(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の配列（配列番号：１）：５’−ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ−３’をもつ、ヒトｕ−ＰＡＲのｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
チオリン酸残基を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
３’および５’末端においてチオリン酸残基を含む、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
適切なキャリアーとの混合物において、請求項１−３に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項５】
陽イオン性リポソーム形態である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
陽イオン性リポソームキャリアーがＤＯＴＡＰである、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
序
本発明は、ウロキナーゼヒト受容体のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチド、および有効成分としてそれを含む製薬組成物に関する。
プラスミノーゲン活性化は、組織破壊や細胞移動が要求される場合に、正常な状態や、がん浸潤を含む病的な状態下の両方で起きる細胞周辺のタンパク質分解の調節における中心的過程と考えられている。イン・ビボでの腫瘍形成とイン・ビトロでの形質転換細胞における組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）とウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の役割は、いまだ解明されていないが、しかし、今日では、ｕ−ＰＡが、腫瘍細胞転換において主要な役割を演じていることは、十分確証されている（Physiol．rev．73(1): 161-195，1993）。
チモーゲン（ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ）として分泌された後、活性型は、ジスルフィド架橋によって結合された２本の鎖へのリジン１５８位における開裂によって得られる。グリコシル−ホスファチジルイノシトールの固定されたタンパク質ファミリー（Exp．cell．Res．203:427-434，1992）に属する特異的受容体（ｕ−ＰＡＲ）（Advances in Cancer Res．57:273-328，1991）と、それらの相互作用の結果として、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡおよび活性酵素は、溶液と細胞表面との間で平衡化する。（ｐｒｏ）−ｕ−ＰＡは、Ａ鎖のアミノ末端断片内にフレーム化された配列によってその受容体に結合し、かくして、触媒部位を含むＢ鎖を細胞外環境に露出する。イン・ビトロで単層のように増殖するいくつかの細胞系では、ウロキナーゼ受容体は、細胞の腹側の特定部位に位置されている（いわゆる焦点接触）。プラスミノーゲン活性化系の他の成分は、細胞接触の細胞外側で同定されており、そして細胞−下層接着と細胞外マトリックス破壊の転形において調節的役割を演じることが示唆されてきた。特に、細胞の主接触部位におけるｕ−ＰＡの存在は、前記下層からの細胞の脱着と組織内進行を決定する上で重要であるものと考えられてきた。細胞単層を用いて、接着部位が、ｕ−ＰＡ結合部位を特異的に集中させていることが観察された（Advances in Cancer Res．57:237-328，1991）。
ウロキナーゼ受容体の発現が、腫瘍細胞の浸潤特性の基本因子であるという多くの証拠が存在する。特に、浸潤性表現型へのｕ−ＰＡＲの寄与が、受容体に結合されたｕ−ＰＡによるプラスミン産生の増大を伴うであろうということが示唆された（J．Biol．Chem．266:752-758，1991）。いく人かの著者（Cancer Res．53:3139-3117，1993）は、ヒト骨肉腫細胞系におけるｕ−ＰＡ結合部位をコードしている外因性ｃＤＮＡの過剰発現が、ラミニン分解の増大に加えてマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）試験における細胞移動の増大を誘導したことを報告した。その他の研究（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:5021-5025，1993）では、酵素活性を欠いている変異ｕ−ＰＡによる受容体結合ｕ−ＰＡの置換が、前立腺がん細胞ＰＣ−３の脳、肺および局所リンパ節転移の低下を引き起こすことが示された。なお、その他の著者（Br．J．Cancer 67:537-544，1993）は、卵巣がん細胞系ＨＯＣ−１によるマトリゲル浸潤が、ｕ−ＰＡ受容体結合性断片に対応するペプチドによって阻害されることを示した。
