(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質：
（イ）作用：ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する酵母が菌体外に生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンのβ−１，３−Ｄ−マンノピラシド結合を特異的に加水分解し、最終的にβ−１，４−マンノビオースを生成する；
（ロ）基質特異性：β−１，３−；β−１，４−  マンナンに特異的に作用し、α−マンナン、コンニャクマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンに作用せず、β−マンノシダーゼ活性を持たない；
（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは５．０であり、３０℃、３０分の条件下ではｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である；
（ニ）温度に対する安定性：ｐＨ５．０、３０分の加熱条件下では４０℃まで安定である；
（ホ）作用温度の範囲：５０℃に至適作用温度を有する；
（ヘ）失活条件：６０℃、３０分の加熱条件下でｐＨ５．０で完全に失活する；
（ト）阻害および活性化：１ｍＭの塩化第二銅、塩化第二水銀により完全に阻害を受ける；
（チ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドおよび未変成ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量：いずれも５２，０００±１，０００；
を有するエンド−β−１，３−マンナナーゼ。
【請求項２】
下記理化学的性質：
（イ）作用：ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する酵母が菌体外に生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンのβ−１，３−Ｄ−マンノピラシド結合を特異的に加水分解し、最終的にβ−１，４−マンノビオースを生成する；
（ロ）基質特異性：β−１，３−；β−１，４−  マンナンに特異的に作用し、α−マンナン、コンニャクマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンに作用せず、β−マンノシダーゼ活性を持たない；
（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは５．０であり、３０℃、３０分の条件下ではｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である；
（ニ）温度に対する安定性：ｐＨ５．０、３０分の加熱条件下では４０℃まで安定である；
（ホ）作用温度の範囲：５０℃に至適作用温度を有する；
（ヘ）失活条件：６０℃、３０分の加熱条件下でｐＨ５．０で完全に失活する；
（ト）阻害および活性化：１ｍＭの塩化第二銅、塩化第二水銀により完全に阻害を受ける；
（チ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドおよび未変成ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量：いずれも５２，０００±１，０００；
を有するエンド−  β−１，３−マンナナーゼ生産能を有し、かつ生育の至適ｐＨを酸性に有するロドトルラ属に属する酵母を培養して培養液中にエンド−β−１，３−マンナナーゼを生成・蓄積させ、それを単離・精製することを特徴とする菌体外エンド−β−１，３−マンナナーゼの製造方法。
【請求項３】
ロドトルラ属に属する酵母の培養を２０〜３０℃で好気的に行う請求項２の方法。
【請求項４】
ロドトルラ属に属する酵母を培養する培養液のｐＨを４．０〜６．０とする請求項２または３の方法。
【請求項５】
ロドトルラ属に属する酵母を培養後、培養上澄液を分離し、さらに精製して精製マンナナーゼを得る請求項２から４のいずれかの方法。
【請求項６】
ロドトルラ属に属する酵母が、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ＹＲ−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２４）である請求項２から５のいずれかの方法。
【請求項７】
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ＹＲ−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２４）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この出願の発明は、新規なエンド−β−１，３−マンナナーゼと、その製造方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、β−１，３−；β−１，４−マンナンを加水分解して分解生成物を有効利用したり、β−１，３−；β−１，４−マンナン自体を糊料等として使用した後に分解・除去するために有用なエンド−β−１，３−マンナナーゼと、その製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
エンド−β−１，３−マンナナーゼは、分子内にβ−１，３−Ｄ−マンノピラノシド結合を持つロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属が生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンを特異的に加水分解し、最終的にβ−１，４−マンノビオースを生成する酵素である。
