(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で示される、ウシ第ＸＩＩＩ因子異常症の第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ遺伝子。
【請求項２】
工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の２４８位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、および
工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について、ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡタンパクのアミノ酸配列中８３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されるアミノ酸配列上の変異をともなう、塩基配列の変異の存在を調べる工程、
を含むウシ第ＸＩＩＩ因子異常症の診断方法。
【請求項３】
遺伝子増幅反応がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応)法によって行われる請求項２記載の診断方法。
【請求項４】
塩基配列の変異の存在を制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を検出して調べる請求項２又は３記載の診断方法。
【請求項５】
ＲＦＬＰを制限酵素ＭｂｏＩＩを用いて調べることを特徴とする請求項４記載の診断方法。
【請求項６】
核酸試料がゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む試料である請求項２〜５いずれか記載の診断方法。
【請求項７】
請求項４記載の診断方法によりウシ第ＸＩＩＩ因子異常症を診断するためのキットであって、
（ａ）：ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の２４８位を含む領域を増幅するためのプライマー、及び
（ｂ）：ＲＦＬＰによって、ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡタンパクのアミノ酸配列中８３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されるアミノ酸配列上の変異をともなう、塩基配列の変異を検出するための制限酵素、
を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウシの出血性疾患である第ＸIII 因子異常症の診断方法に関する。また本発明は、かかる診断方法を用いるウシ第ＸIII 因子異常症の診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
南九州においては和牛の出血性疾患が多発しており、これら出血性疾患のなかにはＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、および第ＸIII 因子異常症といった複数の遺伝性疾患が存在することも多く、臨床症状が重篤であるため畜産上の被害が多い。今後、これまでと同様の交配によって黒毛和牛の生産を続けた場合、第ＸIII 因子異常症をはじめとする遺伝性出血性疾患の増加によりさらなる生産性の低下が危惧されている。
特に第ＸIII 因子異常症を発症したウシでは新生児期において臍帯出血を起こし、大量の腹腔内出血で死亡することが多い。また生存した個体においても皮下出血等を繰り返して成長不良となり、重篤例では失血死する。本疾患の発症例は現在までに１００例を越えている。
【０００３】
第ＸIII 因子（フィブリン安定化因子、血漿トランスグルタミナーゼ）はフィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、α2 −プラスミンインヒビター、α2 −マクログロブリン、アクチン、変性コラーゲンなどのタンパク質間のアミド架橋形成を触媒するＳＨ酵素の前駆体である。
【０００４】
血漿第ＸIII 因子はＡ、Ｂの二つのサブユニットで構成されるＡ2 Ｂ2 のヘテロテトラマーである。活性の発現には主にトロンビンによる限定加水分解を必要とし、これによって分子量７．５万のサブユニットＡが分子量７．１万のＡ' に変化したＡ'2Ｂ2 に変換される。さらにこのときＣａ 2+ の存在によってＡ'2とＢ2 への解離が起こり、Ａ' サブユニット中のＳＨ活性中心が露呈して酵素活性が発現されるようになる。こうして活性化された第ＸIII 因子は血液凝固カスケードによって生成したフィブリン分子間にアミド結合を形成することによりフィブリン塊を安定化し、血液凝固反応を完成させる。
【０００５】
これまでは血漿中の第ＸIII 因子活性を測定することにより、第ＸIII 因子異常症の診断が行われてきた。第ＸIII 因子活性の測定方法としては、（１）精製フィブリノーゲンを用いて生じたフィブリンの酸溶解度で見るもの、（２）検体（血漿）中のフィブリノーゲンを基質とし、希釈系列の第ＸIII 因子中和抗体存在下での酸不溶性フィブリン形成境界値を求めるもの、（３）精製フィブリンモノマーを基質としてその酸溶解度を見るもの、（４）カゼインへの蛍光性アミン化合物の取り込みを測定するもの、（５）上記蛍光性アミン化合物にかえて放射性同位体を使用するもの、（６）基質カゼインからのアンモニアの遊離を定量するもの、（７）完全合成基質を用いるものなどがある。ウシの血漿について第ＸIII 因子の酵素活性を測定する場合には上記の測定法のうち主に（２）、（７）が用いられている。
【０００６】
しかしながら、上記の第ＸIII 因子活性測定方法は、基質の調製に非常に時間がかかる、基質の品質が一定していない、検体中の酵素の精製状態によって得られる活性の値が変動するなどの欠点を有している。また、第ＸIII 因子異常症は常染色体性の劣性遺伝をすることが推定されており、一方の染色体上にのみ異常に関連した遺伝子を有する遺伝子的に第ＸIII 因子異常症のキャリアーのウシについては従来の酵素活性測定に基づく方法ではその異常を知ることができない。したがって上記の方法による診断では異常の認められないウシどうしを交配させた場合でも産まれてくる子牛に異常が現れることがあり、本疾患の発生を未然に防ぐうえでは問題を有している。
