(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列と、
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列のうち、第１番目のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）残基を含まないアミノ酸配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列をコード化するDNAを含み、該DNAがコードする酵素は実質的にマイトジェン活性がない、実質的に精製されたDNA。
【請求項２】
前記DNAはアミノ酸配列
0003644961.tif 000033
をコード化するDNA配列を含む、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
配列番号７のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のDNA。
【請求項４】
適当な細菌宿主細胞に適合する制御配列の少なくとも１つと操作的に連結された請求項１に記載のDNA配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素用の発現ベクター。
【請求項５】
適当な細菌宿主細胞に適合する制御配列の少なくとも１つと操作的に連結された請求項３に記載のDNA配列を含む、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素用の発現ベクター。
【請求項６】
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素をコード化するDNAがバクテリオファージλ由来の配列の少なくとも１つに連結されている、請求項４に記載のベクター。
【請求項７】
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素をコード化するDNAがバクテリオファージλ由来の配列の少なくとも１つと連結されている、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
形質転換された細菌宿主細胞が、請求項４記載の発現ベクターの中に組み込まれたDNAによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で請求項４記載の発現ベクターを用いて形質転換された細菌宿主細胞。
【請求項９】
形質転換された細菌宿主細胞が、請求項５記載の発現ベクターの中に組み込まれたDNAによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で請求項５記載の発現ベクターを用いて形質転換された細菌宿主細胞。
【請求項１０】
（ａ）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列と、
（ｂ）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列のうち、第１番目のアミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）残基を含まないアミノ酸配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、実質的にマイトジェン活性がない、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項１１】
（ａ）請求項８に記載の細菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養された前記細菌宿主細胞を使用してDNアーゼＢ酵素を発現させる工程と、
（ｃ）前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項９に記載の細菌宿主細胞を培養する工程と、
（ｂ）培養された前記細菌宿主細胞を使用してDNアーゼＢ酵素を発現させる工程と、
（ｃ）前記培養された細菌宿主細胞から前記酵素を精製する工程とを含む、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項11に記載の方法により製造される、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項１４】
請求項12に記載の方法により製造される、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項１５】
アミノ酸配列
0003644961.tif 000034
を有するリーダーペプチドがストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の配列番号９のアミノ酸配列のアミノ末端に融合し、実質的にマイトジェン活性がない、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項１６】
配列番号９のアミノ酸配列のうち１個のアミノ酸が別の天然Ｌ−アミノ酸に置換されており、実質的にマイトジェン活性がなく、DNアーゼ酵素活性を示す、タンパク質の変異体。
【請求項１７】
配列番号９のアミノ酸配列のうち１個のアミノ酸が別の天然Ｌ−アミノ酸に置換されている変異体であって、実質的にマイトジェン活性がなく、天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素と結合する抗体によって結合される、変異体。
【請求項１８】
別の遺伝子と融合された請求項３に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢのDNA配列を含み、
DNアーゼ酵素活性と、天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素と結合する抗体によって結合される活性とからなるグループから選択される１または２の活性を示すタンパク質をコードする、転写融合体。
【請求項１９】
別のタンパク質と融合された請求項３に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢのDNA配列を含み、
DNアーゼ酵素活性と、天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素と結合する抗体によって結合される活性とからなるグループから選択される１または２の活性を示すタンパク質をコードする、翻訳融合体。
【請求項２０】
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素、および／または
（２）リーダーペプチドとアミノ末端で融合したストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を含み、前記（１）および（２）のDNアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含まない、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素であって、
（ａ）実質的にマイトジェン活性がなく、
（ｂ）pH7.5でDNアーゼ活性を示し、
（ｃ）等電点がpH8.13とpH8.55との間にあり、
（ｄ）見かけ分子量が25,000ダルトンで、
（ｉ）ジエチルアミノエチル  セルロースへの吸着および溶離により第１溶出物を得る工程と、（ii）第１溶出物のフェニル  アガロース上でのクロマトグラフィーにより第２溶出物を得る工程と、（iii）第２溶出物のヘパリン  アガロース上でのクロマトグラフィーにより第３溶出物を得る工程と、（iv）第３溶出物のクロマトフォーカシングにより、画分Ｉおよび／またはIIを含む、実質的に精製されたDNアーゼＢ酵素を得る工程とを含む工程により製造される、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項２１】
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の画分Ｉを含み、かつストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の画分IIを実質的に含まない、請求項19に記載の実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項２２】
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の画分IIを含み、かつストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の画分Ｉを実質的に含まない、請求項19に記載の実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素。
【請求項２３】
配列番号７のDNA配列のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のアミノ末端のアミノ酸24個をコード化するDNA配列と相補的な一本鎖核酸プローブ。
【請求項２４】
（ａ）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料を準備する工程と、
（ｂ）試験試料中の抗DNアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場合に検出可能な水準の酵素活性を生じるのに十分な量の請求項13に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を前記試験試料に加える工程と、
（ｃ）酵素検定を行うことにより試験試料中のDNアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネス抗体を検出及び／又は測定する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項２５】
（ａ）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料を調製する工程と、
（ｂ）試験試料中の抗DNアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場合に検出可能な水準の酵素活性を生じるのに十分な量の請求項14に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を前記試験試料に加える工程と、
（ｃ）試験試料中のDNアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネス抗体を検出及び／又は測定する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項２６】
（ａ）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料を調製する工程と、
（ｂ）試験試料中の抗DNアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場合に検出可能な水準の酵素活性を生じるのに十分な量の請求項20に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を前記試験試料に加える工程と、
（ｃ）酵素検定を行うことにより試験試料中のDNアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネス抗体を検出及び／又は測定する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項13に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を固体支持体に結合させる工程と、
（ｂ）前記固体支持体に結合されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素に、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料を反応させ、前記抗体を前記酵素に、そして前記固体支持体に結合させる工程と、
（ｃ）前記固体支持体に結合された抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項14に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を固体支持体に結合させる工程と、
（ｂ）前記固体支持体に結合されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素に、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料を反応させ、前記抗体を前記酵素に、そして前記固体支持体に結合させる工程と、
（ｃ）前記固体支持体に結合された抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項２９】
（ａ）請求項20に記載のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を固体支持体に結合させる工程と、
（ｂ）前記固体支持体に結合されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素に、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料を反応させ、前記抗体を前記酵素に、そして前記固体支持体に結合させる工程と、
（ｃ）前記固体支持体に結合された抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項３０】
（ａ）請求項14に記載のDNアーゼＢの緩衝溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記DNアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料と反応させる工程と、
（ｃ）前記溶液中の光吸収及び／又は光散乱の変化を観察及び／又は測定することによって前記DNアーゼＢと前記抗DNアーゼＢ抗体との間の反応を検出する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項３１】
（ａ）請求項14に記載のDNアーゼＢの緩衝溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記DNアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料と反応させる工程と、
（ｃ）前記溶液中の光吸収及び／又は光散乱の変化を観察及び／又は測定することによって前記DNアーゼＢと前記抗DNアーゼＢ抗体との間の反応を検出する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【請求項３２】
（ａ）請求項20に記載のDNアーゼＢの緩衝溶液を調製する工程と、
（ｂ）前記DNアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含むことが疑われる試験試料と反応させる工程と、
（ｃ）前記溶液中の光吸収及び／又は光散乱の変化を観察及び／又は測定することによって前記DNアーゼＢと前記抗DNアーゼＢ抗体との間の反応を検出する工程とを含む、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は病原菌ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿連鎖球菌：Streptococcus pyogenes）から誘導される組換えDNアーゼＢ、その製造方法及びその使用方法に関する。
