(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含み、化学合成法または遺伝子組換え法で作製したポリペプチドＡを抗原として用いることを特徴とする抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項２】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、請求項１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項３】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入されているポリペプチドである、請求項１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項４】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチドである、請求項１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項５】
ポリペプチドＡが配列番号１で示されるペプチドである、請求項１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項６】
ポリペプチドＡが配列番号２で示されるペプチドである、請求項１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項７】
ポリペプチドＡが配列番号３で示されるペプチドである、請求項１記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【請求項８】
配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含み、化学合成法または遺伝子組換え法で作製したポリペプチドＡを抗原として含有してなる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項９】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項１０】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入されているポリペプチドである、請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項１１】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチドである、請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項１２】
ポリペプチドＡが配列番号１で示されるペプチドである、請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項１３】
ポリペプチドＡが配列番号２で示されるペプチドである、請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項１４】
ポリペプチドＡが配列番号３で示されるペプチドである、請求項８記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【請求項１５】
配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含み、化学合成法または遺伝子組換え法で作製したポリペプチドＡを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【請求項１６】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、請求項１５記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【請求項１７】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入されているポリペプチドである、請求項１５記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【請求項１８】
ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチドである、請求項１５記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【請求項１９】
ポリペプチドＡが配列番号１で示されるペプチドである、請求項１５記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【請求項２０】
ポリペプチドＡが配列番号２で示されるペプチドである、請求項１５記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【請求項２１】
ポリペプチドＡが配列番号３で示されるペプチドである、請求項１５記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及びその試薬並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア属の細菌は、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニューモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニエは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
【０００３】
クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエやインフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのため、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発が望まれていた。
【０００４】
感染症の診断は、通常、感染部位等における原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中における（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的になされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニューモニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエの基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られている。
【０００５】
しかし、クラミジア・ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジア・トラコマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に存在する抗原を含むため、この基本小体を用いる方法ではクラミジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、他の種のクラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に欠ける難点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１記載の発明は、クラミジア・ニューモニエに対する抗体を特異的に測定することができる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、感度の高い抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、安定性に優れ、信頼性の高い抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項４記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくい抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
【０００７】
請求項５記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断が可能な抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項６記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の極めて正確な診断が可能な抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
請求項７記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の極めて正確な診断が可能な抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法を提供するものである。
【０００８】
請求項８記載の発明は、クラミジア・ニューモニエに対する抗体を特異的に測定することができる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
請求項９記載の発明は、請求項８記載の発明の効果に加え、感度の高い抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
請求項１０記載の発明は、請求項８記載の発明の効果に加え、安定性に優れ、信頼性の高い抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
請求項１１記載の発明は、請求項８記載の発明の効果に加え、固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくい抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
請求項１２記載の発明は、請求項８記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断が可能な抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
【０００９】
請求項１３記載の発明は、請求項８記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の極めて正確な診断が可能な抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
請求項１４記載の発明は、請求項８記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の極めて正確な診断が可能な抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬を提供するものである。
請求項１５記載の発明は、クラミジア・ニューモニエに対する抗体を特異的に測定することができるクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。
【００１０】
請求項１６記載の発明は、請求項１５記載の発明の効果に加え、感度の高いクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。
請求項１７記載の発明は、請求項１５記載の発明の効果に加え、安定性に優れ、信頼性の高いクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。請求項１８記載の発明は、請求項１５記載の発明の効果に加え、固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくいクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。
【００１１】
請求項１９記載の発明は、請求項１５記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断が可能なクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。
請求項２０記載の発明は、請求項１６記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の極めて正確な診断が可能なクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。
請求項２１記載の発明は、請求項１６記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の極めて正確な診断が可能なクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを純粋に、かつアミノ酸配列が解明された形で取得するため、先ず、クラミジア・ニューモニエを宿主細胞中に培養し、そのクラミジア・ニューモニエからゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素で部分分解し、これをλgt11ＤＮＡに挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを作成し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλファージを精製し、これを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させて増幅させた後そのＤＮＡの塩基配列を分析し、これをポリペプチドに翻訳して、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は、下記（１）〜（２１）に関するものである。
（１）配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドＡを抗原として用いることを特徴とする抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（２）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、前記（１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（３）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入されているポリペプチドである、前記（１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【００１４】
