(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールを含有する物質をコレステロールオキシダーゼで処理後あるいはそれと同様に、マイコバクテリウム属に属する微生物が生産するエピコレステロールデヒドロゲナーゼで処理して、コレステロールをエピコレステロールに変換してコレステロール濃度を低減させることを特徴とするコレステロール低減化物質の製造法。
【請求項２】
コレステロールを含有する物質をコレステロールデヒドロゲナーゼで処理後あるいはそれと同様に、マイコバクテリウム属に属する微生物が生産するエピコレステロールデヒドロゲナーゼで処理して、コレステロールをエピコレステロールに変換してコレステロール濃度を低減させることを特徴とするコレステロール低減化物質の製造法。
【請求項３】
物質が肉、卵、乳、魚介類、およびそれらを含む調理用加工食品または動物用、家禽用および養魚用飼料である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
下記の理化学的性質を有するエピコレステロールデヒドロゲナーゼ
（a）作用：次の反応を触媒する。
0003679805.tif 000004
（b）基質特異性：エピコレステロールに特異的に作用し、コレステロールには作用しない。
（c）至適pH：エピコレステロールからの酸化反応ではpH8〜12、5−コレステン−3−オンからの還元反応ではpH4〜5
（d）安定pH：4〜12
（e）作用適温の範囲：40〜50℃
（f）温度安定性の範囲：50℃、pH8.0、１０分間の加熱処理で、処理前の活性の約80%以上の活性を保持する。
（g）阻害剤、金属イオンの影響：
p−クロロマーキュリフェニルスルホン酸塩、ヨード酢酸、エチレンジアミン四酢酸塩によって活性が阻害される。マグネシウムイオン、マンガンイオンによって活性が促進される。
（h）分子量：約２６０，０００（ゲルろ過法による）。
（i）補酵素
β−ニコチンアマイドアデニンジヌクレオチド（NAD）を補酵素とする。
【請求項５】
マイコバクテリウム属に属する微生物が生産する請求項４記載のエピコレステロールデヒドロゲナーゼ。
【請求項６】
マイコバクテリウム属に属し、エピコレステロールデヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にエピコレステロールデヒドロゲナーゼを生成させ、該培養物より、該エピコレステロールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするエピコレステロールの製造法。
【請求項７】
コレステロール含有物をコレステロールオキシダーゼで処理後あるいはそれと同時に、マイコバクテリウム属に属する微生物が生産するエピコレステロールデヒドロゲナーゼで処理して、コレステロールをエピコレステロールに変換し、該含有物からエピコレステロールを採取することを特徴とするエピコレステロールの製造法。
【請求項８】
コレステロール含有物をコレステロールデヒドロゲナーゼで処理後あるいはそれと同時に、マイコバクテリウム属に属する微生物が生産するエピコレステロールデヒドロゲナーゼで処理して、コレステロールをエピコレステロールに変換し、該含有物からエピコレステロールを採取することを特徴とするエピコレステロールの製造法。
【請求項９】
コレステロールをコレステロールオキシダーゼで処理後あるいはそれと同時に、マイコバクテリウム属に属する微生物が生産するエピコレステロールデヒドロゲナーゼで処理して、コレステロールをエピコレステロールに変換することを特徴とするエピコレステロールの製造法。
【請求項１０】
コレステロールをコレステロールデヒドロゲナーゼで処理後あるいはそれと同時に、マイコバクテリウム属に属する微生物が生産するエピコレステロールデヒドロゲナーゼで処理して、コレステロールをエピコレステロールに変換することを特徴とするエピコレステロールの製造法。
【請求項１１】
エピコレステロールデヒドロゲナーゼを生産する能力を有するマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）EPI-40株（FERM BP-4306）。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、コレステロール低減化物質の製造法、ならびにそれに使用する新規コレステロールオキシダーゼ、新規エピコレステロールデヒドロゲナーゼ、それらの製造法および該エピコレステロールデヒドロゲナーゼを使用するエピコレステロールの製造法に関する。
コレステロール含量の高い食品を過剰に摂取することが血清中のコレステロール値を増大させ、また高コレステロール血清濃度が心疾患の重大な危険因子であることが報告されている〔デイリー・カウンシル・ダイジェスト(Dairy Council Digest)60(2),7(1989)〕。そこで低コレステロール食品や低コレステロール飼料の需要が高まっており、食品中や飼料中のコレステロールを選択的に低減する技術が求められている。また生理学的研究の材料として、簡便で安全な高純度のエピコレステロールの製造法が求められている。
背景技術
公知のコレステロール低減化物質の製造法としては、食品中に含まれるコレステロールをヘキサンまたはアセトンを用いて抽出する方法（特公昭４６−４２９４４号公報、特開昭４７−１９０６２号公報）、超臨界炭酸ガスを用いた抽出方法（特開昭５９−１３５８４７号公報、特開平２−１６７０３５号公報、特開平３−９８５４１号公報）、ジギトニン固定化担体を用いてバターから吸着除去する方法〔ジャーナル・オブ・アグリカルチャー・アンド・フード・ケミストリー(J.Agric.Food Chem.)38(9),1839(1990)〕、βサイクロデキストリンを卵黄液または乳製品に添加後、生成した難溶性の複合体を遠心分離法で除去する方法（特開平１−２５２２５９号公報、特開平３−９８５５３号公報、特開平３−４９６４７号公報）が知られている。
