(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の物理化学的性状を有する新規化合物Ａ−７６２０２またはその塩。
１）性質；白色粉末。
２）溶解性；ジメチルスルホキシドに可溶。水、メタノール、アセトンに難溶。
３）分子式；Ｃ20Ｈ18Ｏ9 （高分解能マススペクトルにより測定）
４）分子量；  ４０２（ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにより測定）
５）紫外線吸収スペクトル；λmax ｎｍ
水溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２５９ｎｍに極大吸収を示し、２５９ｎｍにおける吸光係数（Ｅ1%1cm ）は６８７である。
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）；νmax ｃｍ-1
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである。
３３４８、２９４３、１６２７、１６０１、１５７４、１５１５、１２８４、１２１２、１０７８、１０３６、９６９
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ (ｐｐｍ)
重ジメチルスルホキシド溶液中（ジメチルスルホキシド内部基準: ２．４９ｐｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。
3.46(1H, dd, J=5.5, 11.8Hz), 3.57(1H, dd, J=3.5, 11.8Hz), 3.84(1H, dd, J=3.8, 6.0Hz), 3.96(1H, ddd, J=3.5, 5.5, 6.0Hz), 4.28(1H, dd, J=1.0Hz以下, 3.8Hz), 5.60(1H, d, J=1.0Hz 以下),6.81(2H, d, J=8.5Hz), 7.23(1H, d, J=8.8Hz), 7.39(2H, d, J=8.5Hz), 7.53(1H, d, J=8.8Hz), 8.37(1H, s)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ (ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ジメチルスルホキシド内部基準：３９．５ｐｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
61.14, 76.66, 81.34, 85.95, 107.16, 114.44, 114.9(3C), 119.58, 122.41, 123.17, 130.05(2C), 136.15, 146.03, 147.58, 153.01, 157.17, 175.15
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム；センシューパック ODS-H-2151 （φ6 ×150mm ，センシュー科学（株）製）
移動相；  １６％アセトニトリル−水
流速；  １．５ｍｌ／分
検出波長；  ２１０ｎｍまたは２５９ｎｍ
温度；  ２５℃
保持時間；  １６．２２分
【請求項２】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する請求項１に記載の化合物A-76202の生産菌を培養し、その培養物より請求項１に記載の化合物A-76202を採取することを特徴とする、請求項１に記載の化合物A-76202の製造法。
【請求項３】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する請求項１に記載の化合物Ａ−７６２０２の生産菌がロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株である、請求項２に記載の製造法。
【請求項４】
ロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物Ａ−７６２０２またはその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物Ａ−７６２０２またはその塩を有効成分として含有するα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物Ａ−７６２０２またはその塩を有効成分として含有する抗ＡＩＤＳ剤。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物Ａ−７６２０２またはその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性、及びシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性を阻害する活性を有する新規化合物Ａ−７６２０２及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
α−グルコシダーゼは、生体内に広く分布する酵素である。
【０００３】
