(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子工学的手法を用いて製造された梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を不溶性担体に担持させる工程を含む抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、上記工程のうち感作工程、または、感作工程及びブロッキング工程の反応温度が３０〜４５℃であることを特徴とする抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。
【請求項２】
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が、分子量４７ｋＤａ、分子量１７ｋＤａ及び分子量１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも一種である請求項１記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。
【請求項３】
不溶性担体が合成高分子からなるラテックス粒子である請求項１又は２記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法によって得られる抗トレポネーマ抗体測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法及び抗トレポネーマ抗体測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒は梅毒トレポネーマ・パリダム（Treponema Pallidum）により引き起こされる感染症であり、梅毒に感染しているか否かは、血液中の抗トレポネーマ抗体の存在により判断される。
【０００３】
臨床検査分野において、従来より、梅毒トレポネーマ・パリダムより得られた抗原蛋白質を不溶性担体に担持させ、抗トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することにより該抗体を測定する免疫測定法が用いられてきた。このような測定方法としては、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られている。
【０００４】
また、他の方法として、不溶性担体としてプラスチック製マイクロプレートを用い、これに梅毒トレポネーマ・パリダムより得られた抗原蛋白質を担持させたものと抗トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じた反応生成物に、酵素標識第二抗体を反応させ、反応物の酵素活性の程度を測定することにより、抗トレポネーマ抗体を定量する酵素免疫測定法なども用いられてきた。
【０００５】
従来、これらの方法に用いられる梅毒トレポネーマ抗原蛋白質は梅毒トレポネーマ菌体から抽出されたものが用いられていた（特開平２−２３４０６３号公報）。しかし、梅毒トレポネーマ菌体はin vitroでの培養が現在の技術では不可能であり、in vivo であってもウサギ睾丸中での培養のみ可能であるため、大量の抗原を得ることが困難であった。また、ウサギの体調や菌体からの精製過程も煩雑であること等、不安定な要素が多く、精製毎に測定試薬作成に必要な抗原活性があるものが得られるとは限らなかった。
【０００６】
一方、梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質には種々の分子量のものが存在することが知られており、その抗原抗体反応において主要なものとしては、分子量が４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（以下、４７ｋＤａ抗原という）、１７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（以下、１７ｋＤａ抗原という）、１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（以下、１５ｋＤａ抗原という）などが知られている。これらの表面抗原蛋白質をコードする遺伝子はすでにクローニングされ、アミノ酸配列も決定されているので、遺伝子工学的手法を用いてこれらの表面抗原蛋白質を生産することが可能である（Infection and Immunity 57(1),196-203(1989)。Infection and Immunity 61,1202-1210(1993) 。Molecular Microbiology 4,1371-1379(1990)) 。これらの３種類の表面抗原蛋白質のアミノ酸配列はそれぞれ異なっており、それぞれ全く別の表面抗原蛋白質である。
【０００７】
梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の遺伝子工学的手法を用いた生産方法は、特表昭５９−５０２１３１号公報、特表平２−５００４０３号公報などに提案される（このうち、特表平２−５００４０３号公報には、４７ｋＤａ抗原の生産方法が記載されている）とともに、得られた抗原蛋白質を用いて抗トレポネーマ抗体を検出する方法も提案されているが、今日まで、遺伝子工学的手法を用いて得られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を用いた、実用的に使用可能な抗トレポネーマ抗体測定試薬は報告されていない。
【０００８】
この理由としては、測定に必要な感度の不足、現在使用されている赤血球凝集反応を利用した方法（ＴＰＨＡ法）と特異性が一致しない等が考えられるが、以下に述べるように、感度不足が大きな原因と推定される。
【０００９】
従来、梅毒トレポネーマ・パリダム菌体より分離・精製した抗原を不溶性担体に担持させる工程において、その反応温度は、特開平２−２３４０６３号報に記載されているように、通常、室温であった。しかしながら、遺伝子工学的手法により得られた梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を上記発明に従って不溶性担体へ担持し、得られた試薬を用いて抗トレポネーマ抗体の測定を試みたが、測定に必要な十分な感度が得られなかった。
【００１０】
