(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種をあまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisの１０品種のうちのいずれかであると識別する方法。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種をあまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisの１０品種のうちのいずれかであると識別する方法。
【請求項３】
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とからなるプライマーセット。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とからなるプライマーセット。
【請求項５】
あまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisからなる群から選ばれる大麦又は麦芽の品種の純度を検定する方法であって、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いに基づくタイプ調査をし、検定対象の品種のタイプとは別のタイプのＤＮＡ断片の混入を観察することによって、品種の純度を検定する方法。
【請求項６】
あまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisからなる群から選ばれる大麦又は麦芽の品種の純度を検定する方法であって、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いに基づくタイプ調査をし、検定対象の品種のタイプとは別のタイプのＤＮＡ断片の混入を観察することによって、品種の純度を検定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、遺伝子診断を用いた醸造用大麦又は麦芽の品種の識別方法及び該方法プライマーに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、大麦や麦芽の品種判定法としては、ホルデインやエステラーゼのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを比較することにより品種の判定を行う方法が試みられてきている。また、最近では、遺伝子診断による識別方法も開発されてきている（例えば、Cheeら、J. Am. Soc. Brew. Chem., 51, 93 (1993). ）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ホルデインやエステラーゼの電気泳動パターンの比較による品種判定方法は、大麦の生育条件や製麦中のブロテアーゼによる分解などによって電気泳動のパターンに変化が生じる場合があるため、必ずしも正確な判定法とは言い難い。一方、遺伝子診断による識別方法の多くは、由来の不明な遺伝子をプローブ又はプライマーとしているために、たとえ変異や他品種混入が示唆されたとしても、その結果と醸造上の品質への影響とを直接結びつけることが難しいため、満足のいく結果が得られるとは限らないという問題があった。
【０００４】
本発明は以上のような課題に鑑みなされたものであり、その目的は、醸造用大麦の育種あるいは醸造用原料の品質管理という観点から、より満足のいく遺伝子診断を用いた大麦又は麦芽の品種の識別方法の提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記状況に鑑み、より優れた大麦又は麦芽の品種の識別方法を見い出すべく鋭意研究を重ねた結果、醸造上重要な遺伝子において品種間で塩基配列に差異のある部位をつきとめ、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、下記に示した醸造上重要な遺伝子における品種間で塩基配列に差異のある部位を含むように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、該増幅されたＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種の識別を行う方法を提供するものである。
【０００７】
【表１】
0003660699.tif 000002
また本発明は、上記の品種識別方法のプライマーを提供するものである。本発明に係るプライマーは、例えばβ- シアノエチルホスホアミダイド法やチオホスファイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって得ることができる。
【０００８】
具体的には、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種をあまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisの１０品種のうちのいずれかであると識別する方法である。
【０００９】
また、本発明は、  配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いによって大麦又は麦芽の品種をあまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisの１０品種のうちのいずれかであると識別する方法である。
【００１０】
さらに、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とからなるプライマーセットである。
【００１１】
さらに、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とからなるプライマーセットである。
さらに、本発明は、あまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisからなる群から選ばれる大麦又は麦芽の品種の純度を検定する方法であって、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いに基づくタイプ調査をし、検定対象の品種のタイプとは別のタイプのＤＮＡ断片の混入を観察することによって、品種の純度を検定する方法である。
