(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドまたはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１記載の化合物を含有する医薬的に許容される組成物。
【請求項３】
請求項１記載の化合物を含有する癌の治療剤。
【請求項４】
癌は乳癌または結腸癌である請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
請求項１記載の化合物を含有する再狭窄の治療または予防剤。
【請求項６】
請求項１記載の化合物からなるチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤。
【請求項７】
チロシンキナーゼはＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２またはｅｒｂＢ４である請求項６記載の阻害剤。
【請求項８】
請求項１記載の化合物からなるｅｒｂＢ３のチロシンリン酸化の阻害剤。
【請求項９】
請求項１記載の化合物を含有する乾癬の治療剤。
【請求項１０】
請求項１記載の化合物を含有するアテローム性動脈硬化症の治療または予防剤。
【請求項１１】
請求項１記載の化合物を含有する子宮内膜症の治療剤。
【請求項１２】
請求項１記載の化合物からなるＶＥＧＦ分泌の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、チロシンキナーゼの不可逆的な阻害剤である化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドに関する。本発明はまた、化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドを用いて、癌、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、子宮内膜症および乾癬を治療する方法、ならびに化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドからなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【背景技術】
癌は細胞内シグナリングシステムまたはシグナル伝達機構の疾患と考えられている。細胞は多くの細胞外ソースから、それらを増殖または増殖させないことのいずれかを指示する指令を受ける。シグナル伝達システムの目的はこれらおよび他のシグナルを細胞の表面で受容し、それらを細胞中に取り込み、ついでシグナルを核、細胞骨格、輸送またはタンパク質合成機構に渡すことである。
【０００３】
癌の最も一般的な原因は、これらのタンパク質が突然変異を受けた場合またはそれを過剰にもしくは過小に産生する細胞内のタンパク質量の調節のいずれかにおける一連の欠陥である。細胞に構築的状態を招来する鍵となる損傷が存在し、シグナルが現実には存在しないのに、細胞核が増殖を指示するシグナルを受容する場合が最も多い。これは様々な機構によって起こる。ときには細胞が、それ自身の受容体に対する真正な増殖因子の産生をいわゆる自己分泌ループ機構により、すべきでないときに開始することがある。通常はチロシンキナーゼによって細胞にシグナルを伝える細胞表面の受容体に対する突然変異は、リガンドの不存在下にもキナーゼの活性化を導き、実際には存在しないシグナルを伝達することができる。また、多くの表面キナーゼの細胞表面における過剰発現が、弱いシグナルに対して不適切に強い応答を導くこともある。細胞の内部には、突然変異または過剰発現が細胞中に同じ偽のシグナルの発生を招来できる多くのレベルがあり、また癌に関係する多くの他の種類のシグナリングの欠陥がある。本発明は以下に記載する３つの機構によってもたらされ、上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼファミリー（ＥＧＦＲ）の細胞表面受容体が関与する癌に関係する。このファミリーはＥＧＦ受容体（ｅｒｂＢ１としても知られている）、ｅｒｂＢ２受容体、ならびにその構成的に活性な癌タンパク質突然変異体Ｎｅｕ、ｅｒｂＢ３受容体およびｅｒｂＢ４受容体から構成される。さらにＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーによってもたらされる他の生物学的プロセスも以下に記載する本発明の化合物によって治療することができる。
【０００４】
ＥＧＦＲはその２つの最も重要なリガンドとして上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）を有する。これらの受容体は、成人ヒトにおいてはわずかな機能しかもたないようであるが、すべての癌の大部分、とくに結腸癌および乳癌の疾患過程には明らかに関与するように思われる。密接に類似する  ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ｅｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）受容体はそれらの主要なリガンドとしてヘレグリンのファミリーを有し、受容体の過剰発現および突然変異は予後の貧弱な乳癌の主要な危険因子として明らかに証明されている。さらに、この受容体ファミリーのすべての４つのメンバーは他のファミリーのメンバーとヘテロダイマーのシグナリング複合体を形成し、これは悪性腫瘍において２以上のファミリーのメンバーが過剰発現する場合は相乗的なトランスフォーミング能力を導くことが証明されている。ヒト悪性腫瘍においては、２以上のファミリーのメンバーの過剰発現は比較的に一般的であることが示されている。
【０００５】
癌に加えて再狭窄も望ましくない細胞増殖が起こる疾患である。再狭窄には血管平滑筋細胞の増殖が関与する。再狭窄は、冠状血管形成および他の医学的操作に伴う大きな臨床上の問題である。再狭窄は閉塞した動脈による心疾患を治療する努力で、詰まった冠状動脈を解消するためのバルーン血管形成を受けた患者の約３０〜５０％で一般に約０〜６カ月以内に起こる。生じた再狭窄は患者の実質的な病的状態および保健看護の費用の増加を引き起こす。
【０００６】
再狭窄の過程は動脈および静脈を含めた血管の損傷、ならびにそれに続くトロンボゲン形成性、血管作用性および有糸分裂性因子の放出によって誘発される。内皮および深部血管の損傷は血小板凝集、血栓形成、炎症ならびにマクロファージおよび平滑筋細胞の活性化を招く。これらの現象は成長因子およびサイトカインの産生および放出を誘発し、これが続いてそれら自身の合成および標的細胞からの放出を促進する。すなわちＥＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のような成長因子の関与する自己永続性プロセスが開始される。すなわちとくにＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦまたはｓｒｃチロシンキナーゼのようなチロシンキナーゼのシグナル伝達経路の不可逆的阻害剤を有することは有用である。
【０００７】
増殖性の皮膚疾患、乾癬には現在優れた治療法がない。それはメトトレキサートのような抗癌剤により治療されることが多いが、これはきわめて重篤な副作用を有し、使用しなければならない毒性限界用量ではあまり効果的ではない。ＴＧＦαを過剰に発現するトランスジェニックマウスの５０％が乾癬を発症することから、乾癬ではＴＧＦαが過剰に産生される主要な成長因子であると考えられている。これは、ＥＧＦＲシグナリングの優れた阻害剤は、必須ではないが好ましくは、局所投与による抗乾癬剤として使用できることを示唆するものである。
【０００８】
不可逆性阻害剤は、ターンオーバーとも呼ばれる受容体の再合成の正常な速度によってのみ制限されチロシンキナーゼの長期にわたる抑制に使用できるので、不可逆性のチロシンキナーゼ阻害剤をもつことは可逆性の阻害剤に比較してとくに有利である。
【０００９】
癌および再狭窄に関係する生物学的過程におけるｓｒｃチロシンキナーゼの役割に関する情報は、以下の刊行物に見いだされる。これらはすべて引用により本明細書に導入される。
Benjamin C W & Jones D A, Platelet-derived growth factor stimulates growth factor receptor binding protein-2 association with src in vascular smooth muscle cells, JBC, 1994; 269: 30911-30916。
