(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞中の細菌起源の細胞結合した外層膜蛋白質の単離方法であって、
（ａ）細胞結合した蛋白質を含む微生物細胞の懸濁液を二価のカチオンを含む物質と接触させて加熱する前に綿毛状の塊を形成させ；
（ｂ）その綿毛状の塊をその懸濁液より取り出し；
（ｃ）その綿毛状の塊を加熱して、上記した蛋白質を微生物細胞から離すことを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、蛋白質の単離工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記した接触工程および取り出し工程を繰返す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物細胞中の細菌起源の細胞結合した外層膜蛋白質の単離方法であって、
（ａ）細胞結合した蛋白質を含む微生物細胞の懸濁液を二価のカチオンを含む物質と接触させて加熱する前に綿毛状の塊を形成させ；
（ｂ）その綿毛状の塊を加熱して、上記した蛋白質を微生物細胞から離すことを特徴とする方法。
【請求項５】
さらに、蛋白質の単離工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
細胞結合した蛋白質がボルデテラ、ヘモフィルス、エシュリキア、ストレプトコッカスまたはボレリア種の外層膜蛋白質である請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
外層膜蛋白質がボルデテラ・ペルツッシスの69kD蛋白質である請求項６記載の方法。
【請求項８】
二価のカチオンを含む物質がバリウム、カルシウムまたはストロンチウム塩である請求項４記載の方法。
【請求項９】
塩が塩化バリウムである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞結合した蛋白質をpHが４〜10の範囲にある上清に懸濁させる請求項４記載の方法。
【請求項１１】
細胞結合した蛋白質がボルデテラ、ヘモフィルス、エシュリキア、ストレプトコッカスまたはボレリア種の外層膜蛋白質である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
外層膜蛋白質がボルデテラ・ペルツッシスの69kD蛋白質である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
二価のカチオンを含む物質がバリウム、カルシウムまたはストロンチウム塩である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
塩がハライドである請求項13記載の方法。
【請求項１５】
塩が塩化物である請求項14記載の方法。
【請求項１６】
塩が塩化バリウムである請求項15記載の方法。
【請求項１７】
細胞結合した蛋白質をpHが４〜10の範囲にある上清に懸濁させる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は抗原成分因子または無細胞ワクチンとしての有用性を有する細胞蛋白質の新規単離方法に関する。特に、本発明は細菌の外層膜蛋白質、例えばボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）の外層膜蛋白質であって、約69,000ダルトンの分子量を有し、通常、ボルデテラ・ペルツッシスの69kD蛋白質またはペルタクチン（pertactin）と称される蛋白質の新規抽出方法に関する。
百日咳は、主に子供を冒す高感染性疾患である。呼吸併発症の原因となることに加えて、百日咳は、特に社会経済性の低い層にある子供および母性抗ペルツッシス抗体を有しない新生児にて神経障害および高死亡発生率をもたらす。百日咳の病原菌はグラム陰性球桿菌、すなわちボルデテラ・ペルツッシスである、該細菌は呼吸管を冒し、その消滅後、数日後になってさえ、残存する毒性症状を誘発すると考えられる。
該疾患は、一般に、ボルデテラ・ペルツッシス菌を醗酵槽中にて増殖させ、ついで得られた細胞を加熱処理および／または化学薬剤の添加により不活性することにより調製される「全細胞」ワクチンを用いる免疫処理によって制御される。世界保険機構は、現在、百日咳の発生および蔓延を防止するのに乳児を免疫処理することを推進しているが、多価ワクチン処方に由来して報告されている副作用に対して懸念が生じている。その結果として生じる従来のビー・ペルツッシスワクチンの使用の減少は、百日咳感染症の発病率の増加をもたらした。全細胞ワクチンに由来して報告されている副作用を回避する百日咳ワクチンについて、その必要性が認識されている。したがって、少数の高純度抗原蛋白質成分からなる効果的な無細胞ワクチンの開発に、かなりの研究努力が注がれている。
