(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列：ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有するノナペプチド又はそのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステル又はアミド又はそれら各化合物の薬学的に許容し得る塩又はそれら各化合物と金属との結合物を有効成分として含有することを特徴とする、胸腺外Ｔ−リンパ球の分化を誘導させることにより、消化器障害・疾患のうち内在性細菌の異常増殖を予防、治療するための薬剤。
【請求項２】
下記のアミノ酸配列：ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有するノナペプチド又はそのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステル又はアミド又はそれら各化合物の薬学的に許容し得る塩又はそれら各化合物と金属との結合物を有効成分として含有することを特徴とする、胸腺外Ｔ−リンパ球の分化を誘導させることにより、消化器障害・疾患のうち炎症性腸疾患を予防、治療するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、人間用又は動物用の新規な医薬に関するものであり、さらに詳しく言えば、各種疾患の予防、治療に有用な胸腺外Ｔ−リンパ球の分化を誘導させることを目的とする薬剤に関する。
【０００２】
【背景技術】
消化管は、口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸に区分けされ、食物、水等が口腔より摂取され、栄養分が体内に消化吸収され、大便が肛門から排泄されるまでの一連の過程を担う臓器、器官である。消化管は体内に存在するものの、いわば外界であり、内部には、腸内微生物が常在し、一方病原微生物や外来異物が、意識する、しないにかかわらず、口腔、鼻腔等を通じ侵入してくる臓器である。細菌、ウイルス等の病原微生物の感染による、消化器系感染症については、先進国においては、今日激減したが、発展途上国では未だそれらの患者が多い。
【０００３】
一方、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチエット病などの難治性の消化器疾患が知られているが、原因が十分に解明されておらず、その予防、治療の対策も不充分な現状にある。また、抗炎症剤を代表とする各種薬剤投与により、胃、十二指腸潰瘍が惹起されたり、各種の抗癌剤、免疫抑制剤、抗菌剤等々の化学療法剤等の投与により、あるいは放射線の照射により消化菅内の細菌叢が乱されたり、免疫系が障害されたりなどして、消化器疾患が生じることも知られている。
【０００４】
一方、近年の免疫学の進展により、消化器上皮、たとえば腸管上皮間、肝臓など、あるいは皮膚、粘膜上皮などに胸腺外分化Ｔ−リンパ球の存在がクローズアップされ、それらリンパ球の機能、役割が研究されてきている。
【０００５】
先に、血清胸腺因子（Ｆａｃｔｅｕｒ  ｔｈｙｍｉｑｕｅ  ｓｅｒｉｑｕｅ：ＦＴＳ）として知られるノナペプチドが多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、炎症性神経炎、多発性神経炎などや他の免疫性脱髄疾患などの免疫不全を伴う各種疾患の治療剤として、また老化防止、細胞賦活、老人病予防・治療のための薬剤として好適であることが見出され、このような治療剤が提供されている（特開昭５８−５２２２５号公報および特開平１−３１６３２８号公報参照）。また、たとえばシスプラチン、アドリアマイシンなどの各種の抗癌剤、シクロスポリン、ＦＫ−５０６などの免疫抑制剤、また抗菌、抗ウイルス剤などのこれら化学療法剤、さらにはアミオダロンなどの他薬効分野の薬剤が惹起する、腎臓、心臓等の臓器、組織、細胞の障害をＦＴＳが防護することについても特許出願がなされている（特開平３−１７８９３３号公報、特開平６−１３５８４９号公報および特開平６−１９２１２０号公報など参照）。
【０００６】
本発明者はこれらＦＴＳの作用、効果は、Ｆｕｊｉｎｏらが以前出願したＵＳＰ４２２９４３８の全身性エリテマトーデ等治療剤としてのＦＴＳアナローグの効果が、胸腺内リンパ球の分化を促進する作用に基づくものであるとの主張とは異なる、新たな作用であるとの考えの下に前述のような、各種の消化器系感染症、炎症性腸疾患などの消化器障害・疾患の動物モデルで、前記ノナペプチドの作用を探索したところ、前記ノナペプチドに顕著な薬効があることを見出し、さらにそれら疾患モデル動物におけるリンパ球の動態を詳細に検討するに及び、前記ノナペプチドが胸腺内、血液内リンパ球の分化を誘導するよりも、消化管や肝臓等胸腺外リンパ球の分化、成熟を誘導することを見出した。すなわち、上記の疾患モデルでの前記ノナペプチドの薬効の本態は、前記ノナペプチドによる胸腺外分化Ｔ−リンパ球の誘導によるものであることが明らかにされた。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。
