(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋な形である配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号８で示されるアミノ酸配列の配列番号１〜７２で示されるポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号６で示される塩基配列を有する請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号７で示される塩基配列を有する請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４から６のいずれかの項に記載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
請求項１または２に記載されたポリペプチドを発現させるための条件下で請求項８記載の宿主細胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡに関する。
より詳細に述べると、本発明はヒトのプロＢ細胞株が産生する新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
【発明の目的】
本発明は、造血系細胞から得られた新規なポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡに関するものである。造血系細胞からは、インターロイキン（ＩＬ）をはじめ種々の増殖、分化因子が分泌されていることが知られている。このことはこれまでに見出された分泌因子以外にも同様の作用、または新たな作用を有する因子が分泌されている可能性を示唆している。
【０００３】
本発明者らは、この点に注目し、造血系細胞が産生している新規な因子（ポリペプチド）を見出すことを目的として、先にマウスのストローマ細胞より得られたＳＤＦ−１（Stromal Derived Factor 1；ストローマ由来因子；特願平5-22098号に記載）をプローブとして、クロスハイブリダイゼーションの手法を用い、ヒトのプロＢ細胞が産生しているＳＤＦ−１（αおよびβの２種類）をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
本発明のポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡと同一あるいは相同性の高い配列を有しているものをコンピューターで検索したが皆無であった。従って、本発明のポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡは、新規なものであることが確認された。
【０００４】
【発明の構成】
本発明の主題は、クロスハイブリダイゼーションによって見出された新規なポリペプチドＳＤＦ−１βおよびそれをコードするＤＮＡに関する。すなわち、
（１）  配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）  前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）  配列番号６で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ、および
（４）  配列番号７で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ
に関するものである。
【０００５】
本発明は、実質的に純粋な形である配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメントおよびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号６または７で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
【０００６】
実質的に純粋な形である配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９８または９９％が配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを意味する。
【０００７】
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または８０個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される。
【０００８】
さらに、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【０００９】
配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
【００１０】
配列番号６または７で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１１】
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（in vitro）において、例えばＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００１２】
さらに、本発明には、配列番号６または７で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００１３】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。加えて、本発明のポリペプチドが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行われることが好ましい。
【００１４】
本発明のＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
【００１５】
モノクローナル抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。
