(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分光特性の異なる単一又は複数の蛍光色素で染色・標識された細胞集団に光ビームのスポットを二次元走査する光ビーム走査手段と、
前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、細胞内の微細な構造またはその構造を構成する成分を標識する蛍光を検出する第１の蛍光検出手段と、
前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、細胞全体を標識する蛍光を検出する第２の蛍光検出手段と、
前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記光ビームのスポットを強調する空間フィルタリングを行なう空間フィルタリング手段と、
前記第２の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像領域のうち、第１の閾値を超える第１画像領域を算出する第１画像領域算出手段と、
前記第１画像領域算出手段により算出された第１画像領域内であって、前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記空間フィルタリング手段によるフィルタリングが行なわれた走査画像領域のうち、第２の閾値を超える第２画像領域を算出するとともに、前記空間フィルタリング手段によるフィルタリングが行なわれない前記走査画像について前記第２の閾値を超える第２画像領域を算出する第２画像領域算出手段と
を具備し、前記空間フィルタリングが行なわれた走査画像に基づく第２画像領域を用いて前記光ビームと同程度以下である前記細胞内の微細な構造またはその構造を構成する成分の有無を検出し、前記空間フィルタリングが行なわれない走査画像に基づく第２画像領域を用いて当該第２画像領域の定量測定を行なうことを特徴とする走査型細胞測定装置。
【請求項２】
分光特性の異なる単一又は複数の蛍光色素で染色・標識された細胞集団に光ビームのスポットを二次元走査する光ビーム走査手段と、
前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、細胞核又は染色体の内部の微小な蛍光標識された部分からの蛍光を検出する第１の蛍光検出手段と、
前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、前記細胞核又は染色体の全体を標識する蛍光を検出する第２の蛍光検出手段と、
前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記光ビームのスポットを強調する空間フィルタリングを行なう空間フィルタリング手段と、
前記第２の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像領域のうち、第１の閾値を超える第１画像領域を算出する第１画像領域算出手段と、
前記第１画像領域算出手段により算出された第１画像領域内であって、前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記空間フィルタリング手段によりフィルタリングが行なわれた走査画像領域のうち、第２の閾値を超える第２画像領域を算出するとともに、前記空間フィルタリング手段によるフィルタリングが行なわれない前記走査画像について前記第２の閾値を超える第２画像領域を算出する第２画像領域算出手段と
を具備し、前記空間フィルタリングが行なわれた走査画像に基づく第２画像領域を用いて前記光ビームと同程度以下である前記細胞内の微細な構造またはその構造を構成する成分の有無を検出し、前記空間フィルタリングが行なわれない走査画像に基づく第２画像領域を用いて当該第２画像領域の定量測定を行なうことを特徴とする走査型細胞測定装置。
【請求項３】