【０００３】
β−１，３−マンノシド結合を含むマンナンはロドトルラ属が生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンしか知られていない。これまで、このマンナンが血清コリンエステラーゼの活性化および安定化作用を有し、いくつかの動物腫瘍の発達を阻害することが知られている。
【０００４】
このマンナンのβ−１，３−マンノシド結合を加水分解する酵素として知られているβ−マンナナーゼは糸状菌（Ａｑｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ４２：１６５１，  １９７８）のみである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、糸状菌酵素のβ−１，３−；β−１，４−マンナンに対する作用機作は明らかでなく、工業的に利用する点で不十分であった。β−１，３−；β−１，４−マンナンの加水分解によるマンノオリゴ糖を効率よく回収・利用するためには作用機作が明らかで、安定性に優れ、酵素の精製が容易であることが望ましい。従って、製造・精製が容易で、しかも高い安定性を有するエンド−  β−１，３−マンナナーゼを新たに開発することはβ−１，３−；β−１，４−マンナンを分解し、その分解生成物を利用する上できわめて大きな意義をもつ。
【０００６】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、前記の各種要件を満たす新規なエンド−β−１，３−マンナナーゼと、この酵素を高い生産効率で生成する方法とを提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明者らは、工業的に使用可能なエンド−  β−１，３−マンナナーゼが具備すべき前記諸性質を有する酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべく、広く天然界を検索した結果、β−，３−；β−１，４−マンナンを生成するロドトルラ属に属するある種の酵母が上記要件を備えた酵素を産生し、またこれを量産性良く産生することを見出して発明を完成した。
【０００８】
この出願は、前記の課題を解決する第１の発明として、下記理化学的性質：
（イ）作用：ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する酵母が菌体外に生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンのβ−１，３−Ｄ−マンノピラシド結合を特異的に加水分解し、最終的にβ−１，４−マンノビオースを生成する；
（ロ）基質特異性：β−１，３−；β−１，４−  マンナンに特異的に作用し、α−マンナン、コンニャクマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンに作用せず、β−マンノシダーゼ活性を持たない；
（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは５．０であり、３０℃、３０分の条件下ではｐＨ４．０〜１０．０の範囲で安定である；
（ニ）温度に対する安定性：ｐＨ５．０、３０分の加熱条件下では４０℃まで安定である；
（ホ）作用温度の範囲：５０℃に至適作用温度を有する；
（ヘ）失活条件：６０℃、３０分の加熱条件下でｐＨ５．０で完全に失活する；
（ト）阻害および活性化：１ｍＭの塩化第二銅、塩化第二水銀により完全に阻害を受ける；
（チ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドおよび未変成ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量：いずれも５２，０００±１，０００；
を有するエンド−β−１，３−マンナナーゼを提供する。
【０００９】
またこの出願は、第２の発明として、前記第１発明のエンド−  β−１，３−マンナナーゼ生産能を有し、かつ生育の至適ｐＨを酸性に有するロドトルラ属に属する酵母を培養して培養液中にエンド−β−１，３−マンナナーゼを生成・蓄積させ、それを単離・精製することを特徴とする菌体外エンド−β−１，３−マンナナーゼの製造方法を提供する。
【００１０】
この第２発明の方法においては、ロドトルラ属に属する酵母の培養を２０〜３０℃で好気的に行うこと、ロドトルラ属に属する酵母を培養する培養液のｐＨを４．０〜６．０とすること、ロドトルラ属に属する酵母を培養後、培養上澄液を分離し、さらに精製して精製マンナナーゼを得ることをそれぞれ好ましい態様としてもいる。
【００１１】
また、この第２発明では、ロドトルラ属に属する酵母が、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ＹＲ−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２４）であることを好ましい態様とするとともに、このＹＲ−２株そのものを第３の発明として提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
この出願の第２発明の方法においては、前記第１発明のエンド−β−１，３−マンナナーゼ産生能を有するロドトルラ属酵母を培地で培養し、エンド−β−１，３−マンナナーゼを生成蓄積させる。培地は液体培地がよい。培養に使用する炭素源は、培養酵母が生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンが用いられ、その培地に対する添加量は０．２％Ｗ／Ｖが好ましい。さらに、０．２％のグルコースの添加が有効である。炭素源の添加方法は、培養開始時に全量を一括して添加する方法がよい。窒素源は硫酸アンモニウムが用いられ、その培地に対する添加量は０．３％Ｗ／Ｖが好ましい。さらに、炭素源、窒素源の他に、０．２％のＫＨ２ＰＯ４、０．１％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％のペプトンおよび０．３％の酵母エキスを添加することが望ましい。また、上記酵母の培養開始時のｐＨは、４．０〜６．０、最も好ましくは５．０であるので、約２規定の塩酸溶液で調整することが望ましい。
