(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列
ATGAAAAAAGCAGTCATTAACGGGGAACAAATCAGAAGTATCAGCGACCT
CCACCAGACATTGAAAAAGGAGCTTGCCCTTCCGGAATACTACGGTGAAA
ACCTGGACGCTTTATGGGATTGTCTGACCGGATGGGTGGAGTACCCGCT
CGTTTTGGAATGGAGGCAGTTTGAACAAAGCAAGCAGCTGACTGAAAATG
GCGCCGAGAGTGTGCTTCAGGTTTTCCGTGAAGCGAAAGCGGAAGGCTG
CGACATCACCATCATACTTTCT
を含む回復ＤＮＡ、又はバチルス  アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）のバルナーゼを中和することができる回復タンパク質又はポリペプチドをコードするその変異体、及び
ｂ）植物の雄ずい細胞における発現を誘導する第１のプロモーター
を含む組換えＤＮＡ。
【請求項２】
さらに、
ｃ）標識ＲＮＡ、標識となるタンパク質又はポリペプチドをコードする標識ＤＮＡ；及び
ｄ）植物の細胞において当該標識ＤＮＡの発現を誘導することができる第２のプロモーター
を含む、請求項１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３】
当該回復ＤＮＡが、図２のＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII断片である、請求項１又は２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】
該回復タンパク質又はポリペプチドを該植物細胞の葉緑体又はミトコンドリア中に輸送することができるトランジットペプチドをコードする第１のＤＮＡをも含み、ここで、該第１のＤＮＡが該回復ＤＮＡ及び該第１のプロモーターと同じ転写単位内にあり、かつ、該回復ＤＮＡと第１のプロモーターの間にある、請求項１又は２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項５】
該第１のプロモーターが、葯、花粉及び花糸細胞からなる群より選択される１以上の型の雄ずい細胞における発現を誘導する、請求項１又は２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項６】
該第１のプロモーターが、タペータム細胞のような葯細胞における発現を誘導する、請求項５記載の組換えＤＮＡ。
【請求項７】
該第１のプロモーターが、タバコからのＴＡ２９遺伝子のプロモーターである、請求項６記載の組換えＤＮＡ。
【請求項８】
該第１のプロモーターが、プラスミドｐＭＢ３、ＤＳＭ４４７０のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片に含まれているＴＡ２９プロモーターである、請求項７記載の組換えＤＮＡ。
【請求項９】
該標識ＤＮＡが、除草剤の作用を阻害又は中和するタンパク質をコードする、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１０】
該標識ＤＮＡが、除草剤抵抗性遺伝子、特にホスフィノスリシンのようなグルタミンシンターゼ阻害剤に対する抵抗性を与える遺伝子である、請求項９記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１１】
該標識ＤＮＡが、ｓｆｒ又はｓｆｒｖ遺伝子である、請求項１０記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１２】
該標識ＤＮＡが、グリホサートについての標的としての改変された５−エノールピルビルシキメート−３リン酸塩シンターゼ又はホスフィノスリシンのようなグルタミンシンターゼ阻害剤についての標的としての改変されたグルタミンシンターゼのような、除草剤に対してより低い親和性を有する、除草剤についての改変された標的酵素をコードする、請求項１１記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１３】
該標識ＤＮＡが、遺伝子Ａ１又はＧＵＳ遺伝子のような、少なくとも該特定の組織又は特定の細胞に色を与えるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子；Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子のような、該植物にストレス抵抗性を与えるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子；又は昆虫抵抗性を与えるバチルス  チュリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）エンドトキシンをコードする遺伝子のような病害若しくは病害虫抵抗性を与えるタンパク質若しくはポリペプチドをコードする遺伝子又は細菌抵抗性を与える殺菌ペプチドをコードする遺伝子である、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１４】
該第２のプロモーターが、３５Ｓプロモーター、３５Ｓ′３プロモーター、ＰＮＯＳプロモーター又はＰＯＣＳプロモーターのような構成プロモーター；ＴＲ１′若しくはＴＲ２′プロモーターのような傷害誘導可能なプロモーター；ＳＳＵプロモーターのような、光合成活性を有する植物組織において選択的に遺伝子発現を誘導するプロモーター；又は葉細胞、花弁細胞若しくは種皮細胞のような種子細胞において選択的に遺伝子発現を誘導するプロモーターである、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１５】
該第２のプロモーターが、３５Ｓプロモーター又はＳＳＵプロモーターである、請求項１４記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１６】
少なくとも該特定の組織又は特定の細胞の葉緑体又はミトコンドリア中に該標識タンパク質を輸送することができるトランジットペプチドをコードする第２のＤＮＡをさらに含む、請求項２記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の組換えＤＮＡを含む細胞である、双子葉植物の雄ずい細胞。
【請求項１８】
トランスジェニック双子葉植物、又はその種子若しくは栄養繁殖材料を産生する方法であって、以下の工程：
ａ）植物の出発細胞を請求項１〜１６のいずれか１項記載の組換えＤＮＡで形質転換して、その核ＤＮＡに安定に組み込まれた該組換えＤＮＡを含む双子葉植物の形質転換細胞を産生すること；
ｂ）該トランスジェニック植物を該形質転換細胞から再生すること、
を含む方法。
【請求項１９】
該トランスジェニック植物を繁殖させて、該組換えＤＮＡを含む該種子又は該栄養繁殖材料を得ることをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子導入核雄性不稔又は雌性不稔植物の稔性を回復させる方法であって、被回復植物の核ゲノム内に安定した形で組込まれた回復植物の核ゲノムからの外来性ＤＮＡ配列を有する遺伝子導入被稔性回復植物を提供するため、不稔性植物を遺伝子導入稔性回復植物と交配することによる方法に関する。本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列は、外来性ＤＮＡ（以下「稔性回復ＤＮＡ」と呼ぶ）を含んでおり、この稔性回復ＤＮＡは、１）被回復植物の花、特にその雄性又は雌性繁殖器官、又は種子又は胚の細胞中で産生又は過剰産生された場合、花、種子又は胚細胞内の第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの活性を妨げる第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし、上記第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、花、種子又は胚細胞中で産生又は過剰産生された場合、この花、種子又は胚細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利な形で著しく妨げるものであり、２）第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが産生又は過剰産生されている被回復植物の少なくとも同じ花又は種子又は胚細胞内で稔性回復ＤＮＡの発現を誘導することのできる第１のプロモーターと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にある。第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、不稔性植物の核ゲノムに由来し、被回復植物の核ゲノム内に安定した形で組込まれている「不稔性ＤＮＡ」にコードされており、この不稔性ＤＮＡは、ｉ）被回復植物の各々の花、特に少なくとも１つのその雄性又は雌性繁殖器、又は各々の種子又は各々の胚の特定の細胞の中で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を誘導することができ、ii）特定の花、種子又は胚細胞内での稔性回復ＤＮＡの発現が無い場合に被回復植物を雄性又は雌性不稔にすることができる、「不稔性プロモーター」の制御下にある。
【０００２】
回復植物から被回復植物に移入された本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列は、場合によっては、第２の外来性ＤＮＡ（「第１の標識ＤＮＡ」）をも含みうる外来性キメラＤＮＡ配列であり、上記第２の外来性ＤＮＡは、１）植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞内に存在するとき、その植物全体を、少なくともその特定の組織又は細胞内に第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを含まないその他の植物から容易に分離又は識別できるものにするような第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし、２）植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞内で第１の標識ＤＮＡの発現を誘導することのできる第２のプロモーターと同じ転写単位内にあって、このプロモーターの制御下にあり、しかも、３）稔性回復ＤＮＡと同じ被回復植物核ゲノム遺伝子座内にある。
【０００３】
本発明は同様に、少なくとも１つの第１のプロモーターの制御下にある少なくとも１つの稔性回復ＤＮＡを含み、同様に稔性回復ＤＮＡ及び第１のプロモーターに隣接して少なくとも１つの第２のプロモーターの制御下にある少なくとも１つの第１の標識ＤＮＡをも含みうるような外来性キメラＤＮＡ配列にも関する。
【０００４】
本発明はさらに、本発明の外来性ＤＮＡ配列を含み、植物細胞の形質転換に適したベクターであって、かくして外来性ＤＮＡ配列は細胞の核ゲノム内に安定した形で組込まれることになるようなベクター；結果として得られる稔性回復植物細胞；かかる稔性回復植物細胞の培養；このような稔性回復植物細胞から再生でき、しかも、中に安定した形で組込まれた状態で外来性ＤＮＡ配列を含む核ゲノムを有する、稔性回復植物及びその生殖材料（例えば種子）；その核ゲノム内に安定した形で組込まれた状態で、外来性ＤＮＡ配列ならびに少なくとも１つの不稔性プロモーターの制御下にある少なくとも１つの不稔性ＤＮＡを含んでいる、被稔性回復植物及びその生殖材料；及び、被稔性回復植物の細胞ならびにその培養にも関する。
【０００５】
本発明はさらに、植物の細胞を外来性ＤＮＡ配列で形質転換することにより回復植物及びその生殖材料を生産する方法において、稔性回復ＤＮＡは、１）第１のプロモーターの制御下にあり、しかも、場合によっては、第２のプロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあり、２）植物の細胞の核ゲノム内に安定した形で組込まれることを特徴とする方法にも関する。
【０００６】
