(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる属性を有する細胞を識別するための装置であって、下記のものを含む装置：
液体の懸濁用媒体（103）の中のポリマービーズ（102A）、（102B）の懸濁液の入った懸濁液容器（101）；ここに異なるビーズ（102a、102b）中の細胞は異なる属性を有しており；
懸濁液容器（101）中の液体懸濁用媒体（103）中に浸かるような懸濁液容器（101）中の位置に配置された開口端（104A）を有する流れ管（104）；
液体懸濁用媒体（103）中の該ビーズ（102A、102B）の懸濁液を流れ管（104）の開口端（104A）へ流入させるための手段；ここに流れ管（104）はビーズ（102A、102B）の流れを検出手段（111）、（112）へと導くような形のものであり、該検出手段は個々のビーズ（102A）、（102B）を非侵襲的かつ物理的に検出し、識別してクラス分けするのに用いられ、該クラスは、細胞を含まないかあるいは生きていない細胞のみを含むビーズ（102A）と、１個またはそれ以上の生きた細胞を含むビーズ（102B）であり；
該クラスのうち１のクラスのビーズ（102A）をもう１つのクラスのビーズ（102B）から物理的に分離するための検出手段（111）の下流のビーズ配向手段（119）；ここに該ビーズ配向手段は流れ管（104）の開口端（104C）を含んでおり、該開口端にはビーズ受け（119）の導入開口部が対面しており；
ビーズ受け（119）の導入開口部と流れ管（104）の開口端（104C）とが対面関係にある場合にはビーズ（102B）が流れ管（104）からビーズ受け（119）中へと通るように、それら（104C、119）が対面関係にない場合にはビーズが流れ管（104）からビーズ受け（119）中へと通らないように、互いに対面するようにあるいは対面しないように動くことのできるビーズ受け（119）の導入開口部および／または流れ管（104）の開口端（104C）；
ここに流れ管（104）の開口端（104C）およびビーズ受け（119）の導入開口部は両方とも、陽圧となっている多岐管（113）中にあり、該粒子受け（119）は、周囲に解放された出口開口部（120A）を有するビーズ配向管（120）に接続されており、その結果、ビーズ受け（119）の導入開口部と出口開口部（120A）との間の圧力差によりビーズ（102B）が導入開口部に入り、出口開口部（120A）に向かい、ビーズ収集手段（130）へと向かうものであり；
ビーズ（102B）から分離されたビーズ（120A）および過剰の懸濁用液体（123）を収集する、多岐管（113）に接続されたコレクター（124）；
該検出手段（111、112）の出力に応答してビーズ受け（119）を調節するための調節手段（122）。
【請求項２】
コレクター（124）が多岐管（113）下部にあり、その結果、ビーズ（102A）および過剰の懸濁用液体が該コレクター（124）中に落下するものである請求項１記載の装置。
【請求項３】
流れ管（104）がビーズ直径の２倍未満の内径を有することを特徴とする請求項１または２記載の装置。
【請求項４】
ビーズ配向手段（120）がビーズ受け（119）の下流伸長部分を含み、該伸長部分（120）に沿った圧力差によりビーズが該伸長部分に沿って配向されうることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
ビーズ受け（119）の開口端の下流および開口部の上流の伸長部分の領域（120A）が、減圧状態の多岐管（126）により囲まれており、そのことにより、ビーズ配向管（120）の内部を減圧状態にすることが可能であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
検出手段が光学的検出手段（111）、（112）であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
異なる属性を有する細胞を識別するための方法であって、
培養した１個またはそれ以上の細胞をポリマービーズ（102A、102B）内に封入し；
生きた細胞がビーズ内で数を増やすのに十分な時間、増殖を支持する培地中でビーズ（102A、102B）内の細胞をインキュベーションし；
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の装置の懸濁液容器（101）中の液体の懸濁用媒体中に複数個の該ビーズを懸濁させ、該ビーズを該装置の流れ管（104）に沿って流れさせ、該装置を用いて、１個またはそれ以上の生きた細胞を含むビーズ（102B）から、細胞を含まないかあるいは生きていない細胞のみを含むビーズ（102A）を物理的に分離すること
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、微生物のスクリーニングの新規方法、および該方法を実施するための新規装置に関する。
醗酵等の微生物学の分野において、例えば、生細胞と死細胞を区別し、あるいは有用代謝物の生産レベルを確認するような、異なる属性を有する細胞を区別するために、あるいは類似の属性を有する細胞を確認するために微生物培養物をスクリーニングすることがしばしば必要となる。かかるスクリーニングが特に重要である１の分野は、変異原放射線照射または薬剤による細胞の変異を必要とする微生物細胞系の開発が行なわれているバイオテクノロジーである。微生物培養物が変異原に曝露された後、対象とする変異を検出するために培養物をスクリーニングすることが必要である。無益な変異に対する有益な変異の割合が非常に低く、通常はスクリーニングすべき細胞数が非常に多いので、迅速かつ効果的な、理想的には自動化された方法が、スクリーニングをできるかぎり可能にするために提供される必要がある。
自動細胞スクリーニング装置は知られているが、現在のところ、これらは１年につき比較的少数の培養物をスクリーニングできるに過ぎず、スクリーニング速度の向上が必要である。
本発明者らは、新規な改良された微生物スクリーニング方法およびこの方法を実施するための装置を開発した。
本発明の第１の態様によれば、異なる属性を有する微生物を識別する方法は、以下の工程：
１種またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し；
ビーズ内で生細胞が増殖するに十分な時間、増殖を支持する培地中でビーズ内の細胞をインキュベーションし；
次いで、ビーズ内の細胞の異なる属性に関連した物理的特性に関してビーズまたはビーズに近接した部分を非侵入的かつ物理的に試験することからなる。
本明細書における「細胞」なる用語は、細菌細胞、動物または植物細胞、真菌または細菌胞子（分生子を含む）、微生物プロトプラストおよび菌糸断片を包含する。適当な細胞の例は、ペニシリウム・クリソゲヌム（Penicillium crysogenum）およびストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）の胞子を包含する。
最適には、本発明方法はさらなるインキュベーション後、さらなる工程または選択された属性を有する細胞を含むビーズをかかる細胞を含まないビーズから分離する工程、例えば、増殖した生細胞を含むビーズを死細胞を含むビーズから分離する工程、またはあるタイプの細胞を含むビーズを別のタイプの細胞を含むビーズから分離する工程、あるいは生存率および／または増殖のレベルの程度が異なる細胞を含むビーズを分離する工程を行う。次いで、生細胞を大規模に培養し増殖させる工程がその後に続き、さらに、次いで、増殖した細胞をいくつかの有用な特徴に関して試験および／またはスクリーニングする工程が続いてもよい。最後に大規模培養を行ってもよい。