【００１３】
培養は振とうまたは通気攪拌の好気的条件下でおこなうのが好ましい。培養温度は２０〜３０℃、好ましくは約３０℃である。通気攪拌での培養中のｐＨは４．０〜６．０、好ましくは５．０に保持する。このような培養中のｐＨは、１規定の燐酸溶液を添加して調整することができる。培養時間は特段の制限はなく、エンド−β−１，３−マンナナーゼの生成量が最大に達するまで培養すればよい。振とう培養では約３日、通気攪拌での培養では約３０時間を目安とすることができうる。以上の培養によって得られた培養液は、遠心分離により菌体を除去し、得られた上澄み液（粗酵素液）から、限外濾過法、イオン交換樹脂、ゲル濾過法等による一般的な酵素精製法により目的の酵素を分離・精製することができる。
【００１４】
培養するロドトルラ属酵母は、前記第１発明のエンド−β−１，３−マンナナーゼ産生能を有する酵母であればどのようなものでも使用可能であるが、特に、この出願の発明者らが天然界から新たに単離した新規酵母ロドトルラ・ムシラギノザ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）  ＹＲ−２株が好ましい。このＹＲ−２株は、エンド−β−１，３−マンナナーゼの生産能を有し、生育の至適ｐＨを酸性側に有するロドトルラ属に属する新規の酵母であり、平成１２年９月６日付で生命工学工業技術研究所に特許微生物（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２４）として寄託されている。表１はこのＹＲ−２株の菌学的諸性質であり、Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ第４版に従って、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａに属する新たな菌株と同定した。
【００１５】
【表１】
0003626084.tif 000002
【００１６】
この出願の前記第２発明の方法で得られる第１発明のエンド−β−１，３−マンナナーゼは以下のような理化学的特性を有している。
作用：
ロドトルラ属酵母が生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンのβ−１，３−マンノピラシド結合を特異的に加水分解し、最終的にβ−１，４−マンノビオースを生成する。図１は、β−１，３−；β−１，４−マンナンの構造およびエンド−β−１，３−マンナナーゼの作用部位を示す。生成物がβ−１，４−マンノピオースであることの確認は、従来の化学的分析に加えＮＭＲ分析によっている。この発明の酵素により得られたマンナン分解生成物であるマノンピオースは、ゲル濾過で分画して回収した後、図２に示した手順で過ヨウ素酸酸化、還元および部分加水分解によって生じた生成物により、β−１，４−で結合であることを確認している。さらにこのマノンピオースの構造を、図３に示した１Ｈ  ＮＭＲと、図４に示した１３Ｃ  ＮＭＲにより確認した。β−１，３−；β−１，４−マンナンとマンノピオースの１Ｈ  ＮＭＲを比較した結果、４．７５ｐｐｍの４位に置換された１位のプロトンのシグナルは変化しなかったが、マンナンで見られる４．８７ｐｐｍの３位に置換された１位のプロトンのシグナルはマノンピオースでは還元されなかったため、α形の５．１９ｐｐｍのプロトンのシグナルと、β形の４．９２ｐｐｍのプロトンのシグナルに分かれた。また、これらのマンナンとマンノピオースの１３Ｃ  ＮＭＲを比較した結果、１００．８９ｐｐｍの４位に置換された１位の炭素のシグナルは変化しなかったが、マンナンで見られる９７．５２ｐｐｍの３位に置換された１位の炭素のシグナルはマノンピオースでは高磁場側の９４．５１ｐｐｍにシフトしていたことからも、マノンピオースがβ−１，４−結合であることが確認された。
基質特異性：
β−１，３−；β−１，４−マンナンに特異的に作用し、α−マンナン、コンニャクマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナンおよびガラクトグルコマンナンに作用せず、β−マンノシダーゼ活性を持たない。
至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：
至適ｐＨは５．０であり、４０℃、３０分間の加熱条件下ではｐＨ４〜１０の範囲で安定である。
温度に対する安定性：
ｐＨ５．０、３０分間の加熱条件下では４０℃まで安定である。
作用温度の範囲：
５０℃に至適作用温度を有する。
失活条件：
６０℃、３０分の加熱条件下でｐＨ５．０で完全に失活する。
阻害および活性化：
１ｍＭの塩化第二銅、塩化第二水銀により完全に阻害を受ける。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドおよび未変成ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量：
いずれの場合も分子量は５２，０００±１，０００である。
【００１７】
以下、実施例を示し、この出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例
