(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液としたシュクロースに、シュクロースからのフラクトオリゴ糖の転移反応を行いうるフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて酵素反応によりフラクトオリゴ糖を製造するにあたり、
その酵素反応の当初から系中にホウ酸またはその塩からなるホウ酸類を共存させることにより、副生グルコースを直ちにホウ酸類との錯体に変換させて、副生グルコースとホウ酸類との錯体を形成させること、
その際の副生グルコースとホウ酸類との量的割合を、実質的に、グルコースとホウ酸類との錯体形成反応における量的割合に見合う割合に設定すること、
ついで該錯体を分離除去すること
を特徴とする精製フラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
副生グルコースとホウ酸類との錯体を含む水溶液をアニオン交換樹脂と接触させることにより、水溶液中の錯体を分離除去することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、フラクトオリゴ糖を製造するときに副生するグルコースを除去して、フラクトオリゴ糖濃度の高い精製フラクトオリゴ糖を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シュクロースにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させることにより、フラクトオリゴ糖を主成分とする糖組成物の水溶液（通常シロップという）が得られるが、その際に相当量のグルコースが副生する。そこで用途によっては、この副生するグルコースを除去してフラクトオリゴ糖濃度を高めることが必要となる。
【０００３】
シュクロースにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得られた反応液からフラクトオリゴ糖を精製するには、一般的には活性炭クロマトグラフ法やイオン交換クロマトグラフ法が採用されるが、後述のように種々の問題点があるので、工業的な方法とは言いがたい。そのため、フラクトオリゴ糖の精製方法に関しいくつかの提案がなされている。
【０００４】
たとえば、特開昭５９−９５８９５号公報には、単糖類、ショ糖（つまりシュクロース）およびフラクトオリゴ糖を含有する糖組成物からフラクトオリゴ糖を単離精製するに際し、当該糖組成物にα−グルコシダーゼを作用させてショ糖を単糖類に分解するようにしたフラクトオリゴ糖の精製法が示されている。実施例においては、糖組成物中のショ糖を単糖類に分解した後、先に述べた活性炭クロマトグラフ法を適用している。
【０００５】
特開昭５９−１７９１００号公報には、アルカリ金属形またはアルカリ土類金属形の強酸性カチオン交換樹脂を充填した固定床に三糖類以上のフラクトオリゴ糖類と二糖類以下の糖類との混合原液を下降流あるいは上昇流で通液する循環方式により、三糖類以上のフラクトオリゴ糖と二糖類以下の糖類に分離する方法が示されている。
【０００６】
特開昭６０−１４９５９６号公報には、ニストース含有量が６０％以上であるフラクトオリゴ糖液を固型分濃度７５〜９０％に濃縮し、結晶ニストースを含む種晶を添加・分散させ、結晶固化、熟成を行った後、これを粉末化させるようにしたフラクトオリゴ糖結晶粉末の製造方法が示されている。この場合、ニストース含有量の多いフラクトオリゴ糖液を得るのに、反応液を濃縮した後、活性炭、イオン交換樹脂等のカラムを用いて分画処理する方法を採用している。
【０００７】
特開昭６２−１４７９２号公報には、ショ糖にフラクトース転移作用を持つ酵素を作用させるフラクトース転移反応によりフラクトオリゴ糖を主成分とする糖混合物を得るにあたり、副生するグルコースを減少させる操作を実施するようにしたフラクトオリゴ糖高含有物の製造法が示されている。ここで副生するグルコースを減少させる操作とは、具体的には次の操作である。
(a) 微生物によりグルコースを資化させる操作、微生物のショ糖およびフラクトオリゴ糖を分解する作用を阻害する試剤の共存下に微生物によりグルコースを資化する操作、または、微生物によりグルコースとショ糖を資化させる操作。ここで微生物とは酵母や細菌である。
