(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式で表される構造を有する、ポジトロンエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）計測用ムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物。
【化１】
0003728376.tif 000006
【請求項２】
（１）１４Ｎ（ｐ、α）１１Ｃ反応により、１１Ｃラベル化二酸化炭素（［１１Ｃ］ＣＯ２）を合成するステップと、
（２）前記１１Ｃラベル化二酸化炭素とヨウ化水素とにより、１１Ｃラベル化ヨウ化メチルを合成するステップと、
（３）（＋）３−ピペリジルベンジル酸エステルを、前記１１Ｃラベル化ヨウ化メチルでＮメチル化して、（＋）３−Ｎ−１１Ｃラベル化メチルピペリジルベンジル酸エステルを合成するステップと、
を含む、（＋）３−Ｎ−１１Ｃラベル化メチルピペリジルベンジル酸エステルを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物、その製造方法、及びその合成中間体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化社会を迎えて、痴呆患者数の増加による経済負担の増加が社会的な問題となってきており、かかる痴呆の病理解明とともに効果的な抗痴呆薬の開発が必要とされている。
【０００３】
実際痴呆の病理はいまだ解明されていないが、従来の研究はアセチルコリン神経系の機能低下がその原因の１つであることが示唆されている。また、痴呆の病態解明・抗痴呆薬開発において、アセチルコリン神経薬を評価するための非侵襲的方法、及びその方法に適した標識化合物は、極めて重要な役割を果たすものであり、その開発研究が強く望まれている。係る方法として、ポジトロン放出核種で標識した標識化合物を用いたポジトロンエミッショントモグラフィ（以下ＰＥＴという）計測方法がしられているが、上記目的を達成するための十分な性質を有するＰＥＴ計測用ムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物は知られておれず、その開発が強く望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＰＥＴ計測に使用可能な、新規なムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物、その合成方法に関わるものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
従来、係るＰＥＴ計測用のムスカリン性アセチルコリン神経系の標識化合物として提案されてきたものに、［11C］N-methyl-4-piperidyl benzilate（以下、［11C］4NMPBとする）があるが、以下の問題点がある。
【０００６】
すなわち、4NMPBは、(i)血中においてイオン性が低いため、脂溶性が大きく、組織への移行性は良いが、組織内における非特異的結合量が多く、特異結合の算出に誤差を生じ易い、(ii)その構造から光学異性体が存在しないことも、特異的結合を算出する際の誤差の要因となる、(iii)4NMPBはムスカリン性アセチルコリン神経受容体に対する親和性（アフィニティ）が高く、解離定数(k4)が非常に小さいため、その脳内動態が局所脳血流量の変化に影響を受けやすく、脳循環量の低下を伴うような病態や疾病モデルでは、計測された結果が真のムスカリン性アセチルコリン神経受容体活性の変化によるものか、単に局所脳血流量の変化によるものかの弁別が困難である、また(iv)4NMPBはムスカリン性アセチルコリン神受容体に対する親和性（アフィニティ）が、内在性の神経伝達物質であるアセチルコリンに比較して非常に高いため、神経伝達によって惹起される節前神経からのアセチルコリンの放出による、受容体上での競合を計測することができないといういくつかの問題点である。
【０００７】
本発明者等は、上記問題点を解決した新規なＰＥＴ計測用のムスカリン性アセチルコリン神経系の標識化合物を見出すため、鋭意研究開発を行い、従来の11C］4NMPBの特性を上回る新規標識化合物として、［11C］(+)N-methyl-3-piperidyl benzilate（以下、［11C］(+)-3NMPBとする）を見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明に係る新規ムスカリン性アセチルコリン神経系の標識化合物は、ＰＥＴ計測用標識化合物として使用し、脳機能をアセチルコリン神経系の受容体の機能から計測できるものである、脳機能の診断・治療の客観的評価規準として重要な新規手段を提供するものである。
