(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
総揮発性物質濃度３０〜１００ｇ−ＴＶＳ／Ｌの、酵母が組換え体である酵母菌体懸濁液を液化処理およびガス化処理を含む二相式メタン発酵法によって処理することを特徴とする酵母が組換え体である酵母菌体の処理方法。
【請求項２】
ニッケルおよび／またはコバルトの塩を酵母が組換え体である酵母菌体懸濁液に添加した後に、液化処理することを特徴とする請求項１記載の酵母が組換え体である酵母菌体の処理方法。
【請求項３】
酵母が組換え体である酵母菌体懸濁液を液化処理した後、その液化処理液を揮発性脂肪酸濃度１００００ｍｇ／Ｌ以下に調整してガス化処理することを特徴とする請求項１または２記載の酵母が組換え体である酵母菌体の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵母菌体の処理方法に関し、詳しくは高濃度の総揮発性物質（有機物）を含む酵母菌体懸濁液を処理する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵母菌体は、ビール、日本酒、焼酎、ウイスキー、ワイン、工業用エタノールなどの醸造の際、または酵母を宿主とした組換えタンパク生産の際、副産物として得られる。酵母菌体の一部は、医薬品、食品、飼料などの原料として利用されるがその量は限られており、余剰の酵母菌体は廃棄処分されている。廃棄処分の方法としては、海洋などへの投棄や焼却処理などが行われている。しかし、環境汚染、処理コストの高騰などの問題から、より経済的かつ効率的な処理方法の探索が待たれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる背景の下に、新たな処理方法を探索することによって、経済的かつ効率的に酵母菌体の処理を行い得る処理方法を開発することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、総揮発性物質濃度３０〜１００ｇ−ＴＶＳ／Ｌの酵母菌体懸濁液を二相式メタン発酵法で処理することにより、経済的かつ効率的に酵母菌体が処理されることを見い出し、本発明を完成するに到った。
【０００５】
すなわち、本発明は、総揮発性物質濃度３０〜１００ｇ−ＴＶＳ／Ｌの酵母菌体懸濁液を液化処理およびガス化処理を含む二相式メタン発酵法によって処理することを特徴とする酵母菌体の処理方法である。
【０００６】
本明細書において用いられる略語の定義は以下の通りである。
ＴＶＳ（Total Volatile Solid）    ：総揮発性物質
ＳＳ（Suspended Solid ）          ：浮遊物質
ＶＳＳ（Volatile Suspended Solid）：揮発性浮遊物質
ＭＬＶＳＳ（Mixed Liquor Volatile Suspended Solid ）：混合液揮発性浮遊物質
ＴＯＣ（Total Organic Carbon）    ：溶解性の全有機炭素
【０００７】
本発明において処理され得る酵母菌体の種類は、特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発される組換え体などにも適宜利用することができる。具体的には、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属などが挙げられる。特に、本発明においては、Ｇ４１８感受性株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae) ＡＨ２２株（a. his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリス(Pichia pastoris) ＧＴＳ１１５株（his 4)などを宿主とした組換え体が好適に処理される。
【０００８】
これらの酵母菌体は、生菌の状態か、または既に公知の方法もしくはそれに準じた方法で殺菌処理された後、以下に記載の二相式メタン発酵法により処理される。
【０００９】
二相式メタン発酵法は、液化処理とガス化処理とを含み、酵母菌体は予め水または何らかの水溶液に懸濁された後、液化処理装置およびガス化処理装置に順次投入されて処理される。
【００１０】
液化処理装置に投入される酵母菌体懸濁液のＴＶＳ濃度は、下限が３０ｇ−ＴＶＳ／Ｌであり、上限が１００ｇ−ＴＶＳ／Ｌである。酵母菌体懸濁液のＴＶＳ濃度が３０ｇ−ＴＶＳ／Ｌ未満では、水理学的滞留時間が短くなり、ＶＳＳ消化率が低くなるなど効率的な液化処理ができない。一方、１００ｇ−ＴＶＳ／Ｌを越えると、プロピオン酸などの有機酸の生成量が多くなり、以後のガス化処理に悪影響を及ぼす。
【００１１】
