(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含有する、溶液；
(a)0〜5mMＫ+、
(b)生理的または半生理的な濃度のＮａ+、Ｍｇ++、Ｃａ++、Ｃｌ-、
(c)デンプンの腫脹剤、
(d)式ＲＣＯＯＸで表される有機カルボン酸、塩類、またはそれらのエステル、（式中、Ｒが1〜30個の炭素を含む、分岐状または直鎖状のアルキル、アルケニル、またはアリル基で、炭素は置換されていてもよく、
Ｘが水素あるいはナトリウムまたはその他の生物学的に許容されるイオン置換基で酸素の位置に付加できるものか、直鎖状または分岐状のアルキル基で炭素を1〜4個含むものである。）および
(e)濃度が２〜１０mMの範囲にある糖類（該糖類は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物からなる群から選択された単一の六炭糖である。）、
ただし、本溶液は従来の生物学的緩衝液を含有しない。
【請求項２】
Ｋ+が2〜3mMの範囲の濃度で存在する、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項３】
Ｎａ+が130〜150mMの範囲の濃度で存在する、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項４】
Ｍｇ++が0.20〜0.45mMの範囲の濃度で存在する、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項５】
Ｃａ++が2.0〜2.5mMの範囲の濃度で存在する、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項６】
有機カルボン酸が、乳酸、酢酸、ピルビン酸、またはクエン酸を含む群から選択される、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項７】
溶液がＮａＨＣＯ3を含有する、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項８】
前記腫脹剤がヘタスターチである、請求の範囲１記載の溶液。
【請求項９】
(a)0〜5mMＫ+、
(b)生理的または半生理的な濃度のＮａ+、Ｍｇ++、Ｃａ++、Ｃｌ-、
(c)デンプンの腫脹剤、および
(d)濃度が２〜１０mMの範囲にある糖類（該糖類は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物からなる群から選択された単一の六炭糖である。）
を含有し、従来の生物学的緩衝液を含有しない溶液であって、該溶液中の、全てあるいは実質的に全ての細菌を殺し、全てあるいは実質的に全てのウイルスを不活性化させるのに十分な時間、圧力下で、
前記溶液の温度を上昇させて加熱滅菌された血液代用品を製造することを含む、加熱滅菌された血液代用品を製造する方法。
【請求項１０】
前記溶液の温度が、圧力下で、15分間、120℃に上昇される、請求の範囲９記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液が、オートクレーブにかけられる、請求の範囲９記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、血液の代用品または血漿の増量剤として対象動物に輸液されうる溶液である、請求の範囲９記載の方法。
【請求項１３】
前記腫脹剤がヘタスターチである、請求の範囲９記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
発明の領域
本発明は、血漿様溶液のように、潅流を必要とするような、生きた対象動物を潅流するのに用いられ、血液の代用品として有効な水溶液に関する。本発明は更に（本発明の溶液で潅流した対象動物の、低温保存した臓器および組織の優れた解剖学的完全性によって示されるように）哺乳類のドナー生物の臓器の生物学的な完全性を保つ方法と、部分的にまたは実質的に完全に瀉血した対象動物を、通常哺乳類の維持する温度よりも実質的に低い温度に維持する方法に係るものである。
発明の背景
臨床的に応用されている、２種類の臓器の保存方法が知られている。
（１）はじめに約５分間潅流し、つづいて冷蔵する（２℃）
（２）アルブミンまたは血漿を含む溶液を用いて継続的に潅流する。
はじめに潅流してから冷蔵する方法に使用される溶液の多くは、「Collinsら(1967)Lancet 2:1219」と、「Sacksら(1973)Lancet 1:1024」の溶液に基づくものである。「Rossら(1976)Transplantation 21:498」は、様々な溶液で還流し、72時間保存した後のイヌの腎臓の保存状態を比較した。クエン酸塩の高張液（HC）（80mM K+、55mMのクエン酸塩をその成分として含有し、400mOsmol/kg、pH7.1）で保存した腎臓だけが72時間後も生き残ったことがわかった。CollinsとSacksの溶液は、115〜126mM K+をその成分として含有し、290〜430mOsmol/kg、ph7.0〜7.3であった。「Wallら(1977)Transplantation 23:210」は、250mgの右旋性ブドウ糖、15mEqの硫酸カリウムをその成分として含有する溶液中での、ヒトの肝臓の約４時間までの低体温法での保存状態を報告している。「BishopとRoss(1978)Transplantation 25:235」は、腎臓の機能が、「Rossら(1976)上述」のHC溶液中で、他の溶液に比べて最も良く保存されたことを報告した。「Fischerら(1985)Transplantation 39:122」は、臨床での使用において、Collins、Sacks、HCを含む他の溶液に勝る、低体温の虚血保存のための新規の保存溶液（110mM Na+、115mM K+を含み、400mOsm/kg、D2O溶媒、110mM HEPES）を見いだした。
臓器の継続的な潅流に使われる溶液のなかでも、「Belzerら、(1985)Transplantation 39:118」は、腎臓を48時間潅流し、24時間保存しても腎機能を保存した、新しく開発された溶液（80mMグルコン酸ナトリウム、22mEq/l K+、128mEq/l Na+、4.9mMアデノシン、10mM HEPES、3.0mMグルタチオン、3.75g％アルブミンをその成分として含有し、pH7.45）を報告した。「Kallerhoffら、(1985)Transplantation 39:485」は、２つの異なる溶液（Euro-Collins:10mM Na+、115mM K+、198mMグルコースを含み、406mOsm/L、20℃でpH7.2、と、HTK:15mM Na+、10mM K+、2.0mMトリプトファン、180mMヒスチジン、30mMマンニトールを含み、310mOsm/L、８℃でph7.3）で、継続的に潅流した臓器のpHに対する温度の影響を調べた。インキュベートの温度が5℃から35℃の間では、HTK溶液が、Euro-Collins溶液よりもpHを高い値に保った。
「KlebanoffおよびPhillips、(1969)Cryobiology 6:121」は、7.1℃から16℃の乳酸リンゲル緩衝液で潅流した、イヌの低体温の非血液性の潅流について述べている。「Segallら（米国特許第4,923,442号）」は、基礎溶液、心停止誘導溶液、心停止維持溶液、回復溶液、の異なる４つの溶液を用いて、対象動物とその臓器を20℃より低い温度で維持することが可能な、血液の代用品を説明している。基礎溶液は、生理学的濃度の電解質、高分子の腫脹剤、および生理的pHで有効な従来の生理学的緩衝液、糖類、4から5mEqの範囲にあるＫ+を含有する。心停止誘導溶液は、25から45mEqの濃度のＫ+を含有する。心停止維持溶液は、15から45mEqの濃度のＫ+を含有する。回復溶液は、6から10mEqの濃度のＫ+を含有する。「Segallら（米国特許第5,130,230号）」はさらに、回復溶液が0から10mEqのＫ+を含有する４つの溶液系について記述している。
発明の要約
本発明は、半生理的かつ/または生理的レベルのＫ+とMg++、生理的なNa+、Ca++、Cl-、高分子の腫脹剤、有機カルボン酸またはその塩類と、糖類を含有し、正常な温度または一般に37から38℃以下の通常哺乳類が維持している温度を実質的に下回り、-2℃よりも高い温度で、部分的にないし実質的に完全に瀉血された対象動物を生きたまま保存するような単一の溶液を用いる方法を特徴とする。
本発明の溶液は、正常な体温で血漿の増量剤として使用できる。本発明の溶液はまた、潅流された対象動物および/またはその臓器の生命または生物学的完全性を、かなりの低体温状態にさらされる間およびその後維持するのにも有用である。本溶液は、最適温度の対象動物を対象動物の血液成分が十分に回復するに足る時間の間、酸素濃度を100％まで高めて加圧した条件下で維持するためにも使用することができる。
本発明による溶液は、哺乳類の対象動物を潅流し、対象動物の正常な体温よりもずっと低い温度に冷却するために使用できる。溶液は、通常１時間以上の長時間にわたり、かなりの低体温のもとで、明らかに恒久的な悪影響を受けず、対象動物が損なわれずに回復するように維持するために使用できる。
本発明の溶液の重要な特徴は、血液の置換や、哺乳類の対象動物を低温で保存するために、対象動物へ効果的に投与されるよう多数の溶液を必要としないことである。本発明の溶液は、血漿の増量や血液の置換のあらゆる段階に用いることができる。
本発明の溶液のその他の重要な特徴は、投与の全段階においてＫ+の量が生理的な量を下回ることである。この必要条件により、霊長類およびヒトで輸血の際に起こる高カリウム血症を誘発するに足る心臓の十分条件の危険性が減少する。
