(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロニューロン組織試料を用いて、精神活性化合物候補試料を特性付ける方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該インビトロニューロン組織試料における細胞外電位の周期的なリズム振動のベースライン値を検出する工程；
ｂ）該精神活性化合物候補試料を該インビトロニューロン組織試料と接触させる工程；
ｃ）該インビトロニューロン組織試料における該細胞外電位の周期的なリズム振動の結果値を検出する工程；および
ｄ）周期的なリズム振動の前記結果値の振幅および周波数と、前記ベースライン値の振幅および周波数値を比較して、前記精神活性化合物候補試料を特性付ける工程、
を包含する方法。
【請求項２】
さらに、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値をレンダリングして、それぞれ、計算結果値および計算ベースライン値を作成するレンダリング工程を包含し、
ここで、前記工程ｄ）が、前記計算結果値の振幅および周波数と、前記計算ベースライン値の振幅および周波数値と比較して、前記精神活性化合物候補試料を特性付ける工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値の検出前に、刺激組成物を添加する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激組成物が、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を促進または模倣する１種以上の化合物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記刺激組成物が、１種以上のコリン模倣化合物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記刺激組成物が、カルバコールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記刺激組成物が、共培養組織試料を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
さらに、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値を保存する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値が、θ脳波、β脳波およびγ脳波からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
脳波の前記ベースライン値および前記結果値が、β波である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ａ）および前記工程ｃ）が、前記インビトロニューロン組織試料の複数の測定部位における細胞外電位の複数の前記ベースライン値または前記結果値を検出する工程を含んでおり、
前記工程ｄ）が、複数の前記結果値の振幅および周波数と、複数の前記ベースライン値の振幅および周波数値と比較して、前記精神活性化合物候補試料を特性付ける工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記レンダリング工程が、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値の各々に対して高速フーリエ変換を実行して、それぞれ、前記計算結果値および前記計算ベースライン値を作成する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記レンダリング工程が、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値を、デジタル信号プロセッサで、高速フーリエ変換にかける工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記レンダリング工程が、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値を、汎用計算機で、高速フーリエ変換にかける工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記レンダリング工程が、前記計算結果値および前記計算ベースライン値の時間的順序に対して電流源密度分析を実行して電流流れパターンを作成する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記レンダリング工程が、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値を、デジタル信号プロセッサで、高速フーリエ変換にかける工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記レンダリング工程が、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値を、汎用計算機で、高速フーリエ変換にかける工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値の検出前に、前記インビトロニューロン組織試料を電気的に刺激することにより、細胞外電位のベースライン振動を誘発する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞外電位の周期的なリズム振動の前記結果値および細胞外電位の周期的なリズム振動の前記ベースライン値が、細胞外電位の該周波数および該振幅の組合せの値の空間分布を形成している、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記空間分布が、電位のアレイをインビトロニューロン組織試料の解剖学的特徴と比較することにより得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡により観察される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡画像および画像処理アルゴリズムにより分析される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記レンダリング工程が、さらに、前記計算ベースライン値および前記計算結果値の局所分布を計算する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レンダリング工程が、さらに、前記計算ベースライン値および前記計算結果値の局所分布を計算する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記レンダリング工程が、さらに、前記計算ベースライン値および前記計算結果値の局所分布を計算する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
計算ベースライン値および計算結果値の局所分布が、該計算値をインビトロニューロン組織試料の解剖学的特徴と比較することにより得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
計算ベースライン値および計算結果値の局所分布が、該計算値をインビトロニューロン組織試料の解剖学的特徴と比較することにより得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
計算ベースライン値および計算結果値の局所分布が、該計算値をインビトロニューロン組織試料の解剖学的特徴と比較することにより得られる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡により観察される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡により観察される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡により観察される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡画像および画像処理アルゴリズムにより分析される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡画像および画像処理アルゴリズムにより分析される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記解剖学的特徴が、顕微鏡画像および画像処理アルゴリズムにより分析される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
インビトロニューロン組織試料中を用いて、精神活性化合物候補試料を特性付ける装置であって、該装置は、以下：
ａ）細胞電位測定電極アレイであって、該細胞電位測定電極アレイは、コンピュータに接続可能な複数の微小電極を有し、該微小電極は、該インビトロニューロン組織試料における細胞外電位の周期的なリズム振動を検出するように、かつ、該インビトロニューロン組織試料に対して電気刺激を与えるように適合されている、細胞電位測定電極アレイ；
ｂ）試料導入器であって、該精神活性化合物候補試料を、該インビトロニューロン組織試料と接触して置くためにある、試料導入器；および
ｃ）該コンピュータであって、該コンピュータは、以下のｉ）およびｉｉ）：
ｉ）該精神活性候補試料を該インビトロニューロン組織試料に導入する前後の両方で、該インビトロニューロン組織試料における細胞外電位の周期的なリズム振動を検出すること、およびｉｉ）該細胞外電位の前後の周期的なリズム振動の振幅および周波数の差に基づいて、該精神活性化合物候補試料を特性付けること、のためのプログラミングを含む、コンピュータ、
を備える装置。
【請求項３６】
前記ベースラインおよび細胞外電位の前記周期的なリズム振動が、細胞外電位の周波数、細胞外電位の振幅、および細胞外電位の該周波数および該振幅の組合せからなる群から選択される値の空間的アレイであり、ここで、前記コンピュータが、前記値の空間的アレイの前後を比較するためのコンパレータープログラミングを含む、請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
前記コンピュータが、前記値の空間的アレイの前後を高速フーリエ変換にかけるためのプログラミングを含む、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記コンピュータが、デジタル信号プロセッサを備える、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記コンピュータが、細胞外電位の時間的順序に対して電流源密度分析を実行して電流流れパターンを作成するためのプログラミングを含む、請求項３５に記載の装置。
【請求項４０】
