(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット核酸の特定の配列の領域に相補的な配列を含み、３’末端から３塩基目の塩基が前記ターゲット核酸配列と相補的でない塩基であるプライマーを、前記ターゲット核酸にハイブリダイズさせる工程と、
複数の核酸基質とポリメラーゼとを用いて、前記ターゲット核酸を鋳型とし、前記プライマーを始点とする相補鎖伸長反応を行なわせる工程と、
前記相補鎖伸長反応の反応副産物として生じるピロリン酸をＡＴＰに変換し、前記ＡＴＰと酵素を用いて発光反応を行なわせる工程と、
前記発光反応で生ずる発光を検出する工程とを有し、前記特定の配列の領域は１塩基置換の部位を含み、前記プライマーは前記３’末端が前記１塩基置換の部位と相補鎖結合を生じ得るものであり、前記検出する工程では前記１塩基置換の有無を検出することを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
１塩基の前記相補鎖伸長反応ごとに複数の種類の前記基質もしくはこれらの類似体を加えて、前記相補鎖伸長反応を行なわせることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
前記相補鎖伸長反応を行なわせる工程では、前記相補鎖伸長反応により生じる伸長相補鎖を酵素で分解する工程と、前記分解する工程の後に前記プライマーを前記ターゲット核酸に再度ハイブリダイズさせて前記相補鎖伸長反応を行なわせる工程とを有することを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
前記酵素として５’→３’エキソヌクレアーゼを用い、前記ターゲット核酸の５’末端について、前記５’→３’エキソヌクレアーゼにより分解されないように予め処理を行なうことを特徴とする請求項３に記載の核酸検出方法。
【請求項５】
前記酵素として３’→５’エキソヌクレアーゼを用い、前記プライマーの３’末端について、前記３’→５’エキソヌクレアーゼにより分解されないように予め処理を行なうことを特徴とする請求項３に記載の核酸検出方法。
【請求項６】
前記相補鎖伸長反応は、前記プライマーの複数塩基長の伸長であることを特徴とする請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項７】
ターゲット核酸の特定の配列の領域に相補な配列を含み、前記特定の配列の領域に含まれかつ検出対象である１塩基置換部位に３’末端がハイブリダイズするべく設計されたプライマーと、
前記ターゲット核酸と前記プライマーとの相補鎖伸長反応に用いるポリメラーゼと前記相補鎖伸長反応の基質と、
前記相補鎖伸長反応の反応副産物として生じるピロリン酸をＡＴＰに変換する試薬と、
前記ＡＴＰを用いて発光反応を行なうための試薬とを有し、
前記プライマーは、３’末端から３塩基目に塩基の種類が前記ターゲット核酸配列と相補的でない塩基を持つものであることを特徴とする核酸検出キット。
【請求項８】
アピラーゼをさらに有することを特徴とする請求項７に記載の核酸検出キット。
【請求項９】
前記ピロリン酸をＡＴＰに変換する試薬はＡＴＰスルフリラーゼを含むものであり、前記発光反応を行なうための試薬はルシフェラーゼとルシフェリンを含むものであることを特徴とする請求項７に記載の核酸検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体の核酸中に含まれる特定の配列の有無の検出方法、１塩基置換（Single Nucleotide Polymorphisms; SNPs）の検出方法、これらの検出方法を実行するための核酸検出キット、及び核酸変異検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析計画が進展し、ＤＮＡ配列情報を医療診断、創薬等の種々の産業に応用しようとする動きが活発化してきている。特に医療分野では遺伝子の機能を解明して活用しようとする動きが活発である。特に、生体内で活動している遺伝子を調べる遺伝子発現プロフィール分析と、遺伝子発現の多様性の原因ではないかと考えられているゲノム中の１塩基置換（Single Nucleotide Polymorphisms; SNPs）の分析が注目されている。
【０００３】
ゲノム中の１塩基置換は約１０００塩基に１つあるといわれており、各個人について膨大な数の１塩基置換が存在する。それらの１塩基置換が、各固体、個人の特性に関与していると考えられ、これら１塩基置換を解析することにより、病気治療の際の、個人毎の治療指針等が得られると期待されている。
【０００４】
１人の人間のゲノムに現れる１塩基置換の数は膨大であり、多くの人のゲノムは特定の位置に現れる塩基種が２つあるタイプの多型性で、変異の起こる位置に現れる１塩基置換を調べ、更に、病気等との相関関係を明らかにする必要があるが、膨大なＤＮＡデータの取得が必要であり、それに適した方法の開発が望まれている。
【０００５】
現在使われている塩基置換分析法は種々有るが、大別して未知の塩基置換を検出する方法と、既知の塩基置換が他の多くの人に見られるか、病気との因果関係はあるか等を調べる方法に分けられる。
【０００６】
新たな塩基置換を検出する方法としては、ＤＮＡシーケンサーを用いた塩基配列決定、ＤＮＡプローブアレー（ＤＮＡチップ、又はジーンチップ）を用いてＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーションを利用する方法等が用いられている。
【０００７】
一方、既に分かった位置の１塩基置換の検出には、ＳＳＣＰ（Single Strand Configuration Polymorphism）法、インベーダーアッセイ（Nature Biotechnology, 17，292〜296(1999)）、ＤＡＳＨ（Nature Biotechnology 17, 87〜88(1999)）等の方法が考案され使われ始めている。これらの方法は、何れも光源としてレーザー等を使用する。
【０００８】
また、プライマーを用いたＤＮＡ相補鎖合成を行うときに、プライマーの３’末端がターゲットに相補的であるか否かで相補鎖伸長が進んだり、進まなかったりする。そこで、プライマーの３’末端をミューテーション位置に一致させたプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、生成物をゲル電気泳動などで分析する方法（ＡＲＭＳ:amplified refractory mutation system; Nucleic Acids Research, 17, 2503-2515(1989)）なども使用されている。この場合、どれだけ正確に目的とするターゲットが有るときだけ相補鎖合成を起こし得るかがキーポイントとなる。
【０００９】
ＳＳＣＰ法では、１本鎖ＤＮＡが電気泳動中にとる形状がミューテーション（変異）の有無で異なり、それに応じて泳動速度に差があることを利用して１塩基置換を検出する。
【００１０】
インベーダーアッセイでは、ＤＮＡプローブアレーのＤＮＡプローブ、ターゲットＤＮＡ、ＤＮＡプローブで３本鎖を形成してプローブの一部が酵素切断されるか否かを検出する。
【００１１】
ＤＡＳＨでは、インターカレーター共存下で、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡをハイブリダイズさせ、光照射によりインターカレーターから発する光を、温度を変化させながら観察し、ターゲットＤＮＡに変異がある時には２本鎖が離れて発光が無くなることを利用する。
【００１２】
一方、短時間に短いＤＮＡ塩基配列を決定し、決定されたＤＮＡ塩基配列を用いてミューテーションを調べようとする動きも始まっている。
【００１３】
例えば、Ｎｙｒｅｎらは、ターゲットＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせ、相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変え、ＡＴＰにルシフェリンを作用させて発光させ、この化学発光を検出することにより、相補鎖伸長反応で取り込まれた基質（ｄＮＴＰ）を知り、ＤＮＡ塩基配列を決定する方法（パイロシーケンシング）を提示している。パイロシーケンシングは、ゲル電気泳動を用いない簡易なＤＮＡ配列決定法として注目を集めている。更に、最近、パイロシーケンシングを用いたＳＮＰｓ検出の報告をしている（Anal Biochemistry 280, 103〜110(2000)）。この方法は、化学発光を利用しているので新たな光源は必要としない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
ゲノムＤＮＡ中に現れる変異は生物の個性、又は病気や医薬品に対する感受性等と関連しており大きな分析対象である。対象となる個人は膨大な数にのぼり簡便で大量処理に適しており、ランニングコストの安い方法、及び装置が求められている。
【００１５】
また、測定対象も個別ノゲノム試料のＳＮＰｓ検査の他、病人グループのＳＮＰｓや健常人のＳＮＰｓを比較する計測が必要である。すなわち、ＳＮＰｓと病気との因果関係を調べるには特定ＳＮＰｓについて、これら両グループで見られる当該ＳＮＰｓの頻度を比較する必要がある。これらを簡便に行う為にはそれぞれのグループのＤＮＡを混合して含まれるＳＮＰｓの定量分析をする事がもっとも効率がよいが、そのような精度良い定量分析法が開発課題となっている。さらに、単に個別のサンプルのＳＮＰｓを測定する上でも以下の課題がある。
【００１６】
これまでに提案されている種々方法では、ターゲットとなるＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し、得られるＤＮＡ断片をターゲットとして用いていた。このためＰＣＲは不可欠であるという問題があった。
【００１７】
ＤＡＳＨではレーザー光源、散乱光除去フィルターを装備した検出器を必要とし、装置が大がかりになるという問題があった。
【００１８】
化学発光を検出するパイロシーケンシングは、ピロリン酸をＡＴＰに変換して化学発光を起こさせ、この発光を検出する方法である。しかし、パイロシーケンシング方法では、４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）をそれぞれ独立に順番に反応部に加えていく必要があるという問題、発光強度が弱いという問題、ｄＮＴＰの注入機構が必要であるという問題、装置がかなり大がかりになるという問題等あった。
【００１９】
また、この方法では、試薬を順次注入するため、分析時間がゲル電気泳動等より短いとはいえ、１０分〜２０分が必要であるという問題、試料をそのまま用いるには感度が十分ではなく、試料ＤＮＡはＰＣＲ増幅してターゲット領域のＤＮＡコピー数を増やして使用する必要があるという問題があった。
【００２０】
また、パイロシーケンシングでは、調べようとする試料中に塩基置換が複数個存在する時は得られるスペクトルが複雑になり塩基置換を明確に分析できない場合があるという問題があった。
【００２１】
パイロシーケンシングをＤＮＡ変異の検出に利用するには、一層の高感度化を実現して、容易にＤＮＡ変異を検出できる様にすること、複数種類のミューテーションを含むＤＮＡ鎖を分析できる様にすることが重要な課題である。
【００２２】
発明の目的は、遺伝子診断、遺伝子を用いた創薬、治療の元となるデータベース作製に必要なツールを提供するものであり、遺伝子ＤＮＡの検査方法、及び装置、検査試薬等を提供することにある。
