(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血または再灌流損傷により生じる局所的炎症反応を軽減するための、脈管内投与用の、ヘパリナーゼ酵素と薬学的または獣医学的に許容可能な担体とを共に含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記担体がリポソーム、リポスフェア、プロテオソオーム、ミクロクフェア、マイクロカプセル、および生体内分解性ポリマーマトリックスよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
患者の組織での虚血または再灌流損傷から生じる局所的炎症反応を軽減する脈管内投与用の医薬の調製におけるヘパリナーゼ酵素の使用。
【請求項４】
前記ヘパリナーゼ酵素が、フラボバクテリウム  ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）またはエシェリキア  コリ（Escherichia coli）から過剰発現されたものであることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ヘパリナーゼ酵素がヘパリナーゼＩＩＩであることを特徴とする請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
虚血または再灌流損傷が、心筋梗塞、発作、臓器移植、ショック、または心肺バイパス手術によるものであることを特徴とする請求項３から５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は医学的治療の分野に属し、局所的炎症反応を軽減する治療または予防としてのヘパリナーゼ酵素の使用を指向する。
発明の背景
炎症反応は毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、発熱、および疼痛によって明らかになる細胞損傷に対する局所的反応であり、有害作用物質および損傷組織の除去を開始するメカニズムとして役立つ。
組織内の広汎性炎症反応は、白血球の組織への動員によっておきる。細菌、異物および／または損傷細胞の破壊は、食作用および／または細胞外脱顆粒（分解性酵素、抗細菌性蛋白質およびミエロペルオキシダーゼを分泌し、ミエロペルオキシダーゼは分泌されたＨ2Ｏ2からスーパーオキサイドを形成する）によっておきる。ほとんどの局所的炎症反応は好都合であるが、有害な炎症反応もおこり得る。多くの有害な炎症反応には、組織内への白血球の蓄積も含まれる。この蓄積は生細胞および組織の破壊をおこす。組織の損傷に加えて、これらの反応は攻撃を受けた人にも有害であるか、または衰弱させる。有害な炎症反応の例には下記を含める；心筋梗塞後の虚血／再灌流損傷、ショック、発作、臓器移植、心肺バイパス手術、同種移植片拒絶、リウマチ性関節炎、抗原誘発性喘息、アレルギー性鼻炎、および糸球体腎炎（ハーラン(Harlan)ら、Immunol.Rev.１１４巻、５−１２ページ、１９９０；カルロス(Carlos)＆ハーラン、Blood、８４巻、２０６８−２１０１ページ、１９９４を参照のこと）。
白血球動員は、内皮に隣接する損傷−または感染組織による血管内皮の活性化で始まる一連の細胞性事象のカスケードを含む。内皮の活性化は白血球の内皮細胞への粘着を高め、結合白血球による損傷組織への経内皮的遊走（管外遊走）をおこす。内皮の活性化は、内皮細胞の短期間の速やかな、および／または長期間の刺激によってあらわれる。
トロンビン、化学誘引性ロイコトリエン類のＢ4、Ｃ4およびＤ4(ＬＴＢ4、ＬＴＣ4およびＬＴＤ4）、およびヒスタミンなどの活性剤は、蛋白質合成には無関係に、速やかな一過性の（＜３０分）内皮細胞活性化をもたらし、化学誘引物質、例えば血小板活性化因子（ＰＡＦ；グリセロリン脂質）やＬＴＢ4ヒスタミンで示される）など、および粘着分子；ＩＣＡＭ−１（トロンビンで示される）およびＰ−セレクチンの内皮細胞表面レベルを高めることができる（チンマーマン(Zimmerman）ら、J.Cell Biol.１１０巻、５２９−５４０ページ、１９９０；スガマ(Sugama)ら、J.Cell Biol.１１９巻；９３５−９４４ページ、１９９２；マックインタイヤ(McIntyre)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  ８３巻、２２０４−２２０８ページ、１９８６；ローラン(Lorant)ら、J.Cell Biol.１１５巻、２２３−２３４ページ、１９９１）。内皮細胞の速やかな活性化の結果は、白血球の内皮への粘着増加である（フーバー(Hoover)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  ８１巻  ２１９１−２１９４ページ、１９８４；チンマーマンら、J.Cell Biol.１１０巻、５２９−５４０ページ、１９９０；ハナハン（Hanahan）ら、Ann.Rev.Biochem.５５巻、４８３−５０９ページ、１９８６）。しかし、増加したＬＴＢ4表面レベルが好中球の経内皮遊走を直接的に増加することは証明されておらず（ヒュー(Hughs)ら、Prost.Leuk.Essent.F.A.４５巻、１１３−１１９ページ、１９９２）、場合によっては、活性化された内皮への白血球の粘着にはＰＡＦは必要でない（キュジパーズ(Kuijipers）ら、J.Cell Biol.１１７巻、５６５−５７４ページ、１９９２）。
長期（時間単位の存続期間）蛋白質合成依存性の内皮細胞活性化はＩＬ−１ｂおよびＴＮＦ−ａのようなサイトカイン類、およびリポ多糖体（ＬＰＳ）によってもたらされ、粘着分子：Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の表面レベルを高く維持する（カルロスおよびハーランの研究、Blood、８４巻、２０６８−２１０１ページ、１９９４）。ＩＬ−１ｂおよびＴＮＦ−ａは内皮細胞によるＰＡＦの合成も高める（キュジパーズら、J.Cell Biol.１１７巻、５６５−５７４ページ、１９９２）。その上、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦ−ａ、ＬＰＳおよびヒスタミンによる内皮細胞の活性化は、ケモカイン、ＩＬ−８、の合成および分泌を高めることが証明された（ストリーター(Strieter)ら、Science ２４３巻、１４６７−１４６９ページ、１９８９；ジーニン(Jeannin）ら、Blood ８４巻、２２２９−２２３３ページ、１９９４）。
ケモカイン類、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１、は内皮細胞表面で産生され、そこに存在することが判明した（フーバー(Huber）ら、Science ２５４巻、９９−１０２ページ、１９９１；スプリンガー(Springer)、Nature、３４６巻、４２５−４３４ページ、１９９０）。ケモカイン、ＭＩＰ−１ｂ、はin vivoでリンパ筋内皮上に存在することが示された（タウブ(Taub)ら、Science、２６０巻、３５５−３５９ページ、１９９３；タナカら、Nature  ３６１巻、７９−８２ページ、１９９３）。ケモカイン類；ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−ａ、ＭＩＰ−ｂ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８はすべてヘパリン結合蛋白質であり、それは分泌後、ヘパリンおよびヘパラン硫酸部分をもつ細胞表面および細胞外基質プロテオグリカン類に結合する（ミラーらの研究、Crit.Rev.Immunol.１２巻、１７−４６ページ、１９９２）。
ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、分枝していない同じ炭水化物鎖上に散らばって見いだされる類似のグリコサミノグリカンである。それらはプロテオグリカンの蛋白質バックボーンに共有結合している。これらの２つの名前が意味するものとは異なり、ヘパリンはヘパラン硫酸より高度に硫酸化されている。プロテオグリカンは細胞表面上および細胞外基質中（例えば内皮の基底膜中）に存在する。同じ炭化水素鎖上のヘパリンおよびヘパラン硫酸の領域を区別するのは難しいため、ケモカイン類がヘパリンかヘパラン硫酸部分のどちらに好んで結合するかについてはほとんどデータがない。ケモカイン類ＩＬ−８およびＧＲＯがヘパリンよりもヘパラン硫酸により大きい親和性をもって結合し、ＰＦ４およびＮＡＰ−２はヘパリン部分により大きい親和性をもって結合することが示唆されている（ウィット(Witt)およびランダー(Lander)、Curr.Biol.４巻、３９４−４００ページ、１９９４）。概して、ケモカイン類はヘパリン結合蛋白質と言われている。ケモカインＩＬ−８、ＰＦ４、ＭＣＰ−１およびＮＡＰ−２のＣ末端領域はα−ヘリックスを形成し、ヘパリン／ヘパラン硫酸に結合することが示された（ウェブ(Webb)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  ９０巻、７１５８−７１６２ページ、１９９３；ツッカー(Zucker)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８６巻、７５７１−７５７４ページ、１９８９；マツシマら、in Interleukins:Molec.Biol.Immunol.編集  キスチモト(Kistimoto）、カーガー(Karger)、バーゼル(Basel)、２３６−２６５ページ、１９９２）。これはケモカインのすべてに共通の構造のようである。
活性化内皮細胞によって発現される上記のすべての分子（ＰＡＦ、ＬＴＢ4、セレクチン、ＣＡＭｓおよびケモカイン類）は内皮細胞表面上に存在し、損傷組織部位に隣接する血管内皮に局在する。これらの分子と相互作用する血液運搬(blood-borne）白血球も損傷組織領域に結合して局在する。内皮の長期活性化の結果、白血球の粘着および管外遊走が増加し、隣接組織における白血球の顕著な局部的蓄積がおきるが、これは短期間の活性化中には起こり得ない（エビサワら、J.Immunol.１４９巻、４０２１−４０２８ページ、１９９２；フーバー、およびワイス、J.Clin.Invest.８３巻、１１２２−１１２９ページ、１９８９；オッペンハイマー−マークスら、J.Immunol.１４５巻、１４０−１４８、１９９０）。
内皮への白血球の粘着は、２段階プロセスでおこると考えられる（カルロス、およびハーランの研究、Blood、８４巻、２０６８−２１０１ページ、１９９４）。最初に、白血球は血管表面に沿って回転(roll)する。回転の増加は、最初は血管内皮上で（最初の３０分以内）、白血球表面のSialyl Lewisx構造と、活性化内皮細胞上で増加したＰ−セレクチンおよびＥ−セレクチンとの相互作用によって仲介される（リー(Ley）ら、Blood ８５巻、３７２７−３７３５ページ、１９９５）。増加した回転は、白血球の細胞膜上のＬ−セレクチンと、血管内皮上のヘパリン様分子（これはサイトカイン誘導性である（カリン（Karin）ら、Science ２６１巻、４８０−４８３ページ、１９９３））との相互作用によって、またはリンパ球上のＬ−セレクチンと、リンパ系組織の高内皮細静脈（ＨＥＶｓ）上の血管アドレッシン類(addressins)；ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４およびＭＡｄＣＡＭ−１との間の相互作用によっても仲介される（４０分後）。第２段階−白血球が内皮細胞にしっかり粘着することは、白血球インテグリン（例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ＶＬＡ−４）と内皮細胞粘着分子（ＣＡＭｓ；例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ−１）との相互作用に基づく。白血球は内皮表面上で平らになり、確実な粘着と同時にＬ−セレクチンを発生する（キシモトら、Science ２４５巻、１２３８−１２４２ページ、１９８９；ジュティラ(Jutila)ら、J.Immunol.１４３巻、３３１８−３３２４ページ、１９８９；スミス(Smith）ら、Clin.Invest.８７巻、６０９−６１８ページ、１９９１）。
セレクチンおよびＣＡＭレベルは内皮表面で多くのサイトカインおよび化学誘引物質に反応して増加する。これらの増加は細胞表面上での付加的セレクチンおよびＣＡＭ分子の合成および／または分泌に依存しておきる。それとは異なり、確実な粘着のための白血球の活性化は数秒以内に（Bargatzeら、J.Exp.Med.、１７８巻、３６７−３７３ページ、１９９３）、インテグリンの分泌増加によって、そしてより重要なことには、細胞表面インテグリンおけるコンフォメーション変化（インテグリンの活性化）の誘導によっておき、この結果、インテグリンのＣＡＭｓへの確実な結合が可能になることがわかった。（チンマーマンの研究、Immunol.Today １３巻、９３−９９ページ、１９９２）。
