(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD3と結合する抗原結合領域と、変異されたFcレセプター結合領域を含むヒトFc領域とをさらに含むモノクローナル抗体であって、該抗体は、抗体OKT3と比較して減少したＴ細胞活性化特性を有し、該変異されたFcレセプター結合領域は234位および235位にアラニン残基を含み、該抗体は補体に結合しない、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体が、OKT3と呼ばれるネズミ抗体に由来する抗原結合領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記ヒトFc領域が、IgG1部またはIgG4 Fc部分である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記ヒトFc領域が、IgG1である、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
前記抗体が、OKT3と呼ばれるネズミ抗体に由来する抗原結合領域およびIgG1FC部分を含むことでさらに規定される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体の、免疫応答を引き金とする移植器官組織の拒絶反応の抑制用薬剤の製造のための使用であって、該薬剤が、生理学的に受容可能なキャリヤ中に含まれて、移植前、移植中、または移植後のいずれかに、器官移植患者に投与される、使用。
【請求項７】
移植前、移植中、または移植後のいずれかの器官移植患者への投与によって、免疫応答を引き金とする移植器官組織の拒絶反応を抑制するための薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリヤ中の請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般に、臓器移植および自己免疫疾患の治療に用いられるネズミOKT3由来の免疫抑制剤の免疫学的活性および毒性のモジュレーション（modulation）のための方法ならびに物質に関する。
発明の背景
OKT3は、ヒトCD3複合体内のεサブユニット上のエピトープを認識するネズミモノクローナル抗体（mAb）である（Salmeron,1991;Transy,1989;米国特許第4,658,019号も参照のこと、これらは、本明細書中に参考として援用される）。OKT3は用いたアッセイ次第で強力なＴ細胞の活性化および抑制の特性を有することが、研究により実証された（Landgren,1982;Van Seventer,1987;Weiss,1986）。TcRへのOKT3の結合は、TcRのコーティングおよびまたはモジュレーションを生じ、これによりTcRの遮断（blockade）を仲介し、そしてアロ抗原の認識および細胞介在性細胞毒性を阻害することになる。TcRに結合した抗CD3 mAbのFcレセプター介在性架橋は、Ｔ細胞活性化マーカーの発現および増殖を生じる（Weiss,1986）。同様に、OKT3のインビボ投与は、Ｔ細胞の活性化および免疫応答の抑制の両方を生じる（Ellenhorn,1992;Chatenoud,1990）。OKT3の連日反複投与は、強い免疫抑制を生じ、そして腎移植後の拒絶反応の効果的な治療を提供する（Thistlethwaite,1984）。
げっ歯類のmAbに対する免疫応答の産生は、それらの治療用途にとって主要な障害である。数グループが、免疫原性のネズミ定常領域の配列をその等価のヒト抗体の配列に置換してげっ歯類の抗体遺伝子を再構築することによって、この問題を回避するための試みを報告している（Adair,1992に概説）。しかし、これらのような場合には、その可変領域に対する免疫応答を開始する可能性が依然としてある。この手法のさらなる展開において、可変領域のフレームワーク（framework）領域は、ヒト可変領域遺伝子由来の等価の配列に置換された。抗原−抗体複合体の入手可能なＸ線構造（Poljak,1991に概説）の検査によれば、おそらくごく少数の抗体残基は、抗原と直接に接触しているようである。他のアミノ酸は、接触残基を好ましい立体配置に配置することによって、そして個々の可変ドメインの安定なパッキング（packing）、ならびにＬ鎖およびＨ鎖の可変ドメインの安定な相互作用を誘導することによっても、抗原結合に寄与し得る。抗体のドメインは、詳細な検査の対象であった（例えば、Looney,1986およびその中の参考文献を参照のこと）。
OKT3の使用は、「最初の投与（first dose）」の副作用の問題により制限されるが、その副作用は軽いインフルエンザ様の徴候から重篤な毒性までにわたり、そしてそれはOKT3で刺激されたリンホカイン産生によって起こると考えられる。OKT3をうまく再使用することが報告されているが（Woodle,1991）、それはヒト抗マウス抗体（HAMA）応答（OMTSG,1985）によって複雑になり、その抗体の可変領域に指向される応答の一部（Jaffers,1984）により複雑になる。低力価のHAMAは重要な問題を呈示し得ないが、若干の患者は高力価の抗アイソタイプおよび／または抗イディオタイプの応答を有するようになる。これらは特異的な不活性化および／または薬剤の迅速なクリアランスを生じ得る。
OKT3治療について報告された副作用としては、インフルエンザ様の徴候、呼吸困難、神経症状および急性細管壊死が挙げられ、そしてこれらはこのmAbの最初および時には２回目の注射に続いて起こる（Abramowicz,1989;Chatenoud,1989;Toussaint,1989;Thistlethwaite,1988;Goldman,1990）。OKT3の活性化の特性は、Ｔ細胞（そのＦ（ab'）２部分を介して）およびFcγＲを有する細胞（そのFc部分を介して）に結合したmAbにより仲介されるTCR架橋によって得られる（Palacios,1985;Ceuppens,1985;Kan,1986）。従って、免疫抑制を達成する前にOKT3はmAbを結合したＴ細胞およびFcγＲを有する細胞の活性化の引き金となり、その結果mAbの急性毒性の原因となるサイトカインの全身への大量放出を起こす（Abramowicz,1989;Chatenoud,1989）。チンパンジーおよびマウスの実験モデルを用いて得られたデータは、抗CD3 mAbにより誘導される細胞の活性化を妨げるか、あるいは中和することによって、これらの薬剤の毒性が軽減されることを示唆した（Parleviet,1990;Rao,1991;Alegre,Eur.J.Immunol.,1990;Alegre,Transplant Proc.,1990;Alegre,Transplantation,1991;Alegre,J.Immun.,1991;Ferran,Transplantation,1990）。さらに145−2C11、OKT3と多くの特性を共有するハムスターの抗マウスCD3である145−2C11のＦ（ab'）２フラグメントを用いてマウスにおいて以前報告された結果は、FcγＲ結合および細胞の活性化が起こらない場合に、抗CD3 mAbは少なくともいくつかのインビボにおける免疫抑制の特性を保持することを示唆していた（Hirsch,Transplant Proc.,1991;Hirsch,J.Immunol.,1991）。
免疫抑制剤として使用する抗ヒトCD3 mAbの不活性型に対して、大きな必要性が存在する。
ヒトに使用するための抗ヒトCD3 mAbを不活性化することを見い出す初期の試みは、非マイトジェン性抗TCRaβ mAbであるT10B9.1A−31で拒絶反応を受ける腎臓の同種移植レシピエントの治療に関与する。これは、発熱ならびに神経系および呼吸系の副作用の発生を軽減することになった（Lucas,1993;Waid,1992;Waid,1991）。しかし、多少のＴ細胞の活性化あるいは関連する副作用、おそらくこの抗体の特異性のために残存した。さらに、IgM mAbであるために、T10B9.1A−31のクリアランスは、OKT3（IgG2m mAb）のクリアランスよりも速く、これにより高用量のmAbを頻繁に注射することが必要とされる。
OKT3のFcレセプター結合領域内の単一点変異が、Alegreら（1992）およびJolleffe（1993）により記載されている。Ｔ細胞活性化特性が低減される。
mAbの可変領域をコードする配列が定常領域をコードする配列を保持しているキメラ抗体の利用性に関する初期のデータ（Morrison,1984）は、HAMA応答が確実に低減されることが示唆されたヒト抗体から誘導される。しかし、ネズミ可変領域に対するHAMAの応答は、依然として出現し得（Adair,1992に概説）、そしてごく最近ではヒト化のプロセスは、抗原結合に関係すると考えられる可変領域中のそれらのアミノ酸をヒト抗体に置換することによってさらに実施されて、完全にヒト化された抗体を与える（Reichman,1988）。
主要な関心事は、ヒト化抗体がまだ免疫原性を有していることであり、その理由は、産生され得る任意の抗パラトープ抗体に加えて、適切な抗原結合活性を再生するために移入される必要のある非CDR残基が存在するからである。CAMPATH−1HおよびHu2PLAPのようなヒト化抗体が患者に投与された（LoBuglio,1989）。これらの抗体は共に、1987年にKabatにより規定されたげっ歯類のCDRのアミノ酸配列を用いたが、げっ歯類のフレームワーク残基は、27位では、アミノ酸が覆い隠されており、そして30位では、その残基がCDR1付近に溶媒接近可能であると予測される。両者の場合とも、投与された抗体による初期治療に対する特異的な免疫応答は認められなかったが、２回目の治療過程に対する応答は、リウマチ様関節炎の治療に対してCAMPATH−1Hを用いた１つの研究において見られた（Frenken,1991）。他の非CDRの溶媒接近可能な残基もまた設計に含まれているようなヒト化抗体を用いての臨床研究は報告されていない。
Ｔ細胞レセプター/CD3複合体（TCR/CD3）、MHC、CD8、ED45およびCD4のような種々の細胞表面タンパク質の相互作用は、Ｔ細胞応答の刺激において重要であることが示された（Floury,1991,Swartz,1985,Strominger,1980,Weiss,1988）。これらの分子のうちの２つ、すなわちCD4およびCD3は、Ｔ細胞上に物理的に会合されていることが見い出された（Saizawa,1987,Anderson,1988,Rojo,1989,Mittler,1989,Dianzani,1992）。この会合は、Ｔ細胞レセプターが仲介するシグナル変換（signal transduction）にとって重要であり、部分的にはそれらに会合するキナーゼおよびホスフェート活性に起因する（Ledbetter,1990）。これらの相互作用を中断あるいは妨害し得る分子（すなわち抗体）は、現在、腎臓の同種移植の拒絶反応の治療において治療的に有用であると認められている（Ortho Multicenter Transplant Group,1985）。数個のＴ細胞表面タンパク質が１個の抗体によって直接一緒に結合される抗体治療の改変は、現在の免疫療法のプロトコルにおいて有用であることが立証され得た。細胞接着あるいは細胞から細胞への相互作用をブロックすることに加えて、数個の細胞表面タンパク質を架橋し得る抗体は、Ｔ細胞活性の刺激あるいは異常なシグナリングの誘発を生じさせ得、これにより免疫応答のモジュレーションを起こす（Ledbetter,1990）。
CD3およびCD4、あるいはCD3およびCD8のようなＴ細胞の活性化に関与する分子を一緒に運搬することは、免疫活性化に対して強力な方法になり得る。以前の研究により、CD3およびCD4を抗CD3および抗CD4抗体を含む異種複合体と架橋させることは、CD3同志で架橋した場合、またはCD3およびCD4を別の試薬で同時に架橋した場合に認められるよりも大きなCa2+の流動の大きな刺激を生じることが示された（Ledbetter,1990）。同様にCD3およびCD8を固定化抗体の混合物で架橋すると、Ｔ細胞の増殖およびIL−２レセプター発現に関して相乗的な効果を生じる（Emmrich,1986および1987）。一緒になされたこれらの研究は、Ｔ細胞活性化におけるCD3とCD4/8との相互作用について重要な役割を示す。
種々のＴ細胞表面分子を架橋することによる免疫調節（immunomodulatory）効果は、免疫抑制および免疫刺激の両方であり得る。CD4同志の、またはCD4と他のＴ細胞表面分子との架橋は、CD3同志の架橋に比較して異なったパターンのタンパク質リン酸化を生じることが示された（Ledbetter,1990）。この異常なシグナリングは、単一の架橋試薬によってCD3およびCD4の両者に同時に結合する結果として起り得る。以前の研究により、抗CD3処理の前にCD4同志を架橋するために抗体でＴ細胞を前処理することは、Ｔ細胞活性化を阻害し、そしてアポトーシスを促進することが示された（Newell,1990）。これらの結果は、CD4をCD3または他のＴ細胞表面分子で架橋する試薬が、TCR/CD3複合体による不適切なシグナリングのおかげで強力な免疫抑制剤であり得ることを主張した。
発明の簡単な要旨
一般に、本発明は、OKT3に比べて活性化特性を低減した抗ヒトCD3 mAbの産生を意図する。これを達成するための１つの方法は、ヒトIgGフレームワーク上にOKT3の相補的決定領域を移し、FcγＲに対する「ヒト化」抗CD3 mAbの親和性を減少させる点変異を行うことによる。研究は、OKT3および親のヒト化抗CD3 mAbが同様にＴ細胞を活性化するのに対して、ヒト化Fc変異体はＴ細胞を活性化しないことを示す。Fc変異体および活性化抗CD3 mAbは共に、TCRの類似点のあるモジュレーションおよび細胞溶解的なＴ細胞活性の抑制を誘導する。
本発明はさらに、インビボで顕著な免疫抑制特性を保持している、非活性化抗CD3 mAbを有するヒト同種移植者の延命を意図する。従って、臨床的な移植におけるFc変異体の使用は、臨床的効果を維持しながら、OKT3で見られるよりも少ない副作用を生じるべきである。
本発明はさらに、死体の臓器ドナー由来のヒト脾臓細胞が、これらの抗ヒトCD3 mAbの活性化および免疫抑制の特性をインビボで試験するために、重篤な複合型免疫不全マウス（hu−SPL−SCIDマウス）中へ接種されるような実験モデルの活用を意図する。OKT3あるいは親のヒト化mAbの注射とは異なり、Fc変異体の投与は、活性化による表面マーカーおよび全身性ヒトサイトカイン（IL−２を包含する）の誘導の欠如によって示されるように、インビボにおけるＴ細胞活性化を引き起こさない。
長年の特許法の規則に従って、明細書または請求の範囲中で発明を記載するのに用いられる場合の「ａ」および「an」は、「１つまたはそれ以上」の対象が論じられていることを意味している。
本発明の特定の実施態様は以下の通りである。
１つの実施例においては、本発明は、強力な免疫抑制剤であるネズミOKT3抗体の「ヒト化」型を考えている。好適な実施態様においては、本発明の「ヒト化」モノクローナル抗体は、234位にてロイシンへの点変異を含む。別の実施態様においては、本発明の抗体は、235位にてグルタミン酸への点変異を含む。
本発明の好適な実施態様は、ネズミOKT3に対してＴ細胞活性化特性を低減する抗CD3モノクローナル抗体を包含する。いくつかの好適な実施態様においては、ヒトFc領域およびネズミ抗原結合領域を有する「ヒト化」ネズミOKT3抗体は、抗体の産生のための基礎を形成する。例えば、ヒトFc領域は、IgG1またはIgG4のFc部分であり得る。いくつかの好適な抗体においては、ヒトFc領域は、IgG1部分である。
いくつかの実施態様においては、抗体は、ネズミOKT3に対して減少したＴ細胞活性化特性を有する抗体となる変異型Fcレセプター結合領域を有する。Fcレセプター結合領域は、抗体の約220位から約250位に見い出され、そしてこの領域内の変異は、この領域のFcへの結合能を破壊することによって抗体のＴ細胞活性化特性を低減する可能性を有することが予想される。本発明者らは、「ヒト化」抗体の約230位から約240位までにわたる領域における変異が特定の利点を生じ得ることを発見した。Fcに結合する抗体とFcに結合しない抗体との比較は、この領域における変化が、Ｔ細胞を活性化しない抗CD3抗体を生じることを示唆している。例えば、好適な抗体のいくつかは、234位、235位、またはその両方の位置での変異を含む。230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、または240位のうち１つまたはそれ以上の位置で１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を含む抗CD3抗体は、利点を有することが期待される。
変異の目的は、Fcレセプター結合領域の構造を破壊することである。従って、欠失されるアミノ酸とは著しく異なるアミノ酸を挿入する変異は、おそらく構造を破壊し、そして所望の効果を有することが期待されるが、発明は、特異的な位置での特異的変異に限定されない。例えば、本発明者らは、ロイシンのような中性アミノ酸の代わりにグルタミン酸のような荷電アミノ酸に置き換えることによって成功している。本発明者らはまた、フェニルアラニンのような比較的複雑なアミノ酸の代わりにアラニンのような比較的一般のアミノ酸を挿入することにも成功した。当業者は、その領域の破壊に通じる多種多様な変異を理解している。例えば、中性、正、または負に荷電したアミノ酸は、異なる電荷のアミノ酸に置き換えることができる。親水性アミノ酸は、疎水性アミノ酸を置き換えることができ、そして逆もまた同様である。大きなアミノ酸は、小さなアミノ酸を置き換えることができ、逆もまた同様である。α−ヘリックスを破壊するかまたは他の２次構造を破壊するアミノ酸が挿入され得る。
本発明の１つの特定の実施態様においては、「ヒト化」ネズミOKT3抗体は、gOKT3−５である。例えば、本発明者らは、gOKT3−５の235位でのロイシンからグルタミン酸への変異を配置することによって作成されたモノクローナル抗体にある利点を見い出した。他の特定の実施態様においては、「ヒト化」OKT3抗体は、gOKT3−７である。例えば、このようなgOKT3−７ベースの抗体は、234位にてフェニルアラニンからアラニンへの変異、235位にてロイシンからアラニンへの変異、またはその両方を含む。ある好適の抗体は、234位にてフェニルアラニンからアラニンへの変異と、235位にてロイシンからアラニンへの第２の変異を含み、特定の例は、Ala−Ala−IgG4である。
興味深いことに、本発明者らは、IgG1 Fc領域を有し、234位および235位の両方でアラニンを有するように変異したgOKT3−７抗体（gOKT3−７（γ４−a/a））は、補体に結合しないことを見い出した。特に、この抗体は、C1q成分に結合せず、そして補体が仲介するカスケードを開始しない。この結果は、全体的に予想しなかったものであり、そして抗体での処理による補体活性化に関する懸念を除去する利点を有する。当業者は、補体活性化がヒト被験体において引き起こし得た相対的な困難を理解している。
