(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」と少なくとも一部がそれに相補的なＤＮＡ配列「ａ」から成る塩基配列、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」と少なくとも一部がそれに相補的なＤＮＡ配列「ｂ」から成る塩基配列を付加し、該マイクロ遺伝子断片を変性させて一本鎖にした後、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した３０〜６０塩基対の一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子断片のリガーゼ反応を行うことを特徴とするマイクロ遺伝子のランダム重合体作成方法。
【請求項２】
ＤＮＡ配列「Ａ」が配列番号１で表されるものである請求項１記載のマイクロ遺伝子のランダム重合体作成方法。
【請求項３】
ＤＮＡ配列「Ｂ」が配列番号２で表されるものである請求項１記載のマイクロ遺伝子のランダム重合体作成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロ遺伝子のランダム重合体作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は、触媒機能やエネルギーの変換機能、信号の伝達機能等の生化学的機能を生体において担う分子である。酵素を初め多くのタンパク質が非常に高い効率でこれらの生化学的な機能を果している。
近年のＤＮＡ組換え技術の進歩により、これらタンパク質の大量生産が可能となったが、タンパク質の安定性や機能を人為的に変えることは極めて困難である。
【０００３】
加速型生物機能構築技術と呼ばれる、いわゆる進化分子工学が確立されることにより、これらの問題点を解決する手段が与えられる。すなわち、遺伝子のランダム変異やモジュール、エクソンなどの単位領域の入れ変えによって、従来のタンパク質の構造や機能を改良すること、あるいは全く新しい構造や機能を持つタンパク質を創製することが可能である。
【０００４】
進化分子工学とは、ヒトの手で、新しい遺伝子をゼロから産み出そうという試みとして、1990年代初頭から生物学の新しい思想として登場した技術である。
既に、ある受容体に対して何らかの生理活性を示すポリペプチドや特定の触媒活性をもつ核酸分子等が、ヒトの手で創作された新しい遺伝子として得られている。
【０００５】
これらの物質は、いずれもアミノ酸、ヌクレオチド又は種々の化合物側鎖をブロック単位とし、これらブロック単位が無作為に連結した重合体のプールの中から機能を持つ分子を選択していくという手法により得られたものである。
しかし、アミノ酸やヌクレオチドをブロック単位とした場合、重合体のプールの大きさの限度から重合体の長さに制限があり、その結果、あまり大きなタンパク質を創成することができない。従って、大きなタンパク質を創作するには、ある程度の大きさをもったマイクロ遺伝子をブロック単位として用いるのが望ましい。
【０００６】
従来よりマイクロ遺伝子を単位としてその無作為な重合体を作成する方法としては、Stemmer による「セクシュアルPCR 法」が知られている(Stemmer,W.P.C.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751(1994), Stemmer,W.P.C.,Nature,370:389-391(1994)) 。この方法は、複数の相同遺伝子をコードするDNA をヌクレアーゼにより小さな断片（マイクロ遺伝子）に分解し、これらマイクロ遺伝子の混合状態でＰＣＲを行うことにより、相同遺伝子間の大規模なマイクロ遺伝子単位でのシャッフリング反応（小さいＤＮＡ断片を単位としたモザイク状の新しい組み合わせを組換えにより作る反応）を起こさせるものである。
【０００７】
しかし、セクシュアルＰＣＲ法は、ＤＮＡ塩基配列レベルで類似性の存在する遺伝子間でのシャッフリング反応に限定され、また、マイクロ遺伝子の順列についても本来の遺伝子が有する順列から変えることができないなどの問題点がある。さらに、塩基配列の類似性が低くなる程シャッフリング反応の効率が低くなるという限界を持つ。従って、塩基配列の類似、非類似とは関係なくマイクロ遺伝子間の重合体を作成することができ、さらに遺伝子の順列に関係なく効率良くマイクロ遺伝子を重合させる方法が望まれる。
【０００８】
【発明が解決しようとするための手段】
