(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるアルツハイマー病の診断またはモニターにおける補助のための方法であって、該方法は、以下：
患者の脳脊髄液（CSF）サンプルまたは血漿サンプルにおいて、１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を測定する工程；
測定された量を、該１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の予め決定された指示値と比較する工程；
患者の状態を、該測定された量と予め決定された指示値との間の差に基づいて評価する工程、
を包含し、
そしてここで、該指示値を超える測定された量は、アルツハイマー病の診断における陰性の指標を提供し、そして該指示値以下である測定された量は、アルツハイマー病の診断における陽性の指標を提供する、方法。
【請求項２】
前記患者のサンプルがCSFであり、そして前記指示値が０.45ng/mlと０.7ng/mlとの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者のサンプルがCSFであり、そして前記指示値が０.5ng/mlである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
測定される前記Ａβ（ｘ−≧41）が少なくともＡβアミノ酸33〜41を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記予め決定された指示値が、より早い時期の同じ患者から測定された値であり、そして前記方法がモニター方法を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量が、前記患者サンプルを、アミノ酸残基13から26の間に位置するＡβまたはＡβフラグメントの接合領域に特異的な第１の結合物質に曝し、そして該患者サンプルを、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な第２の結合物質に曝すことにより該第１の結合物質と該可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との間の結合を検出することによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の結合物質が、アミノ酸残基33〜42を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の結合物質が、アミノ酸残基13〜26を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の結合物質と前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との結合が、該結合物質とＡβまたはＡβフラグメントとの結合複合体を分離し、該分離された結合複合体を、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な標識された第２の結合物質に曝し、そして該結合複合体における標識の存在を検出することによって検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
CSFサンプルまたは血液サンプル中の可溶性アミロイドβペプチド（ｘ−≧41）（Ａβ（ｘ−≧41））を検出するための方法であって、該方法は、以下：
Ａβの接合領域に特異的な第１の結合物質を使用して、可溶性Ａβ（ｘ−≧41）を該サンプルから捕捉する工程；および
Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な標識された第２の結合物質を使用して、可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の捕捉を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記サンプルが脳脊髄液である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）が固相上に捕捉され、該捕捉が、該固相を前記標識された第２の結合物質に曝し、その後該固相上の該標識の存在を検出することによって検出される、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
液性サンプル中の可溶性アミロイドβペプチド（ｘ−≧41）（Ａβ（ｘ−≧41））を検出するためのシステムであって、該システムは、
アミノ酸残基13から26の間のＡβの接合領域中のエピトープに特異的な第１の結合物質；およびＡβ（ｘ−≧41）のエピトープに特異的であるが、Ａβ（≦40）のエピトープと交差反応しない第２の結合物質を含み、
ここで、該第１の結合物質および第２の結合物質のうちの１つが固相に結合し、そして他方が標識されている、
システム。
【請求項１４】
前記第２の結合物質が、Ａβのアミノ酸33〜42を有するエピトープに特異的である、請求項13に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第１の結合物質が固相に結合し、そして前記第２の結合物質が標識されている、請求項13に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第１の結合物質および前記第２の結合物質が抗体である、請求項13に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第２の結合物質が酵素標識に結合されている、請求項13に記載のシステム。
【請求項１８】
前記酵素に対する基質をさらに含む、請求項17に記載のシステム。
【請求項１９】
CSF中のＡβ（ｘ−≧41）の量を変化させる能力を決定するための化合物をスクリーニングする方法であって、
アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物のCSF中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第１の量を測定する工程；
該化合物を該非ヒト動物に投与する工程；
該非ヒト動物のCSF中の該１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第２の量を測定する工程；および
該第１の量と該第２の量とを比較する工程を包含し、
この差は、該化合物が該CSF中の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を増加させるか、減少させるか、または変化させないままであるかを示し；
ここで、Ａβ（ｘ−≧41）の量を増加させる化合物は、アルツハイマー病の処置において有用であり得、そしてＡβ（ｘ−≧41）の量を減少させる化合物は、アルツハイマー病を悪化または促進させ得る、
方法。
【請求項２０】
前記非ヒト動物が齧歯類である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記齧歯類がマウスである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
患者におけるアルツハイマー病の診断またはモニターにおける補助のための方法であって、該方法は、以下：
患者のCSFサンプル中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を測定する工程；
測定された量を、該１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の予め決定された指示値と比較する工程；
該患者のCSFサンプル中のタウの量を測定する工程；
測定された量を、該タウの予め決定された指示値と比較する工程；および
患者の状態を、Ａβ（ｘ−≧41）およびタウの該測定された値と該予め決定された値との間の差に基づいて評価する工程、
を包含し、
ここでＡβ（ｘ−≧41）の測定された量が該指示値以下であり、かつタウの測定された量が該指示値以上であることは、アルツハイマー病の診断における陽性の指標を提供し、そしてＡβ（ｘ−≧41）の測定された量が該指示値を超え、かつタウの測定された量が該指示値未満であることは、アルツハイマー病の診断における陰性の指標を提供する、方法。
【請求項２３】
Ａβ（ｘ−≧41）に関する前記指示値が０.45ng/mlと０.7ng/mlとの間にあり、そしてタウに関する前記指示値が０.25ng/mlと０.4ng/mlとの間である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
Ａβ（ｘ−≧41）に関する前記指示値が０.5ng/mlであり、タウに関する前記指示値が０.3ng/mlである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
測定された前記Ａβ（ｘ−≧41）が少なくともＡβアミノ酸33〜41を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記予め決定された指示値が、より早い時期の同じ患者から測定され、そして前記方法がモニター方法を提供する、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量が、前記患者サンプルを、アミノ酸残基13から26の間に位置するＡβまたはＡβフラグメントの接合領域に特異的な第１の結合物質に曝し、そして該患者サンプルを、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な第２の結合物質に曝すことにより該第１の結合物質と該可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との間の結合を検出することによって測定される、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の結合物質が、アミノ酸残基33〜42を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の結合物質が、アミノ酸残基13〜26を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の結合物質と前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との結合が、該結合物質とＡβまたはＡβフラグメントとの結合複合体を分離し、該分離された結合複合体を、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な標識された第２の結合物質に曝し、そして該結合複合体における標識の存在を検出することによって検出される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
CSF中のＡβ（ｘ−≧41）およびタウの両方の量を変化させる能力を決定するための化合物をスクリーニングする方法であって、
アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物のCSF中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第１の量を測定する工程；
該非ヒト動物のCSF中のタウの第１の量を測定する工程；
該化合物を該非ヒト動物に投与する工程；
該非ヒト動物のCSF中の該１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第２の量を測定する工程；
該非ヒト動物のCSF中のタウの第２の量を測定する工程；および
該第１の量と該第２の量とを比較する工程を包含し、
この差は、該化合物が、CSFにおける、該可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を増加させるか、減少させるか、または変化させないままであるか、および該タウの量を増加させるか、減少させるか、または変化させないままであるかを示し；
ここで、Ａβ（ｘ−≧41）の量を増加させかつタウの量を減少させる化合物は、アルツハイマー病の処置において有用であり得、そしてＡβ（ｘ−≧41）の量を減少させかつタウの量を増加させる化合物は、アルツハイマー病を悪化または促進させ得る、方法。
【請求項３２】
前記非ヒト動物が齧歯類である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記齧歯類がマウスである、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
患者のサンプルにおいてアルツハイマー病を診断またはモニターするためのキットであって、該キットは、
Ａβ（ｘ−≧41）と結合するが、Ａβ（≦40）とは結合しない結合物質、およびタウに結合する結合物質；ならびに
患者のCSFサンプル中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を測定すること；
測定された量を、該１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の予め決定された指示値と比較すること；
患者のCSFサンプル中のタウの量を測定すること；
測定された量を、該タウの予め決定された指示値と比較すること；および
患者の状態を、Ａβ（ｘ−≧41）およびタウの該測定された量と該予め決定された指示値との間の差に基づいて評価すること、
についての指示書、
を含み、