ＰＡＦおよびＥ−セレクチンはインテグリンを活性化して内皮細胞へ粘着させることができる（ロラント(Lorant)ら、J.Biol.Chem.１１５巻、２２３−２３４ページ、１９９１；ロ(Lo)、J.Exp.Med.１７３巻、１４９３−１５００ページ、１９９１）。ＣＤ４４（ヘパリン／ヘパラン硫酸部分を所有する）またはヘパリンＢＳＡ結合体に結合することによって固定されたＭＩＰ−１ｂの存在が、固定化ＶＣＡＭ−１分子とＣＤ８＋Ｔ細胞の結合のために必要であることが示された。この結合は、ＶＬＡ−４に対する抗体によってブロックされることがわかり、ＭＩＰ−１ｂがＴ−細胞表面上のＶＬＡ−４を活性化することが示唆された（タナカら、Nature  ３６１巻、７９−８２ページ、１９９３）。好中球表面のインテグリンＣＤ１８（Ｍａｃ−１の部分）のレベルの増加は、ＩＬ−１ｂによって刺激された内皮に好中球が接触したときにおきることがわかった。ＩＬ−８に対する抗体はＣＤ１８アップレギュレーションを阻止し、好中球粘着も阻止した（フーバー、Science ２５４巻、９９−１０２ページ、１９９１）。こうしてケモカイン類は白血球粘着の直接的活性剤として作用し得る。対照的に、ルシナスカス(Luscinaskas）ら(J.Immunol.１４９巻、２１６３−２１７１ページ、１９９２）は、好中球のＩＬ−８による前処理が好中球付着を阻止し、外因性ＩＬ−８の添加が活性化内皮細胞に粘着した好中球を脱着することを示した。ロート(Rot)(Immunol.Today １３巻、２９１−２９４ページ、１９９２）は、内皮細胞表面に結合したＩＬ−８は粘着を促進するが、溶解性ＩＬ−８はそれを阻止し得るということを提案することによって、これらの矛盾する結果を説明した。
異なるケモカイン類は異なる白血球を活性化する。ＩＬ−８は好中球、好酸球およびＴ細胞を活性化する。ＲＡＮＴＥＳは単球、好酸球およびＴ細胞を活性化する。ＭＣＰ−１は単球を活性化する。ＭＩＰ−１ａはＣＤ４＋Ｔ細胞、単球、およびＢ細胞を活性化し、一方ＭＩＰ−１ｂは単球およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する（ラスキーの研究、Current Biol  ３巻、３６６−３７８ページ、１９９３）。セレクチン、インテグリン、ＣＡＭｓおよびケモカインの異なる組み合わせが選択され、異なる炎症組織に認められる白血球サブタイプを粘着および遊走させると考えられる（ブッチャー(Butcher)、Cell ６７巻、１０３３−１０３９ページ、１９９１）。
白血球の粘着および管外遊走におけるインテグリン、ＣＤ１１／ＣＤ１８（Ｍａｃ−１）、およびＩＣＡＭｓの重要性は、多くの系でこれらの分子に対する抗体の使用によって示された。抗体は粘着分子の機能を妨害し、白血球動員をブロックまたは減少させる。白血球粘着性欠乏（ＬＡＤ）Ｉ型症候群は罹患患者の白血球上のインテグリン、ＣＤ１８、を部分的または完全に消失させる。炎症部位への好中球の動員は無視できる。しかし単球および好酸球動員は正常であり、粘着分子の別の組、多分ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１、がこれらの細胞の動員のために機能することを示唆している（ハーラン、Clin.Immunol.Immunopath.６７巻、Ｓ１６−Ｓ２４ページ、１９９３）。ＶＬＡ−４は好中球によっては発現されない（ウィンおよびハーラン、J.Clin.Invest.９２巻、１１６８−１１７４ページ、１９９３）。既述のように、ケモカインは白血球上のインテグリンＶＬＡ−４およびＣＤ１８の活性化および表面レベル増加にとって重要である。ポリカルボネート  フィルター上に固体したＩＬ−８は、好中球のフィルターを通過する遊走を方向づけるのに適することがわかった（ロート、Immunol.Today  １３巻、２９１−２９４ページ）。フーバーら（Science ２５４巻、９９−１０２ページ、１９９１）は、ＩＬ−１ｂで刺激された内皮細胞単層に産生した結合ＩＬ−８の経内皮勾配が好中球の管外遊走のために必要であることを示した。これらの好中球はＩＬ−８で予備活性化され、内皮細胞に結合したが、ＩＬ−８勾配が生じる程には遊走しなかった。この勾配は内皮細胞内腔表面から内皮細胞単層の下にある基底膜を通して広がる。活性化内皮細胞の下にある基底膜から結合ＩＬ−８を洗い去ると、その単層を通過する遊走は阻止された。その上、ＩＬ−８に対する抗体は好中球遊走の７０−８０％を阻止した。キュジパーズら(J.Cell Biol.１１７巻、５６５−５７２ページ、１９９２）は抗ＩＬ−８抗体を用いて、ＩＬ−１ｂおよびＴＮＦ−ａで活性化した内皮を通過する好中球の遊走を６０％減少させ、ＰＡＦ受容体拮抗物質の添加は遊走を８５−９０％減少させた。これらの結果は、ＩＬ−８前処理好中球では活性化内皮細胞単層を通過するそれらの遊走能力が阻害されることを示した実験とは対照的である（ルシナスカスら、J.Immunol.１４９巻、２１６３−２１７１ページ、１９９２）。こうして、ケモカインは白血球の粘着を活性化するのみならず、ケモカインの結合勾配は白血球の管外遊走においても重要であるらしい。溶解性ケモカインが存在すると、粘着および結合ケモカイン勾配に沿う遊走が妨害されることがある。以下で論ずるように、溶解性ケモカインのin vivo局所的濃度の上昇は、血流によって最小になるであろう。
ひとたび活性化された白血球が損傷組織内に蓄積し始めたならば、それらはサイトカイン、ケモカインおよびＬＴＢ4の合成および分泌によってその他の白血球の蓄積を増大することができる。ＬＰＳは単球ＩＬ−１ｂの発現を直接増加することが判明した（ポラト(Porat）ら、FASEB J，６巻；２４８２−２４８９ページ、１９９２）。ＩＬ−８、ＩＬ−１ｂおよびＴＮＦ−ａはＧＭ−ＣＳＦで活性化された好中球によって産生され、その他のサイトカインは活性化マクロファージ、内皮およびＴ−細胞によって産生される（マッケインら、Am.J.Respir.Cell Molec.Biol.,８巻、２８−３４ページ、１９９３；リンデマンら、J.Immunol.１４０巻、８３７−８３９、１９８８；リンデマンら、J.Clin.Invest.８３巻、１３０８−１３１２ページ、１９８９）。ＩＬ−１ｂおよびＴＮＦ−ａは単球を刺激し、それによってケモカイン類、ＩＬ−８およびＭＩＰ−１ａの発現を増加することがわかった（ルカスら、Blood、８２巻、３６６８−３６７４ページ、１９９３）。活性化された好中球および単球は、ＬＴＢ4産生の主要ソースであることがわかった（サミュエルソンら、Science ２３７巻、１１７１−１１７６ページ、１９８７；ブラハ(Brach）ら、Eur.J.Immunol.２２巻、２７０５−２７１１ページ、１９９２）。既述のように、ＬＴＢ4は白血球のその後の動員に直接関係しないが、ＬＴＢ4で刺激された好中球がＩＬ−８を産生するため、ＬＴＢ4−刺激された好中球は、ＩＬ−８勾配の形成を通して間接的に、さらに好中球動員を促進することができる（マッケインら、Am.J.Respir.Cell Molec.Biol.１０巻、６５１−６５７ページ、１９９４）。これらの白血球誘導性活性剤による白血球の連続動員は媒介として血管内皮を用いることを必要とする。内皮細胞と基底膜は、好中球誘導性ケモカインと結合し、好中球誘導性ケモカインの勾配を生成する、または白血球誘導性サイトカインは内皮を活性化し、それもケモカイン勾配を生成せしめる。
血管内の血流は、組織局在的炎症反応によっておきる溶解性活性化因子（サイトカイン、ケモカインおよび化学誘引物質）の局所的濃度の増大を阻止する。もしも局所的炎症が活性化剤の高血中濃度をもたらすならば、白血球の全身的活性化が起こり得る（フィン(Finn)ら、J.Thorac.J.Surg.１０５巻、２３４−２４１ページ、１９９３）。活性化白血球は次いで不活性化内皮に一過性に結合し、および／または脱顆粒し、敗血症をおこす（ソーヤー(Sawyer)ら、Rev.Infect.Dis.１１巻、Ｓ１５３２−１５４４ページ、１９８９）。若干の血液運搬白血球が局所的炎症によって活性化されている場合（活性化白血球のすべてが管外遊走するわけではない）、活性化白血球は付加的サイトカイン、ケモカイン、およびＬＴＢ4を産生し血液中に分泌する。この活性化剤濃度の上昇が不活性化細胞をアップレギュレートし、全身反応を増幅するかも知れない。
炎症反応のメカニズムがいくらか詳細になっているとはいえ、まだ、局所的炎症反応を軽減または阻止するための有効な治療および薬物学的組成物の必要性がある。
発明の概要
本発明はヘパリナーゼ分解酵素類を個々にまたは一緒に用いて局所的炎症反応を軽減するのに用いることができるような発見を指向する。本発明に有用なヘパリナーゼは種々のソースから得られる：グラム陰性菌Flavobacterium heparinumからのヘパリナーゼＩ、II、およびIII、バクテロイデス属（Bacteroides）菌株からのヘパリナーゼ、フラボバクテリウム(Flavobacterium)Ｈｐ２０６からのヘパリナーゼ、シトファーガ属(Cytophagia)菌種からのヘパリナーゼ、および哺乳類細胞からのヘパリナーゼ。これらの酵素は単独で、または組み合わせて、ヘパリナーゼまたはヘパリナーゼ酵素としてここでは記述される。
ヘパリンおよびヘパラン硫酸部分は、内皮細胞表面上および基底膜からヘパリナーゼの適用によって分解される。活性化内皮細胞上のアップレギュレートされたプロテオグリカンからヘパリンおよびヘパラン硫酸部分を除去すると、白血球上で見られるＬ−セレクチンとプロテオグリカンとの相互作用が阻止される。Ｌ−セレクチン−プロテオグリカン相互作用を減らすことによって、活性化内皮上を回転する白血球を阻止することができる。
その上、ヘパリンおよびヘパラン硫酸部分を活性化内皮細胞表面から、およびそれらの基底膜から除去する場合、ヘパリンおよびヘパラン硫酸部分に結合しているケモカイン類は細胞表面および基底膜から放出される。結合ケモカインの喪失はケモカインの局所的濃度を減少させ、活性化内皮によって生成したケモカイン勾配を崩壊させ、それによって、確実な粘着のために必要な、回転白血球のケモカインによる活性化を阻止し、ケモカイン勾配に沿った白血球の管外遊走を防止する。本発明による、白血球の回転(rolling）、活性化および管外遊走の減少は、白血球動員の基本的メカニズムを妨害することによって、局所的組織炎症反応を阻止することができる。
ヘパリナーゼ酵素は、酵素を局所的高濃度で運搬するか、またはその酵素の拡散を物理的に制限するという選択された投与法によって、特異的細胞タイプ、組織または器官を標的にすることができる。その上、本発明により、ヘパリナーゼは酵素を抗体、増殖因子または粘着分子からの結合ドメインに融合することによって標的化することができる。融合蛋白質は、組換え微生物における遺伝子融合物の作成および発現によって産生される。例えば、結合ドメインは、活性化内皮上（例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン）または内皮細胞サブタイプ上（例えばＧｌｙＣＡＭ−１）の細胞表面分子を識別することができる。標的融合酵素はインディケーションの数および特異性を高めることができ、一方では、治療に起因する効果および起こり得る副作用の点から酵素の必要量を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼIIIによって内皮細胞表面から放出された35Ｓ−ヘパリン／ヘパラン硫酸のカウント数のグラフであり、ゲル濾過カラムで、そのサイズによって分離したものである。ダイアモンドは５分間の消化によって放出されるカウント数、四角は３０分の消化によって放出されるカウント数、三角は６０分間消化によって放出されるカウント数を示す。擬似(mock)消化の各フラクションからのバックグラウンドカウント数をヘパリナーゼIII消化から誘導されるフラクションから差し引いてある。
図２Ａおよび図２Ｂは０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩ、II、またはIIIで１時間処理後、指示された時刻における不活性化（２Ａ）−およびＩＬ−１ｂ活性化（２Ｂ）ヒト内皮細胞系に存在するヘパリン／ヘパラン硫酸のパーセントのグラフである。細胞表面ヘパリンに結合する125Ｉ−ｂＦＧＦを用いて存在するヘパリン／ヘパラン硫酸の量を測定した。ヘパリナーゼＩ、II、またはIII処理細胞の結果は、ダイアモンド、四角または三角でそれぞれ示す。垂直線は平均値の標準誤差である。
図３Ａおよび図３Ｂは、１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩで処理後、指示された時刻における不活性化（３Ａ）−およびＩＬ−１ｂ活性化（３Ｂ）ヒト内皮細胞系上に存在したヘパリン／ヘパラン硫酸のパーセントを示すグラフである。細胞表面ヘパリンに結合する125Ｉ−ｂＦＧＦを用いて、存在するヘパリン／ヘパラン硫酸の量を測定した。１、３または５時間処理細胞の結果をそれぞれダイアモンド、四角または三角であらわす。垂直線は平均値の標準誤差である。
図４Ａおよび図４Ｂは、１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼIIIで処理後、指示された時刻における不活性化（４Ａ）およびＩＬ−１ｂ活性化（４Ｂ）ヒト内皮細胞系上に存在するヘパリン／ヘパラン硫酸のパーセントのグラフである。細胞表面ヘパリンに結合する125Ｉ−ｂＦＧＦを用いて存在するヘパリン／ヘパラン硫酸の量を測定した。１、３または５時間処理細胞の結果をそれぞれダイアモンド、四角または三角であらわす。垂直線は平均値の標準誤差である。
図５は、１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼ；Ｉ（５Ａ）、II（５Ｂ）、Ｉ＋III(斜線を含む棒；５Ｂ）、およびIII(５Ｃ）で処理することによってＩＬ−１ｂ活性化ヒト内皮細胞層から放出されるＩＬ−８のレベルをあらわすグラフである。棒は、ヘパリナーゼで処理した活性化内皮層からの上澄液  対  活性化内皮層からの未処理上澄液（分泌されたＩＬ−８のみを含む）に見いだされるＩＬ−８の濃度のパーセント差をあらわす。これらのパーセント差の標準誤差は垂直線によって示される。棒に重なって描かれている線はヘパリナーゼ処理細胞層からの上澄液中のＩＬ−８の濃度を示す。これらの測定値の標準誤差も垂直線によって示される（全部見えるわけではない）。