本発明の溶液のその他の重要な特徴は、従来の生理学的緩衝液が含まれていないことである。溶液中に従来の生物学的緩衝液が含まれていないことにより、溶液の成分を分解することなく、完全に加熱滅菌できるという重要な医学的利点が得られる。
本発明の溶液は、有機カルボン酸、それらの塩類、または短鎖エステルの存在を必要とする。有機カルボン酸、それらの塩類、またはエステルは、哺乳類に用いられた際に生物学的に適切なpHの範囲を維持できる溶液の動的緩衝系の構成成分である。
本発明の溶液は、生理的な浸透圧を維持するのに十分な高分子の腫脹剤の存在が必要である。本発明の溶液中に用いられる高分子腫脹剤は、蛋白質またはデンプンであり得る。
この溶液の利点は、対象動物の血液の最初の洗い出しから、全てないし実質的に全ての循環血液の置換まで、哺乳類の対象動物の血液置換のあらゆる段階において使用できることである。
本発明の特徴は、哺乳類を血液なしで維持するとき、および血液で再潅流するときにも使用できることである。
好ましい態様の詳細
本明細書および付録として付けられた請求の範囲で用いられているように、単数形の「ある」および「その」などは、分中で明確に他を指示しない限り、複数形の指示対象を含むものとすることを特記しなければならない。したがって、例えば「処方物」の指すものは、異なる処方物の混合物を含み、また、「治療法」の指すものは、当業者に既知の同等の操作や方法を指すものを含み、以下同様である。
他に指示のない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明に関する当業者に広く知られている意味と同じである。本明細書において記述されているものと同様、またはそれに相当するあらゆる方法や材料も、本発明の実施または試験に使用されうるが、好ましい方法および材料をここに記述する。本明細書において挙げられている全ての刊行物は、その刊行物が関連をもって引用している特定の情報を説明し明らかにするため、参考文献として本明細書に含まれる。
霊長類の赤血球は、高濃度のカリウムイオン（Ｋ+）を含む。霊長類の血液を保存すると（血液バンクから入手される全血の場合と同様に）、一般に、低レベルの赤血球の溶解でさえ、カリウムイオンの濃度を高くしてしまう。これは、カリウムイオンが溶解した霊長類の赤血球の細胞内部から、細胞を取り囲む血漿中へ放出されるためである。したがって、成分が浸出すると、血液が高カリウム血になる。血液が循環血液が十分な患者に輸血されれば、高濃度のカリウムイオンが希釈されるため、増加したカリウムのレベルは拡散される。しかし、霊長類の血液を、「米国特許第4,924,442号」に記されている、高濃度のカリウムを含むタイプの保存液中へ輸血すると、問題は大きくなる。輸血液中のカリウムイオン濃度は、安全なレベルまで希釈されない。その結果、心不全がしばしば起こりうる。高カリウム血症はまた、火傷、事故、手術、薬物療法、その他の物理的外傷による組織の損傷とともにもたらされる。さきの技術により、低温での臓器の保存には完全な組織保全のため、高濃度のカリウムイオンの存在が必要であることがわかっている。
本発明による溶液は、半生理的な量のカリウムを含む。よって、この溶液は、保存され、輸血された血液において、カリウムイオン濃度の希釈ができる。その結果、高濃度のカリウムイオンと、それによって起こる潜在的な心臓の不整脈と心不全がより容易にコントロールされる。生理的な量を下回るカリウムを含む溶液も血液の置換と低温での対象動物の保存に有用である。「生理的な量を下回るカリウム」とは、0〜5mEq/l Ｋ+(0〜5mM)、好ましくは2〜3mEq/l Ｋ+(2〜3mM)を意味する。
本発明の溶液は、水溶性の溶液にすると、潅流の必要性がある対象動物に使用できるような物質の混合物を含む。その物質は、加熱滅菌に先立って水を加えられるような乾燥した混合物として提供されるが、その溶液は、滅菌された水溶性の溶液の形態で供給されることが望ましい。
本発明の溶液は、対象動物の血液が除去され、置換される、あるいは、対象動物が冷却される操作の全ての段階において、単一の溶液として使用することができる。このような段階には次のようなものが含まれる。正常な体温での血液の希釈または血漿の増量、低体温的な体温での血液の置換と交換、十分に低体温的な体温での血液の代用、および対象動物の加温。「低体温的な体温」は、37から38℃の正常な体温より4〜5℃低いと定義される。言い換えると、低体温状態は、体温が約32〜35℃で現れると考えられる。「十分に低体温的な体温」は、凝固点直下（-2℃）から約10℃の体温として定義される。したがって、本明細書において用いられているように、「低体温的な体温」または「低体温」という用語は、約-2〜3℃から約32〜35℃の体温を指す。
本発明の溶液は、従来の生物学的緩衝液を含まない。「従来の緩衝液」は、溶液内で、すなわちインビトロ（in vitro）で、pHをある特定の範囲に維持する化合物を意味する。「従来の生物学的緩衝液」は、無細胞系でpHを7〜8の生物学的範囲に維持する化合物を意味する。従来の生物学的緩衝液の例には、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropanesulfonic acid)(HEPES)、3-(N-モルフォリノ）プロパンスルホン酸(3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)(MOPS)、2-([2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]アミノ)エタンスルホン酸(2-([2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino)ethanesulfonic acid)(TES)、3-[N-トリス(ヒドロキシ-メチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシエチル]-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(3-[N-tris(Hydroxy-methyl)methylamino]-2-hydroxyethyl]-1-piperazinepropanesulfonic acid)(EPPS)、およびトリス[ヒドロキシメチル]-アミノメタン(Tris[hydroxymethyl]-aminoethane)(THAM)、トリス[ヒドロキシメチル]メチルアミノメタン(Tris[Hidroxymethyl]methyl aminomethane)(TRIS)を含む。従来の生物学的緩衝液は、正常な生物学的過程から独立して機能する。例えば、従来の緩衝液はインビボ（in vivo）では代謝されず、無細胞系で最も効く。
本発明の溶液は、in vivoで生物学的pH、すなわち「動的緩衝系」と呼ばれる概念を維持するために、正常な生物学的構成成分を用いる。動的緩衝系の概念は、in vivoで代謝されうる乳酸塩のような、生物学的範囲に固有の緩衝能力を全くもたない化合物は、他の溶液の成分とともに、動物において、低体温的な温度や本質的に血液のない状態でも、生物学的に適切なpHを維持する働きをするという、本発明者の発見に基づく。本発明の動的緩衝系は、二酸化炭素（CO2）の酸化と除去に一部依存する。そして重炭酸塩（NaHCO3）の添加を許容するが、必要としない。本発明の動的緩衝液は、生物学的な系の外で緩衝液として全く、または実質的に全く機能する能力をもたない。つまり、動的緩衝液は、in vivoでpHを生物学的範囲に維持するが、無細胞環境下では維持しない。本発明の動的緩衝系の成分は、カルボン酸、塩類、またはそれらのエステルである。中に含まれるカルボン酸、塩類、またはそれらのエステルの意味するものはRCOOXの一般構造式を持つ化合物である。Ｒは、分岐状または直鎖状のアルキル基、アルケニル基、またはアリル基で、1から30の炭素を含み、炭素は置換されていてもよく、好ましくは乳酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ピルビン酸塩またはその他の代謝産物を構成する炭素鎖の一つである。そしてＸは水素、ナトリウム、またはその他の、酸素の位置に付くもの、あるいは-CH3、-CH2CH3のように、炭素が１から４個の短い直鎖状または分岐状のアルキル基で、生物学的に親和性のイオン置換基である。
表１に示されるように、典型的な従来の緩衝溶液は初期のpHが約7.7で、0.12mlまでの1.25M HCl溶液を加えるとpHを7.2以上に維持する。比較すると、HLB溶液（初期pH7.7）のpHは、1.25M HCl溶液を0.01ml加えると7.2以下に下がった。
本発明の溶液が低体温的な温度で血液の代用品として使用される場合は、医学的な品質の滅菌されたNaHCO3が加熱滅菌された溶液（HL溶液）に加えられる。NaHCO3を含む溶液は、HLB溶液と呼ばれる。無細胞系での、従来の生物学的な緩衝液に対するHLB溶液の緩衝能力は、表１に示されている。酸素添加のin vivoの条件下では、HLB溶液は1.6から36.1℃の範囲の温度でpHを7.3以上に維持することが示されている（表２および３）。
本発明の溶液が正常な体温で血漿の増量剤として使用される場合は、NaHCO3を添加しなくても、in vivoでpHは生物学的な範囲に維持された。
本発明の溶液に従来の生物学的な緩衝液が含まれないことによって、溶液を加熱滅菌できるという重要な医学的長所が得られる。一般に、医学的溶液は患者に使用される前に完全に加熱滅菌されることが好ましい。本明細書において用いられているように、「完全に加熱滅菌された」あるいは「加熱滅菌された」という用語は、溶液を圧力下で15分間加熱する、つまり溶液中の全てのまたはほぼ全ての細菌を殺し、すべてのまたはほぼ全てのウイルスを不活性化するのに十分な時間の間、熱と圧力の状態を維持することを含む操作を指す。この操作は通常オートクレーブで行われ、「オートクレービング」として知られている。加熱殺菌の目的は、溶液内に存在する感染物質を殺すことである。感染物質は100℃までの温度に耐えることが知られている。一般に、溶液を圧力下で約15分間120℃に加温すると十分に滅菌できることが当業者に知られている。