細菌感染症の予防と治療の進歩にもかかわらず、多数の細菌性病原体は依然として診療（medical practice）において深刻な問題であり、重い病気、さらには命にかかわる病気を引き起こし続けている。これらの病原体のうちの一つは、ストレプトコッカス・ピオゲネスである。ストレプトコッカス・ピオゲネスによって引き起こされる病気の中には、連鎖球菌咽頭炎（“連鎖球菌咽喉炎”）、猩紅熱及びこれらの化膿性合併症、例えば頸部腺炎、中耳炎、乳様突起炎、扁桃周囲膿瘍、髄膜炎、間質性肺炎、肺炎、産褥期敗血症、皮膚の蜂巣炎、膿痂疹、リンパ管炎、丹毒、急性糸球体腎炎及びリウマチ熱がある。
かかる感染症はしばしば病院で発生（院内感染）し、特に正常な免疫系の機能が抑制されている患者において生じる。後者のカテゴリーにはAIDSの患者、癌用に又は移植拒絶を防ぐために免疫抑制剤の投与を受けている患者、及び血行が悪い患者、例えば糖尿病の患者が含まれる。
これらの病気は、化膿性の病巣を根絶するために及び生き残っている化膿性の病巣に対する免疫反応によって引き起こされる続発症を予防するために迅速かつ有効な治療を必要とするので、ストレプトコッカス・ピオゲネスの存在について迅速に診断することがかかる感染症が疑われる患者には欠くことができない。ストレプトコッカス・ピオゲネスを迅速に診断することができないと、治療が極めて困難になり得るし又は治療が不可能になる場合さえあり得る。
現在、ストレプトコッカス・ピオゲネスの複数の検出方法が利用できるが、これらの方法は特に臨床用途において欠点を有する。
ストレプトコッカス・ピオゲネスの検出方法の中には、DNアーゼＢすなわちストレプトコッカス・ピオゲネスによって産生されるDNA−分解酵素に対する抗体の存在の検出がある。この酵素は、感染中にストレプトコッカス・ピオゲネスから分泌される酵素であり、急性リウマチ熱及び急性糸球体腎炎に罹り始めている患者において実質的（substantial）な力価（タイター）の抗体の発現（development）を始める。
これらのリウマチ熱及び糸球体腎炎については、ストレプトリシンＯ及びヒアルロニダーゼに対する抗体の検出法を含めて、血清に基づいた別の診断試験法が利用し得るが、Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌のほとんど全ての菌株の間にDNアーゼＢが認められること並びに皮膚及び咽頭の感染症をもつ患者において高いDNアーゼＢ力価が認められることから、抗DNアーゼＢ抗体の検定法はある利点を提供する。
抗DNアーゼＢ抗体の検定については商業的に入手し得る多数の試験法があるが、これらの試験法は欠点をもっている。前記のように、改良された試験法が大いに必要とされる。
商業的に入手し得る試験法は、次の３つのカテゴリー：すなわち
（１）前記抗体の、酵素活性を阻害することができる能力を使用するDNアーゼＢ阻害に基づいた検定法；
（２）種々のストレプトコッカス・ピオゲネス抗原に対する抗体のラテックス凝集検定法；及び
（３）比濁（turbidimetric）阻害検定法
に分けられる。また、ELISA検定法も研究室で使用されているが、以下に詳述するように、この検定法は日常の臨床応用に適しているということがまだ判明していない。
前記のDNアーゼＢ阻害検定法は非常に遅く、しかも典型的には実行するのに約４〜８時間要する。従って、治療をできるだけ早く開始できるように抗DNアーゼＢ抗体の確認が迅速に必要とされる状況においては、ストレプトコッカス・ピオゲネスの存在が確認されるべきであり、前記の酵素阻害検定法は特に役立つという訳ではない。
前記のラテックス凝集検定法は５種類のストレプトコッカス・ピオゲネス抗原に対する抗体を検出することを目的とする。しかしながら、試験結果はラテックス凝集検定法と特異的抗DNアーゼＢ試験法との間の一致が不十分であることを示している。一つの研究、すなわちG.C.KleinとW.L.Jonesの論文、“Comparison of the Streptozyme Test with the Antistreptolysin O,Antideoxyribonuclease B,and Antihyaluronidase Tests",App.Microbiol.,21,257−259（1971）においては、ラテックス凝集検定で陰性と検査された患者80人中12人は、実際には、抗DNアーゼＢ抗体について陽性であった。この高い水準の誤った反対の結果は、この試験法が臨床用途に望ましくないことを意味している。
前記の比濁阻害検定法は、抗DNアーゼＢ抗体で被覆されたラテックス粒子の凝集を、該ラテックス粒子上の抗体と競争する抗DNアーゼＢ抗体を含んでいる血清の存在下で、限られた量のDNアーゼＢの粗製調剤（crude preparation）で阻害することに依在する。この検定法は米国特許第5,055,395号明細書（本明細書において参照される）に記載されており、比較的感度が悪い。従って、この検定法はストレプトコッカス・ピオゲネスの感染の初期の段階で使用するのには適していない。抗DNアーゼＢ抗体を正確に検定することが最も大切であるのはまさにこの段階である。その上、比濁阻害検定法に使用される試薬は製造することが困難である。
抗DNアーゼＢ抗体のELISA−に基づいた検定法は、M.A.Gerberらの論文,"Enzyme−Linked Immunosorbent Assay of Antibodies in Human Sera to Streptococcal DNase B",J.Lab.Clin.Med.,95,258−265（1980）に報告されている。この検定法は研究手段として有効であることが判明しているが、その商業用途、特に臨床診断におけるスケールアップは実行不可能である。これはかかるスケールアップが前記に詳述したような容易ならない病原体であるストレプトコッカス・ピオゲネスのDNアーゼＢ酵素の製造と精製とを必要とするからである。ELISA検定法の商業化に十分な酵素を製造するのに必要とされる量でこの病原菌を増殖させるには、極めて費用のかかる封じ込め（containment）法を必要とするばかりではなく、またストレプトコッカス・ピオゲネスの増殖に必要とされる培地も非常に複雑でありしかも高価である。これらの問題が抗DNアーゼＢ抗体のELISA検定法の商業用の変形の開発を著しく妨げている。
従って、抗DNアーゼＢ抗体の改良された迅速かつ特異的な検定法に対する要求が存在する。かかる検定法は、内科医が自分の診療室で使用できるものであり、しかも最小限度の装置しか必要としないものであるのが好ましい。これは、連鎖球菌咽喉炎又は猩紅熱のような病気をもつ患者が入院に先立ってその患者の家庭医に会うからであり、しかもその時点でのストレプトコッカス・ピオゲネスの感染についての正確な診断はその患者が入院している場合にのみ行われる爾後の診断よりも好ましいものであるからである。
かかる改良された検定法の開発は、多量のDNアーゼＢ酵素自体の入手可能性に左右される。従って、複雑で、扱いにくくしかも費用のかかる封じ込め手段（measures）を必要とせずに、スケールアップして商業的な量の酵素を製造できる方法を使用するストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の製造方法に対する要求がある。
要約
本発明者らは、大腸菌（Escherichia coli）中でストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの遺伝子をクローン化し、発現させてストレプトコッカス・ピオゲネスの増殖を必要とせずに前記DNアーゼＢ酵素の便利かつ効率的な製造を可能にした。
このクローニング方法は、下記のアミノ酸配列：すなわち（ｉ）以下の図４に示されるストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素〔該酵素はそのアミノ末端にリーダーペプチドから誘導されるアルギニン（Ｒ）残基であって天然のDNアーゼＢ酵素には存在しないアルギニン（Ｒ）残基を含んでいる〕のアミノ酸配列；及び（ii）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化する配列のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列コード化する実質的に精製されたDNAであって、場合によってはリーダーペプチドの残基を少なくとも１つ含んでいてもよいDNAをもたらす。該DNAは図４のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ配列をコード化するDNA、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化するDNA及びリーダーペプチドをコード化するDNA以外のDNAを実質的に含んでいない。
前記DNAは、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のアミノ末端に融合されたリーダーペプチドをコード化するDNA配列をさらに含有するものであることが好ましい。
クローン化された前記DNAは、図３に示される配列をもつDNA、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の全アミノ酸配列とリーダーペプチドとをコード化するDNAであるのが最も好ましい。
本発明の別の要旨は、適当な細菌宿主細胞に適合した制御配列の少なくとも１つに操作して連結された前記DNA配列を含有するストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素用の発現ベクターにある。該発現ベクターはブラスミドベクターであるのが好ましい。典型的には、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素をコード化する前記DNAは、バクテリオファージλ由来の配列の少なくとも１つに連結される。
本発明の別の要旨は、本発明の発現ベクターを用いて形質転換、移入又は感染させた細菌宿主細胞であって、該形質転換細菌宿主細胞が、発現ベクターの中に組み込まれたDNAによってコード化されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢを検出可能な量で発現することを可能にする方法で形質転換、移入又は感染された細菌宿主細胞である。前記の発現されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢは前記酵素を産生する完全な（whole）細胞により分泌されるか又は分泌されないかいずれかであり得、しかも可溶性又は不溶性の形であり得る。
本発明の別の要旨は、図４のアミノ酸配列をもつタンパク質を含有する実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素にある。
本発明のさらに別の要旨は、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の製造方法であって、
（１）本発明の発現ベクターを用いて形質転換させた細菌宿主細胞を培養し；
（２）培養した細菌宿主細胞を使用して前記DNアーゼＢ酵素を発現させ；そして
（３）培養した細菌宿主細胞から前記酵素を精製する
ことを含んでなる実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の製造方法である。
本発明の別の要旨は、アミノ末端においてリーダーペプチドと融合されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素であって、該リーダーペプチドが次の配列：
0003644961.tif 000002
を有するものである、リーダーペプチドと融合されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素にある。
本発明のさらに別の要旨は、図４に示されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列において複数のアミノ酸のうちの少なくとも１つが別の天然産のＬ−アミノ酸によって置換されているタンパク質の変異体にある。得られる変異体は、低下又は増大したDNアーゼ活性を有するか又は別の改変された性質を有する。一つの好ましい態様においては、該変異体は天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の抗原反応性を実質的に保持している。
本発明のさらに別の要旨は、別の遺伝子又はタンパク質に対するストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子又はタンパク質の全体又は部分の翻訳又は転写融合体であって、得られる遺伝子組み立て体がいくつかの改変された性質を有するものである前記翻訳又は転写融合体にある。これらの性質としては、（１）高い水準のRNA発現；（２）高い水準のタンパク質発現；該融合における第２の機能性酵素、レセプター又は他の活性タンパク質；（４）親和性リガンドに対するDNアーゼＢの融合；（５）高分子量タンパク質の産生：及び（６）高められた免疫活性を挙げ得る。
本発明のさらにまた別の要旨は、ストレプトコッカスDNアーゼＢ酵素及びアミノ末端においてリーダーペプチドと融合されているストレプトコッカスDNアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含有していない実質的に精製された天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素にある。該実質的に精製されたタンパク質は、実質的にマイトジェン活性を有していない。前記の実質的に精製された酵素はさらに、等電点（pI）に応じて２つの画分、すなわち画分Ｉと画分IIに精製される。それぞれの画分は実質的に他方の画分を含有していない調剤に精製し得る。
実質的に精製された天然ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の本発明の製造方法は、
（１）ジエチルアミノエチルセルロースに吸着させかつそれから溶出させて第１の溶出物を生成させること；
（２）得られた第１の溶出物をフェニルアガロース上でクロマトグラフィー分離して第２の溶出物を生成させること；
（３）得られた第２の溶出物をヘパリンアガロース上でクロマトグラフィー分離して第３の溶出物を生成させること；及び
（４）得られた第３の溶出物をクロマトフォーカシング（chromatofocusing:等電点クロマトグラフィー分離）して実質的に精製されたDNアーゼＢ酵素を生成させること
を含んでなる。該方法はさらに、前記の実質的に精製されたDNアーゼＢを逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製することを含んでなるのが好ましい。画分Ｉと画分IIの分離は、この２つの画分の酵素の異なるpIの結果としてクロマトフォーカシング工程で生じる。
本発明のさらにまた別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のアミノ末端のアミノ酸24個をコード化するDNA配列であってそのリーダー配列の部分を含んでおらず、約30％以下の誤対合を有するDNA配列のヌクレオチド少なくとも約17個とハイブリッド形成する一本鎖核酸プローブにある。
本発明の別の要旨は増幅反応例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RCR又は他のDNA増幅反応にプライマー部位として機能するのに十分な大きさと特異性とをもつDNA配列の部分を包含する。また、ストレプトコッカス・ピオゲネスＢのDNA配列の同じ諸部分は、DNA増幅反応なしで相同な配列の検出用の特異的プローブとしても機能する。
