(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質：
（１）ペプチド結合グルタミン残基のγ−カルボキシ−アミド基がアシル供与体であるアシル転移反応を触媒する；
（２）Ca2+非依存性である；
（３）pH8.5より高い至適pHを有する；
（４）50℃の至適温度を有する；
（５）ストレプトマイセス・モバラエンセ（Streptomyces mobaraense）からのトランスグルタミナーゼに対するポリクローナル抗体との免疫反応性を有しない；
（６）フェニルメチルスルホニルフルオリドにより阻害されない；及び
（７）ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）により生産されうる；
を有するトランスグルタミナーゼ。
【請求項２】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ。
【請求項３】
配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、又はＣ−末端もしくなＮ−末端の伸長により修飾されており、トランスグルタミナーゼ活性を維持しているアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ。
【請求項４】
配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされているアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ。
【請求項５】
配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼ。
【請求項６】
下記の性質：
（１）ペプチド結合グルタミン残基のγ−カルボキシ−アミド基がアシル供与体であるアシル転移反応を触媒する；
（２）Ca2+非依存性である；
（３）pH９又はそれより高い至適pHを有する；
（４）45℃の至適温度を有する；
（５）モノヨード酢酸、ZnCl2及びHgCl2により完全に阻害され、そしてFeCl2により阻害される；及び
（６）ストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces platensis）により生産されうる；
を有するトランスグルタミナーゼ。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼをコードするDNA。
【請求項８】
前記DNAが、ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）の菌株のDNAライブラリーから単離され、又は当該ライブラリーに基づいて生成されたものである、請求項７に記載のDNA。
【請求項９】
前記ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）がストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）NRRL B-3446である、請求項８に記載のDNA。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のDNAを含んで成るベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項10に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項11に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が微生物細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記微生物細胞が細菌細胞又は真菌細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記細菌細胞がグラム陽性細菌の細胞又はグラム陰性細菌の細胞であり、そして前記真菌細胞が酵母細胞又は糸状菌の細胞である、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記グラム陽性細菌の細胞がバチルス（Bacillus）又はストレプトマイセス（Streptomyces）属の細胞であり、前記グラム陰性細菌の細胞がエスケリチア（Escherichia）属の細胞であり、前記酵母細胞がサッカロマイセス（Saccharomyces）の細胞であり、そして前記糸状菌の細胞がアスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）もしくはフサリウム（Fusarium）の細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記バチルス属が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レントゥス（Bacillus lentus）、又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）である、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記ストレプトマイセス属が、ストレプトマイセス・リジクスである、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記前記エスケリチア属が大腸菌である、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記アスペルギルス属がアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、又はアスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）である、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載のトランスグルタミナーゼの製造方法において、当該トランスグルタミナーゼを生産することが出来る、ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）に属する微生物を培養し、培養物から当該トランスグルタミナーゼを採取することを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記微生物がストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）NRRL B-3446である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼの製造方法において、請求項12〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、培養物から当該トランスグルタミナーゼを採取することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項６に記載のトランスグルタミナーゼの製造方法において、当該トランスグルタミナーゼを生産することが出来る、ストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces platensis）に属する微生物を培養し、培養物から当該トランスグルタミナーゼを採取することを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記微生物がストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces platensis）DSM 40041である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜６に記載のトランスグルタミナーゼ又は請求項２１〜25のいずれか１項に記載の方法により製造されたトランスグルタミナーゼを含んでなるトランスグルタミナーゼ組成物。
【請求項２７】
請求項26に記載の組成物をタンパク質材料と接触せしめることを特徴とする、タンパク質の架橋方法。
【請求項２８】
穀粉、肉製品、魚製品、化粧品、チーズ、ミルク製品、ゲル化食物製品、又は靴磨きにおける、請求項26に記載のトランスグルタミナーゼ組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、微生物のトランスグルタミナーゼ、トランスグルタミナーゼをコードするDNA構成物、トランスグルタミナーゼを産生する方法、トランスグルタミナーゼを含む組成物及びゲルもしくは蛋白質ゼラチン組成物を製造するための方法；並びにそれらの使用に関する。
発明の背景
トランスグルタミナーゼ（EC  ２．３．２．13）は、ペプチド結合グルタミン残基のγ−カルボキシ−アミド基がアシル供与体であるアシル転移反応を触媒することができる酵素である。種々の化合物中の第１アミノ基はアシル受容体として機能し、後にペプチド結合グルタミン酸の一置換γ−アミドを形成し得る。ペプチド鎖中のリシン残基のε−アミノ基がアシル受容体として機能する場合、トランスグルタミナーゼは分子内又は分子間γ−グルタミル−ε−リシル架橋を形成する。
このペプチド架橋活性は、蛋白質のゲル化穀紛のベーキングの質の改良、蛋白質、脂肪及び水からペーストタイプの食物材料を作ること、ミルク濃縮物からのチーズの調製、乱切りの肉製品をつなぐこと、食物蛋白質の味及び構造の改良、皮処理におけるカゼイン仕上げ等を含む種々の工業上の目的のために役立つことが示されている。
広範囲のトランスグルタミナーゼが、いくつかの動物及び少しの植物種から同定され、キャラクタライズされている。最も広範囲に用いられる動物由来トランスグルタミナーゼ、FXIIIａは、多くの工業上の適用に、及び製造に不利である特性である生成物阻害されるCa2+依存性マルチ−サブユニット酵素である。粘菌フィサルム・ポリセファルム（Physarum polycephalum）からのCa2+依存性トランスグルタミナーゼはKlein et al.,(1992)に記載されている。
少しの微生物のトランスグルタミナーゼのみ、即ちストレプトベルチシリウム・モバラエンセ（Streptoverticillium mobaraense）、ストレプトベルチシリウム・シナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum）、及びストレプトベルチシリウム・グリセオカルネウム（Streptoverticillium griseocarneum）種から（US 5,156,956）、及びストレプトマイセス・ラベンジュラエ（Streptomyces lavendulae）であると考えられる種から（US 5,252,469）からのトランスグルタミナーゼが開示されている。
US 5,156,956は、広範囲の生物及び微生物源の5000超の単離物をスクリーニングすることを含むトランスグルタミナーゼの広範囲の調査の後、先に記載の３のストレプトベルチシリウム種のみがトランスグルタミナーゼを産生することが見い出されたことを開示する。この先の属ストレプトベルチシリウムのメンバーは、ストレプトマイセス属内に一般的に含まれる（Kaempfer et al.(1991)、及びOchi et al.(1994)）。
US 5,252,469は、２の関連する種：ストレプトマイセス種、及びストレプトマイセス・ラベンジュラエであると信じられているものからのトランスグルタミナーゼを開示する。しかしながら、考えられるＳ．ラベンジュラエ株のための開示されたデータから、開示された株がＳ．ラベンジュラエではないことを当業者に明らかである。
ストレプトベルチシリアは、ストレプトマイセス及び関連する属のクラスターグループＦ（55〜67クラスター）に共に分類される（Williams.et al.）。それゆえ、周知の微生物のトランスグルタミナーゼは全て、Williams.et al.に定義されるようなこのクラスターのメンバーから源を発する。ストレプトマイセス・ラベンジュラエもクラスターグループＦに分類される。
全ての周知の微生物のトランスグルタミナーゼが、ヒドロキシルアミンがヒドロキサム酸に転化される慣用的酵素アッセイを用いることにより、同定されている（Folk,J.E. & Cole,P.W.(1966)）。
異なる酵素を過剰産生する株を作製するために、組換えDNA技術が広く用いられる。同目的のために、ストレプトベルチシリウム・モバラエンセ（Streptoverticillium mobaraense）トランスグルタミナーゼ遺伝子は、大腸菌、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、及びサッカロマイセス  セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）において発現のためにクローニングされている（Washizu et al.,Tahekana et al.、及びEP−Ａ−0 481 504）。最も成功したこれらの試み（Washizu et al.）でさえ、多数の実験及び最適化にもかかわらず、野生型Ｓ．モバラエンセ株における収率よりかなり低い産出量である。これにより、Ｓ．モバラエンセ酵素を過剰発現するための努力は、コドン最適化遺伝子の化学合成とその次の大腸菌のペリプラズムへの（成熟トランスグルタミナーゼへの切断能異種シグナルペプチド融合のような）発現；又はＳ．セレビシアエ内での成熟トランスグルタミナーゼへの同様の融合としての発現；又はＳ．セレビシアエにおけるプロ−トランスグルタミナーゼへの同様の融合としての発現；又はＳ．リビダンスにおけるプレプロ酵素をコードする天然のDNA配列の伝統的な単離及び発現のようないくつかの異なる試みを含むが、成功したものはない。
US 5,252,469は、慣用的技術によりより多い量のトランスグルタミナーゼを産生するＳ．モバラエンセに密接に関連する株を開示する。
本発明の目的は、好ましくは単一構成物又は単構成物形態における、新規な微生物由来のトランスグルタミナーゼ、トランスグルタミナーゼをコードする新規な遺伝子、及び組換えDNA技術により従来可能であるより高収率かつ高純度でトランスグルタミナーゼを産生するための方法、並びに蛋白質のゲル化；穀紛のベーキングの質；蛋白質、脂肪及び水からのペーストタイプの食物もしくは食物成分を作ること、ミルク濃縮物からのチーズの調製；乱切りの肉又は魚製品をつなぐこと；食物蛋白質の味及び構造の改良；皮処理におけるカゼイン仕上げ；くつみがき等を含む種々の工業上の目的における使用のための単独又は他の酵素との組合せでのトランスグルタミナーゼの使用を提供することである。
発明の概要
広範囲のバクテリア及び真菌株をスクリーニングすることにより、しばしば、伝統的なヒドロキサメートアッセイにおいて陰性の結果を生じる同じ抽出液のスクリーニングにより、改良されたプトレッシンアッセイにおいて陽性の反応を生ずることが知られている。従って、プトレッシン組込みアッセイの改良型は、驚くほど、広範囲の生物においてトランスグルタミナーゼ活性を検出することができるスクリーニング手順に適用されている。
