(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再構成ヒト抗体の、Fv、F(ab')2、Fab' 又はFab フラグメントであって、当該再構成ヒト抗体が、
（ａ）配列番号11に示される１位のアミノ酸で開始しそして123位のアミノ酸で終結するアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成るＨ鎖；並びに
（ｂ）配列番号５に示される１位のアミノ酸で開始しそして107位のアミノ酸で終結するアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＬ鎖の不変部を含んで成るＬ鎖；
を含んで成る、再構成ヒト抗体である、
ことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項２】
再構成ヒト抗体の、Fv、F(ab')2、Fab' 又はFab フラグメントであって、当該再構成ヒト抗体が、
（ａ）配列番号13に示される１位のアミノ酸で開始しそして123位のアミノ酸で終結するアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成るＨ鎖；並びに
（ｂ）配列番号５に示される１位のアミノ酸で開始しそして107位のアミノ酸で終結するアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＬ鎖の不変部を含んで成るＬ鎖；
を含んで成る、再構成ヒト抗体である、
ことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項３】
前記Ｈ鎖がＨ鎖ヒト不変部γ1を含んで成る請求項１又は２に記載の再構成ヒト抗体のフラグメント。
【請求項４】
前記Ｈ鎖がＨ鎖ヒト不変部γ1を含んで成り、そして前記Ｌ鎖がＬ鎖ヒト不変部κを含んで成る、請求項１又は２に記載の再構成ヒト抗体のフラグメント。
【請求項５】
前記再構成ヒト抗体が細胞系EH31.8（ATCC HB11130）により生成されるH3L1と命名されるものである、請求項２に記載の再構成ヒト抗体のフラグメント。
【請求項６】
前記再構成ヒト抗体が細胞系EH11.13（ATCC HB11132）により生成されるH1L1と命名されるものである、請求項１に記載の再構成ヒト抗体のフラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の再構成ヒト抗体のフラグメントの製造方法において、
当該抗体フラグメントを構成するタンパク質を生成する宿主を培養するか、或いは前記再構成ヒト抗体を構成するタンパク質を生成する宿主を培養して当該再構成ヒト抗体を生成せしめ、そして当該再構成ヒト抗体を所望のフラグメントに変換し、
そして所望により、前記フラグメントを単離する、
ことを含んで成る方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体のフラグメントを使用することを特徴とするIgEの定性又は定量測定方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体のフラグメントを含んで成る、IgEの定性又は定量測定のための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のイソタイプ決定基に対して向けられた再形状化されたヒトモノクローナル抗体及びその誘導体に関する。前記抗体及びそれらの誘導体はアレルギーのインビトロ及びインビボ診断、予防及び処理のために有用である。
アレルギーは、外来性物質（アレルゲン）に対しての過大な免疫応答により誘発される過敏性状態である。アレルゲンとの接触のすぐ後でのアレルギー反応により特徴づけられる即座（タイプＩ）過敏性は、Ｂ細胞により仲介され、そして抗原−抗体反応に基づけられており、そして遅延された過敏性はＴ細胞により仲介され、そして細胞免疫性の機構に基づかれている。最近、用語“アレルギー”とは、タイプＩ過敏性とますます同義になって来ている。
【０００２】
即座過敏性は、アレルゲンとの接触に基づいて、抗体分泌性血漿細胞に分化するＢ細胞による免疫グロブリンクラスＥの抗体（ＩｇＥ抗体）の生成に基づかれる。ＩｇＥ誘発された反応は、身体のアレルゲン侵入の部位、すなわち粘膜表面及び／又は局部のリンパ節で生じる局部的な出来事である。局部的に生成されるＩｇＥはまず、局部的な肥満細胞を敏感にし、すなわちＩｇＥ抗体は、肥満細胞の表面上のＦｃe レセプターにそれらの不変部により結合し、そして次に、“あふれた（ｓｐｉｌｌ−ｏｖｅｒ）”ＩｇＥが循環中に侵入し、そして身体を通しての循環性好塩基球及び組織固定された肥満細胞上のレセプターに結合する。結合されたＩｇＥが続いてアレルゲンと接触される場合、Ｆｃe レセプターが、アレルゲンの結合により架橋され、これに基づいて、細胞が脱顆粒化し、そして多くのアナフィラキシーメディエーター、たとえばヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、等を放す。それは、即座過敏性に典型的な臨床学的徴候、すなわち呼吸器又は腸の平滑筋の収縮、小さな血管の拡張及び水及び血漿タンパク質に対するそれらの透過性の上昇、たとえば鼻炎、アトピー性エグゼマ（ｅｘｃｅｍａ）及びぜんそくをもたらす粘膜の分泌、及びかゆさ及び苦痛をもたらす皮膚における神経末端の刺激を担当するそれらの物質の開放である。
【０００３】
さらに、アレルゲンとの二次接触に基づく反応が、細胞表面上にＩｇＥを表わすことによってアレルゲンとの一次接触の後、いくらかのＢ細胞が表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞（ｓＩｇＥ+ Ｂ細胞）の“記憶プール”を形成するので、増強される。
アレルギーの処理のための有望な概念は、ＩｇＥイソタイプ特異的であり、そして従って、ＩｇＥを結合することができるモノクローナル抗体の適用を包含する。このアプローチは、アレルギーの誘発における初期出来事であり、そしてアレルギー状態の維持を提供する、ＩｇＥ免疫応答をダウンレギュレーションすることによってアレルギー反応の阻害に基づかれている。他の抗体種類の応答は影響されないので、アレルギー徴候に対する即座及び長く続く効果が達成される。さらに、抗−アレルギー剤として適切な抗体は、ＩｇＥ生成血漿細胞である表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞と接触し、その結果、それらはそれらのＢ細胞を機能的に排除するように使用され得る。しかしながら、原理上、ＩｇＥに対する抗体がまた、Ｆｃe レセプターを架橋することによってＩｇＥ感受性化肥満細胞からのメディエーター開放を誘発し、従って血清ＩｇＥ及びｓＩｇＥ+ Ｂ細胞レベルに及ぼす有益な効果に対抗する。結果的に、アレルギーの治療に適用できる抗体は、感受性化された肥満細胞及び好塩基性球上に結合されるＩｇＥと反応することができるべきでないが、しかしｓＩｇＥ+ Ｂ細胞を認識する能力を保持すべきである。
【０００４】
そのようなＩｇＥイソタイプ特異的抗体は、Ｃｈａｎｇなど．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，１２２−１２６（１９９０））により、ＰＣＴ出願第８９／０６１３８号及びヨーロッパ特許出願第３９６５０５号に記載されている。しかしながら、開示される抗体はヒト起源のものではないので、それらは、外来性タンパク質としてのそれらの免疫原性、循環におけるそれらのかなり長い持続性、及び損傷免疫複合体の考えられる形成により、ヒトへの適用のためにほとんど適切ではない。それらの欠点は、ゲッ歯動物の抗体の可変ドメインとヒト抗体不変ドメインとを組合すキメラ抗体に、ゲッ歯抗−ＩｇＥモノクローナル抗体形質転換することによって実質的に減じられ得る。このアプローチは、ゲッ歯動物の親の抗−ＩｇＥ抗体の抗原結合部位を保存し、そしてヒトイソタイプ及びエフェクター機能を付与する。しかしながら、ヒトへの使用のためには、そのようなキメラ抗体は、元のゲッ歯動物の抗体よりも十分な臨床学的利点を有さない。
【０００５】
キメラ抗体の免疫原性は、また相補的決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるゲッ歯動物の超可変部を、再形状化されたヒト抗体をもたらすヒトＬ及びＨ鎖可変部ドメインの骨格中に移植することによってさらに減じられ得る。この技法は、“一般的”なヒトＨ及びＬ鎖可変ドメイン内でのそれらの存在のために抗原特異的ゲッ歯動物のＣＤＲ配列の置換又は組換え移植を包含する（ヨーロッパ特許出願第２３９，４００号）。この技術はヒト抗体への抗原結合部位の臨界及び主要部分をトランスファーするであろうことが推定される。
【０００６】
天然の損なわれていない免疫グロブリン又は抗体は一般的に、個々の上部アームの末端で抗原結合部位を有するＹ形状テトラマー分子を含んで成る。抗原結合部位は、Ｌ鎖の可変ドメインに関連するＨ鎖の可変ドメインから成る。より詳しくは、抗体の抗原結合部位は、Ｈ鎖（ＶH ）の可変ドメインの３ＣＤＲ及びＬ鎖（ＶL ）の可変ドメインの３ＣＤＲにより実質的に形成される。ＶL 及びＶH の両者において、ＣＤＲは、下記一般式（Ｉ）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
〔式中、ポリペプチド鎖はＮ−末端で始まり、そしてＣ−末端で終結するように記載される〕で表わされるポリペプチド鎖を形成する４種の骨格領域（ＦＲ）と共に交互に並ぶ。ＶH 及びＶL のＣＤＲはまた、それぞれＨ１，Ｈ２，Ｈ３及びＬ１，Ｌ２，Ｌ３としても言及される。ＦＲ又はＣＤＲを構成することに関する決定は通常、同じ種に生じる多くの抗体のアミノ酸配列を比較することによって行なわれ、そして同定のための一般的な規則は当業界において知られている（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．など．，ＵＳ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）。
【０００７】
最近、結合のエネルギー論にＬ鎖可変ドメインにより付与される貢献は、関連するＨ鎖可変ドメインにより付与される貢献に比較して小さく、そして単離されたＨ鎖可変ドメインはそれら自体、抗原結合活性を有することが見出された。そのような分子は通常、単一のドメイン抗体として言及される（Ｗａｒｄ，Ｅ，Ｓ，など．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））。
【０００８】
ＣＤＲは、ｂ−シート骨格にドメイン内で連結されるループを形成する。アミノ酸配列とループの構造との関係は標準的な構造モデルにより説明され得る（Ｃｈｏｔｈｉａなど．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，８８７−８８３（１９８９））。このモデルによれば、抗体は、個々の超可変領域のために少ない主要鎖コンホメーション又は“標準的な構造体”のみを有する。そのコンホメーションは、ＣＤＲにおける及び一定のループのためには、骨格領域における特異的部位での少々のキーアミノ酸残基の存在により決定される。異なった免疫グロブリンに同じコンホメーションを有する超可変部が、それらの部位で同じ又はひじょうに類似するアミノ酸残基を有する。
【０００９】
ＣＤＲ移植が、ゲッ歯動物のＣＤＲ−ドナー抗体の親和性よりも有意に低い結合親和性を有する再形状化されたヒト（又はヒト化された）抗体を生成するいくつかのゲッ歯動物のモノクローナル抗体について実施された。最近の発見は、ＣＤＲのトランスファーの他に、ヒト配列の骨格内の変化はＣＤＲ−移植された生成物に満足する抗原結合活性を提供するために必要であることを示している。
【００１０】
Ｑｕｅｅｎなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））は、ネズミ抗−Ｔａｃモノクローナル抗体からのＣＤＲがヒト骨格中に移植され得ることを開示する。ヒト骨格は、ネズミ配列との相同性を最大にするように選択された。その著者は、ＣＤＲ又は抗原と十分に相互作用するように選択されるＦＲ内に位置するアミノ酸残基を同定するためにネズミ親抗体のコンピューターモデルを使用した。それらの残基はネズミ配列に見出される残基に突然変異化された。ヒト化された抗−Ｔａｃ抗体は、ネズミ抗−Ｔａｃ抗体の親和性のたった約１／３の親和性を有し、そしてこの抗体のヒト特徴の維持は不確実であった。
【００１１】
驚くべきことには、ネズミＣＤＲ−ドナー抗体の親和性にほぼ等しいか又は越える、抗原、すなわちＩｇＥ結合親和性を有する、ヒトＩｇＥに対して向けられた再形状化されたヒト抗体を生成することが可能であることが現在見出された。
従って、順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んで成る抗原結合部位を含んで成る、ＩｇＥに対して特異的な再形状化されたヒトモノクローナル抗体、前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３が配列Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr を有し、前記再形状化されたヒト抗体がネズミＣＤＲ−ドナー抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の親和性に少なくともほぼ等しい抗原結合親和性を有し、前記再形状化された抗体の直接的な同等物又は誘導体を提供することが本発明の１つの目的である。配列番号１に示されるアミノ酸配列において、ＣＤＲ１はアミノ酸３１から３５であり、ＣＤＲ２はアミノ酸５０から６６であり、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９９から１１２である。ネズミＣＤＲ−ドナー抗体はモノクローナル抗体ＴＥＳ−Ｃ２１である。
【００１２】
好ましくは、本発明は、ａ）順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んで成る第１ドメイン；ここで前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３が配列Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr を有し；及び
ｂ）順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んで成る第２ドメイン；ここで前記ＣＤＲ１はアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His を有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser を有し、前記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr を有し；を含んで成る抗原結合部位を含んで成る再形状化されたヒト抗体に関し、ここで前記再形状化されたヒト抗体はネズミＣＤＲ−ドナー抗体の親和性に少なくともほぼ等しい抗原結合親和性を有し、さらに前記再形状化された抗体の直接的な同等物又は誘導体にも関する。前記第１ドメインのＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号１に同定される配列のタンパク質のＣＤＲである。第２ドメインのＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列におけるそれぞれのアミノ酸２４〜３４，５０〜５６及び８９〜８７である。
【００１３】
抗原結合部位が第１及び第２ドメインの両者を含む場合、それらは同じポリペプチド鎖上に位置し、又は好ましくは、個々のドメインは異なった鎖上に存在し、第１ドメインは免疫グロブリンＨ鎖又はそのフラグメントの部分であり、そして第２ドメインは免疫グロブリンＬ鎖又はそのフラグメントの部分である。
本発明によれば、再形状化されたヒト抗体は、（１）それが個々の存在する鎖がヒト様骨格を含んで成る少なくとも１つの抗原結合部位を含んで成り、そして（２）存在するいづれかの不変部がヒト免疫グロブリン不変部と少なくとも実質的に相同であるか又は好ましくはそれと同一であることで特徴づけられる分子に関する。本明細書で使用される場合、“ヒト様骨格”とは、特にヒト免疫グロブリン配列の骨格におけるアミノ酸と同一の少なくとも約７０又はそれ以上、好ましくは少なくとも約７５又はそれ以上のアミノ酸を含んで成る、骨格部分ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３及びＦＲ４の配列から成る骨格である。従って、たぶん再形状化されたヒト抗体のＣＤＲを除くすべての部分は、１又は複数天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に相同である。たとえば再形状化されたヒト抗体は、ネズミ可変部及びヒト不変部を含んで成るキメラ性抗体を包含しないであろう。
【００１４】
