(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）以下の
ｉ）植物細胞内で活性であり、かつ植物細胞でRNAの形成を保証するプロモーター、
ii）ポリフルクタン（レバン）シュクラーゼをコ−ドするDNA配列、
iii）前記のプロモーターとポリフルクタン（レバン）シュクラーゼをコードするDNA配列との間に位置し、ポリフルクタン（レバン）シュクラーゼを液胞に向かわせるシグナル配列、及び
iv）植物細胞で転写終結並びにRNAの３′−末端にポリ−Ａ−テールの付加をもたらす3'−非翻訳配列
を有するDNA分子を製造し、
（ｂ）植物細胞中に前記DNA配列を移入し、かつ植物細胞ゲノムに該配列を組み込むことを特徴とする、ポリフルクタンを産生するトランスジェニック植物細胞の製造方法。
【請求項２】
植物種がトウモロコシ、米、小麦、大麦又はサトウキビである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により得られる植物細胞。
【請求項４】
以下の工程：
（ａ）以下の
ｉ）植物内で活性であり、かつ意図したターゲット組織もしくはターゲット細胞でRNAの形成を保証するプロモーター、
ii）ポリフルクタン（レバン）シュクラーゼをコードするDNA配列、
iii）ポリフルクタン（レバン）シュクラーゼを液胞に向かわせるシグナル配列、及び
iv）植物細胞で転写終結並びにRNAの３′−末端にポリ−Ａ−テールの付加をもたらす3'−非翻訳配列
を有するDNA分子を製造し、
（ｂ）双子葉植物細胞中に前記DNA配列を移入し、かつ植物ゲノムに該配列を組み込み、かつ
（ｃ）形質転換した植物細胞から完全な全植物体を再生し、
その際、該ポリフルクタン（レバン）シュクラーゼは前記トランスジェニック植物の細胞の液胞に位置し、かつ液胞においてポリフルクタン（レバン）の形成をもたらすことを特徴とする、ポリフルクタンを産生するトランスジェニック双子葉植物の製造方法。
【請求項５】
ポリフルクタンシュクラーゼをコードするDNA配列が1438bp長のヌクレオチド配列（配列−ID  No1）：
0003643591.tif 000005
0003643591.tif 000006
を有する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
農作物植物である、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
テンサイ、タバコもしくはポテト植物である、請求項４から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ポリフルクタンが大量のスクロースを貯蔵する植物の器官において産生される、請求項４から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記の器官がテンサイの根又はデンプン合成の遮断によりその塊茎にスクロースを貯蔵するポテトの塊茎である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項４から９までのいずれか１項記載の方法により得られる双子葉植物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ポリフルクタン（レバン）を生成するDNA配列、これらの配列が配置されたプラスミドを使用するトランスジェニック植物の製造方法に関する。
背景技術
高分子量で、水溶性の線状ポリマー、例えばポリアクリレート又はポリメタアクリレートに基づくものは、鉱油の生産物であり、多くの重要な用途を有する。特に、水性系の粘度を増大させる、懸濁化させる又は沈降促進及び複合化させる等のこれらの特性は技術観点から殊に価値がある。これらの生成物は、さらに、例外的に水結合のためのスーパー吸収剤及び水で希釈可能なラッカーとして大量に使用される。このすぐれた有用な特性にもかかわらず、かかる生成物は処理が困難であり、かつ、生物分解性でないため、それらの使用は益々批判を受けるようになってきている。
再生可能な未処理材料に基づく代替物、殊に澱粉及びセルロースは、これらのポリサッカライドの巨大分子構造のゆえに、限定された価値を有することが判明している。非生物分解性で、化学的に誘導されたポリマーの代替物として、多くの誘導体化高分子量ポリサッカライドが検討されてきた。今日まで、かかるポリサッカライドは、適当な発酵及びグリコシル転移方法を介してバイオテクノロジー的にのみ得ることができた。こうして得られた、デキストラン及びポリフルクタン（レバン）のような生成物は、大量生産物に対する未処理原料としては競合しえない。