【０００７】
【発明の開示】本発明は消化器系感染症、炎症性腸疾患などの各種疾患の予防、治療に有用な胸腺外Ｔ−リンパ球の分化、成熟を誘導させることを目的とする前記ノナペプチド類を含有する薬剤に関するものである。従って本発明は、従来知られている胸腺内リンパ球の分化の不全にまつわる疾患の治療に有用とされるＦＴＳを含む薬剤とは全く異なる薬剤を提供するものであり、本発明は、従来技術と異なり本発明者らによって初めて開示された発明である。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記のアミノ酸配列：
ｐＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎを有するノナペプチド又はそのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステル又はアミド又はそれら各化合物の薬学的に許容し得る塩又はそれら各化合物と金属との結合物を有効成分として含有することを特徴とする、胸腺外Ｔ−リンパ球の分化を誘導させることにより各種疾患を予防、治療する薬剤を提供するものである。
【０００９】
本発明において使用される前記のノナペプチドは公知物質であって、通常ペプチド合成に慣用されている液相又は固相におけるペプチド合成法、例えば特開昭５４−１６４２５号公報、ＵＳＰ４，３０１，０６５記載の方法により、困難なく製造することができる。あるいはまた、このノナペプチドは、遺伝子工学的、細胞工学的方法によっても調製することができる。
【００１０】
本発明において使用される前記のノナペプチドのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるエステルは、薬学的に許容し得るカルボン酸のエステル類であり、その例としては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、イソブチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、イソペンチルエステル、ネオペンチルエステル、ｔｅｒｔ−ペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル、ｓｅｃ−ヘキシルエステル、ヘプチルエステル、オクチルエステル、ｓｅｃ−オクチルエステル、ｔｅｒｔ−オクチルエステル、ノニルエステル、デシルエステル、ウンデシルエステル、ドデシルエステル、トリデシルエステル、テトラデシルエステル、ヘキサデシルエステル、オクタデシルエステル、ノナデシルエステル、エイコシルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、シクロオクチルエステル、アリルエステル、イソプロペニルエステル、ベンジルエステル、
【００１１】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−クロルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フルオルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ブロムベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ヨードベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メチルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エチルベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−イソプロビルベンジルエステル、シンナミルエステル、アミノエチルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ニトロベンジルエステル、
【００１２】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−メトキシベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エトキシベンジルエステル、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノフエネチルエステル、α−フルフリルエステル、α−チエニルメチルエステル、α−ピリジルメチルエステル、α−ピリジルエチルエステル、ピペリジノメチルエステル、α−ピペリジルメチルエステル、モルホリノエチルエステル、α−モルホリニルメチルエステルなどがあげられる。
【００１３】