【００２３】
より詳細には、本発明の目的は、高感度で励起光源を必要とせず、反応は単純で時間も短く簡便な、ＤＮＡ変異検出方法、及び装置、更に、複数の変異を含んだ試料を信頼度高く分析できるＤＮＡ変異検出方法、及び装置を提供することにある。
【００２４】
更に、病気とＳＮＰｓの相関関係を簡便にスクリーニングする手法の提供も本発明の目的である。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明では、目的とするターゲットＤＮＡの存在の有無、又は、ミューテーションの存在の有無を調べるために、相補鎖伸長能力のあるＤＮＡプローブ（プライマー）をターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせ、相補鎖伸長反応で発生するピロリン酸をＡＴＰに変換し発光せしめて、その発光を検出する。ターゲットＤＮＡ配列が被検体試料中に存在しなければ相補鎖伸長は起こらず発光は観測されない。
【００２６】
また、本発明では、ＤＮＡプローブの３’末端の塩基がハイブリダイズする位置を、ミューテーションが存在する位置と一致させておき、３’末端の配列が異なるプローブを準備することで、ミューテーションのある場合にだけ相補鎖伸長反応が起こる、あるいは、ミューテーションのある場合だけ相補鎖伸長反応が起らないようにすることができるので、ミューテーションチェックにも用いることができる。これはプライマーを始点とする相補鎖伸長反応が、３’末端のハイブリダイゼーションマッチングが完全か不完全かに強く依存するからである（文献：Kwok S.et al.Nucleic Acids Res 18,999〜1005(1990)、Huang M.M. Arnhein N. Goodman M.R. Nucleic Acids Res. 20 4567〜4573(1992)）。ＳＮＰｓ測定ターゲットのＤＮＡテンプレートによるプライマー相補鎖伸長反応オン・オフをより確実にするために、プライマーの３’末端近傍に人為的なミスマッチを入れている。相補鎖合成の有無は生成するピロリン酸をＡＴＰに変換し、化学発光試薬と反応させ、得られる化学発光を光学的に検出して行う。この測定では、不純物として含まれるピロリン酸あるいは核酸基質の熱分解で得られるピロリン酸が背景光を与えるので、これらを極力除去すると共に、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅおよびｍｕｔａｎｔに相補的な末端塩基種を物２つのプライマーを用いた相補鎖伸長の結果得られる化学発光を検出することで高精度の検出を可能にしている。
【００２７】
既知のパイロシーケンシングでは、発光強度は１塩基分の相補鎖伸長反応により生じるピロリン酸を利用するため発光強度は弱いが、本発明では、数十以上の塩基長にわたって相補鎖伸長反応を進行させ、得られるピロリン酸をＡＴＰに変換し化学発光を検出するため、既知のパイロシーケンシングに比較して２桁以上の発光強度が得られる。
【００２８】
また、相補鎖伸長反応の進行により得られた２本鎖を酵素を用いて分解し、再び相補鎖伸長反応を進行させることを複数回繰り返し、発光強度を増大させることも可能である。これらにより、試料をＰＣＲ増幅しなくても特定配列、又は、ミューテーションの有無、および混合ゲノム試料に含まれるミュータントの割合を検出できる。
【００２９】
本発明では、プライマーを始点とする相補鎖伸長反応の際に相補鎖合成の基質であるｄＮＴＰを制御された方法で加え、相補鎖伸長反応に伴って生成するピロリン酸を化学発光により検出し、検査対象のＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）中の塩基変異の有無、正常種と変異種の存在を検出する。検査対象のＤＮＡ中の、塩基置換が出現すると予想される位置に、３’末端が来るように設計され、置換の有無で相補鎖伸長反応が起こったり起こらなかったりするように設計されたプライマーを用いて、塩基配列の置換の有無、塩基変異を簡易な方法で高感度で調べる。
【００３０】
相補鎖伸長反応が起こる場合には、複数のｄＮＴＰを同時に加えて、相補鎖伸長を一度に複数個進めて、大量のピロリン酸を生成し、化学発光強度を増大させて高感度に塩基変異を検出する。
【００３１】
ターゲットＤＮＡの配列を考慮して、複数のプライマーを準備し、種々プライマーを始点とする相補鎖伸長反応の進行を検出することにより、複数種存在する変異を検出する。また、既知の基準となるＤＮＡの配列に従って、複数のプライマーを区分けして保持し反応させることにより、複数種含まれる塩基置換を信頼度高く分析できる。試料中に種々変異株が含まれる場合には、基準となる塩基配列を参考にして複数のプライマーを用意し、これらをプライマーの種類毎に固体表面に固定して用いる等して、相補鎖伸長反応を行ない変異株の存在状況をモニターすることができる。
【００３２】
種々の変異が含まれる検体の分析は、従来技術では非常に困難であったが、本発明によれば、簡便な方法、装置により検出できる様になった。
【００３３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を図面を参照して詳細により説明する。
【００３４】
最初に本発明の前提となる発光機構を関連技術であるパイロシーケンシングを用いて説明する。パイロシーケンシングについて説明する。ターゲットＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせる。ＤＮＡポリメラーゼと相補鎖伸長反応での相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰを加えて相補鎖伸長反応を行なわせる。ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖に相補的な基質が１つづつ取り込まれて相補鎖が伸長される。この時、ピロリン酸が反応副産物として生成する。ピロリン酸はｄＮＴＰが１つ取り込まれる毎に１分子生成される。
【００３５】
ピロリン酸はスルフリラーゼによりＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼの存在下でルシフェリンを酸化して光を発する。この発光を検出することにより、プライマーを始点とする相補鎖伸長反応が進行したことを知ることができる。４種のｄＮＴＰを１種類づつ順番に反応部に加えて、発光が検出されればそのｄＮＴＰが取り込まれたことになり、ＤＮＡの配列決定をすることができる。
【００３６】
この時、余剰のｄＮＴＰを分解して次の反応の時にじゃまにならないようにする必要があり、アピラーゼを加えることが必須の技術として報告されている（Science 281、363〜364(1998)）。この場合、アピラーゼはＡＴＰをも分解するので、発光反応と分解反応が競合的におこり発光強度はアピラーゼを入れない時に比べて数分の１になる。この反応を利用して配列決定する場合には、ターゲットＤＮＡは０．２ｐｍｏｌｅ前後の量が必要となる。
【００３７】
本発明とパイロシーケンシングの大きな違いは相補鎖伸長用のプライマーの３’末端あるいは３’末端近傍が、当該サンプルにハイブリダイズしたときに、ミューテーション位置と相補位置に来るように設計されていることである。相補鎖合成されるＤＮＡ鎖部分はミューテーション位置に相補部分を含まない。また、相補鎖合成は連続して複数の塩基が取りこまれて進むものであり、伸長するＤＮＡ鎖の配列を識別せずに多量のピロリン酸を得て化学発光試薬と反応せしめ化学発光を得て、高感度検出するところが特徴である。さらに、より確実なＳＮＰｓ情報あるいは定量的なミュータントの情報を得るために、末端塩基種がミュータントおよびワイルドタイプのＤＮＡの相補塩基に一致するプライマー２種を用いて相補鎖合成反応を行い、化学発光を計測する事を特徴とする。
【００３８】
（実施例１）
図１（ａ）−（ｄ）は、実施例１を説明する図であり、プライマーの３’末端の塩基種によりハイブリダイゼーションが完全、又は不完全となり相補鎖合成が制御されることを説明する図である。
【００３９】
変異を含むＤＮＡから１本鎖状態のターゲットＤＮＡ１を、変異を含まないＤＮＡから１本鎖状態のターゲットＤＮＡ２を、それぞれ調製する。ここでは約４００塩基長の異なるＤＮＡを用いたが、もちろん、もっと長いＤＮＡを用いても良い。プライマー５の３’末端６の塩基が、ターゲットＤＮＡ１、２のミューテーションの有無を調べる位置３の塩基に一致するように設計された１０塩基長のプライマー５を用いて、ターゲットＤＮＡ１、２にハイブリダイズさせる。ＤＮＡポリメラーゼ、相補鎖合成の基質となるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを加えて相補鎖伸長反応を行なわせる。図１に示すプライマーは１０塩基長であるが、一般的に１０塩基長から３０塩基長のプライマーが使用される。
【００４０】
図１（ａ）に示す例では、プライマー５の３’末端６の塩基（Ｇ）と、ターゲットＤＮＡ２のミューテーションの有無を調べる位置３の塩基（Ｃ）とが相補であり、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖に相補的な基質が取り込まれていき、矢印８に示すように、伸長相補鎖が形成される。この結果、ピロリン酸が反応副産物として生成する。
【００４１】
図１（ｂ）に示す例では、プライマー５の３’末端６の塩基（Ｇ）と、ターゲットＤＮＡ１のミューテーションの有無を調べる位置３の塩基（Ａ）とが相補でないため、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖に相補的な基質が取り込まれにくく、相補鎖伸長は起こりにくい。この結果、反応副産物として生成するピロリン酸は少ない。
【００４２】
先に説明したように、ルシフェラーゼによる発光を用いてピロリン酸を検出することにより、図１（ｂ）に示す例では強い信号が検出されず、図１（ａ）に示す例では強い信号が検出される。
【００４３】
しかし、ターゲットによっては３’末端が相補的でなくても鎖伸長がかなり高い確率で進むことがあり得る。
【００４４】
そこで、より正確に変異を検出するために、すなわち、末端塩基種による相補鎖合成のスイッチングをより正確にする為に、プライマー５の代わりにプライマー９を使用する。プライマー９の配列は、プライマー５の配列の３’末端６から５’末端方向に２塩基目、又は、３塩基目の核酸塩基の種類を、ターゲットＤＮＡ１、２の配列と相補的でない配列（Ａ）とした点のみが、プライマー５の配列と異なる。
【００４５】
図１（ｃ）、図１（ｄ）に示すプライマー９は、３’末端６から３塩基目の核酸の種類が、ターゲットＤＮＡ１、２の配列（Ｃ）と相補的でない配列（Ａ）であり、プライマー９は、３’末端６から３塩基目の位置で、人工的なミスマッチが起こる構成を持つ。こうすると、プライマー９の３’末端６がミスマッチの状態では、プライマー９の３’末端６はターゲットＤＮＡから遊離してしまう。これによりプライマー９の３’末端の相補鎖伸長反応が、ミスマッチの有無に、より敏感に影響されるようになる。
【００４６】
図１（ｃ）に示す例では、プライマー９の３’末端６の塩基（Ｇ）と、ターゲットＤＮＡ２のミューテーションの有無を調べる位置３の塩基（Ｃ）とが相補である。この場合、プライマー９のターゲットＤＮＡ１のミューテーションの有無を調べる位置３’末端６から３塩基目の位置で、人工的なミスマッチの塩基（Ａ）がターゲットＤＮＡ２のその位置での塩基と相補でなくても、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖に相補的な基質が取り込まれていき、伸長相補鎖８が形成される。この結果、ピロリン酸が反応副産物として生成する。
