(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数Ｌ種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡ断片を対応するＤＮＡに結合させたサンプルに複数Ｍ種の波長からなる複数Ｍ種の微小なスポット励起光を強度レベルを変化させて照射し、該照射により前記複数Ｌ種類の各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光強度を前記強度レベルの変化と同期して分離検出し、スポット励起光と当該スポット励起光が照射するサンプルの位置とを所望の領域に亘り相対的に変化させることにより複数Ｌ種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡを検査するＤＮＡ検査方法。
【請求項２】
前記スポット励起光と当該スポット励起光が照射するサンプルの位置とを所望の領域に亘り相対的に変化させることを、１回だけ行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項３】
上記複数Ｍ種の微小なスポット励起光はそれぞれ複数Ｎの微小スポット群からなるマルチスポット励起光であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項４】
上記複数Ｍ種の微小なスポット励起光は互いに前記サンプル上で異なる位置を照射することを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項５】
上記複数Ｍ種の微小なスポット励起光は前記サンプルを同時に照射し、該同時に照射することにより得られる蛍光をそれぞれの励起光に応じた複数個Ｋの微弱光検出素子で検出し、上記各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光強度を分離検出することを特徴とする請求項１乃至３の何れかに記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項６】
上記複数Ｍ種の微小なスポット励起光を該励起光の波長に応じ時系列的に前記サンプルを照射し、上記蛍光標識物質に応じた複数種の微小なスポット励起光により得られる蛍光をそれぞれの励起光に対し共通の微弱光検出素子で検出し、上記各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光強度を分離検出することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項７】
上記複数Ｍ種の微小なスポット励起光はサンプル上でほぼ同一位置を照射することを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項８】
上記複数Ｍ種の微小スポット励起光はスポット励起光と照射するサンプルの相対位置がほぼ１画素分変化する時間内において互いに異なる時間帯で点滅することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項９】
上記複数Ｍ種の微小スポット励起光はスポット励起光と照射するサンプルの相対位置がほぼ１画素分変化する時間内においてそれぞれ励起光強度レベルをステップ的に変化させ、各ステップ毎に蛍光強度を検出することにより、４桁以上のダイナミックレンジで検出を行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１０】
上記蛍光強度の分離検出はフォトンカウント法で行うことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１１】
