(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列：
0003626503.tif 000066
を含む、VEGFに対するRNAリガンド。
【請求項２】
請求項１のRNAリガンド、並びに非免疫原性高分子量化合物又は親油性化合物を含む複合体。
【請求項３】
上記リガンドと、上記非免疫原性高分子量化合物又は親油性化合物との間にさらにリンカーを含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
上記非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項２記載の複合体。
【請求項５】
上記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項４記載の複合体。
【請求項６】
上記ポリエチレングリコールが約10〜80Kの分子量を有する、請求項５記載の複合体。
【請求項７】
上記ポリエチレングリコールが約20〜45Kの分子量を有する、請求項６記載の複合体。
【請求項８】
複合体が下記の構造
0003626503.tif 000067
リガンド成分＝
0003626503.tif 000068
（VEGFリガンド）
を有する、請求項７記載の複合体。
【請求項９】
複合体が下記の構造
0003626503.tif 000069
リガンド成分＝
0003626503.tif 000070
（VEGFリガンド）
を有する、請求項７記載の複合体。
【請求項１０】
複合体が下記の構造
0003626503.tif 000071
リガンド成分＝
0003626503.tif 000072
（VEGFリガンド）
を有する、請求項７記載の複合体。
【請求項１１】
複合体が下記の構造
0003626503.tif 000073
リガンド成分＝
0003626503.tif 000074
（VEGFリガンド）
を有する、請求項７記載の複合体。
【請求項１２】
複合体が下記の構造
0003626503.tif 000075
リガンド成分＝
0003626503.tif 000076
（VEGFリガンド）
を有する、請求項７記載の複合体。
【請求項１３】
薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項１のRNAリガンドを含む療法用又は診断用組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項２−12のいずれか１項の複合体を含む療法用又は診断用組成物。
【請求項１５】
VEGF仲介による疾病または医学的状態を処置又は診断するための療法用又は診断用組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項１のRNAリガンドを含む、前記組成物。
【請求項１６】
VEGF仲介による疾病または医学的状態を処置又は診断するための療法用又は診断用組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項２−12のいずれか１項の複合体を含む、前記組成物。
【請求項１７】
VEGF仲介により仲介される血管形成を阻害するための療法用組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項１のRNAリガンドを含む、前記組成物。
【請求項１８】
VEGF仲介により仲介される血管形成を阻害するための療法用組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項２−12のいずれか１項の複合体を含む、前記組成物。
【請求項１９】
腫瘍の増殖を阻害するための療法用組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項１のRNAリガンドを含む、前記組成物。
【請求項２０】
腫瘍の増殖を阻害するための療法用組成物であって、薬学的に許容しうるキャリアー中の、請求項２−12のいずれか１項の複合体を含む、前記組成物。
【請求項２１】
眼適用に適した請求項13ないし20のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本明細書には、血管内皮増殖因子（VEGF）に対する高親和性２′−フルオロ（２′−Ｆ）ピリミジン系RNAリガンドを記載する。このような核酸リガンドを同定するために本発明で用いる方法はSELEXと呼ばれる。これはSystematic  Evolution  of  Ligands  by  Exponential  enrichment（指数的濃縮による系統的リガンド進化）の頭字語である。本発明はさらに、SELEX法によりVEGF核酸リガンドを同定し、このVEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることにより、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複合体を調製する方法を包含する。本発明はさらに、１またはそれ以上のVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複合体を包含する。本発明はさらに、VEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、VEGF核酸リガンドを含む脂質構築体（lipid  construct）、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を使用することにより、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、療法用または診断用薬剤をVEGF核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、VEGFを発現している生物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤をターゲティングする方法であって、複合体がさらに脂質構築体と結合し、VEGF核酸リガンドがさらにその脂質構築体の外側と結合している方法に関する。
発明の背景
A.  SELEX
核酸は主に情報の役割をもつというのが長年の定説であった。指数的濃縮による系統的リガンド進化（SELEXと呼ばれる）として知られる方法によって、核酸はタンパク質と異なる三次元構造多様性をもつことが明らかになった。SELEXは高い特異性でターゲット分子に結合する核酸分子をインビトロ進化させる方法であり、下記に記載されている：米国特許出願第07/536,428号、1990年６月11日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、現在は放棄；米国特許出願第07/714,131号、1991年６月10日出願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第5,475,096号；米国特許出願第07/931,473号、1992年８月17日出願、表題“核酸リガンドの同定法”、現在は米国特許第5,270,163号（国際特許出願公開第WO91/19813号も参照）；これらをそれぞれ本明細書に援用する。これらの各特許出願（本明細書においてはこれらをまとめてSELEX特許出願と呼ぶ）には、目的とするいずれかのターゲット分子に対する核酸リガンドを調製するための、基本的には新規な方法が記載されている。SELEX法によれば、核酸リガンドと呼ばれる一群の生成物が得られる。これらのリガンドはそれぞれユニークな配列をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ。SELEXにより同定された核酸リガンドはそれぞれ、特定のターゲット化合物または分子に特異的なリガンドである。SELEXは、核酸が実質的にいかなる化合物（モノマーであってもポリマーであっても）についてもリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）のに十分な多様な二次元および三次元構造の形成能、ならびにそれに十分な化学的多能性をそれらのモノマー内にもつという、新しい洞察に基づく。いかなるサイズまたは組成の分子も、ターゲットとすることができる。
SELEX法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的にいかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。SELEX法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条件下で混合物をターゲットと接触させ、ターゲット分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分配し、この核酸−ターゲット複合体を解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて核酸リガンド濃縮混合物となす工程を含み、次いで結合、分配、解離および増幅の各工程を目的に応じたサイクル数で再反復して、ターゲット分子に対し特異性の高い高親和性核酸リガンドを得る。
本発明により認識されるように、SELEX法は、核酸が化合物として広範な形状、サイズおよび立体配置のアレイを形成することができ、生物学的系内で核酸が示すよりはるかに広いレパートリーの結合その他の機能を示しうることを証明する。
本発明者らは、いずれか特定のターゲットに対する核酸リガンドを同定しうるものと類似の様式で、SELEXまたはSELEX様方法を利用していずれか特定の反応を促進しうる核酸を同定できることを認識した。理論的には、核酸約1013〜1018の候補混合物内に、多様な物理的および化学的相互作用のそれぞれを促進するのに適した形状をもつ核酸が少なくとも１つ存在すると本発明者らは仮定する。
多数の特定の目的を達成するように、基本的SELEX法が変更されている。たとえば米国特許出願第07/960,093号、1992年10月14日出願、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、SELEXをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりDNAを選択することが記載されている。米国特許出願第08/123,935号、1993年９月17日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、SELEXに基づく方法であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法が記載されている。米国特許出願第08/134,028号、1993年10月７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第5,580,737号）には、近縁分子（非ペプチド系であってもよい）を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗SELEX（Counter−SELEX）と呼ばれる方法が記載されている。米国特許出願第08/143,564号、1993年10月25日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液SELEX"（現在は米国特許第5,567,588号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、SELEXに基づく方法が記載されている。
SELEX法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。SELEXにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許出願第08/117,991号、1993年９月８日出願、表題“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第5,660,985号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２′−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第08/134,028号には、２′−アミノ（２′−NH2）、２′−フルオロ（２′−Ｆ）、および／または２′−Ｏ−メチル（２′−OMe）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第08/264,029号、1994年６月22日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２′−ヌクレオチドを製造するための新規方法”には、種々の２′−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
SELEX法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。これらはそれぞれ米国特許出願第08/284,063号、1994年８月２日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラSELEX"（現在は米国特許第5,637,459号）、および米国特許出願第08/234,997号、1994年４月28日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドSELEX"に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。
SELEX法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包含する。これはたとえば米国特許出願第08/434,465号、1995年５月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体中において、親油性化合物、たとえばジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールと結合したVEGF核酸リガンドは、米国特許出願第08/739,109号、1996年10月25日出願、表題“血管内皮増殖因子（VEGF）核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体中において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、またはグリセロリン脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合したVEGF核酸リガンドは、米国特許出願第08/897,351号、1997年７月21日出願、表題“血管内皮増殖因子（VEGF）核酸リガンド複合体”に記載されている。基本的SELEX法の変更につき記載した上記特許出願それぞれを全体として本明細書に援用する。
B.  脂質構築体
脂質二重層小胞は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をもつ個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水性部分はホスフェート、グリセロホスフェート、カルボキシ、サルフェート、アミノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。親油性基の例は、飽和または不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロール類（たとえばコレステロール）および他の薬剤学的に許容しうる佐剤（α−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。
リポソームはこれらの二重層小胞の集合体であり、主に、脂肪酸鎖から構成される２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に暴露されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、球状二重膜を形成する。したがって膜のそれぞれの側は親水性表面となり、一方、膜の内部は親油性媒質を含む。これらの膜を、内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で薄い水の層で分離された一連の同心球状膜として配置させることができる。これらの多重膜小胞（MLV）に剪断力を付与して、小さな小胞、または単膜小胞（UV）に変換することができる。
療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒である薬物の送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対し感受性の組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。リポソームは長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもでき、これにより投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静脈内送達に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供できる。
多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎となりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれらの投与経路を操作することが含まれる。MLVは、主として比較的大型であるという理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取込まれる。これに対しUVは、MLVと比べて長い循環時間、低いクリアランス速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。
リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違いが生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付着させるものである。抗体はそれらの対応する抗原に対し高い特異性をもつことが知られており、リポソームの表面に付着されたが、多くの場合、結果は成功とはいえなかった。しかし抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティングさせる幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第5,019,369号、第5,441,745号、または第5,435,989号参照。
研究者らが積極的に追求している領域の開発は、特定の細胞タイプのみでなく、細胞の細胞質中へ、さらには核中へ薬剤を送達することである。これは、DNA、RNA、リボザイムおよびタンパク質など、生物学的薬剤の送達に特に重要である。この領域の有望な療法の試みは、アンチセンスDNAおよびRNAオリゴヌクレオチドを疾病の処置に用いるものである。しかしアンチセンス法の有効適用に際し生じる重大な問題のひとつは、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオチドがターゲット細胞に達する前に体液中で、細胞内および細胞外酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解されることである。静脈内投与によっても腎臓により血流から速やかにクリアランスされ、有効な細胞内薬物濃度を生じるのには取込みが不十分である。リポソーム封入は分解酵素からオリゴヌクレオチドを保護し、循環半減期を延長し、リポソームが食作用されるため取込み効率を高める。こうしてオリゴヌクレオチドをインビボでそれらの目的ターゲットに到達させ、細胞に送達することができる。
研究者らがアンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物に付着させた数例が報告されている。しかしアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内薬剤として有効であるにすぎない。上皮増殖因子（EGF）受容体をターゲティングするアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドが、ポリエチレングリコールスペーサ−によりフォレートに結合させたリポソーム（フォレート−PEG−リポソーム）に封入され、フォレート受容体仲介エンドサイトーシスにより培養KB細胞中へ送達された（Wangら、（1995）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3318−3322）。さらに、アルキレンジオールがオリゴヌクレオチドに結合された（Weissら、米国特許第5,245,022号）。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させた親油性化合物が文献に示されている（欧州特許第462  145B1号）。
リポソームへの生物学的薬剤の装填は、脂質配合物への含有または予め形成したリポソームへの装填により達成できる。オリゴペプチドおよびオリゴ糖リガンドをリポソームの外面に受動的にアンカリング（anchoring）させることが記載されている（Zalipskyら（1997）Bioconjug.Chem.8:111:118）。
C.  VEGF
既存の内皮からの新たな血管の増殖（血管形成）は、健康な成人では正および負の調節因子の対抗する作用によって厳密に制御されている。増殖性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬および癌を含めた特定の病的状態では正の調節因子が支配し、血管形成が疾病の進行の一因となる（Folkman（1995）Nature  Medicine  1:27−31に概説）。癌の場合、血管形成が腫瘍の増殖および転移の律速段階となるという考え（Folkman（1971）New  Engl.J.Med.285:1182−1186）が、現在かなりの実験的証拠により支持されている（Aznavoorianら（1993）Cancer  71:1368−1383;FidlerおよびEllis（1994）Cell  79:185−188;Folkman（1990）J.Natl.Cancer  Inst.82:4−６に概説）。
腫瘍組織の血管量は、胸部癌（Weidnerら（1992）J.Natl.Cancer  Inst.84:1875−1887）、前立腺癌（Weidnerら（1992）Am.J.Pathol.143:401−409）、脳腫瘍（Liら（1994）Lancet  344:82−86）、および黒色腫（Fossら（1996）Cancer  Res.56:2900−2903）における強い負の予後指標である。