前記コンピュータが、前記前後の値の振幅または周波数を比較して前記候補試料組成物中の精神活性化合物の存在または不在を検出するためのプログラミングを含む、請求項３５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、好ましくは、インビトロニューロン組織試料上に候補試料を導入する前後の細胞外電位の振動を検出することにより、インビトロニューロン組織試料中の精神活性化合物を検出する方法、およびこれらの方法を実行する装置に関する。細胞外電位のパラロータを分析すると、この候補試料中の精神活性物質の存在の指標およびその薬理学的活性および組成に関する情報が得られる。さらに、本発明は、このインビトロ試料内の反復ニューロン活性の存在を開始し維持する方法を包含する。それに加えて、本発明は、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を促進または模倣する化合物（例えば、カルバコール）を含有する刺激組成物を導入することにより、インビトロニューロン組織試料中の反復ニューロン活性（例えば、脳波）を刺激または開始する方法を包含する。
【０００２】
（発明の背景）
小哺乳動物の海馬中のリズム活性は、３つの周波数バンドに分類されると記述されている：４〜１０Ｈｚ（θ）、１０〜３０Ｈｚ（β）および３０Ｈｚより上（γ）（Ｔｒａｕｂら、１９９８；最近の論述については、１９９９）。θは、断然、これらのうちで最も研究されているものであり、中でも、運動活性（Ｖａｎｄｅｒｗｏｌｆ，１９６９）および記憶コード化（Ｌａｎｄｆｉｅｌｄら、１９７２；Ｖｅｒｔｅｓ  ａｎｄ  Ｋｏｃｓｉｓ，１９９７）に関する。後者の考えに従うと、θと長期間相乗作用とは密接な関係にあり（Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ，１９８６；Ｌａｒｓｏｎら、１９８６；１９９３）、これは、ある種の記憶形態の推定基質である。高周波リズムの機能的な相関は、最近では、相当に関心が持たれている課題となっている。γ活性は、まず、嗅覚系で分析され（初期の概説について、Ｆｒｅｅｍａｎ，１９７５）、その結果、それによって、臭いの到達前に、球（ｂｕｌｂ）、梨状皮質および嗅内皮質の間に、干渉性が生じ得る（ＫａｙおよびＦｒｅｅｍａｎ，１９９８）。γ範囲に入る活性はまた、手掛かり提示（ｃｕｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）中に、視覚皮質に現れ（Ｇｒａｙ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，１９８９）、この場合、細胞を異なる受容野と過渡的に同調させることが提案されている。この仮説によれば、同調により、手掛かりの複数の特徴を干渉性描写に組み立てることができる（概説では、Ｓｉｎｇｅｒ，１９９８）。βリズムは、典型的には、高周波海馬活性の論述において、γ波とは識別されていないが、海馬スライスで、選択的に誘発されている（Ｂｏｄｄｅｋｅら、１９９７）。いずれにしても、皮質終脳での干渉性動作には高周波同調が必須であるという証拠が増加していることで、このβおよびγ振動の原因となっている経路および神経伝達物質系を同定することの重要性が強調されてきた。
【０００３】
上行コリン作動性投射は、βおよびγ範囲にあるものを含めた内生振動を促進する。初期の研究（Ｓｔｕｍｐｆ，１９６５）により、コリン作動遮断剤または中隔外傷は、明白な効果がないことが分かったものの、引き続いた研究では、自由に運動しているラットの速波が、コリンエステラーゼ阻害剤であるフィゾスチグミンにより高まり、また、アンタゴニストにより実質的に低下することが明らかとなった（Ｌｅｕｎｇ，１９８５）。海馬または嗅内スライスのコリン作動刺激は、通常、θ様活性の数秒間ものエピソードを誘発すると記述されているが（Ｋｏｎｏｐａｃｋｉら、１９８７；ＭａｃＶｉｃａｒ  ａｎｄ  Ｔｓｅ，１９８９；Ｄｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｏｎｓｏ，１９９７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｅｒ，１９９７）、最近の実験は、それはまた、皮質および海馬スライスにおいて、高周波リズム（２０〜４０Ｈｚ）を誘発できることを示す（Ｂｏｄｄｅｋｅら、１９９７；Ｆｉｓａｈｎら、１９９８）。コリン作動性中隔海馬線維は、海馬系の別個の領域を神経支配し（Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｓｈｕｔｅ，１９６７；Ｍｏｓｋｏら、１９７３；Ｆｒｏｔｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒａｎｔｈ，１９８５；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８７）、この場合、それらは、介在ニューロンの亜集団と接触して、主細胞の樹状領域を選択する（Ｍｏｓｋｏら、１９７３；Ｌｙｎｃｈら、１９７８；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８７）。ムスカリン様レセプタを刺激すると、錐体細胞が脱分極し、一部の介在ニューロンからの解離が抑制され、他のものの興奮性が高まる（Ｐｉｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｇｅｒ，１９９２；Ｂｅｈｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｇｅｎｃａｔｅ，１９９３）。インビボ結果およびインビトロ結果の組合せは、アセチルコリンが、皮質終脳で高周波活性を生じる際に、重要な役割を果たすことを示唆している。
【０００４】
コリン作動的に駆動した高周波リズムが、いかにして、皮質作動に影響を与えるかは、それらが局部的に特殊化しているかどうか、およびそれらがどのように生成されるかに依存している。カルバコール誘発振動は、嗅内皮質（Ｄｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｏｎｓｏ，１９９７）および海馬（Ｆｉｓａｈｎら、１９９８）にある制限部位に起因していることが報告されているが、さらに一般的な回答には、広大な嗅内皮質−海馬系にわたる系統的なマッピングが必要である。本発明は、海馬皮質でコリン作動的に誘発した高周波リズムの起源および局部的変化を検討する６４個の部位から同時に記録するために最近導入された装置（Ｏｋａら、１９９９）を利用している。
【０００５】
これらのソースの位置に加えて、本発明者らは、振動それ自体が、精神活性物質の存在を同定するために、また、ある場合には、少なくとも、精神活性物質の薬理学的活性または組成を同定し特性付けるために、種々の数学的手段を使用して研究され得ることを発見した。
【０００６】
上述の文献のいずれも、精神活性物質の存在、薬理学的活性の特性付けまたは組成を指示するためのインビトロ試料で見られる高周波振動を利用しない。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、インビトロニューロン組織試料を用いて、精神活性化合物候補試料を特性付ける方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該インビトロニューロン組織試料における細胞外電位の周期的なリズム振動のベースライン値を検出する工程；
ｂ）該精神活性化合物候補試料を該インビトロニューロン組織試料と接触させる工程；
ｃ）該インビトロニューロン組織試料における該細胞外電位の周期的なリズム振動の結果値を検出する工程；および
ｄ）周期的なリズム振動の前記結果値の振幅および周波数と、前記ベースライン値の振幅および周波数値を比較して、前記精神活性化合物候補試料を特性付ける工程、
を包含する方法である。
関連した本発明の方法は、細胞外電位の振動を刺激するかまたはニューロン組織の共に移植したビットを利用するかまたは電気刺激パターンを使用してニューロン試料を刺激する組成物を添加する工程により、反復ニューロン活性を様々に刺激しその始動を刺激する方法である。
【０００８】
一般に、インビトロニューロン組織試料中の精神活性化合物を検出する好ましい方法は、この組織試料中の振動の存在を誘発し、次いで、それを検出し、そしてそれらの振動のベースライン値を提供する工程を包含する。その検出後、このインビトロ試料は、精神活性化合物の候補試料と接触させられる。この候補試料の導入と同時に（またはそれに引き続いて）、その振動（例えば、脳波）が、次いで、測定される。その二組の振動データは、次いで、それぞれ、２つのいわゆる「計算値」を作成するようにレンダリングされる。次いで、これらの２つの計算値を比較すると、その薬理学的活性が検出でき、特性付けでき、そして１種以上の化合物が存在しているなら、その試料中の精神活性化合物の組成が決定できる。
【０００９】
これらの種々の振動は、典型的には、細胞外電位中で見られるものである。例えば、それらは、θ、βまたはγ脳波であり得る。
【００１０】
複数電極ディッシュ（「ＭＥＤ」）を使用するのが望ましく、その結果、このニューロン試料上の多数の異なる活性部位または活性が低い部位は、同時または順次に試料採取され得る。ＭＥＤを使用すると、空間的関係の測定および計算が可能となる；これらのニューロン振動値間の関係が測定され計算される。ＭＥＤの複数電極的な性質により、また、所定インビトロニューロン試料内での局地的な特定の効果を決定しそして特性付けることが可能となる。
【００１１】
細胞外電位の振動の適当な数学的分析には、前後単一部位測定の振幅および周波数の差を高めるために、単一空間点で測定される振動の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）が挙げられる。
【００１２】
同様に、時間の関数としてアレイで得られる細胞外電圧の振動シーケンスは、電流源密度（ＣＳＤ）解析を受けて、このインビトロニューロン組織試料内で、電流流れパターンを作成しそして描写され得る。
【００１３】
本発明のさらに他の部分としては、インビトロニューロン組織試料中の反復ニューロン活性を刺激または誘発する傾向にある化学的または解剖学的組成および電気刺激パターンの使用が挙げられる。これらの組成は、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を模倣または促進する化合物であり得る。それらは、共に蓄積したニューロン組織であり得る。それらは、コリン模倣化合物であり得る。非常に望ましい化学化合物は、カルバコールである。電気刺激もまた、使用され得る。
【００１４】
本発明は、精神活性試験化合物の薬理学的活性を検出し特性付けそしてその組成を決定する種々の方法を包含する。これらの試験化合物を同定する多数の方法は、本発明の方法の範囲内である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、好ましくは、インビトロニューロン組織試料中の細胞外電圧（すなわち、電位）のリズム振動を使用して、精神活性組成物を検出または特性付けするプロセスを包含する。それに加えて、本発明のプロセスは、以下で詳述するあるクラスの組成物または電気刺激技術を使用して、これらの振動を刺激または誘発することを包含する。
【００１６】
ニューロン試料の空間アレイにわたるインビトロニューロン組織中の細胞外電位の測定は、公知である。例えば、米国特許第５，５６３，０６７号および第５，８１０，７２５号（各々は、Ｓｕｇｉｈａｒａらの特許である）で見られるような装置の種々の記述を参照せよ。
【００１７】
（測定装置）
