(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）５０ｍＭ〜１００ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート０．００１重量％〜０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合し、
（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前記全血試料から白血球のペレットを形成し、
（Ｃ）その上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の新鮮な試料中で洗浄し、そして
（Ｄ）前記白血球ペレットを遠心分離して単離する白血球の選択的調製方法であって、
前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式：
Ｒ−ＣＯＯＭ
（上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す）で示され、
前記溶解液のｐＨは６〜８の間にあり、そして
前記（Ａ）〜（Ｄ）を２０分以内で遂行する、白血球の選択的調製方法。
【請求項２】
前記カルボン酸又は前記金属カルボキシレートが０．００５〜０．０５重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボン酸が、モノハロ酢酸、ジハロ酢酸、トリハロ酢酸及び酢酸から成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボン酸が酢酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨが６．５〜７．５の間にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ａ）〜（Ｄ）を１０〜１６分以内で遂行する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記全血試料の体積が０．０１〜１０ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遠心分離工程の各々を１０分未満以内で遂行する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（１）（Ａ）５０ｍＭ〜１００ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート０．００５重量％以上を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合し、
（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前記全血試料から白血球のペレットを形成し、
（Ｃ）その上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の新鮮な試料中で洗浄し、そして
（Ｄ）前記白血球ペレットを遠心分離して単離する方法であって、
前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式：
Ｒ−ＣＯＯＭ
（上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す）で示され、
前記溶解液のｐＨは６〜８の間にあり、そして
前記（Ａ）〜（Ｄ）を２０分以内で遂行する方法により、全血試料中の標的核酸を含有することが疑われる白血球を選択的に調製する工程と、
（２）前記洗浄後のペレットの中の白血球を溶解することにより前記標的核酸を解放させる工程と、
（３）前記標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズし得る一組のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、前記解放された標的核酸を増幅する工程と、
（４）前記増幅された標的核酸を検出する工程とを含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項１０】
前記（Ａ）〜（Ｄ）を１０〜１６分以内で遂行する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記全血試料の体積が０．０１〜１０ｍＬである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
遠心分離工程の各々を１０分未満以内で遂行する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応を耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で遂行し、さらに前記プライマーの一方又は両方を検出のために標識する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識プライマーをビオチンで標識し、さらに所定の基質の存在下で検出可能な信号を提供し得る酵素とアビジンの接合体を使用して検出を行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス、細菌、菌類又は原生動物のＲＮＡ又はＤＮＡを検出するための、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
連鎖球菌属(Streptococcus species)、ミコバクテリア属(Mycobacterium species)、ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、カンジダ属(Candida species)又はアスペルギルス属(Aspergillus species)由来のＲＮＡ又はＤＮＡを検出するための、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、鳥結核菌(Mycobacterium avium)又はサイトメガロウイルスＲＮＡ若しくはＤＮＡを検出するための、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅された標的核酸を、前記標識プライマー上の前記標識に応じて比色用信号又は化学発光信号を提供する試薬を使用して検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズし得る二種のプライマーであって、その一方又は両方を検出部分で標識した一組のプライマー、及び同一又は別の容器に入れた少なくとも一種の他のＰＣＲ試薬、並びに
（ｂ）別の容器に入れた、５０ｍＭ〜１００ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート０．００５重量％以上を含有する溶液又は水で再構成する場合にはその乾燥組成物であって、前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式：
Ｒ−ＣＯＯＭ
（上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す）で示され、そして
前記溶解液のｐＨは６〜８の間にある前記溶液又は乾燥組成物を含む、ポリメラーゼ連鎖反応用キット。
【請求項２０】
前記プライマーの一方又は両方がビオチンで標識されており、さらに前記キットが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム又はマンガン塩であるコファクター、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記一組のプライマーが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、鳥結核菌(Mycobacterium avium)又はサイトメガロウイルスＲＮＡ若しくはＤＮＡの対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズし得る二種のプライマーを含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、白血球を赤血球から分離することによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための全血試料を調製するための方法に関する。本発明はまた、調製した白血球から単離された標的核酸を増幅するための方法、さらには該方法を実施する上で有用なキットにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近の２０年間にわたり、ＰＣＲのような増幅技法においてプローブを使用する非常に巧妙なハイブリダイゼーションアッセイの開発をはじめとし、核酸の量の検出する技術が急速に進歩してきた。研究者であれば、ヒトや動物の被検体の疾患や遺伝的特徴を検出するこれらの技術の価値を認識することは容易である。このような技術におけるプローブやプライマーの使用は、相補性の概念に基づくものである。すなわち、２本の核酸鎖が相補的なヌクレオチド（ヌクレオチド対としても知られている）の間の水素結合により結合する概念である。
