(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のウイルスによる感染を治療するための、第２のウイルスを含む医薬組成物であって、該第２のウイルスが、
ａ）下記のもの：
ｉ）ＴＡＴＡエレメントを有する哺乳動物プロモーター；
ｉｉ）ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流において開始する少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列；および
ｉｉｉ）該オペレーターの３’側に配置され、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子であって、発現された場合、第１のウイルスおよび第２のウイルスの両方の発現をブロックしうる遺伝子
を含むＤＮＡをゲノム中に導入されることにより形質転換され；
ｂ）ｔｅｔリプレッサー蛋白を発現する宿主中で増殖させられ；
ｃ）収集され、精製され；ついで
ｄ）患者に投与される
ものである医薬組成物。
【請求項２】
該オペレーターがＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ないし２４ヌクレオチド下流において開始するものである請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
該プロモーターがヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである請求項１の医薬組成物。
【請求項４】
工程ａ）が
ｉｖ）必須ウイルス遺伝子中に１またはそれ以上の変異を導入されること
をさらに含むものである、請求項１の医薬組成物。
【請求項５】
核酸治療薬を細胞にデリバリーするための、ベクターとして役立つウイルスを含む医薬組成物であって、該ウイルスが
ａ）下記のもの：
ｉ）ＴＡＴＡエレメントを有する組み換え哺乳動物プロモーター；
ｉｉ）ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流において開始する少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列；および
ｉｉｉ）該オペレーターの３’側に配置され、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子であって、該ウイルスの複製を阻害しうる蛋白をコードする遺伝子；
ｉｖ）第２のプロモーターに作動可能に連結された該核酸治療薬
をゲノム中に含むように処理されてベクターとして役立つように調製され；
ｂ）ｔｅｔリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中で増殖させられ；
ｃ）収集され、精製され；ついで
ｄ）患者に投与される
ものである医薬組成物。
【請求項６】
該ウイルスが、該第２の組み換えプロモーター中のＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流であって該第２の組み換え遺伝子の５’側に存在する少なくとも１個のｔｅｔオペレーターをさらに含むものである請求項５の医薬組成物。
【請求項７】
該オペレーター配列が該ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ないし２４ヌクレオチド下流において開始するものである請求項５の医薬組成物。
【請求項８】
該組み換え哺乳動物プロモーターがヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである請求項５の医薬組成物。
【請求項９】
該核酸治療薬が遺伝子発現のアンチセンス阻害剤として作用するものである請求項５の医薬組成物。
【請求項１０】
該核酸治療薬が治療活性を有する蛋白をコードするものである請求項５の医薬組成物。
【請求項１１】
項目ａ）が
ｉｖ）必須ウイルス遺伝子中に１またはそれ以上の変異を導入されること
をさらに含むものである、請求項５の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における転写を制御するためのテトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）オペレーターおよびリプレッサーに依存した組成物および方法に関する。本発明は、かかる方法に使用する蛋白および宿主細胞の組み換え製造法を包含する。さらに、本発明は、ｔｅｔオペレーター／リプレッサー系により複製が制御されるように組み換え法により処理されたウイルスにも指向される。これらのウイルスは、インビトロおよびインビボ両方における遺伝子導入のためのベクターとして、免疫のための作用剤として、ならびに細胞への核酸治療薬のデリバリー手段として役立ちうる。
【背景技術】
【０００２】
導入遺伝子発現を特異的に調節する能力が多年にわたり分子生物学の主要関心事となっている。哺乳動物細胞の場合、重金属イオン（Brinster, et al., Nature 296: 39-42 (1982)）、熱ショック（Nover, in Heat Shock Response, pp. 167-220, CRC, Fla. (1991)）、およびホルモン（Klock, et al., Nature 329: 734-736 (1987)）のごとき要因に応答する誘導可能プロモーターを使用することにより、組み換え遺伝子のインビトロでの調節が最も頻繁に行われている。不幸なことに、一般的には、これらのプロモーターは、インデューサー存在下においてさえ比較的低レベルの発現を提供するにすぎず、インビトロで使用される大部分のインデューサーはインビボにおいて許容されない効果を有している。
【０００３】
誘導可能プロモーターの代替として、十分に特徴づけられた原核調節エレメントを用いて哺乳動物遺伝子発現の制御が試みられている。たいていの場合、調節系は、真核転写モジュレーターを宿主細胞ゲノム中の特定部位に指向するための手段（例えば、Labow, et al., Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356 (1990)参照）、あるいは原核リプレッサーを用いて遺伝子発現を直接阻害する試みにおける手段（例えば、Brown, et al., Cell 49: 603-612 (1987)参照）としての原核オペレーターとリプレッサー蛋白との間の強力な相互作用に依存している。
【０００４】
テトラサイクリン（ｔｅｔ）オペロンに結合した原核エレメントの場合、哺乳動物細胞において転写を転調させることが知られているポリペプチドにｔｅｔリプレッサー蛋白が融合している系が開発されてきた。ついで、ｔｅｔオペレーター配列を配置することにより融合蛋白が特定部位に指向される。例えば、ｔｅｔリプレッサーがトランスアクチベーター（ＶＰ１６）に融合され、選択遺伝子のプロモーターの上流に配置されたｔｅｔオペレーターに対して指向されている（非特許文献１〜３参照）。融合蛋白のｔｅｔリプレッサー部分はオペレーターに結合し、そのことにより、ＶＰ１６アクチベーターを転写誘導が望まれる特定部位に対して指向させる。別のアプローチはｔｅｔリプレッサーをＫＲＡＢリプレッサードメインに融合させ、遺伝子の数百塩基対上流にあるオペレーターに対してこの蛋白を標的化することであった。この系を用いて、キメラ蛋白（ｔｅｔリプレッサー単独ではない）がＣＭＶにより調節された遺伝子発現を１０〜１５倍抑制しうることが見いだされた（非特許文献４参照）。これらのタイプの系に関する主な問題は、哺乳動物トランスアクチベーターまたはリプレッサーに対応する融合蛋白の部分は細胞の転写因子と相互作用し、多面発現的効果を引き起こす傾向があるということである。
【０００５】
理想的には、哺乳動物遺伝子発現調節系は選択遺伝子に対して非常に特異的であり、インビトロおよびインビボ両方における使用に適した因子による誘導に応じるものでなくてはならない。本発明はかかる系を開示し、それをいかにして使用して導入遺伝子の発現を調節するのかを説明する。さらに、本発明は、この系をいかにして適用してウイルスを処理し、ベクター、治療薬およびワクチンとして役立てるのかを説明する。
【非特許文献１】グッセン（Gussen）ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992)
【非特許文献２】キム（Kim）ら, J. Virol. 69: 2565-2573 (1995)
【非特許文献３】ヘンニヒハウゼン（Hennighausen）ら, J. Cell. Biochem. 59: 463-472 (1995)
【非特許文献４】ドイシューレ（Deuschule）ら, Mol. Cell. Biol. 15: 1907-1914 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｔｅｔオペレ−ター／リプレッサー系により調節される遺伝子発現を有するという共通した特徴を有する、多くの異なる組成物および方法を提供することを課題とする。詳細には、本発明により、トランスドミナントネガティブ変異ウイルスポリペプチドをｔｅｔＲにより調節される強力な哺乳動物転写スイッチと組み合わせることにより、新規ウイルス複製スイッチを得て、このスイッチを用いて、トランス−阻害性ウイルスベクターをインビボでの遺伝子導入用ビヒクルとして役立てるだけでなく、内在性および／または潜伏性のウイルス複製をも阻害する。また本発明を用いて、有効な宿主免疫応答を誘導しうるだけでなく、同じ細胞内で内在性ウイルス感染の除去を促進する治療薬としても機能しうるウイルスワクチンを得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）ａ）ＴＡＴＡエレメントを有する組み換えプロモーター；
ｂ）ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流において開始する少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列；および
ｃ）該オペレーターの３’側にあり、該プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子であって、発現された場合に該ウイルスの複製を阻害する遺伝子
をゲノム中に含む、組み換え的に処理されたウイルスで処理された宿主細胞により生成される組み換え蛋白；
（２）（１）のウイルスを含むワクチン；
（３）第１のウイルスによる感染を治療するための、第２のウイルスを含む医薬組成物であって、該第２のウイルスが、
ａ）下記のもの：
ｉ）ＴＡＴＡエレメントを有する哺乳動物プロモーター；
ｉｉ）ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流において開始する少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列；および
ｉｉｉ）該オペレーターの３’側に配置され、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子であって、発現された場合、第１のウイルスおよび第２のウイルスの両方の発現をブロックしうる遺伝子
を含むＤＮＡをゲノム中に導入されることにより形質転換され；
ｂ）ｔｅｔリプレッサー蛋白を発現する宿主中で増殖させられ；
ｃ）収集され、精製され；ついで
ｄ）患者に投与される
ものである医薬組成物；
（４）該オペレーターがＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ないし２４ヌクレオチド下流において開始するものである（３）の医薬組成物；
（５）該プロモーターがヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである（３）の医薬組成物；
（６）工程ａ）が
ｉｖ）必須ウイルス遺伝子中に１またはそれ以上の変異を導入されること
をさらに含むものである、（３）の医薬組成物；
（７）核酸治療薬を細胞にデリバリーするための、ベクターとして役立つウイルスを含む医薬組成物であって、該ウイルスが
ａ）下記のもの：
ｉ）ＴＡＴＡエレメントを有する組み換え哺乳動物プロモーター；
ｉｉ）ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流において開始する少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列；および
ｉｉｉ）該オペレーターの３’側に配置され、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子であって、該ウイルスの複製を阻害しうる蛋白をコードする遺伝子；
