(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子のｍＲＮＡ中に存在し、ヒトの他のｍＲＮＡ中の塩基配列と相同性を有さない塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ２＋結合ポケットを形成するＭｇ２＋結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備えたヘテロダイマーからなり、活性型における左右センサーアーム配列の分岐点が前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部位から４塩基以内に位置する種々の候補マキシザイムを作製し、その特異性及び切断活性を測定・評価することを特徴とする悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法。
【請求項２】
悪性腫瘍細胞が、白血病細胞であることを特徴とする請求項１記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法。
【請求項３】
白血病細胞が、急性前骨髄球性白血病細胞であることを特徴とする請求項２記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法。
【請求項４】
急性前骨髄球性白血病細胞において特異的に発現する融合遺伝子が、
ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子であることを特徴とする請求項３記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法。
【請求項５】
候補マキシザイムが、活性型における左右センサーアーム配列の分岐点が前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部位から２塩基以内に位置することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法。
【請求項６】
候補マキシザイムが、配列ＣＵＧＡＮＧＡ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ）と配列ＧＡＡＡを含むＭｇ２＋結合ポケット周囲配列を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーからなることを特徴とするマキシザイム。
（ａ）  配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）  配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、ｍＲＮＡ切断酵素活性を有するＲＮＡ
（ｃ）  配列番号２に示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｄ）  配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）又は（ｂ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、ｍＲＮＡ切断酵素活性を有するＲＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とからなることを特徴とするマキシザイム。
（ａ）  配列番号３に示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）  配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、酵素活性を有するＲＮＡ
（ｃ）  配列番号４に示される塩基配列からなるＲＮＡ
（ｄ）  配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）又は（ｂ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、ｍＲＮＡ切断酵素活性を有するＲＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８記載のマキシザイムに、ポリＡ及び／又はキャップ構造を付加することを特徴とする安定化マキシザイム。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか記載のマキシザイムを発現することができるベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、悪性腫瘍細胞、特に急性前骨髄球性白血病細胞において特異的に発現する融合遺伝子に対して特異的切断活性を有するマキシザイム及びかかるマキシザイムのスクリーニング方法、並びにかかるマキシザイムの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の一亜種で、我国でＡＭＬの約１５％、日本全体で約５００人／年の割合で発症すると推測されている。ＡＰＬはＡＭＬの中でＦＡＢ分類上Ｍ３とされ、細胞形態的に多数の粗大顆粒と異形成の強い核を有し、束状のアウエル小体（Ｆａｇｇｏｔ）を認めることが多いが、一部の症例では顆粒が繊細で変異型が認められている。ペルオキシダーゼ、アセテートエステラーゼ強陽性、ＣＤ３３（＋）、ＣＤ１３（＋）、ＨＬＡ−ＤＲ（−）であり、骨髄系細胞分化過程において前骨髄球レベルで分化の停止した腫瘍と考えられている。細胞遺伝学的にはｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１１）が８０％以上の症例において認められ、逆にこの転座はＡＰＬ以外では認められていない。
【０００３】
ＡＰＬに特徴的なｔ（１５；１７）は１５番染色体上のＰＭＬ遺伝子と１７番染色体上のＲＡＲ（レチノイン酸受容体）α遺伝子間の転座である。転座切断部位は主に、ＲＡＲα遺伝子イントロン２とＰＭＬ遺伝子イントロン３ないし６である。いずれの場合も、ｄｅｒ（１５）上でＰＭＬ／ＲＡＲαキメラ遺伝子が生じ、キメラ蛋白１１０ｋＤ（ロングフォーム）ないし９０ｋＤ（ショートフォーム）が産生される。このキメラ蛋白は、ＤＮＡ結合ドメインとダイマー形成部を有し、しかもレチノイン酸結合部を持っている蛋白で、ＰＭＬやＲＸＲとヘテロダイマーを形成し、おそらくＰＭＬやＲＸＲが有する一連の核内転写因子機能を阻止し、骨随系細胞の分化をブロックし、細胞増殖のみを促進させる（ドミナントネガティブ作用）。またＰＭＬ−ＲＡＲαはホモダイマーを形成し独自の転写因子として働く可能性もあり、ドミナント変異としての性格も有すると考えられている。