【０００３】
当該技術分野ではＰＣＲが著しく進歩したおかげで、極微量の標的核酸を検出することが可能である。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）に記載されているが、この分野では文献の数は急速に増加している。詳細に触れるつもりはないが、ＰＣＲは、重合剤（例、ＤＮＡポリメラーゼ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下、標的核酸（「鋳型」とみなされる）の鎖にプライマーを適当な条件下でハイブリダイズさせる工程を含むものである。その結果、鋳型に沿ったプライマー伸長生成物、すなわち、その鋳型に相補的であるヌクレオチドが付加した生成物が得られる。
【０００４】
プライマー伸長生成物を変性させ、１コピーの鋳型を調製した後、プライミング、伸長及び変性の周回を所望の回数遂行することにより、標的核酸と同じ配列を有する核酸が指数的に増加して得られる。実際は、標的核酸の検出が容易となるように多数回の複製（又は「増幅」）が行われる。
【０００５】
標的核酸を効果的に増幅して検出するためは、細胞やその他の被検体の破壊屑から当該核酸を分離しなければならないことが普通である。例えば、当該技術分野では、赤血球がＰＣＲを阻害することが周知である。様々な溶解手法が知られており、凍結法、プロテアーゼ（例、プロテイナーゼＫ）のような消化酵素による処理、煮沸法及び洗剤の使用（例えば、１９８８年４月６日出願、Ｈｉｇｕｃｈｉ、米国特許出願第１７８，２０２号明細書、及び１９９１年５月２２日公開、欧州特許公開第０４２８１９７号公報）が知られている。
【０００６】
さらに、全血中の標的核酸の多くは、特定の細胞集団、例えば、赤血球細胞（erythrocytes）と対立する白血球細胞（leucocytes）に見い出されることも知られている。
血液細胞集団（及び二次集団）の分離及び精製のために使用される技術は多くが周知のものである。赤血球から白血球を分離するために最も一般的に用いられている技法の一つに、赤血球を凝集させてその沈降速度を高める試薬を含む溶液と全血試料とを単に混合する方法がある。この沈降流体による白血球への影響は少ないので、赤血球が沈降した後、該流体の上部から白血球を収集することができる。
【０００７】
より最近の技術として、例えば、米国特許第４，２５５，２５６号明細書（Ｆｅｒｒａｎｔｅら）に記載されているように、特定の高分子化合物（例、ＦＩＣＯＬＬ（商標）４００）のような赤血球凝集剤を使用する方法がある。このＦｅｒｒａｎｔｅらの特許明細書の記載によると、白血球の特定の二次集団を凝集させることも可能である。分離は、例えば、ＥｇｇｌｅｔｏｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２１，第１０５〜１１３頁（１９８９）に記載されているデキストラン勾配法を使用して行うこともできる。
【０００８】
しかしながら、赤血球の溶解に用いられる多くの技法及び試薬はポリメラーゼ連鎖反応を妨害し、その効率を低下させることが知られている。このことは、標的核酸が極微量でしか存在しない場合には特に問題となる。また、溶解性洗剤のような溶解剤の中には、白血球の細胞膜を溶解し、細胞分離の際に細胞質ＤＮＡを損失せしめるものもある。さらに、各種溶解剤を使用して調製された細胞は生存しておらず、従って培養することができない。これらの問題を回避するためには、白血球の一体性を損なうことなく赤血球を選択的に溶解する化合物を使用する必要がある。
【０００９】
このような選択的溶解性を示す化合物の一例として塩化アンモニウムがあり、例えば、米国特許第４，４０７，９４２号明細書（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）及びＥｇｇｌｅｔｏｎらのＪ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２１，第１０５〜１１３頁（１９８９）に記載されている。典型的には、塩化アンモニウムを使用した後、溶解した物質を遠心分離で除去して白血球を残存させ、これをさらに処理する。しかしながら、この技法のおける塩化アンモニウムを使用するためのプロトコルの教示は必ずしも十分ではない。例えば、Ｅｇｇｌｅｔｏｎらによると、赤血球を氷温の塩化アンモニウムで溶解した後に白血球をその使用時まで緩衝液で洗浄している。白血球の活性を維持することは重要であるが、Ｅｇｇｌｅｔｏｎらの方法によると白血球もまた溶解を受けてしまう。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このような方法は、ポリメラーゼ連鎖反応のための標的核酸の単離法としては有用ではなく、特に白血球集団に含まれる標的核酸の力価が低い場合には有用ではない。白血球細胞の溶解が早過ぎると、標的核酸の損失が多大となる恐れがある。その上、Ｅｇｇｌｅｔｏｎらの方法は時間がかかりすぎ（４０分を超える）、市販品として有用な細胞調製法とはいえない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記の問題は本発明による白血球の選択的調製方法によって解決される。本発明の方法は、
（Ａ）少なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量％〜約０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合し、
（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前記全血試料から白血球のペレットを形成し、
（Ｃ）その上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の新鮮な試料中で洗浄し、そして
（Ｄ）前記白血球ペレットを遠心分離して単離する白血球の選択的調製方法であって、
前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式：
Ｒ−ＣＯＯＭ
（上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換アルキル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す）
で示され、
前記溶解液のｐＨは６〜８の間にあり、そして
前記（Ａ）〜（Ｄ）を約２０分以内で遂行する方法である。
【００１２】
本発明はまた、
（１）（Ａ）少なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート約０．００１重量％〜約０．１重量％を含む赤血球溶解液と全血試料とを混合し、
（Ｂ）得られた混合物を遠心分離することにより前記全血試料から白血球のペレットを形成し、
（Ｃ）その上清を除去した後、前記白血球ペレットを前記溶解液の新鮮な試料中で洗浄し、そして
（Ｄ）前記白血球ペレットを遠心分離して単離する方法であって、
前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式：
Ｒ−ＣＯＯＭ
（上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換アルキル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す）
で示され、
前記溶解液のｐＨは６〜８の間にあり、そして
前記（Ａ）〜（Ｄ）を約２０分以内で遂行する方法により、全血試料中の標的核酸を含有することが疑われる白血球を選択的に調製する工程と、
（２）前記洗浄後のペレットの中の白血球を溶解することにより前記標的核酸を解放させる工程と、
（３）前記標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズし得る一組のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、前記解放された標的核酸を増幅する工程と、
（４）前記増幅された標的核酸を検出する工程とを含む、標的核酸を増幅して検出するための方法をも提供する。
【００１３】
（ａ）標的核酸の対向鎖に特異的であり且つハイブリダイズし得る二種のプライマーであって、その一方又は両方を検出部分で標識した一組のプライマー、及び同一又は別の容器に入れた少なくとも一種の他のＰＣＲ試薬、並びに
（ｂ）別の容器に入れた、少なくとも約５０ｍＭの塩化アンモニウム及び少なくとも一つのカルボキシル基を有するカルボン酸又は金属カルボキシレート約０．００５重量％以上を含有する溶液又は水で再構成する場合にはその乾燥組成物であって、前記カルボン酸又は金属カルボキシレートは下記構造式：