本発明の他の実施態様は、本発明の抗CD3抗体および生理学的に受容可能なキャリヤを含む薬学的組成物を包含する。生理的に受容可能なキャリヤは、治療方法において本発明の抗体の導入を可能にする任意のキャリヤであり得る。
本発明の他の実施態様は、免疫反応が引き起こす移植器官組織の拒絶を抑制する方法を含む。これらの方法は、移植前、移植の間、または移植の後のいずれかに、免疫抑制活性をモジュレート（modulate）する有用なモノクローナル抗体を、器官移植患者に対して投与する工程を包含する。特定の好適な実施態様において、抗体は、変異を有する「ヒト化」ネズミOKT3モノクローナル抗体である。免疫反応が引き起こす移植器官組織の拒絶を抑制する他の好適なある方法は、CD3と名付けられた第１のＴ細胞表面タンパク質、および同時に、第２のＴ細胞表面タンパク質に対する結合を介して免疫反応をモジュレートする抗体を投与する工程を包含する。例えば、第２のＴ細胞表面タンパク質は、CD3、CD4、またはCD8であり得る。
【図面の簡単な説明】
下記の図面および説明は明細書の一部を形成する。
図1.ヒト化OKT3の可変領域の配列  図1Aおよび1Bは、OKT3のＬ鎖（1A）（配列番号６）およびＨ鎖（1B）（配列番号10）の可変ドメインのアミノ酸配列（列１）、アクセプターフレームワークとして選ばれたヒト抗体由来の可変ドメイン配列（列２）、およびヒト化OKT3の可変ドメイン配列（列３−５）（配列番号８、９、12、13および14）を示す。CDRの選択範囲は１本の下線で示す。３列から５列はヒトのアクセプター配列の違いだけを示し、非CDRの違いは２本の下線で示す。ダッシュは配列の整列を最大にするために配列中に導入されたギャップを示す。番号付けはKabatら（1987）に従う。
図2A−2G.ネズミOKT3のアミノ酸およびヌクレオチド配列
図3.相対的親和性の測定  FITC−mOKT3に対する抗原に関するOKT3抗体およびヒト化OKT3抗体との競合。非標識の競合物抗体の濃度を増加させながら亜飽和濃度のFITC−mOKT3トレーサ抗体に添加し、そしてヒトPBMCと１時間４℃でインキュベートした。細胞を洗浄しそして固定し、そして結合ならびに遊離のFITC−mOKT3の量を算出した。抗体の親和性は、式［Ｘ］−［mODTK3］＝（1/KX）−（1/Ka）に従ってそれぞれ計算された、ここでKaはmOKT3の親和性であり、そして＝＝KXは競合物Ｘの親和性である。［  ］は結合トレーサと遊離トレーサの結合比率がR0/2である時の競合物の濃度を示し、そしてR0は最大のトレーサ結合である（Rao,1992）。ＡおよびＢは別々の実験からの結果を示す。黒四角:Orthomune＠OKT3;白丸:cOKT3（γ４）；黒三角:gPLT3−１（γ４）；黒丸:gOKT3−５（γ４）；白四角:gOKT3−７（γ４）；白三角:mOKT4A。
図4Aおよび4B.細胞増殖アッセイ  COS細胞トランスフェクションにより生成する抗CD3抗体に対するヒトPBMCの増殖。PBMCを、増加する量の抗CD3抗体存在下で68時間インキュベートし、次いで3H−チミジンを用いてさらに４時間パルスし、そして3H−チミジンの取り込み量を定量した。
黒四角:Orthomune＠OKT3;白四角:gOKT3−７（γ４）；白三角:mOKT4A。
図5.OKT3の置換アッセイ  「ヒト化」mAbの系列希釈を、材料および方法に記述された様に、CD3複合体への標識OKT3の結合を競合的に阻害するために使用した。値は、標識されたOKT3単独の結合により達成された最大螢光量（フローサイトメーターによる任意の単位）のパーセントで表わされる。記号は以下の抗体に対応する：白丸,gOKT3−6 mAb;黒三角,gOKT3−5 mAb;白四角,Leu−234 mAb,黒丸,Glu−235 mAb。
図7.CH2ドメインのＮ末端
図8.ネズミおよび「ヒト化」抗CD3 mAbにより誘発されるマイトジェン性  PBMCを、H3−チミジンをウエル当り１μCi添加する前に、mAbの系列希釈液と72時間インキュベートした。増殖は、３回の実験から得た１分当りの平均カウント（CPM）で描かれている（SEM＜10％）。これらのデータは、３種類の異なったドナーのPBMCを用いて得られた増殖の代表である。記号は以下の抗体に対応する：白三角,OKT3;黒三角,gOKT3−5 mAb;黒丸,Glu−235 mAb。
図9Aおよび9B.ネズミおよび「ヒト化」OKT3 mAbによる刺激後のＴ細胞表面上における活性化のマーカーの発現  Leu23およびIL−２レセプターのＴ細胞発現は、PBMCを種々の濃度の抗CD3 mAb存在下で、12または36時間培養した後にそれぞれ測定された。細胞をFITCを連結した抗Leu23あるいは抗IL−２レセプター抗体で染色し、そして活性化のマーカーを発現しているＴ細胞画分（PE連結抗体により対比染色されたCD2またはCD5ポジティブ細胞）を、FCMによって測定した。記号は以下の抗体に対応する：白三角,OKT3;黒三角,gOKT3−5 mAb;黒丸,Glu−235 mAb。
図10.ネズミおよび「ヒト化」OKT3 mAbにより誘発されるTNFの放出  PBMCを、異なる抗体の系列希液と24時間培養した。TNF−αの濃度は、市販のキットを用いてELISAにより測定した。値は、３回の実験の平均として表わされる（SEM＜10％）。記号は以下の抗体に対応する：白三角,OKT3;黒三角,gOKT3−5 mAb;黒丸,Glu−235 mAb。
図11A−11C.抗CD3 mAbによって達成されるTCRのモジュレーションおよびコーティング  PBMCを、種々の量の抗CD3 mAbと12時間インキュベートした。TCR複合体のコーティングおよびモジュレーションを、材料および方法中の説明の通りにFCMにより定量した。Ｔ細胞をPEを連結した抗CD5抗体により対比染色した。底部の黒囲みはモジュレートされるCD3複合体の全％、中央部の灰色の囲みは抗CD3 mAbでコートされたCD3複合体の％、そして上部の白斑点の囲みはＴリンパ球表面上のコートされないCD3複合体の％に対応する。
図12.「ヒト化」OKT3 mAbによるＴ細胞の細胞毒性活性の阻害  HLA A2に特異的なエフェクターCTLを、二次混合リンパ球培養によって作成した。A2を発現するLCL標的の溶解は51Cr遊離アッセイにより定量した。値は最大の特異的溶解の％として表わされる。（最大の特異的溶解は、0.1M塩酸で観察される最大溶解の60％であると決定された）。結果は３回の実験の平均として表わされる（SEM＜10％）。記号は以下の抗体に対応する：白丸,gOKT3−6 mAb;白三角,OKT3;黒三角,gOKT3−5 mAb;黒丸,Glu−235 mAb。
図13A−13C.抗CD3 mAbによって誘導されるCD4およびCD8の表面マーカーの平均螢光性の変動
図14.RES−KW3細胞へのCD4の結合
図15.ELISAプレート上でのCD4の結合
図16.「ヒト化」mAbに対するＴ細胞の増殖  可溶性の抗CD3 mAbで誘導されるPBMCによる3Hチミジンの取り込みを調べた。ヒトPBMCは、可溶性のOKT3（黒丸）、209−IgG4（黒四角）、209−IgG1（黒三角）あるいはAla−Ala−IgG4（黒丸）mAbの連続的な対数希釈により72時間インキュベートし、3Hチミジンでさらに４時間パルスし、そしてシンチレーション計数により定量した。すべてのデータは３連の試料についての１分間当りの平均カウントとして示している。
図17.抗CD3 mAbの血清レベル  Hu−SPL−SCIDマウスがOKT3、209−IgG1またはAla−Ala−IgG4を受け入れた（PBS1ml中100μｇを腹腔投与）。これらの動物は注射後１、２、および８日目に採血された。抗CD3の血清レベルは、FCMにより材料および方法に記述されている通りに測定した。結果はグループ当り５匹の平均値±SEMで示している。
図18.Ala−Ala−IgG4はCD69のアップレギュレーションを誘導しない
Hu−SPL−SCIDマウスがPBS（1ml）またはOKT3、209−IgG1もしくはAla−Ala−IgG4で処置された（PBS1ml中100μｇを腹腔投与）。脾臓を注射後24時間目に採収し、単細胞の懸濁液に調製し、そしてFCMにより分析した。PBSで処置されたマウスにおけるCD4+およびCD8+ヒトＴ細胞上の抗ヒトCD69で得られた平均螢光をベースラインとして用いた。結果は、そのベースラインからの増加％として表わし（グループ当り５匹の平均値±SEM）、そして４回の独立した実験を表示する。
図19.抗CD3 mAb注射後のヒトIL−２の産生  Hu−SPL−SCIDマウスがPBS（1ml）または145−2C11、OKT3、209−IgG1もしくはAla−Ala−IgG4を受け入れた（PBS1ml中100μｇを腹腔投与）。マウスは注射後２時間目に採血され、血清をバイオアッセイにより、ヒトIL−２のレベルを「材料および方法」において記述されている通りに分析した。結果はグループ当りマウス４匹の平均値±SEMとして示し、そして２回の独立した実験を表示する。
図20.抗CD3 mAbによるヒト同種移植における生存の延長  SCID（４匹のマウス）およびhu−SPL−SCIDマウス（29匹）に同種のヒト包皮を移植した。hu−SPL−SCIDマウスをPBS（４匹のマウスで１日に1mlを14日間）、145−2C11（４匹のマウス）、OKT3（８匹のマウス）、209−IgG1（６匹のマウス）またはAla−Ala−IgG4（５匹のマウス）で処置した。mAbを１日あたり50μｇを５日間腹腔投与し、その後１日に10μｇを10日間投与した。結果は３回の独立した実験として表示する。両側フィッシャー精度検定（two−tailed FISHER精度（test））を用い、上記３匹の皮膚移植実験における種々のグループを比較した。最良の結果が各実験において異なる抗体によって達成されたので、異なる抗体間に効力の差は見い出されなかった（OKT3対209−IgG:p＝0.12;OKT3対Ala−Ala−IgG:p＝1.0;209−IgG対Ala−Ala−IgG:p＝0.23）。
発明の詳細な説明
I.発明
有効な免疫抑制剤OKT3は、ヒトTCRと結合しているCD3複合体を支配するネズミIgG2a mAbである（Van Wauwe,1980）。しかしながら、移植レシピエントに対するOKT3の投与は、IL−２、IL−６、TNF−α、およびIFN−γを含むいくつかのサイトカインの系統的な遊離を誘導する（Abramowicz,1989;Chatenoud,1989）。このサイトカインの生産は、OKT3の最初の注入の後にしばしば観察される不都合な副作用に関与し（Van Wauwe,1980;Chatenoud,1989;Thistlethwaite,1988）、治療の１、２週間後のいくつかのやり方において生じる抗イソトピック（anti−isotopic）および抗イディオタイプ抗体の生産を増大し得、そしてOKT3を中和し得、その後の拒絶症状の治療を妨げ得る（Thistlethwaite,1998）。
いくつかの証拠が、これら副作用はOKT3のFc部分を介するＴリンパ球とFcレセプター（FcR）保持細胞との間の架橋によるものであり、両方の細胞型を活性化する結果であることを強く示唆している（Debets,1990;Krutman,1990）:1.）Abはプラスチックに固定されているか、あるいは培養物中に含まれるFCR＋抗原提示細胞に結合していなければ、抗CD3 mAbは、インビトロでＴ細胞の増殖を刺激しなかった（van Lier,1989）;2.）FcR IおよびIIを介したOKT3の架橋は、インビトロでIL−２に応答した増殖を増強した（van Lier,1987）;3.）145−2C11、ネズミCD3複合体に対して指示されるハムスターmAb、によって誘導されるネズミＴ細胞の増殖は、抗−FcR Ab、2.4G2によって阻害された;4.）145−2C11のＦ（ab'）２フラグメントのマウスへの注入は、全Ｔ細胞の活性化を引き起こさずに顕著な免疫抑制を誘導し（Hirsch,1990）、全体のmAbよりもマウスにおいて毒性が少なかった（Alegre,1990）;5.）FcRが仲介するＴ細胞の活性化の減少を示すOKT3のIgAスイッチ変異体の投与は、OKT3 IgG2aと比較して、インビボにおけるチンパンジーにとって副作用が少ない結果となった（Parleviet,1990）。
このように、理論的に、抗CD3 mAb療法の改良が、FcRに対する親和性を減らすように分子的に修飾したOKT3によってなされ得る。得られる変異型抗体は、インビボにおいて、細胞活性と急性毒性を低下させるが、免疫抑制特性は保持されている。
II.免疫系
ヒトおよび動物の免疫系は主に２つのクラスのリンパ球を包含する：胸腺由来の細胞（Ｔ細胞）および骨髄由来の細胞（Ｂ細胞）である。成熟したＴ細胞は胸腺から現われ、組織、リンパ系、血流を循環する。Ｔ細胞は、免疫学的特異性を示し、細胞性免疫応答（移植排除のような）に直接関与する。Ｔ細胞は様々な外来構造（抗原）に対して、あるいは応答して、機能する。多くの例において、これら外来抗原は、感染の結果として宿主細胞に示される。しかしながら、これら外来抗原は腫瘍形成や感染によって変化した宿主由来であり得る。Ｔ細胞は、それ自身は抗体を分泌しないが、通常、第２のクラスであるリンパ球、Ｂ細胞、による抗体の分泌のために必要である。
A.Ｔ細胞
様々なＴ細胞のサブセットが存在する。それらは通常、機能的な活性や外来抗原の認識および細胞表面に見られる抗原決定基によって定義される。CD8+細胞のようなＴ細胞のいくつかのサブセットは、免疫系における機能を制御する役割を担っているキラー／サプレッサー細胞であり、他方CD4+細胞のようなサブセットは、炎症や体液性の応答を導く働きを有する。（CDは細胞分化クラスターの意味である；付随する番号は、白血球分化に関する国際ワークショップ（International Workshops on Leukocyte Differentiation）、Immunology Today,10:254,1989によって定められた専門用語に従って規定されている）。免疫系のすべての解釈のための一般的な引用は、Klein,J.Immunology;自己−非自己認識の科学（The Science of Self−Nonself Discrimination）,Wiley ＆ Sons,N.Y.（1982）の中に見い出され得る。
1.Ｔ細胞活性化
ヒトの末梢Ｔリンパ球は、外来抗原、モノクローナル抗体、フィトヘマグルチニンおよびコンカナバリンＡのようなレクチンを含む種々の薬剤によって有糸分裂への移行に対して刺激され得る。活性化は、おそらく細胞膜上の特異的部位へのマイトジェンの結合によって起こるが、これらのレセプターの性質および、それらの活性化機構は殆んど解明されていない。増殖の誘導は、Ｔ細胞活性化の指示にすぎない。活性化の他の誘導は、細胞の基礎または休止段階における変化として規定され、リンホカイン生産および細胞毒性細胞活性の増加を包含する。
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞の世代に応じて発現する様々な細胞表面分子の関与に依存する予期しない複雑な現象である（Leo,1987;Weiss,1984）。例えば、抗原特異的Ｔ細胞レセプター（TcR）は、Ｓ−Ｓ結合したヘテロダイマーから構成されており、二つのクローン的に分割されている膜貫通型糖タンパク質鎖、αおよびβ、またはγおよびδを含有して、通例CD3（古い用語はT3である）と名付けられた低分子量の一様のタンパク質の複合体と非共有結合的に会合している（Leo,1987）。
TcRのαおよびβ鎖は、抗原特異性を決定する（Saito,1987）。CD3構造は、そのリガンドに対するTcRαβの結合によって開始される活性化シグナルの形質導入エレメントとなるアクセサリー分子を提示していると考えられている。TcRの糖タンパク質鎖の定常領域と可変領域（多形性）の両方がある。多形性TcRの可変領域は、明瞭な特異性でＴ細胞のサブセットを規定する。抗原として可溶性外来タンパク質を認識する抗体と異なり、TcR複合体は主要組識適合性遺伝子複合体（MHC）タンパク質に関連した小さなペプチド性抗原と相互作用する。MHCタンパク質は、種の中で任意に広がった、他の高度に多形化したセットの分子を提示している。このように、活性化は通常、TcRと主要なMHCタンパク質に結合した外来ペプチド性抗原との三者間相互作用を必要とする。
Ｔ細胞による外来抗原認識に関して、多形性MHCと結合し、ある一定のＴ細胞レセプターによって認識され、実際的な機構としての免疫応答を誘導するために十分量存在するペプチドの数は、少ない。臨床免疫学における主要な問題の１つは、MHCの多形性抗原が免疫応答を引き起こす上で強い制限を加えていることである。もう１つの問題は、侵入する抗原の量が免疫応答を引き起こすには少なすぎることである。抗原レベルが上昇するまでの時間は、生体を守るための免疫系にとって遅すぎるかも知れない。
個体間のMHCタンパク質のはなはだしい不均一性が、同種移植片による移植の臨床応用における最も深刻な制限因子として残されている。MHCが同じである２個人を見つけることは、非常にまれである。従って、移植レシピエントからのＴ細胞は、必ずドナーの器官を外来物として認識する。薬や放射線照射によって同種反応性を抑制する試みは、それらの有用性を制限するほどの深刻な副作用を起こす。従って、より最近の実験的および臨床的研究は、インビボで免疫機能を変える抗体療法の使用を包含している。多くの場合、より選択的な免疫抑制療法を開発する最初の試みは、ポリクローナルな異種抗リンパ球抗血清（ATG）の使用であった（Starzl,1967;Shield,1979）。
2.抗体の構造
抗体は、通常の構造的特徴を有する糖タンパク質の１つの大ファミリーを含有している。抗体は、Ｙの字に似ている三次元構造を形成する４本のポリペプチドを包含する。通例、抗体は２種類の異なったポリペプチド、Ｈ鎖およびＬ鎖を包含する。
抗体分子は典型的には３つの機能的ドメイン:Fc、Fab、および抗原結合部位からなる。FcドメインはＹの基底部に位置されている。Ｙの腕部はFabドメインを包含する。抗原結合部位はＹの各腕の末端に位置している。
Ｈ鎖のポリペプチドにはα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる５種類の異なるタイプがある。Ｌ鎖のポリペプチドにはκおよびλと呼ばれる２種類の異なるタイプがある。いずれのＬ鎖もいずれかのＨ鎖と会合し得るが、抗体は通常１種類のタイプだけのＨ鎖および１種類のタイプだけのＬ鎖を含んでいる。
抗体分子は、５種類のクラス、IgG,IgM,IgA,IgEおよびIgDに分類される。１つの抗体分子は１つまたはそれ以上のＹユニットを含有し、そして各Ｙは２本のＨ鎖および２本のＬ鎖を含有している。例えば、IgGは１つのＹユニットからなり、そして２κ２または２λ２の式を有する。IgMは５個のＹ様ユニットを含有する。
各ＨおよびＬ鎖のポリペプチドのアミノ末端は、定常（Ｃ）領域として知られている。各Ｈ鎖およびＬ鎖のポリペプチドのカルボキシル末端は、可変（Ｖ）領域として知られている。これら鎖の可変領域内に超可変領域があり、相補性決定領域（CDR）として知られている。１本のＨ鎖および１本のＬ鎖の可変領域は会合して抗原結合部位を形成している。各Ｈ鎖およびＬ鎖は、３つのCDRを含有する。抗原結合部位の６つのCDRが、抗原に対する真の結合部位を形成するアミノ酸残基を特徴づけている。CDRの可変性が抗原認識の多様性の原因である。