実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢは当該技術において周知の技法により、該DNアーゼＢを特異的に結合する抗体を産生させるのに使用し得る。該抗体はポリクロナール抗体又はモノクロナール抗体のいずれかであり得る。
本発明の別の要旨は、試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する方法にある。該方法は、次の工程：
（１）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料を調製する（provide）工程；
（２）前記試験試料に本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の一定量を加える工程であり、該一定量は試験試料中の抗DNアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場合には検出可能な水準の酵素活性を産生するのに十分な量である；及び
（３）酵素検定を行うことにより試験試料中のDNアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定する工程
を含んでなる。
抗DNアーゼＢ抗体を検出する別の方法は、次の工程：
（１）本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を固体支持体例えばラテックス粒子に結合させる工程；
（２）前記固体支持体に結合されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素に、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料を反応させて該抗体を前記酵素すなわち前記固体支持体に結合させる工程；及び
（３）前記固体支持体に結合された前記抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程
を含んでなる。
このアプローチは、定量について比濁法、混濁法、凝集法又はELISA法に使用し得る。
抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出する別の方法は、（１）DNアーゼＢの緩衝溶液を調製し；（２）前記DNアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料と反応させ；そして（３）前記溶液中の光の吸収及び／又は光の散乱の変化を観察及び／又は測定することによってDNアーゼＢと抗DNアーゼＢ抗体との間の反応を検出することを含んでなる。
抗DNアーゼＢ抗体を検出する別の方法は毛管電気泳動である。
前記のクローン化された配列はストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子と会合した（associated）プロモーターを含んでいるので、本発明のさらに別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターを使用してDNアーゼＢ以外のタンパク質を発現させる方法にある。この方法は、
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターをストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子から分離し；
（２）前記プロモーターをDNアーゼＢの遺伝子以外のストレプトコッカス・ピオゲネスタンパク質の構造遺伝子と操作的に連結させ；そして
（３）前記構造遺伝子によってコード化された前記タンパク質を発現させる
ことを含んでなる。
前記タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス中で又はストレプトコッカス・ピオゲネス以外の原核生物中で発現させ得る。
本発明の別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーター配列であってその中に転写開始部位と、細菌プロモーターの共通−10及び35部位に相同性の部位とを含んでいるプロモーター配列から誘導される実質的に精製されたプロモーター配列にある。
本発明のさらに別の要旨は、原核生物中でタンパク質を発現させるためのDNアーゼＢのリーダーペプチドと、次の配列：
0003644961.tif 000003
との使用にある。この要旨はリーダーペプチドを含んでいる完全なクローン化DNアーゼＢセグメントが大腸菌の中で発現されると、タンパク質が培地中に分泌されるという知見によるものである。リーダーペプチドを使用して原核生物中でタンパク質を発現させる方法は、
（１）リーダーペプチドをコード化するDNAは、タンパク質をコード化するDNAを融合させ、それによって得られた融合DNAにタンパク質のアミノ末端にあるリーダーペプチドをもつ単一の読み取り枠をもつ組換えタンパク質をコード化させ；
（２）前記の融合DNAを原核生物中に導入し；そして
（３）前記の融合DNAを原核生物中で発現させて組換えタンパク質を回収し得る量で産生させる
ことを含んでなる。
前記の原核生物は大腸菌、またはスタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトコッカス種もしくはストレプトマイセス（Streptomyces）種などのグラム陽性菌であり得る。
【図面の簡単な説明】
本発明のこれらの特徴及び別の特徴、要旨（aspect）並びに利点は以下の記載、添付の請求の範囲及び添付の図面を参照してよりよく理解されるであろう。添付の図面において、
図１はクローン化されたDNアーゼＢを含んでいる領域の部分的制限地図を表わすものであり、該クローン中のキメラDNAの領域と、DNアーゼＢの遺伝子との位置を示し；
図２は図１のクローン化されたDNAのサブクローンの位置と、該サブクローンによって産生されたヌクレアーゼ活性の指標を表わすものであり；
図３は図１に示される部分制限地図をもつクローンのDNA配列を表わすものであり；
図４は図２のDNA配列から誘導される組換えDNアーゼＢタンパク質のアミノ酸配列であって、天然産の精製DAアーゼＢの配列決定の結果として決定されたアミノ末端をもつアミノ酸配列を表わすものであり；
図５はDNアーゼＢ配列をコード化するDNAにバクテリオファージλプロモーターを融合するための組立て体（construct）のDNA配列を該組立て体の形成におけるPCRに使用されるプライマーと一緒に表わすものであり；
図６はヒト抗DNアーゼＢ血清による組換えDNアーゼＢの不活性化すなわち失活を表わすグラフであり；
図７はクローン化されたDNA中の読取り枠の上流のDNA配列と、大腸菌プロモーターのコンセンサス配列とを表わすものであり；
図８は組換えDNアーゼＢ酵素を使用するヒト血清中の抗DNアーゼＢ抗体の定量と、ストレプトコッカス・ピオゲネスから単離された市販のDNアーゼＢ酵素を使用するヒト血清中の抗DNアーゼＢ抗体の定量との間の一致を示す補正曲線であり；そして
図９は組換えDNアーゼＢと天然産DAアーゼＢの精製調剤の両方からマイトジェン活性が本質的に欠乏していることを示すグラフである。
詳細な説明
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の商業的に使用可能な供給源に対する要求を満たす目的で、本発明者らはストレプトコッカス・ピオゲネスゲノムDNA由来のDNアーゼＢ用の遺伝子を大腸菌の中にクローン化した。ストレプトコッカス・ピオゲネスと大腸菌の間には、これら２種類の菌の18SリボソームRNAの配列における相当なダイバージェンス（divergence）によって示されるような進化論的違い、並びに形態的特徴及び他の分類学的特徴（大腸菌はグラム陰性菌であり、一方ストレプトコッカス・ピオゲネスはグラム陽性菌である）の違いがあるにもかかわらず、本発明者らはクローン化遺伝子の大腸菌中での発現と、発現されたタンパク質の活性に応じて酵素検定によって選別を行い得る発現タンパク質の活性とについてかかる高い水準を達成した。
I.大腸菌中でストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子のクローニング及び発現
大腸菌中でのストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子のクローニング及び発現は、下記の工程（該工程は、活性な酵素が遺伝子から発現される形態で完全な遺伝子のクローニングを達成するために注意深く最適化される）：すなわち
（１）ゲノムDNAを単離する工程；
（２）DNAクローニング用のゲノムDNA断片を調製する工程；
（３）DNA断片をクローニングベクター中に組み込む工程；
（４）細菌を感染させ、選別する工程；及び
（５）得られたクローン及びDNAを特定する工程
を必要とする。
A.ゲノムDNAの単離
ゲノムDNAはストレプトコッカス・ピオゲネスから、内因性ヌクレアーゼの活性及びDNAを分解又は変性できる他の因子の活性を最小にする条件下で単離するのが好ましい。これは細胞の溶解（lysis）と、タンパク質の分解とを必要とする。好ましい細胞の溶解方法は、65℃でタンパク質分解酵素アクロモペプチダーゼを用いて培養し、次いでカオトロピック界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いて培養する方法である。この方法はキレート剤例えばEDTAの存在下で行うのが最も好ましい。別法として、別のプロナアーゼ例えばプロテアーゼ及びプロテイナーゼＫが細胞を溶解するのに使用できる。他の溶解方法は当該技術において公知である〔S.Horinouchiらの論文、“A New Isolation Method of Plasmid Deoxyribonucleic Acid from Staphylococcus aureus Using a Lytic Enzyme of Achromobacter Lyticus",Agric.Biol.Chem.,41,2487−2489（1977）〕。
次いで、DNAをフェノール又はフェノール−クロロホルムで抽出し、抽出したDNAをエタノールで沈殿させるのが好ましい。適当な抽出順序は、当容量のフェノールを用いて２回抽出し、次いでフェノール／クロロホルムの1:1の混合物を用いて１回抽出することである（例１）。得られた抽出緩衝液は、ヌクレアーゼ活性を最小限にするためにキレート剤例えばEDTAを含有するのが好ましい。かかる方法は周知であり、例えばD.M.Wallaceの論文,"Larger−and Small−Scale Phenol Extractions",Meth.Enzymol.,152,33−40（1987）及びD.M.Wallaceの論文,"Precipitaion of Nucleic Acid",Meth.Enzymol.,152,41−48（1987）に記載されている。
DNAの適当な供給源は、C203Sすなわち菌株C203の非Ｍ含有変異株としても知られているストレプトコッカス・ピオゲネスの菌株ATCC No.14289である。しかしながら、同様の方法は、DNアーゼＢの遺伝子を含有するストレプトコッカス・ピオゲネスの別の菌株を使用し得る。
単離したDNAは抽出及びエタノール沈殿の後にRNアーゼＡを用いて処理し、次いでさらに塩化セシウム勾配で精製するのが好ましい。
B.クローニング用のDNA断片の調製
単離したゲノムDNAはクローニングする前に断片化することが好ましい。断片化はDNAを注射針、最も好ましくは25ゲージ（gauge）の注射針の中を約30回通すことによって行うのが最も好ましい。これは、約６〜8kbの平均サイズをもつ切断されたDNAをもたらす。あまり好ましくない別の方法では、制限エンドヌクレアーゼ例えばSau 3A又はMob Iを用いる部分消化が使用できる。これは例えばA.−M.Frischaufの論文、“Digestion of DNA:Size Fractionation"、Meth.Enzymol.,152,183−189（1987）に記載されている。この文献は本明細書において参照される。
C.クローニングベクターへのDNA断片の組み込み
次の工程はクローニングベクター中へのDNA断片の組み込みである。かかるクローニングベクターは、典型的には適当な細菌宿主細胞に適合した制御配列の少なくとも１つに操作して連結されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢをコード化するDNA配列を含有する。かかる制御配列はオペレーターとプロモーターを含む。適当なプロモーターとしては、バクテリオファージλPLプロモーター、ハイブリッドtrp−lacプロモーター及びバクテリオファージT7プロモーターが挙げられる。また、クローニングベクターは、発現に適したリボソーム結合部位も含有する。好ましいクローニングベクターはλgtll〔R.A.YoungとR.W.Dvisの論文，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,80,1194（1983）〕であり、これは該ベクターに組み込まれ、かつクローン化DNAに操作して連結されたlacプロモーターによって制限された発現を可能にする。他の適当なクローニングベクターが当該技術において周知であり、例えば、J.Sambrookらの著作,"Molecular Cloning:Laboratory Manual"（第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press発行,Cold Spring Harbor,New York,1989年），第３巻、第17章、標題“Expression of Cloned Genes in Escherichia coli”に記載されており、この文献は本明細書において参照される。ファージλgtllに関しては、DNAはEco R I切断部位に挿入される。かかるクローニングに関しては、切断されたDNAは大腸菌リガーゼ次いでT4DNAポリメラーゼを使用し、次いでEco R Iリンカーを加えることにより修復されるのが好ましい。これらのEco R I−末端化断片は、Eco R I制限エンドヌクレアーゼで消化した後にλgtllアームに連結され得る。メチラーゼによる認識部位のアデニン残基においてメチル化されたDNAは制限エンドヌクレアーゼにより消化されないことから、この消化操作の間は、内部のEco R I部位はEco R Iメチラーゼを用いて保護される。
連結反応の完了後に、得られたDNAはファージ粒子の構築（assembly）に必要とされる遺伝子においてバクテリオファージλ変異体を用いて感染させる細菌から調製された抽出物の混合物を使用して、試験管内で（in vitro）バクテリオファージλの頭部に詰め込まれる。詰め込み方法は当該技術において周知であり、例えばSambrookらの著作、前記の著作、第１巻、pp.2.95−2.108に記載されている。
D.細菌の感染と選別
試験管内詰め込みによって構築されたファージ粒子を使用して感受性の大腸菌を感染させた。特に好ましい細菌宿主細胞はY1090（−pMC9）、すなわちpMC9プラスミドを欠いている細胞である。適当な方法は色指示薬としてトルイジンブルーO0.01％を含有するDNアーゼテスト寒天〔Difco社（ミシガン州デトロイト所在）製〕の上部寒天の上層（overlay）とプラークとを重ねる方法である。これはDNアーゼＢ遺伝子を発現するプラークの検出を可能にする。
この系におけるDNアーゼＢ遺伝子の予想外に高い水準の発現は、免疫スクリーニング（これは一般にクローン化遺伝子産生物の検出に必要とされる）を必要とせずに、得られる酵素活性を直接検出することによる陽性クローンの直接検出を可能にした。
感染させた宿主細胞を使用する実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの製造方法は、
（ａ）バクテリオファージλ誘導体であり得る適当な発現ベクターを用いて形質転換させた細菌宿主細胞を培養し；
