(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エポキシ加水分解活性を持ち、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
ハロヒドリンをエポキシドに変換する触媒活性およびその逆反応の触媒活性を持ち、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する請求項３記載の遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有する請求項４記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項３または５記載の遺伝子をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項８】
請求項４または６記載の遺伝子をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項９】
請求項３または５記載の遺伝子と請求項４または６記載の遺伝子を共にベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド。
【請求項１０】
請求項７記載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１１】
請求項８記載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１２】
請求項９記載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体。
【請求項１３】
請求項１０記載の形質転換体を培養して請求項１記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１４】
請求項１１記載の形質転換体を培養して請求項２記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の形質転換体を培養して請求項１および２記載のタンパク質を産生させる方法。
【請求項１６】
請求項１０記載の形質転換体または請求項１記載のタンパク質をエピハロヒドリンに作用させて（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得ることを特徴とする（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールの製造法。
【請求項１７】
請求項１１記載の形質転換体または請求項２記載のタンパク質を１，３−ジハロ−２−プロパノールに作用させて（Ｓ）−エピハロヒドリンを得ることを特徴とする（Ｓ）−エピハロヒドリンの製造法。
【請求項１８】
請求項１２記載の形質転換体または請求項１および２記載のタンパク質を１，３−ジハロ−２−プロパノールに作用させて（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得ることを特徴とする（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハロヒドリンをエポキシドに変換する触媒活性およびその逆反応の触媒活性を有する酵素（以下、ハロヒドリンエポキシダーゼと略す）タンパク質およびエポキシ加水分解酵素タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の一方または両方をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド、該組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体ならびに該形質転換体によるハロヒドリンからの光学活性エピハロヒドリンや光学活性ジオールの製造方法に関する。光学活性エピハロヒドリンや光学活性ジオールは種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ハロヒドリンやエピハロヒドリンを光学活性ジオールへと変換する能力を有する微生物を用いることによる新規な光学活性ジオールの製造法が提案されている。例えば、１，３−ジハロ−２−プロパノールまたはエピハロヒドリンを、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属およびオウレオバクテリウム属に属する微生物が（Ｒ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールに（特開平2-291280号、同2-283295号および同5-219965号公報参照）、また、アグロバクテリウム属およびシュードモナス属に属する微生物が（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールに（特開平4-94689 号および同4-94690 号公報参照）変換することが見い出されている。