(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレポネーマ・ソクランスキー16S rRNA遺伝子に由来するDNA断片を特異的に増幅し得るPCR用プライマーセットであって、前記プライマーセットの一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー16S rRNA遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列のうちの少なくとも15塩基部分を含んでなるプライマーであるプライマーセット。
【請求項２】
前記一方のプライマーが、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列のうちの18〜22塩基部分を含んでなるプライマーである請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記一方のプライマーが、配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるプライマーである請求項１記載のプライマーセット。
【請求項４】
前記プライマーセットの他のプライマーが、配列番号３記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列により表される請求項１〜３いずれか１項記載のプライマーセット。
【請求項５】
以下の工程：
（ａ）対象動物からDNAを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いたPCRを行う工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程、
を含んでなることを特徴とする、トレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病原菌トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出できるＰＣＲ用プライマーセット、及び該ＰＣＲ用プライマーセットを利用したトレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト口腔スピロヘータは、ヒト口腔内に生息するらせん状のグラム陰性嫌気性細菌で、スピロヘータ目、スピロヘータ科、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）に属する細菌の総称である。ヒトにおいては歯の支持組織である歯肉、歯根膜、歯槽骨及びセメント質が傷害又は破壊される歯周疾患の原因菌の一つと考えられている。口腔スピロヘータは、極めて厳密な栄養要求性をもつため、その培養には高度の嫌気度が必要であり、人工培養に成功した菌種は数少ない。
【０００３】
これまでに人工培養に成功した報告例としては、トレポネーマ・アミロボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｍ）、トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・マルトフィラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｕｍ）、トレポネーマ・メディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｍｅｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）、トレポネーマ・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）及びトレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）が挙げられる。
これらの人工培養可能菌のうち、トレポネーマ・ソクランスキーは、歯周病患者から高頻度に分離される菌種であり、本菌を迅速かつ精度よく検出・同定することは、歯周病の発生機序の解明や歯周病の治療法・予防法を開発する上で非常に重要であると考えられる。
【０００４】
現在のところ、トレポネーマ・ソクランスキーを迅速かつ精度よく検出・同定できる方法は開発されておらず、トレポネーマ・ソクランスキーの培養後、その生理的・生化学的性状に基づいてトレポネーマ・ソクランスキーを検出・同定するほかなかった。しかし、この方法では、トレポネーマ・ソクランスキーの培養に特別な栄養素を添加した特製培地や特別な培養装置が必要であり、さらに、培養後にトレポネーマ・ソクランスキーを検出・同定するために多くの生理的・生化学的性状を調べる必要があるため、多大な労力と時間を要し、精度の点からも問題があった。
そこで、トレポネーマ・ソクランスキーを迅速かつ精度よく検出・同定できる方法の開発が切望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トレポネーマ・ソクランスキーを迅速かつ精度よく検出・同定できる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、トレポネーマ・ソクランスキーに属する数種の菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定することに成功した。そして、これらの菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列及び１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析の結果に基づいて、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株は共通に有するが、トレポネーマ・ソクランスキーに属しない菌株は有しない塩基配列からなる部分、すなわち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分を明らかにした。
【０００７】
そして、この塩基配列に基づいて、トレポネーマ・ソクランスキーの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るプライマーセット作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセット。
（２）前記プライマーセットの一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなる、前記（１）記載のプライマーセット。
【０００９】
（３）前記プライマーセットの一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなる、前記（１）記載のプライマーセット。
（４）前記プライマーセットの一方のプライマーが、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列のうちの少なくとも１５塩基部分を含んでなる、前記（１）記載のプライマーセット。
【００１０】
（５）前記プライマーセットの一方のプライマーが、以下の（ａ）又は（ｂ）により表される前記（１）記載のプライマーセット。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した塩基配列であって、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列
【００１１】
（６）以下の工程：
（ａ）対象動物からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のプライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程、
を含んでなることを特徴とする、トレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセットである。
本発明のＰＣＲ用プライマーセットの各プライマーの塩基配列は、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得る限り、特に限定されない。