本発明のプロセスと共に好ましく使用される細胞電位測定電極アレイは、以下の部分を含む：絶縁基板上の複数の微小電極；この微小電極の外側のいくつかの領域にこの微小電極を接続する導電性パターン；電気接点であって、この電気接点は、この導電性パターンの末端に接続される；絶縁フィルムであって、この絶縁フィルムは、この導電性パターンの表面を覆う；およびこの絶縁フィルムの表面にあるこの微小電極を含む領域を取り囲む壁。それらの参照電極は、この測定微小電極のインピーダンスよりも比較的低いインピーダンスを有し得る。それらは、この壁により取り囲まれる領域にある複数の位置で、また、しばしば、この微小電極から特定の距離で、設置され得る。この電気接点は、さらに、通常、各参照電極を配線するこの導電パターンとこの導電パターンの末端との間で、接続される。この参照電極を配線するこの導電パターンの表面は、典型的には、絶縁フィルムで覆われている。
【００１８】
典型的には、これらの微小電極は、例えば、０．８〜２．２ｍｍ（３００μｍの微小電極ピッチの場合）または０．８〜３．３ｍｍ（４５０μｍの微小電極ピッチの場合）の側面を有する長方形において、マトリックス配置で位置している。１つの側面上の５〜１５ｍｍの長方形の４隅で、４個の参照電極が位置されている。さらに好ましくは、約１００〜４５０μｍ、好ましくは、１００〜３００μｍの中心ピッチで、８列および８行で、６４個の微小電極が位置している。
【００１９】
好ましくは、これらの微小電極および参照電極は、酸化インジウム−スズ（ＩＴＯ）フィルム上のニッケルメッキ、金メッキおよび白金黒の層から形成される。
【００２０】
この絶縁基板（例えば、ガラス基板）は、殆ど長方形であり得る。この導電性パターンの末端には、複数の電気接点が接続され得、そしてこれらは、好ましくは、この絶縁基板の４側面に設置される。結果として、複数の微小電極および参照電極の配線パターンレイアウトは、簡単である。これらの電気接点のピッチは、比較的に大きくなるように作製され得るので、電気接点を通す外部ユニットとの電気接続もまた、簡単である。
【００２１】
この微小電極領域は、通常、非常に狭い。その試料を顕微鏡で観察するとき、垂直方向および水平方向の両方の位置を区別することは困難である。この顕微鏡による視覚的な認識を、方向、軸および位置で様々にするために、この微小電極領域の近くに位置合わせ微小刻印を置くことが望ましい。
【００２２】
このインビトロニューロン試料の解剖学的な相関に対して電極位置を決定するために、以下の順序の事象を実行することは、さらに好ましい。そのアレイがこの試料の重要な領域を覆うことができるように、このアレイ上にインビトロニューロン試料の対照を設置すること、このアレイ上の対照試料の写真を撮ること、対照試料からの応答を記録すること、対照試料と同じ相対位置で、できるだけ正確に、このアレイ上に試験試料を設置すること、このアレイ上の試験試料の写真を撮ること、試験試料からの応答を記録すること、ならびに対照写真と試験写真とを比較すること、および対照応答と試験応答とを比較すること。
【００２３】
当業者に適当な代替方法には、物体認識アルゴリズムを使用すること（この場合、この物体は、このインビトロニューロン試料の総体解剖学的構造である）、物体認識アルゴリズムデータを比較すること、および対照応答と試験応答とを比較することがある。
【００２４】
最も好ましい細胞電位測定装置は、細胞設置装置から構成され、これは、細胞電位測定電極、電気接点と接触する接触部位、および上下から挟むことにより絶縁基板を固定する電極ホルダーを有する。この細胞電位測定電極は、この細胞設置アセンブリ装置に電気的に接続され得、この試料から発生してこのような各微小電極および参照電極間で測定された電位または電極信号の処理が可能となる。この細胞電位測定アセンブリは、試料ニューロン細胞または組織を培養する領域（これは、壁により取り囲まれている）を含み得る。それはまた、好ましくは、この壁により取り囲まれた領域で培養される細胞または組織を拡大して光学的に観察するための光学装置を含む。この細胞電位測定装置は、好ましくは、さらに、この光学装置により得られた拡大画像を保存する画像記憶装置を含む。
【００２５】
典型的には、測定ソフトウェアをインストールしたパーソナルコンピュータが含まれ、測定した細胞電位を受容する。このコンピュータおよび細胞設置装置は、典型的には、測定用Ｉ／Ｏ基板を介して接続されている。このＩ／Ｏ基板は、Ａ／Ｄ変換器およびＤ／Ａ変換器を含む。このＡ／Ｄ変換器は、通常、得られた電位を測定し変換するためにある；このＤ／Ａ／変換器は、必要なとき、その試料に対する信号を刺激するためにある。
【００２６】
このコンピュータにインストールされた測定用ソフトウェアは、刺激信号を与えて刺激信号を形成し、そして得られた検出信号を記録するための条件を設定するソフトウェアを含み得る。このような測定用ソフトウェアを使用することにより、このコンピュータは、細胞に刺激信号を与える手段および細胞から検出される信号を処理する手段を含み得る。このコンピュータはまた、任意の光学観察装置（ＳＩＴカメラおよび画像記録装置）および細胞培養システムを制御し得る。
【００２７】
望ましくは、細胞から検出された細胞外電位は、リアルタイムで表示され得る。それに加えて、記録された自発性の活性、電位または誘導電位は、望ましくは、細胞の顕微鏡画像の上にオーバーレイすることにより、表示される。代替的には、このソフトウェアはまた、画像処理（例えば、フィーチャー認識、エッジ検出またはエッジ増強）アルゴリズム性能を含む。この電位を測定するとき、記録された波形全体は、通常、そのニューロン試料における波形の位置に対応して、視覚的に表示される。
【００２８】
データ分析または処理に関して、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）分析、干渉性分析および相関分析もまた、望ましい。下記で議論するバリエーションでは、電流源密度（ＣＳＤ）解析もまた、非常に望ましい。他の使用可能な機能には、波形識別、一時的なプロフィール表示機能および組織分布表示機能を使用する単一スパイク分離機能が挙げられ得る。これらの分析の結果は、この画像記憶装置に保存されたニューロン試料の表示画像の上にオーバーレイすることにより、表示され得る。
【００２９】
このコンピュータから刺激信号が発せられるとき、この刺激信号は、Ｄ／Ａ変換器およびアイソレータを通って、この細胞設置装置に送られる。この細胞設置装置は、細胞電位測定電極を含み、これらは、例えば、マトリックス形状で、ガラス基板上の６４個の微小電極から形成され得、そして微小電極およびそれらの培養流体と接触するニューロン試料（例えば、細胞または組織のセグメント）を維持する囲壁を有する。好ましくは、この細胞設置装置に送られる刺激信号は、これらの６４個の微小電極のうちの任意の電極に適用され、次いで、この試料に適用される。
【００３０】
各微小電極と参照電位（これは、この培養液の電位である）との間で生じる誘導電位、誘発電位または自然電位は、６４チャンネルの高感度増幅器およびＡ／Ｄ変換器を通って、このコンピュータに入る。この増幅器の増幅率は、例えば、約０．１〜１０ｋＨｚまたは〜２０Ｈｚの周波数バンドで、例えば、約８０〜１００ｄＢであり得る。しかしながら、ローカットフィルターを使用することにより刺激信号によって誘発された電位を測定する場合、その周波数バンドは、好ましくは、１００Ｈｚ〜４００Ｈｚまたはそれ以上である。
【００３１】
この所望装置は、細胞培養システムを含み得、このシステムは、温度制御装置、培養流体循環装置、および供給機（これは、例えば、空気および二酸化炭素の混合ガスを供給する）を有する細胞培養システムを含み得る。この細胞培養システムは、市販のマイクロインキュベーター（ｍｉｃｒｏｎｉｎｃｕｂａｔｏｒ）、温度制御装置およびＣＯ２シリンダーから構成され得る。このマイクロインキュベータは、ペルチェ素子によって、０〜５０℃の温度範囲で制御するのに使用でき、そして３．０ｍｌ／分以下の液体供給速度および１．０リットル／分以下の気体流速に適用できる。また、あるいは、温度制御装置を組み込んだマイクロインキュベータが使用され得る。
【００３２】
（データ測定および分析）
一般に、本明細書中で記述した手順は、同時測定、そして好ましくは、細胞外電位または電位値をこのような各々の測定部位で空間的および時間的の両方で記録することを使用する。その空間アレイにおける測定部位の各々で、これらの信号の周波数および振幅を観察することは、さらに好ましい。ニューロン試料の配置およびその試料中の固有の物理的境界が、光学装置および電子感知装置のいずれかを使用して観察できること、およびこれらのマージンが、全て、選択したコンピュータ内のセンサの位置と相関していることは、よりさらに好ましい。
【００３３】
このニューロン試料は、このインビトロ細胞電位測定電極アレイ上に置かれ、その試験中にその生存度を維持するために、当業者に公知の手順が使用される。このニューロン試料は、もし望ましいなら、培養され得る。実施例に関与する典型的な手順は、以下に述べる。これらの微小電極の各々は、細胞外電圧または電位のリズム振動に対して、時間の関数および周波数の関数として、モニターされる。これにより、時間の関数として、周波数および振幅の信号のアレイが生じる。２Ｈｚの直流（ＤＣ）に近い領域から３５Ｈｚより高い領域まで、これらの振動を測定するのが好ましい。これにより、ニューロンリズム活性で見られる典型的な３個の周波数バンドの測定維持が許容される：４〜２０Ｈｚ（θ脳波）、１５〜２５Ｈｚ（β脳波）および３０Ｈｚより高い値（γ脳波）。１０〜５０Ｈｚのさらに高い周波数バンドは、非常に有益である。
【００３４】
本発明者は、薬理学的方法、生理学的方法または解剖学的方法により、細胞外電圧または電位の振動を多様に誘発または刺激するのが望ましいことを発見した。薬理学的組成物（例えば、このニューロン組織中のアセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を促進または模倣する１種以上の化合物）を使用することが好ましいが、しかしながら、他の刺激が、許容できる。この化学刺激組成物は、カルバコール（カルビルコリンクロライド（ｃａｒｂｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））が非常に望ましい１つ以上のコリン模倣化合物であることが、さらに好ましい。
【００３５】
一旦、このインビトロニューロン組織試料に、著名な物質を添加すると、次いで、それらの振動の一組のベースライン値が得られる。
【００３６】
精神活性化合物を含んでもよいしまたは含まなくてもよい候補試料組成物は、次いで、このインビトロニューロン組織試料と接触される。次いで、細胞外電圧または電位のアレイが測定される。本発明者は、これらの振動性細胞外電圧が、精神活性化合物の導入の前後で、精神活性組成物の存在および／または特性付けに関する情報を与えることを発見した。特定の化合物に関するそれ以上の詳細は、実施例において、以下で提供する。
【００３７】
精神活性化合物の存在または特性付けに関する重要な情報を提供する１手順には、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）の使用である。ＦＦＴは、種々の異なる領域で使用され得、そして通例、スペクトル分析器として公知の装置で、使用される。その測定アレイにおいて特定の測定にＦＦＴを適用すること、およびその候補組成物の導入前に、同じ位置で、その結果を特定の測定値と比較することは、精神活性化合物の存在、特性付けまたは薬理学的活性に関して、有益である。具体的には、もし、この候補が、分析されるニューロン試料の領域において精神活性であるなら、そのように分析した信号の比較により、ピークの周波数、振幅またはそれら２つの組合せにおけるシフトが明らかとなり得る。