現在までに多数の血管形成性増殖因子が報告されており、それらのうち血管内皮増殖因子（VEGF）が生理学的および病的血管形成の正の調節因子として重要な役割を果たしていると思われる（Brownら（1996）Control  of  Angiogenesis（GoldbergおよびRosen監修）に概説、ビルクハウゼル、バーゼル、印刷中;Thomas（1996）J.Biol.Chem.271:603−606に概説）。VEGFは、内皮細胞を選択的に刺激して増殖、移動させ、マトリックス分解酵素を産生する、分泌型ジスルフィド結合ホモ二量体である（Connら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87:1323−1327;FerraraおよびHenzel（1989）Biochem.Biophys.Res.Commun.161:851−858;Gospodarowiczetら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA  7311−7315;Pepperら（1991）Biochem.Biophys.Res.Commun.181:902−906;Unemoriら（1992）J.Cell  Physiol.153:557−562）。これらはすべて新たな血管の形成に必要なプロセスである。VEGFは既知の唯一の内皮細胞特異性マイトジェンであるほか、それが高分子に対する一過性の血管透過性増大を誘発する効力をもつ点で、血管形成性増殖因子のうちで独特である（したがってその最初の別名は、血管透過性因子、VPFである）（Dvorakら（1979）J.Immunol.122:166−174;Sengerら（1983）Science  219:983−985;Sengerら（1986）Cancer  Res.46:5629−5632）。血管透過性増大とその結果起きる血管外空間での血漿タンパク質沈着が、内皮細胞の移動のための一時マトリックスを提供することによって新たな血管形成を助成する（Dvorakら（1995）Am.J.Pathol.146:1029−1039）。実際、透過性過剰は腫瘍に伴うものを含めて新生血管の特徴である（Dvorakら（1995）Am.J.Pathol.146:1029−1039）。さらに、組織低酸素により誘発される代償性血管形成がVEGFにより仲介されることは、現在分かっている（Levyら（1996）J.Biol.Chem.2746−2753;Shweikiら（1992）Nature  359:843−845）。
VEGFは、VEGF遺伝子のオータナティブスプライシングの結果、４形態（VEGF−121、VEGF−165、VEGF−189、VEGF−206）で生じる（Houckら（1991）Mol.Endocrin.5:1806−1814;Tischerら（1991）J.Biol.Chem.206:11947−11954）。小さい方の２形態は拡散可能であるが、大きい方の２形態はそれらがヘパリンに対し高い親和性をもつため主に細胞膜に局在したままである。VEGF−165もヘパリンに結合し、最も豊富な形態である。ヘパリンに結合しない唯一の形態であるVEGF−121は、受容体に対する親和性がより低く（Gitay−Gorenら（1996）J.Biol.Chem.271:5519−5523）かつマイトジェン効力も低い（Keyら（1996）J.Biol.Chem.271:7788−7795）ように思われる。VEGFの生物学的作用は、その発現が内皮由来の細胞に著しく限定された２種類のチロシンキナーゼ受容体（Flt−１およびFlk−1/KDR）により仲介される（deVriesら（1992）Science  255:989−991;Millauerら（1993）Cell  72:835−846;Termanら（1991）Oncogene  6:519−524）。高親和性結合にはこれら両方の機能性受容体の発現が必要であるが、内皮細胞における走化性およびマイトジェン性のシグナル発生は、主にKDR受容体により起きると思われる（Parkら（1994）J.Biol.Chem.269:25646−25654;Seetharamら（1995）Oncogene  10:135−147;Waltenbergerら（1994）J.Biol.Chem.26988−26995）。血管の発生にVEGFおよびVEGF受容体が重要であることは、VEGF遺伝子の１つの対立遺伝子を欠如するマウス（Garmelietら（1996）Nature  380:435−439;Ferraraら（1996）Nature  380:439−442）またはFlt−１の両方の対立遺伝子を欠如するもの（Fongら（1995）376:66−70）またはFlk−１遺伝子を欠如するもの（Shalabyら（1995）Nature  376:62−66）において最近証明された。それぞれの場合、明らかに異常な血管形成がみられ、その結果、胚が死に至る。
VEGFは、実質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌される（Brownら（1997）Regulation  of  Angiogenesis（GoldbergおよびRosen監修）、ビルクハウゼル、バーゼル、pp.233−269）。VEGFおよびその受容体が腫瘍の増殖の一因であることの直接的な証拠が、VEGFに対する中和抗体により（Kimら（1993）Nature  362:841−844）、優性ネガティブVEGF受容体flk−１の発現により（Millauerら（1996）Cancer  Res.56:1615−1620;Millauerら（1994）Nature  367:576−579）、Flk−１チロシンキナーゼ活性の低分子量阻害薬により（Strawnら（1996）Cancer  Res.56:3540−3545）、またはVEGF  mRNAに対するアンチセンス配列の発現により（Salehら（1996）Cencer  Res.56:393−401）、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻止できるという証明により得られた。重要なのは、腫瘍の転移発生率もVEGFアンタゴニストによって著しく低下することが認められた点である（Claffeyら（1996）Cencer  Res.56:172−181）。
VEGF阻害薬は抗癌薬としての使用のほか、過度の血管形成を特徴とする多様な増殖性疾患にも有用であり、これには乾癬、眼障害、膠原病および慢性関節リウマチが含まれる。大部分のタイプの腫瘍はVEGFを産生することが知られているが、機能性VEGF受容体を発現することは最近まで示されていなかった。カポジ肉腫（KS）細胞は多量のVEGFを産生するだけでなく、機能性VEGF受容体をも発現し、したがってVEGFをオートクリン増殖に利用することが示された。カポジ肉腫は一般に、慣用される代謝拮抗性薬物を用いて治療される。しかしKS患者に化学療法を採用することの主な欠点は、これに伴って免疫抑制が誘導されることであり、これは免疫系が既に低下している患者には重大な結果をもたらす。代替療法の必要性は、KS病変が出現し始めているが他の点では患者はかなり健康であると感じている疾病初期に特に大きい。これに関し、ダウノルビシンなどの化学療法薬をリポソームに封入するのは、抗腫瘍効力を維持しつつ化学療法の副作用を最小限にする有望な方法であることが、最近証明された。内皮由来の活性化した細胞、たとえば本明細書に記載する核酸リガンドVEGFアンタゴニストに選択的にターゲティングする低毒性薬物は、KSの処置にきわめて有益であろう。
VEGF核酸リガンドに関する他の領域の臨床用途の可能性は、過度の血管形成を特徴とする眼障害である。このような障害の例は、黄斑変性および糖尿病性網膜症である。黄斑変性の場合、黄斑（最高視力に関係する網膜部分）下の進行性脈絡膜血管形成が視覚を妨害する。糖尿病性網膜症の場合、網膜における血管形成が視覚を妨害する。黄斑変性および糖尿病性網膜症における血管増殖を開始する最初の刺激は現在分かっていないが、VEGFは重要な血管形成誘発因子であると思われる（Lopez,P.F.ら（1996）Invest.Ophthalmol.Visual  Science  37,855−868;Kliffen,M.ら（1997）Br.J.Ophthalmol.81,154−162;Kvanta,A.ら（1996）Invest.Ophthalmol.Visual  Science  37,1929−1934;Paques.ら（1997）Diabetes  ＆  Metabolism  23:125−130）。したがってVEGFの阻害薬は黄斑変性において血管形成を減少させるのに有用となりうる。
発明の概要
本明細書には、血管内皮増殖因子（VEGF）に対する高親和性２′−フルオロ（２′−Ｆ）−修飾ピリミジンRNAリガンドを記載する。このような核酸リガンドを同定するために本発明で用いる方法はSELEXと呼ばれる。これは指数的濃縮による系統的リガンド進化の頭字語である。本明細書に記載するリガンドは、30または40の隣接位置でランダム化された当初約1014RNA分子のプールから選択された。本明細書には図２〜６に示す進化したリガンドが含まれる。本発明はさらに、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核酸混合物をVEGFと接触させ、（ｂ）候補となる混合物の員子をVEGFに対する親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してVEGFへの結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得ることにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がVEGFのリガンドである）を同定し、同定したこれらのVEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。本発明はさらに、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を含む。
本発明はさらに、VEGF核酸リガンドまたは複合体を含む脂質構築体を包含する。本発明はさらに、複合体を含む脂質構築体の製造方法であって、複合体がVEGF核酸リガンドおよび親油性化合物からなる方法に関する。
他の態様において本発明は、VEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与することに関する。本発明はさらに、この複合体をさらに脂質構築体と結合させることにより、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。
本発明の目的は、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合した１またはそれ以上のVEGF核酸リガンドを含む複合体、およびそれを製造する方法を提供することである。本発明の他の目的は、複合体を含む脂質構築体を提供することである。本発明の他の目的は、改良された薬物動態学的特性を備えた、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合した１またはそれ以上のVEGF核酸リガンドを提供することである。
VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコール、より好ましくはポリエチレングリコール（PEG）であることが好ましい。より好ましくは、PEGは約10〜80Kの分子量をもつ。最も好ましくは、PEGは約20〜45Kの分子量をもつ。VEGF核酸リガンドおよび親油性化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、親油性化合物はグリセロリン脂質であることが好ましい。本発明の好ましい態様において、脂質構築体は好ましくは脂質二重層小胞、最も好ましくはリポソームである。好ましい態様において、VEGF核酸リガンドはSELEX法により同定される。
VEGF核酸リガンド（１またはそれ以上）に共有結合した非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、VEGF核酸リガンド（１またはそれ以上）はターゲティング能に作用することができる。
さらにVEGF核酸リガンドは、複合体の一部ではない脂質構築体と共有結合または非共有結合による相互作用により結合することができる。
さらに、VEGF核酸リガンドを含む脂質構築体または非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物/VEGF核酸リガンド複合体を含む脂質構築体を目的とする本発明の態様であって、脂質構築体が内部コンパートメントを定める膜を備えたタイプのもの（たとえば脂質二重層小胞）である場合、脂質構築体と会合したVEGF核酸リガンドまたは複合体は脂質構築体の膜と結合するか、またはコンパートメント内に封入されていてもよい。VEGF核酸リガンドが脂質構築体の膜と結合した態様の場合、VEGF核酸リガンドは膜の内側に面した部分または外側に面した部分と結合し、これによりVEGF核酸リガンドが小胞の内側または外側へ突出していてもよい。特定の態様では、予め形成した脂質構築体の外側にVEGF核酸リガンド複合体を受動的に装填することができる。核酸リガンドが脂質構築体から突出した態様の場合、VEGF核酸リガンドはターゲティング能に作用することができる。
脂質構築体のVEGF核酸リガンドがターゲティング能に作用する場合、脂質構築体はさらに療法用または診断用薬剤と結合していてもよい。１態様において、療法用または診断用薬剤は脂質構築体の外側に結合している。他の態様においては、療法用または診断用薬剤は脂質構築体に封入されているか、または脂質構築体の内側に結合している。さらに他の態様において、療法用または診断用薬剤は複合体と結合している。１態様において、療法用薬剤は薬物である。他の態様において、療法用または診断用薬剤は１またはそれ以上の他の核酸リガンドである。
本発明の他の目的は、VEGF核酸リガンド、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、血管形成を阻害する方法を提供することである。本発明の他の目的は、VEGF核酸リガンド、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、腫瘍の増幅を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、VEGF核酸リガンド、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、カポジ肉腫を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、VEGF核酸リガンド、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、黄斑変性を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、VEGF核酸リガンド、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、糖尿病性網膜症を阻害する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、療法用または診断用薬剤をVEGF核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、VEGFを発現している生物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤をターゲティングする方法であって、複合体がさらに脂質構築体と結合し、VEGF核酸リガンドがさらにその脂質構築体の外側と結合している方法を提供することである。
これらおよび他の本発明の目的、ならびに本発明の性質、範囲および有用性は、以下の記載および請求の範囲の記載から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図1A〜1Qは、NX213（図1A）、NX278（図1B）、scNX278（図1C）、scNX213（図1D）、NX31838−PL（図1E）、NX31838脂質アミド１（図1F）、NX31838脂質アミド２（図1G）、NX31838−40K  PEG（図1H）、NX31838−20K  PEG（図1I）、リンカーを含まないNX31838  40K  PEG二量体（NX31838d0）（図1J）、C5リンカー１個を含むNX31838  40K  PEG二量体（NX31838d1）（図1K）、C5リンカー２個を含むNX31838  40K  PEG二量体（NX31838d2）（図1L）、C5アミノリンカー（図1M）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図1N）、18原子スペーサーリンカー（図1O）、アミノテトラエチレングリコールリンカー（図1P）、３′３′−dT（図1Q）、およびNX31917（図1R）の分子の記述を示す。リガンドの５′ホスフェート基を図中に表示する。mPEGはメチルポリエチレングリコール表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記のものを示す:m＝２′−Ｏ−メチル、ａ＝２′−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２′−フルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２′Ｈ）を示す。３′３′−dTは、３′末端の３′３′逆転ホスホジエステル結合を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合からなる主鎖修飾を表す。
図２は、VEGFに対する種々の核酸リガンドの結合性を示す。非修飾核酸リガンド（NX213、白丸）、そのジアルキルグリセロール修飾類似体（NX278、白菱形）およびリポソームNX278（NX278−Ｌ、白四角）、ならびに配列スクランブル型（sc）対照（scNX213、黒丸;scNX278、黒菱形；およびscNX278−Ｌ、黒四角）の結合親和性を、競合電気泳動移動度シフトアッセイにより測定した。
NX213は
0003626503.tif 000002
scNX213は
0003626503.tif 000003
である。
32P5＝末端標識NX−213（1.5nM）を結合用緩衝液（0.01％ヒト血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水）中、37℃で20分間、VEGF（0.33nM）および競合体オリゴヌクレオチド（5pM−0.33μＭ）の存在下でインキュベートした。32P  NX−213/VEGF複合体を、遊離32P  NX−213から８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離した（19:1  アクリルアミド：ビスアクリルアミド、トリス−ボラート、89mM、1mM  EDTAを走行緩衝液とする）。種々の競合体濃度での32P  NX−213/VEGF複合体に対応するバンドの強度を、リン−イマージャー分析（phosphorimager  analysis）により定量した。競合体の不在下で形成された複合体の量につき正規化したデータを、最小二乗法で競合結合方程式に当てはめた。
図３は、種々の核酸リガンドがVEGF誘発性の血管透過性増大に与える影響を示す。予めエバンス・ブルー色素を注射したモルモットに、核酸リガンドを含む、または含まないVEGF（20nM）を、皮内注射した。注射部位の皮膚が吸収した光の相対量を測定することにより、色素の漏出量を定量した。
図４は、NX278−ＬがKS細胞の増殖を阻害することを示す。種々の濃度のNX213、NX278−ＬおよびscNX278−Ｌの存在下でのKSY−１細胞の増殖。KSY−１細胞を、０日目に24ウェルプレートに１×104細胞／ウェルの密度で接種した。１および３日目に、同様に処理した新鮮な培地と交換した。培養５または６日目に細胞をトリプシン処理し、粒子クールター計数器で細胞数を測定した。実験を三重に数回行った。示した結果は代表的実験の平均とSEである。
図5Aおよび5Bは、NX278が無胸腺マウスにおいてKS細胞の増殖を阻害することを示す。１日目に無胸腺マウスの前足後方にKS腫瘍を移植した。マウスを２日目から始めて１日１回５日間、腹腔内注射によりNX278−Ｌ（50μg/日／マウス、図5A、および150μg/日／マウス、図5B）で処理した。対照マウスを、核酸リガンド処理群と同量の脂質を用いて空のリポソームで処理した。２週間にわたって腫瘍サイズを測定した。14日目に腫瘍を摘出して測定した。
図６には、NX31838  20K  PEG（□）、40K  PEG（■）、およびNX31838（マイナスPEG）（▽）の血漿濃度に関するデータを、ボーラス注射後の時間の関数としてまとめる。
図７には、NX31838  PLの血漿濃度に関するデータを、ボーラス注射後の時間の関数としてまとめる。
図8A〜8Dは、表示したVEGFタンパク質（0.8pmol）±核酸リガンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を示す。注射の30分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透視により測定した。図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、NX31838−20K  PEG、NX31838−40K  PEG、NX31838−PL、またはNX31838d2−40K  PEGとタンパク質を注射の30分前に混和した効果を示す。数値は平均±SEMである。＊はVEGF単独と比較してＰ＜0.15。分子の記述に関しては図１参照。
図9A〜9Cは、核酸リガンドによるVEGF誘発性角膜血管形成の減少についての評価を示す。０または3pmolのVEGFタンパク質をバイオポリマー（ハイドロン（Hydron））に取り込ませ、角膜支質に埋め込んだ。図示したように動物を１日２回５日間、PBSまたは核酸リガンドの静脈内投与により処理した。図Ａ、ＢおよびＣは、NX31838−20K  PEG、NX31838−40K  PEG、またはNX31838−PL核酸リガンドによる全身処理が与える効果を示す。数値は平均±SEMである。＊は3pmol  VEGF＋PBS群と比較してｐ＜0.05。分子の記述に関しては図１参照。
図10には、NX31838  40K  PEGの血漿濃度（○、△）または硝子体濃度（●、▲、■）に関するデータを、投与後の時間の関数としてまとめる。
図11は、40mg/kgまたは10mg/kgのVEGF  NX31838  40K  PEG核酸リガンド（NX31838NAL）で１日２回（BID）処理したヌードマウスにおいて、皮下で増殖するヒトA673腫瘍の腫瘍増幅曲線を示す。陰性対照は40mg/kgで１日２回投与したスクランブルVEGF核酸リガンド配列NX31917NAL（分子の記述に関しては図1R参照）からなっていた。陽性対照は100μg/マウスで週２回投与した抗VEGFモノクローナル抗体mAb26503.11（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。40mg/kg投与群と10mg/kg投与群の間に有意差はないように思われたので、14日後は40mg/kg群の投与をそれ以上行わなかった。マウス８匹の群に０日目に１×107個のA673腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。腫瘍の体積（mm3として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×W2/2
図12は、VEGF  NX31838核酸リガンド（NAL）の異なる投与計画（投与期間中１日２回（BID）と１日１回（QD）の比較）、40K  PEGの各バッチ（NX31838.07バッチと新たなNX31838.04バッチの比較）、および異なる薬物配合物（リポソームVEGF  NX31838PL  NALとVEGF  NX31838PL  NAL  40K  PEGの比較）の腫瘍増殖曲線を示す。マウス８匹の群に０日目に１×107個のA673腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。数群で腫瘍の増殖しない動物があり、したがって最終分析につき、ある群では７匹（NX31838.04  10mg/kg  BID、およびNX31838.04  3mg/kg  BID）または６匹（NX31838.04  10mg/kg  QD、およびNX31838.07  10mg/kg  BID）の動物しかいなかった。腫瘍の体積（mm3として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×W2/2
