(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、血清コレステロール低下剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清コレステロール低下作用を有するペプチドを含有している、経口投与が可能な、新規な血清コレステロール低下剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、日本においても食生活の欧米化に伴い、高蛋白質、高脂肪の食品が過剰に摂取される傾向が強くなってきており、高コレステロール血症の発現率が増加している。また、高コレステロール血症により引き起こされる虚血性心疾患が増加している。虚血性心疾患の危険性は、特にＬＤＬコレステロール値と関係が深いと言われているが、単にＬＤＬコレステロール値だけに注目するのではなく、ＬＤＬコレステロール値とＨＤＬコレステロール値の比（＝ＬＤＬコレステロール値／ＨＤＬコレステロール値）や、ヘパリン沈殿コレステロールの値（＝ＬＤＬコレステロール＋ＶＬＤＬコレステロール）を評価することも行われている。
【０００３】
近年、機能性ペプチドにより成人病を予防しようとする試みがなされている。その様な試みの一つとして、本発明者らは特開平１１−２９２８９６において、米の蛋白質由来のペプチドの誘導体であるＸ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐである）で示されるペプチドが、血中コレステロールを低下させる作用を有することを報告している。また、β−ラクトグロビンから派生する４残基の回腸収縮ペプチドであるβ−ラクトテンシン（Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が、経口投与においてコレステロール低下作用を有することを見出している。また、ダイズ蛋白質由来の構造未知の高分子ペプチドが胆汁酸を吸着し、その再吸収を阻害することによってコレステロール低下作用を示すことが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、コレステロール低下作用を有する機能性ペプチドを得ることである。ところで、これまで知られているペプチドより短い機能性ペプチドが得られたならば、生体内で分解を受けにくいと考えられ、またペプチドの合成も行い易い等の利点がある。よって、３アミノ酸程度の短い配列でコレステロール低下作用を有する機能性ペプチドを得ることが、本発明の課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、β−ラクトテンシンと同じく乳蛋白質派生ペプチドであるκ−カゼイン由来の回腸収縮ペプチドについて、血清コレステロール低下作用があるのではないかと考えて、検討を行った。即ち、カソキシンＣ（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）のフラグメントペプチドについて、血清コレステロールに及ぼす影響について検討を行った。カソキシンＣは、Ｃ３ａレセプターに結合して回腸収縮活性の他に免疫促進作用や、抗鎮痛、抗健忘の様な中枢作用を持つ。カソキシンＣの断片ペプチドであるＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇは、カソキシンＣと同様にＣ３ａレセプターに結合する最小単位である。それより更に短いペプチドについて生理活性の検討を行った結果、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇという構造から成るペプチドが、血清コレステロールを低下させる作用を有することを見出した。また、２番目のアミノ酸がＡｌａ又はＰｒｏに変化したペプチドであるＬｅｕ−Ａｌａ−ＡｒｇとＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇもまた、血清コレステロール低下作用を有していた。この様に、トリペプチドがコレステロール低下作用を示すという前例はなく、本発明の最も顕著な効果である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、血清コレステロール低下剤である。これらのペプチドは、血清コレステロールを低下させる目的において有用である。よって、これらの１または２のペプチドを含有するコレステロール低下剤を調整することができる。本発明のペプチドは３アミノ酸から成るトリペプチドであるが、本発明のようにトリペプチドがコレステロール低下作用を示すという前例はこれまでに存在しなかった。上述した様に、機能性ペプチドの配列が短いことにより、分解されにくくなり、合成も容易になるので、トリペプチドがコレステロール低下作用を有することの利点は大きい。上記でいうＬｅｕはロイシン、Ａｒｇはアルギニン、Ｓｅｒはセリン、Ａｌａはアラニンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。
【０００７】
本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ）等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。
【０００８】
この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【０００９】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１０】
次に医薬品として用いる場合について説明する。
本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよい。本発明の血清コレスレロール低下剤は、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１日あたり通常は１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１１】
具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００１２】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１３】
これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１４】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００１５】