【０００７】
ウシの第ＸIII 因子異常症を予防する手段の１つとしてその疾患の原因である遺伝子のキャリアーを交配に用いることを避けていくという方法が考えられる。そのためには現存するウシの第ＸIII 因子異常症の診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを早急に見つけだす必要がある。異常を持つウシの疾患遺伝子が正常なものに比べてどのように変異しているのかを明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により変異遺伝子を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このような遺伝子診断法を確立することができる。
また、ヒトにおいてはサブユニットＡ遺伝子上の変異がその主な原因であることが知られている［ブラッド（Blood ）、第８０巻、第９３７−９４１頁（１９９２）；同、第８４巻、第５１７−５２５頁、（１９９４）］が、ウシの第ＸIII 因子異常症がＡ、Ｂの二つのサブユニットのどちらの異常に起因するかについては知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、ウシの第ＸIII 因子遺伝子を提供することにある。本発明の他の目的は、該遺伝子を利用してウシの第ＸIII 因子異常症を迅速に診断できる遺伝子診断方法を提供することにある。さらに本発明の他の目的は、かかる診断方法に利用する、簡便に診断することのできるウシ第ＸIII 因子遺伝子異常症診断用キットを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、第ＸIII 因子サブユニットＡをコードする遺伝子上の特定の塩基置換が本疾患の原因であることを見出し、さらに、かかる変異により、上記遺伝子上に特定の制限酵素の認識部位が形成されていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  配列番号：２で示される、ウシ第ＸＩＩＩ因子異常症の第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ遺伝子、
〔２〕  工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の２４８位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、および
工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について、ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡタンパクのアミノ酸配列中８３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されるアミノ酸配列上の変異をともなう、塩基配列の変異の存在を調べる工程、
を含むウシ第ＸＩＩＩ因子異常症の診断方法、
〔３〕  遺伝子増幅反応がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応)法によって行われる前記〔２〕記載の診断方法、
〔４〕  塩基配列の変異の存在を制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を検出して調べる前記〔２〕又は〔３〕記載の診断方法、
〔５〕  ＲＦＬＰを制限酵素ＭｂｏＩＩを用いて調べることを特徴とする前記〔４〕記載の診断方法、
〔６〕  核酸試料がゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む試料である前記〔２〕〜〔５〕いずれか記載の診断方法、ならびに
〔７〕  前記〔４〕記載の診断方法によりウシ第ＸＩＩＩ因子異常症を診断するためのキットであって、
（ａ）：ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の２４８位を含む領域を増幅するためのプライマー、及び
（ｂ）：ＲＦＬＰによって、ウシ第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡタンパクのアミノ酸配列中８３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されるアミノ酸配列上の変異をともなう、塩基配列の変異を検出するための制限酵素、
を含むことを特徴とするキット、に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．正常及び異常ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子について
遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず正常なウシ第ＸIII 因子サブユニットＡをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を明らかにする。該遺伝子が単離された例はこれまで報告されていないが、ヒト第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子とのホモロジーを利用して単離することが可能である。すなわち、ヒト第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列［プロシーディングス
オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Science of the USA ）、第８３巻、第８０２４−８０２８頁（１９８６）］をもとに作製したプライマーを用い、ホルスタインより調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行ってヒト第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子とホモロジーを有するいくつかのＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００１２】
