(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸入用装置であって、
（ａ）吸入可能で薬理活性のあるＮＯ以外の固体あるいは液体の気管支拡張剤化合物を格納するチェンバと、
（ｂ）前記チェンバに接続された内腔を形作るハウジングと、
少なくとも１ｐｐｍのＮＯを成分に持つ加圧ガスが入れられた容器とを備え、
前記容器は前記加圧ガスを前記チェンバ中に制御しながら送り込み、それにより
前記気管支拡張剤化合物を送り込まれたガスの中に分散させる機構を有し、前記内腔がチェンバ内のガスを患者の呼吸器系に導入できるように作られていることを特徴とする吸入用装置。
【請求項２】
気管支収縮の治療用装置であって、
内腔を形作るハウジングと、
少なくとも１ｐｐｍのＮＯを成分に持つ加圧ガスが入れられた容器とを備え、
前記容器は前記加圧ガスを前記内腔中に制御しながら送り込み、前記内腔が送り込まれたガスを患者の呼吸器系に導入できるように作られていることを特徴とする吸入用装置。
【請求項３】
請求項２の吸入用装置において、重さが約１ｋｇ以下であることを特徴とする吸入用装置。
【請求項４】
請求項２の吸入用装置において、加圧ガスには、少なくとも４０ｐｐｍのＮＯを含むことを特徴とする吸入用装置。
【請求項５】
吸入用装置であって、
気管支収縮の治療に有効なＮＯの供給化合物を加圧又は液化した推進用ガスに浮遊させた状態で格納した容器と、
（ａ)前記容器が据え付けられたポート及び（ｂ）前記ポートと連絡する内腔を形作るハウジングと、
前記容器から前記内腔へ前記推進用ガスを制御しながら放出し、それによって前記容器から前記内腔へ前記浮遊化合物を放出させる手段と、
前記内腔は個体の呼吸器系へ前記放出された推進用ガスに浮遊している治療に有効な量の前記化合物を一定経路で送り込むように形成されていることを特徴とする吸入用装置。
【請求項６】
請求項５に記載の吸入用装置において、前記化合物が粉末形状であることを特徴とする吸入用装置。
【請求項７】
請求項５に記載の吸入用装置において、前記化合物が生物学的に適合性の液状媒体に溶解又は浮遊していることを特徴とする吸入用装置。
【請求項８】
請求項５に記載の吸入用装置において、前記化合物がＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソシステイン、ニトロソグアニジン、亜硝酸イソアミル、無機亜硝酸塩、アジド、及びヒドロキシルアミンから成るグループから選択されることを特徴とする吸入用装置。
【請求項９】
吸入用装置であって、
加圧あるいは液化推進用ガスを格納する容器と、
（ａ）気管支収縮を治療するために有効なＮＯを供給する化合物が格納されたチェンバと、
（ｂ）前記チェンバと連絡している内腔を形作るハウジングと、
前記容器から前記内腔へ前記ガスを制御しながら放出し、それにより前記ガス中の前記化合物を浮遊し、
前記内腔は治療に有効な量の前記化合物を個体の呼吸器系へ一定経路で送り込むように形作られていることを特徴とする吸入用装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の吸入用装置において、前記推進用ガスが酸化窒素からなることを特徴とする吸入用装置。
【請求項１１】
請求項９に記載の吸入用装置において、前記酸化窒素の供給化合物が、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン、Ｓ−ニトロソシステイン、ニトロソグアニジン、亜硝酸イソアミル、無機亜硝酸塩、アジド、及びヒドロキシルアミンから成るグループから選択されることを特徴とする吸入用装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は吸入用装置に関し、特に気管支収縮（特に、気管支平滑筋の収縮）を弛緩させるための薬学的組成物の吸入用装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
喘息は、正常な肺には影響を及ぼさない種々の刺激に応答して起こる、間欠性、可逆的で広範囲の肺気道収縮を特徴とする慢性疾患である。米国人口における、この疾患の有病率の推定値は３〜６パーセントの範囲である。
【０００３】
喘息の病因を究明するために、この疾患の３つの重要な特徴（慢性気道炎症、可逆的気流閉塞、及び気管支の過剰反応性）に対する細胞学的及び生化学的基礎を探求した。喘息性気道が正常な気道と異なる特徴として、気道機能の自律神経系の制御、気管支平滑筋の収縮特性、または表面を覆っている上皮細胞の保全性における種々の異常が、理論的に示唆された。正常な上皮は、単純な障壁として以上の機能を有することを示唆する論証がある。例えば、上皮は、平滑筋を弛緩させることにより気道の開放性を能動的に維持する弛緩因子を発生すると思われる。上皮が剥離すると弛緩因子の発生が減少するため、気管支の過剰反応性が引き起こされるであろう（“Asthma”, Ch. 14-II in Scientific American Medicine, Vol. 2; Scientific American, Inc.; 1988, p.2, 4）。
【０００４】
喘息の治療に使用される薬物は、一般に以下の２つに分類される。コルチコステロイド及びクロモリンのように主に炎症のインヒビタとして作用するもの、及び、テオフィリンとその派生物、ベータアドレナリン作動性アゴニスト、抗コリン作動性薬物のように主として気管気管支平滑筋の弛緩剤として作用するものである。このような気管支拡張薬のいくつかは経口投与されるが、他のものは一般に静脈または皮下注射により投与されるか、または、エーロゾル化粉末（すなわち、細かく破砕された固体を、空気などの気体中に懸濁した形で供給される）またはエーロゾル化された飛沫（細かい霧状で供給される）などの適当な形態の薬物の吸入により投与される。間欠的な喘息発作を沈静化するかまたは阻止するために、喘息患者は、用量の計測できる吸入器を用いて気管支拡張薬をよく自己投与するのである。
【０００５】
喘息発作中に起こる肺気道の挟小と概念的に類似して、血管収縮は、血管平滑筋の収縮によって起こる可逆的な血管の挟小である。このような血管収縮は、循環器系患部の異常な高血圧を生じ得る。
【０００６】
哺乳類の循環系は、体循環及び肺循環の２つの別個の系から成っており、これらは、それぞれ心臓の左側及び右側によって、互いに協力しながら血流が送り出される。肺循環は、血液を肺に輸送し、ここで肺胞中の酸素及び炭酸ガス濃度を平衡化することにより、酸素を受け取り二酸化炭素を放出する。次いで、酸素に富む血液は心臓の左側に戻り、ここから体循環を経て全身に分配される。
【０００７】
成人ヒトの体循環系の平均全身動脈圧（“ＳＡＰ”）は、一般的には８０〜１００ｍｍＨｇであり、平均肺循環動脈圧（“ＰＡＰ”）は、一般的には約１２〜１５ｍｍＨｇである。正常な肺毛細血管圧は、約７〜１０ｍｍＨｇである。間隙液コロイド浸透圧（１４ｍｍＨｇ）及び血漿コロイド腫脹圧（２８ｍｍＨｇ）、及び間隙遊離液圧（１〜８ｍｍＨｇ）を考慮すると、正常な肺は＋１ｍｍＨｇのネット平均濾過圧を有する（Guyton, Textbook of Medical Physiology, 6th Ed.; W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1981), p.295）。このように圧力傾斜がほぼ平衡化しているため、健康な肺の肺胞には体液が流入しない。そうでなければ、循環系から肺に体液が浸透する。
【０００８】
正常レベルを越えるＰＡＰの上昇を“肺高血圧”と呼ぶ。ヒトにおいては、ＰＡＰが正常レベルを最低５〜１０ｍｍＨｇ上回った場合に肺高血圧という；正常レベルを５０〜１００ｍｍＨｇ上回るＰＡＰも報告されている。ＰＡＰが顕著しく上昇した場合、毛細血管から血漿が肺間隙及び肺胞に流入する：肺にたまった体液（肺水腫）により肺機能が低下し、ある場合には死に至ることもある。
【０００９】
肺高血圧は、急性の場合も慢性の場合もある。急性肺高血圧は、潜在的に可逆的な現象であることが多く、一般に、低酸素症（高山病に見られるような）、アシドーシス、炎症、または肺塞栓症などの症状により引き起こされる肺血管平滑筋の収縮が原因である。慢性肺高血圧は、肺血管の断面積の縮小に起因する肺血管系における大きな構造的変化を特徴とする；これは、例えば、慢性低酸素症、血管塞栓症、または未知の原因（特発性または原発性肺高血圧）に起因する。
【００１０】
肺高血圧は、例えば、成人呼吸ジストレス症候群（“ＡＲＤＳ”）及び新生児持続性肺高血圧（“ＰＰＨＮ”）のような、ある種の生命を脅かす臨床的症状と関連があるとされてきた。Zapol et al., Acute Respiratory Failure, P.241-273, Marcel Dekker, New York (1985); Peckham, J. Ped. 93:1005 (1978) 。ＰＰＨＮ（主に、妊娠全期間を経た小児がかかる疾患）の特徴は、肺血管抵抗の上昇、高肺動脈圧、及び新生児の心臓における開存性動脈管と卵円孔を通る右左短絡である。死亡率は１２〜５０％の範囲である。Fox, Pediatrics 59:205 (1977); Dworetz, Pediatrics 84:1 (1989)。肺高血圧は、“肺性心”として知られる潜在的に致命的な心臓状態、または肺心臓疾患をも引き起こす。Fishman,  “Pulmonary Diseases and Disorders” 2nd Ed.,Mcgraw-Hill, New York (1988）。
既知の全身血管拡張効果を有する薬物（例えば、ニトロプルシド、ヒドララジン及びカルシウムチャネル遮断薬など）の投与による、肺高血圧の治療が試みられてきた。これらの薬物は肺血圧を低下させるのに効果的であるが、概してこれらの薬物は無差別な効果を示し、肺血圧のみならず全身の血圧をも低下させる。全身の血管抵抗の低下により、静脈循環における血液の危険な蓄積、末梢における低血圧（ショック）、右心室虚血、及びそれに引き続く心臓疾患が引き起こされる可能性がある。Zapol(1985); Radermacher, Anaesthesiology 68:152 (1988); Vlahakes, Circulation 63:87 (1981) 。例えば、ＡＲＤＳに起因する急性肺高血圧の治療のために、１５人の患者にニトロプルシドを静脈注射により投与した場合、平均ＰＡＰは２９．６から２４．２ｍｍＨｇに低下し、肺血管抵抗（ＰＶＲ）は、平均３２％低下するが、平均全身動脈圧は８９．６ｍｍＨｇから７０ｍｍＨｇ（許容範囲を下回るレベル）まで低下する（Zapol et al.198）。ニトロプルシドの静脈注射は、“ＱVA／ＱT の増加により、肺のガス交換を顕著に阻害するため”（異常な短絡を経由した静脈血と動脈血の混合）、肺高血圧の臨床的治療には適さないとされている。
