(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）親水性ポリ（アルキレンオキシド）成分およびポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）およびポリ（ε−カプロラクトン）からなる群から選ばれる生分解性疎水高分子成分を有する両親媒性ブロック共重合体からなり、ここで両親媒性ブロック共重合体の分子量は2,500ないし7,400ダルトンであり、親水性成分の含量はブロック共重合体の総重量を基準として45.9ないし80重量％である、生分解性高分子薬物伝達体、および
（ｂ）前記高分子薬物伝達体に物理的に封入された疎水性薬物
を含む親水性環境において、前記疎水性薬物を溶解して溶液を形成し得る疎水性薬物−含有生分解性高分子ミセル組成物。
【請求項２】
前記ポリ（アルキレンオキシド）がポリ（エチレンオキシド）である、請求項１記載の疎水性薬物−含有生分解性高分子ミセル組成物。
【請求項３】
前記生分解性疎水性高分子がポリ（乳酸）またはポリ（ε−カプロラクトン）である、請求項１記載の疎水性薬物−含有生分解性高分子ミセル組成物。
【請求項４】
前記両親媒性ブロック共重合体の親水性成分および疎水性成分の分子量が各々2,000ないし3,400ダルトンおよび500ないし4,000ダルトンである、請求項１記載の疎水性薬物−含有生分解性高分子ミセル組成物。
【請求項５】
前記両親媒性ブロック共重合体が二員−ブロックまたは三員−ブロック共重合体である、請求項１記載の疎水性薬物−含有生分解性高分子ミセル組成物。
【請求項６】
前記疎水性薬物がパクリタクセルであり、前記親水性成分が分子量2,000ないし3,400ダルトンのポリ（エチレンオキシド）であり、前記疎水性成分が分子量500ないし4,000ダルトンのポリ（乳酸）である、請求項１記載の疎水性薬物−含有生分解高分子ミセル組成物。
【請求項７】
１）親水性ポリ（アルキレンオキシド）成分およびポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）およびポリ（ε−カプロラクトン）からなる群から選ばれる生分解性疎水性高分子成分を有する両親媒性ブロック共重合体からなり、ここで両親媒性ブロック共重合体の分子量は2,500ないし7,400ダルトンであり、親水性成分の含量はブロック共重合体の総重量を基準として45.9ないし80重量％である、生分解性高分子薬物伝達体のミセル溶液を製造する段階、
２）疎水性薬物を前記生分解性高分子薬物伝達体のミセル溶液と混合する段階、および、
３）生成した混合物を撹拌、加熱、超音波処理または溶媒蒸発して疎水性薬物を高分子薬物伝達体ミセルに物理的に封入することによって、生分解性高分子薬物伝達体および疎水性薬物を含み、水に溶解して溶液を形成し得る疎水性薬物−含有高分子ミセル組成物を形成する段階を含む、
親水性環境において疎水性薬物を可溶化する方法。
【請求項８】
１）親水性ポリ（アルキレンオキシド）成分およびポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）およびポリ（ε−カプロラクトン）からなる群から選ばれる生分解性疎水性高分子成分を有する両親媒性ブロック共重合体からなり、ここで両親媒性ブロック共重合体の分子量は2,500ないし7,400ダルトンであり、親水性成分の含量はブロック共重合体の総重量を基準として45.9ないし80重量％である、生分解性高分子薬物伝達体を製造する段階、
２）前記生分解性高分子薬物伝達体を有機溶媒に溶解している疎水性薬物の溶液に加える段階、および
３）生成した混合物を緩衝液および水に対して順次透析して疎水性薬物を高分子薬物伝達体ミセルに物理的に封入することによって、生分解性高分子薬物伝達体および疎水性薬物を含み、水に溶解して溶液を形成し得る疎水性薬物−含有高分子ミセル組成物を形成する段階を含む、
親水性環境において疎水性薬物を可溶化する方法。
【請求項９】
前記両親媒性ブロック共重合体の親水性成分および疎水性成分の分子量が、各々2,000ないし3,400ダルトンおよび500ないし4,000ダルトンである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疎水性薬物が、パクリタクセル、サイクロスポリンまたはアドリアマイシンである、請求項１記載の疎水性薬物−含有生分解性高分子ミセル組成物。
【請求項１１】
前記両親媒性ブロック共重合体が水に溶解する特性を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性薬物がパクリタクセル、サイクロスポリンまたはアドリアマイシンである、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、親水性ポリ（アルキレンオキシド）成分および疎水性生分解性成分を有する水溶性両親媒性ブロック共重合体ミセル、およびこのミセルに封入された疎水性薬物を含む生分解性高分子ミセル−タイプ薬物組成物に関する。この組成物は水に溶解したとき透明な溶液を形成する。
