(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析成分と標識用蛍光物質と反応させる第一の収容体と、
標準蛍光物質を収容した第二の収容体と、
これら第一及び第二の収容体に励起光を照射するための光源と、
上記第一の収容体に収容された標識用蛍光物質と第二の収容体に収容された標準蛍光物質の、上記励起光により選択的に励起される蛍光強度を測定する測定手段と、
上記第一の収容体と測定手段との間を光学的に連結する第一の光路と、
上記第二の収容体と測定手段との間を光学的に連結するよう、上記第一の光路に合流する第二の光路と、
上記第二の光路内に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第一のフィルタと、
上記第一の光路における上記第二の光路との合流部と測定手段との間に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第二のフィルタと、
を具備することを特徴とする分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清等の試料を分析検査する時に用いられる分析方法に係り、特に試料中の被分析成分を免疫学的な方法により定量分析する分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清等の試料を分析検査する方法の１つとして、試料中の被分析成分を免疫学的な方法により定量分析する方法が従来から知られている。この種の分析方法は試料中の被分析成分と免疫反応を生ずる抗原または抗体を例えばガラスビーズや磁性粒子に固定化した不溶性の担体を用い、この担体を透明な容器（以下、「反応容器」と称する。）に第１の試薬として添加して試料中の被分析成分と反応させ、次いで担体を洗浄液で洗浄して被分析成分を除いた不要成分を反応容器内から除去した後、被分析成分と免疫反応を生ずる標識用蛍光物質を反応容器に第２の試薬として添加し、被分析成分と反応した標識用蛍光物質の蛍光強度を測定して被分析成分を定量分析する方法であり、標識用蛍光物質としては、被分析成分と免疫反応を生ずる抗原または抗体を蛍光物質に固定化したものが用いられる。
【０００３】
ところで、このような分析方法は標識用蛍光物質を励起させる励起光を反応容器に照射すると、被分析成分と反応した標識用蛍光物質のみから蛍光が発せられるばかりでなく、例えば反応容器内を浮遊するゴミ等の浮遊物や反応容器からも自家蛍光が発せられるため、測定値に誤差が生じ易いという問題がある。
【０００４】
そこで、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた自家蛍光による影響を低減するために、励起光を照射してから所定時間後に標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するようにした分析方法が提案されている（特開平３−２２１８３７号参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような分析方法によると、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた蛍光は標識用蛍光物質から発せられた蛍光に比較して比較的短時間のうちに減衰してしまうため、ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた自家蛍光による影響を低減することができるが、励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化などに起因する誤差を低減することが困難であった。
【０００６】
