(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式  （Ｉ）
0003728627.tif 000008
［式中、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が水素原子を示し、Ｒ1、Ｒ6およびＲ7が水素原子またはメトキシ基を示す。Ｒ2は、
−Ｒが水素またはＣ1-7アルキルもしくはＣ2-7アルケニル基またはフェニル基を示すＯＲ基、あるいは
−Ｃ1-7アルキル、Ｃ2-7アルケニルまたはＣ2-7エポキシアルキル基、
−フェニル基、フェノール、メチレンジオキシフェニルまたはジメトキシフェニル基、あるいは
−以下の置換基：Ｃ1-4アルキルまたはＣ2-4アルケニル基；フェニル、フェノール、ジメチルフェニル、ジメトキシフェニルまたはメチレンジオキシフェニル基；あるいはＲ’が水素またはＣ1-4アルキルまたはＣ2-4アルケニル基を示すＯＲ’基；あるいはＲ”が水素またはＣ1-4アルキルまたはＣ2-4アルケニル基を示すＮＨＲ”基；およびアミド基の少なくとも１つを有するＣ1-7アルキル、Ｃ2-7アルケニルまたはＣ2-7エポキシアルキル基
を示すか、あるいは、
−Ｒ2およびＲ3はこれらが結合してフラン環を形成する。］で表される置換キノリンおよび該キノリンの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種を活性成分として含む、抗リーシュマニア症治療用医薬組成物。
【請求項２】
置換キノリンが、Ｒ2が下記の置換基の少なくとも１つを有するエチル、エチレンまたはエポキシエチル基を示す置換キノリンである請求項１に記載の抗リーシュマニア症治療用医薬組成物：
−Ｃ1-4アルキルまたはＣ2-4アルケニル基、あるいは
−Ｒ’が水素またはＣ1-4アルキルまたはＣ2-4アルケニル基を示すＯＲ’基、
−フェニル、フェノール、ジメチルフェニル、ジメトキシフェニルまたはメチレンジオキシフェニル基、
−アミドまたはアミン基。
【請求項３】
置換キノリンが、−Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が水素原子であり；
−Ｒ1がメトキシ基であり；
−Ｒ2がプロピル基である、
置換キノリンである請求項１に記載の抗リーシュマニア症治療用医薬組成物。
【請求項４】
置換キノリンが、−Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が水素原子であり；
−Ｒ2がトランス−エポキシプロピル基である、
置換キノリンである請求項１に記載の抗リーシュマニア症治療用医薬組成物。
【請求項５】
置換キノリンが、−Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が水素原子であり；
−Ｒ2がプロピル基である、
置換キノリンである請求項１に記載の抗リーシュマニア症治療用医薬組成物。
【請求項６】
置換キノリンが、−Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が水素原子であり；
−Ｒ2がプロペニル基である、
置換キノリンである請求項１に記載の抗リーシュマニア症治療用医薬組成物。
【請求項７】
経口投与に使用される請求項１〜６のいずれかに記載のリーシュマニア症治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、リーシュマニア症治療のための２−置換キノリン類に関する。
リーシュマニア症という用語は、リーシュマニア属のもとに共に分類されるトリパノソーマ科（Trypanosomatidae）の動物性鞭毛虫類（zooflagellates）によって引き起こされる寄生状態を包含する。
リーシュマニア属原生動物は、細網内皮系に寄生し、皮膚、粘膜皮膚または内臓の症状発現を引き起こす。
今日までのところ、リーシュマニア症に対して採用されている治療では、アンチモン塩類、特にＮ−メチル−グルカミンアンチモネート（グルカンチム（Glucantime）（商標））を本質的に使用し、特に内臓リーシュマニア症の治療には１，５−ビス（４−アミジノ−フェノキシ）ペンタン（ペンタミジン（pentamidine））塩類も使用される。アンホテリシンＢも、他の治療に対して耐性を示す重篤な形態において使用される。これら治療は、毒性製品を使用するという欠点を有し、それらは非経口的に投与されねばならず、かなりの副作用を示すために、使用には不都合であり、よってそれらの使用を高価なものとせしめ、それらの使用は病院施設のないところでは実質的に不可能であり、この結果、リーシュマニア症に侵されている地域の住民の大多数にとって、経済的に高価で手が出せないものとなっている。
現在使用されているものよりも使用が簡便な抗リーシュマニア剤を得ることを目的とする、多くの研究が為されてきた。この目的のために、抗感染活性が既に知られている種々の製品について、リーシュマニア症に対するそれらの生物学的作用が評価された。これらには例えば、抗真菌剤、特にケトコナゾール（ketoconazole）およびその誘導体、またはリファンピシンのような抗生物質が含まれる。