本発明者が知っているあらゆる移植または血液の代用溶液は、加熱滅菌に耐えられない。pHが7.0以上の溶液を加熱滅菌すると他の溶液成分を分解してしまうことが知られている。
比較すると、本発明の溶液は、糖類などの溶液成分の分解を最小限にして加熱滅菌するようにデザインされている。溶液HLは、使用の前に加熱滅菌される。NaHCO3を添加してHLB溶液をつくるのが望ましい場合は、NaHCO3は商業的に入手可能な、滅菌された１M溶液として滅菌されたHL溶液に加えられる。一般に、HLB溶液を１l作成するのに、HL溶液１lあたり5mlの１M NaHCO3溶液が加えられる。しかし、さらにNaHCO3が添加されうる。
本発明のHLB溶液、あるいはその緩衝している有機酸と塩類は、in vitroで培養した組織と細胞を維持するのにも使用できる。溶液の動態緩衝系は培養された組織と細胞を適切な生物学的なpHで維持する。われわれは、培養された細胞への乳酸と重炭酸塩の添加が、細胞の正常な成長と形態を維持するのに十分であることを示した。
本発明の溶液は、その中に有機カルボン酸または塩類を含む。「その中の有機カルボン酸または塩類」は、哺乳類に代謝されうるいかなるカルボン酸またはカルボン酸誘導体をも含む。本発明の溶液に適したカルボン酸およびカルボン酸塩の例には乳酸および乳酸ナトリウム、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、グルコン酸およびグルコン酸ナトリウム、ピルビン酸およびピルビン酸ナトリウム、コハク酸およびコハク酸ナトリウム、酢酸および酢酸ナトリウムが含まれる。後に続くHLB溶液の使用法を説明した例では、乳酸ナトリウムが使われている。in vivoで代謝された場合、乳酸が重炭酸塩のレベルを維持するのを助け、よってin vivoで生物学的なpHを維持するため、溶液の動態緩衝系の成分として機能する。
本発明のさらなる詳細の目的のため、本発明による混合物は水溶性の溶液として論ぜられる。本発明の後に続く説明から、当業者は、その混合物を乾燥した混合物として供給され、本発明によれば乾燥混合物の溶媒として使用できる普通の生理食塩水に存在する塩化ナトリウムの量にあわせて塩化ナトリウムとナトリウムの有機塩類の量を必要に応じて調整することができる。
ナトリウムの有機塩類の量は、乾燥成分が添加されたある溶液中の塩化ナトリウム濃度と同様に、対象動物の血液に存在するナトリウムイオンの濃度を考えるのと同じ方法で計算される。ナトリウムの有機塩類から得られるナトリウムイオンの濃度が溶液中のナトリウムイオン濃度が生理的な正常な血漿とほぼ同じにするのに足りるような量が添加される。したがって、ナトリウムの有機塩類と塩化ナトリウムから得られるナトリウムイオンの量あるいは濃度を考慮すると、溶液中のナトリウムイオン濃度は生理的に正常な血漿中にみられるナトリウムイオン濃度とほぼ同じになる。
本発明の溶液のカルシウム、ナトリウム、マグネシウムのイオン濃度は血漿中の正常な生理的濃度の範囲になっている。一般に、カルシウム、ナトリウム、マグネシウムの塩化物を溶かしても、またナトリウムの場合には溶液中に溶かされたナトリウムの有機塩からも、望ましい濃度のこれらのイオンが得られる。
ナトリウムイオンの濃度は、好ましくは70mMから約160mMの範囲にあり、好ましくは約130mMから150mMの範囲にある。
カルシウムイオンの濃度は、約0.5mMから4.0mMの範囲にあり、好ましくは約2.0mMから2.5mMの範囲である。
マグネシウムイオンの濃度は、0mMから10mMの範囲にあり、好ましくは約0.3mMから0.45mMの範囲である。高濃度のマグネシウムイオンは心筋の収縮活動の強さに悪影響を及ぼすため、本発明による溶液中には、過剰な量のマグネシウムイオンを含まないことが重要である。本発明の好ましい態様においては、本溶液は半生理的な量のMg++を含む。
塩化物イオンの濃度は、70mMから160mMの範囲にあり、好ましくは110mMから125mM Cl-の範囲である。
本溶液は、ある量のグルコース、フルクトース、ガラクトースのような簡単な六炭糖を含み、グルコースが好ましい。本発明の好ましい態様において、栄養素の六炭糖が使用され、糖類の混合物が使用されうる。一般に、糖類の濃度は2mMから10mMの範囲にあり、グルコースの濃度が5mMであるのが好ましい。時々、対象動物の組織に溶液がうっ滞するのを抑えるために、六炭糖の濃度を上げることが望ましい。扱われている対象動物の浮腫を防ぐあるいは制限するのに必要な場合は、六炭糖の範囲を50mMまで上げられる。
毛細血管網の窓から体組織の細胞間隙へ出ることによる循環からの消費を防げるような大きさの分子から、腫脹剤はできている。グループとしては、腫脹剤は、血液血漿の増量剤の例である。
ヒト血清アルブミンは、血漿の体積を増やすのに使われる血液血漿蛋白質である。多糖類も、血液血漿の増量剤として用いられるグルカンポリマーとして一般的に特徴づけられ、知られている。一般に、多糖類は非抗原性であることが好ましい。
ヘタスターチ（McGaw,Inc.）は、ヒドロキシエチルエーテル基をもち、アルファ（1---4）連鎖グルコースユニットに導入されたアミロペクチンでほとんどが構成されている蝋性デンプンから誘導される人工のコロイドである。６％ヘタスターチ溶液（wt/wt）のコロイドの性質は、ヒト血清アルブミンとほぼ同じである。その他の多糖類の誘導体は、本発明による溶液中の腫脹剤として適し、ヒドロキシメチルアルファ（1---4）または（1---6）ポリマーを含む。シクロデキストリンは、増量剤に適している。
D-グルコースポリマーも使用できる。例えば、D-グルコースが主にアルファ（1---6）連鎖につながっているデキストランは、本発明の溶液の増量剤として使用できる。デキストランのような、分子量が30,000から50,000ダルトン（D）の範囲の多糖類が好ましい。最も好ましくは、約40,000Dの分子量をもつデキストラン40である。
約70,000Dの分子量をもつデキストラン70のような、分子量の大きい多糖類は、一般にあまり好ましくない。なぜなら、それらはコロイド溶液の粘性を増し、それによって高い流速を減じてしまうからである。しかし、一部の用途においては、毛細血管から漏れる割合が小さいことから、組織の腫脹を防ぐのにより効果的であるため、分子量の大きいデキストラン溶液が好ましい。したがって、このような高分子量のデキストラン溶液は、高酸素圧での脳梗塞の治療と、脳浮腫の管理において特に有用である。そのような条件下では、分子量が50,000から70,000Dのデキストランのような多糖類を使用することが望ましい。
本発明による溶液にデキストラン40が用いられる場合は、8％デキストラン40（wt/wt）または水１リットル（1）あたり約80グラム（g）が用いられる。本発明による血液の代用品のモル濃度は、約290ミリモルから330ミリモルの範囲であり、好ましくはモル濃度が300ミリモルである。最も好ましくは、最終的なモル濃度は約298mMである。
多糖類の濃度は、（ナトリウム、カルシウム、マグネシウムの塩化物とともに混合されると、ナトリウムの有機塩からの有機イオンと前に述べられた六炭糖が）コロイドの浸透圧を正常なヒト血清の約28mmHgに調整するのに適している。
本溶液は、酸素または高圧酸素とともに正常な体温で、あるいは高圧酸素の存在下または非存在下で操作される対象動物において、循環溶液として使用されうる。本溶液はまた、対象動物の体温がその正常な温度よりも著明に低下した場合に、操作されている対象動物にも循環溶液として用いられる。温血の対象動物が手術中に低い温度の状態にさらされたり、低温で死体からの臓器の提供を受けるとき、対象動物の血液を本発明の冷たい循環溶液で置き換えるかまたは、一時的に本溶液を循環させ、対象動物とその臓器を操作の間損なわないように潅流し、管理することが一般に望ましい。
本発明の溶液は、酸素濃度を100％まで高めた加圧された大気中の最適温度での対象動物、あるいは高圧酸素の使用の有無に関わらず体温が正常な温度よりも著しく低下しているような対象動物に対して経静脈的または経動脈的に投与されうる。本溶液が投与され、対象動物の中を循環する一方で、心停止薬などのさまざまな薬物が、直接対象動物の循環系へ、あるいは直接対象動物の心筋に、またあるいは本発明の循環溶液に加えて投与されうる。これらの成分は、正常な心収縮の活動を維持したり、心筋の細動を止めたり、心筋の収縮活動を完全に抑制したりするような、所望の生理的効果を得るために添加される。心停止薬は、心筋の収縮を止める作用をする物質であり、リドカイン、プロカイン、ノボカインなどの麻酔薬と、カリウムイオンなどの一価の陽イオンを、心筋の収縮を抑制するのに十分な濃度で含む。この効果を得るのに必要なカリウムイオンの濃度は、一般に15mMより多い。
対象動物の回復の間（対象動物の維持に本発明による溶液を使用して、正常以下または低体温管理をした後）対象動物に再び本発明による溶液を、対象動物からとっておいた血液または血液提供者から得られた血液とともに、輸液できる。患者が温められると、対象動物の許容できるヘマトクリット値、一般に30％以上、が得られるまで、全血が輸血される。許容できるヘマトクリット値に到達したら、潅流を停止し、従来の方法で手術創を閉じて対象動物を回復させる。
一般に、本発明による溶液は、経静脈的な経路を用いて、または冷やされた対象動物に遠心ポンプ、ローラーポンプ、蠕動ポンプ、あるいはその他の既知の入手可能な循環ポンプなどのポンプ式循環装置を用いて投与される。循環装置は、適切な静脈または動脈に外科的に挿入されたカニューレを経由して対象動物につながれる。本溶液を冷却された対象動物に投与する場合は、一般的に動脈カニューレから投与し、静脈カニューレから除去して廃棄または保存する。