【０００９】
さらには、本発明に係る新規ムスカリン性アセチルコリン神経系の標識化合物は、抗痴呆薬開発における前臨床試験、特にヒトに最も類似したヒト以外の霊長類を対象にした試験において、客観的な評価規準を与えることを可能とするものである。現在提唱されているアセチルコリン神経系の機能低下と痴呆との関連を解明するために新規な手段を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、次式で表される構造を有する、ポジトロンエミッショントモグラフイ（ＰＥＴ）計測用ムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物を提供するものである。
【００１１】
【化３】
0003728376.tif 000002
【００１２】
さらに、本発明は、次式で表される構造を有する、ポジトロンエミッショントモグラフイ（ＰＥＴ）計測用ムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物の合成方法を提供するものである。すなわち、(1)  14N(p、α)11C反応により、11Cラベル化二酸化炭素（［11C］CO2）を合成するステップと、(2)  前記二酸化炭素をヨウ化水素により11Cラベル化ヨウ化メチルを合成するステップと、(3)  (+)3-ピペリジルベンジル酸エステルを、前記ヨウ化メチルでＮメチル化して(+)3-N-メチルピペリジルベンジル酸エステルを合成する方法である。
【００１３】
また、本発明は、次式で表される構造を有する、ポジトロンエミッショントモグラフイ（ＰＥＴ）計測用ムスカリン性アセチルコリン神経系標識化合物の合成中間体を提供するものである。
【００１４】
【化４】
0003728376.tif 000003
【００１５】
以下、実施の形態に従って本発明を説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
（合成方法）
本発明に係る新規ムスカリン性アセチルコリン神経系の標識化合物は、下式に示される化学構造を有するものである（［11C］(±)-3NMPBとして表されている）。ここでは、光学異性体の混合物として表されているが、以下説明するように、適当な手段を用いることで、各光学異性体のそれぞれをも別に単離することができるものであり、下式中の［11C］(±)-3NMPBは、［11C］(+)-3NMPBおよび［11C］(-)-3NMPBを別々に表している場合も含むものである。
【００１７】
【化５】
0003728376.tif 000004
【００１８】
さらに、上の式には、本発明に係る上記標識化合物の合成中間体としての3-piperidyl benzilate（以下3PBとする）が示されている。この化合物は、3-ピペリジノールのベンジル酸エステルである。同様に、ピペリジル基は１つの不斉炭素を有していることから光学異性体(+)-3PB、および(-)-3PBの当量混合物として表されているが、［11C］(±)-3NMPB同様、それぞれを光学分割することが可能であり、上の式はこのそれぞれの異性体をも含むものである。
【００１９】
本発明においては、［11C］(±)-3NMPBの合成方法については特に制限はない。11C誘導体でない場合には、化学構造からは上記3PBのＮメチル化体である。従って係る化学構造を有する3NMPBの合成方法は、通常公知の合成方法が応用可能である。具体的には、3PBのＮにメチル化反応によりメチル基を導入する方法、またはあらかじめメチル基を導入したN-メチル-3-ピペリジノールを出発物質として使用し、ベンジル酸、ベンジル酸エステル等と反応させることからも得られる。
【００２０】
さらにこの場合、(±)N-メチル-3-ピペリジノールを使用した場合には、さらに上で説明した適当な光学分割手段を用いて(+)-3NMPBまたは(-)-3NMPBを単離することが可能である。または、あらかじめ光学分割されたN-メチル-3-ピペリジノールを使用することでいずれかの光学異性体を合成することが可能となる。
【００２１】