（ｂ）培養した形質転換細菌宿主細胞を培養してDNアーゼＢ酵素を発現させ；そして
（ｃ）培養した形質転換細菌宿主細胞から前記酵素を精製する
ことを含んでなり得る。
E.クローンの特定とDNAの配列決定
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子（２−６と命名する）を含有するλgtllファージを単離し、該ファージからDNAを調製した。このクローンを制限分析により分析し、得られた結果を図１に示す。ヌクレアーゼ活性の存在に関するEco R I及びEco R I/Sac Iサブクローンの分析は、図２に示されるように、DNアーゼＢ遺伝子の一部が内部のSac I〜Eco R I領域の中に配置されていることを示す。
クローン化されたDNAの配列決定は標準的な方法、例えばSangerのジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター法を使用して行い得る。配列決定分析は、λgtllファージ内をDNアーゼ活性があると思われる領域にわたってプライマー合成法（primign synthesis）により開始し得る。かかる配列決定の結果を図３に示す。
図３に示される配列をもつクローン化DNAは、長い読み取り枠すなわち転写解読枠（ORF）を組み込んでいる。このORFの翻訳によって誘導されるアミノ酸配列を図３及び図４に示す。アミノ酸44（Gln）において始まるこのORFの5'−末端部分のアミノ酸配列は、精製された天然産のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの配列決定によって得られたアミノ酸配列（セクションIV）と一致する。
従って、本発明は、次のアミノ酸配列：すなわち（ｉ）図４に示されるストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のアミノ酸配列；及び（ii）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化する配列のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化するDNAを含有してなる実質的に精製されたDNAを包含する。該DNAは、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のアミノ末端に融合したリーダーペプチド以外は、図４のアミノ酸配列又はストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の機能的均等物をコード化していないDNAを実質的に含んでいない。以下に述べるように、読み取り枠から生成された翻訳産物はリーダーペプチドを含んでいる。
本明細書において、“機能的均等物（functional equivalent）”という用語は、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢについて一般的に使用される検定法において検出し得るDNアーゼ活性をもつタンパク質であってかつ実質的に生成されたDNアーゼＢに対する抗体と少なくとも検出可能な程度まで交差反応するタンパク質をいう。この“機能的均等物”という用語は、１つ又はそれ以上の同類アミノ酸置換によって図４の配列と異なる配列をもつタンパク質を包含するものであるが、それに限定されるものではない。かかる同類アミノ酸置換としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｂ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかをこれらのアミノ酸のうちの他のいずれかに置換すること；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に及びその逆にグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換すること；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に及びその逆にアスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）に置換すること；並びにセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に及びその逆にスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に置換することを包含するが、これらに限定されるものではない。前記の置換は“同類（conservative）”とみなし得るアミノ酸置換ばかりではない。別の置換もまた具体的なアミノ酸の環境に応じて同類とみなし得る。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）は、アラニンとバリン（Ｖ）であり得るように、頻繁に交換可能であり得る。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしばロイシン及びイソロイシンと置換され得、またバリンと置換される場合もある。リシン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、しばしばその位置で（そこではアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷である）交換可能であり、しかもこれら２つのアミノ酸残基の異なるpHは重要ではない。さらに別の変化は具体的環境において“同類”とみなし得る。
また、図３の配列の一部を含有するDNA配列であって、特異的な塩素ハイブリッド形成を必要とする反応において反応剤として働く十分な大きさと特異性とをもつDNA配列は本発明の範囲内にある。かかるDNA配列は、増幅反応例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）又は別の増幅反応のプライマーであり得る。また、該DNA配列はハイブリッド形成プローブであり得る。該DNA配列は少なくとも塩基10個の長さであるのが好ましく、少なくとも塩基50個の長さであるのがさらに好ましい。
F.バクテリオファージλpLプロモーターの調節下でDNアーゼＢを産生する大腸菌発現プラスミドΔ33中へのストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢのクローン化遺伝子の挿入
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢのクローン化遺伝子を大腸菌発現プラスミドΔ33に伝達させ得る。該プラスミドはバクテリオファージλプロモーターpLの制御下でクローン化遺伝子を発現する。ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子は、前記λ２−６クローン由来のDNアーゼＢ遺伝子に修飾末端を取り付けるために、PCRを使用することにより発現ベクターの中に挿入されるのが好ましい。好熱菌（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼを用いる標準的PCR法に従うPCR反応用のプライマーとして下記のヌクレオチドが使用できる。
0003644961.tif 000004
これらのプライマーは増幅用の鋳型としてλgt11 DNアーゼＢクローン２−6DNAと共に使用できる。得られる増幅生成物は、前記Δ33発現ベクターに挿入するのに先立ち、エンドヌクレアーゼBan H IとSal Iを用いて消化し得る。これはpLプロモーターによって調節された転写融合体を作る。大腸菌の適当な菌株（C600C1+、gal K-）は挿入されたDNAによって形質転換され、血漿を含んでいる細菌はアンピシリンを用いる選別により選別できる。DNAはこれらのクローンから、標準的微小合成法、例えばF.M.Ausbelらの著作,"Current Protocols in Molecular Biology"（John Willey ＆ Sons発行,New York,（1987年）§1.6に記載の方法により、次いで単離したプラスミドを適当な制限エンドヌクレアーゼ（Bam H IとSal I）を用いて切断してプラスミドが所望の組換え断片を含有するかどうかを調べることにより調製し得る。所望の組み立てをもつプラスミドは大腸菌宿主細胞の中に導入でき、その大腸菌宿主細胞は、J.E.Mottらの論文、“Maximizing gene expression from plasmid vectors containig the λpL promoter:Strategies for overproducing transcription termination factorρ”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,88−92（1985）に記載されているようなナリジキシン酸プロトコールによる誘導に供される。該文献は本明細書において参照される。ナリジキシン酸がDNAを損傷し、recAタンパク質、すなわち大腸菌の回収（recovery）タンパク質を誘導することは当該技術においては公知である。recAタンパク質はプロテアーゼ活性をもち、λCI+リプレッサーの不活性化を招く。この不活性化はpLプロモーターによる過剰発現を招く。pLプロモーターから転写を活性化する他の方法もまた使用できる。ナリジキシン酸誘導を使用する場合には、相当な量のDNアーゼＢが細胞の外に分泌される。
II.組換えによって産生された酵素の性質
λ２−６ファージから組換えにより産生された酵素は、DNアーゼＢのアミノ末端に融合されたリーダーペプチドを含んでいる。このリーダーペプチドは次の配列：
0003644961.tif 000005
を有する。
免疫阻害検定（例７）は、基質としてDNA−色素複合体を使用することができるDNアーゼの能力に基づいて、非組換えDNアーゼＢ酵素と同じ方法で組換えストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢがヒト血清中でDNアーゼ酵素により阻害されることを例証する。
III.組換えによって産生されたDNアーゼ酵素の変異体
本発明の別の要旨は、DNアーゼＢ活性が改変されているストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子の変異体又は変異型にある。これらの変異体DNアーゼＢ酵素は、より高いか又はより低い水準のヌクレオアーゼ活性を有し得る。これらの変異体はヌクレオアーゼ活性を全て取り除く単一のアミノ酸置換（change）を含有するが、重要な免疫エピトープを全て維持するので、これらの変異体が天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の抗原反応を実質的に保持しているのが好ましい。従って、大腸菌中での高い水準の発現は、改変されたDNアーゼＢを用いてヒト抗体反応性を変えることなく達成し得る。かかる変異体又は変異型は、当該技術において周知の方法、例えばSambrookらの著作、前記の著作、第15章、標題“Site−Directed Mutangenesis of Cloned DNA"に記載の方法に従って調製し得る。かかる技法としては、リンカー挿入突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いたオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発及び高突然変異菌株中での増殖が挙げられる。
IV.ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素用のリーダーペプチドの使用
0003644961.tif 000006
のアミノ酸配列をもつDNアーゼＢ用リーダーペプチドは、細菌中で組換えタンパク質の発現及び産生に使用し得る。リーダーペプチドの適当な使用方法は、
0003644961.tif 000007
のアミノ酸配列をもつリーダーペプチドをコード化するDNAに、タンパク質をコード化するDNAを融合させ、それによって得られた融合DNAにタンパク質のアミノ末端に存在するリーダーペプチドをもつ単一の読み取り枠をもつ組換えタンパク質を形成させ；
（２）該融合DNAを原核生物中に導入し；そして
（３）該融合DNAを原核生物中に発現させて組換えタンパク質を回収可能な量で産生させる
ことを含んでなる。
前記の細菌は大腸菌であるか又はグラム陽性菌株、例えばスタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びストレプトマイセスであり得る。
組換えタンパク質は、培地から回収し得るように原核生物によって培地中に分泌される。
産生されるべきタンパク質用の遺伝子に対してリーダーペプチドをコード化するDNAセグメントを融合する方法は、当該技術においては周知であり、平滑末端連結が挙げられる。平滑末端連結は典型的にはT4リガーゼ〔V.Sgaramella ＆ H.G.Khoranaの論文,"Studies on Polynucleotides.CXII.Total Synthesis of the Structural Gene for an Alanine Transfer RNA from Yeast.Enzymic Joining of the Chemically Synthesized Polydeoxynucleotides to Form the DNA Duplex Representing Nucleotide Sequence 1 to 20",J.Mol.Biol.,72,427（1972）;V.Sgaramella ＆ S.D.Ehrlichの論文,"Use of the T4 Polynucleotide Ligase in the Joining of Flush−Ended DNA Segments Generated by Restriction Endonucleases",Eur.J.Biocheml.,86,531（1978）〕を用いて行われ、しかも縮合剤例えばポリエチレングリコール又は塩化ヘキサアンミンコバルトの存在下で行われるのが好ましい。
別法として、付着末端を生成する適当な制限エンドヌクレーゼが存在し、リンカーのカルボキシル末端に対応するリンカーをコード化するDNAのタンパク質と、該タンパク質のアミノ末端に対応するタンパク質をコード化する遺伝子の部分との両方を切断できる。該制限エンドヌクレーゼを使用して連結用の付着末端を生成できる。
V.ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の精製
A.天然ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの精製
本発明の別の要旨は、天然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の改良された精製方法にある。この方法は、市販の検定試薬中に存在するDNアーゼＢのポリアクリルアミドゲル分析を使用しかつ組換え酵素のゲル電気泳動における挙動と比較することによって開発された。該精製方法は、酵素の粗抽出物又は別の供給源を用いて出発して、次の工程：（１）ジエチルアミノエチルセルロースに吸着させかつそれから溶出させて第１の溶出物を生成させる工程；（２）得られた第１の溶出物をフェニルアガロース上でクロマトグラフィー分離して第２の溶出物を生成させる工程；（３）得られた第２の溶出物をヘパリンアガロース上でクロマトグラフィー分離して第３の溶出物を生成させる工程；及び（４）得られた第３の溶出物をクロマトフォーカシングして実質的に精製されたDNアーゼＢ酵素を産生させる工程を用いる。前記クロマトフォーカシングはモノ−Ｐカラムを用いて行うのが好ましい。精製されたDNアーゼは、クロマトフォーカシング中に使用した両性電解質を除去するために、逆相高圧液体クロマトグラフィーを使用して0.1％トリクロロ酢酸水溶液と0.08％トリクロロ酢酸アセトニトリル溶液との勾配を用いてC4上でさらに分画されるのが好ましい。