複数Ｍ種の互いに異なる波長を有する光を周期的に強度を変化させながら出射する１ないし複数の光源と、該光源から複数波長の光をそれぞれ複数Ｌ種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡサンプルに微小なスポット励起光として照射せしめる複数波長励起光学系と、該各蛍光標識物質に応じて各々の周期的に強度が変化する励起光により得られる蛍光強度を前記周期的な強度の変化と同期して分離検出する波長分離蛍光検出系と、上記微小なスポット励起光と上記ＤＮＡサンプルの相対位置を所望の領域に亘り変化させる駆動ステージと、該相対位置の変化により上記所望の領域を走査し得られる蛍光検出情報と蛍光検出位置情報からサンプル上にある複数Ｌ種の蛍光標識ＤＮＡの蛍光画像情報を構成する複数蛍光標識同時処理手段と、該複数蛍光標識同時処理手段で得られた情報を総合処理し検査結果を記憶する手段と、当該記憶手段で記憶された結果を所望の出力形式で出力する出力手段からなるＤＮＡ検査装置。
【請求項１２】
上記微小なスポットは上記異なる各波長でＮ個のマルチスポットとなるよう構成された複数波長励起光学系であることを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項１３】
上記光源もしくは複数波長励起光学系は各波長の励起光を交互に時系列的に点滅せしめる手段を具備したことを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項１４】
上記光源もしくは複数波長励起光学系において各波長の励起光の強度を蛍光検出強度に応じ変化せしめる手段を具備したことを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項１５】
上記波長分離蛍光検出系はフォトンカウント検出によることを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡ検査装置。
【請求項１６】
複数Ｌ種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡ断片を対応するＤＮＡに結合させたサンプルに対して波長の異なる複数組のマルチスポット励起光を対物レンズを介して照射し、該照射により前記複数Ｌ種類の各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光を前記対物レンズを介して該蛍光の波長ごとに分離し結像して検出し、前記複数組のマルチスポット励起光と該複数組のマルチスポット励起光が照射する前記サンプル上の位置とを所望の領域に亘り相対的に変化させることにより複数Ｌ種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡを検査するＤＮＡ検査方法。
【請求項１７】
前記波長の異なる複数組のマルチスポット励起光を、異なる時間帯で前記サンプルに照射することを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ検査方法。
【請求項１８】
前記波長の異なる複数組のマルチスポット励起光を、前記サンプル上の互いに異なる位置に照射することを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛍光標識されたＤＮＡまたは蛍光発生物質に励起光を照射し、ＤＮＡ検査を行う方法及び装置または蛍光検出方法に関し、特に複数種の蛍光標識されたＤＮＡまたは複数種の蛍光発生物質を高速に検出検査する方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光標識されたＤＮＡに励起光を照射し、ＤＮＡ検査を行う方法として、励起光であるレーザ光をシングルスポットビームとしてサンプルに絞り込み蛍光を検出し、励起光とサンプルの走査により蛍光画像を採取する方法があった。複数の蛍光標識の検出では先ず第１の励起光でサンプルの所望の全領域を走査し、第１の蛍光標識の蛍光画像を得て、しかる後に第２の励起光でサンプルの所望の全領域を再び走査し、第２の蛍光標識の蛍光画像を採取していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の方法では複数の蛍光標識に応じて波長を変えた励起光で所望の領域を走査し、この走査を複数標識の数だけ繰り返す。シングルスポットビームとサンプルの相対的な位置変化を行い所望の領域を高速に検査するにはサンプルを搭載したステージを高速に動かす必要がある。しかしステージを高速に動かせば往復運動が伴うため、ステージ駆動の加速減速にかなりの時間を要することになる。