B.免疫応答
免疫系の主要な機能は感染性の微生物およびそれらの毒性産物から動物を保護することにある。この系は外来細胞、ウイルス、または巨大分子を発見し；これら侵入者を中和化し；そしてこれらを身体から排除するためにおびただしい範囲の機構を進化させてきた。この監視は体内を循環しているタンパク質および細胞によって実施されている。多くの異なった機構がこの監視を行なっており、そして２種類の広義のカテゴリー「非適応免疫および適応免疫」に分類され得る。
適応免疫は特異的な分子に対して指向し、そして再曝露によって増強される。適応免疫はリンパ球と呼ばれる細胞により仲介されるが。この細胞は、細胞表面レセプターを合成したりあるいは、外来分子に特異的に結合するタンパク質を分泌する。この分泌タンパク質は抗体として知られている。抗体に結合し得るいずれの分子も抗原として知られている。ある分子が適応応答を誘発するのに使用される場合は、この分子は免疫原と呼ばれる。「抗原」および「免疫原」と言う用語は、分子の異なる性状を記述するために使用される。免疫原性は分子の本質的な性状ではなくて、適応応答を誘発する能力によってのみ特徴づけられる。抗原性もまた分子の本質的な性状ではなく、抗体により結合される能力によって特徴づけられる。
「免疫グロブリン」と言う用語は、しばしば「抗体」と互換的に用いられる。正式には抗体は既知の抗原に結合する分子であり、一方免疫グロブリンは結合標的が知られているか、知られていないかに関係しないタンパク質群を指す。この区別はそれ程重要ではないもので、これらの用語は互換的に用いられる。
種々の機能を有するリンパ球の多くのタイプが同定されてきた。免疫系の細胞機能の大部分は、リンパ球を３基本タイプに分類して説明され得る。すなわち、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞である。この３種類はすべて抗原を結合し得る細胞表面レセプターを有している。Ｂ細胞は抗体を分泌し、そしてその表面上に同一抗体の修飾型を持っており、そこで抗原に対するレセプターとして働く。細胞毒性Ｔ細胞は外来または感染された細胞を溶解させ、そしてこれらの標的細胞に、Ｔ細胞レセプターとして知られている表面抗原レセプターを介して結合する。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞および細胞毒性Ｔ細胞の応答を制御するにおいて重要な調節の役割を演じており、そしてまたその表面にＴ細胞レセプターを有する。
免疫系は絶え間なく莫大な数の抗原に攻撃されている。免疫系の重要な特徴の１つは、莫大なレパートリーの抗体および細胞表面レセプターを合成し得ることであるが、それらはそれぞれ異なる抗原結合部位を有している。抗体およびＴ細胞レセプターの外来分子との結合は、免疫応答の特異性に対する分子的基盤を提供する。
免疫応答の特異性は、単純な機構によって制御されている。すなわち、１つの細胞は１個の抗原を認識する。なぜなら単一のリンパ球上の抗原レセプターは、すべて同一だからである。このことはＴおよびＢリンパ球について（たとえこれらの細胞によって形成される応答の形が違ったとしても）真実である。
すべての抗原レセプターは、成熟リンパ球の表面上に見い出される糖タンパク質である。体細胞組換え、突然変異、および他のメカニズムが、107種類以上の異なる結合部位を生成し、そして抗原特異性は、わずか１つのタイプのレセプターだけがいずれか１つの細胞内において合成されることが確実なプロセスによって保持されている。抗原レセプターの生産は、抗原の非存在下で起こる。それ故、抗原レセプターの多様なレパートリーは抗原が見い出される前に準備されている。
類似した構造的特徴を共有してはいるが、Ｂ細胞上の表面抗体およびＴ細胞上に見い出されるＴ細胞レセプターは、別々の遺伝子ファミリーによってコードされていて；それらの発現は細胞タイプに特異的である。Ｂ細胞上の表面抗体は可溶性抗原に結合し得る。その一方、Ｔ細胞レセプターは、他の細胞表面上に抗原が提示された場合のみ抗原を認識する。
Ｂ細胞の表面抗体が抗原と結合する場合、Ｂリンパ球は活性化された抗体を分泌し、そして刺激されて増殖する。Ｔ細胞も類似の様式で応答する。この細胞分裂の突発的増大は、抗原特異的リンパ球の数を増加させ、そしてこのクローンの増加が効果的な免疫応答の分化における第１段階である。抗原が存続する限り、リンパ球の活性化は続き、従って、免疫応答の強さを増大させる。抗原が消滅した後は、抗原特異的リンパ球が増加したプール由来のかなりの細胞は循環し続けている。これらの細胞は、その後同じ抗原にいつさらされても応答するように準備され、免疫記憶に関する細胞の基盤を提供する。
免疫応答を備える最初の段階において、抗原は抗原提示細胞（APC）により包み込まれる。APCは抗原を分解し、そして抗原の断片が主要組識適合遺伝子複合体クラスIIタンパク質（MHC II）として知られている糖タンパク質によって細胞表面上に提示される。ヘルパーＴ細胞は、抗原および上記クラスIIタンパク質を認識することによってAPCと結合する。抗原およびクラスIIタンパク質の認識に対して応答するＴ細胞上のタンパク質が、Ｔ細胞レセプター（TCR）である。
いったんＴ細胞が、APCに結合すると、インターロイキン（IL）ＩおよびIIに応答して、ヘルパーＴ細胞が対数的に増殖する。同様の機構で、Ｂ細胞は抗原に応答し、免疫応答において増殖する。
TCRは、CD3と呼ばれるＴ細胞の表面にも発現しているタンパク質と関連して作用する。この複合体がTCR−CD3複合体である。リンパ球はそのタイプに依存して、CD2、CD4、CD8、およびCD45を包含する他の細胞表面タンパク質を発現し得る。これらの細胞表面タンパク質間の相互作用が、Ｔ細胞応答の刺激において重要である。
Ｔ細胞の２つの主要なサブ集団が同定されている。CD4リンパ球はその細胞表面に、CD4タンパク質、CD3、および各々のＴ細胞レセプターを提示することができる。CD8リンパ球はその細胞表面に、CD8タンパク質、CD3、および各々のＴ細胞レセプターを提示し得る。
CD4リンパ球には、通常、ＴヘルパーおよびＴ遅延型超感受性サブセット（Ｔ−delayed type hypersensitivity subsets）が包含される。CD4タンパク質は、典型的にはクラスII主要組識適合遺伝子複合体と相互作用する。CD4は、Ｔ細胞とそのMHCクラスII APCもしくは刺激細胞との間の結合力（avidity）を増加するように、およびＴ細胞の増殖を増大するように機能し得る。
CD8リンパ球は、一般に細胞毒性Ｔ細胞であり、その機能は外来細胞または外来抗原を提示している宿主細胞を同定して殺すことである。CD8タンパク質は、典型的には、クラスＩ主要組識適合遺伝子複合体と相互作用する。
C.抗体の臨床的使用
ATG治療の臨床的試行は、早期の拒絶症状出現の顕著な軽減、長期生存の改善、および最も重要なこととして、進行する拒絶症状出現の逆戻りを示唆した。しかしながら、それらの結果は、抗血清の個々の調製物を標準化することができないために、通常、一定ではなかった。さらに、ポリクローナル試薬によって認識される標的抗原の詳細な性質が解明され得なかったので、それ故に科学的な解析が困難であった。モノクローナル抗体（mAb）技法の出現は、Ｔ細胞の活性化に関連する特異的細胞表面抗原と反応する有効な治療薬の開発に関する基礎を提供した。
臨床学的に成功したモノクローナル抗体の使用の１つは、免疫系を抑制することであり、従って、器官または組識の移植の効果を増強させることである。米国特許第4,658,019号は、OKT3と命名された新規なハイブリドーマを記載しているが、このOKT3には本質的にすべての正常なヒト末梢Ｔ細胞に見い出される抗原に対するモノクローナル抗体を産生する能力がある。この抗体は、これらＴ細胞上のある１つの決定基に対して単一特異的であり、そして他の正常な末梢血リンパ系細胞とは反応しないと言われている。この特許に記載されているOKT3 mAbは腎移植の拒絶反応を防止するのに現在使用されている（Goldstein,1987）。
OKT3療法の予期されない副作用の１つは、インビボでのこのmAbの強いマイトジェン効果であった（Ellenhorn,1988）。
さらに、Ｔ細胞の機能を活性化し得る他の細胞表面分子が同定されているが、必ずしもＴ細胞表面レセプター複合体の構成要素ではない。Thy−1,TAP,Ly−6,CD2,またはCD28分子に対するモノクローナル抗体は、インビトロで外来抗原の存在しない場合にＴ細胞を活性化し得る（Leo,1989;Takada,1984）。さらに、構造がmAbと違う、あるバクテリアのタンパク質もまたＴ細胞のサブセットに結合し、そしてインビトロでそれらを活性化することが示された（White,1989）。
ある抗体に対する宿主の免疫応答を選択的にダウンレギュレーションする可能性は、IgEを介するアレルギー、自己免疫疾患および臓器移植の免疫拒絶反応の防止についての新しい療法の開発に関する現代免疫学の最も侮りがたい挑戦の１つである。同様の考察が、幅広い範囲の疾患に対して有望な療法モダリティー数を上昇させる。これらには、（もしも免疫原性でなければ）免疫応答を有効にモジュレートし得る外来の生物学的活性薬剤の使用が包含される。これら薬剤の中で、（１）患者のCD4+細胞の異なるエピトープに対する異種間のモノクローナルまたはポリクローナル抗体（本明細書中では一括してxIgと示す）を挙げることができる（Cruse,1989;Diamantste in 1986）が、これは単独でまたはリウマチ様関節炎および他の自己免疫疾患の治療、または移植体に対する宿主反応および臓器移植の免疫拒絶反応の抑制に関する免疫抑制薬と併用して投与された（Cruse,1989）。
これらの免疫学的戦略における治療上の効力は患者の抗体により徐々に弱められる。この患者の抗体は、これら弾丸が標的細胞に到達することを妨げる。さらに、これら薬剤の反復投与は、重篤な併発症を起こし得る。すなわち血清病、アナフィラキシー症状（気管支痙攣、呼吸困難および低血圧）および／またはしばしば肝障害を導く有害な免疫複合体の肝臓内堆積である。
D.モノクローナルおよびポリクローナル抗体の調製
簡単に言うと、ポリクローナル抗体は免疫原で動物を免疫し、その免疫した動物から抗血清を集めて調製する。抗血清の生産には広範囲の動物種が用い得る。典型的には、抗−抗血清の生産に用いる動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギは血液の容量が比較的大きいので、ポリクローナル抗体の生産にはウサギが好ましい選択である。
当該分野で周知であるが、あるポリペプチドまたはポリヌクレオチドでは、その免疫原性が変化し得る。従って、免疫原をキャリヤと結合させることがしばしば必要となる。典型的で好ましいキャリヤはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびウシ血清アルブミン（BSA）である。卵白アルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもキャリヤとして用い得る。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをキャリヤタンパク質と結合させる手段は当該分野で公知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジン（bis−biazotized benzidine）がある。
当該分野では公知であるが、特定の免疫原に対する免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的な刺激因子を用いることにより増強され得る。例示的で好ましいアジュバントには完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
ポリクローナル抗体の産生に用いられる免疫原の量は、免疫に用いた動物と同様に、とりわけ免疫原の性質により変動する。免疫原の投与には種々の経路が用いられ得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後種々の時点で免疫動物の血液を採取することによりモニターされる。望ましいレベルの免疫原性が得られたら、免疫動物から採血し得、そして血清を単離および保存する。
本発明のモノクローナル抗体は、米国特許第4,196,265号（本明細書中に参考として援用する）に例示される技術のような公知の技術を用いて容易に調製され得る。代表的には、技術には、最初に適切な動物を、選択した抗原（例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）で免疫応答が十分に得られるような様式で免疫することを含む。マウスおよびラットなどのげっ歯類は好ましい動物である。次いで、免疫した動物由来の脾臓細胞を不死化ミエローマ細胞と融合させる。免疫動物がマウスの場合、好ましいミエローマ細胞はネズミNS−１ミエローマ細胞である。
親細胞から融合した脾臓／ミエローマ細胞を選択するために、融合した脾臓／ミエローマ細胞を選択的培地で培養する。例えば、組織培養培地にヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を添加することにより、非融合親細胞の混合物から融合細胞を分離する。例示的で好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンとピリミジンとの両方のデノボ合成をブロックする。一方、アザセリンはプリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキレートを用いる場合は、培地にヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンを補う。アザセリンを用いる場合は、培地にヒポキサンチンを補う。
この培養法は、ハイブリドーマの集団を提供し、この集団から特異的ハイブリドーマが選択される。典型的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートにおける単一クローン希釈により細胞を培養し、続いて個々のクローンの上清を抗原ペプチドとの反応性について試験することにより行われる。次いで、選択したクローンを無制限に増殖させて、モノクローナル抗体を供給し得る。
特別な実施例として、モノクローナル抗体を産生するために、本発明のポリペプチドを含む約１〜200μｇの間の抗原をマウスの腹腔内に注射する。Ｂリンパ球細胞は、完全フロイントアジュバント（死滅したMycobacterium tuberculosisを含む非特異的な免疫応答の刺激因子）のようなアジュバントと組み合わせて抗原を注射することにより、増殖するように刺激する。最初の注射からしばらくして（例えば、少なくとも２週間）、不完全フロイントアジュバントと混合した抗原の２回目の用量の注射よりマウスを追加免疫する。
２回目の注射の２〜３週間後、マウスの尾から採血し、免疫沈降により放射能標識抗原に対し血清を力価測定する。好ましくは、適当な力価に達するまで追加免疫および力価測定のプロセスを繰り返す。最高力価を有するマウスの脾臓を取り出し、そしてこの脾臓をシリンジでホモジナイズすることにより脾臓リンパ球を得る。典型的には、免疫マウス由来の脾臓は約５×107〜２×108個のリンパ球を含む。
ミエローマ細胞として知られる変異体リンパ球細胞を、そのような細胞が種々の公知の方法により増殖を誘発されている実験動物から得る。ミエローマ細胞はヌクレオチド生合成の再利用経路を欠いている。ミエローマ細胞は、腫瘍細胞なので、組織培養で無制限に増殖させ得、それゆえ不死と称される。ネズミNS−１ミエローマ細胞のような、マウスおよびラット由来のミエローマ細胞の多くの培養細胞株が確立されてきた。
本発明の抗原／ポリペプチドを注射したマウスまたはラットの脾臓由来の正常な抗体産生細胞との融合を促進するのに適した条件下でミエローマ細胞を結合する。融合条件には、例えば、ポリエチレングリコールの存在が包含される。得られた融合細胞がハイブリドーマ細胞である。ミエローマ細胞と同様に、ハイブリドーマ細胞は培養中で無制限に増殖する。
HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）のような選択培地で培養することにより、ハイブリドーマ細胞を非融合ミエローマ細胞から分離する。非融合ミエローマ細胞は、アミノプテリン、メトトレキセート、またはアザセリンの存在下で死滅するので、この細胞は、再利用経路によりヌクレオチドを合成するのに必要な酵素を欠いている。非融合リンパ球はまた、組織培養で増殖し続けない。このように、成功裡に融合した細胞（ハイブリドーマ細胞）のみが選択培地中で増殖し得る。
各生存ハイブリドーマ細胞は、単一の抗体を産生する。次いで、本発明の抗原／ポリペプチドと免疫反応する特異的な抗体の産生についてこれらの細胞をスクリーニングする。ハイブリドーマの限界希釈により単一細胞のハイブリドーマを単離する。ハイブリドーマを多数回系列希釈し、希釈溶液を増殖させた後、上清をモノクローナル抗体の存在について試験する。次に、その抗体を産生するクローンを、大量に培養し、本発明の抗体を好都合な量産生する。
III.「ヒト化」mAbを用いた免疫抑制のモジュレーション
OKT3の効果を改善し、かつ用途を拡げるために、ヒト化型の抗体を作成した。ループ領域および相補性決定領域（CDR）（Kabat,1987）は抗原に接するアミノ酸を含むと考えられているが、ヒトフレームワークへのこれらの単純な転移は、OKT3の場合には、効率的な抗原結合に必要な構造を提供するのに十分でないということが示された（Woodle,1992）。残るフレームワーク残基を調べることにより、ヒトフレームワークにおいて結合の再構成に潜在的に寄与し得る数個の残基が同定された。ヒトフレームワーク中のこれらの部位のアミノ酸をOKT3由来のアミノ酸と置き換えてgOKT3−５を作成した場合、抗原結合は完全に復元することが示された。従って、OKT3配列に由来する多くのこれらのアミノ酸は、ネズミのOKT3と同じ親和性を有するヒト化抗体を作成するのに必要とされないことが注目された（Jolliffe,1991）。
ネズミOKT3で処置した患者で観察された免疫応答を減少させるために、ネズミの抗CD3 mAbおよび可変フレームワークの相補性決定領域（CDR）ならびにヒトIgG4の定常領域を含む「ヒト化」OKT3（gOKT3−５）を開発した。しかし、治療薬としては、OKT3に関連する別の問題、すなわちmAbによるＴ細胞の活性化に起因する初回用量反応が残った。gOKT3−５はインビトロでOKT3と同様の活性化を産み出すので、同じ副作用がインビボにおいてこの薬剤で生じ得ることはありそうなことである。OKT3のＦ（ab'）２フラグメントは、インビトロで強力な免疫抑制およびTCRモジュレーションを導いた。マウスに対する抗CD3 mAbの非活性化Ｆ（ab'）２フラグメントは、皮膚移植拒絶反応を遅延させることにおいて、全抗CD3と同程度に有効であった。一方、Ｆ（ab'）２フラグメントはマウスにおいて有意に減少したＴ細胞活性化、およびより少ない副作用を示した。しかし、大量のＦ（ab'）２フラグメントの産生は依然困難である。さらに、血流におけるこの薬剤の半減期は、全mAbに比べると比較的短い。このように、抗CD3のＦ（ab'）２フラグメントの頻回注入が最大の免疫抑制を達成するのに必要とされた。このため、このmAbフラグメントの使用は臨床移植には不適当であった。最後に、最近の研究によれば、Ｆ（ab'）２調製物中での全mAbの少量の汚染（＜1/104分子）でさえＴ細胞活性化に相乗的効果を有する。