また、特開平７−２８７０１７号公報には、遺伝子工学的手法を用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと１７ｋＤａ抗原の融合タンパク質、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと１５ｋＤａ抗原の融合タンパク質を生産し、それらを用いて、抗トレポネーマ抗体を測定する試薬が開示されている。しかしながら、この試薬は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを結合しているため、純粋な梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質とは言いがたく、また、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが試薬の反応系に存在することになり、検体への悪影響も懸念される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的は、大量生産可能で、安定した抗原活性を持つ、遺伝子工学的手法を用いて得られた梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を使用し、菌体から精製された抗原を用いて作製された測定試薬と同等の感度を有する抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法及び抗トレポネーマ抗体測定試薬を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するべく、本発明者らは鋭意研究を進めた結果、十分な測定感度を得るには、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を不溶性担体に担時させる工程において、その反応温度が非常に重要な因子であることを見い出し本発明を完成した。すなわち、本発明の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法は、遺伝子工学的手法を用いて製造された梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を不溶性担体に担持させる工程を含む抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法であって、上記工程のうち感作工程、または、感作工程及びブロッキング工程の反応温度が３０〜４５℃であることを特徴とし、そのことにより上記目的が達成される。
【００１３】
本発明の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、上記製造方法によって得られることを特徴とする。
【００１４】
本発明に用いられる梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質は、遺伝子工学的手法を用いて得られた、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質であれば、特に限定されないが、例えば、分子量４７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、４４ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Journal of Genetical Microbiology 133,1793-1803(1987))、４２ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Infection and Immunity 57(9),2612-2623(1989)) 、３５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Infection and Immunity 59(10),3536-3546(1991))、３４ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質（Infection and Immunity 57(11),3314-3323(1989))、１７ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質、１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質などが挙げられ、梅毒トレポネーマの主要な表面抗原蛋白質と考えられている４７ｋＤａの表面抗原蛋白質、１７ｋＤａの表面抗原蛋白質および１５ｋＤａの表面抗原蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも一種が好ましい。
【００１５】
本発明に用いられる梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質は、遺伝子工学的手法を用いて得られたものに限定されるが、梅毒トレポネーマ菌体の遺伝子からクローニングされたものであれば、そのクローニング法はどのような方法でもよい。梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を得るための方法の例を４７ｋＤａ抗原の場合を例として挙げると、４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は、前述のように公知であるので、例えば、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原に対するＤＮＡを増幅、精製し、これを適当な発現ベクターに組み込む。このベクターを大腸菌に導入し、大腸菌に大量生産させる方法が挙げられる。大腸菌から効率よく４７ｋＤａ抗原を精製するには、ベクターとして特公平６−８１５９６号公報に記載されているようなグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴという）遺伝子を含むものを用いるのが好ましい。この方法を用いる場合は、ＧＳＴ遺伝子の後に４７ｋＤａ抗原遺伝子を挿入し、大腸菌にＧＳＴと４７ｋＤａ抗原の融合タンパク質として生産させる。十分に生産させた後、菌体を破壊し、リゼイドを固定グルタチオンカラムと接触させることにより融合タンパク質を分離する。次いで、この融合タンパク質を開裂させて４７ｋＤａ抗原を得る。他の梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質を得るには、上記の４７ｋＤａ抗原に対するＤＮＡの代わりに、それぞれの所望の分子量の抗原に対するＤＮＡとすることにより、同様にして所望の分子量の抗原を得ることができる。
【００１６】
本発明に用いられる不溶性担体としては、例えば、有機高分子粒子、微生物、血球、細胞膜片、プラスチック製マイクロプレート等が挙げられる。
【００１７】
上記有機高分子粒子としては、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の天然高分子粒子；ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粒子等が挙げられ、特に合成高分子粒子を均一に懸濁させたラテックスが好ましい。上記ラテックスを用いる場合、粒径は０．１〜１．０μｍが好ましく、０．１〜０．５μｍがより好ましい。
【００１８】
本発明の免疫学的梅毒診断試薬の製造方法は、上記の梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を不溶性担体に担持させる工程を含み、上記工程のうち感作工程、または、感作工程及びブロッキング工程の反応温度が３０〜４５℃であることを特徴とする。
【００１９】