このうち小胞体に存在するα−グルコシダーゼ、すなわちα−グルコシダーゼＩ，ＩＩは、分泌糖蛋白質、細胞表層糖蛋白質、及びウイルス表層糖蛋白質上のＮ結合型糖鎖の成熟過程においてプロセシングに関わる酵素である。具体的には、未成熟のＮ結合型糖鎖の末端部分に存在する３分子のグルコースを切り出す活性を有している。その後更に別の酵素が働き糖鎖が成熟する。ＨＩＶをはじめとするウィルス感染細胞において本酵素を阻害した場合、生成するウィルス粒子の表層糖蛋白質の糖鎖は未成熟な状態にとどまり、生成ウィルスの感染性が抑制される結果となる。実際に、小胞体α−グルコシダーゼ阻害物質として知られる、１−デオキシノジリマイシン、カスタノスペルミン及びその誘導体は、in vitroにおいてＨＩＶの伝翻、増殖を阻害することが報告されている（H.Shimizu et al., AIDS,4巻、975 〜 979頁、(1990 年) ；B.D.Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、84巻、8120〜8124頁、(1987 年) 等）。
【０００４】
また、小胞体α−グルコシダーゼ阻害剤は悪性腫瘍細胞の転移、浸潤を阻害することが報告されている（M.J.Humphries et al., Cancer Research, 46 巻, 5215〜5222頁, (1986 年); G.Pulverer et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 114巻, 217 〜220 頁, (1988 年))。
従って、小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性を有する化合物は、抗ＡＩＤＳ薬または抗腫瘍薬として有用である。
【０００５】
一方、小腸刷子縁膜上に存在するシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体は、マルトース、シュークロース、イソマルトース等を分解する酵素であり、グルコースをはじめとする単糖を生成する。単糖は、同じく、小腸刷子縁膜上に存在する輸送蛋白質の働きで体内へと輸送され、血中へと移行する。このようにして、シュークラーゼ−イソマルターゼ複合体は糖類の消化、吸収に関与している。なお、シュークラーゼ−イソマルターゼ複合体は１分子中に、シュークロース、イソマルトースのそれぞれの加水分解を触媒しうる２つの触媒部位を有し、マルトースはその双方の部位に基質として利用されるため、マルターゼ活性を測定することで該分子の挙動を見ることができる。
【０００６】
従来、シュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性に対して強い阻害活性を示す物質としては、ＡＯ−１２８、アカルボース等が知られており、抗肥満、抗糖尿等に有用な物質として報告されている（Satosi Horii et al.、ジャーナル  オブ  メディシナル  ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry) 、29巻、1038〜1046頁、 1986年 ; Shigenori Fujioka et al.、インターナショナル  ジャーナル  オブ  オベシティー（International Journal of Obesity)、  15巻、59〜65頁、 1991年 ;  合田敏尚等、「栄養と食糧」、34巻、 139 〜143 頁、 1981年) 。
【０００７】
従って、シュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性を阻害する活性を有する化合物は、抗肥満薬、抗糖尿病薬として有用である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは微生物二次代謝産物中より小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性、及びシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性を阻害する活性を有する物質を検索した結果、土壌より分離したロドコッカス属に属するＳＡＮＫ６１６９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７５１）の培養液中に、小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性、及びシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性を阻害する活性を有する新規化合物Ａ−７６２０２が生産されることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
更に、本発明の他の目的は、Ａ−７６２０２またはその塩を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤、特に抗ＡＩＤＳ剤、抗腫瘍剤、またはシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性の阻害剤、特に抗肥満剤、抗糖尿病剤を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）下記式（Ｉ）で表わされる新規化合物Ａ−７６２０２またはその塩、：
【００１１】
【化２】
0003687929.tif 000002
【００１２】
（２）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するＡ−７６２０２の生産菌を培養し、その培養物よりＡ−７６２０２を採取することを特徴とするＡ−７６２０２の製造法、
（３）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するＡ−７６２０２生産菌がロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株である（２）に記載の製造法、
（４）ロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＳＡＮＫ６１６９４株に関する。
