(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅毒トレポネーマ抗原をラテックスからなる不溶性担体に担持させ、同抗原と抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を測定することにより該抗体を測定する免疫測定法において、該抗原抗体反応の測定系に塩化ナトリウムを０．９７〜２．４％（ｗ／ｖ）存在させることを特徴とする免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ラテックスからなる不溶性担体を使用し、これに担持した梅毒トレポネーマ抗原と検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応に基づいて同抗体を測定する免疫測定法に関し、より詳細には、検出感度が高くしかも非特異反応が少ない免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法の一つとして、梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担持させ、同抗原と検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を測定することにより該抗体を測定する免疫測定法がある。このような測定方法としては、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られている。
【０００３】
この凝集の程度を検出する方法としては、凝集の有無を肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射して散乱光あるいは透過光を測定する方法がある。肉眼で判定する方法は定性法あるいは半定量法として用いられている。
【０００４】
これらの凝集反応の測定において、目的物質以外の共存物質間の反応による、いわゆる非特異凝集が生じることがある。この問題を防止するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウマ血清アルブミンなどの免疫学的に不活性なアルブミン類を反応系に添加する方法が提案されている（特開昭５８−１４４７４８、特開平３−９４１６１）。
【０００５】
また、上記凝集反応の測定において、測定感度の向上あるいは抗原抗体反応の促進を目的として、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略す）などの水溶性高分子化合物を反応系に添加する方法が提案されている（特開昭５８−４７２５６、特開平２−２５７０６３）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のようなアルブミン添加によっても、非特異凝集を完全に阻止することは不可能であり、非特異凝集の発生しない梅毒診断薬の開発が望まれていた。
【０００７】
また、ＰＥＧなどの水溶性高分子化合物は、ロット間で物性的な差違が大きいため、再精製が必要であるという問題点を有しており、汎用性が高く、しかも管理しやすい添加剤が求められている。
【０００８】
本発明は、上記の問題を解決するものであり、その目的とするところは、非特異反応が少なく、かつ検出感度が高い抗梅毒トレポネーマ抗体を検出する免疫測定法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記目的を達成すべく工夫されたものであり、梅毒トレポネーマ抗原をラテックスからなる不溶性担体に担持させ、同抗原と抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合を測定することにより該抗体を測定する免疫測定法において、該抗原抗体反応の測定系に塩化ナトリウムを０．９７〜２．４％（ｗ／ｖ）存在させることを特徴とする免疫測定法である。
【００１０】
本発明で用いられる不溶性担体としては、ラテックス懸濁液が用いられる。ラテックスとしては、例えばポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどがある。用いるラテックスの平均粒径は、測定方法、測定機器によって０．０５〜１．０μｍの範囲で適宜選択される。
【００１１】
本発明により抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する場合の測定系には、ラテックス凝集反応が利用される。試薬の調製は、まず、公知の方法により、不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原を物理的あるいは化学的結合により感作させる。用いる抗原は菌体破砕物でも精製物でもよい。また、遺伝子組み換えの技術により人工的に合成されたものを１種あるいはそれ以上組み合わせたものでもよい。
【００１２】
つぎに、測定系について説明する。
【００１３】
本発明では、梅毒トレポネーマ抗原を担持したラテックス試薬に予め塩化ナトリウムを添加しておく。また、塩化ナトリウムを含まないラテックス試薬を使用することも可能で、この場合には抗原抗体反応時に塩化ナトリウムが該反応系に存在するようにすればよい。例えば、検体に予め塩化ナトリウムを添加しておく方法や、使用する緩衝液にこれを添加しておく方法などがあり、特に限定されない。言い換えれば、本発明の測定試薬は、例えば、梅毒トレポネーマ抗原を担持した不溶性担体と塩化ナトリウムとを含む１液系の試薬；梅毒トレポネーマ抗原を担持した不溶性担体を含む第１試薬と、塩化ナトリウムを含む緩衝液からなる第２試薬とで構成された２液系の試薬；など種々の形態でありうる。
【００１４】
このような試薬を用いて凝集反応を行い、生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目視観察することにより抗梅毒トレポネーマ抗体が測定される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法においては、測定は散乱光強度、吸光度または透過光強度を測定する光学機器で行う。測定の波長は３００〜２４００ｎｍの範囲である。測定方法は公知の方法に従い、用いる不溶性担体の粒子の大きさあるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸収光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定する。また、これらの方法を併用することも可能である。
【００１５】
不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する試薬においては、通常、試料と感作不溶性担体を含む溶液を判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外に、凝集状態をビデオカメラで撮影し、画像処理を施すことによって判定を行うことも可能である。
【００１６】
つぎに、測定条件について説明する。
【００１７】
本発明の免疫測定法において、抗原抗体反応の反応系に存在する塩化ナトリウムの濃度は共存するタンパク、糖類、水溶性高分子などの増感剤の濃度によって適宜選ばれる。塩化ナトリウムは、該反応系に０．９７〜２．４％（ｗ／ｖ）の割合で含有されるように調整される。塩化ナトリウムの濃度が０．９７％（ｗ／ｖ）未満であると非特異凝集抑制の効果が認められない。また、この濃度が２．４％（ｗ／ｖ）を越えると抗原抗体反応が抑制され、検出感度が低下する。
