(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ドメイン、及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメインを含んで成る単量体ポリペプチドであって、前記ドメインは連結されているが、相互に連合(associate)して抗原結合部位を形成することができず、
前記単量体ポリペプチドは第2ポリペプチドと共に二量体を形成することができ、この第2ポリペプチドは、
第2単量体ポリペプチドであるか;又は
免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ドメインと免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメインとを含んで成る第2ポリペプチドであり;
前記単量体ポリペプチドの前記第1ドメインは前記第2ポリペプチドの前記第2ドメインと連合して抗原結合部位を形成することができ、そして前記単量体ポリペプチドの前記第2ドメインは前記第2ポリペプチドの前記第1ドメインと連合して抗原結合部位を形成することができる、
ことを特徴とする前記単量体ポリペプチド。
【請求項２】
免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ドメイン、及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメインを含んで成るポリペプチドであって、前記ドメインは連結されているが相互に連合して抗原結合部位を形成することができないことを特徴とするポリペプチド、但し前記ドメインは5個のアミノ酸のペプチドリンカーにより連結されない。
【請求項３】
免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ドメイン、及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメインから成り、前記ドメインは連結されているが相互に連合して抗原結合部位を形成することができない、ことを特徴とする単量体ポリペプチド。
【請求項４】
繊維状バクテリオファージの表面部分であるドメインに連結される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記表面成分がGIIIである、請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
免疫グロブリン重鎖可変領域の前記結合領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の前記結合領域が、第2のポリペプチドのそれぞれ相補的軽鎖又は重鎖結合領域との連合した場合に、同一のエピトープに結合することができる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
免疫グロブリン重鎖可変領域の前記結合領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の前記結合領域が、第2のポリペプチドのそれぞれ相補的軽鎖又は重鎖結合領域との連合した場合に、相互に異るエピトープに結合することができる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域が他のポリペプチドの免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域と連合しており、そして前記免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域が他のポリペプチドの免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域と連合しており、それぞれの連合が抗原結合部位を形成している、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の種々のポリペプチドのライブラリー。
【請求項１０】
請求項8に記載の、2つのポリペプチドの2個の抗原結合部位を有する二量体。
【請求項１１】
前記2つのポリペプチドが相互に異る、請求項10に記載の二量体。
【請求項１２】
前記2つのポリペプチドが同一である、請求項10に記載の二量体。
【請求項１３】
請求項10〜12のいずれか1項に記載の、種々の二量体のライブラリー。
【請求項１４】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする配列を含んで成る核酸。
【請求項１５】
請求項14に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項１６】
第1ポリペプチドをコードする核酸及び第2ポリペプチドをコードする核酸を含んで成るベクターであって、前記ポリペプチドのそれぞれが免疫グロブリン重鎖可変領域結合領域を含んで成る第1ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメインを含んで成り、各ポリペプチドの第1ドメインがそのポリペプチドの第2ドメインに連結されているがそれと連合して抗原結合部位を形成することができず、前記第1ポリペプチドをコードする前記核酸が、発現後に該第1ポリペプチドを宿主細胞から輸送するためのシグナル配列をコードする核酸に連結されており、前記第2ポリペプチドをコードする前記核酸が、発現後に該第2ポリペプチドを宿主細胞から輸送するためのシグナル配列をコードする核酸及び発現後に繊維状バクテリオファージの表面に前記第2ポリペプチドを提示するための繊維状バクテリオファージの表面成分をコードする核酸に連結されており、ベクターはバクテリオファージ粒子内にパッケージされ得る、ことを特徴とするベクター。
【請求項１７】
請求項15に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞からポリペプチドを発現せしめるための条件下で、請求項17に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る、請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
(a)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ポリペプチドドメイン、及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ポリペプチドドメインをコードする核酸;並びに
(b)繊維状バクテリオファージの表面成分をコードする核酸;
を含んで成るベクターにおいて、
核酸(a)の発現が、第1ドメイン及び第2ドメインを含んで成るポリペプチド(A)を生成せしめ、該第1ドメイン及び第2ドメインは連結されているが相互に連合して抗原結合部位を形成することができず;
核酸(b)と一緒の核酸(a)の発現が、第1ドメイン及び第2ドメインを含んで成るポリペプチド(B)を生成せしめ、該第1ドメイン及び第2ドメインは連結されているが相互に連合して抗原結合部位を形成することができず、
バクテリオファージ粒子の表面上に前記ポリペプチド(B)を提示するために該ポリペプチド(B)は繊維状バクテリオファージの表面成分に融合しており;
核酸(b)は、介在する抑制可能な終止コドンを含んで成る核酸により、核酸(a)に連結されている;
ことを特徴とするベクター。
【請求項２０】
(i)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメインを含んで成る第1ポリペプチド、該第1ポリペプチドのこれらのドメインは連結されているが相互に連合して抗原結合部位を形成することができない;並びに
(ii)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域を含んで成る第1ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域を含んで成る第2ドメイン、及び該第1ドメインと第2ドメインを連結しそしてこれらのドメインの相互の連合による抗原結合部位の形成を可能にするリンカー、を含んで成る第2ポリペプチド;
の二量体であって、
前記第1ポリペプチドの前記第1ドメイン及び前記第2ポリペプチドの前記第2ドメインが連合して抗原結合部位を形成し;そして
前記第1ポリペプチドの前記第2ドメイン及び前記第2ポリペプチドの前記第1ドメインが連合して抗原結合部位を形成する;
ことを特徴とする二量体。
【請求項２１】
前記ポリペプチドの一方が繊維状バクテリオファージの表面成分に融合している、請求項20に記載の二量体。
【請求項２２】
次のいずれかの1つ、
細胞表面タンパク質、
Fc受容体、
腫瘍特異的マーカー、
CEA、
ウィルス、
HIV1、
小形の化学分子、
ホルモン、
サイトカイン、
TNFα、
抗体、
抗体のイデオトープ
に結合する抗原結合部位を有する、10〜12,20又は21のいずれか1項に記載のポリペプチド二量体。
【請求項２３】
請求項8に記載のポリペプチド、又は請求項10〜12、20若しくは21のいずれか1項に記載の二量体を用いる、抗原についての測定。
【請求項２４】
2つの異る細胞表面上の抗原に結合する、請求項10〜12、20又は21のいずれか1項に記載のポリペプチド二量体。
【発明の詳細な説明】
本発明は、結合タンパク質、前記タンパク質の製造法、およびそれらの使用に関する。さらに詳しくは、本発明は免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域からなる合成結合タンパク質に関する。2以上の結合特異性を有することができるマルチマー、例えば、二量体を形成するポリペプチドが提供される。
この明細書の長さのために、読者が問題の進行を見出ことを助けるために内容のリストをここに含めることは適当である。請求の範囲に加えて、この明細書は、順番に、次のものを包含する:
本発明の分野の陳述;
内容;
先行技術の簡単な論考および本発明に対する序説;
本発明の論考;
図面の簡単な説明;
2価および二重特異性の抗体、調製および使用の論考;
「ダイアボディー(diabodies)」の調製、構造および種々の実用性の論考;
ダイアボディーのレパートリーの構成およびバクテリオファージ上のそれらの表示の論考;
実験の実施例のリスト;
実験の実施例および論考;
このテキストの中に述べられているすべての文献をここに引用によって加える。
天然の抗体は多価であり、例えば、IgG抗体は2つの抗原のための結合部位を有しそしてIgMは5つの結合部位を有する。多価は、抗体が固相抗原への結合において多数の相互作用を利用することができ、したがって抗原の結合の結合活性を増加できることを意味する。哺乳動物細胞中の発現により組換えの2価のIgGおよび五量体の10価のIgMを作ることができる。今日まで、多価の種々の可能性のうちで、2価の抗体は最大の重要性を有してきている。
2またはそれ以上の異なるエピトープに結合できる抗体、多重特異性を有するものはさらに重要である。二重特異性抗体は、後述するように、多数の証明されかつ期待される実用性を有する。
構造的には、最も簡単な抗原(IgG)はジスルファイド結合により相互に接続された4つのポリペプチド鎖、すなわち、2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を有する。軽鎖はカッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確な形態で存在する。各鎖は一定領域(C)および可変領域(V)を有する。各鎖は1系列のドメインに有機化されている。軽鎖は、C領域およびV領域に相当する2つのドメインを有する。重鎖は4つのドメイン、すなわち、V領域に相当する1つそしてC領域中の3つのドメイン(1,2および3)を有する。
この抗体は2つのアームを有し(各アームはFab領域である)、それらの各々は互いに連合したVLおよびVH領域を有する。1つの抗体が他と異なる(アミノ酸配列の変動のために)のはV領域のこの部分であり、それらは一緒になって抗原を認識しそして抗原結合部位を提供する責任を負う。なおいっそう詳細には、各V領域は4つのフレームワーク領域(FR)により分離された3つの相補的決定領域(CDR)から構成されている。CDRは可変領域の最も変動性の部分であり、そしてそれらは重要な抗原結合機能を実行する。
結合性抗原の機能は全体の抗体の断片により実行されることができることが示された。結合性3断片の例は次の通りである:(i)VL,VH,CLおよびCH1ドメインから成るFab断片;(ii)VHおよびCH1ドメインから成るFd断片:(iii)抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインから成るFv断片、(iv)VHドメインから成るdAb断片;(v)分離されたCDR領域;および(vi)F(ab′)2断片、ヒンジ領域におけるジスルファイド架橋により連鎖された2つのFab断片からなる2価の断片。
断片は大部分完全な抗原の一部分を表す。しかしながら、用語「断片」は、また、特異的抗原結合能力を有するように連合された、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、あるいはこれらのドメインの結合部分からなる。この型である抗体断片のすぐれた例は「一本鎖Fc」(scFv)断片であり、これは機能的抗原結合部位を形成するように2つのドメインを連合させることができるペプチドのリンカーにより、抗体の軽鎖の可変領域に連鎖した抗体の重鎖の可変領域から成る(参照、例えば、米国特許第4,946,778号、Ladnerら、(Genex);WO88/09344号、Creative Biomolecules,Inc/Hustonら)。WO92/01047号、Cambridge Antibody Technologyら/MaCaffertyらは、可溶性組換え遺伝的表示のパッケージ、例えば、バクテリオファージの表面上のscFv断片の表示を記載している。
scFv分子のペプチドのリンカーの長さを変化させた、いくつかの実験の研究は記載されてきている。リンカーの長さの範囲は一般に12〜18アミノ酸であり、15アミノ酸は最も通常である、参照、例えば、M C Whitlowら、Protein Engineering 6:989-995,1993。すべての場合において、リンカーは2つのドメイン、すなわち、一方のVL、他方のVHのために十分に長くて、連合して抗原結合部位を形成し、これはscFvの特性を示す特徴である。例えば、Condraら(The Jurnal of Biological Chemistry,265:2292-2295,1990)は、細胞レセプターへのヒトライノウイルスの取り付けをブロックすることができるscFv断片のリンカーの長さを変化させた。この論文において著者らがVLドメインと記載しているものはCドメインからのアミノ酸を含み(Kabatら、Sequences of proteins of Immunological Interest,US Goverment Printing Officeを概観することによって理解することができる)、したがってこれらの分子は可変ドメインの間に「長い」リンカーを有して、各分子におけるVLおよびVHドメインが連合して抗原結合部位を形成できるようにする。
本発明は、さらに、連合して多価または多重特異性のマルチマーを形成できるポリペプチドを提供することにより抗体断片の分野に関する。いっそう詳しく後述するように、1つの面において、免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ドメインからなり、前記ドメインは連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない、ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは連合してマルチマー、例えば、二量体を形成することができ、1つのポリペプチドの重鎖の結合領域は他のポリペプチドの軽鎖の結合領域と連合して抗原結合部位を形成する。二量体化の場合において、2つの抗原結合部位が形成される。
用語「ダイアボディー(diabody)」は本発明による二量体を記載するためにつくられた。この用語はこの分野において既に多少の認識を獲得した。本発明において使用するとき、用語は、特記しない限り、二量体にのみ適用されると一般的説明において解釈することを意図しない。ポリペプチドの三量体は可能であり、このとき3つの抗原結合部位が形成される。また、この用語は多価および多重特異性の両方のマルチマーに関係して使用される。
ポリペプチドの各ドメインは完全な免疫グロブリンの重鎖または軽鎖(場合に応じて)の可変ドメインであることができるか、あるいは天然に見出されるドメイン、または、例えば、生体外でWO93/11236号(Medical Research Councilら/Griffithsら)に記載されているような技術を使用して構成された合成ドメインの機能的同等体または突然変異体または誘導体であることができる。例えば、少なくとも1つのアミノ酸を欠いている抗体の可変ドメインに相当するドメインを一緒に接合することが可能である。重要な特性を明らかにする特徴は各ドメインが相補的ドメインと連合して抗原結合部位を形成する能力である。したがって、用語「免疫グロブリンの重鎖/軽鎖の可変領域」は、本発明がいかに働くかに実質的な作用をもたない変異型を排除すると解釈すべきでない。
「誘導体」はポリペプチドに関する物質である。誘導体は1または2以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または挿入によるか、あるいは他の分子の連鎖により異なることができる。変化はヌクレオチドまたはタンパク質のレベルでなすことができる。マーカー、例えば、酵素、フルオレセインなどをポリペプチドに連鎖させることができる。
第1および第2のドメインはアミノ酸残基を介在させないで連鎖することができる。2つのこのような分子は合してなおいっそう小さい二量体を形成するであろう。さらに、ある場合において、この型の分子の剛性は、マルチマーの1つの抗原結合部位への抗原の結合がマルチマーの他の結合部位のコンフォメーションの変化、抗原の結合を増強または減少する場合、有用であることがあるコンフォメーションの変化を引き起こすか、あるいはその他の結合部位の触媒活性を変化することさえあることを意味することがある。
1つの態様において、ポリペプチドのドメインはペプチドのリンカーにより連鎖されている。このリンカーは「短い」ことができ、鎖のVLドメインがその鎖のVHドメインと結合できるようにするためには少な過ぎるアミノ酸から成る。これは10より少ない、最も好ましくは5,4,3,2、または1アミノ酸であることができる。ある場合において、9,8,7または6アミノ酸が適当であることがある。ある場合において、それは「-1」であることができる、すなわち、VHおよびVLドメインは直接一緒に連鎖しているが、それらの一方は1アミノ酸を欠いている。ある場合において、2以上のアミノ酸がドメインの一方または両方から欠けることができる。
なお他の態様において、リンカーは10またはそれ以上のアミノ酸から成ることができるので、構造的特徴を制限しないで、各鎖のドメインは互いに連合して抗原結合部位を形成できるであろう。例えば、リンカーは15アミノ酸またはそれより長いことができる。適当な構造的拘束は、システイン残基をリンカー内にもち、ジスルファイド架橋がそれらの残基を接合してリンカーの有効長さを減少し、どれだけ遠いかにより、Vドメインはリンカーのルーピングにより離れていることを包含する。これはさらに後述する。当業者は他の可能性を知っているであろう。
ポリペプチドの2つの二量体は2価である、すなわち、各抗原結合部位は同一エピトープに結合することができる。VHおよびVLドメインの結合特異性は、場合に応じて、それぞれのドメインが相補的VLまたはVHと連合しているとき、決定可能である。ポリペプチドのVHおよびVLドメインが親の抗体または抗体断片(得られる場合)ポリペプチドの2つ(同一であるか、あるいは異なることがある修飾をもつ)は結合して2価の二量体を形成するであろう。もちろん、連合して2価の二量体を形成するポリペプチドの結合領域は、同一エピトープに結合する2つの異なる抗体から誘導することができるか、あるいは合成であるか、あるいは当業者にとって示唆された任意の方法を使用して得ることができる。
他の場合において、免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域は、それぞれ、相補的軽鎖または重鎖の結合領域と連合したとき、互いと異なるエピトープに結合することができる。2つのこのような分子の二量体は二重特異性であろう。
ポリペプチドは追加のアミノ酸残基に融合することができる。このような残基はペプチドの標識であり、多分単離を促進するか、あるいは合成のとき宿主細胞からのポリペプチドの分泌のためのシグナル配列であることができる(これについては下を参照のこと)。適当には、分泌のリーダーペプチドを使用し、細胞質ゾルの中から外へのポリペプチドの動きを指令するポリペプチドのN-末端に接合したアミノ酸である。
追加のアミノ酸残基はポリペプチドのドメイン、例えば、抗体のCドメインおよび/または生物、例えば、バクテリオファージ、多分繊維状バクテリオファージ、例えば、fdまたはM13の表面成分であることができる。好ましくは、表面成分はバクテリオファージのGIIIまたは他の繊維状バクテリオファージからの同等体である。
本発明によるポリペプチドは、他のこのようなポリペプチドと連合して二量体を形成することができ、各ポリペプチドの免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域は他のポリペプチドの免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域と連合している。
他の態様において、3つの鎖の構成体を形成することができ、この構成体は2つの抗原結合部位を有する。そこで、本発明によるポリペプチドは「遊離の」VHまたはVLドメインと連合して2つの抗原結合部位を形成することができる。例えば、3分子は(VHA-VLB),VHBおよびVLAであって、二重特異性構成体を形成するか、あるいはそれらは(VH-VL),VHおよびVLであって2価の構成体を形成することができる。この態様は、VHおよびVLドメインが安定に連合することができる場合、適当であろう。構成体は標準のダイアボディーに対合よりも柔軟性であるが、なお有利には大きさが小さい。
二量体は、2価または二重特異性であるかどうかにかかわらず、本発明の範囲内にはいる。説明するように、二量体における2つのポリペプチドは互いに異なることができるか、あるいは同一であることができる。それらが異なる場合、第1および第2のドメイン(「VH」および「VL」)の順序は考えられるように同一であるか、あるいは異なることができる。しかしながら、最も好ましくは、第1および第2のドメインのN-末端からC-末端の順序は各ポリペプチドにおいて同一である。そのとき二重特異性の二量体はN-(VHA-VLB)＝C/N-(VHB-VLA)-CまたはN-(VLA-VHB)-C/N-(VLB-VHA)-Cとして表すことができる内に位置する。
また、ポリペプチドの種々のレパートリーが本発明により提供される。このような種々のレパートリー内に、ポリペプチドの異なる対合(または三量体化など)は異なる結合特異性をもつ、2価または二重特異性の二量体の形成を生ずることができる。二量体の種々のレパートリーは本発明の範囲内に包含される。
本発明は、また、本発明のポリペプチドをエンコードする配列からなる核酸、およびこのような核酸の種々のレパートリーを提供する。この核酸は第1ドメインをエンコードする核酸と第2ドメインをエンコードする核酸との間にRNAスプライス部位の核酸を含むことができる。
自己スプライシンググループIのイントロン、例えば、テトラヒメナ(Tetrahymena)からのもの(T.R.Cech Ann.Rev.Biochem.59 543-568,1990)を挿入することができる。イントロンのスプライシングアウトはRNAレベルで起こって、イントロンの内部の誘導配列を残し、この配列はダイアボディーの2つのドメインの間の3アミノ酸をエンコードする。残留するアミノ酸の数が異なるように、例えば、実施例24において、5および6アミノ酸のリンカーが形成されるように、自己スプライシングをデザインすることができる。
他のグループIのイントロンまたはグループIIの自己スプライシングのイントロンを使用することができる。自己スプライシングのイントロンは、例えばloxP部位(下を参照)における、組換えと組み合わせて、ダイアボディー分子の構成において使用することができる。例えば、loxP部位をポリペプチド鎖の2つの抗体ドメインの間の自己スプライシングイントロンの中に含めることができる。これは、例えば、他の可変ドメインの遺伝子および自己スプライシングイントロンの適当な領域を有する他のレプリコン上のloxP部位を通してDNAレベルで組換えることができる。転写後のDNAレベルにおける自己スプライシングは次いで、可変ドメインの新しい組み合わせをもつダイアボディーのポリペプチド鎖に導くであろう。
核酸は、第1ドメインをエンコードする核酸と第2ドメインをエンコードする核酸との間に、生体内または生体外の組換えのための部位をエンコードする核酸を含むことができる。
例えば、loxP部位、すなわち、34bpの部位において、組換えはタンパク質Creにより触媒される(Hoessら、PNAS USA 79:3398-3402,1982、およびStembergら、J.Mol.Biol.150:467-486,1981)。
この系はファージ上で表示される抗体の調製において使用されてきている(P.Waterhouseら、Nuc.Acids Research 21:2265-2266,1993;およびWO93/19172)。
本発明は、また、このような核酸からなるベクターを提供する。このベクターはポリペプチドの発現に必要な核酸からなることができる。ベクターは発現のときのポリペプチドの分泌のための核酸からなることができる。
ベクターは前記ペプチドの2つ、すなわち、第1ポリペプチドおよび第2ポリペプチドをエンコードする核酸からなることができる。第1ポリペプチドをエンコードする核酸と第2ポリペプチドをエンコードする核酸との間に、生体内または生体外の組換えのための部位からなる核酸が存在することができる。
本発明の他の面に従うと、第1ポリペプチドをエンコードする核酸および第2ポリペプチドをエンコードする核酸、ポリペプチドの各々は免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ドメインからなり、各ポリペプチドの第1ドメインはそのポリペプチドの第2ドメインに連鎖されているが、それと連合して抗原結合部位を形成することができず、第1ポリペプチドをエンコードする核酸は発現のとき宿主細胞から第1ポリペプチドの輸出のためのシグナル配列をエンコードする核酸に連鎖されており、第2ポリペプチドをエンコードする核酸は発現のとき宿主細胞から第2ポリペプチドの輸出のためのシグナル配列をエンコードする核酸に連鎖されている、および発現のときバクテリオファージ粒子の表面上の第2ポリペプチドの表示のための繊維状バクテリオファージの表面部分をエンコードする核酸からなり、バクテリオファージ粒子内にパッケージングされることができるベクターが提供される。
このようなベクターからの発現は、バクテリオファージ粒子の表面上に、2つの第1および第2のポリペプチドの二量体を生成し、前記ポリペプチドの一方は表面成分により前記粒子に取り付けられており、他方はそれと連合されている。これは表示されたダイアボディーの選択を可能とし、粒子内にパッケージングされた、エンコーディング核酸は容易に単離される。この種類の技術はWO92/01047に記載されている。
ダイアボディーのレパートリーの発現および分泌された複製可能な遺伝的表示パッケージ、例えば、バクテリオファージ上のそれらの表示は、重鎖および軽鎖の多数の異なる可能な組み合わせ-多数の異なる可能な結合特異性-の中から問題の抗原のためのバインダーの選択のために価値がある。
他の面において、本発明は、
(a)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ポリペプチドのドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ポリペプチドのドメインをエンコードする核酸;および
(b)繊維状バクテリオファージの表面部分をエンコードする核酸;
連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない第1および第2のドメインからなるポリペプチド(「A」)を生産する核酸(a)の発現;
連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない第1および第2のドメインからなり、バクテリオファージ粒子の表面上のポリペプチド(B)の表示のための繊維状バクテリオファージの表面成分に融合した、ポリペプチド(「B」)を生産する核酸(b)と一緒の核酸(a)の発現;
核酸(b)は介在する抑制可能な停止コドンを含む核酸により核酸(a)に連鎖されている;
からなるベクターを提供する。
抑制可能な停止コドンは、サプレッサー宿主細胞中の前記コドンの下流のヌクレオチド配列の翻訳を可能とするが、非サプレッサー細胞において、翻訳は前記コドンにおいて終わることができる。抑制可能な翻訳停止コドンの例は、アンバー、オーカーまたはオパールのコドンである。事実、ほとんどのサプレッサー宿主細胞、例えば、SupE細胞において、多少の「すべり」が存在するので、抑制可能な停止を越える多少の翻訳および停止における多少の翻訳の停止が存在する。
これは有用である。なぜなら、これにより本発明のこの面に従うベクターを使用して可溶性ポリペプチドおよびバクテリオファージの1成分、または他の表示パッケージに融合したポリペプチドの両方を、粒子表面上の二量体の連合のために、発現することができるからである。好ましくは、ポリペプチドが宿主細胞の細胞質ゾルから周辺質の中に分泌されるように、ベクターの核酸は分泌リーダーペプチドまたは他のシグナル配列をエンコードする核酸を含む(Skerraら、Science 240:1038:1041,1988;Betterら、Science 240,1041-1043,1988;WO92/01047)。
本発明は、また、本発明によるベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を包含する。ベクターが前述したような抑制可能な停止コドンを有する場合、好ましくは宿主細胞は両方のポリペプチドAおよびB(前述したような、すなわち、VH-VLであるものおよびバクテリオファージまたは他の生物の表面成分に融合したVH-VLであるもの)の共発現のための条件を提供することができる。
本発明は、また、ポリペプチドAおよびBの同時発現のための条件であることができる、1または2以上のポリペプチドの発現のための条件下にベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を培養することからなる、本発明によるポリペプチド、二量体または他のマルチマーを作る方法を提供する。この方法は、宿主細胞または培地からの、宿主細胞の培養物からの1または2以上のポリペプチド、1または2以上の二量体などの回収を包含する。宿主細胞からの回収は、細胞質からの分泌後の、周辺質からであるか、あるいは封入体からであることができる。変性状態からの再生を要求とすることがある。回収は好ましくは問題の抗原との結合による選択による。
本発明によるポリペプチドの多数の用途が考えられ、それらのいくつかは後述されている。とくに興味ある1つの用途は、均質アッセイまたは不均質アッセイである、抗原についてのアッセイである。
本発明の他の面において、二重特異性二量体が提供され、この二量体は(i)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ドメイン、および第1および第2のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとの連合を可能とするポリペプチドのリンカーを有する第1ポリペプチド;および(ii)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ドメイン、および第1および第2のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとのドメインの連合を可能とするポリペプチドのリンカーを有する第2ポリペプチド;を有する。第1ポリペプチドの第1ドメインおよび第2ポリペプチドの第2ドメインは連合して、第1結合特異性を有する抗原結合部位を形成するが、第1ポリペプチドの第2ドメインおよび第2ポリペプチドの第1ドメインは連合して、第2結合特異性を有する抗原結合部位を形成する。
本発明の他の面において、
(i)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ドメイン、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ドメインからなる第1ポリペプチド、第1ポリペプチドのドメインは連鎖しているが、互いに連合して抗原結合部位を形成することができない;および
(ii)免疫グロブリン重鎖可変領域の結合領域からなる第1ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変領域の結合領域からなる第2ドメイン、および第1および第2のドメインを連鎖しそして抗原結合部位を形成する互いとの第2ポリペプチドのドメインの連合を可能とするポリペプチドのリンカーを有する第2ポリペプチド;
第1ポリペプチドの第1ドメインおよび第2ポリペプチドの第2ドメインは連合して抗原結合部位を形成している;および
第1ポリペプチドの第2ドメインおよび第2ポリペプチドの第1ドメインは連合して抗原結合部位を形成している;
の二量体が提供される。
このような二量体は2価または二重特異性であることができる。
二量体のポリペプチドに対する種々の修飾を、本発明の他の面について前述したのと同一の方法において、行うことができる。同様に、本発明は、本発明のこの面に従う二量体を形成することができる第1および第2のポリペプチドをエンコードする核酸からなるベクター、このようなベクターでトランスフェクションされた宿主細胞、および第1および第2のポリペプチドの発現のための条件下に宿主細胞を培養し、そして二重特異性を有する二量体を回収することからなる方法を包含する。
下の実験の実施例により開示されるポリペプチド、マルチマー、核酸、ベクター、レパートリーなどは本発明の面として提供される。
例えば、本発明は、また、次のいずれかに結合する抗原結合部位を有する分子を提供する:細胞表面のタンパク質、Fcレセプター、腫瘍特異的マーカー、CEA、ウイルスHIV1、小さい化学的分子、ホルモン、サイトカイン、TNFα、抗体、抗体のイディオタイプ。
二量体の1つの抗原結合部位に対する抗原の結合が二量体の他の結合部位への抗原の結合に影響を与える二量体が提供される。
