(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応によりペプチドを合成するために使用する高濃度基質溶液であって、１０Ｍ〜５０ＭのＮ−置換アスパラギン酸と１０Ｍ〜５０Ｍのフェニルアラニン低級アルキルエステルがそれぞれ水中に溶解しており、１５〜３０℃未満に放置しても基質の析出が見られないことを特徴とする高濃度アミノ酸水溶液。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸水溶液にプロテアーゼを加え反応させることを特徴とするペプチドの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応でペプチドを合成する際に使用する高濃度アミノ酸水溶液およびこの高濃度アミノ酸水溶液を用いる酵素反応によるペプチドの合成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは、従来から食品製造、皮革工業、医薬原料等に幅広く利用されている。また、近年、加水分解反応の逆反応を利用した有用ペプチドの合成も検討されており、この関連の研究報告も増加している。
【０００３】
プロテアーゼを用いたペプチド合成の例として、例えば、人工甘味料アスパルテームの前駆体であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ではＺＡＰＭと略記することがある。）の合成が挙げられる。ところが、この合成に用いられる基質のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（以下ではＺＡと略記することがある。）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ではＰＭと略記することがある。）は、水に対する溶解度がいずれも１〜１．５Ｍ程度と低いため、数百ｍＭ程度の濃度の基質を用いた報告例が多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一般に、高濃度基質を用いることにより高い反応速度、生産物濃度を得ることが期待でき、また、反応器の容積を低減することも可能である。しかしながら、上記の事情によりプロテアーゼを用いたペプチド合成においては基質を高濃度で使用することができず、高濃度基質を用いたペプチド合成方法が要望されている。
【０００５】
本発明者らは、高濃度基質を用いたプロテアーゼを利用するペプチド（アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル）の合成を実現すべく鋭意検討した結果、基質のＮ−置換アスパラギン酸の粉末とフェニルアラニン低級アルキルエステル（以下ではＰｈｅＯＲと略記することがある。）の粉末に水を添加し、特定の温度で加熱することにより高濃度基質溶液が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、酵素反応によりペプチドを合成するために使用する高濃度基質溶液であって、１０Ｍ〜５０ＭのＮ−置換アスパラギン酸、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（ＺＡ）と１０Ｍ〜５０Ｍのフェニルアラニン低級アルキルエステルがそれぞれ水中に溶解しており、１５〜３０℃未満に放置しても基質の析出が見られないことを特徴とする高濃度アミノ酸水溶液及び該高濃度アミノ酸水溶液にプロテアーゼを添加して反応させるペプチドの合成方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明の特徴は、ペプチド合成の基質であるＮ−置換アスパラギン酸、フェニルアラニン低級アルキルエステル（以下ではＰｈｅＯＲと略記することがある）及びこれら基質の濃度がそれぞれの水に対する溶解度以上の高濃度となる量の水とを３０℃以上に加熱することであり、かくすることによって高濃度のアミノ酸（基質）水溶液を得ることができる。
【０００８】
合成反応の基質であるアミノ酸の融点は、例えば、ＺＡでは１１５℃、ＰＭでは１６０℃であり、固体状のこれらをそれぞれの融点より低い温度で加熱しても液状アミノ酸は当然のことながら得られない。また、水にＺＡおよびＰＭをそれぞれの水に対する溶解度以上の量加え、加熱しても該溶解度以上の濃度、例えば、２Ｍ以上の濃度のアミノ酸水溶液は得られない。
【０００９】
しかしながら、これらの基質と上記量の水とを３０℃以上に加熱する方法では、例えば、５０Ｍ濃度の高濃度基質（アミノ酸）水溶液を調製することも可能である。このことはＺＡやＰＭ以外の上記各基質においても同様である。この理由は、Ｎ−置換アスパラギン酸／ＰｈｅＯＲ／水の３成分系における融点降下現象により劇的に当該化合物の液状化温度が低下したためと推察される。
【００１０】
本発明で使用するＮ−置換アスパラギン酸としては、例えば、上記のＺＡ、ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、また、フェニルアラニン低級アルキルエステル（ＰｈｅＯＲ）としては、例えば、フェニルアラニンメチルエステル、フェニルアラニンエチルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニルアラニンプロピルエステルなど及びこれらの塩酸塩などが挙げられる。
