(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚細胞のコラーゲンレベルを増加させる局所用化粧品および医薬組成物であって、オジギソウ(Mimosa pudica)より得られる生物学的に活性なフェノール化合物含有抽出物またはその活性画分を有効量含んでなる前記組成物。
【請求項２】
フェノール化合物がフラボノイドまたはフラボンアグリコンである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
フェノール化合物がC-グリコシルフラボノイドまたはそのアグリコンである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
フェノール化合物が、マイシン(maysin)、ax-4”-OH-マイシン、2”-O-ラムノシルオリエンチン(rhamnosylorientin)および2”-O-ラムノシルイソオリエンチン(rhamnosyl isoorientin)、ルテオリン、またはこれらの組み合わせである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
フェノール化合物含有抽出物またはその活性画分を0.001〜10％含んでなる、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
皮膚へ適用することにより皮膚の小ジワおよびシワを治療または予防するための、請求項１〜５いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
皮膚へ適用することにより皮膚のコラゲナーゼ活性を阻害するための、請求項１〜５いずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
皮膚へ適用することにより皮膚のハリを増加させるための、請求項１〜５いずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
皮膚へ適用することによりコラーゲンの減少または不足に関連する皮膚症状を治療するための、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
皮膚症状が創傷である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚症状が薬剤誘発性の皮膚萎縮である、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
皮膚症状が強皮症である、請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
皮膚症状がケロイドである、請求項９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、局所用化粧品組成物または局所用医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、オジギソウ（Ｍｉｍｏｓａ ｐｕｄｉｃａ）より得られる化合物を含有する化粧品組成物に関するものであり、該組成物は、皮膚のコラーゲンレベルを維持および／または増加させるのに有用である。
【０００２】
発明の背景
ミモザ属の植物は周知であり、世界中の熱帯および亜熱帯地域に広く分布している。この属並びに近縁のアカシア属に属する一定の植物の抽出物には、特定の生物学的活性、例えば、鎮痙活性、収斂活性、止瀉活性および抗リウマチ活性があることが知られている。これらの種の中で特によく知られているのはミモザ・テニュイフローラ（Ｍｉｍｏｓａ ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ）であり、樹皮が熱傷の治療および炎症の予防に使用されている低木である（Ａｎｔｏｎら， Ｊ． Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３８：１５３−１５７， １９９３； ＦＲ ２７１０５３３）。この植物の抽出物に認められる他の活性としては、上皮の再生（ＵＳ ５１２２３７４； ＥＰ ３２１７０９）、α−アセトキシ酸の活性増強（ＦＲ ２６４６６０２）および鎮痒活性（ＦＲ ２７１０５３３）が挙げられる。Ｍ．テニュイフローラ（Ｍ． ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ）の活性をより具体的に分析したところ、この抽出物の活性がトリテルペノイドサポニンに起因するものであることが確認された（Ａｎｔｏｎら，前出）。
【０００３】