【００４７】
図１（ｄ）に示す例では、これに対して、プライマー９の３’末端の塩基６（Ｇ）と、ターゲットＤＮＡ１のミューテーションの有無を調べる位置３の塩基（Ａ）とが相補でない。この場合、プライマー９のターゲットＤＮＡ１のミューテーションの有無を調べる位置３’末端６から３塩基目の位置で、人工的なミスマッチの塩基（Ａ）がターゲットＤＮＡ２のその位置での塩基と相補でないため、プライマー９の３’末端に更にミスマッチが起こると相補鎖伸長反応は非常に起こりにくくなり、伸長相補鎖が形成されない。この結果、ピロリン酸が反応副産物として生成することはない。図１（ｂ）と図１（ｄ）とでは、いずれの場合でも、ターゲットＤＮＡ１のミューテーションの有無を調べる位置３’末端６から伸長相補鎖が形成されない相補鎖が形成されないように表示してあるが、図１（ｂ）の場合にはターゲットの塩基配列によっては相補鎖伸長があり得る。たとえば、図２には種々プライマーを用いたときの相補鎖伸長の起こる割合（頻度）を示している。完全な相補配列を持つプライマーＳＮＰ１−１を用いたときに得られる発光強度を１００としたとき、末端塩基種が変化（ミスマッチ）したときの発光強度を示す。末端塩基種がミスマッチでもかなり相補鎖伸長があることが分かる。一方、図１（ｄ）では３’末端から３塩基目に人工的なミスマッチを入れている。このようにすると末端にミスマッチがある物は末端近傍に二つのミスマッチがあることになり、より確実に相補鎖伸長を行わない。具体的には図２のプライマーＳＮＰ２−ｉ（ｉ＝１−４）を用いたときの発光強度に見ることができる。末端がマッチするプライマーＳＮＰ２−１では発光強度は完全マッチのときと比べてほぼ同じであるが、末端にミスマッチがあると発光強度は非常に弱くなる。この値はほぼ試薬中に含まれる不純物に依る発光強度に等しい。すなわち、末端近傍に少なくとも２つのミスマッチがあると相補鎖合成は殆ど行われない。また、ミューテーションの位置に対応するプライマーの部位を末端から３塩基目として、プライマー末端にミスマッチを導入する形のプライマーを用いても同じようなことを行うことができる。すなわち、図１（ｄ）の場合には、図１（ｂ）の構成に比し、プライマー９がターゲットＤＮＡ１のミューテーションの有無を調べる位置３’末端６から３塩基目の位置と３’末端６とで、相補でないため、より確実に伸長相補鎖を形成しないものとなる。
【００４８】
先に説明したように、ルシフェラーゼを用いてＡＴＰとルシフェリンを反応させて発光させ、この発光を検出してミューテーションを調べる。即ち、図１（ｄ）に示す例では変異が検出されず、図１（ｃ）に示す例では変異が検出される。
【００４９】
図２は、実施例１で使用したプライマー５、プライマー９の構成例と、後述するように、それぞれのプライマーによる伸長相補鎖の形成に応じた発光強度を説明する図である。
【００５０】
プライマー５として、３’末端の塩基が異なる以下の４種類（プライマー名：ＳＰＮ１−ｉ、ｉ＝１、２、３、４）を評価に使用した。プライマーＳＰＮ１−ｉ（ｉ＝１、２、３、４）は、配列番号１、２、３、４の２０塩基長の塩基配列を持つ。
【００５１】
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＴＧＴ              ：（配列番号１）
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＴＧＣ              ：（配列番号２）
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＴＧＧ              ：（配列番号３）
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＴＧＡ              ：（配列番号４）
プライマー９（ＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝１、２、３、４））として、人工的なミスマチが起きるように、プライマー５の３’末端から５’末端方向に３塩基目の核酸の種類ＴをＡに変えた以下の４種類（プライマー名：ＳＰＮ２−ｉ、ｉ＝１、２、３、４）を評価に使用した。プライマーＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝１、２、３、４）は、配列番号５、６、７、８の２０塩基長の塩基配列を持つ。
【００５２】
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴ              ：（配列番号５）
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＡＧＣ              ：（配列番号６）
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧ              ：（配列番号７）
ＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＴＧＴＡＧＡ              ：（配列番号８）
以下に、実際に種々のミューテーションが入った試料ＤＮＡでテストした結果の一例を説明する。
【００５３】
図３は、ミューテーションがあるターゲットＤＮＡの検出例を示す図であり、プライマーに応じた相補鎖伸長反応に伴って反応副産物として生成するピロリン酸の有無を示すルシフェラーゼによる相対発光強度を示す図である。
【００５４】
ターゲットＤＮＡはミューテーションを持ち、配列番号９の２０塩基長の塩基配列を含んでいる。配列番号９の表示された塩基配列部分の３’末端がミューテーションによりＣから変異してＡとなっている。
【００５５】
ＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴ  ＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡ              ：（配列番号９）
図３（ａ）は、人工的に３’末端から５’末端方向の３塩基目にミスマッチを入れていないプライマー５（プライマーＳＰＮ１−ｉ（ｉ＝１、２、３、４））を用いた場合の発光の相対強度を示す図、図３（ｂ）は、人工的に３’末端から５’末端方向の３塩基目にミスマッチを入れたプライマー９（プライマーＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝１、２、３、４））を用いた場合の相対発光強度を示す図である。図３（ａ）、図３（ｂ）に示す縦軸は、プライマーＳＰＮ１−１を使用した場合の発光強度を１００とした相対発光強度を示す。プライマー名称、ＳＰＮ１−ｉ（ｉ＝１、２、３、４）、ＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝１、２、３、４）のあとのカッコ（）内に示す数値は、相対発光強度を示す。図２に示した相対発光強度はこの値である。
【００５６】
図３（ａ）、図３（ｂ）に示す横軸は、相対発光強度の時間変化を示し、時間軸の下側に示す時間スケールが１分（１ｍｉｎ）である。相対発光強度を示す各曲線３７、３８、３９、４０および４１、４２、４３、４４の時間軸の起点に於いて、ＤＮＡポリメラーゼ、相補鎖合成の基質となるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰが、ターゲットＤＮＡ、プライマーを含むバッファ液に加えられ、相補鎖伸長反応が開始され、時間の経過とともに反応が進行することを示す。
【００５７】
図３（ａ）に示すように、人工的なミスマッチを入れていないプライマー５（プライマーＳＰＮ１−ｉ（ｉ＝１、２、３、４））を用いた場合では、曲線３７〜４０に示すように、プライマーＳＰＮ１−１による相補鎖伸長反応に関する曲線３７と、ＳＰＮ１−ｉ（ｉ＝２、３）による相補鎖伸長反応に関する曲線３８、曲線３９との区別がつけにくい結果となった。即ち、プライマーＳＰＮ１−２およびプライマーＳＰＮ１−３は、プライマーの３’末端の塩基とターゲットＤＮＡのこの位置の塩基とがミスマッチするにもかかわらず、相補鎖伸長反応が進行したことを示している。もちろん、プライマーＳＰＮ１−２およびプライマーＳＰＮ１−３による発光はプライマーＳＰＮ１−１による発光より低レベルであるから、識別できないわけではないが、高い精度でミュータントとワイルドタイプを識別したり、サンプル中に含まれるそれらの比率を精度良く求めることはできない。
【００５８】
一方、図３（ｂ）に示すように、人工的に３’末端から５’末端方向の３塩基目にミスマッチを入れたプライマー９（プライマーＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝１、２、３、４））を用いた場合では、曲線４１〜４４に示すようにプライマー選択性が上がり、プライマーＳＰＮ２−１に関する曲線４１では、曲線３７と同程度の発光強度が得られ、プライマーＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝２、３、４）に関する曲線４２、４３、４４では、殆ど発光が検出されていない。
【００５９】
このように、人工的に３’末端から５’末端方向の３塩基目にミスマッチを入れたプライマー９（プライマーＳＰＮ２−ｉ（ｉ＝１、２、３、４））を用いることにより、ミューテーションの塩基配列を、より厳正に、検出できる。
【００６０】
図３（ａ）、図３（ｂ）に於いて、プライマー５（ＳＰＮ１−ｉ（ｉ＝２、３、４））に関する曲線３７、３８、３９およびプライマー９（プライマーＳＰＮ２−１）に関する曲線４１は、相補鎖伸長反応により約４００個の相補鎖合成がなされたことを示しており、発光曲線は極大に達した後に、発光が減少して行く。ここで検出される発光は、相補鎖伸長反応で放出されるピロリン酸を化学発光させたものである。
【００６１】
より正確にＳＮＰｓを検出したり、ワイルドタイプの遺伝子とミュータント遺伝子が共存するサンプル中のそれらの比率を求めるにはそれぞれに最適のプライマー合計２種を少なくとも用いる。この場合、ミューテーションはＣ Ａの形で起こる例なので、プライマーＳＮＰ２−１とＳＮＰ２−３が用いられる。ＳＮＰ２−１はミュータントにハイブリダイズして相補鎖合成を起こすが、ワイルドタイプでは相補鎖合成を起こさない。一方、ＳＮＰ２−３はワイルドタイプにハイブリダイズして相補鎖合成をするが、ミュータントに対しては相補鎖合成をしない。表でミュータントに対してハイブリダイズさせたときに観測される発光強度は不純物と核酸基質（ｄＮＴＰ）の分解により生成したピロリン酸に依る背景光で、バックグランド処理すればゼロとなる。ワイルドタイプとミュータントを両方含むゲノム混合試料などではワイルドとミュータントの存在比を知ることは重要である。とくに、病気とＳＮＰｓの関連を調べるには病人のゲノム中に現れる注目しているＳＮＰｓの出現頻度と健常人のゲノムに現れるそのＳＮＰｓの出現頻度を比較し、ＳＮＰｓと病気の相関関係を調べる必要がある。このためには非常に多くの検体についてＳＮＰｓ解析をする必要がある。ＳＮＰｓの数は多いので膨大なデータを取得する必要が生じる。このような場合、病人のゲノム同士、健常人のゲノム同士を混合してＳＮＰｓを測定し、病気との相関を調べる方法が効率よい。通常、有意なＳＮＰｓは出現確立が１％以上であり、病気との相関を有意と見るのは５％以上である。すなわち、混合ゲノム試料において、ＳＮＰｓの存在比を１％程度の精度で測定する必要があるが、これまでの方法ではこれは困難であった。ここで開発した方法を用いて、２つのプライマーを用いてそれぞれの相補鎖伸長反応の割合を知ることにより、１％内外の精度で存在比を決定する事ができる。上記の内容を示す実験結果を図３（ｃ）に示す。図３（ｃ）はワイルドタイプとミュータントの両方を含むゲノム混合試料を本発明により測定した結果である。ワイルドタイプとミュータントの総ゲノム量を一定としてその内のミュータントの存在比を横軸にとり、そのときに得られるワイルドタイプ由来の信号強度（図中○を付したデータ）とミュータントの信号強度（図中△を付したデータ）をあらわしている。ワイルドタイプとミュータントのそれぞれに特異的なプライマーを用いて反応を行わせて測定した。結果から分かるように、ミュータントの比率が上がるとワイルドタイプ由来の信号が低下し、ミュータント増加する。Ｓ／Ｎ比を考慮するとミュータントが１％程度の比率でも検出が可能である。健常と病気との相関において必要な検出比率は、上記のごとく５％なので、本発明は十分な精度を持って検出できることは明らかである。