図13は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したVEGF  NX31838  40K  PEG核酸リガンド（NX31838  NAL）による。皮下増殖中のA673腫瘍の用量依存性阻害を示す。この力価測定（titration）は無効果量に達せず、最低（0.03mg/kg）用量でもなお腫瘍阻害がみられた。マウス８匹の群に０日目に１×107個のA673腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。NX31838  NAL  3mg/kg群では腫瘍の増殖しない動物が２匹あり、したがって６匹の動物しかいなかった。腫瘍の体積（mm3として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×W2/2
図14は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したVEGF  NX31838  40K  PEG核酸リガンド（NAL）による、皮下増殖中の樹立した（staged,established）A673腫瘍の阻害を証明する増殖曲線を示す。陽性対照は100μg/マウスで週２回投与した抗VEGFモノクローナル抗体mAb26503.11（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。マウスに１×107個のA673細胞を移植し、腫瘍を200±100mm3の体積にまで増殖させ、この時点で動物を体重により選別し、永久識別のため入れ墨をし、被験化合物の腹腔内注射による処理を開始し、実験期間中続けた。各時点で平均８匹のマウスであった。腫瘍の体積（mm3として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×W2/2
図15には、ボーラス注射後のNX213、NX278、NX278−リポソームの血漿濃度に関するデータをまとめる。
図16は、ヌードマウスに皮下移植したKSY−１腫瘍の増殖曲線を示す。マウスを、実験期間中１日２回のNX31917  40K  PEGまたはNX31838  40K  PEG（30mg/kg）またはPBSの腹腔内注射により処理した。ヌードマウスの後方側腹部に２×107個のKSY−１細胞を皮膚移植した後、０日目に処理を開始した。各群４匹のマウスを用いた。誤差はSEMである。
発明の詳細な記述
定義：
“共有結合”は、電子の共有により形成される化学結合である。
“非共有結合による相互作用”は、分子が共有結合以外の、イオン相互作用および水素結合を含めた相互作用により互いに保持されるという意味である。
“親油性化合物”は、脂質および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相と結合するか、またはそれらに分配される傾向をもつ化合物であり、実質的に親油性成分からなる構造体がこれに含まれる。親油性化合物には、脂質、ならびに脂質（および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相）と結合する傾向をもつ非脂質含有化合物が含まれる。コレステロール、リン脂質、ならびにグリセロ脂質、たとえばジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロール、ならびにグリセロールアミド脂質は、親油性化合物の他の例である。本発明の好ましい１態様において、VEGF核酸リガンドに共有結合する親油性化合物は、下記の構造をもつグリセロ脂質である：
0003626503.tif 000004
式中、R1、R2およびR3は独立して、CH3（CH2）ｎ−Ｏ（PO3）−CH2−；ならびにCH3（CH2）ｎ−CONH2−CH2−、CH3（CH2）nO−、CH3（CH2）nOCH2−、CH3（CH2）ｎ（CO）OCH2−、CH3（CH2）ｎ（CO）Ｏ−およびＸ−よりなる群から選択され、その際少なくとも１つはＸ−でなければならず、Ｘは独立して（PO4）、ＯおよびCH2OC＝Ｏよりなる群から選択され、ここでｎ＝０〜30、好ましくは10〜20である。ＲがCH3（CH2）ｎ−Ｏ（PO3）−CH2−である場合、親油性化合物はリン脂質である。ＲがCH3（CH2）ｎ−CONH2−CH2−である場合、親油性化合物はグリセロールアミド脂質である。ＲがCH3（CH2）nO−、またはCH3（CH2）nOCH2−である場合、親油性化合物はジアルキルグリセロ脂質である。ＲがCH3（CH2）ｎ（CO）OCH2−、またはCH3（CH2）ｎ（CO）Ｏ−である場合、親油性化合物はジアシルグリセロ脂質である。好ましい態様においてはR3はＸ−である。
本明細書中で用いる“複合体”は、VEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有結合させることにより形成される分子を表す。本発明の特定の態様において、複合体はＡ−Ｂ−Ｙとして示され、ここでＡは本明細書に記載する親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物であり;Bは任意であって１またはそれ以上のリンカーＺであり;YはVEGF核酸リガンドである。
本発明に関し“脂質構築体”は、脂質、リン脂質、またはその誘導体を含有する構造体であり、多様な構造様式を含む。これらの脂質は水性懸濁液中に受容されることが知られている。これらの構造体には脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルション、脂質リボンまたはシートが含まれるが、これらに限定されない。これらは、薬剤学的に許容しうることが知られている種々の薬物および成分と複合体を形成していてもよい。好ましい態様において、脂質構築体はリポソームである。好ましいリポソームは単層であり、200nm未満の相対サイズをもつ。脂質構築体の一般的な追加成分には、特にコレステロールおよびα−トコフェロールが含まれる。脂質構築体は単独で、または個々の用途に望まれる特性を備えていると当業者が認めるいかなる組合わせでも使用できる。さらに、脂質構築体およびリポソーム形成の技術的観点は当業者に周知であり、当技術分野で慣用されるいかなる方法も本発明に採用できる。
本明細書中で用いる“核酸リガンド”は、ターゲットに対し望ましい作用をもつ、天然には存在しない核酸である。本発明のターゲットはVEGFであり、したがってこの語はVEGF核酸リガンドである。望ましい作用には、ターゲットを結合すること、触媒作用によりターゲットを変化させること、ターゲットまたはターゲットの機能活性を修飾／変化させるようにターゲットと反応すること、自殺阻害物質と同様にターゲットと共有結合すること、ターゲットと他の分子の反応を促進することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、その作用はVEGFに対する特異的結合親和性であり、その際、この核酸リガンドはVEGFが結合する既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。
本発明の好ましい態様において、本発明の複合体および脂質構築体のVEGF核酸リガンドはSELEX法により同定される。VEGF核酸リガンドは、候補となる核酸混合物（核酸がVEGFのリガンドである）から下記の方法で同定される:a）候補混合物をVEGFと接触させる、その際、VEGFに対し候補混合物と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる;b）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そしてｃ）これらの高親和性核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物を得る（米国特許出願第08/233,012号、1994年４月25日出願、表題“血管内皮増殖因子（VEGF）に対する高親和性オリゴヌクレオチド";米国特許出願第08/447,169号、1995年５月19日出願、表題“血管内皮増殖因子（VEGF）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド”参照；これらを本明細書に援用する）。
“候補混合物”は、目的とするリガンドをそれから選択する、種々の配列の核酸の混合物である。候補混合物源は、天然核酸もしくはそのフラグメント、化学的に合成した核酸、酵素により合成した核酸、または以上の方法の組合わせにより製造した核酸から得ることができる。好ましい態様において、増殖プロセスを促進するために、それぞれの核酸はランダム領域を囲む固定配列を含む。
“核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のDNA、RNA、またはそのいかなる化学修飾体をも意味する。修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（fluxionality）を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２′−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、たとえばヌクレオシド間ホスホロチオエート結合、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングのような３′および５′修飾も含めることができる。
“非免疫原性高分子量化合物”は、一般に免疫原応答を生じない、約1000〜1,000,000Da、より好ましくは約1000〜500,000Da、最も好ましくは約1000〜200,000Daの化合物である。本発明の目的に関し、免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫原性高分子量化合物の例には、ポリアルキレングリコールおよびポリエチレングリコールが含まれる。本発明の好ましい１態様において、VEGF核酸リガンドに共有結合した非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールであり、構造Ｒ（Ｏ（CH2）ｘ）ｎ）Ｏ−をもち、ここでＲは独立してＨおよびCH3よりなる群から選択され、ｘ＝２〜５であり、ｎはほぼポリアルキレングリコールの分子量/16＋14xである。本発明の好ましい態様において、分子量は約10〜80kDaである。最も好ましい態様において、ポリアルキレングリコールの分子量は約20〜45kDaである。最も好ましい態様において、ｘ＝２、ｎ＝９×102である。１またはそれ以上のポリアルキレングリコールが同一VEGF核酸リガンドに結合して、分子量の和が好ましくは約10〜80kDa、最も好ましくは約20〜45kDaであってもよい。特定の態様においては、非免疫原性高分子量化合物も核酸リガンドであってよい。
“脂質二重層小胞”は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をもつ個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水性部分はホスフェート、グリセロホスフェート、カルボキシ、サルフェート、アミノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。非極性基の例は、飽和または不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロール類（たとえばコレステロール）および薬剤学的に許容しうる他の成分（α−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。
“リポソーム”は脂質二重層小胞の集合体であり、主に、長い脂肪酸鎖から構成される２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に暴露されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、二重膜を形成する。したがって膜のそれぞれの側は親水性表面を提供し、一方、膜の内部は親油性媒質を含む。これらの膜は、形成されたとき一般に内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で層間水相により分離された、閉じた同心膜の系として配列する。これらの多重膜小胞（MLV）に剪断力を付与して、単膜小胞（UV）に変換することができる。
“カチオンリポソーム”は、生理学的pHにおいて全体として正の電荷をもつ脂質成分を含有するリポソームである。
“SELEX"法は、ターゲットと望ましい様式で相互作用する（たとえばタンパク質への結合）核酸リガンドの選択と、選択したこれらの核酸の増幅との組合わせを伴うものである。選択／増幅の工程を反復循環することにより、きわめて多数種類の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も強く相互作用する１種類または少数の核酸を選択することができる。選択した目標に達するまで、この選択／増幅操作の循環を続ける。SELEX法はSELEX特許出願に記載されている。
“ターゲット”は、それに対するリガンドを得たいという関心のあるいかなる化合物または分子であってもよい。ターゲットは、タンパク質（たとえばVEGF、トロンビンおよびセレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態の類似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、増殖因子など、制限がない。本発明の主なターゲットはVEGFである。
“改良された薬物動態特性”とは、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に共有結合するか、または脂質構築体と結合したVEGF核酸リガンドが、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に結合していない、または脂質構築体と結合していない同一VEGF核酸リガンドと対比して、より長い循環半減期をインビボで示すことを意味する。
“リンカー”は、２以上の分子を共有結合または非共有結合による相互作用により連結し、これらの分子１またはそれ以上がもつ機能特性を保存する様式で分子を空間的に分離しうる分子である。リンカーはスペーサーとしても知られる。リンカーの例には、図1M〜1Pに示す構造体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いる“療法”には、治療および／または予防が含まれる。療法という場合、これはヒトおよび他の動物について述べたものである。
本発明は、２′−修飾ヌクレオチドを含む、VEGFに対するRNAリガンドを包含する。本発明はさらに、表２〜６（配列番号:15−132）に示す、VEGFに対するRNAリガンドを包含する。より詳細には、本発明は表２〜６に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同な核酸配列、および実質的に同じVEGF結合能をもつ核酸配列を包含する。実質的に相同とは、70％以上、きわめて好ましくは80％以上、さらに最も好ましくは90％、95％または99％以上の一次配列相同性の程度を意味する。本明細書に記載する相同％は、比較する配列中の一致するヌクレオチド残基とアラインする２配列のうち小さい方にみられるヌクレオチドの％として計算される。その際、アラインメントを補助するために10ヌクレオチドの長さに１ギャップを導入できる。実質的に同じVEGF結合能とは、その親和性が、本明細書に記載するリガンドの親和性の１桁または２桁以内であることを意味する。ある配列−本明細書に具体的に記載したものと実質的に相同−が同じVEGF結合能をもつか否かの判定は、当業者が容易になしうる。
表２〜６（配列番号:15−132）に示す、VEGFの核酸リガンドの配列相同性をみると、一次相同性をほとんど、または全くもたない配列が、実質的に同じVEGF結合能をもつ場合があることが分かる。これらの理由から、本発明は表２〜６に示す核酸リガンドと実質的に同じ推定構造または構造モチーフおよびVEGF結合能をもつ核酸リガンドをも包含する。実質的に同じ構造または構造モチーフは、ツッカーフォールド（Zuckerfold）プログラム（Zucker（1989）Science  244:48−52参照）を用いる配列アラインメントにより推定できる。当技術分野で知られているように、二次構造および構造モチーフを推定するために他のコンピュータープログラムを使用できる。溶液中または結合構造体としての実質的に同じ推定構造または構造モチーフの核酸リガンドは、NMRそのほか、当技術分野で知られている技術を用いて推定することもできる。
本発明はさらに、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核酸混合物をVEGFと接触させ、（ｂ）この候補混合物の員子をVEGFに対する親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してVEGFへの結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得ることにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がVEGFのリガンドである）を同定し、同定したこれらのVEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。
本発明はの他の目的は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有結合した１またはそれ以上のVEGF核酸リガンドを含む複合体をを提供することである。このような複合体は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合していないVEGF核酸リガンドに優る下記の利点１またはそれ以上をもつ:1）改良された薬物動態特性、および２）改良された細胞内送達能、または３）改良されたターゲティング能。さらに脂質構築体と結合した複合体も同じ利点をもつ。
複合体、またはVEGF核酸リガンドもしくは複合体を含む脂質構築体は、これらの利点のうち１、２または３つをもつであろう。本発明の脂質構築体は、たとえば下記のものからなる:a）リポソーム、ｂ）リポソームの内部に封入された薬物、およびｃ）VEGF核酸リガンドと親油性化合物からなる複合体であって、複合体のVEGF核酸リガンド成分が脂質構築体の外側と結合し、そこから突出しているもの。そのような場合、複合体を含む脂質構築体は、１）改良された薬物動態特性をもち、２）封入された薬物の細胞内送達能が増大し、かつ３）外側に結合したVEGF核酸リガンドにより、VEGFを発現している予め選択された位置にインビボで特異的にターゲティングする。
他の態様において本発明は、VEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与する方法を提供する。本発明はさらに、この複合体を脂質構築体とさらに結合させることにより、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良する方法に関する。
他の態様において本発明の複合体は、親油性化合物、たとえばグリセロ脂質、または非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコール（PEG）に共有結合した、VEGF核酸リガンドからなる。これらの場合、複合体の薬物動態学的特性はVEGF核酸リガンド単独と比較して向上するであろう。他の態様において、VEGF核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成し、この複合体を脂質構築体とさらに結合させるか、あるいはVEGF核酸リガンドを脂質構築体に封入すると、VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性がVEGF核酸単独と比較して改良される。
多重のVEGF核酸リガンドがある態様では、VEGFとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が多重のVEGF核酸リガンドを含む態様では、１つのVEGF核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。脂質構築体が多重のVEGF核酸リガンドまたは複合体を含む態様では、１つのVEGF核酸リガンドまたは複合体のみがある脂質構築体と比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。
本発明の特定の態様において、本発明の複合体は他の核酸リガンド１つ（二量体）またはそれ以上（多量体）に結合したVEGF核酸リガンドを含む。この核酸リガンドはVEGFに対するものであってもよく、異なるターゲットに対するものであってもよい。多重のVEGF核酸リガンドがある態様では、VEGFとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が１またはそれ以上の他のVEGF核酸リガンドに結合したVEGF核酸リガンドを含む本発明の態様では、１つのVEGF核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。
非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物をVEGF核酸リガンドの多様な位置に、たとえば塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５−位、プリンヌクレオチドの８−位、ホスフェートのヒドロキシル基、またはVEGF核酸リガンドの５′もしくは３′末端のヒドロキシル基もしくは他の基に、共有結合させることができる。親油性化合物がグリセロ脂質であるか、または非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコールである態様では、それは好ましくはそのホスフェート基の５′もしくは３′ヒドロキシル基に結合する。最も好ましい態様では、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物は核酸のホスフェート基の５′ヒドロキシル基に結合する。VEGF核酸リガンドへの非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の結合は、直接に、またはリンカーもしくはスペーサーを用いて行うことができる。脂質構築体が複合体を含む態様またはVEGF核酸リンカーがリポソームに封入された態様では、VEGF核酸リガンドまたは複合体と脂質構築体との非共有結合による相互作用が好ましい。
核酸を療法に用いる際に生じる問題のひとつは、オリゴヌクレオチドがそれらのホスホジエステル形である場合、目的とする効果を表す前に、体液中で細胞内および細胞外酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解される可能性があることである。VEGF核酸リガンドのインビボ安定性を高めるために、またはVEGF核酸リガンドの送達を向上もしくは仲介するために、VEGF核酸リガンドの特定の化学修飾を行うことができる。本発明において考慮するVEGF核酸リガンド修飾には、VEGF核酸リガンド塩基またはVEGF核酸リガンド全体に、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用および流動性を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定されない。このような修飾には、２′−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェート修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、キャッピングのような３′および５′修飾も含めることができる。
