(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
0.001〜100mMのゼラチンと、
0.01〜1000μＭの凍結保護物質と、
0.001〜100mMの二価キレート化剤と、
0.01μＭ〜300mMの酸化窒素阻害物質と
を含む、細胞組織の長期保存に適したヒドロゲルマトリックスであって、
体温で液体であるヒドロゲルマトリックス。
【請求項２】
上記ゼラチンが、変性コラーゲンを含むことを特徴とする請求項１に記載のマトリックス。
【請求項３】
上記凍結保護物質が長鎖炭水化物を主成分とする糖であることを特徴とする請求項１に記載のマトリックス。
【請求項４】
上記酸化窒素阻害物質が、アミノ酸またはアミノ酸類似体であることを特徴とする請求項１に記載のマトリックス。
【請求項５】
上記アミノ酸類似体が、アミノグアニジンと、Ｎ−モノエチル−Ｌ−アルギニンと、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンと、Ｄ−アルギニンとから成る群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のマトリックス。
【請求項６】
5,000〜40,000の分子量有孔性を有する半透過性膜により被包された請求項１に記載のヒドロゲルマトリックス中の細胞部分を含むことを特徴とする移植可能な生体人工装置。
【請求項７】
半透過性膜によって被包されたヒドロゲルマトリックス中に細胞部分を含有し、該マトリックスが0.01〜30mMの量のゼラチンと、15〜96.5重量％の量の液体と、0.01μＭ〜300mMの量の酸化窒素阻害物質とを含むことを特徴とする移植可能な生体人工装置。
【請求項８】
上記細胞部分が治療上所望される物を産生し、上記膜が該物の分子量から40,000までの間の分子量有孔性を有するポリパラキシリレンを含んで成ることを特徴とする、請求項７に記載の移植可能な生体人工装置。
【請求項９】
上記マトリックスが0.001〜100mMの濃度で存在する二価キレート化剤を含むことを特徴とする請求項７記載の装置。
【請求項１０】
0.001〜100mMのゼラチンと、
0.01〜1000μＭの凍結保護物質と、
0.01μＭ〜300mMの酸化窒素阻害剤と
を含むことを特徴とする、長期の細胞組織の貯蔵に適したヒドロゲルマトリックスであって、
体温で液体であるヒドロゲルマトリックス。
【請求項１１】
上記ゼラチンが変性コラーゲンを含むことを特徴とする請求項10に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１２】
上記酸化窒素阻害剤がＬ−アルギニン類似体を含むことを特徴とする請求項10に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１３】
上記Ｌ−アルギニン類似体がアミノグアニジン、Ｎ−モノメチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項12に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１４】
上記凍結保護物質がデキストランまたは硫酸デキストランを含むことを特徴とする請求項10に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１５】
有効量の極性アミノ酸をさらに含むことを特徴とする請求項10に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１６】
上記極性アミノ酸が、グルタミン酸、アルギニン、およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項15に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１７】
0.001〜100mMの変性コラーゲンと、
0.01〜1000μＭのデキストランまたは硫酸デキストランと
0.01μＭ〜300mMのアミノグアニジンと
を含むことを特徴とする、長期の細胞組織の貯蔵に適したヒドロゲルマトリックス。
【請求項１８】
前記凍結保護物質が、デキストラン、硫酸デキストラン、アミロペクチン、およびプロテオグリカンからなる群から選択される請求項１または10に記載のヒドロゲルマトリックス。
【請求項１９】
ゼラチンと、デキストランまたは硫酸デキストランと、有効量の極性アミノ酸とを含み、体温で液体である、長期の細胞組織の貯蔵に適したヒドロゲルマトリックス。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本出願は1992年２月24日出願の米国特許番号07/841,973の一部継続出願である、1994年９月２日出願の米国特許出願番号08/300,429の一部継続出願である。
発明の背景
本発明はホルモン生産組織を含む、細胞部分の被包（encapsulation）、及び特に糖尿病被験者への異種移植のためのインシュリン生産膵島の膜被包に関する。さらには、本発明は組織に対する改良したマトリックス、特に、組織の長期貯蔵、組織機能の定期的評価、移植に先立つ組織包含装置の非破壊試験を可能にし、その組織成長を促進する、ホルモン生産組織に関する。
糖尿病は米国だけで約2000万人を冒す難病である。この難病はインシュリンのほぼ完全な欠如（Ｉ型糖尿病）又は循環インシュリンの正常水準への耐性（II型糖尿病）のいずれかで特徴づけられる。どちらの状態も現在外部性インシュリンを毎日皮下注射して、ある程度まで制御できる。インシュリン注射は予め決められた薬量で定期的に間隔を置かれるので、開ループ系としての治療法は、代謝要求によってインシュリンを放出するのでもなく、それによって非糖尿病被験者で達成される範囲内へと血糖水準を制御するのでもない。従って、この種の治療は疾患に関連する血管合併症を防ぐために必要な血糖の代謝制御を達成できなかったことは良く認識されている。これらの合併症には、失明、腎不全、心臓疾患、卒中及び末梢知覚神経機能の喪失が含まれる。さらに、インシュリンが約10分毎に不連続な薬量で放出される喪失又は正常インシュリン脈動性は、Ｉ型及びII型の両方の糖尿病で、正常なインシュリン感受性を維持するために必要である。この正常脈動性の喪失及びインシュリン耐性の悪化は、糖尿病関連大血管疾患の進展で第一に重要であると考えられる。糖尿病は現在米国において第三位の死亡原因疾患で、治療のために年間約20〜30億ドルを要する。
糖尿病被験者にインシュリンを送達するために、プログラム化した又は手動操作のインシュリン分注ポンプが、血糖を狭い範囲内に制御する試みでインシュリンの多数で少量の薬量を提供するために使用されている。このようなポンプは、依然として開ループ系として機能するもので、インシュリンの必要量を予期しようとはするが、代謝要求に対応しない。このようなポンプからのインシュリンは正常には皮下組織を通じて吸収されるので、分注されたインシュリンは不連続投与とはならない。従来のインシュリン注射に比較して、現在のポンプによる治療の効率は明らかに優位なものでもなく、臨床的にも受容されていない。閉ループ制御を提供するために血糖センサでポンプを制御する試みはあったが、現在まで長期間生体適合性及び機能性を有する移植可能なセンサは達成されていない。
多年にわたって医学研究者は、選択的透過膜を通って代謝要求に従ってインシュリンを放出する、生きたインシュリン生産細胞、膵島又は分離ベータ細胞を取り込む閉ループ移植装置の望ましさを認識してきた。「生体人工膵臓」と名づけられたこれらの装置は、機能的及び性能的制約によって定義されている。第一に、このような組織は血糖濃度の増加及び減少に応答し、適当な時間内に必要量のインシュリンを放出しなければならない。第二に、装置はインシュリン生産を支持して、抑制してはならない。第三に、装置は免疫拒絶反応に対する保護を提供しなければならない。第四に、膵島は機能的に生き残らねばならず、又は装置は容易に置換されえなければならない。第五に、膜は適当に選択性で、患者に生体適合性で、宿主組織との接触でその機能的特性が変えられてはならない。
種々のカプセル接近が膵島を含み、平面状又は管状膜を用いる物理的装置に関して取られた。技術上提案された膜の例はAmicon中空糸、アルギン酸ポリリジンカプセル、ポリアクリロニトリルシート並びに中空糸、アガロースゲルカプセル、Millipore膜、修飾コロジオン、酢酸セルロース、ポリ二フッ化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、Nuclepore CorporationからのNuclepore膜、Poretic CorporationからのPoretic膜及びその他を含む。一般に、生理的グルコース信号入力及びインシュリンの放出を適当に可能にするために膵島組織に適用すると、これらは膜の汚染につながる生体適合性の欠如及びそれらの厚さのために失敗した。拒絶反応を克服するための試みとして、高度に精製されたベータ細胞が、シクロスポリンのような有効な免疫抑制剤を大量摂取しているヒト被験者に移植された。知られている限りでは、この接近を用いて長期の好結果の移植はなかった。
最近、膵島はアルギン酸ナトリウムのようなヒドロゲルにマクロ被包され、アクリル共重合体を用いる、乾−湿式紡糸技術で作られた中空糸に注入された。マウスのグルコース水準を制御する能力を示したが、線維の長期生体適合性は確立しなかった。
発明の簡単な要約
本発明は、要求によって閉ループインシュリン送達を提供するための前述の問題を克服し、認知された生体適合性材料による宿主の免疫防御から膵島（islet）を選択的に保護することにより拒絶反応の上記問題を克服しながら、上記基準を満足する移植可能な装置を提供する。
さらに特別に、ヒトの又は好適にはより容易に入手可能な動物の膵島が、栄養素、グルコース信号、電解質、水、及び膵島で放出されるインシュリン（それらの全てが約6,000以下の分子量を有する）の通過が可能である多孔性の膜部分を有するポリパラキシリレンを含む高分子材料で包まれる。しかしこの膜の多孔性は、40,000〜500,000の分子量を有する免疫グロブリン及び抗体の通過に必要な多孔性よりは小さい。特にポリパラキシリレンは移植に対して生体がある適合性表面マトリックスとして認知され、フィブリンのような血漿因子又は血小板のような細胞と相互作用しない。従って、カプセルの孔は閉塞しないであろうし、宿主自身のグルコース濃度の関数としてのインシュリン放出が生じるだろう。ポリパラキシリレンの選択的膜多孔性及びその内外表面に対する生体適合性を提供しながら、装置は新鮮な又は凍結した膵島に基づき、種々の細胞配列を形成して、種々のデザインが可能である。