抗寄生虫剤、特に抗マラリア剤も試験された：例えば、プリマキン（primaquine）［ハンソン（HANSON）ら、Int．J．Parasitol.，７ 443-447，（1977）；ビバリッジ（BEVERIDGE）ら、Trans．R．Soc．Trop．Med．Hyg.，74，43-51，（1980）］または後者の誘導体［シェティ（SHETTY）ら、J．Med．Chem．21，995-998，（1978）］、および他の８−アミノキノリン誘導体、例えばレピジン類（lepidines）［キナモン（KINNAMON）ら、Am．J．Trop．Med．Hyg.，27, 751-757，（1977）］を挙げることができる；これらの種々の化合物は、インビトロでより大きな、またはより小さな抗リーシュマニア活性を示し、それらの幾つかは、非経口的に投与されたときインビボでの有意な活性も有する。キニンおよびクロロキンも試験されたが、インビトロでは弱い活性しか示さず、インビボでは不活性であった［マトック（MATTOCK）およびピーターズ（PETERS）、Ann．Trop．Med．Parasitol.，69，359-371（1975）；ピーターズら、Ann．Trop．Med．Parasitol.，74，289-298（1980）；ピーターズら、Ann．Trap．Med．Parasitol.，74，321-335（1980）］。
最近、バウマン（BAUMANN）ら［Antimicrob．Agents Chemoter.，35，1403-1407，（1991）］は、ドノヴァンリーシュマニア（L．donovani）に対する、ポリアミン類縁体の、非経口経路および経口経路による、インビボでの有効性を示した。このポリアミン類縁体は、今日までのところ、経口経路により、その有意な活性が実証された唯一の製品である。
種々の植物ベースの治療もまた、リーシュマニア症が風土病である地域において、土着の住民により採用されている［フルネ（FOURNETT）ら、J．Ethnopharmacol.，24，337（1988）］。これらの植物は、一般に、その病変に対する、局所適用として使用されている。
この方法で使用される植物は、多少なりとも植物学的視点から同定されているが、それらの真の有効性に関するいかなる評価も、今日までのところ為されていない。
本発明者は、南アメリカのインディアン住民の伝統的薬物類で、リーシュマニア症治療に推奨されている種々の植物について研究を行った。こうして、本発明者は、ガリペア  ロンギフロラ  クラウゼ（Galipea longiflora Krause）の抽出物のリーシュマニアに対する有効な作用を立証した。
ガリペア  ロンギフロラ（Galipea longiflora）［クラウゼ（KRAUSE），Notizbl．K．Bot．Gart．Berlin、6，143，（1914）］は、ミカン科（Rutaceae）のガリペア（Galipea）属に属する。それは、ボリビアおよびブラジルとの境界領域のボリビア北東部にかけて存在する、高さが10から15メートルの灌木である。その新鮮な樹皮は、ペースト状に変えられて、ブラジルリーシュマニア（Leishmania braziliensis）によって引き起こされる皮膚病変の局所的治療のための湿布として、およびアメーバ赤痢の治療の煎剤として、その地方の伝統的医薬として使用されている。
ガリペア（Galipea）属の幾つかの種は、化学的研究に供されてきた。該種は、ガリペア  オフィシナリス  ハンコック（Galipea officinalis Hancock）［メスター（MESTER）、Fitoterapia，44，123，（1973）］、および最近ではガリペア  ブラクテアタ（Galipea bracteata）［ヴィエラ（VIERA）、およびルボ（LUBO）、Phytochem．29，813，（1990）］およびガリペア  ロンギフロラ（Galipea longiflora）［フルネ（FOURNET）ら、Can．J．Chem.，67，2116（1989）］である。これらの研究は、キノリンアルカロイドを含む、これらの植物の多数の構成成分を明らかにすることを可能にしたが、これら構成成分のどれも、抗リーシュマニア活性を有するとの記載はない。
にもかかわらず、本発明者は、抗リーシュマニア活性の原因となる物質を同定することを目的として、ガリペア  ロンギフロラ（Galipea longiflora）の研究を続行した。
本発明者の研究は、種々のキノリンアルカロイドを明らかにし、そのうちの幾つかは、参照化合物としてのＮ−メチルグルカミンアンチモネートと同等の、またはより優れた抗リーシュマニア活性を発揮する。
本発明の主題は、下記の一般式（Ｉ）
0003728627.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、それぞれ独立に、水素原子、直鎖状または分岐状のＣ1〜Ｃ7アルキル、アルケニル、エポキシアルキルまたは一価もしくは多価のアルコール基、アミン基またはアミド基、Ｒが水素またはＣ1-7アルキルもしくはアルケニル基またはフェニル基を示すＯＲ基を示し、Ｒ2は、
−Ｒが上記と同一の意味を有するＯＲ基、あるいは
−Ｃ1〜Ｃ7アルキル、アルケニルまたはエポキシアルキル基、
−フェニル基、フェノール、メチレンジオキシフェニルまたはジメトキシフェニル基、あるいは
−以下の置換基：Ｃ1-4アルキルまたはアルケニル基；フェニル、フェノール、ジメチルフェニル、ジメトキシフェニルまたはメチレンジオキシフェニル基；あるいはＲ′が水素またはＣ1-4アルキルまたはアルケニル基を示すＯＲ′基；あるいはＲ”が水素またはＣ1-4アルキルまたはアルケニル基を示すＮＨＲ”基；またはアミド基の少なくとも１つを有するＣ1-7アルキル、アルケニルまたはエポキシアルキル基
を示すか、あるいは、
−Ｒ2およびＲ3は共にフラン環を形成する。］で表される、医薬品として使用される置換されたキノリン類および該キノリン類の塩および該キノリン類の誘導体である。