A.「ヒト化」mAbでの点変異
ネズミIgG2a Ab（OKT3を含む）のFc部分は、ヒトマクロファージおよびIFN−γ刺激多形核白血球上に存在する高親和性の72kD FcR I（CD64）に選択的に結合し（Anderson,1986;Lynch,1990;Shen,1987）、また、ヒトマクロファージ、β細胞および多形核好中球に見い出される低親和性の40kD FcR II（CD32）にも選択的に結合する（Anderson,1986;Petroni,1988;Bentin,1991）。IgGのFc部分中のCH2領域は、FcR IおよびFcR IIと選択的に結合するドメインであることが分った（Ollo,1983;Woof,1984;Burton,1985;Partridge,1986;Duncan,1988）。実際、正確な結合セグメントは、アミノ酸234位〜238位に対応する領域に局在しており（Duncan,1988）、数個のイソタイプのそれぞれの親和性が決定された（Gergely,1990）。Duncanらは、ネズミIgG2bのFcR結合セグメントにおける１個のアミノ酸の変異は、その配列をマウスIgG2aで認められた配列に変換するものであり、これは、FcRへの結合の100倍に増強を引き起こすことを示した（1988）。これらのデータに基づいて、ネズミIgG2bの低親和性配列に類似した配列となるように、抗CD3ヒトIgG4抗体のFc領域中に変異を導入した。このmAbは、ヒトIgG4のＨ鎖の235位にロイシンでなく、むしろグルタミン酸を含む（Glu−235 mAb）。変異分析は、「ヒト化」抗CD3 mAb、すなわちgOKT3−5 mAbについて、ネズミの相補性決定領域をヒト化IgG4フレームワークの遺伝子配列にスプライシングすることにより行った。gOKT3−5 mAbは、ネズミOKT3と同様のCD3複合体に対する結合親和性、ならびにOKT3の全てのインビトロ活性化および免疫抑制特性を保持していることが以前に示された。さらに、gOKT3−5 mAbは、ネズミIgG2b上のFcR結合配列とはアミノ酸２個だけ異なるか、またはネズミIgG2a/ヒトIgG1のそれとはアミノ酸１個だけ異なるFcR結合配列を有していた。mAbのFcR結合領域における変異は、分子のコンフォメーションを改変し得、従って、得られるアミノ酸配列にかかわらず、FcR結合の減少の原因となり得るので、高親和性のネズミIgG2aおよびヒトIgG1で認められるFcR結合領域を真似るために、本発明者らは、アミノ酸234のフェニルアラニンからロイシンへのコントロール変異を行った。このmAbをLeu−234と呼んだ。
従って、AbのFcRへの結合に影響を与えるために、上記の部位特異的組換えをgOKT3−5 mAbのFc部分に導入した。Ｆ（ab'）２フラグメントの低活性化特性、モノクローナル抗体の純度および、Ｆ（ab'）２フラグメントまたはおそらくネズミOKT3と比べても増大した血清半減期を示すように、抗CD3 mAbの適切な変異体を設計した。なぜなら、キメラマウス／ヒト抗体は、マウスの対照品より長く循環することが示されているからである。従って、得られたmAbはインビボでOKT3により誘発される急性毒性および免疫化を避ける。しかし、理論的には、ネズミIgG2bを真似するための235位のグルタミン酸の置換はまた、ヒト化抗体の定常領域の免疫原性エピトープをつくり出すことにもなる。
実際、gOKT3−5 mAbのFc部分の235位でロイシンに代えてグルタミン酸にアミノ酸１個を置換することは、U937細胞にネズミOKT3より100倍弱くしか結合しないmAbを生じた。この変異は、ネズミIgG2bで認められるものと同様のFcR結合配列を生じるが、これは、ネズミIgG2より10倍低いFcRに対する親和性を有するmAbを生じた（データを示さず）。この差異の理由は不明である。しかし、これは、５個のアミノ酸のFcR結合領域のこれと隣接するアミノ酸（Glu mAbの場合には、ヒトIgG4の一部である）との相互作用が、FcR結合と関係していることを示唆し得る。
試験した全てのAbは、12時間培養後いくらかのTCRのモジュレーションを示した。しかし、最大のモジュレーションに達するためには、Glu−235 mAbを、より高濃度でまたはより長時間添加しなければならなかった。このことは、低いFcR結合がTCRの内在化の誘発を遅延させ得るかを示唆する。全てのAbはまた、CTL活性を阻害し、このことは、このアッセイによる同様な抑制特性を示す。このように、部位特異的変異誘発によるgOKT3−5 mAbの結合の変化は、インビトロでのmAbの免疫抑制能に有意な影響を与えなかった。
Glu−235 mAbの結合の低下は、このAbにより誘発されるＴ細胞活性化の顕著な低下と相関しており、そのことはＴ細胞増殖の不在、活性化の細胞表面マーカーの発現の低下、TNF−αおよびGM−CSFの放出の減少、ならびにIFN−γの分泌の欠如により評価される。Ｔ細胞の有糸分裂誘発の大きさは、抗CD3 mAbのFcR Iに対する親和性と相関することが知られており、その相対的な結合は、AbsのヒトサブクラスについてはIgG1＝IgG3＞IgG4であり、ネズミのイソタイプについてはIgG2a＝IgG3＞IgG1＞IgG2bである。この研究で使用した抗CD3 mAbは、予想どおりのFcR結合を示した。すなわち、ヒトIgG4 gOKT3−5 mAbは、U937細胞にネズミIgG2a OKT3 mAbまたはネズミLeu−234 mAbより弱い貪欲さで結合するがGlu−235 mAbよりずっと高い親和性を示した。
試験した別の抗CD3 mAbにより誘発された活性化は、FcRに対するそれらの親和性と完全には相関しなかった。gOKT3−5 mAbと比べてOKT3のFcRsに対する親和性は増加したにもかかわらず、その２つのmAbの間でＴ細胞活性化に有意な差は認められなかった。１つの説明として、Ｔリンパ球とFcRとの間の架橋がある閾値に達すると常に活性化が最大になると言い得る。別の可能性は、mAbのCD3抗原への結合が、FcRを有する細胞に対する結合力を強化することである。
Glu−235 mAbを形成するgOKT3−5 mAbのFcR結合領域に生じた機能的変化の程度は、さらに示唆するところがある。抗CD3 mAbのあるイソタイプが、Ｔ細胞を活性化し、そしてADCCを仲介する能力は、集団内で変動することが示された。ネズミIgG2aおよびIgG3抗CD3 mAbは、実質上全個体に対しマイトジェン性である。対照的に、ネズミのIgG1およびIgG2b mAbは、それぞれ70％および５％〜10％しか増殖を誘発しない。Glu mAbは集団中の少数のフラクションにおいて非活性因子IgG2bとして機能するようである。しかし、これらの個体においてさえもIgG2b mAbは、活性化の別の経路の引き金となることが認められた。例えば、他の抗CD3イソタイプとは対照的に、IgG2b mAbはIL−２またはIFN−γの産生を誘発しない。このように、患者集団の小さな部分集合で認められた増殖はIL−２に非依存性Ｔ細胞の有糸分裂誘発であり得、このことは他の状況で以前に報告されている。さらに重要なことには、Glu−235 mAbのFcRへのFcR結合は、ネズミIgG2b Abと比べて低下しており、このことは、この個体の部分集合の活性化さえも停止するのに十分であり得る。
実施態様の１つとして、本発明は、同種二機能的（homo−bifunctional）抗体の１クラス、すなわちCD4とも相互作用するOKT3のヒト化型を企図している。このヒト化抗体は、OKT3のCD3ε抗原特異性を含むFv領域およびヒトIgG1またはIgG4抗体由来のFc領域を有する。ヒト化抗CD3抗体は、プラスチック上またはCD4+細胞、CD3細胞、FcR細胞上に固定されたCD4と直接結合する。最初のマッピング実験により、結合はCD4上のOKT4Aエピトープの近くで起こることが示唆される。抗原／抗体結合部位とは独立したいくつかの抗体（しかしヒトIgG4ではない）のCD4のこの領域との弱い相互作用が報告されている（Lanert,1991）。しかし、これらの報告とは異なり、本発明の抗体はγ１またはγ４のＨ鎖のいずれかと結合する。ヒト化OKT3上のCD4結合部位はFabフラグメントにマッピングされ、そしておそらく可変領域のフレームワーク配列中に存在する。
本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、本発明の特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチドが抗原として認識され、それにより同定され得る。一度同定されると、これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、抗体アフィニティークロマトグラフィーのような技術により単離および精製され得る。抗体アフィニティークロマトグラフィーにおいて、モノクローナル抗体を固体基質に結合し、目的の抗原を含む溶液に曝す。抗原は結合した抗体との免疫特異的反応により溶液から除去される。次いで、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはさらに基質から容易に除去され、精製される。
VII.薬学的組成物
好ましい実施態様において、本発明は、CD3およびCD4細胞表面抗原と免疫反応性のある抗体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明の組成物は、所望により、標準的で公知の無毒性の生物学的に許容されるキャリヤ、アジュバント、およびビヒクルを含む投与単位の処方で典型的には非経口的に投与される。本明細書中で用いる用語の非経口的とは、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内の注射または点滴技術を包含する。
注射可能な調製物、例えば無菌で注射可能な水生または油性の懸濁液は、適切な分散剤または加湿剤および懸濁剤を用いて既知の技術により処方される。無菌の注射可能な調製物はまた、無毒性で非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒、例えば、1,3−ブタンジオール溶液中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液でもあり得る。
使用し得る受容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液および生理食塩液がある。さらに、無菌の不揮発性油が溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。この目的には、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む、どんな緩やかな不揮発性油も使用され得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射剤の調製に用途がある。
好ましいキャリヤには、リン酸塩、乳酸塩、トリスなどで緩衝化した中性の食塩溶液が含まれる。勿論、製剤から、欠陥干渉アデノウイルス粒子またはエンドトキシンのような望ましくない汚染物および他の発熱性物質を本質的に除くために、ベクターを十分に精製する。その結果、ベクター構築物を投与される個体に不都合ないかなる反応も起こさない。ベクターの精製の好ましい方法には、塩化セシウム勾配遠心分離などの浮遊密度勾配の使用が含まれる。
キャリヤはまた、リポソームであり得る。送達ビヒクルとしてリポソームを用いる方法は、当該分野では公知である［例えば、Gabizonら,1990;Ferrutiら,1986;およびRanade,V.V.,1989参照］。
トランスフェクトした細胞もまたキャリヤとして用い得る。実施例として、肝臓細胞を生体から除去し得、前述した方法を用いて本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトし、そして次いで、さらにそのトランスフェクトした細胞を生体に戻す（例えば、血管内に注射する）。
以下の実施例を本発明の好ましい実施態様を示すために包含されている。以下の実施例で開示された技術は、本発明の実施において十分に機能するために本発明者により発見された技術を代表する。従って、その実施の好ましい様式を構成するものと考え得るということが、当業者により認識されるべきである。しかし、当業者は、この開示を考慮して、開示された特定の実施態様においては多くの変更があり得、そして変更してなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られ得ることを認識すべきである。
実施例
実施例１  ヒトOKT3 mAbのFc部分における変異
mAbのFcR Iへの結合の親和性の増大のための234位のフェニルアラニンのロイシンへの変異（Leu−234）、またはFcR結合を減少させるための隣接するロイシン（235位）のグルタミン酸への変異（Glu−235）を以下のように行った：超コンピテントCJ236 E.coli（Invitrogen、San Diego、CA）を、gOKT3 mAbのＨ鎖遺伝子を含むpSG5を用いて形質転換した。この細菌を、ウリジン（25mg/mL）、アンピシリン（100μg/mL）を補ったLBブロス中において600nmの波長で0.35の光学密度に達するまで増殖させた。CJ236 E.coliをヘルパーファージＭ−13（pfu）（Stratagen）で感染させ、ウリジンを組み込んだ一本鎖の鋳型を作成した。次いで、チミジンを用いて合成され、かつ所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを、ウリジン−一本鎖鋳型にアニーリングして、デオキシヌクレオチド、T7ポリメラーゼおよびT4リガーゼの添加後プラスミドの複製のためのプライマーとして使用した；従って、この野生型DNAはウリジンを含むが、得られた変異プラスミドはチミジンを利用する。合成反応を0.5M EDTAおよび1M Tris HCl−EDTAで停止し、10μｌを、ウリジンDNAを分解するコンピテントDH5 E.coli中に形質転換し、そしてそれ故変異構築物で形質転換された場合アンピシリン選択培地上で増殖した。プラスミドを、Qiagen miniprepにより単離した;pSG5における変異配列を、変異免疫グロブリンの一過性発現のために、このmAbのＬ鎖を含むpsG5ベクターを用いてCOS−１細胞中に共導入した。
実施例２  OKT3可変領域配列の作成および同定
OKT3可変領域配列を、Amersham International Plc.cDNA合成キットを使用してOKT3ハイブリドーマ細胞由来のオリゴ−dTで準備されたcDNAから得た。このcDNAを、EcoR1リンカーを使用してpSP64においてクローニングした。Ｌ鎖およびＨ鎖cDNAを含むE.coliクローンを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して細菌コロニーのオリゴヌクレオチドスクリーニングにより同定した:L鎖のために5'TCCAGATGTTAACTGCTCAC（配列番号15）（これは、マウスκ定常領域における配列に相補的である）、およびＨ鎖のために5'CAGGGGCCAGTGGATGGATAGAC（配列番号16）（これは、マウスIgG2a定常CH1ドメイン領域における配列に相補的である）。
cDNAの配列から推定される可変領域のアミノ酸配列を、Ｌ鎖については図1A（列１）に、Ｈ鎖については図1B（列１）に示す。CDRは一本の下線で示されている。Ｌ鎖は、マウスVLサブグループV Iの一員であり、そしてJK4ミニ遺伝子（minigene）を使用する。Ｈ鎖は、おそらくは、マウスVHサブグループII、最もおそらくはサブグループII bの一員であるが、それはまた、グループV aに関する共通配列にかなりの相同性を有する。Ｄ領域は、現在分類されておらず、そしてJH領域はJH2である。Chothiaら、1987により提案された超可変領域についてのループ予測に関して、ループは、L1については規範構造１、L2については２およびL3については１と、そしてH1については規範構造１、H2については２と割り当てられ得、ChothiaらはH3に対する規範形態を未だ予測していない。
Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列は、Ox−１生殖細胞系遺伝子ならびに公表された抗体45.2.21.1、14.6b.1および26.4.1（Sikder、1985）に高度な相同性を示す。Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列は、14.6b.1を含むJ558ファミリーのサブグループに妥当な相同性を示す。Ｌ鎖およびＨ鎖遺伝子のこれらの組み合せを有するいくつかの抗体は、α−１−６デキストランに対する親和性を有することが以前に示されている。
実施例３  ヒト化OKT3遺伝子の設計および構築
ヒト化抗体に対する可変領域ドメインを、マウス可変領域最適コドン使用（Grantham、1986）で設計し、そしてmAb B72.3（Whittle、1987）のＬ鎖およびＨ鎖のシグナル配列を使用した。9bpのコザック配列（Kozak、1987）であるGCCGCCACC（配列番号17）を、イニシエイターATGの直ぐ5'側に挿入した。真核細胞の発現ベクター中にクローニングする前に、可変領域が、ヒトIgG4およびκ定常領域のDNA配列に直接結合され得るように、5'末端および3'末端制限部位を付加した。
予め構築されたヒト化可変領域のオリゴヌクレオチド部位特異的変異（Ollo、1983）により、全てのCDRおよびループ領域を、M13においてクローニングされたB72.3（Emtageら）に同時に置換すること、またはサイズが27〜67塩基対の範囲でありかつ６塩基の突出部を有する合成オリゴヌクレオチドを使用して配列を組み立てることのいずれかにより、可変領域を作成した。オリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems Model 380B DNA Synthesizerにより合成し、そしてHPLCにより精製した。オリゴヌクレオチドを酵素的にリン酸化し、対にし、アニーリングし、そして次いで各対の等モルのアリコートを混合しそして連結した。クローニング部位を、連結混合物の制限酵素切断に曝し、そして正確なサイズのフラグメントを同定し、そして配列決定および発現の前に、発現ベクター中定常領域の5'側に直接クローニングした。
ヒト化OKT3の可変領域配列の設計のために、REI（Kabat、1987）を、ヒトＬ鎖フレームワークとして選択し、そしてKOLを、Ｈ鎖可変領域に対して選択した。両方の場合において、ヒト可変領域のフレームワークの個々の残基の構造試験がなされ得るように、構造がＸ−線結晶学により決定されている抗体を選択した。ヒトアクセプターのフレームワークの可変領域配列は、図1Aおよび1B（列２）（配列番号７および11）に示される。
