(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子中に少なくとも、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
分子中に少なくとも、配列番号２に記載の塩基配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを構成するアミノ酸配列であって、連続する少なくとも１５のアミノ酸からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞。
【請求項６】
前記組み換え微生物細胞が大腸菌である請求項５に記載の微生物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、プロテアソームアクチベーターに関するものであり、さらに詳しくは該プロテアソームアクチベーターのポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアソームは、別名、多機能性プロテアーゼと呼ばれ、不活性型で細胞内に局在し、エネルギー依存性蛋白質分解系を構成する主要酵素である。本酵素は、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在しており、またすべての組織に存在し、なかでも肝臓では、全可溶性蛋白質の１％も占める。
該酵素は同一分子内に複数の触媒活性部位を持ち、トリプシン型酵素の基質である塩基性アミノ酸、キモトリプシン型酵素の基質である中性アミノ酸、そしてプロテアーゼとしては稀な酸性アミノ酸を含む合成ペプチドのカルボキシ末端のペプチド結合を切断する活性がある。
しかしながら、種々の既知の阻害剤の中で特異的で有効に作用するものがないことから、該酵素は、既知のプロテアーゼとは異なる触媒活性部位を持つと推定されている。
また、沈降係数２０Ｓ、分子量は約７５万と推定され、プロテアーゼとしては例外的に大きい。
【０００３】
かかるプロテアソームは、非リソゾーム系蛋白質分解経路における主要酵素であり、蛋白質の修飾による機能制御や蛋白質の代謝回転の調節など多彩な生理作用を有していると推定される。
さらに、最近、プロテアソームが内在性抗原のプロセシング酵素であると考えられており、注目されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
プロテアソームは、このような２０Ｓ型複合体として見いだされた。
さらに、本発明者は最近、多数の制御因子群がこの２０Ｓプロテアソームに可逆的に結合し、分子量約２００万、沈降係数２６Ｓの巨大な複合体を形成していることを見いだし、２６Ｓプロテアソームと命名した（  特開平５−２９２９６４、特開平６−０２２７５９）。また、これら、多数の制御因子群が結合することによって、２０Ｓプロテアソームの活性が促進されることがしられている。
しかしながら、プロテアソームを活性化する制御因子群は、これら２６Ｓプロテアソーム制御因子群しか明かにされておらず、その他の活性化因子、すなわちプロテアソームアクチベーターについての詳細は明かにされておらず、その詳細を明かにし、各種病態の診断、および治療法を確立することが強く要望されている。
【０００５】
そこで、本願発明者は、このような状況を踏まえ、前記プロテアソームアクチベーターについて、その構成成分である個々のサブユニットの構造、機能等について鋭意研究を重ねた結果、新規なプロテアソームアクチベーターについて解明し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はプロテアソームアクチベーターの構成成分の同定およびその機能を明らかにし、さらに該プロテアソームアクチベーターのポリペプチドのアミノ酸配列を提供することを目的とするものである。
また、本発明は前記プロテアソームアクチベーターの構成成分のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、該プロテアソームアクチベーターの機能の解明および、免疫疾患をはじめ各種病態の診断治療の方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、前記目的を達成可能とするため、前記プロテアソームについて、その構成成分である個々のサブユニットの構造、機能等について詳細に研究を重ねた結果、プロテアソームの構成成分であるプロテアソームアクチベーターについて解明した。
さらに、前記の知見に基づき、各種病態の診断、および治療法を提供することが可能となった。
すなわち、本発明は、前記プロテアソームアクチベーターを同定しそのポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること、さらにそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定することからなる。
【０００７】
さらに本発明は、プロテアソームアクチベーターのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補的ポリヌクレオチドを作製可能とし、これを用いて各種ヒト臓器におけるプロテアソームアクチベーターのｍＲＮＡの発現量を定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方法に使用可能とするものである。
【０００８】
さらに本発明においては、各種プロテアソームアクチベーターに対する抗体を作成可能とし、これらの抗体を用いて、各種細胞中のプロテアソームアクチベーターを定量することを可能にし、免疫疾患等の診断方法に使用可能とするものである。
【０００９】
より詳しくは、本発明は、分子中に少なくとも、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドに係るものであり、さらにそのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに係るものである。
【００１０】
さらに本発明は、分子中に少なくとも、配列番号２に記載の塩基配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリヌクレオチドに係るものである。
【００１６】
さらに本発明は、配列番号１に記載のポリペプチドを構成するアミノ酸配列であって、連続する少なくとも１５のアミノ酸からなるポリペプチドに係るものである。
【００２２】
また本発明は、分子中に少なくとも、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とするヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞、または大腸菌に係るものである。
【００２４】
以下本発明を詳細に説明する。
（ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチド）
以下で説明する方法により塩基配列が決定されたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから推定される、ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１に記載の通りである。
また、本発明に係るヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペプチド、および前記アミノ酸配列のＮ末端にヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのためのシグナルペプチドの部分もしくは全部が結合または、欠損した中間体も含包する。
【００２５】
また、自然の変異により、または人工の変異によりポリペプチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させることが可能である。
本発明のヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有する相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドも含包する。