【００１３】
ここで、「トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片」とは、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合に増幅されるＤＮＡ断片をいい、「トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得る」とは、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合のみ、増幅断片が得られ、それ以外のものを鋳型とした場合には、増幅断片が得られないことをいう。
【００１４】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットとしては、一方のプライマーが、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなり、他方のプライマーがトレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列からなるＰＣＲ用プライマーセットを例示できる。
【００１５】
ここで、「トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分」とは、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株は共通に有するが、トレポネーマ・ソクランスキーに属しない菌株は有しない塩基配列部分をいい、例えば、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分を例示できる。
従って、本発明のＰＣＲ用プライマーの一方のプライマーとしては、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列からなるものを例示できる。
【００１６】
このようなプライマーの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列に基づいて決定することができる。この際、プライマーの塩基配列に、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列の全部又は一部が含まれるようにする。配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列の一部は、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列のどの部分であってもよく、当該一部の塩基数は特に限定されないが、１５〜３３塩基が好ましく、１８〜２２塩基がさらに好ましい。また、当該一部は、プライマーの塩基配列のどの部分に含まれてもよく、プライマーの塩基配列のうち、当該一部以外の塩基配列は特に限定されない。また、プライマーの塩基数は、１５〜３５塩基とするのが好ましく、１８〜２２塩基とするのがさらに好ましい。また、プライマーのＧＣ含量は、５０〜６０％とするのが好ましく、プライマーのＴｍ値は、５０〜６０℃とするのが好ましい。
【００１７】
配列番号１記載の塩基配列に基づいて決定したプライマーしては、配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるプライマーを好ましいものとして例示できる。
配列番号２記載の塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち、１番目の塩基から２０番目の塩基までの部分と同一の塩基配列である。従って、配列番号２記載の塩基配列からなるプライマーは、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る。また、配列番号２記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるプライマーは、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る。
【００１８】
また、プライマーの塩基配列は、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る塩基配列である限り、配列番号２記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列であってもよい。ここで、「１又は複数個の塩基」とは、配列番号１記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなる部分にハイブリダイズし得る限り、その個数は限定されない。
【００１９】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットの一方のプライマーの塩基配列を上記のように決定する場合、他方のプライマーの塩基配列は、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズし得る塩基配列であればよく、具体的には公知のトレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて決定できる。より具体的には、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する各菌株で保存性の高い部分の塩基配列に基づいて決定できる。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号３記載の塩基配列と同一又は相補的な塩基配列からなるプライマーを例示できる。
【００２０】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットの各プライマーの塩基配列が決定すれば、その塩基配列からなるプライマーは常法に従って合成することができる。
本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の検出に使用できる。
また、本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、以下の本発明のトレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法に使用できる。
【００２１】
本発明のトレポネーマ・ソクランスキー感染の判別方法は、以下の工程：
（ａ）対象動物からＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、上記プライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程、
を含んでなることを特徴とする。
以下、各工程ごとに説明する。
【００２２】
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、対象動物からＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。
ここで、「対象動物」とは、トレポネーマ・ソクランスキー感染の有無を判別しようとする動物を意味する。
対象動物は、トレポネーマ・ソクランスキーに感染し得る動物である限り特に限定されず、いかなる動物であってもよい。このような対象動物としては、例えば、ヒト、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００２３】
ＤＮＡを含有する試料は、例えば、対象動物の唾液、歯垢等から常法に従って調製することができる。例えば、対象動物の唾液や歯垢に市販の界面活性剤を加え、９５℃で５分間加熱した後、冷却し、次いで遠心分離して上清を採取することによりＤＮＡを含有する試料を調製することができる。
調製されたＤＮＡを含有する試料には、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の他、各種ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製してもよい。
【００２４】
（２）工程（ｂ）
