(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＩＩ）のイソクマリン又はその薬学的に許容可能な付加塩（式中、Ｒは−ＣＯＮＨ2又は−ＣＨ（ＣＨ3）2である。）を含む抗腫瘍組成物：
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【請求項２】
式ＩのＰＭ−９４１２８と命令されたイソクマリン又はその薬学的に許容可能な塩：
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【請求項３】
請求項２に定義されたＰＭ−９４１２８を得るための方法であって、制御された水中の好気性条件下で同化可能な炭素源及び窒素源及び塩とともに水性栄養培地中でＰＭ−９４１２８を産生することができるバチルス属に属する微生物の株を培養することからなる上記方法。
【請求項４】
微生物がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．Ｍ−００−ＰＨＤ−０９０株、ＣＥＣＴ４５４６である請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項２に定義されたＰＭ−９４１２８を産生することができる微生物バチルスｓｐ．Ｍ−００−ＰＨＤ−０９０株、ＣＥＣＴ４５４６。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗腫瘍活性を有するイソクマリン類に関する。
発明の背景
アミクマシンＡは、Ｊ．Ａｒｔｉｂｉｏｔｉｃｓ３４（５）：６１１−６１３，１９８１及びＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４６（５）：１２５５−１２５９，１９８２から知られている。それは式（ＩＩ）を有している。
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発明の要旨
我々は、化合物アミクマシンＡ及び関連構造を有する新規化合物において抗腫瘍活性を見出した。
本発明は、一般式（ＩＩＩ）
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（ここで、Ｒは−ＣＯＮＨ2または−ＣＨ（ＣＨ3）2を表わす）
で表わされる抗腫瘍イソクマリン類およびその薬学的に許容し得る付加塩を提供する。
Ｒが−ＣＯＮＨ2である化合物が式（ＩＩ）のアミクマシンＡである。
Ｒが−ＣＨ（ＣＨ3）2である化合物は、ＰＭ−９４１２８と命名される新規化合物であり、該化合物は、１９９５年２月２３日付でブダペスト条約に基づいて寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＣＥＣＴ４５４６から単離された。化合物ＰＭ−９４１２８は式（Ｉ）で表わされる。
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好ましい実施態様
我々は、式（ＩＩＩ）の化合物を含有する抗腫瘍組成物、該化合物を用いた腫瘍の処置法、該組成物の調製法、および式（Ｉ）の化合物の調製法を提供する。
本発明の化合物アミクマシンＡおよびＰＭ−９４１２８は、ヒト肺カルシノーマＡ−５４９、ヒト結腸カルシノーマＨＴ−２９およびヒトメラノーマＭＥＬ−２８などのヒト腫瘍由来のセルラインに対して抗腫瘍活性を発揮する。それらの化合物は、アミクマシンＡまたはＰＭ−９４１２８に感受性の悪性腫瘍によって影響を受ける哺乳動物の処置法であって、該化合物またはその薬学的組成物の治療学的有効量を個々の影響を受けた哺乳動物へ投与することを含む上記処置法に用いることができる。
本発明は、また、活性成分としてアミクマシンＡまたはＰＭ−９４１２８あるいはその薬学的に許容し得る付加塩を含有する薬学的組成物に関する。
本発明の薬学的組成物は、活性化合物と薬学的に許容し得る担体とを混合することによって得ることができる。薬学的組成物の例としては、経口、局所あるいは非経口投与に適した組成物の固型剤（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液剤（溶液剤、分散剤、エマルジョン剤）などが挙げられる。該薬学的組成物は、純粋な化合物、あるいはそれと担体または他の薬理学的活性化合物と一緒に含有することができる。
アミクマシンＡまたはＰＭ−９４１２８を含有する薬学的組成物の正しい投与量は、薬剤、適用法、および処置される特定の宿主、バクテリアあるいは腫瘍によって変動する。年齢、体重、性、ダイエット、経口投与時間、排出速度、宿主の状態、薬物との組合わせ、反応感受性、病気の重とく性などの他の因子も考慮される。投与は、最大許容投与量範囲内で継続的にあるいは定期的に実施される。
適当な薬学的に許容し得る付加塩としては、塩酸などの無機酸との塩、蓚酸、フマル酸などの有機酸との塩が挙げられる。
また、本発明は、ＰＭ−９４１２８を得る方法であって、ＰＭ−９４１２８を産生することができる微生物株を、コントロールされた水面下の好気性条件下で、同化性炭素および窒素源および塩を含む水性栄養培地で培養することを含む上記方法を提供する。
好ましい微生物は、Ｍ−００−ＰＨＤ−０９０と命名されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．株であり、該株は新規な株であって本発明の一部である。Ｍ−００−ＰＨＤ−０９０の培養物は、スペインのバレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）大学の