また、本発明において使用される前記のノナペプチドのＣ末端のアスパラギンのカルボキシル基におけるアミドは、薬学的に許容し得るカルボン酸のアミド類であり、その例としては、アミド、メチルアミド、エチルアミド、プロピルアミド、イソプロピルアミド、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド、ｔｅｒｔ−ブチルアミド、ｎ−ペンチルアミド、イソペンチルアミド、ネオペンチルアミド、ｔｅｒｔ−ペンチルアミド、ｎ−ヘキシルアミド、ｓｅｃ−ヘキシルアミド、ヘプチルアミド、オクチルアミド、ｓｅｃ−オクチルアミド、ｔｅｒｔ−オクチルアミド、ノニルアミド、デシルアミド、ウンデシルアミド、ドデシルアミド、トリデシルアミド、テトラデシルアミド、ヘキサデシルアミド、オクタデシルアミド、ノナデシルアミド、エイコシルアミド、シクロペンチルアミド、シクロヘキシルアミド、シクロヘプチルアミド、シクロオクチルアミド、アリルアミド、イソプロペニルアミド、ベンジルアミド、
【００１４】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−クロルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−フルオルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ブロムベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ヨードベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メチルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エチルベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−イソプロピルベンジルアミド、シンナミルアミド、アミノエチルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−ニトロベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−メトキシベンジルアミド、ｏ−、ｍ−、又はｐ−エトキシベンジルアミド、
【００１５】
ｏ−、ｍ−、又はｐ−アミノフエネチルアミド、α−フルフリルアミド、α−チエニルメチルアミド、α−ピリジルメチルアミド、α−ピリジルエチルアミド、ピペリジノメチルアミド、α−ピペリジルメチルアミド、モルホリノエチルアミド、α−モルホリニルメチルアミド、メトキシカルボニル−（α−メルカプトメチル）メチルアミド、エトキシカルボニル−（α−メルカプトメチル）メチルアミドなどがあげられる。
【００１６】
また、前述の薬学的に許容し得る塩としては、前記のノナペプチドのアミノ基における酸付加塩およびカルボキシル基における塩基塩があげられる。酸付加塩としては、有機酸又は無機酸との各塩があげられ、それらの例としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、フマル酸、りんご酸、マレイン酸、しゅう酸、ナフトエ酸などのカルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩があげられる。
【００１７】
上記の塩基塩としては、無機塩基との塩すなわち、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、あるいは有機塩基との塩すなわち、アミンとの塩があげられ、それらの例としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、トリス塩、ジシクロヘキシルアミン塩などがあげられる。
【００１８】
前記の各化合物と金属との結合物における金属としては亜鉛、鉄、マグネシウム、コバルト、ニッケル、クロム、金、ゲルマニウム、ガリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、銅、マンガン、セレンなどの１価、２価、３価又は４価の金属が例示される。
【００１９】
本発明に係る胸腺外Ｔ−リンパ球の分化を誘導させることにより各種疾患の予防、治療を目的とする予防、治療剤は、その剤型に応じて通常慣用の製剤手段を用いて調製される。すなわち、上記のノナペプチドならびにそのエステル又はアミド誘導体もしくはそれらの塩類又はそれら各化合物と金属との結合物から選ばれた有効成分物質を、適宜、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤などを用いて、適当な剤形に調製する。剤形は外用、経口投与、非経口投与等々の投与経路に適した種々の剤形とすることができる。
【００２０】