【０００４】
またステージ走査を励起光の波長ごとに繰り返して行うとステージの駆動精度、再現精度が十分でないと各励起光で得られる蛍光画像の合成像に位置ずれが生じる。この結果今後ますます必要となるＤＮＡ検査の高速化と、高精度化が達成できなくなる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決するため以下に説明する手段を講じるている。
【０００６】
複数Ｌ種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡ断片を対応するＤＮＡに結合させたサンプルに、この蛍光標識物質に応じた複数Ｍ種の微小なスポット励起光を照射する。この複数Ｍ種の微小なスポット励起光により各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光強度を分離検出する。この複数の蛍光標識の分離検出を、蛍光強度検出のため、スポット励起光が照射するサンプルの位置を所望の領域に亘り蛍光標識物質の種類の数Ｌよりも少ない回数、より好ましくは１回だけ変化させることにより行い、複数種の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡを検査する。すなわち従来の蛍光標識の数だけ変化、すなわち蛍光標識の数と同じ複数回走査させて複数種の蛍光標識物質を検査していたものを、蛍光標識の数よりも少ない回数、より好ましくは１回の変化、すなわち１回の走査で検査するものである。
【０００７】
さらに上記の複数種の微小スポット励起光をそれぞれ複数の微小マルチスポット励起光とすると、各蛍光標識について複数点を同時に検出することが可能になり高速検出が実現する。
【０００８】
上記複数種のマルチスポット励起光は互いにサンプル上で異なる位置を照射するようにすると、複数種の励起光により励起された各蛍光標識からの蛍光を互いに雑音となることなく精度よく分離検出することが可能となる。
【０００９】
上記複数種のマルチスポット励起光は同時に照射し、上記蛍光標識物質に応じた複数種の微小なスポット励起光により得られる蛍光をそれぞれの励起光に応じた複数個の微弱光検出素子で検出し、上記各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光強度を分離検出する。このようにすることにより特に微弱な蛍光を検出する際に用いるフォトンカウント法においてフォトンカウントを各蛍光で同時に行うことが可能になり高速に、かつ広いダイナミックレンジで検査することが可能になる。
【００１０】
上記複数種の微小なスポット励起光を励起光の波長に応じ時系列的に照射し、上記蛍光標識物質に応じた複数種の微小なスポット励起光により得られる蛍光をそれぞれの励起光に対し共通の微弱光検出素子で検出し、上記各蛍光標識物質に応じて得られる蛍光強度を分離検出する。このようにすることにより特にマルチスポット検出では微弱光検出素子及びその周辺回路が安価になる。
【００１１】
上記複数種の微小なスポット励起光はサンプル上でほぼ同一位置を照射する。このようにすることにより各励起光での検出を同一場所で行うことができ、合成画像のステージのヨウイングやローリングに伴うずれは全く生じず、精度の高い検出が可能になる。
【００１２】
また上記複数種の微小スポット励起光はスポット励起光と照射するサンプルの相対位置がほぼ１画素分変化する時間内において互いに異なる時間帯で点滅する。このようにすることにより各蛍光標識を互いに雑音が乗ることなく精度よく検出することが可能になる。
【００１３】
上記複数種の微小スポット励起光はスポット励起光と照射するサンプルの相対位置がほぼ１画素分変化する時間内においてそれぞれ励起光強度レベルをステップ的に変化させ、各ステップ毎に蛍光強度を検出する。このようにすることにより広いダイナミックレンジに亘る検出を高速に行うことことが可能になる。