【００１１】
血管の内側を覆っている内皮細胞により非常に不安定な非プロスタノイド内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）が放出されることによって、血管の生理弛緩が引き起こされることが報告されている。ＥＤＲＦは、血管平滑筋中にある酵素グアニレートシクラーゼを刺激し、その結果、サイクリックＧＭＰが増加して筋肉を弛緩させ、これにより血管収縮を解消する。Ignarro et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9265 (1987)及びPalmer et al., Nature 327:524 (1987)は、動脈及び静脈の内皮が放出する血管平滑筋弛緩因子を、酸化窒素（ＮＯ）であると同定した。ＮＯは、例えばニトロプルシド及びグリセリルトリナイトレートなどの有機硝酸塩の分解によっても生成すると考えられている。Ignarro, Circ. Res. 65:1 (1989); Furchgott, FASEB J. 3:2007 (1989)。Higenbottam et al., Ann. Rev. Resp. Dis. Suppl. 137:107 (1988)は、原発性肺高血圧と呼ばれる臨床的症状を有する７人の患者における吸入ＮＯの血管拡張効果を測定した。４０ｐｐｍのＮＯを吸入した場合のこれらの患者の平均ＰＡＰは５６．７ｍｍＨｇであり、ＮＯを添加しない空気を吸入した場合の５９．６ｍｍＨｇと比較して２．９ｍｍＨｇの差があるか、または、治療前のＰＡＰと正常とされるＰＡＰの間（“ΔＰＡＰ”）には約６％の差がある。Higenbottam et al.は、ＮＯの吸入中、これらの患者においてＰＶＲが平均９％低下したことを報告した。これに関連したＳＡＰの低下は見られなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＮＯガスは不安定であり、酸素と接触すると、ＮＯ2及びさらに窒素の高酸化物へと自然に酸化される。これら窒素の高酸化物は肺に対して毒性を示し、それ自体が高濃度であると肺水腫を生じることもある。ＮＯは、“これまでに発見されている中で最も速くヘモグロビンに結合するリガンドである”。Meyer, Eur. Resp. J. 2:494 (1988) 。水溶液が酸素に接触した時、溶解しているＮＯは迅速に無機亜硝酸塩及び硝酸塩へと酸化されるため、その半減期は１０秒以下である。Ignarro, FASEB J. 3:31 (1989) 。The Occupational Safety and Health Administration （ＯＳＨＡ）は、ＮＯの時間−重量（time-weighted ）平均吸入限度を、１０時間に２５ｐｐｍと定めている。“ＮＩＯＳＨ  Recommendations for Occupational Safety and Health Standards, ”Morbidity and Mortality Weekly Report, Vol. 37, No. S-7, p. 21 (1988) 。
【００１３】
そこで、本発明は、上述したＮＯの作用を応用し、安全に気管支収縮を弛緩させるための薬学的組成物を提供する。また、本発明は薬学的組成物を吸入する際に使用できる吸入用装置を提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、哺乳類（特にヒト）における喘息発作または気管支収縮の他の症状、急性呼吸困難、または可逆的肺血管収縮（すなわち、可逆的成分を有する急性肺血管収縮または慢性肺血管収縮）に関する。この時、患者哺乳類は、治療上有効な濃度の気体酸化窒素または治療上有効な量の酸化窒素放出化合物を吸入するよう（例えば従来の診断方法によって、または、本発明の診断方法によって）診断されている。ここでは、肺のメカニズムの標準的な測定方法で測定した患者の気道抵抗が２０％またはそれ以上低下する場合に、気管支拡張治療は“治療上有効である”という。ここでは、以下のいずれか一つまたはそれ以上を誘発する場合に、所定の患者における肺血管拡張治療は“治療上有効である”とする：（１）肺血管収縮を引き起こすと予想される損傷（吸引または外傷など）に続く血管収縮開始の阻害；（２）患者のΔＰＶＲ（患者の増加ＰＶＲと、“正常”ＰＶＲの差、所定の患者に特に設定する以外は、成人ヒトにおける正常ＰＶＲは１ｍｍＨｇ・分／リットル）の２０％またはそれ以上の減少；（３）患者のΔＰＡＰの２０％またはそれ以上の減少；（４）急性または慢性呼吸障害（例えば喘息または肺炎による）を有する成人における最低１０ｍｍＨｇの動脈酸素分圧の上昇；または、（５）小児における肺内外（transpulmonary）Ｏ2輸送の向上（上半身（管前性）動脈Ｏ2飽和における１０％またはそれ以上の増加として測定される）。ＰＶＲは、平均肺動脈圧（ＰＡＰ）から肺毛細血管ウエッジ圧（ＰＣＷＰ）  （または、もしわかれば、左動脈圧）を差し引き、心臓拍出量（ＣＯ）で割ることにより計算される。重度のＡＲＤＳ症例において、６〜２０ｍｍＨｇ・分／リットルもの高いＰＶＲレベルが見られた（Zapol et al., N. Engl. J. Med. 296:476-480, 1977）。
【００１５】
ここに開示された方法は、例えば、肺炎、外傷、吸引または吸入損傷、肺における脂肪塞栓症、アシドーシス、肺の炎症、成人呼吸ジストレス症候群、急性肺水腫、急性高山病、喘息、心臓手術後の急性肺高血圧、新生児の持続性肺高血圧、周産期吸引症候群、ヒアリン膜疾患、急性肺血栓塞栓症、ヘパリン−プロタミン反応、敗血症、喘息、喘息発作重積状態または低酸素症（片肺麻酔中に起こるものを含む）などに起因する急性肺血管収縮、及び、例えば、慢性肺高血圧、気管支肺形成異常、慢性肺血栓塞栓症、特発性または原発性肺高血圧または慢性低酸素症などに起因する慢性肺血管収縮（可逆的成分を有する）の症例の予防（症状が発生する以前に投与した場合）または解消に有用である。酸化窒素ガスは、肺血管収縮または喘息を有する哺乳類に、以下のいずれか一つまたはそれ以上に対応して投与することが好ましい：
（ａ）最低３分間の投与（さらに好ましくは、最低６分間）；
（ｂ）タバコの煙の無い状態での投与；
（ｃ）酸化窒素の吸入濃度は、最低１ｐｐｍ、さらに好ましくは最低２０ｐｐｍ、最も好ましくは最低８０ｐｐｍ、しかし１８０ｐｐｍは上回らない（このような濃度は、例えばケミルミネッセンス法などによりモニターする）；
（ｄ）酸化窒素は、酸化窒素ガス、酸素（Ｏ2）ガス及び窒素（Ｎ2）ガスを含有する混合物として吸入され、ＦIＯ2（すなわち、Ｏ2ガスの容積の割合）が０．２１〜０．９９であるのが最も好ましい、なお、空気中のＯ2の割合は０．２１である；
（ｅ）ＮＯ2濃度はモニターされ、安全限度（１ｐｐｍ以下）の範囲内に維持されている。
【００１６】
気体は散乱する粒子または飛沫を有さずに呼吸管に輸送されるため、気体状の酸化窒素の吸入により喘息の治療は大きく進歩する。気体は、長い自由な拡散経路を有し、障害（収縮した気道など）を容易に迂回し、圧着気管支痙攣を起こす事なく直接組織に溶解する。ＮＯガスは吸入後直ちに気管支平滑筋に対して有益な効果を示すため、もし必要であれば、ＮＯを、さらに長時間作用する薬物の吸入に先立って気管支痙攣に対する有用な初期防御として使用することができる。吸入された酸化窒素は、哺乳類（特にヒト）における慢性肺血管収縮の可逆性を診断する簡便な手段も提供する：患者哺乳類に気体酸化窒素を吸入させ、ＮＯ吸入前と吸入中におけるＰＡＰ及び心臓拍出量に生じた変化を記録する。ＮＯ吸入にともないＰＡＰが減少し、心臓拍出量が一定または増加した場合、または、ΔＰＶＲが顕著に減少した場合（例えば、最低２０％、または好ましくは最低３０％）、哺乳類の慢性肺血管収縮は可逆的成分を有しており、全身投与または吸入療法により投与された気体ＮＯまたはＮＯ放出化合物を用いて治療することが可能である。
【００１７】
その他の方法として、気管支収縮を有する、または気管支収縮を起こす危険性（例えば喘息）若しくは可逆的肺血管収縮を起こす危険性のある哺乳類（特にヒト）を、治療状有効な量の酸化窒素放出化合物を用いて治療することができる。本発明の方法及び装置に有用な既知の酸化窒素放出化合物（酸化窒素供与体または酸化窒素発生化合物とも呼ばれる）は、３つのカテゴリーに分けられる：（ａ）肺の中で得られるなどの生理的条件下で化合物から自然に放出されるかまたは転移される−−ＮＯ部分により特徴づけられるニトロソまたはニトロシル化合物（例えば、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシルアミン、Ｓ−ニトロソ−Ｌ−システイン、及びニトロソグアニジン）；（ｂ）ＮＯが遷移金属複合体上のリガンドである化合物、そしてこのようなＮＯは、生理的条件下で容易に放出または転移される（例えば、ニトロプルシド、ＮＯ−フェレドキシン、またはＮＯ−ヘム複合体）；（ｃ）呼吸系及び／または血管系に内在する酵素により代謝されてＮＯラジカルを生成する窒素含有化合物（例えば、アルギニン、グリセリルトリニトレート、イソアミル亜硝酸塩、無機亜硝酸塩、アジド、及びヒドロキシルアミン）。このような型の酸化窒素放出化合物及びこれらの合成方法は、当業者に熟知されている（例えば、以下の出版物を参照のこと、それらはそれぞれ本発明の参考文献として取り入れられている：Edwards et al., Biochemical Pharmacology 30:2531-2538, 1981; Schmidt and Kukovetz, Eur. J. Pharmacol. 122:75-79, 1986; Curran et al., FASEB J. 5:2085-2092, 1991; Southern et al., FEBS Lett. 276:42-44, 1990; Garg et al., J. Clin. Invest. 83:1774-1777, 1989; Garg et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 171:474-479, 1990; Boje et al., J. Pharmacol. Exp. ther. 253:20-26, 1990; Bruene et al., J. Biol. Chem. 264:8455-8458, 1989; and McNamara et al., Can J. Physiol. Pharmacol. 58:1446-1456, 1980）。以下に記載するin  vivoアッセイの一つにおいて動物モデルを使用することにより、このようなＮＯ放出化合物として知られる、またはＮＯ放出化合物と考えられている化合物の、本発明の方法における有用性を直接試験することができる。その他の方法として、最初に、このような化合物のグアニレートシクラーゼ（この酵素にＮＯが結合し、ここでＮＯは生物活性を受ける）刺激能をin  vitroアッセイ（例えば、Ishii et al., Am. J. Physiol. 61:H598-H603, 1991）によりスクリ−ニングすることもできる。化合物の保存中の安定性は、例えば、保存化合物の、ＮＯ含有化合物に特徴的な波長（典型的には５９５ｎｍ）におけるＵＶ光の吸収を定期的に測定することにより確認することができる。