【００１６】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号５で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列、生物活性の発現に必須な部分だけから成るポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００１７】
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、（１）の配列番号５で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）で特定されるｃＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
（４）に示されるｃＤＮＡは、（３）で特定されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
シグナルペプチドは、翻訳開始Ｍｅｔのすぐ後ろの疎水性に富んだ領域である。本ポリペプチドの場合、配列番号５で示されるアミノ酸配列中、１番目のＭｅｔから２１番目のグリシン（Ｇｌｙ）までと推定される。生物活性を発現する本質は配列番号１で示されるアミノ酸配列中、シグナルペプチドを除いた部分（成熟タン白部分）にあり、シグナルペプチドは活性に関与しない。
【００１８】
配列番号７で示される塩基配列を有するｃＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
(i)   本発明のポリペプチドを産生する細胞、例えば、ヒトプロＢ細胞株からｍＲＮＡを分離し、
(ii)  該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ｃＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ｃＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの合成）、
(iii) 該ｃＤＮＡを適当なファージベクターに組込み、
(iv)  得られた組み換えファージを宿主細胞に感染させ（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(v)   得られたｃＤＮＡライブラリーをマウスＳＤＦ−１  ｃＤＮＡをプローブに用いてプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、
(vi)  得られたポジティブクローンよりファージＤＮＡを調製し、切り出したｃＤＮＡをプラスミドベクターにサブクローニングし、制限酵素地図を作成し、
(vii) 各制限酵素断片の塩基配列を決定し、連結させることで全長をシークエンスすることによって作成することができる。
【００１９】
より詳細に説明すると、工程(i)は、ヒトＢ細胞株を適当な刺激剤（例えば、ＩＬ−１等）で刺激するかまたは、無刺激のままで、オカヤマ（Okayama, H.）等の方法（Method in Enzymology, 154, 3(1987)参照）に従って行なわれる。本ポリペプチドを産生する細胞としては、好ましくはヒトＢ細胞株ＦＬＥＢ１４が挙げられる。該ヒトＢ細胞株ＦＬＥＢ１４は、京都大学医学部医化学教室第一講座において分譲を受けることができる。
工程(ii)、(iii)および(iv)は、ｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変したガブラー・アンド・ホフマン（Gubler＆Hoffman）法（Gene, 25, 263(1983)参照）に準じて行なわれる。
【００２０】
工程(iii)で用いられるベクターとしては、プラスミドベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、pBluescript、pBluescript II等）やファージベクター（例えば、λｇｔ１０、λＤＡＳＨ II等）が多数知られているが、好適にはファージベクターλｇｔ１０（43.3kbp Stratagene社より販売）が用いられる。
工程(iv)で用いられる細胞宿主としては、好ましくは、大腸菌ＮＭ５１４（Stratagene社より販売）が用いられる。
工程(v)および(vi)は、Molecular Cloning（Sambrook, J., Fritsh, E. F.,およびManiatis, T, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）に記載の方法に準じて行なわれる。
工程(vii)のシークエンシングは、マキサム−ギルバート(Maxam-Gilbert)法やジデオキシターミネーター法により行なわれる。
【００２１】
この様にして得られたｃＤＮＡは、該ｃＤＮＡが全長またはほぼ全長であることを確認する必要がある。この確認は、該ｃＤＮＡをプローブとして、ノーザン(Northern)解析により行なわれる（前記Molecular Cloning参照）。ハイブリダイズしたバンドから得られるｍＲＮＡのサイズと該ｃＤＮＡのサイズを比較し、ほぼ同じであれば該ｃＤＮＡはほぼ全長であると考えられる。
配列番号６、７で示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ｃＤＮＡを含有するベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とするｃＤＮＡを必要量得ることができる。
【００２２】
配列番号６、７で示される塩基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
【００２３】
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、
（１）  生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）  ペプチド合成する方法、または
（３）  遺伝子組換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
遺伝子組換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
【００２４】