【００１４】
本発明のＤＮＡ検査装置は下記の構成からなる。すなわち互いに異なる波長を有する光を出射する１ないし複数の光源と、該光源から複数波長の光をそれぞれ複数の蛍光標識物質が付加されたＤＮＡサンプルに微小なスポット励起光として照射せしめる複数波長励起光学系を用いる。さらに各蛍光標識物質に応じて各々の励起光により得られる蛍光強度を分離検出する波長分離蛍光検出系を用いる。さらに上記微小なスポット励起光と上記ＤＮＡサンプルの相対位置を所望の領域に亘り変化させる駆動ステージを用いる。さらに駆動ステージを駆動して、微小なスポット励起光と上記ＤＮＡサンプルの相対位置を所望の領域に亘り変化させることを、蛍光標識物質の種類の数よりも少ない数の回数行うことにより、上記検出系で得られた蛍光検出情報並びに該所望の領域に亘る蛍光標識物質の種類の数よりも少ない数の回数の走査でのステージ位置情報からサンプル上の複数蛍光標識ＤＮＡの画像情報を構成する処理装置を用いる。
【００１５】
また本発明は蛍光標識されたＤＮＡの検査のみならず、蛋白質等の分子特有の蛍光を発する一般的な蛍光発行物質にも同様に適応される。
【００１６】
【発明の実施の形態】
図１は本発明の実施形態を表す図である。２１，２２は後に図９を用いてその詳細を説明する励起光源及びサンプル上に微小なスポットを励起光として照射させるための複数波長励起光学系である。即ち、例えば２１は６３５ｎｍの半導体レーザ複数個からなる光源とこの光源から出射した光をサンプル上で微小なマルチスポットに照射させるための励起光学系の一部であり、２２は５３２ｎｍの波長を有するＹＡＧレーザを光源とし、このレーザ光をサンプル上で微小なマルチスポットに照射させるための励起光学系の一部である。マルチスポット光の微小スポット数は６４個、３２個、１６個、あるいは８個等、検査システムの仕様に応じて選択される。２１，２２から出射する６４個の６３５ｎｍ及び５３２ｎｍのレーザビームはそれぞれ２１０１，２２０１のビーム位置あわせ器により２１Ａ，２２Ａの位置にそれぞれの波長で６４個のマルチスポット空間像を形成する。このマルチスポット空間像はチューブレンズ、あるいは結像レンズ２４と対物レンズ３によりサンプル基板５上に乗っているサンプルに図２に示すように２１Ｂ、２２Ｂに示すマルチスポット励起光像を結像する。
【００１７】
このスポットの詳細は図３に示すようにサンプル上で直径がｄ、ピッチがＰｙでＭ個（６４個）並んでいる。２１Ｂは６３５ｎｍのマルチスポット、２２Ｂは５３２ｎｍのマルチスポットである。２１Ｂと２２Ｂの間隔Ｐｘは本実施例では一致せず数十から数百ミクロンメートルあいている。この間隔は後述するように目標とする仕様によっては一致させる。
【００１８】
図１の３１及び３２は波長選択ビームスプリッタであり、励起光の６３５ｎｍと５３２ｎｍの波長の光は透過する。サンプル上の蛍光物質をマルチスポットで励起すると、この励起微小スポットの位置，２１０１，２１０２、……２１Ｍに照射される６３５ｎｍ（波長λ１）の励起光を吸収し蛍光を発する蛍光物質ＭＬ１が存在すればこの波長よりやや長い波長λ１′の蛍光が生じる。発生した蛍光は図４にも示すように高ＮＡの対物レンズ３を通り、２個の矢印を持つ点線のように進み、波長選択ビームスプリッタ３２で反射し、３２と同様の波長選択特性を有する３３と３４（又は反射率の高いミラー３３’と後述の蛍光λ２′を透過しλ１′を反射する３４’）で反射し、後にその詳細を図５から図８を用いて説明する波長分離蛍光検出系１００に入射する。波長選択特性を有する３３と３４で反射することにより励起光λ１とλ２をかなりカットする。
【００１９】
他方マルチスポット励起光はλ１とは異なる波長である５３２ｎｍ（波長λ２）の励起光を２２０１，２２０２、……２２Ｍに照射する。このマルチスポット励起光を吸収し、蛍光を発する蛍光物質ＭＬ２が存在すればこの波長よりやや長い波長λ２′の蛍光が生じる。発生した蛍光は高ＮＡの対物レンズ３を通り、２個の矢印を持つ２点鎖線のように進み、波長選択ビームスプリッタ３２を透過し、波長選択ビームスプリッタ３１で反射し、波長選択ビームスプリッタ３４（または３４’）を透過し、波長分離蛍光検出系１００に入射する。波長選択ビームスプリッタ３１で反射し、波長選択ビームスプリッタ３４または３４’を透過することにより励起光λ１とλ２をかなりカットする。