例えば、細胞は真菌または微生物の胞子であってもよい。本発明方法は、特に、変異原に曝露された後であって、次いで行われる抗生物質のごとき細胞生産物の分泌のような有用性に関するスクリーニングの前の生細胞のスクリーニングに適する。
好ましくは、単一細胞を各ビーズに封入する。
ポリマービーズ中への単一細胞の封入法は知られている。適当には、ポリマービーズはアルギン酸ポリマーのビーズ、特にアルギン酸カルシウムのビーズである。１の適当な封入法は、細胞を希釈され（例えば１〜５％、適当には約２〜３％）、好ましくは滅菌されたアルギン酸ナトリウム溶液中に懸濁し、次いで、この懸濁液を希釈され（例えば、0.05M〜1M、適当には約1M）、好ましくは、滅菌された塩化カルシウム溶液と混合するものである。適当には、細胞懸濁液を滅菌塩化カルシウム溶液に、例えば注射針を用いて滴下することにより混合を行い、アルギン酸カルシウムポリマーが沈降ビーズとなるようにする。最初の細胞懸濁濃度に基づいて適当な希釈率を選択することにより、滴下工程で得られた各液滴の体積が、平均して多くとも１個の生細胞を含むような体積とし、このようにして製造された各ビーズが多くとも１個の生細胞を含むようにする。適当なビーズ直径は3mm±1mm、例えば、約3mmの直径である。したがって、適当な細胞希釈率は、1Lあたり１〜4x104個、例えば1Lあたり2.5x104個である。
さらに塩化カルシウム溶液に浸漬、例えば、ビーズが形成された溶液中にそのまま浸漬すること、および／または、より高濃度、例えば、0.5〜1.5M、適当には1.0Mの塩化カルシウム溶液に浸漬することにより、ビーズを固化させることができる。さらに増殖が起こるように、あるいはビーズ中にバイオマスを閉じ込めておくために、より高濃度のアルギン酸溶液を用いてビーズを調製してもよい。次いで、適当には溶解しているカルシウムが実質的になくなるまでビーズを水洗する。所望により、例えばさらにアルギン酸を沈着させることにより、ビーズを被覆してもよい。
かかるビーズは多孔性であり、便利には、増殖を支持する培地中にあるビーズ中の細胞のインキュベーションを、対象とする細胞に適する培地にビーズを懸濁し、当業者に明らかな温度、圧力、通気等の適当なインキュベーション条件に置くことにより行うことができる。強固なビーズを得るためには、カルシウムを捕捉ないしはカルシウム交換する化合物またはイオン、例えば、クエン酸カリウムもしくはナトリウムを含まない培地を用いるのが望ましい。
適当には、培地は、ビーズ中の細胞の増殖を促進することがわかっている培地のごとき、希釈された一定の培地である。適当な増殖を支持する培地は、窒素源として酵母エキスを含有する２％ラクトースを主成分とする培地、および基本的窒素溶液、例えば、炭素源として澱粉のかわりにラクトースを用いるクエク（Kuek），アプライド・マイクロバイアル・バイオテクノロジー（Appl.Microbial Biotechnol.）（1991年），第35巻,466〜470頁に記載された培地に由来する培地である。もう１つの適当な培地は、Ｌ−アスパラギン、デキストリン、K2HPO4、MgSO4および微量元素を含有する培地である。他の適当な培地は窯業者に明らかであろう。増殖のための時間は、細胞に関する知識から当業者に明らかであるか、あるいは実験的に、例えば、下記の一連の物理学的試験により容易に決定することができる。
通常は、この段階に終わりに、ビーズの中には、全く空のビーズあるいは死細胞のみを含むビーズ、および１個またはそれ以上の生細胞を含むビーズ（死細胞も含んでいる）が存在するであろう。通常は、１個またはそれ以上の生細胞を含むビーズが最も興味深いものであり、しばしば生細胞は実質的な細胞の生育および増殖の証拠となる。
増殖した生細胞を含むビーズ中のバイオマスの割合が大きい結果として、死細胞のみを含むビーズは、その物理学的特性が増殖した生細胞を含むビーズとは異なる。また、増殖した生細胞は、その生存率または増殖のレベルにおいて異なり、このことにより、生細胞を含んでいるビーズ間におけるバイオマスの異なる割合または分配が異なる。これらの相違は異なる物理学的特性においても明らかである。かかる物理的に異なった特性は試験において本質的に検出可能でありうるか、あるいは試験前に試験対象の物理的特徴を増強するためのある種の工程、例えばビーズを化学染色等に付する必要があるかまたはそうすることが望ましいこともある。
ビーズの物理的特徴の相違は、ビーズに近接した部分、例えば、ビーズが懸濁されている培地の物理特性の相違を生じる。
物理的特徴の相違は、目に見える特徴であるか、肉眼または拡大することにより検知できるものであるか、あるいは適当にプログラムされたイメージプロセッシング装置に接続されたビデオカメラで検知されうるものである。相違は、光透過度、屈折率、色、偏光等のごとき光学的特性における相違であってもよい。相違は、電気伝導率、電気容量、誘電率、マイクロ波、超音波または他の放射線の透過性等のごとき他の物理的特徴であってもよい。ビーズに近接した部分の物理的特徴の相違は、例えば、イオン濃度、pH等の相違であってもよく、ビーズが懸濁されている周囲の培地の相違であってもよい。
標識、例えば、蛍光または放射線標識された成分を含有する増殖培地を使用することにより培養期間中に細胞に物理的特徴を導入し、次いで、標識の特徴についてビーズを試験することができる。
かかる特徴に関して非侵入的にビーズまたはその近接部分を試験する方法は知られており、あるいは当業者に明らかである。一般的には、自動化しうる試験方法が手動方法よりも好ましい。
さらなる工程または分離工程において、ビーズを手動で分離することができ、より好ましくは、自動で分離することができる。分離後、所望によりさらなるインキュベーション工程、例えば、生きたバイオマスの量を増加させるためのインキュベーション工程を行ってもよい。
生細胞を培養し増殖させるさらなる工程において、例えば、マイクロタイターウェル中で、上記の適当な培地中でビーズをインキュベーションすることができる。該適当な培地は、さらに、ポリマービーズ材料のための可溶化剤、例えば、アルギン酸カルシウムビーズの場合には、カザミノ酸溶液、クエン酸三ナトリウム、またはリン酸等のごときカルシウム隔離剤を含有していてもよい。ビーズの可溶化によりバイオモマスへの十分な酸素の移動が可能になり、その結果、増殖がビーズ中で継続し、最終的にはビーズから漏出する。便利には、生細胞を含んでいる各ビーズを、例えばマイクロタイターウェル中で別個に培養し、例えば、突然変異を用いる細胞系の開発の分野において、次いで行う有用性に関するスクリーニングのために個々の変異細胞を別々に培養できるようにする。
特に、本発明方法は、上記ビーズ中に細胞を封入することにより機械的装置によりビーズを物理的に取り扱い分離することができ、その結果、該方法が自動化され迅速なものとなりうる。
さらに本発明は、上記方法を実施することのできる装置を提供する。
したがって、
粒子または粒子に近接した部分の物理的特徴に基づいて非侵入的かつ物理的に検出を行い、個々の粒子をクラス分けするのに適した検出手段に粒子を提供するための手段；
該クラスの１つに属する粒子を別のクラスに属する粒子から物理的に分離するのに適した粒子配向手段、および；
該検出手段の出力に応じて粒子配向手段をコントロールするのに適したコントロール手段からなる、物理的に識別可能な粒子を分離するための装置が提供される。