上記の抽出法、吸着法ではコレステロール以外の脂質や香り成分が失われて食品の品質が低下する。
微生物によりコレステロールを分解する方法〔特開昭63−267231号公報、ジャーナル・オブ・フード・サイエンス(J.of Food Science)53(2),659(1989)〕、コレステロール還元酵素によりコレステロールをコプロスタノールに変換する方法（USP4,921,710）が知られている。
ホスホリパーゼ（特開平５−４９４１４号公報）、プロテアーゼやリパーゼ（特開平５−７６３１１号公報）の処理が上記微生物または酵素による処理を促進することが知られている。
また、コレステロールを４−コレステン−３−オンに酸化するコレステロールオキシダーゼ（EC1.1.3.6）、担子菌が生産するコレステロールを５−コレステン−３−オンに酸化するコレステロールオキシダーゼ（特公昭６０−４８１５９号公報）、コレステロールをコレステノンに酸化するコレステロールデヒドロゲナーゼ（特公平2-18064号公報、特開昭５３−５６０９０号公報）、コール酸の３−α位の水酸基を酸化する３αハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.50）が知られている。
エピコレステロールの腸管吸収性が低いことは知られている〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)206,757(1954)〕。食品中のコレステロールを、腸管での吸収性の低いエピコレステロールに変換してコレステロールを低減するコレステロール低減化物質の製造法は知られていない。エピコレステロールをＮＡＤ（Ｐ）の存在下、コレステノンに酸化するエピコレステロールデヒドロゲナーゼは知られていない。また、ボトリチス(Botrytis)属に属する微生物が生産する、コレステロールを５−コレステン−３−オンに酸化するコレステロールオキシダーゼは知られていない。コレステロールをエピコレステロールに変換する化学的方法が知られている〔ジャーナル・オブ・オルガニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)40(9),1361(1975)〕。
発明の開示
本発明は、コレステロール低減化物質の新規製造法を提供することにある。本発明はさらに上記コレステロール低減化物質の製造法に使用する新規エピコレステロールデヒドロゲナーゼ、新規コレステロールオキシダーゼ、それらの製造法、ならびに新規エピコレステロールデヒドロゲナーゼを使用するエピコレステロールの製造法を提供することにある。
本発明によれば、物質中のコレステロール(cholest-5-en-3β-ol)を腸管吸収性の低いエピコレステロール(cholest-5-en-3α-ol)に変換し、コレステロール濃度を低減させることにより、物質の性状を損なうことなく、選択的にコレステロールを低減した物質を提供することができる。
以下に本発明のコレステロール低減化物質の製造法を詳細に説明する。
本発明で用いられる物質とは、コレステロールを含有する食品、具体的には肉、卵、乳、魚介類またはそれらを含有する調理加工食品、ならびに動物用、家禽用および養魚用飼料などをいう。
本発明における物質中の、コレステロールのエピコレステロールへの変換法としては、生化学的方法と化学的方法のいずれでも用いられる。
生化学的方法としては酵素による作用を用いてコレステロールをコレステノンに変換後さらにこれをエピコレステロールに変換する方法があげられる。たとえば下記の酵素活性を有するものを物質に添加してコレステロールをエピコレステロールに変換することができる。
（１）コレステロールオキシダーゼとエピコレステロールデヒドロゲナーゼの両酵素を用いる場合：下記処理Ａと処理Ｂを並行して行うか、または処理Ａの終了後処理Ｂを行う。
処理Ａ：コレステロールオキシダーゼによる処理
コレステロール＋Ｏ2→コレステノン＋Ｈ2Ｏ2
処理Ｂ：エピコレステロールデヒドロゲナーゼによる処理
コレステノン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→エピコレステロール＋ＮＡＤ（Ｐ）
（２）コレステロールデヒドロゲナーゼとエピコレステロールデヒドロゲナーゼの両酵素を用いる場合：処理Ｃと処理Ｄを並行して行うか、または処理Ｃの終了後処理Ｄを行う。
処理Ｃ：コレステロールデヒドロゲナーゼによる処理
コレステロール＋ＮＡＤ（Ｐ）→コレステノン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
処理Ｄ：エピコレステロールデヒドロゲナーゼによる処理
コレステノン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→エピコレステロール＋ＮＡＤ（Ｐ）
上記酵素活性を有するものとしては、精製酵素、粗酵素、該酵素活性を有する微生物菌体またはその処理物などがあげられる。
上記酵素活性を有するもの（以下酵素源という）は粉体のまま物質に加えてもよいが、水に溶かして水溶液の形で加えることが好ましい。また、必要に応じてＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの補酵素、あるいはホスホリパーゼ、リパーゼ、プロテアーゼなどの酵素を併用することができる。