本発明は、効率的にマイクロ遺伝子を重合させる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、マイクロ遺伝子の両端に特定のＤＮＡを付加し、かかる付加したＤＮＡに相補的なＤＮＡを用いてリガーゼ反応を行うことにより効率的にマイクロ遺伝子を連結し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、マイクロ遺伝子断片の一端に特定のＤＮＡ配列「Ａ」、他端に特定のＤＮＡ配列「Ｂ」を付加し、ＤＮＡ配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列「ａ」及び「ｂ」を調製し、該ＤＮＡ配列「ａ」と「ｂ」とが連結した一本鎖ＤＮＡを用いて該マイクロ遺伝子のリガーゼ反応を行うことを特徴とするマイクロ遺伝子のランダム重合体作成方法である。
ここで、ＤＮＡ配列「Ａ」としては配列番号１、ＤＮＡ配列「Ｂ」としては配列番号２で表されるものが挙げられる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、マイクロ遺伝子とは、数アミノ酸〜数百アミノ酸をコードできる比較的短いＤＮＡ断片をいい、種類は限定されない。
【００１２】
図１に示す通り、本発明の連結反応を行うにあたり、まず、ブロック単位として用いるすべてのマイクロ遺伝子（二本鎖ＤＮＡ断片）の両端に、異なる配列からなる２種類の二本鎖ＤＮＡ配列である「連結配列」を付加する（図１(1) ）。すなわち、マイクロ遺伝子の一端に連結配列の一方を付加し、マイクロ遺伝子の他端に連結配列の他方を付加する。連結配列とは、特定の配列「Ａ」と少なくとも一部がそれに相補的な配列「ａ」により構成される塩基配列（「Ａ／ａ」配列）、及び特定の配列「Ｂ」と少なくとも一部がそれに相補的な配列「ｂ」からなる塩基配列（「Ｂ／ｂ」配列）をいう。この塩基配列は、５〜50塩基対の大きさの任意の配列を含むものである。例えば、配列「Ａ」としては配列番号１、配列「Ｂ」としては配列番号２で表されるものが挙げられる。図１(1) には、連結の対象となる３種類のマイクロ遺伝子（ユニット１、ユニット２及びユニット３) の５’側に「Ａ／ａ」配列、３’側に「Ｂ／ｂ」配列が付加されたものが示されている。連結配列は、化学的ＤＮＡ合成法により調製することができる。マイクロ遺伝子両端には、連結配列と、マイクロ遺伝子の両端の配列を持つオリゴヌクレオチドとを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により連結配列を付加することができる。また、連結配列と、不特定の配列を持つプライマーとを用いたＰＣＲから、両端に連結配列を持ったマイクロ遺伝子を無作為にヒト等のゲノムＤＮＡやｃＤＮＡから作成することができる。
なお、連結の対象となるマイクロ遺伝子は同種のものであっても異種のものであってもよい。
【００１３】
前記「連結配列」が付加されたマイクロ遺伝子を調製した後、該マイクロ遺伝子（ユニット１及びユニット２）、ガイド配列（ガイドオリゴヌクレオチド）並びにリガーゼを適当なバッファーとともに混合し、マイクロ遺伝子の二本鎖を変性させて一本鎖とした後、ユニット１、ユニット２及びガイド配列の３者の複合体を形成させる（図１(2) ）。変性は92〜96℃で行うが、耐熱性リガーゼの安定性を考慮して92℃で行うのが好ましい。
【００１４】
ガイド配列とは、前記連結配列「Ａ」及び「Ｂ」にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含むＤＮＡ配列である「ａ」及び「ｂ」が連結された一本鎖のＤＮＡ配列をいう。ガイド配列の長さ（「ａ」と「ｂ」を連結した長さ）は、10〜100 塩基対のものが用いられるが、効率的に連結できる点で30〜60塩基対のものが好ましい。このガイド配列を用いることにより、ユニット１の３’側にある「Ｂ」配列にはガイド配列の「ｂ」配列が結合し、ユニット２の５’側にある「Ａ」配列にはガイド配列の「ａ」配列が結合する。その結果、ユニット１、ユニット２及びガイド配列の３者の複合体が形成される。
【００１５】
最後に、リガーゼの作用により前記マイクロ遺伝子同士が連結する（図１(3) ）。リガーゼについては、一般に遺伝子の連結反応に用いられるものを使用し得るが、高温で反応させることができる点で耐熱性リガーゼが好ましい。
【００１６】
同様にして、ユニット１とユニット２とのマイクロ遺伝子重合体を、ユニット３のマイクロ遺伝子と連結させることができる（図１(4) ）。
上記反応は、必要に応じて繰り返すことにより、効率を上げることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００１８】
〔実施例１〕
(1) マイクロ遺伝子ブロックの調製
イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする大腸菌遺伝子のileSのＣＰ１と呼ばれる領域に、マイクロ遺伝子Ｉ〜VIの６種類のマイクロ遺伝子ブロックを作成した（図２）。これらのマイクロ遺伝子の切断点は、ileSの２断片化実験から求められた位置である（Shiba & Schimmel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,1880-1884)。I 〜VIのマイクロ遺伝子ブロックは、それぞれ、30、30、35、53、45、69アミノ酸をコードする、90〜207bp の大きさのＤＮＡ断片である。
マイクロ遺伝子の調製は、下記(2) 〜(4) でデザイン合成したオリゴヌクレオチドを用い、下記(5) に記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】
(2) 連結配列「Ａ」及び「Ｂ」のデザイン
ここで用いる連結配列は、グリシンをコードする配列に富んでおり、ポリペプチドとしてはフレキシブルな構造を持つと考えられる翻訳産物をコードするようデザインされている。また、後の重合体の解析の際に利用できるようにするため、制限酵素ＡpaＩ、ＮarＩ、ＮaeＩを持つようにデザインされている。なお、ＮarＩ配列は連結配列「Ｂ」及び「Ａ」が連結した時のみに再構成されるものである。
【００２０】
(3) マイクロ遺伝子と連結配列との連結反応
(1) でデザインしたマイクロ遺伝子を増幅させるため、その５’側に連結配列「Ａ」又は「Ｂ」を持ち、３’側に増幅すべきマイクロ遺伝子ブロックの両端の配列をもつようなオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機を用いて作成した。すなわち、マイクロ遺伝子IIに用いるオリゴヌクレオチドとしては、Ａ配列とブロックIIの５’末端配列とを連結してもつようなKY-601（配列番号５）、及びＢ配列とブロックIIの３’末端配列とを連結してもつKY-545（配列番号６）を、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。その際、「Ａ」配列の５’末端のみにリン酸基がつくように合成した。
【００２１】
これらのオリゴヌクレオチドのデザインに際しては、配列番号１、配列番号２で表される連結配列の読み枠が、マイクロ遺伝子が由来したイソロイシルｔＲＮＡ合成酵素に用いられている読み枠と一致するようにオリゴヌクレオチドをデザインした。これにより、本来の読み枠でない２つの読み枠に存在する翻訳終止コドンにより得られた重合体からのタンパク質の翻訳が途中で停止することを防いでいる。
【００２２】
マイクロ遺伝子Ｉについては３’側に配列「Ｂ」のみを付加し（ΔＩ）、マイクロ遺伝子VIについては５’側に配列「Ａ」のみを付加し（ｐVIΔ）、マイクロ遺伝子II〜V については読み枠に対して５’側に配列「Ａ」を、３’側に配列「Ｂ」を付加した（それぞれｐII、ｐIII、ｐIV、ｐＶという；図３）。
【００２３】
マイクロ遺伝子ブロックI 〜VIを増幅するために用いたプライマーを以下に示す。
ブロックI 用：KY-606（配列番号３）及びKY-543（配列番号４）
ブロックII用：KY-601（配列番号５）及びKY-545（配列番号６）
ブロックIII用：KY-602（配列番号７）及びKY-547（配列番号８）
ブロックIV用：KY-603（配列番号９）及びKY-549（配列番号10）
ブロックV 用：KY-604（配列番号11）及びKY-551（配列番号12）
ブロックVI用：KY-605（配列番号13）及びKY-607（配列番号14）
なお、プライマーKY-601、KY-602、KY-603、KY-604、KY-605については、５’末端にリン酸基が付くように合成した。
【００２４】
(4) ガイド配列の調製
「Ａ」及び「Ｂ」配列にそれぞれ相補的な配列「ａ」及び「ｂ」を連続して有する一本鎖ＤＮＡをガイド配列として合成した。ガイド配列の３’末端側の３塩基は、「Ｂ」配列と塩基対を形成できない配列にし、ガイド配列がＰＣＲプライマーとして機能できないようデザインされている。
【００２５】
用いた配列はKY-638（配列番号15）で表されるオリゴヌクレオチドである。なお、ガイド配列長を検討する実験ではKY-642（配列番号16）、KY-643（配列番号17）、KY-644（配列番号18）、KY-645（配列番号19）で表されるオリゴヌクレオチドも合成した。
【００２６】
(5) マイクロ遺伝子ブロックの増幅
上記(3) で示したオリゴヌクレオチド対をＰＣＲプライマーとし、大腸菌イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素ileSを含むＤＮＡを鋳型として標準的条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で60秒を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