【００６２】
この測定精度をさらに高めるために、２本鎖ＤＮＡの両方の鎖について、合計４種のプライマーを用いてＳＮＰｓ検出をおこなうことが有効である。
【００６３】
図４は、本発明の実施例１の化学反応の概要を説明する図である。図４（ａ）は反応容器２００のバッファ液中にターゲットＤＮＡ４５とプライマー４６が導入された状態を示す。図４（ｂ）は、その反応容器２００のバッファ液にＤＮＡポリメラーゼ、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）が加えられ、矢印４８で示すように、相補鎖伸長反応が進行する状態を示す。この際、さらに、ＡＰＳ（アデノシン５’−ホスフォスルフェート）、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェリンも加える。図４（ｃ）は、相補鎖伸長反応が進行する場合の化学式を示すものであり、ターゲットＤＮＡ４５、プライマー４６および基質となるｄＮＴＰ４７にＤＮＡポリメラーゼが作用して、未反応のターゲットＤＮＡ４５および伸長相補鎖４８とターゲットＤＮＡ４５による二本鎖の合成ＤＮＡに合わせてピロリン酸（ＰＰｉ）４９が生成される。生成されるピロリン酸（ＰＰｉ）４９の分子数は伸長相補鎖４８の形成時の塩基長に比例して取り込まれるｄＮＴＰ４７と等しい。図４（ｄ）は、生成されたピロリン酸（ＰＰｉ）４９の各分子がＡＰＳの存在下でＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰ５０に変換される状態を示す。なお、このとき、同時に、硫酸イオンが生成される。図４（ｅ）は、変換されたＡＴＰ５０がルシフェラーゼの共存下でルシフェリンを酸化して光５１（ｈν）を発する。この際、炭酸ガスが発生するとともに、ピロリン酸はＡＴＰに変換され、ＡＴＰはルシフェリンを酸化しピロリン酸ＰＰｉ４９’を生成する。ＰＰｉ４９’は、ＡＴＰスルフリラーゼの働きで、再び、ＡＴＰ５０となりルシフェリンと反応する。相補鎖伸長反応が４００塩基までなされるとすると、１つのターゲットＤＮＡに対する相補鎖伸長反応で４００分子のピロリン酸４９が生成する。ＡＴＰは反応によりＡＭＰ(adenosine monophosphate；アデノシン・一リン酸）とピロリン酸に変換される。ピロリン酸は再びＡＴＰに変換され、発光反応を繰り返すので、発光は継続する。
【００６４】
相補鎖伸長反応以後のＡＴＰ生成反応は、図３で得られている発光強度のデータを参照して分かるように、十分なＡＰＳ、ルシフェリン、Ｏ2があれば過渡的に継続するため、更に発光反応が続き、発光５１が持続する。発光強度５１はピロリン酸４９の生成量、即ち、伸長相補鎖４８のＤＮＡ鎖長に比例する。
【００６５】
この実施例１では、相補鎖合成の基質ｄＮＴＰ４７はＮ（＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の４種を全て混合して、ＤＮＡポリメラーゼとともに、１本鎖状態のターゲットＤＮＡ４５、プライマー４６を含む反応液中に入れることができるから、段階的反応でＤＮＡ配列決定を行なうパイロシーケンシングに比べると、２桁以上の高い化学発光量が得られ高感度が達成できる。パイロシーケンシングの場合には、相補鎖合成の基質ｄＮＴＰはそれぞれＮ（＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の種類毎に独立に順番に反応部に注入しなければならない。
【００６６】
図５（ａ）は、１本鎖状態のターゲットＤＮＡに図２に示すプライマー９（人工的なミスマッチを入れたプライマーを使用）を結合させて、何れか１種類のＮ（＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ））の基質ｄＮＴＰのみ、又はｄｄＮＴＰのみを用いて１塩基のみの相補鎖伸長反応を行なわせた場合（パイロシーケンシングの場合）に得られる発光強度（図にｄＧＴＰと表示）と、実施例１の方法により得られる、４種類のＮ（＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ））の全ての種類の基質ｄＮＴＰを同時に用いて長い領域にわたって相補鎖伸長反応を行なった場合に得られる発光強度（図にｄＮＴＰｓと表示）とを比較した図である。試料は３ｆｍｏｌのＭ１３である。図５（ｂ）は、試料を加えないで、図５（ａ）と同じ条件で得たバックグランドデータを示す。
【００６７】
この例では試料中にＡｐｙｒａｓｅを共存させ、ＡＴＰおよびｐｐｉを分解しているので、発光反応と分解反応が競合するので強度は低くなり、また、持続せず減少している。試料ＤＮＡ、酵素中あるいはｄＮＴＰ（核酸：デオキシリボ核酸）やｄｄＮＴＰ（ダイデオキシリボ核酸）には不純物としてピロリン酸が含まれることも多く、背景光を与える。Ａｐｙｒａｓｅを加えるとこれらは分解され、背景光は無くなる。含まれるピロリン酸をあらかじめ除去するとＡｐｙｒａｓｅを加える必要は無く、ピーク値の数倍の信号強度が持続する。
【００６８】
図５（ａ）、図５（ｂ）の縦軸は発光強度を、横軸は発光強度の時間変化を示す。図５（ａ）に於いて、４種類のｄＮＴＰを加えて相補鎖伸長反応を行ない、遊離する多量のピロリン酸を化学発光させた時の発光強度は、ｄＧＴＰのみを加えて１塩基のみを伸長させた時に遊離するピロリン酸を化学発光させた時の発光強度の約５０倍である。この比較からも、本実施例１により高感度化が可能なことがわかる。
【００６９】
更に、詳しく説明すると、図５（ｂ）のバックグランドデータを考慮すると、ｄＧＴＰのみを加えた時は、図５（ａ）の信号強度と図５（ｂ）のバックグランドデータの値が同等で、実質的に試料ＤＮＡ（Ｍ１３）を検出することができない。しかし、４種類のｄＮＴＰを加えた時の図５（ａ）の信号強度は、図５（ｂ）のバックグランドデータの値に対して、１２倍の値を示している。測定ノイズは信号強度の１／７８であったので、実際、アトモルレベルでのＤＮＡの１塩基変異の検出が可能である。これはＰＣＲ増幅せずに検出できる十分な信号レベルであると言える。
【００７０】
このような微量のＤＮＡを計測する時に問題となる背景光は、試薬中に含まれているピロリン酸やｄＮＴＰが分解して生成するリン酸である。これらリン酸を除去するために、予め反応に使用する試薬をアピラーゼで処理し、背景光を少なくした。
【００７１】
（実施例２）
実施例２は隣接する２つのＤＮＡプローブを一つのプライマーとして用いる例である。即ち、図２に示すプライマー９のように、プライマー自体ににミスマッチを入れる代わりに、プライマーの長短２種を隣接させてターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせる方法である。短いプライマーはミスマッチがあるとハイブリダイズしにくくなることを利用する。
【００７２】
図６は、実施例２を説明する図である。実施例２では、ターゲットＤＮＡと安定にハイブリダイズするのに十分な長さを持つ第１のプローブと、単独では短くてハイブリダイズして相補鎖合成できない長さを持つが、第１のプローブの３’末端に密着してターゲットＤＮＡとハイブリダイズすることができる第２のプローブを用い、両者を密着して隣接させてプライマーとする。図６は、第１のプローブの３’末端と第２のプローブ５’末端とを密着して隣接させたプライマーの第２のプローブの３’末端を始点とする相補鎖伸長反応を行なわせてルシフェラーゼによる発光を用いてミューテーションを検出する例である。
【００７３】
図６（ａ）に示すように、第１のプローブ６１は、１本鎖状態のターゲットＤＮＡ６３と安定にハイブリダイズするのに十分な長さである１５塩基長から３０塩基長を持つ。第１のプローブは全てのターゲットＤＮＡと１塩基置換の有無にかかわらずにハイブリダイズするので、第１のプローブは相補鎖伸長しないように３’末端がダイデオキシヌクレオチド６４とされている。
【００７４】
もう一つの方法として、まず、短いオリゴマーを長いオリゴマーに直列になるようにハイブリダイズさせる。ついで、ライゲーション反応によりこれらを結合する。この時、ワイルドタイプに相補的な短いオリゴマーとミュータントに相補的な短いオリゴマーとを用意し、反応を行う。ワイルドタイプに相補なオリゴマーの３’末端をダイデオキシヌクレオチドとして相補鎖伸長ができない形にしておく。検体がミュータントの時だけ、オリゴマーがライゲーションで結合し、相補鎖伸長が起こるがワイルドタイプでは伸長が起こらない。このようにしてワイルドタイプとミュータントを識別しても良い。
【００７５】
図６（ｂ）に示すように、第１のプローブ６１の３’末端に密着して、５塩基長から６塩基長の長さを持つ第２のプローブ６２が、ターゲットＤＮＡ６３にハイブリダイズする。第２のプローブ６２は５’末端がリン酸基６７とされており、容易に第１のプローブ６１の３’末端に密着する。第２のプローブ６２の３’末端は相補鎖合成の始点となり得るが、単独ではハイブリダイズしても、短くて、相補鎖合成できない長さとしておく。
【００７６】
第２のプローブ６２は、第１のプローブ６１に密着して隣接してターゲットＤＮＡとハイブリダイズした場合にのみ安定化してプライマーとして機能することが可能である。実施例２の方法では、第１のプローブ６１と第２のプローブ６２とがターゲットＤＮＡ６３にハイブリダイズした時だけ、ｎ個の伸長相補鎖６６が形成され、ｎ分子のピロリン酸６８が生成する。すなわち、２つのプローブが密着して隣接してターゲットＤＮＡにハイブリダイズすることで高い選択性を得ることができる。ここでも、第１の実施例と同様に、第１のプローブ６１と第２のプローブ６２とよりなるプライマーの３’末端の塩基６が、ターゲットＤＮＡ６３のミューテーションの有無を調べる位置３５にくるように設計されることである。図６（ｂ）では、ターゲットＤＮＡは図１（ａ）に示したように、第１のプローブ６１と第２のプローブ６２よりなるプライマーがターゲットＤＮＡ６３とハイブリダイズしたとき、プライマーの３’末端にある塩基６（Ｇ）と、ターゲット位置の塩基３５（Ｃ）とが相補なので相補鎖伸長反応が生ずる。すなわち、置換がないワイルドタイプについて相補鎖伸長反応が起きる例である。
【００７７】