(b) 酵素（たとえばグルコースオキシダーゼ）によりグルコースを変換させる操作。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
シュクロースにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得られたフラクトオリゴ糖を主成分とする反応液からフラクトオリゴ糖を精製する方法のうち、従来より一般的に採用されている活性炭クロマトグラフ法は、展開液としてアルコール等の有機溶媒を含む液を用いるため、爾後の有機溶媒の除去が大変であり、操作も複雑となること、分離した溶出液中のフラクトオリゴ糖濃度が低いこと（数％）、基質に対してカラムヘッドが大きいこと（１００〜５００倍）、処理量に対して装置が大きくなることなどの問題点がある。
【０００９】
特開昭５９−９５８９５号公報においては、糖組成物にα−グルコシダーゼを作用させてショ糖を単糖類に分解しているが、糖組成物からの単糖類の除去には上に述べた活性炭クロマトグラフ法を採用しているので、上記と同様の問題点がある。
【００１０】
イオン交換クロマトグラフ法は、分離したフラクトオリゴ糖の濃度がたとえば１０〜１５％と低いこと、収率を上げようとするとますます濃度が低くなるため、その後の濃縮が大変であることなどの問題点がある。このような問題点は、アルカリ金属形またはアルカリ土類金属形の強酸性カチオン交換樹脂を充填した固定床に原液を循環方式により通液する特開昭５９−１７９１００号公報の改良方法によっても、本質的には解決しえない。特開昭６０−１４９５９６号公報においては、前処理段階として反応液を濃縮した後、イオン交換樹脂等のカラムを用いて分画処理する方法を採用しているが、そのように濃縮して分画処理を行うとフラクトオリゴ糖の収率が低下することを免かれない。
【００１１】
特開昭６２−１４７９２号公報に開示の副生グルコースを減少させる操作のうち、微生物（酵母や細菌）によりグルコースを資化させる方法は、短時間（約２４時間以内）にグルコースを資化しようとすると初期に多くの菌体（基質に対し 0.5〜１倍）が必要となり、菌体の確保が大変であること、微生物の資化故に副生成物が多く、後処理の負荷が大きいことなどの不利がある。
【００１２】
特開昭６２−１４７９２号公報に開示の副生グルコースを減少させる操作のうち、グルコースオキシダーゼ等の酵素によりグルコースを変換させる方法は、分離したフラクトオリゴ糖濃度が低く（１０％）、濃縮が大変であること、グルコースオキシダーゼの生産が大変で、コストが高くなること、反応中通気が必要となることなどの問題点がある。
【００１３】
そのほかゲルろ過クロマト法も考えられるが、この方法は、分離したフラクトオリゴ糖濃度が低く（１０％程度）、濃縮が大変であること、回収率が低いこと（５０〜７０％）、純度を上げるに従い回収率が悪くなることなどの不利がある。
【００１４】
本発明は、このような背景下において、フラクトオリゴ糖の製造に際し、副生するグルコースを従来とは全く別の機構に基いて分離除去することにより、フラクトオリゴ糖濃度の高い精製フラクトオリゴ糖を製造する工業的に有利な方法を提供することを目的とするものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の精製フラクトオリゴ糖の製造方法は、
水溶液としたシュクロースに、シュクロースからのフラクトオリゴ糖の転移反応を行いうるフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて酵素反応によりフラクトオリゴ糖を製造するにあたり、
その酵素反応の当初から系中にホウ酸またはその塩からなるホウ酸類を共存させることにより、副生グルコースを直ちにホウ酸類との錯体に変換させて、副生グルコースとホウ酸類との錯体を形成させること、
その際の副生グルコースとホウ酸類との量的割合を、実質的に、グルコースとホウ酸類との錯体形成反応における量的割合に見合う割合に設定すること、
ついで該錯体を分離除去すること
を特徴とするものである。
【００１６】
以下本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、フラクトオリゴ糖にかかるものである。