卵の処理においては、全卵に酵素源を注入し、または割卵して得た卵黄に酵素源を混合する。牛、豚、羊、鶏の肉の処理においては、酵素源を挽肉に混ぜるか、スライス肉に散布するか、ブロック肉に注入する。あるいはこれらの動物の屠殺前１時間以内に酵素源を投与する。乳の処理においては、乳に酵素源を添加するか、酵素源を固定化した担体に乳を通過させる。また、卵、肉、乳、魚介類を調理する際に、酵素源を添加してもよい。
動物用、家禽用、および養魚用飼料においても同様に、飼料を配合する工程に合わせて、エピコレステロールへの酵素変換が可能な、処理条件および酵素添加量が選ばれる。
上記酵素処理においては、物質の製造工程に合わせて、エピコレステロールへの酵素変換が可能な、処理条件（温度、時間、ｐＨ）、酵素添加量が選ばれるが、一般的には反応温度５〜７０℃、ｐＨ４〜８で、３０分間〜２００時間行われる。コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、エピコレステロールデヒドロゲナーゼの各酵素の使用量は、コレステロール１ｇ当り１〜１０4単位、好ましくは１０〜１０3単位である。必要に応じてＮＡＤ（Ｐ）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、コレステロール１ｇ当り１×１０-4〜２０ｇを添加する。また、必要に応じて各種ホスホリパーゼをリン脂質１ｇ当り１×１０-1〜１×１０5単位添加する。
コレステロールオキシダーゼとしては、下記ボトリチス属微生物由来の酵素、担子菌由来の酵素（特公昭６０−４８１５９号公報）、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、シュウドモナス(Pseudomonas)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属微生物由来のもの（市販品  シグマ社製）があげられる。
コレステロールデヒドロゲナーゼとしては、ノカルディア属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、プロテウス(Proteus)属微生物由来のもの（特公平２−１８０６４号公報）、あるいは動物肝臓由来のもの（特開昭５３−５６０９０号公報）があげられる。
エピコレステロールデヒドロゲナーゼとしては、コレステノンをエピコレステロールに還元する活性を有するものであれば、如何なる酵素も利用できる。例えば下記マイコバクテリウム(Mycobacterium)属微生物由来の酵素があげられる。
一方、コレステロールをエピコレステロールに変換する化学的方法としてはホウミナー(Houminer)らの方法〔ジャーナル・オブ・オルガニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)40(9),1361(1975)〕が使用できる。例えば乾燥してそのままか、あるいは粉砕したコレステロールを含有する物質に臭素を付加してコレステロールをコレステロールジブロマイドとした後、酸化してジブロモコレスタン−３−オンとし、さらに還元してエピコレステロールに変換する。反応液はろ過、遠心分離などにより固形物を分離し、必要により乾燥することによりコレステロール低減化物質が得られる。
本発明のエピコレステロールデヒドロゲナーゼは新規酵素であり、その理化学的性質および製造法は下記のとおりである。
（a）作用：
次の反応を触媒する。
0003679805.tif 000002
（b）基質特異性：エピコレステロールに特異的に作用し、コレステロールには作用しない。
（c）至適pH：
エピコレステロールを基質としてコレステノン生成を測定した場合の至適ｐＨは８〜１２である。５−コレステン−３−オンからエピコレステロールを生成する場合の至適ｐＨは４〜５である。〔0.1M酢酸塩酸緩衝液（pH2-4）、0.1Mリン酸クエン酸緩衝液（pH4-7）、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7-9）、0.1Mグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH9-12）の１ｍＭジチオスレイトールを含む各pH緩衝液を用いて、温度３７℃にて測定。〕
（d）安定pH：
酵素液を各ｐＨ緩衝液で、３７℃、６０分間静置し、残存活性を測定することによって求めた安定pH範囲は、４〜１２である。
（e）力価の測定：
0.３３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１ｍＭエピコレステロールミセル溶液0.１ｍｌに、１ｍＭジチオスレイトールを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ8.０)0.３ｍｌ、１０ｍＭ  ＮＡＤ溶液0.１ｍｌおよび５０ｍＭ塩化マグネシウム0.０１ｍｌを混合し、これに酵素液０．０５ｍｌを加え、３７℃で２時間反応後、0.０５ｍｌクロロホルムを添加してステロールを抽出して反応を停止する。
次に高速液体クロマトグラフィーを用いて、反応液中に生成したコレステノンを定量する。ＯＤＳカラム（GLサイエンス社製Inertsil ODS-2カラム4.6×250mm）を用いてメタノールを移動相として分画定量する。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応物のコレステノンを測定する。１分間に１μｍｏｌのコレステノンを生成する酵素活性を１単位とする。
