(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース又はアミロースのカルバメート誘導体である多糖誘導体を担体にコーティングしてなる充填剤を、塩基を含有する溶媒で洗浄することにより、イソシアン酸エステル又はその誘導体を含む多糖誘導体由来の不純物を誘導体化して除き、多糖誘導体由来の溶出物量の少ない充填剤を得ることを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法。
【請求項２】
多糖誘導体がセルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
塩基がアミン類であり、多糖誘導体由来の不純物がイソシアン酸エステル又はその誘導体である請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
塩基を含有する溶媒が、脂肪族炭化水素、低級アルコール又はこれらの混合液である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項５】
塩基を含有する溶媒で洗浄後、脂肪族炭化水素、低級アルコール又はこれらの混合液からなる溶媒で更に洗浄する請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項６】
多糖誘導体由来の溶出物量が、内径１cm、長さ25cmのカラムに充填した充填剤にｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝８／２（容量比）混合液を流速 4.7ml／min 、温度40℃で通液した溶液1000mlを採取し、濃縮乾固して測定する方法で0.05mg以下となるまで洗浄する請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高速液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法に関するものである。詳しくは、多糖誘導体を担体にコーティングしてなる充填剤であって、多糖誘導体由来の溶出物の量を低減させた高速液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法に関するものである。
【０００２】
本発明の高速液体クロマトグラフィー用充填剤は、光学異性体分取の分野において、分取製品の品質の向上に寄与するものである。また、本発明は、多糖誘導体を担体にコーティングしてなる充填剤で、分離性能を低下させることなく、多糖誘導体由来の溶出物量を低減させた高速液体クロマトグラフィー用充填剤を安価に容易に得る製造法を提供するものである。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
高速液体クロマトグラフィー用充填剤は、大別して化学結合型充填剤とコーティング型充填剤の２種類がある。
化学結合型充填剤は、分離能を有する物質が担体に化学結合しているため、分離能を有する物質由来の溶出物の量が一般に少ない。
一方、コーティング型充填剤は、分離能を有する物質が担体に物理吸着しているため、分離能を有する物質を溶解する溶媒は使用できず、また、不適切な使用条件においては分離能を有する物質が剥離し溶出する可能性がある。この溶出は、分析の場合はクロマトグラムのベースラインのドリフト現象等として現れ、分取の場合は分取製品の汚染につながるので、避けなければならない。
【０００４】
多糖誘導体を担体にコーティングしてなる高速液体クロマトグラフィー用充填剤は、光学異性体の分離に適しており、その分離能は非常に優れていることが知られている（特開昭６０−８２８５８号公報、特開昭６０−１０８７５１号公報、特開昭６０−１４２９３０号公報等）。しかし、この多糖誘導体を担体にコーティングしてなる高速液体クロマトグラフィー用充填剤は、用いる移動相が不適切な場合には、その多糖誘導体の比較的低分子量領域のポリマーが溶出して、クロマトグラムのベースラインが安定しない、分取時の分取製品中に溶出物が混入する、分離性能が劣化する等の問題を起こすことがあった。
【０００５】
そこで、このような溶出物を非常に少なくした多糖誘導体を担体にコーティングしてなる高速液体クロマトグラフィー用充填剤の開発が望まれていた。
