(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ個の塩基配列（ｎは２以上の整数）からなるｎ単位配列の全ての組合せに相当する４ｎを基準として、解析しようとする対象核酸の塩基配列上に出現する各ｎ単位配列の出現頻度を、演算手段を用いて演算する第一の演算工程と；
ｎよりもｍだけ大きいｐ個の塩基（ｍは１以上の整数）からなり、且つ前記対象核酸の塩基配列上に出現する配列を、解析用オリゴ核酸の候補配列として、抽出手段を用いて抽出する第一の抽出工程と、
前記第一の抽出工程で抽出した候補配列上に出現するｎ単位配列を抽出して、第一の演算工程で得られた各ｎ単位配列の出現頻度を基づき、演算手段を用いて、前記対象核酸の塩基配列上における前記候補配列の出現頻度指標を求める第二の演算工程と、
前記第二の演算工程で得られた出現頻度指標の低い単独または複数の候補配列を、抽出手段を用いて、有力候補配列として選択する第二の抽出工程とを具備することを特徴とする、核酸の解析に用いる解析用オリゴ核酸の塩基配列を決定する方法。
【請求項２】
前記ｎが５，６，または７である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有力候補配列からなるオリゴ核酸分子の分子構造の安定性に基づいて、抽出手段を用いて安定性の低い候補配列を選択する第三の抽出工程を更に具備することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分子構造の安定性がＴm値の大きさおよび／または分子内二次構造の安定性であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第三の抽出工程は、選択手段を用いて、前記有力候補配列の中から所定範囲のＴm値を有するものを選択し、更に、形成し得る二次構造が安定でないものを選択することを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記解析用配列は、核酸の塩基配列中に存在する特定の塩基配列を検出するために、核酸のハイブリダイゼーション反応を必要とする酵素反応を利用した方法または核酸のハイブリダイゼーション反応において使用される解析用オリゴ核酸の塩基配列である方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、特定の核酸塩基配列の検出に用いるための解析用オリゴ核酸の塩基配列を決定する方法に関し、特に、膨大な長さの核酸塩基配列における特定の部分塩基配列を検出対象とした解析用オリゴ核酸の塩基配列を、短時間で効率良く決定する方法に関する。
【０００２】
本発明の方法は、限られた計算能力で実行可能な演算プロセスを複数組合せて、目的とする解析用オリゴ核酸の塩基配列を簡便かつ効率良く決定できるので、核酸の塩基配列解析に極めて有効に利用できるものである。
【０００３】
背景技術
一般に、核酸がハイブリッドを形成している二重鎖において、対向している塩基の組合わせがワトソン−クリックの塩基対（アデニン：チミンまたはウラシル、シトシン：グアニン）になっていないときにミスハイブリダイゼーションを生じていると言う。或いは、ミスマッチがあるという。このようなミスマッチがあると、一般にハイブリッドの熱安定性は低くなるから、ハイブリダイゼーション温度を上げることによってミスマッチを排除することも可能である。しかし、例えば30塩基長の解析用オリゴ核酸とのハイブリダイゼーションを想定した場合、３´末端または５´末端に一つだけミスマッチを含むハイブリッドの熱安定性は、完全にマッチしたハイブリッドの熱安定性と殆ど同じである。この場合、ハイブリダイゼーション温度を上げても、ミスマッチとマッチを識別することは困難である。このようなミスハイブリダイゼーションが起きれば、誤った検出結果を導くことになる。
【０００４】
上記のミスマッチを回避するには、設計した解析用オリゴ核酸の塩基配列と検出対象である核酸の全塩基配列とが取り得る全てのハイブリッドの構造を計算し、設計した解析用オリゴ核酸の塩基配列が上記のような微妙なミスマッチを形成しないことを検証する必要がある。ところが、この構造計算には非常に時間を要するため、今までの解析用オリゴ核酸の塩基配列設計法では、作成した候補配列が標的部位に対してどの程度特異的にハイブリダイズするかを予め評価していない。その結果、長時間を費やして構造計算をしたものの良好な結果が得られず、せっかく検討した候補配列を破棄することが多かった。
