(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
0003610600.tif 000010
（但し、上式において、Ｒは炭素数が１〜22個の直鎖または分岐アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基もしくはアリール基を示す。）で表されるラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナンをカンジダ・アンタークティカを起源とするリパーゼを用いて不斉加水分解し、次式（２）：
【化２】
0003610600.tif 000011
で表される（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオールおよび次式（３）：
【化３】
0003610600.tif 000012
（但し、上式において、Ｒは上記と同じである。）で表される（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンの混合物とした後、これらを単離することを特徴とする光学活性エンド−２−ノルボルネオール類の製造方法。
【請求項２】
前記（３）式で表される（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンをさらに酸性条件下または塩基性条件下で加水分解し、次式（４）：
【化４】
0003610600.tif 000013
で表される（Ｓ）−エンド−２−ノルボルネオールとすることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬品等の合成中間体として有用な光学活性エンド−２−ノルボルネオール類の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医薬品等の生理活性物質を光学活性体として合成することの必要性が高まってきている。これらの物質に複数の光学異性体が存在する場合、各異性体間でその活性に差異が認められることが多いが、通常強い活性を示すのは一異性体であり、それ以外の異性体は活性が弱いか、しばしば望ましくない毒性を示すことが認められている。従って、生理活性物質を特に医薬品として合成する場合には、望ましい立体配置を持つ光学異性体を選択的に合成することが、十分な生理活性を発現させるという要請に加え、安全面からも強く望まれている。
【０００３】
従来、光学活性エンド−２−ノルボルネオールを得る方法としては、（１）ラセミ体のエンド−２−ノルボルネオールをジアステレオマー法により光学分割する方法  （Ｗｉｎｓｔｅｉｎら、  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，７４，  １１４７  （１９５２））、（２）ラセミ体の２−ノルボルナノンを微生物で立体選択的に還元して光学分割する方法（Ｎａｋａｚａｋｉら、  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，４５，  ４４３２  （１９８０））、（３）ラセミ体の２−ノルボルナノンを馬肝臓のアルコールデヒドロゲナーゼで立体選択的に還元する方法（Ｊｏｎｅｓら、  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，９８，  ８４７６  （１９７６））、（４）ラセミ体のエンド−２−ノルボルネオールを豚膵臓リパーゼの存在下、立体選択的にアシル化する方法（Ｓａｃｃｏｍａｎｏら、  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．  Ｌｅｔｔ．，  ３３，  １２０１  （１９９２））、（５）ラセミ体のエンド−２−酢酸ノルボルニルをカンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）を起源とするリパーゼの存在下、立体選択的に加水分解する方法（Ｂｒａｃｋｅｎｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．，１，  １０９３  （１９９３））、（６）ラセミ体のエンド−２−酢酸ノルボルニルをカンジダ・シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）を起源とするリパーゼの存在下、立体選択的にエステル交換反応を行わせる方法（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅら、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．，  １，  ２２８７  （１９９３））、（７）ラセミ体のエンド−２−ノルボルネオールをシュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属起源のリパーゼの存在下、立体選択的にアシル化する方法  （Ｎａｅｍｕｒａら、Ｂｕｌｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｊｐｎ．，６６，  ５７３  （１９９３）  等が報告されている。
【０００４】
しかしながら、（１）の方法は、光学純度を向上させるために再結晶を何度も繰り返す必要があり、効率的でない。また、（２）の方法は、使用する菌株の入手が困難であり、また仕込量に対して基質濃度が極めて低い（０．０７５Ｗ／Ｖ％）  などの問題点があり、好ましくない。（３）の方法は、アルコールデヒドロゲナーゼと補酵素であるＮＡＤの入手がともに困難な上、不斉収率も低いため実用性に乏しい。（４）の方法は、副反応が起こり易く、これを防止するためには反応系の水分を厳密に抑えなければならない。また、反応中に酵素を何度にも分けて添加する必要があり、操作が煩雑である。さらに、極めて引火性の強いジエチルエーテルを反応溶媒として使用する必要があるなどの欠点があり、工業的に不利である。（５）の方法は、原料エステルの入手が困難である上、生成物の光学純度が３２％ｅｅと低く満足のいくものではない。（６）の方法は、本発明の方法に最も近いものであるが、反応条件の開示が不十分な上、生成物の光学純度が６０％ｅｅと低いといった問題が避けられない。（７）の方法は、やはり生成物の光学純度が６３％ｅｅと低い上、反応系の水分を厳密に抑えなければ副反応が起こる恐れがある。また、アシル化剤であるイソプロペニルアセテートの安定性には不安があり、大量入手は困難である。