ミモザに属する種のうち、あまりよく知られていないのはオジギソウ（Ｍ． ｐｕｄｉｃａ）である。現在までに、その化学的性質がある程度研究されているものの（Ｅｎｇｌｅｒｔら， Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ６０：１９４， １９９３）、提唱されている生物学的活性はいずれも、主に民間療法（ｅｔｈｎｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）において定着したものに基づくものである。示唆されている活性としては、小児の不眠症、痙攣およびひきつけの治療が挙げられる。今回、予想外にも、オジギソウ抽出物が有用な抗コラゲナーゼ活性を示すことが発見された。該活性は、Ｍ．テニュイフローラにおいて活性であると同定された化合物とは異なる種類の化合物に基づくものである。
【０００４】
発明の概要
本発明は、オジギソウより得られる生物学的に活性なフェノール化合物含有抽出物またはその活性画分を有効量含んでなる局所用化粧品組成物および局所用医薬組成物に関する。このような組成物は、皮膚のコラーゲンレベルを維持および増加させるのに有用であり、したがって、加齢および光老化と関連している小ジワやシワを予防または治療する方法並びに皮膚のハリまたは弾力が失われるのを予防または治療する方法に有用である。好適な実施形態では、該組成物は、少なくとも１種のオジギソウフラボノイド、より好ましくは少なくともＣ−グリコシルフラボノイド、またはその誘導体を含有するものである。
【０００５】
発明の説明
今回、予想外にも、オジギソウのフェノール含有抽出物が、皮膚細胞のコラーゲンレベルを維持または増加させる能力に関する、強力な生物学的活性を有することが発見された。より具体的には、ヒトの線維芽細胞へ適用すると、オジギソウのフェノール化合物含有画分は比較的低濃度であっても、これらの細胞におけるコラーゲンレベルを１００％以上増加させることが可能である。活性抽出物を処理してフェノール化合物を除去すると、抽出物はその活性を失う。
【０００６】
本発明において有用なオジギソウの生物学的に活性な抽出物は、標準的な抽出技術を利用してフェノール化合物を植物材料から抽出し得るものであれば、いずれの手段によっても調製することができる。このような抽出手段としては、エタノール、メタノール、酢酸エチル、アセトン、クロロホルムおよび水、または他の任意の溶剤および水が挙げられるが、これらに限定されない（Ｅｎｇｌｅｒｔら，前出）。活性フェノール画分は、植物のいずれの部分からも取得できるが、好ましくは、葉、小枝、幹、または樹皮、並びに種子といった植物の気生部分から抽出物を採取する。本発明に有用なオジギソウ由来のフェノール化合物は、好ましくは、ジヒドロロビネチン（ｄｉｈｙｄｒｏｒｏｂｉｎｅｔｉｎ）、フスチン（ｆｕｓｔｉｎ）、フィセチンドール（ｆｉｓｅｔｉｎｅｄｏｌ）、ロビネチンドール（ｒｏｂｉｎｅｔｉｎｅｄｏｌ）、カテキン、ガロカテキン、もしくはエピガロカテキン、およびこれらの誘導体等のフラボノイド（例えば、Ｃｒｏｎｊｅら， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． Ｉ：２４６７−２４７７を参照）、またはクリシン（ｃｈｙｓｉｎ）、アピゲニン、ルテオリン、ケンペロール、ガランギン、ケルセチン、ラムネチン、ミリセチン、ゴシペチン等のフラボンアグリコンである。最も好ましくは、該化合物はＣ−グリコシルフラボンおよびこれらのアグリコンである。実施形態の１つでは、好適な化合物はマイシン（ｍａｙｓｉｎ）、ａｘ−４”−ＯＨ−マイシン、２”−Ｏ−ラムノシルオリエンチン（ｒｈａｍｎｏｓｙｌｏｒｉｅｎｔｉｎ）および２”−Ｏ−ラムノシルイソオリエンチン（ｒｈａｍｎｏｓｙｌ ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）、並びにアグリコンルテオリンである。
【０００７】
抽出物を直接使用するだけでなく、フェノール化合物そのものをその起源に拘わらず使用し得ることは明らかであろう。例えば、Ｃ−グリコシルフラボノイドは、オジギソウ（Ｅｎｇｌｅｒｔら，前出）だけでなく、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）からも取得することができ、単離されている（Ｓｎｏｏｋら， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１６３９−１６４７， １９９２； Ｓｎｏｏｋら， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４３：２７４０−２４７５， １９９５）。該化合物はまた、例えばＣｈｏｐｉｎ， Ａｃｔａ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｉｍ． Ｄｅｂｒｅｃｉｎａ １７：２７３−２８４， １９７１およびＫｕｍａｚａｗａら， Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ ６８：１３７９−１３８４， １９９５に記載されているような既知の化学反応によって合成することも可能である。上記文書はそれぞれ、引用により開示内容が本明細書に含まれるものとする。
【０００８】