【００１３】
本発明のＡ−７６２０２は下記の物理化学的性状を有する。
１）性質；白色粉末。
２）溶解性；ジメチルスルホキシドに可溶。水、メタノール、アセトンに難溶。３）分子式；Ｃ20Ｈ18Ｏ9 （高分解能マススペクトルにより測定）
４）分子量；  ４０２（ＦＡＢ−ＭＳスペクトルにより測定）
５）紫外線吸収スペクトル；λmax ｎｍ
水溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２５９ｎｍに極大吸収を示し、２５９ｎｍにおける吸光係数（Ｅ1%1cm ）は６８７である。
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）；νmax ｃｍ-1
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである。
３３４８、２９４３、１６２７、１６０１、１５７４、１５１５、
１２８４、１２１２、１０７８、１０３６、９６９
７） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ (ｐｐｍ)
重ジメチルスルホキシド溶液中（ジメチルスルホキシド内部基準：２．４９ｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである。  3.46(1H, dd, J=5.5, 11.8Hz), 3.57(1H, dd, J=3.5, 11.8Hz),
3.84(1H, dd, J=3.8, 6.0Hz), 3.96(1H, ddd, J=3.5, 5.5, 6.0Hz),
4.28(1H, dd, J=1.0Hz以下, 3.8Hz), 5.60(1H, d, J=1.0Hz 以下),
6.81(2H, d, J=8.5Hz), 7.23(1H, d, J=8.8Hz), 7.39(2H, d, J=8.5Hz),
7.53(1H, d, J=8.8Hz), 8.37(1H, s)
８）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ（ｐｐｍ）
重ジメチルスルホキシド溶液中（ジメチルスルホキシド内部基準：３９．５ｐｐｍ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである。
61.14, 76.66, 81.34, 85.95, 107.16, 114.44, 114.9(3C), 119.58, 122.41,
123.17, 130.05(2C), 136.15, 146.03, 147.58, 153.01, 157.17, 175.15
９）高速液体クロマトグラフィー
分離カラム；センシューパック ODS-H-2151 （φ6 ×150mm ，センシュー科学（株）製）
移動相；  １６％アセトニトリル−水
流速；  １．５ｍｌ／分
検出波長；  ２１０ｎｍまたは２５９ｎｍ
温度；  ２５℃
保持時間；  １６．２２分。
【００１４】
本発明の前記構造式（Ｉ）を有する化合物Ａ−７６２０２は、常法にしたがって塩にすることができる。そのような塩としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩；カルシウム、バリウムのようなアルカリ土類金属塩；マグネシウム塩；アルミニウム塩；等の無機塩またはアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ジシクロヘキシルアミンのようなアミン塩；リジン、アルギニンのような塩基性アミノ酸塩；等の有機塩基塩などをあげることができる。好適には薬理上許容しうる塩である。
【００１５】
なお、本発明の化合物Ａ−７６２０２は、種々の異性体を有する。化合物Ａ−７６２０２においては、これらの異性体およびこれらの異性体の混合物がすべて単一の式で示されている。従って、本発明においてはこれらの異性体およびこれらの異性体の混合物をもすべて含むものである。
【００１６】
また、本発明の化合物Ａ−７６２０２は、大気中に放置したり、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合がある。本発明はこのような水和物をも包含する。
【００１７】
本発明の化合物Ａ−７６２０２の製造法において用いられるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ) 属に属する菌株としては、例えばロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．) ＳＡＮＫ  ６１６９４株（以下、「ＳＡＮＫ  ６１６９４株」という。）を挙げることができる。ＳＡＮＫ  ６１６９４株は茨城県つくば市筑波山東腹の土壌から土壌希釈法によって分離された。
【００１８】
ＳＡＮＫ  ６１６９４株の菌学的性状は、次の通りである。
【００１９】
１．形態学的性状
ＳＡＮＫ  ６１６９４株は、菌株同定用寒天培地上２８℃、７ないし１４日間の培養において普通もしくは貧弱に生育する。コロニーはラフ型を示す。基生菌糸はジグザグ状に伸長し分岐する。基生菌糸は茶味白ないし薄黄味橙色を示す。気菌糸は着生しない。ＳＡＮＫ  ６１６９４株はイースト・デキストロース液で２８℃、２日間の培養において菌糸の分断が観察され、断片はおよそ０．６〜
０．８×０．８〜３．５μｍであり、表面は平滑である。胞子のう、菌核、車軸分岐等の特殊器官は認められない。
【００２０】
２．各種培養基上の諸性質
各種培養基上で２８℃、１４日間培養後の性状は表１に示した通りである。色調の表示はマンセル方式による日本色彩研究所版「標準色表」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。