図６（ｃ）は、これに対して塩基置換が生じたミュータントのＤＮＡにハイブリダイズした例で、相補鎖伸長反応が起きない。図６（ｃ）に示す例では、プライマーの３’末端にある塩基６（Ｇ）と、この位置に対応するターゲットＤＮＡの位置の塩基３５（Ａ）とは相補でない。したがって、図１（ｂ）で説明したと同様に、プライマーのハイブリダイズによる伸長相補鎖が形成されることは無い。本実施例では、図１（ｂ）で説明した場合と異なり、図３（ａ）のプライマーＳＮＰ１−２あるいはＳＮＰ１−３のように相補でないにもかかわらず伸長相補鎖が形成されることは無い。これはプライマーを二つのプローブ６１，６２の合成とすることの効果である。
【００７８】
図６（ｄ）に示すように、本実施例２では、第２のプローブ６２がハイブリダイズすべきターゲットＤＮＡ６３の部位の何れかの位置に、ミューテーション６９（図６（ｄ）の例では、塩基Ｇ）があり、第２のプローブ６２の３’末端から３塩基目の塩基がＴであるので、ハイブリダイゼーションは不安定になる。すなわち、第１のプローブ６１と第２のプローブ６２よりなるプライマーが安定に形成されないことになるので、仮に、プライマーの３’末端にある塩基６（Ｇ）と、この位置に対応するターゲットＤＮＡの位置の塩基３５（Ｃ）とが相補であったとしても、伸長相補鎖は形成されない。これもプライマーを二つのプローブ６１，６２の合成とすることの効果である。ここで、ミューテーション６９（図６（ｄ）の例では、Ｇ）がある場合には、ターゲットＤＮＡ６３の部位６５の配列に対し、第２のプローブ６２の配列に完全に相補である場合、図６（ｄ）の例では、第２のプローブ６２の３’末端から３塩基目の塩基がＣである場合のみ、ハイブリダイゼーションは安定となり伸長相補鎖が形成されることはいうまでも無い。
【００７９】
従って、実施例１と同様にして、ピロリン酸６８の生成の有無を発光の有無により調べることにより、ミューテーションの有無を検出できる。もちろん、逆にミューテーションがある時だけ相補鎖伸長するようにプライマー６２を設計しても良い。
【００８０】
実際にはワイルドおよびミュータントに相補的な短いプライマーを用いた反応をそれぞれ行い、両者の結果を用いてＳＮＰｓの分析あるいはその存在比を決めるのがよい。
【００８１】
また、第１のプローブの３’末端にミューテーションの位置が対応するようにして、ミューテーションが存在する時は、第２のプローブが第１のプローブに密着して隣接してターゲットＤＮＡにハイブリダイズできない形としても良い。
【００８２】
（実施例３）
ＳＮＰｓを調べるには、血液サンプルからＤＮＡを抽出し、種々の検査にしようできるようにライブラリーとして保存したり、平均数ｋｂの長さのＤＮＡに切したＤＮＡをＰＣＲ増幅して検査サンプルとして保存する。種々ＳＮＰｓの検査にあったっては保存されたＤＮＡサンプルの一部を取りだし、必要な短い領域のＤＮＡ（１００−２００ｂ）を再度ＰＣＲ増幅して用いる。しかし、測定の旅に行う増幅は手間と時間と費用がかかり、ＰＣＲ増幅のいらない方法が望まれている。本方法は相補鎖伸長を行い、一度に多量のピロリン酸を生成して化学発光反応に利用するので高感度が得られる。相補鎖合成が１ｋｂ程度行われ、サンプル量も０．１ｆｍｏｌ以下で計測ができ、ＰＣＲ無しで計測できる場合も有る。更に高感度にしてＰＣＲを行わないで済む例が実施例３である。
【００８３】
実施例３は、実施例１、実施例２で生成した伸長相補鎖を酵素切断して、再度、相補鎖伸長反応を行なうことにより、一層多くのピロリン酸を生成して検出感度を向上させた例である。
【００８４】
図７は、実施例３を説明する図であり、伸長相補鎖を酵素切断して、再度、相補鎖伸長反応を行なうことにより、非常に多くの分子数のピロリン酸を生成して検出感度を向上させる原理を説明する図である。
【００８５】
まず、最上段に示すように、５’末端をビーズ等の固体担体８１に固定したターゲットＤＮＡ８５とプライマー８６をＤＮＡポリメラーゼとともにバッファ液中におく。その結果、図４（ｃ）で説明したと同様に、プライマー８６の伸長相補鎖８２が形成されるとともにピロリン酸８７が生成される。ただし、この実施例３では、実施例１と異なり、プライマー８６の相補鎖８２の伸長段階では発光に関する酵素類はバッファ液に入れない。
【００８６】
次いで、所定の相補鎖８２の伸長が進んだ段階で相補鎖伸長反応は終了し、プライマー８６の伸長相補鎖８２により形成された相補鎖８３とターゲットＤＮＡ８５による二重鎖のＤＮＡが形成される。この状態で、バッファ液中に、相補鎖を酵素切断するためのエキソヌクレアーゼを投入する。この結果、プライマー８６の伸長相補鎖８２により形成された相補鎖８３は、エキソヌクレアーゼ反応により、１つずつヌクレオチド８４に分解され、最終的にターゲットＤＮＡ８５が再び得られる。
【００８７】
相補鎖を酵素切断するエキソヌクレアーゼについて説明しておくと、エキソヌクレアーゼにはＤＮＡ鎖の５’末端から３’末端へ１つずつヌクレオチドを分解していく５’→３’エキソヌクレアーゼと、ＤＮＡ鎖の３’末端から分解していく３’→５’エキソヌクレアーゼがある。プライマーの３’末端のマッチ、ミスマッチを相補鎖合成の有無の検出に利用する場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼは都合が悪い。プライマーのミスマッチ部分が削り取られ、正常株と変異株の差が区別できなくなるからである。５’→３’エキソヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡの５’末端からＤＮＡ鎖を分解するが、ターゲットＤＮＡ８５の５’末端をビーズ等の固体担体８１に固定したり、５’末端を修飾して、５’→３’エキソヌクレアーゼによりターゲットＤＮＡが分解を受けないようにしておく。３’末端のミスマッチによる変異の識別を行なう場合には、５’→３’エキソヌクレアーゼが適している。
【００８８】
バッファー中に余剰に存在するプライマー８６はこのターゲットＤＮＡ８５に、再び、ハイブリダイズして、プライマー８６の伸長相補鎖８２が再度形成される。これにより新たにピロリン酸８７が生成される。
【００８９】
プライマー８６の伸長相補鎖８２の形成により、ｎ分子のピロリン酸８７が生成されるものとする。伸長相補鎖８２の形成、相補鎖８３の、５’→３’エキソヌクレアーゼ反応による分解の繰り返しをｍ回行なうものとすると、合計ｍ回の伸長相補鎖８２の形成により、（ｍ×ｎ）分子のピロリン酸８８が生成されることになる。
【００９０】
（ｍ×ｎ）分子のピロリン酸８８が生成された後に、発光に関する酵素類をバッファ液中に投入すると、ピロリン酸８８はＡＴＰに変換され、ＡＴＰはルシフェリンを酸化しピロリン酸ＰＰｉを新たに生成する。新たに生成するＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼの働きで、再び、ＡＴＰとなりルシフェリンと反応する。従って、ｍ＝１０とすれば、１回のピロリン酸生成は１つのＤＮＡ相補鎖を作るときに約１０００個放出され、これが１０回繰り返されるので、発光量はパイロシーケンシングなどに比べて１００００倍となる。
【００９１】
伸長相補鎖８２の形成と、相補鎖８３の分解は同時進行しても良く、この場合には５’エキソ活性を持つＤＮＡポリメラーゼを用いるのが良い。上述した５’→３’エキソヌクレアーゼに代えて、３’→５’エキソヌクレアーゼを用いて、上記と同様にして、伸長相補鎖８２の形成と、相補鎖８３の分解を繰り返す場合には、プライマー８６の３’末端をエキソヌクレアーゼで分解されないように、リン酸結合に代わりサルファー結合としておく。エキソヌクレアーゼによりミューテーションをチェックすべき位置に相補的なプライマー中のヌクレオチドが分解除去されるのを防ぐためである。強い３’エキソヌクレアーゼ活性があるＤＮＡポリメラーゼを用いると都合が良い。
【００９２】
何れの場合も、ターゲットＤＮＡ８５にプライマー８６をハイブリダイズさせる。プライマー８６の３’末端のマッチ、ミスマッチにより相補鎖伸長反応を進行させたり、進行しないようにしたりして、ミューテーションの有無を調べる。プライマー８６の３’末端の近傍に、必要に応じて人工的にミスマッチができるように配列を工夫する等により、正確にミューテーションを調べることができる。
【００９３】
（実施例４）
実施例４は、複数のプライマーを用いる例である。ミューテーションの種類を決めたり、確実にどのようなミューテーションが起こっているのか、又は、ミューテーションの起こる割合を知るには、１つのプライマーを用いて伸長相補鎖が形成されたか否かを調べるだけでは十分でない。
【００９４】
そこで対象となるＤＮＡ２本鎖の両鎖にあらわれるミューテンションを調べることが望ましい。両鎖のワイルドタイプおよびミュータントに相補的なプライマー合計４種を用いて、伸長相補鎖が形成されるか否かを調べることが有効である。
【００９５】
これら４種のプライマーを始点とする相補鎖伸長反応は、それぞれ独立に，しかし，同じ条件下で行ない得られる化学発光の強度を比較検討することにより、変異株の存在比等の情報が得られる。反応条件を同じにするため、４種、又は複数のプライマーは、固体表面の異なる位置に種類毎に固定されたり、異なるビーズに種類毎に固定され、空間的に分離された状態で同じ反応液中で相補鎖伸長反応を行なわせる。もちろん、分離された小さな反応セルにプライマーをそれぞれ入れて反応させても良い。また、反応液は各セル間を移動できるが、プライマーはビーズなどに固定されセルの間を移動できないようにした反応部を用いても良い。また、４種のプライマーだけでなく種々のＳＮＰｓを同時に検出できるように、いろいろなＳＮＰｓに対応したプライマー群を同時に検査しても良い。また、一つあるいは幾つかのＳＮＰｓについて、多くの人々のゲノムを検査しても良い。相補鎖伸長反応により生成されるピロリン酸、及びピロリン酸から生成するＡＴＰを媒介として発する化学発光を、プライマーの種類毎に区別して観測する。
【００９６】
図８、図９は実施例４のＤＮＡ変異検出装置の構成例を説明する図であり、図８は鳥瞰図を、図９は図8の一点鎖線９−９に示す位置で断面をとり矢印方向（Y方向）に見た断面図である。
【００９７】
本実施例では、底面が透明である反応チップ１０１上に区分けされた反応セル１０２−ｉ、１０３−ｉ、１０４−ｉ、１０５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）が形成され、その内部に、プライマーが固定されたビーズ１０６−ｉ、１０７−ｉ、１０８−ｉ、１０９−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）が、プライマーの種類毎に保持されている。一方、反応液セル１００−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）が反応セル１０２−ｉ、１０３−ｉ、１０４−ｉ、１０５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）に並行して形成されるとともに、対応する位置にある反応液セル１００と反応セル１０２とは底部で連通するものとされている。反応液セル１００−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）には、１本鎖状態のターゲットＤＮＡを含む反応液１１０−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）が注入される。反応液セル１００と反応セル１０２とは底部で連通するものとなっているから、反応液セル１００−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）に注入された反応液１１０−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）は、反応セル１０２−ｉ、１０３−ｉ、１０４−ｉ、１０５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）に供給されることになる。
