(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（Ｉ）
0003718226.tif 000015
（式中ｎは７又は１０の整数を示す）で表される環状デプシペプチドおよびその薬理学的に許容されうる塩。
【請求項２】
バシラス属に属する請求項１記載の環状デプシペプチドの生産菌を培養し、その培養物から生産された環状デプシペプチドを採取することを特徴とする環状デプシペプチドの製造法。
【請求項３】
請求項１に記載の環状デプシペプチド、またはその薬理学的に許容されうる塩を含有してなる高脂血症治療薬。
【請求項４】
請求項１に記載の環状デプシペプチド、またはその薬理学的に許容されうる塩を含有してなる脂質分泌抑制薬。
【請求項５】
請求項１に記載の環状デプシペプチド、またはその薬理学的に許容される塩を含有してなるアポリポプロテインＢ産生抑制薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、高脂血症治療薬として利用可能な脂質分泌抑制活性、アポリポプロテインＢ産生抑制活性を有する環状デプシペプチド、その製造法及び用途に関する。
背景技術
高脂血症治療薬に関しては、すでにいくつかの化合物が実用化されている。特に、プラバスタチン、ロバスタチンなどのHMG CoA還元酵素阻害剤は顕著なコレステロール低下作用を有することが報告されており、これらの薬剤の出現以後、高コレステロール血症の治療が飛躍的に進歩したと言える。しかしながら、これらの薬剤は血中トリグリセリドは低下させない。
一方、コレステロールとトリグリセリドの両方を低下させる薬剤としてはクロフィブレート系薬剤とニコチン酸製剤が実用化されているが、ニコチン酸では痒み、熱感、発疹などの副作用が高頻度に出現し、クロフィブレート系薬剤では胆石の易形成、筋障害、肝機能障害、胃腸障害などの副作用が問題となっている。また、投与量についてはニコチン酸製剤であるナイアシンは２〜３ｇであり、クロフィブラートアルミニウムは1.5ｇとかなり多いこともまた問題となっている。
発明の開示
本発明の課題は、高脂血症の治療、予防を効果的に行うために血漿コレステロールとトリグリセリドの両方を、従来の薬剤よりも強力に低下させる化合物の提供である。
血漿中のコレステロールとトリグリセリドの大部分は肝臓で合成、分泌されることから、肝細胞でのコレステロールとトリグリセリドの両方の分泌を抑制する物質は、血漿コレステロールとトリグリセリドの両方を低下させる高脂血症治療薬になることが期待される。本発明者らは、肝実質細胞のモデル細胞であるHep G2細胞を用い、この細胞からコレステロールとトリグリセリドの両方の分泌を抑制する化合物を微生物代謝産物に求めて探索した結果、ある種の細菌の培養液に活性成分を見い出し、このものが環状デプシペプチド構造を有する化合物であることを見いだした。そして培養液よりこれら環状デプシペプチドを精製単離し、新規化合物であることを明らかにし、さらに研究を重ねた結果、これら環状デプシペプチドが、動脈硬化症の原因とされている超低密度リポタンパク質（Very Low Dencity Lipoprotein;VLDL）の主要な構成タンパク質であるアポリポプロテインＢの肝細胞等での産生を抑制し、また肝細胞でのアルブミン等他の蛋白質の合成を妨げずに選択的に脂質分泌を抑制すること等を確認し、本発明を完成するに至った。
本発明によれば、次の構造式（Ｉ）
0003718226.tif 000002
（式中ｎは５〜15の整数を示す）で表される環状デプシペプチド、およびその薬理学的に許容されうる塩が提供される。上記式中、ｎが６〜12の整数である化合物が好ましく、特にｎが７、８、９または10である化合物が好ましい。
本発明によればさらにバシラス属に属する上記新規な環状デプシペプチドを生産する菌を培養し、その培養物から環状デプシペプチドを採取することを特徴とするこれら環状デプシペプチドの製造法が提供される。
さらに本発明によれば、これら環状デプシペプチド、またはその薬理学的に許容しうる塩を含有してなる医薬組成物、特に高脂血症治療薬、脂質分泌抑制薬またはアポリポプロテインＢ産生抑制薬が提供される。
本発明の環状デプシペプチドの製造に用いることができる微生物としてはバシラス属に属しこの環状デプシペプチドを生産する菌であればいずれでもよい。例えば北海道小樽市の土壌より分離されたバシラス・エスピー・No.4691株は使用しうる例として挙げられる。No.4691株の菌学的性状は下記の通りである。