【００２０】
複数波長のマルチスポット励起光とサンプルの相対位置を１回だけ走査し、図１の波長分離検出系１００で、検出された複数の標識蛍光または蛍光物質の情報はメモリ１１に一旦記憶される。図１の入力端末１３より所望の検査仕様、例えば検査領域の座標範囲、検査対象に関する情報、出力の条件等々を入力して置くと、この条件に合った検出が行われると共に、得られた検出結果から所望の出力が例えばディスプレイモニタ１２に出力される。またこの結果を離れた位置にある伝達したい場所に回線１４を介して送信することもできる。上記の装置の条件入力、励起光、ステージ、フォトマル検出の制御、結果の処理、結果の出力等は図１の制御装置１でコントロールされる。
【００２１】
図５は波長分離蛍光検出系１００の実施形態例である。１００１はリレイレンズあるいは結像レンズである。異なる蛍光物質ＭＬ１とＭＬ２で発生した蛍光はレンズ１００１を通過後、干渉フィルタ１２１１，１２２１の位置ではその光束の位置が分離している。この分離は両励起光がサンプルを照射する位置をずらすことによって実現する。また波長選択ビームスプリッタ３３，３４の位置や角度の調整によっても実現する。分離した蛍光λ１、λ２はそれぞれ干渉フィルタ１２１１，１２２１を通過することにより、さらに励起光成分をきわめてわずかにし、蛍光検出の雑音を除去する。
【００２２】
干渉フィルタを通過した蛍光λ１′とλ２′はそれぞれ波長選択ミラー１２１２，１２２２（又はブロードバンドの高反射ミラー１２１２’，１２２２’）で反射し、図６に示すマルチチャンネルフォトマル１０１に入射する。波長選択ミラー１２１２，１２２２は励起光成分を透過し、蛍光を反射するため、反射後の励起光成分は０と見なせるほどきわめて少なくなっている。波長選択ミラー１２１２，１２２２は図に示すようにそれぞれの反射面が１平面上になく、角度がついているため、ここを反射した両蛍光は共に図６に示すようにマルチチャンネルフォトマル１０１の前面に付けた１列状のピンホールアレイのピンホール上又はスリット上に結像する。
【００２３】
図７はマルチチャンネルフォトマル１０１がアレイ方向と直角な方向に長い場合に可能な検出方法を示した実施形態である。この場合図５の波長選択ミラー１２１２，１２２２のミラー面を１平面上に設置することになる。またこのミラーに至るまでに十分励起光がカットできていれば、１個の通常のミラーを用いてもよい。
【００２４】
本実施形態では複数の蛍光を１つのフォトマル（マルチチャンネルフォトマル）１０１で検出するため励起光を異なる時間帯で点滅させる。励起光源である波長６３５ｎｍの半導体レーザ（複数）はレーザを駆動する電源の信号をＯＮ−ＯＦＦする事により点滅を実現する。他方２２の中にあるＹＡＧレーザのビームは図示されていないＡＯ変調器（Acoust-Optic Modulator）を用いてＯＮ−ＯＦＦされる。
【００２５】
６３５ｎｍの励起光の強度Ｉ２１と５３２ｎｍの励起光強度Ｉ２２は図１０の（Ａ１）（Ｂ１）に示すように互いに点滅する時間帯を異にして点滅する。これらの励起光の点灯時間は数十〜数百μｓである。ほとんどの蛍光物質においては励起後の蛍光発生遅延時間が数ｎｓ〜数百ｎｓであるのでほぼ励起光照射時間と一致して蛍光が発生する。。従って図１０の（Ａ２）及び（Ｂ２）に示すように励起光点滅と同期させてそれぞれの蛍光を検出する。図１０（Ｃ）は励起光の点滅と同期してサンプルをホールドし、異なる位置で蛍光検出するためのステージ移動量あるいはステージ位置情報Ｓｔとの関係を示している。即ち上記の２励起光の点滅により６４スポットの蛍光を検出する時間Δｔの間にΔｘ移動する。この移動距離がスポット径ｄ相当の大きさにすることにより走査と点滅により所望の領域を蛍光検出することが可能になる。
