(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルターデバイスであって以下の特徴：
ハウジングが、血液、血清、または血漿を該ハウジングを通し流すための液体流の管腔をその間規定する第１の入口および出口を有する；
該管腔が多孔壁および部分的に閉塞した管腔を有する複数の中空繊維をまた取り囲む；
該多孔壁が肝細胞よりも小さい小孔を含む；
該中空繊維の該管腔が、肝細胞機能および生存性を支持するために、該管腔を通して培地を流すための該ハウジング中の第２の入口および出口で液体流の連絡を有しており；そして
該中空繊維の管腔が、生存肝細胞を含む水性マトリックスで部分的に閉塞されており、ここで該肝細胞が非凝集細胞および凝集細胞塊の混合物である；
その結果該腔と該中空繊維の内側との間の連絡が排他的に多孔繊維壁を通してである、
を含む、フィルターデバイス。
【請求項２】
前記中空繊維が100〜1000μmの内径を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記内径が150〜400μmである、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記内径が200〜250μmである、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記小孔が100,000kdまでの分子量を有する分子の通過を許容する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記培地が無血清培地である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記マトリックスが、コラーゲン、アルギネート、キトサン、およびフィブリンからなる群から選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記マトリックスがコラーゲンである、請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記細胞塊が直径30〜300μmである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記細胞塊が直径35〜150μmである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前期細胞塊が直径40〜70μmである、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記水性マトリックスが、液体として前記繊維中に導入され、そしてインサイチュでゲル化され、ここで該マトリックスゲルが前記生存肝細胞の存在下で圧縮する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記液体が１ミリリットル当たり５〜40×106細胞の濃度で肝細胞を含む、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記濃度が１ミリリットル当たり20〜40×106細胞である、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記濃度が１ミリリットル当たり30〜35×106細胞である、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記細胞の半分が細胞塊の中にある、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記細胞の３分の２が細胞塊の中にある、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記管腔が前記マトリックスにより25〜90％閉塞されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記管腔が33〜75％閉塞されている、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記肝細胞がブタ肝細胞である、請求項１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
これは、出願番号第07/197,700号（1988年５月23日出願、放棄）の一部継続出願である、出願番号第07/355,115号（1989年５月18日出願、放棄）の一部継続出願である、出願番号第07/864,893号（1992年４月３日出願、放棄）の継続出願である、出願番号第08/376,095号（1995年１月20日出願、放棄）および出願番号第07/605,371号（1990年10月29日出願、放棄）の一部継続出願である。これらの出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
発明の背景
肝臓移植は現在、支持療法に好ましい反応を示さない急性劇症肝不全の患者のための処置の唯一の方法である（Starzlら、「肝臓移植（1）」N Engl J Med（1989）321:1092-1099;LangerおよびVacanti「組織工学」Science（1993）260:920-926）。肝不全の患者のための移植に対する橋渡しとしての仮の肝臓補助デバイスに対する必要性は十分に記載されている（Takahashiら、「人工肝臓：この分野の状況」Dig Diseases Sci（1991）36:1327-1340）。人工肝臓の開発により、肝不全の患者は、ドナーの肝臓が利用可能になるまで、または患者自身の肝臓が再生し得るまで維持され得る。そのようなデバイスは、ドナーの器官の不足（Busuttilら、「UCLAでの最初の100の肝臓移植」Ann Surg（1987）206:387-402;Vacantiら、「子供の肝臓移植：初め30カ月のボストンセンターの経験」Transplant Proc（1987）19:3261-3266）、および関連した合併症（WalvatneおよびCerra「多臓器不全における肝機能不全」Multiple Organ Failure:Pathophysiology and Basic Concepts of Therapy、Dietch,E.A.編、（1990）241-260頁、Thieme Medical Publishers、New Youk;Shellmanら、「医学集中治療病棟に収容された肝硬変および慢性肝臓疾患の患者の予後」Crit Care Med（1988）16:671-678）も問題を軽減する。
動物細胞および遺伝的に改変されたその誘導体はしばしば、ワクチン、モノクローナル抗体、および薬物タンパク質（例えば、ホルモン、抗原、組織型プラスミノーゲンアクチベーターなど）の連続的生産のためにバイオリアクター内で培養される。その細胞は本質的には、触媒の系であり、そして培地は栄養物および増殖を阻害する代謝物を供給および除去する。栄養物を供給し、そして代謝物質を除去するために、バイオリアクター内の培地が、液体流により、断続的にまたは連続的に交換される。しかし、その培地に比較して相対的に小サイズおよび小密度差であるために、培地が交換されるとき、細胞は不可避的に引き抜かれ、それはバイオリアクター内での相対的に低い細胞濃度をもたらす。低細胞濃度の結果として、所望の細胞産物の濃度は回収した培地中では低い。
理想的な動物細胞のバイオリアクターは以下の３つの特徴を包含する：
（1）細胞が、ほとんど無限の滞留時間で、できるだけ長くバイオリアクター装置内で高密度で生存状態で維持されること；
（2）高分子量化合物（高価な増殖因子および所望の細胞産物を含む）は、増殖中の細胞による効率的な栄養物の利用、そしてまた高濃度の細胞産物の蓄積の両方を可能にするために、バイオリアクター内で、長いが有限の滞留時間を有すること；および
（3）低分子量化合物（より高価でない栄養物および阻害物質を含む）は、細胞増殖、細胞産物形成、および他の細胞性代謝活性の阻害を低減するために、バイオリアクター内での、非常に短い滞留時間を有するべきであること。
人工肝臓の開発は、複雑な問題である。多くの先達の試み（例えば、プラスマフェレーシス、チャコールおよび樹脂の血液灌流、ならびに異種移植片を横切る循環）が失敗した。一つの主要な生理学的機能を有する心臓とは違い、肝臓は生存に必要な多くの複雑な仕事を行う。それらの仕事は、機械的システムにおいて開発または維持することは困難であった。
肝臓は、内因性のおよび外因性の両方の老廃分子の生体内変化、ならびにグルコース、脂質、タンパク質（アルブミン、酵素、凝固因子、および微量元素用のキャリア分子を含む）の合成に必要とされる代謝工場である。肝臓は、アミノ酸および脂肪酸の適切な血漿濃度を維持し、そして窒素含有老廃物、薬物、および他の化学物質の解毒を行う。老廃産物（例えば、ビリルビン）は、抱合されそして胆道（biliary tree）を介して排出される。肝臓タンパク質合成および生体内変化は、肝臓支持の複雑さを非常に増大させる。
生化学的機能を提供するために肝細胞を用いる系は、肝細胞を培養物中に維持することが困難であり得るために問題が多い。標準的な条件下では、プラスチック上で培養した非形質転換肝細胞は、約12〜24時間でギャップ結合を失い；３〜５日で、扁平になり、無顆粒になり、全ての組織特異的機能を失い；そして１〜２週内に死滅する。（ReidおよびJefferson「肝細胞および他の分化した細胞の培養」Hepatology（1984）May-Jun;4（3）:548-59;Warrenら「初代維持培養におけるラット肝細胞の7-アルコキシクマリンＯ-デアルキラーゼ活性に及ぼす培地組成の影響」Zenobiotica（1988）18（8）:973-81）。
その問題の解決は、ずっとより容易に増殖し得る形質転換肝細胞の使用である。しかし、形質転換肝細胞はしばしば、十分に分化した形質転換細胞でさえ親組織由来の組織特異的機能に顕著なばらつきを示すため、選択されることは少ないと考えられる。（ReidおよびJefferson（1984）前出）さらに、多くの細胞株が、ウイルスにより形質転換される。（Adenら「分化したヒト肝ガン由来細胞株におけるHBsAgの制御合成」Nature（1979）615-6頁;Knowlesら「ヒト肝細胞ガン細胞株は主要な血漿タンパク質およびＢ型肝炎表面抗原を分泌する」Science（1980）209:497-9）。これらの細胞株は患者に形質転換ウイルスを伝達する能力を有する。その結果、取り締まり機関が、伝達の危険性が最少であると証明されたとしても、ヒトのための形質転換細胞の使用を承認するということは疑わしい。
培養肝細胞および他の分化した細胞の生存性および機能を延長するための多くのアプローチが調べられた。それらのアプローチとして、培養培地にホルモンおよび増殖因子を添加すること、細胞外マトリックス構成物を添加すること、および別の細胞型の存在下で肝細胞を増殖させることが挙げられる。肝細胞との共培養に日常的に用いられる細胞は、上皮細胞または肝非実質細胞（例えば、クッパー細胞）である。
インキュベーション培地へのコルチコステロイドの添加が、培養肝細胞の生残性を延長すること、およびアルブミン合成を維持させること（特に、インスリンとの相乗作用において）が示された（Jeffersonら、「培養ラット肝細胞における遺伝子発現の転写後調節」Mol Cell Biol（1984）4（9）:1929-34;Dichら、「肝細胞の長期培養：酵素活性および代謝能に及ぼすホルモンの効果」Hepatology（1988）8（1）:39-45）DMSO（ジメチルスルホキシド）およびフェノバルビタールもまた、肝細胞の生存性および機能を延長することが知られている。（Maher,J.J.「初代肝細胞培養：それは家から離れた家か?」Hepatology（1988）8（5）:1162-6）しかし、組織特異的機能の全てが等しく支持されるわけではない。インスリンは、濃度とともに変化する効果を有して、いくつかの機能を促進し得る。もしインスリンのみが培地に添加されるならば、尿素回路酵素の発現は減少する。この負の効果は、グルカゴンおよびデキサメタゾンの添加により中和され得る（Dichら、（1988）前出）。