それ故，ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ系は、細胞の浸潤作用を低下または遮断して抗腫瘍および抗転移剤として有用になるであろう薬物に対する標的になりうるとの証拠である。
例えば、ヒトｕ−ＰＡに対する抗体が、ヒトがん腫細胞のニワトリ胎児性肺における転移形成を妨げることは、既に分かっている（Cell 35:611-619，1983）。また、アンチ・メッセンジャー戦略が、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｕ−ＰＡ遺伝子に対して使用された：そのような場合には、ｕ−ＰＡ遺伝子の選択的ブロックが、その他のプロテアーゼ、カテプシンＬの遺伝子発現に基づく別の浸潤機構を、細胞中に誘導した（Cancer Res．52:6682-6689，1992）。
ヒト・ウロキナーゼ受容体のメッセンジャーＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドが、ＳＶ−４０で形質転換されたヒト繊維芽細胞（ＶＡ  １３細胞）の浸潤を阻害できることが、ここに見い出された。該形質転換細胞は、ｕ−ＰＡ受容体（ｕ−ＰＡＲ）を、正常細胞（ＷＩ−３８細胞）に比較して１０倍高い程度まで露出する。
典型的には、本発明によるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド約１０〜約５０個、より好ましくは、ヌクレオチド１２〜３０個を含む。オリゴヌクレオチド配列の最小の長さは、明らかに、標的配列に対するハイブリダイゼーション特異性によって決定されるが、一方、最大の長さは、もちろん、細胞膜を通しての浸透の可能性を考慮しなければならない。
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、翻訳開始部位に対応するヒトｕ−ＰＡＲのメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズできる配列をもつ。EMBO J．9(2):467-474，1990に公表されたヒトｕ−ＰＡＲのｃＤＮＡ配列を参照すれば、該翻訳開始部位は、４４−６１残基に見いだされる。したがって、次の配列（配列番号１）：
５’−ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ−３’
をもつオリゴヌクレオチドが特に好適である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、Tetrahedron 39:3，1983;Ann．Rev．Biochem．53:323，1984;“Oligonucleotide Synthesis; A practical Approach”，Yait M．J．Ed．IRL Press．Oxford，U.K. 1984; Chem．Rev．90(4)543，1990に記載のような既知の方法にしたがって調製できる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、細胞浸透を改善するため、そして半減期を延長するために、例えば、Chem．Rev．90(4)543，1990に開示されたように、慣用の構造修飾を用いて安定化されるであろう。
これらの修飾は、全てではないが主として、メチルリン酸、チオリン酸もしくはジチオリン酸、アミドリン酸基、リン酸エステル等に転換されていてもよいヌクレオチド間のリン酸架橋に関する。
チオリン酸残基により完全に置換されるか、または３’−および５’末端において置換された誘導体は、特に、好適である。
また、オリゴヌクレオチドは、細胞膜を通して輸送させ、次いで細胞質酵素によって活性なオリゴヌクレオチドに開裂させるように、例えば、ＷＯ90/10448に開示されるように脂質に共有結合されてもよい。
また、目的とする治療上の使用のために、特に１次または２次的新生物性疾病、ならびにウロキナーゼ受容体の過剰発現が疾病原因である他の病状の治療のために、本発明は、経口もしくは非経口投与に適したキャリヤーとの混合物の状態で、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物に関する。例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook”，Mack Pub．Co.，NY，USA，XVII Ed.に開示されたような慣用の方法にしたがって調製された本発明の組成物は、オリゴヌクレオチド０．１〜１００ｍｇを含み、そしてそれらは、一般に、医者の処方により１日に１〜４回投与されるであろう。特に好適な実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、既知の方法（Biochem．Biophys．Res．Commun．107:818-825，1993）によりＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim）を用いて、リポソーム形態、特に陽イオン性リポソーム形態に製剤化される。本発明は、ここに、次の実施例においてより詳細に記述されるであろう。
