(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチド又はこのペプチドと担体との結合物を免疫原として取得することができる、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、更にプラスミノーゲン及び低密度リポタンパク質には結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
変性又は修飾が、酸化、還元、分解、加熱又は変性剤によるものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ポリクローナル抗体である、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体を用いる、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法。
【請求項６】
変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）が、酸化、還元、分解、加熱又は変性剤による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）である、請求項５に記載の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈硬化症促進の危険因子であるとの指摘がなされ、疾患の診断等に重要な役割を有する変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体、及びこの抗体を用いる変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法に関するものである。
【０００２】
本発明は、臨床検査分野を始めとする医学分野において特に有用なものである。
【０００３】
【従来の技術】
リポタンパク質（ａ）（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）、Ｌｐ（ａ））は、１９６３年ベルクによりβ−リポタンパク質の変異型として初めて報告された〔Ｋ．Ｂｅｒｇ，Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，５９巻，３６９〜３８２頁，１９６３年〕。
【０００４】
その後種々の検討の結果、リポタンパク質（ａ）は、通常生体内でコレステロールエステルの輸送を主な役割とする低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）とリポタンパク質（ａ）に特有なタンパク質であるアポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）、ａｐｏ（ａ）、アポ（ａ））からなり、ＬＤＬのタンパク質部分であるアポリポタンパク質Ｂ−１００とアポリポタンパク質（ａ）との間でジスルフィド結合により結合した物質であることが判明した。
【０００５】
臨床的には狭心症や心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患患者でリポタンパク質（ａ）値が高値のものが多いということが判明した〔Ｇ．Ｄａｈｌｅｎ  ｅｔａｌ．，Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．（Ｓｕｐｐｌ．），５３１巻，１〜２９頁，１９７２年、Ｋ．Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６巻，３４７〜３５２頁，１９７９年、Ｇ．Ｍ．Ｋｏｓｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、３８巻，５１〜６１頁，１９８１年〕。
【０００６】
そして、リポタンパク質（ａ）は、コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール等の虚血性心疾患の既知の危険因子とは相関を示さず、動脈硬化症、虚血性心疾患の独立した新規な危険因子であることが報告された〔Ｃ．Ｅｈｎｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２３６巻，４３１〜４３９頁，１９７１年、Ｈ．Ｓｃｈｒｉｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２巻，５９１〜５９６頁，１９８４年〕。
【０００７】
１９８７年、イートンら〔Ｄ．Ｌ．Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４巻，３２２４〜３２２８頁，１９８７年〕は生化学的手法により、次いでマクリーンら〔Ｊ．Ｗ．ＭｃＬｅａｎｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０巻，１３２〜１３７頁，１９８７年〕はｃＤＮＡ塩基配列よりアポリポタンパク質（ａ）のアミノ酸配列を決定した。
【０００８】
これによりアポリポタンパク質（ａ）はその分子構造の大部分が、線溶系に働くプラスミノーゲン分子と相同性の高い部分から構成されていることが判明した。
【０００９】
このことはリポタンパク質（ａ）が、動脈硬化、リポタンパク質、血液凝固線溶系を同一視点で考えるうえでの重要な鍵となることを示唆するものであった。
【００１０】
また、リポタンパク質（ａ）が動脈硬化症の危険因子としてだけではなく、糖尿病性腎症あるいはＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内腔拡張術）術後再狭窄をおこした人で高値を示す傾向があるということや、ＣＲＰのような急性反応性タンパク質と同様の挙動を示すという報告もあり、血液等の生体中のリポタンパク質（ａ）を測定することは臨床的に重要な意義を持つものとなってきており、リポタンパク質（ａ）を正確に測定できる方法が望まれていた。
【００１１】
リポタンパク質（ａ）の測定は、単純免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）〔Ｊ．Ｊ．Ａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，１８巻，３３１〜３３８頁，１９７７年〕、及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）〔Ａ．Ａｂｅｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１７７巻，３１〜４０頁，１９８８年〕等の免疫学的測定法により行われているが、リポタンパク質（ａ）を免疫原として動物に免疫して得られる抗体をこれらの免疫学的測定法にそのまま使用すると、リポタンパク質（ａ）はその分子中にＬＤＬを含みそしてプラスミノーゲンと相同性の高い部分を持つため、生体試料に含まれるＬＤＬやプラスミノーゲンとも反応してしまい、ＬＤＬやプラスミノーゲンをも測り込んでしまうので、正確なリポタンパク質（ａ）の測定値を得ることができない。
【００１２】
そこで、リポタンパク質（ａ）からＬＤＬ部分を除いたアポリポタンパク質（ａ）を免疫原として用いてリポタンパク質（ａ）に対する抗血清（ポリクローナル抗体）を作製するという方法が報告されているが〔Ｇ．Ｍ．Ｆｌｅｓｓ  ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１巻，８７１２〜８７１８頁，１９８６年、Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５巻，９８１〜９８６頁，１９９０年〕、この方法により得られた抗血清（ポリクローナル抗体）はＬＤＬとは交叉反応を起こさないものの、アポリポタンパク質（ａ）はプラスミノーゲンと相同性の高い部分を持つために、この抗血清（ポリクローナル抗体）はプラスミノーゲンとは交叉反応性を有する。
【００１３】
そのため、この抗血清（ポリクローナル抗体）はヒトプラスミノーゲンで吸収操作を行いプラスミノーゲンと反応する抗体を除去するという煩雑な操作を行わなければ使用できないものであった。
【００１４】
ところで、悪玉リポタンパク質と言われているＬＤＬでは、酸化等の変性又は修飾を受けたＬＤＬと動脈硬化症の発症機序の関わりが指摘されている。
【００１５】
それは、変性又は修飾を受けていないＬＤＬでは、細胞のＬＤＬ受容体がその細胞内のコレステロ−ルの量に応じてネガティブフィードバック調節を行い、細胞内のＬＤＬ量が正常値にコントロ−ルされる。しかし、ＬＤＬが生体内で何らかの化学的修飾又は変性を受けて修飾又は変性型ＬＤＬになってしまうと、マクロファ−ジにより異物と認識され、マクロファージ内に無制限に取り込まれ泡末化してしまい、動脈硬化の初期病変として非常に大きな意味を持つというものである〔Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２巻，３４〜４７頁，１９８６年〕。
【００１６】
このＬＤＬの場合と同様にリポタンパク質（ａ）においても、リポタンパク質（ａ）がある種の酸化を受けると、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）には存在しなかった性質が現れて、これにより動脈硬化症促進の危険因子となるということが指摘されている〔Ｍ．Ｅ．Ｈａｂｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，４１４３〜４１５１頁，１９９２年、Ｊ．Ｇａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２６５巻，１１１〜１１５頁，１９９４年〕。
【００１７】
これは、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）が、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）とは別の異なる面において、動脈硬化症の危険因子となることを意味するものである。
【００１８】
そして、この動脈硬化症の危険因子として重要である変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を正確に測定できる方法が望まれていた。
【００１９】
しかしながら、酸化を受けたＬＤＬとβ２−グリコプロテインＩの複合体、及び酸化を受けたＨＤＬとβ２−グリコプロテインＩの複合体を酵素免疫測定法のサンドイッチ法で測定する方法についてはＷＯ９５／０９３６３号再公表特許公報に開示されているものの、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）には結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体、及び変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法については知られていなかった。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来存在しなかった、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）には結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体、及び変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法の開発を目指して鋭意検討を行った結果、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、更にＬＤＬ並びにプラスミノーゲンには結合せず、かつ変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）であれば特異的に結合することができる抗体、及び、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、ＬＤＬ並びにプラスミノーゲンを測り込むことが無く、かつ変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を正確に測定することができる測定法を完成するに至った。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の発明よりなるものである。
