(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続した多数の動作を含む磁気的細胞分離を実施するために常磁性微小ビーズを使用する方法であって、
該多数の動作とそれらの順序によってプログラムされた機器を準備するステップと、
該連続した多数の動作のうちの複数のものを実施するために該機器を使用するステップと、
該連続した多数の動作のうちの複数の選択されたものを実施するよう人オペレータを促すために該機器を使用するステップと、そして
該複数の選択された動作のうちの各個々の動作又は一群の動作が完了した時に、該機器に検証入力を行うよう人オペレータに要求するステップと、
該機器をして、該選択された動作のうちの直前の動作が完了したという該人オペレータからのそれぞれの検証入力が該機器に受け取られたとき、該磁気的細胞分離における該ある動作のうちの一つを自動的に実施させるステップと、
該機器が該ある動作のうちの一つを完了したときに、該複数の選択された動作のうちの次の連続する動作を該人オペレータが実行するのに備えて、該人オペレータを呼び出すために該機器を使用するステップと、
液中の細胞と常磁性微小ビーズとの混合物を収容した一次容器を攪拌するステップと、該液中の常磁性微小ビーズを磁気的に捕獲するステップと、及び該液中の該常磁性微小ビーズを磁気的に解放するステップを実行するために、該機器を使用するステップと、
該一次容器を担持しそして該攪拌を実行するために動くことのできる攪拌部材を該機器に備えるステップと、
該常磁性微小ビーズの該磁気的捕獲を実行するための該一次容器に隣接した第１の位置と該常磁性微小ビーズの磁気的解放を行うために該一次容器から間隔をあけた第２の位置との間で動くことのできる、一次磁石を該攪拌部材に備えるステップと、そして
該攪拌部材の動きによる該一次容器の攪拌から独立して、該一次磁石を該第１及び第２の位置の間で動かすステップと、
を含む方法。
【請求項２】
混合物から選択された標的細胞を常磁性ビーズに結合させるために機器をして一次容器の最初の攪拌を行わせ、続いて該一次容器内における該常磁性ビーズ及び結合した標的細胞の最初の磁気的捕獲を行わせるステップと、
液を該一次容器から廃棄物へと排液するよう、そして新鮮な液を該一次容器に加えるようオペレータを促すために該機器を使用するステップと、
該機器をして該一次容器内において該常磁性ビーズを該新鮮な液中へと磁気的に解放させるステップと、
次いで該機器をして該一次容器を該新鮮な液及び該常磁性ビーズに結合した標的細胞と共に攪拌させ、そして該常磁性ビーズ及び結合した標的細胞を磁気的に再捕獲させるステップと、
該標的細胞を該常磁性ビーズから解き放つ材料を該一次容器に加えるよう該オペレータを促すために該機器を使用し、該機器をして該常磁性ビーズ及び結合した標的細胞を該新鮮な液及びそれに加えられた材料中へと磁気的に解放させ、そして該常磁性ビーズからの該標的細胞の切り離しを実行するため該一次容器を攪拌するために該機器を使用するステップと、
該標的細胞が該液中に混合して止まっている間に該機器をして該一次容器内において該常磁性ビーズを再捕獲させ、そして該液及び該標的細胞を該一次容器から製品収集容器内へ抜くよう該オペレータを促すために該機器を使用するステップと、
二次磁石を該機器に含めるステップと、
装置セットに該二次磁石と並列した二次容器を含めるステップと、
該液及び該標的細胞を、該二次磁石を通過させて該二次容器を通して該収集容器内へ流すステップと、そして
該一次容器から逃れた如何なる常磁性微小ビーズをも捕獲するために該二次磁石を使用するステップと、
を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
新鮮な液を該一次容器内へ加えるよう該オペレータを促すために該機器を使用するステップと、捕獲された全ての標的細胞と共に該常磁性ビーズを該新鮮な液中へと磁気的に解放するために、そして如何なる捕獲された標的細胞をも該常磁性ビーズから分離するため該一次容器の攪拌を実行するために、該標的細胞が該液中に混合して止まっている間に該常磁性ビーズを磁気的に再捕獲するために該機器を使用するステップと、そして、該液及び標的細胞を該製品容器へと抜くよう該オペレータを促すために該機器を使用するステップと、
を更に含む、請求項２の方法。
【請求項４】
該装置を閉じるようそして該装置を該機器から除去するよう該オペレータを促すために該機器を使用するステップを更に含む、請求項３の方法。
【請求項５】
該攪拌を実行するため該一次容器を回動軸の周りに傾けるよう該機器を構成するステップを更に含む、請求項１の方法。
【請求項６】
該攪拌を実行するため該機器をして該一次容器を該一次容器の水平位置に対して相対する２方向へ連続的に傾けさせるステップを更に含む、請求項５の方法。
【請求項７】
該第１の動力駆動手段の動作によって該攪拌部材を選択的に配置させるよう該機器を準備するステップと、そして、該常磁性ビーズの該磁気的捕獲の第１の相を実行するために、該機器をして水平位置及び垂直位置の双方に対して傾いた該攪拌部材の第１の選択された位置へと該攪拌部材を傾けさせるステップとを更に含む、請求項３の方法。
【請求項８】
該常磁性ビーズの該第１の磁気的捕獲のための該第１の選択された傾いた位置が、該水平位置から約５°に選択されるものである、請求項７の方法。
【請求項９】
該常磁性ビーズの磁気的捕獲の該第１の相を実行するために、該第１の位置への該一次磁石の移動の後、選択された時間の間該一次容器を該第１の選択された傾いた位置に維持するステップを更に含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
該第１の時間間隔を約３０秒とするステップを更に含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
該常磁性ビーズの該磁気的捕獲の第２の相のために、該攪拌部材を該一次容器についての垂直位置へと選択的に傾けるステップを更に含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
該常磁性ビーズの該磁気的捕獲の該第２の相をして約２分の時間間隔を持たせるステップを含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
該最初の攪拌及び該標的細胞の該常磁性ビーズへの結合にに先立って該一次チャンバーに抗凝固材料を加えるよう該オペレータを促すために該機器を使用するステップを更に含む、請求項２の方法。
【請求項１４】
該最初の攪拌ステップの後に且つ該常磁性ビーズの該最初の磁気的捕獲の前に、少量の新鮮な液体を該一次容器に加えるよう該オペレータを促すために該機器を使用するステップを更に含む、請求項２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気的細胞分離の方法及び装置に関する。より具体的には、生存力のある望みの細胞（標的細胞）の異種の細胞混合物からの磁気的分離が、該標的細胞が常磁性ビーズに結合し細胞／ビーズ複合体を形成している間に望まない細胞及び他の材料から望みの細胞を磁気的分離し、続いて常磁性ビーズを標的細胞から遊離させ、そして標的細胞を常磁性ビーズから除去することによって、達成される。
【背景技術】
【０００２】
細胞分離の分野においては、血液又は骨髄の漿液から細胞を分離すること、及び遠心によって白血球を赤血球及び血小板から分離することは普通である。標準の遠心技術により分離された白血球集団は、「軟層」画分として知られている。軟層画分は、ヘモグロビン含有赤血球並びに血小板を排除している。しかしながら、軟層画分は、幹細胞、及び赤血球、リンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球、及び巨核球系列の前駆細胞を含む、造血単核球（ＭＮＣ）の広範な混合物を含む。
【０００３】
種々のタイプの造血単核球は、殆ど等しい比重であり、従ってそれらは遠心のみでは互いから分離することができない。しかしながら、異なった細胞タイプは、それらの表面上の特異的タンパク質及び糖タンパク質などのような、異なった組の細胞表面マーカーを有する。従って、細胞分離技術は、望みの細胞タイプ（「標的細胞」としても知られる）に対する選択的結合を利用することができる。
【０００４】
例えば、造血幹細胞は、しばしば望ましい「標的細胞」である。なぜならばその後代が全ての異なったタイプの造血細胞へと分化する能力を有するからである。理論上は、幹細胞の濃厚懸濁液を注入することによって患者の造血系を復元することが可能である。「ＣＤ34細胞表面抗原」として知られた幹細胞マーカーが、単核球の混合物からヒトの造血幹細胞を分離するのに利用できる。
【０００５】
幹細胞の正の選択が一旦実際的となれば、新たな治療分野が可能となる。例えば、患者の幹細胞を選択でき、ex vivo 培養において増殖を誘発させ、次いで、迅速に分裂している骨髄の造血細胞を破壊するものである照射又は高投与量化学療法の後に、患者に戻すことができる。選択された幹細胞はまた、好中球及び巨核球前駆体のような一層成熟した細胞を生み出すようにex vivo で分化するように誘導することができ、それらを次いで、細菌感染及び出血事件を減少させるために患者へ戻すことができる。幹細胞の濃縮した懸濁液はまた、遺伝子療法のための自然の宿主を提供するであろう。例えば、患者の選択された幹細胞を、発現すれば鎌状赤血球貧血又は慢性肉芽腫性疾患のような造血系の遺伝的疾患を治療できる遺伝子でトランスフェクトすることができる。幹細胞はまた、造血系の外部の遺伝的疾患を治療するための遺伝子でもトランスフェクトできる。例えばある形の血友病は、もしも少数の患者幹細胞が非常に少量のある凝固因子を産生するようにされ得るならば、直すことができる。また、化学療法剤に対する抵抗性を提供する遺伝子により患者の幹細胞がトランスフェクトされるものである、補助的癌療法が考えられる。これらのトランスフェクトされた幹細胞が患者の骨髄に居住し直した後、例えば転移乳癌又は結腸癌に対して、患者は高投与量の化学療法を与えられてよい。化学療法剤は、迅速に分裂する転移癌細胞を標的とするであろうが、骨髄の造血細胞は、その薬物を不活化する遺伝子を発現しているために、免れるであろう。
【０００６】
細胞分離の分野は、２つの一般的な範疇に分けられている。すなわち、負の細胞分離及び正の細胞分離である。負の細胞分離においては、装置内に結合される細胞は、血液や骨髄のような異種の細胞混合物から排除されるべき腫瘍細胞の様な有害な細胞であり、そしてその混合物はその後患者へ戻される。従って、負の細胞分離においては、結合細胞の生存性を維持することは特に重要ではない。寧ろ、負の分離においては、結合細胞の生存性を維持しつつ腫瘍細胞の100 ％を除去することが特に重要である。この出願を通して、術語「結合細胞」は、常磁性微小ビーズの使用に関して用いられるときは、そのような微小ビーズに取り付けられる又は結合細胞／微小ビーズ複合体を形成する細胞をいう。この細胞／微小ビーズ複合体は、例えば、各微小ビーズに結合された数種の細胞を含んでよく、又は単一の細胞のみが特定の微小ビーズに結合しているものである単一細胞複合体を含んでよい。
【０００７】
正の細胞分離は、結合細胞の生存性を維持することが特に重要であるという特別の課題を提起する。正の細胞分離への一つのアプローチは、次の刊行物に見られるであろうように、ビオチン化された二次抗体が結合するものであるアビジンカラムの使用を伴う。ＥＰ  260 280 B1；ＷＯ  92／07243 ；ＷＯ  91／16116 ；ＷＯ  91／16088 ；ＷＯ  93／08258 。
【０００８】
異種細胞混合物は、最初に、例えば、幹細胞に特異的に結合するＣＤ34に対する一次抗体とインキュベートされる。細胞混合物を、次いで、カラム上の二次抗体が該一次抗体（それは今度は望みの細胞に結合している。）と結合するように、カラムを通して流す。望まない細胞は、後で処分される溶出画分とともにカラムを通過する。米国特許第5,240,856 号 (Goffe, et al.)は、カラム処理の間に細胞懸濁液を混合するために、磁気攪拌棒の使用を開示している。正の選択を受けた細胞は、次いで、カラムから機械的に排除される。しかしながら、このカラム式のシステムに関しては、おそらく機械的損傷によるものである細胞の生存性の低さ、及び、カラム中への細胞の捕獲によるものである細胞純度及び収率の低さ等のような問題がある。
【０００９】
細胞分離の分野における他の現在の方法は、例えば、選択的細胞分離のための化学物質又は抗体を物理的に吸着させたか又は共有結合で取り付けた、中空繊維、平たいシート部材、又はビーズ若しくは粒子状材料の充填ベッド等のようなマトリクス材料を利用する。これらの考案は、連続的な全血又は血液成分の流入及び返還を許容するように設計されている。これらの考案は、望みの細胞の濃度が他のタイプの細胞に比して非常に低い可能性があるという条件下に、通常の血液流速で働くことから、その分離工程はしばしば効率が悪い。更には、これらのシステムによれば、選択された細胞を生きた状態で収集することが困難である。
【００１０】