ｉｖ）第２のプロモーターに作動可能に連結された該核酸治療薬
をゲノム中に含むように処理されてベクターとして役立つように調製され；
ｂ）ｔｅｔリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中で増殖させられ；
ｃ）収集され、精製され；ついで
ｄ）患者に投与される
ものである医薬組成物；
（８）該ウイルスが、該第２の組み換えプロモーター中のＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流であって該第２の組み換え遺伝子の５’側に存在する少なくとも１個のｔｅｔオペレーターをさらに含むものである（７）の医薬組成物；
（９）該オペレーター配列が該ＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドから６ないし２４ヌクレオチド下流において開始するものである（７）の医薬組成物；
（１０）該組み換え哺乳動物プロモーターがヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである（７）の医薬組成物；
（１１）該核酸治療薬が遺伝子発現のアンチセンス阻害剤として作用するものである（７）の医薬組成物；
（１２）該核酸治療薬が治療活性を有する蛋白をコードするものである（７）の医薬組成物；ならびに
（１３）項目ａ）が
ｉｖ）必須ウイルス遺伝子中に１またはそれ以上の変異を導入されること
をさらに含むものである、（７）の医薬組成物
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ｔｅｔオペレ−ター／リプレッサー系により調節される遺伝子発現を有するという共通した特徴を有する、多くの異なる組成物および方法が提供される。詳細には、本発明により、トランスドミナントネガティブ変異ウイルスポリペプチドをｔｅｔＲにより調節される強力な哺乳動物転写スイッチと組み合わせることにより、新規ウイルス複製スイッチが得られ、このスイッチを用いると、トランス−阻害性ウイルスベクターは、インビボでの遺伝子導入用ビヒクルとして役立ちうるだけでなく、内在性および／または潜伏性のウイルス複製をも阻害しうる。また本発明を用いて、有効な宿主免疫応答を誘導しうるだけでなく、同じ細胞内で内在性ウイルス感染の除去を促進する治療薬としても機能しうるウイルスワクチンを得ることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ａ．組み換え蛋白製造のための組成物および方法
本発明はその第１の態様において、ＴＡＴＡエレメントを伴う哺乳動物プロモーター配列、少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列、およびプロモーターに作動可能に連結されオペレーターの下流に存在する遺伝子配列を含む組み換えＤＮＡ分子に指向される。ＴＡＴＡエレメントに対するオペレーター配列（複数も可）の正確な位置は本発明にとり重要である。転写制御において有効であるためには、オペレーターはＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド下流から開始しなければならず、蛋白をコードする遺伝子が発現される場合には、オペレーターは翻訳開始コドンの手前に存在すべきである。一般的には、オペレーターはＴＡＴＡエレメントの、多くとも約１００ヌクレオチド下流から開始すべきであり、６ないし２４ヌクレオチド下流から開始すべきである。このように配置される場合、リプレッサー蛋白の結合は転写活性の本質的に完全なシャットダウンを引き起こす。このことは、ヒトＣＭＶ即時初期プロモーターのごとき非常に強力で乱雑なプロモーターに関してさえも真実である。
【００１０】
最も典型的には、ｔｅｔリプレッサー蛋白を構成的に発現する哺乳動物細胞中に上記組み換えＤＮＡ分子が取り込まれるであろうと考えられる。細胞において活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−１プロモーターまたはＳＶ４０プロモーター）に作動可能に連結されたｔｅｔリプレッサー蛋白遺伝子を含むベクターを用いて、哺乳動物細胞系、例えば、Ｕ２ＯＳ細胞またはＶｅｒｏ細胞を形質転換することにより適当な細胞を得てもよい。別法として、ＤＮＡ分子は上記エレメントのほかに、第２のプロモーター、好ましくは構成的でｔｅｔリプレッサー遺伝子配列に作動可能に連結されたものを含んでいてもよい。本発明はＤＮＡ分子のみならず、そのＤＮＡにより形質転換された宿主細胞およびその細胞により生成される組み換え蛋白も包含する。
【００１１】
本発明は蛋白の組み換え製造方法にも指向され、該方法において、哺乳動物宿主細胞は、ＴＡＴＡエレメントを有するプロモーター配列、ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところに位置する少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列、およびオペレーターの３’側に存在していてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子を含むベクターを用いて形質転換されている。オペレーターの３’側の遺伝子は、選択遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸、治療上活性のある作用剤（例えば、腫瘍リプレッサーまたは細胞性蛋白のトランスドミナントネガティブ変異体ペプチド）、実験目的の蛋白または単離目的の蛋白をコードするものであってもよい。遺伝子が蛋白をコードしているすべての場合において、オペレーター配列は当該遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。形質転換細胞はリプレッサー蛋白を構成的に発現すべきであり、組み換え遺伝子の発現はテトラサイクリンを導入することにより細胞において誘導されるものであってもよい。典型的には、ｔｅｔオペレーター配列はＴＡＴＡエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）のところに存在するであろう。好ましいプロモーターはヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである。この系が遺伝子発現を厳密に調節すること、すなわち、インデューサーであるテトラサイクリンが利用可能になるまで発現が本質的にシャットオフされることが見いだされている。
【００１２】
本発明方法を用いて、培養哺乳動物細胞またはトランスジェニックもしくは非ランスジェニック動物において組み換え蛋白を製造することができる。トランスジェニック動物を製造に使用する場合、最も典型的には、トランスジェニック動物はマウスであろうし、上記ベクターで形質転換された細胞は胚性幹細胞であることが必要である。ｔｅｔプロモーターおよび組み換え遺伝子で形質転換する前に、プロモーターに作動可能に連結されたテトラサイクリンリプレッサー遺伝子を用いて形質転換することによりテトラサイクリンリプレッサーを発現するように幹細胞を処理してもよい。別法として、リプレッサー遺伝子をｔｅｔオペレーターと同じ遺伝子中に含ませて、組み換え蛋白をコードしている遺伝子と同じプロモーターの制御下、または別のプロモーターの制御下に置くことができる。形質転換された幹細胞を胚盤胞中に取り込ませてキメラ胚を作成し、それを偽妊娠動物中に移植する。このようにして移植された胚は生きた子孫を発生させることができ、それをスクリーニングして組み換え遺伝子を発現するヘテロ接合動物を同定する。ついで、ヘテロ接合動物を交雑させて、テトラサイクリン投与に応答して組み換え蛋白を生成するホモ接合動物を得る。
【００１３】
本発明は、この方法により作成されるトランスジェニック動物、ならびにＴＡＴＡエレメントを有する哺乳動物プロモーター配列、ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところに存在する少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列、およびオペレーターの３’側に存在していてプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子を含む組み換えＤＮＡをそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック動物を包含する。遺伝子が蛋白をコードする場合、オペレーター配列は遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。典型的には、ｔｅｔオペレーター配列はＴＡＴＡエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）のところに存在するであろう。好ましいプロモーターはヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである。トランスジェニック動物のほかに、本発明は、これらの動物により生成される組み換え蛋白を包含する。
【００１４】
Ｂ．加工されたウイルスおよびそれらの使用
ｔｅｔオペレーター／リプレッサー系の１の特に重要な用途は、複製を制御できるウイルスの製造におけるものである。これらのウイルスの必須の特徴は、それらのゲノム中に少なくとも３つの関連エレメントを含んでいることである。３つの関連エレメントとは、ＴＡＴＡエレメントを有する組み換えプロモーター、ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところに存在する少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列、およびプロモーターに作動可能に連結された遺伝子（オペレータの下流に存在していて、発現された場合にウイルス複製を阻害する）である。典型的には、ｔｅｔオペレーター配列は、ＴＡＴＡエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）のところに存在するであろう。オペレーターの下流に存在する遺伝子は、ウイルス複製を阻害する蛋白をコードすることにより、あるいはアンチセンス機構によりウイルス複製を阻害する転写生成物を生成することにより作用するものであってもよい。遺伝子が蛋白をコードする場合、ｔｅｔオペレーター配列は翻訳開始コドンの上流に存在するであろう。ｔｅｔリプレッサー蛋白を構成的に発現する培養細胞中において、加工されたウイルスを生成させ増殖させてもよい。これらの条件下において、ウイルス複製を阻害する遺伝子がシャットオフされて、大量のウイルスが得られるであろう。ついで、ウイルスを集め、精製し、インビトロまたはインビボにおいて哺乳動物細胞に導入してもよい。通常は、哺乳動物細胞はｔｅｔリプレッサー蛋白を生成しないので、オペレーター配列は占領されないであろう。結果として、ｔｅｔオペレーターの３’側に存在する遺伝子が発現され、ウイルス複製が防止される。
【００１５】
上記方法において加工されたウイルスは広範な用途がある。第１に、ウイルスは、哺乳動物細胞へのＤＮＡ（例えば、遺伝子）のデリバリーのためのビヒクルとして使用することができる。これらの状況下において、典型的には、第２の組み換えプロモーターがウイルスゲノム中に含められて、発現が望まれる遺伝子に作動可能に連結される。この第２のプロモーターには、ＴＡＴＡエレメントから６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のｔｅｔオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。ＤＮＡが宿主細胞にデリバリーされた後、ｔｅｔリプレッサー蛋白不存在のため、新たなウイルスの生成が阻害される。第２のプロモーターに結合した遺伝子は、細胞中での選択遺伝子発現を阻害するアンチセンス核酸をコードしていてもよく、治療上活性のある蛋白（例えば、腫瘍リプレッサーまたは細胞系蛋白のトランスドミナントネガテイブ変異体ポリペプチド）、または単離もしくは実験を目的とした蛋白をコードするものであってもよい。本発明は、ウイルスで細胞をトランスフェクションすることにより宿主細胞を形質転換する方法、形質転換宿主細胞それ自体、ならびにその宿主細胞により得られる組み換え蛋白を包含する。
【００１６】
上記ウイルスを用いて対象を免疫してもよい。加工されたウイルスを含有するワクチンの大きな利点は、免疫による活性ウイルス感染の危険性が大幅に低下していることである。なぜなら、加工されたウイルスは、対象中に注入された後複製しないからである。ウイルス複製が起こらないことをさらに確実にするために、さらなる変異をウイルスに導入してもよい。例えば、欠失変異を１またはそれ以上の必須ウイルス遺伝子に導入してもよい。一般的には、このようなさらなる変異を含むウイルスが好ましい。
