(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の糸状菌の攪拌式発酵槽を用いた培養方法において、培地成分として、酵母エキス、ペプトンから選ばれる１種以上の天然窒素源を０．５〜１．５％使用し、界面活性剤を添加しないことを特徴とする、糸状菌を直径１〜５ｍｍのペレット形状に増殖させる培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、糸状菌の培養においてその形態を制御する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糸状菌（かび）は産業への利用として長い歴史を有しているが、培養形態としてその名の示すとおり糸状状態を成し、他の一般的微生物に比べ菌体の培養液からの分離が非常に困難である。
例えば、酵母、大腸菌などの微生物の分離には遠心法、膜法など簡便でクリーンな方法が用いられるが、糸状菌においてはその形態から、珪藻土を使用した濾過法が最も一般的である。
【０００３】
珪藻土を使用する菌体分離法は、作業も煩雑で作業環境も悪く、更に使用済み珪藻土の廃棄物処理も必要である等の、多くの問題を抱えていることから、この方法によらなければ菌体を分離できない糸状菌培養方法は、やはり問題を抱えていると言わざるを得ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
かかる状況に鑑み、簡便に菌体を分離すべく、糸状菌培養において種菌に用いられる胞子数を制御する事により、培養菌体をペレット化させる研究が報告されている（J. Fermentation & Bioengineering 1993 76 470、等）。しかしながら、培養に入るための初発胞子数を制御する方法は非常に煩雑であり、低胞子濃度での培養は誘導期を延長させ、製造プロセスの遅延を引き起こす。
また、液体培養における攪拌回転数等の物理的培養条件の変更によるペレット化の報告もされている（Acta. Biotechnol. 1989 9 149、等）が、製造プロセスに対応できる特殊な装置を必要とし、かつペレット化も十分とはいい難い。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以上のような問題点を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｕ属の糸状菌の攪拌式発酵槽を用いた培養の培地組成において、酵母エキス、ペプトンから選ばれた１種以上の天然窒素源を０．５〜１．５％添加し、界面活性剤を添加しないことにとり、容易に該糸状菌を培養過程で直径１〜５ｍｍのペレットにさせ得ること、分離も非常に容易であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、天然窒素源を使用した、簡便で工業的に有利な、糸状菌をペレット形状に増殖させる培養方法を提供するものである。
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用される天然窒素源は、酵母エキスあるいはペプトンである。これら天然窒素源は、培地に０．５〜１．５％添加される。０．５％未満では糸状菌のペレット化が十分ではなく、また１．５％を超えて使用しても添加量に見合った効果は期待されない。
【０００７】
本発明で使用される糸状菌は、その液体培養形態においてハルピーとペレットの両形態を有することが可能なもので、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属のものである。
【０００８】
本発明の攪拌式発酵槽を用いた培養方法は、天然窒素源として酵母エキスあるいはペプトンを０．５〜１．５％使用し、界面活性剤を添加しない以外は、公知の糸状菌の培養に用いられる培地組成、培養条件で実施される。
【０００９】
通常、糸状菌の寒天固体培地には、酵母エキスあるいはペプトンが使用されるが、その使用量は０．３〜０．５％程度が一般的である。使用量の多い例としては、特開平５−７６３７８号公報には、コウジ酸を生産する糸状菌の液体培養においてペプトン０．７％を使用したことが記載されているが、この報告では界面活性剤の影響により菌体のペレット化の記載はない。
本発明の培養方法によれば、糸状菌をペレット形状に増殖させることができるため、培養後の分離が容易で、珪藻土等を使用することなく、遠心法、膜法など簡便でクリーンな方法で分離することができる。
【００１０】
【実施例】
次に実施例及び比較例をあげて本発明の方法を説明する。
実施例１  酵母エキスによる糸状菌培養菌体のペレット化
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ斜面寒天固体培地にて増殖させたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（ＩＡＭ２０２４）の胞子を、５００ｍｌの坂口フラスコに分注し滅菌したグルコース２％、酵母エキス１％、Ｔｗｅｅｎ８００．１％を組成とする培地１００ｍｌ（ｐＨ４．０）に接種し、３０℃で４８時間振とう培養（２００ｒｐｍ）したものから更に同様の培地１Ｌを分注し滅菌した５Ｌ三角フラスコに全量を接種し、３０℃で４８時間振とう培養（２１０ｒｐｍ）したものを種菌とした。