ここでＡβ（ｘ−≧41）の測定された量が該指示値以下であり、かつタウの測定された量が該指示値以上であることは、アルツハイマー病の診断における陽性の指標を提供し、そしてＡβ（ｘ−≧41）の測定された量が該指示値を超え、かつタウの測定された量が該指示値未満であることは、アルツハイマー病の診断における陰性の指標を提供する、キット。
【請求項３５】
ＡβまたはＡβのフラグメントと結合するが、APPの他のフラグメントとは結合しない結合物質をさらに含む、請求項34に記載のキット。
【請求項３６】
Ａβ（ｘ−≧41）と結合するが、Ａβ（≦40）とは結合しない前記結合物質が、Ａβ中の番号40を超えるアミノ酸を含むエピトープに結合し、そしてＡβまたはＡβのフラグメントと結合するが、APPの他のフラグメントとは結合しない前記結合物質が、Ａβの接合領域に結合する、請求項35に記載のキット。
【請求項３７】
ａ）Ａβの接合領域に結合する非標識の結合物質;b）Ａβ中の番号40を超えるアミノ酸を含むエピトープと結合する検出可能に標識された結合物質;c）タウに結合する非標識の結合物質；およびｄ）タウに結合する、検出可能に標識された結合物質を含む、請求項36に記載のキット。
【請求項３８】
前記結合物質が抗体である、請求項37に記載のキット。
【請求項３９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項38に記載のキット。
【請求項４０】
Ａβ（ｘ−≧41）に関する前記指示値が０.45ng/mlと０.7ng/mlとの間であり、そしてタウに関する前記指示値が０.25ng/mlと０.4ng/mlとの間である、請求項34に記載のキット。
【請求項４１】
Ａβ（ｘ−≧41）に関する前記指示値が０.5ng/mlであり、タウに関する前記指示値が０.3ng/mlである、請求項40に記載のキット。
【請求項４２】
測定される前記Ａβ（ｘ−≧41）が少なくともＡβアミノ酸33〜41を含む、請求項41に記載のキット。
【請求項４３】
前記予め決定された指示値が、より早い時期の同じ患者から測定され、そして前記キットがモニターに有用である、請求項34に記載のキット。
【請求項４４】
請求項34に記載のキットであって、該キットは、アミノ酸残基13から26の間に位置するＡβまたはＡβフラグメントの接合領域に特異的な結合物質をさらに含み、かつＡβ（ｘ−≧41）に特異的な結合物質を含み、ここで前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量が、前記患者サンプルを、接合領域に特異的な該結合物質に曝し、そして該患者サンプルを、Ａβ（ｘ−≧41）と結合するがＡβ（ｘ−≦40）とは結合しない結合物質に曝すことにより該接合領域に特異的な該結合物質と該可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との間の結合を検出することによって測定される、キット。
【請求項４５】
Ａβ（ｘ−≧41）と結合するがＡβ（ｘ−≦40）とは結合しない前記結合物質が、アミノ酸残基33〜42を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項44に記載のキット。
【請求項４６】
アミノ酸残基13から26の間に位置するＡβまたはＡβフラグメントの接合領域に特異的な前記結合物質が、アミノ酸残基13〜26を有するＡβまたはＡβフラグメントのエピトープを認識する抗体である、請求項45に記載のキット。
【請求項４７】
接合領域に特異的な前記結合物質と前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との結合が、該結合物質とＡβまたはＡβフラグメントとの結合複合体を分離し、該分離された結合複合体を、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な標識された結合物質に曝し、そして該結合複合体における標識の存在を検出することによって検出される、請求項46に記載のキット。
【請求項４８】
患者サンプルにおいてアルツハイマー病を診断またはモニターするためのキットであって、該キットは、
Ａβ（ｘ−≧41）と結合するが、Ａβ（≦40）とは結合しない結合物質；ならびに
患者の脳脊髄液（CSF）サンプルまたは血漿サンプル中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を測定すること；
測定された量を、該１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の予め決定された指示値と比較すること；
患者の状態を、該測定された量と予め決定された指示値との間の差に基づいて評価すること、
についての指示書、
を含み、
ここで該指示値を超える測定された量が、アルツハイマー病の診断における陰性の指標を提供し、そして該指示値以下である測定された量が、アルツハイマー病の診断における陽性の指標を提供する、キット。
【請求項４９】
前記患者のサンプルがCSFであり、そして前記指示値が０.45ng/mlと０.7ng/mlとの間である、請求項48に記載のキット。
【請求項５０】
前記患者のサンプルがCSFであり、そして前記指示値が０.5ng/mlである、請求項48に記載のキット。
【請求項５１】
測定される前記Ａβ（ｘ−≧41）が少なくともＡβアミノ酸33〜41を含む、請求項48に記載のキット。
【請求項５２】
前記予め決定された指示値が、より早い時期の同じ患者から測定された値であり、そして前記キットがモニターに有用である、請求項48に記載のキット。
【請求項５３】
請求項48に記載のキットであって、該キットは、アミノ酸残基13から26の間に位置するＡβまたはＡβフラグメントの接合領域に特異的な第１の結合物質をさらに含み、かつＡβ（ｘ−≧41）に特異的な第２の結合物質を含み、ここで可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量が、前記患者サンプルを、アミノ酸残基13から26の間に位置するＡβまたはＡβフラグメントの接合領域に特異的な第１の結合物質に曝し、そして該患者サンプルを、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な第２の結合物質に曝すことにより該第１の結合物質と該可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との間の結合を検出することによって測定される、キット。
【請求項５４】
前記第２の結合物質が、アミノ酸残基33〜42を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項53に記載のキット。
【請求項５５】
前記第１の結合物質が、アミノ酸残基13〜26を有するＡβのエピトープを認識する抗体である、請求項54に記載のキット。
【請求項５６】
前記第１の結合物質と前記可溶性Ａβ（ｘ−≧41）との結合が、該結合物質とＡβまたはＡβフラグメントとの結合複合体を分離し、該分離された結合複合体を、Ａβ（ｘ−≧41）に特異的な標識された第２の結合物質に曝し、そして該結合複合体における標識の存在を検出することによって検出される、請求項55に記載のキット。
【請求項５７】
請求項13〜15および17〜18のいずれか一項に記載のシステムであって、前記第１の結合物質が抗体である、システム。
【発明の詳細な説明】
本願は、1992年10月26日に提出された同時係属出願第07/965,972号、1993年６月17日に提出された同時係属出願第08/079,511号、および1994年11月14日に提出された同時係属出願第08/339,141号に関し、これらの出願はすべて本明細書において参考として援用される。
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、概してアルツハイマー病の診断法あるいはモニター法に関する。より詳細には、本発明は、患者の流体サンプル中のタウタンパク質の量および／またはβアミロイドペプチド（ｘ−≧41）の量の測定およびこれらの量を診断指標として使用することに関する。
アルツハイマー病（AD）は、記憶、認識、論考、判断力および情緒安定性の進行性損失によって臨床的に特徴づけられる変性脳障害であり、深刻な精神的衰退に徐々に導き、最終的には死に至らしめる。ADは、老人における進行性精神障害（痴呆）の非常に一般的な原因であり、米国における医学的死因のうちで４番目に高いものであると考えられている。ADは世界中のすべての人種および民族で観察され、現在および将来の主要な公衆衛生問題を呈している。現在、米国だけでも約２百万〜３百万人がこの疾患に冒されていると見積もられている。現在のところ、ADは治癒不可能である。ADを効果的に防止する治療法、あるいはその徴候または進行を逆転させる治療法は、現在のところ知られていない。
ADに冒されている個体の脳は、老人斑と称される特徴的な病変および神経細線維もつれを示す。これらの病変の多数は、ADに冒されている患者において、記憶および認識機能のために重要なヒトの脳のいくつかの領域で一般的に見出される。より少数のこれらの病変は、臨床的にADを罹っていない老人の脳において、より制限された解剖学的分布で時折見出される。老人斑およびアミロイド血管症も、21トリソミー症候群（ダウン症候群）およびオランダ型のアミロイド症を伴う遺伝性脳出血（HCHWA−Ｄ）に冒された、ある年齢を超えた個体の脳を特徴づける。現在のところ、ADの確実な診断には、通常、その疾病によって死亡した患者の脳組織中の、あるいは、まれにではあるが、侵襲的神経外科的手順の間に採取された脳組織の小さな生検サンプル中の上記の病変を観察することが必要になる。ADおよび上記のその他の障害に特徴的な老人斑および血管アミロイド沈着物（アミロイド血管症）の主要な化学構成要素は、アミロイドβペプチド（Ａβ）あるいは時折βAP、ＡβＰ、またはβ/A4と称される約39〜43アミノ酸のおよそ4.2キロダルトン（kD）タンパク質である。Ａβが最初に精製され、部分アミノ酸配列がGlennerおよびWong（1984）Biochem.Biophys.Res.Commun.120:885−890に報告された。最初の28個のアミノ酸の単離手順および配列データは、米国特許第4,666,829号に記載されている。番号40を超えるアミノ酸を有するＡβの形態は、最初にKangら（1987）Nature325:733−736に記載された。
Roherら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:10836−840は、Ａβ（１−42）が、顕著な量の異性化されラセミ化されたアスパルチル残基を有する神経炎性局面の主要な構成要素（90％）であることを示した。著者らはまた、Ａβ（17−42）が拡散斑の大部分を占め（70％）、一方、Ａβ（１−40）は髄膜脈管斑の主要な構成要素であってＡβ全体の60％を占め、実質血管沈着物においてＡβ（１−42）はＡβ全体の75％を占めることを示した。Iwatsuboら（1994）Neuron13:45−53は、Ａβ42（43）陽性老人斑は、散発性AD脳における主要な種であることを示した。
この数年間の間に行われた分子生物学的およびタンパク質化学的分析によって、Ａβが、ヒトを含む様々な動物の多数の組織における細胞によって通常生成される、βアミロイド前駆体タンパク質（APP）と称されるさらに大きな前駆体タンパク質の小さいフラグメントであることが示されている。APPをコードする遺伝子の構造を知ることによって、現在のところ未知の酵素（プロテアーゼ）によりAPPのカルボキシ末端から切断されるペプチドフラグメントとしてＡβが生じることが示されている。ＡβフラグメントがAPPから切断され、次いで、脳組織ならびに脳血管壁および髄膜血管壁においてアミロイド斑として沈着する正確な生化学的メカニズムは、現在のところ知られていない。
いくつかの証拠は、Ａβの進行性脳沈着がADの病因において根本的役割を果たし、数年あるいは数十年ほど認識可能な徴候に先行し得ることを示している（概説については、Selkoe（1994）J.Neuropath.and Exp.Neurol.53:438−447およびSelkoe（1991）Neuron6:487を参照）。最も重要な１つの証拠は、APPの770アミノ酸イソ型のアミノ酸717位でのミスセンスDNA変異が、遺伝子的に決定された（家族性）形態のADを患ういくつかの家族のうちの罹病メンバーにおいて見出され得るが、非罹病メンバーには見出されないという1991年の発見である（Goateら（1991）Nature349:704−706;Chartier Harlanら（1991）Nature353:844−846;およびMurrellら、（1991）Science254:97−99）。Suzukiら（1994）Science264:1336−1340は、717位変異を有する人では、Ａβ（１−40）より高い割合のＡβ（１−42）が存在することを示した。
さらに、スウェーデン人家族において見出された（695のイソ型に関して）リジン595−メチオニン596をアスパラギン595−ロイシン596に変化させる二重変異が1992年に報告され（Mullanら、（1992）Nature Genet 1:345−347）、スウェーデン変異と称される。遺伝的連鎖分析は、こららの変異およびAPP遺伝子におけるある種の他の変異が、このような家族の罹病メンバーにおけるADの特異的な分子レベルでの原因であることを示している。さらに、APPの770アミノ酸イソ型のアミノ酸693位における変異は、Ａβ沈着病であるHCHWA−Ｄの原因として同定され、アミノ酸692位におけるアラニンからグリシンへの変化は、ある患者ではADに類似するが、他の患者ではHCHWA−Ｄに類似する表現型を生じるようである。ADの遺伝学に基づく症例におけるAPPのこれらあるいはその他の変異の発見は、APPの変化および続くＡβフラグメントの沈着によってADが生じ得ることを示している。