本溶液は、さまざまな外科的な状況および操作に使用できる。緻密な神経外科のように、鮮明な手術野が必須であり、中枢神経系の活動が低下していることが望ましく、また中心温度かつ/または大脳の温度が著明に低下した対象動物に操作を加えることによって到達されるような場合において有用である。
本溶液は、（著しい量の血液を失った、例えば血液の20％から98％を失ったような）対象動物の維持に、正常な体温で、酸素の濃度を酸素の大気分圧から100％まで高めて加圧した条件のもとで使用できる。大気圧および大気の酸素濃度で対象動物自身によって生命を維持できる程度に血液成分が十分に合成できるまで対象動物は高濃度の酸素中で維持される。本発明による溶液は、正常な体温よりも低い温度や、生命に関わるような外傷の後の代謝が低下したときに、適切な補強または修正的な外科治療が施されるまで対象動物を維持するのに使用できる。さらに本溶液は、珍しい型の血液や組織をもつ対象動物を、適切な適合する提供者が見つかり、代替の血液単位や他の臓器が入手できるまで維持するのに使用できる。
驚くことに、哺乳類の対象動物の循環血液のほぼ全てを本発明による溶液で置き換え、対象動物に血液を再輸血することなく対象動物を生きたまま維持することが可能であることが発見された。哺乳類の対象動物のほぼ全ての循環血液とは、対象動物のヘマトクリット値が10％以下になったときに置き換えられたと考える。ヘマトクリット値は、対象動物に酸素が供給されていると10％を下回りうる。または高圧酸素治療室では実質的に10％を下回る。本発明による溶液は、もちろんヘマトクリット値が10％を越える対象動物にも使用できる。
哺乳類の対象動物のほぼ全ての循環血液を置き換える操作は、哺乳類の対象動物の体温がその本来の正常な温度に保たれた状態で行われる。さらにその操作は、対象動物の冷却および哺乳類の対象動物の体温をその正常な温度以下に下げることを伴っても行うことができる。冷却は、アイスバス、氷と食塩のスラリー、クーリングブランケットで対象動物を冷やしてできる。対象動物は、本発明による溶液を潅流するのに先だって冷やすことによりさらに冷却されうる。
本発明による、哺乳類の対象動物のほぼ全ての循環血液を置き換える操作において、対象動物が冷やされて、動脈カテーテルを用いて対象動物の循環系に本溶液を供給し、静脈カテーテルを用いて対象動物から血液および潅流物を除去して、本溶液で潅流されることが好ましい。静脈カテーテルからの流出物のヘマトクリット値を測定して計算する方法で、対象動物の循環血液のほぼ全てが除去される。対象動物の循環血液のほぼ全てが除去されると、潅流が停止される。
さらに、対象動物のほぼ全ての血液を置き換える操作は高圧の酸素のもとで行うことができる。対象動物は、酸素濃度が20％以上、好ましくは100％の高圧酸素治療室にいれられる。高圧酸素治療室の圧力は、操作のほとんどの間、１平方インチあたり大気圧の0.5ポンド以上から大気圧の約２倍の範囲に維持される。１つの態様において、この操作は、周囲の圧力を0.07気圧から２気圧上回る高圧（１平方インチあたり0.5ポンドから30ポンド[psi]）で、100％酸素の、高圧酸素治療室で対象動物に施行される。必要であれば、高圧酸素治療室の圧力は、手術創の閉鎖の間、大気圧まで下げることができる。対象動物は引き続き高濃度の酸素で高い圧力に保たれる。圧力は徐々に低い圧力に下げられるが、高圧のままである。好ましくは、圧力は数時間から数日の間、10psiから約5psi以下に保たれる。続いて、圧力は１psi以下、好ましくは0.5psiに、再び徐々に下げられ、１日ないしそれ以上の時間、この圧力に保たれる。
本溶液はまた、脳死の起こった直後の臓器提供者の生理的な完全性を維持するためにも使用できる。対象動物は冷やされ、対象動物の血液は除去され、37℃以下に保たれた循環溶液、あるいは本発明による循環冷却溶液で置き換えられる。本溶液の使用を通じて、生きている臓器の虚血が最小限になりうる。本発明による循環冷却溶液を、低温で、高圧酸素治療室に入れているまたは入れていない対象動物の循環系に通すことによって、生きている臓器を長い間維持でき、よって一人のドナーから移植を受けることのできるレシピエントに効果的に利用されうる臓器の数を最大限にする。
本発明のその他の方面では、適切な付加生成物、特にプロパンジオールと高濃度のグルコースを使用して溶液を増やすことによって、ドナー臓器の温度を下げることが可能であり、特にドナーの心臓については、氷点（0℃）以下に下げて凍らせた状態から使用できる状態、つまり、調和した心臓の収縮が維持できる状態に戻すことができることが発見された。さらに、本発明による溶液をこのような付加化合物とともに使用することによって、無傷の哺乳類のドナーの温度を氷点（0℃）以下に下げ、それらを冷凍から調和した心臓の収縮が維持できる状態に戻すことができた。その他の臓器系も、高い生物的完全性、つまり、生命を維持できる生理的状態を保つことができると考えられる。
溶液への付加化合物は、低分子量の脂肪族の多価アルコールを含む。エチレンジオール、プロパンジオール、ブタンジオールに代表されるジオールが好ましい。これらのジオールのうち、プロパンジオールが最も好ましい。その他の多価アルコールで、低温、0℃以下での臓器と臓器提供者の保存の付加化合物として適しうるものは低分子量のポリエチレングリコールである。本発明のこの局面において、最終的な濃度が約0.2モルから１モルの間の範囲になるように、付加化合物を本溶液に添加することが好ましい。プロパンジオールについては、特に0.2Mから0.6Mの範囲であることが好ましい。約0.4Mのプロパンジオールが最も好ましい。低温での臓器およびドナーの保存に用いられる本発明による溶液の付加化合物としては、1,2プロパンジオールが好ましく、1,3プロパンジオールも使用できる。
臓器および臓器提供者の0℃以下の保存に有用な本溶液のグルコース濃度は、約0.6Mから約1.4Mの範囲である。約１Mの濃度のグルコースが好ましい。
低温および0℃以下での臓器および臓器提供者の組織の保存のための本溶液に有用なその他の付加化合物は、トリメチルアミンオキサイド（TMAO）である。TMAOは、いま説明された本溶液に、最終的な濃度が0.2Mから７Mの範囲になるように添加される。TMAOを含む本溶液は、対象動物に潅流されると、組織のすぐれた解剖学的保存によって証明されるように、対象動物の組織の生物学的完全性を改善に導く。
後に続く実施例は、本発明およびその用途を説明しようとするものであるが、本発明者が本発明を制限しようとするものではない。
実施例
後に続く実施例は、当業者に本発明を実施する方法の完全な開示と説明を提供しようとするものであり、発明者がその発明とみなすものの領域を制限しようとするものではない。使用されている数字（例えば量、温度など）に関しては正確さを確実にするべく努力したが、わずかな実験誤差やずれが認められよう。指示のない限り、割合は重量の割合、分子量は平均分子量、温度は摂氏、気圧は大気圧またはその類似したものである。
実施例１.溶液の準備
溶液A10Lの準備  適当な容器に、80g/L（または10リットルに800g）の発熱物質を含まないデキストラン40（PharmachemまたはPharmacia）を加える。イオン除去された水を加え、６から９リットルにする。撹拌し、デキストラン40を完全に溶解する。後に続く成分は、各々が次のものを加える前に完全に溶解されるならば、どのような順序でも加えられる。後に続く試薬は、製薬会社から入手できる。この例において挙げられた試薬はSigma社から入手された。NaCl(5.2g/L)、CaCl2(0.29g/L)、MgCl2(0.40g/L）、グルコース(0.9g/L)、Tris(3.03g/L)、グルコン酸ナトリウム(6.54g/L)。
次に、0.25M HClを滴下して撹拌し、pH計でモニターしながら、溶液を室温でpH7.80にする。それから溶液にさらにイオン除去した水を加えて所望の最終的な体積にする。
最後に、溶液を0.2マイクロのフィルター（Gelman、Whatman、理想的にはPall filter unitsが使用できる）を通して滅菌した容器ないし袋に移す。つめて栓をした溶液は、使用するまで氷蔵する。
本溶液はそれから、滅菌したIV溶液の調整に適した容器で、適切な条件下で凍結乾燥させて、滅菌された乾燥した粉末として調整される。
HL溶液の調整  溶液L（BioTime HextendTM-lactate）を50リットル調整するには、3.0kgの高分子量のヘタスターチ（HES）を25リットルの水に加える。最終的なNaCl濃度が6.72g/lになるように十分なNaClを加える。HESとNaCLの両方が溶解するまで溶液を撹拌する。必要であれば、溶液を50℃に温めてもよい。体積の合計を45リットルにし、後に続く成分が加えられ、完全に溶解するまで撹拌される。CaCl2・2H2O 18.5g、MgCl2・6H2O 4.5g、KCl 11.0g、グルコース45.0g、60％(wt/wt)溶液の乳酸ナトリウム4.03ml。溶液を50リットルにする。溶液をフィルターにかけて溶解していない物質を除去し、オートクレーブできる容器に入れ、オートクレーブで15分間120℃に熱する。
HLB溶液。加熱滅菌されたHL溶液１リットルにつき、滅菌した１M NaHCO3溶液を5ml加え、医学的水準の、HLB溶液（BioTime HextendTM-lactate-bicarbonate）ができる。
具体例２.氷冷の血液代用品を１時間受けた後のハムスター