【００１７】
加工されたウイルスは、ウイルス感染に対する患者の直接的治療においても有用である。この方法の最初の工程は、第２のウイルス（すなわち、患者に感染したのとおそらく同じ株であるが別のウイルス）のゲノムに下記ＤＮＡを組み込むことにより第２のウイルスを形質転換することを包含する。そのＤＮＡとは、ＴＡＴＡエレメントを有するプロモーター配列、ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところ（典型的には、６ないし１００ヌクレオチドのところ）に位置する少なくとも１つのｔｅｔオペレーター配列、およびオペレーターの３’側に存在していてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子を含むものである。この遺伝子が発現された場合に、第２のウイルスおよび患者に感染したウイルスの両方の複製をブロックしうるように、この遺伝子を選択すべきである。遺伝子が蛋白をコードする場合、ｔｅｔオペレーター配列は遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。形質転換された第２のウイルスを、ｔｅｔリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中で増殖させ、そのことにより大量のウイルス子孫を生成させる。ウイルスを集め、精製し、ついで、患者に投与する。好ましい具体例において、ｔｅｔオペレーターはＴＡＴＡボックスの最後のヌクレオチドから６ないし２４ヌクレオチド下流にあり、使用プロモーターはヒトＣＭＶ即時初期プロモーターである。
【００１８】
最後に、本発明は、核酸治療剤を細胞にデリバリーする方法に関する。核酸治療剤は、細胞性蛋白の発現を阻害するアンチセンスフラグメント、あるいは治療作用を有する蛋白をコードする遺伝子を含んでいてもよい。ウイルスを加工してそのゲノム中に下記のｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を含むようにする。それらは、ｉ）ＴＡＴＡエレメントを有する組み換え哺乳動物プロモーター、ｉｉ）ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところ、かつ翻訳開始コドンの５’側に存在する少なくとも１つのｔｅｔオペレーター、およびｉｉｉ）オペレーターの３’側に存在し、プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子である。この遺伝子が発現される場合、ウイルス複製が阻害される。典型的には、ｔｅｔオペレーター配列はＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドの３’側から６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）のところに存在する。好ましいプロモーターはヒトＣＭＶの即時初期プロモーターである。さらに、ウイルスはそのゲノム中に、第２のプロモーターに作動可能に連結された、治療剤をコードする核酸を含んでいなければならない。この第２のプロモーターには、ＴＡＴＡエレメントから６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のｔｅｔオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。
【００１９】
治療剤デリバリー用ウイルスベクターの製造後の、本発明方法の次の工程は、ｔｅｔリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中において大量のウイルスを増殖させることである。このようにして増殖したウイルスを集め、精製し、ついで、患者に投与する。通常は、患者はｔｅｔリプレッサーを合成する細胞を有していないので、ウイルス複製はブロックされるが、核酸治療剤の転写は進行するであろう。
【００２０】
定義
以下の説明には、組み換えＤＮＡ法についての多くの用語を用いる。明細書および請求の範囲について明確かつ一貫した理解を得るために、かかる用語の範囲を含め、以下に定義する。
【００２１】
ウイルスベクター：本明細書の「ウイルスベクター」および均等な用語は、選択ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞中に導入するための使用されるウイルスをいう。インビボまたはインビトロにおいて細胞中にＤＮＡを導入する目的でベクターを使用してもよい。後者の目的に通常使用されているウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびヘルペスウイルスが含まれる。
【００２２】
発現ベクター：この用語およびこれに相当する用語は、宿主細胞中への形質転換後、宿主中でクローン化されたＤＮＡの発現を誘導しうるベクターをいう。通常には、クローン化ＤＮＡは、プロモーターまたはエンハンサーのごとき特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、作動可能に連結される）。おそらく、プロモーター配列は構成的なものであり、誘導可能または抑制可能なものである。
【００２３】
実質的に純粋または精製された：本明細書の「実質的に純粋」または「精製された」は、所望生成物は本質的に細胞性成分を含まないことを意味する。成分としては蛋白、炭水化物および脂質があるが、これらに限らない。蛋白または核酸の純度を調べる１の方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのごときマトリックス中での電気泳動によるものである。染色後の単一バンド出現により純粋であることが明らかとなる。
【００２４】
宿主：ベクターを受容する原核細胞または真核細胞はそのベクターの宿主である。この用語は、ゲノム中に遺伝子を組み込むように処理された原核細胞または真核細胞を包含する。宿主として役立ちうる細胞は、細胞の形質転換法と同様に、当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (1989)参照）。
【００２５】
プロモーター：遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは遺伝子の５’末端に見いだされ、スタートコドンに近い位置にある。プロモーターが誘導可能なタイプである場合、転写速度は誘導剤に応答して増加する。
【００２６】
発現：発現は、ポリペプチドがＤＮＡから作られるプロセスである。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびこのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。文脈に応じて、「発現」とはＲＮＡ、蛋白、あるいはそれら両方の生成をいうこともある。
【００２７】
組み換え：本明細書の用語「組み換え」は、核酸配列および配列エレメントを実験的に組み換えることにより得られる核酸についていう。組み換え宿主は組み換え核酸を受容する宿主であり、用語「組み換え蛋白」はかかる宿主により生成される蛋白をいう。
【００２８】
作動可能に連結：用語「作動可能に連結」は、正常な機能を果たすことが可能なように連結された遺伝学的エレメントについていう。例えば、転写がプロモーターの制御下にある場合、遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されており、かかる転写により通常には当該遺伝子によりコードされる蛋白が生成される。
【００２９】
核酸治療剤：この用語は、直接的あるいは間接的に治療剤として役立つ核酸配列をいう。典型的には、かかる作用剤は２つのカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは、宿主細胞中の相補的配列にアニールする（そのことにより発現を阻害する）ように設計されたアンチセンス核酸を包含する。あるいは、この用語は、治療蛋白をコードする核酸をいうこともある。
【００３０】
遺伝子：本明細書の「遺伝子」は、プロモーター活性の結果としての転写を受ける核酸配列をいう。遺伝子は特定の蛋白をコードしていてもよく、あるいはそれ自体興味あるＲＮＡ配列をコードするものであってもよい。なぜなら、例えば、それはアンチセンス阻害剤として作用するからである。
【００３１】
哺乳動物プロモーター：用語「哺乳動物プロモーター」は哺乳動物細胞中で活性のあるプロモーターをいう。同様に、「原核プロモーター」は原核細胞中で活性のあるプロモーターをいう。
【００３２】
必須ウイルス遺伝子：用語「必須ウイルス遺伝子」は、ウイルス複製に必要な遺伝子と定義される。
【００３３】
必須細胞性遺伝子：この用語は細胞の生存に必要な遺伝子をいう。
【００３４】
本発明は、ｔｅｔオペレーターおよびリプレッサー蛋白を用いて哺乳動物遺伝子発現を調節できるという考えに基づくものである。発現を制御しているプロモーターのＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド下流にオペレーターが存在する場合には、他の哺乳動物転写モジュレーターにリプレッサー蛋白を融合させる必要なく調節が行われうる。
【００３５】
重要ではないが、細菌におけるテトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）オペロンの基本的機能についての知識は、本発明の実施方法を理解するための助けとなるかもしれない。ｔｅｔオペロンにおいて、テトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＡ）およびｔｅｔリプレッサー蛋白をコードする遺伝子（ｔｅｔＲ）は両方とも同じプロモーターおよびオペレーターエレメントの制御下にある。テトラサイクリン不存在下においては、ｔｅｔリプレッサー蛋白はオペレーターＤＮＡ配列に結合し、そのことにより隣のプロモーターがＲＮＡポリメラーゼと相互作用することを立体的に妨げる。かくして、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲの両方の転写がブロックされる。細菌中のテトラサイクリンレベルが上昇した場合、テトラサイクリンはリプレッサー蛋白に結合し、リプレッサー蛋白をオペレーター配列から引き離す。結果として、ポリメラーゼはプロモーター配列に結合可能となり、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲ遺伝子は両方とも転写される。
【００３６】
ｔｅｔリプレッサー蛋白とｔｅｔオペレーターとの間の強力な相互作用により、細胞ゲノム中の特定部位に対して真核調節蛋白を指向させる機構が提供される。上記のごとく、以前説明されていた系は、ｔｅｔリプレッサーおよび哺乳動物転写アクチベーターまたはリプレッサーを含む融合蛋白の標的として役立つ哺乳動物遺伝子の上流にｔｅｔオペレーターが存在するものであった。融合蛋白のｔｅｔリプレッサー部分がオペレーター配列に結合し、そのことにより、それが発現されるべき遺伝子上流に配置されることとなる。ついで、融合蛋白の残りの部分は、細胞性転写因子と相互作用することにより遺伝子発現を転調させるものとして役立つ。
【００３７】
これらのタイプの系に関する主な問題は、オペレーターから離れた部位にある転写因子と哺乳動物転写モジュレーターとの相互作用により多面的効果が生じることである。ｔｅｔリプレッサー蛋白のみ（すなわち、融合蛋白以外のものとして）を用いて遺伝子発現を転調させようとする従前の試みは成功していない（例えば、Kim, et al., J. Virol. 69: 2565-2573 (1995); Deuschule, et al., Mol. Cell. Biol. 15: 1907-1914 (1995)参照）。全ＤＮＡヘリックスターンに相当する約１０塩基対の１個またはそれ以上のｔｅｔオペレーターをｔｅｔオペレーターの下流に挿入することにより、ｔｅｔＲのみを用いて遺伝子発現をうまく転調させることができることを見いだした。このアプローチを用いて、最も強力かつ乱雑な真核エレメントの１つであるｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターにより制御されている転写を厳密に調節することができた。これをインビトロおよびインビボの両方において行うことができる。
【００３８】
Ｉ.転写スイッチとしてのｔｅｔオペレーター
