(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固因子ＸIIIを含む水性医薬調製物の製造方法であって、以下の工程：
少なくとも２Ｕの因子ＸIII/mgタンパク質を含む水溶液を得、そして
ウイルスを非活性化してウイルス安全な血液凝固因子ＸIIIを得るために安定剤を加えることなく４０〜６５℃で加熱する、
を含み、
該水性医薬調製物は、加熱前の水溶液中に存在する因子ＸIIIの元の生物学的活性の５０％を超える活性を有する方法。
【請求項２】
加熱を３０分〜１００時間行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加熱をテンシドの存在下に行う請求項１に記載の方法。
【請求項４】
テンシドが非イオン性テンシドである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液が公知の安定剤を実質的に含まない請求項１に記載の方法。
【請求項６】
加熱を因子ＸIIIの生物学的活性の６０％以上を保持するに適した温度及び時間で行なう請求項１に記載の方法。
【請求項７】
因子ＸIIIを含むＣＯＨＮ−Ｉ画分を供し、
該ＣＯＨＮ−Ｉ画分から因子ＸIIIを沈殿させて沈殿物を形成させて該沈殿を分離し、
溶解した沈殿を短時間加熱して変性したフィブリノーゲンを分離し、そして
該因子ＸIIIを含む溶液を安定剤を添加せずに４０〜６０℃の温度で３０分〜２時間加熱する、
ことを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られるウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物。
【請求項９】
該因子ＸIIIが更にテンシドを含む請求項８に記載のウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物。
【請求項１０】
テンシドが非イオン性テンシドである請求項９に記載のウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物。
【請求項１１】
請求項８に記載の血液凝固因子ＸIII調製物を活性成分として含む治療用又は予防用調製物。
【請求項１２】
請求項８に記載の血液凝固因子ＸIII調製物を活性成分として含む診断用調製物。
【請求項１３】
請求項８に記載の血液凝固因子ＸIII調製物を含む組織接着用調製物。
【請求項１４】
すでにウイルスを不活性化したフィブリノーゲン調製物を更に含む請求項１３に記載の組織接着用調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、低い感染危険性を有すると同時に高活性を有する、ヒト起源の、ウイルスに対して安全な血液凝固因子ＸIII調製物に関する。
【０００２】
プロ酵素因子ＸIIIは血漿中にａおよびｂ鎖の形態(a2b2、分子量約３２０,０００Ｄa)で存在する。式ａ2で示される因子ＸIII(分子量約１６０,０００Ｄa)は、例えば胎盤および血小板中に見い出される。因子ＸIIIの両変異体において、ａ鎖はプロ酵素を正確に構成し、この酵素からＣa2+イオンの存在下、トロンビンの作用の下で活性な酵素である因子ＸIIIaが生成する。
【０００３】
因子ＸIIIは血液凝固の最終期に必須の役割を果たす：トロンビンにより引き起こされるフィブリノーゲンからフィブリンへの変換(凝固)と同時に、因子ＸIIIはＣa2+イオンの存在下に因子ＸIIIaへと活性化され、次いでこの因子ＸIIIaは形成されたフィブリン単量体を共有結合により架橋する。この様にして形成された高重合体は非架橋フィブリンよりかなり高い機械的強度を呈し、さらに繊維素溶解分解に比較的耐性であって、これが有効な止血に決定的に重要である。さらに、因子ＸIIIの存在は正常な癒傷にとって必要な先行条件である。