本発明の好ましい実施態様によると、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は水素原子を示し、Ｒ1、Ｒ6およびＲ7は水素原子またはメトキシ基を示す。
本発明の他の好ましい実施態様によると、Ｒ2は以下の置換基の少なくとも１つを有するエチル、エチレンまたはエポキシエチル基である：
−Ｃ1-4アルキルまたはアルケニル基、あるいは
−Ｒ′が水素あるいはＣ1-4アルキルまたはアルケニル基を示すＯＲ′基、
−フェニル、フェノール、ジメチルフェニル、ジメトキシフェニルまたはメチレンジオキシフェニル基、
−アミドまたはアミン基。
該キノリン類は、ガリペア（Galipea）属の植物から抽出され得る。それらはまた、それ自体公知のあらゆる方法、例えばイシクラ（ISHIKURA）ら［Heterocycles，23，2375（1985）］により記載されている、化学合成によって得ることもできる。
本発明は、医薬品として使用するための、新規な２−置換キノリン類、およびそれ自体公知であるが、治療的性質、特に抗リーシュマニア特性が既知でもなく示唆されてもいない２−置換キノリン類の両方を、包含する。
好ましいキノリン類は、３個の炭素原子を含有する飽和または不飽和の置換または非置換鎖で２−置換されているものであり；この関係において、本発明は、新規な、特にキマニンＡ（chimanine A）と名付けられた４−メトキシ−２−ｎ−プロピルキノリン、キマニンＤ（chimanine D）と名付けられた２−（１′，２′−トランス−エポキシプロピル）キノリン、並びに既知［ヴィエイラ（VIEIRA）およびクボ（KUBO）；イシクラ（ISHIKURA）ら、上述の文献］であるが、その抗リーシュマニア特性が知られていなかった２−ｎ−プロピルキノリンおよび２−プロペニルキノリンに関する。
本発明の抗リーシュマニア性キノリン類は、皮膚および粘膜皮膚リーシュマニア症の原因となるリーシュマニア（例えば、リーシュマニア  アマゾネンシス（Leishmania amazonensis）、リーシュマニア  ヴェネズエレンシス（Leishmania venezuelensis）など）、および内臓リーシュマニア症の原因となるリーシュマニア（ドノブァンリーシュマニア（Leishmania donovani）、リーシュマニア  インファントゥム（Leishmania infantum））の両方に対して活性を有し；それらは、ヒトの医薬または獣医学用医薬に使用でき；それらは更に経口経路で活性である。
本発明の主題は更に、リーシュマニア症の治療のための医薬組成物であり、それは上述のキノリン類の少なくとも１つを有効成分として含有する。
本発明の好ましい実施態様によると、該医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。
本発明のより良い理解は、下記に示される追加的な記載から得られ、それは、本発明のキノリン類の製造およびそれらの抗リーシュマニア活性の立証の実施例に関する。
しかしながら、これらの実施例が、本発明の主題を例示するのみであって、いかなる意味においても制限を加えるものではないことは、明らかである。
実施例１−  ガリペア  ロンギフロラ（Galipea longiflora）からの抗リーシュマニア性キノリン類の獲得
キノリン類は、ガリペア  ロンギフロラ（Galipea longiflora）の種々の器官（葉、根および幹樹皮）を、乾燥してすり潰し、石油エーテルで抽出後にクロロホルムで抽出して得られ、シリカＨ（MERCK社）のカラムでのクロマトグラフィ（80:20のヘキサン／酢酸エチル混合物で溶出）により精製した。
抽出された、リーシュマニアに対するインビトロでの活性を有する種々のアルカロイドの、それぞれの化学名は、以下の通りである。
アルカロイドＩ：２−フェニルキノリン
アルカロイドＩＩ：２−ｎ−ペンチルキノリン
アルカロイドＩＩＩ：２−ｎ−プロピルキノリン
アルカロイドＩＶ：４−メトキシ−２−フェニルキノリン
アルカロイドＶ：２−（３′，４′−メチレンジオキシフェネチル）−キノリン
アルカロイドＶＩ：４−メトキシ−２−ｎ−ペンチルキノリン
アルカロイドＶＩＩ：４−メトキシ−２−ｎ−プロピルキノリンまたはキマニンＡ（chimanine A）
アルカロイドＶＩＩＩ：４−メトキシ−２−（３′，４′−メチレンジオキシフェネチル）キノリンまたはクスパリン（cusparine）
アルカロイドＩＸ：２−（３′，４′−ジメトキシフェネチル）キノリン
アルカロイドＸ：４，７，８−トリメトキシ−（２，３−フロ）キノリンまたはスキムミアニン（skimmianine）
アルカロイドＸＩ：２−プロペニルキノリンまたはキマニンＢ（chimanine B）
アルカロイドＸＩＩ：２−（１′，２′−トランス−エポキシプロピル）キノリンまたはキマニンＤ（chimanine D）
アルカロイドＸＩＩＩ：４−メトキシ−２−プロペニルキノリンまたはキマニンＣ（chimanine C）。
Ｉ  −  ２−置換キノリン類の合成
実施例２−  ２−メチルキノリンからの２−（ヒドロキシプロピル）キノリンおよび２−プロペニルキノリンの製造
１）２−（ヒドロキシプロピル）キノリンの製造
1.6Mのヘキサン中ｎ−ブチルリチウム110ml（＞0.16モル）を、無水エーテル100mlと共に、窒素下に三首フラスコに導入し、０℃まで冷却する。２−メチル−キノリン21.65ml（0.16モル）を、滴下漏斗を用いて攪拌しながら滴下する。溶液を室温で20分間攪拌し、−３０℃まで冷却し、漏斗を介してアセトアルデヒド13.54ml（0.24モル）を加える。該漏斗を無水エーテル30mlで洗浄し、溶液を０℃にまで戻す。