１．形態学的性質
グラム染色                  陽性
大きさ                      0.7〜1.2×1.5〜2.5μｍ
形態                        桿菌
運動性                      なし
胞子及び芽胞                あり  楕円形または円柱状  中央
２．培養的性質
1)  代用肉汁寒天平板培地上での生育
コロニーの形態            周縁は不規則形（Ｒ型）であるが、全体としては円形である
色                        乳白色から薄い茶褐色
光沢                      鈍光で艶がない
拡散性色素                なし
2)  代用肉汁液体培地
菌体の沈殿                なし
中間部                    濁りなし
表面                      菌膜あり
3)  その他
30分間の煮沸              耐性
ＤＨＬ寒天培地            発育せず
デソキシコレート寒天培地  発育せず
4)  ゼラチン穿刺培養
ゼラチンの液化            なし
5)  リトマス・ミルクでの反応
凝固、ペプトン化          あり  pHはややアルカリ性
３．生理学的性質
表１に示す。陽性を＋、陰性を−とする。
0003718226.tif 000003
４．化学分類学的性質
1)  ＤＮＡの塩基組成（ＧＣ含量）
50〜51％
2)  全菌体加水分解物中のジアミノピメリン酸はmeso型である。
以上述べた特徴、特に形態観察及び化学分析の結果から、本菌株はバシラス属に属すると考えられた。よって本菌株をバシラス・エスピー・No.4691株（Bacillus sp.No.4691）株と命名した。なお、No.4691株を通産省工業技術院生命工業技術研究所に寄託申請し、平成６年４月20日、受託番号FERM P−14282号として受託された。また、後日国際寄託へ移管申請し、平成７年５月15日、受託番号FERM BP−5101号として国際寄託された。
本発明の培養に用いられる培地は、本発明の環状デプシペプチドの生産菌が利用できる任意の栄養源を含有するものであればよい。例えば炭素源として、グリセリン、グルコース、マルトース、シュクロース、デキストリン、でんぷん、油脂類などが使用できる。窒素源として大豆粉、肉エキス、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキス、コーンスティープリカーなどの有機物、ならびに硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩が使用できる。また、必要に応じて食塩、塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、重金属塩などの無機塩類も添加することができる。発酵中の発泡を抑制するために、常法に従って適当な消泡剤、例えばシリコーン、大豆油などを適宜添加することもできる。培養法としては静置培養、振とう培養あるいは通気撹拌培養などを用いることができる。培養温度は20〜50℃が適当であるが、25〜40℃が好ましい。この方法での本発明の生理活性物質の生産量は振とう培養、通気撹拌培養共に２〜４日間で最高に達する。
このようにして生産された本発明の環状デプシペプチドは主として菌体中に存在するので、当該物質の採取においては、培養物の遠心分離、あるいはろ過によって得られた菌体から精製操作をおこなうことが望ましい。精製方法は微生物培養菌体から脂溶性物質を採取するのに通常用いられる方法が適用される。すなわち、菌体にメタノール、エタノール、アセトンなどの水混和有機溶媒を加え、撹拌し抽出液を得る。抽出液の有機溶媒を留去してから酢酸エチルのような水と混和しない有機溶媒で抽出する。抽出に用いられる有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチルのようなエステル類、クロロホルム、塩化メチレンのようなハロゲン化炭化水素類、ｎ−ブタノール、iso−ブタノールのようなアルコール類が挙げられる。