発明の背景
多くの重要な薬物は疎水性であり、水の中では制限された溶解度を有する。このような薬物の期待される治療効果を得るためには、通常、可溶化された形態の薬物が患者に投与されなければならない。このような目的のために補助溶媒、界面活性剤、塩および溶媒和物のような可溶性形態の薬物、プロドラックのような化学的に修飾された形の薬物、可溶性高分子−薬物複合体、リポソームのような特別な薬物担体などの使用に基づいた多数の方法が開発された。しかし、前記それぞれの方法は一以上の固有の問題によって制限され、たとえば、界面活性剤ミセルの使用に基づいて疎水性薬物を可溶化する方法は、大部分の界面活性剤が比較的に毒性を有し、また、希釈の際に界面活性剤が沈澱するという問題がある。
これに関連して、最近では疎水性薬物を水可溶性にし得る効果的な薬物担体として両親媒性ブロック共重合体ミセルを使用することが多くの関心を引いている。たとえば、界面活性剤に類似した特性を有する両親媒性ブロック共重合体ミセルに対する多くの研究が報告されており、特に注目すべきものは、共重合体の特定性質および物性によって安定化されたブロック共重合体ミセル内に疎水性薬物を封入しようとする試みである。
たとえば、ヨーロッパ特許公開第０  397  307  A2号は、親水性成分としてのポリ（エチレンオキシド）および疎水性成分としてのポリ（アミノ酸）を含有する、ABタイプ両親媒性二元ブロック共重合体の高分子ミセルを開示しており、ここでは、治療学的に活性な薬物が、高分子の疎水性成分に化学的に結合している。この高分子ミセルは疎水性薬物を投与するための手段として提供されたが、官能基をブロック共重合体内に導入しなければならないことは、不都合なことである。
一方、ヨーロッパ特許公開第０  583  955  A2号は、ヨーロッパ特許公開第０  397  307  A2号に記述された両親媒性二元ブロック共重合体内に疎水性薬物を物理的に封入する方法を開示している。したがって、この方法は、化学結合タイプ高分子ミセル薬物の前記短所を解決している。しかしながら、ポリ（アミノ酸）部分は免疫反応を誘発する可能性があり、また製剤の製造に有機溶媒を用いることによっても問題が起り得る。更に、ペプチド結合は体内で酵素によって切断されるため、そこに封入された薬物の放出速度を調節することが難しい。
ヨーロッパ特許公開第０  552  802  A2号は、親水性成分としてのポリ（エチレンオキシド）と水相で架橋結合して得られる疎水性成分としてのポリ（乳酸）とを有する化学的に固定化されたミセルの形成を開示している。すなわち、化学的に固定化されたミセルは、コアを構成する疎水性成分を化学的に架橋結合することによって、安定化された高分子ミセルを模倣するように製造される。しかし、ブロック共重合体の疎水性成分に架橋結合を導入するためには、架橋結合剤、またはUVおよび加熱のような他の手段を、過酸化物の存在下または不存在下で使用しなければならない。その上、そのような架橋結合された高分子粒子の生体適合性または安全性は、これまで確立はされていなかった。さらに、化学的に固定されたミセルは、水−有機溶媒乳化液において形成された両親媒性分子、すなわち、ポリ（エチレンオキシド）−疎水性共重合体であり、ミセルは、PEGの外層、疎水性高分子の二層およびPEGの内層またはコアを含む。
ヨーロッパ特許公開第０  520  888  A1号は、ポリ（乳酸）およびポリ（アルキレンオキシド）ブロック共重合体からなるナノ粒子を開示している。このナノ粒子は網内系による吸収率の低下を示す。高分子量ポリ（乳酸）が用いられ、ナノ粒子のコロイド性懸濁液の製造に界面活性剤が用いられる。この特許において、ナノ粒子は、ブロック共重合体および薬物を有機溶媒に溶解させ、有機溶媒を迅速に蒸発させて薬物を含有するナノ粒子を沈澱させることによって製造される。生成したナノ粒子は、親水性および疎水性成分の両方を有する微細粒子であり、水に不溶性である。前記特許は、ナノ粒子を水に分散するときの疎水性薬物の可溶化という概念は開示していない。
これまで、ミセルの内部コアで疎水性薬物を物理的に捕獲する水溶性ミセルを用いることにより、そのような薬物を水に可溶化することに対する本格的な努力は行われていなかった。
したがって、本発明者らは、前述した問題を伴わない、改善された水溶性可溶化剤を開発するために努力した結果、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）またはこれらの混合物からなる疎水性コア成分の表面を覆っているポリ（エチレンオキシド）親水性成分で構成された両親媒性ブロック共重合体ミセルが、疎水性薬物を物理的にその中へ封入することによって、それらの薬物を可溶化する上で非常に効果的であることを偶然に発見した。
