(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンを、遊離多糖を除去した条件下で３０分〜５時間加熱処理することを特徴とする、脱色されたヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項２】
遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンを陽イオン交換体処理後に３０分〜５時間加熱処理することを特徴とする、脱色されたヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項３】
脱色されたヒト血清アルブミンが少なくともＡ３５０／Ａ２８０で０.０１６の着色度まで脱色されたヒト血清アルブミンである、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
脱色されたヒト血清アルブミンが少なくともＡ３５０／Ａ２８０で０.０１６の着色度まで脱色されたヒト血清アルブミンである、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
脱色されたヒト血清アルブミンがＡ３５０／Ａ２８０で０．０１５乃至０.０１６の着色度を有する、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
脱色されたヒト血清アルブミンがＡ３５０／Ａ２８０で０．０１５乃至０.０１６の着色度を有する、請求項２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミンの脱色方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルブミン、特にヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とすることがある。
従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療する点に存する。
【０００３】
現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。この製造法の欠点は不経済であることと、血液の供給が困難であるということである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡの代替の原料を開発することが有益となろう。
【０００４】
ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製する技術が確立されつつある。
【０００５】
ところが、遺伝子操作においては、宿主である微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌する物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合することによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われる。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することはできない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、遺伝子操作によりＨＳＡを得るに際し、従来の血漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することができなかった上記着色成分ならびに夾雑成分を除去し、着色を充分に抑えられたＨＳＡを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得られるＨＳＡを得るに際して、当該ＨＳＡの精製工程中に加熱処理を行うことにより当該ＨＳＡを脱色できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明の遺伝子操作により得られるＨＳＡの脱色方法は、遊離多糖を除去した条件下で、詳しくは精製工程中の陽イオン交換体処理後に加熱処理を行うことを特徴とする。
【０００９】
本発明は、遺伝子操作によってＨＳＡを調製する場合のＨＳＡの脱色方法に係わるものであり、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹、動物細胞等）を培養し、菌体外発現（分泌発現）により産生される。
【００１０】
本発明の脱色処理の対象である、遺伝子操作によるＨＳＡの採取ならびに精製は以下の通りである。
（１）ＨＳＡ産生宿主の調製、培養ならびにＨＳＡの分離採取
本発明における遺伝子操作により得られるＨＳＡは、遺伝子操作によって得られるものであれば、その由来に特に制限はない。従って、当該ＨＳＡを産生させるための宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。当該宿種としては、具体的には遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌など）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris ）〕を使用されることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を使用して得られたＨＳＡであってもよい。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（a, his 4, leu 2, can 1）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（his 4 ）等が好適に使用される。
【００１１】
本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。
【００１２】
例えば、ＨＳＡ産生宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）などが例示される。
【００１３】
また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースあるいはメタノール等を適度に少量づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報）などが例示される。
【００１４】
さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分とを分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１９８号公報）などが例示される。
【００１５】
（２）ＨＳＡの精製
ＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用される。
【００１６】
当該精製工程としては、例えば以下の▲１▼〜▲７▼を含む工程が好適に挙げられる。
▲１▼  ＨＳＡの産生宿主の培養上清を分画分子量１０万〜５０万、および１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処理する。
▲２▼  ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。
▲３▼  ｐＨ３〜５で酸処理する。
▲４▼  分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処理する。
▲５▼  ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。
▲６▼  ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収する。そして、
