(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定試薬であって、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液として保存してなる化学発光測定試薬。
【請求項２】
化学発光基質がルミノール類である請求項１記載の化学発光測定試薬。
【請求項３】
酸化剤が過酸化水素である請求項１又は２記載の化学発光測定試薬。
【請求項４】
酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液を調製し、ペルオキシダーゼを含む反応系に、▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の順に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
【請求項５】
酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液を調製し、これらを別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
【請求項６】
酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液を調製し、使用直前にこれらを混合して、ペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
【請求項７】
化学発光基質がルミノール類である請求項４、５又は６記載の化学発光測定方法。
【請求項８】
酸化剤が過酸化水素である請求項４、５、６又は７記載の化学発光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生物学的に特異的な結合反応、例えば抗原抗体反応の検出・定量等に有用な化学発光測定試薬及び化学発光測定方法に関する。特に、臨床検査及び臨床化学の分野等で生体微量成分の高感度な分析・定量に有用な化学発光測定試薬及び化学発光測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
測定対象物質を高感度に検出・定量するために、抗原、抗体、受容体等の特異的捕捉剤を用いた特異的な結合反応を利用することが知られており、代表的な測定方法にサンドイッチ型免疫測定法が知られている。前記結合反応の検出用物質としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光性物質、発光性物質等を利用することができる。これらのうち、酵素を検出用物質として用いる免疫測定法（ＥＩＡ）は、ラジオアイソトープを用いる免疫測定法（ＲＩＡ）のような危険性はなく、特異的な結合反応を増幅することができ、一般にその酵素の触媒活性を定量することによって、特異的に結合した測定対象物質量を間接的に測定することができるため、広く用いられている。
酵素としてペルオキシダーゼを使用し、この酵素活性をルミノール及び過酸化水素による化学発光反応を利用して測定する方法は、通常発光が短寿命であるが、増感剤の添加により、発光量の増加及び発光持続時間の長期化が図れ、この反応を用いるとＲＩＡに匹敵する高感度な測定が可能となることが知られている。そのために種々の増感剤が検討されている（特開昭５９−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２号公報、特開平２−２９１２９９号公報等）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
試薬の構成及び反応時の混合順序として、上記特開昭５９−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２号公報等には、ペルオキシダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の４つを別々の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反応を開始させることが記載される。さらに具体的には、使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始させる方法が記載されている。また、上記特開平２−２９１２９９号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使用の約２時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加えて混合した混合液を、反応系に添加する方法が記載されている。
一般に、これらの化学発光反応を利用する測定方法が適用される測定対象物質は超微量であることが多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに高感度でかつ安定な測定法及び保存安定性の高い試薬の開発が望まれている。
本発明は、これらの課題を解決するものであり、試薬の構成及び添加順序の点から、鋭意検討を行った結果なし得た、さらに高感度でかつ安定な測定方法及び保存安定性が高くかつ試薬キットの簡素化も図れる測定試薬及び測定方法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は、下記の（１）〜（４）に関する。
（１）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定試薬であって、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液として保存してなる化学発光測定試薬。
（２）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液を調製し、ペルオキシダーゼを含む反応系に、▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の順に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
（３）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液を調製し、これらを別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
（４）酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、予め▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液を調製し、使用直前にこれらを混合して、ペルオキシダーゼを含む反応系に添加することを特徴とする化学発光測定方法。
【０００５】