本発明でいう担持させる工程とは、以下の工程を指すものである。一般に、不溶性担体に目的物（本発明の場合は、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質）を担持させる場合、通常、２つの工程よりなる。第１の工程としては、目的物を不溶性担体に結合させる工程で、目的物を物理的吸着により不溶性担体に結合させる、いわゆる感作と呼ばれる工程である。第２の工程としては、上記第１工程が終了した後、不溶性担体の表面が上記目的物で完全に覆われていない場合に、その表面を、例えば、アルブミン、カゼインなどの蛋白質や界面活性剤などで被覆する、いわゆるブロッキングと呼ばれる工程である。本発明でいう担持させる工程とは、上記２つの工程のことを指す。
【００２０】
本発明においては、上記工程の反応温度は、３０〜４５℃に限定されるが、その工程は、上記の感作工程、または感作工程及びブロッキング工程の両方の工程が３０〜４５℃であればよい。
【００２１】
上記反応温度は、３０℃よりも低くなると、例えば、室温（２５℃）では、時間をかければ不溶性担体への梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の吸着反応は進行するが、測定に必要な十分な感度が得られない。また、４５℃を超えて５０℃以下では、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質の不溶性担体への吸着は進行するが、やはり測定に必要な十分な感度が得られない。また、５０℃よりも高い温度では梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が変性してしてしまい抗原性を失ってしまう。
【００２２】
上記反応のｐＨは、４〜１０であることが好ましい。ｐＨ４よりも酸性、又は、ｐＨ１０よりもアルカリ性においては、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が変性してしまう等の問題がある。
【００２３】
上記反応は、通常、水性媒体中で行われる。水性媒体としては、通常、水、特にリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液のような緩衝液が好ましい。
【００２４】
本発明によって得られる抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いて、被検物質中の抗トレポネーマ抗体を測定する方法は、抗トレポネーマ抗体測定試薬の測定原理により異なるが、不溶性担体としてラテックス粒子を用いた抗トレポネーマ抗体測定試薬の場合について、以下に説明する。
【００２５】
抗トレポネーマ抗体を含む被検物質と本発明の試薬を混合することにより、不溶性担体に担持された梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質と被検物質中の抗梅毒トレポネーマ抗体とを反応させ、生じた凝集の度合いを光学的に測定することにより、被検物質中の抗トレポネーマ抗体を測定する。測定方法については、公知の方法に従い、使用する不溶性担体の粒子の大きさ、あるいは、濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行われる。また、これらの方法を併用することもできる。具体的には、散乱光強度、吸光度又は透過光強度を測定する光学機器を用いて行う。測定波長は、２５０〜１０００ｎｍが使用できる。
【００２６】
上記測定方法において、抗原抗体反応の条件は通常の場合と同様であり、反応媒体としては、各種緩衝液が用いられる。この緩衝液は、被検物質を失活させることなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン強度やｐＨを有するものであればよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液などが使用される。反応時のｐＨは、４〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。反応温度は１０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明を実施例につき述べ、その効果を具体的に説明する。なお、以下の実施例においては、検量線感度を比較することにより、その効果を調べた。
【００２８】
参考例１
４７ｋＤａ抗原の調製
（１）発現ベクターの調製
トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパリダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それをもとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合蛋白質を発現するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋと命名した。
【００２９】
（２）４７ｋＤａ抗原の製造
次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋを大腸菌に導入し、培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガラクトピラノシドを加えることにより、４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの融合蛋白質の発現を誘導した。十分に融合蛋白質が発現した大腸菌を超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離により細胞膜、核などを除いた上清に、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を加え、一晩放置し、融合蛋白質をグルタチオンセファロース４Ｂに吸着させた。遠心分離により融合蛋白質が吸着したグルタチオンセファロース４Ｂを回収し、これをカラムに充填した。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流すことにより融合蛋白質がグルタチオンセファロース４Ｂから遊離し溶出した。こうして精製された４７ｋＤａ抗原−ＧＳＴ融合蛋白質溶液にトロンビン溶液を添加し、４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの結合を切断した。この結果、４７ｋＤａ抗原、ＧＳＴ及びトロンビンを含む溶液が得られた。この溶液をグルタチオンセファロース４Ｂカラムに流すことによりＧＳＴを除去した。さらにヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに流すことにより、トロンビンを除去し、４７ｋＤａ抗原を得た。
【００３０】
参考例２
１７ｋＤａ抗原の調製
（１）発現ベクターの調製
トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパリダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに１７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それをもとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により１７ｋＤａ抗原のＤＮＡ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合蛋白質を発現するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１７ｋと命名した。