【００２６】
（ラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチド）
以下で説明する方法により塩基配列が決定されたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから推定される、ラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３に記載の通りである。
本発明に係るラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合していないポリペプチド、および前記アミノ酸配列のＮ末端にラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのためのシグナルペプチドの部分もしくは全部が結合または、欠損した中間体も含包する。
【００２７】
また、自然の変異により、または人工の変異によりポリペプチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させることが可能である。
本発明のラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドは、前記アミノ酸配列を有する相同変異体に相当する構造を有するポリペプチドも含包する。
【００２８】
（プロテアソームアクチベーターの精製）
本発明のプロテアソームアクチベーターは、各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより、精製が可能である。例えば牛赤血球細胞からは、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０５１５−１０５２３，１９９２  に記載の方法に準じて、硫酸アンモニウムによる沈殿の後、セファクリルＳー３００、ＤＥＡＥーＳｅｐｈａｃｅｌ，  ハイドロキシアパタイトカラム、Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬー４Ｂによる分離精製が可能である。
なお、精製を進めるためのアッセイ法としては、２０Ｓプロテアソームのプロテアーゼ活性をアクチベートする活性があるかどうかを調べることによって行うことができる。
【００２９】
精製したプロテアソームアクチベーターは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳーＰＡＧＥ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｄａｖｉｄ  ｌａｎｅ  著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ，６３６−６４０  ，１９８８）や、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ  等による２次元電気泳動（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，４００７−４０２１，１９７５）により分離した後、ゲルをクマシー染色すると、分子量２８  ｋＤａのバンドとして観察される。
【００３０】
（プロテアソームアクチベーターの単離）
上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥや２次元電気泳動によるバンドからプロテアソームアクチベーターを単離するには、分子量約２８ｋＤａ  のバンドを選ぶことにより可能である。さらに、電気泳動法より分離同定されたプロテアソームアクチベーターをポリビニリデンジフルオロダイド（ＰＶＤＦ）等にトランスファーすることが可能である。
【００３１】
（プローブの作成）
上記の処理後、リジルエンドペプチダーゼなどによる各種酵素処理によりポリペプチドフラグメントの混合物とし、得られたペプチドフラグメントの混合物を高速液体クロマトグラフィーで分離する。
上記で得られたポリペプチドフラグメントのいくつかのフラグメントのアミノ酸配列を自動アミノ酸シークエンサー等を用いて決定することが可能である。
上記の解析によって得られたアミノ酸配列の一部の情報をもとにポリヌクレオチドの検索に必要なプローブは、得られたポリペプチドフラグメントのうち縮重頻度の低いものを選択し、これに対応する相補的ポリヌクレオチドとして合成して作成することにより可能である。
【００３２】
また、複数のアミノ酸配列が得られた場合は、対応する相補的ポリヌクレオチドを組み合わせて、ヒトのｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，斎藤隆    監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）により、より長い断片のＤＮＡプローブを得ることが可能である。
以上のようにして、プロテアソームアクチベーターをスクリーニングするためのＤＮＡプローブが得られる。
【００３３】
（相補鎖ＤＮＡライブラリーの作製およびスクリーニング）
本発明においてポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをスクリーニングするためのｃＤＮＡライブラリーの作製は、一般的な方法が使用可能であり例えば次のステップにより可能である。
【００３４】
すなわち、（ｉ）プロテアソーム産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、
（ｉｉ）該ｍＲＮＡから、単鎖の相補鎖ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、次いで２重鎖ポリヌクレオチドを合成し、
（ｉｉｉ）２重鎖ポリヌクレオチドをプラスミドまたはファージに組み込み、
（ｉｖ）得られた組換えプラスミドまたはファージにより適当な宿主細胞を形質転換し、
（ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から、適当な方法、例えばコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションにより、目的とするポリヌクレオチドを含有するプラスミドまたはファージを単離し、
（ｖｉ）そのプラスミドまたはファージから目的とするポリヌクレオチドを切り出し、
（ｖｉｉ）該クローン化ポリヌクレオチドを適当なプラスミドにサブクローニングする、というステップである。
【００３５】
各ステップについてさらに詳しく説明する。
ステップ（ｉ）：プロテアソームアクチベーターのポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、種々の動物の組織、器官、産生細胞から、より具体的には、肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、胸腺、肝臓癌細胞株、腎臓癌細胞株などから得ることができる。
また該酵素産生細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、グアニジウム／セシウムクロライド法（Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ／Ｃｅｓｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍｅｔｈｏｄ，    Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，    Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９４−１９６，  １９８２）やグアニジウムチオシアネート法  （Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １６２，  １５６−１５９，  １９８７）  等が一般に用いられる。
【００３６】
