(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）
【化１】
0003718890.tif 000013
[式中、Ｒ1はＡ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−基（Ａは置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）又はＮＨＲ2で示されるアミノ基（Ｒ2はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基及びイソブチル基からなる群から選択される低級アルキル基、又はフェニル基を表す。）を表す。Ｘは酸素原子又はＮＲ3で示されるイミノ基（Ｒ3は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基及びイソブチル基からなる群から選択される低級アルキル基）を表す。Ｙは酸素原子又は硫黄原子を表す。]で表わされるＮ−ベンゾイルプロリンエステル誘導体。
【請求項２】
Ｒ1はＮＨＲ2で示されるアミノ基（Ｒ2はメチル基又はフェニル基を表す。）であり、ＸはＮＲ3で示されるイミノ基（Ｒ3は水素原子又はメチル基を表す。）であり、Ｙは酸素原子又は硫黄原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1はＡ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−基（Ａはフェニル基を表す。）であり、Ｘは酸素原子又はＮＲ3で示されるイミノ基（Ｒ3は水素原子又はメチル基を表す）であり、Ｙは酸素原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物を有効成分とする消化器官系疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コレシストキニン（ＣＣＫ）−Ａ、Ｂ受容体及びガストリン受容体に対して優れた拮抗作用を有し、さらにヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、以下ＨＰと略称する。）に対して強い抗菌作用を示すことから、消化器官系疾患、特に消化性潰瘍等の予防及び治療に有用なＮ−ベンゾイルプロリンエステル誘導体を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明化合物と類似の構造を持ったプロリン誘導体は、種々提案されており、例えばＡＣＥ阻害作用を有する降圧剤であるカプトプリル、エナラプリル（特開昭５２−１１６４５７号公報）等が知られている。また、プロリン残基を有するペプチド誘導体としては、冠疾患及び器質性脳症候群治療剤（特開昭６２−２１５５２３号公報）、プロリンエンドペプチダーゼ阻害作用を有する抗健忘症剤（特開昭６４−６８３９６号公報）及びＣＣＫ−ガストリン受容体拮抗剤（アメリカ特許  ５３４０８０１号）等が知られている。さらに、特開平７−２５２２１７号公報には蛋白分解酵素阻害活性を有する経口抗凝固剤及び膵疾患治療剤等に有用なプロリンアミド誘導体が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＰに対する抗菌作用並びにこの作用を有する物質については、日本臨床第５１巻、第１２号（１９９３年）に記載されている。すなわち、ＨＰはヒト胃粘膜表層部から分離された微好気性グラム陰性螺旋状短桿菌であり、ヒトの胃及び十二指腸疾患に深く関与していることが指摘されている。特に本菌の感染が消化性潰瘍の治癒の遷延と難治化および再発の大きな要因であることが明らかにされるに従って、消化性潰瘍の再発予防及び治療をする上でＨＰの除菌を試みることが必須であると考えられるようになった。現在のところ、ＨＰを除菌するためには、ペニシリン系、セファロスポリン系、テトラサイクリン系、ニュ−キノロン系、マクロライド系等の抗生物質、ビスマス製剤、プロトンポンプインヒビター、ヒスタミンＨ2受容体拮抗剤及びプラウトノ−ル、ソファルコン、塩酸ベネキサ−ト等の抗潰瘍剤とを組み合わせて投与する併用療法が試みられている。しかしながら、ＨＰに対して未だ充分な除菌効果が得られていないのが現状で、より有効な抗菌剤が望まれている。
一方、ＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ及びガストリン受容体拮抗作用並びにそれらの作用を有する物質についてはアナールス  オブ  ザ  ニューヨーク  アカデミーオブ  サイエンス、第７１３巻、１〜１６７ページ（１９９４年）［Annals of The New York Academy of Sciences,713,1〜167(1994)］に記載されている。すなわち、ＣＣＫ及びガストリン受容体に対して拮抗作用を示す物質は、消化器官系疾患の予防及び治療に有効であるとして、現在までに数多くの拮抗性物質が見い出されている。また、消化性潰瘍の予防及び治療薬としてもプログルミドをはじめとして、グルタミン酸誘導体、Ｎ−アシルトリプトファン誘導体、グリシン尿素誘導体、１，４−ベンゾジアゼピン誘導体等数多くのＣＣＫ及びガストリン受容体拮抗物質が見い出されている。