【０００４】
ＰＭＬ／ＲＡＲα遺伝子産生トランスジェニックマウスを使った最近の研究により、このキメラ蛋白質がＡＰＬの白血病誘発において重要な役割を担うことが明らかにされている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，５３０２−５３０７，１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ８９，３７６−３８７，１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，２５５１−２５５６，１９９８）。上記ＡＰＬ患者にとって非常に効果的な薬品として、白血病細胞の分化誘導に対して効能を有するオールトランス型レチノイン酸（オールトランスＲＡ）が知られている（Ｂｌｏｏｄ  ７２，５６７−５７２，１９８８）。しかし、オールトランスＲＡだけで治療した患者の寛解は通常短期間しか持続しない。また、かかる患者にはしばしばＲＡ耐性疾患にかかることがあり、その結果細胞分化誘導治療の障害になるという深刻な問題がある（Ｂｌｏｏｄ  ８２，１９４１−１９５３，１９９３）。したがって、ＡＰＬ細胞によるＲＡ耐性を克服する治療法は未だ確立されていない。
【０００５】
一方、位置指定ハンマーヘッドリボザイムを用いた腫瘍形成ＰＭＬ／ＲＡＲαｍＲＮＡのターゲッティングは、ＡＰＬのＲＡ耐性を克服するアプローチの１つとして期待されている。ハンマーヘッドリボザイムは、オリゴヌクレオチドの特定部位ＮＵＸ（Ｎ＝いかなるリボヌクレオチドでも可、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）でＰＭＬ／ＲＡＲαを切断することができる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４，  ３６４９−３６５４，  １９９５）が、この特定部位は上記融合遺伝子の切断点により得られるＲＡＲα蛋白質側に存在しているため、ＰＭＬ／ＲＡＲαに対するハンマーヘッドリボザイムは、野生型ＲＡＲα  ｍＲＮＡも、ＡＰＬ特異的ＰＭＬ／ＲＡＲα  ｍＲＮＡも切断することが知られており（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４，  ６３６５−６３６９，  １９９４）、ハンマーヘッドリボザイムで腫瘍形成ＰＭＬ／ＲＡＲα  ｍＲＮＡだけを特異的に切断する活性を有するハンマーヘッドリボザイムをデザインすることは難しいと考えられている。アロステリックとしてトランス活性化された新規リボザイムであるマキシザイムは、特定のＲＮＡ配列を認識するセンサーアームを有し、切断に必要なＭｇ２＋結合部位におけるＭｇ２＋イオンを捕捉するＭｇ２＋結合ポケットを介して、認識した特定のＲＮＡ配列から離れた部位でターゲットＲＮＡを切断する（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２，  ６１７−６２７，  １９９８）。以上のように、マキシザイムは理論的にはどのような配列も切断することができ、また副作用が少なく、標的遺伝子だけを特異的に破壊しうることから、現在ハンマーヘッドリボザイムよりもＰＭＬ／ＲＡＲα  ｍＲＮＡなどの種々の配列に対するマキシザイムが研究・開発されている。
【０００６】
マキシザイムをデザインする際、いくつかのパラメーター、例えば、融合遺伝子のヌクレオチドのＮＵＸ部位の選択に関しては、切断部位の配列の長さ及びエフェクター部位から切断部位までの距離などのパラメーターが挙げられる（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １，  １０８−１１７，  ２０００）。ＰＭＬ／ＲＡＲαに対するマキシザイムについてはすでに報告されており（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １，  １０８−１１７，  ２０００）、その切断部位はキメラ遺伝子のＰＭＬ部分上に位置し、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合部位から活性型における左右センサーアーム配列の分岐点までの距離が４塩基ある。このことは、このマキシザイムがセルフリーシステムにおいてＰＭＬ／ＲＡＲαのエフェクター存在下でＰＭＬ部分を切断するということを示している（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １，  １０８−１１７，  ２０００）。上記のようにマキシザイムは、あらゆる配列を特異的に切断するようにデザインすることができ、それに関連する正常な転写に対してダメージを与えることなく、特異的に切断できるという優れた点を有する。したがって、特異性の高い多くの遺伝子発現を、マキシザイムを使用することによって制御できるはずである。
【０００７】
ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＰＭＬ／ＲＡＲα及びＡＭＬ１／ＥＴＯ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１５，４３１−４３７，１９９５、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７９，１３２５−１３３１，１９９９、Ｂｌｏｏｄ  ９２，１７５８−１７６７，１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，１７５９−１７６８，１９９８）などの染色体転座由来のキメラ遺伝子は白血病細胞に発現し、白血病を誘発するという特徴を有する。したがって、白血病を誘発するキメラ遺伝子に対するマキシザイムは、上記染色体転座由来のキメラ遺伝子に対するマキシザイムと同様に、リボザイムの確実なターゲットとして白血病細胞を認識すると考えられる。現在、マキシザイムとしては強い切断活性とターゲット遺伝子に対する高選択性を有するものが期待されている。ＢＣＲ／ＡＢＬに対するマキシザイムの最近の報告では、マキシザイムがインビトロ、インビボ両方で作用するということが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ  ４６０，４７３−４７４，２０００）。従って、マキシザイムの作用は、異常なｍＲＮＡを特異的に認識するセンサーアームによってアロステリック的にコントロールすることができ、これはマキシザイムが異常なキメラ遺伝子をターゲットとして破壊する強力な武器であり、将来のＡＰＬ患者の治療するための遺伝子治療に有用であることを示唆している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