従って、そして従来知られているのと反対に、トランスグルタミナーゼ（TGases）は極めて広範囲の系統的に分散した微生物により産生されることが現在、見い出されている。また、クラスターグループＦ以外のクラスターグループ、例えばクラスターグループＡ及びＧ内でさえ、トランスグルタミナーゼを産生するメンバーが見つけられている。
供される酵素のいくつかは工業的適用に役立ち得る。その工業的な可能性は、３つの状況に強調される：
１．本発明の新規のトランスグルタミナーゼはいずれの他の微生物のトランスグルタミナーゼのために得られるより高い収率で得られうる；
２．先に言及されるアッセイにより供されるいくつかのTGase−産生性株は、現在の使用における工業的産生株に密接に関連しており、従って、密接に関連した種、例えばバチルス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、アスペルギルス（Aspergillus）、及びトリコダーマ（Trichoderma）属において組換えDNA発現を行うことができる；
３．本発明の新規のトランスグルタミナーゼは細胞外に見い出され得る。
スクリーニングされるべき生物のためのいくつかの異なる増殖条件を適用することにより、本発明者らは、驚くことに、これらの条件が、いくつかの例において、抽出液におけるTGase活性の検出のために決定的であることも見い出した。
本発明者らは、トランスグルタミナーゼ活性を示すストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）の株からDNA配列を単離してキャラクタライズするのにも成功し、それにより単一構成物トランスグルタミナーゼを調製することが可能となる。
従って、他の態様において、本発明は、トランスグルタミナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含むDNA構成物であって、DNA配列が、
ａ）配列番号：１に示されるDNA配列、及び／又は大腸菌DSM10175内のプラスミドから得られうるDNA配列、又は
ｂ）配列番号：１に示されるDNA配列及び／又は大腸菌DSM10175内のプラスミドから得られうるDNA配列のアナログであって、
ｉ）配列番号：１に示されるDNA配列及び／又は大腸菌DSM10175内のプラスミドから得られうるDNA配列と少くとも80％の相同性を有し、又は
ii）配列番号：１に示されるDNA配列及び／又は大腸菌DSM10175内のプラスミドから得られうるDNA配列によりコードされるポリペプチドと少くとも79％の相同性を有するポリペプチドをコードし、及び／又は
iii）配列番号：１に示される及び／又は大腸菌DSM10175内のプラスミドから得られうるDNA配列によりコードされる精製されたトランスグルタミナーゼに対する抗体と免疫学的に反応するポリペプチドをコードするアナログ
を含むことを特徴とするDNA構成物に関する。
配列番号：１に示されるDNA配列は、大腸菌DSM10175内のプラスミドから得られうるDNA配列と同一であると確信される。
その大腸菌株は、ブタペースト条約に従って、DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Maascheroder Weg 1b,D-38125 Braunschweig,Germanyにおいて1995年８月23日に寄託番号DSM10175下で寄託された。
更なる態様において、本発明は、本明細書、実施例及び請求の範囲内で特定される綱、目、科、属及び種のいずれかに属する株、特にストレプトマイセス・リジクス、NRRL Ｂ−3446を、適切な栄養培地内で培養することを含むトランスグルタミナーゼの産生のための方法に関する。
本発明は、本発明のトランスグルタミナーゼ調製物、及び安定剤を含むトランスグルタミナーゼ組成物に更に関する。
更に他の態様において、本発明は、蛋白質を架橋する方法であって、本発明のトランスグルタミナーゼ調製物を含むトランスグルタミナーゼ組成物が蛋白質の基質と接触することを特徴とする方法に関する。
更に、本発明は、穀紛、肉製品、魚製品、化粧品、チーズ、ミル製品、ゲル化食物製品及び靴みがきにおける本発明のトランスグルタミナーゼ調製物の使用に関する。
発明の詳細な記載
本明細書及び請求の範囲において、“トランスグルタミナーゼ”という言葉は、ペプチド結合グルタミン残基のγ−カルボキシアミド基がアシル受容体であるアシル転移反応を触媒することができる酵素として理解されることを意図する。“Ca2+−非依存性トランスグルタミナーゼ”という言葉は、Ca2+イオンの欠如下で、即ち過剰のEDTAの存在下で活性なトランスグルタミナーゼとして理解されることを意図する。
トランスグルタミナーゼは、与えられた微生物により作られる酵素システムにおいて発生する構成物であり得、このような酵素システムはほとんどの場合、いくつかの異なる酵素構成物を含む。あるいは、トランスグルタミナーゼは単一構成物、即ち与えられた微生物により作られる酵素システムにおいて通常発生する他の酵素構成物が本質的にない構成物であり得、ここで該単一構成物は、例えば単一構成物をコードするDNA配列をクローニングし、次にそのDNA配列で細胞を形質転換し、宿主内で発現させることにより作られる組換え構成物である。宿主は好ましくは異種の宿主であるが、宿主は特定条件下では同種宿主でもあり得る。
ネイティブ又は未修飾のトランスグルタミナーゼは微生物源のものであり得る。
トランスグルタミナーゼが、真菌、バクテリア又はイーストにより得られうる、又はそれら由来のものであり得る。得られた酵素構成物は同種又は異種の構成物のいずれかであり得る。好ましくは、構成物は同種である。しかしながら、高度に精製されたトランスグルタミナーゼに対する抗体と免疫学的に反応し、特定の微生物から得られる異種構成物も好ましい。
本文脈において、“得られうる”又は“由来”という言葉は、問題の生物の株により産生されるトランスグルタミナーゼを示すばかりでなく、このような株から単離されたDNA配列によりコードされ、該DNA配列で形質転換された宿主生物において作られたトランスグルタミナーゼも意図する。更に、その語は、合成の及び／又はcDNAの源のDNA配列によりコードされ、問題のトランスグルタミナーゼの同定的特徴を有するトランスグルタミナーゼを示すことを意図する。
好ましい実施形態において、本発明は、真菌、好ましくは担子菌亜門、子嚢菌亜門又は接合菌亜門に属する真菌の培養により産生可能であるトランスグルタミナーゼ調製物に関する。
有用な担子菌亜門の例は、アガリカレス（Agaricales）、アフィロホラレス（Aphyllophorales）、セラトバシジアレス（Ceratobasidiales）、アウリクラリアレス（Auriculariales）、及びニジュラリアレス（Nidulariales）目からなる群に属する株、又はトリコロマタセアエ（Tricholomataceae）、アマニタセアエ（Amanitaceae）、アガリカセアエ（Agaricaceae）、ストロファリアセアエ（Strophariaceae）、コプリナセアエ（Coprinaceae）、コルチナリアセアエ（Cortinariaceae）、パキシラセアエ（Paxillaceae）、ポリポラシアエ（Polyporaceae）、コリオラシアエ（Coriolaceae）、ホミトプシダシアエ（Fomitopsidaceae）、ストレレアシアエ（Strereaceae）、ヒメノカエタシアエ（Hymenchaetaceae）、ラクノクラジアシアエ（Lachnocladiaceae）、セラトバシジアシアエ（Ceratobasidiaceae）、アウリクラリアシアエ（Auriculariaceae）及びニジュラリアシアエ（Nidulariaceae）科からなる群に属する株、又はトリコローマ（Tricholoma）、リオフィルム（Lyophyllum）、アルミラリア（Armillaria）、アマニタ（Amanita）、アガリクス（Agaricus）、カマエマイセス（Chamaemyces）、ストロファリア（Stropharia）、ハイホローマ（Hypholoma）、クーネロマイセス（Kuneromyces）、ホリオタ（Pholiota）、コプリヌス（Coprinus）、サチレラ（Psathyrella）、パナエオルス（Panaeolus）、ジムノピルス（Gmnopilus）、ハイグロオロプシス（Hygrophoropsis）、プレウロトゥス（Pleurotus）、ピクノポルス（Pychoporus）、アントロジア（Antrodia）、トラメーテス（Trametes）、アミロステレウム（Amylostereum）、ハイメノカエテ（Hymenochaete）、シチノストローマ（Scytinostroma）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、アウリクラリア（Auricularia）及びニジュラ（Nidula）属からなる群に属する株である。
好ましい株は、トリコローマ・フラボビレンス（Tricholoma flavovirens）もしくはトリコローマ・マイオマイセス（Tricholoma myomyces）種、リオフィルム（Lyophyllum）種、アルミラリア（Armillaria）種、アマニタ・ビローサ（Amanita Virosa）、アガリクス（Agaricus）種、カマエマイセス・フラシドゥス（Chamaemyces fracidus）、ストロファリア・コエルレア（Stropharia coerulea）、ハイホローマ・ファシクラレ（Hypholoma fasciculave）、クーネロマイセス・バイアビリス（Kuhneromyces variabilis）、ホリオタ・ジァーニー（Pholiota jahnii）、コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コプリヌス（Coprinus）種、サチレラ・マンドレアナ（Psathyrella condolleana）、パナエオルス・パピリオナセウス（Panaeolus papilionaceus）、ジムノピルス・ジュノニウス（Gymnopilus junonius）、ハイグロホロプシス・アウランチアカ（Hygrophoropsis aurantiaca）、プレウロトゥス・ドライヌス（Pleurotus dryinus）、プレウロトゥス（Pleurotus）種、ピクノポルス・シナバリヌス（Pycnoporus cinnabarinus）、アントロジア・セリアリス（Antrodia serialis）、トラメーテス・ヒルスタ（Trametes hirsuta）、アミロステレウム・カイルッチ（Amylostereum chailletii）、ハイメノカエテ・コルチコラ（Hymenochaete corticola）、シチノストローマ・ポルテントスム（Scytinostroma portentosum）、リゾクトニア・ソラーニ（Rhizoctonia solani）、アウリクラリア・ポリトリカ（Auricularia polytricha）及びニジュラ（Nidula）種に属するものである。
特に役立つ例は、アルミラリア（Armillaria）種、CBS 372.94；コプリヌス・シネレウス（Coprius cinereus）、IFO 30116；サチレラ・コンドレアナ（Psathyrella condolleana）、CBS 628.95；パナエオルス・パピリオナシウス（Panaeolus papilionaceus）、CBS 630.95；アミロステレウム・カイレッチ（Amylostereum chailletii）、CBS 373.94；及びハイメノカエテ・コルチコラ（Hymenochaete corticola）、CBS 371.94からなる群に属する株である。
役立つ子嚢菌亜門の例は、ジスコマイセーテス（Discomycetes）、ピレノマイセーテス（Pyrenomycetes）、ロクロアスコマイセーテス（Loculoascomycetes）、及びプレクトマイセーテス（Plectorycetes）綱に属する株、好ましくはレオチアレス（Leotiales）、キシラリアレス（Xylariales）、ジアポルタレス（Diaporthales）、ソルダリアレス（Sordariales）、ハロスファエリアレス（Halosphaeriales）、ハイポクレアレス（Hypocreales）、ドチデアレス（Dothideales）、エウロチアレス（Eurotiales）、及び未知の目の特定のアスコマイセーテス（Ascomycetes）目に属する株である。
好ましい株はレオチアセアエ（Leotiaceae）、キシラリアセアエ（Xylariaceae）、アンフィスファエリアセアエ（Amphisphaeriaceae）、バルサセアエ（Valsaceae）、カエトミアセアエ（Chaetomiaceae）、ラシオスファエリアセアエ（Lasiosphaeriaceae）、ハロスファエリアセアエ（Halosphaeriaceae）、ヒポクレアセアエ（Hypocreaceae）、プレオスポラセアエ（Pleosporaceae）、マイコスファエレラセアエ（Mycosphaerellaceae）、ボトリオスファエリアセアエ（Botryosphaeriaceae)、スポロルミアセアエ（Sporormiaceae）、ヘルポトリキエラセアエ（Herpotrichiellaceae）、及びトリココマタセアエ（Trichocomataceae）科に属する株、特に、ジモルホスポルム（Dimorphosporum）、キシラリア（Xylaria）、アスコトリチア（Ascotricha）、ノジュリスポリウム（Nodulisporium）、サボリエラ（Savoryella）、バルサ（Valsa）、カエトミウム（Chaetomium）、ポドスポーラ（Podospora）、ハロスファエリオプシス（Halosphaeriopsis）、ルルオルチア（Lulworthia）、リグニンコーラ（Lignincola）、フサリウム（Fusarium）、ミロテシウム（Myrotheciumu）、トリコダーマ（Trichoderma）、アルテルナリア（Alternaria）、コチリオポルス（Cochliobolus）、クルブラリア（Curvularia）、セルコスポーラ（Cercospora）、クラドスポリウム（Cladosporium）、ボトリオスファエリア（Botryosphaeria）、スポロルミエーラ（Sporormiella）、プレウッシア（Preussia）、カルポニア（Carponia）、コニオチリウム（Coniothyrium）、ビッソキラミス（Byssochlamys）、タラロマイセス（Talaromyces）、ネオサルトリア（Neosartorya）、バルクピエラ（Warcupiella）、アスペルギルス（Aspergillus）、ベアウベリア（Beauveria）、ホルテア（Hortea）、ヒューミコーラ（Humicola）、モノジクチス（Monodictys）、及びデンドリフィエラ（Dendryphiella）属に属する株である。