３時間後、反応はもはや進行せず、混合物を、飽和塩化アンモニウム溶液で加水分解する。生成物を、エーテルで３回、抽出する。有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に蒸発させる。得られる残渣を、シリカカラム（ヘプタン／酢酸エチル、4:6）でのクロマトグラフィに供し、２−（ヒドロキシプロピル）キノリン7.5gおよび出発キノリン14.1gを得る（収率＝25%）。
２）２−プロペニルキノリンの製造
２−プロペニルキノリンは、無水酢酸の存在下に酢酸中で脱水することにより、２−（ヒドロキシプロピル）キノリンから得られる。
コンデンサーおよび塩化カルシウムのガードチューブを備えた丸底フラスコ中で、468mgの２−（ヒドロキシプロピル）キノリンを、0.5ml（5ミリモル）の無水酢酸と0.5ml（8.3ミリモル）の氷酢酸との混合物中に溶解する。
溶液を、スチーム浴上で45分間、攪拌する。少量の水と炭酸ナトリウムを添加して、次に混合物を1Mの水酸化ナトリウム溶液で中和する。水相を、エーテルで３回、抽出する。有機相を乾燥し、次に減圧下に留去することによって乾燥させる。得られた残渣を、シリカでクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／ジクロロメタン、20:4:76）に供し、250mgの２−プロペニルキノリンを得る（収率＝54%）。
実施例３−  ２−（２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）キノリンおよび２−スチリルキノリンの製造
使用される方法は、スキッドモア（SKIDMORE）およびティッド（TIDD）の方法である［The Quinoline series，PartＩ、1641-1645，（1959）］。5.3mlの２−メチルキノリン（0.039モル）および3.56mlのベンズアルデヒド（0.035モル）を、少量の安息香酸と混合する。混合物を、室温で攪拌し、次に生成物を数週間放置して結晶化する。溶液を、焼結ガラスで濾過し、フィルターを冷却エタノールで洗浄する。焼結ガラス上に残った結晶を、エタノール中で再結晶化させ、次に加熱デシケーター中に置く。こうして、1.53gの２−（２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）キノリンが得られる（収率＝24%）。濾液を合せて、そこから溶媒を留去させ、次に生成物をシリカカラムにかける。3.66gの２−メチルキノリンおよび1.9gの２−スチリルキノリンが得られる（収率＝18%）。69%の出発２−メチルキノリンが、回収される。
より多い量の２−スチリルキノリンが、２−（２−ヒドロキシ−２−フェニル−エチル）キノリンの脱水をパラトルエンスルホン酸を触媒として行い、共沸蒸留により水を除去することによって、得られる。
実施例４−  ２−（１′，２′−トランス−エポキシプロピル）キノリンの製造
0.42gのＮ−ブロモスクシンイミド（2.35ミリモル）を、12mlのジオキサンおよび5mlの水中に溶解させた330mgの２−プロペニルキノリン（1.96ミリモル）の溶液に、少量ずつ加える。９時間、室温で攪拌後、反応混合物を水に注ぎ、エーテルで抽出する。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、エーテルを留去する。
このようにして得られた、２つの中間体位置異性体に、10mlのイソロパノールおよび数滴のフェノールフタレインを加え、混合物を1Mの水酸化ナトリウム溶液で滴定する。その後、溶液を、10mlの水で希釈し、沈殿が形成されるので、これをエーテルで３回抽出する。エーテル相を硫酸ナトリウム上を通過させ、溶媒を留去した後に得られる残渣を、シリカカラムにかける（ヘキサン／酢酸エチル、9：1）。160mgの２−（１′，２′−トランス−エポキシプロピル）キノリン（ラセミ混合物、収率＝44%）および80mgの２−（ジブロモ−プロピル）キノリン（収率＝22%）を得る。
実施例５−  ２−スチリル−キノリンからの２−（１′，２′−トランス−エポキシフェネチル）キノリンの製造
ジオキサン３８ｍｌ及び水１６ｍｌ中、２−スチリルキノリン１．０４ｇ（４．５ミリモル）、Ｎ−ブロモスクシンイミド０．９６ｇ（５．４ミリモル）を使用し、実施例４と同様の操作を行う。シリカ（ヘキサン／酢酸エチル、８：２）によるクロマトグラフィー後、１−フェニル−１−ブロモ−２−（２−キノリル）エタノール７９０ｍｇ（５４％）及び２−（１，２−ジブロモ−フェネチル）キノリン７０ｍｇ（４％）を得る。
１−フェニル−１−ブロモ−２−（２−キノリル）エタノール６４０ｍｇ（２．４２ミリモル）を第２処理に供する。シリカカラム（ヘキサン／酢酸エチル、８：２）による精製後、２−（１′，２′−トランス−エポキシフェネチル）キノリン５１０ｍｇを得る。
II−  本発明のキノリンアルカロイド類の生物学的活性
実施例６−  インビトロでの生物学的活性
生物学的試験を、ブラジルリーシュマニア（Leishmania braziliensis）（Ｍ２９０３株又はＭ２９０４株）、リーシュマニア  アマゾネンシス（Leishmania amazonensis）（ＰＨ８株又はＨ１４２株）及び、ドノヴァンリーシュマニア（Leishmania donovani）（Ｍ２６８２株）のプロマスティゴート（promastigotes）並びにクルーズ  トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）（チュラフエン（Tulahuen）株、Ｃ  ８ＣＬ１及びテフエンテペック（Tehuentepec））のエピマスティゴート（epimastigotes）について行った。
