(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［１］
【化１】
0003705046.tif 000015
で示される4−ハロゲノ−1,3−ブタンジオールの光学活性体にシュードモナス (Pseudomonas)に属する微生物、またはその微生物培養液もしくはその微生物酵素を作用させ、下記式［２］
【化２】
0003705046.tif 000016
で示される１，２，４−ブタントリオールの光学活性体または下記式［３］
【化３】
0003705046.tif 000017
で示される３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学活性体を製造する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物［１］の光学活性体にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-K-436-1株(寄託番号FERM P-17595)若しくはシュードモナス (Pseudomonas) sp. OS-K-29株(寄託番号FERM BP-994)、またはその微生物培養液若しくはその微生物酵素を作用させ、請求項１に記載の化合物［２］の光学活性体を製造する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物［１］の光学活性体にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI−5株(寄託番号FERM P-17596)、またはその微生物培養液若しくはその微生物酵素を作用させ、請求項１に記載の化合物［３］の光学活性体を製造する方法。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物［１］のＲ体にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-K-436-1株(寄託番号FERM P-17595)若しくはシュードモナス (Pseudomonas) sp. OS-K-29株(寄託番号FERM BP-994)、またはその微生物培養液若しくはその微生物酵素を作用させ、請求項１に記載の化合物［２］のＲ体を製造する請求項２の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物［１］のＳ体にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-K-436-1株(寄託番号FERM P-17595)若しくはシュードモナス (Pseudomonas) sp. OS-K-29株(寄託番号FERM BP-994)、またはその微生物培養液若しくはその微生物酵素を作用させ、請求項１に記載の化合物［２］のＳ体を製造する請求項２の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物［１］のＲ体にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI−5株(寄託番号FERM P-17596)、またはその微生物培養液若しくはその微生物酵素を作用させ、請求項１に記載の化合物［３］のＲ体を製造する請求項３の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物［１］のＳ体にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI−5株(寄託番号FERM P-17596)、またはその微生物培養液若しくはその微生物酵素を作用させ、請求項１に記載の化合物［３］のＳ体を製造する請求項３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品、農薬、生理活性物質などの光学活性化合物の製造に、極めて重要なＣ４光学活性化合物である光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール[１]、その誘導体である光学活性１，２，４−ブタントリオール[２]及び光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン[３]の生化学的製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１）光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオールの製法としては、光学活性４−ハロゲノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素カルシウムを用いて還元することにより製造する方法（特開平２−１７４７３３；特開平９−７７７５９；特公平７−７６２０９）が知られている。
２）光学活性１，２，４−ブタントリオールの生化学的製法としては、二階堂らによるラセミ体１，２，４−ブタントリオールにシュードモナス属細菌を作用させＳ体を分解除去し、残存するもう一方のＲ体を回収する方法（特開平６−２０９７８１）が知られている。しかし、Ｒ体しか得ることができず、もう一方のＳ体を得ることができない。
３）光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの生物化学的製法としては、微生物休止菌体を用いたラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルからの製法［特開平９−４７２９６、Enzyme Microb. Technol., 24, 13-20 (1999)］が知られている。
４）特開平９−４７２９６には、クロロヒドリン及びその誘導体の生化学的分割法が記載されているが、４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオールを基質に用いる光学分割法についての具体的記載がない。そして、光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオールから光学活性１，２，４−ブタントリオールまたは光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンへの生物化学的変換への記載もない。