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟タン白部分をコードするＤＮＡの５′末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、pBluescript、pBluescript II、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００２５】
また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号６で示される塩基配列をコードするｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。
次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば，サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の新規なポリペプチドは、プロＢ細胞株が生産、分泌するものであるので、造血幹細胞の生存、増殖、およびＢ細胞系やミエロイド細胞系の増殖、分化に関連した生物活性を有していると予測される。
これらの活性の内、精製されたマウスＳＤＦ−１αのミエロイド前駆細胞株ＤＡ１Ｇに対する増殖刺激作用が実験的に認められており、この事実からヒトＳＤＦ−αも同様の活性を有していることが示唆される。
従って、本発明のポリペプチドは、造血系細胞の発育不全、異常増殖、神経系機能の亢進や低下、免疫機能の亢進や低下に関する疾患、例えば、炎症性疾患（リウマチ、潰瘍性大腸炎等）、骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、放射線治療後または化学療法剤投与後の白血球、血小板、Ｂ細胞またはＴ細胞の減少症、貧血、感染症、ガン、白血病、ＡＩＤＳ、各種神経変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症等）、または神経損傷の予防または治療、骨代謝異常（骨粗しょう症等）の予防または治療薬、あるいは組織修復等のために用いることができる。
【００２７】
これらの活性の内、精製されたマウスＳＤＦ−１αのミエロイド前駆細胞株ＤＡ１Ｇに対する増殖刺激作用が実験的に認められており、この事実からヒトＳＤＦ−αも同様の活性を有していることが示唆される。
また、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
【００２８】
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によって、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療等）に利用できる。また、本発明のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００２９】
【医薬品への適用】
本発明の目的、または造血系細胞の発育不全、異常増殖、神経系機能の亢進や低下、免疫機能の亢進や低下に関する疾患、例えば、炎症性疾患（リウマチ、潰瘍性大腸炎等）、骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、放射線治療後または化学療法剤投与後の白血球、血小板、Ｂ細胞またはＴ細胞の減少症、貧血、感染症、ガン、白血病、ＡＩＤＳ、各種神経変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症等）、または神経損傷の予防または治療、骨代謝異常（骨粗しょう症等）の予防または治療薬、あるいは組織修復等のために本発明のポリペプチドは、通常全身的にまたは局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投与である。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、通常全身的にまたは局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投与である。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
【００３１】
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。このような個体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アスパラギン酸等）を含有していてもよい。
【００３２】
錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで皮膜してもよいし、また２以上の層で皮膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第2,868,691号および同第3,095,355号明細書に詳しく記載されている。
【００３３】
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等が挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいてもよい。
これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結乾燥法等により）、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟コウ、塗布剤、直腸内投与のための坐剤およびペッサリー等が含まれる。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】
実施例１：ヒト細胞株  ＦＬＥＢ１４のノーザン（Northern）解析
ヒトプロＢ細胞株ＦＬＥＢ１４（Katamine, S.,et.al. Nature, 309, 369(1984)参照）をホモジナイズし、オリゴｄＴ−セルロースとインキュベートした。不要物を洗浄した後にポリＡ−ＲＮＡを溶出させ回収した（Vennstorm,B.et.al. Cell,28, 135(1982)参照）。このＲＮＡ １μｇを1.0％アガロース電気泳動後、ニトロセルロースメンブレンにブロッティングし、３２Ｐ標識したマウスＳＤＦ−１ｃＤＮＡ（1797bp、特願平5-22098号明細書中に配列番号３として記載されている、配列番号９で示されているものをラベルした。後に、マウスにはもう一種ＳＤＦ−１があることが判明し、現在はＳＤＦ−１αと呼ばれている。）をプローブとして、５０％ ホルムアミド，５×ＳＳＣ，0.1％ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈａｌｄｔ´ｓ，0.1ｍｇ／ｍｌ Salmon sperm ＤＮＡ，３９℃でハイブリダイズさせ、0.3Ｍ ＮａＣｌ，３０ｍＭ クエン酸ナトリウム,0.1％ＳＤＳ，５０℃で洗浄し、オートラジオグラフィーを行なった。その結果、3.5ｋｂと1.9ｋｂのｍＲＮＡの発現が認められた。