好ましいのは、ジモルホスポルム・ジスポラトリチウム（Dimorphosporum disporatrichum）、キシラリア（Xylaria）種、アスコトリチア・エリナセア（Ascotricha erinacea）、ノジュリスポリウム（Nodulisporium）種、サボリエラ・リグニコーラ（Savoryella lignicola）、バルサ・ピニ（Valsa pini）、カエトミウム・フニコルム（Chaetomium funicolum）、ポドスポーラ・テトラスポーラ（Podospora tetraspora）、ハロスファエリオプシス・メジオセチゲラ（Halosphaeriopsis mediosetigera）、ルルウォルチア・ウニセプタタ（Lulworthia uniseptata）、リグニンコーラ（Lignincola）種、フサリウム・アルメニアクム（Fusarium armeniacum）、フサリウム・デセムセルラレ（Fusarium decemcellulare）、フサリウム・ジメルム（Fusarium dimerum）、フサリウム・メリスモイデス（Fusarium merismoides）、フサリウム・レドレンス（Fusarium redolens）、フサリウム・フロッチフェルム（Fusarium flocciferum）、マイロテシウム・ロリドゥム（Myrothecium roridum）、トリコダーマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）、コクリオボルス・サチブス（Cochliobolus sativus）、クルブラリア・ボレイアエ（Curvularia borreiae）、セルコスポーラ・ベチコーラ（Cercospora beticola）、セルコスポーラ・カリシス（Cercospora carisis）、セルコスポーラ・フシマクランス（Cercospora fusimaculans）、セルコスポーラ・ハイ（Cercospora hayi）、セルコスポーラ・セサミ（Cercospora sesami）、セルコスポーラ・トラベルシアナ（Cercospora traversiana）、クラドスポリウム・クラドスポリオデス（Cladosporium cladosporiodes）、クラドスポリウム・レシナエ（Cladosporium resinae）、クラドスポリウム・オキシスポルム（Cladosporium cladosporiodes）、クラドスポリウム・スファエオスペルムム（Cladosporium sphaeospermum）、ボトリオスファエリア・ロジナ（Botryosphaeria rhodina）、スポロルミエーラ・アウストラリス（Sporormiella australis）、スポロルミエーラ・ミニマ（Sporormiella minima）、プレウッシア・イソメラ（Pressia isomera）、カルポニア・ソリオマリス（Carponia solliomaris）、コニオチリウム・セレアリス（Coniothyrium cerealis）、バイッソキラシス・フルバ（Byssochlamys fulva）、タラロマイセス・ヘリクス（Talaromyces helicus）、ネオサルタリア・クァドリシネタ（Neosartorya quadricineta）、ワルクピエーラ・スピヌローサ（Warcuiella spinulosa）、アルペルギルス・ホエチドゥス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ギガンテウス（Aspergillus giganteus）、アスペルギルス・ヘテロモルフス（Aspergillus heteromorphus）、アスペルギルス・プニセウス（Aspergillus puniceus）、アスペルギルス・プニセウス（Aspergillus puniceus）、アスペルギルス・タマーリ（Aspergillus tamarii）、ビアウベリア・シリンドロスポーラ（Beauvevia cylindrospora）、ビアウベリア・カレンドニカ（Beanveria calendonica）、ホルテア・ウェルネッキ（Hortea werneckii）、ヒュミコーラ・アロパロネラ（Humicola alopallonella）、モノジクチス・ペラギカ（Monodictys pelagica）及びデンドリフィエラ・サリナ（Dendryphiella salina）種である。
特に好ましいのはジモルホスポルム・ジスポラトリチウム（Dimorphosporum disporatrichum）、ATCC 24562；サボソエラ・リグニコーラ（Savoryella lignicola）、CBS 626.95；カエトミウム・フニコルム（Chaetomium funicolum）、ATCC 42779；ルルウォルチア・ユニセプタータ（Lulwothia uniseptata）、IFO 32137；フサリウム・アルメニアクム（Fusarium armeniacum）、IBT 2173；フサリウム・デセムセルラレ（Fusarium decemcellulare）、CBS 315.73；フサリウム・ジメルム（Fusarium dimerum）、IBT 1796；フサリウム・メリスモイデス（Fusarium merismoides）、ATCC 16561；フサリウム・レドレンス（Fusarium redolens）、IBT 2058；ミロセシウム・ロリドゥム（Myrothecium roridum）、ATCC 20605；トリコダーマ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）、CBS 223.93；アルテルナリア・アルテルナータ（Alternario alternata）、CBS 448.94；クルブラリア・ボレイアエ（Curvularia borreiae）、CBS 859.73；セルコスポーラ・ベチコーラ（Cercospora beticola）、ATCC 28056；セルコスポーラ・カリシス（Cercospora carisis）、IMI 167.425；セルコスポーラ・フシマクランス（Cercospora fusimaculans）、IMI 167.426；セルコスポーラ・ハイ（Cercospora hayi）、IMI 160.414；セルコスポーラ・セサミ（Cercospora sesami）、IMI 318.913；セルコスポーラ・トラベルシアナ（Cercospora traversiana）。IMI 318.080；クラドスポリウム・レシナエ（Cladosporium resinae）、CBS 174.61；クラドスポリウム・スファエオスペルムム（Cladosporium sphaeospermum）、CBS 444.94；バイッソキラミス・フルバ（Byssochlamys fulva）、AHU 9252；タラロマイセス・ヘリクス（Talaromyces helicus）、ATCC 10451；ネオサルトリヤ・クアトリシネタ（Neosartoya quadricineta）、IBT 11057；ワルクピエーラ・スピヌローサ（Warcupiella spinulosa）、NKBC 1495；アスペルギルス・ホエチドゥス（Aspergillus foetidus）、CBS 565.65；アスペルギルス・ギガンテウス（Aspergillus giganteus）、CBS 526.65；アスペルギルス・ヘテロモルフス（Aspergillus heteromorphus）、CBS 117.55；アスペルギルス・プニセウス（Aspergillus puniceus）、IAM 13893；アスペルギルス・タマーリ（Aspergillus tamarii）、IBT 3824；ベアウベリア・シリンドロスポーラ（Beauveria cylindrospora）、CBS 719.70；ベアウベリア・カレンドニカ（Beauveria calendonica）、CBS 485.88；ホルテア・ウェルネッキ（Hortea werneckii）、CBS 446.94；モノジクチス・ペラギカ（Monodictys pelagica）、CBS 625.95；及びデンドリフィエラ・サリナ（Dendryphiella salina）、CBS 447.94種である。
役立つ接合菌類の例は、ムコラレス（Mucorales）目に属する株、好ましくはムコール（Mucor）及びクニングハメラ（Cunninghamella）属に属する株である。
好ましい種は、ムコール・アリガレンシス（Mucor aligarensis）、好ましくはATCC 28928、ムコール・ルテウス（Mucor luteus）及びクニングハメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、好ましくはAHU 9445である。
以下の実施例に示されるように、本発明の真菌のトランスグルタミナーゼ調製物は、比較的高い温度、即ち酵素活性が最適である温度でもα−カゼインを重合することができる。
本発明の好ましい真菌トランスグルタミナーゼ調製物は、少くとも55℃、好ましくは少くとも60℃、更に好ましくは少くとも70、いっそう更に好ましくは少くとも80℃、特に少くとも90℃の温度で最適活性を示す。このような調製物は、例えばサボリエラ、クラドスポリウム、モノジクチス、ハイメノカエテ及びルルウォルチア属に属する株、特にサボリエラ・リグニコーラ、クラドスポリウム・フファエオスペルムム、ハイメノカエテ・コルチコーラ、モノジクチス・ペラギカ及びルルウォルチア・ウニセプタータに属する株の培養により産生され得る。
本発明の他の好ましい真菌トランスグルタミナーゼ調製物は、少くとも8.5、好ましくは少くとも9.0のpHにおいて最適相対活性を示す。このような調製物は、サボリエラ、クラバスポリウム、セロコスポーラ、ハイメノカエテモノジクチス及びルルウォルチア属に属するの培養により産生され得る。
更に、真菌トランスグルタミナーゼ活性は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）により阻害されることが考えられる。
一般的なトランスグルタミナーゼは、触媒に本質的である活性部位においてシステイン残基を含むと考えられる。これは、遊離チオール基と反応する化合物がトランスグルタミナーゼを阻害するという観察を基にする。これらの化合物は、例えばモノ−ヨード酢酸又は水銀塩である。
他のタイプの化合物により阻害されるトランスグルタミナーゼは異なる触媒機構を有し得、これによりプロテアーゼの分類に類似したグループにトランスグルタミナーゼを区別し得よう。４のクラスのプロテアーゼが異なる化合物によるそれらの阻害に基づいて区別される。例えば、セリンプロテアーゼはフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）により典型的に阻害されるが、システインプロテアーゼは、トランスグルタミナーゼを阻害する同じ化合物により阻害される。
他の態様において、本発明は、周知の微生物のトランスグルタミナーゼと対照的に、ストレプトマイセス及び関連する属のクラスターＦに属さないバクテリアの培養により産生され得る新規のトランスグルタミナーゼ調製物に関する。
好ましいバクテリアはグラム陰性又はグラム陽性である。
トランスグルタミナーゼ産生性グラム陰性バクテリアの例は、シュードモナス（Pseudomonas）、ハフニア（Hafnia）、ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）及びザイモモナス（Zymomonas）属に属する株である。
TGase産生株グラム陰性バクテリアの好ましい例は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas amyloderamosa）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、ハイドロゲノファーガ・パレロニ（Hydrogenophaga palleroni）（バソニム：シュードモナス・パレロニ（Pseudomonas palleroni））、Moo5A10及びザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）；特にシュードモナス・プチダ、DSM 1693；シュードモナス・プチダ、NCIMB 9869；シュードモナス・アミロデラモサ、ATCC 21262；ハフニア・アルベイ、DSM 30163；ハイドロゲノファーガ・パレロニ、DSM 63；Moo5A10；DSM 10094；及びザイモモナス・モビリス、DSM 424に属する株である。
TGase産生性グラム陽性バクテリアの例は、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ロチア（Rothia）、バチルス（Bacillus）、キタサトア（Kitasatoa）及びバクテリジウム（Bacteridium）属に属する株である。
TGase産生性グラム陽性バクテリアの好ましい例は、ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・ニグレセンス（Streptomyces nigrescens）、ストレプトマイセス・シオヤエンシス（Streptomyces sioyaensis）、ストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces platensis）、ロチア・デントカリオーサ（Rothia dentocariosa）、バチルス・バジウス（Bacillus badius）、バチルス・マイコイデス（Bacillus mycoide）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・アネウリノリチクス（Bacillus aneurinolyticus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス種、Ｂ．アミロリクエファンシエンス（B.amyloliquefaciens）、キタサタオ・プルプレア（Kitasatao purpurea）、バクテリジウム種、及びバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）種に属する株である。
最も好ましいのは、ストレプトマイセス・リジリス、DSM 40555及びNRRL B-3446；ストレプトマイセス・ニグレセンス、ATCC 23941；ストレプトマイセス・シオヤエンシス、ATCC 13989；ストレプトマイセス・プラテンシス、DSM 40041；バチルス・バジウス、DSM 23；バチルス・マイコイデス、GJB 371；バチルス・フィルムス、ATCC 17060；バチルス・フィルムス；DSM 12；バチルス・アネウリノリチクス、ATCC 12856；バチルス・メガテリウム、ATCC 13632；バチルス・メガテリウム、ATCC 15450；バチルス・メガテリウム、AJ 3355及びFerm−P1201；バチルス種、ATCC 21537；Ｂ．アミロリクエファンシエンス、ATCC 23843；キタサタホプルプレア、DSM 43362；バクテリジウム種、DSM 10093、バクテリジウム種、CBS 495.74株である。