常磁性ビーズの開発は、標的細胞の磁気的分離の見通しを提供した。磁性及び常磁性粒子を製造するための種々の方法が、次の米国特許に開示されている：第4,672,040 号 (Josephson)、第5,091,206 号 (Wong等) 、第4,177,253 号 (Davies等) 、第4,454,234 号 (Czerlinski) 、第4,582,622 号 (Ikeda 等) 、及び第4,695,392 号 (Whitehead)。
【００１１】
分析に磁性粒子を用いるための種々の方法が考え出されている。例えば、米国特許第4,272,510 (Smith等) 、第4,777,145 (Luotola等) 、第5,158,871 号 (Rossomando) 、第4,628,037 号 (Chagnon)、第4,751,053 号 (Dodin)、第4,988,618 号 (Li等) 、第5,183,638 (Wakatake)、第4,018,886 号 (Giaever)、及び第4,141,687 号 (Forrest)。
【００１２】
細胞を含む、生物学的成分の分離に磁性ビーズを使用するための試みがなされた。以下は、本出願人が知り且つ磁気的分離器及び方法に直接向けられていると信ずる米国特許のリストである。第4,664,976 号 (Graham等) 、第4,190,524 (Watson)、第4,738,773 号 (Muller-Ruchholtz) 、4,941,969 (Schonert)、第5,053,344 (Zhorowski) 、第5,200,084 (Liberti) 、第4,375,407 号 (Kronick)、第5,076,914 号 (Garashenko) 、第4,595,494 号 (Kukuck) 、第4,290,528 号 (Stekly) 、第4,921,597 号 (Lurie)、第5,108,933 (Liberti等) 、第4,219,411 号 (Yen)、第3,970,518 号(Giaever) 、及び第4,230,685 号(Senyei)。これら全ての装置及び方法は、細胞分離及び保持の効率に関する問題並びに処理細胞の生存性の低さのために、非常に限られた成功を見たに過ぎない。
【００１３】
細胞分離に関する問題を解決するために、次の米国特許によって証拠付けられるところによれば、他の研究者等は、代わりの磁気的分離装置を考案し、それらは、例えば、調節可能な磁石位置（第4,710,472 号; Saur等) 、磁気勾配 (第4,904,391; Freeman) 、及び逆の極性の磁石 (第4,910,148 号、Sorensen等) を提案している。これらの提案された装置は、磁気的正の及び負の細胞分離において一般に遭遇する２つの主要な問題を解決していない。すなわち、第１に、望ましくは、非常に低いパーセントの標的細胞を含んだ異種集団からの、100 ％に達する非常に高い標的細胞分離の必要性、及び第２に、最終細胞製品からの殆ど全ての常磁性ビーズの除去の必要性である。こうして、これらの提案された慣用の磁気的分離装置は、負の又は正の細胞分離の何れについても、大きな成功を見ていない。
【００１４】
上述の負の及び正の細胞分離の両方についての中心的問題は、２つの異なった磁石を連続して利用することによって解決された（Hardwick et al., Artificial Organs 14:342-347, 1990;ＥＰ 0438520) 。この発明においては、第１の磁石は、第１の容器中の常磁性粒子の高比率を磁気的に引きつけて結合させるためその磁気的引力が第１の容器の底を横切るよう、広い「到達」能力と組合わさった比較的強い表面磁場強度を有する。このシリーズにおける第２の磁石は、第１の磁石を逃れた如何なる常磁性ビーズも第２の磁石によって捕獲されて最終の細胞懸濁製品から除去されるよう、第１の磁石よりも遙に強い磁場をその表面に有する。
【００１５】
Hardwick等のこの発明は、一般的に細胞分離に関する、そして特に負の細胞分離に関する中心的問題を解決した。しかしながら、正の細胞分離は、生存選択細胞の一層高い収率が望ましいという点において、更なる問題を提起した。正の細胞分離は、望みの細胞が常磁性ビーズ上において第１の磁石に引きつけられるときに潰されないように、第１の磁石における及び第１の容器における発明的変更によって実際的なものとされた（Hardwick, et al., "Design of Large-Scale Separation Systems for Positive and Negative Immunomagnetic Selection of Cells Using Superparamagnetic Microspheres", J. Hematotherapy 1:379-386, 1992; Hardwick, et al., Adv. in Bone Marrow Purging, Wiley-Liss, Inc., 1992, 第583-589 頁) 。正の細胞分離のために望ましい第１の磁石は、その「到達」能力が常磁性ビーズを第１の容器の深さを横切って引きつけるに十分に広いという点において、負の細胞分離のための第１の磁石の特徴のうちあるものを保持している。しかしながら、正の細胞分離のための第１の磁石は、その表面において、負の細胞分離のために用いられる第１の磁石に比して、遙に弱い磁場強度を有する。更には、正の細胞分離のための第１の容器は、非圧潰性である。第１の磁石と非圧潰性の第１の容器とのこの組み合わせは、生存した望みの細胞の一層大きな収率を許容する。正の並びに負の細胞分離において、第２の磁石は、その表面において第１の磁石より遙に強い磁場強度を有する。
【００１６】
直ぐ上に記述された正の細胞分離のためのシステムは手で操作され、幾分労働集約的であると考えることができる。全ての手動のシステムにおけると同様に、得られる結果はオペレータの熟練に大いに依存し、望む程には反復可能性がないであろう。利用可能労働力の限られた臨床試験室に適した細胞分離装置に対する需要が、残っている。そのような装置は、好ましくは、細胞分離手順の間の大半においてオペレータが自由に他の任務に当たり得るように、半自動化されているであろう。また、この半自動化された装置は、オペレータが複雑な細胞分離工程を各回正しく実施することを保証することによって、細胞分離工程の信頼性及び反復可能性を改善するであろう。また、工程中の多くのステップの遂行がオペレータの熟練のレベルに依存することが少なく且つ該工程に対するオペレータの注意のレベルによって影響を受けることがより少ないことから、工程及び結果の品質の反復可能性は、そのような半自動化された装置によって改善されるであろう。
【００１７】
本発明の尚も更なる一目的は、細胞分離の工程の一部を実施するよう機器を半自動化するためと、細胞分離工程をモニタリングして工程の幾つかのステップを実施する係員の作業を指示しそして検証するためとの両方でプログラム可能な能力を有する機器の使用を含んだ方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の一目的は、半自動化された細胞分離装置及び、中で細胞溶液及び細胞分離のための材料が取り扱われそして処理の間収容されるものである、使い捨て装置セットを提供することである。
【００１９】
尚も別の一目的は、プログラム可能な能力を備えたそのような機器を、当該半自動化された機器と係員の協働によって実施するよう細胞分離工程を半自動化するために該機器を特に構成するためのソフトウェアと共に用いる方法を提供することである。該機器は、細胞分離工程をモニターするため及び工程の各段階において、該工程の多くのステップを自ら学び又は特定の細胞分離工程の間に数個のステップのうちどれが実施され次に実施されるべきはどのステップであるかを記憶する必要のない、当該注意又は指示に従う係員に注意又は指示を提供するために、使用される。
【００２０】
本発明のこれらの及び他の目的及び利点は、本発明の単一の模範的に好ましい具体例の次の詳細な記述を、添付の図面と併せて読むことによって明らかとなろう。図面において、同じ参照数字は、図面を通して同じ特徴部に、又は構造又は機能において類似である特徴部に、言及している。
【発明の開示】
【００２１】
概観
図１及び２を互いに組み合わせて参照して、細胞の磁気的分離のための組合わさった装置が全体として数字１０で示されている。この組合わさった装置１０は、半自動化された機器１２、及び使い捨て装置セット１４を含む。使い捨て装置セット１４及び機器１２は、更に説明されるように、標的細胞の半自動化された磁気的分離を実行するために協働的に使用されるよう構成されている。磁気的な標的細胞分離工程に続いて、該使い捨て装置セット１４は、機器１２から除去されて廃棄される。その後、別の実質的に同一の使い捨ての装置セット１４が、次の磁気的細胞分離の準備のために機器１２に組み込まれる。
【発明の実施するための最良の形態】
【００２２】
使い捨て装置セット１４
使い捨て装置セット１４は、機器１２に組み込まれて図１に示されている。しかしながらこの使い捨て装置セット１４とその機器１２による磁気的細胞分離の工程における使用のより良い理解のために、図２に今や注意が向けられる。使い捨て装置セット１４は、非圧潰性の形状保持性透明円筒状一次容器１６を含む。本発明のこの一次容器が、円筒以外の、例えば全体として長方形の定容的形態の、代わりの幾何学形状を有してもよいことは理解される。この一次容器１６は、上側及び下側端壁それぞれ２０及び２２を有する透明な管状の本体１８を含み、それら端壁は、一次処理チャンバー２４を規定するために、本体１８に永久的に密封的に結合されている。管状の本体１８の垂直距離に沿って、３つのレベルのマークが配置されており、それぞれ、チャンバー２４の底から最上部へと指標「Ｂ」、「Ａ」、及び「Ｌ」で示されている。これらの指標は、細胞分離工程に際して、そして特にチャンバー２４の内容物に特定の液体材料を追加する際に、機器１２の係員によって用いられよう。
【００２３】
上側壁２０に永久的に取り付けられてチャンバー２４と連通しているのは、垂直に延びている排気チューブ２６である。この排気チューブ２６は、排気フィルター２８へと延びてこれを担持している。排気チューブ２６上には、排気制御クランプ３０が担持されており、それはチューブ２６を圧潰させて閉鎖するのに、並びにクランプ３０が解放されたときにチャンバー２４の排気を許容するようそれ自身の弾性によりこのチューブの開通を許容するのに、有効である。やはり上側壁２０に永久的に取り付けられてチャンバー２４と連通しているのは、注入継手３２であり、それは、皮下針及びシリンジによって当該隔壁を通してチャンバー２４内への材料の注入を許容するための、刺通可能な隔壁（示さず）を含む。
【００２４】
底壁２２にあってチャンバー２４と連通しているのは、永久的に接続された短い長さの可撓性のチューブ３４である。この可撓性のチューブ３４は、Ｙ字形コネクター３６へと延びてこれに永久的に結合されている。このＹ字形コネクター３６から、一対の永久的に接続されたチューブ３８及び４０が延びている。チューブ４０は、使い捨て装置１４のための出口排液ラインを規定し、永久的に取り付けられたスパイクコネクター４２を担持している。排液ライン４０上には、ローラークランプ４４が担持されており、それは、チューブ４０を圧潰させることによってチャンバー２４から排液出口４２への連通を閉じ、そしてまたこのチューブが開通するのを許容する効果がある。チューブ３８は、永久的に取り付けられたＹ字形コネクター４６へと延び、そしてローラークランプ４８がチューブ３８を介した連通を制御している。Ｙ字形コネクター４６からは２つの永久的に取り付けられたチューブ５０及び５２が延びている。チューブ５０は、永久的に取り付けられたＹ字形コネクター５８及びこれに永久的に取り付けられた一対のチューブ６０及び６２を介して一対の入口スパイクコネクター５４及び５６と連通している。チューブ６０及び６２上には、これらのチューブを介した連通を制御するために、それぞれのローラークランプ６４及び６６が担持されている。
【００２５】
チューブ５２は、永久的に取り付けられた二次容器６８へと延びている。対応するローラークランプ７０が、チューブ５２を介した連通を制御する。二次容器６８は、図２に見られるように８角形の可撓性のバッグとして形成されている。この容器は、一対の透明な近接して隙間をあけてある全体として平たい壁（数字７２及び７４で示されている）を有し、それらは図２に見られる図の平面内に共に全体として互いに背中合わせになっている。これらの向き合った壁は、二次チャンバー７６のための薄い封筒状の形状を規定するために、図の平面に垂直な方向に僅かな間隔をあけてそれらの８角形の周縁において向かい合わせの関係で結合されている。容器６８内において、壁７２、７４は、互いに向かって延びており、チャンバー７６内に一対の角度のついた仕切り（数字８０で示されている）を形成するよう内部接着されている、それぞれのリブ７８を備えている。仕切り８０のために、チャンバー７６は、それを通る曲がりくねった流路を形成し、それは図２を見ると数字８２で示されている。装置１４は、図２において、恰も卓上に並べたかのように提示されていること及び機器１２及び装置１４の使用に際しては、液体流（及び流れる液体によってチャンバー７６内へ運ばれる材料の流れ）が重力に逆らうように、流路８２はチャンバー７６を通って上方へ延びるということに注意しなければならない。チャンバー７６内における重力に逆らったこの流れの重要性は、更に説明されよう。
【００２６】