さらに、本発明は、あまぎ二条、はるな二条、ミサトゴールデン、Clipper、Schooner、Stirling、Harrington、Manley、Ellice及びAlexisからなる群から選ばれる大麦又は麦芽の品種の純度を検定する方法であって、配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対と、配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とを用いてＰＣＲ法により大麦又は麦芽のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの塩基配列の違いに基づくタイプ調査をし、検定対象の品種のタイプとは別のタイプのＤＮＡ断片の混入を観察することによって、品種の純度を検定する方法である。
【００１２】
【作用】
本発明によれば、まず、サンプルとなる大麦又は麦芽からゲノムＤＮＡを抽出する。サンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は、例えばCTAB法（Nucleic Acids Res., 8,4321 (1980) ）により行う。次に、該ゲノムＤＮＡに本発明プライマーを作用させて、標的遺伝子の一部を増幅させる。標的遺伝子の一部増幅は、例えばＰＣＲ法（Science, 230, 1350 (1985) ）により行う。そして、このようにして得られた増幅ＤＮＡについて、塩基配列を決定するか、または、変性勾配ゲルや温度勾配ゲル電気泳動もしくは制限酵素切断パターンなどによって塩基配列の差異を検出することによって、大麦又は麦芽の品種の識別を行う。
【００１３】
本方法は、醸造上重要な遺伝子をターゲットにしていることに起因して、その結果が醸造上の品質へ直接影響をおよぼす可能性が高くなるため、醸造用大麦の育種あるいは醸造用原料の品質管理という観点からより満足のいく識別方法となり得る。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明するが、本実施例により本願発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【００１５】
［実施例１；ゲノムＤＮＡの抽出］
本実施例においては、大麦又は麦芽の品種として、あまぎ二条（以下、品種番号1 と記す）、はるな二条（以下、品種番号2 と記す）、ミサトゴールデン（以下、品種番号3 と記す）、Clipper （以下、品種番号4 と記す）、Schooner（以下、品種番号5 と記す）、Stirling（以下、品種番号6 と記す）、Harrington（以下、品種番号7 と記す）、Manley（以下、品種番号8 と記す）、Ellice（以下、品種番号9 と記す）、Alexis（以下、品種番号10と記す）を用いた。
【００１６】
上記の大麦の胚又は麦芽の葉芽を取り出し、Clontech社製「植物ゲノム抽出キット」を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００１７】
［実施例２；プライマーの設計と合成］
醸造上重要な既知の大麦遺伝子の塩基配列（β- アミラーゼ; J. Biochem., 115,  47 (1994). α- アミラーゼ; Plant Mol. Biol., 12, 119 (1989). β- グルカナーゼ; Eur.J. Biochem., 194, 831 (1990). B1- ホルデイン; Nucleic Acids Res., 13, 7327  (1985). ）より様々なプライマーを設計し、それらについてＰＣＲを行った後、温度勾配ゲル電気泳動および塩基配列の決定によって品種間で塩基配列に差異のあるものを検索した。
【００１８】
その結果、プライマー配列(1) 〜(8) を用いることによって品種間で塩基配列に差異のある部位が増幅でき、更にその部位に存在する制限酵素認識部位を利用することで、大麦又は麦芽の品種の識別が可能になることが判明した。プライマーの合成及び精製は、（株）サワディー・テクノロジーに委託した。
【００１９】
［実施例３；プライマー配列(1)(2)を用いた品種の識別方法］
ＰＣＲは、各品種10粒の大麦から抽出したゲノムＤＮＡ100 ng、dNTPs 各20 nmol 、プライマー(1)(2)各10 pmol 、Taq DNA polymerase 2.5 Uを含むＰＣＲ用反応液 100μl について、94℃ 1分、55℃ 2分、72℃ 1分を33サイクル行った後、72℃ 5分処理を行った。ＰＣＲ終了後、この反応液 8μl に制限酵素 NcoI と EcoT22I各5 U と酵素反応用緩衝液を加え37℃で 1時間処理した。これを、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色後、UV照射にて視覚化した。結果を図１に示す。10種類の大麦品種をA からC'の5 タイプに識別することができた。なお、品種番号5 と10については、更に１粒毎の分析を行った結果、C とC'あるいはB とC のいずれかを持つことが明らかとなり、C/C'、B/C のように示した。
【００２０】
［実施例４；プライマー配列(3)(4)を用いた品種の識別方法］
プライマー配列(1)(2)の代わりに(3)(4)を用い、ＰＣＲを33から30サイクルに、制限酵素反応をNcoIと EcoT22I／37℃から TaqI ／65℃に代えて実施例３と同様の分析を行った結果、図２に示ように、 A〜C の3 タイプに識別することができた。
【００２１】
［実施例５；プライマー配列(5)(6)を用いた品種の識別方法］
プライマー配列(1)(2)の代わりに(5)(6)を用い、ＰＣＲを33から30サイクルに、制限酵素反応をNcoIと EcoT22Iから HaeIII に代えて実施例３と同様の分析を行った結果、図３に示すように、 AとB の2 タイプに識別することができた。
【００２２】
［実施例６；プライマー配列(7)(8)を用いた品種の識別方法］