本明細書中では、抽出物またはその活性部分の「有効量」は、その供給源における純度に依存するものとする。例えば、約２０％の純度の粗フェノール化合物含有抽出物を使用する場合には、通常、組成物に対して約０．０１〜１０重量％のレベルで抽出物を使用する。一方、純度のレベルが高くなればなるほど、同様の効果を得るのに必要なパーセンテージは低くなる。実質的に純粋なフェノール化合物抽出物（即ち、少なくとも約９０％の活性フェノール化合物またはフラボノイドを含む抽出物）であれば、濃度範囲は組成物に対して約０．００１〜約５重量％となり、好ましくは約０．０１〜約３重量％、最も好ましくは約０．１〜約１重量％となる。
【０００９】
抽出物または実質的に純粋なフラボノイドもしくはフラボノイドアグリコンは、局所適用に適した任意の剤形で送達することができる。このような剤形としては、溶液、コロイド分散液、エマルジョン（水中油型または油中水型）、懸濁液、粉末、クリーム、ローション、ゲル、フォーム、ムース、スプレー等が挙げられる。種々のタイプの送達媒体を処方する方法論は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版、第２巻に見出すことができる。
【００１０】
本発明の組成物は、コラゲナーゼの活性および／または皮膚のコラーゲンレベルの低下が原因となるいずれの症状の予防または治療にも有用である。例えば、本発明の組成物を使用して、加齢および光老化に起因する皮膚の小ジワやシワの発生を抑えることができる。同様に、本発明の組成物は、老化した皮膚のハリと弾力を改善するのにも有用である。また、本発明の組成物には、治療用途もいくつか存在する。１つの例は、創傷治癒過程を促進させるものである。本発明の組成物はまた、強皮症やケロイド等の症状の治療にも使用できる。別の用途は、局所用薬剤および全身用薬剤（例えば、コルチコステロイドおよびレチノイド）によって誘発されるコラーゲン関連症状の治療である。局所用コルチコステロイドは炎症性の皮膚障害の治療に広く使用されているが、その最も一般的な有害作用はコラーゲン合成の低下による皮膚萎縮であり、本発明の組成物を使用すれば、萎縮の発生を治療または予防することが可能である。
【００１１】
本発明の組成物は、治療を必要とする皮膚へ、皮膚１ｃｍ２当たり約０．１μｇ〜２ｍｇの量で直接適用することができる。例えば、加齢老化または光老化の症状を治療または予防するための化粧品を目的とした場合には、週に約１回〜日に約４回もしくは５回、好ましくは週に約３回〜日に約３回、最も好ましくは日に約１回もしくは２回適用するのが好ましい。「長期」適用という用語は、本明細書中では、局所適用の期間が使用者の生涯にわたる場合があることを意味し、好ましくは少なくとも約１ヵ月間、より好ましくは約３ヶ月〜約２０年間、より好ましくは約６ヵ月〜約１０年間、さらに好ましくは約１年〜約５年間であり、その長期適用により老化の外面的な症状が治療または予防される。創傷治癒、薬剤誘発性の皮膚萎縮、ケロイド、および他のコラーゲン関連皮膚症状等に対する治療用途については、通常は該組成物を、必要に応じて例えば日に１回もしくは２回、症状が軽減されるまで適用することが必要となる。
【００１２】
以下、実施例を挙げて本発明の組成物および方法を説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【００１３】
実施例
特に断わらない限り、以下の実施例中では、使用するオジギソウ抽出物は７０％エタノールによって抽出した粗抽出物でＳｅｒｄｅｘから入手したものである。
【００１４】
１．コラーゲン増加活性
正常なヒト皮膚線維芽細胞を９６ウェルプレートに播種してコンフルエントになるまで増殖させ、次いで、溶剤／溶剤抽出液（ヘプタン／７０％エタノール、酢酸エチル／水）にて取得したオジギソウ抽出物またはその画分を完全培地中に各種濃度で調製し、該皮膚線維芽細胞を処理する。培地単独を陰性対照とし、ＴＧＦ−βを陽性対照とする。プレートを４日間３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベートし、次いで上清を回収し、ＥＬＩＳＡを実施するまで−７０℃で保存する。Ｉ型コラーゲンまたはＩ型プロコラーゲンに対する抗体をＥＬＩＳＡ分析に使用して、コラーゲンレベルを測定する。結果より、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで処理した場合には４６％の増加であるのに比べて、粗抽出物を５０ｐｐｍで用いるとコラーゲンレベルが１００％増加し、該抽出物をさらに精製した画分を５０ｐｐｍで用いると１１８％、１４２％および１６６％増加することが判明した。このことより、オジギソウ抽出物がコラーゲンレベルの増加に対して強力な活性を発揮することが明らかである。
【００１５】
２．抗コラゲナーゼ活性
