(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加してなることを特徴とする化学発光試薬。
【請求項２】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、下記一般式（１）
【化１】
0003720988.tif 000009
（前記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされる化合物である請求項１に記載の化学発光試薬。
【請求項３】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１又は２に記載の化学発光試薬。
【請求項４】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、下記一般式（２）
【化２】
0003720988.tif 000010
（前記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされる化合物である請求項１ないし３のいずれかの１項に記載の化学発光試薬。
【請求項５】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１ないし４のいずれかの１項に記載の化学発光試薬。
【請求項６】
前記アミノアルコール化合物が、下記一般式（３）
【化３】
0003720988.tif 000011
（前記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数である。）
で表わされる化合物である請求項１ないし５のいずれかの１項に記載の化学発光試薬。
【請求項７】
前記アミノアルコール化合物が、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１ないし６のいずれかの１項に記載の化学発光試薬。
【請求項８】
前記光照射に用いる光源が可視光を発する光源である請求項１ないし７のいずれかの１項に記載の化学発光試薬。
【請求項９】
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加することを特徴とする化学発光試薬の製造方法。
【請求項１０】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、下記一般式（１）
【化４】
0003720988.tif 000012
（前記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされる化合物である請求項９に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項１１】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、下記一般式（２）
【化５】
0003720988.tif 000013
（前記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされる化合物である請求項９又は１０に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項１２】
前記アミノアルコール化合物が、下記一般式（３）
【化６】
0003720988.tif 000014
（前記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数である。）
で表わされる化合物である請求項９ないし１１のいずれかの１項に記載の化学発光試薬の製造方法。
【請求項１３】
前記光照射に用いる光源が可視光を発する光源であることを特徴とする請求項９ないし１１のいずれかの１項に記載の化学発光試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、制御された化学発光が可能な化学発光試薬として、化学発光分析による種々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬及びその製造方法に関するものであり、更に詳しくは、水素受容体の存在下においてペルオキシダーゼ酵素活性の測定に有用な化学発光試薬及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
化学発光試薬として、古くから用いられているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶液中で微光を呈し、水素受容体、例えば、過酸化水素を加えると強く発光することが知られており、種々の微量分析に利用されている。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリ性化合物の存在下で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には利用することができるが、この反応による発光を制御して発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）等には利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決する手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることにより、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方法等が行なわれている。
【０００３】
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必ずしも十分とは云えない。
従って、化学発光試薬の調製及び化学発光系の操作が容易で、かつ高感度測定が可能な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前記事情に鑑み、過酸化水素を基質とするペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬及びその製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、ルシゲニン等のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボンアミド化合物及びアミノアルコールの存在下において光照射することにより得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬が、特定アルカリ性ｐＨ条件下において、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存して化学発光することを見い出し、これらの知見に基づいて本発明の完成に到達したものである。
【０００６】
即ち、本発明の第一は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物からなり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加してなることを特徴とする化学発光試薬に関するものである。
【０００７】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレートであることが好ましい。
また、前記アミノアルコール化合物が、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群より選択されるものが好ましい。
さらに、前記光照射に用いる光源が可視光を発する光源であることが好ましい。
【０００８】
本発明の第二は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加することを特徴とする化学発光試薬の製造方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の化学発光試薬及びその製造方法に用いられるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、次の一般式（１）
【００１０】
【化７】
0003720988.tif 000002
で表わされる。
【００１１】
一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜１４を有するものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜２０のものが好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１２】
一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
【００１３】
また、一般式（１）において、Ｘn-はｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、特に限定されるものではなく、硝酸イオン（ＮＯ3-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン等）、（メタ）リン酸イオン（ＰＯ3-）等を挙げることができる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１４】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）等を挙げることができる。これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好適である。
【００１５】
本発明の化学発光試薬及びその製造方法に用いられるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、次の一般式（２）
