(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の核酸のDRβ  DNA型を決定するための方法において、
（ａ）DRβ遺伝子第二エクソンを含有するサンプル中の任意の核酸をプライマー対GH46（SEQ ID NO:67）およびGH50（SEQ ID NO:68）を用いて増幅し、
（ｂ）工程（ａ）で増幅された上記核酸を第一のパネルのオリゴヌクレオチドプローブと、これらのプローブが10ヌクレオチド長を越える正確に相補性の配列とのみハイブリダイズするような条件下にハイブリダイズさせ、
（ｃ）DRβ遺伝子第二エクソンの配列を含有するサンプル中の核酸の特異的サブセットをプライマー対GH46（SEQ ID NO:67）およびCRX37（SEQ ID NO:73）またはGH46（SEQ ID NO:67）およびDRB30（SEQ ID NO:107）を用いて増幅し、
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された上記核酸を第二のパネルのオリゴヌクレオチドプローブとこれらのプローブが10ヌクレオチド長を越える正確に相補性の配列とのみハイブリダイズするような条件下にハイブリダイズさせ、ついで
（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）におけるプローブハイブリダイゼーションのパターンからサンプル中のDRβ  DNAの由来するDRβ対立遺伝子を決定する、
工程からなる方法。
【請求項２】
工程（ａ）および（ｃ）の増幅は、一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドプローブの第一のパネルは、プローブCRX60（SEQ ID NO:79）,GH105（SEQ ID NO:91）,GH104（SEQ ID NO:90）,GH59（SEQ ID NO:57）,CRX06（SEQ ID NO:61）,GH122（SEQ IN NO:93）,CRX23（SEQ IN NO:66）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX49（SEQ ID NO:74）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH111（SEQ ID NO:92）,CRX34（SEQ ID NO:70）,CRX04（SEQ ID NO:60）,GH56（SEQ ID NO:86）,CRX68（SEQ ID NO:84），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる群から選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブの第二のパネルは、プローブGH125（SEQ ID NO:94）,CRX50（SEQ ID NO:68）,CRX53（SEQ ID NO:76）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX61（SEQ ID NO:80）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX56（SEQ ID NO:77）,CRX57（SEQ ID NO:78），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる群より選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において用いられるプライマーはGH46（SEQ ID NO:67）およびGH50（SEQ ID NO:68）であり、工程（ｃ）において用いられるプライマーはGH46およびCRX37（SEQ ID NO:73）であり、オリゴヌクレオチドプローブの第一のパネルはプローブCRX60（SEQ ID NO:79）,GH105（SEQ ID NO:91）,GH104（SEQ ID NO:90）,GH59（SEQ ID NO:57）,CRX06（SEQ ID NO:61）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX35（SEQ ID NO:71）,SRX49（SEQ ID NO:74）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH111（SEQ ID NO:92）,CRX34（SEQ ID NO:70）,CRX04（SEQ ID NO:60）,GH56（SEQ ID NO:86）,CRX68（SEQ ID NO:84），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなり、オリゴヌクレオチドプローブの第二のパネルは、プローブGH125（SEQ ID NO:94）,CRX50（SEQ ID NO:68）,CRX53（SEQ ID NO:76）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX61（SEQ ID NO:80）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX56（SEQ ID NO:77）,CRX57（SEQ ID NO:78），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
第一のパネルのプローブは、プローブDRB01（SEQ ID NO:79）,GH104（SEQ ID NO:90）,DRB46（SEQ ID NO:123）,DRB48（SEQ ID NO:125）,DRB207（SEQ ID NO:283）,GH102（SEQ ID NO:89）,DRB209（SEQ ID NO:285）,DRB20（SEQ ID NO:98）,DRB102（SEQ ID NO:178）,DRB112（SEQ ID NO:188）,DRB07（SEQ ID NO:84），およびDRB42（SEQ ID NO:119）からなる群より選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第二のパネルのプローブは、プローブDRB223（SEQ ID NO:299）,DRB37（SEQ ID NO:144）,DRB203（SEQ ID NO:279）,DRB163（SEQ ID NO:239）,DRB118（SEQ ID NO:194）,DRB02（SEQ ID NO:61）,DRB38（SEQ ID NO:115）,DRB222（SEQ ID NO:298）,DRB232（SEQ ID NO:308）,DRB136（SEQ ID NO:212）,DRB198（SEQ ID NO:274），およびDRB42（SEQ ID NO:119）からなる群より選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）において用いられるプライマーは、ビオチン化GH46（SEQ ID NO:67）およびビオチン化GH50（SEQ ID NO:68）であり、工程（ｃ）において用いられるプライマーはビオチン化GH46（SEQ ID NO:67）およびCRX37（SEQ ID NO:73）であり、オリゴヌクレオチドプローブの第一のパネルはプローブDRB01（SEQ ID NO:79）,GH104（SEQ ID NO:90）,DRB46（SEQ ID NO:123）,DRB48（SEQ ID NO:125）,DRB207（SEQ ID NO:283）,GH102（SEQ ID NO:89）,DRB209（SEQ ID NO:285）,DRB20（SEQ ID NO:98）,DRB102（SEQ ID NO:178）,DRB112（SEQ ID NO:188）,DRB07（SEQ ID NO:84），およびDRB42（SEQ ID NO:119）からなり、オリゴヌクレオチドプローブの第二のパネルはプローブDRB223（SEQ ID NO:229）,DRB37（SEQ ID NO:144）,DRB203（SEQ ID NO:279）,DRB163（SEQ ID NO:239）,DRB118（SEQ ID NO:194）,DRB02（SEQ ID NO:61）,DRB38（SEQ ID NO:115）,DRB222（SEQ ID NO:298）,DRB232（SEQ ID NO:308）,DRB136（SEQ ID NO:212）,DRB198（SEQ ID NO:274），およびDRB42（SEQ ID NO:119）からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第二のプローブのパネルは第三のプローブのパネルから選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなり、第三のパネルはパネルGH104（SEQ ID NO:90）,DRB63（SEQ ID NO:140）,DRB113（SEQ ID NO:189）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77）,DRB196（SEQ ID NO:272）,DRB197（SEQ ID NO:273）,DRB215（SEQ ID NO:291），およびDRB216（SEQ ID NO:292）;CRX50（SEQ ID NO:75）,GH125（SEQ ID NO:94）,DRB180（SEQ ID NO:256）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX68（SEQ ID NO:84）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77），およびGH56（SEQ ID NO:86）;CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX64（SEQ ID NO:83）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77）,GH59（SEQ ID NO:87），およびCRX33（SEQ ID NO:69）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX57（SEQ ID NO:78）,DRB181（SEQ ID NO:257）,CRX56（SEQ ID NO:77）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX35（SEQ ID NO:71）からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）において用いられるプライマーはGH46（SEQ ID NO:67）およびGH50（SEQ ID NO:68）であり、工程（ｃ）において用いられるプライマーは、GH46（SEQ ID NO:67）およびCRX37（SEQ ID NO:73）であり、オリゴヌクレオチドプローブの第一のパネルはプローブCRX33（SEQ ID NO:69）,GH104（SEQ ID NO:90）,GH56（SEQ ID NO:86）,GH59（SEQ ID NO:87）,CRX49（SEQ ID NO:74）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH111（SEQ ID NO:92）,CRX34（SEQ ID NO:70）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX68（SEQ ID NO:84），およびCRX62（SEQ ID NO:81）からなる群より選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなり、第二のプローブのパネルは第三のプローブのパネルから選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなり、第三のパネルはパネルGH104（SEQ ID NO:90）,DRB63（SEQ ID NO:140）,DRB113（SEQ ID NO:189）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77）,DRB196（SEQ ID NO:272）,DRB197（SEQ ID NO:273）,DRB215（SEQ ID NO:291），およびDRB216（SEQ ID NO:292）;CRX50（SEQ ID NO:75）,GH125（SEQ ID NO:94）,DRB180（SEQ ID NO:256）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX68（SEQ ID NO:84）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77），およびGH56（SEQ ID NO:86）;CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX64（SEQ ID NO:83）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77）,GH59（SEQ ID NO:87），およびCRX33（SEQ ID NO:69）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX57（SEQ ID NO:78）,DRB181（SEQ ID NO:257）,CRX56（SEQ ID NO:77）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX35（SEQ ID NO:71）からなる群より選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において用いられるプライマーはGH46（SEQ ID NO:67）およびGH50（SEQ ID NO:68）であり、工程（ｃ）において用いられるプライマーは、GH46（SEQ ID NO:67）およびCRX37（SEQ ID NO:73）であり、オリゴヌクレオチドプローブの第一のパネルはプローブCRX33（SEQ ID NO:69）,GH104（SEQ ID NO:90）,GH56（SEQ ID NO:86）,GH59（SEQ ID NO:87）,CRX49（SEQ ID NO:74）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH111（SEQ ID NO:92）,CRX34（SEQ ID NO:70）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX68（SEQ ID NO:84），およびCRX62（SEQ ID NO:81）からなり、第二のパネルはパネルGH104（SEQ ID NO:90）,DRB63（SEQ ID NO:140）,DRB113（SEQ ID NO:189）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77）,DRB196（SEQ ID NO:272）,DRB197（SEQ ID NO:273）,DRB215（SEQ ID NO:291），およびDRB216（SEQ ID NO:292）;CRX50（SEQ ID NO:75）,GH125（SEQ ID NO:94）,DRB180（SEQ ID NO:256）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX68（SEQ ID NO:84）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77），およびGH56（SEQ ID NO:86）;CRX61（SEQ ID NO:80）,CRX64（SEQ ID NO:83）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX57（SEQ ID NO:78）,CRX56（SEQ ID NO:77）,GH59（SEQ ID NO:87），およびCRX33（SEQ ID NO:69）,CRX04（SEQ ID NO:60）,CRX06（SEQ ID NO:61）,CRX57（SEQ ID NO:78）,DRB181（SEQ ID NO:257）,CRX56（SEQ ID NO:77）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX35（SEQ ID NO:71）からなる群より選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドプローブの第一および第二のパネルは固定支持体に固定し、各プローブは上記支持体上の分離した別個の位置に配置させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）において用いられるプライマーGH46（SEQ ID NO:67）およびGH50（SEQ ID NO:68）と、工程（ｃ）において用いられるプライマーGH46（SEQ ID NO:67）およびCRX37（SEQ ID NO:73）、またはGH46（SEQ ID NO:67）およびDRB30（SEQ ID NO:107）と、オリゴヌクレオチドプローブの第一および第二のパネルを含む、請求項２に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１４】