ヒト様骨格は、特定のヒト免疫グロブリンの骨格と同一であり、又は好ましくは、特定のヒト骨格とは異なり、すなわち限定された数のアミノ酸残基が挿入され、欠失され又は他のアミノ酸残基により置換され得る。そのような変性は、単一のＦＲ、すなわちＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３又はＦＲ４に制限され、又は２，３又はすべてのそれらの４種のＦＲを包含する。たとえばヒト受容体骨格内の疎水性アミノ酸は、他のアミノ酸により置換され得、好ましくはまた疎水性アミノ酸、たとえば相同アミノ酸は２つのアミノ酸により置換され得、又は欠失され得る。同様に、ヒト骨格内の親水性アミノ酸は、他のアミノ酸、２種のアミノ酸により置換され得、又は欠失され得、それによって、置換するアミノ酸は好ましくは、元の骨格の水素結合構造を維持する。そのような変性は、“手探り法”基礎に基づいて行なわれ、すなわちその効果は、創造された再形状化されたヒト抗体の抗原−結合親和性と、ネズミＣＤＲ−ドナー抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の親和性とを比較することによって評価される。抗原結合親和性の決定のために適切なアッセイは下記に記載される。
【００１５】
特に、選択されたヒト受容体骨格内の制限された数のアミノ酸残基、好ましくは１〜１２個の残基が、ネズミモノクローナル抗体（ヒトＨネズミ交換）、特にネズミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１において対応する部位で存在するアミノ酸残基、及び／又は異なったヒト抗体（ヒトＨヒト交換）において対応する部位で存在するアミノ酸残基により置換され得る。好ましくは、アミノ酸の予想される置換は、抗原結合及び／又はＶL ／ＶH パッキングのためにたぶん重要なものとして見なされる特定の骨格残基の従来の同定に基づかれている。そのような重要なアミノ酸は、それらの特定の性質及び／又は位置のために、
−抗体のＣＤＲ内のアミノ酸と接触し、又はそのアミノ酸近くに位置すると思われ；
−抗原との臨界的な相互作用に包含され；
−対のＶH ／ＶL 構造の全体の統合性を維持し、ＶH 及びＶL ドメイン内での又はそれらの間での相互作用に直接的に又は間接的に影響を及ぼすことに包含されると思われる骨格残基を含む。
【００１６】
いわゆる決定的なアミノ酸の同定のために適切であることが知られている方法は分子造形法を包含する。たとえば抗原結合部位の分子モデルは創造され、そして一般的に入手でき、そして当業者に良く知られているコンピュータープログラムを用いることによってコンピューターモニター上に示され得る。
特に、再形状化された本発明の抗体の企画は、次の段階を含んで成る：
ａ）配列番号１及び３に示されるアミノ酸配列及び配列調和により高い相同性であることが決定されているネズミ抗体のその対応する解決された構造に基づいてのネズミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１のＶL 及びＶH のためのもっともらしい分子モデルの構成。前記解決された構造は、同じネズミ抗体又は２種の異なったネズミ抗体に起因する。
ｂ）既知のヒト免疫グロブリン配列、たとえば市販されているデータベース、たとえばＫＡＢＡＴデータベース（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．など．，ＵＳ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から得られる配列のＶH 及びＶL からの適切なヒト受容体骨格の選択。適切なヒト受容体骨格は、データベースにおける配列に比較して、抗体ＴＥＳ−Ｃ２１のＶH 及びＶL ドメインに対して高い相同性であり、好ましくは、異常に相同性である特定の免疫グロブリンからの骨格、又は最っとも好ましくは、抗体ＴＥＳ−Ｃ２１のＶH 及びＶL ドメインに対して高い相同性である多くのヒト抗体からのコンセンサス骨格である。移植のために選択されるＨ及びＬ鎖骨格配列は同じヒト抗体に由来される必要はなく、好ましくは異なったヒト抗体に由来される。
ｃ）ネズミＴＥＳ−Ｃ２１のＣＤＲ及び式Ｉの選択されたヒト受容体骨格からのＦＲを含んで成る再形状化されたヒト抗体のＶH 及びＶL の分子モデルの構成。
ｄ）段階ａ）及びｃ）で得られた分子モデルの比較。
【００１７】
本発明の再形状化されたヒト抗体においては、１つ、いくつかの又はすべての同定された重要なアミノ酸残基は、他のアミノ酸残基、特に抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の特定部位に存在する残基により置換され得る。好ましくは、選択されたヒト骨格内の“元の”アミノ酸残基は、それが推定される標準的な構造体の一部又は超可変ループの構造の決定において重要である場合、置換されない。しかしながら、アミノ酸残基の置換は、重要なアミノ酸に限定され得ない。好ましくは、重要でない残基に影響を及ぼす変化は、ヒト−ヒトタイプの変化である。
【００１８】
本発明の再形状化されたヒト抗体において、アミノ酸Ｃｙｓは−Ｓ−Ｓ−橋を形成する酸化された状態で存在できる。
本発明により提供される再形状化されたヒト抗体の例は、単一のドメイン抗体、一本鎖の抗体及び損なわれていない複数鎖、たとえばテトラマー抗体（十分な長さのＨ及びＬ鎖及びそのいづれかのフラグメント、たとえばＦｖ，Ｆ（ａｂ′）2 及びＦａｂフラグメントを含んで成る）を包含する。
【００１９】
単一のドメイン抗体は、単一のドメインを含んで成る単一の抗原結合部位を含んで成る。
一本鎖抗体（またｓｃＦｖとも称する）は、Ｈ及びＬ鎖の可変ドメインから実質的に成る。好ましくは、それらの可変ドメインは、約１０〜３０個、特に約１５個のアミノ酸、たとえばグリシン及びセリンから選択されたアミノ酸を含んで成る短いペプチドリンカーを通して共有結合される。好ましいペプチドリンカーは、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser の３種の反復性単位から成る１５個のアミノ酸ポリペプチドである。一本鎖抗体は、いづれかのＨ又はＬ鎖の不変部を含まない。
【００２０】
本発明の再形状化されたヒト抗体はＩｇＥに対して特異的であり、すなわちそれはヒトＩｇＥのイソタイプ決定基に対して向けられる。従って、本発明の抗体はＩｇＥ種の免疫グロブリンに共通するＨ鎖上の抗原決定基を認識し、すなわちそれは異なった特異性のＩｇＥ分子と反応するが、しかし他のイソタイプの免疫グロブリン又は免疫グロブリンＬ鎖とは反応しない。
【００２１】
本発明の再形状化された抗体は、ネズミＴＥＳ−Ｃ２１の親和性に少なくともほぼ等しいＩｇＥ−結合親和性を有する必要がある。今後本明細書で使用される場合、用語“少なくともほぼ等しい”とは、再形状化されたヒト抗体（試験抗体）のＩｇＥ−結合親和性が統計学的基礎に基づいて、対照抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の少なくとも約９０％、好ましくは９０％以上、特に約１００％〜約２５０％以内である。再形状化された抗体は、ＴＥＳ−Ｃ２１の対応する構造に対して比較されるべきである。たとえば、再形状化された抗体が単一のドメイン抗体である場合、その親和性は単一のドメインＴＥＳ−Ｃ２１に関連づけられるべきである。このネズミ単一ドメイン抗体は、配列番号１及び３に与えられる情報に基づいて容易に調製され得る。この記載において、抗体の“親和性”又は“結合活性”間には区別がないが、しかし用語“親和性”とは親和性又は結合活性のいづれかを言及すべきである。
【００２２】
対照及び形状化された試験抗体の親和性の決定は、同じ態様で、すなわち同じアッセイにおいて同一の条件下で行なわれるべきである。お互い比較される場合、抗体は、同じ程度の純度を有すべきである。高く精製された抗体を使用することが好ましい。
ＩｇＥのための抗体の結合親和性は、既知の技法及び法則に基づいて、当業者により容易に確立され得る適切な定量アッセイを用いて決定される。
【００２３】
決定されるべき適切なパラメーターは、平衡定数Ｋaff （親和性定数）である。種々の数学的等式が、抗体−抗原相互作用のための親和性定数の実験的計算を促進するために開発された。Ｋaff の測定のための適切な実験方法は、たとえば競争ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は競争酵素結合イムノアドソーベントアッセイ（ＥＩＡ）による結合された抗原：遊離抗原の比の測定、又はＢｅａｔｔｙなど．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１００，１７３〜１７９（１９８７））により記載される非競争固相ＥＩＡによる合計の抗体濃度の測定に依存する。
【００２４】
好ましくは、Ｋaff は、ＣＭ５表面チップを用いてのＢＩＡコア（ＴＭ）システム上でＩｇＥ抗原と抗体との即時の生物特異的相互反応（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．など．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１，６２０〜６２７（１９９１））を分析することにより決定される。そのアッセイは製造業者の指針に従って実質的に行なわれ、そして動定数Ｋass 及びＫdissの測定を包含する。適切な抗原は、Ｓｅｒｏｔｅｃにより供給される市販のヒトＩｇＥ（たとえばＢＰ０９４，Ｄｏｔｌｉｋｏｎ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又はヒト不変部を有するキメラ性抗体、たとえばＳＥ４４（Ｓｕｎなど．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９，２８９９（１９８９））である。特に、このアッセイは、次のことを含んで成る実験サイクルを包含する：
１）化学的手段によるチップ表面上へのいわゆる捕獲抗体の固定化、すなわちネズミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１を含む測定のためには、抗−マウス抗体、たとえば抗−マウスＩｇＧが、又は本発明の再形状化された抗体を含む測定のためには、抗−ヒト抗体、たとえば抗−ヒトＩｇＧが使用され、
２）固定された捕獲抗体への対照又は試験抗体の結合、
３）一定濃度の抗原と結合された対照又は試験抗体との接触。
【００２５】
好ましくは、いくつかの、たとえば４回の実験サイクルが、一定量の結合された抗体を用い、そしてＩｇＥの（既知）濃度を変えることで行なわれる。個々のサイクルの完結後、その表面を、たとえば酸、たとえばＨＣｌにより再生する。
本発明の再形状化された抗体の企画は、低い、好ましくは１．９×１０-5／ｓ又はそれ以下の低い解離速度（Ｋdiss）と組合して、高い、好ましくは２．５×１０5 Ｍ-1／ｓ又はそれ以上の高い会合速度（Ｋass ）を示す抗体を構成することを目的とする。
【００２６】
本明細書で使用される場合、本発明の再形状化されたヒト抗体の直接的な同等物は、配列番号１に示されるようなＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３及び場合によっては、配列番号３に示されるようなＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を順に含んで成る再形状化されたヒト抗体であり、ここで１つの可変ドメイン内で、ＣＤＲ内での４個までのアミノ酸残基、すなわちＣＤＲ内の１，２，３又は４個のアミノ酸か他のアミノ酸により置換される。従って、用語“その直接的な同等物”とは、単一ドメインの再形状化されたヒト抗体（タンパク質Ｙ）：
（１）ここで、全体として取られる超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１に示されるようなＣＤＲに少なくとも９０％相同性であり、そして、
（２）タンパク質ＹのＦＲと同一のＦＲを有し、しかも配列番号１におけるＣＤＲと同一のＣＤＲを有する本発明の対照タンパク質の親和性に少なくともほぼ等しい、ＩｇＥのための親和性を有し；又は
結合部位当たり２つのドメインを有する再形状化された抗体（タンパク質Ｙ′）：
（１）ここで全体として取られる超可変部ＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H ，ＣＤＲ３H 及びＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L ，ＣＤＲ３L は配列番号１及び３に示されるようなＣＤＲに少なくとも８０％、好ましくは９０％相同性であり、そして、
（２）タンパク質Ｙ′のＦＲ及び不変部と同一のＦＲ及び不変部を有し、しかも配列番号１及び３における超可変部と同一の超可変部ＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H ，ＣＤＲ３H 及びＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L ，ＣＤＲ３L を有する本発明の対照タンパク質の親和性に少なくともほぼ等しい、ＩｇＥのための親和性を有する。
【００２７】
後者の基準は、たとえば上記方法に従って、Ｋaff を決定することによって試験され得る。
ネズミモノクローナル抗体ＴＥＳ−Ｃ２１は、本発明の再形状化されたヒト抗体にも共通する次の特徴（特に）を示す：
−それはＦｃe 受容体Ｉ又はIIを生む細胞へのＩｇＥの結合を阻害し；
−ヒトＩｇＥ分泌細胞に特異的に結合し；
−Ｆｃe 受容体Ｉ又はIIを生む細胞、たとえば感作された肥満細胞及び好塩基性細胞の表面上に結合されるＩｇＥを認識せず、そして結合せず；
−メディエーター（たとえばヒスタミン）開放のきっかけを生ぜしめず、
−免疫応答におけるＩｇＥ形成を阻害する。
【００２８】
それらの特徴的能力は、当業者において知られている方法、たとえば引用により本明細書に組込まれるヨーロッパ特許出願第３９６５０５号に開示される方法により決定され得る。
本発明の好ましい再形状化された抗体、又はその誘導体は、（ａ）順に超可変部ＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H 及びＣＤＲ３H 並びにヒトＨ鎖の不変部又はそのフラグメントを含んで成る１つの免疫グロブリンＨ鎖又はそのフラグメント；ここで前記ＣＤＲ１H はアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記ＣＤＲ２H がアミノ酸配列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３H がアミノ酸配列Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr を有し；及び
（ｂ）順に超可変部ＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L 及びＣＤＲ３L を含んで成るＬ鎖可変ドメイン並びにヒトＬ鎖の不変部又はそのフラグメントを含んで成る１つの免疫グロブリンＬ鎖又はそのフラグメント；ここで前記ＣＤＲ１L がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His を有し、前記ＣＤＲ２L がアミノ酸配列Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser を有し、前記ＣＤＲ３L がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr を有する：を少なくとも含んで成る。
【００２９】
免疫グロブリンＨ又はＬ鎖のフラグメントは、十分な長さの鎖ではなく、そして可変ドメイン及び場合によっては鎖の不変部の一部を含んで成るＨ又はＬ鎖である。
より好ましくは、本発明の再形状化されたヒト抗体又はその誘導体は、（ａ）１位でのアミノ酸で開始し、そして１２３位でのアミノ酸で終結する配列番号１１に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１つのＨ鎖；及び
（ｂ）１位でのアミノ酸で開始し、そして１０７位でのアミノ酸で終結する配列番号５に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１つのＬ鎖を少なくとも含んで成る。
【００３０】
特に好ましくは、本発明の再形状化されたヒト抗体又はその誘導体は、（ａ）１位でのアミノ酸で開始し、そして１２３位でのアミノ酸で終結する配列番号１３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１つのＨ鎖；及び
（ｂ）１位でのアミノ酸で開始し、そして１０７位でのアミノ酸で終結する配列番号５に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１つのＬ鎖を含んで成る。
【００３１】
本明細書に与えられる残基は、アミノ酸残基の数字に対応する。
ヒトＨ鎖の不変部は、イソタイプα（ａ），δ（ｄ），γ（ｇ）又はμ（μ）のいづれかから選択され得る。種々のサブクラス、たとえばＩｇＧサブクラスのＨ鎖が使用され得る。ヒトｇ１鎖の不変部が好ましい。異なったクラス及びサブクラスのＨ鎖が異なったエフェクター機能に関与し、そして従って、Ｈ鎖不変部のタイプを選択することによって、所望するエフェクター機能を有する再形状化されたヒト抗体が生成され得る。Ｌ鎖の不変部は、ラムダ（ｌ）又は好ましくはカッパ（ｋ）鎖である。