【００３６】
実施例２：ヒトプロＢ細胞株のｍＲＮＡよりｃＤＮＡの調製
ヒトプロＢ細胞株ＦＬＥＢ１４より常法により、ｃＤＮＡライブラリーを作製した（Molecular Cloning；Sambrook, J., Fritsh, E. F.,およびManiatis, T, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)参照）。ｃＤＮＡの合成はタイム・セイヴァーｃＤＮＡ合成キット（Time Saver ｃＤＮＡ synthesis kit）（Pharmacia社）を用い、そのプロトコールにしたがった。すなわち、ＦＬＥＢ１４のポリＡ−ＲＮＡ ５μｇよりオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ＤＮＡポリメラーゼＩによって二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００３７】
【化１】
0003705732.tif 000002
【００３８】
を連結、リン酸化した後、0.9％アガロース電気泳動を行なって、８００ｂｐ以上のｃＤＮＡを切り出し、グラスパウダー（GENECLEAN II  BIO101社）を用いて回収した。
【００３９】
実施例３：ｃＤＮＡライブラリーの作成とクロスハイブリダイゼーション
このｃＤＮＡをホスファターゼ処理済みのＥｃｏＲＩアームをもつλｇｔ１０（Stratagene社）と連結した。
インビトロ・パッキング（in vitro packaging）はインビトロ・パッキング・キットLAMDA INN（in vitro packaging kit LAMDA INN）（日本ジーン）のプロトコールにしたがって行ない、その組換えファージを宿主大腸菌ＮＭ５１４（Stratagene社）に感染させた。その結果、１００万のプラークからなるｃＤＮＡライブラリーが得られた。
ＬＢプレート上に得られた１００万のプラークをニトロセルロースメンブレンにブロッティングし、３２Ｐ標識したマウスＳＤＦ−１αｃＤＮＡ（実施例１で使用したのと同じ配列番号９で示されるもの）をプローブとして、５０％formamide, ５×ＳＳＤ，0.1％ＳＤＳ，５×Denhaldt´s 0.1mg/mlSalmon sperm ＤＮＡ，３９℃でハイブリダイズさせ、0.3Ｍ ＮａＣｌ，３０ｍＭ クエン酸ナトリウム,0.1％ＳＤＳ，５０℃で洗浄し、オートラジオグラフィーを行なったところ、４０個のポジティブクローンが得られた。
【００４０】
実施例４：ポジティブクローンのクローンの単離
その中の９クローンについて、常法（細胞工学実験プロトコール、秀潤社、８ページ参照）により、ファージＤＮＡを調製し、ＮｏｔＩで消化して、アガロース電気泳動でインサートｃＤＮＡの長さを調べたところ、８クローンが1.9ｋｂ、１クローンが3.5ｋｂであった。ノーザン（Northern）解析の結果からこの２種類のクローンはそれぞれヒトＳＤＦ−１のｃＤＮＡのほぼ全長であると考えられた。
そこで、1.9ｋｂの８クローンより１クローンと、3.5ｋｂの１クローンについて、ＮｏｔＩで消化したｃＤＮＡをアガロース電気泳動後、切り出して、プラスミドpBluescriptのＮｏｔＩサイトにサブクローニングした。
【００４１】
実施例５：制限酵素地図の作成とシークエンシング
続いて、ヒトＳＤＦ−１（1.9ｋｂのもの）のｃＤＮＡの制限酵素地図を作成し（図１に示す。）、各制限酵素断片を、pBluescriptにサブクローニングした後、各インサート断片の両端約３００ｂｐの塩基配列を決定し、それらを連結させることによって、最終的に全長の塩基配列を決定した（配列番号３に示す。）。この全長ｃＤＮＡシークエンスデータから、オープンリーディングフレーム（配列番号２に示す。）を決定し、さらにアミノ酸配列に翻訳して配列番号１に示す配列を得た。また、得られたアミノ酸配列のＮ末端側３０〜４０アミノ酸について、既知のシグナルペプチドと比較することにより、本ポリペプチドにおけるシグナルペプチド部分を推定し（Von Heuane, G. Nucleic Acids Res. 14 ,4683(1986)参照）、配列番号４に示す配列を得た。
【００４２】
もう一方の3.5ｋｂのクローンについても同様の操作を行ない、それぞれ、制限酵素地図（図２に示す。）、全長の塩基配列（配列番号７に示す。）、オープンリーディングフレーム（配列番号６で示す。）、アミノ酸配列（配列番号５で示す。）およびシグナルペプチドを示した配列（配列番号８に示す。）を得た。  3.5ｋｂのクローンのアミノ酸配列は、1.9ｋｂのクローンのアミノ酸配列と非常に類似しており、1.9ｋｂのものをＳＤＦ−１α、3.5ｋｂのものをＳＤＦ−１βとそれぞれ命名した。
ＤＮＡの塩基配列決定はＡＢＩ（Applied Biosystem Inc.）の蛍光ダイターミネーターを用いたサイクルシークエンス法により行なった。また塩基配列の読み取りには、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサー（Model 373A）を用いた。
得られたヒトＳＤＦ−１αおよび１βのｃＤＮＡの塩基配列ならびに予想されるアミノ酸配列について、データベース（ＤＮＡについてはGENBANKとEMBL、アミノ酸についてはNBRFとSWISSPROTを使用）とのホモロジー検索を行ない、本ｃＤＮＡは新規のタンパク質をコードしていることが確認された。
【００４３】
実施例６：発現ベクター作製用プラスミドベクターの構築
発現用のベクターとして、ｐＵＣＳＲαＭＬ１（特開平6-56895号にその製造方法とともに開示してある。）の誘導体を用いた。この誘導体は、下に示される２種類のインサート断片（フラグメントＴ７およびフラグメントＳＰ６）を用いて構築した。
【００４４】
【化２】
0003705732.tif 000003