ａ）プロマスティゴート期のリーシュマニアのインビトロでの培養
リーシュマニアｓｓｐの種々の株のプロマスティゴート型を、２５ｍｌ“コーニング（Corning）”タイプ培養皿又は培養チューブで、連続継代培養（successive subculturings；株に応じて７日から１５日毎）によって、インビトロでの培養で維持する。
寄生虫のより良い成育を得るため、液状ＮＮＮ培養培地（Novy,Mac Neal,Nicoll）２ｍｌを皿に添加し、次いで、一皿当り約400,000寄生虫に相当する、約８×１０6寄生虫／ｍｌを含む培養培地５０μｌを添加する。この接種物を、プロマスティゴートの存在が顕微鏡下で観察されたチューブへと移す。これらの寄生虫は、大部分、幼若形態（young forms）である。それらを、２８℃のインキュベーター中に４８時間放置し、再びＮＮＮ培地２ｍｌを加える。
ｂ）エピマスティゴート期のクルーズ  トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）のインビトロでの培養
クルーズ  トリパノソーマの種々の株のエピマスティゴート型は、２５−ｍｌ“コーニング（Corning）”培養皿又は培養チューブで、ほぼ毎週、連続継代培養によって、インビトロでの培養で維持する。
寄生虫を、５６℃で３０分間、不活化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）１％並びにストレプトマイシン０．２５ｍｇ／ｍｌ及びペニシリン２５０Ｕ／ｍｌを含む抗生物質溶液を補捉した、ｐＨ７．２の完全ＬＩＴ液状培地（イェガーズ  リバー  インヒュージョン  トリプトーズ；Yager's Liver Infusion Tryptose）で培養する。
ｃ）インビトロでの生物学的試験
生物学的試験は、滅菌した“リンブロ（Limbro）”又は“ファルコン（Falcon）”タイプの９６平底ウェル（96-flat-bottomed-well）蓋付きマイクロプレートで行う。各ウェルの容量は、約０．３５ｍｌである。
試験される植物抽出物又は精製アルカロイド類の溶解に用いられる溶媒は、一般に、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）である。植物抽出物又はアルカロイド類の試験に取りかかる前に、ＤＭＳＯの細胞毒性を評価した。この溶媒を、０．５％を越えない濃度で使用すると、寄生虫の成育に影響がないことは、明らかである。
植物抽出物又は精製キノリン２ｍｇを、撹拌しながら（Vortex）、ＤＭＳＯ４０μｌに溶解する。この調製物に、所望の濃度を得るために、必要量のＮＮＮ培地（又は、クルーズ  トリパノソーマ（T．cruzi）の場合には、代わりにＬＩＴ培地）を加える。それぞれの精製段階後の抽出物の活性を確かめるための試験を、植物抽出物の１００μｇ・ｍｌ-1の最終濃度で行う。
抽出物が、１００μｇ・ｍｌ-1の濃度で活性である場合は、寄生虫を完全に阻害する最小投与量は、必要に応じて、５０μｇ、２５μｇ、５μｇ及び１μｇ・ｍｌ-1の濃度の溶液を調製することにより決定する
寄生虫を、指数増殖期にとる。寄生虫のカウントは、一般に接種物を１０倍に希釈して行う。寄生虫を含む溶液の一部をサンプルにとり、トーマ細胞（Thome cell）を用いてカウントする。
このカウント後、マイクロピペットを用いて、寄生虫濃度をｍｌ当り１０6寄生虫数に調整し、寄生虫１００μｌ、即ち、100,000寄生虫に相当する量をマイクロプレートの各ウェル（well）に入れる。次いで、２００μｇ・ｍｌ-1の濃度の植物抽出物を含む培養培地を同量（１００μｌ）加える。それぞれの植物抽出物を、それぞれの寄生虫の株につき、各濃度で３回試験する。寄生虫のみを含むコントロールのウェルには、体積を２００μｌにするため、寄生虫を含まない培地１００μｌを加える。溶媒による影響の可能性をチェックするため、寄生虫のみを含むウェルも、植物抽出物を溶解するのに使用したのと同量（４０μｌ）のＤＭＳＯを含む培養培地で調製する。
プレートは、汚染を避けるため、予め炎に当てた蓋で封じ、実験の要件に従って、２８℃で４８時間又は７２時間インキュベーター中に置く。インキュベーターでのこの貯蔵後、プレートを倒立顕微鏡下で調べる。各ウェルを観察し、コントロールの培養ウェルと比較する。
植物抽出物との接触より４８時間又は７２時間後、生じた変化を、顕微鏡下に観察し、寄生虫の完全な溶解（complete lysis）を生じる濃度を記録する。
ｄ）結果
アルカロイド類Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸは、１００μｇ／ｍｌの濃度で、寄生虫（リーシュマニア及びトリパノソーマ）の完全溶解（complete lysis）を引き起こす。アルカロイド類ＩＩＩ、ＩＶ及びＸＩＩは、５０μｇ／ｍｌの投与量で、同じ作用を有し、アルカロイドＸＩは、２５μｇ／ｍｌの投与量で、同じ作用を有する。
実施例７−  Ｌ．アマゾネンシス（L．amazonensis）及びＬ．ヴェネズエレンシス（L．venezuelensis）に対する本発明のアルカロイド類のインビボでの活性
生成物の毒性の測定（ＬＤ50）
マウスについて試験を行う前に、キノリン類の毒性の程度を測定した。