【０００５】
以上のように、従来の方法は何れも工業的レベルで実用化するには満足のいくものではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前記した従来技術の欠点を解消し、医薬品等の合成中間体として有用な光学活性エンド−２−ノルボルネオールを効率よく、大量かつ簡便に得ることができる製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明は以下の特徴を有する。
式（１）：
【０００８】
【化５】
0003610600.tif 000002
【０００９】
（但し、上式において、Ｒは炭素数が１〜22個の直鎖または分岐アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基もしくはアリール基を示す。）で表されるラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナンをカンジダ・アンタークティカを起源とするリパーゼを用いて不斉加水分解し、次式（２）：
【００１０】
【化６】
0003610600.tif 000003
【００１１】
で表される（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオールおよび次式（３）：
【００１２】
【化７】
0003610600.tif 000004
【００１３】
（但し、上式において、Ｒは上記と同じである。）で表される（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンの混合物とした後、これらを単離することを特徴とする光学活性エンド−２−ノルボルネオール類の製造方法。
好ましくは、前記（３）式で表される（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンをさらに酸性条件下または塩基性条件下で加水分解し次式（４）：
【００１４】
【化８】
0003610600.tif 000005
【００１５】
で表される（Ｓ）−エンド−２−ノルボルネオールとする。
リパーゼが担体に固定化されたものであることが好ましい。
【００１６】
リパーゼを固定化するための担体としては、多孔質ポリプロピレン、多孔質アクリル樹脂、表面をホルミル基またはエポキシ基で修飾した多糖類ゲル、表面をホルミル基またはエポキシ基で修飾したアクリル樹脂、表面をホルミル基またはエポキシ基で修飾したシリコン系重合体ゲルからなる群から選ばれる。
本発明の製造方法は、出発原料として（１）式に示すラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナンを用いるが、該式中のＲは炭素数が１〜２２個の直鎖または分岐アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基なる群から選ばれる。特に好ましくは、直鎖アルキル基として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチルおよびｎ−ペンチルの各基を、分岐アルキル基として、ｉ−プロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基およびネオペンチル基を、アルケニル基として、ビニル基および２−メチルビニル基を、シクロアルキル基として、シクロヘキシル基を、アリール基として、フェニル基を、アラルキル基として、ベンジル基をそれぞれ挙げることができる。
【００１７】
該（１）式に示すラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナンは、ラセミ体のエンド−２−ノルボルナノールを公知のアシル化方法を用い、例えば、ピリジン等の塩基の存在下、非プロトン性溶剤中で塩化アシルによりアシル化することにより得ることができる。
本発明の製造方法は、（１）式に示すラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナンを、リパーゼと溶媒の混合下に攪拌し、加水分解反応させることにより行われる。
【００１８】
該加水分解反応時の温度は一般に０℃ないし１００℃が適するが、好ましくは１０℃ないし５０℃である。０℃よりも反応温度が低いと反応が進行し難く、また１００  ℃を越えると、リパーゼの失活現象が現われ、反応が進行しにくくなるので好ましくない。
また、反応時間は一般に１時間ないし１０００時間が適するが、好ましくは１時間ないし２００時間である。反応時間は、反応温度に左右されるが、時間が短すぎると反応が進行し難く、また長すぎると反応効率の面からも好ましくない。
【００１９】
使用するリパーゼの量は、一般に基質の0.1ないし500重量％が適するが、好ましくは１ないし100重量％である。下限の0.1重量％未満では、反応が進行し難く、また上限の500重量％を越えると、反応液の粘度が上昇して攪拌操作が困難となる上、目的生成物の単離操作が困難になるといった操作上の問題に加え、触媒作用に比べ使用量が徒らに増大することとなり、経済的に好ましくないといった問題を生ずる。
リパーゼの種類としては、ラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナンに作用し加水分解反応を触媒するカンジダ・アンタークティカを起源とするリパーゼである。その具体例として、商品名ＳＰ４３５またはＳＰ５２５の下に市販されている上記起源のリパーゼ（共にノボ・ノルディスク社製）を挙げることができる。
【００２０】
使用後のリパーゼは再利用することが望ましいが、そのためには固定化したリパーゼを用いることが有効である。
その際、市販の固定化リパーゼをそのまま用いるか、あるいは未固定のリパーゼについてはこれを例えば下記の方法により固定化して用いることができる。即ち、未固定のリパーゼをまずイオン交換水、蒸留水または緩衝溶液に分散させ、次いで担体を加える。リパーゼは担体が吸着型の場合には、これに吸着、固定化される。一方、担体が共有結合型の場合には、リパーゼは担体上の官能基と反応し、次いで必要により反応部を例えば還元などの方法で安定化させることにより固定化させることができる。