【０００５】
生体試料中に存在する特定の核酸塩基配列を検出することは、特定臓器で発現および機能する蛋白質を核酸分子レベルで解析し、また神経、脳あるいは免疫系での情報伝達における蛋白質の発現制御を研究する上で重要であるのみならず、遺伝子病における変異遺伝子検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出などのような遺伝子診断においても重要な技術である。特に、遺伝子診断は、確定診断として用いられるため誤りが許されない。更に、分子コンピューティングと称する分野において、ＤＮＡを用いた組み合わせ問題の演算を行うときには、如何なる解が得られたかを確認するために、核酸塩基配列の正確な検出が必要である。
【０００６】
種々の核酸分子の定性的または定量的検出に基づいて遺伝子の存在や変異等を解析する遺伝子解析技術にとって、標的核酸の所定部位とのみ特異的に二重鎖を形成するように、解析用オリゴ核酸の塩基配列（以下、解析用配列と称する）を決定することが最も重要である。核酸ハイブリダイゼーション反応では、使用する解析用配列が検出対象遺伝子の標的部位以外の部位での相補配列とも類似する場合に、ミス・ハイブリダイゼーションを起こし易くなる。従って、解析用配列としては、できるだけ標的配列に対する特異性が高くなるように、全長を長く設計する方法がとられる傾向にある。しかし、プローブ配列が長くなるほど、解析用オリゴ核酸自身の分子内で形成される二次構造がより安定になる。その結果、標的核酸とハイブリダイズする効率が著しく低下したり、またハイブリダイゼーション反応を行う温度が高くなって、実験が煩雑になる問題がある。
【０００７】
更に、解析用配列の選択には多くの経験や試行錯誤を要し、また、厳密な特異性をもったプローブ配列を決定するための従来の計算方法は膨大な計算時間を要するものであった。従って、この解析用配列を、経験に頼ったり数多くの予備実験を行うことなく、計算のみで簡便に設計することへの要望はますます強くなってきている。
【０００８】
発明の開示
本発明の第一の目的は、特異性が高く、常に高効率でハイブリダイゼーション反応を行うことができる解析用オリゴ核酸の塩基配列、即ち、解析用配列を決定する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の第二の目的は、特異性の高い解析用配列を迅速に決定できる方法を提供することである。
【００１０】
本発明の第三の目的は、パーソナルコンピュータ程度の簡便な装置を用いて、迅速かつ経済的に所望の解析用配列を決定できる方法を提供することである。
【００１１】
上記の目的は、核酸の解析に用いる解析用オリゴ核酸の塩基配列を決定する方法であって：設計しようとする解析用オリゴ核酸よりも短い所定の長さを有し且つ解析しようとする対象核酸の塩基配列上に存在する全ての単位塩基配列を網羅する工程と、この網羅された個々の単位配列の出現頻度に基づいて、解析用オリゴ核酸の候補配列から、前記対象核酸上での出現頻度が小さい配列を含む塩基配列を、前記対象核酸の塩基配列の解析に適した解析用配列として抽出する工程とを具備することを特徴とする方法によって達成される。
【００１２】
ここで、前記抽出する工程は、複数の異なる処理手順を順次適用して実行するのが好ましい。また、前記抽出する工程は、さらに候補配列毎の化学的特性に基づいて取捨選択する工程を有していてもよい。この場合には、プローブ配列としての反応性の適否に応じた選択ができるので、有効な配列決定ができる。特に、取捨選択の基礎となる化学的特性が分子構造の熱安定性であるようにすれば、ハイブリダイゼーション反応の適否に基づいた選択が可能となる。この化学的特性としては、候補配列が形成する二重鎖の熱安定性および二次構造の安定性のいずれか一方または両方であるのが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、ｎ個（ｎは２以上の整数）の塩基からなる単位配列（以下、ｎ単位配列と言う）の全ての組合せに相当する４ｎ種類を基準として、既知の核酸分子の塩基配列上に出現する各ｎ単位配列について、その出現頻度を演算する第一の演算工程と；ｎよりもｍだけ多いｐ個の塩基（ｍは１以上の整数）からなる単位配列（以下、ｐ単位配列と言う）のうちで、解析対象である核酸上に存在するものを抽出する第一の抽出工程と；前記解析対象である核酸上に存在する各ｐ単位配列の出現頻度指標を、第一の演算工程で得られた各ｎ単位配列の頻度に基づいて演算する第二の演算工程と；該第二の演算工程で得た出現頻度指標が低いｐ単位配列を、プローブ配列として抽出する第二の抽出工程とを具備することを特徴とする、核酸塩基配列の検出に用いるプローブ配列の決定方法である。