発酵培地の培地組成はグルコース１０％、酵母エキス０．７％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、シリコン０．０５％（ｐＨ４．０）とした。
この発酵培地１８Ｌを３０Ｌ容通気攪拌式発酵糟に入れ、１２１℃で１５分殺菌後、種菌を対液１０％接種し温度３０℃、通気量０．８ＶＶＭ、内圧１ｋｇ／ｃｍ2、２５０ｒｐｍの回転数で７日間培養を行った。
この培養において培養３日目より培養菌体のペレット化が観察されはじめ培養７日目には全培養菌体の７０〜９０％がペレット化した。
形成された菌体ペレットは球形から楕円形（卵形）を有し、その直径サイズは１〜５ｍｍであった。
【００１１】
実施例２〜４  添加酵母エキス濃度による菌体ペレット化の比較
実施例１の方法に準じ、発酵培地の酵母エキス濃度を０．５％、１．０％、１．５％と変えて培養を行った。
酵母エキス濃度１．０％以上では培養２日目よりペレット化が観察された。７日目のペレット化菌体の直径サイズは実施例１と差違はなかった。また、０．５％濃度のものは実施例１と同じであった。
【００１２】
実施例５  ペプトンによる糸状菌培養菌体のペレット化
実施例１の方法に準じ、発酵培地組成のうち酵母エキスの代わりにペプトン０．７５％を添加し培養を行った。
この培養において培養３日目より培養菌体のペレット化が観察されはじめ培養７日目には全培養菌体の７０〜９０％がペレット化した。
形成された菌体ペレットは球形から楕円形（卵形）を有し、その直径サイズは１〜５ｍｍであった。
【００１３】
実施例６〜８  添加ペプトン濃度による菌体ペレット化の比較
実施例５の方法に準じ、発酵培地のペプトン濃度を０．５％、１．０％、１．５％と変えて培養を行った。
ペプトン濃度１．０％以上では培養２日目よりペレット化が観察された。７日目のペレット化菌体の直径サイズは実施例５と差違はなかった。また、０．５％濃度のものは実施例５と同じであった。
【００１４】
比較例１
実施例１において、酵母エキス濃度を０．２５％とした以外は実施例１と同様に培養することにより、培養液を得た。
【００１５】
実施例９  酵母エキスによる糸状菌培養菌体のペレット化
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ斜面寒天固体培地にて増殖させたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（ＩＭＡ７１０６）の胞子を、５００ｍｌの坂口フラスコに分注し滅菌したグルコース２％、酵母エキス１％、Ｔｗｅｅｎ８００．１％を組成とする培地１００ｍｌ（ｐＨ４．０）に接種し、３０℃で４８時間振とう培養（２００ｒｐｍ）したものから更に同様の培地１Ｌを分注し滅菌した５Ｌ三角フラスコに全量を接種し、３０℃で４８時間振とう培養（２１０ｒｐｍ）したものを種菌とした。
発酵培地の培地組成はグルコース１０％、酵母エキス０．７％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、シリコン０．０５％（ｐＨ４．０）とした。
この発酵培地１８Ｌを３０Ｌ容通気攪拌式発酵糟に入れ、１２１℃で１５分殺菌後、種菌を対液１０％接種し温度３０℃、通気量０．８ＶＶＭ、内圧１ｋｇ／ｃｍ2、２５０ｒｐｍの回転数で７日間培養を行った。
この培養において培養３日目より培養菌体のペレット化が観察されはじめ培養７日目には全培養菌体の７０〜９０％がペレット化した。
形成された菌体ペレットは球形から楕円形（卵形）を有し、その直径サイズは１〜５ｍｍであった。
【００１６】
評価例１  ペレット化菌体と非ペレット化菌体における濾過速度の比較
実施例１及び比較例１で製造した培養液を用い、濾過試験を行った。
濾過試験は、内径１１ｃｍの磁器製ヌッチェに東洋濾紙製Ｎｏ．２を引き、各培養液１Ｌを濾過し、その時間及び濾液の濁りについて吸光度ＯＤ６６０にて測定した。
結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
0003679474.tif 000002
【００１８】
評価例２  ペレット化菌体と非ペレット化菌体における濾過速度の比較−２
評価例１と同じ培養液を用い、目開き２０メッシュの金網による濾過試験を行った。
濾過試験は内径３０ｃｍのステンレス製篩にて、各培養液１Ｌを濾過し、その時間を測定した。また、濾液の濁りについて吸光度ＯＤ６６０にて測定した。
結果を表２に示した。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
【発明の効果】
以上説明してきた通り、本発明の培養方法によると、従来その特徴的な培養菌体の形態から、緻密な培養条件の設定、あるいは培養終了後の添加剤による凝集化等に依らなければ珪藻土等の濾過助剤なしで菌体分離は困難であった糸状菌を、容易に分離することが可能となり、従来もっとも多く使用されている、内径１ｍｍ程度の中空糸を用いた精密濾過膜等でも容易に分離が可能なため、作業環境、地球環境に優しい製造工程を提供することが可能となる。