神経細線維もつれは、主に、微小管タンパク質であるタウから構成される。Z.S.Khachaturian（1985）Arch.Neurol.42:1097−1105。近年の研究により、タウはアルツハイマー病患者のCSFにおいて上昇することが示されている。M.Vandermeerenら（1993）J.Neurochem.61:1828−1834。
ADの基本的なメカニズムの理解における進展にもかかわらず、この疾患の診断に用いる方法を開発する必要が未だに存在する。タウのレベルはアルツハイマー病の診断においてある程度の補助になるが（M.Vandermeerenら、上記）、より多くのマーカーおよびより特異的なマーカーが有用である。Ａβに関連する病的状態の診断に用いる方法を提供することがさらに望ましい。ここで、この診断は、患者の液性サンプル中のＡβおよび関連フラグメントの検出に少なくとも一部は基づく。Ａβ検出のための特異的アッセイは、液性サンプル中の非常に低濃度のＡβおよび関連フラグメントを検出し得、そしてサンプル中に存在し得るＡβとAPPの他のフラグメントとを区別し得るべきである。
2.背景技術の説明
GlennerおよびWong（1984）Biochem.Biophys.Res.Commun,120:885−890および米国特許第4,666,829号を上述した。'829号特許は、患者サンプル中の「アルツハイマー病のアミロイドポリペプチド」を検出し、そしてADを診断するために28アミノ酸Ａβフラグメントに対する抗体を用いることを示唆している。検出あるいは診断を示すデータは提示されていない。
多くの生化学電子顕微鏡的および免疫化学的研究が、Ａβは正常なpHの生理学的溶液には高度に不溶性であることを報告している。例えば、GlennerおよびWong（1984）Biochem.Biophys.Res.Commun.122:1131−1135;Mastersら（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4245−4249;Selkoeら（1986）J.Neurochem.46:1820−1834;Joachimら（1988）Brain Research474:100−111;Hilbichら（1991）J.Mol.Biol.218:149−163;BarrowおよびZagorski（1991）Science253:179−182;ならびにBurdickら（1992）J.Biol.Chem.267:546−554を参照。さらに、この不溶性は、親タンパク質（APP）を細胞の脂質膜に固定する領域の一部を構成する一連（stretch）の疎水性アミノ酸を含むＡβのアミノ酸配列によって予測され、そしてそれと一致する。疎水性の脂質固定タンパク質（例えば、Ａβ）は、細胞膜あるいは膜フラグメントと結合したままであり、生理学的細胞外液中には存在しないことが予想される。上記の研究およびその他の多くの研究は、AD脳アミロイド沈着物から精製された天然ＡβあるいはＡβ配列を含む合成ペプチドの生理学的溶液中での不溶性を報告している。脳アミロイド沈着物からのＡβの抽出およびそれに続く可溶化は、強力な非生理的溶媒および変性剤の使用を必要とした。ヒト組織の細胞外液を模倣する生理学的緩衝化塩溶液は、一様にＡβを可溶化できなかった。
血漿あるいはCSF中のAPPあるいはそのフラグメントを検出するという別の試みも行われている。インタクトなＡβ領域を含まないAPPの大きな分泌フラグメントが、ヒト脳脊髄液中（Palmertら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6338−6342;Weidemannら（1989）Cell57:115−126;Henrikssonら（1991）J.Nuerochem.56:1037−1042;Palmertら（1990）Neurology40:1028−1034;およびSeubertら（1993）Nature361:260−263）および血漿中（Podlisnyら（1990）Biochem.Biophys.Res.Commun.167:1094−1101）で見出されている。血漿中におけるAPPのカルボキシ末端部分のフラグメントの検出も報告されている（Rumbleら（1989）N.Engl.J.Med.320:1446−1452）が、そのようなフラグメントの検出には失敗している（Schlossmacherら、（1992）Neurobiol.Aging13:421−434）。
天然および合成Ａβの明らかな不溶性にもかかわらず、Ａβは、体液（例えば、脳脊髄液（CFS）あるいは血漿）中に生じ得ると推測されていた（Wongら、（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:8729−8732;Selkoe（1986）Neurobiol.Aging7:425−432;Pardridgeら（1987）Biochem.Biophys.Res.Commun.145:241−248;Joachimら（1989）Nature341:226−230;Selkoeら（1989）Neurobiol.Aging10:387−395）。
CSF中および血漿中のＡβを測定するいくつかの試みは、ラジオイムノアッセイ法（1990年11月１日公開のWO90/12870）およびサンドイッチELISA（Wisniewski、Alzheimer's Disease、BeckerおよびGiacobini編、Taylor and Francas,N.Y.206頁、1990年;KimおよびWisniewski、Techniques in Diagonostic Pathology、Bullockら編、Academic Press、Boston106頁；および1990年11月１日公開のWO90/12871）の両方によって報告されている。これらの報告は、体液中の非常に低レベルのＡβ免疫反応性を検出したが、さらにこの免疫反応性を直接精製し特徴づけ、これがＡβを表したかを決定する試みはなされておらず、努力は放棄された。培養細胞によるＡβ生成の可能性は、考えられても示されてもいなかった。
過去を振り返ると、体液中のＡβを容易に検出することができなかったのは、測定を妨げた、重畳領域を有するアミロイド前駆体フラグメントあるいはＡβのフラグメントが存在すること、およびインタクトなＡβに完全に特異的な抗体が存在しないことに起因するようであった。これは、おそらくは、両方の群によって用いられる抗体が、CSF中に存在することが知られているＡβの一部分を含む他のAPPフラグメントと交差反応し、それによって、インタクトなＡβ（存在する場合）の測定を妨害するからである。これらの困難は、インタクトなＡβの中心接合領域中のエピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いることによって克服された（Seubertら（1992）Nature359:325−327）。
Seubertら（1992）Nature359:325−327およびShojiら、Science（1992）258:126−129は、体液中の別個のＡβの存在についての最初の生化学的証拠を提供した。Vigo−Pelfreyら（1993）J.Neurochem.61:1965−1968は、脳脊髄液における多数のＡβ種の同定を報告した。
発明の要旨
本発明は、患者におけるＡβに関連する病的状態の診断およびモニターにおける補助のために有用な方法を提供する。ここで、この方法は、患者の液性サンプルにおいて、１またはそれ以上の可溶性Ａβまたはそのカルボキシ末端に番号40を超えるアミノ酸残基を有する可溶性Ａβフラグメントの特異的検出に依存する。こららのペプチドを、「Ａβ（ｘ−≧41）」（アミノ酸番号「ｘ」からアミノ酸番号41以上のアミノ酸までのＡβ）と呼ぶ。１つの実施態様において、測定されるペプチドは、少なくともアミノ酸13〜41を含むＡβ（ｘ−≧41）のクラスに属する。
Ａβに関連する病的状態の診断およびモニターのためには、患者の液性サンプル（特に脳脊髄液（CSF））中の前記ペプチドの量が測定され、そして予め決定された値（例えば、指示値（診断の場合）または以前の患者の値（モニターの場合））と比較される。診断の場合、指示値を超えるＡβ（ｘ−≧41）の測定量は、患者がADまたは他のＡβに関連する病的状態に罹患していないことの強い指標であると考えられる。しかし、この情報はまた、確定的な診断をなす際には他の要因と合わせて考慮され得る。指示値以下であるＡβ（ｘ−≧41）の測定量は、患者がADまたは他のＡβに関連する病的状態に罹患していることの陽性の指標であると考えられる。試験される個体の低いＡβ（ｘ−≧41）状態は、通常、それ自体のみでは、Ａβに関連する病的状態の確定的な診断とは考えらないが、代わりに、診断をなす際にＡβに関連する病的状態の受容される他の臨床的徴候と合わせて考慮される。脳脊髄液において、約0.5ng/mlの指示値が有用である。
特定の局面において、本発明は、液性サンプルにおいて可溶性Ａβ（ｘ−≧41）を検出するために有用で、そして上述の患者診断方法およびモニター方法において用い得る特異的結合アッセイを提供する。本発明に従う特異的結合アッセイは、Ａβ（ｘ−≧41）分子の異なるエピトープまたは決定部位に特異的な２つの結合物質を用いる。一方のエピトープまたは部位は、一般に、これらのフラグメントとの交差反応を避けるよう、他のフラグメントまたはアミロイドβ前駆体タンパク質（APP）の分解生成物には見出されない。Ａβ内の接合領域を認識する抗体は、特に有用である。ここで、この接合領域は、残基Lys16とLeu17との間（Eschら（1990）Science248:492−495およびAndersonら（1991）Neuro.Science Lett.128:126−128）の、代表的にはアミノ酸残基13〜26にわたる、APPの正常なタンパク質分解的切断の部位の付近に位置する。他方のエピトープまたは部位は、認識に必須であるが、Ａβまたはカルボキシ末端アミノ酸が番号40以下であるＡβフラグメントと交差反応しない、Ａβのアミノ酸番号40を超える少なくとも１つのアミノ酸を含む。例示的な特異的結合アッセイは、捕捉抗体が、上記のように、Ａβの接合領域に特異的であり、そして第２の検出可能な抗体が、番号40を超える少なくとも１つのＡβアミノ酸を含むエピトープまたは部位に特異的である２部位（サンドイッチ）アッセイを包含する。特に、第２の抗体はＡβアミノ酸33〜42を含むハプテンで免疫することによって作製され得る。
本発明はまた、Ａβ（ｘ−≧41）と微小管タンパク質タウとの両方の測定を包含する、患者におけるアルツハイマー病の診断またはモニターにおける補助のための方法を提供する。この方法は、患者サンプル中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を測定する工程；この測定量を予め決定した可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量と比較する工程；患者サンプル中のタウの量を測定する工程；この測定量を予め決定した上記タウの量と比較する工程；およびＡβ（ｘ−≧41）およびタウの測定量と予め決定した量との間の差に基づいて患者の状態を評価する工程を包含する。また、予め決定した量は指示値または以前の患者値であり得る。Ａβ（ｘ−≧41）の指示値以下およびタウ指示値以上の測定量は、アルツハイマー病の診断における陽性の指標を提供する。Ａβ（ｘ−≧41）の指示値を超え、そしてタウ指示値未満の測定量は、アルツハイマー病の診断における陰性の指標を提供する。Ａβ（ｘ−≧41）について約0.5ng/mlおよびタウについて約0.3ng/mlのCSF中の指示値が有用である。
本発明はまた、アルツハイマー病の診断における補助のためのキットを提供する。このキットは、Ａβ（ｘ−≧41）と結合するがＡβ（≦40）とは結合しない結合物質、およびタウと結合する結合物質を含む。１つの実施態様において、キットは４つの抗体を含む:a）Ａβの接合領域に結合する非標識抗体;b）Ａβ中の番号40を超えるアミノ酸を含むエピトープと結合する検出可能に標識された抗体;c）タウに結合する非標識抗体；およびｄ）タウに結合する、検出可能に標識された抗体。
別の局面において、本発明は、液性サンプルにおいて１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）を検出するためのシステムを提供する。このシステムは、上記のような、Ａβの接合領域のエピトープに特異的な第１の結合物質（代表的には、抗体）、および認識に必須のカルボキシ末端に、Ａβのアミノ酸番号40を超えるアミノ酸を含むＡβのエピトープに特異的な第２の結合物質（代表的には、抗体）を含む。第１の結合物質は、固相に結合した抗Ａβ抗体であるが、他方はＡβのカルボキシ末端に対するレポーター抗体である。レポーター抗体は、それ自身が標識され得、または別の抗体（例えば、標識されたまたは酵素結合された抗ウサギ抗体によって認識可能なウサギ抗体）によって検出可能であり得る。このシステムは、さらに酵素標識のための基質を含む。このシステムは、液性サンプルにおけるＡβ（ｘ−≧41）の検出のために、高い特異性および感度を有する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を実施する際に有用である。