このようにして得られた抽出液を、食塩水で洗い、濃縮して得られる粗粉末をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーに付す。展開溶媒としては、例えばクロロホルム−メタノール又はヘキサン−酢酸エチルなどの混合溶媒系が用いられ、順次溶媒中メタノール又は酢酸エチルなどの極性溶媒の比率を増していくことにより、他の夾雑物と分離して溶出することができる。
このようにして溶出された本発明の環状デプシペプチドを含む区分は、調製用薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによりさらに精製され、最終的に、本発明の環状デプシペプチドが得られる。
また、本発明の環状デプシペプチドは、それ自体公知の方法で、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、あるいはトリエチルアミン塩等の有機アミンとの塩など、薬理学的に許容されうる塩を形成させることができる。
本発明の環状デプシペプチドまたはその薬理学的に許容し得る塩は種々の投与形態の製剤とする事ができる。すなわち、この製剤は経口的に錠剤、糖衣錠、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、顆粒剤、散剤および溶液、エマルジョンまたは懸濁液のような液剤の形態で投与することができる。また、非経口投与の場合には注射液、坐剤の形態で投与される。
これらの製剤の調製にあったては製剤化のための慣用の添加剤、例えば賦形剤、安定剤、防腐剤、溶解剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味剤、着色剤、香味剤、張度調製剤、緩衝剤、酸化防止剤などを添加して製剤化することができる。
添加剤としては、例えばデンプン、白糖、果糖、乳糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール沈降性炭酸カルシウム、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ゼラチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。
本発明の化合物を液剤、注射剤として用いるときは活性成分を慣用の希釈剤中に溶解または懸濁して用いることができる。希釈剤としては、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖水溶液、アルコール類、脂肪酸エステル類、グリコール類、グリセリン脂肪酸グリセリド、植物、動物由来の油源、パラフィン類などが含まれる。
また、これらの製剤は、通常の方法で製造することができる。
そして通常の臨床投与量として、成人一人一日当たり経口の場合0.5〜5000mgの範囲で用いられる。さらに好ましくは５〜500mgの範囲で用いられる。
【図面の簡単な説明】
図１：本発明の環状デプシペプチド（化合物１）の紫外吸収スペクトルを示す。縦軸は吸光度を、横軸は波長（nm）を示す。
図２：本発明の環状デプシペプチド（化合物１）の赤外吸収スペクトルを示す。縦軸は透過率（％）を、横軸は波数(cm-1)を示す。
図３：本発明の環状デプシペプチド（化合物１）の1Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す。横軸は化学シフト（ppm；δ）を示す。
実施例
実施例１．本発明の環状デプシペプチドの製造
可溶性デンプン1.0％、廃糖蜜1.0％、ポリペプトン1.0％、肉エキス1.0％を含む液体培地を500ml容三角フラスコで100mlずつ分注し、常法により120℃で20分間滅菌し、これに寒天斜面培地で培養したバシラス・エスピー・No.4691株を接種し、28℃で48時間回転振とう培養（220回転毎分）して種母培養液とした。可溶性デンプン2.5％、大豆粉1.5％、乾燥酵母0.2％、炭酸カルシウム0.4％を含む液体培地100mlに、この種母培養液２mlを接種し、28℃で毎分220回転で３日間振とう培養させた。この培養液15リットルを遠心分離し、菌体を得た。菌体にメタノール５リットルを加え、よく撹拌した後、18時間静置した。抽出液をろ過し、得られたろ液は減圧下、メタノールを留去した。得られた水溶液に２Ｎ塩酸を加え、pHを５に調整した。水溶液を酢酸エチル１リットルで３回抽出し、これを飽和食塩水500mlで２回洗浄後、無水硫酸ナトリウムを加え、乾燥させた。