【００３２】
細胞系ＥＨ３１．８により生成される、Ｈ３Ｌ１と命名された再形状化されたヒト抗体が最っとも好ましい。
本発明はまた、本発明の再形状化されたヒト抗体の誘導体にも関する。再形状化されたヒト抗体の誘導体は、前記抗体の抗原特異性を有する。本発明によれば、誘導体とは、本発明の抗体の変性、たとえば吸着又は化学的変性により得られるいづれかの分子であることを意味する。たとえば、誘導体の意図された使用に依存して、本発明の抗体は、他のタンパク質性又は非タンパク質性分子の共有又は非共有結合により誘導体化され得る。抗体接合体をもたらす共有結合は、たとえば当業界において知られているカップリング技法を用いて達成される。そのような接合体において、抗体はスペーサー又はリンカー基により又は直接的に、接合パートナーに結合される。誘導体の例は、放射性ラベルされた再形状化されたヒト抗体、及びたとえば酵素、螢光又は化学発光マーカー、適切な細胞毒性又は細胞増殖抑制性物質、金属キレート、酵素でないタンパク質、たとえばアビジン、又は非タンパク質性分子、たとえばビオチンと本発明の再形状化されたヒト抗体との接合体である。
【００３３】
本発明の抗体接合体のために使用される酵素は、たとえばホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ｂ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼである。
【００３４】
螢光マーカーは、フルオレセイン、フルオロクロム、ロダミン及び同様のものを包含する。
化学発光マーカーは、たとえばルミノールのアクリジニウムエステルである。  金属キレートの例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン六酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸、又は同様のものである。
【００３５】
本発明の放射性ラベルされた抗体又はそのフラグメントは、たとえば放射性沃素（ 123Ｉ， 125Ｉ， 131Ｉ）、トリチウム（ 3Ｈ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、イットニウム（90Ｙ）、テクネチウム（ 99mＴｃ）又は同様のものを含む。
本発明はさらに、抗−ＩｇＥ形状化されたヒト抗体、その直接的な同等物及びその誘導体の製造方法にも関する。
【００３６】
本発明の再形状化されたヒト抗体、その直接的な同等物又はその誘導体は、本発明のタンパク質を生成する下記にさらに定義されるような適切な宿主細胞が、インビトロ又はインビボで操作され、そして必要により、その所望するタンパク質が単離され、そしてその誘導体に任意に転換されることを特徴とする、それ自体既知の方法により調製される。本発明のタンパク質は、いづれかの適切な形質転換できる宿主を前記タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し、前記タンパク質を単離し、そして場合によっては、前記単離されたタンパク質を、たとえばタンパク質加水分解により本発明のもう１つのタンパク質に、又はたとえば他の化合物、たとえば上記のようなタンパク質又は非タンパク質性分子の結合により本発明の誘導体に転換することを含んで成る方法により調製され得る。
【００３７】
本発明の好ましい態様においては、（１）下記に定義されるような本発明の第１及び第２ＤＮＡ構造体により形質転換された適切な宿主細胞を培養し、そして（２）その培養物から活性抗−ＩｇＥ再形状化されたヒト抗体を回収することを含んで成る、複数鎖抗−ＩｇＥ再形状化ヒト抗体の生成方法が提供される。複数鎖抗体は、Ｈ及びＬ鎖可変ドメインを含んで成る少なくとも１つの抗原結合部位を含んで成る抗体である。
【００３８】
他方、Ｈ及びＬ鎖は別々に回収され、そしてインビトロでの折りたたみの後、活性抗体に再構成され得る。適切な再構成法は当業界において良く知られている。従って、本発明の複数鎖抗体の製造方法はまた：
（１）本発明の第１ＤＮＡ構造体により形質転換される第１宿主細胞を培養し、そしてその培養物から前記Ｈ鎖又はそのフラグメントを回収し、そして
（２）本発明の第２ＤＮＡ構造体により形質転換される第２宿主細胞を培養し、そしてその培養物から前記Ｌ鎖又はそのフラグメントを回収し、そして
（３）（１）で得られるＨ鎖又はそのフラグメント及び（２）で得られるＬ鎖又はそのフラグメントから活性抗−ＩｇＥ再形状化抗体をインビトロで再構成することを含んで成る。
【００３９】
類似する態様において、（１）本発明の一本鎖又は単一ドメインの再形状化されたヒト抗体をそれぞれコードするＤＮＡ構造体により形質転換される宿主細胞を培養し、そして（２）前記培養物から前記ペプチドを回収することを含んで成る本発明の一本鎖又は単一ドメインの再形状化されたヒト抗体の製造方法がまた提供される。
【００４０】
再形状化されたヒト抗体のフラグメント、たとえばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2 フラグメントは、上記のような組換えＤＮＡ技法により、又は酵素、たとえばパパイン又はペプシンによる消化及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の分解によるそれ自体既知の方法により、上記で調製された損なわれていない複数鎖の再形状化されたヒト抗体から調製され得る。
【００４１】
適切な宿主は、真核細胞、たとえば動物細胞、植物細胞及び菌類、及び原核細胞、たとえばグラム陽性及びグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリを包含する。好ましい真核宿主細胞は、哺乳類起源の細胞及び酵母細胞である。
今後使用される場合、インビトロとはエクス  ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を意味し、従ってたとえば細胞培養及び組織培養条件を包含する。
【００４２】
たとえば、インビトロでの哺乳類細胞の増殖は、通常の市販の培養培地、たとえばダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ１６４０（哺乳類血清、たとえばウシ胎児血清、又は微量元素及び増殖維持補充物、たとえば支持物細胞、たとえば正常なマウス腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸又は同様のものにより任意に補充されている）である適切な培養培地において行なわれる。
【００４３】
インビトロ生成は、比較的純粋な抗体調製物を供給し、そして多量の所望する抗体の大規模産生を可能にする。細菌細胞、酵母及び哺乳類細胞の培養のための技法は当業界において知られており、そしてたとえばエアーリフト反応器又は連続撹拌反応器における均質懸濁培養、又はたとえば中空繊維、マイクロカプセルにおいて、アガロース微小ビース又はセラミックカートリッジ上での固定された又は捕獲された細胞培養を包含する。
【００４４】
本発明の多量の所望する再形状化されたヒト抗体はまた、哺乳類細胞をインビボで増殖することによっても得られる。このためには、所望する抗体を生成するハイブリドーマ細胞が組織適合性哺乳類中に注入され、抗体産生腫瘍の増殖が引き起こされる。場合によっては、動物は、注入の前、炭化水素、特に鉱油、たとえばプリスタン（テトラメチルペンタデカン）により感作される。１〜３週間後、抗体がそれらの哺乳類の体液から単離される。たとえば所望する抗体を生成するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクトされた細胞が、プリスタンにより任意に予備処理されたＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入され、そして１〜２週間後、腹水が動物から採取される。
【００４５】
細胞培養上清液が、所望する再形状化されたヒト抗体について、抗原としてヒトＩｇＥを用いて、好ましくは酵素イムノアッセイ、たとえばサンドイッチアッセイ又はドットアッセイ、又はラジオイムノアッセイによりスクリーンされる。たとえばサンドイッチ酵素イムノアッセイは、正しくアセンブリーされた免疫イムノグロブリンが細胞培養上清液に存在するかどうかを決定するために使用され得、それによってＬ鎖ヒト不変部ｋ又はｌ（適切な場合）に向けられた抗体及び所望するサブクラス９Ｈ鎖ヒト不変部に向けられた他の抗体が使用され、その１つは固体支持体に被覆され、そして他の１つは適切な酵素基質による検出を可能にする酵素に接合される。そのようなイムノアッセイは、酵素結合イムノアドゾーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、ここで適切なキャリヤー、たとえばプラスチック製マイクロタイタープレートが免疫グロブリンＥにより被覆され、そして試験されるべき培養上清液と共にインキュベートされる。結合されたモノクローナル抗体は、上清液における抗−ＩｇＥ抗体を認識する酵素ラベルされた抗体と共にインキュベートし、そして適切な酵素基質溶液の続く添加により検出される。酵素基質反応は、たとえば眼又は光学的測定装置により観察され得る色彩の変化をもたらす。
【００４６】
再形状化されたヒト抗体の単離のためには、培養上清液又は腹水における免疫グロブリンが、硫酸アンモニウムによる沈殿化、吸湿性材料、たとえばＰＥＧに対する透析、選択膜を通しての濾過又は同様の手段により濃縮され得る。必要なら及び／又は所望なら、抗体は通常のクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー、たとえばイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。好ましくは、再形状化されたヒト抗体は、クロマトグラフィー精製段階、たとえばプロティンＡ（本発明の抗体がＦｃ部分を含む場合）によるアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過を含んで成る方法により、それらを含む細胞上清液から単離される。
【００４７】
本発明の再形状化されたヒト抗体誘導体は、それ自体既知の方法により、たとえば他の化合物への再形状化されたヒト抗体の吸着により、又は化学的に結合された接合体を供給するカップリングにより調製される。タンパク質、たとえば酵素と本発明の抗体との接合体は、たとえば上記のようにして調製された抗体とタンパク質とを、カップリング剤、たとえばグルタルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−スクシンイミド、Ｎ−（３−〔２′−ピリジルジチオ〕−プロピオンオキシ）−スクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド又は同様のものの存在下で反応せしめることによって調製される。螢光又は化学発光マーカーとの接合体は、カップリング剤、たとえば上記に列挙されるものの存在下で、イソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応により調製される。
【００４８】
ヨウ素（ 123Ｉ， 125Ｉ， 131Ｉ）により放射性ラベルされた再形状化抗体は、それ自体既知の方法に従ってのヨウ素化により、たとえば放射性ヨウ化ナトリウム又はカリウム及び化学酸化剤、たとえば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ又は同様のもの、又は酵素酸化剤、たとえばラクトペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ及びグルコースにより本発明の抗体から得られる。本発明の抗体又はフラグメントは、たとえばジエチレントリアミン六酢酸（ＤＰＴＡ）−キレート化によりイットニウム（90Ｙ）に結合される。テクネチウム−９９ｍによりラベルされた抗体又はフラグメントは、リガンド交換方法、たとえば錫イオン溶液によるペルテクネート（ＴｃＯ4 - ）の還元、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上での前記還元されたテクネチウムのキレート化及びこのカラムへの抗体の適用、又は直接的なラベリング技法、たとえばペルテクネート、還元剤、たとえばＳｎＣｌ2 、緩衝溶液、たとえばナトリウム−カリウムフタレート溶液、及び本発明の抗体のインキュベーションにより調製される。
【００４９】
タンパク質への本発明の抗体の接合はまた、組換えＤＮＡ技法、たとえば下記に説明される技法により直接的に調製され得る。
再形状化されたヒト抗体、その直接的な同等物又はその誘導体を生成するための方法は、親和性及び特異性の決定のために十分な量で所望するタンパク質を生成する。
【００５０】
本発明はまた、本発明の再形状化されたヒト抗体及びその直接的な同等物をコードする組換えＤＮＡにも関する。ひじょうに一般的な態様において、本発明の単一ドメイン再形状化ヒト抗体、本発明の一本鎖再形状化ヒト抗体、本発明の再形状化ヒト抗体のＨ又はＬ鎖又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子が供給される。定義によれば、そのようなＤＮＡは、コードする一本鎖ＤＮＡ、前記コードＤＮＡ及びそれに対しての相補的ＤＮＡから成る二本鎖ＤＮＡ又はそれらの相補的（一本鎖）ＤＮＡ自体を含んで成る。より詳しくは、本発明は、下記に記載されるような第１及び第２ＤＮＡ構造体に関する。
【００５１】
第１のＤＮＡ構造体はＨ鎖又はそのフラグメントをコードし、そしてａ）選択的にＦＲ及びＣＤＲを含んで成る可変ドメインをコードする第１部分、ここで前記ＣＤＲは順にＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H 及びＣＤＲ３H であり、配列番号１におけるそのアミノ酸配列がそれぞれ３１〜３５位、５０〜６６位及び９９〜１１２位であり；この第１部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、そして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終結し；及び場合によっては、
ｂ）Ｈ鎖の不変部の最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、そして前記不変部又はそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終結し、続いてナンセンスコドンが続く、ヒトＨ鎖不変部又はそのフラグメントをコードする第２部分を含んで成る。好ましくは、この第１部分は、１位でのアミノ酸で開始し、そして１２３位でのアミノ酸で終結する、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。より好ましくは、第１部分は、７９位でのヌクレオチドで始まり、そして４４７位でのヌクレオチドで終結する、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有する。第２部分は、ゲノム起原のＤＮＡフラグメント（イントロンを含む）又はｃＤＮＡフラグメント（イントロンを含まない）であり得る。存在するなら、ｇ１鎖の不変部をコードする第２部分が好ましい。
【００５２】
第２のＤＮＡ構造体はＬ鎖又はそのフラグメントをコードし、そしてａ）選択的にＦＲ及びＣＤＲを含んで成る可変ドメインをコードする第１部分、ここで前記ＣＤＲは順にＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L 及びＣＤＲ３L であり、配列番号３におけるそのアミノ酸配列がそれぞれ２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位であり；この第２部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、そして可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終結し；及び場合によっては、
ｂ）Ｌ鎖の不変部の最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、そして前記不変部又はそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終結し、続いてナンセンスコドンが続く、ヒトＨ鎖不変部又はそのフラグメントをコードする第２部分を含んで成る。好ましくは、この第２部分は、１位でのアミノ酸で開始し、そして１０７位でのアミノ酸で終結する、配列番号５に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメインをコードする。より好ましくは、第２部分は、８２位でのヌクレオチドで始まり、そして４０３位でのヌクレオチドで終結する、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する。第２部分は、ゲノム起原のＤＮＡフラグメント（イントロンを含む）又はｃＤＮＡフラグメント（イントロンを含まない）であり得る。存在するなら、κ鎖の不変部をコードする第２部分が好ましい。