【００３８】
有益な他の分析には、電流源密度（ＣＳＤ）解析がある。この分析手順の論述は、例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、「Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ａｎｕｒａｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７５年３月、３８（２）：３５６−６８）で見られる。この分析手順は、上記装置により測定された電位または電圧を変換し、そしてそれらを、類似の電流の流れ（さらに重要なことには、電流の大きさ）の設定アレイに変換するのに使用される。これらの電流の大きさおよび方向を時間の関数として相関させることにより、電流「シンク」および「ソース」が観察され得る。このような「シンク」および「ソース」の位置は、このインビトロニューロン組織試料に添加された精神活性薬剤の存在、特性付けまたは薬理学的活性を決定する際に、有益である。
【００３９】
本明細書中で使用する「シンク」との用語は、細胞外培地からニューロン要素に吸収される電流を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用する「ソース」との用語は、ニューロン要素内から細胞外培地に注入される電流を意味する。
【００４１】
本明細書中で使用する「海馬」との用語は、ヒトおよび他の動物において、側頭葉の後方に位置していてそして記憶の形成および想起に関与している終脳の領域を意味する。
【００４２】
本明細書中で使用する「海馬スライス」との用語は、一般に、約１００〜５００マイクロメータの厚さの海馬組織の物理的なスライスを意味し、これは、本明細書中で記述した電気生理学的な記録装置上で使用され得る。
【００４３】
本明細書中で使用される「ＣＡ１」、「ＣＡ２」、「ＣＡ３」および「ＣＡ４」との用語は、海馬の４つの領域のうちの１つを意味する。
【００４４】
本明細書中で使用する「樹状」との用語は、神経細胞の細胞体から発している高度に分枝した構造を意味する。
【００４５】
（実施例）
本実施例は、海馬皮質において、コリン作動的に誘発した高周波リズムのソースおよび局所的変化を検討するために、６４個の部位から同時に記録する複数電極デッシュ（ＭＥＤ）を利用した。次いで、これらの振動に関連した別の薬理学的および生理学的な研究を行った。
【００４６】
（複数電極アレイ（ＭＥＤプローブ）の作製）
Ｍｕｌｔｉ−Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ−Ｄｉｓｈ（松下電気産業株式会社、大阪：「ＭＥＤプローブ」）を作製する一般的な手順は、上で記述した。ＭＥＤプローブを作製する手順はまた、Ｏｋａら（１９９９）で記述されている。この装置は、６４個の平面微小電極のアレイを有し、その各々は、５０×５０μｍのサイズを有し、８個×８個のパターンで配列されている。プローブには、２種類の極間距離（１５０μｍ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤ−Ｐ５１５ＡＰ）および４５０μｍ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤ−Ｐ５４５ＡＰ））が付いている。
【００４７】
このＭＥＤ表面に対するニューロン試料スライスの十分な接着性を与えるために、このＭＥＤプローブの表面を、室温で、８時間にわたって、２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）中の０．１％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ−３１４３）で処理した。このプローブ表面を、無菌蒸留水で３回リンスした。このプローブ（チャンバ）に、次いで、３７℃で、少なくとも１時間にわたって、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地（これは、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ：１６１４１−０７９）および１０％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ：１６０５０−１２２）を含有する）を充填した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地は、ダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ−１２（ＧＩＢＣＯ：Ｄ／Ｆ−１２培地。１２４００−０１４）（これらは、Ｎ２栄養剤（ＧＩＢＣＯ：１７５０２−０１４）およびヒドロコルチゾン（２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｈ０８８８））を補充した）。
【００４８】
（海馬スライスの調製）
１７〜２４日齢のＳＤラットを、ハロタン（２−ブロモ−２−クロロ−１，１，１−トリフルオロエタン、Ｓｉｇｍａ：Ｂ４３８８）を使用して麻酔した後、断頭することにより殺し、その全脳を、注意深く取り除いた。その脳を、直ちに、およそ２分間にわたって、以下の組成（ｍＭ）の氷冷した酸素化製剤緩衝液に浸した：１２４ｍＭのＮａＣｌ、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、３ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＳＯ４。この脳の適当な部分を切り取り、そして振動組織スライサー（Ｌｅｉｃａ：ＶＴ−１０００Ｓ）の氷冷ステージに置いた。このステージを、直ちに、酸素化緩衝液および凍結製剤緩衝液の両方で満たした。各組織スライスの厚さは、３５０μｍであった。各スライスを、ペンキブラシにより、そのブレードから穏やかに取り除き、切り取り、そして直ちに、室温で、１時間にわたって、この酸素化製剤緩衝液に浸した。次いで、このＭＥＤプローブの中心に、１個のスライスを置いた。このスライスは、８個×８個のアレイを覆うように、配置した。このスライスを配置した後、このＭＥＤプローブを、直ちに、９５％のＯ２および５％のＣＯ２で満たした箱に置き、そして３２℃で、１時間にわたって、回復させた。
【００４９】
（電気生理学的な記録）
電気生理学的な記録中にて、このＭＥＤプローブ上のスライスを、３２℃で、小さいＣＯ２インキュベータ（Ａｓａｈｉ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ：モデル４０２０）に置いた。このスライスをＭＥＤプローブ上で回復した後、この培地を、血清なしＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地で置き換えた。これらのスライスをその界面に置き、そして加湿した９５％Ｏ２および５％ＣＯ２気体混合物と接触させた。この条件で、それらの応答を２時間より長い間にわたって記録した。
【００５０】
薬剤は、ＲＢＩ（ジアゼパム、ビククリン、ＣＮＱＸ、２−ヒドロキシサクロフェン（ｓａｃｌｏｆｅｎ）またはＳｉｇｍａ（他の全ての化合物））から購入した。ＣＸ６１４およびＣＸ６９１は、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）製であった。全ての薬剤は、既知濃度で浴に適用し、そして凍結アリコートから毎日調製した。
【００５１】
２０ｋＨｚの試料採取速度で、多チャンネル記録システム（松下電器産業株式会社、「ＭＥＤ６４」システム）を使って、６４個の全ての部位での自然電位および誘発電場電位を同時に記録した。この誘発応答の場合、利用できる６４個の平面微小電極のうちの１個を、刺激カソードに使用した。そのアイソレータを介したデータ収集ソフトウェアにより、双極定電流パルス（１０〜５０μＡ、０．１ミリ秒）が生じた。この刺激微小電極は、６４配電箱から選択した。測定した電場電位を、次いで、下記のＣＳＤ分析（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら）を使用して、分析にかけた。
【００５２】
（電流源密度（ＣＳＤ）分析）
電流源密度解析のよく研究された方法は、電流ソースおよびシンク（Ｉｍ）の位置および相対的大きさの確認を試みるために、測定した電場電位（φ）に対して、ラプラシアン変換（∇２）を使用する（概説について、Ｈｏｗｌａｎｄら、１９５５；Ｍｉｔｚｄｏｒｆ、１９８５）。
【００５３】
Ｉｍ＝−（σｘ∇２ｘφ＋σｙ∇２ｙφ＋σｚ∇２ｚφ）
ここで、σは、３つの直交する次元の各々の導電性である。この方法は、電気生理学的な測定のために、その全三次元では滅多に使用されず（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９７３；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＦｒｅｅｍａｎ，１９７５；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＬｌｉｎａｓ，１９７５）、むしろ、一次元に切り詰めた形状が、典型的には、適用される（ＨａｂｅｒｌｙおよびＳｈｅｐｈｅｒｄ，１９７３；ＫｅｔｃｈｕｍおよびＨａｂｅｒｌｙ，１９９３；Ｋｏｌｔａら、１９９６）。しかしながら、一次元電流源密度解析は、二次元またはそれ以上の材料（例えば、脳スライス）で行われ、その結果、その測定軸に対して直交して生じる任意の電流は、検出されず、得られた一次元結果は、従って、誤解を招くおそれがあり得る。それゆえ、一次元分析では、試料を測定する向きに対して側方で最小限の電流が生じることを確実にするように、注意する。好ましくは、このインビトロニューロン試料が脳の海馬領域のスライスであるとき、線形系列の測定の整列は、（先端樹状突起に対して側方の電流が、軸に近接した先端に沿って生じる電流に対して、非常に小さくなることが証明されているので、）先端樹状突起の成長方向に平行となるように、行われる。本実施例で使用した技術は、二次元法であり、ここで、等距離アレイにある複数電極から、同時に試料を記録して、このスライスに存在しているアレイの列および行と樹状突起との相対的な配向とは無関係に、このスライスの平面内の任意の方向で、電流流れを連続的に感知することが可能となった。このアレイは、６４個の平面電極から構成されており、各々は、５０×５０μｍのサイズであり、８個×８個のパターンで配列され、１５０μｍまたは４５０μｍの極間距離である（Ｏｋａら、１９９９）。
【００５４】