【００４５】
【化３】
0003705732.tif 000004
【００４６】
ｐＵＣＳＲαＭＬ１ベクターをＰｓｔＩとＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、約4.1kbp断片を回収し、５′末端のリン酸をＢＡＰ（バクテリアアルカリホスファターゼ）処理した。リン酸化されたＤＮＡ断片Ｔ７をｐＵＣＳＲαＭＬ１から得られた約4.1kbp断片とライゲートし、環状化させた。
ｐＵＣＳＲαＭＬ１ベクターをＰｓｔＩおよびＳａｃＩで消化し、得られたものをアガロースゲル電気泳動にかけ、約4.1kbpの断片を回収し、５′末端のリン酸基をＢＡＰ（バクテリアアルカリホスファターゼ）処理により取り除いた。リン酸化されたＤＮＡ断片Ｔ７をｐＵＣＳＲαＭＬ１から得た約4.1kbp断片とライゲートし、環状化させた。
得られたベクターは、さらにＳｐｅＩとＫｐｎＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、約4.1kbpの断片を回収し、５′末端のリン酸基をＢＡＰ（バクテリアアルカリホスファターゼ）処理により取り除いた。リン酸化されたＤＮＡ断片ＳＰ６ｐＵＣＳＲαＭＬ１から得た約4.1kbp断片とライゲートし、環状化させた。このようにして構築したベクターをｐＵＣＳＲαＭＬ２（図３参照）と命名した。
【００４７】
実施例７：発現ベクターの構築
ヒトＳＤＦ−１α、プライマーＸ、ＹおよびＹＨを合成した。プライマーＸ、ＹおよびＹＨの配列をそれぞれ以下に示す（配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２）。
【００４８】
プライマーＸ：
５′−AATATAGTCGACCACCATGAACGCCAAGGTCGTGGTCGTGCTGG−３′
【００４９】
プライマーＹ：
５′−CGGCGGACTAGTTTACTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGG−３′
【００５０】
プライマーＹＨ：
５′−GCCGCCACTAGTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGG−３′
【００５１】
ヒトＳＤＦ−１αプラスミドをプライマーとして上記合成のオリゴヌクレオチドＸ、Ｙを用いたＰＣＲにかけた。得られたＰＣＲ断片は、開始コドンの５′末端に隣接した、当業者にはコザック配列として知られている配列およびヒトＳＤＦ−１α蛋白を構成する蛋白分子をコードしているｃＤＮＡを含んでいる。ＰＣＲ断片はＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化され、得られたものを分離精製して実施例６で調製したｐＵＣＳＲαＭＬ２のＳａｌＩおよびＳｐｅＩサイトに挿入され、発現ベクターであるｐＵＣＳＲαＭＬ２−ヒトＳＤＦ−１αＡを得た。
さらにヒトＳＤＦ−１αプラスミドをプライマーとして上記合成したオリゴヌクレオチドＸ、ＹＨを用いたＰＣＲにかけた。得られたＰＣＲ断片は、開始コドンの５′末端に隣接した、当業者にはコザック配列として知られている配列、ヒトＳＤＦ−１α蛋白を構成する蛋白分子をコードしているｃＤＮＡおよびＣ末端に存在する６個のヒスチジン残基を含んでいる。ＰＣＲ断片はＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化され、得られたものを分離精製して実施例６で調製したｐＵＣＳＲαＭＬ２のＳａｌＩおよびＳｐｅＩサイトに挿入され、発現ベクターであるｐＵＣＳＲαＭＬ２−ヒトＳＤＦ−１αＢを得た。
ヒトＳＤＦ−１βについて、プライマーＺおよびＺＨを合成した。プライマーＺおよびＹＨの配列を以下に示す（配列番号１３および配列番号１４）。
【００５２】
プライマーＺ：
５′−CGGCGGACTAGTTCACATCTTGAACCTCTTGTTTAAAGC−３′
【００５３】
プライマーＺＨ：
５′−GCCGCCACTAGTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATCTTGAACCTCTTGTTTAAAGC−３′
【００５４】
ヒトＳＤＦ−１βプラスミドをプライマーとして上記合成したオリゴヌクレオチドＸ、Ｚを用いたＰＣＲにかけた。得られたＰＣＲ断片は、開始コドンの５′末端に隣接した、当業者にはコザック配列として知られている配列およびヒトＳＤＦ−１β蛋白を構成する蛋白分子をコードしているｃＤＮＡを含んでいる。ＰＣＲ断片はＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化され、得られたものを分離精製して実施例６で調製したｐＵＣＳＲαＭＬ２のＳａｌＩおよびＳｐｅＩサイトに挿入され、発現ベクターであるｐＵＣＳＲαＭＬ２−ヒトＳＤＦ−１βＡを得た。
【００５５】
さらにヒトＳＤＦ−１βプラスミドをプライマーとして上記合成したオリゴヌクレオチドＸ、ＺＨを用いたＰＣＲにかけた。得られたＰＣＲ断片は、開始コドンの５′末端に隣接した、当業者にはコザック配列として知られている配列、ヒトＳＤＦ−１β蛋白を構成する蛋白分子をコードしているｃＤＮＡおよびＣ末端に存在する６個のヒスチジン残基を含んでいる。ＰＣＲ断片はＳａｌＩおよびＳｐｅＩで消化され、得られたものを分離精製して実施例６で調製したｐＵＣＳＲαＭＬ２のＳａｌＩおよびＳｐｅＩサイトに挿入され、発現ベクターであるｐＵＣＳＲαＭＬ２−ヒトＳＤＦ−１βＢを得た。
ｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＳＤＦ−１αＡおよびｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＳＤＦ−１βＢそれぞれ大腸菌ＤＨ５を形質転換し、形質転換菌の培養液（１００ｍｌ）よりプラスミドを分離し、ＣｓＣｌ密度勾配法を２回繰り返して精製した。
【００５６】
実施例８：ＣＯＳ細胞での発現