リンカーの変更が二量体の抗原結合部位の少なくとも1つの抗原結合アフィニティーの改良に導く二量体は本発明に包含される。
診断であることができるアッセイが提供され、そしてこのアッセイは抗原の架橋または細胞の凝集を包含することができる。それらは表面上の1つの抗原の結合および溶液中の抗原の結合を包含することができ、そして表面のプラズモンの共鳴を使用する検出を包含する。本発明の態様により提供される分子は2つの異なる細胞表面上の抗原に結合することができる。
さらに、本発明は本発明のポリペプチドまたはマルチマーからなる製剤、および薬物の調製におけるポリペプチドまたはマルチマーの使用を提供する。本発明によるポリペプチドまたはマルチマーを使用する処置の方法が包含される。
本発明の多数の他の面は下に記載されている。他の面は当業者にとって明らかであろう。
次に、本発明を図解および例示により、2価および二重特異性の抗体および抗体断片の分野において現存する技術と比較してさらに説明する。以下は本発明をいかなる方法においても限定するものとして解釈すべきではない。次の図面について述べる(追加の記号解は説明の終わりにある):
第1図は、bisAbsと表示するハイブリッド-ハイブリドーマおよび2価の抗体断片を示す。このbisAbsは破線の上にそして2価のAbsは下に記載されている;ハイブリッド-ハイブリドーマ、B:二重特異性Fab′2、C:二重特異性F(ab′-ジッパー)2、D:二重特異性scFv2、E:3鎖の二重特異性断片、F:二重特異性ダイアボディー、G:2価の(FvCys)2、H:2価の(Fvジッパー)2、I:scFvCH32(P.Holliger,G.Winter未発表の結果)、J:2価のダイアボディー、K:2価のF(ab′-ジッパー)2、L:2価のFab′2。
第2図は、2つの連鎖するダイアボディー分子の凝集を示す:
ダイアボディー1-一方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられているので、この結合部位(部位2)は自由である。
ダイアボディー2-一方の特異性は第1ダイアボディー上の部位2に対して向けられた抗イディオタイプ(部位抗-2)でありそして他方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられている。このフォーマットは血球の凝集を可能とし、スパンされた距離は示すように2つのダイアボディー分子の長さである。
第3図は、3つの連鎖するダイアボディー分子を使用する凝集を示す:
ダイアボディー1-一方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられているので、この結合部位(部位2)は自由である。
ダイアボディー2-両方の特異性は第1ダイアボディー上の部位2に対して向けられた抗イディオタイプである(部位抗-2)。
このフォーマットにおいて、ダイアボディー1の2つの分子が異なる赤血球に結合するとき、ダイアボディー2は部位2においてこれらのダイアボディー1の分子の各々に結合することができ、こうして示すように2つの赤血球の間の距離をスパンする3つのダイアボディー分子の複合体を形成する。
第4図は、連鎖を作る2つのダイアボディー分子および1つの非ダイアボディー分子を使用する凝集を示す。
ダイアボディー1-一方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられておりそして他方の特異性アッセイに添加すべき他の非ダイアボディー抗原(部位2)に対して向けられている。
非ダイアボディー抗原分子-これはダイアボディー1の部位2が向けられる大きい分子である。このフォーマットにおいて、ダイアボディー1の2つの分子は2つの異なる細胞に結合する。非ダイアボディー分子は赤血球を架橋する部位2を通して両方のダイアボディー分子に結合するであろう。
第5図は、架橋反応において全生物を使用する凝集を示す。上の場合において、凝集のための連鎖する分子はタンパク質分子である。この原理は架橋すべき生物、例えば、バクテリオファージM13または細菌、例えば、大腸菌(E.coli)の使用に拡張することができる。
上のフォーマット(iii)において、ダイアボディー1の部位1は細胞表面のマーカーに対して向けることができ、そして部位2はバクテリオファージ表面の分子、例えば、遺伝子8タンパク質に対して向けられることができるであろう。
第6図:2価のダイアボディーのレパートリーの構成。種々のクローニングルートを使用して2価のダイアボディーのレパートリーを作ることができる。出発点はVHおよびVL遺伝子の種々のレパートリーあるいはscFvまたはFabとして既にフォーマット化された(および可能ならばバインダーについて濃縮されている)V遺伝子のレパートリーであることができる。詳細はこのテキストの中で説明されている。
第7図:二重特異性ダイアボディーのレパートリーの構成。種々のクリーニングルートを使用して二重特異性ダイアボディーのレパートリーを作ることがでる。出発点はVHおよびVL遺伝子の種々のレパートリー(ルートB)あるいはscFvまたはFabとして既にフォーマット化された(および可能ならばバインダーについて濃縮されている)V遺伝子のレパートリー(ルートC)であることができる。両方のルートにおいて、V遺伝子のレパートリーを段階的制限クローニングまたはPCRアセンブリーにより二重特異性ダイアボディーとしてクローニングすることができる。あるいは、ダイアボディーのレパートリーはヘルパーまたはダミーV遺伝子を使用して作ることができる(ルートA)。より詳細はこのテキストの中で説明されている。
第8図:大きい2価のダイアボディーのレパートリーの構成。テトラヒメナ(Tetrahymena)からの自己スプライシングイントロン、およびloxP組換え系の両方を利用することによって、大きい2価のダイアボディーのレパートリーを作ることができる。VHを含有するレプリコンとCre/loxP仲介組換えを経て組み合わせる。DNAレベルにおいて起こる組換え後、生ずるダイアボディー遺伝子を転写し、そしてイントロンおよびVH遺伝子とVL遺伝子との間のloxP部位をスプライスアウトする。いっそう詳細にはテキストを参照のこと。
第9図は実施例1.Aからのベクター構成体を示す。発現構成体(I,II,VI,VII)の構成に使用した構成体(III〜V)を図解する。(それぞれ、VHB-VLAおよびVHA-VLBをエンコードする構成体VIIIおよびIXは示されていないが、実施例1に記載されている)構成体III〜Vはfd-tet-DOG1(V2)(H.R.Hoogenboomら、前掲)中で、そして他の構成体はpUC19誘発発現ベクター(VI)(L.Riechmannら、1992、前掲)中でlacプロモーター(P)のコントロール下にペプチド標識(T)(S.MunroおよびH.R.B.Pelham1986前掲)を使用してクローニングした。抗体NQ11(VHA,VLA)およびD1.3(VHB,VLB)のV遺伝子は内部のPstI,BstEII,SacIおよびXhoI制限部位を(R.Orlandiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 3833-3837 1989;E.S.Wardら、1989前掲)におけるように有する;さらに、VLAは内部のPstI部位を有する。同一鎖のVHとVLとの間のポリペプチドのリンカー(Lk)または非コーディング領域(N1またはN2)がマークされている。LkはGly4Serのある数の反復(n＝0〜3)から成る。N1は記載されているように(E.S.Wardら、1989、前掲)リボソーム結合部位(rbs1)を含み、そしてN2は記載されているように(J.McLaughlinら、J.Biol.Chem.256 11283-11288 1981)コンセンサスリボソーム結合部位を含む。細菌の周辺質の中への断片の分泌のためのシグナル配列はpelBシグナル配列(L1)(E.S.Wardら、1989前掲)およびファージfd遺伝子3のシグナル配列(L2)(A.N.Zacherら、Gene 9 127-140 1980)である。PCRプライマー1〜8の位置は構成体III〜Vの中に示されている。また、表1から推定されるタンパク質生産物の概略的描写が与えられている。
第10図は、抗体断片のBIAコアおよびFPLC分析を示す。HELで被覆したBIAコアのセンサーチップを使用しかつ共鳴単位(RU)として結合した質量を検出して、FabD1.3(パネルA)からのリゼイトを構成体VI(パネルB)または抗成体VII(パネルC)からのリゼイトと比較する。a.基線;b-d、断片の注入;d-e.結合した断片の解離;e-h.phOx-BSAの注入。eとhとの間のDRUは結合したphOx-BSAの量を反映する。
第11図は、FPLC(0.2mMのEDTA、0.05%のアジ化ナトリウムを含むPBS中のスーパーデックス(Superdex)S-75 10/30)によりリゼイトを分画した後に出現するいくつかの断片のBIAコアによるオンライン検出を図解し、HEL被覆したチップに結合した質量の変化が時間に対してプロットされている(dRu/dt)。ゼロより上の点はHELとの連合を示し、ゼロより下の点は解離を示す。上部の列において、キメラFabD1.3(Mr 47.6k)およびFvD1.3(Mr 25.7k)についての図形をプロットし、そして下部の列において二量体の構成体VI(Mr 53.4k)およびVII(Mr 51.7k)(両方の15残基のリンカー)についての図形をプロットする。アミノ酸配列からMrを計算する。
第12図はモデリングである。2価のD1.3ダイアボディーのモデルは連鎖したドメインのN-およびC-末端の付加(連続の円でマークしそして点線により接続されている)、ドメインのパッキングおよびVLドメインのC-末端の近位(開いた円でマークされている)を図解する。同一のポリペプチド鎖上にVHおよびVLドメインのについてのCaの図形(aまたはb)は、それぞれ、太いか、あるいは細くて、各抗原結合部位が2つの異なる鎖aおよびbのVHおよびVLドメインから形成されることを示す。こうしてVHaはVLbと連合し、そしてVHbはVLaと連合する。結合した抗原の雌鶏の卵のリゾチーム(HEL)はこの図面の上部および下部に示されている。
第13図は、二重特異性ダイアボディーNQ11/D1.3(実施例2)のVLドメインのN-末端またはVHドメインのC-末端におけるアミノ酸欠失により作られた4つの-1構成体を示す。
第14図は、二重特異性ダイアボディーNQ11/D1.3(実施例2)中のVHおよびVLドメインの接合部におけるアミノ酸の欠失により作られた-2および-3構成体を示す。
第15図は、phOx-BSA表面からのNQ11/B1.8二重特異性ダイアボディー(実施例4)の解離についての分離速度(off-rate)曲線を示す。
第16図は、NIPの存在または不存在(対照)下のOx-BSA表面へのNQ11/B1.8の結合についての補正した平衡結合(平衡における応答単位「Req」)曲線を示す。上の部分は表面s2についての曲線を示し、そして下の部分は表面s3についての曲線を示す(実施例4)。
第17図は、s2のphOx-BSAの表面へのNQ11/B1.8Ox/NIPダイアボディーの結合についてのスキャッチャードプロットを示す、上の部分-対照;下の部分-プラス1μMのNIP(実施例4)。
第18図は、s3のphOx-BSAの表面へのNQ11/B1.8Ox/NIPダイアボディーの結合についてのスキャッチャードプロットを示す、上の部分-対照;下の部分-プラス1μMのNIP(実施例4)。
第19図は、ベクターpCANTAB5およびその誘導体pCANTAB6のポリリンカー領域を示す。
第20図は、ベクターpCANTAB6のポリリンカーの領域を示す。
第21図は:MAK195ダイアボディーのELISA。MAK195ダイアボディー(5残基のリンカー)およびscFvをこのテキストに記載するように誘発により調製し(一夜の成長のために24℃を使用する)そして試料を室温または37℃において実施したELISAにおいてヒトTNFに対する結合について分析した。対照のscFvは異なる抗原に対して向け、したがってTNFに結合しない。
第22図:Mab32およびP3A2ダイアボディーのELISA。Mab32ダイアボディー(0および5残基のリンカー)およびMab32scFv断片をこのテキストに記載されているように誘発により調製し、そしてELISAにおいてヒトTNFに対する結合について分析した。
第23図:Mab32およびP3A2ダイアボディーのウェスタンブロット。Mab32ダイアボディー(0および5残基のリンカー)およびMab32scFv断片は、1mMのIPTGおよび一夜の成長のために種々の温度(左に示されている)を使用して、適当なプラスミドを有する細菌を誘発することによって調製した。ダイアボディーはこのテキストに記載されているように培養上澄み液のスポットの試料(未希釈、純粋;および10倍の希釈)中で検出された。
第24図(ゲルI)は、種々の条件下に再生した細胞内で発現させたMab32ダイアボディーの調製物の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。トラック7は、循環手順および添加したレドックス循環剤の不存在下に50mMのTris-HCl、0.5MのNaCl中の一夜インキュベーション後の物質の再生状態を示す。トラック9は、再生-5mMのGSH、0.5mMのGSSGを含む50mMのTris-HCl、0.5MのNaCl-後の一夜インキュベーションのために実施例Xにおいて使用した条件を示す。
第25図(ゲルVII)は、精製の種々の段階からの細胞内で発現させたMab32ダイアボディーの調製物の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。
1.再生されたタンパク質
2.50倍に濃縮した再生されたタンパク質
3.スパロース(Superose)12のクロマトグラフィー後の最終生産物
4.濃縮工程後の回転したペレット
第26図(ゲルIV)は、因子Xa/ダイアボディーの変化するモル比において1mMのNi2+の存在下に37℃において20時間の間因子Xaで切断した(his6標識を除去するために)細胞内で発現させたMab32ダイアボディーの調製物の非還元性SDS-PAGEゲルを示す。因子Xa/ダイアボディーのモル比-トラック1  1:5;トラック2  1:2;トラック3  1:1。
第27図:Mab32ダイアボディーはヒトTNFに特異的に結合する。細菌内で生成しそして再生させて機能的2価の分子を形成したMab32ダイアボディーのELISAのデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキストに記載されているようにアッセイする。
第28図:Mab32ダイアボディーはMab32全抗体とTNFへの結合について競争する。細胞内で生成しそして再生させて機能的2価の分子を形成したMab32ダイアボディーのELISAのデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキストに記載されているようにアッセイする。
第29図:抗301抗血清はMab32-ダイアボディーの結合と競争する。細胞内で生成しそして再生させて機能的2価の分子を形成したMab32ダイアボディーのELISAのデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキストに記載されているように競合するエピトープに対して結合する抗血清の存在下にアッセイする。
第30図:Mab32ダイアボディーは2価である。細胞内で生成しそして再生させて機能的2価の分子を形成したMab32ダイアボディーのELISAのデータ。ヒトTNFおよびBSAへの結合をこのテキストに記載されているようにアッセイする。9E10抗体を使用することによって結合したダイアボディーを検出する代わりに、ビオチニル化TNFを使用し、ダイアボディーは2価であることが証明される。
第31図は、ヒトPBLにより腫瘍細胞のCBM1ダイアボディー仲介溶解を示す。溶解%は51Crの解放を使用して決定した。E:T比はエフェクター細胞(ヒトPBL細胞)/標的腫瘍細胞(LS174T)の比を表す。ヒトPBLはドナーDから得た。CMB-1は1000ng/mlおよび10ng/mlで使用した;w/o抗体は抗体またはダイアボディーの断片なしの対照からのデータである。
第32図は抗CEA抗CD3ダイアボディーのCBM1の構成を示す。クローンCEAはネズミ抗CEA抗体の一本鎖のFvであり、そしてBAR35-L5はモノクローナル抗体3G8の5アミノ酸の抗体のバージョンである。ダイアボディーCBM-1はこの出願に記載されている方法を使用して示した計画に従い構成された。
第33図:二重特異性ダイアボディーのレパートリーの構成。phOxについて濃縮されたscFvレパートリーおよびDigバインダーを構成の出発点として使用した。E1-OXはphOx上で選択したscFvレパートリーからのds-DNAであり、重鎖および軽鎖の両方の遺伝子のレパートリーを供給する(VH-OXおよびVL-OX;より詳細についてはテキストを参照のこと):E2-OXはDig上で選択したscFvレパートリーからのds-DNAであり、VH-DigおよびVL-DIGの両方の遺伝子のレパートリーを供給する(より詳細についてはテキストを参照のこと)。LN11はFab-D1.3を含有するファージミドベクターであり、そして2つのVH-VLカセットの間の領域のための供給として使用する。遺伝子のレパートリーを示すように増幅し(また、テキストを参照のこと)、そして二重特異性ダイアボディーのフォーマットにおいてPCRアセンブリーおよびライゲーション仲介連鎖およびPCRの組み合わせにより一緒に連鎖した。最終の断片をSfi-NotI制限断片としてファージ表示のためにファージミドベクターの中にクローニングした。
第34図:二重特異性ダイアボディーのレパートリーからのクローンのELISAスクリーニング。抗phOx/抗Dig二重特異性レパートリーからの個々のクローンを選択の前にファージダイアボディーとして分析した(プレート1,4および7)、そしてphOx-BSA上の選択後ファージダイアボディー(プレート2,5および8)または可溶性ダイアボディー断片(プレート3,6および9)として分析した。すべてのDigおよびphOx結合性ダイアボディーはそれらの抗原に特異的に結合した;二重特異性クローンは選択前に6/93および選択後に40/96の頻度で同定された。それ以上の詳細についてはテキストを参照のこと。
第35図:二重特異性ダイアボディーの結合。二重特異性ダイアボディーの結合は、ファージ(上部)として、あるいはELISAにおいて可溶性ダイアボディー(下部)として、phOx-BSA上で選択されたレパートリーを形成する。Dig-BSAまたはphOx-BSAに対する相対的結合はクローン毎に変化し、多数の異なるクローンが得られたことを示す。
第36図は、ゼロ残基のリンカーおよび2残基のリンカーをもつNQ11逆ダイアボディーのphOx-BSAへの結合についてのELISAアッセイのシグナルを示す。
二重特異性および2価の抗体
2価および二重特異性の抗体は、免疫診断および治療(Winter G.およびMilstein,C.(1991)Nature 349,298-299;P.Hollinger & G.Winter,Current Opinion in Biotechnology 4 446-449 1993)における使用を包含する、多数の実際的応用を有する。2価は抗体をマルチマーの抗原に大きい結合活性で結合させることができ、二重特異性は、例えば、漸増する細胞障害性T細胞において、2つの抗原の架橋を可能として腫瘍細胞の殺しを仲介することができる(Staerz,U.D.,Kanagawa,O.およびBevan,M.J.(1985)Nature 314,628-631)。
二重特異性抗体の調製はこれまで複雑でありかつ困難であった。二重特異性ダイアボディーはいっそう伝統的方法により作られた二重特異性抗体と同一の応用において利用することができる。しかしながら、ダイアボディーはいっそう小さくそして細菌中で発現されることができるという利点を有する。
二重特異性および2価の抗体の調製および応用
二重特異性抗体(bisAbs)は、異なる特異性の2つの抗体からヒンジシステインの還元およびレドックス(最初のものとしてポリクローナル抗体について示された)(Nisonoffら、Nature 194:355-358,1962)によるか、あるいは対応するハイブリドーマの融合(Milsteinら、Nature 305:537-540,1983)により従来作られてきている。不都合なことには、これは、また、重鎖および軽鎖を混乱させ、10までの異なる抗体種を生じさせ、そしてbisAbsをこの混合物から単離しなくてはならない。あるいは、bisAbsはまた従来2つの異なる抗体の化学的カップリングにより作られてきている。例えば、2つの異なるIgG分子(karpovskyら、J.Exp.Med.160:1686-1701,1984;Brennanら、229:81-83,1985)、Fab′断片およびIgG分子(Karpovskyら、J.Exp.Med.160:1686-1701,1984)または2つの異なるタンパク質分解性Fab′またはFab′2断片がヒンジシステインを使用して架橋されてきている。
2価の抗体は細菌中でFab′2断片として調製された(WO93/06217)。大腸菌(E.coli)中の全ヘテロ四量体の発現の制限された報告が存在したが、この系の一般的実用性はまだ示されてきていない(WO93/07896)。この系を使用して発生された二重特異性抗体は種の複雑な混合物である。
操作された二重特異性抗体分子の調製
操作されたbisAbsをFv,Fabおよび一本鎖Fv抗体断片(第1図参照)から生体外および生体内でアセンブリングした。治療のために、IgGのFc部分はまたFcレセプターを有する細胞をターゲッティングするので、抗体断片はIgGよりいっそう特異性であるべきである(Lanzaveccia,A.およびScheidegger,D.,Eur.J.Immunol.1987,17:105-111)。さらに、より小さい抗体断片はIgGまたはFab′2断片より容易に組織の中に浸透し、そしてまた血清からいっそう急速に除去される(32,33)。これらの特徴は放射性ヌクレオチドまたは毒素を腫瘍にターゲッティングするために望ましいことがある。逆に、より長い血清半減期はエフェクター機能を漸増するために望ましいことがある。ダイアボディーはこれまで作られた最も小さい二重特異性抗体断片であり、これらは腫瘍のそれらをより長く作ることが必要である場合、CH3ドメインとの融合を使用してそれらの大きさを増加し、血清半減期を増加することができる。
生体外の二重特異性抗体のアセンブリー
Carterら(Biotechnology 10:163-167,1992)は、ヒト表皮成長因子レセプター2(p185HER2)に対して向けられたおよびCD3に対して向けられたFab断片をジスルファイド結合により連鎖する二重特異性Fab2を合成した。このbisAbsはp185HER2を過度に発現する細胞の殺しを細胞障害性T細胞により仲介することができる。
ジスルファイド結合は、また、Fab断片を一緒にするカルボキシ末端の二量体化ペプチドを使用して酸化により生体外で推進することができる。Kostelnyら(J.Immunol.148:1547-1553,1992)は、FosおよびJunロイシンジッパーをこの方法において使用した。レドックス緩衝液中で混合しそして透析することによって、ヘテロ二量体のFab断片(抗CD3-Fosおよび抗p55(1L-2R)-Jun)を優先的にアセンブリングすることができ、そして生成したbisAbsは細胞障害性T細胞を漸増してIL-2レセプターを有する標的細胞を溶解することができる(Kostelnyら、J.Immunol.148:1547-1553,1992)。
本発明により提供され、そして実施例1に示すように、二重特異性ダイアボディーは生体外で2つの鎖を「クロスオーバー(crossover)」対合の可変ドメインと一緒に混合することによって簡単にアセンブリングすることができる。
生体内の2価および二重特異性抗体のアセンブリー
いくつかのヒンジシステインをもつFab′断片の哺乳動物細胞(Neubergerら、Nature312:604-608,1984))または細菌(Skerraら、Protein Eng.4:971-979,1991))からの分泌は、2価のFab′2断片の制限されたアセンブリーに導くことがある。ジスルファイド結合の形成は二量体化ペプチドを使用して促進することができる。例えば、カルボキシ末端の両親媒性らせんおよび単一のシステイン残基を使用して操作したscFv断片は、大腸菌(E.coli)からの分泌のときジスルファイド連鎖した(2価)二量体を形成することが示された(Packら、Biochemistry 31:1579-1584,1992)。両親媒性らせん単独の使用はモノマーと二量体との間の平衡を発生する;ジスルファイド結合は二量体を安定化するために要求される(38)。しかしながら、より安定な二量体化ドメインをジスルファイド結合を必要としないで使用することもできる。例えば、安定なscFvホモ二量体は抗体CH3ドメインを通して二量体化し、そして細菌から分泌させることができる(P.Hollinger & G.Winter,1993前掲)。
二量体化のペプチドまたはドメインを使用する代わりに、bisAbsは、また、2つの抗体を直接遺伝子のレベルで融合することによって構成することができる。例えば、2つの一本鎖Fv断片は直列に柔軟性ポリペプチドにより連鎖して、細菌から分泌のためのbisAbsを作ることができる(P.Hollinger & G.Winter,1993前掲)。他方において、多分4つの直列のドメインは、また、同一の鎖内で、あるいは事実他の鎖を使用して交互する(および正しくない)対合を形成することができる。
P11-A ISアミノ酸リンカーを、二重特異性ダイアボディーの発生において、実施例1に示すように構成体N-(VHA-VIB)-C/N-(VAB-VLA)-Cにおいて非共有結合的に連合されるドメインの交差(cross)対合により使用することができる。しかしながら、このフォーマットにおいて、二量体化の程度はモノマーおよびキメラscFvの形態の間の平衡に依存するであろう。
異なる鎖からの可変VHおよびVLドメインの対合に好適な短いリンカーの使用は、ダイアボディーのフォーマットで二重特異性ダイアボディーを作ることが簡単であることを意味する。ダイアボディーの2つの鎖は生体内または生体外で自発的にアセンブリングする。ホモ二量体は二重特異性であるヘテロ二量体と同様によく形成されるであろうが、ホモ二量体は機能的抗原結合部位を形成しないであろう。例えば、問題の2つの抗原の一方を使用するアフィニティクロマトグラフィーを使用して、正しい対合をもつ機能的ヘテロ二量体を不活性のホモ二量体から分離することができる。
ダイアボディーの構造
ここで、われわれは、ダイアボディー、通常2つの抗原結合部位をもつ小さい抗体断片のデザインを記載する。
ダイアボディーを構成する考えは、一部分、細菌から分泌されるscFv断片がモノマーおよび二量体の両方としてしばしば存在するというわれわれの観察により刺激された(Griffiths,A.D.,Malquis t.M.,Marks,J.D.,Bye,J.M.,Embleton,M.J.,McCafferty,J.,Baier,M.,Hollinger,P.,Gorick,B.,Hughes-Jones,N.,Hoogenboom,H.R.およびWinter,G.(1993)EMBO J.12,725-734,G.Winter,oral disclosure at Cardiff,September 1992);参照、また、…Abstract from 8th International Congress of Immunology,August 1992。しかしながら、これらの一本鎖Fv二量体は2価のホモ二量体から成るように思われ、そしてこれらのホモ二量体の構造は明瞭ではない。本発明の1つの態様において、われわれは2つの異なるscFv断片に基づくヘテロ二量体を作る方法を提供する。2つの異なる抗体AおよびBの重鎖および軽鎖のV-ドメインを連鎖して2つの異なる「クロスオーバー」鎖N-(VHA-VLB)-CおよびN-(VHB-VLA)-Cを形成することによって、われわれは鎖が連合のとき両方の抗原結合部位を再びつくることを示す。「クロスオーバー」鎖N-(VHA-VLB)-CおよびN-(VHB-VLA)-Cをもつ二重特異性ダイアボディーを、また、構成して両方の抗原結合部位を再びつくることができる。われわれはこれを「逆」フォーマットと命名した。抗原結合部位のアフィニティーが保持され、両方の結合部位が適切に再びつくられることを示すことは、とくに興味あることである。さらに、調製されたヘテロ二量体の断片は主として二量体であった。
他の態様において、重鎖および軽鎖の可変ドメインは同一鎖上の2つのドメインの間の対合を可能としないリンカーにより接続され、例えば、それは短過ぎるためであり(事実ドメインは直接接続することができる)、したがってドメインは他の鎖の相補的ドメインと対合させられ、そして2つの抗原結合部位をつくる。二量体のコンピューターグラフィックモデルにより示されるように、2対のドメインは抗原結合部位を反対方向に向けて一緒にパックすることができる。2価の二量体のダイアボディーは、二重特異性二量体に加えて、短いリンカーを使用して発生させることができる。VHドメインはVLドメインに対してN-末端であることができるか、あるいはVLドメインはVHドメインに対してN-末端(「逆」)であることができる。両方の場合において、VHおよびVLドメインの順序は最も好ましくは同一であるべきである。
ダイアボディー分子およびリンカーの長さのモデリング
短いリンカーは2つの鎖が連合することができる方法に対して主要な拘束を付与する。したがって、われわれは抗原HELと複合したFabD1.3断片のX線結晶学的構造を使用して二量体のモデルを構成することを試みた(Fischmann,T.O.,Bentley,G.A.,Bhat,T.N.,Boulot,G.,Mariuzza,R.A.,Philipps,S.E.V.,Tello,D.およびPoljak,RJ.(1991),J.Biol.Chem.266,12915-12920)。コンピューターグラフィックスのプログラミングしたFRODO(Jones,TA.(1982),Computational Crystallography,Sayre D.編(Clarendon,オックスフォード,1982)pp.303-310)を使用して、Fv部分の2分子は一緒にされ、こうして各VHドメインのC-末端は各VLドメインのN-末端に対して密接に並べられ(約7オングストロームのC-Nの距離をもつ)、そして5残基のリンカーの拘束を容易に満足した。2つのVHドメインは抗原結合部位から遠位のループにおいて一緒にドッキングすることができ、ここで悪い接触は眼により検出されずそしてプログラミングされたPROLSQ(Hendrickson W.A.およびKonnert,J.H.,“Structure,conformation and evolution”Vol.1(Srinivarsan,R.編)pp.43-57(Pergamon,オックスフォード,1981))。
抗原結合部位は反対方向に向き、そして2組の対になったドメインは二軸により関係づけられる(第12図)。ブルックヘブン(Brookhaven)データベースの他の抗体の結晶学的構造の検査は、それらがまた同様な方法でパックすることができることを示す(示されていない)。二軸(テイル対テイル)を横切る免疫グロブリンのドメインのパッキングは、最近の比較について、抗原またはIg上の上科の構造におけるそれと異なる(参照、Jones,E.Y.,Dabis,J.D.,Williams,A.F.,Harlos,K.およびStuart,D.I.(1992)Nature 360,232-239)。
このモデルを検査すると、VHドメインのC-末端をVLドメインのN-末端に直接接合することができ、そしてリンカーのポリペプチドを省略することができることが示唆される。これは2つのVHドメインが一緒にパックするときそれらの間のわずかのつぶれを生ずることが期待されるであろうが、これらの領域における主鎖の柔軟性によるか、あるいはVLドメインのN-末端のβ-鎖をキンクすることによって、歪みを解放することができるとわれわれは考えた。事実、リンカーをもたない断片は二量体でありかつ二重特異性であることが証明され(実施例1、表2)、提案されたモデルを支持した。phOxについての断片の結合のアフィニティーおよび解離の反応速度論が変更され、ドメインの強制的パッキンクは抗原結合部位における構造の変更に導くことができ、そして事実2つの結合部位の抗原の結合が共同的(または抗共同的)であるダイアボディーを構成できることを示唆する。NQ11/B1.8ダイアボディーの2つの抗原結合部位の間の共同性は実施例4において示唆されており、そしてさらに後述する。
この特許に記載されている実施例は、ダイアボディー分子を異なる抗原特異性をもつ種々の抗体の可変ドメインについて構成できることを証明する。0または5アミノ酸のリンカー長さをもつ多数のダイアボディーを構成し、そして機能的であることが示された。これらは次のものを包含する:2-フェニルオキサゾル-5-オン(phOx)(実施例1);リゾチーム(実施例1);腫瘍壊死因子(実施例5および7);HIVgp120のV3ループ(実施例4);癌胎児性抗原(CEA);FcレセプターFcγRIII(CD16);ヒトFcレセプターFcγRI(実施例17);BCL-1リンパ腫細胞系の表面Ig(実施例19)およびCF3抗原(実施例18)に対して向けられた2価のダイアボディー。次のものに対して向けられた二重特異性ダイアボディーを構成した:phOxおよびリゾチーム(実施例1);phOxおよびNIP(4-ヒドロキシ-2-ヨード5-ニトロフェニル酢酸)(実施例3);CEAおよびCD16;NIPおよびFcRI(実施例17);BCL-1リンパ腫細胞系の表面IgおよびCF3(実施例18);HIVgp120のV3ループおよびヒトFcRI(実施例20)およびphOxおよびエストリオール(実施例11)。ある数のこれらは全細胞上のマーカーにCEA;CD16およびCD3に対して向けられたものを包含するFACS分析により結合することが示された(実施例18)。
特定のクローニングした抗体をダイアボディーのフォーマットに変換しようとする場合、どれが最もよく働くかを見るためにリンカーの長さを変化させる(例えば、0から上方に)ことは簡単なことである。同様に、異なる長さの置換は、同一の長さであってさえ、有利であることがある。
また、実施例3においてわれわれが示すように、リンカーは抗原結合機能を保持して-1に短縮することができる。1系列のマイナスリンカー分子(VLドメインのN-末端またはVHドメインのC-末端からアミノ酸を欠失させることによってゼロより短いリンカーをつくって(-1)、(-2)および(-3)構成体を形成する。-1よりさらにリンカーの長さを減少させると、これらの研究において使用するNQ11/D1.3ダイアボディーのみがフォルディングを妨害する。しかしながら、(-2)リンカーが機能的である場合、異なるVHおよびVLドメインをもつダイアボディーの例が存在する可能性が残る。