本発明はさらに、１）好ましくは回復植物に除草剤抵抗性を付与するタンパク質をコードする第１の標識ＤＮＡをも、核ゲノム内に安定した形で組込まれた状態で含んでいる回復植物を、２）核ゲノム内に安定した形で組込まれた状態で、ａ）不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡと、この不稔性ＤＮＡに隣接して好ましくは核ゲノムの同じ遺伝子座内にある、ｂ）第４のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし、第２の標識ＤＮＡの発現によってこの植物がかかる発現の無い植物と容易に分離又は識別されうる状態になるような少なくとも特定の組織又は細胞内での第２の標識ＤＮＡの発現を誘導できる第３のプロモーターの制御下にあり、好ましくは不稔性植物に除草剤抵抗性を付与する、第２の標識ＤＮＡとを有する核雄性又は雌性不稔植物と、交配することによって生産された雑種種子にも関する。本発明は特に、過度の手作業を必要とせず、高い他家受粉効率で、好ましくはほぼ無作為の個体群の中で商業的規模で生産されるような雑種種子に関する。
【０００７】
【従来の技術】
植物の雑種形成は、親株の望ましい形質の組合せをもつ子孫を生産するための重要なプロセスとして認められている。結果として得られた雑種の子孫は、往々にして、収量、環境変化に対する適応能力及び疾病抵抗性といったさまざまな形質において、親株をしのぐ能力をもつ。この能力は「ヘテロ−シス（雑種強勢）」又は「ハイブリッド・ヴィガー（雑種強勢）」と呼ばれる。その結果、雑種形成は、トウモロコシ、テンサイ及びヒマワリのような主要作物を改良するために広く用いられてきた。主としてほとんどの植物が自家受粉及び他家受粉の両方を受けることができるという事実に関連するさまざまな理由から、雑種種子の収穫物を生産するためのさほど自家受粉を伴わない制御された植物の他家受粉は、商業的規模では達成し難いことであった。
【０００８】
自然界においては、作物植物の大部分は、同じ植物上、通常は同じ花の中で互いに近いところに、雄性及び雌性の繁殖器を生成する。これは自家受粉に有利に働く。しかしながら、いくつかの植物は、他家受粉に有利に作用するその繁殖器の特別な形態の結果、その例外となっている。これらの植物は、改良された生長力及び適応能力をもつ雑種の子孫を生成する。Cannabis ssp.(大麻）におけるこのような形態の１つでは、別々の植物に雄器と雌器がある。Zea mays（トウモロコシ）におけるもう１つのこのような形態には、同一植物の異なる部分に雄器及び雌器がある。Elaeis guineensis(ギネアアブラヤシ）におけるもう１つのこのような形態には、植物の発生中の異なる時期に稔性となる雄性及び雌性の繁殖器がある。
【０００９】
Ananas comosus（パイナップル）といったその他のいくつかの植物種は、その繁殖器の特殊な生理を通して他家受粉に有利に作用している。このような植物は、１つの植物の花粉が同じ植物の又は同じ遺伝子型をもつ他の植物の雌性繁殖器と受精できないようにするいわゆる「自家不和合性システム」を発達させている。
【００１０】
その他のいくつかの種は、いわゆる「雄性不稔」のゲノム特性を自然に示すことにより、他家受粉に有利に作用する。この特性により、植物の葯は、葯が生成した花粉が成熟してしまわないうちに退化する。〔「高等植物における雄性不稔」、M.L.H. Kaul, 1987 年（Monographs on Theoretical and Applied Genetics 10, Springer, Verlag 出版）を参照のこと。〕このような天然の雄性不稔特性は、劣性欠失が関与することが多い広範な天然の突然変異の結果として生じるものと考えられており、天然の条件下では種子が生成されないことから、優勢に自家受粉する植物種においてはこの特性を維持することは容易ではない。
【００１１】
天然に発生するいくつかのタイプの雄性不稔は細胞質でコードされるが、その他のものは核でコードされる。雄性不稔の１つのタイプは、核にコードされた雄性不稔と細胞質にコードされた雄性不稔の両方の組合せの結果である。雄性不稔を誘発する核対立遺伝子は通常劣性であり、雄性不稔性細胞質対立遺伝子を含み、雄性不稔誘発核対立遺伝子に関して同型接合である植物だけが、表現型上雄性不稔である。このタイプの植物においては、対応する優性の雄性稔性誘発対立遺伝子又は「稔性回復遺伝子」は、雄性稔性の表現型を生成する。その結果、このタイプの植物の雄性不稔性の子孫は、雄性不稔植物を稔性回復遺伝子を含む花粉で受粉させることによって雄性稔性にすることができる。その結果、このタイプの植物の子孫は、経済的産物が種子であるような商業的価値のあるものである（例えばトウモロコシ、モロコシ類及びヒマワリなど）。
【００１２】
天然に発生する既知の雄性不稔性遺伝子及び対応するその稔性回復遺伝子の大部分は、ａ）雄性不稔及び回復特性の原因である遺伝子の質が不充分である、及びｂ）これらを発生させる作物の他家受粉能力が低い、という２つの基本的な理由のため、新しい品種の育種又は生産において、これまで使用されなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
１．遺伝子の品質
雄性不稔／稔性回復システムの潜在力を充分に実現するためには、次のようないくつかの品質必要条件を達成しなくてはならない：
ａ）広範な異なる環境条件下での雄性不稔性をコードする遺伝子の安定性。現在知られているシステムの大部分は、それが核でコードされるか細胞質でコードされるかに係わらず、充分な安定性を示さない。その結果、予想できない或る種の気象条件下では、植物内で自家受粉が起こり、異種起源の子孫が収穫される。種子証明規定要件によると、ほとんどの主要農作物について１％未満の非雑種種子が許容される。
ｂ）植物に対する副作用が無いこと。数多くの細胞質雄性不稔性遺伝子は、草勢の減少を誘発する。これは、雑種強勢効果がマイナス効果に比較して作物の著しい改良を提供する場合、或る程度までは許容できる。雄性不稔性遺伝子を有する作物中に見られたもう１つの副作用は、或る種の植物病原体に対する感受性の増大にある（例えば、Ｔ−細胞質雄性不稔を有するトウモロコシ植物はきわめてHelminthosporium maydis に感染しやすい）。
回復遺伝子も又、通常これらの遺伝子自体のせいではなく回復遺伝子に密に関連した遺伝子のせいであるものの、往々にしてマイナスの副作用を示す。これらの副作用は、ほとんどの場合において、疾病又は有害生物に対する感受性の増大又は作物品質の低下をおこす。
【００１４】
２．他家受粉の効率
受容できるコストでの雑種種子の生産のためには、妥当な効率の他家受粉が不可欠である。他家受粉に対する適合性の低い主要農作物については、手で他家受粉を行なうことは現実的なことではない。従って、商品として、Ｆ1 雑種ではなくそれを自殖させたＦ2 子孫を販売することが考慮されてきた（例えば、綿及び小麦）。しかしながら、この方法の欠点は、均一性及び雑種強勢（ヘテロ−シス）の喪失及び特異的に有用な遺伝子組合せの分離にある。農民による作物の高い収量を確保するためには、雑種作物が充分に稔性であることが有利である（ただし、トウモロコシやナタネといったきわめて効率の良い他家受粉種は例外である）。これは特に、風により容易に輸送されない重い又は粘着性ある花粉を形成する作物（例えば綿）、花粉媒介昆虫に対して魅力の無い作物（例えば小麦）及び閉花受精を示す作物（例えば大豆）の場合に言えることである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明に従うと、核ゲノムの中に安定した形で組込まれた状態で、外来性ＤＮＡ配列、好ましくは外来性キメラＤＮＡ配列を含んでいるような遺伝子導入被稔性回復植物が提供される。上記外来性ＤＮＡ配列又は外来性キメラ配列は、
（ａ）植物の花、特にその雄器又は雌器、種子又は胚の細胞内で産生又は過剰産生された場合、花、種子又は胚細胞内で第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの活性を妨げる第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードする稔性回復ＤＮＡ；この第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、花、種子又は胚細胞中で産生又は過剰産生された場合に、花、種子又は胚細胞の代謝、機能及び／又は発生を著しく妨害しうるものであり；第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、同様に植物の核ゲノム内に安定した形で組込まれ、しかも植物の花、特にその雄器又は雌器、及び／又は種子及び／又は胚の各々の特定の細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を誘導すること、ひいては特定の花、種子及び／又は胚の細胞内で稔性回復ＤＮＡの発現が無い場合に、その植物を雄性不稔又は雌性不稔にすることのできる不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡによって、コードされる；及び
（ｂ）不稔性プロモーターが不稔性ＤＮＡの遺伝子発現を誘導する植物の、少なくとも特定の花、種子及び／又は胚細胞内で、稔性回復ＤＮＡの発現を誘導することのできる第１のプロモーター；なお稔性回復ＤＮＡは、この第１のプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロモーターの制御下にある、
ことを特徴とする。
【００１６】
被回復植物の核ゲノム内の外来性ＤＮＡ配列は、同様に、好ましくは稔性回復ＤＮＡと同じ遺伝子座内に、
（ｃ）植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞内に存在するとき、この植物を、少なくとも特定の組織又は特定の細胞内に第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを含まないその他の植物から容易に分離又は識別できるものにするような第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードする第１の標識遺伝子；及び
（ｄ）少なくとも特定の組織又は特定の細胞内で第１の標識ＤＮＡの発現を誘導することのできる第２のプロモーター（なお第１の標識ＤＮＡは第２のプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロモーターの制御下にある）
をも含んでいてもよい。
【００１７】
同様に本発明に従うと、稔性回復ＤＮＡ及び第１のプロモーターを含み、しかも第１の標識ＤＮＡ及び第２のプロモーターならびに、その細胞質内で外来性キメラＤＮＡ配列が発現されている植物細胞の葉緑体又はミトコンドリア内へと第１のタンパク質又はポリペプチド又は第３のタンパク質又はポリペプチドを輸送することのできるトランジットペプチドをコードする少なくとも１つの付加的なＤＮＡをも含みうる、外来性キメラＤＮＡ配列が提供される。
【００１８】
さらに本発明に従うと、安定した形で組込まれた状態で、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡ及び好ましくは第３のプロモーターの制御下にある第２の標識ＤＮＡを含む核ゲノムを有する、遺伝子導入雄性不稔又は雌性不稔植物を、第１のプロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡ及び好ましくは第２のプロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡが安定した形で組込まれている核ゲノムをもつ遺伝子導入稔性回復植物と交配することによって、遺伝子導入稔性回復植物を提供するための方法が提供される。
【００１９】