【００２１】
【表１】
0003687929.tif 000003
0003687929.tif 000004
【００２２】
３．生理学的性質
２８℃で培養後、２ないし２１日間に観察したＳＡＮＫ  ６１６９４株の生理学的性質は表２に示した通りである。
【００２３】
【表２】
0003687929.tif 000005
0003687929.tif 000006
また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ  ９）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ  ６１６９４株の炭素源の資化性は表３に示す通りである。
【００２４】
【表３】
0003687929.tif 000007
４．菌体成分について
ＳＡＮＫ  ６１６９４株の細胞壁は、ビー・ベッカーらの方法（B. Becker et al.、アプライド  マイクロバイオロジー（Applied Microbiology）、12巻、421 〜423 頁、1964年）に従い検討した結果、メソ−ジアミノピメリン酸が検出された。また、ＳＡＮＫ  ６１６９４株の全細胞壁中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの方法（M. P. Lechevalier 、ジャーナル  オブ  ラボラトリー  アンド  クリニカル  メディスン（Journal of Laboratory & Clinical Medicine ）、71巻、834 頁、1968年）に従い検討した結果、アラビノースとガラクトースが検出された。ミコール酸の存在が確認された。細胞壁ペプチドグリカン中のムラミン酸のアシル基型はグリコリル型であった。また、主要メナキノン成分としてＭＫ−８（Ｈ２）が検出された。ＤＮＡのＧＣ含量は６９．５％であった。
【００２５】
ＩＳＰ〔ジ・インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（The International Streptomyces Project）〕基準、バージーズ・マニュアル・オブ・システマテック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）第４巻、ワックスマン（S.A.Waksman ）著、ジ・アクチノミセテス（The Actinomycetes ）第２巻および放線菌に関する最近の文献によって同定を行い、本菌株が放線菌の中でもロドコッカス属に属すると判断した。そこで、本菌株をロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｓｃｃｕｓ  ｓｐ．) ＳＡＮＫ  ６１６９４株と命名した。なお、本菌株は１９９４年７月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７５１を付された。
【００２６】
周知のとおり、放線菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こし易く、本発明のＳＡＮＫ  ６１６９４株もこの点は同じである。本発明にいうＳＡＮＫ  ６１６９４株はそのすべての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば、組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ち、Ａ−７６２０２を生産する、ＳＡＮＫ  ６１６９４株およびその変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ  ６１６９４株に包含されるものである。
【００２７】
【発明の実施の形態】
１．培養
Ａ−７６２０２を得るため、これらの微生物の培養は、他の醗酵生成物を生産するために用いられるような培地中で行う。このような培地中には、微生物が同化できる炭素源、窒素源及び無機塩を含有する。
一般に、炭素源としてグルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニトール、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いる事ができる。一般には、培地量の１〜１０重量％で変量する。
【００２８】
窒素源としては、一般に蛋白質およびその加水分解物を含有する物質または無機塩を醗酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単一または併用して培地量の０．２〜１０重量％の範囲で用いる。
【００２９】
培地中にとり入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類である。また、カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属も含む。
【００３０】
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。ＳＡＮＫ  ６１６９４株を培養し、Ａ−７６２０２を生産する培地のｐＨは、５．０〜８．０に変化できる。
【００３１】
本菌株は７℃ないし３４℃の範囲で生育し、特に１４℃ないし２９℃の範囲で良好である。更にＡ−７６２０２の生産には２２℃ないし２８℃が好適である。Ａ−７６２０２は、好気的に培養して得られるが、通常用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振盪培養法、通気撹拌培養法等が用いられる。
【００３２】