次に、得られた各ＤＮＡ断片の塩基配列を決定してヒト第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子とのホモロジーを確認したうえ、これらの塩基配列を比較、解析してウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子全体の塩基配列を知ることができる。こうして得られた正常ウシの第ＸIII 因子サブユニットＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号：１に示す。
【００１３】
ウシ第ＸIII 因子異常症の原因となる遺伝子上の変異は、正常、および第ＸIII 因子異常症を発症したウシに存在する第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列を比較することによって明らかにすることができる。すなわち、上記の正常ウシの第ＸIII 因子サブユニットＡをコードする塩基配列をもとに該塩基配列全体をいくつかの領域に分けて増幅することが可能な適当なプライマーを合成することができる。次に該プライマーを用い、第ＸIII 因子異常症を発症したウシより調製したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、得られた増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定して両者を比較することにより、第ＸIII 因子異常症を発症したウシの遺伝子上に存在する、該疾患の原因である変異を確認することができる。
【００１４】
本発明では第ＸIII 因子異常症を発症したウシのｃＤＮＡ上では配列表の配列番号：２に示されるように、正常ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列と比較して２４８番目のチミン（Ｔ）がシトシン（Ｃ）に、また、２６１番目のシトシンがチミンに変異していることを見出した。このうち後者はアミノ酸置換をともなわないが、前者ではフェニルアラニンをコードするコドンＴＴＣがセリンをコードするＴＣＣに変化していることから、第ＸIII 因子異常症のウシではこのアミノ酸置換を含む変異型の第ＸIII 因子サブユニットＡが発現されていることが示される。またこのフェニルアラニンは、ヒトの第ＸIII 因子サブユニットＡ等これまでにそのアミノ酸配列が明らかにされた哺乳動物由来のトランスグルタミナーゼのほとんどに存在しており、この遺伝子変異が第ＸIII 因子異常症の原因であることがわかる。さらに、この変異は塩基配列上に新たな制限酵素ＭｂｏIIの切断部位を生じることもわかる。なお、ヒトの第ＸIII 因子異常症ではサブユニットＡの６８１番目のアルギニン〔ブラッド(Blood) 、第８０巻、第９３７−９４１頁、（１９９２）〕、６６１番目のアルギニンあるいは２４２番目のメチオニン〔ブラッド(Blood) 、第８４巻、第５１７−５２５頁、（１９９４）〕に変異が起こっており、本発明で見出されたウシでの変異とは異なるものであった。
【００１５】
２．ウシ第ＸIII 因子異常症の診断方法について
上記のようにして、第ＸIII 因子異常症の原因となる遺伝子上の変異が解明されたことから、この変異を利用して該疾患の診断を行うことができる。
【００１６】
具体的なウシ第ＸIII 因子異常症の診断方法としては、次のような工程を有する態様が例示される。即ち、
工程（ａ）：ウシの核酸試料を得る工程、
工程（ｂ）：工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、第ＸIII 因子遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、および
工程（ｃ）：工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程、である。
【００１７】
工程（ａ）について
本発明において用いられるウシの核酸試料としては、ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子が含まれるものであれば特に限定されるものではなく、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。ウシからのゲノミックＤＮＡ等の調製は、通常行われる公知の方法により行うことができる。
【００１８】
工程（ｂ）について
本工程によって、ウシ第ＸIII 因子遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、ＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法（特開平２−５８６４号公報、特開平７−２０３９９９号公報）や鎖置換増幅法（特公平７−１１４７１８号公報、特開平７−８８２４２号公報）のような核酸増幅法を利用することができる。なかでもＰＣＲ法が好ましく用いられる。
増幅の対象となる、変異部位を含む領域としては、ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の２４８位を含む領域であれば特に限定されない。好ましくは、変異が生じた際に制限酵素ＭｂｏIIの認識部位となる配列、即ち、正常ウシであれば配列番号：１の、罹患ウシであれば配列番号：２の２４４〜２４８位を含む領域である。
【００１９】
ＰＣＲ法で用いるプライマーとしては、変異部位、即ちウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の２４８位を含むＤＮＡ断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。また、ＰＣＲの条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件で良い。
【００２０】
工程（ｃ）について
本工程において、工程（ｂ）で得られる核酸断片について変異の存在が調べられる。変異の存在の検出方法としては特に限定されないが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を検出して調べる方法が好ましく用いられる。ＲＦＬＰを調べる際に用いる制限酵素としては、遺伝子の変異が検出可能なものであれば特に限定されないが、例えば制限酵素ＭｂｏIIやそのアイソシゾマー、あるいは制限酵素ＢｂｒIIやそのアイソシゾマーが挙げられる。制限酵素ＭｂｏIIによる消化は、ＭｂｏII消化に適した組成、例えば、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭのＤＴＴからなる反応液を使用し、また、消化されるＤＮＡの量に応じて添加するＭｂｏIIの量や反応時間を適宜調製して行われる。また、ＲＦＬＰの検出は、診断されるウシの核酸試料と同様の処理を行った正常ウシの核酸試料を対照として、ゲル電気泳動等の公知の方法によって行うことができる。