また、同様に得られた光学異性体の同定については既に説明したように、ＮＭＲ、質量分析等の種々の手段を使用可能である。さらに、光学分割カラムクロマトグラフの特定の測定条件下での保持時間、または旋光度等を比較することにより可能である。さらに、上記の絶対配置が知られているピペリジノール誘導体を用いた場合は、得られた3NMPBの絶対配置も知ることが可能となる。
【００２２】
さらに、本発明においては、ＰＥＴ計測用標識体を得るために、ポジトロン放出核種で標識する必要があるが、特に制限されないが、半減期等の関係から11Cで標識することが好ましい。すなわち、この場合、11Cの半減期は約20分であり、係る半減期を有する標識体は、以下に説明する本発明の目的に係るＰＥＴ計測用としては好ましいものである。
【００２３】
係る11Cによる標識は、本発明においては特に制限はないが、標識反応が少ないステップであること、精製工程が容易なこと、11C源の入手の容易さ等から、上の式に示したスキームによることが好ましい。すなわち、11Cから得られる11CO2から出発し、これをヨウ化メチルに変換する。この還元反応においては特に制限はないが、還元剤としてLiAlH4を使用することが特に好ましい。得られる11Cラベル化したヨウ化メチルは上で説明した3-PBをＮメチル化することにより11Cでラベル化した3-NMPBへ変換することが可能である。
【００２４】
また、本発明において、3-NMPBの合成中間体である(+)-3PB、および(-)-3PBの合成方法についても特に制限されることなく通常公知の合成方法が使用可能である。具体的には、(±)3-ピペリジノールとベンジル酸、又はベンジル酸のエステルとの反応により得られる。
【００２５】
【化６】
0003728376.tif 000005
【００２６】
特にベンジル酸のエステルと(±)3-ピペリジノールとの反応が好ましく、この場合、ベンジル酸エステルとしてはメチルエステルの使用が好ましい。
【００２７】
さらにこの場合、得られた(±)-3PBは、通常公知の種々の光学分割手段により光学分割することが可能である。具体的には、シリカゲルに多糖誘導体を担持させたカラムクロマトグラフの使用が好ましく、市販品も入手可能である。分割された各光学異性体の同定は、特定のカラムクロマトグラフ条件下での保持時間の比較、光学異性シフト試薬を用いた核磁気共鳴吸収スペクトル（以下ＮＭＲとする）における特定の核種の化学シフトの比較、及び旋光度の比較等により可能である。
【００２８】
また、あらかじめ光学分割された3-ピペリジノールを出発物質として上記説明したベンジル酸等と反応させ、(+)-3PBまたは(-)-3PBを合成することが可能である。かかる場合は、使用した3-ピペリジノールの絶対配置が知られている場合には、得られる3PBの絶対配置も知ることが可能となる。
【００２９】
また、この反応条件を使用してラベル化する場合、すでに光学分割された原料として(+)-3PB又は(-)-3PBを使用することが可能となる。
【００３０】
さらに、11C核の製造、ヨウ化メチルへの変換、Nメチル化反応、反応生成物の生成等については、通常の放射生化合物の取扱方法に準じて安全に行うことが可能である。得られた11C標識化合物の貯蔵、濃度調整等についても同様に適当な装置を使用することで安全に取り扱うことが可能である。
【００３１】
（ＰＥＴ計測）
被検体たるサルの入手、必要な前処理、必要なＰＥＴ計測装置、被検体への投与方法等については、従来公知の方法に準じて実施することが可能である（H.Onoe, O.Inoue, K.Suzuki, H.Tsukada, T.Itho, N.Mataga, Y.Watanabe, Brain Research 663 (1994) 191-198）。
【００３２】
ＰＥＴ計測条件は、実験動物の有するサイズの小型の脳の細部まで弁別できる空間分解能に優れたＰＥＴシステム（例えば浜松ホトニクス（株）製ＳＨＲ−７７００）と、麻酔薬の影響を避けるために無麻酔サルの組合せが好ましく使用できる。この場合、得られた計測データを画像再構成ソフト（例えば浜松ホトニクス（株）製ＳＨＲ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌ  ＩＩ）により処理し、イメージ画像化することが可能である。
【００３３】
【実施例】
以下実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
測定機器および測定条件
ＮＭＲスペクトルは、Varian 社製、Gemini 2000  スペクトロメーター（300mHz)；クロロホルム-d3、δppm、TMS）にて測定した。