急性前骨髄球性白血病細胞が発現しているＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子には、ロングフォーム（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）とショートフォーム（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）の２つのアイソフォームが存在し、これらはＰＭＬ領域での切断点の違いによるものであることが知られている（Ｃｅｌｌ  ６６，  ６６３−６７４，  １９９１）。２つのアイソフォームのうち、ロングフォームのＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子に対するマキシザイムについてはすでに報告されている（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １，１０８−１１７，  ２０００）が、かかるマキシザイムは、その認識部位の中心（活性型における左右センサーアーム配列の分岐点）がＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子の融合部位から４塩基離れており、特異性・切断活性において十分なものではなかった。本発明の課題は、急性前骨髄球性白血病等の悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子に対して、従来のものより特異性や切断活性が高いマキシザイムや、かかるマキシザイムのスクリーニング方法や、悪性腫瘍治療薬等のかかるマキシザイムの利用方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、悪性腫瘍として急性前骨髄球性白血病に着目し、かかる白血病細胞において特異的に発現するＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子に対する種々のマキシザイムを、マキシザイムのセンサーアーム（ｓｅｎｓｏｒ  ａｒｍ）によって認識されるＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子のエフェクター（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）との相互作用によって触媒作用が活性化されるヘテロダイマーＲＮＡモチーフをもとにデザインし（図１参照）、それらのセルフリー系における切断活性を調べてみたところ、ほとんどのマキシザイムはエフェクターが存在しなくてもＰＭＬ／ＲＡＲα  ＲＮＡを非特異的に切断することがわかった。このことから、特異的切断活性が不活性型における安定性に依存しているのではないかと考え、Ｍｇ２＋結合ポケット周囲の配列を変化させ、不活性型と同様な安定性を有するように、ＰＭＬ／ＲＡＲαの融合部位をセンサーアーム配列の分岐点近くに位置するように種々の候補マキシザイムをデザインし、セルフリー系における切断活性を調べたところ、特異的切断活性を有するマキシザイムを見い出した。また、かかる特異的切断活性を有するマキシザイム等を含む候補マキシザイムの構造解析から、特異的切断活性に必要な基本構造を決定し、かかる基本構造を数塩基変異させたマキシザイム、すなわち、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム、活性型におけるＭｇ２＋結合ポケットを形成するＭｇ２＋結合ポケット、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの切断部位を含む配列の相補塩基配列からなる切断部位アーム（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ａｒｍ）等の配列を変異させたマキシザイムが、同様に特異的切断活性を有することを見い出し、ＰＭＬ／ＲＡＲアルファ融合遺伝子をもつ急性前骨髄急性白血病に対する特異的治療薬として有用であること確認しを、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子のｍＲＮＡ中に存在し、ヒトの他のｍＲＮＡ中の塩基配列と相同性を有さない塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ２＋結合ポケットを形成するＭｇ２＋結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備えたヘテロダイマーからなり、活性型における左右センサーアーム配列の分岐点が前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部位から４塩基以内に位置する種々の候補マキシザイムを作製し、その特異性及び切断活性を測定・評価することを特徴とする悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法（請求項１）や、悪性腫瘍細胞が、白血病細胞であることを特徴とする請求項１記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法（請求項２）や、白血病細胞が、急性前骨髄球性白血病細胞であることを特徴とする請求項２記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法（請求項３）や、急性前骨髄球性白血病細胞において特異的に発現する融合遺伝子が、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子であることを特徴とする請求項３記