【０００４】
因子ＸIII欠損患者は、負傷したときに止血および癒傷において重い障害を受け、これは因子ＸIII調製物の静脈内投与によってのみ除去することができる。さらにフィブリノーゲンおよび因子ＸIIIに基づく組織接着(「フィブリン接着」)においても、所望の高強度の接着を得るためならびに有効な止血および良好な癒傷のために因子ＸIIIの十分な含量が必須である。
【０００５】
最後に、医学-診断目的のために標準化された因子ＸIII調製物に対する必要性が存在する。
【０００６】
【従来の技術】
因子ＸIII調製物、特にヒトに投与すべき調製物はヒト血漿およびヒト胎盤から得られる。使用される出発物質の故に、無菌的濾過により除去し得ない感染性病原体、例えばウイルスを伝染させる危険性が基本的に存在する。
【０００７】
上記の全ての適用のために、患者またはスタッフのどちらも危険にさらさないように、因子ＸIII調製物が実際に感染のいかなる危険性も有していてはならないという要求が存在する。この必要条件はヒトに投与すべき調製物に関して特に重要であり、例えば因子ＸIII欠損患者に一生を通して定期的な間隔で投与しなければならない注入調製物に関して最も重要である。感染性粒子が完全には除去されていない全ての調製物を用いる場合には、この繰り返し投与は患者においてこれら粒子の蓄積を導き、このようにして感染の危険性の大きな増大を導くであろう。
【０００８】
従って、この危険性を可能なかぎり最小限にするための試み、すなわち一方では出発物質を試験することによる、また他方では存在する可能性のあるあらゆる感染性病原体を不活性化するための追加的な測定による試みがなされている。しかし、既知でありさらに適当な試験法が利用可能である感染性病原体(肝炎およびＨＩウイルス)に対して出発物質を試験することができるのみであり、存在するかもしれない他の未知の感染性病原体に対しては試験することができない。さらに、全ての試験法の感受性は限られており、ゆえに、既にこの理由のために絶対的な安全性を期待することができない。
【０００９】
不安定な生物学的調製物中のウイルスなどの病原体を不活性化する全ての方法は、この方法がウイルス力価をできるだけ低下させるべきであるが、他方では生物学的活性の低下をできるだけ少ない程度にすべきであるという基本的問題を有する。
【００１０】
現在のウイルス不活性化法は、高用量(例えば、凝固因子調製物中、約１０5ＩＤ/mlの最大可能力価に対応する)の試験ウイルスと混合した試験調製物に対して該方法を適用した後に、もはやサンプル中にいかなるウイルスも検出することができず、こうしてウイルス力価が検出限界以下まで低下した場合に有効であると称される。
【００１１】
不活性化の確認としていわゆる「低下係数」(「ウイルス低下係数」)が知られており、これは、試験ウイルスの一回の添加後の最初および最後のウイルス力価の比の１０の対数から算出される。欧州共同体委員会の指導的なEC III/8115/898-ENから、さらにいわゆる全低下係数が知られている。これは個々の続いて行われる不活性化測定の低下係数の合計から算出される。
【００１２】
従って、該方法を実施した後の低下係数(ＲＩ)または全低下係数(Ｒ)の生物学的残存活性(ＲＡ)に対する比は、ウイルス不活性化法を確認するのに役立つ。
【００１３】
溶液中の加熱(低温殺菌)により因子ＸIII調製物中の病原体を不活性化する既知の方法が存在する[EP-A−0 018 561、EP-A−0 037 078]。因子ＸIIIの生物学的活性は、既知の安定化物質、例えばアミノ酸、ペプチド、糖、ポリオールまたはカルボン酸、いわゆる「熱安定化物質」(１０％より多く５０％までの量で用いなければならない)の添加により実質的に保持することができる(シロップ法)。さらに、０.１％より高い濃度のヒトアルブミンが熱安定化物質として示唆されている(特願昭６３−８０９６０号)。また、熱処理前の０.５Ｍより多い硫酸アンモニウムの添加により血液凝固因子を安定化する方法が知られている(AT 376 883)。