１００Ｈｚでローパスフィルタリングした後、そのデータを、３×３の重量平均カーネル（０  １／８  ０、１／８  １／２  １／８、０  １／８  ０）で空間的に滑らかにし、その結果を、３×３ラプラシアンカーネル（０  １  ０、１  −４  １、０  １  ０）と絡めて、第二空間導関数の別個の概算値を得た。好ましくは、その培地は、均一なコンダクタンスを備えて、オーム抵抗性であると考えられている。その全相関マトリックスを、考慮した時間ウィンドウ（０〜３秒）で、全チャンネル（６４）について算定した。このスライス中の単一点に対する電流対時間のプロットは、各時間段階に対する８個×８個の電流源密度を算定することにより、そして２本の線の内挿によって所望位置での値を計算することにより、得られる。電流源密度解析で得ることができる解像度のよく知られた限界は、その電極間距離（試料採取解像度）と、このスライスで生じる電流ソースまたはシンクの半径との間の関係から生じ、そして当業者に理解できる。コンピュータグラフィックスインターフェイスの領域で周知の「エイリアシング」現象とは、試料採取点間の距離が、現れる最小現象のサイズよりも大きいとき、偽のデータ「ゴースト」（エイリアス）の出現を意味する。コンピュータスクリーングラフィックスでは、これは、表示する画像に関して、そのスクリーン解像度が不十分であるとき、起こる（図１の左パネル−滑らかな縁部を備えた高解像度画像、図１の中間パネル−比較的に低解像度の画素間距離で試料採取した同じ画像は、高い空間周波数を備えた新たな特徴を有するように見える（ギザギザの階段状））。このスクリーン上での偽画像の出現は、典型的には、その画像のローパスフィルタリングを画像縁部で部分的に陰影を付けた画素の導入と組み合わせた「アンチエイリアシング」により、処理される（図１右）。アンチエイリアシングには、ローパスフィルターが挙げられ、これは、この画像から、偽エイリアス特徴を取り除き、従って、また、（本発明の場合と同様に）、初期画像から、ある程度高い空間周波数ディテールをなくし得る。アレイ試料採取した生理学的データへのアーチファクトの対応電位導入は、同じアンチエイリアス法により排除でき（以下の図２を参照）、それに対応して、このデータに由来の一定の細かい（高い空間周波数）ディテールをなくす。好ましくは、この分析は、完全アンチエイリアスなしで、ローパスフィルタリングを使用する。あるいは、もし、このデータが、電極間試料採取距離だけ解像するには高すぎる空間周波数を伴う現象を含むなら、その結果は、ローパスフィルタリングされて、高周波データも取り除きつつ、偽エイリアスを除去する（図２）。
【００５５】
具体的には、図２は、アンチエイリアスの効果を描写している。その上部パネルは、試料採取したデータの解像度に対して十分なセンサ間間隔がある場合を示している。エイリアスは、非常に高い周波数の特徴として現れる；そのセンサ間の空間周波数の半分（センサ間距離の２倍）をローパスフィルタリングすると、試料採取データの解像度を低下させることなく、全てのエイリアスがなくなる。他方、図２の左下のパネルは、そのセンサ間間隔が試料採取データの解像度に対して不十分であった場合を示している。エイリアスの空間周波数は、このデータに存在している最高周波数と重なり合っている。この左パネルは、半分のセンサ間空間周波数でのローパスフィルタリングが全エイリアスを排除できず、また、このデータの最も細かいディテールの一部を排除することを示している。図２の右手パネルは、それより低い空間周波数でのローパスフィルタリングが、全ての偽エイリアスを排除することに成功し、さらに、試料採取データの解像度を低下させて、測定データに存在し得る高周波数のディテールの多くを排除することを示している。それより低い周波数または高い事象だけが残る。
【００５６】
（結果）
（連続二次元電流源密度解析）
海馬スライス調製物におけるＣＡ１領域に求心性のＳｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌの刺激に関連して、二次元電流源密度解析を行った。図３Ａおよび３Ｂは、典型的な実験を図示している。図３Ａは、１５０μｍの電極間空間での８個×８個のＭＥＤ電極アレイ上のスライスの配置を示し、これは、海馬スライスにて、ＣＡ１の先端樹状領域の中心にある。これらの電極は、この電極アレイにて、歯状回顆粒細胞領域のＣＡ１基底樹状突起、ＣＡ１の先端樹状突起および上部ブレードを覆っている。ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＢが媒介する禁止成分を抑制するために、この実験は、５０μＭのピクロトキシンおよび１００μＭの２−ヒドロキシサクロフェンを使用して実行した。図３Ｂは、ネズミ色で示した電極（１０）に対する１回の刺激パルスにより誘発された代表的な先端シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を示しており、これは、淡灰色の電極（１２）から測定した。その時間尺度は、このような誘発応答に典型的である。垂直の破線は、全６４個の電極にわたって測定した時間点を示しており、これは、以下の図４で示す。
【００５７】
図３Ｂは、指定した電極でのシナプス後電流の時間経過および大きさを図示しており、これは、ＣＡ１の先端樹状突起の近接部分である。この電流のシンクおよびソースの方向は、指示したとおりである；初期線維ボレー（約１ミリ秒間続く）後、電流シンクは、約５ミリ秒間にわたって上昇し、次の５ミリ秒で低下し、その後、大体１３ミリ秒で、ベースラインに戻る。それは、電流ソースになって、約１５〜２０ミリ秒間にわたって続き、その後、約３５〜４０ミリ秒で、ベースラインに戻る。このシンクおよびソースの相対的な大きさおよび時間経過は、このような誘発応答に典型的である。
【００５８】
二次元電流源密度解析は、同じ応答の電流ソースおよびシンクの同様な尺度を得るために、実行した。図４は、図３Ｂで示した誘発応答の連続的な二次元電流源密度解析を図示している。図４の各パネルは、図３Ｂの垂直の破線で示した選定時間で、このスライスで算定した瞬間的なソースおよびシンクを図示している。このアレイは、図３Ａで示したようにして、このスライス上に配置した；海馬領域ＣＡ１の細胞体層は、各パネルの頂部からの進路の約４分の１で、ほぼ水平の曲線を規定している。これらの点線は、ＣＡ１の細胞体層（上部）および先端樹状領域の最も遠位にある伸長部（下部）を示している。下部にある目盛り棒で見えるように、灰色の電流ニュートラルバックグラウンドに対して、シンクは黒色であり、そしてソースは白色である。
【００５９】
初期線維ボレー（約１ミリ秒間続く）後、ＣＡ１の先端樹状突起での電流シンクは、およそ５ミリ秒間にわたって急速に上昇し（「６ｍｓ」と印したパネルを参照）、引き続いた５ミリ秒で低下し、その後、約１１ミリ秒で消失するが、刺激部位では、特異性を備えたパネルが現れる。約２ミリ秒の暫定期間（この間、電流は、ニュートラルバックグラウンドとは識別不能であった）の後、この先端樹状突起でソースが現れ（「１５ｍｓ」）、これは、さらに約１５〜２０ミリ秒間続いて、その後、およそ３５ｍｓで消失した。単一電極に由来の波形の時間経過および大きさ（図３Ｂ）は、図４の算定した電流源密度のシンク−ソース系列と密接に対応していることが分かる。
【００６０】
二次元電流源密度法により、他の手段では識別困難な電流ソースおよびシンクの空間的様相が明らかになる。その興奮性のシナプス後電流シンクは、Ｓｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ線維（これは、おそらく、初期電流パルス（３ｍｓ〜９ｍｓのパネル）により刺激されている）の領域において、ＣＡ１の先端領域にわたって展開する；次の電流ソースは、ほぼ同じゾーンを占めた（１５ｍｓ〜２７ｍｓのパネル）。この先端樹状突起で生じたシンクおよび次のソースの両方は、ＣＡ１の基底樹状領域（各パネルの上部近く）において、逆極性の電流を伴っていた。それゆえ、その主な誘発応答は、３〜９ミリ秒で生じた電流シンク−ソース双極子として特徴付けることができ、そして逆転して、１５〜２７ミリ秒の電流ソース−シンク双極子を形成する。このスライスには、他のそれより小さい電流が存在していたが、ここでは述べない。
【００６１】
短い休止期間の後、これらの樹状突起には、電流ソースが現れ、その中心は、この電流シンクの中心よりも僅かに遠位にある。この先端ソースは、約５０ミリ秒で、強まり、拡大し、散逸し、そして消失して、約５０ミリ秒の誘発応答「期間」となる。この先端シンクおよび次の先端ソースの両方は、ＣＡ１の基底樹状突起（各パネルの上部）で現れる逆極性領域を伴い、これは、この先端事象とほぼ同じ時間経過で、成長し散逸する。
【００６２】
ここで記述したように、エイリアスが原因のアーチファクトの導入を防止するために、これらの分析で実行されるアンチエイリアシングは、十分に高い空間周波数で、データ損失を引き起こす。そのフィルタリングは、せいぜい試料採取周波数の半分で、空間周波数を伴う現象だけを通す；本実施例では、その電極間距離は、１５０μｍであり、約３００μｍの幅（１５０μｍの半径）よりも小さい電流ソースまたはシンクの測定を防止する。これは、ＣＡ１の海馬領域のサイズについて、構造上の欠陥であり、この方法では、細かい空間的ディテールが失われると予想される。従って、この方法で測定したＣＳＤの空間解像度を検査することが有益である。
【００６３】
図５Ａおよび５Ｂは、測定領域において重ね合わせられたＣＡ１領域の先端樹状突起の境界を描写している。
【００６４】
図５Ａは、（図３Ａおよび３Ｂに由来の）アレイのスライスおよび位置を示す；右側には、指示した電極での刺激の６ミリ秒後、（図４に由来の）電極アレイの領域における瞬間的ＣＳＤがある。このアレイの上部は、ＣＡ１の基底樹状突起と一致している；このアレイの上部中心部は、ＣＡ１の先端樹状突起の領域を覆っており、そしてアレイの下部３分の１は、歯状回の上部ブレードを覆っている。その点線は、ＣＡ１の細胞体層（上部）および先端樹状突起領域の最遠位伸長部（下部）を示す。
【００６５】
図５Ｂで示すように、その主要測定電流シンク（黒色）は、先端樹状突起が生じる領域だけを占め、その相反電流ソース（白色、上部）は、基底樹状突起の領域でだけ生じた。（この刺激電極に対応している位置では、その算定画像において、電流の不在が現れた；その電極からは記録がなされず、得られたＣＳＤ処理では、ギャップが残った）。単一電極の刺激の６ミリ秒後、連続二次元電流源密度解析により、その生理学的応答を算定した（ネズミ色で示した）；この画像は、図４Ｂからの６ミリ秒フレームのクローズアップである。点線は、ＣＡ１の先端樹状突起領域の限界を示している。その誘発電流シンクの伸長部は、これらの先端樹状突起の限界と密接に対応していることが分かる。この刺激電極の部位では、この電流シンクにおいて、見かけホールが生じ、この場所では、記録は実行されず、電流源密度は算定されない。この細胞体層自体では、殆ど電流はなく、電流ソースは、この基底樹状突起で現れる（パネルの上部）。このＣＡ１樹状突起の先端チップでは、殆ど電流はなく（パネルの中間部）、歯状回の顆粒細胞の先端樹状突起では、ある程度弱い電流ソースが生じる。
【００６６】
算定したシンクの境界は、樹状領域の解剖学的な限界位置とは正確に一致せず、不正確は、この方法の解像度限界から生じ得ることが分かる。
【００６７】
（海馬内のカルバコール誘発β波の分布および電流ソース）
図６Ａは、海馬スライスおよびその下にある６４個の電極アレイの顕微鏡写真（「ブロードアレイ」）を含み、記録位置間は、４５０μｍである。海馬およびその下にある皮質の亜領域もまた、見られ得る。図６Ｂは、このスライスでの海馬の一部と接触している２０個の電極部位でのカルバコール誘発自然活性のスペクトルを示す。各ｘ軸は、１〜１００Ｈｚの対数目盛上にある。活性は、１０〜３０Ｈｚの周波数範囲で見られ、特に、ＣＡ１およびＣＡ３領域の先端樹状突起にあり、他の箇所では、活性レベルは低い。その目盛り棒は、５×１０−１１Ｖ２である。図６Ｃで分かるように、そのベースライン活性は、低電圧であり、一般に、振動活性を欠いており、亜領域間では、信頼できる差はなかった。