（４）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチドである、前記（１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（５）ポリペプチドＡが配列番号１で示されるペプチドである、前記（１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（６）ポリペプチドＡが配列番号２で示されるペプチドである、前記（１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
（７）ポリペプチドＡが配列番号３で示されるペプチドである、前記（１）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法。
【００１５】
（８）配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドＡを抗原として含有してなる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
（９）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、前記（８）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
（１０）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入されているポリペプチドである、前記（８）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
（１１）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチドである、前記（８）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【００１６】
（１２）ポリペプチドＡが配列番号１で示されるペプチドである、前記（８）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
（１３）ポリペプチドＡが配列番号２で示されるペプチドである、前記（８）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
（１４）ポリペプチドＡが配列番号３で示されるペプチドである、前記（８）記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬。
【００１７】
（１５）配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドＡを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（１６）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、前記（１５）記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（１７）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又は配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入されているポリペプチドである、前記（１５）記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（１８）ポリペプチドＡが、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸配列にアミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチドである、前記（１５）記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【００１８】
（１９）ポリペプチドＡが配列番号１で示されるペプチドである、前記（１５）記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（２０）ポリペプチドＡが配列番号２で示されるペプチドである、前記（１５）記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
（２１）ポリペプチドＡが配列番号３で示されるペプチドである、前記（１５）記載のクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬。
【００１９】
なお、本明細書において、塩基の数が１のデオキシヌクレオチドはモノデオキシヌクレオチドといい、塩基の数が２以上のデオキシヌクレオチドは、特に断らない限り、ＤＮＡと総称した。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチド
本発明において抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドは、ペプチドが抗原性を有する最小の大きさの観点から、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド（以下  「ポリペプチドＡ」という）からなるものである。
ポリペプチドＡのペプチド鎖中に含有されるクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列が長いほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることから、ポリペプチドＡとしては、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した２０個以上のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドであることが好ましく、１００個以上のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドであることがより好ましく、２５０個以上のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００２１】
また、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡは、配列番号１で示されるペプチドからアミノ酸（例えば１〜２５０個）が欠落しているものであってもよい。欠落するアミノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドＡのクラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性が損なわれる傾向がある。
欠落するアミノ酸の個数が多い場合（例えば５個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくするためには、配列番号１で示されるペプチドから欠落するアミノ酸は連続して  （例えば５個以上）いるものであることが好ましい。
【００２２】
また、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡとしては、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列に加えてそれ以外のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを利用することもできるが、このポリペプチドは、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性に対して、クラミジア・ニューモニエ抗原以外の物質としての抗原性がないか又は低いことが必要とされる。
このようなポリペプチドの例としては、配列番号１で示されるペプチドの中のアミノ酸（例えば１〜１００個）が他のアミノ酸で置換されているポリペプチド、配列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸（例えば１〜１００個）が挿入されているポリペプチド、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列に、直接又は介在アミノ酸配列を介して、アミノ酸若しくは他のペプチドが結合したポリペプチド等が挙げられる。
【００２３】
置換又は挿入されるアミノ酸の個数が多い場合（例えば５個以上）、また、結合する他のペプチドに含まれるアミノ酸の個数が多すぎる場合（例えば１，０００個を超える場合）、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくするためには、配列番号１で示されるペプチドの中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続して（例えば５個以上）いるものであることが好ましく、また、結合する他のペプチドは、１，０００個未満のアミノ酸からなるものであることが好ましく、５００個以下のアミノ酸からなるものであることがより好ましく、２００個以下のアミノ酸からなるものであることがさらに好ましい。
【００２４】
置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものであることが好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換が挙げられる。
結合するアミノ酸若しくはペプチドとしては、例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニン、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
介在アミノ酸配列は特に限定されないが、例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニンのアミノ酸配列等が挙げられる。
前記介在アミノ酸配列及び結合するアミノ酸若しくはペプチドは、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも５個のアミノ酸からなる配列のアミノ基末端側とカルボキシル基末端側のいずれに結合してもよい。
【００２５】
ポリペプチドＡの具体例としては、例えば、配列番号１、配列番号２及び配列番号３で示されるペプチドが挙げられる。
配列番号１で示されるペプチドは、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチド全体を含むポリペプチドであり、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する。
配列番号２で示されるペプチドは、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの一部を含み、さらに、そのカルボキシル基末端側に他のペプチドが結合したポリペプチドであり、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する。
配列番号３で示されるペプチドは、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの一部からなるポリペプチドであり、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する。
上記抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドの中では、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチド全体を含むものである配列番号１で示されるペプチドが好ましい。
【００２６】
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドの製造法
本発明に係る、抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドを製造する方法としては、化学合成法や遺伝子組換え法が挙げられる。
化学合成法としては、例えば、マップ（Multiple Antigen Peptide、ＭＡＰ）法があり、３０個以下のアミノ酸配列からなるペプチドの合成に適しており、市販のペプチド合成機を使用して合成することができる。
遺伝子組換え法としては、例えば、前記抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに挿入して組換えベクターを構築し、それを宿主に挿入して形質転換体を作製し、その形質転換体から目的のポリペプチドを精製する方法が挙げられる。
【００２７】
前記抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡについては後述する。
ベクターとしては、例えば、プラスミドやファージ等が挙げられる。
宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母等が挙げられる。
以下、形質転換体の作製法と、その形質転換体を用いた目的のペプチドの精製法について詳しく説明する。
【００２８】
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
スクリーニングで取得したλファージ自体（後述）も、前記抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターであるが、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ（後述）を常法で既存のプラスミドベクターやファージベクター等に挿入して、新たに組換えベクターを作製することもできる。その際、必要に応じ、リンカーを使用する。挿入されたＤＮＡを発現させる場合は、ＤＮＡの挿入箇所はプロモーター領域の下流であることが必要とされる。既存のプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＢＫ１０ＭＭ等を使用することができる。ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９は市販されており、また、ｐＢＢＫ１０ＭＭについては特開平４−１１７２８４号公報に詳細に記載されており、ｐＢＢＫ１０ＭＭを含む大腸菌は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３９４として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、ファージベクターとしてはλgt11ファージ、λgt10ファージ等が利用できる。いずれも、用いた親ベクターに対応する組換えベクターが得られる。