選ばれた方法は、単一投与（single dose）による５０％致死量（ＬＤ50）の測定である。ＬＤ50は、特定の条件下で、単一の動物種において、実験に供される動物の半数を殺すことができる投与量に相当する。投与量の対数の関数として死亡率を表わすカーブは、ＬＤ50を挟む２つの投与量間で直線であると仮定されるので、後者は、次のような内挿により、計算される。
0003728627.tif 000003
Ｂ＝ＬＤ50より直ぐ下の投与量
Ｎ＝投与量Ｂにより引き起こされる死亡率（１に対する小数として表わされるパーセンテージ）
Ｍ＝ＬＤ50より直ぐ上の投与量により引き起こされる死亡率（１の小数として表わされるパーセンテージ）
γ＝数列の公比。
次の作業条件が選ばれた：
−実験動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、
−生成物の濃度当りの動物の数：同性、同体重及び同齢の６匹のマウス、
−ｍｇ・ｋｇ-1での実験投与量：４００、２００、１００、５０、２５、１２．５（数列の公比２）、
−生成物の接種経路：腹腔内、
−ＬＤ50の計算：０時間並びに２４ｈ、４８ｈ及び７２ｈ後。
試験された全てのキノリン類は、生成物の接種より７２ｈ後、４００ｍｇ／ｋｇを超えるＬＤ50を有する。残りの実験には、１００ｍｇ／ｋｇの投与量を使用した。
１．実験プロトコール
それぞれの実験群は、同性、同体重及び同齢の１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから成る。それぞれの実験では、幾つかの実験群を形成する：
−いかなる処理も受けない寄生虫コントロール群（Ｃｏｎ．）
−処理全体を通してＰＢＳ溶液を与えられる寄生虫コントロール群（Ｃｏｎ．＋ＰＢＳ）、培地は寄生虫を含む
−２００ｍｇ・ｋｇ-1をベースに、参照医薬品であるＮ−メチルグルカミンアンチモネート又はグルカンチム（Glucantime、商標、スペシアフランス（Specia France）から市販）の処理を受ける群
−濃度１００ｍｇ／ｋｇの、ガリペア  ロンギフロラ（Galipea longiflora）から単離された又は実施例１〜４のいずれかに記載されている合成法によって得られたキノリン類で処理されるマウスの群。
２．マウス
実験動物は、体重１８−２４ｇの約８週齢の雄性又は雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスである。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、リーシュマニアｓｐｐ及びクルーズ  トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）に対する、それらの感受性が大きいことを考慮して選ばれた。
３．寄生虫の維持
最初に、体重１２０−１３０ｇのハムスター（チャールズ  リバース、米国）の後足（hind feet）の背側に、株ＩＦＬＡ／ＢＲ／６７／ＰＨ８又はＭＨＯＭ／ＧＦ／８４／ＣＡＹ  Ｈ−１４２又はＬ．ヴェネズエレンシス（L．venezuelensis）（参照、ＭＨＯＭ／ＶＥ／７４／ＰＭ−Ｈ３）のプロマスティゴートの皮下接種により、Ｌ．アマゾネンシス（L．amazonensis）の無べん毛型（amastigote forms）を得た。８〜１２週間後、株のビルレンス（virulence）に応じて、肉芽種が現れる。
残りの実験では、ハムスターを、肉芽腫中で回収される無べん毛型で感染させる。この方法により、肉芽腫は、より急速に成長する。
４．寄生虫の調製及び感染
無べん毛型を得るために、十分なサイズの非潰瘍化（non-ulcerated）肉芽腫を示すハムスターが選ばれる。その動物を、クロロホルムで殺す。寄生虫を感染させた後足を、アルコールヨードチンキ（alcoholic iodine tincture）で洗浄し、次いで、７０°エタノールで洗浄する。滅菌した鉗子及び滅菌したメスを用い、肉芽腫を切除する。次に、肉芽腫を、滅菌した砂及び０．９％塩化ナトリウム５ｍｌを含む乳鉢で細切化する。その全体を乳棒を用いてホモジネートし、懸濁液をピペットで回収し、４℃で１０分間、２０００ｒｐｍで遠心分離する。寄生虫及び細胞の破砕物を含む上澄み層、砂及び肉芽腫の大型破砕物の沈底層、並びに寄生虫及び赤血球からなる中間層、の三層が得られる。この中間層を取り出してチューブに入れ、０．９％塩化ナトリウムで洗い、再び遠心分離して、寄生虫から赤血球を分離する。これは白い層の状態をとる。
該寄生虫を、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）１０％、Ｌ−グルタミン２％及び抗生物質１％を有するＭＥＭ（最小必須培地（minimum essential medium））栄養培地中にとる。それらを希釈し、トーマ細胞（Thoma cell）を用いて数える。一つの肉芽腫から、約１０8の寄生虫が得られる。濃度を、ｍｌ当り１０6寄生虫に調整する。このようにして得られた寄生虫を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを感染させ、植物から単離された生成物のインビボでの生物学的試験を行うために使用する。この寄生虫の分離技術は、本実験で使用される全てのリーシュマニア株に対して同じである［Ｌ．アマゾネンシス（L．amazonensis）ＰＨ８及びＨ−１４２）及びＬ．ヴェネズエレンシス（L．venezuelensis）（Ｈ−３）、ボンファンテ−ガリド（Bonfante-Garrido）、１９８３）］。