（f）作用適温の範囲：４０〜５０℃
ｐＨ8.０で５０℃まで温度上昇とともに活性は増大する。
（g）温度安定性の範囲：
５０℃、ｐＨ8.０、１０分間の加熱処理で、処理前の活性の約８０％以上の活性を保持する。
（h）阻害剤、金属イオンの影響：
阻害剤無添加時の酵素活性値を１００％とし、それぞれ１ｍＭ  p−クロロマーキュリフェニルスルホン酸塩、ヨード酢酸、エチレンジアミン四酢酸塩を添加し、ｐＨ8.０、３７℃、２時間反応した場合の残存活性は、７％、６７％、７１％である。また、本酵素は0.１〜１０ｍＭのマグネシウムイオン、マンガンイオン存在下で反応させると無添加の場合に比べ、活性が促進される。
（i）精製方法：
培養物を遠心分離し湿潤菌体を集菌し、この菌体を0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.５、ジチオスレイトール１ｍＭ含有）に懸濁する。超音波処理により菌体を破砕し、遠心分離にて固形分を除去し、粗酵素液を得る。その粗酵素液を0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.５、ジチオスレイトール１ｍＭ含有）に対して２４時間透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースファストフロウ（ファルマシア社製）に吸着させる。次いで食塩濃度を０〜0.３Ｍに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。次いで、0.２Ｍ塩化ナトリウムを含有した0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（Superose6、ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液で溶出し活性画分を集める。この活性画分を再度、同じゲルろ過カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた活性画分を精製標品とする。
（j）分子量
本酵素の分子量は、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中で３０秒間ソニック処理後、高速液体クロマトグラフィー(Superose6ファルマシア社製)によるゲルろ過で測定した結果、約２６0,０００であった。
（k）β−ニコチンアマイドアデニジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とする。
本酵素は以上の性質から新規と認められ、本酵素の性質を活用すれば、コレステロール含有物からエピコレステロールを酵素法により製造することが可能となる。
上記コレステロール含有物とはコレステロールの分散水溶液、コレステロールミセル水溶液、あるいは、コレステロールが溶解した有機溶媒層を乳化させた水溶液のことをいう。
コレステロールをエピコレステロールに変換するためには、前記のコレステロール低減化物質の製造法において、生化学的方法としてあげられた処理Ａおよび処理Ｂ、または処理Ｃおよび処理Ｄを行えばよく、酵素源をコレステロール含有物に、粉体のまま、または水に溶かして水溶液の形で加える。あるいは、酵素源を固定化した担体にコレステロール含有物を通過させる。また必要に応じてＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの補酵素を併用することができる。
酵素処理は、エピコレステロールへの酵素変換が可能な、処理条件（温度、時間、ｐＨ）、酵素添加量が選ばれるが、一般的には反応温度１０〜５０℃、ｐＨ４〜８で、３０分間〜４８時間行われる。コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、エピコレステロールデヒドロゲナーゼの各酵素の使用量は、コレステロールの１ｇ当り１〜１０4単位、好ましくは１０〜１０3単位である。必要に応じてＮＡＤ（Ｐ）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、コレステロール１ｇ当り１×１０4〜２０ｇ添加できる。
酵素処理したコレステロール含有物を、必要に応じてろ過、遠心分離などにかけることにより、目的物であるエピコレステロールを採取することができる。
次に新規エピコレステロールデヒドロゲナーゼの製造法を以下に述べる。
本酵素を製造するにあたり使用される微生物としては、マイコバクテリウム属に属し、上記エピコレステロールデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物であれば如何なるものでもよく、またこれらの微生物の変種もしくは変異株でもよい。マイコバクテリウム属に属し、エピコレステロールデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物の具体例として、例えばマイコバクテリウム・エスピー(Mycobacterium sp.)ＥＰＩ−４０があげられる。
上記マイコバクテリウム・エスピーＥＰＩ−４０は本発明者が、土壌中より新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は下記のとおりである。
（a）形態
▲１▼  細胞の形及び大きさ；桿状
直径0.5-1.2μm、長さ1.5−5.0μm
▲２▼  細胞の多形性；多形性有り。短桿〜長桿。稀に分枝形態をとる。
▲３▼  運動性；なし。