５）光学活性４−クロロ−１，３−ブタンジオールを基質として用い、光学活性１，２，４−ブタントリオール或いは光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（光学活性［３］）へ変換する方法は報告されていない。勿論、微生物等の生体触媒を用いた例の報告はされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール［１］、光学活性１，２，４−ブタントリオール[２]及び光学活性３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン[３]は医薬、農薬などの有用な原料であり、より簡便で、かつ経済的な製法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、下記式［１］
【化４】
0003705046.tif 000002
で示される４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオールのラセミ体に微生物菌体、その培養物或いはその微生物の生産する酵素を作用させることにより、その光学活性体[１]と下記式［２］
【化５】
0003705046.tif 000003
で示される１，２，４−ブタントリオールのＲ体または下記式［３］
【化６】
0003705046.tif 000004
で示される３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンのＳ体を簡便、かつ実際的な方法で得られることを見出した。そして、さらに、光学活性体［１］に微生物菌体、その培養物或いはその微生物の生産する酵素を作用させることにより、光学活性体［２］、或いは光学活性体［３］を簡便かつ収率よく、そして実際的に製造できることを見出した。
【０００５】
即ち、本発明はラセミ体４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール（ラセミ体［１］）にシュードモナスに属する特定の微生物菌体、その培養物或いはその微生物の生産する酵素を作用させ、Ｒ体［１］を立体選択的に脱ハロゲン化し、速度論的にラセミ体［１］を光学分割することにより、反応液中に残存するＳ体［１］及び生成するＲ体１，２，４−ブタントリオール（Ｒ体［２］）を得る方法、またラセミ体［１］にシュードモナスに属する特定の微生物菌体、その培養物或いはその微生物の生産する酵素を作用させ、Ｓ体［１］を立体選択的に脱ハロゲン化し、反応液中に残存するＲ体［１］と生成するＳ体３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン（Ｓ体［３］）を得る方法からなる。
更に詳しくは、本発明はラセミ体［１］にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-K-436−１株、或いはその微生物培養液またはその微生物酵素を作用させ、Ｓ体［１］及びＲ体［２］を製造する方法、及びＳ体［１］またはＲ体［２］を単離する方法、並びにラセミ体［１］にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI−5株或いはその微生物培養液またはその微生物酵素を作用させ、Ｒ体［１］及びＳ体［３］を製造する方法及びＲ体［１］またはＳ体［３］を単離する方法に関する。
【０００６】
本発明は、また光学活性体［１］にシュードモナス (Pseudomonas)に属する微生物或いはその微生物培養液またはその微生物酵素を作用させ、ラセミ化することなく光学活性体［２］或いは光学活性体［３］に変換する方法にも関する。  更に詳しくは、光学活性体［１］にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-K-436-1株またはシュードモナス (Pseudomonas) sp. OS-K-29株 (FERM BP-994)、或いはその微生物培養液またはその微生物酵素を作用させ、生成物から光学活性体［２］を製造する方法、並びに光学活性体［１］にシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI-5株或いはその微生物培養液またはその微生物酵素を作用させ、生成物から光学活性体［３］を製造する方法に関する。
【０００７】
上記の通り、本発明方法を実施することにより医薬、農薬などの分野で重要なＣ４キラルシントンである光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール［１］、１，２，４−ブタントリオール[２]、そして３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン[３］を簡便かつ経済的に、そして高光学純度で得ることができる。
なお、本発明方法で出発化合物として使用されるラセミ体４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール（ラセミ体［１］）は、ラセミ体４−ハロゲノ−３−ヒドロキシブタン酸エステル、例えばラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸メチルエステルを水素化ホウ素ナトリウムや水素化アルミニウムリチウム等の還元剤を用いる還元法により容易に得ることができる[Comprehensive Organic Transformation, pp. 548-552 (1989), by Richard C. Larock, VCH Publishers, Inc.；J. Am. Chem. Soc., 158-163 (1950); Tetrahedron Lett., 2709-2712 (1987); Tetrahedron Lett., 6069-6072 (1987)]。
【０００８】
本発明方法を、以下に具体的に説明する。
ラセミ体［１］を基質とし、これからＳ体［１］とＲ体［２］、或いはＲ体［１］とＳ体［３］を得るには、立体選択的な脱ハロゲン化活性を有するシュードモナスに属する微生物菌体、即ちシュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-K-436-1株、シュードモナス (Pseudomonas) sp. DS-SI-5株を培養し、これに基質であるラセミ体［１］を添加し、反応させればよい。
反応は該菌株の至適ｐＨ、至適温度の範囲内で行うのがよい。
なお、反応の進行に伴い基質［１］より遊離するハロゲンイオンによりｐＨが徐々に低下する場合、適当なアルカリ源を添加することにより反応液中のｐＨを至適範囲内にコントロールする必要がある。例えば、炭酸カルシウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、炭酸カリウム、炭酸アンモニウなどの炭酸アルカリ塩溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液、またはアンモニア水溶液など通常、酸を中和させることができるものを用いてｐＨを至適範囲内に制御するのがよい。