本発明に係る胸腺外Ｔ−リンパ球の分化を誘導させることにより各種疾患を予防、治療することを目的とする予防・治療剤の薬理効果、胸腺外Ｔ−リンパ球分化誘導効果などは下記の如き試験により確認される。抗癌剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、免疫抑制剤などの化学療法剤等により惹起される消化器系感染症等により生じる消化管の潰瘍、炎症、壊死、また消化管や肝、腎、膀胱等での細菌、ウイルスの異常増殖、そして動物個体の便秘、下痢、血便、衰弱、致死等の予防、治療の試験においては、マウス、ラットを代表として、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、バブーン等哺乳動物を用い、これら動物に対し、５−ＦＵ等５−ＦＵ系抗癌剤、チオイノシン、メルカプトプリン、メトトレキサート、シタラビン、塩酸アンシタビン、エノシタビンなどの代謝拮抗剤系抗癌剤、
【００２１】
シクロホスファミド、マイトマイシン、エトポシド、シスプラチン等白金系錯体抗癌剤、アドリアマイシン、ダウノマイシン、ニトロソウレア系抗癌剤、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ストレプトゾトシン、ミスラマイシンなどの各種抗癌剤またセファロリジン、セファロチン、セファレキシン、セファラジン、セフォキシチンなどのセファロスポリン系およびメチシリン、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリンなどのペニシリン系のβ−ラクタム抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、エノキサシン、オフロキサシン、ナリジクス酸、ピペミド酸、ノルフロキサシンなどの合成抗菌剤、リファマイシン、アンホテリシンＢ、またアシクロビル、ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣなどの抗ウイルス剤、
【００２２】
またアザチオプリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ−５０６、ラパマイシン、ＲＳ−６１４４３、１５−デオキシスパーガリン等の免疫抑制剤などの試剤を非経口あるいは経口で所定量を、単回あるいは隔口に投与し、一定期間経時的に血液検査、尿検査を行い、血清ＧＯＴ、血清ＧＰＴ、ＢＵＮ、ビリルビン、コリンエステラーゼ、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、トランスグルタミナーゼなどを測定し、その際、上記のノナペプチドの所定量をこれら薬剤の投与に先立って、あるいは投与直後から、連日あるいは隔日に、所定の期間、腹腔内注射、皮下注、筋注、静注、経口などの各種の投与ルートで投与し、対照群とノナペプチド投与群との間の血液、尿検査値、臓器重量値、体重測定値、病理組織像さらには生存率などを比較、観察した。
【００２３】
また開腹した動物の腸管からパイエル板を除いた後、腸管を開き、１ｃｍごとの断片に切り、培養液に漬け、遠心分離などにより腸管リンパ球を集めた。同時に胸腺細胞、脾臓細胞、リンパ節細胞なども集めた。そしてこれらリンパ球の数の測定、モノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳｃａｎによる各リンパ球の分画、同定、解析（フローサイトメトリー）を行った。また病理学的所見においては、細胞接着因子の変動の同定も行った。さらに肝臓、腎臓、小腸等の内在細菌数の変動なども測定した。
【００２４】
一方、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病などの消化器障害の動物モデルを硫酸多糖類などを用いて作製し、ノナペプチドの薬効が検討された。また高カロリー輸液の中心静脈栄養療法を施したラットや、またＸ線やγ線などの放射線を照射したマウス等を実験動物として用意し、上記と同様の試験を行った。またＩＬ−２あるいはαβＴＣＲなどの遺伝子をノックアウトした炎症発症動物を用いることができる。
【００２５】
これら試験結果によると、対照群マウス、ラットなどが、薬剤の投与量の増加に応じて、消化器障害の程度が増し、胸腺外リンパ球の減少、分化の遅れが起こり、更には死亡に至るものが現れるのに対して、ノナペプチド投与群においては、消化器障害の症状の程度が軽く、胸腺外リンパ球の減少が抑えられ、分化も早まることがわかり、また細胞生着分子などのマーカーも正常化された。さらに抗癌剤等による動物の内在性細菌の異常増殖や小腸絨毛の短小化さらには死亡も、本願ノナペプチドの投与によって、明瞭に抑制、阻止されることが明らかとなった。
【００２６】
また対照実験として胸腺摘出マウスに、抗癌剤を投与し惹起される消化器障害や死亡も、ノナペプチドの投与による胸腺外リンパ球の減少の抑制、回復の促進とあいまって、抑制されることが、胸腺無処置のマウス同様に見られることから、胸腺外リンパ球の減少の抑制が胸腺リンパ球変動とは独立に起こることが理解され、ＦＴＳノナペプチドが直接的に胸腺外リンパ球の分化を誘導していることが示された。
【００２７】