【００２２】
（１）配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチド又はこのペプチドと担体との結合物を免疫原として取得することができる、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、更にプラスミノーゲン及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）には結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体。
【００２４】
（２）  変性又は修飾が、酸化、還元、分解、加熱又は変性剤によるものである、前期（１）に記載の抗体。
【００２５】
（３）  モノクローナル抗体である、前期（１）又は（２）に記載の抗体。
【００２６】
（４）  ポリクローナル抗体である、前期（１）又は（２）に記載の抗体。
【００２７】
（５）  前記（１）、（２）、（３）又は（４）に記載の抗体を用いる、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法。
【００２８】
（６）  変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）が、酸化、還元、分解、加熱又は変性剤による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）である、前記（５）に記載の測定法。
【００２９】
【発明の実施の形態】
（１）  変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）
本発明において、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）とは、酸化、還元、加水分解などの分解、加熱、又はタンパク質変性剤などの変性剤等により、一次構造、高次構造若しくは立体構造の変化、分解又は化学的修飾を受け、本来の自然な（ネイティブな）リポタンパク質（ａ）である変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）とその構造、組成又は立体的配置が異なってしまったものを言う。
【００３０】
（２）  抗体
本発明の抗体は、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）には結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体であるが、更に、ＬＤＬ及びプラスミノーゲンにも結合せず交叉反応を起こさないものである。
【００３１】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体よりなる抗血清、又はモノクローナル抗体のいずれのタイプのものをも含み、又これらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’等）をも含むものである。
【００３２】
（３）  免疫原としてのペプチド
本発明の抗体は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチド又はこのペプチドと担体との結合物を免疫原として、動物に免疫することにより取得することができる。
【００３３】
この免疫原としての配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドにおけるアミノ酸配列の一部とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の任意の連続したアミノ酸の配列のことであるが、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を抗体は認識できるとの報告〔Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年〕があるので、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の任意の連続した３以上のアミノ酸の配列であることが好ましい。
【００３４】
そして、この免疫原としての配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体よりなるペプチドに加えて、そのペプチドのＮ末端側又はＣ末端側又はＮ末端側とＣ末端側の両方に更にアミノ酸又はペプチドが結合したものも含むということを意味する。
【００３５】
ここで結合するアミノ酸又はペプチドは、ＬＤＬ又はプラスミノーゲンと相同性の高いアミノ酸配列を含まなければ特に制限されるものではない。
【００３６】
但し、アミノ酸数が増えペプチドが大きくなると、ＬＤＬ又はプラスミノーゲンとの相同性が生じてくる可能性があるので、この免疫原としての配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドは、５０以内のアミノ酸から構成されるのが好ましく、アミノ酸数が３０以内であればより好ましい。
【００３７】
（４）  免疫原としてのペプチドの調製
免疫原としての配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドは、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、またペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学IV」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学  下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができる。
【００３８】
そして、このペプチドは対応する配列を持つＤＮＡより組換えＤＮＡ技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１  遺伝子研究法I」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１  遺伝子研究法II」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１  遺伝子研究法III」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製を行えばよい。
【００３９】
（５）  免疫原としてのペプチドと担体の結合物
免疫原としての、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドと担体との結合物は、上記記載の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドと抗体産生用の担体（キャリア）を結合させたものである。
【００４０】
担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００４１】
そして、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチドと担体との結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ペンジジン法又はジパルミチルリジン法等の公知の結合法を用いることができる。
【００４２】
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に上記のペプチドを吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００４３】
なお、免疫原が低分子物質の場合には、担体と結合したものを免疫するのが一般的であるものの、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告〔木山ら「日本薬学会第１１２年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年〕もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００４４】
（６）  ポリクローナル抗体又は抗血清の調製
本発明の抗体において、ポリクローナル抗体及び抗血清は以下の操作により調製することができる。
【００４５】
まず、上記の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチド又はこのペプチドと担体との結合物を免疫原として、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）又は鳥類（ニワトリ等）に免疫する。
【００４６】
この免疫原の免疫量は免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には約５〜１０週齢のマウス一匹当たり一回につき０．１μｇ〜５ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの上記ペプチドを含む量の免疫原を免疫注射する。また、ウサギの場合はウサギ一匹当たり一回につき１０μｇ〜数十ｍｇの上記ペプチドを含む量の免疫原を免疫注射するのが好ましい。
【００４７】
なお、この免疫原はアジュバントを添加混合して免疫注射をすることが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
【００４８】
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００４９】
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に免疫原を追加免疫注射する。この場合も免疫原はアジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００５０】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して本発明の抗血清を得る。
【００５１】
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、本発明におけるポリクローナル抗体を得ることができる。
【００５２】
なお、免疫原に担体としてヒト血清アルブミン又はＢＳＡを用いた場合は、得られた抗体あるいは抗血清中にヒト血清アルブミンと交叉反応を起こす抗体が含まれる可能性があるので、このような抗体の除去処理を行うことが好ましい。この除去処理方法としては、担体として用いたヒト血清アルブミン又はＢＳＡを、得られた抗体あるいは抗血清の溶液中に添加して精製した凝集物を取り除くか、担体として用いたヒト血清アルブミン又はＢＳＡを不溶化担体に固相化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
【００５３】
（７）  モノクローナル抗体の調製
本発明の抗体におけるモノクローナル抗体の調製法について以下説明を行う。
【００５４】
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法〔Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年〕によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