以上のように消化器官系疾患、特に消化性潰瘍の再発予防及び治療には、ＨＰに対する抗菌剤やＣＣＫ及びガストリン受容体拮抗物質が有用であることが知られている。しかしながら、消化器官系疾患、特に消化性潰瘍の再発予防及び治療に有用であると考えられるＣＣＫ及びガストリン受容体拮抗作用並びにＨＰに対する抗菌作用を併せ持った医薬品は現在のところ知られておらず、両作用を併せ持つことで、より優れた予防及び治療効果が期待できる。
従って、本発明は、ＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ及びガストリン受容体拮抗作用を有し、さらに、消化性潰瘍に深く関与していると考えられているＨＰに対して優れた抗菌作用を併せ持つ消化器官系疾患、特に消化性潰瘍の再発予防及び治療するための医薬組成物を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記のような状況に鑑みて、鋭意研究を行った結果、従来のプロリン誘導体とは異なる新規なＮ−ベンゾイルプロリンエステル誘導体がＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ及びガストリン受容体拮抗作用を有し、かつＨＰに対して強い抗菌作用を有することを見い出し、本発明を完成することができた。
【０００５】
すなわち、本発明は、下記の一般式（Ｉ）で表されるＮ−ベンゾイルプロリンエステル誘導体を有効成分とするＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ、ガストリン受容体拮抗作用及びＨＰに対する抗菌作用を有する消化器官系疾患、特に消化性潰瘍の再発予防及び治療するための医薬組成物に関する。
【０００６】
【化２】
0003718890.tif 000002
【０００７】
［式中、Ｒ1はＡ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−基（Ａは置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）又はＮＨＲ2で示されるアミノ基（Ｒ2は水素原子、低級アルキル基、シクロアルキル基、低級アルケニル基、アラルキル基又はフェニル基を表す。）を表す。Ｘは酸素原子又はＮＲ3で示されるイミノ基（Ｒ3は水素原子、低級アルキル基、ベンジル基又はフェニル基を表す。）を表す。Ｙは酸素原子又は硫黄原子を表す。］で表される。
【０００８】
以下に、上記一般式（Ｉ）で表される本発明のＮ−ベンゾイルプロリンエステル誘導体におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ及びＹの具体例を示す。
【０００９】
Ｒ1が、Ａ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−基で示される場合のＡとしては、フェニル基、４−トリル基、３，４−ジメチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基及び４−クロロフェニル基等を挙げることができるが、特にフェニル基が好ましい。
また、Ｒ1がＮＨＲ2で示されるアミノ基である場合のＲ2としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、シクロヘキシル基、アリル基、ベンジル基、フェネチル基及びフェニル基等を挙げることができるが、特にメチル基又はフェニル基が好ましい。
【００１０】
Ｘとしては、酸素原子が好ましい。
【００１１】
また、ＸがＮＲ3で示されるイミノ基である場合のＲ3としては、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ベンジル基及びフェニル基等を挙げることができるが、特に水素原子又はメチル基が好ましい。
【００１２】
Ｙとしては、酸素原子又は硫黄原子が好ましい。
【００１３】
更に、本発明化合物（Ｉ）は、少なくとも１つの不斉中心を含有しており、これらの光学異性体も本発明に含まれる。更に本発明化合物（Ｉ）には、構造による幾何異性体も含まれる。
【００１４】
上記一般式（Ｉ）で表されるＮ−ベンゾイルプロリンエステル誘導体は、種々の方法で製造できるが、代表的な方法を挙げれば以下の通りである。
【００１５】
【化３】
0003718890.tif 000003
【００１６】
［式中、Ｒ1、Ｘ及びＹは前記と同義である。］
【００１７】