別の局面において、本発明は、CSFにおけるＡβ（ｘ−≧41）の量を変化させるその能力を測定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物のCSF中の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第１の量を測定する工程；上記化合物をこの非ヒト動物に投与する工程；この非ヒト動物のCSF中の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第２の量を測定する工程；および第１の量と第２の量とを比較する工程を包含する。この差は上記化合物がCSF中のＡβ（ｘ−≧41）を増大させるか（この場合、この化合物はアルツハイマー病の処理に有用であり得る）、またはこの量を減少させるか（この場合、この化合物はアルツハイマー病を悪化または促進し得る）を示す。非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯類、そして最も好ましくはマウスである。
別の局面において、本発明は、CSF中のＡβ（ｘ−≧41）およびタウの両方の量を変化させるその能力を測定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物のCSF中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第１の量を測定する工程；この非ヒト動物のCSF中のタウの第１の量を測定する工程；上記化合物をこの非ヒト動物に投与する工程；この非ヒト動物のCSF中の１またはそれ以上の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の第２の量を測定する工程；この非ヒト動物のCSF中のタウの第２の量を測定する工程；および第１の量と第２の量とを比較する工程を包含し、この差は、上記化合物が、CSFにおける、可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量を増大させるか、減少させるかまたは変化させないままであるか、およびタウの量を増大させるか、減少させるか、または変化させないままであるかを示す。この情報は、上記のように、アルツハイマー病を処置することにおいて有用であり得るか、あるいはアルツハイマー病を悪化または促進させ得る化合物を同定するために有用である。非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯類、そして最も好ましくはマウスである。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ａβ（28）でもＡβ（38）でもＡβ（40）でもなくＡβ（42）を検出するための抗体266（Ａβ接合領域に特異的）および抗体277/2（Ａβアミノ酸33〜42に特異的）を使用するELISAアッセイの結果を示す。
図２は、ELISAによって検出される、Ａ群におけるコントロールの患者（Ｃ）およびADの患者（AD）のCSF中のＡβ（ｘ−≧41）の量を示す。
図３は、ELISAによって検出される、Ｂ群におけるAD患者（AD）、非アルツハイマー病の神経学的コントロール（NC）およびコントロール（Ｃ）のCSF中のＡβ（ｘ−≧41）の量を示す。
図４は、ELISAによって検出される、AD患者（AD）、非アルツハイマー病の神経学的コントロール（ND）、および非痴呆コントロール（NC）のCSF中のＡβ（ｘ−≧41）の量を示す。
図５は、アルツハイマー病患者（AD）、非アルツハイマー病の神経学的コントロール（ND）、および非痴呆コントロール患者（NC）のCSF中のタウの量を示す。
図６は、アルツハイマー病患者（AD）、非アルツハイマー病の神経学的コントロール（ND）、および非痴呆コントロール（NC）のCSF中のＡβ（ｘ−≧41）およびタウの量を示す。図４および５のデータを、AD群を識別する際に、２つの尺度を同時に考慮することの効果を示すために組み合わせる。線は最適化されたカットオフを示す。高タウ／低Ａβ（ｘ−≧41）の象限（quadrant）にはAD患者が含まれる（例外がただ１つ存在する;21/22患者）が、低タウ／高Ａβ（ｘ−≧41）の象限には、コントロールの個体のみが含まれる。
特定の実施態様の説明
本発明は、アルツハイマー病に罹病した個体の脳脊髄液（「CSF」）が、一般に、アルツハイマーでない個体のCFS中に存在する正常範囲のまさに下限量（特に、約0.5ng/ml未満）のＡβ（ｘ−≧41）を含むという発見の少なくとも一部に起因する。この発見は驚くべきものである。なぜなら、アルツハイマー病に罹病したヒトの脳組織におけるＡβ沈着物の大部分がＡβ（１−42）であり、そしてアルツハイマーでない個体におけるＡβ（１−42）の量に比較して顕著に上昇しているからである。
この発見に基づいて、本発明は、アルツハイマー病を診断およびモニターする方法を提供する。１つの方法に従って、まず患者のサンプルが得られる。患者のサンプルは通常液性サンプルであり、そして好ましくは、脳脊髄液である。次いで、患者のサンプルにおける可溶性Ａβ（ｘ−≧41）の量が測定される。その量を測定する好ましい方法は、本明細書中に記載のサンドイッチアッセイの使用による。次いで、測定された量は予め決定された値（例えば、診断の場合における指示値）、またはモニターの場合における事前の患者の値と比較される。患者の状態は、２つの量の間の差に基づいて評価される。
以下でさらに詳細に記載されるように、本発明の方法は、試験された個体におけるADおよび他のＡβに関連した病的状態の陽性および陰性の両方の指標として有用である。実験の節におけるデータは、アルツハイマー病に罹病していない個体が、約0.2ng/ml〜約1.0ng/mlの範囲の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）のCSF濃度を有することを示す。しかし、アルツハイマー病の患者は、一般に0.5ng/ml未満の可溶性Ａβ（ｘ−≧41）のCSF濃度を有する。それゆえ、約0.5ng/mlの指示値より上の測定量は、アルツハイマー病の非常に強力な陰性の指標である。つまり、このようなレベルを有する個体は、Ａβに関連した病的状態および、特に、アルツハイマー病にほとんど罹病していないと考えられる。0.7ng/mlの指示値は、検出される偽陰性の数を減少させ、そしてまた、予め決定される量として有用である。対照してみると、0.5ng/mlの指示値未満の測定量は、アルツハイマー病の陽性の指標であり、そしてこれらのレベルを有する個体はアルツハイマー病に、より罹病しやすいと考えられる。0.45ng/mlの指示値は、偽陽性の数を減少させ、そして予め決定された値としても有用である。しかし、0.5ng/mlおよび0.45ng/ml未満の値は、アルツハイマーでない個体において見出される正常範囲の下限にあるので、指示レベル未満の測定された量だけでは、アルツハイマー病の診断を提供するのに十分でない。それゆえ、本発明の方法は、NINCDS−ADRDA診断基準に記載される症状（例えば、臨床上の痴呆および記憶障害）のような、他の公知のAD症状も考慮する診断手順の一部として有用である。
本発明はまた、個体のCSFにおいて、Ａβ（ｘ−≧41）が正常範囲の下限であるという所見（finding）をタウが正常量より高いという所見と合わせると、いずれか単独の所見よりも強力なアルツハイマー病の陽性の指標であるという発見、および個体のCSFにおいてＡβ（ｘ−≧41）が高レベルであり、かつタウが低レベルであるという所見は、アルツハイマー病の非常に強力な陰性の指標であるという発見に一部帰因する。従って、これらの２つのマーカーの併用は、重要な補足的診断情報を提供するようである。
図６に示されるデータは、高いタウ（約0.3ng/mlを超える）および低いＡβ（ｘ−≧41）（約0.5ng/ml未満）を示す患者が、アルツハイマー病を有する96％（22/23）の確率を有することを示す。この研究におけるアルツハイマー病患者の59％（22/37）はこのカテゴリーに分類される。逆に、低いタウ（約300ng/ml未満）および上昇したＡβ（ｘ−≧41）を示す患者は、アルツハイマー病を有さない100％（28/28、図６）の確率を有する。わずかに半分を超えるアルツハイマー病でない被験体（28/52、54％）がこのカテゴリーに分類される。ひとまとめにして考えると、CSFタウとＡβ（ｘ−≧41）とを組み合わせた分析は、この研究において登録された全ての個体のわずかに半分を超える個体におけるアルツハイマー病の存在または非存在のいずれかについて高度に予言的であった。組み合わせたCSFタウ測定およびＡβ（ｘ−≧41）測定は、低Ａβ（ｘ−≧41）／低タウ群に分類された患者においては有益ではない。それにもかかわらず、高い特異性およびたとえ中度の感度であっても、何らかの試験がアルツハイマー病の包含または除外を補助する能力は大いに重要である。
本発明の第２の方法によれば、患者のサンプルにおける可溶性Ａβ（ｘ−≧41）およびタウの両方の量が測定される。タウの量を決定する１つの有用な方法は、以下に、より詳細に記載されるようにELISAによる。次いで、Ａβ（ｘ−≧41）およびタウの測定量が、それぞれ予め決定した値と比較される。患者の状態は、予め決定した値と測定値との間の差に基づいて評価される。
以下に論議されるように、指示値は、用いられる特定の結合物質および検出されるべき特定のＡβ（ｘ−≧41）およびタウタンパク質に基づいて較正され得る。較正は、Ａβに関連した疾患を有する個体由来の標準、およびそのような疾患を有さない個体由来のコントロール標準に対して結合物質を試験する工程を包含する。指示値は、当業者が進んで黙認する偽陽性または偽陰性の数に基づくこれらの結果から選択される。異なる結合物質を用い、そして本明細書中に記載の目的に関する指示値は、本明細書中に記載の指示値とおおよそ同じであると予想される。Ａβ（ｘ−≧41）に対しては0.45ng/ml未満で、タウに対しては0.4ng/mlを超える指示値は、偽陽性の結果の数を減少させ；一方、Ａβ（ｘ−≧41）に対しては0.7ng/mlを超え、タウに対しては0.25ng/ml未満の指示値は、アルツハイマー病でないという不正確な指標の可能性を減少させる。
ADにおける減少したCSF Aβ（Ｘ−≧41）についての理由が、実際にプラーク沈着の進行に対して２次的であるならば、多くの神経学的疾患被験体および数人のコントロール被験体が、CSFにおける低いＡβ（ｘ−≧41）レベルを示した理由を説明できる。プラーク沈着は、認識障害に先行すると仮定され、そしてこれらの年老いた非AD被験体のかなりの部分は、次の数年以内にADを発症すると予想される（DMA Mannら（1992）Neurodegeneration1:201−215およびDL Priceら（1991）Neurobiol Aging12:295−312）。長期的な研究は、低いＡβ（ｘ−≧41）レベルがADに予言的である可能性と取り組むために明らかに必要である。
AD CSFにおけるタウのレベルが、年齢、MMSE、全てのＡβ、Ａβ42、またはApoEε４と関係しないこともまた見出された。ADにおけるタウの上昇についての正確な理由は不明なままであるが、この疾患におけるユーロンの変性の進行と組み合わされたAD脳組織における増加したタウのレベルに起因するようである（S.Khatoonら（1992）J Neurochem59:750−753）。
実施例の節に記載されるサンドイッチアッセイは、Ａβの接合領域およびＡβの残基33〜42に対して惹起された抗体を用いた。このアッセイにおいて、アルツハイマー病患者は、一般に、この抗体により検出したところ0.5ng/ml未満のレベルのＡβ（ｘ−≧41）を有した。0.5ng/mlの指示値は、一部分、使用される抗体により認識される特定のペプチドおよび較正を行う際に用いられるペプチドのロットの関数である。それゆえ、当業者は、試験においてＡβ（ｘ−≧41）を測定する際に使用されるべき試薬およびプロトコルを用いる再較正に予め決定した量の基礎をおき得る。
Ａβに関連した病的状態の初期診断に加えて、この疾患の進行を追うために、そして処置の有効性（ただし、このような処置が利用可能になる場合）を潜在的に追うために、Ａβの測定濃度をモニターし得る。Ａβ（ｘ−≧41）のレベルは、この疾患が進行するにつれて減少すると予想される。
本明細書中で使用される用語「アミロイドβペプチド」または「Ａβ」は、AD、ダウン症候群、HCHWA−Ｄ、および一部の正常な老齢の被験体の脳において、小脳および髄膜の血管における老人（アミロイド）斑（プラーク）およびアミロイド沈着物（アミロイド血管症）を含むアミロイドフィラメントのサブユニットを形成する、約4.2kDタンパク質をいう。Ａβは、フィラメント状の重合体の形態で生じ得る（この形態では、Ａβは、Ａβに関して記述されるアミロイドに特徴的なコンゴ−レッドおよびチオフラビン−Ｓ色素結合性を示す）。Ａβまたは、組織内で非フィラメント状形態（「プレアミロイド」または「アモルファス」または「拡散」沈着物）で生じ得、この形態ではコンゴ−レッドによる検出可能な複屈折性染色は生じない。髄膜血管から得られる不溶性形態のこのタンパク質の一部は、米国特許第4,666,829号に記載される。Ａβは、大きな膜貫通糖タンパク質（β−アミロイド前駆体タンパク質（APP）という）の約39個〜43個のアミノ酸フラグメントであり、ヒトの第21番染色体の長腕上の遺伝子によってコードされる。43アミノ酸より長いＡβの形態もまた、本明細書にて意図される。Ａβは、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）におけるＡβの相対的な移動度によってさらに特徴づけられる。43アミノ酸型のＡβの配列は以下の通りである：
0003634375.tif 000002
本明細書中で使用されるように、Ａβはまた、関連する多形型のＡβもいい、APP正常遺伝子のＡβ領域における変異によりもたらされるものを含む。