【００１８】
本発明に使用するために選択された酸化窒素放出化合物は、粉末（すなわち、細かく砕いた固体であり、精製物、または生物学的に適合性のある担体粉末または一つまたはそれ以上の付加的な治療用化合物との混合物のいずれかの形で供給される）として、または、液体（すなわち、生物学的に適合性のある液体担体中に溶解または懸濁されており、任意で一つまたはそれ以上の付加的な治療用化合物と混合されている）として投与でき、また、エーロゾル化した形（直径１０μｍ以下の粒子または飛沫を含んでいることが望ましい）で簡便に吸入されることができる。吸入に適した担体液体及び粉末は、喘息の治療に従来広く使用されているものであり、このため、これらはこのような治療を開発するものに熟知されている。最適用量の範囲は、薬剤師または当業者により日常的な方法によって決定される。例えば、ＳＮＡＰの有用な投薬レベルは、吸入用量につき１〜５００μｍｏｌ（好ましくは、１〜２００μｍｏｌ）であり、必要な吸入回数は患者の必要性によって異なる。
【００１９】
また、本発明には、肺機能を改善させる（例えば、気管支収縮の解消、または肺の中でのガス交換の促進）ための薬剤または装置の製造、またはこのような応用のためのキットにおける、酸化窒素の供給源の使用も含まれる。このような酸化窒素供給源は、例えば、ＮＯを含有する圧縮ガス混合物、またはＮＯ発生化合物、または他の既知の化学的ＮＯの供給源など、ＮＯが、気道の、本発明に関連した有用な効果を提供し得る部位に輸送されるようなものならよい。本発明の範囲内のキットには、酸化窒素供給源以外には、酸化窒素供給源を肺機能改善のために使用する（例えば、ＮＯガスの吸入により、またはＮＯ放出化合物の吸入により）ための説明書一式を含んでいる。
【００２０】
また、本発明には、気管支収縮または肺血管収縮の治療または予防に適した吸入装置（携帯可能であるよう十分に軽量であることが望ましい、すなわち、５ｋｇ以下、さらに好ましくは１ｋｇ以下）も含まれる。この装置は、喘息発作の治療のために近年入手可能になった吸入器と類似したデザインの物であることもあり、これは、（ａ）圧縮された酸化窒素ガス、及び（ｂ）酸化窒素放出化合物、のいずれかまたは両方を含有している。このような装置は典型的には、最低１ｐｐｍ（好ましくは最低５ｐｐｍ、さらに好ましくは最低４０ｐｐｍ、最も好ましくは最低１００ｐｐｍ）の酸化窒素を含有する圧縮ガスを含む容器；導管及び任意で、吸入可能な薬理学上活性のある薬物を含有するチャンバー（このチャンバーは導管と連結している）を有する外箱；導管またはチャンバー（ここで製薬上活性のある薬剤を放出ガス中に懸濁する）に制御可能な様式でガスを放出するための機構（バルブを押し下げることにより操作することができる放出バルブなど）；患者の呼吸系に放出ガス（及び、もしあれば懸濁された薬物）を輸送するよう配置された導管を有する。導管は、チューブ、マスク、または現在入手可能な吸入器に典型的に見られる再呼吸チャンバーを含むこともある。この装置は、任意で、チャンバー内の化合物を迂回してガスを導管に放出する機構を有することもある。これにより、患者を、最初は酸化窒素を含有するガスのみで治療し、次いで、酸化窒素含有ガスに懸濁した薬理学上活性のある薬物を、必要に応じて投与することができる。薬理上活性のある薬物は、例えば、液体状または固体状の気管支拡張薬化合物などである。このような化合物は、現在既知の、または、気管支収縮を解消するのに効果的であるとして今後発見されるいかなる化合物でもよい。喘息の吸入治療に有用であるとして知られる薬物の型には、Ch.39 of Principles of Medical Pharmacology, Fifth Edition, Kalant and Roschlau, Ed. (B.C. Decker Inc., Philadelphia, 1989）（本発明の参考文献として取り入れられている）に記載されているとおり、クロモリンナトリウム；抗コリン作動性薬剤（例えばアトロピン及び臭化イプラトロピン）；β2アゴニスト（例えばアドレナリン、イソプロテレノール、エフェドリン、サルブタモール、テルブタリン、オルシプレナリン、フェノテロール、及びイソエタリン）、メチルキサンチン（例えば、テオピリン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル）；及びグルココルチコイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、及び吉草酸塩ベクロメタゾン）などがある。吸入療法におけるこれら及び他の効果的な気管支拡張薬の使用法及び用量は、喘息患者を日常的に治療している開業医に熟知されている。
【００２１】
上述の気管支拡張薬に加えて、またはその代わりに、本発明の吸入器装置はＮＯ放出化合物（例えば、ＳＮＡＰ、Ｓ−ニトロソシステイン、ニトロプルシド、ニトロソグアニジン、グリセリルトリナイトレート、イシアミル亜硝酸塩、無機亜硝酸塩、アジド、またはヒドロキシルアミン）を含有することもある。これらの化合物は、吸入されたＮＯガスにより得られる即効的な効果を補うために、長期的な気管支拡張効果を提供する。喘息の治療及び／または可逆的な肺血管収縮における、ＮＯ放出化合物の有用性は、このような症状に対する治療法を日常的に開発している開業医に熟知されているin vitro及びin vivo アッセイによって試験することができる。治療上有用なＮＯ供与体化合物を選択するための判定基準には、吸入までの間の保存における安定性、及び呼吸器官の適切な部位に堆積して、治療上有用な速度でＮＯを放出するよう分解する能力が含まれる。例えば、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシルアミン（“ＳＮＡＰ”）は固体では安定であることが示されているが、生理的条件下（例えば、細気管支管または肺胞管の表面上の、生理的液のフィルム中）では容易に分解してＮＯを放出する（Ignarro, Circ. Res., 1989 ）。酸化窒素放出化合物は粉末状で供給されるか、または生物学的に適合性のある液体担体中に溶解または懸濁されることができる。本発明の装置は、喘息を有する人が使用する典型的な吸入器に類似した携帯吸入器であるが、この吸入器は、窒素ガス（または他の不活性ガス）と、酸化窒素ガス（不活性であり液化された推進薬（propellant）（例えばフレゴンなどのフルオロカーボン）の代わりに、またはこれに加えて使用する）の圧縮混合物を含有する。代替物としては、本発明の装置に含有される、薬理学上活性のある薬物は、抗菌性薬物、またはヒアリン膜疾患の治療に適した界面活性剤でもよい。
【００２２】
他の好適な実施の形態において、本発明の装置は以下を含む：
液化された推進薬中に懸濁された酸化窒素供与体化合物（例えば、液体状または固体状）を含有する容器；
（ａ）容器を搭載するポート、及び（ｂ）ポートに連結した導管、を有する外箱；及び
推進薬を容器から制御可能な様式で導管に放出し、これにより化合物を容器から導管に放出する機構；この導管はヒトの呼吸系に化合物を輸送するよう配置されている。
【００２３】
代わりになされるべきものとして、装置は以下のものを含む：
圧縮された、または液化された推進薬（最低１ｐｐｍの酸化窒素ガスを任意で含む）を含有する容器；
（ａ）酸化窒素供与体化合物を含有するチャンバー、及び（ｂ）チャンバーに連結した導管、を有する外箱；及び
推進薬を容器から制御可能な様式でチャンバーに放出し（例えば、あらかじめ設定した用量で）、これにより化合物をガスに懸濁する機構；この導管はヒトの呼吸系に化合物を輸送するよう配置されている。装置は、現在入手可能な多くのデザインに内の一つに類似した用量計測型吸入器であることが好ましく、治療の必要のある患者が一回または複数回の呼吸で吸入するために噴霧した時、設定された量の気管支拡張薬（ＮＯガスおよび／またはＮＯ放出化合物を含有する）を自動的に排出する。一つの装置において、患者の自由意思で、ＮＯガス（Ｎ2のような不活性ガスにより希釈されている）を出すよう（固体または液体の気管支拡張薬を伴って、またはこのような気管支拡張薬を伴わずに）、任意に設計することもできる。このような“２−ステージ”設計により、Ｎ2中の気体ＮＯの噴霧によって患者の気道が開かれるまで、より長く作用する固体または気体の気管支拡張薬を温存しておくことができ、長期にわたる効用に必要な固体または気体の薬物の服用量を減少させることができる。排出されるＮＯ及び／またはＮＯ放出化合物の最適レベルは、ここに記載する方法などを使用して薬理学者により決定され得る。喘息の治療に有用な、吸入投与によるＮＯガスの用量は１／２分間につき最低１０ｐｐｍであり、好ましくは１分間につき１００〜３００ｐｐｍである。これは、例えば、吸入器のノズルから放出される（または再呼吸チューブまたはマスク内に放出される）圧縮ＮＯを、Ｎ2との混合物中最低１，０００ｐｐｍで詰めることにより達成できる。肺血管収縮の自己投与治療においては、患者の肺に有効レベル（１０〜３００ｐｐｍ）のＮＯを含ませるために、ノズル部分に１，０００〜３０，０００ｐｐｍの濃度のＮＯ（Ｎ2中）が必要であり、これを５００ｍｌの呼吸容量中に５ｍｌ送り込む。
【００２４】
