(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列で表される蛋白質、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において幾つかのアミノ酸残基が欠失、置換及び/又は付加したアミノ酸配列で表され、接着特性を有する蛋白質をコードするフジツボ接着蛋白質遺伝子。
【請求項２】
配列番号１で示されるフジツボ接着蛋白質遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水中や湿潤な環境で使用できる接着剤の原料となるペプチドを組み換えＤＮＡ技術を用いて製造するために用いるＤＮＡに関する。接着蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む微生物や培養細胞を培養液中で培養し、該培養物中に蓄積される該ポリペプチドを採集することにより、得られる該ペプチドは、接着剤の原料や細胞培養の基質として広い用途で利用されることが期待される。
【０００２】
【従来の技術】
乾燥条件下で強い接着力を示す接着剤は様々な種類のものが開発されている。そのうちの多くのものは一旦乾燥条件下で接着してしてしまえば湿潤環境におかれてもその強度を維持できる。しかし、湿潤な条件下や水中で接着を開始した場合、有効な強度に達することができる接着剤は存在しなかった。
【０００３】
フジツボは、セメントと呼ばれる蛋白質を主成分とする物質を基盤に分泌して、海水中で強く付着することができる。この蛋白質のアミノ酸組成は調べられており、一般的な不溶性の蛋白質とは異なることが示唆されていた（G.Walker,J.mar.biol.Ass.U.K.（1972）52,429-7435 ）。セメントの不溶性画分を構成する第１接着蛋白質については、すでにその遺伝子がクローニングされその構造が決定されているが、その他の蛋白質成分については未だわかっていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子工学の手法を用いてセメント第２蛋白質を生産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、セメント第２蛋白質の全配列を得るために、セメント蛋白質由来の60kDaの可溶性蛋白質を単離、その部分アミノ酸配列をまず決定し、それをもとにセメント第２蛋白質をコードするｃＤＮＡを単離した。研究の結果、セメント蛋白質より得られた可溶性60kDaの蛋白質のＮ末端配列及び５つの断片ペプチドの部分アミノ酸配列をもつｃＤＮＡを単離することに成功し、さらにその塩基配列を決定して本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードするフジツボ接着蛋白質遺伝子である。
また、本発明は、ＤＮＡ配列が、配列番号１で示される上記記載のフジツボ接着蛋白質遺伝子である。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のフジツボ接着蛋白質遺伝子は、配列番号２示されるアミノ酸配列、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする。ここで、「配列番号２で示されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であって、前記配列と同様の接着特性を有するアミノ酸配列をいう。本発明の遺伝子の塩基配列の一例としては、配列番号１で示される塩基配列を挙げることができる。
【０００８】
本発明遺伝子は以下の手順で得ることができる。まず、セメント第２接着蛋白質を得るために、フジツボの底殻より分泌されるセメントを集め７０％ギ酸等により可溶化される画分を除去する。残された不溶性の画分に、還元剤及びＳＨ基保護剤を作用させ、反応後脱塩し、１０％ギ酸等への可溶化画分を遠心により上清として回収する。この可溶化画分を電気泳動により分離し、疎水性の膜であるＰＶＤＦ膜等に電気的に転写する。クマシーブリリアントブルーＲ-250（ＣＢＢ−Ｒ-250）等の色素で検出される60kDaのバンドを切り出し、プロテインシークエンサーによりアミノ末端からのアミノ酸配列を決定する。また、ＰＶＤＦ膜に転写後、Ponceau-S等の色素で検出して60kDaのバンドを切り出し、ＰＶＰ-40等による吸着防止処理後、Achromobacter proteaseＩ等の酵素により60kDaの蛋白質を消化し、逆相等のクロマトグラフィーによって断片ペプチドを分離、回収する。断片ペプチドは、化学的蛋白質断片化方法によっても得られる。
【０００９】
フジツボ全組織をチオシアン酸グアニディン等により可溶化し、フェノール／クロロホルムによる抽出を行い、イソプロパノールにより沈殿させることにより全ＲＮＡを得ることができる。全ＲＮＡを得る方法はこの方法に限定されるものではなく、LiCl沈殿法や塩化セシウム溶液に重層して遠心することによっても得られる。全ＲＮＡから、オリゴdTセルロースカラムを用いてポリアデニル酸鎖を有するＲＮＡ（ポリＡ-ＲＮＡ）を調製する。このポリＡ-ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて２本鎖ＤＮＡを調製する。この２本鎖ＤＮＡの合成はS1ヌクレアーゼ法やオカヤマーバーグ法により行ないえるが、市販のｃＤＮＡ合成キットを用いて合成することも可能である。次いで、得られたｃＤＮＡを適当なベクターに挿入し、このベクターを適当な宿主に導入して増幅させるとともに目的のＤＮＡを持つクローンを選択する。ベクターはλファージ由来の各種ベクターたとえばλgt10やλZapIIなど、あるいはpＢＲ322等のプラスミドベクターを用いることができる。目的クローンの選択には、セメント蛋白質由来の断片ペプチド部分アミノ酸配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして用い、これに強く結合するクローンを選択すればよい。配列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手順により翻訳開始コドンから終始コドン、さらにポリアデニル酸鎖付加シグナルを含むセメント蛋白質ｃＤＮＡの全長を単離することができる。