実施例1に示すように、15アミノ酸のリンカーにより連鎖されたVH-VLポリペプチドはダイアボディーのフォーマットにおいてモノマーとしておよび二量体としてそれらのVHおよびVLドメインを対合することができるが、5アミノ酸のリンカーをもつVH-VLポリペプチドはダイアボディーのフォーマットにおいて二量体を形成することによってそれらのVHおよびVLドメインを対合することができるのみである。VHおよびVLドメインがダイアボディーのフォーマットにおいて(そして単一のポリペプチド内ではない)対合することができる、リンカーの長さの最大の限界をわれわれはまだ決定していない。しかしながら、10アミノ酸のリンカーを使用する実験は、VHおよびVLドメインがモノマーのポリペプチドにおいて対合することができることを示唆する(実施例16)。
ダイアボディーの構造はコンパクトでありそして短いリンカーは剛性であるべきである。柔軟性の欠如は2つの可溶性抗原の架橋から、あるいは細胞表面の抗原および可溶性抗原の架橋を弱めると思われない。われわれは実施例13において、二重特異性ダイアボディーによる天然のキラー細胞への腫瘍細胞の架橋を達成できるという証拠を提供する。実施例9および15において、2価および二重特異性のダイアボディーを使用して、抗原被覆された赤血球を凝集することができることをわれわれは証明する。しかしながら、ある場合において2つの細胞の架橋について、ダイアボディー分子の多少の柔軟性は有利であることがある。長いリンカーはダイアボディーのヘッドのより大きい柔軟性を可能とするが、また、同一鎖内の対合およびモノマー断片の形成を可能とするであろう。3つの鎖の断片(第1図)におけるように、リンカーの一方を完全に破壊すると、高度に柔軟性のヘッドが形成するであろうが、3つの鎖を緊密に連合して保持することはいっそう困難であることが証明された。この3つの鎖の断片の構成および性質は実施例1に記載されている。短いリンカーの距離の拘束をもつ二量体N-(VH-VL)-Cをわれわれはモデリングしたが、また、相互に変換される重鎖および軽鎖の位置、すなわち、VHドメインに対してN-末端のVLドメインを除外して、まさに第12図におけるように二量体N-(VL-VH)-Cをモデリングすることができる。ダイアボディーのN-(VL-VH)-Cフォーマット(「逆ダイアボディー」)を構成し、そして効率よく発現されそして抗原に結合することが示された(実施例15)。対照的に、短いリンカーの拘束が与えられると、われわれはヘテロ二量体としてN-(VH-VL)-CおよびN-(VL-VH)-CまたはN-(VH-VH)-CおよびN-(VL-VL)-Cをモデリングすることができなかった。
2つの異種鎖から構成されたダイアボディー、例えば、二重特異性ダイアボディーについて、非対称リンカー、例えば、一方の鎖上に＋1、他方の鎖上に-1をもつダイアボディーを調製できるであろう。事実、ISアミノ酸のリンカーを有する1つの鎖および0の1つにより例示されるように、異なる長さの組み合わせをもつ非対称ダイアボディーは可能である(実施例を参照のこと)。二量体においてポリペプチドのただ1つが、そのドメインの連合を防止する方法で連鎖されたそのドメインを有することが必要である。
ダイアボディー分子のパッキング界面の修飾
前述のダイアボディーのモデルは、N-(VH-VL)-Cフォーマットのダイアボディー中の2つのFv断片の2つのVHドメイン、あるいはN-(VL-VH)-Cフォーマットのダイアボディー中の2つのFv断片の2つのVLドメインの間にパッキング界面を生ずる(これは、一定ドメインが一定ドメインと制限された相互作用を作るFab断片と対照的である)。例えば、共同的性質を変更することによって、活性を調節することができるであろう2つのFvドメインの間の界面に残基を導入することが可能であることがある。
共同性
この出願において、2-フェニルオキサゾル-5-オンおよびNIPに対して向けられたダイアボディーB1.8/NQ11の2つの部位の抗共同的結合が存在できることをわれわれは証明し、これは共同的変化が一方のドメインから他方のドメインに転移され得ることを示唆する。抗原の結合後にモノマーのFab断片中の個々のVH/VL対内にコンフォメーションの変化の例が存在する(R.L.Stanfieldら、Structure 1 83-93,1993;J.N.Herronら、Proteins 11 159-175,1991)が、いずれかの抗体の2つの抗原結合部位の間の共同性が証明されたのはこれが最初である。特定のアミノ酸残基の導入によりダイアボディーの結合部位の間の共同性の程度を増強(または減少)することが可能であろう。
安定性
界面を横切るそれ以上の非共有結合的相互作用、例えば、塩の架橋、芳香族のスタッキング、水素結合、またはファンデルワールス接触またはジスルフィド残基を通る共有結合的相互作用またはグルタミルリジン架橋を導入する残基の操作は、ダイアボディーに余分の安定性を付与することができるであろう。この安定性はダイアボディーの貯蔵半減期、あるいは血清または非水性溶媒中のその半減期に対して有利であろう。短いリンカーにより強制されるような2つのドメインのパッキングと、ダイアボディーの2つの鎖との相互作用は、また、モデルにより定められるような界面を横切るパッキングの相互作用により多分強制されることができるであろう。この場合において、一本鎖Fv断片よりむしろダイアボディーのフォーマットにおける鎖の連合に好適であるために短いリンカーを使用することは不必要であることがある。
共同性および安定性の調節のために修飾すべきVHドメインの界面における残基
われわれは(VH-VL)D1.3ダイアボディーのモデルを検査し、そして修飾のためにいくつかの残基を選択した。2つのVHドメインの間の主要な相互作用はVHの2つのループにより形成される。これらのループの一方はフレームワーク2の中に存在し、2つのVHドメインの残基43(VHD1.3中のリジン)は約5A内に近づく。他方はフレームワーク3の中に存在し、このモデルにおける最も近い接近は残基86〜88においてであり、これらは隣接するVHドメイン上で残基86〜88および残基43に密接に近づく。したがって、これらの残基は安定性および共同性を変調するための修飾の突然変異誘発のための強い候補である。実施例22は界面が次のことを目的として修飾された例を与える:
(i)イオン結合の導入
(ii)ジスルファイド架橋の導入
(iii)水素結合の数の増加
(iv)疎水性相互作用の数の増加
(v)反発的相互作用の増加
イオン結合および水素結合は強い方向的要素であり、したがって含まれる残基の向きに依存する。
VHドメインの間の相互作用に関係するループは、全抗体、一本鎖FvおよびFab断片の中の極性の環境の中に通常存在する。したがって、水を排除することがあるダイアボディー中のVHドメインの間の界面にこれらの残基が存在することは、エネルギー的に不適切であろう。したがって、極性残基を疎水性残基と置換すると、ダイアボディーの界面のパッキングをいっそう剛性としかつ安定とすることができる。
修飾を類似の方法でなすことができる逆ダイアボディーの場合において、一緒にパックする2つのVLドメインの中の同様な位置に類似の残基が存在する。
導入することができる他の修飾が存在し得る。例えば、界面におけるか、あるいはリンカー内のヒスチジンの導入は、pHまたは金属イオン濃度を変化させて、互いに関するドメインの向きを変更させ、これにより結合のアフィニティーを調節することができる。
共同性の可能性は、また、例えば、VHおよびVLドメインの間のリンカーの長さを変更することによって調節できる。これらは、また、リンカーの長さが非対称であり、例えば、一方の鎖上で＋1、他方の鎖上で-1であるように、変更することができる。
ダイアボディーの構造におけるジスルファイド架橋の使用
ジスルファイド架橋を使用してダイアボディー内の領域を共有結合的に連鎖することができる。
例えば、VL-VHダイアボディーのCLドメインの2つのC末端はジスルファイド架橋により連鎖することができる。(VH-VL)D1.3ダイアボディーのモデルにおいて、VLドメインのC-末端は密接な近位にあり、これらの領域がジスルファイド結合により連鎖できるであろうことを示唆する。事実、Cys残基がNQ11(5残基のリンカー)の2価の断片のVLドメインのC-末端に挿入されそして断片を記載するようにphOx-BSAセファローズで精製したとき、非還元性SDS-PAGEおよび溶離した断片のウェスタンブロッティングにより決定して、共有結合的に連鎖した二量体が認められた(実施例23)。これが示すように、ジスルファイド連鎖された鎖は抗原の結合において活性であり、われわれの提案したモデルを支持する。これは細菌から分泌されたFab断片の間の分子間ジスルファイド結合の形成の推進における成功の欠如と対照をなす(Glockshuber,R.Maila,M.,Pfitzinger,I.およびPluckthun,A.(1990)Biochemistry 29,1362-1367)。
同様に、逆ダイアボディーのVHドメインのC末端におけるジスルファイド結合の導入のための可能性が存在し得る。
さらに前述したように、(VH-VL)ダイアボディーのVHドメインの間の界面を横切ってジスルファイド結合を導入することができる。
リンカー分子のいずれかの末端にシステイン残基を組み込むことによって、長い、例えば、15リンカーのダイアボディーにおけるダイアボディーの形成を促進することができる。次いで、これらのシステインはジスルファイド結合を形成し、ペプチドのループアウトをもつ2残基のリンカーの同等体を得ることができる。上のような(実施例23)およびメタロチオネインを含有するダイアボディー(実施例25)におけるVLドメインのC-末端におけるジスルファイド架橋の形成は、このアプローチが実行可能であることを示唆する。
対合VH/VLドメインの界面の修飾
抗原が抗体に結合するとき、ある場合においてコンフォメーションのシフトが存在し得る。ダイアボディーのVH/VLの対の内部およびその間の、このコンフォメーションの変化の移行の程度は、VHおよびVLドメインの間の相互作用の程度に依存するであろう。
また、ダイアボディー分子の共同性を増強する、作ることができる修飾が存在し得る。互いに相互作用しそしてVHおよびVLドメインが互いに関して動く容易さを調節するように修飾すべき可能性を有する、ある数の残基がVHおよびVLドメインの界面に存在する。これらの残基の修飾は、ダイアボディーの2つの抗原結合部位の間の共同性の可能性を増強することができる。
CH3ドメインをもつ融合体
各ダイアボディーはFab断片とほぼ同一の大きさである。例えば、血清中の保持を増強するために、大きさを増加することは有利であろう。したがって、ダイアボディーは他のタンパク質、または他の抗体ドメインに、例えば、抗体のCH3ドメインを通して遺伝的に融合して、VH-VL-CH3ホモおよびヘテロ二量体の鎖を形成することができる(実施例12に記載するように)。
ダイアボディーの二量体
ダイアボディーは、また、ダイアボディー-二量体として、すなわち、4つのVH-VL鎖と化学的架橋により連鎖することができる。これは大きさが(Fab)2断片に等しい。例えば、VLドメインのC-末端にC-末端のシステイン残基を導入する(VL-VH二量体について)と、ジスルファイド結合(P.Carterら、Biotechnology 10 163-167,1992)またはチオエーテル連鎖(M.J.Glennieら、J.Immunol.139 2367-2375 1987)。これは4結合特異性、または2結合特異性(しかし各々について2つの結合部位)、または単一の結合特異性(しかし各々の4コピー)をもつ(Fab)2に似た断片を作る可能性を与える。このようなダイアボディー-二量体は(Fab)2断片と比較して増強された結合活性を有することができる。
3以上のポリペプチドのマルチマー
三量体および四量体は、また、精製された2価のダイアボディー調製物(D1.3、5残基のリンカー)において観察され(Fisch,I.,Holliger,P.およびWinter,G.,未発表の結果)短いリンカーがマルチマーの形成と適合性であることを示す。
二重特異性または三重特異性のFabγ3分子はヒンジ不含システインの生体外カップリングによりFab′断片から構成されたが、われわれの観察によると、生体内でアセンブリングする小さい三重特異性抗体断片をダイアボディーのデザインに類似する方法で作ることができることが示される。3つの異なる抗体A,BおよびCの重鎖および軽鎖のVドメインを連鎖して2つの異なる鎖VHA-VLB,VHB-VLCおよびVHC-VLAを形成することによって、鎖は連合のとき3つの異なる抗原結合部位を再びつくることができる。
短いリンカー(5残基)を使用してVHおよびVLドメインが連合しそしてダイアボディーのデザインに類似する安定なFv断片を形成することが知られている抗体を選択して、同一の鎖上のVHおよびVLドメインが互いに対合するのを防止すべきである。
モデリング
われわれは、抗原HELと複合化したD1.3抗原のFab断片のX線結晶学的構造を使用して三量体のモデルを構成することを試みた(Fischmannら、前掲)。コンピューターグラフィックスのプログラムFRODO(Jonesら、前掲)を使用して、各VHドメインがVLドメインのN-末端に対して密接に並置され、かつ5残基のリンカーの拘束を容易に満足するように、Fvタンパク質の3分子を一緒にした。ダイアボディーのモデル(上を参照)と対照的に、トリアボディー(triabody)中の3つの抗原結合部位は分子の同一面上に位置し、そして三軸により関係づけられる。
VLドメインのC-末端のすべては分子の対向する面上にかつ互いから距離を置いて位置する。C-末端にシステインを導入することによって、2つのトリアボディーを架橋させて、IgGとほぼ同一の分子量の6価の分子を形成することができる。
C-末端の間の距離は、ダイアボディーについてと類似する方法で分子内ジスルファイド架橋を形成する可能性をなくする。
トリアボディーの構造は、ダイアボディーの構造よりもコンパクトではなくそしていっそう柔軟性であると思われる。事実、結合部位は分子の2面の間でフリップ-フロップすることができると思われる。トリアボディー分子の可能なコンフォメーションは平らであり、3つの結合部位が平面の中に互いから120°の角度で位置する。
分子の中心は孔を含有する。分子の界面または中央の孔における架橋(例えば、ジスルファイド結合、金属結合部位)を使用して、安定性を増加しそして断片をいっそう剛性とすることができる。3つのFvドメインの間の堅固な連鎖は、3つの結合部位の抗原の結合が共同的(または抗共同的)であるトリアボディーの構成を可能とする。
二重特異性の3鎖のダイアボディーの構成体(VII、上を参照)に類似するように、4鎖のトリアボディーの構成体を想像することができ、ここで、例えば、3つの可溶性ドメイン;VHA,VLBおよびVHCは1つのポリペプチド鎖上にエンコードされたVLA-VHB-VLCドメインとアセンブリングすることができる(他の組み合わせは同様に可能である)。しかしながら、このような構成体は希釈のとき解離するいくつかのFv断片の傾向により制限されることがある。
応  用
本発明により提供される分子の応用および実用性のここにおける説明において、「ダイアボディー」に対する一般的言及は、ダイアボディーが2価または二重特異性であるかどうかにかかわらず、マルチマー、例えば、適当ならばそして適当な変更を加えて、三量体の「トリアボディー」などを包含する。
エフェクター機能の漸増および腫瘍細胞の処置
二重特異性抗体は、細胞障害性T細胞または天然のキラー(NK)細胞の強力なエフェクター機能を漸増する特定の用途を見出した。こうして、bisAbsはT細胞のコレセプター(CD3)(Staerzら、Nature 314:628-631,1985)またはFcRIII(CD16)(DePalazzoら、Cell Immunol.142:338-347,1992)および標的細胞の細胞表面の抗原を架橋して、細胞障害性T細胞はまたNK細胞による標的細胞の殺しを仲介するために使用されてきている。マウスにおいて、このような抗CD3bisAbsは充実腫瘍の増殖を阻害する(Titusら、J.Immunol.138:4018-4022,1987,Garridoら、Cancer Res.50:4227-4232,1990)か、あるいはリンパ腫を根絶することさえできる(Brissinckら、J.Immunol.147:4019-4026,1991);それらは悪性グリオームに対して使用されてきている(Brissinckら、J.Immunol.147:4019-4026,1991)。二重特異性抗体は、また、骨髄から白血病細胞を半ビボのパージングのために使用されてきている(T.Kanekoら、Blood 81 1333-1341,1993)。
生体外で合成された二重特異性抗体は、また、酵素、抗原、毒素、ラジオヌクレオチドおよび細胞障害性薬物を腫瘍細胞に送り出すために使用されてきている(参照、12-14;M.A.Bonardiら、Cancer Res.53 187-199 1992)。
腫瘍の像形成
二重特異性抗腫瘍マーカー、抗ハプテン抗体は腫瘍を像形成するために使用されてきている(J.M.LeDoussalら、Int.J.Cancer Supplement 7 58-62,1992;P.Peltierら、J.Nucl.Med.34 1267-1273 1993;C.Somasundaramら、Cancer Immunol.Immnother.36 337-345,1993;A.Bruynckら、Br.J.Cancer 67 436-440,1993)。第1に、抗体を注射しそして腫瘍マーカーへの結合により腫瘍に対して局在化する。次いで、放射性標識化ハプテン、例えば、99Tまたは111Inとの金属キレートを注射し、これは二重特異性抗体への結合により、腫瘍に対して優先的に局在化し、腫瘍の像形成を可能とする。同様に、腫瘍細胞に対して特異性の1つのアームおよび金属キレートに対して特異性の1つのアームをもつダイアボディーを使用して、放射性金属イオン、例えば、90Yのキレートを癌の治療のために送り出すことができる。
他の応用
二重特異性抗体は、腫瘍細胞のターゲッティングを越えて拡張するある数の実験の目的を達成するために利用されてきている;血栓崩壊は凝血塊に組織プラスミノゲンアクチベーターをターゲッティングすることによって増強された(15):細胞培養におけるヒト免疫不全ウイルス(HIV)-1の増殖はウイルスをFcレセプター(それらの正常のレセプター、CD4、ではなく)に向けることによって阻害された(16,17):非許容性ヒト細胞系は主要な組織適合性複合体(MHC)クラスIおよびII細胞-表面タンパク質に対するウイルスの連鎖によるマウスレトロウイルスにより感染された(18)。bisAbsは、抗原を抗原提示細胞に架橋させるために使用するとき、アジュバントとして作用することが発見された(14,19)。
抗FcgRIII抗体デング熱ウイルスbisAbは、感染すべき細胞とウイルスを密接に接合させることによって、ウイルス感染性を増強するために使用された(B.J.Madyら、J.Gen.Virol.74 839-844,1993)。
ダイアボディーのいくつかの実用性
二重特異性抗体は癌および他の疾患の治療において大きい可能性を有するように思われるが、それらの生産および精製における困難はそれらの応用を制限した。それらの使用は、二重特異性断片の調製に関係する努力の量が価値がある、困難な治療上の問題に制限される傾向がある。本発明において記載されるダイアボディーは二重特異性抗体の生産方法を簡素化し、そしてこれはそれらを使用できる応用範囲を大きく拡張する。
二重特異性ダイアボディーは、例えば、ダイアボディーの一方のアームがエフェクターの機能を誘発しそして他方のアームが細胞、ウイルスまたは細菌をターゲッティングする、前述したように、二重特異性抗体が使用されてきている、事実上任意の応用のために使用することができる。ターゲッティングのエフェクターの機能について、一方のアームはヒトIgGレセプター(FcγRI,FcγRII、およびFcγRIII)またはIgEレセプター(FcεRIおよびFcεRIII)に対して向けることができる。高いアフィニティーのFcγRIレセプターについて、断片はIgGのFc部分によりブロックされないエピトープに対して向けられるべきである。ダイアボディーは、また、ヒトT細胞抗原、例えば、CD3に結合することができるが、T細胞を活性化して殺しを誘発することが必要であろう。エフェクターのアームは、また、放射性同位元素、例えば、キレートと複合化した放射性金属イオン、または放射性ヨウ素化ハプテンの結合によるか、あるいはプロドラッグを切断することができる酵素への結合により提供することができる。
2価(および二重特異性)のダイアボディーは、また、赤血球の凝集の診断アッセイのように、多数の相互作用を作ることによって、細胞、細菌またはウイルスの凝固のために使用できるであろう。また、二重特異性ダイアボディーは、例えば、特定の細胞の中に遺伝物質を導入する遺伝子のターゲッティングのために細胞にレトロウイルスをターゲッティングするために、異なる粒子の間の架橋を形成するために使用できるであろう。ダイアボディーは、また、同一表面、例えば、ウイルスのコート上の2つのエピトープに同時に結合して、ウイルスに高い結合活性で結合しそしてウイルスの脱外被をブロックすることができる;あるいはCD3抗原を架橋させることによってT細胞を活性化することができる。実施例9および15に記載するように2価および二重特異性のダイアボディーによる抗原被覆赤血球の凝集は、これらのアプローチが実行可能であることを示唆する。これは実施例13における腫瘍細胞の細胞溶解により支持される。同一レセプターの2つの鎖、例えば、1L2-レセプターのαおよびβ鎖に対する特異性をもつダイアボディーを使用することができる。同一ポリペプチド上の2つの異なるエピトープに対して向けられた二重特異性ダイアボディーは、その鎖に余分の特異性および結合活性を与えることができる。また、ダイアボディーは、マトリックスの1成分に対して向けられた一方の結合部位および問題の抗原に対して向けられた他方の結合部位を設けることによって、抗原のアフィニティクロマトグラフィーのためのマトリックスを作るとき使用できる。この原理は、表面、例えば、表面のプラスミノゲンの共鳴を使用するか、あるいは消散する波の検出を使用する結合の検出の研究において使用されるチップ上の抗体の固定化に拡張することができる。一方の特異性はチップ表面上のマトリックスに対して向けられることができるが、他方のアームはチップの表面の外に向けられて抗原を使用する結合の研究を実施可能とする。
抗体断片の表示のためのレトロウイルスの使用(S.J.Russell,R.E.HawkinsおよびG.Winter,Nucl.Acids Res.21 1081-1085,1985)をダイアボディーの表示に適応することが可能である。例えば、レトロウイルスは腫瘍細胞の結合のために結合活性を増加するために2価のダイアボディーを表示することができる。
ダイアボディーは、薬物を送り出す一方の結合部位および腫瘍に結合する他方を使用するか、あるいはP.A.Trailら(Science 261 212-215,1993)による腫瘍へのドキソルビシンの送り出しについて記載された系に類似する系を使用して、腫瘍細胞に細胞障害性薬物を送り出すことができる。これらの著者は、ドキソルビシンに共有結合的に連鎖した、ルイスY抗原に対して向けられた抗体を使用し、これはリソソームおよびエンドソームの中に内部化されていた。連鎖はこれらの環境において切断されて、薬物をこれらの細胞に送り出すことができる。2価のダイアボディーは腫瘍細胞のための抗体の結合活性を増加するために有用である。特異性は2つの異なるマーカーに対して向けられた二重特異性抗体の使用により増加することができる。いずれかのFHA、細菌百日咳菌(Bordetella pertussis)の付着に対して、あるいは白血球の付着分子のCR3のための天然のリガンドに対して向けられた一方のアーム(E.I.Tuomanenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 7824-7828,1993)をもつ二重特異性ダイアボディーを使用して血液脳関門を横切ってダイアボディーを送り出すことができ、次いで他方のアームを標的に対して向けて治療的機能を提供することができる。
腫瘍の像形成のために、キレート化される金属イオンの導入により標識化することができ、そしてここでキレートは一方の結合部位に結合するか、あるいはVHおよびVLドメインの間のリンカーの一部分として、あるいは延長部として取り込まれる追加のペプチドにより標識化することができる。
2価の抗体は、例えば125I標識化抗体を使用する腫瘍抗原の結合により腫瘍を局在化するとき、像形成の目的のためにとくに有用である。抗原のための2つの結合部位の存在は、バックグラウンドと比較して腫瘍からのシグナルを増加できる結合活性成分を与えるであろう。腫瘍細胞の表面上の2つのマーカーに対する二重特異性は、また、バックグラウンドと比較して腫瘍特異性像形成シグナルの増加を助ける。また、一方のアームが腫瘍細胞表面のマーカーに対して向けられそして他のアームが腫瘍細胞から脱落するが、腫瘍細胞付近に高い濃度で見出される抗原に対して向けられている、二重特異性抗体を使用することは有利である。
抗体が通常の環境下に特異性をもたない部位または抗原に対して抗体を再ターゲッティングするとき、ダイアボディーを使用できる。ダイアボディーは2つの特異性を有するであろう;一方は標的部位に対する特異性、他方は抗体分子の選択した部分に結合することができる。この方法において、抗原の標的に対する特異性をもたない抗体をダイアボディーを介して抗原に近位させる。これの原理は循環の中の抗原を体内の部位、例えば、腫瘍に再ターゲッティングし、そして自己免疫疾患により例示された不適当な免疫応答をブロックするために有利であり、そしてエフェクター機能の漸増を可能とするであろう。
このようにして、ダイアボディーは全抗体鎖への結合によりエフェクター機能を漸増するために使用できるであろう。1つのアームは治療のための抗原に対して向けられ、そして第2のアームはエフェクター機能の漸増のために全抗体に対して向けられるであろう(参照、実施例21)。V-ドメイン(およびV-ドメインを含有する断片)は抗原との相互作用について大きい責任を負うが、C-ドメインはエフェクター機能を漸増する。漸増されるエフェクター機能の型はC-ドメインのクラス(アイソタイプ)により大きく支配される。例えば、IgG1(γ1)アイソタイプのC-ドメインは細胞表面における相補的カスケードを誘発することによって細胞を殺し、溶解を発生させることができ、そして、また、特殊化された食細胞およびキラー細胞上のC-ドメインのレセプター(Fcレセプター)に結合することができる。対照的に、IgG4(γ4)アイソタイプの抗体はエフェクター機能を活性的に妨害し、これにより免疫応答をブロックするように思われる。
2つの抗原結合部位が密接に一緒に連鎖されているダイアボディーのフォーマットは、二重特異性抗体から区別される他の可能性、または細菌において生産される他の二重特異性抗体断片を提供する。2つの結合部位の一緒のパッキングはアフィニティーの増強に導くことができる;そして一方の結合部位における抗原の結合は他方における結合の増強または減少に導くことができる。この特徴は、次により例示されるように、あるシグナルに対する応答における活性のオンまたはオフの切り替えのための、「条件的」スイッチの構成を可能とするとき望ましいことがある;
(1)分析物および酵素に対するダイアボディーを使用する、均質アッセイ。こうして、1端における分析物への結合は他端における酵素の解放を誘発することができる。酵素の活性がダイアボディーの結合により阻害された場合、その解放は酵素の活性の増加を引き起し、これは着色した基質または蛍光性の基質により検出できるであろう。あるいは、ダイアボディーの他端はアポ酵素の活性のために要求される補欠分子族を解放できるであろう。逆に、ダイアボディーは分析物の結合により誘発されて酵素に結合し、これによりその活性をオンにする。
(2)前述の均質アッセイに類似する、プロドラッグの活性化。腫瘍細胞のマーカーの結合が酵素への結合のための他端の活性化に導くダイアボディーを作ることができるであろう(これは細胞表面の結合した抗体のみが酵素に結合するということにおいて、簡単な二重特異性ダイアボディーを越えた利点であろう)。他の特徴、例えば、酵素へのダイアボディーの結合がその触媒活性を誘発するという特徴を、また、導入できるであろう。
アロステリック抗体の選択
アロステリック抗体を二重特異性レパートリーから選択により単離できるであろう。このようなアロステリック抗体は第1抗原への結合により選択し、そして第2抗原の添加により溶離することができる。これは第1部位における結合のアフィニティーが第2部位の占有により減少するものを選択するであろう。同様に、選択は第2抗原の添加のときの第1抗原との改良された相互作用によることができる。
ダイアボディーを使用する凝集のためのフォーマット
前述したように、2価および二重特異性のダイアボディーは、細胞、細菌またはウイルスの凝固のために、赤血球の凝集の診断アッセイを使用するときのように、多数の相互作用を作ることによって使用できるであろう。細胞表面の上によく暴露される抗原、例えば、血球グループB抗原について、単一のダイアボディー分子を使用して細胞を直接凝集することが可能である。しかしながら、よく暴露されない抗原を使用して凝集するか、あるいは凝集の一般的効率改良するために、架橋する分子のスパンを増加することが望ましいであろう。次のものを包含する、ダイアボディーを使用してこれを実施できるある数のフォーマットが存在する。
(i)2つの連鎖するダイアボディー分子:例えば、使用する2つの抗体は次のものであることができる:
ダイアボディー1-一方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられているので、この結合部位(部位2)は自由である。
ダイアボディー2-一方の特異性は第1ダイアボディー上の部位2に対して向けられた抗イディオタイプ(部位抗-2)でありそして他方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられている。
このフォーマットは血球の凝集を可能とし、スパンされた距離は第2図に示すように2つのダイアボディー分子の長さである。
(ii)3つの連鎖するダイアボディー分子:例えば、連鎖において使用する分子は次のものであることができる:
ダイアボディー1-一方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられておりそして他方の特異性は血液の中に通常存在しない抗原に対して向けられているので、この結合部位(部位2)は自由である。
ダイアボディー2-両方の特異性は第1ダイアボディー上の部位2に対して向けられた抗イディオタイプである(部位抗-2)。
このフォーマットにおいて、ダイアボディー1の2つの分子が異なる赤血球に結合するとき、ダイアボディー2は部位2においてこれらのダイアボディー1の分子の各々に結合することができ、こうして第3図に示すように2つの赤血球の間の距離をスパンする3つのダイアボディー分子の複合体を形成する。
(iii)連鎖を作る2つのダイアボディー分子および1つの非ダイアボディー分子:例えば、連鎖において使用する分子は次のものであることができる:
ダイアボディー1-一方の特異性は血球表面の抗原(部位1)に対して向けられておりそして他方の特異性はアッセイに添加すべき他の非ダイアボディー抗原(部位2)に対して向けられている。
非ダイアボディー抗原分子-これはダイアボディー1の部位2が向けられる大きい分子である。好ましい分子は多数の同一のエピトープを有し、例えば、マルチマー、例えば、大腸菌(E.coli)のβ-ガラクトシダーゼ、200kDの四量体は抗原であることができるであろう。他の方法は、ハプテンで誘導した大きい分子の多重性、例えば、2-フェニルオキサゾル-5-オンで誘導したチログロブリンを使用することであり、そしてダイアボディー1の部位2について2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けることであろう。非ダイアボディー抗原分子は血液の中に通常見出されない分子、例えば、ハプテンであることが好ましいであろう。このフォーマットにおいて、ダイアボディー1の2つの分子は2つの異なる細胞に結合する。非ダイアボディー分子は赤血球を架橋する部位2を通して両方のダイアボディー分子に結合するであろう(第4図)。
種々の異なる大きい分子をこの凝集のために使用することができ、例えば、ダイアボディー1の第2部位は、多分凝集する細胞と異なる種からのものである、IgMのCμ領域に対して向けることができるであろう。
この同一のフォーマットを使用することが可能であろうが、ダイアボディー2は部位1を通して血球表面の抗原と結合するが、その第2部位を通して非ダイアボディー抗原分子上の異なるエピトープと結合して、同様な形状寸法をもつ架橋した複合体を発生する。
プロテインAを2つのダイアボディー分子の間のリンカーとして使用できるであろう。プロテインAはヒトVH3族のVドメインのフレームワーク領域に結合しそしてVH1族のある種のVドメインに結合し、そしてこれらの族から誘導されたダイアボディーを架橋するであろう。
(iv)架橋反応において完全な生物を使用する
上の場合において、凝集のための連鎖する分子はタンパク質分子である。この原理は生物、例えば、バクテリオファージM13または細菌、例えば、大腸菌(E.coli)を架橋に使用することに拡張できる。
上のフォーマット(iii)において、ダイアボディー1の部位1を細胞表面のマーカーに対して向けそして部位2をバクテリオファージ表面の分子、例えば、遺伝子8タンパク質に対して向けることができる(第5図)。
このようなダイアボディーは、例えば、細胞表面のマーカーおよび遺伝子8タンパク質に対してレイズされた前もって単離した抗体から構成できる。しかしながら、ファージ表示法を使用してこのような抗体を選択することが可能であろう。ダイアボディーは、細胞表面のマーカーおよび遺伝子8タンパク質の両方に対する特異性をもつ、ファージゲノム内の可溶性断片として発現させることができるであろう。次いで、このダイアボディーはファージの表面上に表示されるであろう。別法はペプチド標識配列、例えば、c-myc標識を遺伝子8タンパク質の中に組み込むことであり、そして標識に対して向けられたダイアボディーの第2特異性を有してそのファージ表面上の表示を可能とする。これらのフォーマットにおいて、凝集のために適当な細胞表面に対する抗体ファージ表示ライブラリーから直接選択することができ、ここで一方のVH/VL対は可変ドメインのレパートリーから誘導され、そして他方のVH/VL対は遺伝子8タンパク質または標識への結合を可能とする。遺伝子3タンパク質は遺伝子8タンパク質に対する代替物として使用できるであろう。
(v)可溶性抗原をアッセイする方法としての凝集
フォーマット、例えば、上の(iii)に記載されているフォーマットは可溶性抗原を測定する手順において代わりに使用できるであろう。この場合において、既知の細胞表面のマーカーをもつ細胞は試薬として使用され、そして凝集の程度は存在する可溶性抗原の量に依存するであろう。
この原理は、結合したハプテンをもつ抗体を認識する部位をもつダイアボディーを使用するハプテンのアッセイに拡張できるであろう。このフォーマットにおいて、2つのダイアボディーが存在する:
細胞表面のマーカーを認識する部位1およびハプテンを認識する部位2をもつダイアボディー1。