Kovalenko Mら, Selective platelet-derived growth factor receptor kinase blockers reverse cis-transformation, Cancer Res, 1994; 54: 6106-6114。
Schwartz R Sら, The restenosis paradigm revisted: An alternative proposal for cellular mechanisms, J Am Coll Cardiol, 1992; 20: 1284-1293。
Libby Pら, Cascade model for restenosis-A special case of atherosclerosis progression, Circulation, 1992; 86: 47-52。
【００１０】
癌および再狭窄に関係する生物学的過程におけるＥＧＦチロシンキナーゼの役割に関するその他の情報は、以下の刊行物に見いだされる。これらは引用により本明細書に導入される。
Jonathan Blay & Morley D Hollenberg, Heterologous regulation of EGF receptor function in cultured aortic smooth muscle cells, Eur J Pharmacol,Mol Pharmacol Sect, 1989; 172(1): 1-7。
【００１１】
ＥＧＦもしくはＥＧＦＲに対する抗体がインビボにおいて抗腫瘍活性を示すという情報が以下の刊行物に見いだされる。これらは引用によって本明細書に導入される。
Modjtahedi H, Eccles S, Box G, Styles J & Dean C, Immunotherapy of human tumour xenografts overexpressing the EGF receptor with rat antibodiesthat block growth factor-receptor interaction, Br J Cancer, 1993; 67: 254-261。
Kurachi H, Morishige K I, Amemiya K, Adachi H, Hirota K, Miyake A & Tanizawa O, Importance of transforming growth factor alpha/epidermal growth factor receptor autocrine growth mechanism in an ovarian cancer cell line in vivo, Cancer Res, 1991; 51: 5956-5959。
Masui H, Moroyama T & Mendelsohn J, Mechanism of antitumor activity inmice for anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies withdifferent isotypes, Cancer Res, 1986; 46: 5592-5598。
Rodeck U, Herlyn M, Herlyn D, Molthoff C, Atkinson B, Varello M, Steplewski Z, Koprowski H, Tumor growth modulation by a monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor: Immunologically mediated and effector cell-independent effects, Cancer Res, 1987; 47: 3692-3696。
Guan E, Zhou T, Wang J, Huang P, Tang W, Zhao M, Chen Y, Sun Y, Growthinhibition of human nasopharyngeal carcinoma in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies, Internat J Cell Clon, 1987; 7: 242-256。
Masui H, Kawamoto T, Sato J D, Wolf B, Sato G, Mendelsohn J, Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies, Cancer Res, 1984; 44: 1002-1007。
【００１２】
さらに、以下の刊行物にはタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の抗腫瘍活性が示されている。この刊行物は引用により本明細書に導入される。
Buchdunger E, Trinks U, Mett H, Regenass U, Muller M, Meyer T, McGlynnE, Pinna L A, Traxler P, Lydon N B, 4,5-Dianilinophthalimide: A protein tyrosine kinase inhibitor with selectivity for the epidermal growth factor receptor signal transduction pathway and potent in vivo antitumor activity, Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91: 2334-2338。
Buchdunger E, Mett H, Trinks U, Regenass U, Muller M, Meyer T, Beilstein, P, Wirz B, Schneider P, Traxler P, Lydon N, 4,5-Bis(4-fluoroanilino)phthalimide: A selective inhibitor of the epidermal growth factor receptor signal transduction pathway with potent in vivo Mdd antitumor activity, Clinical Cancer Research, 1995; 1: 813-821。
【００１３】
チロシンキナーゼの可逆的な阻害剤である化合物は、米国特許第５,４５７,１０５号、５,４７５,００１号および５,４０９,９３０号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ ９５１９７７４およびＷＯ ９５１９９７０に記載されている。今回開示された化合物は上述の刊行物に記載されたチロシンキナーゼ阻害剤とは構造的に異なっていて、チロシンキナーゼの不可逆的阻害剤である。
【００１４】
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５７７８（公開番号ＷＯ ９７／３８９８３）にはチロシンキナーゼの不可逆的阻害剤である化合物が記載されている。これは引用により本明細書に導入される。
このＰＣＴ出願中に表示された一般式Ｉは化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミド（本明細書では「化合物１」と呼ぶ）を包含するが、このＰＣＴ出願中には化合物１はとくに名指されてはいない。
【００１５】
化合物１は以下の化学構造を有する。
【化１】
0003687900.tif 000002
【００１６】
ＰＣＴ出願には実施例２１に、化合物：Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミドが開示され、この化合物は以下の化学構造を有する。
【化２】
0003687900.tif 000003
【００１７】
化合物１はキナゾリン基に窒素原子を介して結合するフェニル環の置換基において異なっている。化合物１のフェニル環は３−位で塩素、４−位でフッ素によって置換されている。これに対し、ＰＣＴ出願の実施例２１（以下、「実施例２１」と呼ぶ）におけるフェニル環は３−位で臭素により置換されているのみである。これらの２つの化合物は構造が類似しているが、化合物１は、ＰＣＴ出願の実施例２１と比較した場合、インビボにおいて驚くべき、予期されなかった性質を示す。