さらに本発明に従うと、外来性ＤＮＡ配列で形質転換され、稔性回復植物を再生するのに使用できる、遺伝子導入稔性回復植物の細胞ならびにそれで構成された培養細胞；遺伝子導入被稔性回復植物の細胞ならびにそれで構成された培養細胞；及び遺伝子導入稔性回復植物を、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡを有する遺伝子導入雄性又は雌性不稔植物と交配することによって、遺伝子導入被稔性回復植物へと生長する雑種種子を得るための方法も提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明に従うと、細胞の核ゲノム内に本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列を安定した形で挿入するよう周知のやり方で植物細胞を形質転換することによって、稔性回復植物が、植物の単一の細胞から生産される。この外来性ＤＮＡ配列には、第１のプロモーターの制御下にあり、その５′末端でこの第１のプロモーターに融合され、その３′末端でポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終結（又は調節）シグナルに融合されている、少なくとも１つの稔性回復ＤＮＡが含まれる。かくして、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、少なくとも回復植物の花、好ましくはその単数又は複数の雄性又は単数又は複数の雌性繁殖器、及び／又は種子及び／又は胚の各々の細胞内で産生又は過剰産生され、そのため回復植物が核雄性不稔又は核雌性不稔植物と交配された場合、雑種雄性稔性雌性稔性の子孫が得られることになる。この外来性ＤＮＡ配列は、第２のプロモーターの制御下にあり、その５′末端でこの第２のプロモーターに融合され、その３′末端でポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終結シグナルに融合された、少なくとも１つの第１の標識ＤＮＡをも含んでいてもよい。この第１の標識ＤＮＡは、好ましくは稔性回復ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあり、かくして第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、少なくとも稔性回復植物の特定の組織又は特定の細胞内で産生され、この植物を特定の組織又は特定の細胞内に第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを含まない植物から容易に識別及び／又は分離できるようにしている。こうして、きわめて高い確実性で稔性回復ＤＮＡ及び第１の標識ＤＮＡの両方が植物の子孫にいっしょに分離することが保証される。
【００２１】
植物（特にAgrobacterium の感染を受けることのできる植物）の細胞は、好ましくは、外来性ＤＮＡ配列を含みAgrobacterium により運ばれる非病原化されたＴｉ−プラスミドであるベクターを用いて、本発明に従って形質転換される。この形質転換は、例えば欧州特許公報０，１１６，７１８号及び０，２７０，８２２号内に記されている手順を用いて行なうことができる。好ましいＴｉ−プラスミドベクターは、Ｔｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡのボーダー配列の間、又は少なくとも右側ボーダー配列の左側に位置づけされた形で、外来性ＤＮＡ配列を含む。当然のことながら、直接遺伝子移入（例えば欧州特許公報０，２２３，２４７号に記載のもの）、花粉媒介形質転換（例えば欧州特許公報０，２７０，３５６号、ＰＣＴ公報Ｗ０８５／０１８５６号及び欧州特許公報０，２７５，０６９号に記されているもの）、生体外原形質体（プロトプラスト）形質転換（例えば米国特許４，６８４，６１１号に記されているもの）、植物ＲＮＡウイルス媒介形質転換（例えば欧州特許公報０，０６７，５５３号及び米国特許４，４０７，９５６号に記載のもの）及びリボゾーム媒介形質転換（例えば米国特許４，５３６，４７５号に記載のもの）といった手順を用いて、その他のタイプのベクターを植物細胞の形質転換のために用いることもできる。
【００２２】
好ましくは、本発明に基づく稔性回復植物は、第１のプロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡ（及び場合によっては第２のプロモータの制御下にある第１の標識ＤＮＡ）を含む外来性ＤＮＡ配列を含む非病原化されたＴｉ−プラスミドベクターを用いて、植物細胞を形質転換することによって提供される。標識ＤＮＡは、Ｔｉ−プラスミドベクターにおいて稔性回復ＤＮＡの上流にあっても下流にあってもよいが、好ましくはこれら２つは互いに隣接し合い、Ｔｉ−プラスミドベクターのボーダー配列の間にあるか又は少なくとも右側ボーダー配列の左側に位置づけされ、植物細胞の核ゲノム内に一緒に適切に移入されるようになっている。しかし望まれる場合には、細胞を、最初、稔性回復ＤＮＡ及び第１のプロモーターを含む外来性ＤＮＡ配列で形質転換し、その後、稔性回復ＤＮＡと同じ細胞核ゲノム内遺伝子座内に挿入される形で標識ＤＮＡ及び第２のプロモーターを用いて形質転換してもよいし、或いは又この形質転換を逆に行なうこともできる。この目的に適当なベクターは、外来性ＤＮＡ配列での細胞の形質転換の場合について前述したものと同じである。好ましいベクターは非病原化されたＴｉ−プラスミドベクターである。
【００２３】
本発明に基づく稔性回復ＤＮＡの選定は重要なことではないが、回復されるべき雄性又は雌性不稔性の原因である不稔性ＤＮＡの選択によって左右され、このＤＮＡに対応していなくてはならない。特に、稔性回復ＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの産生又は過剰産生は、被回復植物の花細胞、好ましくは少なくとも１つの雄性又は少なくとも１つの雌性繁殖器の細胞、又は種子細胞又は胚細胞内で、不稔性ＤＮＡによりコードされる第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの特異的活性を中和、阻害、相殺、克服又はその他の形で妨害しなくてはならない。
【００２４】
本発明の稔性回復ＤＮＡに対応しなくてはならず、又これらが妨害すべき作用を有するような雄性及び雌性不稔ＤＮＡの例については、それぞれ本書中に参考として包含されている欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号及び９０４０２１９６．１号の中に記述されている。不稔性プロモーターにより不稔性ＤＮＡが発現されている花、特に雄器又は雌器、種子及び／又は胚のいずれかの細胞内における不稔性ＤＮＡの効果を克服するよう、周知の方法で適当な稔性回復ＤＮＡを選択及び分離することができる。
【００２５】
稔性回復ＤＮＡの好ましい例は、バルナーゼ（これはあらゆるグアニン残基の後の結合を加水分解することによりＲＮＡ分子を分解する）の活性を中和するバルスター；エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩの活性を妨げるＥｃｏＲＩメチラーゼ；又はパパインのようなタンパク質分解酵素（例：パパインチモーゲン及びパパイン活性タンパク質）の活性を中和するタンパク質分解酵素抑制因子、をコードする。
【００２６】
稔性回復ＤＮＡのもう１つの例は、不稔性プロモーターの制御下で、そうでなければ不稔性である植物の花、種子又は胚細胞内で転写される不稔性ＤＮＡをコードするＤＮＡの１つの鎖に対し相補的なＤＮＡの鎖をコードするアンチセンスＤＮＡ（例えば欧州特許公報０，２２３，３９９号に記載のもの）である。このようなアンチセンスＤＮＡは、不稔性ＤＮＡの発現の結果として花、種子及び／又は胚内に生成された「不稔性ＲＮＡ」のコード部分及び／又は非コード部分に結合することのできるＲＮＡ配列内に転写され得、かくしてこのように産生された不稔性ＲＮＡの翻訳を中和する。このようなアンチセンスＤＮＡの例としては、バルナーゼ；ＥｃｏＲＩ；サイトキニン生合成の第１段階にて触媒として作用しAgrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子４によりコードされる酵素であるイソペンテニルトランスフェラーゼ等の植物ホルモンの合成に対し触媒として作用する酵素；オーキシン合成に関与する、Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡの遺伝子１及び遺伝子２によりコードされる酵素、又は代替的に遺伝子１又は遺伝子２のいずれかによりコードされる酵素；グルカナーゼ；ホスホリパーゼＡ2 等のリパーゼ〔Verheij 他著（1981年）Rev. Biochem. Pharmacol, 91., 92-203〕；脂質ペルオキシダーゼ；植物細胞壁抑制因子；及び細菌毒素等の植物細胞にとって有害なタンパク質（例：ジフテリア毒素又はボツリヌス毒素のＡ−フラグメント）；等の第２のタンパク質をコードする不稔性ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡ、ならびに天然の自家不和合性遺伝子をコードする不稔性ＤＮＡのアンチセンスＤＮＡがある。
稔性回復ＤＮＡのその他の例は、Haseloff及びGerlach(1988年）Nature 334, 585-591 によって記述されているように、一定の与えられた標的配列に対するきわめて特異的な切断が可能な特異的ＲＮＡ酵素（すなわち、いわゆる「リボザイム」）をコードする。このようなリボザイムは、例えば、上に挙げた不稔性ＤＮＡの１つをその標的とするリボザイムである。
【００２７】
稔性回復ＤＮＡのさらなる例は、上述の異なる稔性回復ＤＮＡの単数又は複数の組合せでありうる。
【００２８】
本発明の外来性ＤＮＡ配列に関して用いている「外来性」という語は、この外来性ＤＮＡ配列が外来性稔性回復ＤＮＡ及び／又は外来性の第１のプロモーターを含んでいることを意味している。外来性ＤＮＡ配列内の、稔性回復ＤＮＡ及び第１のプロモーター等のＤＮＡ、ならびに第１の標識ＤＮＡ、第２のプロモーター及びその他のＤＮＡ、のようなＤＮＡに関して用いられる「外来性」という語は、このようなＤＮＡが、本発明に従ってこのＤＮＡで形質転換された植物細胞の中で、その起源である植物、細菌、動物、真菌、ウイルスその他の細胞の中で自然に見い出されるのと同じゲノム環境の中にないということを意味している。すなわち、例えば、外来性稔性回復ＤＮＡ又は第１の標識ＤＮＡは、１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対し内在性であり（すなわち形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ原植物からのものである）；しかも３）形質転換された植物細胞内の本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列内で（原植物からの）３′末端転写調節シグナル及びそれ自体の内在性プロモーターと同じ転写単位内にあるものの、４）形質転換された植物内では原植物内で天然にそれをとり囲んでいた遺伝子によってとり囲まれることがないよう、原植物内における場合とは異なる場所に、形質転換された植物の核ゲノム内に挿入されていることが考えられる。外来性稔性回復ＤＮＡ又は第１の標識ＤＮＡは同様に、例えば１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対し内在性であるものの、３）形質転換された植物細胞内の本発明の外来性キメラＤＮＡ配列内で、異なる（すなわちそれ自身のものでない）内在性プロモーター及び／又は３′末端転写調節シグナルと同じ転写単位内にあることが考えられる。外来性稔性回復ＤＮＡ又は第１の標識ＤＮＡは同様に、例えば１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対し内在性であるものの、３）形質転換された植物細胞内で本発明の外来性キメラＤＮＡ配列内の非相同プロモーター及び／又は３′末端転写調節シグナルと同じ転写単位内にあることが考えられる。外来性稔性回復又は第１の標識ＤＮＡは、例えば、形質転換された植物細胞に対して非相同で、しかも、形質転換された植物細胞内の本発明の外来性キメラＤＮＡ配列内で、内在性プロモーター及び／又は３′転写調節シグナル（例えば、形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノムからのもの）と同じ転写単位内にあることも考えられる。外来性稔性回復ＤＮＡの一例は、形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノムからのもので、形質転換される植物に対し内在性であるタンパク質分解酵素又はリボヌクレアーゼ抑制因子等の触媒酵素の抑制因子をコードすることができ、そのためこの酵素は、それが中で発現される花細胞、特に雄器及び雌器細胞、又は種子細胞又は胚細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利な形で著しく妨害するようなタンパク質分解酵素又はリボヌクレアーゼ（すなわち雄性又は雌性不稔性ＤＮＡによりコードされる第２のタンパク質）の活性を中和するべく、形質転換された細胞内で過剰産生されることになる。
【００２９】
好ましくは、各々の稔性回復ＤＮＡ及び第１の標識ＤＮＡは、形質転換される植物細胞に対し非相同である。
【００３０】