ポリフルクタンは、多くの単子葉及び双子葉性の高等植物、緑藻並びに多くのグラム陽性及びグラム陰性菌において見い出されている（メイアー（Meier）及びレイド（Reid），（1982）エンサイクロ  ペディア  オブ  プラント  フィジオロジー，ニューシリーズ,13A.418−471）。植物の進化及び植物の成長のためのフルクタンの役割は完全には理解されていない。今まで提案されたフルクタンの機能は、低温での凍結に対する保護、限定された澱粉生合成による代替炭水化物の保存、並びに光同化のための応用された中間保存物としてのものであり、種子に移動する間隙には、草の茎に存在している。
すべてのフルクタンは重合化反応のための出発分子として、ショ糖（グルコース−フルクトース）分子を含有しており、これにフルクトースポリマーが結合している。
フルクトース分子のカップリングに依存して、植物起源のフルクタンは４種に分類することができる（メイアー及びレイド（1982），エンサイクロペディア  オブ  プラント  フィジオロジー，ニュー  シリーズ,13A,418−471）：
ａ）  （２−１）結合β−Ｄ−フルクタン（イヌリン型）
ｂ）  （２−６）結合β−Ｄ−フルクタン（フレイン（phlein）又はレバン型）
ｃ）  ２−１及び２−６結合体の混合物を有する高度に分枝したフルクタン
ｄ）  ａ〜ｃ項の型のものとは対照的に、グルコース及びポリフルトース残基からのフルクトース残基の両方から重合させたフルクトース残基より完全に添加された、（２−１）結合したβ−Ｄ−フルクタン（ネオケストース型）。
バクテリア起源のフルクタンは、レバン又はイヌリン型のいずれかに相当する（カールソン（Carlsson）（1970）Caries Research 4,97〜113）及びデドンダー（Dedonder）（1966）Methods Enzymology 8,500〜505）。
植物及びバクテリア中のフルクタンの生合成に関する実験によれば、生合成は種々の経路により進行すると結論される。バクテリア及び植物フルクタンは、さらに、その一次構造のみならず、主にその分子量において区別される。植物から分離されたフルクタンは5000及び50,000dの間の分子量を有することが示されているのに対して（ポロック（Pollock）及びチャタートン（Chatterton）（1988）:The Biochemistry of plants 14,109−140）、バクテリアから分離されたフルクタンは2,000,000dまでの分子量であることが記載されている（クルーク（Clarke）ら（1991）:Carbohydrates as Organic Raw Materials,VCH Weinheim 169−182）。
バシラス種並びにストレプトコッカス種のグループの種々の微生物はポリフルクトースを生成しており、その中にはレバン型のフルクタン及びイヌリン型のフルクタンが記載されている（カールソン1970）Carise Research4,97〜113及びデドンダー（1966）Methods Enzymology8,500〜505）。
生合成の経路に関する実験によれば、高等植物での生合成経路に比較してより単純なパターンがあり、唯一の酵素が共有されていることが明らかである。レバンシュクラーゼ（levan sucrase）という平凡な名前を有するこの酵素は、トランスフルクトシラーゼ（ショ糖：β−Ｄ−フルクトシル  トランスフェラーゼ,E.C.2.4.1.10.）であり、これは次の反応の触媒作用を行う：
ショ糖＋受容体→グルコース＋フルクトシル受容体
代表的な受容体は、水、アルコール、砂糖又はポリフルクトースである。唯一種の酵素がこの反応を触媒するという説は、一方では蛋白化学的精製酵素の試驗に基づくものであり、他方では、レバン  シュクラーゼに関する遺伝子が種々のバシラス種及びストレプトコッカス種から分離され、E.coliに転移させた後にE.coliでレバンが形成されるという事実に基づくものである（Gay et al.（1983）J.Bacteriology153,1424−1431及びトーら（1986）Infection and Immunity52,166〜170）。