【００１８】
さらに驚くべき予期されなかったことは、化合物１および実施例２１はある種のアッセイにおいて類似のインビトロ活性を示すが、インビボ活性では有意に異なっていることである。
【００１９】
【発明の概要】
本発明は、化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドまたはその医薬的に許容される塩を提供する。
本発明はまた、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドからなる医薬的に許容される組成物を提供する。
本発明はまた、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を、癌を有する患者に投与することからなる、癌を治療する方法を提供する。
【００２０】
癌を治療する方法の好ましい実施態様においては、癌は乳癌である。
癌を治療する方法の好ましい実施態様においては、癌は結腸癌である。
本発明はまた、再狭窄を有する患者または再狭窄を有する危険にある患者に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を投与することからなる再狭窄を治療または予防する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、チロシンキナーゼの阻害を必要とする患者に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドのチロシンキナーゼ阻害量を投与することからなるチロシンキナーゼを不可逆的に阻害する方法を提供する。
【００２２】
チロシンキナーゼを不可逆的に阻害する方法の好ましい実施態様においては、チロシンキナーゼはＥＧＦＲである。
チロシンキナーゼを不可逆的に阻害する方法の好ましい実施態様においては、チロシンキナーゼはｅｒｂＢ２である。
チロシンキナーゼを不可逆的に阻害する方法の好ましい実施態様においては、チロシンキナーゼはｅｒｂＢ４である。
【００２３】
本発明はまた、乾癬を有する患者に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を投与することからなる乾癬を治療する方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、アテローム性動脈硬化症を有する患者またはアテローム性動脈硬化症を有する危険にある患者にＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を投与することからなるアテローム性動脈硬化症を治療または予防する方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、子宮内膜症を有する患者に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を投与することからなる子宮内膜症を治療する方法を提供する。
【００２６】
本発明はまた、ＶＥＧＦ分泌の阻害を必要とする患者に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を投与することからなるＶＥＧＦ分泌を阻害する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ｅｒｂＢ３のチロシンリン酸化を阻害する方法において、チロシンリン酸化の阻害を必要とする患者に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの治療有効量を投与することからなるチロシンリン酸化を阻害する方法を提供する。
【００２８】
【発明の詳述】
本発明は、化合物：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミド（化合物１）またはその医薬的に許容される塩を提供する。
【００２９】
化合物１は、チロシンキナーゼとくにＥＧＦＲチロシンキナーゼの不可逆性阻害剤である。化合物１によって阻害することができる他のチロシンキナーゼにはＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ｓｒｃ、ｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ４が包含される。化合物１の治療有効量を癌を有する患者、または再狭窄を有する患者もしくは再狭窄を有する危険にある患者、または乾癬、アテローム性動脈硬化症を有するもしくはアテローム性動脈硬化症を有する危険にある患者、または子宮内膜症を有する患者に投与することができる。本技術分野の熟練者には、癌、再狭窄、乾癬、アテローム性動脈硬化症または子宮内膜症を有する患者を同定することは容易である。たとえば、再狭窄を有する危険にある患者は血管形成、副側路または移植操作を受けた患者である。同様に、アテローム性動脈硬化症を発症する危険のある患者には、肥満患者、高脂肪食を摂取している患者、高コレステロール患者または高血圧症の患者が包含される。「患者」なる語には、イネ、ネコ、ウシ、ヒツジのような動物を意味し、またヒトが包含される。
【００３０】
「癌」なる語にはそれらに限定されるものではないが、以下の癌が包含される。すなわち、
乳癌；
卵巣癌；
子宮頚癌；
前立腺癌；
精巣癌；
食道癌；
グリア芽細胞腫；
神経芽細胞腫；
胃癌；
皮膚癌、角化棘細胞腫；
肺、類表皮腫、大細胞癌、腺癌；
骨腫；
結腸癌、腺癌、腺腫；
膵臓癌、腺癌；
甲状腺癌、濾胞状癌、未分化癌、乳頭状癌；
精上皮癌；
黒色腫；
肉腫；
膀胱癌；
肝臓癌および胆道癌：
腎臓癌；
骨髄性障害；
リンパ性障害、ホジキン病、毛様細胞腫；
口腔前庭および咽頭（口部）、唇部、舌、口部、咽頭癌；
小腸癌；
結腸−直腸癌、大腸癌、直腸癌；
脳および中枢神経系腫瘍；ならびに
白血病である。
【００３１】
化合物１を治療に使用できる好ましい癌には、乳癌、結腸癌、結腸−直腸癌および卵巣癌が包含される。
さらに、化合物１は血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)分泌の阻害を必要とする患者の治療に使用することができる。ＶＥＧＦの分泌の阻害が必要な患者には癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、子宮内膜症を有する患者、胚移植を受けた患者または新脈管形成もしくは新生血管形成が役割を果たしている他の疾患を有する患者が包含される。
【００３２】
本発明の化合物はｅｒｂＢ３のチロシンリン酸化を阻害するために使用することができる。ｅｒｂＢ３のチロシンリン酸化の阻害が必要な患者はＥＧＦＲの阻害およびＶＥＧＦ分泌の阻害に関して本明細書に記載の疾患を有する患者またはそれを有する危険にある患者である。
【００３３】
化合物１はヒトおよび動物に、経口的、経直腸的、非経口的（静脈内、筋肉内または皮下）、槽内、膣内、腹腔内、嚢内、局所的（粉末、軟膏または滴剤）にまたは口腔内もしくは鼻用スプレーとして投与することができる。化合物は単独でまたは医薬的に許容される賦形剤を含む医薬的に許容される組成物の一部として投与することができる。
【００３４】
非経口的な注射に適当な組成物は、生理学的に許容される滅菌水性または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくは乳化液から、または滅菌された注射用溶液もしくは分散液を再構築するための滅菌粉末から構成されていてもよい。適当な水性または非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの適当な混合物、植物油（たとえばオリーブ油）および注射可能な有機エステルたとえばオレイン酸エチルが包含される。適当な流動性はたとえばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は要求される粒子径を維持することにより、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。
【００３５】
