(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を蛍光標識試薬と結合させ、抗原抗体反応に供して、蛍光強度の測定により抗原の検出を行うための蛍光標識抗体の製造方法であって、
抗体を０．５ＭＰａ〜１０００ＭＰａの高圧力下に、抗体のアミノ酸残基に化学的に結合する蛍光標識試薬と、水系媒体中で化学的に結合させることにより、抗体の失活を抑えて蛍光標識の導入を行うことを特徴とする蛍光標識抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗体を蛍光標識試薬と結合させて蛍光標識抗体を製造する方法、特に診断薬、医薬などとして利用可能な蛍光標識抗体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗体を蛍光物質で標識した蛍光標識抗体を、診断薬として用いることが広く行われている。これは抗体を蛍光標識試薬と結合させて蛍光標識を行い、この蛍光標識抗体を用いて抗原抗体反応で析出した析出物の蛍光強度を測ることにより、抗原の検出を可能にするものである。
【０００３】
従来より用いられている蛍光標識試薬の代表的なものとして、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）があるが、従来の標識化の方法はこのような蛍光標識試薬と抗体とを常温常圧で反応させているため、反応効率が低く、抗体１分子中へのＦＩＴＣの結合数は１５個程度と少なかった。そこで、さらに高感度化を達成するために、より多くの蛍光物質を導入することが望まれている。
【０００４】
一般にタンパク質は高濃度の尿素溶液中などでは、構成ドメインが解離することなどにより変性を受けるが、この変性した状態を保持したまま種々の修飾操作を行うことにより、未変性状態での修飾に比べ、より高い反応効率が得られることが知られている。例えば水谷等は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を６Ｍ尿素共存下で変性させてからＦｃ修飾を行うことにより、修飾率が高く、電子伝達媒介能の高いメディエーターを調製している（電気化学、５６、１１００（１９８８））。
しかしこの方法では、修飾酵素の調製後に、カラム等により脱尿素処理を行わねばならないという問題点があった。
【０００５】
一方、近年、タンパク質を高圧力下に置くことにより、タンパク質の高次構造および集合体構造が、変化あるいは変性し、またタンパクの種類によっては、可逆的に元の状態に復帰することが知られるようになった。功刀等は、ＢＳＡおよびグルコースオキシダーゼにフェロセンを物理吸着により導入する過程において、高圧力下での反応を試みている。その結果、高圧力下で、圧力変性を受けているＢＳＡおよびグルコースオキシダーゼとフェロセンとを作用させることにより、常圧下での反応に比べ、速やかにフェロセンを導入できることを報告している（S.Kunugi,et al.,Int.J.Biol.Macromol.,14,210(1992))。また、岡本等は、リボヌクレアーゼＡなどのメルカプトエタノールによる還元反応を５００ＭＰａで行うことにより、その後に行ったカルボキシメチル化およびピリジルエチル化反応がいずれも１００％にまで完遂できることを報告している(M.Okamoto,et al.,Colloque INSERUM,224,167(1992)。
しかしいずれも抗体の蛍光標識については全く示唆されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗体への蛍光標識の導入を効率よく行うとともに、多量の蛍光標識を導入して検出精度を高め、かつ抗体の活性を高く維持して、高感度、高活性の蛍光標識抗体を製造することが可能な蛍光標識抗体の製造方法を提案することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗体を蛍光標識試薬と結合させ、抗原抗体反応に供して、蛍光強度の測定により抗原の検出を行うための蛍光標識抗体の製造方法であって、抗体を０．５ＭＰａ〜１０００ＭＰａの高圧力下に、抗体のアミノ酸残基に化学的に結合する蛍光標識試薬と、水系媒体中で化学的に結合させることにより、抗体の失活を抑えて蛍光標識の導入を行うことを特徴とする蛍光標識抗体の製造方法である。
【０００８】
本発明において用いられる抗体は、主に牛、ヤギ、ウサギ、マウス、ニワトリ、ヒト等のあらゆる動物種に由来のＩｇＧであるが、この他にもＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥなどいずれのクラスに属する免疫グロブリンであってもよく、またポリクローナルあるいはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ）′など抗体由来の種々のセグメントであってもよい。
【０００９】
本発明で用いられる蛍光標識試薬としては、抗体のアミノ酸残基に化学的に結合して、蛍光標識機能を行うことができるものであればその種類は特に限定されない。このような蛍光標識試薬としては、前記フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、例えばフルオレセイン−４−イソチオシアネートのほか、７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンズオキサジアゾール、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン、４−フルオロ−７−スルホベンゾフラザン・アンモニウム塩、スルホローダミン１０１酸クロリドなどが例示でき、このほか和光純薬工業（株）カタログ「ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｒｅａｇｅｎｔｓ」に記載の蛍光物質も使用することができる。