【００２１】
上記の担体として、高分子物質、例えばポリプロピレン、アクリル樹脂、多糖類ゲルまたはシリコーン樹脂の粉体や粒体であって、吸着型のものは多孔質構造を有しており、一方、共有結合型のものは表面が臭化シアンなどで活性化されるか、ホルミル基、エポキシ基、カルボキシル基またはアミノ基等で修飾されたものを一般的に示すことができる。
【００２２】
吸着型担体の中では、特に高分子物質がポリプロピレンまたはアクリル樹脂のものが好ましく、また共有結合型担体の中では、特に表面をホルミル基またはエポキシ基で修飾したそれぞれアクリル樹脂、多糖類ゲルまたはシリコーン樹脂から得られるものが好ましい。なお、ホルミル基で修飾した多糖類ゲルの具体例として、ホルミルセルロファイン（商品名、チッソ株式会社製）を示すことができる。
【００２３】
加水分解反応終了後、固定化リパーゼは濾過あるいは傾斜法等により反応系内から回収され、そのまま次回の反応に用いることができる。
使用溶媒としては、イオン交換水、蒸留水または緩衝液が適している。またこれらの溶媒と混合性が良好な有機溶媒、例えばアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール類等を共溶媒として用いることもできる。溶媒の量は、基質であるラセミ体のエンド−２−アシルオキシノルボルナン（１）の０．１ないし１００重量倍であるが、反応効率を考慮した場合、好ましくは１ないし１０重量倍である。
【００２４】
また、反応の進行に伴い、有機酸が遊離してくるので、このことを考慮して系内をリパーゼの至適ｐＨに保つ必要がある。その手段としては、リパーゼの至適ｐＨに調整した緩衝液を使用する方法や水酸化ナトリウム水溶液を適宜滴下して系内のｐＨをリパーゼの至適ｐＨに保つ方法等がある。
加水分解反応終了後、生成する（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオールと（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンの混合物は有機溶媒による抽出の後、抽出液の濃縮、さらに蒸留またはカラムクロマトグラフィー等の処理を経て、それぞれ（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオールと（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンとに単離される。該（Ｓ）−エンド−２−アシルオキシノルボルナンは、さらに酸性条件下あるいは塩基性条件下の加水分解処理に付され、光学活性な（Ｓ）−エンド−２−ノルボルネオールとなる。
【００２５】
本発明により得られる光学活性なエンド−２−ノルボルネオールは、医薬品等の合成中間体として有用である。
例えば、上記により得られるＲ−（＋）−エンド−２−ノルボルネオール（２）は下記参照の工程を経て喘息、気管支炎及び皮膚炎等の治療薬として有用なピリミドン誘導体（９）へ導くことができる。
【００２６】
【化９】
0003610600.tif 000006
【００２７】
すなわち、該Ｒ−（＋）−エンド−２−ノルボルネオール（２）はテトラヒドロフラン中、アゾジカルボン酸ジエチルとトリフェニルホスフィンの存在下３−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒドと還流下に反応させることにより、３−［（２Ｓ）−エキソ−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イルオキシ］−４−メトキシベンズアルデヒド（６）を得た後、続く３工程（ＥＰＯ  ４２８  ３１３  Ａ  参照）を経てピリミドン誘導体（９）へと誘導される。
【００２８】
さらに、上記のＲ−（＋）−エンド−２−ノルボルネオール（２）は、下記参照の工程を経て血液凝固阻止剤として有用なトロンボキサンＡ２受容体アンタゴニスト（１４）へ導くこともできる。
【００２９】
【化１０】
0003610600.tif 000007
【００３０】
すなわち、該Ｒ−（＋）−エンド−２−ノルボルネオール（２）は、アセトン中冷却下に、予め硫酸と三酸化クロムから調製したジョーンズ試薬と反応させることによりＲ−（＋）−２−ノルボルナノン（１０）を得た後、続く数段階の工程（Ｎａｒｉｓａｄａ等の方法、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，３１，  １８４７  （１９８８））を経て目的のトロンボキサンＡ２受容体アンタゴニスト（１４）へと誘導される。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の利点を述べると次の通りである。
(1) 光学活性エンド−２−ノルボルネオールを高い光学純度（88〜93％ee）で得ることができる。
(2) リパーゼを固定化した場合、その回収と再利用ができる。
(3) 本発明の製造方法は加水分解反応に基づいているため、水分の混入を気にすることなく、解放系で実施できる。
(4) 温和な反応温度下（室温付近）で実施できる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例によりさらに詳しく説明する。尚、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
なお、実施例中における光学活性なエンド−２−ノルボルネオールの光学純度は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（商品名    β−ＤＥＸ（登録商標）１２０；スペルコ社製）により分析して算出した。
【００３３】
実施例１
ラセミ体のエンド−２−プロピオン酸ノルボルニル1.7ｇ（10mmol）、リパーゼ（ＳＰ４３５、起源／Candida antarctica、ノボ・ノルディスク社製）0.25ｇおよび0.7Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.0）30mlとを混合し、35℃で160時間攪拌した。この時点で上記ラセミ体化合物の転換率は37％であった。反応液からリパーゼを濾去した。
【００３４】