適当には、装置において、粒子は流体の流れ中を検出手段まで輸送および／または提供される。それゆえ、適当には、装置はさらにかかる流れを提供するための手段、例えば、流体中に粒子を懸濁するための手段およびこの懸濁液を流すための手段からなる。かかる懸濁液は、上記の本発明方法において用いられる粒子、特にポリマービーズを便利に取り扱うための担体を提供する。
上記インキュベーション工程から得られるビーズは、細胞を含まないかまたは死細胞のみを含むこと、あるいは増殖した生細胞（１個またはそれ以上の死細胞を含む可能性もある）を有することにより異なる。かかるビーズは上記の物理的特徴において異なっていてもよい。
流体中に粒子を懸濁するための手段は、適当には、流体中の粒子懸濁液を入れる容器からなる。粒子が上記ビーズであれば、適当には、流体は水または増殖を支持する培地からなる。懸濁液容器はインキュベーション容器として作動するものであってもよく、あるいは装置がインキュベーション後に粒子が導入される別々の懸濁液容器からなっていてもよい。好ましくは、粒子の懸濁を維持するように流体を懸濁する。
検出手段は、ビーズ、粒子自身または隣接する懸濁流体に関する、上で説明したようないくつかの適当な物理特性に応答する既知の検出手段からなっていてもよい。
粒子の検出およびそのクラス分けを、粒子を検出し、かつ識別する単一の検出／識別装置により行ってもよく、あるいは粒子を検出し、次いで、個々に識別する装置により行ってもよい。
検出手段は、本質的に粒子のクラスを識別できる手段であってもよく、あるいは、例えばコンピューターを用いてキャリブレーションまたはプログラミングした後、そのようにすることのできる手段であってもよい。かかる手段は、例えば、粒子をモニターし、ビデオのイメージを分析し粒子を識別するためのイメージプロセッシング装置と共働するビデオカメラからなっていてもよい。さらに、最適な流速および粒子の分離が達成されるように、かかるキャリブレーションまたはプログラミングが、粒子を検出手段に提供するための手段と連動していてもよい。このコントロールは、その操作パラメーターの範囲内で、装置のオペレーターにより、個々の目的のために個別にセットアップされてもよい。
粒子が光源と検出器の間を通過する場合の光透過度または屈折率により粒子を検出するように設置された、あるいは光が検出器の所で屈折しうる位置に設置された光検知器を伴う光源のごとき既知の光学的装置、もしくは粒子が視界に入った際に粒子を観察するビデオ顕微鏡カメラ、または粒子の存在を検出し粒子の光学的特徴に基づいて粒子のクラスを識別できる光学的検出器からなる光学的な検出手段が適当である。その間を粒子が通過した際の光透過度の変化に感応する光検出器を対向面に設置した光源が適当である。典型的には、かかる光源は、可視領域のスペクトルの光を放射しうるものであり、検出器はかかる放射に感応しうるものである。一般的には、増殖した生細胞のバイオマスを含むビーズは、細胞を含まないビーズまたは生細胞を含まないビーズよりも光学的に透過度が低い。
粒子が上記ビーズである場合、検出手段により識別される２つのクラスは：細胞を含まないかまたは死細胞のみを含むビーズ；および生きた増殖細胞を含むビーズである。識別されうる他の２つのクラスは、その生存率の程度またはその増殖のレベルが異なる生細胞を含むビーズである。例えば、ビーズ中のバイオマスの不存在、存在、量または分配に基づいて、かかるクラスを識別することができる。
１の具体例において、適当には、粒子を検出手段に提供するための方法は、粒子懸濁液を１つまたはそれ以上の流れに分流させる手段であって、粒子を該流れ中に一列に配列させ、流れを検出手段の近傍に配向させる手段からなる。
各粒子が一列に配列している流れに懸濁液を分流させるための手段は、適当には、各開口端が流体中につかっており、内径が粒子直径よりもわずかに大きい、すなわち、粒子直径に２倍より小、適当には粒子直径の1.5倍よりも小である内径を有する１本またはそれ以上の管からなる。流れ管の開口端は、例えば、懸濁液またはビーズが撹拌されている場合には懸濁液容器中のある位置にあってもよく、あるいは懸濁液容器中を移動可能であってもよい。知られた方法、例えば、懸濁液を置換して流れ管中に送るようにさらなる流体を懸濁液容器に導入することにより、懸濁液をかかる流れ管中に流してもよく、あるいは陰圧（吸引）を装置にかけてもよい。置換による方法が好ましい。流れ管中への懸濁液の流速が実質的に一定であることを確認するのが望ましい。流れ管がなめらかにカーブして粒子流れが流れ管における鋭角部分により妨げられないようにするのが望ましい。かかる流れ管中で、一定の流速の粒子の一連の流れ、および検出手段の動作を容易にする粒子の一定の間隔が達成される。
上記のごとく、流れが流れ管中にある場合、検出手段は流れ管中にあってもよく、あるいは管壁または管壁外にあってもよい。また、流れ管が懸濁液流れを検出チャンバー、すなわち、検出手段の入ったチャンバー中に配向されるものであってもよい。便利には、検出手段が光学的検出手段である場合、あるいは放射の透過性に依存する手段である場合、かかる手段は管壁外にあり、光または他の放射線に対して透明な管壁の部位に接していてもよく、あるいは検出チャンバー内にあってもよい。検出手段が電気的性質に依存する場合には、かかる手段は、管内または管壁、もしくは管壁外、あるいは検出チャンバー内に設置された電気的プローブからなっていてもよい。
流れ管中の粒子が検出され、粒子の属するクラスに識別された場合、通常は電気信号である検出手段からの出力を用いて粒子配向手段を作動させて選択されたクラスに基づいて粒子を物理的に分離することができる。流れが流れ管中にある場合に用いることのできる種々の粒子配向手段は当業者に明らかである。
検出および識別手段の下流の好ましい粒子配向手段において、流れ管の開口端が終了し、この開口部は粒子受けの導入口に対面し、粒子は流れ管の開口端から粒子受けの導入口へと移動する。一方から他方への粒子の自由な通過を許可あるいは阻止するために、流れ管の開口端および／または導入口に流れ調節手段が設置される。
例えば、流れ調節手段の１の具体例において、粒子受けの導入口および／または流れ管の開口端が、互いに対面する位置関係にあったりなかったりするように相対的に移動できるようになっていてもよく、その結果、それらが対面した位置関係にある場合には粒子は流れ管から粒子受けへと通過するが、それらが対面した位置関係にない場合には通過できない。また、流れ管の開口端および粒子受け導入口が互いに固定された位置関係にあってもよく、さらに、それらの間を移動可能なシャッターまたは迂回器が存在していてもよく、その結果、流れ管開口端から粒子受け導入口への粒子の直接の通過を可能にするかまたは妨げることができる。他の形態のかかる流れ調節手段は当業者に明らかである。
適当には、例えば、対象細胞（例えば、生細胞）を含む上記ビーズの場合には、対象粒子はこの様式で粒子受け中に入る。この好ましい形態の粒子配向手段は、特に、付随して流れている流体から粒子が実質的に分離されるという利点を提供する。
上記流れ管および粒子受けを有する好ましい形態の装置において、流れ管の開口端および粒子受け導入口は、両方とも正の気圧の領域、例えば、それらを取り囲む多岐管中の増大した気圧の領域にあり、粒子受けはより低い気圧の領域、例えば、周囲の大気に対して開口した出口に連絡している。このようにして、粒子受け導入口とその出口との間の気圧差は、粒子が導入口に入るのを促進し、粒子を出口へと配向させることを助ける。便利なことに、周囲の多岐管は拒絶された粒子を集めるのにも役立ち得る。