ホルモン規定培地もまた、肝細胞の機能および生存性を延長し得る。（Jeffersonら、（1984）前出）無血清のホルモン規定培地を用いて、ヒヒ肝細胞において良好な機能が、70日間にわたり示された。その培地は、上皮増殖因子（100ng/ml）、インスリン（10μg/ml）、グルカゴン（４mg/ml）、アルブミン（0.5mg/ml）、リノレイン酸（５mg/ml）、ヒドロコルチゾン（10-6Ｍ）、セレン（10-7Ｍ）、コレラ毒素（２ng/ml）、グリシル-ヒスチジル-リジン（20ng/ml）、トランスフェリン（５mg/ml）、エタノールアミン（10-6Ｍ）、プロラクチン（100ng/ml）、ソマトトロピン（１mg/ml）、およびチロトロピン放出因子（10-6Ｍ）からなった。（Lanfordら、「無血清培地中で維持したヒヒ肝細胞の長期初代培養における血漿タンパク質およびリポタンパク質の分析」In Vitro Cell Dev Biol（1989）25（2）:174-82）
現在では、細胞外マトリックスが、細胞機能および生存性に重大な影響を与えることが明らかである。（BissellおよびAggeler「動的相互作用：どのように細胞外マトリックスおよびホルモンは遺伝子発現を指揮するか」Mechanisms of Signal Transduction by Hormones and Growth Factors Alan R.Liss,Inc.（1987）251-62.3）マトリックスエレメントが特異的増殖因子の要求性を低減またはまたは取り除くことが示された。抽出した肝臓の結合組織を用いて、肝細胞が５カ月にわたり培養され、そして少なくとも100日間アルブミン合成を維持した。その抽出物は、肝臓の約１重量％を示した。その抽出物の３分の１が、炭水化物および非コラーゲン性タンパク質から構成され；その他の３分の２はコラーゲンであった（Ｉ型43％、III型43％、そして残りはIV型を含む他のものの未同定の混合物）。（Rojkindら、「結合組織生物マトリックス：正常なラット肝細胞の長期培養のためのその単離および利用」J Cell Biol（1980）87:255-63）この混合物は正確には、局所的肝細胞環境である、類洞周囲腔、またはディッセ腔を反映し得ない。
ディッセ腔中のマトリックスの存在は議論の的であった。初めに何人かの研究者は、類洞周囲腔が「空」であることを示唆した。現在では、基底膜の主要構成成分の全てがディッセ腔中または周囲に存在することが認められている。（BissellおよびChoun「正常肝臓における細胞外マトリックスの役割」Scand J Gastroenterol（1988）23（別冊151）:1-7）
ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、細胞増殖因子および細胞の両方に結合する。（Sakselaら「上皮細胞由来ヘパラン硫酸は塩基性繊維芽細胞増殖因子に結合しそしてそれをタンパク質分解から保護する」J Cell Biol（1988）107（2）:743-51;Gordonら、「ヘパラン硫酸はヒト初期造血前駆細胞と骨髄微小環境の細胞外マトリックスとの間の接着相互作用に必要である」Leukemia（1988）2（12）:804-9）ヘパラン硫酸は肝細胞の核に直接的に効果を与え得る。（Ishiharaら「ヘパラン硫酸の肝細胞の核への移送」J Biol Chem（1986）261（29）:13575-80）肝細胞は比較的大量のヘパラン硫酸を培養物中で分泌する。（Arensonら「正常ラット肝臓における細胞外マトリックスの形成：プロテオグリカンの主要供給源としての脂肪細胞」Gastroenterology（1988）95（2）:441-7）免疫学的研究は、ディッセ腔中に、Ｉ型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンを同定した。（Geertsら「正常ラット肝臓の超薄凍結切片上のプロコラーゲンIII、フィブロネクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンの免疫金局在化」Histochemistry（1986）84（4-6）:355-62;Martinez-Hernandez,A「肝細胞外マトリックス。Ｉ。正常ラット肝臓における電子免疫組織化学的研究」Lab Invest（1984）51（1）:57-74）通常、ディッセ腔にはＩ型コラーゲンはほとんど存在しないが、培養物中の肝細胞は脱分化とともに、III型コラーゲン合成を犠牲にして増加するＩ型合成を示す。その効果は組織特異的肝細胞活性を支持する培養技術を用いて逆転される。
肝細胞はまたMatrigelTM（肉腫細胞株により産生されたバイオマトリックス（EHS））上で培養され得る。MatrigelTMは、IV型コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、およびヘパラン硫酸を含む。MatrigelTM上で、肝細胞は、21日間通常のアルブミン合成を維持する。（BissellおよびAggeler（1987）前出）
肝細胞の通常の環境の密な複製（close duplication）がまた、コラーゲン上のコンフルエントな単層に肝細胞を培養することにより試みられた。Ｉ型コラーゲンの第２の層が肝細胞の「トップ」および「ボトム」上に形成された通常のマトリックス「サンドイッチ」を再創出するために添加される。この技術は顕著に、42日以上の間、向上した生存性、およびアルブミン合成の機能を示した。（Dunnら「肝細胞機能および細胞外マトリックス幾何学：サンドイッチ形態での長期培養」FASEB（1989）3:174-7）
また、ギャップ結合のタンパク質合成および遺伝子発現に及ぼす種々のプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの効果が入念に調べられた。最も効果的な化合物はデルマタン硫酸プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、およびヘパランであった。肝臓から抽出したヘパランが最も効果的であった。ラムダカラギーナン（海草抽出物）もまた効果的であった。（Sprayら「プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンは初代肝臓培養物においてギャップ結合合成および機能を誘導する」J Cell Biol（1987）105:541-55）最終的に、キトサン（甲殻類の殻およびカビの膜中に見出された多糖）が、正常なマトリックスを模倣し、そして細胞の機能および生残性を促進し得ることが示唆された。（Muzzarelliら「キトサンの生物学的活性：超微細構造的研究」Biomaterials（1988）9（3）：247-52;ScholzおよびHu「細胞、高および低分子量化合物に対する３つの異なる保持時間を有する２区画細胞捕獲バイオリアクター」Cytotechnology（1990）4:127-137)
分化した肝細胞を培養するための別の好結果の技術として非実質細胞を用いる共培養が挙げられる。最近、種々の上皮株における肝細胞の共培養が比較された。共培養は顕著に、改善したアルブミン合成およびギャップ結合の維持を示した。細胞がインスリンおよびデキサメタゾンの存在下で増殖させられた。血清の添加は結果を改善しなかった。共培養により付与された改善された生残性および機能は近接した細胞を用いてのみ生じ、そして細胞上清によっては移されなかった。（Goulerら「細胞相互作用は、初代培養肝細胞の組織特異的機能、バイオマトリックス付着、および結合連絡を促進する」Hepatology（1988）8（5）:1010-8）
共培養の有益な効果がマトリックス相互作用を通して生じるのか、または細胞-細胞接触を必要とするのかどうか、未だに論点である。
また、脂肪細胞がマトリックス生成に鍵的役割を果たしている証拠がある。脂肪細胞は、クッパー細胞と同じくらい多く報告されており、そして多くのI型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ラミニン、ならびにプロテオグリカン、特にデルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを産生することが示唆されている。（Friedmanら「肝脂肪細胞：正常なラット肝臓の主要コラーゲン産生細胞」PNAS（1985）82:8681-5）それらの特別のプロテオグリカンがギャップ結合を最もよく支持するものであったことは、特に興味深い。（Sprayら（1987前出）。
人工的支持の多くの技術が過去35年にわたり利用されてきた。それらは簡易な交換輸注（simple exchange transfusion）を含む（LeeおよびTink「肝性昏睡における交換輸注：事例の報告」The Med J Australia（1958）11:40-42;Treyら「血液交換による肝性昏睡の処置」NEJM（1966）274（9）:473-81）;血漿交換でのプラスマフェレーシス（SabinおよびMerritt「プラスマフェレーシスおよび血漿輸注［血漿交換］」Annals of Internal Medicine（1968）68（1）:1-6）;体外異種または同種肝臓灌流（Eisemannら「肝不全の処置における異種肝臓灌流」Annals of Surgery（1965）162（3）:329-345;Senら「肝不全の管理における単離した灌流死体肝臓の使用」Surgery（1966）59（5）:774-781）;交叉循環（Burnellら「交叉循環または交換輸注により処置された急性肝性昏睡」NEJM（1967）276（17）:943-953）;血液透析（Opolonら「ポリアクリロニトリル膜（PAN）血液透析（HD）により処置された肝不全昏睡（HFC）」Trans ASAIO（1976）22:701-710;活性炭血液輸注（Gazzardら「劇症肝不全の処置におけるチャコール血液輸注」Lanceti:1301-1307）;そして、より最近は、培養肝細胞を含む生体人工肝臓系（BAL）。
肝不全の支持のために最近研究されている生体人工肝臓の例として、体外バイオリアクターが挙げられる（Arnaoutら「生体人工肝臓の開発：Gunnラットにおけるビリルビン抱合」Journal of Surgical Research（1990）48:379-382;Margulisら「急性肝不全を有する患者の総合的な集中治療における不安定な（suspense）活性ドナー肝細胞を通しての血液灌流による一時的臓器置換」Resuscitation（1989）18:85-94；マイクロカプセル化ゲル小滴のような移植可能な肝細胞培養物（Caiら「生体人工肝臓のためのマイクロカプセル化肝細胞」Artificial Organs（1988）12（5）:388-393）および球状体凝集物（Saitoら「球状凝集培養された肝細胞のラット脾臓への移植」Transplantation Proceedings（1989）21（1）:2374-77）。
それらの生体人工肝臓系は、正常な肝臓の解毒、合成、および生物物理の利点を有する。臨床装置において用いられている体外バイオリアクターはほんのわずかである。（Matsumuraら「肝不全におけるハイブリッド生体人工肝臓：予備臨床報告」Surgery（1987）101（1）:99-103;Margulisら（1989）前出）。移植可能な肝細胞培養物は、臨床的には未試験のままである。
マイクロカプセル化したゲル小滴内の肝細胞捕獲（肝細胞マイクロカプセル化）のための技術は、膵島のカプセル化に、好結果に用いた技術に類似している（O'SheaおよびSun「ランゲルハンス島のカプセル化は、糖尿病マウスにおける異種多植片生存を延長させる」Diabetes（1986）35:943-46;Caiら（1988）前出）。マウクロカプセル化は肝細胞への栄養物の拡散を可能にする。またマイクロカプセル化は、宿主防御由来の「免疫単離（immuno-isolation）」と共に、腹腔内肝細胞を提供する（WongおよびChang「マウスにおける人工的な細胞マイクロカプセル化ラット肝細胞異種移植片の生存性および再生」Biomat Art Cells Art Org（1988）16（4）:731-739）。