具体的な反応条件は、至適ｐＨを６−８とし、１５−５０℃、好ましくは２５−３５℃に保つのがよく、反応基質濃度は、０．１−１５％（w/w）で行うのがよい。反応を効率的に行うために、撹拌或いは振とうさせながら反応してもよい。
【０００９】
本微生物を培養するための培地組成としては、通常この微生物が生育する培地ならば特に制限されない。例えば炭素源としてグルコース、ガラクトース、フラクトース、シュークロース等の炭水化物、グリセロール、ラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール、ラセミ体２，３−ジクロロ−１−プロパノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類などの有機酸、またはそれらの混合物を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物及び尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、更に必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
また、高酵素活性を持った菌体を得るための酵素誘導添加物として、上記培地及びペプトン培地、ブイヨン培地などの栄養培地にラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール、ラセミ体２，３−ジクロロ−１−プロパノールを添加してもよい。その他、ラセミ体２，３−ジハロゲノ−１−プロパノール、ラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする完全合成培地で培養するのも有効である。
【００１０】
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨを４〜１０、好ましくは５〜９、培養温度は１５〜５０℃、好ましくは２０〜３７℃の範囲で好気的に１０〜９６時間行なうことが好ましい。
上記の方法以外に、
１）上記培養方法により得た微生物の培養液、
２）この培養液を遠心分離等により得た菌体及びその菌体処理物（菌体破砕物または菌体抽出液）、
３）それらを常法により固定化したものを、緩衝液等に混合した混合液、
または
４）上記菌体から抽出した酵素に、基質[1]を反応させることによっても目的とする上記化合物を製造することができる。
この場合の反応温度は１５〜５０℃が好ましく、反応ｐＨは６〜８で行なうのが好ましい。反応液中の基質濃度は０．１−１５％(v/v)が好ましく、基質は初期に一括していれてもよいし、分割添加してもよい。反応は通常攪拌あるいは振とうしながら行ない、反応時間は基質濃度、微生物菌体量などにより異なるが１〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィー等の分析によりラセミ体［１］の残存基質量が初期基質濃度に比して５０％で反応を終了させるか、或いは目的とする光学活性体の光学純度を測定して終点を決定するのがよい。
【００１１】
反応液中に残存する光学活性体［１］及び光学活性体［２］或いは光学活性体［３］は、一般的な方法で回収、分離、精製できる。例えば反応液から菌体を遠心分離で除いた後、上清をエバポレーターにより濃縮し、酢酸エチル、エタノール等の溶媒で抽出する。抽出液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し光学活性体［１］と光学活性体［２］或いは光学活性体［３］の混合物のシロップを得ることができる。更に蒸留により精製してもよい。
光学活性体［１］と光学活性体［２］或いは光学活性体［３］を分離するには、１）沸点の差を利用する減圧蒸留法、２）シリカゲル、活性炭、イオン交換樹脂等の分離担体を用いる各種クロマトグラフィー、３）溶媒に対する分配率の差を利用する溶媒抽出法等により行うことができる。
【００１２】
光学活性体［１］にシュードモナスに属する微生物菌体、例えばシュードモナス（Pseudomonas) sp. OS-K-29株（FERM BP-994）、シュードモナス（Pseudomonas) sp. 436-1株、シュードモナス（Pseudomonas) sp. DS-SI-5株を作用させることにより、或いはそれらの微生物培養液またはその微生物酵素を作用させ、光学活性体［２］または光学活性体［３］への変換は、上記と同じ方法で行えばよい。この反応は穏和な反応であるため光学純度を低下させることなく行うことができる重要な反応である。
本発明に使用される微生物のうち、シュードモナス（Pseudomonas) sp. OS-K-29株は工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-994として既に寄託されており、他の２株はそれぞれDS-K-436-1株、DS-SI-5株と命名し、生理学的、菌学的諸性質からシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌と同定された。これら２菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号 FERM P-17595、 FERM P-17596として、それぞれ寄託されている。
【００１３】
シュードモナス（Pseudomonas) sp. DS-K-436-1株及びシュードモナス（Pseudomonas) sp.DS-SI-5株の生理学的、菌学的諸性質は下記に示す通りである。各培地における生育状態
0003705046.tif 000005
【００１４】
0003705046.tif 000006
0003705046.tif 000007
【００１５】
0003705046.tif 000008
0003705046.tif 000009
−        −
0003705046.tif 000010
【００１６】
0003705046.tif 000011
0003705046.tif 000012
【００１７】
0003705046.tif 000013
【００１８】
以下実施例をもって、本発明を詳細に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り、％（w/v）を意味する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
実施例１