【００１８】
フラクトオリゴ糖は、水溶液としたシュクロースに、シュクロースからのフラクトオリゴ糖の転移反応を行いうるフラクトシルトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。この反応は次式で表わされる。なお説明の簡略化のため、必要に応じ、グルコース単位をＧ、フラクトース単位をＦで表わし、ＧＦＦの場合はＧＦ2 、ＧＦＦＦの場合はＧＦ3 というように表わすこととする。
0003643603.tif 000002
【００１９】
実際の反応では、ＧＦ2 のほかにＧＦ3 も多量に生成し、ＧＦ4 も少量生成する。ＧＦ5 以上の生成量はごくわずかである。フラクトオリゴ糖とは、ＧＦ2 からＧＦ4 またはＧＦ5 程度までを指す。
【００２０】
上記の反応式から、相当量のグルコースが必然的に副生することがわかる。ところがグルコースは、整腸作用、ビフィズス菌増殖作用、乳酸菌増殖作用を有しないので、糖組成物中におけるグルコースの比率をできるだけ低減する方法が有利である。なお反応液中には未反応のシュクロースも相当量含まれるが、その存在はフラクトオリゴ糖の通常の用途には特に問題とならないことが多い。
【００２１】
本発明においては、水溶液としたシュクロースに、シュクロースからのフラクトオリゴ糖の転移反応を行いうるフラクトシルトランスフェラーゼを作用させて酵素反応によりフラクトオリゴ糖を製造するにあたり、その酵素反応の当初から系中にホウ酸またはその塩からなるホウ酸類を共存させることにより、、副生グルコースを直ちにホウ酸類との錯体に変換させて、副生グルコースとホウ酸類との錯体を形成させる。
【００２２】
酵素反応の当初からとは、シュクロースにフラクトシルトランスフェラーゼ（オーレオバシディウム属やアスペルギルス属の菌の菌体内に産生されるフラクトース転移酵素である）を作用させることによりフラクトオリゴ糖を生成させるときの原料仕込み時など反応前か、反応が実質的に始まるまでの段階を言う。
【００２３】
ところで、副生グルコースは生成直後はα型であるが、間もなくβ型との間で平衡関係となる。ホウ酸類はα型のグルコースとのみ錯体を形成するので、転移反応の当初から系中にホウ酸類を共存させることにより、生成直後のα型の副生グルコースを直ちにホウ酸類との錯体に変換することが有利なのである。
【００２４】
ホウ酸類としては、ホウ酸またはホウ砂が用いられる。ホウ酸類は酵素阻害を起こさないので、酵素反応の当初から系中に共存させてもよいのである。
【００２５】
上述の錯体形成反応は下記の式で表わされる。また錯体の構造は下記の化１で表わされるものと考えられる。
0003643603.tif 000003
【００２６】
【化１】
0003643603.tif 000004
【００２７】
ホウ酸類の添加量は、上記の式(2) に従い副生グルコースの量に見合うように計算量に設定することが望ましいが、若干の増減は許容される。すなわち、副生グルコースとホウ酸類との量的割合を、実質的に、グルコースとホウ酸類との錯体形成反応における量的割合に見合う割合に設定する。錯体形成反応は酸性下に進むので、系のｐＨは４〜６程度に調節することが望ましい。形成した錯体は酸性物質であるので、錯体形成反応が進行すると系のｐＨが低下する。そこで適宜ｐＨ調節剤を添加して系のｐＨが４〜６程度に保たれるように留意する。
【００２８】
錯体形成反応終了後は、その錯体を系から分離除去する。錯体分離方法としては種々の方法が採用されるが、本発明者らは上記錯体がアニオン交換樹脂にほぼ定量的にイオン交換吸着することを見い出したので、フラクトオリゴ糖および上記錯体を含む水溶液をアニオン交換樹脂と接触させる方法が推奨される。
【００２９】
アニオン交換樹脂処理により錯体がほぼ完全に除去されるので、処理液を適宜ｐＨ調整し、さらには濃縮したり粉体化して製品とする。なおアニオン交換樹脂に吸着した錯体はアルカリ水溶液を通すなどすることによりアニオン交換樹脂から脱離させることができるので、アニオン交換樹脂を繰り返し使用することができる。なお脱離させた錯体は、必要に応じグルコースとホウ酸類とに分解することができる。
【００３０】
【作用】