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法（請求項４）や、候補マキシザイムが、活性型における左右センサーアーム配列の分岐点が前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部位から２塩基以内に位置することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法（請求項５）や、候補マキシザイムが、配列ＣＵＧＡＮＧＡ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ）と配列ＧＡＡＡを含むＭｇ２＋結合ポケット周囲配列を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法（請求項６）や、以下の（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーからなることを特徴とするマキシザイム。（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、ｍＲＮＡ切断酵素活性を有するＲＮＡ（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ｄ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）又は（ｂ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、ｍＲＮＡ切断酵素活性を有するＲＮＡ（請求項７）や、以下の（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とからなることを特徴とするマキシザイム。（ａ）配列番号３に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ｂ）配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、酵素活性を有するＲＮＡ（ｃ）配列番号４に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ｄ）配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）又は（ｂ）とのヘテロダイマーが、塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ2+結合ポケットを形成するＭｇ2+結合ポケット周囲配列と、前記融合遺伝子のｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備え、ｍＲＮＡ切断酵素活性を有するＲＮＡ（請求項８）に関する。
【００１１】
また本発明は、請求項７又は８記載のマキシザイムに、ポリＡ及び／又はキャップ構造を付加することを特徴とする安定化マキシザイム（請求項９）や、請求項７〜９のいずれか記載のマキシザイムを発現することができるベクター（請求項１０）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の悪性腫瘍細胞特異的融合遺伝子のｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニング方法としては、急性前骨髄球性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、小児急性リンパ性白血病細胞等の白血病細胞や、悪性リンパ腫瘍細胞、急性リンパ芽球性白血病などの悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子のｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡ）中に存在し、ヒトの他のｍＲＮＡ中の塩基配列と相同性を有さない塩基配列中のＮＵＸ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ、Ｘ＝Ａ、Ｃ又はＵ）を切断部位として認識する切断部位アーム配列と、活性型におけるＭｇ２＋結合ポケットを形成するＭｇ２＋結合ポケット周囲配列と、前記標的ｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とを備えたヘテロダイマーからなり、活性型における左右センサーアーム配列の分岐点が前記標的ｍＲＮＡの融合部位の近傍（融合部位から４塩基以内）に位置する種々の候補マキシザイムを作製し、インビトロ（セルフリー系）又はインビボにおいて、候補マキシザイムの特異性及び切断活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、スクリーニングにより得られる特異的切断活性を有するマキシザイムを用いると、悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子をｍＲＮＡの段階で切断し、その機能を破壊することができる。
【００１３】
上記悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子としては、遺伝子の転座により悪性腫瘍細胞において特異的に発現するものであれば特に限定されるものでなく、ＰＭＬ／ＲＡＲα（急性前骨髄球性白血病）、ＢＣＲ／ＡＢＬ（慢性骨髄性白血病）、ＡＭＬ１／ＥＴＯ（ＭＴＧ８）（急性骨髄性白血病）、ＡＭＬ１／Ｅｖｉ１（急性骨髄性白血病）、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１（急性骨髄性白血病）、ＤＥＫ／ＣＡＮ（急性骨髄性白血病）、Ｆｕｓ／ＥＲＧ（急性骨髄性白血病）、ＰＤＧＦＲβ／ＴＥＬ（慢性骨髄単球性白血病）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１（小児急性リンパ性白血病）、ＭＬＬ／ＡＦ４（急性リンパ性白血病）、ＭＬＬ／ＡＦ９（急性リンパ性白血病、ＭＬＬ／ＥＮＬ（急性リンパ性白血病）、ＩＧＨ／ＢＣＬ２（悪性リンパ腫）、ＩＧＨ／ＰＡＸ５（悪性リンパ腫）ＩｇＨ／Ｃ−ＭＹＣ（悪性リンパ腫）、ＩｇＨ／ＰＲＡＤ１（悪性リンパ腫）、ＡＬＫ／ＮＰＭ（悪性リンパ腫）等の融合遺伝子を具体的に例示することができる。
【００１４】
