(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源からの励起光をマイクロレンズアレイディスクの個々のマイクロレンズにより集光し、各マイクロビームをピンホールディスクの対応するピンホールを通過させて試料上に照射すると共に、試料を通り抜けたビームを試料の集光面と光学的に共役な位置に配置された反射鏡で反射させて再び試料に照射するように構成されたニポウディスク方式の二光子吸収蛍光顕微鏡であって、
前記レーザ光源とマイクロレンズアレイディスクの間に部分反射鏡を配置し、この部分反射鏡と前記反射鏡が試料を挟んで光共振器を形成するように構成されたことを特徴とするニポウディスク方式の二光子吸収蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記レーザ光源とマイクロレンズアレイディスクとの間に、前記光共振器からの反射光または部分反射鏡を透過した反射鏡からの反射光が、レーザ光源側に戻らないように遮断するための光学素子を配置したことを特徴とする請求項１に記載のニポウディスク方式の二光子吸収蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二光子吸収現象を利用した光学顕微鏡装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の二光子吸収蛍光顕微鏡の一例を図４に示す。図において、光源３１から出た波長λの光はダイクロイックミラー３２で反射し、顕微鏡の対物レンズ３３で集光され、試料３４に照射される。試料上の光照射強度が十分に大きくなると、波長λの光子が同時に二個吸収される二光子吸収が生じ、試料は波長λ／２の光で励起される。
【０００３】
この二光子吸収は光強度の二乗に比例して起こる非線形過程であるため、光源には短パルスレーザが用いられることが多い。
蛍光を発する試料は、波長λ／２の光で励起されると、波長がλ／２よりもやや長い波長の蛍光を発するため、ダイクロイックミラー３２はこの蛍光を透過するように作られている。
【０００４】
ダイクロイックミラー３２を透過後、蛍光は受光器３５に導かれ、蛍光像を得ることができる。受光器３５に入射する光を途中でミラー（図示せず）を介して折り曲げ、目視で観察することも可能である。
【０００５】
ところで、図４のものは光源３１の出射光が試料３４上の１点にしか照射されず、また共焦点効果を得ることもできないため、図５に示すように光源３１から出た光ビームを試料３４上でＸ，Ｙ方向に走査できるようなスキャンミラー３６および３７を設け、かつ共焦点効果を持たせるためのピンホール３８を対物レンズ３３の結像位置に配置する構成が従来とられていた。図５における受光器３５からは光ビームのスキャン位置に応じて電気信号を取り出すことができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の構成においては、試料に吸収されなかった光は試料３４の後方に通りぬけてしまい、光利用効率が低く、そのため高価な大出力レーザを用いる必要があるという課題があった。
【０００７】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、光利用効率が高く、低パワーのレーザ光で十分な蛍光像を得ることのできるニポウディスク方式の二光子吸収蛍光顕微鏡を実現することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１の発明では、
レーザ光源からの励起光をマイクロレンズアレイディスクの個々のマイクロレンズにより集光し、各マイクロビームをピンホールディスクの対応するピンホールを通過させて試料上に照射すると共に、試料を通り抜けたビームを試料の集光面と光学的に共役な位置に配置された反射鏡で反射させて再び試料に照射するように構成されたニポウディスク方式の二光子吸収蛍光顕微鏡であって、
前記レーザ光源とマイクロレンズアレイディスクの間に部分反射鏡を配置し、この部分反射鏡と前記反射鏡が試料を挟んで光共振器を形成するように構成されたことを特徴とする。
このような構成によれば、試料を透過したレーザ光を励起光として再利用できるため、光利用効率が向上し、レーザパワーを低く抑えることができる。
【０００９】
この場合、請求項２のように、光共振器からの反射光あるいは反射鏡からの反射光がレーザ光源側に戻らないように遮断する光学素子を配置することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る二光子吸収蛍光顕微鏡の一実施例を示す要部構成図である。レーザ光源１から出たレーザビーム２は、コリメート拡大光学系部３によりビーム径が拡大された後、マイクロレンズアレイディスク４に入射する。
【００１２】
個々のマイクロレンズによって集光された個々のマイクロビームは、ダイクロイックミラー５を透過後、ピンホールディスク６の個々の対応するピンホールを通過する。ピンホールを通過後、顕微鏡の第一の収斂レンズ１０で平行光束となり、第一の対物レンズ１１で試料１２の上に集光する。
【００１３】
なお、説明を簡明にするために、今後、収斂レンズ１０以降については、個々のマイクロビームのうち、すべての焦点が光軸７上にあるビーム８と軸外にあるビーム９のみを示す。
【００１４】
ピンホールディスク６のピンホールと試料上に個々のビームが集光する集光面１３とは互いに光学的に共役である。生物試料の多くは光透過性が良いため照射光の大部分は試料を通り抜ける。通り抜けたビームは第二の対物レンズ１４により再び平行光束になり、第二の収斂レンズ１５により反射鏡１６上に集光する。
【００１５】
ここでビームは折り返され、全く同じ光路を経て第二の収斂レンズ１５と第二の対物レンズ１４を通り、再び試料１２を照射する。試料は左側から入射した直接励起ビームと右側からの反射励起ビームの両方で励起される。