【００５３】
第１及び第２部分の両者を含んで成る第１及び第２ＤＮＡ構造体が好ましい。この場合、第１及び第２部分はイントロン配列により分離され得る。
好都合には、第１及び第２ＤＮＡ構造体は、第１部分の上流に位置し、そしてリーダーペプチドをコードする第３部分を含んで成り；この第３部分はリーダーペプチドの最初のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そしてそのペプチドの最後のアミノ酸をコードするコドンで終結する。適切なリーダーペプチドは、宿主生物により鎖の分泌のために必要とされるペプチドであり、ここでそれらは発現され、そして続いて宿主により除去される。好ましくは、第１及び第２ＤＮＡ構造体の第３部分は、免疫グロブリン遺伝子のリーダーペプチドをコードする。最っとも好ましくは、第１ＤＮＡ構造体の第３部分は、１９位でのアミノ酸により始まり、そして１位でのアミノ酸により終結する、配列番号１３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸を有するリーダーペプチドをコードする。また、最っとも好ましくは、第２ＤＮＡ構造体の第３部分は、２０位でのアミノ酸で始まり、そして１位でのアミノ酸で終結する、配列番号５に示される配列と実質的に同一のアミノ酸を有するリーダーペプチドをコードする。
【００５４】
本発明はまた、本発明の再形状化されたヒト抗体の直接的な同等物をコードする組換えＤＮＡ、及びタンパク質への本発明の抗体の接合体をコードする組換えＤＮＡにも関する。
技術の現情況は、当業者が本明細書に提供される情報を付与する本発明のＤＮＡ分子；すなわちＣＤＲのアミノ酸配列及び従ってＤＮＡ配列コード（配列番号１及び３）を合成できるであろうような情況である。本発明の再形状化されたヒト抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡ構造体を得るための適切な方法は、多くのオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ方法によるそれらの増幅及び所望するＤＮＡ配列を付与するためにそれらのスプライシングを含んで成る。可変ドメイン遺伝子を構成するための他の方法は：
−特異的なヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし；
−ＦＲ及びＣＤＲをコードするＤＮＡセグメントを決定し；
−ＣＤＲをコードするＤＮＡセグメントを除去し、その結果、ＦＲをコードするＤＮＡセグメントが連結部での適切な制限部位と一緒に融合し；
−配列番号１及び３における上記で同定された配列に従って二本鎖合成ＣＤＲカセットを調製し、ここで前記カセットは付着端を有し；
−ＦＲの連結部で前記カセットを連結する（ヨーロッパ特許第２３９，４００号）ことを含んで成る。
【００５５】
所望により、本発明のＤＮＡ構造体は、種々の良く知られた方法により、たとえばランダム変異を誘発することによって又は特定部位変異誘発により変異誘発され得る。本発明の再形状化されたヒト抗体をコードするＤＮＡ構造体において、変異誘発はＣＤＲ内に位置するいづれのアミノ酸の変更をも導びかない。本発明の再形状化された抗体の直接的な同等物をコードするＤＮＡ構造体においては、他のヌクレオチドによるヌクレオチドの置換が、１又は複数のＣＤＲにおけるアミノ酸配列を変更することができる。
【００５６】
本発明の再形状化された抗体の直接的な同等物をコードするＤＮＡは、当業界において知られている方法に従って、たとえば本発明の再形状化された抗体をコードするＤＮＡのランダム又は部位特異的変異誘発により調製され得る。不活性変異ではないが、しかしＣＤＲ内に位置する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をもたらす変異誘発は、このようにして生成されたタンパク質が上記基準を満たす場合、本発明の再形状化された抗体の直接的な同等物をコードするＤＮＡを生成できる。
【００５７】
明細書の次の部分で使用される場合、本発明の再形状化されたヒト抗体とは、その直接的な同等物を包含することを意味する。
さらに本発明は、上記ＤＮＡ構造体の少なくとも１種、たとえばＬ鎖可変ドメイン及び／又はＨ鎖可変ドメインをコードする挿入体を含んで成るハイブリッドベクターである組換えＤＮＡにも関し、ここで前記ベクターは、原核及び／又は真核宿主において複製できる。
【００５８】
本発明の好ましいハイブリッドベクターは、上記のようなＬ鎖をコードする挿入体及び／又は上記のようなＨ鎖をコードする挿入体を含んで成る。
本発明のハイブリッドベクターは、複製又は自主的に複製する配列の起点、１又は複数の優先的なマーカー配列及び場合によっては、発現制御配列、シグナル配列及び追加の制限部位を含んで成る。
【００５９】
好ましくは、本発明のハイブリッドベクターは、発現制御配列に操作可能的に連結される上記挿入体、特にこの後に記載されるものを含んで成る。
ベクターは典型的には、適合できる宿主細胞と共同して２種の機能を行なう。１つの機能は、免疫グロブリン鎖をコードする核酸のクローニングを促進し、すなわち有用な量の核酸を生成することである（クローニングベクター）。他の機能は、染色体外要素としての維持により、又は宿主染色体中への統合により、適切な宿主における複製及び遺伝子構造体の発現を提供することである（発現ベクター）。クローニングベクターは、上記のような遺伝子構造体、複製又は自主的に複製する配列の起点、選択マーカー配列及び場合によっては、シグナル配列及び追加の制限部位を含んで成る。発現ベクターはさらに、遺伝子の転写及び翻訳のために不可欠な発現制御配列を含んで成る。
【００６０】
複製又は自主的に複製する配列の起点は、ＳＶ４０又は他のウィルス源に起因する外因性起点を含むようにベクターを構成することにより、又は宿主細胞の染色体機構により提供される。
マーカーは、ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする。選択マーカーは、重金属、たとえば銅又は抗生物質、たとえばテトラサイクリン、アンピシリン、ゲネチシン（Ｇ−４１８）、ネオマイシン、カナマイシン又はヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、又は宿主細胞の遺伝的損傷、たとえばチミジンキナーゼ、ヒポキカンチンホスホリルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、又は同様のものの不在を補足する遺伝子を包含する。
【００６１】
シグナル配列は、たとえば抗体の分泌を指図するリーダーペプチドをコードするプレ配列又は分泌リーダー、スプライスシグナル、又は同様のものであり得る。
発現制御配列として、ベクターＤＮＡは、プロモーター、転写の開始及び停止及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列及び場合によっては、エンハンサー及びさらに調節配列を含んで成る。広範囲の種類のプロモーター配列が、宿主細胞の性質に依存して使用され得る。強く且つ同時に、十分に調節されるプロモーターが最っとも有用である。翻訳の開始のための配列は、たとえばシャイン・ダルガーノ配列である。転写の開始及び停止及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列は、ウィルスｃＤＮＡ又はたとえば発現宿主からの真核ｃＤＮＡの非コード５′−領域及び３′−領域からそれぞれ利用できる。エンハンサーは、ゲノム起原又はたとえばシミアンウィルス、ポリオーマウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、Ｍｏｌｏｎｅｙ肉腫ウィルス又は特にヒトサイトメガロウィルスに由来するウィルス起原の転写−刺激ＤＮＡ配列である。
【００６２】
ベクターＤＮＡの種々のＤＮＡセグメントは操作可能的に連結され、すなわちそれらは隣接し、そしてお互い機能的な関係に配置されている。
Ｅ．コリ株における複製及び発現のために適切であるベクターの例は、バクテリオファージ、たとえばλバクテリオファージの誘導体又はプラスミドである。適切なベクターは、完全なレプリコン、マーカー遺伝子、制限エンドヌクレアーゼのための認識配列（その結果、外来性ＤＮＡ及び適切には、発現制御配列がそれらの部位で挿入され得る）、及び場合によってはシグナル配列、及びエンハンサーを含んで成る。本発明の発現ベクターは、ＤＮＡがプロモーターにより制御されている、上記で定義された適切なプロモーター及びＤＮＡ構造体を含んで成る発現カセットを含んで成る。
【００６３】
微生物プロモーターは、感温性リプレッサーにより制御されるバクテリオファージλの強い左方向プロモーターＰL である。Ｅ．コリプロモーター、たとえばｌａｃリプレッサーにより調節され、そしてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドにより誘発されたｌａｃ（ラクトース）プロモーター、ｔｒｐリプレッサーにより調節され、そしてトリプトファン飢餓により誘発されたｔｒｐ（トリプトファン）プロモーター、及びｌａｃリプレッサーにより調節されたｔａｃ（ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）である。
【００６４】
酵母における複製及び発現のために適切であるベクターは、酵母複製開始部及び酵母のための選択遺伝子マーカーを含む。そのようなベクターの１つのグループは、いわゆる、複製の起点としてのａｒｓ配列（自立性複製配列）を含む。それらのベクターは、形質転換の後、酵母細胞内での染色体外に保持され、そして自立的に複製される。さらに、サッカロミセス  セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの２μのプラスミドＤＮＡのすべて又は一部を含むベクターが使用され得る。そのようなベクターは、細胞内にすでに存在する２μのプラスミド中に組換えにより組込まれ、又は自立的に複製するであろう。２μの配列は、高い形質転換頻度及び高いコピー数が達成される予定である場合に特に適切である。
【００６５】
酵母における発現のために適切である発現制御配列は、高く発現された酵母遺伝子の配列である。従って、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨ１又はＡＤＨII遺伝子、酸ホスファターゼ（ＰＨ０３又はＰＨ０５）遺伝子、イソシトクローム遺伝子、又は解糖路に関与するプロモーター、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のためのプロモーターが使用され得る。
【００６６】
哺乳類宿主細胞のために適切なプロモーターは、ヒト免疫グロブリン、又はウィルス、たとえばＳＶ４０、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）、パポーウィルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）又はマウス又はヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）から得られる。ヒトＣＭＶプロモーターが好ましい。他方、ベクターは、哺乳類発現生成物、たとえばアクチン、コラーゲン、ミオシン等からのプロモーター、又は天然のプロモーター、及び免疫グロブリン遺伝子配列に通常、関係する制御配列を含むことができる。
【００６７】
ベクターは真核及び原核宿主の両者のために適切である。本発明のＤＮＡ分子が調製されれば、それは便利には、適切な発現ベクター中にトランスファーされ得る。適切なプロモーター、又はＨ鎖又はＬ鎖不変部をコードする遺伝子を含んで成る発現ベクターは市販されている。
Ｌ鎖及びＨ鎖のための遺伝子構造物は、２種のベクターの助けにより宿主細胞中に連続的に又は同時にトランスファーされる。他方、Ｈ及びＬ鎖の両者は、同じハイブリッドベクター中にクローン化され、そして宿主細胞中に単一構造体として１段階方法で導入される。第３の方法は、連結されていないＤＮＡフラグメントの同時トランスフェクションを利用する。
【００６８】
所望する再形状化されたヒト抗体をコードする組換えＤＮＡは、たとえば形質転換された宿主細胞を培養することによって調製され得る。
特に、そのようなＤＮＡは、
ａ）ＩｇＥに対して特異的な再形状化されたヒト抗体の可変Ｈ及び／又はＬ鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを調製し；
ｂ）ゲノムライブラリィーからＤＮＡを単離し、そして抗体の不変領域をコードする所望するＤＮＡをＤＮＡプローブを用いて選択することによって、ヒト抗体のＨ及び／又はＬ鎖不変領域をコードするＤＮＡを調製し；
ｃ）段階ａ）のＤＮＡ又は段階ａ）及びｂ）のＤＮＡを適切なハイブリッドベクター中に導入し；
ｄ）得られたハイブリッドベクターを受容宿主細胞にトランスファーし、又は所望する遺伝子をコードするＤＮＡを回収し、そして適切な受容宿主細胞中に連結されていないＤＮＡをトランスファーし；
ｅ）形質転換された宿主細胞を選択し、そして培養し、そして場合によっては；
ｆ）所望するＤＮＡを単離することを含んで成る方法により調製され得る。
【００６９】
上記方法の段階ｂ）に従ってのゲノムヒトＤＮＡが、適切なヒト組織、好ましくはヒト胎盤又はヒト胎児肝細胞から当業界において知られている方法に従って単離される。ゲノムＤＮＡライブラリィーが、適切な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化によりそれから構成される。そのゲノムＤＮＡライブラリィーがたとえばニトロセルロース膜上で複製され、そして対象のＤＮＡ配列のためのＤＮＡプローブによりスクリーンされる。所望するＤＮＡは、ＰＣＲ技法を用いて増幅され得る。
【００７０】
組換えＤＮＡのトランスファー、たとえばハイブリッドベクターのトランスファー及び形質転換された細胞の選択が下記に説明される。
さらに、本発明は、上記組換えＤＮＡにより形質転換された適切な宿主細胞、すなわち本発明の所望する再形状化されたヒト抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡ及び／又はＬ鎖をコードするＤＮＡにより形質転換される宿主細胞にも関する。宿主細胞は細胞当たり多数のベクターのコピーを含むことが好ましい。
【００７１】
本発明の宿主細胞は、インビトロ培養できるべきである。適切な宿主細胞は原核又は真核起原のものであり、そして細菌細胞、特にＥ．コリ、酵母、たとえばサッカロミセス  セレビシアエ又は哺乳類細胞を包含する。官能テトラマー抗体の生成のための適切な環境を提供するためには、真核、特に哺乳類又は酵母起源の宿主細胞が好ましい。なぜならば、官能テトラマー抗体分子の生合成は正しい新生ポリペプチド鎖折りたたみ及びアセンブリーを必要とする。原核宿主、特にＥ．コリは、本発明の抗体フラグメント、たとえばＦａｂ−及びＦｖ−フラグメントの生成のために使用され得る。
【００７２】
適切な宿主の例は、制限又は変性酵素を欠く又はほとんど有さない微生物、たとえば細菌、特にＥ．コリの株、及び酵母、たとえばサッカロミセス  セレビシアエである。
本発明の好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞、たとえばＣＯＳ−７細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胎児肺細胞Ｌ−１３２及びリンパ起原の哺乳類細胞、たとえばリンパ腫、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマ又はクオドローマ細胞である。
【００７３】
それらの宿主細胞は、２つの別々のベクターの助けにより連続的に又は同時にトランスファーされ、又はこれまで示されたように二重−構造体（Ｌ−鎖／Ｈ−鎖）ベクターを用いての一段階方法によりトランスファーされた、Ｌ鎖遺伝子構造体のみにより、Ｈ鎖遺伝子構造体のみにより又は両者によりトランスフェクトされる。他方、連結されていない遺伝子構造体は、宿主細胞中に連続的又は同時にトランスフェクトされ得る。
【００７４】
上記のような再形状化されたヒト抗体を分泌する両遺伝子構造体によりトランスフェクトされた宿主細胞、特に細胞系ＥＨ３１．８が好ましい。
本発明の宿主細胞の追加の例は、本発明の抗体の高レベルの発現を促進するように追加のＤＮＡ要素を組込む、Ｈ−及びＬ−鎖遺伝子構造体の他の配向を含む類似する組換えプラスミドによりトランスフェクトされた細胞である。
【００７５】
本発明の宿主細胞は、遺伝的に安定しており、一定した特異性の本発明の再形状化されたヒト抗体を生成し、そして好ましくは分泌し、そして強く凍結された培養物を融解し、そして再クローン化することによって活性化され得る。