ＣＯＳ−７細胞[Cell, 23, 175(1981)に記載]にプラスミドＤＮＡ、ｐＵＣＳＲαＭＬ２、ｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＳＤＦ−１αＡ、ｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＳＤＦ−１αＢ、ｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＳＤＦ−１βＡおよびｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＳＤＦ−１βＢをそれぞれジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン法［J. Immunology, 136, 4291(1986)に記載］により導入した。すなわち、約1.8×１０6個のＣＯＳ−７細胞を５０ｍｌの増殖培養液（１０％非働化牛胎児血清を含むダルベッコ変法ＭＥＭ培養液）とともに、２２５ｃｍ2フラスコ（コーニング社製）に植え込み、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で一晩培養した。翌日、培養液を除去した後、フラスコ当り１２ｍｌのＤＮＡカクテル（それぞれのプラスミドＤＮＡ１５μｇ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4）、４００μｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−デキストランを含むダルベッコ変法ＭＥＭ培養液）を加えて、３７℃、５％ＣＯ2中で３時間反応させた。次にＤＮＡカクテルを除去し、クロロキン液（１５０μＭクロロキン、７％非働化牛胎児血清を含むダルベッコ変法ＭＥＭ培養液）１５ｍｌを加えてさらに３時間反応させた。
【００５７】
クロロキン液を除去した後、増殖培養液（５０ｍｌ）を加えて、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で７２時間培養し、細胞がほぼ単層になるまで増殖させた。次に、培養液を除去し、無血清培養液（商品名：ＳＦＭ−１０１、日水製薬社製）で一度洗浄した後、新たに無血清培養液（７５ｍｌ）を加えて、さらに７２時間培養した。培養液を回収し、除菌フィルター（商品名：ＳＴＥＲＩＶＥＸ−ＧＳ、ミリポア社製）を通じてろ過した。これらの培養液は４℃に保存し、以後の実験に供した。得られた培養液のうち、ｈＳＤＦ−１αおよびβのｃＤＮＡインサートを含むプラスミドで形質導入されたＣＯＳ細胞の培養液には、ｈＳＤＦ−１αおよびβに相当するポリペプチドの成熟蛋白部分が分泌されているはずである。
【００５８】
実施例９：発現の確認
形質導入を行なったＣＯＳ細胞培養上清（実施例８で得られた。）をそれぞれ２ｍｌずつ取り、これを遠心濃縮フィルター（商品名：セントリコン−１０、ミリポア社製）を用いて１００μｌに濃縮した。それぞれ１μｌを等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動）用ローディングバッファー［0.125Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ6.8）、４％ナトリウムドデシルサルフェート、３０％グリセロール］と混合し、９０℃で３分間処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
さらに、Ｃ末端にＨｉｓヘキサマーを導入したｈＳＤＦ−１αおよびβ蛋白質については、ＣＯＳ細胞培養上清だけでなく、精製品についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行なった。
【００５９】
精製は、Ｈｉｓが様々な遷移金属イオンと複合体を形成することを応用して、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーの手法[Biotechnology, 9, 273(1991)に記載]で精製した。すなわち、ＣＯＳ細胞より得られた培養上清（３５０ｍｌ）に、最終濃度１Ｍになるように塩化ナトリウム水溶液を加え、亜鉛を結合させたキレーティングセファロースカラム[商品名：キレーティングセファローズファストーフロー(Chelating Sepharose Fast-Flow)、ファルマシア社製、４ｍｌ]に吸着させた。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）でカラムを洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液および0.4Ｍイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）を用いて溶出した。溶出液を１００μｌに濃縮し、そのうち１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＳＤＳ１０／２０グラディエント（gradient）を用いて行ない、ｈＳＤＦ−１αおよびβの分子量に対応する生成物がそれぞれ検出された。
【配列表】
0003705732.tif 000005
0003705732.tif 000006
0003705732.tif 000007
0003705732.tif 000008
0003705732.tif 000009
0003705732.tif 000010
0003705732.tif 000011
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0003705732.tif 000013
0003705732.tif 000014
0003705732.tif 000015
0003705732.tif 000016
0003705732.tif 000017
0003705732.tif 000018
0003705732.tif 000019
0003705732.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトのＳＤＦ−１α  ｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図２】  ヒトのＳＤＦ−１β  ｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図３】  プラスミドベクターｐＵＣＳＲαＭＬ２の構築図である。
【図１】
0003705732.tif 000021
【図２】
0003705732.tif 000022
【図３】
0003705732.tif 000023