二次容器６８から、永久的に取り付けられたチューブ８４が、Ｙ字形コネクター８６へと延びており、該コネクターはまたチューブ８４に並びに一対のチューブ８８及び９０に、永久的に取り付けられている。チューブ８８及び９０は、製品出口ルーアロック継手９２へ、及び製品出口リングキャップ継手９４へと、それぞれ延びている。それぞれのローラークランプ９６及び９８が、チューブ８８及び９０内の連通を制御している。
【００２７】
機器１２
使い捨て装置セット１４の構造について述べたので、今や再び図１に注意を向けることができる。図においてこの使い捨て装置セットは、組み合わせた装置１０による磁気的細胞分離工程の実施を準備して機器１２に組み込まれて示されている。図１に見られるように、機器１２は、基部１０２及び該基部１０２上において垂直に上方へ延びているタワー部１０４を有するハウジング１００を含む。ハウジング１００内に入れ子式に受け入れられて調節可能にそこから延びているのは、Ｔ字形バッグハンガー１０６である。このバッグハンガー１０６は、矢印１１２によって示されているように、バッグハンガー１０６のシャフト部１１０をタワー部１０４に対して上又は下へスライドさせることにより、横断部分１０８の垂直位置に関して調節可能であり、そして、ハウジング１００にネジ式に担持された手動の係止ネジ（図には見られない）の使用によって選ばれた位置に係止する。この係止ネジの外部ノブ１１６が、タワー部１０４の全面から突出しているのが見られる。
【００２８】
横断棒１０８上には、２つのバッグ１１８、１２０が担持されており、それぞれ、一方は調製された細胞懸濁液であり他方は緩衝液である。バッグ１１８及び１２０は、入口スパイクコネクター５４及び５６において、使い捨て装置セット１４に接続されている。一次容器１６は、タワー１０４の片側に軸支されている揺動アセンブリ１２６の上側及び下側クランプ特徴部、それぞれ１２２、１２４中に担持されている。揺動アセンブリ１２６は、一般的に１２８で示した回動軸の回りに矢印１３０によって示されたように、図１に示された垂直位置と、垂直位置から約120 °時計方向にある限界位置との間で、更に説明されるように、回動する。揺動アセンブリ１２６上の下側クランプ特徴部１２４は、揺動アセンブリ１２６から上方へ延びたカップ状のブラケット１３２の形をとっており、チューブ３４の通過のためのスロットを有する。上側クランプ特徴部１２２は、揺動アセンブリ１２６の上側の限界付近に配置された、管状本体１８と係合するための円弧状の鞍部材１３４及び、この第１の容器１６をブラケット１３２及び鞍１３４と係合した状態に維持するためのバネ負荷された協働するラッチ腕１３６の形を取っている。
【００２９】
タワー１０４の前面には、二次磁石１３８及び二次容器６８のための保持器１４０が担持されている。この保持器１４０は、中に透明な窓部１４２ｂを担持した中央開口を備えた金属の枠部１４２ａを有するドアアセンブリ１４２を含む。ドア１４２には回動ドア把手機構１４４が備えられており、それらの双方が図１に見られる。二次容器６８は、チューブ５２が下側ノッチ（図１には見えない）を介してこの保持器内へ延びている状態で、保持器１４０内に挿入されており、チューブ８４は、上側ノッチ（やはり図１には見られない）を介してこの保持器から外方へと延びている。チューブ３８はチューブ３４の長さと連結して、第１の容器１６の底まで延びて、以下に記述するように、この揺動アセンブリの範囲いっぱいの回動運動にわたる、揺動アセンブリ１２６上のこのチャンバーの運動を許容するのに十分に長い。
【００３０】
ハウジング基部１０２の前面の傾斜したパネル１４６は、オペレータアナンシエータ画面１４８及び入力キーボード１５０が配置されている。アナンシエータ画面１４８は、コマンド、信号、及び人オペレータへの指示が綴られるよう、そして秒読み時間などのような数値をオペレータに表示するよう、好ましくは液晶英数字タイプのものである。この前面パネル１４６はまた、例えば工程の特定の相が完了したとき又は工程の一部が係員によって完了されることが必要な場合に、係員に聴覚的信号を送るための矢印１５２で示されたブザー等のような、聴取し得る警報信号発生器をも含む。係員は、次いで、キーパッド１５０に入力することによってブザーを止め、通告された指示を画面１４８から読みとる。聴覚的信号か又は単に画面上１４８の通告信号又は指示のみの何れによっても、機器１２がオペレータに操作を求めて信号を送ることができるということに注意しなければならない。傾斜した前面パネル１４６の上方に、ハウジング基部１０２は、一対の立ち上がったチューブ支持体１５４を担持しており、それらは、使い捨て装置１４の種々のチューブを組織化し配置するのに用いられる。機器１２に隣接して、製品容器１５６が配置されており、それは製品出口継手９２、９４の一方と連通している。排液容器（図１に示されており、数字４２ａで参照されている）は、好ましくは廃液排出継手４２に接続されていてよい。
【００３１】
今や図３に移ると、機器１２の機構の図式的表現が提示されている。図３に見られるように、タワー部１０４は、管状シャフト部材１５８を軸支している。シャフト部材１５８は、揺動アセンブリ１２６を担持し、そしてまた、歯付プーリー１６０、角度エンコーダ及び止めディスク１６２、及び、一次磁石アセンブリを保持し配置するための、一般的に数字１６４によって示された機構（それは下に更に記述される）を、駆動的に担持している。歯付プーリー１６０からは、歯付タイミングベルト１６６が、モータ１７０の出力シャフト上に駆動的に担持された歯付プーリー１６８へと延びている。プーリー１６０、１６８は、歯付ベルト１６６と協働して、モータ１７０と揺動アセンブリ１２６との間に正の３：１ギア比を規定する。モータ１７０は、このモータのためのモータ制御装置１７２と共に、ハウジング１００の基部１０２内に担持されている。シャフト部材１５８は、モータ１７０により駆動されるベルト１６６及びプーリー１６０、１６８によるこのシャフトの回転が、揺動アセンブリをその種々の位置の間で回動させるよう、揺動アセンブリ１２６のための回動軸１２８を規定し、モータ１７０の磁気的係合のために揺動アセンブリ１２６のための選択された位置を保持する効果があり、そして、一次容器１６の内容物を攪拌又は混合させるよう軸１２８の周りに揺動アセンブリ１２６を角度的に振動させる効果もある。
【００３２】
タワー部１０４内に、ハウジング１００は、揺動アセンブリ１２６が軸１２８の周りに反時計方向に実質的にこれらの図面に見られる垂直位置へと回されたとき角度エンコーダ及び止めディスク１６２のエッジ面１７６によって係合可能である、止め棒１７４を担持している（図１及び３を参照）。センサ１７８も、タワー部１０４内においてハウジング１００に担持されており、適当な導線１８０によって、数字１８２で示されたマイクロプロセッサに基づく制御装置へ接続されている。このマイクロプロセッサに基づく制御装置１８２はまた、モータ制御装置１７２との、及び他の類似のモータ制御装置１８４との接続を有している。モータ制御装置１８４は、該機構１６４の一部を形成する、出力シャフト上にギア１８８を駆動的に担持したギアヘッドステッパモータ１８６を制御する。マイクロプロセッサに基づく制御装置１８２はまた、図３に図式的に示されているように、アナンシエータパネル１４６及びキーパッド１４８とも接続している。
一次磁石アセンブリ４００を動かす機構１６４を一層詳しく考察すると、揺動アセンブリ１２６は、中空の箱状のハウジング１９０よりなり、それは図３において破線で見られる。ハウジング１９０は、前部開口１９２を備え、それは図１及び４に最もよく見られる。中空のハウジング１９０内に、４つの案内棒１９４が、開口１９２の外側においてこのハウジングの前部から後部へと延びている。案内棒１９４にスライド可能に担持されているのは、一次磁石枠部材１９６である。この枠部材１９６は、その突出した部分１９８上に、中にそれぞれの一次永久磁石２０２が捕獲されて一次磁石アセンブリ４００を形成するものである４つの磁石窓２００を備えている。
【００３３】
適切には、各一次永久磁石２０２は、ケンタッキー州Elizabethtown のCrucible Magnetics Co.より入手可能な、ネオジム、鉄及びホウ素よりなる高磁性合金で作られている。磁石の強さを測定するに当たっては、典型的には、磁石の表面上でガウスメーターが動かされ、磁石の種々の領域における、また「極大」としても知られる「ピーク磁束密度」がガウスで記録される。各一次永久磁石２０２は、好ましくは2,000 乃至3,000 ガウス、最も好ましくは2,100 乃至2,600 ガウスの磁場強度（極大）をその表面に有する。一次磁石アセンブリ４００を形成するためには、一次永久磁石２０２は、内方又は外方へ面したＮ極及びＳ極のいかなる組み合わせで組み立ててもよい。各一次永久磁石の極が全てのＳ極が外方へ向くか又は全てのＮ極が外方へ向くように配列される場合には、一次磁石アセンブリ４００は、一次磁石アセンブリ４００の両端付近の表面において好ましくは3,000 ガウスの磁場強度（極大）を有し、一次磁石アセンブリ４００の中央付近の表面においては約2,100 乃至約2,600 ガウスの磁場強度（極大）を有する。一次永久磁石２０２がＳ極及びＮ極が交互に外方へ向く状態で組み立てられる場合には、一次磁石アセンブリ４００は、Ｎ極とＳ極との境界付近の表面において約4,000 ガウスの磁場強度（極大）を有する。異なったタイプの磁気的細胞選択のために有利な磁場特性を有する一次磁石アセンブリ４００を提供するために一次永久磁石２０２を内方又は外方を向いたＮ極及びＳ極のいかなる順列で配列することも、本発明の範囲内である。
【００３４】
一次磁石枠部材１９６の最初の又は前進位置において、その部分１９８は、一次永久磁石２０２が使い捨て装置セット１４の一次容器１６の管状部材１８に対して実質的に同一面にあるよう、開口１９２を通って延びる。一次磁石アセンブリ４００についてのこの第１の位置は、図１、３及び６に見られる。
【００３５】
一次磁石枠部材１９６（及びこれに担持された一次磁石２０２）を図３に図解されている第１の前進位置から図４及び５に見られる第２の又は引っ込められた位置へと動かすために、機構１６４は、管状部材１５８内に通されたシャフト２０４を含む。このシャフト２０４は、モータ１８６の歯車１８８とかみ合った歯車２０６を担持し、そしてまた枠部材１９６の背後において揺動ハウジング１９０内に配置されたアクチュエータ腕２０８をも担持している。アクチュエータ腕２０８の先端と枠部材１９６に取り付けられたブラケット２１０との間には、リンク部材２１２が延びている。このリンク部材２１２は、アクチュエータ腕２０８及びブラケット２１０の各々に、数字２１４で一般的に示した関連した回動ピンを介して、回動式に連結されている。従って、図３を見て、モータ１８６、かみ合った歯車１８８及び２０６によってシャフト２０４が反時計方向に回されるとき、アクチュエータ腕２０８は、枠部材１９６及び一次永久磁石２０２を一次容器１６から図４に示された位置まで引き離す。勿論、シャフト２０４及びアクチュエータ腕２０８の反対の回動運動は、一次永久磁石２０２を図１及び３に示した位置まで前進させる。
【００３６】
更に説明するように、モータ１８６及び機構１６４は、揺動アセンブリ１２６の回動運動が、一次容器１６に対する磁石枠１９６及び一次永久磁石の位置に対して影響を与えず且つこれから独立しているように、管状のシャフト１５８及び揺動部材ハウジング１９０と共に回動する。やはり図３に見られるのは、枠部材１９６に担持されてこれから上方へ延びているフラッグ部材２１６である。このフラッグ部材２１６は、枠部材１９６のそれぞれ前進した及び後退した位置にある２つのセンサ２１８、２２０のうちの一方又は他方によって感知される。これらのセンサ２１８、２２０の各々は、適当な導線２２２を介して、マイクロプロセッサに基づく制御装置１８２と接続されている。従って、制御装置１８２は、一次永久磁石２０２を前進位置と後退位置との間で動かすために適切な方向へモータ１８６を操作する。一次永久磁石２０２は、それらの前進した及び後退した位置の間を横切るとき、これら２つの位置の間のある位置しか占めない。一次永久磁石２０２は、それらの前進位置又は後退位置以外の位置では停止されない。
【００３７】
機器１２及び使い捨て装置セット１４の使用の方法
一緒になって組合わさった装置１０を構成するものである機器１２及び使い捨て装置セット１４についての全体的理解が得られたから、今や機器１２の更なる構造的特徴に注意を向けることができ、それは、磁気的細胞分離の工程を実施するに当たって如何にして機器１２及び装置セット１４が一緒に使用されるかについての記述と組み合わせて記述されよう。
【００３８】
図１及び４を見ると、揺動アセンブリ１２６がその垂直位置にある状態で、そして一次磁石２０２が引っ込められた状態で、磁気的細胞分離工程の第１の相が、一次チャンバー２４内へ、バッグ１２０から少量の緩衝液をそしてバッグ１１８から細胞混合物を加えることによって、開始される。バッグ１１８を一次チャンバー２４内へと空けた後、人であるオペレータは、望むならば、残っている細胞をバッグ１１８からチャンバー２４内へと濯ぎ込むために、少量の緩衝液をバッグ１２０からバッグ１１８内へと流し込み次いでチャンバー２４内へと流し込む。次いで、中の液体レベルを特定のレベルラインまで到達させるために、緩衝液が、チャンバー２４に加えられる。次いでチャンバー２４内に、注入ポート３２を介して、計算された量の常磁性ビーズが入れられる。一次チャンバーに出入りする液体の流れを制御している全てのクランプが、次いで閉じられる。
