(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板、前記基板上に設けられた少なくとも測定極と対極を有する電極系、前記電極系上またはその近傍に形成された反応層、および前記電極系上に設けられた親水性高分子層からなり、
前記反応層が、前記親水性高分子層上に形成された酸化還元酵素を含む層と、前記酸化還元酵素を含む層と隔離して設けられた電子メディエーターを含む層と、を備え、
前記電子メディエーターがフェロセン６フッ化リン酸塩およびフェロセン４フッ化ホウ酸塩からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記基板に組み合わされて基板との間に前記電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の試料液供給路に露出する面に親水性高分子層を設け、
前記カバー部材上の親水性高分子層上に前記電子メディエーターを含む層が形成されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記基板上の電極系の隣接部に、前記電極系上の親水性高分子層に隔離して別の親水性高分子層が設けられ、前記別の親水性高分子層上に前記電子メディエーターを含む層が形成されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記基板に組み合わされて基板との間に前記電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の試料液供給路に露出する面に前記電子メディエーターを含む層が形成されており、かつ前記電子メディエーターを含む層に親水性高分子が混合されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記酸化還元酵素を含む層の隣接部に隔離して前記電子メディエーターを含む層が形成されており、かつ前記電子メディエーターを含む層に親水性高分子が混合されている請求項１記載のバイオセンサ。
【請求項６】
請求項２または３に記載のバイオセンサの製造方法であって、前記電子メディエーターを含む層を形成する工程が、電子メディエーターを酸性溶液に溶解させた溶液を滴下し乾燥させる工程からなることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項７】
請求項４または５に記載のバイオセンサの製造方法であって、前記電子メディエーターを含む層を形成する工程が、親水性高分子および電子メディエーターを酸性溶液に溶解させた溶液を滴下し乾燥させる工程からなることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項８】
前記酸性溶液が塩酸であることを特徴とする請求項６または７に記載のバイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定成分を迅速、高精度に、かつ簡便に定量することができるバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、試料中の特定成分について、試料液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方式として、様々なバイオセンサが提案されている。
例えば、グルコースの定量方法として、グルコースオキシダーゼと酸素電極あるいは過酸化水素電極とを組み合わせた方式が一般に知られている。グルコースオキシダーゼは、基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。この時、酸素が電子メディエーターの働きをする。この反応にともない、酸素は過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸素電極によって測定するか、または生成される過酸化水素の量を白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定することによりグルコースを定量することができる。
しかし、上記の方法では、酸素のない条件下では測定が不可能である。そこで、酸素を電子メディエーターとして用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、またはキノン誘導体等の金属錯体や有機化合物を電子メディエーターとして用いるタイプのグルコースセンサが開発されている。
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエーターの還元体を電極で酸化することにより、その酸化電流値からグルコース濃度が求められる。この手法は、グルコースに限らず他の基質の定量にも広く応用され、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的には可能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記したようなバイオセンサにおいては、電子メディエーターとして安定性に優れ、また大量生産に適するフェリシアン化カリウムを用いる場合が多い。
しかし、フェリシアン化物イオンと酵素間の二次反応速度は、比較的遅いという問題点があった。
本発明は、電子メディエーターと酵素間の二次反応速度が速く、短時間で高精度の測定ができるバイオセンサを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために本発明によるバイオセンサは、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた少なくとも測定極と対極を有する電極系、前記電極系上またはその近傍に形成された反応層、および前記電極系上に設けられた親水性高分子層からなり、前記反応層は、前記親水性高分子層上に形成された酸化還元酵素を含む層と、前記酸化還元酵素を含む層と隔離して設けられた電子メディエーターを含む層と、を備え、前記電子メディエーターとしてフェロセン６フッ化リン酸塩およびフェロセン４フッ化ホウ酸塩からなる群より選ばれた少なくとも１種を用いる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