前記操作により得られる全ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離、精製は例えば、オリゴｄＴーセルロース（コラボレイティブ    リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ    Ｒｅｓｅａｒｃｈ社））やオリゴテックスーｄＴ３０（タカラ社）等を用いて吸着カラム法またはバッチ法により実施できる。
ステップ（ｉｉ）：このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて、例えばオカヤマーバーグ法  （Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｐ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３，  ２８０，  １９８３）  やグブラーとホフマンの方法  （Ｇｕｂｌｅｒ  ，Ｖ．  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｇｅｎｅ，  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３）等に従いｃＤＮＡを合成する。
【００３７】
ステップ（ｉｉｉ）：得られたｃＤＮＡをプラスミドやファージに組み込み、ｃＤＮＡのライブラリーを調製する。
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、例えば、ＰＢＲ３２２  （Ｇｅｎｅ，  ２，  ９５，１９７７）  、ＰＢＲ３２５  （Ｇｅｎｅ，  ４，  １２１，  １９７８），  ＰＵＣ１２  （Ｇｅｎｅ，  １９，  ２５９，  １９８２），  ＰＵＣ１３  （Ｇｅｎｅ，１９，２５９，１９８２），  ＰＵＣ１８  （Ｇｅｎｅ，  ３３，  １０３，  １９８５），  ＰＵＣ１９  （Ｇｅｎｅ，  ３３，１０３，１９８５），  ＰＵＣ１１８  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５３，  ３，  １９８７），    ＰＵＣ１１９  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５３，  ３，  １９８７），  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９８９  ）、などが挙げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも用いることができる。
【００３８】
また、ｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えば、λｇｔ１０  （Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．Ｖ．，  Ｙｏｕｎｇ，  Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．Ｗ．，ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １，  ４９，  １９８５）  、λｇｔ１１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８０，  １１９４，  １９８３）またはλＺＡＰＩＩ  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，１７，９４９４，１９８９）、などが使用可能であるが、その他のベクターであっても、適当な宿主内で増殖できるものであれば良い。
また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えば、Ｈｙｕｎｈ，  Ｔ．Ｖ．  等の方法  （  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １，  ４９，  １９８５）  などが使用可能である。
【００３９】
ステップ（ｉｖ）：前記の方法により得られたプラスミドやファージベクターは、これを適当な宿主たとえば、エシェリヒア    コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  、サッカロミセス    セレビシアエ  （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  等に導入して、これを形質転換できる。
プラスミドベクターで宿主を形質転換する方法としては、例えば、文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １．７４−１．８４，  １９８９）  記載のエレクトロポーレーション法あるいはカルシウムクロライド法などが挙げられる。また、ファージベクターにはたとえば、増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導入することができる。
【００４０】
ステップ（ｖ）：前記方法によるｃＤＮＡから目的のプロテアソームアクチベーターのｃＤＮＡを選択するには、例えばラベル化したプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法または、プラークハイブリダイゼーション法  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １．８５−１．１０４  ｏｒ  ２．１１２−２．１２０，  １９８９）などが使用可能である。
前記のハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いるポリヌクレオチドとしては、プロテアソームアクチベーターとハイブリダイズする少なくとも１２の塩基からなるポリヌクレオチドであれば、何でもよく、例えばプロテアソームアクチベーターのアミノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチド，あるいはプロテアソームの他のコンポーネントをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡ等が使用可能である。
【００４１】
さらに、プロテアソームの他のコンポーネントをコー  ドするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、およびこれらの部分ＤＮＡも、サブユニットとハイブリダイズ可能であるかぎり使用可能である。
以上のようにして、プロテアソームアクチベーターをコードするポリヌクレオチドが調製可能となる。
【００４２】
（プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの塩基配列の決定）
前記に従い得られたｃＤＮＡの塩基配列の決定は、例えば、マキサムーギルバート（Ｍａｘｉａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６５，  ４９９−５６０，  １９８０）  、ジデオキシ法  （Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ    ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９，  ３０９，  １９８１）、蛍光色素を用いたＴａｑ  サイクルシークエンシング法等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，４９４−４９９，１９８９）により可能である。
決定されたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は例えば配列番号２に記載のごとく表される。またラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は例えば配列番号４に記載のごとく表される。
【００４３】
本発明に係る上記ポリヌクレオチドは、配列番号２または４に記載塩基配列であって、５’末端にＡＴＧが結合していない塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む。