▲４▼  胞子；形成しない。
（b）各培地における生育状態
▲１▼  肉汁寒天平板培養；
1)生育の様相；コロニー形状は不定形で、波状の外周をもち、表面は粗。
2)色；アイボリ−。
3)光沢；なし。
4)拡散性色素；生成しない。
▲２▼  肉汁液体培養；
1)表面生育；なし。
2)濁度；あり。
▲３▼  肉汁ゼラチン培養；
1)生育の状態；培地の表面に生育する。
2)ゼラチンの液化；培地全体を液化する。
▲４▼  リトマス・ミルク；
1)反応；アルカリ性。
2)凝固；なし。
3)液化；なし。
（c）生理的性質
▲１▼  グラム染色性；3%水酸化カリウム試験ではグラム陽性であるが、酵母エキス肉汁寒天培地上、18時間培養細胞のグラム染色性は陰性。
▲２▼  硝酸塩の還元；陽性。
▲３▼  脱窒反応；陰性。
▲４▼  ＭＲテスト；陰性。
▲５▼  ＶＰテスト；陰性。
▲６▼  インドールの生成；陰性。
▲７▼  硫化水素の生成；陰性。
▲８▼  デンプンの加水分解；陽性。
▲９▼  クエン酸の利用；（Koser）陽性。
（Christensen）陽性。
▲１０▼  無機窒素の利用；硝酸塩（陽性）。
アンモニウム塩（陽性）。
▲１１▼  色素の生成；陰性。
▲１２▼  ウレアーゼ；陰性。
▲１３▼  オキシダーゼ；陰性。
▲１４▼  カタラーゼ；陽性。
▲１５▼  生育の範囲；
（1）ｐＨ；ｐＨ5.0−ｐＨ11.0。
（2）温度；１２〜３８℃。
▲１６▼  酸素に対する態度；好気性。
▲１７▼  糖類からの酸およびガスの生成；
0003679805.tif 000003
（d）化学分類学的性質
▲１▼細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成；
細胞壁ペプチドグリカンのジアミノ酸としてジアミノピメリン酸のメソ型を持つ。
▲２▼菌体脂質
1)イソプレノイド・キノン；ＭＫ９(H2)をメインに持つ。
2)脂肪酸（ミコ−ル酸を含む）；ミコ−ル酸（コンプレックス型）を持つ。
以上の菌学的性質を有する菌について、バ−ジェイのマニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジ−（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）の記載と照合した結果、グラム陽性（3%水酸化カリウム試験）で長桿状あるいは短桿状の多形性の形態をとること、好気性で生育し、嫌気性で生育せず、細胞壁のジアミノ酸組成としてメソ型のジアミノピメリン酸を持ち、菌体脂質としてコンプレックス型のミコール酸を持つこと、また、主なキノンとしてMK-9(H2)を持つことより、本菌株は、Vol.2(1986)のSection 16（The Myco-bacteria）に属するマイコバクテリウム属に属する細菌であると判断し、ＥＰＩ−４０菌株を、マイコバクテリウム・エスピ−ＥＰＩ−40(Mycobacterium sp.EPI-40）と命名した。本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（FRI）に受託番号FERM BP-4306として寄託されている。
本発明のエピコレステロールデヒドロゲナーゼを生産する微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機物などを含有する合成培地または天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、糖蜜、エピコレステロールなどの種々の炭水化物が用いられ、その使用量は５〜７０ｇ／ｌ程度が好ましい。また窒素源としては例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいはペプトン、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は、５〜２０ｇ／ｌ程度が好ましい。さらに無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、などが用いられ、その使用量は0.０５〜５ｇ／ｌ程度が好ましい。また、必要に応じて界面活性剤を添加する。培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行われる。培養温度は菌が生育し、エピコレステロールデヒドロゲナーゼが生成する温度であればよく、好ましくは２５〜３７℃である。培養時間は条件により異なるが、エピコレステロールデヒドロゲナーゼが最大量に生産される時間まで培養すればよく、通常３〜７日間程度である。
本発明のコレステロールオキシダーゼは新規酵素であり、その理化学的性質および製造方法は下記のとおりである。
（a）作用：
次の反応を触媒する。
コレステロール＋Ｏ2→５−コレステン−３−オン＋Ｈ2Ｏ2
（b）基質特異性：３−β位に水酸基を有するコレステロールに特異的に作用し、エピコレステロールには作用しない。
（c）至適pH  ３〜７。
（d）安定pH  酵素液を各ｐＨ緩衝液で、３７℃、６０分間静置し、残存活性を測定することによって求めた安定pH範囲は、２〜８である。
（e）力価の測定
0.３３％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含有する１ｍＭコレステロールミセル溶液0.１ｍｌに、２０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ6.０）0.３ｍｌを混合し、これに酵素液0.０５ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応後、0.０５ｍｌクロロホロムを添加してステロールを抽出して反応を停止した。