約１カ月齢の41gのメスのハムスター（Mesocricetus auratus）に、0.04mlのベタラール(Vetalar)、麻酔薬ケタミン(Ketamine)の100mg/ml溶液を筋肉注射した。動物を粉砕した氷の中につめて、直腸温が10℃になるまで冷やした。動物は粉砕した氷から取り出され、腹側を上にして、動物の特定の部位が手術中に実体顕微鏡を通して観察されるように特別にデザインされたステージにのせた。動物は四肢を固定され、EKG誘導と直腸体温計プローブを備え付けられた。
右の鼠形部を切開し、右の伏在静脈、それから右の伏在動脈に、溶液Aで満たしが、特別にデザインされたマイクロカニューレを用いてカニューレを挿入した。カニューレ挿入の後、溶液A中の0.02mlのヘパリン（1000U/ml)を、静脈カニューレを通して動物に注入し、キャップした。
右の鼠径動脈にカニューレを挿入した後、カニューレを、手術台に備えられたバルブに接続された、滅菌したプラスチックチューブに接続した。バルブは、次により太く、厚く、弾力性のあるチューブにローラーポンプの上を通って接続された、他のチューブに接続された。この太いチューブの端には、貯蔵槽から流体を引き出すチューブがついていた。本明細書において「ピックアップ」と呼ばれるこの貯水槽から液体を取り出すチューブは、18ゲージの皮下注射針でつくられていた。この「ピックアップ」は、小さいラバー製「O」リングで固定された血液濾過物質で覆われていた。「ピックアップ」は、粉砕した氷の中に漬けられた遠心管に入った溶液Aの貯蔵槽に挿入されていた。溶液（15ml）に1M KClを0.06ml加え、約4M KClのモル濃度にした。ラインをバルブで閉じ、動脈カニューレへの逆流を防いだ。
ハムスターを粉砕した氷で囲み、４℃に冷やした。それから0.2mlの１M KClをバルブに注入し、そこから動物の伏在動脈に注入した。バルブは注入した溶液を、動脈カニューレにつながったラインへ流せるように開けておいた。ハムスターの心臓を停止した。動物をさらに冷やし、動脈カニューレを通して8mlの溶液A４mM KClで潅流した。ほとんどがハムスターの血液である流出液は、動脈カニューレに集めた。ヘマトクリット値が５以下に下がった後、ローラーポンプを67分間停止した。
それからハムスターを動脈カニューレを通して、KClを含まない溶液A８mlで潅流し、つづいて他のハムスターの心臓に穿針して採取した、ヘパリン入り血液８mlで潅流した。同量の流出液が動脈カミューレから得られた。ヘマトクリット値が40％を越えた後、全血での潅流を停止し、カニューレを除去した。
ハムスターを、刺激が受けられるようになるまでデスクランプで温めた。カニューレを除去し、開いた血管を結紮し、切開を閉じた。さらに再加温した。動物はすっかり回復し、実験の後何週間か生き続けた。
具体例３.氷点下保存の後の心臓の維持
絶食（一晩）した、40gのメスのハムスターに0.02mlの麻酔薬ケタミン（100mg/ml）を筋肉注射した。ハムスターは、体温が+14℃になるまで粉砕した氷に漬けた。それから手術台に載せ、EKG誘導と直腸体温計のプローブを備え付けた。動物の体温が10から14℃の間に維持される一方で、頚動脈と径静脈を外科的に露出させ、動脈と静脈にカニューレを挿入した。動脈カニューレは蠕動ポンプに連結しているチューブにつけた。チューブは、20mM KClを添加した溶液Aで満たしておいた。静脈カニューレは、粉砕した氷と温度調節ステージセットを用いて、動物の体温が５℃に下がるまでキャップをしておいた。
動物は体温が10℃以下に下がると自発呼吸を停止した。100％酸素での呼吸を開始した。５℃で、静脈カニューレのキャップを外し、約0.3ml/分の流速で、3.5mlの溶液Aを動脈に注入した。その後、溶液Aと４mM KCl、1.0Mグルコース、４％プロパンジオールを含む凍結防止溶液（すなわち、1.8gのグルコースおよび0.4gのプロパンジオールを含む溶液10ml）を4.5ml輸液した。潅流の間、静脈の流出液を集めた。潅流の間に、動物の体温は徐々に0℃に低下した。潅流の開始から５分後に、呼吸が停止した。このとき、患者の血液の30％以上が除去されていた。心臓は拍動を続け、最終的に停止した。前段落で説明した凍結防止溶液での潅流の後に、動物をフリーザーに一晩置いた氷点下のNaClスラッシュ（0.6M）溶液の中に入れた。
フリーザーの温度は平均-５℃に保った。動物をフリーザーに入れてから15分後に、その直腸温度は０℃から-1.0℃に低下した。12時間後の動物の直腸温度は-2.5℃であった。そして動物を、Quasar商業用台所用電子レンジで７秒間の加温を１周期として約2.5℃の温度に温められた。加温は１分間隔で行った。動物を凍結するのに18周期の加温を要した。
動物を再び手術台にのせ、EKG誘導と直腸体温計のプローブを備え付けた。3.5mlの溶液Aを、約0.2ml/分の流速で頚動脈に潅流した。動物の体温は５℃以下に保った。そしてハムスターは全血で潅流し、徐々に温めた。
２mlの血液を潅流し、動物の温度が13℃に上がった後、周期的なEKGシグナルがとらえられた。潅流と加温を続けるとともに、シグナルの振幅が大きくなり、振動数が増加した。5.5mlの血液を潅流し動物の温度が25℃に達した後、動物を開胸すると、心臓が継続して拍動するのが観察された。
実施例４.高圧酸素治療室での血液代用品の合成溶液
前もって一晩絶食した、40gのハムスターに、0.03mlのケタミン（100mg/ml）を筋肉注射した。ハムスターを体温が15℃に下がるまで粉砕した氷に入れた。ハムスターを砕いた氷から取り出し、マイクロ手術のために実体顕微鏡の下に据え付けられた温度調節台に、腹側を上にして置いた。ハムスターの温度は、12℃から15℃の間に保った。
右の鼠径部の切開に続き、右の伏在動脈と静脈を露出させた。伏在静脈はカニュレーションされ、0.1mlのヘパリンが注入され、そして出血を防ぐためにカニューレにキャップをした。
それから右の伏在動脈をカニュレーションし、カニューレを溶液Aで満たされたチューブに簡単につないだ。チューブは蠕動ポンプの先を通った。動脈カニューレに血液が無いようにするため、少量の溶液（約0.3ml）を注入した。動脈と静脈の両方のカニューレを縫合糸で動物に固定した。動脈カニューレにキャップし、動物を高圧酸素治療室（HBO）の中の台の上へ移した。温度プローブを直腸に挿入した。
動脈カニューレは、蠕動ポンプを通り、貯蔵槽に入るチューブにつながれた。チューブと貯蔵槽は、４mM KClを含む溶液Aで満たされた。
静脈カニューレからキャップを外し、HBO室を閉鎖して加圧した。蠕動ポンプのスイッチを入れ、動物を溶液で潅流して、その血液のほとんどを置き換えたこの血液は、静脈流出液として動物から除去された。最終的なチャンバーの圧力は周囲よりも1.5atm高くなり、そのまま保たれた。動物への溶液の流速は、約0.3ml/分であった。ハムスターは、HBO室で置かれた温度調節台を用いて、14℃から16℃の間に保たれた。
心臓の活動と呼吸は、この潅流の間を通して維持された。血液を置換しているハムスターに、さらに４mM KClを含んだ溶液Aを15ml注入した後、室内を徐々に減圧した。
それからチャンバーを開放し、ヘマトクリット用の検体を採取した。ヘマトクリット値は、５％であった。静脈と動脈のカニューレにキャップをし、チャンバーを閉鎖して、周囲よりも1.5気圧高く加圧した。
動物は、血液を除去してから４時間、チャンバーの中で自力で呼吸していた。このあと、チャンバーを徐々に減圧した。同時に、動物を12℃に冷やした。チャンバーを開放し、動物を他の手術台へ移動した。動物に氷をのせ、0.2ml/分の流速で全血を動物に潅流し、溶液を静脈流出物として洗い出した。
１mlの血液を潅流した後、氷を除去した。ハムスターの体温は４℃であった。継続的な輸血によってヘマトクリット値が上昇するに従って、動物は徐々に温められた。
１mlの血液が返された後、人工呼吸を開始した。動物の心臓は周期的に拍動することを全く停止しなかった。21℃で、動物は自力で規則正しく呼吸していた。人工呼吸を停止し、動物の温度が25℃に達するまで加温と輸血を続けた。ハマトクリット値は40％と測定された。潅流を停止し、カニューレを除去し、血管を結紮して切開を閉じた。
この操作の１時間後、動物は非常に活発で敏捷であった。この実験の４時間後、動物は飲食していた。上記の操作の終了の24時間後、行動に関しては全く正常に思われ、実験の後数週間生き延びた。
実施例５.ハムスターの氷冷血液代用品
およそ１カ月齢の46gのハムスターに、0.02mlのベタラールおよびケタミンの100mg/ml溶液を筋肉注射した。動物を、直腸温度が約12℃になるまで、砕いた氷で囲んだ。それから動物を砕いた氷から取り出し、実体顕微鏡下に動物を冷やして置いておけるように設計された手術台の上へ腹側を上にして置いた。四肢は固定し、EKG誘導と直腸体温計を備え付けた。
右の鼠径部を切開した。カニューレを右の伏在静脈に入れ、0.02mlのヘパリン溶液（250U/ml）をカニューレを通じて動物に注入し、そしてカニューレにキャップをした。そして右の伏在動脈がカニュレーションされた。カニューレはプラスチックチューブのルーレ状の扇形部分につながれており、チューブは蠕動ポンプを通って、0.05Mグルコースを含む溶液Aが入った貯蔵槽に入っていた。チューブの先端は、メッシュの血液濾過物質がラバー製の「O」リングで固定された18Gの皮下注射針に挿入されていた。ポンプのスイッチを入れ、貯蔵槽の溶液をチューブを通って動物の伏在動脈に注入した。動物の温度が９℃に低下したとき、100％酸素での換気（20回/分）を開始した。動物は直腸温が４℃になるまでさらに冷却し、伏在静脈に挿入されている24G血管カテーテルに、0.1mlの0.2M KClを注入した。この注射によって心臓が停止し、EKGシグナルが停止した。ポンプのスイッチを入れ、溶液Aを約0.2ml/分で動脈に潅流する一方、静脈流出物が集められた。潅流の間、動物の温度は１℃近くに低下した。４mlの溶液が動物に潅流された後、ポンプを止め、血液の循環を止めたまま、動物を砕いた氷の中に２時間おいた。それから動物はおよそ７mlの全血（他のハムスターの血液のドナーから集められたもの）で潅流され、デスクランプを用いて徐々に温められた。潅流の間、静脈流出物を集めた。10℃で、動物が血液の循環を止めて３時間11分経ってから、EKGシグナルのモニター上で心拍が最初に観察された。それから100％酸素を用いて動物の換気（６回/分）を開始した。動物がさらに温められ、心拍がより強く速くなるにしたがって、換気の割合は約１５回/分に増加した。動物の温度が28℃になったとき、動物は自力で呼吸をしはじめ、刺激に反応するようになった。潅流を停止し（ヘマトクリット値は44％）、カニューレを除去して切開を閉じた。このハムスターは明らかに正常な健康状態で実験後何週間も生き延びた。