細胞表面のマーカーを認識する部位1および結合したハプテンをもつダイアボディー1を認識する第2部位をもつダイアボディー2。
可溶性抗原を測定するこれらの方法はダイアボディーがそれに対して向けられた細胞を使用することに拘束されず、凝集のために適当な任意のフォーマット、例えば、ラテックスビーズを代わりに使用できるであろう。
三量体
3価または三重特異性のトリアボディーは、ある数の応用においてダイアボディーまたは他の二重特異性抗体を越えた利点を有することができる:
より高い柔軟性および1つの面に向いた3つの結合部位は、3価値のトリアボディーを反復したエピトープを表示する表面に大きい結合活性をもって結合するために理想的とすることができる(IgMに類似する)。3倍の対称は、多数のウイルスのコートタンパク質における普通の3倍の対称によく似るので、ウイルスへの結合においてとくに利点をもつことができる。
トリアボディーは同一の可溶性分子(例えば、タンパク質またはタンパク質アセンブリー、生物学的に活性なペプチドなど)上の異なるか、あるいは同一であるエピトープに結合し、診断および治療の目的に有用な非常に高いアフィニティーおよび特異性に導くことができる。(有機化学において、この効果はすぐれた特異性およびアフィニティーをもつそれらのリガンドに結合するキレート、クリプタントまたはクラウンエーテルと命名される分子において利用される。)
エフェクターの機能(CD3またはCD16による細胞障害性T細胞、FcRによるマクロファージおよび顆粒球)は、トリアボディーによりいっそう効果的に漸増することができる:
(1)抗原刺激を受けていないT細胞は、T細胞上の2つのCD3分子の架橋(Tutt91)またはCD3とCD28との架橋(Jung91)により活性化することができる。
(2)細胞障害性細胞および活性化サイトカイン(IL-1,IL-2,IFNγ,TFNα,GM-SFなど)を同一細胞にターゲッティングすることによる細胞障害性の増大。
(3)同一エフェクター(例えば、毒素、ラジオヌクレオチド、プロドラッグ変換酵素、相補的成分など)の2つのコピーまたは2つの異なるエフェクターの1つのコピーをターゲッティングすることができる。
(4)より高い特異性は、標的細胞表面上の2つの異なるマーカーを認識するか、あるいは2つの同一のマーカーを結合活性的に結合することによって達成することができる。標的細胞上の2つのマーカーの架橋は、また、例えば、遺伝子治療のために毒素またはレトロウイルスをターゲッティングするとき有益である、エンドサイトーシスを促進するであろう。
(5)2つの異なる組の細胞障害性細胞(キラーT細胞、NK細胞、マクロファージなど)は同一標的に対して漸増することができる。
ダイアボディーのレパートリーの構成およびバクテリオファージ上のそれらの表示
ファージ上の2価および二重特異性のダイアボディーの表示は、ファージ上の抗体の抗原を使用する選択力(WO92/01047;J.McCaffertyら、1990、前掲;H.R.Hoogenboomら、Immunol.Rev.130,41-68,1992)を、V遺伝子のレパートリーからのダイアボディーの直接選択および突然変異誘発または鎖シャフリング(Shuffling)による改良されたダイアボディーの選択に適用可能とする。2価のダイアボディーは、例えば、VH-VLまたはVL-VHドメインをファージ遺伝子3タンパク質に直接融合することによって、ファージ上で表示させることができる。最後のV遺伝子およびファージ遺伝子3の間で、アンバー停止コドンを挿入してサプレッサー(supE)大腸菌(E.coli)株において不完全の読み過ごしに導くことができる:結局いくつかの可溶性鎖が生成され、これは遺伝子3タンパク質に融合した鎖と対合して2価の抗体を形成できる。あるいは(しかし好ましさに劣るが)、部分的生体内のタンパク質分解的切断に対して感受性である部位はVH-VLおよび遺伝子3の接合において操作することができる。V遺伝子/遺伝子3接合におけるタンパク質分解はいずれにしても自然に起こる(抗体を表示するファージのウェスタンブロット分析から明らかである;WO92/01047;J.McCaffertyら、1990、前掲)ので、常に多少の可溶性VH-VLまたはVL-VHタンパク質が存在するであろう。
同様に、二重特異性レパートリーは、1つのVH-VLまたはVL-VHの組み合わせをファージ遺伝子3タンパク質(例えば)に融合し、そして合致するVH-VLまたはVL-VHの組み合わせを可溶化断片として発現させることによって、作ることができる。二重特異性リパートリーにおいて、1つの断片を可溶化断片として発現させることが必要であるので、抗体-遺伝子3接合においてアンバーコドンを存在させるという絶対的要件は存在しない。
2価または二重特異性のレパートリーは、また、3分子のアセンブリーとしてファージ上で構成しかつ表示させることができ、1つのVH-VL分子はファージ遺伝子3に融合されておりそして合致するVHおよびVL遺伝子の両方は可溶性(しかし別の)タンパク質として生成した。最後に(しかし好ましさに劣るが)、2価または二重特異性のレパートリーは、両方のVH-VLまたはVL-VHの組み合わせを遺伝子3に融合し、そして操作したアンバーコドンまたは操作したまたは天然のタンパク質分解に頼って、2価/二重特異性のダイアボディーを形成するために十分な可溶性V遺伝子の組み合わせの物質を生成することによって、構成することができる。
scFvまたはFabレパートリーの構成と同様に、種々のV遺伝子のレパートリーはダイアボディーのレパートリーをつくるための出発点として使用することができる(H.R.Hoogenboomら、1992、前掲)。ダイアボディーのレパートリーは、免疫化または「天然の」二量体(V遺伝子は末梢血液リンパ球からか、あるいは骨髄または脾臓から単離される)から、ハイブリドーマのプールから、生体内または生体外の免疫化により抗原バインダーについて多分濃縮されたEBV形質転換された血球からか、あるいはクローニングされた生殖細胞系遺伝子を使用して生体外(再)構成されたV遺伝子からのV遺伝子のレパートリー、あるいはこれらのレパートリーの任意の組み合わせから直接作ることができる。
これらのV遺伝子のレパートリーを使用して、2価および/または二重特異性のダイアボディーのレパートリーを種々の方法で構成することができる。われわれは、ここにおいて、ある数の異なるアプローチを論考するが、詳細にかつ概念的に異なることがある、多数の他の方法を使用できるであろう。
2価のダイアボディーを構成するために、V遺伝子のクローニングは、2つのV遺伝子ドメインの各々の5′および3′末端に制限部位導入した後、適合性部位および必要に応じてダイアボディーのフォーマットで遺伝子を一緒に接合するための短いリンカーをエンコードする配列をもつベクターの中に段階的にクローニングすることによって実施することができる(第6図、ルートI)。あるいは、PCR反応およびPCRアセンブリーを使用することによって、VHおよびVL遺伝子のレパートリーを一緒に連鎖しそして直接クローニングすることができる(第6図、ルートII)。これはV遺伝子配列またはダイアボディーのリンカー配列と適合性の制限部位をデザインする必要性を回避する。制限部位、アクセプターファージミドおよびオリゴヌクレオチドのプライマーの正しいデザインにより、リンカーの配列の任意の長さがV遺伝子の間である、VH-VLまたはVL-VHダイアボディーを構成することができる。
クローニングしないおよび未選択のV遺伝子のレパートリーから出発する代わりに、2価のダイアボディーのレパートリーは、また、最初にscFvまたはFab断片として発現された、VHおよびVL遺伝子を一緒に連鎖することによって得ることができる。これらはファージ上に表示された(そして可能ならば抗原上で選択してバインダーについて濃縮された)V遺伝子のレパートリーから誘導することができる(第6図、ルートIIIおよびIV)。例えば、VH遺伝子および3′末端およびVL遺伝子の5′末端における制限部位を適当にデザインすることによって、scFv構成体中の標準の15残基のリンカーを簡単な切断およびペーストクローニングにより欠失して、ダイアボディーのレパートリーを生成することができる(第6図、ルートIIIb)。あるいは、scFvおよびFabフォーマット中のV遺伝子のレパートリーを再増幅しそして段階的にクローニングするか、あるいは使用するオリゴヌクレオチドに依存してPCRアセンブリーにより一緒に連鎖することができる。
1つの「ヘルパー」の特異性が一定である、二重特異性ダイアボディー、例えば、抗CD16特異性(天然のキラー細胞上のCD16抗原に結合する)または抗腫瘍細胞連合抗原を構成するために、キャリヤーベクターをつくって、これらの特異性(VH-CおよびVL-C)と二重特異性フォーマットにおいてVHおよびVLドメインのレパートリーと急速に組み合わせることができる(第7図、ルートAの第1工程)。このアプローチにおいて、適当な「ヘルパー」V遺伝子(VH-CおよびVL-C)およびV遺伝子のレパートリーの直接クローニングのための制限部位を有する2つのプラスミドベクターをつくる。クローニングはVH-レパートリーがVL-Cに連鎖され、そしてVL-レパートリーがVH-Cに連鎖されるように実施する。この方法は1つの一定の特異性をもつライブラリーの構成を可能としそしてこれと組み合わせて、新しい特異性の選択を可能とする。例えば、抗Fcレセプター抗体をレパートリーと組み合わせ、腫瘍細胞上で選択し、そしてFcレセプターを有する細胞を生体外アッセイにおいて腫瘍細胞に特異的にターゲッティングする特異性について選択することができる。
ダミーとして「ヘルパー」V遺伝子を使用することによって、これはアプローチは、また、ダイアボディーの両端にレパートリーをもつ二重特異性ダイアボディーを構成するために使用することができる(第7図、ルートA)。2つのダイアボディーのレパートリーを作り、1つはレパートリーAを有しそして1つはヘルパーV遺伝子の組み合わせから成り、そしてレパートリーBから成る1つと任意の他のヘルパーV遺伝子の組み合わせから成る。レパートリーはバインダーを特異性AまたはBについて濃縮するように選択し、そして引き続いて相互にフォーマット化されかつ選択されたレパートリーAの中にクローニング(余分のPCRを必要としないで)することができる。このクローニング手順とscFvアプローチ(第7図、ルートC)との差は、選択をダイアボディーのフォーマットにおいて直接実施することである。他の差は、scFvアプローチにおいて、再クローニングしたV遺伝子をシャフリングするが、このアプローチにおいては、VHおよびVL遺伝子が対合を常に保持することである(第1クローニング工程により決定される;VH-AはVL-Aとともに止まり、VH-BはVL-Bとともに止まる)。このアプローチによると、例えば、特定の特異性、例えば、前述したように抗CD16特異性をエンコードすることができ、そして必要に応じて他の「ヘルパー」V遺伝子と容易に組み合わせることができる、ヘルパーV遺伝子をもつ多数の異なる二重特異性抗体を作ることができる。
二重特異性レパートリーは、また、V遺伝子のレパートリーから、4つのV遺伝子ドメインの各々の5′および3′末端に制限部位を導入し、そして適合性部位および必要に応じてダイアボディーのフォーマットにおいて遺伝子を一緒に接合するための短いリンカーをエンコードする配列をもつ適当にファージミドベクターの中に段階的にクローニングすることによって、構成することができる(第7図、ルートB、下部)。他のアプローチにおいて、PCR反応およびPCRアセンブリー(スプライスオーバーラップの延長)を使用することによって、VHおよびVL遺伝子のレパートリーを一緒に連鎖しそして段階的に、あるいは完全な4-V遺伝子のレパートリーのカセットのアセンブリー後にクローニングすることができる(第7図、ルートB、上部)。アセンブリーはV遺伝子配列またはダイアボディーのリンカー配列と適合性の制限部位のデザインの必要性を回避する。制限部位、アクセプターのファージミドおよびオリゴヌクレオチドのプライマーを正しくデザインすることによって、任意のダイアボディーのフォーマットを構成することができる。
クローニングしないおよび未選択のV遺伝子のレパートリーから出発する代わりに、二重特異性のダイアボディーのレパートリーは、また、ファージ上で表示され(そして可能ならば抗原上で選択してバインダーについて濃縮された)V遺伝子のレパートリーから誘導されたscFvまたはFab断片からVHおよびVL遺伝子を一緒に連鎖することによって得ることができる(第7図、ルートC;実施例14)。例えば、2つの抗原に対する特異性をもつ別のscFvレパートリーを構成しそして選択し、V遺伝子のレパートリーを段階的にクローニングまたはPCRアセンブリーによりシャフリングして、二重特異性ダイアボディーとして再フォーマット化することができる。このアプローチは実施例14に記載されている。
大きいライブラリーを作るために、組み合わせ感染および引き続く生体内の組換えを、特許出願PCT WO92/20791および特許出願WO93/19172に記載されているように、利用することが可能であろう。例えば、プラスミド(2価のダイアボディーの107クローンをエンコードする)上のランダムアセンブリングされた鎖のライブラリーを収容する細菌をVH-B-VL-Aライブラリーを収容するファージで感染させる。次いで、感染した細菌は、ファージ上に表示された二重特異性ダイアボディーのレパートリーを生産するであろう。ファージ上に表示されたダイアボディー配列の多様性は、2つのライブラリーの多様性の生産物であろう。
同一の方法で、組み合わせの感染を使用してVHおよびVL遺伝子の高度に多様な2価のライブラリーをアセンブリングして、各ダイアボディー鎖をエンコードすることができる。しかしながら、これは組換えのための部位、例えばloxP部位をVHおよびVL遺伝子の間に導入することを必要とする。ダイアボディーの構造はこれらの残基を収容するが、最も好ましくは配列は除去される。例えば、loxPは、タンパク質が発現されるときスプライスアウトされるべきイントロン内にエンコードされることができる。実施例24はこれを例示し、テトラヒメナ((Tetrahymena)からの自己スプライシングイントロンをVHおよびVLドの間に挿入できること、およびスプライシング(これはRNAの中への翻訳後にのみ起こる)後、機能的ダイアボディーを形成できることを示す。タンパク質レベルで、イントロンの内部の誘導配列(IGS)の3アミノ酸は唯一の残留物として残る。これはダイアボディーのフォーマットと適合性である。
大きいレパートリーを作るために、テトラヒメナ(Tetrahymena)からの自己スプライシングイントロンは自己スプライシング活性と適合性の部位に挿入された組換え部位を含有することができる。第8図は2価の抗体のレパートリーを使用する原理を証明する。それはVHおよびVL遺伝子のレパートリーの直接クローニングにより発生したレプリコン、および組換え後に生ずるレプリコンを示す。loxP部位におけるCre仲介組換えは生体内で実施する(P1ファージをもつ両方のレプリコンを有する細菌の重感染によるか、あるいは温度依存症P1ファージを使用することによって)か、あるいはCreレコンビナーゼを使用して生体外で実施することができる。DNAレベルで起こる組換え後、生ずるダイアボディー遺伝子が転写され、そしてイントロンおよびVHおよびVL遺伝子の間のloxP部位をスプライスアウトする。自己スプライシング系を同様な方式で二重特異性レパートリーに適用することができる。
実施例のリスト
実施例1  2価および二重特異性のダイアボディー断片の構成、発現および特性決定
主要な面は次のものを包含する:
(a)NQ11/D1.3phOx-D1.3二重特異性ダイアボディーの構成、発現および特性決定
(b)2価および二重特異性のダイアボディーの構成、発現および特性決定
(c)3鎖の構成体の構成、発現および特性決定
実施例2  -1および-2リンカーの長さをもつNQ11/D1.3ダイアボディーの構成および発現
実施例3  NQ11/B1.80x/NIPダイアボディーの構成および発現
実施例4  BIAコア分析によるNQ11/B1.8ダイアボディーの共同的(アロステリック)性質の特性決定
実施例5  腫瘍壊死因子に対して向けられたMAK195ダイアボディーの構成および発現
実施例6  ヒト免疫不全ウイルスのgp120のV3ループの構成および発現
実施例7  腫瘍壊死因子に対して向けられたMab32ダイアボディーの構成および発現
実施例8  Mab32ダイアボディーの細胞内発現
実施例9  2価および二重特異性のダイアボディーを使用するrbxの凝集
実施例10  リゾチームおよび2-フェニル-5-オキサゾロンに対して向けられた二重特異性ゼロリンカーのD1.3/NQ11ダイアボディーのファージの表示
実施例11  2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられた1つのアームおよびエストリオールに対して向けられた1つのアームをもつ二重特異性ダイアボディーの構成
実施例12  ダイアボディーおよびCH3ドメインの間の融合体の構成
実施例13  二重特異性抗CEA、抗d16抗体の細胞溶解活性:ヒトPBLによるヒト腫瘍細胞のダイアボディー仲介溶解
実施例14  ファージ上に表示された二重特異性ダイアボディーのレパートリーの構成
実施例15  VHドメインに対してN-末端のVLドメインをもつ逆ダイアボディー:2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられた2価のダイアボディーの構成および発現
実施例16  VHおよびVLドメインの間の10アミノ酸のリンカーは二量体の形成よりむしろモノマーを好む証拠
実施例17  二重特異性抗NIP、抗ヒトFcR1ダイアボディーの調製
実施例18  二重特異性抗イディオタイプ(bc11)-抗CD3の調製および生体外の細胞障害性へのその適用
実施例19  2価の抗イディオタイプ(bc11)ダイアボディーの調製および特性決定
実施例20  二重特異性抗HIVgp120HIV V3ループ-抗ヒトFcR1ダイアボディーの調製および特性決定
実施例21  二重特異性2-フェニルオキサゾル-5-オン、抗マウスラムダ軽鎖のダイアボディーの調製および特性決定
実施例22  NQ11/B1.80x/NIPダイアボディーの2つのVHドメインの間の界面における残基の突然変異誘発
実施例23  ジスルファイド架橋を導入する軽鎖のC末端にシステインをもつダイアボディーの構成および特性決定
実施例24  ダイアボディー分子の構成における自己スプライシングイントロンの使用
実施例25  メタロチオネインとの融合体を含有するダイアボディー分子の構成および特性決定
実施例1  2価および二重特異性ダイアボディーの分子の構成、発現および特性決定
この実施例は、可変ドメインの間にある範囲のリンカーの長さをもつ、種々の型のダイアボディー分子の構成、発現および特性決定を記載する:
(a)モノクローナル抗体NQ11(C.Berekら、Nature 316 412-418,1985)およびD1.3(A.G.Amit Science 233 747-753,1986)から誘導された可変ドメインを使用して2-フェニルオキサゾル-5-オン(phOx)または雌鶏卵リゾチーム(HEL)に対して向けられた2価のダイアボディー。
(b)2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられた1つのアームおよび雌鶏卵リゾチームに対して向けられた1つのアームをもつ二重特異性ダイアボディー。
(c)phOxおよびHELに対して向けられた二重特異性の3鎖の断片。
ダイアボディーは普通の中間体を通して構成され、したがって一緒に記載する。
方  法
ベクターの構成。大腸菌(E.coli)TG1(T.J.Gibson,1984博士論文、ケンブリッジ大学)を、プラスミドの調製および抗体断片の発現のために使用した。ほとんどの構成体の概略については第9図を参照のこと(構成体VIIIおよびIXを除外する)。HELに対して向けられたモノクローナル抗体D1.3(A.Amitら、1986前掲)のscFv(J.MaCaffertyらNature 348 552-554 1990)およびFv(E.S.Wardら、Nature 341 544-546 1989)断片をエンコードする構成体II,IVおよびVはT.Simonにより提供された。ハプテンのフェニルオキサゾロンに対して向けられたマウスハイブリドーマNQ11.7.22のFv断片(C.Berekら、1985前掲)をエンコードする構成体IIIは、L.Riechmannにより提供された。構成体III、およびそれから誘導されたもの(構成体I,VI,VII,VIIIおよびIX)はVHドメイン中の突然変異を含む(L.Riechmannら、J.Mol.Biol.224 913-918,1992)。
それ以上の構成体(第9図)は制限断片(ここでベクター断片と命名しそしてベクターの主鎖およびV遺伝子またはV遺伝子の部分からなる)の再結合によるか、あるいは制限断片(ここでPCR断片と命名しそしてV遺伝子、リンカーまたは非コーディング配列からなる)との結合により標準の方法(J.Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク州プレインビュー、1990)を使用して誘導した。ベクター断片は構成体IIIをBstII/SacIで消化し、そして構成体VIをBstEIIまたはXhoIまたはPstIで消化することによって得た。
15残基のリンカーのためのPCR断片は構成体IVをもつプライマー1および2を使用して発生させた。AscIおよびSacIを使用する消化は遺伝子3リーダー、VHセグメントおよびリンカーからなるPCR断片a-15を生じた。BstEIIおよびAscIを使用する消化はリンカーおよびVLセグメントからなるPCR断片b-15を生じた。より短い連鎖のためのPCR断片は次のものを使用して発生させた:プライマー3または4または5をもつプライマー1(それぞれ、0,5または10残基のリンカーをエンコードする)およびプライマー6または7または8をもつプライマー2(また、それぞれ、0,5または10残基のリンカーをエンコードする)そして上のように消化してPCR断片a-0,a-10,b-0,b-5およびb-10をつくった。構成体Vの中に非コーディング配列(N1)を提供するためのPCR断片を構成体Vをもつプライマー1および2を使用して発生させ、そしてBstEIIおよびAscIで消化した。
構成体VIを作るために、構成体IVからのPCR断片(a-0,a-5,a-10およびa-15)を対応するPCR断片bおよびベクター断片III-BstEII/SacIと結合した。構成体VIIを作るために、構成体IVからのPCR断片(a-5およびa-10)を同様に断片cと結合した。構成体VIIIおよびIXを構成体VIから、それぞれ、PstIまたはXhoIで部分的に消化し、そしてベクター断片を再結合させることによって誘導した。5,10および15残基のリンカーをもつ構成体Iを同様に対応する構成体VIのBstEII消化により発生させた。PstIおよびSacIで切断した断片a-5と断片II-PstI/SacIを結合することによって、5残基のリンカーをもつ構成体IIを発生させた。
結合混合物および形質転換は記載されている通りであった(J.D.Marksら、Bio/Technology 10 779-783,1992)。リンカーまたは非コーディング領域をジデオキシ法(F.Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74 5463-5467,1977)によりVENT(exo-)ポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して配列決定した。構成体の各々のヌクレオチド配列は要求に応じて著者らから入手可能である。
オリゴヌクレオチド。使用したプライマーの配列は表1に記載されている。プライマー1はAscIを導入しそして3′VLにおいてプライミングする;プライマー2はAscIおよび合成リボソーム結合部位を導入しそして5′fd遺伝子3シグナルにおいてプライミングする;プライマー3,4および5はVHおよびVLの間に0,5,10残基のリンカーのリンカーを導入し、BstEII部位を含み、そして5′VLにおいてプライミングする;プライマー6,7および8はVHおよびVLの間に0,5,10残基のリンカーのリンカーを導入し、SacI部位を含み、そして3′VHにおいてプライミングする。
二重特異性断片の発現。断片は周辺質リゼイト(A.SkerraおよびA.Pluckthun,Science 240 1038-1041,1988)または細菌の上澄み液(M.Betterら、Science 240 1041-1043,1988)から調製した。HELまたはphOx-BSAに結合する断片の検出のために、ELISAを記載されているように実施した(H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.19 4133-4137,1991)。サンドイッチ-ELISAのために、プレートをHELで被覆し、そして周辺質リゼイトまたは培養上澄み液を前述したように添加した。結合は100μlの1μg/mlのphOx-BSAで、次いで100μlの100ng/mlのphOxに対して向けられたマウス抗体NQ22.18.7(C.Berekら、1985前掲)およびペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(1:1000)(Sigma)で検出された。すべてのインキュベーションは2%w/vのスキムミルク粉末を含有するPBS中で実施した。ウェスタンブロットは記載されている通りであった(20)。断片を細菌の上澄み液からHEL-セファローズ(Sepharose)(S.MunroおよびH.R.B.Pelham,Cell 46 291-300,1986)および/または記載されているようにphOx-BSA(M.Dreher博士論文  ケンブリッジ大学、1992)のアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。
結合アフィニティー。記載されているように(A.D.Griffithesら、EMBO J.12 725-734,1993)BIAコア(Pharmacia BiosensorAB)を使用して、プラズモン表面共鳴によりHELおよびphOxに対する抗体断片の解離の反応速度を測定した。HELおよびphOx-BSAの両方に対して結合活性をもつ断片の検出のために、10μlの周辺質リゼイトまたはアフィニティー精製した断片をHEL被覆センサー(上を参照)上に5μl/分の一定速度で注射し、次いで直ちに10μlの1mg/mlのphOx-BSAのパルスを与えた。蛍光クエンチ滴定(H.N.Eisen,Methods Med.Res.10 115-151,1994)によりハプテン4-γ-アミノブチリル-2-フェニルオキサゾル-5-オン(phOx-BSA)記載されているように(J.FooteおよびC.Milstein Nature 352 530-532,1991)を使用して、phOxについての断片の結合のアフィニティーを測定した。
結  果
scFv断片におけるように、VHおよびVLドメインの間に15残基のリンカーをもつ2つの異なる抗体の二重特異性および2価の断片の発現のための構成を、われわれは作った。15残基はVHドメインのC-末端から同一鎖のVLドメインのN-末端にストレッチするために十分である(構成体の概略については第9図を参照のこと)。しかしながら、共発現された鎖(VHA-VLB,VHB-VLA)をもつ「二重特異性」抗体の構成体の両方のHELおよびphOx-BSAに結合した断片を生じたので、鎖はまた互いに対合することができることをわれわれは発見した。(表2)。ELISAにより、結合は特異性であった:シチメンチョウの卵リゾチーム(TEL)またはウシ血清アルブミン(BSA)に対する結合を検出することができず、そしてphOx-BSAへの結合は可溶性ハプテンにより阻害することができた。対照的に、クロスオーバー鎖を別々に発現させた(構成体VIIIおよびIX)とき、期待されるように、それらはELISAにおいてHEL,TEL,BSAまたはphOx-BSAに結合しなかった;しかしながら、生体外で一緒に混合したとき、2つの鎖はHELおよびphOx-BSAへの結合により検出されるように連合せず、そして2つの鎖が共発現されるとき得られるシグナルのELISAシグナルの約10%を生成した。
われわれは、また、5〜10残基のより短いリンカーの長さを使用した:5残基のリンカーは同一鎖のVHおよびVLドメインの間でストレッチすることができず、それは二重特異性断片の形成を事実可能とする(表2)。事実、二量体のコンピューターグラフィックモデルにより促進されて(論考を参照のこと)、われわれはVHドメインのC-末端をVLドメインのN-末端に直接接合した。再び、断片は両方の抗原に(表1)、また、ファージミドベクターpHEN1を使用してファージの表面上に表示されたとき、結合した(実施例10)。鎖(VHA-VLB)上にゼロアミノ酸のリンカーおよび他の鎖(VHB-VLA)上に15アミノ酸のリンカーをもつ構成体VIのそれ以上のバージョンを調製した。15アミノ酸はリンカーにおいてポリペプチドの2つのドメインが互いに連合して抗原結合部位を形成することができるようにする。この抗原はELISAで両方の抗原に結合し、この型の「非対称の」二量体は機能的であることを示す。
両方の抗原結合部位が同一の二重特異性断片上に位置することを証明するために、われわれはサンドイッチ-ELISA(表2)およびまたBIAコアを使用して、HELに結合した二重特異性断片がまたphOx-BSA結合することを示した。例えば、第10図(B)において、断片を注入しそしてHELで被覆したバイオセンサーのチップ(セグメントbc)に結合した。屈折率の変化(セグメントcd)および多少の解離(セグメントde)が存在した後、断片は注入したphOx-BSAに結合することが見えた(eおよびhの間の共鳴単位(RU)の差は結合したphOx-BSAの量を反映する)。対照として、FabD1.3はHELに結合することが示されたが、結合した断片は引き続いてphOx-BSAに結合しなかった(第10図(A))。
HELまたはハプテンに結合する断片の大きさはFPLCゲル濾過により二量体に相当することが示された(第11図)。われわれは抗体断片を含有するリゼイトをFPLCカラム上に負荷し、そして抗原またはハプテンを被覆したBIAコアセンサーチップの上に流出液を通過させた。チップの表面における質量の増加により、断片の結合を検出した(実時間で)(A.D.Griffiths 1993前掲)。二重特異性断片は大きさがキメラD1.3Fab断片に類似することが発見され、そしてphOx-BSA被覆したチップならびにHEL被覆したチップに結合した(表2)。これはこれらの二重特異性断片が、2つの鎖の連合により形成された、二量体であるに違いないことを示す。
また、バイオチップ上に固定化されたモノクローナル抗体9E10に断片のC-末端のmyc tagの結合により、断片の大きさを検査した。このフォーマットは断片が抗原結合活性を有するかどうかに無関係に断片を検出し、そして単一のクロスオーバー鎖(構成体VIIIおよびIX)(抗原に結合しない)が長いリンカーをもつモノマーを除いて、短いリンカーをもつ二量体であることを示すために使用可能とする。再び、二重特異性断片は、リンカーの長さに無関係に、二量体に相当する主要なピークの中に出現する。
われわれは、5および15残基のリンカーをもつ、およびまたリンカーをもたない、二重特異性断片を、HELのアフィニティクロマトグラフィー、次いでphOx-BSA-セファローズのカラムにより精製した。c-myc標識に対する抗体を使用するウェスタンブロットによるか、結合ELISAにより検出したときの断片の収率は、細胞を誘発後より低い温度(20℃)に移したとき改良された(H.Takagiら、Bio/Technology 6 948-950,1988)。一夜の発酵後、タンパク質の大部分は培養上澄み液の中に位置し、そしてアフィニティー精製後、0.3mg/l〜1mg/lの断片を生じた。収量はscFvまたはFab断片について報告されたものに匹敵するように思われる(R.Glockshuberら、Biochemistry 29 1362-1367,1990;A.SkerraおよびA.Pluckthun,Protein Eng.4 971-979,1991)。
われわれは、HEL上で精製した二重特異性断片の可溶性phOx-GABAについての結合のアフィニティーを蛍光クエンチ滴定により測定した。結果(表3)が示すように、5および15残基のリンカーをもつ二重特異性断片の結合のアフィニティーは親のFvに類似する。しかしながら、リンカーをもたない断片は10倍の改良されたアフィニティーを有した。われわれは、また、phOx-BSAおよびHELからの断片の解離反応速度をBIAコアにより測定した。phOx-BSAからのリンカーをもたない断片の解離は少なくとも10倍遅かった。(表2)
われわれは、また一本鎖VHB-VLAが2つの相補的ドメインVHAおよびVLBとともに分泌される、3鎖の断片(第9図、構成体VII)を構成した。断片は両方のHELおよびphOxに結合し(表2)そして二重特異性であることが示されたが、FPLC上で、断片はモノマーと二量体との間の大きさで出現したので、鎖は速い平衡にあるように思われた、論考および参考文献については(D.H.Jonesら、Biochemistry 24 5852-5857 1985)を参照のこと。
論  考
ここで、VHおよびVLドメインの分子間対合を利用する二重特異性抗体のアフィニティーのデザインを説明する。これは化学的架橋または二量体化ポリペプチドへの融合と対照的である。1つの抗原のVHドメインを同一のポリペプチド鎖上の他のVLドメインに連鎖させて、2つの鎖VHA-VLBおよびVHB-VLAをつくり、これらは同一細胞中で共発現されそして連合して同一分子上に2つの抗原結合部位をもつ二量体を形成する。同一細菌から両方の鎖が分泌されるとき、ヘテロ二量体、ホモ二量体およびモノマーが形成することをわれわれは期待したが、ヘテロ二量体のみが抗原に結合しそして単一のラウンドのアフィニティクロマトグラフィーにより単離することができる。
VHおよびVLドメインが連合しそして安定なFab断片を形成することが知られている(E.S.Wardら、1989前掲;L.Riechmannら、1992前掲)2つの抗体、D1.3およびNQ11を選択した。15残基のリンカーをもつ二重特異性断片のFPLC分析から、二量体がリゼイトの中で優勢であるように思われる(表2)。多分、2つの異なる鎖上の相補的ドメインの間の好適な相互作用は二量体の形成の推進を助ける。しかしながら、VHおよびVLドメインがいっそう弱く連合される抗体について二量体化を促進するために(A.SkerraおよびA.Pluckthun,1988前掲)、例えば、クロスオーバー鎖(構成体VIIIおよびIX)において、同一鎖上のVHおよびVLドメインが互いに対合するのを防止するために短いリンカー(0または5アミノ酸)を使用した(表2)。