【００１０】
これら蛍光標識物質と抗体との結合様式は、抗体中のチオール基、アミノ基、カルボン酸基、水酸基などを有するアミノ酸残基に共有結合、配位結合などにより化学的に結合させる方法であり、特に水系媒体中で化合結合できる方法である。
【００１１】
抗体と蛍光標識試薬の結合は、水系媒体中で化学反応により結合させる。ここで用いる水系媒体としては、水または緩衝液のほか、水または緩衝液とジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン等の有機溶媒との混合液なども使用できる。有機溶媒を混合する場合は、抗体の失活を抑えるために、混合液中の有機溶媒の濃度は、２０重量％以下であることが好ましい。
【００１２】
抗体と蛍光標識試薬との結合（反応）のための仕込み比は特に限定されないが、重量比で１：１〜１：１０００、好ましくは１：５０〜１：１００とするのが適当である。また結合（反応）時における媒体中の抗体濃度も特に限定されないが、１０〜４０ｍｇ／ｍｌとするのが好ましい。
【００１３】
本発明では抗体と蛍光標識試薬を結合させる際、０．５ＭＰａ〜１０００ＭＰａの高圧下で結合させる。
抗体と蛍光標識試薬とを反応させる場合は、抗体の失活を最小限に抑えるために、水あるいは緩衝溶液中で反応させるのが好ましく、０．５ＭＰａ〜１０００ＭＰａ、好ましくは、５０ＭＰａ〜７００ＭＰａの圧力下、０〜１２０℃、好ましくは４〜４０℃で１秒〜７２時間、好ましくは３０秒〜１時間反応させるのが好ましい。このような条件で、上記の水系媒体中で反応させて標識化を行うことにより抗体の失活を最低限に抑え、高効率で標識の導入を行うことができる。
【００１４】
一般に、抗体などのタンパク質は０．５ＭＰａ〜１０００ＭＰａの高圧力下で、二次構造、三次構造の変化に由来する圧力変性を起こす。これにより正常な状態ではタンパク質内部にあり隠蔽されている反応可能な部位が、圧力変性によって外部に露呈され、修飾試薬が作用しやすくなるため、高い反応効率で標識化が行われる。本発明では、この圧力変性状態にある抗体に対し、蛍光標識試薬を作用させることにより、高効率で標識化を行い、蛍光標識抗体を得る。
【００１５】
この場合、高圧力下で標識化を行うと、常圧の場合よりも標識化速度が速くなり、標識の導入量も多くなるほか、抗体の活性も高く維持される。このようなことは物理吸着等の物理的標識化でも起こるが、化学反応の場合に優れ、特に水系媒体中において水溶性の標識化試薬と反応させて標識化を行う場合顕著になり、標識化率が高く、高活性の抗体が得られる。
【００１６】
このようにして得られた標識抗体は、凝集や変性がなく、標識化率および活性が高いため、そのままで、あるいは透析、限外ろ過、アフィニティカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換カラム等により精製して免疫学的診断薬として使用することができ、感度の高い診断が可能となる。また凍結乾燥等により、乾燥させて免疫学的診断薬として用いることもできるほか、医薬などとしても利用可能である。
【００１７】
【発明の効果】
本発明によれば、抗体を蛍光標識試薬と結合させ、抗原抗体反応に供して、蛍光強度の測定により抗原の検出を行うための蛍光標識抗体の製造方法において、抗体を０．５ＭＰａ〜１０００ＭＰａの高圧力下に、抗体のアミノ酸残基に化学的に結合する蛍光標識試薬と、水系媒体中で化学的に結合させることにより、抗体の失活を抑えて蛍光標識の導入を行うので、抗体の失活を最低限に抑え、抗体への蛍光標識の導入を効率よく行うとともに、多量の蛍光標識を導入して、検出精度を高め、かつ抗体の活性を高く維持して、高感度、高活性の蛍光標識抗体を製造することができる。
【００１８】
【実施例】
以下実施例によりさらに詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
ヤギ由来の抗ヒトアルブミン抗体を０．２５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝９．０）に溶解し、２０ｍｇ／ｍｌに調製した。この抗体溶液１ｍｌにフルオレセイン−４−イソチオシアナート  １ｇを加え、４００ＭＰａの圧力下、４℃で、３時間反応させた。得られた反応混合物はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５およびＤＥＡＥ−セルロースカラムにより精製し、ＦＩＴＣ標識抗体を得た。得られた標識抗体１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ中の蛍光強度を励起波長４９５ｎｍ、測定波長５２０ｎｍで測定し、抗体１分子当たりの蛍光物質モル数に換算した結果４６ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２０】
実施例２
実施例１と同様にして、ただし圧力を２００ＭＰａに代えて、得られた標識抗体の１分子当たりの蛍光物質モル数を求めた結果、２８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２１】
実施例３
実施例１と同様にして、ただし圧力を５０ＭＰａに代えて、得られた標識抗体の１分子当たりの蛍光物質モル数を求めた結果、１９ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２２】
実施例４
実施例１と同様に、ただし蛍光標識試薬として７−ベンジルアミノ−４−ニトロベンズオキサジアゾールを用い、反応時の圧力を５００ＭＰａとして標識抗体を得た。得られた標識抗体１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ中の蛍光強度を励起波長４６４ｎｍ、測定波長５３２ｎｍで測定し、抗体１分子当たりの蛍光物質モル数に換算した結果５４ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２３】