実施例６.氷冷ハムスターの心拍の回復
（一晩）絶食した、45gのメスのハムスターに、0.03mlの麻酔薬ケタミン（100mg/ml）を筋肉注射した。ハムスターは、体温が14℃に低下するまで、砕いた氷に沈められた。そして動物を手術台にのせられ、EKG誘導と直腸体温計のプローブを備え付けた。実体顕微鏡を用いて、頚動脈と径静脈を外科的に露出させた。動物の体温は10℃から14℃に保った。頚動脈と径静脈にカニューレを挿入した。蠕動ポンプを通り、溶液Aに11mM KCl、1.0Mグルコース、４％プロパンジオールを添加した凍結防止溶液が入った貯蔵槽に続くチューブに、動脈カニューレを接続した。静脈カニューレは、砕いた氷と温度を-1.0℃付近にセットした手術台で、動物の体温が５℃に下がるまで、はじめキャップしておいた。
体温が10℃に下がると、動物は自力で呼吸するのを停止した。このとき、動物を100％酸素で換気した。動物の温度が５℃になったとき、静脈のキャップを外し、ポンプを0.20ml/分の流速で作動させた。動物は21分後に心拍が停止し、潅流の開始から５分後に換気を停止した。潅流の間、血液は静脈の流出物として集められた。およそ４mlの凍結防止溶液Aが動物に注入された。それから動物は温度が-２℃の食塩と氷のスラリーで囲まれた。スラリーと動物を入れた容器は、-５℃にセットされた温度槽の中に入れられた。動物の直腸温度は徐々に低下し、朝には-3.4℃になった（動物が低温槽に入れられてから18時間後）。容器を低温槽から取り出した。スラリーは凍って固まった。それを氷温の水で融解した。「スラリー」を除去してみると、動物は凍っているようだった。それから動物を台所用電子レンジに入れた。電子レンジは、７秒間、「温め」にセットした。動物を、20秒周期の７秒加熱のサイクルに、約20回かけた。そうして動物を解凍し、直腸温度を約２℃にした。
動物は再び手術台に載せられ、頚動脈に溶液Aを輸液された。凍結防止溶液は、静脈流出物として集められた。約３mlの溶液Aが、0.15ml/分の流速で動物に潅流された。そしてハムスターのドナーから集められた血液が、同じ流速で輸血された。ハムスターの動脈に２mlの血液が潅流された後、ハムスターをデスクランプでゆっくりと温めた。輸血と加温が続けられるにつれ、動物の温度は15℃を越え、強い周期的なEKGシグナルが記録された。外科的に開胸し、実際に心拍を観察することができた。
実施例７.高圧酸素治療室での血液代用品としての合成溶液
43gのメスのハムスター（一晩絶食したもの）に、0.02mlのケタミン（100mg/ml）を筋肉注射した。ハムスターを、体温が約14℃になるまで砕いた氷に入れた。そしてハムスターを、腹側を上にして、マイクロ手術用に実物顕微鏡の下に置かれた、温度制御の手術台に載せた。ハムスターの温度は12℃から15℃の間に保たれた。右の鼠径部に切開を入れ、右の伏在静脈と動脈を露出させた。伏在静脈にカニューレをさし、0.1mlのヘパリン（250U/ml）を注入し、出血を防ぐためにカニューレにキャップをした。そして右の伏在動脈にカニューレをさし、カニューレを、蠕動ポンプを通り、溶液Aの入った貯蔵槽に続くチューブへ接続した。動脈のラインに血液が無いようにするため、少量の溶液（つまり、0.2ml）を注入した。静脈と動脈の両方のカニューレが動物に固定された。動脈のカニューレにキャップし、動物を高圧酸素治療室の温度制御の手術台に移した。動物の直腸温度は13℃から18℃に保たれた。ハムスターをこの範囲の温度に保つ目的は、動物の自力での呼吸と刺激への反射的な反応性を確保しつつ、動物の活動性を低く保つことである。
動脈カニューレを、蠕動ポンプを通り、、溶液Aと2.5mM KClが入った貯蔵槽（チャンバーの中）に入り、チャンバーの外を通るチューブに接続した。静脈カニューレからキャップを外し、約0.2ml/分の流速でポンプを動かした。溶液が動物に潅流されると、静脈流出物（血液）が集められた。チャンバーを速やかに閉鎖し、徐々に加圧して20psiから24psi（100％酸素）にした。圧力下で約１時間潅流した後、約１時間以上かけてチャンバーを減圧した。それから潅流を停止した。合計で約13mlの溶液を動物に潅流した。ヘマトクリット値の測定のために静脈流出物の検体を採取した後、カニューレにキャップをした。動物を再び手術台に置かれ、カニューレを除去し、手術創を閉じた。動物にほとんど血液が無く、室内の空気で呼吸している間は、動物は非常にわずかな反射活動を見せた。動物をすみやかにチャンバー内の箱の中に入れ、徐々に20psiに加圧した。チャンバー内には、ハムスターの餌と水を用意した。ヒートランプを用いてチャンバーとハムスターを温めた。チャンバー内の圧力を、５psiまで徐々に（１時間以上かけて）下げた。動物の活動が増して、すっかり活発になるまで１時間以上かかった。動物はチャンバーの中で約16時間、５psiに保たれた。それから圧力を徐々に0.5psi（100％酸素）に下げ、その圧力で24時間保った。そして動物をチャンバーから出し、普通のケージにいれた。動物は実験の後数週間にわたって全く正常であった。
実施例８.血液置換哺乳類における塩化カリウムと混合した溶液Aの使用
この例８では、パテイオ・アヌビス(Patio anubis)の幼いオスのヒヒに60mgのケタミンを筋肉注射した。22Gx1-1/4インチのカテーテルを右の頭部の静脈に刺し、３mlの2.5％ペントタール(pentothal)を静注した。動物に気管内挿管し、手術台に載せ、100％O2と0.7〜2.5％フレサー(Flether)で換気し、動物の活動を滴定した。目はラクリルーブ(lacrylube)で保護した。
換気装置を１分あたり18回（bpm）にセットし、１回呼吸量を240mlにし、呼気/吸気比を37％にした。気道の圧力をおよそ10mmHgに保ち、各呼吸ごとに供給される体積を、CRTまたはstrip-chart記録器で感知される気道圧力から求めた。気道圧力はコンピュータでオンラインでモニターした。
動物の体毛を剃り、乳酸リンゲル液を1〜3ml/分の流速で、動物の動脈の血圧を滴定した1〜3ml/分の流速で、静脈内への滴下を開始した。テラマイシン(Terramycin)を投与した。
体外循環は、血液酸化装置、血液貯蔵槽、ポンプからなり、二次的なインラインの熱交換機を動物にできるだけ近づけて設置した。さらに外部に氷水の貯蔵槽を装備した。氷水の貯蔵槽には、酸化装置に備え付けられた熱交換機に供給するためのポンプが付いていて、二次熱交換機に対しても同様に、氷水を循環させた。血液ないし血液代用品に接するチューブは全て滅菌した。酸化装置、貯蔵槽、回路は、２リットルの溶液Aで満たした。
酸化装置の貯蔵槽とバイパス回路の２リットルの溶液AにKCl（2.0M、４ml）を加えてKCl濃度を４mMにした。動脈の血圧のモニター用の５F NIHカテーテルを左の上腕動脈に導入した。それに三方活栓をつけた（操作の全体にわたって10〜60分ごとに動脈血のサンプルを採取するため）。各々のサンプルについて血液ガス分圧、pH、Ｋ+、ヘマトクリット値を測定し、一部では電解質と酵素も測定した。カテーテルを圧トランスデューサーに接続した。中心動脈圧（CAP）をモニターするために、トランスデューサーをコンピュータにつないだ。その他の温度や圧力のパラメーターも、同じコンピュータでオンラインで測定された。
中心静脈圧（CVP）をコンピュータでモニターするために、６F NIHカテーテルを左の上腕静脈の遠位の枝に挿入した。開胸し、左心房圧をモニターするために６F心カテーテルを左心房に挿入した。
10F動脈カテーテルを左の伏在動脈に挿入し、16F静脈カテーテルを左の塾剤静脈に挿入した。メチルプレドニソロン（80mg）を静脈内に投与した。食道チューブを挿入し、マーロックスを３ml投与した。食道チューブにサーミスタプローブを付けて、深部の食道温度を記録した。長時間にわたる手術のため、ヒヒは５時間麻酔をかけられた。EKG誘導をつけてから、動物をネットスリングに置き、絶縁した氷の容器に下ろした。それから砕いた氷の中へ沈めた。砕いた氷の中で１時間６分冷やした後、体温は23℃に下がった。ニプリド（25mgの塩化ニトロプルシドを500mlの５％デキストロース水溶液に溶かしたもの）の輸液を、６ml/時間の流速で始めた。17分後、温度が21℃に下がったとき、動物をバイパスにつないだ。
そのとき、200mlの全血が静脈流出物として動物から除去された。サルの循環をバイパス回路から遮断していたクランプを外し、２M KClを添加した溶液A（最終濃度は２mM KCl）を２リットル、動物の血液と置き換えた。つづいて、２M KClを15ml静脈内に投与し、心臓を停止させた。
４リットルの溶液A（２M KClが22ml添加されたもの）で循環溶液を置き換えるまで、血液と血液代用品の混合物が静脈流出物として除去された。50分間、冷やした血液を置き換えた後、霊長類の温度は３℃に下がった。動物内の流れはよく、肺楔状圧が伏在動脈の潅流にしたがって僅かに上昇する傾向がみられた。流量の増加と比較的急激な温度の低下は、ニトロプルシドの使用や、冷却の間の比較的長い麻酔の使用が関係し、冷却するにつれ動物をいくらか活動的にしていたようだった。