例えば、リンパ球増多因子（LPF）を含め、さらにヒスタミン感作因子、島活性化蛋白質または、より一般的には百日咳トキシン（PT）、線状血球凝集素（FHA）および線毛凝集原として知られている多くの抗原が無細胞ワクチン成分として提案されている。
別の可能性のある抗原は、ビー・ペルツッシスのすべてのビルレント菌株に見られる約69,000ダルトンの分子量を有する、細胞の外層膜蛋白質の一つ（ペルタクチン）である。ビー・ペルツッシス69kD蛋白質は、ヒト病原体のビー・パラペルツッシス（B.parapertussis）および動物病原体のビー・ブロンキセプティカ（B.bronchiseptica）により産生される免疫学的に関連する類似蛋白質であり、電気泳動移動性においてわずかな違いを有する。69kD蛋白質は、ビー・ペルツッシスの培養の間、醗酵ブロスに比較的少量にて分泌されるが、その大部分は細胞膜に付着し、69kD蛋白質はその細胞膜から容易に抽出されることが判明している。しかしながら、69kD蛋白質の抽出および精製について公開されている操作は、高純度の安定した抗原の大規模な商業的生産を可能とするものではない。
EP−０  162  639は、細胞を酸−グリシン抽出操作に付し、つづいて特異的モノクローナル抗体を用いるアフィニティー・クロマトグラフィー分離操作にて完結する複数の精製工程を記載する。得られた蛋白質は、安定性に欠け、アデニレルシクラーゼ活性を有すると報告されており、下流（downstream）精製操作は大規模生成に適しない。
ブレンナン（Brennan）ら（インフェクション・アンド・イムニティー（Infection and Immunity）56,3189−3195,1988）は、加熱処理により蛋白質を細胞から分離して蛋白質抽出物を得、それをフェチュイン−セファロース（fetuin−Sepharose）およびモノクローナル抗体アフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィーにより精製する別の方法を記載する。
米国特許出願第7/308,864号は、加熱処理および遠心分離に付し、つづいてDEAE−セファロ−スイオン交換クロマトグラフィーおよび蛋白質特異的染料リガンドゲルクロマトグラフィーに付すことからなる抽出および精製を記載する。この方法は高価なモノクローナル抗体の使用を回避するが、にもかかわらず、大規模生産に適していない。同定された１つの問題は、溶液中に放出される69kD蛋白質の量が、加熱処理後に分離される蛋白質全体の割合として少量であるということである。EP−Ａ−０  437  687は、一連の複数の抽出工程からなる反復抽出法を用いることにより、培養ブロスからの69kD蛋白質の放出効率が改良されると詳説する。
本発明は一回の抽出工程後に微生物細胞から放出される蛋白質の収量を向上させ、さらに細胞残骸を除去するのにその後の遠心分離操作の必要性を除外する方法を提供することにより非効率的な蛋白質の回収の問題を解決するものである。さらには、本発明の方法は、醗酵後に培養ブロス中に存在し、熱を加えることにより膜蛋白質を抽出した場合に溶液中に放出される高分子量エンドトキシン（リポ多糖体）の大部分を効果的に排除するという利点を有する。
醗酵後に微生物細胞の懸濁液を加熱処理することは、醗酵の間に微生物により培養ブロス中にわずかに分泌される、蛋白質、例えば外層膜蛋白質の単離における重要な工程である。ビー・ペルツッシスの69kD蛋白質は、ブロス上清からの生産規模での直接単離を保証するのに十分な量で分泌されない外層膜蛋白質の典型例である。この点において、該蛋白質は、無細胞百日咳ワクチンについての他の抗原候補である、百日咳トキシン（PT）および線状血球凝集素（FHA）と異なっている。
加熱処理は、細胞懸濁液を、緩衝液中、例えば、60℃で約１時間加熱することからなり、その間に外層膜蛋白質は細胞膜から溶液中に移行する。しかしながら、該溶液は易流動性液体でなく、辛うじて小規模（５〜10mlアリコート）で易流動性液体から（例えば、濾過または遠心分離により）分離できる、死菌細胞とその内容物とからなる粘着性のゼリー状塊である。この重く水和されたゼリー物は、原液体容量の50％以上を占めることが度々であり、除去されれば、69kD蛋白質の収量がかなり減少する。該ゼリー物はすぐにフィルターをふさぎ、液体の濾過を妨げるため、きめの粗い濾過はさらに満足のいくものではない。