今日まで、バシラス・アミロリクファシエンス（Tang）et al.,（1990）Gene 96,89〜93）及びバシラス・サチリス（Steinmetz et al.（1985）Mol.Gen.Genetics 200,220〜228）からのレバン  シュクラーゼに関する遺伝子が記載されており、これは互いに比較的高い相同性を示し、そのいずれもレバン型のフルクタンの合成を触媒する。さらに、ストレプトコッカス  ミュータンス（Shiroza et al.（1988）J.Bacteriology170,810−816）からのフルクトシル  トランスフェラーゼが記載されている。これはバシラス種からのレバン  シュクラーゼにはほとんど相同性を示さない。ストレプトコッカス  ミュータンスで形成されるフルクタンはイヌリン型のものである。
WO  89/12386号において、トランス  ジェニック植物、特にトランスジェニック植物の果実の中においてデキストラン又はレバンのような炭水化物ポリマーを生成する可能性を記載している。これらの植物を製造するために、アエロバクター・レバニクム（Aerobacter levanicum）、ストレプトコッカス・サリバリウス及びバシラス・サチリスからのレバン・シュクラーゼを使用すること及びリューコノストク・メゼンテロイデスからのデキストラン・シュクラーゼを使用することが記載されている。
さらに、バシラス・サチリスからのレバン・シュクラーゼ及びリューコノストク・メゼンテロイデスからのシュクラーゼをトランスジェニック植物中で発現させるのに適したキメラ遺伝子の構築が記載されている。また、これらの構築体を含むトランスジェニック植物の製造も記載されている。さらに、これらの構築体を含むトランスジェニック植物の製造が記載されている。ポリフルクタンが現実に記載された方法で製造し得るか否かは未知である。
バイオテクノロジー方法により、トランスジェニック植物における炭水化物の濃度を修飾し、及び／又は炭水化物の濃度を上げる一連の方法も記載されている。このように澱粉の濃度を増大させ、かつ、物理的及び化学的観点から澱粉を改変することがすでに知られているという事実からみて、ADP−グルコース−ピロホスホリラーゼ活性を上昇させる又は低下させることによりジャガイモの炭水化物濃度を改変することは達成可能である（ヨーロッパ特許第455316号）。
ヨーロッパ特許第442  592号から、サイドゾリック（cytosolic）及びアポプラスチック（apoplastic）インベルターゼにより光同化体（photoassimilates）の分布を修飾することが可能であること及びポテト植物中の異種ピロホスファターゼの発現を通してポテト植物の収率並びに千魃及び霜抵抗性を修飾しうることもすでに知られている。
ポリサッカライドのように益々その使用が増大している未処理材料の物理−化学的パラメータを化学産業の要求に適合させるため、並びにこれらの生成物を得るコストを最少にするために、トランスジェニック植物の製造方法を発展させ、既知の方法に比較して、良好な、より高い収率をもつ植物を得なければならない。
発明の開示
ところで、驚くべきことに、次のヌクレオチド配列（配列−ID  NO1）：
0003643591.tif 000002
0003643591.tif 000003
を有するエルウニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）属のグラム陰性バクテリアからのレバン・シュクラーゼのDNA配列がトランスジェニック植物内で大量のポリフルクタン（レバン）を形成可能であり、これが再使用可能な未精製材料という観点で化学産業の必要性に決定的に合致するということを見い出した。
DNA配列を植物ゲノムに組み込み、上記のDNA配列を存在させることにより、植物、殊に葉及び塊茎におけるポリフルクタン（レバン）の発現が可能である。本発明のレバン・シュクラーゼは、DNAレベルでは既知のレバン  シュクラーゼに有意の相同性を示さない。
本発明は、さらに以下の工程を含む、葉及び塊茎においてポリフルクタン（レバン）発現を行うトランスジェニック植物の製造方法を提供する：
（ａ）以下の部分配列を有するDNA配列を製造する：
ｉ）  植物内で活性であり、そして意図したターゲット組織又はターゲット細胞内でRNAの形成を保証するプロモーター、
ii）  レバン  シュクラーゼのDNA配列、及び
iii）  植物細胞内で転写及びRNAの３′−末端へのポリＡ残基の付加を終止させる３′−非−翻訳配列、
（ｂ）プラスミドを使用して、植物細胞から組換え二重鎖DNA分子の植物ゲノムでDNA配列を移入（transfer）し、かつ組み込む、及び
（ｃ）形質乾燥した植物の細胞からの完全な全植物体を再生する。
工程（ａ）,ii）で得られたレバン  ショ糖は、好適には配列IC  No1.で記載したタクレオチド配列を示す。