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に受託番号ＣＥＣＴ４５４６として１９９５年２月２３日に寄託されている。この寄託はブダペスト条約の条項み基づき行われている。特に本発明は、本質的に他の微生物を含まない該微生物の単離培養物を提供する。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＣＥＣＴ４５４６は、適当な栄養培地中でコントロールされた条件下で培養する時に、化合物ＰＭ−９４１２８を産生する。この株は、好気性で中温性の条件下、好ましくは２４℃から３５℃の間でｐＨ６．０から８．０の間で、水性栄養培地中で好ましく生育する。広範囲の液状培養培地が、この微生物の培養に用いることができる。有用な培地は、スターチ、デキストリン、グルコース、マルトース、糖蜜などの同化性炭素源；プロテイン、プロテイン加水分解物、脱脂肉、コーン漬け液などの同化性窒素源；塩化ナトリウム、ナトリウムスルフェート、ナトリウムチオスルフェート、ナトリウムカーボネート、ナトリウムビカーボネート、ナトリウムブロマイドなど、および塩化カリウム、カリウムマグネシウムスルフェート、カリウムクロライドなどの海水中に見出される無機塩；等を含有することができる。微量の元素を加えてもよい。本件微生物の培養を実施するには、慣用的な醗酵タンクが適していることが見出された。
抗腫瘍活性
本発明の化合物の抗腫瘍活性は、Ｂｅｒｇｅｒｏｎらが記載している方法（”ＡｎｔｉｎｅｏＰｌａｓｔｉｃ  ａｎ  ａｎｔｉｈｅｒｐｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｄｅ  ｉｒｏｎ  ｃｈｅｌａｔｏｒｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８４，１２１（３）、８４８−８５４、及びＳｃｈｒｏｅｄｅｒら、”Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｃｙｃｌｉｃ  Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２４，１０７８−１０８３も参照のこと）を適切な形式で用いて測定した。３種類の抗腫瘍細胞培養株を利用した。Ａ−５４９（ヒト肺癌腫の単層培養株）、ＨＴ−２９（ヒト結腸癌腫の単層培養株）及びＭＥＬ−２８（ヒト黒色素細胞腫の単層培養株）である。
Ａ−５４９、ＨＴ−２９及びＭＥＬ−２８を、所定の濃度の薬剤を含んだＭＥＭ  １０ＦＣＳの１ｍｌアリコット中ウエルあたり細胞２×１０4個の割合で、１６ｍｍウエルに接種した。これらとは別に、細胞が指数増殖期にあったことを確認するための対照増殖物として、薬剤無添加の培地に接種した。測定はすべて二回繰り返して行った。３７℃、１０％ＣＯ2、湿度９８％の雰囲気中における恒温培養三日後、ウエルを０．１％クリスタルバイオレットで染色した。薬剤を加えたウエルにおける増殖を対照ウエルにおける増殖と比較することにより、おおよそのＩＣ50を測定した。
得られた結果は以下のとおりである。
ＰＭ−９４１２８  ＩＣ50（μｇ／ｍｌ）
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ａｍｉｃｏｕｍａｃｉｎ  Ａ  ＩＣ50（μｇ／ｍｌ）
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微生物バチルス種Ｍ−００−ＰＨＤ−０９０（ＣＥＴＣ  ４５−４６）
上記微生物は太平洋の海洋堆積物から分離した。
以下に記載する分類学的研究は次の方法を基礎としている。
1.  コロニー形態学−普通寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）
2.  細胞形態学−普通ブイヨン培地（Ｄｉｆｃｏ）
3.  オキシダーゼ−Ｋｏｖａｃｓ，Ｎ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７８；７０３（１９５６）
4.  生化学的特性−ＰＡＳＣＯTM  Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｆｃｏ）  ＩＤ  グラム陽性
5.  抗生物質感受性−ＰＡＳＣＯTM  Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｆｃｏ）  ＭＩＣ  グラム陽性
培養株はすべて２８℃で恒温培養し、結果の記録は恒温培養４８時間後に行った。培養株の様子と試験結果は以下のとおりである。
コロニー形態学：コロニーは不透明、若干凸状、球形または不規則で、着色しない
細胞形態学：単独で、まっすぐな、自動性桿状体、エンドスポア形成性。胞子は卵型である。
好気性カタラーゼ及びオキシダーゼを生成する。
生化学的特性：グルコース、アラビノース、セロビオース、ラクトース、マンノース、スクロースから酸をつくらない。ウレアーゼとアルギニンヒドロラーゼをつくらない。ホスファターゼ、β−グルコシダーゼ及びα−グルコピラノシドをつくる。フォゲス−プロスカウエル陰性である。
抗生物質感受性：バシトラシン、テイコプラニン及びバンコマイシンに対して抵抗性あり。ナリジキシン酸、ノボビオシン、アンピシリン、ペニシリン、オキサシリン、テトラサイクリン、リファンピシン、ノルフロキサシン、エリスロマイシン、セフォキシチン、セフラクロール、セフロキシム、ホスホマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アミカシンに対して感受性あり。