候補マキシザイムにおける上記切断部位アーム配列は、標的ｍＲＮＡ中に存在するＮＵＸを含む塩基配列と相補的配列からなり、上記ＮＵＸを含む塩基配列がヒトの他のｍＲＮＡ中の塩基配列と実質的に相同性をもたないことから、標的ｍＲＮＡの塩基配列中のＮＵＸを切断部位として認識し、センサーアーム配列と協働して、標的ｍＲＮＡを特異選択的に切断することを可能とする。例えば、融合遺伝子がＰＭＬ／ＲＡＲαアイソフォームの場合、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合部位から７１塩基下流に位置する、ＲＡＲαのヌクレオチド配列における４７６〜４７８番目のＡＵＣの３つの塩基を含む１６のヌクレオチド配列はヒトのどの配列にも相同しないことから、切断部位として好適に選択することができる。
【００１５】
候補マキシザイムにおける上記Ｍｇ２＋結合ポケット周囲配列は、図１（上）に示されるように、上記切断部位アーム配列と前記標的ｍＲＮＡの融合部分を認識するセンサーアーム配列とが、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズした活性型（ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）におけるＭｇ２＋結合ポケットを形成する配列で、例えば、融合遺伝子がＰＭＬ／ＲＡＲαアイソフォームの場合などにおいては、Ｍｇ２＋結合ポケット周囲配列を配列ＣＵＧＡＮＧＡ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵ）と配列ＧＡＡＡを保存配列として含み、他の部分を変異させた構成とすることが、特異的切断活性を有するマキシザイムを効率よくスクリーニングする上で好ましい。
【００１６】
候補マキシザイムにおける上記センサーアーム配列は、前記標的ｍＲＮＡの融合部分を認識することができるように、該融合部分と相補的な配列からなり、活性型における左右センサーアーム配列の分岐点が前記標的ｍＲＮＡの融合部位の近傍、好ましくは融合部位から２塩基以内に位置するように構成されている。活性型における左右センサーアーム配列の分岐点を標的ｍＲＮＡの融合部位の近傍、特に融合部位から２塩基以内に位置するように構成することにより、形成される前記活性型におけるＭｇ２＋結合ポケットが高切断活性構造となり、標的ｍＲＮＡの特異的切断活性に優れたマキシザイムを作製しうる可能性が高くなる。
【００１７】
また、候補マキシザイムとして、不活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ）において安定な構造を有するマキシザイムを用いることが好ましい。不活性型マキシザイムは、Ｍｇ２＋結合ポケットが形成されたヘテロダイマーで構成される上記活性型マキシザイムと異なり、図１（下）に示されるように、前記切断部位アーム配列のみが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、Ｍｇ２＋結合ポケットが形成されていないヘテロダイマーで構成されている。そして、不活性型において安定な構造とは、Ｍｇ２＋結合ポケットに相当する配列間に形成される相補塩基対が多い構造をいい、例えば、融合遺伝子がＰＭＬ／ＲＡＲαアイソフォームの場合などにおいては、不活性型において８〜９の相補塩基対を有する候補マキシザイムが、標的ｍＲＮＡの特異的切断活性に優れたものとなる可能性が大きくなる。
【００１８】
標的ｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムのスクリーニングは、種々の濃度の候補マキシザイムを用いて、インビトロ及び／又はインビボで行われるが、その簡便さからしてセルフリー系で行うことが好ましい。上記候補マキシザイムの特異性は、上記切断部位ＮＵＸを有する非融合遺伝子のｍＲＮＡ（正常ｍＲＮＡ）を切断することなく、標的ｍＲＮＡを選択的に切断するかどうかにより評価され、候補マキシザイムの切断活性はマキシザイムの使用濃度により評価することができる。かかるスクリーニング方法によって得られる標的ｍＲＮＡに対して特異的切断活性を有するマキシザイムは、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、小児急性リンパ性白血病等の白血病や、悪性リンパ種などの悪性腫瘍に対する治療に有用である。以下に悪性腫瘍細胞として急性前骨髄球性白血病細胞を例に挙げ、急性前骨髄球性白血病細胞において特異的に発現するＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子を特異的に認識し、高い切断活性を有するマキシザイムについて説明する。
【００１９】
本発明において、急性前骨髄球性白血病細胞において特異的に発現するＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子を認識し、高い切断活性を有するマキシザイムとしては、例えば、ロングフォーム（ｌｏｎｇ  ｆｏｒｍ）ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子の場合、次の（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーからなるマキシザイムを挙げることができる。（ａ）は配列番号１に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ＭｚＰＲＴ５０Ｌ）で、（ｂ）は配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーが酵素活性（ＲＮＡ切断活性）を有するＲＮＡで、（ｃ）は配列番号２に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ＭｚＰＲＴ５０Ｒ）で、（ｄ）は配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ上記（ａ）又は（ｂ）とのヘテロダイマーが酵素活性を有するＲＮＡである。かかる（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーからなるマキシザイムとしては、図１６に示されるＭｚＰＲＴ５０や、図１８に示されるＭｚＰＲＴ５０＋Ｇを具体的に挙げることができる。
【００２０】