本発明はヒドロゲルマトリックスを用いた選択的透過性膜による上記装置のコンフォーマルコーティングのための方法をも提供する。この方法は細胞損傷又はヒドロゲルの侵食無しに、高真空条件下で、ヒドロゲルを含む膵島の被覆を可能にする。この被覆は共形的あるいは相似的な（装置の形状に適合する）性質と適切な厚さを有するので、本発明は独特にグルコース信号への非常に急速なインシュリン応答を可能にし、生理的インシュリン脈動性が生じることを可能にする。
本発明はさらに、機能性の定期的試験や、膜の使用のための改良したマトリックス、細胞部分並びに関連装置の非破壊試験、このような装置の長期貯蔵、膵島を含む細胞部分の長期貯蔵を可能にする、改良した細胞マトリックスを提供する。製造後の装置の機能性試験を移植に先立って行うことができる。さらに、マトリックスは膵島複製及び他の細胞部分の複製を促進する環境を提供する。従来、膵島移植の当業者は、全て日々の問題内で、装置製造のための膵島単離及び精製から直接着手する必要があった。装置製造後、装置は非破壊的試験装置機能性に対する可能性もなく、移植されてきた。本発明は、膵島がそこに付着し、繁殖するコラーゲン性及び／又はゼラチン性基材からなる天然膵臓システムに類似するマトリックスを提供する。さらに特に、マトリックスは、媒体及び添加物と共に、膵島が単独で及び一団になって付着する高分子鎖を提供する、煮沸コラーゲンを使用する。以下に詳細に記載するように、マトリックス調合は汚染無しで六ヶ月以上の貯蔵で膵島の機能性を維持し、移植に先立つ機能性試験に対する能力付きで数カ月間完成した装置の貯蔵を可能にし、性能の低下無しに、時間と共に改善するインシュリン生産の証拠を示しながら、インビボ寿命を延ばした。さらに、移植した装置に関して補足的に使用したマトリックスは膜の直近で血管分布を促進した。
本発明は、熱的に依存する水素結合生成及び双極子モーメント相互作用に基づいて、膵島、肝細胞又は同類の細胞付着のためのマトリックスを使用する細胞マトリックスを提供する。好適なマトリックスは部分的に、細胞成長のための自然環境を提供し、アミン、カルボキシル基、水酸基、及びスルフヒドリル基水素結合生成及び双極子モーメント相互作用に基づいて煮沸又はその他の方法で変性すると容易にゲルを形成する極性並びに非極性アミノ酸を含む、コラーゲンベースのゼラチンを含む。力に対するこのマトリックスの抵抗性は、水素結合及び双極子モーメント相互作用から二価陽イオン干渉を除くキレート化剤の添加により増加する。露出した活性基は、この水素結合生成を経て低温で水を不動化するために使用され、低温における熱的障害を最少にする。
本発明はさらに、核損傷、及び他の関連傷害から細胞死を生じることが知られる、酸化窒素及びその代謝物からの保護を生じる細胞マトリックスを提供する。細胞マトリックスは、構成的又は誘導的のいずれかで、酸化窒素合成酵素による酸化窒素の生成からＬ−アルギニンを抑制するために役立つアミノ酸及び関連化合物を使用する。特に、コラーゲン性物質に見られる、システイン及び他のスルフヒドリル基のある関連化合物は酸化窒素を除去するのに役立ち、その有害（又は有益）特性を制限する。
本発明はさらに、熱依存性細胞膨張及び収縮に対し不活性クッションを提供する、代謝的に安定な凍結保存剤を含む細胞マトリックスを提供する。好適な凍結保存剤は硫酸デキストラン（sulfated dextran）で、ここではスルフヒドリル基はジスルフィド結合のための部位を提供し、力に対するマトリックスの抵抗性を増加し、及び酸化窒素集積を抑制する。このような硫酸化基も、継続した膵島成長及び維持に必要であることが当業者に知られている、IGF−Ｉ及びIGF−IIのような成長因子のための部位を提供する。
本発明はさらに、望ましい細胞部分を放出するための酵素溶液を用いる消化のための改良した方法を提供し、そこでは酸化窒素阻害剤の有効な量が、内皮合成を増加し、改良した酵素開裂を生じる方法で溶液に加えられる。
生物学移植の当業者は、簡単に記述したような装置及びマトリックスが、制限無しで、変性コリン性ニューロンの喪失を防ぐためのヒト神経成長因子を分泌する細胞、心筋再生のためのサテライト細胞、Huntington病のための線状体脳組織、肝臓細胞、骨髄細胞、パーキンソン病のためのドーパミンが豊かな組織及び細胞、アルツハイマー病のためのコリンが豊かな神経系、中枢神経系への鎮痛剤送達のための副腎クロム親和性細胞、皮膚移植のための培養上皮、及び筋委縮性側索硬化症のための毛様体神経親和性因子を放出する細胞を含む、種々の移植治療における応用を発見するであろうことを評価するだろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記の並びに他の特徴及び利点が、そこに伴う図面と結びつけて、好適な実施態様の次に書かれた説明を読んで明らかになるだろう：
図１は本発明の実施態様に一致する生体人工内分泌装置の横断面図であり、
図２は本発明の別の実施態様の横断面図であり、
図３は図２の線３−３に沿って採られた横断面図であり、
図４は本発明の別の実施態様の横断面図であり、
図５は発明のさらに別の実施態様の断面図であり、
図６はさらにマトリックスのコラーゲン線維への膵島の集団の付着を示す走査電子顕微鏡写真であり、
図７はマトリックス中の膵島の付着した及び付着しない集団を図解する図６の部分の拡大図であり、
図８は膵島の付着しない集団を示す図７の部分の拡大図であり、
図９は膵島の付着した集団を示す図８に同様なものであり、
図10Aは線維へ付着のための結合部位を含む単独膵島の図６と同様な図で、図10Bは細胞分裂を受ける単独膵島の図であり、
図11は変性コラーゲン鎖に付着した膵島の集団を示す図６の部分の拡大図及びコラーゲンのそのままの鎖を示す差し込み拡大図であり、
図12及び13はマトリックスからの除去を受ける膵島の光学顕微鏡写真であり、
図14は本発明による装置に対する100mg/dlグルコースのインビボ挑戦に応答するインシュリン対時間のグラフであり、
図15は図14の装置に対する50mg/dlグルコースのインビボ挑戦に応答するインシュリン対時間のグラフであり、
図16は本発明による装置の別の実施態様の上面及び横立面図であり、
図17は図16に示した装置を移植した糖尿病イヌに関する日を関数とした血糖値であり、
図18はマトリックス培養の時間の関数としての膵島RNA含量、インシュリン分泌、及び生存膵島数であり、
図19は図17のイヌに対するブタＣ−ペプチド対移植後日数であり、
図20は図17のイヌに対する静脈内グルコース耐性試験（IVGTT）データであり、
図21A及び22Bは移植後６、40及び57日のイヌに関するIVGTTデータであり、
図22A及び22Bは移植後45及び59日の別のイヌに関するIVGTTデータであり、
図23は図21のイヌについての移植後日数を関数とするブタＣ−ペプチド量であり、
図24は図21のイヌに対するIVGTTデータであり、
図25〜30は一連の試験イヌからの最大血清Ｃ−ペプチド値であり、
図31は移植の14日後、及び膵臓切除後50日にイヌAXAに再移植した21日齢膵島の静脈内グルコース耐性試験であり、及び
図32は移植後80日のイヌC324からの静脈内グルコース耐性試験である。
好ましい実施例の態様
本発明は、膵臓、甲状腺、上皮小体、胸腺、脳下垂体、副腎皮質、及び副腎髄質のような内分泌腺に正常に関連する、細胞部分により正常に生産される生物物質の提供における特別の効用を有する。膵臓及び脳下垂体の細胞部分が好適である。ここで用いるように、細胞部分は、天然に生じる物質及び合成又は他の方法のその同族の両方を分泌する、天然に生じる及び遺伝的に変換された細胞の両方を含む。本発明の方法で有用な細胞は、限定されないが、成長ホルモン分泌細胞、催乳ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン細胞、性腺刺激ホルモン細胞、及び皮質脂質刺激ホルモン細胞を含む。
本発明の方法で提供される生物物質は典型的にホルモンと呼ばれる。ここで用いるように、「ホルモン」は特異的組織により分泌される生物物質として定義され、分泌の部位で活性を有し、ときとしてオートコイド（autocoide）と呼ばれるそれらの物質及びその前駆体を含む。典型的ホルモンはペプチド、蛋白質、糖蛋白質、脂肪、脂質、多糖類、及び炭水化物を含む。ペプチドが好適で、ここで用いるように用語「ペプチド」は分離した分子又は蛋白質内にあるものを指す。
脳下垂体又は下垂体前葉で分泌されるホルモンは成長ホルモン（GH）、プロラクチン、ゴナドトロンピン、チロトロピン、コルチコトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、ソマトメジン、及びリポトロピンを含む。
ゴナドトロピンは一般に脳下垂体により分泌される糖蛋白質で、卵胞刺激ホルモン（FSK）、黄体ホルモン（LH又はICSH）、塩素イオン性ゴナドトロピン（CG）、チロトロピン（TSH）、その個々のペプチド鎖、及びそれと結合する炭水化物を含む。エストロゲン、プロゲスチン、及びアンドロゲン同族のホルモンと共に、これらのホルモンは不妊症の治療に有用であろう。卵胞刺激ホルモン放出ホルモン（FSHRH）又は黄体ホルモン放出ホルモン（LHRH）のような、ゴナドトロピン放出ホルモンも本発明により提供される。
メラニン細胞刺激ホルモンは、コルチコトロピン（ACTH）、アルファメラニン細胞刺激ホルモン（alpha−MSH）、ベータメラニン細胞刺激ホルモン（beta−MSH）、ベータリポトロピン（beta−LPH）、ガンマリポトロピン（gamma−LPH）、及びその共通前駆体、プロオピオメラノコルチンを含む。
ソマトメジンは分子量で約7,000から8,000ドルドンまでの範囲のペプチドホルモンの一族で、神経成長因子（NGF）、表皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）と同様である。一つの典型的ソマトメジンはインシュリン様成長因子（IGF）である。組織成長因子のような、成長因子自体はさらに皮膚／骨成長を促進し、創傷治癒を促進するために、本発明の適用範囲に含まれる。成長因子は小さい及び大きい形の両方で本発明によって提供される。