上記の問題を解決する方法として特開平７−２６０７６２号公報に記載の方法がある。この方法は多糖誘導体を担体にコーティングしてなる充填剤を、脂肪族炭化水素、低級アルコールまたはこれらの混合液等の溶媒で洗浄し、分離能を有する物質である多糖誘導体由来の溶出物を低減する方法である。このような方法によって、多糖誘導体由来の溶出物として、低分子量ポリマー等の溶出量が低減できた例がこの公報の実施例に記載されている。しかし、特にカルバメート誘導体の場合、多糖を誘導体化する際に原料として使用するイソシアン酸エステルは脂肪族炭化水素、低級アルコールまたはこれらの混合液等の溶媒には抽出されにくく、これらの溶媒で洗浄してもなお充填剤中に残留しやすいため、使用中にイソシアン酸エステルとして、あるいはアルコールや水と反応しイソシアン酸エステル誘導体として長時間溶出し続け、好ましくない。
【０００６】
従って、本発明の目的は、イソシアン酸エステルあるいはその誘導体等の溶媒に抽出されにくい不純物も充填剤から除去し、多糖誘導体からの溶出物量を低減せしめた、高速液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討の結果、充填剤を脂肪族炭化水素、低級アルコールまたはこれらの混合液等の溶媒で洗浄する際に、溶媒にジエチルアミン等の塩基を少量加え、イソシアン酸エステル等の多糖誘導体に混入した不純物を誘導体化すると、分離能を低下させることなく、効率良く多糖誘導体から抽出除去できることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００８】
即ち、本発明は、多糖誘導体を担体にコーティングしてなる充填剤を、塩基を含有する溶媒で洗浄することにより、多糖誘導体中に含まれる不純物を誘導体化して除き、多糖誘導体由来の溶出物量の少ない充填剤を得ることを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１０】
本発明における多糖とは、天然多糖、合成多糖いずれを問わず、光学活性であればいかなるものでもよいが、好ましくは結合様式の規則性の高いもので、高純度の多糖を容易に得ることのできるものである。例示すれば、セルロース、アミロース、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、β−１，４−キシラン等であり、セルロース及びアミロースが特に好ましい。
【００１１】
本発明における多糖誘導体とは、多糖の水酸基の８０〜  １００％が置換基により置換された化合物をいう。具体的には、ウレタン結合を形成したカルバメート誘導体、エステル結合を形成したエステル誘導体、エーテル結合を形成したエーテル誘導体であるが、特に、カルバメート誘導体を対象とする場合において好ましく適用される。
【００１２】
本発明に用いられる担体としては、多孔質有機担体または多孔質無機担体があり、好ましくは多孔質無機担体である。多孔質有機担体として適当なものは、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート等からなる高分子物質が挙げられる。多孔質無機担体として適当なものは、シリカ、アルミナ、マグネシア、酸化チタン、ガラス、ケイ酸塩、カオリン等の合成または天然の物質が挙げられ、多糖誘導体との親和性を良くするために表面処理を行っても良い。表面処理の方法としては有機シラン化合物を用いたシラン化処理やプラズマ重合による表面処理法等が挙げられる。
【００１３】
本発明において多糖誘導体を担体にコーティングする方法としては、多糖誘導体を有機溶媒に溶解し、この溶液に担体を混合してよく攪拌した後に有機溶媒を留去する方法等が挙げられる。
【００１４】
上記のようにして多糖誘導体を担体にコーティングしてなる充填剤上の多糖誘導体は、非常に薄い（数十オングストローム）フィルム状になっており、このコーティング層を大きく乱すことなく洗浄するために、洗浄溶媒は、充填剤を高速液体クロマトグラフィーに使用する際に移動相として用いられる溶媒が好ましい。本発明における充填剤を高速液体クロマトグラフィー用として用いる際は、一般にｎ−ヘキサン等の脂肪族炭化水素とエタノール、２−プロパノール等の低級アルコールとの混合液を移動相として用いるため、これらの溶媒を本発明の充填剤の洗浄液として使用すると良い。即ち、本発明の洗浄溶媒としては、脂肪族炭化水素、低級アルコール、またはこれらの混合液が好ましく用いられる。脂肪族炭化水素としては、沸点、粘度、コーティング層への影響等の観点からｎ−ヘキサンが好ましいが、ｎ−ヘプタン、イソオクタン等も用いることができる。低級アルコールとしては、同様の観点から２−プロパノールが好ましいが、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール等も用いることができる。
【００１５】
本発明においては、充填剤をこのような溶媒で洗浄する際に、溶媒に塩基を含有せしめることにより、上記溶媒のみでは抽出されにくく、これらの溶媒で洗浄してもなお充填剤中に残留する不純物、例えば多糖誘導体がカルバメート誘導体の場合、多糖を誘導体化する際に使用するイソシアン酸エステル等を、塩基により誘導体化して除き、溶出物量を低減させるのである。