レバン  シュクラーゼは次の反応の触媒を行う：
ショ糖−（フルクトース）ｎ＋ショ糖→
ショ糖−（フルクトース）n+1＋グルコース
基本的にこの方法を使用して、ポリフルクタン（レバン）発現に関して、すべての植物、好適には、トウモロコシ、米、小麦、大麦、テンサイ、サトウキビ、タバコ及びジャガイモのような作物を改質することができる。
工程（ｂ）において、基本的には配列ID  No1で記載されてDNA配列を有するすべてのプラスミドが使用できる。好適には、プラスミドp35s−CW−LEV（DSM  7186）、プラスミドp35s−CY−LEV（DSM7187）又はプラスミドp33−CW−LEV（DSM  7188）が使用される。
ショ糖はレバン・シュクラーゼに対する基質であるから、大量のショ糖を蓄積する器官では特にポリフルクタンの製造が有利である。かかる器官は、例えばテンサイの根又はサトウキビの茎である。遺伝的に改質したポテトにおいては、澱粉の生合成を抑止することによりその塊茎にショ糖を蓄積するので、特に有利である。
ショ糖の生合成はサイトゾルで起こるのに対して、蓄積は空胞で行う。サトウキビ又はポテトの蓄積組織への輸送又は種子の内胚乳への輸送の間に、ショ糖は細胞間隙を横断しなければならない。ポリフルクタンの製造において、３個のすべての細胞分画、即ち、サイトゾル、空胞及び細胞間隙が適切である。
ヌクレオチド配列ID  No1のレバン  ショ糖のコード配列、形成される酵素をコードするコード配列にセンス・オリエンテーション（コード配列の５′−末端へのプロモーターの３′末端）で結合する特定の順序の転写を保証するプロモーターを提供することができる。mRNA合成の終止を決定する終止シグナルは、コード配列の３′−末端に付着している。葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリア、空胞、アイトゾル又は細胞間隙のような特定の細胞下分画で発現される酵素を指令するために、いわゆるシグナル配列又は遷移ペプチドコード配列をプロモーターとコード配列の間に位置させることができる。この配列は、酵素のコード配列と同一の読み取りフレームの中になければならない。
高等植物における本発明のDNA配列の導入のために、大量のクローニングベクターが利用され、これはE.Coliに対する複製シグナル及びマーカーを有しており、形質転換された細胞の選択を可能とする。ベクターの例は、pBR322,pUC−シリーズのもの、M13mp−シリーズのもの、pACYC  184;EMBL3等である。所望の遺伝子を植物に導入する方法によっては、他のDNA配列も適切かもしれない。もしTi−又はRi−プラスミドが例えば、植物細胞の形質転換のために使用されなければならない場合には、フランキング領域として、Ti−及びRi−プラスミドＴ−DNAの少くとも右境界、しかしながら、しばしば左右両方の境界が導入される遺伝子に付着される。植物細胞の形質転換のためのＴ−DNAの使用は広く研究されており、ヨーロッパ特許第120516号;Hoekama,“The Binary PLant Vector System"Offset−drukkerij Kanters B.V.Alblasserdam,（1985），第５章;Fraley,et al.,“Crit.Rev.Plant Sci.,4:1〜46及びAn et al.,（1985）EMBOJ.4:277〜287に十分に記載されている。導入されたDNAがゲノムに組み込まれると、一般には安定であり、元の形質転換された細胞の子孫にも維持される。これは通常、選択マーカーを含有しており、これは殺生物剤又はカナマイシン、G418,ブレオマイシン、ヒグロマイシン又はホスホリノトリシン等のような抗生物質に対する抵抗性を形質転換された植物にもたらす。使用された個々のマーカーは、それゆえ、導入されたDNAに欠けている細胞から形質転換された細胞を選択することを可能とする。
アグロバクテリアを使用する形質転換のほかに、DNAを植物に導入するために、多くの他の利用しうる方法がある。これらの方法には、プロトプラストの融合、DNAのマイクロインジェクション及びエレクトロポレーション並びにミサイル方法及びウイルス感染が含まれる。選択のための抗生質又は殺生物剤を含有する適当な媒質中で、形質転換した植物材料から、全植物を再生させることができる。次いで生成した植物について、導入したDNAの存在を試験することができる。注入及びエレクトロポレーションにおいてプラスミドには特別の要求は存在しない。例えば、pUC−誘導体のような単純なプラスミドを使用しうる。しかしながら、もし全植物がかかる形質転換した細胞から再生される場合には、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。