得られたＰＣＲ産物を２％アガロースで電気泳動後、目的のＤＮＡを切り出し、キアゲン社のQIAquick Gel Extraction Kit を用いて精製した。精製したマイクロ遺伝子ブロックを２％アガロースで電気泳動した結果を図４に示す。
【００２７】
図４中、レーン１〜６は、それぞれマイクロ遺伝子Ｉ〜VIの泳動結果である。図４から、期待される大きさのマイクロ遺伝子ブロックが調製されたことがわかった。
同様に、マイクロ遺伝子ブロック連結反応におけるガイド配列の効果を、ΔＩとｐVIΔブロックの連結反応を検討した。
【００２８】
連結反応の条件は以下の通りである。
0003680392.tif 000002
上記混合物を0.2 mlプラスチックチューブに混合し、温度可変インキュベーターを用いて、92℃で１分、65℃で１分を１サイクルとしてこれを７サイクル行った。
連結産物を検出するために、得られた反応産物１μlについて、ΔＩブロックの５’末端に相補的配列をもつオリゴヌクレオチド（KY-606）、及びｐVIΔブロックの３’末端に相補的配列をもつオリゴヌクレオチド（KY-607）を用いて標準ＰＣＲ（50μl）を行った。
【００２９】
その結果、図５に示されるように、ガイド配列の存在がマイクロ遺伝子ブロックの連結反応を促進することがわかった。また、マイクロ遺伝子ブロックの10倍分子数以上のガイド配列を用いることで、高効率の連結反応を行うことができる。
【００３０】
(6) ガイド配列長の影響
種々の長さを有するガイド配列を用いて、ΔＩ及びｐVIΔブロックの連結反応についてガイド配列長の影響を検討した。
連結反応の条件を以下に示す。
0003680392.tif 000003
【００３１】
上記混合物の中、ガイド配列としては、オリゴヌクレオチドKY-638（配列番号15; 37mer)、KY-642（配列番号16; 30mer)、KY-643（配列番号17; 24mer)、KY-644（配列番号18; 18mer)又はKY-645（配列番号18; 12mer)（いずれも、その３’末端に非相補領域コドンを含む）を用いている。この混合物を0.2ml プラスチックチューブに混合し、温度可変インキュベーターを用いて、92℃で１分、65℃で１分を１サイクルとしてこれを７サイクル行った。
【００３２】
連結産物を検出するために、得られた反応産物１μlについて、KY-606とKY-607を用いて標準ＰＣＲ（50μl）を行った。
その結果、図６に示されるように、マイクロ遺伝子ブロックとの相補的配列の長さが30塩基以上のオリゴヌクレオチドを用いた場合に効率良く連結反応が進むことがわかった。
【００３３】
〔実施例２〕ランダム重合体の作成
連結反応の条件を以下に示す。
0003680392.tif 000004
【００３４】
上記混合物を0.2ml プラスチックチューブに混合し、温度可変インキュベーターを用いて、92℃で１分、65℃で１分を１サイクルとしてこれを７サイクル行った。
次に、得られた反応産物５μlについて、ΔＩブロックの５’末端に相補的配列をもつオリゴヌクレオチド（KY-606）、及びｐVIΔブロックの３’末端に相補的配列をもつオリゴヌクレオチド（KY-607）を用いて標準ＰＣＲ（50μl，25サイクル）を行った。
【００３５】
ＰＣＲ後の反応産物10μlについて、1.2 ％アガロースを用いた電気泳動を行った。大きさが１ｋｂに相当するＤＮＡをアガロースから抽出後、その10分の１量を、再度KY-606及びKY-607を用いた50μlの標準的ＰＣＲ（25サイクル）にかけ、その10μlを0.8 ％アガロース電気泳動にかけた。
その結果を図７に示す。図７の結果より、マイクロ遺伝子ブロックの重合物が観察される。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、効率的にマイクロ遺伝子を重合させる方法が提供される。
【００３７】
本発明の方法により、各種機能的タンパク質を創成するために必要な遺伝子のライブラリーを構築することができ、また、分子量の大きな機能性タンパク質を創成することができ、新しい生理活性物質やポリマー開発への応用が考えられる。
【００３８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAACGCC GGCAAGGGG
【００３９】
配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGGCCCGGCT CTGAGGGAGG
【００４０】
配列番号：３
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGACGGTCAC CTGCACAAAG GCGCGA
【００４１】
配列番号：４
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCTCCCTCAG AGCCGGGCCC GGACGGAGAA GTTTTGTCGT A