【００２６】
図８は本発明の複数波長の励起光を同時に照射し、同時に蛍光検出する場合の実施形態である。この場合にはＤＮＡサンプル、あるいは蛍光物質サンプルに２つ（あるいは３つ以上）の励起光を同時に、かつ同一場所（異なる場所でも良い）に照射する。各波長の励起光を同一場所に照射する場合には、図１で示す波長選択ビームスプリッタ３１と３４の位置と傾きを予め調整しておく。このようにすることにより、例えば６３５ｎｍの励起光による蛍光は図８の干渉フィルタ１２１１を、５３２ｎｍの励起光による蛍光は図８の干渉フィルタ１２２１を通過するようにできる。この結果、それぞれの蛍光をミラー１２１２´と１２２２´で反射させ、異なるマルチチャンネルフォトマル１０１１と１０１２に入射させ、分離して同時に蛍光を検出することが可能になる。
【００２７】
図９は本発明の実施形態を表す図であり、３種の励起光を用いる例である。２１０は６３５ｎｍ（波長λ１１）の半導体レーザを用いるマルチスポット励起光学系、２２０は５９０〜６００ｎｍ（波長λ１２）の波長を用いるマルチスポット励起光学系、２３０は５３２ｎｍ（波長λ１３）のレーザを用いるマルチスポット励起光学系である。それぞれの光源から  出射した光をマルチスポットにする方法を２１０により用いて説明する。
【００２８】
光源から出射したビームはビーム整形器２１１により所望のビーム径とビーム広がり角になり、偏光器２１１で所望の偏光状態になり、ビーム分割器２１３，２１４，２１５を通過していく。これらビーム分割器は２等分直角三角形の斜辺と頂角が４５度の平行四辺形の斜辺が張り合わされ、この貼り合わせ面がビームスプリット面である。また平行四辺形の貼り合わされた面と対向する面までの距離は２１３ののビーム分割器がｄであるとすると、２１４と２１５のビーム分割器ではそれぞれ２ｄと４ｄになっている。この結果ビーム分割器２１５を通過するビームは８本になっており、各ビームの間隔は√２ｄになっている。  ８本になったビームは凸レンズアレー２１６１〜２１６８により２１Ａ−２１Ｂ線２１００上に所望のビーム径のマルチスポットを形成する。
【００２９】
図９の２２０および２３０も上記のこのような構成からなるマルチスポット励起光学系である。波長選択ビームスプリッタ２０２は波長λ１２の励起光を通過させ、波長λ１３の励起光を反射する。波長選択ビームスプリッタ２０１は波長λ１２と波長λ１３の励起光を通過させ、波長λ１１の励起光を反射する。
【００３０】
３つの波長の励起光は複屈折材料である、例えば方解石からなるビームスプリッタ２０３，２０５および波長板２０４および２０６によりそれぞれ８本からなるマルチビームが４倍の３２本になり、２１Ａ−２１Ｂの面上の直線２２００および２３００に所望のビーム系でマルチスポットを形成する。この空間内の直線２１００，２２００および２３００上にできた３つの励起光からなるマルチスポットはチューブレンズ２４および図１で説明した対物レンズ３によりサンプル５に所望のスポット径で励起光を照射する。
【００３１】
図１１は本発明の励起波長が２つの場合の実施形態である。蛍光検出のダイナミックレンジを大きく採るには励起光強度変えて検出する必要がある。即ち検出対象の単位面積当りの蛍光分子数が、例えば1分子／μｍ２  〜１万分子／μｍ２  ときわめて少ないものから多いものまでを検出しようとするとフォトマル等の高感度検出器の検出分解能（検出範囲／雑音レベル）を超えてしまう。そこで図11に示す方法によりこの課題を解決する。図１１の（Ａ１）および（Ｂ１）は横軸が時間、縦軸はそれぞれ励起波長λ１とλ２の励起光のサンプル上での強度を表している。本実施形態では励起光λ１とλ２での検出を時系列的に行っているが、以下の説明は同時に行う場合にも同じようにできる。時刻ｔ０から時刻ｔ２の間は励起光λ１で励起し，検出する。時刻ｔ０からｔ１までの間は励起光強度Ｉ２１´は強い光Ｉ１Ａで、時刻ｔ１からｔ２までの間は励起光強度Ｉ２１´は弱い光Ｉ１Ｂで励起する。図11（Ａ２）と（Ｂ２）に示すようにそれぞれの時間帯ｔ０−ｔ１およびｔ１−ｔ２に励起光強度Ｉ１ＡとＩ１Ｂにおける蛍光を検出する。