プライマーGH46（SEQ ID NO:67）、GH50（SEQ ID NO:68）、およびCRX37（SEQ ID NO:73）、プローブCRX60（SEQ ID NO:79）,GH105（SEQ ID NO:91）,GH104（SEQ ID NO:90）,GH59（SEQ ID NO:57）,CRX06（SEQ ID NO:61）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX49（SEQ ID NO:74）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH111（SEQ ID NO:92）,CRX34（SEQ ID NO:70）,CRX04（SEQ ID NO:60）,GH56（SEQ ID NO:86）,CRX68（SEQ ID NO:84），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる群より選ばれる２種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにプローブGH125（SEQ ID NO:94）,CRX50（SEQ ID NO:68）,CRX53（SEQ ID NO:76）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX61（SEQ ID NO:80）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX56（SEQ ID NO:77）,CRX57（SEQ ID NO:78），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる群より選ばれる２種またはそれ以上のプローブからなる、請求項13に記載のキット。
【請求項１５】
プライマーGH46（SEQ ID NO:67）,GH50（SEQ ID NO:68），およびCRX37（SEQ ID NO:73），プローブCRX60（SEQ ID NO:79）,GH105（SEQ ID NO:91）,GH104（SEQ ID NO:90）,GH59（SEQ ID NO:57）,CRX06（SEQ ID NO:61）,GH122（SEQ ID NO:93）,CRX23（SEQ ID NO:66）,CRX35（SEQ ID NO:71）,CRX49（SEQ ID NO:74）,GH102（SEQ ID NO:89）,GH111（SEQ ID NO:92）,CRX34（SEQ ID NO:70）,CRX04（SEQ ID NO:60）,GH56（SEQ ID NO:86）,CRX68（SEQ ID NO:84），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる第一のパネルのオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにプローブGH125（SEQ ID NO:94）,CRX50（SEQ ID NO:68）,CRX53（SEQ ID NO:76）,CRX15（SEQ ID NO:64）,CRX62（SEQ ID NO:81）,CRX63（SEQ ID NO:82）,CRX61（SEQ ID NO:80）,GH54（SEQ ID NO:85）,CRX56（SEQ ID NO:77）,CRX57（SEQ ID NO:78），およびCRX12（SEQ ID NO:63）からなる第二のパネルのオリゴヌクレオチドプローブからなる、請求項14に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
本出願は、1986年３月13日出願の現在は放棄された一連番号第839,331号の一部継続出願である、1986年８月22日出願の現在は放棄された一連番号第899,344号の一部継続出願である、1989年８月15日出願、係属中の一連番号第491,210号の一部継続出願である、1990年12月６日出願、係属中の一連番号第623,098号の一部継続出願であり、上記各出願は参考として本明細書に導入される。
発明の背景
発明の分野
本発明は、HLA DRβ（DRB）核酸のDNAタイピングのための方法および試薬に関する。本発明は、RNAまたはcDNA鋳型からなるサンプルを含めた各種起源のホモ接合またはヘテロ接合サンプルのタイピング、および現在の血清学的、細胞学的、もしくは生化学的方法では識別できない対立変異体の検出を可能にする。本発明のタイピング系は、移植組織のタイピング、個体の同一性の決定、および疾患に罹患しやすい個体の同定を容易にする。したがって、本発明は、一般的に医学の分野、とくに医学的研究および診断の領域、法科学の分野、ならびに分子生物学の分野に応用される。
関連技術の説明
HLAクラスII蛋白質HLA DR,HLA DQ,およびHLA DPは、ヒト染色体６の短腕上の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の遺伝子によってコードされている。クラスII蛋白質は、約34kDα鎖および約29kDβ鎖からなるヘテロダイマー糖蛋白質である。クラスII蛋白質は、マクロファージ、Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞、および他の細胞タイプの表面上に発現し、抗原の結合およびヘルパーＴリンパ球への提供に関与する（Giles ＆ Capra:Structure,functuon,and genetics of the Human Class II molecules.Adv.Immunol.37:1,1985参照）。さらに、クラスII蛋白質は、成熟Ｔリンパ球に発現したＴ細胞受容体のレパートリーを決定することにより、特異的免疫応答に影響する。HLAクラスII遺伝子および蛋白質の一般的な総説には、Trowsdaleら:"Structure,sequence and polymorphism in the HLA D region",Immunol.Rev.85:5（1985）がある。
クラスIIαおよびβ鎖は別の遺伝子によってコードされ、DP,DQ,およびDR遺伝子はそのMHCの別の領域に位置する。DR領域では、単一のDRA遺伝子座、または遺伝子は非多形DRα鎖をコードするが、DRB1,DRB2（DRB6ともいわれる）,DRB3,DRB4,およびDRB5と命名された５つの異なるDRB遺伝子座が多形DRβ鎖をコードする。一部の遺伝子座はある種のハロタイプ上にのみ存在し（たとえばDR2ハロタイプ上DRB5）、さらに発現されるDRB遺伝子の数もハロタイプ間で変動する（Bohmeら:HLA−DRbeta genes vary in number between different DR−specificities,whereas the number of DQbeta genes is constant.J.Immunol.135:2149,1985参照）。
同定された明らかに異なるDRB1対立遺伝子の数は増加を続けている。HLA系因子についてのWHO命名委員会からの1989年報告では、34の明らかに異なるDRB1対立遺伝子が同定された。これらの対立遺伝子によって、血清学的DR特異性DR1〜DRw18が現れるものと考えられている（WHO命名委員会による"Nomenclature for factors of the HLA system,1989"と題する文献,Immunogenetics 31:131−140,1990参照。参考として本明細書に導入する）。1990年の報告までに、認識されたDRB1対立遺伝子の数は45にまで上った（WHO命名委員会による"Nomenclature for factors of the HLA system,1990"と題する文献,Immunogenetics 33:301−309,1991参照。参考として本明細書に導入する）。本発明は、数種の新たに発見された対立遺伝子の配列を提供するものである。
DRB2遺伝子座（現在はDRB2遺伝子座と呼ばれる）の対立遺伝子は、DR1,DR2,およびDRw10ハロタイプ上に存在し、見掛け上発現されない（Erlichら:Analysis of isotypic and allotypic sequence variation in the HLA DRB region using the in vitro enzymatic amplification of specific DNA segments."Immunology of HLA",Dupont編、Springer−Verlag,New York,1991年刊参照）。
DRB3遺伝子座の対立遺伝子は、スーパータイプ特異性DRw52（DRw52a,DRw52b,およびDRw52c）をコードし、DR3,DRW6,DRW11,DRW12,DRW13,DRW14,DRW17,ならびにDRw18ハロタイプ上に存在する。
単一対立遺伝子を有するDRB4遺伝子座はDRw53スーパータイプ特異性をコードし、DR4,DR7,およびDRw9ハロタイプ上にのみ存在する［Matsuyamaら:Structural relationships between the DRbeta1 and DRbeta2 subunits in DR4,7,and w9 halotypes and the DRw53（MT3）specificity.J.Immunol.137:934,1986参照］。
DRB5遺伝子座の対立遺伝子はDR2ハロタイプ上にのみ存在する（Analysis of isotypic and allotypic sequence variation in the HLA DRB region using the in vitro enzymatic amplification of specific DNA segments,前出）。
クラスII DR抗原（蛋白質）の多形は現在、経産婦から得られたアロ血清を用い、精製Ｂリンパ球上微量細胞傷害試験で分類されている。また、さらに細かい特異性によるタイピングを可能にし、アロ反応性Ｔ細胞クローンの特異性、またはＴ細胞培養体のホモ接合タイピング細胞（HTC）による刺激に対する増殖応答に基づく、細胞タイピングプロトコールが開発されている。
これらの細胞ベースの分析では、さらに血清学的に定義される多くの抗原、たとえばDR4の５つのDWサブタイプに細分類されるDw特異性が定義される（Cairnsら:Sequence polymorphism of HLA DRβ I alleles relating to T cell recognized determinants.Nature 317:166,1985参照）。しかしながら、血清学的および細胞性いずれのアッセイ操作も困難で、時間がかかる。制限フラグメント長多形（RFLP）に基づくDNAタイピングプロコトールも発表されている（米国特許第4,582,788号参照、この記載は参考として本明細書に導入する）。しかしながら、これらのRFLPに基づく分析は大量の高分子量DNAを必要とし、集中的な労力を要し、一方、有益な制限酵素の数が限られているので、得られる結果に限界がある。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の出現は、複雑なゲノムDNAの分析および操作を容易にした。PCR法は、核酸のきわめて複雑な混合物に出発して、特異的な核酸の増幅を可能にし、米国特許第4,683,195号、4,683,202号、4,889,818号、および4,965,188号、ならびに欧州特許公告第237,362号に詳細に記載されている。これらの記載は参考として本明細書に導入する。
PCR法はまた、個体のクラスII HLA DNAのタイピングを容易にする。科学者らは、オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、これらのプライマーを興味のある配列の増幅に用いることにより、ゲノムDNAにおけるDRB遺伝子座の多形の第二エクソンを検討してきた（Scharfら:Hum.Immunol.,22:61,1988の"Sequence analysis of the HLA DRB and HLA DQB loci from three Pemphigus vulgaris patients"と題する論文参照）。
PCRプライマーが制限酵素認識配列を含有する場合は、増幅されたDNAはシーケンシングベクターに直接クローン化することが可能で、増幅生成物のヌクレオチド配列を容易に決定できる（Scharfら:Hum.Immunol.,233:1076,1986における"Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequence"と題する論文参照）。
増幅DNAはまた、配列特異的オリゴヌクレオチド（SSO）プローブを使用する検出方法によっても検討できる（Sakiら:Nature 324:16,1986による"Analysis of enzymatically amplified beta−globin and HLA DQalpha DNA with allele−specific oligonucleotide probes"と題する論文参照）。