本明細書中で使用される用語「Ａβフラグメント」は、哺乳類細胞によって低濃度で生成されるＡβのフラグメントおよび分解産物をいう。特定のＡβフラグメントは、約3kDの分子量を有し、そして現在、例えばＡβのアミノ酸残基３〜34、６〜27、６〜34、６〜35、６〜42、11〜34、11〜40、17〜40、11〜43および12〜43を有するペプチドを含むと考えられる。
本明細書中で使用されるように、用語「Ａβ（ｘ−≧41）」は、アミノ末端がＡβのアミノ酸番号１で始まるか、あるいは切り詰められており、そしてカルボキシ末端がアミノ酸番号40を越えて伸びるＡβをいう。これらのペプチドおよびフラグメントは、不均質な群を含む。例えば、Ａβ（６−42）Ａβ（11−43）、およびＡβ（12−43）は、全てCSFにおいて見い出されている。しかし、この列挙は、限定されることを意図しない。その群の中の他のペプチドは、CFSに存在すると推定され、そして本明細書中に記載の方法を用いて検出可能である。
全てのＡβ（ｘ−≧41）群の中から測定される特定のペプチドは、使用される特定の測定方法に依存する。抗体のような結合物質を使用する場合、結合物質は、ペプチド群の中からの１つ以上に関し得る。例えば、Ａβ（１−40）と交差反応しない、Ａβのアミノ酸33〜42に対して惹起される抗体は、Ａβ（ｘ−42）に結合する。それはまた、Ａβ（ｘ−41）およびＡβ（ｘ−43）に結合し得る。本発明の１つの実施態様によれば、この方法は、少なくともＡβのアミノ酸13〜41を有するＡβ（ｘ−≧41）の量を決定する工程を包含する。これらの種は、接合領域（アミノ酸13〜26）を認識する抗体、および実施例に記載されるようにＡβアミノ酸33〜42を有するハプテンでの免疫により産生される抗体を利用するサンドイッチアッセイを使用して測定され得る。
本明細書中で使用される用語「Ａβ接合領域」は、APPのタンパク質分解プロセシングのターゲットであるアミノ酸残基16と17（Lys16およびLeu17）との間の部位に中心が置かれるＡβの領域をいう。このようなプロセシングは、種々のAPPフラグメントをもたらす。これらのフラグメントは、例えば、Ａβのアミノ酸16で終結し得、従って、これらは、本発明の方法における同定されるべき完全なＡβ分子に対する抗体に、潜在的に免疫学的に交差反応性である。抗体は、必要な特異性を表すことが見いだされているアミノ酸残基13〜29を含む合成ペプチドに対して惹起された。
本明細書に対して使用される用語「アミロイドβ前駆体タンパク質」（APP）は、ヒトにおける第21番染色体の長腕上に局在する同名の遺伝子によってコードされ、そしてそのカルボキシル側の３分の１の中にＡβを含むポリペプチドとして定義される。APPは、グリコシル化される単膜貫通タンパク質（single−membrane−spanning protein）であり、多くの哺乳動物組織内の広範な種類の細胞において発現される。ヒト中に存在することが一般に知られている、特定のイソ型のAPPの例として、「正常の」APPと呼ばれる、Kangら（1987）Nature325:733〜736に記載の695アミノ酸ポリペプチド;Ponteら（1988）Nature331:525〜527およびTanziら（1988）Nature331:528〜530に記載の751アミノ酸ポリペプチド；およびKitagutiら（1988）Nature331:530〜532に記載の770アミノ酸ポリペプチドが挙げられる。APPの特定の変形物の例は、位置および表現型の両方が異なり得る点変異体を含む（公知の変形変異の概説については、Hardy（1992）Nature Genet.1:233〜234を参照のこと）。
本明細書中で使用される用語「Ａβに関連した病的状態」は、アルツハイマー病（家族性アルツハイマー病を含む）、ダウン症候群、HCHWA−Ｄ、および脳の進行した老化を含むと定義される。
本明細書中で使用されるように、「タウ」は、微小管結合タンパク質のファミリーをいう。アルツハイマー病患者の脳における神経細線維もつれの対合したらせん状フィラメントは、タウタンパク質からなる（例えば、本明細書に参考として援用される、M.Goedertら（1989）Neuron3:519〜526およびM.Goedert（1993）TINS16:460〜465を参照のこと）。Goedertら（1989）もまた、タウに対するDNAおよびアミノ酸の配列を示す。
本明細書中で使用される用語「体液」は、測定可能な量のＡβ、Ａβフラグメント、またはタウタンパク質を含むと予想される哺乳動物宿主の液体をいい、特に、脳脊髄液（CFS）、血液、尿、および腹膜液を含む。用語「血液」は、全血ならびに血漿および血清をいう。
本発明の方法およびシステムは、カルボキシ末端のアミノ酸番号40を超えて伸びるＡβの種を検出し、従って、これらを例えばＡβ（40）のようなより短い種から区別する能力を包含する。Ａβ（ｘ−≧41）の検出は、ペプチドを検出するための当該分野で公知の任意の方法により達成され得るが、結合物質（例えば、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体など）を用いる免疫学的検出技術の使用が好ましい。特に適切な検出技術は、ELISA、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイなどを含む。単一の抗体を用いる適切な免疫学的方法、例えば、≧41型のＡβに特異的な抗体を用いるラジオイムノアッセイ、または単一抗体ELISA方法もまた、意図される。
従って、本発明はまた、Ａβ（≦40）と交差反応しないＡβ（ｘ−≧41）に特異的な抗体を提供する。これらの抗体は、Ａβの番号40を超えるアミノ酸を含む合成ペプチドで動物を免疫することにより作製され得る。例えば、合成ペプチドは、アミノ酸33〜42を含み得る。このような抗体の産生の特定の例は、実施例の節において提供される。
本発明の１つの実施態様によれば、Ａβ（ｘ−≧41）ペプチドの検出および測定は、２つの抗体の使用を包含する。ここで、一方の抗体は、Ａβにおける番号40を超えるアミノ酸を含有するエピトープに対して特異的であり、そして他方の抗体は、ＡβおよびＡβフラグメントをサンプル中に見出され得る他のAPPフラグメントから区別し得る。特に、Ａβの接合領域に対して単一特異性である抗体が、Ａβを他のAPPフラグメントから区別し得ることが見出されている。Ａβの接合領域は、アミノ酸残基16および17に中心を置き、代表的には、アミノ酸残基13〜26にわたり、そしてこのような接合部特異的抗体は、免疫原としてこの配列を有する合成ペプチドを用いて調製され得る。
好ましいイムノアッセイ技術は、捕捉抗体（固相に結合されている）としての接合部特異的抗体およびＡβにおける番号40を超えるアミノ酸を含むエピトープに結合する第２の抗体を用いる、２部位または「サンドイッチ」アッセイである。このような抗体を調製するための特定の方法、および代表的なELISAにおいてこのような抗体を利用するための方法は、本明細書中以下の実施例の節および関連する米国特許出願第07/965,972号（前出）に記載される。
Ａβに特異的な抗体は、所望の標的エピトープ（例えば、アミノ酸残基13〜29からなる接合領域およびアミノ酸残基33〜42からなるカルボキシ末端）を含む適切な抗原またはハプテンに対して調製され得る。簡便には、合成ペプチドが、従来の固相技術により調製され得、適切な免疫原に結合され得、そして従来技術により抗血清またはモノクローナル抗体を調製するために使用され得る。適切なペプチドハプテンは、通常、Ａβ内の少なくとも５個の連続する残基を含み、そして６より多い残基を含み得る。
合成ポリペプチドハプテンは、周知のMerrifield固相合成技術により生成され得、この技術において、アミノ酸は、伸長鎖に連続的に付加される（Merrifield（1963）J.Am.Chem.Soc.85:2149−2156）。アミノ酸配列は、上記のＡβの配列に基づき得る。
一旦、十分な量のポリペプチドハプテンが得られると、これは、HudsonおよびHay,Practical Immunology,Blackwell Scientific Publications,Oxford,第1.3章,1980（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に一般的に記載されるように、適切な免疫原キャリア（例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、または他の適切なタンパク質キャリア）に結合され得る。以下に提供する実施例において利用される代表的な免疫原性キャリアは、α−CD3ε抗体（Boehringer−Mannheim,クローン番号145−2C11）である。
一旦、十分な量の免疫原が得られると、所望のエピトープに特異的な抗体は、インビトロ技術またはインビボ技術により生成され得る。インビトロ技術は、免疫原にリンパ球を曝すことを含み、一方、インビボ技術は、適切な脊椎動物宿主内への免疫原の注入を必要とする。適切な脊椎動物宿主は、非ヒトであり、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギなどを含む。免疫原は、あらかじめ決定された日程にそって、動物に注入され、そして動物は定期的に採血され、ここで連続的な採血は、改善された力価および特異性を有する。注入は、筋肉内、腹腔内、皮下などになされ得、そして不完全フロイントアジュバントのようなアジュバントが用いられ得る。
所望であれば、モノクローナル抗体は、所望の特異性を有する抗体を産生し得る、不死化した細胞株を調製することにより得られ得る。このような不死化した細胞株は、種々の方法により産生され得る。簡便には、小脊椎動物（例えば、マウス）を、直前に記載の方法により所望の免疫原で過免疫する。次いで、脊椎動物を通常、最後の免疫の数日後に屠殺し、脾臓細胞を取り出し、そして脾臓細胞を不死化する。不死化の様式は、厳密ではない。現在、最も一般的な技術は、KohlerおよびMilstein（1975）Nature256:495−497により最初に記載された、ミエローマ細胞融合パートナーとの融合である。他の技術は、EBV形質転換、裸のDNA（例えば、オンコジーン、レトロウイルスなど）での形質転換、または細胞株の安定的な維持およびモノクローナル抗体の産生を提供する任意の他の方法を含む。モノクローナル抗体を調製するための特定の技術は、Antibody:A Laboratory Manual,HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory,1988（この開示全体が、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（抗血清）に加えて、本発明の検出技術はまた、抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ab）、Fv、VL、VH、および他のフラグメント）を使用し得る。しかし、ポリクローナル抗体の使用において、単一特異性抗体の集団を産生するためには、標的エピトープに対する抗血清を吸収することが必要とされ得る。特許および科学文献に現在十分に記載されるように、組換えにより生成された抗体（免疫グロブリン）およびそれらの変形物を用いることも可能である。例えば、EPO8430268.0;EPO85102665.8;EPO85305604.2;PCT/GB85/00392;EPO85115311.4;PCT/US86/002269;および日本国出願第85239543号を参照のこと。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。直前に記載したように調製される、抗体の結合特異性を模倣する他の組換えタンパク質を調製することも可能であり得る。
タウの検出もまた、当該分野において公知の、ペプチドを検出するための任意の方法により達成され得る。しかし、結合物質を用いる免疫学的検出技術の使用が好ましい。有用な検出技術は、上記で言及したすべての技術を含む。捕捉抗体および標識検出抗体（両方ともタウに対する）を含むELISAアッセイが、特に有用である。
タウに対する抗体は、AD脳または組換え供給源から精製されたタウを動物に接種することにより調製され得る。組換えタウは、J.Knopsら（1991）J Cell Biol1991:114:725−733に記載されるように、昆虫細胞における、pVL941−タウ−４反復イソ型を含むバキュロウイルスベクターからの発現により産生され得る。精製されたタウはまた、Immogenetics（Zwijndrecht,Belgium）より入手可能である。タウに対する抗体は、Sigma（St.Louis,MO）から入手可能である。さらなる供給源は、Lindscott録（directory）において同定され得る。
タウは、Merckenら（1992）J Neurochem58:548の方法により、AD脳から調製され得る。代表的には、50gの新鮮な脳をハサミで小片に切断し、そして緩衝液Ａ（20mM 2−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、80mM NaCl、2mM EDTA、0.1mM EGTA、1mM MgCl2、および1mM β−メルカプトエタノール、pH6.75）中で1:1（重量／容量）で、Teflonプランジャーを備えたPotterホモジナイザーを用いてホモジナイズする。ホモジネートを４℃にて150,000gで１時間遠心分離し、そして上清を沸騰水中で５分間加熱し、そして再び氷上で10分間冷却する。スラリーを、４℃にて150,000gで２時間遠心分離し、そしてその後、上清を回収する。熱安定性のサイトゾル抽出物を2.5％過塩素酸にし、そして４℃にて150,000gで１時間遠心分離し、その後、上清を3M Trisを用いて中和する。次いで、上清を、Centiprepコンセントレーター（Amicon,Lausanne,Switzerland）中で水中に透析および濃縮する。最終産物は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）（Laemmli法）において評価され得る。この調製物は、抗タウ抗体を産生するために動物を免疫するに有用である。