血漿タンパク質およびアルブミン合成（Sunら「生体人工肝臓としてのマイクロカプセル化肝細胞」Trans ASAIO（1986）32:39-41;Caiら（1988）前出）；チトクロムP450活性および抱合活性（Tompkinsら「アルギン酸固定化ラット（rate）肝細胞の酵素的機能」Biotechnol Bioeng（1988）31:11-18）；糖新生（Miuraら「アルギン酸カルシウムに捕捉した肝細胞の肝機能」Ann NY Acad Sci（1988）542:531-32）；尿素生成（Sunら「マイクロカプセル化肝細胞：インビトロおよびインビボ研究」Biomat Art Cells Art Org（1987）15:483-486；および肝臓刺激物質産生（KashaniおよびChang「遊離およびマイクロカプセル化肝細胞の培養物由来の肝臓刺激物質の放出」Biomat Art Cells Art Org（1988）16（4）:741-746）全てがアルギン酸カルシウム捕捉肝細胞に関して報告された。
凝集した肝細胞が劇症肝不全の処置手段として提案されている。（Saitoら「球状凝集培養された肝細胞のラット脾臓への移植」Transplantation Proceedings（1989）21（1）:2374-77;Koideら「肝臓由来プロテオグリカンの存在下で形成された成体ラット肝細胞の多細胞球状体による連続的高アルブミン生成」Biochem Biophys Res Comm（1989）161（1）:385-91）。
人工肝臓支持の目的のための体外バイオリアクター設計は、小肝臓キューブ（liver cube）の灌流を含む（Lieら「ブタにおける新しい人工肝臓デバイスによる肝性昏睡の好結果な処置」Res Exp Med（1985）185:483-494）肝細胞懸濁液に対する透析（Matsumuraら（1987）前出；Margulisら（1989）前出）；多平行プレートの灌流（Uchinoら「多プレート肝細胞単層から構成されるハイブリッド生体人工肝臓」Trans ASAIO（1988）34:972-977）；および中空繊維灌流。体外肝細胞懸濁液を用いるヒト研究が報告されている。
肝細胞懸濁液に対する透析による人工肝臓支持の最初の臨床報告は、1987年に発せられた（Matsumuraら（1987）前出）。このデバイスは酢酸セルロース透析膜により患者血液から分離された、ウサギ肝細胞懸濁液（1〜2リットル）からなる。各処理は、単回の4〜6時間の透析（行程（run））の間、新鮮な肝細胞を用いた。複数の行程が、血清ビリルビンを好結果に低減し、そして一回の事例で代謝性脳障害を反転させた。
急性肝不全の支持のための標準的医学療法を用いる肝細胞懸濁液に対する透析と比較するUSSRからの制御研究が、最近報告された（Margulisら（1989）前出）。その生体人工デバイスは、活性炭と共に、懸濁液中のブタ肝細胞で満たした小型の20mlカートリッジからなる。このカートリッジは、Scribner動静脈吻合短絡通路を通して灌流された。患者は毎日６時間処置された。肝細胞懸濁液は、各６時間の処置機関にわたり１時間ごとに交換された。標準の医学療法コントロールグループ（41％）に比較したとき、処置グループ（63％）において、向上した生残性が証明された。
中空繊維カートリッジでの肝細胞の培養は生体人工肝臓支持の別の例である。伝統的には、肝細胞は中空繊維カートリッジのキャピラリー外空間にロードされる。一方培地、血液、血漿は中空繊維の管空を通して灌流される。細胞は懸濁液中で遊離であり得る（WolfおよびMunkelt「培養細胞および合成キャピラリーから構成される人工肝臓によるビリルビン抱合」Trans ASAIO（1975）21:16-27）；壁への接着（Hagerら「ハイブリッド人工肝臓の原型」Trans ASAIO（1978）24:250-253）；またはキャピラリー外空間内の表面領域を顕著に増加させるマイクロキャリアへの接着（Arnaoutら（1990）前出）。
中空繊維カートリッジ内でのReuber肝ガン細胞によるビリルビン取り込み、抱合、および分泌が1975年に報告された。（WolfおよびMunkelt（1975）前出）。ガン細胞懸濁物が、メディウムを含むビリルビンが中空繊維の管腔内空間を通して灌流される間に、区画の殻側にシリンジにより注射された。この技術は、肝ガン細胞によるガン細胞の接種の危険性のために、臨床報告はなかった。
肝臓支持のために開発された別の中空繊維デバイスは、中空繊維カートリッジのキャピラリー外腔内に負荷されたマイクロキャリアに結合した肝細胞を使用する。そのデバイスにおいて、血液は、小分子の交換を可能にする半透過性の中空繊維を通って流れる。そのシステムを用い、増加した抱合ビリルビンレベルを、グルクロノシルトランスフェラーゼ欠損（Gunn）ラットの胆汁中で測定する。（Arnaoutら、「生体人工肝臓の開発：Gunnラットでのビリルビン抱合」J Surg Research（1990）48:379-82）。外殻は灌流されないので、すべての酸素および栄養は患者の血流によって供給される。さらに、そのシステムは、胆汁および有毒な老廃物の排泄のための完全なインビボの胆汁管系を必要とし得る。
しかし、臨床適用に関して、BALの肝臓特異的機能を高めることが所望される。それにより、さらに多くの細胞を必要とするか、または細胞あたりの肝臓特異的機能を高める。前者の手段は、一般的には考慮されない。なぜなら、正常な細胞は得ることが困難であり、その細胞は維持することが困難であり、そしてバイオリアクターは、エクスビボ療法の間、大容量の血液を制御し得ないからである。
初代のラット肝細胞は、特定の改変された表面上に播種されると、凝集体を形成し、その凝集体は、増強された細胞あたりの肝臓特異的機能を示す（Koideら、「肝臓由来のプロテオグリカンの存在下で形成された成熟ラット肝細胞の多細胞球体による持続する高アルブミン産生」Biochem Biophys Res Commun（1989）161:385-391;Tongら、「成熟ラット肝細胞球状体の長期間培養」Exp Cell Res（1992）200:326-332）。新たに単離されたラット肝細胞は、正に荷電したポリスチレン表面上に30−80％の間のコンフルエンスで播種されると（Koideら、「正に荷電した表面を有するディッシュ内および他の非接着性環境下での成熟ラット肝細胞からなる多細胞球状体の形成」Exp Cell Res（1990）186:227-35）、最初外側に拡散し、そして不規則に動くようである。48時間後、細胞の動きは、細胞が多細胞島（mutlicellular island）に凝集し始めるような方向性であるようである。その多細胞島は、最終的に、凝集体が自由に懸濁されるように、懸濁液中に剥がれ落ちる。そのようにして形成された凝集体は、約100μmの均一な直径を示し、そして６−８細胞層の厚さである。
凝集体を作製するための報告されたシステムは、以下のものを含む：充填床培養システムでポリウレタンフォームマトリックス内での凝集体の培養（Ijimaら、「人工肝臓支持システムのためのPUF孔中での成熟ラット肝細胞の三次元培養の適用」Animal Cell Technology:Basic&Applied Aspects Murakamiら編（1992）81-86頁、Kluwer Academic Publishers,The Hague,Netherlands）、パイレックスカラスビーズを充填した管状反応槽内での凝集体の培養（Liら、「捕捉された凝集体としての初代肝細胞の充填床バイオリアクターでの培養：潜在的な生体人工肝臓」In Vitro Cell Dev Biol（1993）29A:249-254）、中空床（spoutedbed）培養槽でのアルギン酸カルシウムでカプセル化された凝集体の培養（Takabatakeら、「ラット肝細胞のカプセル化された多細胞球状体は中空床循環培養システムにおいてアルブミンおよび尿素を産生する」Artif Organs（1991）15:474-480;Koideら、「肝細胞球状体：人工肝臓支持のバイオリアクターのための差別化される特徴および潜在的な利用」アブストラクト、日本動物細胞工学会年会、1993年11月９〜12日、名古屋、日本）、および中空繊維バイオリアクターのキャピラリー外空間に接種されたコラーゲン捕捉凝集体（SakaiおよびSuzuki「コラーゲンゲル内に捕捉された肝細胞球状体を用いる中空繊維型生物人工肝臓」アブストラクト、日本動物細胞工学会年会、1993、名古屋、日本）。
これらのシステムのそれぞれに共通する制限は、バイリアクターでの使用のために得られる肝細胞の数が低いことである。凝集体として約5000万から7500万の肝細胞が、これらの研究で用いられた。一定のペトリディッシュまたは他の表面を用いる凝集体形成プロセスは、非常に時間および労力を要する。凝集体形成は、狭い細胞密度範囲内でのみ生じる（約３〜８×１０4細胞／cm2）。最初に播種された細胞については、接種細胞の30〜40％のみが、培養後２〜３日で凝集体を形成する。従って、凝集体として１億個の肝細胞を供給するためには、約３〜４億個の細胞の接種が必要とされる。播種密度の必要条件に基いて、それは、8000cm2の表面積または200枚の直径60mmのペトリディッシュに移される。従って、生体人工肝臓の適用における再構成された肝細胞（凝集体）を用いる可能性は、再構成された肝細胞形成を、より迅速で、かつより高効率で操作する能力に依存する。
より多くの数の凝集体を得ることは、デバイスの大きさを好ましくないほど大きくすることなく、BAL内での生存細胞を最大にし得る。
発明の要旨
本発明の目的は、オルガノイドに形成された肝細胞を含む人工肝臓を提供し、細胞あたりの肝臓特異的機能を最大にすることである。予備形成されたオルガノイドと分散された肝細胞との組合せが、管腔内の栄養の流れによる灌流を可能にする中空繊維内で収縮したマトリックスゲル内に捕捉される。
【図面の簡単な説明】
図１は、細胞、オルガノイド、またはその組合せがゲル中に捕捉されるときのゲル圧縮の程度を示す。グラフにおいて、白四角で示される曲線は、５×106／mlの分散細胞を表す；黒四角は、１×106／mlの分散細胞を表す；白丸は、オルガノイド中の2.5×106／mlの細胞および2.5×106／mlの分散細胞を表す；黒丸は、オルガノイド中の細胞および分散細胞のそれぞれが0.5×106／mlであることを表す；白三角は、オルガノイド中で５×106／mlの細胞を表す；そして黒三角は、オルガノイド中で１×106／mlの細胞を表す。
図２Ａおよび２Ｂは、単層細胞およびコラーゲンゲル捕捉細胞、ならびにオルガノイドによる尿素産生を示す。図２Ａは単層培養物に関し、そして図２Ｂはコラーゲン捕捉細胞に関する。両方のパネルで丸で示されるプロットはオルガノイドに関する。そして、両方のパネルで四角で示されるプロットは単細胞に関する。
図３は、コラーゲン捕捉オルガノイドおよび分散細胞によるアルブミン産生のレベルを示す。グラフにおいて、丸はオルガノイドに関し、そして四角は単細胞に関する。
図４は、オルガノイド、細胞およびその組合せを用いるゲル圧縮のレベルを示す。ゲルディスクは、1.3mmの厚さであった。100万個の細胞が、各ディスク内に取り込まれた。白丸は、オルガノイドに関し；黒丸は、分散細胞に関し；三角は、２：１の比のオルガノイド中の細胞：分散細胞に関し；そして四角は、１：１の比のオルガノイド中の細胞：分散細胞に関する。
図５は、コラーゲン捕捉凝集体および非凝集細胞のアルブミン産生を示す。
図６は、ゲル捕捉細胞およびオルガノイドのリドカインのクリアランス速度を示す。図において、四角で示されるプロットは、オルガノイドに関し、そして三角で示されるプロットは、分散細胞に関する。
図７は、オルガノイドまたは分散細胞を含有するBALのアルブミン産生速度を示す。四角で示されるプロットは、オルガノイドに関し、そして三角で示されるプロットは、分散細胞に関する。
図８は、オルガノイドまたは分散細胞を含有するBALの尿素生成速度を示す。四角で示されるプロットは、オルガノイドに関し、そして三角で示されるプロットは、分散細胞に関する。
本発明の詳細な説明