実施例１
次の配列：５’−ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ−３’をもつオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡシンセサイザーを使って合成した。
このヌクレオチドを、既知の方法にしたがって、３’−および５’末端においてチオリン酸残基によって置換した。ＨＰＬＣによって精製して得られたオリゴヌクレオチドを、３７℃で５分間、ＤＯＴＡＰの存在下でプレインキュベートし、０．２μＭフィルターを通して滅菌し、そして最終濃度、オリゴヌクレオチド１０μＭおよびＤＯＴＡＰ１３μＭにおいて、１０％熱不活性化ＦＣＳ（Gibco，USA）を含む培養基に適用した。
実施例２
オリゴヌクレオチドによる細胞単層の処理
細胞株ＷＩ−３８（ヒト胎児性肺繊維芽細胞）およびウイルスＳＶ４０による形質転換によって細胞株ＷＩ−３８から得られたＶＡ−１３細胞を使用した。該細胞は、Flow Laboratories（Milano，Italy）から市販されており、それらを、１０％ウシ胎児血清を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変培地で、５％ＣＯ2−９５％空気の雰囲気中３７℃で培養した。ｕ−ＰＡＲの過剰発現を特徴とする形質転換ＶＡ−１３細胞およびＷＩ−３８正常細胞を、２４穴ペトリ皿で１０％熱不活性化ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中に、２０ｘ１０3細胞／ウエルで接種した。実施例１のオリゴヌクレオチド／ＤＯＴＡＰ複合体を、濃度１０μＭで培養基に添加し、そしてペトリ皿を３７℃４日間培養した。オリゴヌクレオチド濃度を一定に維持するために、実施例１のオリゴヌクレオチド／ＤＯＴＡＰ複合体の第２回添加を、濃度５μＭにおいて４８時間後に行った。
２５ｃｃＦａｌｃｏｎフラスコ中で、コンフルエントになるまで増殖した両細胞系の培地の一定量を、交差−結合実験に直接使用した。細胞単層をＰＢＳで２回洗浄し、そして酸洗浄にかけて受容体から内因性ｕ−ＰＡを脱離した。中和し、さらにＰＢＳ中で洗浄後、細胞を、そのフラスコ中で、５００μｌの溶解バッファー（０．５％ＣＨＡＰＳ、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭＥＤＴＡ、１％アプロチニン、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１１４、１ｍＭフッ化フェニルメタン−スルホニル［ＰＭＳＦ］）で溶解し、そしてその混合液を遠心分離した。並列の培養では、細胞を、ＰＢＳ中ＥＤＴＡ５００μｌを用いて脱着し、そして遠心分離した。そのペレットを、溶解バッファー５００μｌ中で溶解し、一定量を交差−結合のために使用した。ＥＤＴＡで脱着後、フラスコ上に最後に残っている物質（ＳＡＭ、表面接着物）を、ＰＢＳ１０ｍｌで５回洗浄し、溶解バッファー５００μｌで抽出し、そして一定量を、放射能標識ＡＴＦ（ヒトｕ−ＰＡのアミノ酸１４０個のアミノ末端残基）を用いる交差−結合にかけた。各サンプル５０μｌを、１００ｍＭ無標識ｕ−ＰＡの添加もしくは無添加で、１２５  Ｉ−ＡＴＦの５００ｘ１０3ｃｐｍとともに４℃で６０分間インキュベートし、次いで、スベリン酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（最終濃度１ｍＭ）を添加し、その混合液を室温で１５分間インキュベートし、そして交差−結合を、酢酸アンモニウムを１０ｍＭまで添加して停止した。次に、そのサンプルを、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって解析した。
得られた結果は、１０μｍの濃度のアンチセンス・オリゴヌクレオチドに対するＶＡ−１３細胞の４日間の曝露が、細胞表面におけるｕ−ＰＡＲの顕著な減少を引き起こしたことを証明する。酸性化ＶＡ−１３単層において行われた競合−結合実験は、オリゴヌクレオチドによる処理に続いて、ｕ−ＰＡＲの顕著な減少を示した：３７．５（±６．３）ｘ１０3受容体／細胞。