次にＴＬＣ／ＦＩＤイヤトロスキャン（ダイアヤトロン社製）を用いて、反応液中に生成したコレステノンを定量した。対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応物を測定した。１分間に１μｍｏｌのコレステノンを生成する酵素活性を１単位とする。
（f）作用適温の範囲：
３０〜６０℃。ｐＨ6.０で６０℃まで温度上昇とともに活性は増大する。
（g）温度安定性の範囲：
６０℃、１０分間の加熱処理で、処理前の活性の約８０％以上の活性を保持する。
（h）阻害剤、金属イオンの影響：
阻害剤無添加時の酵素活性値を１００％とし、それぞれ１mM  ｐ−クロロマーキュリフェニルスルホン酸塩、ヨード酢酸、エチレンジアミン四酢酸塩を添加し、pH6.0、３７℃、１０分間反応した場合の残存活性は、１００％、８９％、９３％である。また、本酵素は0.１〜１０ｍＭの鉄イオン、銅イオン、マグネシウムイオン存在下で反応させると無添加の場合に比べ、活性が促進される。
（i）精製方法：
培養物を遠心分離して培養上清を得る。この上清液に５０v／v％までエタノールを添加し、生成した沈澱を遠心分離にて集め、0.02Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）に懸濁して同緩衝液に対して２４時間透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースファストフロウ（ファルマシア社製）に吸着させる。次いで食塩濃度を０〜1.０Ｍに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、活性画分を集める。次いで、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有した0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（Superose6、ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液で溶出し活性画分を集める。この活性画分を再度、同じゲルろ過カラムクロマトグラフィーにかけ、得られた活性画分を精製標品とする。
（j）分子量：
本酵素の分子量は高速液体クロマトグラフィー（Superose6、ファルマシア社製）によるゲルろ過で測定した結果、約４5,０００であった。
本酵素は以上の性質から新規コレステロールオキシダーゼと認められ、本酵素の性質を活用すれば、広い温度範囲と広いｐＨ範囲でコレステロールを５−コレステン−３−オンに変換することが可能となる。
以下に、本酵素の製造法を述べる。
本酵素を製造するにあたり使用される微生物としては、ボトリチス属に属し、上記コレステロールオキシダーゼ生産能を有する微生物であれば如何なるものでもよく、またこれらの微生物の変種もしくは変異株でもよい。ボトリチス属に属し、コレステロールオキシダーゼ生産能を有する微生物の具体例として、例えばボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）CO-33があげられる。
ボトリチス・シネレアCO-33の菌学的性質は次の通りである。
麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で培養したとき、集落は灰色から暗緑色がかった灰色を呈する。菌糸は隔壁を有し、平滑、無色から淡褐色でよく分枝する。分生子柄は菌糸から直立し、長さ２ｍｍあるいはそれ以上に達する。幅は１５〜３０μmで、平滑、隔壁を有する。分生子柄は単生、その上部において疎に分枝し、各々の先端部に分生子を多数形成する。分生子の個体発生様式は外生出芽型で、その形成様式は単生の房状出芽型である。分生子は、無色〜淡黄褐色、長さ６〜２６μm、幅４〜１１μm、平滑で、多くは楕円形〜倒卵形、洋なし形、ときに不定形を呈する。本菌株は、上述したアナモルフのみ観察され、テレオモルフは観察されない。以上の観察の結果、本菌株は、ボトリチス・シネレアと同定された。ボトリチス・シネレアについての菌学的性質は、エリス(M.B.Ellis)著、「デマチアシアス・ハイフォミセテス［1971年］（DEMATIACEOUS HYPHOMYCETES［1971］）」の１７９頁に詳しく記載されている。本菌株は“Botrytis cinerea CO-33”と命名され、ＦＲＩに受託番号FERM BP-4307として寄託されている。
本発明の新規コレステロールオキシダーゼを生産する微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機物などを含有する合成培地または天然培地のいずれも使用できる。炭素源としては、例えばグリコース、グリセロール、糖蜜、野菜ジュース、澱粉などの種々の炭水化物が用いられ、その使用量は５〜７０ｇ／ｌ程度が好ましい。また窒素源としては例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいはペプトン、酵母エキス、コーン／スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどの窒素含有有機物などが用いられ、その使用量は、５〜20g/ｌ程度が好ましい。さらに無機物としては、例えば、塩化ナトリウム、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが用いられ、その使用量は0.０５〜５ｇ／ｌ程度が好ましい。培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行われる。培養温度は菌が生育し、新規コレステロールオキシダーゼが生成する温度であればよく、好ましくは２０〜３０℃である。培養時間は条件により異なるが、新規コレステロールオキシダーゼが最も大量に生産される時間まで培養すればよく、通常５〜８日間程度である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例９において、コレステロール低減化卵黄粉末試料中から抽出した脂質のガスクロマトグラフィー分析を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