▲７▼  ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。
【００１７】
また、前記工程▲６▼の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程▲７▼の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程▲５▼と▲６▼の間、▲６▼と▲７▼の間、または▲７▼の後に、ｐＨ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈殿画分を回収する工程をさらに含むものであってもよい。
【００１８】
（３）高度精製
さらに、ＨＳＡを高度精製するために以下のような処理を行うことができる。
（ｉ）キレート樹脂処理
キレート樹脂処理は、ＨＳＡの脱色を目的として行う。上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とＨＳＡとを接触させることにより行われる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体などが挙げられる。
【００１９】
一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキレンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRBO2（リガンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAION CR20 （リガンド部；−ＮＨ（CH2 CH2 NH) n Ｈ、三菱化成製）、LEWATIT TP214 （リガンド部；−ＮＨＣＳＮＨ2 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００などが好適に使用される。
【００２０】
当該キレート樹脂による処理条件は、好適には次の通りである。
ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７）
時間：１時間以上、好ましくは６時間以上
イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍｍｈｏ
混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）
【００２１】
（ii）疎水性クロマト処理
上記精製工程（▲１▼〜▲７▼およびキレート樹脂処理を含む）を経て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が充分に除去されていない。
【００２２】
そこで、これらの処理終了後に得られるＨＳＡを、ｐＨ２〜５（好ましくは、ｐＨ３〜４）、塩濃度０．４〜１Ｍ（好ましくは、０．４〜０．７Ｍ）の条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８（好ましくは、ｐＨ６．５〜７）、塩濃度０．０１〜０．３Ｍ（好ましくは、０．０５〜０．２Ｍ）の条件下で溶出する工程を組み合わせる。または、前記の工程▲６▼の代わりに当該疎水性クロマト処理工程を組み合わせる。こうして、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質が充分に除去されたＨＳＡを回収することができる。
【００２３】
ここにフェノール硫酸法とは、一般的には糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液にフェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成されるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の夾雑物質としては、例えば中性糖（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オリゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などが例示され、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体反応を起こさない夾雑物質を言う。
【００２４】
疎水性クロマト用担体としては、炭素数４〜１８のアルキル基型（例：ブチル基型、オクチル基型、オクチルデシル基型など）、フェニル基型などが例示される。ブチル基型としては、ブチル−アガロース、ブチル−ポリビニル（商品名ブチル−トヨパール、東ソー社製）などが、オクチル基型としては、オクチル−アガロースなどが、オクチルデシル基型としては、オクチルデシル−アガロースなどが、フェニル基型としては、フェニル−セルロース（商品名フェニルセロファイン、生化学工業社製）などが例示される。
【００２５】
（iii)  ホウ酸またはその塩による処理
ＨＳＡを、ホウ酸またはその塩で処理することによって、宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質を除去することができる。
【００２６】
使用されるホウ酸としては、例えばオルトホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。またその塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩など）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１０時間程度が例示される。処理時の電導度は低電導度であることが好ましい。具体的には１ｍＳ以下が例示される。さらに、ＨＳＡ濃度は低濃度であることが好ましく、具体的には５％以下、好ましくは０．１〜３％程度が例示される。
【００２７】
ホウ酸またはその塩による処理終了後、例えば遠心分離、濾過などにより沈殿を除去し、上清を回収して濃縮脱塩する。
【００２８】
（iv）限外濾過処理
上記精製工程を経て、回収されたＨＳＡは限外濾過処理することが望ましく、分画分子量約１０万の限外濾過膜が好適に使用される。限外濾過処理によりパイロジェン（発熱性物質）を除去することができる。
【００２９】
（４）陽イオン交換体処理後の加熱処理
加熱処理は、遊離多糖を除去した条件下、すなわち（２）の精製工程中、▲５▼陽イオン交換体処理後であれば、その直後であっても、またはその後の精製工程（高度精製工程も含む）、最終工程のいずれに組み入れてもよい。具体的には、遊離多糖の含量はＨＳＡ２５０ｍｇ／ｍｌ当たり５ｍｇ／ｍｌ程度またはそれ以下が例示される。
処理温度は、５０〜１００℃、好ましくは６０〜８０℃程度が例示される。処理時間は、１０分間〜１０時間、好ましくは３０分間〜５時間程度が例示される。ＨＳＡの処理濃度は、０．０１〜２５％、好ましくは０．１〜５％程度が例示される。加熱処理は、公知の安定化剤（例えば、アセチルトリプトファンまたはその塩（例、ナトリウム塩）、脂肪酸（炭素数６〜２０）またはその塩（例、ナトリウム塩）の存在下に行う（特開平３−１０３１８８号公報）ことが好ましく、ＨＳＡの安定化を完全にすることができる。
【００３０】
当該加熱処理は還元剤の存在下に行うことが好ましい。
還元剤としては、還元作用を有する物質であれば、特に限定されないが、具体的には、ＳＨ基を含む低分子化合物（例、システイン、システアミン、シスタミン、アミノプロパンチオール、メチオニン、エチオニン、グルタチオン等）、亜硫酸塩（例、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸カルシウム等）、ピロ亜硫酸塩（例、ピロ亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カルシウム等）、亜リン酸・ピロ亜硫酸塩（例、亜リン酸・ピロ亜硫酸ナトリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カリウム、亜リン酸・ピロ亜硫酸カルシウム）、アスコルビン酸等が例示される。
