(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）又はグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）測定用であって、２−オキソグルタル酸が両性イオン緩衝液に溶解していることを特徴とする、安定な２−オキソグルタル酸含有液状試薬。
【請求項２】
両性イオン緩衝液がグッド緩衝液である、請求項１に記載の安定な２−オキソグルタル酸含有液状試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、安定な２−オキソグルタル酸含有液状試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野において、適切な治療を行うためには、正確に疾病を診断することが必要である。生体試料中に含まれる多数の指標物質を、精度良く、迅速・簡便に測定することが望まれ、種々の試験法、試薬及び分析機器が開発されてきた。
近年は、自動検査装置によって多数の検体を短時間で処理し、自動的に測定結果を得ることが主流となり、ハード（検査装置）、ソフト（試薬）の両面でより高度な性能が求められている。
特に試薬に関しては、従来は、酵素や基質物質等の試薬組成物の保存安定性を考慮して、多くの場合、試薬は凍結乾燥品として供給され、検査時に溶解して用いてきたが、近年は、検査時における手間を省くために、試薬の形態を、当初から液状のままで供給することが望まれている。
【０００３】
また、測定対象物質は多岐に渡っており、多くの指標物質が測定されている。中でも、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下、ＧＰＴともいう）及びグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（以下、ＧＯＴともいう）は、心臓や肝に多く分布する酵素であり、各種疾患時に血中に遊出されるので、尿や血液等の生体液中のＧＰＴ並びにＧＯＴの測定は心疾患、肝疾患の診断や治療の経過観察の指標として重要な項目の一つとして、頻繁に測定されている。
【０００４】
ＧＰＴの測定法としては、Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を基質として、ＧＰＴによって生成されるピルビン酸を乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと略称する）によって乳酸に変え、共存させておいた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略称する）量の減少量を、波長３４０ｎｍ付近で測定することによりＧＰＴを測定する方法が汎用されている。
【０００５】
この反応式を示せば、以下のとおりである。
0003617675.tif 000002
なお、ＮＡＤは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下同様）である。
【０００６】
また、ＧＯＴの測定法としては、Ｌ−アスパラギン酸とα−ケトグルタル酸を基質として、ＧＯＴによって生成されるオキザロ酢酸をリンゴ酸脱水素酵素（以下、ＭＤＨと略称する）によってリンゴ酸に変え、共存させておいた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）量の減少量を、波長３４０ｎｍ付近で測定することによりＧＯＴを測定する方法が汎用されている。
【０００７】
この反応式を示せば、以下のとおりである。
0003617675.tif 000003
【０００８】
前述の通り、一般的に酵素を含む試薬は、その保存安定性の面を考慮して、反応に必要な組成物を含む凍結乾燥品として提供され、使用時に緩衝液等で溶解して用いられていた。しかし、作業性やコスト面から、予め液状の試薬形態で供給することが要求されるようになった。これらの試薬は多くの場合、自動分析機にて使用されるので、試薬構成を２試薬系とし、しかも試薬組成物の安定性を長期間（例えば半年から１年）維持する必要がある。
特に、溶液状態においては酵素類の安定性が著しく低下するため、溶液の至適ｐＨの設定や各種安定化剤の添加等が検討され、一応の成果が得られている。
【０００９】
これに対して、基質物質（上記の例の場合、Ｌ−アラニンあるいはＬ−アスパラギン酸及び２−オキソグルタル酸）については、酵素類に対するほど安定化の検討が行われていない。というのも、一般的に、基質物質の多くは、化学的に安定な物質が多く、酵素のように急激に分解することはなく、また、試薬組成として大過剰量添加するように設計されているため、たとえある程度の分解が進行しても、測定時において所望の反応が発現するのに十分な量が残存していれば、目的物質の検出には支障が無いので、酵素と比較して、安定化という面でさほど重要視されていなかった。
