(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を発現しうる組換発現ベクターにより形質転換された形質転換体をプロテアーゼ・インヒビターの存在下に培養し、該培養物から、以下１）の精製工程により得る、以下２）の特徴を有する１本鎖の組換ヒト成熟肝実質細胞増殖因子の製造方法。
１）精製工程
(a)陽イオン交換クロマトグラフィー
S-セファロースＦＦカラムを緩衝液（50mM Tris-HCl(pH8.5)、150mM NaCl、1mM PMSF、0.01%Tween80）で平衡化後、培養上清を充填し、カラムを同緩衝液で洗浄する。更に、緩衝液（50mM Tris-HCl(pH8.5)、400mM NaCl、1mM PMSF、0.01%Tween80）で洗浄する。次いで、緩衝液（50mM Tris-HCl(pH8.5)、1M NaCl、1mM PMSF、0.01%Tween80）を流下させて、１本鎖の成熟肝実質細胞増殖因子（HGF）含有画分を分取する。
(b)ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラムを緩衝液（10mM Tris-HCl(pH7.5)、0.3M NaCl、1mM PMSF、0.01%Tween80）で平衡化後、上記(a)のHGF含有画分を充填し、同緩衝液で洗浄する。その後、当該緩衝液中のNaClを0.3Mから2.0M直線濃度勾配で溶出し、１本鎖ＨＧＦ含有画分を分取する。
(c)疎水性クロマトグラフィー
フェニル５ＰWカラムを緩衝液（20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、4M NaCl）で平衡化後、上記(b)のHGF含有画分を充填し、同緩衝液で洗浄する。その後、上記緩衝液に別の緩衝液（20mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、50％エチレングリコール）を加えて連続的に混合比を変化させて溶出し、１本鎖ＨＧＦ含有画分を分取し、得られた画分を用いて、上記と同様な操作により目的とする純度の１本鎖ＨＧＦが得られるまで精製を繰り返す。
２）特性
(a)ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドの、実質的に１本鎖ポリペプチドのみからなり、
(b)ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が、非還元条件下で８２，０００±５，０００ダルトンであり、還元条件下で９２，０００±５，０００ダルトンであり、
(c)Leu-Arg-Val-Val-Asn-Gly-Ileの連続した７アミノ酸を含有する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規な物理化学的形態を有する成熟肝実質細胞増殖因子ＩＩ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ；ＨＧＦ（ＩＩ）と略す）に関するものであり、詳しくは成熟肝実質細胞の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）  での培養を可能ならしめる生理活性を有するペプチド因子に係わる。本発明のＨＧＦ（ＩＩ）は肝実質細胞や肝臓の生物学的研究のための研究用試薬として、さらには肝再生促進試薬、慢性肝炎治療薬、肝硬変治療薬といった肝臓に対する医薬品としての使用が期待される。またＨＧＦ（ＩＩ）は肝細胞に対する生理作用以外に内皮細胞や上皮細胞に対しても増殖促進作用を有しており、また癌細胞や腫瘍細胞の増殖抑制作用や細胞障害作用をも有している。このことから本発明のＨＧＦ（ＩＩ）は創傷治療薬や制癌剤としての利用も期待される。
【０００２】
【従来技術】
肝臓は多種多様な機能を有し、生体の恒常性維持に欠くべきからざる重要な役割を担っている臓器である。肝臓の主な機能として多種の血漿タンパク質の合成分泌、糖新生やグリコーゲン代謝による血糖調節、尿素合成、胆汁分泌、各種薬物に対する代謝、解毒などがある。そして該肝臓の機能は肝臓を構成する成熟肝実質細胞が    夫々担っていることが知られている。また、肝臓の大きな特徴として、その驚くべき再生能を挙げることができる。例えば、ラットの肝臓の３分の２を切除しても、約１週間から１０日でその大きさに戻ることが知られている。この肝臓の再生機能が未知の体液性の因子（肝再生因子：ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）  によって担われていることが推察されていたが、その本体については長らく明らかにされていなかった。
【０００３】
本発明者らは初代肝細胞培養法がこの肝再生因子を研究する上で、有効な手段であることを見出し、該培養系を用い、血清に含まれる特定のタンパク質成分の存在下において、肝実質細胞を増殖し得ることに初めて成功し、該特定の血清成分を分離し、成熟肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）と名付けた［Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １２２  （Ｎｏ．３），  １４５０，  １９８４，    特開昭６０−４５５３４号）］。更に本発明者らは、哺乳類動物の血小板のトロンビン刺激上清液よりＨＧＦを精製することに成功し［ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲ，  ２２４  （Ｎｏ．２），  ３１１  （１９８７）］  、その諸性質を明らかにした。