形質転換された宿主細胞は、当業界において知られている方法により、同化可能な炭素源、たとえば炭水化物、たとえばグルコース又はラクトース、窒素源、たとえばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、又はそれらの分解生成物、たとえばペプトン、アンモニウム塩又は同様のもの、及び無機塩、たとえばスルフェート、リン酸及び／又は炭酸ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムを含む液体培地において培養される。その培地は、さらに、たとえば増殖促進物質、たとえば微量元素、たとえば鉄、亜鉛、マンガン及び同様のものを含む。
【００７６】
培地は好ましくは、選択圧力を付与し、そして形質転換されていない又はハイブリッドベクターを損なった細胞の増殖を防ぐために選択される。従って、たとえば、抗生物質が、ハイブリッドベクターがマーカーとして耐抗生物質性遺伝子を含む場合、培地に添加される。たとえば、必須アミノ酸において栄養要求性であり、そしてハイブリッドベクターが宿主欠損を補足する酵素をコードする遺伝子を含む宿主細胞が使用される場合、前記アミノ酸を欠く最少培地が、形質転換された細胞を培養するために使用される。
【００７７】
培養は、当業界において知られている方法によりもたらされる。培養条件、たとえば温度、培地のpH値及び発酵時間が、本発明のポリペプチド又は誘導体の最大力価が得られるように選択される。従って、Ｅ．コリ又は酵母株は好ましくは、約２０℃〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度及び４〜８、好ましくは約７のpHで、約４〜３０時間、好ましくは本発明のポリペプチド又は誘導体の最大収率が達成されるまで、振盪又は撹拌しながら、含浸培養により好気性条件下で培養される。
【００７８】
細胞密度が十分な値に達した場合、培養は中断され、そしてポリペプチド又は誘導体が単離され得る。ハイブリッドベクターが適切な分泌シグナル配列を含む場合、ポリペプチド又は誘導体が、培養培地中に形質転換された細胞により直接的に分泌される。さもなければ、細胞は、たとえば界面活性剤、たとえばＳＤＳ，ＮＰ−４０（ＴＭ），Ｔｒｉｔｏｎ（ＴＭ）又はデオキシコール酸により破壊されるべきであり、リゾチーム又は同様に作用する酵素により溶解されるべきである、又は浸透ショック又は超音波により破壊されるべきである。細胞の破壊はまた、シグナル配列が細胞周辺に所望するタンパク質の分泌を指図する場合に必要とされるであろう。酵母が宿主微生物として使用される場合、細胞壁は、ダルコシダーゼによる酵素的消化により除去され得る。他方又はさらに、機械的力、たとえば剪断力（たとえばＦｒｅｎｃｈプレス、Ｄｙｎｏミル及び同様のもの）又はガラスビーズ又は酸化アルミニウムと共に振盪又はたとえば液体窒素における交互の凍結、及びたとえば３０℃〜４０℃での融解並びに超音波処理を用いて、細胞を破壊することができる。
【００７９】
タンパク質、核酸及び他の細胞成分を含む、細胞の分解の後に得られた混合物の遠心分離の後に得られた細胞上清液又は溶液は、それ自体既知の態様で、本発明のポリペプチドを含むタンパク質において富化される。従って、たとえばほとんどの非タンパク質成分は、ポリエチレンイミン処理により除去され、そして本発明のポリペプチド及び誘導体を含むタンパク質はたとえば、上記方法により単離される。
【００８０】
本発明はまた、上記適切な受容宿主細胞が本発明の１又は複数のベクターにより形質転換され、そしてその形質転換された細胞が選択されることを特徴とする、形質転換された宿主細胞の調製方法にも関する。
微生物の形質転換は、たとえばＳ．セレビシアエ（Ａ．Ｈｉｎｎｅｎなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９，１９７８）及びＥ．コリ（Ｍ．Ｍａｎｄｅｌなど．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９，１９７０）に関して、従来のようにして行なわれる。
【００８１】
従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換方法は、たとえばＤＮＡ摂取を可能にするために細胞のＣａ2+前処理、及びハイブリッドベクターと共にインキュベートを包含する。形質転換された細胞の続く選択は、たとえばベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存する親細胞からの形質転換された細胞の分離を可能にする選択培地に細胞をトランスファーすることによって達成され得る。好ましくは、ベクターを含まない細胞の増殖を可能にしない増殖培地が使用される。酵母の形質転換はたとえば、グルコシダーゼによる酵素細胞壁の酵素的処理、ポリエチレングリコール及びＣａ2+イオンの存在下でのベクターによる前記得られたスフェロプラストの処理、及び前記スフェロプラストを寒天に埋め込むことによって前記細胞壁の再生を含んで成る。好ましくは、再生寒天は、上記形質転換された細胞の同時での再生及び選択を可能にする手段で調製される。
【００８２】
高等真核起原の細胞、たとえば哺乳類細胞系の形質転換は、好ましくはトランスフェクションにより達成される。トランスフェクションは、従来の技法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、細胞核中へのマイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、すなわち細胞膜の透過性を一時的に高める短い電気パルスによるＤＮＡの導入、又は同様の手段により従われる。トランスフェクションは、ヘルパー化合物、たとえばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコール又は同様のもの、又はベクターＤＮＡ及びリン酸カルシウムの同時沈殿物の存在下で行なわれ得る。
【００８３】
トランスフェクション工程の後、トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションのために使用されるＤＮＡの選択マーカーに適合する選択方法の助けにより同定され、そして選択される。選択マーカーは、重金属、たとえば銅又は抗生物質、たとえばＧ−４１８（ゲネチシン、ネオマイシン−誘導体）又はヒグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、又は宿主細胞の遺伝的損傷、たとえばチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又は同様のものの不在を補足する遺伝子を含む。たとえば、トランスフェクションのために使用されるＤＮＡがゲネチシン耐性のためのマーカーを含む場合、形質転換された細胞は、抗生物質ゲネチシンの存在下での培養により形質転換された細胞から同定され、そして分離される。
【００８４】
本発明の再形状化されたヒト抗体又はその誘導体は、特に体液、たとえば血清における、インビトロでの及びインビボでのＩｇＥの定性及び定量決定のために有用である。
たとえば、再形状化されたヒト抗体又はその誘導体は、ＩｇＥの抗原決定基と前記抗体のパラトープとの間の結合相互作用による既知のいづれかのイムノアッセイに使用され得る。そのようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素、イムノフルオレセンス、化学ルミネセンス、免疫沈殿、ラテックス凝集又は血球凝集イムノアッセイである。
【００８５】
本発明の再形状化されたヒト抗体は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）においてそれ自体で又は放射性ラベルされた誘導体の形で使用され得る。ＲＩＡのいづれか既知の変法、たとえば可溶相（均質）ＲＩＡ、固相（不均質）ＲＩＡ、ＩｇＥの直接的な又は間接的な（競争）決定による単一ＲＩＡ又は二重（サンドイッチ）ＲＩＡが使用され得る。
【００８６】
そのようなラジオイムノアッセイの例はサンドイッチＲＩＡであり、ここで適切なキャリヤー、たとえばマイクロタイタープレート又は試験管、たとえばポリスチレン、ポリプロピレン又はポリ塩化ビニルのプラスチック表面、又はプラスチックビーズ、フィルター紙、デキストラン等、酢酸セルロース又はニトロセルロースシート、磁気粒子又は同様のものが、単純な吸着により又は場合によってはキャリヤーの活性化の後、本発明の抗体により被覆される。次に、ＩｇＥ及び最終的に、抗原とまた反応し、そしてたとえば 125Ｉにより放射性ラベルされる再形状化された抗体を含む試験溶液が添加される。試験溶液におけるＩｇＥの量は、結合された再形状化抗体の量に直接的に比例し、そしてキャリヤーに結合される放射能を測定することによって決定される。
【００８７】
本発明の再形状化されたヒト抗体は、酵素イムノアッセイにおいてそれ自体で又は酵素接合された誘導体の形で使用され得る。上記のように、ラジオイムノアッセイに関しては、酵素イムノアッセイのいづれか既知の変法が使用され得る。
試験は、放射性ラベルの代わりに酵素ラベルを用いて上記ラジオイムノアッセイに類似する態様で行なわれる。試験溶液に存在するＩｇＥの量に対応する、形成された免疫複合体の量は、酵素基質溶液の添加により決定される。酵素基質反応は、たとえば眼又は光学的測定装置により観察され得る色の変化をもたらす。
【００８８】
本発明の再形状化された抗体は、化学発光アッセイにおいてそれ自体で又は化学発光マーカーと接合された誘導体の形で使用され得る。上記のように、ラジオイムノアッセイに関しては、化学発光アッセイのいづれか既知の変法が使用され得る。
試験は、放射性ラベルの代わりに化学発光ラベルを用いて上記ラジオイムノアッセイに類似する態様で行なわれる。試験溶液に存在するＩｇＥの量に対応する、形成された免疫複合体の量は、発光のきっかけをつくる化合物、たとえばＨ2 Ｏ2 及びＮａＯＨを添加し、そして光学的測定装置により光の発光を測定することによって決定される。
【００８９】
ＩｇＥの決定のためへの上記のような本発明の再形状化されたヒト抗体又はその誘導体の使用はまた、それ自体既知の他のイムノアッセイ、たとえば免疫螢光アッセイ、抗体被覆された又は抗原被覆されたラテックス粒子によるラテックス凝集、抗体被覆された又は抗原被覆された赤血球による血球凝集、抗体被覆された光学繊維を用いての弱い光アッセイ及び結合の出来事を電気的又は光学的シグナルに転換する他の直接的に作用するイムノセンサーを包含する。
【００９０】
本発明の再形状化されたヒト抗体又はその誘導体はまた、好ましくはプラーク形成細胞（ＰＦＣ）アッセイにおいて、ＩｇＥ産生細胞の決定のためにも有用である。
本発明のプラーク形成アッセイは、固相イムノアッセイの原理に基づかれている。固相イムノアッセイのいづれか既知の変法、たとえばラジオイムノアッセイ、酵素、免疫螢光又は化学発光イムノアッセイ又は同様の方法が使用され得る。
【００９１】
そのようなプラーク形成細胞アッセイの例は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づくＰＦＣアッセイである。ＩｇＥ−産生細胞の合計量の決定のためには、サンドイッチＲＩＡのための上記のような適切なキャリヤーが本発明の抗体により被覆される。遠心分離、濾過又は同様の手段によりＩｇＥ−産生細胞を含む体液から得られるそのような細胞の懸濁液、及びＩｇＥに対して特異的な第２ポリクローナル又はモノクローナル抗体、たとえば酵素、たとえばアルカリホスファターゼと接合される、第１抗体以外のＩｇＥの異なったエピトープを認識する本発明の抗体が添加される。試験懸濁液におけるＩｇＥ−産生細胞の量は、結合された第２抗体の量に直接的に比例し、そして着色された反応生成物の進行をもたらす適切な基質溶液を添加し、そして着色されたスポット（プラーク）を計数することによって決定される。特定のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを生成するＩｇＥ−産生細胞の画分の決定のためには、キャリヤーがまず、上記のような細胞懸濁液の添加の前、アレルゲン又はアレルゲンの吸着可能接合体により被覆される。アレルゲンに対して向けられる試験懸濁液におけるＩｇＥの画分は表面結合されたアレルゲンに結合し、そして酵素により接合される本発明の抗体、及び着色された反応生成物の進行をもたらす適切な基質溶液を添加、そして着色されたスポット（プラーク）を計数することによって決定される。
【００９２】
さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体、及び場合によっては、他のモノクローナル又はポリクローナル抗体及び／又は付随物を含んで成るＩｇＥ及び／又はＩｇＥ産生細胞の定性及び定量決定のための試験キットにも関する。
ラジオイムノアッセイのための本発明の試験キットは、たとえば適切なキャリヤー、１又は複数のモノクローナル抗体の任意に凍結乾燥せしめられた又は濃縮された溶液、放射性ラベルされたモノクローナル抗体又は放射性ラベルされたＩｇＥの溶液、ＩｇＥの標準溶液、緩衝溶液及び場合によっては、非特異的吸着及び凝集体形成を防ぐための界面活性剤、ピペット、反応容器、検量曲線及び同様のものを含む。試験キットの１又は複数のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体である。特定のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを生成するＩｇＥ−産生細胞の決定のための試験キットは、さらに、アレルゲンの溶液又はアレルゲンの吸着性接合体の溶液を含む。
【００９３】
酵素イムノアッセイのための本発明の試験キットは、たとえば適切なキャリヤー、１又は複数のモノクローナル抗体の任意に凍結乾燥され又は濃縮された溶液、酵素ラベルされたモノクローナル抗体、酵素ラベルされたＩｇＥ、ポリクローナル抗−ＩｇＥ血清及び／又は抗−ＩｇＥ抗体を認識し、そして結合する酵素ラベルされたモノクローナル又はポリクローナル抗体の任意に凍結乾燥され又は濃縮された溶液、固体又は溶解された形での酵素基質、ＩｇＥの標準溶液、緩衝溶液、界面活性剤、ピペット、反応容器、検量曲線、色彩基準表及び同様のものを含む。試験キットの中の１又は複数のモノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体である。特定のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを生成するＩｇＥ−産生細胞の決定のための試験キットはさらに、アレルゲンの溶液又はアレルゲンの吸着性接合体の溶液を含む。
【００９４】
さらに、本発明の再形状化されたヒト抗体及びそれらの誘導体は、いづれかの既知の従来の染色技法、たとえば流動細胞計測分析により表面ＩｇＥ陽性（ｓＩｇＥ+ ）Ｂ細胞の定質及び定量決定のために使用され得る。
さらに、本発明のモノクローナル抗体及び／又はそれらの誘導体は、アレルギーの処理及び／又は予防のために有用である。
【００９５】
治療効果は、本発明の再形状化されたヒト抗体及びその誘導体の特定の特徴によりＩｇＥ免疫応答をダウンレギュレートすることによって達成される。
それらは、遊離ＩｇＥを結合し、そしてＦｃE レセプターＩ又はIIを担持する細胞、特に肥満細胞及び好塩基性細胞へのＩｇＥの結合を阻害することによって、形成されたＩｇＥを中和できる。
【００９６】
それらは、表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞（ｓＩｇＥ+ Ｂ細胞）の表面上に発現されるＩｇＥを認識し、そして結合し、そして従って、アレルゲンへの第２の暴露の後、ＩｇＥ生成をもたらす“記憶プール”を形成するそのような細胞の集団の消耗において有用である。選択された免疫グロブリン（サブ）クラスの再形状化されたヒト抗体の生成の可能性は、ｓＩｇＥ+ Ｂ細胞の特定の殺害をもたらす宿主免疫システムの細胞機構の活性化を可能にする。これはまた、細胞毒性薬物を標的細胞に運ぶであろう、そのような細胞毒性薬物と本発明のモノクローナル抗体との接合体により達成され得る。
【００９７】
本発明の再形状化されたヒト抗体及びそれらの誘導体はＦｃE レセプターＩ又はIIを担持する細胞、たとえば肥満細胞及び好塩基性細胞上での細胞親和性ＩｇＥを認識しないので、それらはそれらの細胞により仲介体開放を誘発しない。
本発明のモノクローナル抗体及びその誘導体はまた、それらは免疫応答におけるＩｇＥの形成に対して有意な阻害効果を有するので、長く続く治療効果を有する。
【００９８】
結果的に、本発明の再形状化されたヒト抗体及びそれらの誘導体は、たとえばＩｇＥ抗体及び表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞の除去、従ってアレルギー応答を排除し、そしてＩｇＥ形成を阻害することによって、徴候を処理するよりもむしろ、アレルギーの根底にある原因に実際的に影響を及ぼす処理を提供する。前記処理は前進する反復された用量を必要とせず、そして本発明の再形状化されたヒト抗体及びそれらの誘導体は、アレルギーの徴候の検出の前、投与による予防処理のために使用され得ることが特に好都合である。
【００９９】
それらはヒトに投与される場合、弱い免疫原性又は非免疫原性であるので、本発明の再形状化されたヒト抗体及びその誘導体は特に、インビボ診断、治療用途及び予防のために有用である。好ましくは、再形状化されたヒト抗体は、治療目的のために投与される場合、自己タンパク質としてヒトにより許容される。
哺乳類のための毎日の治療的用量は、患者の状態及び適用の態様に依存して、体重１kg当たり約０．１mg〜１０mgである。