図６は、活性化されていない内皮細胞、ＩＬ−１ｂ活性化内皮細胞、またはＩＬ−１ｂ活性化後に０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIで処理した内皮細胞への好中球の粘着レベルである。粘着レベルは粘着している好中球の、加えた好中球に対するパーセントとしてあらわされる。
図７Ａ、図７Ｂおよび図７ＣはＩＬ−１ｂ活性化内皮細胞層を通る好中球管外遊走の阻止パーセントのグラフである。斜線を含む棒は、１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼで１時間処理した結果をあらわす。白い棒は０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼで１時間処理した結果をあらわす。黒い棒は０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩまたはIIIで１５分間処理した結果をあらわす。そして垂直線を含む棒は１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼIIで１５分処理した結果をあらわす。阻止パーセントの標準偏差は垂直線によってあらわす。小さい星印は１時間処理の結果が、同じヘパリナーゼで１５分処理した結果と有意に異なることを示す（ｐ＜０．０５）。大きい星印は１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼで１時間処理した結果が０．１ＩＵ／ｍｌの同じヘパリナーゼで１時間処理した結果と有意に異なることを示す。棒の下の括弧内の数字は、各データセットに含まれる実験数である。
図８は、ｐＨ５．８および７での、ＥＣＭ上のヒトヘパリナーゼ（β−トロンボグロブリン）の活性を示すグラフである。黒棒は１μｇヒトヘパリナーゼで処理したＥＣＭから放出される35ＳＯ4  対  未処理ＥＣＭから放出される35ＳＯ4のパーセント差をあらわす。斜線を含む棒は、５μｇのヒトヘパリナーゼで処理したＥＣＭから放出される35ＳＯ4  対  未処理ＥＣＭから放出される35ＳＯ4のパーセント差をあらわす。平均値の標準偏差は垂直線によって示される。
図９は、ＨＵＶＥＣ層をＩＬ−１ｂで活性化時、および活性化ＨＵＶＥＣ層をヒトヘパリナーゼ（ｈｈｅｐ）で処理した後、の好中球の管外遊走レベルの変化をあらわすグラフである。平均値の標準偏差は垂直線によって示される。
図１０は、５時間の注入期間にわたるラット血漿ヘパリナーゼIII濃度のグラフである。プロトコル中の時点は矢印によって示され、その矢の上に説明がある。垂直線は平均値の標準誤差を示す。
図１１は、３時間の虚血後の再灌流中のラット微小血管系における白血球回転のレベルのグラフである。丸印は未処理ラットにおけるレベルを示し、四角は虚血状態にした疑似処理ラットにおけるレベルを示し、三角形は虚血状態にしたヘパリナーゼ処理ラットのレベルを示す。垂直線は平均値の標準誤差を示す。
図１２は、３時間虚血後の再灌流中のラット微小血管系における白血球粘着レベルのグラフである。丸印は未処理ラットのレベルを示し、四角は虚血状態にした疑似処理ラットのレベルを示し、三角形は虚血状態にしたヘパリナーゼ処理ラットのレベルを示す。垂直線は平均値の標準誤差を示す。
図１３は、３時間の虚血後の再灌流中のラット微小血管系における白血球管外遊走レベルのグラフである。丸印は虚血状態にしたヘパリナーゼ処理ラットにおけるレベルを示す。垂直線は平均値の標準誤差を示す。
図１４は、２時間虚血後の再灌流中のラット微小血管系における白血球管外遊走レベルのグラフである。白棒は疑似処理ラットのレベル  対  未処理ラットのレベルのパーセント差である。斜線を含む棒はヘパリナーゼ処理ラットのレベル  対  未処理ラットのレベルのパーセント差である。垂直線は平均値の標準誤差を示す。
図１５は、３時間虚血後の再灌流中のラット後毛細管細静脈における灌流レベルのグラフである。丸印は未処理ラットのレベル、四角は虚血状態にした疑似処理ラットにおけるレベル、三角は虚血状態にしたヘパリナーゼ処理ラットにおけるレベルを示す。垂直線は平均値の標準誤差を示す。
図１６は、ヘパリナーゼ処理をした場合としない場合における、虚血および再灌流中のウサギの心拍数と血圧の積のグラフである。白丸および白四角は、それぞれ生理的食塩液前処理ラットおよび再灌流処理ラットのデータである。白いピラミッド形および黒丸は、それぞれヘパリナーゼ前処理ウサギおよび、再灌流処理したウサギのデータである（ヘパリナーゼIIIの標的血漿レベル２５μｇ／ｍｌ）。黒い四角、黒いピラミッド形および黒いダイアモンド形は、ヘパリナーゼIIIの標的血漿レベルがそれぞれ５、１．２５および０．２５μｇ／ｍｌで、ヘパリナーゼ再灌流処理したウサギのデータである。ＢＡＳＥはベースラインレベルを示す。３０Ｉは虚血３０分でのレベルを示す。３０Ｒ、６０Ｒ、１２０Ｒおよび１８０Ｒは、再灌流３０、６０、１２０および１８０分でのレベルを示す。垂直線は平均値の標準偏差を示す。
図１７は、異なるヘパリナーゼ処理を受けたウサギの心臓における虚血および再灌流後の梗塞の大きさ  対  リスクゾーンのパーセントのグラフである。黒丸は各処理群の平均レベルを示す。白い形は個々のウサギにおけるレベルを示す。ＣＰＴおよびＣＲＴはそれぞれ生理的食塩水前処理および再灌流処理ウサギを示す。ＤＰＴおよびＤＲＴはそれぞれヘパリナーゼ前処理および再灌流処理ウサギを示す。ＤＰＴおよびＤＲＴの下の数字は血漿中のヘパリナーゼIIIの標的レベルを示す。垂直線は平均値の標準偏差を示す。
図１８は、ヘパリナーゼ処理ウサギに注入したヘパリナーゼIIIの濃度のグラフである（ＩＵ／ｍｌ）。ＤＰＴおよびＤＲＴはそれぞれヘパリナーゼ前処理および再灌流処理ウサギを示す。ＤＰＴおよびＤＲＴの下の数字は血漿中のヘパリナーゼIIIの標的レベルを示す（μｇ／ｍｇ）。Ｃｏｎは生理的食塩液を注入した対照ウサギを示す。垂直線は平均値の標準偏差を示す。
図１９は、前処理および再灌流中のウサギ血漿中に測定されたヘパリナーゼIIIの濃度のグラフである。丸印は血中ヘパリナーゼIII濃度２５μｇ／ｍｌを標的としたヘパリナーゼ前処理ウサギで測定した実際の濃度を示す。四角、ピラミッド形、三角およびダイアモンドは、それぞれ２５、５、１．２５および０．５μｇ／ｍｌ血漿ヘパリナーゼIII濃度を標的とするヘパリナーゼ再灌流処理ウサギで測定した実際の濃度を示す。ＢＡＳＥはベースライン濃度を示す。３０Ｐおよび６０Ｐは前処理３０分および６０分での濃度を示す。１５Ｒ、３０Ｒ、６０Ｒ、１２０Ｒおよび１８０Ｒは、それぞれ再灌流１５、３０、６０、１２０および１８０分での濃度を示す。垂直線は平均値の標準偏差を示す。
本発明の詳細な説明
白血球と内皮との相互作用は、局所的炎症反応の進行に重要である。これらの重要な相互作用としては、内皮結合ケモカインと白血球ケモカイン受容体との間、および白血球Ｌ−セレクチンと内皮上のヘパリン／ヘパラン硫酸プロテオグリカン類との間の機能的接触を含む。本発明はこの発見に基づき、ヘパリナーゼ酵素およびヘパリナーゼ融合蛋白質を使用して、白血球−ケモカインおよび白血球内皮細胞プロテオグリカン相互作用を減らし、それによって局所的炎症を阻止することを指向する。
ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、多くの異なる細胞タイプの表面上にあるプロテオグリカンのグリコサミノグリカン部分であり、多くの細胞によって産生された細胞外基質中にも見いだされた。内皮細胞は、主としてそれらの基底膜と呼ばれる管腔外部上に、細胞外基質を作り出す。或る種のサイトカイン類またはその他の炎症反応刺激物質によって活性化された内皮細胞は、それら表面のヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンレベルを高め（高内皮細静脈は除く）、それは炎症粘着分子としてはたらき、回転白血球上のＬ−セレクチンと相互作用する。この相互作用は白血球と内皮との接触を増やし（白血球回転の増加）、それは白血球動員のひき続く段階のために必要である。活性化された内皮はケモカインの合成および分泌も増加させる。ケモカインの分泌はそれはそれで、同じケモカインの局所的濃度を高める、なぜならばそれらケモカインは内皮細胞表面上および基底膜中のプロテオグリカンのヘパリンおよびヘパラン硫酸部分に結合するからである。この局所的濃度勾配は、白血球が活性化されてしっかり粘着し、管外遊走するために必要であり、炎症部位への白血球動員をおこす。
ヘパリナーゼ酵素はFlavobacterium heparinum（ローズ(Lohse）およびリンハルト(Linhardt)、J.Biol.Chem.２６７巻、２４３７−２４３５５ページ、１９９２）、バクテロイド属菌株（セイラーズ(Saylers）ら、Appl.Environ.Microbiol.３３巻、３１９−３２２ページ、１９７７；ナカムラら、J.Clin.Microbiol.２６巻、１０７０−１０７１ページ、１９８８）、フラボバクテリウムＨｐ２０６（ヨシダら、第１０回糖結合体に関するシンポジウム、エルサレム  １９８９）、およびシトファーガ属菌株（ボーン(Bohn)ら、Drug Res.４１（Ｉ）、No.４：４５６−４６０ページ、１９９１）を含める微生物にみいだされた。哺乳類細胞からのヘパリナーゼも報告されている（フックス(Fuks)ら、米国特許第５３６２６４１号、１９９４；フジワーフ(Hoogewerf)ら、J.Biol.Chem.２７０巻、３２６８−３２７７ページ、１９９５）。Flavobacterium heparinumからのヘパリナーゼＩ（ＥＣ４．２．２．７）、およびヘパリナーゼIIはヘパリンを分解し、他方ヘパリナーゼIIもヘパリナーゼIII（ＥＣ４．２．２．８）と同様にヘパラン硫酸を分解する。これらの酵素による完全消化産物は主として二糖類である；ただし少量の四糖およびオリゴ糖も存在するかも知れない。これらの酵素を用いて細胞表面および基底膜のグリコサミノグリカン類、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を除去することができる。
内皮細胞からのヘパリンおよびヘパラン硫酸の除去は、Ｌ−セレクチンと内皮との相互作用を妨害し、白血球回転の増加防止する。内皮細胞および基底膜からのグリコサミノグリカンの除去は、白血球動員のために重要なグリコサミノグリカン結合ケモカインも除去する。内皮細胞結合ケモカインの消失は白血球インテグリンの活性化を弱め、白血球のしっかりした粘着を阻止する。それは白血球の管外遊走をも阻止する、なぜならば白血球は遊出するためにケモカインの結合勾配の存在を必要とするからである。非結合の化学誘引物質が血流によって内皮層からなくなり、顕著な溶解性化学誘引物質勾配の形成を阻止すると考えられている。
概して、１時間のヘパリナーゼ処理後、消化された細胞表面および基底膜のヘパリンおよびヘパラン硫酸の５０％が２ないし４時間以内に置換され、１２ないし１６時間以内には完全に置換される。処理時間がより長くなると（３および５時間）、同量のヘパリン／ヘパラン硫酸の置換に必要な時間が著しく延びる。細胞表面ヘパリン／ヘパラン硫酸の緩徐な置換によって炎症反応は著しく減少する。ヘパリナーゼの適切な投与は弱められた炎症反応の持続時間を延ばすことができる。
ヘパリナーゼの調製法
本発明に用いる個々のヘパリナーゼまたはそれらの組み合わせは、種々のソースから作ることができる。ヘパリナーゼは細菌または哺乳動物細胞から分離することによって作られる。これらの細菌または細胞は、その酵素を天然に産生するか、または公知の方法に記載されたように遺伝子工学的操作によって酵素を産生する。さらに、ヒト細胞からの哺乳動物ヘパリナーゼは、フックらにより記載された精製手順によって分離することもできる（米国特許第５３６２６４１号、１９９４）。
Flavobacterium heparinumからのヘパリナーゼの分離
ヘパリナーゼ酵素を下記のようにしてFlavobacterium heparinum培養物から精製できる。F.heparinumは、ガリエル(Galliher)らのAppl.Environ.Microbiol.４１巻（２）３６０−３６５ページ、１９８１に記載された規定栄養培地の変法中で１５Ｌコンピューター制御発酵槽において培養する。ヘパリンリアーゼを産生するように設計された発酵では、ヘパリナーゼ合成誘導剤として半精製ヘパリン（Celsus Laboratories社製）を１．０ｇ／Ｌの濃度で培地に含む。細胞を遠心分離によって収穫し、細胞周辺腔から放出される所望の酵素をチンマーマンらの米国第５１６９７７２号（１９９２）に報告された浸透性ショック法の変法によって収穫する。
