(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絹フィブロインを溶解した中性塩水溶液に、共重合可能なビニルモノマーを加えて、４０から７０℃に段階的に昇温して重合し、得られたゲル状の絹フィブロイン重合物中の水分を、乾燥速度を制御しながら徐々に蒸発固化し塊状物とした後に、該塊状物内に含まれる未反応物の除去および脱塩処理をすることを特徴とする絹フィブロイン塊状物の製造方法。
【請求項２】
共重合可能なモノマーが、スチレン、メチル（メタ）アクリレイト、メタアクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレイト、ヒドロキシプロピルメタクリレイト、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドから選ばれる少なくとも１種類であることを特徴とする請求項１記載の絹フィブロイン塊状物の製造方法。
【請求項３】
共重合可能なモノマーが、ヒドロキシエチルメタクリレイト及びヒドロキシプロピルメタクリレイトから選ばれる少なくとも１種類であることを特徴とする請求項１記載の絹フィブロイン塊状物の製造方法。
【請求項４】
前記絹フィブロイン中性塩水溶液に、共重合可能なビニルモノマーの他に架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレイト、テトラエチレングリコールジメタクリレイト、アリルメタクリレイトおよびトリメチロールプロパントリメタクリレイトから選ばれる少なくとも１種類を加えることを特徴とする請求項１記載の絹フィブロイン塊状物の製造方法。
【請求項５】
前記中性塩水溶液の中性塩濃度が４．０ｍｏｌ／Ｌ〜飽和溶液であり、絹フィブロインの溶解温度が４０〜９８℃であることを特徴とする請求項１記載の絹フィブロイン塊状物の製造方法。
【請求項６】
前記中性塩水溶液の中性塩濃度が８．０ｍｏｌ／Ｌ〜９．０ｍｏｌ／Ｌであり、絹フィブロインの溶解温度が４０〜５０℃であることを特徴とする請求項１記載の絹フィブロイン塊状物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、絹フィブロイン塊状物の製造方法に関するものであり、さらに詳しくは、絹フィブロインと共重合性ビニルモノマーとを重合させて得られる絹フィブロイン塊状物の製造方法および該塊状物から作成したコンタクトレンズに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
家蚕等から得られる絹フィブロインは、昆虫由来の絹蛋白質であり、特殊なアミノ酸配列を持つために、他の生体高分子材料とは異なる高次構造をとるものである。そのため、単一の単位を繰返して構成される有機高分子物質の機能とは多くの点で異なっている。
【０００３】
すなわち、絹蛋白質表面では、抗血液凝固性があり、生体細胞の付着増殖性がが優れているので生体適合性が良好で安全な素材として医療材料や生化学的材料、例えば、酵素固定膜、透析膜、人工皮膚、人工角膜、コンタクトレンズ、医療カプセル等の材料としての応用が期待されているものである。
【０００４】
絹フィブロインのコンタクトレンズ（以下、ＣＬという）への利用としては、絹蛋白質の親水的な生化学特性を活かした、絹フィブロイン膜によるＣＬ表面の親水化処理技術が開示されており（特開平４−４３９２１号公報）、また、特開平５−３１３１０５号公報には絹フィブロイン固形物によりＣＬを作成する方法、さらに、絹フィブロイン水溶液の蒸発速度を制御することで、光学的にも機械的にも均質で光学的歪のない絹フィブロイン塊状物よりＣＬを作成する方法も開示されている（特開平７−３１４５６９号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の方法ではＣＬとしての形状は得られるものの、その性能は満足のいくものではなかった。すなわち、上記の方法で形成したＣＬは乾燥状態で使用するには機械的強度等が不十分であり、湿潤状態で使用するには含水率や引張強度等に問題があった。
【０００６】
また、絹フィブロインを含水性ＣＬとして使用するために、含水性ＣＬ材料としては公知であるヒドロキシエチルメタクリレイト（以下、ＨＥＭＡという）と共重合させることも考えられた。
【０００７】