酢酸エチル抽出液は減圧濃縮乾固してから少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲルをクロロホルムに懸濁して充填したカラム（200ml）にマウントした。クロロホルム300ml、クロロホルム−メタノール（98：２）、クロロホルム−メタノール（95：５）各300mlの順番でカラムを洗浄し、不純物を除いた。次に、カラムをクロロホルム−メタノール（80：20）の溶媒系300mlで活性区分を溶出させた。活性区分は減圧濃縮乾固してから、調製用薄層クロマトグラフィー（担体、シリカゲルガラスプレート60F254、0.50mm、独メルク社製）に付し、クロロホルム−メタノール（３：１）で展開した。Rf＝0.28を示す活性区分をかきとった後、メタノールで溶出し、溶出液を減圧濃縮乾固した。これを少量のメタノールに溶解し、セファデックスLH20（ファルマシア社製）を充填したカラム（1.6cm直径×60cm高さ）にマウントし、メタノールで溶出をおこない、2.5mlずつ分取した。フラクション18から20番まではまとめて濃縮乾固して無色結晶を得た。これを化合物１とする。
フラクション15から17番までは濃縮乾固後、高性能液体クロマトグラフィー［カラム；Inertsil ODS（内径20mm,長さ250mm、GLサイエンス社製）、移動相；メタノール：水：酢酸アンモニウム＝95：５：0.1、流速15ml／分、検知器ＵＶ222nm］にかけ、保持時間15.20分のピークと保持時間18.06分のピークを分取した。それぞれを濃縮乾固し、保持時間15.20分の区分より化合物２の白色粉末を、保持時間18.06分の区分より化合物３の白色粉末を得た。フラクション21から23番までも同様に濃縮乾固後、高性能液体クロマトグラフィー（条件は上と同じ）にかけ、保持時間25.02分のピークを分取した。これを濃縮乾固し、化合物４の白色粉末を得た。
このようにして得られた本発明の環状デプシペプチドの物理化学的性質は、次に示す通りである。
化合物１
形状：無色結晶
融点：155〜157℃
質量分析（ＦＡＢＭＳ）：ｍ／ｚ 1057（Ｍ＋Na）
分子式：Ｃ53Ｈ94Ｎ8Ｏ12
紫外吸収スペクトル（MeOH）：末端吸収（図１参照）
赤外吸収スペクトル（KBr錠法による）：
3290,2958,2928,2870,1750,1658,1528,1468,1387,1370,1260,1199,1025,796（cm-1、図２参照）
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル
（400MHz，ppm，多重度，Methyl-d3 alcohol中）：
0.79(6H,d),0.80(3H,t),0.81(3H,d),0.82(3H,d),0.83(6H,d),0.86(6H,d),0.87(3H,d),0.88(6H,d),1.10(2H,m),1.20(16H,m),1.45(1H,m),1.50(6H,m),1.54(2H,m),1.57(1H,m),1.58(1H,m),1.63(1H,m),1.85(2H,m),1.95(1H,m),2.12(1H,m),2.18(2H,d-d),2.35(1H,d-d),2.52(1H,d-d),2.75(2H,t),4.00(1H,d-d),4.24(1H,m),4.26(1H,d-d),4.32(1H,m),4.37(1H,m),4.42(1H,m),4.60(1H,m),5.05(1H,m),6.76(1H,bs),7.50(1H,bs),7.75(1H,d),7.95(1H,d),8.08(1H,d),8.12(1H,d),8.14(1H,d),8.19(1H,d),8.24(1H,d)（図３参照）
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル
（100MHz，ppm，多重度，Methyl alcohol-d4中）：
11.9(q),16.1(q),18.5(q),19.7(q),22.2(q),22.2(q),22.8(q),23.1(q),23.1(q),23.1(q),23.4(q),23.4(q),25.8(d),26.0(d),26.0(d),26.1(t),26.4(t),28.5(t),29.1(t),29.1(d),30.3(t),30.6(t),30.6(t),30.7(t),30.9(d),31.0(t),32.7(t),35.2(t),37.4(t),38.4(d),40.2(t),41.2(t),41.5(t),41.5(t),42.0(t),52.0(d),52.8(d),53.4(d),53.8(d),54.1(d),58.3(d),61.2(d),73.9(d),172.2(s),172.5(s),173.0(s),173.3(s),173.7(s),173.7(s),174.8(s),175.0(s),175.4(bs),177.8(s)