本発明は加熱処理の間にゼリー状塊の形成を排除する効果的な方法を提供するものである。加熱処理の前にフロキュレート化剤を細胞懸濁液に添加すると細胞の激しいフロキュレーションが起こることが見いだされた。フロキュレート化した細胞の塊は懸濁しているブロスから容易に分離でき、洗浄して加熱処理の前に不要なブロス成分を除去してもよい。死菌細胞は加熱処理後に再度フロキュレート化し、大部分の可溶性蛋白質を含有する実質的に細胞不含の上清が残る。この操作は、溶液中、下流精製について、所望の蛋白質の高回収率を付与する。
本発明は、さらにその上、高分子量エンドトキシンの大部分がフロキュレート化した死菌細胞の塊と一緒に加熱処理後に得られる蛋白質含有の溶液より排除されるため、さほど厳重な下流精製に付す必要がない回収蛋白質を提供しうるという利点がある。したがって、予防および治療的用途に求められる基準の蛋白質純度を得るのに要する下流精製工程の数を減少させる可能性がある。
したがって、本発明は、細胞結合蛋白質の懸濁液をフロキュレート化剤と接触させることからなる細菌原の細胞結合した蛋白質を抽出する方法を提供する。
当該分野において周知の広範なフロキュレート化剤を本発明の方法に用いて、加熱処理後の細胞懸濁液の処理特性を改良してもよい。本発明にて用いるのに好ましいフロキュレート化剤は二価カチオンからなる物質である。本発明にて用いるのに適当な二価カチオンは、バリウム、カルシウムおよびストロンチウムの塩、例えば塩化バリウム、塩化カルシウムまたは塩化ストロンチウム、好ましくは塩化バリウムのようなハライド塩から利用される。
フロキュレート化剤を、適当には、調整されたpH条件下、細胞の懸濁液と接触させ、液体容量を適当な緩衝剤を添加することで調節する。混合した後、フロキュレート化細胞が沈殿する。フロキュレート化した細胞を、適当には、沈降法（または遠心分離）で採集し、加熱処理に付す前に、セイラインまたは緩衝液で洗浄してもよい。
本発明の抽出方法を、さらなる下流処理と組み合わせて用いた場合、非常に高純度の濃度のビー・ペルツッシス由来の69kDが得られる。例えば、検出可能な濃度のPTまたは熱不安定性トキシンは含まれず、エンドトキシン濃度は蛋白質1mg当たりナノグラムにまで減少する。加えて、該蛋白質は、従来の製法に付随する、酵素活性、特にアデニルシクラーゼ活性を何ら有しない。
本発明の好ましい具体例において、69kD蛋白質をビー・ペルツッシスの醗酵ブロスまたは培養にて産生する。本発明にて用いるのに適当な菌株は以下に記載されており、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国、メリーランド州、ロックビル）から容易に入手される。好ましい菌株は液体培地にて増殖能を有し、69kD蛋白質を高収率にて産生するできる菌株である。
用いてもよい菌株は、例えば、限定されるものではなく、Ｉ期ビー・ペルツッシス（B.pertussis phase I）、II期ビー・ペルツッシス（B.pertussis phase II）、Ｉ期ビー・ペルツッシスCS（B.pertussis phase I CS）、ビー・ペルツッシス・トハマ（B.pertussis Tohama）、ビー・ペルツッシス株185−30（B.pertussis strin 185−30）、ビー・ペルツッシス株18323（B.pertussis strain 18323）、ビー・ペルツッシス株134（B.pertussis strain 134）、ビー・ペルツッシス株509（B.pertussis strain 509）、ビー・ペルツッシス株ウェルカム28（B.pertussis strain Wellcome 28）、およびオフィス・オブ・バイオロジックス（Office of Biologics）のビー・ペルツッシス株165（B.pertussis strain 165）が挙げられる。本発明にて用いるのに好ましい菌株は、日本国、大阪府に住所を有する醗酵研究所（インスティテュート・オブ・フェルメンターション）より、受託番号IFO−14073で入手可能なＩ期ビー・ペルツッシス・トハマである。
本発明にて用いる場合、選択されるビー・ペルツッシス株は、当業者に公知の種々の方法にて増殖させることができる。種子培養の量および起源または保存方法に依存して、異なる培養工程、液体または固体培地を用いる種々の培養方法が知られている。しかし、いずれの公知方法も本発明にて用いるのに十分であり、大規模生産について通常許容される大きさの接種物を提供する。