本発明に係る薬剤における有効成分物質の毒性を検討するため、マウスに対し、有効成分物質ノナペプチド１００ｍｇ／ｋｇを連日１４日間皮下投与したが外見的に何ら異常は見られなかった。また、ラットに対し、同有効成分物質３０ｍｇ／ｋｇを連日２１日間、皮下投与したが、外見的にも血清生化学的にも、また病理解剖を行った結果でも、何ら異常は見られなかった。このように、本発明に係わる薬剤は、きわめて毒性の少ない安全な薬剤であり、長期間投与することが可能である。
【００２８】
本発明に係る薬剤を投与することができる対象動物としては、例えばヒト及びウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコなどの家畜、ライオン、ゾウ、キリン、クマ、ゴリラ、サル、チンパンジー、タヌキ、キツネ、イタチ、ミンクなどの動物園等で飼育されている哺乳類動物、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモットほか各種の実験動物、ニワトリ、七面鳥などの家禽類、ペット用の鳥類、爬虫類、両棲類、魚類などがあげられる。その投与量はこれら動物の体重１ｋｇあたり通常、０．１μｇ〜５００ｍｇ／日で、これらは、例えば、１日１回〜６回に分割投与してもよく、また投与対象者の年齢、病状などにより適宜投与量を増減することができる。その投与経路は特に限定されないが、静脈内、筋肉内、皮内、皮下に注射投与することもできる。
【００２９】
また軟膏剤を調製することにより、眼部、口腔内、鼻腔内、皮膚などに塗布することができ、坐薬やペレット剤、ゼリー剤、点眼剤、点鼻剤、鼻口腔吸収剤、エアロゾル剤、噴霧剤、経口剤などとして投与することもできる。有効成分物質の生体内での急速な分解あるいは不活性化を阻止するために、有効成分物質を適当な製剤成分、たとえば、アルコール性、レシチンなどの油性、脂肪性の生理的に無害な固体または液体材料あるいはそれらの懸濁物リポソームなどを用いて製剤とし長時間活性が持続する製剤とすることもできる。
【００３０】
本発明に係る薬剤は、他の薬剤、たとえば免疫賦活剤等のｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒや各種の細胞増殖・分化因子、ステロイド、また各種の消化器疾患治療剤などとともに投与することもでき、また、これらを製剤中に添加し、合剤として臨床効果を高めることができる。
以下に実施例および実験例を記載し、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら各例によって限定されるものではない。
以下の実施例において、前記のノナペプチドを便宜上、ＦＴＳと略記する。
【００３１】
【実施例】
実施例１  注射用バイアル製剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業（株）製）１ｍｇを蒸留水に溶解し、除菌濾過し、バイアル内に充填し、凍結乾燥した。
【００３２】
実施例２  注射用アンプル製剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業（株）製）５ｍｇを生理食塩水に溶解し、除菌濾過し、アンプル内に充填した。
【００３３】
実施例３  皮下注射用注射剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業（株）製）を単位投与量あたり２ｍｇを２％カルボキシメチルセルロースＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液中に懸濁し、大豆ホスフアチドからなるＬｉｐｏｍｏｌ（Ｈｕｈｔａｍａｋｉ  Ｏｙ／Ｌｅｉｒａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（製）あるいは静脈用水中油型乳濁液であるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と混合した。Ｌｉｐｏｍａｌを用いる場合は、ＦＴＳ溶解ＰＢＳ溶液とＬｉｐｏｍａｌは等量ずつ混ぜ合わせた。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄを用いる場合は、ＦＴＳ溶解ＰＢＳ溶液２．５ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ社製）０．１ｍｌ及びＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ  ４．６ｍｌを混ぜ合わせた。
【００３４】
実施例４  リポソーム製剤
リポソーム製剤には、電荷の異なる３種類があり、それらが、更に構造上から、４種類に分類される。