本発明の好ましいバクテリアトランスグルタミナーゼ調製物は、少くとも6.5、好ましくは少くとも7.0、更に好ましくは少くとも7.5、いっそう更に好ましくは少くとも8.0、更に少くとも8.5、最も好ましくは少くとも9.0のpHにおいて最適活性を示す。
更に、本発明の好ましいバクテリアトランスグルタミナーゼ調製物のトランスグルタミナーゼ活性はフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）により阻害される。実施例16を参照のこと。
好ましくは、トランスグルタミナーゼは組換えトランスグルタミナーゼ、即ち親微生物からの他の蛋白質又は酵素蛋白質が本質的にないトランスグルタミナーゼである。組換えトランスグルタミナーゼは当業者に慣用的な標準的技術に従ってクローニングされ、発現され得る。
有利には、バクテリア源の親トランスグルタミナーゼ、例えばストレプトマイセス、アクチノプラネス、アモルホスポランギウム、アミコラータ、ダクトロスポランギウム、バクテリジウム、キタサトア、ミクロノスポーラ、又はバチルス属の株由来のトランスグルタミナーゼが用いられ得る。例えば、親トランスグルタミナーゼは、（ARS Patent Culture Collection North Central Region,1815 North University Street,Peonia,Illinois 61640,U.S.A.,NRLL B-3446（先のStreptomyces libani）において寄託された）ストレプトマイセス・リジクス種の株から得られ得る。
好ましい実施形態において、親トランスグルタミナーゼはストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446、トランスグルタミナーゼ、又は
ｉ）親トランスグルタミナーゼのアミノ酸配列と少くとも60％の相同性であるアミノ酸配列を含み、
ii）親トランスグルタミナーゼに対する抗体と反応し、及び／又は
iii）親トランスグルタミナーゼをコードするDNA配列と同じプローブとハイブリダイズするDNA配列によりコードされた
前記親トランスグルタミナーゼの機能的アナログである。
アナログの特性ｉ）は、第２の配列から第１の配列の起源を示すアナログと親トランスグルタミナーゼとの間の同一性の程度を示すことが意図される。特に、ポリペプチドは、各々のアミノ酸配列の比較が70％，80％，85％，90％又は95％超のような約60％より大きい同一性を示すなら、親トランスグルタミナーゼに相同性があると考えられる。配列比較は、Lipman及びPearson（1985）により記載されるもののような周知のアルゴリズムにより行われ得る。
親トランスグルタミナーゼのアナログの更なる特性ii）及びiii）は以下のように決定され得る：
特性ii）、即ち免疫交差反応性は、親トランスグルタミナーゼの少くとも１のエピトープに対する抗体又はそれとの反応性を用いてアッセイされ得る。モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであり得る抗体は、例えばHudson et al.により記載されるような当該技術で周知である方法により作られ得る。免疫交差反応性は、例えばHudson et al.,1989により記載されるようなウエスタン・ブロッティング又は放射免疫拡散アッセイのような当該技術で周知であるアッセイを用いて決定され得る。
先に定義される特性iii）に従うアナログのキャラクタリゼーションに用いられるプローブは、新トランスグルタミナーゼの全てもしくは部分的なヌクレオチド又はアミノ酸配列を基にして適切に調製され得る。ハイブリダイゼーションは、DNA配列がハイブリダイズするのを許容するいずれかの適切な条件下で行われ得る。例えば、このような状況は、例えば５×SSC中にプレソーキングし、20％ホルムアミド、５×Denhardt's溶液、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、及び50μｇの変性音波処理ウシ胸腺DNAの溶液中に約40℃で１時間、ハイブリダイズし、次に100μＭ ATPが供された同溶液中で約40℃で18時間、ハイブリダイズする又は例えばSambrook et al.,1989により記載される他の方法を含む特定の条件下でのハイブリダイゼーションである。
親トランスグルタミナーゼの他の例は、ストレプトマイセス・プラテントシス（Streptomyces platentsis）、好ましくはDSM 40041、ストレプトマイセス・ニグレセンス（Streptomyces nigrescens）、好ましくはATCC 23941又はストレプトマイセス・シオヤエンシス（Streptomyces sioyaensis）、好ましくはATCC 13989から得られる又はそれらにより産生され得るものである。
これらの親トランスグルタミナーゼはα−カゼインを重合させることができ、これにより多くの工業的目的のために役立つ。
更なる態様において、本発明は、トランスグルタミナーゼの産生のための方法であって、本明細書で特定される綱、目、科、属及び種のいずれかに属する株、特にストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446を適切な栄養培地内で培養することを含むことを特徴とする方法に関する。
更に更なる態様において、本発明は先に記載の真菌又はバクテリアトランスグルタミナーゼ調製物及び安定剤を含むトランスグルタミナーゼ組成物に関する。
本発明は、蛋白質を架橋する方法であって、本発明の真菌又はバクテリアトランスグルタミナーゼ調製物を含むトランスグルタミナーゼ組成物を蛋白質の基質に接触させることを含むことを特徴とする方法にも関する。
本発明のトランスグルタミナーゼ調製物は、穀紛、肉製品、魚製品、化粧品、チーズ、ミルク製品、ゲル化食物製品及び靴みがきに役立つ。
本文脈において、配列番号：１に示されるDNA配列の“アナログ”は特性ｉ）〜iii）のいずれか又は全てを有するトランスグルタミナーゼ活性を示す酵素をコードするいずれかのDNA配列を示すことが意図される。アナログDNA配列は、
ａ）例えば本明細書に記載される方法を用いて、配列番号：１に示されるDNA配列に基づいてトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素を産生する他の又は関連する（例えば同じ）生物から単離され得、例えば本明細書に示されるDNA配列を含むDNA配列の対立又は種変異体であり得る。
ｂ）例えばDNA配列によりコードされるが、酵素の産生を意図された宿主生物のコドン利用に相当するトランスグルタミナーゼの他のアミノ酸配列を生じないヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により、配列番号：１に示されるDNA配列に基づいて作製され得る。しかしながら、後者の場合、アミノ酸変換は、好ましくは少し天然のもの、即ち蛋白質のホールディング又は活性に大きな影響を与えない保存性アミノ酸置換、典型的には１〜約30アミノ酸の小さな欠失、アミノ末端メチオニン残基のような小さなアミノ−もしくはカルボキシル末端伸長、約20〜25残基までの小さなリンカーペプチド、又はポリヒスチジン域、抗原エピトープもしくは結合ドメインのような精製を容易にする小さな伸長のものである。一般的なFord et al.(1991)を参照にこと。保存性置換の例は、（アルギニン、リシン、ヒスチジンのような）塩基性アミノ酸、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような）酸性アミノ酸、（システイン、グルタミン及びアスパラギンのような）極性アミノ酸、（プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリンのような）疎水性アミノ酸、（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンのような）芳香族アミノ酸及び（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニンのような）小さなアミノ酸のグループ内である。
このような置換が、分子の機能に重大である領域の外側で行われ得、なお活性なポリペプチドとなることは当業者に明らかであろう。本発明のDNA構成物によりコードされるポリペプチドの活性に本質的であり、それゆえ好ましくは置換されないアミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニン−スキャニング変異誘発（Cunningham and Wells,(1989)）のような当業者に周知である手順に従って同定され得る。後者の技術において、変異は分子内の全ての残基に導入され、生ずる変異分子は、分子の活性に重大であるアミノ酸残基を同定するために生物学的（即ちトランスグルタミナーゼ）活性についてテストされる。基質−酵素相互作用は、核磁気共鳴、結晶学又はホトアフィニティーラベリングのような技術により決定されるような結晶構造の分析によっても決定され得る。例えば、de Vos et al.,(1992);Smith et al.,(1992);Wlodaver et al.,(1992)を参照のこと。
先のｉ）に言及される相同性は、第２の配列からの第１の配列の由来を示す２つの配列の間の同一度として決定される。相同性は、GCGプログラム・パッケージ（Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.,(1970)）において供されるGAPのような当該技術で周知であるコンピュータープログラムの手段により適切には決定され得る。例えばDNA配列比較のための次のセッティング：5.0のGAPクリエーション・ペナルティ及び0.3のGAPエクステンション・ペナルティでGAPを用いて、DNA配列のコーディング領域は配列番号：１に示されるDNA配列又は大腸菌DSM 10175内のプラスミドから得られうるDNA配列のコーディング領域と少くとも80％、更に好ましくは少くとも82％、更に好ましくは少くとも85％、特に少くとも90％の同一度を示し得る。
先のii）に言及される相同性は、第２の配列からの第１の配列の由来を示す２つの配列間の同一度として決定される。相同性は、適切には、GCGプログラム・パッケージ（Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.,(1970)）のような当該技術において周知であるコンピュータープログラムの手段により決定され得る。例えば次のポリペプチド配列比較のためのセッティング：3.0のGAPクリエーション・ペナルティ及び0.1のGAPエクステンション・ペナルティでGAPを用いて、類似したDNA配列によりコードされるポリペプチドは、配列番号：１に示されるDNA配列又は大腸菌、DSM 10175内のプラスミドから得られうるDNA配列を含むDNA構成物によりコードされる酵素と好ましくは少くとも79％、更に好ましくは少くとも80％、より更に好ましくは少くとも82％、特に少くとも90％の同一度を示し得る。
先の特性iii）に関連して、株DSM 10175から単離されたDNA配列によりコードされ、該DNA配列で形質転換された宿主生物内で産生されるか、又は株DSM 10175により産生されるトランスグルタミナーゼを示すことが意図される。免疫学的反応性は、後の材料及び方法のセクションに記載される方法により決定され得る。
更なる態様において、本発明は、本発明のDNA構成物を有する発現ベクター、該DNA構成物又は発現ベクターを含む細胞、並びにトランスグルタミナーゼ活性を示す酵素を産生する方法であって、該方法が前記酵素の産生を許容する条件下で前記細胞を培養し、そしてその培養物から前記酵素を回収することを含むことを特徴とする方法に関する。
更なる態様において、本発明は、トランスグルタミナーゼ活性を示す酵素であって、該酵素が、
ａ）本発明のDNA構成物によりコードされ、
ｂ）本発明の方法により産生され、及び／又は
ｃ）配列番号：１に示されるDNA配列又は大腸菌、DSM 10175内のプラスミドから得られうるDNA配列によりコードされた精製されたトランスグルタミナーゼに対する抗体と免疫学的に反応することを特徴とする酵素に関する。
先のｃ）に言及されるトランスグルタミナーゼは大腸菌株、DSM 10175から単離されたDNA配列によりコードされ、そして該DNA配列で形質転換された宿主生物内で産生されるか、又はストレプトマイセス・リジクス、好ましくはAgricultural Research Service Culture Collection,1815 North University Street,Peoria,Illinois 61604,U.S.A.により供され、それから利用できるストレプトマイセス・リジクス株、NRRL B−3446により産生され得る。
トランスグルタミナーゼ活性を示す酵素をコードする本発明のDNA配列は、
ストレプトマイセス・リジクスからのDNAライブラリーを適切なベクター内でクローニングするステップと、
適切なバクテリア又はイーストの宿主細胞を前記ベクターで形質転換するステップと、
前記DNAライブラリー内のクローンによりコードされた関心のいずれかの酵素を発現するために適切な条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
それらのクローンにより産生された前記酵素のいずれかのトランスグルタミナーゼ活性を測定することにより陽性クローンをスクリーニングするステップと、
それらのクローンから前記酵素コーディングDNAを単離するステップと、
を含む一般的方法により単離され得る。
この一般的方法は、その内容が引用により本明細書に組み込まれるWO 94/14953に更に開示される。そのスクリーニング方法のより詳細な記載は後の実施例15に与えられる。
本発明のDNA構成物のDNA配列は公知の方法により単離され得る。これにより、そのDNA配列は、例えばその配列を有することが予想される生物からcDNA又はゲノムライブラリーを確立し、慣用的手順により陽性のクローンについてスクリーニングすることにより単離され得る。このような手順の例は、配列番号：２に示される全アミノ酸配列、又は標準的技術（例えばSambrook et al.,1989）、及び／又は先に記載されるようなトランスグルタミナーゼ活性を発現するクローンのための選択、及び／又は配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含むトランスグルタミナーゼ酵素に対する抗体と反応性のある蛋白質を産生するクローンのための選択に従うそのサブ配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションである。