さらに、１，３−ジハロ−２−プロパノールを（Ｒ）−エピハロヒドリンに変換する微生物からはハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子がクローン化され、高活性な組換え体が作製されている（特開平4-278089号公報参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、１，３−ジハロ−２−プロパノールを（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールに変換する酵素系については、いまだ単離されておらず、その性質も全く不明であるが、（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールに変換する微生物についても、クローン化した遺伝子を有する組換え体を作製することにより活性の飛躍的向上が期待できる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは本酵素系遺伝子のクローニングを試み、組換え体を用いた本酵素系の高発現化に成功し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、(1) エポキシ加水分解活性を持ち、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とするタンパク質、(2) ハロヒドリンをエポキシドに変換する触媒活性およびその逆反応の触媒活性を持ち、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とするタンパク質、(3) 上記(1) 記載のタンパク質をコードする遺伝子、(4) 上記(2) 記載のタンパク質をコードする遺伝子、(5) 配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する上記(3) 記載の遺伝子、(6) 配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有する上記(4) 記載の遺伝子、(7) 上記(3) または(5) 記載の遺伝子をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド、(8) 上記(4) または(6) 記載の遺伝子をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド、(9) 上記(3) または(5) 記載の遺伝子と上記(4) または(6) 記載の遺伝子を共にベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド、(10)上記(7) 記載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体、(11)上記(8) 記載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体、(12)上記(9) 記載の組換え体プラスミドを宿主微生物に導入した形質転換体、(13)上記(10)記載の形質転換体を培養して上記(1) 記載のタンパク質を産生させる方法、(14)上記(11)記載の形質転換体を培養して上記(2) 記載のタンパク質を産生させる方法、(15)上記(12)記載の形質転換体を培養して上記(1) および(2) 記載のタンパク質を産生させる方法、(16)上記(10)記載の形質転換体または上記(1) 記載のタンパク質をエピハロヒドリンに作用させて（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得ることを特徴とする（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールの製造法、(17)上記(11)記載の形質転換体または上記(2) 記載のタンパク質を１，３−ジハロ−２−プロパノールに作用させて（Ｓ）−エピハロヒドリンを得ることを特徴とする（Ｓ）−エピハロヒドリンの製造法、ならびに(18)上記(12)記載の形質転換体または上記(1) および(2) 記載のタンパク質を１，３−ジハロ−２−プロパノールに作用させて（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得ることを特徴とする（Ｓ）−３−ハロ−１，２−プロパンジオールの製造法、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で例示した遺伝子供与体微生物はアグロクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter)ＤＨ０９４株であるが、その他にアグロクテリウム（Agrobacterium) sp.ＤＨ０７９株などが用いられる。これらは FERM P-15959 （ＤＨ０９４株）および FERM P-11651 （ＤＨ０７９株）として生命工学工業技術研究所に寄託されている。
ＤＨ０７９株の菌学的性質は特開平4-94689 号公報に記載されており、ＤＨ０９４株の菌学的性質は以下のとおりである。ＤＨ０９４株は Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, volume 1 (1984)に従って検索すると、Agrobacterium radiobacter と同定された。
【０００７】
0003728045.tif 000002
0003728045.tif 000003
【０００８】
本発明で用いられるベクターとしては、プラスミドベクター（例えば pUC18、pUC19 、pUC118、pUC119等）、ファージベクター（例えばλgt11等）の何れもが用いられる。また、形質転換に用いる宿主微生物としては E. coli JM109株あるいは E. coli JM105株が用いられるが、特にこれらに限定されるものではなく、他の宿主微生物を用いることができる。
【０００９】
本発明の形質転換微生物は、これを含む培養液、分離した菌体または菌体処理物として用いられる。これら形質転換微生物の培養は、通常は液体培養で行われるが、固体培養によっても行うことができる。培地としては、例えば、LB培地が用いられる。培養は10〜50℃の温度で、pH２〜11の範囲で行われる。微生物の生育を促進させるために通気撹はんを行ってもよい。
【００１０】
本発明におけるハロヒドリンは１，３−ジハロ−２−プロパノール、具体的には１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール等、エピハロヒドリンはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン等の光学活性体、ジオールは３−ハロ−１，２−プロパンジオール、具体的には３−クロロ−１，２−プロパンジオール、３−ブロモ−１，２−プロパンジオール等の光学活性体である。