本発明は上記のような点に鑑みてなされたもので、その目的は励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化等に起因する誤差を低減でき、試料中の被分析成分を正確に定量分析することのできる免疫学的分析方法を提供せんとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、請求項１に係る発明は、被分析成分と標識用蛍光物質と反応させる第一の収容体と、標準蛍光物質を収容した第二の収容体と、これら第一及び第二の収容体に励起光を照射するための光源と、上記第一の収容体に収容された標識用蛍光物質と第二の収容体に収容された標準蛍光物質の、上記励起光により選択的に励起される蛍光強度を測定する測定手段と、上記第一の収容体と測定手段との間を光学的に連結する第一の光路と、上記第二の収容体と測定手段との間を光学的に連結するよう、上記第一の光路に合流する第二の光路と、上記第二の光路内に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第一のフィルタと、上記第一の光路における上記第二の光路との合流部と測定手段との間に配置され、蛍光物質が発する蛍光のみを選択的に透過させる第二のフィルタと、を具備することとした。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
図１は血清等の検体試料を標識用蛍光物質を用いて分析検査する時に使用される分析装置の概略構成図であり、この分析装置は、反応容器１内の標識用蛍光物質に励起光を照射する励起光照射系２と、被分析成分と反応した標識用蛍光物質の蛍光強度を測定する蛍光強度測定系３とを備えている。
【００１０】
前記励起光照射系２は、光源としてのキセノンフラッシュランプ４と、このキセノンフラッシュランプ４から発せられた光源光を平行光に修正するコリメータレンズ５とを備えており、このコリメータレンズ５の光出射側にはフィルタ６が設けられている。
【００１１】
前記フィルタ６はキセノンフラッシュランプ４で発生した光のうち反応容器１内の標識用蛍光物質を励起させる波長光（例えば３５０ｎｍ付近）のみを選択的に透過させるものであり、このフィルタ６を透過した光はハーフミラー７、第１のシャッター８、ミラー９および集光レンズ１０を経て反応容器１に励起光として照射されるようになっている。
【００１２】
一方、前記蛍光強度測定系３は反応容器１内で発生した蛍光を集光する集光レンズ１１を備えており、この集光レンズ１１に入射した光はハーフミラー１２を透過してフィルタ１３に入射するようになっている。
【００１３】
前記フィルタ１３は反応容器１内の標識用蛍光物質で発生した蛍光（例えば６１５ｎｍ付近）のみを選択的に透過させるものであり、このフィルタ１３を透過した光は光拡散板１４を透過してフォトマルトランジスタ（以下、「ＰＭＴ」と称する。）等からなる光検出器１５の光電変換面に照射されるようになっている。
【００１４】
また、前記フィルタ６を透過した光は、ハーフミラー７および第２のシャッター１６を経てガラスセル１７に照射されるようになっている。このガラスセル１７内には反応容器１内の標識用蛍光物質と同一の蛍光物質（例えば希土類金属キレート、好ましくはユーロピウムキレート）である標準蛍光物質１８が封入されており、この標準蛍光物質１８で発生した標準蛍光はフィルタ１９に入射するようになっている。
【００１５】
前記フィルタ１９は標準蛍光物質１８で発生した蛍光（例えば６１５ｎｍ付近）のみを選択的に透過させるものであり、このフィルタ１９を透過した光はハーフミラー１２、フィルタ１３および光拡散板１４を経て光検出器１５の光電変換面に照射されるようになっている。なお、フィルタ１９の詳細な機能については後述する。
【００１６】
前記光検出器１５から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器２０でデジタル信号に変換された後、ＣＰＵ（中央処理装置）２１に供給されるようになっている。
前記ＣＰＵ２１は光検出器１５からの信号に基づいて試料中の被分析成分を定量演算したり、キセノンフラッシュランプ４を点灯制御したり、あるいは第１のシャッター８および第２のシャッター１６を開閉制御したりするものであり、このＣＰＵ２１には記憶装置２２が接続されているとともに、分析結果等を表示するＣＲＴ表示器２３やプリンタ（不図示）が接続されている。
【００１７】