５．リーシュマニア  アマゾネンシス（L．amazonensis）及びＬ．ヴェネズエレンシス（L．venezuelensis）での感染。
マウスは、右後足の腹側肉趾（ventral pad）において皮下的に、リーシュマニア  ヴェネズエレンシス（L．venezuelensis）の、参照株ＩＦＬＡ／ＢＲ／６７／ＰＨ８又はＭＨＯＭ／ＧＦ／８４  ＣＡＹ  Ｈ  １４２の、或いは、バークィジメト、ヴェネズエラ（Barquisimeto,Venezuela）（宿主：人間）に由来するリーシュマニア  ヴェネズエレンシス（L．venezuelensis）（参照  ＭＨＯＭ／ＶＥ／７４／ＰＭ−Ｈ３）の無べん毛型で感染させ、左足はコントロールとする。
接種される無べん毛型の量は、リーシュマニア  アマゾネンシス（L．amazonensis）（ＰＨ  ８）及びリーシュマニア  ヴェネズエレンシス（Ｈ−３）株については、ＰＢＳ０．２ｍｌ中１０6であり、リーシュマニア  アマゾネンシス（L．amazonensis）（Ｈ−１４２）株については、無べん毛型の量は、同量のＰＢＳ中３×１０6である。この寄生虫濃度は、種々の寄生虫濃度でのテストにより予め決定した。
６．活性成分による処理
処理を、リーシュマニアｓｐｐの無べん毛型の接種より２４時間後に開始し、連続１４日間続ける。
Ｎ−メチルグルカミンアンチモネートを、蒸留水に溶解し、２００μｌ中２００ｍｇ・ｋｇ-1の用量で注射する。ＰＢＳ培地で補足したポリソルベート（トゥイーン８０（Tween 80）、プロラボ（Prolabo））４０ｍｌ中に供試用キノリン類を溶解して、所望の濃度を得る。得られた溶液２００μｌを、次に背部皮下に接種する。生成物の濃度は、その毒性に依存する。生成物の注射中、ほとんど問題は起こらなかった。処理された全てのマウスにおいて、注射部位で、局所的な炎症が観察されたが、処理を中止すると一般に消失する。
感染した足における、医薬生成物の局所的接種の試験も行なわれた。マウスは、上記の方法で感染させられるが、処理は、寄生虫に感染された後足の足底肉趾（plantar pad）への一回の注射により、寄生虫感染から１４日後に行う。
これら局所的接種試験では、投与される医薬生成物の濃度を２倍にまで倍増する。医薬生成物は、全身的処理の場合と同様の方法で調製する。
７．検討されるパラメーター
寄生虫の接種より４８時間前に最初の測定を始め、１／１０ｍｍ目盛りのマイクロメーターを用いて、感染された足及びコントロールの足の病巣（lesion）の直径を、毎週８週間にわたって測定する。２つの測定間の差を計算して、病巣の厚さ、即ちリーシュマニア指数（leishmanian index）（Ｌ．Ｉ．）を得る。
結果は、リーシュマニア指数の相加平均の計算、及び次式で計算される５％に等しい危険度（risk）αでの、実測平均の信頼区間の計算により表わされる：
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ｘ＝２．２３［危険度α＝５％でｎ（マウスの数）＝１０の場合］
ｘ＝２．４５［危険度α＝５％でｎ＝６の場合］
ｓ＝実測平均
ｎ＝実験群当りの動物の数（１０）。
生成物で処理されたマウスの病巣の平均直径が、Ｎ−メチルグルカミンアンチモネート（グルカンチム（Glucantime）（商標））で処理されたマウスの病巣の平均直径と等しいか又はそれより小さい時は、当該生成物は活性があると考えられる。
Ｌ．アマゾネンシス（L．amazonensis）で感染されたＢＡＬＢ／ｃマウスについて得られた結果を、図１〜４に示す。
図１（ａ）は、１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量での全身的処理における、アルカロイドＩＩＩ（２−ｎ−プロピルキノリン）の作用（■）を、１４日間連続の２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのグルカンチムの作用（◆）と比較して示す（感染より２４ｈ後に処理開始）；□＝コントロール。
図１（ｂ）は、２０ｍｇ／ｋｇの用量での、局所的処理（一回の注射を感染から１４日後、感染した足において）におけるアルカロイドＩＩＩの作用（■）を、同じ条件下での処理によるグルカンチム（商標）４００ｍｇ／ｋｇの作用（◆）と比較して示す；□＝コントロール。
図２は、アルカロイドＶＩＩ（４−メトキシ−２−ｎ−プロピニルキノリン又はキマニンＡ（chimanine A））の作用を示す。
図３（ａ）及び３（ｂ）は、それぞれ、１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量での全身的処理における、アルカロイドＸＩ（２−ｎ−プロペニルキノリン又はキマニンＢ（chimanine B）の作用（■）と、１４日間連続の２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのグルカンチムの作用（◆）との比較（感染より２４ｈ後に処理開始）；□＝コントロール；及び２００ｍｇ／ｋｇの用量での局所的処理（一回の注射、感染から１４日後、感染した足において）（■）と、同じ条件下での処理によるグルカンチム（商標）４００ｍｇ／ｋｇの作用（◆）との比較を示す。
図IVは、１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量での全身的処理における、アルカロイドＸＩＩ（キマニンＤ（chimanine D）又は２−（１′，２′−トランス−エポキシプロピル）キノリン）の作用（■）を、１４日間連続の２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのグルカンチム（商標）の作用（◆）と比較して示す（感染より２４ｈ後に処理開始）；□＝コントロール。