液化処理においては、酵母菌体懸濁液を希釈してもよいが、ＶＳＳ消化率を向上させる点から、酵母菌体懸濁液を希釈しない方が好ましい。
【００１２】
液化処理において作用する微生物は、酸生成菌と水素生成酢酸生成菌とに大きく分けられる。酸生成菌は、高分子有機物から酢酸、プロピオン酸、酪酸などの低級脂肪酸を生成する一群の微生物である。また、水素生成酢酸生成菌は、水素資化性のメタン生成菌や硫酸還元菌と共生して低級脂肪酸から酢酸と水素とを生成する。当該微生物としては、下記の表１に記載のものが例示される。
【００１３】
【表１】
0003728758.tif 000002
【００１４】
液化処理においては、まず、種々雑多の当該微生物を含む（微生物群からなる）汚泥または嫌気性消化シード〔種汚泥または嫌気性消化汚泥ともいう。下水処理などにおいて得られた嫌気性汚泥（嫌気性菌群）を馴養したもの。〕を通常の方法により馴養する。すなわち、この馴養は液化処理を行い易い状態に馴らしていくことを意味する。具体的には、嫌気性消化シードを例えば、ＭＬＶＳＳとして１０2 〜１０5 mg／Ｌの濃度に対して、混合汚泥、合成廃水などを用いて、有機物容積負荷、ｐＨ、温度条件などの条件を当該液化処理の条件に合わせた条件下で適当な期間馴養する。次いで、酵母菌体懸濁液の液化処理を開始する。
【００１５】
液化処理装置は、公知文献記載の温度で運転することができる。一般的には３０〜７０℃程度が例示される。特に本発明においては、中温発酵（３０〜４０℃）よりも高温発酵（５０〜６０℃）で液化処理を実施することが反応速度の点から好ましい。
【００１６】
液化処理の水理学的滞留時間は、通常５〜４０日間程度とし、有機物容積負荷は、１〜１０ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄ程度、好ましくは３〜５ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄ程度とする。液化処理のｐＨは６〜８程度となるように調整すればよく、酸またはアルカリを適宜添加して制御する。
【００１７】
液化処理においては、必要に応じてニッケルおよび／またはコバルトの塩を酵母菌体懸濁液に添加することが、液化反応を向上させる点で好ましい。具体的には、塩化第一ニッケル六水塩、塩化第一コバルト六水塩などが例示される。ニッケルおよび／またはコバルトの塩は、酵母菌体懸濁液のＴＶＳ濃度に応じて適宜添加される。具体的には、終濃度として各々１〜１００mg／Ｌ程度が例示される。
【００１８】
液化処理における攪拌方法としては、ポンプ循環、機械攪拌、ガス攪拌などがある。一般にガス攪拌は保守管理が容易で、脱硫後の発生ガスを用いれば、メタン生成に阻害を及ぼす硫化物の除去効果も得られるなどの利点がある。
【００１９】
上記処理条件下で、酵母菌体懸濁液は連続的に処理され、液化処理装置におけるＶＳＳの消化率を５０％以上に維持することが可能となる。
【００２０】
液化処理後の酵母菌体懸濁液（液化処理液）は、希釈せずに、あるいは水または何らかの水溶液で希釈した後、ガス化処理装置に投入される。ガス化処理装置は、公知文献記載のものおよびそれに準じたものを使用することができる。例えば、上向流式嫌気性汚泥床法、嫌気性固定床法、嫌気性流動床法などの方法が、ガス化処理装置で用いられる。特に本発明においては、嫌気性固定床法を用いることが好ましい。
【００２１】
ガス化処理においては、良好なガス発生量（４００ml-gas／ｇ−ＴＶＳ以上）を達成するために、液化処理液を揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）濃度１００００mg／Ｌ以下となるように調整して用いることが好ましい。
【００２２】
ガス化処理において作用する嫌気性菌は、Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales の３目に分けられ、さらに下記の表２に示される４科８属１４種に分類される。
【００２３】
【表２】
0003728758.tif 000003
【００２４】
これらの嫌気性菌のうち、Methanosarcina属とMethanothrix属とは酢酸を基質にできるメタン生成菌であり、この２属がメタン生成過程の主要な役割を果している。
【００２５】
ガス化処理においても、液化処理の場合と同様に、まず、種々雑多の当該嫌気性菌を含む（嫌気性菌群からなる）汚泥または嫌気性消化シード〔種汚泥または嫌気性消化汚泥ともいう。下水処理などにおいて得られた嫌気性汚泥（嫌気性菌群）を馴養したもの。〕を通常の方法により馴養する。すなわち、この馴養はガス化処理を行い易い状態に馴らしていくことを意味する。具体的には、嫌気性消化シードを例えば、ＭＬＶＳＳとして１０2 〜１０5 mg／Ｌの濃度に対して、混合汚泥、合成廃水などを用いて、有機物容積負荷、ｐＨ、温度条件などの条件を当該ガス化処理の条件に合わせた条件下で適当な期間馴養する。次いで、液化処理後の酵母菌体懸濁液（液化処理液）のガス化処理を開始する。