本発明の外来性ＤＮＡ配列内の稔性回復ＤＮＡ、第１又は第３のプロモーター、第１の標識ＤＮＡ及びその他のＤＮＡ等の、ＤＮＡに関して用いられている「非相同の(heterologous)」という語は、このようなＤＮＡが、形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物の細胞の核ゲノム内に、天然に見い出されないということを意味している。非相同ＤＮＡの例としては、形質転換される植物と同じ遺伝子型を有する植物から得られた葉緑体及びミトコンドリアＤＮＡがあるが、好ましい例は、形質転換される植物とは異なる遺伝子型をもつ植物からの葉緑体、ミトコンドリア及び核のＤＮＡ、及び、動物及び細菌性ゲノムからのＤＮＡ及び真菌及びウイルス性ゲノムからの染色体及びプラスミドＤＮＡである。
【００３１】
本発明の外来性ＤＮＡ配列に関して用いる「キメラ（の）」という語は、その稔性回復ＤＮＡのうち少なくとも１つが、１）自然界で、１つの稔性回復ＤＮＡに対するその第１のプロモーターの制御下になく；及び／又は２）自然界で、その第１の標識ＤＮＡの少なくとも１つと同じ遺伝子座内に見い出されない、ということを意味している。本発明の外来性キメラＤＮＡ配列の例には、植物起源の第１のプロモーターの制御下にある細菌起源の稔性回復ＤＮＡ；及び植物起源の第１のプロモーターの制御下にあり、しかも細菌起源の第１の標識ＤＮＡと同じ遺伝子座内にある、植物起源の稔性回復ＤＮＡが含まれる。
【００３２】
「花」というのは、その発生が全体的又は部分的に遅らされたか又は止められた場合、花の中の生存種子の発生及び／又は増殖又はその雄性繁殖器の発生及び／又は増殖が妨げられるような、苗条軸、がく片、花片、雄性繁殖器（又は雄ずい）及び／又は雌性繁殖器（又は心皮）全体を含むものとする。「雄器」又は「雄性繁殖器」というのは、花の中で雄性配偶子の生産に関与している器官全体、ならびにその葯、花粉及び花糸等の単数又は複数のその個々の部分のことである；「雌器」又は「雌性繁殖器」というのは、花のうち雌性繁殖器及び／又は生存種子及び／又は生存胚の生産に関与する器官全体、ならびに胚珠、子房、花柱、柱頭、花冠、花盤、隔膜、がく及び胎座等の単数又は複数の個々の部分を意味する。「胚」というのは、植物の胚全体、ならびにその胚軸及び子葉等の単数又は複数の個々の部分を含む。
【００３３】
稔性回復ＤＮＡが、被稔性回復植物のうち、少なくとも、不稔性ＤＮＡが中で発現されているような特定の細胞内で発現されるためには、稔性回復ＤＮＡの発現を制御する第１のプロモーターが、少なくとも、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡが中で選択的に発現されているような同じ被稔性回復植物細胞（すなわち特定の花細胞、好ましくは雄器又は雌器細胞、又は種子細胞又は胚細胞）内で、遺伝子発現を誘導することのできるプロモーターであることが好ましい。このような第１のプロモーターは、内在性プロモーターであっても外因性プロモーターであってもよく、植物細胞のミトコンドリア又は葉緑体ゲノムから又は核ゲノムからのものでありうる。いずれの場合でも、第１のプロモーターは、形質転換されている植物細胞の核ゲノムに対し外来性である。第１のプロモーターは構成的プロモーターであってよいが、同様に、不稔性プロモーターと同じ選択的プロモーターであってもよい。好ましくは、第１のプロモーターは、不稔性ＤＮＡが発現されているものと同じ特定の花、種子又は胚細胞、特に同じ特定の花細胞の中での、充分な量の稔性回復用の第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの産生を通して、稔性の回復をひき起こす。
【００３４】
本発明に基づく第１のプロモーターは、例えば、植物の雄ずい（例えば葯）細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を誘導し、この植物のその他の部分における不稔性ＤＮＡの発現を妨げるのに有効な雄性不稔性プロモーターを開示する、本書に参照により包含される欧州特許出願明細書８９，４０１１９４．９号；ならびに、植物の花の細胞、特に雌器（例えば雌ずい）、又は種子細胞又は胚細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を誘導し、この植物のその他の部分における不稔性ＤＮＡの発現を妨げるのに有効な雌性不稔プロモーターを開示している、本書に参照により包含される欧州特許出願明細書９０４０２１９６．１号の中に記されているように、１つの植物種から既知の方法で選択及び単離されうる。例えば、適当な内在性の器官又は組織特異的な第１のプロモーターは、１つの植物内で、以下の作業により識別及び単離されうる：
【００３５】
１．花、種子又は胚、好ましくは葯、花粉、花糸、子房、胚珠、花柱、柱頭、胎座、がく、胚盤、隔膜、種皮、胚乳又は子葉の発生の間にのみ植物の中に存在するｍＲＮＡを探すこと；
２．この特異的ｍＲＮＡを単離すること；
３．この特異的ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製すること；
４．このｃＤＮＡをプローブとして用いて、特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域を識別すること、そして次に
５．特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡから上流にあり（すなわち５′側）、このＤＮＡのプロモーターを含む植物ゲノムの一部分を識別すること。
【００３６】
これらの第１のプロモーターにより制御される遺伝子はさらに、上述の工程４と同様にしてプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーション条件において、これらのプローブは、もう１つの植物種のゲノムからのＤＮＡ配列の混合物中の特定のｍＲＮＡをコードするＤＮＡとハイブリダイズする〔Maniatis他著（1982年）, 「Molecular Cloning. A Laboratory Manual 」Cold Spring Harbor Laboratory 刊行〕。その後、上記工程５にあるように、もう１つの植物種についての特異的な第１のプロモーターを識別することができる。
【００３７】
雄器特異的な第１のプロモーター及び不稔性プロモーターの例としては、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号に記されているような、タバコから分離されたタペタム特異プロモーターであるＰＴＡ２９プロモーター、ＰＴＡ２６プロモーター及びＰＴＡ１３プロモーター；ならびに、ＰＴＡ２９、ＰＴＡ２６及びＰＴＡ１３プロモーターが単離された遺伝子である欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号の遺伝子ＴＡ２９、ＴＡ２６又はＴＡ１３にハイブリダイズ可能なタペタム特異的ｍＲＮＡをコードする遺伝子のあらゆるプロモーターがある。雌器特異的な第１のプロモーター及び不稔性プロモーターの例としては、欧州特許出願明細書９０４０２１９６．１号内に記載のｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に対応する胚珠特異的プロモーター及びＰＳＴＭＧ０７、ＰＳＴＭＧ０８、ＰＳＴＭＧ４Ｂ１２及びＰＳＴＭＧ３Ｃ９等の花柱及び／又は柱頭特異的プロモーター；ならびに、それぞれｉ）ＳＴＭＧタイプの花柱−柱頭特異的遺伝子又はii）欧州特許出願明細書９０４０２１９６．１号のｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８、に対しハイブリダイズ可能な、ｉ）花柱−柱頭特異的又はii）胚珠特異的ｍＲＮＡをコードする遺伝子のプロモーターがある。
【００３８】
本発明の遺伝子導入稔性回復植物と交配されるべき遺伝子導入不稔植物の中に複数の核不稔性ＤＮＡが存在する場合には、回復植物は、少なくとも不稔性植物の核ゲノム内の不稔性ＤＮＡの数に等しい数の本発明に基づく複数の稔性回復ＤＮＡがその核ゲノム内に挿入されている必要があるかもしれない。全ての稔性回復ＤＮＡが単一の第１のプロモーターの制御下にあってもよいが、好ましくは、各々の稔性回復ＤＮＡは、少なくとも、不稔性プロモーターが不稔性ＤＮＡに第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを発現させるような細胞内において、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの発現を誘導するような独自の個別の第１のプロモーターの制御下にある。各々の稔性回復ＤＮＡはその第１のプロモーターに隣接しており、全ての稔性回復ＤＮＡ及びその第１のプロモーターは、好ましくは、本発明の外来性ＤＮＡ配列内で、及びこのような外来性ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあらゆるベクターの中で、互いに隣接している。しかしながら、稔性回復ＤＮＡが外来性ＤＮＡ配列内で互いに隣接する必要はなく、いくつかの場合において、これらは独立した形質転換事象を通して回復植物の核ゲノム内に挿入されてもよい。
【００３９】
本発明の第１の標識ＤＮＡの選択も同様に重要ではない。第１の標識ＤＮＡを発現する植物がこれを発現しない植物から容易に識別され、分離されうるようにする、第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードするように、周知の方法で適当な第１の標識ＤＮＡを選択し、単離することができる。多くの場合において、第１の標識ＤＮＡは、本発明に従って稔性が回復されるべき核雄性又は雌性不稔植物内で第２の標識ＤＮＡがコードするのと同じＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードする。第１の標識ＤＮＡの例としては、ジヒドロケルセチン−４−還元酵素をコードするＡ１遺伝子〔Meyer 他（1987年）Nature 330, 677-678 〕及びグルクロニダーゼ遺伝子〔Jefferson 他（1988年）、Proc, Natl, Acad, Sci. U.S.A (「PNAS]) 83, 8447〕のように植物細胞に対し識別可能な色を与えるもの；矮形性成長又は葉の異なる形状等の特定の形態学的特性を提供するもの；欧州特許出願明細書８８４０２２２２．９号に記されているようにスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子により提供されるように、植物にストレス許容性を付与するもの；欧州特許出願明細書８６３００２９１．１号に記されているように虫害抵抗性を付与するBacillus thuringiensis内毒素をコードする遺伝子により提供されるもののように、疾病又は有害生物に対する抵抗性を植物に付与するもの；或いは、欧州特許出願明細書８８４０１６７３．４号に記されている細菌ペプチドにより提供されるような、細菌抵抗性を植物に付与するもの等の、いずれかのタンパク質又はポリペプチドをコードする、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号及び９０４０２１９６．１号に記されている核雄性及び雌性不稔植物の核ゲノム内の標識ＤＮＡがある。
【００４０】
好ましい第１の標識ＤＮＡは、欧州特許出願明細書８７４００５４４．０号内に記載されているようなBialaphos 及びホスフィノトリシン等のグルタミンシンセターゼ抑制因子に対する抵抗性を付与する酵素をコードするｓｆｒ遺伝子及びｓｆｒｖ遺伝子；ならびに、欧州特許公報０，２４０，７９２号に記されているホスフィノトリシンの標的としての改変グルタミンシンセターゼ及びヨーロッパ特許公報０，２１８，５７１号に記されているグリホセートの標的としての改変５−エノールピルビルシキメート−３リン酸塩シンターゼ等の、天然に産生される内在性酵素に比べ除草剤に対する親和力が低い、いくつかの除草剤の改変標的酵素をコードする遺伝子等の、除草剤の活性を抑制又は中和する第３のタンパク質又はポリペプチドをコードする。その他の第１の標識ＤＮＡは、除草剤ブロモキシニル〔Stalker 他著（1988年）；「Genetic Improvements of Agriculturally important Crops」、刊行：R.T. Fraley, N.M. Frey及びJ. Schell, Cold Spring Harbor Laboratories〕又は除草剤スルホニル尿素〔Lee 他著（1988年）EMBOJ. 7, 1241-1248 〕又は除草剤２，４−Ｄ（エルサレムにて１９８８年１１月１３−１８日に開催された第２回国際植物分子生物学シンポジウムにて公表）の作用を中和する第３のタンパク質をコードする。