前記空間フィルタリングの演算子のサイズは、前記標本上で走査されるビームスポットと同じ程度のスポットにマッチングするサイズを下限とするものであり、
前記第１画像領域算出手段により算出された第１の画像領域内の前記第２画像領域算出手段により算出された第２画像領域の数を記憶する記憶手段をさらに具備することを特徴とする請求項１又は請求項２記載の走査型細胞測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光ビームを収束させたスポットにより細胞集団を走査し、自動的に細胞の小核等の検査を行なうことができる走査型細胞測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スライドグラス上の細胞集団を光ビーム（レーザ光線）を収束させたスポットで走査し、該細胞集団の個々の細胞が発する蛍光等を検出し、データ処理する“生物標本の複数の光学的特性を測定する方法および装置”（以下、走査型サイトメータと呼称する）が、特開平３−２５５３６５号公報に開示されている。
【０００３】
走査型サイトメータは、レーザ及び該レーザビームを収束させたスポットが固定され、該スポット上を単離浮遊液状態の細胞がジェット水流として流れ出るフローサイトメータに対し、細胞はスライドグラス上に静置されており、レーザスポットが光学的および機械的に走査される点で、基本構成には差がある。
【０００４】
しかし、走査型サイトメータは、蛍光色素で生化学的に標識された生物細胞集団にレーザスポットを照射・励起し、個々の細胞の発する蛍光を測光して高速に測定し、測定結果を細胞集団の免疫学的特性、遺伝学的特性、細胞増殖性等を表す統計的なデータとして提示することを目的としている点においては、フローサイトメータと同一である。
【０００５】
走査型サイトメータは、フローサイトメータに比べて、以下の特長をもつ：
１．  レーザスポットの二次元走査により蛍光量のほか、面積・形状など形態的な情報を得られる。
【０００６】
２．  スライドグラス上の各細胞の座標位置を記録し、かつ座標位置が再現可能であることにより、統計データの中の個々の細胞データを提示した細胞一個一個を顕微鏡視野内に位置再現し、顕微鏡観察像と細胞データとを対応付けすることができる。
【０００７】
走査型サイトメータにおけるレーザ光源としては、通常、空冷アルゴンレーザの青色波長（４８８ｎｍ）が用いられる。また、標本を標識する蛍光色素としては、蛍光光抗体法と組み合わせた蛍光標識色素として、緑黄色蛍光を発するＦＩＴＣ（Fluorescein is othiocyanate ）が一般的であり、核内または染色体内ＤＮＡの蛍光定量色素としては、燈色蛍光のＰＩ（Propidium Iodide）が一般的である。
【０００８】
また、ＡＯ（Acridine Orange ）という色素があり、ＲＮＡとの結合では燈色蛍光を発し、ＤＮＡとの結合では緑黄色蛍光を発する。ＡＯは一つの励起波長で異なる二色の蛍光を発し、フローサイトメータでは、ＲＮＡとＤＮＡの２パラメータ測定に用いられる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
最近、薬品や食品の安全性試験として、小核検査による変異原性試験が行なわれている。この変異原性試験は、製造物責任の明確化などの情勢により、近年ますます重要視されている。
【００１０】
小核検査には、培養細胞を用いる方法（in vitro) と、実験動物の血液を用いる方法（in vivo ）があり、どちらかというと、前者は基礎実験的手法であり、後者のほうがより実用的手法とされている。
【００１１】
実験動物の血液を用いる方法では、骨髄や末梢血をスメアしたスライド標本を用い、顕微鏡下で数百から千個の赤血球を肉眼観察し、赤血球内に小核の発現したものの比率を調べる。
【００１２】
小核標本は、通常ＡＯ（Acridine Orange ）で染色され、蛍光顕微鏡で観察される。このとき、赤血球（特に、幼若赤血球）内のＲＮＡ成分と結合した燈色蛍光で赤血球全体を確認し、小核のＤＮＡ成分と結合した緑黄色蛍光で赤血球内の小核の有無を目視して確認する。