【００５５】
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
【００５６】
まず、上記の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチド又はこのペプチドと担体との結合物を免疫原として、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット等、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリ等）に免疫する。
【００５７】
この免疫原の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当たり一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの上記ペプチドを含む量の免疫原を免疫注射するのが好ましい。
【００５８】
なお、免疫原はアジュバントを添加混合して免疫注射をすることが好ましい。
【００５９】
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
【００６０】
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００６１】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に免疫原を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も免疫原はアジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００６２】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、免疫原を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
【００６３】
この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００６４】
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット等）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）  ９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）などを用いることができる。
【００６５】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソーム又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
【００６６】
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００６７】
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）とは結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）と特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ、この方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明におけるモノクローナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００６８】
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明のモノクローナル抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
【００６９】
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明のモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００７０】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせることにより、精製された本発明におけるモノクローナル抗体を得ることができる。
【００７１】
（８）  測定法
本発明の測定法は、上記の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部若しくは全体を含む５０以内のアミノ酸から構成されるペプチド又はこのペプチドと担体との結合物を免疫原として取得することができる、上記の変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、更にプラスミノーゲン及びＬＤＬには結合せず、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）には特異的に結合する抗体を用いる、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法であるが、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、ＬＤＬ及びプラスミノーゲンを測り込むことが無く、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を正確に測定することができる測定法である。
【００７２】
この本発明の測定法においては、上記の抗体のうち１種類の抗体を用いるだけでなく、複数種類の抗体を組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
そして、本発明の測定法は、抗体を用いる測定法即ち免疫学的測定法であればいずれの方法においても、その測定法で使用される抗体として上記の抗体を用いることにより、所期の効果を奏するものであって、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫比濁法、ラテックス凝集反応法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法又はウエスタンブロット法等により本測定法は実施することができる。
【００７４】
（９）  測定試料
本発明の測定法における試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水などの体液、大便、血管若しくは肝臓などの臓器、組織、細胞、又は臓器、組織若しくは細胞の抽出液等、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００７５】
（１０）  標識抗体を用いた免疫測定法
本発明の測定法を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合には固相化抗体又は標識抗体等の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）と直接結合する抗体のうち少なくとも１種の抗体が上記の抗体であればよい。
【００７６】
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック、又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
【００７７】
固相化抗体は、固相担体と抗体を物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により調製することができる。
【００７８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させることにより行うことができる。
【００７９】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより行うことができる。
【００８０】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ2 −ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００８１】
標識物質と抗体との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００８２】
測定の操作法は公知の方法〔日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年、北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年〕により行うことができる。
【００８３】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させて、固相化抗体−変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）−標識抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量より試料中の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）量を測定することができる。
【００８４】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００８５】
（１１）  凝集反応法
本測定法を免疫比濁法、ラテックス凝集反応法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００８６】
抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
【００８７】
この感作の方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００８８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させることにより行うことができる。
【００８９】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル、マレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより行うことができる。
【００９０】
測定の操作法は公知の方法により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
【００９１】
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロタイタープレート等の容器中で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。
【００９２】
なお、目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【００９３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９４】
〔実施例１〕
（配列表の配列番号２で示されるペプチドの合成）
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドの合成を行った。
【００９５】
まず、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル４３０Ａペプチド自動合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ４３０Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により、取扱説明書に従って、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸固相法で当該ペプチドの合成を行った。副反応を抑制するためスカベンジャーとして、ジメチルスルファイド、ｐ−チオクレゾール、ｍ−クレゾール、そしてアニソールの存在下でフッ化水素法により樹脂からの合成したペプチドの脱離を行った。