【０１００】
本発明はまた、本発明の再形状化されたヒト抗体及び／又はその誘導体を含んで成る医薬調製物にも関する。医薬調製物は、たとえば治療的に有効量の再形状化されたヒト抗体及び／又はその誘導体及び無機又は有機固体又は液体の医薬キャリヤーを含んで成る。
非経口適用及び吸入のための医薬調製物が好ましい。筋肉内皮下又は静脈適用又は吸入のための調製物は、たとえば凍結乾燥又は濃縮された調製物からの使用のすぐ前、等張水溶液又は懸濁液により調製される。医薬調製物は、滅菌され、そしてたとえば成分を保存し、安定化し、湿潤し、乳化し又は溶解するためのアジュバント、浸透圧の調整のための塩、緩衝液及び／又は粘性を調節するための化合物、たとえば、ナトリウムカルボキシセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン又はゼラチンを含む。それらは、たとえば従来の混合、溶解又は凍結乾燥による当業界において知られている方法により調製され、そして約０．０１％〜約５０％の活性成分を含む。注射のための調製物は、加工され、アンプル、バイアル又は使い捨て注射装置中に満たされ、そして当業界において知られている方法に従って滅菌状態下で密封される。
【０１０１】
本発明の医薬調製物は、ヒトにおけるアレルギー反応、特に、アレルギー性ぜん息、アレルギー性鼻炎及びアトピー性エグゼマ（ｅｘｃｅｍａ）に関連する即座タイプの過敏性に特有な反応の予防及び処理のために使用され得る。
本発明は特に、再形状化されたヒト抗体、組換えＤＮＡ、形質転換された宿主細胞、及び例に記載されるようなその調製方法に関する。次の例は本発明を例示するものであって、本発明を制限するものではない。
【０１０２】
略語：ＶL ＝Ｌ鎖可変部；ＶH ＝Ｈ鎖可変部；ＣＤＲ＝相補的決定領域；ＦＲ＝骨格領域；ＨＣＭＶ＝ヒトサイトメガロウィルス。
材料：
ヒト血漿から精製された、ｋＬ鎖を有するヒトＩｇＧは、すべてＳｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入された（ＩｇＧ１：Ｉ−３８８９；ＩｇＧ２：Ｉ−４１３９；ＩｇＧ３：Ｉ−４３８９及びＩｇＧ４：Ｉ−４６３９）。ヒト骨髄腫血清からのヒトＩｇＭ（カタログ番号ＰＨＰ００３）及びヒトＩｇＤ（カタログ番号ＰＨＰ００５）は、Ｓｅｒｏｔｅｃから得られた。ヒト血漿からのＩｇＡ（ＩｇＡ１：４００１０５；ＩｇＡ２：４００１０８）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから得られた。
【実施例】
【０１０３】
例１：モノクロナール抗体Ｃ２の１ＶL 及びＶH の分子モデル構築
ヒトＩｇＥを認識するマウスのモノクロナール抗体Ｃ２１のＶL 領域（配列番号１）及びＶH 領域（配列番号２）の分子モデルは、ＶL については、高い相同性のマウスの抗リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ，Ｅ．Ｗ．，Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｒ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：５９３８；Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ中に配列３ＨＦＭと称されている、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １１２，５３５−５４２（１９７７））の解析構造に基づいて構築され、そして、ＶH については、マウスの抗リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−５（Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．，Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ，Ｅ．Ｗ．，Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｉｎｚｅｌ，Ｂ．Ｃ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｒ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：８０７５；前記のＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ中に配列２ＨＦＭと称されている）の解析構造に基づいて構築される。ｍＡｂ  Ｃ２１及びＨｙＨＥＬ−１０又はＨｙＨＥＬ−５のＬ鎖及びＨ鎖の可変領域は、それぞれ、９１％と９０％のアミノ酸の同一性を有している。このモデルは、ＵＮＩＸオペレーティング・システム下に作動するＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩＲＩＳ  ４Ｄ上で、そして分子モデル構築パッケージＱＵＡＮＴＡ（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）を使用して構築される。このフレームワーク内の同一残基は保持され；非同一残基はＱＵＡＮＴＡの蛋白モデル構築能力に取り込まれた最大重複手段（Ｓｎｏｗ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ  Ａｍｚｅｌ，Ｌ．Ｍ．，１９８６，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １：２６７）を用いて置換される。
【０１０４】
マウスＣ２１抗体由来の、ＶL 領域の相補的決定領域ＣＤＲ１（１１），ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＣＤＲ３（Ｌ３）並びにＶH 領域の相補的決定領域ＣＤＲ１（Ｈ１）及びＣＤＲ２（Ｈ２）は、以前に仮定された標準的な形態（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．，Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ａｉｒ，Ｇ．，Ｓｈｅｒｒｉｆ，Ｓ．，Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．，Ｔｕｌｉｐ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｐｉｎｅｌｌｉ，Ｓ．，Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７）に一致する。これらのループの主鎖のねじれ角は、元の抗体の構造内のもの（Ｌ−１〜Ｌ−２のためのＨｙＨＥＬ−１０及びＨ−１〜Ｈ−２のためのＨｙＨＥＬ−５）と同じに保たれている。ＶH 領域のＣＤＲ３（Ｈ３）については、標準的な構造は存在せず、それ故、異なってモデル化される。３０の候補ループが、ＱＵＡＮＴＡ内で実行される如き頒布されたアルゴリズム（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ａｎｄ  Ｔｈｉｒｕｐ，Ｓ．，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：８１９−８２２）を使用して、９１の高分解蛋白構造から抽出され、そして最も良い変異体が肉眼により選ばれる。このループは、Ｈ３  ＣＤＲのいずれかの側の上の３つのフレームワーク残基上で固定されている。従って、ＶH 領域のＨ３は、ＣＤＲ３（Ｌ３）に大まかに対応している残基８７〜１０６の領域内のＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ蛋白ＲＨＥ（Ｆｕｒｅｙ，Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｃ．，Ｙｏｏ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｎ，Ｍ．，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６７：６６１−６９２）上でモデル化される。
【０１０５】
好ましくない原子接触を緩和し、そしてファン・デル・ワールス力及び静電相互作用を最適化するために、ＱＵＡＮＴＡ内で実行される如きＣＨＡＲＭポテンシャル（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｏｌａｆｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｍ．，１９８３，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７）を用いて、最も急な降下のそして結合勾配エネルギーの細小化に供される。
【０１０６】
例２：再形成化されたヒトＣ２１のＶL 及びＶH 領域の設計
再形状化されたヒトＣ２１のＶL 及びＶH 領域のデザインは、第一に、ＫＡＢＡＴデータベース（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍｅｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）に見られるようなヒトＶL 及びＶH 領域の上記共通配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（変異体Ｃ２１−Ｌ１，Ｃ２１−Ｌ２，Ｃ２１−Ｌ３，Ｃ２１−Ｈ１及びＣ２１−Ｈ３）に基づいている。さらに、２つの、より再形状化されたヒトＣ２１のＶH 領域（Ｃ２１−Ｈａｙｌ及びＣ２１−Ｈａｙ３）は、個々のヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）に基づいている。
【０１０７】
共通性に基づく再形状化ヒトＣ２１可変領域の設計のために、マウスＣ２１抗体からのＶL 及びＶH 領域のアミノ酸配列を、上記ＫＡＢＡＴデータベースからのヒト抗体のＶL 及びＶH 領域のための上記共通配列と比較する。この分析により、マウスＣ２１  ＶL 領域及びマウスＣ２１  ＶH 領域が、それぞれ、ヒト・カッパＶL サブグループIII 共通配列（７７％のアミノ酸配列が同じ）及びヒトＶH サブグループＩ共通配列（７１％のアミノ酸配列が同じ）に最も似ていることが、明らかにされる。これらのヒト共通配列を、ネズミＣ２１のＣＤＲ及びその対応共通配列のヒトＦＲを含む、上記の再形状化されたヒトＣ２１のＬ及びＨ鎖可変領域Ｃ２１−Ｌ０及びＣ２１−Ｈ０を設計するために使用する。良好な抗原結合を達成するのに潜在的に重要であり、そしてＶL ／ＶH パッキングに対して臨界的であることができるであろうフレームワーク残基を同定するために、マウスＣ２１可変領域の分子モデル（例１）を使用する。このグラフィック分析の結果として、ＦＲ内の著名なヒト共通アミノ酸のいくつかを、それらの対応するマウスＣ２１残基と交換する。これらの交換は、以下の範疇の１つに陥らない場合には、ヒト・フレームワーク領域内にのみあると考える。
〔１〕ヒト共通配列（ヒト・サブグループ１；ＨＳＧ１）は、この位置で好まれる主要なアミノ酸を全く示さないが、元のマウスＣ２１配列中に見出されたアミノ酸は、その対応するヒト免疫グロブリン可変領域サブグループの少なくとも１つの別個の配列内に存在する。例えば、ＨＳＧ１は、アミノ酸残基１９に共通配列をもたないと記載されている（Ｋａｂａｔ他、前記）、但しいくつかのヒト抗体は、この位置にＬｙｓ残基をもっている。Ｌｙｓは、上記Ｃ２１配列中にもあるので、それが、上記再形状化抗体中に保持されている。
〔２〕フレームワーク位置でのアミノ酸は、仮定された標準的な構造の一部分であり、上記ＣＤＲ又は超可変領域ループの構造を決定することにおいて重要であり、そしてそれ故、その抗原結合部位の形状及び完全性を維持するために必須であると思われている（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１；Ｃｈｐｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９、前記）。
【０１０８】
これらの規則に従って、上記再形状化されたヒトＬ鎖及びＨ鎖の可変領域Ｃ２１−Ｌ０及びＣ２１−Ｈ０内の４つ及び６つのアミノ酸を、ヒト共通配列と比べたときに、交換し、変異体Ｃ２１−Ｌ１′及びＣ２１−Ｈ１を生じさせる。この交換されたアミノ酸の位置は、Ｃ２１−Ｌ１′及びその以下に決定された修飾変異体Ｃ２１−Ｌ１（配列番号５）中の、１，３，４９及び６０である。Ｃ２１−Ｈ１（配列番号１１）中では、交換アミノ酸の位置は、３８，４０，６７，７０及び８７である。上記の規則の例外は、上記再形状化されたヒトＣ２１  ＶH 領域の位置７６であり、当該位置で、我々は、上記ヒトＶH 共通配列中に見つけられるような、この位置のための最も頻度の多いヒト・アミノ酸（ｔｈｒ）を選択する。
【０１０９】
ＶL 及びＶH の更に新しい変異体は、（それぞれ、Ｃ２１−Ｌ１及びＣ２１−Ｈ１に比較しての）以下の変更を含んでいる：
Ｃ２１−Ｌ２（配列番号７）：位置６０でのアスパラギン酸（セリンの代わり）Ｃ２１−Ｌ３（配列番号９）：位置１でのグルタミン酸（アスパラギン酸の代わり）；位置３でのバリン（ロイシンの代わり）；
Ｃ２１−Ｈ３（配列番号１３）：位置３８でのアルギニン（リジンの代わり）；位置４０でのアラニン（アルギニンの代わり）；位置６７でのアルギニン（リジンの代わり）；位置８７でのアルギニン（トレオニン）
Ｃ２１−Ｌ１′及びＣ２１−Ｈ１を用いたデータベース検索により、再形状化されたヒトＣ２１  ＶL 変異体Ｃ２１−Ｌ１′が、ヒト・カッパＬ鎖可変領域ＨＵＭＩＧ  ＫＡＦ（ＥＭＢＬ  ｄａｔａｂａｓｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．Ｍ．，Ｇｒａｍ，Ｈ．，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｇ．Ｆ．，Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｃａｐｒａ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｉｓｓｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｌ．，１９８８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：１５１１−１５１８）に最も似ている（９１％の配列が同じ）こと、並びに、再形状化されたヒトＣ２１  ＶH 変異体Ｃ２１−Ｈ１が、ヒトＨ鎖可変領域ＨＵＭＩＧ  ＨＡＹ（ＥＭＢＬ  ｄａｔａｂｅｓｅ、前記；Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎ，Ｈ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：２４９６−２５０１）に最も似ている（７８％の配列が同じ）ことが、明らかになる。これらの配列は、以下に、それぞれ、ＫＡＦ及びＨＡＹと称する。ＫＡＦ及びヒト・カッパＶL サブグループIII 共通配列のＦＲは、位置４９及び８５のみで異なる。位置４９では、その推定の抗原結合のために、その対応マウスＣ２１アミノ酸（リジン）が保持されている、しかるに、位置８５では、ヒトＶL  III共通アミノ酸であるバリンが、ＫＡＦ内にみられるメチオニンに交換されている。従って、Ｃ２１−Ｌ１′の変更された変異体は、Ｃ２１−Ｌ１（配列番号５）と名付けるが、個々のヒトＬ鎖可変領域ＫＡＦ（Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８、前記）に基づいている。それは、その中に位置８５でバリンの代わりにメチオニンが在るということにおいて、第一の変異体Ｃ２１−Ｌ１′とは異なっている。この再形状化された変異体Ｃ２１−Ｌ２（配列番号７）及びＣ２１−Ｌ３（配列番号９）も、位置８５にメチオニンをもっている。
【０１１０】
反対に、ヒトＨ鎖可変領域ＨＡＹ及びヒトＶH サブグループＩ共通配列のＦＲは、数カ所で異なっている。この個々のヒト抗体に高程度の類似性を示す再形状化されたヒトＣ２１  ＶH 領域を構築するために、再形状化されたヒトＣ２１  ＶH 領域の２以上の変異体を、ヒトＨ鎖可変領域ＨＡＹのＨ鎖可変領域由来のＦＲに基づき設計する。ＨＡＹを基礎とする再形状化されたヒトＣ２１  ＶH 変異体の構築は、再形状化されたヒトＣ２１変異体Ｃ２１−Ｈ１及びＣ２１−Ｈ３の、ＦＲ２及びＦＲ３内の、それぞれ、位置４３，４４，４８，７６及び７７での５つの変更を必要とする。これらのＨＡＹを基礎とする変異体を、それぞれ、Ｃ２１−Ｈａｙ１（配列番号１５）及びＣ２１−Ｈａｙ３（配列番号１７）と称する。ＨＡＹ及びヒトＶH サブグループＩ共通配列のＦＲ間の、位置３０及び７２での２つの追加の違いは、マウスＣ２１  ＶH 領域内のものとして保持され、そして交換されるものとして見なされていない。なぜなら、それらは、ＣＤＲの構造を定義している標準的な残基であるからである（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９、前記）。