これらの進歩にもかかわらず、HLA DRβ遺伝子の複雑さにより、個体のHLA DRβ DNAタイプを決定するための有益かつ効率的な手段の開発は妨げられてきた。本発明は、効率的かつ有益なDRβ DNAタイピング法の要求に合致する新規な方法および試薬を提供するものである。一方、これらの新規な方法および試薬は、これまで知られていなかったDRβ遺伝子座の発見をもたらし、さらにこれらの遺伝子座は本発明の方法によって分類、同定することができる。
本発明のタイピングシステムは、mRNAから合成されたcDNAのタイピング、ならびに組織、トランスジェニックシステム、病的状態および細胞系におけるDRB遺伝子の発現のタイピングおよび研究に使用できる。DR抗原を発現しないか、または異常な血清活性を示す細胞、たとえば腫瘍細胞も、容易にタイピングできる。しかも、異常な起源のサンプル、たとえば古代のDNAや法科学サンプルで、EDAが分解していたり、きわめて微量しか分析に使用できなくても、型の判定が可能である。
PCRは標的DNAのフラグメントを百万倍にも増幅できるので、また本発明のシステムはPCR発生核酸を使用するので、放射標識プローブを使用する必要がなく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に共有結合させた非同位元素SSOで十分な検出感度が得られる。本発明の特異的に結合したHRP標識プローブの存在は、発色性染料または化学発光性基質による単純なドットブロットフォーマットにより、分単位の速度で、検出できる。
発明の要約
本発明は、増幅および検出方法、一般的および対立遺伝子または群特異的増幅プライマー、DRB1遺伝子座における未知の対立遺伝子の同定のためのプローブを含めた非同位元素配列特異的オリゴヌクレオチド（SSO）プローブ、ならびに血清学的方法では識別できない対立遺伝子を含めてHLA DRB対立遺伝子のタイピングのための迅速、単純かつ正確な系を同時に与える方法を実施するキットを提供する。
本発明の一態様は、サンプル中の核酸のDRβ DNA型を決定するための方法において、（ａ）DRβ遺伝子第二エクソンを含有するサンプル中の任意の核酸を増幅し、（ｂ）工程（ａ）で増幅された上記核酸を第一のパネルのオリゴヌクレオチドプローブと、これらのプローブが10ヌクレオチド長を越える正確に相補性の配列とのみハイブリダイズするような条件下にハイブリダイズさせ、（ｃ）DRβ遺伝子第二エクソンの配列を含有するサンプル中の特異的サブセットの核酸を増幅し、（ｄ）工程（ｃ）で増幅された上記核酸を第二のパネルのオリゴヌクレオチドプローブとこれらのプローブが10ヌクレオチド長を越える正確に相補性の配列とのみハイブリダイズするような条件下にハイブリダイズさせ、ついで（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）におけるプローブハイブリダイゼーションのパターンからサンプル中のDRβ DNAの由来するDRβ対立遺伝子を決定する工程からなる方法を提供する。
他の態様として、本発明はサンプルが、DR1,DR2,DR4,DR7,DRw9,およびDRw10型からなる群より選ばれる血清学的タイプのDRB1対立遺伝子の核酸を含有するか否かを決定する方法において、（ａ）サンプル中のDRB1核酸を増幅し、ついで（ｂ）工程（ａ）で増幅された上記核酸をオリゴヌクレオチドプローブのパネルとこれらのプローブが10ヌクレオチド長を越える正確に相補性の配列とのみハイブリダイズするような条件下にハイブリダイズさせ、この場合これらのプローブはDRB1第二エクソンのアミノ酸残基９〜16をコードする独特の多形配列にハイブリダイズする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、DRB一般的およびDRB1特異的増幅および検出（例２参照）の結果を示す図であり、
図２は、DRB1特異的増幅および検出（例２参照）の結果を示す図であり、
図３は、古典的血清型DR1〜DR10のHLA DRB DNAタイピング（例３参照）の結果を示す図であり、
図４は、DR4血清学的特異性で細胞系をサブタイプに分類するためのHLA DRB DNAタイピング（例５参照）の結果を示す図であり、
図５は、DR3,DR5,DRw6,およびDRw8の特異性をサブタイプに分類するためのHLA DRB DNAタイピング（例６参照）の結果を示す図であり、
図６は、DRB型を決定するためのプローブハイブリダイゼーションの結果（例６参照）を表化したものであり、
図７は、多数の異なる細胞系のHLA DRB DNAタイピング（例６および７参照）の結果を示す図であり、
図８は、DR3細胞系のHLA DRB DNAサブタイピング（例７参照）を示す図であり、
図９は、ヘテロ接合および他の異常なサンプルのHLA DRB DNA型を決定するためのプローブハイブリダイゼーションの結果（例７参照）を表化したものであり、
図10は、HLA DRB DNA型を決定するためのプローブハイブリダイゼーションの結果（例９参照）を表化したものであり、
図11、12および13は、DRB対立遺伝子型を決定するためのプローブハイブリダイゼーションの結果（例９参照）を表化したものである。
発明の詳細な説明
本発明は、HLA DRB型判定システム、およびDRB対立遺伝子を分析するための配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（SSO）を提供する。本発明は、cDNA鋳型を包含する各種起源からのヘテロ接合サンプルのタイピングに使用でき、また血清学的方法では識別できない対立遺伝子変異体の検出に使用できる。このタイピングシステムは、実行が単純で迅速なドットブロットフォーマットを利用でき、検出可能なシグナルを分単位の速度でで生成させることができ、組織のタイピングならびに固体の同一性および疾患への罹患しやすさの決定に価値が認められる。
本発明は、HLA DRB対立遺伝子の検出および同定の方法を提供する。認識された明らかに異なるDRB1対立遺伝子の数は増加を続けている。WHO命名委員会からの1989年報告には、34のDRB1対立遺伝子を掲げられており、この対立遺伝子セットは、本明細書においては、以下1989対立遺伝子セットと呼ぶ。1990年のWHO命名委員会からの報告には45の対立遺伝子が掲げられ、この対立遺伝子セットは以下1990対立遺伝子セットと呼ぶことにする。本発明は、さらに７個の新たに発見された対立遺伝子の配列を提供する。
HLAクラスII遺伝子座で最も高度な多形を示すDRB遺伝子座の多様性、および集団中でのこれらの遺伝子座における多数の対立遺伝子により、サンプル中の核酸が由来する特定のDRB遺伝子座および対立遺伝子の同定を困難にしている。本発明は、この決定を高い特異性をもって実施し、そのサンプルが採取された特定の個体の同定を可能にする。さらに、この識別力は、本発明の法科学分野における応用を可能にするものである。
PCR（または他の増幅方法）をきわめて少量のDNA（または分解DNA）の増幅に使用することができので、本発明は、異常な起源、たとえば口内綿棒、一本の毛、また保存された古代の標本のDNAのようなサンプルからのHLA DRB DNAの型の判定に使用できる。古代標本サンプルの場合には、有史以前起源のたとえば初期原人の対立遺伝子の分析が可能である。
本発明の方法は、DRB遺伝子を発現しない細胞のDRB DNA型の決定に使用できる。しかしながら、この方法はまた、DRB mRNAから合成されたcDNAのDRB DNA型の決定にも適している。この方法は、様々な細胞系または組織におけるHLA DRBの発現の研究を容易にし、HLA DRB発現と形質転換、自己免疫、または他の健康状態に対する感受性との間に関連があるかどうかの決定に使用できる。
本発明の研究への利用可能性としては、直接的な臨床応用が明白である。MHCの遺伝子および遺伝子産物は個体の免疫学的状態に中心的役割を果たし、特定のMHC遺伝子産物が疾患の抵抗性および感受性に関連している。本発明は、サンプル中のMHC DRB遺伝子産物の測定を可能にし、本発明はまた、医学とくに医学的診断方法の分野に応用できる。
このシステムの識別力は、拒絶または移植片対宿主病の危険を最小限にするために極めて性格なHLA DRBマッチングが必須と思われる移植ドナーの型の判定に有用である（Pojjackら:J.Clin.Immunol.3:341,1983における"Mixed lymphocyte reactions for individuals with phenotypic identity for specific HLAB,DR determinants:The role of linkage disequilibrium and of specific DR and other Class II determinants"と題する論文参照）。疾患感受性に関する研究では、DRB対立遺伝子における単一のヌクレオチドの相違が医学的に重要であることが示されている（Scharfら,"Specific HLA−DQB and HLA−DRB1 alleles confer susceptibility to Pemphigus vulgaris".Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:215,1989ならびにNepomら,"Identification of HLA−Dw14 genes in DR4＋ Rheumatoid Arthritis".Lancet,1002頁,1986参照）。
上述の利益に加えて、本発明はまた、以前には知られていなかったDR対立遺伝子を同定する方法、および関連プライマー、プローブ、ならびにDRB対立遺伝子の同定方法を提供する。このタイピングシステムを使用する異常パターンのSSOプローブハイブリダイゼーションでは、"Beguit"細胞系のDNAタイピングによって例示されるように（例７参照）、新しい対立遺伝子が同定される。この細胞系はDRB1遺伝子座において異常パターンのプローブハイブリダイゼーションを示し、現在はDRB1＊1103［配列同定番号（SEQ ID NO）:27］と命名された、以前には報告されていなかった配列が明らかにされた。
同様にして、ライム病の患者のDRB1対立遺伝子の本発明の分析で、新しいパターンのプローブハイブリダイゼーションが明らかにされた。DRB1対立遺伝子配列は患者のゲノムDNAからクローン化され、配列が決定された。患者のDRB1対立遺伝子の配列は、これまでに報告されているDRB1対立遺伝子とは異なり、新たに、DR′LY10′（また、DRB1＊LY10）と命名された。その患者における他の対立遺伝子はDRB1＊0402であった。DR′LY10′対立遺伝子は、５′−末端に、DRB1＊0801,＊0802,＊0803,および＊1201に、そして３′−末端に、＊1401に類似の配列の領域を有する。本発明は、DR′LY10′対立遺伝子を他のDRB対立遺伝子から識別するためのプローブを提供する。DR′LY10′対立遺伝子は、現在はDRB1＊1404（SEQ ID NO:40）と命名されている。
他の新たに発見されたDRB1遺伝子座のDRB1対立遺伝子は、最初はDR′PEV′と命名されたDRB1＊1305（SEQ ID NO:36）,DRB1＊1303（SEQ ID NO:34），および最初はDRB1＊BUGSと命名されたDRB1＊1105（SEQ ID NO:29）である。いずれも、本発明の方法による分析が新たなパターンのプローブハイブリダイゼーションを明らかにした場合に発見された。ついで各対立遺伝子を配列分析を行ったところ、新規なハイブリダイゼーションパターンを生じる配列変異が明らかにされた。本発明は、新たに発見された対立遺伝子を他のDRB対立遺伝子から識別するためのプライマーおよびプローブを提供する。
本発明はまた、本発明のDRBタイピング法の実施をより便利にするためのキットを提供する。一種のキットは、増幅およびタイピングの両試薬を包含する。他のキットは、本発明の１種または２種以上のDRBプローブのみを包含する。いずれのキットにおいても、プローブは標識されていてもされていなくても、また固体支持体に結合されていてもよい。プライマーをキット中に入れる場合は、検出を容易にするため、すなわち、シグナル発生試薬の結合または固定化のために標識することができる。キットにはまた、プローブハイブリダイゼーションを容易にするための試薬、すなわち発色性基質TMBおよびストレプトアビジン接合西洋ワサビペルオキシダーゼを含有させることもできる。要約すれば、本発明の方法の実施に有用な試薬は、本発明の利用を促進する任意の配置でパッケージできる。
各対立遺伝子の第二のエクソンのヌクレオチド配列は、コードされるアミノ酸配列とともに、配列掲載部に示す。以下の表１および２には、1989対立遺伝子セットにおける対立遺伝子の相当するヌクレオチド配列情報を、比較が容易な様式で掲げる。表１にはまた、対立遺伝子DRB＊0101の核酸配列、ならびにコードされるアミノ酸配列を三文字および一文字の両コードで示す。同様に、表３には、相当するアミノ酸配列情報を一文字コードを用いて示す。各対立遺伝子の配列同定番号（SEQ ID NO）を以下に示す。DRB1＊1503,DRB1＊0303,およびDRB1＊1105を除き、すべての対立遺伝子は、1990年WHO命名委員会報告（上述、1990対立遺伝子セット）に掲載されている。DRB1＊1503の配列については、Demopolosら:Hum.Immunol.30:41−44,1991も参照されたい。
表１、２および３に掲載されない対立遺伝子のヌクレオチド配列は、配列掲載部のほかに、以下の表９に掲げる。
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以下の表１、２および３では、最近同定された"PEV"および"LY10"対立遺伝子を除いて、すべての配列は、上述の1990年WHO HLA命名委員会報告に掲載されていて、DRB1＊0101ヌクレオチド配列はコンセンサス配列として働く。コンセンサス配列についての推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の上部に一および三文字コードで記載する。配列ホモロジーは横線で指示し、文字は多形塩基を示す。表中のアラインメントの右端に記載した設計SSOプローブおよびプライマーは、四角で囲った配列の領域と同一の配列であるか、またはそれと相補性である。アラインメントの端に２つの名前がある場合は、最左端の名前が最左端の四角に相当し、最右端の名前が最右端の四角に相当する。プローブCRX12は、すべてのDRB対立遺伝子に示された領域にハイブリダイズされる。
A,BおよびＣと命名された３部からなる表１には、DR特異性DR1〜DRw18に相当する35 DRB1対立遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
表２は,DRB2,DRB3,DRB4,およびDRB5遺伝子座の対立遺伝子についてのヌクレオチド配列アラインメントを示す。DRB1対立遺伝子の配列多形の主要領域は、アミノ酸位置９−16,25−34,67−74,および86に局在し、第二のエクソン配列の残部は比較的不変である。
表３には、DRB対立遺伝子によってコードされる推定アミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸配列の分析から、数種の異なる対立遺伝子い見出される特定の多形配列をもつ複雑な、しかし限定されたパターンの多形が明らかにされた。しかしながら、一部の多形配列は各対立遺伝子に独特である。DR1,DR2,DR4,DR7,DRw9,およびDRw10対立遺伝子はそれぞれ、DRB1遺伝子座最初の超可変領域（位置９〜16）に独特の多形配列を有し、これはSSOタイピングによる血清学的DR特異性の決定に使用できる。これに対し、DR3,DRw11,およびDRw6対立遺伝子は、多形エピトープ"YSTS"を共有し、この領域のプローブ単独では識別できないが、各対立遺伝子の他の位置における多形によって識別可能である。同様に、DRw8とDRw12も、この領域では識別できない。