【００９８】
相補鎖伸長反応に先立って、プライマー−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）とターゲットＤＮＡ−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）とを、それぞれ十分にハイブリダイズさせる。この後、反応液セル１００−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）にそれぞれ、４種のｄＮＴＰ混合溶液を加えて相補鎖伸長反応を開始する。
【００９９】
相補鎖伸長反応によって得られる化学発光は、反応チップ１０１の透明な底面に配置されたレンズ１１１、ラインセンサー、又は２次元センサーの光検出器１１２で、反応チップ１０１の透明な底面から検出する。ラインセンサー１１２を使用する場合には、検出器支持台１１３を反応チップ１０１の底面に沿って走査して発光を計測する。２次元センサーを使用する場合には、検出器支持台１１３の走査は必要ない。
【０１００】
また、上述の光の検出機構を反応チップ１０１の上面に配置することもできるのは当然である。されに光の検出に光電子増倍管を用いてこれを反応チップ１０１の底面または上面に沿って走査して、順次各反応セル毎に発光を計測しても良い。
【０１０１】
図８、図９に示すＤＮＡ変異検出装置では、同時に複数種類のターゲットＤＮＡについての分析を行なうことができる。
【０１０２】
以上の説明では、３’末端の塩基の種類を変えたプライマーの例を説明したが、ターゲットＤＮＡの異なる位置で起こる塩基置換の検出のため、異なるプライマーを複数種類用意して、ターゲットＤＮＡの異なる位置にある塩基置換を、一括して検出するのにも有効に活用できる。この場合には、反応チップ１０１は少なくとも、プライマーの種類の数だけの、複数個の反応セルをＸ方向に設ける構成とする。
【０１０３】
また、装置構成を簡単にするため、回転テーブル上に反応部を保持する構成としても良い。
【０１０４】
図１０は、実施例４のＤＮＡ変異検出装置の他の構成例を説明する図である。図１０に示す構成では、円形の回転テーブル１２１上の動径方向に、４個の底部が透明な反応槽１２２−ｉ、１２３−ｉ、１２４−ｉ、１２５−ｉが保持されている。反応槽の中には、各々異なるプライマーが表面に固定されたビーズが入っている。反応槽１２２−ｉ、１２３−ｉ、１２４−ｉ、１２５−ｉの底面積は同じである。
【０１０５】
円形の回転テーブル１２１上の周方向に、複数の反応槽１２２−ｉ、１２３−ｉ、１２４−ｉ、１２５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）が保持されている。反応槽１２２−ｉ、１２３−ｉ、１２４−ｉ、１２５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）に、４つの流出口を持つ注入ノズル１２６を用いて、ターゲットＤＮＡを含んだ反応溶液を加えて、ビーズに固定されたプライマーとハイブリダイズさせる。その後、ｄＮＴＰ混合溶液を加えて、各反応槽で相補鎖伸長反応が実行される。
【０１０６】
相補鎖伸長反応の結果得られる化学発光は、回転テーブル１２１の下部に配置された光電子倍増管１２７、１２８、１２９、１３０を用いて、回転テーブル１２１を回転しながら、回転テーブル１２１上の周方向に保持される複数の反応槽について順次行なう。
【０１０７】
（実施例５）
実施例５は、実施例２で説明した２つのオリゴマーを直列にターゲットにハイブリダイズさせて、相補鎖伸長反応を行なう例である。固体に固定された、実施例４で説明した４種のプライマーを用いる代わりに、２番目のオリゴマー（実施例２で説明した第２のプローブ）の種類を変化させてミューテーションを調べる方法である。
【０１０８】
実施例５の方法では、１番目のオリゴマー（実施例２で説明した第１のプローブ）を、ビーズ等の固体担体の表面に固定するので、固体担体に固定するプライマーの種類を少なくすることができる利点が有る。１番目のオリゴマー（プローブ）が固定された固体担体は、実施例４で説明した反
応セル、反応槽に入れられる。
【０１０９】
図１１は、ターゲットＤＮＡとしてｐ５３遺伝子由来の１本鎖ＤＮＡであり、エクソン８の配列を含むＤＮＡ２００を例にとった場合のプライマーの構成例を説明する図である。ＤＮＡ２００は配列番号１０により示される標準的な１５８塩基長の塩基配列を持つ。もちろん、ＤＮＡ２００は配列番号１０により示される標準的な１５８塩基長の塩基配列を含むＤＮＡ鎖であり、図示した配列に加えて、５’末端側、及び／又は、３’末端側に、ｐ５３遺伝子由来の塩基配列が連なっている場合でも、ミューテーション１５０、１５１、１５２、１５３、１５４の検出に関する以下の議論は成立する。
【０１１０】
ＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡ  ＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡ  ＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧ
ＡＧＧＴＧＣＧＴＧＴ  ＴＴＧＴＧＣＣＴＧＴ  ＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧ
ＡＣＣＧＧＣＧＣＡＣ  ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＡＡＴＣＴＣＣＧＣＡ
ＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡ  ＧＣＣＴＣＡＣＣＡＣ  ＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣ
ＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣ  ＴＡＡＧＣＧＡＧＧＴ  ＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧ
ＧＡＣＡＡＧＡＡ                                      ：（配列番号１０）
ミューテーションに対応して、図１１に示した長いオリゴマー１４２、１４４、１４６、１４８を用意する。ここでは簡単のため片側のDNA鎖についての説明をするが、検体２本鎖DNAの両方の鎖について検出を行い、精度を上げることができる。この長いオリゴマーは、図６（ａ）、図６（ｂ）、図６（ｃ）、図６（ｄ）に示す第１のプローブ６１と同様に、相補鎖伸長能力がないように末端処理されている。
【０１１１】
長いオリゴマー１４２、１４４、１４６、１４８と密着して、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズする６塩基長のオリゴマー１４１、１４３、１４５、１４７を用意する。６塩基長のオリゴマー（１４１、１４３、１４５、１４７）は、図６（ｂ）、図６（ｃ）、図６（ｄ）に示す第２のプローブ６２に相当する。６塩基長のオリゴマー（１４１、１４３、１４５、１４７）は、実施例２に於いて説明したように、単独でターゲットＤＮＡにハイブリダイズして相補鎖合成する確率は低いが、長いオリゴマー（１４２，１４４，１４６，１４８）と密着して隣接してハイブリダイズして相補鎖合成することが可能である。
【０１１２】
しかし、長いオリゴマー（１４２、１４４、１４６、１４８）の３’末端がターゲットＤＮＡとミスマッチを起こしていたり、６塩基長のオリゴマー（１４１、１４３、１４５、１４７）の３’末端、又は、６塩基長のオリゴマーの配列の何れかの塩基が、ターゲットＤＮＡとミスマッチである場合、６塩基長のオリゴマーはターゲットＤＮＡにハイブリダイズしない。もちろん５塩基長のオリゴマーを用いても良い。
【０１１３】
ここでは、６塩基長のオリゴマーの３’末端が、ターゲットＤＮＡのミューテーションを検査すべき位置となるようにプライマーを設計して検査を行う。ワイルドタイプとミュータントにそれぞれ相補な６塩基プライマーを用いて相補鎖合成することにより、単にミューテーションの存在の有無だけでなく、存在比をも知ることができる。
【０１１４】
そこで６塩基長のオリゴマーの３’末端が、ターゲットＤＮＡのミューテーションを検査すべき位置となるようにプライマーを設計して検査を行なう。６塩基長のオリゴマーの種類を変化させて検査することにより、６塩基長のオリゴマーの３’末端の塩基種の違いによる相補鎖伸長反応の起こり安さ等も調べることができる。
【０１１５】
実際にｐ５３のｅｘｏｎ（エクソン）８では、図１１の矢印で示す位置１５０、１５１、１５２、１５３、１５４のミューテーションを検出することができる。標準的な塩基Ｘが塩基Ｙに置換された場合をＸ→Ｙと表わすと（Ｘ、ＹはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかである）、図１１で矢印で示す位置１５０、１５１、１５２、１５３、１５４に於けるミューテーションは、Ｔ→Ａ、Ｃ→Ａ、Ｃ→Ｔ、ＧＣ→ＡＴ、Ｃ→Ｔである。
【０１１６】
図１２は、図１１に示すミューテーションを検出するための、相補鎖伸長能力がないプローブ、及び６塩基長のプライマーの構成を示す図である。
【０１１７】
相補鎖伸長能力がないプローブ１４２は、配列番号１０の配列の５’末端から４３番目から５８番目の部分に相補結合し配列番号１１の１６塩基長の塩基配列を持つ。もちろん、プローブ１４２は２０塩基長から３０塩基長のオリゴマーでも良い。Ｎ1は、ワイルドタイプおよびミュータントに対応した塩基種でＧあるいはＴのいずれかである。
【０１１８】
ＣＴＣＣＣＡＮ1ＧＡＣ  ＡＧＧＣＡＣ                  ：（配列番号１１）
６塩基長のプライマー１４１は、配列番号１０の配列の５’末端から３７番目から４２番目の部分に相補結合し配列番号１１’の６塩基長の塩基配列を持つ。Ｎ2は、Ａ、Ｔの何れかである。
【０１１９】
Ｎ2ＡＡＣＡＣ                                      ：（配列番号１１’）
Ｎ2＝Ｔの場合に信号が得られ、Ｎ2＝Ａの時に信号がなければ、ミューテーション１５０が存在することが分かる。
【０１２０】
相補鎖伸長能力がないプローブ１４４は、配列番号１０の配列の５’末端から５８番目から７２番目の部分に相補結合し配列番号１２の１６塩基長の塩基配列を持つ。この塩基長は安定なハイブリダイズに十分なもので有れば良く、必要に応じて更に長いオリゴマーを使用しても良い。Ｎ1はＧあるいはＡ、Ｎ2Ｎ3はＣＧあるいはＴＡである。
【０１２１】
ＴＣＴＧＴＮ3Ｎ2ＧＣＣ  Ｎ1ＧＴＣＴＣ                ：（配列番号１２）
６塩基長のプライマー１４３は、配列番号１０の配列の５’末端から５２番目から５７番目の部分に相補結合し配列番号１２’の６塩基長の塩基配列を持つ。Ｎ4は、Ｔ、Ｇの何れかである。
【０１２２】
ＴＣＣＣＡＮ4                                      ：（配列番号１２’）