【００１０】
例えば、特開昭５７−３９７９９号及び特開昭５７−３９８００号各公報には、ＧＯＴ及びＧＰＴ試薬の安定性に関する技術が記載されている。特にＬＤＨの安定化のために、従来からの殺菌剤の添加のみならず、スルフヒドリル化合物（例えば還元型グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン等）とキレート剤（例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を併用・添加してＬＤＨの安定化を図ったものである。
しかし、これらの特許公報に記載されている技術は３試薬系であり、溶液状態での保存安定性は室温で１０日程度しかない。また、これらのＬＤＨ等の酵素類の安定性に主眼をおいており、ＧＯＴ及びＧＰＴ測定に必要なその他の配合成分、例えばＮＡＤＨの安定性については、単にｐＨ９〜１１のアルカリ性条件下におけば、その寿命に問題はなく、特に基質のα−ケトグルタル酸についても殺菌剤（アルカリ金属のアジ化物、陽イオン界面活性剤、安息香酸の誘導体、メチレングルタロニトリルの臭化物、種々の抗生物質等）を使用すればその安定性に問題はないと記載しているに過ぎない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、本発明者らが確認したところによれば、例えば、従来、その安定性についてはさほど重要視されていなかった基質２−オキソグルタル酸を過剰量添加した液状試薬を調製し、長期間保存後の含有量を測定したところ、試薬の組成条件によっては、最初の含有量の５０％以下に低下することが認められ、測定対象物質の検出結果にも影響を与えることがわかった。
【００１２】
例えば、２−オキソグルタル酸を試薬構成成分として用いる診断用測定試薬の代表例としては、前述のＧＯＴやＧＰＴの測定試薬がある。これら測定試薬としては、種々の市販品が存在し、例えば、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準ずる試薬の組成は以下に示すように２試薬系で構成されている。
【００１３】
ＧＯＴ測定用試薬
第１試薬：
ＮＡＤＨ：０．２ｍＭ
ＭＤＨ  ：６２５Ｕ
ＬＤＨ  ：６２５Ｕ
Ｌ−アスパラギン酸：２５０ｍＭ
８８ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．８０，３０℃）
第２試薬：
α−ＫＧ：１００ｍＭ
８８ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．８０，３０℃）
【００１４】
ＧＰＴ測定用試薬
第１試薬：
ＮＡＤＨ：０．２ｍＭ
ＬＤＨ  ：２５００Ｕ
Ｌ−アラニン：６２０ｍＭ
１１１ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５０、３０℃）
第２試薬：
α−ＫＧ：１５０ｍＭ
１１１ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．５０、３０℃）
【００１５】
本発明者は、前記のＧＯＴ測定用試薬及びＧＰＴ測定用試薬のそれぞれの第２試薬の２−オキソグルタル酸（α−ＫＧ）基質溶液について保存安定性を追跡したところ、調製直後のα−ＫＧ量を１００％とした場合、約３週間でそれぞれ７０〜８０％の残存量しかないことが確認された。より長期間保存した試薬においては、更にα−ＫＧ量が低下してしまう。α−ＫＧの残存量が５０％まで低下すると、ＧＯＴやＧＰＴ活性値が約３〜５％低値として測定され、正確な診断を要求されるケースにおいては影響が大きい。
【００１６】
上記のように２試薬系で試薬を構成する際に、測定で使用する酵素や基質を安定な条件で維持し、なおかつ、両者を混合した後の反応時のｐＨをＧＯＴやＧＰＴの至適ｐＨ付近に設定するためには、それぞれの成分を緩衝液で溶解し構成することが常である。例えば、特開昭５５−２６８９４号公報はＧＯＴ及びＧＰＴの測定方法及び測定試薬について開示しているが、該公報に記載されているように、通常の測定用試薬に用いる緩衝液に対しては、あくまでもその緩衝作用を期待するものであって、緩衝剤の種類は厳密ではないというのが一般的認識である。従って、構成成分の安定化に対しては、緩衝液のｐＨや各種安定化剤の添加の検討が中心に行われてきたのである。
【００１７】
これに対して、本発明者は、試薬成分の２−オキソグルタル酸（α−ＫＧ）の安定化を目的とする研究を行ったところ、単にｐＨの調整を行うだけでなく、緩衝液の種類によって安定化効果が異なることを確認し、驚くべきことに、両性イオン緩衝液を用いると、２−オキソグルタル酸を長期間安定に保てることを見出した。