【００９６】
その後、ジメチルエーテルによりスカベンジャーを抽出し、そして２Ｎ酢酸により合成したペプチドの抽出を行った。
【００９７】
陰イオン交換樹脂であるダウエックス１−Ｘ２（ＤＯＷＥＸ  １−Ｘ２）により陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い精製をして、オクタデシル（ＯＤＳ）カラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、メインピークのパターンの確認を行った。
【００９８】
そして、エバポレーターにより凍結乾燥をして濃縮を行った後、ＨＰＬＣにより精製を行い分取した。なお、このＨＰＬＣ精製時の装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｄ−ＯＤＳ−５（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速７．０ｍｌ／分で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。
【００９９】
ここで精製分取した合成ペプチドをエバポレーターで凍結乾燥して濃縮した。
【０１００】
得られた合成ペプチドの純度をＨＰＬＣで分析した。装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｒ−ＯＤＳ−５（４．９ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速１．０ｍｌ／分、２５分間で行い、日本分光工業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。
【０１０１】
この分析の結果を図１に示した。この図において、ＰＫＮＯはチャート中のピークの番号、ＴＩＭＥは溶出時間、ＡＲＥＡはピーク面積、ＣＯＮＣは全ピーク面積中のそのピーク面積の比率（即ちパーセント濃度）を表す。
【０１０２】
【図１】
これより得られた合成ペプチドの純度がほぼ１００％であることが分かる。
【０１０３】
また、得られた合成ペプチドのアミノ酸組成分析をミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ピコ−タグ（Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ）アミノ酸分析装置により、取扱説明書に従って行った。なお、ペプチド試料の加水分解は、１％フェノールを含む６Ｎ塩酸中１５０℃で１時間行った。
【０１０４】
このアミノ酸分析の結果を表１に示した。（塩酸加水分解法ではシステインは定量できないので、分析値は省略した。）
【表１】
0003713585.tif 000002
表１において、Ａｓｘはアスパラギン又はアスパラギン酸を表す。
【０１０５】
これより得られた合成ペプチドが、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一の組成であり、配列表の配列番号２で示されるペプチドであることが確認された。なお、この得られた合成ペプチドの等電点は５であった。また、この合成ペプチドの質量スペクトルを図２に示した。
【０１０６】
【図２】
〔実施例２〕
（配列表の配列番号２で示されるペプチドと結合した担体よりなる免疫原の調製）
担体であるスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）〔カルビオケム社製〕又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔生化学工業社製〕１０ｍｇを１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解している２．５％マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）〔ピアース社製〕溶液１５０μｌを加え室温で攪拌しながら３０分間反応させた。
【０１０７】
これを４℃中においてある１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたゲル濾過カラムであるセファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラム〔ファルマシア−エルケービー社製〕にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、ＭＢＳ−担体結合成分を分取した。
【０１０８】
このＭＢＳ−担体結合成分をリン酸三ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに実施例１で合成した配列表の配列番号２で示されるペプチドを添加混合して１５０分間反応させた。
【０１０９】
反応後、水に対して３回透析した後、凍結乾燥を行って、配列表の配列番号２で示されるペプチドと結合した担体よりなる免疫原を得た。
【０１１０】
なお、担体がＫＬＨの場合、得られた免疫原の収量は３．０ｍｇ（収率７５％）であり、この得られた免疫原中の配列表の配列番号２で示されるペプチドの量は０．９ｍｇであって、この免疫原中の配列表の配列番号２で示されるペプチドの割合（重量比）は３０．３％（Ｗ／Ｗ）であった。
【０１１１】
また、担体がＢＳＡの場合、得られた免疫原の収量は７．１ｍｇ（収率５２％）であり、この得られた免疫原中の配列表の配列番号２で示されるペプチドの量は１．５ｍｇであって、この免疫原中の配列表の配列番号２で示されるペプチドの割合（重量比）は２１．７％（Ｗ／Ｗ）であった。よってこのことより、この担体がＢＳＡである免疫原は、担体であるＢＳＡ１分子に配列表の配列番号２で示されるペプチドが１６〜１７分子結合したものであることがわかる。
【０１１２】
〔実施例３〕
（変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体の調製）変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を下記のように調製した。
【０１１３】
〔１〕  動物への免疫
（１）  実施例２で得た免疫原（担体がＫＬＨのもの）を４００μｇ／ｍｌになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）で溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に０．５ｍｌを免疫注射した。
【０１１４】
（２）  初回免疫から２週間後に、上記の免疫原を２００μｇ／ｍｌになるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍｌにより追加免疫注射を行った。
【０１１５】
この追加免疫注射は２週間おきに行った。
【０１１６】
（３）  免疫動物であるこのマウスの血清中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。
【０１１７】
このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。
【０１１８】
▲１▼  配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む配列表の配列番号２で示されるペプチドよりなる実施例２で得られた免疫原（担体がＢＳＡのもの）を５μｇ／ｍｌになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解し、これを９６ウエル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウエル当たり１００μｌずつ加え、３７℃で２時間静置してペプチドの固相化を行った。
【０１１９】
▲２▼  このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウエル当たり３００μｌずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
【０１２０】
▲３▼  このマイクロプレートのウエルに、上記の抗体の産生を検査すべきウエルの上澄み液を１００μｌずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
【０１２１】
▲４▼  また対照として、上記▲２▼のマイクロプレートのウエルに、ＨＡＴ培地を１００μｌずつ加え、３７℃で２時間静置して、その後洗浄液で洗浄した。
【０１２２】
▲５▼  パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で２，０００倍に希釈した後、▲３▼及び▲４▼のマイクロプレートに１ウエル当たり１００μｌずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
【０１２３】
▲６▼  これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭ  ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍｌに対して２μｌの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの）を１ウエル当たり１００μｌずつ加え、室温で反応させた。１５分後に１ウエル当たり５０μｌの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
【０１２４】
▲７▼  これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０１２５】
（４）  初回免疫から１８週間目以降、抗体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で８００μｇ／ｍｌとした実施例２で得た免疫原（担体がＫＬＨのもの）の０．５ｍｌを注射した。
【０１２６】
その後３日目に、この免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
【０１２７】
〔２〕  骨髄腫細胞の増殖
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク  ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（バイオセル社製）で増殖を行った。
【０１２８】
これは、この骨髄腫細胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍｌ容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増殖させた。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び血球計で計数を行った。
【０１２９】
〔３〕  細胞融合
（１）  上記の免疫動物のマウスから取得した脾臓を、ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分にほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄しながら濾過した。
【０１３０】
その後、２００ｇで遠心分離を行い、脾臓細胞を分離した。
【０１３１】
更に、再度血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。
【０１３２】