【００４１】
第１の標識ＤＮＡを制御する本発明の第２のプロモーターは、同様に、第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの性質に応じて望まれるように、植物全体の中に構成的に、又は単数又は複数の特定の組織又は細胞内で選択的に、第１の標識ＤＮＡが発現されるように、周知のやり方で選択及び単離されうる。多くの場合において、第２のプロモーターは、本発明に従って稔性が回復されるべき雄性又は雌性不稔植物内で第２の標識ＤＮＡを制御する第３のプロモーターと同じである。例えば、第１の標識ＤＮＡが除草剤抵抗性をコードする場合、３５Ｓプロモーター〔Odell 他（1985年）Nature 313, 810-812 〕、３５Ｓ′３プロモーター〔Hull及びHowell（1987年）「Virology」 86, 482-493〕、Ｔｉ−プラスミドのノパリンシンセターゼ遺伝子のプロモーター（「ＰＮＯＳ」）〔Herrera-Estrella (1983年) 、Nature 303, 209-213 〕又はオクトピンシンターゼ遺伝子のプロモーター（「ＰＯＣＳ」）〔De Greve他、（1982年）、J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 〕等の強い構成的な第２のプロモーターを用いて、第１の標識ＤＮＡを植物の全ての細胞内で発現させることが有益でありうる。第１の標識ＤＮＡが、疾病抵抗性を付与するタンパク質をコードする場合には、例えばＴｉ−プラスミドのＴＲ１′又はＴＲ２′プロモーター等のＴＲプロモーターである〔Velten他（1984年）EMBO J. 3, 2723-2730〕第２のプロモーターを用いることにより、傷害組織内で第１の標識ＤＮＡを選択的に発現させると有利かもしれない。第１の標識ＤＮＡが除草剤抵抗性をコードする場合には、例えば、Rubisco の小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（欧州特許出願明細書８７４００５４４．０号）等を第２のプロモーターとして用いて、緑色組織内で第１の標識ＤＮＡを選択的に発現させることが有利であるかもしれない。第１の標識ＤＮＡが色素をコードする場合には、第１の標識ＤＮＡが花弁細胞、葉細胞又は種子細胞等の特定の細胞、好ましくは種皮の外側層内で発現されるように、第２のプロモーターを選択することが有利であるかもしれない。
【００４２】
本発明の回復植物又は被回復植物内で本発明の外来性ＤＮＡ配列内に包含させるのに適した組織特異的な第２のプロモーターを既知の方法で識別及び単離し、かくして、第２のプロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡを担持しているものとしてこの植物を容易に識別できるようにすることができる。これは、以下の作業によって可能である：
【００４３】
１．花弁、葉又は種子等の特定の組織の発生中にのみその植物内に存在するｍＲＮＡを探すこと、
２．この組織特異的ｍＲＮＡを単離すること、
３．この組織特異的ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製すること、
４．このｃＤＮＡをプローブとして用いて、組織特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域を識別すること、そして次に、
５．組織特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡから上流にあり、このＤＮＡのためのプロモーターを含む植物ゲノムの一部分を識別する。
【００４４】
本発明の外来性ＤＮＡ配列の中に複数の第１の標識ＤＮＡが存在する場合、全ての第１の標識ＤＮＡが単一の第２のプロモーターの制御下にあってもよいが、好ましくは、各々の第１の標識ＤＮＡはそれ自体の個別の第２のプロモーターの制御下にある。さらに好ましくは、各々の第１の標識ＤＮＡは、独自の第２のプロモーターの制御下にあり、形質転換された植物に対して異なる識別可能な特性を与える異なる第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードする。いずれの場合でも、第１の標識ＤＮＡ及び第２のプロモーターは、互いに対して、及び、本発明の外来性ＤＮＡ配列内及び外来性ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあらゆるベクター内に含まれる単数又は複数の稔性回復ＤＮＡに対して、隣接しているべきである。
【００４５】
一般に、稔性回復ＤＮＡによりコードされる第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、不稔性ＤＮＡが発現されている植物細胞の核又は細胞質内で、不稔性ＤＮＡによりコードされる第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの活性を実質的に妨げるものであることが好ましい。しかしながら、第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第３のタンパク質又はポリペプチドを、形質転換された植物の細胞の葉緑体又はミトコンドリアへと細胞質から輸送させることが望ましい場合、外来性ＤＮＡ配列はさらに、トランジットペプチドをコードする付加的な外来性ＤＮＡを含むことができる。この付加的なＤＮＡは、第１のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送されるべきである場合、稔性回復ＤＮＡと第１のプロモーターの間にあり、第３のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送されるべき場合には、第１の標識ＤＮＡと第２のプロモータの間にある。「トランジットペプチド」というのは、通常、葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はこのタンパク質のサブユニットと結合しており、細胞の核ＤＮＡによりコードされる前駆体タンパク質として細胞内に生成されるポリペプチドフラグメントのことである。トランジットペプチドは、葉緑体又はミトコンドリアの中への、核にコードされた葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニットの転移プロセスの原因となるものであり、このようなプロセス中に、トランジットペプチドは葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニットから分離されるか又はタンパク質分解により除去される。欧州特許出願明細書８５４０２５９６．２号及び８８４０２２２２．９号及びVan den Broeck他（1985年）Nature 313, 358-363; Schatz （1987年）Eur. J. of Bioch. 165, 1-6; 及びBoutry他（1987年）Nature 328, 340-342 に一般的に記されているように、単数又は複数の第１又は第３のタンパク質又はポリペプチドを輸送するために本発明の外来性ＤＮＡ配列内にこのような付加的なＤＮＡを単数又は複数与えることが可能である。葉緑体内への輸送のための適当なトランジットペプチドの一例は、酵素ＲＵＢＰカルボキシラーゼの小サブユニットのトランジットペプチドであり（欧州特許出願明細書８５４０２５９６．２号）、ミトコンドリア内への輸送のためのトンジットペプチドの一例は、酵素Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼのトランジットペプチド（欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号；本書例３も参照のこと）である。
【００４６】
本発明の外来性ＤＮＡ配列において、３′転写終結シグナルは、植物細胞内で適正な転写終結とｍＲＮＡのポリアデニル化を提供することのできるものの中から選ぶことができる。転写終結シグナルは、転写されるべき外来性遺伝子又はＤＮＡの天然のものであってもよいし、或いは外来性又は非相同性のものであってもよい。
【００４７】
非相同性転写終結シグナルの例としては、オクトピンシンターゼ遺伝子〔Gielen他（1984年）EMBO. J. 3, 835-845 〕およびＴ−ＤＮＡ遺伝子７〔Velten及びSchell（1985年）「Nucleic Acid Research 」（「ＮＡＲ」, 13, 6981-6998 〕のものがある。
【００４８】
同様に、本発明に従うと、本発明の外来性ＤＮＡ配列を含む植物細胞の培養（物）は、一倍体細胞培養物〔Chuong及びBeversdof （1985年）Plant Sci 39, 219-226 〕について必要な形質転換を行ない、次に周知の技術により（例えばコルヒチンを使用して）染色体の数を倍増させることによって；又代替的には２倍体細胞培養（物）について必要な形質転換を行ない、次に、後に２倍体にされうる１倍体後代を生産すべく再生植物の葯を培養することによって、同型接合優性稔性回復植物を再生するのに用いることができる。Plant Tissue and Cell Culture, Plant Biology 3, A.R. Liss, Inc. N.Y.（1987）参照のこと。かくして外来性ＤＮＡ配列は、培養（物）のこのようにして形質転換された植物の各々の核ゲノム内に同型接合の形で存在することになる。これは、稔性回復ＤＮＡがそれから誘導された全ての雄性又は雌性繁殖器又は植物細胞の中で存在し、発現されうるように、ｉ）特に減数分裂後の、花粉等の植物の雄性繁殖器、ii）特に減数分裂後の、胚珠等の植物の雌性繁殖器又はiii)種子又は胚細胞等の雄性又は雌性繁殖器から誘導された細胞、の或る一定の発生段階において遺伝子の発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡを含む植物細胞培養にとって好ましいことである。
【００４９】
さらに本発明に従うと、雑種稔性回復植物に生長しうる雑種種子を生成するための方法も提供されている。１つの方法には、少なくとも１つの第３のプロモーターの制御下にある少なくとも１つの第２の標識ＤＮＡを含む核雄性不稔雌性稔性植物を、第２の標識ＤＮＡと同じものである第１の標識ＤＮＡを持たず、少なくとも１つの第１のプロモーターの制御下にある少なくとも１つの核雄性稔性回復ＤＮＡを含む同型接合の核雄性稔性回復植物と、交配する工程が関与している。この方法においては、雄性不稔及び雌性稔性植物は無作為に播かれ、受粉の後、第２の標識ＤＮＡによりコードされた選択可能な標識を用いて、稔性回復植物が除去され、かくして雄性不稔植物上でのみ種子が収穫されることになる。このことにより、収穫された全ての種子が雑種であると同時に稔性であることが保証される。もう１つの方法には、同型接合型で第２のプロモーターの制御下にある核第１標識ＤＮＡ及び第１のプロモーターの制御下にある核雌性稔性回復ＤＮＡを含む核雄性不稔雌性稔性回復植物を、同型接合型で少なくとも第２のプロモーターの制御下にある同じ核第１標識ＤＮＡ及び第１のプロモーターの制御下にある核雄性稔性回復ＤＮＡを含む核雄性稔性雌性不稔回復植物と、交配する作業が関与している。雄性不稔及び雄性稔性の親株の両者共、ほぼ無作為の個体群（母集団）の中で栽培することができ、かくして正確な栽植パターンの必要無く他家受粉の機会が増大され、第１の標識ＤＮＡによりコードされた特性を用いて、１００％稔性の雑種種子を収穫することができる。好ましくはこれらの方法の両方において、第１の標識ＤＮＡは構成的な第２のプロモーターの制御下にあり、不稔性植物を特定の除草剤に対し耐性あるものにする第３のタンパク質又はポリペプチドをコードする。すると、特定の除草剤を用いて、他家受粉に先立ち、望ましくない遺伝子型を破壊することができる。
【００５０】
１）本発明に従った、優性対立遺伝子として何世代にもわたり伝達可能な、核ゲノム内に安定した形で組込まれている稔性回復ＤＮＡを含む稔性回復植物を、２）欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号及び９０４０２１９６．１号に従った、優性対立遺伝子として何世代にもわたって伝達可能な、核ゲノム内に安定した形で組込まれた不稔性ＤＮＡ、好ましくは不稔性ＤＮＡと第２の標識ＤＮＡの両方を含む雄性又は雌性不稔性植物と交配する、本発明に従った方法は、以下に記述するように、雑種作物を育種し生産するための現在用いられているシステムに対する１つの代替案であり、このシステムに比べいくつかの利点を提供している：
【００５１】