比較目的のために、Sequences of Proteins of Immunbiological Interest 4/e（1987）から得られたネズミOKT3のアミノ酸およびヌクレオチド配列（配列番号２〜５および１）を図２に示す。
図1Aおよび1Bのそれぞれにおける列３（（配列番号８）および（配列番号12））は、最初の設計図gLおよびgHの可変領域の配列を示す。ヒトアクセプター配列との差異のみを示す。gLに対して、CDR選択は、Kabat＝＝らにより示唆され、そして他の非CDRネズミ残基を使用しなかった。gHに対しては、OKT3のCDRは、Kabatらへの参照により示唆されるように、27、28および30位でのネズミ残基と共にKOL配列中に置換された。これらの残基は、CDR1に隣接するループ領域中に通常結合している（Chothia、1987;1989）。残基27の抗原結合決定因子としての重要性は、Riechmannら（Riechmann、1988）によりCAMPATH−１抗体の結合活性の再構築において示された。残基28および30は、抗体の表面およびCDR1の近傍にあると予測されている。残基29は、KOLおよびOKT3（図1B）の両方において同一であり、それゆえ改変を必要としない。
最初のヒト化Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域をコードするDNA配列を、抗体B72.3のヒト化形態の予め作成されたＬ鎖およびＨ鎖DNAにおける配列の部位特異的変異誘発による同時置換により構築した。次いで、ヒト化可変領域をコードするDNA配列を、ヒトγ−４およびκ定常領域配列に結合し、そしてキメラ遺伝子について記述されるように発現ベクター中に挿入した。gL遺伝子およびgH遺伝子は、COS細胞において共発現したとき抗体gOKT3−１を産生する。
gOKT3−１は、HPB−ALL細胞にあまり結合せず、mOKT3のこの細胞への結合をブロックし得ない（図３）。故に、CDRの外側の別のOKT3残基がヒト化抗体中への置換について考慮される必要があることが明らかであった。Ｌ鎖について、これらの位置は、１および３位の残基（これらの残基は、抗体の可変領域の公知の構造を参考にすることにより、CDR近傍に位置するおそらく表面の残基である）、残基46（通常ドメイン界面（domain interface）にある）および47位のパッキング残基である。gLAは、ネズミ配列由来の４つ全ての残基を有する。他方、gLCは、46および47位でのみネズミ残基を有する。
同様に、Ｈ鎖について、多くの位置が考えられた。これらは、23、73および76位（これらは、公知の抗体構造との相似性より、一部または完全に溶媒に曝されたCDR近傍の残基であると考えられる）、６、24、48、49、71、78および88（これらは、CDRの配置および／またはドメイン内パッキングのいずれかに関与する残基であると考えられる）、ならびに可変ドメイン界面残基91であった。最後に、CDR2における残基63（これは、通常ドメイン内パッキング残基である）で、ヒトフレームワーク由来の他のパッキング残基との好ましくない接触の可能性を避け得るように、KOL中に見出された残基を使用した。多くのＬ鎖およびＨ鎖変異体を、これらフレームワーク残基の寄与を評価するために作成した。Ｌ鎖上の残基１および３は、ネズミの配列に由来する必要はなかったが、残基46および47のうちの１つまたは両方は、ネズミの配列に由来すべきであることが、実験により見出された。図1A列４（配列番号９）は、残基46および47でネズミの配列を有することによりgLとは異なるgLCの配列を示す。同様に、Ｈ鎖において、gHA（図1B列４）（配列番号13）を与えるために上述の全ての改変を組み込むこと、およびこの遺伝子をcLまたはgLCと共発現することは、cOKT3またはmOKT3に等価に結合する抗原に導くであろうが、これらの残基のいくつかは、等価の結合親和性を保持する必要はなかったことが見出された。特に、KOL配列が、gHG遺伝子において71、73、76、88および91位で使用される場合、gHGのcLまたはgLCとの共発現は、cOKT3またはmOKT3と等価に結合する抗原を導いた。故に、gLC/gHA（gOKT3−５）およびgLC/gHG（gLC/gHG）の組合せの結合親和性は、さらに詳細に分析されている。
大規模COS細胞発現調製物を作成し、ヒト化抗体をプロテインＡによりアフィニティー精製した。相対的結合親和性を測定した。図３は、２つのそのような実験の結果を示す。mOKT3の抗原（Ka）に対する親和性を、スキャチャード分析により1.2×109M-1であると測定した。mOKT3についてのこの値は、スキャチャード分析による1.3×109M-1という値によく匹敵する。mOKT3についてのこの値は、以前に測定された1.3×109M-1という値（Gergely、1990）によく匹敵する。図3Aにおいて、gOKTE−５を、mOKT3に対する競合についてcOKT3およびmOKT3と比較した。1.2×109M-1および1.1×109M-12343という値が、それぞれcOKT3抗体およびgOKT3−５抗体について得られた。
続いて、（図3B）同様な結果が、mOKT3についての1.2×109M-1、cOKT3についての1.4×109M-1およびgOKT3−５についての1.1×109M-1に匹敵するgOKT3−７（Ka1.4×109M-1）について得られた。これらの実験は、OKT3の抗原を結合する活性がヒト化抗体に成功裡に移入されたことを示す。以前の研究は、マイトジェン能力が、抗CD3mAbのＴ細胞活性化特性の高感度パラメータであることを示した（Woodle、1991）。初期の研究において、gOKT3−５は、IgG4イソタイプの状況においてさえもなおマイトジェン能力を示すことを明らかにした。従って、gOKT3−７抗体の活性化能力を、増殖反応を定量化することにより評価した。gOKTE−７は、mOKT3のマイトジェン能力と等価なマイトジェン能力を示した（図４）。このことは、結合した抗体の架橋が増殖シグナルを導くγ４イソタイプとになお生じることを示唆する。治療用のヒト化OKT3抗体は、このような影響を最小化するために定常領域にさらなる改変を必要とし得る。
実施例４  キメラOKT3遺伝子の構築および発現
ネズミcDNAを、ヒト化抗体の生物学的機能の発現ベクターコントロールに組み立てた。ネズミ可変領域cDNA配列を、上述のストラテジーに従って、ヒトκＬ鎖およびγ4H鎖定常領域のDNA配列に結合してキメラOKT3（cOKT3）遺伝子を作成し、次いで、この遺伝子を真核生物の発現ベクター中に挿入した。最終的な目的は、有用なエフェクター薬物動力学特性を保持しながらCD3に効率的に結合し得、そして初回投与による副作用を有しないヒト化OKT3IgG抗体を設計することであるので、FcRに対して減少した親和性を、γ４遺伝子を使用して構築物に組み込んだ。
小規模COS細胞発現および代謝標識研究は、記載されたもの（Whittle、1987）と同様であった。大規模COS細胞発現研究を、ローラーボトルにおいて行い、トランスフェクション５日後に生成物上清を採取した。（T.Livelli、Specialty Media Inc.、Lavallette、New Jersey）。大規模トランスフェクションからの材料を、プロテインＡセファロースクロマトグラフィーにより精製した。COS細胞上清において組み立てられた抗体の収率を、Woodleら、1992により記載されているように測定した。
COS細胞から発現するネズミOKT3、cOKT3、およびネズミ／キメラハイブリッド抗体は、mOKT3と等価に抗原に結合し、そしてMOKT3のCD3ポジティブ細胞への結合をブロックすることが示された。
実施例５  ネズミおよびヒトOKT3 mAb遺伝子の一過性発現
COS−１細胞発現研究を、ローラーボトル内での使用のために改変（T.Livelli、Specialty Media、私信）した一過性発現キット（Specialty media、Lavallette、NJ）の試薬および手順を使用して行った。試験Abの精製のための生成物上清をトランスフェクション６日後に採取した。
ELISAアッセイを、COS細胞上清において組み立てられた「ヒト化」抗体の収率を測定するために行った。96ウェルプレートを、ヤギ抗ヒトFc抗体Ｆ（ab'）２でコートした。COS細胞上清を添加してそして室温で１時間インキュベートしそして洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合化ヤギ抗ヒトκ鎖（Caltag）を、検出のためのｏ−フェニレンジアミン（OPD）と共に使用した。精製ヒトIgGを基準として使用した。
実施例６  変異した「ヒト化」OKT3 mAbは、ネズミOKT3と同様な親和性を有するＴ細胞のCD3複合体に結合する
gOKT3−5 mAbのFc部分を、上記の手順に従い、そのFcRを有する細胞への結合を変化させるために変異させた。234位のフェニルアラニンをロイシン（Leu−234）に置換、または隣接のロイシン（235位）をグルタミン酸（Glu−235）に換えた。gOKT3−5 mAbのTCR複合体に対する親和性は、OKT3のTCR複合体に対する親和性と同様であることが以前に示された（Van Wauweら、1980）。mAbのFc部分の変化は、Ag結合親和性を変化させるはずはないが、AbのCH2領域（ヒンジ近傍）における点変異は、Leu−234およびGlu−235 mAbのCD3抗原への結合を損なわないないことを示すのは重要であった。
ヒトＴ細胞へのネズミOKT3の結合を競合的に阻害する変異したAbの能力を調べるために、置換（displacement）アッセイを行った。ヒト末梢血の急性リンパ性白血病細胞を、フローサイトフルオリメトリー（FCM）緩衝液に５×105細胞/mLで再懸濁した。抗CD3 mAbの希釈溶液を加えそして４℃で１時間インキュベートした。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解して、10mg/ml溶液を得た。FITC/DMFを、精製mAbに1:10w/wで加え、そして25℃で４時間インキュベートし、その後、陰イオン交換樹脂（AG1−X8、200〜400メッシュ、塩化物形態;Bio−rad）を含有するPBS中に透析した。凝集物を、使用の前にエアフュージ（airfuge）遠心分離（Becton−Dickinson）により取り除いた。固定された飽和量のOKT3−FITCを加え、そして細胞を４℃で１時間さらにインキュベートし、洗浄しそしてフローサイトフルオリメトリー（FCM）により分析した。
１色または２色のFCMを、Hewlett−Packard 310コンピュータにインターフェイスで接続したFACScanフローサイトメーターを使用して行った。データ分析を、Consort−30ソフトウェアを使用して行った。対数的に増幅した蛍光データを、前方および直角方向光拡散強度により測定して、10,000個の生存細胞について収集した。１色蛍光データを、ｘ軸に蛍光強度をとり、そしてｙ軸に細胞数をとったヒストグラムモードで表示した。２色蛍光データを、ｘ軸に緑色（FITC）蛍光をとり、ｙ軸にオレンジ色（フィコエリトリン）蛍光をとる等高線図（contour plot）として表示した。FCM染色手順は全て、FCM緩衝液中にて４℃で行った。
このアッセイの結果を図５に示す。データを、（ブロッキングAbの非存在下でのOKT3−FITC結合により測定された）最大蛍光強度の％阻害として表した。両変異Abとも、それらのエピトープに対し親gOKT3−5mAbと同様な親和性を示した。これに対し、gOKT3−6 mAb（CD3抗原に対し非常に弱い結合活性を有する別の「ヒト化」OKT3）（Van Wauweら、1980）は、OKT3 mAbに置き換わり得なかった。これらの結果は、ネズミ抗CD3 mAbのイソタイプ−スイッチ変異体のパネル（panel）において以前得られたデータと相関する。これらの研究において、異なるイソタイプを発現する抗CD3 mAbは、スキャチャード分析（Van Wauweら、1980）により、またはTCR複合体の沈澱およびクロスブロッキング実験により評価される場合には、TCR複合体に対し匹敵する結合活性を有した。従って、変異したAbの活性化または抑制の性質のいかなる差異も、抗CD3 mAbの結合部位のＴ細胞に対する親和性の改変の結果であるとし得なかった。
実施例７  U937細胞上のFcRへの変異抗CD3 mAbの結合
ヒトIgG4 gOKT3−５のCH2領域において作成される変異は、ヒトIgG1のFcR結合領域（Leu−234）のアミノ酸配列（これは、ヒトIgG4よりヒトFcR Iに対しより高い親和性を有する）、またはネズミIgG2bのFcR結合領域（Glu−235）のアミノ酸配列（これは、FcR Iと弱く結合するが、なおヒトFcR IIに結合する）のいずれかを模倣した。これらの変異のFcR結合に対する効果を測定するために、種々の「ヒト化」OKT3 mAbのFcR結合親和性を、FcR IおよびFcR IIを有する単球U937細胞株において、PE結合ネズミIgG2aの置き換えまたは125I標識ヒトIgG1の置き換えのいずれかにより試験した。
上記のようにFITC結合ネズミ抗CD5 IgG2a−PE、OKT3E IgG2b、OKT3D IgG2b、OKT3 2a、およびヒトIgG4 Abを、FcR結合アッセイにおいて結合に対して競合させるために使用した。活性化アッセイにおける対比染色として使用したフィコエリトリン結合（PE）抗CD2および抗CD5をCoulter Immunologyより購入した。TCRのモジュレーションおよびコーティングを、FITC結合OKT3 IgG2aおよびOKT3D IgG2aを使用して下記のように行った。
FcR結合アッセイを、FcR IおよびFcR IIを有するU937ヒト細胞株を使用して行った。
PE結合ネズミ抗CD5 IgG2aを用いた競合阻害アッセイのために、30×106個の細胞を、FcR Iの発現を高めるために500U/mLのヒトIFN−γの存在下に完全培地中で37℃で一晩培養した。細胞を、25μM HEPESを含有するDMEMで３回洗浄し、無FCS培地中で37℃で２時間インキュベートし、そしてDMEM中で２回、そしてフローサイトフルオリメトリー（FCM）緩衝液（0.1％ FCSおよび0.1％アジ化ナトリウムを含有するPBS）中で１回洗浄した。FCM緩衝液中で系列希釈した抗CD3 mAbのアリコートを、96ウェルＶ底組織培養プレートに、250,000 U937細胞／ウェルと共に加えた。細胞を０℃で15分間インキュベートした後、0.3μｇの抗CD5を加えた。Fcを介する抗CD3結合の置き換えを０℃で90分間行った。その後、細胞を採取しそしてFCM緩衝液中で洗浄した。PE−抗CD5 Abで染色された10,000個の細胞の蛍光を、FACScanフローサイトメーターを使用して測定した。データを、下記のようにConsort30ソフトウェアを使用する形式にプロットした。
125IヒトIgGとのFcR結合についての競合阻害アッセイのために、U937細胞を洗浄し、そしてアッセイ培地（PBS中に0.2％ BSA）中に1.4×108細胞/mLの濃度で再懸濁した。チューブ当たり１×106細胞のアリコートを、１×10-9Mの最終濃度の125I標識ヒトIgGと共に37℃で１時間インキュベートした。ネズミまたは「ヒト化」OKT3を、0.023μg/mlから150μg/mlの範囲の最終濃度で加え、総体積を21μL/チューブに揃えた。インキュベーション後、混合液を10％スクロース上に層状に加えた。11000gで５分間の遠心分離により、ペレット化した細胞（結合した125I−huIgG）を遊離125I−huIgGを含有する培地より分離した。次いで、チューブをドライアイス中で凍結し、そしてペレット化した細胞を含むチューブの底の部分を、結合した125I−huIgGの分析のために取り出した。
125I−huIgGの最大結合を、阻害剤の非存在下で測定した。結果を、最大結合に対する阻害剤存在下で結合した125I−huIgGのパーセントで表した。非特異的結合は、過剰な阻害剤（150μg/mlのネズミOKT3）の存在下で結合したパーセントとして見られる。全てのコントロールおよび試料は、３つのチューブでアッセイされた。
変異した構築物のCH2ドメインのＮ末端を図７に要約した。ネズミOKT3 IgG2aは、期待されたように、U937細胞上のFcRについて試験された全ての抗CD3 mAbの内で最も高い親和性を有した。ヒトIgG4 mAbについて以前に示されたように、gOKT3−５は、同一の阻害を達成するために10倍高い濃度を必要とした。FcR結合を高めるために発現させられたLeu−234 mAbは、gOKT3−5 mAbより効率的にFcR結合に対して競合することが一貫して証明されている。対照的に、Glu−235 mAbは、ネズミIgG2bと同様なFcR結合領域を有し、U937細胞にあまり結合せず、同一のパーセント阻害を達成するために、gOKT3−５より10倍高い濃度、そしてネズミOKT3より約100倍高い濃度を必要とする。これらの結果は、FcR結合ドメインにおけるそれぞれのアミノ酸配列から予想されるように、mAbのU937細胞への結合の順位がネズミOKT3＞Leu−234＞gOKT3−５＞Glu−235 mAbであることを示した。
実施例８  増殖アッセイ
Glu−235 mAbを、Ｔ細胞増殖を誘発する能力について試験した。ヒト末梢血の単核細胞（PBMC）を、健常ボランティアから、EDTA抗凝固化全血のフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離法により得た。EBVで形質転換したリンパ芽球腫細胞株（LCL）およびヒト組織球腫由来U937細胞株を、完全培地（2mMのＬグルタミン、2mMの非必須アミノ酸、100U/mLのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）、５×105Mの２−メルカプト−エタノール（Gibco）、25μＭのHEPES（Gibco）および10％ウシ胎児血清（FCS、Gibco）を補ったDMEM）において連続培養中で維持した。
PBMC調製物を、１％FCSを含む完全DMEM中に再懸濁し、そして96ウェル丸底組織培養プレート（Costar）に１×105細胞／ウェルで分注した。別のAbを、培養培地における系列対数希釈によりウェルに加えた。５％CO2インキュベーター中における37℃での72時間培養の後、１μCiの3H−チミジンを各ウェルに加え、次いでさらに24時間インキュベートした。細胞を半自動細胞採取器により採取し、そして3H−チミジン取り込みを液体シンチレーションカウンターにおいて測定した。全てのデータを３回計測の平均CPMとして表した。
野生型gOKT3−5 mAbを用いたPBMCの刺激は、図８に示されるように、ネズミOKT3を用いて刺激されたPBMCで観察された細胞増殖に匹敵する細胞増殖を引き起こす。これとは対照的に、３人の異なるドナーからのPBMCを使用した10μg/mlまでのmAb濃度でのGlu−235 mAbにより増殖は誘発されなかった。このことは、このmAbのFcR結合領域の変化がそのマイトジェン的性質を弱めたことを示唆する。
実施例９  CDR移植変異体mAbによるＴ細胞の活性化