本発明は、第１の態様において、ＴＡＴＡエレメントを伴う哺乳動物プロモーター配列を含む組み換えＤＮＡ分子に指向される。テトラサイクリンオペレーター配列はＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところに置かれ、プロモーターにより転写が制御されるＤＮＡ配列がその後に続く。プロモーター、オペレーターおよび他のＤＮＡを合成または精製する方法は当該分野においてよく知られており、分子生物学における標準的方法を用いて、適当に配置されたエレメントを有するＤＮＡ分子を構築することができる（例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor (1989)参照）。好ましい方法の例は、ｔｅｔオペレーターの完全配列とともに「実施例」のセクションに記載されている。
【００３９】
どのようなタイプのプロモーターであっても本発明に使用することができ、誘導可能、抑制的または構成的なものが含まれる。好ましい哺乳動物プロモーターは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子（Hamer, et al. J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)）のプロモーター；ヘルペスウイルスの即時初期およびＴＫプロモーター（Yao et al., J. Virol. 69: 6249-6258 (1995)）；ＳＶ４０初期プロモーター（Benoist, et al. Nature 290: 304-310 (1981)）；ならびに、特に、ヒトＣＭＶ即時初期プロモーター（Boshart, et al. Cell 41; 521-530 (1985)）を包含する。全長または最小プロモーターを使用してもよく、他の調節エレメント（例えば、図１参照）を含めてもよい。「実施例」セクションで説明するように、全長ヒトＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターが本発明にうまく使用され、特記しないかぎり、「ヒトＣＭＶ即時初期プロモーター」という場合には、当該プロモーター自体ならびに図１の示す他のいずれかまたはすべての転写調節エレメントと組み合わされた当該プロモーターをいうものとする。
【００４０】
ＴＡＴＡエレメントの少なくとも６ヌクレオチド下流から開始するｔｅｔオペレーター配列による転写を受けている配列からプロモーターを分離する。典型的には、オペレーターはＴＡＴＡエレメントの６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）下流の位置から開始するであろう。これらのエレメントの配置は、下流配列の転写または遺伝子産物の翻訳を指令するプロモーターの能力を実質的に妨害するものであってはならない。
【００４１】
典型的には、他の転写または翻訳エレメントを含有するベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）中に上記ＤＮＡ分子が含まれるであろう。所望ならば、大量のベクターＤＮＡを得ることができる（例えば、リプレッサー蛋白を生成する細菌中にベクターを導入する）。ついで、好ましくは、ｔｅｔリプレッサーを発現するように処理された哺乳動物宿主細胞中にベクターを導入する。哺乳動物細胞をｔｅｔリプレッサーを発現するように処理する１の方法は、リプレッサー遺伝子配列を別のプロモーターに連結し、これをｔｅｔオペレーター含有ベクター中に取り入れ、ついで、そのＤＮＡを細胞中に導入することである。別法として、ｔｅｔオペレーター含有構築物を導入する前に、ｔｅｔリプレッサー配列を含む発現ベクターを用いて細胞を形質転換してもよい。ｔｅｔリプレッサーを発現する細胞を得るために使用したプラスミドの一例はｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲ（「実施例」セクション参照）である。
【００４２】
本発明に使用されうる発現ベクターを細胞に導入する方法は、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームによる導入、ウイルスによる導入、または微粒子による遺伝子の導入を包含する。インビボにおいて宿主細胞への導入を行う場合、導入のための好ましい方法はウイルスベクターによるものである。当該分野でよく知られたハイブリダイゼーション法を用いて、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて特定の組み換え配列を増幅することにより、取り込んだ構築物を有する細胞を同定することができる。細胞中に導入した組み換えＤＮＡが、例えば免疫学的または酵素によるアッセイによって検出されうる蛋白を生成する場合には、テトラサイクリンを細胞に導入し、ついで、細胞周囲の培地または細胞溶解物のいずれかをアッセイすることにより、組み換え蛋白の存在を確認することができる。
【００４３】
テトラサイクリン不存在下においては、構築物で形質転換された宿主細胞は実質的な量の組み換えＤＮＡを発現するはずがない。宿主細胞中に取り込まれた組み換えＤＮＡ配列の発現は、テトラサイクリン自体またはテトラサイクリンアナログのいずれかを用いることにより誘導される。後者を、ｔｅｔリプレッサーに特異的に結合する能力を維持しているという意味で、テトラサイクリンに関連した化合物であると定義する。かかるアナログの解離定数は少なくとも１ｘ１０−６Ｍでなくてはならず、好ましくは、１ｘ１０−９Ｍよりも大きい。使用可能なアナログの例は、Hlavka, et al. ("The Tetracyclines," in Handbook of Experimental Pharmacology 78, Blackwood, et al. (eds.), New York (1985))およびMitschef ("The Chemistry of Tatracycline Antibiotics," Medicinal Res. 9, New York (1978))により議論されたものを包含するが、これらに限らない。同様に、リプレッサーまたはオペレーターの配列における小規模な修飾は、かかる修飾がリプレッサー／オペレーター相互作用のアフィニティーまたは特異性を実質的に低下させない場合には、本発明に影響しないであろう。
【００４４】
ＩＩ.インビトロおよびインビボにおける蛋白の組み換え製造方法
上記ベクターおよびＤＮＡ構築物を、インビトロまたはインビボにおける蛋白の組み換え製造方法の一部として使用することができる。インビトロにおいて蛋白を製造するには哺乳動物宿主細胞が好ましく、Ｕ２０Ｓ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞等がある。これらの種々の細胞タイプのそれぞれに適したベクターは当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrookらの上記文献参照）。
【００４５】
ＤＮＡ構築物を用い、トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物を用いてインビボにおいて組み換え蛋白を製造することもできる。いずれのタイプのトランスジェニック動物における製造であっても本発明に適合するが、ほとんどの場合マウスが用いられると考えられる。典型的には、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞をＤＮＡ構築物で形質転換し、ついで、発達中のマウス胚中に導入する。発達中の胚の生殖系の一部に組み込まれ、あるいはその一部となりうるＥＳ細胞系を用いることができ、例えば、ネズミ細胞系Ｄ３（ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., カタログ番号ＣＲ １９３４）がある。細胞を培養し、当該分野でよく知られた方法（例えば、Robertson, in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells; A Practical Approach, Robertson, ed., I.R.L. Press Washington, D. C. (1987); Bradley, et al., Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371 (1986);およびHogan, et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1986)）を用いるＤＮＡ挿入に備える。上記のごとくｔｅｔリプレッサー蛋白を発現するように幹細胞を処理することが必要であろうし、ｔｅｔオペレーターを含む同じ構築物中にリプレッサー遺伝子を導入すること、あるいはリプレッサー遺伝子含有構築物で細胞を形質転換することのいずれかにより、かかる処理を行うことができる。
【００４６】
当該分野で知られたいずれの方法を用いてもＤＮＡを細胞に取り込ませることができるが、最も典型的には、エレクトロポレーションを用いてこの導入が行われるであろう。ＤＮＡ構築物がプラスミドタイプのベクターに挿入されている場合、トランスフェクション前にＤＮＡを直鎖状にすることが好ましい。発現されるべきＤＮＡ配列の外側を切断するように選択された適当な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡベクターを消化することにより直鎖化を行うことができる。種々の方法のいずれを用いてもトランスフェクションされた幹細胞のスクリーニングを行うことができる。例えば、細胞中に導入したＤＮＡ中に存在する配列に特異的な標識プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ってもよい。別法として、選択配列に対するＰＣＲ増幅を行うこともできる。
【００４７】
胚性幹細胞が形質転換され、選択された後の次の工程は、細胞を胚に取り込ませることである。これを行うための好ましい方法は、発達における胚盤胞段階の胚に幹細胞をマイクロインジェクションすることによる。マウスにおいて、妊娠動物の子宮を潅流することにより発達の約３.５日目の胚盤胞を得てもよい。これを行うための適当な方法は当該分野においてよく知られている（Bradley, in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (1987)参照）。好ましい胚盤胞は雄性であり、幹細胞遺伝子によりコードされるのとは異なる表現型マーカー（例えば、毛の色）の遺伝子を有するものである。このようにして、簡単に子孫をスクリーニングできる。
【００４８】
トランスジェニック動物を製造するプロセスの次の工程は、キメラ胚を偽妊娠動物の子宮中に移植することを包含する。典型的には、メスを同じ種の精管切除したオスと交配させることにより、かかる動物を得る。メスの偽妊娠段階は移植の成功にとり重要であり、種により異なるであろう。マウスについては、典型的には、偽妊娠２〜３日目のメスを用いるべきである。
【００４９】
キメラ胚を偽妊娠マウス中に移植した後、それらを最後まで発達させ、ついで、子孫をスクリーニングする。表現型選択法を用いる場合、モザイク状の毛の色または容易に明らかな他の表現型マーカーについて動物を簡単に検査することにより最初のスクリーニングを行ってもよい。さらに、あるいは別法として、子孫の組織、例えば、マウスの尾の組織から染色体ＤＮＡを得て、サザンブロットおよび／またはＰＣＲ増幅を用いて組み換えＤＮＡの存在につきスクリーニングしてもよい。ついで、ヘテロ接合のものを種間交配させることによりホモ接合トランスジェニックマウスを得て、ついで、これを用いて組み換えＤＮＡを発現しうる動物を連続的に供給してもよい。組み換え体の合成が必要となるまで、動物をテトラサイクリン不存在下に維持することにより発現を制御することができる。これらの条件下において、ｔｅｔリプレッサー蛋白がオペレーター配列に結合し、そのことにより組み換えプロモーターの活性が阻害されるであろう。テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログを動物に投与すると、容易に細胞膜を通過し、その後、ｔｅｔリプレッサー蛋白をオペレーター配列から解離させるであろう。かくして、組み換えプロモーターの下流の組み換え遺伝子が転写され始めるであろう。
【００５０】
このようにして作成された動物を、研究目的、例えば、種々の薬剤の効果を研究するために使用してもよく、あるいはまた、組み換え蛋白を製造する目的で使用してもよい。後者の場合、細胞で発現された組み換え遺伝子を、動物の血中に蛋白を分泌させるシグナル配列に連結することが好ましい。ついで、これを集めて、組み換え蛋白精製用の源として役立ててもよい。
【００５１】
ＩＩＩ.組み換え的に処理されたウイルス
Ａ.組み換えウイルス、ワクチンの製造および抗ウイルス治療