これらの組成物にはまた、補助剤たとえば防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を添加することもできる。微生物の作用の防止は、各種の抗菌剤および抗かび剤たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により保証することができる。等張化剤たとえば糖、塩化ナトリウム等の添加も望ましい。注射用医薬形態の長期間の吸収は、吸収遅延剤たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００３６】
経口投与用の固体剤形には、カプセル、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が包含される。このような固体剤形では、活性化合物は少なくとも１種の不活性な慣用の賦形剤（または担体）たとえば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムまたは(ａ)充填剤もしくは増量剤、たとえばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸；(ｂ)結合剤、たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴム；(ｃ)保湿剤、たとえばグリセロール；(ｄ)崩壊剤、たとえば寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯もしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の複合シリケートおよび炭酸ナトリウム；(ｅ)溶液硬化遅延剤、たとえばパラフィン：(ｆ)吸収促進剤、たとえば四級アンモニウム化合物；(ｇ)湿潤剤、たとえばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート：(ｈ)吸着剤、たとえばカオリンおよびベントナイト；(ｉ)滑沢剤、たとえばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合には、剤形にはまた緩衝剤を包含させることもできる。
【００３７】
類似のタイプの固体組成物には、軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤としてラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等を用いることもできる。
【００３８】
固体剤形たとえば錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤は、コーティングおよび外皮、たとえば腸溶性コーティングおよび本技術分野で周知の他のコーティングで調製することができる。それらは不透明化剤を含有させることが可能であり、また活性化合物を腸管のある部分で遅延様式によって放出するような組成物にすることもできる。使用できる包埋組成物の例はポリマー物質またはワックスである。活性化合物はまた適宜、上述の賦形剤１種または２種以上を用いてマイクロカプセルの形態とすることもできる。
【００３９】
経口投与用の液体剤形には医薬的に許容される乳化液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシールが包含される。活性化合物に加えて液体剤形には、本技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、たとえば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、たとえばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジルエステル、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油とくに綿実油、ラッカセイ油、コーン胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ならびにソルビタンの脂肪酸エステルまたはこれらの物質の混合物等が添加される。
【００４０】
このような不活性希釈剤のほかに、組成物には補助剤たとえば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味剤および芳香剤を含有させることができる。
懸濁液には活性化合物に加えて、懸濁剤たとえばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタンおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、水酸化メタアルミニウム、ベントナイト、寒天ならびにトラガントゴムまたはこれらの物質の混合物等を含有させることができる。
【００４１】
経直腸投与用組成物は好ましくは、本発明の化合物を適当な非刺激性賦形剤または担体、通常の温度では固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣腔では溶融して活性成分を放出するたとえばカカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐剤用のワックスと混合して調製することができる坐剤である。
【００４２】
局所投与用の剤形には軟膏、粉末、スプレーおよび吸入剤が包含される。活性成分を滅菌条件下に、生理学的に許容される担体および任意の防腐剤、緩衝剤、または必要に応じて噴射剤と混合する。眼科用製剤、眼軟膏、粉末および溶液も本発明の範囲内に包含することが意図される。
【００４３】
本明細書で用いられる「医薬的に許容される塩、エステル、アミドおよびプロドラッグ」なる語は、本発明のカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミドおよびプロドラッグを意味し、これらは有効な医薬的判断の範囲内において、不適当な毒性、刺激、アレルギー反応等がなく患者の組織と接触して使用するのに適していて、合理的な利益／危険比に相応し、それらの意図された用途で有効であり、可能な場合には本発明の化合物の両性イオン型である。「塩」なる語は本発明の化合物の比較的に非毒性の、無機および有機酸の付加塩を意味する。これらの塩は、化合物の最終的な単離および精製時に系中でまたはその遊離塩基型に精製された化合物を適当な有機または無機酸と別個に反応させ、このようにして形成された塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩等が包含される。これらはアルカリおよびアルカリ土類金属に基づくカチオンたとえばナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびに非毒性のアンモニウム、四級アンモニウムおよびアミンカチオン、たとえばそれらに限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等が包含される（たとえばS.M. Bergeら、“Pharmaceutical Salts,”J. Pharm. Sci. 1977；66：1-19参照。これは引用により本明細書に導入される)。
【００４４】
医薬的に許容される本発明の化合物の非毒性エステルの例には、Ｃ1〜Ｃ6アルキルエステルが包含される。この場合、アルキル基は直鎖または分枝鎖である。許容されるエステルにはまた、Ｃ5〜Ｃ7シクロアルキルエステルならびにアリールアルキルエステルたとえばそれらに限定されるものではないが、ベンジルエステルが包含される。Ｃ1〜Ｃ4アルキルエステルが好ましい。本発明の化合物のエステルは慣用方法によって調製することができる。
【００４５】
医薬的に許容される本発明の化合物の非毒性アミドの例にはアンモニア、一級Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミンおよび二級Ｃ1〜Ｃ6アルキルアミンに由来するアミドが包含される。この場合、アルキル基は直鎖または分枝鎖である。二級アミンの場合、アミンは１個の窒素原子を含有する５または６員の複素環の形態であってもよい。アンモニア、Ｃ1〜Ｃ3アルキル一級アミンおよびＣ1〜Ｃ2ジアルキル二級アミンに由来するアミドが好ましい。本発明の化合物のアミドは慣用方法により調製することができる。
【００４６】