実施例８−  ドノヴァンリーシュマニアに感染されたマウスにおける本発明のアルカロイド類のインビボでの活性
１−実験プロトコール
各群のマウスは、同性、同体重及び同齢の１０匹のＢＡＢＬ／ｃマウスから成る。２つの異なるプロトコールが実行され、各実験について、数種の実験群が形成された；
ａ）腹腔内的処理
−非感染及び非処理コントロール群；
−感染及び非処理のマウスのコントロール群；
−２００ｍｇ／ｋｇに相当する、連続５日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇをベースとする、参照生成物Ｎ−メチルグルカミンアンチモネート又はグルカンチム（商標）の処理を受けるマウス群
−連続５日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度のキノリン類で処理されるマウス群。
ｂ）経口又は皮下的処理
−非感染及び非処理コントロール群；
−感染及び非処理のマウスのコントロール群；
−皮下的に連続５日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇをベースとする、参照生成物グルカンチム（商標）の処理を受けるマウス群；
−皮下的に連続１０日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇをベースとする、参照生成物グルカンチム（商標）の処理を受けるマウス群；
−皮下的に連続５日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度のキノリン類で処理されるマウス群；
−皮下的に連続１０日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度のキノリン類で処理されるマウス群；
−経口的に連続５日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度のキノリン類で処理されるマウス群；
−経口的に連続１０日間０．５４ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度のキノリン類で処理されるマウス群；
２−マウス
イッファ−クレド（Iffa-Credo）（フランス）から供給される体重１８ｇの雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス。
３−ドノヴァンリーシュマニアによる感染
マウスは、心臓内経路で、ドノヴァンリーシュマニア（L．donovani）（株ＬＶ／９）の無べん毛型（amastigotes）で感染される。この株は、ロンドン・スクール・オブ・ハイジーンのパラシトロジーラボラトリー（the Parasitology Laboratory of the London School of Hygiene）から供給される。無べん毛型は、ドノヴァンリーシュマニア（L．donovani）（ＬＶ９）で感染されたハムスターの肝臓から単離される。
接種される無べん毛型の量は、培地０．２ｍｌ中、２×１０7である。
４−活性成分による処理
処理を、寄生虫感染から１週間後に開始し、５日間又は１０日間続ける。
活性成分（グルカンチム（商標）及びキノリン類）は、実施例７に記載されたインビボでの試験と同じ条件下で溶解させる。実験の終りに、即ち、寄生虫感染より１４日後又は２１日後に、マウスを殺す。
５−検討されるパラメーター
下記のパラメーターが、考慮される：
−マウスの体重増加（初期重量及び剖検重量（autopsy weight））；
−肝臓の重量；
−脾臓の重量；
−細胞中の無べん毛型の数を、スライドへの肝臓の塗布に由来する１００個の細胞について、顕微鏡下でカウントし、その後、このスライドを、メイ−ギムザ（May-Giemsa）試薬で染色する；
−感染及び非処理のコントロールマウスに対する寄生虫血症（parasitemia）の減少率。
結果は、相加平均、分散（variance）、各パラメーターの標準偏差の計算及び肝臓の重量を考慮するシュタウバー（Stauber）の計算により表わされ、下記の表Ｉ、II及びIIIに記録されている。
表Ｉは、腹腔内投与でのグルカンチム（商標）と比較して、ドノヴァンリーシュマニア（Leishmania donovani）（ＬＶ／９）での感染から１週間後より、連続５日間ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与されたキノリン類の活性を示す。
表IIは、皮下的投与でのグルカンチム（商標）の活性と比較して、ドノヴァンリーシュマニア（Leishmania donovani）（ＬＶ／９）で感染されたＢＡＬＢ／ｃマウスに、５日間又は１０日間皮下投与されたキノリン類の活性を示す。
表IIIは、皮下投与されたグルカンチム（商標）の活性と比較して、ドノヴァンリーシュマニア（Leishmania donovani）（ＬＶ／９）で感染されたＢＡＬＢ／ｃマウスに、５日間又は１０日間経口投与された数種類のキノリン類の活性を示す。
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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