工程（ｂ）は、上記試料に対して、上記プライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程である。
工程（ｂ）におけるＰＣＲは、常法に従って行うことができる。
工程（ｂ）により、試料中にトレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するトレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子由来の増幅断片が得られる。
【００２５】
（３）工程（ｃ）
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られる増幅断片の有無により、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かを判別する工程である。
増幅断片の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動により増幅断片の有無を確認することができる。
増幅断片の有無の確認の結果、増幅断片が存在する場合には、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染していると判別することができる。また、増幅断片の有無の確認の結果、増幅断片が存在しない場合には、対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染していないと判別することができる。
【００２６】
対象動物がトレポネーマ・ソクランスキーに感染しているか否かをさらに精度よく判別するために、増幅断片がトレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来することを確認することが好ましい。確認する方法としては、例えば、増幅断片を制限酵素で処理して得られる制限断片長多型解析を行う方法が挙げられる。この際使用する制限酵素としては、増幅断片を切断し制限断片長多型を示し得るものであれば特に限定されない。制限酵素は、単独で使用してもよいが、２種以上を組み合わせて使用することが望ましい。増幅断片を制限酵素で処理して得られる制限断片長多型は、例えば、サザンブロット法により検出することができる。
【００２７】
【実施例】
〔実施例１〕トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分の特定
１．トレポネーマ・ソクランスキーに属する数種の菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定
トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株として基準株３菌株と臨床分離株１４菌株を使用し、これらの１７菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
使用した基準株３菌株を以下に示す。
【００２８】
▲１▼トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）    ＪＣＭ  ８１５７Ｔ
▲２▼トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｃｃａｌｅ）  ＪＣＭ  ８１５５Ｔ
▲３▼トレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．
ｐａｒｅｄｉｓ）  ＪＣＭ  ８１５６Ｔ
また、使用した臨床分離株１４菌株は、１０４３株、１１４２株、１１６４Ａ株、１１６６株、１２２Ｂ株、１２２Ｃ株、１２６７株、１２８Ｂ株、１２８Ｄ株、１２９２株、３５１株、６７３株、Ｂ４１８株、Ｔ１０株である。
【００２９】
まず、各菌株の培養液（約１．５〜３ｍｌ）を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）して集菌した。遠心分離により得られるペレットを１００μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した。次いで、この懸濁液に１００μｌの１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、９５℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）を行った。
【００３０】
遠心分離により得られた上清を鋳型ＤＮＡ溶液としてＰＣＲを行い、上記各菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。
ＰＣＲはＴａＫａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて行った。
【００３１】
ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液  ５．０μｌ、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １０．０μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ８．０μｌ、プライマー２７Ｆ    １．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー１４９２Ｒ    １．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、Ｈ２Ｏ    ７４．５μｌ、及びＥｘＴａｑ    ０．５μｌで、総容量は１００．０μｌである。なお、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅはＴａｋａｒａ  ＥｘＴａｑのキットに添付されているものを使用した。
ユニバーサルプライマー２７Ｆの塩基配列は、５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号４）であり、ユニバーサルプライマー１４９２Ｒの塩基配列は、５’−ｇｇｔｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号５）である。
【００３２】
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を９５℃で３分行った後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で１分３０秒を１サイクルとして、これを３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分の伸長反応を行った。
ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．２％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。
【００３３】
増幅が確認されたサンプルをスピンカラムによって精製し、シークエンス反応に供した。シークエンス反応は、ＡＢＩのＢｉｇ  Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｐａｎ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｃｈｉｂａ，  Ｊａｐａｎ）を用いて行い、塩基配列解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。
以上のようにして配列決定した各菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を図１〜８に示す。図１〜８の各図において、中段に示す塩基配列は上段に示す塩基配列の続きであり、後段に示す塩基配列は中段に示す塩基配列の続きである。また、図２は図１の続きであり、同様に図３は図２の、図４は図３の、図５は図４の、図６は図５の、図７は図６の、図８は図７の続きである。また、図１〜８中、「ＴＳ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）    ＪＣＭ  ８１５７Ｔを表し、「ＴＢ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｃｃａｌｅ）  ＪＣＭ  ８１５５Ｔを表し、「ＴＰ」はトレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒｅｄｉｓ）  ＪＣＭ  ８１５６Ｔを表し、「＊」は各菌株で共通する塩基を表す。