前記組換えベクターとしては、例えば、後述するようにｐＣＰＮ５３３αプラスミド、５３−３Ｓλファージ等が挙げられる。
【００２９】
得られた組換えベクターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸菌由来のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主としては大腸菌を使用することができ、例えば、大腸菌ＨＢ１０１株を使用することができる。この宿主をコンピテントセルとなるように処理をする。大腸菌ＨＢ１０１株を処理して得たコンピテントセルは宝酒造(株)等から販売されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換体を作製する方法の一般的手法は、「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニング  第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samblook et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クローニング″という）に記載されている。
【００３０】
得られた形質転換体を培養してコロニーを形成させ、各コロニーからプラスミドＤＮＡを取得し、適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択する。このようにして作製されたプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＣＰＮ５３３αプラスミドが挙げられる。
【００３１】
このようにして作製された形質転換体をとしては、例えば、前述の組換えベクターｐＣＰＮ５３３αが入った大腸菌ＨＢ１０１株が挙げられる。
形質転換体を培養する方法としては、例えば、その形質転換体が成長しうる培地でこの抗原ポリペプチドが形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で培養器を振とうする方法を使用することができる。形質転換体として前述の組換えベクターｐＣＰＮ５３３αが入った大腸菌ＨＢ１０１株を使用する場合は、アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振とう培養し、その後、この培養液をアンピシリンを含むＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養する方法を利用することができる。ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００３２】
培養した形質転換体を破砕する方法としては、例えば、遠心分離で形質転換体を集め、これを緩衝液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁液に物理的な衝撃を与える方法を採用することができる。緩衝液としては、例えば、ＴＥ緩衝液を使用することができる。上記懸濁液に物理的な衝撃を与える方法としては、例えば、上記懸濁液に超音波を照射する方法を使用することができる。
形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液に物理的な衝撃を与える代わりに、例えば、上記懸濁液にリゾチームを加え、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むＴＥ緩衝液を加えて撹拌することよって形質転換体を溶解させる方法を採用することもできる。
形質転換体を破砕又は溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取得する。
【００３３】
なお、目的のペプチドが、そのアミノ末端側にシグナルペプチドが結合した融合タンパク質となっている（すなわち、目的のペプチドを細胞外に分泌させることが可能である）場合は、培養液を遠心分離して上清を取得する方法を使用することができる。
ペプチドの精製法としては、例えば、ストレプトマイシン硫酸塩を添加する核酸の除去及び硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得の各工程を使用することができる。
ストレプトマイシン硫酸塩を添加して核酸を除去する工程としては、例えば、上記のいずれかの上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿物として除去し、上清を取得する操作を使用することができる。
【００３４】
硫酸アンモニウムを添加して蛋白質を取得する工程としては、例えば、核酸を沈殿物として除去した後の上清に硫酸アンモニウムを添加し、撹拌し、遠心分離する操作を使用することができる。通常、沈殿を取得するが、目的のポリペプチドが上清に含まれていることもあり、サンプリングして、目的のポリペプチドの有無を確認しておくことが好ましい。
【００３５】
続いて、目的とするポリペプチドを含む画分を取得する工程を行う。この工程としては、例えば、上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、目的とするポリペプチドが含有されている画分を同定してその画分を取得する方法を使用することができる。目的とするポリペプチドが含有されている画分を同定する方法としては、例えば、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体（後述）を用いるウェスタン・ブロット法が挙げられる。細胞残渣の除去、ストレプトマイシン硫酸塩を添加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得及びウェスタン・ブロット法の具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００３６】
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明において、配列番号１で示されるペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号１で示されるペプチドをトリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号４のＤＮＡも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡとは、ポリペプチドＡをコードするＤＮＡであり、このＤＮＡは、ポリペプチドＡのアミノ酸配列をトリプレット暗号表に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群から選ばれるＤＮＡのことである。
ポリペプチドＡとしては、前記抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドの項で説明したものが挙げられ、ポリペプチドＡをコードするＤＮＡも、それらのポリペプチドのアミノ酸配列に対応したヌクレオチド配列のものがある。
【００３７】
同様に、本発明において、配列番号２で示されるペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号２で示されるペプチドをトリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号５のＤＮＡも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。
また、配列番号３で示されるペプチドをコードするＤＮＡとは、配列番号３で示されるペプチドをトリプレット暗号表に従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのＤＮＡ群（この中には、配列番号６のＤＮＡも含まれる）から選ばれるＤＮＡのことである。
【００３８】
ポリペプチドＡをコードするＤＮＡは、化学合成法か遺伝子組換え法で作製することができる。
化学合成法としては、例えば、ホスホアミダイド法が挙げられ、全長が１００塩基以下の塩基配列からなるＤＮＡの合成に適しており、市販のＤＮＡ合成機で化学合成することができる。
遺伝子組換え法としては、例えば、後述するようにクラミジア・ニューモニエの基本小体から、抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングする方法や、既に取得したＤＮＡを鋳型にし、そのＤＮＡの任意の位置の塩基配列を元にして作製したプライマーを利用したＰＣＲ法等が挙げられる。遺伝子組換え法は１００塩基以上の長いＤＮＡの作製も可能である。
【００３９】
次に、クラミジア・ニューモニエの基本小体から、抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングする方法について詳しく説明する。
【００４０】
クラミジア・ニューモニエの培養
培養したＨＬ細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを感染させておき、この細胞をＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）に懸濁し、この動物細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して上清（クラミジア・ニューモニエの浮遊液）を取得する。クラミジア・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニューモニエＹＫ４１株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用できる。
培養したＨＬ細胞等から細胞浮遊液を調製し、培養上清を除去した後に前記クラミジア・ニューモニエ浮遊液を添加して培養し、遠心分離し、細胞内でクラミジア・ニューモニエが増殖したクラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を取得する。
【００４１】
クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製
クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリング社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されていることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンドを回収する。
【００４２】
クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡの調製
クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸  （ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）（以下、ＴＥ緩衝液という。）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。
【００４３】
ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化ＤＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphate、以下、ＡＴＰと略す。）及びＴ４リガーゼを添加して、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。
これを、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。
【００４４】
このＤＮＡ断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt11ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。
【００４５】
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次いでフィルターをクラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体と反応させる。クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体としては、例えば、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８やＳＣＰ５３を使用することができる。ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１５４として寄託されている。また、ＳＣＰ５３を産生するハイブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、132巻、583-588頁(1994)（J. Clin. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994）に記載されている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィルターを洗浄し、風乾させる。
【００４６】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性の前記ポリペプチドを発現するλファージを取得する。
【００４７】
抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキットを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。このＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Polymerase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたＤＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11・フォワード・プライマー（λgt11 forward primer）及びλgt11・リバース・プライマー（λgt11 reverse primer）（いずれも宝酒造株式会社製、商品名）が挙げられ、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymerase）（宝酒造株式会社製、商品名）がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００４８】