核酸リガンドをSELEX法により得る場合、修飾はSELEX前または後、いずれの修飾であってもよい。SELEX前修飾によれば、VEGFに対する特異性および改良されたインビボ安定性の両方を備えたVEGF核酸リガンドが得られる。２′−OH核酸リガンドにSELEX後修飾を行うと、核酸リガンドの結合能に不都合な影響を与えずに、改良されたインビボ安定性が得ることができる。本発明のVEGF核酸リガンドの好ましい修飾は、５′および３′ホスホロチオエートキャッピング、ならびに／あるいは３′末端の３′３′逆転ホスホジエステル結合である。最も好ましい態様では、好ましいVEGF核酸リガンド修飾は３′末端の３′３′逆転ホスホジエステル結合である。さらに、一部または全部のヌクレオチドの２′−フルオロ（２′−Ｆ）、２′−アミノ（２′−NH2）、および２′−Ｏ−メチル（２′−OMe）修飾が好ましい。
本発明の他の態様では、VEGF核酸リガンドと非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の共有結合により、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合していないVEGF核酸リガンドと比較して改良された薬物動態特性（すなわち、より遅いクリアランス速度）が得られる。
本発明の他の態様では、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物を含む複合体をさらに脂質構築体と会合させることができる。この会合により、脂質構築体と会合していないVEGF核酸リガンドと比較して改良された薬物動態特性が得られる。VEGF核酸リガンドまたは複合体を共有結合または非共有結合による相互作用により脂質構築体と会合させることができる。好ましい態様において、会合は非共有結合相互作用による。好ましい態様において、脂質構築体は脂質二重層小胞である。最も好ましい態様において、脂質構築体はリポソームである。
本発明に用いるリポソームは当技術分野で現在知られている種々の方法または今後開発される方法のいずれによっても調製できる。一般にそれらはリン脂質、たとえばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、他の材料、たとえば中性脂質（たとえばコレステロール）、および界面改質剤、たとえば正に荷電した化合物（たとえばコレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノースまたはアミノマンニトール誘導体）または負に荷電した化合物（たとえばリン酸ジアセチル、ホスファチジルグリセロール）を含有してもよい。多重膜リポソームは常法により、すなわち脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させて容器の内側に薄膜を残留させて、適切な容器または器の内壁に選択した脂質を沈着させるか、または噴霧乾燥することにより形成できる。次いで容器に水相を添加し、回転運動または渦撹拌運動を与えると、MLVが生成する。次いでMLVのホモジナイゼーション、超音波処理または押出し（フィルターを通して）により、UVを形成できる。さらに、界面活性剤分離法によりUVを形成できる。
本発明の他の態様において脂質構築体は、脂質構築体の表面と結合したターゲティング用VEGF核酸リガンド（１またはそれ以上）および封入された療法薬または診断薬を含む。好ましくは脂質構築体はリポソームである。予め形成したリポソームをVEGF核酸リガンドと会合するように修飾してもよい。たとえばカチオン性リポソームは静電相互作用によりVEGF核酸リガンドと結合する。グリセロ脂質などの親油性化合物に共有結合したVEGF核酸リガンドを、予め形成したリポソームに添加してもよく、これによりグリセロ脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質がリポソーム膜と結合する。あるいはリポソーム形成中にVEGF核酸リガンドをリポソームと結合させてもよい。
リポソームが広範な療法薬または診断薬の封入または取込みに有利であることは当技術分野で周知である。多様ないかなる化合物もリポソーム内部の水性コンパートメントに収容できる。療法薬の具体例には、抗生物質、抗ウイルス性ヌクレオシド、抗真菌性ヌクレオシド、代謝調節薬、免疫モジュレーター、化学療法薬、毒素解毒薬、DNA、RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれる。同様に、脂質二重層小胞に診断用放射性核種（たとえばインジウム111、ヨウ素131、イットリウム90、リン32またはガドリニウム）、ならびに蛍光物質、またはインビトロおよびインビボ用途において検出できる他の物質を装填することができる。療法薬または診断薬を水性内部にリポソーム壁により封入できることを理解すべきである。あるいは保有された薬剤が小胞壁形成材料の一部であってもよく、すなわちその材料に分散または溶解していてもよい。
リポソーム形成中に、水溶性キャリヤー物質を水和溶液に含有させることにより水性内部に封入し、そして親油性分子を脂質配合物に含有させることにより脂質二重層に取り込ませてもよい。特定の分子（たとえばカチオン性またはアニオン性の親油性薬物）の場合、予め形成したリポソーム中への薬物の装填は、たとえば米国特許第4,946,683号に記載された方法で達成できる。その開示事項を本明細書に援用する。薬物封入後、リポソームをゲルクロマトグラフィーまたは限外ろ過などの方法で処理して、封入されていない薬物を除去することができる。次いでリポソームを一般に無菌的にろ過して、懸濁液中に存在する可能性のある微生物を除去する。微生物は無菌処理によっても除去できる。
大型の親水性分子をリポソームで封入したい場合、逆相蒸発法（REV）または溶剤注入法などの方法で、比較的大きな単層小胞を形成できる。リポソーム形成のための他の標準法は当技術分野で知られている。たとえば商業的なリポソーム製造方法には、米国特許第4,753,788号に記載されたホモジナイゼーション法、および米国特許第4,935,171号に記載された薄膜蒸発法が含まれる。それらを本明細書に援用する。
療法薬または診断薬が脂質二重層小胞の表面と結合していてもよいことを理解すべきである。たとえば薬物をリン脂質またはグリセリドに結合させることができる（プロドラッグ）。このプロドラッグのリン脂質またはグリセリドの部分を脂質配合物に含有させることによりリポソームの脂質二重層に取り込ませるか、または予め形成したリポソーム中へ装填することができる（米国特許第5,194,654号および第5,223,263号参照。それらを本明細書に援用する）。
個々のリポソーム調製法が、意図する用途、および二重膜形成に用いる脂質の種類に依存することは当業者に自明である。
LeeおよびLow（1994,JBC,269:3198−3204）、ならびにDeFreesら（1996,JACS,118:6101−6104）は、リガンド−PEG−脂質と脂質成分の同時配合物によりPEG−リガンドが内側と外側の両方に面したリポソームが得られることを最初に示した。受動アンカリングはZalipskyら（1997,Bioconj.Chem.8:111−118）が、オリゴペプチドリガンドおよびオリゴ糖リガンドをもっぱらリポソーム外面にアンカリングする方法として概説した。彼らの報文に提示された中心的概念は、リポソーム−PEG−脂質コンジュゲートを調製し、次いで既存の脂質二重層中への脂質テイルの自然取込み（“アンカリング”）により、予め形成したリポソーム中へ配合しうるというものである。脂質基は、その疎水性脂質アンカーを水溶液から抜き出し、次いで疎水性脂質二重層中に配置することによって、より低い自由エネルギー状態に達するために、この挿入を行う。このような系の重要な利点は、オリゴ脂質がもっぱら脂質二重層の外側にアンカリングすることである。したがって、オリゴ脂質が内側に面した配向であることによりそれらの生物学的ターゲットとの相互作用に利用されないため浪費されるということはない。
細胞へのVEGF核酸リガンド送達効率は、リポソームと細胞膜の融合を促進することが知られている脂質配合物および条件を採用することにより、最適化できる。たとえば、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンなど負に荷電した特定の脂質は、特に他の融合誘導物質（fusogen）（たとえばCa2+など多価カチオン、遊離脂肪酸、ウイルス性融合タンパク質、短鎖PEG、リゾレシチン、洗浄剤および界面活性剤）の存在下で融合を促進する。ホスファチジルエタノールアミンも、膜融合を高め、同時に細胞送達を促進するために、リポソーム配合物に含有させることができる。さらに、たとえばカルボキシラート部分を含む遊離脂肪酸およびその誘導体を用いて、高いpHでは負に荷電し、低いpHでは中性またはプロトン化しているpH感受性リポソームを調製できる。そのようなpH感受性リポソームは、より高い融合傾向をもつことが知られている。
好ましい態様において、本発明のVEGF核酸リガンドはSELEX法で得られる。SELEXは、米国特許出願第07/536,428号、表題：指数的濃縮による系統的リガンド進化、現在は放棄；米国特許出願第07/714,131号、1991年６月10日出願、表題：核酸リガンド、現在は米国特許第5,475,096号；米国特許出願第07/931,473号、1992年８月17日出願、表題：核酸リガンドの同定法、現在は米国特許第5,270,163号（国際特許出願公開第WO91/19813号も参照）に記載されている。それぞれ本明細書に援用するこれらの特許出願を、まとめてSELEX特許出願と呼ぶ。
SELEX法によれば、それぞれユニークな配列をもち、それぞれ目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ核酸分子である一群の生成物が得られる。ターゲット分子は好ましくはタンパク質であるが、特に炭水化物、ペプチドグリカンおよび多様な小分子も含めることができる。SELEX法は、生物学的構造体、たとえば細胞表面またはウイルスを、その生物学的構造体の一体部分である分子との特異的相互作用によりターゲティングするのにも使用できる。
SELEX法は、その最も基本的な形態では下記の一連の工程により定義される：
１）候補となる、種々の配列の核酸の混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列の領域（すなわち候補混合物の各員子が同じ位置に同じ配列を含む）およびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は以下のように選択される：（ａ）後記の増幅工程を補助する、（ｂ）ターゲットに結合することが分かっている配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の特定の構造様式の核酸の濃度を高める。ランダム配列は完全にランダムであってもよく（すなわちある塩基をいずれかの位置に見出す確率は1/4である）、または部分的にランダムであってもよい（たとえばある塩基をいずれかの位置に見出す確率は、０〜100％のいずれの水準でも選択できる）。
２）ターゲットと候補混合物の員子の結合に好ましい条件下で、候補混合物を選択されたターゲットと接触させる。これらの状況は、ターゲットと候補混合物の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲットに対し最も強い親和性をもつ核酸の間に核酸−ターゲット対を形成するものと考えることができる。
３）ターゲットに対し最も高い親和性をもつ核酸を、ターゲットに対しより低い親和性をもつ核酸から分配する。候補混合物中には最高親和性の核酸に相当する配列はきわめて少数存在するにすぎない（おそらくわずか１分子の核酸）ので、一般に分配に際し有意量の核酸（約５〜50％）が保持されるように分配基準を設定することが望ましい。
４）分配に際し、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつとして選択された核酸を、次いで増幅させて、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつ核酸が濃縮された新たな候補混合物を形成する。
５）上記の分配工程および増幅工程を反復することにより、新た形成された候補混合物が含有するユニーク配列はいっそう少なくなり、ターゲットに対する核酸の平均親和度は一般に高まるであろう。極端にSELEX法は、最初の候補混合物からターゲット分子に対し最も高い親和性をもつ核酸に相当する１または少数の核酸を含有する候補混合物を与えるであろう。
多数の特定の目的を達成するように、基本的SELEX法が変更されている。たとえば米国特許出願第07/960,093号、1992年10月14日出願、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、SELEXをゲル電気泳動と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりDNAを選択することが記載されている。米国特許出願第08/123,935号、1993年９月17日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、SELEXに基づく方法であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいはそれらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法が記載されている。米国特許出願第08/134,028号、1993年10月７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第5,580,737号）には、近縁分子を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗SELEXと呼ばれる方法が記載されている。米国特許出願第08/143,564号、1993年10月25日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液SELEX"（現在は米国特許第5,567,588号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、SELEXに基づく方法が記載されている。米国特許出願第07/964,624号、1992年10月21日出願、表題“HIV−RT及びHIV−1Revに対する核酸リガンド”（現在は米国特許第5,496,938号）には、SELEXによって改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。米国特許出願第08/400,440号、1995年３月８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：化学SELEX"には、リガンドをそのターゲットに共有結合させる方法が記載されている。
SELEX法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。SELEXにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許出願第08/117,991号、1993年９月８日出願、表題“修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第5,660,985号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２′−位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載されている。前掲の米国特許出願第08/134,028号には、２′−アミノ（２′−NH2）、２′−フルオロ（２′−Ｆ）、および／または２′−Ｏ−メチル（２′−OMe）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第08/264,029号、1994年６月22日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２′−修飾ヌクレオチドを製造するための新規方法:"には、種々の２′−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。
SELEX法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。これはそれぞれ米国特許出願第08/284,063号、1994年８月２日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラSELEX"（現在は米国特許第5,637,459号）、および米国特許出願第08/234,997号、1994年４月28日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：ブレンドSELEX"に記載されている。これらの特許出願により、オリゴヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。
SELEX法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包含する。これはたとえば米国特許出願第08/434,465号、1995年５月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。SELEX法はさらに、特定のVEGF核酸リガンドをジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールなどの親油性化合物と結合させることを包含する。これはたとえば米国特許出願第08/739,109号、1996年10月25日出願、表題“血管内皮増殖因子（VEGF）核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、またはグリセロリン脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合したVEGF核酸リガンドは、米国特許出願第08/897,351号、1997年７月21日出願、表題“血管内皮増殖因子（VEGF）核酸複合体”に記載されている。基本的SELEX法の変更につき記載した上記特許出願それぞれを全体として本明細書に援用する。
SELEXにより、高い親和性および卓越した特異性でターゲットと結合しうる核酸リガンドが同定される。これは核酸研究の分野で前例のない見事な成果である。これらの特性はもちろん当業者が療法用または診断用リガンドにおいて追及する望ましい特性である。
薬剤として用いるのに望ましい核酸リガンドを得るために、核酸リガンドは好ましくは（１）ターゲットに対し目的とする効果を達成しうる様式でターゲットに結合し；（２）目的効果を得るために可能な限り小さく；（３）可能な限り安定であり；かつ（４）選択したターゲットに対し特異的リガンドである。大部分の場合、核酸リガンドはターゲットに対し可能な限り最高の親和性をもつことが好ましい。さらに、核酸リガンドは促進性をもつことができる。
同一出願人による米国特許出願第07/964,624号、1992年10月21日出願（‘624）（現在は米国特許第5,496,938号）には、SELEXによって改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。HIV−RT及びHIV−1Revに対する核酸リガンドと題するこの‘624出願を本明細書に援用する。
SELEX法は、ランダム２′−アミノピリジンRNAライブラリーからVEGFに対する一群の高親和性RNAリガンドを同定し、ランダムssDNAライブラリーからssDNAリガンドを同定するために用いられた（米国特許出願第08/233,012号、1994年４月25日出願、表題：血管内皮増殖因子（VEGF）に対する高親和性オリゴヌクレオチドの一部継続出願である、米国特許出願第08/447,169号、1995年５月19日出願、表題：血管内皮増殖因子（VEGF）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド参照；これら両者を本明細書に援用する;Greenら（1995）Chemistry  and  Biology  2:683−695も参照）。
VEGF核酸リガンド（１またはそれ以上）がターゲティング能に作用しうる態様において、VEGF核酸リガンドには、VEGF核酸リガンドがそのターゲットに結合しうるために保持しなければならない三次元構造がある。脂質構築体が複合体を含み、この複合体のVEGF核酸リガンドが脂質構築体の表面から突出している態様において、VEGF核酸リガンドは、そのターゲット結合能が損なわれないように脂質構築体の表面に対し適正に配向しなければならない。これは、VEGF核酸リガンドをVEGF核酸リガンドの結合用部分から離れた位置で付着させることにより達成できる。この三次元構造および適正な配向は、前掲のリンカーまたはスペーサーを用いることによっても保持できる。
複合体によりターゲティングする送達のために、多様な療法薬または診断薬のいずれも複合体に結合させることができる。さらに、脂質構築体によりターゲティング送達のために、多様な療法薬または診断薬のいずれも前記の脂質構築体に結合させ、封入し、または取り込ませることができる。
複合体がたとえばリポソームに会合した親油性化合物およびVEGF核酸リガンドからなる態様において、VEGF核酸リガンドは、抗腫瘍薬（たとえばダウノルビシン）または造影剤（たとえば放射性標識）の送達のために、VEGFを発現している腫瘍細胞（たとえばカポジ肉腫）をターゲティングすることができる。腫瘍の周囲の細胞や組織もVEGFを発現する可能性がある、これらの細胞をターゲティングした抗腫瘍薬送達も有効であることを留意すべきである。
別態様において、ターゲット細胞へ送達すべき療法薬または診断薬が他の核酸リガンドであってもよい。
本発明によればさらに、送達すべき薬剤（たとえばプロドラッグ、受容体アンタゴニスト、または治療もしくは造影のための放射性物質）をリポソームの外面と結合するように複合体に取り込ませることができる。VEGF核酸リガンドと同様に、これらの薬剤を共有結合または非共有結合による相互作用により結合させることができる。リポソームによりこれらの薬剤を細胞外からターゲティング送達し、その際リポソームはリンカーとして作用する。
他の態様では、非免疫原性高分子量化合物（たとえばPEG）をリポソームに結合させて、複合体の薬物動態特性を改良することができる。VEGF核酸リガンドをリポソーム膜に結合させるか、または非免疫原性高分子量化合物に結合させ、これを膜に結合させてもよい。この方法で複合体を血液タンパク質から遮蔽し、こうしてVEGF核酸リガンドがなおそのターゲットと接触して結合するのに十分な程度に露出した状態で、長期間循環させることができる。
本発明の他の態様では、２以上のVEGF核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これにより同じVEGF分子を互いに接近させることができ、これを利用してVEGF分子間に特異的相互作用を生じさせることができる。
本発明の別態様では、VEGF核酸リガンドおよび異なるターゲットに対する核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これによりVEGFを異なるターゲットに接近させることができ、これを利用してVEGFと他のターゲット間に特異的相互作用を生じさせることができる。ターゲットを接近させる方法としてリポソームを用いるほか、相互作用の強度を高めるためにリポソームに薬剤を封入できる。