フェロセン６フッ化リン酸塩およびフェロセン４フッ化ホウ酸塩は、中性域では非常に不安定であるが、酸性溶液中では、極めて長時間安定に存在する。そのため、本発明によるバイオセンサの反応層は、これらフェロセン化合物を酸性溶液に溶解させ、この溶液を滴下乾燥させることにより形成するのが好ましい。従って、酸化還元酵素をはじめとする反応試薬系の他の成分が、酸性条件下で不安定である場合には、これらよりなる層を前記電子メディエーターを含む層とは分離して形成することが好ましい。この構成を採用することにより、反応試薬系全体を安定に保つことができ、かつより迅速に測定対象物の濃度を測定できるバイオセンサを得ることができる。
【０００６】
大部分のフェロセン化合物は、還元体として市販されている。従って、電子メディエーターとしてフェロセンを用いる場合は、電極上にて還元体フェロセンを酸化体フェロセンに変換する必要がある。
本発明は、酸化型フェロセン化合物のフェロセン６フッ化リン酸塩およびフェロセン４フッ化ホウ酸塩を用いるので、これをそのまま反応層に適用できる。
これらの酸化型フェロセン化合物は、フェリシアン化カリウムを用いた場合よりも、応答速度が著しく速く、より高精度な測定を迅速に行うことが可能になる。
【０００７】
これらの電子メディエーターは、その溶媒として、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、過塩素酸、メタンスルホン酸、トリフロロ酢酸等の酸性溶液が好適に用いられる。
この電子メディエーターを含む層と酸化還元酵素を含む層との配置に関してはいくつかの好ましい形態がある。
すなわち、酸化還元酵素を含む層を基板上に電極系に接して設け、電子メディエーターを含む層をこの層の隣接部にそれぞれ隔離して、またはカバー部材の試料液供給路に露出する面に設けるなどである。以下に、さらに詳しく説明する。
【０００８】
まず、本発明による第１のバイオセンサは、基板上の電極系に接して親水性高分子層を設け、この親水性高分子層に接して、酵素類を含む層を設けてある。さらに前記基板に組み合わせて基板との間に試料液供給路を構成するカバー部材には、試料液供給路に露出する面に接して親水性高分子層を設け、この層に接して電子メディエーターを含む層を設けてある。また、必要に応じて脂質を含む層が前記酵素類を含む層および／または電子メディエーターを含む層を被覆している。
試料液供給路に露出するカバー側の面に接して設けられた親水性高分子層は、電子メディエーターを含む層が剥がれやすくなるのを防止するのに役立つ。
本発明による第２のバイオセンサは、基板上の電極系に接して親水性高分子層を設け、この親水性高分子層に接して、酵素類を含む層を設けてある。さらに前記酵素類を含む層の試料液供給路の開口部側に、この層とは接しないように電子メディエーターを含む層を設けてある。また、必要に応じて脂質を含む層が前記酵素類を含む層および電子メディエーターを含む層を被覆している。この脂質を含む層は、前記２つの層の近傍に設けられていてもよい。
上述のバイオセンサにおいて、親水性高分子層とこの層に接する電子メディエーターを含む層とを形成する代わりに、親水性高分子と電子メディエーターの混合物からなる層を設けてもよい。
【０００９】
親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、水溶性セルロース誘導体（特にエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース）、ゼラチン、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、またはポリ２ーヒドロキシエチルメタクリレートなどを用いることができる。
さらに、コレステロルエステラーゼには、シュードモナス類由来のものとほ乳類膵臓由来のものが挙げられる。
シュードモナス由来のコレステロルエステラーゼを用いる場合、界面活性剤として、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、Ｌｕｂｒｏｌ  ＰＸ、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、ＤＫ−エステルを用いると良好な応答を示す。
また、ほ乳類膵臓由来のコレステロルエステラーゼものを用いる場合は、コール酸ナトリウムなどの、胆汁酸骨格を持つ界面活性剤を用いると、さらに良好な応答性が得られる。
試料溶液の反応層への導入を容易にする脂質には、レシチン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親媒性脂質が好ましい。
酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二極電極系と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。
【００１０】
【実施例】