本発明に適するバイオリアクターデバイスは、同時係属出願の米国特許出願番号第08/376,095号（1995年１月20日出願）（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。本発明の発明原理に従うバイオリアクターは、一般に近位端および遠位端を有する収容体（housing means）内に２つのチャンバーを含む。
２つのチャンバーは、多孔性膜により生じる。一方のチャンバーに肝細胞が存在し、そして他方のチャンバー内を、血液、血漿、または血清が流れる。好ましい実施態様において、膜は、繊維の管腔内に含まれる肝細胞を有する多孔性壁の中空繊維の形状である。
好適な膜は、選択的に、低分子量化合物および高分子量化合物（例えば、栄養物および細胞産生物）を、細胞を含有するチャンバーともう一方のチャンバーとの間で交換し得る。膜の望ましい分子量の上限は、特定の目的に適するように可変であり、そして変化し得る。従って、BALに適切な膜は、100,000kDの程度であり得、多くの非細胞分子の自由な通過を可能にする。本発明のバイオリアクターシステムとともに用いられ得る限外濾過膜は、ポリスルホン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエステル／ポリカーボネート、イオン荷電した膜、セロファン▲Ｒ▼、ニトロセルロース、ポリエチレン、およびセラミックスから作製されるものを含む。いくつかの市販の例として、以下のものが挙げられる：ポリカーボネートおよびポリエステルのヌクレオポア▲Ｒ▼（Nucleopore▲Ｒ▼)膜フィルター（Nucleopore Corporation、Pleasanton、California）；ポリスルホンのPTGC膜（Millipore、Bedford、Massachusetts）；およびニトロセルロースのコロジオン▲Ｒ▼（Collodion▲Ｒ▼)膜（Schleicher and Schuell,Inc.、Keene、New Hampshire）。
BALとして機能するようにリアクターを改変する目的のために、中空繊維バイオリアクターを用いることが好ましい。適切な中空繊維アセンブリは、圧力制御バルブを備え、そして濾過ガラスを除いたAmicon（W.R.Grace&Co.の一部門、Danvers、MA）のAmicon PN5407モデルDH4である。その場合、中空繊維は、オルガノイドおよび細胞が収容される部位として機能する繊維の内部区画を有する種々の多孔性膜材料から構築される。約100,000の上限分子量を有するAmicon H1P3-100中空繊維膜アセンブリが使用され得る。そのアセンブリの中空繊維は、ポリスルホンから形成される。しかし、上記のような任意の適切な膜組成物もまた、首尾よく用いられ得る。
本発明のデバイスの基本的な機能は、血液、血漿または血清を無毒化することであるため、子孔サイズは、多くの既知の毒素が中空繊維内に通過し得るように選択しなければならない。多くの毒素および代謝産物が、循環しているキャリア分子に結合または付着することは知られている。一般的なキャリア分子は、アルブミンである。例えば、非抱合ビリルビンはアルブミンによって運搬されることが知られている。従って、アルブミンの大きさ程度の分子の通過を可能にする小孔を有することは有益である。アルブミンは、繊維の壁を通過する約70,000の分子量を有する。
中空繊維は種々の長さおよび直径で市販され、入手し得る。適切には、繊維の長さは、ハウジング（housing）の大きさに合わせられる。繊維の直径を選択して、その中に含まれる細胞の数を最大にし、栄養培地の流れを最大にして最大の細胞生存率を維持し、繊維内の表面積および繊維の外表面を最大にし、そしてオルガノイドを収容するのに適切な大きさを保持するようにする。
約１mmまでの直径を有する繊維を日常的に使用する。そして、約100μmの直径は、おそらく、繊維の大きさの実用的な下限を示す。さらに中間的な直径の繊維を使用し得る。そして、しばしば、約150〜400μmの直径を有する繊維の使用が好ましい。その結果、ハウジング内に保持され得る繊維の数を最大にする。従って、約200〜250μmの繊維もまた、適切である。
適切な中空繊維アセンブリは、それらの間でチャンバーを規定する間隔を持って配置された端部を有するハウジングを有する。ハウジングは、第１の液体導入口および第２の液体導入口を有する。第２の液体導入口は、一般的に、第１の液体導入口の内側方向に位置する。ハウジングはまた、第１の液体取り出し口および第２の液体取り出し口を有する。第２の液体取り出し口は、一般的に、第１の液体取り出し口の内側方向に位置される。ハウジングは、一般的に、シリンダー状であるが、形状は、それ程限定されない。中空繊維を収容する任意のハウジングが、首尾よく用いられ得る。
ハウジング内には、少なくとも１つの選択的に透過性の中空繊維が存在する。それは、栄養および細胞産生物が通過する前で、細胞の通過を実質的に受けつけず、ハウジングの長さ方向に伸びている。中空繊維は、チャンバーを、中空繊維内のキャピラリー内部の空間と中空繊維の外側のキャピラリー外の空間とに分ける。キャピラリー内の空間およびキャピラリー外の空間は、中空繊維の壁を介してのみ連絡する。好ましくは、キャピラリー内部の空間は、選択されたマトリックス内に捕捉された細胞のための細胞チャンバー、および栄養培地の通過のための二次的な管腔を提供する。一方、キャピラリー外の空間は、血液、血漿または血清に繊維の外表面を浸すための空間を提供する。所望であれば、それらの役割は、逆にし得る。好ましくは、多数の繊維が用いられる。中空繊維の内部の管腔は、第１の液体導入口と第１の液体取り出し口との流れの伝達中にある。キャピラリー外の空間は、第２の液体導入口と第２の液体取り出し口との流れの伝達中にある。
本発明の原理を用いるバイオリアクター装置は、捕捉された細胞に対して高い酸素輸送を提供し、低い循環流を有するバイオリアクター内での細胞の生存を維持する。結果は、さらに、バイオリアクター装置の迅速な立ち上がりが、血清含有培地から無血清培地への工程変化と同様に可能であり、そして多くの場合、無タンパク質培地への工程変化でさえ迅速な立ち上がりを可能にすることを示す。「工程変化」は、徐々にではなく、即座に変化させることを意味する。
一般的に、細胞−生体適合性マトリックスまたはゲルは、選択された細胞を、より低温（例えば、０℃〜30℃）で、より低いpH値（例えば、２〜5.5）で、より低温およびより低いpH値の両方で、または異なるイオン構造（makeup）の溶液中で、マトリックス前駆体溶液と混合するとき、形成される。選択されたマトリックス前駆体は、好ましくは、最初は、細胞懸濁物を生じるために可溶性の形態である。次いで、細胞−マトリックス前駆体懸濁液を、導入口を通して細胞チャンバー内に導入する。pH、温度またはイオン特性あるいはポリマー鎖相互作用が最初の値から変化する場合、重合または凝集が起こり、不溶性凝集物を形成するポリマー鎖をもたらす（例えばpH値を6.8〜7.4の範囲に上げる、温度を37℃〜45℃の範囲に上げる）。一般的に、不溶性凝集物は、さらに凝集して繊維を形成する。一方、繊維は、実質的に不溶で、細胞−生体適合性マトリックスとして参照されるものを生じる細胞を捕捉する。
選択されたマトリックス前駆体は、実質的に不溶で、生体適合性マトリックスをインサイチュで迅速に形成し、細胞が定着する前に細胞を均一に捕捉する能力を有することが望ましい。選択されたマトリックス前駆体は、好ましくは、細胞−マトリックス前駆体懸濁物中の、物理的または化学的な変化で線維状のマトリックスを形成すべきである。このような変化は、pHまたは温度の値の移動、あるいは両者、重合または架橋のコモノマーまたは任意の他の開始剤の添加、あるいはこれらの方法の任意の組合せの結果であり得る。選択されたマトリックス前駆体に依存して、形成されるマトリックスは、重合、凝集、イオン的複合化、水素結合などの結果であり得る。
便宜上、ポリマーまたは凝集物の用語は、常にマトリックス構築物を示すために使用されることが理解されるはずである。マトリックスは、その特徴をもった化合物に限定されない。インサイチュで生じ、そして細胞を捕捉する任意の生体適合性で、実質的に不溶なマトリックスは、少なくとも最初は、本発明の範囲内であると見なされる。同様に、マトリックス前駆体は、重合または凝集または会合などによりインサイチュでマトリックスを形成しやすいすべての化合物を含むと理解されるべきである。しかし、これらに限定されない。
その中に含まれる生細胞によって生じ得る収縮のために、細胞−生体適合性マトリックスは、ときには数時間または数日で混合物によって占められる元の体積の約４分の１に収縮する。本発明に関して、細胞−生体適合性マトリックスが繊維内で収縮し、栄養の通過のためにその内部の管腔を提供することが必要である。混合物によって占有される元の体積の約90％に収縮する細胞−マトリックスが望ましい。元の占有体積の約75％に収縮する細胞−マトリックスが、より良好である。元の体積の約50％に収縮する細胞−マトリックスが、より好ましい。しかし、最も望ましい細胞−マトリックスは、混合物によって占有される元の体積の約３分の１に収縮する。
特に適切なマトリックスを形成することが見出されている１つの化合物は、コラーゲンである。無菌で、高純度の天然のアテレオペプチド（ateleopeptide）のＩ型コラーゲンは、Collagen Corporation（Palo Alto、California）からVitrogenTM100の登録商標名で市販されている。テレオペプチド（teleopeptide）のＩ型コラーゲンはまた、有用であることが証明され、そして比較的純粋な形態でGottefosse Corporation（Elmsford、New York）からPancogene STMの登録商標名で入手し得る。コラーゲンの用語が本出願で用いられる場合は常に、最適な細胞培養条件下で、少なくとも部分的に不溶である任意のタイプのコラーゲンまたは改変コラーゲンを含むことが理解されるはずである。例えば、コラーゲンは、Kasaiらの米国特許第4,559,304号の技術に従い改変され得る。その開示は、本明細書中で参考として援用される。
コラーゲン−細胞溶液を繊維内に導入し、周囲の温度を約25℃より高く、好ましくは約35〜45℃、そして理想的には約37〜43℃に高めることによりインサイチュで配置する。
コラーゲン−キトサン混合物もまた、使用され得る。適切なキトサン（これは、キチンの誘導体であり、キチン内の多くのN−アセチル結合は加水分解されてフリーのアミンにされている）は、Protan Labs（Redmond、Washington）から、乾燥状態で、Ultrapure Chitosanのラベルのもとで入手し得る。コラーゲンの場合と同様に、キトサンもまた、化学的に改変され得、そして依然としてマトリックス形成の有効な手段であることが認識されるはずである。さらに、フィブリンを形成するフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物のインサイチュ重合も、首尾よく用いられている。
本システムの必要条件を満たす他の材料は、以下のものを含む：（１）ポリアミン（ポリマーを作成するサブユニットは、一般的に７〜10の範囲のpKa値を有する）、例えば、コラーゲンおよびキトサン。このようなポリアミンは、一般的に２〜5.5（プロトン化された形態である場合）の範囲内のpH値での細胞培養培地中で可溶であり、そして一般的に6.8〜7.4（部分的に非プロトン化された形態である場合）の範囲内のpH値での細胞培養培地中で部分的に不溶である；（２）水溶性ポリアニオン性ポリマーおよびポリカチオン性ポリマーの混合物。この混合物は、イオン結合を介して会合し、そして溶液から沈澱する；および（３）ポリマー、例えば、セルロースエーテル（これは、０℃〜30℃の範囲の温度で細胞培養培地中で可溶であるが、一般的に32℃〜45℃の範囲の温度のようなより高温での細胞培養培地中で不溶である）がまた意図される。
操作において、選択された細胞栄養培地は、ペリスタティックポンプによって、培地貯蔵部から、第１の液体導入口および第１の培地経路（media channel）を通って、栄養培地プレート孔（window）にポンプ送液される。適切なポンプは、Cole Palmer（Chicago,Illinois）から得られる、サイズ16のMasterflexシリコーンチューブを備えた速度可変のMasterflex（Cat.No.7533-30）である。培地は、栄養培地プレート孔から、第1の液体取り出し口を通って、第２の培地経路および続いてバイオリアクターに流れ出る。
