(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離し、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉後、重水により軽水を置換し、次いで重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッピングカラムより溶出することを特徴とするＮＭＲ測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフィーにおける移動相の変換方法。
【請求項２】
高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離する分離・サンプリングセクション、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉するトラッピングセクション、重水により軽水を置換する重水置換セクション、重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッピングカラムより溶出する重溶媒送出セクションを備えることを特徴とするＮＭＲ測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
ポンプ、インジェクター、分離用カラム、切り替えバルブ、検出器、分配バルブ、サンプリングループ、トラッピングカラムを備えた高速液体クロマトグラフィーシステムであって、
分離・サンプリングセクションが、ポンプ（Ｐ1）から試料分離用移動相を送出し、検出器で所望の化合物ピークを検出し、バルブ（Ｖ１）を通って、両端をバルブ（Ｖ2）及び（Ｖ3）に挟まれたループ（ＬＯＯＰ）に所望の化合物を蓄積する手段を備え、
トラッピングセクションが、ポンプ（Ｐ2）から送出される試料濃縮用移動相を、バルブ（Ｖ１）、バルブ（Ｖ２）、ループ（ＬＯＯＰ）、バルブ（Ｖ3）、バルブ（Ｖ４）、バルブ（Ｖ５）、トラッピングカラム（ＴＣ）、バルブ（Ｖ４）の順に流し、バルブ（Ｖ３）とバルブ（Ｖ４）の間に分配バルブ（Ｒ）を介して試料濃縮用移動相を混合しながら所望の化合物をトラッピングカラム（ＴＣ）中に濃縮する手段を備え、
重水置換セクションが、重水を、ポンプ（Ｐ３）、バルブ（Ｖ５）、トラッピングカラム（ＴＣ）、バルブ（Ｖ４）の順に送出して軽水を重水に置換する手段を備え、
重溶媒送出セクションが、重水以外の重溶媒を、ポンプ（Ｐ4）、バルブ（Ｖ４）、トラッピングカラム（ＴＣ）、バルブ（Ｖ５）、バルブ（Ｖ４）、分離カラム２（ＡＣ）、検出器（Ｄ２）の順に流し、所望の化合物を収集して、ＮＭＲ分析に供する請求の範囲第２項に記載のＮＭＲ測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフィー装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）用の試料を効率的に分取できる高速液体クロマトグラフィーにおける移動相の変換方法と装置に関する。
従来背景
試料中の微量成分を分析する技術として、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略すことがある）が汎用されている。
近年では、このＨＰＬＣを質量分析装置と組み合わせて、成分の分離と同定とを同時に行うシステムも用いられている。
例えば、特開平３−１７５３５５号公報には、高速液体クロマトグラフィー質量分析における移動相の変換方法と装置が開示されている。これには、高速液体クロマトグラフィーで、試料中の所望成分を捕捉するとともに、その成分を試料の分離とは異なる質量分析に適した移動相により質量分析装置に送ることが記載されている。
一方、ＮＭＲを用いて構造解析を行うには、少なくとも数百マイクログラムの試料が必要である。そのため、例えば、医薬物質中の0.1％の不純物を分取するためには、数百ミリグラムの元試料を必要とする。