実施例５
実施例１と同様に、ただし蛍光標識試薬として４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンを用い、反応時の圧力を２００ＭＰａとして標識抗体を得た。得られた標識抗体１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ中の蛍光強度を励起波長４６４ｎｍ、測定波長５１２ｎｍで測定し、抗体１分子当たりの蛍光物質モル数に換算した結果２８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２４】
実施例６
実施例１と同様に、ただし蛍光標識化合物として４−フルオロ−７−スルホベンゾフラザン・アンモニウム塩を、緩衝液として０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ＝９．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを用い、反応時の圧力を１００ＭＰａとして標識抗体を得た。得られた標識抗体１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ中の蛍光強度を励起波長３８５ｎｍ、測定波長５１５ｎｍで測定し、抗体１分子当たりの蛍光物質モル数に換算した結果２２ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２５】
実施例７
実施例１と同様に、ただし蛍光標識試薬としてスルホローダミン１０１酸クロリドを用い、反応時の圧力を５０ＭＰａとして標識抗体を得た。得られた標識抗体１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌ中の蛍光強度を励起波長５６８ｎｍ、測定波長６２０ｎｍで測定し、抗体１分子当たりの蛍光物質モル数に換算した結果１８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２６】
比較例１
実施例１と同様に、ただし常圧力下で反応を行ったところ、得られた標識抗体の抗体１分子当たりの蛍光物質モル数は１１ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２７】
比較例２
実施例４と同様に、ただし常圧力下で反応を行ったところ、得られた標識抗体の抗体１分子当たりの蛍光物質モル数は１０ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２８】
比較例３
実施例５と同様に、ただし常圧力下で反応を行ったところ、得られた標識抗体の抗体１分子当たりの蛍光物質モル数は８ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００２９】
比較例４
実施例６と同様に、ただし常圧力下で反応を行ったところ、得られた標識抗体の抗体１分子当たりの蛍光物質モル数は１１ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００３０】
比較例５
実施例７と同様に、ただし常圧力下で反応を行ったところ、得られた標識抗体の抗体１分子当たりの蛍光物質モル数は１０ｍｏｌ／ｍｏｌであった。
【００３１】
参考例１
γ−アミノプロピルシランの２％溶液にて活性化処理したガラスビーズ（直径３ｍｍ、粗面）を、５％グルタールアルデヒド水溶液中、室温で３時間振盪した。これを生理食塩水でよく洗浄し、活性化ガラスビーズを得た。この活性化ガラスビーズを、抗ヒトアルブミン抗体２０μｇ／ｍｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、室温で１時間振盪し、生理食塩水でよく洗浄した。これを１Ｍグリシン水溶液中、室温で１時間振盪することにより、残余のアルデヒド基をブロックし、さらに１％ウシ血清アルブミンにてブロックを行い、抗ヒトアルブミン抗体担持ガラスビーズを得た。
次に抗原溶液として、５０μｇ／ｍｌのヒトアルブミン溶液（０．５Ｍ  ＫＣｌ、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を調製し、その０．４ｍｌと、上記抗ヒトアルブミン抗体担持ガラスビーズ２個とを試験管中、室温で１時間反応させた。その後、０．５Ｍ  ＮａＣｌで３回、さらに生理食塩水で１０回洗浄を行い、余剰の抗原を除去しヒトアルブミン担持ガラスビーズを得た。
【００３２】
実施例８
標識抗体として、実施例１で得られたＦＩＴＣラベル化抗ヒトアルブミン抗体１００μｇ／ｍｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．４ｍｌを参考例１で得たヒトアルブミン担持ガラスビーズに加え、室温で１時間反応させた。これを０．５Ｍ  ＮａＣｌで３回、生理食塩水で１０回洗浄し、サンドイッチ法にて標識抗体を担持したガラスビーズを得た。これに４Ｍ  ＭｇＣｌ2水溶液０．５ｍｌを加えて室温で１時間振盪し、抗原・抗体複合体を解離させた。ここで得られた遊離標識抗体を含んだ上澄液を、マイクロセルを備えた蛍光光度計で測定した。
また同様にして実施例２、３および比較例１で得られた標識抗体について、蛍光強度を励起波長４９５ｎｍ、測定波長５２０ｎｍで測定した。比較例１で得られた標識抗体での、蛍光強度を１としたときの実施例１〜３の相対強度を表１に示す。
【００３３】
【表１】
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