【００１３】
顕微鏡観察による小核検査では、手動でステージを動かしながら百個から千個の赤血球を肉眼で観察することになり、測定時間と操作者の苦痛がきわめて大きい。
【００１４】
理論上、測定精度の向上のために、検体数、すなわち測定する赤血球の数を多くする必要があるが、顕微鏡観察による測定では、測定時間と操作者の苦痛を考えると、現実的には、測定細胞数を大幅に増やすことはできない。
【００１５】
また、従来の目視観察では、形態を人間の目で観察して判断するため、客観的データとしての信頼性に欠ける。また、小核の蛍光量（すなわちＤＮＡ量）を定量することができなかった。
【００１６】
また、スメア標本内に混在する種々の血球や血小板から、赤血球を選び出して、小核の有無を調べる測定作業は、顕微形態に依存しており、顕微形態情報の得られないフローサイトメーターは使用できない。
【００１７】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、細胞の微細な構造またはその構造を構成する成分を自動的に計数・計測することのできる走査型細胞測定装置を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
したがって、まず、上記目的を達成するために請求項１に係る発明は、分光特性の異なる単一又は複数の蛍光色素で染色・標識された細胞集団に光ビームのスポットを二次元走査する光ビーム走査手段と、前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、細胞内の微細な構造またはその構造を構成する成分を標識する蛍光を検出する第１の蛍光検出手段と、前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、細胞全体を標識する蛍光を検出する第２の蛍光検出手段と、前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記光ビームのスポットを強調する空間フィルタリングを行なう空間フィルタリング手段と、前記第２の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像領域のうち、第１の閾値を超える第１画像領域を算出する第１画像領域算出手段と、前記第１画像領域算出手段により算出された第１画像領域内であって、前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記空間フィルタリング手段によるフィルタリングが行なわれた走査画像領域のうち、第２の閾値を超える第２画像領域を算出するとともに、前記空間フィルタリング手段によるフィルタリングが行なわれない前記走査画像について前記第２の閾値を超える第２画像領域を算出する第２画像領域算出手段とを具備し、前記空間フィルタリングが行なわれた走査画像に基づく第２画像領域を用いて前記光ビームと同程度以下である前記細胞内の微細な構造またはその構造を構成する成分の有無を検出し、前記空間フィルタリングが行なわれない走査画像に基づく第２画像領域を用いて当該第２画像領域の定量測定を行なうことを特徴とする走査型細胞測定装置、である。
【００１９】
また、請求項２に係る発明は、分光特性の異なる単一又は複数の蛍光色素で染色・標識された細胞集団に光ビームのスポットを二次元走査する光ビーム走査手段と、前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、細胞核又は染色体の内部の微小な蛍光標識された部分からの蛍光を検出する第１の蛍光検出手段と、前記光ビーム走査手段により走査される光ビームにより励起された細胞からの蛍光のうち、前記細胞核又は染色体の全体を標識する蛍光を検出する第２の蛍光検出手段と、前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