上記ｔｅｔオペレーター／リプレッサー調節系を用いて、子孫の生成が厳密に調節されているウイルスを製造することもできる。プロモーター（好ましくは、ヒトＣＭＶ即時初期プロモーター）、ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチド下流のｔｅｔオペレーター配列およびオペレーターの３’側にありプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む構築物をウイルスゲノムに導入することにより、これを行うことができる。この遺伝子は、発現され、ウイルス複製の必要な蛋白をコードするＲＮＡに結合するアンチセンス配列の形態となることができる場合にウイルス複製を阻害するものである。あるいはまた、その遺伝子は、複製を阻害する蛋白をコードするものであってもよい。後者の場合、ｔｅｔオペレーター配列は、遺伝子の翻訳開始コドンの前に置かれるであろう。ウイルス複製を阻害する蛋白の例は、ＨＳＶ−１のＵＬ９蛋白のトランスドミナントネガティブ形態であり、それはＨＳＶ−１複製開始点に結合し、過剰発現された場合、新たなウイルス形成をブロックする。類似蛋白が他のウイルスにも同様に存在することがわかっている。
【００５２】
ｔｅｔリプレッサー蛋白を構成的に生成する細胞において上記ウイルスを得ることができる。これらの環境下において、リプレッサーはｔｅｔオペレーター配列に結合し、下流遺伝子の発現を阻害するであろう。よって、ウイルス阻害性ＤＮＡ配列をウイルスゲノムに取り込ませることができ、大量のウイルスを得ることができる。例えば、リプレッサーはＵＬ９蛋白の変異形態の合成をブロックする可能性があり、そのことによりＨＳＶ−１が生成される。所望ならば、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログを細胞に導入してもよい。テトラサイクリンはリプレッサー蛋白に結合し、そのことによりそれをオペレーター配列から解離させるであろう。ついで、組み換えプロモーターからの核酸の転写が進行し、ウイルス複製が阻害されるであろう。
【００５３】
上記の系をインビトロおよびインビボの両方において使用できることに注意すべきである。例えば、ｔｅｔリプレッサー蛋白を生成する培養細胞に感染させることにより大量のウイルスを増殖させることができる。ついで、ウイルスを集め、精製し、対象に投与することができる。投与された場合、ウイルスはそのＤＮＡを対象中の細胞にデリバリーするが、ｔｅｔリプレッサー蛋白が存在しないので、ウイルスゲノム中の組み換えＤＮＡの転写が進行し、ウイルス複製が阻害される。これらの特徴はそれ自体、処理されたウイルスを免疫方法およびウイルス性疾患の治療に特に使用されるようにする。
【００５４】
Ｂ.免疫方法における、処理されたウイルスの用途
実際には疾病を引き起こさずに免疫学的応答を刺激するように修飾された特定病原体に対象を曝露することにより大部分の免疫方法が行われている。例えば、死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルスのいずれかを含有するワクチンを個体に与えてポリオに対して個体を免疫してもよい。ｔｅｔオペレーター／リプレッサー系を用いて処理されたウイルスを、ｔｅｔリプレッサーを生成する培養細胞中で大量に増殖させ、ついで、ワクチンの一部として患者に投与することができる。このようにして治療された患者は、ウイルス上に通常的に存在する蛋白に曝露されることになり、それゆえ、免疫学的応答を生じるであろう。しかしながら、通常、哺乳動物細胞はｔｅｔリプレッサーを生成しないので、ウイルスは複製できず、疾病に対する十分な曝露が妨げられるであろう。
【００５５】
ウイルスが生成されないことをさらに確認するために、さらなる変異を組み換えウイルスに導入することができる。例えば、欠失変異を必須ウイルス遺伝子中に導入してもよい。後者のウイルスを作成し、ｔｅｔＲおよび野生型の必須ウイルス遺伝子の両方を発現する細胞中で増殖させることができる。
【００５６】
単離された実質的にすべての感染性ウイルスに関して、免疫のためのこのアプローチを用いることができ、ヒトの免疫ならびに動物の免疫に適用することができる。
【００５７】
Ｃ.ウイルス性疾患の治療における、処理されたウイルスの用途
本発明のｔｅｔオペレーター／リプレッサー系を用いて処理されたウイルスを、ウイルス感染の治療に直接使用することができる。例えば、上記方法でＨＳＶ−１ウイルスを処理して、強力な哺乳動物プロモーター、ｔｅｔオペレーター配列およびＵＬ９のトランスドミナントネガティブ形態をコードする遺伝子を含有する構築物をそのゲノム中に含ませることができる。処理されたＨＳＶ−１を、ｔｅｔリプレッサーを発現する細胞において大量に発現させることができ、ついで、ＨＳＶ−１感染にかかっている患者に投与することができる。処理されたウイルスは患者の細胞に入り、トランスドミナントネガティブ変異ＵＬ９蛋白を発現するであろう。このことは、処理されたＨＳＶ−１のみならず元々患者に感染していたＨＳＶ−１の複製を阻害することに役立つ。要するに、処理されたウイルスは、インビボにおいて抗ウイルス剤をデリバリーするためのビヒクルとして役立つ。処理されたウイルスは感染ウイルスと同じ細胞特異性を有しているので、理想的に治療に適している。
【００５８】
処理されたウイルスがワクチンまたは治療薬として役立つ動物およびヒトのウイルスとしては、アルボウイルス、鳥類白血症ウイルス、ＣＥＬＯウイルス、Chagresウイルス、鼻炎ウイルス、コクサッキーウイルス、出血性ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、感染性ブタ脳脊髄炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、センダイウイルス、および狂犬病ウイルスが挙げられるが、これらに限らない。
【００５９】
Ｄ.核酸治療薬デリバリー用ベクターとしての処理されたウイルス
少し修飾すれば、上記の処理されたウイルスを、いずれかのタイプの核酸治療薬を細胞にデリバリーするために使用することができる。これらの作用剤は、相補的配列に結合してそれらの蛋白としての発現を阻害するアンチセンス核酸の形態であってもよく、あるいは治療作用を有する蛋白をコードする遺伝子の形態であってもよい。
【００６０】
治療薬として使用される核酸は、治療を要する細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されなくてはならない。これは、ウイルス複製を制御する組み換え遺伝子を調節するのと同じプロモーターであってもよく、ウイルスゲノム中の別の異なるプロモーターであってもよい。患者の治療における基本的手順は、本質的には、ウイルス感染治療用に処理されたウイルスに関して上で説明したものと同じである。特別には、核酸治療薬を含むように処理されたウイルスは、ｔｅｔリプレッサー蛋白を生成する細胞において増殖するであろう。このようにして作成されたウイルスを集め、精製し、ついで、治療を要する対象に投与する。ついで、処理されたウイルスは対象の細胞に感染し、内部に入ったならば、ウイルス複製を阻害する核酸および治療薬として役立つ核酸の両方を発現し始めるであろう。この系は遺伝子治療に理想的に適しているが、それをインビトロにおいて細胞に核酸をデリバリーする機構として、あるいはインビボにおいて細胞を処理する試みのための手段としても使用できる。例えば、欠損カウンターパートを置換するための、あるいは異常な遺伝子発現を防止するための相同組み換え用に設計されたＤＮＡ構築物を、このようにしてデリバリーしてもよい。
【００６１】
上記のように、さらなる変異を必須ウイルス遺伝子に導入して、ウイルスが複製しないことを確実ならしめてもよい。
【実施例１】
【００６２】
実施例１：ｔｅｔリプレッサーを用いる、ヒトＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターの調節スイッチへの変換
Ａ.材料および方法
リポーターおよびｔｅｔ発現プラスミド：プラスミドｐＷＲＧ１６３０はヒトＥＧＦ発現プラスミドであり、その中で成熟ｈＥＧＦをコードする配列がｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターにより制御されている。ｐＷＲＧ１６３０中には２個のＳａｃＩ部位があり、これらのＳａｃＩ部位の１つはｈＣＭＶ主要即時初期プロモーターのＴＡＴＡエレメントの３塩基下流に存在する。ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦを構築するために、オリゴヌクレオチド：
CTCCCTATCA GTGATAGAGA TCTCCCTATC AGTGATAGAG ATCGTCGACG AGCT
およびその相補的配列をアニールさせ、すでに記載されているように（Yao, et al., J. Virol. 68: 8158-8168 (1994)）１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。テトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を太字で示し（Heuer, et al., J. Mol. Biol. 202: 407-415 (1988)）、クローニング分析に用いるＳａｌＩ制限酵素部位に下線を付してある。ついで、ＳａｃＩでｐＷＲＧ１６３０を部分消化することにより、精製２本鎖ｔｅｔオペレーター含有フラグメントを、プラスミドｐＷＲＧ１６３０中のｈＣＭＶ即時初期プロモーターのＳａｃＩ部位に挿入した。ｐＷＲＧ１６３０へのｔｅｔＯ配列の挿入により、ユニークなＳａｌＩ部位ができ、ｈＣＭＶ即時初期プロモーターへのｔｅｔＯの挿入により、７０１塩基対のＥｃｏ ＲＩ−Ｂａｍ ＨＩ ｈＣＭＶプロモーター含有フラグメントができた。図１は、研究に用いたプラスミドｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦ中のｔｅｔＯ含有ｈＣＭＶ即時初期プロモーターをスキーム的に示す。
【００６３】
ｐＣＭＶＧＬ２およびｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２はｐＧＬ２基本ベクター（Promega, Madison, WI）から誘導されたプラスミドであり、その中においてホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡが野生型ｈＣＭＶプロモーターまたはｔｅｔＯ担持ｈＣＭＶプロモーターの制御下に置かれている。これら２つのプラスミドを得るために、ｐＷＧＲ１６３０由来のＥｃｏ ＲＩ−Ｂａｍ ＨＩ ｈＣＭＶプロモーター含有フラグメントまたはｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦ由来のｈＣＭＶ−ｔｅｔＯプロモーター含有フラグメントをｐＧＬ基本ベクターのＳｍａＩおよびＢｇｌＩ部位に挿入した。
【００６４】
先ずｐＳＧ５ｔｅｔＲのＢｇｌＩ−ＳａｌＩ−ｔｅｔＲ含有フラグメントをｐＧＥＭ３ＺのＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位に挿入してｐＧＥＭ３Ｚ−ｔｅｔＲを得ることにより、テトラサイクリンリプレッサー発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲを構築した。ついで、ｐＧＥＭ３Ｚ−ｔｅｔＲのＳａｌＩおよびＫｐｎＩ−ｔｅｔＲフラグメントをｐｃＤＮＡ３ベクターのＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ部位に挿入した。
【００６５】
細胞培養およびトランスフェクション
１０％ウシ胎児血清を補足したDulbeccoの修飾Eagle培地（ＤＭＥＭ）中でアフリカミドリザル（African green monkey）腎臓（Vero）細胞を増殖させ、維持した。60mmのディッシュ１枚あたり２ないし３ｘ１０５個の細胞をまいた。細胞をまいてから２０ないし２４時間後に、２μｇのｐＵＣ１９ベクターＤＮＡまたは２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在下において、リポフェクチンにより媒介されるトランスフェクションにより、０.５μｇのｐＷＲＧ１６３０または０.５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦのいずれかで細胞をトランスフェクションした。血清および抗生物質不含ＤＭＥＭ中で１６〜２０時間トランスフェクションを行った後、トランスフェクション培地を除去し、５ｍｌの通常の増殖培地（テトラサイクリン含有または不含）を添加した。製造者（GIBCO BRL. Life Technologies）の手順に従って、２.５μｇのプラスミドＤＮＡにつき１０μｌのリポフェクチンとして、リポフェクチン−ＤＮＡ複合体の調製を行った。