本発明の上記ポリヌクレオチドはまた、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのシグナルペプチドの部分または全部をコードする５’フランキングポリヌクレオチドを含むＤＮＡも含む。
さらに、自然の変異により、または人工的変異により、主たる活性に変化を与えることなく、ポリヌクレオチドの構造およびそれから演繹されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめることが可能である。
従って、本発明に係るポリヌクレオチドは、前述のすべてのポリペプチドの相同異性体に相当する構造を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含有する。
【００４４】
さらに、遺伝暗号の縮重に従い、ポリヌクレオチドから生産されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくそのポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一つの塩基を他の種類の塩基に置換することができる。
従って、本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、変換された塩基配列を含有する。この場合、上記置換により得られた塩基配列より、演繹されるアミノ酸配列はヒトの場合は配列番号１に記載のアミノ酸配列と一致し、ラットの場合は配列番号３に記載のアミノ酸配列と一致する。
【００４５】
本発明のプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、前記の方法の他に、ヒト、ラット、マウスなどのゲノムＤＮＡのライブラリーからのクローニングによっても得ることができる。
これら、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βをコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、目的により、そのままあるいは制限酵素で切断して使用することが可能である。
【００４６】
本発明により得られたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのｃＤＮＡの構造は図１に示されるように、７６３残基からなり、オープンリーディングフレームは７１７残基であり、２３９アミノ酸をコードする。
計算上の分子量は、２７０７２であり、等電点は、５．  ３３である。
【００４７】
また本発明により得られたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのｃＤＮＡの構造は図２に示されるように、７５４残基からなり、オープンリーディングフレームは７１４残基であり、２３８アミノ酸をコードする。
計算上の分子量は、２６７９１であり、等電点は、５．  ２８である。
【００４８】
（免疫疾患等の診断用測定方法）
プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βは実施例２でも示すように免疫インターフェロンとよばれるインターフェロンーγにより強く誘導される。
また、本発明のヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βをホモロジー検索したところ、  代表的な自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ  ）の患者において見出された自己抗体の抗原蛋白質Ｋｉ−Ａｎｔｉｇｅｎ  （Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９，  ２０９−２１４，１９９０）に４０％のホモロジーをもつことがわかった。
【００４９】
従って、前記得られたポリヌクレオチドをプローブとして用いることは、免疫疾患をはじめとする各種疾患の診断等にも有効な手段を与える。すなわち、本発明で得られたプロテアソームアクチベーターの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、各種ヒト臓器のｍＲＮＡ発現量を例えばノザンブロット解析やＲＴ−ＰＣＲ解析（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，斎藤隆    監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）を行うことにより定量的に測定可能となり、前記各種疾患の診断手段を与えるものである。
さらにプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの遺伝的多型性を調べることにより、各種疾患との関連も明らかにでき、ポリヌクレオチド診断に有効に使用可能となる。
【００５０】
また、本発明において得られたプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成することが可能である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄ．，  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８  に記載の方法に準じて可能である）。なお、モノクローナル抗体を作成する際の抗原とするポリペプチドは少なくとも４のアミノ酸から成ればよい。得られた抗体を用いた免疫的測定法により、各種細胞中の該プロテアソームアクチベーターの変化を定量的に測定する手段が与えられる。
【００５１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）    プロテアソームアクチベーターの遺伝子配列の決定
プロテアソームアクチベーターの調製
（１）プローブの調製
（１ー１）出発物質の調製
牛血液あるいは心臓細胞より、プロテアソームアクチベ−ターは、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１０５１５−１０５２３，１９９２  に記載の方法に準じて精製可能である。ただし、精製の過程で蛋白質の分解を防ぐために蛋白質分解阻害剤としてバッファ−類に１０ｍＭロイペプチン（ＳＩＧＭＡ社）  、２．５    ｍＭ  ４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社）  を添加する必要がある。
【００５２】
精製の概略は、以下の通りである。牛血液をヘパリン存在下で収集し、２０００ｘｇで１時間遠心し赤血球細胞を集めた後、得られた沈殿を４倍体積のリン酸緩衝液に懸濁し、再沈殿することにより洗浄し、ＤＥ５２（ＤＥＡＥ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，  Ｗｈａｔｍａｎ  社）を添加し、結合画分を調製し、硫安沈殿後、セファクリルＳ−３００、ＤＥＡＥ    Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ハイドロキシアパタイト、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ  （１０ｘ２５ｃｍ）のカラムクロマトグラフィ−による精製を行う。
（１ー２）活性画分の測定方法
プロテアソームアクチベーター活性は、２０Ｓプロテアソームと精製の各ステップの蛋白を混合して，  ２０Ｓプロテアソームのペプチダーゼ活性を促進するかどうかを測定することにより、測定可能である。    反応は、  Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ  （キモトリプシン様活性を測定するための合成基質）、５０  ｍＭ，  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ），２０Ｓプロテアソームと精製各段階の蛋白を添加して最終容積１０００μｌ  で行った。この反応液を、３７℃で１０分間インキュベートして、蛍光を測定した。
制御因子群にアクチベート活性があれば、２０Ｓプロテアソームによる合成基質の分解活性が上昇することから、活性画分を同定可能となる。