記光ビームのスポットを強調する空間フィルタリングを行なう空間フィルタリング手段と、前記第２の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像領域のうち、第１の閾値を超える第１画像領域を算出する第１画像領域算出手段と、前記第１画像領域算出手段により算出された第１画像領域内であって、前記第１の蛍光検出手段により検出された蛍光により得られる走査画像に対して前記空間フィルタリング手段によりフィルタリングが行なわれた走査画像領域のうち、第２の閾値を超える第２画像領域を算出するとともに、前記空間フィルタリング手段によるフィルタリングが行なわれない前記走査画像について前記第２の閾値を超える第２画像領域を算出する第２画像領域算出手段とを具備し、前記空間フィルタリングが行なわれた走査画像に基づく第２画像領域を用いて前記光ビームと同程度以下である前記細胞内の微細な構造またはその構造を構成する成分の有無を検出し、前記空間フィルタリングが行なわれない走査画像に基づく第２画像領域を用いて当該第２画像領域の定量測定を行なうことを特徴とする走査型細胞測定装置、である。
【００２０】
さらに、請求項３に係る発明は、請求項１又は請求項２記載の発明において、前記空間フィルタリングの演算子のサイズは、前記標本上で走査されるビームスポットと同じ程度のスポットにマッチングするサイズを下限とするものであり、前記第１画像領域算出手段により算出された第１の画像領域内の前記第２画像領域算出手段により算出された第２画像領域の数を記憶する記憶手段をさらに具備することを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る走査型細胞測定装置のマルチパラメータ蛍光測光光学系を示す図である。
【００２５】
レーザー１１より出射した光ビームは、主ダイクロイックミラー１２で反射され、紙面に直交する図示されていない回転軸を中心に回動するガルバノメーターミラー１３で反射・偏向される。
【００２６】
ガルバノメーターミラー１３で反射・偏向された光ビームは、瞳投影レンズ１４で対物レンズ像画１５上に結像され、紙面上左右方向に走査される走査スポットを形成する。
【００２７】
該走査スポットは、対物レンズ１６によって標本面１７上に投影され、微小スポットとして標本上の細胞を走査する。該微小スポットによって励起された個々の細胞の蛍光標識からの蛍光は、ガルバノメーターミラー１３まで光路を遡る。
【００２８】
ここで、ガルバノメーターミラー１３は、瞳投影レンズ１４で対物レンズ１６の瞳と共やくに結合されているため、標本からの蛍光は、ガルバノメーターミラー１３の走査偏向角に依存することなく、レーザー光路を遡って行く。
【００２９】
標本からの蛍光は、主ダイクロイックミラー１２を透過し、副ダイクロイックミラー１８に入射する。ここで、細胞からの蛍光のうち、短波長成分（例えば、緑黄色）は、副ダイクロイックミラー１８で反射され、第１光電子増倍管１９に入射し、光電検出される。細胞からの蛍光のうち、長波長成分（例えば、燈色）は副ダイクロイックミラー１８を透過して第２光電子増倍管２０に入射し、光電検出される。
【００３０】
これにより、第１光電子増倍管１９と、第２光電子増倍管２０で同時に二つの蛍光成分を検出することができる。また、レーザをガルバノメータミラー１３による光学偏向手段で左右方向に走査しながら、走査ステージで標本１７を紙面に直交する方向に移動させることにより、標本面をレーザスポットで二次元走査することができ、分光学的に異なる二種類の蛍光色素標識を併用した２成分の走査測光が可能となる。
【００３１】
図２は、同実施の形態における走査型細胞測定装置の電気系の構成を示す図である。
二本の光電子増倍管（ＰＭＴ）２１ａ、２１ｂで検出した光電信号は、各々の検出信号（チャンネルと呼ぶ）ごとに設けられた信号処理系統で処理され、コンピュータ３１内の拡張スロット上のメモリーボード３２に設けられた各チャンネル毎のメモリー回路に転送・記憶される。