従来は、元試料から数回に分けてＮＭＲ用試料を分取していたが、試料を濃縮するために長時間を要する上、不安定な試料は濃縮中に分解することもあった。
また、ＮＭＲ分析においては、水素原子をその同位体である重水素に置換した重水や重メタノール等の溶媒が使われる。これらの溶媒は、非常に高価であるので、できるだけ効率的に測定試料を調製することが求められている。
高速液体クロマトグラフィーとＮＭＲを連結したシステムは公知であるが、分析用のＨＰＬＣを使用するため、少量のサンプルしか注入することができない。そのため、医薬物質中に0.1％含まれる不純物などの微量成分を単離して、構造解析するのは困難である。また、専用のプローブを別途購入しなければならないので、経費が嵩むという不都合があるので、より簡便なシステムが求められている。
以上の従来技術の有する問題点を鑑みて、本発明は、混合物中の微量成分を単離精製、脱塩、濃縮、重水素化置換をオンラインで行い、特に、高価な重水や重メタノール等の重溶媒の使用量を極めて少なく済ますシステムを提供することを目的とする。
発明の開示
上記目的を達成する本発明のＮＭＲ測定用試料の分取と調製を行う高速液体クロマトグラフィーにおける移動相の変換方法は、高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離し、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉後、重水により軽水を置換し、次いで重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッピングカラムより溶出することを特徴とする。
これによると、高速液体クロマトグラフィーによる試料中の微量成分の分離に際し、濃縮操作と移動相の変換を行うことで、ＮＭＲ測定に適した所望化合物の分取と調製を同時にかつ効率的に行える。
この本発明方法を実施する本発明装置は、高速液体クロマトグラフィーにより試料中の成分を分離する分離・サンプリングセクション、別の移動相によりトラッピングカラムで成分を捕捉するトラッピングセクション、重水により軽水を置換する重水置換セクション、重水以外の重溶媒により、その目的成分をトラッピングカラムより溶出する重溶媒送出セクションを備えることを特徴とする。
その好適な装置の詳細は、分離・サンプリングセクションが、ポンプ（Ｐ1）から試料分離用移動相を送出し、検出器で所望の化合物ピークを検出し、バルブ（Ｖ１）を通って、両端をバルブ（Ｖ2）及び（Ｖ3）に挟まれたループ（ＬＯＯＰ）に所望の化合物を蓄積する手段を備え、トラッピングセクションが、ポンプ（Ｐ2）から送出される試料濃縮用移動相を、バルブ（Ｖ１）、バルブ（Ｖ２）、ループ（ＬＯＯＰ）、バルブ（Ｖ3）、バルブ（Ｖ４）、バルブ（Ｖ５）、トラッピングカラム（ＴＣ）、バルブ（Ｖ４）の順に流し、バルブ（Ｖ３）とバルブ（Ｖ４）の間に分配バルブ（Ｒ）を介して試料濃縮用移動相を混合しながら所望の化合物をトラッピングカラム（ＴＣ）中に濃縮する手段を備え、重水置換セクションが、重水を、ポンプ（Ｐ３）、バルブ（Ｖ５）、トラッピングカラム（ＴＣ）、バルブ（Ｖ４）の順に送出して軽水を重水に置換する手段を備え、重溶媒送出セクションが、重水以外の重溶媒を、ポンプ（Ｐ4）、バルブ（Ｖ４）、トラッピングカラム（ＴＣ）、バルブ（Ｖ５）、バルブ（Ｖ４）、分離カラム２（ＡＣ）、検出器（Ｄ２）の順に流し、所望の化合物を収集して、ＮＭＲ分析に供する装置である。
なお、ポンプとは、高速液体クロマトグラフィー用の送液ポンプであり、バルブとは、高速クロマトグラフィー用の六方バルブ等である。
分離用カラムとは、通常の高速液体クロマトグラフィーに使用される分離カラムであり、いわゆる順相カラム、逆相カラム、ＧＰＣカラム等特に限定されず、試料中の目的とする微量成分を分離することができるカラムを適宜選択できる。
トラッピングカラムとは、目的成分を捕捉し、濃縮するためのカラムであり、必ずしも高速液体クロマトグラフ用のカラムでなくてもある程度耐圧性のカラムであれば使用できる。