肝細胞は、任意の種々の当該分野で認められた手段で入手し得る。器官および細胞の穏やかな処置が、生存性を高めるために推奨される。例えば、消化性酵素（例えば、コラゲナーゼ）を含む溶液での潅流は、適切な方法である。動物を麻酔し、そして肝臓の血管を単離する。肝臓を、緩衝液で、好ましくは２価カチオンキレート剤を含む無カルシウム緩衝液で潅流して、器官内の血液の置換を高め、そして細胞間マトリックスを解離する。
肝臓を取り出し、そして次いでコラゲナーゼを含む緩衝液で潅流する。被膜を切り、そして器官を処理して細胞を遊離させる。細胞を洗浄し、そして標準的な方法（例えば、トリパンブルー排除）により生存率を評価する。
オルガノイドを、所定のホルモンを含む無血清培地中の肝細胞の単細胞懸濁物を入手することによって得る。培地は、インスリン、デキサメタゾン、グルカゴン、上皮成長因子、肝臓成長因子、トランスフェリン、リノール酸、銅、セレン、および亜鉛を含む。細胞を、シリコン化したスピナーフラスコ内に播種し、そして約40〜120rpmで、好ましくは約70〜90rpmで、そしてより好ましくは80rpmで、加湿した５％CO2環境において攪拌する。培地を、24時間後、そしてその後２〜３日毎に交換し得る。
一般的に、オルガノイド形成の動力学は、細胞の種起源によらず一様である。しかし、オルガノイドを形成する時間は種毎に変化し得ることには留意されたい。通常、細胞は、最初に、２つ、３つ、４つなどの塊でかたまる。次いで、時間ととももに、塊は大きな塊に合体するか、または個々の細胞が大きな塊に接着するかのいずれかでより大きくなる。従って、初期の時間では、オルガノイドは、直径が約20〜30μm程度であり得、その後、オルガノイドは、大きさが約35〜40μmの直径に、その後の測定で100〜140μmなどに増加し得る。直径が約150〜300μmのオルガノイドが、日常的に測定される。
中空繊維内に取り込まれるオルガノイドの好ましい大きさに関して、最大の生存率がより小さい大きさのオルガノイドで確実にされ得ることに留意されたい。しかし、最大数の細胞をバイオリクター内に含むことが望まれる。さらに、細胞は肝臓特異的機能を保持し、そしてオルガノイドの大きさはそれらの所望の活性の保持に役割を果たし得ることが望まれる。
中空繊維内に取り込まれ得るオルガノイド、または肝細胞塊は、直径が約30〜300μmの大きさの範囲であり得る。特定の場合、細胞塊の理想的な大きさは、直径が約35〜150μmの程度から、直径が約40〜70μmのより狭い範囲であることを要求し得る。
好ましくは、肝細胞は、水性の多孔性ゲル（例えば、アルギン酸塩、コラーゲン、寒天、キトサン、フィブリンなど）内に捕捉される。オルガノイドの混合物および単細胞は一緒に混合され、中空繊維内の形成されたゲルの必要な収縮が得られ、栄養培地の通過を可能にする繊維の「二次的な管腔」または「閉塞管腔」を形成する。
オルガノイドの単細胞に対する比を最適化して、最大数の捕捉細胞による適当なゲル収縮を確実にする。オルガノイド中の細胞の単細胞に対する比は、１：３〜３：１が使用され得る。好ましくは、１：２〜２：１の比が好ましい。１：１の比もまた、有利に使用され得る。
マトリックス−細胞の溶液を、上記の部分を介して繊維内に潅流する。繊維の管腔内に含まれるオルガノイドの大きさおよび細胞の総数は、ゲル化前のマトリックス溶液中の細胞数を操作することによって調節される。オルガノイド中の細胞数を評価し、そしてその数を単細胞の数に加えて細胞総数を得る。
上記に示したように、目的は、血液、血清または血漿の効率的な解毒を確実にするバイオリアクター内での最大数の細胞を得ることである。細胞総数の適切な濃度は、約５〜40×106細胞／mlの程度である。より適切な濃度は、約20〜40百万細胞／mlであり、そして理想的な濃度は、約30〜35百万細胞／mlである。その理想的な細胞数から、次に、オルガノイド中に見出される細胞数が、上記の単細胞に対するオルガノイド中の細胞の所望の比に基づいて計算されることは明らかなはずである。従って、30×106細胞／mlの細胞濃度およびオルガノイドの単細胞に対する１：１の比を用いる場合、15×106細胞がオルガノイド中に存在し、そして残りの半分の細胞は単細胞である。
細胞塊を用いることにより、本発明のオルガノイドは、上記の方法により加速した速度で生成され、肝臓特異的機能を最大にし、そして保持することが可能である。そうすることによって、増強されたバイオリアクターが得られる。なぜなら、そのデバイスは、大きさを小さくし得る。すなわち、ハウジングは、大きさを小さくし得るからである。その結果、デバイス中に大量の身体外の血液を保有する必要を最少化する。
本発明は、以下の非限定的な実施例で例示される。
実施例Ｉ．攪拌槽内で形成されたブタオルガノイドは増強した肝臓活性を示す
ブタ肝細胞の回収
肝細胞を、８〜10Kgの雄ブタから、Seglen（Seglen,P.O.「単離されたラット肝臓細胞の調製」Meth Cell Biol（1976）13:29-38）によるラット肝細胞について開発された原法を改変した２段階のインサイチュでのコラゲナーゼ灌流技術により回収した。ブタは、最初、ケタミン（100mg/ml）：ロンプン（100mg/ml）が5ml:1mlであるIMで麻酔し、挿管および機械的な換気を可能にした。次いで、ブタを、イソフルオラン（1.5％）で気管内チューブによって麻酔し、そしてスクシニルコリン（20mg IV）で麻痺させた。腹部に、両面肋骨弓下山形切開（bilateral subcostal chevron incision）を施した。
肝臓に至る、および肝臓からの静脈血管供給を完全に単離し、そして紐で締めた。肝動脈、総胆管、小網静脈および横隔静脈を結んだ。門脈にポンプチューブを挿管し、そして灌流を、酸素化灌流溶液I（Per I）を用いて300ml/分で開始した。Per Iは、143mM塩化ナトリウム、6.7mM塩化カリウム、10mMヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）（Gibco,Grand Island,NY）、および1g/lエチレングリコール-ビス-アミノエチルエーテル（EGTA）を含む無カルシウム溶液（pH7.40）である。肝上大静脈（suprahepatic vena cava）および肝臓下大静脈（infrahepatic vena cava）を結び、そして適度な灌流背圧に対して肝臓下大静脈中に抜け口を作製した。
肝臓を取り出し、大きな無菌の洗面器内に置き、そして酸素化灌流溶液II（Per II）を用いて300ml/分で灌流した。Per IIは、100mM HEPES、67mM塩化ナトリウム、6.7mM塩化カリウム、4.8mM塩化カルシウム、１％（v/v）ウシアルブミン、および１g/lコラゲナーゼ-Ｄ（Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN）からなる（pH7.6）。20〜30分後、肝臓溶解の目視および触診の観察に基づき、被膜を破り、そして肝臓実質を調べ、15mM HEPES、0.2U/mlインスリン（Lilly）、２mM L-グルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充した冷ウイリアムズＥ培地（Gibco）を注いだ。遊離した細胞を、100μmの開孔（opening）を有するナイロン網を通して濾過し、そして新鮮なウイリアムズＥ培地中に再懸濁した。生存率を、トリパンブルー排除により評価した。
攪拌槽におけるブタ肝細胞オルガノイドの形成
単離したブタ肝細胞を、所定のホルモンの培養培地（LTE培地と呼ぶ）中に、0.5〜1×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。培地は、Enatら（Enatら、「肝細胞のインビトロ増殖：無血清の所定ホルモン培地および細胞外マトリックスの基質の利用に関するその依存性」Proc Natl Acad Sci USA（1984）81:1411-1415）の無血清培地の改変であった。その培地は、以下のものを補充したウイリアムズＥ基本培地（pH7.4）を含む：100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.2ユニット/mlインスリン（Lilly Co.,Indianapolis,IN）、１nmol/mlデキサメタゾン、４ng/mlグルカゴン、25μg/ml EGF、20ng/ml肝臓成長因子、6.25μg/mlトランスフェリン、50ng/mlリノール酸、500μg/mlアルブミン、0.1μM CuSO4・5H2O、３nM H2SeO3、50pM ZnSO4・7H2O、および15mM HEPES（Gibco）。すべての培地補充物は、特に示されていない限り、Sigmaから購入した。細胞懸濁を、250mlのシリコン化したスピナーフラスコ内に置き、そして加湿した５％CO2インキュベーター内で37℃で、懸濁した磁気攪拌棒により80rpmで攪拌した。培地を、細胞播種の24時間後、およびその後２〜３日毎に、振盪を止め、オルガノイドを沈降堆積させ、続いて疲労培地を吸引し、そして新鮮な培地と入れ替えることによって交換した。
攪拌条件下で培養された肝細胞は、24時間内にオルガノイドを形成する。形成期間中、細胞は最初に集まって、不規則な形状および「でこぼこな」境界の多細胞凝集体を形成した；個々の細胞は、依然として識別可能であった。細胞凝集体のその後の再配置および圧縮により、比較的滑らかで、起伏のある外表面の構造が生じた。そしてこの時の個々の細胞は、互いに区別し得なかった。
24時間までに、ほとんどすべての凝集細胞が、オルガノイドの形態となった。オルガノイドの直径は、副尺を備えた10倍の対物レンズを用いる倒立型顕微鏡下で評価された。特に、直径が30μmを超えるもののみを計数した。オルガノイドの２つの直交する軸に沿った長さの平均をオルガノイドの直径として定義した。80〜100の間を評価して、代表的な平均直径を得た。オルガノイドは、大きさが、第1日目の直径が40〜70μmから、５日の培養後、100〜140μmに成長した。
比較のために、単層の培養もまた行った。LTE培地中の新しく単離した肝細胞懸濁液（５×１０5細胞/ml）を用いて、12ウエル組織培養ポリスチレンプレート（Falcon Multiwell,Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）に２ml/ウエルで播種した。培養培地は、新鮮な培地で毎日交換した。一方、疲労培地を回収し、そしてアッセイするまで-20℃で凍結保存した。測定期間中、オルガノイドは、１つも形成されなかった。しかし、長期の培養でオルガノイドが形成される。
攪拌条件下で形成されたオルガノイドの超構造は表面上に形成されたオルガノイドに類似する
培養５日目のオルガノイドの走査型電子顕微鏡は、いくらかの亜鈴型（恐らく、２つのオルガノイドの合体により生じたもの）を除いて、多くが、比較的球状であることを示した。より高倍率で、オルガノイドの表面上に広範囲の細胞-細胞接触、多数の微小絨毛および小さな（２〜４μm）孔が認められ得る。このような孔は、頻繁に、３つの細胞の接触点で見出された。オルガノイド表面のこれらの孔は、隣接する細胞間との接合領域に位置し、そして分化した毛細胆管（bile canaliculus）様構造の表面の開口部（opening）に存在すると考えられる。
オルガノイド内の肝細胞の透過型電子顕微鏡は、広範囲の細胞-細胞接触および円形または卵形の形状の核を示した。多数のミトコンドリアおよび種々の大きさの脂質滴が、いくつかの細胞の細胞質内で観測された。オルガノイド内で主だった形態学的特徴は、接合複合体（例えば、デスモソーム）および肝細胞間での肝細管様構造である。直径が約0.1μmの連続した管状構造は、オルガノイドを通して分布し、そしてオルガノイド表面上で小孔として開いているのが認められ得る。