本発明においては、ホウ酸類のα型グルコースに対する錯体形成能力を利用して、フラクトオリゴ糖を主体とする糖組成物の水溶液から副生グルコースを除去している。錯体形成反応はイオン反応であるので、反応率が高くかつ反応速度が速い。
【００３１】
ホウ酸類はフラクトオリゴ糖の製造工程における酵素反応の当初から系中に共存させるが、フラクトオリゴ糖を酵素反応により製造する場合、このように酵素反応の当初から系中にホウ酸類を添加してもその転移反応は何ら阻害されず、転移率はホウ酸無添加の場合と実質的に変らない。
【００３２】
生成した錯体はアニオン交換樹脂との接触により容易かつ確実に除去することができるので、フラクトオリゴ糖濃度の高い精製フラクトオリゴ糖を製造することができる。
【００３３】
【実施例】
次に実施例をあげて本発明を詳細に説明する。
【００３４】
実施例１
下記のようにして、フラクトオリゴ糖シロップの製造およびそのシロップ中に含まれるグルコースの除去を行った。
【００３５】
〈酵素の精製〉
オウレオバシディウム・プルランスのフラクトシルトランスフェラーゼ含有菌体２kgを細胞膜破砕し、フラクトシルトランスフェラーゼを３０リットルの水中に遊離させた。このとき、フラクトシルトランスフェラーゼの力価を１００ユニット／mlに調整し、粗フラクトシルトランスフェラーゼ水溶液を得た。なお１ユニットは、温度５０℃、濃度５０重量％のシュクロース水溶液において、１分間に１−ケストースを１マイクロモル生成する力価である。
【００３６】
次に分画分子量２００００の限外ろ過により、上記の粗フラクトシルトランスフェラーゼ水溶液を 1.5リットル、力価２０００ユニット／mlまで濃縮精製し、精製フラクトシルトランスフェラーゼ水溶液を得た。
【００３７】
〈フラクトオリゴ糖の製造〉
（参考例）
まず参考例として、ホウ酸類を添加しない場合の実験を行った。すなわち、シュクロース（グラニュー糖）１００ｇを水１００mlに溶かし、上記で得た力価２０００ユニット／mlの精製フラクトシルトランスフェラーゼ水溶液 0.5mlを加えて、５５℃で２４時間撹拌反応を行い、反応終了後１００℃で滅菌した。反応物であるフラクトオリゴ糖化グラニュー糖シロップ中の固形分の分析結果は次の表１の通りであった。なおニストースには、GF3 のほか、少量生成するGF4 やGF5 を含めてある。* 印で示したものがフラクトオリゴ糖であり、合計量は61.7重量％となる。
【００３８】
【表１】
0003643603.tif 000005
【００３９】
（実施例）
次に実施例として、ホウ酸類を添加した場合の実験を行った。すなわち、シュクロース（グラニュー糖）１００ｇを水１００mlに溶かし、ホウ酸 4.2ｇを加えた後、少量の水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ 5.0に調節し、上記で得た力価２０００ユニット／mlの精製フラクトシルトランスフェラーゼ水溶液 0.5mlを加えて、５５℃で２４時間撹拌反応を行った。反応進行中にはｐＨが徐々に低下するので、時々水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨがほぼ５に維持されるように調節した。なおホウ酸添加量を 4.2ｇとしたのは、上記参考例で反応終了時にシロップ中に含まれる固形分のうちグルコース量が24.5重量％であるので、ホウ酸（分子量61.8）１モルに対しグルコース（分子量１８０）が２モルとなるようにするべく、24.5×61.8／(180×2)＝ 4.2％から設定したものである。
【００４０】
〈フラクトオリゴ糖の精製〉
上記実施例の反応終了後、反応液を１００℃で滅菌し、ついで反応液を、アニオン交換樹脂（オルガノ株式会社販売の「アンバーライトＩＲＡ−４１０−ＯＨ型」を２５０ml充填しかつジャケットに４０℃の温水を通して保温した内径６０mm、長さ３５０mmのカラムにアップフローにて空間速度 0.3、１サイクル１２時間で通液すると共に、通過液を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ 9.8〜10.0に調節しながらカラムに循環させた。「アンバーライトＩＲＡ−４１０」の充填量を２５０mlとしたのは、予備的実験により、該アニオン交換樹脂１ml当りの交換吸着可能なグルコース量が0.10〜0.11ｇであることを確認しているからである。