生成した生分解性高分子ミセルは水溶性であり、疎水性薬物に対する効果的な可溶化剤である。生成した組成物は薬物の透明な溶液であり、生体内においては薬物の持続的な放出に適しているため、それにより、薬物の治療効果は向上される。そのような効果は、親水性および疎水性ブロックの分子量および相対的な比率を調節することによって極大化され得る。
発明の要約
したがって、本発明の目的は、薬学的に有効な薬物組成物の製造に使用し得る可溶化された疎水性薬物を含有する水溶性高分子ミセル−タイプ組成物を提供することである。
本発明の一つの側面に従って、親水性表面成分および疎水性コア成分を有する両親媒性ブロック共重合体ミセルと、前記高分子ミセルに封入された少なくとも一つの疎水性薬物とを含有する生分解性高分子ミセルタイプの薬物組成物が提供され、ここで、疎水性成分は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）およびこれらの混合物からなる群から選ばれた生分解性高分子であり、親水性成分はポリ（アルキレンオキシド）である。
本発明の両親媒性ブロック共重合体ミセルは、その中に疎水性薬物を物理的に封入することによって、それらの薬物を可溶化する上で非常に効果的である。可溶化された疎水性薬物を含有する生成された生分解性高分子ミセル組成物は水に溶けて透明な溶液を形成し、生体内においては薬物の持続的な放出に適しているため、それにより、薬物の治療効果は向上させる。そのような効果は親水性および疎水性ブロックの分子量および相対的な比率を調節することによって極大化され得る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）三元ブロック共重合体（EL−3L−１）のGPC（ゲル透過クロマトグラフィー、カラム:MT3−MT4（Waters、米国）、流速:10ml/分、溶出剤：テトラヒドロフラン）の結果である。
図２は、ポリ（エチレンオキシド）−ポリカプロラクトン二元ブロック共重合体（EC−2C−１）のGPC（ゲル透過クロマトグラフィー、カラム:Asahipak GS 520H、溶出剤：蒸留水）の結果である。
図３は、EL−3L−２共重合体ミセルに封入されたパクリタクセル（paclitaxel）およびサイクロスポリンＡ（cyclosporin  Ａ）の放出プロフィールを示す。
図４は、EL−2L−２共重合体ミセルに封入されたパクリタクセルの抗癌活性を示す。
発明の詳細な説明
本発明の生分解性高分子ミセル−タイプ薬物組成物は、生分解性両親媒性ブロック共重合体と一つ以上の疎水性薬物とから製造された生分解性高分子ミセルを含み、投与された際、生体内で単純加水分解によって毒性のない小分子に分解される。平均直径が10ないし60nmである生分解性高分子ミセルは、特に水に不溶性であるか難溶性である疎水性薬物の可溶性注射剤組成物の製造に適合する。
本発明の両親媒性ブロック共重合体からなる生分解性高分子ミセルは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）およびこれらの誘導体のような生分解性疎水性高分子と、ポリ（アルキレンオキシド）のような親水性高分子とを結合させることによって製造できる。疎水性薬物は、本発明の高分子ミセルによって運搬される際、遥かに効果的に患者に送達され、ミセル内に封入された薬物の持続的な放出が、薬物の治療効果を向上させる。
本発明の薬物組成物に用いられるブロック共重合体は、下記式（Ｉ）または（II）を有する高分子であり得る：
0003634377.tif 000002
前記式で、
R1は、水素またはC1-20アルキル、好ましくは、C1-5アルキルであり、
ｍは、２より大きい整数、好ましくは、10ないし136であり、
Ｘは、100以上、好ましくは、300ないし4,000の分子量を有する生分解性疎水性高分子部分であって、好ましくは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）およびこれらの誘導体からなる群から選ばれる。
前述したように、本発明のブロック共重合体の好ましい親水性成分としては、ポリ（エチレンオキシド）が用いられ、本発明のブロック共重合体の疎水性成分は次のような構造を有するポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−co−グリコール酸）、ポリ（ε−カプロラクトン）、これらの誘導体などを含み得る：
0003634377.tif 000003
前記式で、
R2およびR3は、独立的にＨまたはCH3であり、
ｘ、ｙおよびｎは、独立的に２より大きい整数、好ましくは、２ないし45である。