上皮小体で分泌される典型的ホルモンは上皮小体ホルモン及びその前駆体、プロパラチロイドホルモンである。ホルモンカルシトニン及びプロラクチンは甲状腺、上皮小体及び胸腺で分泌される。成長因子のように、プロラクチンａは小さい及び大きい形の両方で本来生じ、その両方が本発明の細胞部分により提供される。副腎皮質で正常に分泌されるホルモンは、アデノコルチコトロピン、及びその合成同族のような、副じん皮質ステロイドを含んで、本発明の実施によりさらに提供される。
本発明は脳内に正常に見られ、神経学的に活性な物質を分泌する、細胞部分を提供するために使用されるだろう。したがって、神経ペプチドはエンドルフィンの神経ペプチド同族、グルカゴンセクレチン、及び物質Ｐ神経ペプチドを含んで、発明の実施で提供されるだろう。エンドルフィンはプロオピメラノコルチン、プロエンケファリン、プロジノルフィン及びそれから誘導されるホルモンを含む。グルカゴンセクレチンは、両方とも膵島に見られる、グルカゴン、血管作用性小腸ポリペプチド、セクレチン及び成長ホルモン放出因子（GHRF）を含む。物質Ｐ神経ペプチドは、バソトシン、バソプレシン及びオキシトシンを含む。オキシトシン、バソプレシン、LHRH、GHRH、及びプロオピオメラノコルチンのような、神経の単一で大きい集団で分泌される物質、及びソマトスタチン、コレシストキニン及びエンケファリンのような、脳全体に正常に分布した細胞で分泌される物質が本発明の範囲に含まれることが特異的に意図される。
本発明は特別な細胞部分としてマスト細胞を提供するためにも使用されるだろう。したがって、ペンタガストリンのような、ヒスタミン同族中のもの及びその合成同族を含む、これらの細胞で分泌された物質が発明の方法で提供されることは、発明の一層の見地である。
本発明の細胞部分で提供される他の生物物質は、限定されないが、次を含む：ポリペプチドオータコイド（例えばアルドエステロン）、血漿キニン（例えばブラジキニン及びカリジン）、オートジオテンシン好酸球走化因子（ECFA）、好中球走化因子（NCFA）、移植における器官拒絶反応の治療に有用なペプチドに基づく免疫抑制剤、骨髄移植を可能にするのに有用なヒト顆粒球コロニー刺激因子、自己免疫及び結合組織疾患の治療に有用なＴ細胞受容体ペプチド、二糖ペプチド、免疫増強薬、血小板誘導成長因子（PDGF）、アミリン、グルカゴン、プラミンチド、及びトロムポエチン。
本発明は第一にヒト被験者の治療に関するが、ウシ、ブタ、ヤギ、ネコ、及びイヌのような、他の被験ほ乳類の治療に対して、家畜の目的で、使用されるだろう。例えば、発明の一つの実施態様はホルモン分泌のための移植であり、ウシ、ヤギ、又は他のいずれかの乳生産動物の乳生産の増加のためのソマトトロピンのような、家畜及び／又は農業目的のための動物の類似のものである。成長ホルモンは乳生産増加の目的で被験動物に投与されるだろう。
以下に詳細に記載される好適な実施態様は、第一に、受容患者の内分泌欠乏を克服するための移植、特にインシュリン生産細胞部分が血清グルコースの変化に応答してインシュリンを放出する、生体人工膵臓の生体人工内分泌装置に関する。しかし、当業者は、種々の細胞及び分子欠乏疾患を治療するために受容者に生きている細胞を移植するための研究が広い基礎で行われていることを予期するであろう。これらの移植細胞は、疾患、傷害又は他の不全の理由の結果として、受容者が自身では生産できない生物生産物を生じさせることを目的とする。
好適な実施態様だけを記述する目的で図面を参照すると、図１はホルモンの有効放出のための生体人工内分泌装置を示す。装置はその上下の底面に生体適合性接着剤で付けられた一対の選択的透過膜14を有する円筒12からなる。スリーブへの膜の及びスリーブ同志の付着のための適当な接着剤はシリコーン接着剤、Dow−Corningで製造されたSilastic Type A、シアノアクリレート、Locktiteで製造したPrism 454、エポキシ又は他の接着剤で、好適には生体適合性で、空洞の保全を密封して維持するために十分な接着を提供するものである。内部体積又は室15は円筒12の内壁及び膜14で限定される。室15は液体又はゲルマトリックス中のホルモン生産組織、好適にはブタ膵島、又は他のホルモン生産細胞部分16を含む。マトリックスという用語は、組織を支持するための材料として当該技術において受容された意味においてここで使用される。ここに具体的に記載されたものに加えて、マトリックスはアルギン酸基剤（Schrezenmeir,J.ら.,Transplantation 57:1308−14,1994）、寒天又はアガロース基剤（Iwata,H.ら.,Diabetes 38:224−225,1989）であろう。
充填に先立って、組立てられた装置は熱又はガンマ線で滅菌される。円筒の側壁は、室15へ細胞マトリックスを導入するための下の放射状管接続口及び充填中室15を通気するための上の放射状管接続口を備えられる。管接続口18、20は滅菌生体適合性部品22で封じられる。
円筒12金属又はプラスチックのような、いずれかの適当な材料で作られるだろう。部品14はポリパラキシリレン（ポリパラキシリレンＮ）、又はポリモノクロロキシリレン（ポリパラキシリレンＣ）、及びポリジクロロキシリレン（ポリパラキシリレンＤ）のような、共通にパラレンとして名づけられるその同族及びその混合物の高分子膜である。膜14は、細胞部分のための有効栄養素及びそこで生産されるホルモンの通過を可能にする、多孔性を有する。生体人工膵臓装置では、以下に記載のように、約2,000から5,000オングストロームまで及び好適には約2,500から3,500オングストロームまでの厚さでポリパラキシリレンＮからなる膜は望む多孔性特性を与える。下限は、厚さが不十分な膜強度を生じない限り、前記のもの以下であろう。
膜は従来からある真空蒸着法により作られ、選択性膜が確立するように正確に制御できる多孔性を有する。上記のように、パラレン被覆は、パラレン二量体を供給する、Specialty Coatings System of Indianapolis,Indiana又はPara Tech Coating,Inc.of Aliso Viejo,Californiaから入手可能な従来の装置を用いて施される。装置は様々な形状が採られ、被膜を可能にする。一つの特別な機械構成がRileyに発行された米国特許第4,683,143号に発表される。基本的に、全てのこのようなシステムは、コールドトラップで保護した真空ポンプで減圧された真空室に結合される熱分解器に結合される気化器を用いる。真空及び熱で、パラレン二量体は気化器で気化され、熱分解器を通って、そこで二量体は熱的に単量体に開裂され、それは長鎖高分子として、環境温度で、室内の装置上に共形で蒸着される。よく知られているように、被覆部分の被覆の厚さは、被覆工程中に被覆器中の平面ウイトネスプレート（planar witness plate）を配置して決定されるだろう。全室、固定具及び部品は実質的に均一な被覆を受けるので、ウイトネスプレートは除かれ、従来の厚さ測定装置で試験されて、それによって被覆部分の厚さを決定する。以下の実施態様のあるものに記載のように、これは予備成形膜に対する便利な方法である。しかし、以下の他の実施態様に記載のように、被覆がヒドロゲルマトリックス上に施されると、マトリックスの冷却が液体のガス放出のために起こり、その間の色変化に基づいて視覚的に観察可能なように、ウイトネスプレートと施された膜の間の厚さの変化を生じ、パラレンは特色のある着色スペクトル対厚さを有することが、気づかれる。現在、出願者はこれらの条件下で膜の厚さの直接測定を提供するための入手可能な厚さ測定装置に気づかない。にもかかわらず、本発明による膜装置の特異的属性は下記のように基本パラメータ必要条件で補足されるように機能的インビトロ試験で決定されるだろう。
本発明では、最大孔寸法は、40,000から約500,000の分子量を有する免疫グロブリン及び抗体の通過を防ぐために選ばれる。最少孔寸法は、グルコース、電解質並びに水、及びホルモン、約5,600の分子量を有するインシュリンのような、栄養素分子の通過を可能にするように選ばれる。他の細胞部分では、前述の最大空孔率は適用可能であるが、最小空孔率は、当業者が理解するように、放出される生物生産物に依存するだろう。例えば、脳組織から分離されるsubstantia migra細胞を含むパーキンソン病の治療のための装置はドーパミン及び関連化合物の通過を可能にするために少なくとも1000の分子量カットオフを必要とするが、分離した甲状腺組織による甲状腺機能低下症の治療は、甲状腺ホルモンの移動を可能にするために500だけの分子量カットオフを必要とする。
本発明は、芳香族環が活性化学部位を有する直鎖炭素高分子よりも少ないインビボ化学結合部位を提供する限り、脂肪族鎖の代りに第一に芳香族環を利用する何らかの高分子を利用するだろう。パラレンのような芳香族高分子は容易に入手可能な結合部位を有しないので、被験者の免疫システムは外来として認識せず、その表面に結合できず分子の孔は閉塞されないままである。他のこのような高分子は例としては、ポリフェニルオキシド、ポリフェニルスルフィド、ポリフェニルアミン及び繰り返し芳香族部分を有する他の高分子を含む。
実施例１
3271オングストロームの厚さを有するポリパラキシリレンＮの膜は円筒スリーブに取り付けられ、部分的に蒸留水に浸された。変化する分子量の液体含有成分が膜の上部表面におかれた。その後水の試料がSDS−PAGEゲルに適用され、分子量によって試料を分離するために電気泳動にかけられた。グルコース、インシュリン及び細胞栄養素に対応する低分子量が同定された。高分子量成分、すなわち、26,000以上が排除された。
さらに詳細に、移植可能な生体人工膵臓装置に対して、細胞部分は複数のインシュリン生産膵島を含む。膵島は、ヒト及び動物の両方の供与者の膵臓器官から、コラーゲン消化及びフィコル又はデキストラン、勾配分離を用いる方法で誘導される。膵島はミクロリットル当たり約10から50膵島の濃度でマトリックスを形成するために従来の培養媒体と混和される。
円筒は、取扱、被覆及び移植の考慮、及び受容者に必要な治療用インシュリン生産の目的で形と寸法を変えうるだろう。
移植生体適合性の目的で、円筒は医用級ステンレス鋼又は好適にはポリパラキシレンを共形（形に沿うように）被覆して、のような適当な材料で作られ、その厚さは特に重要ではなく、しかし約0.5ミクロンの被覆厚さが好適である。この被覆は従来の技術によって制御された厚さで正確に施されるだろう。被覆及び膜材料はヒト移植に対して非免疫マトリックスとして認知される。材料はフィブリンのような血漿要素又は線維芽細胞、マクロファージ又は血小板のような細胞と相互作用しない。したがって、装置及び膜孔は閉塞されず、宿主組織成長の関数としてインシュリン放出を損なわない。
実施例２