【００５３】
（２）プロテアソームアクチベーターのアミノ酸配列の決定
（２ー１）プロテアソームアクチベーターの単離
（１）の処理で得られた分子量約２８ｋＤａ  のプロテアソームアクチベーター画分を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−３００  Ｃ８カラム  ２．１ｘ１００ｍｍ，  ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社、Ｍｏｄｅｌ１３０Ａ）を使用し、以下の条件で分離した。
分離条件：
流速    ５０μｌ／ｍｉｎ  、
溶媒Ａ、０．０６％  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；溶媒Ｂ，０．０５％ＴＦＡ／７０％アセトニトリル／３０％水。
【００５４】
Ａ（６４％  ）とＢ（０％）からなる混合溶媒によりカラムを平衡化し、Ｂ溶媒を０  から７０％  まで用いたグラジエントで溶出した。
【００５５】
２１４ｎｍ  の波長で検出し、ピーク画分をスピードバックコンセントレータ（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）  で乾燥した。その結果、２本のピ−クが観察されたので、後半に溶出された画分について、以下の操作を行った。
【００５６】
（２ー２）電気泳動による分離
前記得られた乾燥サンプルはＳＤＳサンプルバファーに溶解し、１０％  ＳＤＳーＰＡＧＥ（  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｄａｖｉｄ  ｌａｎｅ  著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ，６３６−６４０  ，１９８８）により分離した。  電気泳動が終わったゲルは、イモビロン−ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）にセミドライエレクトロブロティング装置を用いてトランスファーした。
蛋白質をブロットした膜フィルターは、蒸留水で洗浄した後、クマシーブルー染色液（０．２  ％クマシーブリリアントブルーＲ２５０  を含む４０％メタノール、１０％酢酸溶液）で染色後、脱色液（６０％メタノール溶液）に浸し、振とうしてバックグラウンドを脱色した。
【００５７】
このメンブラン上の約２８Ｄａの位置のスポットを切出し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  でＬ−１−ｔｏｓｙｌａｍｉｄｏ−２−ｐｈｅｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ  処理トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ社）、またはＬｙｓ−Ｃ  プロテアーゼ（ベーリンガーマンハイム社）により酵素処理した。生成したペプチドはＨＰＬＣ（パーキンエルマー社製）によって分離精製した（流速５０μｌ／ｍｉｎ，  ０．１％ＴＦＡを溶媒とし０−７０％  のアセトニトリルによるグラジエント、ＲＰ３００  カラム（２．１ｘ１００ｍｍ））。
得られたポリペプチドフラグメントのいくつかをペプチドシークエンサー（パーキンエルマー社製プロテインシークエンサー４９７型分析装置）により解析を行った。
【００５８】
以上のアミノ酸解析により次の２  種類のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を決定した。
フラグメント１；ＱＶＥＶＦＲ
フラグメント２；ＱＮＬＦＱＥＡＥＥＦＬＹＲ
フラグメント３；  ＦＬＰＱＫ
フラグメント４；ＩＩＹＬＮＱＬＬＱＥＤＳＦＮＶＴＤＬＮＳＬＲ
フラグメント５；ＡＰＬＤＩＰＩＰＤＰＰＰＫＤＤＥＭＥＴＤ
フラグメント６；  ＴＫＶＥＡＦＱＴＴＩＳＫ
フラグメント７；ＡＬＶＨＥＲＤＥＡＶＹＧＤＬＲ
フラグメント８；ＡＭＶＬＤＲ
フラグメント９；ＡＦＹＡＥＬＹＨＩＩＳＳＮＬＥＫ
（３）ｃＤＮＡプローブの作製
（３ー１）プライマーの合成
（プロテアソームアクチベーターＰＡ２８β）
得られた以上のペプチドフラグメントの配列から縮重度の低い配列として、フラグメント５からＰＰＫＤＤＥＭＥ、フラグメント６からＡＬＶＨＥＲＤＥＡＶの配列を選択した。
【００５９】
次に、これら選択したポリペプチドに対応する相補的オリゴヌクレオチドとして、フォワードプライマーとして５’−ＣＧＣＡＴＡＡＧＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＧＡ−−３’  を選び，  リバースプライマーとして５’−ＡＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣ（Ｇ／Ｔ）ＣＴＣＡＴＧＴＧＡＧＩＡＧＩＧＣ−３’をＤＮＡ合成機３８０Ｂ（アプライドバイオシステムズ社製）で合成した。
得られたオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドカートリッジ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して精製した。
【００６０】
（３ー２）ＰＣＲ用ｍＲＮＡ調製
牛肝臓５ｇからの全ＲＮＡはグアニジンチオシアネイト法  （Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２，  １５６−１５９，  １９８７）  により以下のようにして分離精製した。
５ｇの試料をグアニジンチオシアネイト溶液（ｓｏｌ．Ｄ  溶液；  ６Ｍのグアニジンチオシアネート、０．５％のザルコシル、  １０ｍＭ  のクエン酸ナトリウム（ｐＨ７），  １００ｍＭ  の２ーメルカプトエタノール，  ０．１％のアンチフォームＡ）中で超音波処理し、変性させた後遠心して上澄を得た。
これに（１／１０）量の  ２Ｍ  酢酸および等量のエタノール、（１／５）  量のクロロフォルムーイソアミルアルコール（４９：１  ｖｏｌ／ｖｏｌ）  を加え、氷上で１５分間静置して、１０，０００ｇ  で１５分間４℃にて遠心処理して沈殿を得た。
【００６１】
水相を別の試験管に移し、等量のイソプロパノールを添加し、ー２０℃で１時間静置し、１０，０００ｇ  で２０分間４℃において遠心した。
得られた沈殿を  ｓｏｌ．  Ｄ  溶液に溶解し等量のイソプロパノールを添加し、遠心して沈殿を  ７５％エタノールで洗浄した。
次にこの沈殿をｓｏｌ．  Ｄ溶液に懸濁し、等量のイソプロパノールを再度添加し、−２０℃で１時間冷却した後、遠心処理を行った。
遠心分離により沈殿を集め、７５％エタノールで洗浄し、遠心処理後、上清を除去し、これをＤＥＰＣ処理（ジエチルピロカーボネート０．１％で５時間処理後、オートクレーブ処理）したミリＱに溶解し、５４ｍｇの全ｍＲＮＡを得た。
【００６２】
前記の処理により得られた全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）−ラテックス（タカラ社；ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０）を用いてｍＲＮＡを得た。
すなわち全ＲＮＡ１ｍｇに対して反応緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  １ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），  ０．１％ＳＤＳ  ）を加えて全量で１ｍｌ  とした。
次に、これにＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  １ｍｌを加え、６５℃で５分間熱変性し、氷上で３分間急冷した。
５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．２ｍｌ  を加え撹拌後、３７℃で１０分間インキュベートし、１５，０００ｒｐｍ  １０分間遠心した後上清を除去した。