本発明の薬物組成物に使用され得るさらに好ましいブロック共重合体は、下記式（Ｖ）、（VI）、（VII）および（VIII）を有する二元または三元ブロック共重合体である：
0003634377.tif 000004
前記式で、
R1は、水素またはC1-20アルキル、好ましくは、C1-5アルキルであり、
ｉは、２より大きい整数、好ましくは、２ないし55であり、
ｊおよびｋは、独立的に１より大きい整数、好ましくは、２ないし55であり、
ｌは、２より大きい整数、好ましくは、２ないし35であり、
ｍは、前に定義した通りであり、
ｎおよびｐは、独立的に１より大きい整数、好ましくは、２ないし35である。
二元または三元ブロック共重合体は（ABタイプおよびABAタイプ）、下記式（IX）および（Ｘ）に示したように、ポリ（エチレンオキシド）（PEO）親水性成分（Ｂ）とポリ（乳酸）（PLA）疎水性成分（Ａ）で構成され得る：
0003634377.tif 000005
前記式で、
ｉ、ｊ、ｋおよびｍは前述した通りである。
本発明の二元または三元ブロック共重合体は、開環重合によって製造され得る。たとえば、親水性成分（Ｂ）としてのPEOと疎水性成分（Ａ）としてのPLAとからなるABタイプ二元ブロック共重合体は、一方の末端にメトキシ基を有し、他方の末端にヒドロキシ基を有するPEOを用いて製造できる。ABAタイプ三元ブロック共重合体は、両方末端にヒドロキシ基を有するPEOを用いて製造し得る。親水性成分と疎水性成分との比率を調節することによって、水に疎水性薬物を可溶化するための、ブロック共重合体の溶解度を調節できる。
本発明のブロック共重合体ミセル内に封入され得るのに適当な疎水性薬物は、パクリタクセル（paclitaxel）およびサイクロスポリンＡ（cyclosporin  Ａ）およびアドリアマイシン（adriamycin）である。
前述した一つ以上の薬物をブロック共重合体ミセルに封入、または可溶化するためには、下記の種々の方法を単独でまたは組み合わせて使用することができる。
（１）攪拌
ブロック共重合体水溶液に薬物を加え、２ないし24時間攪拌して薬物を含有するミセルを得る。
（２）加熱
薬物とブロック共重合体水溶液を混合し、40ないし120℃で５分ないし24時間攪拌した後、攪拌しながら常温に冷却して薬物を含有するミセルを得る。
（３）超音波処理
薬物とブロック共重合体水溶液の混合物を、１秒ないし１時間超音波処理した後、室温で攪拌して薬物を含有するミセルを得る。
（４）溶媒蒸発
薬物を、水不混和性有機溶媒、たとえば、ジクロロメタン、クロロホルムなどに溶かし、ブロック共重合体水溶液に加える。次いで、攪拌しながら有機溶媒を25−40℃で徐々に蒸発させた後、溶けなかった残在薬物を濾過して除く。
（５）透析
有機溶媒に溶かした薬物の溶液にブロック共重合体を加え、その混合物を緩衝液に対して透析した後、水に対して透析する。
透析法において、薬物を溶かすための適当な水混和性有機溶媒は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジオキサン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、ジメチルアセトアミド（DmAc）、酢酸エチル、テトラヒドロフラン（THF）などである。
本発明の両親媒性ブロック共重合体は、実施例の表１に示すように平均の大きさが10−60nmの安定化されたミセルを形成する。このような大きさの範囲のミセルは、注射製剤用として適当である。ミセルの安定性は、図２に示すゲル透過クロマトグラフィーから分かるように非常に優れている。更に、疎水性薬物は、前述した方法以外の方法によって本発明の生分解性高分子ミセルに封入され得るが、ここで封入された薬物の量および物理的状態はブロック共重合体の組成および高分子ミセルを製造する方法によっても大きく変わり得る（表１、２および３）。疎水性成分の緻密に詰まったコアに含有された薬物は、インビトロで調節された方式で放出されるため（図３）、本発明の組成物は通常の製剤化技術に適しないような薬物を製剤化するのに特に適する。
たとえば、パクリタクセルは優れた抗癌剤であるが、主にこの薬物の低い水溶性のために製剤化が難しい。このような理由で、補助薬として、アレルギー反応のような深刻な副作用を起こし得る、クレモフォア（Cremophor）ELを含有するパクリタクセル製剤が現在市販されている。前記特定製剤は、他の問題も有している：すなわち、この製剤は微細な沈澱物を形成する傾向があるので、注入ライン（injection  line）にフィルターを取付ける必要があり、また、投与に必要な時間が約24時間と長い。