前記精製方法は、ストレプトコッカスDNアーゼＢ酵素及びそのアミノ末端においてリーダーペプチドに融合されたストレプトコッカスDNアーゼＢ酵素以外のタンパク質を実質的に含んでいない実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素をもたらす。この実質的に精製されたタンパク質は実質的にマイトジェン活性を有していない（下記の例６参照）。
精製は電荷の異なる２つの実質的に精製されたDNアーゼＢ画分をもたらす。この画分のそれぞれは、他の画分及び他のタンパク質を実質的に含んでいない。これらの画分を画分Ｉ（これはpH8.55〜8.4でクロマトフォーカシングカラムから溶出する）及び画分II（これはpH8.22〜8.13でクロマトフォーカシングカラムから溶出する）と命名する。質量分光分析により得られた分子量データ（例３）は、精製された天然DNアーゼＢの画分Ｉと画分IIの間の分子量の違いが別の方法による（otherwise）同じアミノ酸配列の僅かな（minor）変性（modification）と一致していることを示す。可能な変性は脱アミノ化であり、これは適当なpIシフトを生じる。
精製したタンパク質は配列決定し得る。画分Ｉと画分IIの両方の最初のアミノ酸23個は次の読取り可能な配列：
0003644961.tif 000008
（但し、配列中のＸはトリプトファン又はリシンを表わす）を生じた。
以下に詳しく述べるように、この配列は遺伝子のアミノ末端アミノ酸配列をコード化するDNA配列の１つとハイブリッド形成するのに適したプローブを設計する手段を表わす。
B.組換えによって生成されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の精製
組換えストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢは、キメラ細胞中で高濃度で存在し、同様の方法で精製し得る。例えば、組換えDNアーゼＢは、λDNアーゼB2−６ファージを用いて感染させて大腸菌から採取したファージ溶解液から、Ｑ−セファロース（トリメチルアミノエチルアガロース）上でクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ヘパリンセファロース上でのクロマトグラフィー及びＱ−セファロース上でのクロマトグラフィーにより精製し得る。pLプロモーターからストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢを発現する組換えプラスミドΔ33を用いて感染させた大腸菌中で生成させた組換えDNアーゼＢは、ヘパリンセファロースを用いてクロマトグラフィー、Ｑ−セファロース上でのクロマトグラフィー及び逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製し得る。他の精製方法が公知であり、当業者によって使用され得る。
VI.クローン化DNAにハイブリッド形成し得るDNAプローブの精製
本発明の別の要旨は、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のアミノ末端アミノ酸24個をコード化するDNA配列であって、約30％以下の誤対合（mismatch）を有するDNA配列とハイブリッド形成する一本鎖核酸プローブの製造にある。上記の核酸プローブはRNA又はDNAであり得る。該プローブがDNAである場合には、標準的な緊縮条件、すなわちF.Ausubelらの著作，Current Protocols in Molecular Biology（Wiley−Interscience,New York,1990年）に記載の条件下では、好ましくは下誤対合の程度は約10％以下である。
かかるプローブの適当な配列は、表１の関連アミノ酸について示した腸内細菌遺伝子についてのコドン使用表を使用することによって誘導し得る。
0003644961.tif 000009
0003644961.tif 000010
かかるプローブの一例を下記に示す。
プローブ1:
0003644961.tif 000011
この配列において、Ｒはプリンを表わし（すなわち、Ａ又はＧ）、Ｙはピリミジンを表わし（すなわち、Ｔ又はＣ）、ＳはＧ又はＣを表わし、ＷはＡ又はＴを表わしかつＮは４種類の共通デオキシリボヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）を表わす。
このプローブ及び他のプローブは当該技術において周知の方法、例えば“Nucleic Acid in Chemistry and Biology"（G.M.Blackburn ＆ M.J.Gait編,IRL Press発行,Oxford,1990年）、第３章第106〜123頁に記載されているようなホスホトリエステル法又はホスファイトトリエステル法による固相DNA合成により合成し得る。
VI.ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢと会合した上流プロモーターの使用
本発明の別の要旨は、DNアーゼＢ以外のタンパク質を発現するための、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子と元来会合された上流プロモーターの単離と使用にある。このプロモーター配列の検出は以下の例11に記載する。
前記プロモーター配列はλ２−６クローン中に保持される。この配列は、転写用の開始部位と、細菌プロモーターの共通−10及び−35部位と実質的に相同性の部位とを含む（例11）。この実質的に精製されたプロモーター配列は本発明の範囲内にある。
このプロモーター配列を使用してDNアーゼＢ以外のタンパク質を発現させる方法は、
（１）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子と元来会合していたプロモーターをストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子から分離し；
（２）前記プロモーターを、DNアーゼＢ用の遺伝子以外のストレプトコッカス・ピオゲネスタンパク質用の構造遺伝子と操作的に連結させ；そして
（３）前記構造遺伝子によってコード化された前記タンパク質を発現させる
ことを含んでなる。
前記タンパク質はストレプトコッカス・ピオゲネス中で又はストレプトコッカス・ピオゲネス以外の原核生物、例えば大腸菌で発現させ得る。前記プロモーターはベクター又はプラスミドのプロモーターに操作して連結された遺伝子を発現するためのベクター又はプラスミドに組み込み得る。
VII.実質的に精製されたDNアーゼＢの使用
本発明はまた、天然の供給源から精製されるか又は組換えDNA技術によって産生されるかにかかわらず、実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の幾つかの使用を包含する。
A.抗体の調製における酵素の使用
本発明の方法によって製造された酵素の使用の中には、抗体の調製がある。抗体はポクロナール抗体又はモノクロナール抗体のいずれかであり得る。ポクロナール抗体及びモノクローナル抗体の両方の製造は、E.HarlowとD.Laneの著作,"Antibodies:A Laboratory Manual"（Cold Spring Harbor Laboratory発行,Cold Spring Harbor,New York,1988年）第53〜318頁に記載されている。得られる抗体はストレプトコッカス・ピオゲネス酵素の検出、すなわち存在が疑われる培地において使用し得る。
B.抗DNアーゼＢ抗体の検出における酵素の使用
本発明の実質的に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の重要な用途は、血清中におけるような抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体の検出にある。かかる抗体の存在は、活性なストレプトコッカス・ピオゲネス感染を示すものであり、しかも重い化膿性続発症が生じるかもしれないという警告信号である。
DNアーゼＢ抗体の一つの検出方法は、該抗体が酵素の活性を阻害し得るということを用いる。かかる方法は、次の工程：すなわち
（１）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含有していると疑われる試験試料を調製する工程；
（２）前記試験試料に本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素の一定量を加える工程であり、該一定量は試験試料中の抗DNアーゼＢ抗体による酵素活性の阻害がない場合には検出可能な水準の酵素活性を産生するのに十分な量である；及び
（３）酵素検定を行うことにより試験試料中のDNアーゼＢ酵素の活性の水準を測定して試験試料中の抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を検出及び／又は測定工程
を含んでなり得る。
前記の酵素検定は、標準的方法例えばWampole Laboratories（Cranbury,NJ）のDNA−色素複合体分解検定法により行い得る。この検定法は、基質としてDNA−色素複合体を使用することができるDNアーゼの能力に基づいている。この複合体は642nmの最大吸収波長を示す。しかしながら、該DNA−色素複合体はDNアーゼによって分解されるので、最大吸収波長のシフトと、642nmにおける吸収低下とがある。他の酵素検定法、例えば粘度検定法が利用できる。該粘度検定法は長いDNA分子を分解できる、すなわちDNAを含有する溶液の粘度を著しく低下させることができる酵素の能力を測定する。別法として、検定法は基質として放射性DNAを使用し、培養後に放射能の放出を定量することによって行い得る。デオキシリボヌクレアーゼの別の検定方法は当該技術において周知である。
血清中の抗DNアーゼＢ抗体の別の検定法は、ELISA検定法である。この検定法は、
（１）本発明のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を固体支持体に結合させる工程；
（２）抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料を前記ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素と反応させて、該抗体を該酵素にすなわち前記固体支持体に結合させる工程；及び
（ｃ）前記固体支持体に結合された前記抗体を検出して試験試料中の前記抗体を検出及び／又は測定する工程
を含んでなる。
ELISA法は当該技術において周知であり、例えばP.Tijssenの著作、“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays"（Elsevier発行,Amsterdam,1985年）に記載されている。使用される固体支持体は、典型的にはプラスチック、例えばポリスチレンであるが、他の固体支持体例えばニトロセルロースも使用できる。結合抗体の検出は、典型的には第１の抗体に特異的な第２の抗体を加えることによって行われる。該第２の抗体はストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を結合しない。かかる抗体は、例えば酵素標識抗ヒト免疫グロブリンＧであり得る。酵素標識は典型的には、アルカリホスファターゼ、λ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。かかる酵素類は可視スペクトラムにおいて光学吸収を有し、肉眼で又は分光光度計を用いて検出し得る。
また、血清中の抗DNアーゼＢ抗体の検定には、抗原−抗体・複合体の形成を検出及び／又は測定する別の技法も使用し得る。これらの技法は、凝集した抗原−抗体・複合体、ここでは酵素−抗体・複合体を光の吸収又は散乱の変化により検出する。一般に、かかる検定法は、
（１）本発明のDNアーゼＢの緩衝溶液を調製し；
（２）前記DNアーゼＢの緩衝溶液を、抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体を含有すると疑われる試験試料と反応させ；そして
（３）前記溶液中の光吸収及び／又は光散乱の変化を観察及び／又は測定することによってDNアーゼＢと抗ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ抗体との間の反応を検出する
ことを含んでなる。
前記のDNアーゼＢと抗DNアーゼＢ抗体の間の反応は、比濁分析（nepherometry）又は混濁分析（turbidimetry）により検出し得る。抗DNアーゼＢ抗体の別の検出方法は毛管電気泳動である。
C.他の用途
組換えタンパク質は感受性の個体においてストレプトコッカス・ピオゲネスに対して免疫化するためのワクチン開発に使用し得、また病気例えば粘度が高濃度のDNAを含有する滲出液によるものである場合の嚢胞性繊維症における肺粘度症（lung viscosisty symptoms）の治療におけるエアゾールとしても使用し得る。
例
以下の例は、説明を目的としたものであり、本発明を限定する意図のものではない。
例１
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子のクローニング
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子を、組換え体λバクテリオファージから生じたヌクレアーゼ活性の活性に基づく比色検出により同定した。ファージは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Lansfield  Group  ATCC  No.14289）ゲノムDNAから精製した剪断DNAを含むλライブラリーの生成物であった。
ストレプトコッカス・ピオゲネスからの染色体DNAの調製
ストレプトコッカス・ピオゲネス株ATCC14289を、Todd  Hewitt寒天平板で画線培養して、37℃で２日間温置した。単一のコロニーを用いて１リットルのTodd  Hewitt培養液を10％仔ウシ血清と共に温置した。培養物は、約36時間振とうしながら37℃で成長させて高密度にした。
細胞は、3500rpmで４℃で45分間のBeckman  J6遠心機による遠心分離により集めた。細胞ペレットは、25mlの40mMのTris（pH7.5）、1mMのEDTA中に再び懸濁させた。1mlの緩衝液に含むようにしたタンパク質分解酵素アクロモペプチダーゼ（achromopeptidase）（60mg）（Wampole）を加え、得られる混合物を65℃で１時間温置した。溶菌は、見られなかった。次に、全量で20mlの10％SDSを加え、温置を１時間継続させた。溶菌は、非常に明白であった。次に、50mlの緩衝液を加え、SDSの濃度を2.5％に下げた。
この混合物を、同じ量のフェノールで２回抽出してから、フェノール／クロロホルム（1:1）で１回抽出した。水相中のDNAをエタノールにより沈殿させた。DNAは、遠心分離により回収した。ペレットを、4mlの10mMのTris−HCl（pH7.5）、1mMのEDTA（TE）中に再び懸濁させた。RNアーゼＡ（10mg/mlで50μｌ）を加え、この混合物を３時間37℃で温置した。
DNAを、塩化セシウム勾配中でさらに精製した。DNAの最終濃度は、0.5mg/mlであった。
λgtll中でのストレプトコッカス・ピオゲネスライブラリーの組立て
単離した染色体DNA（300μml）をTE緩衝液200μｌに加えた。この混合物を、25ゲージ針を有する1mlの注射器（syringe）に約300回通過させてDNAを剪断して平均の大きさ6kbとした。