抽出物の作用機序を解明するためには、コラゲナーゼ阻害アッセイ（ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）コラゲナーゼアッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をウェルプレートで実施する（全反応容量は２００μｌ）。アッセイは、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２ｍＭアジ化ナトリウムからなる反応緩衝液（ｐＨ７．６）中で行う。各種オジギソウ画分を反応緩衝液へ徐々に濃度を上げながら溶解させるが、最終的には溶解性を向上させるために少量の有機溶媒を含ませてもよい。各アッセイウェルへ８０μｌのオジギソウサンプルを添加する。次いで、２０μｌのコラゲナーゼ基質ＤＱゼラチン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）を添加する。最後に、１００μｌの酵素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍコラゲナーゼ、反応緩衝液中０．６Ｕ／ｍｌ）を添加する。蛍光（λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ）を約２０分間測定する（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ＬＳ ５０Ｂ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。オジギソウ抽出物のＩＣ５０値を、各アッセイウェルの初期反応速度から算出すると、約７５μｇ／ｍｌである。
【００１６】
次いで、抽出物の各種画分および分離によって得た沈澱物の検査を続けたところ、コラゲナーゼに対する強力な活性が明らかとなった。しかしながら、活性サンプルをポリアミドカラム（ＰＶＰ）で濾過してフェノール化合物を除去すると活性が消失することから、活性成分がフェノール化合物であることが明らかである。
【００１７】
３．活性化合物の同定
オジギソウの気生部分由来の粗抽出物を、ヘプタン脱脂７０％エタノール抽出物を酢酸エチルと水とへ分離することによって取得する。上述したように、抗コラゲナーゼ活性という特徴がフェノール化合物であることを既に明らかにしている。次いで酢酸エチル抽出物をブタノールと酸性水（ｐＨ５）とへ分離し、ブタノール残渣をメタノールへ溶解してエーテルで沈澱させ、次いで分取ＨＰＬＣを用いた２段階分画法にかける。各段階で抗コラゲナーゼ活性を評価し、最も活性な画分を選択してさらに精製を行う。最も活性な画分中に見られる化合物をマイシンおよびａｘ−４”−ＯＨマイシンと同定する。
【００１８】
４．抽出物の皮膚に対する効果
皮膚のハリ、小ジワやシワ、および皮膚の厚みに対するミモザ抽出物の効果を観察するため、臨床試験を設計する。３種類のサンプルを調製する。即ち、最初のサンプルには０．２％の粗生成物を含ませ、２番目のサンプルには該抽出物の清澄化部分を０．２％含ませ、３番目のサンプルには媒体のみを含ませる。合計で４７人の女性ボランティアを採用し、そのうちの４６人が試験を完了した。被験者に製品を支給し、目の周囲の領域に１日２回８週間にわたってそれを塗布してもらう。全ての被験者に、クレンジング剤、日焼け止め剤および化粧品を試験期間中使用し続けてもらう。処置前、処置後４週目と８週目に測定を行う。
【００１９】
各時点とも、開始前に被験者に３０分間安静（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）にしてもらう。以下の測定を行う：小ジワおよびシワについては、検査日ごとに顔の両側の外側眼角領域から取得したシリコーン製のレプリカと外側眼角領域の超音波画像を利用する；皮膚のハリについては、バリストメーターを使用する。
【００２０】
結果より、抽出物で処置した場合、小ジワおよび皮膚のシワが４および８週間後にはそれぞれ基準値から２４％および２５％減少することが判明した。清澄化サンプルでは、４および８週間後にはそれぞれ２６％および３０％減少することが判明した。媒体ではわずかに１３％有効であったが、これはおそらく皮膚に水分が補給されたためである。
【００２１】
超音波画像からは、皮膚の密度の最も高い領域と最も低い領域が明らかとなり、より高濃度のコラーゲンおよびエラスチンが関連していると考えられる。皮膚密度の向上は、密度の高い領域が増加し、かつ密度の低い領域が減少したことを反映している。抽出物で処置した場合では、４週間後には密度の高い領域が１６％増加し、８週間後には３０％増加する。清澄化抽出物で処置した場合では、４および８週間後にはそれぞれ３３％および３７％向上する。媒体ではわずかに１９％および１６％有効なだけである。同時に、密度の低い領域は、抽出物で処置した場合では１５％および１４％減少し、清澄化抽出物で処置した場合では２１％および１８％減少し、媒体で処置した場合では１５％および７％減少する。
【００２２】
バリストメーターで測定した皮膚のハリは、抽出物で処置した場合では４および８週目には８％および２２％増加し、清澄化抽出物で処置した場合では１６％および２４％増加し、媒体で処置した場合では７％および８％増加する。
【００２３】
以上の結果全てより、オジギソウ抽出物が、測定を行った各種の老化徴候を改善する上で強力な活性を発揮することが明らかである。