本発明に含まれる化合物（Ｉ）は、２−置換エチルアルコール誘導体（II）とＮ−ベンゾイルプロリン（III）を、通常、塩基の存在又は非存在下で溶媒中、ペプチド合成に使用されるカップリング試薬を用いて反応させることにより製造できる。反応に用いる溶媒は、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒を挙げることができるが、特に塩化メチレン及びテトラヒドロフランが好ましい。また、この反応に用いる塩基としては、４−ジメチルアミノピリジンが好ましい。さらにカップリング試薬としては、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール、Ｎ，Ｎ′−ジスクシンイミドカーボナート、Ｎ，Ｎ′−ジスクシンイミジルオキザラート等を挙げることができるが、特にＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドが好ましい。
反応温度は０℃から溶媒の沸点程度であるが、特に室温程度が好ましく、反応時間は通常３０分から４８時間の範囲内で行うことができる。
【００１８】
前記の反応において原料として用いた２−置換エチルアルコール誘導体（IIａ、IIｂ及びIIｃ）は、以下の方法により製造することができる。
【００１９】
【化４】
0003718890.tif 000004
【００２０】
［式中、Ｒ2、Ｒ3及びＹは前記と同義である。］
【００２１】
化合物（IIａ）は、化合物（IV）と化合物（Ｖ）を原料に用い、ジャーナル  オブ  ファーマシュチカル  サイエンス、第５９巻、第１０号、１５１５〜１５１８ページ（１９７０年）［J. Pharm. Sci., 59(10), 1515〜1518(1970)］に記載の方法に従って合成できる。
【００２２】
【化５】
0003718890.tif 000005
【００２３】
［式中、Ｒ1及びＲ3は前記と同義である。］
【００２４】
化合物（IIｂ）は、化合物（VI）と化合物（VII）を原料に用い、ＷＯ９４／１４７４９号に記載の方法に従って合成できる。
【００２５】
一方、化合物（IIｃ）は、化合物（VI）と化合物（IV）を原料に用い、ジャーナル  オブ  ファーマシー  アンド  ファーマコロジー、第２９巻、１４７〜１５２ページ（１９７７年）［J. Pharm. Pharmac., 29, 147〜152(1977)］に記載の方法に従って合成できる。
【００２６】
本発明化合物（Ｉ）はＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ、ガストリン受容体拮抗作用及びヘリコバクター・ピロリに対する強い抗菌作用を有することから消化器官系疾患の予防及び治療に有用である。本発明化合物を医薬として用いる場合の一般的な製剤の形態としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤又は注射剤などとして、経口又は非経口的に投与することができる。
【００２７】
製剤化の際は、通常の製剤担体を用い、常法に従って製造できる。すなわち、経口用固形製剤を製造する場合は、主薬に賦形剤及び必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法に従って錠剤、被覆製剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。ここで賦形剤としては、例えば乳糖、ショ糖、デンプン、タルク、セルロース、デキストリン等が用いられる。これらの錠剤、顆粒剤に糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングを施すことは何等差し支えない。また、非経口投与のための注射剤を調製する場合には、主薬に溶剤又は懸濁剤、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、レシチン等が用いられ、必要に応じてｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とすることができる。
【００２８】
本発明化合物（Ｉ）の投与量及び投与回数は患者の症状、年齢、体重等に応じて適宜選択することができる。例えば、一般成人に対して一日５〜１５００ｍｇ、好ましくは２０〜８００ｍｇを１回から数回に分けて投与してもよいし、間欠投与してもよい。また、注射剤として用いる場合には、一回量０．０１〜１００ｍｇを連続又は間欠投与してもよい。
【００２９】
【実施例】
以下に、本発明を実施例、製剤例及び試験例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例、製剤例及び試験例に限定されるものではない。
【００３０】
〔実施例１〕
Ｎ−［Ｎ−ベンゾイル−（Ｓ）−プロリノイルオキシエチル］−Ｎ′−フェニル尿素の合成