サンプリングループとは、分離カラムにより試料から分離された成分を蓄積するための細管であり、通常ステンレス管を用いる。その長さは、成分濃度等により適宜調節する。
また、ポンプ、カラム、バルブ等は、通常ステンレス管により連結される。
重溶媒とは、溶媒中の水素原子を重水素に置換した溶媒（ただし重水を除く）を意味し、例えば、重メタノール、重クロロホルム、重メチレンクロライド等である。中でも重メタノールが汎用される。
本発明おいては、高速液体クロマトグラフィーに用いる移動相を数回変換するが、その手順等については以下の発明の実施の形態において具体的に説明する。しかし、本発明は、その説明に限定されるものではなく適宜設計変更可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明による装置の一例を示す説明図である。第２図は、本発明装置における検出器Ｄ１及びレコーダーにより得られたクロマトグラムである。第３図は、本発明装置における検出器Ｄ２及びレコーダーにより得られたクロマトグラムである。第４図は、本発明装置により得られたＮＭＲ測定用試料を用いて得られたＮＭＲチャートである。
発明を実施するための最良の形態
図面を基に、本発明を詳述する。
第１図は、高速液体クロマトグラフィーによる試料濃縮と溶媒変換装置を示す。
ポンプ（Ｐ１）に連結する部分が、分離・サンプリングセクションである。
分離・サンプリングセクションは、目的成分を分離するための移動相を入れた容器に連通したポンプ（Ｐ１）、インジェクター（Ｉ）、分離カラム（ＰＣ）、検出器（Ｄ１）、レコーダー（Ｒｅｃ）、並びに、ラインの切り替えを行う六方バルブ（Ｖ１）、バルブ（Ｖ２、Ｖ３）、ループ（ＬＯＯＰ）からなる。
六方バルブ（Ｖ１）に接続された排出ドレイン（ＤＲ１）は、不要な成分を移動相とともに排出するためのものであり、これらのドレイン（ＤＲＡＩＮ）は、通常ステンレス管からなるラインで接続されている。
六方バルブ（Ｖ１）を切替えることにより、ラインは切替えバルブ（Ｖ２、Ｖ３）に接続するサンプリングループ（ＬＯＯＰ）に接続し、移動相は排出ドレイン（ＤＲ１）から排出される。
サンプリングループ（ＬＯＯＰ）には、多数のループが接続されていて、切り替えバルブ（Ｖ２、Ｖ３）の操作で、移動相の流路を任意のループに連結するように選択できる。
こうして、分離・サンプリングセクションで分離した成分を、成分毎に異なるループに分けて蓄積する。ループの数は適宜任意に設定する。
ポンプ（Ｐ２）に連結する部分が、トラッピングセクションである。
トラッピングセクションは、上述の分離移動相とは異なる組成からなる移動相を送出するポンプ（Ｐ２）、分離・サンプリングセクションと共通の六方バルブ（Ｖ１）、バルブ（Ｖ２、Ｖ３）、ループ（ＬＯＯＰ）、共通ではない六方バルブ（Ｖ４、Ｖ５）、トラッピングカラム（ＴＣ）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、更に、上記流路中に設けられた副流路中に配設した分配バルブ（Ｒ）からなり、移動相は、バルブ（Ｖ４）に接続される排出ドレイン（ＤＲ２）から排出される。
トラップカラムは、目的成分を吸着できるように分離カラム（ＰＣ）と同じ分離モードのカラムを使用するが、必ずしも高速液体クロマトグラフ用のカラムでなくてもよく、ある程度の耐圧性があるカラムであれば使用できる。
カラム（ＰＣ）とカラム（ＴＣ）は、例えば、順相カラム、逆相カラム、イオン交換カラム、アフィニティークロマトカラム、ＧＰＣカラム等の種々の分離モードのカラムを、分離分析しようとする物質に応じて適宜選択する。
ポンプ（Ｐ３）に連結する部分が、重水置換セクションである。
重水置換セクションは、重水を送出するポンプ（P３）とトラッピングセクションと共通の六方バルブ（Ｖ５）、トラッピングカラム（ＴＣ）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、六方バルブ（Ｖ４）からなり、各パーツは、通常ステンレス管で接続されていて、重水は排出ドレイン（ＤＲ２）から排出される。