しかし、精練した絹フィブロインを中性塩に溶解した後に、該中性塩を透析して脱塩した絹フィブロイン水溶液と水溶性モノマーであるＨＥＭＡとを混合すると両者の間に水素結合ができたり、絹フィブロイン／ＨＥＭＡの混合系を対象に従来の方法で重合反応を進めると両者間での分子相互作用が高まり、絹フィブロインがＨＥＭＡの重合物中に沈殿物として析出してしまうという問題があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明は、かかる課題を解決するために検討した結果、ＣＬ用材料として有用な絹フィブロインを製造する方法を見い出した。すなわち、中性塩が存在する絹フィブロイン水溶液中で絹フィブロインと共重合可能なビニルモノマーをグラフトさせるという方法である。以下、グラフトさせる共重合可能なビニルモノマーをグラフト用モノマーという。
【０００９】
絹フィブロインとグラフト用モノマーとを中性塩水溶液で効果的に重合させ塊状物を得るには、精練した絹フィブロインとグラフト用モノマーから得られるゲル状の重合物中の水分を、その蒸発速度を制御しながら乾燥させ塊状物とした後に、脱塩処理するという順序で絹フィブロインとグラフト用モノマーを重合させるとＣＬの素材として良好な重合物が得られるというものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、繭糸、絹糸を精練して調整した絹フィブロインを中性塩水溶液に溶解させた後、該中性塩水溶液から金属イオン等を脱塩処理により除去することなく、絹フィブロインを含む中性塩水溶液に重合性に富むグラフト用モノマーを混合し、重合開始剤を添加し、あるいは必要に応じて架橋剤を加え、得られたゲル状重合物を乾燥固化させ塊状物とした後に未反応物および金属イオン等を除去するという方法により本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明においては、重合反応が進行しても中性塩が混在する絹フィブロインとＨＥＭＡ等のグラフト用モノマーとの混合系が沈殿物として析出しないのは、次の理由によるものと思われる。絹糸では、近接分子間に水素結合が多数形成されており、また分子が良く引き揃えられており、分子間の凝集密度が高いため絹糸は水に溶解しない。ＬｉＢｒを中性塩に選んだ場合、Ｌｉ＋  が近接分子間の水素結合を切断し、絹フィブロインの分子鎖が解けるので水溶化する。溶液中に存在する中性塩が絹フィブロイン分子間の水素結合の再結合を妨げるためＨＥＭＡとの重合反応が進行しても中性塩が混在する絹フィブロイン溶液中では沈殿物として析出することはない。
【００１２】
ここで近接分子間とは、蛋白質の主鎖を構成するペプチド結合のＣＯと他の主鎖のＮＨ間を意味する。場合によっては、例えば絹フィブロインを構成するアミノ酸残基側鎖のＯＨと他のアミノ酸側鎖のＯＨとの間を意味することもある。
【００１３】
【発明の実施の形態】
絹フィブロインを溶解する中性塩としては、種々の金属塩であれば種類を問わず利用できるが、好ましいものとしては、ＬｉＢｒ、ＬｉＳＣＮ、ＺｎＣｌ２  、ＣａＣｌ２  、ＭｇＣｌ２  、ＮａＳＣＮが例示できる。絹糸の溶解性が最も良いものは、Ｌｉイオンであるので、特に望ましいものは、ＬｉＢｒおよびＬｉＳＣＮである。
【００１４】
絹フィブロイン繊維の溶解性は、溶解用として用いる中性塩の種類により異なる。色々ある中性塩の陽イオンの中で絹フィブロイン繊維を良好に溶解するのは、Ｌｉ＋  である。中性塩としてはＬｉＢｒが好んで用いられる。中性塩の濃度と溶解温度の組み合わせで溶解時間が決まる。例えば、４．０ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ溶液に０．５重量％となるように絹フィブロイン繊維を加え、溶液を沸騰させると１５分で繊維は完全に溶解する。６．０ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ溶液では、５分で完全に溶解する。従って、中性塩濃度としては、４．０ｍｏｌ／Ｌ〜飽和溶液が好ましく、絹フィブロインの溶解温度は４０〜１００℃が好ましい。
【００１５】
さらには、中性塩の水溶液で絹フィブロイン繊維を溶解するには、中性塩濃度と溶解温度との組合せを工夫して絹フィブロインの変性程度が軽微となるように最適条件を設定することが特に好ましい。
【００１６】
天然の絹フィブロインの特性を活用した絹フィブロイングラフト重合物を調製するには、変性程度の少ない絹フィブロインを用いることが好ましいので、できるだけ穏やかな条件で絹フィブロインを溶解する。本発明では、４ｍｏｌ／Ｌ濃度のＬｉＢｒでも８０℃で１時間処理をすると絹フィブロインは溶解することが確かめられている。絹フィブロイン繊維の溶解条件は生成する重合物の特性に影響を及ぼすので中性塩の濃度および溶解温度並びに溶解時間は目的に合わせて調整すればよいが、特に好ましくは、中性塩濃度が８．０〜９．０ｍｏｌ／Ｌ程度であり、絹フィブロインの溶解温度が４０〜５０℃程度である。