【００３９】
キーパッド１５０における適当な入力によって、この最初の調製動作が完了したことをオペレータが機器１２に指示すると、マイクロプロセッサに基づく制御装置１８２は、揺動アセンブリ１２６を図１及び４に示されている垂直位置から第１の攪拌位置（これは図５において実線の位置によって図解されている）を通り、続いて水平位置を通り、そしてこの水平位置を超えて第２の攪拌位置（図５における破線を参照）へと動かす。揺動アセンブリ１２６のこの第１の攪拌位置は、好ましくは容器１６についての水平位置の手前約22.5°であり、一方第２の攪拌位置は、図１に見られる一次チャンバー１６の垂直位置に対する水平を超えた22.5°である。機器１２がこれらの角度による第１及び第２の攪拌位置を特定する方法は以下に記述される。しかしながら、オペレータは、望むならば、揺動アセンブリ１２６について他の第１の攪拌位置を用いるよう制御装置１８２を予めプログラムすることができる。機器１２は、水平の直ぐ手前乃至水平から30°の範囲内の何処にでも第１の攪拌位置を許容するよう構成されている。機器１２は、揺動アセンブリ１２６を第１の攪拌位置から、水平位置を通過させ、そして同じだけ角度をなす第２の攪拌位置（これは図５において破線で示されている）へと図５における時計方向へ回動させる。
【００４０】
選ばれた時間間隔の間、機器１２は一次容器１６を図５における第１及び第２の攪拌位置の間で、やはり変化させることのできる予めプログラムできる速度で、前後に連続的に揺動させる。勿論、一次容器１６の各揺動は、この容器の液体内容物をしてチャンバー２４の端から端まで前後へ流動させ又はうねらせ、この一次チャンバーの内容物を完全に攪拌し混合する。この最初の攪拌間隔は、チャンバー２４内の標的細胞の全て又は実質的に全てに結合した、適正に被覆された常磁性ビーズをもたらす。一次容器１６のこの揺動及びチャンバー２４の内容物の攪拌は、モータ１７０の回転方向の反復的逆転によって達成される。この時間の間、基本磁石２０２は、これらの磁石からの磁場が常磁性ビーズに影響を及ぼさないよう、ハウジング１９０内へと引っ込められている。
【００４１】
今や図７に注目することは、このアセンブリの垂直位置を位置決めし、第１及び第２の攪拌位置を位置決めし、そして記述されるであろう分離位置にこの揺動アセンブリを位置決めするために揺動アセンブリ１２６を制御するように、如何にして制御装置１８２が準備されるかを読者が理解する助けとなろう。図７は、揺動アセンブリ１２６がやはり垂直位置にある状態の、機器１２の機構についての、しかし図３の反対側からとられた、他の幾分図式的な表現を提供している。図７を見ると、揺動アセンブリの垂直位置において、ディスク１６２のエッジ面１７６が止め棒１７４に直面しているが、しかし好ましくはこの止め棒と実際には接触していない。また、垂直位置において、センサ１７８は、エンコーダ／止めディスク１６２の縁２２４を丁度こえている。モータ１７０が揺動アセンブリ１２６を図７において反時計方向（時計方向は図１及び３に見られる）に水平位置へと回動させると、スリット２２６、エンコーダ／止めディスク１６２にあるスリット２２６がセンサ１７８と整列してこれによって感知される。この水平位置から、制御装置１８２は、揺動アセンブリを後にロッド１７４とのエッジ１７６の接触へ向けてしかしその寸前まで回動させる。これは、揺動アセンブリ１２６についての垂直位置である。
【００４２】
モータ１７０は、好ましくは1.8 °のシャフト回転が完全な１ステップ回転でありそして半ステップ能力を有するステッパタイプのモータである（すなわち、モータ１７０は、その出力シャフトを完全な１ステップである1.8 °のシャフト回転だけ回転させるよう制御装置１８２によって命令されることができ、また0.9 °の半ステップもまた命令されることができる）。モータ１７０と揺動アセンブリ１２６を担持しているシャフト１５８との間のギア比が３：１であることから、制御装置１８２は、モータ１７０の１ステップが揺動アセンブリ１２６の0.6 °の回動運動に等しい（半ステップは0.3 °の運動に等しい）という情報をもってプログラムされる。制御装置１８２は、機器１２の動作の最初の較正相において、揺動アセンブリ１２６を水平位置から棒１７４とエッジ１７６との接触へむけて後方へ回動させ、揺動アセンブリをこの接触位置の寸前で停止させる。こうして、機器１２がスイッチを入れられて較正相が実施されるとき、揺動アセンブリ１２６がどの位置にあっても、制御装置は、その後、スリット２２６を参照するこによって水平位置についての参照を有し、モータ１７０のステップ及び半ステップを数えることによって揺動アセンブリ１２６の他の位置を確認することができるであろう。
【００４３】
揺動アセンブリ１２６の揺動の間、制御装置１８２は、水平位置からの及びこれに戻るモータ１７０のステップ数を数え、そしてこの参照位置は、スリット２２６がセンサ１７８と整列する度毎に更新される。揺動の間に揺動アセンブリ１２６が傾斜する総角度は、制御装置１２６によって変化させることができる。更に説明されるであろうように、もしも、容器１６の内容物を攪拌するために機器１２のオペレータが揺動アセンブリが例えば50°だけ揺動されるよう命令したならば、制御装置１８２は、50を２で割り、そしてその結果（25）を完全な１モータステップについての0.6 °の値で割る。この結果についての最も近い整数値（42）が、水平参照位置（スリット２２６を参照）からの各方向へのステップ数である。
【００４４】
磁気的捕獲分離の最初の相のための揺動アセンブリ１２６の好ましい位置は、水平から約５°であり、やはり水平の参照位置を参照して決定される。モータのステップ当たりの0.6 °は、揺動アセンブリ１２６を水平位置から図６に見られる磁気捕獲位置へと動かすため、モータ１７０のステップ数についての最も近い整数値を得るために好ましい揺動アセンブリについての角度位置に割り振られる。
【００４５】
図７はまた、機構１６４が、一緒に回動するために管状シャフト１５８上に担持された、モータ取付けハウジング２２８を含むことをも示している。管状シャフト１５８は、窓２３０を備え、そこにおいて歯車２０６が露出されている。モータ１８６に駆動的に担持された歯車１８８は、歯車２０６とかみ合い、そしてモータ１８６は、軸１５８と共に回動運動するためにハウジング２２８に固定されている。このモータ取付けハウジング２２８は、好ましくは、モータ取付けハウジング２２８が止め棒１７４を打つ迄、水平位置を超える揺動アセンブリ１２６の約30°の角度的運動を許容する。従って、揺動アセンブリ１２６は、所望により、対称的な揺動運動のために水平位置から約30°各々反対の方向へ交互に係止されることができる。揺動運動のこの一層大きな30°という角度は、揺動アセンブリ１２６についての水平の参照位置と各々の極限の傾斜運動との間にモータ１７０が50のステップをなすことを要求する。勿論、揺動アセンブリ１２６の一層小さい揺動も、制御装置１８２の適当なプログラミングによって選択してよい。
【００４６】
好ましくは、スリット２２６は、エンコーダ／止めディスク１６２のエッジ１７６から30°の所に配置される。機器１２のオペレータが30°又はこれに近い値の揺動アセンブリ１２６の揺動角度を選択した場合には、エッジ１７６は、揺動アセンブリ１２６が水平位置を30°超えてその第２の攪拌位置に到達したときセンサ１７８と整列して、モータハウジング２２８が止めロッド１７４に近いという警報を制御装置１８２に提供するであろう。制御装置１８２は、水平に対する揺動アセンブリ１２６の位置を連続的に更新しそしてまた、エッジ１７６がこのセンサに到達したとき、一次容器１６の揺動攪拌の間にモータハウジング２２８と止め棒１７４との間の衝突が起きないよう、センサ１７８から警報を受け取るであろう。
【００４７】
選ばれた攪拌間隔の完了したとき、制御装置１８２は、揺動アセンブリ１２６をチャンバー２４内の常磁性ビーズ（及び結合した標的細胞）の磁気的捕獲のための最初の分離位置で停止させる。この最初の分離位置は、又は磁気的捕獲のための最初の位置は、好ましくは、図６において水平から半時計方向に約５°である。一次磁石２０２が次いで、制御装置１８２の制御の下にモータ１８６及び機構１６４の動作によって進められる。この分離位置は、好ましくは約30秒である時間の間維持される。尤も、最初の磁気的分離には他の時間間隔も選択できる。
【００４８】
その直後に、揺動アセンブリ１２６は、一次磁石２０２が図６の前進位置に維持された状態で、制御装置１８２によって二次的分離位置へと動かされる。この二次的分離位置は、図１に見られるように、実質的に垂直である。出願人は、チャンバー２４内の液体からの標的細胞及び結合した常磁性ビーズの磁気的捕獲のための最初の傾斜した分離位置を用いるこの２つの相よりなる分離工程が、チャンバー２４の液体内容物を、第１の分離相の間に一次磁気アセンブリ４００の長手方向に沿って有利に展開させることを見出した。図６に示されているように、結合した標的細胞は、矢印２３２によって示されているように移動して容器１６の壁面上の塊となる傾向があり、該塊は案内線及び数字２３４によって示されている。未結合の常磁性ビーズ及び幾らかの非標的細胞もまたこの塊２３４内に捕獲されることが認識されるであろう。この点において、容器１６がその第２の分離位置へ動かされた後、そして第２の分離時間が経過した後、オペレータは、チャンバー２４を通気して液抜きするよう機器１２より信号を受ける。殆どの非標的細胞及びこれらの細胞を運んできたバッグ１１８からの液体は、チャンバー２４から排液容器内へと排出される。
【００４９】
次いでオペレータは、塊２３４からの結合標的細胞のための一連の類似の洗浄操作であってよいもののうち最初の洗浄を開始する。すなわち、チャンバー２４は、緩衝液で部分的に満たされそして再閉鎖される。オペレータは、キーパッド１５０を介して機器１２に、一次処理１６が更なる処理のために準備できたということの信号を送る。次いで制御装置１８２は、結合された細胞をチャンバー２４内の新鮮な緩衝液中に遊離させるために、磁石２０２を引っ込める。機器１２は、容器１６を第１及び第２の攪拌位置の間で、予め選ばれた時間の間攪拌し、そして結合標的細胞を上に説明したように容器１６の壁面上の新鮮な塊内へと磁気的に分離する。
【００５０】
これらの新鮮な塊は、塊２３４のようではあるが、しかし塊中の非標的細胞その他の材料の排除という点で一層高純度のものである。やはり、機器１２は、容器１６の壁面上へ結合標的細胞を塊内へ捕獲することによって磁気的細胞分離を完了し、揺動アセンブリ１２６を二次的分離時間のための垂直位置へと動かし、そして、チャンバー２４を液抜きするようオペレータに信号を送る。もしも他の洗浄及び分離サイクルに従うべき場合には、オペレータは、チャンバー２４に新鮮な緩衝液を再充填するようアナンシエータ画面１４８上の指示によって指図される。好ましくは、標的細胞は、これらの洗浄／分離サイクルの完了時にはチャンバー２４が実質的に常磁性ビーズに結合した標的細胞及び未結合の常磁性ビーズのみを含有しているよう、３回の洗浄／分離サイクルに付される。
【００５１】
洗浄／分離サイクルが完了すると、オペレータは一次チャンバー２４に緩衝液を再充填しそしてポート３２を介して酵素キモパパイン等のような遊離材料を注入するよう指図される。キモパパインは、細胞のビーズへの結合を仲介しているタンパク質の酵素的分解によって、標的細胞を常磁性ビーズから遊離させる。遊離のための代わりの手段は、本発明の範囲内である。例えば、他の遊離材料としては、細胞のビーズへの結合を仲介している抗体／抗原結合部位において結合を求めて競合する、小さなペプチド、タンパク質その他の分子を含むことができよう。遊離手段のための他の例としては、細胞のビーズへの結合は、ビオチン／アビジンによって、ビオチン／抗ビオチン結合によって、又はビオチン類縁体／抗ビオチン結合によって仲介されていてもよい。この後者の場合には、遊離材料はビオチンであろう。
【００５２】
チャンバー２４は再び閉じられ、そして機器１２は、結合した標的細胞を酵素その他の解放材料と共にインキュベートするためにそして全ての又は実質的に全ての標的細胞を常磁性ビーズから遊離させるために、容器１６の内容物を攪拌する。この攪拌の完了後、一次磁石アセンブリ４００を前進させ、次いで２相磁気捕獲及び分離手順が反復される。しかしながら、この分離段階は、磁性ビーズを容器１６の壁面上に捕獲し、一方、未結合の標的細胞は緩衝液中に遊離した状態で残る。オペレータは、再び次の処理ステップを実施するよう信号を発する。
【００５３】
オペレータは、機器１２のアナンシエータパネルにより、一次チャンバー２４を、二次チャンバー７６を介して、図１に見られる製品受取容器１５６内へ液抜きするように指図される。二次磁石１３８は、その表面において少なくとも約7,000 ガウスの磁場強度を有し、従って、一次チャンバー２４を逃れた如何なる常磁性ビーズをも二次チャンバー７６内に強固に捕獲する。また、チャンバー７６を通る流れは、重力に逆らっており、そのことはまた、如何なるビーズもチャンバー７６を通過しないということを保証する助けとなる。従って、容器１５６に放出される製品は、標的細胞に富んでおり、且つ、非標的細胞及び常磁性ビーズを実質的に含まない。
【００５４】