当業者であれば、ビー・ペルツッシス接種物の増殖用の適当な培地を選択できる。適当な培地は、限定されるものではないが、ゲンゴウ（Gengou）培地（EP−Ａ−0 077 646）；エヌ・アンドーン（N.Andorn）ら（アプル・ミクロバイオール・バイオテクノール（Appl.Microbiol.Biotechnol.）,28,356−360,1988）およびその中の引用文献に記載の培地；スタイナー−ショルツ（Stainer−Scholte）培地（ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）,63,211−220,1971）；エイ・イマイズミ（A.Imaizumi）ら（インフェクション・アンド・イムニティー（Infect.Immun.）,41,3,1138−1143,1983およびジャーナル・オブ・ミクロバイオロジカル・メソッズ（J.Microbiol.Methods）,2,339−347,1984）に記載の変形したスタイナー−ショルツ培地；ベルウェイ（Verway）培地（米国特許第4,784,589号）；合成培地B2（ピー・フォン・へマート（P.Van.Hemert）；プログ・インダスト・ミクロバイオール（Prog.Indust.Microbiol.）；（Bull,M.J.ed.）,13巻,151頁，エルセバイアー・サイ（Elsevier Sci），アムステルダム（1977））またはその記載されている変形を包含する。
本発明の出発物質であるビー・ペルツッシス培養物を増殖させる場合、接種物を適当な液体培地に加え、当該分野において知られている通常の醗酵法および醗酵槽のデザインを用いて醗酵操作を行う。当業者であれば、従来の醗酵槽のデザイン、醗酵培地、方法および変数を、個々に組み合わせて選択することに依存して異なる結果が得られることは明らかであろう。本発明で用いるのに好ましい組み合わせは大規模生産に適するものである。かかる方法、デザインおよび培地の組み合わせの例は、EP−Ａ−0 077 646、好ましくはEP−Ａ−0 121 249およびEP−Ａ−0 239 504に例示されている。
醗酵完了後、ビー・ペルツッシス醗酵ブロスを適当に処理し、醗酵ブロス中に直接分泌される抗原因子のPTおよびFHAを、例えば、出典明示により本明細書の一部とする、EP−Ａ−0 427 462に記載の方法により、ヒドロキシ燐石灰に吸着させることで除去する。
蛋白質の放出を行うために加熱処理に付す前に、細胞結合した69kD蛋白質を含有する残りの細菌懸濁液を本発明に係るフロキュレート化剤で処理する。
残りのエンドトキシン濃度は上清のpHを調整することにより最小としうることが判明した。慣用実験により、選ばれたフロキュレート化剤に対するpHの最適値を選択できる。例えば、上清のpHを、適当には、例えばバリウム、カルシウムまたはストロンチウムのハライド塩、好ましくは塩化バリウムの水溶液を添加する前または後に、塩基を添加することにより４と10の間、好ましくは8.5と9.5の間に調整する。液体容量は緩衝液、適当にはトリス緩衝液を添加することで調整してもよい。適当には、混合を適宜５分間行い、得られたスラリーを約１時間にわたってフロキュレート化させる。ついで、増殖培地の未使用成分（塩、アミノ酸、鉱物など）および醗酵の間にブロス中に放出される他の蛋白質物質およびエンドトキシンを含有する上清を分離して捨て、フロキュレート化体をさらに緩衝液またはセイラインで洗浄する。別法として、フロキュレート化細胞を洗浄する前に遠心分離により分離してもよい。
醗酵ブロス中に存在する高濃度の塩、アミノ酸および鉱物は、後の精製工程を妨げるため、必要ならば、フロキュレーション／洗浄工程を数回繰り返し、ハライド塩の濃度が許容される濃度、例えば、約0.02％w/vにまで減少したスラリー状フロキュレート化細胞を得る。
ついで、スラリー状のフロキュレート化細胞を、約60℃の温度で15〜60分間加熱処理に付すと、その間に69kD蛋白質が液体懸濁液に遊離し、細菌が死亡する。例えば約４℃で、適当な期間、好ましくは一夜、冷却した後、例えば、デカンテーションまたは遠心分離により死菌細胞塊を除去し、上清を濾過し、滅菌条件下、低温、約４℃で貯蔵する。