複合体を含む脂質構築体は、VEGFに多くの結合相互作用をもたらすことができる。これはもちろん複合体当たりのVEGF数、および脂質構築体当たりの複合体数、ならびにそれぞれの膜中でのVEGF核酸リガンドおよび受容体の移動度に依存する。有効結合定数は各部位についての結合定数の積と共に増大するので、多数の結合相互作用があることは実質的に有利である。すなわち、多数のVEGF核酸リガンドを脂質構築体に結合させることにより、したがって多価を形成することにより、ターゲットに対する多重複合体の有効親和性（すなわちアビディティー）は、各部位についての結合定数の積と共に良好になるであろう。
本発明の特定の態様において、本発明の複合体はグリセロール脂質などの親油性化合物に結合したVEGF核酸リガンドからなる。この場合、複合体の薬物動態特性は、VEGF核酸リガンド単独と比較して改良されるであろう。前記に述べたように、グリセロール脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質を、VEGF核酸リガンド上の多数の位置でVEGF核酸リガンドに共有結合させることができる。グリセロール脂質を用いる態様では、VEGF核酸リガンドをホスホジエステル結合により脂質に結合させることが好ましい。
本発明の他の態様では、脂質構築体がVEGF核酸リガンドまたは複合体を含む。この態様において、グリセロ脂質は他の親油性化合物と結合する傾向をもつため、グリセロ脂質がリポソームへのVEGF核酸リガンドの取込みを補助することができる。VEGF核酸リガンドと結合したグリセロ脂質を、配合物に含有させることにより、または予め形成したリポソームに装填することにより、リポソームの脂質二重層に取り込ませることができる。グリセロ脂質は、VEGF核酸リガンドがリポソームの内または外へ突出する様式で、リポソームの膜と結合することができる。VEGF核酸リガンドがリポソームの外へ突出する態様では、VEGF核酸リガンドはターゲティング能に作用することができる。脂質構築体の薬物動態特性をさらに改良するために他の化合物を脂質構築体と結合させうることを理解すべきである。たとえばPEGを脂質構築体の膜の外側に面した部分に結合させてもよい。
他の態様において、本発明の複合体は非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールまたはPEGに共有結合したVEGF核酸リガンドからなる。この態様では、VEGF核酸リガンド単独と比較して複合体の薬物動態特性が改良される。ポリアルキレングリコールまたはPEGをVEGF核酸リガンド上の種々の位置に共有結合させることができる。ポリアルキレングリコールまたはPEGを用いる態様では、VEGF核酸リガンドを５′ヒドロキシル基によりホスホジエステル結合を介して結合させることが好ましい。
特定の態様では、多数の核酸リガンドを単一の非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールもしくはPEG、または親油性化合物、たとえばグリセロ脂質に結合させることができる。核酸リガンドはすべてがVEGFに対するものであってもよく、VEGFと他のターゲットに対するものであってもよい。多数のVEGF核酸リガンドがある態様では、VEGFとの多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに他の態様では、多数のポリアルキレングリコール、PEG、グリセロール脂質分子を互いに結合させることができる。これらの態様では、１またはそれ以上のVEGF核酸リガンドまたはVEGFおよび他のターゲットに対する核酸リガンドを、ポリアルキレングリコール、PEG、グリセロール脂質それぞれに結合させることができる。これにより、同様にターゲットに対するそれぞれの核酸リガンドのアビディティーが増大する。多数のVEGF核酸リガンドがポリアルキレングリコール、PEGまたはグリセロール脂質に結合した態様では、VEGF間に特異的相互作用を生じさせるために、VEGF分子を互いに接近させることができる。VEGFおよび異なるターゲットに特異的な多数の核酸リガンドがポリアルキレングリコール、PEGまたはグリセロール脂質に結合した態様では、VEGFおよび他のターゲット間に特異的相互作用を生じさせるために、VEGFおよび他のターゲットを互いに接近させることができる。さらに、VEGFに対する核酸リガンドまたはVEGFおよび異なるターゲットに対する核酸リガンドがポリアルキレングリコール、PEGまたはグリセロール脂質に結合した態様では、薬物をポリアルキレングリコール、PEGまたはグリセロール脂質と結合させることもできる。したがって複合体はその薬物をターゲティング送達し、その際ポリアルキレングリコール、PEGまたはグリセロール脂質はリンカーとして作用する。
VEGF核酸リガンドはVEGFを選択的に結合する。したがってVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、またはVEGF核酸リガンドもしくはその複合体を含む脂質構築体は、医薬または診断薬として有用である。したがって本発明は、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはVEGF核酸リガンドを含むか、またはVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を投与することにより、血管形成を阻止する方法を包含する。VEGF核酸リガンドを含む複合体および脂質構築体を用いて、不適性なVEGF産生を伴ういずれかの疾病状態、特に血管形成を、治療、阻止、予防または診断できる。血管形成は月経周期および創傷治癒以外には、健康な成人で起きるのは稀である。しかし癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチ（これらに限定されない）を含めた種々の疾病状態では、血管形成は主な特徴である。したがって本発明は、糖尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチを、治療、阻止、予防または診断する方法をも包含する（これらに限定されない）。さらに、VEGFは実質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌される。したがって本発明は、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一部ではないVEGF核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することにより、癌を治療、阻止、予防または診断する方法を包含する。癌の１タイプであるカポジ肉腫（KS）では、細胞が多量のVEGFを産生するだけでなく、機能性VEGF受容体をも発現し、したがってVEGFをオートクリン増殖に利用する。したがって本発明は、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一部ではないVEGF核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することにより、カポジ肉腫を阻止する方法を包含する。
本発明の１態様において、脂質構築体はVEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物からなる複合体を含み、さらに脂質構築体に封入された、または脂質構築体の内側と結合した診断薬もしくは療法薬を含む。好ましい態様において脂質構築体は脂質二重層小胞、より好ましくはリポソームである。療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒である薬物の送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対し感受性の組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。リポソームは長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもでき、これにより投与回数を減らすこともできる。さらにリポソームは、普通は静脈内送達に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供できる。
多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎となりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれらの投与経路を操作することが含まれる。MLVは、主として比較的大型であるという理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取込まれる。これに対しUVは、MLVと比べて長い循環時間、低いクリアランス速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。
リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違いが生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付着させるものである。本発明の１態様では、VEGF核酸リガンドがリポソームの外面に結合し、ターゲティング能に作用する。当業者に自明のとおり、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドなど、追加のターゲティング成分を含有させてもよい。さらに、抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティングさせる幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第5,019,369号、第5,435,989号、および第5,441,745号参照。これらの代替ターゲティング法を採用するのは当業者に自明であろう。
VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、VEGF核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物からなる複合体を含む脂質構築体、ならびに複合体の一部ではないVEGF核酸リガンドが脂質構築体と会合したものの、療法用または診断用組成物を注射により非経口的に投与できる。ただし他の効果的な投与形態、たとえば関節内注射、吸入ミスト、経口用配合物、経皮イオン導入または坐剤も想定される。好ましいキャリヤーのひとつは、生理的食塩水であるが、薬剤学的に許容しうる他のキャリヤーの使用も考慮できる。１態様では、キャリヤーおよびVEGF核酸リガンド複合体が生理学的に適合する徐放性配合物を構成することが想定される。このようなキャリヤー中の主な溶剤は、水性でも非水性でもよい。さらにキャリヤーは、配合物のpH、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭気を変更または維持するための、薬理学的に許容しうる他の賦形剤を含有してもよい。キャリヤーは、VEGF核酸リガンドの安定性、溶解、放出または吸収の速度を変更または維持するために、さらに他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、１回量形または多数回量形の非経口投与用剤形を製造するのに普通に慣用されている物質である。
療法用および診断用組成物を配合した後、それを無菌バイアルに液剤、懸濁液剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、または脱水もしくは凍結乾燥した散剤として保存できる。このような配合物は、そのまま使用する形または投与直前に再構成する必要のある形で保存できる。VEGF核酸リガンドを含有する配合物を全身送達のために投与する方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内、または膣もしくは直腸坐剤による。
本発明の複合体および脂質構築体の利点には、下記のものが含まれる:i）血漿中での核酸リガンドの薬物動態が改良される;ii）核酸リガンドを、それらのターゲットとの相互作用のアビディティーを高めるために多価アレイで提示できる;iii）異なる特異性をもつ提示核酸リガンド２以上を、同一リポソーム粒子に組み合わせることができる;iv）リポソーム固有の腫瘍ターゲティング特性を利用して、腫瘍への提示核酸リガンドの送達を高めることができる；およびｖ）リポソーム内容物を特定のターゲットへ導くために、抗体のものに匹敵する提示核酸リガンドの親和性と特異性を利用できる。大部分のタンパク質と異なり、熱、種々の分子変性剤および有機溶剤による提示核酸リガンドの変性は易可逆性であるので、提示核酸リガンドは本明細書に記載する種類の製剤に好適である。
以下の実施例は本発明を説明し、具体的に示すために記載したものであり、本発明を限定するものとみなすべきではない。以下の実施例に記載した核酸リガンドの構造を図１に示す。実施例１には、核酸リガンドと脂質試薬の結合を記載する。VEGF核酸リガンド（NX278）−遊離リガンドとして、またはリポソームの二重層に取り込まれたもの（NX278−Ｌ）−のジアルキルグリセロール誘導体がインビトロおよびインビボでVEGFの活性を阻害する効力を、実施例２に記載する。実施例３には、VEGFに対する２′−Ｆピリミジン修飾RNAリガンドを調製するための実験法を記載する。実施例４には、VEGFに対する２′−Ｆピリミジン修飾RNAリガンドを記載する。実施例５には、グリセロ脂質、リン脂質、およびグリセロールアミド脂質、ならびにPEG修飾したVEGF核酸リガンドの合成を記載する。実施例６には、リン脂質（PL）およびPEG修飾したVEGF核酸リガンドの薬物動態特性を記載する。実施例７にはNX31838PL−リポソーム複合体の調製、実施例８〜10にはVEGF核酸リガンド複合体のインビボ有効性を記載する。実施例11には、ウサギにおけるNX31838−40K  PEGの硝子体内薬物動態を記載する。
実施例1.  ジアルキルグリセロール（1,2−ジ−Ｏ−オクタデシル−sn−グリセロール）修飾VEGF核酸リガンドの合成
本実施例においては、核酸リガンドと脂質試薬とのコンジュゲートを記載する。（1,2−ジ−Ｏ−オクタデシル−sn−グリセロール）修飾VEGF核酸リガンドの合成を以下に示す。
スキーム１
0003626503.tif 000005
テトラエチレングリコールモノトシル酸（2a）：テトラエチレングリコール（200mL,1.15mol）を500mLのピリジンに溶解し、０℃に冷却し、22.0g（0.115mol）の塩化ｐ−トルエンスルホン酸にて処理した。溶解が完結した後、反応混合液を冷却装置内に一晩保存し、その後、減圧下で濃縮した。残渣を800mLのEtOAcに溶解し、3x600mLのH2Oにて抽出した。H2O画分をEtOAcにて戻し抽出し、合わせたEtOAc画分を飽和Na2HPO4水溶液にて抽出した。有機層をMgSO4上で乾燥させ、無色の油になるまで濃縮した。800mLのシリカゲルを用い、ヘキサン、25％EtOAc−50％EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％MeOH−20％MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにてその油を精製し、純粋な生成物を23.7g（60％）、および少量の不純物を含む生成物を11％得た。2a:1H NMR（300MHz,CDCl3）d7.77（d,J＝8.1Hz,2H）,7.32（d,J＝8.1Hz,2H）,4.13（t,J＝4.8Hz,2H）,3.68−3.53（m,14H）,2.58（t,J＝5.6Hz,1H）,2.42（s,3H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）d168.2,158.3,144.8,135.9,133.8,132.0,129.9,128.0,127.7,126.6,123.1,113.0,85.9,73.0,70.6,70.4,70.0,69.7,67.8,64.4,55.1,37.1;
C15H24O3Sに関して算出した低分解能MS m/e（Ｍ＋１）:349.1。
テトラエチレングリコールモノフタルイミド（3a）：攪拌した31.96g（0.092mol）の2aの400mL無水DMF溶液に、14.2g（1.05当量）のフタルイミドおよび14.4mL（1.05当量）の1,8−ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデク−７−エンを加えた。溶液を70℃にて18時間熱し、その後減圧下で濃縮した。1600mLのシリカゲルを用い、25％EtOAc−50％EtOAc−75％EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％MeOH−20％MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗黄色油を精製し、23.8g（80％）の3aを油として得た。静置するとすぐに、3aは蝋状白色固体になった。1H NMR（300MHz,CDCl3）d7.84−7.78（m,2H）,7.70−7.66（m,2H）,3.86（t,J＝5.6Hz,2H）,3.70（t,J＝5.6Hz,2H）,3.64−3.51（m,12H）,2.67（bs,1H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）d168.2,133.8,132.0,123.1,72.4,70.5,70.4,70.2,70.0,67.8,61.6,37.2.
化合物4aの合成:15g（0.0464mol）の3aの150mL THFおよび15mL DMF溶液を、Ar下０℃に冷却した。臭化アリル（6.0mL、1.5当量）を溶液に加え、1.76g（1.5当量）のNaHを固体として加えた。不透明な黄色の懸濁液を０℃にて30分間、その後室温で18時間攪拌した。MeOH（50−100mL）を加え濃縮し、その後混合液を減圧下で濃縮した。1500mLのシリカゲルを用い、25％EtOAc−50％EtOAc−75％EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗物質を精製し、11.05g（65％）の4aを黄色油として得た。
1H NMR（300MHz,CDCl3）d7.84−7.80（m,2H）,7.72−7.67（m,2H）,5.94−5.84（m,1H）,5.28−5.14（m,2H）,3.99（d,J＝5.61Hz,2H）,3.88（t,J＝5.85Hz,2H）,3.72（t,J＝5.76Hz,2H）,3.64−3.54（m,13H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）d168.0,134.6,133.7,131.9,123.0,116.9,72.0,70.4,69.9,69.2,67.7,37.0.
１−ジメトキシトリチル−３−（フタルイミドテトラエチレングリコール）−sn−グリセロール（９）：スキーム１に従い、化合物９を以下のように合成した。すなわち、攪拌した4a（10.13g、0.0279mol）の100mLアセトンおよび1mLH2O溶液に、3.98g（1.22当量）のＮ−メチルモルフォリン−Ｎ−オキシドを加えた。この懸濁液に、1.75mL（0.005当量）の四酸化オスミウムを2.5％のiPrOH溶液として加えた。OsO4溶液の添加後、反応混合液は透明な黄色になった。4aの完全な変換（約16時間）を示すTLC解析の後、反応混合液を1.5gのヒドロ亜硫酸ナトリウムおよび5.0gのflorisilにて処理し、30分間攪拌した。懸濁液をflorisilにて濾過し、濾液を油にまで濃縮した。1.0gの4aから同様にして調製した別の群とこの粗生成物を合わせた。100mLピリジン部分２つを、合わせたロットから共蒸発させ、残渣を300mLピリジンに溶解した。溶液を０℃に冷却し、10.89g（1.05当量）の塩化4,4'−ジメトキシトリチルを加えた。乾燥管をフラスコ内に挿入し、反応混合液を室温で16時間攪拌した。溶液を20mLのMeOHにて処理し、減圧下、水浴の温度を40℃以下に保ちながら、濃縮した。1100mLのシリカゲル（３％トリエチルアミンのヘキサン溶液を用いてカラムに湿装填した）を用い、10−100％EtOAcのヘキサン溶液（すべて３％トリエチルアミンを含む）にて溶出する、フラッシュカラムにて粗油を精製し、21.3g（２工程後、89％）の９を黄色油として得た。
1H NMR（300MHz,CDCl3）d7.80−7.77（m,2H）,7.66−7.64（m,2H）,7.39−7.22（m,9H）,7.20−6.76（m,4H）,3.97（bs,1H）,3.84（t,J＝5.97Hz,2H）,3.74（s,6H）,3.68（t,J＝5.7Hz,2H）,3.60−3.49（m,14H）,3.13−2.76（m,2H）,2.00（bs,1H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）d168.2,158.3,144.8,135.9,133.8,132.0,129.9,128.0,127.7,126.6,123.1,113.0,85.9,73.0,70.6,70.4,70.0,69.7,67.8,64.4,55.1,37.1;
C40H45O10Nに関して算出した低分解能MS m/e（Ｍ＋NH4＋）:717.5。
１−ジメトキシトリチル−３−（アミノテトラエチレングリコール）−sn−グリセロール（10）：スキーム１に従い、化合物10を以下のように合成した。すなわち、化合物９（5.2g、7.2mol）を50mLの40％メチルアミンのH2O溶液に溶解し、10mLのメタノールを加えて出発物質を可溶化した。反応溶液を50℃にて５時間熱し、その後、減圧下で濃縮しトルエンと共蒸発させた。200mLのシリカゲルを用い、15％メタノールアンモニアのジクロロメタン溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗物質を精製した。3.94g（96％）の10を薄い黄色の油として回収した。
1H NMR（300MHz,CDCl3）d7.46−7.21（m,9H,DMT）,6.81（d,4H,DMT）,4.00（m,1H）,3.80（s,6H）,3.70−3.49（overlapping m,18H）,3.20（dd,J＝9.24,5.49Hz,1H）,3.12（dd,J＝9.21,6.0Hz,1H）,2.84−2.80（m,3H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）d158.30,144.82,136.01,129.95,128.04,127.66,126.61,112.95,85.85,73.46,72.85,70.55,70.45,69.99,69.51,64.43,55.10,41.40;
C32H44O3Nに関して算出した低分解能MS m/e（Ｍ＋1+）:570.353、570.4。
スキーム２
0003626503.tif 000006
クロロホルム酸19:攪拌した3g（5.03mmol）の1,2−ジ−Ｏ−オクタデシル−sn−グリセロール18の60mLトルエン溶液に、200mLの1.93Mホスゲン溶液を加えた。さらにホスゲン溶液（2X10mL;計15.4当量のホスゲン）を、アルコール出発物質が残らなくなるまで（濃縮した分注物の1H NMR解析による）加えた。過剰のホスゲンおよびHClをアスピレーターによって除き、反応混合液を減圧下濃縮し、目的とするクロロホルム酸19を白色粉末として3.3g（98％）得た。
1H NMR（300MHz,CDCl3）d4.45（dd,J＝11.22,3.69Hz,1H）,4.34（dd,J＝11.22,6.15Hz,1H）,3.65（m,1H）,3.56−3.40（m,6H）,1.53（m,4H）,1.24（m,62H）,0.87（t,J＝6.36Hz,6H）;13C NMR（75MHz,CDCl3）d75.90,71.91,71.35,70.93,69.36,31.99,29.96−29.44（炭化水素鎖由来のオーバーラップするシグナル）,26.13,26.04,22.76,14.18.