経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００１６】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００１７】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００１８】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００１９】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
（ペプチドの合成）
市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、新規ペプチドについて以下のように合成を行った。
まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）と、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ  Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。
【００２０】
得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｓｅｒをカップリングさせた方法と同様にＦｍｏｃ−Ｌｅｕをカップルさせて、Ｌｅｕ（Ｐｍｃ）−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２１】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ18−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＬＳＲ）を得た。
本品をプロテインシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ社製４７７Ａ型）により分析した結果、上記の組成であることが判明した。同様の方法で、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ（ＬＡＲ）及びＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＬＰＲ）もまた得た。
【００２２】
（血清コレステロールの測定）
オスＩＣＲマウス（４週齢２０−２４ｇ、１群８匹）に高コレステロール、高コール酸食を３日間与えた。高コレステロール・高コール酸食には０．６％のコレステロールと０．２％のコール酸を含有しており、餌の組成については表１に示す。本発明のペプチドを、上記３日間の飼育中、２日目と３日目の実験開始と同時に５０ｍｇ／ｋｇとなるような重量を生理食塩水に溶かして、ゾンデ針で経口投与した。即ち、合計１００ｍｇ／ｋｇを投与した。ペプチド投与中も高コレステロール食を与え、２回目のペプチド投与後２４時間絶食させた後、心臓採血法により血液を採取した。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
回収した血液を３７℃の恒温槽で３０分間インキュベートした後、３０００ｇで１０分間遠心分離を行い、得られた血清について酵素法で血清コレステロールを測定した。即ち、総コレステロール及びヘパリン沈殿コレステロールの濃度を測定キット（和光純薬工業株式会社製、コレステロールＥテストワコー及びＨＤＬコレステロール沈殿試薬セット）により６００ｎｍの吸光度を測定することにより測定した。ヘパリン沈殿リポ蛋白質（ＨＰＬ）コレステロール濃度は、ＬＤＬコレステロールとＶＬＤＬコレステロールの和であり、血清総コレステロール値からＨＤＬコレステロール値を差し引いて求めた。
【００２５】
本発明のペプチドを投与した試験群とコントロール群の総コレステロール及びヘパリン沈殿コレステロールの濃度の平均値を求め、コレステロール低下率（％）を算出した。なお低下率（％）はコントロール群の平均値から試験群の平均値を引いた値をコントロール群の平均値で割った百分率で表した。さらに試験群（８匹）との総コレステロール及びヘパリン沈殿コレステロール濃度の低下率（％）の有意差を検定した。低下値が大きい程、また有意水準（Ｐ）が高い程、上昇抑制作用が大きいことを示す。
【００２６】
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＬＳＲ）及びその誘導体であるＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ（ＬＡＲ）とＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＬＰＲ）の投与による、総コレステロール及びヘパリン沈殿（ＨＰＬ）コレステロールの低下率（％）を、コントロール群との比較により検討した。結果を表２に示す。表２に示されるように、本発明の３つのペプチドは全て、２４％以上のコレステロール低下率を示した（ｎ＝８）。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
以上の結果より、本発明のペプチドは、高コレステロール食投与マウスへの５０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量での経口投与によって２０〜３０％の血清コレステロール低下作用をもたらす。本発明のペプチドは経口投与により高コレステロール食投与マウスの血清コレステロールを低下させるが、正常マウスの血清コレステロールは変化させず、安全なコレステロール低下物質である。
【００２９】
本発明のＬＳＲが、どの様な機構でコレステロール低下作用を示すかは、まだ不明である。しかし、カソキシンＣ由来の種々の断片ペプチドの中で、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＡｒｇやＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇがファゴサイトーシス促進活性作用を示さなかったにも関わらず、ＬＳＲはファゴサイトーシスを促進した。以上のことから、ＬＳＲのコレステロール低下作用は、免疫系を介した調節によるものと考えられる。また、ＬＳＲは糞中胆汁酸量を上昇させなかった。この結果から、ＬＳＲによるコレステロール低下作用は胆汁酸の再吸収阻害によるものではないと考えられる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇで表される新規ペプチドを含有する、新規な血清コレステロール低下剤が与えられた。これまでに、トリペプチドが血清コレステロール低下させるという報告はなく、本発明のペプチドは経口投与が可能であることから、本発明の効果は大きい。