【００１８】
本発明において抗原抗体反応の条件は通常の場合と同様であり、反応媒体としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液などが使用される。反応系のｐＨは４．５〜１０．０が好ましく、６〜８が特に好ましい。反応温度は０〜５０℃が好ましく、４〜４０℃の範囲が特に好ましい。反応時間は適宜決められる。
【００１９】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を述べ、その効果を具体的に説明する。
【００２０】
比較例４
（１）梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５０μｇ／ｍｌの蛋白濃度で溶解した梅毒トレポネーマ抗原液４００μｌを平均粒径０．４００μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学社製）１００μｌに添加し、４℃にて１時間攪拌した。次いで、ＢＳＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌを添加し、１．５時間攪拌した。この液を、１０℃にて３０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックスを調製した。
【００２１】
（２）検体希釈液の調製
ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）、ｐＧＥＭＡ（グリコシルエチルメタクリレートのホモポリマー、平均分子量１１４万、日本精化社製）を１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムをその濃度が１５０ｍＭになるよう溶解した。
【００２２】
（３）抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬
抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬は、上記（１）項の梅毒トレポネーマ抗原感作ラテックスからなる第１試薬と、上記（２）の緩衝液からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬である。
【００２３】
（４）標準物質
抗梅毒トレポネーマ抗体を０、１７、６７、４７５Ｔ．Ｕ．（タイターユニット）含むヒト血清を標準抗梅毒トレポネーマ抗体液として使用した。
【００２４】
（５）自動分析装置による抗梅毒トレポネーマ抗体価の測定
以下に、生化学自動分析装置「日立７０５０形」（日立制作所社製）により、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法を示す。
【００２５】
測定モード  ；Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ａｂｓ
パラメーター；検体量                        ２０μｌ
ラテックス試薬（第１試薬）量  ５０μｌ
検体希釈液（第２試薬）量    ３５０μｌ
測定波長    ；５７０ｎｍ
測定時間    ；検体分注後、直ちに検体希釈液が添加・混合され、その後、ラテックス試薬が添加・混合される。ラテックス試薬の添加後８０秒から３２０秒まで吸光度変化量を求め、これを反応量とした。
【００２６】
塩化ナトリウムの濃度は該反応系に０．７３％（ｗ／ｖ）である。
【００２７】
実施例２
比較例４の（２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）、ｐＧＥＭＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムをその濃度が２００ｍＭになるよう溶解し、得られた検体希釈液を使用して（５）測定を行った以外は比較例４と同様の操作を行った。塩化ナトリウムの濃度は該反応系に０．９７％（ｗ／ｖ）である。
【００２８】
実施例３
比較例４の（２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）、ｐＧＥＭＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムをその濃度が５００ｍＭになるよう溶解し、得られた検体希釈液を使用して（５）測定を行った以外は比較例４と同様の操作を行った。塩化ナトリウムの濃度は該反応系に２．４％（ｗ／ｖ）である。
【００２９】
比較例１
比較例４の（２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）、ｐＧＥＭＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムを添加せず、同緩衝液をそのまま検体希釈液として使用して（５）測定を行った以外は比較例４と同様の操作を行った。
【００３０】
比較例２
比較例４の（２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）、ｐＧＥＭＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムをその濃度が２ｍＭになるよう溶解し、得られた検体希釈液を使用して（５）測定を行った以外は比較例４と同様の操作を行った。塩化ナトリウムの濃度は該反応系に０．０１％（ｗ／ｖ）である。
【００３１】
比較例３
比較例４の（２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡを０．２５％（ｗ／ｖ）、ｐＧＥＭＡを１％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に塩化ナトリウムをその濃度が１５００ｍＭになるよう溶解し、得られた検体希釈液を使用して（５）測定を行った以外は比較例４と同様の操作を行った。塩化ナトリウムの濃度は該反応系に７．３％（ｗ／ｖ）である。
【００３２】
結果
実施例２〜３および比較例１〜４で得られた、検体の吸光度変化量を表１にまとめた。いずれもｎ＝２の平均値を示す。
【００３３】
【表１】
0003644704.tif 000002
【００３４】
上記のように、塩化ナトリウムを所要量添加した系（実施例２〜３）では、その濃度が増加するに連れて感度が若干低下したが、梅毒陰性検体Ｎｏ．１〜３について全て非特異反応を抑制することができた。一方、塩化ナトリウムを添加しない系（比較例１）、および塩化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）添加した系（比較例２）では、梅毒陰性検体Ｎｏ．  １〜３の非特異反応を抑制することができなかった。また、塩化ナトリウムを７．３％（ｗ／ｖ）添加した系（比較例３）では、梅毒陰性検体Ｎｏ．１〜３の非特異反応は抑制できたが、梅毒陽性抗体での反応性も大きく低下し、必要な測定範囲が得られなかった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の以上の通り構成されているので、非特異反応が少なく、かつ検出感度が高い抗梅毒トレポネーマ抗体を検出する免疫測定法を提供することができる。