【００６６】
ルシフェラーゼアッセイには、２μｇのｐＵＣ１９ベクターまたは２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在下で０.５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２用いること以外は上と同様の方法で、Vero細胞をまいて、トランスフェクションした。トランスフェクションから２０時間後、リポフェクチン−プラスミドＤＮＡ含有培地を除去し、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有通常増殖培地を細胞に供給した。トランスフェクションから７０〜７２時間後に細胞を集め、製造者（Promega）により記載されたプロトコールに従って細胞抽出物を調製した。
【００６７】
微粒子により媒介される遺伝子導入
インビボ遺伝子導入に使用したブタは家畜用のメスのヨークシャー種で、生後３〜４カ月、体重４０〜４５ｋｇのもであった。酸素／亜酸化窒素の３：５混合物中ハロタン（１〜１.５％）麻酔を用いて中間層創傷（１５Ｘ１５Ｘ１.２ｍｍ）をブタの背中の皮膚に作成した。
【００６８】
Accell（Agracetus/Geniva, Inc.）微粒子媒介遺伝子導入のための被覆ＤＮＡ−金ビーズを用いるカートリッジの作成ならびにAccellヘリウム遺伝子銃の使用は、Geniva, Inc. （8520 University Green, Middleton, WI 53562）により提供されたプロトコールに従うものであった。０.２μｇのｈＥＧＦ発現プラスミドおよび０.８μｇのｐｃＤＮＡ３または０.２μｇのｈＥＧＦ発現プラスミドおよび０.８μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲを各中間層創傷に与えた。使用ドライブ圧は８００ポンド／インチ（ｐｓｉ）であった。ＤＮＡ導入後、トランスフェクションされた創傷を、密封ビニールチャンバー（１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する等張セイライン１.２ｍｌ入り）で封じた。遺伝子導入２２時間後、チャンバーから創傷の液体を抜き取り、トランスフェクション部位を新たなチャンバーで封じた。遺伝子導入から４６時間後に創傷の液体を収集し、新たなチャンバーを適用した後、５００ｍｇのテトラサイクリンをブタに静脈注射した。テトラサイクリン投与２４時間後、創傷の液体を集め、−７０℃で保存した。創傷の液体中のＥＧＦレベルを、抗ＨＥＧＦ特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡにより調べた。
【００６９】
ＥＬＩＳＡ
細胞外培地および創傷の液体におけるｈＥＧＦの発現を、抗ｈＥＧＦ特異的モノクローナル抗体（ＭＡＢ２３６，R&D systems）（ウェル１個あたり７５ｎｇ）を１次コーティング抗体とし、抗ｈＥＧＦ特異的ポリクローナル抗体（ｓｃ２７５，Santa Cruz）（ウェル１個あたり１００ｎｇ）を２次抗体として使用して、マイクロタイタープレート（９６ウェル）で調べた。ＨＲＰ−抱合ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−２００４，Santa Cruz）（ウェル１個あたり３.３３ｎｇ）を３次抗体として使用した。ＴＭＢperoxidaseＥＩＡsubstrate kit（BIO-RAD）を用いてペルオキシダーゼアッセイを行い、Bmax Kinetic Microplate Reader （Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA）で分析した。試料中のｈＥＧＦ濃度をウェル１個あたり２００μｌの体積中、倍々希釈して２ｐｇから２００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲とした組み換えｈＥＧＦ（234-EG, R&D systems）を用いてSOFTmax ４−パラメーター標準曲線に適合させた。
【００７０】
Ｂ.結果
テトラサイクリンリプレッサーによるｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビトロでの調節
ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターは哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現を指令するための最も強力なｃｉｓ−調節ユニットの１つである。ＴＡＴＡエレメントのほかに、種々の上流シス−作用性エレメントが同定されており（図１）、細胞またはウイルスのトランスアクチベーターと相互作用することにより、これらのエレメントはＴＡＴＡエレメントにより指令される高効率転写を確実なものとする。転写開始には、協同的にＴＡＴＡエレメントと相互作用して転写開始前複合体を形成する基礎転写因子が必要である。ＴＡＴＡ結合蛋白（ＴＢＰ）は、ＤＮＡと特異的に相互作用する最初かつ唯一の転写因子であり、ＴＡＴＡエレメントへのＴＢＰの結合はプロモーター転写のシグナルを発する。今回の実験は、テトラサイクリンリプレッサーが、プラスミドｐＷＲＧ１６３０中のｈＣＭＶ ＴＡＴＡエレメントの約１０塩基対下流にある２個のｔｅｔオペレーターと相互作用することにより、ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターを調節スイッチに変化させるかどうかを試験するために設計された。ｔｅｔリプレッサーとＴＡＴＡ結合蛋白とがＤＮＡヘリックスの同じ側に結合するようにｔｅｔオペレーター配列を配置した。それらが非常に近い位置にあるので、ｔｅｔオペレーターへのｔｅｔリプレッサーの結合は、ＴＡＴＡエレメントへのＴＢＰの結合をブロックするか、あるいは開始前複合体のアッセンブリーを直接妨害すると仮定された。
【００７１】
１ｍｌにつき１μｇのテトラサイクリン不含または含有培地中、１μｇ、２μｇ、および３μｇのｔｅｔリプレッサー発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの不存在下または存在下において０.５μｇのｐＷＲＧ１６３０またはｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦでVero細胞をトランスフェクションした。２４時間ごとにトランスフェクション細胞から細胞外培地を集め、ついで、１μｇのテトラサイクリン含有または不含の新鮮増殖培地を添加した。集めた細胞外培地中の
ｈＥＧＦ濃度をＥＬＩＳＡにより調べた。
【００７２】
図２に示す結果は、ｐＷＲＧ１６３０からのヒトＥＧＦの発現はｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在によっては影響されず、ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーター近傍へのｔｅｔ−オペレーター含有配列の挿入はｔｅｔＲ不存在下でのヒトＥＧＦ発現に影響しないことを示す。ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦからのＥＧＦの発現は、ｔｅｔＲ存在下において、量および時間に依存して有意に減少した。３μｇのｔｅｔＲリプレッサー発現プラスミド、すなわちｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在下、テトラサイクリン不存在下において、ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦからのＥＧＦはトランスフェクションから２０時間後には約２００倍抑制され、トランスフェクションから２０〜２４時間後には１０００倍抑制され、トランスフェクションから４４〜６８時間後には３５００倍抑制された。テトラサイクリン存在下においては抑制はほとんど観察されないかまたは観察されなかった。２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在下において、トランスフェクションから０〜２０時間後、２０〜４４時間後、および４４〜４８時間後において、約１００倍、６００倍、および２０００倍の発現阻害が検出された。１μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲ存在下において、上記３時点において約６０倍、１００倍、および２００倍のヒトＥＧＦ合成低下が観察された。疑似トランスフェクションされたVero細胞においてはヒトＥＧＦは発現されなかった。
【００７３】
ｔｅｔＲにより媒介される抑制がテトラサイクリンにより効果的に逆転しうるかどうかを試験するために、０〜２０時間目はテトラサイクリン不存在下で（図３Ａ）、２０〜４４時間目はテトラサイクリン存在下または不存在下で（図３Ｂ）、ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦのみ、またはｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦおよびｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲのいずれかでVero細胞をトランスフェクションした。結果は、トランスフェクションから０〜２０時間後に観察された抑制は、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンにより効果的に逆転させることができるが、試験条件下においては０.１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンではｔｅｔＲにより媒介される抑制を逆転させるには不十分であることを示す。図２に示す実験と矛盾せずに、データは、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲ存在下において、ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦの基底プロモーター活性が、トランスフェクションから０〜２０時間において１００〜２００倍低下し、トランスフェクションから２０〜４４時間において約５００倍低下したことを示す。
【００７４】
分泌性ペプチドであるヒトＥＧＦに関してｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターのｔｅｔＲにより媒介される調節についての反応動力学が示されたので、非分泌性蛋白であるホタルルシフェラーゼの発現を調節するこの系の能力を試験した。図４は、Vero細胞が１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン存在下または不存在下において、０.５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２のみでトランスフェクションされた、あるいは０.５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２および２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲで同時トランスフェクションされた２つの独立した実験の結果を示す。ｔｅｔＲ発現プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在下においてｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２からのルシフェラーゼ発現レベルは少なくとも１００倍低下し、この抑制はテトラサイクリンにより効果的に解放されうることが見いだされた。野生型ｈＣＭＶ即時初期エンハンサー−プロモーターからのルシフェラーゼ発現レベルはｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在によっては影響されない。
【００７５】
ＨｅＬａ細胞について同様の実験を行った場合、トランスフェクション後６８〜７２時間目に４０〜５０倍の抑制が検出された。このことは、ｔｅｔＲ−ＶＰ１６による活性化系と同様に、ｔｅｔＲによる抑制の効率が細胞タイプに依存することを示す。
【００７６】
テトラサイクリンリプレッサーによるｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビボでの調節