【００１４】
しかし、加熱産物からの高濃縮された熱安定化物質の必要な除去は厄介である。安定化物質の存在下での低温殺菌によるウイルス不活性化法は、所望の生物学的活性と同時にウイルス自体が安定化され、これにより低下係数の残存活性に対する特に好ましい比(Ｒ／ＲＡ)が得られないという不利益をさらに有する。
【００１５】
これまで、安定化物質を含まない因子ＸIII含有溶液の液体加熱は専門家の観点から不可能であると考えられていた；例えば、EP-A−0 037 078における比較例において、安定化物質を添加せずに因子ＸIIIを６０℃で１０時間加熱した。この実施において、因子ＸIIIの活性は完全に破壊された。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物であって、大量の因子ＸIIIを投与したときでさえ感染性病原体の伝染が排除されることを該調製物から予測することができ、それにもかかわらず高活性を有する調製物を提供するという目的を有する。さらに本発明は、溶液中で加熱することにより因子ＸIII含有調製物中の感染性病原体を不活性化する方法であって、既知の低温殺菌法に固有の不利益を呈しない方法を提供する目的を有する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明に従い、これら目的はウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物により達成され、これは、全タンパク質１mgあたり少なくとも２Ｕの比活性を有する血液凝固因子ＸIIIを含有する水溶液であって、糖、ポリオール、アミノ酸、ペプチドおよびカルボン酸からなる群から選択される１０％未満の既知の安定化物質、ならびに０.５モル/Ｌ未満の硫酸アンモニウムを含む溶液を、感染性病原体を不活性化するに十分な時間、好ましくは３０分〜１００時間加熱することにより達成される。
【００１８】
さらに本発明は、感染性病原体が加熱により不活性化されるウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物を製造する方法であって、糖、ポリオール、アミノ酸、ペプチドおよびカルボン酸からなる群から選択される１０％未満の既知の安定化物質、ならびに０.５モル/Ｌ未満の硫酸アンモニウムを含み、少なくとも２単位、好ましくは少なくとも１５単位/mg全タンパク質の比活性を有する因子ＸIII含有分画の水溶液を、４０〜６５℃の温度で、感染性病原体を不活性化するに十分な時間、好ましくは３０分〜１００時間加熱することを特徴とする方法を包含する。
【００１９】
驚くべきことに、因子ＸIII含有溶液を既知の安定化物質の不在下または低含有量の下で加熱した場合に、非常に好ましいこれまで達成されなかったウイルス低下係数の因子ＸIII残存活性に対する比が得られることが見い出された。比較アッセイにより、溶液(６０℃)中で加熱することによるＨＩＶ力価の一定の低下は、加熱を安定化物質(EP-A−0 018 561に従った５０％スクロース、２Ｍグリシン)の存在下で行うときには少なくとも１０倍長い加熱時間を必要とすることが示された。
【００２０】
因子ＸIII活性が高度に保存されたいう事実はさらに驚くべきことであった。この理由は、因子ＸIIIを例えばEP-B−0 159 311に従って熱処理に供する場合には因子ＸIIIが比較的、熱不安定であると考えられるからである。
【００２１】
本発明による方法を、因子ＸIIIの生物学的活性の５０％より多くが保存される温度および時間で行う。
【００２２】
本発明の方法の好ましい態様は次の測定を特徴とする：
・因子ＸIII含有ＣＯＨＮ Ｉ分画を得、