0または5アミノ酸のリンカーの長さをもつ多数のダイアボディーを構成し、そして機能的であることが示された。これらは次のものに対して向けられた2価のダイアボディーを包含する:2-フェニルオキサゾル-5-オン(phOx)(実施例1);リゾチーム(実施例1);腫瘍壊死因子(実施例5および7);HIVgp120のV3ループ(実施例4);癌胎児性抗原(CEA);FcレセプターFcγRIII(CD16);ヒトFcレセプターFcγRI(実施例17);BCL-1リンパ腫細胞系の表面Ig(実施例19)およびCD3抗原(実施例18)。次のものに対して向けられた二重特異性ダイアボディーを構成した:phOxおよびリゾチーム(実施例1);phOxおよびNIP(4-ヒドロキシ-2-ヨード-5-ニトロフェニル酢酸)(実施例3);CEAおよびCD16;NIPおよびFcRl(実施例17);BCL-1リンパ腫細胞系の表面IgおよびCD3(実施例18);HIVgp120のV3ループおよびヒトFcRl(実施例20)およびphOxおよびエストリオール(実施例11)。
CEA;CD16およびCD3(実施例18)を包含するこれらのある数は、FACS分析により全細胞上のマーカーに結合することが示された。
実施例2  -1および-2リンカーの長さをもつNQ11/D1.3ダイアボディーの構成および発現
この実施例は、実施例1において作られたNQ11/D1.3ダイアボディーに基づいた1系列の二重特異性NQ11/D1.3ダイアボディーの構成を記載する。
目的は二重特異性ダイアボディー上で働く構成的拘束を研究することであった。scFv分子において使用した15アミノ酸からのリンカーの長さの減少は、同一のポリペプチド鎖からのVHおよびVLドメインの連合を妨害し、そしてダイアボディーの形成を促進する。実施例1は0,5および10アミノ酸のリンカーを記載する。この実施例において、活性ダイアボディーの形成を可能とする最小のリンカーの長さを決定する。1系列のマイナスリンカー分子(重鎖3′コドンまたは軽鎖5′コドンを除去することによって、ゼロより短いリンカーを作る)を構成した。VLドメインのN-末端またはVHドメインのC-末端からアミノ酸を欠失させることによって、VH VLリンカーの長さをゼロから減少して(-1),(-2)および(-3)構成体を形成した。-1以上のリンカーの長さの減少はNQ11/D1.3ダイアボディーのフォルディングを妨害する。
マイナスリンカーのダイアボディーの構成
ダイアボディーNQ11/D1.3の構成は、0,5および10アミノ酸のリンカーについて実施例1に記載した。
実施例1におけるのと同一の方法を使用して、マイナスリンカーの長さの変異型を作った。BstEII部位を含有するプライマー3およびSacI部位を含有するプライマー6を再デザインすることによって、重鎖および軽鎖の間のリンカーの長さを変更させた。これらのプライマーの各々はダイアボディーの2つのVH/VL接合の1つをスパンする。したがって、1または2以上のコドンが最終のダイアボディーのVH/VL接合をスパンする配列から外に残るように、これらのプライマーを変更することができる。
(-1)変異型を作るとき、VH/VL接合における重鎖配列の3′末端および軽鎖配列の5′末端からコドンを欠失させることができる。この方法において表4に示し、その配列が表1に記載されているオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して作った、4つの可能な変異型が第13図に示されている。構成体NQ11/D1.3(-1)1-3は、1つのポリペプチド鎖上のNQ11から誘導されたVHドメインのC-末端から欠失したアミノ酸および他の鎖上のD1.3から誘導されたVHドメインのC-末端から欠失した1つのアミノ酸を有する。構成体NQ11/D1.3(-1)1-4は、1つのポリペプチド鎖上のD1.3から誘導されたVLドメインのN-末端から欠失したアミノ酸および他の鎖上のD1.3から誘導されたVHドメインのC-末端から欠失した1つのアミノ酸を有する。構成体NQ11/D1.3(-1)2-3は、1つのポリペプチド鎖上のNQ11から誘導されたVHドメインのC-末端から欠失したアミノ酸および他の鎖上のNQ11から誘導されたVLドメインのN-末端から欠失した1つのアミノ酸を有する。構成体NQ11/D1.3(-1)2-4は、1つのポリペプチド鎖上のD1.3から誘導されたVLドメインのN-末端から欠失したアミノ酸および他の鎖上のNQ11から誘導されたVLドメインのN-末端から欠失した1つのアミノ酸を有する。断片をpUC19の中にクローニングし、そして実施例1に記載するように発現させた。ELISAを実施例1におけるように実施した。これらの変異型のすべての4つ、1-3,1-4,2-3および2-4は発現し、そして活性であり、ELISA上で2-フェニルオキサゾル-5-オンおよび雌鶏卵リゾチームの両方に結合したが、BSAに結合しなかった(すなわち、それらはそれらの抗原に特異的に結合する)。
第14図は作った2つの他の構成体を示す。コドンの欠失によりプライマー3および6から誘導した表4に示すプライマーを使用して、NQ11 VHおよびD1.3 LV接合の5′軽鎖配列から2コドンが欠失しそしてD1.3 VHおよびNQ11 VL接合のVH配列から2コドンが欠失した、構成体NQ11/D1.3(-2)変異型(AE)を作った。
各接合から3コドンが除去された、構成体NQ11/D1.3(-3)(CF)を作った。一方のポリペプチド鎖について、構成において表4に示すオリゴヌクレオチドを使用することによって、NQ11から誘導されたVHドメインのC-末端から1つのアミノ酸を欠失させそしてD1.3から誘導されたVLドメインのN-末端から2つのアミノ酸を欠失させた。他方のポリペプチド鎖について、構成において表4に示すオリゴヌクレオチドを使用することによって、D1.3から誘導されたVHドメインから2つのアミノ酸を欠失させそしてNQ11から誘導されたVLドメインのN-末端から1つのアミノ酸を欠失させた。上のように発現させそしてELISAによりアッセイしたとき、(-2)および(-3)変異型のいずれもシグナルを与えなかった。
H.R.Hoogenboomら、Nucleic Acids Res.19 4133-4137,1991に記載されているように、抗体構成体の各々のC-末端におけるmyc標識に結合するモノクローナル抗体9E10を使用する検出により、ウェスタンブロットを実施した。これらのブロット上で分析した試料は、D1.3 scFv(J.McCaffertyら、Nature 348 552-554,1990),NQ11/D1.3(-3)変異型1-3および2-3およびNQ11/D1.3(-2)構成体(AE)を包含した。シグナルが示すように、(-1)構成体はダイアボディー生産物のscFvの比率のそれに近い発現収率を有するが、ホモ二量体のミスフォルデッド(misfolded)物質または不活性な均質鎖、すなわち、それ自体と対合したNQ11VH/D1.3VLおよびそれ自体と対合したD1.3VH/NQ11VLであろう)。(-2)生成物は非常に低い濃度でのみ存在しそして試料を10倍に濃縮したときにのみブロット上で検出することができた。
誘発しそしてダイアボディーの変異型1-4および2-4を作るとき、首尾一貫した問題が経験された。これらの2つの(-1)構成体は機能的にフォルディングすることができるへりにちょうど存在するように思われる。
これらの特定のダイアボディー構成体におけるVHおよびVLドメインの間のリンカーの長さについての下限はそれゆえ(-1)であった。(-2)が機能的である異なるVHおよびVLドメインをもつダイアボディーの例が存在する可能性がある。
実施例3  NQ11/B1.8ダイアボディーの構成および発現
この実施例は、抗体NQ11(これはハプテンphOxに結合する)および抗体B1.8(Rothら、Eur.J.Immunology 8 3019 1978)(これはハプテンNIPに結合する)に基づく二重特異性ダイアボディーを記載する。
ダイアボディーNQ11/B1.8の構成
このダイアボディーのために出発点は存在するNQ11/D1.3であった。この構成の中央のD1.3VK/D1.3VH部分は制限酵素BstEIIおよびSacIで切除した。次いで、B1.8VH配列をこの構成体の中にBstEIIおよびSacI部位を使用してクローニングした。
存在するB1.8scFvクローンからプライマーVLB18baLinkOBstEおよびVLB18foAscを使用するPCR増幅により、ダイアボディーのためのB1.8VLインサートを作った。プライマーVLB18baLinkOBstEは、切断したベクター構成体のNQ11VHの3′末端におけるBstEII部位と適合性のBstEII部位を含有する。プライマーVLB18foAscはB1.8VHインサートの5′末端におけるAscI部位と適合性のAscI部位を含有する。B1.8VLインサートをベクター構成体の中へのクローニングのためにBstEIIおよびAscIで切断した。
存在するB1.8scFvクローンからプライマー2および6を使用するPCR増幅により、ダイアボディーのためのB1.8VHインサートを作った。プライマー6は切断したベクター構成体のNQ11VLの5′末端におけるSacI部位と適合性のSacI部位を含有する。プライマー2はB1.8VLインサートの3′末端におけるAscI部位と適合性のAscI部位を含有する。B1.8VHインサートをベクター構成体の中へのクローニングのためにSacIおよびAscIで切断した。
次いで、BstEII/AscI切断B1.8VL切断およびSacI/AscI切断B1.8断片をBstEII/SacI切断NQ11ベクター構成体と混合し、そして一緒に結合してNQ11VH/B1.8VL//B1.8VH/NQ11VLダイアボディーを発生させた。
ダイアボディーNQ11/B1.8の発現
可溶性ダイアボディーNQ11/B1.8を37℃において2YT/0.1%グルコース/100mg/ml中で0.9〜1.0のOD550nmに成長させることによって発現させ、そしてIPTGを1mMに添加することによって誘発した。次いで、培養物をより低い温度(22または26℃)においてさらに24時間成長させた。
培養上澄み液から可溶性抗体は、NIP-BSAまたはphOx-BSAを被覆したELISAプレートを使用するELISAにおいてNIPおよびphOxの両方に結合することが示された。(ELISAプレートのコーティングはPBS中の10μg/mlのNIP-BSAまたは10μg/mlのphOx-BSAを使用する一夜の100μl/ウェルであった)。1.0より大きいELISAシグナルが50μlの上澄み液で各抗原を使用して得られた。
実施例4  BIAコア分析によるNQ11/B1.8二重特異性ダイアボディーのアロステリック性質の特性決定
ダイアボディーにおけるポリペプチド鎖の緊密なパッキングは、一方の抗原結合部位から他方の抗原結合部位へのコンフォメーションの変化の伝搬の可能性を開く。一方の部位における抗原の結合が他方の部位における結合のアフィニティーの増加または減少に導くアロステリック二重特異性ダイアボディーは、均質アッセイおよびプロドラッグ活性化に対する応用の可能性を有する。
この実施例において、phOxに対する二重特異性NQ11/B1.80x/NIPダイアボディーのアフィニティーへのNIP(4-ヒドロキシ-2-ヨード-5-ニトロフェニル酢酸)の結合の効果を研究した。実施例3において構成されたNQ11/B1.8ダイアボディーを発現させ、そしてphOx-BSA-セファローズカラムのアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。こうして発現されたダイアボディーは2つのポリペプチド鎖NQ11VH-B1.8VLおよびB1.8VH-NQ11-VLの二量体である。VHおよびVLドメインは互いに対して直接融合された(ゼロアミノ酸のリンカー)。
ファーマシア(Pharmacia)BIAコアを使用する表面プラズモン共鳴(SPR)により、phOx-BSAおよびNIP-BSAへのダイアボディーの結合を研究した。SPRセンサーチップ表面をphOx-BSAで誘導して、2-フェニルオキサゾル-5-オンへのNQ11結合部位の結合を分析した。通常、誘導したチップ表面からの抗体の解離についての反応速度(koff)を測定するとき、チップ表面を非常に低いレベルの抗原で被覆する。これは、より遅い見掛けの分離速度(off-rate)に導く再結合を防止する。しかしながら、NQ11についての分離速度は普通のBIAコア分析のためにはかなり高過ぎるので、チップ表面をphOx-BSAで高いレベルに被覆して再結合を利用した。観測された分離速度曲線はここで表面からの抗体の解離についての速度定数(koff)および表面への抗体の結合についての速度定数(kon)の両方の関数である。したがって、観測された分離速度曲線は表面における抗原についての抗体の解離定数(kd)に関係する。
第15図は、phOx-BSAからのNQ11/B1.8二重特異性ダイアボディーの解離についての分離速度曲線である。ダイアボディーを「前インキュベーション」工程において表面に結合させ、そして結合した抗体は「溶離」工程において解離させた。各場合において、曲線は表面に結合したままであるダイアボディーの3000共鳴単位から開始することが示されており、そして分離速度はこの点において計算する。曲線1について、前インキュベーションのための緩衝液はPBSであり、そして溶離はPBSを使用して実施し、そして0.0045s-1の見掛けのkoffが得られる。曲線2について、前インキュベーションは1μMのNIP/PBSを使用して実施し、そして溶離はPBSを使用して実施し、そして0.0047s-1の見掛けのkoffが得られる。曲線2について、曲線3について、前インキュベーションはPBSを使用して実施し、そして溶離は1μMのNIP/PBSを使用して実施し、そして0.0069s-1の見掛けのkoffが得られる。曲線4について、前インキュベーションは1μMのNIP/PBSを使用して実施し、そして溶離は1μMのNIP/PBSを使用して実施し、そして0.0071s-1の見掛けのkoffが得られる。こうして、1μMのNIPが溶離結合の中に存在する曲線3および4は、溶離緩衝液の中にNIPが存在しない曲線1および2と比較して50%より高い見掛けのkoffを示す。このNIPは見掛けのkoffを増加し、そしてphOxについてのNQ11/B1.8ダイアボディーの見掛けの結合のアフィニティーを減少する。相互作用は複雑であるので、分離速度曲線はkoffおよびkonの複雑な関数である。真の解離定数への効果は定量することができないが、NIPの結合がphOxの結合に影響を与えることは明らかである。
NIPとの前インキュベーションは観測された分離速度に影響を与えないが、NIPとの前インキュベーションが、phOx被覆表面からのダイアボディーの解離へのNIPの観測された効果と一致して、チップに結合するダイアボディーの合計量を減少する。
NIPはphOx/BSA被覆表面へのscFvNQ11の結合に有意な効果をもたなかった。
NIP-BSA被覆センサーチップ表面からのNQ11/B1.8ダイアボディーの分離速度曲線へのアロステリック効果は、phOxの存在で見られなかった。
これをさらに研究するために、1μMのNIPの不存在(対照)および存在(試験)下にダイアボディーの別の調製物を使用して平衡結合試験を実施した。各希釈を2000RUのBSA-Ox4.6(「s2」)で修飾した表面;7900RUのBSA-Ox1.8(「s3」)で修飾した表面;および未修飾表面の上で実施して、各試料の全体の屈折率を測定した。第16図(上の部分)はNIPの存在および不存在下にs2への結合についての曲線を示し、そして第17図(下の部分)はs3への結合のそれを示す。両方の場合において、NIPはBSA-Ox表面へのダイアボディーの結合を減少する。また、飽和は到達されなかったが、対照についてさえの最大の結合は、BSA上のハプテン分子のすべてが抗原として等しく活性であった場合に期待されるものより非常に少なかったことが明らかである。
データをスキャッチャード分析により処理してアフィニティーの推定を得た。しかしながら、アフィニティーを計算するためにいくつかの仮定を行うことが必要であった。ダイアボディーは100%純粋でありかつ100%活性であると仮定した。最低の濃度の抗体(ことにNIPを含有する試料)についてのデータは適合線より有意に離れており、これは多分平衡が達成されなかったことから生ずるので、これらの結果は分析から省略した。第17図及び第18図は、それぞれs2およびs3へのダイアボディーの結合を示す。ダイアボディーについてのKdはs2について275nMであることが発見され、計算した最大の結合(Rmax)は510RUであった;s2についてのそれぞれの値は275nMおよび335nMであった。しかしながら、NIPの存在下に、Oxについての見掛けのKdはs2について425nMそしてs3について418nMであった。Rmax値(それぞれ、461および348RU)は対照についてのそれらと合理的によく合致する。明らかなように、効果の量は精密にわれわれの仮定に依存する。われわれのデータは多分効果の下限を与える。なぜなら、ダイアボディーのすべての分子が100%の活性を有したという仮定は多分誤りであるからである。同様な調製物の蛍光クエンチの測定は約30%の各ハプテンについての活性を与えた。不活性のNIP(NQ11)部位以外に活性のOx結合(B1.8)部位をもつダイアボディー分子が存在する場合、これらはNIPの存在により影響を受けないBSA-Ox表面に結合し、そしてこれはBSA-Oxへの合計の結合へのNIPの見掛けの効果を減少するであろう。さらに、ハプテン分子はBSA上にいくつかのエピトープを提供し、そしてこれはいくつかのクラスの結合部位を生ずる可能性が存在する。
それにもかかわらず、データが示すように、ダイアボディーへの第1ハプテン(NIP)の添加は、多分第1ハプテンの結合のときの分子におけるコンフォメーションの変化の伝搬により、第2ハプテン(phOx)のための結合部位の少なくとも1つのクラスに対するダイアボディーの見掛けのアフィニティーを変更することが明らかである。
こうして、このダイアボディーによるphOx-BSAの結合へのNIPのアロステリック効果が存在する。これは抗体についてのこのようなアロステリック効果の最初の観察である。
実施例5  ヒト腫瘍壊死因子アルファに対して向けられたMAK195抗体の構成および発現
MAK195はヒトTNFαに特異的に結合するネズミモノクローナル抗体である
0003720353.tif 000002
それはファージミドベクターpCANTAB5mycにおいて向きVH-VLに5残基のリンカーGGGGSを使用してダイアボディーフォーマットでクローニングされた(第19図、WO92/01047)。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマー(AJR21)の中に組み込んだ。BstEIIのために制限部位をプライマーAJR21のリンカー配列の5′末端およびまたVH1FOR-2の3′末端に組み込み(E.S.Ward,D.Gussow,A.D.Griffiths,P.T.JonesおよびG.Winter,Nature 341 544-546,1989)、VHおよびリンカー-VL断片を3方法結合反応における発現ベクターpCANTAB5mycの中にクローニングすることを可能にした。
RNAをMAK195ハイブリドーマ細胞から抽出しそしてcDNAの調製に使用した。MAK195のVHおよびVLドメインのDNAを、cDNAからのPCRにより、プライマー対MAKVHBACKNCOおよびVH1FOR-2、およびAJR21およびVK4FORNOT1(T.Clackson,H.R.Hoogenboomら、A.D.GriffithsおよびG.Winter,Nature 352,624-628,1991)を使用して、それぞれ、標準条件下に増幅した。(注:MAX195V遺伝子は前にクローニングしかつ配列決定されたので、われわれは「標準の」VH1BACKプライマーを使用するよりむしろMAK195-VH特異的プライマーをデザインした(R.Orlandi,D.H.Gussow,P.T.JonesおよびG.Winter,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,3833-3837,1989))。VH PCR反応の生成物を制限酵素NcoIおよびBstEIIで消化し、そしてVH PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインDNAをNcoI/NotI消化したpCANTAB5mycの中にモル比3:3:1(VH:VL:pCANTAB5myc)で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を大腸菌(E.coli)TG1細胞の形質転換に使用した。組換えクローンのいくつかの配列は標準のベクターに基づくプライマーを使用して確証された。われわれはこれらを構成体MAK195-5と呼んだ。
可溶性ダイアボディーを24℃における成長により発現させた。5mlの2YT/1%グルコース/100μg/mlのアンピシリン中で対数期成長の細胞を5mlの2YT/1mMIPTG/100mg/mlのアンピシリンの中に再懸濁させ、そして24℃で3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)しそして細胞ペレットを250μlの氷冷したPBS/1mMのEDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に15分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)しそしてダイアボディーを含有する上澄み液をELISAにおいて使用した。
50μlの周辺質上澄み液＋50μlの3%マーベル(marvel)/PBSを組換えヒトTNFα(0.1MのNH4HCO3 PH9.6中の10μg/ml)で被覆したELISAウェルに添加し、3%マーベル/PBSでブロックした。モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGでmyc標識を検出する、標準のELISAプロトコールに従った(H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.19,4133-4137 1991)。90分後のELISAの読みを第21図に示す。クローンの発現を30℃において誘発したとき、TNFへの結合は検出できなかった(示されていない)。しかしながら、クローンの発現を24℃において誘発し、そしてELISAを37℃および室温の両方において実施したとき、匹敵する陽性のシグナルが得られた。これが示すように、このダイアボディーは37℃において安定であるが、効率よい発現のためにはより低い温度を必要とする。
実施例6  HIVgp120のV3ループを認識する5リンカーのダイアボディーの構成
Mab447-52-DはHIVgp120のV3ループを認識するモノクローナル抗体である(Gorny,M.K.,J.-U.Xu.,V.Gianakakos,S.Karawowska,C.Williams,H.W.Sheppard,C.V.Hanson、およびS.Zolla-Pazner,1991。HIV-Iエンベロープ糖タンパク質の第3可変ドメインに対する部位選択中和性ヒトモノクローナル抗体の生産。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3238-3242)。scFvとしてクローニングしたとき、抗体はその抗原特異性を保持し、gp120およびV3ループ配列を表す合成ペプチドに結合する。447:P4B1は447-scFvのより高いアフィニティーの変異型である:4アミノ酸の置換は一緒にペチプド抗原からの解離速度を減少させる。重鎖および軽鎖の可変領域を接合するリンカー配列の長さを15から5残基に減少することによって、2価の447ダイアボディーを操作した。
ファージミドベクターpCANTAB5myc中でクローニングした鋳型447:P4B1scFvのPCR増幅により、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をエンコードするDNA断片を別々に調製した(第19図)。ベクター特異的プライマーPUC19rev(表1)およびプライマーHuJH6ForLINK(表1)(これは抗体のJH領域(肉太)およびscFvリンカーの最初の5残基(下線)に対して特異性である)を使用して、重鎖断片を発生させた。同様に、ベクター特異的プライマー、FDTSEQ1およびプライマーLINKUHullBack(表1)(HuJH6ForLINKのリンカー領域(下線)に対して相補的でありそして抗体軽鎖(肉太)に対して特異的である)を使用して、軽鎖断片を調製した。一次PCR生成物のPCRアセンブリー(T.P.Clacksonら、1991前掲)は、プライマーHuJH6ForLINKと、LINKUHullBackとの間のリンカー配列の相補性によって構成された。次いで、アセンブリングした生成物をプライマーPUC19revおよびFDTSEQ1を使用して再増幅し、NcoIおよびNotIで標準のプロトコールに従い消化し、そしてpCANTAB5mycの中にクローニングした。
ダイアボディー447:P4B1(5)を、V3ループ配列を表す合成ペプチドの認識の可溶性捕捉アッセイにおいて試験した。まず、適当な構成体で形質転換したTG1の一夜の培養物からscFVおよびダイアボディーの周辺質の抽出物を調製した。可溶性抽出物を3%マーベル(Marvel)/PBS中で30℃において30分間ブロックした。次いで100nMのビオチニル化ペプチド抗原を100μlの各周辺質抽出物に添加し、そしてこの混合物を30℃において1時間平衡させた。インキュベーション後、試料を前ブロックしたストレプトアビジンのダイナビーズ(dynabeads)と短時間混合し、次いでビーズを磁石で回収しそしてPBSでよく洗浄した。scFvまたはダイアボディー断片のC-末端におけるmyc標識を認識するマウスモノクローナル抗体を使用して、ビオチニル化抗原に結合したABを検出した。9E10を引き続いてアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗マウスIgGを使用して検出し、反応をPNPPで発生させ、そして405nmにおいてマイクロタイタープレートのリーダーで吸収を測定した。scFvクローン447 P4B1(15)は1.0の吸収を与えたが、ダイアボディーのクローンP4B1(5)は1.37の吸収を与えた。それゆえ、HIVgp120のV3ループに対して向けられた抗体は機能的である。
実施例7  ヒト腫瘍壊死因子アルファに対して向けられた、ネズミMab32抗体およびヒト化誘導体P3A2からのダイアボディーの構成および発現
Mab32ダイアボディー
ネズミMab32抗体をクローニングしそして、標準のプライマーを使用してcDNAからクローニングした後、標準の15残基のリンカー(配列(GGGGS)3)を使用して一本鎖Fv(scFv)として発現させた(Clacksonら、1991、前掲;WO93/06213)。この構成体をダイアボディー構成のための出発点として使用した。scFv鋳型からのPCRプライマーとしてFL-VLまたはZL-VL、およびfd-tet-seq24を使用してMab32 VLを再増幅し、そしてVH遺伝子を含有するプラスミドDNAの中にBstEII-NotI切断断片としてクローニングした(pHEN1-VH-Mab32,BstEII-NcoI切断)。この発生したVHドメインをもつクローンは5または0アミノ酸のリンカーでVLドメインに融合した(それぞれ、FL-V1およびZL-VLプライマー)。pHEN1およびオリゴヌクレオチドMab32-VL-REVに基づく標準のプライマーを使用する配列決定により、ベクターダイアボディー配列は確証された。
実施例5(第22図)に記載されているように、被覆した抗原(ヒトTNF-アルファ)を使用するELISAにおいて、ダイアボディーの活性は確証された。前述したように、37℃に比較して室温(ほぼ20〜24℃)においてダイアボディーを誘発しかつ成長させたとき、より活性の物質が得られる。結果はMab32-0(ゼロ-リンカーのダイアボディー);Mab32-5(5残基のリンカー、GGGGSリンカー);Mab32-15(scFvリンカー)。
Mab32ダイアボディーおよび一本鎖Fvクローンの培養上澄み液中の生成したタンパク質の相対量を推定するために、スロットブロットアッセイを実施した。培養上澄み液(10μl＝純粋;および2×YT中のこれの10倍の希釈物)をハイボンド(Hybond)-C上にブロットし、膜を乾燥し、そして3%マーベルでブロックした。フィルターに結合したMab32分子を、それらのC-末端に存在するmyc標識に対して向けられた9E10抗体で検出した。9E10(ほぼ1μg/ml)とインキュベーションした後、PBS-ツイーン20(0.1%)で洗浄し、そしてペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスIgとインキュベーションした後、結合した抗体を化学発光(Amersham)の増強により検出した。スロットブロット(第23図)により、ELISAシグナルはその温度において生産される物質の量と相関関係を有することが確証される。Mab32-0およびMab32-5ダイアボディーについてのELISAシグナルはMab32-scFvについてよりわずかに高いが、また、生産されている(30℃および室温において)より高い物質が存在する。
ヒト抗体P3A2(WO93/06213に記載されている)を標準のプライマー(Clacksonら、1991、前掲)を使用してscFv断片として以前にクローニングされた。このscFvのDNAをPCRにおいて鋳型として使用してVHを増幅(プライマーpUC-逆およびVH1FOR-1Xhoを使用する)しそしてVL遺伝子を増幅(プライマーFL-VL-A2およびZL-VL-A2、およびfd-tet-seq24を使用する)して、5残基およびゼロ残基のリンカーのダイアボディーを作った。NcoIおよびXhoI(VH)およびNcoI(VL)で制限した後、2つの断片をファージミドベクターpHEN1(NcoI-NotI切断した)中で一緒に結合し、そして組換え体のVH-VL結合をVLA2-REVを使用して配列決定した。
30℃において誘発および成長した後、ダイアボディーの最小結合が得られた;ダイアボディーを室温において生産したとき、よりすぐれたシグナルが得られた。9E10抗体を使用するスロットブロット(第23図)により、再び、ELISAシグナルはその温度において生産される物質の量と相関関係を有することが確証される。
実施例8  大腸菌(E.coli)中で細胞内で発現されたダイアボディー:腫瘍壊死因子に対して向けられたMab32ダイアボディーの生産、フォルディングおよび特性決定
この実施例は、マウスモノクローナル抗体Mab32から誘導された、腫瘍壊死因子に対して向けられたダイアボディーの大腸菌(E.coli)中の生産を記載する。このタンパク質を細胞内で発現させ、次いで正しくフォルディングされる二量体の量を最大とするように注意して最適化された、レドックス変性-復元手順を使用して再生させる。このレドックス変性-復元手順の原理は、発明の名称「ポリペプチドの処理」のデンマーク国特許出願、DK0130-93およびDK0139-93(H.C.Thogersen,T.L.HoltetおよびM.E.tzerodt)に記載されている。
5アミノ酸のリンカーをもつダイアボディーのフォーマット(実施例7に記載されている)でエンコードされたMab32を含有するファージミドクローンをポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として使用して、Mab32ダイアボディーに相当するcDNA断片を生成した。
ウシ制限プロテアーゼ、因子Xaのための切断部位を構成するアミノ酸配列GSIEGRをエンコードするDNA配列を5′末端に取り込むように、PCRのためのプライマーをデザインした(K.NagaiおよびH.C.Thogersen,Mcthods in Enzymology 152 461-481,1987)。増幅されたDNA断片を大腸菌(E.coli)発現ベクターpT7H6の中にサブクローニングして(Christensenら、FEBS Letters 295 181-184,1991)プラスミドpT7H6FX-DBを発生させた。このプラスミドを大腸菌(E.coli)BL21細胞の中に形質転換した。
ダイアボディー断片を調製するために、プラスミドpT7H6FX-DBを、StudierおよびMoffat(J.Mol.Biol.189 113-130,1986)が記載しているように、100μg/mlおよび5mMのMgSO4を含有する4リットルの2×TY培地中で37℃においてA600=0.8まで成長させた。次いで、指数的に成長する培養物にバクテリオファージλCE6をほぼ5の感染の多重度で感染させた。感染後40分において、リファンピシンを添加し(2mlのメタノール/lの培地中の0.2g)そして4時間後に細胞を収穫した。細胞を150mlの0.5MのNaCl、10mMのTris-HCl,pH8,1mMのEDTAの中に再懸濁させた。フェノールpH8(100ml)を添加し、そしてこの混合物を超音波処理して全体のタンパク質を抽出した。2.5体積のエタノールを添加しそして遠心することによって、タンパク質をフェノール相から沈殿させた。
タンパク質のペレットを6Mの塩化グアニジニウム、50mMのTris-HCl,pH8および0.1Mのジチオエリスリトールを含有する緩衝液中に溶解した。セファデックス(Sephadex)G25(Pharmacia、スイス国ウップサラ)のゲル濾過により、8Mの尿素、1MのNaCl,50mM Tris-HCl,pH8および10mMの2-メルカプトエタノールの中に入れた後、精製の精製タンパク質をNi2+活性化NTA-アガロースカラム(75ml,8Mの尿素、1MのNaCl,50mM Tris-HCl,pH8および10mMの2-メルカプトエタノールで洗浄した)を精製のために適用した(Hochuli,Bannwarth,Dobeli,GentzおよびStuber,Bio/Technology 6 1321-1325,1988)。カラムを200mlの8Mの尿素、1MのNaCl,50mM Tris-HCl,pH8および10mMの2-メルカプトエタノール(緩衝液I)および100mMの6Mの塩化グアニジニウム、50mMのTris-HCl,pH8,10mMの2-メルカプトエタノール(緩衝液II)で洗浄した。MGSHHHHHHSIEGR融合タンパク質を10mMのEDTAを含有する緩衝液IIで溶離し、そして溶出液をセファデックスG25でゲル濾過し、溶離液として緩衝液Iを使用した。
次いで溶離したタンパク質を再生させた。タンパク質を100mlのNi-NTAセファローズと混合した。結合したタンパク質を含有する樹脂を直径5cmのカラムの中に詰め、そして緩衝液Iで洗浄した。ここで再生を表5に示すサイクリングプログラムを使用して11℃〜12℃において次の緩衝液を使用して実施した:
緩衝液A:50mMのTris-HCl,pH8;0.5MのNaCl;2mMの還元したグルタチオン(GSH);0.2mMの酸化したグルタチオン(GSSG)
緩衝液B:50mMのTris-HCl,pH8;1MのNaCl;3mMのGSH;8Mの尿素
タンパク質をこのカラムから50mMのTris-HCl;0.5MのNaCl;25mMのEDTAで溶離し、次いで5mMのGSH,0.5mMのGSSGに加え、そして20℃において12〜15時間インキュベーションして正しい分子の形態に再生した。次いで、タンパク質をYM10膜を使用する限外濾過により50倍に濃縮した。第24図において、非還元性SDS-ポリアクリルアミドゲルでタンパク質をエレクトロポレイションすることによって再生状態を分析し、そしてこの実施例において使用した条件(トラック9)が再生された生成物の最高の収量を与えたことが示された。