【００１４】
第一の演算工程において、ｎは、例えば５，６または７の何れかであるのが好ましい。この場合、出現頻度を求める基礎となるｎ配列の全種類は、それぞれ 1024通り（ｎ＝５）、4096通り（ｎ＝６）または16384通り（ｎ＝７）となる。この数字は、第一の演算を実用的な処理速度で実行可能な範囲である。また、第一の抽出工程におけるｐ単位配列の長さは、核酸プローブの合成が容易な長さ、例えばｐ＝10〜50の範囲に設定することができる。
【００１５】
また、少なくとも第二の抽出工程は、複数の低頻度・ｐ単位配列の中から化学的条件に基づいて取捨選択するのが好ましい。ここで、化学的条件は、分子構造の安定性を判定基準にするのが好ましく、具体的には、Ｔｍ値および／または自己分子内の二次構造の安定性であるのが好ましい。特に、Ｔｍ値と二次構造の安定性の両方で選択する場合、前記取捨選択する工程は、先ず所定範囲内のＴｍ値を有する単位配列を複数個選択し、次いで、Ｔｍ値を基準に選ばれた複数のｐ単位配列の中から、２次構造が安定でないものを選択するのが好ましい。
【００１６】
さらに、上述した決定方法は、比較的少ない演算処理量によって実行できるので、全ての工程を、コンピュータにより順次実行するようにして、簡単かつ安価に解析用配列を決定することができる。その際、スーパーコンピュータのような超高速の計算速度を要せず、一般に普及しているパーソナルコンピュータで実行できる利点が得られる。
【００１７】
二次構造の安定性は、核酸分子が自己の分子内でハイブリッドを形成するかどうかを判定するための指標になり得る。核酸プローブが自己の分子内で安定な構造をとると、該プローブは標的核酸との間で所望のハイブリッドを形成し難くなる。ここで安定な構造とは、核酸鎖のループ化、プローブ核酸鎖同士の部分的ハイブリダイゼーションなどを言う。かかる安定な構造をとらない核酸は、核酸塩基配列の解析過程において、効率良く標的核酸配列に結合する。
【００１８】
本発明の方法で得られるプローブ配列は、遺伝子核酸配列の検出だけでなく、人工配列をもつ核酸および部分的な配列をも検出対象とすることができる。例えば、人工的に合成した核酸における特定の塩基配列の検出、ｃＤＮＡライブラリーに含まれる特定のｃＤＮＡの検出、或いは真核生物のゲノム配列中におけるエクソン配列部分の検出にも適用することができる。更に、生物のゲノムＤＮＡにおける塩基配列やメッセンジャーＲＮＡにおける塩基配列のみならず、そのコピーおよび部分配列をも検出対象とすることができる。さらに、ＰＣＲ（polymerase Chain Reaction）におけるプライマーのように、核酸のハイブリダイゼーション反応を利用した各種酵素反応のためのプローブ配列を設計するためにも利用することが可能である。
【００１９】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の方法を実施の形態に沿って説明するが、本発明は、以下の説明によって限定されるものではない。
【００２０】
図１は、解析用オリゴ核酸として使用する遺伝子同定プローブ核酸の塩基配列を設計する場合を例に、本発明の適用を模式的に示したフローチャートである。ここでは、大腸菌ゲノム上の或る特定のＯＲＦ(Open Reading Frame)を検出するためのプローブ核酸を設計する。大腸菌のような原核生物には、真核生物に存在するようなエクソン／イントロン構造がなく、ＯＲＦの殆どが遺伝子の塩基配列に対応している。即ち、特定のＯＲＦを検出することは、特定遺伝子を検出することに相当する。この実施の形態は、計算量がゲノムの長さに比例する高速アルゴリズムを提供するものである。
【００２１】
まず、大腸菌ゲノム全体の塩基配列を走査して、該ゲノムに存在する７個の塩基配列からなる単位配列（以下、７-タプルと称する）の全てを網羅的に列挙しする。例えば、図２に示すように、ゲノム１の適当な末端配列から７塩基分の塩基配列を最初のタプル２として決定したのち、この最初の７-タプルの枠をゲノム上で一塩基ずつ順次ずらしていくことにより、全ての７-タプルを網羅的に列挙することができる。次いで、これら全ての７-タプルをその塩基配列に従って分類することにより、全ての種類の７-タプルについて、当該ゲノム上に存在する個数を得る。