プライマー配列(1)(2)のかわりに(7)(8)を用いて、実施例３と同様の条件で、アニーリングを55℃から57℃に、33サイクルから30サイクルにかえてＰＣＲを行ったもの（図４の左半分）と、更に実施例３と同様の条件で制限酵素 HaeIII 処理を行ったもの（図４の右半分）の比較により、図４に示すように、 A〜E の5 タイプに識別することができた。
【００２３】
［実施例７；総合評価による品種の識別方法］
実施例３〜６において行ったタイプ分けをまとめると表２のようになる。このような総合評価から、10種類全ての品種を識別できるということがわかる。
【００２４】
【表２】
0003660699.tif 000003
［実施例８；品種の純度検定］
購入した大麦又は麦芽100 粒の胚又は葉芽をひとまとめにして実施例３〜６に示したタイプを調査するようにすると、その品種のタイプとは別のタイプのＤＮＡ断片の混入が観察されるか否かで品種の純度検定が行えることとなる。
【００２５】
他品種混入が予想された場合には、そのときのバンドの濃さによってある程度純度が予想でき、さらにこのサンプルを一粒ずつ同様の分析を行えばどのような品種がどの程度混入しているかが明らかとなる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明に係るプライマーは醸造上重要な遺伝子をターゲットにして作成されているため、その結果が醸造上の品質へ直接影響をおよぼす可能性が高くなる。このため、このようなプライマーを使用する本発明に係る識別方法によれば、醸造用大麦の育種あるいは醸造用原料の品質管理という観点からより満足のいく識別をすることができる。
【００２７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：TTCAAAGCAG CAGCAGCG                                           18
配列番号：２
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：TTCTTCTGGT GCGCTCATC                                          19
配列番号：３
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：ATAAGTGGGC ATCAATTCGG C                                       21
配列番号：４
配列の長さ：18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：GTGTGTCTGG CCAGGTAT                                           18
配列番号：５
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：CGTGAAAAAA CCGCCGCCGA                                         20
配列番号：６
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：CTTTCTCTCT CTAGCTGCGT                                         20
配列番号：７
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：CCACCATGAA GACCTTCCTC                                         20
配列番号：８
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：DNA
配列：TCGCAGGATC CTGTACAACG                                         20
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマー(1)(2)を用いてＰＣＲを行い、それを制限酵素で処理した後のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンの写真である。図中、１〜１０は大麦品種を、Ａ，Ｂ，Ｂ´，Ｃ，Ｃ´は電気泳動パターンのタイプを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マーカー9 を示す。
【図２】プライマー(3)(4)を用いてＰＣＲを行い、それを制限酵素で処理した後のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンの写真である。図中、Ａ，Ｂ，Ｃは電気泳動パターンのタイプを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マーカー9 を示す。
【図３】プライマー(5)(6)を用いてＰＣＲを行い、それを制限酵素で処理した後のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンの写真である。図中、Ａ，Ｂは電気泳動パターンのタイプを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マーカー9 を示す。
【図４】プライマー(7)(8)を用いてＰＣＲを行ったもの（左半分Ａ〜Ｅ）と、それぞれを制限酵素HaeIIIで処理したもの（右半分Ａ〜Ｅ）のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンの写真である。図中、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅはポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンのタイプを、Ｍはニッポンジーン社製 DNA MW マーカー9 を、Ｍ´はニッポンジーン社製 DNA MW マーカー2 を示す。
【図１】
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【図２】
0003660699.tif 000005
【図３】
0003660699.tif 000006
【図４】
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