【００１６】
【化８】
0003720988.tif 000003
前記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子、等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基は、アルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子、等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ1 及びＲ3 のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基等の直鎖状又は分岐状のものを挙げることができる。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１７】
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を挙げることができる。
さらに、本発明の化学発光試薬及びその製造方法に用いられるアミノアルコール化合物は、次の一般式（３）
【００１８】
【化９】
0003720988.tif 000004
で表される化合物である。
前記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数である。
前記アミノアルコール化合物の具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００１９】
本発明の化学発光試薬は、前記の説明の如く、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物からなるものであり、アミノアルコール化合物は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の混合物に光照射前に添加してもよいが、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下における光照射によるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の反応時及び／又は反応後に添加してもよい。特に、発光性能の安定性維持の観点からは光照射後、即ち反応後に添加することが好ましい。
【００２０】
本発明におけるアミノアルコール化合物の添加は、発光反応時においてブランク値を低下させる効果及びペルオキシダーゼの高濃度領域における発光強度を上昇させる効果を有し、また、化学発光試薬の保存時において、その発光性能の低下を防ぐ保存安定性を改善する効果等を有し、化学発光試薬の感度や安定性等の性能の向上に寄与する処が大きい。
【００２１】
本発明の化学発光試薬及びその製造方法に用いられる光照射用の光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができる、白熱電灯が好ましく用いられる。該光照射により得られる化学発光試薬は、前記光源を用いずに自然光の下で製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示すことと、この反応を光遮断下に実施した場合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られないことから、化学発光性化合物の生成には光照射が重要な役割を担っていることが認められる。
【００２２】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の高い塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位又は溶媒和によって安定化され、この安定化されたビラジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する活性酵素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強度が得られるものと考えられる。
【００２３】
前記光照射による反応において、前記アミノアルコール化合物はＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの電荷移動に関与してその反応を促進し、発光反応時のブランク値を高める副生成物の生成を抑え、且つ生成するビラジカルを更に安定化する作用を有するものと考えられる。
【００２４】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物の混合割合（モル比）は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、アミノアルコール化合物を１〜１万倍モルの量でそれぞれ用いることができ、さらに、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。
【００２５】
前記光照射反応の反応温度は用いられる溶媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３０分〜１０時間の範囲の時間で行なうことができる。また、本発明の新規化学発光試薬は、塩基性条件下に過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で反応して発光するが、この反応は過酸化水素の検出及びペルオキシダーゼの定量等に利用することが可能であり、ペルオキシダーゼを標識物質として用いることにより、さらに、種々の物質の定量に用いることが可能になる。
【００２６】
本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
【００２７】
本発明の新規化学発光試薬を用いて化学発光分析を行なう場合には、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲で用いるのが望ましい。
【００２８】
また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。
【００２９】
また、化学発光反応に用いる過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが望ましい。
【００３０】
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００３１】
化学発光反応に用いる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもできる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発光試薬を得た。
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光強度が得られ、トリエタノールアミンを添加してない比較例１に較べて感度及び発光強度において大幅な改善が認められた。
【００３４】
【表１】
0003720988.tif 000005
【００３５】
［実施例２］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、モノエタノールアミン０．１ｍｌを添加し混合することにより化学発光試薬を得た。
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光強度が得られ、モノエタノールアミンを添加してない比較例１に較べて感度及び発光強度において大幅な改善が認められた。
【００３６】
【表２】
0003720988.tif 000006
【００３７】
［実施例３］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリイソプロパノールアミン０．１ｍｌを添加し混合することにより化学発光試薬を得た。
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光強度が得られ、トリイソプロパノールアミンを添加してない比較例１に較べて感度及び発光強度において大幅な改善が認められた。
【００３８】
【表３】
0003720988.tif 000007
【００３９】
［比較例１］
化学発光試薬の調製
ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射することにより化学発光試薬を得た。
ペルオキシダーゼ活性の測定
この化学発光試薬５０μｌを採り、これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 溶液１００μｌずつを充填し、これに溶液注入装置から前記化学発光試薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光強度が得られた。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
【発明の効果】
本発明により提供される新規化学発光試薬は、安価な製造原料を用いて比較的に短時間で容易に製造することができ、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することができる。さらに、ペルオキシダーゼを標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、酵素免疫測定法により抗体、抗原等を、ウェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノーザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素標識核酸プローブを用いて核酸を各々特異的に、且つ高感度で測定することができる。