【００４１】
上記操作の後、固形分濃度が７０重量％になるまで濃縮して製品となした。得られた製品中の糖組成は次の通りであった。なおニストースには、GF3 のほか、少量のGF4 やGF5 を含めてある。
グルコース                 2.7 wt%
シュクロース              16.0 wt%
１−ケストース GF2        51.3 wt%
ニストース GF3            30.0 wt%
【００４２】
ＧＦ2 とＧＦ3 との合計の割合は81.3重量％となる。なおグルコース除去率が１００％とならないのは、上記参考例と実施例の場の違いによりホウ酸添加量が理論値より若干不足していたことによるものであり、ホウ酸添加量を理論値の１００％とすればグルコース除去率はほぼ１００％となる。
【００４３】
図１の（イ）、（ロ）は、上記実施例における転移反応終了時点の糖組成およびアニオン交換樹脂充填カラムによる精製処理後の糖組成についての高速液体クロマトグラフのチャートである。
【００４４】
実施例２
実施例１に準じてホウ酸共存下の転移反応を行うと共に、実施例１に準じて転移反応終了後の反応液の「アンバーライトＩＲＡ−４１０−ＯＨ型」による精製を行った。シュクロース仕込み量は４００ｇ、転移反応時のホウ酸添加量はグルコース生成量２５％として17.2ｇ、酵素使用量は１０ｕ／シュクロース、ｐＨは 5.0, 温度は５０℃に設定し、精製条件としては、アニオン交換樹脂充填量１０００ml、空間速度 0.8、温度４０℃、１サイクル２０時間、処理液循環方式を採用し、固形分濃度６０重量％の反応液６６６ｇをアップフローで供給した。精製処理前の糖組成、精製処理中の糖組成の変化を系のｐＨと共に次の表２に示す。
【００４５】
【表２】
0003643603.tif 000006
【００４６】
２０時間処理後のものにも少量のグルコースが検出されているが、これは転移反応終了後、シュクロースが分解されて生じたものと判断される。
【００４７】
実施例３
フラクトシルトランスフェラーゼとしてオウレオバシディウム・プルランスまたはアスペルギルス・ジャポニクスを用い、実施例１および参考例に準じてホウ酸共存下または非共存下の転移反応を行い、１−ケストースGF2 とニストースGF3 （ただし少量のGF4 、GF5 を含む）の経時的な生成割合を測定した。転移反応条件は、シュクロース仕込み量は１００ｇ、転移反応時のホウ酸添加量はグルコース生成量２５％として 4.3ｇ、酵素使用量は１０ｕ／シュクロース、ｐＨは 5.0, 温度は５０℃に設定した。結果を図２に示す。
【００４８】
図２から、ホウ酸の添加は何ら酵素障害を示さないこと、転移率もホウ酸添加の有無により事実上差がないことがわかる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明においては、ホウ酸類のα型グルコースに対する錯体形成能力を利用している。錯体形成反応はイオン反応であるので、反応率が高くかつ反応速度が速い。グルコースに対する除去の選択性が高いことは、回収率が高いことを意味する。また分離したフラクトオリゴ糖濃度を高く（たとえば５０％以上）することができるので、濃縮が容易である。
【００５０】
ホウ酸類はフラクトオリゴ糖の製造工程における酵素反応の当初から系中に共存させるが、フラクトオリゴ糖を酵素反応により製造する場合、ホウ酸類の存在は転移反応を阻害せず、また転移率はホウ酸類無添加の場合と変らない。
【００５１】
生成した錯体は、アニオン交換樹脂との接触により容易かつ確実に除去することができる。
【００５２】
そのほか、本発明の方法にあっては、ホウ酸類が安価であることも工業上有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  転移反応終了時点の糖組成と、アニオン交換樹脂充填カラムによる精製処理後の糖組成を示したグラフである。
【図２】  １−ケストースGF2 とニストースGF3 の経時的な生成割合を示したグラフである。
【図１】
0003643603.tif 000007
【図２】
0003643603.tif 000008