増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用することができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製、商品名）を使用することができる。また、塩基配列を決定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されているキットを使用することができる。また、分析にあたっては市販の機械、例えば、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）を利用することができる。
【００４９】
塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトとしては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いることができる。
解析の結果、完全長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されているＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによって取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造(株)から販売されているキットを使用することができる。
一旦、抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡが取得されると、遺伝子組換え法や前述したＰＣＲ法を利用することによって、そのＤＮＡを複製させることができるので、クラミジア・ニューモニエの基本小体から抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを再度取得する操作は不要である。
【００５０】
遺伝子組換え法を用いる方法は、例えば、次のようにして行うことができる。まず、取得された前記ＤＮＡを上述したように既存のプラスミドベクターやファージベクター等に挿入して組換えベクターを作製し、その組換えベクターを宿主に入れて形質転換体を作製し、その形質転換体を培養する。この培養により形質転換体内で組換えベクターが増幅されるので、その形質転換体から増幅された組換えベクターを取得し、制限酵素を用いて前記ＤＮＡを切り出す。形質転換体から増幅された組換えベクターを取得する操作は、例えば、次のようにして行うことができる。組換えベクターがプラスミドである場合、その形質転換体を破砕し、フェノール／クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを取得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用い、取得したＤＮＡを超遠心分離し、組換えベクターをプラスミドＤＮＡとして取得する。一方、組換えベクターがファージである場合、その形質転換体を破砕し、ファージ粒子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベクターをファージＤＮＡとして取得する。
【００５１】
ＰＣＲ法を利用する方法としては、例えば、増幅させようとするＤＮＡの両末端の塩基配列を基にして化学合成法によりプライマーＤＮＡを作製し、抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行えばよい。
遺伝子組換え法やＰＣＲ法を用いてＤＮＡを複製させる方法の一般的手法は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００５２】
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及び試薬並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬
抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法としては、例えば、前記抗原又は有効成分として用いられるポリペプチドを担体に固定化し、検体を添加し、洗浄し、標識化された二次抗体を添加し、洗浄し、この標識を直接的又は間接的に測定する方法を利用することができる。
担体としては、例えば、粒子、糸、プレート（アッセイプレート等）などが利用でき、これらの材質としては、例えば、ラテックス、セルロース、プラスチック（ポリスチレン等）などが挙げられる。
上記ポリペプチドを担体に固定化するには、例えば、共有結合や物理吸着を利用することができる。
【００５３】
検体としては、例えば、ヒトの血清等を使用することができる。なお、検体中の他の抗体等が担体に非特異的に結合するのを防止するために、検体の添加前に、牛血清アルブミン等で担体の表面をブロッキングしておくことが好ましい。
洗浄は、例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液等を利用して行うことができる。
【００５４】
標識化された二次抗体としては、例えば、標識化された抗ヒトモノクローナル抗体が挙げられる。標識としては種々のものが利用でき、例えば、酵素（アルカリフォスファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラーゼ（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidase）、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等）、蛍光物質（フルオレセイン（Fluorescine）等）を利用することができる。また、抗体と標識物の間に化学物質（ビオチン（Biotin）、アビジン（Avidin）、ストレプトアビジン（Streptoavidin）、ディゴキシゲニン（Digoxigenin）等）を介在させてもよい。
標識を直接的又は間接的に測定する方法としては、例えば、その標識が酵素である場合は、基質を添加し、酵素の触媒作用により発生する光や発色を測定するか吸光度の変化を測定する方法が利用できる。また、標識が蛍光物質である場合は、反応系に紫外線を照射し、発生する蛍光を測定する方法が利用できる。必要に応じ、増感剤を使用することが好ましい。
なお、本発明において、「測定」は定量的又は半定量的な測定だけでなく、定性的な測定（検出等）も意味する。
【００５５】
上記ポリペプチドを抗原として含有してなる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬としては、例えば、上記ポリペプチドを固定化した担体、上記標識化された二次抗体、基質等が必要量同封されたキット、これらの単品のバルクなどが挙げられる。
上記ポリペプチドを有効成分とするクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬としては、例えば、上記試薬をそのまま利用することができる。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
以下の実施例において、使用したモノクローナル抗体は、ＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。ＳＣＰ５３は、本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブリドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体であり、また、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合させて得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌する抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。
表１に示されるように、モノクローナル抗体のＳＣＰ５３及びAY6E2E8は C.ニューモニエに特異的である。
【００５７】
【表１】
0003692598.tif 000002
【００５８】
モノクローナル抗体の作製方法については後述する。
以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定まで、順を追って説明する。
【００５９】
実施例１  クラミジア・ニューモニエ特異的５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製
（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養
予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm2）の底面いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液８mlと１０％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混合液４mlずつを６ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。
【００６０】
（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１の培養
クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株（金本ら：Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,1993）を用いた。
取得したＨＬ細胞に予めクラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株を感染させておき、この細胞をＳＰＧ液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、クラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。
６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラミジア・ニューモニエ浮遊液を１ウェルあたり２ml加えて、２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/mlシクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。
【００６１】
（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ４１の基本小体の精製
−７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹＫ４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【００６２】
別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液  （pH７．４）、次いで、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量との混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量のＳＰＧ液を加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧ液に懸濁した。遠心分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rpmで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエＹＫ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁したバンドを回収し、これをＳＰＧ液で２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳＰＧ液に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保存した。
【００６３】
（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡの調製
上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮＡを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、ＰＣＩという。）３００μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返した。
【００６４】
得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分間放置し、ＤＮＡを析出させた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に保存した。
【００６５】
（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。なお、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液にＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
【００６６】
得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌに溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示すリンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ４ ．５μｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時間反応させ、リンカーを付加させた。
【化１】
0003692598.tif 000003
【００６７】
リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得られた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。）２０μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶かした。
【００６８】