ＮＯガスは、気管支を拡張し、これにより、吸入投与された他の薬剤をより良く分布させるためにも使用することができる。このような、頻繁に吸入投与される薬剤の例には、抗生物質及び他の抗菌物質（例えば、pneumocytis 肺炎の治療に用いるペンタミジン）、及び、例えばヒアリン膜疾患を有する小児に与えるような界面活性剤などが含まれる。ここに記載された発明により、喘息発作、急性呼吸困難（例えば、ＡＲＤＳまたは肺炎）、及び血管収縮性肺高血圧に対する、簡便、安全、迅速かつ効果的な治療または予防的治療法が提供される。本発明の実施の形態の一つにおいては、圧縮ＮＯのカートリッジまたはＮＯ放出化合物（粉末状または液状）のエーロゾルコンテナを有する携帯吸入装置を、病院に設置しても、または応急手当ての分野においても、喘息または肺血管収縮の吸入療法に使用することができる。このような吸入器は、例えば、低酸素症を起こす危険性のある人（例えば、登山家）、または、スキーパトロール隊員（緊急時に、低酸素性肺水腫を起こしたスキーヤーに吸入療法を施すことができる）が携帯することができる。気管支拡張薬を含有する類似の吸入器は、喘息患者に日常的に携帯される。本発明の他の実施の形態においては、圧縮ＮＯのカートリッジまたはＮＯ放出化合物のエーロゾルコンテナを換気回路に連結することができる。これは、ＰＰＨＮを有する新生児をある病院から他の集中治療室を有する病院に移送する時に、その新生児の治療及び安定に使用するか、または、病院または応急手当室においてマスク療法による肺炎及びＡＲＤＳの治療に使用することができる。
【００２５】
ＮＯ放出化合物を固体状または液状で吸入すると、粒子または飛沫は呼吸系全体に蓄積し、この場合、大きめの粒子は入り口（すなわち、口また鼻の中）付近に蓄積しやすく、小さめの粒子または飛沫は、呼吸系のより奥まで輸送され、トラケア（空気管）、気管支、及び最終的には肺胞に蓄積する（例えば、Hounam & Morgan,  “Particle Deposition ”, Ch. 5 in Respiratory Defense Mechanisms, Part 1, Marcel Dekker, Inc., NY; ed. Brain et al., 1977; p.125 参照）。本発明の方法において使用する粒子／飛沫は、直径が１０μｍまたはそれ以下であることが好ましい。治療目的が肺血管収縮である場合、粒子／飛沫の大きさは一般的に、肺胞に蓄積するのに適した大きさの分布（すなわち、平均５μｍ以下、理想的な大きさは１〜３μｍ）である必要があり、主に気管支が関与している喘息発作の治療には、約２〜８μｍの大きさの粒子／飛沫を吸入することが望ましい。好適な担体（もしあれば）、推進薬（Ｎ2のような不活性ガス中で希釈されたＮＯを含む場合もある）、吸入器の設計、及び担体中のＮＯ放出化合物の処方の決定は、喘息の日常的な吸入療法の開発に従事する者に熟知されている。携帯吸入器は、圧縮ＮＯ（Ｎ2のような不活性担体ガス中に存在することが好ましい）を含有する容器（キャニスタ）、または他のＮＯ供給手段のいずれかを有してもよい。これ以外の方法で、またはこれに加えて、吸入器は、乾燥状態で推進薬と混合されているかまたは推進薬と区別されたチャンバー中に保存されているかのいずれか、または、適切な大きさの粒子の霧状にできるよう液体担体と混合されているか、または、携帯吸入器技術に長けた者に既知の、他のいずれかの形のＮＯ放出化合物を有してもよい。現在までに開発されている数種の型の吸入器デザインの一部は、例えば、米国特許第４，６６７，６６８号；第４，５９２，３４８号；第４，５３４，３４３号；及び第４，８５２，５６１号に記載されている（これらの特許は、参考文献として本発明に取り入れられている）。他の吸入器デザインは、Physicians' Desk Reference, 45th Edition, Edward R. Barnhart, Publisher (1991)に記載されている。これらの各々及び他のエーロゾル型吸入器は、ＮＯガス及び／またはＮＯ放出化合物を分配するために適応させることができる。また、非エーロゾル型吸入装置（例えば、Allen & Hanburys, Research Triangle Park, North Carolinaにより開発された装置）は、乾燥粉末状で処方されたＮＯ放出化合物の分配に有用である。
【００２６】
血流中に入ったＮＯガスはヘモグロビンと結合することにより迅速に不活性化されるため、吸入ＮＯの気管支拡張効果は換気された気管支に制限され、吸入ＮＯの血管拡張効果は血流に流入するＮＯ流路部位付近の血管（すなわち、肺微小血管）に制限される。このため、本発明の気管支拡張方法及び血管拡張方法双方の重要な利点は、全身血圧を潜在的に危険なレベルまで低下させることなく、気管支痙攣及び／または肺高血圧を選択的に予防または治療できることである。本発明により、全身血管拡張に伴うおそれのある、生命を維持するために重要な諸器官への灌流量低下、静脈の滞留、虚血及び心臓疾患の危険性を有さずに肺高血圧を効果的に解消することができる。このような独立した肺血管拡張は、新生児のＰＰＨＮの治療にも重要である。なぜならば、全身的な血管拡張により、新生児の動脈管または卵円孔を通過する際、酸素を供給された血液及び酸素を消費された血液の望ましくない混合が促進されるからである。さらに、本発明の方法に付随して血管拡張及び換気された動脈への血流量の増加が生じるため、本発明の方法は喘息患者または急性呼吸困難患者において酸素輸送を増進し、典型的な血管拡張剤には見られない付加的な有用性を提供する。
【００２７】
本発明は、ＮＯ吸入療法に応答性のある形の慢性肺高血圧に対する、簡便、迅速、かつ悪影響のない診断方法をも提供する。これらの患者は、本発明の方法による長期吸入療法の恩恵、または、例えば、ニトロプルシド及びグリセリルトリナイトレートなどのＮＯ生成血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬または他の型の血管拡張薬を用いた慢性的な全身治療の恩恵を受けることができる。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点は、以下に述べる発明の実施の形態、実施例から明白である。
【００２９】
【発明の実施の形態】
肺血管収縮に対するＮＯ吸入療法
本発明は、患者の全身血圧の低下を伴うことなく、急性及びある種の慢性肺高血圧を治療または予防するための、簡便、迅速、選択的かつ効果的な方法を初めて提供する。肺高血圧は、多様な患者を悩ます広範囲な臨床的症状である。吸入されたＮＯを、以下の疾患を患うまたは患う危険性のある患者に対して（しかしこれらに限定されるものではない）使用することは広く考えられている：ＡＲＤＳ、肺炎、喘息、急性肺水腫、急性または慢性低酸素症、肺胞過換気状態、高地肺水腫（“高山病”）、ＰＰＨＮ、ヒアリン膜疾患、アシドーシス、特発性肺高血圧、敗血症、肺血栓塞栓症、肺高血圧続発性肺性心、周産期吸引症候群、及びヘパリン抗凝血のプロタミン解消（“ヘパリン−プロタミン反応”）に応答した急性肺血管収縮。
【００３０】
投与方法
圧縮ガスは、典型的には純粋Ｎ2ガス中に２００〜８００ｐｐｍのＮＯを含有する混合物として、例えば、Air Products and Chemicals, Inc. (Allentown, PA)またはAirco (Murray Hill, NJ) などの業者から入手可能である。窒素の高酸化物（ＮＯとＯ2の反応により生成する）は潜在的に肺組織に対して有害であるため、ＮＯをＯ2またはこのような窒素の高酸化物非含有状態で入手し、保存することは必要不可欠である。もし望むなら、患者に投与する前に、既知の方法を用いてＮＯの純度をケミルミネッセンスにより証明することができる。ＮＯ−Ｎ2混合物は、例えば、あらかじめ肺活量計により確認された較正済みのロタメータを通して、空気またはＯ2と混合される。呼吸用混合物の最終ＮＯ濃度は、当業者に熟知された化学的またはケミルミネッセンス技術（例えば、Fontijin et al., Anal. Chem. 42:575-579, 1970 ）を用いて確認することができる。ＮＯ2などのいかなる不純物も、ＮａＯＨ水溶液、baralyme、またはソーダ石灰に接触差せることにより除去することができる。付加的なコントロールとして、最終的なガス混合物のＦiＯ2も測定することができる。もし望むなら、隣接した環境中に大量のＮＯが流出することのないように、換気器の呼気放出口にガス捕促剤を添加することができる。
【００３１】
病院または応急手当ての分野においては、Ｎ2中に圧縮ＮＯガスを有するタンク及び酸素または酸素／Ｎ2混合物の第二のタンクを、これら２つのガス供給源を混合するよう設計された吸入器に連結することにより、ＮＯガスの投与を行なうことができる；各ガス供給源からのガスの流量を制御することにより、患者が吸入するＮＯの濃度を最適レベルに維持することができる。
【００３２】
ＮＯは、急性肺血管収縮の疑いのある哺乳類に、空気、純粋酸素、または他の適切なガスまたはガス混合物中に１ｐｐｍ〜４０ｐｐｍの濃度で必要な期間投与することができる。短期においては、濃度を８０〜１８０ｐｐｍまで増加させることができる：即座に劇的な効果が望まれる場合、例えば、５分間に１８０ｐｐｍのＮＯを投与することができる。
【００３３】
肺脈管圧及び流量の評価
肺動脈圧は、局部麻酔した患者の静脈を経由して経皮的に設置した流量対応型肺動脈（ＰＡ）カテーテルを用いることにより、最も正確にモニターすることができる；ＰＡ流量は、通常、このようなＰＡカテーテルを経由して熱希釈（thermaldilution ）を用いて測定することができる。この代わりとして、間接的な非侵略的モニタリングの方法もある：例えば、心臓超音波、心収縮時間間隔のモニタリング、及びレンジ−ゲーティッド（range-gated ）ドップラー技術など。このような代替的なモニタリング方法は、例えば、緊急状況、カテーテルの適用に適さない患者、または現在進行中の治療または確立した方法において有用である。
【００３４】
酸化窒素の薬理学的効果