なお、Ａ／Ｄ変換器２０は反応容器１に励起光が照射されて所定時間（ゴミ等の浮遊物や反応容器から発せられた自家蛍光の強度が零レベルに減衰するまでの時間）が経過した後に、光検出器１５の出力信号を取り込むように構成されている。
【００１８】
図２はＣＰＵ２１の制御を示すフローチャートであり、以下、同図を参照して本発明の一実施形態について説明する。図２に示すように、本発明の一実施形態では、標識用蛍光物質が添加された反応容器１を励起光の照射位置にセットすると、ＣＰＵ２１からの光路開放信号により第２のシャッター１６が作動し、ハーフミラー７とガラスセル１７との間に形成された第２のシャッター１６が開き光路が開放される（ステップＳＴ１）。なお、キセノンフラッシュランプ４は常時点灯されていると共に、第１、第２のシャッター８，１６の双方は通常遮断されているものとする。ハーフミラー７とガラスセル１７との間に形成された第２のシャッター１６が開き光路が開放されると、キセノンフラッシュランプ４で発生した光がコリメータレンズ５、フィルタ６、ハーフミラー７を経てガラスセル１７内の標準蛍光物質１８に励起光として照射される（ステップＳＴ２）。
【００１９】
このとき、標準蛍光物質１８で発生した蛍光はフィルタ１９、ハーフミラー１２、フィルタ１３、光拡散板１４を経て光検出器１５の光電変換面に照射され、標準蛍光物質１８の蛍光強度信号として光検出器１５から出力される。そして、光検出器１５から出力された標準蛍光物質１８の蛍光強度信号は、Ａ／Ｄ変換器２０を経てＣＰＵ２１に供給され、標準蛍光物質１８の標準蛍光値として記憶装置２２に格納される（ステップＳＴ３）。
【００２０】
標準蛍光物質１８の標準蛍光値が記憶装置２２に格納されると、ＣＰＵ２１から第２のシャッター１６に光路遮断信号が送出され、ハーフミラー７とガラスセル１７との間に形成された光路が第２のシャッター１６により遮断されると共に、ＣＰＵ２１から第１のシャッター８に光路開放信号が送出され、ハーフミラー７とミラー９との間に形成された光路が開放される（ステップＳＴ４，ＳＴ５）。ハーフミラー７とミラー９との間に形成された光路が第１のシャッター８により開放されると、キセノンフラッシュランプ４で発生した光がコリメータレンズ５、フィルタ６、ハーフミラー７、第１のシャッター８、ミラー９、集光レンズ１０を経て反応容器１内の標識用蛍光物質に励起光として照射される（ステップＳＴ６）。
【００２１】
このとき、反応容器１内の標識用蛍光物質で発生した蛍光は集光レンズ１１、ハーフミラー１２、フィルタ１３、光拡散板１４を経て光検出器１５の光電変換面に照射され、標識用蛍光物質の蛍光強度信号として光検出器１５から出力される。そして、光検出器１５から出力された標識用蛍光物質の蛍光強度信号は、Ａ／Ｄ変換器２０を経てＣＰＵ２１に供給され、標識用蛍光物質の検体蛍光値として記憶装置２２に格納される（ステップＳＴ７）。
【００２２】
標識用蛍光物質の検体蛍光値が記憶装置２２に格納されると、ＣＰＵ２１は記憶装置２２に格納された検体蛍光値を下記に示す式（１）に基づいて補正する（ステップＳＴ８）。そして、式（１）により得られた補正蛍光値に基づいて被分析成分の濃度を定量演算し、その演算結果をＣＲＴ表示器２３や図示しないプリンタ等に出力する（ステップＳＴ９，ＳＴ１０）。
【００２３】
式（１）は、
0003720458.tif 000002
ここで、αは（検体蛍光値−暗電流）／（標準蛍光値−暗電流）を絶対濃度に換算するための定数である。また、βは機差補正用の係数（機差の補正を行わない場合はβ＝１とする）である。係数βについては後述する。
【００２４】
なお、検体蛍光値の補正は、標識用蛍光物質の蛍光強度を測定する度に標準蛍光値と暗電流を測定して行なわれる。
また、本発明の一実施形態では暗電流を測定する時に測定値が一定値以上の場合には「シャッター８，１６開エラー」をＣＲＴ表示器２３に表示し、また標準蛍光を測定する時に測定値が一定値以上の場合には「シャッタ８開エラー」をＣＲＴ表示器２３に表示するように構成されている。
【００２５】