【００３１】
（２）１７ｋＤａ抗原の製造
次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１７ｋを大腸菌に導入し、培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガラクトピラノシドを加えることにより、１７ｋＤａ抗原とＧＳＴの融合蛋白質の発現を誘導した。十分に融合蛋白質が発現した大腸菌を用い、参考例１の（２）４７ｋＤａ抗原の製造の説明における、４７ｋＤａ抗原という表現を、１７ｋＤａ抗原という表現に置き変える他は、参考例１の（２）と同様に操作して、１７ｋＤａ抗原を得た。
【００３２】
参考例３
１５ｋＤａ抗原の調製
（１）発現ベクターの調製
トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパリダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに１５ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それをもとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により１５ｋＤａ抗原のＤＮＡ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合蛋白質を発現するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１５ｋと命名した。
【００３３】
（２）１５ｋＤａ抗原の製造
次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−１５ｋを大腸菌に導入し、培養した。培養液にイソプロピル−β−（−）−チオガラクトピラノシドを加えることにより、１５ｋＤａ抗原とＧＳＴの融合蛋白質の発現を誘導した。十分に融合蛋白質が発現した大腸菌を用い、参考例１の（２）４７ｋＤａ抗原の製造の説明における、４７ｋＤａ抗原という表現を、１５ｋＤａ抗原という表現に置き変える他は、参考例１の（２）４７ｋＤａ抗原の製造と同様に操作して、１５ｋＤａ抗原を得た。
【００３４】
（実施例１）
１）４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌに、参考例１で得られた４７ｋＤａ抗原（タンパク濃度；１ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌ加えた。この４７ｋＤａ抗原溶液０．５ｍｌに、平均粒径４００ｎｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業社製、固形分濃度１０％（Ｗ／Ｖ））懸濁液０．１ｍｌを添加し、３７℃で１時間撹拌した。次いで、牛血清アルブミン（シグマ社製、以下ＢＳＡとする）を１％（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、更に、３７℃で１時間撹拌し、ブロッキングを行った。
【００３５】
この液を、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得られた沈澱物に、ＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、ラテックスを再懸濁し、４７ｋＤａ抗原担持ラテックス溶液を調製した。
【００３６】
２）検体希釈液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、ＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）、ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク社製、平均分子量７５００、以下ＰＥＧ６０００とする）を２％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解し、検体希釈液を調製した。尚、ＰＥＧ６０００を含むこの溶液は、抗原抗体反応の促進剤として使用した。
【００３７】
３）抗トレポネーマ抗体測定試薬
本実施例の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、上記１）で得られた４７ｋＤａ抗原担持ラテックス溶液からなる第１試薬と、上記検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬である。
【００３８】
４）抗トレポネーマ抗体の測定
上記３）の抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いて、以下のようにして検量線感度の測定を行った。測定には、生化学用自動分析装置（日立７０５０形、日立製作所社製）を用いた。梅毒陽性標準血清〔抗トレポネーマ抗体濃度は、積水化学工業社製、市販梅毒診断試薬「メディエース  ＴＰＬＡ」で測定し、０、３９、１０９、２４２又は４６０Ｔ．Ｕ．〕２０μｌに、検体希釈液（第２試薬）３５０μｌを添加・混合し、一定時間経過後、４７ｋＤａ抗原担持ラテックス溶液（第１試薬）５０μｌを添加・混合する。第１試薬添加後、８０秒から３２０秒間の測定波長５７０ｎｍの吸光度変化量を、上記梅毒陽性標準血清の反応量とした。なお、全反応は３７℃で実施した。梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表１及び図１に示した。
【００３９】
（実施例２）
実施例１における、４７ｋＤａ抗原の代わりに、参考例３で得られた１５ｋＤａ抗原を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表１及び図１に示した。
【００４０】
（実施例３）
実施例１における、４７ｋＤａ抗原の代わりに、参考例２で得られた１７ｋＤａ抗原を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表１及び図１に示した。
【００４１】
（実施例４）
実施例１の１）４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液の調製における、ポリスチレンラテックスに４７ｋＤａ抗原を担持させる際の温度（感作工程及びブロッキング工程）を３０℃に変更したことの他は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表１及び図１に示した。
【００４２】
（実施例５）
実施例１の１）４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液の調製における、ポリスチレンラテックスに４７ｋＤａ抗原を担持させる際の温度（感作工程及びブロッキング工程）を４５℃に変更したことの他は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表１及び図１に示した。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