（２）  この脾臓細胞と上記の増殖させたＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割合で混合した後、遠心分離を行った。
【０１３３】
混合した細胞を、ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベーリンガーマンハイム社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６４０培地液にゆっくりと懸濁した。
【０１３４】
そして、最終的にポリエチレングリコール濃度が５％となるように、これをＲＰＭＩ１６４０培地液で徐々に希釈した。
【０１３５】
（３）  これより細胞を遠心分離で分離し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オリゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。
【０１３６】
そして、平底の９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウエルに、１ウエル当たり１０6 個／１００μｌの細胞数の細胞を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養した。
【０１３７】
（４）  細胞融合後１日目に、各ウエルに１００μｌのＨＡＴ培地（上記の増殖培地に０．０１ｍＭヒポキサンチン、１．６μＭチミジン及び０．０４μＭアミノプテリンとなるようにそれぞれを補充したもの、いずれも東京化成社製）を加えた。
【０１３８】
その後３日間は、毎日、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換し、更にその後は、２〜３日ごとに同様の交換を行った。
【０１３９】
（５）  細胞は、顕微鏡で観察を行った。
【０１４０】
ハイブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以降より出現し、１４日以降に配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を認識する抗体の産生を検査するため、ウエルの上澄み液をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。
【０１４１】
なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は上記〔１〕の（３）と同様にして行った。
【０１４２】
（６）  上記（５）のスクリーニングにおいて、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を認識する抗体を産生していることが判明したウエルのハイブリドーマを、２４穴のウエルがあるプレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従い、小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培養した。
【０１４３】
（７）  そして、ハイブリドーマはＨＴ培地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングファクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。
【０１４４】
（８）  配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を認識する抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により上記（５）と同様にして調べたところ、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドよりなる実施例２で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生する４個のハイブリドーマを確認した。
【０１４５】
〔４〕  ハイブリドーマサブクローニング
（１）  上記の４個のハイブリドーマを、限界希釈法にてサブクローニングした。
【０１４６】
これらのハイブリドーマの細胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を行った。
【０１４７】
そして、これらのハイブリドーマを、１００μｌのＨＴ培地当たり、０．５個の生育細胞数の割合と１個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴の平底マイクロプレートの１ウエル当たり１００μｌずつ分注した。
【０１４８】
これを２〜３日ごとに培地を交換して、ハイブリドーマを増殖させた。
【０１４９】
（２）  ２週間後、顕微鏡下で各ウエルのコロニー数を調べ、そして配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドよりなる実施例２で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するウエルを上記と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。
【０１５０】
１ウエル中に１コロニーが存在し、そしてこのような抗体を産生するウエルを４個得た。
【０１５１】
（３）  これを、２４穴のプレートに移し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。
【０１５２】
（４）  次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体の、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。
【０１５３】
操作は、ハイブリドーマの培養上清について、後に記載した実施例４と同様にして行った。
【０１５４】
この結果、１個のハイブリドーマが、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に対する抗体を産生する細胞株であることが判明した。
【０１５５】
（５）  このハイブリドーマを、再度上記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、それぞれのウエルについて抗体の産生を調べたところ、１ウエル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そして配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドよりなる実施例２で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するものを全部で９クローン得た。
【０１５６】
（６）  これらのハイブリドーマのクローンが産生する抗体の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）との反応性を、再度上記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。
【０１５７】
これより、これら全てのハイブリドーマのクローンが、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を産生する細胞であることが確かめられた。
【０１５８】
（７）  これを本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株〔３２２Ｈ４Ｐ２株〕とした。
【０１５９】
このハイブリドーマ細胞株〔３２２Ｈ４Ｐ２株〕は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５６１１として平成８年５月７日付けにて寄託されている。
【０１６０】
〔５〕  モノクローナル抗体の産生
（１）  得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に対するモノクローナル抗体産生細胞株を、中型ボトル（ヌンク社製）の中で、底面の約８割を細胞が占めるまでＨＴ培地中で培養を行った。
【０１６１】
（２）  その後、これらのハイブリドーマを掻き取り、そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い集めた。
【０１６２】
次に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回洗浄した後、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地液に懸濁した。
【０１６３】
（３）  前もって２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、上記（２）で得たハイブリドーマ懸濁液１ｍｌを注射した。
【０１６４】
注射から２週間以内に腹部の膨張が認められなかった場合には、再度これを繰り返し行った。
【０１６５】
（４）  このマウスの腹部の膨張が認められたときに腹水を採取した。
【０１６６】
これを２００ｇ、５分間の遠心分離にかけ、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に対するモノクローナル抗体を含む上澄み液をハイブリドーマから分離して取得した。
【０１６７】
〔６〕  モノクローナル抗体の精製
（１）  変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に対するモノクローナル抗体を含む上澄み液の１０ｍｌに、２２℃で硫酸ナトリウム１．８ｇを攪拌しながら加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更に１時間攪拌を続けて塩析を行った。
【０１６８】
（２）  これを２２℃で遠心分離（７０００ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍｌに溶解した。
【０１６９】
（３）  次に、これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して充分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のものを除去した。
【０１７０】
（４）  これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社製）〔１×１０ｃｍ〕に流速０．４ｍｌ／分で通して、溶出液を２ｍｌずつ集めた。
【０１７１】
（５）  免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認し、これを集めて２ｍｌに濃縮した。
【０１７２】
（６）  更に、これをプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精製を行い、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を得た。
【０１７３】
なお、この得られたモノクローナル抗体の量はタンパク質量で７ｍｇであった。
【０１７４】
また、ここで得た変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合するモノクローナル抗体の抗体クラスとサブタイプは、市販の特異抗マウス免疫グロブリン抗血清（ダコ社製）を用いたオクタロニイ免疫拡散法によりＩｇＧ1、λ鎖と決定した。
【０１７５】
〔実施例４〕
（酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定）
実施例３で得られた、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を用いて、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定系を確立した。