・因子ＸIIIをＣＯＨＮ Ｉ分画から沈殿させて沈殿物を分離し、
・所望なら、因子ＸIII含有沈殿物を溶解および再沈殿によりさらに精製し、
・溶解沈殿物を短時間加熱して熱変性フィブリノーゲンを分離し、
・所望なら、因子ＸIII含有溶液をさらに精製および濃縮し、
・既知の安定化物質を添加せずに４０〜６０℃の温度で３０分〜２時間、ＸIII含有溶液を加熱する。
【００２３】
溶解したＣＯＨＮ Ｉ分画からの因子ＸIIIの沈殿は、例えば硫酸アンモニウム(２０℃で約１０〜２０％飽和)またはグリシン(約１.５〜３モル/Ｌ)を用いて行うことができる。また、因子ＸIIIを沈殿させる(フィブリノーゲンの存在下で)のに適当であることが知られているさらに別の沈殿化物質を用いてもよい。
【００２４】
得られた沈殿物の分離および溶解後に、同じかまたは異なる沈殿化物質を用いて沈殿を繰り返してもよい。次いで、沈殿物を溶解して短時間(例えば５６℃で３分間)加熱し、存在するあらゆるフィブリノーゲンを変性および沈殿させる。加熱沈殿後に得られた上清は、約０.５〜２.５mg/mlの全タンパク質含量を有し、約２〜１０Ｕ/mg全タンパク質の比活性を有する因子ＸIIIを含有する。
【００２５】
さらにこの因子ＸIII含有溶液を精製してもよく、この場合、伴われるタンパク質はポリエチレングリコール(例えば、約４℃で約３.５％までの濃度のＰＥＧ４０００)の添加により沈殿および分離される。
【００２６】
さらに、１０％までの濃度のＰＥＧ４０００の添加により因子ＸIIIを沈殿させて、緩衝溶液、例えば０.１％クエン酸溶液(pＨ７.０)中に溶解して数百単位/mlの濃度にすることができる。
【００２７】
次いで、このようにして得た溶液を、既知の安定化物質を添加せずに加熱し(例えば、６０℃で２７時間または５０℃で１２時間)、因子ＸIII活性は実質的に保存される。
【００２８】
好ましい態様において、加熱すべき溶液はさらにテンシド(tenside)、好ましくは非イオン性テンシドを含有する。テンシド濃度は、用いるテンシドの型により可変的に選択すべきである。加熱工程中にテンシドがさらに抗ウイルス薬的に活性となり、因子ＸIII活性が実質的に損傷されない濃度が適当である。
【００２９】
各々の所望のテンシドに対してこのような適当な濃度は簡単な実験により決定されるであろう。
【００３０】
適当な濃度は、例えばデスオキシコレートについては０.２％(w/v)以下であり、塩化ベンジルトリメチルアンモニウムおよび塩化ベンジル-ジメチル-２-ヒドロキシエチル-アンモニウムについては０.１％(w/v)以下であり、スルホベタインＳＢ １２(Serva；Ｎ-ドデシル-Ｎ',Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパン-スルホネート)については０.３％(w/v)以下であり、Ｎ-オクチルグルコシドについては１％以下であるが、Tween 80またはTriton X-100などのテンシドを実質的に比較的高い濃度(１５％(w/v)およびそれ以上)で用いても良い。
【００３１】
驚くべきことに、テンシド存在下の溶液中で加熱したときに因子ＸIIIの安定性は、テンシド不在下とおよそ同程度に良好であるが、ウイルス不活性化はさらに迅速に進行し、これにより概してウイルス低下係数の因子ＸIII残存活性に対するさらに好ましい比が得られる。必要ならば、添加されるテンシドを加熱工程後に本質的に既知の方法、例えば再沈殿またはイオン交換クロマトグラフィーにより再び除去してもよい。
【００３２】
感染性病原体、例えば肝炎またはＡＩＤＳウイルス(ＨＩＶ)の伝染の点でこれまで達成されなかった安全性と同時に存在する酵素の高い比活性のために、本発明による調製物は、ヒトに対する予防的および治療的投与のための調製物の製造、組織接着物質の製造ならびに診断的目的のために適している。
【００３３】