【００３５】
質量分析は、日本電子社製、JMSAX-500にて測定した。
【００３６】
旋光度は、日本分光社製、JASCO DIP-370にて測定した。
【００３７】
以下の実施例で使用した高速液体クロマトグラフィ（HPLC)条件は以下に示した。
【００３８】
また、以下のHPLC測定系においてはUV吸収(254 nm)および放射活性とは連続して検出された。
【００３９】
系（Ａ）
カラム：ダイセル化学キラルセルOJカラム(Daiseru Chemicals Chiralcel OJ column)(4.6x250 mm)
溶媒：ヘキサン／エタノール混合溶媒（80/20、v/v）
流速：0.5 ml/分
系（Ｂ）
カラム：Waters μBondapak-C18カラム(7.8x300 mm)
溶媒：アセトニトリル/0.1M 酢酸ナトリウム(AcONa)/酢酸混合溶媒（700/300/1、v/v/v）
流速：7 ml/分
系（Ｃ）
カラム：GL Science Inertsil ODSカラム(4.6x250 mm)
溶媒：アセトニトリル/0.1M 酢酸アンモニウム(AcONH4)/酢酸混合溶媒（500/500/1、v/v/v）
流速：2 ml/分
薄層クロマトグラフ(TLC)はメルク製の0.2mm厚のシリカゲルを塗布したアルミニウムプレートで行った。展開溶媒は、ブタノール／酢酸／水（4/1/1、v/v/v）混合溶液であった。
【００４０】
比放射能は最終溶液における全放射能の測定とUV吸収により決められた濃度と、既知濃度の3NMPBとの比較によった。
【００４１】
(+)3-ピペリジルベンジル酸エステル（(+)3-piperidyl benzilate、(+)-3PB）の合成。
【００４２】
攪拌器、環流冷却器、環流冷却により滴下する溶媒からメタノールをトラップするためのモレキュラーシーブ4A(15g)管とソーダライム管をつけた50mlの三つ首フラスコに、30mlベンゼン、0.4g(4 mmol)の3-ピペリジノール(3ーpiperidinol)、および1.0g（4 mmol)のベンジル酸メチルエステル(methyl benzilate)を入れた。この混合物を攪拌しつつ加熱環流した。すべてのベンジル酸メチルエステルが溶解した後、20mgのナトリウムメトキシド(sodium methoxide、Aldrich社製)を環流溶媒に加えた。３時間後、反応混合物を室温に冷却した。1Nの塩酸を50ml加え、有機溶媒層を除いた。得られた水溶液層を50mlエーテルで２回洗浄した後、水溶液層を水酸化アンモニウム(28%)で塩基性とした。得られたエステルを30mlのエーテルを２回用いて溶解した後、エーテル層を分離した。エーテル層を50mlの水で２回洗浄し、エーテル層を無水炭酸カリウムで乾燥した。乾燥剤を除いた後、溶媒を減圧下で留去した。得られた油状の残渣をエーテル−ヘキサンから再結晶して結晶性生成物として3PBを0.5g(収率40%)得た。
【００４３】
得られた3PBの構造確認は、1Ｈ−ＮＭＲ、及び質量分析で行った。
【００４４】
1Ｈ-ＮＭＲデータ：7.36（m、10H）、4.92（m、1H)、2.94（m、1H）、2.70(m,4H)、1.82(m,1H)、1.71(m,1H)、1.47(m,2H)、1.26(m,4H)。
【００４５】
質量スペクトル：m/z（相対強度）312(0.16)、183(35.5)、105(45.1)、83(100)、77(30.0)。
【００４６】
3PBの光学分割は、上記HPLC系（Ａ）で行った。保持時間は、(+)-3PBが27.0分、(-)-3PBが16.8分であり、［αD］は+13.8°（濃度0.97%)であった。
【００４７】
(+)3-N-メチルピペリジルベンジル酸エステル（(+)3-N-methylpiperidyl benzilate、(+)-3NMPB）の合成。
【００４８】
上で説明した合成反応条件において、0.45gの3-ピペリジノールの代わりに、0.4gの3-N-メチルピペリジノールを用いて実施し、3-N-メチルピペリジルベンジル酸エステルを0.43g（収率33%)得た。構造決定は1Ｈ−ＮＭＲ、及び質量分析で行った。
【００４９】
1Ｈ-ＮＭＲデータ：7.36（m、10H）、5.02（m、1H)、2.69（m、1H）、2.46(m,4H)、2.24(s,3H)、2.17(m,1H)、1.94(m,1H)、1.82(m,2H)、1.71(m,1H)、1.58(m,1H)、1.41(m,1H)、1.26(m,4H)。