これとは対照的に、本発明の生分解性高分子ミセルは、パクリタクセルの溶解度を大きく向上させ、得られた生分解性高分子ミセル−パクリタクセル組成物は本質的に無毒性であり、高い抗癌治療活性を示す（図４、表４）。加えて、特定生分解性高分子ミセルに封入されたパクリタクセルの量は、水に単独で溶解したパクリタクセルの量より、25.16±3.27％も劇的に増加し、サイクロスポリンＡの場合は、水に単独で溶解したサイクロスポリンＡの量より23.13±2.31％も劇的に増加した（表２および３）。さらに、本発明の生分解性高分子ミセル−パクリタクセル組成物は、封入されたパクリタクセルの85％を48時間にわたって持続的に放出しながら、癌細胞の成長を効果的に防止した。生分解性高分子ミセル−サイクロスポリンＡ組成物の場合には、活性成分の40％が48時間にわたって持続的に放出された（図３）。前記結果から分かるように、本発明の生分解性高分子ミセル−パクリタクセル組成物は、毒性、副作用および効果の面で通常の製剤に比べて優れている。
このように、本発明は、疎水性薬物の通常の製剤に比べて物理的により安定であり、治療学的にもより効果的であり、毒性学的には遥かに安全な生分解性高分子ミセル−タイプ薬物組成物を提供する。
下記製造例および実施例は、本発明の特定側面を詳細に説明するのみであり、いずれかの面でも本発明を制限すると解釈されてはならない。
製造例1:ポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（EL−3L−０）の合成
2gのポリ（エチレングリコール）（Mw 3400）を減圧下、120℃で２時間乾燥し、これに、触媒として0.59mgのオクタン酸第一スズ（stannous  octoate:0.1％のD,L−ラクチドに該当する量）を加えた。生成した混合物を100℃で20ないし30分間減圧して揮発性化合物を除き、0.5882gのD,L−ラクチドと混合し、混合物を130℃で13時間反応させた。
このようにして得られたブロック共重合体を、10mlのクロロホルムに溶かした後、攪拌しながら過剰量のジエチルエーテルを加えて高分子の沈澱を誘導した。沈澱物を濾過し、ジエチルエーテルで数回洗浄した後、30℃で一日間減圧乾燥してEL−3L−０と命名された、ポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（PLA−PEO−PLA）2.46gを得た（収率93％）。このブロック共重合体の特性を表１に示し、ゲル透過クロマトグラフィー結果を図１に示す。
製造例2:ポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（EL−3L−１）の合成
2gのポリ（エチレングリコール）（Mw 3400）および1.18gのD,L−ラクチドを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEL−3L−１と命名されたポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（PLA−PEO−PLA）2.95gを得た（収率93％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例3:ポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（EL−3L−２）の合成
2gのポリ（エチレングリコール）（Mw 3400）および1.76gのD,L−ラクチドを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEL−3L−２と命名されたポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（PLA−PEO−PLA）3.46gを得た（収率89％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例4:ポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（EL−3L−３）の合成
2gのポリ（エチレングリコール）（Mw 3400）および2.35gのD,L−ラクチドを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEL−3L−３と命名されたポリラクチド−ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド三元ブロック共重合体（PLA−PEO−PLA）3.87gを得た（収率93％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例5:ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド二元ブロック共重合体（EL−2L−０）の合成