【０００４】
ＨＧＦはゲル濾過での推定分子量が約１５万ダルトンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは非還元条件下で約８万２千ダルトン、還元条件下で約６万〜６万５千ダルトンのα鎖と約３万〜３万５千ダルトンのβ鎖の２本のバンドに分かれる。即ち、ＨＧＦはα鎖とβ鎖の２種のポリペプチドがジスルフィド結合で連結されたヘテロダイマータンパク質である。またＨＧＦは熱および酸に対して不安定であり、ヘパリンセファロースに強い親和性を有するタンパク質であるこも明らかにした。
【０００５】
本発明者らは、更に研究を重ねた結果、トロンビン刺激血小板上清中や血漿中以外に哺乳動物の血小板な白血球などの血球細胞や、肝臓、腎臓、肺臓、胎盤、脳、脾臓など種々の生体組織ホモジネート中にも、成熟肝細胞を生体外において極めて良好に活性を有する物質が存在することを見出した。該物質を精製、単離すべく種々検討を行ったところ、上記生体組織中に含まれる成熟肝細胞の増殖活性を有する物質には２種のポリペプチド鎖から成るヘテロダイマータンパクと還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥでも単一バンドを示すモノマータンパクの２種類のものが存在することを明らかにした。そして該ヘテロダイマータンパク〔（ＨＧＦ（Ｉ）と名付けた）〕を単一にまで精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をはじめ、諸性質を明らかにした（特開平２−２８８８９９号）。
さらに得られたβ鎖のアミノ酸配列に基づき、ＨＧＦ（Ｉ）の遺伝子クローニングを行い、ラットの肝臓からラットＨＧＦのｃＤＮＡのクローニングに成功し［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７，  ３２００  （１９８９）］  、更にヒト肝臓由来ＨＧＦｃＤＮＡ［Ｎａｔｕｒｅ，  ３４２，  （６２４８），  ４４０  （１９８９）］  及びヒト白血球由来ＨＧＦｃＤＮＡ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕ．，  １７２（１），  ３２１  （１９９０）］  のクローニングを行い、ＨＧＦ（Ｉ）の全構造を明らかにした。
【０００６】
一方、還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも単一バンドを示すモノマータンパク質（ＨＧＦ（ＩＩ）と名付けた）についてはＨＧＦ（Ｉ）の混入が見られ、ＨＧＦ（ＩＩ）のみを単離することが出来ず、該モノマータンパク質であるＨＧＦ（ＩＩ）本体は全く不明であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的はＨＧＦ（ＩＩ）、その製造方法およびＨＧＦ（ＩＩ）を含む組成物を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、引き続きＨＧＦ（ＩＩ）を単離すべく、鋭意研究を重ねた結果、該ＨＧＦ（ＩＩ）を単一に精製することに成功し、その化学的構造を解析すると共に、生物学的機能を明らかにして、その本体を明らかにすることに成功し、本発明を完成させるに到った。
【０００９】
本発明は、成熟肝実質細胞を生体外で増殖させる活性を有する、熱に不安定な、かつヘパリン・セファロースに高い親和性を有するタンパク質であり、下記の構成よりなるものである。すなわち本発明は、下記の理化学的性質を有する一本鎖ポリペプチドから成る成熟肝実質細胞増殖因子、少なくとも該増殖因子を含有する組成物、及びその製造法に係わる。
（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドの、実質的に１本鎖ポリペプチドのみからなる。
（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が、非還元条件下で８２，０００±５，０００ダルトンであり、還元条件下で９２，０００±５，０００ダルトンである。
（ｃ）Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅの連続した７アミノ酸を含有する。
【００１０】
ＨＧＦの従来の調製方法は、血小板のトロンビン刺激上清液や劇症肝炎患者血液を出発物質として、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製して得られていた［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，  ２２４（２），  ３１１（１９８７），及びＪ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ８，  ４１４  （１９８８）  参照のこと］  。上記方法により得られたＨＧＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで非還元条件下で分子量７６，０００〜９２，０００ダルトンの単一バンドとして移動し、また還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量５６，０００〜６９，０００および３２，０００〜３５，０００ダルトンの２本のバンドに分かれて移動することにより、２種のポリペプタイドより成るヘテロダイマータンパク質であると考えられてきた。