次に上述した分析装置の較正について説明する。キセノンフラッシュランプ４や光検出器１５は時間とともに劣化する。このため、以下のようにして補正を行う。すなわち、励起光の照射位置に基準試料（ユーロピウムキレートを硝子に溶し込んだものを反応容器内に固定したもの）をセットする。そして、基準試料の蛍光強度と標準蛍光物質１８の蛍光強度を測定し、基準試料の蛍光強度測定値を初期基準蛍光値として、また標準蛍光物質１８の蛍光強度測定値を初期標準蛍光値として記憶装置２２に格納しておく。そして、電源をＯＮにしてから３０分が経過した時点（ＰＭＴ周辺の温度が一定になった時点）で標準蛍光物質１８の蛍光強度を再度測定し、その測定値を記憶装置２２に記憶された初期標準蛍光値と比較する。そして、初期標準蛍光値との差が一定以下（例えば１０％以下）の場合には、光検出器１５のゲインを自動的に必要なだけ上げ、標準蛍光物質１８の蛍光強度測定値を初期標準蛍光値と同じ値にする。また、比較した値が一定以下（例えば５０％以下）の場合には、その旨をユーザに報知することにより調整やキャリブレーションを促すことができる。
【００２６】
一方、本分析装置の設計上の測定値と実際上の測定値の誤差、すなわち機差を除去するために以下のようにして補正のための係数βを求める。なお、機差は主に光路に起因するものである。
【００２７】
機差を除去するためには、測定ダイナミックレンジの上限及び下限近傍の蛍光値、すなわち基準蛍光値及び標準蛍光値について設計上の値と実際の値を比較する。予め蛍光値が判明しているサンプルＳ１，Ｓ２の設計上の蛍光値をそれぞれ初期基準蛍光値Ａ１，初期標準蛍光値Ａ２とする。一方、サンプルＳ１，Ｓ２の実際の分析装置における蛍光値をそれぞれ計測基準蛍光値Ｂ１，計測標準蛍光値Ｂ２とする。機差を除去するためには、計測基準蛍光値Ｂ１，計測標準蛍光値Ｂ２を初期基準蛍光値Ａ１，初期標準蛍光値Ａ２に合わせて比例配分すればよい。すなわち、初期基準蛍光値Ａ１と初期標準蛍光値Ａ２とを結んだ直線と、計測基準蛍光値Ｂ１と計測標準蛍光値Ｂ２とを結んだ直線が一致するように調整する。
【００２８】
具体的には、計測標準蛍光値Ｂ２が初期標準蛍光値Ａ２と一致するように光検出器１５のゲインを調整する。このゲインの調整に伴なって変化した蛍光値（以下、「較正基準蛍光値Ｂ１′」）を測定する。したがって、Ａ１／Ｂ１′から直線の傾きを補正する係数βが求められる。
【００２９】
したがって、係数βは、
β＝（初期基準蛍光値Ａ１）／（較正基準蛍光値Ｂ１′）        …（２）
で示される。
【００３０】
例えば、初期基準蛍光値Ａ１＝４０００万、初期標準蛍光値Ａ２＝２万の分析装置において、計測基準蛍光値Ｂ１＝４１００万、計測標準蛍光値Ｂ２＝１９０００とする。次に、計測標準蛍光値Ｂ２が２万となるように光検出器１５のゲインを上げる。これに伴ない計測基準蛍光値Ｂ１が上昇し、較正基準蛍光値Ｂ１′＝４２００万となる。したがって、β＝４０００万／４２００万＝０．９５２…となる。
【００３１】
フィルタ１９の機能について図３の（ａ），（ｂ）を参照して説明する。図３の（ａ）に示すように、フィルタ１９がなく、第１のシャッター８が遮断している場合には、上述したステップＳＴ２において、標準蛍光物質１８の蛍光値を計測している際に、ガラスセル１７を通過するのは、励起光Ｒと蛍光Ｋ１となる。励起光Ｒはハーフミラー１２を経て励起光Ｒ１及び励起光Ｒ２に分けられる。励起光Ｒ１はフィルタ１３で吸収され、蛍光Ｋ１のみが光検出器１５に入射する。一方、励起光Ｒ２は反応容器１内の標識用蛍光物質に照射され、蛍光Ｋ２が発生する。蛍光Ｋ２はハーフミラー１２を経て、光検出器１５に入射する。このため、光検出器１５には蛍光Ｋ１と蛍光Ｋ２とが加算された蛍光が入射され、測定の対象となっている標準蛍光物質１８の正確な蛍光値が得られない。
【００３２】
同様に、図３の（ｂ）に示すように、フィルタ１９がなく、第２のシャッター１６が遮断している場合には、上述したＳＴ６において、反応容器１内の標識用蛍光物質の蛍光値を計測している際に、反応容器１を通過するのは励起光Ｒ′と蛍光Ｋ′１となる。
【００３３】