約3100オングストロームの厚さでポリパラキシリレンＮの膜は円筒スリーブ上に取り付けられ、部分的に蒸留水に浸された。75個の成体ブタ膵島が膜の上部表面でRPMI培養媒体中におかれた。媒体は定期的に試料採取され、核採取後変えられた。二分割量が四日目及び六日目に媒体から抽出された。分割量は125IインシュリンRIA（Ventrex）で複製で試験された。四日目の試料のインシュリン水準は70＋49uU/mlで、六日目の試料は235＋150uU/mlで、インシュリンが膜を横切って膵島から分泌されることを示した。フィブリン又は他の細胞付着は起こらなかった。
実施例３
移植装置は二つのPVCスリーブ、1.27cm（1/2"）O.D.,0.952cm（3/8"）I.D.,0.467cm（3/16"）厚さを用いて調製された。スリーブは約0.5ミクロンの厚さまでポリパラキシリレンＮで被覆された。2959オングストロームの厚さを有する円形ポリパラキシリレン膜がシリコーン接着剤でスリーブの上部表面に接着された。スリーブはついで放射線滅菌された。
一つの膜スリーブは20デカリットルの細胞マトリックスで充填された。マトリックスは約5,000個のブタベータ細胞膵島を含んだ。膵島はコラーゲン消化法によって調製された。その後スリーブはシリコーン接着剤で結合された。装置は非肥満糖尿病マウスで腹腔に移植された。
移植に先立って三週間、マウスの絶食血糖（FBG）はグルコースオキシダーゼ分析で決定されて760mg/dlであった。移植に続く日に、絶食血糖水準は380mg.mlであった。装置が移植に続いて除かれると、装置又は膜への線維又はリンパ芽球の付着は観察されなかった。
実施例４
移植装置は図１の実施態様によって構築された。つばは1.27cm（1/2インチ）の外径及び0.635cm（1/4インチ）の内径を有した。約3000A（オングストローム）のポリパラキシリレンＮの膜は、シリコーン接着剤でつばの面に接着された。放射状充填孔を通って、装置の内容積が約5,000個の成体ブタ膵島で充填された。充填孔はシリコーン栓で密封された。４個のこのような装置が、約12kgの体重の膵炎雌雑種イヌの腹腔に移植された。移植に続く第１日、血漿インシュリン水準は21.2及び22.2uU/mlと測定された。移植に続く第二日に、血漿インシュリン水準は21.5及び20.5uU/mlt測定された。
図２及び３を参照して、装置30は一般に長方形ポリパラキシリレン被覆板36中の貫通孔の列で限定されるように円筒室32の複数性で提供される。孔34の上部及び底部は上記のようにポリパラキシリレン膜38で密封される。液体マトリックス中の細胞組織は放射状充填管接続口40を通って室32へ送達され、それはその後栓で密封される。室32のアレーは膜損傷又は汚損、細胞生産の減少及び同類の事象で装置に対して過剰を提供する。
図４を参照して、装置は、その上に配列した細胞液滴72の複数性を有し、上記のようにポリパラキシリレンの膜74で覆われる板70からなる。装置は、ポリパラキシリレン被覆板上で、液体状で、又はアルギン酸ナトリウムのような保護被覆中にマクロ被包されて、組織媒体を析出して形成される。析出後、液滴及び板はポリパラキリシレンで望む厚さまで被覆される。選択的に、液滴及び板は凍結され、被覆され、移植が用意されると、装置は細胞を再構成するために解凍される。細胞は、R.V.Rajotte（Cryoreservation on Isolated Islets,2nd International Conference on Use of Human Tissues and Organs Search In Transplant,October 1985,pages 45−51）に述べられたプロトコルによって凍結され、解凍される。
装置は前述の膜で被包される個々の液滴として形成されるだろう。凍結され、又は被包された、個々の液滴は自由落下被覆工程で在来的に被覆され、又は埋め込まれた糸に吊るされ被覆されるだろう。細胞はその後再構成され、適当な媒体に混和され、ついで選ばれた部位に注射で移植される。
本装置80は図５に示される形を取ってもよい。より具体的には、長方形プレート82には複数の通し孔102が設けられている。プレートの上面およびホールの先端開口部はポリパラキシリレン被膜104で被覆されており、上記の膜を作っている。プレートの底表面およびホールの底開口部は、適当な生物適合接着剤により付着させたポリパラキシリレン被覆裏カバー106で被覆されている。ホールの側壁、膜およびカバーにより定められた内部室は液体またはゲルマトリックス内のインシュリン産生細胞で満たされている。
図５の装置は、開口部を定める壁等のすべての表面に連続した相似被覆を提供するようにプレート82を最初にポリパラキシリレンで被覆することにより作られるのが好ましい。底は封止されてホールが上面の僅かに下の高さまで蒸留水で満たされている。この満たされたプレートを次に凍結し、その後にポリパラキシリレンで所望の厚みになるまで被覆する。被覆後、該装置を温めて解凍し、裏プレートを外し、水を蒸発により除去する。装置をさかさまにしてホール中および膜中を所望の細胞濃度とする。次に、裏プレートを示されたように底表面に付着させる。
もしくは、細胞含有媒質をホール内で凍結してプレートを膜厚みまで相似に被覆し、細胞は上記のように凍結する。そのような装置において、上部膜と下部膜は各区画で設けられよう。
生体人工膵臓および他の生物学的装置の開発に大きな重要性を持つのは、（１）将来利用のための膵島の保存とそのリストを作り；（２）インビボでの性能規格値を保証するための機能性を証明し定量するためのリストの膵島を定期的に試験し；（３）膵島を所望のマトリックスおよび移植装置中へ導入し；（４）移植前の装置の機能性のリストを作り、機能性を試験、測定し；そして（５）ヒトの利用のために安全性を確保するため潜在的ウイルスまたは他の病理学的生物汚染物の存在を十分な時間で決定することである。これまで報告された膵臓島のインビトロでの機能性の保持の成功は限定されてきた。
これらの目標は、保存、製造、機能性試験リスト、および病原性試験のために患者の体温前後で易流動性であるか、注射可能であるか、または液体の状態を提供するために水素結合を切断するように処理されたハイドロゲルに基づくマトリックスを利用することにより達成される。さらに具体的には、ハイドロゲルは、分子内水素結合を壊すことができる結果としてトロポコラーゲン構造が解かれるＲ基を有するアミノ酸の長鎖配列からなる骨格により特徴付けられる。これらの分子内結合はＲ基の水素と水との水素結合に置き換えられる。ハイドロゲルには、非コラゲナーゼハイドロゲルの場合、効果的な量の未変性コラーゲンおよび／または煮沸または変性コラーゲン、すなわちゼラチンが補われる。いずれも細胞部分が付着することのできる結合部位を安定な環境に提供するのに効果的である。コラーゲン系化合物は、熱依存性水素結合形成と双極子モーメント相互作用に基づいて、膵島、肝細胞等の細胞付着のマトリックスとして働き、自然な環境を細胞成長に提供する。コラーゲン系化合物は煮沸させると、アミン、カルボキシル基、ヒドロキシル基、およびスルフヒドリル基の相互作用に基づくゲルを容易に形成する極性および非極性アミノ酸を含有する。力に対するマトリックスの抵抗は、水素結合および双極子モーメント相互作用から二価カチオン干渉を除くキレーターを添加することにより増強することができる。露出された活性基は低温でこの水素結合形成により水を固定するために用いられ、こうして低温での熱的外傷を最小化する。
保存のために、マトリックスを低温で細胞を損傷することなく保存することを可能とする効果的な量の高分子量の凍結保護剤を加えることにより、低温保存の必要性なしに抑制代謝条件が得られる。さらに、本発明は、熱依存性細胞の膨張と収縮に不活性な緩和物を提供する代謝的に安定な低温保存剤を包含する細胞マトリックスを提供する。好ましい低温保存剤は、スルフヒドリル基がジスルヒド結合部位および力に対する増強マトリックス抵抗を提供し、ならびに酸化窒素の蓄積を抑制している硫酸デキストランである。そのような硫酸化された基は、継続した膵島の成長と保持のために必要であると当業者に知られているIGF−ＩおよびIGF−II等の成長因子の部位も提供する。
−NH2と−COOHとの水素結合の阻害を取り除くことにより、スーパーオキシドからの有害ヒドロキシルフリーラジカル（OH−）の形成を、これが起こるために必要とされる遷移金属および重金属をキレート化することにより阻害することにより、ならびにその微生物汚染に対して保護することによりマトリックスの剛性を高めることのできるクエン酸、EDTAまたはEGTA等の二価キレーターの添加が保存マトリックスに有利である。マトリックスを構成する液体は細胞に栄養を提供するための認識された成長媒質の形を取ってもよい。微生物学的汚染に対する付加的な保護を提供するために、従来の抗生物質を添加することができる。
採取した直後に細胞部分を装置に直接に導入して移植が低温保存を必要とせずに行われる場合、低温保存剤は減少させても省いてもよい。しかし、経膜による向上した運搬のために、マトリックスはホストまたは患者体温では実質的に液体であるのが望ましい。これは二価キレーターの量により達成することができる。生長媒質および抗生物質を補うことも望ましいであろう。
マトリックスおよび細胞部分が、装置の製造中に外傷、力および温度変化を受ける場合、液化温度に影響を与えることなくマトリックスの剛性の増加させることが望ましいであろう。下記のように、これは、異なる水素結合潜在性の−Ｒ基を有するアミノ酸を利用して結合形成を高めることにより得られよう。
そのようなアミノ酸および関連化合物は、核の破壊と他の関連した障害から細胞死を引き起こすことが知られている酸化窒素およびその代謝物からの細胞の保護を提供する。細胞マトリックスはこれらのアミノ酸および関連化合物を利用してＬ−アルギニンが酸化窒素合成酵素のいずれかのイソ型タンパク質により酸化窒素を形成するのを阻害する。特に、システイン、およびコラーゲン材料中に見られるスルフヒドリル基を有する他の関連化合物も既に形成された酸化窒素を除去することで酸化窒素が誘導する損傷の防止にも役立つ。