剪断DNA（150μｌ）を、大腸菌リガーゼで処理して、後続の操作によりギャップとなり得るであろうDNA中の存在するニックを修復した。DNA150μｌに、20μｌの10x大腸菌リガーゼ緩衝液（0.5MのTris−HCl（pH7.6）、100mMのMgCl2、100mMのジチオスレイトール（dithiothreitol）および500μg/mlウシ血清アルブミン）を加え、20μｌのNAD+（36mM）および７μｌの大腸菌リガーゼ（New  England  Biolabs,Beverly,Mass.,4単位／μｌ）を、DNAに加え、次に、この混合物を室温で４−５時間放置した。リガーゼを、65℃で15分間熱して死なせた。DNAは、エタノールにより沈殿させた。
リガーゼ処理DNA中のEco  R I部位は、製造者（Promega,Madison,Wis.）のプロトコールに準じてEcoメチラーゼによりメチル化した。これは、その切断が、クローニング手順を妨げるであろう内部Eco  R I部位を封鎖（block）するためにした。
DNAの剪断末端は、メチル化の後、DNA混合物へ、T4  DNAポリメラーゼ（3000U/ml）２μ１、2.5mMの４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートのそれぞれ20μｌおよび0.1MのMgCl230μｌを加えることによりT4DNAポリメラーゼにより修復した。反応は、室温で15分間行った。混合物は、フェノール／クロロホルムにより１回、次にエーテルにより１回抽出した。水性分画中のDNAは、次に、エタノールにより沈殿させた。
Eco  R Iリンカーは、DNAに結合させた。使用したリンカーは、New  England  Biolabsからの八量体であった。リンカー結合の後、DNAは、過剰量のEco  R I制御エンドヌクレアーゼ酵素により消化された。所望の大きさの範囲、すなわち６−8kbのDNAを、電気泳動の後、アガローズゲルから精製した。DNAは、エタノール沈殿により濃縮し、次に、λgtllへの結合のために準備した。
約２μｇの剪断DNAを、Eco  R I制限エンドヌクレアーゼで予め消化した１μのλgtllと結合させ、この際、末端りん酸塩残基は、アルカリ性ホスファターゼにより処理して除去しておいた。連結は、全量５μｌのバクテリオファージT4リガーゼにより行った。連結反応は、４℃で夜通し行った。
全結合混合物は、Promega（Madison,Wis.）パッケージング抽出物を用いて試験管内でパッケージングした。１μｌのパッケージングしたファージを、イソプロピルチオ−β−Ｄガラクトシド（IPG）の存在下でY1090大腸菌の菌叢に塗布し、色素形成基質５−プロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラクトシド）（Xgal）約５％のプラークが青色であった。パッケージング効率は、DNA1μｇ当たり約106プラークであった。
ヌクレアーゼ活性を持ったλ組換え体クローンに対するスクリーニング
増幅されていないライブラリー（10μｌ）に、LE392のオーバーナイト（overnight）培養物0.1mlを塗布した（plated）。５時間後、プレートに、0.5xBBL  DNアーゼテスト寒天および0.01％トルイジンブルーおよび10mMのMgCl2を塗布した。全部で10のプレートをスクリーニングした。44のピンクのプラーク（潜在的にヌクレアーゼ陽性）を再スクリーニングした。44のピンクのプラークのうち９つはヌクレアーゼ活性について陽性であると一貫して再スクリーニングされた。
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼの生産が、ホスト大腸菌バクテリアに有害であるため、これらのヌクレアーゼ陽性クローンのプラークの大きさは、ヌクレアーゼ陰性クローンに対するよりもより小さい。したがって、ヌクレアーゼ活性を下げるであろう突然変異を蓄積する選択圧があり、これが、安定なヌクレアーゼ陽性クローンの単離の仕事を複雑にする。
本発明の選択およびスクリーニング手順の改良の１つは、安定なヌクレアーゼ陽性クローンを可能とする選択圧を下げることである。これをするために、プラズミドpMC9なしの大腸菌株Y109をヌクレアーゼ担持ファージに対するホストとして用いた。プレートライゼートを用いてクローンをプラーク精製する系統を発生させた。この手順で、ホストおよびファージは、温置５時間の後に塗布する代わりに、0.5xBBL  DNアーゼテスト寒天および0.01％トルイジンブルーおよび10mMのMgCl2に直接塗布した。
９つの組換え体クローンのライゼートを、DNA含有のSDS−ポリアクリルアミドゲルで分析した。すべての９つのクローンのヌクレアーゼは、SDS変性の後その活性を保持した、またすべてが、同じ約25kdの見かけ分子量を有する。
これらの９つのライゼートを、等電点分離法用のIEF3−９ゲルを有するPhastGelシステムで分析した。電気泳動の後、ゲルに、TAE（40mM  Tris、5mM  酢酸ナトリウム、1mM  EDTA、pH8）中の１％アガロースに含むようにした3.5mlのDNアーゼ基質（ストレプトナーゼＢキット）（Difco,Detroit,Michigan）を塗布した。ゲルの基端の縁のすべて９つのライゼートについての活性バンドは、クローン化されたヌクレアーゼについての非常に高いpIを示唆する。このことは、また、すべて９つのクローンが、同じ遺伝子を含むことを示唆した。
特に、２−６と呼ばれるDNアーゼ活性を示す１つのファージをさらに分析した。λDNアーゼB2−６クローンを、制御エンドヌクレアーゼ分析により分析してDNAフラグメントを特徴づけた。２−６クローン中のλベクター中のストレプトコッカス・ピオゲネスゲノム挿入断片（insert）は、約5.2kbであった。ヌクレアーゼ遺伝子の位置、DNアーゼ２−６クローンのより小さな領域をλgtllにサブクローニングし、ヌクレアーゼ活性についてサブクローンをテストすることにより測定した。図２は、さまざまなサブクローンとそれらのヌクレアーゼ活性の位置を示している。サブクローン１および４は、ヌクレアーゼ活性を生じたが、非常に不安定であった。サブクローン２および３は、ヌクレアーゼ活性に欠けるが、安定であった。このサブクローニングの結果は、DNアーゼＢ遺伝子の少なくとも一部が、内部Sac  I/Eco  R Iフラグメントに存在することを示した。DNアーゼＢタンパク質からのアミノ末端配列が遺伝子暗号と共に用いられ、サブクローンのいくつかおよびDNアーゼ２−６挿入断片にハイブリット化するために用いられた一組の同義性（degenerate）オリゴヌクレオチドを発生させた。これらのオリゴヌクレオチドは、DNアーゼB2−６中の3.5kbEco  R Iフラグメントおよびサブクローン３中のSac  I/Eco  R Iにハイブリッド化した。このデータは、サブクローン化データと共に、ヌクレアーゼ遺伝子の転写が、図解したように左から右に非常になり得ることを示唆し、Sac  Ｉ部位がDNアーゼＢ遺伝子内にあることを示唆する。
5.2kb挿入断片に隣接するストレプトコッカス・ピオゲネスDNAのマッピングが、ゲノムDNAブロットハイブリッド形成によりなされる。λDNアーゼ２−6DBAの3.5kbおよび1.5kb  Eco  R Iフラグメントをゲル精製し、ランダムプライミングにより32Pで標識した。同じゲノムブロットを、２つのプローブと連続的にハイブリッド化させた。ストレプトコッカス・ピオゲネス染色体中の挿入断片およびその隣接領域の部分的制限エンドヌクレアーゼマップを図１に示す。
例２
ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢを含むクローン２−６の配列決定
ヌクレオチド配列分析を、上記のSanger  et  al.のジデオキシヌクレオチド読み終わり法（chain  termination  method）によりクローン２−６に行った。配列分析は、クローン２−６のλgtllファージ内からDNアーゼ活性の疑問領域を横断してプライミング合成により開始された。配列決定の結果は、図３および４に示してある。ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢは、配列の初めの全部の読み取り枠内にある。
例３
未変性（native）ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの精製
未変性ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢを、正しいヌクレアーゼのマーカーとして商業的DNアーゼＢ分析試薬を用いて精製した。言い換えるなら、商業的キットのDNアーゼＢで得られるポリアクリルアミドゲル電気泳動結果が、ストレプトコッカス・ピオゲネスATCC  No.14289から得られる抽出物中のゲル電気泳動からの結果と比較された。精製手順は、以下を含んだ:DE−23ジエチルアミノエチルセルロース（Whatman）へのバッチ吸着（２）フェニルSepharose▲Ｒ▼（Pharmacia,Uppasla,Sweden）上でのクロマトグラフィー；（３）ヘパリンSepharose▲Ｒ▼（Pharmacia）上でのクロマトグラフィー；（４）およびモノ−Ｐ等電点分離法。
細菌培養物
Ａから誘導したストレプトコッカス・ピオゲネスATCC  No.14289（American  Type  Culture  Collection,Rockville,Maryland）。Bernheimer  C203S（C203の変異型を含むnon−Ｍ）を、DNアーゼＢ含有培地のコレクションに対して細菌源として用いた（酵素は、バクテリアにより培地に分泌された）。0.01％洗浄済ヤギ赤血球で補足した脳心臓注入媒質（brain  heart  infusion  media）（１リットル）（Difco  Laboratories,Detroit,Michigan）の各容量を新たなオーバーナイト培養物1mlで接種した。これらの培養物を２リットルの三角フラスコ中で37℃で温和に攪拌しながら（300rpm）20時間成長させた。精製に先立ち、培地は、Pelliconフィルター（0.22μｍ  Durapore  GVLP膜）を用いてろ過し、さらに0.45μｍ使い捨てろ過装置（Nalgene,Nalge  Co.,Rochester,New  York）によりろ過して、透明にし滅菌した。この手順により約105リットルの培地を処理した。
ジエチルアミノエチルセルロースのバッチ吸収
透明にした媒質は、Pellicon装置と、フィルター面積約0.46m2、流量120ml/分、圧力201b/平方インチ（1.4kg/cm2）で10K膜（PLGC、再生セルロース）を用いて濃縮した。媒質の最初の容量105リットルを、タンパク質濃度2.3mg/mlとして４リットルに最終的に濃縮した。
ジエチルアミノエチルセルロース（DEAE−セルロース）（DE23,Whatman,England）が、15容量の0.5MのHClによる洗浄と、これに続く15容量の0.5MのNaOHによる２回目の洗浄により再生された。水酸化ナトリウムによる洗浄の繰り返しの後、DEAE−セルロースを中性になるまで水洗した。最後に、セルロースをTMC緩衝液（1mM  Tris、1mM  MgCl2、1mM  CaCl2、pH7.5）中で夜通し平衡化させた。
平衡化させたウエットセルロース（100g）を、500mlの濃縮ストレプトコッカス・ピオゲネス媒質上澄みに加えた。この混合物を４℃で20分間300rpmで振とうしてから、45分間3500rpmで遠心分離させた。セルロースは、TMC緩衝液450mlで洗浄し、２つの上澄み液を一緒にした。
フェニルファロースのクロマトグラフィー
ジエチルアミノエチルセルロースバッチ吸収からの上澄み液を0.45μｍ膜を通して濾過することにより透明にした。硫酸アンモニウムを0.8Mに加えてから、0.8Mの硫酸アンモニウム、20mMのりん酸ナトリウム（pH8.0）で平衡化したフェニルセファロースCL45（Pharmacia,Uppsala,Sweden）に通した。
80mlのフェニルセファロースカラムに、258μg/mlの濃度でサンプル1100mlを1.85ml/分で充填した。DNアーゼ活性を、フロースルーで収集してから、10kd膜（Diaflo  YM10,Amicon  Division,W.R.Grace  ＆  Co.）を用いて限外濾過により濃縮した。最後タンパク質濃度は、0.245mg/mlであった。
ヘパリンセファロースのクロマトグラフィー
フェニルセファロースカラムからの濃縮流出液を、ヘパリン緩衝液Ａ（20mM  HEPES、pH7.9、2mM  ジチオスレイトール、10mM  MgCl2、0.2mM  EDTA、0.1NaCl、10％グリセロール）に対して透析した。ヘパリンセファロースCL−6B（Pharmacia）カラム（80ml）を、ヘパリン緩衝液Ａと平衡化させてから、流量1.0ml/分で充填した。カラムを３容量のヘパリン緩衝液Ａで洗浄してから、０％と100％緩衝液Ｂの間の勾配を、2.2ml/分の流量で流した。緩衝液Ｂは、塩化ナトリウムの濃度が1.0モル／リットルであることを別として緩衝液Ａと同じであった。DNアーゼ活性は、約250mlの容量で350mMのNaClで溶離した。DNアーゼ活性は、限外濾過により濃縮した。
Mono−Ｐ等電点分離法
濃縮DNアーゼ９画分を、25mMのジエタノールアミノpH9.5に対して透析してから等電点分離した。充填緩衝液（loading  buffer）（25nM  エタノールアミン、pH9.5）中で平衡化したmono  Ｐ  5/20カラム（Pharmacia,Piscataway,N.J.）を500μｌのサンプルと共に注入してから、9mlの充填緩衝液で洗浄した。カラムは、100％緩衝液Ｂ（10％ポリバッファ−96（Pharmacia）、pH6.0）で溶離した。溶離した全容量は、34mlであり;0.5mlの画分が収集された。活性の２つのピークは、pH8.55−8.4（画分25−29）で収集され、画分Ｉと名づけ、8.22−8.13（画分34−35）で収集されたものを画分IIと名づけた。収集した画分は、等電点フォーカシング活性ゲル、銀染色法およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
逆相高圧液体クロマトグラフィー
クロマトフォーカシングからのピーク画分は、C4カラム（Beckman  System  Gold  Instrument,Beckman  Instruments,Fullerton,California）を用いて逆相高圧液体クロマトグラフィーによるクロマトフォーカシングのために用いた両性電解質（ampholyte）を除去するようにさらに精製した。サンプルを緩衝液Ａ（水に含むようにした0.1％トリフルオル酢酸）に充填し、０％−100％緩衝液Ｂ（アセトニトリル中の0.8％トリフルオル酢酸）の勾配を用いて流量1ml/分でカラムを溶離した。これらのタンパク質は、約1mlの容量の65％緩衝液Ｂで溶離した。
SDSおよび等電分析
すべてのサンプルのSDS−ポリアクリルアミドゲル分析を、PHASTシステム（Pharmacia  LKB,Piscataway,New  Jersey）自動化装置の使用により行った。SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、PhastGel  10−15％ゲルで行った。等電ゲルは、PhastGel  IEF3−９ゲルを用いて流した。SDSおよび等電ゲルの両者の銀染色法は、PhastSystem自動化染色装置（Pharmacia  LKB）を用いて行った。等電フォーカシングゲルへのDNアーゼサンプルの活性検定は、再構成したDNアーゼ基質染料（Wampole）1mlとりん酸塩緩衝塩を含む１％溶解アガロース溶液5mlとによる電気泳動の後、ゲルを上塗りすることにより行った。室温で基質オーバーレイと共にIEFゲルを温置したところ、ヌクレアーゼ活性を中心としてピンク色に青色の基質染料を変えることにより活性の検出をもたらした。SDS変性サンプルの活性検定は、500μg/mlヘリングテステス（herring  testes）DNAの存在下で重合させたSDS−14％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。電気泳動の後、ゲルを、水で洗浄してから、40mMのTris−HCl（pH7.5）、2mMのMgCl2、0.02％のアジ化ナトリウムと37℃で２時間平衡化させた。ヌクレアーゼによるDNAの分解の結果として見えるようになるヌクレアーゼ活性を観察するため、エチジアムブロミド（ethidium  bromide）を１μg/mlまで加える。