タウはまた、この調製物から免疫精製され得る。10mgの抗タウモノクローナル抗体を、製造者によって提唱される方法により1gの臭化シアン活性化Sepharose（Pharmacia）に結合させる。50mlの上記の熱安定性サイトゾル抽出物を、0.1Mリン酸緩衝液（pH8.5）中で1:2希釈し、そしてカラムにアプライする。カラムを0.1Mリン酸で洗浄し、そしてタウを0.1Mクエン酸（pH2.5）を用いて溶出し、そして1M NaOHを用いてすぐに中和する。画分は、10％ゲルでのSDS−PAGEおよび抗タウ抗体を用いるイムノブロッティングにより評価され得る。
本発明はまた、アルツハイマー病の診断を補助するアッセイを行うためのキットを提供する。キットは、Ａβ（Ｘ−≧41）を検出するための手段およびタウを検出するための手段を含む。手段は、公知または上記の任意の手段（例えば、結合物質）を含み得る。有用な結合物質は、抗体の結合部分を含有する分子（例えば、完全な抗体または抗体フラグメント）を含む。結合物質は、モノクローナル抗体であり得る。１つの実施態様において、キットは、Ａβ（Ｘ−≧41）には結合するがＡβ（≦40）には結合しない結合物質およびタウに結合する結合物質を含み得る。
１つの実施態様において、キットは、例えば、上記のように、それぞれの化合物を検出するためにサンドイッチELISAを行うために、抗体などを含む。１つの実施態様において、Ａβ（Ｘ−≧41）を検出するための手段は、Ａβにおける番号40を超えるアミノ酸を含有するエピトープに結合する結合物質、およびＡβまたはＡβのフラグメントを結合するがAPPの他のフラグメントを結合しない結合物質を含み得る。タウを検出するための手段はまた、サンドイッチELISAを含み得る。例えば、キットは、以下を含み得る、ａ）Ａβの接合領域に結合する。非標識結合物質;b）Ａβにおける番号40を超えるアミノ酸を含有するエピトープに結合する、検出可能に標識された結合物質;c）タウに結合する非標識結合物質；およびｄ）タウに結合する検出可能に標識された結合物質。
検出可能な標識は、当該分野で公知でありそしえ用いられている任意のものであり得、例えば、ビオチン化、放射能標識、酵素、蛍光標識などを含む。
動物モデルが、現在、アルツハイマー病を研究するために用いられている（例えば、国際特許出願第WO93/14200号、1993年10月27日に出願された米国特許出願第08/143,697号、および米国特許第5,387,742号を参照のこと、これらはすべて本明細書中に参考として援用される）。これらのモデルは、アルツハイマー病の経過に影響する（病的状態を改善するおよび悪化させるの両方）それらの能力について化合物をアスクリーニングするために有用である。ADはCSFにおけるＡβ（Ｘ−≧41）の量の減少により特徴付けられるので、アルツハイマー病の有効な処置が、CSFにおけるＡβ（Ｘ−≧41）の量の増加をもたらし、一方、疾患の進行を促進する薬剤が、CSFにおけるＡβ（≧41）の量の減少をもたらすことが予想される。
従って、本発明は、液性サンプル、特にCSFにおけるＡβ（Ｘ−≧41）の量を上昇または減少させる、従って、疾患の処置に使用される候補であるか、または疾患を促進し、そしてヒトにより回避されるべきである化合物をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物のサンプルにおける１つ以上の上記可溶性Ａβ（Ｘ−≧41）の第１の量を測定する工程；動物に化合物を投与する工程；動物のサンプルにおける１つ以上の可溶性Ａβ（Ｘ−≧41）の第２の量を測定する工程；および、第１の量と第２の量とを比較する工程を包含する。この差は、化合物が、サンプルにおける可溶性Ａβ（Ｘ−≧41）の量を増加させるか、減少させるか、または変化させないでおくかを示す。動物に与えられる用量レベルおよび第２の量を測定する前に経過する時間の量は、当然、モデル系に依存する。
本発明はまた、液性サンプル、特にCSFにおける、Ａβ（Ｘ−≧41）の量を上昇させ、そしてタウの量を減少させる、従って、疾患の処置に使用するための候補である化合物か；またはＡβ（Ｘ−≧41）のレベルを減少させ、そしてタウのレベルを増大させる、従って、この疾患を促進し、そしてヒトにより回避されるべきである化合物をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、アルツハイマー病のモデルとして使用される非ヒト動物の液性サンプルにおける１つ以上の上記可溶性Ａβ（Ｘ−≧41）およびタウの第１の量を測定する工程；動物に化合物を投与する工程；動物の液性サンプルにおける１つ以上の可溶性Ａβ（Ｘ−≧41）およびタウの第２の量を測定する工程；ならびに、第１の量と第２の量とを比較する工程を包含する。この差は、化合物が、液性サンプルにおける可溶性Ａβ（Ｘ−≧41）およびタウの量を増加させるか、減少させるか、または変化させないでおくかを示す。動物に与えられる用量レベルおよび第２の量を測定する前に経過する時間の量は、当然、モデル系に依存する。
１つの有用な非ヒト動物モデルは、APPのスウェーデン変異（アスパラギン595−ロイシン596）をコードする１コピーの発現可能なトランスジーン配列を有する。この配列は、一般的に、天然に生じる内在性APP遺伝子（存在する場合）を正常に発現する細胞において発現される。哺乳動物モデル、より詳細には齧歯類モデル、および特にマウスおよびハムスターのモデルは、この使用に適切である。このようなトランスジーンは、代表的にはスウェーデン変異APP発現カセットを含み、ここで、連結されたプロモーター、および好ましくはエンハンサーがスウェーデン変異を含む異種APPポリペプチドをコードする構造配列の発現を駆動する。
スウェーデン変異APPポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、通常、トランスジーンまたはターゲッティング構築物を受精卵または胚幹（ES）細胞に、代表的には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、またはバイオリスティック（biolistic）によって導入することにより作製される。トランスジェニック動物は、トランスジーンのスウェーデン変異APP遺伝子（または相同的に組換えられたターゲッティング構築物）を、代表的には脳組織において発現する。好ましくは、内在性APP対立遺伝子の１つまたは両方が不活化され、そして野生型APPを発現することができない。
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
実施例
I.Aβ（ｘ−≧41）は、アルツハイマー病患者において減少する
材料および方法
1.抗体の調製
a.Aβ接合領域に対するモノクローナル抗体
Ａβ接合領域に対するモノクローナル抗体を、アミノ酸残基13〜31にわたる合成ペプチドを用いて調製した。但し、AI、アミノ酸30および31を、GCで置換した。このペプチドをＡβ13-28と称した。Ａβ13-28を、製造業者（Pierce）の指示に従って、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いて免疫原（α−CD3ε抗体；クローン番号145−2C11、Boehringer−Mannheim）に結合させた。
まず、完全フロイントアジュバントと混合したＡβ接合体を用いてA/Jマウスを初期腹腔内（IP）免疫した。14日後、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と混合したＡβ接合体を用いてマウスを14日毎にIP追加免疫した。合計６回の追加免疫後、最後に、不完全フロイントアジュバントと混合したＡβ接合体を用いてマウスを静脈内追加免疫し、そして３日後融合した。脾臓細胞のP3.653ミエローマ細胞との融合を、0iおよびHerzenberg、Selective Methods in Cellular Immunology、MishellおよびShigii編、W.H.Freeman and Company、San Francisco、17章（1980）に記載されるように行った。血清力価および初期スクリーニングを、以下に記載するRIA方法によって行った。いくつかのクローンを24ウェルプレートに広げ、以下に記載するようにさらなる分析を行った。目的のクローンをマウスの腹水中に産生した。
血清採取物（serum bleed）および融合ハイブリドーマ上清をスクリーニングするのに用いたRIA方法は、Wangら（1977）J.Immunol.Methods18:157−164によって開発された方法に基づいた。簡単に言うと、上清（または血清）を、125I標識Ａβ1-28、およびヒツジ抗マウスIgGが臭化シアンを介して結合されたSepharose▲Ｒ▼4Bビーズと共にローテーターで室温で一晩インキューベートした。各ウェルからのビーズを細胞採集機を用いてグラスファイバーフィルターディスク上に採集し、PBSで数回洗浄した。次いで、フィルターディスクをγ管に移し、結合した放射能をγカウンターでカウントした。
すべてのハイブリドーマのＡβ1-28への結合を、初期スクリーニングについて上述した方法を用いてテストし、次いで、３日後に再テストした。Ａβ1-28ポジティブクローンを、上記のRIA方法を用いて、125I標識Ａβ1-16への反応性についてさらに特徴づけた。Ａβ1-16に結合したクローンは見いだせなかった。ペプチド捕捉ELISAにおいて、すべてのクローンがＡβ13-28と反応するが、Ａβ17-28と反応するクローンはなかったことが見いだされた。それ故、すべてのクローンは、アミノ酸16および17にわたる接合領域内にエピトープを有すると決定された。
上記のアッセイの結果に基づいて、いくつかのクローンを24ウェルプレートに広げた。これらのクローンを飽和分析によってさらに特徴づけた。50％力価点（上記のRIA方法によって決定される）における上清を、Sepharose▲Ｒ▼−ヒツジ抗マウスIgGビーズ、一定量の125I標識Ａβ1-28、および量を変化させた非標識Ａβ13-28またはＡβ17-28を含むウェルに加えた。50％阻害のコールドペプチドの濃度を各抗体について決定した。Ａβ17-28に関しては、すべてのクローンについて100ng/ウェルで阻害は見られなかった。Ａβ13-28に対する50％阻害点は、10〜80ng/ウェルの範囲であった。クローンをまた、ウェスタンブロットにおける反応性に基づいて特徴づけた。力価点、感受性（50％阻害点によって決定される）、およびウェスタンブロット上の反応性に基づいて、いくつかのクローンを腹水内で産生した。266と称されるハイブリドーマからの抗体を、以下のアッセイにおいて捕捉抗体として使用するために選択した。
b.Aβのアミノ酸33〜42を含むＣ末端エピトープに対するポリクローナル抗体
Ａβ（33−42）に対するポリクローナル抗体を以下のように作製した。ペプチド277−２（Ｃ−アミノヘプタン酸−GLMVGGVVIA（配列番号２））をカチオン化BSA（Pierce活性化「スーパーキャリア」）に、10mgのカチオン化BSAに対して5mgの277−２ペプチドの割合で以下のように結合させた。１バイアルのPierceスーパーキャリア（10mg）を1mLの脱イオン水に再懸濁させた。5mgの277−２ペプチドを5mlの10mM PO4 pH8.0に溶解させた。277−２ペプチドをスーパーキャリアに加え、室温で一晩インキュベートした。次いでこれを濃縮し、そしてEDTAを除去した。
免疫原（500mgのペプチド等価物）を完全フロイントアジュバント中で皮下注射した。３週間後、ウサギに0.2〜0.5mgの追加免疫を与え、その後２〜４週間毎に0.2〜0.5mgの追加免疫を与えた。追加免疫を、不完全フロイントアジュバント中で皮下投与した。各追加免疫の一週間後に25mlの血清を回収した。採取物を以下のようにスクリーニングした。７週目のウサギの採取物を連続希釈によって力価測定した。ELISAプレートをＡβ１〜42で一晩コートし、次いで、３％ゼラチンでブロックした。1/100〜1/200,000のウサギの採取物の連続希釈物を、プレート上で室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、抗ウサギHRPを各ウェルに加えた。これを１時間インキューベートした。プレートを洗浄し、TMB基質を用いた。ウサギのELISA力価は、1/20,000〜1/200,000であった。
次いで、ELISAポジティブウサギ採取物を捕捉RIA中で力価測定し、125I Aβ（１−42）を捕捉する能力と125I Aβ（１−40）を捕捉する能力とを比較した。1/25〜1/675のウサギ抗血清の希釈物を、ほぼ同数のcpmの両トレーサーと共にインキュベートした。タンパク質Ａセファロースを用いて免疫複合体を沈降させ、次いで、これらをマイクロベータシンチレーションカウンターでカウントした。277−２ウサギＤは、Ａβ（１−42）トレーサーに対して最も高い力価を示し、Ａβ（１−40）トレーサーとは交差反応を示さなかった。次いで、最も高い力価の採取物を、抗体のアフィニティ精製にかけた。