エピコレステロールデヒドロゲナーゼの製造：
ブイヨン顆粒（極東製薬製）２７０ｇおよび酵母エキス（Difco社製）７０ｇを脱イオン水１０ｌに溶解し、ｐＨを7.０に調整し、２ｌ三角フラスコに３００ｍｌずつ分注した。この培地を温度１２０℃で１５分間殺菌後、マイコバクテリウム・エスピーＥＰＩ−４０を接種し、温度２８℃で７２時間振とう培養した。
培養終了後培養液１０ｌを遠心分離して得られた菌体を0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.５、ジチオスレイトール１ｍＭ含有）で１回洗浄後、同緩衝液に懸濁し液量を２００ｍｌとした。この菌体懸濁液を２０ＫＨｚの超音波破砕機で１０分間処理して遠心分離し、固形分を除去し、粗酵素液を得た。その粗酵素液を0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.５、ジチオスレイトール１ｍＭ含有）に対して２４時間透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースファストフロウ（ファルマシア社製）に吸着させた。次いで食塩濃度を０〜0.３Ｍに連続的に上昇させ溶出を行った。
次いで、0.２Ｍ塩化ナトリウムおよび１ｍＭジチオスレイトールを含有した0.02Ｍトリス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（Superose6、ファルマシア社製）にかけ、高速液体クロマトグラフィーにより、同緩衝液で溶出し活性画分を集めた。この活性画分を再度、同じゲルろ過カラムにかけ、高速液体クロマトグラフィーにより集めた活性画分を精製酵素液とした。本酵素の蛋白質濃度をプロテイン・アッセイキット（バイオラッド社製）により測定し、活性を測定したところ、比活性1.０８単位／ｍｇ蛋白質であった。
実施例２
コレステロールオキシダーゼの製造：
Ｖ８野菜ジュース（キャンベル社製）２ｌおよび炭酸カルシウム30ｇに脱イオン水を加えて１０ｌとし、ｐＨを7.２に調整し、２ｌ三角フラスコに３００ｍｌずつ分注した。この培地を温度１２０℃で１５分間殺菌後、ボトリチス・シネレアＣＯ−３３を接種し、温度２５℃で５日間振とう培養した。培養終了後培養液１０ｌを遠心分離して培養上清を得た。この上清液に５０v／v％までエタノールを添加し、蛋白質の沈澱を遠心分離により集めた。沈澱を0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.５、ジチオスレイトール１ｍＭ含有）に懸濁し、同緩衝液に対して２４時間透析した後、その遠心分離の上清を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースファストフロウ（ファルマシア社製）に吸着させた。次いで食塩濃度を０〜1.０Ｍに連続的に上昇させ溶出を行った。
次いで、0.２Ｍ塩化ナトリウムおよび１ｍＭジチオスレイトールを含有した0.０２Ｍトリス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム（Superose6、ファルマシア社製）にかけ、高速液体クロマトグラフィーにより、同緩衝液で溶出し活性画分を集めた。この活性画分を再度、同じゲルろ過カラムにかけ、高速液体クロマトグラフィーにより集めた活性画分を精製酵素液とした。本酵素の蛋白質濃度をプロテイン・アッセイキット（バイオラッド社製）により測定し、活性を測定したところ、比活性１0.４単位／ｍｇ蛋白質であった。
実施例３
0.３３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１ｍＭコレステロールミセル溶液１０ｍｌに、１ｍＭジチオスレイトールを含有する１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.０）３０ｍｌと１０ｍＭ  ＮＡＤＨ溶液１０ｍｌを混合しこれに実施例２で得られたコレステロールオキシダーゼ1.０単位と実施例１で得られたエピコレステロールデヒドロゲナーゼ0.２単位を加え、３７℃で３時間反応後、１０ｍｌのクロロホルムを添加してステロールを抽出した。高速液体クロマトグラフィーを用いて、生成したエピコレステロールを定量した。ＯＤＳカラム（ＧＬサイエンス社製Inertsil ODS-2カラム4.６×250mm）を用いてメタノールを移動相として分画定量しエピコレステロールの変換率を測定した結果９2.５％であった。
実施例４