【００３４】
２．１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析
以下の菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析を行った。
（１）トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）（ＡＦ０３３３０６）
（２）トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｃｃａｌｅ）（ＡＦ０３３３０５）
（３）トレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒｅｄｉｓ）（ＡＦ０３３３０７）
（４）トレポネーマ・ソクランスキー・０４（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ０４）
【００３５】
（５）トレポネーマ・アミロボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｍ）（Ｙ０９９５９）
（６）トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（Ｍ７１２３６）
（７）トレポネーマ・マルトフィラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｘ８７１４０）
（８）トレポネーマ・メディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｄ８５４３７）
（９）トレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）（Ｍ７１２３７）
（１０）トレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＡＦ０３３３０９）
【００３６】
（１１）アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（Ｍ７５０３９）
（１２）バクテロイデス・フォーシンサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）（Ｘ７３９６２）
（１３）バクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｌ０４３２０）
（１４）カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．  ｒｅｃｔｕｓ）（Ｌ０４３２０）
（１５）カプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｘ６７６０８）
【００３７】
（１６）エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（Ｍ２２５１２）
（１７）フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（Ｍ５８６８３）
（１８）ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｌ１６４９２）
（１９）プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｌ１６４６８）
（２０）プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｌ１６４７１）
【００３８】
アライメント解析の結果を図９〜１８に示す。図９〜１８の各図において、中段に示す塩基配列は上段に示す塩基配列の続きであり、後段に示す塩基配列は中段に示す塩基配列の続きである。また、図１０は図９の続きであり、同様に図１１は図１０の、図１２は図１１の、図１３は図１２の、図１４は図１３の、図１５は図１４の、図１６は図１５の、図１７は図１６の、図１８は図１７の続きである。また、図９〜１８において、「Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙ」はアクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（Ｍ７５０３９）を表し、「Ｂ．ｆｏｒｓｙｔｈｕ」はバクテロイデス・フォーシンサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．  ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）（Ｘ７３９６２）を表し、「Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ」はバクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｌ０４３２０）を表し、「Ｃ．ｒｅｃｔｕｓ」はカンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．  ｒｅｃｔｕｓ）（Ｌ０４３２０）を表し、「Ｃａ．ｇｉｎｇｉｖａ」はカプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｘ６７６０８）を表し、「Ｅ．ｃｏｒｒｏｄｅｎ」はエイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（Ｍ２２５１２）を表し、「Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕ」はフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（Ｍ５８６８３）を表し、「Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａ」はポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｌ１６４９２）を表し、「Ｐｒ．ｉｎｔｅｒｍｅ」はプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｌ１６４６８）を表し、「Ｐｒ．ｎｉｇｒｅｓｃ」はプレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）（Ｌ１６４７１）を表し、「Ｔ．ａｍｙｌｏｖｏｒ」はトレポネーマ・アミロボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｍ）（Ｙ０９９５９）を表し、「Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌ」はトレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（Ｍ７１２３６）を表し、「Ｔ．ｍａｌｔｏｐｈｉ」はトレポネーマ・マルトフィラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｘ８７１４０）を表し、「Ｔ．ｍｅｄｉｕｍ」はトレポネーマ・メディウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｄ８５４３７）を表し、「Ｔ．ｖｉｎｃｅｎｔｉ」はトレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＡＦ０３３３０９）を表し、「Ｔ．ｐｅｃｔｉｎｏｖ」はトレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）（Ｍ７１２３７）を表し、「Ｔ．ｓ．ｓｏｃｒａｎ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）（ＡＦ０３３３０６）を表し、「Ｔ．ｓ．ｂｕｃｃａｌ」はトレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｃｃａｌｅ）（ＡＦ０３３３���５）を表し、「Ｔ．ｓ．ｐａｒｅｄｉ」はトレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒｅｄｉｓ）（ＡＦ０３３３０７）を表し、「Ｔ．ｓ．０４」はトレポネーマ・ソクランスキー  ０４（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ０４）を表す。