粗浸透法産物(osmolate)からの蛋白質を陽イオン交換樹脂（ＣＢＸ、J.T.Baker）に１ないし７ｍｈｏｓの伝導度で吸着する。抽出物からの未結合蛋白質を棄て、その樹脂をクロマトグラフィーカラム（５．０ｃｍ内径×１００ｃｍ）に充填する。結合蛋白質は０．０１Ｍ燐酸塩、０．０１Ｍ燐酸塩／０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ燐酸塩／０．２５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍ燐酸塩／１．０Ｍ塩化ナトリウム（全部ｐＨ＝７．０±０．１である）の段階グラジエントで、直線的流速３．７５ｃｍ・ｍｉｎ-1で溶出する。ヘパリナーゼIIは０．１ＭＮａＣｌフラクション中に溶出し、一方ヘパリナーゼＩおよびIIIは０．２５Ｍフラクション中に溶出する。別法として、０．１Ｍ塩化ナトリウム段階を省き、３つのヘパリナーゼを０．２５Ｍ塩化ナトリウムで同時に溶出させる。ヘパリナーゼフラクションをセルフィン(cellufine）硫酸を含むカラム（５．０ｃｍ内径×３０ｃｍ．アミコン(Amicon)）に直接載せ、０．０１Ｍ燐酸塩、０．０１Ｍ燐酸塩／０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ燐酸塩／０．４Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍ燐酸塩／１．０Ｍ塩化ナトリウム（全部ｐＨ＝７．０±０．１）の段階グラジエントで、直線的流速２．５０ｃｍ・ｍｉｎ-1で溶出する。ヘパリナーゼIIおよびIIIは０．２Ｍ塩化ナトリウムフラクション中に溶出し、ヘパリナーゼＩは０．４Ｍフラクション中に溶出する。セルフィン硫酸カラムからの０．２Ｍ塩化ナトリウムフラクションを０．０１Ｍ燐酸ナトリウムで希釈すると５ｍｈｏｓ未満の伝導度が得られる。その物質をヒドロキシアパタイトカラム（２．６ｃｍ内径×２０ｃｍ）に載せ、結合蛋白質を０．０１Ｍ燐酸塩、０．０１Ｍ燐酸塩／０．３５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ燐酸塩／０．４５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ燐酸塩／０．６５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍ燐酸塩／１．０Ｍ塩化ナトリウム（全部ｐＨ７．０±０．１）の段階グラジエントで１．０ｃｍ・ｍｉｎ-1の直線的流速で溶出することによってその溶液をさらに精製する。ヘパリナーゼIIは０．４５Ｍ塩化ナトリウムフラクション中に単一の蛋白質ピークとなって溶出し、一方ヘパリナーゼIIIは０．６５Ｍ塩化ナトリウムフラクションに単一の蛋白質ピークとして溶出する。ヘパリナーゼＩは、セルフィン硫酸カラムからの物質をヒドロキシアパタイトカラム（２．６ｃｍ内径×２０ｃｍ）に載せ、伝導度５ｍｈｏｓ未満に希釈し、結合蛋白質を直線的流速１．０ｃｍ・ｍｉｎ-1で、燐酸塩（０．０１ないし０．２５Ｍ）および塩化ナトリウム（０．０ないし０．５Ｍ）の直線的勾配で溶出する。ヘパリナーゼＩはグラジエントのほぼ真ん中で単一蛋白質ピークに溶出する。
この方法によって得られたヘパリナーゼ酵素は逆相ＨＰＬＣ分析（BioCad,POROS II）によって測定して９８．５％を超える純度である。ヘパリナーゼ酵素の精製結果を表Ａに示す。
0003713276.tif 000002
組換え酵素の分離
グリコサミノグリカン分解酵素を下記のような組換え発現系から分離することもできる：サシセカラン(Sasisekharan)らが報告したヘパリナーゼＩ発現系(Proc.Natl.Acad.Sci.USA  ９０巻、８６６０−８６６４ページ、１９９３）；１９９４年６月１０日に出願されたスー(Su)らの同時係属米国特許出願第０８／２５８，６３９号、「Flavobacterium heparinumから誘導されるヘパリナーゼIIおよびヘパリナーゼIIIの核酸配列および発現系」に記載されたヘパリナーゼIIおよびIII発現系。これらの教示は本明細書に組み込まれている。これらの発現系では、Flavobacterium heparinum遺伝子は単離され、誘導性プロモーターから下流にプラスミドにクローン化される。プラスミドを大腸菌(E.coli)に挿入し温度シフト、または培地へのＩＰＴＧ添加などの適切な誘導法、によって所望酵素を発現させる。
酵素はここに記載の方法の変法によって精製した形で回収できる。細胞破壊は、ホモジナイゼーション、超音波処理または酵素処理によって、細胞壁を破壊し、細胞質成分を放出することによって達成する。もしも酵素合成が凝集をおこしたならば、その凝集物をその後変性剤、３ないし６ＭグアニジンＨＣｌまたは４ないし８Ｍ尿素によって溶解することができ、透析または希釈によってその変性剤を除去して蛋白質を再生させることができる。再生酵素は上記の液体クロマトグラフィーを用いてさらに精製することができる。
融合蛋白質の構成
特異的結合特性をもつ蛋白質に融合したヘパリナーゼ酵素を組み込んだ融合蛋白質は組換え分子生物学的技法によって作ることができる。適した結合蛋白質を選択することによって、ヘパリナーゼ活性をin vivoの特異的部位に標的化することができる。ＩＣＡＭ−１は活性化内皮細胞表面に発現させるのが好ましいことがわかった（ダスチン(Dustin)ら、J.Immunol.１３７巻、２４５−２５４ページ、１９８６）。融合蛋白質の例としては下記のものがある；ヘパリナーゼ酵素またはその活性部分に融合したとき活性化した内皮の内腔および外腔表面近くにヘパリナーゼ活性を局所化する、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１またはＰ−セレクチンに特異的な抗体、Ｆａｂフラグメントまたは可変部。ヘパリンおよびヘパラン硫酸部分はこの領域で取り出され、その内皮によって生じるケモカイン勾配の破壊をおこす。その他の例として、ヘパリナーゼ酵素またはその活性部分の、ＬＦＡ−１またはＭａｃ−１（両方共ＩＣＡＭ−１に結合する）のＩ−ドメインへの融合は、活性化内皮を標的とし、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を除去し、白血球回転およびケモカイン勾配形成を阻止する。ＩＬ−１ｂのようなサイトカインの受容体は活性化内皮上でアップレギュレートされ、融合蛋白質の結合のためのもう一つの標的となる。ＩＬ−１ｂまたはＩＬ−１ｂの受容体結合ドメインをヘパリナーゼに融合することによっても標的化は実現する。融合蛋白質は、未融合ヘパリナーゼを用いた場合に匹敵する分だけ減少させるのに必要である濃度よりも低い血中濃度で炎症反応を減らすことができる。その上、血管系のその他の細胞は融合蛋白質の酵素活性によって比較的影響を受けにくく、治療による考えられる副作用を減らすことができる。
遺伝子工学によって作りだされたヘパリナーゼ融合蛋白質は、ヘパリナーゼおよびヘパリナーゼが融合している蛋白質の結合および触媒特性を保有する。３つのヘパリナーゼをF.heparinumから均質になるまで精製し、大腸菌中で組換え型として産生した。抗体または粘着分子の結合ドメインと一緒になったヘパリナーゼ酵素からなる融合蛋白質は、組換え宿主において遺伝子融合によって作ることができ、個々の蛋白質の結合機能および酵素活性は保持されたままである。これらの分子も、融合蛋白質の個々の部分の精製に通常用いる方法（例えばアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリナーゼ精製プロトコールなど）によって均質になるまで精製することができる。Flavobacterium heparinumから精製した天然ヘパリナーゼとは異なり、組換え酵素はアミノ末端ピログルタメートまたは炭水化物部分を含まないかも知れない。すべての組換えヘパリナーゼは欠失、付加および／または変化したアミノ酸を含むことがあり、それらは天然酵素の酵素活性または結合ドメインの機能を変化させる。ヘパリナーゼおよび融合ヘパリナーゼをポリエチレングリコール、架橋剤とのコンプレックス形成および微小被包形成(microencapsulation)によって、in vivo使用のために安定化することができる。
例えば、ヘパリナーゼＩの遺伝子は、サシセカランら、Proc.Natl.Acad.Sci.９０巻、３６６０−３６６４ページ、１９９３に記載されたようにF.heparinumら分離した。そしてＥｃｏＲ  Ｉ制限部位を、ポリメラーゼ鎖反応によって、グルタミン−２１残基をコードするコドンの５’側に挿入した。ヘパリナーゼＩ遺伝子含有フラグメントを制限エンドヌクレアーゼ；ＥｃｏＲ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化することによって作り、ＥｃｏＲ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ切断ｐＭＡＬｃ２プラスミド（New England Biolabs社製）に結合した。得られたプラスミドは、ヘパリナーゼＩ遺伝子に５’側に融合したマルトース結合蛋白質（ＭａｌＢ）を組込む８２，０００−８５，０００ダルトンの蛋白質をコードするハイブリッド遺伝子を含んでいた。このプラスミドを、コーエンらがProc.Natl.Acad.Sci.６９巻、２１１０−２１１ページに報告した塩化カルシウム仲介性方法を用いて大腸菌ＨＢ１０１細胞に挿入した。これらの細胞は、誘導剤ＩＰＴＧ０．１ｍＭを増殖培地に添加することによって融合蛋白質を合成することができ、ｔａｃプロモーターのコントロール下でヘパリナーゼ活性をあらわす。
ＨＢ１０１（ｐＭＡＬｃ２−ＨＥＰ１Ｑ２１）細胞を、３７℃で０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＭ９培地５００ｍｌ中に１．０ｇ／Ｌ乾燥細胞重量の細胞密度まで増殖させ、１０，０００ｇ×１０分の遠心分離によって濃縮した。細胞ペレットを０．０２５Ｍトリス、ｐＨ７．７、１０ｍｌに懸濁し、それら細胞をヒートシステムズ(Heat Systems)ＸＬ２０２０型を用いて、４．５分間、出力３で、３０秒オン−３０秒オフのサイクルで超音波処理することによって破壊した。細胞かすを１０，０００ｇ×１０分の遠心分離によって除去し、上澄液をアミロース  フィニティー樹脂カラム（１．０ｃｍ内径×２ｃｍ、New England Biolabs）に入れた。結合蛋白質をＰＨ７．５で、０．０１Ｍマルトースを含む０．０２５Ｍトリス、ｐＨ７．５、の段階グラジエントで溶出した。融合蛋白質は、ヘパリナーゼ比活性２３．７７ＩＵ／ｍｇをあらわす蛋白質ピークに溶出した。
ヘパリナーゼ−マルトース結合融合蛋白質もヘパリナーゼ特性に基づく標準的蛋白質分離法によって精製することができる。細胞超音波処理物を硫酸アンモニウム沈殿によって分画化した。非特異的蛋白質を１．７Ｍ硫酸アンモニウムによる沈殿段階で除去し、上澄液を、硫酸アンモニウム濃度を３．２Ｍまで高めることによって沈殿させた。沈殿物質は融合蛋白質を含んでおり、０．０２５Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．５、に再懸濁した。その物質を弱い陽イオン交換カラム（１．６ｃｍ内径×１０ｃｍ、ＣＢＸ、J.T.Baker）に入れ、０．０Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ塩化ナトリウム、０．２５Ｍ塩化ナトリウムおよび１．０Ｍ塩化ナトリウム（全て０．０２５Ｍ燐酸ナトリウム中）の逐次的段階グラジエントで溶出した。融合蛋白質は０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶出フラクションに溶出し、ヘパリナーゼ非活性２９．９５ＩＵ／ｍｌを示した。これら二つの精製法は、機能的ヘパリナーゼ融合蛋白質が、所望の結合特性をもつ蛋白質をヘパリナーゼのＮ−末端に遺伝子的に結合することによって作られ、生成した融合蛋白質は、ヘパリナーゼとそれが融合した蛋白質両方の機能を保有することを示している。
融合蛋白質のもう一つの例として、Flavobacterium heparinumからのヘパリナーゼIII遺伝子を含むｐＧＢＨ３からのＢａｍＨ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｈ制限フラグメントを、ｐＭＡＬｃ２に挿入し、マルトース結合蛋白質をヘパリナーゼIIIと融合させる遺伝子を形成した。融合遺伝子プラスミドを含む大腸菌株ＤＨ５ａ抽出物を最後の例に記載のように作り、これらの抽出物はヘパリナーゼIII活性１８．７ＩＵ／ｍｌ／Ｏ．Ｄ．を含んでいた。その抽出物もアミロースアフィニティー樹脂と結合させ、その後その樹脂を遠心分離によって抽出物から分離した。その樹脂を０．０２５Ｍトリス（ｐＨ７．５）溶液で１回洗い、その樹脂に結合した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁し、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでサイズによって分離した。そのゲルを抗ヘパリナーゼIII特異的抗体でウェスターンブロット分析すると、１１６，０００Ｄａ．蛋白質が同定された。それは融合蛋白質の予想サイズに一致する。この分析は、融合蛋白質は機能性マルトース結合ドメインを有することを示す。この例は、ヘパリナーゼIII蛋白質は結合ドメインに融合して二官能価融合酵素を作り出すこともできることを示している。
In vivoでの蛋白質の保護
特に酵素の場合は、in vivo半減期を延ばす方法は公知であり、日常的に用いられている。適切な方法の１例は、ポリエチレングリコール部分を蛋白質に付加することであり、これは細網内皮系による取り込みを阻止する。このような非免疫原性蛋白質の製法および特徴はルー(Lu)ら（Pept.Res.６（３）、１４０−１４６、１９９３）、デルガド(Delgado）ら(Critical Rev.Ther.Drug Carrier Syst.９（３−４）、２４９−３０４ページ、１９９２）およびデイビス（Davis）ら（米国特許第４１７９３３７号、１９７９）によって報告されており、これらの教示は本明細書に組込まれている。適した方法のもう一つの例は、二官能価架橋剤を使用し、蛋白分解に対して酵素を安定化することである。グルタールアルデヒドは二官能価架橋剤の１種である。Novo Nordisk A/SによるＰＣＴ  ＷＯ９５／００１７１は、その他の有用な二官能価架橋剤のリストを含み、それらの使用を教示しており、これは本明細書に組込まれている。
薬剤学的組成物の製法
ヘパリナーゼ酵素は局所的に、または全身的に投与することができる。局所的投与はより大きいコントロールが可能である。ヘパリナーゼを適した薬剤学的または獣医学的担体と混合し、次いで当業者には公知の方法、例えば局所的適用、灌流の使用、注射またはカテーテルなどを用いて処理細胞に所望の効果をもたらす有効量を投与する。