小規模な培養においては、２８℃で数日間振盪培養を行うのが良好である。培養は、三角フラスコ中で、一段階または複数段階の種培養の発育工程により開始する。種培養フラスコは定温インキュベーター中で数日間、または充分に成長するまで振盪培養する。成長した種培養液は、その一部または全部を次段階の種培地または生産培地に接種するのに使用される。接種した生産培地を含むフラスコを一定温度で数日間振盪培養し、培養終了後、フラスコの含有物を遠心分離またはろ過により分別する。
大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を付けた適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれば、栄養培地をタンクの中で作製することができる。栄養培地を１２５℃まで加熱して滅菌し、冷却後この滅菌培地に、あらかじめ成長させてあった種培養液を接種する。培養は２８℃で通気撹拌して行う。この方法は多量の化合物を得るのに適している。
【００３３】
培養の経過に伴って生産されるＡ−７６２０２の量の経時変化を知るには、例えば培養液をろ過して得たろ液を酸性で酢酸エチルを用いて抽出し、濃縮、乾固した油状物中のＡ−７６２０２の量を小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験、または高速液体クロマトグラフィーに付して測定する。通常は９６時間から１６８時間の培養でＡ−７６２０２の生産量は最高値に達する。
【００３４】
２．抽出精製
培養終了後、培養液中の液体部分に存在するＡ−７６２０２は、菌体、その他の固形部分を、珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ液または上清中に存在するＡ−７６２０２を、その物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。
例えば、ろ液または上清中に存在するＡ−７６２０２をイオン交換樹脂、例えばアンバーライトＩＲＣ−５０、ＣＧ−５０（ローム・アンド・ハース社製）、ダウエックス５０ＷＸ４、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ（ダウケミカル社製）の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ−７６２０２を吸着させた後、アンモニア水を用いて溶出させることにより得られる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（三菱化成（株）社製）等が使用される。Ａ−７６２０２を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ−７６２０２を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることにより得られる。また、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の有機溶剤により抽出することによっても得られる。
【００３５】
このようにして得られたＡ−７６２０２は、更にシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相カラム、イオン交換カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【００３６】
本発明のＡ−７６２０２の精製における所在は次に挙げる各々の方法によって測定することができる。
【００３７】
１）小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験（１）
ラット肝臓ミクロソーム画分のトリトンＸ−１００可溶化処理液を酵素液とし、トリチウム標識グルコースを含む水疱性口内炎ウイルス糖蛋白質を基質として各被検試料存在下でα−グルコシダーゼ反応を進行させる。トリクロロ酢酸水溶液を添加して反応を停止させ、蛋白質を不溶化して、ポアサイズ０．６５μｍのメンブランフィルターでろ過したろ液中の遊離グルコースの放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて計測する。阻害剤を含まない反応液の放射活性と比較して、被検試料の酵素活性の阻害率を算出する。
【００３８】
２）小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験（２）
ラット肝臓ミクロソーム画分のトリトンＸ−１００可溶化処理液を酵素液とし、パラニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシドを基質として各被検試料存在下でα−グルコシダーゼ反応を進行させる。ｐＨ  １０の緩衝液を加えて反応を停止させ、４１５ｎｍの吸光度を計測して遊離パラニトロフェノールの量を求める。阻害剤を含まない反応液の遊離パラニトロフェノ−ル量と比較して、試料の酵素活性の阻害率を算出する。
【００３９】
３）高速液体クロマトグラフィーを用いる方法
分離カラム；センシューパック ODS-H-2151(φ6 ×150mm,センシュー科学（株）製）  移動相；  １６％アセトニトリル−水
流速；  １．５ｍｌ／分
検出波長；  ２１０ｎｍ
温度；  ２５℃
保持時間；  １６．２２分。
【００４０】
本発明のＡ−７６２０２またはその塩は、文献未載の新規化合物であり、小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性を有する。従って、Ａ−７６２０２またはその塩は抗ＡＩＤＳ薬、抗腫瘍薬としての用途に有用である。また、Ａ−７６２０２はシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性を阻害する活性も有する。従って、Ａ−７６２０２またはその塩は抗肥満薬、抗糖尿病薬としての用途に有用である。本発明は特に、Ａ−７６２０２またはその塩を有効成分として含有するα−グルコシダーゼ阻害剤、特に抗ＡＩＤＳ剤、抗腫瘍剤を提供する。