吸入されたＮＯガスは、肺胞に隣接した脈管空間に拡散して肺脈管平滑筋の弛緩を引き起こし、これにより肺血流量及びガス交換を増加させることによって作用する傾向がある。重度の急性呼吸困難を患うヒト５人において得られた初期的な証拠により、１カ月までの期間の機械的な換気の間吸入したＮＯ（約２０ｐｐｍ）により、肺動脈圧及びＱVA／ＱT（右左短絡：肺酸素輸送の無効果の測定値）の両方を低下させ、これにより、患者の酸素レベルを顕著に増加させた。このことより、ＮＯの血管拡張は、換気された肺胞のみで起こり、換気されていない肺胞では起こらないことを示唆している。これは、例えば、ニトロプルシドのような血管拡張薬を静脈注射により投与した後に見られる結果と顕著な対照を示す。気体状のＮＯを直接肺に限定的に送り込むことにより、溶解したＮＯは、ヘモグロビンの結合により不活性化される前に、標的脈間平滑筋に対して薬理学効果を発揮することができる。これと同時に、ＮＯにヘモグロビンが迅速に結合することにより、吸入されたＮＯの血管拡張作用は肺血管のみに局所的または選択的なものもあり、体循環下流の血管拡張を伴わないことを保証している。
【００３５】
慢性肺高血圧の診断及び治療
慢性肺高血圧は、肺における血管の閉塞または構造的狭小により特徴づけられる。ある特定の患者の慢性的な症状が肺脈管平滑筋の痙攣性収縮または気管支収縮により引き起こされたかまたは悪化したものである以上、症状は、少なくとも部分的にはＮＯの吸入により改善される：このような、ＮＯまたは恐らく全身的血管拡張薬を用いた治療の影響を受けやすい症状は、断片的なＮＯ吸入試験（例えば、８０ｐｐｍのＮＯを６分間吸入した場合と、ＮＯを添加しない空気を６分間吸入した場合の違いを、２〜４回繰り返して検討する）においてＰＡＰ、ＰＣＷＰ及び心臓からの流出量を測定した時の応答性により、容易に同定することができる。応答性のある症例（例えば、ＰＶＲが２０％以上低下する場合など）は、次いで、携帯ＮＯ吸入療法、固体状または液状のＮＯ放出化合物の吸入、またはグリセリルトリニトレートまたは他の非特異的全身拡張薬（例えば、カルシウムチャネル遮断薬）のいずれかで治療することができる。
【００３６】
肺血管収縮に対するＮＯ放出化合物吸入療法
気体状ＮＯの吸入によりある型の肺血管収縮が効果的に解消されるという知見から、肺血管収縮に対する他の吸入療法（気体状ＮＯではなくＮＯ放出化合物を吸入する）が示唆される。この方法においては、蓄積されたＮＯ放出化合物が比較的長期間にわたってＮＯを放出するために、気体状ＮＯを断片的に吸入する場合よりも長期の効力を提供する。当業者は、選択されたＮＯ放出化合物の処方及び用量を不必要な実験を行なうことなく決定することができる。一例として、乾燥粉末状のＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）またはＳ−ニトロソシステインのようなＮＯ放出化合物の典型的な単回吸入用量は、１時間にわたり、体重１ｋｇあたり活性化合物（ＮＯ）６０〜６５０μｇの範囲である。実験的にＰＡ圧を上昇させたヒツジにおいて、１．３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＰの吸入により、ＰＡ圧の低下が延長された。
【００３７】
喘息に対する吸入療法
血管収縮と同様、気体状ＮＯ、または固体状または液状のＮＯ放出化合物のいずれかを吸入することにより、喘息において起こるような気道の痙攣性収縮を解消することができる。気体状ＮＯは、粒子を含まずに迅速に拡散する利点があり、気管支が拡張した領域の血管も拡張する。これにより、動脈内の酸素分圧が上昇する。投与は上記のとおり行ない、典型的には、発作開始時または発作が起こる直前から投与を始める。所定の患者に対して継続的な気管支拡張が必要な場合、マスクやテントなどを使用して、患者の回りの全体的な環境を低用量のＮＯガスで充満（高いガス入れ替え率で）させることができる。
【００３８】
吸入装置
本発明の吸入療法は、本発明の吸入装置の一つを使用して投与することが好ましい。このような装置の１つ（装置１０）の断面図を図１７に示す。これは、導管１６が連結したチャンバー２０を有する外箱１４、推進薬または圧縮不活性化ガス中に最低１ｐｐｍの酸化窒素が溶解している圧縮ガス、及び／または固体状または液状の酸化窒素供与体治療薬の懸濁物を含んでいる容器１２、この容器１２は、スライド可能な状態でチャンバー２０上に搭載されている。容器１２中の圧縮された含有物を導管１６へと制御可能な様式で放出するための、圧力活性化バルブ機構１８、及び、導管１６の片方の末端となっている再呼吸チャンバー２２、このチャンバー２２は一方向バルブ２４を有し、空気２８はこのバルブを通って再呼吸チャンバー２２に入ることができるが、治療薬ガスは流出することができない。患者は、容器１２の上端２６（外箱１４から突出している）を押して、この装置を使用する。これにより容器１２をチャンバー２０内にスライドさせ、バルブ機構１８を押し下げる。これにより、容器１２中の圧縮された内容物は導管１６及び再呼吸チャンバー２２に放出される。次いで、患者は再呼吸チャンバー２２の内容物の一部を吸入する。この時、一方向バルブ２４を通して空気２８が再呼吸チャンバー２２に引き込まれ、患者により吸入された内容物の一部と置換される。容器１２から再呼吸チャンバー２２に放出された単回用量の治療薬が、患者に十分に吸入されるためには、数回の呼吸が必要であろう。この装置の総重量は２００グラム以下であるため、容易に携帯することができる。
【００３９】
他の好適な実施の形態１００（図１８に図示）において、外箱１０２は、（ａ）吸入可能な、薬理学的に活性のある化合物１０６を含有する第一チャンバー１０４と、（ｂ）第一チャンバー１０４に連結した導管１０８を有する。圧縮ガスまたは、最低１ｐｐｍの酸化窒素を含む液状推進薬を含有する容器１１０が、外箱１０２の第二チャンバー１１２にスライド可能な状態で搭載されている。このため、容器１１４の上端に圧力をかけると、容器１１６の下端に位置する圧力放出バルブが外箱１０２の壁に対して押し下げられ、これによりバルブが開いて容器１１０の圧縮された内容物の一部が第一チャンバー１０４へと放出される。このようにして放出されたガスは、第一チャンバー１０４中の化合物１０６と混合され、この化合物をエーロゾル化された霧として懸濁する。次いで、この霧は、導管１０８の、開放されたマウスピース末端１１８を通って患者により吸収される。患者は任意で、圧力放出バルブを開ける前、または開けている最中に、バネを有するちょうつがい１２２上のタブ１２０を手動で押し下げることができる。これは放出された圧縮ガスの流路から第一チャンバー１０４を一時的に遮断するよう作用し、これにより、放出された圧縮空気は治療薬１０６が入っている第一チャンバー１０４を迂回して直接導管１０８に流入する。治療薬１０６が懸濁されていない酸化窒素ガスを最初に吸入することにより、その後吸入される、より緩慢に作用する固体状または液状治療薬１０６の潜在的な有用性を最大限にするよう患者の気道が十分に開かれる。このため、患者は次いで、タブ１２０を離し、容器１１４上端を押し下げてバルブ１１６を開き、導管１０８の開放末端マウスピースから、このように放出された、圧縮ガス中に懸濁された治療用化合物１０６を吸入する。
【００４０】
【実施例】
以下に、実験動物及びヒトに対する実施データ、さらにヒト患者に実施した場合の応用例を用いてより具体的に説明する。
【００４１】
１．肺血管拡張
Ａ．仔ヒツジへの気体酸化窒素の投与
ｉ．方法
動物モデルの外科的調製：
研究の３日前に、ハロタン／酸素を用いた一般的な器官内麻酔下でサフォーク種仔ヒツジ（体重２５〜３５ｋｇ）を無菌的に開胸し、左心房線、気管開口及び大腿動脈線を導入した。３日間回復させた後、仔ヒツジに、７個のフレンチ熱希釈肺動脈モニタリングカテーテルを局部麻酔下で無菌的に導入した。
【００４２】
実験条件：
低酸素性血管収縮を起こしにくくする一般的な麻酔を避けるため、覚醒した、麻酔していない仔ヒツジを実験に供した。仔ヒツジをBabraham檻に入れ、随時飲食させた。２つの実験を別々に２日間、６匹の仔ヒツジ各々について行なった。実験終了後、バルビツレートを大量に与えて仔ヒツジを屠殺し、それらの肺を固定、染色して病理学的変化を光学顕微鏡を用いて観察した。
【００４３】
Ｕ４６６１９により誘発された肺血管収縮を有する仔ヒツジへのＮＯの投与：
実験１日目、６０〜７０％の酸素を呼吸している仔ヒツジに、トロンボキサンの安定なエンドペルオキシドアナログ（５Ｚ、９α、１３Ｅ、１５Ｓ）−１１，９−（Epoxymethano）prosta−５、１３−dien−１−oic acid（Ｕ４６６１９、The Upjohn Company, Kalamazoo, MI ）を、０．４〜０．８μｇ／ｋｇ／分で与えた。開口気管を、５リットルリザーババッグと一方向バルブ（これにより排出ガスから吸入ガスを独立させる）を有する非再呼吸回路に連結した。排出ガスは排気し、捨てた。吸入ガスは確実に酸素と窒素の混合物であり、ＮＯにより迅速に希釈して正しい吸入濃度を作製した。容積測定用に較正した流量計を用いて種々の容量のＮＯをＮ2と混合し、吸入酸素濃度に対する望ましいＮＯ濃度（ＦiＯ2）０．６〜０．７を得た。各レベルのＮＯ吸入後、リザーババッグを空にした。Ｎ2の変換を最低限にするために、ガスリザーバ中のＮＯの貯蔵半減期は１５秒またはそれ以下とした。ＮＯは、純粋Ｎ2中にＮＯを２３５ｐｐｍ含有する混合物としてAir Products and Chemicals, Inc., Allentown, PA から入手した。Fontijin, Anal. Chem. 27:1903 (1981)。
【００４４】
ＮＯ濃度が５、１０、２０、４０、及び８０ｐｐｍと順次増加する一連のＮＯ／Ｏ2混合物を６分間呼吸させた仔ヒツジ８匹について、Ｕ４６６１９注入中の吸入ＮＯ濃度に対するＰＡＰの変化をプロットした肺血管拡張薬の用量応答曲線を作成した（図１）。各レベルのＮＯへの接触の後、ＮＯを含有しない酸素混合物を６分間呼吸させた（図２）。２回目のＮＯへの接触も、同様の期間で測定した。次いで、酸素混合物を呼吸するコントロール期間について、Ｕ４６６１９の注入終了後６分後に測定した。実験中ＮＯの投与または投与中止後３分または６分の期間各々について、平均及び局面の肺動脈圧（ＰＡＰ）、左動脈圧（ＬＡＰ）、全身動脈圧（ＳＡＰ）及び中心静脈圧（ＣＶＰ）を測定した。すべての圧力は、胸部中心点の大気圧をトランスデューサの０としてHewlett Packard Multi-Channel ストリップチャート記録計に記録した（例えば、図３参照）。心臓流出量  （ＣＯ）は、０℃でRingers 乳酸を５ｍｌ注入して、２回決定した平均値として熱希釈により測定した。肺脈管抵抗（ＰＶＲ）及び全身脈管抵抗（ＳＶＲ）は、標準的な公式から計算した。各吸入ＮＯ濃度において測定したＰＶＲを図４に示す。適切な統計学的解析を行ない、すべてのデータは平均±標準誤差により表した。
【００４５】
低酸素症により誘発された肺血管収縮を有する仔ヒツジへの、ＮＯの投与：