「プロドラッグ」なる語は、インビボにおいてたとえば血液中で加水分解され、迅速に変換して上記式の親化合物を生成する化合物を意味する。完全な考察はT. Higuchi & V. Stella, “Pro-drugs as novel delivery systems," 14巻, A.C.S. Symposium SeriesおよびBioreversible carrier in drug design, Edward B. Roche編, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987に提供されている。これらの両者は引用により本明細書に導入される。
【００４７】
本発明の化合物は、約０.１〜約１,０００mg／日の範囲の用量レベルで患者に投与することができる。体重約７０kgの正常なヒト成人には、体重１kgあたり約０.０１〜約１００mgの範囲の投与量が十分である。しかしながら、使用される特定の投与量は変動させることができる。たとえば、投与量は、患者の要求、治療される状態の重篤度、および用いられる化合物の薬理活性に依存する。特定の患者に対する至適用量の決定は本技術分野の熟練者には周知である。
【００４８】
本発明の化合物は、溶媒和のない化合物、ならびに水、エタノール等のような医薬的に許容される溶媒との溶媒和の型で存在することができる。一般に、溶媒和型は本発明の目的のためには非溶媒和型と同等であると考えられる。
化合物１は合成的に製造されるかまたは生物学的にたとえば代謝によって産生されることが意図される。
【００４９】
【実施例】
以下の実施例は本発明の特定の例を例示するものであり、特許請求の範囲を包含する明細書を何らかの様式で限定する意図ではない。
【００５０】
化合物１は次のように合成することができる。
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミド
工程Ａ：４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン
氷浴上窒素下に保持したイソプロパノール（１.０９Ｌ）中３−クロロ−４−フルオロアニリン（５３.１８３ｇ、３６５.３mmol）およびＮ,Ｎ−ジメチルアニリン（８８.５ｇ、７３０mmol）の溶液を機械的に撹拌しながら、これに粉末の４−クロロ−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン（J. Med. Chem. 1996；３９：９１８)(８２.７７ｇ、３６３.７mmol）を１０分を要して少量ずつ加えた。添加の終了時に氷浴を除去し、混合物を２５℃で６時間撹拌した。ついで混合物を再度氷浴上で冷却し、水（２００ml）ついでＮａ2ＣＯ3水溶液（１０％ ｗ／ｖ、２００ml）を撹拌しながら滴下して加えた。さらに１０分後、混合物をブフナーろ斗でろ過し、残った固体を薄いＮａＨＣＯ3溶液（飽和／５，２×１００ml）、水（２×１００ml）およびイソプロパノール（２×１００ml）で濯いだ。混合物を風乾し、ついでＰ2Ｏ5上真空オーブン中、７５℃で１２時間乾燥すると４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン（１１０.７１ｇ、９０.４％）が芥子色の固体として得られた。
1H NMR（DMSO-d6）：δ 10.44(s, 1H, NH), 9.51（d, J=8.0 Hz, 1H, H-5), 8.67（s, 1H, H-2）, 8.07（dd, J=2.7, 6.8 Hz, 1H, H-2′), 7.79 (d, J=12.4 Hz, 1H, H-8), 7.74 (ddd, J=2.7, 4.2, 9.0 Hz, 1H, H-6′), 7.43 (t, J=9.2 Hz, 1H, H-5′)。
【００５１】
工程Ｂ：４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］−６−ニトロキナゾリン
ジメチルスルホキシ（ＤＭＳＯ)(２５０ml）中４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン（５０.５０３ｇ、１５０mmol）および３−（４−モルホリノ）プロパン−１−オール（３２.６７ｇ、２２５mmol）の明黄色のスラリーを２５℃の水浴上Ｎ2下に激しく撹拌しながら、これにＤＭＳＯ（１５０ml）中トリメチルシラノール酸カリウム（５７.７３ｇ、０.４５mol）の溶液を５０分を要して滴下して添加した。直ちに深赤色を呈し、添加の終了時までには反応混合物は深赤黒色の粘稠な混合物となった。６時間後、反応混合物を飽和Ｎａ2ＣＯ3水溶液（１５０ml）を含有する氷水（４Ｌ）中に撹拌しながら徐々に注いだ。１３時間放置したのち、橙赤色のスラリーをブフナーろ過で集めた。沈殿を薄いＮａＯＨ溶液（０.０５Ｍ、５００ml；０.０２Ｍ、５００ml）、希釈ＮａＨＣＯ3溶液（飽和／５,５００ml）および水（２×５００ml）で濯ぎ、４時間風乾し、ついでＰ2Ｏ5上真空オーブン中、５０℃で一夜乾燥すると４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］−６−ニトロキナゾリン（６２.４７ｇ、８９％補正）が明橙黄色の固体として得られた。
【００５２】
1H NMR（DMSO-d6）：δ10.11 (s, 1H, NH), 9.18 (s, 1H, H-5), 8.65 (s, 1H, H-2), 8.15 (dd, J=2.4, 6.8 Hz, 1H, H-2′), 7.79 (ddd, J=2.7, 4.3, 9.0 Hz, 1H, H-6′), 7.45 (t, J=9.0 Hz, 1H, H-5′), 7.44 (s, 1H, H-8), 4.32 (t, J=6.1 Hz, ArOCH2), 3.57 (t, J=4.5 Hz, 4H, H-2 モルホリノ), 2.45 (t, J=6.5 Hz, 2H, NCH2), 2.34 (brs, 4H, H-3 モルホリノ), 1.93 (pentet, J=6.5 Hz, 2H, H-2  プロポキシ）。
【００５３】
工程Ｃ：６−アミノ−４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］キナゾリン
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ)(１２００ml）中４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］−６−ニトロキナゾリン（６２.９ｇ、１３６.２mmol）の溶液をラネーニッケル（２０ｇ）上、５０psi、２３℃において１７.６７時間水素化した。さらにラネーニッケル（２０ｇ）を加え、混合物をさらに４.３３時間同じ条件で水素化した。反応混合物をセライトを通して減圧下にろ過すると、６−アミノ−４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］キナゾリン（５７.８１ｇ、９７.６％補正）が、淡緑色の固体として得られた。
1H NMR（DMSO-d6）：δ9.40 (s, 1H, NH), 8.38 (s, 1H, H-2), 8.20 (dd, J=2.5, 7.0 Hz, 1H, H-2′), 7.79 (ddd, J=2.5, 4.5, 9.0 Hz, 1H, H-6′), 7.40 (s, 1H, H-5), 7.40 (t, J=9.1 Hz, 1H, H-5′), 7.08 (s, 1H, H-8), 5.38 (brs, NH2), 4.19 (t, J=6.1 Hz, ArOCH2), 3.58 (t, J=4.4 Hz, 4H, H-2 モルホリノ), 2.49 (t, J=7.0 Hz, 2H, NCH2), 2.36 (brs, 4H, H-3 モルホリノ), 1.97 (pentet, J=6.5 Hz, 2H, H-2 プロポキシ）。
【００５４】
工程Ｄ：Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）キナゾリン−６−イル］アクリルアミド