【００４１】
その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与、また注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点眼剤、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、コーティング剤等既知の医薬製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日１ｍｇから１０００ｍｇを一回または数回にわけて投与することが好ましい。
【００４２】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００４３】
実施例  １．
（Ａ）培養
ロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．) ＳＡＮＫ  ６１６９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７５１）を培地組成−１で示される培地８０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコ２本に、スラントより一白金耳接種し、
２１０ｒｐｍ回転振盪培養機で、２８℃で１２０時間培養し種培養液とした。
【００４４】
0003687929.tif 000008
培地組成−２で示される培地を５００ｍｌ容三角フラスコ６０本に１００ｍｌづつ入れ、１２０℃で４０分間加熱滅菌した。これを２８℃に冷却した後、種培養液  ２ｍｌを接種した。次いで２１０ｒｐｍの回転振盪培養機で２８℃で
１４４時間培養した。
【００４５】
0003687929.tif 000009
（Ｂ）単離
得られた培養液６リットルにろ過助剤としてセライト  ５４５（ジョンズ  マンビル  プロダクト  コーポレーション製）を０．３ｋｇ加えてろ過し、ろ液
４．６５リットルを得た。塩酸を用いてｐＨ  ４．０に調整したろ液を、ダウエックス５０ＷＸ４（Dowex50WX4（H+）)   ４６０ｍｌを充填したカラムに供与してＡ−７６２０２を吸着させ、脱イオン水  １．５リットルで洗浄後、０．５Ｎアンモニア水溶液で溶出を行った。最初の６００ｍｌを除き、以後の１．３リットルの溶出液を集め、減圧下濃縮し１５ｍｌとした。
【００４６】
次いでこの濃縮液をアンバーライトＣＧ−５０ (ＮＨ4+）  ５００ｍｌを充填したカラムに供与し、脱イオン水で展開溶出し、溶出液を２０ｍｌづつ分画した。後述の方法（α−グルコシダーゼ阻害試験（その１），（その２）および高速液体クロマトグラフィー）により分析を行い、Ａ−７６２０２の存在が確認されたフラクション２９、３０を集めた。活性画分を減圧下で濃縮後、凍結乾燥を行い、Ａ−７６２０２を含む粗粉末  １４３．６ｍｇを得た。
この粗粉末を２０ｍｌの蒸留水に溶解し、塩酸を用いてｐＨ  ４．０に調整して、再度アンバーライトＣＧ−５０（ＮＨ4+）  ５００ｍｌを充填したカラムで精製して、粉末  ４８．２ｍｇを得た。
次いでこの粉末をＨＰＬＣを用いて分取し精製した。ＨＰＬＣカラム（センシューパック  ＯＤＳ−Ｈ−５２５１）を１６％アセトニトリル−水で平衡化し、これに、粉末を蒸留水に溶解して１．５ｍｌとした試料溶液のうち０．３ｍｌを注入した。１６％アセトニトリル−水を移動相として流速８ｍｌ／分で溶出し、検出波長２１０ｎｍでモニターして、保持時間４２分から４４分の溶出液を集めた。残りの試料溶液  １．２ｍｌについても同様に操作した。計５回のＨＰＬＣを用いた分取により得た溶出液を濃縮、凍結乾燥することにより、Ａ−７６２０２の白色粉末  １．１ｍｇを得た。
【００４７】
この白色粉末の一部を取り、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、下記の結果を得た。
【００４８】
分離カラム; センシューパック ODS-H-2151 (6φ×150mm,センシュー科学（株）製）  移動相；  １６％アセトニトリル−水
流速；  １．５ｍｌ／分
検出波長；  ２１０ｎｍ
温度；  ２５℃
保持時間；  １６．２２分。
【００４９】
実施例  ２．
（Ａ）培養
培地組成−３で示される培地１５リットルを３０リットル容ジャーファーメンター４基に仕込み、１２０℃で３０分間加熱滅菌した。これを２８℃に冷却した後に、実施例１．と同様に調製した種培養液  １５０ｍｌを接種した。そして溶存酸素量５ｐｐｍを保持させるように回転数を１００〜１１０ｒｐｍの範囲内で調整し、 通気量１５リットル／分、３０℃で、 １２０時間攪拌培養した。
【００５０】
0003687929.tif 000010
（Ｂ）単離
得られた培養液  ５６リットルにろ過助剤としてセライト５４５( ジョンズ  マンビル  プロダクト  コーポレーション製）  ３ｋｇを加えてろ過することにより、ろ液  ５２リットルを得た。このろ液を塩酸でｐＨ  ４．０に調整し、ダウエックス５０ＷＸ４（Ｈ+ ）  ６リットルを充填したカラムに供与してＡ−７６２０２を吸着させた。
カラムを脱イオン水  ２５リットルで洗浄後、０．５Ｎアンモニア水溶液で溶出を行った。溶出液は３リットルづつ分画し、活性フラクション２〜６を集めて濃縮し、３００ｍｌとした。