【００４２】
配列番号：５
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAACGCC GGCAAGGGGG GTATCGACGT TGCTTTCCAG GC
【００４３】
配列番号：６
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCTCCCTCAG AGCCGGGCCC GGTCCAGATT ACCAGCGAGA
【００４４】
配列番号：７
配列の長さ：４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAACGCC GGCAAGGGGG GTACCACGCC GTGGACTCTG CC
【００４５】
配列番号：８
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCTCCCTCAG AGCCGGGCCC TTTCGCCAGA ATCACGGCCT
【００４６】
配列番号：９
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAACGCC GGCAAGGGGG ATCTGGTTGA AAGCGTAATG C
【００４７】
配列番号：１０
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCTCCCTCAG AGCCGGGCCC GGTACCGGCA TCCAGGGTA
【００４８】
配列番号：１１
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAACGCC GGCAAGGGGG GTGCCGTTCA CACCGCG
【００４９】
配列番号：１２
配列の長さ：３９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCTCCCTCAG AGCCGGGCCC GTTCACGCCA TCCAGCGTC
【００５０】
配列番号：１３
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGCCAACGCC GGCAAGGGGG TCTTCAAAGC GAACGACATC
【００５１】
配列番号：１４
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGCGGGATCC ACTGCACGCC TTTGAT
【００５２】
配列番号：１５
配列の長さ：４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCCCCTTGCC GGCGTTGGCG CCTCCCTCAG AGCCGGGAAA
【００５３】
配列番号：１６
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTGCCGGCGT TGGCGCCTCC CTCAGAGCCG AAA
【００５４】
配列番号：１７
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCGGCGTTGG CGCCTCCCTC AGAGAAA
【００５５】
配列番号：１８
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GCGTTGGCGC CTCCCTCAAC A
【００５６】
配列番号：１９
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTGGCGCCTC CCAAT
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の手法を示す模式図である。
【図２】６種類のマイクロ遺伝子ブロックの連結を示す図である。
【図３】マイクロ遺伝子に連結配列を付加した図である。
【図４】アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図６】アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図７】アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１】
0003680392.tif 000005
【図２】
0003680392.tif 000006
【図３】
0003680392.tif 000007
【図４】
0003680392.tif 000008
【図５】
0003680392.tif 000009
【図６】
0003680392.tif 000010
【図７】
0003680392.tif 000011