Ｎ−ベンゾイル−（Ｓ）−プロリン（２．１９ｇ，１０ｍｍｏｌ）とＮ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ′−フェニル尿素（１．８ｇ，１０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、４−ジメチアミノピリジン（０．１２２ｇ，１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温でＮ、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ，１０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液を加えた。室温で２０時間攪拌し、不溶物を濾過した後、濾液を減圧乾固し、残査に酢酸エチル（５０ｍｌ）を加えて溶解し、再度不溶物を濾過した。濾液を２Ｎ塩酸洗浄、飽和炭酸ナトリウム水溶液洗浄、次いで飽和食塩水洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー〔溶出溶媒：クロロホルム−酢酸エチル（５：１から１：１）の混合溶媒〕により精製し、表記化合物（３．５５ｇ，９３％）を無色油状物として得た。
【００３１】
［α］D；−３７．７（２４℃，ｃ＝１．１，ＭｅＯＨ）
ＩＲ（ｎｕｊｏｌ法）νmax ｃｍ-1；３３５２（ＮＨ），１７３４（Ｃ＝Ｏ）
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（＋） ｍ／ｚ；３８２（Ｍ＋１）+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ；１．８−２．２  ａｎｄ  ２．４−２．６（３Ｈ ａｎｄ １Ｈ，ｍ，ｐｒｏｌｉｎｅ−ＣＨ2ＣＨ2），３．２５−３．４５，３．５５−３．８５，３．９５−４．１，４．５−４．６５  ａｎｄ  ４．７−４．８５（１Ｈ，３Ｈ，１Ｈ，１Ｈ  ａｎｄ  １Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｎ，ＣＨＮ  ａｎｄ ＣＨ2Ｏ），６．１３（１Ｈ，ｍ，ＮＨ），６．８−６．９ ａｎｄ ７．０−７．１５（１Ｈ  ａｎｄ  ４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），７．２６（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），７．４−７．６５（５Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ）
元素分析（Ｃ21Ｈ23Ｎ3Ｏ4）
理論値（％）：Ｃ，６６．１３；Ｈ，６．０８；Ｎ，１１．０２
実測値（％）：Ｃ，６５．６７；Ｈ，５．８５；Ｎ，１０．９０
【００３２】
〔実施例２から６〕
実施例１と同様の方法で得られた化合物を一括して表１に示した。
【００３３】
【表１】
0003718890.tif 000006
【００３４】
〔実施例７〕
［Ｎ−ベンゾイル−（Ｓ）−プロリノイルオキシ］エチル−（Ｅ）−４−オキソ−４−フェニル−２−ブテノエートの合成
Ｎ−ベンゾイル−（Ｓ）−プロリン（２．１９ｇ，１０ｍｍｏｌ）と（Ｅ）−２−ヒドロキシエチル−４−オキソ−４−フェニル−２−ブテノエート（２．２１ｇ，１０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（０．１２２ｇ，１ｍｍｏｌ）を加えた後、室温でＮ、Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．０６ｇ，１０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１０ｍｌ）溶液を加えた。室温で２０時間攪拌し、不溶物を濾過した後、濾液を減圧乾固し、残査に酢酸エチル（５０ｍｌ）を加えて溶解し、再度不溶物を濾過した。濾液を２Ｎ塩酸洗浄、飽和炭酸ナトリウム水溶液洗浄、次いで飽和食塩水洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー〔溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（５０：１）さらにヘキサン−酢酸エチル（２：１）の混合溶媒〕により精製し、表記化合物（１．３ｇ，３１％）を淡黄色油状物として得た。
【００３５】
［α］D；−３９．７（２４℃，ｃ＝１．０３，ＭｅＯＨ）
ＩＲ（ｆｉｌｍ法）νmax ｃｍ-1；１７２６（Ｃ＝Ｏ）
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（＋） ｍ／ｚ；４２２（Ｍ＋１）+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ；１．８−２．１５  ａｎｄ  ２．２５−２．４５（３Ｈ ａｎｄ １Ｈ，ｍ，ｐｒｏｌｉｎｅ−ＣＨ2ＣＨ2），３．４５−３．７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｎ），４．３５−４．５５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｏ），４．６５−４．７５（１Ｈ，ｍ，ＣＨＮ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，＝ＣＨ），７．３−７．７（８Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），７．９−８．０５（３Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ ａｎｄ ＝ＣＨ）