cDNA又はゲノムライブラリーから本発明のDNA構成物を単離する好ましい方法は、親トランスグルタミナーゼ酵素のアミノ酸配列に基づいて調製される縮退オリゴヌクレオチドプローブを用いるポリメラーゼ鎖反応（PCR）の使用によるものである。例えばPCRは米国特許第4,683,202号又はR.K.Saiki et al.(1988)により記載される技術を用いて行われ得る。
あるいは、本発明のDNA構成物のDNA配列は、確立された標準的方法、例えばBeaucage and Caruthers(1981)により記載されるホスホアミジト法、又はMatthes et al.(1984)により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジト法に従ってオリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機において合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター内でクローンされる。
最後に、DNA構成物は、標準的技術に従って、全体の組換えDNA分子の種々の部分に対応する（適切なものとして）合成、ゲノム又はcDNA源のフラグメントと連結反応させることにより調製されたゲノム及び合成の混合、合成及びcDNAの混合又はゲノム及びcDNAの混合の源のものであり得る。
トランスグルタミナーゼ酵素をコードするDNA配列は、例えばストレプトマイセス・リジクスのDNAライブラリーをスクリーニングし、そして適切な酵素活性（即ちトランスグルタミナーゼ活性）を表現し、又はDSM（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 16,D-38124 Braunschweig,Germany）において1995年８月23日にブタペスト条約下で寄託された大腸菌、DSM 10175からのクローンについて選択することにより単離され得る。その後、適切なDNA配列が、例えば実施例１に記載されるようにクローンから単離され得る。
相同的な酵素、即ち類似したDNA配列をコードするDNA配列は他の微生物から得られうることが予想される。例えば、DNA配列は、他のバクテリア、好ましくはグラム陽性バクテリア、更に好ましくはストレプトマイセス種の株、特にＳ．プラテンシスの株のDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得られうる。
あるいは、本発明のトランスグルタミナーゼをコードするDNAは、公知の手順に従って、便利には本明細書に開示されるDNA配列を基にして調製される合成オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、先に言及される生物のいずれかのような適切なソースからのDNAから単離され得る。例えば、適切なオリゴヌクレオチドプローブは配列番号：１に示されるヌクレオチド配列又はそのいずれかの適切なサブ配列に基づいて調製され得る。
次にそのDNA配列は組換え発現ベクター内に挿入され得る。これは、便利に組換えDNA手順が行われ得るいずれかのベクターであり得、ベクターの選択は、しばしば、それが導入されるべき宿主細胞によるだろう。これにより、そのベクターは、自己複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在し、その複製が染色体の複製から独立しているベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、そのベクターは、宿主細胞内に導入された時に宿主細胞ゲノム内に一体化され、それが一体化されている染色体と共に複製されるものであり得る。
ベクターにおいて、トランスグルタミナーゼをコードするDNA配列は、適切なプロモーター及びターミネーター配列に作用的に接続されるべきである。そのプロモーターは、選択された宿主細胞内で翻訳活性を示すいずれかのDNA配列であり得、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子から得られうる。トランスグルタミナーゼをコードするDNA配列、プロモーター及びターミネーター各々を接合し、それらの適切なベクター内に挿入するのに用いられる手順は、当業者に公知である（例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY,1989）。
本発明の酵素をコードするDNA配列で形質転換された宿主細胞は、好ましくは真核細胞、特にイースト又は糸状菌細胞のような真菌細胞、又はバクテリア細胞のような原核細胞である。特に、真核細胞は、アスペルギルス、フサリウム又はトリコデルマの種、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ、アスペルギルス・ニジュランス又はアスペルギルス・ニゲルに属し得る。真菌細胞は、プロトプラスト形成及びそのプロトプラストの形質転換、次のそれ自体周知の様式における細胞壁の再生を含む方法により形質転換され得る。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は、その内容が引用により本明細書に組み込まれる（Novo Nordisk A/Sの）EP 238023に記載される。宿主細胞は、イースト細胞、例えば、サッカロマイセス、特にサッカロマイセス・クルイベリもしくはサッカロマイセス・ウバルムの株、スキゾサッカロマイセス・ポムベのようなスキゾサッカロマイセス種の株、ハンセヌラ種、ピキア種、ヤロウィア・リポリチカのようなヤロウィア種、又はクルイベロマイセス・ラクチスのようなクルイベロマイセス種の株でもあり得る。宿主細胞は、バクテリア細胞、好ましくはグラム陽性バクテリアさらに好ましくはバチルス又はストレプトマイセス、特にバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラウトゥス、バチルス・メガテリウム、バチルス・シュリンジエンシス、又はストレプトマイセス・リビダンス、Ｓ．リジクスもしくはストレプトマイセス・ムリヌス；又はグラム陰性バクテリア、好ましくはエスケリチア（Escherichia）、更に好ましくは大腸菌の株でもあり得る。バクテリアの形質転換は、例えばプロトプラスト形質転換により、又はそれ自体周知の様式におけるコンピテント細胞を用いることにより行われ得る。
本発明のDNA構成物、プロモーター、ターミネーター及び他の要素各々を連結し、それらを複製のために必要な情報を含む適切なベクター内に挿入するのに用いられる手順は当業者に公知である（例えばSambrook et al.(1989)）。
本発明の発現ベクターは、適切な転写ターミネーター、及び真核生物において本発明の蛋白質ジスルフィドレドックス剤をコードするDNA配列に作用的に接続されたポリアデニル化配列も含み得る。ターミネーション及びポリアデニル化配列は、適切にはプロモーターと同じソースから得られうる。
更なる態様において、本発明は、本発明に従う酵素を産生する方法であって、該酵素をコードするDNA配列で形質転換された適切な宿主細胞を前記酵素の産生を許容する条件下で培養し、その培養物から結果として生ずる酵素を回収することを特徴とする方法に関する。
形質転換された宿主細胞を培養するのに用いられる培地は、問題の宿主細胞を増殖させるのに適切ないずれかの慣用的培地であり得る。発現されたトランスグルタミナーゼは便利には培養培地内に分泌され得、遠心又はろ過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩の手段により培地の蛋白質の構成物を沈殿させ、次にイオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィーの手順を行うことを含む公知の手順によりそれから回収され得る。発現されたトランスグルタミナーゼは細胞壁に結合したものでもあり得る。
本発明の組成物
有用なトランスグルタミナーゼが添加され得るが、適切な組成物内に製剤化されることが好ましい。工業的に用いられるべきトランスグルタミナーゼは、問題の使用に適切ないずれかの形態、例えば乾燥紛体又は粒状体、特に非散布性粒状体、液体、特に安定化された液体又は保護された酵素の形態であり得る。粒状体は例えばUS 4,106,991及びUS 4,661,452に開示されるように製造され得、当該技術で周知である方法により任意に被覆され得る。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、糖、糖アルコールもしくは他の多価アルコール、又は乳酸もしくは他の有機酸のような栄養的に許容される安定剤を加えることにより安定化され得る。保護された酵素は、EP 238,216に開示される方法に従って調製され得る。本発明の酵素調製物は防腐剤も含み得る。
通常、穀物、肉製品、チーズ及び他のミルク製品、魚製品、化粧品、種々のゲル化食物中の包含のために、酵素調製物は乾燥品、例えば非散布粒状物の形態であることが有利であり得、他方液体と共の包含のために、液体形態が有利である。
本発明は以下の非限定の実施例に更に詳説される。
実施例１
トランスグルタミナーゼを産生する微生物の同定
〔１，４−14Ｃ〕−プトレッシン組込みアッセイの検出限界はヒドロキサメートアッセイの検出限界の１／20であることが見い出された。
用いられるアッセイは、もとの手順の少し改良されたバージョンである（Cutris,C.G. & Lorand,L.(1976)）。トランスグルタミナーゼ活性は〔１，４−14Ｃ〕プトレッシンのα−カゼイン内への組込みとして測定される。
Ａ．トランスグルタミナーゼ産生性真菌：
トランスグルタミナーゼを以下に詳細に記載されるアッセイを用いて真菌源のいくつかの微生物の培養ブイヨン内で同定した。EP−Ａ−0 481 504に記載されるようなヒドロキサメートアッセイ（Folk,J.E. & Cole,P.W.(1966)）を用いてこれらのトランスグルタミナーゼ活性を検出することが可能であった。
PDAスラント（39ｇ／ｌポテトデキストロース寒天）から菌糸体を収集することにより真菌を振とうフラスコ内に接種した。振とうフラスコは、培地Ｅ（４ｇ／ｌ肉エキス、４ｇ／ｌイーストエキス、40ｇ／ｌグルコース、８ｇ／ｌトリプトン、0.001ｇ／ｌ FeSO4 7H2O，２タブレット／ｌ  EBIOS，pH7.0）、培地Ｄ（50ｇ／ｌポテト粉、25ｇ／ｌ大麦粉、0.025ｇ／ｌ  BAN 800 MG，５ｇ／ｌ  Na−カゼイン、10ｇ／ｌ大豆粉、4.5ｇ／ｌ  Na2HPO4，0.05ml／ｌプルロニック）、培地Ａ（75ｇ／ｌポテト粉、0.075ｇ／ｌ  BAN 800 MG，40ｇ／ｌ大豆粉、９ｇ／ｌ  Na2HPO4，1.5ｇ／ｌ  KH2PO4，0.1ml／ｌプルロニック）、培地Ｆ（４ｇ／ｌイーストエキス、15ｇ／ｌグルコース、１ｇ／ｌ K2HPO4，0.5ｇ／ｌ  MgSO4，pH7.0）、培地Ｂ（30ｇ／ｌ大豆粉、15ｇ／ｌマルトデキストリン、５ｇ／ｌバクトペプトン、0.2ｇ／ｌプルロニック）、培地Ｇ（グルコース40ｇ／ｌ，Soytone 10ｇ／ｌ，CaCl2 10ｇ／ｌ，FeSO4 10mg/ｌ，MnSO4・4H2O 1mg／ｌ，ZnSO4・7H2O １mg／ｌ，CuSO4・５H2O ２mg／ｌ、軟材のパルプ（枝分かれしていないマツ）2.5ｇ／ｌ（乾燥重量），pHを5.0に調整or培地Ｃ（KH2PO4 0.2ｇ／ｌ；MgSO4，７H2O 0.05mg／ｌ；CaCl2，２H2O 0.013mg／ｌ；（NH4）H2PO4 0.24mg／ｌ；0.01Ｍ酢酸ナトリウム（pH4.5）；鉱物溶液７ml／ｌ；グルコース１ｇ／ｌ；蒸留水863mg／ｌ；pHを6.0に調整；寒天15ｇ／ｌ；チアミン（オートクレーブ後）１mg／ｌ）のいずれかを含む。その培養物を振とうしながら３〜30日間、26℃で培養した。結果として生ずる培養ブイヨンを10分間、2300ｇで遠心して無細胞培養ブイヨン（トランスグルタミナーゼ調製物）を供した。
20μｌのサンプルに５μｌの〔１，４−14Ｃ〕プトレッシン（２％エタノール水溶液中1.85MBｑ／ml；特異活性4.22GBｑ／mmol）及び20μｌカゼイン（50ml  Tris−HCl，100mM  NaCl，５mM  DTT，pH7.5中２％）を加える。室温で２時間、インキュベートした後、30μｌのアッセイ混合物を小さな円形のWhatmann  3MMフィルター上にスポットする。そのフィルターを冷やした10％トリクロロ酢酸中に浸水されたバスケット内に直ちにおき、過剰の放射能を除去するために20分間、洗浄する。この最初の洗浄の後、そのフィルターを冷やした５％トリクロロ酢酸で３回、冷やしたエタノール：アセトン（50：50，Ｕ：Ｕ）で１回、冷やしたアセトンで１回、洗浄する。これらの洗浄の各々を５分間行う。全ての洗浄ステップにおいて、洗浄液の量は少くとも５ml／フィルターであるべきである。その洗浄したフィルターをシンチレーションバイアル内で直接計数する。
ユニット：時間当り１nmol〔１，４−14Ｃ〕−プトレッシンを組み込む酵素活性を１Ｕとして定義する。
以下の表は、培養に基づく特定の増殖培地においてトランスグルタミナーゼを産生する種を示す。酵素活性はトランスグルタミナーゼのユニット単位で示す。
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トランスグルタミナーゼ産生性バクテリア：
トリブトン−イースト寒天プレート上で増殖したバクテリアを振とうフラスコの接種のために用いた。振とうフラスコは以下に列挙される100mlの塩地を含んでいる。培養物を250rpmで振とうしながら１〜12日間、30℃でインキュベートした。サンプル（５ml）をブイヨンから取り、（2300×ｇでの15分間の遠心の後の）無細胞上清において、又は当量の滅菌培地内に懸濁された細胞ペレットにおいて、いずれかの粗ブイヨン内でTgase活性について分析した。
以下の表は、列記される培地内での培養に基づいてTGaseを産生するバクテリア種の例を示す。Tgase活性はユニット／mlで与えられる。
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培地Ｋのためのトレース要素溶液（mg／ｌ  Milli Ｑ水）：MnCl2×４H2O：100，CoCl×６H2O：36.34，CuSO4×５H2２O：15.64，Na2MoO4×２H2O×10，ZnCl2：20，LiCl：５，SnCl2×２H2O：５，H3BO3：310，KBr：20，KI：20，Na2−EDTA：８。
実施例２
トランスグルタミナーゼの培地依存発現
微生物の培養ブイヨン内で見い出されるトランスグルタミナーゼ活性の量は、培養のために用いられた増殖培地によることが見い出された。これは、全ての微生物、即ち真菌又はバクテリアについて確かであると信じられる。
Ａ．真菌：
以下の表は、３つの異なる培地（用いられた培地の組成について実施例１を参照のこと）上で各々培養された真菌ヒメノカエテ・コルチコーラ及びセロコスポーラ・カリシスの培養ブイヨン中で見い出されたトランスグルタミナーゼ活性を示す。
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Ｂ．バクテリア：