好ましい形態のかかる粒子受けは、固定された流れ管に対して移動可能な受け、例えば、柔軟性のある、旋回する、蝶番式に動く、あるいは回転可能な管の形状の受けである。
例えば、別の構成において、流れ管は、Ｙ字型に分岐していてもよく、あるいは、柄の部分に検出手段と選択された粒子を選択された枝へと流す分流手段を備えたフォーク型の配置の管であって、懸濁液の流れが柄を通りフォークの先の方へと流れる管であってもよい。
例えば、粒子が流れ管を下流へと進む場合、粒子を枝のうちの１本または別の枝に配向させるための水平方向に適用される流体のパルスまたはゲート機構により、さらに所望により一定の流れによりまたはさらなる流体の添加により、流体をフォークの１本の枝または別の枝へと迂回させる。例えば、もう１つの方法において、一方のラインの流れを閉じてもう一方のラインを開ける慣用的なタイプの２路バルブ配置により流体流れを迂回させてもよい。例えば、もう１つの方法において、流体流れを可動スライドまたは回転可能な輪の上の異なる別個のコンパートメント中に迂回させてもよく、例えば、適当なフォークの枝に配向させて集めることにより、そこからコンパートメント中の対象粒子を取り出してもよい。
好ましくは、粒子受けは、受けた粒子を直接コレクターに配向させるための粒子配向器に連結している。粒子受けが上記のような管の形状である場合、便利には、粒子配向器は、受けの管につながる下流方向の伸長部分からなる。例えば、伸長部分に沿った正の気圧の相違（例えば、流れ管の開口端および粒子受けを取り囲む多岐管に適用される、伸長部分の開口端に対して正の気圧）により、管に沿って粒子が配向される。多岐管と伸長部分の開口端（周囲の大気圧）との間のあまりに大きい気圧差を避けるのが望ましい。なぜなら、粒子はかかる圧力を伴って現れ、その結果損傷を受けるか、または収集が困難になるからである。便利には、粒子受けの開口端の下流および伸長部分の開口端の上流の伸長部分の領域を、低真空の多岐管により取り囲んで過剰の流体を粒子から除去し、粒子の移動に対する空気の流れの影響を減じ、粒子を減速するようにしてもよい。次いで、伸長部分の開口端から現れる粒子を収集することができる。
上記粒子配向手段のそれぞれにおいて、粒子配向手段の機械的操作は検出手段とリンクしていてもよく、その結果、対象粒子の配向が粒子の検出および粒子のクラスの識別に応答して行われる。適当には、検出後の遅延時間が計算されてから粒子配向手段の操作が行われ、その結果、流れ管中の流速に応じて粒子は下流の粒子配向手段の近傍に移動する。流れ管および／または粒子受けを対面するようにあるいは対面しないように移動させる適当な機械的手段、またはシャッターまたは迂回器を作動させる適当な機械的手段は、当業者に明らかであり、例えば、圧縮空気、電磁気学的ソレノイド、または別の形態の機械的連結である。
さらなる具体例において、適当には、例えば上記ビーズのような粒子を検出手段に提供する手段は、粒子を把握するプローブまたは吸引プローブの形態の１個またはそれ以上の検出プローブからなる。例えば、吸引プローブは、粒子直径よりも小さい寸法の１個またはそれ以上の口を有する管状プローブからなり、各吸引プローブは粒子近傍に存在することができ、吸引プローブの口へと粒子が吸引され、少なくとも１個の粒子が各口に止まり実質的に口を綴じた恰好になるように大気圧以下の圧力が各吸引プローブに適用される。次いで、保持された粒子が検出器に提供される。
適当には、各吸引プローブは、粒子直径よりも小さい内径を有する管であって、その開口端が口を形成し、もう一方の開口端には陰圧が供給される。
便利には、プローブ自体が粒子近傍へと移動してもよく、口へと粒子を吸引するように減圧状態が供給され、生じた圧力の変化により、口が粒子により閉じられ、コントロールシステムにより感知される。
粒子近傍への吸引プローブの移動を多くの方法で行うことができる。１の具体例において、懸濁液容器中の粒子懸濁液中にプローブを挿入するだけのものであってもよい。別の具体例において、上記と同様に、粒子懸濁液を１つまたはそれ以上の流れに分流し、プローブを流れ中に挿入してもよい。かかる流れを、例えば、１つまたはそれ以上の流路に懸濁液を流すことにより作り出してもよく、該流路は、プローブ用アクセス穴を有するテーブルまたは流れ管である開いた流路であってよい。
粒子がプローブに保持されると、プローブは検出手段の近傍へと移動され、各粒子は検出手段に提供される。１個またはそれ以上の検出手段を用いて連続的に各粒子に提供してもよく、あるいは十分な数の検出手段を用いて各粒子を同時に検出手段に提供してもよい。上記検出手段を使用することができる。
口において粒子が検出され、粒子の属するクラスに識別されたら、通常は電気信号である検出手段からの出力を用いて粒子配向手段を作動させて選択されたクラスに基づき粒子を物理的に分離することができる。
便利には、粒子配向手段は、空気、水または試薬のごとき流体を口に供給して粒子を保持している吸引を終了させることができる手段からなっていてもよい。次いで、粒子は簡単に口から落ち、収集されることができる。
流路がテーブルの形態である場合、適当には、懸濁液を板に沿って流して粒子の２次元的配列を形成してもよい。適当には、検出手段は、ビデオカメラおよびプログラムされた映像プロセッシング装置からなっていてもよく、ビデオカメラは、所望の特徴を有する粒子、例えば、生細胞のバイオマスを含むビーズ、このような性質を有していないビーズ、例えば、細胞を含んでいないかまたは死細胞のみを含んでいるビーズを識別することができる。映像プロセッシング装置が、粒子配向プローブをコントロールするコントロール装置とリンクしていてもよく、該粒子配向プローブは、個々の選択粒子に向けられ、次いで、粒子の配列から粒子を取り出し、それらを収集するものであってよい。かかるプローブは、上記のような粒子を把握または吸引するプローブであってもよく、配列から粒子が拾われ、吸引によりプローブに保持され、次いで、吸引をやめることにより解放される。あるいはまた、かかるプローブが吹き出しプローブであって、空気のごとき流体のジェットまたはカーテンを粒子に向けて噴出し、粒子を配列から吹き飛ばして収集される場所に置くものであってもよい。
対象でない粒子、例えば、細胞を含まないビーズまたは生細胞を含まないビーズである場合には、上記装置から収集された粒子は簡単に処分され、また、対象粒子である場合には、さらなる試験のために取っておかれるか、またはさらなる適当な処理に付されることができる。生細胞を含むビーズ、例えば、変異処理後に得られたビーズの場合には、慣用的には、これはさらなる培養および増殖に付されるであろう。細胞スクリーニング工程において、これらのビーズを、例えば、マイクロタイタープレートのウェル中に集めることにより有用性のスクリーニングのために培養してもよい。本発明装置においては、マイクロタイターウェル中のビーズの収集を、装置から、例えば、粒子配向装置からまたはプローブからウェル中へとビーズを配向させ、次いで、配向装置、プローブおよびプレートに相対的なＸ−Ｙ移動を行わせ、プレートが一杯になるまで次のビーズを隣のウェルに落とすようにすることにより行うことができる。次いで、新しいウェルに取り替えられ、ウェルが積み上げられるか、または／そして細胞増殖培地が入れられる。このＸ−Ｙ移動、ウェル取り替えおよび積み上げ工程を、上記コントロール手段、例えば、コンピューターにリンクされた従来から知られた自動的手段により行うことができる。