形質転換した細胞は通常の態様で植物内で成長する（McCormick et al.,（1986）Plant Cell Reports 5:81〜84も参照）。これらの植物は普通成育でき、かつ植物と交雑でき、これは同一の又は異なる形質転換した遺伝子を有する。得られたハイブリッドの個体は相応の表現型特性を有する。
寄託
以下のプラスミドを1992年７月16日にドイツ、ブラウンシュバイツにあるドイツ微生物収集所（Deutschen Sammlung von Mikroorganismen:DSM）に寄託した（寄託番号）：
プラスミドp35s−CW−LEV（DSM  7186）、プラスミドp35s−CY−LEV（DSM  7178）、プラスミドp33−CW−LEV（DSM7188）
【図面の簡単な説明】
第１図は、p35−CW−LEVプラスミドの構造を示す。これは、３個のフラグメントA,B及びＣを含む。フラグメントＡは、カリフラワー（cauliflower）モザイク  ウイルス（CaMV）の35sプロモーター、ヌクレオチド6906−7437を含有する。
フラグメントＢは、エルウィニア  アミロボーラからのレバン  シュクラーゼのヌクレオチド689−2122の配列を有する（配列ID  No.1）。
フラグメントＣは,Ti−プラスミドのpTi  ACH5のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニール化シグナル、ヌクレオチド11749−11939を含有する。
第２図は、p35s−CY−LEVプラスミドの構造を示す。これは、３個のフラグメントA,B及びＣを含む。フラグメントＡは、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）の35sプロモーター、ヌクレオチド6909−7437を含む。
フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバン  シュクラーゼのヌクレオチド配列864−2122を含有する（配列ID  No.1）。
フラグメントＣは、Ti−プラスミドのpTi  ACH5のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニール化シグナルを含む。
第３図は、p33−CW−LEVプラスミドの構造を示す。これは、３個のフラグメントA,B及びＣを含む。フラグメントＡは、パタチン（Patatin）遺伝子B33のプロモーター領域のDra I−Dra I−フラグメント（−1512の位置から＋14の位置）を含む。
フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバン  シュクラーゼのヌクレオチドの配列689−2122を含む（配列  ID  No.1）。
フラグメントＣは、Ti−プラスミドのpTi  ACH5のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニール化シグナルのヌクレオチド11749−11939を含む。
第４図は、形質転換したタバコ植物におけるポリフルクタンの検出を示す（No.2,3及び13）。
ここで、Ftu＝フルクトース,Suc＝ショ糖,Kes＝ケストース,C1＝コントロール1,C2＝コントロール2,M＝マーカーである。
本発明の基礎をなす実施例を理解するために、これらの試験に必要なそれ自体既知のすべての方法を最初に掲げる：
1.  クローニング  プロセス
クローニングのためにベクターpUC18（Yanisch−Perronら，（1985）Gene33:103−119）を使用した。
植物の形質転換のために、遺伝子構築物をバイナリーベクターBIN19（Bevan（1984）Nucl.Acids Res12:8711−8720）にクローン化した。
2.  菌株
E.Coli株BMH 71−18（Messing et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1977）,24,6342−6346）又はTB1をpUCベクターに対して使用した。TB1は,JM101株の組換え−ネガティヴ、テトラサイクリン−抵抗性誘導体である（Yanisch−Perronら.,Gene（1985）,33,103−119）。TB1株の遺伝子型は、（Bart Barrel,Personal communication）:F'（tra D36,proAB,lac I,lac ZΔM15），Δ（lac,pro）,SupE,thiS,recA,Srl::Tnl0（TcR）である。