比旋光度
0003718226.tif 000004
薄層クロマトグラフィー
（担体：シリカゲルガラスプレート60F254、0.25mm，独メルク社製）
展開溶媒                                            Rf
クロロホルム−メタノール（３：１）                  0.28
クロロホルム−メタノール−28％アンモニア水(10:4:1)  0.52
化合物２
形状：白色粉末
質量分析（ＦＡＢＭＳ）：ｍ／ｚ  1007（ＭＨ）+
分子式：Ｃ51Ｈ90Ｎ8Ｏ12
紫外部吸収スペクトル（MeOH）：末端吸収
赤外吸収スペクトル（KBr錠法による）：
3320,2958,2928,1740,1658,1520,1439,1391,1202（cm-1）
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル
（400MHz，ppm，多重度，Methyl alcohol-d4中）：
0.79(6H,d),0.80(3H,t),0.81(3H,d),0.82(3H,d),0.83(6H,d),0.86(6H,d),0.87(3H,d),0.88(6H,d),1.10(2H,m),1.20(12H,m),1.45(1H,m),1.50〜1.65(11H,m),1.85(2H,m),1.95(1H,m),2.12(1H,m),2.18(2H,d-d),2.35(1H,d-d),2.55(1H,d-d),2.78(2H,d),4.00(1H,d),4.24(1H,d-d),4.26(1H,d),4.32(1H,d-d),4.37(1H,d-d),4.42(1H,d-d),4.60(1H,d-d),5.08(1H,m)
薄層クロマトグラフィー
（担体：シリカゲルガラスプレート60F254、0.25mm，独メルク社製）
展開溶媒                                            Rf
クロロホルム−メタノール（３：１）                  0.28
クロロホルム−メタノール−28％アンモニア水(10:4:1)  0.52
高性能液体クロマトグラフィー
カラム；Inertsil ODS（GLサイエンス社製）
移動相；メタノール：水：酢酸アンモニウム（97：３：0.1）
流速；1.0ml/min、検知器；ＵＶ222nm、保持時間；4.38分
化合物３
形状：白色粉末
質量分析（ＦＡＢＭＳ）：ｍ／ｚ  1021（ＭＨ）+
分子式：Ｃ52Ｈ92Ｎ8Ｏ12
紫外部吸収スペクトル（MeOH）：末端吸収
赤外吸収スペクトル（KBr錠法による）：
3330,2958,2928,1736,1652,1520,1456,1389,1203（cm-1）
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル
（400MHz，ppm，多重度，Methyl alcohol-d4中）：
0.79(6H,d),0.80(3H,t),0.81(3H,d),0.82(3H,d),0.83(6H,d),0.86(6H,d),0.87(3H,d),0.88(6H,d),1.10(2H,m),1.20(14H,m),1.45(1H,m),1.50〜1.65(11H,m),1.85(2H,m),1.95(1H,m),2.13(1H,m),2.18(2H,d-d),2.38(1H,d-d),2.52(1H,d-d),2.68(1H,d-d),2.73(1H,d-d),4.05(1H,d),4.25(1H,d-d),4.27(1H,d-d),4.32(1H,d-d),4.35(1H,d-d),4.42(1H,d-d),4.60(1H,d-d),5.08(1H,m)
薄層クロマトグラフィー
（担体：シリカゲルガラスプレート60F254、0.25mm，独メルク社製）
展開溶媒                                            Rf
クロロホルム−メタノール（３：１）                  0.28
クロロホルム−メタノール−28％アンモニア水(10:4:1)  0.52