多数の微細絨毛が構造内に突き出ていた。攪拌条件下で形成されたオルガノイドは、ペトリディッシュで形成されたオルガノイドと構造的に同一のようである。
攪拌条件下で形成されたオルガノイドの肝臓特異的機能
尿素生成
単層としておよびオルガノイドとして培養された肝細胞による尿素生成を公知の技術を用いて比較した。培地の単位容量当たり接種された肝細胞の数は、両方の場合で同じであった。各時点についての尿素濃度の測定後、毎日の尿素生成を算出した。最初の肝細胞濃度で割った尿素生成速度を、特異的尿素生成速度とした。
両方の培養物における特異的生成能は、最初の３日間増加し、次いで徐々に減少した。遊離のオルガノイドとして培養された肝細胞は、組織培養プレート上で単層として増殖した細胞よりも尿素生成において、２倍、より活性であった。
アルブミン生成
スピナーフラスコ中のオルガノイドおよび単層として培養された細胞によるアルブミン合成を、公知の技術（例えば、ELISA、またはRIA）を用いて測定し、そして７日間にわたる蓄積値として表した。特異的アルブミン合成速度を、データの直線的回帰適合（linear regression fit）により決定した。
オルガノイドおよび単層培養物についてのアルブミン生成速度は、それぞれ50μg/106細胞/日、および14μg/106細胞/日と測定された。オルガノイドは、アルブミン生成において単層よりも少なくとも３倍活性であった。
リドカイン代謝
コラーゲン中に捕捉された肝細胞オルガノイドのチトクロムP-450機能を、公知の技術を用いてリドカイン代謝をモニターすることによって評価した。外部から加えたリドカイン単独の消失は、この薬物が肝細胞によってさらなる生体変化なしに、吸収され得るので、P-450活性の十分な指標ではなかった。従って、リドカイン代謝物（例えば、モノエチルグリシンエキシリジド（MEGX））の生成を、リドカインクリアランスに加えて、従来の技術を用いて測定し、P-450の定量化を確認した。
リドカインクリアランスは、21日間にわたり、約28μg/106細胞/日で、比較的一定のままであった。MEGX特異的生成もまた、約1.2μg/106細胞/日の速度で比較的一定に保たれ、このことは、チトクロムP-450酵素系の連続的な機能を示す。
4-メチルウンベリフェロン（4-MU）抱合
コラーゲンゲル中に捕捉された肝細胞オルガノイドの抱合能を、公知の技術を用いて4-MU代謝を評価することにより試べた。4-MU濃度は24時間以内に、65μMから0.1μM未満に低下した。グルクロン酸抱合代謝物（4-MUG）が、培養培地中に出現した。高いグルクロン酸抱合活性が、21日間ずっと培養において維持された。硫酸化4-MU代謝物（4-MUS）は、１μMの感度では検出されなかった。この活性は、コラーゲンゲルに捕捉されている長時間の間、ブタ肝細胞オルガノイドの、第II期代謝を行う能力を表す。
実施例II．攪拌容器中で形成されたラットオルガノイドは増強された肝活性を示す
ラット肝細胞の回収
肝細胞を、４〜６週齢の雄Sprague-Dawleyラットから、改変２段階インサイチュコラゲナーゼ灌流技術（Seglen,P.O.（1976）前出;Nybergら、「円柱状のコラーゲンゲル中に捕捉したラット肝細胞の初代培養：生体人工肝への適用を伴うインビトロシステム」Cytotechnology（1992）10:205-215）により回収した。回収後の肝細胞生存性は、トリパンブルー排斥法に基づくと85〜90％に変動した。
攪拌容器中でのラット肝細胞オルガノイドの形成
新しく回収した分散させたラット肝細胞を、最終密度が100ml LTE培地中で0.3〜1.0×106細胞/ml（スピナー容器でのブタ肝細胞オルガノイド形成のために使用したものと同一）になるように250mlのシリコーン化したスピナー容器に接種した。培地は、ペトリ皿におけるラット肝細胞オルガノイド形成のために使用した培地と異なる。容器を、加湿５％CO2インキュベーター中で37℃で、懸濁磁石攪拌棒を用いて、100rpmで、攪拌した。培地を、攪拌を停止しオルガノイドを重力で沈殿させ、その後、使用した培地を吸引し、新鮮培地と置換することにより、３〜４日ごとに交換した。
攪拌条件下で培養されたラット肝細胞は、接種後72時間以内にオルガノイドを形成した。最初の８時間の間に、細胞は、ほとんど２連および３連を形成するのが観察された。24時間後、細胞は、30以上の細胞の塊に凝集した。その後の細胞の再変性および密集により、球状の細胞構造、または比較的均一な直径100〜140μmおよびなめらかな外表面を示すオルガノイドの集団を生じた。
オルガノイド形成の効率を評価するために、形成期間中の細胞懸濁液の生存能力を決定した。トリパンブルー排斥法下で青色を示した単細胞および集団化した塊中の細胞を、非生存およびオルガノイド形成に参加し得ないと判断した。生存細胞のみがオルガノイドを形成できると想定された。
各サンプリングポイントで、2.5ml細胞懸濁液を15mlの遠心管に移し、重力沈殿法により２つの画分に分けた。細胞凝集塊画分は、主に、最初の２分間に15ml遠心管の底に沈積するオルガノイドおよび細胞凝集塊からなる。この画分をリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁し、超音波処理し、そして全タンパク質のアッセイまで-20℃で保存した。上清画分は、培養培地、およびサンプリング後最初の２分間で沈積しなかった非生存および非凝集細胞のほとんどを含んでいた。全画分を、肝特異的機能分析が実施されるまで、-20℃で保存した。
72時間までには、スピナー容器中のほとんど全ての単細胞が非生存であり、そして全てのオルガノイドが生存のようであった（臭化エチジウムおよびフルオレセインジアセテートによる蛍光染色に基づく）。臭化エチジウムは、非生存細胞の核をオレンジ〜赤に染め、そしてフルオレセインジアセテートは、生存細胞の細胞質を緑に染める。非生存細胞の蓄積を決定すること、およびそれに次ぐ容器周辺の全細胞バランスを実施することは、接種された細胞の約50〜80％が、オルガノイドを形成したことが示す。一貫して、オルガノイド中および凝集細胞画分の全タンパク質の画分はまた、最初の全タンパク質含量の約50〜80％であった。
攪拌条件下で形成されたオルガノイドの超微細構造は表面上に形成されたものに類似する
走査型電子顕微鏡は、オルガノイドが、直径約50〜200μmで変化するが、大部分は、直径約120μmのほぼ均一な大きさであり、そして球状の形態であることが示す。オルガノイド中の個々の細胞は、区別不可能であった。高倍率で、明らかに胆小管様構造と一致する広範囲の細胞-細胞接蝕、多数の微小絨毛、および小孔がオルガノイド表面に観察され得る。透過顕微鏡法は、細胞間のギャップ結合、および微小絨毛で並んだ胆小管様チャンネルの広範なネットワークを明確に示す。オルガノイドの細胞構築および超微細構造は、インビボの肝小葉のそれを模擬しているようである。電子顕微鏡法は、スピナーフラスコ中で形成されたオルガノイドが、平らな表面上に形成されたオルガノイドと構造的に類似していることが示される。
攪拌条件下で形成されたオルガノイドの肝特異的機能
尿素生成
尿素濃度の測定後、スピナー培養物中のラットオルガノイドによる毎日の尿素生成を算出した。最初の肝細胞濃度で割った尿素生成速度を、特異的尿素生成速度とした。
最初の72時間で減少した特異的産生能は、おそらくオルガノイド形成の間に生存性が50％低下したためであろう。オルガノイドの形成後、特異的速度は、約24μg/106/細胞/日に安定した。全タンパク質の生成速度の標準化により、特異的生産能は、約120μg/mgタンパク質/日であった。
アルブミン合成
スピナーフラスコ中のアルブミン濃度を測定し、そして蓄積値を、７日間について測定した。特異的アルブミン合成速度をデータの線回帰適合により決定した。
オルガノイドについてのアルブミン合成速度は、28μg/106細胞/日であった。ペトリ皿上で形成されたオルガノイドの特異的合成速度は、スピナー培養物中で形成されたオルガノイドの速度と類似していた。
実施例III．攪拌培養物由来のコラーゲン捕捉ブタオルガノイド
コラーゲンゲル圧縮
ゲル圧縮の観察は、BAL系におけるオルガノイドの適用に重要である。なぜなら、ゲル収縮が、中空繊維バイオリアクターに捕捉された肝細胞への培養培地の管腔内灌流に必要であるためである。ゲル収縮率を研究するために、オルガノイドおよび分散肝細胞の両方を、直径22mmおよび厚さ約1.3mmのディスク型コラーゲンゲルに捕捉した。
オルガノイドを、スピナー培養６日から得たのに対し、分散細胞は、分離した肝細胞回収の直後に使用した。ゲル捕捉は、細胞を、Vitrogen 100および４倍濃縮Williams'E培地（pH7.4に調製した）の3:1（v/v）混合物からなるコラーゲン混合物中に懸濁し、次いで、懸濁液を12ウェルプレートに0.5ml/ウェルで培養することにより、実施した。
研究した６つの条件は：（１）コラーゲン混合物1ml当たりオルガノイドとして１×106細胞、（２）コラーゲン混合物1ml当たり１×106の分散細胞、（３）コラーゲン混合物1ml当たりオルガノイドとして0.5×106細胞および0.5×106分散細胞、（４）コラーゲン混合物1ml当たりオルガノイドとして５×106細胞、（５）コラーゲン混合物1ml当たり５×106分散細胞、（６）コラーゲン混合物1ml当たりオルガノイドとして2.5×106細胞および2.5×106分散細胞であった。コントロールとして、肝細胞をコラーゲン捕捉前に、50％エタノールに15分間曝露することにより死滅させた。オルガノイドとしての細胞数を、６日のスピナー培養物1mlあたりの総タンパク質に基づき見積もった。
37℃で20分間のインキュベーションの後に、ゲルが形成された。次いで、1mlのLTE培地を各ウェルに添加し、そしてゲルをプレート下部から移動させ、培地がゲル底に到達するようにした。ゲルの直径を、各ゲルの２本の直行する軸に沿って、定規で測定した。図１の各データポイントは、３連の測定の平均値を表す。その結果は、生存肝細胞が、コラーゲンゲル収縮に必要とされることが示す。
オルガノイドおよび分散した細胞は共に、コラーゲンゲルに収縮し得た。しかし、分散した肝細胞によるゲル収縮率は、オルガノイドとして捕捉された肝細胞による収縮率よりも高い。単細胞とオルガノイドの両方の組み合わせによる収縮率は、これらを別々に捕捉した際の率の間に落ちついた。収縮は、収縮度がディスク中でより濃縮した細胞濃度を用いてより高くなるに従い、細胞濃度により影響されるようである（ScholtzおよびHu Cytochemistry（1990）4:127-137;Nybergら、Biotechnol Bioeng（1993）41:194-203）。収縮はまた、ゲル中の細胞の分布により影響されることが予想され、そして収縮率における差異に帰し得る。
コラーゲンゲル捕捉オルガノイドの肝特異的機能
尿素生成
分散した細胞およびオルガノイドを共に、同一の細胞濃度で、コラーゲンゲルディスクに別々に捕捉し、培地中に浸し、そして12ウェルプレート中で培養した。
２つの培養系の比較は、尿素生成が、コラーゲン捕獲後にオルガノイド培養物中でより高いことが示す。さらに、コラーゲン捕獲オルガノイドおよび分散した細胞両方による尿素生成は、フリーの懸濁液中、または単層における尿素生成よりもより安定であった。最初の３日間における活性の最初の増加の後、尿素生成速度は、初日と同等のレベルに減少し、そして21日目まで、比較的不変のままであった。従って、オルガノイドおよび非凝集細胞のコラーゲンゲルへの捕捉は、その活性を延長させた（図２）。
アルブミン生成
コラーゲン捕捉オルガノイドおよび分散した肝細胞によるアルブミン生成を21日間測定した。特異的活性を算出し、そして図３に示す。
活性が増加する最初の期間の後、サンプルは、約50μg/106細胞/日および18μg/106細胞/日で、それぞれ安定化した。このレベルは、少なくとも21日間維持された。コラーゲン捕捉オルガノイドのアルブミン合成活性は、遊離の懸濁液中の活性および単層中の活性と顕著には異ならなかった。この生成レベルは、ヒト肝臓について報告されているインビボのアルブミン生成と同程度であった（Peters,P．「タンパク質および血漿タンパク質代謝」In Molecular and Cell Biology of the Liver 9 31頁-64頁LeBouton,AV.（1993）CRC Press編,USA）。