抗277−２抗体をアフィニティ精製するために、277−２アフィニティマトリクスを以下のように調製した。3mlのスルホ−結合ゲル（Pierce）を６容量の50mM Tris、5mM EDTA、pH8.5で洗浄した。0.3mlのDMSO中に溶解させた3mgの277−２ペプチドを、50mM Tris、5mM EDTA pH8.5で3mlにし、そしてゲルに加えた。15分間緩やかに混合した後、カラム樹脂を６容量の50mM Tris、5mM EDTA、0.5M NaCl pH8で洗浄した。次いで、カラム樹脂を16容量のPBS/0.05％ NaN3で洗浄した。
抗体をアフィニティ精製するために、20mlの高力価血清をPBSで40mlに希釈し、そして４℃で撹拌しながら等量の飽和（NH4）2SO4を徐々に加えた。混合物をさらに30分撹拌し、次いで、Beckman JA17ローターで10,000rpmで15分間回転させた。ペレットをPBS中に再懸濁し、PBSで40mlの容量にし、そして（NH4）2SO4沈殿を上記のように繰り返した。ペレットを全体で20mlのPBS中で再懸濁し、PBSに対して４℃で一晩透析した。
277−２カラムを10mlのPBSで洗浄した。次いで、透析物をカラムに流した。カラムを50mlのPBSで洗浄した。0.1Mグリシン、0.5M NaCl pH2.5を一度に1ml加え、画分を回収した。活性（elated）タンパク質の大部分を含む最初の４画分をプールし、0.4mlの1M Tris pH8.0で中和した。プールを膜濾過によって2mlよりわずかに少なくなるまで濃縮した。最初のカラムフロースルー（flow−through）を、第２のクロマトグラフ工程（カラムを最初に中和し、それをPBS中で再平衡化した後）に適用した。第２のアフィニティ精製材料を同様に中和し、濃縮し、第１の材料と合わせ、次いで、PBSに対して４℃で一晩透析した。タンパク質含有量を測定し（Pierce BCA方法）、これら抗体をELISA実験で使用した。
2.ELISAアッセイ
a.捕捉抗体のマイクロタイターウェルへの結合
モノクローナル抗体266を、0.23g/L NaH2PO4H2O、26.2g/L Na2HPO4;7H2O、1g/L NaN3、pH8.5を含む緩衝液中で10μg/mlの濃度に希釈した。次いで、100μl/ウェルのこの溶液を、96ウェル白色Dynatech Microlite2（96ウェル平底プレート）に分配した。プレートを密閉し、室温で一晩インキュベートした。コーティング後、残留溶液を吸引し、非特異結合部位を、１ウェル当たり200μＬの0.2g/L（NaH2PO4H2O）、0.8g/L Na2HPO47H2O、2.5g/L結晶化および凍結乾燥したヒト血清アルブミン（HSA）、pH7.4でブロックした。これらプレートを、ブロッキング溶液中で室温で１時間インキュベートすることによってブロックした。
b.アッセイプロトコル
キャリブレーターを、DMSO中に１μg/ml Aβ1-42のストック溶液から調製した。試料希釈液（0.2g/L（NaH2PO4H2O）、2.16g/L Na2HPO47H2O、0.5g/L NaN3、6g/Lウシ血清アルブミン（BSA）（グロブリンを含まない）、0.5ml/L triton x−405 8.5g/L NaCl、pH7.4）で、最も高いキャリブレーター、1000pg/ml（10mlのカゼイン試料希釈液中10μｌのＡβ1-42ストック（１μg/ml DMSO））を調製した。試料希釈液で連続希釈物を形成し、500、250、125、62.5および31.25pg/mlの濃度のＡβ1-42を得た。
CSF試料を以下のように調製した。CSF試料（100〜500μｌ）を３分間煮沸させた。沸騰させた試料をアッセイ前に10〜14時間４℃で維持した。CSF試料を希釈しないでアッセイした。最初に計算した値が最も高いキャリブレーター（1000pg/ml）を上回る場合にのみ希釈物を作製する。
１ウェル当たり100μｌのキャリブレーターまたは試料を、マイクロタイタープレートに添加した。プレートを密閉し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液（80g/L NaCl、3.85g/L KCl、31.75g/L Tris−HCl、0.5ml/L tween−20、pH7.5）で３回洗浄した。
抗Ａβ（33−42）（抗体277−２）を試料希釈液中で１μg/mlに希釈し、１ウェル当たり100μｌを加えた。プレートを覆い、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。アルカリホスファターゼアフィニティ精製したＦ（ab'）２フラグメントロバ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）（Jackson）を、試料希釈液中で1:1000に希釈した。１ウェル当たり100μｌを加えた。プレートを覆い、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次に、100μl/ウェルの化学発光基質を加えた。化学発光基質は、化学発光試薬、AMPPD（Tropix）およびエンハンサー、エメラルドグリーン（Tropix）を、1mM MgCl2および0.2％ NaN3を含む1Mジエタノールアミン（diethanolemine）緩衝液、pH10中で1:1000および1:100にそれぞれ希釈することによって調製した。プレートを密閉し、室温で10〜15分間インキュベートした。溶液を吸引しなかった。今回は、異なる抗体ロットに対して最適化され得なければならない。
15分後、Dynatech ML 1000を用いて化学発光を読みとり、相対化学発光単位（CLU）として表現した。
結果
1.Ａβ（Ｘ−≧41）アッセイ特異性
Ａβ（Ｘ−≧41）ELISAは、Ａβ（１−28）、Ａβ（１−38）、またはＡβ（１−40）とは交差反応しない（図１）。
2.Ａβ（Ｘ−≧41）アッセイ感受性
このアッセイの感受性の下限は、31pg/mlまたは3.1pg/ウェル（0.7fmol/ウェル）である（図１）。
3.CSF中のＡβ（Ｘ−≧41）レベル
Ａβ（Ｘ−≧41）ELISAを用いて、Ａβ（Ｘ−≧41）をCSF中で確認した。時折、CSFサンプルの２つの異なる群（Ａ群およびＢ群と称される）が種々の供給源から得られた。時々、アッセイの前に、200μＬのCSFサンプルを３分間煮沸した（煮沸が、いくつかのケースにおいてＡβ（Ｘ−≧41）免疫反応を増加することが分かった）。このアッセイの結果を、図２および図３に示す。表Ｉにこれらの結果をまとめた。
0003634375.tif 000003
4.齧歯動物およびイヌのCSF中のＡβ（Ｘ−≧41）
モルモットおよびイヌのCSFにおいても、Ａβ（Ｘ−≧41）免疫反応を検出した（表II）。
0003634375.tif 000004
このサンドイッチELISAは、CSF中のＡβ（Ｘ−≧41）の存在を実証する。Ａβ（Ｘ−≧41）は、CSF中の合計Ａβの微量成分でしかない。CSF中のＡβ（Ｘ−≧41）のレベルは、正常および神経学的コントロールよりもADが有意に低かった。50％の感受性限界を考慮すると、特異性は、Ａ群では93.8％、Ｂ群では97.4％である。これらの２つの独立した群は顕著な類似性を示し、CSF中のＡβ（Ｘ−≧41）の測定が診断利用性があることを実証している。
II.Ａβ（Ｘ−≧41）およびタウの組み合わせ測定はアルツハイマー病に対して高い感受性を有する
材料および方法
1.被験者
この研究に登録された被験者全員が、大学医療センターで、痴呆の診断に熟練した神経学者によって詳しい臨床的および神経学的評価を受けた。適正なインフォームドコンセントを、被験者、または被験者の保護者から得た。評価には、病歴、物理的試験および神経学的試験、痴呆の代謝原因を排除するための実験室的血液検査、神経画像研究（痴呆の患者および神経学的コントロールについての過去３年以内の頭部CTまたはMR）、および詳細な精神測定学的検査（これは施設によって変化した）を含んだ。さらに、被験者全員を以下の評価器械にかけた:Mini−Mental State Examination（MMSE）（American Psychiatric Association,Committee on Nomenclature and Statistics:Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders:Revised Third Edition,Washington D.C.Am.Psych Associ.（1987））、the Hamilton Depression Inventory（V.C.Hachiniskiら（1975）Ann Neurol32:623−637）、およびHachinski Ischemic Index（G.McKannら（1984）Neurology34:939−944）。２つ以上の痴呆診断、最近の発作、頭部外傷、または重大な末梢神経系障害を有する患者は排除した。以下の診断基準を用いた：
i.AD（ｎ＝37）:ADの可能性についてのNINCDS−ADRDAガイドラインを満たした患者;ADの可能性についての基準を満たした患者は排除した（The Lund and Manchester Groups（1994）J Neurol Neurosurg Psychiatr57:416−418）。患者全員がコミュニティ施設で居住し、軽度から中程度の痴呆を有していた。
ii.神経学的疾患コントロール（ND;n＝32）：非AD痴呆、または中枢神経系に影響を及ぼす変性障害を患う患者。神経学的コントロールについては、診断を確認し、共存するADの見込みがないことを確実にするために、臨床記録のまとめを第二の神経学者（DG）がまた再調査した。前頭葉痴呆を患う患者を、Lund and Manchester群（Kawasaki E.S.、PCR Protocols:A guide to methods and applications.Academic Press,Inc.,New York 1990 146−152頁）によって記載された基準に従って診断した。
iii.非痴呆性コントロール（NC;n＝20）：被験者は50齢以上で、重大な認識病訴がなく、機能障害を有さず、神経学的試験において正常な結果を有し、そしてMMSEにおいて28〜30と評価された。これらのコントロールの亜群は、重大な認識または機能障害を生じない鬱病の症状を有し、ADまたはあらゆる器質性（organic）の神経学的状態にないと判断された。
一晩の絶食後、朝に腰椎穿刺を行った。全てのCSFサンプルを全ての部位に対して供給した標本チューブに回収した。地元の医療センターの実験室で、最初の２〜3mlのCSFを、タンパク質、グルコース、および細胞について分析し、そして4.5mLを元の回収チューブから取り出して、（最終的なCSF溶液組成が:20mMのリン酸ナトリウム、20mMトリエタノールアミン、0.05％のTriton X−100、100mMのNaCl、0.05％のNaN3、1mMのジエチレントリアミンペンタ酢酸、1mMのEGTA、pH7.4を含むような添加剤を含有する）500μＬの緩衝液を含有する8mLのSarstedtチューブに加え、分析まで−20℃で凍結した。アッセイ技師には、被験者の診断に関して知らせなかった。
2.ApoE遺伝子型決定
ApoE遺伝子型決定を、EDTA vacutainerチューブに回収した、利用可能な血液サンプルについて行った。Kawasakiの方法（Kawasaki ES、PCR Protocols:A guide to methods and applications,Academic Press,Inc.,New York 1990 146−152頁）によってサンプルを調製し、そしてWenham（P.R.Wenhamら（1991）Lancet 337:1158−1159）に記載されたようにPCR分析を行った。
3.総ＡβELISA
Seubertら（1992）Nature359:325−327に記載のように、連続二重モノクローナル抗体サンドイッチELISAで総Ａβを測定した。簡単に述べると、CSF中のＡβを、マイクロタイタープレートウェル中で予めコートしたモノクローナル抗体266（Ａβペプチド残基13〜28に特異的）で捕捉した。検出には、第２のＡβ特異的、ビオチン化モノクローナル抗体6C6（Ａβ残基１〜16を認識する）を利用し、次いでアルカリホスファターゼ−アビジン結合体と反応させた。蛍光生成物を、蛍光性（fluorogenic）基質４−メチル−ウンベリフェリルリン酸（MUP）とのインキュベーションの後に、Millipore Cytofluor2350蛍光計を用いて測定した。
4.Ａβ（Ｘ−≧41）ELISA
266を捕捉抗体として用いる、同様な方式のアッセイにおいて、Ａβ（Ｘ−≧41）を測定した。レポータポリクローナル抗体277−２を、アミノ末端にシステイン−アミノヘプタン酸を有する、Ａβ残基33〜42（GLMVGGVVIA）［配列番号２］を含む合成ペプチドに対して惹起した。これをシステインを介して、カチオン化BSA（Pierce）に結合した。抗体277−２はsulfo結合樹脂（Pierce）に結合した合成ペプチドを使用してアフィニティ精製され、そしてトレーサの沈降により検出されるように125I−Ａβ1-42と強く反応した。免疫沈降またはELISA方式のいずれにおいても、Ａβ1-40との検出可能な交差反応は示されず、このことはＡβ1-40ペプチドに対して少なくとも1000倍低い感受性を示す。合成Ａβ1-42をスタンダードとして用いた。ロバ抗ウサギIgG−アルカリホスファターゼ結合体、およびEmeraldエンハンサー（Tropix）（C.Vigo−Pelfreyら（1994）J Neurochem61:1965−1968）を有するAMPPD化学発光基質を用いて、277−２レポータ抗体の検出を達成した。