ダイアボディーの二量体をセファローズ12カラムを使用するゲル濾過により精製し、溶離液としてPBSを使用した。
この手順により正しくフォルディングされた物質Mab32ダイアボディーの全体の収量はほぼ4mg/lであった。これは全体の再生収量の20%を表す。
精製の種々の段階からのタンパク質の非還元性のSDS-PAGEによる分析を第25図に示す。
因子Xa(モル比1:5の因子Xa:ダイアボディー)で37℃において20時間処理することによって、ダイアボディー生成物のN-末端からhis6標識を切断することができた。これは第26図において未切断の物質のちょうど下の低分子量のバンドの出現として示されている。精製した細胞内で発現されたMab32ダイアボディーの性質
1．Mab32ダイアボディーはヒトTNF-アルファに特異的に結合する。
TNF-アルファおよびBSAを0.1Mの炭酸ナトリウムの緩衝液中で4℃において一夜10μg/mlに被覆した。2%マーベルで1時間ブロックし、そしてPBS-ツイーン20(0.1%)およびPBSで洗浄した後、ダイアボディーを2%マーベルの中に添加し、そして引き続いて9抗myc標識E10抗体およびペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスIgで検出した。第27図に示すように、Mab32ダイアボディーはTNF-アルファに特異的に結合し、BSAとの小さい交差反応性がダイアボディーの最高濃度においてはじめて可視である。
2．Mab32ダイアボディーはTNFへの結合についてMab32全抗体と競争する。
TNF-アルファおよびBSAを0.1Mの炭酸ナトリウムの緩衝液中で4℃において一夜10μg/mlに被覆した。2%マーベルで1時間ブロックし、そしてPBS-ツイーン20(0.1%)およびPBSで洗浄した後、Mab32全抗体を2%マーベルの中に添加し、そして引き続いてペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスIgで検出した。同一ELISAを反復し、ここで競合ダイアボディーをウェルに添加し(10μlの調製物、0.21mg/mlに等しい)。第28図はダイアボディーがTNF被覆表面から離れて(2価の)Mab32抗体と極めて効果的に競争する方法を示す。
3．Mab32ダイアボディーはヒツジ抗301抗血清と競争する。
ヒトTNF-アルファの最初の18アミノ酸残基をエンコードするペプチドでヒツジを免疫化することによって抗301抗血清をレイズし、そしてこれはネズミMab32抗体により認識されるエピトープの少なくとも一部分からなっていた。この血清を分析するために、Mab32抗体を使用する対照ELISAを実施した。(2)におけるのと同一のELISAを反復し、ここで競合ヒツジ抗301抗血清(10μlの未希釈血清)をウェルにMab32全抗体(前のように3倍の希釈)と一緒に添加した(第29図の上)。また、(1)におけるのと同一のELISAを反復し、ここで競合ヒツジ抗301抗血清(10μlの未希釈血清)をウェルにダイアボディー(前のように3倍の希釈)と一緒に添加した(第29図の下)。図面に示すように、親の抗体Mab32に似て、ダイアボディーは抗301抗血清の添加によりTNF表面から離れて競合し、ダイアボディーがTNF上の親の抗体と同一のエピトープを認識する。
4．Mab32ダイアボディーは2価である。
TNF-アルファを4℃において0.1Mの炭酸ナトリウムの緩衝液中で一夜10μg/mlに被覆した。2%マーベルで1時間ブロックし、そしてPBS-ツイーン20(0.1%)およびPBSで洗浄した後、Mab32ダイアボディーを2%マーベルの中に添加しそして1時間放置した。
洗浄後、ウェルを30分間2%マーベル中のビオチニル化TNFを含有する試料とインキュベーションし、そして30分間ペルオキシダーゼ標識化エキストラビジン(Sigma、コードE-2886)とインキュベーションした。第30図はダイアボディーをこのELISAの構成において検出できる方法を示し、調製物の少なくとも一部分が2価の分子であることを証明する。
実施例9  2価および二重特異性のダイアボディーを使用する抗原で被覆した赤血球の凝集
抗原で被覆した赤血球の凝集は、二量体のダイアボディー中の2つの抗原結合部位存在の明確な試験としておよび診断試験のための凝集アッセイにおけるダイアボディーの使用のためのモデルとして働く。
この実施例において、3つのダイアボディーおよび一本鎖Fv断片を抗原被覆赤血球を凝集するそれらの能力について試験した:phOxおよび雌鶏卵リゾチームに対して向けられた、ゼロアミノ酸のリンカーをもつNQ11/D1.3ダイアボディー(NQ11/D1.3/0:実施例1);雌鶏卵リゾチームに対して向けられた、5アミノ酸のリンカーをもつD1.3ダイアボディー(D1.3/5;実施例1);ゼロアミノ酸のリンカーをもつD1.3ダイアボディー(D1.3/0;D1.3/5のようであるが、VLD1.3に直接融合されたVHD1.3)およびscFvD1.3(J.McCaffertyら、1990、前掲)。
抗原被覆赤血球の調製
ヒト赤血球(RBC)をこの技術に使用した。赤血球からバッフィーコート除去しそして廃棄した後、それらを洗浄し、回転し、そしてPBSで4回再懸濁させ、各回上澄み液を廃棄した。この洗浄工程の前に、異なる血液のグループの細胞を混合することが重要であった。最後の洗浄および回転後、RBC、被覆タンパク質溶液(PBS中の20mg/mlまたはそれより少ないリゾチームまたはphOx-BSA)および1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カーボジイミド(EDAC;PBS中の100mg/ml)を混合することによって、充填したRBCをタンパク質で被覆した。この混合物を回転プラットホームで4℃において1.5時間転倒させ、次いで赤血球を回転しそして上澄み液を除去しそして廃棄した。引き続いて、細胞をほぼ10mlのPBS中で5回洗浄し(それ以上の溶血が存在しなくなるまで)次いで使用するために10mlの最終体積の中に再懸濁させた。
アッセイ手順
抗体断片のためのクローンを、細菌の周辺質中で室温(ほぼ24℃)において、実施例1に記載するように1mMのIPTGを使用して誘発しながら発現させた。無菌の丸底マイクロタイタープレート中のウェルの第1列を除去した各々に、50μlのPBSを添加した。ウェルの第1列に、62μlの周辺質調製物を添加した(複製物において)。12μlをウェルからウェルに移す(最後のウェルから12μlを廃棄する)ことによって、プレートを横切って最初のウェルの内容物の5倍の希釈を行った。各対の第1行に、50μlの抗原被覆RBCを添加し、そして各々の複製物に、被覆抗原の不存在下にPBS中のEDACで処理したRBCを添加した。ウェルの内容物をおだやかに震盪することによって混合し、そしてプレートを混乱させないで室温において60〜90分間放置した。
結  果
ウェルの下部の全体を被覆する細胞の平坦なマットの発生は、表6中で「+」により示されている、赤血球凝集の発生を示す。赤血球凝集が起こらない場合、細胞はウェルの中央に緊密なボタンを形成する。
D1.3/5およびD1.3/0の2価のダイアボディーは、純粋な周辺質上澄み液およびリゾチーム被覆赤血球を含むが、phOx-BSA被覆赤血球または未被覆赤血球を含まない1:5希釈物の両方で凝集を示し、2価の断片の存在を示す。対照的に、実施例1に示すscFvD1.3は、モノマーと二量体との間の平衡として存在し、血球を凝集しない。NQ11/D1.3/0二重特異性ダイアボディーは、リゾチームで被覆した赤血球およびphOx-BSAで被覆した赤血球の混合物で凝集を示すが、phOx-BSAまたはリゾチームのみで被覆した赤血球では凝集を示さない。これは周辺質調製物中の二重特異性ダイアボディーの存在を示す。
実施例10  リゾチームおよび2-フェニル-5-オキサゾロンに対して向けられた二重特異性ゼロリンカーのD1.3/NQ11ダイアボディーのファージの表示
この実施例は、リゾチームおよび2-フェニル-5-オキサゾロンに対して向けられた二重特異性ゼロリンカーのD1.3/NQ11ダイアボディーを繊維状バクテリオファージの遺伝子IIIに融合し、そして両方の抗原への結合を保持してバクテリオファージ上に表示できることを示す。
実施例1からの構成体VI(リンカーなし)を、ファージの表示のためにファージミドpHEN1(H.R.Hoogenboomら、Nucleic Acids Res.19 4133-4137,1991)の中に再クローニングさせた。両方のポリペプチド鎖をエンコードする断片を、HindIIIを使用する消化およびXhoIによる部分的消化により切除した。部分的消化から発生したより大きい断片を、J.D.Marks(J.Mol.Biol.222 581-597,1991)に記載されてる方法を使用するゲル電気泳動により精製した。この断片をPstI/XhoI切断pHEN1の中に結合しそしてTG1の中にエレクトロポレイションした。
ファージミドをM13K07でレスキューし、そしてファージを含有する上澄み液を直接アッセイした。ファージの上澄み液(50μl)を実施例1におけるようにphOx-BSAおよび雌鶏卵リゾチームを被覆したプレートを使用するELISAにおいて使用したが、ただしM13に対して向けられたヒツジ抗体を使用してJ.McCaffertyら(Nature 348 552-554,1990)におけるようにファージ抗体の結合を検出した。NQ11/D1.3/0二重特異性ダイアボディーは、ファージの表面上の表示されるとき、両方の抗原に結合した。0.1のバックグラウンドの値に比較して、雌鶏卵リゾチームで2.8そしてphOx-BSAで2.7の吸収シグナルが得られた。
実施例11  二重特異性ダイアボディーNQ11/OE13の構成
実施例1に記載する2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられた一本鎖Fv断片をエンコードするDNAから、そして実施例1に本質的に記載するように方法を使用してエストリオールに対して向けられたハイブリドーマOE13(American Diagnositics Ltd)から誘導されたDNAから、5アミノ酸のリンカーをもつ2-フェニルオキサゾル-5-オンおよびホルモンのエストリオールに対して向けられた二重特異性ダイアボディーをエンコードするクローンを調製した。
OE13のVHおよびVκドメインをハイブリドーマV遺伝子から誘導された一本鎖FvのDNAから増幅し、そしてApaLI-NotI断片として、Clacksonら(1991、前掲)が記載するようなプライマーおよび方法を使用して、fd-tet-DOG1の中にクローニングした。scFv断片をエンコードするDNAをfd-tet-DOG1からPstI-NotI断片として切除し、そしてpHEN-1の中に再クローニングした。
このクローンからのDNAを、実施例1におけるように、プライマーVH1BACK,VH1FOR-2,Vk2BACKおよびVk4FORを使用するPCRにおいてV遺伝子を増幅するために使用した。遺伝子IIIのリーダー配列を含む遺伝子間領域を、プライマーNterVHfoおよびCterVkbaを使用するPCRにより増幅した。3断片をオーバーラップ延長によるスプラインシング(Clacksonら、1991)によりアセンブリングし、そしてアセンブリー生成物をゲル精製し、そしてプライマーVkbLink5-SacBstEおよびVH1foBsetElink5Sacで再増幅した。これはOE13Vk-遺伝子間領域-OE13VHインサートを与える。
プライマーVkbLink5-SacBstEおよびVH1foBstELink5Sacの各々は、最終のダイアボディー構成体の重鎖と軽鎖との間に、5アミノ酸のリンカー、GGGGSをつくるための正しい配列を含有する。プライマーVkbLink5-SacBstEはリンカー配列に対して5′のBstEIIのための制限部位を含有し、そしてVH1foBstELink5Sacはリンカー配列に対して5′のSacI部位を含有する。したがって、これらのプライマーで増幅したOE13インサートはBstEIIおよびSacIで消化し、そしてBstEII/SacI切断ベクターの中に挿入することができる。
OE13インサートをpUC19中のFvNQ11構成体(実施例1参照、構成体III)の中にクローニングした。これはNQ11/pUC19をBstEIIおよびSacIで切断することによって調製した。OE13インサートをこの中に3:1のモル比(VLN2NH:pUC19-NQ11)で結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。プライマーLMB2およびLMB3を使用する組換えコロニーからのインサートのPCR増幅により、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。
Ox-BSA(ほぼ10〜12モルのphOx/モルのBSA)で10μg/mlに被覆するか、あるいはエストリオール-BSA(ほぼ30モルのエストリオール/モルのBSA)で10μg/mlで被覆したプレートを使用するELISAにより、これらのクローンをそれらの抗原について結合する能力についてアッセイし、そしてphOx-BSAまたはエストリオール-BSAで被覆したELISAウェルに50μlの4%マーベル/PBSを添加した。モノクローナル抗体9E10によるmyc標識の検出を使用する、標準のELISAのプロトコールに従った。陽性のELISAシグナル(＞1.0)が得られた。
実施例12  ダイアボディーとCH3ドメインとの間の融合体の構成
ダイアボディーは遺伝的に他のタンパク質、または他の抗体ドメインに融合することができる。この実施例は、ダイアボディーを発生させ、この分子の両端において抗原に結合する能力を保持して、ヒトIgGγ4のCH3ドメインに融合させることができ、ただし十分な大きさのリンカーを接合部に挿入することを条件とすることを証明する。
IgGγ4(T.Simonからの提供)のヒトCH3ドメインを、実施例1に記載するNQ11/D1.3二重特異性ダイアボディーのC-末端に融合した。それを直接に、あるいはC-末端とCH3ドメインとの間の15アミノ酸の柔軟なスペーサーと融合した。
pUC19-NQ11/D1.3/0をHindIIIで消去しそしてXhoIで部分的に消化することによって、NQ11/D1.3を切り出した(実施例1)。
CH3ドメインの5′末端を増幅するために使用したプライマーHuCH3baXhoおよびHuCH3baLinkXhoの中に、XhoI制限部位を導入した。CH3の3′末端を増幅するために使用したプライマーHuCH3foEcoの中に、EcoRI制限部位を導入した。これはダイアボディーおよびCII3断片を3方法結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングできるようにする。
ダイアボディーNQ11/D1.3/CH3の構成
ヒトCH3鎖に直接連鎖したダイアボディーを構成するために、IgGγ4のヒトCH3ドメインをプライマーHuCH3foEcoおよびHuCH3baXhoで標準の条件下にPCR増幅した。PCR生成物(CH3およびLinkCH3)をXhoIおよびEcoRIで切断した。ダイアボディー断片HindIII/XhoIおよびCH3ドメインDNAをHindIII/EcoRI消化したpUC119SfiNotmycの中にモル比2:3:1:(NQ11/D1.3/0:CH3:pUC119SfiNotmyc)で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。プライマーHuCH3FoEcoおよびLMB3を使用する組換えコロニーのPCR増幅により、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。
ダイアボディーNQ11/D1.3/リンカー/CH3の構成
CH3ドメインに対して15アミノ酸のリンカーをもつダイアボディーを構成するために、同様なプロトコールに従った。IgGγ4のヒトCH3ドメインをプライマーHuCH3baEcoおよびHuCH3baLinkXhoで標準の条件下にPCR増幅した。PCR生成物(CH3およびLinkCH3)をXhoIおよびEcoRIで切断した。ダイアボディー断片HindIII/XhoIおよびCH3ドメインDNAをHindIII/EcoRI消化したpUC119SfiNotmycの中にモル比2:3:1(NQ11/D1.3/0:CH3:pUC119SfiNotmyc)で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。プライマーHuCH3foEcoおよびLMB3を使用する組換えコロニーのPCR増幅により、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100mg/mlのアンピシリン中で対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度にIPTGを添加することによって誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g、10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mMのEDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g、10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液をELISAにおいて使用した。実施例1に記載されているようにphOxおよびリゾチームへの結合についてELISA(セロテク(Serotech)からの抗ヒトCH3γ4を使用する結合した抗体の検出を使用する)および実施例1に記載するようにBIAコアにより分析すると、15アミノ酸のスペーサーをもつ抗体のみが2-フェニルオキサゾル-5-オンおよびリゾチームに対する特異性を保持した。
スーパーデックス(Superdex)75を使用するFPLCゲル濾過により分析およびBIAコアを使用する結合の検出(実施例1に記載するように)は、物質の約30%が二量体であることを示した。こうして、より大きい断片がこの方法において事実作ることができる。このCH3融合体中の30%の二量体は親NQ11/D1.3リンカーのダイアボディーをもつ100%の二量体と対照をなし、CH3ドメインの存在がこのダイアボディーの二量体化の平衡を混乱させる。
実施例13  ヒトPBLによるヒト腫瘍細胞のダイアボディー仲介溶解
腫瘍特異的マーカーを介して腫瘍細胞に結合しそしてレセプター、例えば、CD16を介してヒトエフェクター細胞に結合する二重特異性抗体は、ヒトエフェクター細胞による腫瘍細胞の溶解を仲介することができる。(参照、例えば、Garcia de Palazzo l.ら、CA19-9抗原およびCD16をターゲッティングする二重特異性抗体の抗腫瘍作用、Cancer Research 52,pp5713-5719)。
腫瘍特異性抗原癌胎児抗原(CEA)に結合するネズミ抗-CEA抗体およびヒト細胞表面タンパク質CD16に結合するモノクローナル抗体3G8(Flcit,H.B.,Wright,S.D.およびUnkeless,J.C.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,p3275-3279)から誘導された可変領域を使用して、二重特異性ダイアボディー(CBM-1)を構成した。CBM-1はこの特許に記載されている技術により第32図に概説されているスキームを使用して構成し、可変ドメインの間に5アミノ酸のリンカーを有しそしてCEAおよびCD16の両方に結合する。CBM-1は精製したCEAおよびCD16にELISAにより結合する。
クロム51解放アッセイによりアッセイした溶解百分率(溶解%)により細胞の殺しを決定した(Brunner,K.T.,Engers,H.D.およびCerottini,J.C.(1976)、生体外の細胞仲介細胞溶解の定量的測定に使用した51Cr解放アッセイ;Bloom,B.およびDavid,J.R.(編)、細胞仲介および腫瘍免疫性における生体外の方法、p423。Academic press、ニューヨーク)。
エフェクター細胞(末梢血リンパ球(PBL))はヒトドナーから入手しそして、フィコール-イソパーク(Ficoll-Isopaque)(Ficoll-Paque,Pharmacia,スイス国ウップサラ)密度遠心を使用してBoyum,A(1968)Scan.J.Clin.Lab.Invest.21(suppl.97),p7のプロトコールに従い全血から単離した。
CEAを収容する2×106のLS174T標的細胞をトリプシン処理後に収穫し、そして10%胎児仔ウシ血清を含有するRPMIで洗浄した。細胞の遠心後、ペレットを51Cr(200μCi)で37℃において1時間標識化する。RPM1中で2回洗浄後、標的細胞をマイクロプレート(5000細胞/ウェル)にエフェクター細胞と一緒に添加して、種々のエフェクター:標的比を得る。ダイアボディー(1mg/mlまで)を200μlで添加した後、37℃において4時間インキュベーションする。細胞を回転し、そして上澄み液の半分(100μl)を集め、そしてクロムの解放をガンマカウンターで決定する。各の試料点を三重反復実験において実施し、そして比溶解を次のようにして計算する:
100×(平均の試料の解放-自発的解放)/(最大の解放-自発的解放)
自発的解放はアッセイ培地単独中の標的細胞から測定し、そして最大の解放は1MのHCl中の標的細胞の同等の数の溶解後に測定する。
第31図は、PBLエフェクター細胞/LS174T腫瘍細胞の標的の種々の比におけるドナーDからのPBLを使用する実験からのデータを示す。データは、1000ng/mlのダイアボディーを使用するが、10ng/mlのダイアボディーを使用しないときの、エフェクター細胞を増加するCBM-1仲介細胞溶解を示す。こうしてCBM-1は腫瘍標的細胞の殺しを仲介し、そして細胞の殺しは使用するCBM-1ダイアボディーの投与量に依存する。
この実験が証明するように、二重特異性ダイアボディーは1つの細胞(腫瘍細胞)の他の細胞(ヒトPBLの中に含有されるCD16陽性細胞)により殺しを仲介することができる。
実施例14  ファージ上に表示される二重特異性ダイアボディーのレパートリーの構成
われわれは、ここで、2工程の構成、およびダイアボディーのレパートリーのバクテリオファージ上の表示および2つのハプテン、一方のアーム上の2-フェニルオキサゾル-5-オン(phOx)、および他方のアーム上のジゴキシン(Dig)に対する特異性をもつ二重特異性ダイアボディーの選択を記載する。
最初に、免疫化マウスの脾臓から得られたV遺伝子を使用して、2つのscFvレパートリーをアセンブリングした。これらのレパートリーをファージ上に表示させ、そして抗原上で選択してバインダーについて濃縮した。第2クローニング工程において、V遺伝子を再シャフリングして二重特異性ダイアボディーのレパートリーを形成し、レパートリーはファージ上に表示されそして順次に2つの抗原(phOx-ウシ血清アルブミン(BSA)およびジゴキシゲニン-BSA)上で選択した。
この節に記載する増幅反応のすべては、特記しない限り、基本的サイクリングのプロトコールを使用する:94℃1分間、55℃1分間、および72℃2分間、25サイクル、セツス(Cetus)またはベーリンガー・マンヘイム(Boehringer Mannheim)から購入したTaqポリメラーゼ、および供給業者が記載する緩衝液組成物を使用する。
2つの構成ブロック:抗ジゴキシンおよび抗phOx活性の種々のscFvレパートリーの構成
免疫化マウスの脾細胞からの抗体の高度に多様なレパートリーを、本質的にClacksonら、Nature 352,624-628(1991)に記載されているようにして作った。2つのハプテン、ジゴキシンおよびphOxを選択した。3匹のマウスのグループを抗原(Dig-ニワトリ血清アルブミン(CSA)またはphOx-CSA)で免疫化した。抗原に対する免疫応答を被覆抗原(phOx-BSAまたはDig-BSA)を使用する標準のELISAによりモニターした。すぐれたphOx応答をBalb/Cマウスにおいて誘発することができた(10-5の抗体力価)が、満足すべき抗ジゴキシン力価(105またはこれよりすぐれる)を達成するためにA/Jマウス使用することが必要であった。また、一次応答および二次応答の間に生成する抗体の潜在的変動を探索するために、phOx-CSAで免疫化した3匹のマウスを同一抗原で免疫化した残りの3匹のマウスより4週早く脾摘出した。いったん適当な応答が達成されたとき、二次免疫化を抗原のみ(phOxおよびDig)で実施し、3日後に脾臓を取り出した。
単細胞の懸濁液を各超免疫化脾臓から調製しそしてプールし、次いでRNAzolのB系(Biogenesisリミテッド、英国ボウネマウス)を使用してRNA調製した。この方法において単離されたRNAをそれ以上修飾しないで使用して第1鎖cDNAを調製し、そして、これから、一次VHおよびVLバンドを調製した(Clacksonら、1991、前掲、におけるように)。増幅されたVHおよびVLのDNAをPCR誘導法において、クローニングのための制限部位で標識化したプライマーを使用してscFv遺伝子としてアセンブリングした。PCRアセンブリーを使用して標準のscFvフォーマットにおいて15アミノ酸のリンカーをエンコードする断片を介してVHおよびVL遺伝子を接合した((Gly4Ser)3配列を使用する)。SfiIおよびNotIで制限後、アセンブリングした断片を適当に切断したファージミドベクターpCANTAB5mycの中に結合し、そしてレパートリーを大腸菌(E.coli)の中にエレクトロポレイションした。Dig-レパートリーを同様な方法においてわずかに異なるプライマーを使用して作ってそれ以上の研究のための追加のクローニング部位を含めた(そしてリンカー配列を(Gly4Ser)2Gly2Scr2に変化させた)。(注:唯一の差はリンカー配列をLINK-FOR-XHOおよび標準のLINK-BACKプライマーを使用して作ったということである:LINK-FOR-XHO配列は後のクローニングのためにXhoI部位を導入する)。
われわれは1×106および7×106の独立のクローンのライブラリーの大きさを一次および二次のphOxの応答のために、そして3×106のライブラリー大きさをジゴキシゲニンのために生成することができた。多様性はscFvDNAのBstNI消化により確証され、多数の異なるパターンを示した(示されていない)。2つのphOxライブラリーをプールすると、phOxおよびDigバインダーについての濃縮は、それぞれ、高度に誘導されたphOx-BSA(14:1のモル比)およびDig-BSA(25:1のモル比)上の数ラウンドのパニング(panning)により達成された。すべての可能なバインダーを保持するために、パニング選択において使用した免疫管上のコーティングのために非常に高い抗原濃度を使用した(1mg/ml)。1および2ラウンドのパニング後、phOxライブラリーからのすべてのクローンの66%および94%がそれぞれphOx-BSAに結合し、そしてBSAに結合しない(示されていない)。同様に、ジゴキシゲニンのバインダーは2ラウンドの選択後豊富である(90%)。広範な種類のELISAのシグナルが1ラウンドの選択後に見られ、それ以上のラウンドにわたっていっそう均質にかつより高くなる。二重特異性ダイアボディーのレパートリーのための構成ブロックとして、ラウンド1の抗phOxレパートリーからのDNA(E1-OX ds-DNA;66%の陽性)およびラウンド2の抗Digレパートリー(E2-DIG ds-DNA;90%の陽性)を選択した。
二重特異性レパートリーの構成
クローニングのスキームの外観は第33図に記載されている。第1V-VLの組み合わせをスプライスオーバーラップ延長PCR反応により作った。選択したVL-DIGレパートリーおよび選択したVH-OXレパートリーを、次のようにして2つの停止コドン、リボソーム結合部位およびシグナル配列をエンコードするDNA断片と一緒にスプライスした。VH-DIGレパートリーをE2-DIG ds-DNAからプライマーpUC逆およびVH1FOR-2を使用して増幅した。VH-OHレパートリーをE1-OX ds-DNAからプライマーMVKBBSTおよびVK4FORを使用して増幅した(Clacksonら、1990、前掲)。MVKBBSTはVH1FOR-2に対して相補的な5′配列、それゆえ、VH遺伝子3′配列を含有するようにデザインした。RBS断片と呼ぶ第3断片をファージミドpCANTAB5-FabD1.3(クローンLN11)からのde-DNAから増幅して、2つのVH-VLカッセトの間のための配列を供給した。増幅された鋳型の配列は次の通りである:5′-TAA TAA CCC TGC AGG TCG ACA AGG AGA CAG TCA GTG AAA AAA CTC CTC TTT GCC ATA CCA CTC GTG GTG CCA TTT TAC TCC GCG GCT GCC CCA GCG ATG GCG-3′。逆プライマー混合物(LBRBS-1,2,3,4,5)(VL遺伝子3′配列に対して相補的な配列領域を含有するようにデザインされた)および前方プライマー、LFRBS-2(これはVL-OXの3′以外のどこかに位置するリンカーと望ましくないアセンブリー生成物の形成を回避するためにVH遺伝子と相補的な配列を含有しないように適合された)を使用して、鋳型を増幅した。3つの断片、VH-DIG,VL-OXおよびLN11誘導断片を、PCRおよびオリゴヌクレオチドpUC逆およびLFRBS-2を使用してスプライスオーバーラップ延長によりアセンブリングした。VH-DIG/VL-OX-RBS断片をゲル精製しそして次の工程において使用した。
第2工程において、VL-OXレパートリーをE1-OX ds-DNAからプライマーVH1BACKSfiKspおよびVH1FOR-2 Xhoを使用して増幅した。第1プライマーは標準のVH1BACKプライマーの回りにデザインした(Clacksonら、1990、前記)が、KspI部位を含有する長い5′標識を含有する。前方プライマー(VH1FOR-2 Xho)は再び標準のVH1FOR-2に基づく(Clacksonら、1991、前掲)が、ここでXhoIクローニング部位を含有する。増幅された生成物をゲル精製し、そしてゲル精製したプライマーVH-TagおよびXho-Tag、およびVH-OX断片を使用して再増幅した。
アセンブリングされたVH-DIG/VL-OX-RBS生成物およびVL-OXを引き続いてKspIで切断し(VH-OXの5′標識の中およびRBS断片の3′末端におけるリーダー配列内に存在する)、そして結合キット(Amersham)によりT4 DNAリガーゼを使用して一緒に結合した。結合混合物の試料を、プライマーpUC逆およびXhoTagを使用するPCRにおいて直接使用して、結合された生成物をプルースルー(pull-through)した。この断片、VH-DIG/VL-OX-RBS-VH-OX、をゲル精製し、XhoIで切断し、そして再びゲル精製して、最後の工程、すなわちVL-DOGレパートリーの添加のためにそれを準備した。
最後のV遺伝子のレパートリー、VL-DIGは、プライマーLINKBACK(Clacksonら、1991、前掲)およびfd-tet-seq24を使用するPCRによりE2-DIG ds-DNAからPCRにより得た。断片をゲル精製し、XhoIで切断しそしてゲル精製した。VL-DIG DNAをVH-DIG/VL-OX-RBS-VH-OX DNAに結合し、そして結合混合物の試料をプライマーBioGene3Leadおよびfd-tet-seq24を使用するPCRにおいて直接使用して結合した生成物をプルースルーした。この断片は、ここで2つのアセンブリングされたVH-VL遺伝子のカッセトを含有し、ゲル精製し、SfiIおよびNcoIで切断し、ゲル精製し、ファージミドベクターpCANTAB5mycの中に結合し、(第19図)(同一酵素で制限した)、そしてエレクトロポレイションにより大腸菌(E.coli)TG1の中に導入した。
第1クローニングは50000クローンのレパートリーを生じ、クローンの95%は完全な二重特異性のダイアボディーのインサートを有し、そしてBstNIフィンガープリンティングにより判定して多様性を保持した(示されていない)。
ファージ粒子をレパートリーから、基本的にMarksら、J.Mol.Biol.222,581-697,1991に記載されているように調製した。レスキュー手順における唯一の差は、ヘルパーファージの感染後の培養の成長温度であった。30℃の代わりに、より低い温度を使用した(22℃)。一夜(20時間)のインキュベーション後、2回のPEG沈澱により培養上澄み液からファージを調製した。力価はファージ上に表示されたscFvレパートリーから得られた力価に類似した(ほぼ1012コロニー形成単位/ml培養上澄み液)。ファージをphOx-BSA上の選択のために使用し(前述したように、パニングにより)、そして結合するファージをTG1の中に再感染させた。この選択の前後の個々のクローンをELISAによりphO-BSA,Dig-BSAおよびBSAへの結合について分析した。ダイアボディーをファージ-ダイアボディー(ダイアボディーはヘルパーファージで個々のクローンのレスキュー後にファージ上に表示された)としておよび可溶性ダイアボディー(1mMのIPTGで誘発しそして22℃において20時間成長させた培養物の上澄み液を使用する)として分析した。第34図は簡索化のために灰色の目盛りでELISAの結果示す;＜0.2のELISAのODを結合の証拠のためのカット-オフとして取った;したがって、灰色のシグナルをもつすべてのウェルは陽性であると考慮した。プレート1,4および7は、ファージ上に表示されたダイアボディーとして未選択のレパートリーの96クローンのELISA分析(それぞれ、Dig-BSA,phOx-BSAおよびBSA上の)に相当する(同一のクローンからのファージを含有する上澄み液を3つのELISAの各々において分析した)。phOx-BSA上で選択したレパートリーをファージ上に表示されたダイアボディー(プレート2,5および8)としておよび可溶性ダイアボディー(プレート3,6および9)として分析した。最初に、ファージのELISAを論考する。第34図が示すように、選択の前に、レパートリーはDIGのみ(ウェルA7,C7など)、phOxのみ(ウェルG2,H4,F11)に対するバインダーを含有するが、また、両方(ウェルA3,A6,B9,C5,D12,H12)に対するバインダーを含有する。この二重特異性のレパートリーのための出発レパートリーは66%のphOxバインダーおよび90%のDigバインダーを有した。再クローニング後、9/96(9.3%)phOxバインダーおよび14/96(14.5%)Digバインダーが得られる。それゆえ、すべてのV遺伝子のレパートリーは再クローニングの間にシャフリングされており、そしてV遺伝子のレパートリーのいくつかはほぼ100サイクルのPCRに付されたが、われわれの二重特異性レパートリーにおいて比較的高いレベルのバインダーが得られる。また、これが示すように、scFvフォーマットにおいて抗原に結合する大部分の抗体は、また、二重特異性ダイアボディーのフォーマットにおいて機能することができるに違いない。6/96クローンは両方の抗原に結合するので、50000クローンのもとのレパートリーは3000より多い二重特異性抗体を有するであろう。