本発明は、生人工膵臓の目的のために新しいハイドロゲルマトリックスを利用するもので、ここにおいて単離されたブタの膵島は準周囲温度、例えば冷蔵庫温度の４℃で６ヶ月以上の長期間にわたって保存することができる。上記のように、改良ハイドロゲルマトリックスは、デキストラン、アミロペクチン、プロテオグリカン類および類似の高分子量の凍結保護剤等の不活性高分子緩衝物質により、低温条件に対して保護される加熱もしくは変性を受けた動物コラーゲンに基づく。当業者には理解されるように、本改良ハイドロゲルマトリックスは煮沸または化学処理により共有化学結合の破壊、および熱感受性水素結合の数および双極子モーメント引力の増加に基づくものである。共有化学結合をそれらの温度感受性結合および引力に置き換えることにより、保存のためににさらに低温で長期間にわたって所望の組織を固体のマトリックス処方物中に埋め込むことができる。所望の組織をより固体のマトリックス中に保つことにより、水に常にさらされていることから生じる損傷が減少し、代謝および気体交換が抑制される。事実上、本発明は氷点下低温保存技術の極端に走ることことなく組織を保存する。次に、このマトリックスは所望の高い温度で液体となり代謝および成長を高め、栄養およびホルモン生成物の分散を促進することができる。元のハイドロゲルマトリックスはその分子間共有結合（スルフヒドリル結合等）を壊してしまっているので、マトリックスは次に双極子モーメント引力または水素結合を増加させる部分を加えることにより所望の規格値にしたがって改良することができる。
ゼラチンに加えてこの方法のために適当なハイドロゲルマトリックスの多くの具体物が利用可能であり、例えば煮沸アガロース、アルギネート、ケラチンおよび他のアミノ酸、アミノグルカン類およびプロテオグリカン類、および分子内水素結合が壊されてＲ基の水素と水との水素結合と置き換えられてよく認識されたゲラチン状のコンシステンシーを生じうることのできるＲ基を有するアミノ酸の長鎖配列からなる構成骨格を有する他のゲル等が挙げられる。これと関連して、例えば、20グラムの寒天を5mlのMedia 199に置き、得られた溶液を1Nの塩酸でpH2に減少させた。溶液を37℃で維持し、10分間撹拌して溶解した。この溶液に100mgのデキストランおよび１ミリモル濃度のEDTAを加えた。得られた処方物は受容者体温37℃では液体であり、４℃の冷蔵庫温度では相当にさらに粘性であった。そのような技術は、所望の目的を得るために必要とされるように添加物を調整して他の所望の水素のために用いることもできる。
所望の物理的性質に依存しながら、これらのマトリックスは他の薬品の添加により増加もしくは減少した力（堅さ）に対する抵抗を有することができる。以下の実施例に記載されるように、そのような堅さは、極性Ｒ基または接近可能な水素／ヒドロキシル基を有するアミノ酸部分を添加することにより高められて、その増強マトリックスが冷却されるにつれて双極子モーメント引力と水素結合を高める。基本的に未変性のコラーゲンまたは変性コラーゲン、ゼラチンの上記のハイドロゲルマトリックスへの添加は、組織または単離細胞が固定するための格子構造を提供する。よって、いずれの組織もこのタイプのハイドロゲルマトリックスに埋め込むことができ、その性質は、以下の実施例に記載のように単離組織の所望の性能に応じて適合させることができる。
単離された膵臓島の保護と保存目的のために、一つの実例は加熱された動物コラーゲン、すなわちゼラチンを利用し、そしてデキストラン、アミロペクチン、プロテオグリカン類、または水中での熱変化により誘導される外傷を制限することのできる他の高分子量の低温保存剤等の効果的な量の不活性高分子緩衝物質を用いることにより、低温条件に対して生存組織を保護する。これらのマトリックスは熱的な膨張と収縮に対する緩衝物質として働く。そのような緩衝物質がないと、膵島は熱的変化により引き起こされる膨張および収縮により誘導される物理的外傷ならびに水の熱感受性移動の結果として細胞膜に対して誘導される外傷に耐える能力を減少させてしまう。
さらに、本改良ハイドロゲルマトリックスは、ポリマー被覆操作中に遭遇する真空圧等の激しい気圧外傷に対してそれら組織を防御する。これは、温度とマトリックスに依存する水素結合とジスルヒド結合の調節により力に対するゼラチンの抵抗を高めることにより達成される。カルボキシルまたはアミンＲ基（グルタミン酸またはアルギニン中に見られるもの）を含有するアミノ酸の添加による水素結合形成の増強により、システインまたはメチオニン残基の添加によるジスルヒド結合により、またはグルタミン、スレオニン、またはアスパラギン等の非荷電であるが極性Ｒ基を有するアミノ酸の添加による増加した双極子モーメントにより保存および製造用マトリックスを強化してもよい。水素結合および双極子モーメント引力は、保存中にマトリックスの細菌汚染に対する保護も提供するEDTA等の二価キレーターによりさらに高めることができる。
コラーゲンは他のタンパク質には通常見られないアミノ酸、例えばグリシン、ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシジンからなる繰返しトロポコラーゲンポリペプチドサブユニットとしてすべての動物組織中に見られる。コラーゲンは、共有架橋結合が成熟組織により形成された場合に高い引張強さを有する不溶性の繊維を形成する。しかし、従来のゼラチンの製造方法におけるようにコラーゲンを煮沸すると、これらの架橋結合は壊され、その三次元構造は解かれて緩やかな会合による多くのポリペプチドが生じる。
コラーゲンは、剛性が高くなる順で挙げれば靱帯、腱、軟骨、骨および歯等の多様な組織に見られる主要結合タンパク質であり、分子内および分子間結合力に基づく態様な物理的性質を達成するコラーゲン能を示す。未変性トポコラーゲンは、長さが3,000オングストロームである最も長い公知のタンパク質であるが、直径はわずかに15オングストロームである。コラーゲンの煮沸は、不溶性の硬くコイルしたヘリックストロポコラーゲンサブユニットを壊して、不溶性のトロポコラーゲン分子をその元の硬くコイルされたケーブル立体配座を開いて三つの分離したペプチド鎖に分させることができる。次に個々のペプチド鎖は埋め込まれた膵島のために二つの重要な機能を果たすために用いられる。第一に、それらは単離された膵島組織が付着するための結合部位を提供し、第二にそれらは上記の被覆方法の間に膵島の保護のために用いられる温度感受性マトリックスを提供する。
硬くコイルされた三本鎖構造の損失は、協同的相互作用により協同的に互いを強化する弱い個々の相互作用の和によりストランドが安定化されていることを示している。煮沸は個々の鎖を解いてそれらの側鎖のＲ基を他の相互作用に利用可能とさせる。煮沸されたコラーゲンは、膵島が付着するように多様な結合領域を露出させる。図６は電子顕微鏡写真である（硬くコイルされたトロポコラーゲンヘリックスから一度は構成されたもので、開かれた単一ペプチド鎖の一つに対して結合している単離された3,000倍の膵島）。不完全なほどけたヘリックスは図７の括弧内の領域にまだ存在し、未変性材料が結合部位を増加させる補足物として用いられうることも示している。
個々のコラーゲン鎖を互いに結合させる横断水素結合が壊されて、ヒドロキシプロリンおよびプロリン残基のピロリドン環の反発により与えられた立体安定性を無効となる。その結果、十分な鎖間水素結合が壊されるとき、立体的反発は超螺旋コイルを不安定にして個々の鎖を別々に分ける。グルタミン酸およびアルギニン等の高い荷電の極性基を含有する補充アミノ酸を添加することにより、周囲のゼラチン鎖に対する増加水素結合形成が生じて、30℃以下の温度で他のゼラチン鎖上に水と極性基を引き付け固定する。水のこの固定は温度変化からの細胞膜損傷を減少する。システインの添加により強いジスルヒド架橋結合を形成できる。これらの種類の結合形成を高める他のアミノ酸としては、荷電または非荷電の極性側鎖基を有するものとスルヒド結合形成能を有するものとが挙げられる。
水素結合の数とジスルヒド結合形成とを高めることにより、マトリックスは30℃以下の温度で力に対してより耐性がある。未変性ブタ皮膚コラーゲンは65℃の熱安定性定数を有し、この温度でトロポコラーゲン鎖の50％が解離する。ヘリックス構造を壊すことにより、ゼラチン系マトリックスの融解温度は約30℃まで低下する。これはマトリックスを体温（37℃）で適切に液体とするために重要で、パラキシリレン膜を経るグルコースおよび他の栄養の迅速で生理学的運搬を可能とする。
水素結合に干渉する二価カチオンの除去により、力に対する抵抗性すなわちマトリックスの剛性が向上する。これは、EDTA、EGTA、クエン酸および類似の二価カチオンキレーター等多くのキレーター（キレート化剤）の添加により達成することができる。得られたマトリックス剛性の増加は、ある場合では膵島に悪影響を与え得るポリマー被覆法、真空圧および低温度中のマトリックス組織により経験される条件に対して保護を提供する。
膵島の結合を高めるために、ブタの未変性コラーゲンを少量で加えてブタの膵島に更に結合ネットワークを提供してもよい。上記のように、保存および製造用マトリックスは、保存中のマトリックス汚染に対して保護も提供するキレーターのEDTA等の二価キレーターにより水素結合またはアミン−カルボキシル架橋結合の増強により強化してもよい。インビボでの経膜による最大分散を提供するために、マトリックスは受容者体温で易流動性であるか、注射可能であるか、または液相である一方で、低い保存温度、好ましくは患者体温よりも僅かに低い温度すなわち35℃および保存温度で固相であるように設計される。膵島が低温で減少した代謝を有し、膜の被覆法が該温度程度、通常は周囲温度で実施される限り、被覆のために上記マトリックスを患者体温よりも僅かに低く保持することが望ましい。
ブタの膵島とともに用いられるゼラチン、好ましくはブタ系のゼラチンが液体、好ましくは従来の生物成長媒質の一つと混合される。所望のゲル温度に基づいて、ゼラチンは約0.01〜30mM濃度、通常0.1〜10mM濃度、好ましくは約0.5〜5mM濃度で存在し、すべてが保存温度で固相を、移植温度で液相を提供する。液体、水または実質的に活性のない液体、好ましくは少なくとも部分的に成長媒質は、通常は15〜96.5重量パーセントのマトリックス、好ましくは約45〜84.5重量パーセントのマトリックスの量で存在する。緩衝物質は、選択された保存温度にて熱的保護を提供するのに十分な量でマトリックス中に存在し、マトリックスに対して0.1〜30重量％、通常は0.5〜20重量％、好ましくは２〜10重量％の濃度でゼラチンおよび液体マトリックス中に存在する。二価キレーターはマトリックス中に、通常はマトリックスに対して約０〜20重量％、好ましくは約0.05〜10重量％で保存マトリックス中に存在して所望の構造的結合性を与える。このタンパク質媒質は0.0〜30.0重量パーセントのマトリックス、通常は約0.05〜20重量パーセントのマトリックスの範囲、好ましくは５〜15重量パーセントの範囲の量で媒質中に存在して栄養を膵島に提供してもよい。抗生物質は0.0〜30重量パーセントのマトリックス、通常は0.05〜10重量パーセントのマトリックスの範囲、好ましくは１〜６重量パーセントのマトリックスの範囲の量で存在させて従来の生物学的パッケージ中での感染または汚染を防止する。未変性コラーゲンはマトリックス中でマトリックスに対して約０〜30重量％、通常は約0.1〜５重量％、好ましくは約１〜３重量％で存在してもよい。アミノ酸は０〜300mM濃度の量で存在する。