再び、オペレータは、部分的に一次チャンバー２４を緩衝液で満たすようアナンシエータパネル１４８に指図され、次いで、機器１２は、常磁性ビーズの塊に捕らえられている標的細胞がその間に緩衝液中へ遊離するものである別の攪拌期間を実行する。攪拌期間に続いて、機器２０２を再び前進させ、そして図６の分離位置における分離間隔が、常磁性ビーズを捕獲する。オペレータは再び、二次チャンバー７６を介して製品受取容器１５６内へチャンバー２４を液抜きするよう命じられる。再び、常磁性ビーズが容器１６の壁面上に又は二次容器６８内に捕獲され、一方、標的細胞は、標的細胞の収率を増大させるよう、容器１５６へ放出される。好ましくは、容器１５６内に収集のために後に加えられるものである更なる標的細胞を遊離させるための一次チャンバー２４内における常磁性ビーズのこの洗浄は、少なくとも１回行われるが、望むならば数回行ってもよい。
【００５５】
今や図８に注目すると、二次磁石１３８及び二次容器のためのホルダー１４０が協働して二次容器の６８のための窪み２３８を規定していることが示されている。二次磁石１３８は、この窪み２３８のための平たい背後壁を規定し、一方、ドアアセンブリ１４２の窓部１４２ｂは、窪み２３８内へと但し二次磁石１３８に規定された背部壁の手前まで延びている、突出した６角形の部分２４０を規定する。この部分２４０は、二次磁石１３８によって規定された窪み２３８の背後壁と協働して、二次チャンバー内を通る常磁性ビーズの完全な捕獲を保証するよう、二次容器７６が二次磁石１３８に密接して平たい且つ薄い形態を維持することを保証する。
【００５６】
ホルダー１４０内へのチューブ５２及び８４の通過を許容するものとして先に述べたノッチ２４２、２４４は、部分的にはドア１４２の枠部１４２ａによってそしてまた部分的にはホルダー１４０のリム２４６によって規定されているのが見られる。ノッチ２４２、２４４は、ホルダー１４０のリム２４６を横切って窪み２３８内へと開いている。ドア１４２上において、ドア把手１４４は、内方へ延びたカム部２４８を含み、それは、把手１４４の外側部分が持ち上げられたときに二次磁石からの強い磁場に抗してドアアセンブリ１４２を開くために、リム２４６の下にある部分と係合する。ドアアセンブリ１４２の一部が磁性金属材料で作られていることから、ドアの他のラッチは必要とされない。更には、ドアアセンブリ１４２の枠部に設けられているノッチ２４２、２４４は、二次容器に隣接したチューブ部分５２及び８４を受け入れるために使用することができ、ドア１４２が閉じられているときこの容器を突出部２４０に保持する。
【００５７】
また、把手１４４及びカム部２４８によって提供される梃子作用は、ドア１４２を手で容易に開くのに十分遠くへと二次磁石１３８の強い磁場からドア枠１４２ａを動かすのを助る。ドア１４２及びカム部２４８を備えたドア把手１４４のこの構成はまた、二次容器６２を窪み２３８内へ組み込む際に重要な利点を有する。上述のように、二次容器６２は、本質的に、透明のプラスチックシート材料よりなる平たい封筒又はバッグのように作られている。この容器が窪み２３８内へ配置されてドア１４２が閉じられるとき、二次磁石１３８により、増大する磁気的引力がドアに対して作用する。しかしながら、ドア１４２がこの磁気的引力によって勢いよく閉まるということは、許されない。従って、把手１４４のカム作用は、容器６２が窪み２３８内に正しく配置されて、挟まれることのないことを保証しつつ、オペレータがゆっくりとドア１４２を閉じることを許容する。
【００５８】
半自動化された細胞分離工程の概観
図９を見ると、図２の使い捨て装置セットと共にそして人であるオペレータの参加を得て図１の機器１２によって実行される半自動化された細胞分離工程のための最上レベルの流れ図が示されている。図９を眺めると分かる通り、係員は参照数字２５０で示されているように機器１２を「オン」する。やはり２５０で示されているように、機器１２のための細胞分離工程サイクルを開始させるものである人である係員の行動はまた、前の細胞分離サイクルの終了時にキーパッド１５０において入力される「リセット」コマンドであることもできる。
【００５９】
工程のこの点において、数字２５２で一般的に示されているように、機器１２は、オペレータに機器１２の位置の較正を要求するよう促すであろう。そしてその要求は、キーパッド１５０において入力されると、上述のように、機器が「オン」に入れられた時に揺動アセンブリがたまたま占めている任意のから（又は図１に見られる垂直位置から）その水平位置（センサ１７８との整列へ至るスリット２２６の通過によって示されている）への機器１２による揺動アセンブリ１２６の回動式回転、一次磁石アセンブリ４００の引っ込み、及び図１に見られる垂直位置へ戻る揺動アセンブリ１２６の回動運動をもたらす。この時、一連の追加のプロンプトがオペレータに表示されている間、機器１２は待機もする。これらのプロンプトは、オペレータに、使い捨てセット１４の準備とその機器１２上への組み込み、バッグ１２０からの緩衝液によるこのセットのプライミング、バッグ１１８から一次チャンバー２４への細胞混合物の添加、及びポート３２を介した常磁性ビーズの添加を連続的に指図する。
【００６０】
この時、オペレータは、ブロッキング剤をポート３２を介して一次処理チャンバー２４内へ添加するようやはり促される。このブロッキング剤は、Gammagard TM(Baxter Hyland
) のようなプールしたヒトイムノグロブリン又は、ヒト血清アルブミン (Baxter Hyland)のような別のタイプのタンパク質濃縮物であってよい。この時点におけるブロッキング剤の添加は、標的細胞及び他の細胞が細胞混合物中において相互に接着することを防止するのに助けとなり、そして、非標的細胞の抗体とビーズへの非特異的結合を防止する。ここに使用される正の免疫磁気細胞分離工程からの生存力ある標的細胞の収率は、このブロッキング剤によって増大される。各活動の完了したとき、オペレータは、キーパッド１５０によって機器１２に示されたステップが完了したことを指示するよう指図される。次いで機器１２は、次の連続的プロンプトをオペレータに表示するか、又は、この活動への準備における人オペレータの活動が完了したときには、適当な場合にはいつでもそして制御装置１８２の制御に従って、磁気的細胞分離工程のそれ自身の部分を開始する。
【００６１】
要するに、機器１２によって実施される磁気的細胞分離工程の各ステップは、標的細胞を常磁性ビーズと結合させるための最初の混合、及び結合した標的細胞の最初の磁気的捕獲を含む。機器１２は次いで、チャンバー２４から緩衝液を抜くようオペレータを促すが、これはまた、バッグ１１８からチャンバー２４に最初に入った非標的細胞及び他の材料の大部分をもこのチャンバーから搬出する（工程のこの部分は、一般に図９において２５４で示されている）。廃棄物へと抜き取られるべき緩衝材料並びに他の材料は、図１において数字４２ａで示した廃棄物容器へと抜き取られる。
【００６２】
次に、機器１２及びオペレータは、実質的に全ての非標的細胞を一次処チャンバー２４から成功裏に除去するために、結合した標的細胞の一つの又は一連の洗浄を協働して実施する。これらの洗浄は各々、一次処理チャンバー２４への新鮮な緩衝液の添加、結合した標的細胞／ビーズ複合体の遊離（上述のように。そしてそれらは、以下「結合細胞」という）、並びに磁気的に捕獲された標的細胞の塊２３４中に捕獲された非標的細胞のこの新鮮な緩衝液中への遊離、短時間の混合、及び結合した標的細胞の磁気的な再捕獲、続いて一次チャンバー２４から容器４２ａ内への緩衝液及び非標的細胞のもう一回の液抜きを含む。この洗浄又は一連の洗浄は、図９において一般的に数字２５６で示されており、機器１２のマイクロプロセッサに基づく制御装置１８２のために予め選択された通りに可変の回数だけ反復することができる。より具体的には、各洗浄サイクルは、一般に、数字２５８で示された充填及び混合動作、及び図９において数字２６０で一般的に示された分離動作を含む。
【００６３】
実質的に全ての非標的細胞を一次処理チャンバー２４から除去するために標的細胞が一旦十分に洗浄されると、機器１２は、材料遊離開始シーケンスに入り（図９において２６２で示されている）、その間に機器１２は、再び新鮮な緩衝液をチャンバー２４に加えるよう、そして酵素キモパパイン等のような遊離材料を加えるよう、オペレータにプロンプトを提供する。この解放材料は、標的細胞を常磁性ビーズから分離する。工程のこの段階は、一般的に図９において数字２６２で示されている。
【００６４】
機器１２は、磁気捕獲された結合標的細胞を緩衝液中へ再び遊離させ、これらの細胞を更なる遊離材料を添加した緩衝液と攪拌して標的細胞と常磁性ビーズとを分離させ、そして再び時期的に常磁性ビーズを捕獲する（図９において２６４で示されている）。重要なことに、標的細胞（もはや常磁性ビーズに結合していない）は、緩衝液中に懸濁して止まる。
【００６５】
再び、オペレータは、緩衝液をチャンバー２４から抜くよう機器１２によって促される。しかしながら、今度は、緩衝液及び標的細胞を一次チャンバー２４から図１に見られる製品受器１５６内へと二次処理チャンバー７６を介して抜き取るよう指図されるであろう。上に指摘したように、この第２の処理チャンバーは、二次磁石１３８と連携して配置されている。結合していない標的細胞は、第２の処理チャンバー７６を通って製品受器１５６へと流れる。しかしながら、一次チャンバー２４において磁気捕獲を逃れて第２の処理チャンバー７６へと流れる如何なる常磁性ビーズも、磁気的にこのチャンバーにおいて捕獲される。その結果、製品受器１５６は、標的細胞に富んだ、そして実質的に非標的細胞及び常磁性ビーズを含まないものである緩衝液を受け取る。
【００６６】
今や機器は再びオペレータに新鮮な緩衝液をチャンバー２４に加えるよう指図し、そして磁気的に捕獲された常磁性ビーズを、ビーズの塊内に捕らえられた残りの標的細胞と共に、遊離させるであろう。これに、短時間の攪拌が続く。捕獲された常磁性ビーズのこの遊離及び攪拌時間は、一次チャンバー２４内に保持されている可能性のある標的細胞の実質的に全てを、新鮮な緩衝液内へ分布させる。これらの動作は、図９において参照数字２６６によって一般的に示されている。
【００６７】
その後、機器１２は、一次処理チャンバー２４内において常磁性ビーズを再捕獲する。しかしながら、この時には緩衝液中の標的細胞の濃度は今や遙に低いことから、常磁性ビーズの塊中にはほんの僅かな標的細胞が捕らえられるに過ぎない。機器１２は、一次処理チャンバー２４を製品受器１５６内へ第２の処理チャンバー７６を介して液抜きするよう、再び係員に信号を発する。これらの動作は、一般的に図９において数字２６８で示されている。
【００６８】
今度は、機器１２は、図９において数字２７０で示されている一時停止シーケンスに入り、その間に機器は、使い捨て装置セット１４を正しく閉じて、セット１４を機器１２から取り除き、そしてセット１４を処分するよう、係員を促す。この際に、オペレータは、機器１２を一時停止させるか又はリセットを命令して別の次の磁気的細胞分離工程のために機器を準備することができる（図９において数字２７２で示されている。）。
【００６９】
図１０〜１７を考察し、そして図９をも念頭において、使い捨て装置セット１４を伴ったそして人オペレータの時折の注意と連携した機器１２の操作の方法における詳細なステップが、示されている。これらの図において、工程への数個の入力は、「係員の義務＃ 」（「ＡＤ  ＃ 」と略す。）として参照されており、これらの義務は、係員のこれらの義務は、各々の場合に機器１２のアナンシエータ画面１４８によって促され、そして係員に、必要な動作の各々が完了したことを機器１２に対して入力キーパッド１５０を介して指示するように要求する。従って、工程へのこれらの「係員の義務」入力は、実際は画面１４８上に通告された要求と係員からの応答の結果である。機器１２は、これらの通告された要求、又はプロンプトを、そのプログラミングの一部として提供する。これらの動作の各々は、係員によって実施されるステップの形で下に記述されているが、各々は、機器１２による出力動作を表し、それに対して係員は単に応答し、そして機器１２に対してその動作が完了したことを検証する。
【００７０】
上に概括した特徴の重要な面のうちの一つは、係員が磁気的細胞分離工程における各段階を学ぶ必要が全くないということである。係員が完全な工程を学んだか否かに関わりなく、係員は、各々が異なった細胞分離工程段階にある機器１２の一団のような、各機器がある特定の時間に工程の何処にあるかを記憶するのを係員が非常に負担に思うことになるであろうような、この係員の注意を必要とする他の義務をも持つことができる。機器１２は、機器が実施しつつある完全な磁気的細胞分離工程を追跡し、そしてこの工程は、例えば工程の収率を最大にするために、その者の為にこの細胞分離が実行されているものである医者等のような監督者の意思によって変更することができる。従って、工程への各々の「係員の義務」入力は、機器１２による必然的結論としての出力プロンプトへの応答を表し、それに対して係員は機器に検証入力を提供しなければならない。
【００７１】