上述のように標的化酵素を作成するか、またはカテーテルまたは局所注射、などの標的化ビヒクルを用いて、酵素の制御部位特異的デリバリーを実現するという方法で、標的化および有効濃度の投与が成し遂げられる。
放出調節性マトリックスまたは注射による酵素の投与
ヘパリン酵素を標準的方法論を用いる注射による投与のために、担体中に例えば生理的食塩液または水性緩衝液中に配合するか、またはポリマーのマトリックス中に封入することができる。ヘパリナーゼを放出調節性処方に封入することは公知であり、材料としては（これらに制限されるものではないが）リポソーム、リポスフェア(liposphere)、生体内分解性ポリマーマトリックスおよび小胞がある。これらの被包物は一般的には直径６０ｎｍから１００ミクロンまでの微粒子であるが、１０ミクロン未満であるのが好ましく、直径１ミクロン以下であるのがより好ましい。
プロテオソームは髄膜炎菌(Meningococcal bacteria)の外側膜蛋白質から作られ、疎水性アンカーを含む蛋白質に結合することがロウェル(Lowell)らによって報告された(Science、２４０巻、８００ページ、１９８８）。プロテオソーム蛋白質は高度に疎水性で、膜透過(transmembrane）蛋白質およびポーリンとしてのそれらの役割を反映している。分離すると、それらの疎水性蛋白質−白質相互作用のために、それらの分離のために使用した界面活性剤の強度に依って、多分子膜性の６０から１０００ｎｍの小胞、または膜性小胞フラグメントを自然に形成する。ヘパリナーゼは、ミラーらのJ.Exp.Med.１７６巻、１７３９−１７４４ページ、１９９２年に記載されているように、プロテオリポソーム内に被包することもできる（プロテオソームの参考として上述のように本明細書に組み込まれる）。或いは、ヘパリナーゼはNovasome（登録商標）脂質小胞(Micro Vescular Systems, Inc.社，Nashua, NH）のような脂質小胞内に被包することができる。もう一つの担体はNova PharmaceuticalsによるＰＣＴ  ＵＳ９０／０６５９０（この教示は本明細書に組込まれている）に記載されているもので、固体コアおよびリン脂質からなる外殻層を有するリポスフェアーと呼ばれるものである。
担体はポリマーの徐放系であってもよい。生体内分解性合成ポリマー類はヘパリナーゼの調節性放出をおこすのに特に有用である。微小被包された（microencapsulated）薬剤の注射のために微小被包(microencapsulatation)を用い、調節性放出を与えることができる。微小被包のための特定のポリマーの選択には多数の要因が寄与する。ポリマー合成および微小被包過程の再現性、微小被包物質およびそのプロセスのコスト、毒物学的プロフィール、種々の放出動態のための要求事項およびポリマーと抗原との物理化学的適合性が考慮しなければならない全要因である。有用ポリマーの例はポリカルボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルトエステルおよびポリアミドで、特に生体内分解性のこれらのものである。
薬剤の担体として選択されることが多いのはポリ（ｄ、１−ラクチド−コーグリコライド）（ＰＬＧＡ）である。これは、侵食性縫合糸、骨板およびその他の一時的人工補装具に医学的に使用された長い歴史をもつ生体内分解性ポリエステルであって、毒性は現れていない。ペプチドおよび抗原を含める非常に種々様々の医薬品がＰＬＧＡマイクロカプセルに処方されてきた。ＰＬＧＡ微小被包プロセスは油中水形乳剤の相分離を利用する。ヘパリナーゼは水溶液として作られ、ＰＬＧＡは塩化メチレンおよび酢酸エチルのような適した有機溶媒に溶解する。これら２つの混合することのできない溶液を高速撹拌機によって共乳化する。次いでポリマーのための非溶剤を加え、水性滴の周囲にポリマーを沈殿させて、初期マイクロカプセルを形成する。そのマイクロカプセルを集め、１群の作用物質（ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ゼラチン、アルギネート、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース）の１つで安定化し、真空乾燥かまたは溶媒抽出によって溶媒を除去する。被包のためのその他の手段は、噴霧乾燥、共沈殿および溶媒抽出を含める。
投与方法
ヘパリナーゼ酵素は注射、注入または灌流によって投与できる。典型的には注射器かカテーテルを用いて注射を行う。注射器かカテーテルを用いて、ヘパリナーゼを血管、組織または器官の諸領域に局所的に投与することができる。局所的炎症と診断された患者を、これらの方法によってヘパリナーゼを彼らの脈管系に導入することによって治療することができる。ヘパリナーゼを手術の前または手術と同時に投与して、生成する炎症反応を減らすこともできる。その上、移植手術に先立って、ドナー臓器にヘパリナーゼ製剤を灌流し、移植後の再灌流時の炎症を減らすことができる。
本発明は下記の非制限的例を参照することによってより詳細に理解できる。
実施例
実施例１：ヘパリン／ヘパラン硫酸を放出させるための内皮細胞のヘパリナーゼによる処理
ヘパリナーゼはヘパリンおよびヘパラン硫酸部分を細胞表面および細胞外基質プロテオグリカンから切断することによって細胞表面および基底膜を変化させる。これらのグリコサミノグリカンの除去は、白血球上のＬ−セレクチンの内皮プロテオグリカンへの結合を減らすことによって白血球−内皮相互作用（白血球回転）を減らす。その上、ヘパリンおよびヘパラン硫酸の除去は、ケモカインの内皮への結合を減らし、それは白血球の活性化、粘着(sticking)および管外遊走を減らす。35Ｓ−ヘパリン／ヘパラン硫酸プロテオグリカンを有するウシ角膜内皮細胞を生成し、その後、これらの放射性標識プロテオグリカンをフラボバクテリウム  ヘパリナーゼIIIで消化すると、その酵素の細胞表面に与える効果の定性的評価ができる。細胞表面プロテオグリカンをヘパリナーゼIIIで消化すると、ヘパリンもヘパラン硫酸部分も放出される、なぜならばこれらの部分は同じ、分岐していない炭水化物鎖上に散在しているからである。35Ｓ−ヘパリン／ヘパラン硫酸の著量がヘパリナーゼIIIの処理によって溶解性になった。
２４ウェル皿に一次ウシ角膜内皮細胞を播種することによって35Ｓ硫酸含有内皮細胞層を作った。これらを、１０％ウシ胎児血清および５％子ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で集密する１日前まで増殖させた。集密の１日前に、細胞を１０％ウシ胎児血清、５％ウシ血清、４％デキストラン、および２５ｍＣｉ／ｍｌＮａ235ＳＯ4を補充したフィッシャー培地に入れて１０倍に希釈し、１日あたり０．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加して３日間培養した。近集密細胞による標識の導入は、その標識を細胞内および細胞上に局在し、基底膜に取り込まれる35Ｓ−標識を最小にする。
35Ｓ−硫酸塩を含む内皮細胞を、二重ウェル中で、６００μｌの燐酸緩衝食塩液、または燐酸緩衝食塩液中１．０ＩＵ／ｍｌ濃度のヘパリナーゼIIIで処理した。消化は３７℃で５、３０または６０分間行った。指示された消化時間後、消化溶液４００μｌを各ウェルから取り出し、オートサンプラーを備えた、ベックマンシステムゴールド(Beckman System Gold）ＨＰＬＣによってコントロールされたＢｉｏ−ｓｉｌ  ＳＥＣ１２５−５ゲル濾過カラムで分画化した。流速は１ｍｌ／分で、１ｍｌフラクションを集めた。各フラクション中にある35Ｓ−硫酸塩の量を、各フラクションのアリコートをパッカード１６００ＴＲ液体シンチレーションカウンターで測定することによって決定した。標識化、未処理対照溶液を分画化し、同じ方法で測定した、そして各フラクション中の放射性物質量（バックグラウンド）をヘパリナーゼ消化サンプルからのフラクション中に存在する量から引いた。ヘパリナーゼIII処理によって放出された各フラクション中の細胞表面35Ｓ−標識ヘパリン／ヘパラン硫酸の量を図１に示す。
実施例２：ヘパリナーゼ処理した内皮細胞上および基底膜中のヘパリン／ヘパラン硫酸部分の除去程度および置換速度の決定
増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は十分特徴づけられたヘパリン結合蛋白質であり、それは細胞表面および細胞外基質中のプロテオグリカンのヘパリン部分に結合することが知られている（マッカラナ（Maccarana）ら、J.Biol.Chem.２６８巻、２３８９８−２３９０５ページ、１９９３）。125Ｉ−標識ｂＦＧＦの細胞表面および基底膜プロテオグリカンへの結合を用いて、不活性化およびＩＬ−１ｂ活性化内皮細胞層およびそれらの基底膜からヘパリナーゼＩ、II、またはIIIによって除去されるヘパリン／ヘパラン硫酸の量を測定した。細胞表面および基質膜のヘパリナーゼ消化はヘパリン部分とヘパラン硫酸部分の両方を除去する、なぜならばこれらの部分は同じ、分枝していない炭化水素鎖上に散在しているからである。125Ｉ−標識ｂＦＧＦ結合をこの実験にも用い、ヘパリン／ヘパラン硫酸部分がヘパリナーゼＩ、II、またはIIIで処理した内皮の細胞表面および基底膜上で置換される速度を測定した。ヘパリン／ヘパラン硫酸の大部分はヘパリナーゼを用いて除去することができた（７０から９０％；図２、図３、および図４）。これは、ヘパリナーゼの使用によって内皮からほぼ完全にヘパリン／ヘパラン硫酸をなくすことができることを示すものである。１時間のヘパリナーゼ処理では、ヘパリン／ヘパラン硫酸の置換速度は本来二相性である。消化したヘパリン／ヘパラン硫酸の４０から５０％の置換が数時間以内におきる。涸渇したヘパリン／ヘパラン硫酸のさらなる置換が残りの実験時間中、より遅い速度でおき、完全な置換は１２から１６時間でおきる。３および５時間のヘパリナーゼ処理は細胞表面上のヘパリン／ヘパラン硫酸の置換をより遅い速度でおこした（図３および図４）。これは不活性化内皮で最も顕著であった。ＩＬ−１活性化内皮で図３および４に描かれた実験結果では、３つの処理時間（１、３および５時間）すべてが、図２に描かれた実験結果に認められるものより低い置換率を与えた。
このデータは、ヘパリナーゼ処理によってＬ−セレクチン結合および固定化ケモカイン勾配形成の顕著な阻害がおきることを示し、これは局所的炎症反応の顕著な阻止を導く。また、３および５時間の処理期間はヘパリン／ヘパラン硫酸置換速度を低下させて、軽減された炎症反応の期間を著しく延ばすことができる。
ヒト内皮細胞系を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２０％胎児血清を含むＲＰＭＩ培地、０．２５ｍｌ／ウェルの４８ウェル皿で、集密的となるまで増殖させた。半数のウェル中細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ｂを１０μｌで４時間活性化した。活性化後、全ウェルをＨＢＳＳで３回洗い、培養培地（ＲＰＭＩ培地、２５ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、および０．１％ＢＳＡ）または培養培地で薄めた０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIで、３７℃で５％ＣＯ2中で６０分間処理した実験結果が図２に描かれ、あるいは、培養培地で希釈した１．０ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩまたはIIIで、３７℃、５％ＣＯ2中、６０分間処理（酵素のとりかえなし）したもの、１時間毎の酵素のとりかえを３または５回行った結果が図３および４に描かれた。酵素処理後、ウェルをＨＢＳＳで３回洗い、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２０％胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で、±ＩＬ−１ｂ、３７℃、５％ＣＯ2中で図２に示す時間培養した。ウェルを再びＨＢＳＳで３回洗い、培養培地０．１ｍｌを各ウェルに加え、プレートを氷上で５分間冷やした。すべてのウェルに１２５ｎｇ／ｍｌの125Ｉ−ｂＦＧＦを２０μｌ、および２０μｇ／ｍｌ未標識ｂＦＧＦを２０μｌ加えた。若干の対照ウェルに、１０ｍｇ／ｍｌヘパリン１５μｌも加え、非特異的バックグラウンド結合を測定した。プレートを氷上で４０分間インキュベートし、冷ＨＢＳＳで２回洗った。０．２５ｍｌのＬＡＢ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４および２Ｍ  ＮａＣｌ）を各ウェルに加えてｂＦＧＦを可溶化し、その後それをチューブに集めた。この段階を繰り返し、チューブの内容物をガンマ計数管でカウントした。非特異的バックグラウンド結合の量を各未処理対照および処理サンプルから差し引いた。サンプルのカウントを対照カウントで割り、結合の起こったパーセントを決定した。結果±標準誤差（ＳＥ）を図２、図３、および図４に示している。
実施例３：ヘパリン／ヘパラン硫酸結合ケモカイン、ＩＬ−８を放出させるための活性化内皮細胞層および基底膜のヘパリナーゼによる処理。
炎症組織に隣接する活性化内皮によって形成される結合ケモカイン勾配の除去は、この組織内の好中球の蓄積を阻止し、そして炎症反応を軽減する。ケモカイン、ＩＬ−８は、炎症組織から分泌されるＩＬ−１ｂおよびその他のサイトカインおよび化学誘引物質によって活性化された内皮によって産生される。もしも内皮に結合したＩＬ−８がヘパリナーゼ処理によって可溶化し得るならば、それは炎症領域から血流によって除去され、局所的炎症反応は阻止される。In vitroでの０．５から３倍を超える内因性、固定化ＩＬ−８（分泌されるＩＬ−８に対し）が、ヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIによって、またはヘパリナーゼＩおよびIIIによって活性化内皮から除去され、可溶化されることは、結合ケモカイン勾配をヘパリナーゼ処理によって破壊することができることを示している。