phOx-BSA上で濃縮すると、ほぼ40/96二重特異性抗体が得られ、17クローンはphOxのみに結合し、そして9クローンはDigのみに結合する。明らかなように、phOxの選択はphOxバインダーの頻度を増加し(9/96から57/96)に、そして期待されるように、Digのみのバインダーの数は減少する(14/96から9/96)。この選択は、ダイアボディーをレパートリーから標準のファージのフォーマットを使用して選択することができることを証明する。
第35図は、可溶性断片(下部)のファージのダイアボディー(上部)として、選択された二重特異性クローンのいくつかについてのDigおよびphOxへの結合についてのELISAシグナルの試料を示す。いくつかのクローンは両方のDigおよびphOxについて同様なELISAシグナルを有するが、他のものはそれらの結合の挙動が完全に異なる。これらの結果から明らかなように、われわれは、異なる二重特異性ダイアボディーの全系列を選択し、そして、BstNIフィンガープリントの分析により確証することができるのは、ちょうど1クローンだけではない(結果は示されていない)。
可溶性ダイアボディー断片のELISAは、ファージのダイアボディーのELISAと同一の傾向を示す。プレート3,6および9は、ファージのダイアボディーを分析した同一のクローンから得られた可溶性ダイアボディーを使用するELISAである(プレート2,5および8;第34図)。陽性の頻度は明らかなようにより低い、これは多分ELISAの感度が低いか、あるいは生産されるダイアボディーの量の変動のためである。しかしながら、可溶性ダイアボディーのELISAの結果はファージのELISAの結果と完全に一致する。例えば、プレート3および6のウェルB8におけるクローンは可溶性ダイアボディーとして二重特異性であるが、また、ファージ上に表示されるとき二重特異性である(プレート2および3上のウェルB8)。同様に、ウェルB2におけるクローンは可能性およびファージの両方のダイアボディーとしてDig特異性である。
これらのクローンが二重特異性であることをさらに証明するために、4クローン(ウェルG9,F12,H4およびF2から)を凝集アッセイにおいて可溶性断片およびファージのダイアボディーとして分析した。基本的に実施例9に記載されているように、赤血球をDig-BSAまたはphOx-BSAで被覆し、細胞を混合しそして周辺質抽出物または培養上澄み液(可溶性ダイアボディーについて)または培養上澄み液(ファージのダイアボディー)とインキュベーションした。凝集はすべての4クローンについてすべての期待した場合において透明である(そして培養上澄み液についてより周辺質抽出物についていっそう強い)(結果は示されていない)。
これらの結果が示すように、二重特異性(したがって、最もありそうなことには2価の)ダイアボディーのレパートリーを発生させ、ファージ上に表示させ、そして抗原で選択することができる。
実施例15  VHドメインに対してN-末端のVLドメインをもつダイアボディー:2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられた2価のダイアボディーの構成および発現
通常のダイアボディーのフォーマットにおいて、重鎖の可変ドメインは軽鎖の可変ドメインに対してN-末端である(N-(VH-VL)-C)。この実施例は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの向きが逆転されている(VL-VH)ダイアボディーの構成を記載する(「逆」ダイアボディー)。これは、2つのVIIドメインよりむしろ、2つのVHドメインの並置を生ずる。
2価のNQ11逆ダイアボディーの構成
ベクターfd-CAT1中のNQ11scFvクローン(J.McCaffertyら、1990、前掲)を、VLおよびVHドメインの増幅のための基質として使用した。増幅生成物を制限酵素XhoIで消化しそして結合してSfiIおよびNcoIの消化およびファージミドベクターpCANTAB5-mycの中へのクローニングのための逆ダイアボディー構成体をエンコードするDNAを提供することができるように、プライマーをデザインした。プライマーSfiVLBack(表1)およびfdtseq1を使用してVLドメインを増幅し、そしてプライマーVL/VHBackXho1またはVL/LHBackXho1AをVHドメインの増幅のためにVHForNotとともに使用した。
SfiVLBackは、NQ11VLの5′末端に対して相補的である配列および引き続いてSfi1制限部位を含有する33塩基のオーバーハングから成る。Fdtseq1はVL配列に対して3′に横たわる遺伝子IIIコーディング配列内の領域に結合する。増幅したVLドメインは、3′末端の10bp内に前もって存在するXhoI部位および5′末端にプライマー誘発SfiI部位を含有する。
VHForNotは、NQ11VHの3′末端に対して相補的である配列および引き続いてNcoI制限部位を含有する24塩基のオーバーハングから成る。VL/VHBackXho1はNQ11VHのDNAの5′末端に対して相補的である配列および、XhoI制限部位を含むNQ11VLのDNAの3′末端に対して相補的である配列から成る。VL/VHBackXho1AはVL/VHBackXho1に類似するが、VHおよびVL配列の間の接合部に2つの余分のグリシンコドンを含有する。
増幅生成物をXhoIで消化しそしてゲル精製した。断片を結合しそして結合生成物をフランキングプライマーSfiVLBackおよびFdtseq1を使用するプルスルー(pullthrough)増幅のための鋳型として使用した。VL/VHBackXho1を一次PCRにおいて使用した場合、プルスルー生成物はリンカー残基をもたない逆ダイアボディーを発生した。VL/VHBackXho1Aを使用した場合、プルスルー生成物は2つのグリシン残基のリンカーをもつ逆ダイアボディーを発生した。
プルスルー生成物をSfiIおよびNcoIで消化し、そしてSfiI/NotI消化ベクター、pCANTAB5-mycに結合した。精製した構成体を電気成分の大腸菌(E.coli)TG1細胞の中にエレクトロポレイションしそして2%グルコース、100μg/mlアンピシリンを含有する2TY/寒天プレート上にプレートした。
生ずるコロニーを2TY,0.1%グルコース、100μg/mlアンピシリン中で30℃において対数期に成長させることによって、可溶性ダイアボディーを発現させた。IPTGを1mMに添加し、そして細胞を22℃において24時間インキュベーションした。細胞を遠心(1000g,10分)そして上澄み液をELISAにおいて使用した。
80μlの上澄み液を2-フェニルオキサゾル-5-オン/BSA接合体(PBS中の100μg/ml)で被覆したELISAウェル中の20mlの5×PBS,10%マーベルに添加し、そして2%マーベル/PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い(H.R.Hoogenboomら、1991、Nucl.Acids Res.19,4133-4137)モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検出を使用した。0リンカーおよび2残基のリンカーのNQ11逆ダイアボディーの両方により結合が検出された(第36図)。
逆ダイアボディーが2価であることを確証するために、誘発後4時間に調製された周辺質抽出液について赤血球凝集アッセイを実施した。細胞を5mlの培養物中で成長させ、上のように誘発し、そして22℃において4時間成長させた。細胞を遠心し、そしてペレットを250μlのPBS,1mMのEDTAの中に再懸濁させた。氷上で15分間インキュベーションした後、細胞を遠心しそして周辺質上澄み液を凝集アッセイにおいて使用した。50μlの周辺質上澄み液を2-フェニルオキサゾル-5-オン/BSA接合体で誘導した50μlのヒツジ赤血球とインキュベーションした(誘導はPBS中の20mg/mlの2-フェニルオキサゾル-5-オン/BSAおよびPBS中の100mg/mlのエチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カーバミドと赤血球を4℃において1.5時間インキュベーションすることによって達成した)。
0リンカーおよび2残基のリンカーの逆ダイアボディーからの純粋な周辺質上澄み液は誘導された赤血球を凝集させ、そして非誘導の細胞を凝集させなかった。これにより示されるように、Vドメインの向きが逆転されたダイアボディーはフォルディングして安定な活性の2価の結合性タンパク質を形成することができる。
2価のphOx特異性逆ダイアボディーをエンコードするDNAは、一方のアームがphOxに対して向けられそして他方のアームがNIPに対して向けられた逆のフォーマットで二重特異性ダイアボディーの構成において使用できる。これはVH NIP-遺伝子間領域をエンコードするDNAを2価のNQ11クローンの中に挿入し、こうして2つのポリペプチド鎖を生成し、こうしてVL Ox/VH NIPおよびVL NIP/VH Oxを生成することによって達成される。遺伝子間領域はリボソーム結合部位および第2ペプチドのためのリンカー配列を含有する(VL NIP/VH Ox)。
実施例16  VHおよびVLドメインの間の10アミノ酸のリンカーはモノマーの形成を可能とするという証拠
実施例1において構成体の発生について記載したよに、一本鎖FvNQ11の10アミノ酸のリンカーのバージョンを調製した。実施例1において、このダイアボディーの5および15アミノ酸のバージョンを作った。この実施例において、ダイアボディーの構成はプライマーを使用して10アミノ酸のリンカーを発生させてリンカーを導入することによって完結する。
クローンをTG1中で発現させそして断片を実施例1におけるようにphOx-BSA-セファローズのクロマトグラフィーにより精製した。
精製したタンパク質をセファデックスのカラムを使用するFPLCゲル濾過により分析し、そしてファーマシアBIAコアによりphOx-BSAへの結合を分析した。10アミノ酸のリンカーのNQ11ダイアボディーの見掛けの分子量はFvNQ11および15アミノ酸のリンカーのscFvNQ11のそれと同一であったが、ダイアボディーを形成する5アミノ酸のリンカーのNQ11分子のそれより小さかった。こうして、10残基のリンカーは同一鎖からVHおよびVLドメインの間の対合を可能とするために十分であるように思われる。しかしながら、モノマーの形成を可能とするリンカーの正確な大きさは、また、リンカーの配列に依存するようである。例えば、リンカーの中に崇高の鎖の配列(例えば、Tyr)が存在した場合、このような短いリンカーでモノマーを形成することはいっそう困難であったであろうことが予測される。
実施例17  二重特異性抗NIP、抗ヒトFcRlダイアボディーの調製
NIP(4-ヒドロキシ-2-ヨード-5-ニトロフェニル酢酸)および0アミノ酸のリンカーをもつヒトFcγRIレセプターに対して向けられた二重特異性ダイアボディーを、中間体として調製した2価の抗FcγRIダイアボディーを使用して調製した。
2価の抗FcγRIダイアボディーの構成
022はヒトFcγRIに特異的に結合するネズミモノクローナル抗体である。それはファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLで5残基のリンカーを使用してダイアボディーのフォーマットでクローニングされた。リンカーの配列はVKの5′末端の増幅に使用されたプライマー(Vk022SacbaLink5BstEII)の中に取り込まれ、そしてこのプライマーは、また、SacI制限部位をVkの開始に導入する。BstEIIのための制限部位はプライマーVk022SacbaLink5BstEIIのリンカー配列の5′およびまたVH1FOR-2の3′末端に組み込まれた(E.S.Wardら、1989、前掲)。SfiI制限部位をVHの5′末端の増幅に使用されたプライマーVH022Sfibaの中に導入する。NcoI制限部位をVKの3′末端の増幅に使用されたプライマーVk022foNotの中に導入する。これはVHおよびリンカー-VL断片を3方法の結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングできるようにするであろう。
VH022遺伝子をプライマーVH022SfibaおよびVH1fo-2を使用するPCRにより増幅した。Vk022遺伝子をプライマーVk022SacbaLink5BestEIIおよびVk022foNotで増幅した。鋳型として022VHおよびVL遺伝子(Sctogenにより供給される)をエンコードするM13ファージとともに、標準の条件使用した。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIおよびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI/NotI消化pUC119SfiNotmycおよびpCantab6の中にモル比3:3:1(VH:VL:pUC119SfiNotmyc)で結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。組換え体を022特異的プライマーVH022baSfiおよびVk022foNotを使用して正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。VHおよびVLドメインのDNAを、また、同一の方法でSfiI/NcoI消化pCANTAB6ベクターの中に結合し、そして大腸菌(E.coli)HB2151細胞を形質転換するために使用した。
可溶性ダイアボディーをpUC119SfiNotmycクローンからTG1中で37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100mg/mlアンピシリン中で対数期の成長の細胞を、IPTGを1mMのIPTGの最終濃度に添加することによって誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g、10分)し、そして細胞ペレットを、100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g、10分)し、そしてダイアボディー含有上澄み液をELISAにおいて使用した。
ELISAについて、アッセイのプレートを炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ヒトIgM(SeraLab)の1:500希釈物で37℃において4時間被覆した。ウェルをPBS/1%BSAでブロックしそして100μlのヒトFcガンマRI-IgM融合体を含有するCos上澄み液を添加し(1%BSA/PBS中で1:4に希釈した)そして37℃において1時間インキュベーションした。上のようにして調製したダイアボディーの上澄み液をその2×希釈で200μlに添加した。さらに、各ウェルは10μg(10μl)のヒトIgG1,λ(Sigma)を含有した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ヒトカッパ抗体(Sera-Lab)を使用して37℃において1時間、結合を検出し、そしてOPD基質で展開した。濃縮した上澄み液の試料を使用して492nmにおいて、1.0より大きいELISAシグナルが得られた。
二重特異性抗NIP、抗FcγRIダイアボディー022/B18/0の構成
このダイアボディーは実施例3におけるダイアボディーNQ11/B1.8について使用した方法に類似する方法で構成した。ダイアボディー022/5(上を参照)をBstEIIおよびSacIで切断して、VH022およびVL022アームをもつベクター構成体を生成した。次いで、抗体B1.8のVHおよびVL配列をこの中にクローニングして、二重特異性ダイアボディー022/B1.8/0を生成した。
2つの抗体の特異性022(抗ヒトFcγRI)およびB1.8(抗NIP)を二重特異性ダイアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを直接0リンカーと向きVH-VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で融合した。リンカー配列をV1の5′末端の増幅に使用したプライマー(V1B1.8baLinkOBstE)の中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVIBのリンカー配列の5′に取り込まれた。AscI制限部位をVKの3′末端の増幅を使用するプライマーV1B1.8foAscの中に導入する。これにより、VH-リンカーおよびリンカー-VL断片を3方結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングすることができるであろう。
VHB1.8をプライマー2および6(実施例1)で増幅し、V1B1.8をプライマーV1B1.8baLinkOBstEおよびV1B1.8foAscで増幅し、プライマーV1B1.8baLinkOBstEおよびV1B1.8foAscはfdDOG-1の中にクローニングされたscFvB1.8からのものであった(R.Hawkinsにより供給された)。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびSacIで消化し、そしてVI PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化した。ダイアボディー022/5(上を参照)のベクター断片をBstEII/SfiIで切断し、そしてVHおよびVLドメインのDNAをそれとモル比3:3:1(VH:VL:pUC119-022/5)で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。組換え体をプライマーLMB2およびLMB3を使用して正しい大きさのインサートについてスクリーニングし、組換え体からのインサートをPCR増幅した。
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g、10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g、10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液をELISAにおいて使用して前述したようにヒトFcγRIレセプターに結合しそして次のようにしてNIP-BSAに結合した。
50mlの周辺質上澄み液+50mlの4%マーベル/PBSをNIPで被覆したELISAウェル(BSAを10〜12分子のNIPで誘導した)(PBS中の10μg/ml)に添加し、2%マーベル/PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い(H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.19,4133-4137,1991)、モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検出を使用した。10分後、両方の抗原についてのELISAの読みは1.0より大きかった。
NP-セファローズのアフィニティーカラム(T.Simon、博士論文、コルン大学、1990)による精製のために、発現を前述したように実施したが、ただし誘発後、細胞を22℃において26時間成長させた。細胞を8000rpm/10分/4℃におい沈澱させ、そして上澄み液を0.16μのFILTRONミニセッテ(Minisette)を使用して濾過して残留する細胞を除去し、次いでFILTRONミニセッテを使用して濃縮した。濃縮物をNP-セファローズカラム上に2回通した。カラムを20カラム体積のPBSで洗浄し、そして10カラム体積のPBS/0.5M NClで洗浄した。結合したタンパク質を0.2MのグリシンpH2.3で4℃において溶離し、そして1MのTrispH7.3で直ちに中和し、次いでPBS/0.2mM EDTA pH7.4の中に透析し、そしてアリコートで凍結させた。
精製したタンパク質はELISAアッセイにより決定したときNIPおよびHuFcγRIレセプターに強くかつ特異的に結合し、タンパク質生成物の二重特異性の本質を示した。
実施例18  二重特異性抗イディオタイプ(bcll)-抗CD3ダイアボディーの調製
5アミノ酸のリンカーをもつ二重特異性ダイアボディーをエンコードするクローンを調製し、一方のアームはBCL-1リンパ腫細胞系の表面Igに対して向けられた抗イディオタイプ抗体B1を発現し、そして他方のアームは、ハムスターハイブリドーマ細胞系から誘導された、マウスT細胞レセプターのクラスター分化抗原CD3に対して向けられていた。中間の工程として、2価のダイアボディー2C11を調製した。両方の2価のダイアボディーおよび二重特異性ダイアボディーは、EL-4マウスT細胞系上のFACS走査により、CD3に結合することが示された。
5アミノ酸のリンカーをもつ2価のダイアボディーB1の構成は実施例19に記載されている。
2C11はマウスCD3T細胞コレセプターに結合するハムスターモノクローナル抗体である。それはダイアボディーのフォーマットで5残基のリンカーを使用してファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLでクローニングされた。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマー(VkCbaLink5BstEII)の中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVkCbaLink5BstEIIの5′およびまたVH1FOR-2の3′末端に取り込まれた。SfiI制限部位をVHの5′末端の増幅に使用したプライマーVH2CllSfibaの中に導入した。NcoI制限部位をVKの3′末端の増幅に使用したプライマー混合物Vk4FORNot(Clackson,1991、前掲)の中に導入した。これにより、VHおよびリンカー-VL断片を3方結合反応において発現ベクターpUV119SfiNotmycの中にクローニングすることができた。
RNAを2C11ハイブリドーマ細胞(Kris Thielemans教授により供給された)から抽出し、そしてcDNAの調製に使用した。2C11のVHおよびVLドメインのDNAを、PCRによりcDNAから、それぞれ、プライマーの対VH2cbaSfiおよびVH1FOR-2、およびVkCbaおよびVK4FOR(T.Clackson,H.R.Hoogenboom,A.D.GriffithsおよびG.Winter,Nature 352,624-628,1991)を使用して標準の条件下に増幅した。(注:2C11V遺伝子は前もってクローニングおよび配列決定されていたので、われわれは「標準の」VH1BACKプライマー(R.Orlandi,D.H.Gussow,P.T.JonesおよびG.Winter,Proc.Natl,Acd.Sci.USA 86,3833-3837,1989)を使用するよりむしろ2C11-VII特異的プライマーをデザインした)。
VH2CllをプライマーVII2CllbaSfi,VH1FOR2で増幅し、Vk2CllをプライマーVk2CllbaLink5BstEII,Vk4FORNotで増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIおよびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI/NotI消化pUC119SfiNotmycの中にモル比3:3:1(VH:VL:pUC119SfiNotmyc)で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。同様に、VHおよびVLドメインのDNAをSfii/NotI消化pCANTAB6の中に結合し、そして同一の方法で大腸菌(E.coli)HB2151細胞の中に形質転換した。それぞれ、pUC119SfiNotmycまたはpCANTAB6中の組換え体のために2C11特異的プライマーVH2CllbaSfiおよびLBM3またはVH2CllbaSfiおよびfdSeqを使用して、組換え体を正しい大きさについてスクリーニングした。
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液をマウスT細胞系EL-4およびMD90(これはCD3抗原を発現する)を使用するFACSScanにおいて使用した。ダイアボディーはこれらの細胞系について親のダイアボディーと同一の特異性を示した。
FACS走査は次のようにして実施した:細胞系EL-4およびMD90(G.Grossら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 10024-10028,1989)を、標準の組織培養条件下に成長させた。約107細胞を収穫し、そしてPBS/1%BSA/0.05%NaN3で2回洗浄し、次いで少なくとも105細胞のアリコートで細胞ウェルプレートのウェルの中に分布させた。2C11/52価の抗CD3ダイアボディーを添加して100μlの最終体積とし、そして4℃において30分〜1時間結合させた。次いで細胞を1600rpmで2分間遠心し、そして上澄み液を吸引により除去した。次いで細胞を100μlのPBS/1%BSA/0.05%NaN3中のMab9E10(1:100に希釈した)の中に再懸濁させ、そして4℃において30分間結合させた。次いで細胞を1600rpmで2分間遠心することによって沈澱させ、そして上澄み液を吸引により除去した。次いで細胞を100μlのPBS/1%BSA/0.05%NaN3中の標識化Fab′2抗マウスF1TCO(1:128に希釈した、Sigmaから)の中に再懸濁させ、そして暗所で4℃において30分間結合させた。次いで細胞を1600rpmで2分間遠心することによって沈澱させ、そして上澄み液を吸引により除去した。次いで細胞を1mlのPBS/1%BSA/0.05%NaN3で2回洗浄し、そして5mlのファルコン(Falcon)管に1mlの最終体積で移し、そして直ちに分析した。蛍光活性化細胞の選別をベクトン-ディキンソン(Becton-Dickinson)-FACSScanで実施した。5アミノ酸のリンカーをもつ2C11抗CD3ダイアボディーのEL-4およびMD-90への結合は、細胞を9E10およびFab′2抗マウスFITC標識化試薬とインキュベーションするが、ダイアボディーとインキュベーションしない対照に比較して、より高い蛍光の読みへの細胞集団におけるシフトにより検出された。2C11ダイアボディーを使用するシフトと、商用FITC標識化抗マウスCD3IgG(Serotech)を使用して得られたシフトとを比較することによって、走査を目盛り定めした。2つの抗CD3試薬は匹敵するシフトを与えた。こうして、2C11/5ダイアボディーはEL-4およびMD-90細胞に効率よく結合する。
5アミノ酸のリンカーをもつ二重特異性抗イディオタイプ/抗CD3ダイアボディーB1/2C11/5の構成
2つの抗体特異性B1(抗-Id BCL-1)および2C11(抗マウスCD3)をダイアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを5残基のリンカーとファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLで融合した。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマー(Vk2CllbaLink5BstEII)の中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVk2CllbaLinkOBstEIIの5′に取り込まれた。AscI制限部位を、pclBリーダーおよびlacZリボソーム結合部位を含むVH2Cllの増幅に使用したプライマーLinkAscの中に導入した。これにより、VH-リンカーおよびリンカー-VL断片を3方結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングすることができた。
VH2CllをプライマーLinkAscおよびプライマー(実施例1に記載するような)で増幅し、Vk2CllをプライマーVk2CllbaLink5BstEII、プライマー1(実施例1に記載するような)で増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBacIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化した。ダイアボディーB1/5(実施例19参照)をBstEII/SacIで切断し、そしてVHおよびVLドメインのDNAをそれとモル比3:3:1(VH:VL:pUC119-B1/5)で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。プライマーLMB2およびLMB3使用して、組換え体を正しい大きさについてスクリーニングした。
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を前述したようにFACSScanにおいて使用し、そしてEL-4細胞に結合することが発見された。
Mab9E10-セファローズのカラム(myc標識を介するアフィニティー精製)による精製のために、発現を前述したように実施したが、ただし誘発後、細胞を22℃において26時間成長させた。引き続いて、細胞を8000rpm/10分/4℃において沈澱させ、そして上澄み液をFILTRONミニセッテ(実施例17参照)を使用して濾過および濃縮した。9E10セファローズのカラムから溶離されたアフィニティー精製された細胞は、IgBCL-1(実施例19に記載する方法を使用するELISAにより、そしてBCL細胞上のFACSScanにより決定して)およびマウスT細胞(マウスT細胞系EL-4およびMD90上のFACSScanにより決定して)に強くかつ特異的に結合した。
それゆえ、5アミノ酸のリンカーをもつ機能的二重特異性抗イディオタイプ(bcll)-抗CD3ダイアボディーが調製された。
生体外のBCL-1リンパ腫の溶解の刺激(細胞の架橋による)のためのモデル系においてMD90細胞系を使用して、このダイアボディーの活性を試験した。BCL-1リンパ腫細胞(Kris Thielemansにより供給された)を標的細胞として使用した;エフェクター細胞として、T細胞ハイブリドーマMD90を選択した(Zelig Esharにより供給された)。
6×106の標的細胞に150mCiの51Cr(Amersham)を37℃において1時間負荷させ、そしてPBSで5回洗浄して取り込まれなかった標識を除去した。次いで細胞をエフェクター細胞と比20/1,10/1および5/1で混合し、そして37℃において精製したダイアボディーの存在(30μg/ml)または不存在下に8時間インキュベーションした。培養上澄み液中のガンマ線をカウントすることによって、解放された51Crを決定した。
5:1のエフェクター:標的の比について、MD90細胞によるBCL-1リンパ腫細胞の20%の特異的殺し(上澄み液の中に解放された51Crにより測定して)がダイアボディーの存在下に得られ(ダイアボディーの不存在下に特異的殺しなし)、エフェクター細胞と一緒のダイアボディーの添加が標的細胞の殺しに導くことが示唆されてる。殺しの効率はエフェクター/標的の比が20:1におけるわずかの殺しから5:1における20%の殺しに増加し、これはMD90細胞系について典型的であることが知られているパターンである。
実施例19  2価の抗イディオタイプ(抗bcll)ダイアボディーの調製および特性決定
B1はリンパ腫BCL-1の表面1gに対して抗イディオタイプであるネズミモノクローナル抗体である(J.Brissinckら、J.Immunol.147 4019-4026,1991)。それはダイアボディーのフォーマットで5残基のリンカーを使用してファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で向きVH-GGGGS-VLでクローニングされた(Clackson,Nature)。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマー(VlBlbaLink5BstEII)の中に組み込み、そしてこのプライマーはまたVKの開始においてSacI制限部位を導入する。BstEIIの制限部位はプライマーVlBlbaLink5BstEIIの5′およびまたVHlFOR-2の3′末端に取り込まれた。SfiI制限部位をVHの5′末端の増幅に使用したプライマーVHBlSfibaの中に導入した。NotI制限部位をVKの3′末端の増幅に使用したプライマー混合物Vk4foNotI(Clackson,Nature)の中に導入した。これにより、VIIおよびリンカー-VL断片を3方結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングすることができた。
VHBlをプライマーVIIBlbaSfi,VHlBlfo-2で増幅し、VLBlをプライマーVlBlbaLink5BstEII,Vk4foNotI(これらの両方はKris Thielemans教授(Vrije Universiteit Brussel)により供給されるscFvクローンからのものであった)で増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIおよびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI/NotI消化pUC119SfiNotmycの中にモル比3:3:1(VH:VL:pUC119SfiNotmyc)で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。また、VHおよびVLドメインのDNAをpCANTAB6第20図の中に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)HB2151細胞を形質転換した。それぞれ、pUC119SfiNotmycおよびpCANTAB6クローンのためにB1特異的VHBlbaSfiおよびLMB2またはVHBlbaSfiおよびfdScqを使用して、組換え体を正しい大きさについてスクリーニングした。
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を下に概説するプロトコールを使用するELISAにおいて使用した。
50μlの周辺質上澄み液+50μlの3%BSA/PBSをBCL-1 Ig(PBS中の10μg/ml;Kris Thielemans博士)で被覆したELISAウェルに添加し、そして3%BSA/PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い(H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.19,4133-4137,1991),モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検出を使用した。10分後、両方の抗原についてのELISAの読みは1.0より大きかった。