従って、本発明の目的は、２−オキソグルタル酸を含有する液状試薬の安定化を図り、信頼性の高い試薬を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）又はグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）測定用であって、２−オキソグルタル酸が両性イオン緩衝液に溶解していることを特徴とする、安定な２−オキソグルタル酸含有液状試薬に関する。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう両性イオン緩衝液とは、同一分子内に酸性基と塩基性基とを有し、電離によって正負の両電荷を帯び、水中では両性イオンとなる両性電解質物質を用いた緩衝液をいう。例えば、両性電解質として分子内にアミノ酸を有する物質を用いた緩衝液をいう。具体的には、Ｎ−置換タウリン類あるいはＮ−置換グリシン類あるいは脂肪族アミン類等のアミノ酸誘導体、又は未置換アミノ酸類をいう。
この場合、単に酸性基、塩基性基を有していてもｍ−アミノフェノール等の弱酸−弱塩基の電荷をもたない物質は効果が少なく、少なくとも中性種が正負両方の電荷をもつ物質が好ましい。
【００２０】
上記のような特性を有する物質として、グリシン；タウリン；グリシルグリシン；アミノアセトアミド；Ｎ−置換グリシン、例えば、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ２酢酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、又はＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；Ｎ−置換タウリン、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、シクロヘキシルプロパンスルホン酸、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸、又はピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）；脂肪族アミン、例えば、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、又は（２−アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド塩酸塩；あるいは、Ｎ−置換アミノプロパンスルホン酸、例えば、３−モルホリノプロンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−３−アミノプロパンスルホン酸、又はシクロヘキシルプロパンスルホン酸等を挙げることができる。これらの多くは、一般的にグッド緩衝剤（液）と呼ばれている。
【００２１】
前記の両性電解質化合物は、１〜５００ｍＭの濃度範囲内で用いる。好ましくは５〜５００ｍＭ、より好ましくは１０〜３００ｍＭの濃度範囲となるように用いる。前記の両性電解質緩衝液で、構成成分（α−ＫＧ）を所望の濃度となるように溶解する。両性電解質化合物の濃度が１ｍＭよりも低いとｐＨ緩衝能が不十分で、長期保存時に溶液のｐＨが変動する危険性があり好ましくない。また、５００ｍＭを超えると、２−オキソグルタル酸の安定性の面では問題は無いものの、２試薬系の場合、一方の試薬の緩衝能が強すぎると、所望の反応系の至適ｐＨに設定するのが難しくなる点で好ましくない。
【００２２】
こうして調製したα−ＫＧ含有液のｐＨを適当な酸（例えば、ＨＣｌ）あるいはアルカリ（例えば、ＫＯＨ）で所望の値に設定することができる。本発明で用いられる両性イオン緩衝液は、その緩衝能が中性付近で好適に発現することから、α−ＫＧ単独での安定性を保つには、ｐＨ６．０〜９．５であれば良い。しかし、多くの場合には、α−ＫＧを含まないもう一方の試薬と混合して用いられることから、混合時の反応系のｐＨが目的の至適付近に設定されるように、上記ｐＨ範囲内で適宜調整して用いればよい。
前記の必須の配合成分の他に、必要により、一般的に添加される成分、例えばＥＤＴＡ等のキレート剤、アジ化物等の防腐剤、及び各種界面活性剤等を適宜添加することができる。
【００２３】
このように構成された２−オキソグルタル酸液状試薬は、半年以上に渡って安定性を保つことができる。この２−オキソグルタル酸含有試薬は、前述のとおり、ＧＯＴ又はＧＰＴ測定用試薬に用いることができる。この際、試薬構成として、２−オキソグルタル酸含有試薬に、ＧＯＴやＧＰＴの測定時に用いられるもう一方の基質物質（Ｌ−アスパラギン酸あるいはＬ−アラニン）と混合して構成しても何ら問題は無く、ＧＯＴ又はＧＰＴを正確に測定することができる。また、場合により、２−オキソグルタル酸と、酵素、例えば、ＬＤＨ（ＧＰＴ測定用試薬）又はＬＤＨ及びＭＤＨ（ＧＯＴ測定用試薬の場合）との組み合わせから試薬を構成しても、酵素類に対する影響は無い。
【００２４】