ヒトコラーゲンの３ｍｇ／ｍｌ溶液、１ｍｌを用いて１２ウェルプレートのウェルを覆った。残っているコラーゲン溶液を吸引により除去した。集密な１０ｍｌプレートからのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；１ないし８継代培養したものを用いた）をトリプシン処理し、２０％胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌヘパリン、１０μｇ／ｍｌ上皮成長因子および２００μｇ／ｍｌ内皮細胞増殖因子を含むＲＰＭＩ培地で１から７倍に希釈した。希釈細胞１ｍｌをコラーゲン被覆１２ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞を３７℃で、５％ＣＯ2中で集密的となるまで増殖させた。増殖期間中、培養培地を１日おきに変えた。ケモカイン−アッセイの前日に、培地をヘパリンを含まないＲＰＭＩ培地１ｍｌと交換した。
内皮層を活性化するために、ＲＰＭＩ培地（胎児血清、上皮成長因子、内皮細胞増殖サプリメントおよびヘパリンを除く）で希釈した５０μｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−１ｂおよび２％ＢＳＡを非対照(non-control）ウェルに最終濃度２ｎｇ／ｍｌになるまで加えた。そのマルチウェル  プレートを３７℃で５％ＣＯ2中、４時間インキュベートした。培地をすべてのウェルから除去し、ウェルをHanks Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）で２回洗った。０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地（胎児血清、上皮成長因子、内皮細胞増殖サプリメントおよびヘパリンを除く）および２％ＢＳＡを図３に示された時点でウェルに加えた。指示された時間後、ウェルを空にし、１ｍｌのＨＢＳＳで１回洗った。ヘパリナーゼＩ、II、またはIIIまたはヘパリナーゼＩおよびIIIを１ＩＵ／ｍｌ含む、または含まない０．５ｍｌのＨＢＳＳをウェルに加えた。プレートをヒートブロック上で時々撹拌しながら１５分間３７℃でインキュベートした。１５分後、上澄液を集め、ＩＬ−８をアッセイした。Perseptive Diagnostics社の酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）システムを用いて上澄液のＩＬ−８濃度を測定した。メーカーの推薦するプロトコルにしたがった。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに上澄液９０μｌおよび５Ｍ塩化ナトリウム１０μｌを用いた。各洗浄段階に、ウェルあたり１５０μｌ洗浄溶液を３回繰り返して用い、各反復の間に２−３分撹拌した。ＩＬ−１ｂ誘導性ヘパリナーゼＩ、IIまたはIII処理内皮  対  ＩＬ−１ｂ誘導性未処理内皮からの上澄液のＩＬ−８濃度のパーセント差を図５に示す。その他に、ＩＬ−１ｂ誘導性、ヘパリナーゼＩ、IIまたはIII処理内皮からの上澄液中のＩＬ−８濃度も図５に示す。
実施例４：  好中球粘着を阻止するための内皮細胞層のヘパリナーゼによる処理
炎症部位に好中球を集中させるために、内皮細胞表面分子は回転する好中球を活性化して、後毛細管細静脈の壁にしっかり結合させる。ヘパリン／ヘパラン硫酸に結合するケモカイン類が好中球を活性化してミクロキャピラリーにしっかり結合させる重要なシグナル分子として確認された。下記のin vitroでの好中球粘着アッセイシステムは、好中球の内皮細胞への粘着に影響する条件を分析するのに一般に用いられている。このアッセイに用いられる活性化ヒト内皮細胞層のヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIによる処理は、好中球の内皮への粘着レベルの有意な減少を起こした。これらの結果は、脈管構造のヘパリナーゼ処理がミクロキャピラリーにおける局所的好中球蓄積を阻止し、炎症反応を阻止することを示している。
ヒト好中球の分離
静脈血２５ｍｌを健康ドナーから採取し、１／１０容量の０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、に加え、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含むダルベッコ(Dulbecco)の燐酸緩衝食塩液（Ｄ−ＰＢＳ）２５ｍｌで希釈した。希釈した血液１０ｍｌアリコートを５０ｍｌチューブ中のFicoll-Paque １０ｍｌ上に重層にした。このチューブを４００×ｇで３０分間２０℃で遠心分離し、ブレーキをかけずに自然に停止させた。上層を除去し、１５５ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液（ｐＨ７．４）３容量中に４℃でペレットを再懸濁し、赤血球を溶解した(lyse)。数分後チューブを逆さにし、７から８分後に内容物は黒変した。１０分後、チューブを４００×ｇで４℃で５分間再び遠心分離した。上澄液を吸引し、ペレットを０．５％ヒトアルブミンを含むＮＨ4Ｃｌ溶液に再懸濁した。上澄液を集め、容量を５０ｍｌにした。細胞懸濁液を氷上で１５分間インキュベートし、４００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。上澄液を吸引し、ペレットを、０．５％ヒトアルブミンを含むＮＨ4Ｃｌ溶液に再懸濁した。その懸濁液を集め、容量を５０ｍｌにした。その細胞懸濁液を氷上で１５分間インキュベートし、４℃で４００×ｇで５分間遠心分離した。上澄液を除去し、もしもペレットがまだ赤かったならば、それを再び０．５％ヒトアルブミンを含むＮＨ4Ｃｌ溶液で洗った。最後に細胞を、５ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを含むＤ−ＰＢＳ中に再懸濁し、使用するまで冷蔵した。懸濁液の１０μｌアリコートをトリパンブルー１０μｌで希釈し、細胞を血球計でカウントし、懸濁液の体積あたりの生細胞の数を測定した。
好中球の標識化
１０×１０6好中球の懸濁液を、５ｍｇ／ｍｌヒトアルブミンを含むＰＢＳ（ＣａもＭｇも含まず）２ｍｌ中に作った。ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（分子プローブ）を懸濁液に加え、最終濃度４６μＭとした。好中球を設定温度３７℃の水浴で３０分間インキュベートし、その後それらを遠心分離し、５ｍｇ／ｍｌヒトアルブミンを含むＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇ含まず）で２回すすいだ。それらを最後に１０ｍｌのＲＰＭＩ＋２０％ウシ胎児血清中に３７℃で再懸濁した。
内皮細胞のヘパリナーゼ処理
継代数３のＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、数えた。細胞を９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ＋２０％ウシ胎児血清＋９５μｇ／ｍｌヘパリン＋ＥＣＧＳ＋ＥＧＦに１ウェルあたり５×１０4個の細胞を平板培養した。それらを３７℃、５％ＣＯ2で１８時間増殖させた。その時点で増殖培地をＲＰＭＩ＋２０％ウシ胎児血清（２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１ｂ）に代え、４時間増殖させた。それから細胞をＨＢＳＳですすぎ、３７℃、５％ＣＯ2でＨＢＳＳ中の０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIで１時間処理した。
好中球粘着アッセイ
処理期間後、ＨＵＶＥＣをＨＢＳＳで１回洗った。好中球懸濁液２００μｌ（２００，０００好中球に相当する）を処理または対照ＨＵＶＥＣの各ウェルに加えた。プレートを３０分間、３７℃、５％ＣＯ2に保った。そのプレートを逆さにして２５０×ｇで５分間遠心分離することによって粘着期間を停止させた。２００μｌのＰＢＳ（ＣａもＭｇもなし）＋５ｍｇ／ｍｌヒトアルブミンを各ウェルに加え、プレートをFluorolite １０００蛍光プレートリーダーで電圧２．５Ｖで読んだ。放射フィルターは５３５ｎｍ±３５、励起フィルターは４８５±２２であった。
データ分析
標準曲線は、ＰＢＳ（ＣａもＭｇも含まず）＋５ｍｇ／ｍｌヒトアルブミンに再懸濁した既知量のＢＣＥＣＦ−ＡＭ−染色好中球を、集密ＨＵＶＥＣ層を含む別の９６ウェルプレートのウェルに入れることによって作成した。蛍光単位を好中球の量に対してプロットし、勾配を計算した。標準曲線を用いて対照およびヘパリナーゼ処理ウェル中の結合好中球の数を決定した。ヘパリナーゼＩ、IIおよびIIIで処理したＩＬ−１ｂ活性化ＨＵＶＥＣ層と比較ＨＵＶＥＣ層のパーセント差を図６に示す。
実施例５：好中球管外遊走を阻止するための内皮細胞層および基底膜のヘパリナーゼによる処理
血液からの白血球が隣接内皮を通って遊出すること（管外遊走）により炎症組織に蓄積する。内皮細胞層は炎症組織によって活性化され（サイトカインおよび化学誘引性物質を媒介し）、変化した内皮は炎症組織に白血球蓄積が起きるように作用する。白血球を活性化して管外遊走させるために、そして白血球の遊走を炎症組織に向けるために、活性化内皮はその細胞表面上およびその基底膜中に固定化ケモカイン勾配を形成する。下記のin vitroでの好中球遊出アッセイシステムは好中球管外遊走に影響を与える条件を分析するために一般的に用いられる。このシステムに用いる活性化ヒト内皮細胞層のヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIでの処理は内皮を通過する好中球遊走レベルを著しく減少させる。これらの結果は、脈管構造のヘパリナーゼ処理が局所的好中球の蓄積および炎症反応の阻止することを示している。
好中球管外遊走アッセイ
好中球を実施例４に記載したように分離した。ヒトフィブロネクチンを血清を含まないＲＰＭＩ培地中に０．４ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解した。孔の大きさ３μｍまたは８μｍのフィルターインサート(inserts)（６．２５ｍｍ）を４μｇ／ｃｍ2のヒトフィブロネクチンで室温で１時間被覆し、蒸留水ですすいだ。２４ウェルプレートのウェルに、２０％ウシ胎児血清、９５μｇ／ｍｌヘパリン、２００μｇ／ｍｌＥＣＧＳおよび１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを含むＲＰＭＩ培地０．３ｍｌを充填した。被覆したフィルターインサートをそれらのウェルに置き、完全ＲＰＭＩ培地０．３ｍｌ中８×１０4個のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；継代１ないし７で用いる）を被覆フィルターインサート上で平板培養した。細胞を４８から６５時間３７℃、５％ＣＯ2中で増殖させた。フィルターインサートおよびウェルからの培養培地を、増殖期間中１回、ヘパリンを含まないＲＰＭＩ培地に変えた。増殖期間後、陰性対照インサートを除くすべてのインサートの下の培養培地を除去し、ヘパリンおよび増殖因子を含まないがヒト組換えＩＬ−１ｂ２ｎｇ／ｍｌは含む新鮮培養培地に置き換えた。陰性対照インサート下の培養培地を新鮮培養培地に置き換えた。マルチウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。培地をインサートおよびウェルから除去し、細胞をHank's Balanced Salt Solution(ＨＢＳＳ）で１回すすいだ。フィルターおよびウェルを０．３ｍｌのＨＢＳＳ溶液で満たし、処理インサートはＨＢＳＳの代わりにヘパリナーゼＩ、IIまたはIIIを含むＨＢＳＳを受けとった。この処理は図１に示す時間に、３７℃で５％ＣＯ2中で行われた。溶液を除去し、細胞をＨＢＳＳで１回すすいだ。ヘパリンおよび増殖因子を含まない新鮮培養培地０．３ｍｌをウェルに加え、ヘパリンおよび増殖因子を含まない培養培地０．３ｍｌ中に調製したばかりのヒト好中球１．５×１０6をすべてのインサートに加えた。プレートを３７℃で５％ＣＯ2中で図３に示す時間インキュベートした。この時間の後、インサートを除去し、底を０．３ｍｌＤ−ＰＢＳで１回すすいだ。ウェルの内容物を除去し、ウェルをＤ−ＰＢＳ  ０．３ｍｌで洗った。すすいだ液をウェル内容物に加え、合一した内容物を容量１ｍｌにした。これらのサンプルを、ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイにかけるまで、１６時間まで冷凍した。
ミエロペルオキシダーゼアッセイ
好中球懸濁液のアリコートをＤ−ＰＢＳで希釈することによって、容量１ｍｌ中に１×１０5および１×１０6の間の好中球を含む標準を作った。０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび０．５％トリトンを含む５０ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ６．７、４ｍｌを各標準および解凍サンプルに加えた。各サンプルまたは標準０．１ｍｌをプラスチックキュベットに加えた。０．１６７ｍｇ／ｍｌのｏ−ジアニシジン塩酸および０．０００５％過酸化水素を含む５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ６．０、２．９ｍｌをキュベットに加えた。４６０ｎｍにおける吸光度の変化を３０秒ごとに３分間、分光光度計を用いてモニターした。