Ｒ−ＣＯＯＭ
（上式中、Ｍは水素又は１価のカチオンを表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基、炭素原子数１〜６の置換アルキル基、炭素原子数２〜６のアルケニル基、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す）で示され、そして
前記溶解液のｐＨは６〜８の間にある前記溶液又は乾燥組成物を含む、ポリメラーゼ連鎖反応用キット。
【００１４】
本発明は、全血試料から、標的核酸を増幅して検出するために白血球を選択的に調製するための迅速且つ有効な方法を提供する。この調製法は、標的核酸が非常に低濃度で存在する場合でも、約２０分以内（好ましくは１５分以内）で遂行することができる。その上、この方法は室温で実施することができるが、これは分離した白血球の活性(viability) がポリメラーゼ連鎖反応にとって重要ではないからである。本発明の調製法により、核及び細胞質両方のＤＮＡが保持される。
【００１５】
これらの利点は、塩化アンモニウムとカルボン酸又は金属カルボキシレートとを含む溶液を用いて赤血球を選択的に溶解し、そして分離された白血球を同溶液を用いて洗浄した後に、その白血球を溶解して標的核酸を解放させることによって得られる。単に塩化アンモニウム溶液を使用して赤血球を溶解するだけでは、増幅して検出するために用いられる標的核酸を含有する白血球の十分な力価を提供するには十分ではない場合が多い。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、動物又はヒトから採集した全血試料の中に存在する一種又は二種以上の標的核酸の抽出及び検出に特に適している。標的となる核酸は該試料の特定の細胞（白血球）の中に存在することが典型的であるため、これらの細胞を損なうことなく該試料の残部から分離するために本発明による工程が採用される。
【００１７】
まず初めに、塩化アンモニウム及びカルボン酸又は金属カルボキシレートを含む赤血球溶解性の緩衝液と全血試料とを適当な容器内で混合する。本発明における使用に適したカルボン酸及び金属カルボキシレートは、カルボキシル基を一つ以上有し、下記構造式で示される。
Ｒ−ＣＯＯＭ
上式中、Ｍは水素又は１価のカチオン（例、ナトリウム、カリウム又はリチウム）を表し、Ｒは炭素原子数１〜６のアルキル基（例、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、等）、炭素原子数１〜６の置換アルキル基（例、ブロモメチル、クロロメチル、フルオロメチル、１，１−ジクロロメチル、１，１，１−トリクロロメチル、１，１，１−トリフルオロメチル、２，２，２−トリクロロエチル、等のようなハロアルキル）、炭素原子数２〜６のアルコキシアルキル基（例、メトキシメチル、メトキシエチル、等）、炭素原子数１〜６のヒドロキシアルキル基（例、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシエチル、２，３−ヒドロキシエチル、等）、炭素原子数１〜６のアミノアルキル基（例、アミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノエチル、３−アミノプロピル、２，４−ジアミノブチル、メチルアミノメチル、４−アミノブチル、等）、炭素原子数２〜６のアルケニル基（例、エテニル、１−プロペニル、イソプロペニル、２−ブテニル、等）、炭素原子数２〜６の置換アルケニル基、アリール基、置換アリール基（例、フェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、４−アミノフェニル、２−クロロフェニル、４−クロロフェニル、等）、アリールアルキル基又は置換アリールアルキル基を表す。
【００１８】
好ましくは、Ｒは炭素原子数１〜４の、より好ましくは１〜３の、置換又は未置換のアルキル基である。さらにより好ましくは、Ｒは置換メチル基、例えば、ハロゲンで置換されたメチル基である。最も好ましいＲはメチル基である。このように、好適なカルボン酸の例として、モノハロ酢酸、ジハロ酢酸、トリハロ酢酸及び酢酸並びにこれらの金属カルボキシレートが挙げられる。
【００１９】
赤血球溶解性溶液は約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの塩化アンモニウムを含有する。該溶液中にはカルボン酸又は金属カルボキシレートが約０．００１重量％〜約０．１重量％存在する。該溶解液は、カルボン酸又は金属カルボキシレートを約０．００５重量％〜約０．０５重量％含有することが好ましい。
【００２０】
本発明のカルボン酸及び金属カルボキシレートは遊離酸として又は金属カルボキシレートとして一般に市販されているが、当業者であれば周知の方法で合成することもできる。本発明のカルボン酸の市販品の例として、Eastman Organic Chemicals (Kingsport, Tennessee)より市販されている下記のものが挙げられる：酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、１，１，１−トリクロロ酢酸、２−メトキシ安息香酸、４−クロロフェニル、２−ブロモ−３−メチル酪酸、イソ酪酸、シアノ酢酸、２−ブテン酸、１，３−ジカルボキシルベンゼン、２−エチル酪酸、trans-桂皮酸、及びその他。上記のもの及びその他はまた、当業者であれば周知である別の供給業者や製造業者、例えば、TCI America (Portland, Oregon)、Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri)、ICN (Irvine, California)及びその他多数からも入手可能である。
【００２１】
本発明で用いられる赤血球溶解液に対する全血試料の体積比率は、約１：１〜約１：１０である。この比率は約１：１〜約１：５であることが好ましい。より好ましくは、この比率は約１：４である。全血試料の体積は任意とすることができるが、一般には約０．１〜約１０ｍＬである。
【００２２】
本発明で用いられる溶解液は、一般に、約６．０〜約８．０（好ましくは約６．５〜約７．５）の範囲のｐＨを与える適当な緩衝液の中に、塩化アンモニウムとカルボン酸又は金属カルボキシレートを含むものである。有用な緩衝剤として、重炭酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、リン酸塩、その他当該技術分野で周知の緩衝剤が挙げられるが、これらに限定はされない。該溶解液は、エチレンジアミン四酢酸やその他当該技術分野で周知のもののようなイオンキレート化剤を必要に応じて含有することができる。
【００２３】
溶解液で赤血球が溶解されるように、室温で最長約１０分間（好ましくは約５分間）の混合を行う。
得られた混合物を、常用の遠心分離機を用いた最長１０分間（好ましくは約５分間）の遠心分離にかけ、溶解の生成物及びその他の望ましくない破壊屑を含有する上清液から（ペレット状の）白血球を分離する。
【００２４】
上清液を除去した後、白血球のペレットを室温で少なくとも１回は該溶解液の新鮮な試料で洗浄し、続いて室温で２回目の遠心分離を最長約１０分間（好ましくは約５分間）行う。白血球のペレットを再度単離すると、その白血球はその後の取扱い（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に先立つ溶解処理）に利用することができる。白血球を単離する方法は、全体として、最長でも約２０分を要し、好ましくは約１０〜約１６分かかる。１５分が最も好適である。
【００２５】
単離された白血球は、生物学や医学の分野における研究者であれば容易に想到し得る多くの目的に利用することができる。例えば、この白血球を用いて、各種白血球細胞の機能について研究すること（二次集団の分画をさらに要するであろう）、ヒトγ−インターフェロンを調製すること（例、Ｔｏｔｈらの米国特許第４，６９６，８９９号明細書に記載）、Ｔ４／Ｔ８細胞比率を測定すること（例、Ｐｒｉｖｉｔｅｒａの米国特許第４，８２６，７６０号明細書に記載）、ウイルスを培養すること、そしてワクチンを調製すること（例、Ｈａｒｔらの米国特許第４，９５６，２７８号明細書に記載）が可能である。ポリメラーゼ連鎖反応のための調製においてこれらの白血球を分離することが好ましく、以下これについて詳細に説明する。
【００２６】
ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅及び検出についての一般的な原理及び条件は周知であり、その詳細については、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，９６５，１８８号及び国際特許出願公開第９１／１２３４２号並びにGuatelliらのClin. Microbiol. Rev., 2 (2), pp. 217-226 (1989)をはじめとする多数の文献に記載されている。参照により上記米国特許明細書を本明細書で援用する。当該技術分野における教示及び本明細書中の具体的教示を鑑みることにより、当業者であれば、本発明の白血球調製法とポリメラーゼ連鎖反応技法とを組み合わせることにより本発明を実施することに、何らの困難性も見い出さないであろう。
【００２７】
本発明は、全血の試料中の一種又は二種以上の標的核酸に存在する一種又は二種以上の特別な核酸配列を増幅又は検出することに関する。
【００２８】
本発明は、白血球中に存在する感染因子と関わりのある少なくとも一つの特異的核酸配列を、関与する反応工程数に対して指数増加する量で得るのに特に有用である。この生成物は、用いた特異的プライマーの端部に対応する末端を含む関連のない(discrete)核酸二重鎖であることができる。さらに、複数種の標的核酸を、各特異的核酸に対応するプライマーセット及び検出手段を使用することによって、同時に増幅して検出することができる。同一核酸に含まれる複数の配列を増幅して検出することもできる。本発明は、細菌のＤＮＡ、菌類のＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡ又は細菌若しくはウイルスに感染した白血球に含まれるＤＮＡに含まれる標的核酸の増幅及び検出に特に有用である。
【００２９】
本明細書で説明する方法を使用することにより、感染疾患、遺伝的欠陥若しくは細胞障害、例えば癌、又はこれらの範疇に明確には含まれないその他の疾患状態に関わる特別な核酸配列を検出することができる。また、この方法を法医学的な調査及びＤＮＡの型別に使用することもできる。本発明の目的として、遺伝的欠陥には、鎌型赤血球貧血、嚢性線維症、α−地中海貧血、β−地中海貧血及びその他当業者であれば容易に想到し得るもののような、生物由来のゲノムＤＮＡにおける特殊な欠失又は変異が含まれる。本発明によりヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を分類することができる。検出可能な細菌として、血中に存在し得る細菌、サルモネラ属、連鎖球菌属、クラミジア属、淋菌属、ミコバクテリア属（例、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)及び鳥結核菌(Mycobacterium avium) 複合体）、マイコプラズマ属（例、マイコプラズマ・ヘモフィリス・インフルエンザ(Mycoplasma Haemophilus influenzae) 及び肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae) ）、レジュネラ・ニューモフィラ菌(Legionella pneumophila)、ボレリア・ブルグドルフェライ(Borrelia burgdorferei) 、ニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile ）、カンピロバクテリア種（Camplyobacteri species）、エルシニア種（Yersinia species）、シゲラ種（Shigella species）ならびにリステリア種（Listeria species）が含まれるが、これらに限定はされない。検出可能であるウイルスには、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）、ＥＢウイルス（Epstein Barr virus）、呼吸性合胞体ウイルス(respiratory syncytial virus) 、肝炎ウイルス（hepatitis virus ）ならびにレトロウイルス（例えば、HTLV-I、HTLV-II 、HIV-I およびHIV-II）が含まれるが、これらに限定はされない。原生動物寄生体及び菌類（酵母及びカビを含む）もまた検出可能である。別の検出可能な種は、当業者であれば容易に想到し得るであろう。本発明は、各種細菌又はウイルスに関わるＤＮＡの存在を検出するのに特に有用である。
【００３０】
本明細書においてプライマー又はプローブをさして用いる場合の用語「オリゴヌクレオチド」は、二種又は三種以上の（好ましくは四種以上の）デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子を意味する。その大きさを特定することは重要ではなく、該オリゴヌクレオチドの最終的用途又は機能をはじめとする多くの因子によって変わってくる。このオリゴヌクレオチドは当該技術分野で周知のいずれの方法によっても誘導されることができる。
【００３１】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必須であるとみなされる試薬のすべて、すなわち、標的核酸に対する一又は二以上のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターおよび一又は二以上のデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸を称する。
【００３２】
「プライマー」の語は、核酸鎖（すなわち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作用し得る、天然の又は合成されたオリゴヌクレオチドを称する。このような条件として、ヌクレオチド（例、４種類の標準的なデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸）、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ・コファクターの存在、並びに好適な温度及びｐＨが挙げられる。
【００３３】
プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成をプライムするのに十分長いものである。各プライマーの正確なサイズは、予定される用途、標的とされる配列の複雑さ、反応温度、及びプライマーの供給源に応じて変化し得る。一般には、本発明に使用されるプライマーは１２〜６０個のヌクレオチドを有し、そして好ましくは１８〜４５個のヌクレオチドを有する。
【００３４】
本発明に用いられるプライマーは、増幅しようとする各特異的配列の別々の鎖に対して「実質的に相補的」となるように選択される。これは、それらが、それぞれの核酸鎖にハイブリダイズし、所望のハイブリダイズ生成物を形成し、その後ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が可能となる程度に十分に相補的でなければならないことを意味する。好ましく且つ最も実用的な状況は、プライマーが標的核酸に対して正確な相補性を有する場合である。
【００３５】
本明細書中の有用なプライマーは、例えば、ABI ＤＮＡ合成機（Applied Biosystemsより入手可能）またはバイオサーチ8600シリーズもしくは8800シリーズ合成機（Biosearch 8600 Series もしくは8800 Series Synthesizer ）（Milligen-Biosearch, Inc.より入手可能）及び周知のその使用方法（例えば、米国特許第 4,965,188号）をはじめとする既知の技法および装置を用いて調製すること、或いはいくつかの出所から入手することができる。また、生物学的供給源から単離された天然プライマーも有用である（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）。本明細書では、用語「プライマー」はプライマーの混合物をも意味する。
【００３６】
検出のために、プライマーの一方又は両方を、同種の又は異種の標識で標識することができる。標識を結合させる方法やプライマーの調製方法は当該技術分野では周知であり、例えば、Agrawal らのNucleic Acid Res., 14, pp. 6227-45 (1986) 、ビオチン標識に関する米国特許第４，９１４，２１０号（Levensonら) 、酵素標識に関する米国特許第４，９６２，０２９号（Levensonら) 、及びこれらの中に引用されている文献に記載されている。また、有用な標識には、放射性同位元素、電子高密度試薬、色素原、蛍光原、リン光原、フェリチン及びその他の磁性粒子（Owenらの米国特許第４，７９５，６９８号及びPoynton らの米国特許第４，９２０，０６１号を参照のこと）、化学発光部分（例、ルミノール）、並びに特異的結合種（アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、糖類又はレクチン）も含まれる。好ましい標識は酵素、放射性同位元素及び特異的結合種（例、ビオチン）である。有用な酵素として、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、その他当該技術分野で周知の酵素が挙げられ、またこれらの酵素は周知の方法でオリゴヌクレオチドに結合させることができる。このような酵素と共に比色用信号又は化学発光信号を提供する試薬は周知である。