ポンプ（Ｐ４）に連結する部分が、重溶媒送出セクションである。
重溶媒送出セクションは、重メタノール等の重溶媒（重水を除く）を送出するポンプ（Ｐ４）と、重水置換セクションと共通の六方バルブ（Ｖ４）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、トラッピングカラム（ＴＣ）、六方バルブ（Ｖ５）、並びに、共通でない分離カラム（ＡＣ）、検出器（Ｄ２）からなる。
ミキシングチャンバーは、特開平５−１８０８２０号公報に開示された溶媒混合カラムであり、チャンバー内に移動相とは異なる溶媒をあらかじめ充填しておくことにより、簡便にグラジエント分析を行うことができる装置である。本発明においては、ＮＭＲ用サンプルを分取する前に更に分離分析を行い目的成分のより一層の精製濃縮を行うために有用であるが、本発明に必須の構成要素ではない。
次に、上記のように構成された装置を使用して溶媒を変換する方法を説明する。
まず、ポンプ（Ｐ１）を稼動して成分分離用移動相をライン（３０）、（３１）に送り込み、インジェクター（Ｉ）から目的とする成分を含有する試料を注入する。
試料は、移動相とともに分離カラム（ＰＣ）を通過し、カラム中で試料中に含有される種々の成分に分離され、各成分は、検出器（Ｄ１）及びレコーダー（Ｒｅｃ）でモニターされる。
目的成分以外は、排出ドレイン（ＤＲ１）より排出される。
分離された各々の目的成分は、六方バルブ（Ｖ１）を切替えることによりライン（３２）を通り、両端が切替えバルブ（Ｖ２）、（Ｖ３）に連結したサンプリングループ（ＬＯＯＰ）に送り込まれる。各成分は、切替えバルブ（Ｖ２）、（Ｖ３）を操作することにより、それぞれ所定のループに蓄積される。
バルブ（Ｖ２）、（Ｖ３）の切替えは、試料中の各々の成分が所定のループに蓄積できるように検出器（Ｄ１）の検出信号に応じて行われる。
なお、成分分離用移動相は、ライン（３３）、バルブ（Ｖ１）を通って排出ドレイン（ＤＲ１）より排出される。
このようにして、サンプリングループ（ＬＯＯＰ）に適当量の目的成分が蓄積された後、六方バルブ（Ｖ１）を切替えてライン（３４）と（３２）を連通させる。
そして、ポンプ（Ｐ２）を稼動して成分分離用移動相とは異なる組成の移動相（以下、トラップ用移動相と称する）をライン（３４）、（３２）、バルブ（Ｖ２）から、サンプリングループ（ＬＯＯＰ）に送り込む。これによって、サンプリングループ（ＬＯＯＰ）に蓄積された成分をトラップ用移動相とともに押出して、ライン（３３）、バルブ（Ｖ１）及びライン（３５）、六方バルブ（Ｖ４）、ライン（３６）、六方バルブ（Ｖ５）、ライン（３７）、（３８）を通ってトラッピングカラム（ＴＣ）に送り込み目的成分を捕捉する。
トラップ用移動相はライン（３９）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、ライン（４０）、六方バルブ（Ｖ４）を通って排出ドレイン（ＤＲ２）へ排出される。
この時、副流路（３４’）をライン（３４）に接続し、トラップ用移動相をライン（３４）の流路へ混合すると、トラッピングカラム（ＴＣ）に成分が捕捉されやすくなる。
即ち、トラッピングカラム（ＴＣ）に目的成分を捕捉するためには、成分分離用移動相とは異なる組成の移動相を流す必要があるが、サンプリングループ（ＬＯＯＰ）内に蓄積された成分及び分離用移動相を副流路からの移動相の混合なしにトラップ用移動相により押出すと、一時的に分離用移動相濃度が高くなり、目的成分がトラップされにくい。副流路からトラップ用移動相を混合し分離用移動相を希釈することにより、トラップ効率を高めることができる。副流路には、分配バルブ（Ｒ）を設置して流量を調節することができる。
また、トラップ用移動相は、目的成分をトラッピングカラム（ＴＣ）に捕捉させるとともに、サンプリングループ（ＬＯＯＰ）中に貯留された分離用移動相で用いた緩衝成分を取り除く役割を果たす。トラップ用移動相としては、例えば逆相系では水などが使用でき、順相系ではヘキサン等の炭化水素やクロロホルム等のハロゲン化炭化水素などが使用できる。