標準から得られた比率の変化を用いて、吸光度  対  好中球数の増加速度曲線を作成した。この曲線を用いて各サンプル中の、処理または未処理内皮層を通って遊走した好中球数を定量化した。遊走する好中球の数を１．５×１０6で割り、好中球遊走パーセンテージを決めた。
データ分析
このアッセイにおけるヘパリナーゼ処理の効果は、ＨＵＶＥＣのフィルター表面の被覆程度に依存した。被覆の程度は、管外遊走実験後に行った色素排除試験に基づいており、それは１回の実験でフィルターごとに若干の変動があった。一般に、フィルターが、すき間なく詰まったＨＵＶＥＣ層で密に覆われている場合、管外遊走する好中球のパーセンテージは低く（＜１０％）、処理および未処理ウェルの差は統計的に有意ではなかった（ウェル間変動性が大きい）。フィルターの広い面積がＨＵＶＥＣ層で覆われていない場合（フィルターの３０−４０％と推定）、好中球の多数（４０−６０％）がフィルターを通って遊走するが、１時間のヘパリナーゼ処理ではその遊走を阻止するほど有効ではない。この遊走は管外遊走（近隣内皮細胞間に押し出される好中球として機能的には説明される）には匹敵しない。もしもフィルターの７５から９０％がＨＵＶＥＣで覆われるならば、一般に好中球の１５から３０％が管外遊走し、これらの条件下では１時間のヘパリナーゼ処理が最も有効であることがわかった。スチュデントのｔ検定を用いて、実験を分析して１時間のヘパリナーゼ処理で有意な効果（ｐ＜０．５）が認められるかどうかを分析した。これらの実験のデータをまとめ、図７に示す。図７に示される１５分間のヘパリナーゼ処理のデータは１時間の処理と同じ実験から誘導される。スチュデント−ニューマン−クールズ検定(Student-Newman-Keuls test）を用いて同じ酵素を用いる異なる処理間の差の有意性（ｐ＜０．０５）を調べた。図７では有意差は星印（*）で示される。
実施例６：好中球管外遊走を阻止するための内皮層および基底膜のヒトヘパリナーゼ（β−トロンボグロブリン）による処理
β−トロンボグロブリンの市販製剤はケモカインＣＴＡＰ−IIIおよびＮＡＰ−２の混合物である。非生理学的ｐＨ（ｐＨ５．８−６）では、これらのケモカインはヘパリナーゼ活性を有し、一方ｐＨ７ではそれらはヘパリンに結合し、白血球に対する化学走性サイトカインとして作用する。市販のβ−トロンボグロブリン製剤のヘパリナーゼ活性をｐＨ５．８およびｐＨ７での放射性35ＳＯ4標準ＥＣＭの消化によって分析した。これらの製剤はｐＨ５．８においてのみ顕著なヒトヘパリナーゼ活性を示した。次いで後実施例５に記載したin vitroでの管外遊走アッセイシステムにそれらを用いて、そのヒトヘパリナーゼ活性が内皮細胞層を横切る好中球の管外遊走を阻止できるかどうかを調べた。活性化ヒト内皮細胞層のヒトヘパリナーゼ（β−トロンボグロブリン）による処理は好中球管外遊走の顕著な減少をおこした。これらの結果は、脈管構造をヒトヘパリナーゼで処理すると局所的好中球蓄積および炎症反応が阻止されることを示した。
標識化基質上のβ−トロンボグロブリンの活性
市販のβ−トロンボグロブリンのｐＨ５．８およびｐＨ７におけるヘパリナーゼ活性を、35ＳＯ4−標識化ヘパリン／ヘパラン硫酸のＥＭＣからの放出によって試験した。１から８継代でのウシ角膜内皮細胞を集密的プレートから１：１０に分離し、４ウェルプレートにおいて１０％ウシ胎児血清、５％ウシ血清および４％デキストランを加えたＤＭＥＭ低グルコースに播種した。それらの皿に、集密に達する１週間前に１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを３回加えた。集密に達する直前に、Ｈ2Ｏ中のＮａ235ＳＯ4を１ｍＣｉ／ｍｌになるようにＤＭＥＭ低グルコースで希釈したものを細胞に加え、１０％ウシ胎児血清、５％子ウシ血清および４％デキストランを含むフィッシャー培地中での最終濃度を２５μＣｉ／ｍｌとした。３ないし４日後、再び標識を与えた。プレートは集密後１２から１４日間は乱さないようにした。基質を収穫するために、培地を除去し、０．５％トリトン、０．０２Ｍ  ＮＨ4ＯＨのＰＢＳ溶液（ＣａもＭｇも含まず）に代えた。この溶液を除去し、基質をＰＢＳ（ＣａもＭｇも含まず）で３回洗った。プレートを４℃で保存し、ＰＢＳで覆った。これらの基質を１年以内に使用した。
ウェルマーク(Wellmark)（製品♯４１７０５）またはカルビオケム(Calbiochem)（製品＃６０５１６５）からのβ−トロンボグロブリンを標識ＥＣＭの消化のために使用した。酵素１００μｇを水（ウェルマーク）またはＰＢＳ（カルビオケム）１ｍｌに溶解した。その後の希釈はｐＨ５．８または７のＰＢＳで行った。基質をＰＢＳのみ、または１または５μｇのβ−トロンボグロブリンを含むＰＢＳ２５０μｌで覆った。基質をＣＯ2インキュベーター中で３時間インキュベートした。１００μｌアリコートを各ウェルから取り、計数した。各酵素処理基質から放出される放射能の量を未処理基質と比較し、結果を図８に示す。
β−トロンボグロブリン処理をしたＨＵＶＥＣを通過する好中球の遊走
ＨＵＶＥＣをフィルターインサート上に増加させ、実施例５に記載したように活性化した。ｐＨ５．８のＰＢＳ中の５μｇのβ−トロンボグロブリン、またはＰＢＳのみをＨＵＶＥＣ層に１時間適用した。好中球をフィルターの上に加え、管外遊走好中球の数を実施例５に記載のように定量化した。ヒトヘパリナーゼ処理の好中球管外遊走への影響を図９に示す。
実施例７：虚血／再灌流後の白血球−内皮細胞相互作用を阻止するラットのヘパリナーゼによる処理
この実施例はin vivoにおける白血球挙動に与えるヘパリナーゼIIIの影響を示す。炎症性組織における白血球蓄積の３つの重要なメカニズム；白血球回転、粘着、および管外遊走、を虚血後のラット骨格筋微小血管系において分析した。虚血前に血管系をヘパリナーゼIIIで前処理し、ヘパリナーゼIIIの血漿濃度を再灌流中一定に維持すると、白血球回転、粘着および管外遊走を有意に減らせることがわかった。この実施例は、血管系のヘパリナーゼ処理がミクロキャピラリーおよびその周囲組織における好中球蓄積を阻止することを示す。In vivoヘパリナーゼ処理は炎症反応の減少をもたらす。この実施例によっても証明されるように、ヘパリナーゼ処理は虚血後再灌流された筋肉内の微小血管系の灌流を有意に増加させた。好中球蓄積の減少に加えて、増加した微小血管系の灌流は筋肉組織の回復にプラスの影響を与え、虚血／再灌流（すなわち炎症）事象の結果にプラスの影響を与える。
包括的解説
約１ＩＵ／ｍｌの血漿中レベルを確立するために、パイロット研究を行い、我々のin vivo研究に必要な５時間にわたってヘパリナーゼを注入する影響を試験した。前に報告した３時間の虚血後の白血球挙動に関する文献（フォルブス(Forbes)ら、１９９６、Microvascular Research  ５１巻；２７５−２８７ページ）は、完全無傷および疑似処理ラットに関するデータを含む。方法および時期はこの以前の研究および本研究の３時間虚血で同じだったから、ヘパリナーゼ処理の効果はこれまでに公表された結果から得られた完全無傷試験結果および疑似試験結果に匹敵するであろう。２時間の虚血プロトコールでは、追加の完全無傷および疑似処理ラットを分析した。
ヘパリナーゼのin vivo効果を直接研究するために、我々は生体内ビデオ顕微鏡をラット後肢の長指伸筋に用いた。この分析はそれぞれ２または３時間の無流（no-flow）虚血の後におきた１０５または９０分の再灌流の期間中に行った。このような虚血/再灌流（Ｉ−Ｒ）期間は、白血球−内皮細胞相互作用をおこすのに十分な炎症反応を骨格筋におこす。
方法
２２５から２５０ｇの体重の雄ウィスターラットをハロタン（１％−１．５％）吸入によって麻酔し、頸動脈および頸静脈にカニューレを挿入し、それぞれ血圧を検査し、液体を注入した。ラット後肢の長指伸（ＥＤＬ）筋を生体内顕微鏡のために準備した。つまり、顕微鏡の台の上に横たわっている麻酔ラットで、覆っている皮膚を反転し、前脛骨筋と腓腹筋とを分離することによってＥＤＬ筋を露出させた。縫合糸を筋肉の遠位腱の回りに結び、顕微鏡台上に置かれた生理食塩液浴中に筋肉を反転させた。正常な筋肉温度および体温をヒートランプによって維持した（すなわち、筋肉は３２℃；体温は３７℃）。筋肉をガラスカバースリップによって覆い、露出したすべての組織をサランラップで覆い、脱水を防いだ。生体内ビデオ顕微鏡のためにＥＤＬ筋を準備し、標本作製法によって生じた充血後に微小血管血流が正常に戻るため３０分間回復させた後、２本以上の後毛細管細静脈を各々含む１−２視野を選んだ。これらの視野を実験期間中用い、白血球フロー挙動の一過性変化を測定できた。低倍率を用いて、これらの視野の１分間の記録を作り、個々の毛細血管内のＲＢＣフローに関する情報とした。低倍率記録後、後毛細管細静脈の視野を高倍率で１分間記録した。このような視野のビデオ記録は、微小循環パラメーターの“オフライン”分析を可能にする。こうして灌流毛細血管密度および白血球のフロー挙動（単位面積あたりの粘着、回転および管外遊走数）のコントロール値が測定された。
ヘパリナーゼIIIの血漿レベルをヘパリナーゼIII  ＥＬＩＳＡを用いて測定する。ヘパリナーゼIII  ＥＬＩＳＡは定量的２抗体サンドウィッチ検定法である。親和性精製抗ヘパリナーゼIII  ウサギ抗体をミクロタイタープレート上にコーティングする。ウェルを洗い、３７℃、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ、１％ＢＳＡ＋１％Ｔｗｅｅｎ２０）で２時間インキュベートする。３回洗った後、標準およびサンプルをウェルに加え、存在するすべてのヘパリナーゼIIIを固定抗体によって結合する。未結合物質をそれから洗い去り、ビオチン標識抗ヘパリナーゼIII  ウサギ抗体をウェルに加える。過剰の抗体を洗浄によって除去する。ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを加え、ウェルに存在するすべてのビオチンコンプレックスに結合させる。全ての未反応ストレプトアビジンを洗い流した後、ＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット(Biorad, CA)の説明書に記載の方法によって、水性ＤＭＦ中の過酸化水素および３、３’、５、５’テトラメチルベンチジンを含む基質溶液をウェルに加え、サンプル中のヘパリナーゼIIIの量に比例して発色する。１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4溶液は反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定する。
特定プロトコル
１組のラットに静脈カテーテルを介してヘパリナーゼIIIを３ｍｌ／ｈｒの速度で５時間注入し、血液中のヘパリナーゼレベルを１．０ＩＵ／ｍｌに維持した。そのようなパイロット研究により０．３３ＩＵ／ｇ体重／ｈｒがこの目的には適していることが確認された。
微小血管血流および白血球挙動を合計９０から１０５分の再灌流期間中１５分毎に記録した。血液サンプルをヘパリナーゼ投与前と再灌流中に取り、正しい血漿ヘパリナーゼ濃度を確かめた。
統計的分析
すべての場合に平均値はそれらの推定値の標準誤差と共にあらわされる。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較し、その後、適していれば、シェフェの検定を臨時目的の分析として用いた。ｐ＜０．０５を有意と仮定した。
結果
約１ＩＵ／ｍｌ（活性に調整）の血漿濃度が注入中に得られた、そして最後の２時間の注入の期間中血漿レベルの増加傾向があるとはいえ、血漿濃度は一定のままであった（図１０）。ヘパリナーゼIIIの長期注入は少なくとも血圧または呼吸速度に関しては不都合な副作用をもたないようにみえる。
虚血３時間後、回転白血球（Ｌｒ）の数は疑似Ｉ−Ｒラットでは（１４．７７±１．３３）、完全無傷ラット（５．６６±０．１１）に比較して有意に増加した。これらの再灌流中の濃度では、平均回転白血球数は疑似および完全無傷ラットで９０分間の再灌流期間中一定のままであった（図３）。３時間の虚血にもかかわらず、ヘパリナーゼIII処理ラットの後毛細管細静脈内の白血球回転の変化は認められなかった。実際、ヘパリナーゼ処理後の回転白血球の平均数（２．８１±０．６４）は、９０分間の観察期間中、完全無傷ラットにおけるよりも少ない傾向があった（図１１）。
後毛細管細静脈の壁に粘着する白血球数（Ｌｓ）は疑似Ｉ−Ｒラットでは漸増し、止血帯を緩めて４５分以内には一定レベルに達する（３時間虚血）。しかし、ヘパリナーゼIII処理ラットにおける粘着白血球数は虚血後変化を示さず、そして完全無傷ラットとの有意差はなかった（図１２）。
ヘパリナーゼIII処理後の粘着白血球の少ない数に基づいて予想されるように、管外遊走白血球の数（Ｌｅ）は３時間の虚血後の再灌流中に変化なかった（図１３）。疑似および完全無傷ラットのＬｅは３時間虚血プロトコール中は得られなかった。２時間の虚血プロトコール中、ヘパリナーゼ処理ラットのＬｅは完全無傷ラットのそれより高かったが、疑似処理動物におけるＬｅよりは有意に低かった。このデータは図１４にヘパリナーゼおよび疑似処理ラット  対  完全無傷ラットのＬｅにおけるパーセント差として示される。
３時間の虚血後の止血帯を緩めた後、疑似およびヘパリナーゼIII処理ラット両方の微小血管灌流（ＣＤｐｅｒ）は完全無傷ラットで測定された灌流に比較して有意に減少した。しかし疑似ラットにおける灌流とは異なり、ヘパリナーゼIII処理筋での微小血管灌流は止血帯を緩めた３０分以内に正常に戻った（図１５）。
実施例８：  虚血／再灌流損傷のウサギ標本におけるヘパリナーゼIIIの心臓保護効果
序文