１．穀物（例えば小麦、大麦、エンバク）、米、綿及び多くのマメ科植物（例えば大豆及びエンドウ豆）といったような、容易に他家受粉せず、種子が経済的産物であり、増殖速度が低い作物については、本発明に基づく方法は、１００％雑種の稔性子孫を生産し、かくして高い結実及び正常な収率を保証する可能性を提供する。親株として雄性不稔及び雌性不稔親株、及びそのそれぞれの不稔性に対する回復遺伝子を用いて、雑種植物を生産するための典型的な戦略の一例には、以下のような工程が含まれると考えられる（なお、ここで、「ＦＨ１」というのは、除草剤１抵抗性に関連する雌性不稔性を意味し、「ＲＦ」というのは、雌性不稔性の回復遺伝子であり、「Ｍ１Ｈ１」というのは、除草剤１抵抗性に関連する雄性不稔性１を意味し、「Ｍ２Ｈ２」は除草剤２抵抗性に関連する雄性不稔性２を意味し、「ＲＭ１」は雄性不稔性１の回復遺伝子、「Ａ」は雌性親株、「Ｂ」は雄性親株を表わす）：
【００５２】
Ａ．雌性親株Ａの育成
１Ａａ）（雄性親株の雌性不稔性ＤＮＡの発現生成物を特異的に中和する）第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし、少なくとも雄性植物内の雌性不稔性ＤＮＡが発現されるべきものと同じ細胞の中で遺伝子発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある、本発明に基づく稔性回復ＤＮＡを用いて、植物Ａを形質転換する。こうしてＡRF/rf が生み出される。
１Ａｂ）ＡRF/rf を自家受粉させ、２５％のＡRF/RF 植物を得る。
１Ａｃ）雄器特異的プロモーターの制御下にある「雄性不稔ＤＮＡ１」及び除草剤１に対する抵抗性を付与する標識ＤＮＡを含むキメラＤＮＡ配列を用いて、ＡRF/RF を形質転換する。こうして雄性不稔性植物ＡRF/RF;M1H1/mh が生み出される。
１Ａｄ）ＡRF/RF;M1H1/mh ×ＡRF/RF;mh/mh の交配を行なうことにより雄性不稔性植物を増殖し、
５０％ＡRF/RF;M1H1/mh ：雄性不稔１、除草剤１に対して抵抗性、
５０％ＡRF/RF;mh/mh ：雄性稔性、除草剤感受性、
から成る子孫を得る。
【００５３】
この混合物を雌性親株のスケールアップの連続する世代にわたって播き、純粋な雌性親株ストックを作り出すため交互の畦又は畦ブロックの形で除草剤１を用いる。除草剤が散布されていない畦又は畦ブロックは、花粉源として用いられる。除草剤処理された畦又は畦ブロックの種子だけを収穫して次の世代を構成させる。
【００５４】
Ｂ．雄性親株Ｂの育成
Ｂの経済的な生産のために、雌性不稔親株は２つの異なる不稔性ＤＮＡの使用を必要とする。第１のＤＮＡは、植物の雌器の細胞内で選択的に遺伝子発現を誘導するプロモーターの制御下にあり、除草剤１に対する抵抗性を付与する標識ＤＮＡに連結された雌性不稔ＤＮＡである。第２のものは、植物の雄器細胞内で選択的に遺伝子発現を誘導するプロモーターの制御下にあり、除草剤２に対する抵抗性を付与する第２の標識ＤＮＡに連結されている雄性不稔ＤＮＡ（雄性不稔ＤＮＡ１とは異なるもので、「雄性不稔ＤＮＡ２」と呼ばれる）である。
【００５５】
１Ｂａ）少なくとも雌性親株内の雄性不稔ＤＮＡ１が発現される同じ雄器細胞内で遺伝子発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にあり、雌性親株で発現される雄性不稔ＤＮＡ１の活性を特異的に中和する第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードする本発明の外来性ＤＮＡ配列で、植物Ｂを形質転換する。こうしてＢRM1/rmが生み出される。
１Ｂｂ）ＢRM1/rmを自家受粉させて、２５％のＢRM1/RM1 を得る。
１Ｂｃ）（１）植物の雌器細胞内で選択的に遺伝子発現を誘導するプロモーターの制御下にある雌性不稔ＤＮＡ及び除草剤１に対する抵抗性を付与する標識ＤＮＡを含むキメラＤＮＡ配列で、ＢRM1/RM1 を形質転換する。こうして雌性不稔植物ＢRM1/RM1;FH1/fhが得られる。
【００５６】
（２）雄器特異的プロモーターの制御下にある雄性不稔ＤＮＡ２及び除草剤２に対する除草剤抵抗性を付与する標識ＤＮＡを含むキメラＤＮＡ配列で、ＢRM1/RM1 を形質転換する。こうして雄性不稔植物ＢRM1/RM1;M2H2/mh が得られる。
１Ｂｄ）（１）ＢRM1/RM1;M2H2/mh ×ＢRM1/RM1;mh/mh の交配を行なうことにより、１Ｂｃ）（２）の雄性不稔植物を増殖させ、
５０％ＢRM1/RM1;M2H2/mh ：雄性不稔、除草剤抵抗性、及び
５０％ＢRM1/RM1;mh/mh ：雄性不稔、除草剤感受性、
から成る子孫を得る。
【００５７】
（２）別々の畦に植栽されたＢRM1/RM1;M2H2/mh;fh/fh ×ＢRM1/RM1;mh/mh;FH1/fhの交配を行なうことにより、１Ｂｃ）（１）の雌性不稔植物を増殖させ、雄性不稔畦に以下の遺伝子型を生み出す：
２５％ＢRM1/RM1;M2H2/mh;FH1/fh：不稔で、除草剤１及び２に対して抵抗性、
２５％ＢRM1/RM1;mh/mh;FH1/fh：雌性不稔で除草剤１に対して抵抗性、
２５％ＢRM1/RM1;M2H2/mh;fh/fh ：雄性不稔で除草剤２に対して抵抗性、及び
２５％ＢRM1/RM1;mh/mh;fh/fh ：稔性で除草剤感受性。
【００５８】
１Ｂｅ）この混合物は再び、さらなる増殖交雑において雄性親株（ＢRM1/RM1;mh/mh;FH1/fh）として用いることができ、かくして各世代で除草剤１を噴霧することで雌性稔性植物は除去され、雄性親株が維持される。この混合物は、１Ｂｄ（１）で得られた混合物と共に交互の畦又は畦ブロックに植栽される。この１Ｂｄ（１）の混合物は、雄性稔性植物を除去すべく除草剤２で処理される。代替的には、１Ｂｄ）（２）で得られた混合物をこのようにして播き、交互の畦を除草剤１又は除草剤２のいずれかで処理することもできる。このような状況下では、工程１Ｂｄ）（１）は不要である。
【００５９】
Ｃ．雑種種子ＡＢの生産
工程１Ａｄ）及び１Ｂｅ）で得た混合物を無作為に播く。他家受粉が起こらないうちに、除草剤１を噴霧して望ましくない遺伝子型を全て除去する。
ＡRF/RF;rf/rf;M1H1/mh;fh/fh ×ＢRM1/RM1;rm/rm;mh/mh;FH1/fh
で他家受粉が起こり、１００％稔性雑種粒子を構成する、
２５％ＡＢRF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;FH1/fh
２５％ＡＢRF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;fh/fh
２５％ＡＢRF/rf;mh/mh;rm/RM1;FH1/fh
２５％ＡＢRF/rf;mh/mh;rm/RM1;fh/fh
を生み出す。
【００６０】
２．育種される作物の特別な特性に応じて、前述の一般的戦略を単純化することが可能である。このような特殊な特性としては、以下のものがある：
（２．１）作物が昆虫による適正な又は優れた他家受粉を受ける場合、混合物中の親株Ｂの相対的割合は、作物の収量に影響を及ぼすことなく下げることができる（例；綿、Pisum(エンドウ）のようなマメ科植物、アルファルファ、ナタネ及びトウモロコシ）。代替的には、雄性不稔及び除草剤抵抗性にされた雌性親株及び雄性不稔のための稔性回復遺伝子を有する雄性親株が関与する作物のためには、はるかに単純化された育種計画を用いることが可能である。
これにより以下の戦略が可能となる：
掛け合せ：同時的に着花しない作物について、畦状に又は無作為にＡMH/mh ×ＢRM/RM を播く。
無作為に播種した場合、受粉後に除草剤処理する。
収量：１００％稔性雑種子孫を構成する、５０％ＡＢMH/mh;RM/rm 及び５０％ＡＢmh/mh;RM/rm 。
【００６１】
（２．２）Ｆ２子孫が商業的種子産物である場合（例・綿）、以下の派生戦略を用いることができる：
ａ）親株Ａの雄性不稔植物を形質転換により生産し、ＡM/m;r/r を得る。
ｂ）生成物がａ）の雄性不稔植物内の雄性不稔遺伝子の活性を特異的に中和するような稔性回復遺伝子をその核ゲノムの２つの独立した遺伝子座内にもつ稔性回復植物を、２回の独立した形質転換事象により生産し、自家受粉によって同型接合形で両方の回復遺伝子を得、Ｂm/m;R1/R1;R2/R2 を生じさせる。
ｃ）ＡM/m;r/r ×Ｂm/m;R1/R1;R2/R2 のかけ合せを行ない、
１００％雑種稔性子孫を構成する５０％ＡＢM/m;R1/r;R2/r 及び５０％ＡＢm/m;R1/r;R2/r を生産する。そして、
ｄ）ｃ）で得た混合物を自家受粉させる。子孫の半数は以下の表１に示されている通りであり、合計６４本の植物のうちわずか１本のみが雄性不稔である（表１）に＊で示されているもの）、その他全ては稔性である。
この結果はこの方法を経済的に価値あるものにしている。
【００６２】
【表１】
0003720497.tif 000002
【００６３】
（２．３）雄性不稔ＤＮＡ２が除草剤２に対する抵抗性をコードする遺伝子以外の標識ＤＮＡ（例えば色遺伝子）に連結される場合、この雄性不稔性ＤＮＡを有する植物は、その他の植物に損傷を与えることなく容易に除去されうる。代替的には、いかなる選択可能な標識ＤＮＡも無く、雄性不稔ＤＮＡ２を導入することができる。雄性不稔ＤＮＡ２を担持する植物の除去は、小規模でのみ行なう必要のある、手による選択によって行なうことが可能である〔前記（１）Ｂｄ）参照のこと〕。
【００６４】
（２．４）形質転換すべき親株の組織が一倍体物質で構成されている場合、これはその後の育種を著しく減少させ、同型接合形で不稔性をコードする優性遺伝子を与える。
【００６５】
（２．５）種子の価値又は手作業コストが、少なくとも雑種生産前の最後の工程まで、望ましくない遺伝子型の手による除去を可能にする場合、全体的システムも同様に単純化できる。
【００６６】
３．本発明の稔性回復システムと組合わされた雄性及び雌性不稔を用いた育種戦略のもう１つの例には、以下のような工程が含まれると考えられる：
３Ａ．雌性親株Ａの育成
３Ａａ）雄性親株で発現された雌性不稔ＤＮＡの生成物の活性を特異的に中和する第１のＤＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし；少なくとも雄性親株の雌性不稔ＤＮＡが中で発現されている細胞と同じ雌器細胞内で稔性回復ＤＮＡの発現を誘導するような第１のプロモーターの制御下にあり；除草剤２に対する抵抗性をコードする第１の標識ＤＮＡに隣接している、本発明の稔性回復ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡ配列で、系統Ａを形質転換する。これによりＡRFH2/rfhを生じさせる。
【００６７】
同様にこれと並行して、雄器特異的プロモーターの制御下にあり、第１の標識ＤＮＡによりコードされたものとは異なる除草剤抵抗性（すなわち除草剤１に対する抵抗性）をコードする第２の標識ＤＮＡに隣接している雄性不稔ＤＮＡを含むＤＮＡ配列で、系統Ａを形質転換する。これによりＡMH1/mhを生じさせる。
３Ａｂ）ＡRFH2/rfh×ＡMH1/mhのかけ合わせを行ない、
２５％ＡRFH2/rfh;MH1/mh
２５％ＡRFH2/rfh;mh/mh
２５％Ａrfh/rfh;MH1/mh
２５％Ａrfh/rfh;mh/mh
を生じさせる。
【００６８】
除草剤１及び２を噴霧し、ＡRFH2/rfh;MH1/mh を選択する。
３Ａｃ）ＡRFH2/rfh×ＡRFH2/rfhの自家受粉を行ない、自家受粉により維持できる２５％ＡRFH2/RFH2 を生じさせる。
３Ａｄ）ＡRFH2/RFH2;mh/mh ×ＡRFH2/rfh;MH1/mh のかけ合せを行なう。
こうして
２５％ＡRFH2/RFH2;MH1/mh
２５％ＡRFH2/RFH2;mh/mh
２５％ＡRFH2/rfh;MH1/mh
２５％ＡRFH2/rfh;mh/mhを生じさせ、
【００６９】
かくして、同型接合形で稔性回復ＤＮＡを有する雄性不稔植物を、除草剤１の噴霧及び親株Ａ系統とのテスト交配により選択することができる。
【００７０】
３Ａｅ）ＡRFH2/RFH2;MH1/mh×ＡRFH2/RFH2;mh/mh の交配を行なうことにより、雌性親株Ａを維持する。
【００７１】
Ｂ．雄性親株Ｂの育成
３Ｂａ）雌性親株で発現された雄性不稔ＤＮＡの生成物の活性を特異的に中和する第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし；少なくとも雄性不稔ＤＮＡが発現されている細胞と同じ雄器細胞内で稔性回復ＤＮＡの発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にあり；除草剤２に対する抵抗性をコードする第１の標識ＤＮＡに隣接している、本発明の稔性回復ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡ配列で、系統Ｂを形質転換する。これによりＢRMH2/rmhを生じる。