【００１１】
一方、本発明者らは、血小板や白血球といった血球細胞、肝臓、腎臓、肺臓、脾臓、胎盤など広く生体組織にＨＧＦ活性物質が含まれていることを見出した。これらの生体組織のホモジネートからイオン交換クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを組み合わせた方法で精製し、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで約８２，０００ダルトンの単一バンドを示すＨＧＦ活性物質を得た。このＨＧＦ活性物質は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約９２，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン及び約３２，０００ダルトンの３本のバンドとして移動することが示された。この結果は血小板をはじめとする種々の生体組織ホモジネートに由来するＨＧＦ活性物質はヘテロダイマータンパク質（ＨＧＦ（Ｉ）と名付けた）とモノマータンパク質（ＨＧＦ（ＩＩ）と名付けた）の２成分が含まれていること示すものである。
【００１２】
本発明者らはＨＧＦ（ＩＩ）のＨＧＦ（Ｉ）からの分離方法について種々の検討を行い、ついにＨＧＦ（ＩＩ）を均一に精製することに成功し、ＨＧＦ（ＩＩ）の本体を明らかにした。更に、本発明者らはＨＧＦ遺伝子を導入した組換え細胞を作製し、該組換え細胞をプロテインインヒビターを添加した無血清培地で培養し、細胞外にＨＧＦ（ＩＩ）が分泌されること、その培養液からイオン交換クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどを組み合わせた方法により、均質なＨＧＦ（ＩＩ）を高い収率で単離し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
上記のように産生された本発明に係わるＨＧＦ（ＩＩ）は肝細胞の増殖活性を有する一本鎖のポリペプチドタンパク質であることで特徴づけられている。
【００１４】
以下に本発明のＨＧＦ（ＩＩ）の製造方法につき詳述する。本発明ＨＧＦ（ＩＩ）は、例えば哺乳動物の血球細胞や肝臓、肺臓、腎臓、脾臓、胎盤などの生体組織のホモジネートより、効率よく単離することができる。また特に遺伝子組換え技術によりＨＧＦ遺伝子が導入された細胞や、ＨＧＦを分泌する細胞株をプロテアーゼ阻害剤存在下で培養した培養物より効率よく、しかも高収率で得ることができる。ここで原料として用いられる哺乳動物組織や遺伝子組換え細胞や細胞株は特に限定はなく、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、サルなどに由来するものであれば、いずれも使用することができる。
【００１５】
本発明ＨＧＦ（ＩＩ）は上記生体組織のホモジネートまたはアプロチニンやセトラキセート等のプロテアーゼ阻害剤が添加された培養物より精製することにより、ＨＧＦ（Ｉ）とともに得られる。ＨＧＦ（Ｉ）及びＨＧＦ（ＩＩ）の精製は、該ＨＧＦ（Ｉ）及び（ＩＩ）の物理的、化学的、免疫学的性質を利用して各種分離手段の組合せにより実施することができる。特に好ましい精製手段の例としては塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、免疫抗体クロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフィー、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、更には電気泳動法、限外濾過法や透析法などを組み合わせた手法を例示出来る。
【００１６】
塩析には硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩を使用することができる。また、イオン交換クロマトグラフィーに用いられる担体としてはタンパク質の分離に用いられている通常の各種イオン交換クロマトグラフィー用の担体をいずれも用いられることができる。その具体例としては、ＣＭ−セルロース、ＣＭ−セファデックス、ＣＭ−トヨパール、Ｐ−セルロース、ＳＰ−トヨパール、モノＳ、Ｓ−セファロースＦＦなどの陽イオン交換樹脂や、ＤＥＡＥ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファデックス、モノＱ、Ｑ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−トヨパール、ＱＡＥ−トヨパールなどの陰イオン交換樹脂が例示される。色素アフィニティークロマトグラフィーの具体例としては、アフィゲルブルーやブルートリスアクリルＭが、レクチンアフィニティークロマトグラフィーの具体例としては、ＣｏｎＡセファロースが、吸着クロマトグラフィーの具体例としては、ヒドロキシアパタイトやＨＡ−ウルトロゲルが、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーの具体例としては、キレーティングセファロースＣＬ６ＢＦＦやＴＳＫゲルＡＦキレート・トヨパールが、疎水性クロマトグラフィーの具体例としては、フェニル５ＰＷ、フェニルトヨパール、ブチル・セファロース、ブチル・トヨパール、エーテルトヨパールが例示される。