ついで、69kD蛋白質を当該分野における適当な公知技法を用いて下流精製に付す。好ましくは、該69kD蛋白質を、イオン交換、疎水性相互作用およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを用いて精製する。適当なクロマトグラフィー支持体はDEAE−セファロース、Ｑ−セファロース、SP−セファロース、CM−セファロースのようなアニオン交換支持体；ブチル−、フェニル−、オクチル−セファロース、TSKのような疎水性相互作用支持体；およびセファクリル、セファロース、セファデックス、スーパロース、スーパデックスなどのゲル濾過支持体を包含する。
高純度69kD蛋白質を濾過、必要ならば、透析濾過に付すことにより滅菌処理してもよい。
前記の方法にしたがって単離した精製69kD外層膜の抗原強度は、例えば、SDS−PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いる当該分野における周知技法、およびモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析により測定してもよい。純度を定性的にSDS−PAGEを用いて測定してもよい。定量分析はELISA（固相酵素免疫測定法）またはHPLCを用いて実施できる。
本発明に従って得られた精製69kD蛋白質は、ELISA試験により、該試験の限界感度以下のPTおよびFHA含量を有することがわかった。PT活性（CHO細胞）は全く検出されなかった。LSL−CS（リムラス・アモエボサイト溶解菌−色素産生基質）試験によれば、エンドトキシン濃度は0.1単位/mcg蛋白質以下である。69kD蛋白質は何ら検出可能なアデニルシクラーゼ活性を有さず、アデニルシクラーゼについてのウェスタンブロット分析は陰性である。
得られた69kD蛋白質は、ビー・ペルツッシスによる感染に対して保護抗体応答を顕在化させるのに投与される無細胞ワクチンの抗原成分としての有用性を有する。このようなワクチンは常法により製造してもよい。例えば、直接的使用として、生理学的pHに緩衝処理した水溶液中、抗原因子と適当な通常の担体とからなるワクチンを製造してもよい。また、抗原因子を従来のアジュバント、例えば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム上に吸着させてもよい。加えて、69kD蛋白質を包含する、１またはそれ以上のビー・ペルツッシス抗原をさらに別の免疫原と組み合わせテ１種以上の病原に対する保護誘発能を有する、多機能性ワクチンを調製してもよい。
本発明は、特に、ビー・ペルツッシスの単一醗酵操作より、無細胞百日咳ワクチン用の、数種の蛋白質抗原候補を単離または精製する包括的な方法の一部としての有用性を有する。すなわち、PT、FHAおよび69kD蛋白質は、各々、単一百日咳ワクチンにおける配合用に、同一醗酵ブロスから純粋な形態にて単離できる。ビー・ペルツッシス醗酵ブロスを、適当には、EP−Ａ−0 427 466に記載の方法に従って処理し、PTおよびFHAを単離し、残りの上清を本明細書の記載に従って処理し、69kD蛋白質を得る。百日咳トキシンを、出典明示により本明細書の一部とするWO91/12020に記載の方法に従ってトキソイド化してもよい。別々に精製した抗原成分を別々にアジュバント処理に付し、その後、プールしてもよい。
細胞結合した蛋白質の抽出およびフロキュレート化剤、好ましくは二価カチオンを添加することによるエンドトキシンの溶液からの除去は、ボルデテラ・ペルツッシスのような病原性ボルデテラ菌からの、ペルタクチンのような外層膜蛋白質の単離に限定されない。本発明の方法は、予防または治療用外層膜蛋白質の産生を包含するいずれの生物学的方法においても有用性を有する。本発明から利益を得る他の生物学的方法の典型例は：
ａ）ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のようなメニンジティディス種からの外層膜蛋白質の生成
ｂ）エシュリキア・コリ（Escherichia coli）からのポリ線毛および凝集原の生成
ｃ）ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）のようなヘモフィルス種からの外層膜蛋白質の生成
ｄ）ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）のようなボレリア種からの外層膜蛋白質の生成、および
ｅ）Ａ群およびＢ群ストレプトコッカスの菌株のようなストレプトコッカス種からの外層膜蛋白質の生成。
本発明の方法に従って得ることができる生物学的生成物は、ヒトに使用するための蛋白質に限定されない。利益を派生しうる他の典型的な方法は、以下の生成に用いるための外層膜蛋白質の単離である：