【００２６】
ガス化処理は公知の温度条件下で行うことができる。一般的には３０〜６０℃程度が例示される。特に本発明においては、中温発酵（３０〜４０℃）および高温発酵（５０〜６０℃）のいずれでも実施可能である。
【００２７】
ガス化処理の水理学的滞留時間は、通常１〜５日間程度とし、有機物容積負荷は、0.1 〜１０ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄ程度、好ましくは１〜４ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄ程度とする。ガス化処理のｐＨは６〜８程度となるように調整すればよく、酸またはアルカリを適宜添加して制御する。
【００２８】
ガス化処理においても、上記の液化処理と同様に、必要に応じてニッケルおよび／またはコバルトの塩を液化処理液に添加することが、ガス化反応を向上させる点で好ましい。また、ガス化処理における攪拌方法は、上記の液化処理と同様に、ポンプ循環、機械攪拌、ガス攪拌などが例示される。
【００２９】
上記のガス化処理条件下で、安定にガス化処理を行うことができ、生成されるガスは、５０％以上のメタンを含有し燃料として利用することができる。
【００３０】
以下に本発明の好ましい態様を列挙する。
１．本発明の酵母菌体の処理方法において、ニッケルおよび／またはコバルトの塩を酵母菌体懸濁液に添加した後に、液化処理に付する態様。
２．本発明の酵母菌体の処理方法において、酵母菌体懸濁液を液化処理した後、その液化処理液を揮発性脂肪酸濃度10,000mg／Ｌ以下に調整してガス化処理する態様。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
▲１▼  酵母菌体懸濁液の調製
ピキア・パストリス(Pichia pastoris) ＧＴＳ１１５株に、ヒト血清アルブミン発現用プラスミドｐＭＭ０４２を導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特開平４−２９９８４号公報参照）。
【００３３】
この形質転換体ＵＨＧ４２−３株をジャーファーメンターを用いて通気攪拌培養し、培養終了後に圧搾機にて、酵母菌体と濾液とに分離した。圧搾により得られた酵母菌体を湿重で２５０ｇ採取し、これを蒸留水にて懸濁して１Ｌの懸濁液とした。この懸濁液を１２１℃にて２０分間蒸気加圧滅菌して、酵母菌体懸濁液１Ｌを得た。この酵母菌体懸濁にNiCl2 ・６Ｈ2 ＯおよびCoCl2 ・６Ｈ2 Ｏをそれぞれ終濃度で18.1および5.1 mg／Ｌとなるように添加した。
【００３４】
この酵母菌体懸濁液の浮遊物質（ＳＳ）濃度は、約65,000mg／Ｌ、揮発性浮遊物質（ＶＳＳ）濃度は約60,000mg／Ｌ、総揮発性物質（ＴＶＳ）濃度は約65,000mg／Ｌであった。
【００３５】
▲２▼  酵母菌体懸濁液の液化処理
液化処理は、２Ｌ容ジャーファーメンターを用い、処理温度５３℃、攪拌速度３００rpm の条件下で実施した。２Ｌ容ジャーファーメンターに嫌気性消化シード（ＭＬＶＳＳ：10,000mg／Ｌ）を1.7 Ｌ加え、混合汚泥を用いてdraw-and-fill 法により馴養を行った。馴養初期の有機物容積負荷は２ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄとし、最終的に５ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄまで上昇させた。
【００３６】
馴養終了後に、水で３倍に希釈した酵母菌体懸濁液を有機物容積負荷が２ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄとなるようにポンプで連続的に供給した。その後、有機物容積負荷を４ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄに上昇し、酵母菌体懸濁液を３倍希釈のものから無希釈のものに変更した。
【００３７】
同じく、馴養終了後、水で1.5 倍に希釈した酵母菌体懸濁液を単独で用いた液化処理も実施した。1.5 倍希釈した酵母菌体懸濁液の液化処理では、有機物容積負荷を2.5 ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄとし、段階的に有機物容積負荷を変更した。
【００３８】