相補鎖伸長能力がないプローブ１４６は、配列番号１０の配列の５’末端から６９番目から８４番目の部分に相補結合し配列番号１３の１６塩基長の塩基配列を持つ。
【０１２３】
ＧＴＴＴＣＴＣＴＴＣ  ＣＴＣＴＧＴ                    ：（配列番号１３）
６塩基長のプライマー１４５は、配列番号１０の配列の５’末端から６３番目から６８番目の部分に相補結合し配列番号１３’の６塩基長の塩基配列を持つ。Ｎ1はＧあるいはＡであり、Ｎ2Ｎ3はＣＧあるいはＴＡである。
【０１２４】
Ｎ3Ｎ2ＧＣＣＮ1                        ：（配列番号１３’）
それぞれの位置のミューテーションを調べるにはワイルドタイプも含めて４つのプライマーを用意する（両方のＤＮＡ鎖を調べるときは８つ）。ミューテーションが有るか否かを調べるだけならワイルドタイプに対応するプライマーは混合物にして用いればよい。もちろん、ターゲットＤＮＡに相補結合するプライマーの位置をずらして、１又は複数のミューテーションを順次検出できるようにしても良い。
【０１２５】
相補鎖伸長能力がないプローブ１４８は、配列番号１０の配列の５’末端から１４１番目から１５６番目の部分に相補結合し配列番号１４の１６塩基長の塩基配列を持つ。
【０１２６】
ＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣ  ＴＴＣＧＴＴ                    ：（配列番号１４）
６塩基長のプライマー１４７は、配列番号１０の配列の５’末端から１３５番目から１４０番目の部分に相補結合し配列番号１４’の６塩基長の塩基配列を持つ。Ｎは、ＧあるいはＡのいずれかである。
【０１２７】
ＡＣＣＴＣＮ                                        ：（配列番号１４’）
Ｎ＝Ａの場合に、ミューテーション１５４の存在を検知できる。
【０１２８】
なお、実施例４で説明したＤＮＡ変異検出装置を、上記で説明した各実施例でのミューテーションの検出に使用できることは言うまでもない。
【０１２９】
以上説明したように本発明によれば、４種類のｄＮＴＰを同時に反応部に加えて相補鎖伸長反応を行なうことにより、一度に生成するピロリン酸の分子数を増やし、また、ピロリン酸の生成プロセスを繰り返すことにより、従来のパイロシーケンス法に比較して、数桁高い発光強度を得ることができる。
【０１３０】
従って、ＰＣＲ等の増幅プロセスを行なわずにターゲットＤＮＡの有無、及びミューテーションの有無を調べることができる。また、ターゲットＤＮＡ中にワイルドタイプとミュータントが一定の比率で存在するときには、それぞれに対応するプライマーをそれぞれ異なる固体担体の表面上に固定して用いることにより、種々の塩基置換を調べることができる。特に、長いＤＮＡに含まれる複数部分の置換を知ることができる。本発明の方法は、ターゲットＤＮＡをビーズに固定したり、区画された固体表面に固定したりして、多くのＤＮＡ試料を同時に解析する高スループット装置に応用可能である。
【０１３１】
以下に、本発明の変異検出方法の特徴を列記する。
【０１３２】
本発明の変異検出方法では、検出しようとする特定のＤＮＡ配列、又は特定のＲＮＡ配列の領域に相補的な配列を含むプライマーを、ＤＮＡ試料、又はＲＮＡ試料にハイブリダイズさせて、核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、あるいは、これらの類似体）と、ＤＮＡ試料の場合にはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ試料の場合には逆転写酵素を用いた相補鎖伸長反応が進行するか否かを、相補鎖伸長反応の反応副産物として生じるピロリン酸をＡＴＰに変換し、ルシフェラーゼ等の酵素を用いて発光反応を行ない発する光を検出することにより特定配列の有無を検出する。
【０１３３】
ＲＮＡ試料に直接ハイブリダイズするプライマー、４種の核酸基質、逆転写酵素を用いた相補鎖伸長反応では、ｃＤＮＡが形成され、この時、遊離するピロリン酸を検出することにより、ＲＮＡの変異を検出することができる。
【０１３４】
上記方法に於いて、特定の配列にハイブリダイズするプライマーに加えて、複数種の核酸基質を同時に加えて相補鎖伸長反応を繰り返すことにより生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して発光反応を起こさせて発光を検出する。また、特定の配列にハイブリダイズするプライマーに加えて、４種の核酸基質を同時に加えて相補鎖伸長反応により生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して発光反応を起こさせて発光を検出する。
【０１３５】
また、上記方法に於いて、プライマーの３’末端の近傍に人為的に、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡと相補的でないヌクレオチドを入れて、相補鎖伸長反応が起きたか否かを、ピロリン酸をＡＴＰに変換して、ルシフェラーゼ等によりルシフェリン等の発光基質と反応せしめ化学発光をおこして光を検出することにより１塩基置換（ＳＮＰｓ）を検出する。
【０１３６】
また、上記方法において、ワイルドタイプおよびミュータントにハイブリダイズして相補鎖合成を起こし得る少なくとも２種のプライマーを用いて、それぞれ独立に相補鎖合成と化学発光の検出を行い、これらの情報から正確にミュータントの存在の有無、および存在比を決定する。さらに、２本鎖DNAのそれぞれについて、上記２種のプライマーを準備して（合計４種）相補鎖合成と発光検出を行い、正確にミュータントの存在比を決定する。これは測定サンプルが種々ノゲノムDNAの混合物であり、病気とSNPsの関連を統計的に調べる上で有効である。
【０１３７】
また、上記方法に於いて、相補鎖伸長反応による伸長相補鎖を末端から酵素で分解し、繰り返しプライマーをターゲットＤＮＡ、ターゲットＲＮＡにハイブリダイズさせて相補鎖伸長反応を繰り返し行ない、一連の繰り返しの相補鎖伸長反応で多量のＰＰｉを生成してＡＴＰに変換し、ルシフェリンと反応させて光を得てこれを検出する。伸長相補鎖を分解する酵素として、５’末端からＤＮＡ鎖、又はＲＮＡ鎖を分解する酵素を使用する。
【０１３８】
また、上記方法に於いて、ターゲットとなるＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖に相補であり、目的とする２塩基置換部位又はその近傍に３’末端が結合するプライマーを用いて相補鎖伸長反応を行ない、相補鎖伸長反応で生じるピロリン酸をＡＴＰ等に変換してルシフェリン等の発光基質と反応させ化学発光を起こし光学的に１塩基置換（ＳＮＰｓ）を検出する。
【０１３９】
本発明の試薬キットは、ターゲットとなるＤＮＡ鎖、又はＲＮＡ鎖に相補であり目的とする１塩基置換部位又はその近傍に３’末端が結合するプライマーと、核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、あるいは、これらの類似体）を少なくとも含み１塩基置換（ＳＮＰｓ）を少なくとも含み、１塩基置換（ＳＮＰｓ）を検出したり、その存在比を調べるための試薬キットである。
【０１４０】
また、本発明の試薬キットは、ターゲットとなるＤＮＡ鎖、又はＲＮＡ鎖に相補であり目的とする１塩基置換部位又はその近傍に３’末端が結合するプライマーと、核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、あるいは、これらの類似体）と、不純物として含まれるピロリン酸を分解する酵素を少なくとも含み、１塩基置換（ＳＮＰｓ）を検出したり、その存在比を調べるための試薬キットである。
【０１４１】
本発明の１塩基置換の検出法では、末端ヌクレオチドの種類がそれぞれ異なるプライマーを、プライマーの種類毎にそれぞれ固体表面の異なる区画に、あるいは、プライマーの種類毎にそれぞれ異なる反応槽に保持し、各区画に、あるいは、各反応槽の反応液に、複数種類のｄＮＴＰの混合物を加えることにより、プライマーを始点とする相補鎖伸長反応が起こり得る状態として、実際に相補鎖伸長反応がどの種類のプライマーで起こったかを、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを始点とする相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して、ルシフェリン等と反応させることにより生じる化学発光を検出することにより、相補鎖伸長反応が起こったプライマーの種類を識別して、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡ中の変異を検出する。
【０１４２】
また、本発明の１塩基置換の検出法では、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズし、相補鎖伸長能力のない、互いに異なる配列を持つ複数種類の長いオリゴマーを、長いオリゴマーの種類毎にそれぞれ固体表面の区画に、あるいは、長いオリゴマーの種類毎にそれぞれ異なる反応槽に保持し、各区画に、あるいは、各反応槽に、相補鎖伸長能力のある５塩基長から８塩基長の範囲の短いオリゴマーを添加して、短いオリゴマーを長いオリゴマーと直列にターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズさせて、複数種類のｄＮＴＰの混合物を更に加えることにより、短いプライマーを始点とする相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して、ルシフェリン等と反応させることにより生じる化学発光を検出することにより、相補鎖伸長反応が起こったプライマーの種類を識別して、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡ中の変異を検出する。この場合用いる化学発光試薬はルシフェリンに限定されるものではない。
【０１４３】
本発明の変異検出装置は、末端ヌクレオチドの種類がそれぞれ異なるプライマーを、プライマーの種類毎にそれぞれ固体表面の異なる区画に保持する複数の区画を具備する反応チップ、あるいは、プライマーの種類毎にそれぞれ異なる反応槽に保持する複数の反応槽が配置される反応槽支持基板と、各区画に、あるいは、各反応槽の反応液に、複数種類のｄＮＴＰの混合物を加えることにより、プライマーを始点とする相補鎖伸長反応が起こり得る状態として、実際に相補鎖伸長反応がどの種類のプライマーで起こったかを、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを始点とする相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して、ルシフェリン等と反応させることにより生じる化学発光を検出する光検出器とを有し、相補鎖伸長反応が起こったプライマーの種類を識別して、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡに含まれる変異を検出する。
【０１４４】