ｆ）ブタに感染し、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）およびヘモフィルス・プリゥロニュウモニエ（Haemophilus pleuropneumoniae）により引き起こされる鼻炎用ワクチンの生成；
ｇ）ブタに感染し、エシュリキア・コリにより引き起こされる大腸菌症用ワクチンの生成；および
ｈ）家畜動物、ウシおよびヒトに感染するレプトスピラ症に対するELISA試験用抗原の生成。
本発明の方法を、ボルデテラ・ペルツッシス由来の69kD外層膜蛋白質の抽出に関連する以下の実施例により説明するが、これに限定されるものではない。
添付図面において：
図１は精製した69kD蛋白質に対する実施例１にて試験した４種のフロキュレート化剤のフロキュレーション実験についての結果（SDS−PAGE）を示す；
図２は精製した69kD蛋白質に対する実施例１にて試験した４種のフロキュレート化剤のフロキュレーション実験についての結果（ウェスタンブロット）を示す；
図３は精製した69kD蛋白質に対する実施例２にて試験した３種のフロキュレート化剤のフロキュレーション実験および非フロキュレート化対照についての結果（SDS−PAGE）を示す；
図４は精製した69kD蛋白質に対する実施例２にて試験した３種のフロキュレート化剤のフロキュレーション実験および非フロキュレート化対照についての結果（ウェスタンブロット）を示す；
図５は実施例３にて記載した塩化バリウムでのフロキュレーション実験についての結果（SDS−PAGE）を示す；および
図６は実施例３にて記載した塩化バリウムでのフロキュレーション実験についての結果（ウェスタンブロット）を示す。
実施例１
フロキュレーション実験
ビー・ペルツッシス・トハマ株を調整した醗酵槽条件下に培養し、上清からPTおよびFHAをヒドロキシリン石灰ゲル上に吸着させることによって抽出するのに十分な量の細胞の懸濁液を得た。残りの細胞懸濁液を以下の工程に付した：
１）懸濁液を４℃に冷却し、50mlの試料アリコートに分けた。
２）以下に示すフロキュラントのうちの１つを各試料に添加し、次の最終濃度を得た：デキストランT500（10g/L）、塩化カルシウム（10g/L）、メタノール（20％）およびポリエチレングリコール50000（10g/L）。
３）各試料を激しく混合し、同時にpHを所定の値（デキストランT500、pH5;塩化カルシウム、pH4および9;メタノール、pH6;ポリエチレングリコール50000、pH5）に調整した。ついで、該試料を４℃で混合することなく放置してフロキュレート化した。
４）上清をデカントし、125mMの濃度の等容量のTRIS緩衝液と置換した。再懸濁の後、該試料を加熱し、水浴中、60℃に１時間維持した。各試料を定期的（５分毎）に振盪し、等温分布させた。
５）攪拌することなく４℃に冷却した後、死菌細胞を再フロキュレート化した。遠心分離に付した後、各試料からの上清を、SDS−PAGE法、ウェスタンブロット法およびELISA法により69kD蛋白質の存在についてだけでなく、LAL−CS試験法を用いてエンドトキシン汚染の存在についても試験した。
SDS−PAGE法およびウェスタンブロット法の結果を、各々、図１および図２に示す。容量15および45μＬに対応する、２本の隣接するレーンを用い、各試料（一のフロキュラントに対応する）を該ゲルおよび該ブロットに付した。残りの３本のレーンには55mg/Lの濃度の精製した69kD蛋白質のプールから連続的に増加する容量（6.8、13.6および27.2μＬ）を装填した。該ゲルおよびウェスタンブロットにおけるレーンについての凡例を以下の表に示す：
0003629555.tif 000002
ELISAおよびLAL−CS試験の結果を以下の表に示す：
0003629555.tif 000003
図１および２は複数の試料における69kD蛋白質の存在および位置を示す。69kD蛋白質の存在は上記表２に示されるELISA試験の結果より確認される。
pH4および９の両方のCaCl2でフロキュレーションが生じるが、ゲルに関するレーン５および６（図１）は、pH9のCaCl2で処理した後に、上清中に存在するエンドトキシンの濃度が著しく低下することを示す。このことを上記表２に示されるLAL−CS試験の結果によって確認した。
実施例２
二価カチオンの選択
実施例１に記載の方法論を用いるフロキュレーション実験を、以下のハライド塩（10g/Lの濃度およびpH9）：塩化カルシウム、塩化バリウムおよび塩化ストロンチウムを用いて実施した。