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古典的な血清学的方法で定義されるDRタイプ（DR3およびDR4を除いて）は、一般的DRBプライマーGH46（SEQ ID NO:67）およびGH50（SEQ ID NO:68）で増幅し、増幅生成物を表４に示す第一のパネルのプローブで分析することにより、識別できる。表４に示す対立遺伝子特異性は、1989対立遺伝子セットに関するものである。本発明の目的においては、「一般的プライマー」は、DRB遺伝子第二エクソン配列にハイブリダイズし、DRB遺伝子座の任意の対立遺伝子の増幅に使用することができるPCRプライマーである。増幅生成物がプライマーGH50で発生された場合、GH50のハイブリダイゼーション部位のために、位置86（アミノ酸配列参照）の多形は試験できない。位置86の多形を分析できる生成物を発生に使用できる別のプライマーにDRB151（SEQ ID NO:227）、
0003643375.tif 000009
がある。
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表４に示すプローブをハイブリダイズし、ついで42℃で15分間洗浄する。GH59のみは42℃で20分間洗浄する。SSPE洗浄溶液はすべて、0.1％SDSを含有する。各プローブは５′−末端でHRPに接合させる。
このPCR/SSO DRβタイピングシステムは、血清学的に定義されたDRハプロタイプのサブタイピングに有用である。たとえば、細胞系"KOSE"は血清学的に判定した場合、DRw6にホモ接合であるが、PCR/SSO DRβタイピングから、"KOSE"には２つの異なるDRw6対立遺伝子、DRB1＊1302およびDRB1＊1401があることがわかっている。
DR3またはDRw6であるサンプルは、DRB1特異的プライマーGH46およびCRX37で増幅し、増幅生成物を第二パネルのプローブからのプローブGH125とCRX50で分析して、識別できる。
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表５に示すプローブについて、SSPE洗浄溶液はすべて0.1％SDSを含有する。さらに、ａの記号を付したプローブは、プライマーGH46/CRX37でのDRB1特異的増幅を要求する。CRX154は42℃ではなく50℃でハイブリダイズさせる。各プローブは５′−末端でHRPに接合させる。プローブCRX56およびCRX57はそれぞれ、エピトープ"G"およびエピトープ"V"対立遺伝子とは完全な塩基対を作らない。これらのプローブは、対立遺伝子よりＧ残基が１個少ないからである。CRX56およびCRX57が欠くＧ残基を含むように改良したプローブは本発明の範囲内に包含される。
本発明の目的では、「DRB1特異的」プライマーは、DRB1遺伝子の第二エクソンに隣接するイントロン配列にハイブリダイズし、他のDRB遺伝子にハイブリダイズしない少なくとも１つのプライマーからなるプライマー対である。表６には、DR3ハプロタイプのDRB1およびDRB3イントロンのヌクレオチド配列の、最後の10のコドンから３′下流イントロンの開始前までを示す。CRX37（SEQ ID NO:73）の配列に下線を付す。実線の矢印はプライマーの延長方向を指示する。星印はDRB1およびDRB3イントロン配列の間での配列の相違を示す。３′下流イントロンのセグメントは、配列掲載部に、SEQ ID NO:314（DRB1）およびSEQ ID NO:315（DRB3）として掲げる。イントロンの上流配列は対立遺伝子配列内にある。
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DR3,DR4,およびDRw6ハプロタイプは、DR2,DR7,およびDR9ハプロタイプと、進化論的に異なることものと思われる。これらの対立遺伝子には、プライマーが延長を誘発するにはミスマッチが多すぎるような、イントロン配列に差があると考えられる。DRB1対立遺伝子は遺伝子重複以前に進化で分化してしまったために、すべてのDRハプロタイプからのDRB1遺伝子第二エクソンを増幅させるためのDRB1特異的プライマー配列を見出すことが困難なのかもしれない。
HLA DRB1対立遺伝子は、一般的およびDRB1特異的プライマーで増幅し、必要に応じて両パネル（表４および５）のプローブで分析することにより、より高い特異性で識別できる。表４および５の特異的プローブで識別できない1989対立遺伝子セットの対立遺伝子は、４つのDR2サブタイプ,DRB1＊1501,＊1502,＊1601,および＊1602ならびにDR4サブタイプ,DRB1＊0403,およびDRB1＊0406である。
DRB1特異的PCRプライマーは、DR2,DR7,およびDR9ハプロタイプを除くすべてから、DRB1配列を再現性よく増幅することができる。プライマーCRX37はDR3,DR4,およびDRw6ハプロタイプからのイントロンヌクレオチド配列から設計された（Hornら:Sequence analysis of HLA Class II genes from insulin−dependent diabetic individuals.Hum.Immunol.1:249,1988参照）。
本発明は、DRB1特異的プライマー対GH46/CRX37に加えて、多数の対立遺伝子および群特異的プライマーを提供する。これらのプライマーを以下に示す。AB60の配列については、Toddら:Nature 329:599,1987参照。
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たとえば、DR4特異的増幅はPCRプライマー対AB54/AB60で達成できる（PCRプロフィル:35サイクル:94℃へランプ、94℃で30秒変性、30秒アニーリング、65℃で延長）。DR3,DR5,およびDR6群特異的増幅はPCRプライマー対AB82/AB60で達成できる（35サイクル:96℃へランプ、96℃で30秒変性、30秒アニーリング、65℃で延長）。DR2特異的増幅はPCRプライマー対AB83/AB60で達成できる（35サイクル:96℃へランプ、96℃で30秒変性、30秒アニーリング、70℃で延長）。
特異的対立遺伝子は、本明細書に記載のエピトープ特異的プローブによる群特異的増幅後に検出できる。たとえば、DRB1＊1601は、"F−DR"エピトープ特異的プローブを用い、AB83/AB60プライマー対でDR2特異的増幅後に検出できる。
DR2ハプロタイプの対立遺伝子の検出は困難であるが、それは本発明の群特異的プライマーとタイピング方法により克服される。DR2ハロタイプからのDRB対立遺伝子の一般的プライマー増幅では、DRB1およびDRB5の両遺伝子座が増幅される。血清DRw15およびDRw16サブタイプの決定には、"F"（位置47）エピトープ特異的DNAプローブを使用できたが、"F"は0301,一部のDRw13対立遺伝子，ならびにすべてのDRw11およびDRw12対立遺伝子にも存在し、他の方法によればさらに完全な識別が可能になる。すなわち、エピトープ"I−−A"をコードする配列にハイブリダイズするように設計された群特異的プライマーがDRB1＊1501およびDRB1＊1502対立遺伝子を増幅し、増幅生成物が"WPR"エピトープ特異的DNAプローブとハイブリダイズする。プライマーDRB150（SEQ ID NO:226）
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は、このような対立遺伝子特異的増幅（GH46と）の実施のために設計されたプライマーである。DRB5＊0201およびDRB5＊0202対立遺伝子も群（エピトープ）特異的"I−−A"プライマーで同様に増幅されるが、これらの対立遺伝子はDRB1＊1601およびDRB1＊1602対立遺伝子としか存在しないので、プローブハイブリダイゼーションの結果はエピトープ"QDY"陽性および"WPR"陰性である。
さらに、本明細書に例示したDRB1特異的プライマーはDR2対立遺伝子を増幅しないので、上述のDR2特異的増幅は、同じ反応管中で、DRB1特異的増幅と同時に実施できることに注目すべきである。他の対立遺伝子および群特異的プライマーおよび増幅方法は実施例に記述する。
HLA DRB遺伝子座における著しい対立遺伝子の多様性は、他のクラスIIβ遺伝子の場合と同様に、主として第二エクソンに局在する。一般的に、第二エクソン配列多形のパターンは、特定のDRB遺伝子座において集団に存在する場合には、多様な異なる対立遺伝子に認められる特異的多形セグメントをもつ寄せ集めである。原理的には、このような異なる対立遺伝子間で共通のエピトープには、共通の祖先、遺伝子変換、または収束進化の反映を考えることができた。しかしながら、オリゴヌクレオチドの型判定の目的では、この多形の寄せ集めのパターンは、単一のオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによっては多くの対立遺伝子は同定することができず、パネルのプローブによる独特なハイブリダイゼーションパターンによって同定できることを意味する。
"SSO"と呼ばれる本発明の配列特異的オリゴヌクレオチドプローブは、適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に本発明の方法に使用されると、極めて特異的で、単一のヌクレオチド多形を識別できる。RFLP法で用いられるプローブとは異なり、本発明のSSOは、対立遺伝子が異なるかどうかのみでなく、対立遺伝子がどこでどう異なるかを決定するためにも使用できる。
好ましい実施態様においては、プローブは、表１および２で四角に囲んだ各対立遺伝子のDNA領域と同じ配列またはそれに相補性の配列からなる。たとえば、プローブCRX60はアミノ酸"W−Ｆ−L"をコードするDNAに特異的で、DR1対立遺伝子に独特にハイブリダイズする。プローブCRX49はアミノ酸をコードする"G−YK"に特異的で、DR7対立遺伝子に独特にハイブリダイズする。他の例は表を考慮すれば明白であろう。
DR3,DRw11,およびDRw6を他のDR血清型から識別するためには、単一のプローブ（すなわちGH56）を使用すればよいが、DR3,DRw11,およびDRw6の間での識別には付加的なプローブが必要である。DRw11DをDR3およびDRw6から識別するためには、DRw11上の"YSTS"および"E"エピトープ（コドン10〜13および58）をコードするDNAにハイブリダイズするGH56＋CH122プローブの組み合わせが使用できる。同様に、DRw6（DRB1＊1301およびDRB1＊1302,ただしエピトープ"I−−DKを有するが、なおDRw6であるDRB1＊1303は含まない）をDRw11およびDR3から識別するためには、"YSTS"および"I−DE"（コドン67〜71）エピトープに相当するプローブの組み合わせGH56＋1CRX06が使用できる。
大部分の血清DR型を決定するために使用される、表４記載のSSOプローブの組み合わせを、表７に示す。
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DR血清型（表４）をさらに細分類するためには、以下の表８に示すように、表５に示すプローブの使用が要求される。
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"HRP−SSO"と呼ばれる本発明の西洋ワサビペルオキシダーゼ接合SSOには、使用が簡単で検出可能なシグナルを急速に（通常１〜10分）生成する発色性または化学発光性基質を使用する検出方法が許容される。HRP−SSOは４℃で保存すれば、活性の明らかな低下を伴うことなく２年以上にわたって安定である。PCR protocols:A Guide to Methods and Applications（Innis,Gelfand,Sninsky ＆ White編,Academic Press,Inc.,San Diego,1989刊）中のLevenson ＆ Changによる"Nonisotopically labeled probes and primers"と題する論文を参照。放射標識プローブも使用できるが、本発明によって与えられる重要な利益は優れた感度であって、その必要はない。
検出のためのドットブロットフォーマットは、多数のサンプルの迅速なタイピングを可能にし、HLA DRBの対立遺伝子頻度の決定に有用である。PCR/SSO DRβタイピング用に最近開発された変法に固定化逆相ドットブロットフォーマットがある。Sekiら:Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence−specific oligonucleotide probes.Proc,Natl.Acad.Sci.USA 86:6230,1989および1989年５月４日出願の係属中の出願番号第347,495号参照。これは参考として本明細書に導入する。この操作においては、SSOプローブはフィルターに適用され固定されるので（フィルターに適用され固定される増幅DNAよりも）、「逆相ドットブロット」の語が使用される。
逆相ドットブロット操作によれば、単一のサンプルを、一連の固定化プローブを含有する膜と１回ハイブリダイズさせることで分析が可能となる。サンプル数が使用プローブを越える場合（たとえば、患者対コントロールまたは集団遺伝学研究）では慣用のドットブロットフォーマットが有用である。逆相ドットブロットフォーマットは、臨床的、診断的、および法科学的分析に場合に価値がある。逆相ドットブロットフォーマットは例８に詳細に記載する。
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を例示するものである。この例は、本発明が、好ましい実施態様においては、多様な起源からの様々なサンプルについての単純、迅速かつ正確なDRBタイピングを可能にするHLA DRBタイピングのための非同位元素PCR/SSOシステムを提供するものであることを示している。
例１
増幅および検出方法
プローブの第一のパネル（表４）でのサンプルのタイピングには、0.5μｇのヒトゲノムDNAを、Sekiら:Primer−directed enzymatic amplification of DNA polymerase.Science 239:487,1988;Scharfら:Hum.Immunol.22:61,1988;およびScharfら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6215,1989に記載された反応成分を用いて増幅した。これらの文献は参考として本明細書に導入する。
HLA DRB一般的PCRプライマーはGH46およびGH50である。これらのプライマーの配列を以下に示す。
0003643375.tif 000017
プライマーは反応混合物中に500nM存在させた。これらのプライマーは、272塩基対（bp）フラグメントを生成し、PCR産物をクローニングするためのBamH IおよびPst I制限部位の配列を含有する。増幅DNAをBamH IおよびPst Iで消化すると内部Pst I部位により248bp産物が生成する。