タンパク質配列決定
精製DNアーゼの画分ＩおよびIIのアミン末端配列は、Applied  Biosystems（Foster  City,California）477配列決定装置を用いて決定した。精製した酵素（画分ＩおよびII）のそれぞれのサンプルは、Applied  Biosystems（Foster  City,CA）470  Protein  Sequencerに充填した。画分ＩおよびIIの両方の初めの23個のアミノ酸が次の読み取り可能な配列を生じた：
0003644961.tif 000012
（ここで、Ｘは、明確には確認できないアミノ酸を示すが、最もおそらくは、トリプトファンまたはリジンである）。
質量分光学分析
イオンスプレー質量スペクトル分析を、組換え体DNアーゼＢ（例１）と精製未変性DNアーゼＢの画分ＩおよびIIに、Finnigan  Electrosprayイオン化システムを有するFinnigan  MAT  TSQ700三段階四重極質量分析計を用いて行った。サンプルは、上記したようにC4カラムを用いて逆相分画により得た。DNアーゼＢタンパク質が、65％緩衝液Ｂで溶離し、保存のため凍結乾燥させた。流量１μl/分での注入に先立ち、サンプルは、アセトニトリル−水−酢酸（50:50:1）に溶解させた。
質量分析により測定された分子量は、次のようであった：組換え体NDアーゼＢ（例１）−−25,549;精製した自然のDNアーゼの画分Ｉ−−25,390;精製した自然のDNアーゼＢの画分II−−25,397。これらの結果は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列決定の結果と一致していて、組換え体DNアーゼＢがアミノ末端に１つの追加のアミノ酸を有することを示している。精製した自然のDNアーゼＢの画分ＩとIIとの間の分子量の差は、さもないと同一のアミノ酸配列の小さな変更と一致する。可能な変更は、脱アミノ化であり、これは、適当なpIシフトを起こす。
例４
バクテリオファージλ２−６クローンから生じた組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの精製とアミノ末端配列分析
λDNアーゼB2−６ファージライゼート中の組換え体DNアーゼＢタンパク質を、Westernブロット分析によりSDSポリアクリルアミドゲルで確認した。商業的なDNアーゼＢに対するウサギ抗体を用いて、組換え体DNアーゼＢの存在を検出した。SBS−ポリアクリルアミドゲルのクーマーシーブルー染色（Coomassie  blue  staining）は、組換え体DNアーゼＢタンパク質が、ライゼート中の全タンパク質の約５％であったことを示唆する。わずか１個のヌクレアーゼが、SDS−DNA−ポリアクリルアミドゲルシステム中に検出された。ヌクレアーゼは、25,000ダルトンの見かけ分子量を有している。
組換え体DNアーゼＢタンパク質の精製が、商業的なDNアーゼＢ検定キット中の対照用に用いた基質を使用するヌクレアーゼ活性検定とSBS−ポリアクリルアミドゲルとを用いて監視された。精製手順は、次の（１）−（４）を含んだ：（１）Ｑ−セファローズ（トリメチルアミノメチルアガロース）でのクロマトグラフィー；（２）硫酸アンモニウム沈殿；（３）ヘパリン−アガロースでのクロマトグラフィー；（４）Ｑ−セファロースでのクロマトグラフィー。２リットルのλDNアーゼB2.6ファージライゼートを、10mMのMgCl2で補足したルリアブイヨン（Luria  broth）上のオーバーナイト細胞組織として得た。上澄みを、４℃45分間で3635xgのBeckman  Instruments（Fullerton、CA）遠心機で細胞組織の遠心分離の後に集めて、細胞デブリ（上澄みの液の容量は1900mlであった）を除去した。
ライゼートを、0.45μｍ濾過ユニットを通して濾過して残りのバクテリアと細胞デブリを除去した。次にこの濾液を、Ｑ−セファローゼ（Pharmacia,Piscataway,NJ）（これは20mlのTris−HCl（pH7.5）、1mMのEDTAと平衡させておいた）の約200mlカラムを通してた。カラムのフロースルーを集めた。この画分は、硫酸アンモニウムをゆっくりと加えて室温で80％の最終濃度としてライゼートを濃縮した。脱塩したタンパク質を、30分間15,000xgで遠心分離した。
透析したタンパク質にグリセロールを加えて最終濃度10％とした。この標品（preparation）を、0.45μｍ濾過ユニットを通して濾過した。タンパク質標品の導電率を測定し、タンパク質標品を20mMのTris−HCl（pH7.5）で希釈して、導電率を20mMのTris−HCl（pH7.5）、25mMのNaCl、10％のグリセロール（緩衝液Ａ）の溶液とそれと同じとした。最終容量は1800mlであった。
このサンプルを、流量120ml/時でPharmacia  EPLCシステムでヘパリン−セファロースカラム（約100ml）に充填した。カラムを400mlの緩衝液Ａで洗浄した。DNアーゼＢを、緩衝液Ａ中に含むようにした勾配25mM−500mMのNaClの１リットルで溶離した。DNアーゼ活性は、容量約175ml中の約125mMのNaClで溶離した。
ヘパリンアガロースカラムから溶離したDNアーゼ画分を20mMのTris−HCl（pH8.5）に対して透析し、20mMのTris−HCl（pH8.5）で平衡化した約175ミリリットルＱ−セファロースカラムに充填した。Ｑ−セファロースカラムからのフロースルーを集め、等電フォーカシング活性ゲル、銀染色法およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。組換え体DNアーゼＢタンパク質の標品は、99％均質であった。最終的な溶出液（110ml）のタンパク質濃度は、約100μg/mlであった。これは、約5.5mg/培養物１リットルの収量に当たる。次に、例３に上記したように、最終生成物を逆相高圧液体クロマトグラフィーにかけた。
精製組換え体DNアーゼＢのアミド末端配列は、Beckman  Microsequencing  System  2020/Goldを用いて決定した。アミノ酸配列は、アミド末端がアルギニン（Ｒ）であることを別として、自然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢのそれと同一であった。このアルギニンは、組換え体DNアーゼＢをつくる方法から生じた。
DNアーゼＢの分光分析は、DNアーゼが均質であることを示した。
例５
pLプロモーターの規制下での大腸菌プラズミド中のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素のクローニングと発現
バクテリオファージλプロモーターpLを組み入れたプラズミドベクターを用いてストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ遺伝子の規制された発現を証明するために追加の遺伝組立てを行った。この組立ては、λ２−６クローン中のDNアーゼＢ遺伝子に修飾末端を組み込むためポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて行った。次のオリゴヌクレオチドを指名し、製造者の推奨に従いPharmacia  Gene  Assembler  Plus  DNA合成装置で合成した：
0003644961.tif 000013
製造者の指示に従い、AmpliTaq  kit（Perkin−Elmer−Cetus,Norwalk,CT）を用いてPCR反応でこれらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。MgCl2の最終濃度を4mMに調節し、Perkin−Elmer480サーマルサイクラー（thermal  cycler）を用いて20サイクル反応（37℃、２分間;72℃、３分間;95℃、２分間）を行った。λgtllクローン２−６（100mg）のDNAを、各プライマーの200μＭと共に鋳型として用いた。得られる増幅された生成物は、Δ33発現ベクターに組み込むのに先立って、さらに、BamH IおよびSal  Ｉにより消化された。これらの操作は、図５に示すような配列との翻訳融合体を生じさせた（これは、λpLプロモーターにより規制される）。
Ｃ  600  Cl+,galKバクテリアを結合混合物により形質転換させ、LB−Amp皿に塗布した。その後、DNAのミニ標品をつくり（F.M.Ausubel  et  al.,eds.,"Current  Protocols  in  Molecular  Biology"（John  Wiley,1987）（Section  1.6）、次に、プラズミドを酵素Bam  H IおよびSal  Ｉによりカットしプラズミドが組換え体DNアーゼＢフラグメントからなるかどうかを決定した。所望の組立てのプラズミドをさらにAR120ホスト株へと形質転換した。組換え体DNアーゼＢを含んでなるプラズミドを有するこれらのホスト細胞をナリジキン酸プロトコール（上記Mott  et  al.）を介して誘導操作に付した。形質転換したAR120を含んでなるコロニーを寒天平板から上げ、Superbroth（塩基:12gトリプトン、24g酵母エキス、5mlグリセロール、900ml蒸留水；塩／塩基１リットル:1.7gKH2PO4、15.8gK2HPO4（無水）、100ml蒸留水）および100μg/mlペニシリン中で接種し、37℃で成長させて、650nmでの培養物の光学密度を0.4とした。
その後、ナリジキン酸を、最終濃度60μg/mlで接種混合物に加えた。培養物を、37℃で約８時間または夜通し（約16時間）温置した。すべての細胞画分を、培養物からの上澄み液、音波処理済細胞ペレットおよび音波処理済細胞ペレットからの上澄み液を含めてDNアーゼＢ活性について検定した。
オーバーナイト誘導については、DNアーゼＢが、大腸菌細胞の外に分泌された。８時間誘導は、細胞の外（約30％が内部であった）に分泌したDNアーゼＢのほとんどを音波処理した上澄み液中で回収した。DNアーゼＢの量は、十分大きく、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのクーマーシーブリリアントブルー染色で視覚化された。
例６
pLプロモーターの規制下での大腸菌中に生じた組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの精製
組換え体DNアーゼＢクローンのある量（６リットル）を、超ブイヨン（superbroth）中で成長させ、例５に記載したように夜通し誘導した。上澄み液を収穫し、10K膜を用いてPellicon濃縮装置により濃縮した：濃縮により容量600mlとなった。
濃縮した抽出物は、ヘパリン緩衝液Ａ（20mM  HEPES、pH7.9、2mM  ジチオスレイトール、10mM  MgCl2、0.2mM  EDTA、0.1M  NaCl、10％  グリセロール）に対して透析した。ヘパリンカラムを例３に示すように充填し、流し、溶離させた。
ヘパリンカラムからの溶出液を20mMのエタノールアミン（pH8.5）中で透析した。少量の外来性のタンパク質が、DNアーゼＢ標品からバッチ吸収によりＱ−セファロースに吸収された。ある量のＱ−セファロース（100ml）を、20nMのエタノールアミン（pH8.5）と平衡化させてから、100mlのヘパリンDNアーゼＢ画分に加えた。Ｑ−セファロースは、４℃20分でのバッチ手順で抽出物に結合させた。結合の後、Ｑ−セファロースを、0.45μｍ濾過ユニットを通して濾過した。樹脂は、遠心分離による分離に先立って、50mlの20mMのエタノールアミン（pH8.5）により20分間最終的に洗浄した。この手順からの２つの溶出液を一緒にし、逆相クロマトグラフィー、アミノ酸配列決定および質量分光分析により分析した。逆相クロマトグラフィーについては、1mlの精製DNアーゼＢを、C4カラムに通し、容量1mlの65％緩衝液Ｂで溶離した。例３の未変性DNアーゼＢの精製についてと同じ緩衝液を用いた。
アミノ酸配列は、Beckman  Microsequencing  System  2020/Goldを用いて決定した。アミノ酸配列は、
0003644961.tif 000014
であった。
質量分光分析も自然のDNアーゼＢについて記載したようにして行い、同等な結果を得た。
例７
DNアーゼＢ酵素のアミノ末端配列に対応するDNAプローブの準備
VAX  GCGプログラム（表１）への腸内細菌の高度に発現された遺伝子についてのコドン処理を用いることにより、次の同義性プローブが得られた：
0003644961.tif 000015
この配列で、Ｒは、プリン（すなわちＡまたはＧ）であり、Ｙは、ピリミジン（ＴまたはＣ）であり、Ｓは、ＧまたはＣであ、Ｗは、ＡまたはＴであり、そしてＮは、４つの普通のデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。このプローブは、効率的に、λgtllクローン2.6にハイブリッド化され、未変性DNアーゼＢタンパク質が、クローン化された遺伝子から誘導されとことが確認される。
例８
抗DNアーゼＢ抗体による組換え体DNアーゼＢの抑制
組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢがその特性において自然のDNアーゼＢに相当することを示すため、免疫抑制を実施した。組換え体DNアーゼＢを、抗DNアーゼＢ抗体を含む対照の正の（positive）ヒト血清を用いる抑制検定で商業的に入手し得る自然のDNアーゼＢと比較した。使用した検定は、基質としてDNA−染料複合体を使用するDNアーゼＢの能力に基づいた。この複合体は、最大光学吸収度を642nmで示す。しかしながら、DNA−染料複合体は、DNアーゼにより分解されるので、吸収の最大波長にシフトがあり、酵素活性は、642nmでの測定される吸収の減少により示される。図６に示されるように、組換え体酵素は、自然に存在するストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢに対する免疫反応の結果として抗DNアーゼＢ酵素を含むヒト血清により自然のストレプトコッカス・ピオゲネスと同じようにして不活性化される。
例９
DNアーゼＢ遺伝子の転写がΛ２−６クローン中のストレプトコッカスプロモーターから生じることの測定
例４に示されるように、λ２−６クローンからのDNアーゼＢ遺伝子の発現の高いレベルがあった。この発現の原因である強い細菌プロモーターの開始部位を測定するため、大腸菌RNAポリメラーゼを用いて試験管内ランオフ転写検定を行った。この検定は、転写RNAランオフの長さをサンガー（Sanger）ジデオキシ配列決定ラダーと比べることにより転写開始の正確な塩基を決定させることを可能とする。この検定は、大腸菌の転写の開始部位に強い証拠を与える。各種ストレプトコッカスの公知の転写開始部位との比較は、この部位が、連鎖球菌転写の原因領域であることを立証する（J.Frretti  ＆  R.Curtiss,『連鎖球菌遺伝学（Streptococcal  Genetics）』（1987）第293頁、連鎖球菌の転写の開始と翻訳の前兆となるヌクレオチド配列の編集（Compilation  of  Nucleotide  Sequences  that  Signal  the  Initiation  of  Transcription  and  Translation  in  Streptococci））。