上記の特性から、該培養株はバチルス属の一種と結論された。
上記微生物によってＰＭ−９４１２８を生産するための典型的な工程は次のとおりである。すなわち、凍結細胞、凍結乾燥細胞又は新鮮細胞のいずれかを出発原料とする。振盪フラスコ中に上記薬剤を含んだ培地で最初の細胞を中温菌生育温度、好気性条件下にて培養することにより細胞塊を得る。この工程は必要に応じて数回繰り返してもよく、集めた材料は適当な培地を含んだ一又は複数の醗酵槽に接種するための接種材料として使うことになる。この槽は所望により接種材料として使用することができ、あるいは必要とするブイヨン体積によっては生産の場所として役立てることもできる。
ＰＭ−９４１２８の接種発生及び生産に使用できる典型的な培地は以下のとおりである。
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ここに記載した培地を広範囲の普通培地ととりかえてもよく、そこから良好な生育と生産が結果すると信じられている。また、ある微生物がある物質を生産することが発見されれば、多少なりともこれに類似した多数の微生物が同一の生産特性を有するものとして分離されることもよく知られている。
抗生物質ＰＭ−９４１２８は、醗酵ブイヨン全体から酢酸エチルのような適当な有機溶剤で抽出することによって分離することができる。抽出を１回又は２回繰り返し、抽出物を合わせ、真空下で蒸発乾固する。
粗活性抽出物からのＰＭ−９４１２８の分離精製は、従来の手法、例えば、カラムクロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィなどを適当に組み合わせて用いることにより行うことができる。
分画は、抗腫瘍活性又は２５４ｎｍの紫外光とニンヒドリンによって可視化されたＴＬＣを指標として行うことができる。
化合物ＰＭ−９４１２８
様々な分光特性の詳細な分析に基づいて、その純粋な化合物はＰＭ−９４１２８として同定することができる。図１−５に再現されたデータを参照のこと。
図面
図１はＰＭ−９４１２８のＫＢｒ中でのＩＲ吸収スペクトルである。
図２はＰＭ−９４１２８のＵＶスペクトルである。
図３はＰＭ−９４１２８の1Ｈ−ＮＭＲである。
図４はＰＭ−９４１２８の13Ｃ−ＮＭＲである。
図５はＰＭ−９４１２８のマススペクトルである。
実施例
本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、この実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。ここに報告されるすべてのパーセンテージは特に断らない限り重量によるものである。すべての温度は℃で表現されている。すべてのインキュベーションは２８℃で行なわれ、フラスコは２５０ｒｐｍでオービタルシェーカーで振とうされる。すべての媒体と容器は殺菌され、すべての培養プロセスは無菌である。
細胞培養：細胞はイーグルの最小必須培地でイーグルのバランス塩を用い、２０ｍＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸を用い、重炭酸ナトリウムを用いることなく（ＥＭＥＭ／ＮＥＡＡ）、１０％子牛血漿（ＦＣＳ），１０-2Ｍ重炭酸ナトリウム及び０．１ｇ／ｌペニシリンＧ−硫酸ストレプトマイシンを補充して、対数的成長相に維持した。
ストック培養：バチルスアナログ、Ｍ−００−ＰＨＤ−０９０株（ＣＥＣＴ４５４６）の純粋培養の全培養基は２０％グリセロール中で凍結して保存される。
接種物：十分成長した傾斜培養を用いて上述の１００ｍｌの種培地を１０００ｍｌ振とうフラスコに接種する。このフラスコは２８℃で４８時間インキュベートされる。２Ｌエーレンマイヤーフラスコ中に同じ培地５００ｍｌを最初の段階の接種物５％とともに接種する。
発酵：５００ｍｌの第２段階接種物とともに、１５Ｌ発酵タンクに入れられている既述の製造培地１０Ｌを接種する。発酵を２５０ｒｐｍの攪拌及び０．５Ｖ／Ｍ／Ｖの空気流で４０時間行なう。二次代謝産物をＰ−３８８細胞に対する全培養基のアッセイによりモニターする。
単離：全収穫培養基（１０Ｌ）を１０Ｌの酢酸エチルで抽出する。有機溶媒を真空中で濃縮乾固し２．１６ｇの粗抽出物を得る。この抽出物を３００ｍｌのＮａＣｌ  １０％：メタノール  １：１混合物に溶解し、３００ｍｌのヘキサンで２度分画することによって脱脂する。水／アルコール分画を３００ｍｌのエチレンクロリドで２度抽出する。いっしょにした有機溶媒層を真空中で濃縮して６００ｍｇの活性有機抽出物を得た。抽出物を溶出溶媒としてヘキサン／酢酸エチルの混合物を用いてシリカゲルでクロマトグラフにかける。抗腫瘍活性（２８０ｇ）をヘキサン／酢酸エチル７５／２５で溶出する。さらに精製をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって行い、クロロホルム／メタノール９８／２で活性を溶出してもよい（９０ｍｇ）。最後の精製を、溶出溶媒として水／メタノール１５／８５を用いてＣ１８逆相でカラムクロマトグラフィーにより行ない、５２ｍｇの純粋なＰＭ−９４１２８を得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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