Ａβ（Ｘ−≧41）分析において、因子としてのアッセイ内変動（variability）を排除するために、全てのサンプルについて、同日に、同じロットの標準を用いて２連で行った。アッセイ間変動は、10％未満であった。測定の前に、CSFサンプルのアリコートを100℃まで３分間加熱し、次いでアッセイの前に一晩４℃で保存した。加熱工程は、診断と無関係にCSFサンプルにおける免疫反応を一般に増加することが見出され、そしてそれゆえ加熱工程を含めた。異なるロットの、合成Ａβ（Ｘ−≧41）は、アミノ酸解析によって基準化されたにも関わらず、わずかに異なる標準値を生じることに注目すべきである。列挙した値は、全研究にわたって使用する単一の標準に基づく。CSFへの合成Ａβ（Ｘ−≧41）の添加を包含する研究は、測定された回復が80±５％であったことを実証した。
5.ELISAによるタウの検出
a.精製タウ
ヒトAD脳組織および組換え供給源から精製したタウをアッセイおよび抗体の特徴付けに用いた。以前に記載されたpVL941−タウ−４−反復イソ型を含むバキュロウイルスベクター（J.Knopsら、（1991）J Cell Biol 1991:114:725−733）を用いて、組換えヒトタウを産生した。高レベルのタウを発現させ、SF9および高レベルの５つの昆虫細胞の両方から精製した。最高に発現した細胞培養物を収集し、PBS中で一回洗浄し、氷上で冷却した。次いで、細胞を0.1M MES（pH6.5）、1mM EGTA、18μM EDTA、0.5mM MgCl2、５μg/mlロイペプチン、1mM PMSF中で超音波破砕した。細胞細片を低速遠心分離により除去し、上清を0.75M NaCl、２％  β−メルカプトエタノールに調整した。サンプルを、蓋をしたチューブ内で10分間煮沸し、氷中で冷却し、そして30分間100,000×ｇで遠心分離することにより明澄化した。その後、上清を2.5％過塩素酸に調整し、15分間13,000×ｇで回転させた。ペレットを２回目の沸騰／酸沈澱サイクルに曝し、プールした上清を100mM KH2PO4（pH6.9）、2mM EDTA、2mM EGTA、2mM β−メルカプトエタノール、0.3mM PMSFで透析した。
組換えタウは、クーマシーブルーで染色したSDS−PAGEにより少なくとも85％純粋であると判断され、さらなる精製なしに用いた。全タウ標準の濃度を、アミノ酸分析により推定した。タウを脱リン酸化するために、アリコートを20mM Tris−HCl（pH8.6）、2mM MgCl2、1mM DTT、10μM ZnCl2緩衝液で透析した。サンプルの半分に対して、１μｇ−タウ当たり0.1ユニットのアルカリホスファターゼ（Boehringer Mannheim）を添加した；残りの半分を、緩衝液のみで同様に希釈し、２つのサンプルを５時間37℃でインキュベートした。
b.タウに対するモノクローナル抗体
KohlerおよびMilsteinの方法（G.KohlerおよびC.Milstein（1975）Nature256:495−497）の改変法により、モノクローナル抗体を調製した。すべての注射およびスクリーニングアッセイで用いられたタウを、タウ含有バキュロウイルス構築物に感染したSF9細胞から精製した。６週齢のA/Jマウスに、100μｇの精製タウを２週間間隔で注射した。タウを、１回目の免疫化のために完全なフロイントアジュバント中で乳化し、それに続く全ての免疫化のために不完全なフロイントアジュバント中で乳化した。３回目の注射から３日後に血清サンプルを採取してこれらの動物の力価を評価した。最も力価の高かったマウスに、３回目の注射を与えてから２週間後に、500μL PBS中の100μｇタウを静脈注射した。３日後に融合パートナーとしてSP2/0を用いて、ミエローマ融合を起こした。この融合からは抗体16G7および8C11が得られ、これに続く融合からは抗体16B5および16C5が単離された。
ハイブリドーマ細胞を含むウェル由来の上清を、125I標識タウを沈澱させる能力についてスクリーニングした。製造者（Bio−Rad）の指示に従って固定化グルコースオキシダーゼおよびラクトペロキシダーゼを用いて、タウを放射ヨウ素標識した。簡単に述べると、10μｇの精製組換えタウを、1mCiのNa125Iで、20μCi/μｇタンパク質の比活性で放射標識した。16G7、8C11、16B5、および16C5を、タウに特異的な４つの最も高い親和性のモノクローナル抗体として同定し、限界希釈によりクローン化した。タウに特異的な４つのモノクローナル抗体全てのイソ型をγ１κであると決定した。
c.タウELISA
抗タウモノクローナル抗体16G7を、TBS中に５μg/mlで懸濁し、100μl/ウェルでマイクロタイタープレート（Dynatec Microlite2）にコーティングした。コーティングを、室温で一晩行った。次いで、溶液を吸引し、プレートをリン酸緩衝化生理食塩水中（PBS）の0.25％カゼイン（W/V）でブロックした。抗タウ抗体16Bを、製造者（Pierce）の指示に従って、ビチオンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。50μl CSFまたはキャリブレータ（50μｌの３〜1000pg/mlヒトタウ）のいずれかのサンプルを、16G7コートされたウェル中で50μｌのビチオン化抗タウ抗体（PBSカゼイン、0.05％ Tween20中の0.75g/ml）と組み合わせ、常に振盪しながら室温で一晩インキュベートした。次いで、溶液を吸引し、プレートをTTBS中で３回洗浄した。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Boehringer−Mannheim）をPBS−カゼイン、0.05％ Tween20中で1:1000に希釈し、100μｌを各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、液体を吸引し、ウェルを３回洗浄した。化学発光試薬である３−（４−メトキシスピロ｛1,2−ジオキセタン−3,21−トリシクロ［3.3.1.13,7］ｔデカン（tdecan）｝−４−イル）フェニルホスフェート二ナトリウム（AMPPD,Tropix）およびエンハンサーであるEmerald green（Tropix）を1mM MgCl2、0.02％ NaN3（pH10）を含む1Mジエタノールアミン緩衝液中で各々1:1000および1:100に希釈した。ウェル当たり100μｌを添加し、30分後Dynatech ML 1000化学発光測定器でプレートを読み取った。ここで報告するデータは、キャリブレーターとして脳から単離したヒトタウを用いた。
6.統計学的分析
InStat、バージョン1.21を用いて一元分散分析（ANOVA）により、データの統計学的分析を行った。
結果
３つの患者群（表III）の比較は、これらの群が年齢および性別についてよく合致しているということを示した。AD群は、平均MMSEが17.5±7.1であり、これは認識障害が軽度から中程度であることを示している。神経学的疾患コントロール群は、種々の障害からなり、これらの障害は、血管性痴呆（４）、前頭葉痴呆（７）、鬱病（６）、パーキンソン病（３）、皮質基底核変性（cortico−basal ganglionic degeneration）（２）、小脳性失調（２）、進行性核上麻痺（１）、常圧水痘症（１）、大発作（１）、ベル麻痺（１）、老人性記憶障害（１）、錐体外路徴候を有する痴呆（１）、健忘症（１）、および小脳退化（１）を含む。コントロール群は神経学的疾患を有さず認識力が正常であった個体からなった（表III）。
0003634375.tif 000005
全CSF Aβレベルの分析により、異なる患者群間の有意な差異が明らかになった（表III）。平均値は、AD群の19.0ng/mlからNC群の17.9ng/mlの範囲であった。群間でかなりの重複があったが、統計学的には有意な差異はなかった（ｐ＞0.05）。しかし、ペプチドのＡβ（Ｘ−≧41）形態の分析により、AD群の平均値がNDおよびNC被験体の両方と比較して減少した（それぞれ、383pg/ml対543pg/mlおよび632pg/ml）ことが示され、この減少はｐ＜0.0001レベルで顕著であった（図４）。AD群の比較的小さい標準偏差（76pg/ml）は特に目立った。逆に、ND患者の何人かはCSF中におけるＡβ（Ｘ−≧41）の減少を示した。カットオフを505pg/mlに設定したとき、37人のND患者のうち15人、および23人のNC患者のうち僅か４人がこのレベルより下であった。あるいは、505pg/mlより高いＡβ（Ｘ−≧41）レベルを有する35人の個体のうち、ADと診断されたものは皆無であった。このことは、テストがこの疾患の不在に対して高度に特異的であることを示唆している。Ａβ（Ｘ−≧41）を、本明細書に記載されているように測定した。全ての測定値は２つの決定値の平均値であり、変動は≦10％であった。サンプルをランダムにプレートに割り当て、オペレーターは被験体の診断を認識していなかった。各マイクロタイタープレート上の参照標準は、プレート間で有意には異ならなかった。
同一の被験体のCSFサンプル中のタウレベルもまた調査した。タウ測定を２回で行った。一貫性を確実にするために、すでに行ったアッセイからのいくつかのサンプルを後のプレートにも含ませ、全サンプルを少なくとも反復測定で評価した。反復測定値は、元の値の15％以内であった。AD群といずれかのコントロール群との間に有意な差異が存在する（ｐ＜0.001）。ヒト脳由来のタウを参照標準として用いた。AD患者は、神経学的コントロールおよび正常コントロールの、それぞれ168pg/mlおよび212pg/mlに対して、407pg/mlの平均値を有した（図５）。AD群と他の群との間のこの差異は、ｐ＜0.001で有意である。312pg/mlのカットオフを用いた場合、このレベルより高い値を有する個体は、アルツハイマー病である可能性が非常に高い（22/24＝92％）。僅か１人のNCおよび１人のND被験体が、このカットオフより上の値を示した。各センターから得た平均CSF Aβ、Ａβ（Ｘ−≧41）、またはタウレベルを別途分析したところ、一元分散量分析により現れたような疾患のカテゴリーのいずれに対しても、統計学的に有意な各センター間の差異は現れなかった。特に興味深かったのは、同一のCSFサンプル中におけるＡβ（Ｘ−≧41）とタウ測定値との同時分析であった（図６）。図６は、上述のＡβ（Ｘ−≧41）およびタウ用のカットオフを用いて４つの象限に分割されている。増加したタウおよび減少したＡβ（Ｘ−≧41）（右下の象限）の両方の存在は、ADについて高度に予言的であった（22/23＝96％）。逆に、高いＡβ（Ｘ−≧41）および低いタウ（左上の象限）は、全体的にコントロール患者によって表された（図６）。この研究における全個体の半分を超える個体（58.7％）がこれら２つの象限の一方に含まれた。残りの患者は、低いＡβ（Ｘ−≧41）と低いタウレベルを示した（左下象限）。
以上本発明を、理解を明瞭にするために詳細に述べてきたが、添付の請求の範囲内において、ある種の改変がなされ得ることは明らかである。
本出願書類において引用された全ての刊行物および特許書類は、その全体を全ての目的のために本明細書に援用し、各刊行物または特許書類の全体が個々に記載されていると解釈されるものとする。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：シューベルト，ピーターエイ．
ビゴ−ペルフレイ，カルメン
シェンク，デイルビー．
バーボー，ロビン
（ii）発明の名称：アミロイドβペプチド（ｘ−＞41）およびタウを測定することによりアルツハイマー病の診断を補助する方法
（iii）配列数:2
（iv）連絡住所：
（Ａ）名称：タウンゼンド  アンド  タウンゼンド  クーリー  アンド  クルー
（Ｂ）番地：スイート2000,スチュアート  タワー，ワン  マーケット  プラザ
（Ｃ）市：サンフランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:94105
（ｖ）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピー  ディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース♯1.0,パージョン♯1.25
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日:1995年４月７日
（Ｃ）分類：
（viii）代理人／事務所情報：
（Ａ）氏名：ヘスリン，ジャームズエム．
（Ｂ）登録番号:29,541
（Ｃ）照会／記録番号:15270−002110
（ix）電話回線情報：
（Ａ）電話:415−326−2400
（Ｂ）テレファックス:415−326−2422
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:43アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号1:
0003634375.tif 000006
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:10アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号2:
0003634375.tif 000007
【図１】
0003634375.tif 000008
【図２】
0003634375.tif 000009
【図３】
0003634375.tif 000010
【図４】
0003634375.tif 000011
【図５】
0003634375.tif 000012
【図６】
0003634375.tif 000013