実施例５
力抵抗に対するマトリックスに望まれる要件に依存しつつ、広範囲の濃度の添加物が組織の保存、組織培養、または上記の相似ポリマーによる組織の被覆のいずれかのために存在する。適切なマトリックスは保存、製造および移植のために下記のマトリックス基材を用いて上記にしたがって調製してもよい。
低温保存剤
0.01〜1000μＭのデキストラン、分子量50,000（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号D5251
ゼラチン
0.001〜100mMのブタ由来コラーゲンからのゼラチン、だいたいの光沢５−300（Sigma Chemical社、St.Louis MO）
タンパク質添加物
０〜30％の新生ウシ血清（Life Technologies,Gaithersburg,MD）、カタログ番号16010−43
抗生物質
0.1〜30％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Irvine Scientific,Santa Ana,CA）、カタログ番号9366
0.001〜30％のフンギゾン（Irvine Scientific,Santa Ana,CA）、カタログ番号9352
0.001〜30％のコリスチン
0.001〜30％のセフタジジム
コラーゲン
0.01μＭ〜30mMの小ウシ皮膚からの酸可溶性タイプII（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号3511
アミノ酸
0.01μＭ〜300mMのdl−システイン塩酸塩（Sigma Chemical）、カタログ番号9768
0.01μＭ〜300mMのグルタミン（Sigma Chemical）、カタログ番号Ｇ−7029
0.01μＭ〜300mMのdl−アルギニン塩酸塩（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号Ａ−4881
0.01μＭ〜300mMのｌ−システイン塩酸塩（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号Ｃ−4820
0.01〜10mMのｌ−グルタミン酸塩酸塩（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号Ｇ−2128
二価キレーター
0.001mM〜100mM EDTA
生長培地
他成分を所望の濃度とする適当な容量、Media 199（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号12340−022
本発明において、安定で固いコラーゲンの下部構造のこれらの条件は、好ましくは上記の緩衝物質の存在下、さらにEDTA、EGTA、クエン酸等の二価またはカルシウムキレーターの存在下に煮沸変性コラーゲンからなるマトリックスに膵島を置くことにより造り直される。このマトリックスは、マトリックスの性質が体温で液相を提供するように調節してもよいコラーゲン媒質に膵島を再び付着させる。さらに、力に対するマトリックス抵抗は二価キレートにより調節して、膜を適用するために、被覆サイクルで経験される被覆温度にて固相を提供する。低温保存剤の熱的保護により高められた固体被覆相は、さもなければ被覆真空で経験される気圧外傷からの保護を提供する。さらに、このマトリックスは膜適用前膵島組織とその後の移植前膵島組織の試験を可能とするインビトロでの膵島の生存度を向上させる。上記のマトリックス以前では、当業者により一般的に報告されて受け入れられた膵島の生存は７〜14日の範囲であった。以下に詳細に論じられるように、存在するマトリックス中の膵島はインビトロで174日を超えた期間で機能性を減少させることなしに生存した。
コラーゲンを含有する媒質は変性コラーゲンまたは基本的に未変性コラーゲンであってもよい。適当な変性コラーゲンは、動物、鳥、魚およびヒト起源に由来する通常の煮沸によるゼラチンである。例えば、未変性コラーゲンの三次元構造が解かれ、得られたコラーゲンが緩い会合でポリペプチドを作る解かれた繊維構造となるように処理された食物等級のゼラチンならびに医薬等級の煮沸コラーゲンを用いてもよい。ゼラチンには基本的に未変性の動物コラーゲンを補って未変性コラーゲン性結合構造を提供してもよい。コラーゲンは、三次元マトリックスに所望の構造結合性を提供し、その内部の膵島に結合部位を提供するのに十分な量で存在する。低温で膵島を保護するための緩衝物質は、好ましくは500,000分子量のデキストランで、好ましくは硫酸側鎖基のために水素結合形成の増加に寄与するように硫酸化されている。他のものとしてはアミロペクチンが挙げられる。生長媒質はMedium 199、RPMI等の組織培養培地であってよい。タンパク質媒質はヒトまたは動物起源に由来する血清であり、好ましい血清は例えば新生ウシ血清または胎児ブタ血清である。
他のマトリックスが７％以上のデキストランを有した一方で、１％未満のデキストランを有する以外は同一のマトリックス成分を測定した一連の実験において、100mg/dlグルコース誘発に応答してインシュリンを分泌する埋め込まれた膵島の能力は、さらに多いデキストランを有するマトリックスにおいて二倍となる一方で、デキストランが少ないかまたは存在しないマトリックス中の膵島は同じ時間にわたって半減したインシュリン分泌能を有した。
実施例６
新鮮なブタ膵臓の脾臓葉から従来のコラゲナーゼ消化およびフィコリ分離を用いて膵島を単離した。次に、膵島をMedia 199中で37℃で５日間インキュベートした。膵島を、コラーゲンを含有する媒質、緩衝物質、成長媒質、タンパク質媒質、および二価キレーターからなるハイドロゲルマトリックスに移した。マトリックスは抗生物質および細菌発育防止剤等の多様な従来の添加物も含んだ。マトリックスは室温あたりで固体であるが、37℃あたりの患者体温で液相となる。
実施例７
保存、製造および移植のためのマトリックス基材として以下のものを用いて、上記にしたがって適当なマトリックスを調製してもよい。
低温保存剤
6.0グラムのデキストラン、分子量500,000（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号Ｄ−5251
ゼラチン
14.5グランのKnox非味付ゼラチン（Knox Gelatin社、Englewood Cliffs,NJ）
生長媒質
60mlのMedium 199（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号12340−022
タンパク質媒質
０〜15％の新生ウシ血清（Life Technologies,Gaithersburg,MD）、カタログ番号16010−043
抗生物質
０〜３％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Irvine Scientific,Santa Ana,CA）、カタログ番号9366
１〜３％のフンギゾン（Irvine Scientific,Santa Ana,CA）、カタログ番号9352
コラーゲン
50〜100mgの小ウシ皮膚からの酸可溶性タイプII（Sigma Chemical社、St.Louis MO）、カタログ番号Ｃ−3511
マトリックス基材を処方するために、生長媒質をビーカーに置き、撹拌棒を用いて迅速に撹拌しながら撹拌／加熱プレートで加熱して十分に混合する。緩衝物質を、撹拌を維持しつつ生長媒質にゆっくりと加える。一緒に溶液を１〜２分間音波処理し、その後に撹拌加熱しながら溶液にゼラチンをゆっくりと加える。その後、溶液を５回の10秒間の間隔でマイクロ波をかけ、次に１〜２分間音波処理する。次に、２〜10mMのEDTAをその温かい溶液に加え、完全に混合し、60〜70℃に加熱された／真空乾燥オーブン中におき、排気する。加熱され排気された溶液を少なくとも５分間平衡化し、膵島を加える前に37℃まで冷却する。
実施例８
膵島を上記の実施例６のマトリックスに約200膵島/100μｌマトリックスの割合で加えた。膵島マトリックスの一部を36mmのポリスチレンウエルに移した。残りの膵島マトリックスは、220膵島/10mlマトリックスの割合で18mm・6.5mmの開放端円筒状装置に移した。装置を冷却してマトリックスを固化し、約4,000オングストロームのポリパラキシリレンＮで形に沿うように（conformally）被覆した。
ウエルに入れた膵島と装置を２週間までの期間冷蔵庫で保存し、その後種々のグルコース濃度で１〜３時間、静的インキュベーションを実施して37℃にした。
ウエル中の膵島には、環境栄養培地を30日ごとに交換して与えた。分離後73日目に、22.0mMグルコース中で15分間インキュベートして３μＵインシュリンを刺激した。分離後36日目に2.25、5.5および11.0mMグルコースでの180分間の静的インキュベーションに応答して、装置は1.61μＵ、6.67μＵ、15.6μＵのインシュリンを分泌した。すべての膵島において73日間細菌汚染を生じず、膵島構造は肉眼的に無傷のままであった。
図６〜11は90日齢の膵島の走査型電子顕微鏡写真（45−18,000倍）を示している。図６に示すように、代表的に200の数字で指示された膵島のクラスターは、その長さに沿った種々の位置でコラーゲン線維202に結合しており（45倍）、膵島の粗構造を維持しながら、膵島組織がマトリックスポリマーに付着していることを示している。図７は図６をさらに拡大したもので、コラーゲン線維に沿った膵島の結合を例示しており（3,000倍）、図７の挿入図は図８に示されいるまだ線維に結合していない膵島クラスターである。図９は線維網に結合した代表的な膵島クラスターを示す（9,000倍）。図10Aは、コラーゲン線維への付着のための単一ベータ細胞の結合部位204を示す（18,000倍）。図10Bは、マトリックス中で細胞分裂が起こっていることを表わす単一ベータ細胞を示している。図11は、煮沸中に展開されなかったコラーゲンの線維206を示す。図12と13は、二価カチオン（4mm塩化カルシウム）を加えてマトリックスから取り出した後の90日齢の膵島の光学顕微鏡写真で、肉眼的に無傷の形態を明らかにしている。