図１０を眺めると、機器準備シーケンス（２５２）が最初、機器１２による、図１及び４に見られる垂直位置への揺動アセンブリ１２６の配置を、そして、一次永久磁石２０２より構成されている一次磁石アセンブリ４００の、図４に見られる配置への引っ込めを含むことが分かる（図１０において数字２７４によって示されている）。これらの段階は、図２に見られるように、オペレータが機器１２上に使い捨て装置セット１４を組み込む（図１に見られるように）ために機器１２を準備する。機器１２は、セット１４上の全てのクランプを閉じるよう、バッグ１１８及び１２０をセット１４に接続するよう、使い捨て装置セット１４を機器１２に組み込むよう、排気クランプ３０を開くよう、セット１４を（バッグ１２０から接続チューブの全ての部分を通って一次チャンバー２４内への少量の緩衝液によって）プライミングするよう、細胞調製物をバッグ１１８から一次チャンバー２４内へ加えるよう、常磁性ビーズを一次チャンバー２４内へ加えるよう、望むならばブロッキング剤を加えるよう、チャンバー２４内の液体レベルを又はこの液体中の細胞濃度を望みのレベルへもたらすために計算量の緩衝液を加えるよう、セット上の全てのクランプを閉じるよう、そして排気クランプ３０を閉じるよう、そして最後に、機器上への装置１４の取付けを確認するよう、オペレータを促す。
【００７２】
上に指摘したように、機器１２は、これらのステップを個々に実施するようオペレータを促し、オペレータは、次のプロンプトが表示する前に適当な入力をキーパッド１５０上に行うことによって、各ステップを機器１２に検証する。これらの係員の義務は、図１０において集合的に「ＡＤ  ＃ 」といい、そのように略されており数字２７６で参照されている。図１０の２７８には、オペレータが促され、実行し、そしてキーパッド１５０においてオペレータ入力によってオペレータ義務の各々の実行を機器に検証している間、機器１２の機械的部分が待機していることが示されている。機器１２の制御装置１８２は、これらのプロンプトを画面１４８において提供し、キーパッド１５０において検証を受け取る。
【００７３】
ＡＤ  ＃１についての義務の最後の一つをオペレータが実施し検証したとき、機器１２は、制御装置１８２の制御の下で、磁気的細胞分離工程の最初の混合及び分離相（２５４）を開始する。この最初の混合及び分離相は、第１の数回の混合操作（数字２８２で示されている）、及び第１の数回の磁気的分離（一次チャンバー２４内における常磁性ビーズの磁気的捕獲）（図１０において数字２８４で示されている）を含み、それらは各磁気的細胞分離工程に際して機器１２によって実行されるであろう。
【００７４】
図１０を眺めると、混合及び分離工程が、単に以下の記述の便宜と簡潔さの目的で各々サブルーチン（数字２８６及び２８８でそれぞれ示されている）として示されていることがわかる。当業者は、大量の比較的低コストのプログラム可能メモリを備えた高速のマイクロプロセッサに基づく制御システムにおける現行の技術が、プログラムが単に類似の又は同一の動作を反復するためのコードの反復する行を含むということを示唆していることに気づくであろう。全プログラムは、次いで、サブルーチンが呼び出され、実行されそしてプログラムへの復帰が実行される間、プログラムの割り込みを実行するよりも寧ろ、逐次的に実行される。しかしながら、プログラムのためのこの構造は、一層多数のコード行につながり、そして本発明の目的のための説明には非常に負担となろう。従って、現在の目的のためには、機器１２は完全な細胞分離工程の間に幾つかの動作を完全に同じように又は実質的に、数回反復するということを認識しなければならない。反復される動作は、最初に実施されるときに動作の完全な記述を参照することによって、素早く理解するくことができる。動作が実質的に、しかし完全に同じではなく反復される場合には、違いのみが記述される。
【００７５】
図１１〜１３を見る間に上記を念頭において、混合ルーチン（２８６）が、図１１に最初に示されている。混合ルーチン２８６は、２９０で示されているように開始し、そして２９２に示されているように、値ｎの読み取りを含む。このｎ値は、ルーチンに、実施されようとする混合が最初のものか又は、細胞分離工程中に機器１２によって実施されるその後の類似の（しかし必ずしも同一ではない）混合操作のうちの一つであるかを告げる。最初の混合／分離については、ｎ値は「１」である。ルック・アップ・テーブル（図１２）は、混合ルーチンのための適正な値を提供する。Ｎｎは、揺動アセンブリ１２６が一次チャンバー２４の内容物を攪拌するために揺動される水平からの、各方向への度数である。Ｔｎは、一次容器２４の内容物の攪拌が揺動アセンブリ１２６の揺動によって続けられる、分で表した時間である。Ｒｎは、揺動アセンブリ１２６の揺動についての分当たりのサイクルで表した速度である。換言すれば、揺動アセンブリ１２６は、激しく前後に震盪されるか、又は穏やかに前後に傾けることができ、そしてチャンバー２４の内容物のための、如何なる望みの中間の混合速度も可能である。
【００７６】
２９４に示されているように、チャンバー２４の攪拌又は混合を実行するために、機器１２は最初に揺動アセンブリ１２６を図１及び４の垂直位置から、センサ１７８と整列したスリット２２６によって示されている水平位置まで回転させる。次に、２９６に示されているように、制御装置１８２が、揺動アセンブリ１２６を水平位置からモータ１７０についてのステップ数αだけ各反対方向に前後に揺動させ始める。α値は、Ｎｎ値をモータ１７０の動作についての0.6 °（完全な１ステップ）か又は0.3 °（半ステップ）の増分値で割り、そしてその結果に最も近い整数値をαに等しいと設定することによって得られる。揺動アセンブリ１２６の揺動は、図１を見て時計方向に始まる。揺動アセンブリは最初に垂直位置から離れてこの方向へ動くからである。揺動の速度は値Ｒｎを参照することによって制御され、期間Ｔｎの間持続する。期間Ｔｎの終わりに、混合ルーチンは図９及び１０に見られるプログラムに戻る。
【００７７】
直ちに、プログラムは、図１３に見られる別のルーチン（２８８）を呼出す。３００に示されているように、この別のルーチンは、開始してそして直ぐにｎ値を読み（３０２に示されている）、ルック・アップ・テーブル（図１２）から値Ｓｔ１ｎを取ってくる。この別のルーチン２８８は、混合ルーチンのための時間間隔Ｔｎの終わりの時にたまたま動いている如何なる方向にも揺動アセンブリの回動運動を持続させ、そしてプログラム可能な第１の分離位置において揺動アセンブリを滑らかに停止させるが、この位置は、好ましくは容器１６についての水平位置から反時計方向に（図１に見られそして図６に示されているように）５°である（この動作は、図１３に数字３０４で示されている）。揺動アセンブリ１２６についてのこの第１の位置を見出すために、制御装置１８２は、上述のように、５°をモータ１７０についてのステップ当たりの0.6 °で割った値に最も近似する整数ステップ数だけアセンブリ１２６を水平位置から反時計方向に、回動させる。
【００７８】
永久一次磁石２０２よりなる一次磁石アセンブリ４００は、次いで図６に見られる位置へと進められ、そしてオペレータに信号が送られる。この時、（図１３を参照して数字３０６によってＡＤ  ＃２として示されているように）オペレータは、バッグ１２０から少量の緩衝液をチャンバー２４内へ加えるよう、そしてセット１４のクランプを再閉鎖するよう促される。少量の緩衝液のこの添加は、一次容器１６の攪拌の間にチューブ３４内へ入り込んだ如何なる標的細胞及び常磁性ビーズをも、一次チャンバー内へ流し戻すのに有効である。オペレータがチャンバー２４へのこの緩衝液の添加を行っている間、図１３において数字３０８で示されているように、制御装置１８２は待機する。
【００７９】
ＡＤ  ＃２が完了したということを、図１３において数字３１０で示されているようにキーパッド１５０において適当なオペレータ入力（ＯＰＩ）を行うことによってオペレータが指示したとき、制御装置１８２は、図１３において数字３１２で示されているように、秒単位でＳt1n の値に等しい時間間隔の秒読みを開始する。この第１の分離位置は、プログラム可能な時間間隔Ｓt1n  (好ましくは30秒である) の間保持される。本出願は、下にある一次容器１６の壁へ向けての結合した標的細胞の重力による及び磁力による組合わさった沈降の影響により、結合した標的細胞の90％より多くを磁気的に捕獲するのに30秒という最初の時間間隔が十分であると判定した。
【００８０】
この時において、そしてもしも望むならば、チャンバー２４へのこの新鮮な緩衝液の添加の後にチューブ３４内に止まっている少量の新鮮な緩衝液を液抜きするよう動作をまた促してもよい。少量の新鮮な緩衝液のこの液抜きは、クランプ４４を開き、ほんの僅かな緩衝液を廃棄物容器内へ液抜きすることによって実行される。磁気的細胞分離工程の実施には必須ではないものの、この少量の液抜き操作は、クランプ４４の上方の排液チューブ４０中に存在し得る如何なる常磁性ビーズ又は非標的細胞をもＹ字形コネクタ３６から排除するのに有効である。
【００８１】
次に、図１３において数字３１４で示されているように、制御装置１８２は、一次磁石アセンブリ４００が前進位置に維持された状態で、揺動アセンブリ１２６を図１に見られる垂直位置へと回動させる。制御装置１８２は次いで、追加の分離時間間隔を図１２のルック・アップ・テーブルからのＳt2n に等しい分単位でカウント・ダウンする。本発明のこの第２の２相式磁気的分離の間に、図６にあったように、チャンバー２４内の残存の結合標的細胞が塊２３４中に捕獲される。この時間間隔Ｓt2n は、２分である。この時間間隔Ｓt2n の終わりに、制御装置１８２は、オペレータに信号を送り、次いで、図１３の数字３１６に示されているように、図９及び１０の主プログラムへの復帰を実行する。
【００８２】
図１０のプログラムリストに戻って、そしてこの図において数字３１８で示されているように、オペレータは今や、一連の動作（係員の義務＃３）を実行するよう促される。これは、排液クランプ４４を開き、排気クランプ３０を開き、チャンバー２４から液体を廃棄物容器内へと排液し（制御装置１８２は、チャンバー２４内の液体について図１２のルック・アップ・テーブルから、「廃棄物」又は「製品」の指定を得る）、そして排液クランプを再閉鎖することを含む。オペレータがこれらの義務を実行している間、図１０を眺めると数字３２０で示されているように、制御装置１８２は待機する。図１０の数字３２２で示されているように、オペレータがＡＤ  ＃３についてのそれらの義務を果たしそしてキーパッド１５０に適当な検証入力を行ったとき、制御装置１８２は、図９において２５６で示されているように、第１の洗浄充填／混合へと進む。
【００８３】
図１４の数字３２４で示されているように（ＡＤ  ＃４）、オペレータは、先ず、緩衝液クランプ６６を開きそしてチャンバー２４に緩衝液をレベル「Ａ」まで再充填するよう、全てのクランプを再閉鎖するよう、排気クランプ３０を再閉鎖するよう、及び装置の設定を検証するよう、促される。やはり、制御装置は、プロンプトのこのシーケンスを表示する間待機し（図１４において数字３２６で示されている）、オペレータが、最後の検証を入力したとき（図１４の数３２８に示されている）、制御装置１８２は、一次磁石アセンブリ４００を引っ込め（この動作は、図１４において数字３３０で示されている）、そして、次の「混合」操作（図１４の数３３２）の入力時に、ｎ値を１だけ増分する。この混合操作は、ルーチン２９０を呼び、それは図１２の表から得られた該値で反復される。こうして、各混合操作は、個々の事象として理解され、それについての好ましい値は、図１２の表に示されているが、しかしそれらの値は、機器１２の使用者の意図に従って変更することができる。
【００８４】
次に、制御装置１８２は、洗浄分離動作（図９の数字２６０を参照）に入り、分離ルーチン３００を呼出し、そしてこのルーチンを、現在のｎ値に従って図１２の表からの適切な値を得て実行する。図９に見られ且つ図１３のＡＤ  ＃２を参照して論じられている数字２５４の最初の混合分離のみが、Ｙ字形コネクター３６からの少量の緩衝液の排液を含むということに注意しなければならない。もしもこの選択肢が工程に含まれているならば、制御装置１８２はオペレータにこの排液操作をｎ＝１のときにのみ実行するよう促し、そして、分離ルーチンの全ての後に続く使用については、この排液操作をオペレータプロンプトから省く。
【００８５】
図１４の数３３６に示されているように、オペレータは、今や義務（ＡＤ  ＃５）（図１０を参照して上に論じたＡＤ  ＃３、数字３１８についての義務と同じである）を実行するよう促される。やはり、制御装置１８２は、待機し（図１４の数字３３８）、そして磁気的細胞分離工程の次の相へ進む前に、一連の検証を受け取らなければならない（図１４の数字３４０）。
【００８６】
図９及び１４の両方において数字３４２で示されているように、機器１２の監督的使用者は、条件的な枝分かれした決定のための値を入力する機会を有する。この条件的な枝分かれした決定は、洗浄充填／混合、及び洗浄分離ステップが一回のみ又は反復して実施されることを許容する。好ましくは、この洗浄充填／混合及び洗浄分離ステップ（２５８、２６０）は、３回反復される。しかしながら、機器１２の使用者の好むところに応じて、これらのステップは２回のみ反復してもよく、又は３回より多く反復してもよい。図１２のルック・アップ・テーブルに注意すれば、この典型的な表が３つの同一の洗浄充填／混合、及び洗浄分離ステップを含んでいることが示されるであろう。しかしながら、機器１２の監督的使用者は、ステップ２５８、２６０のために表中へ異なった値を入力してもよく、そして、単に条件的分枝２４２におけるこの優先を指示しそして図１２のルック・アップ・テーブルの優先的デフォールト値を用いないならば望みの値を表１２に入力することによって、これらのステップを３回より多く反復させてもよい。代わりとして、機器１２は、オペレータがこれらの洗浄の速度、時間間隔、及び他のパラメータを変更する機会を与えられていてさえも、常に３回の洗浄を実行するようにプログラムしてもよい。尚も代わりとして、機器１２は、オペレータが動作それらの動作についての及びパラメータ値をキーパッド１５０において入力することのできるものである手動モードが備えられていてもよい。