ポテト植物へのプラスミドの形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4404を使用して実施した（Bevan,（1984）,Nucl.Acids Res.12,8711−8720）。
3.  アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換
BIN19誘導体の場合、アグロバクテリウムへのDNAの挿入はホルスター（Holsters）ら.,（1978）（Mol Gene Genet 163:181−187）の方法に従って直接形質転換により実施した。形質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドDNAは、バーンボイム（Birnboim）及びドーリー（Doly）（1979）（Nucl Acids Res 7:1513−1523）の方法に従がって分離し、適当な制限切断の後にゲル電気泳動により分析した。
4.  植物形質転換
Ａ）  タバコ：選択下に成長させ、一晩培養したアグロバクテリウム・ツメファシェンスの一晩の培養物10mlを遠心分離し、上澄み液を捨て、そして抗生物質を含有しない同容積の媒質に菌を再懸濁させた。滅菌ペトリ皿上で、中心葉脈の除去され、滅菌された植物の葉のディスクをこの菌の懸濁液に浸した。この葉のディスクを２％のショ糖及び0.8％のバクト寒天を有するMS媒質含有のペトリ皿内に、緊密に充填した形態で載置した（Murashige et sl.,（1962）Physiologia Plantarum15,473−497）。暗所で25℃にて２日間培養した後、これらを100mg/lカナマイシン,500mg/lクラフォラン（claforan）,1mg/lベンジルアミノプリン（BAP）,0.2mg/lのナフチル酢酸（NAA）及び0.8％バクト寒天を含有するMS媒質に移しかえた。生育物を250mg/lのクラフォランを含有し、ホルモン不含のMS媒質に移した。
Ｂ）  ジャガイモ：メスで傷つけた滅菌ポテトの培養物の10枚の小さな葉を,30〜50μｌのアグロバクテリウム・ツメファシエンスを含有し２％のショ糖を有する10mlのMS媒質中に載置し、選択しながら１晩培養した。３〜５分軽く振った後で、この葉を、1.6グルコース,2mg/lのゼアチン  リボース,0.02mg/lのナフチル酢酸,0.02mg/lのジベレリン酸,500mg/lのクラフォラン,50mg/lのカナマイシン及び0.8％のバクト寒天を有するMS媒質上に置いた。25℃及び3000ルクスで１週間培養した後で、媒質中のクラフォラン濃度を半分に下げた。その後、Rocha−Sosa et al.,（1989）EMBO Journal 8,29により記載された方法を使用して培養を実施した。
5.  形質転換した植物からのゲノムDNAの分析
ゲノム植物DNAの分離は,Rogers et al.,（1985）Plant Mol Biol 5,69−76に従い実施した。
DNA分析に関して、適当な制限切断の後で、サザーン・ブロット方法により、検討すべきDNA配列の組み込みについて10〜20μｇのDNAを分析した。
6.  形質転換植物からの全RNAの分析
植物の全RNAの分離は、（Logemann et al.（1987）,Analytical Biochem.163,16−20に従って実施した。
分析に関して、ノーガン  ブロット方法により、求めるトランスクリプトの存在について合計50μｇのRNAを研究した。
7.  植物体内のポリフルクトースの抽出及び測定
抽出及び測定をPortis H.G.（1990）,Meth.Plant Biochem.2,353−369の方法に従って実施した。
実施例１
プラスミドp35s−CM−LEVの調製及びタバコ並びにポテトのゲノムへのプラスミドの挿入
プラスミドp35s−CM−LEVは３個のフラグメントA,B及びＣを有しており、これらをpUC18からのポリリンカーの制限酵素に対する切断個所でクローン化した（第１図参照）。