クロロギ酸イソブチル（２７.２ｇ、０.２０mol）を、０℃で窒素下で撹拌したＴＨＦ（８００ml）中のアクリル酸（１４.４０ｇ、０.２０mol）およびトリエチルアミン（４０.４８ｇ、０.４０mol）の溶液に１０分間かけて滴加した。さらに１０分後に、白色スラリーを−２５℃の冷却浴に移し、窒素下に２０分間撹拌した。ＴＨＦ（５００ml）中６−アミノ−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］キナゾリン（４３.１９ｇ、０.１００mmol）を１.３３時間を要して滴加した。冷却浴を−２０℃に調整し、さらに２.３３時間後、反応混合物に水（１００ml）を一度に加えて反応を停止させた。２０分後に、反応混合物を砕氷（２kg）中に渦を巻かせながら注ぎ、水（５ml）で徐々に希釈する。混合物を１６時間放置し、ついでブフナーろ斗でろ過した。沈殿を水（２×１Ｌ）で濯ぎ、１８時間風乾し、ついでＰ2Ｏ5上真空オーブン中において６０℃で１６時間乾燥すると粗製のＮ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド（３５.７６ｇ、７３％未補正）が帯緑黄色の固体として得られた。母液からさらに固体を沈殿させてブフナーろ斗でろ過し、水（１Ｌ）で濯ぎ、１４時間風乾すると、さらに粗製の生成物（４.７３ｇ、１０％未補正）が緑黄色の固体として得られた。この物質をＤＭＳＯから再結晶するとその５５％が淡い帯黄カーキ色の部分水和物、融点１８６.５〜１８８.５℃として回収された。
元素分析：Ｃ24Ｈ25Ｎ5Ｏ3ＣｌＦ・０.８５Ｈ2Ｏとして
計算値：Ｃ ５７.６１；Ｈ ５.３７；Ｎ １３.９７％
分析値：Ｃ ５７.５１；Ｈ ５.２６；Ｎ １３.８８％
1H NMR（DMSO-d6）：δ9.81 (s, 1H, NH), 9.63 (s, 1H, NH), 8.87 (s, 1H, H-5), 8.54(s, 1H, H-2), 8.15 (dd, J=2.5, 7.0 Hz, 1H, H-2′), 7.81 (ddd, J=2.7, 4.4, 9.0 Hz, 1H, H-6′), 7.43 (t, J=9.1 Hz, 1H, H-5′), 7.30 (s, 1H, H-8), 6.72 (dd, J=10.1, 10.7 Hz, 1H, H-2 アクリロイル), 6.32 (dd, J=9, 17.0 Hz, 1H, H-3 アクリロイル), 5.83 (dd, J=1.9, 10.1 Hz, 1H, H-3 アクリロイル), 4.27 (t, J=6.2 Hz, ArOCH2), 3.58 (t, J=4.4 Hz, 4H, H-2 モルホリノ), 2.48 (t, J=7.1 Hz, 2H, NCH2), 2.36 (brs, 4H, H-3 モルホリノ), 2.00 (pentet, J=6.5 Hz, 2H, H-2 プロポキシ）。
マススペクトル ＡＰＣＩ ４８９.２(９)，４８８.２(３５)，４８７.２(２６)，４８６.２(１００)。
【００５５】
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５７７８の実施例２１の化合物は以下のようにして合成することができる。
実施例２１
Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリノ）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド
ＴＨＦ（６０ml）中３−モルホリノプロパン−１−オール（２２.０mmol、３.２０ｇ）の溶液にＮ2下、ナトリウム金属（２７.６mmol、０.６３ｇ）を加えた。生成した懸濁液を２０℃で２時間撹拌し、ついでＴＨＦ（５０ml）中４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン（J. Med. Chem. 1996 (39)：918)(２.０ｇ、５.５１mmol）の溶液にＮ2下でカニューレにより加えた。この溶液をついで２４時間還流したのち水で希釈してＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出液を合わせて無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、減圧下に濃縮し、アルミナ上クロマトグラフィーに付し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）〜ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡｃ（２：３：５）で溶出すると、４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−７−［（３−モルホリノ）プロピルオキシ］−６−ニトロキナゾリン（１.７５ｇ、６５％）が黄色の粉末として得られた。融点（ＭｅＯＨ） ２１６〜２２０℃。
1H NMR [(CD3)2SO]：δ10.12 (s, 1H, NH), 9.24 (s, 1H, 芳香族), 8.69 (s, 1H, 芳香族), 8.19 (t, J=1.8 Hz, 1H, H-2′), 7.88 (dt, Jd=7.8 Hz, Jt=1.4 Hz, 1H, H-6′), 7.49 (s, 1H, 芳香族), 7.38 (t, J=8.0 Hz, 1H, H-5′), 7.34 (dt, Jd=8.1 Hz, Jt=1.4 Hz, 1H, H-4′), 4.35 (t, J=6.2 Hz, 2H, CH2CH2CH2O), 3.58 (t, J=4.6 Hz, 4H, モルホリノメチレン), 2.45 (t, J=7.0 Hz, 2H, NCH2CH2CH2), 2.37 (br s, 4H, モルホリノメチレン), 1.94 (quintet, J=6.6 Hz, 2H, CH2CH2CH2)。
13C NMR：δ157.76, 157.26, 153.76, 153.21, 140.32, 138.86, 130.37, 126.38, 124.26, 121.70, 121.13, 120.72, 110.11, 107.88, 67.87, 66.13(×2), 54.42, 53.28(×2), 25.30。
元素分析：Ｃ21Ｈ22ＢｒＮ5Ｏ4・０.７５Ｈ2Ｏとして
計算値：Ｃ ５０.３；Ｈ ４.７；Ｎ １４.０％
分析値：Ｃ ５０.３；Ｈ ４.４；Ｎ １３.８％
【００５６】
氷酢酸（２.０ml）を含むＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（２：１、８０ml）中上記ニトロキナゾリン（１.５０ｇ、３.０７mmol）の溶液を還流しながら、新たに洗浄した（１Ｎ ＨＣｌついで蒸留水）鉄粉末（１２mmol、０.６８６ｇ）を少量ずつ加えた。生成した懸濁液を激しく撹拌しながら２０分間還流下に加熱し、ついで冷却して濃ＮＨ3を加えて塩基性にし、セライトのパッドを通してろ過した。セライトのパッドをＥｔＯＨで洗浄したのち、ろ液を減圧下に濃縮し、水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出液を合わせて無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、減圧下に濃縮し、アルミナ（グレードIII）上クロマトグラフィーに付し、ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡｃ（１：１）〜ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（２：９８）で溶出すると、６−アミノ−４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−７−［（３−モルホリノ）プロピルオキシ］キナゾリン（１.０８ｇ、７７％）が淡褐色の粉末として得られた。融点（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン） １５８〜１６０℃。
1H NMR [(CD3)2SO](400 MHz)：δ9.37 (s, 1H, NH), 8.40 (s, 1H, 芳香族), 8.24 (t, J=1.9 Hz, 1H, H-2′), 7.86 (ddd, J=8.2, 0.8, 1.8 Hz, 1H, H-6′), 7.42 (s, 1H, 芳香族), 7.30 (t, J=8.1 Hz, 1H, H-5′), 7.21 (ddd, J=8.2, 1.0, 1.9 Hz, 1H, H-4′), 7.09 (s, 1H, 芳香族), 5.36 (s, 2H, NH2), 4.20 (t, J=6.2 Hz, 2H, CH2CH2CH2O), 3.59 (t, J=4.6 Hz, 4H, モルホリノメチレン), 2.50 (t, J=7.3 Hz, 2H, NCH2CH2CH2), 2.39 (br s, 4H, モルホリノメチレン), 1.99 (quintet, J=6.7 Hz, 2H, CH2CH2CH2)。