コンジュゲート20:攪拌した2.25g（3.95mmol）の10の60mLピリジン溶液に、2.6gのジステアリルグリセロールクロロホルム酸18を加えた。２時間後の濃縮した分注物の1H NMR解析により、残っているクロロホルム酸がないことが明らかになり、混合液を減圧下濃縮した。0.5g（0.88mmol）の10および0.58gのクロロホルム酸から同様に調製した物質と粗残渣を合わせ、200mLヘキサン、その後、250mLのそれぞれ10−20および30％EtOAcのヘキサン溶液、500mL40％EtOAcのヘキサン溶液、その後、それぞれ50−60−70および80％EtOAcのヘキサン溶液、最後に250mLのEtOAcにて溶出する、100mLのシリカゲル上のフラッシュシリカゲルカラム（２％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した）にて、合わせたロットを精製した。生成物を含む画分を濃縮し、3.3g（57％）のコンジュゲート20を得た。
ホスホロアミダイト21:攪拌した3.8g（3.26mmol）のコンジュゲートの25mL CH2Cl2溶液に、1.14mL（6.52mmol）のジイソプロピルエチルアミンエテン、その後1.09mL（4.88mmol）の２−シアノエチルN,N−ジイロプロピルクロロ−ホスホロアミダイトを加えた。２時間後、混合液をCH2Cl2にて希釈し、飽和NaHCO3溶液にて洗い、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。100mLヘキサン、その後、250mLのそれぞれ10および20％EtOAcのヘキサン溶液、500mL30％EtOAcのヘキサン溶液、その後、250mLの50％EtOAcのヘキサン溶液にて溶出する、125mLのシリカゲルのフラッシュシリカゲルカラム（22％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した）にて、粗残渣を精製した。生成物を含む画分を濃縮して4.2g（95％）のホスホロアミダイト21を得た。
31P NMR（CDCl3）d151.52,151.08.
VEGF核酸リガンド−1,2−ジ−Ｏ−オクタデシル−sn−グリセロコンジュゲート
ホスホロアミダイト21（スキーム２）を用い、1,2−ジ−Ｏ−オクタデシル−sn−グリセロ基をVEGF核酸リガンドNX213（図1A参照）とコンジュゲートさせた。得られたコンジュゲートをNX278（配列番号:2）（図1B）と名付けた。NX278を逆相HPLCにより精製し、その組成を電子スプレー質量分析器にて確認した（観測されたm/s＝11703±４、算出したm/z＝11720）。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合をNX278内の８つの位置（3'および5'末端）に用いたが、予想質量と乾燥質量間の16質量単位の違いは、おそらく平均で１分子あたり予想よりも１つ少ないホスホロチオエート結合をもたらす硫化剤による、不完全な酸化のためである。
実施例2.  核酸リガンド−リポソーム複合体のin vitroおよびin vivoにおける効力。リポソーム二重層内に埋め込まれたジアルキルグリセロール（DAG）修飾VEGF核酸リガンド（NX278）
NX−278（1mg）（図1B;配列番号:2）を、噴霧乾燥したDSPC:コレステロール（50mg/ml;2:1、Mol:Mol）の混合物と、９％ショ糖を含む25mMリン酸（pH7.4）緩衝液中でインキュベートし、プローブ型音波処理器を用いておよそ60度Ｃで、乳光色の溶液が得られるまで15−30分間音波処理することにより、NX278−リポソーム複合体を調製した。リガンドNX278の配列を乱雑化した（scrambled）類似体（scNX278）（図1C;配列番号:3）を含む、対照核酸リガンド−リポソーム複合体を同様にして調製した。典型的な調製物において、平均直径が50nmで1/2高における分布幅が20nmであるリポソームが得られた。リポソーム粒子のサイズは、粒子解析装置（Leeds ＆ Northrup Model Microtrack UPA 150、Horsham、PA）で求めた。比較可能なサイズ分布のリポソームを、同じ脂質組成だが脂質コンジュゲートした核酸リガンドなしで得た。50nmのリポソームは、二重層の両側に提示された平均40の核酸リガンドを含むと期待される。計算は以下のように行った。コレステロールに対して19Å、ジステアリルホスファチジルコリンに対しては60Åと、リポソーム内の表面積を仮定すると、外径50nmで膜厚20Åの球状のリポソームに関してリポソームあたり3.13x104という多数の脂質分子を得た。リポソームの組成物（2:1mol:molジステアリルホスファチジルコリン（MW＝790.2）：コレステロール（MW＝386.7））から、脂質の均一な分布を仮定すると、リポソームの分子量2.1x107が計算された。
リポソームの内側と外側表面間の核酸リガンドの分配を決定するために、リポソーム製剤内のNX278の、T1リボヌクレアーゼに対する接近しやすさを調べた。配列内の２つのリボグアノシン（Green et al.（19950 Chemistry and Biology 2:683−695）で、NX278はリボヌクレアーゼT1により効率よく切断される。NX278を予め形成したリポソームで単にインキュベートすると、リボヌクレアーゼT1から核酸リガンドを保護しない。しかし、NX278が音波処理によりリポソーム内に取り込まれている場合は（NX278−リポソーム）、約1/3がヌクレアーゼから保護される。ヌクレアーゼの活性に影響することなくリポソームを阻害する0.1％Triton X−100をNX278−リポソームに加えると、それまで保護されていた核酸リガンドが切断にさらされる。これらの結果は、核酸リガンドが二重層の両側に分布しているという概念と一致する。
NX213、NX278、およびNX278−リポソームの、VEGFに対する結合親和性
NX213、NX278、およびNX278−リポソームの、VEGFに対する結合親和性を、競合電気泳動移動度シフト法（図２）を用いて調べた。VEGFに対するNX278の結合親和性はNX213のものと同等であった。NX278−リポソームの見かけの結合親和性は、NX278と比較して３倍低かった。観察された親和性減少の一部は、核酸リガンド画分のリポソーム内部への限局のためであるかもしれない。予想したように、配列を乱雑化した類似体はVEGFに十分低い親和性で結合する（図２）。
NX213、NX278、およびNX278−リポソームの血漿薬物動態学的特性
時間の関数としてのSprague Dawleyラットの血漿内のNX213、NX278、およびNX278−リポソームの濃度を図15に示し、コンパートメント解析のパラメーターを表１に要約する。NX213の大部分は、ｔ1/2が７分かつ全体的なクリアランス速度が6.8ml/kg/minで、α相において急速に除去される。核酸リガンドにリン脂質をコンジュゲートさせると、NX213と比較して増加したβ（ｔ1/2）かつ幾分遅い全体的なクリアランス速度（4.95ml/kg/min）で血中から極めて二相性なクリアランスという結果になる。NX278のリポソーム内への取り込みは、核酸リガンドの血漿からのクリアランスが実質的にさらに減少することを示す（1.88mg/kg/min）。
HUVEC増殖および血管新生に対するNX278の効果
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）の増殖に対する、NX278−リポソーム、scNX278−リポソームおよびNX213の効果を調べた。HUVECをVEGF（10ng/ml）存在下、10％胎児ウシ血清（FCS）およびヘパリン（45μg/ml）を含むIMDM:Ham's F12（1:1）培地中で培養した。細胞を24穴ゼラチンコートした24穴プレートに１穴あたり20,000細胞の密度で０日目にまき、0.1nMから１μＭのあいだの濃度の上記リガンドで、１、２、および３日目に処理した（リガンドを加えた培地と置き換える）。NX278−リポソームはHUVECの増殖を〜300nMのIC50（核酸リガンド成分の濃度）で阻害し;scNX278−リポソームおよびNX213は有意に低い効果（IC50＞1:μＭ）であった。
VEGFはトリ尿膜（CAM）アッセイにおいて血管新生を誘導し、このアッセイは血管新生を阻害する化合物を研究するのに用い得る。VEGFに浸したフィルターディスクをCAM上に置くことによりアッセイを行い、新血管の発生を定量化し得る。NX278−リポソームはVEGFが誘導する血管新生を効果的に阻害した（データは示さず）が、一方、NX213、NX278およびscNX278−リポソームは効果がなかった。これらの研究はともに、NX278がin vitroにおけるVEGFが誘導する内皮細胞の増殖およびin vivoにおける新血管形成の特異的阻害剤であることを証明する。
VEGFが誘導する毛細血管透過性に対するNX278の効果
VEGFは、毛細血管の透過性を一過性に増強する既知の唯一の血管新生因子である。NX278−リポソームの、in vivoにおけるVEGFの血管透過性活性を阻害する能力を調べた。血管透過性アッセイ（Milesアッセイ（Miles,A.A.and Miles,E.M.（1952）J.Physiol.（London）118:228）として知られている）を、本来記載されているように（Senger,R.S.et al.,（1983）Scinece 219:983）モルモットにおいて行った。１μＭの濃度のNX278−リポソーム、NX278、およびNX213をVEGF（20nM）とともに、あらかじめエバンスブルー色素を注入しておいたモルモットの皮内に注入した。VEGFに応答して、血管透過性の上昇のためにアルブミンに結合したエバンスブルー色素が管外溢出し、注入部位に青い斑点を生じる結果となる。有機溶媒抽出による色素回収率は一般的に非常に低いため、皮膚を透過する光の吸収を測定する定量方法が開発された。NX213、NX278、NX278−リポソームおよびVEGFに対する中和モノクローナル抗体は、図３に示すようにVEGFが誘導する透過性をすべて有意に阻害した。核酸リガンドの中で、NX278−リポソームはもっとも強力なアンタゴニストであるとみられた。これらの化合物の配列を乱雑化した類似体は阻害性ではなかった。この違いは目視観察で劇的かつ顕著であった。
NX278−Ｌはin vitroにおいてカポジ肉腫細胞株を阻害する
VEGFの阻害剤は、腫瘍の進行および転移が新血管形成に依存する悪性腫瘍を含め、様々な疾患において有益である可能性がある。ほとんどの種類の腫瘍はVEGFを産生すると知られているが、機能するVEGF受容体を発現していることが示されたものはこれまでに一つもない。最近、カポジ肉腫（KS）細胞が大量のVEGFを産生するのみならず、機能するVEGF受容体をも発現しており、それゆえVEGFを自己分泌性（autocrine）増殖に用いていることが示された。したがって、KS細胞株はNX278の、自己分泌性VEGF増殖活性を阻害する能力を調べる唯一の機会を提供する。
KS細胞の増殖に対するNX278−リポソーム、scNX278リポソームおよびNX213の効果を調べた。KS細胞株KSY−１を、ゼラチンコートした24穴プレートに１穴あたり7,500−10,000細胞の密度で、２％FCS、Ｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったRPMI 1640を含む培地中、０日目にまいた。核酸リガンドを１、２、および３日目に新鮮な培地中に0.1nMから１μＭのあいだの濃度で加え、細胞計数を４日目に行った。NX278−リポソームはKS細胞の増殖を100nMのIC50で阻害し、１μＭのNX278−リポソームではこれらの細胞の増殖は完全に阻害された。scNX278−リポソームおよびNX213は＞１μＭのIC50値を示した（図４）。
NX278−リポソームはin vivoにおいてKS細胞の増殖を阻害する
VEGFはKS細胞の増殖因子であるため、in vivoにおけるKS腫瘍に対するVEGFアンタゴニストの効果は２倍、すなわち腫瘍とともにいる内皮細胞に対するVEGFの傍分泌性（paracrine）増殖効果の阻害および腫瘍細胞に対する自己分泌性増殖効果の阻害であるとみられる。KS細胞はしたがって、VEGFアンタゴニストに対して特に感受性であり得る。核酸リガンドのin vivoにおける活性を試すために、腫瘍トロカール（3mm3）を無胸腺のマウスに１日目に移植し、２日目から開始して50、100または150μg/日／マウスで５日続けて処理した。腫瘍増殖の速度を２週間ごとに測定した。NX278−リポソームは用量依存的に、50μg/日／マウス用量というもっとも低い投与量で極めてわずかな腫瘍増殖阻害を示し（図5A）、100および150μg/日／マウス投与量の両方で腫瘍増殖阻害を示した（図5B、150μg/日／マウスを示す）。空のリポソーム（図5A、Ｂ）、scNX278−リポソームも、NX213およびNX278と同様に調べたすべての用量で無効果だった。加えて、NX278−リポソームはVEGFが誘導する血管からの液体漏出を阻害した。
実施例3.  VEGFに対する2'−フルオロピリミジン修飾RNAリガンドに関する実験手順
本実施例は、VEGFに対する2'−フルオロ修飾核酸リガンドの開発に関する実施例４に続き、援用されている一般的な手順を提供する。
材料
昆虫細胞株Sf21から精製した組み換えヒトVEGF165を、キャリアーのない凍結乾燥粉末としてR ＆ D Systemsより購入した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水に、10μＭの濃度になるように再懸濁し、少量に分注して使用するまで−20℃にて保存した。分注物を融解後４週間まで４℃で保存した。Sf21発現させたマウスVEGF164および大腸菌発現させたヒトVEGF121、VEGF/PIGFヘテロ二量体、およびPIGFも、キャリアーのない凍結乾燥調製物としてR ＆ D Systemより購入した。
オリゴヌクレオチドはOperon Technologies,Inc.から購入したか、あるいはApplied Biosystems Model 394オリゴヌクレオチド合成機を用い、最適化されたプロトコールにしたがって合成した。2'−Ｆ−および2'−OMe−リボヌクレオチドホスホロアミダイトはJBL Scientific,Inc.（San Luis Obispo,CA）により調製された。2'−Ｆ−ピリミジンNTPもJBLから購入した。2'−OH−プリンNTPおよびdNTPはPharmacia Biotech,Piscataway,NJより購入した。
T.aquaticus耐熱性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）をPerkin Elmer−Cetus、（Foster City,CA）から購入し;AMV逆転写酵素（AMV RT）をLife Science,Inc.から；クレノーDNAポリメラーゼをNew Ingland Biolabs,Beverly,MAより購入した。T7 RNAポリメラーゼをEnzyco,Inc.（Denver,CO）から購入した。sequenase DNAポリメラーゼはUnited States Biochemical Corp.（Cleveland,OH）により生産されたものである。
α−［32P］−ATPおよびγ−［32P］−ATPはNew England Nuclear（Boston,MA）より得た。
SELEXプロトコール
SELEX手順はSELEX特許出願に詳細に記載されている。化学的に合成したDNAオリゴヌクレオチドライブラリー（"30N7"および"40N7"）を、共通の5'および3'固定配列（5'−TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG（30または40N）CAGACGACTCGCCCGA−3':配列番号:133及び134）が両側に接している、30または40ヌクレオチドの無作為化した領域により調製した。各鋳型の5'末端のイタリック体にしてあるヌクレオチドはT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列と一致する。鋳型の調製と増幅、および逆転写において使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーも合成した。すなわち、5'−TCGGGCGAGTCGTCTG−3'（“3N7";配列番号:135）および5'−TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG−3'（“5N7";配列番号:136）。プライマー3N7を30N7または40N7ライブラリーにアニールさせ、クレノーDNAポリメラーゼまたはAMV RTを用いてプライマーを伸長させることにより、二本鎖DNA鋳型を調製した。AMV RTに用いたより高いインキュベーション温度（37℃よりもむしろ45℃）は、高次構造をとった鋳型オリゴヌクレオチドにもかかわらず完全な伸長をより促進し得る。T7 RNAポリメラーゼを、各1mM 2'−OH−ATPおよびGTP、各3mM 2'−Ｆ−CTPおよびUTP、および50μCiα−32P−ATPの存在下用いてライブラリーを転写した。RNAを含むゲルスライスを切り出し、粉砕し、2mM EDTAに長時間浸すことにより、RNAを変性ポリアクリルアミドから精製した。