【００７２】
これと並行して同様に、雌器特異的プロモーターの制御下にあり、除草剤１に対する抵抗性をコードする第２の標識ＤＮＡに隣接する雌性不稔ＤＮＡを含むＤＮＡ配列で、系統Ｂを形質転換する。これによりＢFH1/fhを生じさせる。
３Ｂｂ）ＢRMH2/rmh;fh/fh×Ｂrmh/rmh;FH1/fhをかけ合わせ、
２５％ＢRMH2/rmh;FH1/fh
２５％ＢRMH2/rmh;fh/fh
２５％Ｂrmh/rmh;FH1/fh
２５％Ｂrmh/rmh;fh/fh
を生じさせる。
【００７３】
除草剤１及び２を噴霧することにより、ＢRMH2/rmh;FH1/fh を分離する。
３Ｂｃ）ＢRMH2/rmh×ＢRMH2/rmhの自家受粉を行ない、自家受粉を通じて維持されうる２５％ＢRMH2/RMH2 を生じさせる。
３Ｂｄ）ＢRMH2/RMH2 ×ＢRMH2/rmh;FH1/fh を掛け合わせ、
２５％ＢRMH2/RMH2;FH1/fh
２５％ＢRMH2/RMH2;FH/fh
２５％ＢRMH2/rmh;FH1/fh
２５％ RMH2/rmh;fh/fh
を生じさせ、
かくして同型接合形の稔性回復ＤＮＡをもつ雌性稔性植物は、除草剤１の噴霧及び親株Ｂ系統とのテスト交配により選択される。
【００７４】
３Ｂｅ）ＢRMH2/RMH2;fh/fh ×ＢRMH2/RMH2;FH1/fhの交配を行なうことにより、雄性親株Ｂを維持する。
【００７５】
Ｃ．雄性又は雌性親株（Ａ又はＢを両方共Ｃと呼ぶ）の育成のための代替的方法
３Ｃａ）もう一方の親株で発現された不稔性ＤＮＡの生成物の活性を特異的に中和する第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードし；少なくとももう一方の親株の不稔性ＤＮＡが発現されている細胞の中で稔性回復ＤＮＡの発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にあり；除草剤２に対する抵抗性をコードする第１の標識ＤＮＡに隣接している、本発明の稔性回復ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡ配列で、系統Ｃを形質転換する。これによりＣRH2/rhを生じさせる。
３Ｃｂ）ＣRH2/rh×ＣRH2/rhの自家受粉を行ない、自家受粉を通じて維持されうる２５％ＣRH2/RH2 を生産する。
３Ｃｃ）雄器又は雌器特異的プロモーターの制御下にあり、除草剤１に対する抵抗性をコードする第２の標識ＤＮＡに隣接する不稔性ＤＮＡを含むＤＮＡ配列で、ＣRH2/RH2 を形質転換する。これにより、ＣRH2/RH2;SH1/shが生じる（なお、ここで「ｓ」は雄性又は雌性不稔を意味する）。
３Ｃｄ）ＣRH2/RH2;SH1/sh×ＣRH2/RH2;sh/sh のかけ合わせにより系統Ｃを維持する。
【００７６】
３Ｄ．雑種種子ＡＢの生産
工程３Ａｅ）及び３Ｂｅ）で得られた混合物又は工程３Ｃｄ）で得られた混合物を無作為に播種する。自家受粉が起こる前に、望ましくない全ての遺伝子型を除去するため除草剤１及び２を噴霧する。この結果、次のかけ合せが導かれる；
ＡRFH2/RFH2;rm/rm;MH1/mh;fh/fh×ＢRMH2/RMH2;rf/rf;FH1/fh;mh/mh。
こうして１００％雑種稔性種子から成る、以下の子孫が生じる：
２５％ＡＢRFH2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;FH1/fh
２５％ＡＢRFH2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;fh/fh
２５％ＡＢRFH2/rf;RMH2/rm;mh/mh;FH1/fh
２５％ＡＢRFH2/rf;RMH2/rm;mh/mh;fh/fh 。
【００７７】
４．以前のシステムに比べて、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号及び９０４０２１９６．１号に記されている雄性又は雌性不稔システムと組み合わせた本発明に基づく稔性回復システムは、さらに以下のような利点を有する：
ａ）品質を管理するため充分に識別及び選択可能な複数の標識を用いるフールプルーフ生産；
ｂ）信頼性の高い生産及び生産コストの低減にとって必要不可欠なことである、最終種子増殖因子レベルでの複雑性の著しい削減。及び
ｃ）商業的雑種種子の生産に必要な時間の縮減。
【００７８】
以下の例が本発明を明確に説明している。
例中に相反する記述のないかぎり、組換え型ＤＮＡを作り、操作するための全ての手順は、Maniatis他著「分子クローニング、−実験室マニュアル」、Cold Spring Harbor Laboratory(1982年）に記されている標準化された手順により実施された。例中で用いられている以下のプラスミド及びベクターは、ブタペスト条約の規定に基づきドイツ連邦共和国Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig のDeutsche Sammlung Feur Mikroorganismen und Zellculturen （「ＤＳＭ」）に寄託されている：
【００７９】
【表２】
0003720497.tif 000003
【００８０】
【実施例】
例１−ＰＴＡ２９及びバルスター遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築
図１に示されている「ｐＴＶＥ７４」という名のプラスミドを、ＰＴＡ２９プロモーターと以下の周知のＤＮＡフラグメントを組合わせることによって構築する；
【００８１】
１．ペニシリナーゼ（β−ラクタマーゼ）遺伝子が欠失しているｐＧＳＣ１７００〔Cornelissen 及びVandewiele（1989年）NAR 17(1) 19-29 〕から誘導された、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列を含むベクターフラグメント；なおこれらのボーダー配列の間には以下のＤＮＡフラグメント２及び３が位置づけられている。
【００８２】
２．細胞外リボヌクレアーゼBarnase 〔Hartley 他（1972年）Preparative Biochemistry 2 (3) 243-250; Hartley 及びSmeaton （1973年）J. Biol. Chem. 248 (16), 5624-5626〕の細胞抑制因子であるバルスターをコードするBacillus amyloliquefaciensの遺伝子とＡＴＧ開始コドンにてフレーム内で融合された、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号からのプロモーターカセットＰＴＡ２９を含むキメラ配列；なお、以下の工程が実施される：
【００８３】
ａ）コード配列の第１のメチオニンコドンにおいて適当なＣｌａＩクローニング部位を得るため、第１のＡＴＧコドンの上流の位置７〜１０にあるヌクレオチド配列ＧＣＡＣを、ヌクレオチド配列ＡＴＣＧへと突然変異させる（図２参照）；これは、部位特異的突然変異誘発（欧州特許出願明細書８７４０２３４８．４号）を用いて達成され、ｐＭｃ５−ＴＰＢＳＣを生成する；酵素ＳＩによりＣｌａＩ突出末端を消化し、３３０ヌクレオチド（図２）のＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントとしてバルスター遺伝子を単離する；そして
【００８４】
ｂ）ｐＭＢ３のＳＩ処理を受けたＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント（欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号）及び、転写終結及びポリアデニル化のためのノパリンシンセターゼ（「ＮＯＳ」）の３′末端シグナルを含む制限フラグメント〔An他（1985年 , EMBO J. 4 (2), 277 〕と、ＳＩ処理を受けたｐＭｃ５−ＴＰＢＳＣのＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを融合させる；及び
【００８５】
３．Arabidopsis Rubisco ＳＳＵプロモーター（「ＰＳＳＵ」又は「ＰＳＳＵＡＲＡ」）、カナマイシン抵抗性をコードするｎｅｏ遺伝子（欧州特許出願明細書８７４００，５４４．０号）、及びオクトピンシンターゼ（「ＯＣＳ」）遺伝子の３′末端シグナル〔Dhaese他（1983年）EMBO J. 2, 419〕を含むキメラ配列。
【００８６】
ｐＴＶＥ７４は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列内に、３つのキメラ配列、すなわち；独自の第２のプロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡを含むＰＮＯＳ−ｎｅｏ及びＰＳＳＵ−ｓｆｒ；ならびに、バルスターが、タペタム特異的ＰＴＡ２９第１プロモーターの制御下で発現されたときに、そうでなければ雄性不稔である植物のタペタム細胞の中で、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号に記されているようにタペタム特異的不稔性プロモーターの制御下で不稔性ＤＮＡによりコードされたバルナーゼの活性を中和することになる稔性回復ＤＮＡであるようなＰＴＡ２９−バルスター、を含むバイナリータイプのＴ−ＤＮＡベクターである。
【００８７】
例２−タバコ及びナタネへの例１のキメラＤＮＡ配列の導入
E. coli(大腸菌）から、ｐＭＰ９０を含むAgrobacterium tumefaciens Ｃ５８Ｃ１  ＲｉｆR 中にｐＴＶＥ７４（例１からのもの）を可動化（授動）することにより、組換え型Agrobacterium 菌株を構築する〔Koncz 及びSchell（1986年）Mol. Gen. Genetics 204, 383-396 〕。結果として得られたｐＭＰ９０とｐＴＶＥ７４を宿したAgrobacterium 菌株は、例えば欧州特許出願明細書８７４００５４４．０号に記されているような標準的手順を用いてタバコのリーフディスク（N. tabacum Petite Havane SR1）を形質転換するため、及びLloyd 他（1986年）Science 234, 464-466及びKlimaszewska他（1985年）Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 183-197の手順に従ってナタネ（Brassica napus）を形質転換するために用いられる。感染後、Agrobacterium 菌株を殺すためにはカルベニリシンが用いられる。
【００８８】
形質転換されたカルスを、１００μg/mlのカナマイシンを含む基質上で選択し、抵抗性のあるカルスを植物へと再生させる。苗条（従長枝）及び根の誘導後、形質転換体を温室に移し、着花するまで栽培する。花を検査したところ、完全に天然の形態を示していた。これらの花の花粉は、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号の例１３に記されているタペタム細胞特異的ＰＴＡ２９不稔性プロモーターの制御下で、不稔性ＤＮＡとしてバルナーゼ遺伝子を含む核雄性不稔タバコ及びナタネ植物を受粉させるために用いられる。これらの受粉した雄性不稔植物の子孫を分析してみると、その花の７５％は雄性不稔表現型（すなわち、その花の雄ずい内の正常なタペタム層の欠如）を示していない。
【００８９】
例３−ＰＴＡ２９及びＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築ＰＴＡ２９プロモーターと以下の周知のフラグメントを組立てることにより、図３に示されている「ｐＴＶＥ７３」と呼ばれるプラスミドを構築する：
【００９０】
１．ボーダー配列の間に以下のＤＮＡフラグメント２〜４がある状態の、例１に記載のｐＧＳＣ１７００から誘導されたＴ−ＤＮＡボーダー配列を含むベクターフラグメント；
２．ｎｅｏ遺伝子、及びＯＣＳ遺伝子の３′末端の発現を制御するｐＳＳＵプロモーターを含む、例１のキメラ配列（No. ３）；
３．ノパリンシンターゼプロモーター（「ＰＮＯＳ」）〔欧州特許出願明細書８７４００５４４．０号〕、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子〔Van den Elzen 他（1985年）Plant Molecular Biology 5, 299-302〕及びＮＯＳ遺伝子の３′末端（例１）を含むキメラ配列；及び