すべてのハプロタイプ（DR2,DR7,およびDR9を除く）からのDRB1対立遺伝子は、PCRプライマーGH46およびCRX37によって特異的に増幅された。CRX37プライマーの配列を以下に示す。
0003643375.tif 000018
GH46/CRX37プライマー対での増幅は297bpフラグメントを産生する。プライマーCRX37は５′−末端にEcoR I制限エンドヌクレアーゼ認識配列を挿入してクローニングを容易にし、プライマー対GH46/GH50と異なり、このプライマーでの増幅およびBamH I/EcoR I消化は完全長PCR産物の単離および分析を可能にする。
このような単離および分析は多くの場合、PCR産物のヌクレオチド配列の決定を包含する。HLA DRB対立遺伝子の配列決定には、１μｇの精製ヒトゲノムDNAをプライマー対GH46/GH50およびGH46/CRX37を用いて増幅した。増幅されたDNAを、Scharfら:Hum.Immunol.22:61,1988およびScharfら:Hum.Immunol.233:1076,1986（これらの記載は参考として本明細書に導入する）に記載の方法によって、M13mp10にクローン化した。挿入体を次に、Sangerら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463,1977に記載のジデオキシチェーンターミネーション操作（1988年９月23日出願の米国特許出願第249,367号も参照。この記載は参考として本明細書に導入する）によって配列決定した。
上記表１および２に示した配列は、ゲノムクローニングにより（Hornら:Hum.Immunol.21:249,1988,参照。この記載は参考に本明細書に導入する）、PCR増幅により［Erlichら:Immunobiology of HLA（du Pont編,Springer−Verlag,New York）1989年刊、およびScharfら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6215,1989参照。この記載は参考に本明細書に導入する］、または文献［WHO命名委員会:Immunogenetics 31:131,1990;およびGregersenら:First domain diversity of DR and DQ subregion alleles.in Immunobiology of HLA（du Pont編,Springer−Verlag,New York）1989年刊参照］から得られたものである。
サンプルは、Taqポリメラーゼ（PECI,Norwalk,CT）1.25単位（2.5単位でなく）を反応容量100μｌあたり加えたほかは上述の反応条件を用い、32サイクル（とくに指示のない限り）で増幅した。膀胱癌患者についてのcDNAを、HLA−DRB遺伝子座で、報告されているように（Kawasaki:"Amplification of RNA"in PCR protocols:A Guide to Methods and Applications（Innisら編,Academic Press,San Diego）1989刊参照）増幅した。すべてのサンプルを高級鉱油（Sigma,St.Louis,MO）100μｌで覆い、蒸発を防止した。増幅後、鉱油被覆液を100μｌのクロロホルムで抽出した。
各サイクルの熱プロフィルは以下の温度での指示時間のインキュベーションとした。すなわち、94℃で45秒（DNA鎖の変性）、55℃で45秒（プライマーのアニーリング）、および72℃で45秒（刺激鋳型の延長）である。最終サイクルののちに、PECIサーマルサイクラー（Perkin Elmer Centus Instruments,Norwalk,CT）は、最終の延長が完全に行われることを確実にするため、サンプルを72℃で10分間インキュベートするようにプログラムした。サンプルの交差夾雑を避けるための注意が必要である。とくに、一つのPCRの産物を非増幅サンプルと夾雑させることは防止しなければならない。1990年７月24日出願の米国特許出願第557,517号およびその出願の1990年11月２日付CIP出願（いずれも、参考として本明細書に導入する）には、非増幅サンプルに「キャリオーバー」したPCR産物の増幅を防止する好ましい方法が記載されている。
増幅後、増幅DNAの小部分を変性し、一連のナイロンフィルターへのクロスリンキングに適用した。各フィルターをついで標識プローブの一つにハイブリダイズした。各SSOプローブは西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に共有結合で接合させ、発色性または化学発光性基質の存在下における非同位元素検出手段を提供する。ヌクレオチド配列、コードされたアミノ酸（またはエピトープの可能性）、および同定されるDR型、ならびに各プローブの洗浄条件を表４および５に掲げる。
すなわち、各増幅DNAサンプル５μｌを、0.4M NaOHおよび25mM EDTAからなる混合物100μｌと混合し、得られた混合物を、ドットブロットマニフォルド（BioRad Richmond,CA）を用いてBioDyne Bナイロンフィルター（Pall Corp.,Glen Cove,NY）に適用した。まだドットブロットマニフォルド中にあるフィルターを、10mM Tris−HClおよび0.1mM EDTAからなる混合物,pH8.0で洗浄し、Whatman 3MM濾紙で乾燥させた。StratalinkerTM（Stratagene,La Jolla,CA）UV光線ボックスを用い、出力55mJ/cm2での紫外線照射により、DNAをナイロンフィルター上に固定化した。
他の記載がない限り、フィルターはすべて、２×SSPE（食塩リン酸ナトリウムEDTA）,5×デンハルト溶液および0.5％SDS中、ハイブリダイゼーション溶液1mlあたり2pmoleのHRP−SSOプローブを用いて、42℃で15分間ハイブリダイズした。西洋ワサビペルオキシダーゼ接合オリゴヌクレオチドは,Levenson ＆ Chang:in PCR Protocol:A Guide to Methods amd Application（Innisら編,Academic Press,Inc.,San Diego）およびSekiら:N.Eng.J.Med.319:537,1988の記載に従つて製造された。各プローブのフィルターは25mlのSSPE溶液中、表４および５に示した温度で15分間（他の記載がない限り）洗浄した。
洗浄後、発色性の染料基質で展開すべきフィルターは、PBS中室温で30分間洗浄し、ついで0.1mgの3,3′,5,5′−テトラメチルベンチジン（TMB）（Fluka）を1mlあたり、および0.0015％の過酸化水素を含有する100mMクエン酸ナトリウム中に取り、穏やかに攪拌しながら室温で５〜15分間インキュベートした。展開したフィルターをPBS中ですすぎ、直ちに撮影した。化学発光検出系（ECL;Amersham,Arlington Height,IL）で展開したフィルターはPBS中で５分間すすぎ、穏やかに攪拌しながらECL溶液中に１分間置いた。ついで、フィルターは室温で１〜５分間Ｘ線に露出した。
例２
DRB1特異的増幅
各種DRB1対立遺伝子を識別するDRB1遺伝子座の対立遺伝子の数種の多形配列は、他のDRB遺伝子座の対立遺伝子上にも存在する（表３参照）。DR3 DRB1対立遺伝子上のエピトープ"K−GR"（コドン71〜74）をコードするヌクレオチド配列がその例であり、この領域に対するプローブ（CRX50）はDRw11およびDRw6対立遺伝子からDR3を識別できる。しかしながら、このエピトープは、DRB3対立遺伝子DRw52a（DRB3＊0101）によってもコードされ、一部のDRw6ハプロタイプおよび一部のDR3ハプロタイプ上にも同様に存在する。PCRプライマーGH46/GH50はすべてのDRB遺伝子座を増幅するので、DRB3遺伝子座においてDRw52aであったDRw6サンプルを、このプローブを用いてDR3サンプルから識別することは不可能である。
本発明は、DRB1遺伝子座のみを特異的に増幅するPCRプライマーを提供することによって、この問題を解決する。これらのプライマーの一つは、第二のエクソンからすぐ下流のイントロン内領域にハイブリダイズする。イントロンは、DRB1とDRB3遺伝子座を識別する配列を含有する。プライマー（CRX37）はDRB1イントロン配列に特異的にハイブリダイズし、このプライマーをGH46と組み合わせると大部分のハプロタイプについて、DRB1特異的増幅を可能にする。
DRB1遺伝子座がこれらのDRB1特異的プライマー候補で増幅される唯一の遺伝子座であるかどうかを確認するために、DR2,DR3,およびDR4 HTC（ホモ接合タイピング細胞）DNAを、これらのプライマーおよびすべてのDRB遺伝子座のためのSSOプローブで増幅し、分析した。DRB1遺伝子座に加えて、DR2ハプロタイプはDRB2およびDRB5遺伝子座を有し、DR3ハプロタイプはDRB3遺伝子座を有し、DR4ハロタイプはDRB4遺伝子座を有する。結果は図１に示す。
これらの結果を得るには、約200ngのHTC DNAを一般的DRBプライマーであるGH46/GH50またはDRB1特異的プライマーGH46/CRX37によって増幅し、例１の記載のようにフィルターに適用した。増幅細胞系DNA（サンプル１〜４）を含有する各フィルターは図１に示すプローブとハイブリダイズさせた。各プローブがハイブリダイズする遺伝子座をカッコ内に示す。CRX36はDR4,DR7,およびDR9のDRB4遺伝子座にハイブリダイズする。CRX22はDRB3対立遺伝子DRw52bにハイブリダイズする。
SSOの配列：
0003643375.tif 000019
は、Scharfら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6215,1989によって記載されている。この記載は参考に本明細書に導入する。
プローブGH91
0003643375.tif 000020
はDRB2遺伝子座に特異的にハイブリダイズする。このプローブは例１に記載したようにハイブリダイズさせ、１×SSPE,0.1％SDS中、42℃で15分間洗浄した。増幅されたサンプルは、（１）No DNA（陰性対照）；（２）DR2 HTC"SCHU";（３）DR3 HTC"QBL";および（４）DR4 HTC"BSM"である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程後、プローブは増強化学ルミネッセンスで検出された。
図１は、３つのHTCすべてについてのすべてのDRB遺伝子座は一般的DRBプライマーで増幅するが、DRB1特異的プライマーはDR3およびDR4 HTCからのDRB1遺伝子座を増幅するのみであることを示している。興味あることに、DR2 HTCについては、DRB2遺伝子座は、弱いとはいえ、DRB1特異的プライマーで増幅される。DRB1特異的プライマーは、図１および２に示すように、DR2,DR7,およびDR9を除き、試験されたすべてのDRハロタイプからのDRB1配列を効率的に増幅する。図２に示す結果を得るには、HTCからのゲノムDNA約0.5μｇを、DRB1特異的プライマーGH46/CRX37で、HLA DRBについて増幅した。増幅反応およびフィルターは、例１に記載したのと同様にした。各フィルター片は示したプローブの一つと、適当なハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズし、緊縮条件下に洗浄した（表４、５および７参照）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程後、フィルターは発色性基質TMBで展開した。サンプルは、
0003643375.tif 000021
である。
図２の結果は、DR7プローブCRX49（"G−YK"）が、この実験では弱く増幅されたDR7 HTCにはハイブリダイズしないことを示している。これらの結果から、完全なDRB1タイピングには一般的およびDRB1特異的プライマーを使用できることが明らかである。
例３
血清DR型１〜10のタイピング
HTCからのゲノムDNA約0.5μｇを、HLA DRBについて増幅した。３番および６番のを除くすべてのサンプルは一般的プライマーGH46/GH50で増幅した。３番および６番のサンプルは、DRB1特異的プライマーGH46/CRX37で増幅した。増幅反応およびフィルターは、例１に記載したのと同様にして準備した。各フィルター片は示したプローブの一つと、適当なハイブリダイゼーションおよび緊縮条件下にハイブリダイズさせた（表４、５および７参照）。プロービングおよび洗浄後に、フィルターは発色性基質TMBで展開した。サンプルは、
0003643375.tif 000022
である。
図３は、古典的、血清学的に定義されたDR型１〜10についての、HTCのパネル上でのDRタイピングの結果を示す。各古典的DR型の検出に単一のプローブを使用することができるが、２つの異なるPCRプライマーが必要であった。DR3およびDRw6を除くすべてのサンプルで、一般的PCRプライマーGH46/GH50が使用できる。この系列のDR3およびDRw6サンプルのDNAの増幅には、DRB1特異的プライマー対GH46/CRX37を使用した。DR3 HTC"QBL"（DRw17）上の"Y"エピトープ（GH125;コドン26）を検出するために使用されたプローブは、DRw6サンプルのDR3対立遺伝子（DRw52a）上にも存在するからである。標準DRBプライマーを使用されていたならば、"Y"プローブはDRw6サンプルにも同様にハイブリダイズしたと考えられる。
例４
一般的DRB1タイピング戦略
特定のサンプルのタイピングに際しては、一般的プライマーを最初の増幅に使用し、ついで増幅DNAを最初のパネルのプローブによってプロービングしなければならない（表４および７）。このパネルのプローブは大部分の血清型を同定するが、GH56（"YSTS"）はDRw6からDR3を明らかに識別しない。
GH56で陽性を示したサンプル、または特定のDR型の細分類（たとえば、DR4のDw型またはDRw8のサブタイプ）するサンプルには、第二のパネルのプローブ（表５）を使用しなければならない。上述のように、第二のパネルの一部のプローブはPCRプライマーのDRB1特異的対による増幅を要求する。第一および第二のパネルからのプロービングを組み合わせることにより、1989対立遺伝子セットにおける34のDRB1対立遺伝子中、31の識別ができる。これらの対立遺伝子の同定に用いられるSSOプローブの組み合わせを表８に示す。これらのプライマーおよびプローブによってはDR2サブタイプ（DRB1＊1501,＊1502,＊1601,および＊1602）は識別されず、これらのプローブによってはDRB1＊0403とDRB1＊0406対立遺伝子は識別されない。
本発明の一つのDR2プローブは、DRB5遺伝子座の第一の超可変領域（"Q−Ｄ−Y"）にハイブリダイズする配列からなる。DRB5遺伝子座はすべての既知DR2ハロタイプ上に存在し、それらのハロタイプ上にしか存在しないので、このようなプローブは、一般的DRBプライマーで増幅したDR2の型の判定に信頼をもって使用できる。プローブGH104（"W−Ｐ−R"）はDR2 DRB1遺伝子座の第一の超可変領域にハイブリダイズし、一般的プライマーで増幅するとDR2 DNAに特異的にハイブリダイズする（図１）が、DRB1特異的プライマーではハイブリダイズしない。これらの２つのプローブは一般的プライマーでの増幅においては、DR2の同一のインジケーターである。