【００１７】
例えば、８．５ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒであれば４０℃で２０分、５０℃では１０分で絹フィブロイン繊維を溶解させる。１０ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒでは、４０℃で１５分、５０℃では８分で溶解させる。この中性塩の濃度が高すぎたり、溶解時間が長すぎたりすると絹フィブロインが低分子化して絹蛋白質本来の特性が絹フィブロイン塊状物の機能に発揮できないことがある。
【００１８】
重合開始剤としては、蛋白質分子側鎖にグラフト反応の拠点となるラジカルを作るものであれば種類を問わず利用できる。一例を挙げると、アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、アゾビスジメチルバレロニトリル、ベンゾイルパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、各種光増感剤等がある。
【００１９】
グラフト反応を適切に制御でき、かつグラフト効率を上げるためには、これらの重合開始剤のうち、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ベンゾイルパーオキサイド（ＢＰＯ）、あるいは過硫酸カリウムが特に好ましい。
【００２０】
重合開始剤の濃度は、調製する絹フィブロイン塊状物の理化学的な特性が失われない範囲のものであれば良く、通常は、３００〜２０００ｐｐｍである。重合開始剤の濃度が高すぎると生成する絹フィブロイン塊状物が着色したり、その機械的特性が劣化する等の問題が生ずる。特に好ましい重合開始剤の濃度は４００〜８００ｐｐｍである。
【００２１】
本発明は、好ましくは、精練した絹フィブロインを０．１〜３重量％、グラフト用モノマーを４０〜７０重量％を含む混合溶液を、金属イオン等や重合開始剤の存在下でグラフト重合して得られるゲル状物質の乾燥速度を制御しながら、該ゲル状物質中の水分を蒸発固化させることで絹フィブロイン塊状物を得るものである。
【００２２】
絹フィブロイン塊状物の力学的特性は、両者の混合重量比を変えることで自由に調整できる。すなわち、絹フィブロイン量が増すと、絹フィブロイン塊状物は若干脆くなるが、絹フィブロインの生化学特性に基づく細胞付着性、気体透過性、生体細胞に対する適合性等は向上する。絹フィブロインの量は、少なすぎると塊状物の特性は良くならない。
【００２３】
そのため、絹フィブロイン塊状物の機能特性、力学的特性を向上させるためには、絹フィブロイン含有率は、より好ましくは０．５〜１．０重量％、特に好ましくは０．５〜０．８重量％である。一方、グラフト用モノマーの含有率は５０〜７０重量％が特に好ましい。
【００２４】
本発明に利用できるグラフト用モノマーとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレイト、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレイト、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレイト、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドなどの親水性モノマーであってもよいし、スチレン、メチル（メタ）アクリレイト、ｎ−ブチル（メタ）アクリレイト、トリデシル（メタ）アクリレイト、２，２，２−トリフルオロエチル（メタ）アクリレイトなどの水不溶性モノマーであっても同様に利用できる。
【００２５】
水溶性モノマ−を用いる時には、絹フィブロインと水溶性モノマーを含む中性塩溶液に重合開始剤を添加させた後に塊状重合させてゲル状物質を形成させることができる。
【００２６】
一方、水不溶性モノマ−を用いる時には、絹フィブロインと水不溶性モノマーを含む中性塩溶液に界面活性剤と重合開始剤を添加した系を塊状重合させてゲル状物質を形成させることができる。
【００２７】