図１は、反応層を除いたバイオセンサの分解斜視図である。電極系を形成した絶縁性基板１と、空気孔１６を備えたカバー１４およびスペーサー１３を、図１中に一点鎖線で示すような位置関係をもって接着してバイオセンサを作製する。このようなバイオセンサでは、基板１とカバー１４との間において、スペーサー１３のスリット１５の部分に試料液供給路を構成する空間部が形成され、その開口部となるスリット１５の先端部１８に、試料液を接触させるだけの簡易操作で、試料液は容易に試料液供給路を通じて反応層部分へ導入される。試料液の供給量はカバーとスペーサーによって生じる空間容積に依存するため、あらかじめ定量する必要はない。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑えることができ、精度の高い測定が可能となる。ここで、カバーおよびスペーサーに透明な高分子材料を用いると、反応層の状態や試料液の導入状況を外部から容易に観察することができる。
図２は、スペーサー１３とカバー１４を重ね合わせたカバー部材の斜視図であり、図１とは上下逆に配置してある。このカバー部材と基板を組み合わせて、試料液供給路を構成する空間部が形成される。１７は、この試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面を示す。
【００１１】
図３は、本発明による第１のバイオセンサの縦断面図である。
１は、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性基板を示す。この基板１上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷してリード２と３を形成してある。そして、基板１上に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷することにより、測定極４と対極５を含む電極系を、また絶縁性ペーストを印刷することにより絶縁層６をそれぞれ形成している。絶縁層６は、測定極４および対極５の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的に覆っている。前記電極系上に親水性高分子層７、および試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面１７に接して親水性高分子層１２がそれぞれ形成されている。さらに、この親水性高分子層７に接して、酵素類を含む層８（８ａ）を形成し、脂質を含む層９でこれらの層を覆っている。また、親水性高分子層１２に接して、電子メディエーターを含む層１０を形成している。
図４は、図３における親水性高分子層１２と電子メディエーターを含む層１０の代わりに、親水性高分子と電子メディエーターからなる混合層１１を形成している。
図５は、本発明における第２のバイオセンサの縦断面図である。
絶縁性基板１上にリード２と３、測定極４、対極５、絶縁層６、親水性高分子層７は、図３と同様にして形成したものである。そして、前記親水性高分子層７に接して、酵素類を含む層８を形成している。さらに、酵素類を含む層８と試料液供給路の開口部１８との間に、親水性高分子層１９を隔離して形成し、この層に接して、電子メディエーターを含む層２０を形成してある。
酵素類を含む層８と電子メディエーターを含む層２０を覆うように、脂質を含む層９が形成されている。
図６は、図５における脂質を含む層９を試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面１７に接して形成している。
以下に、具体的な実施例を詳しく説明する。
【００１２】
《実施例１》
本発明における第１のバイオセンサの構成で、コレステロールセンサを形成した。
図３の基板１の電極系上に、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下ＣＭＣと略す）の０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させ、ＣＭＣ層７を形成した。つづいて、ノカルジア由来のコレステロールオキシダーゼ（以下、コレステロールオキシダーゼをＣｈＯＤと略す。）を４００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、シュードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（以下コレステロールエステラーゼをＣｈＥと略す）を１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、およびｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを１．２ｗｔ％をそれぞれ水に溶解させ、混合水溶液を作製した。この混合水溶液をＣＭＣ層７上に滴下し、５０℃で１５分間乾燥させＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび界面活性剤の混合層８を形成した。
【００１３】
この混合層８の上に、ホスファチジルコリンの０．５ｗｔ％トルエン溶液を５μｌ滴下して、乾燥させ、レシチン層９を形成した。
さらに、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面１７にも、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾燥させてＣＭＣ層１２を形成した。つづいて、０．０５規定塩酸にフェロセン４フッ化ホウ酸塩をその濃度が１０ｍＭ／ｍｌになるように溶解させて溶液Ａを作製した。この溶液Ａ５μｌをＣＭＣ層１２上に滴下し、常温空気中で乾燥させて、電子メディエーターを含む層１０を形成した。
そして、カバー１４およびスペーサー１３を図１中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着し、コレステロールセンサを作製した。
このコレステロールセンサに、コレステロール標準液３μｌを試料供給路の開口部１８より供給した。そして、３分後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ＋０．５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した。こうして、コレステロールセンサのコレステロール標準溶液に対する応答を測定した。