この液０．６μｌに、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したλgt11 ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタジーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液０．５μl、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapack）II Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）を用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングした。
【００６９】
（Ｆ）クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体の作製
骨髄腫細胞株の培養及び継代
モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）である。１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、継代した。細胞融合に供する２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニン、０．５μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去剤、大日本製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後の１週間は通常の培地で培養した。
【００７０】
マウスの免疫
タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記基本小体の懸濁液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心分離し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁した。これに２００μｌのフロイントコンプリートアジュバントを加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマウスの背中の皮下に注射した（この日を０日目とする）。１４日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質の濃度が２７０μg/mlの精製基本小体の懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射した。更に、６９日目にタンパク質の濃度が８００μg/mlの精製基本小体の懸濁液５０μｌ、９２日目に同懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射し、９５日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。
【００７１】
細胞融合
免疫したマウスの脾臓から得られた脾細胞１０8個に対して骨髄腫細胞１０7個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去した後、細胞を更によく混合した。予め３７℃に保温しておいた３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＲＰＭＩ１６４０培地０．４mlを加え、３０秒間放置した。７００rpmで６分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１０mlを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転させ、１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に５mlのＨＡＴ培地を加え、５分間放置した。更に１０〜２０mlのＨＡＴ培地を加え、３０分間放置した後、骨髄腫細胞濃度が３．３×１０5/mlとなるようにＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピペットを用い９６ウェルプラスチック製培養容器のウェルに２滴ずつ分注した。５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、１日後、７日後及び１４日後にウェルにＨＡＴ培地を１〜２滴加えた。
【００７２】
抗体生産細胞のスクリーニング
精製したクラミジアニューモニエＹＫ４１の基本小体を１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで可溶化し、０．０２％アジ化ソーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に対して透析したのち、タンパク質濃度が１μg/mlとなるように希釈した液を、塩化ビニル製９６ウェルＥＩＡ用プレートのウェルに５０μｌとり、４℃で一晩放置し、抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳ１５０μｌを加え、３分間放置し、その後除去・洗浄した。洗浄操作を更に１回行なった後、ウェルに１％（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、４℃で一晩放置し、ブロッキングを行なった。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ加え、室温で２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに２５ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ加え、室温で２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μｌ加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させた後、９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度を測定した。
【００７３】
この結果、陽性のウエルが見出され、その培養上清中には基本小体と反応する抗体が含まれていることが分かった。このウェル中の細胞をそれぞれパスツールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製培養容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２ｍｌを加え、同様に培養した。
【００７４】
限界希釈法によるクローニング
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個／mlとなるようそれぞれをＨＴ培地で希釈した。別にＨＴ培地に懸濁した４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラスチック製培養容器に２×１０5個／ウェルとり、これに上記の融合細胞（細胞濃度が２０個／ml）を５０μｌ／ウェルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、その１日後、７日後及び１４日後にＨＴ培地を１〜２滴／ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェルの培養上清を５０μｌ回収し、上記と同様の方法で抗体の生産を確認した。
ウェル中に単一の細胞コロニーしか存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもので、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を得た。
【００７５】
モノクローナル抗体の生産
ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを入れた７５cm2プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、３〜４日ごとにその培養液から１６〜１８mlを抜き取り、代わりに新鮮な１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地を総量で２０mlとなるように補い、継代培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、１２００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗体含有培養上清）を回収した。
また、予め２週間前にプリスタン０．５mlを腹腔内に注射しておいたＢａｌｂ／ｃマウスのその腹腔内に、１×１０6個／mlとなるようＰＢＳで懸濁したハイブリドーマ株を１ml注射した。３週間後、ｂａｌｂ／ｃマウスの腹水を回収し、１２００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗体含有腹水）を回収した。
【００７６】
モノクローナル抗体の精製
ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が生産するモノクローナル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８をマウス腹腔内に注射して得られたモノクローナル抗体含有腹水１容に３容のＰＢＳを加えて混合し、３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清をポアサイズ０．２２μｍのフィルタで濾過後、これをクロマトップスーパープロテインＡカラム（径４．６mm×１００mm、日本ガイシ(株)製）を用いるＨＰＬＣで精製した。カラムは予め、ＰＢＳで平衡化しておいた。
０．２２μｍフィルタで濾過後のサンプル１ｍｌをカラムに注入後、ＰＢＳを１ml/minで３分間流し、次いで、５ml/minで４分間流してカラムを洗浄した後、精製水１ＬにＮａＣｌ ８．７７ｇ、クエン酸（一水和物）１６．７ｇ及びＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １４．７２ｇを溶かした液を２ml/minで５分間流してモノクローナル抗体を溶出した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、ＴＴＢＳ溶液で希釈した。
【００７７】
クラミジア・ニューモニエの基本小体を溶解し、基本小体に含有されているペプチドを取得した。このペプチドと上記モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行い、取得したモノクローナル抗体の特異性を確認した。
その結果、取得したモノクローナル抗体はクラミジア・ニューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識することがわかった。
ハイブリドーマ ＡＹ６Ｅ２Ｅ８と同様にして、ハイブリドーマＳＣＰ５３を取得した。上記の方法と同様にしてハイブリドーマＳＣＰ５３が産生するモノクローナル抗体の特異性を調べた結果、このモノクローナル抗体は、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識することがわかった。
また、ハイブリドーマ ＡＹ６Ｅ２Ｅ８及びハイブリドーマＳＣＰ５３が産生するモノクローナル抗体のサブクラスを調べた結果、これらの抗体のサブクラスは、それぞれ、ＩｇＧ2及びＩｇＧ1bであった。
【００７８】
（Ｇ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳＯ4３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシリン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した後、これを２，０００rpmで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液の０．３５mlを採り、これにλgt11（ＤＮＡライブラリー）懸濁液を０．１μｌ加え、３７℃で２０分間インキューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５mlに、上記λgt11感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭ  ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０ ．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
【００７９】
フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行った。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄したのち、５μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体（ＳＣＰ５３又はＡＹ６Ｅ２Ｅ８）のＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％  ４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０mlを加えて調製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。
【００８０】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパスツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラチン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）  （以下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化した。
このようにして、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファージが得られ、これを５３−３Ｓλファージと命名した。
【００８１】
（Ｈ）５３−３Ｓλファージの培養とＤＮＡ精製
前記（Ｇ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成させ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μｌに、λファージ液５μｌを加え、３７℃で２０分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地５０mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こるまで３７℃で５時間振とう培養した。２５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λファージＤＮＡは、Wizardλ preps キット（プロメガ社、商品名）を用いて精製した。