2gのモノメトキシポリ（エチレングリコール）（Mw 2000）および0.5gのD,L−ラクチドを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEL−2L−０と命名されたポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド二元ブロック共重合体（PEO−PLA）2.28gを得た（収率91％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例6:ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド二元ブロック共重合体（EL−2L−１）の合成
2gのモノメトキシポリ（エチレングリコール）（Mw 2000）および1.0gのD,L−ラクチドを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEL−2L−１と命名されたポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド二元ブロック共重合体（PEO−PLA）2.70gを得た（収率90％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例7:ポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド二元ブロック共重合体（EL−2L−２）の合成
2gのモノメトキシポリ（エチレングリコール）（Mw 2000）および1.5gのD,L−ラクチドを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEL−2L−１と命名されたポリ（エチレンオキシド）−ポリラクチド二元ブロック共重合体（PEO−PLA）3.22gを得た（収率92％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例8:ポリカプロラクトン−ポリ（エチレンオキシド）−ポリカプロラクトン三元ブロック共重合体（EC−3C−１）の合成
2gのポリ（エチレングリコール）（Mw 3400）および1.1765gのカプロラクトンを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEC−3C−１と命名されたポリカプロラクトン−ポリ（エチレンオキシド）−ポリカプロラクトン三元ブロック共重合体（PCL−PEO−PCL）2.86gを得た（収率90％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例9:ポリ（エチレンオキシド）−ポリカプロラクトン二元ブロック共重合体（EC−2C−１）の合成
2gのモノメトキシポリ（エチレングリコール）（Mw2000）および1.5gのカプロラクトンを用いることを除いては、製造例１の手順を繰返してEC−2C−１と命名された、ポリ（エチレンオキシド）−ポリカプロラクトン二元ブロック共重合体（PEO−PCL）3.2gを得た（収率91％）。このブロック共重合体の特性を表１に示す。
製造例10:高分子ミセルの製造
製造例１ないし９で製造した各ブロック共重合体を、蒸留水または0.1Mリン酸塩緩衝溶液（pH7.4）に0.01ないし５％（w/v）の濃度で溶かして高分子ミセル溶液を得た。動的光散乱法によって測定された各高分子ミセル溶液内のミセルの大きさは表１に示したように10ないし60nmの範囲内であった。この大きさの高分子ミセルは薬物担体としての使用に適切である。高分子ミセルの形成は図２においてゲル透過クロマトグラフィーによって確認した。
【表１】0003634377.tif 000006
実施例1:パクリタクセルを含有するブロック共重合体ミセルの製造
（１）攪拌法によるEL−3L−２、EL−2L−２およびEC−3C−１内へのパクリタクセルの封入
製造例３、７および８で合成したブロック共重合体EL−3L−２、EL−2L−２およびEC−3C−１各々を、10mgずつ3mlの蒸留水に溶かし、水に極めて難溶性である抗癌剤パクリタクセル5mgをこれに加えた後、２時間攪拌した。生成した溶液を0.45μｍメンブランフィルターで濾過して不溶のパクリタクセルを除き、パクリタクセルを含有するブロック共重合体ミセルの透明な溶液を得た。1mlの水に分散された高分子ミセルに封入されたパクリタクセルの量を、HPLC（カラム:Curosil−PFP（4.6x250mm、５μｍ粒子大きさ、Phenomenex、アメリカ）、移動相：アセトニトリル／蒸留水＝45:55（v/v））を用いて測定した。その結果を表２に示す。
（２）溶媒蒸発による封入
製造例３で製造したEL−3L−２、10mgを蒸留水に溶かし、パクリタクセル3mgを含有するクロロホルム溶液をこれに徐々に加えた。生成した混合物を室温で一晩攪拌してクロロホルムを蒸発させた。生成した溶液を0.45μｍのメンブランフィルターで濾過して不溶のパクリタクセルを除き、パクリタクセルを含有するブロック共重合体ミセルの透明な溶液を得た。製造例７および８で合成したEL−2L−２およびEC−3C−１を用いて前記手順を繰返した。パクリタクセル封入率は、前記（１）と同様な方法で測定した。その結果を表２に示す。