また、図９〜１８中の「Ｎ」はＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのいずれかを表し、「＊」は各菌株で共通する塩基を表す。
【００３９】
３．トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分の特定
上記１及び２の結果より、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が共通に有し、かつトレポネーマ・ソクランスキーに属しない菌株は有しない塩基配列部分、すなわち、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分を特定することに成功した。
すなわち、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２０７番目から２３９番目の塩基配列（配列番号１）は、トレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分であることが判明した。
【００４０】
〔実施例２〕プライマーの作製
実施例１で特定されたトレポネーマ・ソクランスキーに特異的な塩基配列部分の塩基配列（配列番号１）に基づいて、この塩基配列部分にハイブリダイズし得るプライマーＴＲＳ２０７Ｆを作製した。
プライマーＴＲＳ２０７Ｆの塩基配列は、（５’−ａｇｇｔａｇａｃａｇｃｇｇｇａａａｇｇａ−３’）であり（配列番号２）、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２０７番目から２２６番目の塩基配列と同一の塩基配列である。
【００４１】
また、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち、トレポネーマ・ソクランスキーに属する各菌株において保存性の高い領域に基づいて、プライマー１０８９Ｒを作製した。プライマー１０８９Ｒの塩基配列は、（５’−ｔａａｃｃｃａａｃａｃｃｔｃａｃｇｇｃａ−３’）であり（配列番号３）、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１１０８番目から１０８９番目の塩基配列と相補的な塩基配列である。
【００４２】
〔実施例３〕ＰＣＲによるトレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の検出
（１）トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）に属する６菌種及び代表的な歯周病関連菌９菌種について、実施例２で作製したプライマーの特異性を調べた。
使用したトレポネーマ属の６菌種及び代表的な歯周病関連菌９菌種を以下に示す。
【００４３】
（トレポネーマ属の６菌種）
▲１▼トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）（ＪＣＭ  ８１５７Ｔ）
▲２▼トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｃｃａｌｅ）（ＪＣＭ  ８１５５Ｔ）
▲３▼トレポネーマ・ソクランスキー・パレディス（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ．  ｓｕｂｓｐ．
ｐａｒｅｄｉｓ）（ＪＣＭ  ８１５６Ｔ）
▲４▼トレポネーマ・デンチコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＪＣＭ  ８２２５）
▲５▼トレポネーマ・ペクチノボラム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕｍ）（ＪＣＭ  ８１５４Ｔ）
▲６▼トレポネーマ・ビンセンチ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）（ＪＣＭ  ８２２７）
【００４４】
（代表的な歯周病関連菌９菌種）
▲１▼アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ＪＣＭ  ２４３４、ＪＣＭ８５７８）
▲２▼バクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＪＣＭ  ８５３８Ｔ、ＦＤＣ４０１、ＦＤＣ４０２、ＦＤＣ４０６）
▲３▼カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ．  ｒｅｃｔｕｓ）（ＪＣＭ  ６３０１Ｔ）
▲４▼カプノサイトファガ・ジンジバリス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（ＤＳＭ  ３２９０Ｔ）
【００４５】
▲５▼エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（ＤＳＭ  ８３４０Ｔ、ＦＤＣ３７３、ＦＤＣ４７０、ＦＤＣ１０８５）
▲６▼フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（ＪＣＭ  ８５３２Ｔ）
▲７▼ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（ＪＣＭ  ８５２５）
▲８▼プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＪＣＭ  ７３６５Ｔ）
▲９▼プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ．  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）（ＮＣＴＣ  ９３３６Ｔ）
【００４６】
まず、上記各菌種の培養液（約１．５〜３ｍｌ）を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）して集菌し、得られたペレットを１００μｌのＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。懸濁液に１００μｌの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、９５℃で５分間加熱した。加熱後、氷中で冷却し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１分間）した。
遠心分離により得られた上清を鋳型ＤＮＡ溶液とし、プライマーとしてＴＲＳ２０７Ｆ及び１０８９Ｒを使用して、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲはＴａＫａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて行った。
【００４７】
ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液  ５．０μｌ、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ８．０μｌ、プライマーＴＲＳ２０７Ｆ    １．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、プライマー１０８９Ｒ    １．０μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、Ｈ２Ｏ    ７４．５μｌ、及びＥｘＴａｑ    ０．５μｌで、総容量を１００．０μｌとした。なお、１０Ｘｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ及びｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅはＴａｋａｒａ  ＥｘＴａｑのキットに添付されているものを使用した。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰを用いて次のように行った。すなわち、初期変性を９５℃で３分行った後、９５℃で３０秒、６７℃で３０秒、及び７２℃で１分を１サイクルとして、これを３０サイクル行い、最後に７２℃で２分の伸長反応を行った。