【０１１１】
例３：ヒト化抗体遺伝子の設計及び構築
ヒト化抗体遺伝子カセットの設計のために、効率的な発現及びクローニングに必要な追加の配列を、得られたコード領域の５′−及び３′−末端に追加する。再形状化ヒトＣ２１抗体の効率的な発現のための真核生物のリーダー配列を、フレーム内で、設計されたヒト化可変領域に追加する。再形状化ヒトＣ２１  ＶL 領域のためのリーダー配列は、そこからの可変領域がＣ２１  ＶL 領域の再形状化のために使用されるヒト抗体ＫＡＦのカッパＬ鎖内で見つかったリーダー配列（Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８、前記）から得られる。再形状化ヒトＣ２１  ＶH 領域のためのリーダー配列は、ヒト抗体ＨＧ３  ＣＬ（Ｒｅｃｈａｖｉ，Ｇ．，Ｒａｍ，Ｄ．，Ｇｌａｚｅｒ，Ｌ．，Ｚａｋｕｔ，Ｒ．ａｎｄ  Ｇｉｖｏｌ，Ｄ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８０：８５５−８５９）、すなわち、ヒトＶH サブグループＩのメンバー（ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）のＨ鎖内に見つけられたリーダー配列から得られる。再形状化ヒトＣ２１  ＶL ／ＶH 領域のための、得られた蛋白配列を、次に、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内に見られるような、マウス配列のためのコドン慣用表（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｔａｂｌｅ）を使用して、ＤＮＡ配列に逆翻訳する。そしてまた、設計されたＤＮＡフラグメントに、その５′−末端で、真核生物の翻訳シグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，１８９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９４７−９５０）を、その３′−末端で、供与体のスプライジング部位（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ，Ｒ．，Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．，Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｋ．，Ｇａｎｎｏｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｐ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：４８５３−４８５７）を、そしてその設計された哺乳類発現ベクターへの便利なサグクローニングのためのＨｉｎｄIII （５′−末端）及びＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（３′−末端）を追加する。
【０１１２】
上記の再形状化ヒトＣ２１  ＶL 及びＶH 領域Ｃ２１−Ｌ１及びＣ２１−Ｈ１をコードする設計されたヒト化抗体遺伝子カセットを、次に、合成ＤＮＡポリヌクレオチドを使用した遺伝子合成により構築する。完全なＤＮＡフラグメントを、２０個のヌクレオチドにより、互いに重複する６つの領域に再分割する。それぞれの再形状化ヒトＣ２１可変領域遺伝子カセットのために、６つの５′−リン酸化及びＰＡＧＥ−精製ポリヌクレオチド、すなわち、Ｃ２１−ＬＡ（配列番号１９）、Ｃ２１−ＬＢ（配列番号２０）、  Ｃ２１−ＬＣ（配列番号２１）、Ｃ２１−ＬＤ（配列番号２２）、Ｃ２１−ＬＥ（配列番号２３）、Ｃ２１−ＬＦ（配列番号２４）、Ｃ２１−ＨＡ（配列番号２５）、Ｃ２１−ＨＢ（配列番号２６）、Ｃ２１−ＨＣ（配列番号２７）、Ｃ２１−ＨＤ（配列番号２８）、Ｃ２１−ＨＥ（配列番号２９）〜ＨＦ（配列番号３０）と名付けるものを、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡから購入する。次に、それらを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく遺伝子合成において組み立てる。５ピコモルのそれぞれのポリヌクレオチド（すなわち、ＬＡ〜ＬＦ）を、最初にアニーリングし、そして１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．３、１．５mMのＭｇＣｌ2 、５０mMのＫＣｌ、１０mMのβ−メルカプトメタノール、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０、０．０５％のＮＰ−４０（Ｍｅｒｃｋ，Ｚｕｅｒｉｃｈ）、２００μＭ／のｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｔ又はＣ）及び５ＵのＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１００μｌの反応液内に希釈する。温度段階は、Ｔｅｃｈｎｅ  ＰＨＣ−２温度サイクラーを使用して、９５℃／１分、５０℃／２分及び７２℃／４分である。この第一のサイクルの後、オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｃ２１−５′（配列番号３１）及びＣ２１−Ｌ３′（配列番号３３）又はＣ２１−Ｈ３′（配列番号３２）の５０ピコモルを所望の５′−及び３′−末端でハイブリダイズさせ、完全な長さのＤＮＡフラグメントを添加し、そして以下：９５℃／１分、６０℃／２分及び７２℃／２分、のサイクリング・パラメーターを使用する約２０サイクルのＰＣＲ反応において増幅する。次に、このＰＣＲ混合液を、クロロホルム１容量で１回抽出し、そして８Ｍ  ＬｉＣｌの１／１０容及びエタノールの３容の添加により、そのＤＮＡを沈殿させる。この沈殿ＤＮＡを、Ｈ2 Ｏに再溶解し、そして供給者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により示された条件下で、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩ制限酵素処理エンドヌクレアーゼにより処理する。所望のサイズのＤＮＡフラグメント（Ｃ２１−Ｌ１＝４１６塩基対及びＣ２１−Ｈ１＝４５９塩基対）を、１％アガロース／ＴＢＥ内で、電気泳動により精製し、そしてそのゲルから切除する。ゲル片をより小さなフラグメントに切断し、液体窒素中５分間で冷凍し、そして次に、マイクロ遠心分離機内の遠心分離（３０分間、１３６０００×ｇ）により、ガラスウールを通して溶出する。室温での、フェノール−クロロホルム抽出及びＬｉＣｌ／エタノール沈殿の後、上記の精製ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ制限フラグ��ントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  II  Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし、そしてコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからのＨＢ１０１株）にトランスフェクトする。正確なサイズのＤＮＡ挿入物を含むＫＳ＋Ｃ２１／Ｌ１又はＣ２１／Ｈ１のどちらかの多数のプラスミド・クローンを、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）を使用して配列決定する。このＤＮＡ配列内の点突然変異誘発及び／又は欠失を、異なったクローン間でのＤＮＡ制限酵素フラグメントの交換及び／又は頒布された手順（ｋａｍｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌａｕｆｓ，Ｊ．，Ｓｃｈｅｌｌ  Ｊ．ａｎｄ  Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ  Ｂ．，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：５４０４）に従うオリゴヌクレオチド特異的ＰＣＲ突然変異誘発により訂正する。正しいＤＮＡ配列を示すＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントを、次に、Ｌ又はＨ鎖発現ベクターにサブクローニングし、プラスミドＨＣＭＶ−カッパ−Ｃ２１／Ｌ１及びＨＣＭＶ−ガンマ１−Ｃ２１／Ｈ１（図１に示す）を創出する。ここでは、再形状化ヒトＬ又はＨ鎖可変領域をコードする上記のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントは、それぞれ、ヒト・カッパ及びガンマＩ定常領域をコードするＤＮＡに結合されている。両方のプラスミドは、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）、ＨＣＭＶエンハンサー・ドメイン、ＨＣＭＶプロモーター、及びアンピシリン選択遺伝子の原型を含んで成る（ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、前記）。
【０１１３】
再形状化ヒトＣ２１  ＶL 領域変異体Ｃ２１−Ｌ２及びＣ２１−Ｌ３を、ＰＣＲ反応の間に生じる組み換え事件（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．，Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．，Ｓａｉｋｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｓｙｍｐ．，５１：２６３  ａｎｄ  Ｙｏｌｏｖ，Ａ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．Ａ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３９８３）を利用するオリゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発により作りだす。オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｃ２１−５′（配列番号３１）、Ｌ／Ｄ６０ＳＬ（配列番号３５）、Ｌ／Ｄ６０Ｓ−ＳＬ（配列番号３６）（Ｃ２１−Ｌ２のための）、ＲＳＰ（配列番号３４）、Ｌ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３Ｌ（配列番号３７）、Ｌ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３Ｌ−ＳＬ（配列番号３８）（Ｃ２１−Ｌ３のための）及びＣ２１−Ｌ３′（配列番号３３）（Ｃ２１−Ｌ２及び−Ｌ３のための）を、２つのＬ鎖のＶ−領域変異体のそれぞれのための、２つのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅により作りだすために合成する。ターミナル・オリゴヌレクオチド・プライマー（Ｃ２１−５′，ＲＳＰ及びＣ２１−Ｌ３′）を除き、オリゴヌクレオチドは、所望のコドン変更の必要のある配列を取り込む。プライマー対ＲＳＰ及びＬ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３Ｌを除き、約５０ピコモルの適切なプライマー対を、約１０ngのＫＳ＋Ｃ２１／Ｌ１由来ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントと組合せ、３ユニットのＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ及び２５ＰＣＲ増幅サイクルを使用する（６０℃／２５秒、７２℃／４０秒及び９３℃／２５秒）。プライマー対ＲＳＰ及びＬ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３Ｌのために、約１５０ngのＫＳ＋Ｃ２１／Ｌ１プラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用し、３５サイクル（４０℃／３０秒、７２℃／１分及び９３℃／３０秒）を使用して所望のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅する。これらの反応の生成物を、アガロース・ゲル電気泳動により精製し、最初に結合させ、そして約５〜３０ngのそれぞれのＤＮＡフラグメントを、５ユニットのＶｅｎｔＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼにより増大させる（９５℃／１分、５０℃／２分及び７２℃／４分）。ターミナル・オリゴヌクレオチド・プライマーＣ２１−５′及びＣ２１−Ｌ３′を次に添加し、そしてその結合した完全な長さのＤＮＡフラグメントを、２５サイクル（９５℃／１分、５０℃／２分及び７２℃／２分）を使用してＰＣＲ増幅する。Ｃ２１−Ｌ２及びＣ２１−Ｌ３のためにＰＣＲ増幅されたＤＮＡを、次に、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩを使用した処理の後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  II  Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。次に、正しい配列を、前記のように、ＨＣＭＶ−ガンマ１−発現ベクターに転移させる。
【０１１４】
再形状化ヒトＣ２１  ＶH 領域変異体Ｃ２１−Ｈ３，Ｃ２１−Ｈａｙ１及びＣ２１−Ｈａｙ３を、Ｃ２１−Ｌ１及びＣ２１−Ｌ２のために記載された同様の方法で作りだす。これらのＣ２１  ＶH 領域変異体を得るために、オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｃ２１−５′，Ｈ／Ｒ３８Ｋ−Ａ４０Ｒ−Ｌ（配列番号３９）、Ｈ／Ｒ３８Ｋ−Ａ４０Ｒ−ＳＬ（配列番号４０）、Ｈ／Ｒ６７Ｋ−Ｌ（配列番号４１）、Ｈ／Ｒ６７Ｋ−ＳＬ（配列番号４２）、Ｈ／Ｒ８７Ｔ−Ｌ（配列番号４３）、Ｈ／Ｒ８７Ｔ−Ｓ（配列番号４４）、ＨａｙＦＲ２（配列番号４５）、ＨａｙＦＲ２−Ｓ（配列番号４７）、ＨａｙＦＲ３（配列番号４８）、ＨａｙＦＲ３Ｓ（配列番号４９）及びＣ２１−Ｈ３′を、ＤＮＡテンプレートとして、すなわち、異なった再形状化ヒトＣ２１のＶH 変異体のための所望のコドン変更を含む２本鎖ＤＮＡフラグメントとして、Ｃ２１−Ｈ１（Ｃ２１−Ｈ３及びＣ２１−Ｈａｙ１のための）及びＣ２１−Ｈ３（Ｃ２１−Ｈａｙ３のための）を使用したＰＣＲ増幅のために使用する。対応するアガロース・ゲル精製フラグメントを次にＰＣＲ組み換えし、前記のように、完全な長さのＤＮＡフラグメントを産生する。ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩによる処理、これに続く、前記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  II  Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へのクローニングの後に、ＨＣＭＶ−ガンマ１−発現ベクターにクローニングされる前にその正しい配列についてプラスミドのクローンをチェックする。
【０１１５】
例４：ＣＯＳ細胞中の組み換えプラスミドのトランジエント発現
再形状化ヒトＣ２１  Ｈ及びＬ鎖をコードする遺伝子を有するＨＣＭＶ発現ベクターの１０μｇを使用して、ＣＯＳ細胞をエレクトロポレーションする。１０μｇのＨ−及びＬ−鎖発現プラスミドを、ＰＢＳ／ｏ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより供給されたＣａ２＋及びＭｇ２＋を欠くＰＢＳ；ｃａｔ．ｎｏ．０４１−０４１９０Ｍ）中のＣＯＳ細胞の１×１０7 細胞／ml懸濁液０．８mlに添加する。次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを、上記懸濁細胞に、２５μＦの静電容量での１９００Ｖのパルスを届けるために使用する。この細胞は、５％ｖ／ｖのガンマグロブリンを含まず、そして熱により不活性化されたウシ血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ｃａｔ．ｎｏ．０６３−０６５１０Ｈ）を含む１０mlのＤＭＥＭにプレーティングする前に、１０分間、回復に供される。７２時間のインキュベーションの後、培地を回収し、細胞及び細胞破壊物を取り除くために遠心分離する。次に、このＣＯＳ細胞の上澄み液を、０．４５μｍの膜を通して濾過し、そしてＥＬＩＳＡにより、ヒト・ガンマ１／カッパ・イソタイプの集合した抗体の存在について分析する。このヒト化抗体を、更に、蛋白Ａアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製する。
【０１１６】
例５：ヒトＩｇＧ／カッパ製造のためのＥＬＩＳＡ検定