【００２２】
次に、これら塩基配列に従って分類された夫々の種類の７-タプルについて、その出現頻度を求める。この出現頻度として存在確率を取るのであれば、分母にはゲノム１上に存在し得る７-タプルの総数でなければならない。しかし、本発明では総計が１００％になるような存在確率は必ずしも必要ではなく、異なった種類の７-タプルの間の相対的な出現頻度が得られれば充分である。そこで、計算をより容易にするために、７-タプルとして数学的に可能な組合せの数を分母に取るのが便利である。即ち、遺伝子の塩基配列を構成する塩基は４種類（アデニン、チミン、グアニン、シトシン）であるから、理論的に７-タプルを構成し得る塩基配列の種類は４７（＝16384通り）であり、より一般的にｎ-タプルの場合は４ｎ通りである。
【００２３】
次に、上記４７（＝16384通り）を分母に用いることにより、前記ゲノム上に存在していた夫々の種類の７-タプルについて、全ゲノム配列上での出現頻度を求める（第一の演算工程）。この場合、図４に示すように縦軸に出現頻度をとり、横軸に各タプルを割当てたグラフを作成すれば比較検討し易い。なお、このような計算およびグラフ化は、市販のコンピュータで容易に実施可能である。また、７-タプルの各塩基配列毎の出現頻度は、メモリ等に記憶しておく。
【００２４】
次に、図３に示すようにして、解析用配列の候補として、７-タプルよりも１個以上、好ましくは10〜50個多い塩基（例えば30塩基）からなり、且つ検出するＯＲＦ上に存在する塩基配列を網羅する。この30塩基の候補配列の夫々について、下記のように、第一の演算工程で計算した７-タプルの出現頻度に基づいて出現頻度指標計算する。
【００２５】
30塩基の中には24個の７-タプルが存在する。これらの７-タプルに対して、30塩基の５´末端側から順に１〜２４の番号を付し、これら夫々の７-タプルについて、先に算出した出現頻度をｐ１，ｐ２，……ｐ２４とする。この場合、これら30塩基の解析用配列の出現頻度指標は、その中に含まれる２４個の７-タプルについて求めた出現頻度の積、即ち、ｐ１・ｐ２・…・ｐ２４として計算する。この出現頻度指標は、候補配列がどの程度検出対象のＯＲＦと特異的なハイブリッドを形成するかを示しており、この値が低いほど特異性が高いことを示す。対象ＯＲＦ上に含まれる全ての30塩基候補配列についてこの出現頻度指標を計算し、適当な閾値に基づいて候補配列を絞り込む。この計算工程で選ばれた候補配列を、低頻度候補配列群と呼ぶことにする。なお、このような計算およびグラフ化は、市販のコンピュータで容易に実行可能である。また、各30塩基部分配列毎の出現頻度は、メモリ等に記憶しておくものとする。
【００２６】
次に、上記で抽出された低頻度候補配列群について、出現頻度以外の条件、即ち、物理化学的条件によって目的のプローブ配列を取捨選択する。プローブ配列を単に出現頻度のみで決定しない理由は、標的配列特異的な塩基配列を有するプローブが必ずしも効率よくハイブリッドを形成するとは限らないからである。そこで、具体的には、図５および図６に示すように、複数の低頻度部分配列について、それぞれの熱的安定性を検討するのが好ましい。まず、図５のように、Ｔｍ値をグラフ化して、所定のＴｍ値範囲に収まるような低頻度候補配列のセットを選択する。この計算法には、例えば、SantaLuciaのパラメータ（John SantaLucia, Jr., Hatim T. Allawi, and P. Ananda Seneviratne “Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability.” Biochemistry 35, 3555-3562）がある。ここで、Ｔｍ値を所定範囲に収める理由は、それぞれのＯＲＦに特異的な多数の解析用塩基配列を用いて、ハイブリダイゼーション反応を同一温度下で同時に行うことを可能にするためである。次に、取捨選択により除去されなかった残りの低頻度候補配列のセットを有力候補として、自己分子内で形成する二次構造の安定性を検討する。
【００２７】