高性能液体クロマトグラフィー
カラム；Inertsil ODS（GLサイエンス社製）
移動相；メタノール：水：酢酸アンモニウム（97：３：0.1）
流速；1.0ml/min、検知器；ＵＶ222nm、保持時間；4.68分
化合物４
形状：白色粉末
質量分析（ＦＡＢＭＳ）：ｍ／ｚ  1049（ＭＨ）+
分子式：Ｃ54Ｈ96Ｎ8Ｏ12
紫外部吸収スペクトル（MeOH）：末端吸収
赤外吸収スペクトル（KBr錠法による）：
3310,2958,2928,1745,1658,1525,1440,1391,1202（cm-1）
1Ｈ核磁気共鳴スペクトル
（400MHz，ppm，多重度，Methyl alcohol-d4中）
0.79(6H,d),0.80(3H,t),0.81(3H,d),0.82(3H,d),0.83(6H,d),0.86(6H,d),0.87(3H,d),0.88(6H,d),1.10(2H,m),1.20(18H,m),1.45(1H,m),1.50〜1.65(11H,m),1.85(2H,m),1.95(1H,m),2.12(1H,m),2.18(2H,d-d),2.35(1H,d-d),2.53(1H,d-d),2.75(2H,d),4.00(1H,d),4.24(1H,d-d),4.26(1H,d),4.32(1H,d-d),4.37(1H,d-d),4.42(1H,d-d),4.60(1H,d-d),5.04(1H,m)
薄層クロマトグラフィー
（担体：シリカゲルガラスプレート60F254、0.25mm，独メルク社製）
展開溶媒                                            Rf
クロロホルム−メタノール（３：１）                  0.28
クロロホルム−メタノール−28％アンモニア水(10:4:1)  0.52
高性能液体クロマトグラフィー
カラム；Inertsil ODS（GLサイエンス社製）
移動相；メタノール：水：酢酸アンモニウム（97：３：0.1）
流速；1.0ml/min、検知器；ＵＶ222nm、保持時間；5.40分
以上の結果より、化合物１〜４の構造は以下に示されるとおりである。
0003718226.tif 000005
（薬理作用）
試験例１：本発明の環状デプシペプチドのコレステロール分泌抑制活性
Hep G2細胞１×105個／ml(10％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（日水製薬社製；以後、D-MEM培地と呼ぶ）を24穴組織培養用プレートに１mlずつ注入し、37℃、炭酸ガス５％および空気95％の混合ガス雰囲気下で培養した。４日後に、培地を除去し、10％リポ蛋白欠損血清（シグマ社製）を含むD-MEM培地１mlを加え、さらに、この環状デプシペプチドのメタノール溶液10μｌを加えた。18時間後、培地を再び交換（10％リポ蛋白欠損血清を含むD-MEM培地）し、この環状デプシペプチドのメタノール溶液10μｌと〔1-14C〕酢酸３μCiを加え、さらに37℃で18時間培養した。培地中に生成した〔14C〕コレステロールは〔「バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）」1042巻、36〜41巻(1990)〕の方法に従って定量した。
すなわち、培地をクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出し、ついで抽出物を15％水酸化カリウム中85℃、45分間の条件でケン化反応を行い、エステル型コレステロールを遊離型コレステロールとした。コレステロールを石油エーテルで抽出し、これをシリカゲル薄層クロマトグラフィーに付し、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸(80：20：１)で展開した。コレステロールのスポットをかきとり、液体シンチレーションカウンターによって、放射活性を測定し、これを〔14C〕コレステロール量とした。
また、試験例１において環状デプシペプチドのメタノール溶液のかわりにメタノールを用いた以外は同様に行い測定し、コントロールとした。さらにコントロールの［14C］コレステロール量を100としてコレステロール相対量を計算した。
本発明の環状デプシペプチドの各濃度におけるコレステロール分泌に及ぼす影響を表２に示す。