また、本発明のＤＮＡ又はＲＮＡの変異検出装置は、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズし、相補鎖伸長能力のない、互いに異なる配列を持つ複数種類の長いオリゴマーを、長いオリゴマーの種類毎にそれぞれ固体表面の区画に保持する複数の区画を具備する反応チップ、あるいは、長いオリゴマーの種類毎にそれぞれ異なる反応槽に保持保持する複数の反応槽が配置される反応槽支持基板と、各区画に、あるいは、各反応槽に、相補鎖伸長能力のある５塩基長から８塩基長の範囲の短いオリゴマーを添加して、短いオリゴマーを前記長いオリゴマーと直列にターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズさせて、複数種類のｄＮＴＰの混合物を更に加えることにより、短いプライマーを始点とする相補鎖伸長反応で生成するピロリン酸をＡＴＰに変換して、ルシフェリン等と反応させることにより生じる化学発光を検出する光検出器とを有し、相補鎖伸長反応が起こった短いプライマーの種類を識別して、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡに含まれる変異を検出する。
【０１４５】
更に、本発明の変異検出方法は、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡの特定の配列の領域に相補的な配列を含むプライマーをハイブリダイズさせる工程と、４種類の核酸基質とポリメラーゼ又は逆転写酵素とを用いて、プライマーを始点とする相補鎖伸長反応を行なう工程と、相補鎖伸長反応の反応副産物として生じるピロリン酸をＡＴＰに変換し、ルシフェラーゼ等の酵素を用いて発光反応を行ない発光を検出する工程とを有し、特定の配列の有無を検出する。
【０１４６】
更に、本発明の変異検出方法は、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡの特定の配列の領域に相補的な配列を含み、３’末端から２塩基目、又は、３塩基目の塩基の種類がターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡの配列と相補的でない配列を持つプライマーをハイブリダイズさせる工程と、４種類の核酸基質とポリメラーゼ又は逆転写酵素とを用いて、プライマーを始点とする相補鎖伸長反応を行なう工程と、相補鎖伸長反応の反応副産物として生じるピロリン酸をＡＴＰに変換し、酵素を用いて発光反応を行ない発光を検出する工程とを有し、特定の配列の有無を検出する。
【０１４７】
更に、本発明の変異検出方法は、相補鎖伸長能力のある５塩基長から８塩基長の範囲の短いオリゴマーと、ターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズし相補鎖伸長能力のない長いオリゴマーとを直列にターゲットＤＮＡ、又はターゲットＲＮＡにハイブリダイズさせる工程と、４種類の核酸基質とポリメラーゼ又は逆転写酵素とを用いて、短いプライマーを始点とする相補鎖伸長反応を行なう工程と、相補鎖伸長反応の反応副産物として生じるピロリン酸をＡＴＰに変換し、酵素を用いて発光反応を行ない発光を検出する工程とを有し、特定の配列の有無を検出する。
【０１４８】
本発明の検出方法はターゲットとなるワイルドタイプおよびミュータントに対応した２つのプローブ（プライマー）を使用し、精度を上げるもので、相補鎖合成により生成したピロリン酸の検出に限定されるものではない。生成物のDNA鎖をそれぞれ異なる標識蛍光体で標識し、電気泳動などで比較分析しても良い。さらに、他のSNPs検出方法似も応用可能である。すなわち、ワイルドタイプに作用して信号を与えるプローブとミュータントに作用して信号を与えるプローブの両方を活用して精度良くミュータントの存在比を求める。
【０１４９】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、（１）ＤＮＡに含まれるミューテーションの有無を特別に設計されたプライマーを用いること、（２）プライマーが相補鎖伸長反応により伸長相補鎖を形成するか否かで判断できる様にすること、（３）伸長相補鎖の検出を、相補鎖伸長反応により放出されるピロリン酸の数を、公知のパイロシーケンシングに比べて２桁以上とできることにより、ミューテーションを、簡単に容易に高感度で検出できる。また、複数のプローブあるいはプライマーを用いることにより、ワイルドタイプおよびミュータントを含む複数の試料について、精度高く変異種の存在比を調べることができる。
【０１５０】
また、本発明によれば、複数種のＤＮＡ変異株が含まれるＤＮＡ試料の分析が可能であり、予想される塩基配列を考慮して、プライマーを複数種類準備して、ミューテーションを調べることにより、ＤＮＡ変異計測に要求される種々の項目（予想された塩基配列だけが存在するのか、変異が含まれているのか、変異はどのような種類で何処に現れるのか、変異が何カ所に現れるのか等）を簡便に知ることができる。
【０１５１】
本発明では、ゲル電気泳動を使わず、高感度で励起光源を必要とせず、反応は単純で時間も短く簡便な、ＤＮＡ変異検出方法、及び装置、更に、複数の変異を含んだ試料を信頼度高く分析できるＤＮＡ変異検出方法、及び装置を提供することができる。従って、ＤＮＡ変異計測に要求される種々の項目を容易に知ることができる。
【０１５２】
【配列表】
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配列表フリーテキスト
（１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記載
伸長相補鎖を形成するためのＤＮＡプライマー。
【０１５３】
（２）配列番号２の配列に関する他の関連する情報の記載
伸長相補鎖を形成するためのＤＮＡプライマー。
【０１５４】
（３）配列番号３の配列に関する他の関連する情報の記載
伸長相補鎖を形成するためのＤＮＡプライマー。
【０１５５】
（４）配列番号４の配列に関する他の関連する情報の記載
伸長相補鎖を形成するためのＤＮＡプライマー。
【０１５６】
（５）配列番号５の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号１の配列の５’末端から１８番目の塩基Ｔを塩基Ａに置き換えミスマッチをを導入したＤＮＡプライマー。
【０１５７】
（６）配列番号６の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号２の配列の５’末端から１８番目の塩基Ｔを塩基Ａに置き換えミスマッチをを導入したＤＮＡプライマー。
【０１５８】
（７）配列番号７の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号３の配列の５’末端から１８番目の塩基Ｔを塩基Ａに置き換えミスマッチをを導入したＤＮＡプライマー。
【０１５９】
（８）配列番号８の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号４の配列の５’末端から１８番目の塩基Ｔを塩基Ａに置き換えミスマッチをを導入したＤＮＡプライマー。
【０１６０】
（９）配列番号９の配列に関する他の関連する情報の記載
ターゲットＤＮＡ。
【０１６１】
（１０）配列番号１０の配列に関する他の関連する情報の記載
ｐ５３遺伝子由来の１本鎖ＤＮＡでありエクソン８の配列を含むターゲットＤＮＡ。
【０１６２】
（１１）配列番号１１の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号１０の配列の５’末端から４３番目から５８番目の部分に相補結合し、６塩基長の塩基配列を持つ相補鎖伸長能力がないＤＮＡプローブ（ｎは、ａ、ｃ、ｇ、ｔの何れか）。
【０１６３】
（１２）配列番号１２の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号１０の配列の５’末端から５８番目から７２番目の部分に相補結合し、１６塩基長の塩基配列を持つ相補鎖伸長能力がないＤＮＡプローブ（ｎ1はｇあるいはａ、ｎ2ｎ3はｃｇあるいはｔａ）。
【０１６４】
（１３）配列番号１３の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号１０の配列の５’末端から６９番目から８４番目の部分に相補結合し、１６塩基長の塩基配列を持つ相補鎖伸長能力がないＤＮＡプローブ。
【０１６５】
（１４）配列番号１４の配列に関する他の関連する情報の記載
配列番号１０の配列の５’末端から１４１番目から１５６番目の部分に相補結合し、１６塩基長の塩基配列を持つ相補鎖伸長能力がないＤＮＡプローブ。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１を説明する図。
【図２】実施例１で使用したプライマーの構成例と、それぞれのプライマーによる伸長相補鎖の形成に応じた発光強度を説明する図。
【図３】ミューテーションがあるターゲットＤＮＡの検出例を示す図であり、プライマーに応じた相補鎖伸長反応に伴って反応副産物として生成するピロリン酸の有無を示すルシフェラーゼによる相対発光強度を示す図。
【図４】本発明の実施例に於ける化学反応の概要を説明する図。
【図５】公知のパイロケーシングによる相補鎖伸長反応の発光強度と、実施例１による相補鎖伸長反応の発光強度とを比較した図。
【図６】本発明の実施例２を説明する図。
【図７】本発明の実施例３を説明する図。
【図８】本発明の実施例４のＤＮＡ変異検出装置の構成例を示す鳥瞰図。
【図９】本発明の実施例４のＤＮＡ変異検出装置の構成例を示す断面図。
【図１０】本発明の実施例４のＤＮＡ変異検出装置の他の構成例を説明する図。
【図１１】本発明の実施例５を説明する図。
【図１２】図１１に示すミューテーションを検出するための、相補鎖伸長能力がないプローブ、及び６塩基長のプライマーの構成を示す図。
【符号の説明】
１、２、４５、６３、８５…ターゲットＤＮＡ、３、３５…ターゲットＤＮＡのミューテーションの有無を調べる位置、５、４６、８６…プライマー、６…プライマーの３’末端の塩基、７、８、４８、６６、６７、７０、８２…伸長相補鎖、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４…相対発光強度を示す曲線、４７…相補鎖合成の基質、４９、４９’、６８、８８…ピロリン酸、５０…ＡＴＰ、５１…発光、６１…第１のプローブ、６２…第２のプローブ、６４…ダイデオキシヌクレオチド、６５…第２のプローブがハイブリダイズすべきターゲットＤＮＡの部位、６９…ミューテーション、８１…固体担体、８３…伸長相補鎖により形成された相補鎖、８４…ヌクレオチド、１０１…反応チップ、１０２−ｉ、１０３−ｉ、１０４−ｉ、１０５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）…反応セル、１０６−ｉ、１０７−ｉ、１０８−ｉ、１０９−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）…ビーズ、１１１…レンズ、１１２…光検出器、１１３…検出器支持台、１４１、１４３、１４５、１４７…６塩基長のオリゴマー、１４２、１４４、１４６、１４８…長いオリゴマー、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４…ミューテーション、１２１…円形の回転テーブル、１２２−ｉ、１２３−ｉ、１２４−ｉ、１２５−ｉ（ｉ＝１、２、…、Ｎ）…反応槽、１２６…注入ノズル、１２７、１２８、１２９、１３０…光電子倍増管、２００…ｐ５３遺伝子由来のエクソン８の配列を含むＤＮＡ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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