初期のＴ細胞活性化事象をさらに分析するために、種々の抗CD3 mAbと共に培養したヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Leu 23およびIL−２レセプターの細胞表面発現について、それぞれ12時間インキュベーションの時点および36時間インキュベーションの時点で評価した。
活性化マーカーのＴ細胞発現を含む研究のために、２×106個のPBMCを、24ウェル組織培養プレートにおいて種々の濃度のmAbの存在下で12時間（Leu23発現）または36時間（IL−２レセプター発現）のいずれかの間培養した。
これらの細胞表面マーカーの発現に関してはネズミOKT3とgOKT3−5 mAbとの間に有意差がないことが、再現性を有して観察された（図９を参照のこと）。これに対して、Glu−235 mAbによる活性化は、両方のマーカーの発現をより低いレベルで引き起こした。実際、使用された最も高い濃度のAb（10μg/mL）は、標準OKT3を用いて得られた最大活性化の40％未満を達成した。CD4+細胞とCD8+細胞との間でこれらのマーカーの発現の差異はないことが観察された（データを示さず）。
実施例10  「ヒト化」OKT3 mAbにより誘発されるIFN−γ、GM−CSFおよびTNF−αの産生
OKT3の初回投与後に移植レシピエントにおいて観察される急性毒性は、mAbによりトリガーされるリンホカインの系統的放出に起因している。従って、「ヒト化」抗CD3 mAbにより誘発されるGM−CSF、TNF−αおよびIFN−γのインビトロ産生を測定した。リンホカイン産生を含む研究のために、２×106個のPBMCを、24ウェルプレート中で24時間（TNF−α）または72時間（GM−CSFおよびIFN−γ）のいずれかの間培養した。組織培養上清を、それぞれのインキュベーション期間の終了時に採集し、そして−20℃で保存した。リンホカインのレベルを、市販のキットを使用してサンドイッチELISA技術により測定した。
同程度の量のサイトカインは、OKT3およびgOKT3−5 mAbとのPBMCの培養後に産生された。これに対して、最も高い濃度のGlu−235 mAbは、少量のTNF−α（図10を参照のこと）およびGM−CSF（データを示さず）を誘発し、そしてINF−γは誘発しなかった（データを示さず）。
実施例11  分子工学的に操作されたOKT3 mAbによるTCR複合体のモジュレーションおよびコーティングの誘発
異なるmAbの免疫抑制特性をインビトロで比較した。最初に、TCR複合体をモジュレートおよび／またはコートするそれらの能力についてmAbを試験した。ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、既知の濃度の抗CD3 mAbと共に24ウェルプレート中において１×106細胞/mLで12時間インキュベートした。各グループからのPBMCを採取して、そしてOKT3−FITCまたはOKT3D−FITCのいずれかを用いて染色した。蛍光染色された細胞を抗CD5−PEを用いて対比染色してＴリンパ球を同定し、そしてフローサイトフルオリメトリー（FCM）により分析した。OKT3D−FITCを、OKT3 mAbに結合するエピトープとは異なるエピトープへのその結合のために選択した。従って、このAbは、モジュレートされていない表面CD3の直接測定を提供した。
0003611573.tif 000002
図11に示すように、gOKT3−５およびネズミOKT3により達成される、TCR複合体の組み合わされたモジュレーションおよびコーティングは非常に似ており、1/2最大TCRブロッキングは約1ng/mlで達成された。しかし、Glu−235 mAbを用いて観察された1/2最大モジュレーションおよびコーティングは、ネズミOKT3より100倍大きな濃度のmAb（１μg/mL）を必要とした。Glu−235 mAbと他のAbとの主要な差異は、動態の変化によるものであった。なぜなら、48時間までに、mAbは、OKT3と同様にTCR複合体をコートし、そしてモジュレートした（データを示さず）。従って、Glu−235 mAbによるTCRの内在化の達成（これは、多価の架橋に依存し得る）は、他の抗CD3 mAbと比べて遅れていた。
実施例12  CDR移植変異体mAbによるCTL活性の阻害
Abの同種反応性（alloreactive）Ｔ細胞の細胞毒性を抑制する能力を比較した。HLA−A2特異的CTLを正常HLA−AIドナーから作成した。細胞溶解活性を、FcRネガティブEBVで形質転換したHLA−A2標的細胞上で評価した。CTLをバルク同種（bulk allogeneic）MLC技法により作成した。健常ヒトドナーをHLA−Ａ発現について表現型に分類した。反応因子および刺激因子の組合せを選択してHLA−A2特異的CTLエフェクターを特異的に作成した。反応因子および刺激因子PBMCを、上述のようなフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離により調製し、そして2mMのＬ−グルタミン、100U/mLのペニシリン−ストレプトマイシン、25μＭのHEPESおよび15％の補体除去正常ヒト血清を含むRPMI 1640中に再懸濁した。刺激因子PBMC（１×107/mL）を放射線照射（3000ラド）し、そして反応因子PBMC（１×107/10mL）と共に直立の25cm組織培養フラスコ中で培養した。培養の７日後、新たに放射線照射した刺激因子PBMC（４×106/10mL）を、４×106/10mLの初代培養細胞に加え、そしてさらに５日間インキュベートした。次いで、細胞を採取し、そしてCTL活性について51Cr放出によりアッセイした。
HLA−A2特異的CTLエフェクターを上記のように作成し、採取しそして96ウェルＵ底組織培養プレートに４つの異なるエフェクター／標的比で分液した。エフェクターを、各抗CD3 mAbの系列希釈溶液と共に30分間プレインキュベートした。mAbとのインキュベーション後、51Cr標識Fcレセプターネガティブ標的細胞［非特異的標的として使用されたHLA−A2を発現するLCL株（Z2B）またはHLA−A1を発現するLCL株（G12B）］を加えた。自発的溶解を培地における標的単独のインキュベーションにより測定し、そして最大溶解を0.05N HClの添加により達成した。エフェクターおよび標的を共培養した；上清アリコートを採取し、そしてガンマカウンター内で放射能を測定した。
Ｔ細胞の細胞毒性は、同系（syngeneic）HLA−A1 EBVで形質転換した細胞株の溶解が存在しない（データを示さず）ことにより示されるように特異的であった。抗CD3 mAbによる溶解の阻害は、mAbによるTCR遮断に起因してＴ細胞がそれらの標的を認識し得ないことによることは以前より示されている。本研究において、ネズミOKT3、gOKT3−5 mAbおよびGlu−235は、同種反応性Ｔ細胞の細胞溶解活性に対し匹敵する阻害効果を示した。これらの結果は、30分間のインキュベーション時間内に異なるmAbのTCRをコートする能力が同じであったことを示唆する（図12を参照のこと）。これに対して、CD3抗原に対する結合活性が有意に減少している「ヒト化」OKT3であるgOKT3−6 mAbは、CTL活性を阻害しなかった。これらの結果は、FcRに対する改変された親和性が抗CD3 mAbのインビトロでの免疫抑制特性を変化させないことを示唆する。
実施例13  CD4モジュレーション研究
フィコール−ハイパック密度勾配遠心分離により単離されたPBMCを、１×106細胞/mLで既知の濃度のOKT3抗体と共に37℃で24時間インキュベートした。細胞を採取し、そしてFITC−OKT4を用いて染色した。この細胞をPE標識抗CD5（PE−Leu1、Becton Dickinson Immunocytometry Systems、San Jose、CA）を用いて対比染色して他のPBMC由来のＴリンパ球を識別し、そしてFACScanにより分析した。得られた研究のデータを図１に報告する（Transy、1989）。
0003611573.tif 000003
CD4モジュレーション％を以下のように計算した：
0003611573.tif 000004
図13の左のプロットのデータは、研究されたヒト化抗体が容量依存様式でCD4のモジュレーションを誘発することを明らかにする。mOKT3に関するデータ（黒塗り丸）はこれとは対照的である。この抗体からヒト化抗体および変異した抗体が構築されるのであるが、これは、0.01から0.10μg/mLまでの抗体濃度の間での直線プロットにより示されるように、CD4に対し何の効果も有しなかった。ヒト化も変異もされていないmOKT3D IgG2b抗体（黒塗り三角）についても同じことを言い得る。
右のプロットは、期待されるように、研究したいずれの抗体についてもCD8のモジュレーションがないことを示す。
実施例14  ELISAおよびRES−KW3のCD4結合についての研究
RES−KW3細胞を、PBS＋0.2％BSA＋0.1％アジ化ナトリウム（染色緩衝液）を用いて洗浄し、そして最初に種々の濃度のOKT3抗体と共に１時間氷上でインキュベートした。細胞を冷たい染色緩衝液を用いて３回洗浄し、そしてFITC標識したヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウス抗体を加えた（Caltac Lab.So.、San Francisco、CA）。細胞を、氷上でさらに１時間インキュベートし、その後、洗浄しそしてFCMにかけた。
FCMを、Hewlett−Packard 340コンピュータにインターフェイスで接続したFACScan（Becton−Dickinson Immunocytometry Systems、Mountain View、CA）フローサイトメーターを使用して行い、データをlysis IIソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して分析した。蛍光データを、10,000個の生存細胞の対数増幅を使用して、前方および直角光散乱強度により測定して収集した。１色蛍光データを、ｘ軸に蛍光強度をとりそしてｙ軸に相対細胞数をとったヒストグラムモードに表示した。
DuPontのHIVgp120/CD4レセプターEIAコートマイクロプレートをCD4結合アッセイに使用した。標準曲線を構築するために、100μL/ウェルのCDR移植OKT4AIgG1を、種々の濃度（50ng/mLの開始濃度で1:2希釈）で２列のウェルに加えた。次いで、100μL/ウェルのOKT3抗体試料を種々の希釈で加えた。希釈剤はPBS＋10％ウシ血清＋0.05％ Tween−20である。プレートを室温で２時間インキュベートした。
プレートを、PBS＋0.05％ Tween−20を用いて６回洗浄し、その後希釈剤中に1:15000希釈した100μL/ウェルのHRPO結合化ヤギ抗ヒトｘ（ｆ＋Ｂ）抗体を加えた。プレートを、室温でさらに２時間インキュベートした。プレートを再び６回洗浄し、そして100μL/ウェルのOPD/過酸化水素溶液（13mLのMili−Ｑ水に2mgのOPD錠剤を５個加えた；それらを溶解した後、次いで５μＬの30％過酸化水素を加えた）を各ウェル中に加えた。プレートを、室温で30分間暗闇でインキュベートし、そして反応を停止するために50μL/ウェルの2.5N HClを加えた。次いで、プレートを490nmで読み取った。
得られたデータを図14および15に報告する。これらのデータは、ヒト化OKT3が、ELISAプレートに固定化されているかまたはRES−KW3細胞の表面に結合したかのいずれかのCD4に結合することを示す。209IgG1A/A−１（白抜き丸）について示されたようなデータが予期されず、そして２価結合（例えば、CD3とCD4との両方への結合）が、この抗体のプレートへの安定な接着に必要とされることは、当業者により正しく認識される。
実施例15  gOKT3−７に基づく非活性化抗CD3 mAbの作成
改善された治療的指標を有する抗ヒトCD3 mAbを作成するために、本発明者らは、OKT3の相補性決定領域（CDR）をヒトIgG1およびIgG4分子上に分子的に移入すること（Woodleら、1992;Adairら、投稿中）により、OKT3に由来する「ヒト化」抗CD3 mAbのパネルを開発した。さらに、本発明者らは、免疫抑制が抗CD3 mAbにより細胞活性化の最初の工程の不在時になされ得るか否かを試験した。正式にはgOKT3−７（γ１）と名付けられ、209−IgG1と略される、ヒトFcγRsに対して高い親和性を有する「ヒト化」mAbは、OKT3と同様な活性化特性を有することがインビトロで示され（Alegre、1992;Xuら、執筆中）、それゆえ患者において活性化されたＴ細胞およびFcγＲを有する細胞によるリンホカイン放出に関連する急性毒性を誘発すると予想された。第２のmAbは、正式にはgOKT3−７（γ４−a/a）と名付けられ;Ala−Ala−IgG4と略されるが、この抗体は、「ヒト化」gOKT3−７（γ４）（209−IgG4）mAbのCH2部分における２つのアミノ酸置換（234−235位でのフェニルアラニン−ロイシンからアラニン−アラニンへの置換）により開発された。これらの変異は、ヒトおよびネズミFcγR IおよびIIへのmAbの結合を有意に減少させ、そしてインビトロでの活性化特徴の顕著な減少を導いた（Alegre、1992;Xuら、執筆中）。重要なことは、この変異体mAbが、インビトロでTCRモジュレーションを誘発しそして細胞溶解を予防する能力を保持し（Xuら、執筆中）、従って可能性のある新規な免疫抑制治療剤を代表することである。
重症複合型免疫不全（SCID）マウスは、結果として免疫グロブリンおよびTCRをうまく再配置することができない、常染色体劣性自然発生変異を有する。故に、これらの動物は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を欠いている（McCune、Annu.Rev.Immum.、1991;McCune、Curr.Opin.Immun.、1991;Bosma、1983;Bosma、1991）。本発明者らは、最近、軽度に放射線照射したSCIDマウスに死体臓器ドナーからのヒト脾臓細胞（splenocyte）を注射するモデルを開発した（Alegreら、投稿中）。これらのhu−SPL−SCIDマウスは、インビトロでマイトジェンおよび同種抗原に反応し得、そしてインビボでヒト包皮の同種移植片を急性に拒絶し得る機能的なヒトＴ細胞を維持した。本研究において、本発明者らは、hu−SPL−SCIDマウスを利用して、非活性化「ヒト化」抗CD3 mAbの免疫抑制特性をインビボで評価した。
材料および方法
略号
Ala−Ala−IgG4  gOKT3−７（γ4a/a）
FCM  フローサイトメトリー
GVHD  移植片対宿主病
IP  腹腔内
PE  フィコアリスリン
209IgG1  gOKT3−７（γ１）
209IgG4  gOKT3−７（γ４）
SCID  重篤な複合免疫不全
マウス  ホモ接合性C.B−17 scid/scid（SCID）Ｈ−2dfounderマウスを、M.Bosma博士（Fox Chase,Phila,PA）から入手し、その後シカゴ大学にて特異的病原体のない動物隔離施設内で繁殖させた。
抗体  145−2C11、すなわちハムスター抗マウスCD3 mAbを、前述のように（Leo,1987）プロテインＡカラム（Sigma,Saint Louis,MO）を用いてハイブリドーマ上清から精製した。OKT3、209−IgG1およびAla−Ala−IgG4を下記のように作成した。Ｔ細胞のマーカーとして、フィコエリスリン（PE）結合抗ヒトCD4およびCD8をCoulter Immunology（Hialeah,FL）から入手した。Ｔ細胞活性化の初期マーカーとして、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗CD69をBecton Dickinson（San Jose,Ca）から購入した。すべての抗ヒトAbを、ネズミ細胞に対する交叉反応性を排除するために試験した。
「ヒト化」抗CD3 mAbの作成および機能  ネズミおよびヒトOKT3 mAb遺伝子の永久ミエローマトランスフェクタントを、前述のように（Xuら，執筆中）作製した。ヒトおよびネズミのFcγR IおよびFcγR IIに対するそのmAbの親和性を減少させるために、234−235位のフェニルアラニン−ロイシン配列をアラニン−アラニンへ変異させることを前述のように（Alegre,1992;Xuら，執筆中）行った。ヤギ抗ヒトFc Abおよびヤギ抗ヒトκAbの組合せを用いて、COS細胞上清または永久にトランスフェクトされたミエローマ細胞株中の組み立てられた「ヒト化」抗体の収量を決定するために、ELISAを行った（Woodle,1992）。
Ｔ細胞増殖アッセイのために、96ウェル平底マイクロタイタープレート（Costar,Cambridge,MA）において、各抗体の系列対数希釈溶液と共に１×106細胞/ml（最終容量＝200μｌ）のPBMCを完全培地（RPMI−1640＋10％ FCS）中で37℃で３日間インキュベートした。このアッセイ（Beckman,Carlsbad,CA）の前に、前形成された凝集体を除去するために、すべてのmAb試料を＞30psiで20分間エアフュージした。3H−チミジン（NEN−DuPont,Wilmington,DE）を１μCi/ウェルで加え、そして採取する前にさらに４時間プレートをインキュベートした。細胞を自動96ウェル細胞採取機（Tomtec,Orange,CT）で採取し、そして3H−チミジンの取込みをBetaplate Liquid Scintillation Counter（Pharmacia）で測定した。
hu−SPL−SCIDマウスの構築および処置  シカゴ大学Institutional Review Boardにより承認されたプロトコルの下で、新鮮なヒト脾臓を死体の器官ドナーから得た。前述のように（Alegreら，投稿中）、単一の細胞懸濁液を調製した。簡単に言えば、108細胞／マウスを腹腔内（ip）注射する前に、４〜６週齢のSCIDマウスをγ線照射（200ラド）した。末梢血液中のヒト細胞のパーセントは、フローサイトメトリー（FCM）により測定した。最初に、末梢血単核細胞（PBMC）を、その後のFcγＲ結合をブロックするために非標識化ネズミIgG抗体と共にインキュベート（15分）した。次に、細胞を、PE結合抗ネズミクラスＩ（PharMingen,San Diego,Ca）で染色し、そしてFITC結合抗ヒトCD45 mAb（Coulter Immunology,Hialeah,FL）で対比染色して、ヒト細胞の集団を同定した。ヒト細胞の比率を、細胞の総数のパーセントとして表す。PBMC中で５％と20％との間のヒト細胞を有する動物を、さらなる実験のために選んだ。末梢血液中のヒト細胞の移植のレベルがマッチしたマウスは、ヒト脾臓細胞の注入11日から３週間後に、PBS（1ml）、145−2C11、OKT3、209−IgG1、またはAla−Ala−IgG4（本文中に他に記述ない場合、1mlのPBS中に再懸濁された100μｇ）のいずれかを腹腔内（ip）に投与した。