【００１７】
【作用・効果】
本発明のＨＧＦ（ＩＩ）は外科手術による部分肝摘切後の肝再生促進薬ならにびに急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変への移行、劇症肝炎などの肝疾患の治療薬として、また制癌剤や創傷治療薬などの医薬品として、また上記各疾患の診断薬として有用である。更にＨＧＦ（ＩＩ）の利用により、ヒトをはじめとして各種動物由来の肝細胞を該ＨＧＦ（ＩＩ）存在下に生体外で極めて容易に増殖維持することが出来、かくして増殖維持される肝細胞は、人工肝臓への応用や肝機能などの基礎研究用に、また各種ホルモン、ペプタイド、もしくは各種薬剤等の肝細胞に対する作用の研究用に、肝疾患などのスクリーニング試験用に、さらに発癌試験用及び肝炎ウィルスの生体外培養における宿主細胞としての極めて有用である。
【００１８】
本発明のＨＧＦ（ＩＩ）は、熱に対して不安定であるから、通常安定化剤としてＴｗｅｅｎ  ８０などの界面活性剤、マンニトール、ソルビトール、ヘパリン、グルコサミノグルカンなどの糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、エチレングリコールなどのアルコール類、グリシン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸などのアミノ酸類、および血清アルブミンなどのタンパク質のうち１種ないしは２種以上を組み合わせて配合することが好ましい。
【００１９】
本発明のＨＧＦ（ＩＩ）を上記の如き医薬品とする場合には、ＨＧＦ（ＩＩ）自体または自体既知の担体とともに凍結乾燥品または注射剤に製剤化され、非経口的に投与される。
【００２０】
【実施例】
以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
参考例１
（ＨＧＦ活性の測定その１）：  ［Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．，  ８０，  ７２２９−７２３３  （１９８３）］
ウィスター系雄ラット（１８０−２００ｇ）を用い、ｉｎ  ｓｉｔｕ  コラーゲン潅流法［Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （ＴＯＫＹＯ）  ８４，  ９３７−９４６  （１９７８），      中村敏一，  初代培養肝細胞実験法，  学会出版センター  ｐｐ  ５−５３  （１９８７）］により肝実質細胞を分離、精製した。得られたラット肝実質細胞を５％ウシ血清、２×１０−９Ｍ  インスリンおよび２×１０−９Ｍ  デキサメサゾンを添加したウィリアムＥ培地（フローラボラトリー社）に懸濁し、２４ウェルマルチプレートに１．２５×１０５  個／ウェルの濃度で播いた。５％ＣＯ２  及び３０％Ｏ２  および６５％Ｎ２  の存在下、３７℃で２０時間培養後、０．１  μｇ／ｍｌのアプロチニンを添加したウィリアムスＥ培地に交換すると同時に所定量の被試料を添加した。１５時間後、１５μＣｉ／ｍｌ  の１２５  Ｉデオキシウリジン１０μｌ／ウェルを添加した。コントロール群には、１２５  Ｉデオキシウリジン添加の１５分前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリンを添加した。さらに６時間培養した１２５  Ｉでラベルした。細胞をｐＨ７．４  のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞を１ウェル当たり０．５ｍｌ  の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化し、その放射能をガンマカウンターにより測定した。また放射能測定後の試料の１部をとってローリー法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９３，  ２６５，  １９５１）に従いタンパク量を測定した。被験試料を添加したときの肝実質細胞に取り込まれた１２５  Ｉの量をコントロールとのカウントの差として求め、これをラット肝実質細胞蛋白質１ｍｇ  当たりに換算して、ＤＮＡ合成活性（ｃｐｍ／ｍｇ  蛋白質）  とした。被験試料のＨＧＦ活性は、同一試験において上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌ  を用いた時の肝実質細胞のＤＮＡ合成活性の５０％に相当する活性を１  単位と定義して表示した。
【００２２】
実施例１
▲１▼  肝抽出液の調製
ラット（系統ＳＤ；体重２００  〜３００ｇ）１００匹の腹腔内にサラダ油に溶解した２０％四塩化炭素溶液を１０ｍｌ／ｋｇ  投与し（四塩化炭素として２ｍｌ／ｋｇ投与）  、３０時間後に肝臓を摘出した。摘出した肝臓は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ  、１ｍＭ    モノヨード酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  を含む緩衝液Ａ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）  、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０］４リットル中でワーリングブレンダーで破砕した。破砕後、冷却遠心機（日立２０ＰＲ−５２）で１０，０００回転／分の遠心を行い沈澱物を除いた。上澄を濾紙で濾過し、濾液を肝抽出液として得た。