血液の置き換えに続き、動物の循環を１時間40分間停止した。この停止期間の終わりに、回路に氷冷の溶液Aを２リットル加え、２リットル置き換わったものを静脈流出物として除去した。記録された最低体温は2.8℃であった。それからふたたび加熱した。13分間加熱すると、動物の体温は10℃になり、血液と血液代用品が１：３の比の混合物を800ml、つづいて１：１のものを450ml、そして最後に全血を約１リットル回路に加えて、溶液Aをおきかえた。
動物に血液を導入した直後、心拍が感知された。１時間22分後、40mlのNaHCO3を静脈内に投与した。機械的換気を開始し、ドーパミン（250ml中に200mg）を30ml/時間で点滴した。CaCl2（50mg）も静脈内に注入した。およそ１時間後、体温が正常近くに上昇したとき、動物からバイパスを外し、全血を点滴した。動物の血液ガス分圧と血圧は正常な範囲に落ちついた。
１時間後、カニューレを除去した。動物は開胸してカテーテルを入れていたため、潜在的な胸部の感染を治療する間、飼い慣らされていないヒヒを再び拘束する取り扱い状の問題から、動物を手術後長期にわたって管理することは適切でないと判断された。もう１時間後に換気を停止すると、動物は苦しむような動きを見せ、心停止に至った。サルの血圧と血液ガス分圧は一定であったので、動物が10℃（深部食道温）で２時間30分間血液を置き換えられた後、生き延びる能力を持っていたことは明らかである。
実施例９.霊長類の血液代用品を添加しない溶液Aの使用
この例では、幼いオスの８kgのヒヒ、パテイオ・アヌビスを冷やし、10℃以下で１時間22分間血液を置き換えた。この低温での血液の置き換えに先立って、４F 60cmのスワンガンズ(swan-Ganz)カテーテルを、右の大腿静脈から肺動脈に設置した。開胸術なしで、肺動脈楔入圧が測定できた。
温度が28℃になったとき、ニトロプルシドを用いて動物を軽く麻酔した状態に保ち、バイパス回路の流量を増加した。操作の全体は円滑に行われたが、実験の終わりに大量の血栓ができたために発熱した間、クエン酸を添加した血液を与えた後、塩化カルシウムを50mg静脈内に投与した。このとき、心臓血管系にはヘパリンが全くなかった。
手順  ヒヒにケタミンを70mg筋肉内に注入した。22Gx1-1/4インチのカテーテルを左の頭部の静脈に挿入し、2.5％のペントサルを３ml静脈内に注入した。それからサルに気管内挿管し、Ｘ線室に移動した。Ｘ線撮影台に乗せ、100％O2に１％のイソフロレン（又は、フレザー（Flether））の混合物で換気し、４F 60cmのアローエッジ（arrow wedge）カテーテルを、右の大腿静脈から肺動脈に入れた。
換気は、20bpm、一回拍出量を200mlにセットし、吸気/呼気比は37％であった。気道内圧はおよそ10mmHgにたもたれ、各呼吸ごとの体積は、CRTまたはストリップチャート（strip-chart）記録器で気道内圧を感知して測定された。気道内圧はコピュータによってオンラインでモニターされた。
動物の毛を剃り、動物の動脈圧にあわせて乳酸リンゲル液を約1〜3ml/分で点滴した。
体外循環回路については、前述の例で説明した。酸化貯蔵槽と回路は２リットルの溶液Aで満たした。
20ゲージのハイドロメア（hydromere）カテーテルを右大腿在静脈に付け、中心静脈圧（CVP）をコンピュータでモニターできるようにした。サンプリングできるように三方活栓をラインにとりつけた。動脈圧をモニターする20ゲージのハイドロメア（hydromere）カテーテルは、右の上腕動脈に入れられた。それにも三方活栓をつけた（操作の全体にわたって10〜60分ごとに動脈血のサンプルを採取するため）。各々のサンプルについて、血液ガス分圧、pH、Ｋ+、ヘマトクリット値を測定し、一部では電解質と酵素も測定した。カテーテルを圧トランスデューサーに接続した。中心動脈圧（CAP）をモニターするために、トランスデューサーをコンピュータにつないだ。その他の温度や圧力のパラメーターも、同じコンピュータでオンラインで測定された。
14F静脈カテーテルを左の大腿静脈に挿入し、10F動脈カテーテルを左の大腿動脈に挿入した。静脈カニューレを挿入した後、2.6mlのヘパリンを静脈内に注入した。食道チューブを挿入し、マーロックスを３ml投与した。食道チューブにサーミスタプローブを付けて、深部の食道温度を記録した。メチルプレゾニン（80mg）を静脈内に注入した。目をラクリルーブでおおい、保護した。動物に軽く麻酔をかけるため、１mlのペントサルを静脈内に投与した。
EKG誘導をつけてから、動物をネットスリングに置いた。それから砕いた氷の中へ沈めた。砕いた氷の中で29分冷やした後、体温は28℃に下がった。動物を軽く麻酔がかかった状態に保ちフレザーを切ると温度は30℃以下に下がった。ニプリド（nipride）（25mgの塩化ニトロプルシドを500mlの５％デキストロース水溶液に溶かしたもの）の輸液を、20ml/時間の流速で開始し、それから40ml/時間に増加させた。20分経ってから、血圧と体温が低下するのに応じて、ときどきニプリドの点滴を入れたり切ったりした。27分後、動物をバイパスにおき、温度が23℃に下がったとき、点滴を止めた。そのとき、サルの循環をバイパス回路から遮断していたクランプを外し、２リットルの溶液Aで動物の血液を置き換え、全血と希釈された血液が静脈流出物として除去され、回復のときのためにとっておいた。つづいて、２M KClを15ml静脈内に投与し、心臓を停止させた。
４リットルの溶液Aで循環溶液を置き換えるまで、血液と血液代用品の混合物が静脈流出物として除去された。39分間、冷やした血液を置き換えた後、霊長類の温度は４℃に下がった。動物内の流れは速かった。正確に測定された肺循環圧から、循環がよく、楔形カテーテルがきちんと入っていることが示された。
10℃以下で血液を置き換えた50分後、最低の体温の記録は2.9℃であった。それからふたたび加熱しはじめ、28分間加熱すると、動物の体温は10℃になり、750mlの全血を回路に加えて溶液Aを置き換えた。
動物に血液を再潅流した８分後、心拍が感知された。動物が加温される間、30分後に、10mlのNaHCO3を静脈内に投与し、CaCl2（50mg）も静脈内に注入し、80mgのプレドニソロン(prednisolone)も同様に注入した。CaCl2を添加して数分以内に、大量の血栓形成がみられた。これは、クエン酸によって抗凝固されていた血液が、CaCl2の添加によって凝集したためと考えられた。そして実験を停止した。
この実験では、左心房圧が許容できる範囲で低く保たれていたことから、動物および循環回路内の血液代用品の流速は高かったとみられる。この原因となったと考えられる要素は、ニトロプルシド(nitroprusside)の使用や、冷却の間、軽く麻酔がかかった状態に保ったりしたことである。１〜２mlのヘパリンを再投与の前に動物に添加することができる。再投与する血液をヘパリン処理すれば、この実験を予想外の結果に導いた大量の血栓をなくすことができると考えられる。
実施例10.HLB溶液を含んだ、イヌにおける氷冷の血液代用品
部分的な心肺バイパスにつながれた、25〜30kgのイヌを用意する。イヌの体表面と中心を、氷点近くに冷却する（1〜3℃）。例１にあるように、イヌの血液をHLB溶液を含んだ低体温の血液と置き換える。再加温の時の輸血用に、血液を保存しておく。動物の体温を氷点近く（４℃以下）にし、そして再加温する。血液代用品を血液と再び置きかえる。
準備  イヌの右の撓骨静脈からペントサルを静脈内に注入し、気管内挿管し、100％酸素にイソフロレン（またはFlether）を添加したもので換気して、カテーテルを挿入する。イヌの動脈の血圧にあわせて、乳酸リンゲル液の点滴を始める（静脈内に、およそ40ml/時間）。氷水を循環させて冷やしたクーリングブランケットにイヌをのせる。血圧（CAP）をモニターするために右の頚動脈にカテーテルを入れ、操作の全体にわたって動脈血を10〜60分ごとに採取できるように、三方活栓をラインにつなぐ。操作の全体にわたって尿を集め、体積を測定するために、カテーテルを挿入する。右の頚静脈あるいは右の大腿静脈から、２層、７Fのスワンガンズエッジ（Swan-Ganz wedge）カテーテルをいれ、右心を通って肺動脈にいれる。遠位のものを肺楔入圧（PAW）を測定するのに用い、近位のものを中心静脈圧（CVP）を測定するのに用いる。（必要であれば、CVPは上腕静脈からカテーテルを挿入して測定してもよい。）カニュレーション用に、左の大腿動脈と静脈を独立させる。動物をヘパリン処理する（およそ5,000U）。バイオメディクス（Biomedicus）静脈返血カニューレ（15〜19F）を大腿静脈に挿入し、バイオメディクス動脈カニューレ（12〜15F）を大腿動脈に挿入する。（血液の置換まで）45分ごとに活性部位凝固時間（ACT）を測定し、400秒以上になるようにヘパリンを調節する。サーモカップルを食道チューブのほぼ中央に付けて、チューブが胃に入るようにユニットを挿入する。第２のサーモカップルは、直腸に入れる。ECG誘導をとりつける。ソル・デル・コルテフ（Solu-Delta-Cortef）（アップジョン(Upjohn)社、プレドニソロン酢酸ナトリウム）80mgを静脈注射する。目をテリムシン（Terrimucin）（またはラクリルーブ）でおおい、食道チューブからダイゲル（DiGel）（またはマーロックス（Maalox）20ml）を加える。
測定  各々の血液サンプルに対して、動脈血ガス分圧、pH、ヘマトクリット値を測定し、一部については、電解質、酵素、その他の化学物質についても測定する。食道と直腸の温度と同様に、動脈の流入、静脈の返血の温度をモニターする。CAP、PAW、CVP、ECG、気道内圧をモニターする。温度は、デジタルで表示され、時間の関数としてコンピュータのデータ捕捉システムに保存されなければならない。圧力とECGは、リアルタイムの波形または数値のデータとして表示され、コンピュータに保存されなければならない。