【００３７】
標識がペルオキシダーゼのような酵素である場合には、アッセイのある時点で、過酸化水素と適当な色素生成性組成物を添加して、検出可能な色素を得る。例えば、有用な色素提供試薬として、テトラメチルベンジジン及びその誘導体、ロイコ色素、例えば、水不溶性トリアリールイミダゾール系ロイコ色素（Bruschi の米国特許第４，０８９，７４７号に記載されている）、又はその他ペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下で色素を提供するように反応する化合物、が挙げられる。特に有用な色素提供組成物が欧州特許公開第０３０８２３６号（１９８９年３月２２日発行）に記載されている。また、適当な試薬を使用することにより、ペルオキシダーゼ標識に応じた化学発光信号を発生させることもできる。
【００３８】
プライマーの一方又は両方をビオチン化した場合には、増幅後の核酸を、検出可能に標識されたアビジン又はその均等物（例、ストレプトアビジン）を用いて検出することができる。例えば、アビジンは、酵素と接合されること、或いは既知の技法により放射性同位元素を含むことができる。増幅された生成物に結合しているビオチンはアビジンと複合化し、そして放射性信号、比色用信号又は化学発光信号を検出するための適当な技法を使用する。
【００３９】
本明細書に用いられている捕捉「プローブ」は、標的核酸の一又は二以上の鎖の核酸配列に実質的に相補的であり且つ増幅後の核酸を不溶化するために用いられるオリゴヌクレオチドである。プローブのオリゴヌクレオチドは、適当な水不溶性支持体、例えばポリマービーズ、ガラスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ポリマー系若しくはセルロース系の薄膜又はその他当業者であれば容易に想到し得る材料、に一般に結合されている。オリゴヌクレオチドの長さは、一般にヌクレオチド数で約１２〜約４０であるが、この長さは重量ではない。
【００４０】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型の複合体における該プライマーの３′−ヒドロキシ末端にデオキシリボクレオシド一リン酸分子を付加させる酵素であるが、この付加は、鋳型に依存するように（すなわち、鋳型に含まれる特異的ヌクレオチドに依存して）行われる。当該技術分野では有用なＤＮＡポリメラーゼが多数知られている。このポリメラーゼは「耐熱性」であること、すなわち、熱に対して安定であり且つ高温、特にＤＮＡ鎖の変性に用いられる高温における活性が優先することが好ましい。より具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書で説明したＰＣＲに用いられる高温によって実質的に不活化されない。この温度は、ｐＨ、標的核酸やプライマーのヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃度及びその他当該技術分野で既知の条件をはじめとするいくつかの反応条件により変化する。
【００４１】
数多くの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが従来技術文献に報告されており、それらには米国特許第 4,965,188号明細書（Mullis他）および米国特許第 4,889,818号明細書（Gelfand 他）に詳細に記載されているものが包含される。特に有用なポリメラーゼは、種々のサーマス細菌種、例えば、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）もしくはサーマス・フラバス（Thermus flavus）から得られるものである。別の有用な耐熱性ポリメラーゼが、サーモコッカス・リテラリス（Thermococcus literalis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）、サーモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-89/06691 （1989年 7月27日発行）に記載のものを包含する種々の微生物源より得られる。有用な耐熱性ポリメラーゼには市販されているものがある。天然のポリメラーゼを生物体から単離する技法や、組換え技法を用いて遺伝子工学酵素を製造するための技法がいくつか知られており、この段落で引用した技術分野で説明されている。サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)から得られたものと等価なＤＮＡポリメラーゼを調製するための好ましい方法が、欧州特許出願公開第０４８２７１４号（１９９２年４月２９日発行）に記載されている。
【００４２】
ＤＮＡポリメラーゼ・コファクターは、活性について酵素が依存する非タンパク質化合物を称する。従って、酵素はコファクターが存在しないと触媒的に不活性である。現在のところ、ポリメラーゼとコファクターの相互作用の正確な機構については知られていない。このような物質のいくつかは、マンガン化合物及びマグネシウム化合物をはじめとする既知のコファクターである。このような化合物は、二価のアニオンが水溶液中に解放されるような形態でマンガン又はマグネシウムを含有する。有用なコファクターとして、マンガン塩およびマグネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂肪酸塩（例えば、酪酸塩、カプロン酸塩、カプリル酸塩、カプリン酸塩及びラウリン酸塩）が挙げられるが、これらに限定はされない。比較的小さな塩、すなわち塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。
本発明を実施する上で最も好ましいものは、塩化マグネシウム及び硫酸マグネシウムのようなマグネシウム塩である。
【００４３】
ＰＣＲにはまた、デオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ又はｄＴＴＰが必要である。通常は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのすべてをＰＣＲにおいて使用する。また、ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰのような類似体も有用である。
【００４４】
各ＰＣＲ試薬は、個別に包装して供給してもよいし、またプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ・コファクター及びデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸をはじめとする一種又は二種以上の他のＰＣＲ試薬のすべてを適当な緩衝液に混合した混合物として供給してもよい。代表的な緩衝剤として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（これが好ましい）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸及びＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４５】
増幅し検出しようとする核酸は通常は二重鎖形であるので、この二重鎖を分離（すなわち、プライミングの前に変性）しなければならない。これは抽出工程の際に行うことができ、またその後の別工程とすることもできる。変性は、熱処理単独で行われるか、または従来技術文献に記載されている他の適当な物理的、化学的もしくは酵素的方法と組み合わせて行われる。初期変性は、一般に、標的核酸を含有することが疑われる試料を、約８５〜約１００℃の第一温度で適当な時間、例えば約１秒間〜３分間、加熱することにより行われる。
【００４６】
次いで、変性された鎖を、一般に約５５〜約７０℃の範囲内にある温度に冷却する。変性鎖の冷却に要する時間は、ＰＣＲ方法に使用される機器の型により異なる。
変性鎖を冷却した後、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を、プライマー伸長生成物の形成に適した温度でインキュベートする。一般に、この温度は、約５０℃以上であり、好ましくは約６５〜約７５℃の範囲にある。実施態様によっては、プライミングのためにある温度を使用し、プライマーの伸長には異なる温度を使用する態様もある。好ましい実施態様では、プライミングもプライマーの伸長も同じ温度を使用する。インキュベーション時間は、インキュベーション温度に依存して大きく変化し得るが、好ましい実施態様では、約１〜約１２０秒間である。
【００４７】
このように形成されたプライマー伸長生成物は、ハイブリダイズした生成物のまま適当な方法で検出してもよいし、また、一方若しくは両方の鎖を検出するため、又はさらにＰＣＲ法でサイクルを繰り返すために変性してもよい。