【００５０】
質量スペクトル：m/z（相対強度）325(0.38)、183(15.2)、105(23.2)、97(100)、77(15.5)。
【００５１】
3MNPBの光学分割は、上記HPLC系（Ａ）で行った。保持時間は、(+)-3MNPBが15.8分、(-)-3MNPBが13.2分であり、［αD］は+19.7°（濃度0.71%)であった。
【００５２】
ヨウ化［11C］メチル(［11C］methyliodide、［11C］CH3I)の合成。
【００５３】
［11C］ニ酸化炭素（［11C］CO2）は、Japan Steal Works BC-168サイクロトロンを用いて、14N(p、α)11C反応により製造された。［11C］CO2を水素化リチウムアルミニウムで還元し、さらにヨウ化水素酸で処理して［11C］CH3Iを得た。この合成は、Japan Steal Works CBBを用いて行った。
【００５４】
(+)3-N-［11C］メチルピペリジルベンジル酸エステル（(+)3-N-［11C］methylpiperidyl benzilate、［11C］(+)-3NMPB）の合成。
【００５５】
P2O5およびソーダライムトラップを通じたヘリウム(150ml/分)流で、ヨウ化［11C］メチルを、200μｌのDMFに溶解した(+)-3PB(0.5mgの入った2 mlの反応バイアルに-40℃でトラップした。放射能が最大に達した時に、バイアルを５分間80℃に加熱した。バイアルを冷却した後、反応混合物をHPLC系（Ｂ）に導入した。保持時間は10.5分であった。純粋な［11C］(+)-3NMPBをフラスコに単離した。溶媒を蒸発させた後、残渣を生理的食塩水(10ml)に溶解し、0.22μmの滅菌フィルターを通じて10 mlのマルチドースバイアルに濾過して入れ、滅菌、熱分解のない組成物を得た。［11C］(+)-3NMPBの最終組成物の放射化学純度と比活性はHPLC系（Ａ）と系（Ｃ）およびTLCで測定した。
【００５６】
ＰＥＴ測定
上記の方法で得られたポジトロン放出核種である11Cで標識された［11C］-CH3Iを、上記方法で得られた(+)3-piperidyl benzilate（以下、(+)-3PB）、または(-)3-piperidyl benzilate（以下、(-)-3PB）に反応させＮメチル化して、比放射能値37GBq／μmol以上、放射化学純度99%以上の品質を有するN-メチル化標識化合物を合成し、以下のＰＥＴ測定に使用した。さらに、光学異性体のそれぞれについて合成しそれを用いたＰＥＴ測定を行った。それぞれを［11C］(+)-3NMPB、及び［11C］(-)-3NMPBとする。
【００５７】
測定は、被検体として体重5kg前後のアカゲザルを無麻酔下でＰＥＴ装置に固定（H.Onoe, O.Inoue, K.Suzuki, H.Tsukada, T.Itho, N.Mataga, Y.Watanabe, Brain Research 663 (1994) 191-198に記載の方法に従った）して行った。また、ＰＥＴ測定の吸収補正のためにトランスミッションを計測した後、該被検体に約200MBqの［11C］(+)-3NMPBまたは［11C］(-)-3NMPBを静脈より投与し、76分間のダイナミック計測を行った。
【００５８】
また、同一の被検体の測定から得られた核磁気共鳴断層画像装置（以下ＭＲＩとする）による脳の断層画像に基づき、関心領域（ＲＯＩ）を決定し、各ＲＯＩにおける上記標識化合物によるＰＥＴイメージングの経時変化を測定した。
【００５９】
その結果、［11C］(+)-3NMPBを投与した場合は、図１および３に示されるように、基底核・後頭葉に高い分布が認められ、さらに前頭葉・側頭葉にも比較的高い分布が認められた。この結果は、従来知られてきたアセチルコリンのムスカリン受容体の分布とよく一致するものであり、［11C］(+)-3NMPBが活性体であることを意味する。
【００６０】
一方［11C］(-)-3NMPBの投与した場合には、いずれのＲＯＩにおいても、脳内でアセチルコリンのムスカリン受容体がほとんど存在しない小脳と同一の動態を示した（図２、４）。この結果は［11C］(-)-3NMPBが不活性体であることを意味する。
【００６１】
さらに、［11C］(+)-3NMPBは脳内への取込量の絶対量は［11C］4-NMPBに比較して低いが、小脳との相対比、すなわち特異的結合量で評価すると、各ＲＯＩにおいて極めて高い値を示すことが示された（図５、６）。ここで、［11C］(+)-3NMPBは脳内への取込量の絶対量が低いのは、脂溶性が低いためと考えられる。