【００１６】
試料から発せられた蛍光は第一の対物レンズ１１、第一の収斂レンズ１０、ピンホールディスク６を透過後、ダイクロイックミラー５で反射され、観察光学系部１７（図示せず）に導かれる。また、蛍光は第二の対物レンズ側にも放たれるので、第二の対物レンズ１４と収斂レンズ１５を透過後、反射鏡１６で折り返され、再び試料側に戻り、最初の蛍光と同じ光路を辿って観察系に導かれる。
【００１７】
マイクロレンズアレイディスク４とピンホールアレイディスク６は互いに結合された状態で回転することにより試料１２の上の集光面１３全面を掃引している。試料は左側から入射した光子を同時に吸収した場合、右側から入射した反射光の光子を同時に吸収した場合に加えて左右から同時に光子を吸収した場合も二光子吸収を起こすことができる。
【００１８】
励起レーザが連続発振波（以下ＣＷという）である場合には、左右からの入射光が互いに強め合うように反射鏡１６の位置を調整すれば良いが、パルス発振波の場合には、光速をｃ、パルス発振周波数をｆ、試料１２と反射鏡１６との間隔をｄとして、
ｎｃ／ｆ＝２ｄ    （ｎは整数）
の条件を満たす必要がある。
【００１９】
図２は本発明の他の実施例であり、図１の実施例に反射ビームがレーザ光源側に戻らないように偏光板２０と１／４波長板２１を追加したものである。レーザビーム２はコリメート光学系部３を透過後、偏光板２０によって直線偏光となる。ただし、レーザビームが元々直線偏光を持つ場合は、この偏光板はなくてもよい。
【００２０】
偏光板２０の後方に透過ビームの偏光が円偏光になるように角度調整された１／４波長板２１が配置されている。以下ビームがマイクロレンズディスクを透過して、試料を照射し、反射鏡で折り返され再度試料を照射することは図１の実施例と同じである。
【００２１】
この後、試料を右側から左に向けて戻ったビームはマイクロレンズアレイディスク４を透過し、１／４波長板２１に再度入射するが、反射鏡１６によって円偏光は逆回転しているので１／４波長板２１を透過したビームは最初の入射ビームとは９０度回転した直線偏光となっている。
【００２２】
したがって、反射ビームに対して偏光板２０は丁度直交ニコルの位置に配置されたことになるため、反射ビームは偏光板２０を通過できず、レーザ光源側に達することはない。
【００２３】
励起光がＣＷ発振の場合は、光共振器内に定在波が立つように反射鏡１６の位置を光軸方向に調整する。パルス発振の場合には、光速をｃ、パルス発振周波数をｆ、試料１２と反射鏡１６との間隔をｄ、共振器長をＬとして、次の条件を満たす必要がある。
ｎｃ／ｆ＝２ｄ
ｍｃ／ｆ＝２（Ｌ−ｄ）
ただし、ｍ、ｎは整数
【００２４】
図３は本発明の更に他の実施例図である。本実施例は、図２の構成に部分反射鏡を加え、この部分反射鏡と反射鏡とで試料を挟んだ光共振器を形成したものである。部分反射鏡は、反射領域全体にわたって入射光の一部を透過および反射する半透過特性を有する。
【００２５】
１／４波長板２１を出た照射ビームは部分反射鏡２２を通過後、マイクロレンズアレイディスク４に入る。以下ビームがマイクロレンズディスクを透過して、試料を照射し、反射鏡で折り返され、再度試料を照射後、試料を右側から左に向けて戻ったビームがマイクロレンズアレイディスク４を透過することは図２の実施例の場合と同じである。
【００２６】
マイクロレンズを右側から左側に通過したビームは再び平行光束となっているため、部分反射鏡２２によって反射され、最初の励起ビームと同じ光路を経て試料に達する。部分反射鏡２２と反射鏡１６は試料１２を挟んで光共振器を形成しており、中に閉じ込められたビームは常に試料の集光面１３の上で集光する。
【００２７】
最初の励起ビームが部分反射鏡２２で反射された戻り光および反射鏡１６からの反射光の一部は部分反射鏡２２を透過するが、１／４波長板２１を透過したビームは最初の入射ビームとは９０度回転した直線偏光となっている。
【００２８】
反射ビームに対して、偏光板２０は丁度直交ニコルの位置に配置されたことになるため、反射ビームは偏光板２０を通過できず、レーザ光源側に達することはない。
【００２９】
なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。したがって本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００３０】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
１）二光子吸収励起の効率を高めることができる。
２）レーザパワーを低く抑えることができる。
３）図３の実施例ではレーザ発振の安定化を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る二光子吸収蛍光顕微鏡の一実施例を示す要部構成図である。
【図２】本発明の他の実施例を示す構成図である。
【図３】本発明の更に他の実施例を示す構成図である。
【図４】従来の二光子吸収蛍光顕微鏡の一例を示す構成図である。
【図５】従来の二光子吸収蛍光顕微鏡の他の一例を示す構成図である。
【符号の説明】
１  レーザ光源
２  レーザビーム
３  コリメート拡大光学系部
４  マイクロレンズアレイディスク
５  ダイクロイックミラー
６  ピンホールディスク
７  光軸
８，９  ビーム
１０  第一の収斂レンズ
１１  第一の対物レンズ
１２  試料
１３  集光面
１４  第二の対物レンズ
１５  第二の収斂レンズ
１６  反射鏡
１７  観察光学系部
２０  偏光板
２１  １／４波長板
２２  部分反射鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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