他方、ショートフォーム（ｓｈｏｒｔ  ｆｏｒｍ）ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子の場合、次の（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーからなるマキシザイムを挙げることができる。（ａ）は配列番号３に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ＭｚＰＲＫ５５Ｌ）で、（ｂ）は配列番号３に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーが酵素活性を有するＲＮＡで、（ｃ）は配列番号４に示される塩基配列からなるＲＮＡ（ＭｚＰＲＫ５５Ｒ）で、（ｄ）は配列番号４に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ上記（ａ）又は（ｂ）とのヘテロダイマーが酵素活性を有するＲＮＡである。かかる（ａ）又は（ｂ）と、（ｃ）又は（ｄ）とのヘテロダイマーからなるマキシザイムとしては、図１７に示されるＭｚＰＲＫ５５や、図１９に示されるＭｚＰＲＫ５５＋Ｇを具体的に挙げることができる。
【００２１】
本発明の安定化マキシザイムとしては、上記ＭｚＰＲＴ５０やＭｚＰＲＫ５５等の前記スクリーニング方法により得られる本発明のマキシザイムに、ポリＡ及び／又はキャップ構造が付加され、リボヌクレアーゼ等による分解から保護され、安定性の高い構造を有するものであれば特に制限されるものではなく、上記キャップ構造としては、マキシザイムの５'末端ヌクレオシドにリン酸基を介して５'→５'結合した７−メチルグアノシン５'−リン酸［（７ＭｅＧ）−５'−ｐｐｐ−末端ヌクレオシド］を付加したＣａｐ０構造や、Ｃａｐ０構造にさらに１番目の末端ヌクレオチドの２'位のＯＨをメチル化させたＣａｐ１構造や、Ｃａｐ１構造にさらに２番目のヌクレオチドの２'位のＯＨをメチル化させるＣａｐ２構造を例示することができ、安定化マキシザイムとしてこれらキャップ構造と３'側にポリＡ構造を共に付加した構造を有するマキシザイムをより好適に挙げることができる。
【００２２】
本発明のＲＮＡベクターとしては、本発明のマキシザイムを悪性腫瘍細胞等の細胞内において発現することができるベクターであれば特に制限されるものではなく、プラスミド、ウイルス、レトロトランスポゾン及びコスミドを含む種々のベクターを用いることができる。また、これらベクターの種類に応じて、マキシザイムのヘテロダイマーを構成するＲＮＡ配列をそのまま、あるいは該ＲＮＡ配列の逆転写物であるＤＮＡ配列を１又は２以上ベクターに組み込むことができる。マキシザイム発現用のプラスミドベクターとしては、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、アデノウイルス由来のｔＲＮＡ又はＶＡ−１）、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、又はＳＶ４０初期プロモーターのような真核プロモーターを有するものを挙げることができ、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス１型又はアデノ随伴ウイルス２型ベクター、レトロウイルスベクターなどを具体的に挙げることができる。これらベクターの作製については公知の方法（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９９１参照）を用いることができ、例えば、組換えレトロウイルスベクターを用いて、悪性腫瘍細胞等をトランスフェクトすることにより、本発明のマキシザイムをコードする遺伝子をヒト細胞の染色体中へ導入し、効率よくマキシザイムを発現させることができる。
【００２３】
本発明はまた、本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクターが導入された悪性腫瘍細胞や、本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクターを用いる標的ｍＲＮＡの特異的切断方法や、本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクターを悪性腫瘍患者の悪性腫瘍細胞に導入することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法に関する。本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクターを悪性腫瘍細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウム沈降を用いるトランスホーメーション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等を挙げることができる。悪性腫瘍細胞に本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクターを導入すると、標的ｍＲＮＡが特異的に切断されることから、本発明のマキシザイム等は悪性腫瘍患者における遺伝子治療や養子免疫療法に有用である。
【００２４】
本発明の悪性腫瘍治療薬としては、本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクターを有効成分とし、必要に応じて薬学的に又は生理的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤を含有するものであれば特に制限されるものではなく、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、小児急性リンパ性白血病等の白血病や、悪性リンパ種などの悪性腫瘍の発症に関与する融合遺伝子を切断することから、上記悪性腫瘍に対する特異的な治療法に好適に使用することができる。本発明の悪性腫瘍治療薬は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等種々の形態で投与することができる。また、投与すべき有効量は、悪性腫瘍治療薬の種類・組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを１日当たり１〜数回投与することが好ましい。また、静脈等の注射により投与する場合には、本発明の悪性腫瘍治療薬を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液等に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（マキシザイムのデザインと作製）