【００４８】
ハイブリダイズしたプライマー伸長生成物を変性する場合、プライマー伸長生成物を形成して変性するＰＣＲのサイクルをさらに所望の回数遂行することができる。一般に、少なくとも２０回は遂行するが、２０〜５０回が好ましい。
アッセイの最終時に変性した後、最終のプライマー伸長生成物を下記のように検出することができる。
【００４９】
本発明の増幅方法は、反応混合物の温度サイクルが所望の所定時間について制御されるよう、連続的に自動化された方式で実施されることが好ましい。このために開発された装置がいくつかあり、当業者であれば知っている。
この目的の装置の一つが、米国特許第４，９６５，１８８号及び欧州特許出願公開第０２３６０６９号に詳細に記載されており、ある温度環境から別の環境へ制御された条件下で液体を移送する工程が含まれる。
【００５０】
別の装置に、液体を取り扱うシステムを含まない温度サイクリングを利用するものがあり、米国特許第４，９６５，１８８号及び欧州特許出願公開第０２３６０６９号に詳細に記載されている。一般に、この装置は、反応混合物を含有する多数の反応チューブを保持する伝熱性容器と、加熱手段と、冷却及び温度維持手段と、増幅の序列、温度変化及びタイミングを制御するための信号を発生する計算手段とを含む。
【００５１】
例えば、Hoffman らのBiotechniques, 6(10), pp. 932-936 (1988)に記載されているように、増幅にはガスクロマトグラフも使用されており、さらに、「ティーカップ」における増幅が簡単且つ安価な技法として記載されている〔Innis ら (編) 、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Chapter 51, pp. 429-434, Robert Watson, Academic Press, Inc., 1990〕。
【００５２】
使い捨て可能な化学試験パックで増幅反応を行うのに好適な装置が、欧州特許出願公開第０４０２９９４号（１９９０年１２月１９日発行）に詳細に記載されている。一般に、この装置は、化学試験パックを支持するための表面と、該試験パック内の隣接チャンバー間で流体を移動させるために反応パックに作用する、該表面の上方で支持された圧力アプリケータと、試験パックを差し渡す移動範囲で圧力アプリケータを作動させるための手段とを含む。
【００５３】
欧州特許出願公開第０４０２９９４号は、それに記載された装置を用いて処理することができる有用な化学試験パックについて詳細に記載している。また、同刊行物には、本発明の方法に適した、繰り返し間隔を置いて（すなわち、サイクル化して）試験パックを加熱、冷却するための手段も記載されている。既述のように、これらの装置及び試験パックは本発明を実施する上で好ましいものではあるが、本明細書に記載した有益な結果を得るのにこれらが不可欠であるとは考えられない。
【００５４】
本発明の方法は適当な容器の中で行うことも有用である。最も簡素な容器は試験管、キュベット、フラスコ又はビーカーであろうが、該方法を実施するための自動化工程を促進するために、より複雑で巧妙な容器が開発されている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９１／１２３４２号を参照のこと）。例えば、該方法を実施する際に特定の温度特性を提供するように構成されたキュベット及び化学試験パック（パウチとしても知られている）が、米国特許第４，９０２，６２４号（Columbusら）及び欧州特許出願公開第０３８１５０１号（１９９０年８月８日発行）に記載されている。このような試験パックは、増幅又は検出方法における各種段階で有用な各種試薬、緩衝液その他材料を有する複数の反応チャンバーを含む。該パックは、本発明の増幅法の各種工程を促進するために適切且つ迅速に加熱及び冷却を繰り返すことができる。その他の有用な容器を、本発明の方法の自動化用途又は使い捨て用途のために適当に開発することもできる。
【００５５】
増幅生成物を検出するため、これを反応媒体中の他の物質から分離することが有用である場合が多い（しかし、必要ではない）。これはいくつかの方法で行われるが、好ましくは、該方法で複製されたプライマー伸長生成物が水に不溶化して反応混合物から分離されるように水不溶性捕捉プローブを使用することにより行われる。プローブは適当な方法で不溶性材料に結合されることができる。
【００５６】
増幅生成物は、これに相補的なオリゴヌクレオチドを使用することにより、望ましくない物質から分離することができる。このオリゴヌクレオチドは、捕捉プローブを形成するための周知の結合技法により不溶性支持体（例、ポリマー粒子又は磁性粒子）に結合される（既述）。このような技法の一つが欧州特許出願公開第０４３９２２２号（１９９１年９月１８日発行）に記載されている。その他の技法が、例えば、米国特許第４，７１３，３２６号（Dattaguptaら) 、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１３０２号（１９８８年２月２５日発行）及び欧州特許公報第００７０６８７号（１９８３年１月２６日発行）に記載されており、この技法によると、捕捉オリゴヌクレオチドと増幅核酸が結合する多成分のハイブリダイズ生成物において中間体オリゴヌクレオチドが用いられる。分離は、遠心分離法又は混合物を磁場に置く方法によって行うことができる。
【００５７】
その他の有用な分離手段として、Pall社より市販されているポリアミド膜（例、 LOPRODYNE（商標）又は BIODYNE（商標）膜）のような微孔質濾過膜がある。これらは、コーティングすることなく使用してもよいし、また分析工程を促進する界面活性剤その他材料で予備コーティングしたものを使用してもよい。
【００５８】
これらの膜は、アッセイの別の工程を実施するための適当な容器と共に独立した支持体として使用することができる。これらは、使い捨て可能な試験装置の一部として取り付けることができる。当該技術分野では各種の使い捨て可能な試験装置が知られており、米国特許第３，８２５，４１０号（Bagshawe）、同第３，８８８，６２９号（Bagshawe）、同第３，９７０，４２９号（Updike）及び同第４，４４６，２３２号（Liotta）に記載されているものが含まれる。特に有用な装置が米国特許第４，９２１，６７７号（Hinckleyら）に記載されており、そして Eastman Kodak社よりSURESELL（商標）試験装置として市販されている。
【００５９】
検出用の水不溶性生成物の分離には、マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、ビーズ、フィルム、メンブランフィルター、濾紙、ゲル、磁性粒子又はガラスウールをはじめとする有用ないずれの固体支持体でも使用することができる。それは、ガラス、セラミックス、金属、天然又は合成ポリマー、セルロース系材料、フィルター材料、その他当業者であれば容易に想到し得る材料をはじめとする多様な材料から製造することができる。特に有用な固体支持体の材料は、平均粒径が一般に約０．１〜約１０μｍのポリマービーズである。
【００６０】
検出は、捕捉プローブを、平らな支持体、例えば、上記の微孔質濾過膜、又は薄いポリマーフィルム、フィルムラミネート、非コーティング紙若しくはポリマーコーティング紙の上に固定化することにより実施することもでき、これらのいくつかについては当該技術分野で知られている。このような材料に関しては欧州特許出願公開第０４０８７３８号（１９９１年１月２３日発行）に詳細に記載されている。
【００６１】
本発明の増幅方法を遂行するために必要な試薬、材料及び指示は、試験キットの中で供給することができる。塩化アンモニウム及びカルボン酸又は金属カルボキシレート、プライマー、ＰＣＲ試薬、試験装置（又は試験パック）、その他該方法に一般に必要な材料について、別々の包装又は容器を使用してもよい。好ましくは、試験キットは、塩化アンモニウム及びカルボン酸又は金属カルボキシレートの混合物、必要なすべてのＰＣＲ試薬、並びに反応を行うための適当な容器又は試験パックを含む。
【００６２】
【実施例】
本発明の実施を説明するために、以下の実施例を含めるが、これらは本発明の限定を意味するものではない。特に断らないかぎり、パーセントは重量％を表す。
実施例１：全血試料の調製
この実施例は、下記の赤血球溶解液調製物及び手順を使用して全血試料中の赤血球その他の物質から白血球を分離した後に得られた白血球の数を比較するものである。
【００６３】
ヘパリンを含む全血試料を異なる４つのドナーから得た。
各試料のアリコート（０．５ｍＭ）を、１．５ｍＬの微小遠心分離管の中で、１０ｍＭの重炭酸ナトリウムと、
Ａ．１６０ｍＭの塩化アンモニウム（１６０ＡＣ）、又は
Ｂ．１６０ｍＭの塩化アンモニウム及び０．０１重量％の酢酸（１６０ＡＣ／ＡＡ）、又は
Ｃ．８０ｍＭの塩化アンモニウム（８０ＡＣ）、又は