濾液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオール（0.39ｇ、3.5mmol、35％）を得た。このものを前述のガスクロマトグラフィーに付して光学純度を測定したところ、93％eeであった。
【００３５】
実施例２
リパーゼをＳＰ４３５に代えてＳＰ５２５（起源／Candida antarctica、ノボ・ノルディスク社製）とし、かつ攪拌時間を110時間とする以外は実施例１と同様にして混合物を調整し、攪拌した。この時点で転換率は47％であった。
【００３６】
次いでリパーゼの濾去からシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すまでの工程を実施例１と同様に行い、（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオール（0.50ｇ、4.3mmol、43％）を得た。このものを前述のガスクロマトグラフィーに付して光学純度を測定したところ、88％eeであった。
【００３７】
比較例１〜８
表１に示す各種の酵素０．２５ｇをそれぞれラセミ体のエンド−２−プロピオン酸ノルボルニル１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）および０．７Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌと混合し、所定時間、３５℃で攪拌した。その結果（転換率、光学純度）を表１に示す。
【００３８】
【表１】
0003610600.tif 000008
【００３９】
注：
１）起源／Ｐｏｒｃｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ、ノボ・ノルディスク社製
２）起源／Ｐｏｒｃｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ、ノボ・ノルディスク社製
３）起源／Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、ノボ・ノルディスク社製
４）起源／Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．、ノボ・ノルディスク社製
５）起源／Ｐｏｒｃｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ、ノボ・ノルディスク社製
６）起源／Ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ、シグマ社製
７）起源／Ｐｏｒｃｉｎ  ｌｉｖｅｒ、シグマ社製
８）起源／Ｐｏｒｃｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｓ、天野製薬社製
【００４０】
表１からも明らかなように、各比較例は本発明に含まれない酵素を用いる場合を示しているが、何れの結果も、反応性（転換率）と立体選択性（光学純度）が共に著しく劣るか、反応性がある程度良好であっても（比較例４及び比較例７参照）、立体選択性に劣ることが知られる。これに対し、カンジダ属起源の酵素を用いる本発明の前記実施例１〜４では、転換率が１６〜７６％、光学純度が７６〜９３％ｅｅであり、反応性と立体選択性がともに良好であることが知られる。
【００４１】
実施例３
実施例２で用いたものと同じリパーゼ（ＳＰ５２５）0.25ｇを、0.1ＭのＮａＣｌを含む0.2Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.0）40ml中に溶解させた。この溶液と水洗した担体（商品名ホルミルセルロファイン、チッソ社製）20ｇとを混合し、室温で30分間攪拌した。これにシアノ水素化ホウ素ナトリウム0.14ｇを加え、室温で12時間攪拌した。上澄を濾去し、濾残を0.2Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.2）300 mlで洗浄した後、エタノールアミン0.24ｇおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウム0.1ｇを含む0.2Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.2）40mlを加え、室温で３時間攪拌した。上澄を濾去し、濾残を0.1Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ8.0）150ml、次いで0.07Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ7.0）100mlで洗浄し、固定化リパーゼを得た。
【００４２】
得られた固定化リパーゼ２０ｇ、ラセミ体のエンド−２−プロピオン酸ノルボルニル１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）および０．７Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌの混合物を３５℃で５０時間攪拌した。この時点で転換率は４７％であった。反応液から固定化リパーゼを濾去、回収した。濾液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、（Ｒ）−エンド−２−ノルボルネオール（０．５０ｇ、４．５ｍｍｏｌ、４５％）を得た。このものを前述のガスクロマトグラフィーに付して光学純度を測定したところ、８８％ｅｅであった。
【００４３】
実施例４
実施例３で回収した固定化リパーゼを用い、実施例３と同様にしてラセミ体のエンド−２−プロピオン酸ノルボルニルの加水分解反応を行い（第２回目）、以下この操作を11回目まで繰り返し行った。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
0003610600.tif 000009
【００４５】
表２から明らかなように、実施例３で回収した固定化リパーゼを使用すると、繰り返し使用しても立体選択性が良好であり、活性が低下しにくいことがわかった。すなわち、本発明の方法によれば、高価なリパーゼを繰り返し使用できるので、光学活性なエンド−２−ノルボルネオールを安価に、効率よく、かつ大量に生産することができる。