最近の研究により、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合蛋白質による転写抑制のメカニズムが、ＡＰＬの分子病因論と、オールトランスレチノイン酸（ＲＡ）によるＡＰＬでの異なる反応により明らかにされている（Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ８１１−８１４，  １９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ８１５−８１８，  １９９８）。さらに、ＰＭＬ／ＲＡＲαの変異は、ＡＰＬ患者でのＲＡ耐性の発達による１つのメカニズムではないかと考えられている（Ｂｌｏｏｄ  ９２，  ３７４−３８２，  １９９８）。したがって、ＰＭＬ／ＲＡＲαのターゲッティングは、ＲＡ耐性の場合を含むＡＰＬ患者の治療において役立つと考えられる。上記ＰＭＬ／ＲＡＲαはＰＭＬ領域における切断点の違いから、今までに２つのアイソフォームが明らかとなっている。そこで、ＰＭＬ／ＲＡＲαの２つのアイソフォームに対して、２つのＲＮＡ分子（ＭｚＬとＭｚＲ）によるヘテロダイマーとして構成されているいくつかのマキシザイムをデザインした。かかるマキシザイムは、図１に示されるエフェクター（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）がセンサーアームによって認識されることから（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２，  ６１７−６２７，  １９９８）、かかるエフェクターとの相互作用によって活性化されるヘテロ二量体ＲＮＡモチーフに基づきデザインした。
【００２６】
上記デザインしたマキシザイムの全ての２次構造はｍＦｏｌｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍａｔｈ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／〜ｍｆｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ）によって予測した（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０，１９９９）。ＲＡＲαのヌクレオチド配列における４７６〜４７８番目のＡＵＣは、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合点から７１塩基下流に位置し、この３つの塩基を含む１６のヌクレオチド配列は、前記のように、ヒトのどの配列にも相同性を有しないことから切断部位として選択し（Ｎａｔｕｒｅ  ３３０，４４４−４５０，１９８７）、図１中のＰ及びＱで示した非保存塩基を適切な塩基に置換し、不活性型マキシザイムを安定化させた。なお、図１中の枠で囲んだヌクレオチドは切断活性に必要な保存配列を示し、また、Ｙ及びＺは標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的であることを意味している。
【００２７】
上記デザインしたマキシザイムの切断活性及び特異性をセルフリー系により調べた。セルフリー系での切断反応は、１０μｌのリアクションバッファー［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｎｇ／μｌの基質（センサーアームが認識することができるエフェクター部位を有するＰＭＬ／ＲＡＲα  ＲＮＡ、センサーアームが認識することができるエフェクター部位を有しないＰＭＬ／ＲＡＲα  ＲＮＡ、又はＲＡＲα  ＲＮＡ）、及びマキシザイム（基質／マキシザイム＝１／１、１／２、１／４、１／８、又は１／１６）を含む溶液］中で３７℃にて行った。その後、８μｌのストップバッファー（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ社製）を加えることにより反応を停止させ、６％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルで分析した。この結果、ほとんどのマキシザイムはエフェクターが存在しないＰＭＬ／ＲＡＲα  ＲＮＡも切断しているのが確認できた。このことは、切断活性の特異性が不活性型マキシザイムの安定性に依存していることを示唆している。
【００２８】
図１の活性型の構造は、エフェクター“ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”分子によって安定化し、エフェクター“ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ“を有しない場合、ＭｚＬ及びＭｚＲはＭｇ２＋結合ポケットを形成することができないので不活性型をとる。また、ＰＭＬ／ＲＡＲαに対してデザインされたマキシザイムにおける切断活性は、ＰＭＬ／ＲＡＲαの融合部位から活性型におけるセンサーアームの分岐点が離れるにつれ減少することがわかった。以上のことから、Ｍｇ２＋結合ポケット周囲の配列を変化させ、不活性型において安定性を有し、かつＰＭＬ／ＲＡＲαの融合部位がセンサーアームの分岐点の近くに位置するように再度マキシザイムをデザインした（表１及び図２〜１５）。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