急性低酸素性肺高血圧を誘発するために低酸素ガス混合物を呼吸させた覚醒仔ヒツジ５匹について、この呼吸中観察を行なった。３匹は、敗血症及び心臓疾患を有したため除外した。上述のものと類似した血流力学的モニタリング技術を使用した。２５リットルリザーババッグを用い、約３０ｍｍＨｇのＰaＯ2における平均ＰＡＰを約２５ｍｍＨｇにするためにＦiＯ2を０．０６〜０．０８に低下させた。次いで、４０または８０ｐｐｍのＮＯを吸入ガス混合物に添加した。過剰換気による再呼吸を防止するために、ガスの総流量を３５ｌ／分に維持した。電極（モデル５５９０、Hudson Co., Temecala, CA）を用いて吸入ＦiＯ2をモニターし、純粋ＣＯ2を吸入ガスに添加して潮汐終了時の（end tidal ）ＣＯ2濃度を４．５〜６％に維持した。低酸素症中、及び低酸素症中に３分または６分間ＮＯを呼吸した場合、中心血流力学及びガス交換はベースラインを示した。対応したｔ試験により比較を行なった。
【００４６】
ｉｉ．結果
薬物を吸入しないコントロール仔ヒツジ２匹に、８０ｐｐｍのＮＯをＦiＯ2０．６〜０．７で呼吸させた。これらの仔ヒツジにおいて、平均ＰＡＰ、ＳＡＰ、ＣＯまたはＳＶＲに変化は見られなかった。
【００４７】
８匹の仔ヒツジにおいて、ＳＶＲ、ＣＯまたはＳＡＰに対する、Ｕ４６６１９注入中のＮＯ濃度を回帰解析したところ大きな変化は見られなかった。しかし、Ｕ４６６１９に誘発された肺血管収縮及び肺高血圧は、すべての用量レベルのＮＯ吸入により迅速に減少した（図１、２）。ＮＯ吸入開始後数秒以内に肺血管の拡張が始まった。血管拡張効果は３分以内にほぼ最大となった（図３）。ＮＯ吸入を中止すると、血管収縮は３分から６分以内に当初のレベルに戻った。８匹の仔ヒツジにおける吸入ＮＯ肺血管拡張応答曲線を図１に示す。５ｐｐｍのＮＯ  （吸入肺用量は０．８９μｇ／ｋｇ／分）はＰＡ圧を大きく低下させ、４０または８０ｐｐｍ吸入した場合、ほぼ完全な血管拡張応答が起こった。Ｕ４６６１９注入中のベースラインＰＡＰ時のわずかな減少を考慮した後、５、１０及び２０ｐｐｍのＮＯを含む呼吸に二回目に接触した時の血管拡張応答は、最初の一連の接触の場合と比較して大きく減少することはなかった（図２）。追加の実験として、４匹についてＵ４６６１９注入中、一時間にわたって８０ｐｐｍのＮＯを吸入させたところ肺血管は正常ＰＡＰになるまで拡張し、ＮＯ吸入後に肺高血圧は再発した。
【００４８】
急性低酸素性肺高血圧を誘発させた５匹の仔ヒツジすべてにおいて、心臓流出量が顕著に増加した。吸入低酸素ガス混合物に４０または８０ｐｐｍのＮＯを添加した各瞬間において、心臓流出量は上昇したままであるにもかかわらず、肺動脈圧はコントロールレベルに戻った；平均ＰＶＲは、３３％低下した（表１）。低酸素症の間のＰaＯ2及びＰVＯ2は、ＮＯを吸入させてもさせなくても類似していた。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
ｉｉｉ．その他の実験
覚醒ヒツジ９匹における、１８０ｐｐｍのＮＯの吸入の、ヘパリン−プロタミン反応によるＰＡＰ及びＰＶＲの上昇を阻害する能力を、コントロール（空気を呼吸したヒツジ）との比較で示している。これら９匹において、最初にヘパリン（２００Ｕ／ｋｇ；Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ）を投与し、その５分後にプロタミン（２ｍｇ／ｋｇ；Elkins-Sinn ）を投与することによりヘパリン−プロタミン反応を誘発させた。これらヒツジの各々は、コントロールとしても使用した。さらに別の６匹に、空気を呼吸させながら、ニトロプルシドナトリウム（４０μｌ／ｋｇ体重／分；Elkins-Sinn ）を静脈注射で注入した（データ示さず）。１８０ｐｐｍのＮＯ吸入で、ヘパリン−プロタミンにより誘発されたＰＡＰは、４０μｌ／ｋｇ／分のＳＮＰを注入した場合と同程度低下した。また、ＮＯ吸入時には、ＳＮＰ注入時に特徴的に見られる顕著な全身性低血圧は見られなかった。  １８０分間にわたって８０ｐｐｍのＮＯを呼吸したヒツジ３匹から摘出した肺を光学顕微鏡で観察し、ＮＯを呼吸したことに起因する形態学的変化の存在を調べた。これらの肺とコントロールの肺の間には特筆すべき違いは見られなかった。
【００５１】
Ｂ．新生児持続性肺高血圧を有する小児への気体ＮＯの投与方法
Massachusetts General Hospitalにおいて承認された、新生児への実験的なＮＯの投与方法を以下に説明する。
【００５２】
被験者の選択：
新生児持続性肺高血圧（ＰＰＨＮ）を有する患者１０人を本研究に選択した。
【００５３】
ａ．選択基準
−生後１週間以内の小児
−管前性及び管後性分配に、動脈血の採取部位を有する小児
−機械的な換気の補助が必要な小児
−Short, Clin. Perinatol. 14:737-748, 1987の判定基準による呼吸疾患を有する小児
−全身的な血管拡張薬及び／または緩衝液（重炭酸塩）の注入を受ける可能性のある小児
ｂ．除外基準
−観察、母体−胎児超音波及び日数から判定した妊娠期間が＜３７週であると定義される未熟児
−出生時体重が＜２５００ｇ
−羊水過少症から示唆される肺の発育不全、先天性横隔膜ヘルニア、先天性側弯症、または窒息性胸郭形成異常と合致する特徴−胸管を用いても排気されない気胸
−低血圧を伴う気心膜症または気縦隔症
−固定した解剖学的心臓及び脈管病変
（単離された開存性動脈管及び開存性卵円孔を除く）
−活性化された肺出血または血小板数が＜５０，０００／ｍｍ3
−実験開始後２４時間以内の、頭蓋出血の証拠となる頭蓋超音波
−出生後２４時間以内の静脈ヘマトクリトが≧７０％であることにより定義される血液過粘稠
−血液の培養物中病原体が陽性であることにより定義される敗血症
−親または法的保護者のインフォームドコンセントが得られない者
【００５４】
研究方法：
選択された患者は仰臥姿勢を維持させ、鎮静のため３μｇ／ｋｇのフェンタニル、及び筋肉弛緩のため０．１ｍｇ／ｋｇの臭化パンクロニウムを投与する（その前一時間以内にこのような処置を受けていない場合）。小児は、小児麻酔科医の立ち会いのもとでカテーテル法手術室に移送され、ここで、流量対応型肺動脈カテーテルを、大腿静脈を経由して局部麻酔下で経皮的に導入する。ＮＯ吸入に応答した肺高血圧及び血管拡張の度合いを迅速に評価するために、カテーテルにより肺動脈圧を直接測定する。新生児ＩＣＵに戻ってから、ＦiＯ2を０．９０に調整する。必要な看護及び医学的介入がすべて終了した後、患者を２０分間このコントロール状態で平衡化させる。以下に定義するような改善が見られない場合、動脈血試料は管後部位から採取する。次いで、窒素中のＮＯを連続的に呼吸回路に導入する。一方向バルブにより、酸素がＮＯタンクに逆流するのが防止される。同一のＦiＯ2（０．９０）及び流速を維持する。吸入されたＮＯの初期濃度は２０ｐｐｍである。ＰaＯ2＞１００ｍｍＨｇ及びＡ−ａＤＯ2＜５７０ｍｍＨｇ（管後の試料）である時、改善されたと定義する。変化が認められない場合、一定のＦiＯ2及び流速で、吸入ＮＯを４０ｐｐｍに上昇する。管後動脈血のガスを再度測定する。同様の判定基準が再び得られない場合、ＮＯ濃度を８０ｐｐｍに上昇し、３回目の、管後動脈血のガスの採取を行なう。各濃度のＮＯの呼吸期間は、１０分間とする。
【００５５】
治療期間終了後、動脈血ガスの分析のため再度採血する。メトヘモグロビン及びヘモグロビンレベル及び網状赤血球数の解析のため、ＮＯとの接触前後の試料も採取する。血液スミアについて、ハインツ体の存在を調べる。ＮＯ吸入に関連したあらゆる変化を評価するために、これらを、治療後２４時間繰り返す。血液試料の総量は５ｍｌ以下とする。
【００５６】
統計的手法：
大きさの異なるグループについて繰り返し測定した分散を解析して、データを評価する。Winer,“Single fctor experiments having repeated measures on the same elements”,in Statistical Principles in Experimental Design, 2nd. Ed., NY, McGraw-Hill, (1971), pp. 261-308 。Post hoc testingは、Mann-Whitney Uにより行なった。重要度は、５％のレベルで判断した。
【００５７】
Ｃ．新生児持続性肺高血圧（ＰＰＨＮ）を有する小児にＮＯを投与した結果
第一の被験者  注意深い（compassionate)使用を通して、持続性肺高血圧及び先天性心臓疾患を有する小児に酸化窒素を投与した。換気の期間延長、管前性動脈血採取部位がないこと、及び心房心室（ＡＶ）管があることにより、この患者は、上述のＰＰＨＮ試験に含まれなかった。
【００５８】
患者は、妊娠全期間を経た３２２５ｇの男児で、重度の先天性心臓疾患及び低酸素血症のために、体外膜酸素付加（ＥＣＭＯ）による治療を受けていた。この患者からＥＣＭＯを外し、新生児集中治療室内で挿管及び換気を続けた。この患者の低酸素血症は進行を続け、これは、管後性パルスオキシメトリー（ＰＯＸ）値に反映されていた。この患者がカテーテル法研究室に移送され、Ａ−Ｖ管の存在が確認され、ある種の緊急心臓手術が必要であると決定されるまでに、最大限の医学的及び換気的な救命手段を施されており、危険な低酸素血症が続いていた。このような状況下で、我々は、患者に酸化窒素治療を行なう了承を得た。
【００５９】
カテーテル法研究室に到着したとき、この患者は極度のチアノーゼであった。酸化窒素の投与に先立ち、この患者にフェンタニル、酸素、過剰換気及び静脈注射による液体薬を施して状態を安定させた。表２に示すとおり、カテーテル法により重度の肺高血圧及びＡ−Ｖ管の存在が明確になった。酸素及び過剰換気治療による短絡の修正は認められなかった。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
ブレンダへのＮＯの圧力を段階的に減少させるため、レギュレータを使用した。これにより、供給する８００ｐｐｍ  ＮＯ／Ｎ2及び１００％  Ｎ2の比容量を調整することができた。患者を純粋酸素で治療しながら、呼吸回路の吸入回路へのＮ2の流量（流量レギュレータを通した）をＦIＯ2が０．９になるまで増加させた。その効果を表２に示す。これは、１：１０希釈の窒素ガスを供給する。次いで、０〜８０％のＮＯを供給するよう、Ｎ2及びＮＯ／Ｎ2の比容量をブレンダを用いて調整した。
【００６２】