【００１１】
また、本発明におけるエピハロヒドリンや３−ハロ−１，２−プロパンジオールを得る方法としては、上記のように培養して得た微生物の培養液あるいは遠心分離などにより得た菌体の懸濁液に基質を添加する方法、菌体処理物（例えば菌体破砕物、粗酵素・精製酵素等）あるいは常法により固定化した菌体または菌体処理物等の懸濁液に基質を添加する方法、微生物の培養時に基質を培養液に添加して培養と同時に反応を行う方法等がある。
【００１２】
反応液中の基質濃度は特に限定するものではないが、 0.1〜10 (W/V)％が好ましく、基質は反応液に一括して加えるかあるいは分割添加することができる。
反応温度は５〜50℃、反応pHは４〜10の範囲で行うことが好ましい。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反応条件等によって変わるが、通常１〜120 時間で終了するように条件を設定するのが好ましい。
【００１３】
かくして、反応液中に生成、蓄積したエピハロヒドリンまたは３−ハロ−１，２−プロパンジオールは公知の方法を用いて採取および生成することができる。例えば、反応液から遠心分離などの方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、滅菌下に溶媒を除去することによりシロップを得ることができる。また、このシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
実施例１
(1) Agrobacterium radiobacter ＤＨ０９４株染色体ＤＮＡの調製とＤＮＡライブラリーの作成：
Agrobacterium radiobacter ＤＨ０９４株から Saito and Miuraの方法〔Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963) 参照〕により染色体ＤＮＡを分離し、これを制限酵素 Sau3AI で部分分解後、６kb以上の断片をアガロースゲル電気泳動により分離、取得した。これを BamHIで切断したベクタープラスミド pUC118 に挿入し組換え体ＤＮＡのライブラリーを作成した。
【００１５】
(2) 形質転換体の作成および組換え体ＤＮＡの選別：
工程(1) で調製した組換え体ライブラリーによる形質転換体を作成した。形質転換は、宿主微生物として E. coli JM109株を用い、塩化カルシウム法〔J. Mol. Biol. 53, 154 (1970)〕により行った。その中からハロヒドリンエポキシダーゼ活性を示すようになったものを選別した。選別は以下のようにして行った。アンピシリン(100μg/ml) と IPTG(1mM)を含む LB 寒天培地（１％バクトトリプトン、 0.5％バクトイーストエキス、 0.5％NaCl、 1.5％寒天）にコロニーを形成させた。10mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)、0.02％ブロモクレゾールパープル、１％１，３−ジクロロ−２−プロパノールを染み込ませたロ紙にコロニーを移し室温にて数時間放置した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つコロニーは塩酸を遊離しコロニー付近のpHは低下し、pH指示薬であるブロモクレゾールパープルは青紫色から黄色に変化するため、肉眼観察によりハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を持つ株を選別することができる。
こうして得られた形質転換株から再びプラスミドＤＮＡを取り出し、選別された目的のプラスミドを得た。このプラスミドを pDHD001と名付けた。
【００１６】
(3)  pDHD001〜003 の制限酵素地図の作成とハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の位置：
工程(2) で得られたプラスミド pDHD001について制限酵素地図を作成した（図１）。その後、数種の制限酵素で切断し、より小さなＤＮＡ断片を持つプラスミドを作成した。これらのプラスミドによって形質転換された組換え体のハロヒドリンエポキシダーゼ活性の有無により目的遺伝子の含まれている領域を調べた。これらのプラスミドのうちの一つ pDHD002は pDHD001を制限酵素 SacI による切断後、セルフライゲーションにより得られた。pDH002の制限酵素地図を作成し、上記と同様により小さな断片を持つプラスミドを作製した。これらのプラスミドのうちの一つ pDHD003は pDHD002を制限酵素 PstI による切断後、セルフライゲーションにより得られた（図２）。なお、ここで得られた形質転換体 JM109/pDHD003は FERM P-15960 として生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１７】
実施例２
アンピシリン (50μg/ml) と IPTG(1mM)を含むLB培地（１％バクトトリプトン、 0.5％バクトイーストエキス、 0.5％NaCl) に JM109/pDHD003を植菌し37℃にて16時間振盪培養を行った。こうして得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、50mM Tris-硫酸緩衝液(pH 8.0)50mlで２回洗浄後50mlの1M Tris-塩酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁し菌体懸濁液を調製した。得られた菌体懸濁液に50mMとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを添加し20℃にて４時間反応させた。反応終了後、基質および生成物をガスクロマトグラフィーで定量した。予想されたエピクロロヒドリンは検出されず、３−クロロ−１，２−プロパンジオールが5.3mM 生成していた。一方、菌体懸濁液にエピクロロヒドリンおよび塩化ナトリウムをそれぞれ50mMとなるように添加し、同様にして2.5 時間反応させたところ、１，３−ジクロロ−２−プロパノールは検出されず、基質は消失し、全量が３−クロロ−１，２−プロパンジオールに変換された。