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％を含む栄養培地（ｐＨ７．２）１００mlを入れた５００ml容のバッフル付き３角フラスコ（培養器）を１２１℃、１５分滅菌した。予め供試菌であるシュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-K-436−1株をペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％を含む寒天培地（ｐＨ７．２）で３０℃、２４時間静置培養して種菌を調製し、上記培地に一白金耳の菌体を無菌的に接種した。そして温度３０℃、約２４時間、振とう培養(125rpm)を行なった。培養終了後、培養液を取り出し、遠心分離にて集菌し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、休止菌体を調製した。その菌体を１．０％の炭酸カルシウムを含む同緩衝液１００ｍｌを入れたバッフル付きの５００ｍｌ容三角フラスコに懸濁し、その懸濁液に１ｍｌのラセミ体４−クロロ−１，３−ブタンジオールを加え、３０℃で攪拌しながら反応させた。その時の反応液中に残存する４−クロロ−１，３−ブタンジオールをガスクロマトグラフィー（カラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ，６０−８０メッシュ）で分析した結果、その残存率は３５％であった。反応終了後、約１ｍｌまで濃縮し、エタノールで抽出した。無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧化で溶媒を除去し、３６８ｍｇの４−クロロ−１，３−ブタンジオールと５９０ｍｇの１，２，４−ブタントリオールを得た。本物質の同定及び定量は同ガスクロマトグラフィー及びＧＣ-ＭＳにより行なった。
【００２０】
このシロップ中の４−クロロ−１，３−ブタンジオールをアステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（０．２５mm X ３０m）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。一方、１，２，４−ブタントリオールは無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロ化した後、上記ガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行った。その結果、回収した４−クロロ−１，３−ブタンジオールは光学純度９９．５％ｅｅのＳ体であることが判明した。また、回収した１，２，４−ブタントリオールは光学純度５２％ｅｅのＲ体であることが判明した。なお、上記のガスクロマトグラフィーによる光学異性体の分析条件は以下の通りである。
４−クロロ−１，３−ブタンジオールのリテンションタイムはＲ体，１５．９分；Ｓ体，１７．１分。分析条件：カラム温度，１２０℃；検出器温度，２００℃；キャリアーガス，窒素；流速，０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出器，ＦＩＤ；スプリット比，２００／１。
トリフルオロ化した１，２，４−ブタントリオールのリテンションタイムはＲ体，３８．９分；Ｓ体，４０．４分。分析条件：カラム温度，１００℃；検出器温度，２００℃；キャリアーガス，窒素；流速，０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出器，ＦＩＤ；スプリット比，２００／１。
【００２１】
実施例２
使用する微生物を微生物シュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-SI-5株に代えた以外は実施例１と同様の方法で反応（抽出溶媒：酢酸エチル）を行ない、３９９ｍｇの４−クロロ−１，３−ブタンジオールと５７９ｍｇの３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを得た。本物質の同定及び定量は同ガスクロマトグラフィー及びＧＣ-ＭＳにより行なった。
このシロップ中の４−クロロ−１，３−ブタンジオールをアステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（０．２５mm X ３０m）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。一方、３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロ化した後、上記ガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行った。その結果、回収した４−クロロ−１，３−ブタンジオールは光学純度９９％ｅｅのＲ体であることが判明した。また、回収した３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは光学純度５８％ｅｅのＳ体であることが判明した。
【００２２】
実施例３、４、５、６、７、８
使用する微生物をシュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-K-436-１株からシュードモナス（Pseudomonas） sp. OS-K-29株、或いはシュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-SI-5株に代え、実施例７と８では抽出溶媒をエタノールから酢酸エチルに変更し、基質をＲ体４−クロロ−１，３−ブタンジオール、或いはＳ体４−クロロ−１，３−ブタンジオールに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行なった。また、得られた種々の化合物を実施例１と同様の方法で同定と定量分析を行ない、光学異性体の分析についても同様の方法で行った。なお、実施例７及び８の３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの光学純度の分析はトリフルオロ化した後、実施例１と同じ条件で行った。
得られた結果を下表に示す。
【００２３】
0003705046.tif 000014
上記表中の略号は下記の化合物を意味する。
CBD: ４−クロロ−１，３−ブタンジオール
BT: １,２,４−ブタントリオール
HL: ３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン
【００２４】
【発明の効果】
本発明によればシュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-K-436-1株やシュードモナス（Pseudomonas） sp. DS-SI-5株を用いることにより、ラセミ体［１］よりＳ体［１］及びＲ体［２］、或いはＲ体［１］及びＳ体［３］を安価で、かつ工業的に簡便な方法によってを製造することができる。また、シュードモナス属に属する微生物を用いることにより光学活性体［１］より光学活性体［２］或いは光学活性体［３］を光学純度を低下させることなく、工業的に簡便な方法によって変換できる。