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試験例２：本発明の環状デプシペプチドのトリグリセリド分泌抑制活性
Hep G2細胞１×105個／ml（10％牛胎児血清を含むD-MEM培地）を24穴組織培養用プレートに１mlずつ注入し、37℃、炭酸ガス５％および空気95％の混合ガス雰囲気下で培養した。４日後に、培地を除去し、10％リポ蛋白欠損血清(シグマ社製)を含むD-MEM培地１mlを加え、さらに、新規環状デプシペプチドのメタノール溶液10μｌを加えた。18時間後、培地を再び交換（10％リポ蛋白欠損血清を含むD-MEM培地）し、新規環状デプシペプチドのメタノール溶液10μｌと〔2-3H〕グリセロール３μCiを加え、さらに37℃で18時間培養した。培地中に生成した〔3H〕トリグリセリドは〔「バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）」1170巻、32〜37頁（1993）〕の方法により定量した。
すなわち、培地をヘキサン／イソプロパノール（３：２）によって抽出し、これをシリカゲル薄層クロマトグラフィーに付し、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（90：10：１）で展開した。トリグリセリドのスポットをかきとり、液体シンチレーションカウンターによって、放射活性を測定し、これを〔3H〕トリグリセリド量とした。
また、試験例２の環状デプシペプチドのメタノール溶液のかわりにメタノールを用いて同様に行い測定し、コントロールとした。さらにコントロールの［3H］トリグリセリド量を100としてトリグリセリド相対量を求めた。
本発明の環状デプシペプチドの各濃度におけるトリグリセリド分泌に及ぼす影響を表３に示す。
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以上表２および表３の結果より本発明の環状デプシペプチドは濃度依存的に肝細胞のコレステロールおよびトリグリセリドの分泌を抑制することが示された。
試験例３：本発明の環状デプシペプチドのＨｅｐ  Ｇ２細胞でのアポリポプロテインＢとアルブミン産生に与える影響
Hep G2細胞１×105個／ml（10％牛胎児血清を含むD-MEM培地）を24穴組織培養用プレートに１mlずつ注入し、37℃で炭酸ガス５％および空気95％の混合ガス雰囲気下で培養した。４日後に、培地を除去し、10％リポ蛋白欠損血清（シグマ社製）を含むD-MEM培地１mlを加え、さらに環状デプシペプチドのメタノール溶液10μｌを加えた。18時間後、培地を再び交換（10％リポ蛋白欠損血清を含むD-MEM培地）し、環状デプシペプチドのメタノール溶液10μｌを加え、さらに37℃で18時間培養した。培地中に生成したアポリポプロテインＢとアルブミンはエンザイムイムノアッセイ法によって定量した。以下に各蛋白質の定量法を記載する。
１）  アポリポプロテインＢの定量
本方法で使用した緩衝液の組成を表４に示す。なお、PBSとはリン酸緩衝液を、PBS-TはTween20を添加したリン酸緩衝液を示す。
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ヒツジ抗ヒトアポリポプロテインＢ IgG分画（バインディングサイト社製）を0.05Ｍ炭酸水素ナトリウム（pH9.5）に10μｇ／mlになるように溶解した。この50μｌをヌンクイムノプレートに分注し、４℃で16時間静置した。
PBS 300μｌで３回洗浄後、ブロッキング液300μｌを加え、37℃で２時間静置した。再びPBS 300μｌで３回洗浄し、サンプル溶液50μｌ（Hep G2培地を10％の乳タンパク質由来の免疫用ブロック剤(Block Ace；大日本製薬社製)で3.3倍希釈したもの）を加え、室温で２時間放置した。PBS-T 300μｌで３回洗浄後、ヒツジ抗ヒトアポリポプロテインＢペルオキシダーゼ標識体（バインディングサイト社製）の0.5％溶液（10％ Block Ace）50μｌを加え、室温で２時間放置した。PBS-T 300μｌで５回洗浄し、発色液（0.1Ｍクエン酸カリウムpH4.5 １ml，30％過酸化水素水0.4μｌ，オルトフェニレンジアミン１mg）100μｌを加え、そのまま２分間放置した。２Ｎ硫酸100μｌを加え反応を止め、490nmの吸光度と650nmの吸光度の差を求め、これをアポリポプロテインＢの吸光度とした。試験例３において、環状デプシペプチドのメタノール溶液のかわりにメタノールを用いた以外は同様に行い測定し、コントロールとした。低密度リポ蛋白（シグマ社製）を標準品とした場合の検量線よりアポリポプロテインＢの絶対量を求め、各サンプルの相対アポリポプロテインＢ量はこれとコントロールの比率×100％で表した。