【０１７６】
〔１〕  試料としての変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の調製
（１）  リポタンパク質（ａ）濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行い比重が１．０５以上かつ１．１２以下の部分を分取し、更にリジン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精製リポタンパク質（ａ）を得た。
【０１７７】
（２）  この精製リポタンパク質（ａ）を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で十分に透析した。
【０１７８】
（３）  この透析を行った精製リポタンパク質（ａ）を、０．５６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した後この１．８ｍｌずつを、それぞれ、０、１、２、５、１０、２０、４０、６０、１００μｇ／ｍｌの塩化銅（ＩＩ）（ＣｕＣｌ2 ）〔和光純薬工業社製〕の水溶液０．２ｍｌに添加混合して、それぞれ、０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、４．０、６．０、１０．０μｇ／ｍｌの塩化銅（ＩＩ）濃度の０．５ｍｇ／ｍｌ精製リポタンパク質（ａ）溶液を調製した。
【０１７９】
（４）  上記（３）で調製した各精製リポタンパク質（ａ）溶液を３７℃で１２時間加温し、銅（ＩＩ）イオンによる酸化を行い、酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の試料を調製した。
【０１８０】
（５）  なお、上記（４）で調製した酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料の酸化度を、過酸化脂質の測定試薬である「過酸化脂質テストワコー」（八木法、蛍光法）〔和光純薬工業社製〕で測定した。
【０１８１】
この結果を表２に示した。
【０１８２】
【表２】
0003713585.tif 000003
これより、酸化に使用した塩化銅（ＩＩ）の濃度が高い試料ほど、酸化度を示すＴＢＡＲＳ値〔ｎｍｏｌ（マロンジアルデヒド換算）／ｍｌ〕が比例して高くなっていることがわかる。
【０１８３】
よって、酸化に使用した塩化銅（ＩＩ）の濃度に応じて上記試料のリポタンパク質（ａ）が酸化を受けていることが確かめられた。
【０１８４】
〔２〕  ＥＬＩＳＡ法による測定
（１）  実施例３で得られた、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５μｇ／ｍｌとした後、９６ウエル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウエル当たり１００μｌずつ加え、３７℃で２時間静置して、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体の固相化を行った（固相化抗体）。
【０１８５】
（２）  このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウエル当たり３００μｌずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
【０１８６】
（３）  上記〔１〕の（４）において、それぞれ、０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、４．０、６．０、１０．０μｇ／ｍｌの濃度の塩化銅（ＩＩ）により酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料を生理食塩水で１００倍に希釈した後、（２）で調製したマイクロプレートに１ウエル当たり１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置して抗原抗体反応を行わせた。
【０１８７】
（４）  これを洗浄液で洗浄した後、５０μｇ／ｍｌになるように３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で溶解した、実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を、１ウエル当たり１００μｌずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ（一次抗体）、その後洗浄液で洗浄した。
【０１８８】
（５）  パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で２，０００倍に希釈した後、上記（４）のマイクロプレートに１ウエル当たり１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置して反応を行わせた（二次抗体）。
【０１８９】
（６）  これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍｌに対して２μｌの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの）を１ウエル当たり１００μｌずつ加え、室温で反応させた。
【０１９０】
１５分後に１ウエル当たり１００μｌの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
【０１９１】
（７）  これをＥＩＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
【０１９２】
これらの酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料を測定して得た検量線を図３に示した。なお、この図において、横軸はリポタンパク質（ａ）の酸化に使用した塩化銅（ＩＩ）の濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、塩化銅（ＩＩ）濃度０μｇ／ｍｌの試料の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０１９３】
【図３】
この図より、塩化銅（ＩＩ）濃度が高く酸化度が高いリポタンパク質（ａ）の試料ほど、吸光度の測定値が高くなっており、リポタンパク質（ａ）の酸化度に比例した測定値が得られていることがわかる。
【０１９４】
よって、酸化による変性又は修飾において、本発明の抗体が変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合すること、及び本発明の測定法が変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を定量的に測定できることが確かめられた。
【０１９５】
〔実施例５〕
（還元による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定）
実施例３で得られた、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を用いて、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定系を確立した。
【０１９６】
〔１〕  試料としての変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の調製
（１）  リポタンパク質（ａ）濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行い比重が１．０５以上かつ１．１２以下の部分を分取し、更にリジン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精製リポタンパク質（ａ）を得た。
【０１９７】
（２）  この精製リポタンパク質（ａ）を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で十分に透析した。
【０１９８】
（３）  この透析を行った精製リポタンパク質（ａ）を、０．５６ｍｇ／ｍｌの濃度になるように生理食塩水で希釈した後この１．８ｍｌずつを、それぞれ、０、０．１、１、５、１０、５０％の２−メルカプトエタノール〔東京化成社製〕の水溶液０．２ｍｌに添加混合して、それぞれ、０、０．０１、０．１、０．５、１．０、５．０％の２−メルカプトエタノール濃度の０．５ｍｇ／ｍｌ精製リポタンパク質（ａ）溶液を調製した。
【０１９９】
（４）  上記（３）で調製した各精製リポタンパク質（ａ）溶液を３７℃で３時間加温し、２−メルカプトエタノールによる還元を行い、還元による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の試料を調製した。
【０２００】
〔２〕  ＥＬＩＳＡ法による測定
測定の操作は、上記実施例４の〔２〕の（１）〜（７）の工程と同様にして行った。但し、試料を、酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料から、それぞれ、０、０．０１、０．１、０．５、１．０、５．０％の濃度の２−メルカプトエタノールにより、還元による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の６種類の試料に変えて、測定を行った。
【０２０１】
これらの還元による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の６種類の試料を測定して得た検量線を図４に示した。なお、この図において、横軸はリポタンパク質（ａ）の還元に使用した２−メルカプトエタノールの濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、２−メルカプトエタノール濃度０％の試料の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０２０２】
【図４】
この図より、２−メルカプトエタノール濃度が高く、より強く還元を受けたリポタンパク質（ａ）の試料ほど、吸光度の測定値が高くなっており、リポタンパク質（ａ）の還元度に比例した測定値が得られていることがわかる。
【０２０３】
よって、還元による変性又は修飾においても、本発明の抗体が変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合できること、及び本発明の測定法が変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を定量的に測定できることが確かめられた。
【０２０４】
〔実施例６〕
（分解による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定）
実施例３で得られた、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を用いて、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定系を確立した。
【０２０５】
〔１〕  試料としての変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の調製
（１）  リポタンパク質（ａ）濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行い比重が１．０５以上かつ１．１２以下の部分を分取し、更にリジン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精製リポタンパク質（ａ）を得た。
【０２０６】