（３）透析による封入
5mgのパクリタクセルを5mlのDMFに溶かした。生成した溶液に製造例３で製造したEL−3L−２を加え、混合物を一晩攪拌した。混合物を透析膜（MWCO:12000）を用いて0.1Mリン酸塩緩衝溶液（pH7.4）で５時間透析した後、蒸留水で５時間透析した。透析した溶液を0.45μｍメンブランフィルターで濾過してパクリタクセルを含有するブロック共重合体ミセルの透明な溶液を得た。製造例７および８で合成したEL−2L−２およびEC−3C−１を用いて前記手順を繰返した。パクリタクセル封入率は、前記（１）と同様な方法で測定した。その結果を表２に示す。
前記実験は、パクリタクセルが、25.16±3.23％の量で本発明の高分子ミセルに容易に封入され得ることを示す。
【表２】0003634377.tif 000007
実施例2:サイクロスポリンＡを含有するブロック共重合体ミセルの製造
（１）溶媒蒸発による封入
水に極めて難溶性である免疫抑制剤サイクロスポリンA10mgを、1mlのN,N−ジメチルアセトアミドに溶かし、20mlの蒸留水にEL−3L−２  20mgを含有する溶液に徐々に加えた。生成した混合物を室温で一晩攪拌してN,N−ジメチルアセトアミドを蒸発除去した後、生成した溶液を0.45μｍメンブランフィルターで濾過して、サイクロスポリンＡを含有するブロック共重合体ミセルの透明な溶液を得た。製造例９で合成したEC−2C−１を用いて前記手順を繰返した。サイクロスポリンＡ封入率は実施例１と同様な方法で測定した。その結果を表３に示す。
（２）透析による封入
10mgのサイクロスポリンＡを5mlのDMFに溶かした。生成した溶液に、製造例３で製造したEL−3L−２  20mgを加え、混合物を一晩攪拌した。混合物を透析膜（MWCO:12000）を用いて0.1Mリン酸塩緩衝溶液（pH7.4）で５時間透析した後、蒸留水で５時間透析した。透析した溶液を0.45μｍメンブランフィルターで濾過して、サイクロスポリンＡを含有するブロック共重合体ミセルの透明な溶液を得た。製造例９で合成したEC−2C−１を用いて前記手順を繰返した。サイクロスポリンＡ封入率は実施例１と同様な方法で測定した。その結果を表３に示す。
前記実験は、サイクロスポリンＡが、23.13±2.31％の量で本発明の高分子ミセルに容易に封入され得ることを示す。
【表３】0003634377.tif 000008
実施例3:放出試験
実施例１および２で製造したパクリタクセル−およびサイクロスポリンＡ−含有EL−3L−２共重合体ミセル溶液各5mlを、透析袋（MWCO:12,000）に入れた。透析袋を1lのH2Oに入れ、ミセルから放出されたパクリタクセルまたはサイクロスポリンＡの量を経時測定した。図３から分かるように、封入された薬物は持続的な放出プロフィールを示す。
実施例4:毒性試験および効果試験
106 P388白血病細胞を、体重22ないし25gの雌性BDF1マウス６匹ずつからなる三つのグループのマウスの各々に対して腹腔内に注入した。
白血病細胞を注入してから24時間後、グループＩの各マウスにベヒクル（５％DMSOおよび５％クレモフォア食塩溶液）12.5mg/kgを24時間の間隔で４回腹腔内注入し、グループIIの各マウスには同一な条件の下でパクリタクセルおよびベヒクル（５％DMSOおよび５％クレモフォア食塩溶液）で同様に処理した。
一方、グループIIIの各マウスには、実施例１（２）で製造したパクリタクセル−含有EL−2L−２共重合体ミセル溶液25mg/kgを、白血病細胞を投与してから24時間および72時間後に２回腹腔内投与した。
平均生存時間および第５日の体重変化を表４に示す。
【表４】0003634377.tif 000009
パクリタクセル−含有EL−2L−２共重合体ミセルの抗癌活性は、指定された時間にグループIIIの腫瘍重さをグループＩおよびIIと比べて測定することによって決定した。図４の結果は、腫瘍の成長が本発明の高分子ミセル薬物組成物によって効果的に阻害されたことを示す。
前述したように、水不溶性疎水性薬物は、親水性成分および疎水性成分を有する本発明の生分解性ブロック共重合体ミセル内に攪拌、加熱、超音波処理、溶媒蒸発、透析などによって容易に封入され得る。このようにして得られた高分子ミセル薬物組成物はより多い量の薬物を患者の体内に効果的に搬入するため非常に向上した薬学的効能を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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