この濃縮液に塩酸を加えてｐＨを７．０に調整し、アンバーライト  ＣＧ−５０（ＮＨ4+）  ９リットルを充填したカラムに供与してＡ−７６２０２を吸着させ、脱イオン水で展開溶出した。最初の４．４リットルを除去後、１８ｍｌずつ分画した。Ａ−７６２０２を含むフラクション３０〜８５を集め、減圧下濃縮し、凍結乾燥を行って粗粉末  ２３．４ｇを得た。
これを脱イオン水  ５００ｍｌに溶解し塩酸でｐＨを２．５に調整し酢酸エチル  ５００ｍｌで３回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、減圧下濃縮して１００ｍｌとした。濃縮液に水  １３０ｍｌを加えた後、更に水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを９．５に調整してＡ−７６２０２を逆抽出し、水層を７０ｍｌに濃縮して塩酸でｐＨを６．９に調整した。
【００５１】
次いで、１００ｍｌのＨＰ−２０を充填したカラムに供与して吸着させ、水洗後、更に１０％アセトン水  ３００ｍｌで洗浄してから、５０％アセトン水で溶出し１００ｍｌずつ分画した。活性フラクション２、３を集め減圧下濃縮、凍結乾燥して７３．７ｍｇの粉末を得た。
この粉末  ６０ｍｇを１５ｍｌの水に溶解し、あらかじめ５％アセトニトリル−水で平衡化したコスモシール１４０Ｃ18−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）
４０ｍｌを充填したカラムに吸着させた。５％アセトニトリル−水  ５４０
ｍｌで洗浄後、１０％アセトニトリル−水で溶出し、溶出液を２０ｍｌずつ分画した。活性フラクション３６〜４４を集め、減圧下濃縮し、凍結乾燥を行ってＡ−７６２０２の白色粉末  ２０ｍｇを得た。
【００５２】
この白色粉末の一部を取り高速液体クロマトグラフィーで分析したところ下記の結果を得た。
【００５３】
分離カラム; センシューパック ODS-H-2151 (6φ×150mm,センシュー科学（株）製）  移動相；  １６％アセトニトリル−水
流速；  １．５ｍｌ／分
検出波長；２１０ｎｍ
温度；  ２５℃
保持時間；  １６．２２分。
【００５４】
【発明の効果】
試験例  １．  小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験（その１）
トリチウム標識グルコースを含む糖鎖を有するウイルス蛋白質を基質とし、遊離した標識グルコースの放射活性を測定することで酵素活性を求めた。
【００５５】
ウィスター系ラットの肝臓  １５ｇを細切し、０．２５Ｍシュークロース、０．５ｍＭジチオスレイトールを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）  ６０ｍｌ中で、テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした。これを１，８００×ｇ，１０分の遠心分離に供して上清を得た。この上清を、１５，０００×ｇ, ３０分の遠心分離に供して上清を得た。
【００５６】
この上清を１２０，０００×ｇ, ６０分の遠心分離に供して沈渣を得た。この沈渣に１０％  グリセロール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．５μＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）  ６０ｍｌを加えてホモゲナイズし、再度１２０，０００×ｇ, ６０分の遠心分離に供した。得られた沈渣に１０％グリセロール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．５μＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）  ６０ｍｌを加えてホモゲナイズしたものを肝臓ミクロソーム画分とした。
【００５７】
この肝臓ミクロソーム画分を、２％トリトンＸ−１００存在下で、テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした。プロテインアッセイ（バイオラッド社製）により牛血清アルブミンを標準試料として換算し、蛋白質濃度３．４ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含んだ１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）で希釈したものを酵素液とした。
【００５８】
カングらの方法（M. S. Kang et al., Analytical Biochemistry, 184 巻, 109 〜112 頁 (1989年) ）に従ってトリチウム化グルコースで水疱性口内炎ウイルスをラベルした。すなわち、水疱性口内炎ウイルスを感染させたＢＨＫ細胞を、培養面積１５０ｃｍ2 の培養ボトル１８個に接種して２４時間培養した。これら１８個の培養ボトルから回収した培養上清を１００，０００×ｇ、２時間の遠心分離処理に供し、ウイルスを含む沈渣を得た。これを蒸留水に溶解後、トリクロロ酢酸で沈殿させた。この沈殿を０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、５ｍＭジチオスレイトール存在下で、ｐＨ  ７に調整した溶液  ７ｍｌを基質液とした。
【００５９】