【００２３】
▲２▼  陽イオン交換クロマトグラフィー
肝抽出液約４リットルを約４倍容の０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに２時間以上を３回透析した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで平衡化したＳ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）のカラム（サイズ、内径１１．３ｃｍ×高さ１０ｃｍ）  に添加した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄後、０．１５Ｍ  から１．０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配（全量６ｌ）により溶出した。溶出画分を参考例１に示した方法によりＨＧＦ活性を測定し、活性画分を集めＳ−セファロースＦＦ溶出液とした。図１にその溶出パターンを示す。
【００２４】
▲３▼  色素アフィニティークロマトグラフィー
Ｓ−セファロースＦＦ溶出液を１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７．５  に調整後、同量の０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０  を含む蒸留水で希釈し、緩衝液Ｂ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）  、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０］で平衡化したＢｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ    カラム（ＩＢＦ社製、カラムサイズ：内径２．６ｃｍ  ×高さ１３．５ｃｍ）  に添加した。緩衝液Ｂで洗浄後、０から０．５Ｍのアルギニンの直線濃度勾配（全量３５０ｍｌ）により溶出した。溶出パターンを図２に示す。ＨＧＦ活性の高い画分を集めＢｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ溶出液とした。
【００２５】
▲４▼    ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ溶出液を９倍容の緩衝液Ｃ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）  、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０］で希釈した後、０．３Ｍ  ＮａＣｌ  を含む緩衝液Ｃで平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ  カラム（ファルマシア社製、カラムサイズ：内径１．６ｃｍ  ×高さ７ｃｍ）  に添加した。０．３Ｍ  ＮａＣｌ  を含む緩衝液Ｃで洗浄後、０．３Ｍから２．０Ｍ  ＮａＣｌ  直線濃度勾配（全量１５０ｍｌ）により溶出した。溶出パターンを図３に示す。ＨＧＦ活性の高い画分を集めヘパリン・セファロース溶出液とした。
【００２６】
▲５▼  疎水性クロマトグラフィー
溶媒Ａ［２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４Ｍ  ＮａＣｌ］と溶媒Ｂ［２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５０％  エチレングリコール］  の２：１混液により平衡化されたフェニル５ＰＷ  カラム（東ソー社製、カラムサイズ：内径７．５ｍｍ  ×高さ７．５ｃｍ）にヘパリン・セファロース溶出液を添加した。溶出は溶媒ＡとＢの組成比を２：１から０：１に連続的に変えることにより行った。その溶出パターンを図４に示す。４５分前後に溶出したＨＧＦ活性を示す画分は均質なＨＧＦ（Ｉ）であり、８５分前後に溶出したＨＧＦ活性画分はＨＧＦ（ＩＩ）を含む画分であった。しかし図６に示す様に還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、このＨＧＦ（ＩＩ）画分には依然としてＨＧＦ（Ｉ）の混入が認められた。
ＨＧＦ（ＩＩ）画分を集めるため、▲１▼から▲５▼の操作を繰り返し（▲５▼の疎水性クロマトグラフィーについては、溶出条件を変更した）、総計約５００  匹のラット肝臓より、ＨＧＦ（ＩＩ）画分を集めた。
【００２７】
▲６▼  疎水性クロマトグラフィーの繰り返し
溶媒Ａにより平衡化したフェニル５ＰＷカラム（東ソー社製、カラムサイズ：内径７．５ｍｍ  ×高さ７．５ｃｍ）に▲５▼の項で集めたＨＧＦ（ＩＩ）画分に２倍量の溶媒Ａを加えた溶液を添加した。溶媒Ａを流し、カラム洗浄後、溶媒ＡとＢとの組成比を１：０から０：１に連続的に変えることにより、溶出操作を行った。その溶出パターンを図５に示す。ＨＧＦ（ＩＩ）の画分中に含まれるＨＧＦ（Ｉ）が最初に、次いでＨＧＦ（ＩＩ）が溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＨＧＦ（Ｉ）の混入のないフラクションを求め、ＨＧＦ（ＩＩ）のみを含むフラクションを集めた。得られた精製ＨＧＦ（ＩＩ）は９５μｇ  であった。