ペレットを洗浄液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１％ＳＤＳ，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）２．５ｍｌ  に懸濁し、３７℃で１０分間放置した。
これを１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心分離した。
【００６３】
得られたペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、  ＥＤＴＡ  １ｍＭ  ）１ｍｌ  に懸濁し、６５℃、５分間加熱し、ｍＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  から溶出した。
さらに１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を回収し、エタノール沈殿を行うため３Ｍ  ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６）１００  μｌ  と冷エタノール２ｍｌ  を加え、ー８０℃で３０分間放置した。
１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液５０μｌ  に溶解した。
本実施例により、１０ｍｇの全ＲＮＡから４５μｇ  のｍＲＮＡを得ることができた。
【００６４】
（３ー３）ＰＣＲ用ｃＤＮＡ合成
得られたｍＲＮＡを鋳型としてＯｌｉｇｏ（  ｄＴ  ）  １５をプライマーとして相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（ファルマシア社製、ｃＤＮＡ合成キット）。
（３ー４）ＰＣＲによるｃＤＮＡプローブの調製
前記（３ー１）で得られたフォワードプライマーとともにリバースプライマーを用い前記（３ー３）で得られた牛肝臓のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行った（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，斎藤隆    監訳、ＰＣＲ実験マニュアル、ＨＢＪ出版局、１９９１年）。
各プライマー濃度は２０ｐｍ／  μｌ，  ＴａｑＤＮＡ  ポリメラーゼは０．０２５Ｕ／  μｌ  、ｃＤＮＡ  １ｎｇ／  μｌ  で３０サイクル、パーキンエルマー（シータス）社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて増幅し、約６００ｂｐのｃＤＮＡプローブを得た。
【００６５】
（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製
（４ー１）ｃＤＮＡの調製
ヒト肝細胞癌ＨＥＰＧ２  （ＡＴＣＣから入手可能）から、（３ー２）記載のグアニジウムチオシアネイト法  （Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６２，  １５６−１５９，  １９８７）  によって全ＲＮＡを分離した。全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）ラテックス（タカラ社；Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ）を用いて（３ー２）記載の方法と同様にＨＥＰＧ２  細胞からｍＲＮＡ１０μｇ  を得た。
前記の方法によって得られたポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、ファルマシア社製ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  合成キットを用いてｃＤＮＡを得た。
【００６６】
より詳しくは、オリゴｄＴプライマーを前記ｍＲＮＡのポリＡ部分にアニールさせ、逆転写酵素（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）  により、１本鎖ＤＮＡを合成し、Ｅ．  ｃｏｌｉ    ＤＮＡポリメラーゼ１により、２本鎖ｃＤＮＡとして合成した。
得られた前記ｃＤＮＡの両端にＮｏｔＩ／ＥｃｏＲ  Ｉアダプターを付加するため、Ｔ４ＤＮＡライゲース処理およびポリヌクレオチドキナーゼ処理を行ない、両端にＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡを得た。
【００６７】
（４ー２）インビトロパッケージング反応
得られた両端にＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位をもつｃＤＮＡをクローニングベクターであるλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ処理λＺＡＰＩＩを含むλＺＡＰＩＩクローニングキット）のＥｃｏＲＩ間にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入した。
ライゲーション反応溶液  １ｍｌをＧｉｇａｐａｃｋＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  社）によりパッケージングを行った。
【００６８】
パッケージングした組換えバクテリオファージを含むパッケージング溶液と大腸菌  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅを３７℃で１５分間培養した。
これを  ２〜３  ｍｌのトップアガー（４８℃）に加えＮＺＹアガープレートへプレーティングして、３７℃で１夜培養した。
１５０ｍｍ  ＮＺＹ  プレートには約  ５０，０００  個のプラークを培養し、１０枚のプレートにまいて、約  ５ｘ１０  ５    ／個のプラークをスクリーニング用に用いた。
【００６９】
（５）クローンの単離
（５ー１）スクリーン用フィルタの調製
ＮＺＹ  プレートを４℃で２時間冷却し、このプレート上にナイロンフィルタ（アマシャム社、ハイボンドＮ＋）をのせ、２分間放置した。
これをはがしてフィルターペーパ上で乾燥し、紫外線照射により固定してスクリーニング用フィルターを調製した。
これを用いて以下のハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】
（５ー２）ハイブリダイゼーションのためのプローブは（１）で得られたＤＮＡプローブを、ランダムプライムラベリング法（タカラ社；ランダムプライマＤＮＡラベリングキットＶｅｒ．２  ）で３２Ｐ−ｄＣＴＰ  （アマシャム社）標識したものを使用した。
プレハイブリダイゼーション溶液として、５ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ，  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．０１５Ｍ），５０％フォルムアミド、１  ｘｄｅｎｈａｒｄｔ  （ウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）  ０．２％，ポリビニルピロリドン０．２％，  Ｆｉｃｏｌｌ４００  ０．２％）溶液、０．１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。
【００７１】
フィルターは４２℃、３時間、プレハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％ｄｅｘｔｒａｎ    ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダイゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。
以上の操作により９個のポジティブクローンが得られた。
【００７２】
（６）ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ（きりだし）による大腸菌組換え体の作成
（５ー２）で得られたアガープレート中のポジティブＺＡＰ  ファージクローン９個のプラークの中心をそれぞれ竹くしでつき、５００  μｌ  のＳＭ緩衝液と２０μｌ  のクロロフォルム混合液中に溶出し、ボルテックスをした後、一夜放置した。