SDS−PAGEおよびウェスタンブロット法の結果を、各々、図３および４に示す。最初の３本のレーンには55mg/Lの濃度の精製した69kD蛋白質のプールから連続的に増加する容量（6.8、13.6および27.2μＬ）を装填した。最後のレーンには細胞懸濁液の非フロキュレート化した対照試料を装填した。該ゲルおよびウェスタンブロットにおけるレーンについての凡例を以下の表に示す：
0003629555.tif 000004
ELISA試験の結果を以下に示す：
0003629555.tif 000005
図３および４はすべての試料における69kD蛋白質の存在および位置を示す。対照試料（レーン７）にて観察される69kD蛋白質バンドは、実質的に、二価カチオンでフロキュレート化した試料（レーン４、５および６）で観察されるバンドほど密でなく、それは非フロキュレート化試料からの上清中の69kD蛋白質が実質的に低濃度であることを示す。
表４のELISA試験にて得られる低い69kD蛋白質濃度は、ストロンチウムがカルシウムまたはバリウムほど効果的なカチオンではないという印象を与えるが、ゲル（図３）またはブロット（図４）においてもこのような観察は反映されなかった。
しかしながら、カルシウムまたはバリウムのいずれかでフロキュレート化した試料の上清において観察される69kD濃度は、ELISA試験においては実質的に等しく、ゲルおよびブロット法においても同様の強度の69kD蛋白質バンドが得られた。
フロキュレーション速度およびフロキュレート化物の形態に関して、視覚観察した場合、フロキュレーション工程は、バリウムがカルシウムまたはストロンチウムよりもわずかに効果的であった。
実施例３
フロキュレーションおよび洗浄操作
フロキュレーションおよび洗浄を以下の操作を用いて実施した：
１）PTおよびFHAを抽出した後の残りの細胞懸濁液を４℃に冷却し、４つの試料アリコート（50ml）に分けた。１の試料を対照として取っておいた。
２）塩化バリウムを残りの３つの試料に加えて10g/Lの最終濃度を得、各懸濁液をそのpHを適当な塩基を用いて９に調整しながら激しく混合した。
３）ついで該懸濁液を４℃で混合することなく放置してフロキュレート化した。
４）上清をデカントして各ペレットを分離し、３種の濃度のTRIS緩衝液（125、50または20mM）を各ペレット（ペレット当たり１の濃度）に加え、50mlの最終容量とした。
５）再び懸濁させた後、その３種の試料を４℃で混合することなく再び放置してフロキュレート化した。
６）前記の４）および５）に示される操作を必要ならば数回繰り返し、塩化バリウムの濃度が約0.2g/L以下になるまで希釈した。
７）対照試料を10,000xgで１時間遠心分離に付し、上清をデカントして等容量のTRIS緩衝液（125mM）と置換した。
８）最後に所望の濃度のTRIS緩衝液中に再び懸濁させた後、試料（対照を包含する）をすべて加熱し、水浴中、60℃に１時間維持した。各試料を周期的（５分毎）に振盪して等温分布させた。
９）すべての試料を攪拌することなく４℃に冷却した後、塩化バリウム含有の試料中死菌細胞を再び懸濁させ、対照試料中の死菌細胞を10,000xgで１時間再び遠心分離に付した。
10）各試料（対照を包含する）からの上清をSDS−PAGE、ウェスタンブロットおよびELISAにより69kD蛋白質の存在について試験した。
SDS−PAGEおよびウェスタンブロットの結果を、各々、図５および６に示す。容量15および45μＬに相当する、２本の隣接するレーンを用い、各試料をゲルおよびブロットに付した。ゲルおよびウェスタンブロットにおけるレーンについての凡例を以下の表に示す：
0003629555.tif 000006
ELISA試験の結果を以下の表に示す：
0003629555.tif 000007
図５および６は、すべての試料における69kD蛋白質の存在および位置を示す。69kD蛋白質の存在を前記表６に示されるELISA試験の結果から確認した。
前記した繰り返しフロキュレーションおよび洗浄工程に付した懸濁液の上清に見られる69kD蛋白質の濃縮物の存在および類似性は、この技法を適用することにより得られる懸濁ブロスのイオン強度の主たる減少がビー・ペルツッシスからの69kD蛋白質の抽出および収量に悪影響を及ぼさなかったことを示した。
加えて、上清中、約0.2g/Lと低濃度の塩化バリウムのフロキュラントとしての有効性が証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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