13C NMR：δ154.88, 151.94, 150.19, 144.84, 141.94, 138.50, 130.16, 124.66, 123.02, 121.09, 119.65, 110.42, 106.37, 100.81, 66.45, 66.14(×2), 54.77, 53.29(×2), 25.50。
元素分析：Ｃ21Ｈ24ＢｒＮ5Ｏ2・０.２５Ｈ2Ｏとして
計算値：Ｃ ５４.５；Ｈ ５.３；Ｎ １５.１％
分析値：Ｃ ５４.６；Ｈ ５.５；Ｎ １５.０％
【００５７】
ＤＭＦ（２０ml）中上記６−アミノキナゾリン（０.５０ｇ、１.０９mmol）、アクリル酸（６mol、６.５４mmol、４４９μl）およびＥｔ3Ｎ（過剰、２.０ml）の溶液をＮ2下に撹拌しながら、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ)(３mol、３.２７mmol、６２７mg）を加えた。反応混合物を０℃で１５分間撹拌し、ついで室温まで放置して加温してさらに２時間撹拌した。溶媒を減圧下に除去し、得られた残留物を飽和ＮａＨＣＯ3で希釈し、ＥｔＯＡｃで繰り返し抽出した。有機抽出液を合わせて食塩水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、減圧下に濃縮した。アルミナ（グレードIII）上クロマトグラフィーに付し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（９：１）〜ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（２：９８）で溶出すると、Ｎ−［４−［（３−ブロモフェニル）アミノ］−７−［（３−モルホリノ）プロピルオキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド（３２９mg、５９％）がクリーム色の粉末として得られた。融点（ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ2Ｏ／ヘキサン） １７０〜１７２℃。
1H NMR [(CD3)2SO]：δ9.78 (s, 1H, CONH), 9.62 (s, 1H, NH), 8.89 (s, 1H, 芳香族), 8.56 (s, 1H, 芳香族), 8.18 (t, J=1.9 Hz, 1H, H-2′), 7.88 (br d , J=8.2Hz, 1H, H-6′), 7.34 (t, J=8.1 Hz, 1H, H-5′), 7.30 (s, 1H, 芳香族), 7.27 (ddd, J=7.9, 1.4, 0.8 Hz, 1H, H-4′), 6.72 (dd, J=17.0 10.2 Hz, 1H, CH2CHCO), 6.33 (dd, J=17.0, 1.9 Hz, 1H, CH2CHCO), 5.83 (dd, J=10.2, 1.9 Hz, 1H, CH2CHCO), 4.27 (t, J=6.3 Hz, 2H, CH2CH2CH2O), 3.58 (t, J=4.6 Hz, 4H, モルホリノメチレン), 2.48 (t, J=7.1 Hz, 2H, NCH2CH2CH2), 2.38 (br s, 4H, モルホリノメチレン), 1.99 (quintet, J=6.7 Hz, 2H, CH2CH2CH2)。
13C NMR：δ163.49, 156.68, 154.96, 153.92, 149.19, 141.20, 131.58, 130.19, 127.16, 126.95, 125.52, 123.97, 121.03, 120.52, 116.78, 108.80, 107.28, 66.96, 66.14(×2), 54.54, 53.28(×2), 25.31。
元素分析：Ｃ24Ｈ26ＢｒＮ5Ｏ3・０.５Ｈ2Ｏとして
計算値：Ｃ ５５.３；Ｈ ５.２；Ｎ １３.４％
分析値：Ｃ ５５.３；Ｈ ４.９；Ｎ １３.３％
【００５８】
比較試験
組織培養
Ａ４３１ヒト上皮癌細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞は、American Type Culture Collection, Rockville, MDから入手し、１０％ウシ胎児血清を含有するｄＭＥＭ（Dulbeccoの改良eagleメジウム）／Ｆ１２，５０／５０（Gibco／BRL, Bethesda, MD）中に単層として維持した。細胞は空気中に５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中３７℃で増殖させた。
【００５９】
上皮成長因子受容体チロシンキナーゼの精製
ヒトＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ）をヒト上皮癌細胞Ａ４３１から以下の方法によって単離した。すなわち、細胞を１０％ウシ胎児血清を含有するｄＭＥＭ／Ｆ１２メジウム（Gibco／BRL, Bethesda, MD）中ローラー瓶内で増殖させた。約１０9細胞を、２０mMのHepes、pH ７.４、５mMのＥＧＴＡ、１％Triton X-100、１０％グリセロール、０.１mMオルトバナジン酸ナトリウム、５mMフッ化ナトリウム、４mMピロリン酸、４mMのベンズアミド、１mM ＤＴＴ、８０μg／mlのアプロチニン、４０μg／mlのロイペプチンおよび１mMのフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含有する緩衝液２容量中で溶解させた。２５,０００×ｇで１０分間遠心分離したのち、上清をファストＱセファロースカラム（Pharmacia Biotech., Inc., Piscataway, NJ）に適用し、５０mM Hepes、１０％グリセロール、pH ７.４中０.１Ｍ ＮａＣｌ〜０.４Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。酵素活性を示す分画をプールし、アリコートに分割して−１００℃に保存した。線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリンおよびｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼは、本技術分野の熟練者には周知の方法によって得られた。たとえば、Fryら“Strategies for the discovery of novel tyrosine kinase inhibitors with anticancer activity,”Anticancer Drug Design, 1994; 9: 331-351参照。この記載は引用により本明細書に導入される。
【００６０】
チロシンキナーゼアッセイ
ＩＣ50決定のための酵素アッセイは９６−ウエルフィルタープレート（Millipore MADVN6550, Millipore, Bedford, MA）中で行った。総容量は２０mMのHepes、pH ７.４、５０μＭバナジン酸ナトリウム、４０mM塩化マグネシウム、０.５μＣｉの[32Ｐ]ＡＴＰを含む１０μM ＡＴＰ、２０μgポリグルタミン酸／チロシン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、１０ng ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼおよび適当に希釈した阻害剤を含有する０.１mlとした。ＡＴＰを除くすべての成分をウエルに添加し、プレートを振盪しながら２５℃で１０分間インキュベートした。反応は[32Ｐ]ＡＴＰを加えて開始させ、プレートを２５℃で１０分間インキュベートした。反応は、２０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）０.１mlの添加によって停止させた。プレートを４℃に少なくとも１５分間保持し、基質を沈殿させた。ついでウエルを０.２mlの１０％ＴＣＡで５回洗浄し、32Ｐの取り込みをWallacのベータプレートカウンターにより測定した。ＰＤＧＦ、ＦＧＦおよびインスリン受容体ならびにｃ−ｓｒｃの細胞内キナーゼドメインを用いるアッセイは、１０mMの塩化マンガンを反応に添加したほかはＥＧＦ受容体について記載されたのと同様にして実施した。