バイパス回路の構成  回路は、バイオメディクス遠心型血液ポンプと流速計、熱交換機内蔵のテルモ（Terumo）中空繊維膜式酸化装置、フィルター付きのシェル（Shell）ハードシェル静脈貯蔵槽、完全バブルトラップ付きの二次熱交換機（Electromedics）から構成され、できるだけ動物に近づけて設置される。濾過部分は静脈貯蔵槽の入り口付近に設置され、端にチェックバルブが付いている。これで急激かつ効率的に血液/血液代用品が交換される。バイパスのない場合には、A-Vシャント部分で循環できる。
クイックプライム（quick prime）口を通る１リットルの分離した漏斗と、心臓方向の入り口の一つを通る複式輸血バッグのいずれからも貯蔵槽を満たすことができる。酸化装置から動脈カニューレとA-Vシャントへの動脈回線は、1/4"チューブで構成されていて、静脈の返血、濾過、ポンプの回線は3/8"で構成されている。これらの部品はきつく曲げられることがあり、ヘビーウォール（heavy-wall）チューブを用いるか、またはチューブをスパイラル  ラップ（spiral wrap）で包むかする。
患者のループは二重に巻かれ、回路全体（工業的に滅菌された貯蔵槽、二次熱交換機、酸化装置を除く）は、６つの基本的な部分（ポンプの揚程、流速計部分、中枢のバイパスループ、漏斗、輸血回線、ガスフィルター回線）に分けて、エチレンオキサイドガスで滅菌する。
バイパス回路の支援  ２つの10ガロンの絶縁貯蔵槽のうちの１つから氷水をポンプでくみ出し、酸化装置と二次熱交換機を冷却するのに用いる。その他の貯蔵槽は、クーリングブランケットに供給する。手術が始まったら、氷水がクーリングブランケットを循環する。バイパスが始まったら、室温の水が回路の熱交換機を循環する。
食道と血流の温度差が７〜10℃になるような量の氷を貯蔵槽に加えて、徐々に温度を下げる。血液を置換した後（つまり、ヘマトクリット値が約４％以下）、完全な氷水の流れが始まる。
再加温の際、貯蔵槽から氷を取り除き、ヒーターを作動させる。加温水流の温度は、ヒーターのサーモスタットを手動で調節して、最高で静脈の返血の温度よりも10℃高い温度にとどめる。酸化装置には、滅菌し、フィルターにかけた100％O2を供給する。
血液の置換  回路に２リットルの溶液Ｌ（例１）を通し、温度-ガス平衡を確認するためにA-Vシャントに再循環させた。カニューレを、バイパス回路の動脈と静脈の回線に接続し、回線を鉗子でとめたままにしておいた。深部食道温が35℃になるまで患者をクーリングブランケットで包み、体表を冷やした。
鉗子を外し、室温（およそ25℃）で溶液Ｌで希釈した血流で、バイパスを開始した。冷却を開始した時点でガス麻酔を停止し、イヌは2.5％ペントサルで維持された。
血流を徐々に冷却して動物の食道温度を20℃にし、そのとき、静脈の返血を貯蔵槽の入り口で鉗子をかけて止めて、溶液Ｌを輸液している間に濾過部分から取り出して、血液を除去した。この交換の間、２リットルの溶液Ｌを静脈貯蔵槽に追加し、溶液Ｌの水位が250mlまで落ちたら、およそ６リットルのHLBを、血液が全て除去されるまで、段階的に加える（目での観察で、HCTは２％未満）。滅菌された容器におよそ４リットルの血液/血液代用品混合液が集められ、再輸血用に保存される。希釈されすぎた血液混合液（約5.5リットル）は廃棄する。
４リットル交換した後（つまり、２リットルの溶液Ｌと２リットルのHLB溶液を加えた後）、二次熱交換機のバルブから20meq KClを注入し、心臓を停止させる。交換の間、PAWが5mmHg以下に保たれ、流入と流出の速さが等しくなるように、流入量を調節した。つまり、体積平衡に近づけた。交換の終わりには、貯蔵槽の最終的な水位は約500mlになり、PAWは5mmHgより低く、CVPも5mmHgより低い。体積平衡（一定の貯蔵槽の水位と上記の圧力。つまり、PAW＜5mmHg、CVP＜5mmHg）が維持されるように、流れを調節する。
血液のほぼ全てが除去されたとき（目による観察でHCTが４％未満）、冷却水の温度を（貯蔵槽に氷を入れて）氷水の温度に下げられ、イヌはその最低温度まで急激に冷却される。低温潅流の間にHCTが上昇するのが観察されれば、血液の混合液は上記の方法による、２から４リットルのHLB溶液で交換することにより、除去される。
全操作の間、動脈血のサンプルを採取し、血液ガス分圧、pH、HTCをモニターし、一部については電解質、その他の化学物質についてもモニターする。
１〜２時間の血液交換の冷却の間、イヌの温度は約１〜４℃になり、再加温が始まる。供給貯蔵槽から氷を取り除き、その中身をヒーターで温めるとブランケットが暖まり、イヌが再加温される。食道温度が15℃にあると、25gのマンニトールを含んだ４リットルの溶液ＬがHLB溶液と交換され、つづいて４リットルの回収した血液の混合液と交換される。流出物は廃棄される。
動物は穏やかに温められ、血流の温度は10℃未満から40℃以下で変化する。心臓は直ちに拍動し始める。動物の温度（食道および直腸）が約35℃になり、生理学的なパラメータが安定し、自己を維持できるようになると、体外循環回路から外すことができる。
実施例11.氷点下で血液置換をしたイヌの回復
26.8kgのオスのイヌにネンブタールで麻酔をかけ、気管内挿管した。手術室に移動し、換気し、静脈、フォーレイ（Foley）、動脈、スワンガンズ（Swan-Ganz）カテーテルを挿入し、ヘパリンを静脈注射した後、右の伏在動脈と静脈にカニューレを挿入した。食道チューブを挿入し、制酸薬を投与した。温度センサーを食道と直腸に設置した。メチルプレドニソロンを静脈注射した。
動物をクーリングブランケットで包み、体表の冷却を開始した。動物のカニューレは、ボルテックス（vortex）血液ポンプ、発熱機内蔵の酸化装置、直列の二次熱交換機、血液および血液代用品の急激な投与のための漏斗で構成されたバイパス回路に接続された。イヌから全血（225ml）を除去し、再加温のためにとっておいた。血液は速やかにHLB溶液で置換された。1.05リットルのHLB溶液を含んだバイパス回路が動物に開かれ、核心の冷却が始まった。
33リットルの血液代用品が交換された。氷点下に達するまでに、ヘマトクリット値は１％をはるかに下回った。動物の深部食道温度は４時間５分の間10℃よりも低く、0.7℃の最低温度を記録した（表２）。
低体温期に続いて、動物を温めた。体温が10℃を過ぎたとき、静脈流出物と前もって集められた全血及び、提供された血液を回路に戻した。ヘマトクリット値は、温度の上昇に伴って増加した。リドカインと重炭酸塩を投与し、心臓の細動を止め、換気を開始した。血圧と体温がほぼ正常になったとき、動物をバイパスから外し、プロタミンおよびラシックス(Lasix)を注入した。加温の数時間後、動物は覚醒し、刺激に反応した。動物は実験後、生き延び、健康であった。
実施例12.氷点下で血液を置換したヒヒの蘇生
24kgのオスのヒヒ、パテイオ・アヌビスに、はじめケタミンとアセプロマジンを筋肉注射し、それからペントサルを静脈注射して麻酔をかけた。気管内挿管し、換気し、静脈、フォーレイ、動脈カテーテルを挿入した。動物をクーリングブランケットで包み、体表の冷却を開始した。
ヘパリンを静脈注射した後、ヒヒの右大腿動脈と、並行する静脈にカニューレを挿入した。温度センサーを食道、直腸、脳に設置した。動物に、EKG、体性感覚の電極（SSEPs）、EEGをとりつけた。デキサメタゾンを静脈注射した。
動物のカニューレは、ボルテックス（vortex）血液ポンプ、ヒートジェネレーター内蔵の酸化装置、直列の二次熱交換機、血液および血液代用品の急激な投与のための漏斗で構成されたバイパス回路に接続された。ヒヒから全血（300ml）を除去し、再加温のためにとっておいた。その体積は、速やかに300mlの生理食塩水で置換した。２リットルのプラズマライト（Plasmalyte）（商業的に入手できる電解質溶液）を含んだバイパス回路が動物に開かれ、中枢の冷却が始まった。
深部食道温度が13℃を下回ったとき、12.5gのマンニトールを含んだプラズマライトをもう２リットル回路に加え、先に回路を満たした血液とプラズマライトの混合物を置換した。この希釈された血液は加温の際に使用するため、保存した。直後に、10リットルのHLB溶液を加えプラズマライトを置換した。氷点下に達したときには、ヘマトクリット値は１％をはるかに下回っていた。動物の脳の温度が3.4℃になり、深部食道温度が2.8℃になったとき、血液ポンプを停止し、45分間循環の停止した状態（心停止）に動物を維持した。この後、循環を再開した。
低体温期に続いて、4.2リットルのHLB溶液をバイパス回路に加えて動物を温めた。体温が15℃に達したとき、２リットルのプラズマライトを回路に加えてHLB溶液を置換した。マンニトール（６，２５ｇ/l）をプラズマライトに添加し、回路に加えた。さらに、静脈流出物と前もって集められた全血、提供された血液及び新鮮な冷凍血漿を回路に戻した。動物のヘマトクリット値は、温度の上昇に伴って増加した。マンニトールをもう12.5g回路に加えた。食道と直腸の温度がほぼ正常になると、加温の間、細動していた心臓が拍動し始め換気も行われはじめた。血圧と体温がほぼ正常になったとき、プロタミンを静脈注射し、動物をバイパスから外し、カニューレとカテーテルを除去し、切開を閉じた。
動物の深部食道温度は３時間の間15℃を下回り、２時間17分の間10℃を下回り、記録された最低温度は2.8℃であった（表３）。次の朝、動物はケージの中でまっすぐに座り、バナナをつまみ上げて食べ、同様にリンゴジュースを飲んだ。動物は、１週間以上後に組織学的検査のために殺されるまで生き延び、健康であった。
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上記に説明しそして以下にクレームする本発明は、種々の操作において有用な新規の溶液を包含する。当業者は、本明細書と請求の範囲とが開示するものを参照し、開示した本発明の本質から離れることなく、本発明にある程度の追加あるいは修飾を加えることができる。