【００３２】
同様に時刻ｔ２からｔ４までには図11の（Ｂ１）に示すようにλ２の励起光に対し励起光強度Ｉ２２´がｔ２からｔ３はＩ２Ａ，ｔ３からｔ４はＩ２Ｂになるようにし、図11の（Ｂ２）に示すようにこの時間帯にそれぞれの蛍光強度を検出する。
【００３３】
図１２は非常に蛍光分子が少ない場合から多い場合にも適応できるフォトマル信号の検出方式を示している。蛍光分子が少ない場合にはフォトンカウント法を適用する。フォトンカウント法は光が弱くなり光子が検出時間内にフォトンパルスが数カウントから数百ないし数千カウント程度の場合に有効な検出法である。逆に蛍光が非常に大きくなるとフォトンパルスがパルス信号の時間幅以内に頻繁に検出されるとパルスを正確に計測できなくなる。このような場合に上記図１１で説明したように励起光強度桁違いに小さくして励起照射すれば、フォトンパルスの重なりは少なくなり、蛍光検出が可能になる。
【００３４】
図１２（Ａ１）は図１１（Ａ１）と同用の図であるが、横軸の時間軸を拡大したものである。本実施形態ではサンプルと励起光を相対的に走査をしながら３種の蛍光分子を同時に検出する例である。即ち２種あるいは３種の励起光をサンプルに図１２（Ａ１）に示すように同時に照射する。それぞれの励起光強度の相対値はＩ１Ａ、Ｉ２Ａ、（及びＩ３Ａ）とけた違いに弱い強度のＩ１Ｂ，Ｉ２Ｂ（及びＩ１Ｂ）である。３種の蛍光物質Ｌ１、Ｌ２及びＬ３から得られる蛍光のフォトンカウントパルスを図１２（Ｃ１）、（Ｃ２）及び（Ｃ３）に示す。蛍光物質Ｌ１は中程度の蛍光強度、Ｌ２は弱い蛍光強度、Ｌ３は非常に強い蛍光強度の場合である。
【００３５】
パルスカウントの方法には大きく２つの方法がある。図１２にあるようにパルス幅が大きなものでも１パルスとして計測する第１の方法とパルス信号がハイレベルにある時間を測る第２の方法である。第１の方法ではパルス数が大きくなると計数値が逆に小さくなり、検出強度とパルス計数値の関係が１価関数とならず計数値を特定できない。これに対し第２の方法はパルス数が大きくなっても計数値が小さくなることはなく、１価関数となり、刑すうちに補正を加えることにより正しい計測ができる。第２の方法はより正確な計数ができるが、パルスの幅が小さくなると計数回路の時定数を非常に小さくしないと正確な計数が困難になる。
【００３６】
図１２の実施形態では強い励起光と弱い励起光を照射しそれぞれのフォトンカウントを行うので、強弱の励起光でのそれぞれの計数値から１価関数が得られない第１の方法でもほぼ誤らずに計数を行うことができる。即ち、例えば図１２（Ｃ１）の場合ｔ０―ｔ１時間で得られる計数値とｔ１−ｔ２時間とが大きく変わらなければ、後者の値が正しいことがわかる。また図１２（Ｃ３）のようにｔ０―ｔ１時間で得られる計数値が小さく、ｔ１−ｔ２時間で得られる計数値が大きければ後者の値が正しいことが分かる。他方図１２（Ｃ２）のようにｔ１−ｔ２時間で得られる計数値がほとんど０であればｔ０―ｔ１時間で得られる計数値が正しいことが分かる。
【００３７】
更に大きなダイナミックレンジが必要な場合には図１１と図１２（Ａ１）に示した励起光強度を非常に強い、中程度、及び非常に弱い励起光と３段階にすることにより広いダイナミックレンジの検出が可能になる。
【００３８】
図１３は本発明の実施形態を示す図である。図１３は蛍光検出の部分のみを表している。励起光照射光学系は図９の３つの励起光２１００，２２００及び２３００が同一光路に成るよう波長選択ビームスプリッタ２０１と２０２の位置あわせが行われている。図１に示すサンプル５に３つの異なる波長のマルチスポット励起光２１００´、２２００´及び２３００´を同一場所に照射し、得られる蛍光Ｌ１，Ｌ２及びＬ３を下記のように検出する。Ｌ１は図１の波長選択ビームスプリッタ３２と３４で反射させ、Ｌ２とＬ３は波長選択ビームスプリッタ３２を透過させ、３１で反射させ３４を透過させ、図１３に示す蛍光検出に導く。サンプル上のマルチスポット励起光から得られる蛍光は図１の対物レンズ３と図１３のチューブレンズ１００１により、マルチチャンネルフォトマル１０１１、１０１２及び１０１３の受光部にマルチスポット像として結像する。