電荷は中性、陽性、陰性の３種であり、構造的には多重層リポソーム（ＭＬＶ、ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、小さな一枚膜リポソーム（ＳＵＶ、ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、および大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ、ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、更にＬＵＶに近似の構造を有しながら数枚膜のもの（ＲＥＶ、ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の４種類が知られている。
【００３５】
▲１▼  ＦＴＳ封入中性電荷リポソーム
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、およびコレステロールのクロロホルム溶液をモル比２：１、４：１、あるいは１：１となるように混合し、一旦溶媒を減圧留去したものに、脂質量に対し１／１００〜１／１０００当量のＦＴＳのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液を添加し、Ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒにて十分混和すると、ＭＬＶが得られた。
【００３６】
更に、リン脂質の相転移温度（Ｔｃ）以上で超音波処理することによりＳＵＶが得られた。
得られたＳＵＶに塩化カルシウム水溶液を加え、３７℃で１時間イキューベートして融合させた後、ＥＤＴＡを添加し、３７℃で３０分間インキュベートしてＣａ＋＋を除くと、ＬＵＶが得られた。
ＲＥＶは以下の通りにして調整される。すなわち脂質のクロロホルム溶液から溶媒を減圧留去した後、ジエチルエーテルを適当量加えて充分に溶解したものに、ＦＴＳのＰＢＳ溶液を加え、超音波処理すると均一な単相の溶液となった。得られた溶液を室温にて減圧濃縮した後、ＰＢＳ溶液を加え、Ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒにて充分に混和すると、ＲＥＶが得られた。
【００３７】
▲２▼  ＦＴＳ封入陽性電荷リポソーム
脂質の構成成分が異なるだけで、調製方法は上記中性電荷リポソームの場合と同様である。
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、コレステロール、およびステアリルアミン等の陽性電荷の高級脂肪族アミンをモル比で７：２：１又は４：１：１で混合して、脂質成分とし、同様の方法でＦＴＳを封入した。
【００３８】
▲３▼  ＦＴＳ封入陰性電荷リポソーム
ホスフアチジルコリン類、スフインゴミエリン等のリン脂質、コレステロールおよびジセチルホスフエート、スルフアチド等の陰性電荷の高級樹脂族エステル等をモル比で７：２：１又は４：１：１で混合して、脂質成分とし、同様の方法でＦＴＳを封入した。
【００３９】
実施例５  軟膏剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業（株）製）２ｍｇを精製水に溶解した。次に白色ワセリン２５ｇ、ステアリルアルコール２０ｇ、ＨＣＯ−６０  ４ｇおよびモノステアリン酸グリセリン１ｇをとり、混和して予め調製したプロピレングリコールＩ２ｇ、パラオキシ安息香酸メチル０．１ｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０．１ｇの水溶液（ＦＴＳ含有）を加えて充分に混和し、乳液とした後、冷却して固化するまで混和操作を続けて調製した。
【００４０】
実施例６  坐剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業（株）製）１０ｍｇを予め加温したハードファットに分散し、全量を２ｇとした。
【００４１】
実施例７  経鼻用カプセル剤
ＦＴＳ０．０５ｍｇを無菌条件下で２９．９５ｍｇのミグリオル８１２中性油（ダイナマイトノーベル社製）に溶解した。この溶液を常用の単位投与用投与器に充填し、これを使用前に駆動カプセルに装着した。
【００４２】
実施例８  点鼻剤
蒸留水に以下の量のリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム及びＥＤＴＡ−ジナトリウム塩を室温にて溶解した。この溶液にＦＴＳを溶解し、メンブランフィルターにより濾過した。
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ                      ０．１０ｍｇ
リン酸一水素ナトリウム・２Ｈ２Ｏ                      ０．３０ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ                  １０．１０ｍｇ
塩化ベンザルコニウム                                  ０．１０ｍｇ
エチレンジアミン四酢酸−ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ）    ０．５０ｍｇ