バクテリアについても、バクテリアの培養ブイヨン内で見い出されたTGase活性の量が培養のために用いられた増殖培地によることが見い出された。
TGase活性の発現への培地の効果を研究するために、選択された株を異なる培地（先の実施例１参照）中で増殖させた。以下の表において、シュードモナス・プチダ及びヒドロゲノファーガ・パルレロニTGaseのための例が与えられる。研究した他の株は、ストレプトマイセス・リジクス、シュードモナス・プチダ（DSM 1693）、ロチア・デントカリオザ、バチルス・フィルムス、バチルス・バジウス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・アネウリノリチクス、バチルス・メガテリウム（３株、実施例１参照）、バチルス・マイコイデス、ザイモモナス・モビリス、ハフニア・アルベイ、キタサタオ・プルプレア、バクテリジウム種、株Moo5A10である。
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実施例３
Ａ．真菌のトランスグルタミナーゼの温度依存性
クラドスポリウム・スファエオスペルム、ヒルコスポーラ・カリシス、サボリエーラ・リグニコーラ及びルルウォルチア・ウニセプタ（寄託番号について実施例１参照）のトランスグルタミナーゼ調製物内に存在するトランスグルタミナーゼの温度依存性を、実施例１に記載されるプトレッシンアッセイの改良を用いて研究した。
温度依存性の決定のために、40℃，55℃，60℃，70℃，80℃又は90℃のいずれかの室温において１時間、インキュベーションを行った。
以下の表は、真菌のトランスグルタミナーゼの温度依存性を示す。酵素活性は相対活性で与えられる。
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Ｂ．バクテリアのトランスグルタミナーゼの温度依存性
本実験において次の株：シュードモナス・プチダ（NCIMB 9869）、バクテリジウム種（DSM 10093）、株Moo5A10、バチルス・フィルムス、バチルス・バジクス及びロチア・デトカリオーサにおいてTgaseの温度依存性を検査した。
これらの株からのTGase含有サンプルを20，30，40及び55℃（２時間のインキュベーション）においてアッセイした。サンプルは、無細胞培養流体（シュードモナス・プチダ、バクテリジウム種、株Moo5A10）、滅菌培地中に再懸濁された遠心された細菌（バチルス・フィルムス、バチルス・バジウス）、又は粗培養ブイヨン（ロチア・デントカリオサ）のいずれかである。
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実施例４
Ａ．真菌のトランスグルタミナーゼのpH依存性
クラドスポリウム・スファエオスペルムム、セルコスポーラ・カリシス、サボリエーラ・リグニコーラ及びルルウォルチア・ウニセプタのトランスグルタミナーゼ調製物中に存在するトランスグルタミナーゼのpH依存性を、実施例１に記載されるプトレッシンアッセイの改良を用いて研究した。
50mM  Tris−HCl，100mM  NaCl，pH7.5内に４％α−カゼイン溶液を作り、以下に示されるpH値における改良型200mM Britton−Robinson緩衝液（0.1Ｍ  CH3COOH，0.2Ｍ  H3BO3）中に１：１に希釈した。アッセイする前に、CaCl2及びシステインを加えて各々５mM及び１mMの最終濃度にした。
pH依存性の決定のために、pH7.0，7.5，8.0，8.5又は9.0において１時間、室温においてインキュベーションを行う。
以下の表は、真菌のトランスグルタミナーゼのpH依存性を示す。酵素活性は相対活性で与えられる。
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Ｂ．バクテリアのトランスグルタミナーゼのpH依存性
選択された株からのTGase活性を、pH6.5，７，7.5，８，8.5及び９に調整された改良型Britton-Robinson緩衝液を用いて研究した。４％α−カゼイン溶液を50mM  Tris−HCl，100mM  NaCl，pH7.5中に作り、先に示されるpH値における200mM Britton−Robinson緩衝液（0.1Ｍ  CH3COOH，0.2Ｍ  H3BO3）中に１：１に希釈した。
TGase活性を２時間のインキュベーション及び２mM  EDTAでの標準的アッセイにおいて20℃で測定した。研究した株は、バクテリジウム種、Moo5A10、バチルス・フィルムス、バチルス・マイコイデス、バチルス・パジウス、バチルス・アネウリノリチクス、ロチア・デントカリオサである。
結果：
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実施例５
Ａ．真菌のトランスグルタミナーゼのCa2+依存性
セルコスポーラ・カリシス及びサボリエラ・リグニコーラのトランスグルタミナーゼ調製物中に存在するトランスグルタミナーゼのCa2+依存性を、実施例１に記載される改良型プトレッシンアッセイを用いて研究した。
トランスグルタミナーゼ調製物をFiltronからのMacrosepTM濃縮器を用いて約10倍濃縮した。次にサンプルを、50mM  Tris−HCl，100mM  NaCl，１mMシステイン、pH7.5（−Ca2+）中において、又は50mM  Tris−HCl，100mM  NaCl，１mMシステイン＋５mM  CaCl2，pH7.5（＋Ca2+）で10倍希釈した。
Ca2+依存性の決定のために、１時間、40℃でインキュベーションを行った。α−カゼインを50mM  Tris−HCl，100mM  NaCl，1mMシステイン、pH7.5、又は50mM  Tris−HCl，100mM  NaCl，１mMシステイン＋５mM  CaCl2，pH7.5のいずれか中に溶かした。
結果を次の表に示す。
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Ｂ．バクテリアのトランスグルタミナーゼのCa2+依存性
Tgase活性へのCa2+イオンの効果を、セントリコン処理の後に得られた選択されたCa2+のないサンプルにおいて研究した。サンプルを10KDセントリコン（Centricon）濃縮器内に入れ、遠心し（ろ液に活性はない）、保留物中の酵素を等量のCa2+のないトリス緩衝液（0.1Ｍ，pH7.5）中に再懸濁して、再び遠心してそれらをろ液から分離した。全てのサンプルを遠心して、Ca2+のない状態を確実にするために第２の時間希釈した。
第２のセントリコン処理からのサンプルをCa2+効果を決定するためにCa2+（５mM  EDTA）の存在（２mM CaCl2）及び欠如の両方においてインキュベートした。TGase活性を、（100％にセットされた）セントリコン処理の前かつ第１及び第２のセントリコン処理の後に測定した。選択された株：バクテリジウム、Moo5A10、バチルス・フィルムス及びバチルス・バジウスのみを研究した。
結果は：
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本実験において、バクテリジウム、Moo5A10及びバチルス・フィルムスから研究されたTGaseはCa2+非依存性である：EDTA含有アッセイにおけるろ過の後の活性は未処理のサンプルにおける遠心の前とほぼ同じくらいであった（80〜99％）。第２のセントリコンの後、Moo5A10及びバクテリジウムのためのCa2+の添加により活性が少し刺激された。バクテリジウムについてはなお約80％，Moo5A10については約93％の活性がCa2+なしで測定された。それゆえ、これらの活性はCa2+非依存性として定義される。
バチルス・バジウスTGaseはCa2+依存性であった：第１のセントリコンの後、Ca2+を添加しないで活性（５％）は測定されなかった。その活性は、２mM  Ca2+を加えた後約50℃に回復し得た。
実施例６
トランスグルタミナーゼのカゼインの重合
いくつかの選択されたトランスグルタミナーゼ産生性微生物の無細胞培養ブイヨンを、溶液中でカゼインを重合するそれらの能力について研究した。更に、２つの精製された微生物のトランスグルタミナーゼも研究した。
一般に、100μｌのサンプルを0.2Ｍ  Tris−HCl，pH7.9中の0.1Ｍグルタチオン  20μｌ、及び0.2ＭのTris−HCl中1.5％α−カゼイン100μｌと混合し、37℃で種々の時間、インキュベートした。その反応を、SDS−PAGEのために20μｌのインキュベーション混合物を20μｌのサンプル緩衝液と混合することにより停止させ、10分間、95℃に加熱した。重合をSDS−PAGEにより視覚化した。
研究した発酵ブイヨンは、ストレプトマイセス・リジクス、セルコスポーラ・カリシス、クラドスポリウム・スファエオスペルムム及びサボリエラ・リグニコーラからのものであり、他方精製されたサンプルは、ストレプトマイセス・リジクス及びストレプトマイセス・プラテンシスからのものである。
本実験は、唯一の違いが70℃及び90℃においてインキュベーションを行ったことであるルルウォルチア・ウニセプタータからの発酵ブイヨンでも行った。更に、80℃でのインキュベーションを伴うクラドスポリウム・スファエオスペルムムからの発酵ブイヨンでも実験を行った。
全ての場合において、インキュベーションによりα−カゼインモノマーの還元を伴って形成された極めて高分子量のカゼインポリマーの迅速な形成を生じた。
実施例７
ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446（先のストレプトマイセス・リバーニ）からのトランスグルタミナーゼの精製
ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446（先のストレプトマイセス・リバーニ）を１ｌのZym培地（20ｇ／ｌイーストエキス、12ｇ／ｌグルコース、10ｇ／ｌバクトペプトン、0.01％プルロニック、pH6.5）内に接種し、24時間、30℃で振とうしながら培養した。結果として生ずる種培養液を16ｌのZym培地に加え、その後それを４日間、30℃で振とうしながら培養した。結果として生ずる培養ブイヨンをろ過して11.8ｌの培養ろ液を供した。培養ろ液中のトランスグルタミナーゼ活性は３Ｕ／mlであった。
培養ろ液を３KDaカットオフのFiltron Minisette膜を用いて６倍濃縮した。その濃縮物の500ml部から、周囲温度で硫酸アンモニウムを65％飽和まで加えることにより沈殿させた。この沈殿物を10mM酢酸ナトリウム、pH6.0中に溶かした。更に10mM酢酸ナトリウムpH6.0に対して透析した後、そのサンプルを10ｍM酢酸ナトリウムpH6.0で平衡化されたSP−セファロースカラムにかけた。０から0.5Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配を用いてトランスグルタミナーゼを溶出した。高特異活性を有する画分を収集して、そのプールを、10KDaカットオフのDiaflo膜を備えたAmiconセル内で濃縮した。Amiconセルにおいて20mMリン酸ナトリウムpH6.5への緩衝液変換を行った。その調製物中の最後の不純物を、それを20mMリン酸ナトリウムpH6.5で平衡化されたBlue−セファロースカラムを通すことにより除去した。トランスグルタミナーゼを０から1.0Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配を用いて溶出した。この酵素は、SDS−PAGE及びＮ末端シーケンシングにより判断して純粋であった。この純粋なトランスグルタミナーゼの特異活性は、培養ろ液のそれの90倍であった。
実施例８
ストレプトマイセス・プラテンシスからのCa2+非依存性トランスグルタミナーゼの精製
ストレプトマイセス・プラテンシスを500mlのＨ培地（７ｇ／ｌイーストエキス、10ｇ／ｌグルコース、７ｇ／ｌポリペプトン、30ｇ／ｌ可溶性デンプン、３ｇ／ｌ  NaCl，５ｇ／ｌ  CaCO3，PH7.0）内に接種して24時間、30℃で振とうしながら培養した。結果として生ずる種培養液を８ｌのＨ培地に加え、その後、それを２日間、30℃で振とうしながら培養した。結果として生ずる培養ブイヨンをろ過して5.0ｌの培養ろ液を供した。その培養ろ液中のトランスグルタミナーゼ活性は2.4Ｕ／mlであった。
その培養ろ液を３KDaカットオフのFiltron Minisettc膜を用いて300mlに濃縮した。更に10mM酢酸ナトリウム、pH5.5に対して透析した後、トランスグルタミナーゼを０から0.25Ｍの塩化ナトリウムの直線勾配を用いて溶出した。高特異活性を有する画分を収集して、そのプールを10mM  Tris−HCl，pH9.0に対して透析した。そのプールを５mlアリコートにおいて10mM  Tris−HCl，pH9.0で平衡化された１ml  Mono−Ｑセファロースカラムに適用した。０〜0.25Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配を用いてトランスグルタミナーゼを溶出した。トランスグルタミナーゼ含有画分をプールして10KDaカットオフのDiaflo膜を備えたAmiconセル内で濃縮した。Amiconセルにおいて100mMリン酸ナトリウムへの緩衝液変換を行った。調製物中の最後の不純物を100mMリン酸ナトリウム、pH6.5で平衡化されたセファデックス75カラムを用いるゲルろ過により除去した。その酵素はSDS−PAGE及びＮ末端シーケンシングにより判断して純粋であった。その培養ろ液に対する特異活性は培養ブイヨンのそれの800倍であった。
最適温度は45℃であることが見い出され、最適pHはpH９超であることが見い出された。
実施例９
ストレプトマイセス・プラテンシスからのCa2+非依存性トランスグルタミナーゼの阻害
一般的なトランスグルタミナーゼは遊離Cys−残基の存在に依存すると考えられるので、ストレプトマイセス・プラテンシスからのトランスグルタミナーゼをシステインに対して9倍モル過剰なインヒビター（50mMの存在及び欠損下でインキュベーションした。４つのシステイン反応性化合物：モノ−ヨード酢酸、ZnCl2，HgCl2、及びFeCl3を用いた。サンプルを、活性を測定する前に室温で２時間、インヒビターを有する及び有さないプトレッシンアッセイにおいてインキュベートした。インキュベーションは重複して行った。
モノ−ヨード酢酸、ZnCl2、又はHgCl2と共にインキュベートされたサンプルにおいて、残った活性はなかった。FeCl3でのサンプルにおいて、１％未満の残余活性が見い出された。これはＳ．モバラエンセでのトランスグルタミナーゼでのAndo et al.（Agric.Biol.Chem.53(10),2313〜2317,1989）により得られた結果から異なる。これらの著者は、１mMモノ−ヨード酢酸、１mM  FeCl3及び１mM  ZnCl2での25℃における30分間のトランスグルタミナーゼのプンインキュベーションの後、各々76％，89％及び11％の残余活性を見つけている。これにより、２つのトランスグルタミナーゼの阻害プロファイルは明らかに異なる。