ウイルス安全な血液凝固因子ＸIII調製物の好ましい適用は、既にウイルス不活性化されたフィブリノーゲン調製物への因子ＸIIIの添加による、ウイルス安全な組織接着調製物の製造から成る。
【００３４】
所望の低下係数を得るための本発明による熱処理の継続時間は、一定量の試験ウイルスが混合された因子ＸIIIサンプルについて実験的に決定することができる。
【００３５】
ウイルス不活性化のために、依然として測定可能なウイルス力価が得られるまで因子ＸIIIサンプルを特定の温度で熱処理する。時間当たりのウイルス力価単位の低下から、ウイルス力価の所望の全低下を得るために必要な処理時間を計算することが可能である。
【００３６】
この様式で計算する場合には、ウイルス不活性化が、変化しない速度定数を有する一次の反応であることが前提とされる。
【００３７】
これは実際に常に起こらないとしても、なおその時間経過の間に方法の効力の低下(いわゆるテーリング)が観察されることが多いが、記載される計算の様式は依然として様々なウイルス不活性化法の効力を互いに比較する認められた方法である。
【００３８】
しかし、熱処理の間に一定量の試験ウイルスを繰返し加えることもEP 0 519 901の方法に従って可能であり、各繰返しはウイルス力価が特定の値、好ましくは検出限界以下まで低下したときにのみ行う。次いで、全低下係数は個々の低下係数の合計から得られる。
【００３９】
本発明の方法を実施するために、高度に精製された因子ＸIIIを含有している分画が特に適していることが判明した。従って、本発明の方法の好ましい態様は、熱不活性化の前に、因子ＸIII含有分画を精製して、所望なら濃縮して因子ＸIIIの少なくとも１５単位/mg全タンパク質の比活性を得ることから成る。
【００４０】
本発明の方法を実施したときに、調製物の精製度が高いほど、すなわちその比活性が高ければ高いほど因子ＸIIIの安定性が高くなることは驚くべきことであった。
【００４１】
通常、不安定な酵素は他のタンパク質(既知の例はアルブミン)の存在により安定化されるから、全く正反対のことが予想されねばならないであろう。
【００４２】
しかし、驚くべきことに、本発明に従った方法においてはアルブミンは因子ＸIIIに対していかなる安定化効果も有さず、さらに他の血漿タンパク質も安定化物質として作用しないことが見い出されている。
【００４３】
因子ＸIII含有分画を血漿から得ることは都合がよい。その場合因子ＸIIIはａ鎖およびｂ鎖の両方を含むであろう。
【００４４】
本発明に従った方法を実施する前に、存在する可能性のあるフィブリノーゲンを分離するのは都合がよい。熱変性されたフィブリノーゲンの存在下で、ウイルスの封入も起こるであろう。このような封入ウイルスは熱作用に関して安定化され、これにより方法の信頼性は疑わしいものとなるであろう。短時間の加熱(例えば、５６℃〜６０℃で数分間)の後に、フィブリノーゲンは変性し、次いで沈殿物として分離することができる。
【００４５】
本発明に従った方法を、因子ＸIIIが溶液中に少なくとも２単位/mg全タンパク質の比活性で存在する血漿分画法のあらゆる段階で行うことができる。
【００４６】
以下の実施例において、以下の分析法を適用した：
全タンパク質：ビウレット法。
【００４７】
因子ＸIII：２つの異なるが両方とも同じ基本的原理、すなわち因子ＸIIIによるフィブリン架橋に基づく方法に従い測定を行った。
【００４８】
方法１：
因子ＸIIIを含まないフィブリノーゲン溶液の一部を、測定すべきサンプルの異なる希釈物およびトロンビン-ＣaＣl2溶液と混合し、３７℃でインキュベートする。一定のインキュベート時間後に反応を１％モノクロロ酢酸(ＭＣＡ)の添加により停止させ、ＭＣＡ中のフィブリン凝塊の溶解性または不溶性を測定する。
プールした十分に凍結させたヒトクエン酸化血漿を標準とする(定義により血漿１mlが１単位の因子ＸIIIを含有する)。