２）  アルブミンの定量
アポリポプロテインＢと同じ方法によって定量した。ただし、ヒツジ抗ヒトアポリポプロテインＢ IgG分画（バインディングサイト社製）のかわりにヒツジ抗ヒトアルブミンIgG分画（バインディングサイト社製）を使用し、ヒツジ抗ヒトアポリポプロテインＢペルオキシダーゼ標識体のかわりにヒツジ抗ヒトアルブミンペルオキシダーゼ標識体を使用した。また、サンプル溶液はHep G2培地を10％Block Aceで13.3倍希釈したものを50μｌ加えた。検量線作成時の標準品としては、ヒトアルブミン（シグマ社製）を使用した。サンプルの相対アルブミン量はコントロールのアルブミンの絶対量を100とした際の比率（％）として求めた。
本発明の環状デプシペプチドの各濃度におけるアポリポプロテインＢとアルブミン産生に及ぼす影響を表５に示す。
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以上表５の結果より、本発明の環状デプシペプチドがHep G2細胞において、アルブミンの産生に影響を及ぼさずに、アポリポプロテインＢの産生を選択的に抑制することが示された。
以上の結果より、本発明の環状デプシペプチドは、Hep G2細胞のコレステロールとトリグリセリドの分泌を低濃度で強力に抑制し、さらにはアポリポプロテインＢの産生も抑制するが、アルブミン等の他の蛋白質の分泌を抑制しないことから、選択性の高い、新しいタイプの高脂血症治療薬としての利用が期待される。
（製剤例）
製剤例１  錠剤（１錠）
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化合物１、けい酸マグネシウム及び乳糖を混合し、これをヒドロキシプロピルセルロースを溶解したアルコール液で練合し、次いで適当な粒度に造粒し、乾燥、整粒後さらにステアリン酸マグネシウム及び植物硬化油を添加混合し均一な顆粒とする。次いでロータリー式打錠機により直径7.0mm、重量150mgおよび硬度６kgの錠剤を調製した。
製剤例２  顆粒剤
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上記処方例中ヒドロキシプロピルセルロースを除いた各原料を均一に混合し、これにヒドロキシプロピルセルロースを溶解したアルコール溶液を加えて練合した後押出造粒機により造粒し、乾燥して顆粒を得た。この顆粒を整粒して12メッシュの篩を通過し48メッシュの篩上に残留するものを顆粒剤とした。
製剤例３  シロップ剤
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白糖、Ｄ−ソルビトール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル及び化合物１を精製水（温水）60ｇに溶解する。冷却後香味料を溶解したグリセリン及びエタノールの溶液を加える。次にこの混合物に精製水を加えて100mlにする。
製剤例４  注射液
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炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム及びこの化合物１のナトリウム塩を蒸留水に加えて溶解し、全量を10.0ｍｌとする。
製剤例５  坐剤
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化合物１にグリセリンを加えて溶解する。そこへ、ポリエチレングリコール4000を加えて加温し溶解後、坐剤型に注入して冷却固化し１個あたり1.5ｇの坐剤を製造する。
産業上の利用可能性
本発明により提供される環状デプシペプチド（Ｉ）は、高脂血症治療薬、特に脂質分泌抑制剤およびアポリポプロテインＢ産性抑制剤として有用である。本発明の化合物はバシラス属に属する本化合物の生産菌を培養することにより製造される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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