【００１１】
本発明の高濃度アミノ酸水溶液は、Ｎ−置換アスパラギン酸とＰｈｅＯＲ及び水とを加熱することで調製することができ、加熱に際しては両基質と水の三者は共存している状態にあればよく、三者が均一に混合されている必要はない。従って、両基質と水との共存状態は、例えば、粉末状態の両基質の混合物に水を加える方法、該混合物に水を加えて更に混合する方法、容器にランダムに三者を入れる方法などの任意の方法で形成することができる。
【００１２】
Ｎ−置換アスパラギン酸とＰｈｅＯＲの使用割合は、特に限定されないが、Ｎ−置換アスパラギン酸／ＰｈｅＯＲ（モル比）が０．１〜１．５程度が好ましく、更に好ましくは１〜１．５である。また、Ｎ−置換アスパラギン酸及びＰｈｅＯＲに対する水の添加量は、両基質の濃度が、それらの水に対する溶解度以上の濃度となる量であり、水の添加量を調整することで該溶解度以上の任意の濃度の高濃度の基質（アミノ酸）水溶液を調製することができる。
【００１３】
次に両基質及び水の三者を３０℃以上に加熱する。両基質の濃度が２０Ｍ以下の場合には３０〜５０℃に加熱することが好ましい。また、両基質濃度が２０Ｍを超える場合には４０℃以上に加熱することが好ましく、加熱の上限温度は所望の両基質濃度において両基質が液化する温度である。いずれの場合も加熱温度が３０℃未満では両基質の水溶液を得ることは難しい。又、一旦得られた基質の水溶液は、加熱温度に関係なく１５〜３０℃未満に放置しても基質の析出は見られない。
【００１４】
かくして得られた水の溶解度以上の濃度で両基質を含む水溶液（アミノ酸水溶液）を用い、これにプロテアーゼを加えて反応させることによって目的のペプチドを合成することができる。
【００１５】
本発明に用いるプロテアーゼとしては、例えば、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテアーゼなども使用することができる。酵素濃度は、ペプチド合成反応が充分に進行する濃度であれば特に限定されない。
【００１６】
本発明のアミノ酸水溶液は、上記のように、３０℃未満、例えば、室温（１５〜２５℃）に放置してもアミノ酸の析出は見られないから、ペプチド合成の反応温度は酵素の持つ最適反応温度に調整すればよく、特に制限されない。本発明における好ましい反応温度は４０〜６０℃であり、これ以外の温度でもペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難い。
【００１７】
また、反応に際しては、アミノ酸水溶液にアミノ酸濃度が水の溶解度未満の濃度、例えば２Ｍ未満、とならない量の水、有機溶媒、アルカリ等を添加することによって、酵素反応速度、転換率に向上が見られる場合もあり、好ましい。
【００１８】
以上の反応により、ペプチド、即ち、アスパラチルフェニルアラニン低級アルキルエステルを高収量で得ることができる。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【００２０】
実施例１
ＰＭ粉末２１５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ) およびＺＡ粉末２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に水１００μｌを加え、４０℃に加熱したところ、透明なアミノ酸水溶液が得られた。アミノ酸濃度はそれぞれ１０Ｍである。
【００２１】
実施例２
ＰＭ粉末２１５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ) およびＺＡ粉末２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に水４０μｌを加え、７０℃に加熱したところ、透明なアミノ酸水溶液が得られた。アミノ酸濃度はそれぞれ２５Ｍである。
【００２２】
実施例３
ＰＭ粉末２１５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ) およびＺＡ粉末２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に水２０μｌを加え、９０℃に加熱したところ、透明なアミノ酸水溶液が得られた。アミノ酸濃度はそれぞれ５０Ｍである。
【００２３】
実施例４
フェニルアラニンエチルエステル粉末２３０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ) およびＺＡ粉末２６５ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）に水１００μｌを加え、４０℃に加熱したところ、透明なアミノ酸水溶液が得られた。アミノ酸濃度はそれぞれ１０Ｍである。
【００２４】
【発明の効果】
以上の本発明によれば、ペプチド合成の基質である二種のアミノ酸を、それぞれの水に対する溶解度以上の濃度で溶解した高濃度基質（アミノ酸）水溶液を、両基質と水とを、両基質の融点以下の温度に加熱することで容易に調製することができる。また、本発明の高濃度アミノ酸水溶液を用いることにより、高収量の酵素によるペプチド合成が可能となった。