元素分析（Ｃ24Ｈ23ＮＯ6）
理論値（％）：Ｃ，６８．４０；Ｈ，５．５０；Ｎ，３．３２
実測値（％）：Ｃ，６７．９０；Ｈ，５．２６；Ｎ，３．３２
【００３６】
〔実施例８〕
Ｎ−｛［Ｎ−ベンゾイル−（Ｓ）−プロリノイルオキシ］エチル｝−（Ｅ）−４−オキソ−４−フェニル−２−ブテナミドの合成
実施例１と同様の方法で表記化合物（２．６５ｇ，６３％）を淡黄色油状物として得た。
［α］D；−２９．９（２６℃，ｃ＝１．０７，ＭｅＯＨ）
ＩＲ（ｆｉｌｍ法）νmax ｃｍ-1；３３００（ＮＨ），１７４２（Ｃ＝Ｏ）
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（＋） ｍ／ｚ；４２１（Ｍ＋１）+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ；１．８−２．２  ａｎｄ  ２．２８−２．４２（３Ｈ  ａｎｄ  １Ｈ，ｍ，ｐｒｏｌｉｎｅ−ＣＨ2ＣＨ2），３．５−３．８５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｎ），４．２５−４．４６（３Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｏ  ａｎｄ  ＣＨＮ），６．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，＝ＣＨ），７．３−７．６５（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ  ａｎｄ  ＮＨ），７．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，＝ＣＨ），７．９５−８．０５（２Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ ）
元素分析（Ｃ24Ｈ24Ｎ2Ｏ5）
理論値（％）：Ｃ，６８．５６；Ｈ，５．７５；Ｎ，６．６６
実測値（％）：Ｃ，６８．６７；Ｈ，５．５８；Ｎ，６．３１
【００３７】
〔実施例９〕
Ｎ−｛［Ｎ−ベンゾイル−（Ｓ）−プロリノイルオキシ］エチル｝−Ｎ−メチル−（Ｅ）−４−オキソ−４−フェニル−２−ブテナミドの合成
実施例１と同様の方法で表記化合物（０．９５ｇ，２２％）を淡黄色油状物として得た。
［α］D；−４９．２（２５℃，ｃ＝１．００，ＭｅＯＨ）
ＩＲ（ｆｉｌｍ法）νmax ｃｍ-1；１７４４（Ｃ＝Ｏ）
ＦＡＢ−Ｍａｓｓ（＋） ｍ／ｚ；４３５（Ｍ＋１）+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ；１．８−２．１５  ａｎｄ  ２．２５−２．４（３Ｈ ａｎｄ １Ｈ，ｍ，ｐｒｏｌｉｎｅ−ＣＨ2ＣＨ2），３．１４ ａｎｄ ３．２８（３Ｈ，ｅａｃｈ  ｓ，Ｎ−ＣＨ3），３．４５−３．９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｎ），４．３−４．７（３Ｈ，ｍ，ＣＨ2Ｏ ａｎｄ ＣＨＮ），７．３−７．７（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ  ａｎｄ  ＝ＣＨ），７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，＝ＣＨ），８．０−８．１（２Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ ）
元素分析（Ｃ25Ｈ26Ｎ2Ｏ5）
理論値（％）：Ｃ，６９．１１；Ｈ，６．０３；Ｎ，６．４５
実測値（％）：Ｃ，６８．７１；Ｈ，６．１７；Ｎ，６．１７
【００３８】
〔製剤例１〕
実施例８の化合物及び乳糖を混合粉砕し、この混合物に乳糖、コーンスターチ、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、タルクを加えて、さらに均一に混合し、打錠機を用いて加圧成型して有効成分５０ｍｇを含有する２００ｍｇ／錠の錠剤を製造した。
0003718890.tif 000007
【００３９】
〔製剤例２〕
下記成分を混合し、打錠機を用いて加圧成型して有効成分１００ｍｇを含有する２２５ｍｇ／錠の錠剤を製造した。
0003718890.tif 000008
【００４０】
〔製剤例３〕
実施例７の化合物及び乳糖を混合粉砕し、この混合物を乳糖、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース及び軽質無水ケイ酸を加えて、さらに均一に混合した。これを１カプセルあたり２００ｍｇの割合で３号ゼラチン硬カプセルに充填してカプセル剤を製造した。
0003718890.tif 000009
【００４１】