更に、本発明の液状試薬は、ＧＯＴ又はＧＰＴ測定試薬だけでなく、その他の２−オキソグルタル酸を用いる測定試薬に広く適用することができる。例えば、尿素窒素測定試薬やグルタミン酸脱水素酵素測定試薬等に適用できる。
【００２５】
【作用】
本発明による２−オキソグルタル酸の安定化の機構は、現在のところ不明であるが、両性イオン緩衝液が水に極めて溶解し易い点、イオン強度が低い点、錯塩形成能が低い点等が相俟って、２−オキソグルタル酸の非酵素的分解が効果的に抑制され、長期間に渡って安定化を可能にしたものと推察される。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
両性イオン緩衝液として、１００ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、ＢＥＳという）緩衝液に２−オキソグルタル酸４．６ｇ及びＬ−アスパラギン酸ナトリウム塩７０ｇを溶解し、全量を１リットルとした後、ＫＯＨでｐＨ７．８０に調整し、本発明による液状試薬ＧＯＴ用−ＢＥＳを調製した。
また、これとは別に、上記の両性イオン緩衝液に２−オキソグルタル酸６．８ｇ及びＬ−アラニン９０ｇを溶解し、全量を１リットルとした後、ＫＯＨでｐＨ７．５０に調整し、本発明による液状試薬ＧＰＴ用−ＢＥＳを調製した。
【００２７】
上記と同様に本発明による液状試薬を調製したが、但しＢＥＳに換えて、両性イオン緩衝液として、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）及びグリシン（Ｇｌｙ）による緩衝液を用いて２−オキソグルタル酸及びＬ−アスパラギン酸（あるいはＬ−アラニン）を同量添加して溶解し、ＫＯＨでｐＨを調整し、それぞれ本発明による液状試薬ＧＯＴ用−ＨＥＰＥＳ、ＧＯＴ用−ＴＡＰＳＯ、ＧＯＴ用−ＰＯＰＳＯ、ＧＯＴ用−ＭＯＰＳ、ＧＯＴ用−ＴＥＳ、ＧＯＴ用−ＤＩＰＳＯ、ＧＯＴ用−Ｇｌｙ及びＧＰＴ用−ＨＥＰＥＳ、ＧＰＴ用−ＴＡＰＳＯ、ＧＰＴ用−ＰＯＰＳＯ、ＧＰＴ用−ＭＯＰＳ、ＧＰＴ用−ＴＥＳ、ＧＰＴ用−ＤＩＰＳＯ、ＧＰＴ用−Ｇｌｙを調製した。
【００２８】
比較用として前記と同様の液状試薬を調製したが、但し、前記の両性イオン緩衝液に換えて、１００ｍＭトリス緩衝液、２００ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭイミダゾール緩衝液、及び１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液を用いて、それぞれ比較用液状試薬ＧＯＴ用−１００トリス、ＧＯＴ用−２００トリス、ＧＯＴ用−イミダゾール、ＧＯＴ用−トリエタ及びＧＰＴ用−１００トリス、ＧＰＴ用−２００トリス、ＧＰＴ用−イミダゾール、及びＧＰＴ用−トリエタを調製した。
【００２９】
それぞれの２−オキソグルタル酸含有溶液を１０℃にて保存し、調製直後、１ケ月後及び３ケ月後の２−オキソグルタル酸の含有量を以下の操作により測定した。
すなわち、それぞれの２−オキソグルタル酸含有液１ｍｌを０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）で希釈して２−オキソグルタル酸希釈液２０ｍｌを得た。その希釈液０．１ｍｌに１０ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＨ及び１６０ｍｇ／ｍｌの塩化アンモニウムを含む０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）２．９ｍｌを添加し、次いでグルタミン酸脱水素酵素水溶液（６０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを添加し、２５℃で１０分間反応させた後、波長３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
これとは別に、２−オキソグルタル酸標準溶液を用いて同様の操作を行い吸光度を測定した。また、標準溶液に換えて、０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）を用いて同様の操作を行い吸光度を測定した（ブランク）。
各吸光度値から、保存溶液中に含まれる２−オキソグルタル酸の含量を、調製直後を１００％として求めた。結果を表１（ＧＯＴ）及び表２（ＧＰＴ）に示す。以上の結果から、本発明によって調製した液状試薬中の２−オキソグルタル酸は、長期間に渡って安定化されていることを確認することができた。
【００３０】
【表１】
0003617675.tif 000004
【００３１】
【表２】
0003617675.tif 000005
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、２−オキソグルタル酸を両性イオン緩衝液に溶解させることにより、安定な２−オキソグルタル酸含有液状試薬を提供することができる。