【００１６】
本発明に用いられる塩基としては、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン等の鎖状及び環状アミンが挙げられる。
本発明において塩基を含有する溶媒中の塩基の含有量は、含まれる不純物に対して過剰であれば特に限定されないが、  ０．００１〜１０容量％が好ましい。
【００１７】
本発明においては、塩基を含有する溶媒で洗浄後、脂肪族炭化水素、低級アルコール又はこれらの混合液からなる溶媒で更に洗浄することが好ましい。
【００１８】
洗浄液の量に関しては、充填剤の取り扱い量にもよるが、通常、充填剤１ｇに対して３〜１０ｍｌの洗浄液を１回に使用し、複数回洗浄することが好ましい。
洗浄温度については、高温の方が洗浄能力が大きいが、多糖誘導体の熱安定性も勘案して、通常、５０〜７０℃が好ましい。
洗浄時間は、上記の条件で３０分〜１時間程度行うのが好ましい。
【００１９】
本発明による高速液体クロマトグラフィー用充填剤は溶出物の量が極めて少ないが、その指標としては、内径１ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに充填した充填剤にｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝８／２（容量比）混合液を流速４．７ｍｌ／ｍｉｎ．、温度４０℃で通液した溶液１０００ｍｌを採取し、濃縮乾固して測定する方法で０．０５ｍｇ以下である。
【００２０】
本発明の方法により製造される多糖誘導体コーティング型充填剤は、通常の溶媒洗浄しない多糖誘導体コーティング型充填剤と比べて、溶出物の量が極めて少ない。特に、脂肪族炭化水素、低級アルコール、またはそれらの混合液に塩基を添加したものを洗浄液に用いることにより、誘導体化剤であるイソシアン酸エステルおよびその誘導体等の溶出量を大幅に低減することができる。このため、光学異性体等の分取の場合、分取製品中への多糖誘導体由来の溶出物が混入することなく、高純度の製品が得られる。また、分析の場合、クロマトグラムのベースラインがドリフトせず、安定するまでの時間が短いため、分析所要時間が短縮され、移動相溶媒使用量も少なくて済む。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００２２】
合成例１
窒素雰囲気下で、セルロース（平均重合度約  ３００）２５０ｇをピリジン  ３．５リットルに加え、これにセルロースに対して大過剰のイソシアン酸４−クロロフェニル１０５０ｇを加え、９０℃で攪拌しながら６時間反応した。次いで、この反応液を冷却し、メタノール  １００ｍｌを加えた後、メタノール／水＝４／１（容量比）溶液２０リットル中に投入した。生じた沈殿物を濾過により回収後、乾燥し、粗セルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）  ９８０ｇを得た。
【００２３】
得られた粗セルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）９８０ｇをアセトン５リットルに溶解し、この溶液をメタノール／水＝１０／１（容量比）１３リットルに投入した。生じた沈殿物を濾過により回収後、乾燥し、セルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）８８０ｇを得た。得られたセルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）の元素分析値及び分子量は以下の通りである。
【００２４】
元素分析値：
Ｃ％：５１．７２      Ｈ％：３．５５    Ｎ％：６．１７
分子量（ポリスチレン換算）：
数平均分子量（Ｍｎ）      ７．９９万
重量平均分子量（Ｍｗ）  ２１．５４万
Ｍｗ／Ｍｎ      ２．５４
得られたセルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）１ｇをアセトン  １００ｍｌに溶解し、ガスクロマトグラフィーでイソシアン酸４−クロロフェニル由来の不純物含有量を測定したところ、以下の通りであった。
【００２５】
メチル  ４−クロロフェニルカルバメート    ４２０ｐｐｍ
４−クロロアニリン                        ２００ｐｐｍ
４−クロロフェニルイソシアン酸            ２００ｐｐｍ
参考例