次いで、各ウェル中での細胞の増殖を、本質的には光度測定法による各ウェル中のバイオマス量を分析のごとき慣用的手段によりモニターすることができる。その後、やはり本質的には適当な分析試薬と生成物との反応のごとき慣用的な手段により細胞増殖中の有用生成物の生産を分析することができる。
驚くべきことに、上記装置が自動細胞スクリーニングの速度を実質的に増大させうることが見いだされた。
したがって、さらに本発明は、異なる属性を有する細胞、例えば、生細胞と死細胞、あるいは異なる程度の生存率または増殖レベルを有する細胞を識別する方法であって、
培養物からの１個またはそれ以上の細胞をポリマービーズ内に封入し；
ビーズ内の生細胞の増殖にとり十分な時間、ビーズ内の細胞を増殖を支持する培地中でインキュベーションし；
次いで、上記装置を用いて、選択された属性を有する増殖した生細胞のバイオマスを含むビーズを細胞を含まないビーズまたは選択された属性を有しない細胞を含むビーズから分離することからなる方法を提供する。
本発明装置および方法を、以下の図面を参照し、例のみを用いて説明する。
図１は、図式的に示した本発明装置全体の配置である。
図２は、図１の装置の別の構成の多岐管を示す。
図３は、図１の装置に用いる別の形態の粒子配向手段を示す。
図４は、さらに別の形態の粒子配向手段を示す。
図５は、さらに別の形態の粒子配向手段を示す。
図６は、さらに別の形態の粒子配向手段を示す。
1.ポリマービーズ中への細胞の封入
例えば、遠紫外光、NTG、またはガンマ線照射に曝露することにより、一定濃度のペニシリウム・クリソゲヌムまたはストレプトミセス・クラブリゲルスの胞子を変異させる。次いで、一定体積の一定濃度の変異した胞子懸濁液を2.5〜３％アルギン酸ナトリウム滅菌溶液に添加する。胞子がアルギン酸ナトリウム溶液中に均等に分散するまで、合わせた溶液をゆるやかに混合する。変異した胞子の濃度および生存率を知ることにより、一定の体積のアルギン酸ナトリウムに十分な胞子を添加することができ、その結果、最適数のアルギン酸カルシウムビーズが１個の生きた胞子を含むようになる。
蠕動ポンプを用いて、１リットルのアルギン酸ナトリウム／胞子懸濁液をシリコンチューブを通して、注射針から、醗酵容器中の2.5リットルの0.1M塩化カルシウム滅菌溶液中に送り出す。アルギン酸ナトリウム／胞子懸濁液が注射針を通ると、液滴が形成され、次いで、塩化カルシウムと接触して硬化してアルギン酸カルシウムビーズになる。マグネチックスターラーおよび従輪を用いて塩化カルシウム溶液をゆるやかに撹拌する。すべてのビーズが形成されたら、それらをさらに１時間放置して硬化工程を完了し、次いで、塩化カルシウム溶液を醗酵装置から排出する。
この時点において、2.5リットルの1.0M塩化カルシウム溶液を添加してさらに１時間ゆるやかに撹拌することにより、ビーズをさらに硬化させることができる。再度塩化カルシウム溶液を醗酵装置から排出する。適当には、ビーズを硬化させ、塩化カルシウムを排出してからビーズを洗浄する。２リットルの滅菌脱イオン水をポンプで醗酵装置に入れる。ビーズを20分間撹拌し、次いで、水を排出する。洗浄工程を５回繰り返すか、または洗液中のカルシウムが測定されなくなるまで洗浄工程を繰り返す。
最後の洗液を排出した後、2.5リットルの滅菌増殖培地をポンプで醗酵容器中に入れる。１分間に0.5容器体積の流量で滅菌空気を送りながら、マグネチックスターラーおよび従輪を用いてビーズをゆるやかに撹拌する。胞子が発芽し、ビーズ中での菌糸の成長が見えるまで、適当な温度、例えば、26℃でビーズをインキュベーションする。醗酵装置中のビーズが、増殖中心を持たないか、または１個もしくはそれ以上の増殖中心を有するかを見ることが可能である。
適当な増殖培地の例は、培地１および培地２である。
培地１
リン酸水素二カリウム                         0.07g
リン酸二水素カリウム                         0.13g
硫酸マグネシウム（７水和物）                 0.20g
硫酸ナトリウム（10水和物）                   0.20g
硫酸鉄（II）（７水和物）                     0.02g
硫酸マンガン（II）                           0.01g
硫酸亜鉛（７水和物）                         0.02g
硫酸銅（II）（５水和物）                     0.02g
Ｌ−グルタミン酸−ナトリウム塩               0.55g
酵母エキス                                   0.5 g
ラクトースBP                                20.0 g
塩化カルシウム                               3.68g
水                       添加して1.0リットルとする
これらの成分を撹拌しながら脱イオン蒸留水に添加する。pHを5.5に調節すべきである。脱イオン蒸留水で混合物を所定の体積とする。必要ならば、適当な部分試料を調製する。121℃で15分間オートクレーブすることにより培地を滅菌すべきである。
培地２
Ｌ−アスパラキナーゼ                          1.0g
デキストリン                                  5.0g
リン酸水素二カリウム                          0.5g
硫酸マグネシウム                              0.2g
M5D微量元素                                  1.0ml
水                       添加して1.0リットルとする
これらの成分を撹拌しながら脱イオン蒸留水に添加する。pHを5.5に調節すべきである。脱イオン蒸留水で混合物を所定の体積とする。必要ならば、適当な部分試料を調製する。121℃で15分間オートクレープすることにより培地を滅菌すべきである。
2.装置の説明
図１を参照すると、本発明装置の全体が示されるが、主な特徴を明確にし強調するために、スケールは正確でない。
装置は、水または増殖培地であってよい懸濁用流体（103）中の直径約3mmのポリマービーズ（102）の懸濁液の入った約５リットル容の懸濁液容器（101）からなる。ビーズ（102）は細胞を含まないかまたは死細胞を含むもの（102A）であるか、あるいは、生細胞のバイオマスを含むもの（102B）である。ビーズは上記１で説明したように増殖培地中に調製され、所望により水洗工程に付されている。１リットルあたり約50000〜80000個のビーズ濃度が典型的である。
流れ管（104）の開口端（104A）の運動により懸濁液を撹拌することにより、ビーズ（102A、102B）を懸濁液中に保つ。流れ管（104）の開口端（104A）の運動は、モーターおよび管に作用する機械的連結（105）によるものであってよく、例えば、管は、柔軟性のあるフイゴのシール（107）を介して容器（101）の蓋（106）を貫通していてもよい。
滅菌水の流れは、供給部（108）を通して導入され、その流量は調節器（109）によりコントロールされる。容器（101）に入る前に、水はフィルター（110）により滅菌濾過される。容器（101）中への水の導入により、ビーズ懸濁液が流れ管（104）へと置換される。管内径はビーズ（102A、102B）の直径よりもわずかに大きく、典型的には、内径3.5〜4.0mmである。容器（101）内において、管（104）はステンレス鋼製であり、容器（101）外部において、流れの観察ができるような透明なPVC製のなめらかに曲がっている流れ管（104B）に接続されている。流入流速は100〜750ml/分の範囲が典型的に用いられる。