上記データは、（１）ｔｅｔリプレッサーは、培養哺乳動物細胞において強力な配列特異的トランスリプレッサーとして作用する能力があること；および（２）ＴＡＴＡエレメントの約１０塩基対下流への２つのタンデムなオペレーターの挿入により、プロモーターが効果的なテトラサイクリン依存性転写スイッチに変化させられることを示す。このｔｅｔＲオペレーター調節ユニットがインビボにおいて機能するかどうかを試験するために、中間層創傷をブタの背中の皮膚に作成し、９カ所の創傷に０.２μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦおよび０.８μｇのｐｃＤＮＡ３ベクターＤＮＡを与え（創傷１個あたり）、さらに９カ所の創傷に０.２μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦおよび０.８μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲを与えた（創傷１個あたり）。図５に示すように、ｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷におけるヒトＥＧＦ発現は、テトラサイクリン不存在下においてｐｃＤＮＡ３ベクターとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷における発現よりも有意に低かった。遺伝子導入１日後に１３倍の抑制が検出された。
【００７７】
明らかに、遺伝子導入から１日目から２日目にかけてｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦでトランスフェクションされた創傷におけるヒトＥＧＦ発現は約３倍上昇したが、ｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷におけるヒトＥＧＦ収量は１.５倍低下した。要約すると、ｔｅｔＲ存在下において、ヒトＥＧＦ発現レベルは、テトラサイクリン不存在下における遺伝子導入から２日目に約５５倍抑制された。遺伝子導入後２ないし３日目にテトラサイクリンを静脈注射により投与すると、ｔｅｔＲにより媒介される抑制が解放されることは重要であり、そのことは、ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦおよびｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲの両方を与えられた創傷におけるヒトＥＧＦ発現が４倍増加したことにより明らかである。ｐｃＭＶｔｅｔＯＥＧＦのみによりトランスフェクションされた創傷においては、遺伝子導入から２ないし３日後に４倍のＥＧＦ発現抑制がみられた。この観察結果は、遺伝子治療における導入遺伝子の発現制御におけるこの調節スイッチの利用可能性を証明するものである。
【００７８】
Ｃ.議論
標的細胞における導入遺伝子発現の調節は遺伝子治療の最も重要かつ困難な様相である。ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターを哺乳動物細胞プロモーターのプロトタイプとして使用した場合、ＴＡＴＡエレメントから１０塩基対のところにテトラサイクリンオペレーターを配置することにより、テトラサイクリンリプレッサーが哺乳動物細胞における遺伝子発現の強力なリプレッサーとして機能しうることが示された。
【００７９】
最近になって、ヒトＫＯＸ１ジンクフィンガー蛋白のＫＲＡＢリプレッサードメインをｔｅｔリプレッサーと融合させ、転写開始部位から６８５塩基対上流に７個のｔｅｔオペレーターをコードするＤＮＡ配列を挿入することにより、ｔｅｔＲ単独でなくｔｅｔ−ＫＲＡＢキメラ蛋白がｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターを１０〜１５倍抑制しうることが、ＨｅＬａ細胞においてルシフェラーゼをリポーターとして用いる一時的発現アッセイにおいて示された（Deuschle, et al., Mol. Cell. Biol. 15: 1907-1914 (1995)）。ｔｅｔオペレーターがＴＡＴＡエレメントの１０塩基対（ヘリックスターン全体に相当）下流に配置される、別の方法を用いて、ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターがｔｅｔＲのみにより厳密に調節されうることが示された。HeuerおよびHillenの研究（J. Mol. Biol. 202: 407-415 (1988)）に基づいて、この特別な設計は、ｔｅｔリプレッサーをＤＮＡヘリックスのＴＢＰ結合側と同じ側に配置するものであり、ｔｅｔオペレーターへのｔｅｔＲの結合は直接ＴＢＰを立体的にブロックすると仮定された。ｈＥＧＦを分泌可能プロモーターとして用いて、ｔｅｔＲにより媒介される抑制が利用された。トランスフェクションから３日後に４０００倍近い抑制が観察された。ブタ創傷モデルを微粒子による遺伝子導入と結び付けて考えると、この研究は、遺伝子治療のための導入遺伝子発現の微調整において、このｔｅｔＲにより媒介される調節スイッチがインビボにおいて直接確認されたことになる。
【００８０】
他のｔｅｔリプレッサー／オペレーター調節系、例えば、ｔｅｔＲ−ＶＰ１６に基づく活性化およびｔｅｔＲ−ＫＲＡＢリプレッサー系とは異なり、本明細書開示の調節スイッチは、効果を発揮するためにテトラサイクリンリプレッサー／哺乳動物細胞トランスアクチベーターまたはリプレッサー融合蛋白の使用を必要としない。よって、細胞性転写因子により引き起こされる細胞遺伝子発現に対する潜在的な多面的効果は最小であり、高レベルのレギュレーター（すなわち、テトラサイクリンリプレッサー）の発現が起こりうる。明らかに、ｔｅｔＲにより媒介される調節スイッチの有効性は、インビボと比較するとインビトロにおいて有意に変化することがわかった。この明らかな相違は、おそらく、１）遺伝子導入手段の相違により同時トランスフェクション効率が異なる可能性があること；および２）細胞タイプの相違、によって説明できよう。
【００８１】
実施例２：ウイルス複製スイッチ
上記のｔｅｔＲにより調節される転写スイッチが新規ウイルス複製スイッチに変換されて、可逆的な様式でドゥノボウイルス生成を調節し、トランス破壊的組み換えウイルスを生成しうるかどうかを試験するために、Ｉ型単純ヘルペスウイルスをプロトタイプとして使用して以下の実験を行った。
【００８２】
Ａ.トランスドミナントネガティブＨＳＶ−１ ＵＬ９変異ポリペプチドを発現するプラスミドの構築
ＵＬ９蛋白は、ウイルス複製に直接関与している７種のＨＳＶ−１必須遺伝子産物の１つである。ＵＬ９はＨＳＶ−１のＤＮＡ複製開始点に特異的に結合する。それは長さ８５１アミノ酸の核ホスホ蛋白である。研究により、ＵＬ９のＣ末端アミノ酸５３５〜８５１が蛋白ＤＮＡ結合ドメインを有しており、過剰発現された場合には、ドミナントネガティブ様式でウイルスＤＮＡ複製をブロックしうることが示されている。
【００８３】
ＪＬ９のＣ末端の３１７個のアミノ酸をクローンし、それをｔｅｔオペレーター含有ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターの制御下に置くために、プラスミドｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦ中のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ ＥＧＦ含有フラグメントをプラスミドｐＳＰ６ＵＬ９由来のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ ＵＬ９含有フラグメントに置き換えた。得られたプラスミドをｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１と命名し、それはＵＬ９のＣ末端アミノ酸５７１〜８５１を発現する。
【００８４】
プラスミドｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−ｎ１０／Ｃ５３５（ＵＬ９のアミノ酸１から１０までおよびＵＬ９のアミノ酸５３５から８５１までを含むＵＬ９蛋白フラグメントを発現するプラスミド）を構築するために、アミノ酸Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙが後に続くＵＬ９蛋白の最初の１０個のアミノ酸をコードする２本鎖オリゴをｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１のＢａｍＨＩ部位に挿入した。
【００８５】
ＵＬ９のＣ末端アミノ酸５３５から８５１までを発現するプラスミドｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５３５Ｃを、ＢａｂＨＩ−ＫｐｎＩで消化したｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−ｎ１０／Ｃ５３５の再連結により構築した。
【００８６】
Ｂ.ＨＳＶ−１複製の一時的阻害分析
ｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１およびｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−ｎ１０／Ｃ５３５によりコードされる変異ＵＬ９ポリペプチドが、ＨＳＶ−１複製を阻害するトランスドミナントネガティブ変異ポリペプチドとして機能しうるかどうかを試験するために、最も重要には、阻害効果がｔｅｔリプレッサーにより調節されうるかどうかを試験するために、Vero細胞を６０ｍｍディッシュ１枚あたり５ｘ１０５個まいた。まいてから２０〜２４時間後に、１.５μｇのｐｃＤＮＡ３ベクターＤＮＡまたはｔｅｔリプレッサー発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｔｅｔＲの存在下において、リポフェクチン法により、０.１μｇの精製感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡのみで、または０.１μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１またはｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−ｎ１０／Ｃ５３５とともに同時トランスフェクションした。トランスフェクションから１４時間後にリポフェクチン−ＤＮＡ含有トランスフェクション培地を除去し、ついで、ディッシュ１枚あたり１０ｍｌのメチルセルロースをトランスフェクション細胞に添加した。トランスフェクションから６８〜７２時間後に、トランスフェクションしたディシュをニュートラルレッドで染色することによりウイルスプラークを可視化し、１４時間後に計数した。図１に示すように、感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡとｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１との同時トランスフェクションにより、ウイルスプラーク形成効率は約３０倍低下する。ｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−ｎ１０／Ｃ５３５Ｃとの同時トランスフェクションを行った場合、感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡのプラーク形成効率は少なくとも１００倍低下した。重要なことに、Ｃ５７１およびｎ１０／Ｃ５３５Ｃの両方により媒介されるＨＳＶ−１ ＤＮＡ複製の抑制は、ｔｅｔリプレッサーにより効果的に沈静化しうる。ｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５３５Ｃを用いて同様の実験を行ったところ、ＨＳＶ−１ ＤＮＡのプラーク形成効率は少なくとも２００倍低下し、さらに、このＣ５３５Ｃにより媒介される抑制はｔｅｔＲにより効果的に逆転されうる。
【００８７】