【００３２】
すなわち、二本の光電子増倍管（ＰＭＴ）２１ａ、２１ｂで検出された各々の光電信号は、ヘッドアンプ（Ｈｅａｄ  Ａｍｐ）２２ａ，２２ｂで増幅された後に、ミキサー２３ａ，２３ｂを介して、アナログ積分器（Ａｎａｌｏｇ  Ｉｎｔｅｇ．）２４ａ，２４ｂによりノイズが除去され、アナログディジィタル変換器（Ａ／Ｄ）２５ａ，２５ｂによって、１２ビットディジタル信号に変換される。
【００３３】
そして、ディジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）２７ａ，２７ｂによって，信号処理が行なわれ、走査型細胞測定装置のコンピュータ３１内の拡張スロット上のメモリーボード３２に設けられた各チャンネル毎のメモリー回路に転送・記憶される。
【００３４】
走査型細胞測定装置のコンピュータ３１の拡張スロットには、ＩＥＥＥ−４８８規格に基づくＧＰＩＢ（General Purpose Interface Bus ）制御を行うＧＰＩＢボード３３が設けられており、装置側のＧＰＩＢインターフェイス制御回路（ＧＰＩＢ  Ｉ／Ｆ）３４を介して、装置側のＣＰＵ（中央演算処理装置）３７とコンピュータ３１との間で通信を行なう。
【００３５】
装置側のＣＰＵバス（ＣＰＵ  Ｂｕｓ）には、走査ステージのＸ軸、Ｙ軸をそれぞれ駆動する二つのステッピングモータ４０ａ，４０ｂの駆動制御を行なうモータコントローラ３８ａ，３８ｂ、ガルバノメータミラー４５を駆動する波形を生成する波形発生回路４１、それぞれの光電子増倍管（ＰＭＴ) ２１ａ，２１ｂの陰極への印可電圧を発生し増倍率を制御するディジタルアナログ変換器（Ｄ／Ａ）、３０ａ，３０ｂ、それぞれの光電子増倍管（ＰＭＴ）２１ａ，２１ｂで検出した光電信号のオフセット調整電圧を発生するディジタルアナログ変換器（Ｄ／Ａ）２９ａ，２９ｂが接続されている。
【００３６】
上記モータコントローラ３８ａ，３８ｂには、それぞれステッピングモータ４０ａ，４０ｂを駆動するためのモータドライバ３９ａ，３９ｂが接続されている。波形発生回路４１は、ディジタルアナログ変換器（Ｄ／Ａ）４２、オフセット調整電圧を発生するディジタルアナログ変換器（Ｄ／Ａ）４３、ミキサ４４により構成されている。
【００３７】
コンピュータ３１は、ＩＢＭ社ＰＣ／ＡＴまたはそのコンパチブル機であり、コンピュータモニタディスプレイ用のビデオ・グラフティ・アダプター（ＶＧＡ）ボード以下に少なくとも二つの、１６ビットＩＳＡ（Industry Standard Architecture）拡張スロットを有している。
【００３８】
二つのスロットは１枚のメモリーカード３２とＧＰＩＢボード３３を実装する。本実施の形態に係る走査型細胞測定装置においては、コンピュータはＧａｔｅｗａｙ社（ＵＳＡ）の４ＤＸ−３３Ｖ型（Ｉｎｔｅｌ社製ＣＰＵ、８０４８６ＤＸ−３３を使用）ＰＣコンピュータ、ＧＰＩＢボードはNational Instruments社（ＵＳＡ）製のＡＴ−ＧＰＩＢ型ボードを使用している。
【００３９】
以上の光学系および電気系の構成により、走査型細胞測定装置のコンピュータ３１からのＧＰＩＢ制御コマンドによって、走査および信号処理等、装置の動作を包括的にコントロールし、標本をレーザで二次元走査して複数の蛍光を検出し、走査画像データを得ることができる。
【００４０】
次に、走査型細胞測定装置の動作について説明する。
最初に、図３のフローチャートを参照して、走査型細胞測定装置の概略動作について説明する。
【００４１】
まず、標本を走査型細胞測定装置のステージにセットする（ｓｔｅｐ１）。次に、コンピュータ３１のキーボード等の入力手段からコンピュータ３１に標本走査領域、ゲイン、オフセット等の測定条件を入力する（ｓｔｅｐ２）。そして、コンピュータ３１により、画像データリストの初期化及び作成が行なわれる（ｓｔｅｐ３）。
【００４２】