９６−ｗｅｌｌのマイクロタイター・プレート（Ｎｕｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂ，ｃａｔ，Ｎｏ．４３９４５４）を、ＰＢＳ／ｏ，pH７．２中のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的；Ｄｉａｎｏｖａ，＃１０９−００５−０９８）の１：１０００希釈の５０μｌにより、一夜、被覆する。この段階及び全てのこれに続く段階の後、プレートを、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ／ｏ  pH７．２）で３×洗浄する。自由な結合部位を、１００μｌのＲＩＡ−バッファー（ＰＢＳＴ中の１％ウシ血清アルブミン）により、３７℃で１時間、保護する。５０μｌのサンプル、及びＲＩＡ−バッファー中のそれらの希釈液を添加し、そして混合液を３７℃で１時間インキュベーションする。高精製組み換えヒト抗体Ｆ５−４４４（ヒト・ガンマ１／カッパ・イソタイプ、欧州特許出願第４９８７６７号）が、標準として役立つ。ＲＩＡ−バッファー中のワサビダイコン・ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ；ｃａｔ．ｎｏ．Ａ−７１６４）と結合したアフィニティー−精製ヤギ抗−ヒト・カッパ−Ｌ鎖抗血清の１：１０００希釈液の５０μｌを、次に使用し、そして３７℃で１時間インキュベーションする。ＡＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸））基質溶液（ＢｉｏＲａｄ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；＃１７２−１０６４）を、発色のために使用する。適切なインキュベーション時間の後、この酵素反応を２％（ｗ／ｖ）のシュウ酸の等容量を使用して停止させる。４１５nmでの吸収を、結合し、そして十分に集合したヒト抗体の定量化のために使用する。
【０１１７】
例６：ＣＯＳ細胞上澄み液からのヒト抗体の蛋白Ａ精製
トランジエント発現したヒト化抗体を、ＨＲ５／５  ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中に充填した１mlのＰｒｏｓｅｐ  Ａカラム（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上のアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製する。このカラムを、ＦＰＬＣ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で、２ml／分の一定流速で操作し、そしてこのカラムから溶出する蛋白を、２８０nmでの紫外線吸収によりフロー・セル内で検出する。このカラムを、ＰＢＳ／ｏ  pH８．０（２０mMリン酸Ｎａ、１５０mM  ＮａＣｌ）の１０カラム容量で洗浄すること、１００mMのクエン酸ナトリウム・バッファーpH３．０による前溶出すること、及びＰＢＳ／ｏ  pH８．０の１０カラム容量による再平衡することにより、調製する。０．４５μｍ膜を通しての濾過により清澄化された、ＣＯＳ細胞上澄み液（２０〜５０ml）を、蠕動（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）ポンプにより上記カラムの上に直接的に充填する。次に、このカラムを、紫外線吸収がベースラインに戻るまでＰＢＳ／ｏ  pH８．０で洗浄する。次に、ウシＩｇＧを、このベースラインがゼロに戻るまで１００mMクエン酸ナトリウム・バッファーpH５．０で洗浄することにより、溶出する。最後に、１００mMクエン酸ナトリウム・バッファーpH３．０を使用して、ヒト化抗体を溶出して、そしてその溶出液を、１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ−Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加により、直ちにpH７．０に調整する。このヒト化抗体の精製度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２７７：６８０−６８５）を使用したＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分析する。バイオセンサー分析のために、この中性とした蛋白Ａの溶出液を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０マイクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）内で濃縮し、そしてこのバッファーをＰＢＳ／ｏ  pH７．２に変更する。この抗体調整物の精製度に依存して、この蛋白濃度を、２８０nmでの紫外線吸収、又は、標準として既知の、マッチングするイソタイプの精製組み換えキメラ抗体Ｆ５−４４４を使用するヒト・ガンマ／カッパＥＬＩＳＡの、いずれかにより定量する。
【０１１８】
例７：生体特異的相互作用検定（ＢＩＡ）による、マウスと再形状化ヒトＣ２１
抗体との結合活性及び特異性の分析
再形状化ヒトＣ２１可変Ｌ及びＨ鎖の異なった組合せの結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）及び特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を、リアルタイムの生体特異的相互作用検定（Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．，Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．，Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｌｕｎｄｈ，Ｋ．，Ｌｏｅｆａｓ，Ｓ．，Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｒｏｏｓ，Ｈ．，Ｒｏｅｎｎｂｅｒｇ，Ｉ．，Ｓｊｏｅｌａｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ，Ｒ．，Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，ＯＥｓｔｌｉｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｍ．，１９９１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：６２０−６２７）を使用して分析する。全ての実験を、ＣＭ５センサー・チップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ商標システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で実施する。捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体として、約１１，０００RU（１１ng／mm2 ）のポリクロナール・ウサギ抗−マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＲ−１０００−５５）又はウサギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢから得る）を、本質的に先に記載された（Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１、前記）それらのアミノ基及びＥＤＣ／ＮＨＳの化学を使用して、上記センサー・チップ上に固定する。ヒトＩｇＥへの結合の集合速度を決定するために、それぞれの抗体について、４つの実験サイクルを実施する。それぞれのサイクルは、一定量のテスト抗体とその対応する受取抗体との結合、これに続く、このテスト抗体と固定濃度抗体（ヒトＩｇＥ；モノクロナール抗体ＳＥ４４；３．１２５，６．２５，１２．５及び２５nM）との相互作用、これに続く、４０mM  ＨＣｌを使用したその表面の最終的な再生から成る。実験の詳細は、以下のようである：
【０１１９】
〔１〕流速は、５μｌ／分であり；
〔２〕ＨＢＳ（１０mM  Ｈｅｐｅｓ、３．４mM  ＥＤＴＡ、１５０mM  ＮａＶ１、０．０５％  ＢＩＡ界面活性剤、pH７．４）を操作バッファーとして使用し；
〔３〕テスト抗体（ＰＢＳ／ｏ  pH７．２中の）を、ＨＢＳ中で、最終濃度５〜１０μｇ／mlまで希釈し、そして捕獲抗体に結合させ、１３００〜２２００RU（１．３〜２．２ng／mm2 ）の結合テスト抗体を得て；
〔４〕ヒト・モノクロナール抗体ＩｇＥ（ＳＥ４４）を、上記結合テスト抗体上を９分間通過させ；
〔５〕４μｌの４０mM  ＨＣｌを、抗体−抗原複合体を取り出すために使用し、そして次のサイクルのために、その表面を準備し；
〔６〕この検定温度を２５℃とする。
この抗体−抗原相互作用の集合定数を、次に、Ｂｉｏｃｏｒｅ商標システム内で実行されるコンピュータ・プログラムを使用して計算する。
【０１２０】
分解速度定数を決定するためにも、同様のプロトコールを使用する、但し、分解相は含まれない。検定条件は、先に記載したものと同じである。テスト抗体を、固定された受取（ｃａｔｃｈｉｎｇ）抗体を介して、最初に上記センサー・チップ表面に結合させる。最も高い濃度（２５nM）でのＩｇＥ（ＳＥ４４）を、上記抗体に結合させる。結合後、ＨＢＳバッファーを、５μｌ／分の一定流速で上記センサー・チップ表面を通過させ、そして１５〜２５分間にわたり共鳴シグナルの減少を監視する。このセンサー・チップを、最後に、４μｌの４０mM  ＨＣｌ溶液で洗浄することにより再生する。抗体：ＩｇＥ複合体の分解は、一次反応であるため、このセンサーグラムの線型部分を、ＢＩＯＣＯＲＥ商標システム内で実行されるコンピュータ・プログラムを使用してその分解速度定数を計算するために使用する。
【０１２１】
ヒト化Ｃ２１抗体の、速度定数Ｋass （抗体−抗原集合物の速度定数）及びＫdiss（抗体抗原複合体の分解の速度定数）及び結合活性（等量定数Ｋaff により表される）を、表１に要約する。
表１：再形状化ヒトＣ２１抗体の速度定数及び結合活性。Ｋass については、独立実験の数をカッコ内に与え；それぞれのＫdissを、２つの独立した実験において決定する。
【０１２２】
【表１】
0003718214.tif 000002
【０１２３】
これらのヒトＣ−２１抗体の全ては、殆ど同じ集合定数をもっている。結合の結合活性における減少は、主に、高い分解速度により引き起こされる。再形状化ヒトＣ２１  Ｌ鎖の異なる変異体を、そのアミノ末端での位置１及び３の重要性について分析する。抗原への良好な結合は、これらの位置でのアミノ酸が上記Ｃ２１  Ｌ鎖中に在るものと同じであるときに得られる。完全なヒトＫＡＦを使用すれば、ＦＲ１が、そのＨ鎖パートナーにも係わらず結合を減少させる。
【０１２４】
本再形状化ヒトＣ２１抗体を、生体特異的相互作用検定により、ヒト免疫グロブリンの全てのイソタイプへの結合についてもテストする。最初に、テスト抗体を、前記のように、センサーチップ上の固定化捕獲抗体に別々に結合させる。次に、それぞれの固体化ウサギ抗−ヒトＩｇＧとウサギ抗−マウスＩｇＧ１抗体との交差活性を、全イソタイプ、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＧ４，ＩｇＧ３，ＩｇＧ２，ＩｇＧ１及びＩｇＥ（ＳＥ４４）のヒト免疫グロブリンの５μｇ／mlをそれぞれ５分間上記前処理された表面上に次々に通過させる前に、キメラ抗−ＣＥＡ抗体１０μｇ／ml  ＲｅＫ．４１を使用して５分間遮断（ｂｌｏｃｋ）する（ヒト・ガンマ１／カッパ、欧州特許出願第３２３８０６）。最後に、この表面を、４０mM  ＨＣｌにより再生する。流速、温度及び他の条件は、前記のものと同じである。センサーグラムを、ＢＩＯＣＯＲＥ商標システムを使用して記録する。本再形状化されたヒトＣ２１抗体は、ヒトＩｇＥイソタイプに特異的である。
【０１２５】
例８：永久細胞系の調製
トランスフェクションのための、再形状化されたＴＥＳＣ−２１ヒトＣＭＶ  Ｈ−及びＬ−鎖発現ベクターのプラスミドＤＮＡを、塩化セシウム勾配における平衡のための遠心分離により２回精製する。この組み換え免疫グロブリン遺伝子を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）の使用によるエレクトロポレーションにより、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞に導入する。ＮＳＯ細胞（２〜３×１０7 ）を、リン酸塩−バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そしてＢｓｐＣＩ−線状化Ｈ−及びＬ−鎖プラスミドＤＮＡのそれぞれ１０μｇを含む０．８mlのＰＢＳに再懸濁する。２１０Ｖの電場及び９６０μFDの静電容量で、エレクトロポレーションを実施する。回収した細胞を、２％  ＦＢＳ（胎児ウシ血清）を含む無蛋白ハイブリドーマ培地（ＰＦＨＭ，Ｇｉｂｃｏ）中で希釈し、そして９６−ｗｅｌｌのマイクロタイター・プレート内にｗｅｌｌ当たり１０4 細胞でプレーティングする。４８時間のインキュベーションの後、トランスフェクト細胞を、０．７mg／mlのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）及び２％のＦＣＳ（胎児ウシ血清）を含むＰＦＨＭ内で選択する。２週間後、薬剤耐性コロニーを含むｗｅｌｌを、ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧの製造のために、スクリーニングする。ＥＬＩＳＡは、上記培養上澄み液内に発現した組み換えヒトＩｇＧ／カッパ抗体の定量のために開発される。Ｉｍｍｕｌｏｎ２（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ）の９６−ｗｅｌｌプレートを、室温で、ＰＢＳ中の０．５μｇ／mlのヤギ抗−ヒト・カッパ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１００μｌにより、一夜被覆する。次に、ｗｅｌｌを、Ｂｌｏｔｔｏ（ＰＢＳ中の５％乾燥ミルク粉）により１時間、ブロックし、そして０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄する。培養上澄み液（５０μｌ）を、上記被覆ｗｅｌｌに添加し、そして１時間インキュベーションする。ＰＢＳＴで洗浄後、Ｂｌｏｔｔｏ内で１／５０，０００に希釈したワサビダイコン・ペルオキシダーゼ−結合のヤキ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）の１００μｌを、それぞれのｗｅｌｌに添加し、そしてそのプレートを１時間インキュベーションする。０．１％の３′，３″，５′，５″−テトラメチル・ベンジジン（Ｓｉｇｍａ）及び０．００３％の過酸化水素（ｓｉｇｍａ）を含むペルオキシダーゼ基質溶液を、ｗｅｌｌ当たり１００μｌで添加し、そして室温で０．５時間インキュベーションを行う。この反応を５０μｌの２Ｍ硫酸の添加により停止し、そしてそれぞれのｗｅｌｌ中の反応混合液の吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５０００プレート・リーダーを使用して４５０nmでの指示を読む。再形状化されたＴＥＳＣ−２１ヒトＣＭＶ発現プラスミド、Ｈ１，Ｈ３，Ｌ１、及びＬ３を、４つの組合せ：Ｈ３Ｌ１，Ｈ３Ｌ３，Ｈ１Ｌ１、及びＨ１Ｌ３内のＮＳＯ細胞をトランスフェクトするために使用する。Ｈ３Ｌ１，Ｈ３Ｌ３，Ｈ１Ｌ１、及びＨ１Ｌ３のそれぞれ１４２，１２２，６８、及び６４ｗｅｌｌの全てが、０．０１より低いバックグランドを伴って、０．０５よりも大きい吸光度の読みを与える。それぞれの組合せのために、ＩｇＧの分泌レベ���に基づく１つの細胞系：Ｈ３Ｌ１抗体を分泌するＥＨ３１．８；Ｈ３Ｌ３抗体を分泌するＥＨ３３．１６；Ｈ１Ｌ１抗体を分泌するＥＨ１１．１３；及びＨ１Ｌ３抗体を分泌するＥＨ１３．５を選ぶ。
【０１２６】
寄託データ：
以下の細胞系を、１９９２年９月２３日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した（寄託番号をカッコ内に与える）。
再形状化されたヒト抗体Ｈ３Ｌ１を生産する細胞系ＥＨ３１．８（ＨＢ  １１１３０）
再形状化されたヒト抗体Ｈ１Ｌ１を生産する細胞系ＥＨ１１．１３（ＨＢ  １１１３２）
ネズミ・モノクロナール抗体ＴＥＳ−Ｃ２１を生産する細胞系ＴＥＳ−Ｃ２１（ＨＢ  １１１３３）
再形状化されたヒト抗体Ｈ３Ｌ３を生産する細胞系ＥＨ３１．１６（ＨＢ  １１１３１）
再形状化されたヒト抗体Ｈ１Ｌ３を生産する細胞系ＥＨ１３．５（ＨＢ  １１１３４）
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】ヒトｋＬ鎖不変ドメインに融合されるＣ２１−Ｌ１及びヒトｒ１Ｈ鎖不変ドメインに融合されるＣ２１−Ｈ１を生成するために使用されるＨＣＭＶ−哺乳類発現ベクターが示される。
【図１】
0003718214.tif 000003
【配列表】
0003718214000001.app