【００８７】
次に、制御装置１８２は、遊離材料初期設定シーケンス（図９の数字２６２）に入る。このとき、オペレータは、義務（図１５において数３４４で示されたＡＤ  ＃６）を実行するよう促されるが、これは、新鮮な緩衝液によるレベル「Ｂ」までのチャンバー２４の充填、クランプの再閉鎖、及びポート３２を介したチャンバー２４への酵素材料の添加を含む。以前のように、制御装置１８２は、一連のプロンプトが表示され、各動作が完了したことをオペレータが検証（図１５の数３４８）する間、待機する（図１５において数３４６で示されている）。制御装置１８２は、次いで、図１５の３５０で示されているように一次磁石アセンブリ４００を引っ込め、そしてオペレータにＡＤ  ＃７を実行するよう促す。この動作は、単に、オペレータが排気クランプ３０を閉鎖することと、そして装置１４の取付けをチェックすることを含むだけである。やはり、制御装置１８２は、ＡＤ  ＃７が実施されたというオペレータからの検証（３５６）を待つ（３５４）。
【００８８】
図１５の数字３５８及び３６０で示されているように、制御装置１８２は次いで他の混合動作を実施し、表１２から適切な値が選択されるよう、再び増分されたｎの値を得て別の分離動作がこれに続く。これらの混合及び分離動作は、図９において数字２６４で示されている。遊離材料分離動作の終わりにおいて、図１５の数字３６２によって示されているように、オペレータは、ＡＤ  ＃８を実行するよう促される。この一組の係員の義務には、オペレータが製品容器１５６を準備する（そして必要ならば接続する）こと、製品クランプ６４、６６（図２を想起）のうちの適切なものを開くこと、排気クランプ３０を開くこと、そして液体製品を標的細胞と共にチャンバー２４から製品容器１５６内へと、二次容器２８のチャンバー７６を介して排液することが含まれる。チャンバー２４の液抜きの完了したとき、オペレータはまた、先に開いた製品クランプを再び閉じるよう促される。やはり、工程中を進む前に、容器１８２は待機し（３６４）、そして各動作の完了の検証を得なければならない（３６６）。
【００８９】
今や、制御装置１８２は、図９に示されているように、製品洗い出し充填／混合、及び製品洗い出し分離ステップ（それぞれ、２６６及び２６８）に入る。図１６の数字３６８に見られるように、オペレータは、制御装置１８２によってＡＤ  ＃９を実行するよう促される。この一組の係員の義務は、オペレータが、新鮮な緩衝液でレベル「Ａ」までチャンバー２４を再充填し、そして緩衝液クランプを再閉鎖することを要求する。制御装置１８２は待機し（３７０）、そして工程中をさらに進む前に、ＡＤ  ＃９が完了したことの検証（３７２）を必要とする。
【００９０】
ＡＤ  ＃９の実行の間、オペレータが緩衝液を一次チャンバー２４内へ加えているとき、制御装置１８２は、一次磁石アセンブリ４００を引っ込める。好ましくは、一次磁石アセンブリ４００の引っ込みは、チャンバー２４への緩衝液の再充填の約30秒に行われる。一次チャンバー２４の再充填が開始された後であるが再充填の完了する前における、一次磁石アセンブリ４００のこの引っ込みは、２つの重要な利点を有する。第１に、チャンバー２４のこの部分的な緩衝液充填は、標的細胞及び常磁性ビーズが遊離されるときそれらが容器１６の底壁２２へと落下して当たらないように、液体クッションを提供する。第２に、一次磁石アセンブリ４００の引力による標的細胞及び常磁性ビーズの磁気的遊離の後に緩衝液の添加を続けることにより、緩衝液の流入が標的細胞を常磁性ビーズから分離するのに、及び細胞を捕獲しており得るこれらのビーズの凝集をほぐすのに、助けとなる。一次磁石アセンブリ４００のこの引っ込みは、ＡＤ  ＃９の必要なオペレータ入力（ＯＰＩ’ｓ）（その入力は、チャンバー２４への緩衝液の再充填が開始したことを示す）のうちの一つをオペレータが供給した後、選ばれた時間の間（好ましくは約30秒）制御装置１８２によって命令される。
【００９１】
ＡＤ  ＃９義務の完了及び一次磁石アセンブリ４００の引っ込みに続いて、制御装置は、オペレータにＡＤ  ＃１０（図１６において数字３７６で示す）を実行するよう要求し、やはりこの動作が実行されている間（図１６の数字３７８）待機し、そして動作が完了したことの検証（数字３８０）を要求する。ＡＤ  ＃１０についての動作は、単に、オペレータが、全てのクランプを再閉鎖し、排気クランプ３０を再閉鎖し、そして再び装置の取付けをチェックすることを要求する。制御装置１８２は次いで、図１２の表から適切な値が選ばれるよう１だけ増分したｎ値を以て、混合ルーチン２９０を用いて一次容器１６の内容物を混合する（図１６の３８２）。
【００９２】
製品洗い出し混合（３５２）の完了時、制御装置１８２は、分離ルーチン３００の使用により、常磁性ビーズを容器１６の壁上へもう一度分離する（３８４、図１６）。これは、常磁性ビーズを一次チャンバー内に捕獲し、緩衝液が追加の標的細胞と共に再び製品容器１５６内へ排液されることを許容する。これらの動作は、制御装置１８２が待機（３８８）し、この動作が完了したことの検証を要求（図１６の３９０）している状態で、ＡＤ    
【００９３】
＃１１において促される（図１６における数字３８６を参照）。
最後に、制御装置１８２は、図９の２７０に示されている一時停止シーケンスに入る。図１７を眺めると、この一時停止シーケンスが、この図の数字３９２で参照される一組の係員の義務、ＡＤ  ＃１２を含むことが分かる。この係員の義務は、使い捨て装置セット１４上の全てのクランプを閉じること、及び装置セット１４を機器１２から除去することを含む。前と同様に、制御装置１８２は待機し（３９４）、そして、係員についての各動作が完了したことの検証を要求する（３９６）。オペレータは、セット１４、廃棄物容器４２ａ、を正しく処分するよう訓練され、それらを有害な生物学的廃棄物として取り扱うであろう。次に、別の磁気的細胞分離工程が現在実施されることになっているならば、制御装置１８２は、オペレータが一層容易に使い捨ての装置１４の新しいセットを機器１２に組み込むことができるよう、一次磁石アセンブリ４００を引っ込める（３９８に示されている）。今やオペレータは、図９が上において最初に考察されたときにそれに関して指摘されているように、機器１２を「オフ」にし、又は、全プログラムシーケンス及び磁気的細胞分離工程を再び開始させるリセット操作を選択する。
【実施例１】
【００９４】
骨髄吸引物からのＣＤ34＋幹細胞の単離
白血球の濃縮された低密度画分（造血単核球（ＭＮＣ）としても知られている）を、ヒト患者及び健常提供者の骨髄吸引物から慣用の手段で分離した。サンプル中の細胞は、遠心によって分離したFicoll/Histopaque (Sigma) によって分離し、境界バンドからの単核球を収集した（Smith, S.L., et al., Exp Hematol 20:870-877, 1993)。特定のＭＮＣサンプルは、その骨髄を患者に投与するに先立って、医者によって、滅菌ガーゼ及び／又はステンレススチールスクリーンを通す濾過に付した。特定の前臨床実験については、捕獲されたＭＮＣをスクリーン及び／又はガーゼから回収した。他の実験のためには、未濾過の骨髄吸引物のＭＮＣが使用された。
【００９５】
細胞の感作：
ＭＮＣ濃縮物中の標的ＣＤ34＋細胞を、抗ＣＤ34抗体で「感作」した。抗ＣＤ34抗体は、「抗Ｍｙ１０」としても知られているが、ＡＴＣＣ（Rockville メリーランド州）に寄託されているハイブリドーマ＃ＨＢ−8483によって分泌されるモノクローナル抗体として、米国特許第4,965,204 号 (Civin)に記述されている。感作ステップの間に、抗ＣＤ34抗体が、標的細胞上のＣＤ34抗原に特異的に結合する。単核球をゆっくり（４回転／分）回転させつつ、30分間２〜８°にて、細胞106 個当たり0.5 μｇの抗ＣＤ34抗体と共にインキュベートした〔血清不含細胞培養（Baxter Hyland, Hayward、カリフォルニア州) によって調製された抗ＣＤ34  ＃9069〕。細胞は、次いで、残存の未結合抗体を除去するために３回洗浄される。
【００９６】
常磁性マイクロスフィアの調製：
羊抗マウス抗体で被覆したDynal TM常磁性マイクロスフィア（ビーズ）を、緩衝液10ｍ
Ｌ中にビーズ４×109 個の濃度にてIsolexTM300 キットと共に準備した。Dynal TMビーズ
を、ビーズ懸濁液中に存在する0.2 ％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液を除去するために、３回洗浄した。
【００９７】
Dynal TMビーズと感作細胞との混合
洗浄した細胞、洗浄したビーズ、及び濃縮したヒトＩｇ（Gammagard TM) の調製物を、
IsolexTM300 の一次チャンバー内へ導入した。（Gammagard TMは、細胞の非特異的結合を
減少させるために加えられるヒトのイムノグロブリンの濃縮物である。）
【００９８】
IsolexTM300 の操作：
IsolexTM300 磁気的細胞分離器は、オペレータに、連続的に混合しつつ室温にて装置上
30分間のインキュベーションを実施するよう促した。幹細胞上のマウスモノクローナル抗ＣＤ34抗体に対するビーズ表面上のヒツジ抗マウス抗体の結合によるロゼットを形成して、ビーズは各ＣＤ34＋細胞の周りに房状になった。
【００９９】
非標的細胞からのビーズ／ロゼットの分離：
混合後、IsolexTM300 の予めプログラムされた操作に従って、非標的細胞が重力流れに
よりチャンバーから予め接続された1000ｍＬ移し替えパック内へ流れ出るのを許容しつつ、ビーズ／ロゼットを磁気的にIsolexTM300 の一次チャンバー内に保持した。
【０１００】
ビーズ／ロゼットの洗浄：
非標的細胞を除去した後、３回の洗浄サイクルを実施した。オペレータは、機器上に標記されたプロンプトに従ってこの３回の洗浄サイクルを開始させた。該1000ｍＬの移し替えパック内に、非標的細胞と共に洗浄緩衝液を収集した。このパックの内容物を、捕獲効率を測定するためにアッセイした。
【０１０１】
ビーズからの細胞の遊離：
ChymoCell-T TM（ChymoCell-T TMは、Boots, Ltd, 英国、によって供給されている臨床グレードのキモパパインである）を用いた酵素的消化によって、Dynal TMビーズから細胞
を遊離させた。ChymoCell-T TMは、IsolexTM300 キット中に提供された滅菌水で復元させ
、次いで、ビーズ／ロゼット及び緩衝液を含有するIsolexTM一次チャンバー内へ、注射部
位を通した無菌的注射によって導入した（最終のキモパパイン濃度＝200 単位／ｍＬ）。オペレータプロンプトは、持続的攪拌を伴う15分の室温インキュベーションを導いた。ビーズを次いで磁気的に一次容器内に保持し、一方、ＣＤ34＋標的細胞は二次磁石上へと通過し、最終の収集容器内へ収集された。
【０１０２】
細胞集団の表現形解析：
ビーズから遊離された細胞を、次いで、記述されているようにして（Smith, S.L., et al., Exp Hematol 21:870-877, 1993)、ＣＤ34に対するFITC-8G12 モノクローナル抗体（Baxter Immunotherapy Division, Irvine カリフォルニア州）で氷上15分間染色しそしてFACScan TMフローサイトメータ (Becton Dickenson, San Jose, カリフォルニア州）で定
量することによって、ＣＤ34＋純度について評価した。
【０１０３】
結果：
骨髄吸引物（３）及び骨髄スクリーンサンプル（５）からの合わせた結果を、下の表１に示す。
【０１０４】
表１
出発ＣＤ34＋細胞：    1.10  ±  1.19％  （範囲0.16〜3.48）
最終ＣＤ34＋細胞：    73.0  ±  19.5％  （範囲42.8〜88.0）
％収率：              50.1  ±  21.8％  （範囲18.0〜79.7）
濃厚化倍数：          146   ±  116     （範囲25〜296 ）
【０１０５】
更なる３つの骨髄吸引物サンプルからの個々の結果を下の表に示す。
【０１０６】
表２
出発ＭＮＣ
全細胞            ９×109   １×1010    １×1010
％ＣＤ34＋細胞      1.56      2.12        1.4 
ＣＤ34＋細胞単離
全細胞            4.9 ×107   1.09×108   5.7 ×107 
％ＣＤ34＋細胞      73.8        76          72
【実施例２】
【０１０７】
単離されたＣＤ34＋細胞によるコロニー形成
いくつの個々の細胞が増殖して一層分化した細胞のコロニーを形成する能力を有するかを判定するために、標準のコロニー活性を実施した。