液化処理における揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）濃度、溶解性全有機炭素（ＴＯＣ）濃度、揮発性浮遊物質の消化率（ＶＳＳ digestion efficiency ）、ガス生成率（Gas production）、有機物容積負荷（Organic matter loading rate ）の経時変化を酵母菌体懸濁液の３倍希釈のものおよび無希釈のものは図１に、1.5 倍希釈のものは図２にそれぞれ示した。
【００３９】
無希釈の酵母菌体懸濁液を投入することにより、有機物容積負荷６ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄで、６０％以上の有機性浮遊物質消化率を得ることができた。また、このときの揮発性脂肪酸濃度は30,000mg／Ｌに達した。この液化処理工程においては、酸またはアルカリの添加を行わずに、ｐＨ７前後に維持することができた。
【００４０】
液化処理における希釈率（Dilution rate ＝水理学的滞留時間の逆数）と有機性浮遊物質の消化率との関係を図３に示した。希釈率を0.10ｄ-1以下（すなわち水理学的滞留時間が１０日間以上）とすることで、５０％以上の有機性浮遊物質消化率を得ることができる。
【００４１】
▲３▼  ガス化処理
かくして得られた酵母菌体懸濁液の液化処理液にNiCl2 ・６Ｈ2 Ｏを終濃度が１１mg／Ｌとなるように添加し、無希釈または水で1.5 倍、３倍、５倍にそれぞれ希釈した後、ガス化処理装置に投入した。ガス化処理は、５００ml容のガラス製容器に嫌気性消化シード（ＭＬＶＳＳ：10,000mg／Ｌ）を４００ml加え、draw-and-fill 法で実施した。ガス化処理の処理温度は５３℃とし、攪拌はマグネチックスターラーを用いて実施した。有機物容積負荷は、２ｇ−ＴＶＳ／Ｌ／ｄとした。ガス化処理においては、酸またはアルカリの添加を行わずにｐＨ７前後を維持することができた。
【００４２】
ガス化処理におけるメタンガス生成率（Gas production）、溶解性全有機炭素（ＴＯＣ）濃度、揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）濃度の経時変化をそれぞれ図４、５、６に示した。酵母菌体の液化処理液を３倍以上希釈することにより、４００ml-gas／ｇ−ＴＶＳ以上のガス生成率が得られ、ガス化処理装置内の有機性炭素濃度と揮発性脂肪酸濃度を一定に保つことができた。
【００４３】
かくして生成されたガスは５０％以上のメタンを含有し燃料として利用することができる。
【００４４】
実施例２
液化処理の温度条件を３７℃で行う以外は、実施例１に準じて二相式メタン発酵法による処理を行った。その結果、実施例１と同様の良好な結果が得られた。
【００４５】
実施例３
液化処理の温度条件を７０℃で行う以外は、実施例１に準じて二相式メタン発酵法による処理を行った。その結果、実施例１と同様の良好な結果が得られた。
【００４６】
実施例４
ガス化処理の温度条件を３７℃で行う以外は、実施例１に準じて二相式メタン発酵法による処理を行った。その結果、実施例１と同様の良好な結果が得られた。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の酵母菌体の処理方法によれば、総揮発性物質濃度３０〜１００ｇ−ＴＶＳ／Ｌの酵母菌体懸濁液を液化処理およびガス化処理を含む二相式メタン発酵法によって処理することによって、酵母菌体が効率的にメタンガスに転換され、酵母菌体の経済的な廃棄処理が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵母菌体懸濁液を３倍希釈から無希釈に変更した場合の、液化処理における揮発性脂肪酸濃度、溶解性全有機炭素濃度、揮発性浮遊物質の消化率、ガス生成率、有機物容積負荷の経時変化を示す図である。
【図２】  1.5 倍希釈した酵母菌体懸濁液を単独で用いた場合の、液化処理における揮発性脂肪酸濃度、溶解性全有機炭素濃度、揮発性浮遊物質の消化率、ガス生成率、有機物容積負荷の経時変化を示す図である。
【図３】液化処理における希釈率と揮発性浮遊物質の消化率との関係を示す図である。
【図４】ガス化処理におけるメタンガス生成率の経時変化を示す図である。
【図５】ガス化処理における溶解性有機炭素濃度の経時変化を示す図である。
【図６】ガス化処理における揮発性脂肪酸濃度の経時変化を示す図である。
【図１】
0003728758.tif 000004
【図２】
0003728758.tif 000005
【図３】
0003728758.tif 000006
【図４】
0003728758.tif 000007
【図５】
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【図６】
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