還元剤の添加量は、システイン等の場合で１〜１００ｍＭ程度、亜硫酸塩等の場合で０．００１〜１０％程度が例示される。
【００３１】
また、着色を抑制することが知られているアミン化合物（特開平５−２６０９８０号公報）を併用することができる。当該アミン化合物としては、アルキルアミン類、ジアミン類、グアニジン類、ベンズアミジン類、塩基性アミノ酸、アミノフェニル酢酸が挙げられる。アルキルアミン類としては炭素数１〜６のものが好ましく、例えばメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン等が挙げられる。ジアミン類としては、アルキレンジアミン（特に炭素数１〜６のもの、例えばメチレンジアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアルキレンジアミン（特にアルキル、アルキレンおのおのの炭素数１〜６のもの、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン等）が挙げられる。グアニジン類としては、グアニジン、アミノグアニジン、フェニルグアニジン等が挙げられる。ベンズアミジン類としては、ベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニン等が挙げられる。アミン化合物の添加量としては、０．０１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは０．１〜１ｗ／ｖ％）が例示される。
【００３２】
ＳＨ化合物の場合、処理ｐＨは６〜８、好ましくはｐＨ６．５〜７．５が例示される。アスコルビン酸の場合、処理ｐＨは３〜６、好ましくはｐＨ４〜５が例示される。その他の還元剤の場合、処理ｐＨは６〜１０、好ましくはｐＨ８〜９が例示される。
【００３３】
本発明の加熱による脱色処理によれば、ＨＳＡ着色度は、処理直前に比較して処理直後は３０〜７０％低減される。
【００３４】
（５）製剤化
上記で得られたｒＨＳＡ（含有組成物）は、公知の手法（限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。また、製剤化工程での安定性及び製剤化した後での保存安定性を確保するため、必要に応じて安定化剤としてアセチルトリプトファンまたはその塩（例えば、ナトリウム塩）およびカプリル酸ナトリウムが配合される。安定化剤の添加量としては、0.01〜0.2 Ｍ、好ましくは0.02〜0.05Ｍ程度が例示される。また、ナトリウム含量は3.7mg/ml以下が例示される。当該安定化剤の添加時期は、限外濾過、除菌濾過、分注、凍結乾燥等の処理前である。
【００３５】
かくの如き限外濾過、除菌濾過されたｒＨＳＡ製剤は、投与単位あたりに容器に無菌充填される。ここで、投与単位あたりに容器に充填するとは、ｒＨＳＡ製剤の投与量、例えば、ｒＨＳＡを25％含有し、ｐＨは 6.4〜7.4 程度、浸透圧比は１程度の液状製剤を、20〜50ml（ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ）ごとに容器に充填することを意味する。あるいはｒＨＳＡを５％含有し、100 〜250ml ( ｒＨＳＡとして５〜12.5ｇ) ごとに容器に充填することを意味する。ｒＨＳＡ製剤を充填する容器としては、10〜250ml 容のガラス製容器、ポリエチレン製容器、脱アルカリ処理した軟質ガラス製容器（特開平４−２１０６４６号公報）等が挙げられる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、遺伝子操作により得られるＨＳＡについて、原料中のある種の着色成分、あるいは微生物が分泌する物質が夾雑し、これらがＨＳＡと結合することによって起こる着色が充分に抑えられたＨＳＡを提供することができる。
【００３７】
【実施例】
本発明をさらに詳細に説明するために、実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものはない。
【００３８】
参考例１  ＨＳＡ産生宿主の培養
(1)  使用菌株：Pichia pastoris GCP101株
特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法により、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ1 遺伝子領域に、ＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ1 遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００３９】
ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ540 ＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０7 cells/plate になるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００４０】
(2)  菌株の培養
（前々培養）
グリセロール凍結ストック菌株１mlを２００mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。
【００４１】
【表１】
0003684584.tif 000002
【００４２】
（前培養）
ＹＰＤ培地５ｌを含む１０ｌ容ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５ｌ／分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施しなかった。
【００４３】
（本培養）
バッチ培養用培地（表２）２５０ｌに前培養液を植菌し、１，２００ｌ容ファーメンターを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／cm2 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持するように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。回分培養において培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中にメタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加することにより、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３０ml／ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加することで実施した。
【００４４】
【表２】
0003684584.tif 000003
【００４５】
【表３】
0003684584.tif 000004
【００４６】
参考例２
参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（YEAST, 5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol., 9, 1316-1323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラスミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特開平４−２９９９８４号公報）。参考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産生させた。