〔製剤例４〕
下記化合物をよく混合した後、湿潤液（３０％エタノール）を加えて練合し、押し出し造粒機で造粒し、直ちにマルメライザーで整粒した後、乾燥、篩過して１２〜４２メッシュの柱状顆粒を製造した。
柱状顆粒２００ｍｇ中の組成
0003718890.tif 000010
【００４２】
〔製剤例５〕
実施例７の化合物を１ｍｌあたり１ｍｇ含有する下記成分からなる注射剤を常法により製造した。
実施例７の化合物                          １０ｍｇ
注射用ポリエチレングリコール４００          ２ｍｌ
塩化ナトリウム                              １ｍｇ
注射用蒸留水を加えて全量１０ｍｌとする。
【００４３】
〔試験例１〕  インビトロにおけるＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ及びガストリン受容体拮抗作用に関する試験
（１）  ＣＣＫ−Ａ及びＣＣＫ−Ｂ受容体拮抗作用
ＣＣＫ受容体標品の作成：
ｄｄＹ系雄性マウスを断頭屠殺後、膵臓（ＣＣＫ−Ａ）及び大脳皮質（ＣＣＫ−Ｂ）を速やかに摘出した。
受容体標本（粗膜分画）の調製：
マウスを断頭屠殺し、直ちに大脳及び膵臓を取り出し、あらかじめ冷却しておいたＰＢＳ液で洗浄し、大脳皮質を分離した。膵臓及び大脳皮質は冷却した５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）で再度洗浄した。膵臓は０．５〜１．０ｇ／バイアルに秤量し、使用時まで−８０℃に保存した。１０倍量の５０ｍＭトリスバッファーを加え、テフロン−ガラスホモジナイザーにてホモジナイズ（７ストローク）し、さらにポリトロンホモジナイザーにて２０秒間ホモジナイズした。１５分間４００００×ｇにて遠心分離し、ペレットを得た。さらに１０倍量の５０ｍＭトリスバッファーを加え、ポリトロンホモジナイザーにて２０秒間ホモジナイズし、同様に遠心分離し、ペレットを得た（２回繰り返し、蛋白質量を測定した）。１０倍量のインキュベーションバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2０、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び０．２５ｍｇ／ｍｌバシトロシンを含む）を加え、ポリトロンホモジナイザーにて２０秒間ホモジナイズ後、同バッファーにて大脳皮質は最終的に２００倍、膵臓は１００倍希釈し、それぞれＣＣＫ−Ｂ及びＣＣＫ−Ａ受容体標本とした。
バインディングアッセイ：
被験薬液の調製：ガラス試験管にそれぞれ被験化合物を秤量し、ＤＭＳＯ液に溶解して１０ｍＭ濃度、さらに蒸留水で２倍、５０％ＤＭＳＯ液で２倍希釈して２．５ｍＭ（最終濃度０．１ｍＭ）の被験薬液を調製した。
チューブに被験薬液２０μｌ、［3Ｈ］ＣＣＫ−８（５０ｎＭ）１０μｌ及び受容体標本４７０μｌを添加した。２５℃で３０分間インキュベーションした後、吸引濾過し（Ｗｈａｔｍａｎ  ｇｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒ，ＧＦ／Ｃ）、冷却した５０ｍＭトリスバッファーにて３回洗浄した。５ｍｌのインスタゲルカクティルを加え、振盪後数時間放置し、放射能を液体シンチレーションカウンターにより５分間計測した。総結合数の測定は、被験薬液の代わりに５０％ＤＭＳＯ液２０μｌを用い、また非特異的結合数の測定には、セルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）（１μＭ）２０μｌを用い、同様に行った。被験薬液（０．１ｍＭ濃度）の特異的な結合数［総結合数（ｄｐｍ）−非特異的結合数（ｄｐｍ）］を算出し、競合的阻害率を求め、その結果を表２に示した。
【００４４】
（２）  ガストリン受容体拮抗作用
ガストリン受容体標品の作成：
Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモットを断頭屠殺後、胃を速やかに摘出し、バーグリン及びオブリンク、アクタ・フィジオロジカ・スカンジナビカ、第９６巻、第１５０ページ、１９７６年［Berglingh and Obrink, Acta Physiologica Scandinavica, 96, 150(1976)］およびプライスマンら、Ｃ．Ｊ．レセプター・リサーチ、第３巻、１９８３年［Praissman et al., C. J. Receptor Res., 3(1983)］の方法に従って、胃粘膜腺を調製した。
受容体標本（遊離胃腺）の調製：