【００１８】
実施例３
実施例２と同様にして得られた菌体懸濁液に50mMとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを添加し20℃にて2.5 時間反応させた（菌体懸濁液濃度：OD630=33）ところ、37.8 mM の３−クロロ−１，２−プロパンジオールが生成した。反応上清より酢酸エチルにより１，３−ジクロロ−２−プロパノールを抽出後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で溶媒除去した。ｐ−トルエンスルホン酸クロライドを用いて誘導体を作製し、高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製カラム Opti-pak PC) により光学異性体の分析を行った。その結果、生成した３−クロロ−１，２−プロパンジオールは光学純度94.4％e.e.の（Ｓ）体であった。
一方、エピクロロヒドリンとして30分間反応させた場合には20mMの３−クロロ−１，２−プロパンジオールが生成した。上記と同様にして光学純度を求めた結果、 3.6％e.e.（Ｓ）体であった。
【００１９】
実施例４
実施例１〜３の結果より、１，３−ジクロロ−２−プロパノールより（Ｓ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが生成する反応はエピクロロヒドリンを経由した反応であると考えられた。
すなわち、１，３−ジクロロ−２−プロパノールより（Ｒ）−３−クロロ−１，２−プロパンジオールが生成する反応と同様に、２種の酵素が関与することが推定された。そこで、プラスミド pDHD003より欠失プラスミドを作製し、このことを検証した。欠失プラスミドの作製は各制限酵素切断部位を利用して、もしくは、TAKARAデレーションキット（宝酒造（株））を利用して行った。これらのプラスミドに含まれるＤＨ０９４株由来の領域を図３に示した。
これらのプラスミドをJM109 株に導入し、実施例２と同様にして培養を行った。エポキシ加水分解活性は実施例３と同様にしてエピクロロヒドリンを基質として測定した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性は１，３−ジクロロ−２−プロパノールを基質として反応を行い、pH指示薬の変化により活性の有無を確認した。その結果、この断片中にエポキシ加水分解酵素、ハロヒドリンエポキシダーゼの順に遺伝子がならんでいることが推定された（図３）。
実施例１で得られたプラスミドpDHD003 のＤＨ０９４株由来のＤＮＡの塩基配列をファルマシア社蛍光シーケンサー ALF II を用いて決定した。その結果、配列番号５に示される塩基配列が得られ、配列番号６に示されるように２つのオープンリーディングフレームが見いだされた。この２つのオープンリーディングフレームの塩基配列は配列番号３および４、対応するアミノ酸配列は配列番号１および２で示した。
【００２０】
実施例５
実施例２と同様にして得られた JM109/pDHD050菌体懸濁液に50mMとなるように１，３−ジクロロ−２−プロパノールを添加し20℃にて24時間反応させた（菌体懸濁液濃度：OD630=30）ところ、10.5 mM のエピクロロヒドリンが生成した。反応上清から酢酸エチルによりエピクロロヒドリンを抽出後、ｐ−トルエンスルホン酸を用いて誘導体を作製し、高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製カラム Opti-pak PC) により光学異性体の分析を行った。その結果、生成したエピクロロヒドリンは光学純度35.5％e.e.の（Ｓ）体であった。
【００２１】
【発明の効果】
遺伝子組換えの方法でクローン化されたエポキシ加水分解酵素および／またはハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が菌体内に多数存在する形質転換微生物の使用により、光学活性エピハロヒドリンおよび光学活性ジオールを効率よく製造することができる。
【００２２】
【配列表】
0003728045.tif 000004
【００２３】
0003728045.tif 000005
【００２４】
0003728045.tif 000006
【００２５】
0003728045.tif 000007
【００２６】
0003728045.tif 000008
0003728045.tif 000009
【００２７】
0003728045.tif 000010
0003728045.tif 000011
0003728045.tif 000012
0003728045.tif 000013
【００２８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は組換え体プラスミド pDHD001の制限酵素地図を示す。
【図２】図２は組換え体プラスミド pDHD002およびpDHD003 の制限酵素地図を示す。
【図３】図３は pDHD003より作製された欠失プラスミド、およびそれらにより形質転換された組換え体の酵素活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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