水不溶性モノマ−を重合させる際に用いることができる界面活性剤としては、水不溶性モノマーをグラフト系に分散乳化できる界面活性剤であればいかなるものも用いることができる。例えば、ノイゲンＨＣ（第一工業（株）製、商品名）のような非イオン界面活性剤やニューカルゲン１５１５−２Ｈ（竹本油脂（株）製、商品名）のような非イオン界面活性剤とアニオン界面活性剤の混合界面活性剤等が例示できる。
【００２８】
重合条件は、絹フィブロイン塊状物の重合性に多大な影響を及ぼす要因になっている。
【００２９】
絹フィブロインへのグラフト重合を効率的に進めるには、グラフト用モノマーにＨＥＭＡを選んだ場合には、絹フィブロイン／ＨＥＭＡ系の反応温度を段階的に時間をかけて昇温させる方法が好都合である。すなわち、混合溶液を入れた容器を水浴中にて４０℃−１６時間同温度を保持し、次いで５５℃で２２時間、さらに７０℃で２時間同温度を保持するものである。
【００３０】
そして、未反応物を十分に反応させるため、９０℃で４８時間空気浴中にて処理をして反応を進める。さらに、必要に応じて、１１０℃の真空中で７日間乾燥することが好ましい。
【００３１】
このように、段階的に昇温して反応させ、また塊状物中の水分を段階的に除去することで、生成する絹フィブロイン塊状物の歪等は減少し、その上、光学的異方性のない光学的にも透明であるものが得られるという効果がある。
【００３２】
絹フィブロイン塊状物には、強度、脆性等の諸性質を改善するため、架橋剤を加えることができる。架橋剤としては、エチレングリコールジメタクリレイト（ＥＤ）、テトラエチレングリコールジメタクリレイト（４ＥＤ）、アリルメタクリレイト（ＡＭＡ）、トリメチロールプロパントリメタクリレイト（ＴＭＰ）等が好ましい。架橋剤の添加には、ＣＬを形成した場合にレンズとしての曲面を維持する目的もある。
【００３３】
本発明では、生成した絹フィブロイン塊状物をブロック状に加工して、切削研磨してＣＬ形状とすることができる。
【００３４】
このような方法で得られた塊状物には、中性塩のイオンおよび未反応物が含まれるので、該塊状物を純水に入れて、透析処理をしてこれを除去する。すなわち、該塊状物を６０℃の純水に入れ１５時間以上、望ましくは２４時間浸漬して、中性塩等を析出するものである。一方、この操作ではフィブロインは析出しないことが確認されている。
【００３５】
【作用】
絹フィブロインを溶解した中性塩水溶液に、グラフト用モノマーを加えて重合し、得られたゲル状の絹フィブロイン重合物中の水分を、乾燥速度を制御しながら徐々に蒸発固化し塊状物とした後に、該塊状物内に含まれる未反応物の除去および脱塩処理をする。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明する。
［実施例１］
家蚕由来の繭糸繊維表面のセリシンを除去するため、該繊維を０．０５重量％炭酸ナトリウムと０．２重量％マルセル石鹸を含む水溶液に９８℃で１時間浸漬し、水洗後、５０℃の乾燥器で乾燥した。
【００３７】
得られた精練絹フィブロイン繊維０．１２ｇを５ｍｌの８．５ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液に入れ、５０℃に加熱して溶解させ絹フィブロイン水溶液を得る。
【００３８】
次に、ＨＥＭＡ１０ｇを該絹フィブロイン水溶液に加え、２５℃で１時間攪拌して溶解させる。ＨＥＭＡ重量に対してＡＩＢＮを５００ｐｐｍ加え、ポリプロピレン製の試験管（以下、ＰＰ容器）に入れ、水浴中にて４０℃で１６時間保持し、さらに５５℃で２２時間、そして７０℃で２時間と段階的に昇温して、重合反応を進めゲル状物質を形成する。
【００３９】
さらに、該ゲル状物質を、９０℃で４８時間空気浴中にて乾燥し固化した後に、ＰＰ容器から生成物を離型し、さらに、真空中にて、１１０℃で７日間乾燥して水分を完全に除去して得られた透明な絹フィブロイン塊状物を従来の切削研磨法にてブロック状とし、上下両面を鏡面状にして、光学的、外観的かつ形状も良好なサンプルとした。
【００４０】
得られた絹フィブロイン塊状物を６０℃の純水中に２４時間浸漬した後、抽出液中の臭化物（ＬｉＢｒ）の存在を硝酸銀反応で評価した。また、抽出液中の未反応物のアミノ酸及び蛋白質の有無を１％ニンヒドリン反応により評価した。結果を表１に示した。
【００４１】
さらに、浸漬時間２４時間の時点で浸漬液を全部交換し、引き続き３７℃の純水中に４８時間浸漬した後、抽出液中の臭化物（ＬｉＢｒ）の存在を硝酸銀反応で再度評価した。また、抽出液中の未反応物のアミノ酸及び蛋白質の有無を１％ニンヒドリン反応により再評価した。結果を表１に示した。
【００４２】