B1/5ダイアボディーをpCANTAB6クローンから発現された周辺質調製物からの固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)により製造業者のプロトコール(Daigen)を使用して精製した。得られた物質はELISA上のBCL-1抗原に結合した。
両方の周辺質画分およびIMAC精製したB1/5ダイアボディーは、実施例18に記載する、FACS走査によりBCL-1リンパ腫細胞に結合することが発見された。リンパ腫へのB1/5ダイアボディーの結合は、より高い蛍光の読みへの細胞集団におけるシフトにより検出された。
このような2価の抗イディオタイプダイアボディーは、細胞表面の抗原を架橋し、レセプターを誘発しそして、また、アポプトーシスを誘発するために有用であることを証明できる。同一細胞の表面上の抗原を架橋する二重特異性ダイアボディーを、同様に、使用することができる。小さい大きさのダイアボディーは同一細胞上の抗原を架橋するためにとくに有用であることがある。
実施例20  二重特異性抗HIVgp120のV3ループ-抗ヒトFcRlダイアボディーの調整および特性決定
F58はHIV3Bgp120のV3ループに結合するマウスモノクローナル抗体である。(PCT/GB92/01755参照)。それはファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中でscFv断片としてクローニングされた。
二重特異性ダイアボディー022/F58/0の構成
2つの抗体の特異性022(抗ヒトFcRl)およびF58(抗IIIV3Bgp120のV3ループ)を二重特異性ダイアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを直接0リンカーと向きVH-VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で融合した。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマーVkba-SacLinkOBstEIIの中に組み込み、そしてVHの3′末端の増幅に使用したVHlfo-BstEIILinkOSacの中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマーVkba-SacLink5BstEIIのリンカー配列の5′に取り込まれ、そしてSacI制限部位はプライマーVHlfo-BstEIILink5Sacの5′に組み込まれた。これにより、アセンブリングされたVH-リンカーおよびリンカー-VL断片は3方結合反応において発現ベクターpUC119022/5BstEII/SacIの中にクローニングすることができた。
VHF58をプライマーVHlfo-2およびVHlbaで増幅し、VkF58 DNAをプライマーVk4foおよびVk2baで増幅した。gIIIリーダーを含む遺伝子間領域N2(実施例1)をプライマーNterVHfoおよびCterVkbaで増幅した。3断片をゲル精製し、次いで標準の条件下にPCRアセンブリングし、そしてアセンブリー生成物をゲル精製しそしてプライマーVkba-SacLink5BstEIIおよびVHlfo-BstEIILink5Sacで増幅した。
PCR反応の最終生成物を制限酵素SacIおよびBstEIIで消化した。pCantab6の組換えダイアボディー022/5(実施例17参照)をBstEII/SacIで消化して022/5ベクター構成体を生成し、そしてVHF58をアセンブリングし、そしてVHF58 DNA断片をそれとモル比3:1(VLN2VH:pCantab6-022/5)で結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)HB2151細胞を形質転換した。プライマーLMB3およびfdSeqを使用する組換え体コロニーのPCR増幅により、組換え体を正しい大きさインサートについてスクリーニングした。
発現およびアッセイ
ELISAによる分析のために、可溶性ダイアボディーの周辺質調製物を作った。可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBSの中に再懸濁させ、そして10分間あるいは細胞懸濁液は半透明となるまで、超音波処理した。超音波処理した細胞懸濁液遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液をELISAにおいて使用した。
二重特異性ダイアボディーのアッセイのために、ELISAを実施例17に記載するようにFcγRIレセプターについて実施し、そしてHIVgp120のV3ループの抗体について、次のプロトコールを使用した。50μlの周辺質上澄み液+50μlの3%BSA/PBSをgp120(PBS中の50ng/ml)で被覆したELISAウェルに添加し、そして3%BSA/PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い(H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.19,4133-4137,1991)、モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgGを使用するmyc標識の検出を使用した。両方の抗原についての陽性のELISAが得られた(10分後、1.0より大きい)。
022/F58/0ダイアボディーの精製
精製したダイアボディーを作るために、可溶性ダイアボディーを、実施例3に記載するように、IPTG誘発細胞中の成長により発現させ、そしてダイアボディーを培養上澄み液から精製した。製造業者のインストラクションに従い「キアゲン(Qiagen)」ニッケルNTAアガロース(カタログNo.30210)を使用する固定化金属アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)により、精製を実施した。
精製したタンパク質は両方のHIV3Bgp120およびHuFcRlに強くかつ特異的に結合した(ELISAにより決定して)。
実施例21  二重特異性抗2-フェニルオキサゾル-5-オン、抗マウスラムダ軽鎖ダイアボディーの調製および特性決定
ハイブリドーマNQ11(抗マウス(実施例1参照)から誘導された2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられた抗体をエンコードするDNAから、およびマウスラムダ軽鎖に対して向けられたハイブリドーマLS136から誘導されたDNAから、本質的に実施例1に記載されている方法に従い、2-フェニルオキサゾル-5-オンおよびゼロアミノ酸のリンカーをもつマウスλ軽鎖に対して向けられた二重特異性ダイアボディーをエンコードするクローンを調製した。マウスラムダ軽鎖に対して向けられた2価の抗体を中間工程として調製した。
LS136はマウス抗体λ軽鎖に対して向けられたネズミハイブリドーマである。それはダイアボディーのフォーマットで5残基のリンカーを使用して向きVH-GGGGS-VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中でクローニングされた。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマー(VkCbaLink5BstEIIおよびプライマー4(表1))の中に組み込んだ。プライマー4は、また、VKの5′末端にSacI制限部位を導入する。BstEIIの制限部位はプライマーVkCbaLink5BstEIIおよびプライマー4のリンカー配列の5′および、また、VHlFOR2-の3′末端に取り込まれた(E.S.Ward,D.Gussow,A.D.Griffiths,P.T.JonesおよびG.Winter,Nature 341,544-546,1989)。これにより、VHおよびリンカー-VL断片を3方結合反応において発現ベクターpUC119SfiNotmycの中にクローニングすることができた。
RNAをLS136ハイブリドーマから抽出し、そしてcDNAの調製に使用した。LS136のVHおよびVLドメインのDNAを、PCRによりcDNAから、それぞれ、プライマーの対VH3AbaおよびVHlFOR-2、およびVkCbaおよびVK4FOR(T.Clackson,H.R.Hoogenboom,A.D.GriffithsおよびG.Winter,Nature 352,624-628,1991)を使用して標準の条件下に増幅し、そしてVH3AbaSfiおよびVHlfo-2(VHについて)およびプライマー4(PNAS論文に記載されているように)およびVk4foNotI(Vkについて)を使用することによって再増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素SfiIおよびBstEIIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素NotIおよびBstEIIで消化した。VHおよびVLドメインのDNAをSfiI/NotI消化pUC119SfiNotmycの中にモル比3:3:1(VH:VL:pUC119SfiNotmycまたはpCantab6)で同時に結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。また、VHおよびVLドメインのDNAをSfiI/NotI消化pCANTAB6ベクター(第20図)の中に同一の方法で結合し、そして大腸菌(E.coli)HB2151細胞の中に形質転換した。ベクターpUC119SfiNotmyc中の組換え体についてプライマーLMB2およびLMB3を使用するか、あるいはpCANTAB6中の組換え体のためにLMB3およびfdSeqを使用して、組換え体を正しい大きさについてスクリーニングした。
LS136ダイアボディーの発現
可溶性ダイアボディーを37℃におけるpUC119SfiNotmycクローンの成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を下のようにELISAにおいて使用した。
50μlの周辺質上澄み液および50μlの3%BSA/PBSをマウスIgM1またはマウスIgG2a1(両方共Sigmaから)(PBS中の10μg/mlで被覆したELISAウェルに添加し、3%BSA/PBSでブロックした。標準のELISAのプロトコールに従い(H.R.Hoogenboomら、Nucl.Acids Res.19,4133-4137,1991)、モノクローナル抗体9E10、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスIgG(IgMλについて)、および抗マウスk鎖およびペルオキシダーゼ-ビオチン-ストレプトアビジン複合体(両方共Amersham)(IgG2aλについて)を使用するmyc標識の検出を使用した。ELISAの読みは1.0より大きかった。
二重特異性ダイアボディーLS136/NQ11/5および二重特異性ダイアボディーLS136/NQ11/0の構成
2つの抗体の特異性LS136(抗マウス1抗体軽鎖)およびNQ11(抗phOx)を二重特異性ダイアボディーのフォーマットで組み合わせて、VHおよびVLを5アミノ酸のリンカーVH-GGGGS-VLと、あるいは直接0リンカーと向きVH--VLでファージミドベクターpUC119SfiNotmyc中で融合した。リンカー配列をVKの5′末端の増幅に使用したプライマー4および5(表1)の中に、およびVHの3′末端の増幅に使用したプライマー7および8(表1)の中に組み込んだ。BstEIIの制限部位はプライマー5のリンカー配列の5′に取り込まれ、そしてSacI制限部位はプライマー8のリンカー配列の5′に取り込まれた。これにより、アセンブリングされたVH-リンカーおよびリンカー-VL断片は3方結合反応において発現ベクターpUC119LS136/5BstEII/SacIの中にクローニングすることができた。
二重特異性ダイアボディーLS136/NQ11/5(5アミノ酸のリンカー)の構成
VHNQ11をプライマー2および6(表1)で増幅し、VkNQ11をプライマー1および4で鋳型としてfdDOG-1の中にクローニングされたscFvNQ11を使用して増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびSacIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化した。ダイアボディーLS136/5のベクター断片(上を参照)をBstEII/SacIで切断し、そしてVHおよびVLドメインのDNAをそれとモル比(3:3:1)(VH:VL:pUC119-LS136/5)で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。組換え体コロニーのPCR増幅のためにプライマーLMB2およびLMB3を使用して、組換え体を正しい大きさインサートについてスクリーニングした。
二重特異性ダイアボディーLS136/NQ11/0(0アミノ酸のリンカー)の構成
VHNQ11をプライマー2および8(表1)で増幅し、VkNQ11をプライマー1および5で鋳型としてfdDOG-1の中にクローニングされたscFvNQ11を使用して増幅した。VH PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびSacIで消化し、そしてVL PCR反応の生成物を制限酵素AscIおよびBstEIIで消化した。ダイアボディーLS136/5のベクター断片(上を参照)をBstEII/SacIで切断し、そしてVHおよびVLドメインのDNAをそれとモル比(3:3:1)(VH:VL:pCU119-LS136/5)で同時に結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。組換え体コロニーのPCR増幅のためにプライマーLMB2およびLMB3を使用して、組換え体を正しい大きさインサートについてスクリーニングした。
二重特異性ダイアボディーLS136/NQ11/5および二重特異性ダイアボディーLS136/NQ11/0の発現
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1%グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を下のようにELISAにおいて上のようにλ軽鎖について、あるいは実施例1におけるようにphOxについて使用した。10分後のELISAの読みは1.0より大きかった。これはダイアボディー調製物が両方の結合部位を含有することを示す。
抗体におよびまた他の抗原、例えば、腫瘍細胞のマーカーに結合するこのようなダイアボディーは、腫瘍部位に対する抗体のエフェクター機能を漸増するために有用であろう。
実施例22  NQ11/B1.8 OX/NIPダイアボディーの2つのVHドメインの間の界面における残基の突然変異誘発
前述したように、わわわれは(VH-VL)D1.3ダイアボディーのモデルを検査しそして、その構成および共同的性質を実施例3および4に記載した、NQ11/B1.8ダイアボディーにおける共同性および安定性の調節のために修飾すべきVHドメインの間の界面における残基を選択した。
界面は種々の目的で修飾された:
(i)イオン結合の導入:
突然変異B1.8 T86Kにおいて、B1.8 VHドメインの残基86はスレオニンからリジンに変換されて、NQ11 VHドメインのAsp88とイオン結合を形成する可能性を与えられた。
突然変異NQ11 K43Eにおいて、NQ11 VHドメインの残基86はグルタミン酸に変換されて、B1.8 VHドメインのリジン43とイオン結合を形成する可能性を与えられた。
(ii)ジスルファイド架橋の導入:
突然変異NQ11 K43C B1.8 R43Cにおいて、NQ11 VHドメインの残基43はシステインに変換されて、2つのドメインの残基43の間でジスルファイド架橋を形成する可能性を与えられた。
(iii)水素結合の数の増加:
突然変異NQ11 R86Qにおいて、NQ11 VHドメインの残基86はアルギニンからグルタミンに変換されて、それ以上の水素結合のための可能性を与えられた。
(iv)疎水性相互作用の数の増加:
突然変異NQ11 K43L B1.8 R43Iにおいて、NQ11 VHドメインのリジン43はロイシンに変換され、そしてB1.8 VHドメインのアルギニン43はイソロイシンに変換されて、2つのVHドメインの間の界面における疎水性パッキングのための可能性を与えられた。
(v)反発相互作用の数の増加:
突然変異B1.8 T86Eにおいて、B1.8 VHドメインのスレオニン86はグルタミンに変換されて、NQ11 VHドメインのアスパルテート88との反発相互作用のための可能性を与えられた。
突然変異誘発反応
実施例3に記載したNQ11/B1.8 Ox/NIPダイアボディーをHindIIIおよびEcoRIで消化し、そしてHindIIIおよびEcoRIで切断したファージミドベクターpBluescript II KS-(Stratagene)の中にサブクローニングした。M13K07でレスキュー後に一本鎖DNAを調製し、そして生体外の突然変異誘発を実施した(Amersham)。次の突然変異原性オリゴヌクレオチドを使用した:
突然変異B1.8 T86Kについて、オリゴヌクレオチドT86K(表1);
突然変異NQ11 K43Eについて、オリゴヌクレオチドK43E;
突然変異NQ11 K43C B1.8 R43Cについて、2つのオリゴヌクレオチドを使用した;
K43CおよびR43C;
突然変異NQ11 R86Qについて、およびR86Q;
突然変異NQ11 K43L B1.8 R43Iについて、2つのオリゴヌクレオチドを使用した;
K43LおよびR43I;
突然変異B1.8 T86Eについて、オリゴヌクレオチドT86E。
PCRにより調製した鋳型上でTaqDNAポリメラーゼ(Boehringer)を使用するサイクル配列決定により、突然変異誘発手順により発生したコロニーを突然変異の存在について分析した。突然変異のコロニーを同定した。次いで発現を異なる温度において測定し、そして両方の抗原への結合を種々の条件下にELISAおよびBIAコア分析により研究することができる。ダイアボディーの安定性およびアロステリック結合物質(実施例4参照)への突然変異の効果は決定されるであろう。
実施例23  鎖を架橋するジスルファイド架橋を導入するための軽鎖のC-末端にシステインをもつ2-フェニルオキサゾル-5-オンに対して向けられたNQ11ダイアボディーの構成および特性決定
この実施例において、5アミノ酸のリンカーをもつVLドメインに対してN-末端のVHドメインをもつフォーマットで、2-フェニルオキサゾル-5-オン(phOx)に対して向けられた2価のNQ11ダイアボディーの中にジスルファイド架橋を導入する。VLドメインのC-末端に取り込まれたシステイン残基の間に、ジスルファイド架橋を形成する。このC-末端領域はダイアボディーのモデルにおいて比較的拘束されない。2つのC-末端はダイアボディーのモデルにおいて密接しているように思われる。この実験の目的は、ジスルファイド架橋をこれらのC-末端の間に形成できることと確立することであった。
この実施例において作った構成体は、C-末端のLys-Arg配列の直ぐ後のVL鎖のC-末端にシステイン残基を組み込んだ。構成体I(5残基のリンカー)の鋳型上にPCRプライマー10(これはダイアボディー分子をエンコードするDNAに対して5′をプライミングする)および11(これは3′末端においてプライミングしそしてシステインのコドンを組み込む)を使用するPCRを実施することによって、システム残基をVLドメインのC-末端に挿入した。PCR断片を制限酵素PstIおよびNotIで消化し、そしてファージミド発現ベクター(pUC119SfiNotpolymyc)の中にクローニングした。こうして発生したダイアボディーは、phOx-BSA被覆プレート上のELISAにおける陽性のシグナルにより示されるようにphOx-BSAに結合した(実施例1におけるように実施した)。
phOx-BSA-セファローズ上のアフィニティクロマトグラフィー(T.Clacksonら、Nature 352 624-628,1991)を使用して2価のダイアボディーを精製し、そして還元性または非還元性条件下のSDS-ポリアクリルアミドの電気泳動により精製したタンパク質を分析することによって、ジスルファイド架橋の存在が確立された。C末端のシステインを持たない親のNQ11ダイアボディーは、両方の還元性および非還元性条件下に25000ダルトンの分子量で移動する。還元性条件下に、C末端のシステインをもつNQ11ダイアボディーは25000ダルトンの分子量で移動するが、非還元性条件下ではタンパク質の約30〜50%が50000ダルトンの分子量で移動し、タンパク質のこの比率が鎖の間の共有結合のジスルファイド架橋を形成したことを示す。アフィニティクロマトグラフィーで非連鎖ダイアボディーと共精製されたジスルファイド連鎖されたダイアボディーは、ジスルファイド連鎖されたダイアボディーがphOx-BSAに結合できるに違いないことを示す。
実施例24  ダイアボディー分子の構成における自己スプライシングイントロンの使用
この実施例において記載する研究において、それぞれ、2-フェニルオキサゾル-5-オンおよび雌鶏卵リゾチームに対して向けられたダイアボディーのフォーマット、NQ11およびD1.3においてクローニングされた2つの抗体のVHおよびVLドメインの間に、自己スプライシングイントロンを導入した。この自己スプライシングイントロンは、機能的2価のダイアボディーの発現により決定して、発現後にスプライスアウトされることが示された。
切除して2価のダイアボディーのVHおよびVLドメインの間に5アミノ酸のリンカーを残す、自己スプライシングイントロンを含有するNQ11およびD1.3クローンの構成
テトラヒメナ(Tetrahymena)からの自己スプライシングイントロン(T.R.Cech,Ann.Rev.Biochem.59 543-568,1990)は、大腸菌(E.coli)細胞質中でスプライスすることができることが示された。スプライシングアウトのときリンカーVH-GLSSG-VLをもつダイアボディーをエンコードするオープンリーディングフレームをつくるような方法において、抗体D1.3およびNQ11のVHおよびVLドメインをエンコードする遺伝子の間に、クローンIEI10(Ian Eperon、レイセスター大学)からのこのような自己スプライシングイントロンを挿入した。スプライシングしないと、自己スプライシングイントロンは3リーディングフレームの中にいくつかの停止コドンを含有するので、機能的ダイアボディーを生成することができない。
EstEIIのための制限部位をプライマーTlbaBstEIIの5′末端に組み込み、そしてSacI制限部位をプライマーTlfoSacの中に導入した。これにより、自己スプライシングイントロン断片は2方結合反応において発現ベクターpUC119D1.3(D1.3抗リゾチーム抗体のVドメインをエンコードする)またはpUC19NQ11(抗phOx抗体NQ11のVドメインをエンコードする)(各々はBstEIIおよびSacIで切断された)の中にクローニングすることができた。
TlbaBstEIIは自己スプライシングイントロンの5′末端においてプライミングし、そしてスプライシング活性のために要求される内部誘導配列(IGS)を保存しそして余分のグリシン残基をVHドメインの3′末端に挿入する。TlfoSacは自己スプライシングイントロンの3′末端においてプライミングしそして、イントロンの一部分ではないが、テトラヒメナ(Tetrahymena)DNAの中に存在する自己スプライシングイントロンのちょうど3′にチミジン塩基を保存する。TlfoSacは余分のGlyおよびSer残基をVLの5′末端に挿入して5アミノ酸のリンカーをつくる。
自己スプライシングイントロンをプライマーTlbaBstEIIおよびTlfoSacで標準の条件下に増幅した(実施例14におけるように)。PCR反応の生成物を制限酵素SacIおよびBstEIIで消化し、そしてBstEII/SacI消化pUC119D1.3またはpUC19NQ11の中にモル比4:1(SS1:pUC119D1.3またはpUC19NQ11)で結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。自己スプライシングイントロンに対して特異性のプライマー、TlfoSacおよびTlbaBstEIIを使用して、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。
可溶性ダイアボディーを37℃における成長により発現させた。2mlの2YT/0.1％グルコース/100μg/mlアンピシリン中の対数期の成長の細胞を1mMのIPTGの最終濃度へのIPTGの添加により誘発し、そして22℃において3時間成長させた。細胞を遠心(1000g,10分)し、そして細胞のペレットを100μlの氷冷PBS/1mM EDTAの中に再懸濁させ、そして氷上に60分間放置した。細胞懸濁液を遠心(1000g,10分)し、そしてダイアボディーを含有する上澄み液を実施例1に記載するようにリゾチームおよびphOx上のELISAにおいて使用した。
ELISAシグナルはスプライシングした5アミノ酸のリンカーのD1.3ダイアボディーについて、5アミノ酸のリンカーのD1.3ダイアボディーで得られたものに同等であった(10分後1.0より大きい)。しかしながら、スプライシングした5アミノ酸のリンカーのNQ11ダイアボディーについて、実施例1において構成した5アミノ酸のリンカーのダイアボディーと比較したとき、このシグナルは非常に低かった(20分後の2.0に比較して0.2)。これについて2つの可能な説明が存在する;-NQ11ダイアボディーはGLSSGリンカー配列で機能的ではないが、これはありそうに思われない;-イントロンの3′(VLドメインの5′における)のDNA配列は自己スプライシングのために適当ではないので、自己スプライシングはダイアボディーNQ11の場合において適切に働かない。VLドメイン遺伝子の5′末端におけるD1.3配列は自己スプライシングを可能とするとき効率よいが、この領域におけるNQ11配列は劣る。
切除して2価のダイアボディーのVHおよびVLドメインの間に6アミノ酸のリンカーを残す、loxP部位を含む自己スプライシングイントロンを含有するNQ11およびD1.3クローンの構成
RNAレベルで効率よい自己スプライシングを可能とする自己スプライシングの3′にNQ11構成体の配列を導入するように、プライマーTlba2BstEIIおよびTlfo2Sacをデザインした。
自己スプライシングイントロンをPCRによりTlba2BstEIIおよびTlfo2Sacで増幅した。このイントロンは抗体NQ11のVHおよびVLドメインの遺伝子の間に挿入されそして、スプライスアウトのとき、リンカーVH-GSLKVG-VLをもつダイアボディーをエンコードするオープンリーディングフレームをつくる。スプライシングしないと、自己スプライシングイントロンは3リーディングフレームの中にいくつかの停止コドンを含有するので、機能的ダイアボディーを生成することができない。
BstEIIのための制限部位をプライマーTlba2BstEIIの5′末端に組み込み、そしてSacI制限部位をプライマーTlfo2Sacの中に導入した。これにより、自己スプライシングイントロン断片は2方結合反応においてBstEIIおよびSacIで切断された発現ベクターpUC19NQ11の中にクローニングすることができた。TlbaBstEIIは自己スプライシングイントロンの5′末端においてプライミングし、そしてスプライシング活性のために要求される内部誘導配列(IGS)を保存しそして余分のグリシン残基をVHドメインの3′末端に挿入する。TlfoSacは自己スプライシングイントロンの3′末端においてプライミングしそして、イントロンの一部分ではないが、テトラヒメナ(Tetrahymena)DNAの中に存在する自己スプライシングイントロンのちょうど3′にチミジン塩基を保存し、そして余分のGlyおよびSer残基をVLドメインのN-末端に挿入する。
この場合において使用した自己スプライシングイントロンはbp236と237との間にloxP部位を含有した。それをプライマーTlba2BstEIIおよびTlfo2Sacで標準の条件下に増幅した。PCR反応の生成物を制限酵素SacIおよびBstEIIで消化し、そしてBstEII/SacI消化pUC19NQ11の中にモル比4:1(SS1:pUC19NQ11)で結合し、そして生ずる結合混合物を使用して大腸菌(E.coli)TG1細胞を形質転換した。自己スプライシングイントロンに対して特異性のプライマー、TlfoSacおよびTlbaBstEIIを使用して、組換え体を正しい大きさのインサートについてスクリーニングした。
可溶性ダイアボディーを上のように発現させ、そしてELISAによりアッセイした。この場合において、同等のシグナル(10分後に1.0より大きい)が、実施例1において構成した5アミノ酸のリンカーのダイアボディーについてのように、自己スプライシングにより形成された6アミノ酸のリンカーのNQ11ダイアボディーについて得られた。こうして、この戦略はNQ11構成体におけるいっそう効率よい自己スプライシングを可能とする。
実施例25  メタロチオネインとの融合体を含有するダイアボディー分子の構成および特性決定
腫瘍を像形成するために、メタロチオネインペプチドをVHおよびVLドメインの間のリンカーの一部分として、あるいはVLドメインのC末端における延長として組み込むことができる。次いで、これはメタロチオネインペプチドによりキレートされた放射性金属イオンを導入することによって標識化することができる。
メタロチオネインペプチドをダイアボディーのVHおよびVLドメインの間のリンカーの一部分として組み込む場合、scFvよりむしろダイアボディーの形成はなお可能であろう。(より長いリンカーは通常scFvの形成に好適であろう。)リンカー配列の中にシステインを組み込んでリンカー内にジスルファイド架橋を与えることは、同一鎖からのVHおよびVLドメインの対合を促進してダイアボディーの形成に好適とすることができる。
これを研究するために、メタロチオネイン配列をダイアボディーのフォーマットにおいて抗体のVドメインの間のリンカーとして使用した。メタロチオネイン配列を2つのペプチドA:GGGDPNCSCAAGDSCTCAGGSおよびb:GGGGSCKCKECKCTSCKGGSGにスプリットし、下線の配列をスペーサーとして導入した(有効リンカー長さ21アミノ酸)。二重特異性ダイアボディーをフォーマット鎖1:VHNQ11-A-VkD1.3、鎖2:VHD1.3-B-VkNQ11、後者の鎖は、また、C-末端のc-myc標識を有する。メタロチオネインペプチドの各々の1つを各鎖のC-末端にもつNQ11/D1.3ゼロリンカーのダイアボディーを使用して、第2二重特異性ダイアボディーを構成した。両方の構成体は発現され、そしてHEL-セファローズで精製後2-フェニル-5-オキサゾロンで誘導したリゾチームおよびBSAの両方に結合することが証明され(実施例1)、リンカーの中にシステイン残基をもつ構成体は二重特異性ダイアボディーとしてフォルディングすることができることを示す。
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図面に対する追加の記号解
第6図:
垂直の矢印は制限部位を示す。
x-scFvリンカー
y-10残基のリンカー
z-5残基のリンカー
A-PCRアセンブリーを経るクローニング
B-制限部位を経るクローニング
第10図:
垂直の矢印は制限部位を示す。
x-scFvリンカー
y-ダイアボディーのリンカー結合(0〜10残基)
1-PCR
2-PCRアセンブリーおよび制限消化後のクローニング
3-制限部位を経るクローニング
ルートA-ダイアボディー断片としてバインダーを選択する、最初のレパートリーは1つの一定の特異性(C)を有する。
ルートB-二重特異性ダイアボディーのレパートリーを直接構成する。
ルートC-svFv断片としてバインダーを選択する。
第8図:
1-標準のクローニング
2-loxP制限部位を経るCre仲介生体内組換え
3-RNAの自己スプライシング
x-loxP認識部位
y-認識部位のスプライス(いくつかの部分はダイアボディーのリンカー配列を形成するであろう)
z-自己スプライシングイントロン(クラスI)
A-VH遺伝子のレパートリー
B-VL遺伝子のレパートリー
C-VHおよびVL遺伝子の大きいレパートリー
D-ダイアボディーのレパートリー(RNA)
第9図:
IおよびII-scFv断片および2価の断片
III,IVおよびV-構成体のためのベクター
VI-二重特異性断片
VII-3鎖の断片
第10図:
グラフは時間(秒)に対する相対的応答(RU)である。
第11図:
グラフは分離1n(R1/Rt)/時間である。分離速度曲線は表面上の3000ruから開始する。見掛けのkoff(0〜21秒);
s1:0.0045,s2:0.0047,s3:0.0069,s4:0.0071
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第16図:
1μMのNIPの存在および不存在におけるBSA-Ox表面に対するB1.8/NQ11ダイアボディーのBIAコア分析。グラフはμM抗体に対するReqを示す。
x-対照
y+1μMのNIP
第17図:
表面2への結合のスキャッチャード分析。グラフはReq/μMに対するReqである。
A-対照。y=-0.275x+510.444r2=0.977 Kd=275nM Rmax=510RU
B-+1μMのNIP y=-0.425x+461.316 r2=0.992 kd=425nM Rmax=461RU
第18図:
表面3への結合のスキャッチャード分析。グラフはReq/μMに対するReqである。
A-対照。y=-0.275x+355.052 r2=0.951 Kd=275nM Rmax=355RU
B-+1μMのNIP y=-0.418x+348.166 r2=0.968 kd=418nM Rmax=348RU
第31図:
x-CBM-1 1μM/ml
y-CBM-1 10ng/ml
z-w/o CBM-1
第33図:
二重特異性レパートリーのクローニング(実施例14)
1-pUC逆およびLFRBS-2を使用するPCRアセンブリー
2-KspIによる切断、結合
3-pUC逆およびXhoTagを使用するPCR
4-XhoIによる切断、結合
5-BioGene3Leadおよびfd-tet-seq24を使用するPCR
6-pCANTAB5mycファージミドベクターの中にSfiI-NotI断片としてクローニングして二重特異性ダイアボディーのレパートリーを生成する。
第34図:
レパートリー:
プレート1,4および7-未選択クローンからのファージ
プレート2,5および8-phOx-BSA上で選択したクローンからのファージ
プレート3,6および9-phOx-BSA上で選択した可溶性ダイアボディー
ELISA:
プレート1,2および3-Dig-BSA
プレート4,5および6-phOx-BSA
プレート7,8および9-BSA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３２ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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