塩化ナトリウム                                        ４．５０ｍｇ
蒸留水                                            ９８７．６０ｍｇ
ｐＨ値                                              ５．０±０．３
【００４３】
実施例９  経鼻用スプレー製剤
ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（三井製薬工業（株）製）２ｍｇをヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースに懸濁し、噴霧製剤機にてスプレー用剤とした。
以下に、本発明の薬剤に関する薬理実験、毒性実験の例を掲げる。
【００４４】
【実験例】
実験例１
雄性７週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ）を入手し、手袋で取り扱い、食事は１２１℃１５分間オートクレーブし、乾燥させたものを与え、水も同様に、１２１℃１５分間オートクレーブしたものを与え、それぞれ自由に摂取させ、ＳＰＦ条件下で飼育し、８週令で以下の実験を２群に分けスタートさせた。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、協和発酵）２００ｍｇ／ｋｇを両群のマウスに腹腔内投与し、その２日前より第１群には、ＦＴＳ・ＣＨ３ＣＯＯＨ・２Ｈ２Ｏ（以下、各実験例の記載中において、ＦＴＳ物質と略記し、図中では単にＦＴＳと略記する）を生理食塩水に溶かし、１０μｇ／マウス／を４日まで皮下投与し、第２群には同じ期間生食水を同様に皮下投与した。
【００４５】
図１に５−ＦＵ  ２００ｍｇ／ｋｇを投与した１群１０匹のマウスの経時的生存率を示す。生食水投与群は６日目に死亡例が出、１３日目には全例死亡するのに対し、ＦＴＳ物質投与群は１２日目に１匹死亡したが、試験終了の２０日目にも９匹生存しており、ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔで２群の間には、ｐ＜０．０５の有意差があることが示された。
【００４６】
実験例２
実験例１において５−ＦＵの投与量が２００ｍｇ／ｋｇであると、図１に示すようにほとんどのマウスカが８日目までに死亡するので、５−ＦＵをｓｕｂｌｅｔｈａｌな１５０ｍｇ／ｋｇマウスに投与した。各群６匹ずつ２群に分け、ＦＴＳ物質と生食水をそれぞれ実験例１同様に投与し、８日目に屠殺し、肝臓、脾臓および小腸の内在性大腸菌の菌数を測定した。臓器を１００−ゲージステンレスメッシュを通しながらつぶし、１００ｍｌの細胞浮遊液を作り、それを腸内細菌属用培地（日水製薬）にまき、また小腸内容物は洗って集め、培地中でホモジナイズし、適度に希釈して浮遊液を作り、それぞれを３７℃で一晩培養して、翌日プレート上のコロニー数を数えた。
【００４７】
６匹ずつのマウスについて３回実験をくりかえし、その平均値±ＳＤを算出し、その結果を図２に示す。Ａは肝臓、Ｂは脾臓中の細菌数で、白丸はＦＴＳ物質＋５−ＦＵ、黒丸はＦＴＳ物質＋生食水投与のそれぞれの群のマウスの結果である。このように小腸においても歴然としたＦＴＳの効果がわかった。即ち生食水＋５−ＦＵ投与群のコロニー数は１×１０７であるのに対し、ＦＴＳ＋５−ＦＵ投与群のそれはわずか２×１０４であった。ＦＴＳ物質は５−ＦＵにより誘導された内在性細菌の異常増殖を明瞭に抑えることが示された。
【００４８】
実験例３
実験例２同様に６匹ずつ２群のマウスに５−ＦＵ  １５０ｍｇ／ｋｇ投与し、５−ＦＵ投与前２日前から４日目までＦＴＳ物質あるいは生食水を皮下投与し、経日的にマウスを屠殺し、各日の腸管上皮間リンパ球（以下ｉ−ＩＥＬ）、胸腺および脾臓の細胞数を測定した。ｉ−ＩＥＬはパイエル板を除去してから小腸を開き、１ｃｍ片に切り、各断片を３７℃３０分間、１０％Ｎｕ−血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１ｍＭ  ＤＴＴを添加したＭｅｄｉｕｍ  １９９（Ｇｉｂｃｏ）中でかきまぜた。上皮細胞とリンパ球を含むこの上清を、２２００ｒｐｍ、２０分間、室温で、４５．０／６６．６％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）グラジエント中で遠沈し、細胞を集め洗って、細胞数を数えた。
【００４９】
脾臓細胞はＨＢＳＳの中で１００−ゲージステンレスメッシュでつぶしながら、浮遊液として集めた。胸腺細胞はスライドグラスでつぶしながら浮遊液として集めた。それぞれの生細胞数をトリパンブルー染色で計数した。３回実験を繰り返し、その平均値±ＳＤを算出した。結果を図３に示す。Ａはｉ−ＩＥＬ、Ｂは胸腺、Ｃは牌臓の細胞数を示す。白丸はＦＴＳ物質＋５−ＦＵ、黒丸は生食水＋５−ＦＵを示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔで有意差検定を行い、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．００１で白丸と黒丸との間に有意差があることを示す。