ランオフ転写反応では、RNAポリメラーゼが、プロモーター領域を認識し、転写を開始させる。酵素が、鋳型の端から最終的に脱落するので、これはランオフー転写である。これは、転写開始部位を調べる標準的な方法である。
DNアーゼＢ遺伝子の上流領域を含むPCRフラグメントが、大腸菌RNAポリメラーゼとの試験管内ランオフ転写反応のための鋳型として用いられた。２つのオリゴヌクレオチド、位置298−280のオリゴヌクレオチド♯246およびオリゴヌクレオチド♯267（図３には示してない）を用いて、約290の塩基対のPCR  DNA生成物が、つくられ、フラグメントが、ゲル電気泳動の後に精製された。ランオフ転写反応は、30mMのTris（pH8）、120mMのKCl、4mMのMgCl2、10mMの２−メルカプトテサノール（２−mercaptotethanol）、4mMのスペルミジン、0.4mMのATP、0.4mMのCTP、0.4mMのGTP、0.08mMのUTP、80単位のRNAsin（Promega）、１単位のRNAポリメラーゼ（Promega）および５μｌ［32P］UTP（全量で100μｌ）中で行った。この混合物を37℃で30分間温置した。反応を停止させるため、10μｌの0.5MのEDTAを加えた。
サンプルを希釈し、配列決定ゲルで電気泳動にかけた。転写産物の大きさを正確に決定するため、２−6DNAにオリゴヌクレオチド246を用いる配列決定反応を行った。反応は、GIBCO/BRL（Bethesda,MD）サイクル配列決定キットを用いて行った。配列決定ラダーの開始点は、ランオフ転写産物のランオフ点と同じである。尿素ポリアクリルアミドゲル中の配列決定ラダーと一緒に転写産物を分析することにより、転写開始部位の位置が決定された。
図７は、転写解読枠の上流のDNA配列および大腸菌プロモーターの共通配列（D.K.Hawley  ＆  W.R.McClure,Nucl.Acids  Res.11:2237−2255（1983））を示している。転写データは、RNAポリメラーゼについて２つの可能な開始部位（位置96および97）があることを示唆する。これらの部位は、図７で星印をつけてある。−35および−10領域は、下線がしてある。
例10
ヒト血清サンプル中の抗DNアーゼＢ抗体との反応での自然のDNアーゼＢとの精製された組換え体ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢの等価性（equivalence）
ヒト血清サンプル中の抗DNアーゼＢ抗体との反応で、組換え体DNアーゼＢが、商業的なストレプトナーゼ（Streptonase）Ｂの形で自然のDNアーゼＢと等価であることを示すため、精製したDNアーゼＢ酵素を、ストレプトナーゼＢ検定で商業的なストレプトナーゼＢの代わりに用いた。Boston  Biomedica（Boston,MA）からの患者サンプルを、ストレプトナーゼＢ診断キットにある指示にしたがってテストした。同じサンプルについて、再構成したストレプトナーゼＢと同様なヌクレアーゼ活性を与えるように希釈した精製組換え体DNアーゼＢを用いてテストした。結果を表２に示し、図８に相関関係の形でグラフにした。
0003644961.tif 000016
分かるように、商業的ストレプトナーゼＢと精製組換え体DNアーゼを用いた結果の間の相関関係は極めて高い。このように、精製組換え体DNアーゼＢは、商業的なストレプトナーゼＢのように血清中に見られる抗DNアーゼ抗体と実質的に同じように反応する。
例11
精製した自然のDNアーゼＢのマイトジェン活性の欠如
精製された自然のDNアーゼＢが、ヒトリンパ球マイトジェン検定でマイトジェン活性を有するかどうか測定するため、精製された自然のストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢのさまざまな画分を、T.Yutsudo  et  al.の『ストレプトコッカス・ピオゲネスによりつくられたマイトジェン因子の新しい種類（Ａ  New  Type  of  Mitogenic  Factor  Produced  by  Streptococcus  pyogenes）』、FEBS  Lett.308:30−34（1992））により用いられた手順に従いマイトジェン検定でテストした。マイトジェン活性についてのDNアーゼＢのテストにたいして、製造者により記載されたようにして行ったFicoll−Paque（Pharmacia）１段階勾配手順を用いて、ヒトリンパ球を単離した。リンパ球を105細胞／ウエルの濃度でマイクロタイタープレート（96個のウエル）に塗布した。湿度を持たせた雰囲気（37℃、５％CO2、１μCiの三重水素化したチミジン）（Amersham,Arlington  Heights,IL）での３日間の成長の後、1mCi/mlで、各ウエルに加えた。さらに24時間の成長の後、細胞は、10％の胎児ウシ血清でMEM媒質に溶解させた100mMのEDTA20μｌを用いて、ガラス管に移した。ウエルを、10％胎児ウシ血清と共に追加の200μｌのMEMで洗浄した後、加えた三重水素化したチミジンを沈殿させるため、500μｌの10％のトリクロル酢酸（TCA）を各ガラス管に加えた。TCA/細胞混合物は、ガラスフィルター（Schleicher  and  Schuell,Keene,NH）での濾過に先立ち、20分間氷上で温置させた。フィルターは、さらに、５％のTCAおよび100％のエタノールで洗浄してから、乾燥させ、次に、シンチレーションで計数した。マイトジェン活性についての正の対照として、コンカナバリンＡ（示すように１μg/ml−100μg/ml）を用いた。
大腸菌DNアーゼＩ、例３のヘパリン−セファロース画分、例３の精製した画分、および例３ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢについて結果を図９に示す。結果は、両方の精製した画分ＩおよびIIさらに組換え体DNアーゼＢが実質的にマイトジェン活性を有さないことを示している。ヘパリン−セファロース画分が、検出可能なマイトジェンを有さなく、なぜなら、さらなる精製で除去されたからである。このことは、マイトジェン活性が、DNアーゼＢタンパク質に存在しなく１種またはそれ以上の不純物に存在すること示している。
発明の利点
本発明は、多量のストレプトコッカス・ピオゲネスを成長させる高価で危険な工程を必要とすることなく高度に精製されたストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢ酵素を得る方法を提供する。該酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネスのほかのタンパク質からそれを精製することなく得られる；該酵素は、適当な発現ベクターにより移入された大腸菌からまたは組換え体ファージ感染大腸菌から精製され得る。発現ベクターは、発現を最適化させるように選択され得る。
次に、ストレプトコッカス・ピオゲネスDNアーゼＢは、DNアーゼＢに特異的な検定で血清中の抗DNアーゼＢ抗体についての検定をするために用いられ得る。特に、精製されたDNアーゼＢの有用性は、固相に吸着された精製酵素を用いるELISA検定の利用を可能とし、これは、広範囲の利用に適当であり実施が容易で便利な検定である。この検定は、高い感度を有しまた特異的である。このような検定は、ストレプトコッカス・ピオゲネス感染を検出する臨床での用途に特に適当である。
以上、本発明を本発明のある好ましい形についてかなり詳細に説明したが、他の形も可能である。したがって、添付の請求の範囲の精神と範囲は、ここに含まれる好ましい形の説明に限定されるものではない。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人（発明者）：アダムス，クレイグ  ダブリュー  パン，パティー  ベレイ，マリーナ
（ii）発明の名称：ストレプトコッカス・ピオゲネスから誘導された組替えDNアーゼＢ
（iii）配列の数:11
（iv）通信住所：
（Ａ）受信人：シェルドン  アンド  マク
（Ｂ）通り：サウス  レイク  アベニュー  225,ナインス  フロア
（Ｃ）市：パサデナ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:91001
（ｖ）コンピューター判読形態：
（Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM  PC  コンパーチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース  ♯1.0,バージョン  ♯1.25
（vi）現在の出願のデータ：
（Ａ）出願番号:US   ／ ， 
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）弁護士／弁理士情報：
（Ａ）氏名：ファーバー，マイケル  ビー
（Ｂ）登録番号:32,612
（Ｃ）参照／名簿番号:9521
（ix）電気通信情報：
（Ａ）電話：（818）796−4000
（Ｂ）ファックス：（818）795−6321
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:1:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:43  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:No
（ｖ）フラグメント型:N−末端
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）
（xi）配列:SEQ  ID  NO:1:
0003644961.tif 000017
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:2:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:26  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：合成プライマー
（xi）配列:SEQ  ID  NO:2:
0003644961.tif 000018
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:3:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：合成プライマー
（xi）配列:SEQ  ID  NO:3:
0003644961.tif 000019
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:4:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:23  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:No
（ｖ）フラグメント型:N−末端
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス
（xi）配列:SEQ  ID  NO:4:
0003644961.tif 000020
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:5:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：合成プライマー
（xi）配列:SEQ  ID  NO:5:
0003644961.tif 000021
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:6:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:38  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:No
（ｖ）フラグメント型:N−末端
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス
（xi）配列:SEQ  ID  NO:6:
0003644961.tif 000022
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:7:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:1083  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス
（ix）配列の特徴
（Ａ）特徴を表す記号／キー:CDS
（Ｂ）存在位置:129..944
（xi）配列:SEQ  ID  NO:7:
0003644961.tif 000023
0003644961.tif 000024
0003644961.tif 000025
0003644961.tif 000026
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:8:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:271  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列:SEQ  ID  NO:8:
0003644961.tif 000027
0003644961.tif 000028
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:9:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:229  アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス
（xi）配列:SEQ  ID  NO:9:
0003644961.tif 000029
0003644961.tif 000030
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:10:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:200  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス
（xi）配列:SEQ  ID  NO:10:
0003644961.tif 000031
（２）配列番号（SEQ  ID  NO）:11:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:944  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:No
（iv）アンチセンス:No
（vi）起源
（Ａ）生物名：ストレプトコッカス・ピオゲネス
（xi）配列:SEQ  ID  NO:11:
0003644961.tif 000032
【図１】
0003644961.tif 000035
【図２】
0003644961.tif 000036
【図３】
0003644961.tif 000037
0003644961.tif 000038
【図４】
0003644961.tif 000039
【図５】
0003644961.tif 000040
0003644961.tif 000041
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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