（比較例１）
実施例１の１）４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液の調製における、ポリスチレンラテックスに４７ｋＤａ抗原を担持させる際の温度（感作工程及びブロッキング工程）を２５℃に変更したことの他は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表２及び図２に示した。
【００４５】
（比較例２）
実施例１の１）４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液の調製における、ポリスチレンラテックスに４７ｋＤａ抗原を担持させる際の温度（感作工程及びブロッキング工程）を５０℃に変更したことの他は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表２及び図２に示した。
【００４６】
（比較例３）
実施例１の１）４７ｋＤａ抗原担持ラテックス液の調製における、ポリスチレンラテックスに４７ｋＤａ抗原を担持させる際の温度（感作工程及びブロッキング工程）を６０℃に変更したことの他は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ抗体測定試薬の調製、及び得られた試薬の検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表２及び図２に示した。
【００４７】
（比較例４）
この比較例においては、トレポネーマ・パリダム菌体より得られた抗原蛋白質を担持した、従来の抗トレポネーマ抗体測定試薬を製造し、その性能を測定した。
【００４８】
１）トレポネーマ・パリダム菌体由来抗原蛋白質の調製
特開平２−２３４０６３号公報に記載の方法で、トレポネーマ・パリダム菌体由来抗原蛋白質を調製した。
【００４９】
２）トレポネーマ・パリダム菌体由来抗原蛋白質担持ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌに、上記１）で得られたトレポネーマ・パリダム菌体由来抗原蛋白質（タンパク濃度；１ｍｇ／ｍｌ）を０．１ｍｌ加えた。この抗原蛋白質溶液０．５ｍｌに、平均粒径４００ｎｍのポリスチレンラテックス（積水化学工業社製、固形分濃度１０％（Ｗ／Ｖ））懸濁液０．１ｍｌを添加し、室温で１時間撹拌した。次いで、牛血清アルブミン（シグマ社製、以下ＢＳＡとする）を１％（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、更に、室温で１時間撹拌し、ブロッキングを行った。
【００５０】
この液を、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得られた沈澱物に、ＢＳＡを１％（Ｗ／Ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を５ｍｌ添加し、ラテックスを再懸濁し、トレポネーマ・パリダム菌体由来抗原蛋白質担持ラテックス溶液を調製した。
【００５１】
３）検体希釈液の調製
実施例１の２）検体希釈液の調製と同様にして、検体希釈液を調製した。
【００５２】
４）抗トレポネーマ抗体測定試薬
本比較例の抗トレポネーマ抗体測定試薬は、上記２）で得られたトレポネーマ・パリダム菌体由来抗原蛋白質担持ラテックス溶液からなる第１試薬と、上記検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬である。
【００５３】
５）抗トレポネーマ抗体の測定
上記４）の抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いたことの他は、実施例１の４）抗トレポネーマ抗体の測定と同様にして、検量線感度の測定を行ない、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を表２及び図２に示した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
表１、表２、図１及び図２より、実施例１〜５で得られた抗トレポネーマ抗体測定試薬は、抗トレポネーマ抗体測定に十分な検量線感度が得られているが、比較例１〜３で得られた抗トレポネーマ抗体測定試薬は、抗トレポネーマ抗体測定に必要な検量線感度が得られていないことが分かる。また、実施例１〜５で得られた抗トレポネーマ抗体測定試薬の検量線感度は、比較例４で得られたトレポネーマ・パリダム菌体より得られた抗原蛋白質を担持した、従来の抗トレポネーマ抗体測定試薬の検量線感度と同等であることが分かる。
【００５６】
【発明の効果】
請求項１記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法の構成は、上記の通りであり、遺伝子工学的手法を用いて製造され得る梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質を不溶性担体に担持させる工程において、その反応温度が３０〜４５℃とされているので、本発明により製造した試薬を用いると、菌体から精製された抗原を用いて作製された測定試薬と同等の感度を有する抗トレポネーマ抗体測定試薬が得られる。
【００５７】
請求項２記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法の構成は、上記の通りであり、上記の請求項１記載の発明の全ての効果を奏するとともに、梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質が、分子量４７ｋＤａ、分子量１７ｋＤａ及び分子量１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白質からなる群より選ばれる少なくとも一種に限定されているので、梅毒診断に特に適した、抗トレポネーマ抗体測定試薬が得られる。
【００５８】
請求項３記載の抗トレポネーマ抗体測定試薬の製造方法の構成は、上記の通りであり、上記の請求項１記載の発明の全ての効果を奏するとともに、不溶性担体が合成高分子からなるラテックス粒子であるので、得られる試薬は、測定精度がより高く、かつ安定性がよい試薬が得られる。
【００５９】
本発明４の抗トレポネーマ抗体測定試薬の構成は、上記の通りであり、本発明の試薬を用いると、菌体から精製された抗原を用いて作製された測定試薬と同等の感度をもって抗トレポネーマ抗体を測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１〜５の抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いて得られた、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を示すグラフである。
【図２】比較例１〜４の抗トレポネーマ抗体測定試薬を用いて得られた、梅毒陽性標準血清中の抗トレポネーマ抗体濃度（Ｔ．Ｕ．）と吸光度変化量の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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