トランス−ドミナントネガティブＣ末端ＵＬ９ポリペプチドのＨＳＶ−１複製に対する阻害効果はｔｅｔリプレッサーにより効果的に沈静化されうることが示されたので、このｔｅｔＲに関連したウイルス複製スイッチの特異性をさらに調べた。Vero細胞を、１）０.２μｇの感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡおよび２.１μｇのｐｃＤＮＡ３；２）０.２μｇの感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡ、０.１μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−５７１および２μｇの感染性ｐｃＤＮＡ３；ならびに３）０.２μｇの感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡ、０.１μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１および２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲでトランスフェクションした。１ｍｌあたり１μｇのテトラサイクリンの不存在下または存在下のいずれかでトランスフェクションを行った。トランスフェクションから１６時間後、トランスフェクション培地を除去し、１ｍｌあたり５μｇのテトラサイクリン不含または含有新鮮培地５ｍｌを各ディッシュに添加した。トランスフェクションから４８時間後、細胞を集め、ウイルス収量を測定した。図２に示すデータは、１）Ｃ５７１により媒介されるＨＳＶ−１複製の発現はｔｅｔリプレッサーにより逆転されうること；および２）ＨＳＶ−１プラーク形成ユニットに対するｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−５７１の効果がテトラサイクリン存在下において有意に減少したことにより明らかなように、このｔｅｔＲにより調節されるＨＳＶ−１複製の逆転はテトラサイクリン特異的であること、を示す。
【００８８】
要するに、これらの観察結果は、トランスドミナントネガティブ変異ウイルスポリペプチドをｔｅｔＲにより調節される強力な哺乳動物転写スイッチと組み合わせることにより、新規ウイルス複製スイッチが形成されうることを示すものである。理論上は、ウイルスの複製的感染を阻害しうるポリペプチドまたはアンチセンスＲＮＡを、この新規ウイルス複製スイッチに導入することができる。このスイッチを用いると、トランス−阻害性ウイルスベクターは、インビボでの遺伝子導入用ビヒクルとして役立ちうるだけでなく、内在性および／または潜伏性のウイルス複製をも阻害しうる。また本発明を用いて、有効な宿主免疫応答を誘導しうるだけでなく、同じ細胞内で内在性ウイルス感染の除去を促進する治療薬としても機能しうるウイルスワクチンを得ることもできる。
をコードする遺伝子を含んでいてもよい。ウイルスを加工してそのゲノム中に下記のｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を含むようにする。それらは、ｉ）ＴＡＴＡエレメントを有する組み換え哺乳動物プロモーター、ｉｉ）ＴＡＴＡエレメントの３’側から少なくとも６ヌクレオチドのところ、かつ翻訳開始コドンの５’側に存在する少なくとも１つのｔｅｔオペレーター、およびｉｉｉ）オペレーターの３’側に存在し、プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子である。この遺伝子が発現される場合、ウイルス複製が阻害される。典型的には、ｔｅｔオペレーター配列はＴＡＴＡエレメントの最後のヌクレオチドの３’側から６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）のところに存在する。好ましいプロモーターはヒトＣＭＶの即時初期プロモーターである。さらに、ウイルスはそのゲノム中に、第２のプロモーターに作動可能に連結された、治療剤をコードする核酸を含んでいなければならない。この第２のプロモーターには、ＴＡＴＡエレメントから６ないし１００ヌクレオチド（好ましくは、６ないし２４ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のｔｅｔオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のウイルス複製スイッチを用いて各種の遺伝子導入用ビヒクルを作成することができるので、本発明は、医薬、詳細には遺伝子治療用医薬の分野に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターのダイヤグラムおよびｔｅｔＲ−応答性転写スイッチの作成方法を示す。パネルＡは、ｔｅｔオペレーターを有するｈＣＭＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターの作成に使用する２つのタンデムなｔｅｔオペレーターを示す。パネルＢは、細胞性転写因子と相互作用することが知られている、周辺のＴＡＴＡエレメントおよびシス作用性配列を示す。ｔｅｔオペレーターの挿入に使用するＳａｃＩ制限部位に下線を付した。
【図２】図２は、ＴＡＴＡエレメントのすぐ下流へのオペレーター配列の挿入により、ｈＣＭＶ主要即時初期エングァンサー−プロモーターをｔｅｔＲ−感受性転写スイッチに変化させることを示す。６０ｍｍのディシュ１枚あたり３ｘ１０５個のＶｅｒｏ細胞を撒き、撒種から２４時間後に、（１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン存在下または不存在下のいずれかにおいて）０.５μｇのｐＷＲＧ１６３０またはｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦ単独で、あるいは１μｇ、２μｇおよび３μｇのｔｅｔリプレッサー発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｔｅｔＲの存在下で細胞をトランスフェクションした。ｐＵＣ１９ベクタープラスミドを用いてｐＣＤＮＡ３−ｔｅｔＲとバランスさせ、３.５μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションアッセイに使用した。２０〜２４時間ごとに細胞外培地を取り、新鮮増殖培地（１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有または不含）を添加した。０〜２０時間（パネルＡ）、２０〜４４時間（パネルＢ）、および４４〜６８時間（パネルＣ）において集めた細胞外培地中のｈＥＧＦを、抗−ｈＥＧＦ特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。
【図３】図３は、テトラサイクリンによる、ｔｅｔＲにより媒介される抑制の解放を示す。テトラサイクリン不存在下において、ｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦ（０.５μｇ）、またはｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦ（０.５μｇ）およびｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲ（２μｇ）でＶｅｒｏ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから２０時間後、細胞外培地を集め、新鮮増殖培地をトランスフェクション細胞に添加して、０.１μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下または不存在下において、さらに２４時間培養した。０〜２０時間（パネルＡ）、２０〜４４時間（パネルＢ）、および４４〜６８時間（パネルＣ）において集めた細胞外培地におけるｈＥＧＦ発現をＥＬＩＳＡにより調べた。各同時トランスフェクションアッセイにつき２つの独立した実験が示される。
【図４】図４は、ルシフェラーゼを受容体として用いる、ｔｅｔＲにより媒介される導入遺伝子の積算調節効率の測定を示す。テトラサイクリン不存在下または存在下、０〜２０時間において０.５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２のみ、または０.５μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＧＬ２および２μｇのｐＣＤＮ３−ｔｅｔＲを用いて、さらに２０〜７０時間において１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの不存在下または存在下、６０ｍｍのディッシュ中のＶｅｒｏ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション７０時間後に、室温において、０.２ｍＭのＰＭＳＦ、１００μｇ／ｍｌのＴＰＣＫおよび１ｍＭのロイペプチンが存在する０.５ｍｌの１ｘルシフェラーゼ溶解バッファー中でＶｅｒｏ細胞を１５分間溶解させた。４℃において微量遠心分離を２０分行うことにより不溶性細胞残渣を除去し、ついで、ルシフェラーゼ活性を、１０μｇの蛋白あたりのｍＶ数として測定した。
【図５】図５は、ｅｔリプレッサーによるｈＣＶ主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビボ調節を示す。全部で１８個の中間層創傷（１５ｘ１５ｘ１５ｘ１.２ｍｍ）をブタの背の皮膚に作成した。微粒子を用いる遺伝子導入により、９個の創傷に０.２μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦおよび０.８μｇのｐｃＤＮＡ３ベクターＤＮＡを投与し、残りの創傷には０.２μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＥＧＦおよび０.８μｇのｐｃＤＮＡ３−ｔｅｔＲを投与した。微粒子爆撃後、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが存在する１.２ｍｌの等張セイラインを入れた密封ビニール製付着性チャンバー中にトランスフェクションされた各創傷を封じた。遺伝子導入から２２、４６および７０時間後に傷の液体をチャンバーから集め、−７０℃で保存した。各時点で傷の液体を集めた後、新たなチャンバーを用意した。遺伝子導入から４６時間後に、静脈注射により各ブタに５００ｍｇのテトラサイクリンを与えた。傷の液体中のｈＥＧＦ発現をＥＬＩＳＡにより調べた。各棒グラフの縦線は標準偏差を示す。
【図６】図６は、トランスドミナントネガテイブ形態のＵＬ９ペプチドによるＨＳＶ−１複製の阻害ならびにｔｅｔリプレッサーを用いた場合の復帰可能性を示す。６０ｍｍのディシュ１枚あたり５ｘ１０５個のＶｅｒｏ細胞を撒いた。撒種から２０ないし２４時間後、精製された感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡ（単独またはｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１もしくはｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−ｎ１０／Ｃ５３５のいずれかとともに）を用いて細胞をトランスフェクションした。１.５μｇのｐＣＤＮＡ３ベクターＤＮＡまたはｔｅｔリプレッサー発現プラスミドｐＣＤＮＡ３−ｔｅｔＲの存在下でトランスフェクションを行った。トランスフェクションから１４時間後、培地を除去し、ついで、ディッシュ１枚あたり１０ｍｌのメチルセルロースをトランスフェクション細胞に添加した。トランスフェクションから６８ないし７２時間後に細胞をニュートラルレッドで染色することによりウイルスプラークを可視化し、１４時間後にプレートを計数した。
【図７】図７は、テトラサイクリンを用いた場合のＨＳＶ−１複製阻害の復帰可能性を示す。ＤＮＡベクターの３つの異なるセットを用いてＶｅｒｏ細胞をトランスフェクションした。３つのセットとは、１）０.２μｇの感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡおよび２.１μｇのｐＣＤＮＡ３、２）０.２μｇの感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡ、０.１μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１および２μｇのｐＣＤＮＡ３、３）０.２μｇの感染性ＨＳＶ−１ ＤＮＡ、０.１μｇのｐＣＭＶｔｅｔＯＵＬ９−Ｃ５７１および２μｇのｐＣＤＮＡ３−ｔｅｔＲである。１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン存在下または不存在下のいずいれかにおいてトランスフェクションを行った。トランスフェクションから１６時間後、培地を細胞から除去し、５ｍｌの新鮮培地（濃度５μｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有または不含）を各ディッシュに添加した。トランスフェクションから４８時間後、細胞を集め、ウイルス収量を測定した。この測定結果を図に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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