虚血は冠状血管床内に、筋細胞および内皮細胞レベルで顕著な損傷をおこす；これは血漿、およびその他の血液および細胞成分の間質腔への管外遊走に導き得る。多形核白血球は内皮細胞層を通って遊走することができ、好中球のこの結合組織障壁を通る遊走は血漿抗プロテアーゼが存在する場合でさえ、好中球由来蛋白分解酵素の作用に依存する。血流の回復は危険にさらされている（jeopardized）心筋に炎症細胞を速やかに近づける。内皮細胞への好中球の粘着は内毒素ＩＬ−１ｂ（血管内皮を活性化し、白血球のための粘着分子を産生する）、または腫瘍壊死因子によって刺激される。多数の研究が、特に再灌流相中の血管または心筋細胞への好中球の粘着を阻止するために、モノクローナル抗体を含める種々の薬物学的介入方法を用いる可能性を模索している。好中球−細胞相互作用（好中球回転、粘着および管外遊走）の妨害は、虚血／再灌流後の細胞損傷程度を著しく減らすことがわかった。これは、虚血誘導性細胞損傷の病態生理学において炎症細胞が重要な役割を演ずることを示唆する。炎症細胞は、虚血発作中におきるものを超えて広がる筋細胞損傷（すなわち再灌流損傷）においても役割を演ずる。ヘパリナーゼ処理は好中球−内皮相互作用を防止するのに有効であるので（上の実施例を参照されたし）、ヘパリナーゼ処理によるウサギ心筋の再灌流損傷の防止をこの実施例で説明する実験で研究した。ヘパリナーゼIIIは、標的量２５μｇ/ｍｌを冠状動脈閉塞開始前または再灌流開始時に投与すると、組織壊死程度を減少させることがわかった。それより少量のヘパリナーゼIIIはこの動物標本の虚血−再灌流損傷には心臓保護効果をもたらさなかった。しかし、５μｇ／ｍｌの標的量では梗塞の大きさの減少傾向があった。心臓血液動態または経壁的血流分布の顕著な変化なしに保護効果が得られた。
炎症反応が虚血エピソード、例えば（非制限的例ではあるが）心臓発作および卒中、の結果であるとき、この実施例は、炎症性事象の前または炎症時のヘパリナーゼ処理は組織損傷を減らすことができることを示す。その上、この実施例は、炎症性事象の最中に白血球蓄積から起きる組織損傷はヘパリナーゼ処理または前処理によって減らすことができることを示す。
方法
雄ニュージーランド白ウサギ（２．２−３．０Ｋｇ体重）をこれらの研究に用いた。ウサギをカナダ動物ケア委員会(Canadian Council on Animal Care）の実験動物のケアおよび使用の指針(Guide to the Care and Use of Experimental Animal)(１および２巻）にしたがって世話をした。それらに筋注用アセプロマジンマレート（５ｍｇ／Ｋｇ；オースチン研究所）を前投与し、ペントバルビタールナトリウムで麻酔した（２５ｍｇ／Ｋｇ；ｉ．ｖ．；MTC Pharmaceuticals)。１時間おきに麻酔を追加した。気管にカニューレを挿入し、ウサギを室内空気で機械的に換気した。右頸静脈に薬剤（ヘパリナーゼIIIまたはビヒクル）投与のためのカニューレを挿入した；左頸静脈にカニューレを挿入して、血漿ヘパリナーゼレベル測定のための血液を採取するためのカニューレを挿入した。カニューレ（ＰＥ−９０）を左頸動脈に置き、放射性標識ミクロスフェアーの注入中に基準とする動脈血を採取した。
左開胸術によって心臓を露出し、係蹄（４−０絹）を房室間溝と尖端との間の左回旋冠動脈中心の第一前側枝の周囲に置いた。絹縫合糸をタイゴン  チューブ(Tygon tubing)を通し、冠動脈閉塞のための係蹄とした。尖端を介して置かれた液体充填カテーテルで左心室圧を得た。心臓血液動態を２０分間安定させた。
縫合糸をプラスチックチューブを通して引っ張り、モスキート止血鉗子でクランプすることによって部分的心筋虚血をおこした。虚血は、部分的心外膜部チアノーゼの出現と、心電図（導出ＩＩ）のＳＴ部の上昇によって、視覚的に検証した。心室細動が発生した心臓では、ＬＶのおだやかなフリッキングによって正常な洞リズムが回復し（これらの実験では電気的除細動は用いなかった）、２回試みて除細動できなかった心臓はデータ分析から排除した。Gould(ＴＡ２４０)EasyGraph ４−チャンネル生理形態学的(physiograph）記録器(Interfax Inc.,Montreal,Quebec)を用いて、導出II心電図およびＬＶ圧を実験中記録した。
実験プロトコル
ウサギを７種類の投与群に割り当てた；第１群ウサギには虚血開始前６０分間生理的食塩液を与えた（ｉ．ｖ．）；第２群ウサギには冠状動脈再灌流の開始時に生理的食塩液を与えた（ｒ，ｖ．）；第３群ウサギには虚血開始前６０分間ヘパリナーゼIIIを与えた（２５μｇ／ｍｌ標的濃度、ｉ．ｖ．）；第４群ウサギには冠状動脈再灌流開始時にヘパリナーゼIIIを投与した（２５μｇ／ｍｌ標的濃度、ｉ．ｖ．）；第５、６および第７群ウサギには０．２５、１．２５、または５．０ｇ／ｍｌのヘパリナーゼIIIのいづれかの標的レベルをそれぞれ冠状動脈再灌流の開始時に投与した。２つの処理群（第１群および第３群）では心筋虚血開始前６０分間薬剤または生理的食塩液を静脈内注入し（４．０ｍｌ／ｈｒ）、それからハーバード注入ポンプ(Ealing Scientific,Montreal,Canada)を用いて連続的に注入した。残る実験群では、ビヒクルまたは薬剤注入を再灌流時に開始し、再灌流中に３時間続けた。７種類の処理プロトコルの薬剤を回転させる(rotating)処理を逐次的実験を行う特別の群にウサギを割り当てた。すべてのウサギは４５分間の部分的冠状動脈閉塞にさらされ、その後１８０分間再灌流を受けた。
血漿ヘパリナーゼIII測定
第１および第３群ウサギでビヒクルまたは薬剤注入後ベースライン、３０分および６０分後に右頸静脈から血液サンプルを採取し、冠状動脈再灌流１５、３０、６０、１２０および１８０分にも血液を採取した。残る実験群では血液をベースラインおよび冠状動脈再灌流１５、３０、６０、１２０および１８０分に血液を採取した。血液サンプルを４℃で１５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、血漿を凍結し、その後の分析まで−２０℃で保存した。ヘパリナーゼIII血漿レベルを実施例７に記載したように測定した。
経壁的血流
虚血性および非虚血性血管床への血流を、標準離脱法により、放射性標識ミクロスフェア（±１５μｍ；ＮＥＮ、ボストン、ＭＡ）を用いて測定した。各血流測定では、113Ｓｎ、46Ｓｃ、または85Ｓｒ（使用直前に渦巻きミキサーで機械的に撹拌した）のいずれかで標識した０．４−０．６×１０6ミクロスフェアを血液動態的定常状態の条件下で左心房に注入し、その後３ｍｌの温生理的食塩液により２回フラッシュした（ミクロスフェアの左心房への注入はＬＶ室における十分な混合を確実にし、ミクロスフェアの冠状循環への直接注入でおきる人為的流れを防ぐ）。頸動脈から基準動脈血サンプルをミクロスフェア注入の１０秒前に開始し、その後２．６ｍｌ／分の速度で２分間続けて集めた。心筋血流分布を次のように評価した；１−ベースライン、２−冠動脈再灌流開始３０分後、３−冠動脈再灌流１８０分後。組織および基準血液放射能を多チャンネル波高分析器（Cobra II,Canberra Packard）を用いて測定し、同位元素スペクトルの重なりを補正した。
梗塞の大きさの分析
実験プロトコルの終わりに、飽和塩化カリウム１０ｍｌの静脈注射によって心臓を拡張期で停止させ、心臓をすばやく摘出し、生理的食塩液中ですすぎ、ランゲンドルフ灌流装置上で大動脈を経てカニューレを挿入した。心臓を７５ｍｍＨｇで２、３、５−トリフェニルテトラゾリウムクロライドで３７℃で２０分間大動脈を経てex vivo灌流した。引き続き、動脈縫合糸を再び結び、モナストラルブルーを大動脈カニューレを介して逆行性に注入し、解剖学的リスクゾーンを描写できるようにした。心臓を次いで灌流装置から取り出し、その心房および右心室を切り取り、左心室を秤量し、緩衝１０％ホルマリン中に浸漬することによって固定した。
死後研究
本研究の主な目的は、薬剤処理が梗塞の大きさ（解剖学的リスクゾーンの大きさに標準化する）に及ぼす影響をテトラゾリウム染色を用いて評価することであった。心臓の２ｍｍ切片を作り、ＬＶスライスのアウトラインおよびテトラゾリウム陰性（すなわち梗塞）領域のアウトラインを透明なアセテートシート上にトレースした。解剖学的リスクゾーンの輪郭をモナストラルブルー色素の欠如によって描写し、透明なアセテートシート上にトレースした。各心臓で梗塞を解剖学的リスクゾーンの大きさに標準化した。総ＬＶ横断面積、リスク面積、梗塞面積は、トレースを拡大したもの（１．５×）から、ＩＢＭ  Ｓ／２コンピューターに連結したSummagraphics Summasketch Plus Bitpadを用いるコンピューター面積測定法(Sigma Scan;Jandel Scientific Inc.,Calif.)によって測定した。各スライスにおけるリスク容量、梗塞容量、およびＬＶ容量をコンピューター面積測定法によって得た面積と、各心室切片の厚さとの和として計算した。系列的切片からの数値を合計してＬＶ、リスクゾーンおよび梗塞ゾーンの総容量とした。
データ分析
冠状動脈閉鎖の前および後の血液動態的データの差を一元ＡＮＯＶＡを用いて検定した。心拍数・血圧積を心臓の代謝的要求の指標として用いた。梗塞容量、リスク容量、梗塞の大きさ、およびＬＶ容量を一元ＡＮＯＶＡによって比較した。全体的群の差が検出される場合、ダンネットの多重比較検定を用いて対照との比較を行った。すべての統計的比較はパーソナルコンピューター用統計分析システムプログラム(SAS Institute,Cary,NC）で行った。確率（ｐ）水準が０．５未満の場合を統計的有意と考えた。この研究のためのサンプルの大きさを決めるために、梗塞の大きさの最低１５％減少（予想標準偏差８％）を検出するために０．９０の検出力をもたらす“ｎ／群”値を計算した。
結果
１３０匹のウサギを本研究に使用した；５匹のウサギが呼吸不全（ｎ＝１）、手術の失敗（ｎ＝１）、または回復不可能の心室細動（ｎ＝３）のために死亡した。３６匹のウサギを用量−反応研究に含み、別の２８匹を生化学的評価（心臓血液動態および血漿ヘパリナーゼIIIレベルは全体的統計分析に含んだ）に割り当てた。したがって、６１匹のウサギを梗塞サイズ−データ分析に含んだ。
心臓血液動態変数を表１にまとめる。冠状動脈閉鎖開始前の心拍数、左心室収縮期および拡張期血圧および心拍数・血圧積（心筋酸素要求の指標）を投与群のすべてで比較した。再灌流６０分の心拍数・血圧積（図１６）は、再灌流時にヘパリナーゼIII（２５μｇ／ｍｌ標的濃度）で処理したウサギにおいて比較的高いようにみえた（第４群）。しかし心臓血液動態は本研究の終わりには全動物で同様であった。
左心室重量、梗塞およびリスク容量、ＬＶ容量のパーセントとしてあらわした梗塞の大きさおよび解剖学的リスク面積を表３にまとめる。リスクゾーンの大きさに標準化した梗塞の大きさ（図１７）は、ビヒクル前処理をした対照およびこの前処理をしなかった対照ではそれぞれ４２．３±４．８（平均値±１ＳＤ）および４０．０±５．３パーセント（ｐ＝ＮＳ）であった。ヘパリナーゼIII前投与および再灌流時におけるヘパリナーゼIII投与（２５μｇ／ｍｌ標的濃度）は、それぞれ２６．１±５．２および２４．７±５．１パーセントの筋細胞壊死の有意な減少をおこした（ビヒクル処理対照に対しｐ＝０．０１）。虚血前に投与するか、または冠動脈再灌流時に投与した群の間では差は検出されなかった。０．５、１．２５または５．０μｇ／ｍｌ標的濃度のヘパリナーゼIIIの投与は梗塞の大きさを制限しなかった；それらはそれぞれ４２．８±６．５、３９．１±５．４、および３７．９±４．６パーセントであった。５．０μｇ／ｍｌ投与群でより梗塞が小さい傾向がわずかに見られた（ｐ値は０．０６６）。
それぞれの投与群で投与したヘパリナーゼIII注入物レベルを図１８に示す。２５μｇ／ｍｌの初回ヘパリナーゼIII標的量（すなわち治療量）を調べ、その後希釈を生理的食塩液で行い、それぞれの薬剤の希釈１：５、１：２０、および１：１００を行った。実際の血漿ヘパリナーゼIII濃度の時間的経過を図１９に示す；ヘパリナーゼIII前処理および再灌流時処理は第３群および第４群において同様な血漿中薬剤濃度を示した。最初に前投与したウサギ（実験プロトコルの最初の３時間の間のみ薬剤を投与）では３時間の冠動脈再灌流後には、血漿ヘパリナーゼIII濃度は、かなり低めであった；最も重要なことは、その薬剤が冠動脈再灌流時に与えられていたということである。これは梗塞の大きさに関して第３群および第４群で得られた同様な結果を説明することができる。
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数値は平均値±１ＳＤ。ＨＲ＝心拍数、ＬＶＰｓｙｓ＝収縮期左心室圧、ＬＶＰｄｉａｓ＝拡張期左心室圧、ＲＰＰ＝心拍数・血圧  積
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数値は平均値±１ＳＤ。1ｐ（第６群に対して０．０５）。
ＢＡＳＥ＝ベースライン流量測定値（すなわち虚血前）、ＲＰ＝冠動脈再灌流。データはｍｌ／分／ｇ湿重量であらわされている。
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数値は平均値±１ＳＤ。1ｐ（対照に対して０．０５）。Ｈｔｗｔ＝心室重量；ＡＮ＝壊死面積、ＡＲ＝リスク面積、ＡＮＡＲ＝解剖学的リスク面積に標準化された壊死、ＡＲＬＶ＝総ＬＶ面積に標準化されたリスクゾーン。
これらのデータは、局所的炎症反応を軽減するためにヘパリナーゼを含有する組成物の有用性を示す。
本発明の組成物および使用法の変更および変形は、この詳細な説明から当業者には明らかである。このような変更は次の請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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