循環抗CD3 mAbの検出  SCIDおよびhu−SPL−SCIDマウスを、そのmAbの注射（100μg ip）24時間、48時間、および１週間後に眼窩後静脈穿刺により採血した。EDTAにより抗凝固化された健常供血者の全血から得られ、フィコール−ハイパック（Ficoll−Hypaque）（Lymphoprep,Nycomed,Oslo,Norway）密度勾配遠心分離法により単離されたヒトPBMCを用いるFCM分析によって、抗CD3 mAbの血清力価を測定した。精製したOKT3、209−IgG1およびAla−Ala−IgG4の３倍希釈による６つの濃度を、標準曲線を得るために用いた。ヒトPBMCを、各血清（1:10、1:30および1:90）の３つの系列希釈溶液と共にインキュベートし、次いでOKT3の検出に対しては、FITC結合ヤギ抗マウスIg（Boehringer−Mannheim,Indianapolis,IN）で染色し、そしてヒト化抗体の検出のためには、ヤギ抗ヒトIg（Caltag Laboratories,San Francisco,CA）で染色した。標準曲線上の精製抗CD3 mAbの対応する濃度と比較して、血清レベルを抗CD3染色細胞の平均蛍光から推定した。
循環IL−２の検出  抗CD3処理またはコントロール処理２時間後、SCIDマウスおよびhu−SPL−SCIDマウスより得られた血清をIL−２の存在に対して分析した。このIL−２の存在は、前述のように（Mosmann,1983）IL−2/IL−４依存性細胞株、すなわちCTLL−４を利用する比色アッセイを用いて分析された。CTLL−４細胞は、組換えネズミIL−２および組換えヒトIL−２に対して同様に増殖し、そしてヒトIL−４ではなくてネズミIL−４に応答した。観察された増殖においてネズミサイトカインの関与を除外するために、抗ネズミIL−4 mAb、すなわち［11B11（Ohara,1985）］、および抗ネズミIL−2 mAb、すなわち［S4B6,（Cherwinski,1987）］を、ヒトIL−２ではなくてそれぞれネズミIL−４およびIL−２に対するCTLL−４細胞の増殖をブロックすることが見い出された濃度で選択されたウェルに加えた。
皮膚移植  ヒト脾臓細胞の接種11日後に、SCIDマウスおよびhu−SPL−SCIDマウス上にヒト新生児の包皮を移植した。60μg/mlのクロロハイドレート（120μｌを腹腔内に送達）（Sigma,St.Louis,MO）とヒドロキシフルラン（Metophane,Pitman−Moore,Mundelein,IL）の断続的な吸入とでマウスを麻酔した。皮膚移植片を、マウスの背側胸郭上に配置した。各包皮を４匹の動物、すなわち異なるグループ（SCID、PBS処理、145−2C11処理および抗CD3処理hu−SPL−SCIDマウス）からの各々に移植するために用いた。マウスに、1mlのPBS中で希釈されたOKT3、209−IgG1、Ala−Ala−IgG4または145−2C11（50μg/日を５日間、次いで10μg/日を10日間）、もしくは1mlのPBSのみを投与した。７日目に移植片の包装を解き、そして最初の30日間は毎日、その後は１週間に１度、２人の研究者によって盲検的に（blindly）かつ独立して移植片の状態を採点した。点数は、０から４までの範囲とした：グレード０は、インタクト（intact）で柔軟性がある皮膚移植片を表した；グレード１は、小さな領域に改変された色素形成を有する皮膚移植片を表した；グレード２は、脱色素状態の大きな領域を有する柔軟な皮膚移植片を表した；グレード３は、堅くなった、またはわずかにかさぶたを生じた皮膚移植片を表した；グレード４は、収縮している、またはかさぶたを生じている皮膚移植片を表した。点数がグレード３またはそれ以上の場合は、拒絶反応を記録した。
結果
「ヒト化」mAbの特徴付け  OKT3および「ヒト化」mAbは、姉妹編の研究において、FITC結合OKT3を用いる競合的結合アッセイ（Alegre,1992）におけるフローサイトメトリー（FCM）によって測定されるように、ヒトCD3複合体に対して類似の結合力を有することが示された。125I−ヒトIgGおよびヒト単球細胞株U937を用いる、FcR結合に対する競合的阻害アッセイにおいて、OKT3、209−IgG4および209−IgG1は、ヒトFcγＲに対して類似の親和性を有することが見い出されたが、一方ヒトFcγR IまたはFcγR IIへのAla−Ala−IgG4 mAbおよびAla−Ala−IgG1 mAbの結合は、非常に減少した（Xuら，執筆中）。最後に、「ヒト化」mAbを、Ｔ細胞増殖を誘導する能力に対して試験した。209−IgG4 mAbまたは209−IgG1 mAbによるPBMCの刺激は、ネズミOKT3で刺激されたPBMCで観察された細胞増殖に匹敵する細胞増殖を起こした（図16）。それに対して、100ng/mlまでの濃度のAla−Ala−IgG4 mAbによって顕著な増殖は誘導されなかった。事実、最も高い濃度で観察された増殖は、mAbの凝集によるものであり得る。これらの結果は、このmAbのFcγＲ結合領域の変化が、そのマイトジェン特性を損なうことを示唆している。
抗CD3 mAbの循環レベルの測定  108個のヒト脾臓細胞の腹膜腔内注入10日から３週間後に、マウス末梢血に移植したヒト細胞のパーセントについて、SCIDマウスを試験した。既に記載した通り、移植片対宿主病（GVHD）は25％〜30％より多いヒト細胞を有するマウスにおいて明らかに認められた（Alegreら、投稿中）。従って、抗CD3処理前にヒトＴ細胞活性化のレベルを最小にするために、５％〜20％の循環ヒトCD45+細胞を有する動物を次の実験のために選択した。ヒト細胞での移植のレベルが適合したマウスを、OKT3、209−IgG1、Ala−Ala−IgG4またはPBSでの処理のために異なるグループに割り当てた。図17に示す通り、注入24時間後に全ての抗CD3 mAbの有意な血清レベル（８μg/mlと13μg/mlとの間）を測定した。PBSで処理したSCIDマウスおよびhu−SPL−SCIDマウスでは、抗CD3 mAbは検出されなかった（データを示さず）。48時間までに劇的に減少したレベルのゆえに、mAbの持続は比較的短かった。これらのデータは、他のhu−SPL−SCID実験モデルにおける免疫イムノグロブリンの短い半減期に関する、既に報告された結果（Duchosal、1992）と一致する。これらはまた、ヒトへの注入後の循環OKT3のクリアランスの時間経過を連想させる（Thistlethwaite、1988）。
抗CD3 mAb投与後のＴ細胞の検出  OKT3および209−IgG1のhu−SPL−SCIDマウスへの注入により、急速かつ実質的な循環ヒトCD45+細胞の枯渇が誘発され、これは注入３時間後最初の測定時にほぼ最大であった（データを示さず）。これらのデータは、OKT3の注入後にヒトで見られるＴ細胞の末梢血からのクリアランスと一致する。興味深いことに、hu−SPL−SCIDマウスにおいてAla−Ala−IgG4注入後に末梢血で観察された枯渇は、一貫して活性化抗CD3 mAbの注入後ほどではなかった。このことから、抗CD3 mAbのFcγＲへの結合は、循環Ｔ細胞数の減少においてある役割を果たすことが示唆される。ヒト細胞の脾臓および腹膜腔からのクリアランスは、活性化または非活性化の任意の抗CD3 mAbの単回注入後には完全ではなかった。さらに、脾臓における枯渇（depletion）の動力学は、末梢血においてよりも遅く、48時間まで60％のヒト細胞の損失という最大損失は達成されなかった（データを示さず）。これとは対照的に、ヒト移植レシピエントにおいて臨床的に用いられるプロトコールに類似のプロトコールは、抗CD3 mAb（10μｇ）の14日間連続腹腔内投与からなり、Ala−Ala−IgG4の投与後でさえ末梢血、脾臓および腹膜腔内のCD3+T細胞の完全な枯渇を生じさせる（データを示さず）。PE結合抗CD4 mAbまたは抗CD8 mAbによる染色では、残存するヒトＴ細胞は１つも認められなかったので、CD3+細胞の不在はmAbによるTCR複合体のモジュレーションおよび／またはコーティングに起因するものではなかった。さらに、このプロトコールの終了３日後に採取されたhu−SPL−SCID脾臓細胞は、インビトロで固定化OKT3に対して増殖し得なかった（データを示さず）。興味深いことに、脾臓またはリンパ節のようなヒトのリンパ系コンパートメントからＴ細胞を枯渇させるOKT3の能力は知られていないことが認められた。しかし、抗マウスCD3 mAb、すなわち145−2C11を用いた研究により、Ｔ細胞はまた、免疫適格マウスの末梢リンパ器官から枯渇されることが示されている。
抗CD3 mAb投与後のＴ細胞上での活性化の表面マーカーの誘導  移植レシピエントへのOKT3注入後の初期の現象は、FcγR+細胞によるTCRの架橋によるCD3+T細胞の活性化である（Abramowicz、1989;Chatenoud、1989;Ceuppens、1985）。患者におけるＴ細胞の活性化は、CD69、CD25およびHLA−DRのようなマーカーの表面発現の増加を引き起こす。既に記載したとおり、GVHDの結果として、かなりのパーセントのhu−SPL−SCID T細胞がCD25およびHLA−DRを発現する（Alegreら、投稿中）。これとは対照的に、活性化のより早期でかつより一過性のマーカーであるCD69のレベルは、ヒト由来のＴ細胞上に認められるCD69のレベルに匹敵する。両CD4+およびCD8+脾臓細胞上でのCD69+の発現の有意な増加は、hu−SPL−SCIDマウスへのOKT3および209−IgG1の注入24時間後には観察されたが、Ala−Ala−IgG4またはPBS投与後には観察されなかった（図18）。このことから、Ala−Ala−IgG4 mAbは、FcγＲ結合抗CD3 mAbほどＴ細胞活性化を誘導しないことが示唆された。
抗CD3療法後のIL−２の産生  OKT3を患者に投与すると、TNF−α、IL−２、IL−６およびINF−γのようなサイトカインの急速な全身性放出が誘導され、注入２から６時間後にピークに達することが示されている（Abramowicz、1989;Chatenoud、1989）。このサイトカイン産生は、移植レシピエントにおいて抗CD3療法に関連する急性毒性を引き起こす。本研究では、バイオアッセイを用いて、PBS、OKT3、209−IgG1、Ala−Ala−IgG4、またはハムスターの抗マウスCD3 mAbである145−2C11でのhu−SPL−SCIDマウスの処理２時間後に、ヒトIL−２の血清レベルを測定した。図19に示したとおり、OKT3および209−IgG1の注入のみが、hu−SPL−SCIDマウスにおいて検出可能なヒトIL−２の放出を誘導した。移植されたヒト細胞のパーセントが比較的少なかったため、検出されたレベルは低かったが、実施した実験では、容易に検出できた。異なるパーセントのヒト細胞が各動物に移植された結果、個々の動物からのリンホカイン産生は変化した。145−2C11注入後はヒトIL−２もマウスIL−２も検出されず、このことからこれらのマウスには内因性のネズミＴ細胞は存在しないことが確認された。Ala−Ala−IgG4の投与はIL−２産生を誘導しなかった。このことは、ヒトＴ細胞を完全に活性化するこのmAbの能力が減少したことと一致する。検出されたヒト起源のサイトカインを確認するために、ネズミサイトカインと交叉反応しないプライマーを用いて、処理６時間後にSCIDおよびhu−SPL−SCIDマウスの脾臓上でポリメラーゼ連鎖反応アッセイを実施した。IL−２に加えて、INF−γ mRNAは、OKT3および209−IgG1 mAb注入後、アップレギュレーションされるが、Ala−Ala−IgG4 mAb注入後アップレギュレーションされないことが見出された（データを示さず）。同時にこれらの結果をまとめると、Ala−Ala−IgG4 mAbは、OKT3および209−IgG1と比較して、減少した活性化特性を有することが示される。
抗CD3 mAbの投与による皮膚移植片生存の延長  次に、異なるmAbの免疫抑制特性を調べた。以前の研究では、209−IgG1 mAbおよびAla−Ala−IgG4 mAbは、インビトロでTCRをモジュレートすることおよび細胞毒性Ｔ細胞応答を抑制することの両方の点でに有効であることが示されている（Alegre、1992;Xuら、執筆中）。初期のインビボでの研究は、同様に迅速な免疫抑制効果が、両「ヒト化」mAbにより誘導されたことを示した。なぜならTCRは、いずれかのmAb注入24時間後に細胞表面から有意にモジュレートされるからである（データを示さず）。しかし、これらのmAbの免疫抑制の有効性を直接調べるため、本発明者らは皮膚移植実験を実施した。本発明らの研究所での以前の研究により、hu−SPL−SCIDマウスはヒト包皮同種移植片を拒絶し得、そしてヒトＴ細胞はこの過程に関与していることが示されている（Alegreら、投稿中）。SCIDマウスおよびhu−SPL−SCIDマウスに環状切除より得られ、そして養子免疫細胞移入に使用したヒト細胞に関しては同種であると思われた、ヒト包皮を移植した。末梢血におけるヒトCD45の発現レベルがマッチしたhu−SPL−SCIDマウスに、PBSまたは皮膚移植の日から開始して15日間連日投与のOKT3、209−IgG1、Ala−Ala−IgG4、または145−2C11のいずれかを投与した。図20に示したとおり、PBSまたは145−2C11を投与した動物は移植片を拒絶し、50％平均生存時間は13日であった。これは本発明者らの以前の結果と一致した。これとは対照的に、OKT3処理した動物の全てならびに209−IgG1およびAla−Ala−IgG4処理したマウスの１匹を除く全ては、80日より長い間皮膚組織片を保持した。80日目にマウスを屠殺し、そしてグループあたり２匹の動物を、異なる細胞コンパートメントにおけるヒト細胞のパーセントについて分析した。FCMによって測定した場合、末梢血、脾臓または腹膜腔中においてヒトCD3+細胞を再発現した抗ヒトCD3処理マウスは１匹もなかった。これとは対照的に、PBS処理動物は、かなりのパーセントのヒトCD45+細胞およびCD3+細胞を異なるコンパートメント内に保持したが、初期の移植と比較して、時間経過に伴ってその絶対数は減少した（データを示さず）。グループあたり５〜７匹の動物を使って、さらに３種類の皮膚移植実験を実施した。これらの実験では、OKT3、209−IgG1およびAla−Ala−IgG4で処理した動物の66〜80％が、動物が試験されている間は移植片を維持した。３種の実験のうち２種は、Ala−Ala−IgG4で処理したマウスのより高いパーセントが、永久的に皮膚移植片を維持した。これら３つのグループ間に統計上の差は認められなかった。
考察
これらの研究より、OKT3由来で、かつFcγＲへの結合を妨げるためにFc部分に２個のアミノ酸の変異を有する「ヒト化」mAbは、前臨床モデルにおいてインビボでヒトＴ細胞活性化を誘導しないが、ネイティブのmAbの免疫抑制特性を保持する。
OKT3は、Ｔリンパ球とFcγR+細胞を架橋することによってＴ細胞活性化を仲介することが示されている（Palacios、1985;Ceuppens、1985;Kan、1985）。hu−SPL−SCIDマウスはキメラ動物であって、ネズミおよびヒトの両FcR+細胞を有しているため、ヒトおよびネズミFcγＲに対する同様な結合力を有するmAbsを用いることは重要であった。従って、OKT3、すなわちネズミIgG2a、およびヒト209−IgG1 mAbは、両種のFcγＲに対して高い結合活性を有している（Xuら、執筆中）。これとは対照的に、ヒトAla−Ala−IgG4は、ネズミおよびヒトFcγＲへの結合を劇的に減少させる変異を有している。ヒトFcγＲの供給体（provider）として、ヒトＢ細胞、単球／マクロファージおよびNK細胞を用いる異なる細胞コンパートメントの移植の有効性は、観察されたヒトＴリンパ球の割合と比較すると、このhu−SPL−SCIDモデルにおいては比較的低かった［腹膜腔内および末梢血内で10％および脾臓内で20％（Alegreら、投稿中）］。一方、ネズミの単球／マクロファージおよびNK細胞は、SCIDマウスにおいて機能的に正常であり、そして正常レベルのネズミFcγＲを発現する（Bosma、1991;Kumar、1989）。このキメラ系において、すなわちネズミであろうとヒトであろうといずれにしても、OKT3および209−IgG1によって仲介される架橋の原因であるこのタイプの補助細胞は、OKT3注入後の患者で観察される細胞活性化と類似の細胞活性化の引き金となる。実際、ヒトIL−２の産生およびヒトINF−γ mRNAの蓄積、ならびにＴ細胞上での、活性化の表面マーカーであるCD69の発現の増加によって測定したとおり、OKT3および209−IgG1が引き起こすヒトＴリンパ球の活性化は、処理したマウスにおいて明白であった。これとは対照的に、Ala−Ala−IgG4がFcγＲと相互作用する能力を有していないことは、mAbをＴ細胞活性化の完全な引き金となり得なくする。
OKT3で処置した患者におけるＴリンパ球およびFcγR+細胞の活性化は、発熱、悪寒、頭痛、急性細管壊死、下痢、急性呼吸困難症候群などの副作用（adverse reaction）と関連している（Abramowicz、1989;Chatenoud、1989;Toussaint、1989;Thistlethwaite、1988;Goldman、1990）。同様に、145−2C11を注入した免疫適格マウスは、低体温症、低血糖症、嗜眠、肝臓脂肪症、急性細管壊死を発症する（Alegre、Eur.J.Immun.,1990;Alegre、Transplantation、1991;Feran、1990）。ヒト細胞移植片のパーセントが中程度の場合、hu−SPL−SCIDマウスは、OKT3または209−IgG1治療後、検出可能な徴候を示さなかった。しかし、PBMC中に30％を越えるヒト細胞を有する動物にOKT3または209−IgG1を注入した場合、これらの動物は著しい嗜眠状態となり、そして動物死のパーセントの上昇が観察された。既に示したとおり、高いパーセントのヒトＴ細胞を移植された動物は、しばしばGVHD様症候群にかかるが、その結果、膵臓炎、びまん性出血性壊死、を含む多くの病理学的徴候を招き、そして多くの場合動物死を招く。興味深いことに、多くの移植を行った動物へのAla−Ala−IgG4の投与はGVHDの徴候を減少し、そしておそらく死亡を予防するものと思われた。しかし、試験した動物の数が少なすぎたため、統計上の差が生じなかった。
３種類の抗CD3 mAb全てのhu−SPL−SCIDマウスへの投与は、活性化または非活性化にかかわらず、Ｔリンパ球の表面からのCD3分子のモジュレーション、およびそれに続くＴ細胞の枯渇を招く（データを示さず）。同様に、OKT3で処理した移植患者においては、末梢循環からのTCR複合体およびＴ細胞の枯渇の迅速なモジュレーションは、おそらくは本薬物の免疫抑制特性の原因となるであろう（Chatenoud、1982）。重要なことに、本研究で、Ala−Ala−IgG4 mAbの投与は、活性化OKT3 mAbおよび209−IgG1 mAbの場合と同様に、同種移植片の生存の劇的な延長を引き起こした。これらの所見は、Ｔリンパ球/FcR+細胞架橋による完全なＴ細胞活性化は、強力な抗CD3−介在免疫抑制の達成に必ずしも必要ではないことを示す。