表２のデータは、ＮＯへの接触が、動脈飽和、パルスオキシメトリー値、及び動脈の酸素分圧の適度な上昇を誘発するが、全身血圧（“Mean Pressure-Art ”）に不都合な効果を与えないことを示している。これは、この期間における、ガスの安定化効果を反映している。酸化窒素の供給を停止し、中央カテーテルを除去すると、動脈飽和及び酸素ガス分圧は急激に低下した。カテーテルを除去したため、ＲＡ値及びＰＡ値は決定できなかった。他の手段で患者を回復させることができなかったため、症状の改善のために酸化窒素の供給を再開した。これにより酸素飽和及び血液ガス分圧が改善された。この後、酸化窒素供給を中止すると、患者の酸素付加レベルは、危険な低レベルへと低下した。患者に酸化窒素の供給を続けながら新生児集中治療室に戻した。
【００６３】
集中治療室にいる間に、肺血管系を拡張するために患者にプロスタグランジンＥ１を注入した。標準的な用量のプロスタグランジンを投与したにもかかわらず、酸化窒素の供給を中止すると、酸素飽和は危険なレベルまで低下した。ＥＣＭＯによる治療ができるようになるまで、患者に酸化窒素を供給し続けた。この試験により、肺高血圧及び先天性心臓疾患を有するこの患者において、酸化窒素がガス交換を改善するのに効果的であることが証明された。
【００６４】
その他の患者  さらに２人の、ＰＰＨＮを有する小児にＮＯ吸入治療を施した。双方において、２０〜８０ｐｐｍのＮＯの吸入に対して良好な応答性を示し（管前性酸素付加が増加）、２人とも長期間生存した。このうち１人については、ＮＯ吸入単独により非常に迅速に回復したため、ＥＣＭＯはすべて除去された。
【００６５】
Ｄ．成人呼吸ジストレス症候群を有する成人へのＮＯ投与の結果
第一の被験者  患者（４２才の女性）は、吸引性肺炎に起因する成人呼吸ジストレス症候群（ＡＲＤＳ）を３週間患っていた。この患者においては、広範囲の肺水腫が見られ、ＱVA／ＱTが高かった（３０％）。２１日間の静脈静脈性体外膜酸素付加器の補助（３リットル／分血流量）の後の平均ＰＡＰは５５ｍｍＨｇであった。
【００６６】
吸入酸化窒素の短期間効果を、静脈注射により投与したプロスタサイクリン  （ＰＧＩ2；５ｎｇ／ｋｇ／分）の短期間効果と比較した。平均肺動脈圧（ＰＡＰ）、右心室拍出分画（ＲＶＥＦ）及びガス交換変数が上昇した。ＲＶＥＦは温度希釈により評価し、ガス交換変数は複数不活性化ガス排出技術（ＭＩＧＥＴ）を用いて解析した。ＭＩＧＥＴ及びＲＶＥＦデータは２つの異なる状況から取得した。換気器は、潮汐容量６ｍｌ／ｋｇ、呼吸速度１４／分、ＦIＯ2０．４〜０．４８及び５ｃｍＨ2ＯのＰＥＥＰ（positive end expiratory pressure）に設定した。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
図６及び表３に示したとおり、吸入ＮＯは、静脈注射ＰＧＩ2と同様、ＰＡＰを低下させ、ＲＶＥＦを改善したが、ＰＧＩ2とは対照的に、ＮＯはＰaＯ2を上昇させ、右左短絡及びＶD／ＶTを低下させた。酸素中１８ｐｐｍのＮＯの吸入により、平均ＰＡＰは３８〜４２ｍｍＨｇに低下し（１２〜１４ｍｍＨｇの低下）、ＰＶＲは４４％低下した。この時、ウエッジ圧は１５ｍｍＨｇ内外で一定であり、心臓流出量は７リットル／分内外で不変であった。ＮＯ濃度を３６ｐｐｍに上昇すると、若干の付加的な血管拡張（２〜５ｍｍＨｇ）が見られた。ＮＯの投与を選択的に停止すると、ＮＯによる血管拡張は約１  １／２時間持続した。ＮＯ吸入中、六フッ化イオウを用いて測定したＱVA／ＱTが３８％から２６％  （１８ｐｐｍのＮＯ）及び３３％（３６ｐｐｍのＮＯ）へと低下した。ＮＯ吸入に伴う全身動脈圧の変化は見られなかった。全身血管拡張薬であるＰＧＩ2がＱVA／ＱTを５７％へと上昇させるのと異なり、吸入ＮＯは換気された肺領域の血管系を優先的に拡張した。この試験は、低レベル（１８〜３６ｐｐｍ）の吸入ＮＯが重度の急性肺疾患（ＡＲＤＳ）患者において、短絡を助長することなく、強力な肺血管拡張薬として作用する能力を有することを明確に証明している。
【００６９】
その他の被験者  さらに９人の患者について、ＡＲＤＳに対するＮＯ吸入治療を２８日間まで行なった。ＮＯ吸入によりＱVA／ＱT及びＰＡＰが低下して、重度の呼吸系ジストレス症状にもかかわらず、７人が救命された。顕著なメトヘモグロビンレベルの上昇は見られなかった。これらの結果は、数週間までのＮＯ吸入が急性呼吸困難の有力な治療法であることを示している。
【００７０】
Ｅ．正常（収縮していない）な肺及び低酸素症（収縮している）の肺を有するヒトへのＮＯ投与の結果
覚醒した健常なヒトのボランティア被験者５人について種々のガス混合物を１０分間吸入させ、６分目から測定を開始して、４０ｐｐｍのＮＯを吸入した時の効果を調べた。表４は、正常な（２１％ｖ／ｖ）濃度のＯ2を有する空気を吸入した被験者（肺は血管収縮していない）においては、ＮＯは肺及び全身の血管拡張効果を示さないことを示している。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
対照的に、同じに被験者に比較的低レベルの酸素（１２％ｖ／ｖ）吸入させると、低酸素症に誘発された肺血管収縮（ＰＡＰ及びＰＶＲの上昇を伴う）を起こし、吸入ガス混合物に４０ｐｐｍのＮＯを添加するとこの症状は完全に解消される（表５）。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
２．気道平滑筋の拡張
Ａ．方法
動物の調製
雄のHartley 種モルモット（体重３００〜４４０ｇ）をα−クロラローズ（５０ｍｇ／ｋｇ）及びウレタン（５００ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した（Drazen et al., J. Appl. Physiol. 48:613-618, 1980 ）。気管開口術を施し、チュービングアダプタ（内径１．６５ｍｍ）を用いて挿管し、８ｍｌ／ｋｇ、６０呼吸／分で小動物換気器（Harvard Apparatus, a division of Ealing Scientific, Natick, MA）により換気した。薬物の静脈投与のため、頸静脈にカニュレータを挿入した。腹側の肋骨の一部を両側切除して胸部を開くことにより、肺を大気圧に暴露した（Shore and Drazen, J. Apl. Physiol. 67:2504-2511, 1989 ）。positive end expiratory pressureは３〜４ｃｍＨ2Ｏであった。
【００７５】
材料
次いで、モルモットをプレチスモグラフ（Amdur and Mead, Am. J. Physiol. 192:363-368, 1958 ）の内部に入れた。このプレチスモグラフは、銅製の網を有する大きなリザーバに連結しており、これによりプレチスモグラフは等温に維持された。プレチスモグラフ圧は、差動圧力トランスデューサ（differential pressure transducer）（Celesco, Canoga Park, CA）により測定した。このトランスデューサの反対側は同様のリザーバに連結した。気道開口部の圧力は、気管カニューラ中の側面コックから測定した。肺内外圧は、差動圧力トランスデューサ（Celesco ）を用いて、気道開口部の圧力とプレチスモグラフ内部の圧力の差を測定した。流量は、容積（プレチスモグラフ圧）の差の電子信号から求めた。潮汐容積は、体プレチスモグラフの圧力変化を記録することにより測定した。容積、流量、及び肺内外圧の信号は、ストリップチャート（General Scanning, Watertown, MA ）に記録した。肺抵抗及び力学コンプライアンスは、von Neergard and Wirz の方法（Z. Klin. Med. 105:35-50, 1927;Z. Klin. Med. 105:52-82, 1927 ）に従い、コンピュータプログラムにより計算した。
【００７６】
使用した装置及び条件を図７に示す。吸入ガスは、Ｙピースチューブを経由して混合された、確実に窒素と酸素の混合物であり、正確な吸入濃度にするために、５リットルガス混合バッグ内で酸化窒素（ＮＯ）により迅速に希釈された。容積測定用に較正された流量計により、種々の体積のＮＯ（Ｎ2と混合されている）を純粋Ｎ2と置換して、望ましいＮＯ濃度（吸入酸素濃度（ＦIＯ2）が０．３０〜０．３２）にした。総流入ガス速度は２．５ｌ／分に維持した。次いで、ガス混合物を、９０ｍｌのソーダ石灰を詰めた内径３ｃｍのチューブ内に通して二酸化窒素を排除し（Stavert and Lehnert, Inhal. Toxicol. 2:53-67, 1990）、次いで、換気器に入れる前にフィルタに通した。ガス混合バッグをほぼ空にして換気器回路に新鮮な空気を連続的に送り込むために、換気器流入チューブの直後を真空にした。換気器からの排気ガスを真空により排除し、positive end expiratory pressureを３〜４ｃｍＨ2Ｏに維持した。ＮＯは、純粋窒素中１，０３４ｐｐｍのＮＯとして、Air Products and Chemicals, Inc.(Allentown, Penn）から入手した。ソーダ石灰を詰めたチューブの直前及び直後、及び換気器の吸入バルブの直前（図７参照）のケミルミネッセンスＮＯ／ＮＯX解析（Fontijin et al., Anal. Chem. 42:575-579, 1970 ）を行なうことにより、二酸化窒素濃度を評価して、ＮＯ濃度が異なるレベルになることのないよう流量計を調整した。
【００７７】
方法
２４匹のモルモットを実験に供した。異なる３群のモルモットについて３種の実験を行なった。
【００７８】
Ａ群
３組の測定に９匹を使用した。
【００７９】
ｉ．正常な気管支トーンにおけるＮＯの効果
潮汐容量のベースライン、肺抵抗及び力学コンプライアンスを測定した後、３００ｐｐｍのＮＯ（ＦIＯ2０．３０〜０．３２）を６〜１０分間吸入した時の、ベースライン気管支トーンへの影響を検討した（図８）。
【００８０】
ｉｉ．メタコリン注入中の断続的なＮＯ吸入の、用量−応答実験