本発明における化学発光測定試薬及び化学発光測定方法は、酵素としてペルオキシダーゼを用い、酵素活性の検出・定量に化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いるものであれば、測定対象及び測定手法に特に制限はない。
例えば、ペルオキシダーゼを標識酵素として用いる特異的結合反応系として、酵素免疫測定法の一抗体法、二抗体法、競合分析法、サンドイッチ分析法、ホモジーニアス分析法、ヘテロジーニアス分析法、ウエスタン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用できる。
【０００６】
本発明で用いられるペルオキシダーゼは特に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの各型が知られているが、これらの中ではＣ型がＲＺ値（ヘミンとタンパク質の比を示す）及び酵素活性の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡（株）から市販され入手可能である。
【０００７】
化学発光反応に用いる化学発光基質としては、ルミノール類、ルシゲニンなどがあるが、ルミノール類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール等が挙げられる。中でもルミノール又はイソルミノールが好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノールは、通常入手できる試薬グレードのものには、製造原料であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いので、再結晶を繰返し精製したものを用いるのが好ましい。
【０００８】
化学発光反応に用いる酸化剤としては、過酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが挙げられるが、過酸化水素が好ましい。
化学発光反応に用いる増感剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば特に限定するものではないが、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロムフェノール、フェノールインドフェノール、４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾール、４−  （４−ハイドロキシフェニル）チアゾール等のベンゾチアゾール誘導体、３−  （１０−フェノチアジル）−プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジエチルアニリン等が好ましいものとして用いられる。特に好ましいものは、Ｓ／Ｎ比（シグナルとノイズの比）が高い点で４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノールである。
【０００９】
本発明の化学発光測定試薬は、化学発光に関与する物質を▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液として保存してなる。このように保存すると、従来のような化学発光基質を▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質溶液、▲３▼増感剤溶液の３液系として保存する必要がないので、試薬キットの構成を簡素化でき、測定機器付属の自動分注装置に適用できる試薬数が少ない場合は便利である上、保存安定性も３液系と同等以上であり、優れる場合もある。
酸化剤溶液は安定性又は発光反応のＳ／Ｎ比を高めるために、緩衝液に防腐剤や界面活性剤やタンパク質等を添加した溶液を溶媒として用いるのが好ましい。酸化剤の濃度は、高発光が得られ、基質阻害がかからない濃度であれば特に限定するものではないが、溶液中０．１〜１０ｍＭが好ましい。
化学発光基質・増感剤溶液は、安定した発光を得るためにｐＨ８〜１３のアルカリ性であることが好ましい。
増感剤濃度は、Ｓ／Ｎ比の高い発光が得られれば特に限定するものではないが、溶液中０．０１〜５ｍＭの範囲が好ましい。
発光基質濃度は高発光が得られ、基質阻害がかからない濃度であれば特に限定するものではないが、溶液中０．０１〜５０ｍＭの範囲が好ましい。
【００１０】
本発明の化学発光測定方法は、予め化学発光に関与する物質を▲１▼酸化剤溶液、▲２▼化学発光基質・増感剤混液の２液として調製し、
（ａ）ペルオキシダーゼを含む反応系に、▲１▼の溶液、▲２▼の混液の順に添加するか、（ｂ）▲１▼の溶液及び▲２▼の混液を、別々にかつ同時にペルオキシダーゼを含む反応系に添加するか、
（ｃ）▲１▼の溶液及び▲２▼の混液の２液を使用直前に混合して、ペルオキシダーゼを含む反応系に添加するものである。
これらの方法をとることにより、従来の方法に比べて化学発光量の大きい、高感度な測定をすることができる。これらのうち、（ｃ）の方法より（ａ）、（ｂ）のほうが感度が高く好ましく、さらに（ｂ）の方法より（ａ）の方法のほうが、感度がより高く好ましい。
なお、これらの測定方法には、前記の本発明の化学発光測定試薬を用いることができる。
【００１１】
▲１▼の溶液と▲２▼の混液は、等量ずつ用いられるように、酸化剤、発光基質、増感剤の濃度をあらかじめ調整しておくと、使用時に制約が少なく便利である。
また、低温では、化学発光反応が遅いので、反応は室温（１５〜３０℃）で行うのが好ましい。そのために▲１▼の溶液、▲２▼の混液を低温で保管している場合には、これらの試薬を反応前に室温に戻しておくことが好ましい。
反応時間は、用いる増感剤の種類等により異なるが、経時的に安定した発光が得られる時間を選択する方が良い。通常は、１時間以内が好ましく、特にフェノール誘導体を増感剤に用いた場合は、２０分以内が好ましい。
本発明を利用できる測定対象物は、ペルオキシダーゼを直接又は標識物として用いる反応を利用するものであれば特に限定するものではないが、酵素免疫測定法との組み合わせによりａｍｏｌオーダーまでの高感度測定が可能となるので、成長ホルモンやエンドセリンの測定にも好ましい方法として適用できる。
また、化学発光反応はｐＨが高いほど発光量は増大するが、同時にペルオキシダーゼの触媒能に依存しない発光量も増大するので、両者を考慮してｐＨ７〜１１の範囲で反応が行えるように試薬のｐＨを調整することが好ましい。
【００１２】
【実施例】
本発明をさらに実施例により詳述する。
実施例１
化学発光測定試薬の組成が保存安定性に及ぼす影響
化学発光測定試薬の組成が保存安定性に及ぼす影響を検討するため、以下の実験を行った。すなわち、化学発光基質の構成試薬の数を１〜３とし、それぞれを３７℃で一週間保管し、保管した試薬を用いた化学発光反応で発光量の変化を見ることにより、試薬の保存安定性を調べた。
まず、次の４構成の試薬を調製した。
（１）３液系
▲１▼過酸化水素溶液（４ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０））