（２）  この精製リポタンパク質（ａ）を、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０４％ＥＤＴＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）で十分に透析した。
【０２０７】
（３）  この透析を行った精製リポタンパク質（ａ）を、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０４％ＥＤＴＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）で希釈した後この２．０ｍｌずつに、上記緩衝液に溶解したそれぞれ、０、５００、１，０００、２，０００ｎｇ／ｍｌのカテプシンＤ〔シグマ社製〕０．０１ｍｌを添加混合して、それぞれ、０、５．０、１０．０、２０．０ｎｇ／ｍｌのカテプシンＤ濃度の０．５ｍｇ／ｍｌ精製リポタンパク質（ａ）溶液を調製した。
【０２０８】
（４）  上記（３）で調製した各精製リポタンパク質（ａ）溶液を３７℃で９０分間加温し、プロテアーゼ（タンパク質加水分解酵素）であるカテプシンＤによるリポタンパク質（ａ）の加水分解を行い、分解による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の試料を調製した。
【０２０９】
〔２〕  ＥＬＩＳＡ法による測定
測定の操作は、上記実施例４の〔２〕の（１）〜（７）の工程と同様にして行った。但し、試料を、酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料から、それぞれ、０、５．０、１０．０、２０．０ｎｇ／ｍｌの濃度のカテプシンＤにより、分解による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の４種類の試料に変えて、測定を行った。
【０２１０】
これらの分解による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の４種類の試料を測定して得た検量線を図５に示した。なお、この図において、横軸はリポタンパク質（ａ）の分解に使用したカテプシンＤの濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、カテプシンＤ濃度０ｎｇ／ｍｌの試料の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０２１１】
【図５】
この図より、カテプシンＤ濃度が高く、より強く分解を受けたリポタンパク質（ａ）の試料ほど、吸光度の測定値が高くなっており、リポタンパク質（ａ）の分解度に比例した測定値が得られていることがわかる。
【０２１２】
よって、分解による変性又は修飾においても、本発明の抗体が変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合すること、及び本発明の測定法が変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を定量的に測定できることが確かめられた。
【０２１３】
これらのことより、本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体そして変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法は、一次構造、高次構造若しくは立体構造の変化、分解又は化学的修飾を受け、本来の自然な（ネイティブな）リポタンパク質（ａ）とその構造、組成又は立体的配置が異なってしまった変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）であれば、特異的に結合することができ、そして正確に測定が行えるものであることが確認された。
【０２１４】
〔参考例１〕
（本発明の抗体の変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、ＬＤＬ及びプラスミノーゲンとの反応性の検討）
実施例３で得られた、変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体の、プラスミノーゲン、ＬＤＬ及び変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）との反応性をウエスタンブロット法で確かめた。
【０２１５】
〔１〕  プラスミノーゲン、ＬＤＬ及びリポタンパク質（ａ）の調製
（１）  プラスミノーゲン濃度が高いヒト血漿を、超遠心分離を行い比重が１．２１以上の部分を分取し、リジン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけ、更に抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）をリガンドとして結合させたアフィニティークロマトグラフィーにかけて素通り画分を分取し、精製プラスミノーゲンを得た。
【０２１６】
（２）  ＬＤＬ濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行い比重が１．００６以上かつ１．０６３以下の部分を分取し、抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）をリガンドとして結合させたアフィニティークロマトグラフィーにかけて素通り画分を分取して、精製ＬＤＬを得た。
【０２１７】
（３）  リポタンパク質（ａ）濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行い比重が１．０５以上かつ１．１２以下の部分を分取し、更にリジン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて、精製された変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）を得た。
【０２１８】
〔２〕  ウエスタンブロット法による反応性の測定
（１）  ウエスタンブロット法において泳動させる抗原を、以下のように調製した。
【０２１９】
▲１▼  精製プラスミノーゲン抗原：  上記〔１〕の（１）の精製プラスミノーゲンを、０．５ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水で希釈した。
【０２２０】
▲２▼  精製ＬＤＬ及び精製リポタンパク質（ａ）抗原：  上記〔１〕の（２）の精製ＬＤＬ及び上記〔１〕の（３）の精製された変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）を、それぞれ混合液中で０．５ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水で希釈、混合した。
【０２２１】
▲３▼  精製リポタンパク質（ａ）抗原：  上記〔１〕の（３）の精製された変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）を、０．５ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水で希釈した。
【０２２２】
（２）  上記（１）で調製した、精製プラスミノーゲン抗原、精製ＬＤＬ及び精製リポタンパク質（ａ）抗原、及び精製リポタンパク質（ａ）抗原それぞれの２μｌずつをタイタン・ジェル・リポ蛋白電気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロースゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して行った。
【０２２３】
（３）  転写はノバ・ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ方式で行った。
【０２２４】
（４）  転写用装置上においた（２）のアガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。
【０２２５】
（５）  転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））２０ｍｌに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。
【０２２６】
（６）  次にこれを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）２０ｍｌ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
【０２２７】
（７）  実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を、２０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ溶解し、この溶液に（６）の操作を行ったニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
【０２２８】
（８）  なお対照として、実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体の代わりに、同濃度のヒツジ抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）、ＬＤＬの構成成分のアポリポタンパク質Ｂ−１００に対する同濃度のヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体（インターナショナルエンザイム社製）、及び同濃度のヤギ抗プラスミノーゲン抗体（医学生物学研究所社製）の混合物（抗体混合物）を用いて、上記（７）の操作を行った。
【０２２９】
また、陰性対照として、（６）で得られたニトロセルロース膜に、実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体、ヒツジ抗リポタンパク質（ａ）抗体、ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体及びヤギ抗プラスミノーゲン抗体のいずれも作用させないものを用意した。
【０２３０】
（９）  上記（７）又は（８）の操作を行ったニトロセルロース膜を洗浄液２０ｍｌで１０分間振とう洗浄を行った。これを３回行った。
【０２３１】
（１０）  次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）、パーオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（ダコ社製）及びパーオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（ダコ社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈をして２０ｍｌの溶液を調製し、これにニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
【０２３２】
（１１）  このニトロセルロース膜を洗浄液２０ｍｌで１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。
【０２３３】
（１２）  ０．０２５％３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水２０ｍｌに室温で１５分間（１１）のニトロセルロース膜を浸漬して発色させた。
【０２３４】
〔３〕  測定結果
このウエスタンブロット法の結果を図６に示した。
【０２３５】