【００６１】
ＥＧＦ−およびヘレグリン−依存性チロシンリン酸化アッセイ
Ａ４３１ヒト上皮癌細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を６−ウエルプレート中で約８０％の集密度まで増殖させ、ついで血清を含まないメジウム中で１８時間インキュベートした。細胞を化合物１または実施例２１のいずれかの様々な濃度に２時間暴露し、ついで１００ng／mlのＥＧＦ（Ａ４３１）もしくは１０ng／mlのヘレグリン（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）のいずれかで５分間刺激した。細胞抽出液を作成し、ホスホチロシン中の低下をウエスタンブロットで測定した。
【００６２】
ウエスタンブロッティング操作
抽出液は単層を０.２ml中の沸騰Laemlli緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、および５０mM Tris、pH ６.８）中で溶解し、溶解物を１００℃に５分間加熱した。溶解物中のタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移した。この膜を［１０mM Tris、pH ７.２、１５０mM ＮａＣｌ、０.０１％ナトリウムアジド］(ＴＮＡ)中で１回洗浄し、５％ウシ血清アルブミンおよび１％オバルブミンを含むＴＮＡ中で一夜ブロックした。膜を抗ホスホチロシン抗体（UBI, Lake Placid, NY, ブロック緩衝液中１μg／ml）により２時間ブロットし、ついでＴＮＡ中で２回、０.０５％Tween-20および０.０５％nonidet P-40を含有するＴＮＡで１回ならびにＴＮＡで２回洗浄した。ついで膜を０.１μＣｉ／ml［125Ｉ］プロテインＡを含むブロック緩衝液中で２時間インキュベートし、ついで上述のようにして再び洗浄した。ブロットを乾燥したのち、それらをフィルムカセットにロードし、Ｘ−ＡＲ ｘ線フィルムに１〜７日間暴露した。バンドの強度をレーザー濃度計で測定した。
【００６３】
表１のデータは、実施例２１および化合物１がインビトロにおいて、精製ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ、ＥＧＦ仲介受容体の自己リン酸化、およびヘレグリン仲介チロシンリン酸化に対してほぼ等しい活性を示すことを表している。
【表１】
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【００６４】
インビボ腫瘍阻害アッセイ
ヒト上皮癌、Ａ４３１を連続移植によりインビボで増殖させた。この腫瘍モデルは、増殖のその既知のＥＧＦ受容体依存性およびインビボにおけるモノクローナル抗体療法に対する初期段階での応答性により、この研究に選択された。この実験では、体重１８〜２２ｇのヌードマウスに、日０に右腋窩の領域に３０mgのＡ４３１腫瘍フラグメントを皮下移植した。腫瘍を１００〜１５０mgの大きさまで増殖させ、この時点で担癌動物を無作為化して治療ケージに分配した。動物は連続１５日間、実施例２１および化合物１のイセチオン酸塩の水溶液で経口的に治療した。イセチオン酸塩は、化合物を２当量のイセチオン酸とともに溶液中に滴下して調製することができる。治療は平均グループ体重に基づいて実施した。対照動物には水を投与した。実験の評価は腫瘍の増殖の遅延、治療および対照腫瘍が評価サイズの７５０mgに達するまでの日数の差、Ｔ−Ｃに基づいて行った。データは腫瘍の増殖の遅延を治療回数で除した値の１００倍と定義された腫瘍増殖阻止百分率としても表すことができる。腫瘍増殖の遅延および腫瘍増殖の阻害値が大きいほど、化合物はより活性であることを示す。統計解析はMacintoshのJMP（SAS Institute, Inc., Cary, NC）を用いて行った。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
個々の腫瘍が７５０mgに達するのに要する時間に基づく化合物１についての値は実施例２１の場合と有意に（ｐ＜０.０５、Studentのｔ検定）異なっている。
【００６７】
ＶＥＧＦ分泌アッセイ
血管透過性因子（ＶＰＦ）としても知られる血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は大部分のタイプの癌において、主要な血管形成刺激物質と考えられている。腫瘍ＶＥＧＦ分泌の多くの誘発物質があり、その最も強力な２つは、いずれもＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）のリガンドである上皮成長因子（ＥＧＦ）ならびにトランスフォーミング増殖因子αである。
【００６８】
ＶＥＧＦ分泌の阻害は抗血管形成効果を生じ、ＶＥＧＦ分泌の部分的阻害でも腫瘍中の新たに形成された未成熟血管壁の破壊を招来するので、腫瘍の減退を導くことができる（Benjamin L.E. & Keshel E., Conditional switching of VEGF expression in tumors: induction of endothelial cell shedding and regression of hemangioblastoma-like vessels by VEGF withdrawal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 8761-8766)。
【００６９】
本発明者らは、２つのＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、化合物１および実施例２１を、Ａ４３１腫瘍細胞に対するそれらの作用について比較した。Ａ４３１腫瘍に対してインビボで、化合物１は、実施例２１（Ｔ−Ｃ＝２６日）よりも予期に反して大きな抗腫瘍応答（Ｔ−Ｃ＝５３日）を生じた。上に掲げたアッセイを参照されたい。次に本発明者らはＶＥＧＦのＡ４３１分泌に対する両化合物の効果を調べた。驚くべきことに、化合物１は、インビトロにおけるＡ４３１細胞からのＶＥＧＦの分泌阻害において、実施例２１よりも優れていた。０.５μMにおいて、化合物１はＥＧＦまたはＴＧＦα刺激ＶＥＧＦ分泌をブロックした。これに反し、０.５μMの実施例２１は、化合物１の０.１μMにおける観察とほぼ同じレベルにＶＥＧＦの分泌を阻害した。０.１μMの化合物１はＥＧＦ刺激ＶＥＧＦ分泌を６３％阻害し、０.５μMでは８６％阻害した。これに反し、０.１μMの実施例２１はＥＧＦ刺激ＶＥＧＦ分泌を４８％阻害し、０.５μMでは実施例２１はＥＧＦ刺激ＶＥＧＦ分泌を５７％阻害した。類似の結果はＥＧＦの代わりにＴＧＦα刺激ＶＥＧＦ分泌を用いても得られた。０.５μMの化合物１は、ＴＧＦα刺激ＶＥＧＦの分泌を８０％以上阻害したが、同じ濃度の実施例２１はＶＥＧＦの分泌を５７％しか阻害しなかった。化合物１はまたＡ４３１細胞からのＶＥＧＦ分泌の基礎レベルを阻害するように見えるが、実施例２１はこのような作用を示さなかった。
【００７０】
方法
American Type Culture Collection（Rockville, MD）から入手したＡ４３１ヒト上皮癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したDulbeccoのＭＥＭ／Ｆ１２メジウム（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で培養した。薬物および成長因子で処置する前に細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２で３回洗浄した。細胞を２時間、指示した濃度の化合物１または実施例２１で処置したのち、１０ng／mlのＥＧＦまたはＴＧＦ−αのいずれかを加えた。３７℃で４８時間インキュベートしたのち、メジウムを除去し、−７０℃において凍結保存した。ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡアッセイ（Intergen, Co., Purchase, NY）は製造業者の説明書に従いメジウムサンプルについて実施した。このアッセイの結果は以下に表の形式で示す。
【００７１】
【表３】
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