Ｄ．８０ｍＭの塩化アンモニウム及び０．０１重量％の酢酸（８０ＡＣ／ＡＡ）とを含有する溶解液（ｐＨ＝７．２）の１ｍＬと混合した。
【００６４】
上記溶液中に試料を含有する微小遠心分離管を、自動ロッカーにより室温で５分間穏やかに混合した。次いで、その管を室温で３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。溶解した赤血球、可溶性成分その他の物質を含有する上清液を廃棄した。白血球を含むペレットを、最初に試料を混合した溶液と同じ新鮮な溶解液の中で再懸濁した。この懸濁液を再度室温で３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。その上清液を廃棄し、そしてそのペレットを１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝化塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ＝７．２、Sigma Chemical社、製品番号 P0261）に再懸濁した。ばらばらになった白血球を含有する懸濁液のアリコートを新鮮なＰＢＳで１：１０に希釈した。上記方法を全体で約１５分で遂行した。
【００６５】
白血球の存在を顕微鏡で確認し、その細胞数を、ヘモサイトメーターチャンバーを使用して顕微鏡下で計数した。希釈し再懸濁した試料の各々について計数を３回繰り返し、その平均計数値とその平均についての標準偏差を算出した。希釈係数とヘモサイトメーターの補正率（ヘモサイトメーターの製造業者より入手）とを組み合わせて、ヘモサイトメーターで得られた平均計数値を、元の試料に含まれる全血１ミリリットル当たりの白血球数の推定値に換算した。上記各種塩化アンモニウム溶液についてのこれらの推定計数値を下記表１に示す。
【００６６】
0003715405.tif 000002
【００６７】
表１に示した結果は、カルボン酸である酢酸が存在した場合には、元の試料から回収される白血球が顕著に増加したことを示しており、好ましい実施態様（８０ＡＣ／ＡＡ）では回収量が最大となった。このことは、細胞集団中に標的核酸が非常に低い力価で存在し得る場合には特に有利である。
【００６８】
実施例２：標的核酸を単離し、増幅し、そして検出するための方法
この実施例は、実施例１に記載した白血球細胞を単離するための方法を使用して白血球から解放されたＨＩＶ−１  ＤＮＡを増幅して検出する方法を例示するものである。
この実施例では以下の材料及び方法を使用した。
【００６９】
この実施例では以下の配列を有するプライマーを使用した。以下のプライマーはいずれもＨＩＶ−１  ＤＮＡのｇａｇ領域に対して相補的である。
配列番号：１： 5'-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3'
配列番号：２： 5'-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3'
プライマー中、Ｘは、米国特許第４，９６２，０２９号（Levensonら）に記載されている技法で２個のアミノテトラエチレングリコールのスペーサー基を介してオリゴヌクレオチドに添付されたビオチニル部分（DuPont社、ビオチンホスホルアミダイト試薬より誘導）を表す。
【００７０】
この実施例では以下の配列を有する捕捉プローブを使用した。
配列番号：３： 5'-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-Y-3'
Ｙは、米国特許第４，９１４，２１０号（Levensonら）の教示により１個のアミンジオール結合基に接続された２個のテトラエチレングリコールのスペーサーを表す。
【００７１】
これらプライマー及び捕捉プローブは、Applied Biosystems Model 380B （３本カラム式ＤＮＡ合成機、標準ホスホルアミダイト法、規模ABI １μモル、迅速サイクルプロトコル）を用い、公知の出発物質及び方法で調製した。ヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト及びヌクレオシド誘導体化孔径制御ガラス支持体をApplied Biosystemsから入手した。すべての精製は、核酸精製カラムを用いた後、逆相ＨＰＬＣ技法を使用して行った。
【００７２】
捕捉試薬を得るため、従来法でポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比９５：５）から調製したポリマー粒子（平均粒径１μｍ）に上記プローブを共有結合させた。この粒子を水に含む懸濁液を２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１モル、ｐＨ６）で洗浄し、そして固形分約１０％になるように懸濁した。洗浄後の粒子を該緩衝液（０．１モル）で固形分３．３３％になるように希釈した試料（３．３ｍＬ）を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（８４ｍｇ／ｍＬ水のもの２．１ｍＬ）及びプローブ（４４．４４ＯＤ／ｍＬナノ純水のもの９８３μＬ）と混合した。得られた懸濁液を、間欠的に混合及び遠心分離を行いながら水浴中、５０℃で約２時間加熱した。その後、これらの粒子を、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（０．１ミリモル）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（０．０１モル、ｐＨ８）で３回洗浄し、そしてその中に固形分４％になるように再懸濁した。
【００７３】
緩衝液で固形分０．２５％になるように希釈して、その捕捉試薬（１．２μＬ）をSURECELL（商標）使い捨て試験装置(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics 社より入手できる) のテストウェルにおいて微孔質膜(LOPRODYNE（商標）ポリアミド膜、平均孔径５μｍ、Pall社) に適用して乾燥した。このことは米国特許第４，９４８，５６１号（Hinckleyら）に詳細に記載されている。
【００７４】
ＰＣＲ法は、米国特許第５，０８９，２３３号に詳細に記載されている Johnson & Johnson Clinical Diagnostics 社製の自動ＰＣＲ処理装置を用い、下記の加熱及び冷却のプロトコルで実施した。本明細書ではこの米国特許明細書を参照することにより援用する。
サーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus) 由来の組換えＤＮＡポリメラーゼを従来法で得た。
グリセロール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤及びｄＮＴＰは Sigma Chemical 社から入手した。
【００７５】
地方の病院から、ＨＩＶに対して血清陽性(sero-positive) である患者の全血（試料番号１〜１０）及びＨＩＶに対して血清陰性(sero-negative) である患者の全血（試料番号１１及び１２）を入手した。実施例１の溶解液Ｄを使用して、赤血球を溶解して白血球細胞を単離するために全血を実施例１の方法により処理した。第二の洗浄工程の後に得られた白血球細胞ペレットから、白血球細胞由来のＤＮＡを抽出した。
【００７６】
白血球細胞由来のＤＮＡを抽出は、係属中の米国特許出願第０８／３０６，８７０号（１９９４年９月１５日出願）に記載されているＤＮＡポリマー捕捉法によって行った。簡単に説明すると、ペレット状の白血球細胞に、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、０．１５％の界面活性剤TWEEN 20（商標）及び２５μＧ／μＬの子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する白血球溶解液１５０μＬを添加した。その懸濁液を混合した後、１００℃で５分間加熱した。この懸濁液を室温にまで冷却した後、１５０μＬのＡＣＥＳ（２−〔（２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ〕エタンスルホン酸）緩衝液を添加し、続いてポリマー捕捉剤の溶液２５μＬを添加した。その混合物を激しく混合し、次いで室温で１４，０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離にかけた。その上清液を分離して廃棄した。この捕捉剤−ＤＮＡ複合体を含有するペレットに、２０ミリモルの水酸化ナトリウム１００μＬを添加し、次いでその混合物を１００℃で５分間加熱してＤＮＡを解放させた。この溶液（２５μＬ）を、さらに処理することなく、ＰＣＲ試薬混合物中に直接導入した。
【００７７】