実施例10
ストレプトマイセス・リジクスからのトランスグルタミナーゼの構造的キャラクタリゼーション
トランスグルタミナーゼの構造的キャラクタリゼーションを、小量の高度に精製された酵素（1.5ml；Ａ280＝0.3）に基づいて行った。直接的Ｎ末端アミノ酸シーケンジングのために５分の１を用いた。残った材料を凍結乾燥して、350μｌの６Ｍ塩化グアニジニウム、0.3Ｍ  Tris−HCl，pH8.3中に再び溶かして37℃で一晩、変性させた。その溶液に10μｌの0.1Ｍ DTTを加え、20μｌの0.5Ｍの新しく調製されたICH2COOHを加える前に室温で４時間、インキュベートした。還元され、Ｓ−カルボキシメチル化されたサンプルを平衡化されたNAP ５カラム（Pharmacia）を用いて脱塩し、20mM  NH4HCO3で溶出した。
真空濃縮した後、Ｓ−カルボキシメチル化トランスグルタミナーゼを10μｇのリシン特異的プロテアーゼ（Achromobacter protease I）で37℃で16時間、分解した。結果として生ずるペプチドを0.1％ TFA中80％の２−プロパノールの直線勾配で溶出するVydac Ｃ18カラムによる逆相HPLCを用いて分画した。選択されたペプチド画分を、0.1％ TFA中80％のアセトニトリルの直線勾配で溶出する他のVydec Ｃ18カラムによる逆相HPLCを用いて再精製した。
完全なトランスグルタミナーゼのＮ末端アミノ酸シーケンシング及び精製されたペプチドのシーケンシングを、製造元の説明に従って稼動させたApplied Biosystems 473A protein Sequencerにおいて行った。
得られた配列は次の通りである：
Ｎ−末端配列：
0003720363.tif 000024
ペプチド１：
0003720363.tif 000025
ペプチド２：
0003720363.tif 000026
ペプチド３：
0003720363.tif 000027
ペプチド４：
0003720363.tif 000028
ペプチド５：
0003720363.tif 000029
ペプチド６：
0003720363.tif 000030
ペプチド７：
0003720363.tif 000031
ペプチド８：
0003720363.tif 000032
ペプチド９：
0003720363.tif 000033
ペプチド10：
0003720363.tif 000034
ペプチド11：
0003720363.tif 000035
ペプチド12：
0003720363.tif 000036
ペプチド13：
0003720363.tif 000037
ペプチド14：
0003720363.tif 000038
ペプチド15：
0003720363.tif 000039
ペプチド16：（Ｃ−末端ペプチド）：
0003720363.tif 000040
以下に、ストレプトベルチシリウムからのトランスグルタミナーゼの配列にアラインしたこれらの配列を示す（Kanaji et al.,1994；Washizu et al.,1994；EP−Ａ−0 481 504）。２つの酵素は相同的であるが、ストレプトマイセス・リジクストランスグルタミナーゼから配列決定された残基の22％（279中62）がストレプトベルチシリウムトランスグルタミナーゼにおける対応する残基から異なるように明らかに異なる。見い出された置換の多くが非保存的であることが強調されるべきである。−例えばAsplAla，Pro19Ala，Pro22Ala，Ser23Tyr，Tyr24Gly，Glu28Thr，Thr29Val，Arg49Ile，Lys49Gln，Ser84Phe，Lys95Glu，Ser101Pro，Gly102Asn，Arg105Gln，Gln124Lys，Lys152Thr，Gly157Lys，Asn163Tyr，Pro169Asn，His188Tyr，Arg208Gln，Ser209Arg，Ala226Asp，Pro227Gln，Ala287Pro，His289Asn，Glu300Ala，Asp324Ala，Lys325Glu及びPro331Serである。最初に記載される残基はストレプトベルチシリウムからのトランスグルタミナーゼにおいて見い出されたものであり、第２の残基はストレプトマイセス・リジクスからのトランスグルタミナーゼにおいて見み出されたものである。
ストレプトベルチシリウムトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列に対するストレプトマイセス・リジクストランスグルタミナーゼから得られたペプチド配列のアラインメント：
上側配列：ストレプトマイセス・リジクストランスグルタミナーゼ
下側配列：ストレプトベルチシリウムトランスグルタミナーゼ
相違：配列決定された279残基のうち62
（22％）
差異をアスタリスク（*）でマークする。
0003720363.tif 000041
実施例11
ストレプトマイセス・プラテンシスからのCa2+非依存性トランスグルタミナーゼの構造的キャラクタリゼーション
トランスグルタミナーゼの構造的キャラクタリゼーションを高度に精製された酵素のアリコート（４ml：Ａ280＝0.74）に基づいて行った。その材料を凍結乾燥して、350μｌの６Ｍ塩化グアニジニウム、0.3Ｍ  Tris−HCl，pH8.3中に再び溶かして37℃で一晩、変性させた。その溶液に５μｌの0.1Ｍ DTTを加えて、25μｌの0.5Ｍの新しく調製されたICH2COOHを加える前に室温で４時間、インキュベートした。還元され、Ｓ−カルボキシメチル化されたサンプルを20mM NH4HCO3で平衡化し、溶出されるNAP ５カラム（Pharmacia）を用いて脱塩した。そのサンプルを凍結乾燥して500μｌの20mM NH4HCO3中に溶かした。
Ｓ−カルボキシメチルトランスグルタミナーゼの、200μｌに20μｇのリシン特異的プロテアーゼ（Achromobacter protease I）を加え、37℃で16時間、分解し、他方更に200μｌにシュードモナス・フラジからのAsp−Ｎプロテアーゼ２μｇを加えて37℃で16時間分解した。結果として生ずるペプチドを、0.1％ TFA中80％  ２−プロパノールの直線勾配で溶出するVydac Ｃ18カラムによる逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。選択されたペプチド画分を0.1％ TFA中80％のアセトニトリルの直線勾配で溶出する他のVydac Ｃ18カラムによる逆相HPLCを用いて再精製した。
完全なトランスグルタミナーゼのＮ末端アミノ酸シーケンシング、及び精製されたペプチドのシーケンシングを、製造元の説明に従って、稼動されるApplied Biosystems 473A protein sequencerにおいて行った。
得られた配列は次の通りである：
（Xaaは未同定の残基を示し、AsxはAsp又はAsnのいずれか存在するかが決定され得ない位置を示す）
Ｎ−末端配列：
0003720363.tif 000042
ペプチド１：
0003720363.tif 000043
ペプチド２：
0003720363.tif 000044
ペプチド３：
0003720363.tif 000045
ペプチド４：
0003720363.tif 000046
ペプチド５：
0003720363.tif 000047
ペプチド６：
0003720363.tif 000048
ペプチド７：
0003720363.tif 000049
ペプチド８：
0003720363.tif 000050
ペプチド９：
0003720363.tif 000051
ペプチド10：
0003720363.tif 000052
ペプチド11：
0003720363.tif 000053
ペプチド12：
0003720363.tif 000054
ペプチド13：
0003720363.tif 000055
ペプチド14：
0003720363.tif 000056
ペプチド15：
0003720363.tif 000057
ペプチド16
0003720363.tif 000058
ペプチド17：
0003720363.tif 000059
ペプチド18：
0003720363.tif 000060
ペプチド19：
0003720363.tif 000061
ペプチド20：
0003720363.tif 000062
ペプチド21：
0003720363.tif 000063
ペプチド22：
0003720363.tif 000064
ペプチド23：
0003720363.tif 000065
ペプチド24：
0003720363.tif 000066
ペプチド25：（Ｃ−末端ペプチド）：
0003720363.tif 000067
以下に、ストレプトベルチシリウムからのトランスグルタミナーゼの配列に、組み合わされた配列がアラインされる（Kanaji et al.,1994；Washizu et al.,1994；EP−Ａ−0 481 504）。２つの酵素は相同的であるが、それらは、ストレプトマイセス・プラテンシンストランスグルタミナーゼから配列決定された残基の19％（240のうち46）がストレプトベルチシリウムトランスグルタミナーゼにおける対応する残基から異なるように明らかに異なる。見い出された置換の多くが非保存的であることが強調されるべきである。−例えば、AsplAla，Ser84Phe，Glu115Gly，Glu119Ala，Glu120Phe，Gln124Lus，Asn149His，Lys152Thr，Gly157Lys，Pro169Ser，His188Tyr，Arg208Pro，Ser209Arg，Ala226Asp，Pro227Gln，Ser246Lys，Gly250Pro，Ala287Pro，His289Asx，Glu300Ala，Asp324Ala及びLus325Gluである。最初に示される残基はストレプトベルチシリウムからのトランスグルタミナーゼにおいて見い出されたものであり、第２の残基はストレプトマイセス・プラテンシスからのトランスグルタミナーゼにおいて見い出されたものである。
ストレプトベルチシリウムトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列に対するストレプトマイセス・プラテンシストランスグルタミナーゼから得られた組み合わされたペプチド配列のアライメント：Ｘは未同定の残基を示し、ＢはAsxを示す。
上側配列：ストレプトマイセス・プラテンシストランスグルタミナーゼ
下側配列：ストレプトベルチシリウムトランスグルタミナーゼ
相違：配列決定された240残基のうち46
差異をアスタリスク（*）でマークする。
0003720363.tif 000068
実施例12
ストレプトマイセス・リジクストランスグルタミナーゼ−最適pH及び温度、並びにストレプトマイセス・モバラエンセからのトランスグルタミナーゼとの免疫学的交差反応性
酵素アッセイ：
プトレッシンアッセイ：
主にLorand et al.(1972)に従ってプトレッシンアッセイを行った。
反応混合物は、0.2Ｍ  Tris−HCl，pH7.9又は関連したpHにおける40mM Britton−Robinson緩衝液で１mlにされた50nmolの（14Ｃ）−プトレッシン（4.03GBq／mmol；Amersham）、６mgのα−カゼイン（脱リン酸化、Sigma no.Ｃ−8032）、５μmolのグルタチオン、及び５〜10μｇのTGaseを含んでいる。周囲温度でインキュベーションを行った。各々１及び２時間後、30μｌのアリコートを取り、Whatman 3MMフィルター（Ｄ＝２cm）上にスポットした。そのフィルターを氷冷10％ TCAに浸されたバスケット内に直ちに置き、20分間、洗浄した。最初の洗浄の後、そのフィルターを氷冷５％ TCAで３回洗浄し、氷冷アセトンで２回洗浄した。各々の洗浄ステップにおいて、それはフィルター当り少くとも５mlの洗浄溶液であるべきである。そのフィルターを乾燥させて、８mlのシンチレーション液体（Optiphase，Wallac）を含む計数バイアル内に入れ、Packard Tri−Carl液体シンチレーションスペクトロメーターにおいて放射能を測定した。３回重複して各々の測定を行った。
ヒドロキシメートアッセイ：
主にFolk and Cole(1965)により記載されるようにヒドロキシメートアッセイを行った。
停止剤を等量の15％酢酸、５％ FeCl3、及び2.5Ｎ HClから作った。
反応混合物は、40mM Britton−Robinson緩衝液、pH7.5で１mlにされた５μmolのグルタチオン、100μmolのヒドロキシルアミンクロライド、30μmolのCBZ-Gln-Gly及び0.1mgのTGaseを含んでいる。異なる温度でインキュベーションを行い、等量の停止試薬を加えることにより20分のインキュベーションの後に停止させた。490nmにおける吸収を、UVmax反応速度マイクロプレートリーダーで測定した。
Ｓ．リジクスTGaseのための最適温度をヒドロキシメートアッセイにおいて測定し、最適なのは50℃であることを見い出した。
結果は：
0003720363.tif 000069
Ｓ．リジクスのためのpHプロファイルを、６から９にpHを変化させるプトレッシンアッセイにおいて決定した。最適なのは約pH８であることを見い出した。結果は：
0003720363.tif 000070
Ｓ．リジクスからのTGaseを、ストレプトベルチシリウム・モバラエンセからのTGaseとの免疫学的交差反応性について分析した。ポリクローナル抗体を純粋なＳ．モバラエンセ酵素に対して発生させ、Ouchterlony免疫拡散アッセイを用いて、Ｓ．リジクス及びＳ．モバラエンセからのTGaseの間の交差反応性がないことを見い出した。
実験：
４のウサギを標準的に手順に従ってＳ．モバラエンセからの純粋なTGaseで免疫化した。全ての４のウサギからの抗血清をプールし、推奨される手順に従いPharmaciaからのHiTrap Protein Ｇカラム上で抗体を精製した。その精製された抗体を、抗原としてＳ．モバラエンセ及びＳ．リジクスからの純粋なTGaseを用いるOuchterlony免疫拡散法（0.1Ｍ  Tris−HCl中１％アガロース）に用いた。
実施例13
発酵、及びストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446（先のストレプトマイセス・リバーニ）からのTGaseの産生
磁気共役撹拌駆動装置、pH及び温度制御、並びに固定された速度で炭素ソースを加えるためのぜん動ポンプを備えた２リッター発酵容器内で株を増殖させた。30℃でYPGアガースラント上で３日間、増殖させた後、菌糸体の塊りをYPDブイヨン（２％イーストエキス、１％バクトペプトン、６％グルコース）を既に含む500ml振とうフラスコ内に接種し、250rpm，30℃で24時間、増殖させた。この培養物100mlを用いて以下の組成を有する1.3リッターブイヨンを含む発酵槽に接種した。
イーストエキス，50％：          60ｇ
Amicase：                       30ｇ
MgS2SOO4・7H2O：                ３ｇ