流れ管（104B）は、多岐管（113）の上部（113A）に設置された光源（111）と光検出器（112）との間を通過する。光源（111）と光検出器（112）との間において、流れ管（104B）は光学的に透明である。ビーズ（102）の流れが光源（111）と光検出器（112）との間を通過する際、検出器（112）からの電気信号に変化が生じ、ビーズ（102）が生細胞の増殖による高比率のバイオマスを含む場合、その信号は、ビーズ（102A）が生細胞を含まないかまたは細胞を全く含まない場合に比べて変化する。検出器（112）の出力は調節器（114）によりモニターされる。典型的には、流れ管（104）中において約17〜130cm/秒の流速が用いられる。流れ管（104）中のビーズ（102A、102B）の間隔は、典型的には、0.5〜4.0cmである。流れ管（104A）は多岐管（113）中の開口端（104C）において終了する。調節器（117）のコントロール下のフィルター（116）により濾過された滅菌空気を供給する空気導入口（115）を通して与えられる、典型的には１〜2psiのわずかに陽圧の内圧下に多岐管（113）が維持される。過剰に空気は流出バルブ（118）を通して多岐管（113）から流出する。
多岐管（113）内には、内径約4.0mmの管状の粒子受け（119）がある。これが伸長して配向管（120）を形成し、粒子受け（119）と配向管（120）との間の連結は（121）において回転可能であり、その結果、粒子受け（119）が２種の終端位置（119）および（119A）を占める。（119）の位置において、粒子受けの開口端は流れ管（104）の開口端（104C）に対面し、すなわち対面した位置関係にあり、一方、粒子受け（119）の開口端（119A）はこの位置関係にない。
それゆえ、操作にあたり、充填ビーズ（102B）が光源（111）と検出器（112）との間を通過すると、モニターされた出力は、粒子受け（119）の調節器（122）を作動させるために用いられる。該調節器（122）は、粒子受け（119）を終端位置（119）に移動させるために粒子受け（119）に機械的に連結しており、その結果、ビーズ（102B）は、流れ管（104）の開口端（104C）から落下した場合に、粒子受け（119）の開口端中に落下することができる。ビーズ（102B）が光源（111）と検出器（112）との間を通過してからの電気的に計算された時間間隔をおいてこの動作が行われ、その結果、ビーズ（102B）が流れ管（104）の開口端（104C）に到達する直前に、粒子受け（119）の開口端が位置（119）に来る。粒子受け（119）は、位置（119A）に戻る前に、ビーズ（102B）を受け取るに十分な時間位置（119）に保持される。典型的には、配向管（119）の調節器（122）は、典型的には、圧縮空気ピストン（示さず）をコントロールするための電気で作動するソレノイド（示さず）である。時間の計算は、流れ管（104）中のビーズ（102A）（102B）の速度および検出器（112）と流れ管（104）の開口端（104C）との距離に基づく。特別には、調節器（109）を通って入って来る流速および管（104）の内径から、流れ管（104）中のビーズ（102A、102B）の速度を計算することができる。
空のビーズまたは生細胞を含まないビーズ（102A）が光源（111）と検出器（112）との間を通過すると、粒子受け（119）は位置（119A）に保持されるかまたは戻され、その結果、かかるビーズは多岐管（113）を通って、多岐管（113）底部のコレクター（124）中の過剰の培地（123）中に集められ、そこからビーズがドレイン（125）を通って処分される。
ビーズ（102B）が粒子受け（119）に入った後、それらは多岐管中の正の気圧によって柔軟性のある配向管（120）中へと送られる。配向管（120）の低い部分（120A）は、多岐管（126）に入っているかまたは多岐管（126）により取り囲まれている。調節器（128）によりコントロールされている減圧ライン（127）を通して典型的には10ミリバールの減圧状態が多岐管（126）によって与えられる。この減圧状態の適用は、ビーズ（102B）を減速し、かつ流体を除去してビーズ（102B）を乾燥させる。過剰の流体は多岐管から容器（129）に集められ、そこから処分される。
配向管（120）の低い方の末端（120B）において、ビーズ（102B）が出現し、マイクロタイタープレート（130）のウェル（130）中に配列して落下する。一般的に知られたタイプの調節および移動手段（示さず）によりマイクロタイタープレート（131）が移動され、各ビーズ（102B）が低い方の末端（120B）から落下すると空のウェル（130）がそれを受け取る。多岐管（113）中の正の気圧および多岐管（126）に適用される減圧状態を調節することにより、（120B）に出現する際のビーズ（102B）の速度を十分に低下させて損傷を回避することができる。空気ライン（115）により適用される圧力、流出口（118）からの流出速度、ライン（127）により適用される減圧状態、およびライン（108）からの水の流入をバランスさせてビーズを図示した方向へ流して、16Bにおいてビーズ（102B）が十分に遅い速度で出てウェル（130）に収集されるようにすることが重要である。装置のセットアップ中において、このことを容易に達成することができる。
プレート（131）の自動操作は、特別には、調節器（114）および（122）にリンクしており、充填ビーズ（102B）が検出器（112）により検出された場合に、調節器（114）は粒子受け（119）を採取位置に向け、空のウェル（130）がビーズ（102B）を受け取る準備をする。さらに調節器（114）はプレート（131）のドライブ手段（示さず）にも指令を出して、ビーズ（102B）が検出器（112）近傍から受け取りウェル（130）に至るまでの一定時間により計算した時間間隔後に、プレート（131）のドライブ手段を動かす。その結果、ビーズ（102B）がウェル（130）中に来るとすぐに、それが入ったウェルが配向管（120）の開口端（120B）から離れ、新たなウェル（130）が開口端（120A）の下に移動して次の充填ビーズ（102B）を受け取る。プレート（131）に必要なＸ−Ｙモーションを与えるドライブ手段は当該分野において知られている。便利には、Ｘ方向の動きを開口端（120B）に与え、Ｙ方向の動きをプレート（131）に与える。
ビーズが検出器（112）を通過してから調節器（122）を作動させるまでの時間間隔を計算できるような電気的調節手段および装置に対する他の調節機能は当業者に知られており、それらはマイクロプロセッサー（図示せず）からなっていてもよい。また、かかる調節手段は調節器（109）（117）（122）および128）ならびにマイクロタイタープレート（131）のＸ−Ｙモーションを作動させる。
3.別の多岐管の構成
図２には、図１の装置の、多岐管および付属部品の別の、好ましい構成を図式的に示す。図１と共通した部品は図１に対応して番号づけしてある。一般的には、図に２に示す多岐管および部品は、図１に示す対応する部品と同様である。
図２を参照すると、図１と同様に、流れ管（104B）は光源（111）と光検出器（112）との間を通るが、この領域では流れ管（104）は水平に配置されていることが異なる。流れ管（104B）は水平に多岐管に入り、開口端で終了する。