【００１４】
《実施例２》
実施例１と同様にして、図４の基板１の電極系上に接して、ＣＭＣ層７と混合層８とレシチン層９を形成した。つづいて、実施例１で作製した溶液ＡとＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を混合して溶液Ｂを作製した。そして、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面１７にこの溶液Ｂを５μｌ滴下し、常温空気中で乾燥させて、ＣＭＣと電子メディエーターからなる混合層１１を設けた。こうして、実施例１と同様にして、コレステロールセンサを作製し、そのコレステロール標準溶液に対する応答を測定した。
【００１５】
《実施例３》
本発明における第１のバイオセンサの構成で、グルコースセンサを形成した。実施例１と同様にして、図３の基板１の電極系上にＣＭＣ層７を形成した。つづいて、グルコースオキシダーゼ（以下ＧＯｘと略す）の１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌをＣＭＣ層７を覆うように４μｌ滴下し、５０℃の乾燥機中で１０分間乾燥させることにより、ＧＯｘ層８ａを形成した。
さらに、ＧＯｘ層８ａの上に実施例１と同様にして、ホスファチジルコリンの０．５ｗｔ％トルエン溶液を５μｌ滴下して乾燥させ、レシチン層９を形成した。
次に、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面１７にも、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾燥させてＣＭＣ層１２を形成した。このＣＭＣ層１２を覆うようにして、実施例１で作製した溶液Ａを５μｌ滴下し、常温空気中で乾燥させて、電子メディエーターを含む層１０を形成した。
こうして、実施例１と同様にして、グルコースセンサを作製し、そのグルコース標準溶液に対する応答を測定した。
【００１６】
《実施例４》
実施例３と同様にして、図４の基板１の電極系上に接して、ＣＭＣ層７とＧＯｘ層８ａとレシチン層９を形成した。つづいて、実施例１で作製した溶液Ｂを、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面１７に５μｌ滴下し、常温空気中で乾燥させて、ＣＭＣと電子メディエーターからなる混合層１１を設けた。
こうして、実施例１と同様にして、グルコースセンサを作製し、そのグルコース標準溶液に対する応答を測定した。
【００１７】
《実施例５》
本発明における第２のバイオセンサの構成で、コレステロールセンサを形成した。
実施例１と同様に、図５の基板１の電極系上にＣＭＣ層７、ＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび界面活性剤の混合層８を形成した。さらに、このＣＭＣ層７に接した混合層８と試料液供給路の開口部１８に相当する基板先端部の間に、これらの層と接触しないように、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を滴下し、乾燥させてＣＭＣ層１９を形成した。このＣＭＣ層１９を覆うようにして、実施例１で作製した溶液Ａを５μｌ滴下し、常温空気中で乾燥させて、電子メディエーターを含む層２０を形成した。
次に、混合層８と電子メディエーターを含む層２０を覆うように、スファチジルコリンの０．５ｗｔ％トルエン溶液を５μｌ滴下し、乾燥させ、レシチン層９を形成した。
こうして、実施例１と同様にして、コレステロールセンサを作製し、そのコレステロール標準溶液に対する応答を測定した。
【００１８】
以上のいずれのバイオセンサも、各標準溶液に対する応答は、良好な直線性を示した。
【００１９】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、試料液中の特定成分濃度を測定するバイオセンサにおいて、より短い時間で高精度の測定ができるバイオセンサを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例におけるバイオセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
【図２】同バイオセンサのカバーとスペーサーを重ね合わせたカバー部材で、図１とは上下逆に配置した斜視図である。
【図３】同バイオセンサの要部の縦断面図である。
【図４】本発明の他の実施例のバイオセンサの要部の縦断面図である。
【図５】本発明の他の実施例のバイオセンサの要部の縦断面図である。
【図６】本発明の他の実施例のバイオセンサの要部の縦断面図である。
【符号の説明】
１  絶縁性基板
２    リード
３  リード
４  測定極
５  対極
６  絶縁層
７  ＣＭＣ層
８  ＣｈＯＤ、ＣｈＥおよび界面活性剤の混合層
８ａ  ＧＯＸ層
９  脂質を含む層
１０  電子メディエーターを含む層
１１  ＣＭＣと電子メディエーターからなる混合層
１２  ＣＭＣ層
１３  スペーサー
１４  カバー
１５  スペーサーのスリット
１６  空気孔
１７  試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面
１８    試料液供給路の開口部
１９    ＣＭＣ層
２０    電子メディエーターを含む層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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