次に、設定されたスライドグラス標本上の走査領域を走査画像メモリ１枚分のメモリ容量で限定される小走査領域ごとに区切って、二次元走査を行ないながら、光電信号をディジタル化して、コンピュータ３１上のメモリボード３２に走査画像データを転送する（ｓｔｅｐ４）。
【００４３】
各小走査領域ごとの走査画像データは、その都度コンピュータによって読みとられ、走査画像データがコンピュータで処理された後に（ｓｔｅｐ５）、各細胞毎に相当する領域を抽出し、細胞情報を算出して、細胞データリストを作成、追記してゆく（ｓｔｅｐ６）。
【００４４】
そして、所定の走査領域全体の細胞データリストを作成し終わったところで測定は終了する（ｓｔｅｐ７、ｓｔｅｐ８）。測定の結果得られた細胞データリストは、データファイルとして保存され、ヒストグラム表示等、統計的な演算処理を受けながらコンピュータスクリーンに表示され検査が終了する（ｓｔｅｐ９、ｓｔｐ１０）。
【００４５】
次に、走査画像データに対して適用する、各細胞領域・細胞情報を抽出する画像処理過程について、図４のフローチャートを参照して説明する。
ここで標本には、実験動物の血液による小核標本を用いるとする。すなわち、燈色蛍光を検出する第２チャンネルの走査画像では赤血球の全体像が得られ、緑黄色蛍光を検出する第１チャンネルの走査画像では赤血球内に出現する小核の像が得られている（ｓｔｅｐ１１）。
【００４６】
次に、第２チャネルにおいてあらかじめ設定した閾値を越える領域を抽出し、“赤血球”として認識する（ｓｔｅｐ１２、ｓｔｅｐ１３）。ここでは、“赤血球”として認識された画像領域を領域Ａとする。
【００４７】
次に、“赤血球”として認識した範囲内で、今度は第１チャンネルにおいてあらかじめ設定した閾値を越える領域を抽出し、小核として認識する（ｓｔｅｐ１４）。ここでは、小核として認識された画像領域を領域Ｂとする。
【００４８】
次に、ｓｔｅｐ１５における処理について説明する。
ｓｔｅｐ１５においては、例えば、小核のサイズなどの形態情報が必要であれば、第１チャネルにおいて閾値を越えた領域の走査画像データの数（画素数）を測定データとする。
【００４９】
また、赤血球内の小核のサイズの比率が必要な場合、第１チャンネルで抽出した領域の画素数を、第２チャンネルで抽出した領域の画素数で割る（除算）ことにより得る。
【００５０】
小核のＤＮＡ量などの定量測光情報が必要であれば、第１チャネルにおいて閾値を越えた領域の走査画像データの総和をとる。このとき、バックグラウンド値の補正等については、特開平３−２５５３６５号公報に記述されている方法が適用可能であり、バックグラウンド値の補正等を追加することで、より正確に定量測定できる。
【００５１】
一方、小核の存在の有無を知るだけであれば、“赤血球”として認識した範囲内で第１チャンネルにおいて閾値を越えるかどうかだけを検出すればよい。また、赤血球内の小核の数は、第１チャンネルのデータが閾値を越えた領域の数で表わされる。
【００５２】
次に、ｓｔｅｐ１５において算出された計算結果を、各領域Ａごとに、領域Ａ、領域Ｂのデータを記録し、細胞データリストしてデータファイルに追記し（ｓｔｅｐ１６）、画像処理を終了する（ｓｔｅｐ１７）。
【００５３】
ここで、小核標本測定の目的が、小核のＤＮＡ量などの定量情報や小核の大きさなどの形態情報を得ることではなく、小核の有無すなわち出現率を確認することであるならば、走査画像を用いた定量測定を行う必要はない。
【００５４】
したがって、緑黄色蛍光検出する第１チャネルの走査画像においては、赤血球内に出現する小核の像がコントラストよく得られていることが必要であって、走査画像における各画素データの蛍光測光値としての定量性は必要でない。
【００５５】
以下、このような場合における小核の有無や数の検出方法について、図５のフローチャートを参照して説明する。
まず、燈色蛍光を検出する第２チャンネルにおいて、赤血球全体の走査画像が得られ、緑黄色蛍光を検出する第１チャンネルにおいて、赤血球内に出現する小核の像が得られる（ｓｔｅｐ２１）。
【００５６】