例５
DR4のサブタイピング
DR4特異性のサブタイピングは血清学的には実施できない。サブタイプは二次元蛋白質ゲル電気泳動および細胞性タイピングによって明らかにされたが、両方法とも繁雑で時間がかかる。Dw4,Dw10,Dw13,およびDw14は互いに、遺伝子の第三の超可変領域の位置70〜74で異なっている。Dw15はまた、位置57にセリン（"S"）を有する。Dw13はまた、位置71にDw14およびDw15と同じアルギニン残基を有するが、位置74のグルタミン酸（"E"）で異なっている。
結果として、SSOプローブ、CRX04（"R"）はDw13,Dw14,およびDw15対立遺伝子にハイブリダイズする。これらの対立遺伝子を互いに識別するには、さらにプローブが必要である。SSOプローブ、CRX15（"R−E"）はDw13をDw14およびDw15から特異的に識別し、CRX61（"S"）はDw14からDw15を特異的に識別する。様々なDRB1対立遺伝子（たとえばDw14.1またはDw14.2からのDRB1＊0404またはDRB1＊0408）を識別する位置86の"G"対"V"多形はCRX56プローブ（"G"）およびCRX57プローブ（"V"）を用いて検出される（表５参照）。
DRタイプ１〜10のHCTおよび５つのDR4 Dwサブタイプは、DRB1特異的プライマーGH46/CRX37で増幅し、６つの同一のナイロンフィルターに適用し、Dw型に特異的なHRP−SSOとハイブリダイズさせた。結果は図４に示す。
図４に示した結果を得るには、約500ngのHTCゲノムDNAを上述のDRB1特異的プライマーGH46/CRX37によって増幅した。ＡおよびＢの対のフィルターそれぞれを図４に示すプローブとハイブリダイズさせた。サンプルは、列Ａでは、
0003643375.tif 000023
ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程後、プローブは増強化学ルミネッセンスで検出された。パネルＡは、DR2,DR7,およびDRw9 HTCを除くすべてがCRX12にハイブリダイズすることを示している。
パネルＢは、CRX53がDw4 HTC BSMに特異的にハイブリダイズすることを示している。DR4 Dw4のタイピングのための他のプローブには、DRB163（SEQ ID NO 239）があり、例６に記載のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用される。ズする。低い緊縮条件（２×SSPE,5×デンハルト,0.5％SDS,42℃15分ハイブリダイゼーションおよび２×SSPE,0.1％SDS,42℃15分洗浄）ではるかに強いシグナルを与えるDR4 Dw4のタイピングのためのさらに他のプローブは、以下に示すプローブCRX64である。
0003643375.tif 000024
HRPは西洋ワサビペルオキシダーゼである。Ｉはイノシンで、これはプローブを不安定化する。
パネルＣはDw10 HTC"YAR"のSSO CRX06（"I−DE"）による検出を示す。このプローブはHTC"OMW"にもハイブリダイズし、これはDRw13でありこの多形を共有する。
パネルＤはCRX15の特異的ハイブリダイゼーションを示し、これはDW13サンプルJHAを、Dw14サンプルBM92およびDw15サンプルLKT3から識別する。
パネルＥは、CRX04の、それぞれDw13,Dw14,およびDw15であるJHA,BM92,およびLKT3へのハイブリダイゼーションを示す。CRX04はDRB1＊0101であるDR1 HTC KAS9003にもハイブリダイズし、これらの３つのDw型とこの多形（"R"）を共有する。DR4 Dw14型は、サンプルがCRX15（"R−E"）またはCRX61（"s";パネルＦ）のいずれにもハイブリダイズせず、CRX04（"R"）とハイブリダイズするプローブハイブリダイゼーションパターンから、推測される。パネルＦはCRX61のDw15HTC"LKT3"へのハイブリダイゼーションを示す。
図４は、一般的に、本発明が、第一のパネルのプローブへのハイブリダイゼーションのパターンにより、これらのプローブで認識される多形領域を共有するサンプルを識別できることを示している。たとえば、"R"エピトープ陽性のDR4 Dw型はGH59（"V−H"）陽性およびCRX60（"W−Ｌ−F"）陰性によりDR1から識別され、DR4 Dw10は、GH59陽性およびGH56（"YSTS"）陰性によりDRw13から識別される。
表８は、このシステムが識別できない２つのDR4サブタイプがDRB1＊0403およびDRB1＊0406対立遺伝子であることを示している。これらの２つの対立遺伝子は２つのパネルのプローブで同じハイブリダイゼーションのパターンを与える。位置37がDRB1＊0403ではチロシン残基であるのに対し、DRB1＊0406ではセリン残基である点を除いて、DRB1＊0406はDRB1＊0403と同一である。上に示したプローブの例示的パネルではこの多形は検出できないが、さらに付加的なプローブを使用すれば、完全な識別が可能となる。
例６
DR3,DR5,DRw6,およびDRw8のサブタイピング
DR3,DR5,DRw6,およびDRw8の「スプリット」についてのサブタイプは、各ハロタイプの各種対立遺伝子間を識別するプローブの使用により、同定できる。たとえば、DRw17およびDRw18の両者は"K−RG"プローブCRX50にハイブリダイズするが、DRw17のみが"Y"プローブGH125にハイブリダイズし、これでDRw17は、DRw18から識別できる。同様に、DRw11およびDRw12対立遺伝子（通常DR5として分類される）は互いに、また３つのDRw8対立遺伝子から、プローブの別の組み合わせを用いて識別できる。
「一般的」血清型１〜10のHTCと、同時にDR3,DR5,DRw6,およびDRw8サブタイプのHTCから、DRB1特異的PCRプライマーCRX37/GH46で増幅したDNAを12のフィルターに適用した。これらのサンプルの血清DR型は既知であったから、本発明のこの態様を例示するために、これらの対立遺伝子のサブタイプの決定に必要なプローブのみを使用した。結果は図５に示す。
図５に示す結果を得るためには、約500ngのHTCゲノムDNAをDRB1特異的プライマーGH46/CRX37によって増幅した。ＡおよびＢの対のフィルターそれぞれを図４に示すプローブとハイブリダイズさせた。サンプルは、列Ａでは、
0003643375.tif 000025
GH56（"YSTS"）がDR3,DR5,およびDRw6にハイブリダイズし、GH102（"YSTG"）がDRw8にハイブリダイズすることを示す第一パネルのプローブのデータは図７に示す（例７参照）。
ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程後、結合したプローブは増強化学ルミネッセンスで検出された。各サンプルにハイブリダイズするプローブのパターンを決定することにより（表８参照）、図６に示すように、サンプルは特異的な対立遺伝子に細分類できる。図６には、プローブにハイブリダイズしたサンプルに＋の記号を付してある。空欄は特定のプローブにハイブリダイズしなかったサンプル示している。"KOSE"および"BARP"を除いて、すべてのサンプルがホモ接合型細胞であった。
DR3,DR5,DRw6,およびDRw8サンプルのハイブリダイゼーションデータおよびDR型は図６に示す。サンプル"KOSE"は血清学的にDRw6ハロタイプのホモ接合体と分類された（このサンプルはDw9およびDw19と表示されていたが）。しかしながら、それはDRB1＊1302（CRX06＋CRX56）およびDRB1＊1401（CRX23＋CRX57）と分類された。
サンプル"BARP"は血清学およびMLCでDR4 Dw10およびDRw6と分類される。したがって、"BARP"はプローブCRX35およびCRX56（"F−DR"および"G"）にハイブリダイズし、これにより新たに発見された"DR PEV"DRw6対立遺伝子として分類され、またプローブCRX06およびCRX57（"I−DE"および"V"）的ににハイブリダイズして、DR4 Dw10対立遺伝子（DRB1＊0402）の存在を反映している。
例７
細胞系のDRタイピング
確立された細胞系の多くはクラスII分子を発現しないので、それらのDR型を血清学的に判定することは不可能である。ブラインドパネルとしてコードされた５つのクラスII陰性細胞系からのDNAサンプルを一般的プライマー対GH46/GH50で増幅し、第一のパネルのプローブ（表４）で探査し、サンプルの一般的血清DR型を確立した（図７）。
これらのおよび他の細胞系のDR型判定のためには、100ngの細胞系DNAを一般的HLA DRBプライマーGH46/GH50により、30サイクルを行って増幅した。増幅された細胞系DNA（サンプルＡ〜Ｆ）を含有する各フィルターを、一般的HLA DRBプライマーで増幅したHTC DNAを含有する対照フィルター（サンプル１〜11）と同時にハイブリダイズさせた。フィルターはすべて例１に記載のようにして調製した。結果は図７に示す。各フィルター対は、示したSSOプローブにハイブリダイズさせた。サンプルは、
0003643375.tif 000026
CRX12プローブのシグナル強度は、すべてのサンプルが等しく良好に増幅されたことが明らかである。Raji,RM3,およびRS225は、DRw10に特異的なプローブCRX34にハイブリダイズする。サンプル616は、このサンプルがDR1対立遺伝子を有することと矛盾しない、プローブCRX60（"WLF"）およびCRX04（"R"）にハイブリダイズする。
細胞系Beguitは、DR7プローブCRX49（"G−YK"）および２つの他のプローブ、GH56（"YSTS"）およびGH122（"E"）にハイブリダイズし、それはDR7およびDRw11であることが示唆される。しかしながら、このサンプルからの推測されるDRw11対立遺伝子はCRX35（"F−DR";DRB1＊1101）またはCRX06（"I−DE";DRB1＊1102）のいずれかにハイブリダイズすることが期待されたがせず、以下にさらに述べるように、DRw11の新規な変異体であることが示唆される。
重篤なリンパ球症候群を有する患者に由来するこのサンプルは、この位置における多形の性質を決定するために、クローン化し、配列を決定した。対立遺伝子の配列決定により、エピトープ"F−DE"をコードする第三の超可変領域に実際、配列多形のあることが示された。この対立遺伝子はDRB1＊1103として分類された（表３の配列"Beguit"参照）。プローブCRX68が第三の超可変領域のこの多形に特異的にハイブリダイズする（表４参照）。
他のサンプルすべてもGH56"YSTS"プローブにハイブリダイズし、したがって、これらは、DR3,DRw11,またはDRw6でありうる。これらの他のサンプルは"E"プローブにハイブリダイズしないので、DR3またはDRw6の可能性がある。しかしながら、このサンプルは、３つのDRw6対立遺伝子、DRB1＊1301,DRB1＊1302,およびDRB1＊1401に共通に存在する配列を認識する、プローブCRX06（"I−DE"）またはCRX23（"A−H"）にハイブリダイズせず、DRw6ではなくDR3であることが示唆される。
これを確認するために、このサンプルをDRB1特異的プライマーGH46/CRX37で増幅し、DR3,GH125（"Y"）およびCRX50（"K−GR"）についてSSOで探査した。約100ngの細胞系ゲノムDNAを、例１の記載のようにDRB1特異的プライマーGH46/CRX37で増幅した。増幅細胞系DNAを含む各フィルター（サンプルＡ〜Ｆ）をDRB1特異的プライマーで増幅したHTC DNAを含有する対照フィルター（サンプル１〜11）と同時にハイブリダイズさせた。フィルターはすべて例１に記載のようにして調製した。結果は図８に示す。各フィルター対は、示したSSOプローブにハイブリダイズさせた。サンプルは、
0003643375.tif 000027
ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程後、結合したプローブは増強化学ルミネッセンスで検出された。
図８に示すように、Raji,616,RM3,およびRS225は"Y"および"K−GR"の両者にハイブリダイズし、これはそれらをDR3（DRw17）に分類させる。要約すると,Raji,RM3,およびRS225はDRw10/DRw17として分類される。RM3およびRS225はRajiに由来する細胞系であるから、それらが同じDRBタイプを有していても驚くべきことではない。細胞系616はDR1/DRw17として分類され、BeguitはDR7/DRw11として分類されるが、上述のように、Beguit細胞系は"F−DE"エピトープを有するDRB1＊1103対立遺伝子を含有する。以前には、大部分のDRw11型細胞は、"F−DR"エピトープを有するDRB1対立遺伝子を含有することが認められていた。したがって、Beguit細胞系はDRw11型としては、異常なDRB1対立遺伝子を含有する。
細胞系サンプルに加えて、３つの異なる起源からのDNAを増強し、分類した。一つの起源は、Center for Study of Human Polymorphism（CEPH,Paris,France）からの一連の無関係なヘテロ接合個体の精製ゲノムDNAである（サンプル555〜863）。他の起源は膀胱癌患者の癌組織のmRNAから作成したcDNAであった（サンプル2426,2446,2540,2671,2755）。正常ヒト膀胱細胞はクラスII分子を発現しないが、各種癌細胞ではクラスII分子の発現が記録されている。
残りのサンプル（PSW）は、口内綿棒で、DNAを精製することなく直接HLA DRBについて増幅した。完全なDRタイピングには、サンプルを一般的DRBプライマーGH46/50およびDRB1特異的PCRプライマーGH46/CRX37の両者で増幅する。一般的プローブで増幅されたDNAサンプルを含有するフィルター片を第一のパネルのプローブ（表４）で探査し、DRB1特異的に増幅したDNAサンプルを含有するフィルター片は第二のパネルのプローブ（表５）で探査した。
表３および表８とのハイブリダイゼーションのパターンの比較により、サンプルのDRB型を明瞭に誘発することができる。ヘテロ接合サンプルの型判定の結果を図９に示す。図９では、プローブにハイブリダイズするサンプルは＋の記号で示す。空欄はサンプルが特定のプローブとハイブリダイズしなかったことを指示する。
サンプル555〜863はCEPHから提供された純粋なゲノムDNAである。サンプル"PSW"は口内綿棒から直接増幅されたサンプルである。このサンプルは200μｌの５％Chelex中、95℃に５分間加熱した（Singer−Samら:Amplifications 3:11,1989）。この溶液約50μｌを直接、反応容量200μｌ中で増幅させて、一般的DRBおよびDRB1特異的増幅反応をサンプルにつき40サイクル実施した。
サンプル2426,2446,2540,2671,および2755は、膀胱癌cDNAプレパレーションから増幅した。膀胱癌サンプル2426,2446,2540,2671,および2755は、SSO GH125,CRX50,CRX56,およびGH54では分析しなかった。これらのプローブは、DRB1特異的プライマーGH46/CRX37による増幅を要求するからである。CRX37はイントロン配列に由来するので、cDNAの増幅には使用できない。NDは測定していない。