【００８２】
（Ｉ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの増幅
６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μｌ、１０倍濃度  反応用緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチンを含むトリス−塩酸緩衝液pH８．３）１０μｌ、２０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μｌ、２０ｎＭ  λgt11 forward primer（宝酒造(株)製、商品名）１μｌ、２０ｎＭ  λgt11 reverse primer（宝酒造(株)製、商品名）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase（宝酒造(株)製、商品名）０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２滴重層した。９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７３℃  ２分のサイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡを増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizard PCR Prep キット（プロメガ社製、商品名）で精製した。
【００８３】
（Ｊ）ＤＮＡ塩基配列分析
ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社製、商品名）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト  「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名）を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号７の配列を得た。配列番号７の配列の解析結果から、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かった。
【００８４】
上記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエに特異的で、かつ、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を利用してクローニングされたので、このＤＮＡは、明らかに５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードしている。
配列番号７の塩基配列及びアミノ酸配列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベースで行なった結果、高い相同性を示す既知の配列は無かった。
【００８５】
実施例２  クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
前述したように、取得したＤＮＡが５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードしていることが明らかであるが、念のため、下記のようにして、取得したＤＮＡを発現させ、上記抗体と反応するか否か調べた。
プラスミドｐＢＢＫ１０ＭＭを制限酵素BamHIとXhoIで切断し、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、約４．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出して精製した。このＤＮＡ断片100ngに、配列番号８及び配列番号９の合成ＤＮＡ各１ngを添加し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造(株)製、商品名）を用いてこれらのＤＮＡを連結した。この反応物を大腸菌ＨＢ１０１株コンピテントセル（宝酒造(株)製、商品名）に入れ、形質転換体を作製し、プラスミドを取得し、これをｐＡＤＡ４３１と名付けた。このプラスミドを制限酵素MunIで切断した後、アルカリホスファターゼ処理し５′リン酸基を除去した。
【００８６】
一方、５３−３ＳλファージＤＮＡを制限酵素EcoRIで切断し、このＤＮＡ断片５０ngに、上記の制限酵素ＭｕｎＩで切断したｐＡＤＡ４３１プラスミドＤＮＡ１００ngを添加し、同様に連結し、形質転換体を作製し、５３−３ＳλファージＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＩ断片が組み込まれたプラスミドを取得し、これをｐＣＰＮ５３３αと名付けた。このプラスミドは、配列番号１０の塩基配列を有する約５．７ｋｂｐのＤＮＡであり、５３Ｋ抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドを宿主大腸菌で発現させることができるものである。この５３Ｋ抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号５のようになっており、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はを配列番号２のようになっていた。プラスミドｐＣＰＮ５３３αをもつ大腸菌を同様に培養し、電気泳動、ニトロセルロース膜への転写、モノクローナル抗体での検出を同様に行った結果、上記ポリペプチドに相当する発色したバンドが観察され、プラスミドｐＣＰＮ５３３αをもつ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエに特異的に反応するモノクローナル抗体と反応することができる５３Ｋ抗原ポリペプチドを発現していることが示された。
【００８７】
実施例３  クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取得
配列番号７の塩基配列を元に、配列番号１１及び１２の塩基配列を有するＤＮＡを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ含有量：約１μｇ）に、１０倍濃縮Ｋバッファ５μｌ、精製水３５μｌ及び制限酵素ＨｉｎｄIII（１９Ｕ／μｌ）５μｌを添加し、３７℃で３時間保温した。
得られた反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離して沈殿を取得した。この沈殿に、ＰＣＲ in vitro Cloning Kit(宝酒造(株)製、商品名)中のＨｉｎｄIIIカセットＤＮＡ（２０ng/μl）５μｌ、ライゲーション溶液１５μｌを添加し、１６℃で３０分間保温した。
取得した反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離して沈殿を取得し、これを１０μｌの精製水に溶解した。
【００８８】
得られた溶液１μｌに、精製水７８．５μｌ、１０倍濃縮ＰＣＲ用バッファ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ８μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（５Ｕ／μｌ）を添加し、さらに、プライマーＤＮＡとして、配列番号１１の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１３の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおいて、プライマーＣ１として同封されていたもの）１μｌを添加して、これらを０．６mlのマイクロチューブに入れ、ミネラルオイル２滴を重層し、９４℃３０秒、５５℃２分、７２℃３分の温度サイクルを３０回繰り返した。以上の工程をＰＣＲ工程という。
ＰＣＲ工程後の反応液１μｌに、プライマーＤＮＡとして、配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１４の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおいて、プライマーＣ２として同封されていたもの）１μｌを用い、再度ＰＣＲ工程を行った。
【００８９】
２番目のＰＣＲ工程後の反応液を１．２％低融点アガロースゲル電気泳動させ、約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡが含有されているアガロースゲルを切り出した。ＤＮＡの精製には Wizard PCR Prep キット（プロメガ社製、商品名）を用いた。即ち、切り出したアガロースゲルにキットに同封されている緩衝液を添加し、加熱してアガロースゲルを溶解し、キットに同封されている精製用樹脂を添加してＤＮＡを樹脂に吸着させ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿として取得した。沈殿をプロパノールで洗浄し、再度遠心分離して沈殿を取得した。沈殿に精製水を添加し、精製用樹脂からＤＮＡを溶出して、遠心分離し、上清（ＤＮＡ水溶液）を得た。以上の工程をＤＮＡ精製工程という。
【００９０】
取得したＤＮＡ水溶液を用い、含まれるＤＮＡを鋳型とするTaq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社製、商品名）でそのＤＮＡの塩基配列を分析した。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名）を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の工程を塩基配列解析工程という。
取得したＤＮＡの塩基配列を解析した結果、このＤＮＡは実施例１で取得したクラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの中の３′末端側の約５０ｂｐの塩基配列を有していた。さらに、その塩基配列の下流には、終始コドンを含有する約０．７ｋｂのコード領域が存在していることがわかった。
【００９１】
配列番号７の塩基配列を元に、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドのをコードするＤＮＡの上流部分に相当するプライマーとして、配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡを、また、上記の約０．７ｋｂのコード領域を含む塩基配列を元に、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドのをコードするＤＮＡの下流部分に相当するプライマーとして、配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡを、それぞれ、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１μｌを用い、プライマーＤＮＡとして配列番号１５の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１６の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌを用いてＰＣＲ工程を行った。
【００９２】
３番目のＰＣＲ工程後の反応液を用い、上記ＤＮＡ精製工程を行い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを取得した。
取得したＤＮＡ水溶液を用い、上記塩基配列解析工程を行った。
取得したＤＮＡの塩基配列を解析した結果、このＤＮＡは配列番号４の塩基配列を有しており、配列番号１のアミノ酸配列をコードしていることがわかった。
またプラスミドｐＣＰＮ５３３αと前述のλgt11のＤＮＡライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行い、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを取得した。
【００９３】
実施例４  クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作製
クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを含む組換えベクター及びそれを含む形質転換体は、以下のようにして作製することができる。
クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡとベクターを用い、実施例２と同様にしてクラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを含む組換えベクターとそれを含む形質転換体を作製する。
【００９４】
実施例５  抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定
抗原ポリペプチドを抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定は、以下のようにして行うことができる。
抗原ポリペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用い、これをＰＢＳに溶解し、マイクロタイタープレートのウェル（くぼみ）に注ぎ、４℃で一晩以上放置し、これにより抗原ポリペプチドをマイクロタイタープレートの固定（物理吸着）させる。続いて、牛血清アルブミンを含むＰＢＳを加え、４℃で一晩以上放置し、ブロッキングを行なう。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに患者の血清を加え、室温で２時間放置する。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにパーオキシダーゼ標識化マウス抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、室温で２時間放置する。０．０２％  （ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させ、９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度を測定する。
【００９５】
【発明の効果】