【００１０】
単離した配列は適当な発現ベクターに挿入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることにより、当該ペプチドを大量調節することが可能である。この際、当該ＤＮＡはシグナル部分を含むため、当該ペプチドを宿主細胞外に分泌させることができる。また、シグナル部分を除去して適当なベクターに組み込んで用いることにより細胞内で生産させることも可能である。
【００１１】
【実施例】
〔実施例１〕
アカフジツボセメント第２蛋白質の断片ペプチドの単離と部分アミノ酸配列の決定
岩手県宮古市宮古湾で採取したアカフジツボの底殻より分泌されるセメントを集め、７０％ギ酸水溶液に懸濁した。ギ酸濃度を１０％に希釈後２０００００×ｇで１時間遠心し、得られた沈殿にトリ-n-ブチルホスフィン及び4-ビニルピリジンを作用させ、暗所で７時間反応後暗所で透析し、凍結乾燥後７０％ギ酸水溶液に懸濁した。ギ酸濃度を１０％に希釈後２０００００×ｇで１時間遠心し、上清を回収した。この上清を電気泳動によって分離した。分離後、ＰＶＤＦ膜（アップライドバイオシステムズ社）に電気的にブロッティングし（日本エードー）、ＣＢＢ-Ｒ２５０あるいはPonceau-Sによって染色しペプチドを検出した。切り出した60kDaのバンドはプロテインシークエンサー473A（アップライドバイオシステムズ社）によりそのＮ末端アミノ酸配列を決定した。また、内部アミノ酸配列を得るために、ＰＶＰ-40で吸着防止処理後、Achromobacter protease  Ｉにより60kDaの蛋白質を消化し、逆相のHPLCによって断片ペプチドを分離、回収し、アミノ酸配列を決定した。
〔実施例２〕
アカフジツボｃＤＮＡライブラリーの作製
岩手県宮古市宮古湾で採取した底殻直径４−５cmのアカフジツボ１０個体をチオシアン酸グアニディン、クエン酸ナトリウム、Ｎ-ラウリルザルコシン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール等の溶液中で組織を機械的に破砕し、フェノール及びクロロホルムによる抽出を行なって、蛋白質などを除去した後、イソプロパノールを加えて沈殿させることにより全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセルロースカラムに導通してポリアデニル酸鎖を有するＲＮＡ（ポリＡ-ＲＮＡ）を調節した。この操作により約２μｇのポリＡ-ＲＮＡが得られた。次にこのポリＡ−ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて２本鎖ｃＤＮＡを調製した。この操作はアマシャム社のｃＤＮＡ合成キットを用いて添付プロトコールに従って行なった。次いで得られた２本鎖ＤＮＡにEcoR I−Not I−BamH Iアダプターを付加し、ファージベクターλZapIIに挿入した。この操作は、アマシャム社のｃＤＮＡ合成システムを用いて添付のプロトコールに従って行なった。挿入の完了したファージベクターは同キットに添付のインビトロパッケージング溶液を用いて組み換えＤＮＡをファージ内に封入させた。封入の完了した組み換えファージは、大腸菌ＸＬ-I blueに感染させ、増幅した。
〔実施例３〕
接着蛋白質ｃＤＮＡを含む組み換えファージの選択
実施例２で得られた組み換えファージを増幅させ、得られた５万個のプラークをナイロンメンブレン  ハイボンドＮ（Amersham社）上に固定した。次いでアカフジツボのセメント蛋白質断片ペプチド配列の一部の相補鎖に相当するオリゴヌクレオチドプロープＣ（Ｇ,Ｔ）（Ｔ,Ｃ）ＴＧ（Ａ,Ｇ）ＴＴ（Ａ,Ｇ）ＴＣ（Ａ,Ｇ,Ｔ,Ｃ）ＧＣ（Ｔ,Ｃ）ＴＧ（Ａ,Ｇ,Ｃ, Ｔ）ＡをミリジェンサイクロンＤＮＡ合成機により合成し、α32P-ATPによる末端ラベルにより標識して、プラークハイブリダイゼーションを行なった。その結果、５万クローンより、プローブと結合する４０個以上のプラークが得られた。これらのうち１０個のプラークを任意に選び、挿入されているｃＤＮＡの長さをアガロース電気泳動により調べて、最も長い挿入断片を持つものについてファージベクターからＥＸＡＳＳＩＳＴ  system（Stratagene社）を用いてプラスミドベクターを切り出した。このプラスミドベクターを大腸菌SOLR-BCP-2に導入した。この大腸菌SOLR-BCP-2は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-14954号として寄託されている（寄託日：平成７年５月29日）。
〔実施例４〕
接着蛋白質遺伝子の配列決定
実施例３で得られた挿入断片の配列をアプライドバイオシステムズ社製３７３Ａ-ＤＮＡシーケンサー及びシーケンシングキットを用いて配列を決定した。その結果、この挿入断片が第２接着蛋白質の成熟体の全長を含む配列であることが判明した。得られた接着蛋白質遺伝子は配列番号１に示した通り、成熟体のＮ末端アミノ酸から翻訳終了コドンまで４１６アミノ酸配列をコードする全長１７１５bpの配列であり、最上流から１９残基はシグナルペプチドにあたる。下流側の非翻訳領域にはポリアデニル酸鎖付加シグナルＡＡＴＡＡＡが存在し、その更に下流にポリアデニル酸鎖が存在した。
【００１２】
【発明の効果】
本発明はフジツボ第２接着蛋白質遺伝子を提供する。本発明の遺伝子から作られる蛋白質は、接着剤の原料として極めて有用である。
【００１３】
【配列表】
配列番号  １
配列の長さ：１７１５
配列の型  ：核酸
鎖の数    ：２本鎖
トロポジー：直線状
配列の種類：ｍＲＮＡ  to ｃＤＮＡ
起源
生物名  ：アカフジツボ（Megabalanus rosa）
配列
0003679835.tif 000002
【００１４】
配列番号  ２
配列の長さ：４１６
配列の型  ：アミノ酸
トロポジー：不明
配列の種類：蛋白質
起源
生物名  ：アカフジツボ（Megabalanus rosa）
配列
0003679835.tif 000003