多岐管（113）内には、内径約4.0mmの管状の粒子受け（119）がある。これが伸長して配向管（120）を形成し、粒子受け（119）と配向管（120）との間の連結は（121）において回転可能であり、その結果、粒子受け（119）が２種の終端位置（119）および（119A）を占める。（119）の位置において、粒子受けの開口端は流れ管（104）の開口端（104C）に対面し、すなわち対面した位置関係にあり、一方、粒子受け（119）の開口端（119A）はこの位置関係にない。
それゆえ、操作にあたり、充填ビーズ（102B）が光源（111）と検出器（112）との間を通過する際、モニターされた出力は、粒子受け（119）の調節器（122）を作動させるために用いられる。該調節器（122）は、粒子受け（119）を終端位置（119）に移動させるために機械的に連結しており、その結果、ビーズ（102B）は、流れ管（104）の開口端（104C）と粒子受け（119）との間の狭い隙間を越えて粒子受け（119）の開口端中に入る。ビーズ（102B）が光源（111）と検出器（112）との間を通過してからの電気的に計算された時間間隔をおいてこの動作が行われ、その結果、ビーズ（102B）が流れ管（104）の開口端（104C）に到達する直前に、粒子受け（119）の開口端が位置（119）に来る。粒子受け（119）は、位置（119A）に戻る前に、ビーズ（102B）を受け取るに十分な時間、位置（119）に保持される。典型的には、配向管（119）の調節器（122）は、典型的には、圧縮空気ピストン（示さず）をコントロールするための電気で作動するソレノイド（示さず）である。時間の計算は、流れ管（104）中のビーズ（102A）（102B）の速度および検出器（112）と流れ管（104）の開口端（104C）との距離に基づく。特別には、調節器（109）を通って入って来る流速および管（104）の内径から、流れ管（104）中のビーズ（102A、102B）の速度を計算することができる。
空のビーズまたは生細胞を含まないビーズ（102A）が光源（111）と検出器（112）との間を通過する際には、粒子受け（119）は位置（119A）に保持されるかまたは戻され、その結果、かかるビーズは多岐管（113）を通って、多岐管（113）底部のコレクター（124）中の過剰の培地（123）中に集められ、そこからビーズがドレイン（125）を通って処分される。
4.別の粒子配向手段
図３に、フォーク状流れ管からなる別の３種の粒子配向手段を示す。本発明装置において、それらを用いて粒子を分離することができる。
図3Aを参照すると、図１の装置の流れ管（104B）は、枝（301）および（302）を有する「Ｙ字」のフォーク型の管に別れている。「Ｙ字」の柄は光源（111）と検出器（112）との間を通っている。分枝のすぐ上流に、流体注入装置（303）および（304）があり、それらは互いに流れ管（104）において対面しており、「Ｙ字」の平面内にある。検出器（112）が、生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）の存在を検出した場合、ビーズ（102B）が注入装置（303）のわずかに下流に来るのに十分な時間が経過した後、注入装置（303）を通して水のパルスが適用されてビーズ（102B）を枝（301）中に配向する。逆に、同様の動作により、ビーズ（102A）は、注入装置（304）からのパルスにより枝（302）中へ配向される。これらのパルスを、図１の調節器（122）と類似の調節器（図示せず）により作動するポンプ（図示せず）により供給してもよい。
枝（301）が伸長して配向管（図示せず、しかし図１の（120）と類似）を形成していてもよく、例えば、周囲に設置した減圧多岐管（図示せず、しかし図１の（126）と同様の配置）により過剰の流体が除去された後、ビーズ（102B）をマイクロタイタープレートへと導くものであってもよい。さらに、空気をビーズ（102A、102B）間に導入して「Ｙ字」管から間隔をおいて出るようにしてもよい。図１のドレイン（125）と類似の処理システム（図示せず）中にビーズ（102A）を送るように枝（302）を配置してもよい。
図3Bを参照すると、図１の流れ管（104）は、筒状バルブチャンバー（305）からなる２流路バルブ中に到達している。該筒状バルブチャンバー（305）は、その内部に、チャンバー（305）内で回転可能な適合バルブプラグ（306）を有し、さらに、流れ管（104）をフォークの２本の出口管（308）および（309）のいずれかに連絡せしめるカットアウトチャンネル（307）有している。流れ管（104）は、光源（111）と検出器（112）との間を通る。動作において、図2Aの装置の検出器と同様に、検出器（112）が生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）を検出した場合、バルブプラグ（306）はビーズ（102B）を出口管（308）に配向させるように回転する。逆に、同様の動作において、図3Bの斜線を付した位置に流路（307）が来る位置にプラグ（306）を回転させることにより、空のビーズ（102A）が出口管（309）に配向される。出口管（308）および（309）が配向管中に伸長し、図3Aと同様な様式でビーズを処分するようになっていてもよい。
図3Cを参照すると、配置および一般的動作は図3Bのものと同様であるが、２流路バルブ（305〜309）の代わりに筒状チャンバー（310）が存在する。該筒状チャンバー（310）の内部には、一定数のくぼみを周上に有する適合筒状プラグ（311）があり、プラグの回転により、フォークの出口管（313）（314）に連絡しうる。検出器が、生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）を検出した場合、プラグ（311）は適当な時間経過後、ビーズ（102B）を捕獲するように回転し、次いで、ビーズを出口管（313）に導入するようにさらに回転することができる。
逆に、生細胞を含まないビーズ（102A）が出口管（314）中に導入される。出口管（313）および（314）が配向管内に伸長して、図3Aと同様の様式でビーズを処分するものであってもよい。
さらに、適当には、流体の流れは妨げられないように、チャンバー（305）（310）は、チャンバー壁（305）（310）とそのプラグとの間に周に沿ったギャップ（315）を有している。
4.装置のもう１つの形態
図４を参照すると、図１に対応する部品にはその番号を付してある。上記１記載のごとく調製された、直径約3mmのポリマービーズであって、空もしくは生細胞を含まないビーズ（102A）、または増殖した生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）のいずれかの懸濁液（402）を入れた懸濁液容器（401）からなる本発明装置を示す。
該装置は、減圧ライン（404）に接続された吸引プローブ（403）である多くの粒子配向プローブを有し、各プローブ（403）は減圧調節バルブ（405）を有する。図4Aに示すように、プローブ（403）を懸濁液中（402）に挿入すると、ビーズ（102A）および（102B）はプローブ開口端（403）に吸引され、プローブが懸濁液（402）から離れた場合、吸引によりプローブ開口端（403）に接した位置に保持される。