【００２８】
▲７▼  ＨＧＦ（ＩＩ）の理化学的性質の解析
（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
▲５▼の項および▲６▼の項で得られたＨＧＦ（ＩＩ）についてＬａｅｍｍｌｉの方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。その結果を図６に示す。▲６▼の項で得られたＨＧＦ（ＩＩ）は非還元下では分子量８２，０００±５，０００ダルトンを示し、還元下条件下でも分子量９２，０００±５，０００ダルトンの一本のバンドのみを示し、ＨＧＦ（ＩＩ）が一本のポリペプチド鎖から成るタンパクであることが示された。１ウェル当たりのタンパク添加量は約２００ｎｇであり、染色は銀染色法（和光純薬製）によって行った。
【００２９】
（ｉｉ）  生理活性測定
▲６▼の項で均質にまでに精製されたＨＧＦ（ＩＩ）と▲５▼の項で得られたＨＧＦ（Ｉ）とを用いて、参考例１に示した方法に従って、それぞれラット初代培養肝細胞増殖促進活性を測定した。均質なＨＧＦ（ＩＩ）の活性は３５万±１０万ユニット／ｍｇ  であり、▲５▼の項で得られたＨＧＦ（Ｉ）の活性は（３０  万±１０万ユニット／ｍｇ）と同等の肝細胞増殖促進活性を示した。尚、タンパク量は２１４ｎｍ  での吸光度が１４Ｏ．Ｄ．のとき、タンパク濃度は１ｍｇ／ｍｌとして算出した。
【００３０】
（ｉｉｉ）    部分アミノ配列
▲６▼の項で精製されたＨＧＦ（ＩＩ）を蒸発乾固後、５Ｍ塩酸グアニジンと０．２  ％ＥＤＴＡを含む１Ｍトリス・塩酸（ｐＨ８．１）緩衝液を加え再溶解した。窒素ガスで溶存酸素をとばした後、２−メルカプトエタノール５０℃、１５時間還元した。還元後、モノヨード酢酸を等量添加し、室温で１時間反応させ、システイン残基をカルボキシメチル化した。反応液を逆相ＨＰＬＣ［  μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μ  Ｃ４−３００Ａ，  ３．９ｍｍ  ×１５ｃｍ（ウォーターズ社）］により脱塩した。溶出は０．１  ％ＴＦＡを含む水から０．１  ％ＴＦＡを含む２０％水−８０％〔アセトニトリル：イソプロパノール（１：１）〕混液までの連続濃度勾配によって行った。以上の様にして還元−カルボキシメチル化ＨＧＦ（ＩＩ）を得た。その一部をとり、減圧乾固後、得られた還元−カルボキシメチル化ＨＧＦ（ＩＩ）を２００  μｌ  の０．１Ｍ    トリス塩酸緩衝液（  ｐＨ９．５）に再溶解し、アクロモバクター・リティカスのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬）を１μｇ加え、３７℃、５時間反応させ、ＨＧＦ（ＩＩ）の部分消化物を得た。この部分消化物を逆相ＨＰＬＣ［  μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μ  Ｃ１８−３００Ａ  （ウォーターズ社）］にかけ、ペプタイドマッピングを行った。溶出は０．１  ％ＴＦＡを含む水から０．１  ％ＴＦＡを含む２０％水−８０％〔アセトニトリル：イソプロパノール（１：１）〕混液までの連続濃度勾配によって行った。得られたＨＧＦ（ＩＩ）のペプタイドマップを図７に示す。
次に図７のペプタイドフラグメントを分取し、そのアミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム社４７７Ａ）を用いて解析した。得られたペプタイドフラグメントのアミノ酸配列はＨＧＦ（Ｉ）のｃＤＮＡ配列から推測されるアミノ酸配列［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７，  ３２００  （１９８９）］  と一致するものでった。即ちＨＧＦ（ＩＩ）はＨＧＦ（Ｉ）の前駆体である一本鎖タンパク質であることが示された。特に図７の＊印のペプタイドのアミノ酸配列は、Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−であり、ＨＧＦ（Ｉ）のα鎖とβ鎖の切断部位（Ａｒｇ−Ｖａｌ  間）  を含むペプタイドであった。このペプタイドが得られることはＨＧＦ（Ｉ）がα鎖とβ鎖に切断される前のタンパク質がＨＧＦ（ＩＩ）であることを明確に示している。
以上の結果からＨＧＦの生成機構として、まずＨＧＦのｍＲＮＡが翻訳され、プレＨＧＦタンパクが作られ、次いで分泌シグナルが切断され、一本鎖のＨＧＦ（ＩＩ）となり、小胞体に貯えられる。ＨＧＦ（ＩＩ）は小胞体内もしくは細胞外で、プロテアーゼの作用により２本鎖に切断されＨＧＦ（Ｉ）になる機構が推定される。一本鎖ＨＧＦが天然の組織中に存在し、かつ生物活性を保持していることが本発明により初めて明らかにされた。
【００３１】
実施例２
遺伝子組換え法によるＨＧＦ（ＩＩ）