親和性選別し、その後選別したプールを増幅するというSELEXの過程は、詳細に記載されている（SELEX特許出願参照）。簡潔に述べると、選別と増幅の一巡を以下のように行った。すなわち、VEGFを５−または10−倍過剰のRNAと、1mM MgCl2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSM）中で（30N7および40N7ライブラリー）あるいはトリス緩衝生理食塩水、1mM MgCl2、1mM CaCl2（TBSMC）中で（30N7ライブラリーのみ）混合し、続いて混合物を３倍に希釈した。37℃にて15分間インキュベーションした後、混合物を0.45μType HAフィルター（Millipore）に通し、VEGFとRNAの複合体を回収した。2:1フェノール、pH7:7M尿素中でインキュベートすることにより、選別したフィルターからRNAを溶出した。水層から精製した後、RNAをプライマー3N7にアニールさせ、AMV RTを用いて逆転写した。3N7および5N7プライマーおよびTaq DNAポリメラーゼを用いた15サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、得られたcDNAを増幅した。PCR産物の転写により、VEGFに親和性を有する配列に富んだ新しいライブラリーが得られた。４巡目に、VEGF非存在下におけるかなりのバックグラウンドフィルター結合シグナルが、選別した３つのうちのすべてのRNAプールに出現した。フィルターに結合したRNAのプールを除くため、５巡および６巡目は、非結合分子からVEGF結合RNAを分離するための代替計画で行った。すなわち、RNAプールを増殖因子とインキュベートした後、各混合物を８％ポリアクリルアミド、非変性ゲルにのせ、10Wで45−60分間、４℃にて電気泳動した。VEGF/RNA複合体はこの系において非結合のRNAよりも上方に移動し、ゲルにＸ線フィルムを感光させることにより可視化された。これらの巡目では、上に記載したように粉砕および浸漬法により、選別したRNAを精製した。選別および増幅を12巡した後、選別したプール内の個々の分子を、Stratagene（La Jolla,CA）のpCr−Script Direct Cloning kitを用いてクローン化した。アルカリ溶解法（PERFECTprep Plasmid DNA kit,5prime→3Prime,Boulder,CO）を用いてプラスミドを精製し、Perkin Elmer（Foster City,CA）より入手可能なDye Terminator Cycle Sequencing kitを用いて、クローン化した領域の配列を得た。蛍光の配列を決定するラダーを国立ユダヤ人センター、Brain Kotzin研究室、Denver、COにて読んだ。配列をファミリーに分類し、目で整列させた。
結合親和性の測定
転写の際のα−32P−ラベルされたNTPの取り込みにより、あるいはγ−32P−ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成した後に放射標識された核酸リガンドを、低濃度で様々な濃度のVEGFまたは他の増殖因子と、37℃にて15分間インキュベートした。インキュベーションはTBS、PBS、またはHEPES緩衝生理食塩水（HBS）、pH7.4中で、補足の二価の陽イオンを添加するか、あるいは添加せずにであった。あらかじめ洗っておいた0.45μm Type HAフィルター（Millipore）に試料を通し、続いて結合バッファーにより５−10ml洗いを行った。フィルターをシンチラントに浸し、計数して各フィルターに保持されているタンパク結合RNAの量を見積もった。特異的なタンパク質に結合している核酸リガンドの平衡解離定数（KD）をGreen et al.（1996）Biochem.35;14413−14424に記載のデータ点から算出した。
核酸リガンド断片の親和性選別
10pmolの内部放射標識された、高親和性VEGF核酸リガンドの転写産物を、S7ヌクレアーゼにより部分的に切断し、放射標識された断片の混合物を作った。断片化されたRNAの1/10を、ニトロセルロースを通す濾過の前に、10pM VEGFと45ml結合バッファー中でインキュベートした。フィルターから回収された選別した断片を、高分離能変性ポリアクリルアミドゲル上で無選別の断片のプールをのせたレーンの隣で泳動した。最小の選別したバンドをそれぞれゲルから精製し、５％末端をポリヌクレオチドキナーゼでさらに標識して比活性を増加させた。試料の1/2をもとの転写産物のcDNAとアニールさせ、Sequence DNAポリメラーゼを用いて鋳型の末端まで伸長した。精製された断片およびその伸長産物の移動度と標準の配列決定ラダーとの比較を用い、選別された断片のもっともらしいサイズおよびもとの転写産物内における位置を決定した。親和性選別された断片と配列上一致する合成オリゴヌクレオチドを調製し、端を一部切断した核酸リガンドがVEGFに対する親和性を保持しているかどうか確かめた。
2'−OMe−置換
実質的にGreen et al.（1995）Chem.Biol.2:683−695に記載されているようにして、2'−OMe−置換実験を行った。５または６つの2'−OH−プリン位が部分的に2'−OMe−置換されている、３または４つのライブラリーを、端を一部切断したリガンド３つ（t22、t2、t44）のそれぞれについて調製した。各プリン位はライブラリーのうちのただ一つにおいて部分的に2'−OMe−修飾されていた。各5'−放射標識されたライブラリーをVEGFとインキュベートし、タンパク質と結合した置換オリゴヌクレオチドをニトロセルロースフィルター上に回収した。選別したプールおよび開始の無選別のライブラリーをアルカリによって部分的に加水分解し、生成物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。選別したプール内のその位置における加水分解から得られたホスホロイメジ（phosphorimage）シグナルを、無選別のライブラリー内の同じ位置に関して得られたシグナルで除すことにより、“バンド強度比”を各プリン位に対して決定した。特定の位置に対する範囲よりも十分に下がったバンド強度比は、親和性選別したプール中の2'−OHの（2'−OMeに対する）偏りを示す。
結合速度定数
少量（典型的には1pmolより少ない）の5'−放射標識された核酸リガンドを、二価の陽イオンを補った1mlの緩衝生理食塩水中で、1nM VEGFと37℃にてインキュベートした。時間“ゼロ”の時点で、50μｌをニトロセルロースに通して濾過し、タンパク質に結合したRNAの画分を決定し、その後、過剰（別々の実験において100または500nM）の非標識核酸リガンドを加え、50μｌ分注物をその後の時点で濾過した。フィルターをシンチラント中で計数し、各時点でVEGFに依然として結合している放射標識されたRNAの量を求めた。結合したRNAの画分（ｆ）対時間としてプロットしたデータを、指数減少に関する等式に当てはめた。すなわち、
ｆ（ｔ）＝fOe-kt＋b,
式中、fOは時間ゼロの時点で結合していたRNAの画分であり、ｋは解離速度定数（kd）であり、ｂは実験の終わりの時点でのフィルターに対する、放射標識されたRNAの残留結合（事実上、タンパク質の非存在下）である。以下の等式：
ka＝kd/KD
にしたがい、測定したkdおよびKD値から会合速度定数（kas）を算出した。
実施例4.  VEGFに対する2'−フルオロ−修飾RNAリガンド
リガンドの選別
30または40の無作為なヌクレオチドを含む2'−Ｆ−ピリミジン修飾RNAのライブラリーから、VEGFに対するリガンドを３つの独立したSELEX実験にて単離した。選別は、1mM MgCl2を補ったPBS（30Nおよび40Nライブラリー）あるいは1mM MgCl2および1mM CaCl2を含むトリス緩衝生理食塩水（30Nライブラリーのみ）中で行った。およそ1014の独特な配列を各実験の最初の選別サイクルに含めた。10サイクル後、VEGFと各RNAプールの間の親和性は、開始プールと比較しておよそ1000倍に改善された。さらに２サイクル後、結合親和性に関してさらなる改善が観察されたなかったため、12巡目のプールの個々の要素をクローン化し、各選別から約50個の配列を決定した。
VEGF165に対するオリゴヌクレオチドリガンドを３つの独立なSELEX実験にて単離した。個々のクローンを単離し、配列を決定し、共通な一次構造モチーフに基づいて配列をファミリーに分類した（表２）。各リガンドの名前は、標的（Ｖ＝VEGF）、選別バッファー（Ｐ＝PBS;T＝TBS）、ライブラリー内の無作為化した領域の長さ（30または40ヌクレオチド）およびクローン番号（小数点以下）を示す。ある配列が解析したクローン内に現れる頻度は括弧内に示し、ただ一ヌクレオチドだけ異なる配列は共通の前駆体のPCR突然変異のためであるとし、適切な記号（Ｙ＝ＵまたはＣ）で配列内に示してある不定な塩基と一緒に分類した。すべてのリガンドに共通な固定配列を、一番上のロアーケース内の文字で示す。個々のクローンについて、可変領域の配列をアパーケース内に示す。いくつかのリガンドに関しては、可能性として考えられる二次構造に寄与する、ロアーケース内の固定領域配列を可変領域配列に追加してある。VEGFに対する結合の高親和性Kdを各リガンドについて示す。各ファミリーのうちの一つのリガンドを、さらなる解析のために選んだ（灰色の囲み）。
解析した合計143クローンのうち、１ヌクレオチド以上異なる76個の配列を得た。これらの配列のうちの44個は、保存された一次構造モチーフに基づいた３つの主要なファミリーに分類することができた（表２）。５またはそれ以下の要素の少数ファミリーに分類し得る配列および単離したものの中で唯一であった“孤児（orphan）”配列を表６に示す。ファミリー１および２により定義される一次構造モチーフを含むリガンドは、３つの親和性選別のすべてにおいて現れた。両ファミリーの保存されている一次構造間の類似性は、それらが同様の二次構造をも共有し得ること、および／またはそれらが同様の接触領域を用いてVEGFを阻害し得ることを示唆している。ファミリー２のメンバーは、大“ループ”内の保存された配列モチーフを囲む、塩基対になった短い軸を形成する可能性を共通に有している（表２中の下線）。閉鎖したA/U塩基対を除き、予想される軸領域内の配列同一性は保存されていない。一次構造よりはむしろ二次構造を保存している塩基のこのような“共−変異（co−variation）”は、予想される軸の存在を支持しており、この構造がこのファミリーのVEGFリガンドの高親和性立体構造にとって重要であり得るということを示唆している。ファミリー１配列間には、同様に保存された塩基対相互作用は一つも検出されなかった。リガンドの第３のファミリーは、TBSMC（ファミリー３、表２）中で行った選別においてのみ現れた。非常に保存された一次構造モチーフに加えて、このファミリーのすべてのメンバーにおいて、保存された領域の3'の配列は、5'固定領域内のヌクレオチドに相補的な塩基対を共通に有している（表２中の下線）。リガンドのほとんどに関しては、予想される軸の5'側の塩基はその塩基対形成相手と共に変化するとは言えないため、この観察は共通の二次構造をさほど予言するようなものではないが、それにもかかわらず、このファミリーに由来する最小の高親和性配列に関する当初の推測（以下に記載する）は、このモチーフの強力な保存によって導かれた。VEGFに対する個々のRNAリガンドの親和性を、その相互作用のKDの単一決定に基づいて見積もった。わずかな例外を除き、リガンドは増殖因子に対して、KDが５と50pMの間という、非常に高い親和性を示した。
最小のリガンド
各配列ファミリーを定義する共通の一次および二次構造モチーフは、VEGFに対する高親和性結合に必要な最小配列要素をほのめかしている。各ファミリー由来の典型的なリガンドの、入れ子した端切断（nested truncation）（表２中の灰色の囲みで示す）を、化学合成により作り、VEGFに対するそれらの相対的な親和性を求めた（表３）。リガンドVP30.22、VP30.2およびVT30.44の端を切断した版を化学合成により調製し、VEGFに対するそれらの親和性を、実施例３に記載のように求めた。最初の端切断（t22、t2、t44）を、5'および／または3'末端から欠けている塩基を加えてオリゴヌクレオチドを合成することにより、さらに精製した。化学合成を始めるために、リガンドのいくつかの最も3'のヌクレオチドを、2'−OH−シチジンを2'−Ｆ−シチジンに置換すること（下線）により、あるいは3'−3'−結合デオキシチミジン“キャップ”を加えること（星印）により修飾した。各オリゴヌクレオチドの長さ（引くキャップ）およびVEGFに対する結合の高親和性KDを示す。
クローンVP30.22（ファミリー１）由来の最小配列に関する当初の予測は、精製した、全長のリガンドの親和性選別した断片の末端のマッピングにより行った（実施例３参照）。この29ヌクレオチド分子（“t22"）は、全長のリガンドと比較してVEGFに対する結合親和性の点でおよそ３倍の喪失を示した。この分子の3'末端のさらなる端切断は、親和性の点で険しい喪失をもたらしたが、さらに６個までのヌクレオチドを、ほとんど、あるいは全く無影響で5'末端から除き得た（表３）。ファミリー２由来のクローンVP30.2およびファミリー３由来のクローンVT30.44について、予想される５塩基対軸およびすべての保存された配列モチーフを含む、端切断したリガンド“t2"および“t44"を合成した。端切断したいずれのリガンドも全長分子のほとんど全ての結合活性を保持していた。一回に一つの予想塩基対（リガンドの各末端から１ヌクレオチド）を欠失させることによるさらなる端切断は、親和性を徐々に喪失させた。したがって、これらの配列に関しては、可能性としてあり得る二次構造に基づいた端切断は、最小の高親和性リガンドを非常によく予測た。さらに、予想される軸がこれらのリガンドの高親和性立体構造に寄与するという仮説を支持する。
2'−OMe修飾
RNAオリゴヌクレオチドの2'−OH位の2'OMeによる置換は、ラット尿中にも他の生物分泌液中にも存在するヌクレアーゼに対する安定性を改善することが観察されている。ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性は、治療または診断剤としてのそれらの成功にとって重大であるとみられる。運悪く、2'−OMe−修飾ヌクレオシド三リン酸は、一般的には標準的な反応条件下ではRNAポリメラーゼに基質として受け取られない。しかし、2'−OMeプリンは化学合成によって特異的なオリゴヌクレオチド内に導入し得る。いくつかの高親和性2'−OHプリンRNAリガンドが、驚くべきことに標的タンパク質に対する親和性をわずかに失うだけで高い割合の2'−OMeプリン置換を受けるであろうということが観察されている。2'−OMe置換がVEGFに対する高親和性結合に影響しないようなプリン位を同定するために、１回あたり５または６個のプリンを修飾ヌクレオチドで部分置換してリガンドt2、t22およびt44のいくつかの合成を調製した（実施例３に記載）。各部分置換ライブラリーの親和性選別を用い、VEGFに対する十分な親和性を保持した分子を単離した。そのような親和性選別したプールにおいて、置換を許容しない位置は2'−OHに偏っており、したがって、無選別のライブラリー内の同じ位置に比較して、アルカリによる加水分解に対してより高い感受性を示す。5'−放射標識された、無選別および親和性選別したプールをアルカリにより部分的に加水分解し、生成物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。リガンドt22においてはG10およびA12が、親和性選別したプール内の2'OHにかなりの偏りを示し、リガンドt2においてはA6およびG21が、そしてリガンドt44においてはA5およびA6がそうであった。前述の解析により2'OMeヌクレオチドによる置換を許容しないと見られる位置を同定されるが、これらのデータからは、他のすべてのプリンの同時修飾がいかに結合親和性に影響するかは予想し得ない。実際、G10、A2およびG22（これらは2'−OHに対してぎりぎりの優先を示した）を除きすべて2'−OMe−プリンで合成したリガンドt22は、すべて2'−OH−プリン配列よりよいわけではないとしても、それと同等の親和性でVEGFに対して結合した（表４）。
端切断したオリゴヌクレオチド（t22、t2、およびt44）を、１、２または３個以外はすべてのプリン位を2'−OMe−プリンで置換して、化学的に合成した。残っている2'−OH−プリンを、各リガンド名の中に示し、リガンド配列中に太字で示す。各置換リガンドのVEGFに対するKDを示す。G22におけるさらなる置換は、VEGFに対する結合にわずかしか影響しなかったが、予想されたように、G10またはA12に2'−OMeを導入するのは、結合親和性にとって不利益だった。同様に、リガンドt2およびt44は、VEGFに対する核酸リガンドの親和性に３から４倍の影響で、２個以外はすべてのプリンにおける2'−OMe−置換を許容した（表４）。
置換端切断体の結合の親和性および速度定数
最小の長さの、非常に2'−置換されたVEGF核酸リガンドの同定を期待して、結合を劇的には減少させなかったすべての2'−OMe置換を、端切断したリガンドt22、t2a、およびt44a（表３参照）に導入した。2'OHヌクレオチドを太字で示し、2'OMeヌクレオチドを無修飾の文字で示す。得られた核酸リガンド、t22−OMeおよびt44−OMeは、VEGFに対してKDがそれぞれ67pMおよび49pMで結合したが、一方でリガンドt2OMeはKDがおよそ140pMで結合した（表５）。これらのKDは、NX−213（KD＝140pM）、以前記載されている（本明細書中で参考文献として援用されている、アメリカ合衆国特許出願No.08/447.169参照）VEGFに対する2'−NH2−ピリミジン−、2'−OMe−プリン−置換オリゴヌクレオチド阻害剤に、有利に匹敵する。端切断された2'−OMe−置換オリゴヌクレオチドのそれぞれが、VEGFに対する結合に関してNX213と、そしてお互いに競合することがわかった。
３つの2'−OMe−置換リガンドのそれぞれについて、大過剰の非標識リガンドを加えた際に、放射標識したリガンドとVEGF間の完成した複合体が失われるのを追跡することにより、解離速度定数（kd）を決定した。リガンドt22−OMeは半減期がおよそ60秒で、最も速い解離速度を示した。リガンドt2−OMeおよびt44−OMeは、それぞれ半減期が170および90秒のオーダーで、わずかに遅い解離速度を示した。会合速度定数（ka）は、平衡解離定数と解離速度定数から算出され（KD＝kd/ka）、3x107から2x108M-1sec-1の範囲であった（表５）。このような会合速度は、これらのリガンドとVEGF間の、近接した移動が限られた結合相互作用を示唆しており、他の標的に対するSELEX由来核酸リガンドに関して観察された会合速度定数と一致している。
二価の陽イオン依存性
ファミリー１および２のリガンドは、マグネシウム陽イオンの存在下で選別したが、ファミリー３リガンドはマグネシウムとカルシウムの両方を含むバッファー中で選別した。二価の陽イオンは、高親和性RNA構造の非特異的または特異的な安定化を介してRNA/タンパク質相互作用に寄与し得るため、VEGFに対する典型的なリガンドの高親和性結合にマグネシウムおよび／またはカルシウムが必要であるかどうか検討した。核酸リガンドt22−OM2およびT2−OMe（それぞれファミリー１および２由来）の親和性は、補足の二価の陽イオンあるいはキレート剤EDTAの非存在または存在下で変わらなかった（データは示さず）。しかし、ファミリー３リガンドは、リガンドt44−OMeに代表されるように、VEGFに対する高親和性に関してカルシウム存在に対して絶対的な依存性を示した。結合バッファー中の二価の陽イオンをEDTAによって置き換えると、結合は劇的に減少した（KD＞10-7）。二価の陽イオンを除いた結合バッファーに過剰のMgCl2を加えても、結合親和性に改善はみられなかったが、CaCl2は、EDTAよりも２倍モル過剰で、結合活性を完全に元に戻した。同様の結合挙動が無修飾のリガンドt44についても観察された（データは示さず）。