口内綿棒サンプル、PSWはDR4Dw14（DRB1＊0404）およびDRw11である。
これらのデータは本システムによれば、様々な起源から、標準精製ゲノムDNAから、mRNAから合成されたcDNAから、異常な起源たとえば口内綿棒もしくは１本の毛からの、ヘテロ接合DNAのタイピングが可能であることを示している。
例８
DRBタイピング−逆ドットブロットフォーマット
本発明のこの実施態様においては、DRBプローブは膜に固定され、増幅された標的DNAは膜結合プローブにハイブリダイズさせる。タイピングプローブのセットは、各プローブが、セット中の他のすべてのプローブと同じ温度および塩濃度で特異的標的配列にハイブリダイズする（そして同じ洗浄条件でハイブリダイズしたままである）ように設計される。PCR Protocolと題する本（参考として本明細書に導入する）に記載されているように、増幅に用いられるPCRプライマーは、膜に結合したプローブにハイブリダイズした増幅DNAが容易に検出できるように、ビオチン化される。
一実施態様においては、検出は、膜結合プローブにハイブリダイズしたビオチン化、増幅DNAと、ストレプトアビジン（SA）接合西洋ワサビペルオキシダーゼの反応によって行われる。すなわち、HRPはＳ−Ａ−ビオチン相互作用を介して増幅されたDNAに結合され、よく知られた多様な手段での発生、たとえばテトラメチルベンチジンの酸化によるたとえば着色化合物の発生（米国特許第4,789,630号参照。参考として本明細書に導入する）に使用できる。
プローブは膜に任意の手段で固定できるが、好ましい方法には、長さ約13〜25のオリゴヌクレオチドプローブの、はるかに長い配列ポリ−dTによる「テイリング」がある。生成したポリ−dTテイルはついで膜上のアミノ基と反応させてプローブを膜に共有結合で固定できる。この反応は紫外線照射によって促進される。
ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT,Ratliff Biochemicals;以下の反応には約120単位／μl,100pmol/μｌに相当の濃度が想定される）はプローブ上にポリ−dTテイルを創製するために使用できる。またテイルをもつプローブは、市販のDNAシンセサイザーで合成することもできる。しかしながら、DNAシンセサイザーでテイルをもつプローブを作成する場合は、主としてテイル領域に望ましくない未熟チェーンターミネーションが起こらないように、プローブの５′末端にテイルを配置すべきである。
TdT反応は１×TdT塩、200pmolのオリゴヌクレオチド、800μM dTT、および60単位のTdTを含有する約100μｌの容量で行われる。10×TdT塩は100mMカコジル酸カリウム、10mM塩化コバルト、2mMジチオスレイトール、250mM Tris−Cl,pH7.6であり、Roychoudhury ＆ Wu:Meth.Enzymol.65:43−62の記載に従い（この記載は参考として本明細書に導入する）製造する。8mM dTTPの10×保存溶液（NaOHでpH7に中和）を調製するのが便利である。
TdT反応は37℃で２時間行い、ついで100μｌの10mM EDTA,PH8の添加により停止させた。テイルをつけたオリゴヌクレオチドの最終濃度は１μＭ（1pmol/μｌ）であり、ホモポリマーテイルの長さは約400残基である。テイルの長さはdTTPとオリゴヌクレオチドのモル比を調整することによって変化させることができる。テイルをもつプローブは使用時まで−20℃で保存できる。
逆ドットブロットフォーマットには２種類の好ましいナイロン膜がある。すなわちBiodyneTMナイロン膜、孔径0.45ミクロン（Paul製）およびBiotransTMナイロン膜、孔径0.45ミクロン（ICI製）がある。プローブは、BioRad製のドットブロット装置Bio−DotTMを用いて。極めて簡便に膜上にスポットできる。各プローブは膜上、独自の分離した部位にスポットする。テイルをもつプローブそれぞれ約５〜10ピコモルを予め60〜100μｌのTE緩衝溶液と混合したのち、ドットブロット装置に適用する。ドットブロット後、膜を短時間吸い取り紙上に置いて過剰の液体を吸い取らせる。
ついで、膜を、たとえばStratagene製のStratalinkerTM光線ボックスのような紫外線ボックスの内側に置き、出力50〜60ミリジュールに露出し、テイルをもつプローブをナイロン膜に固定化させる。簡単に洗浄して（ハイブリダイゼーション溶液中約15分）非結合プローブを除去し、ついで膜をビオチン化PCR産物とハイブリダイズさせる。PCR産物0.5〜１ピコモル（典型的なPCR産物100μｌの４分の１〜２分の１）を各プローブパネルに加えてハイブリダイズさせる。約50μｌのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（SA−HRP,RECIから市販品を入手できる。Ampli TypeTMDQαDNAタイピングキットの指示マニュアル参照、参考として本明細書に導入する）接合体をこの時点で添加するのが便利であるが、緊縮条件下の洗浄についで別個にSA−HRPの室温でのインキュベーションおよび洗浄を行う方が良好なシグナルが得られる。
ハイブリダイゼーションは通常、水浴中、0.5％SDSおよび３×〜５×SSPE、通常は４×からなるハイブリダイゼーション緩衝液を用いて、50℃で30分間行う。緊縮条件下の洗浄は、水浴中、0.1％SDSおよび１×SSPEからなる洗浄液を用いて、50℃で15分間行う。室温で１×PBSによる後洗浄を30分行うとシグナル量を増強できる。
逆ドットブロット法のためのビオチン化プライマーおよび本発明の他の有用なプライマーは以下に示す。しかしながら、一方または両者のプライマーを増幅中にビオチン化することもできるし、またプライマーは任意の検出フォーマットで増幅に使用してもよいことに留意すべきである。
0003643375.tif 000028
Ｂはビオチンである。CRX11は、DR3,DR5およびDRw6（13および14）ハロタイプのDRB1第二エクソンを増幅するためGH50と使用するように設計された右端プライマーである。CRX28はビオチン化左端プライマーGH46、CRX29はビオチン化右端プライマーGH50、DRB17はビオチン化右端プライマーCRX37である。DRB30はCRX37の配列を含有し、CRX37とは異なりDRB30はDR7 DRB1配列を増幅できる以外はCRX37と同じDRB1範囲を有する右端プライマーである。DRB152はDR7およびDR9対立遺伝子のための群特異的右端プライマーである。DB259およびDB260はDRB1特異的増幅の範囲をDR2およびDR9にまで延長するように設計された同じく右端プライマーである。
逆ドットブロット法に使用されるテイルを付したプローブのハイブリダイゼーション領域を以下に示す。Ｘはイノシンである。DRB01/CRX60のように２つのプローブ名が示されている場合は、最初の名称はテイル付きプローブのハイブリダイゼーション領域（示されている）を表し、第二の名称はHRP標識非テイリングプローブを表示する。
0003643375.tif 000029
0003643375.tif 000030
0003643375.tif 000031
0003643375.tif 000032
0003643375.tif 000033
0003643375.tif 000034
0003643375.tif 000035
予備試験の結果、「Ｓ」とマークした上記プローブは他の「Ｕ」とマークした上記プローブよりも好ましいことがわかっている。「Ｔ」とマークした上記プローブはまだ試験されていない。
好ましい逆ドットブロットについてのハイブリダイゼーションパターンおよび特異性（1989対立遺伝子セット）を以下に示す。「特異性」のカラムに使用される「Ｘ」のマークは、＊印の後の始めの２つの数字で指示されるすべての対立遺伝子を包含することを表す。
0003643375.tif 000036
0003643375.tif 000037
例９
逆ドットブロットタイピングキット
迅速かつ簡単な逆ドットブロットハイブリダイゼーションフォーマットが挿入されたHLA DRBタイピングキットは、対立遺伝子特異的な増幅を含めた精密なサブタイピングを進めるに先立ち、サンプルの単純かつ迅速なプレスクリーニングを行うために設計されたものである。このキットは、増幅試薬、陽性対照として使用されるDNA、プローブが予め固定化されているナイロン片、発色検出試薬、試験管および指示書を包含する。
タイピングは２回の増幅反応を用いて行われ、一つには、DRB一般プライマー、他方にはDRB特異的プライマーを使用した。このプライマー対は、同じ熱サイクル条件下に増幅し、したがって、２つの反応は同時にも実施できる。２つのパネルのプローブ中、一つは各増幅反応に特異的で、逆ドットブロットハイブリダイゼーションフォーマットに使用された。プローブのパネルはそれぞれ、取扱いを容易にするため、単一のナイロンストリップ上に固定化した。
ビオチン化プライマーを増幅反応に使用したので、上記例８に記載したような比色検定を用いる以後の検出が可能となった。使用されたDRB増幅プライマーはCRX28（SEQ ID NO:67）およびCRX29（SEQ ID NO:68）であった。DRB1増幅プライマーはCRX28およびCRX37（SEQ ID NO:73）であった。両セットのプライマーとも上記例８に記載されている。
２つのプローブパネル、すなわち一方はDRB増幅の増幅産物とのハイブリダイゼーション用、他方はDRB1特異的増幅の増幅産物とのハイブリダイゼーション用は、以下に示す。各プローブのヌクレオチド配列は配列掲載部に掲げるが、各プローブの配列同定番号（SEQ ID NO）は以下に示す。
0003643375.tif 000038
0003643375.tif 000039
DRBプローブ１〜８はほぼアミノ酸９〜13の領域に特異的であり、プローブ９はアミノ酸58に特異的であり、プローブ10はアミノ酸57〜60に特異的であり、プローブ11はアミノ酸67〜74に特異的である。DRB1プローブ13〜18,20,および21はアミノ酸67〜74に特異的であり、プローブ12はアミノ酸57に特異的であり、プローブは20アミノ酸26に特異的であり、プローブ22はアミノ酸57〜60に特異的である。対照プローブはアミノ酸51〜56に特異的である。
上記パネルに示したプローブは標識して、例７に記載のDRBタイピング方法に使用できることに留意すべきである。同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用される。
キットは２つの箱にパッケージされた。一つの箱にはDRB試薬を、他の箱にはDRB1試薬を充填した。各箱にパッケージされたものは、DRBまたはDRB1 PCRミックス、DNAコントロール、およびタイピングストリップ;8mM塩化マグネシウム溶液；鉱油;SA−HRP接合体；発色原（TMB）；反応管；ならびに指示書であった。PCRは塩化マグネシウムおよび鋳型DNAを除くPCRに必要な試薬を含有する。記載の方法の実施に必要な他の試薬および装置はキットユーザーによって供給され、すべて一般に市販されていた。
PCR増幅に使用するのに適したサンプル調製操作はいくつか、本技術分野において既知である。好ましい操作は、Singer−Samら:Amplification 3:11,1989,およびWalshら:BioTechniques 10（４）:506−513,1991に記載された（両記載とも参考として本明細書に導入する）Chelex抽出法である。生物学的サンプルから核酸を抽出する他の技術の例には、Sambrookら:Molecular Cloning:A Laboratory Manual（New York,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）;Arrand:Preparation of Nucleic Acids Probes,pp18−30,in Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach（Hames ＆ Higgings編,IRL Press,1985）；またはPCR in Protocols,18〜20章（Innisら編,Academic Press,1990）の記載がある。すべて参考として本明細書に導入する。
すべてのDRB配列を増幅するためおよびDRB1配列を特異的に増幅するためのプライマー対は、２つの別個のPCR反応に使用される。増幅反応はSaikiら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230−6234,1989の記載（参考として本明細書に導入する）にほぼ従い、以下のように改良して行う。
反応は総容量100μｌ中サンプル25μｌを用いて実施する。各反応は,50mM KCl,10mM Tris−HCl（pH8.4）,1.5mM MgCl2,10μｇのゼラチン、各200μＭのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,0.2μＭの各ビオチン化増幅プライマー、ならびにThermus aquaticus DNAポリメラーゼ（PECI）を含有させる。
両増幅反応には同一の温度プロフィルを使用し、両反応を同じサーモサイクラー中で同時に行うことが可能にする。サーモサイクラーは、以下の温度プロフィル、すなわち95℃で60秒間変性、60℃で30秒間アニーリング、72℃で60秒間延長の35サイクルにプログラムする。サーモサイクラーは、最後のサイクルに続いて72℃でさらに７分間サンプルをインキュベートするようにプログラムする。
PCRからの増幅DNAは二重鎖で、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするように変性されなければならない。増幅DNAはサーモサイクラー中95℃で５〜10分間変性し、その温度に使用時まで保持する。別法として、変性した増幅DNAを95℃の温度から直接氷浴中に移すことができる。急速な冷却は、DNAを変性型で安定化する。増幅DNAは、ハイブリダイゼーションが行われるまで、氷浴中に保持する。
２個のナイロン膜ストリップのそれぞれに12種のプローブを付着させる。一方のストリップはDRB増幅産物とのハイブリダイゼーションに使用されるプローブを含有し、他のストリップはDRB1特異的増幅産物とのハイブリダイゼーションに使用されるプローブを含有する。ハイブリダイゼーション反応は、それぞれのプローブ含有ストリップを別個のウエル中に保持するトレー中で行われる。ハイブリダイゼーショントレーはPECIから市販されている。通常、キットで供給される。以下に記載するハイブリダイゼーション条件はDRBハイブリダイゼーションに特異的である。DRB1 DNAハイブリダイゼーションプロトコールはDRBプロトコールとは、DRB1ハイブリダイゼーションが50℃ではなく55℃で行われる点で異なる。プロトコールの他の点はすべて同一である。
ストリップを含む各ウエルは、予め加温したハイブリダイゼーション溶液（４×SSPEおよび0.5％重量／容量SDS）3ml、ついで25μｌの増幅DNAを加える。トレーの内容を注意深く混合下後、トレーを50℃の振盪水浴中に入れ50℃、約50rpmで20分間インキュベートする。