例えば、図６に示すように、固相支持体４上に適当なリンカー分子５を介して解析用配列を固定し、被検サンプル等の反応成分を含んだ混合液中に置かれた条件下での、分光構造の安定性について考察する。分子内でループ状の自己ハイブリッドを形成する低頻度候補配列６や、分子間で部分的な相補結合を生じる配列７は、このような二次構造が安定であると、標的配列との間で目的のハイブリッドを形成することが困難または不可能になる場合がある。従って、このような安定な二次構造を形成し得るものを排除して、ハイブリダイゼーション環境下で検出対象配列と自由にハイブリダイゼーション反応をできる状態にある部分配列８を最有力候補として選択する。なお、二次構造の安定性は、適当な解析用ソフトウエアを用いて、塩基配列から算定することができる。
【００２８】
最後に、上述した出現頻度および物理化学的条件により絞り込まれた最有力候補配列が、ＯＲＦを同定するための解析用配列として使用可能かどうかを確認する。この確認工程は、大腸菌ゲノムの全長を用いて、選択した解析用塩基配列が唯一の特定位置に相補的に結合するか否かを調べることによって実行することができる。かかる結合特異性の検討も、コンピュータを用いた演算処理により行うことができる。例えば、ダイナミックプログラミング法による局所結合地図を作成することにより、大腸菌ゲノム全体の塩基配列と対比して、ミス・ハイブリダイゼーションが生じ難い配列であることを確認することができる。また、この確認工程は、最有力候補配列と大腸菌ゲノム全体の塩基配列との間のハミング距離を算出することによって行ってもよい。このように、確認工程で合格した塩基配列を解析用塩基配列として決定する。
【００２９】
上記で決定した解析用配列を用いてハイブリダイゼーションによる検出を行うに当っては、例えば、上記解析用配列からなるオリゴ核酸に測定可能な標識物質を結合した標識化プローブ作成する。この標識化プローブを被検サンプルと混合し、所定のハイブリダイゼーション反応を実行し、ハイブリダイズした標識物質を選択的に測定すればよい。標識物質がＦＩＴＣ(Fluorescein Isothiocyanate)のような蛍光性物質であれば、適宜の蛍光測定機により容易に測定し、データ処理手段により自動的に定量または定性分析を行うことができる。この場合、標識物質の有無または量を示す定性的または定量的な測定データ（数値または画像）に基づいて、標的核酸分子の有無または反応量を判定することができ、報告書として印刷したり画面上に表示することによって、遺伝子解析の結果を得ることができる。
【００３０】
核酸のハイブリダイゼーション反応は、遺伝子検出だけでなく、ＰＣＲのような核酸増幅反応や、ＬＣＲ(Ligase Chain Reaction)のような同定用反応においても利用されている。従って、本発明の方法により設計した解析用配列をもつオリゴ核酸は、ＰＣＲにおけるプライマーや、ＬＣＲにおけるプローブとして利用することもできる。また、検出の原理に応じて、適宜、同一のゲノムについて複数種の解析用配列を利用することができ、また、解析用オリゴ核酸を固相支持体（微粒子、基板状チップ、カラム、フィルタ、試験紙、ウエル等）に固定して用いてもよい。
【００３１】
なお、本発明は上述した実施の形態に限定されることなく、発明の要旨に基づいて、種々の変更が可能である。例えば、図１で説明した全ての工程を全自動化してもよい。この場合は、決定したプローブ配列のみを表示または出力するだけでもよく、タプルの出現頻度に関するグラフ、検出対象核酸上での解析用配列の結合位置、検出用配列のＴｍ値および二次構造に関するデータやグラフ等の画面表示ないしプリントアウトについては、使用者の要望に応じて適宜省略することができる。また、各演算工程、Ｔｍ値および二次構造の安定性の計算およびその結果の数値化および／またはグラフ化のみをコンピュータで行い、最終的な取捨選択を含む評価については、これら数値化および／またはグラフ化された表示画面に基づいて使用者行い、その抽出および取捨選択した情報をキーボードもしくはマウス等の入力手段を用いて入力するようにしてもよい。この場合には、各種演算ないし計算したデータをメモリ等に記憶することは必ずしも必要ではない。また、自動化の際には、オンラインを通じて、ホストコンピュータや各種病院、大学、検査センター等を結ぶネットワーク上で、各種計算データや、抽出または決定結果を相互に電送して情報交換するようにしてもよい。
【００３２】