ヒト白血球由来ＨＧＦのｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドｐＥＶＳＳＶ（ｄＬｅＨＧＦ、微工研条寄第２９００号）をＷｉｇｌｅｒらの方法によりＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯｄｈｆｒ−  ）  細胞に導入し、形質転換させた。即ち、３０μｇ  のｐＥＶＳＳＶ（ｄＬｅＨＧＦ）  プラスミドを２４０  μｌ  の０．５Ｍ    塩化カルシウム液に溶解し、２×ＨＥＰＥＳ緩衝液［２８０ｍＭ  ＮａＣｌ  と１．５ｍＭ  リン酸ナトリウムを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ７．１）］  の等容量を攪拌しながら加えた。室温で３０分間攪拌し、プラスミドＤＮＡとリン酸カルシウムの共沈澱を形成させた。１０％ウシ胎児血清と１  ％グルタミンとを含むα−ＭＥＭ培地で３７℃、２４時間培養した。ＣＨＯｄｈｆｒ−  細胞に前記共沈澱物を加え、室温で２０分間放置した。さらに３７℃、４  時間培養した後、培地を除去し、１．５  ％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え５分間室温で放置した。１０％の透析胎児血清と１  ％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含むヌクレオシド不含のα−ＭＥＭ培地で細胞を洗浄後、３７℃、７日間培養し、形質転換細胞を得た。形質転換細胞を上記培地で継代培養後、安定なＨＧＦ高産生株を得るため、上記培地中のメソトレキセートの濃度を１００  ｎＭ、２５０  ｎＭ、５００  ｎＭ、７５０  ｎＭ、１μＭ  、そして２μＭ  と順次増加させながら継代培養を行った。得られたＨＧＦ産生形質転換細胞のクローン選別を行い、ＨＧＦ産生株５１５Ｃを選別した。選別した５１５Ｃ株をローラーボトルを用い、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）と１％グルタミンと２μＭ  メソトレキセートを含むヌクレオシド不含のα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）で３７℃、５％ＣＯ２  下で培養し、細胞がコンフリエントに増殖するまで培養した。次いで培養液を抜き取り、ＰＢＳで２回細胞を洗浄後、１％グルタミンと５００  μＭ    メソトレキセートとプロテアーゼ阻害剤である。アプロチニンを４００  ユニット／ｍｌ  を含むα−ＭＥＭ培地（ヌクレオシド不含）  を加え、３７℃、５％ＣＯ２  下で培養した。毎日培養上清を交換することにより、培養上清を採取した。得られた培養上清約５００ｍｌ  より３段のクロマト操作により組換えＨＧＦ（ＩＩ）を精製した。
【００３２】
（１）陽イオン交換クロマトグラフィー
５１５Ｃ株のプロテアーゼ阻害剤添加無血清培地にＰＭＳＦとＴｗｅｅｎ  ８０を最終濃度それぞれ１ｍＭ  と０．０１％  になるように添加し、次いでフィルター濾過により不溶物を除去した。この濾液に１／２０容の１Ｍ  トリス・塩酸（ｐＨ８．５）  緩衝液を加え緩衝液Ｄ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  、  １ｍＭ  ＰＭＳＦ  、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む５０ｍＭ    トリス・塩酸（ｐＨ８．５）］で平衡化したＳ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイズ：内径１．６ｃｍ  ×高さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｄでカラムを洗浄した後、緩衝液Ｅ［４００ｍＭ  ＮａＣｌ  、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む５０ｍＭ    トリス・塩酸（ｐＨ８．５）］でカラムを洗浄し、次いで緩衝液Ｆ［１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む５０ｍＭ    トリス・塩酸（ｐＨ８．５）］    を流下させ、ＨＧＦ（ＩＩ）を含む画分を溶出させた。その溶出クロマトパターンを図８に示す。緩衝液Ｆで溶出された画分を集め、組換えＳ−セファロース溶出液とした。
【００３３】
（２）アフィニティークロマトグラフィー
組換えＳ−セファロース溶出液を１Ｎ塩酸でｐＨ７．５  に調整した後、３倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０と１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む蒸留水で希釈した。緩衝液Ｇ［０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を含む  １０ｍＭ  トリス・塩酸（ｐＨ７．５）］で平衡化したヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、カラムサイズ：内径１ｃｍ×高さ５ｃｍ）に前記希釈液を添加し、次いで緩衝液Ｇでカラムを十分洗浄後、緩衝液Ｇ中のＮａＣｌ溶液を０．３Ｍから２．０Ｍに連続的に変化させた濃度勾配法による溶出（全量４０ｍｌ）  を行い、ＨＧＦ（ＩＩ）を溶出させた。ＨＧＦ活性を持つフラクションを集め、組換えヘパリン溶出液とした。そのクロマトパターンを図９に示す。
【００３４】
（３）第１回疎水性クロマトグラフィー