【００５０】胸腺細胞は３日目に両群とも急激な減少が見られたが、ＦＴＳ物質投与群は１０日目に急速に正常値に回復した。一方生食水投与群は激減したままであった。ｉ−ＩＥＬの細胞数は両群ともに６日目まで減少し、１０日目までに回復していったが、ＦＴＳ物質投与群は生食群に比べ、その速度が速かった。ＦＴＳ物質投与はｉ−ＩＥＬ細胞数の減少をよく抑え、胸腺細胞が回復するよりも早い時期に正常値に回復させた。脾臓細胞についてはＦＴＳ物質投与群の方が多い傾向があったが、３日目以外は有意差はなかった。
【００５１】
実験例４
実験例３と同様にマウスを処置し、ｉ−ＩＥＬのｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎの個々の細胞数を経日的にフローサイトメトリーで解析し、細胞数を算出した。ｉ−ＩＥＬはＦＩＴＣ−抗ＣＤ３ｍＡｂ、ＰＥ−ＣＤ４ｍＡｂおよびビオチン−抗ＣＤ８αｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳｃａｎで解析した。各群６匹ずつ、３回実験を繰り返し、平均値±ＳＤを算出した。ＡはＣＤ４−ＣＤ８＋、ＢはＣＤ４＋ＣＤ８−、ＣはＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＤはＣＤ４−ＣＤ８−であり、白丸はＦＴＳ物質＋５ＦＵ、黒丸は生食水＋５ＦＵである。＊はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。ＤのＣＤ４−ＣＤ８−はＡのＣＤ４−ＣＤ８＋の前駆細胞である。
【００５２】
実験例５
実験例３、４と同様にマウスを処置し、ＣＤ４−ＣＤ８＋ｉ−ＩＥＬの２つのｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、すなわちＣＤ８ααホモダイマー、あるいはＣＤ８αとβのヘテロダイマーのうちどちらのＣＤ８＋ｉ−ＩＥＬのｐｏｐｕｌａｔｉｏｎをＦＴＳ物質投与が選択的に回復させるかを５−ＦＵ投与後８日目に調べた。各群６匹ずつ、３回実験を繰り返し、その平均値±ＳＤを算出し、図５に示す。ＡはＣＤ８αα、ＢはＣＤ８αβ、黒の棒線は生食水＋５−ＦＵ、斜線の棒線はＦＴＳ物質＋５−ＦＵを示す。ｉ−ＩＥＬはＰＥ−抗ＣＤ８αｍＡｂおよびビオチン−ＣＤ８βｍＡｂで染色し、ＦＡＣＳｃａｎで解析し、細胞数を算出した。５−ＦＵ投与後８日目にＣＤ８αα＋ｉ−ＩＥＬの細胞数は激減したのに対し、ＦＴＳ投与群では大した減少は見られなかった。一方、ＣＤ８αβ＋ｉ−ＩＥＬは５−ＦＵ投与およびＦＴＳ物質投与によって影響を受けなかった。これらの結果はＦＴＳがＣＤ４−ＣＤ８−ｉ−ＩＥＬのＣＤ４−ＣＤ８αα＋ｉ−ＩＥＬへの分化を選択的に加速しうることを示すものである。
【００５３】
実験例６  毒性試験
ｄｄｙ系５週令雄性マウス１群５匹に、ＦＴＳ５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇをそれぞれ連日１４日間、皮下投与したが、何ら毒性は見られなかった。
【００５４】
実験例７  毒性試験
５週令のウイスターラット１群１０匹に、ＦＴＳ３０ｍｇ／ｋｇを連日２１日間、皮下投与したが、何ら毒性は見られなかった。
以上の結果はＦＴＳ物質が、消化器系感染症や炎症性腸疾患などの予防、治療に有効で、有用な薬剤であることを示すものである。本発明に係る薬剤は、上記のように直接的に、あるいは間接的に種々の作用を通して生体防御系を活性化して、上記のような消化器系の各種障害や疾患に対し優れた予防、治療効果をもたらす点で画期的なものである。また、本発明において使用するノナペプチドは動物由来のペプチドであり天然物質であるので、類似のアミノ酸配列を持つ他のＦＴＳ類縁体と異なり、生体においても全く無害であり、抗原性、アナフラキシーショックなどの問題も存在せず、安全性の点で問題は全く存在しない。
【図面の簡単な説明】
【図１】    ５−ＦＵ投与マウスにおけるＦＴＳ投与による生存率の飛躍的増大を示す図。
【図２】    ５−ＦＵ投与マウスにおけるＦＴＳ投与による内臓の細菌の異常増殖の抑制を示す図。
【図３】    ｉ−ＩＥＬ、胸腺および脾臓の細胞数の経日変化を示す図。
【図４】    ｉ−ＩＥＬのｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎの細胞数の経日変化を示す図。
【図５】    ＣＤ８ααあるいはＣＤ８αβｉ−ＩＥＬの細胞数の経日変化を示す図。
【図１】
0003728515.tif 000002
【図２】
0003728515.tif 000003
【図３】
0003728515.tif 000004
【図４】
0003728515.tif 000005
【図５】
0003728515.tif 000006