なお、ゾル分率は、膨潤前の乾燥物重量（Ｗ０  ）、膨潤後の再乾燥物重量（Ｗ１  ）より、（１−Ｗ１  ／Ｗ０  ）×１００％の式に代入して求めた。
【００４３】
0003629571.tif 000002
【００４４】
以上の結果から、絹フィブロイン塊状物中の中性塩を除去するには、６０℃の純水に２４時間浸漬する処理で完全に除去できる（２４時間後に交換した新しい浸漬液には硝酸銀反応が認められない）。また、浸漬処理を行っても膨潤状態の絹フィブロイン塊状物からは絹フィブロインが離脱したり、流出しないことがニンヒドリン反応により確認された。
【００４５】
［実施例２］
８．５ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液５ｍｌに０．１２ｇの絹フィブロイン繊維を加え５０℃で加熱して絹フィブロイン繊維を完全に溶解させた。次いで、ＨＥＭＡとＨＰＭＡとを重量比で８０：２０で混合したものを合計１０ｇ調整して、該絹フィブロイン水溶液に加える。ＡＩＢＮを対モノマーで５００ｐｐｍ加えた後、実施例１と同様に水浴中で重合して絹フィブロインのポリマーを調製した。こうして得た絹フィブロインポリマーは機械的強度に優れ、良好な透明性を示した。
【００４６】
［実施例３］
０．１２ｇの精練フィブロイン繊維を５ｍｌの８．５ｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒ水溶液に入れ、５０℃で処理して繊維状試料を完全に溶解させる。次に、重量比が８０：２０のＨＥＭＡとＨＰＭＡとの混合モノマー１０ｇ、並びに架橋剤ＥＤを０．０７５ｇ加える。該絹フィブロイン水溶液に対モノマーで５００ｐｐｍのＡＩＢＮを加えた後、ＰＰ容器に入れ実施例１と同様の方法で昇温加熱することでＨＥＭＡ／ＨＰＭＡ／絹フィブロイン混合系の重合反応を進めた。
【００４７】
［実施例４］
実施例３と同様にして、絹フィブロイン繊維状試料を溶解した臭化リチウム溶液を調整する。次に、ＭＭＡ９．０ｇ並びに架橋剤ＥＤを０．１２ｇ加える。次いで該グラフト系に対モノマーで５００ｐｐｍのＡＩＢＮと、非イオン界面活性剤であるノイゲン−ＨＣ（第一工業（株）製、商品名）を０．１ｇ加えて十分に攪拌する。しかる後に実施例３と同じ方法で、ＭＭＡ／絹フィブロイン混合系の重合反応を進め絹フィブロインのポリマーを調製した。
【００４８】
＜評価方法＞
上記実施例に付き、次の方法でＣＬ材料としての評価をした結果を示す。
【００４９】
１．外観
塊状物をＣＬ加工に適するブロック状物として、目視によりその透明性や着色の程度、および内部の浮遊物をみる。
【００５０】
２．性状
上記ブロック状物を手でさわり、その硬さを比較例のものと比較する。（素材が剥離したり、崩れたりしないこと）
【００５１】
３．透明性
上記ブロック状物を厚さ０．２ｍｍ程度のディスクとし、可視部領域（３８０〜７８０ｎｍ）で光線透過率を測定する。
【００５２】
４．強度
上記ブロック状物を厚さ０．２ｍｍ程度のディスクとし、生理的食塩水で含水状態とした後に、幅２ｍｍ程度の短冊状の試験片とした。該試験片を温度２５℃、湿度５０％の環境下にて６ｍｍ間隔で上下端を挟み、引き延ばして、試験片が破断したときの荷重を測定した。
【００５３】
５．加工性
上記ブロック状物を従来の切削研磨法で加工をして、ＣＬを作成して次の基準にて評価した。
0003629571.tif 000003
【００５４】
６．耐汚染性
耐汚染性は以下のようにして評価した。卵白リゾチーム０．１ｇを純水１００ｍｌに溶解し、リン酸水素二ナトリウム（無水）水溶液とリン酸二水素ナトリウム（無水）水溶液でｐＨ７．２に調整する。これを汚染液（Ａ）とする。この汚染液（Ａ）１ｍｌにレンズ１枚を６０〜７０℃で１５分浸漬後、室温で乾燥する。本操作を５回繰り返した後、指で軽くこすりながら精製水で洗浄し乾燥したレンズを肉眼で観察する。
【００５５】
0003629571.tif 000004
【００５６】
７．含水率
上記ブロック状物を厚さ０．２ｍｍ程度のディスクとし、生理的食塩水で含水状態とした後に、次式により含水率を算出した。
【００５７】
0003629571.tif 000005
【００５８】
８．酸素透過係数
製科研式フィルム酸素透過測定計（理科精機工業（株）製）により、３５℃、０．９％生理食塩水中にて測定した。
【００５９】
【表１】
0003629571.tif 000006
【００６０】
【効果】
本発明による絹フィブロインのグラフト重合方法によれば、光学的、機械的強度に優れたＣＬ材料として有用な絹フィブロイン塊状物を得ることができる。