【００６２】
また、図７、８、９には、アセチルコリンのムスカリン受容体のアンタゴニストであるスコポラミンの前投与により、［11C］(+)-3NMPBの各ＲＯＩにおける特異的結合量が用量依存的に低下することが示されている。
【００６３】
また、シナプス間隙のアセチルコリンの量を増加させるために、アセチルコリンの分解酵素の阻害薬であるフィゾスチグミンを前投与した場合、［11C］(+)-3NMPBの特異結合量は減少した（図１１、１３）。一方［11C］4NMPBの特異結合は、フィゾスチグミンの前投与による血流増加を反映した増加傾向を示した（図１０、１２）。
【００６４】
以上の結果から、(+)-3NMPBがアセチルコリンのムスカリン受容体に対する特異的結合活性を有すること、一方(-)-3NMPBがアセチルコリンのムスカリン受容体に対する特異的結合活性をほとんど有しないことが明らかとなった。
【００６５】
さらに、11Cでラベル化することにより、(+)-3NMPBのアセチルコリンのムスカリン受容体に対する特異的結合活性をＰＥＴを用いることで非侵襲的に計測することが可能となった。
【００６６】
この場合、アセチルコリンのムスカリン受容体に対する特異的結合活性をほとんど有しない［11C］(-)-3NMPBを対照として使用することにより、脳内の各ＲＯＩにおける［11C］(+)-3NMPBの特異結合のより正確な計測が可能となる。
【００６７】
さらに、(+)-3NMPBを用いることにより、従来の4NMPBを使用した場合に生じる血流変化の影響を受けることなく、アセチルコリン神経の活動をシナプスへのアセチルコリンの放出量を指標として計測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＥＴにより計測した［11C］(+)-3NMPBの無麻酔アカゲザルの脳内分布を表すＰＥＴイメージを示す写真である。
【図２】ＰＥＴにより計測した［11C］(-)-3NMPBの無麻酔アカゲザルの脳内分布を表すＰＥＴイメージを示す写真である。
【図３】無麻酔アカゲザルの脳内の各ＲＯＩにおける［11C］(+)-3NMPBの経時変化を示す図である。
【図４】無麻酔アカゲザルの脳内の各ＲＯＩにおける［11C］(-)-3NMPBの経時変化を示す図である。
【図５】［11C］(+)-3NMPBの特異結合を表す図である。
【図６】［11C］4NMPBの特異結合を表す図である。
【図７】［11C］(+)-3NMPBの特異結合におよぼすスコポラミンの影響を表す図であり、Salineのみの場合の結果を示す図である。
【図８】［11C］(+)-3NMPBの特異結合におよぼすスコポラミンの影響を表す図であり、スコポラミン５μg/kg投与した場合の結果を示す図である。
【図９】［11C］(+)3-NMPBの特異結合におよぼすスコポラミンの影響を表す図であり、スコポラミン５０μg/kg投与した場合の結果を示す図である。
【図１０】［11C］(+)-3NMPBの特異結合におよぼすフィゾスチグミンの影響を示す図であり、フィゾスチグミン100μg/kg投与した場合の結果を示す図である。
【図１１】［11C］(+)-3NMPBの特異結合におよぼすフィゾスチグミンの影響を示す図であり、Salineのみの場合の結果を示す図である。
【図１２】［11C］4NMPBの特異結合におよぼすフィゾスチグミンの影響を示す図であり、フィゾスチグミン100μg/kg投与した場合の結果を示す図である。
【図１３】［11C］4NMPBの特異結合におよぼすフィゾスチグミンの影響を示す図であり、Salineのみの場合の結果を示す図である。
【図１】
0003728376.tif 000007
【図２】
0003728376.tif 000008
【図３】
0003728376.tif 000009
【図４】
0003728376.tif 000010
【図５】
0003728376.tif 000011
【図６】
0003728376.tif 000012
【図７】
0003728376.tif 000013
【図８】
0003728376.tif 000014
【図９】
0003728376.tif 000015
【図１０】
0003728376.tif 000016
【図１１】
0003728376.tif 000017
【図１２】
0003728376.tif 000018
【図１３】
0003728376.tif 000019