合成例１で得られたセルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）３ｇを、表１に記載の溶媒９０ｍｌに懸濁し、６０℃で３時間攪拌後濾別した。濾液を濃縮乾固後、抽出された多糖誘導体由来の不純物の含有量をガスクロマトグラフィーで定量し、抽出率を計算した。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0003634929.tif 000002
【００２７】
表１から明らかなように、セルロースの誘導体化剤であるイソシアン酸４−クロロフェニルはこれらの溶媒では抽出されにくいが、メチル  ４−クロロフェニルカルバメート、および４−クロロアニリンは抽出されやすいことが分かる。また、洗浄液中には、２−プロパノールが含まれるが、イソプロピル  ４−クロロフェニルカルバメートが検出されていないことより、洗浄中にイソシアン酸４−クロロフェニルを２−プロパノールで誘導体化後、抽出除去することは困難であることが分かる。
【００２８】
実施例１
合成例１で得られたセルローストリス（４−クロロフェニルカルバメート）１０ｇをアセトン６５ｍｌに溶解し、これを３−アミノプロピルシラン処理したシリカゲル（粒子径５０μｍ、孔径１３００オングストローム）４０ｇに攪拌しながら滴下し、完全に混合した後、溶媒を留去して充填剤５０ｇを得た（以降、充填剤Ａ’と呼称する）。
【００２９】
充填剤Ａ’５０ｇを２−プロパノール／ジエチルアミン＝  １００／０．１（容量比）混合液  ３００ｍｌに懸濁し、温度６０℃で３０分攪拌、洗浄した。充填剤を濾別後、ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝１／３（容量比）混合液  ３００ｍｌに懸濁し、温度６０℃で３０分攪拌、洗浄後濾別することを５回繰り返し、乾燥して、洗浄された充填剤（以降、充填剤Ａと呼称する）を得た。
【００３０】
原料シリカゲル、充填剤Ａ’、充填剤Ａの元素分析を行った結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
0003634929.tif 000003
【００３２】
また、各洗浄工程において、洗浄後、充填剤を濾別して得られた濾液をそれぞれ濃縮乾固して、抽出された多糖誘導体由来の不純物の含有量をガスクロマトグラフィーで測定した。結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
0003634929.tif 000004
【００３４】
表３から明らかなように、充填剤の多糖誘導体中に含まれていた不純物は、上記洗浄処理によってほぼ完全に抽出除去されたことが分かる。
【００３５】
充填剤Ａを内径１ｃｍ、長さ２５ｃｍのステンレス製カラムに充填し、充填剤Ａの充填カラム（以降、カラムＡと呼称する）を作成した。
次に、作成直後のカラムＡにｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝８／２（容量比）混合液を、流速４．７ｍｌ／ｍｉｎ．、温度４０℃で通液し、この溶液１０００ｍｌを採取した。これを濃縮乾固して、残渣重量を測定した。結果を表４に示す。
【００３６】
さらに、カラムＡについて、下記の条件で表５に示すラセミ体の光学分割実験を行った。結果を表５に示す。
【００３７】
＜光学分割条件＞
移動相  ：表５
流  速  ：４．７  ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長：２５４  ｎｍ
温  度  ：２５℃
比較例１
上記の洗浄しない充填剤Ａ’を乾燥し、実施例１と同様の方法でカラムに充填し、充填カラムを作成した（以降、カラムＡ’と呼称する）。
次に、作成直後のカラムＡ’にｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝８／２（容量比）混合液を、流速４．７ｍｌ／ｍｉｎ．、温度４０℃で通液し、この溶液１０００ｍｌを採取した。これを濃縮乾固して、残渣重量を測定した。結果を表４に示す。
【００３８】
さらに、カラムＡ’について、実施例１と同様の条件で表５に示すラセミ体の光学分割実験を行った。結果を表５に示す。
【００３９】
【表４】
0003634929.tif 000005
【００４０】
表４から明らかなように、洗浄しない充填剤Ａ’を用いた場合（比較例１）と比べて、洗浄した充填剤Ａを用いた場合（実施例１）は溶出物量が格段に少なくなっていることがわかる。
【００４１】
【表５】
0003634929.tif 000006
【００４２】
表５から明らかなように、洗浄しない充填剤Ａ’を用いた場合（比較例１）と比べて、洗浄した充填剤Ａを用いた場合（実施例１）は分離能は低下していないことがわかる。