【００４８】
ＰＣＲ後、Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて１．２％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的バンドの増幅の有無を確認した。なお、上記歯周病関連菌９菌種のうち、同種の菌株については、そのうちの１菌株について電気泳動を行った。すなわち、▲１▼アクチノバシラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ．  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）（ＪＣＭ  ２４３４、ＪＣＭ８５７８）においてはＪＣＭ  ２４３２について、▲２▼バクテロイデス・グラシリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ＪＣＭ  ８５３８Ｔ、ＦＤＣ４０１、ＦＤＣ４０２、ＦＤＣ４０６）においてはＪＣＭ  ８５３８Ｔについて、▲５▼エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ．  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）（ＤＳＭ  ８３４０Ｔ、ＦＤＣ３７３、ＦＤＣ４７０、ＦＤＣ１０８５）においてはＤＳＭ  ８３４０Ｔについて、電気泳動を行った。
【００４９】
電気泳動の結果を図１９に示す。図１９中、「Ｍ」は分子量マーカーを表し、レーン１〜６は、それぞれ上記トレポネーマ属６菌種▲１▼〜▲６▼についての結果を示し、レーン７〜１５は、それぞれ上記歯周病関連菌９菌種▲１▼〜▲９▼についての結果を示す。
図１９に示すように、レーン１〜３、すなわち、▲１▼トレポネーマ・ソクランスキー・ソクランスキー、▲２▼トレポネーマ・ソクランスキー・ブッカレ及び▲３▼トレポネーマ・ソクランスキー・パレディスから得られた鋳型ＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲを行った場合のみ、増幅断片が得られた。
【００５０】
（２）トレポネーマ・ソクランスキー臨床分離株２２菌株について、上記と同様にしてＰＣＲを行い、実施例２で作製したプライマーの特異性を調べた。
電気泳動の結果を図２０に示す。なお、図２０には、臨床分離株２２菌株のうちの１５菌株についての電気泳動結果を示してある。
図２０に示すように、トレポネーマ・ソクランスキー臨床分離株から得られた鋳型ＤＮＡ溶液を用いてＰＣＲを行った場合、いずれの臨床分離株においても増幅断片が得られた。
【００５１】
（３）以上の（１）及び（２）の結果を以下の表１に示す。
【００５２】
【表１】
0003629634.tif 000002
【００５３】
表１に示す結果から、プライマーＴＲＳ２０７Ｆ及び１０８９Ｒを用いたＰＣＲにより、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅できることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来するＤＮＡ断片を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセットが提供される。
本発明のＰＣＲ用プライマーセットにより、トレポネーマ・ソクランスキー１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出することができ、これにより対象動物のトレポネーマ・ソクランスキー感染を精度よく判別することができる。
【００５５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図２】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図１に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図３】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図２に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図４】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図３に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図５】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図４に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図６】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図５に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図７】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図６に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図８】トレポネーマ・ソクランスキーに属する菌株が有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（図７に示す塩基配列の続き）を示す図である。
【図９】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果を示す図である。
【図１０】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図９の続き）を示す図である。
【図１１】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１０の続き）を示す図である。
【図１２】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１１の続き）を示す図である。
【図１３】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１２の続き）を示す図である。
【図１４】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１３の続き）を示す図である。
【図１５】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１４の続き）を示す図である。
【図１６】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１５の続き）を示す図である。
【図１７】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１６の続き）を示す図である。
【図１８】１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアライメント解析結果（図１７の続き）を示す図である。
【図１９】ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図２０】ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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