【００２１】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法以外の診断法としては、上記に例示された態様の工程（ｃ）をその他の変異検出方法に変更した方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む適当なＤＮＡ断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法や、ＳＳＣＰ法のような公知の変異検出方法が使用できる。また、特開平７−３２７６９８号公報にはＭｕｔＳタンパク質を用いる変異の検出方法が開示されているが、この方法も本発明の診断方法に適用可能である。さらに、増幅されたＤＮＡを適当なベクターにクローニングしたものの塩基配列を決定することや、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基配列を決定することによっても変異の検出を行うことができる。
【００２２】
本発明のウシ第ＸIII 因子異常症の診断方法により、第ＸIII 因子異常症を発病しているウシのみならず、発病の予想されるウシ、さらに第ＸIII 因子異常症のキャリアーのウシについても診断することができる。従って、本発明でいうウシ第ＸIII 因子異常症とは、遺伝子的に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、またキャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
【００２３】
３．ウシ第ＸIII 因子異常症診断用キットについて
上記の診断方法を利用することにより、該異常症診断用キットを提供することができる。
具体的には、上記記載の診断方法によりウシ第ＸIII 因子異常症を診断するためのキットであって、
（ａ）：第ＸIII 因子遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を増幅するためのプライマー、及び
（ｂ）：ＲＦＬＰによって変異を検出するための制限酵素、
を含むことを特徴とするものである。
かかるキットを用いることにより、簡単にウシ第ＸIII 因子異常症を診断することができる。本発明のキットに用いられるプライマー、制限酵素は前記の診断方法の項で述べたようなものが例示される。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例をもってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
正常ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列の決定
ＰＣＲ法によってウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得するための鋳型となるｃＤＮＡを、ホルスタインより採取した血液より以下に示す方法によって調製した。
まずウシ全血（クエン酸ナトリウム添加）２００mlより比重遠心（約 100g ×20 min. ）にて血小板濃縮血漿（PRP 、Platelet rich plasma）を分離し、さらに約 1500g× 5min.の遠心分離により、血小板画分を調製した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS ）にて３回洗浄した後、ＲＮＡｚｏｌTMＢ（バイオテックス  ラボラトリーズ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。こうして得られた全ＲＮＡのうち１μg を用い、ｃＤＮＡサイクルキット（インビトロジェン社製）を使用してｃＤＮＡの合成を行い、最終的に４０μl のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解したｃＤＮＡ（Ｐｔ  ｃＤＮＡ）溶液を得た。
【００２６】
Proceedings of the National Academy of Science of the USA 、第８３巻、第８０２４−８０２８頁（１９８６）に記載のヒト第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列、ならびにその他の動物由来のトランスグルタミナーゼの塩基配列の相同性を利用してプライマー１Ｓ、２Ｓ、３Ｒ、５Ｒ、６Ｓ、および７Ｒを化学的に合成した。配列表の配列番号：３〜配列番号：８にそれぞれプライマー１Ｓ、２Ｓ、３Ｒ、５Ｒ、６Ｓ、および７Ｒの塩基配列を示す。
本実施例及び以下の実施例において実施されたＰＣＲ反応は特に断らない限り以下に示す組成の反応液中で実施した：１０mM  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2 、０．２５mM  ｄＡＴＰ、０．２５mM
ｄＣＴＰ、０．２５mM  ｄＧＴＰ、０．２５mM  ｄＴＴＰ、０．００１％ゼラチン、２．５単位  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）。反応液は全量１００μl とし、適量の鋳型ＤＮＡとともにそれぞれ終濃度１０μg/mlの２種のプライマーを添加した。
【００２７】
即ち、上記のＰｔ  ｃＤＮＡ溶液３μl とプライマー２Ｓおよび７Ｒ（それぞれ終濃度１０μg/ml）を含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、４２℃で１分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。この反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルから回収した約１４００ｂｐに相当するＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＣＲTMII（インビトロジェン社製）に組み込んだ組換えプラスミドを作製した。得られた組換えプラスミドを鋳型とし、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いてこの組換えプラスミドに組み込まれているＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号：９に示す。