ベースライン測定後、同じモルモットに、強力な気管支収縮薬メタコリンを流速２．５〜７．５μｇ／ｋｇ／分で静脈注入し、中程度の気管支収縮（ベースライン肺抵抗の３〜４倍）を起こさせた。安定状態の後、一連のガス混合物（５、１０、２５、５０、１００及び３００ｐｐｍのＮＯ）を用いて１０分間一定のＦIＯ2（０．３０〜０．３２）で各モルモットを換気した。各レベルのＮＯへの接触の後、気道閉塞の影響を最小限にするために、肺を総体積まで膨脹させた。１０ｐｐｍ及び５０ｐｐｍのＮＯへの二回目の接触を１０分間行ない、各モルモットについて急性耐性が起きているかどうか調べた。最終レベルのＮＯ換気の後メタコリン投与を停止し、肺機能の安定期間の後、測定を行ない、用量応答実験用の参照点（reference point ）を得た。この後、肺を総容量まで膨脹させ、新たな安定ベースラインに到達させた（図９〜１２）。
【００８１】
ｉｉｉ．  メタコリン注入中の、１時間のＮＯ吸入に対する耐性実験
モルモットにメタコリンを注入して、気管支トーンを３〜４倍に上昇させ、この後、１００ｐｐｍのＮＯガスを用いて１時間、ＦIＯ2０．３０〜０．３２で各モルモットを換気した。５分毎に気道測定を繰り返し、次いで、ＮＯ吸入停止後５分および１０分後にも気道測定した。次いで、メタコリン注入を中止し、肺換気の安定状態後、測定を繰り返し、肺を総容量まで膨脹させた後、もう一度測定を行なった。外科手術時及び耐性試験の後にメトヘモグロビンレベルを測定した（Zwart et al., Clin Chem 27:1903-1907, 1981）（図１３）。
【００８２】
Ｂ群
２組の実験に２匹を使用した。
【００８３】
ｉ．８０分間のメタコリン注入のみを行なった場合の耐性実験
この気管支収縮薬モデルを検討するために、メタコリンを流速２．５〜７．５μｇ／ｋｇ／分で注入し、１時間のＮＯ吸入実験の場合（図１３参照）と同程度の気管支収縮を起こさせた。酸素／窒素ガス混合物を用いて一定のＦIＯ2（０．３０〜０．３２）で各モルモットを換気した。５分毎に気道測定を繰り返した。１０分目及び７０分目に、流量計を調整してＮＯ換気をシュミレートした。次いで、メタコリン注入を中止した。肺換気の安定状態後、測定を繰り返し、肺を総容量まで膨脹させた後、もう一度測定を行なった。
【００８４】
ｉｉ．サイクリックＡＭＰ及びサイクリックＧＭＰ依存性機構による気道平滑筋トーンの共制御実験
ベースライン測定後、モルモット５匹にメタコリンを注入し、中程度の気管支収縮まで肺抵抗を上昇させた。まず始めにモルモットにテルブタリンエーロゾルを与え、その１０分後に１００ｐｐｍのＮＯを一定のＦIＯ2（０．３０〜０．３２）で６分間吸入させた。テルブタリンエーロゾルは以下のとおり与えた。４０μｇ／ｍｌのテルブタリン溶液４ｍｌをネブライザ（Respigard II）のリザーバに入れ、４ｌ／分の空気で動かした。ネブライザは、ストップコックを経由して換気器回路のＹピース及び水に３〜４ｃｍ浸したチューブに連結した。霧状にする時に換気器を外し、ネブライザ回路を気道に連結して、同じ潮汐容量の霧状テルブタリンを２０呼吸与えた。次いで換気器を再連結し、ネブライザを外した。この実験の終了時、肺機能が安定状態に戻るまでメタコリン注入を中止し、次いで、肺を総容量まで膨脹させて、最終的なベースライン値に到達させた。ＮＯ及びテルブタリン供給期間中、２分毎に肺機能測定を繰り返した（図１４及び１５）。
【００８５】
Ｃ群：
メタコリン気管支収縮中のＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）実験
ＳＮＡＰは、Field et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. (1978), 249-250 に記載の方法により調製し、分解を検出することなく（５９５ｎｍの吸収でアッセイ）０℃で最長１２０日間結晶として保存した。
【００８６】
ベースラインの呼吸を測定後、モルモット５匹にメタコリンを注入し、中程度の気管支収縮まで肺抵抗を上昇させた。２分後、各モルモットにＳＮＡＰエーロゾルを与えた。ＳＮＡＰエーロゾルは以下のとおり与えた。エタノール／水に溶解した２００ｍＭのＳＮＡＰ混合液（４ｍｌ）をネブライザ（Respigard II）のリザーバに入れ、４ｌ／分の空気で動かした。ネブライザは、ストップコックを経由して換気器回路のＹピース及び水に４ｃｍ浸したチューブに連結した。霧状にする時に換気器を外し、ネブライザ回路を気道に連結して、同じ潮汐容量の霧状ＳＮＡＰを２０呼吸与えた。次いで換気器を再連結し、ネブライザを外した。この実験の終了時（１５分）、肺機能が安定状態に戻るまでメタコリン注入を中止し、次いで、肺を総容量まで膨脹させて、最終的なベースライン値に到達させた。２分毎に肺機能測定を繰り返した（図１６）。
【００８７】
Ｂ．結果
酸化窒素を含有したガス混合物の吸入は、不変、迅速及び完全な肺抵抗の低下をもたらし、また、肺コンプライアンスを上昇させた（図９〜１２）。拡張作用の開始は迅速であり、吸入後数秒以内に始まった。酸化窒素吸入は、メタコリン注入に起因する完全な気管支収縮を解消したが、メタコリンを注入していない麻酔下のモルモットにおいて気管支運動のベースラインを低下させた（図８）。酸化窒素吸入は、非常に低用量（５ｐｐｍ）で気管支拡張をもたらしたが、１００または３００ｐｐｍのＮＯを用いた場合に、より大きくより迅速に、気道抵抗を低下させた（図１０、１１、及び１２）。３００ｐｐｍのＮＯで、メタコリン性気管支収縮は完全に解消された。１００ｐｐｍのＮＯの吸入は、１時間にわたって気道抵抗を効果的かつ安定に低下させたため、ＮＯ吸入による耐性は生じなかった（図１３）。１００ｐｐｍのＮＯの吸入を１時間行なった後のメトヘモグロビンレベルは５％以下に保たれた。メタコリン注入により気道収縮を発生させるこのモデルは、最長１時間にわたり気道抵抗を安定に上昇させ（図１３参照）、気管支拡張薬としてのＮＯの効力を調べる上述のような実験の信頼性及び再現性に寄与した。
【００８８】
メタコリン注入中のＮＯの気管支弛緩効果は、一般的に霧状で使用される気管支拡張薬であるβ2アゴニスト、テルブタリンの吸入の効果に付加的である（図１４）。ＮＯガスをテルブリン注入の前（図１４）または後（図１５）に投与しても、このような付加的な気管支拡張効果が見られた。酸化窒素供与体分子であるＳＮＡＰを霧状にし、メタコリンにより気管支収縮を発生させたモルモット５匹の気道に２０呼吸吸入させた。各モルモットにおいて、迅速かつ完全な肺抵抗の低下が見られ、これは約１５分間持続した（図１６）。このように、ＮＯ供与体化合物も同様に気管支を拡張することができる。
【００８９】
【発明の効果】
以上の通り、所定範囲の濃度のＮＯを含む組成物を実験動物等に吸入させることにより、気管支平滑筋に対する弛緩の効果が観察された。従って、気管支収縮を伴う患者に本発明のＮＯを含む組成物を吸入させることにより、患者の気管支収縮を解消し疾患の治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｕ４６６１９に誘発された肺血管収縮を有する仔ヒツジにおけるＮＯ用量応答曲線のグラフである。
【図２】  継続的にＵ４６６１９が注入されている仔ヒツジにＯ2と混合した種々の濃度のＮＯを吸入させた場合のＰＡＰの経時的変化を示す図である。
【図３】  Ｕ４６６１９により誘発された肺血管収縮を有する仔ヒツジに、８０ｐｐｍのＮＯを６分間吸入させた結果を記録したストリップチャートを示す図である。
【図４】  継続的にＵ４６６１９が注入されている仔ヒツジに、Ｏ2と混合した種々の濃度のＮＯを吸入させた場合の肺脈管抵抗（ＰＶＲ）の経時的変化を示す図である。
【図５】  ヘパリン−プロタミン反応によりＰＡＰ（ａ）及びＰＶＲ（ｂ）の上昇が誘発されたヒツジに１８０ｐｐｍのＮＯを吸入させた場合の効果を示すグラフである。
【図６】  重度のＡＲＤＳを患う成人ヒトにおける、ＰＧＩ2による治療及びＮＯ吸入による治療の比較を記録したストリップチャートを示す図である。
【図７】  気管支拡張実験において、モルモットの肺にＮＯガスを輸送するのに使用した装置及び条件の代表例、及び装置の３か所各々において収集したケミルミネッセンスデータを示す図である。
【図８】  気管収縮を有しない正常なモルモット９匹の肺に３００ｐｐｍのＮＯガスを吸入させた場合の効果を示したグラフである。
【図９】  実験的に気管支収縮を誘発したモルモット８匹に、種々の濃度のＮＯガスを吸入させた場合の肺抵抗への効果を示したグラフである。
【図１０】  実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット８匹を種々の濃度のＮＯガスで治療した場合の肺抵抗を比較したグラフである。
【図１１】  実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット９匹を種々の濃度のＮＯガスで治療した場合に観察される肺抵抗における用量応答曲線グラフである。
【図１２】  実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット９匹を種々の濃度のＮＯガスで治療した場合に観察される最大肺抵抗率における用量応答曲線グラフである。
【図１３】  実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット８匹の肺に１００ｐｐｍのＮＯまたはメタコリンのみを１時間吸入させた場合の効果を示すグラフである。
【図１４】  実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット３匹に、テルブタリン及びＮＯの両方を吸入させた場合の肺抵抗に対する効果を示したグラフである。
【図１５】  実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット３匹にテルブタリン及びＮＯの両方を吸入させた場合の肺コンプライアンスに対する効果を示したグラフである。
【図１６】  Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を噴霧吸入させて実験的に気管支収縮を起こさせたモルモット５匹における肺抵抗の変化を示したグラフである。
【図１７】  実施の形態の吸入器装置の断面図である。
【図１８】  他の実施の形態の吸入器装置の断面図である。
【符号の説明】
１２，１１０  容器、１６，１０８  導管、１８  圧力活性化バルブ機構、２０  チャンバー、２２  再呼吸チャンバー、２８  空気、１０４  第一チャンバー、１０６  化合物、１１２  第二チャンバー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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