励起光Ｒ′はハーフミラー１２を経て励起光Ｒ′１及び励起光Ｒ′２に分けられる。励起光Ｒ′１はフィルタ１３で吸収され、蛍光Ｋ′１のみが光検出器１５に入射する。一方、励起光Ｒ′２は標準蛍光物質１８に照射され、蛍光Ｋ′２が発生する。蛍光Ｋ′２はハーフミラー１２を経て、光検出器１５に入射する。このため、光検出器１５には蛍光Ｋ′１と蛍光Ｋ′２とが加算された蛍光が入射され、測定の対象となっている標識用蛍光物質の正確な蛍光値が得られない。
【００３４】
したがって、フィルタ１９により測定中以外の蛍光物質が励起することを防止することで正確な蛍光値を得ることができる。
なお、フィルタ１９の代わりに励起光Ｒ２又はＲ′２を遮断するシャッタを両光路又は合流部に設ける方法も考えられるが、装置の構成及び制御が複雑となるという問題があり、好適ではない。
【００３５】
上述したように、本発明の一実施形態では、標識用蛍光物質の蛍光強度を測定するときに標識用蛍光物質と同一の蛍光物質１８の蛍光強度を測定し、この標準蛍光物質１８の蛍光強度と標識用蛍光物質の蛍光強度との比に基づいて被分析成分を定量分析することにより、キセノンフラッシュランプ４の輝度変化や光検出器１５の感度変化に起因する誤差を低減することができ、試料中の被分析成分を正確に定量分析することができる。
【００３６】
また、本発明の一実施形態では、試料中の被分析成分を標識する標識用蛍光物質と標準蛍光物質１８とが同一の蛍光物質であるので、蛍光物質の時間応答特性や光検出器１５の波長特性等の影響を受けず被分析成分を正確に定量分析することができる。
【００３７】
また、本発明の一実施形態では、標準蛍光物質１８として希土類金属キレートを硝子や樹脂等の透明体に溶し込んだものを使用しているので、大きさが小さくても十分で安定した蛍光量を得ることができ、蛍光物質の温度による影響も少ない。
【００３８】
さらに、本発明の一実施形態では、反応容器１とガラスセル１７との間にフィルタ１９が設けられているので、励起光が測定中以外の蛍光物質を励起させて蛍光が発生することを防止できる。
【００３９】
また、本発明の一実施形態では、集光レンズ１１と光検出器１５との間に光拡散板１４を設けたことにより、反応容器の位置が変化し、光検出器１５の光電変換面上での受光位置が変化しても影響が少ない。
【００４０】
なお、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではない。すなわち、上記実施の形態では、蛍光物質として、希土類金属キレートを使用したが、これに限られるものではなく、例えば蛍光寿命の長い蛍光物質であれば代用することは可能である。また、上記実施の形態では、標識用蛍光物質を収容した反応容器１をセットした後、標準蛍光物質１８の測定を行うようにしているが、反応容器１をセットされるまでの間に標準蛍光物質１８の測定を行うことで、計測に用いられる標準蛍光物質１８の値を正確に求めることができる。このほか、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変形実施可能であるのは勿論である。
【００４１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、励起光を発生する光源の輝度変化や光検出器の感度変化等に起因する誤差を低減でき、試料中の被分析成分を正確に定量分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試料中の被分析成分を標識用蛍光物質を用いて定量分析する時に使用される分析装置の概略構成図。
【図２】本発明の一実施形態に係る分析方法を説明するためのフローチャート。
【図３】分析装置に組み込まれたフィルタの機能を説明する説明図。
【符号の説明】
１…反応容器
４…キセノンフラッシュランプ
５…コリメータレンズ
６…フィルタ
７…ハーフミラー
８…第１のシャッター
９…ミラー
１０…集光レンズ
１１…集光レンズ
１２…ハーフミラー
１３…フィルタ
１４…光拡散板
１５…光検出器
１６…第２のシャッター
１７…ガラスセル
１８…標準蛍光物質
１９…フィルタ
２０…Ａ／Ｄ変換器
２１…ＣＰＵ
【図１】
0003720458.tif 000003
【図２】
0003720458.tif 000004
【図３】
0003720458.tif 000005