要するに、５×104 個の細胞（分離前）又は５×102 個の細胞（分離後）を、各35ｍｍの皿中において、ＩＭＤＭ、予めスクリーンされた胎仔牛血清、及びメチルセルロースを含有する１ｍＬの培地（Terry Fox Laboratory) 中に播種した。コロニー刺激活性は、Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３，ＩＬ−６及び幹細胞因子（皿当たり20ｎｇ）によって提供した。ＣＦＵ−ＧＭ（50個以上の細胞よりなる無色のクラスター）、ＢＦＵｅ（50個以上の赤い細胞よりなるクラスター）、及びＣＦＵ−Ｍｉｘ（両方の形態を有するコロニー）を、逆転した顕微鏡を用いて培養14日後に採点した。
【０１０８】
結果：
２つの隔離した実験からの細胞によるコロニー形成を平均した（下の表３を参照）。
【０１０９】
表３
104 細胞当たりのコロニー
ＣＦＵ−Ｍｉｘ    ＣＦＵ−ＧＭ    ＢＦＵｅ
選択前              14                33              9 
ＣＤ34＋選択後     713              3413            303 
──────────────────────────────
濃厚化倍数          51               104             56 
【実施例３】
【０１１０】
動員した末梢血サンプルからのＣＤ34＋細胞の選択
提供者をＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、又はＧ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦで処理した。この処理は、骨髄から末梢血への幹細胞の「動員」を刺激し、従って末梢血サンプルから得られる幹細胞の数を大きく増加させる。
白血球を供血者から収集し、ＣＤ34＋細胞を上の実施例１に記述したように単離した。上に記述したようにFACSにより細胞集団をＣＤ34＋発現について分析した。
【０１１１】
結果：
17の実験からの結果を下の表４に示す。
【０１１２】
表４
％ＣＤ34＋          ％収率
ＭＮＣ選択前          0.47  ±  0.33
（範囲0.4 〜1.5 ）
単離ＣＤ34＋細胞      73.2  ±  10.7      40.8  ±  16.1
（範囲58.3〜92.0）  （範囲16.4〜67.5）
【実施例４】
【０１１３】
末梢血から単離されたＣＤ34＋細胞によるコロニー形成
動員した末梢血からの細胞集団（上記実施例３）を、標準のメチルセルロースアッセイ（上記実施例２）においてコロニー形成能につきアッセイした。
【０１１４】
結果：
３つの単離実験からの結果が下の表５において平均されている。
【０１１５】
表５
104 細胞当たりのコロニー
ＣＦＵ−Ｍｉｘ    ＣＦＵ−ＧＭ    ＢＦＵｅ
選択前              12                15              5 
ＣＤ34＋選択後     575              2366            365 
──────────────────────────────
濃厚化倍数          54               156             89 
【実施例５】
【０１１６】
ＣＤ34＋細胞単離物からのＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）の枯渇
異系同種移植を意図する骨髄からは、Ｔ細胞を枯渇させることが望ましい。提供された骨髄からのある主のＴ細胞は、移植された細胞集団中のリンパ球が免疫反応を受け手側の組織に対して起こすものであるＧＶＦ疾患の部分的原因であると考えられている。細胞表面の抗原ＣＤ３は、Ｔ細胞に特異的であり、移植集団内のＴ細胞の数を推定するためのマーカーとして使用することができる。
ＣＤ34＋細胞を選択するために、骨髄サンプルを、実施例１に記述されているようにしてIsolexTM300 で処理した。
Ｔ細胞を枯渇させるためのある古い方法は、赤血球ロゼット／大豆アグルチニン法（E rosette/SBA) (Frame, J.N., et al., 1989, Transplantation 47:984-8; Reisner, Y., et al., 1981, Lancet 2:327-31; Reisner, Y., et al., 1980, Lancet 2:1320-4)によるＣＤ３＋細胞の選択的沈殿を伴う。この方法は、完了までに一般に16〜18時間の技術的注意を必要とする。
IsolexTM300 によるＣＤ34＋選択の前後の骨髄サンプルを、FACS分析によりＣＤ３抗原
についてアッセイした。同様に、E rosette/SBA 法によってＣＤ３＋細胞を枯渇させた骨髄サンプルを、ＣＤ３抗原についてFACS分析によりアッセイした。
【０１１７】
結果：
５つの骨髄サンプルからの結果を下の表６に平均してある。
【０１１８】
表６
ＣＤ３＋細胞／ｋｇ    対数枯渇
ＣＤ34＋細胞／IsolexTM300     2.2 ×104         2.73±0.28
E rosette/SBA 枯渇細胞        9.86×105         1.41±0.35
【０１１９】
結論
IsolexTMによるＣＤ34＋細胞の選択は、一層分化した造血細胞へと増殖する能力を有す
る幹／前駆細胞の濃厚化した集団を与える。更には、望ましくないＴ細胞は、IsolexTMに
よるＣＤ34＋選択によって集団から枯渇される。
【実施例６】
【０１２０】
ＣＤ34＋を濃厚化させた自家骨髄移植物の造血能力
乳癌患者から収穫した骨髄を、実施例１に記述されているように処理して、単核球（ＭＮＣ）の懸濁液を作った。収穫されたＭＮＣの２つの部分を、ＭＮＣ移植及びバックアップのために冷凍保存し（各々１×108 細胞／ｋｇ）、一方、残りを、ＣＤ34＋選択のために、実施例１に記述されているようにして本発明のIsolexTM300 免疫選択法を用いて処理
した。選択されたＣＤ34＋細胞を、続いて冷凍保存した。処理した８つの骨髄サンプルのうち、選択された製品ＣＤ34＋細胞の純度は56〜89％（平均＝77％）の範囲にあった。選択された細胞は、ＣＤ34＋細胞について47乃至72倍（平均＝59）濃厚化されており、そして30〜72％（平均＝48）のＣＤ34＋細胞の回収をみた。製品中の夾雑のＣＤ34陰性細胞は、主としてＣＤ19＋Ｂ細胞（22〜27％）よりなり、ＣＤ３＋Ｔ細胞は非常に少なかった（１〜８％）。
４名の患者に注入されたＣＤ34濃厚化細胞移植物の前駆細胞回収及び造血能力を、in vitro前駆細胞アッセイ及び長期造血培養（ＬＨＴＣ）にて評価した。ＣＤ34選択細胞（全前駆体におけるそれらの含量において31〜68倍（平均＝53倍）に濃厚化されている）は、89％のＣＦＵ−ＧＭ並びにＭＮＣ中に存在する全前駆体を生み出し、そして8.7 乃至12.4×104 個の全前駆体／ｋｇ（平均＝10.8×104 ）を与えた。新しく単離された又は冷凍保存されたＣＤ34濃厚化細胞によって開始したＬＴＨＣにおいて、前駆体の産生は、43日まで続き、ＣＦＵ−ＧＭに数において12倍までの増加を与えた。患者は、ＣＤ34濃厚化細胞の移植物において3.8 乃至10×105 個のＣＤ34＋細胞／ｋｇ（平均＝6.7 ×105 ）を受け取り、そして絶対的顆粒球カウント500 ／Ｌまで、中位時間で19日（範囲15〜21日）で植えつけられた。冷凍保存したＭＮＣ又は冷凍保存したＣＤ34濃厚化骨髄細胞の何れによる移植後も、如何なるリンパ球造血系列の免疫復元の速度にも何ら差は見られなかった。これらのデータは、本発明の方法によって単離されたＣＤ34濃厚化細胞が、それらの完全な造血能力を保持し、自家骨髄移植を患者に適切な幹細胞移植を提供したことを示唆している。
【実施例７】
【０１２１】
完全骨髄又は選択されたＣＤ34＋細胞による自家骨髄移植による植付け
自家骨髄移植（ＡＢＭＴ）を受けた、前後の高投与化学療法を受けている乳癌患者を、サイクル１又はサイクル２において完全骨髄又はＣＤ34＋濃厚化細胞の何れかを投与されるように、ランダム化した。高リスク段階ＩＩ、ＩＩＩＢ、又は以前に治療を受けた段階ＩＶの乳癌の患者が、２〜４×108 細胞／ｋｇの骨髄採取を受けた。収穫を３つの部分に分けた。１サイクルの療法のための１×108 細胞／ｋｇ、バックアップとしての１×108 、そして残りは、ＣＤ34＋選択のために実施例１に記述したようにして処理した。患者は次いで２つの計画されたシクロホスファミド、カルボプラチン、及びエトポシドのサイクルのうちの最初のものを受け、続いて骨髄又はＣＤ34＋選択細胞の何れかを代わりのサイクルにおいて注入された。移植後、Ｇ−ＣＳＦを与えた。４名の患者において、採取された細胞の中位数は、3.94×108 有核細胞／ｋｇ（範囲2.63〜7.01）であった。注入されたＣＤ34濃厚化細胞の中位数は、8.61×105 ＭＮＣ／ｋｇ（範囲6.35〜18.0）であった。完全骨髄収穫中のＣＤ34＋細胞の中位パーセントは、1.13％（範囲0.82〜1.38％）であり、選択細胞のそれは63.4％（範囲56.9〜73.8％）であった。完全骨髄を与えられたサイクルについて、全ての患者は15日（範囲10〜20日）という、そしてＣＤ34選択細胞によるサイクルについては19日（範囲15〜21日）という中位時間で絶対的顆粒球カウント500 ／μＬまでに植えつけられた。血小板植付けまでの時間：骨髄については38日（範囲30〜43日）、ＣＤ34選択細胞については29日（範囲27〜34日）。骨髄サイクルについての入院の期間：24日（範囲22〜32日）、ＣＤ34選択サイクルについては26日（範囲25〜29日）。必要なパック赤血球輸血及び血小板輸血の数は、２つの治療の間で同等であった。結論として、ＣＤ34＋選択細胞は、完全骨髄移植の植付けと同等の植付けを与えた。更には、ＣＤ34＋選択細胞の注入は、移植物中の腫瘍細胞の負荷を減少させ、そして注入細胞の体積を減少させる。注入細胞の体積の減少と共に、細胞の回答及び注入に先立って冷凍保存剤として使用される注入ＤＭＳＯ体積の減少もある。
本発明は、本発明の特定の好ましい具体例を参照して描かれ、記述され、そして規定されているが、そのような参照は、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、そのようないかなる限定も推測してはならない。本発明は、当業者に行われるようなかなりの修正、変更、及び形態及び機能における均等物が可能である。描かれ且つ記述された本発明の好ましい具体例は、単に模範例に過ぎず、本発明の範囲を尽くしているものではない。従って、本発明は、全ての面において均等物に対する完全な認識を与えている添付の請求の範囲の精神及び範囲によってのみ制限されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明において使用される組み合わさった磁気的細胞分離装置の前方向透視図を提供し、該組合わさった装置は、半自動機器、及び永久的に相互接続されたチューブ及び連携した弁及び継手を備えた処理チャンバーの使い捨て装置セットを含む。
【図２】本発明において図１の機器と共に使用するための使い捨て装置セットの、構造及び種々の部品の相互接続をより良く描くために恰も卓上に並べられたようにして示した、透視図を提供する。
【図３】図１に見られる機器の機構、モータ、制御回路、及びオペレータ入力／出力装置の図式的表現である。
【図４】図１の平面４−４においてとった、そして該機器の動作部品が代わりの動作位置に示されている状態の部分的断面図を提供する。
【図５】図１に見られる機器の一部分の図式的な部分的表現であり、該機器の一部によって提供される振動する揺動を実線及び破線で描く。
【図６】図１に見られる機器の一部分の図式的な部分的表現であり、磁気的細胞分離の工程の一段階を実施するための選択的に配置された機器部分を描く。
【図７】図１に見られる機器の別の図式的表現を提供する。
【図８】図解の明瞭さのために機器の部品が代わりの作動配置に示されている状態の、図１の機器の部分的な透視図である。
【図９】図１〜８の機器及び装置と共に実行される本発明の半自動化された工程の最上レベルの流れ図を提供する。そして
【図１０】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１１】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１２】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１３】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１４】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１５】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１６】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１７】係員を伴って図１の機器によって及び図２の使い捨て装置によって実行される半自動化された工程の高レベル流れ図の連続的断面を提供し、該流れ図は、図９の最上レベルの下のレベルに位置する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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