フラグメントＡは、カリフラワー  モザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーターを含む。これはCaMV（Franckら.,（1980）Cell 21,285−294）のヌクレオチド6909から7437を含むフラグメントを含有し、プラスミドpDH51（Pietrzak et al.,Nucleic Acids Research  14,5857−5868）からのEco R I−Kpn Iフラグメントとして分離し、そしてプラスミドpUC18のポリリンカーのEco R I−Kpn I切断部位の間でクローン化した。
フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバン  シュクラーゼ遺伝子（配列、ID No.1）のヌクレオチド689−2122の配列を有しており、これをpUC18のポリリンカーのBamH I/Sal I切断部位の間でクローン化した。
フラグメントＣは、プラスミドpAGV40（Herrera−Estrella et al.,（1983）Nature 303,209−213）からPvu II−Hind IIIフラグメントとして分離されたTi−プラスミド,pTi  ACH5（Gielenら（1984）;EMBO J.3,835−846）のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナル，ヌクレオチド11749−11939を有しており,Pvu II切断部分にSph Iリンカーを添加した後で,pUC18.von pUC18のポリリンカーのSph I−Hind III切断部位の間でクローン化した。プラスミドp35s−CW−LEVは2151塩素対の大きさを有している。
フラグメントA,B及びＣを有するプラスミドp35s−CW−LEVの部分がバイナリーベクターに導入され、アグロバクテリウム  システムを使用してタバコ及びポテト植物に導入した。完全な植物が形質転換した細胞から再生された。この遺伝子で形質転換した一連のタバコ植物からの葉の分析は、遺伝子35s−CW−LEVの発現に起源を有するポリフルクタン（レバン）の存在を明らかに示した。（第４参照）
実施例２
プラスミドp35s−CW−LEVの調製及びタバコ並びにポテトへのこのプラスミドの挿入
フラグメントＢ（レバン  シュクラーゼをコードする）を５′−末端でヌクレオチドを短かくするという修飾を行った他は、実施例１で記載したのと同様にして、本実施例を実施した。この結果、トランスジェニック植物のサイトゾール内で蛋白質の発現が生じた。
このプラスミドp35s−CY−LEVは,3個のフラグメントA,B及びＣを含有し、これらはpUC18からのポリリンカーの制限酵素に対する切断個所でクローン化した（第２図参照）。
フラグメントＡは、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーターを有する。これは、CaMV（Franckら、（1980）Cell 21,285−294）のヌクレオチド6909−7437を有するフラグメントを含有し、プラスミドpDH51（Pietrzak et al.,Nucleic Acids Research 14,5857−5868）からEco R I−Kpn Iフラグメントとして分離し、そしてプラスミドpUC18のポリリンカーのEco R I−Kpn I切断部位の間でクローン化した。
フラグメントＢは、エルウィニア・アミロボーラからのレバン  シュクラーゼの遺伝子（配列、ID No.1）のヌクレオチド864−2122の配列を有しており、そして,pUC18のポリリンカーのSma I/Sal I切断部分の間でクローン化した。
フラグメントＣは、プラスミドpAGV40（Herrera−Estrella et al.,（1983）Nature 303,209−213）からPvu II−Hind IIIフラグメントとして分離した、Ti−プラスミド,pTi  ACH5（Gielenら（1984）;EMBO  J.3.835−846）のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド11749−11939を含有し、そして、pvu II切断部位へSph Iリンカーを添加した後で,pUC18.von pUC18のポリリンカーのSph I−Hind III切断分位の間でクローン化した。プラスミドp35s−CY−LEVは1976個の塩基対を有している。
フラグメントA,B及びＣを含有するプラスミドp35s−CY−LEVの部分がバイナリーベクターに導入され、そしてアグロバクテリアシステムを使用してタバコ及びポテト植物に導入された。形質転換した細胞から完全な植物が再生した。