また、Ｔｍ値と二次構造の安定性の検討は、逆の順番でもよく、同時でもよい。また、このような物理化学的条件で解析用塩基配列の最適化を図る場合、抽出した低頻度候補配列について、上記物理化学的条件の何れかを優先するために、出現頻度が最下位ではないようなタプルを含むように、解析用塩基配列を選んでもよい。
【００３３】
本発明の方法は、ゲノムの塩基配列のみならず、発現したメッセンジャーＲＮＡおよびそのコピーであるｃＤＮＡ、人工的に合成したＤＮＡ等を対象にして、そのうちの特定の塩基配列を標的とした解析用塩基配列を設計するために利用することもできる。
【００３４】
実施例
以下、本発明の方法を用いて、マウス遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し、得られたプライマーを用いてＰＣＲ実験を行った例を示す。
【００３５】
マウス（balb/c）の全ての遺伝子塩基配列は解明されていないので、便宜上、1999年9月5日の時点でGenBankに登録されていたマウス（balb/c）の塩基配列を、マウスの全塩基配列として計算に使用した。下記に示すマウスのＤＮＡを増幅するプライマーを設計した。
【００３６】
【表１】
0003610303.tif 000002
本発明による計算で求めたプライマーの配列と、計算された増幅産物の長さおよびＴmの値を下記の表に記す。なお、プライマー配列は5’末端から書いたものである。また、これらプライマー配列を求めるための計算には、下記の環境において２時間を要した。もし、本発明のタプル法を使用しないで同様の計算をするとすれば、11.5時間以上を要する。
【００３７】
使用計算機
CPU ：Pentium III 500MHz
RAM ：384 Mbyte
OS   ：linux
コンパイラ：c++
【表２】
0003610303.tif 000003
ＰＣＲ条件
反応液  50 μL中
テンプレート      ：Clonetech社製  マウス（balb/c）肝臓抽出
ゲノムＤＮＡ0.4μg
酵素              ：TaKaRa社製  ExTaq 5 units
dNTP（dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物）：各2.5 nmol
ExTaq用バッファー：TaKaRa社製  5 μL（Mg２＋濃度 2mM）
プライマー        ：各20 pmol
ＰＣＲ温度サイクル条件
（１）95℃  30秒
（２）65℃  60秒
（３）72℃  60秒
ストリンジェンシーを上げるために、温度は高めに設定してある。（２）お    よび（３）を30サイクル行う。
【００３８】
電気泳動条件
ゲル：  FMC社製 NuSieve GTG agarose 4% TAEバッファー
電圧および時間：  100Ｖ、30分
結  果
上記ＰＣＲにより、予定した長さの増幅産物が得られた。
【００３９】
以上詳述したように、本発明の方法によれば、標的塩基配列に対して常に正確なハイブリダイズ反応を示すような解析用配列を決定することができる。また、本発明によれば、解析用配列を迅速に決定できる。更に、本発明によれば、大容量の計算能力を必要としない比較的比較的小規模の計算を組み合わせて段階的に解析用配列を決定するので、大型コンピュータを用いる必要がなく、経済的に有利な普及型のコンピュータを用いて簡便に解析用配列を決定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法を実施したときの手順を模式的に示したフローチャートである。
【図２】図２は、単位配列としてのタプルを設定する方法を示す模式図である。
【図３】図３は、解析用配列の一次候補を設定する方法を示す模式図である。
【図４】図４は、単位配列の核酸上での出現頻度分布の例を示したグラフである。
【図５】図５は、塩基配列に基づいて計算した解析用オリゴ核酸候補のＴｍ値分布の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、ハイブリダイゼーション環境において解析用オリゴ核酸が取り得る可能な形態を示す模式図である。
【図１】
0003610303.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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