緩衝液Ｈ［４Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］で平衡化したフェニル５ＰＷカラム（東ソー社製、カラムサイズ：内径０．７５ｃｍ×高さ７．５ｃｍ）に組換えヘパリン溶出液を添加し、緩衝液Ｈでカラムを洗浄した。溶出は緩衝液Ｈと緩衝液Ｌ（５０％エチレングリコールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］との混合比を連続的に変化させた濃度勾配法により行った。その溶出パターンを図１０に示す。各溶出フラクションのＨＧＦ活性を測定し、ＨＧＦ活性を有するフラクションについては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、組換えＨＧＦ（Ｉ）及び組換えＨＧＦ（ＩＩ）の含有量を測定した。組換えＨＧＦ（ＩＩ）を主に含むフラクションを集め、疎水カラム溶出液とした。この溶出液にはまだ若干の組換えＨＧＦ（Ｉ）の混入が認められた。前記疎水カラム溶出液に緩衝液Ｈを加え希釈した。
【００３５】
（４）第２回疎水性クロマトグラフィー
緩衝液Ｈで平衡化したフェニル５ＰＷカラム（（３）と同じ）に上記希釈した疎水カラム溶出液を添加した。カラムを緩衝液Ｈで洗浄後、緩衝液Ｈと緩衝液Ｉとの混合比を連続的に変化させた濃度勾配法により溶出を行った。その溶出クロマトパターンを図１１に示す。図１１中の矢印で示したフラクションを集め均質な組換えＨＧＦ（ＩＩ）〔ヒト白血球由来５アミノ酸欠失型のＨＧＦ（ＩＩ）〕を得た。組換えＨＧＦ（ＩＩ）の収量は約７５μｇ  で、活性回収率は１５％であった。
【００３６】
（５）ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動
（４）項で得られたヒト白血球由来５アミノ酸欠失型の精製組換えＨＧＦ（ＩＩ）についてＳＤＳ−アクリルアミドゲル（テフコ社製０１０２５）電気泳動を行った。タンパク質の染色は銀染色法〔和光純薬（株）社製〕によって行った。その結果を図１２に示す。精製組換えＨＧＦ（ＩＩ）は非還元条件下で推定分子量８２，０００±５，０００ダルトンを示し、２−メルカプトエタノールによる還元条件下において推定分子量９２，０００±５，０００ダルトンの単一バンドを示した。組換えＨＧＦ（Ｉ）のα鎖やβ鎖に由来するバンドや他の不純物のバンドは検出されなかった。
【００３７】
（６）生理活性測定
（４）項で得られたヒト白血球由来５アミノ酸欠失型の精製組換えＨＧＦ（ＩＩ）について参考例１に示した方法に従ってラット初代培養肝実質細胞の増殖促進活性を測定した。その結果、該組換えＨＧＦ（ＩＩ）の比活性は２７万±８万ユニット／ｍｇとの値が得られた。尚、タンパク量が２１４ｎｍ  での吸光度が１４Ｏ．Ｄ．のときタンパク濃度は１ｍｇ／ｍｌとして換算して求めた。
【００３８】
製剤例
精製ＨＧＦ（ＩＩ）の１ｍｇ相当量をとり、０．８７６６ｇ  のＮａＣｌと１０ｍｇの界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ  ８０および１００ｍｇ  のヒト血清アルブミンを加え、ｐＨ７．０  の０．０２Ｍ  リン酸緩衝液にて全量を１００ｍｌ  に無菌的に調整し、１ｍｌ  ずつアンプルに無菌的に分注熔閉する。
【図面の簡単な説明】
【図１】肝抽出液のＳ−セファロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＨＧＦ活性との関係を示す線図である。
【図２】肝抽出液のＢｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＨＧＦ活性との関係を示す線図である。
【図３】肝抽出液のヘパリン・セファロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＨＧＦ活性との関係を示す線図である。
【図４】肝抽出液のフェニル５ＰＷ溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＨＧＦ活性との関係を示す線図である。
【図５】肝抽出液の溶出条件を変更したフェニル５ＰＷによる溶出パターンを示す線図である。
【図６】ＨＧＦ（ＩＩ）及び精製ＨＧＦ（ＩＩ）の還元下および非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。
【図７】精製ＨＧＦ（ＩＩ）のペプタイドマップを示す線図である。
【図８】組換えＨＧＦ（ＩＩ）のＳ−セファロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
【図９】組換えＨＧＦ（ＩＩ）のヘパリン・セファロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
【図１０】組換えＨＧＦ（ＩＩ）の第１回フェニル５ＰＷ溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
【図１１】組換えＨＧＦ（ＩＩ）の第２回フェニル５ＰＷ溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
【図１２】精製組換えＨＧＦ（ＩＩ）及び組換え精製ＨＧＦ（ＩＩ）の還元下および非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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