実施例３
プラスミドp35s−CY−LEVの調製及びタバコ及びポテトのゲノムへのこのプラスミドの挿入
35sプロモーターをクラスＩパタチン遺伝子B33のプロモーター（Rocha−Sosa et al.,（1989）EMBO J 8,23−29）で置き代えた外は、実施例１記載されたのと同様の態様で本実施例を実施した。
プラスミドp33−CW−LEVは,3個のフラグメントA,B及びＣを含み、これらはpUC18からのポリリンカーの制限酵素に対する切断部位でクローン化した（第３図参照）。
フラグメントＡは、パタチン遺伝子B33（Rocha−Sosa et.al.,（1989）EMBO J 8,23−29）のプロモーター領域のDra I−Dra Iフラグメント（−1512部位から＋14部位）を有しており、これはpUC118のポリリンカーのSma I部位でクローン化した。フラグメントＢは、エルウィニアアミロボーラのレバン  シュクラーゼ遺伝子（配列、ID  No1）のヌクレオチド689−2122を含有し,pUC18のポリリンカーのBamH I/Sal I切断部位の間でクローン化した。
フラグメントＣは、プラスミドpAGV40（Herrera−Estrella et al.,（1983）Nature303,209−213）からPvu II−Hind IIIフラグメントとして分離されたTi−プラスミド,pTi  ACH5（Gielenら（1984）;EMBO J.3,835−846）のＴ−DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナル、ヌクレオチド11749−11939を有しており、Pvu II切断部分にSph Iリンカーを添加した後で、pUC18.von  pUC18のポリリンカーのSph I−Hind III切断部位の間でクローン化した。このプラスミドp33−CM−LEVは,3149の塩基対の大きさを有している。
フラグメントA,B及びＣを有するプラスミドp33−CM−LEVの部分がバイナリー  ベクターに導入され、これはアグロバクテリア  システムを使用してタバコ並びにポテト植物へ導入された。形質転換した細胞から完全な植物が再生された。この遺伝子で形質転換した一連のタバコ植物から得た葉を分析すると、遺伝子33−CM−LEVの発現に起源をもつポリフルクタン（レバン）の存在が明らかに示された。
実施例４
13C−NMR分光法によるトランスジェニック植物内で合成されたβ2,6−Ｄ−フルクトフラン（レバン）の分析
構築物p33−CW−LEVで形質転換されたトランスジェニック植物の分析が実施例として示される。この分析は,p35s−CW−LEV又はp35s−CY−LEV構築物で形質転換したトンスジェニック植物に同じように適用することができる。
NMR分光法を実施するためのトンスジェニック植物により合成された十分量のレバンを得るために、約10gの葉組織を10mlの水中ですりつぶした。このホモジネートをベックマン  ミニ遠心分離機にて4000rpmで遠心分離を行い、低分子量の化合物を除去するために上澄み液をPD10カラム（LKB−ファルマシア）に適用した。2.5mlの上澄み液が適用される前にカラムを水で平衡化し、次いで、高分子量化合物を水3.5mlで溶出した。この溶出物をさらにイオン交換ビーズ（AG501×8,Biorad）を添加することにより精製し、30分間振動させた。このビーズを除去するために、4000rpm（ミニ遠心機、ベックマン）で遠心分離を行い、この上澄み液をセファロース4Bカラム（直径16cm、分離容積24ml）に適用し短鎖シュガーを除去する。溶出物を真空遠心機（ユニベーポ150H,Uniquip,Martinsried（FRG））内で真空乾燥し、次いで以下の条件で13C−NMRにより分析した。
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分析結果を第５図に示す。得られたNMRピークパターンは、グロス（Gross）らにより発行された（1992）,Physiol Mol Plant Pathol 40:371に記載されたレバンに対するものと同一である。
このことは、実施例１から３に記載された構築物の１つによる形質転換の後で、形質転換された植物がレバンを合成することを証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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