▲２▼増感剤溶液（２ｍＭ４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノールを含むジメチルスルホキシド）
▲３▼ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．５ｍＭＮａＯＨ）
（２）２液系Ａ
▲１▼過酸化水素・増感剤混液（上記３液系試薬の▲１▼と▲２▼を体積比５０：８の割合で混合）
▲２▼ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．５ｍＭＮａＯＨ）
（３）２液系Ｂ（本発明の試薬）
▲１▼過酸化水素溶液（４ｍＭ過酸化水素を含む５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０））
▲２▼ルミノール・増感剤混液（上記３液系試薬の▲２▼と▲３▼を体積比８：５０の割合で混合）
（４）１液系
▲１▼過酸化水素・ルミノール・増感剤混液
（上記３液系試薬の▲１▼と▲２▼と▲３▼を体積比５０：８：５０の割合で混合）
【００１３】
化学発光量の測定は次の通り行った。黒色のマイクロフルオロリモーバウェル（ダイナテク社製）にペルオキシダーゼ標識抗エンドセリン抗体液（ヤマサ醤油社製）を０．１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）で１０万分の１に希釈した溶液）１００μｌを添加した。次に、上記の３液系試薬を用いる場合には▲１▼を５０μｌ、▲２▼を８μｌ、▲３▼を５０μｌの順に約１分間隔で添加、２液系Ａ試薬を用いる場合には▲１▼を５８μｌ、▲２▼を５０μｌの順に約１分間隔で添加、２液系Ｂ試薬を用いる場合には▲１▼を５０μｌ、▲２▼を５８μｌの順に約１分間隔で添加、１液系試薬を用いる場合には▲１▼を１０８μｌ添加した後、混合撹拌し１０分後に、化学発光測定装置（コロナ電気社製（ＭＬＲ−１００））を用いて発光量を測定した。
上記で１〜３液系に調製した４構成の試薬を３７℃で保存し、そのうちの一定量を経時的にサンプリングし、上記と同様に化学発光量を測定した。
図１に化学発光測定試薬の保存日数と発光量との関係を示したが、１液系と２液系Ａでは保存２日でほとんど発光が得られなくなったので、過酸化水素と増感剤、さらにルミノールとの混合により、化学発光測定試薬が急激に劣化することがわかった。一方、３液系と２液系Ｂは保存安定性は良好であり、過酸化水素溶液、ルミノール・増感剤混液の形で保存した場合（２液系Ｂ）は、過酸化水素、増感剤、ルミノールを分けて保存した場合（３液系）と同等以上であることがわかった。
【００１４】
実施例２
化学発光測定試薬の添加方法が発光量に及ぼす影響
実施例１で保存安定性が良好な化学発光測定試薬（３液系及び２液系Ｂ）の化学発光反応系への添加方法について検討した。
抗エンドセリンモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製（ＭＣＡ  ＥＴ−０１））を固定化した黒色のマイクロフルオロリモーバウェル（ダイナテク社製）に、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）でエンドセリン−１を種々の濃度（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈した溶液２００μｌを注入し、２４時間反応後ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗エンドセリン抗体（ヤマサ醤油社製）の１００倍希釈液を２００μｌ注入し３時間反応させることにより、抗原抗体反応によりウェルに固定したエンドセリン−１と結合させた。洗浄後、ペルオキシダーゼを触媒とするルミノール／過酸化水素の化学発光を測定した。
【００１５】
測定に用いた化学発光測定試薬を次に示す。
（１）３液系
▲１▼過酸化水素溶液（２ｍＭ過酸化水素、０．１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０））
▲２▼増感剤溶液（２ｍＭ４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノールを含むジメチルスルホキシド）
▲３▼ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．５ｍＭＮａＯＨと５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）の体積比１：１の混合液）
（２）２液系
▲１▼過酸化水素溶液（２ｍＭ過酸化水素、０．１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０））
▲２▼ルミノール・増感剤混液（上記３液系試薬の▲２▼と▲３▼を体積比８：１００の割合で混合）
【００１６】
測定ａは３液系試薬の▲１▼を１００μｌ、▲２▼を８μｌ、▲３▼を１００μｌの順に約１分間隔で添加、測定ｂは３液系試薬の▲２▼を８μｌ、▲１▼を１００μｌ、▲３▼を１００μｌの順に約１分間隔で添加、測定ｃは２液系試薬の▲１▼を１００μｌ、▲２▼を１０８μｌの順に約１分間隔で添加、測定ｄは２液系試薬の▲１▼１００μｌと▲２▼１０８μｌを別々にかつ同時に添加、測定ｅは２液系試薬の▲１▼と▲２▼を体積比１００：１０８の割合で使用直前に混合したものを２０８μｌ添加した後、混合撹拌し１０分後に、化学発光測定装置（コロナ電気社製（ＭＬＲ−１００））を用いて発光量を測定した。
図２にエンドセリン−１濃度と発光量との関係を示したが、増感剤溶液を第一番目に添加した測定ｂではほとんど発光が得られなかった。その他の測定では、エンドセリン−１  ３０ｎｇ／ｍｌ以上で発光量は一定となるが矛盾のない良好な発光量が得られた。また、化学発光量は測定ｃ、測定ｄ、測定ｅ、測定ａの順で大きかった。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の化学発光測定試薬は、試薬キットの構成が簡素化されると共に保存安定性に優れる。また、この測定試薬を用いる本発明の化学発光測定方法は、発光量が高く、高感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測定法、ＤＮＡプローブ法等による生体微量成分の定量・分析等、臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】横軸に化学発光測定試薬の保存日数、縦軸にそれぞれの試薬を用いた化学発光反応で定量された発光量を示し、化学発光測定試薬の保存安定性を表すグラフである。発光量の１カウントは、１．２×１０−１６Ｗである。
【図２】横軸にエンドセリン−１濃度、縦軸に発光量を示し、化学発光試薬の添加方法と発光量との関係を表すグラフである。発光量の１カウントは、１．２×１０−１６Ｗである。
【図１】
0003632990.tif 000002
【図２】
0003632990.tif 000003