要約すると、Ala−Ala−IgG4、すなわち「ヒト化」OKT3のFc部分に２個のアミノ酸変異を有するmAbは、OKT3よりも低い免疫原性でありながら免疫抑制を誘導し、そしてOKT3より少ない副作用を誘導するための臨床的移植において、有用であることを立証し得る。さらに、「ヒト化」mAbを使用することにより、OKT3の反復投与後にしばしば生じる抗異種型Abの産生を減少し得る（Thistlethwaite、1988）。最後に、非活性化Ala−Ala−IgG4 mAbはまた、mAbによって誘導される潜在的副作用および強力な体液性応答のためにOKT3での処理が実施できない自己免疫疾患を患う患者への抗CD3 mAbの適用を広げ得る。
実施例16  抗体のインビトロ使用
上記の使用に加えて、請求項に記載された抗体は種々のインビトロ使用を有する。これらのいくつかを以下に記載するが、その他も当業者に理解される。
1.イムノアッセイ
本発明の抗体は、CD3の検出のためのイムノアッセイにおいて有用性を見い出す。最初にイムノアッセイについて言えば、本発明の好適なイムノアッセイは、当該技術分野で公知の種々のタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を含む。しかし、抗体の有用性がこのようなアッセイに限定されず、そしてその他の有用な実施態様にはRIAおよびその他の非酵素結合抗体結合アッセイまたは手法が含まれることが容易に理解される。
好適なELISAアッセイにおいて、CD3について試験されるべき試料は、選択される表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面上に固定化される。不完全に吸着した物質を除去するために洗浄した後、抗CD3抗体に関して抗原的に中性であることが知られている、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼインまたはミルク粉末の溶液のような非特異的タンパク質を、ウェルに結合またはコートすることが望ましい。このことで固定化表面上の非特異的吸着部位がブロックされ、そしてそれ故抗体のこの表面上への非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを減少させる。
抗原性物質をウェルに結合させ、バックグラウンドを減少させるために非反応性物質でコートし、そして非結合物質を取り除くために洗浄した後、固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成の助けとなる様式で、抗CD3抗体と接触させる。そのような条件は、好ましくはBSA、ウシγグロブリン（BGG）、およびリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）/Tweenのような希釈剤で希釈することを包含する。これらの添加される試薬はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向にある。重層された抗体を、次いで、好ましくは25゜〜27℃のオーダーの温度で、２〜４時間インキュベートする。インキュベーションの後、非免疫複合体化物質を除去するために抗体と接触した表面を洗浄する。好適な洗浄手法は、PBS/Tween、またはホウ酸緩衝液のような溶液を用いた洗浄を含む。
試験試料と結合抗原との間の特異的免疫複合体の形成、および引き続く洗浄の後、抗CD3抗体に特異性を有する第２の抗体に特異的免疫複合体を曝すことにより、免疫複合体形成の出現および量さえも決定し得る。勿論、抗CD3は、代表的にはヒトIgG領域を有するので、第２の抗体は、好ましくは、一般にヒトIgGに対して特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、第２の抗体は、好ましくは、適切な発色性基質とインキュベートする際に、発色反応を生じる関連酵素を有する。従って、例えば、免疫複合体形成の成長に適した時間および条件下（例えば、PBS−TweenのようなPBSを含む溶液中室温で２時間のインキュベーション）で、抗血清結合表面を、ウレアーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGと、接触およびインキュベートすることが好ましい。
酵素が結合した第２の抗体とのインキュベーション後、そして非結合物質を除去するための洗浄に次いで、尿素およびブロムクレゾール紫、または酵素標識としてペルオキシダーゼの場合には、2,2'−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）［ABTS］およびH2O2のような発色性基質とのインキュベーションにより標識の量を定量する。定量化は、次いで、発色の程度を、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて測定することによりなされる。
2.蛍光励起細胞選別法（FACS）
蛍光励起細胞選別法、すなわちフローサイトメトリーまたはフローマイクロフルオロメトリーは、抗原の存在について個々の細胞を走査する手段を提供する。この方法は、液体媒体中の標識細胞の励起放射を活性化、および検出し得る器具を使用する。
FACSは、生存している細胞または固定された細胞のいずれかに関して、迅速で、信頼できる、定量的、かつ多変量の分析を提供するその能力において独特である。「ヒト化」抗CD3抗体は、個々の細胞の抗原性、生物物理学的特性、および生化学的特性の分析および定量のための有用な道具を提供する。静電偏向技術とともに使用される場合、本発明の抗体は、細胞のサブ集団の特異的単離に使用され得る。
3.免疫組織化学
本発明の抗体はまた、免疫組織化学（IHC）による研究から調製された新鮮に凍結された組織ブロックおよびホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された組織ブロックと組み合わせて使用され得る。例えば、各組織ブロックは、50mgの残存「粉末された」（residual"pulverized"）腫瘍からなる。これらの粒子状標本から組織ブロックを調製する方法が開発され、および種々の予後因子についての先に述べたIHC研究において首尾良く使用されており、そして当業者に周知である（Brownら、（1990）;Abbondanzoら、（1990）;Allredら、（1990））。
要約すれば、凍結切片は、（Ａ）50ngの凍結「粉末化」胸部腫瘍を、室温で、小プラスチックカプセル中においてPBS中で再水和すること、（Ｂ）遠心分離により粒子をペレット化すること、（Ｃ）それらを、粘稠包埋剤（embedding medium）（OCT）中に再懸濁すること、（Ｄ）カプセルを逆さにしてかき混ぜ、そして遠心分離により再度ペレット化すること、（Ｅ）−70℃のイソペンタン中で急速凍結すること、（Ｆ）プラスチックカプセルを切断しそして凍結した円柱状の組織を取り出すこと、（Ｇ）この円柱状組織を低温維持ミクロトームのチャック上に固定すること、および（Ｈ）平均約500個の著しくインタクトな腫瘍細胞を含む25〜50枚の連続切片に切断すること、により調製され得る。
永久切片は、（Ａ）50mgの試料をプラスチック微量遠心分離チューブ中で再水和、（Ｂ）ペレット化、（Ｃ）４時間の固定のために10％ホルマリン中に再懸濁、（Ｄ）洗浄／ペレット化、（Ｅ）2.5％温寒天中に再懸濁、（Ｆ）ペレット化、（Ｇ）氷水中で冷却して寒天を硬化、（Ｈ）チューブから組織／寒天ブロックの取り出し、（Ｉ）ブロックをパラフィン中に浸潤し包埋すること、および（Ｆ）50枚までの連続永久切片に切断することを含む同様な方法により調製され得る。
4.免疫沈降
本発明の抗体は、免疫沈降によるCD3の単離に特に有用である。免疫沈降は、複合体混合物から標的抗原成分の分離を含み、そして微小量のタンパク質を区別しまたは単離するために使用される。膜タンパク質の単離には、細胞を界面活性剤ミセル中に可溶化しなければならない。胆汁酸塩のような他の薬剤は、酸性pHまたは２価の陽イオンの存在下で沈殿するので非イオン性の塩が好適である。
本発明の組成物または方法を、好適な実施態様に関して記載してきたが、本発明の概念、思想および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載される組成物、方法、および方法の工程または工程の配列に、改変を適用し得ることは当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的に関連する特定の試薬が、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細書に記載される試薬と置換され得ることは明らかである。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変は、添付の請求の範囲により規定されるように、本発明の思想、範囲および概念内にあると見なされる。すべての請求項に記載された事項は、過度の実験をすることなくなされ得る。
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Woodleら（1991）Transplantation 52:354.
Woodle ESら（1983）Transplantation.52:361.
Woodle ESら（1992）J.Immunol.143:2756.
Woof JMら（1984）G.Mol.Immunol.21:523.
Woof JMら（1986）G.Mol.Immunolo.23:319.
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：アーチ  ディベロプメント  コーポレイション
（Ｂ）番地：イースト  58ティーエイチ  ストリート  1101
（Ｃ）市：シカゴ
（Ｄ）州：イリノイ
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:60637
（ii）発明の名称：モノクローナル抗体の免疫抑制活性および毒性のモジュレーションのための方法ならびに物質
（iii）配列数:17
（iv）連絡住所
（Ａ）住所人：アーノルド，ホワイト  アンド  ダーキー
（Ｂ）番地：ピー．オー．ボックス  4433
（Ｃ）市：ヒューストン
（Ｄ）州：テキサス
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:77210
（ｖ）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PC−DOS/MS−DOS,ASCII
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：未知
（Ｂ）出願日：本明細書と同時
（Ｃ）分類：未知
（vii）先願データ：
（Ａ）出願番号:070.116
（Ｂ）出願日:1993年６月１日
（viii）代理人／事務所情報：
（Ａ）氏名：ウィルソン，マーク  ビー．
（Ｂ）登録番号:37,259
（Ｃ）照会／記録番号:ARCD137P−−
（ix）電話回線情報：
（Ａ）電話:512−320−7200
（Ｂ）テレファックス:512−474−7577
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:2399塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:CDS
（Ｂ）存在位置:53..760
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1151..1186
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1308..1634
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1732..2055
（xi）配列：配列番号1:
0003611573.tif 000005
0003611573.tif 000006
0003611573.tif 000007
0003611573.tif 000008
0003611573.tif 000009
0003611573.tif 000010
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:235アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号2:
0003611573.tif 000011
0003611573.tif 000012
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:12アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号3:
0003611573.tif 000013
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:109アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号4:
0003611573.tif 000014
0003611573.tif 000015
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:108アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号5:
0003611573.tif 000016
0003611573.tif 000017
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:107アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号6:
0003611573.tif 000018
0003611573.tif 000019
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:108アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号7:
0003611573.tif 000020
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:107アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号8:
0003611573.tif 000021
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:107アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号9:
0003611573.tif 000022
（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:119アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号10:
0003611573.tif 000023
（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:126アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号11:
0003611573.tif 000024
0003611573.tif 000025
（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:119アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号12:
0003611573.tif 000026
0003611573.tif 000027
（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:119アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号13:
0003611573.tif 000028
0003611573.tif 000029
（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:119アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号14:
0003611573.tif 000030
0003611573.tif 000031
（２）配列番号15の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号15:
0003611573.tif 000032
（２）配列番号16の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号16:
0003611573.tif 000033
（２）配列番号17の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:9塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号17:
0003611573.tif 000034
【図１Ａ】
0003611573.tif 000035
【図１Ｂ】
0003611573.tif 000036
【図２Ｇ】
0003611573.tif 000037
【図２Ａ】
0003611573.tif 000038
【図２Ｂ】
0003611573.tif 000039
【図２Ｃ】
0003611573.tif 000040
【図２Ｄ】
0003611573.tif 000041
【図２Ｅ】
0003611573.tif 000042
【図２Ｆ】
0003611573.tif 000043
【図３Ａ】
0003611573.tif 000044
【図３Ｂ】
0003611573.tif 000045
【図４】
0003611573.tif 000046
【図９Ａ】
0003611573.tif 000047
【図５】
0003611573.tif 000048
【図７】
0003611573.tif 000049
【図８】
0003611573.tif 000050
【図９Ｂ】
0003611573.tif 000051
【図１１Ａ】
0003611573.tif 000052
【図１１Ｂ】
0003611573.tif 000053
【図１０】
0003611573.tif 000054
【図１１Ｃ】
0003611573.tif 000055
【図１２】
0003611573.tif 000056
【図１３Ａ】
0003611573.tif 000057
【図１３Ｂ】
0003611573.tif 000058
【図１４】
0003611573.tif 000059
【図１５】
0003611573.tif 000060
【図１６】
0003611573.tif 000061
【図１７】
0003611573.tif 000062
【図１８】
0003611573.tif 000063
【図１９】
0003611573.tif 000064
【図２０】
0003611573.tif 000065