【００６８】
カルバコールの注入に続いて、ＣＡ１およびＣＡ３領域（これは、試験した５５個のスライスのうち４１個で、βバンド（１０〜３０Ｈｚ）内かそれに近かった）では、リズム活性が徐々に発生した（一例では、図６Ｄ）。４１個のスライスのうちの３４個は、ＣＡ１およびＣＡ３の両方の領域で、βバンド振動を有していた。残りの７個の場合、ＣＡ１またはＣＡ３のいずれかの領域では、そのθ範囲の上端において、低電圧活性が観察された。ＣＡ１対ＣＡ３の相対的なプロミネンス（ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）は、スライスにわたって一貫していなかった。歯状回では、高い振動周波数の活性もまた見られ、その構造体の外部ウイングよりも内部ウイングにおいて、そうであった（図６Ｂ、Ｄ）。図６Ｅは、このアレイの上部左電極でのカルバコール誘発活性のクローズアップを示し、これは、ＣＡ１領域の細胞体層にわたる極性の逆転を示している。図６Ｅでは、その目盛り棒は、０．１ｍＶ；２５０ミリ秒であった。図６Ｅのそれより高いゲイン記録で見られ得るように、錐体細胞領域では、その波は、基底樹状突起よりも先端において大きく、典型的には、２個の部位間で位相の逆転があった。
【００６９】
カルバコール誘発リズムの周波数および分布の定量的分析のために、高速フーリエ変換を使用した。図６Ｂに図示される例について、スペクトルにおける大部分の出力（ｐｏｗｅｒ）は、２０Ｈｚに明確なピークを伴って、１０Ｈｚと３０Ｈｚとの間に見出された。全てのスライスについての主ＣＡ１周波数の群平均は、１８．８±５．７Ｈｚ（平均±標準偏差）であり、βの場合単独については、１９．２±４．８Ｈｚであった。ＣＡ３についての等価な値は、１６．４±５．７Ｈｚおよび１７．３±４．２Ｈｚであった。ＣＡ３とＣＡ１との差は、統計学的有意に達しなかった。１０〜３０Ｈｚ帯における最大の出力を記録した部位は、ＣＡ３領域およびＣＡ１領域の先端樹状突起、代表的には、より遠位の領域に位置していた。
【００７０】
図７Ａに示され得るように、１５０μｍの間隔の空いたアレイ（「濃密アレイ」）は、リズム活動のより細かい空間解像度を与えた。ＣＡ３／ＣＡ１境界上に集中した記録は、遠位から近位への次元において絶対電位の驚くほど急な傾斜を示し、最大の電位は、ＣＡ３ａ領域およびＣＡ３ｂ領域の分子層に対応する別個の領域を占めた（図７Ｂ）。電位が細胞層境界を横切って逆転することに注目すべきである（例えば、図７Ｂの左上欄を参照のこと）。少ないがなお実質的な電圧帯がまた、ＣＡ１に存在する。全てのチャンネルについての周波数スペクトルを、図７Ｃに示す。
【００７１】
連続２次元電流源密度解析法を行い、これらのコリン作動性誘発振動のソースをさらに規定した。図８は、図７に示される濃密アレイの同一の自発的活動の間、任意に選択された開始時間である０から４ミリ秒の間隔で、瞬間的なソース（白）およびシンク（黒；灰色の中性バックグラウンドに対して）を図示する。ＣＡ３およびＣＡ１の顆粒細胞領域および錐体細胞領域の輪郭およびその先端樹状突起の範囲を、この期間に起こる事象の位置を図示するために重ねる。アレイは、歯状回の上部ブレード（ｂｌａｄｅ）の一部を含む。各フレームは、電極アレイの領域における瞬間的な計算電流源密度を示す。任意に選択された開始点から、シンクはＣＡ３領域とＣＡ１領域との間の境界の先端樹状突起に現れ、付随するソースは、基底樹状突起における細胞境界層にまたがって現れる。先端ＣＡ１における大きなシンクは、ＣＡ１の基底樹状突起におけるソースを伴う。このシンクおよびその付随する基底ソースは、およそ１２ミリ秒間にわたり増強および拡大し、そして最初に出現しておよそ１６ミリ秒後までにおよそベースラインレベルまで、両方とも減退する。活動がバックグラウンドと区別されない間の短い合間の後、ソースは約２０ミリ秒で先端樹状突起中に現れ、対応するシンクは基底樹状突起に現れる。これらは、およそ２０ミリ秒後までに散逸する前に、拡大および増強し（４０ミリ秒）、この後、先端シンクが再出現し、サイクルを再び開始する。ソース（およびその付随する双極子）は、散逸する前におよそ２０ミリ秒間持続した。１５０μｍの電極間間隔の解像度の範囲内で、先端ソースは、その中心が、先端ソースの前方に有る、より局所的な（ｍｏｒｅ  ｆｏｃａｌ）先端シンクの中心より遠位に位置しているようであることに注目するべきである。シンク−ソース双極子は、反復し（ｒｅｃｕｒ）そして図７Ｃに示される周波数プロットを生じ；この反復する先端シンク−ソース双極子のピークからピークまでの時間経過は、約４０ｍｓｅｃであり、約２５Ｈｚの周波数と一致した。
【００７２】
図９Ａおよび９Ｂは、スライスにおけるカルバコールにより誘発される反復振動の代表的な記録を示す。ソース−シンク双極子およびシンク−ソース双極子、ならびにインビトロニューロン試料の錐体細胞体層に沿ったソースとシンクとの間の鋭く明確な境界は、１つの先端シンクから先端ソースを通って次の先端シンクまでの潜伏性のように、多くの実験にわたって繰り返される特徴であった。
【００７３】
図９Ａは、幅広（電極間間隔４５０μｍ）のアレイ上の海馬スライスを示す。錐体細胞領域の基底樹状突起応答を測定するために使用される電極は、淡灰色で示され；先端樹状突起応答を測定するために使用される電極は、暗灰色で示される。図９Ｂは、先端樹状突起領域（黒）および基底樹状突起領域（淡灰色）からの平均応答が、図９Ａのスライスについて５００ｍｓｅｃ（０．５秒）の経過時間にわたって示されるということを示す。カルバコール誘発（２０μＭ）振動は、この代表的な応答におけるように、全てのサンプリングした期間にわたって持続された。平均先端応答および平均基底応答は、極性が逆であり；すなわち、位相が１８０度ずれている。ＣＡ３およびＣＡ１の細胞体層を横切る交互の電流ソース−シンク双極子の持続した出現（１０〜３０Ｈｚ（β）の範囲内）が、スライスの大部分およびサンプリングした期間の大部分において強く観測された。
【００７４】
距離が１５０μｍのアレイを使用した以前の電流源密度の例とは反対に、４５０μｍの電極間間隔を有する電極アレイを使用する連続２次元電流源密度解析法を用いて、より大きな面積にわたってシンクとソースとの間のシフトを評価した。生じたエイリアスおよびアンチエイリアシング（図２を参照のこと）は、必然的に解像度のさらなる損失を伴い；４５０μｍの電極間間隔および付随するアンチエイリアシングについては、確実に画像化し得る最小の事象は、４５０μｍ以上の半径（直径９００μｍ以上）を有する事象である。
【００７５】
図１０は、４２ｍｓｅｃにわたる電流源密度の計算した漸進的変化を示す。各フレームは、幅広（４５０μｍ間隔）アレイでの自発的活動の記録の間の、特定の時点（各フレームの左上の角にミリ秒で示される）における計算された電流源密度を示す。黒は、シンクの最大の大きさを示し；白は、ソースの最大の大きさを示す。錐体細胞領域および顆粒細胞領域の位置を示す。
【００７６】
任意に選択された時間０ｍｓｅｃで生じ、ＣＡ３領域の先端樹状突起における弱い電流源は、錐体細胞層に中心のある拡散したソースにより取り囲まれる。ＣＡ３領域の先端樹状突起または近位放線状層（ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ）における強い局所的シンクは、約６ｍｓｅｃに生じ、それに伴いＣＡ３の細胞層および基底樹状突起層におけるソースも生じる。このシンクが発達し、ＣＡ３ｂ上に中心のある完全に発達したシンク−ソースの関係が、９ｍｓｅｃの時点で明らかになる。このシンクはＣＡ１領域に向って拡大し始める前のおよそ１２ｍｓｅｃを通して存続する。先端ＣＡ３におけるシンクは、およそ１８ｍｓｅｃで散逸し、次いで約３ｍｓｅｃ後にＣＡ１における先端シンクが散逸し、これに伴い明白な細胞体／基底樹状突起ソースが１５ｍｓｅｃで出現した。この時点までにＣＡ３におけるシンク−ソースの関係が崩壊し始めていたことに留意すること。基底ソースは、それに付随する先端シンクとほぼ同時に散逸する。先端ソースは、約２４ｍｓｅｃにＣＡ３において生じ、それに伴い数ミリ秒以内にＣＡ３において弱い基底ソースが生じ；次いで先端ソースは、ＣＡ１における基底シンクを伴って、ＣＡ１に向って拡大する。次いでこれらのソース−シンク対は、約１５〜２０ｍｓｅｃ後に散逸する。このようなサイクルは、このスライスにおいて不規則に繰り返す。波は、約１０ｍｓｅｃ続く強い先端樹状突起シンク、次いでこの期間の約２倍の間続く先端ソースを含んでいた。これらの事象は、ＣＡ３で始まり、そして３〜５ｍｓｅｃ以内にＣＡ１において見られた。要約すると、コリン作動性誘発β範囲リズムは、先端樹状突起に位置し、かつより近位に位置する電流シンクよりも通常より明確な電流源を有する。
【００７７】
これらの観察は、比較的短い先端シンクが、より長く持続する先端ソース間に挿入されるということを示した。平均電流の試験は、海馬の錐体細胞細区画にわたるソースおよびシンクの分布が、スライス間で変化することを実証した。事象がＣＡ１に対してＣＡ３に集中する程度の大きな差を伴い、連続する電流ソース密度の解析において、スライス間の変動性がまた存在した。しかし、先端樹状突起についての短い先端シンク−より長い先端ソースの連続は、β範囲の振動を示す全てのスライスにおいて顕著であった。
【００７８】
（カルバコールは、海馬後部（ｒｅｔｒｏｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ）皮質において４０Ｈｚリズムを誘発する）
電極アレイが、海馬自身の錐体細胞領域に沿った海馬後部皮質領域のかなりの部分の下に位置付けされたスライスを精密に調べることにより、カルバコールにより惹起されるリズムが局所的に差異を生じるか否かという疑問に取り組んだ。図１１Ａは、幅広アレイ上の皮質−海馬の顕微鏡写真を示す。目的の２つの部位−−ＣＡ１中の部位（１００）および内側嗅皮質の深層の部位（１０２）を示す。ＣＡ１領域および内側嗅皮質において示された位置からの、カルバコール（５０μＭ）誘発速波を、図１１Ｂと比較した。出力値は、図面に１０−１１倍で示す。図１１Ｂに示され得るように、内側嗅振動は、海馬からの振動よりも高い周波数を有する。高速フーリエ変換は、皮質における主要な周波数は、ＣＡ１領域における周波数の約２倍であることを示した。２０Ｈｚ付近にピークを有するリズム活動は、海馬錐体細胞領域の先端樹状突起を通して見出され、一方４０Ｈｚの活動は、内側嗅部位と関連した。４０Ｈｚの振動が、内側嗅（ｍｅｄｉａｌ  ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）皮質の深層に中心が有るということもまた観察された（図１１Ｂにおける右上のスペクトル）。海馬と内側嗅皮質との間にある領域は、両方のピークを示した。実際、４０Ｈｚ対２０Ｈｚの相対バランスは、海馬後部皮質に含まれる一連のステップにわたる順序正しい様式で増加するようである。４０Ｈｚ活動を、適切に電極を位置付けされた１５個のスライスの各々において内側嗅皮質の深層で記録した；それにより、これはコリン作動性刺激に対するこの領域の特徴的な応答であるように思われる。全ての記録部位についての結果を、図１１Ｃ（スライスにおける代表的な活動の分布（較正線：０．１ｍＶ，５００ｍｓｅｃ））および図１１Ｄ（スライスにおけるローパス（０〜１００Ｈｚ）フィルターした出力のスペクトル（較正線：２×１０−１１Ｖ２））に要約する。
【００７９】
（カルバコール誘導β波に関与する送信系）