大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ２００  μｌ  とポジティブファージクローン２００  μｌ（＞１ｘ１０  ５  ファージパーティクル）、ヘルパーファージ  Ｒ４０８  １  μｌ（＞１ｘ１０  ６      ｐｆｕ／ｍｌ）  を５０ｍｌチューブにて混合し３７℃、１５分間で、ＺＡＰとヘルパーファージを感染させた。
【００７３】
５ｍｌ  の２ｘ  ＹＴ培地（１０ｇ  ＮａＣｌ，  １０ｇ  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，  １６ｇ  Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ／１ｌ）  を加え、３７℃で３時間振とう培養し、大腸菌よりファージミドを分泌させた。
７０℃で２０分間熱処理した後、４０００ｇ  で５分間遠心し、菌体を死滅させた。
上清のファージミドを別の試験管に移した。
この上清にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）  粒子が含まれており、この上清２００  μｌ  あるいは１００倍に希釈した溶液２０μｌ  とＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ２００  μｌ（ＯＤ６００  ＝１．０）  を混合し３７℃で１５分間混合し感染させた。
【００７４】
１  〜１００  μｌ  の培養液をＬＢ／Ａｍｐプレートにプレーティングした後、３７℃で一晩培養した。
インサートＤＮＡを含む２本鎖のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）をもった大腸菌（ＸＬ−１Ｂｌｕｅ）形質転換体のコロニーが現われた。
これらポジティブクローンの大腸菌を培養後プラスミドＤＮＡを  ＱＩＡｐｒｅｐＰｌａｓｍｉｄ  キット（Ｑｕｉａｇｅｎ社）  を用いて調製し、制限酵素  ＮｏｔＩ  で切断して、そのうち最も長いインサートをもつクローンについて以下のＤＮＡ塩基配列の決定を行った。
【００７５】
（７）塩基配列の決定
前記で得られたクローンの塩基配列を、パーキンエルマー社製ＤＮＡ  シークエンサー３７３Ａを用い、Ｔａｑ  サイクルシークエンシング法により決定した。
得られたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの塩基配列の解析結果を図１に示す。
決定した塩基数は７６３残基で、オープンリーディングフレームは７１７残基であり、２３９個のアミノ酸がコードされている。
計算上の分子量は２７０７２  であり、等電点は、５．３３である。
図１の下線部は、（２ー２）記載の牛より精製したプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βから決定されたペプチドシークエンスと相同性のある部分を示すものである。
【００７６】
（８）ラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの遺伝子配列の解析
ラット肝癌細胞株Ｈ  ４ＴＧ（ＡＴＣＣから入手可能）から、ｃＤＮＡライブラリーを（４）記載の方法と同様に調製し、約  ５ｘ１０  ５    ／個のプラークをスクリーニング用に用いた。
（５）記載の方法と同様にして、５個のクローンを単離して、（６）記載のｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ（きりだし）による大腸菌組換え体の作成を行い、（７）記載の方法と同様にして塩基配列の決定を行った。
【００７７】
得られたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの塩基配列の解析結果を図２に示す。
決定した塩基数は７５４残基で、オープンリーディングフレームは７１４残基であり、２３８個のアミノ酸がコードされている。
計算上の分子量は２６７９１  であり、等電点は、５．２８である。
【００７８】
図２の下線部は、（２ー２）記載の牛より精製したプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βから決定されたペプチドシークエンスと相同性のある部分を示すものである。
なおこのラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの０．７５ｋｂのインサートをもつ大腸菌ＢＬ−２１形質転換体についてはＰＲＯ／ＢＬ−ｒＰＡ２８と命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成７年５月２５日に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ    Ｐ−１４９３８）。
【００７９】
（９）ラットおよびヒト間でのプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのホモロジー
図３のホモロジーアライメントの結果に示されるように、ヒトおよびラット間では、ホモロジーが高く、８９％のホモロジーがあった。これらの結果から、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βは種間で高く保存されていることがわかった。
【００８０】
（実施例２）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのポリヌクレオチドの発現解析
（１）    プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いて、各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ発現量のノザンブロット分析を行った。
プローブとしては、実施例１（４）で得られた組み換え体を使用し、プラスミドＤＮＡを大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅより、ＱＩＡｗｅｌｌ    Ｐｌａｓｍｉｄ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ    Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて調製した。このプラスミドを制限酵素Ｎｏｔ１（タカラ社）で処理後、２％アゲロースゲル電気泳動で分離して、１．４ｋｂｐのサブユニットＰ４５のプローブをＱＩＡ    ｑｕｉｃｋ    ＧＥＩ    Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ    Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で調製した。
【００８１】
これをマルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）で３２Ｐ標識してプローブとして用いた。
フィルターは、各種ヒト臓器（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）より抽出したｍＲＮＡ（  ２μｇ）がブロットされたポジチィブチャージドナイロンフィルター（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ，  クローンテック社）を用いた。
プレハイブリダイゼーション溶液として、５ｘＳＳＣ（ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ，  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．０１５Ｍ），５０％フォルムアミド、１  ｘｄｅｎｈａｒｄｔ  （ウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）  ０．２％，ポリビニルピロリドン０．２％，  Ｆｉｃｏｌｌ４００  ０．２％）溶液、０．１％ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサーモンスパームＤＮＡを用いた。
【００８２】
フィルターは４２℃、３時間、プレハイブリダイゼーション溶液でインキュベートし、続いて標識プローブを加えたハイブリダイゼ−ション溶液（１０％ｄｅｘｔｒａｎ    ｓｕｌｆａｔｅを含むプレハイブリダイゼーション溶液）で４２℃、１６時間、インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。
フィルターは２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで４２℃、１５分間で４回洗浄し、さらに１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで３０分間１回洗浄した。
【００８３】
オートラジグラフィーは、Ｋｏｄａｋ    ＸＡＲ−５フィルムを用いて、−７０℃で行った。
オートラジオグラフィーの結果、図４に示すように、プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βは、約０．９  ｋｂのｍＲＮＡと反応し、その発現量は、心臓、骨格筋で高く、腎臓、肺では低い発現であることが明確に定量可能であり、本発明のプローブを用いることにより、ｍＲＮＡ発現量を測定することが可能である。
【００８４】
（２）（１）と同条件で、ヒト腎臓癌由来株化細胞、ＫＰＫー１細胞のインターフェロンーγ添加によるノザンブロット分析を行った。ＫＰＫー１細胞は１０ｃｍ  シャーレで培養した。培養液は、１０％仔牛胎児血清を含むＤＭＥ  培養液を用い、これにヒトインターフェロンーγ（５００Ｕ／ｍｌ  ）を添加して、経時的（０  、１２、２４、３６、４８時間後）に細胞を回収しトータルＲＮＡ  を得た。各トータルＲＮＡ１０  μｇ  を用いて、ナイロンメンブランフィルター（アマシャム社、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  ）  を作成し、（１）と同じプローブを用いて、ノザンブロット解析を行った。その結果、図５に示すように、ＰＡ２８βはインターフェロンーγ添加１２時間後から強く誘導されていることが判明した。従って、ヒトにおいて免疫系の異常による疾患等により、インターフェロンーγが誘導されたような状態の際に、ＰＡ２８βを測定することにより、診断が早期に可能となると考えられる。
【００８５】
（実施例３）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βポリペプチドの発現解析
（１）プロテアソームアクチベーターＰＡ２８βに反応するポリクローナル抗体の作製
ヒトおよびラットで共通し、他のサブユニットとホモロジーのない部分であるプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのＮ末端側付近、３番目から１７番目の１５アミノ酸  （ＫＰＣＧＶＲＬＳＧＥＡＲＫＱＶＥ）を選択し、このペプチドをＦ−Ｍｏｃ法  （Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９，  Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．著）により、パーキンエルマー社製ペプチド合成機４３３Ａを用いて合成した。
【００８６】
合成したポリペプチドの脱保護および精製は、抗ペプチド抗体実験プロトコール、大海忍    他著、秀潤社、２５−  ４６ページに記載の方法で行った。
なお脱保護後のペプチドの精製はＣ１８ＯＤＳカラム（島津  Ｓｙｎ  ＰｒｏＰｅｐ  カラム、４．６ｘ１５０ｍｍ，  ０．１％ＴＦＡ，  ０−８０％  アセトニトリルグラジエント）を用いた。
（２）前記ペプチドにヘモシアニン（ＫＬＨ）をイムジェクトアクチベイテッドイムノグロビンコンジュゲイションキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて結合させ、ペプチドとＫＬＨとの複合体を前記のキット中のカラムにより調製した。
（３）初回約１５０μｇ  をフロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ  、キャペル社）  とともにエマルジョンにし、ラビット（ジャパニーズホワイト）の背中に免疫した。その後２週間おきに３回不完全アジュバント（ＦＩＡ）により同様に免疫した。
初回免疫後、７、８、９週目にＥＬＩＳＡ  法により抗体価を測定し、抗体価の上昇を確認後全採血を行なった。
（４）    ウサギ血液は、室温で３時間静置後、セパラピッドチューブ（積水化学）にアプライし、３０００回転で３０分間の遠心によりプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βに対する血清を得た。
【００８７】
（５）ヒト腎臓癌由来株化細胞、ＫＰＫー１を実施例２（２）と同様にして、インターフェロンーγ添加によるイムノブロット分析を行った。ＫＰＫー１細胞にヒトインターフェロンーγ（５００Ｕ／ｍｌ  ）を添加して、経時的（０  、４８時間後）に細胞を回収し、ソニケーションして、細胞蛋白を得た。各蛋白５０  μｇ  を用いて、電気泳動後、ＰＶＤＦメンブランにトランスファーし、（３）の抗体を２００倍希釈して、ＥＣＬ  （アマシャム社）を用いて、イムノブロット解析を行った。その結果、図６に示すようにプロテアソームアクチベーター抗体が２８ｋＤａのバンドを認識して反応することが明かとなり、またＰＡ２８βはインターフェロンーγ添加により、強く誘導されていることが判明した。従って、ヒトにおいて免疫系の異常による疾患等により、インターフェロンーγが誘導されたような状態の際に、ＰＡ２８βの蛋白量を測定することにより、診断が早期に可能となると考えられる。
【００８８】
【発明の効果】
プロテアソームアクチベーターを構成する個々のサブユニットのポリペプチドのアミノ酸配列、およびそれぞれのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより、抗体による免疫反応による方法、さらに相補的ポリヌクレオチドを利用する方法で、各種疾患等の診断および治療が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの決定された塩基配列と塩基配列から推定したアミノ酸配列（ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの１次構造）を示す図（下線は、ペプチドシークエンスの結果得たアミノ酸配列と相同性のある部分を示す）である。
【図２】実施例１で得られたラットプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの決定された塩基配列と塩基配列から推定したアミノ酸配列（ヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βの１次構造）を示す図（下線は、ペプチドシークエンスの結果得たアミノ酸配列と相同性のある部分を示す）である。
【図３】ラットおよびヒトプロテアソームアクチベーターＰＡ２８βのホモロジーアライメントの比較結果を示す図である。
【図４】ヒトプロテアソームアクチベーターの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いた各種ヒト臓器でのｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す図である。
【図５】ヒトプロテアソームアクチベーターの相補鎖ポリヌクレオチドをプローブに用いたＫＰＫ−１  細胞でのインターフェロンーγ誘導によるｍＲＮＡ発現量のノザンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】ヒトプロテアソームアクチベーターの抗体を用いたイムノブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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