不溶性の凝塊が依然として得られるサンプルおよび標準の最も高い希釈を、各々、次の式に従い、未知のサンプル(ｘ)の因子ＸIII含量を算出するために供した：
【数１】
ｘ ＝ Ｖx ／ Ｖs
[式中、Ｖxは未知のサンプルの希釈であり、そしてＶsは標準の希釈である]。
従ってこの通常の測定法は、最終的に１％モノクロロ酢酸中の非架橋フィブリンの溶解性または架橋フィブリンの不溶性に基づく。ゆえに、その精度はこの溶解性限界の不正確性により制限される。
【００４９】
方法２：
反応混合物は方法１のものに対応するが、反応は尿素、Ｎa-ドデシル硫酸(ＳＤＳ)およびβ-メルカプトエタノールの混合物の添加により停止され、タンパク質に含有されるジスルフィド架橋は還元により切断される。
このようにして得られたサンプル中のフィブリン-γ-鎖の架橋度は、ＳＤＳゲル電気泳動およびクーマシーブルーによる染色後に濃度計により測定する。グラフ内挿法により、フィブリン-γ-鎖の架橋が５０％に達するサンプルおよび標準の希釈が得られる。これら希釈を各々ＶxおよびＶsとしたときに、未知サンプル(ｘ)の因子ＸIII含量は次式に従い方法１のように算出される：
【数２】
ｘ ＝ Ｖx ／ Ｖs
その性質により、方法２は(通常の)方法１より正確であるが、これははるかに多くの作業を含む。
従って方法２は、因子ＸIII測定の比較的高い正確度が本発明の方法を説明するために都合がよいかまたは必要であるらしい場合に用いた。
【００５０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  フィブリノーゲンを含まない因子ＸIII溶液の調製(熱沈殿上清)
通常のＣＯＨＮ Ｉ沈殿物(フィブリノーゲンおよび因子ＸIIIを含有する血漿分画からエタノールを用いた沈殿により得た)を１０倍量のクエン酸含有緩衝溶液(pＨ７.０)(０.０５Ｍクエン酸、０.５Ｍ ＮaＣl、２０.０００ＫＩＵアプロチニン／Ｌ)を用いて溶解し、撹拌しながら１６％飽和になるまで(室温で)硫酸アンモニウムと混合した。直ちにこれを４℃まで冷却し、混合物をさらに２時間撹拌した。生成した沈殿物を上記緩衝溶液を用いて溶解し、硫酸アンモニウムを用いて沈殿をもう１度繰り返した。
この沈殿物をクエン酸含有緩衝溶液(pＨ７.０)[０.０２Ｍクエン酸、０.１２Ｍ ＮaＣl、１００ＫＩＵアプロチニン／ml]に溶解し、５６℃で１０分間加熱した。生成した沈殿物(変性化フィブリノーゲンから)を遠心分離した。熱沈殿上清は２.１mg/mlのタンパク質含量および７.７Ｕ/mlの因子ＸIII含量(方法２による)を有していた。従って、比活性は因子ＸIII３.７Ｕ/mg(タンパク質)であった。
【００５１】
実施例２  溶液加熱時の因子ＸIIIの安定性
実施例１に対応する熱沈殿上清を４０〜６５℃の温度で安定化物質を添加せずに加熱した。熱処理の一定持続時間後に、加熱前の活性に基づく因子ＸIIIの残存活性を測定した。
【表１】
0003692153.tif 000002
【００５２】
実施例３  溶液中で加熱した場合の因子ＸIIIの比活性および安定性
安定化物質を含まない溶液中で加熱した場合の次の因子ＸIII溶液の安定性を比較した：
Ａ）実施例１の熱沈殿上清
Ｂ）さらに精製するために、実施例１の硫酸アンモニウム沈殿物をクエン酸含有緩衝溶液[０.０２Ｍクエン酸、０.１２Ｍ ＮaＣl、５０,０００ＫＩＵアプロチニン/Ｌ]に溶解し、グリシン(１.７５モル/Ｌ)で再沈殿させた。沈殿物を同じ緩衝溶液中に溶解し、熱沈殿を実施例１に従って行った。
Ｃ）実施例１に従った熱沈殿上清を、さらに精製および濃縮するために以下の様式でさらに処理した。
１）４℃で３.５％(w/v)ＰＥＧ４０００を用いた沈殿による伴われるタンパク質の分離
２）４℃で１０％(w/v)濃度までのＰＥＧ４０００の添加による上清からの因子ＸIIIの全沈殿、遠心による沈殿物の分離および０.１％クエン酸ナトリウム緩衝液(pＨ７.０)の元の容量の１／２５への溶解