オリゴヌクレオチド処理された細胞を、移動チャンバーの低室において、ＷＩ−３８順化培地の存在下で、基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌへのそれらの浸透能を評価するために浸潤アッセイにかけた。Collaborative Researchより市販される基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍の抽出液を、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍｌをもつ保存液として使用した。直径１３ｍｍのフィルターを備えたＢｌｉｎｄ  ｗｅｌｌ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｃｈａｍｂｅｒを、浸潤アッセイのために使用した。ポリビニルピロリドン不含ポリカーボネート・フィルター、ポアーサイズ８μｍ（Nuclepore，California）を、マトリゲル５０μｇ／フィルターで被膜した。マトリゲルを、冷蒸留水により最終濃度まで希釈し、フィルターに適用し、フード下で乾燥し、そして血清不含培地と再構成した。被膜したフィルターを、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー中に置いた。血清不含ＤＭＥＭ中に懸濁した細胞（４０ｘ１０3）を、上部チャンバーに添加した。順化培地（コンフルエント後２４時間、血清不含条件下の培養で維持されたＷＩ−３８ヒト繊維芽細胞から得られた）を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの低室中に置いた。この培地を、化学誘引物質の給源として使用した。そのほかにまた、ｕ−ＰＡを、移動チャンバーの低室中に置いた。低室における化学誘引物質の不在下（ＤＭＥＭのみ）での細胞移動を、５時間にわたって各細胞系のバックグラウンド移動として行った。フィルターのポアーサイズが、細胞よりも小さいので、細胞移動は、受動的な拡散には寄与できないであろう。ある種の実験では、浸潤過程の免疫抑制を得るために、移動チャンバーの上室中の細胞を、モノクローナル抗体とともにインキュベートした。アッセイは、５％ＣＯ2中、３７℃で５時間実施された。インキュベートの終了時に、フィルターを除去し、メタノール中で２時間固定した。次いで、フィルターの上部の細胞を、ゴムのスポンジで拭うことによって完全に除去した。そのフィルターを、フクシンで染色し、そしてより下の表面に付着したすべての細胞、すなわち浸潤性細胞を、カウントした。各アッセイは、４並列で実施された。
これらの条件が、浸潤系の上室におけるモノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ｒ３およびｍＡｂ  ５Ｂ４）の不在もしくは存在のいずれの下でも、正常細胞および形質転換細胞の間の顕著な差異を明らかにした。図１は、オリゴヌクレオチド処理が、細胞浸潤性においてかなりの低下をもたらしたことを示している。移動フィルターの下側の細胞数は、偶発的なランダム移動の条件下よりもずっと低下し、ＷＩ−３８の細胞数に接近した。対照として、実施例１のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ａＯＤＮ）と同じ塩基組成をもつが、乱された配列をもつナンセンス・オリゴヌクレオチド（ｎｓＯＤＮ）。
実際に、浸潤特性の欠如と、処理されたＶＡ−１３細胞の膜ｕ−ＰＡＲにおける顕著な減少が、アンチ−メッセンジャーに仲介されるｕ−ＰＡＲ遺伝子発現阻害の結果であることを証明する目的で、実施例１のオリゴヌクレオチドで処理されたＶＡ−１３細胞のｕ−ＰＡＲｍＲＮＡレベルを測定した。内部標準に基づく定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイが使用された（Cancer Res．52，108-116，1992）。図２に示すように、１３μＭＤＯＴＡＰによって運ばれた１０μＭａＯＤＮに対するＶＡ−１３細胞の４日間の曝露は、未処理およびランダム−センスの両オリゴヌクレオチド処理の対照と比較されるように、ｕ−ＰＡＲｍＲＮＡレベルの劇的な減少（８０％以上）をもたらした。それ故、このアッセイによって証明されるように、処理細胞におけるｕ−ＰＡＲ遺伝子ｍＲＮＡの最終的な定常状態レベルは、正常の未処理ＷＩ−３８細胞のレベルに類似する。この結果は、ａＯＤＮ投与の結果として、ｕ−ＰＡＲ遺伝子過剰発現の完全な復帰を示している。
配列表
（２）  配列番号：１：
（Ａ）配列の長さ：１８  塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＹＥＳ
（xi）配列：配列番号：１：
ＣＧＧＣＧＧＧＴＧＡ  ＣＣＣＡＴＧＴＣ
【図１】
0003687919.tif 000002
【図２】
0003687919.tif 000003