請求項１記載の測定法は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項２記載の測定法は、請求項１記載の測定法の効果を奏し、さらに、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列の長さが短いため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチドの数を多くすることができ、高感度である。
請求項３記載の測定法は、請求項１記載の測定法の効果を奏し、さらに、抗原ポリペプチドがタンパク質分解酵素による分解を受けにくい構造を作ることができるので安定性に優れており、測定結果の信頼性が高い。
請求項４記載の測定法は、請求項１記載の測定法の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドを、アミノ酸若しくはペプチドを利用して担体等に固定化できるので、固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくく、クラミジア・ニューモニエ感染を診断する上で優れている。
【００９６】
請求項５記載の測定法は、請求項１記載の測定法の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチド全体を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
請求項６記載の測定法は、請求項１記載の測定法の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
請求項７記載の測定法は、請求項１記載の測定法の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
【００９７】
請求項８記載の測定用試薬は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項９記載の測定用試薬は、請求項８記載の測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列の長さが短いため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチドの数を多くすることができ、高感度である。
請求項１０記載の測定用試薬は、請求項８記載の測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原ポリペプチドがタンパク質分解酵素による分解を受けにくい構造を作ることができるので安定性に優れており、測定結果の信頼性が高い。
請求項１１記載の測定用試薬は、請求項８記載の測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドを、アミノ酸若しくはペプチドを利用して担体等に固定化できるので、固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくく、クラミジア・ニューモニエ感染を診断する上で優れている。
【００９８】
請求項１２記載の測定用試薬は、請求項８記載の測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチド全体を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
請求項１３記載の測定用試薬は、請求項８記載の測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
請求項１４記載の測定用試薬は、請求項８記載の測定用試薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
【００９９】
請求項１５記載の診断薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項１６記載の診断薬は、請求項１５記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原ポリペプチドのアミノ酸配列の長さが短いため、担体等に固定化できる抗原ポリペプチドの数を多くすることができ、高感度である。
請求項１７記載の診断薬は、請求項１５記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原ポリペプチドがタンパク質分解酵素による分解を受けにくい構造を作ることができるので安定性に優れており、診断結果の信頼性が高い。
請求項１８記載の診断薬は、請求項１５記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドを、アミノ酸若しくはペプチドを利用して担体等に固定化できるので、固定化による抗原性の低下又は喪失が生じにくく、クラミジア・ニューモニエ感染を診断する上で優れている。
【０１００】
請求項１９記載の診断薬は、請求項１５記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチド全体を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
請求項２０記載の診断薬は、請求項１５記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
請求項２１記載の診断薬は、請求項１５記載の診断薬の効果を奏し、さらに、抗原として用いられるポリペプチドがクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原部分を有するので、抗体検査やクラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に極めて適切である。
【０１０１】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：488
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
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0003692598.tif 000006
【０１０２】
配列番号：2
配列の長さ：271
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
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0003692598.tif 000008
【０１０３】
配列番号：3
配列の長さ：259
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
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【０１０４】
配列番号：4
配列の長さ：1464
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
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【０１０５】
配列番号：5
配列の長さ：813
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
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【０１０６】
配列番号：6
配列の長さ：777
配列の型：核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列
ATGTCTATTT CATCTTCTTC AGGACCTGAC AATCAAAAAA ATATCATGTC TCAAGTTCTG     60
ACATCGACAC CCCAGGGCGT GCCCCAACAA GATAAGCTGT CTGGCAACGA AACGAAGCAA    120
ATACAGCAAA CACGTCAGGG TAAAAACACT GAGATGGAAA GCGATGCCAC TATTGCTGGT    180
GCTTCTGGAA AAGACAAAAC TTCCTCGACT ACAAAAACAG AAACAGCTCC ACAACAGGGA    240
GTTGCTGCTG GGAAAGAATC CTCAGAAAGT CAAAAGGCAG GTGCTGATAC TGGAGTATCA    300
GGAGCGGCTG CTACTACAGC ATCAAATACT GCAACAAAAA TTGCTATGCA GACCTCTATT    360
GAAGAGGCGA GCAAAAGTAT GGAGTCTACC TTAGAGTCAC TTCAAAGCCT CAGTGCCGCG    420
CAAATGAAAG AAGTCGAAGC GGTTGTTGTT GCTGCCCTCT CAGGGAAAAG TTCGGGTTCC    480
GCAAAATTGG AAACACCTGA GCTCCCCAAG CCCGGGGTGA CACCAAGATC AGAGGTTATC    540
GAAATCGGAC TCGCGCTTGC TAAAGCAATT CAGACATTGG GAGAAGCCAC AAAATCTGCC    600
TTATCTAACT ATGCAAGTAC ACAAGCACAA GCAGACCAAA CAAATAAACT AGGTCTAGAA    660
AAGCAAGCGA TAAAAATCGA TAAAGAACGA GAAGAATACC AAGAGATGAA GGCTGCCGAA    720
CAGAAGTCTA AAGATCTCGA AGGAACAATG GATACTGTCA ATACTGTGAT GATCGCG       777
【０１０７】
配列番号：7
配列の長さ：1048
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：C. ニューモニエ
株名：YK-41
直接の起源
クローン：53-3S
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：236..1012
特徴を決定した方法：P
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【０１０８】
配列番号：8
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GATCCAATTG CCATGGGGGC CCTTAATTAA TTAAC                                35
【０１０９】
配列番号：9
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC AATTG                                35
【０１１０】
配列番号：10
配列の長さ：5702
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
配列の種類：他の核酸  プラスミド
配列
ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCGG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA     60
TCAGTCTGAT TGCGGCGTTA GCGGTAGATC GCGTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCGT    120
GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTGGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA    180
TGGGCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC    240
TCAGCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA    300
TCGCGGCGTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCGGTCGC GTTTATGAAC    360
AGTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAAGGCG    420
ACACCCATTT CCCGGATTAC GAGCCGGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC GAATTCCACG    480
ATGCTGATGC GCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTGGAGCGG CGGATCCAAT    540
TCGAACCCCT TCGCGGCTCT TTCTGGAACT CTAGAATCTT TACATCTCGA AGAGTTAACT    600
CAAGGATTAT TCCCTTCTGC CCAAGAAGAT GCCAACTTCG CAAAGGAGTT ATCTTCAGTA    660
GTACACGGAT TAAAAAACCT AACCACTGTA GTTAATAAAC AAATGGTTAA AGGCGCTGAG    720
TAAAGCCCTT TGCAGAATCA AACCCCTTAG GATACAAACA TGTCTATTTC ATCTTCTTCA    780
GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA CATCGACACC CCAGGGCGTG    840
CCCCAACAAG ATAAGCTGTC TGGCAACGAA ACGAAGCAAA TACAGCAAAC ACGTCAGGGT    900
AAAAACACTG AGATGGAAAG CGATGCCACT ATTGCTGGTG CTTCTGGAAA AGACAAAACT    960
TCCTCGACTA CAAAAACAGA AACAGCTCCA CAACAGGGAG TTGCTGCTGG GAAAGAATCC   1020
TCAGAAAGTC AAAAGGCAGG TGCTGATACT GGAGTATCAG GAGCGGCTGC TACTACAGCA   1080
TCAAATACTG CAACAAAAAT TGCTATGCAG ACCTCTATTG AAGAGGCGAG CAAAAGTATG   1140
GAGTCTACCT TAGAGTCACT TCAAAGCCTC AGTGCCGCGC AAATGAAAGA AGTCGAAGCG   1200