現在受け入れられている膵島分離の手法は、移植用の高度に精製された無傷全膵島に頼っている。この成果を達成するために必要な時間と材料は長大で費用がかかり、概して収率が低い。これまで、膵臓が過剰消化されて膵島の実質的な断片化が生じた時には、従来、断片化された膵島が機能を保持しているとは認められなかったため、分離は失敗であった。上述したマトリックスは、従来の保存媒質あるいはマトリックス中での、無傷の機能を備えたそのような断片化した膵島の使用を可能にする。
本発明はまた、過剰消化された膵を上述したマトリックスにおいて使用することを可能にする。特に、ブタの膵臓を従来のようにコラゲナーゼ法によって消化した。遊離した浮動全膵島が生じた時に消化を終了せずに、実質的な断片化が認められるまで消化を継続した。その後、消化を終了させ、断片を繰り返し洗浄して、実質的に腺房組織を含まない断片化した膵島のペレットが得られるまで遠心分離にかけた。約3,000膵島当量/mlマトリックスの割合で膵島を上記の実施例７のマトリックス製剤と混合した。次に膵島マトリックスを36mmプレートウエルに沈着させ、冷蔵した。毎日、膵島マトリックスを37℃に加熱して、顕微鏡下で観察し、ビデオテープに収めた。最初の数日間、各々の視野は多数の遊離した浮動膵島断片を示した。しかし日にちが経過すると共に、断片は減少し、見掛け上完全な膵島のクラスターが現われた。分離後14日目には、実質的に断片化の存在しない、膵島のクラスターだけが見え、100mgグルコースの刺激に応答して放出されたインシュリンレベルは150μＵであった。
上記のマトリックスはまた、18ヵ月間液体窒素中で凍結した寒冷保存膵島に関しても良好な成績を提供する。これまで、そのような寒冷保存膵島は低い機能性を示していた。寒冷保存しておいた膵島を解凍し、1,000膵島/100μｌマトリックスの割合で上記のマトリックスに混合し、８つの開放端円筒を持つ装置に分配して固化した。次に装置を約4,000オングストロームのポリパラキシリレンＮで形に沿うように被覆した。被覆後２日目の装置からの最大分泌は2.2μU/mlであった。その後３〜４日ごとに、100mgの正常血糖濃度との接触に応答して最大分泌は4.4、8.3、19.0、33.0μU/mlとほぼ倍増した。非糖尿病被験者における平均空腹時血清インシュリン濃度は５〜20μU/mlの範囲であるので、解凍後の寒冷保存膵島が治療的な機能を提供することは明白である。
装置の外部でインビボで使用した時のマトリックスも、筋肉内移植部位において膜に隣接する血管新生と脂質形成を促進する。これは今まで、膵島の長命化を促進するのに十分な酸素付加と血管アクセスを提供するとはみなされてなかった。特に、図５の約32の充填して被覆した開放端円筒を、15kgのビーグル成犬において広背筋の間に筋肉内移植した。他の部位としては、皮下脂肪、腹腔内区域、あるいは門脈循環付近の位置などの容易にアクセスできる領域が含まれる。装置の挿入後手術部位に約20mlのマトリックスを充填した。円筒は全体で約30,000の膵島を含んだ。イヌを膵切除し、血糖レベルおよびブタＣ−ペプチドレベルに関してモニターした。血糖レベルおよびＣ−ペプチドレベルへの装置の明確な寄与が認められたが、17日目に、膵切除術から生じた重篤な器管機能不全を認め、動物を犠牲剖検した。装置の除去後、病理的検査は膜の上に存在するマトリックスにおいて、いずれも膵島の保持と長命化にとっての必要条件である、実質的な微小血管形成と脂質成長を明らかにした。
膜と組み合わせたマトリックスも、グルコース誘発に応答して認められた時間枠内でインシュリンを放出し、誘発除去後は放出を停止して、インシュリン放出を刺激する膵島へのグルコースシグナルの速やかな伝達と、シグナルが除去された時の、放出されたインシュリンの膜を越えた拡散を示す。さらに、グルコースレベルの正常化後装置を速やかに切ることができない場合、正常化後もインシュリンの産生が継続され、潜在的に生命を脅かす低血糖状態をもたらすことがある。本発明の装置は速やかにこれができることを以下に明瞭に示す。約4,000オングストロームのポリパラキシリレンＮで立体被覆した18円筒装置にマトリックスを包埋した。その後３、８および12日目に装置を検査した。図14に示すように、100mg/dlグルコースとの接触に応答し、装置は刺激後15分以内にインシュリン産生の増加を示し、300μU/mlのインシュリンピークに達した。装置を取出し、50mg/dlのグルコース溶液中に入れると、図15に示すように130μU/mlのインシュリンピークに達し、前記と比較して実質的に低下した。さらなる試験で、インシュリン産生は10−20分以内に休眠レベルに戻ることを確認した。さらに、装置を400mg/dlのグルコース溶液に入れた。その場合の刺激の傾向と遮断は同様であった。試験期間中にわたってグルコースに応答した膵島分泌の明らかな低下はなく、膵島が被覆された装置内でその機能を維持し、且つ改善しうることを示した。
実施例９
細胞マトリックスを包含するのに適した装置は、多数の膵島含有カプセルを提供する、CoStar Inc.,Cambridge,MAから市販されている18ウエルのポリエチレンストリップである。図16に示すように、ストリップ242の各々のカプセルあるいはウエル240に約20dlのマトリックス244を注入した。各ストリップは、ウエルに実質上均一に分配された約30,000〜100,000の膵島を含んだ。マトリックスの上部表面はストリップの上部表面よりも下に引っ込んでいる。ストリップとマトリックスの上部表面を、ポリパラキシリレンＮで約4,000オングストロームの厚さに立体被覆する。引っ込んだマトリックスは、移植の際に直接組織と接触することから保護された膜表面246を備えている。さらに、宿主（被移植者）によって生じる流体の力は膜に対する圧縮力をもたらすだけであり、それによってマトリックスは膜の断裂あるいは裂傷の潜在的な可能性が低下する。
最初のイヌである、9kgの意図的に飼育された雌性ビーグル犬、Dog ASYに、肩の後の左背側胸郭に沿った筋肉内切開を通して挿入した約30,000の膵島を含有する当量の３つのストリップを植え込んだ。その後、切開部に約20mlの非細胞マトリックスを浸透させ、切開を閉じた。７日後、Dog ASYに完全膵切除術を行った。Lifescanによって製造されたOnTouch Meterを使用し、同時に標準臨床自動化学機器によって毎日血糖値を測定した。毎日の空腹時血糖値の読取り結果を図17に示す。血糖レベルを約150mg/dl以下に保つため、Dog ASYにヒトUltra−Lenteインシュリンとレギュラーインシュリンの組合せを表示されている量で、実質的に等しく分配して与えた。いずれも従来の慣例に従って、血糖レベルを抑えるためにレギュラーインシュリンを投与し、血糖レベルを維持するためにUltra−Lenteを登用した。装置中の膵島の数は、他の研究者達が血糖コントロールのために推定している数よりもはるかに低く、kg当り約8,000膵島あるいは試験した大きさのイヌについて約120,000膵島である。
膵島が少ないことを考慮すると、やはり装置が宿主内で機能しているかどうかを調べることが重要である。これはブタ特異的放射免疫測定法（RIA）を通してＣ−ペプチドレベルを測定することにより達成できる。この検定は、膵島を離れる前にペプチダーゼによってプロインシュリン分子から開裂されて、生物活性インシュリン分子を生じる、「Ｃ」形をしたペプチドを測定する。Ｃ−ペプチドは種特異的である。Linco,Inc.,St.Louis MOから市販されている極めて特異性の高いRIAキットは、イヌＣ−ペプチドとブタＣ−ペプチドを容易に識別する。後者が検出されることは移植した装置によるインシュリンの産生を示す。Dog ASYに関して、定期的に血液サンプルを採取し、ブタＣ−ペプチドについて検定した。その結果を図19に示す。１日目に装置を移植し、８日目に膵を切除した。膵を切除するまでの期間中は血液サンプル中にブタＣ−ペプチドが検出され、装置がブタインシュリンを産生していることを示した。試験期間を通じて、明らかな静止期間を除き、検出可能なレベルが測定された。
上述したマトリックスの、RNA含量、たんぱく産生のための細胞遺伝子コード化の測定、およびインシュリン分泌能力への影響を調べるため、インビトロ実験を実施した。図18から、分離７日目に5,500膵島が最大のインシュリン分泌と、測定された総RNAの最低点を示したことがわかる。同様に、21日目に総RNAが最大濃度に達し、一方でインシュリン分泌機能は極めて低かった。測定期間中、膵島の生活能力は一定なままであった。これらのデータは、MRNAが増加すると共にインシュリン分泌能力が低下し、逆もまた同様で、経時的なインシュリン分泌能力とRNA産生間の逆の周期を示唆している。これらのインビトロデータは、すぐ後に述べる実験記録の中のIVGTT C−ペプチド測定によって裏付けられる。そのような静止期間後、Ｃ−ペプチド産生は前の試験期間中のレベルと実質的に同じかまたはそれを越えるレベルに回復した。15日目に、Dog ASYに関して従来の静脈内耐糖能試験（IVGTT）を実施した。図20に示す結果は、装置がグルコース負荷に応答して多量のブタインシュリンを産生できたことを明らかにしている。
２番目のイヌ、10kgの意図的に飼育した雌性ビーグル犬、Dog ABJは、肩の後の左背側胸郭に沿った筋肉内切除を通して挿入した、約200,000膵島を含む当量の４つのストリップを有していた。その後、切開部に約20mlの非細胞マトリックスを浸透させ、切開を閉じた。７日後、Dog ABJに完全膵切除術を行った。血糖値を毎日測定した。血糖値の読取り結果を表24に示す。Dog ASYと同様に、実質的に一日中血糖レベルを約150mg/dl以下に維持するために、表示されている総量のUltra−LenteインシュリンとレギュラーインシュリンをDog Bに与えた。
Ｃ−ペプチドレベルも定期的に測定した。その結果を図23および図21Aと21Bに示す。１日目に装置を移植し、８日目に膵切除した。膵を切除するまでの期間中、標準0.5g/kg IVグルコースボーラスに応答して、0.04〜0.18ng/mlのレベルで血液サンプル中にブタＣ−ペプチドが検出された。試験期間を通じて、静止期間を除き、検出可能なレベルが測定された。そのような静止期間後、Ｃ−ペプチド産生は前の試験期間中のレベルと実質的に同じかまたはそれを越えるレベルに回復した。図21Bは、移植後40日目と57日目（膵切除後31日目と48日目）のDog ABJに関するIVGTTグルコース、Ｃ−ペプチド、および総インシュリン値を示す。40日目には、グルコースボーラスの１分後に最大グルコースレベルが629mg/dl、57日目には690mg/dlであった。しかし、57日目まで、Ｃ−ペプチドは１分で第１期の最大放出レベルに達し、初期値からの有意の低下（0.14mg/ml）はなかった。