実施例IV．コラーゲン捕捉ラット肝細胞オルガノイド
コラーゲンゲル収縮
48時間のスピナー培養物由来のラット肝細胞オルガノイドおよび新しく回収したラット肝細胞を、種々の比率で混合し、直径22mm、厚さ約1.3mmのコラーゲンディスク中に捕捉した。ゲル捕捉は、細胞を、Vitrogen 100および４倍濃縮されたWilliam's E media（pH7.4に調整した）の3:1（v/v）混合物中に懸濁し、次いで、細胞-コラーゲン混合物を、12ウェルプレートに0.5ml/ウェルで播種することにより実施した。研究された４つの条件は：（１）分散細胞を含まない106細胞/mlのオルガノイド、（２）共に、106細胞/mlのオルガノイドおよび分散細胞、（３）106細胞/mlのオルガノイド、および0.5×106細胞/mlの分散細胞、（４）106細胞/mlの分散細胞。37℃で20分間培養後、ゲルが形成された。次いで、１mlのLTE培地を各ウェルに添加し、そしてゲルをプレート下部から移動させ、培地がゲル下部に届くようにした。ゲルの直径を、各ゲルについての２つの直行する軸に沿って、定規で測定した。図４の各データポイントは、３連の測定の平均値を示す。
分散細胞の添加がなければ、オルガノイドを含むゲルは、わずかな程度までしか収縮しなかった。ゲル中の分散細胞の存在は、収縮を容易にした。最終的な直径は、最初よりも約30％小さかった。
ペトリ皿において形成されたコラーゲンゲル捕捉オルガノイドの肝特異的機能
アルブミン合成
Falcon Primaria培養皿（60×15mm）に、新しく回収したラット肝細胞を、1.2×106細胞/プレートで播種し、そして、37℃で、５％CO2加湿インキュベーター中で培養した。Primariaペトリ皿上でのオルガノイドの調製に使用した培地は、以下の成分を補充したWillam's E培地（Gibco Laboratories,Grand Island,NY）からなる。0.2U/mlのウシインシュリン（Lilly Research Laboratories,Indianapolis,IN）、2mM L-グルタミン、15mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸（HEPES）、100U/mlペニシリンおよび100mg/Ｌストレプトマイシン（Gibco Laboratories）、さらに50ng/ml上皮成長因子（EGF）、50ng/mlリノール酸、0.1μM CuSO4・5H2O、3nM H2SeO3および50pM ZnSO4・7H2O（Sigma Chemical Company,St.Louis,MO）。オルガノイド形成は、４日目までには観察された。
非凝集細胞、塊になった細胞、およびオルガノイドの組み合わせを含む、各ペトリ皿の細胞の内容物を、穏やかにピペッティングすることにより除去した。各プレートの内容物を、10mlのピペット中に吸引し、そして１分間、重力により沈積させた。主にオルガノイドおよび凝集した細胞からなる各サンプルの底部４分の１を、オルガノイド画分とみなした。主に凝集しない細胞からなる上部４分の３を、分散した細胞画分とした。
総タンパク質含量に基づくオルガノイド画分および分散細胞画分中の同数の肝細胞を、円柱状のコラーゲンゲル中に捕捉し、そして新鮮オルガノイド培地中で培養した。凝集および非凝集細胞の両方のからなる、非分離細胞懸濁液がまた、播種後4.5日に円柱状のゲル中にコラーゲン捕捉された。
３つの異なる条件からの培地を、播種後７日、または捕捉後2.5日に回収し、そしてアルブミン濃度を分析した。結果を図５に示す。データを、各培養物中に最初に存在した全細胞タンパク質に対して標準化した。コラーゲン捕捉分散細胞培養物と比較して、コラーゲン捕捉オルガノイド培養物では約２倍高いアルブミン合成の活性が観察された。２つの細胞画分からの寄与度は、非分離細胞混合物により産生されたアルブミンのレベルと等しかった。
３つのコラーゲン捕捉培養物をまた、オルガノイドを形成した細胞、および同じ実験期間についてPrimaria皿上で維持された細胞と比較した。コラーゲン捕捉培養物に従って、皿を、改変後4.5日に新鮮オルガノイド培地でrefedし、そしてアルブミン合成を７日間の培養期間中測定した。結果により、コラーゲンゲルに捕捉した場合でさえ、分離しなかった細胞捕捉培養物は、高レベルのアルブミン合成を維持し得た。ペトリ皿で維持されたオルガノイドと凝集しなかった細胞との混合物は、同等のアルブミン合成レベルを示した。
リドカイン代謝
リドカインクリアランス速度を、P-450活性の指標として測定した。4.5日のペトリ皿培養物由来のオルガノイドおよび分散した細胞の画分を円柱状のコラーゲンゲルに、総タンパク質量とほぼ等量捕捉した。ラット回収直後の円柱状のコラーゲンゲル中に捕捉された単一の細胞を、コントロールとして実験に含んだ。円柱状のゲルを、12μg/mlのリドカインを含む２mlの予め温めたオルガノイド培地が入っているウェルに配置した。その後５日間、使用した培地を回収し、毎日新鮮な培地と交換した。回収したサンプルをリドカインクリアランスについて分析した。
総タンパク質含量と関連して、0.2mg/mlの平均の細胞のタンパク質含量を得、そして特異的リドカインクリアランスを決定するために使用した。円柱状コラーゲンゲルへの捕捉の際、オルガノイドおよび分散した細胞は、それぞれ平均クリアランス速度6.2±0.5pg/細胞/時、および3.2±0.4pg/細胞/時を示した（図６）。オルガノイドを捕捉した円柱状のコラーゲンゲルにおいて得られた速度は、分散した細胞を捕捉した培養物よりも約２倍高く、そしてコントロール培養物による速度1.7±0.2pg/細胞/時よりも３倍高かった。コントロール培養物の速度は、先に報告された、コラーゲンに捕捉された単一細胞の肝細胞の静止培養物についての特異的クリアランス速度2.1±0.2pg/細胞/時とよく一致する。
捕捉されたオルガノイドの超微細構造
オルガノイドをPrimariaディッシュ上で4.5日間培養し、そしてコラーゲンに捕捉した。コラーゲン捕捉オルガノイドをオルガノイド培地で２日間培養し、次いで、顕微鏡観察のために固定し、染色した。走査型電子顕微鏡により、オルガノイド中の個々の細胞は、識別できなかった。オルガノイドの全ての構造は、コラーゲンへの捕捉２日後、損なわれていない状態を保っていた。逆相顕微鏡で観察した場合、コラーゲンゲルは圧縮しているようであり、これはおそらく、凝集しなかった肝細胞（捕捉前に完全にオルガノイドから分離できなかった）が、コラーゲン線維を圧縮し得たからである。
ペトリ皿におけるオルガノイドと同様に、コラーゲンに捕捉されたオルガノイドは、広範囲の細胞−細胞接触、多数の微小絨毛、および捕捉したオルガノイドの表面における小さな２〜４μmの開口を示すようである。穴または細孔構造は、細胞連絡部周辺に位置し、オルガノイドにおける肝細胞の、分化しそして極性化した細胞の形態を示し得る。
コラーゲン捕捉オルガノイドの透過型電子顕微鏡写真は、ペトリ皿におけるオルガノイドについて観察されたものと同様の微小構造を示す。最外層の肝細胞は平らであり、形態においてより上皮様であり、そして大きな核と共に少ない細胞質容量を有する。オルガノイドの内部を構成する細胞は、立方体様であり、そして大きな細胞質容量と共に小さいサイズの核を有する。細胞膜および核周辺は無傷なままであった；基質体を伴うミトコンドリア、ペルオキシソーム、脂質小滴、グリコーゲン顆粒、無傷なゴルジ装置、および装飾された粗面小胞体は全て観察できた。肝細胞間の小胆管様構造の広範なネットワークは維持されていた。コラーゲン捕捉オルガノイド内での肝細胞の構成は、懸濁されたオルガノイドの構成と類似していた。ペトリ皿中のオルガノイドと、コラーゲンに捕捉されたオルガノイドとの印象的な違いは、後者の最外層の肝細胞が、微小絨毛様の突起物によって広範に覆われていることである。ペトリ皿上で維持されているオルガノイドにおいて、細胞の外層上の表面微小絨毛は、数がより少なく、そして、通常は、隣接する肝細胞間の連結部内および周辺領域に位置していた。
実施例Ｖ．生体人工肝臓（BAL）
中空繊維バイオリアクターは、繊維中でマトリックス捕捉肝細胞および肝細胞オルガノイドを維持し、マトリックス圧縮により形成される空間に沿って管腔を通じて維持栄養培地を灌流し、そしてキャピラリー外空間中の繊維の周囲に血液を通過させることにより、生体人工肝臓として使用され得る。
従って、無毒化されるべき血液、血清または血漿の流れは、外皮側を通って流れる。肝細胞のような細胞は、キャピラリー外の外皮空間中に存在するよりもむしろ、ゲルマトリックス中に捕捉されて中空繊維腔内に存在する。その構造は、最初に、肝細胞を、コラーゲンの溶液またはコラーゲンと細胞外マトリックス成分との混合物の溶液中に懸濁することにより達成される。次いで、pHを7.4に調整し、そして細胞懸濁物を中空繊維の管腔中に播種する。温度を４℃から37℃に変えることにより、コラーゲン繊維の形成が誘導される。これは、不溶性の繊維性のかつ高度に多孔性の円柱状ゲル中の細胞の捕捉をもたらす。
播種後、ゲルマトリックス円柱の断面積は75％程圧縮し得る。これは、最初にゲルマトリックスで充たされた後でさえも、中空繊維管腔の灌流を可能にする。分子交換が、中空繊維中の孔を通じて起こる。高分子量成分を有する培地は、中空繊維の入口を通って中空繊維の出口へ、生体マトリックス中に包埋された肝細胞の圧縮したコアを含有する中空繊維を通って流れる。
この技術を、チャイニーズハムスター卵巣細胞、Hep2、HepG2、Vero、293細胞、および正常な二倍体ヒト肝臓細胞を含む複数の細胞株について使用した。７日後の圧縮したゲルマトリックス中のヒト胚芽腫（HepG2）細胞の、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した薄切片の研究は、組織密度および細胞構築がインビボの組織学に非常に似ていることを示した。
このバイオリアクターは、他の構造に対して明確な利点を提供する。細胞は、組織の密度に近い密度で培養され得る。高密度において、細胞はより小さい空間を占有し、従って、バイオリアクターのサイズを減少させる。細胞はまた、最少の酸素および栄養の制限と密接に接触する利益を得る。高密度において、哺乳動物細胞は、組織特異的機能をより良好に維持し得る。
バイオリアクター構造はまた、肝細胞の局所的な環境の操作を可能にする。分化した肝細胞機能を支持するマトリックス成分は、ゲル中に取り込まれ得る。内部の管腔を灌流する能力は、高濃度で高分子量の増殖因子を提供する。
このようなシステムの別の利点は、異なる細胞型がゲルに同時に捕捉され得、組織特異的機能を改善し得る可能な相乗効果を提供し得ることである。
従って、本発明は、肝臓特異的機能の維持に必要な、または有益な多くの要因（培地、ゲルマトリックス、同時培養、高細胞密度）を取り込み得る。これは、肝不全の患者を支持するための生体人工肝臓として使用され得る。
実施例VI．コラーゲン捕捉ブタオルガノイドBAL
100キロダルトン（kD）の名目上の分子量カットオフ（MWCO）、1.1mmの内径、および10mlの全管腔容量を有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（H1P3-100,Amicon,Danvers,MA）をBALとして使用した。中空繊維カートリッジを、121℃で30分間、蒸留水に浸してオートクレーブした。培養器の他の部分（酸素添加器（oxygenator）、培地リザーバー、pHプローブ、および溶存酸素プローブを含む）を別々に滅菌した。全体の組立を無菌的に行った。バイオリアクターを中空繊維細胞培養インキュベーターであるAcusyst Maximizer-1000（Cellex Biosciences Inc.,Coon Rapids,MN）中に組み立てた。これは、pHおよび溶存酸素を維持するために気体の混合によりマイクロプロセッサー制御されていた。