カルバコール誘発高周波数リズムを、２０μＭのアトロピンで完全に消去し、そしてＡＭＰＡレセプターアンタゴニストＣＮＱＸ（２０μＭ）でかなり減少した。ビククリン（１０μＭ）の存在下で、ムスカリン様刺激は、三角骨（ｐｙｒａｍｉｄａｌｅ）層において高周波スパイクを生じ、そしていくつかの例ではてんかん様放電を生じたが、リズム活動は、存在しなかった。これらの条件下で、カルバコールは、繰り返しバースト挙動および時々の発作を開始した。てんかん様バースト間の間隔は、θ波の期間に近づくこともあった（データは示さず）。これらの発作は、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＫａｕｓｅｒ（１９９７）により報告される活動に類似していた。
【００８０】
（錐体細胞の順方向活動は、先端樹状突起においてβ様活動を誘発する）
先端ソースの原因であるＧＡＢＡ作動性細胞がどのように活性化されるかは、β振動の起源を理解するために明らかに重要である。錐体細胞側副枝が関与する場合、繰り返しスパイクを引き起こすのに十分な順方向刺激は、カルバコール惹起リズムが見出される領域においてβ様活動の出現を生じる。Ｓｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ線維の単一パルス刺激は、典型的には、繰り返しスパイクを引き起こさない。なぜならば、（ｉ）放線状層における強力なフィードフォワード樹状突起阻害が、興奮性電流の分路を作るからであり、そして（ｉｉ）体細胞周囲（ｐｅｒｉｓｏｍａｔｉｃ）阻害が繰り返し放電を防ぐからである。ＧＡＢＡａレセプタープールを部分的にブロックする濃度のビククリンを、これらの阻害性応答を低減し、それにより順方向刺激に応じて錐体細胞が４〜５回のスパイクを放出することを可能にするために使用した。
【００８１】
図１２Ａ〜１２Ｄは、ＣＡ３領域の順方向活動により惹起されるβ様活動の２次元電流源密度解析法を示す。図１２Ａは、ＣＡ３領域に中心のある、海馬スライスに対するアレイ（電極間間隔１５０μｍ）の位置を示す。無地色で示される電極（１０６）において刺激を誘発し、そして取り囲む電極（１０８）において記録した。以下に示すように、図１２Ｂは、ＣＡ３領域の順方向刺激に対する代表的な応答を示す。この応答は、スパイクの小さなバースト、次いで約３０〜４０ｍｓｅｃ持続する正方（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｇｏｉｎｇ）波を示す。矢印は、ピークシンク（５３ｍｓｅｃ）およびピークソース（８３ｍｓｅｃ）を示す。図１２Ｃは、スライスにおける出力スペクトルの分布を示し：最大の応答はＣＡ１の先端樹状突起ならびにＣＡ３の先端および近位の樹状突起にある。フーリエ変換は、この応答についての周波数スペクトルが、１５〜２０Ｈｚおよび１００〜２００Ｈｚにピークを有することを示した（図１２Ｃ）；使用される対数スケールが１〜１０００に及ぶことに留意すること。図１２Ｄは、２つの時点（刺激後５３ｍｓｅｃおよび８３ｍｓｅｃ、矢印で示される）での２次元瞬間電流源密度解析を示す。１５〜２０Ｈｚの成分は、遠位先端樹状突起において顕著であり、そしてカルバコール誘発β波についての分布と同様の分布を有していた。５３ｍｓｅｃにおいて、生じた電流シンクは、そのピークにあり、そして基底樹状突起における対応するソースと共に、主にＣＡ３の先端樹状突起に現れることが分かる。８３ｍｓｅｃにおいて、リバウンドソースピークはまた、基底樹状突起における対応するシンクと共に、ＣＡ３の先端樹状突起に現れることがまた、分かる。
【００８２】
図１２Ｂに記載される型の応答は、ビククリン濃度に感受性であり、そして２０μＭのビククリンでブロックされた。遅くに生じた応答の電流源密度解析は、三角骨層の約２００〜４００μｍ上の放線状層において、門（ｈｉｌｕｓ）付近の刺激部位からＣＡ１に向って延びるソースを示す；これは、細胞体および基底樹状突起における高密度シンクと平行していた。
【００８３】
（ベンゾジアゼピン同定および特性付け）
図１３Ａ〜１３Ｃは、カルバコール誘発β波に対するベンゾジアゼピンの効果を示す。図１３Ａ（２０μＭカルバコール単独）と図１３Ｂ（カルバコールおよび３μＭのジアゼピンを用いた同じスライス）の比較において見られ得るように、ベンゾジアゼピンは、β振動の振幅を顕著に増大させた。フーリエ変換は、増加した振幅にこの波の周波数における有意な変化が伴わないことを示した。リズム活動は、大きく増大され、そして比較的に不活性な領域に広がる（図１３Ａおよび１３Ｂについての較正線：０．２ｍＶ、５００ｍｓｅｃ）。
【００８４】
図１３Ｃは、海馬内の記録位置についての周波数スペクトルを要約し、そしてジアゼパムの非存在下（黒）および存在下（灰色）での出力スペクトルの重ね合わせを示す。このことは、ジアゼパム（灰色スペクトル）が、周波数が多く変化することなく、２０Ｈｚバンド内でカルバコール単独（黒スペクトル）に対して出力のおよそ３倍の増加を引き起こしたことを示す。さらに、ジアゼパムの添加により、より高い（約４０Ｈｚγ）周波数にピークが加えられる（較正線：５μＶ）。
【００８５】
さらに、表１は、カルバコール誘発高周波数リズムがジアゼパムの注入の前に存在した８つの実験の結果を要約する。ピーク周波数における出力の増加は、ＣＡ３について３２１±１７０％であり、そしてＣＡ１について２１７±１３７％であった。ジアゼパムのスライス内における効果を、相関させ（ｒ＝０．９３）、そしてＣＡ３における増加は、ＣＡ１における増加よりも統計学的に大きかった（ｐ＜０．０５、対ｔ−検定、すそ（ｔａｉｌ）２）。ジアゼパム後の振動の周波数を、カルバコール単独下で記録された振動と、スライスにわたって相関させた（ＣＡ３：ｒ＝０．８５；ＣＡ１：ｒ＝０．９６）。
【００８６】
（表１．カルバコール誘発高周波数リズムが、ジアゼパムの注入の前に海馬スライスに存在した８つの実験の要約。ＣＡ３領域およびＣＡ１領域におけるピーク周波数での出力の最大増加パーセントが示される。）
【００８７】
【表１】
0003617972.tif 000002
示されるように、ベンゾジアゼピンのクラスの化合物のメンバーの適用は、β振動の振幅を顕著に増大した。図１４Ａ〜Ｃおよび１５Ａ〜Ｃに示される結果について、カルバコール単独ならびにカルバコールおよび２つの型のベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉｚｅｐｉｎｅ）を用いたそれぞれの試料について電位を測定した（１つの例は、３μＭのジアゼパム（図１４Ａ〜Ｃ）であり、そして別の例は、２０μＭのフルラゼパム（図１５Ａ〜Ｃ）であった）。
【００８８】
図１４Ａは、ＭＥＤアレイの頂上に置いた海馬スライスの顕微鏡写真である。同様に、図１５Ａは、ここで使用されるＭＥＤアレイの頂上の海馬スライスの顕微鏡写真である。電極間距離は、４５０μｍであった。両方のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果が（それぞれ図１４Ｂおよび１５Ｂにおける、淡灰色の、バックグラウンドにおける有意な解剖学的境界と共に）示される。同様に解析されたデータは、ベンゾジアゼピン注入データの増加した振幅が、波の周波数における有意な変化を伴わないことを示す。図１４Ｃおよび１５Ｃにおいて見られるように、両方のベンゾジアゼピンは、２０Ｈｚ帯内の出力においておよそ３倍の増加をもたらした。ピーク周波数における出力の増加は、約３００％であった。
【００８９】
（アンパカイン（ａｍｐａｋｉｎｅ）同定および特徴付け）
この実施例において、広い間隔のＭＥＤを海馬試料に使用した（それぞれ図１６Ａおよび１７Ａに、下に置かれた微小電極とともに示される）。カルバコール単独、その後１０μＭのアンパカインを用いたサンプルについて、再び電位を測定した（図１６Ａ〜ＣにおけるＣＸ６１４および図１７Ａ〜ＣにおけるＣＸ６９１）。両方のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果を、（淡灰色の、バックグラウンドにおける有意な解剖学的境界と共に、そしてデータに相関させて）それぞれ図１６Ｂおよび１７Ｂに示す。得られたデータは、アンパカイン注入データの増加した周波数はまた、波の振幅における有意な変化を伴っていたことを示す。具体的には、図１６Ｃおよび１７Ｃは、特定の選択された記録位置についての周波数スペクトルを要約する。これは、アンパカインが２０Ｈｚ帯（矢印）内の出力の有意な増加をもたらしただけでなく、ピークの１０Ｈｚシフトを生じたことを示す。
【００９０】
アンパカインは、同期性（ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ）の顕著な減少および１０Ｈｚよりわずかに大きい二次ピークを生じた。得られたデータは、アンパカイン注入データの減少した振幅が、波の周波数におけるわずかに低いシフトを伴うことを示す。構造的に異なるアンパカインの両方が、２０Ｈｚ帯内の出力の有意な減少だけでなく、ピークの１０Ｈｚシフトを生じた。示されるように、二次ピークは、アンパカイン前のベータリズムのＣＡ１鉤状回局在化と反対に、歯状回およびＣＡ３領域に中心があるようであった。
【００９１】
（ＧＡＢＡアンタゴニスト同定および特性付け）
ＧＡＢＡ作動性レセプターのアンタゴニストは、顕著な減少および複雑なスパイクで中断される脱同期化活動をもたらした。図１８Ａ〜Ｃおよび１９Ａ〜Ｃは、それぞれ、カルバコール誘発β波に対するビククリンおよびピクロトキシンの効果を示す。
【００９２】
図１８Ａは、ＭＥＤアレイの頂上に置かれた海馬スライスの顕微鏡写真である。同様に、図１９Ａは、そこで使用されるＭＥＤアレイの頂上の海馬スライスの顕微鏡写真である。電極間距離は、４５０μｍであった。カルバコール単独、続いて２つの列挙された型のＧＡＢＡ作動性アンタゴニスト（１０μＭビククリン（図１８Ａ〜Ｃ）および５０μＭのピクロトキシン（図１９Ａ〜Ｃ））を用いた試料について電位を測定した。
【００９３】
両方のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果を、（淡灰色の、バックグラウンドの有意な解剖学的境界と共に、そしてデータと相関させて）それぞれ図１８Ｂおよび１９Ｂに示す。得られたデータは、アンタゴニスト注入データの振幅が、ＧＡＢＡ作動性アンタゴニストのいずれかの投与後に顕著に減少することを示した。このアンタゴニストは、２０Ｈｚ帯内の出力の有意な減少をもたらしただけでなく、遅い成分（これは、複雑なスパイクからなる）も生じた。これらのスパイクは、ＣＡ１、鉤状回および皮質に中心があるようであった。図１８Ｃおよび１９Ｃは、図１８Ｂおよび１９Ｂからの選択されたデータを示す。
【００９４】
（ＡＭＰＡアンタゴニスト同定および特性づけ）
ＡＭＰＡ型グルタミン酸レセプターの構造的に異なるアンタゴニストは、予めカルバコールで処理されたインビトロのニューロン試料における同期性活動の急速な損失を引き起こした。カルバコール単独、およびその後３つの型のグルタミン酸アンタゴニスト（一例は２０μＭのＣＮＱＸ（図２０Ａ〜Ｃ、１つは２０μＭのＤＮＱＸ（図２１Ａ〜Ｃ）および他は１０μＭのＮＢＱＸ（図２２Ａ〜Ｃ））を用いた試料について電位を測定した。各々のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果を、（淡灰色で、バックグラウンドにおける有意な解剖学的境界と共に、そしてデータに相関させて）図２０Ｂ、２１Ｂおよび２２Ｂに示す。得られたデータは、アンタゴニスト注入試料の振幅データが有意に減少されたか、および／または消去されたことを示す。これら３つのアンタゴニストは、出力の有意な減少を生じた。図２０Ｃ、２１Ｃおよび２２Ｃは、図２０Ｂ、２１Ｂ、および２２Ｂからの選択されたデータを示す。