３蛍光標識から得られる蛍光は図１３の波長分離ビームスプリッタ１２３１と１２３２により分離される。即ち、励起光２１００´から得られる蛍光Ｌ１は波長分離ビームスプリッタ１２３１で反射し、この蛍光のみを透過する干渉フィルタ１２４１を通り、マルチピンホールアレイ１０１０の開口を通過しマルチチャンネルフォトマル１０１１で検出される。同様に蛍光Ｌ２とＬ３は波長選択ビームスプリッタ１２３１を通過し、蛍光Ｌ２ｈａ波長選択ビームスプリッタ１２３２を透過し、蛍光Ｌ３はここで反射し、それぞれ干渉フィルタ１２４２及び１２４３を透過後に、それぞれマルチチャンネルフォトマル１０１２と１０１３で検出される。
【００３９】
上記の図１３の実施形態では励起光として３つの波長を用いているが、励起光を２つの波長にし、３つの蛍光物質を検出することも可能である。即ち励起光として波長６３５ｎｍの半導体レーザと５３２ｎｍのＹＡＧＳＨＧレーザを用い、蛍光物質としてＣｙ５，Ｃｙ３．５及びＣｙ３を検出する。この場合それぞれの蛍光スペクトルのピーク値は６７０ｎｍ、５７０ｎｍ及び６００ｎｍの近辺にあるので、波長選択ビームスプリッタ１２３１は６５０ｎｍ以上を反射させ，この波長以下では透過するようにする。また波長選択ビームスプリッタ１２３２は波長５８５ｎｍ以下は反射し、この波長以下は透過するようにする。
【００４０】
以上説明したような蛍光検出をすることにより、励起光とサンプルを所望の、例えばスライドガラスの２０×４０ｍｍの領域に亘り、励起光とスライドガラスを相対的に１回走査するだけで複数の蛍光物質の濃度を蛍光検出強度として検出することが可能になる。
【００４１】
上記の実施形態の説明では励起光としてマルチスポットアレイを例にしているが、シングルスポットでも，あるいは走査方向と直交する方向に長細いシート状の励起光でも同様に高速に検出できる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により複数の種類の蛍光標識からなるＤＮＡ被検査対象、あるいは複数の種類の蛍光物質を含むサンプルを検出したい広がり内を蛍光標識あるいは蛍光物質を含むサンプルの種類の数よりも少ない回数の走査で、より好ましくは１回の走査で検出することが可能になり、従来に比べ格段に早い検出が可能になった。この結果大量の検査対象を高速に検出、検査することが可能になり、非常に大きい時間的，経済的効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＤＮＡ検査装置の全体の概略構成を示す斜視図である。
【図２】本発明による検出視野内のマルチスポット励起光を示す平面図である。
【図３】本発明によるマルチスポット励起光の拡大平面図である。
【図４】本発明による励起光と蛍光の経路を示す光学系の一部の正面図である。
【図５】本発明による蛍光検出光学系の１例を示す正面図である。
【図６】本発明によるフォトマル上の蛍光検出スポットの一例を示すフォトマルの正面図である。
【図７】本発明によるフォトマル上の蛍光検出スポットの他の例を示すフォトマルの正面図である。
【図８】本発明による複数の蛍光とフォトマルの関係を表す図である。
【図９】本発明による複数波長励起光学系の斜視図である。
【図１０】本発明による励起光強度の時間変化と検出のタイミングの関係を示すグラフである。
【図１１】本発明による励起光強度の時間変化と検出のタイミングの関係を示すグラフである。
【図１２】本発明によるフォトンカウント検出法を表すグラフである。
【図１３】本発明による蛍光検出部の斜視図である。
【符号の説明】
１…制御装置    ２１，２２…励起光源を含む複数波長励起光学系    ２４…レンズ    ３…対物レンズ    ３１，３２，３４…波長選択ビームスプリッタ
１００…蛍光検出光学系    ５…蛍光標識もしくは蛍光体を含むサンプル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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