0.３３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１ｍＭコレステロールミセル溶液１０ｍｌに、１ｍＭジチオスレイトールを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）３０ｍｌと３０ｍＭ  ＮＡＤ溶液１０ｍｌを混合しこれにコレステロールデヒドロゲナーゼ（天野製薬製CHDH“Amano”II）２００単位を加え３７℃で２時間反応した。コレステロールデヒドロゲナーゼの活性測定法は特公平２−18064号公報記載の方法に従った。反応終了後１０ｍｌのヘキサンを加えステロールを抽出し乾固させた。さらに、0.３３％ＴｒｉｔｏｎＸ−100と１ｍＭジチオスレイトールを含有する１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ4.０）３０ｍｌに得られたステロールを分散させた後、１０ｍＭ  ＮＡＤＨ溶液１０ｍｌを混合しこれに実施例１で得られたエピコレステロールデヒドロゲナーゼ0.２単位を加え３７℃で２時間反応した。反応終了後１０ｍｌのクロロホルムを添加してステロールを抽出した。実施例３の方法に従い、得られた標品のエピコレステロールへの変換率を測定した結果５8.８％であった。
実施例５
市販鶏卵の卵黄５ｇに５ｍｌの水を添加してｐＨ４に調整し、これに実施例２で得られたコレステロールオキシダーゼ２００単位、実施例１で得られたエピコレステロールデヒドロゲナーゼ５単位、ＮＡＤＨ0.７ｇを添加し３７℃で５時間反応した。反応後ｐＨ７に調整した。処理済みの卵黄を凍結乾燥し、得られた試料より脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出し分取した。
実施例３の方法に従い、得られた標品のエピコレステロールへの変換率を測定した結果７2.３％であった。コレステロールの７2.３％が低減された卵黄を得ることができた。
実施例６
市販牛肉のミンチ５ｇをｐＨ４に調整し、ホスホリパーゼＤ２５単位、実施例２で得られたコレステロールオキシダーゼ３０単位、実施例１で得られたエピコレステロールデヒドロゲナーゼ0.２単位、ＮＡＤＨ１７ｍｇを添加し３７℃で５時間反応した。反応後ｐＨ７に調整した。処理済みの肉を凍結乾燥し、得られた試料より脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出し分取した。
実施例３の方法に従い肉のエピコレステロールへの変換率を測定した結果２3.１％であった。コレステロールの２3.１％が低減された牛肉を得ることができた。
実施例７
市販牛乳の５０ｍｌに実施例２で得られたコレステロールオキシダーゼ１００単位、実施例１で得られたエピコレステロールデヒドロゲナーゼ1.０単位、ＮＡＤＨ0.１ｇを添加し、ｐＨ４、３７℃で５時間反応した。反応後ｐＨ７に調整した。処理済みの牛乳を凍結乾燥し、得られた試料より脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出し分取した。実施例３の方法に従い牛乳のエピコレステロールへの変換率を測定した結果１5.３％であった。
コレステロールの１5.３％が低減された牛乳を得ることができた。
実施例８
市販鶏卵の卵黄５ｇに５ｍｌの水を加えｐＨ８に調整した後、コレステロールデヒドロゲナーゼ（天野製薬製CHDH“Amano”II）２００単位、ＮＡＤ0.３ｇを添加して３７℃で３時間反応した。反応後、ｐＨ４に調整し、実施例１で得られたエピコレステロールデヒドロゲナーゼ9.０単位、ＮＡＤＨ0.７ｇを添加し３７℃で４時間反応した。反応後ｐＨ７に調整した。
処理済みの卵黄を凍結乾燥し、得られた試料より脂質画分を溶媒（クロロホルム：メタノール＝２：１）で抽出し分取した。実施例３の方法に従い卵黄のエピコレステロールへの変換率を測定した結果10.5％であった。コレステロールの１0.５％が低減された卵黄を得ることができた。
実施例９
卵黄をガーゼで濾過後、凍結乾燥して粉末試料を得た。この試料２０ｇを１４０ｍｌのエーテルに４０℃に加温しながら分散させ、無水酢酸ナトリウム６６０ｍｇを加えて溶解した後に臭素（Br2）3.５mlを加えた酢酸８０ｍｌを滴下した。その後、直ちに氷冷して１ｌの水に分散後、遠心分離して沈澱を得た。
この沈澱を酢酸２６０ｍｌに分散させて、得られた分散液に重クロム酸ナトリウム二水和物（Na2Cr2O7・2H2O）4.２ｇを溶解し９０℃に加熱した酢酸１０４ｍｌを添加し、５分間攪拌した。その後１０分間氷冷し、これを２ｌの水に分散後、遠心分離して沈澱を得た。
得られた沈澱をエタノール１１０ｍｌに分散させ、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)1.２ｇを加えて２５℃に保ち３時間攪拌した。酢酸５０ｍｌを添加して過剰のNaBH4を分解し、さらに５００ｍｌの水を添加し分散後、遠心分離して沈澱を得た。この沈殿を凍結乾燥してコレステロール低減化卵黄粉末を得た。
コレステロールのエピコレステロールへの変換率はガスクロマトグラフィー法で算出した。粉末試料よりクロロホルム−メタノール(2:1)溶液で脂質を抽出後、TC-1701ガスクロカラム（15m×0.53mm  ＧＬサイエンス社製）で２４０℃から２８０℃まで毎分２℃の昇温分析を行い、水素炎イオン化検出器で検出した。その結果を第１図に示す。
以上より、コレステロールの４8.７％がエピコレステロールに変換された、コレステロールが低減化された卵黄を得ることができた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、食品の食感、風味を損なうことなく食品中のコレステロールの量を著量に低減化することができる。
【図１】
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