モルモットを断頭屠殺し、直ちに胃を摘出し、大弯部を切開し内容物を冷水中で洗浄した。胃粘膜を剥離し、完全に洗浄した後、下記成分からなる標準緩衝液中鋭いはさみで切り刻んだ（１２８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭ  グルコース及び４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ｐＨ７．４の１２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳに０．０２５％トリプシンインヒビター、ＭＥＭビタミン溶液、ＭＥＭアミノ酸溶液を添加）。切り刻んだ組織を洗浄した後、０．１％コラゲナーゼ及び０．１％ＢＳＡを含有した緩衝液と共に３７℃の振盪浴中で４０分間インキュベーションした。組織を２０ｍｌプラスチック製シリンジに４回通過させて胃腺を遊離させた後、２００メッシュフィルターに通して濾過した。濾過した胃腺を２７０×ｇで２分間遠心分離し、再懸濁及び遠心分離によって２回洗浄し、ガストリン受容体標本とした。
バインディングアッセイ：
被験薬液の調製：ガラス試験管にそれぞれ被験化合物を秤量し、ＤＭＳＯ液に溶解し１０ｍＭ濃度（最終濃度０．１ｍＭ）を被験薬液を調製した。
調製した洗浄済みモルモット胃腺をバシトラシン０．２５ｍｇ／ｍｌ含有標準緩衝液４０ｍｌに再懸濁した。シリコナイズした１．５ｍｌプラスチックチューブに胃腺２３０μｌを加え、１５分間インキュベーションした後、１０μｌの緩衝液（全結合用）又はガストリン（最終濃度１μＭ、非特異的結合用）と２．５μｌのＤＭＳＯ又は被験薬液及び１０μｌの125Ｉ−ガストリン（ＮＥＷ、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、最終１００ｐＭ）を加えた。２５℃で１５分間のインキュベーションした後、冷却した緩衝液１ｍｌを添加し、９０００×ｇで１分間遠心分離した。さらに０．５ｍｌの緩衝液で洗浄後、遊離胃腺が沈殿したプラスチックチューブの先端をカットすることにより採取した遊離胃腺の放射能をガンマーカウンターにより計測した。被験薬液（０．１ｍＭ濃度）の特異的な結合数［総結合数（ｄｐｍ）−非特異的結合数（ｄｐｍ）］を算出し、競合的阻害率を求め、その結果を表２に示した。
【００４５】
【表２】
0003718890.tif 000011
【００４６】
〔試験結果〕  前記の表２の結果から、本発明化合物はＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ及びガストリン受容体拮抗作用を有することが明らかとなった。
【００４７】
〔試験例２〕  ヘリコバクター・ピロリに対する抗菌作用
寒天希釈法を用い、それぞれのヘリコバクター・ピロリ（標準菌株  ＡＴＣＣ４３５０４及びＡＴＣＣ  ４３５２６）に対する抗菌活性を測定した。試験に先立って、５％馬脱繊血を含むトリプチケース  ソイ  寒天（Tripticase soyagar）斜面培地上、ＨＰ菌を１０％ ＣＯ2／９０％ air条件下、３７℃  ４日間前培養した。その後、２mlのブルセラ液体培地（Brucella broth）を加え、軽くピペッティングすることによりＨＰ菌液を回収した。次に、得られた菌液の１００μｌを９６穴マルチウエルプレートに取り、６５０ｎｍにおける濁度を測定し、マックファーランド（MacFarland）Ｎｏ．２［衛生検査技術講座  ４，微生物学（第５版），３３８〜３３９（１９６９）］の濁度（ＯＤ６５０  約０．１４８）になるようにブルセラ液体培地で調製した。一方、被験化合物はジメチルスルホキシドに溶解し、この溶媒の最終濃度が１％以下になるように滅菌蒸留水を加え、５μｇ／ｍｌから８０ｍｇ／ｍｌの２倍希釈系列の被験薬液を調製した。この被験薬液を８０μｌをオートクレーブ滅菌後、４８℃に保温した１０％無菌馬血清を含むミューラー・ヒントン寒天培地（Mueller Hintone agar）８ｍｌに、被験薬液８０μｌを加え、充分に混合した後に直径６０ｍｍのシャーレに注ぎ、放冷固化してこれを試験培地とした。次に、この試験培地にブルセラ液体培地で調製したＨＰ菌液５μｌをマイクロプランターで接種し、ガスパックジャー中、微好気下に３７℃で３日間培養した後、肉眼で可視的発育を示さない最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。なお、対照薬として、ストレプトマイシン、オメプラゾール及びプラウノトールを使用し、被験化合物と同様に操作してそれぞれのＭＩＣ値を求めた。それらの結果を表３に示した。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
〔試験結果〕  前記の表３の結果から、本発明化合物はＨＰに対して、強い抗菌作用を有することが明らかとなった。
【００５０】
〔試験例３〕  急性毒性試験
本発明化合物（５００ｍｇ／ｋｇ）を０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液に懸濁し、２４時間絶食したｄｄＹ系雄性マウス（５週令、一群５匹）に、経口投与し、投与後７日間観察したところ、全例に死亡例は認められなかった。
【００５１】
【発明の効果】
以上の結果から、本発明化合物（Ｉ）は、ＣＣＫ−Ａ、ＣＣＫ−Ｂ、ガストリン受容体拮抗作用及びＨＰに対して強い抗菌作用を有することから、消化器官系疾患の予防及び治療薬として有効である。