以下、希釈等の操作には、２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）を使用した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、被検試料溶液  ５μｌ、酵素液  １０μｌ、基質液の５倍希釈液  １０μｌおよび上記緩衝液  ７５μｌを加え、総計  １００μｌとして、反応を開始した。３７℃で６０分静置して反応を進行させた後、１０ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン水溶液と５０％トリクロロ酢酸水溶液をそれぞれ２５μl ずつ分注し、α−グルコシダーゼ反応を停止した。４℃で６０分静置した後、マルチスクリーンアッセイシステム（ミリポア社製）を用いて、ポアサイズ  ０．６５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。ろ液  １００μｌ中に含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて計測した。阻害剤を含まない反応液の放射活性と比較し、被検試料の酵素活性の阻害率を算出した。
この方法においてＡ−７６２０２が小胞体α−グルコシダーゼを５０％阻害する濃度は８．１ｎｇ／ｍｌであった。
【００６０】
試験例  ２．  小胞体α−グルコシダーゼ阻害試験（その２）
試験例  １．で調製した、ラット肝臓ミクロソーム画分を、２％トリトンＸ−１００存在下で、テフロンホモゲナイザーを用いてホモゲナイズした。プロテインアッセイ（バイオラッド社製）により牛血清アルブミンを標準試料として換算し、蛋白質濃度  ２．６ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８) で希釈したものを酵素液とした。
【００６１】
希釈等の操作には、２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．８）を使用した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、被検試料溶液  ５μｌ、酵素液  １０μｌ、１０ｍＭパラニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド溶液  ５０μｌと緩衝液  ８５μｌを加え、総計  １５０μｌとして、反応を開始した。３７℃で２０分静置して反応を進行させた後、４Ｍグリシンナトリウム緩衝液（ｐＨ  １０）を２０μｌ分注して、反応を停止させた。
【００６２】
４１５ｎｍの吸光度を計測して遊離パラニトロフェノールの量を求め、阻害剤を含まない反応液の遊離パラニトロフェノール量と比較し、試料の酵素活性の阻害率を算出した。
【００６３】
この方法においてＡ−７６２０２が小胞体α−グルコシダーゼを５０％阻害する濃度は４．７ｎｇ／ｍｌであった。
【００６４】
試験例  ３．  ラットシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性に対する阻害試験
ケスラーらの方法（M.Kessler et al.、ビオキミカ  エト  ビオフィジカ  アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)、 506 巻、136〜154 、 1978年）に従い、ウイスター（Wistar）系ラット（雄）の小腸より小腸刷子縁膜酵素液を調製した。これをコリンスカとクラムルの方法（J. Kolnska and J.Kraml、 ビオキミカ  エト  ビオフィジカ  アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)、284巻、235〜247、 1972 年) に従い、ペプシン処理後、セファデックスＧ−２００カラムで２回精製を行なった。この操作を通じて、シュークラーゼ活性、イソマルターゼ活性、マルターゼ活性が同一の溶出画分に見られた。この結果は、シュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が同時にマルターゼ活性を有するとする文献（J. Kolinska and J.Kraml、ビオキミカ  エト  ビオフィジカ  アクタ（Biochimica et Biophysica Acta)、284巻、235〜247、 1972 年）により知られている事実に適合した。こうして得たシュークラーゼ−イソマルターゼ複合体画分を酵素液として用いた。
【００６５】
４−アミノアンチピリンはシグマ社より、ペルオキシダーゼ（Grade Ｉ)、グルコースオキシダーゼ（Grade Ｉ) はベーリンガーマンハイム社より購入したものを用いた。以下、希釈等の操作には、２０ｍＭクエン酸−４０ｍＭリン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．２) を使用した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、牛血清アルブミン  ０．２ｍｇ, グルコースオキシダーゼ  ３ｕｎｉｔ，ペルオキシダーゼ  ０．１３２ｕｎｉｔ，４−アミノアンチピリン  ２０μｇ，フェノール  ４０μｇ，マルトース  ３μmoleを含む前記の緩衝液  １２５μｌと被検試料溶液  ５μｌを加え、総計  １３０μｌとした。次いで、これに酵素液  ２０μｌ（総活性  ０．００１ｕｎｉｔ（国際単位））を加えて、反応を開始した。
これを３７℃で２０分間反応させ、遊離したグルコースの濃度を４９２ｎｍの吸光度変化を測定することにより定量した。阻害剤を含まない反応液のグルコース遊離量と比較し、被検試料の酵素活性の阻害率を算出した。
【００６６】
この方法においてＡ−７６２０２がマルターゼ活性を５０％阻害する濃度は１．２μｇ／ｍｌであった。
【００６７】
以上のように本発明のＡ−７６２０２またはその塩は顕著な小胞体α−グルコシダーゼ阻害活性を有するので、抗ＡＩＤＳ剤、抗腫瘍剤として有用である。更に、シュークラーゼ−イソマルターゼ複合体が示すマルターゼ活性を阻害する活性を有しているので、抗肥満剤、抗糖尿病剤等として有用である。