GTTGTTGTTG CTGCCCTCTC AGGGAAAAGT TCGGGTTCCG CAAAATTGGA AACACCTGAG   1260
CTCCCCAAGC CCGGGGTGAC ACCAAGATCA GAGGTTATCG AAATCGGACT CGCGCTTGCT   1320
AAAGCAATTC AGACATTGGG AGAAGCCACA AAATCTGCCT TATCTAACTA TGCAAGTACA   1380
CAAGCACAAG CAGACCAAAC AAATAAACTA GGTCTAGAAA AGCAAGCGAT AAAAATCGAT   1440
AAAGAACGAG AAGAATACCA AGAGATGAAG GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA AGATCTCGAA   1500
GGAACAATGG ATACTGTCAA TACTGTGATG ATCGCGAAGG GGTTCGAATT GCCATGGGGG   1560
CCCTTAATTA ATTAACTCGA GAGATCCAGA TCTAATCGAT GATCCTCTAC GCCGGACGCA   1620
TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG CGCCTATATC GCCGACATCA   1680
CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA   1740
TGGTGGCAGG CCCGTGGCCG GGGGACTGTT GGGCGCCATC TCCTTGCATG CACCATTCCT   1800
TGCGGCGGCG GTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC   1860
GCATAAGGGA GAGCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC AACCCAGTCA GCTCCTTCCG   1920
GTGGGCGCGG GGCATGACTA TCGTCGCCGC ACTTATGACT GTCTTCTTTA TCATGCAACT   1980
CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC GAGGACCGCT TTCGCTGGAG   2040
CGCGACGATG ATCGGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC TTGCACGCCC TCGCTCAAGC   2100
CTTCGTCACT GGTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG CAGGCCATTA TCGCCGGCAT   2160
GGCGGCCGAC GCGCTGGGCT ACGTCTTGCT GGCGTTCGCG ACGCGAGGCT GGATGGCCTT   2220
CCCCATTATG ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCGGGATG CCCGCGTTGC AGGCCATGCT   2280
GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACAGCTTCAA GGATCGCTCG CGGCTCTTAC   2340
CAGCCTAACT TCGATCACTG GACCGCTGAT CGTCACGGCG ATTTATGCCG CCTCGGCGAG   2400
CACATGGAAC GGGTTGGCAT GGATTGTAGG CGCCGCCCTA TACCTTGTCT GCCTCCCCGC   2460
GTTGCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA ATGGAAGCCG GCGGCACCTC   2520
GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA GCCAATCAAT TCTTGCGGAG AACTGTGAAT   2580
GCGCAAACCA ACCCTTGGCA GAACATATCC ATCGCGTCCG CCATCTCCAG CAGCCGCACG   2640
CGGCGCATCT CGGGCAGCGT TGGGTCCTGG CCACGGGTGC GCATGATCGT GCTCCTGTCG   2700
TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGGGGTTGC CTTACTGGTT AGCAGAATGA ATCACCGATA   2760
CGCGAGCGAA CGTGAAGCGA CTGCTGCTGC AAAACGTCTG CGACCTGAGC AACAACATGA   2820
ATGGTCTTCG GTTTCCGTGT TTCGTAAAGT CTGGAAACGC GGAAGTCAGC GCCCTGCACC   2880
ATTATGTTCC GGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC CCTGTGGAAC ACCTACATCT   2940
GTATTAACGA AGCGCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC TCTGGTCCCG CCGCATCCAT   3000
ACCGCCAGTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGG CATGTTCATC ATCAGTAACC   3060
CGTATCGTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA CCCCCATGAA CAGAAATTC    3120
CCCCTTACAC GGAGGCATCA AGTGACCAAA CAGGAAAAAA CCGCCCTTAA CATGGCCCG    3180
CTTTATCAGA AGCCAGACAT TAACGCTTCT GGAGAAACTC AACGAGCTGG ACGCGGATG    3240
AACAGGCAGA CATCTGTGAA TCGCTTCACG ACCACGCTGA TGAGCTTTAC CGCAGCTGC    3300
CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGT    3360
CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGG    3420
GTGTTGGCGG GTGTCGGGGC GCAGCCATGA CCCAGTCACG TAGCGATAGC GGAGTGTAT    3480
ACTGGCTTAA CTATGCGGCA TCAGAGCAGA TTGTACTGAG AGTGCACCAT ATGCGGTGT    3540
GAAATACCGC ACAGATGCGT AAGGAGAAAA TACCGCATCA GGCGCTCTTC CGCTTCCTC    3600
GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAA    3660
AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC ATGTGAGCA    3720
AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA AAGGCCGCGT TGCTGGCGTT TTTCCATAG    3780
GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACC    3840
CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCT    3900
GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGC    3960
GCTTTCTCAA TGCTCACGCT GTAGGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGC    4020
TGGGCTGTGT GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTAT    4080
CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAA    4140
CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTA    4200
ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG CCAGTTACC    4260
TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGG    4320
TTTTTTTGTT TGCAAGCAGC AGATTACGCG CAGAAAAAAA GGATCTCAAG AAGATCCTT    4380
TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTG    4440
GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTT    4500
TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCA    4560
GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCC    4620
GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGAT    4680
ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAA    4740
GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT TATCCGCCTC CATCCAGTCT ATTAATTGT    4800
TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCAT    4860
TGCTGCAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTT    4920
CCCAACGATC AAGGCGAGTT ACATGATCCC CCATGTTGTG CAAAAAAGCG GTTAGCTCC    4980
TTCGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTAT    5040
GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT CTGTGACTG    5100
GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGC    5160
CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCAT    5220
TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTT    5280
CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTT    5340
TCTGGGTGAG CAAAAACAGG AAGGCAAAAT GCCGCAAAAA AGGGAATAAG GGCGACACG    5400
GAAATGTTGA ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTT    5460
ATTGTCTCAT GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTT    5520
CCGCGCACAT TTCCCCGAAA AGTGCCACCT GACGTCTAAG AAACCATTAT TATCATGAC    5580
ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTTCAAGAAT TAATTGTTA    5640
TCCGCTCACA ATTAATTCTT GACAATTAGT TAACTATTTG TTATAATGTA TTCATAAGC    5700
TT                                                                  5702
【０１１１】
配列番号：11
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA                                                 20
【０１１２】
配列番号：12
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CTCGAAGGAA CAATGGATAC                                                 20
【０１１３】
配列番号：13
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG                                             23
【０１１４】
配列番号：14
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
TAATACGACT CACTATAGGG AGA                                             23
【０１１５】
配列番号：15
配列の長さ：28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT                                        28
【０１１６】
配列番号：16
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA                                      30