新たに採集された初代ブタ肝細胞を、スピナー培養物にLTE培地中1×106細胞/mlで播種した。24時間後、約95％の細胞がオルガノイドを形成したが、残りの５％は単細胞として懸濁されたままであった。単細胞のほとんどは、エチジウムブロマイド／フルオレセインジアセテート二重蛍光生存性染色により見たところ、なお生存していた。同時に、全部で120mlをスピナー容器から取り出し、50mlの遠心分離チューブに分け、そして遠心分離（34g、２分）して、軟らかいペレットにした。上清を吸引した後、次いで、ペレットを予め混合したコラーゲン溶液に再懸濁した。溶液を４℃で、15mlのVitrogen（Ｉ型コラーゲン）と５mlの４倍濃縮したWilliamのＥ培地とを混合することにより調製した。混合物のpHを、滅菌した１Ｎ水酸化ナトリウムの滴下添加により7.4に調整した。
オルガノイドペレットをコラーゲン溶液中に懸濁した後、細胞−コラーゲン混合物を中空繊維カートリッジの管腔空間に穏やかに注入した。総量約10mlの溶液、または60×106細胞を管腔空間に注入した。カートリッジを培養器に取り付ける前に、最初にカートリッジ全体を10分間37℃のインキュベーター中に置いて、コラーゲン混合物をゲル化させた。4-メチルウンベリフェロン（4-MU）を加えた約400mlの予め温めたLTE培地を、20ml/分で再循環させた。24時間後に、培地のみで9ml/時間で管腔灌流を開始した。管腔内流出物に由来する培地を１回の通過後に廃棄した。３日毎にキャピラリー外の回路に由来する培地を排出し、そして12μg/mlの4-MUを含有する新鮮な培地を補充した。サンプルをキャピラリー外回路の滅菌した隔壁および管腔出口から抜き取り、そしてアルブミン、尿素、4-MU、および代謝産物の測定を行うまで-20℃で保存した。リドカインを4-MUと共に添加したが、外因性リドカインの培養器への吸収のために、細胞によるリドカインのクリアランスの評価は容易には得られ得なかった。
肝臓特異的機能は、分散細胞BALにおけるよりもオルガノイド捕捉BALにおける方が高い
アルブミン合成
アルブミン合成プロフィールを、オルガノイド捕捉BALおよび分散細胞捕捉BALの両方について、キャピラリー外空間および管腔流出物について得た。中空繊維バイオリアクターをめぐって取られる物質平衡を行って、類組織捕捉BALについては0.25mg/日、そして分散細胞BALについては0.15mg/日の累積全速度を得た（図７）。BAL中の推定される肝細胞数（全タンパク質の分析により決定された）でこれらの値を割ることにより、それぞれ0.2pg/細胞/時間および0.1pg/細胞/時間の特異的アルブミン合成速度が得られた。
尿素生成
尿素生成プロフィールを、オルガノイド捕捉BALおよび分散細胞捕捉BALの両方について、キャピラリー外空間および管腔流出物について得た。中空繊維バイオリアクターをめぐって取られる物質平衡を行って、類組織捕捉BALについては2.57mg/日、そして分散細胞BALについては1.16mg/日の累積全速度を得た（図８）。これらの値をBAL中の推定される肝細胞数（全タンパク質の分析により決定された）で割って、1.8pg/細胞/時間および0.8pg/細胞/時間の特異的尿素生成速度がそれぞれ得られた。
4-MU代謝
BALデバイス中のコラーゲン捕捉肝細胞オルガノイドが結合する能力を、4-MU代謝を評価することにより試験した。３日毎に、キャピラリー外回路の培地を排出し、そして35μMの4-MUを含む新鮮なLTE培地を補充した。毎日のサンプリングは、4-MUの濃度が24時間以内に35μMから１μM未満に減少したことを示した。グルクロン酸化（glucuronidated）代謝産物である4-MUGが、培養培地中に出現した。高いグルクロン酸化活性が、10日間にわたって培養物中に維持された。硫酸化4-MU代謝産物（4-MUS）は１μMのアッセイ感度では検出され得なかった。活性は、BALデバイスにおける長期間の第II期代謝を行うブタ肝細胞オルガノイドの能力を示す。
実施例VII．コラーゲン捕捉ラットオルガノイドBAL
100キロダルトン（kD）の名目上の分子量カットオフ（MWCO）、1.1mmの内径、および10mlの全管腔容量を有するポリスルホン中空繊維カートリッジ（H1P3-100,Amicon,Danvers,MA）をBALとして使用した。中空繊維カートリッジを、121℃で30分間蒸留水に浸してオートクレーブした。培養器の他の部分（酸素添加器、培地リザーバー、pHプローブ、および溶存酸素プローブを含む）を別々に滅菌した。全体の組立を無菌的に行った。バイオリアクターを中空繊維細胞培養インキュベーターであるAcusyst Junior（Cellex Biosciences Inc.,Coon Rapids,MN）中に組み立てた。これは、pHおよび溶存酸素を維持するために気体の混合によりマイクロプロセッサー制御されていた。
新たに採集された初代ラット肝細胞を、60×15mmのFalcon Primaria培養ディッシュ（Becton Dickinson Laboratories,Oxnard,CA）に5.3×104細胞/cm2または7.4×104細胞/cm2の密度で播き、５mlのオルガノイド培地中でインキュベートした。４日後、オルガノイドおよび非凝集肝細胞をディッシュから穏やかなピペッティングによって取り出した。オルガノイドと非凝集肝細胞との混合物を穏やかに遠心分離（34ｇ、２分）し、上清を吸引し、そして、ペレットを予め混合したコラーゲン溶液に再懸濁した。溶液を４℃で、15mlのVitrogen（Ｉ型コラーゲン）と５mlの４倍濃縮したWilliamのＥ培地とを混合することにより調製した。混合物のpHを、滅菌した１Ｎ水酸化ナトリウムの滴下添加により7.4に調整した。コラーゲン−細胞混合物を、中空繊維カートリッジの管腔空間に播種した。約500mlの予め温めたオルガノイド培地を、キャピラリー外側で200ml/分で再循環させ、コラーゲンマトリックスのゲル化を誘導した。ゲル化後、または30分以内に、キャピラリー外培地の再循環速度を35ml/分まで下げた。最初の１時間以内に、キャピラリー外培地に、リドカインHCl（Abbott Laboratories,North Chicago,IL）をキャピラリー外培地リザーバーに注射することにより12μg/mlのリドカインを加えた。オルガノイド培地での管腔の灌流を、24時間後に9ml/時間で開始した。管腔内流出物に由来する培地を１回の通過後に廃棄した。48時間後、キャピラリー外回路の培地を排出し、そして12μg/mlのリドカインを含有する新鮮なオルガノイド培地を補充した。サンプルをキャピラリー外回路の滅菌した隔壁および管腔流出物から抜き取り、管腔流出物をアルブミン、リドカインおよびその代謝産物を測定するまで-20℃に保存した。
２つの異なる細胞濃度を、バイオリアクターの播種において使用した。低播種細胞濃度については、肝細胞オルガノイドを、それぞれ5.0mlのオルガノイド培地に懸濁した1.5×106細胞を播いた54枚ののPrimaria培養ディッシュから調製した。高播種細胞濃度については、152枚のPrimariaディッシュにそれぞれ2.1×106細胞を播いた。培養の２日後に培地を入れ替えた。４日目に、オルガノイドおよび非凝集肝細胞を、穏やかなピペッティングの繰り返しによりディッシュから採集し、そして富化培地に懸濁した。オルガノイドと非凝集肝細胞の混合物をペレット化し、そしてバイオリアクターに播種する前にコラーゲン溶液に再懸濁した。各実験からの１枚のディッシュの内容物を、比重によりオルガノイド画分と分散細胞画分とに分離した。各画分の全タンパク質含量に基づいて、それぞれ35％および45％の元来のプレートした細胞が、低播種実験および高播種実験についてオルガノイドを形成した。
肝臓特異的機能は、分散細胞BALにおけるよりもオルガノイド捕捉BALにおける方が高い
酸素取り込み、アルブミン合成、およびリドカイン代謝を使用して、オルガノイド捕捉BAL機能を評価した。培養の最後において、フルオレセインジアセテートおよびエチジウムブロマイドを用いる蛍光染色（Nikolaiら、「蛍光染色によるマイクロキャリア上の哺乳動物細胞の改善された顕微鏡的観察」Cytotechnology（1991）5:141-146）により、オルガノイドにおける肝細胞について良好な生存性が示された。ほとんどのオルガノイドは、単細胞へ崩壊することなく球状の形態を維持することが観察された。
酸素取り込み
キャピラリー外空間でのバイオリアクターの入口と出口との間の溶存酸素分圧の減少が観察された。このことは、捕捉されたオルガノイドおよび細胞による酸素消費を示す。分圧の差に、37℃での培地中の酸素の溶解度（1.29×10-9mol O2/ml/mmHg）をかけ、そしてキャピラリー外培地流速をかけて、低細胞濃度バイオリアクターおよび高細胞濃度バイオリアクターについて、それぞれ24.5μmol O2/時間および40.0μmol O2/時間の平均酸素消費速度を得た。両方のリアクターは、全タンパク質分析により決定された各バイオリアクターに接種される細胞の数で速度を割った後、0.6±0.3pmol O2/細胞/時間の類似した特異的酸素取り込み速度（OUR）を生じた。
アルブミン合成
アルブミン合成プロフィールを、両方の研究について、キャピラリー外空間および管腔流出物について得た。中空繊維バイオリアクターのまわりで得られた物質平衡を行って、低接種バイオリアクターおよび高接種バイオリアクターについて、それぞれ13.0μg/時間および80.6μg/時間の累積全アルブミン合成速度が得られた。BAL中の見積もられた肝細胞数（全タンパク質の分析により決定された）でこれらの値を割ることにより、0.54±0.04pg/細胞/時間の平均の特異的アルブミン合成速度が得られた。
リドカイン代謝
第１日目のロード後の最初の１時間以内に、両方のバイオリアクターのキャピラリー外培地に12μg/mlのリドカインを加えた。３日目に、キャピラリー外培地を流し出し、そして12μg/mlのリドカインを含有する新鮮な凝集培地を補充した。リドカインおよびMEGXの両方を、培養の１日目および３日目に２つのリアクターについて測定した。
バイオリアクターシステム中で、培養物に添加されたリドカインは、培養器（バイオリアクター、チューブ、オキシゲネーター、培地リザーバー）に急速に吸収された。従って、リドカインクリアランスは、代謝の有効な指標ではなかった。代わりに、MEGXの出現をP-450機能の指標として使用した。MEGXの特異的産生速度は、0.11±0.04pg/細胞/時間であった（表１）。
既に、単細胞を捕捉したバイオリアクターの使用により、0.08±0.04pg/細胞/時間の比較用のMEGX特異的産生速度が報告された（Shatfordら、「中空繊維バイオリアクター中の肝細胞機能：潜在的な生体人工肝臓」J.Surg.Res.（1992）53:549-557）。
表１は、単細胞の肝細胞に対する捕捉されたオルガノイドを含むBALの代謝活性を要約する。オルガノイド捕捉BALについての特異的アルブミン合成速度は、単細胞捕捉BALと比較してより高いことが観察された。オルガノイド捕捉BALにおけるP-450活性もまた、より少ない程度ではあるが、より高かった。
結果は、オルガノイドとして培養された肝細胞についての増強された特異的（または細胞当たりの）肝臓機能が、コラーゲン捕捉物上で維持されることを示す。２日間コラーゲンゲルに捕捉された場合、オルガノイドが全体の形態を保持することが観察された。超微細構造評価は、オルガノイドが、オルガノイドの最外表面上の微絨毛の存在により示される細胞外マトリックスタンパク質の存在を検出する能力を有することを示唆する。Matrigel（ラミニンが主要な成分である）での捕捉マトリックスの補充は、コラーゲン捕捉オルガノイドと比較してアルブミン合成の改善された維持を導いた。
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本明細書中に引用された全ての参考文献は、その全体が参照として援用される。様々な変更および改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することなく本明細書に示される教示に対しなされ得ることが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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