ストリップは最初、緊縮条件下の洗浄の前に洗浄液（1.0×SSPEおよび0.1％重量／容量SDS）10ml中、室温で数秒間洗浄し、各ウエルを吸引する。緊縮洗浄の温度および時間にはとくに制限はない。予め加温した洗浄液（10ml）を各ウエルに加え、トレーを、50℃の振盪水浴中約50rpmで12（±２）分間インキュベートする。各ウエルを吸引したのち、各ウエルに10mlの洗浄液を加え、トレーを室温で、旋回振盪機上約50rpmで５分間インキュベートし、ウエルを再び吸引する。
ストリップを含む各ウエルに、3mlの洗浄／酵素接合溶液（3.3mlの洗浄液と、使用の15分以内に調製した酵素接合体27μｌの溶液から）を加える。トレーを室温で、旋回振盪機上約50rpmで20分間インキュベートする。各ウエルから溶液を吸引し、ストリップを10mlの洗浄液中、室温、旋回振盪機上約50rpmで５分間洗浄する。最後に、洗浄液を各ウエルから吸引し、ついでストリップを発色工程に移す。
発色工程はDRBおよびDRB1の両者について同じである。各ウエルに10mlのクエン酸緩衝液（100mMクエン酸ナトリウム,pH5.0）を加え、トレーを約50rpmの旋回振盪機上に置く。好ましくは発色溶液はこの間に調製する（使用前10分以内）。各ウエルの発色溶液は、10mlのクエン酸緩衝液、10μｌの３％過酸化水素、および0.5ml［TMB］色素原溶液（PECIから市販されている）を穏やかに（渦を起こさない）混合する。トレーを旋回振盪機からはずし、クエン酸緩衝液を吸引し、新たに作成した発色溶液10mlを各ウエルに加える。トレーは、発色工程の始めから、アルミホイルのカバーを用いて遮光する。ストリップは、室温、旋回振盪機上約50rpmで30分まで発色させる。所望のシグナル強度が得られたならば直ちに、発色工程は終結させることができる。
所望のシグナル強度が達成されたならば、トレーを旋回振盪機からはずし、各ウエルの内容を吸引する。各ウエル内を10mlの脱イオン水で洗浄して発色を停止させる。水を加え、トレーを室温、約50rpmの旋回振盪機上で５分間振盪し、各ウエルの内容を徐々に注ぎ出す。少なくとも３回洗浄しなければならない。
ストリップは、タイピングトレー中に遮光して、２℃〜８℃で２〜３日間保存できる。ストリップは湿潤時に永久保存用に撮影する。ストリップは、わずかに褪色はするが、乾燥して暗所に保存することもできる。結果は、DNAプローブストリップ上の青色のドットのパターンを読取り解釈する。それぞれの青色ドットは、ビオチン化増幅生成物が固定化プローブとハイブリダイズしたことを意味する。すべてのDRB対立遺伝子を検出する内部対照プローブ（DRB42）は、ストリップ上の他の陽性ドットの強度と同等もしくはそれより弱い強度のドットを産生するように設計する。これは、陽性と評価すべき最低のドット強度を指示する。
上記キットのプローブは、31のDRB1タイプを識別する。これらのプローブで定義されるタイプの一部が関連対立遺伝子のセットである。図10には、1990対立遺伝子セットのプローブハイブリダイゼーションパターンを示す。図11,12,および13には、各プローブハイブリダイゼーションパターンの可能な判定を提示する。ストリップの結果は、図11〜13を直接用いて容易に判定できる。
結果の簡便な判定操作はまた、プローブハイブリダイゼーションパターンを入力すると、すでに入力されている既知の対立遺伝子のパターンと合致させて、可能な判定を提供するコンピュータープログラムによって行うこともできる。プローブハイブリダイゼーションパターンを可能性のある対立遺伝子の組み合わせと合致させるのに適当なアルゴリズムには、単純なテーブルルックアップおよび判定トリ−アルゴリズムが包含される。プログラム入力は手操作によっても、また青色のハイブリダイゼーションドットの強度を検出する自動ストリップリーダーによってもよい。
上述のように、この逆ドットブロットタイピングによっても、可能なすべてのタイプを完全に識別はできない。たとえば、このシステムはDR2血清型の細分類はできない。ある種のヘテロ接合体の組み合わせも完全には分割できない。これらはすべて、以下の例12に説明するように、対立遺伝子特異的増幅およびプローブのための別のプライマー対によって解決できる。
プライマーCRX28およびCRX29のハイブリダイゼーション位置のため、このプライマー対で増幅した場合、位置86に存在するアミノ酸変異は件すつできない。したがって、位置86のみが異なる対立遺伝子は識別できない。位置86におけるグリシンおよびバリンのみが異なる対立遺伝子は７対が知られている。これらの対立遺伝子を以下に掲げる。
0003643375.tif 000040
例10
一般DRB1タイピング戦略II
例４には、DRB1対立遺伝子のタイピングの戦略を記載した。ここには、別の戦略を記載する。DRB1遺伝子座におけるすべての45＋対立遺伝子の完全な識別を達成するためには、２段階検定が使用される。第一段階は、全サンプルのDRB一般プライマー、GH46およびGH50による増幅である。得られたPCR産物を固定化し、どの対立遺伝子特異的増幅を実施する必要があるかおよび第二の段階でスクリーンすべき増幅産物を決定するために、第一パネルのプローブで探査する（例４と同様にして）。増幅およびハイブリダイゼーションプロトコールは例４とほぼ同一である。対立遺伝子特異性を参照したハイブリダイゼーションパターンの判定は、各プローブパネルについて掲げる。
第一段階タイピング
プローブの第一のパネルは、表４に示したプローブパネルと、２、３のプローブが異なるだけで、類似している。以下のプローブパネルに示す対立遺伝子特異性中、対立遺伝子記号の最後の文字としてのＸは、特定された番号で始まるすべての対立遺伝子が認識されることを指示する。たとえば、030Xは、0301,0302および0303と同一である。
0003643375.tif 000041
プローブをハイブリダイズし、ついで、42℃で20分間洗浄するGH59を除き、42℃で15分間洗浄する。SSPE溶液はすべて0.1％SDSを含有する。各プローブは、５′末端でHRPに接合させる。第一のプローブパネルから得られたハイブリダイゼーションパターンに基づいて、サブタイピングこうていには対立遺伝子特異的増幅が必要になる。
DR7,DR9,およびDR10の各タイプは同定できる唯一の対立遺伝子しかなく、第一段階のプローブパネルから直接同定できる。実際、DR7タイプを特定する対立遺伝子には、DRB1＊0701およびDRB1＊0702がある。しかしながら、これらの２つの対立遺伝子は第三のエクソンのみで異なり、第二のエクソンからの配列を増幅および検出する本方法では識別できない。したがって、本発明の方法では唯一の明瞭な対立遺伝子が同定できる。
第二段階タイピング
DR2
すべてのタイプが血清学的にDR2である、Ｗ−Ｐ−Ｒ（GH104）に対する陽性シグナルを含有するサンプルはＷ−Ｐ−Ｒエピトープを有する対立遺伝子に特異的なプライマー対、AB83およびAB60で増幅される。得られた生成物は以下のパネルで探査される。
0003643375.tif 000042
示されたプローブは、ハイブリダイズし、ついで42℃で15分間洗浄する。SSPE溶液はすべて0.1％SDSを含有する。各プローブは、５′末端でHRPに接合させる。
DR3,DR5,DRw6
プローブGH56でエピトープYSTSに対する陽性シグナルを含有するサンプルは、DR3,DR5,またはDRw6のいずれかである。これらの対立遺伝子は、AB82およびAB60で特異的に増幅される。これらの対立遺伝子は、以下のプローブパネルを用いて識別できる。
0003643375.tif 000043
示されたプローブは、ハイブリダイズし、ついで42℃で15分間洗浄する。SSPE溶液はすべて0.1％SDSを含有する。各プローブは、５′末端でHRPに接合させる。
DR4
プローブGH59でVHエピトープに対する陽性シグナルを含有するサンプルはDR4である。これらの対立遺伝子は、AB54およびAB60で特異的に増幅される。これらの対立遺伝子は、以下のプローブパネルを用いて識別できる。
0003643375.tif 000044
示されたプローブは、ハイブリダイズし、ついで42℃で15分間洗浄する。ただし、GH59の場合は例外で、42℃で20分間洗浄する。SSPE洗浄溶液はすべて0.1％SDSを含有する。各プローブは、５′末端でHRPに接合させる。
DR1,DRw8,およびDRW12
プローブCRX33でWLFエピトープに対する陽性シグナルまたはプローブGH102でYSTGエピトープに対する陽性シグナルを含有するサンプルはDRB1特異的プライマーGH46およびCRX37で増幅される。これは、DR2,DR7,およびDR9を除きすべてのDRB1対立遺伝子も増幅する。対立遺伝子は、ついで、以下に示すプローブパネルを用いて識別できる。
0003643375.tif 000045
示されたプローブは、ハイブリダイズし、ついで42℃で15分間洗浄する。SSPE洗浄溶液はすべて0.1％SDSを含有する。各プローブは、５′末端でHRPに接合させる。
プローブによって認識されるエピトープの一部は多くの対立遺伝子によって共有されるので（たとえばFDR）、上記プローブパネルとのハイブリダイゼーションパターンから得られる結果は、プローブがDR1,DRw8,もしくはDRw12に関連するか、またはDRB1特異的プライマーで同様に増幅される他の対立遺伝子が関連するかを決定するために、ほかの対立遺伝子特異的増幅と比較される。WLFおよびYSTGエピトープはタイピングの結果の判定を単純化する。
例11
ヘテロ接合体の対立遺伝子サブタイピング
例10のプローブパネルとのハイブリダイゼーションパターン単独では、ある種のヘテロ接合個体に存在する対立遺伝子の明確な決定には不十分である。プローブハイブリダイゼーションパターンは、サンプル中にどの対立遺伝子エピトープが存在するかは指示するが、存在する特異的対立遺伝子を決定するには、どのエピトープがどの対立遺伝子に存在するかを知る必要がある。通常、エピトープ起源は、対立遺伝子の組み合わせの可能性に限定があるので、推測可能で、このような不明瞭はほとんど起こらない。起こることがある希な場合は対立遺伝子特異的増幅を用いて解決される。
DR5/DRe6ヘテロ接合体では、以下のプローブパターンが起こり得る。
0003643375.tif 000046
３つの異なるDR5/DRe6ヘテロ接合対立遺伝子の組み合わせが、このプローブハイブリダイゼーションパターンを生じる。これらの組み合わせを以下に掲げる。これらのヘテロ接合対立遺伝子の組み合わせは他のプローブでは識別できない。
0003643375.tif 000047
これらの可能性を識別するためには、位置86における独特の二形性を利用する他のプライマーが設計された。DRB1対立遺伝子はすべて、位置86にバリンまたはグリシンを含有する。上に掲げた各ヘテロ接合体では、一方の対立遺伝子は位置86にバリンを、他方はグリシンを含有する。DRB1＊1301,DRB1＊1104,およびDRB1＊1102はそれぞれ位置86にバリンを、DRB1＊1101,DRB1＊1302,およびDRB1＊1305はそれぞれグリシンを含有する。ＶまたはＧ特異的プライマーを群特異的プライマー（Ｗ−PR,VH,またはYSTS）と組み合わせて用いた増幅では、位置86における多形に基づいた単一対立遺伝子の増幅が可能になる。この方法で、各ヘテロ接合体に存在する２つの対立遺伝子の一方を選択的に増幅することが可能で、直接プローブハイブリダイゼーションによって決定できる。第二の対立遺伝子は、可能な対立遺伝子の組み合わせに基づく第一の対立遺伝子の知識から推定できる。
単一対立遺伝子増幅によるDR5/DRe6ヘテロ接合体のサブタイピングは、PCRプライマー対AS82/RAP05およびAB82/RAP06を用いて達成された。増幅は、PCR緩衝液に最終濃度1.0mM  MgCl2を添加したほかは例10と同様に実施した。サーモサイクラーは35サイクルにプログラムした。温度プロフィルは、94℃にランプ、94℃で30秒間変性、30秒間アニーリング、および70℃で延長とした。プローブハイブリダイゼーションは前述の通り行った。Ｖ−特異的（RAP06）およびＧ−特異的（RAP05）プライマーは以下に、また配列掲載部に示す。それぞれAB82と組み合わせて使用したが、他の群特異的プライマーも適当である。
0003643375.tif 000048
例12
DRB2段階タイピングキット
ここに記載されるキットは、可能な限り多数のタイプを独特に同定するために設計されたものである。プライマーおよびプローブは、逆ドットブロットフォーマットにおいて、DRB1およびDRB3遺伝子座の迅速な、しかしながら完全なタイピングを提供するために設計される。DRB1遺伝子座における全45＋対立遺伝子およびDRB3遺伝子座の３個の対立遺伝子の完全な識別を達成するために、２段階検定を使用する。第一段階は、全サンプルのDRB一般プライマー、DRB27（SEQ ID NO:105）およびDRB28（SEQ ID NO:106）による増幅である。得られたPCR産物を13プローブのストリップに対してスクリーニングし、これで対立遺伝子特異的増幅、および第二段階のスクリーニングが必要か否かが決定される。
増幅およびハイブリダイゼーションは例９と同様に行う。DRB一般的増幅からの増幅産物は、DRB1遺伝子座の第一可変領域に特異的な８つのプローブ、３つのDRB3遺伝子座（52a,52b,52c）に特異的な４つのプローブ、および１つのコントロールプローブを含有するプローブパネルに対してスクリーニングする。３つの対立遺伝子を有し、DR2ハロタイプに見出されるDRB5遺伝子座をタイピングするため、このストリップにさらにもう１つのプローブを付加することもできる。認識される特異的ハイブリダイゼーション領域およびタイプを以下に掲げる。
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DRB3タイプはこの検定の結果から決定され、この検定の結果に基づいて、どちらの対立遺伝子特異的増幅（ASA）を行う必要があるかを決定する。サンプルのタイピングに最も必要なものは２つであるが、５つの異なるASAを提供する。同じ３′プライマー、AB60たとえば、すべての５つのASAに代えて使用でき、通常、キット中に加えられる成分に包含される。５′プライマーによって、増幅特異性が付与される。各５′プライマーによって増幅されるDRBタイプおよび認識されるエピトープを以下に掲げる。プライマー２、３および４が設計され、広範囲に試験され、上記実施例で説明した。
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第二段階は、ASAからの増幅産物の５つのタイピングを可能にする一連のプローブに関する。一実施態様においては、すべてのプローブを単一のストリップに付着させ、この単一のストリップをASAからの生成物のタイピングに使用する。以下の領域に特異的なプローブがASAの結果のタイピングに十分である。
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「その他」の領域の多形は白人の間では極めて希である。しかしながら、本発明の重要な目的は非白人集団のタイピングも可能にすることである。これらの位置における他のプローブを、ヘテロ接合体対ホモ接合体の認識における不明瞭性の解決のために、包含させることもできる。
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【図１】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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