【００９５】
（要約）
図２３は、ニューロン組織への種々の神経薬理活性物質の添加により引き起こされる誘発電位における相対的な差を、定性的様式で示す。これらの相対的差の観測または定量は、種々の機能的グループ分けおよび例えば以下のグループの特異的メンバーの検出および特性付けを可能にする：
１．ＧＡＢＡアンタゴニスト（例えば、ビククリン、□−ヒドラスチン、ピクロトキシン、ＳＲ−９５５３１（ガバジン（Ｇａｂａｚｉｎｅ）））
２．ＡＭＰＡアンタゴニスト（例えば、ＣＮＱＸ、ＤＮＱＸ、ＧＹＫＩ  ５２４６６ＨＣＩ、ジョロウグモ毒素、１−ナフチル−アセチルスペルミン、ＮＳ２５７、ＮＢＱＸ
３．ベンゾジアゼピン（一般的に、強力な催眠作用および鎮静作用を有する化学的に類似の向精神薬のグループのいずれか；抗不安薬および催眠薬として広く使用される）例えば、アルプラゾラム、クロラゼパート、テマゼパム、フルラゼパム、クロルジアゼポキシド（Ｃｈｏｌｒｄｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）、ジアゼパム、オキサゼパム、メダゼパム、ロラゼパム、フルトラゼパム、フルジアゼパム、アルプラゾラム、オキサゾラム、クロチアゼパム、エチゾラム、フルラゼパム、Ｈｌｏｘａｚｏｌａｍ、エスタゾラム、ニトラゼパム、ニメタゼパム、フルニトラゼパム、トリゾラム（Ｔｒｉｚｏｌａｍ）、Ｒｉｍａｚａｆｏｎｅ、フルマゼニル、ブロマゼパムなど
４．アンパカインのようなＡＭＰＡレセプターモジュレーター（ベンゾイルピペリジン薬物（ＢＤＰ））：ＣＸ５１６（ＢＤＰ−１２）、ＣＸ５５４（ＢＤＰ−２０）、ＣＸ６１４、ＣＸ６９１、ピラセタム様ヌートロープ（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ）−アニラセタム、ネフィラセタム（ｎｅｆｉｒａｃｅｔａｍ）など
５．抗精神病薬（一般的に、例えば、フェノチアジン誘導体、チオキサンテン誘導体、ブチロフェノン誘導体（ドーパミンレセプターアンタゴニスト）、イミノジベンジル誘導体、ジベンゾチアゼピン（Ｄｉｂｅｎｚｏｔｔｈｉａｚｅｐｉｎｅ）誘導体、ベンズアミド誘導体、チエピン（Ｔｈｉｅｐｉｎｅ）誘導体、ベンゾイソオキサゾール誘導体（セロトニンおよびドーパミンアンタゴニスト）および具体的には以下のような抗精神病薬：カルバマゼピン、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、ジバルプロエートナトリウム（ｄｉｖａｌｒｏｅｘ  ｓｏｄｉｕｍ）、フルフェナジン、ハロペリドール、炭酸リチウム、炭酸リチウム、クエン酸リチウム、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン（ｏｌａｎｚａｐｉｎｅ）、ペルフェナジン、ピモジド、クエチアピン（ｑｕｅｔｉａｐｉｎｅ）、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン（ｔｈｉｏｔｈｉｘｅｎｅ）、トリフロペラジン、およびトリフロプロマジン）
６．抗うつ薬（一般的に、例えば、三環式抗うつ薬および四環式抗うつ薬、選択的セロトニン再取込みインヒビター（ＳＳＩＲ）、セロトニンおよびノルエピネフィリン再取込みインヒビター、およびモノアミン酸化（ｏｘｉｄｉｚｅ）インヒビター、ならびに具体的には以下のような抗うつ薬：アミノケトン、アミトリプチリン、アモキサピン、アムフェブタモン（ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ）、ドキセピン、デシプラミン、クロミプラミン、フルオキセチン、フルボキサミン、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェニルピペラジン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシクロプロミン、トラゾドン、チアゾロピリジン、トリミプラミン、およびベンラファキシン
７．中枢神経系刺激剤（一般的に、例えば、キサンチンおよびアンフェタミン、ならびに具体的には以下のような中枢神経刺激剤：デキストロアンフェタミン、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ、メタンフェタミン、メチルフェニデート、メチルフェニデート、およびペモリン）
８．鎮痙薬（一般的に、例えば、バルビツレート、オキサゾリジンジオン誘導体、カルボニックアンヒドラーゼインヒビター、ベンゾジアゼピン、およびＧＡＢＡトランスアミナーゼインヒビター；具体的には、例えば、カルバマゼピン、クロバザム、デジナミド、ジバルプロエートナトリウム、フェルバマート、フルナリジン、ホスフェニトイン、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、ミダゾラム、ミラセミド、ＭＫ−８０１、オクスカルバゼピン、フェノバルビタール、プリミドン、プロガビド、スチリペントール、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、トピラマート、バルプロ酸、ビガバトリン、およびゾニサミド。
９．抗不安薬（一般的に、例えば、抗ヒスタミン薬、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、β−遮断薬、ブスピロン、プロパンジオール、選択的セロトニン再取込みインヒビター（ＳＳＩＲ）、セロトニンレセプターアゴニスト、および三環式抗うつ薬；具体的には、例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロミプラミン、クロラゼパート、ジアゼパム、フルオキセチン、フルボキサミン、ハラゼパム、ロラゼパム、メプロバメート、オキサゼパム、フェノバルビタール、Ｐｉｐｅｒ、Ｐｉｐｅｒ  ｍｅｔｈｙｓｔｉｃｕｍ、プラゼパム、およびプロプラノロール。
１０．催眠薬（一般的に、催眠薬は、睡眠または催眠に適切な薬物であるか、または求心性心尖部拍動を阻害するか、もしくは脳の皮質中心における間隔印象の受容を阻害して、部分的または完全な無意識を引き起こすことにより、疼痛に対する無感覚を引き起こす薬剤である）。催眠薬は、一般的に、鎮静薬、鎮痛薬、麻酔薬、および酔わせる物質を含み、そして睡眠を誘導するのに使用された場合、催眠薬（ｓｏｍｎｉｆａｃｉｅｎｔ）および催眠薬（ｓｏｐｏｒｉｆｉｃ）とよばれることもある。具体的な催眠薬としては、脂肪族アルコール、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ、メラトニン、特定の非バルビツレート、Ｐｉｐｅｒ、Ｐｉｐｅｒ  ｍｅｔｈｙｓｔｉｃｕｍ、Ｖａｌｅｒｉａｎａ、およびＶａｌｅｒｉａｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓが挙げられる。
１１．麻酔性鎮痛薬（例えば、オピオイドレセプターアンタゴニストおよび具体的には、例えば、ヘロインおよびモルヒネ）。
１２．ドーパミン作動性薬剤（例えば、アマンタジン、ベンツアトロピン（ｂｅｎｚｔｒｏｐｉｎｅ）、カルビドパ／レボドパ、およびトリへキシフェニジル）
【００９６】
【表２】
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添付の図面は、本発明の原理を例示および説明する。これらは、いかなる方法でも、本発明の範囲を限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、低解像度で測定された画像を描く際の「エイリアシング」の現象を示す。
【図２】図２は、アンチエイリアシングの効果を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、各々、８×８の検出器アレイ上の海馬スライスの配置、およびそれらの電極の１つにおいて誘起されたシナプス後応答を示す。
【図４】図４は、図３Ａおよび３Ｂにおけるスライスの配置から計算された、誘起された応答の連続する二次元電流源密度解析を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、計算された生理学的現象の、既知の解剖的構造とのアラインメントを示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、海馬スライスの顕微鏡写真および海馬内のカルバコール誘導β波の分布を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、高密度微小電極アレイで測定した、海馬におけるカルバコール誘導β波を示す。
【図８】図８は、図７Ａに示されるスライスについての、カルバコール誘導活性の電流源密度解析を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、先端樹状突起および基底樹状突起における、カルバコール誘導反復振動の関係を示す。
【図１０】図１０は、特定の時間にわたる電流源密度の計算された漸進的変化を示す。
【図１１】図１１は、海馬および皮質における、２つの異なるカルバコール誘導リズムを示す。
【図１２】図１２は、ＣＡ３領域の順方向活性化により誘起された、β様活性の二次元電流源密度解析を示す。
【図１３】図１３は、カルバコール誘導β波に対するベンゾジアゼピンの影響を示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するジアゼパムの影響を示す。
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するフルラゼパムの影響を示す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するアンパカイン（ａｍｐａｋｉｎｅ）（ＣＸ６１４）の影響を示す。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するアンパカイカイン（ＣＸ６９１）の影響を示す。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するビククリンの影響を示す。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するピクロトキシンの影響を示す。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＣＮＱＸの影響を示す。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＤＮＱＸの影響を示す。
【図２２】図２２Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＮＢＱＸの影響を示す。
【図２３】図２３は、本発明のプロセスに従う、神経組織への特定のクラスの神経活性剤の添加の前後の振動リズムの比較の予測した結果を広範に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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