【００２８】
また、Ｐｔ  ｃＤＮＡ溶液３μl とプライマー６Ｓ、３Ｒを含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、３７℃で１分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。増幅された約７００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した後、その一部を鋳型として含む上記同様のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲTMIIに組み込んだ組換えプラスミドを作製し、上記同様にこの組換えプラスミドに組み込まれているＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号：１０に示す。
【００２９】
配列表の配列番号：９および配列番号：１０に示された２つの塩基配列を比較したところ、両配列は約２００ｂｐの塩基配列を共通に含み、両者で約１９００ｂｐの塩基配列をカバーしていた。
こうして明らかとなった上記の塩基配列をもとに、さらに２種類のプライマー、８Ｒおよび９Ｓを合成した。配列表の配列番号：１１および配列番号：１２にそれぞれプライマー８Ｒ、９Ｓの塩基配列を示す。
【００３０】
上記の２つの断片でカバーされないウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列を明らかにするため、上記のＰｔ  ｃＤＮＡ溶液３μl とプライマー１Ｓおよび３Ｒを含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。次にこのＰＣＲ反応後の反応液１μl とプライマー１Ｓおよび８Ｒとを含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、５２℃で２分間、７２℃で３０秒間からなる工程を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。この反応液の一部を２％アガロースゲル電気泳動に供し、約３００bpのＤＮＡ断片を回収して上記のプラスミドベクターｐＣＲTMIIにサブクローニングした後、その塩基配列をジデオキシ法によって調べ、このＤＮＡ断片（２６９bp）の塩基配列がヒト第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の５’側領域にホモロジーを有することを確認した。配列表の配列番号：１３にこのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
【００３１】
続いて、上記のＰｔ  ｃＤＮＡ溶液３μl とプライマー４Ｓ（配列番号：１４）および５Ｒを含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。次にこのＰＣＲ反応後の反応液１μl とプライマー９Ｓおよび５Ｒとを含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、５２℃で２分間、７２℃で３０秒間からなる工程を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。この反応液より回収したＤＮＡ断片を上記のプラスミドベクターｐＣＲTMIIにサブクローニングした後、その塩基配列をジデオキシ法によって調べた。配列表の配列番号：１５にこのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
こうして得られた種々のＤＮＡ断片の塩基配列を比較、総合してウシ第ＸIII 因子サブユニットＡをコードするｃＤＮＡ全長の塩基配列（２１９６bp）を決定した。配列表の配列番号：１にこの２１９６bpの塩基配列を示す。また、正常ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡのアミノ酸配列を配列表の配列番号：１６に示す。
【００３２】
実施例２
ウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子上の変異の確認
配列表の配列番号：１に示されるウシ第ＸIII 因子サブユニットＡ遺伝子の塩基配列を３つの領域に分け、これらのそれぞれをＰＣＲによって増幅することができるプライマーＡＳ、ＡＲ、ＢＳ、ＢＲ、ＣＳ、ＣＲを合成した。配列表の配列番号：１７〜配列番号：２２にそれぞれプライマーＡＳ、ＡＲ、ＢＳ、ＢＲ、ＣＳ、ＣＲの塩基配列を示す。
【００３３】
第ＸIII 因子異常症を発症したウシの血液より実施例１と同様の操作によってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーＡＳおよびＡＲ、プライマーＢＳおよびＢＲ、プライマーＣＳおよびＣＲの３組のプライマー対を用いたＰＣＲ反応を行った。実施例１で使用したものと同じ組成で上記の鋳型、プライマー対を含む１００μl のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片について実施例１と同様にしてその塩基配列を決定し、それぞれを配列表の配列番号：１の塩基配列と比較した。また、決定された第ＸIII 因子異常症ウシの第ＸIII 因子サブユニットＡのｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号：２に示す。
【００３４】
この結果、プライマー対ＢＳ、ＢＲおよびＣＳ、ＣＲで増幅された領域の塩基配列には違いは認められなかったが、プライマー対ＡＳ、ＡＲで増幅された、第ＸIII 因子サブユニットＡのＮ末端側をコードする領域では正常、および発症ウシの間でその塩基配列に差が見い出された。すなわち、発症ウシにおいては配列表の配列番号：１に示される塩基配列のうち、２４８番目のチミン、および２６１番目のシトシンがそれぞれシトシン、チミンに変異していることが示された。このうち２４８番目のチミンからシトシンへの変異は第ＸIII 因子サブユニットＡタンパクのアミノ酸配列中、８３番目のフェニルアラニンがセリンに置換されるアミノ酸配列上の変異をともなうことから、第ＸIII 因子異常症を発症したウシではこのアミノ酸置換を有する変異型の第ＸIII 因子サブユニットＡを発現すると考えられ、これが本疾患の原因であることが明らかとなった。