３番目のビーグル犬、ABMは、移植後21日目、膵切除後２週間目に、0.14mg/mlの最大Ｃ−ペプチド濃度を示した。膵切除術前のIVGTTデータを図22Aに示す。45日目に、反復IVGTTは0.28mg/mlの最大ブタＣ−ペプチド濃度を示し、59日目には0.48mg/mlの最大濃度を示した（図22B）。同様に、IVGTTグルコースボーラスに応答してABMの最大血糖値は1740mg/dlから790mg/dlに低下した。
上述したように、マトリックス製剤において膵島が生育し、複製することは明白である。この改善の性質を調べるため、マトリックスの電子顕微鏡評価とMRNAの定量を行った。再び図６−11を参照すると、膵島のクラスターが74日目にコラーゲン線維に沿って付着していることは明らかであるが、当初の所見はそのような付着がごくわずかであることを示している。インビボおよびインビトロで、前述したマトリックスにおける経時的なＣ−ペプチド産生量の改善が認められる。これは、膵島細胞が刺激を受けてインシュリンを産生できるようになる前に起こるような、膵島のコラーゲン下部構造への結合に関係している。膵島の外側表面のくぼみが、コラーゲン線維への膵島の結合に関与すると考えられる２つの部位のひとつである。
膵島組織複製しているかどうかをさらに調べるため、硫酸デキストラン（５％w/v）培地199、５％新生児ウシ血清、子ウシ皮膚およびブタ皮膚コラーゲン、dl−システイン、ｌ−グルタミン酸、dl−アルギニン（50−100μＭ）、ならびに酸化窒素阻害物質として働く、アミノグアニジン、Ｎ−モノメチルＬ−アルギニン、Ｎニトロ−Ｌ−アルギニンを含めたｌ−アルギニン類似化合物を含有する前述のマトリックスにおいて培養した分離ブタ膵島を、培地199で培養した膵島と比較して、標準トリチウム標識チミジンの取り込み実験を実施した。前駆物質（トリチウム標識チミジン、１μCi/ml）を３日間のインキュベーション期間にわたってDNAレベルに増殖させ、その後組織から抽出した。かかる手順はLevyaとKelley（Analytical Biochemistry62:173−9,1974）の方法に基づいている。トリス緩衝液中で凍結／解凍処理を繰り返して細胞を溶解し、全核酸を沈澱させ、過塩素酸で加水分解した。試料の一部を用いて、シンチレーション計数によって検出される放射能としてチミジンの取り込みを測定した。もうひとつ別の部分標本を用いて、ジフェニルアミンとアセトアルデヒドを使用して600nmで検出可能な色を生じさせ、存在する全DNAの定量を行った。
これらの試験は、４℃あるいは37℃での従来の表面培養に比べて、マトリックス中で３日間培養した膵島ではチミジンの取り込みが増強されることを明らかにした。さらに、これら２つの条件下で30日間まで保持した膵島を比較すると、箸しい増殖活性の差を呈し、標識してマトリックスに包埋した膵島は対照培地で認められた量のほぼ30倍の取り込みを生じた。対の培養を分析すると、マトリックスと培地培養物の両方について、標識取り込み量に関して極めて緊密な一致を示した。経時的なトリチウム標識チミジンの取り込みを検討した。２つの実験からの結果は、初期培養期間におけるこの活性の期限を明らかにし、先に、膵島培養における遺伝子発現とインシュリン分泌に関して認められたように、この過程の30日までの期間での周期的性格を示唆した。DNA定量の結果は、上記のマトリックスに包埋した28,000膵島から300μｇ以上のDNAを確認し、この含量が30日間にわたって安定なままであることを認めた。これらのデータはさらに、インシュリン分泌によって測定されるように、マトリックスが膵島の生活能力ならびに機能を増強させうることを確認している。
上述した酸化窒素阻害物質とスカベンジャー、すなわちＬ−アルギニン類似化合物と、デキストラン、ヘパリン、システイン、シスチン等のような硫酸化合物を添加することは、膵島の生存率と分泌機能を改善する。前述したマトリックスの一部は、高い構造的安定性を提供することにより先に述べたような二重の働きをするが、同時に膵島の相対的な低酸素状態から生じる酸化窒素形成も抑制するように働く。従って、酸化窒素が阻害されるために、前述したマトリックスに包埋した膵島は、比較的低い酸素状態で数ヵ月間保存した後でも中心壊死を示さない。酸化窒素は、結合転位あるいは、スーパーオキシド（O2−）から毒性と反応性が極めて高いヒドロキシル基（OH−）への変換のための触角として働く鉄あるいは亜鉛のような重金属による虚血性灌流亢進損傷において保護的役割を果たす。酸化窒素は金属結合部血に結合することができ、従ってより毒性の高いヒドロキシル基の形成を阻害し、金属キレート化剤あるいはスーパーオキシドジスムターゼのような抗酸化剤として働く。マトリックスにEDTAを加えると、もはやこの機能を果たすことができない結合酸化窒素の代わりにヒドロキシル基を阻害する役割を果たす。
寒冷保存が必要でなければ、上述したマトリックスは煮沸したコラーゲンを添加せずに製剤することができ、膵島は、37℃のより普通の液体環境で数週間保持することができる。広範囲の硫酸化合物およびＬ−アルギニンの添加は、滅菌培養条件下で数週間、そのように保持された膵島の生活能力を増強する。
さらに、これらの酸化窒素阻害物質およびスカベンジャーを、遊離膵島のための膵臓、肝細胞を調製するために肝臓、脂肪細胞を調製するための皮膚、脾細胞を調製するための脾臓のような器官および組織を消化するための酵素溶液に加えて使用すると、収率の改善が得られる。たとえば、膵臓から膵島を分離する時点で従来のコラゲナーゼ消化媒質に加えると、酸化窒素阻害物質およびスカベンジャーは内皮の硬さを増強し、それによって結合組織の伸張を防ぎ、また完全な酵素開裂が膵島の大きさと数の改善をもたらす。適切な酸化窒素阻害物質およびスカベンジャーは、デキストラン、ヘパリン、システインおよびシスチンを含めた前述の物質、ならびにアミノグアニジン、Ｎ−モノエチルＬ−アルギニン、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニンあるいはＤ−アルギニンを含めたＬ−アルギニン類似化合物を含む。許容される酵素溶液は、コラゲナーゼ、トリプシン、Liberase（Boehringer−Manheim）および蛋白分解酵素を含む。有効量は消化される組織あるいは器官と消化溶液の成分に依存して変動するが、使用する量は、完全な内皮開裂をもたらすような内皮の硬さを達成するのに十分でなければならない。一般に、器官および組織、特にブタ膵臓に関しては、酸化窒素阻害物質およびスカベンジャーの量は約0.001〜20％重量である。
試験したすべてのイヌにおいて、Ｃ−ペプチドは上記の周期に従って時間と共に増加したり減少したりする傾向があったが、経時的に上向きの傾向にあった（図25〜30）。インビトロで認められたように、ほとんどのイヌが６日目にＣ−ペプチドのスパイクを示し、その後21日目に最低点を示して、これまでに述べた周期を示唆した。図31は、膵島を移植前に21日間培養条件下に保持した時の、AXAにおける活発なＣ−ペプチド反応を示す。インビボで絶対重要なのは、静脈内耐糖能試験で調べたように、移植された装置がグルコース誘発に応答して速やかにインシュリン（Ｃ−ペプチド）を産生する能力である。図31では、時間を経た装置（120,000膵島当量）は、良好な最大Ｃ−ペプチド応答だけでなく、50日前に膵切除されたイヌにおいて血糖値の正常化を示した。（時間を経た装置の生活能力を調べるため、試験動物のそれまでの装置は除去した。）図は、グルコース濃度のスパイクに応答した二相性のＣ−ペプチド放出（ＡおよびＢ）を明瞭に示している。これは試験動物C324においても示されており（図32）、移植した装置は80日を経過していたが、90分以上にわたってグルコースピーク刺激からＣ−ペプチドピークが生じた。これらのデータは、II型糖尿病患者にとって治療上の恩恵となるであろうインビボでの正常なインシュリン拍動性を明らかにしている。
好ましい具体化を説明するために、前述の被包はブタ膵島の異種移植を参照して述べたが、細胞移植の当業者は、本発明が、甲状腺欠損、成長ホルモン欠損、先天性副腎過形成、パーキンソン病等のような内分泌状態の欠損している個人へのホルモン産生あるいは組織産生移植のための他の適用において、また中枢神経系疾患や他の慢性疾患の治療のための生物学的に活性な物質および遺伝子治療物質のための移植可能な供給送達系から恩恵を受ける治療条件のために適用において有効に使用しうることを認識するであろう。特に、上述した装置およびマトリックスは、制限を伴わずに、変性コリン作動性ニューロンの喪失を防ぐためのヒト神経成長因子を分泌する細胞、心筋再生のための衛星細胞、ハンチントン病のための線条体脳組織、肝細胞、骨髄細胞、パーキンソン病のためのドパミンに富む脳組織および細胞、アルツハイマー病のためのコリン作動性の高い神経系、中枢神経系に鎮痛薬を送達するための副腎クロム親和性細胞、皮膚移植のための培養上皮、ならびに筋萎縮性側索硬化症のための毛様体神経向性因子を放出する細胞を含めて、種々の移植治療における適用が見出せるであろう。それ故、上述した具体化の様々な修正は当業者には明白であろう。従って、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１４】
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【図９】
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【図１５】
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【図１０Ａ】
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【図１２】
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【図１０Ｂ】
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【図１３】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２３】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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