K2SO4：                         ４ｇ
微量金属：                      ３ml
ビタミンＩ：                    1.5ml
ビタミンII：                    1.5ml
Pluronic（消泡剤）：            ３ml
容量を水道水で1.3リッターに調節した。60分間、121℃でのオートクレーブにおける滅菌の前にpHを7.0に調節した。更に、水道水中に250ｇのグルコース、１H2O及び0.25グラムのクエン酸を含む１リッターフラスコ内にグルコース溶液を分離して作った。先に記載のオートクレーブの前に容量を500mlに調節した。
生物量増殖及び酵素生成
先に記載のような培養物の接種の後、グルコース溶液を次の17時間にわたり発酵槽に一定速度（９ｇ／ｈ）で供給した。ぜん動Watson−Marlowポンプを用いた。更に滅菌ろ過した空気を、1.4リッター／分の速度での底のドライブにおいて発酵槽内にまきちらし、この速度を発酵全体にわたり維持した。撹拌速度は開始時に300rpmにセットしたが、溶解された酸素圧シグナル及び10％ DOTの設定値と自動的に関連し、それゆえ17時間後に最大値1100rpmに近づく。グルコース供給速度を14.5グラム／時間に増加させて、次の24時間、それを維持し、グルコースリザーバーを仕上げる。この間、撹拌速度は最大（1150rpm）であり、DOTは０に近い。過剰のグルコースも存在し、これを次の７時間にわたり約0.1％グルコースに減らした。温度を30＋／−0.1℃に制御し、水中の希釈アンモニアを加えることによりpHを7.00＋／−0.05に制御する。
これら48時間の増殖の後、リッター当り45ｇの乾燥重量の生物量を有する培養物を収集し、極めて粘性の菌糸体を500mlの水道水を加えることによりほぼ定量的に除いた。その懸濁液を３日間、冷やして（４℃）保存した。4000rpmで30分間の遠心後上清を除去した。その沈殿を水道水でもとの容量まで希釈して、懸濁して再び45分間、遠心した。２つの上清の酵素濃度をヒドロキサメートアッセイにより決定した。
収量を以下の表に示す：
0003720363.tif 000071
この収量は約180mg／ｌの未希釈ブイヨンに相当する。
これは、ヒドロキサメートアッセイにおける約2.47ユニット／mlほど高くないと報告されるトランスグルタミナーゼの先行技術分野と比較すべきである（US 5,252,469参照のこと）。
微量金属溶液
Conc.HCl                          ５ml
ZnCl2                               3.4ｇ
FeCl3・６H2O                        27ｇ
MnCl2・４H2O                        9.55ｇ
CuSO4・５H2O                        1.1ｇ
CoCl2                               1.29ｇ
H3BO3                               0.31ｇ
(NH4）６Mo7O24・４H2O                0.1ｇ
蒸留水で                            1000ml
ビタミンＩ
ビオチン                            1.25ｇ
チアミン                            20ｇ
Ｄ−パントテレ酸カルシウム          250ｇ
ミオイノシトール                    500ｇ
コリシクロライド                    500ｇ
ピリドキシン                        16ｇ
ナイアシンアミド                    12ｇ
葉酸                                ２ｇ
蒸留水で                            10ｌ
ビタミンII
リボフラビン                        ４ｇ
蒸留水で                            10ｌ
実施例14
Na−カゼイネート溶液における粘度増加
９％蛋白質を含むNa−カゼイネート（Miprodan 30，MD Foods，Denmark）の溶液を調製した。pHをNaOHを用いて7.0に調節した。
Sofraser MIVI 2000粘度計を用いて粘度を測定した。酵素添加なしで測定する時０mVに設定値をmVでセットして粘度の読み取りを与える。
実験は２つのトランスグルタミナーゼを比較した：
１．デキストリン24％、乳酸カルシウム75％及び酵素１％で製剤化された市販のトランスグルタミナーゼ（Ajinomoto TG−Ｋ）。
２．ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446（先のストレプトマイセス・リバーニ）発酵からの凍結乾燥酵素調製物。
EP 0379606 A1に記載されるようなヒドロキサメートアッセイにより両酵素の活性を測定する。これに基づいて、両酵素のための投与量は５ml基質溶液のために0.36mg酵素であった。
実験は、50℃及び55℃で各々２回行い、その結果を以下の表に示す。
50℃で測定（mV）：
0003720363.tif 000072
55℃で測定（mV）：
0003720363.tif 000073
両酵素は、50℃及び55℃で活性を示す。その結果は、ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446（先のストレプトマイセス・リバーニ）トランスグルタミナーゼの活性がTG−Ｋトランスグルタミナーゼに比較して55℃においてより高いことを示し、ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446（先のストレプトマイセス・リバーニ）酵素についてより高い最適温度及び／又はより高い熱安定性を示した。
実施例15
ストレプトマイセス・リジクスからのトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子
材料及び方法
ドナー生物：
ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446からDNAを単離した。用いた宿主は大腸菌SJ２（Diderichsen,B.et al.,(1990)）である。
プラスミド・ジーンバンクベクターは引用により本明細書に組み込まれるWO91/19454に更に開示されるpSJ1678である。クローニングベクターはpPL1759である。
ストレプトマイセス・リジクス、NRRL B−3446から染色体DNAを制限酵素Sau３A1で部分的に消化した。そのフラグメントをクローニングベクターpSJ678のBamHＩ部位内にクローンし（例えば図１及びWO95/01425）、大腸菌SJ２（Diderichsen,B.et al.,(1990)）内に形質転換し、それによりＳ．リジクスの遺伝子ライブラリーを形成した。
Ｓ．リジクストランスグルタミナーゼ蛋白質を配列決定することにより作られた蛋白質配列かに２つのPCRプライマーを予想した。PstＩ部位及び予想される５’末端の30塩基を含むプライマー（プライマー7854）、並びに制限酵素HindIII制限配列及びＳ．リジクスからの成熟トランスグルタミナーゼの予想されるトランスグルタミナーゼ３’配列（プライマー7855）に相補的な30塩基を含むプライマーを調製した。
0003720363.tif 000074
Ｓ．リジクスからの２〜４mgの染色体DNAを、プライマー7854及び7855並びにSuper Taq DNAポリメラーゼを用いて、製造元の説明に従って、PCR反応（20サイクル）においてテンプレートとして用いた(Super TaqTM DNAポリメラーゼ／PCR緩衝液、HT,BIOTECHNOLOGY LTD)。
Ｓ．リジクスからのトランスグルタミナーゼの予想されるサイズに相当するPCRフラグメントをアガロースゲルから回収し、制御酵素HindIII及びPstＩで消化した。
プラスミドpPL1759（図２及びHansen,C.(1992)を参照のこと）を制限酵素PstＩ−HindIIIで消化し、その大きなベクターフラグメントをPCRフラグメントに連結した。連結混合物をバチルス・サブチリスDN1885（P.L.Jprgensen et al.,(1991)）内に形質転換した。
形質転換体についての選択及びこれらの再単離を10μｇカナマイシン／mlを有するLBPG培地上で行った。DNAシークエンシングキット(SEQUENASETM(United States Biochemicals))を用いるこれらのクローンからのプラスミドのDNA分析は、翻訳され、Ｓ．リジクスの部分的に配列決定されたトランスグルタミナーゼ蛋白質と比較した時、成熟トランスグルタミナーゼコーディング領域の予想される配列（配列番号：１）を示した。このプラスミドをpJA243と呼ぶ、このプラスミドを有するＢ．サブチリス  DN1885株をJA243と呼ぶ。pJA243のプラスミドマップを図３に示す。
pJA243のPstＩ−HindIIIフラグメントを、製造元により記載されるようなTranslation KitTM（Amershamからのコード番号5500）を用いて放射能標識プローブを作製するためのテンプレートとして用いた。この放射能プローブをＳ．リジクスのジーンバンクへのコロニーハイブリダイゼーションのために用いた。ネイティブトランスグルタミナーゼ遺伝子を見つけるために、陽性クローンを単離した。このバクテリアはプラスミドpSJ1678内に挿入されたフラグメントを含んでいる。クローンされたDNAは、正確なサイズのフラグメントを与えるプライマー7854及び7855で増幅され得る。そのクローンはJA260と示され、DSM10175（大腸菌；として1995年８月23日にブタベスト条約下で寄託された。
実施例16
PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）でのバクテリアのTGaseの阻害
異なるバクテリアの株からのTGaseがPMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）に対して感受性があるか否かを研究するためにプトレッシン対照アッセイを行った。Ｓ．リジクス及びＳ．モバラエンセからの精製されたトランスグルタミナーゼがPMSFに対して感受性がないことが分かった。
最適条件（実施例１〜３を参照のこと）、即ち30℃，pH8.5での１時間のインキュベーション（100ml改良型Britton−Robinson−緩衝液0.1Ｍ，pH8.5中２％α−カゼイン＋EDTA）下でアッセイを行った。PMSFの最終濃度は1.6mMであった。対照として、プロパノールを含むアッセイが含まれる：プロパノールはPMSFの溶媒である。このアッセイは溶媒効果が排除されることを確かにする。このアッセイは、0.9Ｍの２−プロパノール（２−プロパノール中８μｌのPMSFのかわりの13Ｍからの８μｌプロパノールの添加）、即ちPMSF含有アッセイと同じ濃度を含む。
結果：
0003720363.tif 000075
Ｓ．リジクスを除く研究された全ての株のTGase活性は、PMSFの添加により阻害された：バチルス・バジウス、バチルス・フィルムス、バチルス・マイコイデス、バチルス・アネウリノリチクス、株Moo5A10、バクテリジウム（DSM10093）及びバクテリジウム（CBS 495.74）。
この結果は、ストレプトマイセス・リジクス及び周知の微生物のトランスグルタミナーゼからのTGaseに対照的である。この結果は、先に列記されるPMSF−センシティブTGaseがストレプトマイセスからのTGase及び（因子ＸIIIを含む）全ての他の周知のTGaseより異なる触媒活性部位を有することを意味する。
実施例17
バクテリアのTGaseでのスキムミルクのゲル化
実験：
150μｌのスキムミルク溶液（15及び20％）及び50μｌの上清（即ち異なるTGase活性）をサーモスタット振とう器上で700rpmで振とうしながらエッペンドルフチューブ内で30℃でインキュベートした。
時間ごとに、そして一晩のインキュベーション（約18時間）の後にアッセイを視覚的に制御した。
用いたサンプルを（Ca2+イオンを除去するために）セントリコン処理した：対応するサンプル（１ml）を10KDaセントリコン（Centricon）チューブ内で濃縮し（ろ液にTGase活性はない）、Ca2+のないTris緩衝液(0.1Ｍ，pH7.5）で１mlに再懸濁し、再び遠心して、その保留物を0.25mlのトリス緩衝液で再懸濁することにより濃縮した。
対照：用いられた培地のいくつかは高濃度のCa2+（培地Ｈ：34mM；培地Ｋ及びＱ：3.4mM；培地Ｌ：13.6mM）を含むので、Ca2+依存（TGase依存）効果をチェックするために対照を用いた。その培地はセントリコンチューブでのサンプルについて記載されるように処理した。
結果：
研究された全ての株は15及び／又は20％スキムミルクのゲル化を示した：
バクテリジウム（２株）、バチルス・フィルムス、バチルス・マイコイデス、バチルス・バジウム、バチルス・アネウリノリチクス、株Moo5A10及びロチア・デントカリオーサ。バチルス・マイコイデス及びバチルス・アネウリノリチクスは60分のインキュベーションの後に明確な効果を示し、他の全ては一晩のインキュベーションの後、明確になった。
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配列表
（２）配列番号：１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：993塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：DNA（ゲノム）
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ストレプトマイセス・リジクス
（Streptonyces lydicus）
（Ｃ）単離クローン名：NRRL B−3446
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：CDS
（Ｂ）存在位置：1..993
（ｘ）配列の記載：配列番号：１：
0003720363.tif 000078
0003720363.tif 000079
0003720363.tif 000080
（２）配列番号：２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：331アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0003720363.tif 000081
0003720363.tif 000082
【図１】
0003720363.tif 000083
【図２】
0003720363.tif 000084
【図３】
0003720363.tif 000085