【００３５】
実施例３
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるウシ第ＸIII 因子異常症の診断
実施例２より明らかとなった第ＸIII 因子異常症ウシの遺伝子上の変異のうち、２４８番目のチミンからシトシンへの塩基置換により遺伝子上に新たな制限酵素ＭｂｏIIの認識切断部位が生じた（図１）。この塩基置換部位を含む１４１bpの領域を増幅するためのプライマーとして上記のプライマーＡＳおよび８Ｒを使用した。
【００３６】
正常ウシおよび第ＸIII 因子異常症ウシ（計２３頭）の全血より、比重遠心法および０．１５M 塩化アンモニウムを用いて末梢血単核球を分離し、マニアティス（T.Maniatis）ら編集、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行のモレキュラー  クローニング  ：  ア  ラボラトリー  マニュアル（Molecular Cloning : A Laboratory Manual ）第２版、９．１６−９．２３に記載の方法に従ってゲノミックＤＮＡを分離した。このゲノミックＤＮＡ  ５０ngと上記のプライマー対（それぞれ終濃度２０μg/ml）を含む５０μl のＰＣＲ反応液（１０mM  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2 、０．２mM各ｄＮＴＰ、１単位  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）を調製し、まず９４℃、５分のインキュベーションの後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で３０秒間からなる工程を１サイクルとした３０サイクルの反応を行った。
【００３７】
反応後、ＰＣＲ産物をエタノール沈殿によって回収し、そのうちの１／５量を用いて１０μl のＭｂｏII消化反応液（１０mM  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０mM  ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ  ＤＴＴ）を調製し、４単位のＭｂｏII（宝酒造社製）を加えて３７℃、１時間のインキュベーションを行った。反応液を３％アガロースゲル上で電気泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して分離されたＤＮＡ断片を分析した。その結果、図２の上の段に示すように、正常ウシ由来のゲノミックＤＮＡより増幅されたＤＮＡ断片では約１４０bpの単一のバンドが検出されたのに対し（Ｎｏ．１８〜２３）、第ＸIII 因子異常症ウシにおいてはそのバンドが約８０bpと約６０bpの２本のバンドに分解されており（Ｎｏ．１〜４）、増幅断片中にＭｂｏIIの認識切断部位が生じていることが示された。
【００３８】
また、Ｎｏ．５及びＮｏ．６は臨床的には第ＸIII 因子異常症の症状を示さないウシの分析結果である。これらのサンプルでは、約１４０bpのバンド及び約８０bpと約６０bpのバンドの計３本のバンドが確認されたことから、これらのウシは正常及び変異型アリルに関するヘテロザイゴートであることが分かった。したがって、本発明の診断方法によって、見かけ上正常な、第ＸIII 因子異常症のキャリアーのウシを検出できることが分かった。
また、図２の下の段のＮｏ．７〜１７は、発症ウシとの血縁関係が明らかなウシ１１頭について同様の方法によって診断をおこなって得られた電気泳動の結果を示す図である。この結果から、１１頭のうち５頭が第ＸIII 因子異常症のキャリアーであることが分かる。
【００３９】
また、サンプルＮｏ．１〜２３について、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による診断結果と血清中の第ＸIII 因子の活性の相関関係について調べた。
第ＸIII 因子の活性は、イアトロ−ＦＬＦ．ＸIII （ヤトロン社製）を用いたモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）取込み法により測定した。結果を図３に示す。
【００４０】
図３の横軸は、本変異に関する各遺伝子型を示し、−／−は、遺伝子型が変異型のホモ、＋／−は正常型・変異型のヘテロ、＋／＋は正常型のホモを示す。また、縦軸は血清中の第ＸIII 因子の活性を示す。
この図より、本変異に関する遺伝子型と血清中の第ＸIII 因子活性との間には明らかな相関が認められることが分かる。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によりウシの第ＸIII 因子異常症およびそのキャリアーを簡便かつ迅速に摘発することが可能となった。
【００４２】
【配列表】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４６】
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【００４８】
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【００５０】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、塩基の置換による制限酵素ＭｂｏIIの切断部位の発生を示す模式図である。
【図２】図２は、正常ウシ由来のＤＮＡ断片及び第ＸIII 因子異常症ウシ由来のＤＮＡ断片をＭｂｏII消化後に電気泳動に付して得られた結果を示す図である。
【図３】図３は、遺伝子型と血清中の第ＸIII 因子の活性の相関を示すグラフを表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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