表２に組成を示した種培地を５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気減菌した。この培地に、ＹＲ−２株の斜面培養物を１エーゼ接種して３０℃で２４時間培養し、種培養物とした。振とう培養によって酵素を生産する場合は、５００ｍｌの三角フラスコに、表２の主培地を１００ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。十分に生育した種培養物を１ｍｌ当たり１０６の細胞濃度となるよう主培地に移植し、回転数３００ｒｐｍ、３０℃の条件下で、ｐＨは無調整で３日間培養した。一方、１０リッターのジャーファーメンターによって酵素を生産する場合は、表２に示した主培地７リットル分をジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で１５分間蒸気滅菌した。十分に生育した種培養物を１ｍｌ当たり１０６の細胞濃度となるよう主培地に移植し、攪拌数５５０ｒｐｍ、通気７．０リットル、３０℃の条件下で３０時間培養した。培地のｐＨは１規定の燐酸を添加して５．０に保持した。
【００１８】
【表２】
0003626084.tif 000003
【００１９】
培養終了後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により、菌体を除去した。得られた上澄液（粗酵素液）から以下の手順でエンド−β−１，３−マンナナーゼを分離・精製した。
【００２０】
粗酵素液（０．２８ｎｋａｔ／ｍｌ）を、平均分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて約１０分の１に濃縮した後、２４時間５℃で１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に対して透析した。生じた沈殿を遠心分離して除き、得られた上澄液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、１．０ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液の直線的濃度勾配法によって酵素を溶出した。溶出した活性画分を集め、平均分子量１０，０００の限外濾過膜を用いて約１０分の１に濃縮した後、０．１５  ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデクスＡ−５０に吸着させ、０．５  ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液の段階的濃度勾配法によって酵素を溶出させた。その結果、マンナナーゼ活性を持った３つの画分が得られ、その内の最も活性の高い画分を集めた。その画分の活性回収率は１２．９％であった。次いで、同緩衝液で平衡化したセファデクスＧ−１５０によるゲルクロマトグラフィーにかけ、同緩衝液で溶出した。得られた活性画分を濃縮した後、同上カラムを用いて同一条件で再度ゲルクロマトグラフィーにかけ濃縮し、精製酵素を得た。活性回収率は７．３％であった。この精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドおよび未変成ポリアクリルアミド電気泳動法で均一性を検討した結果、両方の方法でもいずれも分子量５２，０００±１，０００の均一のバンドが検出された。
【００２１】
マンナナーゼ活性の測定法および活性表示法は以下の通りである。１／１５Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌと、０．５％ロドトルラマンナン水溶液１ｍｌに酵素液２ｍｌを混合し、３０℃、２時間反応させた後、還元糖量を３，６−ジニトロフタル酸による糖の微量定量法（化学の領域、第１７巻、  ８９１〜８９５、１９６３）により１００μｇ／ｍｌのマンノースを標準として測定した。酵素活性の単位は前述の条件下で１分間にマンノースに相当する還元糖を精製するのに要する酵素量をＫａｔとして表示する。表３はβ−１，３−マンノシド結合を加水分解すると報告されているβ−マンナナーゼ（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｏｎｌ．，  ５７：３２−３８，  １９７９）と、この実施例で得られた酵素の理化学的性質および酵素化学的性質である。
【００２２】
【表３】
0003626084.tif 000004
【００２３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、新規なエンド−β−１，３−マンナナーゼと、このエンド−β−１，３−マンナナーゼを効率よく製造する方法、並びにこの製造方法に用いることのできる新規なロドトルラ属酵母が提供される。この発明のエンド−β−１，３−マンナナーゼは、β−１，３−；β−１，４−マンナンのβ−１，３−マンノシド結合を選択的に加水分解するため、反応時間を違えることにより、種々の分子量のマンノオリゴ糖を生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】β−１，３−；β−１，４−マンナンの構造およびエンド−β−１，３−マンナナーゼの作用部位を示す。
【図２】β−１，４−マンノピオースの過ヨウ素酸酸化、還元および部分水解生成物を示す。
【図３】β−１，３−；β−１，４−マンナンおよびβ−１，４−マンノピオースの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】β−１，３−；β−１，４−マンナンおよびβ−１，４−マンノピオースの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
0003626084.tif 000005
【図２】
0003626084.tif 000006
【図３】
0003626084.tif 000007
【図４】
0003626084.tif 000008