なお、この図において、「３」は陰性対照であり、「４」は対照であって精製プラスミノーゲン抗原を泳動後転写した膜に抗体混合物を作用させたもの、「５」も対照であって精製ＬＤＬ及び精製リポタンパク質（ａ）抗原を泳動後転写した膜に抗体混合物を作用させたもの、「６」も対照であって精製リポタンパク質（ａ）抗原を泳動後転写した膜に抗体混合物を作用させたものであって、そして、「７」は精製プラスミノーゲン抗原を泳動後転写した膜に実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を作用させたもの、「８」は精製ＬＤＬ及び精製リポタンパク質（ａ）抗原を泳動後転写した膜に実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を作用させたもの、「９」は精製リポタンパク質（ａ）抗原を泳動後転写した膜に実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を作用させたものである。
【０２３６】
【図６】
この図より、対照である「４」、「５」及び「６」において市販のヒツジ抗リポタンパク質（ａ）抗体、ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体及びヤギ抗プラスミノーゲン抗体それぞれが発色を示す位置に、実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を作用させた「７」、「８」及び「９」においては発色が認められないことがわかる。
【０２３７】
よって、本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体は、プラスミノーゲン、ＬＤＬ、及び変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）のいずれとも結合しないことが確かめられた。
【０２３８】
なお、実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体、ヒツジ抗リポタンパク質（ａ）抗体、ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体及びヤギ抗プラスミノーゲン抗体のいずれも作用させていない陰性対照「３」に発色が見られないことから、非特異的な発色が起きていないことが示された。
【０２３９】
〔参考例２〕
（本発明の抗体の配列表の配列番号２で示されるペプチドとの反応性の検討）
実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体の、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドとの反応性をＥＬＩＳＡ法で確かめた。
【０２４０】
〔１〕  配列表の配列番号２で示されるペプチドよりなる試料の調製
実施例２で得られた、免疫原である、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物を、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、及び３００ｎｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解して、３種類の試料を調製した。
【０２４１】
〔２〕  ＥＬＩＳＡ法による測定
測定の操作は、上記実施例４の〔２〕の（１）〜（７）の工程と同様にして行った。但し、試料を、酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料から、上記〔１〕で調製した１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、及び３００ｎｇ／ｍｌの濃度の配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物の３種類の試料に変えて、測定を行った。
【０２４２】
これらの３種類の試料を測定して得た検量線を図７に示した。なお、この図において、横軸は配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物の濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、生理食塩水を試料として測定した時の吸光度を盲検値として差し引いたものを表した。
【０２４３】
【図７】
この図より、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物の測定のグラフが原点を通る直線であり、定量的に測定が行えており、本発明の抗体がこのペプチドと担体の結合物に特異的に結合することがわかる。
【０２４４】
よって、本発明の抗体が配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を特異的に認識することが確かめられた。
【０２４５】
〔参考例３〕
（本発明の測定法における血清試料の影響の検討）
本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を用いる変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法が、血清試料の影響を受けないことを、ＥＬＩＳＡ法での添加回収試験により確認した。
【０２４６】
〔１〕  添加回収試験の試料の調製
変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を含まないことを確認してある２種類の血清（Ａ、Ｂ）を用意し、これをベースに以下の試料を調製した。
【０２４７】
▲１▼  ２種類の血清（Ａ、Ｂ）０．９ｍｌに対して生理食塩水０．１ｍｌをそれぞれ添加混合した２種類の試料。〔試料▲１▼〕
▲２▼  生理食塩水で３，０００ｎｇ／ｍｌとした実施例２で得られた免疫原である配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物０．１ｍｌを、２種類の血清（Ａ、Ｂ）それぞれの０．９ｍｌに対して添加混合することにより、▲１▼で調製した２種類の血清試料の配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体との結合物の濃度を３００ｎｇ／ｍｌ増加させた２種類の試料。〔試料▲２▼〕
▲３▼  実施例２で得られた免疫原である配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物を生理食塩水で希釈して３００ｎｇ／ｍｌとした試料。〔試料▲３▼〕〔２〕  ＥＬＩＳＡ法による測定
測定の操作は、上記実施例４の〔２〕の（１）〜（７）の工程と同様にして行った。但し、試料を、酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料から、上記〔１〕で調製した５種類の試料に変えて測定を行った。
【０２４８】
これらの５種類の試料を測定して求めた吸光度値を表３にまとめた。
【０２４９】
【表３】
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この表より、本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法では、血清試料の測定でもほぼ理論値通りの測定値が得られることが判明した。
【０２５０】
よって、本発明の測定法は、血清試料による非特異的反応等の影響を受けずに正確に測定できる方法であることがわかり、臨床検査等において実用上問題のないことが確かめられた。
【０２５１】
【作用】
本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体が、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）には結合せず、本来の自然な（ネイティブな）リポタンパク質（ａ）とはその構造、組成又は立体的配置が異なってしまった変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合することができることの理由は現在のところ明らかではない。
【０２５２】
推測ではあるが、リポタンパク質（ａ）が変性又は修飾を受けることにより、分子内部に存在した配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分が分子表面に出てきたり、分子の立体構造が変化して配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分も立体構造が変化することによるなどして、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を認識することができる本発明の抗体と結合することができるようになるためではないかと考えられる。
【０２５３】
つまり、リポタンパク質（ａ）の配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分がリポタンパク質（ａ）の変性又は修飾を特徴的に現す部位であるために、上記のことが可能になるのではないかと推察される。
【０２５４】
【発明の効果】
本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体は、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、更にＬＤＬ及びプラスミノーゲンには結合せず、かつ変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）であれば特異的に結合することができるという特徴、効果を有するものである。
【０２５５】
そして、本発明の変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の測定法は、変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）、ＬＤＬ及びプラスミノーゲンのいずれをも測り込むことが無く、かつ変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）を正確に測定することができるという特徴、効果を有するものである。
【０２５６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた配列表の配列番号２で示されるペプチドのＨＰＬＣによる分析結果を示した図である。
【図２】実施例１で得られた配列表の配列番号２で示されるペプチドの質量スペクトルを示した図である。
【図３】本発明の測定法により、酸化による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の９種類の試料を測定して得た検量線を示した図である。
【図４】本発明の測定法により、還元による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の６種類の試料を測定して得た検量線を示した図である。
【図５】本発明の測定法により、分解による変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）の４種類の試料を測定して得た検量線を示した図である。
【図６】実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体の、プラスミノーゲン、ＬＤＬ及び変性又は修飾を受けていないリポタンパク質（ａ）への反応性をウエスタンブロット法で確かめた電気泳動のパターンを示す写真である。
【図７】実施例３で得られた変性又は修飾を受けたリポタンパク質（ａ）に特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により、配列表の配列番号２で示されるペプチドと担体の結合物の３種類の試料を測定して得た検量線を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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