次に、六方バルブ（Ｖ５）を切替えてライン（４１）とライン（３８）を連通させ、ポンプ（Ｐ３）を稼動させることにより、重水をトラッピングカラム（ＴＣ）に送り込んで、トラッピングカラム（ＴＣ）及びライン（３８）、（３９）、（４０）中に存在するトラップ用移動相を重水に置換する。
なお、この時、トラッピングカラム（ＴＣ）中の成分は、カラム中に蓄積されたまま溶出されない。
最後に、バルブ（Ｖ４）、（Ｖ５）を切替えて、ライン（４３）、（４０）、ミキシングチャンバー（ＭＧ）、ライン（３９）、トラッピングカラム（ＴＣ）、ライン（３８）、バルブ（Ｖ５）、ライン（３７）、（３６）、バルブ（Ｖ４）、ライン（４２）、分離カラム（ＡＣ）、並びに、検出器（Ｄ２）を連通させ、ポンプ（Ｐ４）を稼動する。
これにより、重メタノール等の重溶媒（重水を除く）を送出し、トラッピングカラム（ＴＣ）内に貯留された目的成分を溶出させる。そして、その目的成分は分離カラム（ＡＣ）により更に分離精製されるとともに、より濃縮された状態となって、検出器（Ｄ２）を通過し分取される。
以下に、実験例を示す。
試料として、不純物を約2.5％含有するクロタミトン（Crotamiton）を用い、次の条件により、本発明による装置及び方法の効果を確認した。
実験条件：
ポンプ１（Ｐ1）・・・・・・・・TOSOH CCPM
移動相・・・・・・・・・・・・H2O：CH3CN＝100：40
分離用カラム１（ＰＣ）・・・・ODS-AM,10x300mm(YMC)
検出器（Ｄ１）・・・・・・・・検出波長UV230nm(Shimazu SPD-6A)
流速・・・・・・・・・・・・・4.0ml/min
ポンプ２（Ｐ２）・・・・・・・TOSOH CCPM
移動相・・・・・・・・・・・・H2O（軽水）
流速・・・・・・・・・・・・・2.0ml/min
トラッピングカラム（ＴＣ）・・4.6x34mm(Inertsil)
トラップ時間・・・・・・・・・30分
ポンプ３（Ｐ３）・・・・・・・TOSOH CCPM
移動相・・・・・・・・・・・・D2O（重水）
流速・・・・・・・・・・・・・1.0ml/min
変換時間・・・・・・・・・・・10分
ポンプ４（Ｐ４）・・・・・・・TOSOH CCPM
移動相・・・・・・・・・・・・CD3OD（重メタノール）
分離用カラム（ＡＣ）・・・・・ODS,2.1x250mm(Inertsil)
検出器（Ｄ２）・・・・・・・・検出波長UV230nm(Shimazu SPD-6A)
流速・・・・・・・・・・・・・0.2ml/min
ＮＭＲ・・・・・・・・・・・・JEOL JNM-α400
実験の結果は、図２ないし４に示す通りであり、重水使用量は10ml、重メタノール使用量は４mlであった。
従来は、分取、濃縮、乾燥後にＮＭＲ測定を行っていたが、本発明による装置及び方法では、オンラインによる連続操作によりＮＭＲ測定試料を得ることができ、また、高価な重水や重メタノール等の重溶媒の使用量が極めて少量で済むことが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によると、構造解析試料の単離精製・脱塩・濃縮・重水素化置換がオンライン操作により行えるため、試料のドライアップが不要であり、特に不安定なサンプルの構造解析に有用である。
また、例えば医薬品として有望な生理活性物質中の極微量な不純物の単離精製・脱塩・濃縮・重水素化置換を、短時間で行うことができる。
更に、試料中の複数の微量成分を分離するとともに、ＮＭＲ分析に適した重メタノール等の重溶媒への置換を、容易に行うことができ、しかも、重メタノールの使用量を極めて少量で済ませられる。
【図１】
0003720058.tif 000002
【図２】
0003720058.tif 000003
【図３】
0003720058.tif 000004
【図４】
0003720058.tif 000005