図4Bに示すように、光源（図示せず）および光検出器からなるセンサー（406）に各プローブ（403）を供する。ビーズは光源と光検出器との間に位置する。ビーズ（102A）は光透過性がビーズ（102B）とは異なり、このことにより検出器（図示せず）から異なる電気信号が得られる。この異なる信号を用いて、ビーズが保持されている吸引プローブ（403）中への空気の導入をバルブ（405）を通してコントロールする。その結果、これらのビーズはプローブ（403）から落下し、一方、吸引プローブ（403）中で減圧が維持されると、ビーズ（102B）はその位置で保持され、所定の位置で保持される。
図4Cに示すように、ただ１個のビーズ（102B）を保持した吸引プローブ（403）を、収集タンク（407）（別法として、プローブを静止させておいてタンクを移動させてもよい）上の位置に移動させることができる。バルブ（405）を通してビーズ（102B）を保持しているプローブ（403）中に空気が送られる。その結果、ビーズ（102B）は増殖培地（408）の入ったタンク（407）中に落下する。
別法として、マイクロタイタープレート（図示せず）を用いてビーズ（102B）を収集してもよい。かかるプレートをプローブ（403）の真下に置き、プローブ（403）およびプレートに相対的なＸ−Ｙモーションを与え、ビーズ（102B）を保持しているプローブ中（403）に適当に空気を導入すると、ビーズ（102B）はそれぞれマイクロタイタープレートのウェル中に落下する。
図4Dに示す付加的なさらなる工程において、吸引プローブ（403）をタンク（407）中に再挿入してもよく、各プローブ開口端に接続されている多岐管（404）を通して減圧することによりビーズ（102B）が吸引される。図4Bを参照して上記方法と同様にして、各プローブ（403）開口端におけるビーズの存在を、図4Eに示すセンサー（406）に供することによりチェックしてもよい。次いで、バルブ（405）開き、空気をプローブ（403）中に導入することにより、プローブ（403）の開口端の真下にあるマイクロタイタープレート（図示せず）のウェル中にビーズ（102B）を落下させる。
図4Eを参照すると、ビーズ（102B）中での細胞増殖期間経過後、上記方法と同様の方法でプローブ（403）を培地（408）中に再挿入し、そこからビーズ（102B）を吸引プローブ（403）の開口端に取ることができる。次いで、ビーズ（102B）を、ビーズ（102B）中でのバイオマス量の増加を検知するセンサー（406）に供する。次いで、ビーズ（102B）を保持したプローブ（406）を、マイクロタイタープレート（131）中のウェル上の位置に移動させ、図4Fに示すように、ビーズ（102）をウェル中に落下させる。
図５を参照すると、図１に対応する部品にはその番号を付してある。本発明装置は、上記１に記載したように調製されたビーズの２次元配列が乗っているテーブル（501）からなる。ビーズは、細胞を含まないかもしくは生細胞（102A）を含まないビーズ（102A）、または生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）のいずれかである。
ビデオカメラ（502）をテーブル（501）上方に置き、ビーズ（102A、102B）の配列をモニターする。カメラ（502）はイメージプロセッシングおよび調節装置（503）に接続されており、さらに減圧多岐管（図示せず）に連結された管である粒子配向プローブ（504）に接続されている。ビデオカメラ（502）およびイメージプロセッシング装置（503）はビーズ（102A）および増殖細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）の異なる外観を検知する。プローブ（504）中の減圧状態はビーズ（102B）をプローブ（504）の開口端に引き付け、吸引によりその場にビーズを保持する。次いで、図4Bに示すように、調節装置（503）は、ビーズ（102B）を伴うプローブ（504）をマイクロタイタープレート（131）の空のウェル（130）上に移動させる。プローブ（504）中への空気の導入は、ビーズ（102B）をウェル（130）中に落下させる。プローブ（504）およびマイクロタイタープレート（131）に相対的なＸ−Ｙモーションを与えることにより、プレート（131）を移動させて上記方法のごとく、新たな空のウェル（130）をプローブ（504）の真下に置いて新たなビーズ（102B）を受けるようにしてもよい。
図６を参照すると、図１に対応する部品にはその番号を付してある。本発明装置は、上記１に記載したように調製されたビーズ（102A）および（102B）の２次元配列が乗っているテーブル（601）からなる。該ビーズは空のビーズ（102A）であるか生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）のいずれかである。
図５と同様に、ビデオカメラ、イメージプロセッシングおよび調節装置の配列を利用して、粒子配向プローブ（602）を対象とするビーズ（102B）に配向する。プローブ（602）は、ビーズ（102B）に吹き出し空気の筒状カーテン（603）を配向し、このカーテン（603）はビーズ（102B）をプローブ（602）近傍に保持する。次いで、調節手段（図示せず）により、プローブ（602）をビーズ（102B）が乗っているテーブル（601）の穴（604）の上の位置に移動させ、そこでビーズ（102B）を穴を通してマイクロタイタープレート（131）のウェル（130）中に落下させる。テーブルおよびプレート（131）の相対的なＸ−Ｙモーションを与えることにより、プレート（131）を移動させて、上記工程を繰り返して新たな空のウェル（130）は穴（604）の真下の位置に来るようにして新たなビーズ（102B）を受け取るようにしてもよい。
5.大規模な生細胞の培養および増殖
マイクロタイタープレート（131）のウェル（130）中で、増殖した生細胞のバイオマスを含むビーズ（102B）を大規模に増殖させてより多くの増殖細胞を試験用に得ることができる。上記１のごとき適当な培地であって、ポリマービーズ材料の可溶化剤（例えば、アルギン酸カルシウムのビーズの場合には、カザミノ酸、クエン酸三ナトリウム、またはリン酸溶液のごときカルシウム捕捉剤）を含有する培地をウェル中に導入することにより、このことが達成される。最初に十分な培地を導入してビーズ（102B）が部分的にのみ浸るようにし、酸素の移動を可能にする。ビーズ（102B）中での十分な細胞の増殖が起こり、培地表面上のビーズ（102B）の一部分から増殖した細胞が噴出する。さらに培地をビーズ（102B）を覆うまで導入して細胞を増殖させる。次いで、さらなる増殖が起こるにつれ、増殖がビーズの範囲を越えて培地中または培地表面で起こるようになる。このような増殖が起こるまでの時間は細胞株により異なるであろうし、当業者により実験的に決定されうる。
【図２】
0003626185.tif 000002
【図１】
0003626185.tif 000003
【図３Ａ】
0003626185.tif 000004
【図３Ｂ】
0003626185.tif 000005
【図３Ｃ】
0003626185.tif 000006
【図４Ａ】
0003626185.tif 000007
【図４Ｂ】
0003626185.tif 000008
【図４Ｃ】
0003626185.tif 000009
【図４Ｄ】
0003626185.tif 000010
【図４Ｆ】
0003626185.tif 000011
【図４Ｅ】
0003626185.tif 000012
【図５】
0003626185.tif 000013
【図６】
0003626185.tif 000014