次に、第１チャンネル（緑黄色蛍光）の走査画像に対して、スポットを強調する空間フィルタを適用し、微少な小核を前処理で強調する（ｓｔｅｐ２２）。
ここで、スポットを強調する空間フィルタ処理は、二次元演算子のたたみ込み積分による。演算子のサイズは、標本上で走査するビームサイズと同等のスポットにマッチングするサイズを下限とし、その整数比、またはべき乗比でより大きなスポットにマッチングするよう設定するよう構成する。
【００５７】
これにより、スポットサイズと同程度以下の大きさの小核に対して空間フィルタ処理を最適化して鋭敏に検出することができる一方、やや大きめの小核に対しては大きめの演算子を用いることで空間フィルタ処理を最適化し、鋭敏に検出することもできる。
【００５８】
次に、第２チャンネル画像において所定の閾値を超える画像領域（領域Ａとする）を抽出する（ｓｔｅｐ２３、ｓｔｅｐ２４）し、領域Ａ内に相当する第１チャンネル画像領域内で所定の閾値を超える画像領域（領域Ｂとする）を抽出する（ｓｔｅｐ２５）。
【００５９】
次に、各領域Ａごとに、領域Ａ内の領域Ｂの数を記録し、細胞リストとしてデータファイルに追記して画像処理を終了する（ｓｔｅｐ２６、ｓｔｅｐ２７）。
すなわち、第１チャンネルの走査画像に対して、スポットを強調する空間フィルタ処理を前処理として行ない、微小な小核を前処理で強調した後に、閾値を超える領域を小核として認識・抽出して、小核の有無、すなわち出現率、および／または、出現した小核の数を個々の赤血球毎の細胞データとして出力する。これにより、微小な小核の有無や数の検出率を上げることができる。
【００６０】
また、微少な小核の有無や数の検出率を上げると同時に、ある程度大きめの小核のＤＮＡ量や大きさを測定する必要があれば、図４に示す処理を行ないながら、第１チャンネルの走査画像にスポットを強調する空間フィルタ処理を平行して行ない、両方の処理結果を出力する。
【００６１】
以下、図６のフローチャートを参照して、スポット強調空間フィルタ処理を併用した場合の処理について説明する。
まず、燈色蛍光を検出する第２チャンネルにおいて、赤血球全体の走査画像を得て、緑黄色蛍光を検出する第１チャンネルにおいて、赤血球内に出現する小核の走査画像を得る（ｓｔｅｐ３１）。
【００６２】
次に、スポット強調空間フィルタ処理を併用した画像処理が開始される。
すなわち、上述の図４に示したフローチャートにおいて述べたように、まず、第２チャネルにおいてあらかじめ設定した閾値を越える領域（領域Ａとする）を抽出し、“赤血球”として認識する（ｓｔｅｐ３２、ｓｔｅｐ３３）。
【００６３】
次に、“赤血球”として認識した範囲内で、今度は第１チャンネルにおいてあらかじめ設定した閾値を越える領域を抽出し、小核として認識する（ｓｔｅｐ３４）。すなわち、領域Ａ内に相当する第１チャンネル画像領域内で閾値を超える画像領域（領域Ｂとする）を抽出する。
【００６４】
次に、図４のフローチャートにおいて述べたように、領域Ａ、領域Ｂにおける画素数（＝面積）、測光値データ総和（＝積算値）、領域Ａと領域Ｂの面積比等を計算する（ｓｔｅｐ３５）。
【００６５】
次に、ｓｔｅｐ３５において算出された計算結果を、各領域Ａごとに、領域Ａ、領域Ｂのデータを記録し、細胞データリストしてデータファイルに追記し（ｓｔｅｐ３６）、画像処理を終了する（ｓｔｅｐ３７）。
【００６６】
一方、ｓｔｅｐ３３〜ｓｔｅｐ３６の処理と平行して、以下の処理が行なわれる。
まず、第１チャンネル（緑黄色蛍光）の走査画像に対して、スポットを強調する空間フィルタを適用し、微少な小核を前処理で強調する（ｓｔｅｐ４１）。ここで、スポットを強調する空間フィルタ処理は、図５の説明において述べた通りである。
【００６７】
次に、ｓｔｅｐ３３において抽出された画像領域Ａ内に相当する第１チャンネル画像領域内で所定の閾値を超える画像領域（領域Ｃとする）を抽出する（ｓｔｅｐ４２）。次に、各領域Ａごとに、領域Ａ内の領域Ｃの数を記録し、細胞リストとしてデータファイルに追記して画像処理を終了する（ｓｔｅｐ４３、ｓｔｅｐ３７）。