４．その発現生成物が、ＧＡＡＴＴＣ部位で２本鎖ＤＮＡを切断するＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの活性を中和する〔Wilson（1988年）TIG 4 (11), 314-318 〕、ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子〔Botterman 及びZabeau（1985年）Gene 37, 229-239〕とフレーム内で融合された、例１からのＰＴＡ２９プロモーターカセットを含むキメラ配列；
【００９１】
なお、以下の工程が実施される：
ａ）ＥｃｏＲＩメチラーゼのコード配列を含むｐＥｃｏＲ４からのＢｇｌII−ＨｉｎｄIII フラグメント〔Botterman 及びZabeau, 1985年〕を、ｐＭａ５−８内にクローニングする（欧州特許出願明細書８７４０２３４８．４号）；部位特異的突然変異誘発により、メチラーゼコード配列のＮ末端にＦｓｐＩ部位を導入する。
0003720497.tif 000004
【００９２】
ｂ）ｐＭＢ３のプロモーターフラグメントを、その充てんされたＮｃｏＩ部位で平滑ＦｓｐＩ末端に連結し、
0003720497.tif 000005
を生み出し、例１のＮＯＳ遺伝子の３′末端と融合させる。
【００９３】
ｐＴＶＥ７３は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列内に、３つのキメラ配列、すなわち；独自の第２プロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ−ｎｅｏ及びｐＮＯＳ−ｈｐｈ；ならびに、タペタム特異的ＰＴＡ２９第１プロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡであるＰＴＡ２９−ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、を含むバイナリータイプのＴ−ＤＮＡベクターである。ＰＴＡ２９プロモータの制御下にある稔性回復ＤＮＡの、そうでなければ雄性不稔である植物のタペタム細胞内での発現は、欧州特許出願明細書８９４０１１３４．９号の例１６に記されているようにタペタム特異的不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡによりコードされたＥｃｏＲＩのこのような細胞内での活性を中和することになる。
【００９４】
図４に示されている「ｐＴＶＥ７６」という名のプラスミドも、同様に、ＰＴＡ２９プロモーターと以下の周知のフラグメントを組立てることによって構築される；
【００９５】
１．ペニシリナーゼ遺伝子が欠失しているｐＧＳＣ１７００〔Cornelissen 及びVandewiele（1989年）Nar 17 (1) 19-29〕から誘導された、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列を含み、そのボーダー配列間には以下のＤＮＡフラグメント２〜４があるような、ベクターフラグメント；
２．ｐＳＳＵプロモーター、ｎｅｏ遺伝子、及びＯＣＳ遺伝子の３′末端を含む、例１のキメラ配列（No. ３）；
３．ＰＮＯＳプロモーター、ｈｐｈ遺伝子、及びＮＯＳ遺伝子の３′末端を含むキメラ配列；及び
４．Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（「Ｍｎ−ＳＯＤ」）〔Bowler他（1989年）EMBO J. 8,31-38 〕のトランジットペプチド（「ＴＰ」）をコードする遺伝子フラグメントとフレーム内で融合された、例１からのｐＴＡ２９プロモーターカセットを含むキメラ配列；欧州特許出願明細書８７４０２３４８．４号に記されているような部位特異的突然変異誘発を用いてクローニングする目的でフラグメントを単離するため、トランジットペプチド配列内に以下の変更を行なう：
【００９６】
ｉ．ＡＴＧ開始コドンの上流の位置−２及び−１にあるＡＡヌクレオチドをＣＣヌクレオチドに変更し、開始コドンにＮｃｏＩ部位を作り出し、以下のヌクレオチド配列、
−ＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＡＣ
ＮｃｏＩ
を生み出す：
【００９７】
ii．トランジットペプチドのプロセッシング部位のすぐ近くにあるＣＴＴＧヌクレオチドをＧＧＴＡＣに変更し、プロセッシング部位にＫｐｎＩ部位を作り出し、以下のヌクレオチド配列を生成する：
【００９８】
【表３】
0003720497.tif 000006
【００９９】
なお、ここで矢印はトランジットペプチド配列のプロセッシング部位を示し、上線はＭｎ−ＳＯＤコード配列に対応するアミノ酸配列を示す；KlenowＤＮＡポリメラーゼでＫｐｎＩを処理した後、ｐＴＶＥ７３の構築において用いられたようなＥｃｏＲＩメチラーゼコード配列の平滑ＦｓｐＩ  Ｎ末端に対してＮｃｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントをフレーム内で融合させ、例１のＮＯＳ遺伝子の３′末端と融合させる。
【０１００】
ｐＴＶＥ７６は、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列内に、３つのキメラ配列、すなわち：独自の第２プロモーターの制御下にある第１の標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ−ｎｅｏ及びＰＮＯＳ−ｈｐｈ、及びＰＴＡ２９の第１プロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡであるＰＴＡ２９−ＴＰ−ＥｃｏＲＩメチラーゼ遺伝子、を含むバイナリータイプのＴ−ＤＮＡベクターである。そうでなければ雄性不稔である植物のタペタム細胞内でのＭｎ−ＳＯＤのトランジットペプチドに融合されたＥｃｏＲＩメチラーゼの発現、及びこれらの細胞のミトコンドリアに対するタペタムタンパク質のターゲティング（ミトコンドリアにタペタムタンパク質を輸送させること）は、欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号の例１６に記されているようにトランジットペプチドに融合されタペタム特異的プロモーターの制御下にある相当する不稔性ＤＮＡによりコードされたＥｃｏＲＩのこのような細胞内での活性を中和することになる。
【０１０１】
例４−タバコ及びナタネへの例３のキメラＤＮＡ配列の導入
組換え型Agrobacterium 菌株は、大腸菌からｐＭＰ９０を含むAgrobacterium Ｃ５８Ｃ１  ＲｉｆR 〔Koncz 及びSchell（1986年）Mol. Gen. Genetics 204, 383-396 〕へ例３のｐＴＶＥ７３及びｐＴＶＥ７６を可動化（授動）することによって構築される。結果として得られる、それぞれｐＭＰ９０及びｐＴＶＥ７３ならびにｐＭＰ９０及びｐＴＶＥ７６を宿す菌株は、例２に示されているようにタバコのリーフディスクの形質転換及びナタネの形質転換のために用いられる。形質転換されたカルス及び苗条は、１００μg/mlのカナマイシンを含む基質上で選択される。
【０１０２】
形質転換された菌条を発根させ、温室の土壌に移し、着花するまで栽培する。タバコ及びナタネの両方の花を検査したところ、両方共天然の形態を示していた。これらの花の花粉は、それぞれベクターｐＴＶＥ６３及びｐＴＶＥ６２での形質転換により得られた（欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号の例１７に記されているように）核雄性不稔のタバコ及びナタネ植物を受粉するのに用いられる。なおこれらのベクター内で、ＥｃｏＲＩ遺伝子はＰＴＡ２９不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡであり、ｐＴＶＥ６２においてはＥｃｏＲＩ遺伝子は同様に、Ｍｎ−ＳＯＤのトランジットペプチドをコードするＤＮＡにも融合されている。これらの雄性不稔性植物の子孫を分析したところ、その花の７５％が雄性不稔表現型（すなわち、その花の雄ずい内の正常なタペタム層の欠如）を示していなかった。
【０１０３】
言うまでもないことであるが、本発明は、何らかの特定の植物の形質転換に限られているわけではない。本発明は、植物が自家受粉及び他家受粉の両方を受けうるように、植物の花、特に少なくとも１つのその雄器又は雌器、及び／又は種子及び／又は胚の細胞内で選択的に稔性回復ＤＮＡの発現を誘導できる第１のプロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡで形質転換されうる核ゲノムをもつあらゆる植物に関する。例えば本発明は、トウモロコシ、ナタネ、小麦、米、ヒマワリ、テンサイ、トマト、レタス、コショウ、モロコシ類、大豆、エンドウマメ、アルファルファ、イネ科牧草、クローバー、ニンジン、キャベツ、ニラネギ、タマネギ、タバコ、ツクバネアサガオ（ペチュニア）、カカオ及びカンキツ属の木等の植物に関する。
【０１０４】
同様に、本発明は前述の例に記されている特定のプラスミド及びベクターに制限されるものではなく、むしろ第１のプロモーターの制御下にある稔性ＤＮＡを含むあらゆるプラスミド及びベクターを包含する。
【０１０５】
さらに、本発明は、ＰＴＡ２９プロモーター等の前述の例に記されている特定の第１のプロモーターに制限されず、少なくとも、そうでなければ不稔性ＤＮＡの発現により雄性又は雌性不稔になると思われる植物の花、種子及び／又は胚の細胞内で、稔性回復ＤＮＡの発現を誘導することのできる第１のプロモーターをコードするあらゆるＤＮＡ配列を包括する。この点において、本発明は、雄性不稔にされるべき植物の雄ずい細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を制御する上で使用するための欧州特許出願明細書８９４０１１９４．９号に記載のプロモーター、ならびに雌性不稔にされるべき植物の花、種子又は胚の細胞内で選択的に不稔性ＤＮＡの発現を制御する上で使用するための欧州特許出願明細書９０４０２１９６．１号に記載のプロモーターを包含している。代替的には、第１のプロモーターは、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが、不稔性ＤＮＡの発現が無い場合にそれが中で発現される細胞の機能、代謝又は発生を不利な形で著しく妨げないことを条件として、その植物のための構造プロモーターであってもよい。
【０１０６】
さらに、本発明は前述の例に記されている特定の稔性回復ＤＮＡに制限されるものではなく、むしろ、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性ＤＮＡによりコードされ、そうでなければその植物の花、種子又は胚の細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利な形で著しく妨げるような第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの活性を、稔性回復植物の中で、中和、阻止、相殺、克服又はその他の形で妨げる第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードするあらゆるＤＮＡ配列を包括している。
【０１０７】
同様に、本発明は前述の例に記されている特定の第１の標識ＤＮＡに制限されるものではなく、むしろ、少なくともそのＤＮＡ配列が発現される特定の植物組織又は特定の植物細胞に対して、このようなＤＮＡ配列が発現されないかかる特定の植物組織又は植物細胞に比べて卓越した形質を付与するような第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコードするあらゆるＤＮＡ配列を包括するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】例１のベクターｐＴＶＥ７４の地図である。
【図２】例１で使用されているバルスター遺伝子のＤＮＡ配列を示し、そのＣｌａＩ部位の突然変異配列を表わしている。
【図３】例３のベクターｐＴＶＥ７３の地図を示す。
【図４】例３のベクターｐＴＶＥ７６の地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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