【００４７】
参考例３
(1)  培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ）
参考例１ないしは参考例２で得られた培養液約８００ｌを圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０ｌに濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。
続いて、６０℃、３時間の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いてＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換した。
【００４８】
(2)  陽イオン交換体処理
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにＨＳＡを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９でＨＳＡの溶出を行った。
【００４９】
(3)  疎水性クロマト処理
Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたＨＳＡ溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを充填したカラムに添加した。この条件ではＨＳＡはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラムを通過した。カラムを通過したＨＳＡは、分画分子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０ｌに濃縮するとともに、ＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
【００５０】
(4)  陰イオン交換体処理
疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったＨＳＡ溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加した。この条件ではＨＳＡはＤＥＡＥ−セファロースに吸着することなく、カラムを通過した。
【００５１】
(5)  キレート処理
２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ  ＣＲＢ０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキレート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イオン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌した。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして回収した。
【００５２】
(6)  ホウ酸塩処理
ＨＳＡ濃度２．５％に調製し、溶液の電導度を１ｍＳ以下とした。四ホウ酸カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ｐＨを９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈殿を除去し、上清を回収して濃縮脱塩した。次いで、分画分子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理した。
【００５３】
実施例１
参考例１または参考例２で得られた培養液約８００ｌを圧搾することにより、培養上清を分離した。培養上清を分画分子量３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量約３万の限外濾過膜で用いて約８０ｌに濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。
濃縮液をｐＨ４．５に調整した後に再度、分画分子量３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量３万の限外濾過膜を用いてＨＳＡ溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に交換した。５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に平衡化したＳ−セファロース充填カラムにＨＳＡを吸着させ、同緩衝液で充分に洗浄後に、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９）でＨＳＡを溶出した。遊離多糖の含量をフェノール硫酸法で測定したところ、Ｓ−セファロース処理の前後で１／２０に低下した。Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたＨＳＡ溶液を６０℃で１時間加熱処理した。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、５ｍＭアセチルトリプトファン、１００ｍＭアミノグアニジンおよび１０ｍＭシステインの共存下にｐＨ７．５で行った。システイン処理の前後でＡ350 ／Ａ 280が５０％低減した。
【００５４】
実施例２（陽イオン交換体処理と加熱処理の順序と脱色効果の関係）
参考例１または参考例２で得られた培養液約８００ｌを圧搾することにより、培養上清を分離した。培養上清を分画分子量３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量約３万の限外濾過膜で用いて約８０ｌに濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。濃縮液をｐＨ４．５に調整した後に再度、分画分子量３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。この処理液を用いて以下の実験を行った。
▲１▼実施例１と同様に陽イオン交換体処理を行った後に加熱処理した。なお、膜分画（ＩＩ）後の遊離多糖の含量は、ＨＳＡ２５０ｍｇ／ｍｌ当たり１１０ｍｇ／ｍｌ程度、陽イオン交換体処理後のそれは５ｍｇ／ｍｌ程度であった。
▲２▼実施例１と工程順を逆にして、先に加熱処理を行った後に陽イオン交換体処理した。
各々の場合において、工程毎のＨＳＡ画分の着色度を測定し、比較検討した。結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
0003684584.tif 000005
【００５６】
表４に示されるように、陽イオン交換体処理後に加熱処理を行った場合では、着色度が加熱処理前後で５５％低減したのに対して、加熱処理を陽イオン交換体処理前に行った場合は３６％の低減に留まり、陽イオン交換体処理後に加熱処理を行った場合の方が、その反対の場合に比べて着色度が低く抑えられることが判明した。この差は、陽イオン交換体処理によりＨＳＡ画分中の遊離多糖がかなりの量で除去されたことに由来するものと考えられる。
【００５７】
実施例３（精製段階における加熱処理の位置（順序）と脱色効果の関係）
参考例３のＨＳＡの精製工程を基礎として、加熱処理の位置（順序）と脱色効果の関係について検討した。すなわち、参考例３では加熱処理は陽イオン交換体処理の直前に行っているが、加熱処理を最終工程にした場合、加熱処理を陽イオン交換体処理の直後にした場合、最終工程で再度加熱処理を追加して行った場合で着色度を比較検討した。各々の加熱処理条件は上記と同一とした。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
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