【００６８】
そして、これら両方の処理結果がコンピュータ３１のディスプレイ等に表示される。
本実施の形態の走査型顕微鏡測定装置においては、図４乃至図６に示した処理を任意に切り替えることができ、用途に応じて使いわけすることができるように構成されている。
【００６９】
従って、本実施の形態にの走査型顕微鏡測定装置によれば、小核の有無・出現率を確認する用途においては、スポット強調用空間フィルターを適用して、小さな小核も漏れなく検出することができる。
【００７０】
また、小核のＤＮＡ量などの定量情報や小核の大きさなどの形態情報を測定する用途においては、スポット強調用空間フィルターを適用しないで閾値処理した後、定量情報や、形態情報の抽出を行うことにより、より正確な測定データを得ることができる。
【００７１】
すなわち、小核試験の小核の有無・出現率の検出、および、小核のＤＮＡ量などの定量情報や小核の大きさの測定用途に適した、細胞測定装置を提供することができる。
【００７２】
なお、上述の実施の形態の説明においては、赤血球における小核試験標本に基づいて行った。しかしながら、本発明の主旨は、細胞、細胞核、または染色体などの生態構造の内部に出現する微小な蛍光標識の定量／形態測定と出現率／数のカウントとを併用するその他の用途、たとえば染色体標識やＤＮＡの特定分子配列の標識、細胞内に局所的に発見する抗原・抗体物質の検出と定量測定などに対して、同様に適用可能であることはいうまでもない。
【００７３】
また、小核検査における赤血球標本をＰＩ（Propidium Jodide）にて単染色し、細胞の検出を蛍光の代わりに前方散乱光の検出によって行ない、小核の検出のみでＰＩの蛍光検出によって行なう場合でも、本実施の形態において述べた手法を用いて小核を検査することができる。
【００７４】
【発明の効果】
以上詳記したように、本発明によれば、細胞の小核等の微細な構造またはその構造を構成する成分を自動的に観察することができる走査型細胞測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係る走査型細胞測定装置のマルチパラメータ蛍光測光光学系を示す図である。
【図２】同実施の形態における走査型細胞測定装置の電気系の構成を示す図である。
【図３】同実施の形態における走査型細胞測定装置の動作の概略構成を説明するためのフローチャートである。
【図４】同実施の形態における走査型細胞測定装置の走査画像データに対して適用する、各細胞領域等を抽出する画像処理過程を説明するためのフローチャートである。
【図５】同実施の形態における走査型細胞測定装置における小核の有無や数の検出方法を説明するためのフローチャートである。
【図６】同実施の形態における走査型細胞測定装置におけるスポット強調空間フィルタ処理を並列に行なう処理を説明するためのフローチャートである。
【符号の説明】
１１…レーザー、１２…主ダイクロイックミラー、１３…ガルバノメーターミラー、１４…瞳投影レンズ、１５…対物レンズ像画、１６…対物レンズ、１７…標本面、１８…副ダイクロイックミラー、１９…第１光電子増倍管、２０…第２光電子増倍管、２１ａ，２１ｂ…光電子増倍管（ＰＭＴ）、２２ａ，２２ｂ…ヘッドアンプ、２３ａ，２３ｂ…ミキサー、２４ａ，２４ｂ…アナログ積分器、２５ａ，２５ｂ…アナログディジィタル変換器、２７ａ，２７ｂ…ディジタルシグナルプロセッサ、３１…コンピュータ、３２…メモリーボード、３３…ＧＰＩＢボード、３４…ＧＰＩＢインターフェイス制御回路、３７…ＣＰＵ、４０ａ，４０ｂ…ステッピングモータ、４５…ガルバノメータミラー。
【図１】
0003686713.tif 000002
【図２】
0003686713.tif 000003
【図３】
0003686713.tif 000004
【図４】
0003686713.tif 000005
【図５】
0003686713.tif 000006
【図６】
0003686713.tif 000007