ロイコ色素分散液は、アガロース（０．５％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール系ロイコ色素（２５０μモル）、ジエチレントリアミン五酢酸（１００μモル）、４’−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）、ポリビニルピロリドン（１１２ミリモル）及びリン酸ナトリウム、一塩基性、一水和物（１０ミリモル）を含有した。
【００７８】
この実施例で使用した接合体溶液は、市販品（Zymed Laboratories社）の西洋ワサビペルオキシダーゼとストレプトアビジンの接合体（１２６μＬ／Ｌ）、カゼイン（０．５％）及びメルチオレート（０．５％）をリン酸緩衝化塩化ナトリウム水溶液（２４ミリモルのリン酸ナトリウム及び７５ミリモルの塩化ナトリウム）に含有するものとした。接合体の最終濃度は３１２ｎＧ／ｍＬであった。
【００７９】
この実施例で使用した洗浄液は、塩化ナトリウム（３７３ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（２．５ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（３８ミリモル）及びエチル水銀チオサリチル酸ナトリウム（２５μモル）をリン酸ナトリウム、一塩基性一水和物緩衝液（２５ミリモル、ｐＨ７．４）に含有するものとした。
【００８０】
「ＴＰ４」モノクローナル抗体を反応混合物に使用した。この抗体はサーマス・アクアティクス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、最近特許された米国特許出願第０７／９５８，１４４号（Scalice ら）に詳細に記載されている。本明細書ではこれを参照することにより援用する。一般に、MilsteinらのNature 256、pp. 495-497 、1975に記載されているような従来法でＤＮＡポリメラーゼ免疫化したマウスの免疫細胞及びハイブリドーマ細胞系統(ATCC 由来のHB 11126又は11127)から該抗体は調製される。この方法により、宿主動物の抗体分泌細胞をリンパ様組織（例、脾臓）から単離し、ポリエチレングリコールの存在下、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞と融合し、選択培地中へ希釈し、そしてマルチウェル組織培養皿において平板培養した。７〜１４日後、抗体を含有するハイブリドーマ細胞を収穫して従来法で精製した。
【００８１】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物（１００μＬ）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々１．５ミリモル）、プライマー（各々０．４μモル）、ゼラチン（０．０１％）、上記ＤＮＡポリメラーゼ（１６単位／１００μＬ）並びに「ＴＰ４」モノクローナル抗体（対ＤＮＡポリメラーゼのモル比として５０：１）を含有するものとした。
試薬及び材料の残部は、市販品を利用したか、或いは Johnson & Johnson Clinical Diagnostics 社で従来法により調製した。
【００８２】
増幅ＨＩＶ−１  ＤＮＡの検出
本発明のＰＣＲプロトコルは下記の通りとした。
増幅サイクル４０回
各サイクルは、
Ａ）９５℃で１５秒間加熱して変性する工程（第一回目のサイクルだけは１９５秒間とした）、及び
Ｂ）、Ｃ）６４℃で３０秒間プライミング（アニーリング）及び伸長する工程
【００８３】
アッセイは、上記のように、反応混合物において、１００μＬ及び２５μＬのＤＮＡ抽出混合物に対して１６単位のＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。
【００８４】
増幅生成物の検出は下記のように行った。最終増幅反応混合物の一部（５μＬ）を、緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）及びゼラチン（０．０１％）〕と混合し、そして９５℃５分間インキュベートすることにより核酸を変性させた。次いで、得られた溶液をSURECELL（商標）試験装置に移し、増幅された標的核酸を５０℃で捕捉プローブにハイブリダイズさせた。
【００８５】
続いて、試験装置の試験ウェルを、緩衝液〔リン酸二水素ナトリウム（１０ミリモル）、塩化ナトリウム（１５０ミリモル）、デシル硫酸ナトリウム（１％）及びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル）〕（２５０μＬ、ｐＨ７．４）によって５５℃で洗浄した。上記ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液（５０μＬ）を各試験ウェルへ添加し、そしてその膜を室温で透過させた。２分後、試験ウェルを２回洗浄した。
【００８６】
各試験ウェルに上記ロイコ色素分散液（１００μＬ）を添加して、その装置を室温で２分間インキュベートした。アジ化ナトリウム（０．１％）の溶液（１００μＬ）を添加することにより発色を停止させた。
アッセイで観測された得られた色素信号について、濃度スケール０〜１０（最高観測濃度は１０）により視覚的に等級分けを行った。アッセイの結果を下記表２に示す。
【００８７】
0003715405.tif 000003
【００８８】
内部標準を基準とした色評点が２．０以下のものは、バックグラウンドレベルの信号を表す。この色評点は、ＰＣＲが明らかに行われており、標的ＨＩＶ−１由来のＤＮＡが増幅されて検出されたことを示唆している。
【００８９】
本発明をその好ましい実施態様を特に参照しながら詳細に説明したが、本発明の精神及び範囲内で変更や置換が可能であることを理解すべきである。
本明細書において言及した刊行物はすべてここに援用するものとする。
【００９０】
【配列表】
（１）一般情報
（ｉ）出願人：エケゼ，トビアス  イー．(Ekeze, Tobias E.)
ケルシュナー，ジョアンヌ  エイチ．(Kerschner, Joanne H)
（ｉｉ）発明の名称：赤血球細胞を選択的に溶解するための塩化アンモニウムとカルボン酸又は金属カルボキシレートを使用するポリメラーゼ連鎖反応のための白血球試料の調製法
（ｉｉｉ）配列の数：３
（ｉｖ）通信用住所：
（Ａ）名宛人：Johnson & Johnson
（Ｂ）ストリート：One Johnson & Johnson Plaza
（Ｃ）シティー：New Brunswick
（Ｄ）ステート：New Jersey
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：０８９３３
（ｖ）コンピューター読み取り可能なフォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換性
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテント  イン  リリース（Patent In Release ）＃１．０，バージョン＃１．２５
（ｖｉ）最新の出願データ：
（Ａ）出願数：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人／代理業者情報
（Ａ）氏名：オグデン，ステーシア  エル．（Ogden, Stasia L.）
（Ｂ）登録番号：３６，２２８
（Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＤＳ−９６
（ｉｘ）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：９０８−５２４−２８１９
（Ｂ）テレファックス：９０８−５２４−２８０８
【００９１】
配列番号：１
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ (genomic)
配列の特徴
特徴を表す記号：modified base
存在位置：１
他の情報：標識＝その他
注釈＝ビオチニル部分で変性された塩基
配列
0003715405.tif 000004
【００９２】
配列番号：２
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ (genomic)
配列の特徴
特徴を表す記号：modified base
存在位置：１
他の情報：mod base＝その他
注釈＝ビオチニル部分で変性された塩基
配列
0003715405.tif 000005
【００９３】
配列番号：３
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ (genomic)
配列の特徴
特徴を表す記号：modified base
存在位置：４１
他の情報：mod base＝その他
注釈＝１個のアミンジオール結合基に接続された２個のテトラエチレングリコールのスペーサーで変性された塩基
配列
0003715405.tif 000006