デザインした１４のマキシザイムは、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１５，４３１−４３７，１９９５）記載のインビトロ転写により作製した。マキシザイム又はエフェクターの鋳型ｃＤＮＡは、それらの３′末端にバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域を含んでいる。各マキシザイムｃＤＮＡに、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータに相補的なＤＮＡオリゴマーを同量混合し、各２ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ社製）と、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＩ社製）とを含む２００μｌの緩衝液で３７℃，４時間インキュベーションした。その後、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ社製）で３７℃で１５分間インキュベーションし、次いでＤＥＰＣで処理した水に再度懸濁した。基質ＲＡＲα  ＲＮＡも、各０．５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰと、０．１ｍＭのＣＴＰと、３．７ＭＢｑ［α−３２Ｐ］ＣＴＰとを含む緩衝液中で、ヌクレオチド位置４６４−７３７（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｘ０６５３８）（Ｎａｔｕｒｅ  ３３０，４４４−４５０，１９８７）等のＲＡＲαセグメントのｃＤＮＡを有するＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ社製）をインビトロ転写することにより作製した。
【００３１】
実施例２（各マキシザイムの切断活性及び特異性）
次に、実施例１により新たにデザインした１４のマキシザイム（図２〜１５）の切断活性及び特異性を実施例１記載の方法と同様にセルフリー系で調べてみた。その結果を表１に示す。この結果から、ＭｚＰＲＴ５０（図１６）及びＭｚＰＲＫ５５（図１７）の構造が切断活性、特異性共に高いことが確認できた。これらのマキシザイムは、認識部位（活性型センサーアームの分岐点）がＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子の融合部位から２塩基と非常に近く、不活性型における相補塩基対数がそれぞれ８（ＭｚＰＲＴ５０）又は９（ＭｚＰＲＫ５５）であることから、高い特異的切断活性を有すると考えられた。このＭｚＰＲＴ５０やＭｚＰＲＫ５５における活性型Ｍｇ２＋結合ポケット周囲ＲＮＡ配列を基本構造とし、ＭｚＰＲＴ５０＋Ｒ（図１８）やＭｚＰＲＫ５５＋Ｒ（図１９）等かかる基本構造に数塩基配列を加えたり、変えたりした類似構造のマキシザイムは、特異的切断活性を有することもわかった。なお、各マキシザイムにおける活性型Ｍｇ２＋結合ポケットの１塩基は、Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌの記載の方法により欠失させた（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，５６７９−５６８５，１９８９）。また、センサーアームや切断部位アームを短くしたマキシザイム、あるいは延長したマキシザイムも同様に特異的切断活性を有することも確認できた。
【００３２】
実施例３（エフェクターによる効果）
次に、実施例１と同様に、マキシザイムとして各種濃度のＭｚＰＲＴ５０を、各種基質［センサーアームに認識されるｍＲＮＡが非存在（Ｎｏ）、ＰＭＬ／ＲＡＲα、又はＲＡＲα単独］に作用させ、特異的切断反応の効果を調べてみた。結果を図２０に示す。なお、図２０中の基質とマキシザイムの割合（Ｓｕｂ／Ｍｚ  ｒａｔｉｏ）は、一定濃度の基質に対するマキシザイムの濃度の割合を示す。この結果、マキシザイムＭｚＰＲＴ５０は、標的ｍＲＮＡにおけるＲＡＲα  ＲＮＡを特異的に切断するが、正常型ＲＡＲα単独及びエフェクターが存在しないＰＭＬ／ＲＡＲαにおいては切断活性を有しないことがわかった。ＭｚＰＲＫ５５についてもＭｚＰＲＴ５０と同様に、ＰＭＬ／ＲＡＲαエフェクターが存在するときにのみＲＡＲα  ＲＮＡを特異的に切断していた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のマキシザイムは、悪性腫瘍細胞において特異的に発現する融合遺伝子のｍＲＮＡを選択的に認識して切断することができることから、従来のマキシザイムに比べて特異性・切断活性において優れている。したがって、本発明のマキシザイム、安定化マキシザイム、マキシザイム発現ベクター等は、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、小児急性リンパ性白血病等の白血病や、悪性リンパ種などの悪性腫瘍に対する治療薬として有用である。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】デザインしたマキシザイムの基本構造を示す図である。
【図２】マキシザイムＭｚＰＲＴ１の基本構造を示す図である。
【図３】マキシザイムＭｚＰＲＴ２の基本構造を示す図である。
【図４】マキシザイムＭｚＰＲＫ１の基本構造を示す図である。
【図５】マキシザイムＭｚＰＲＫ２の基本構造を示す図である。
【図６】マキシザイムＭｚＰＲＫ１−２２の基本構造を示す図である。
【図７】  マキシザイムＭｚＰＲＫ１−３３の基本構造を示す図である。
【図８】  マキシザイムＭｚＰＲＫ１−５４の基本構造を示す図である。
【図９】  マキシザイムＭｚＰＲＫ５５の基本構造を示す図である。
【図１０】  マキシザイムＭｚＰＲＫ６０の基本構造を示す図である。
【図１１】  マキシザイムＭｚＰＲＫ６１の基本構造を示す図である。
【図１２】  マキシザイムＭｚＰＲＴ５０の基本構造を示す図である。
【図１３】  マキシザイムＭｚＰＲＴ５１の基本構造を示す図である。
【図１４】  マキシザイムＭｚＰＲＴ５２の基本構造を示す図である。
【図１５】  マキシザイムＭｚＰＲＴ５３の基本構造を示す図である。
【図１６】  マキシザイムＭｚＰＲＴ５０のスタンダードフォームの基本構造を示す図である。
【図１７】  マキシザイムＭｚＰＲＫ５５のスタンダードフォームの基本構造を示す図である。
【図１８】  マキシザイムＭｚＰＲＴ５０＋Ｇのスタンダードフォームの基本構造を示す図である。
【図１９】  マキシザイムＭｚＰＲＫ５５＋Ｇのスタンダードフォームの基本構造を示す図である。
【図２０】  本発明のＭｚＰＲＴ５０を用いた場合の、エフェクターの存在下又は非存在下での切断
活性の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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