熱処理(６０℃で４時間、安定化物質なし)後の３つの溶液Ａ、Ｂ、Ｃの因子ＸIII残存活性を測定した(方法２)。
【表２】
0003692153.tif 000003
実施例は、安定化物質を含まない溶液中で加熱した場合に因子ＸIIIの安定性がその純度(比活性)と共に上昇することを示している。
【００５３】
実施例４  テンシドの存在下に溶液(安定化物質を含まない)中で加熱した場合の因子ＸIIIの安定性
因子ＸIII含有溶液は実施例３、変形Ｃに従い製造した。比活性は２１Ｕ因子ＸIII/mg(タンパク質)に達した。溶液を分割し、一部を１％(w/v)のTween80（登録商標）と混合した。両溶液を６０℃で６時間加熱した。６時間の加熱後に、因子ＸIII残存活性はテンシドの添加なしで８２％、テンシドを添加した場合には８４％に達した(方法２に従い測定)。
【００５４】
実施例５
異なる濃度の様々なテンシドと共に実施例４を繰り返した(加熱：６０℃、４時間)。
【表３】
0003692153.tif 000004
実施例４および５は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性イオン性テンシドの存在下でもいかなる問題も伴わず、因子ＸIII活性の大きな損失を受けることなく本発明の方法を行うことができることを示している。
以下の実施例６および７は本発明による方法の効果を示す。
【００５５】
実施例６  変性化フィブリノーゲンの存在または不在下での本発明の方法によるモデルウイルスの不活性化
実施例１による因子ＸIII含有分画のサンプルについて、Ａ）熱沈殿およびフィブリノーゲンの分離前に、またはＢ）熱沈殿分離後の沈殿物をシンドビス、ワクシニア、ポリオまたは水疱性口内炎(ＶＳ)ウイルスの１０容量％の懸濁物と混合して６０℃で加熱し、ウイルス力価を異なる加熱時間の後に測定し、６０分の加熱時間に基づいて低下係数(Ｒ)を算出した。変形Ａ)においては、ウイルス力価測定を加熱中に形成した熱沈殿上清由来のＢ)と同様に行った。
結果を表４に挙げる。
【表４】
0003692153.tif 000005
結果は、最もこれに類似している既知の方法、すなわち安定化物質の存在下での低温殺菌と比較したときに本法の優れた効力を示す。
この既知の方法の効力は、例えば、R.MaulerおよびJ.Hilfenaus[Arzneim.Forsch./Drug Res. 34, 1524-1527 (1984), Table 2, p.1526]より知られている。
【００５６】
ポリオおよびワクシニアウイルスに対する各低下係数(６０℃、１時間)を計算し、その後にウイルス力価の１０5の低下が発生する(Ｒ＝５)加熱時間(６０℃)を決定した(グラフ内挿法により)場合に、結果として以下の比較が得られる(表５)：
【表５】
0003692153.tif 000006
結果(表４)はさらに、ワクシニアウイルスの例により、沈殿した変性化タンパク質を除去することは都合がよいことを示している。
【００５７】
実施例７  テンシド存在下または不在下の本発明の方法によるモデルウイルス(シンドビス)の不活性化
実施例３、変形Ｃに従った因子ＸIII含有溶液を分割し、一部を０.３％(w/v)Ｎ-オクチルグルコシドと混合した。
両溶液を６０℃で加熱し、１０容量％のシンドビスウイルス懸濁物と混合し(ウイルス不活性化反応の開始)、さらに６０℃でインキュベートした。一定の時間間隔で、サンプルを採取し、ウイルス力価を測定した。
結果を以下の表６に挙げる。
【表６】
0003692153.tif 000007
本実施例は、本発明の方法がテンシドの存在下で行われた場合に一層有効であることを示す：
さらに迅速で一層広範囲なウイルス不活性化が、因子ＸIII活性の大きな損失を受けることなく達成される(実施例５を参照)。