タンパク質特異性
本明細書中で記載のオリゴヌクレオチドは、この増幅因子の２つの拡散性アイソフォームのうちの大きい方である、VEGF165に対する親和性に基づいて選別された。小さい方のアイソフォームであるVEGF121は、VEGF165内の１つのエキソンを欠いており、後者と異なりヘパリンに結合しない。３つの端切断された2'−OMe−置換オリゴヌクレオチドのいずれも、VEGF121に対して測定できるほどの親和性で結合しなかった。さらに、オリゴヌクレオチドとインキュベートする前にタンパク質をDTTにて還元すると、いかなる結合も観察されないため、VEGF165の天然の構造は３つの核酸リガンドのすべての結合に必須である。
VEGFは種間で非常に保存されたタンパク質であり、ヒトVEGF165およびマウスVEGF164アイソフォームは88％の配列同一性を示す。端切断された、2'−OMe置換リガンドはヒトおよびマウスVEGFに対して同等によく結合した。しかし、保存された血小板由来増殖因子様ドメイン間でVEGFと53％の配列同一性を有する胎盤由来タンパク質であるPIGFのホモ二量体に対するいかなるリガンドについても、結合は観察されなかった。VEGFとPIGFのヘテロ二量体が最近、正常および腫瘍由来細胞株の両方の上清から単離され、そのようなヘテロ二量体は、高親和性VEGF受容体２つのうちの１つに対する結合に関して、および培養内皮細胞における誘導性の応答に関して活性を示す。VEGF/PIGFヘテロ二量体の生物学的な関連は未知である。親和性は大幅に減少したが、十分な結合がVEGF/PIGFヘテロ二量体について観察された。これらのデータは、核酸リガンドが二量体をとる２つのサブユニット間の中間面またはその近傍で結合すること、およびPIGFは高親和性結合に必要な接触部位のすべてに存在するわけではないということを示唆し得る。あるいは、核酸リガンド結合表面に必然的なひずみをもってPIGFとのヘテロ二量体に参加することにより、VEGFサブユニットの構造が変えられている可能性がある。
実施例5.リン脂質、グリセロールアミド脂質及びPEG−修飾VEGF核酸リガンドの合成
各種親油性化合物／核酸リガンド複合体の合成に以下の３つの異なる製剤（formulation）を用いた：
0003626503.tif 000007
1.PL製剤の合成のためのＣ−18ホスホロアミダイト
Ｃ−18ホスホロアミダイト調製の概略をスキーム３に示す。１−オクタデカノールを標準条件でリン酸化した。反応混合物を処理した後、残渣をシリカゲルカラムでヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（90:10:5）を用いて精製して純粋生成物21.5g（57％収率）を得た。
スキーム３
0003626503.tif 000008
II.脂質アミド１の合成
このホスホロアミダイトは前記PLとは異なり、アミド結合をもつ。この脂質をコンジュゲートすることから得られるオリゴの構造を以下に示す。いくつかの実験から、有機溶媒中への化合物22の高い不溶性がNMRとMSによる性状決定と、化合物22のDAGアミド23へのさらなるホスフィチル化を不可能にしていることを示している。しかしながら、脂質−スペーサーアミダイト調製（スキーム１）の結果から、混合物を還流したらクロロ−（２−シアノエトキシ）−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスフィンによる化合物22のホスフィル化（phsphylation）が進行すると期待した。DAGアミダイトを製造するこのアプローチをスキーム４に示す。
スキーム４
0003626503.tif 000009
N,N'−ビス（ステアロイル）−1,3−ジアミノプロパノール−２（22）
ClCH2CH2Cl（50mL）中の塩化ステアロイル（6.789g,22.41mmol）の溶液を、ClCH2CH2Cl（100.0mL）とTEA（2.896g,22.41mmol）中の1,3−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（1.0g,11.10mmol）の溶液中に室温で攪拌しながら滴下した。添加終了後、一晩混合物を70℃に加熱すると透明溶液が生成し、この溶液を室温に冷却し、濾過し、固体をCH2CH2、CH3OH、５％NaHCO3及びエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥すると22（6.40g,93％収率）を白色固体として得た。
1H NMR（pyridine−d5;60℃，δ,ppm）:3.82−3.78（m,1H）,2.37（t,J＝7.5Hz,4H）,1.81−1.76（m,4H）,1.30−1.27（m,60H）,0.87（t,J＝5.7Hz,6H）．
N,N'−ビス（ステアロイル）−Ｏ−（ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィニル）−1,3−ジアミノ−２−プロパノール−２（23）
一晩真空乾燥した化合物22（5.80g,9.31mmol）を無水CH2Cl2（150.0mL）に入れて、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（4.2mL,18.62mmol）を注入した。混合物を氷水浴で冷却しクロロ−（２−シアノエトキシ）−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスフィン（8.6mL,0.47mmol）を注入した。30分攪拌後、混合物を60℃に90分加熱した。室温に冷却後、不溶性物質を濾過し溶液を５％NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をCH3CNから沈殿させると純粋生成物（4.65g,61％収率）を白色固体として得た。31P  NMR（CDCl3,ppm）:154.04
I.  DAG−スペーサーアミダイト、脂質アミド２の合成
ジアミド化合物22（これは脂質アミダイト23の直接の中間体である）の不溶性を緩和するために脂質アミダイト中にヘキサ（エチレングリコール）を導入した。脂質−スペーサーアミダイト29の調製の概略をスキーム５に示す。THF中での化合物25と1,3−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンとｔ−ブトキシドカリウムとのカップリング工程は良好に進行せず、収率は約20％にとどまった。収率を改良する一つの試みとして25とジアミド22を反応させたが、所望の生成物は検出できなかった。
スキーム５
0003626503.tif 000010
（4,4'−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコール（24）
無水ピリジン（400mL）中に溶解したヘキサ（エチレングリコール）（18.93g,67.05mmol）を無水ピリジン（3x50mL）と共蒸留し、０℃に冷却した後、ピリジン（50mL）中のDMTrCl（23.85g,70.40mmol）をアルゴン雰囲気下に攪拌しながら30分かけて滴下した。反応混合物を一晩室温に維持した。高真空でピリジンを除去し、残渣をCH2Cl2に溶解し、これを５％NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチル、次いでCH2Cl2及び0.5％TEAを含むメタノール（95/5）のグラジエントを用いて精製した。適切な分画を集めて蒸発させ、真空乾燥すると24（26.1g,66.6％収率）が明るい黄色オイルとして得られた。
1H NMR（MDSO−d6;δ,ppm）:7.40（d,J＝7.2Hz,2H）,7.33−7.24（m,7H）,6.89（d,J＝8.9Hz,4H）,4.61（t,J＝5.1Hz,1H）,3.73（s,6H）,3.05（m,24H）;13C NMR（DMSO−d6;δ,ppm）:158.02,145.02,135.78,129.67,128.13,127.71,126,61,113.14,85.29,72.33,72.27,70.06,69.87,69.80,69.75,69.70,62.84,60.25,60.19,55.01.
（4,4'−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコールトシレート（25）
無水ピリジン（50mL）中の24の氷冷（０℃）溶液に、ピリジン（30mL）中のトルエンスルホニルクロリド溶液を加えた。室温で２時間後に、溶液を蒸発させて明るい黄色オイルを得た。残渣をCH2Cl2に取り、これを５％NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルを用いて溶出して精製すると生成物（4.08g,93％収率）が明るい黄色オイルとして得られた。
1H NMR（DMSO−d6;δ,ppm）:7.78（d,J＝8.3Hz,2H）,7.46（d,J＝8.1Hz,2H）,7.40（d,J＝7.4Hz,2H）,7.32−7.23（m,7H）,6.88（d,J＝8.8Hz,4H）,4.09（t,J＝4.3Hz,2H）,3.72（s,6H）,3.06（m,22H）,2.40（s,3H）;13C NMR（DMSO−d6;δ,ppm）:158.01,145.01,135.78,132.38,130.12,129.67,128.12,128.02,127.80,127.70,127.62,113.13.
２−（4,4'−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサエチレングリコール−1,3−ジアミノプロパン（26）
無水THF中の1,3−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（747mg,8.28mmol）とｔ−ブトキシドカリウム（2.78g,24.84mmol）の混合物を70℃で２時間加熱し、次いで室温に冷却した。THF中の化合物25（4.08g,5.25mmol）を注入し、TLCで確認して25が残っていなくなるまで混合物を一晩70℃で攪拌した。溶液を室温に冷却した後、THFを真空除去してCH2Cl2（25mL）と水（25mL）を加えた。CH2Cl2層を分離して水層をCH2Cl2で抽出した。CH2Cl2溶液を集めてNa2SO4で乾燥し、減圧蒸留した。粗製生成物（2.43g）をさらに精製することなく次の反応に直接用いた。
1H NMR（DMSO−d6;δ,ppm）:7.41（d,J＝7.7Hz,2H）,7.32−7.21（m,7H）,6.87（d,J＝8.8Hz,4H）,3.73（s,6H）,3.52−3.40（m,24H）,3.17（s,1H）,3.07−3.02（m,4H）．
N.N'−ビス（ステアロイル）−２−（4,4'−ジメトキシトリチルオキシ）−ヘキサンエチレングリコール−1,3−ジアミノプロパン（27）
ClCH2CH2Cl中の塩化ステアロイル（3.363g,11.1mmol）の溶液を、ClCH2CH2ClとTEA（1.9mL,11.1mmol）中の26の溶液に室温で攪拌しながら加えた。混合物を室温で２時間維持し、次いで一晩混合物を70℃に加熱した。溶液を室温に冷却した後、溶液を５％NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルとCH2Cl2（50/50）、次いで酢酸エチルとメタノール（50/50）のグラジエントを用いて精製した。第２分画を集めて、蒸発させ、真空乾燥すると27（640mg）が明るい黄色オイルとして得られた。
1H NMR（DMSO−d6;δ,ppm）:7.40（d,J＝7.2Hz,2H）,7.37−7.20（m,7H）,6.74（d,J＝8.9Hz,4H）,3.71（s,6H）,3.63−3.51（m,24H）,3.17（s,1H）,3.16−3.13（m,4H）,2.12（t,J＝73Hz,4H）,1.18（m,60H）,0.80（t,J＝6.2Hz,6H）．
N,N'−ビス（ステアロイル）−２−ヘキサエチレングリコール−1,3−ジアミノプロパン（28）
化合物27（640mg）、CH2Cl2（5mL）中の2.5％DCA及びトリヘキシルシラン（2mL）の混合物を、オレンジ色が青白くなるまで室温で攪拌した。CH2Cl2を除去した後、残渣をヘキサンから繰り返し沈殿させると明るい黄色固体（210mg,63％収率）が得られた。
1H NMR（CDCl3,δ,ppm）:3.3.69−3.59（m,24H）,3.17（s,1H）,3.06−3.01（m,4H）,2.21（t,J＝7.9Hz,4H）,1.18（m,60H）,0.81（t,J＝6.3Hz,6H）．
N,N'−ビス（ステアロイル）−２−（ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシホスフィニル−ヘキサエチレングリコール）−1,3−ジアミノプロパン（29）
真空で一晩乾燥した化合物28（210mg,0.237mmol）を無水CH2Cl2（5.0mL）に溶解し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（218μL,1.25mmol）を加えた。溶液を氷水浴で冷却しクロロ−（２−シアノエトキシ）−N,N−ジイソプロピルアミノ−ホスフィン（106μL,0.47mmol）を注入した。30分撹拌した後、反応混合物をCH2Cl2で希釈し、５％NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮して化合物29を得た。31P  NMR（CDCl3,ppm）:154.04。
VEGF核酸リガンドへの20K又は40K  PEG  NHSエステルのコンジュゲート
一般的方法:VEGFオリゴヌクレオチドをトリエチルアンモニウム塩に変換して凍結乾燥した。粗製オリゴヌクレオチドを100mMホウ酸ナトリウムバッファー（pH9）に60mg/ml濃度に溶解した。２当量のPEG  NHSエステル（Shearwater Polymers,Inc.）を乾燥DMFに溶解し（ホウ酸:DMFの比率＝1:1）、混合物を温めてPEG  NHSエステルを溶解した。オリゴヌクレオチド溶液をPEG溶液に素早く加えて、混合物を室温で10分激しく撹拌した。約90％のオリゴヌクレオチドがPEG  NHSエステルとコンジュゲートした。図1H及び1Iを参照のこと。
２量体VEGF核酸リガンドの合成
図1J,K及びＬに示す２量体VEGF核酸リガンドを以下のように作製した。
0003626503.tif 000011
1,3−ジピバロイル−２−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール32の合成
McGee et al.（1988,Synthetic Communication,1651）に従って調製した化合物31（ピリジン200ml中、70％純度の生成物を62g,200mmol）の撹拌ピリジン溶液に、ジメトキシトリチルクロリド（84g,240mmol.1.2倍過剰）を加えて、反応物を室温で16時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して残渣をCH2Cl2（1L）に取り、水で洗浄、乾燥（MgSO4）して濃縮した。粗製混合物（130g）をそのまま次の反応に用いた。
２−Ｏ−ジメトキシトリチルグリセロール33の合成
粗製化合物32（130g）、NaOMe（28g）及びメタノール（900ml）の混合物を50℃で16時間加熱した。反応終了後（TLC）、混合物を濃縮乾燥して残渣を水とCH2Cl2（1:1）に溶解した。有機層を分離して水層を飽和NH4Cl、水及びブラインで洗浄、乾燥（MgSO4）した。溶媒を蒸発させるとガム状化合物が得られ、これをシリカゲルカラムでヘキサン/2％TEA含有酢酸エチル（1:1）を用いて精製すると、化合物33を75％収率で得た。
1H NMR（DMSO−d6）3.02−3.07（m,2H）,3.17−3.23（m,2H）,3.3−3.35（m,1H）,3,7（s,6H）,4.26（t,J＝4.1Hz,2H,D2O exchangeable）,6.59−6.86（m,4H）,7.17−7.68（m,9H）．
ビスアミダイト34の合成
CH2Cl2（125ml）とジイソプロピルエチルアミン（58ml,320mmol）中にアルコール33（16.2g,41.1868mmol）を溶解した氷冷撹拌溶液に、ホスフィチル化剤試薬（20.5ml,90.62mmol）を加え、溶液をゆっくり室温まで温めて同じ温度で２時間撹拌した。反応混合物を砕いた氷の中にゆっくりと注ぎ、CH2Cl2で抽出し、５％NaHCO3、水及びブラインで洗浄して乾燥した。溶媒を蒸発後に得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーでヘキサン/2％TEA含有酢酸エチル（1:1）を用いて精製すると、化合物34を70％収率で得た。
1H NMR DMSO−d6）1.03−1.12（2d,24H）,2.69−2.75（2t,4H）,3.1−3.33（m,4H）,3.33−3.55（m,5H）,3.66−3.7（m,4H）,3.72（s,6H）,6.83−6.89（m,4H）,7.19−7.48（m,9H）．
31P  D3PO4を外部標準として153.64＆153.39（2S）。
VEGF2量体の調製
VEGF2量体の合成は8800自動DNA/RNA合成機で行った。NX31838を調製し、ここではrAはアデノシンを意味し、mGとmAはそれぞれ2'−Ｏ−メチルグアノシンとアデノシンを、そしてfCとfUは2'−デオキシ−2'フルオロシチジンと2'−フルオロウリジンを意味し、［3'−3'］は3',3'−ヌクレオチド間結合を意味する。合成は、5'−DMT−2'−Ｏ−メチル−N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデノシン、5'−DMT−2'−Ｏ−TBDMS−N2−tert−ブチルフェノキシアセチルグアノシン、5'−DMT−2'−Ｏ−TBDMS−N6−tert−ブチルフェノキシアセチルアデノシン3'−N,N−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイト及び2'−デオキシ−2'−フルオロ−5'−DMT−N4−アセチルシチジン及び2'−デオキシ−2'−フルオロ−5'−DMT−ウリジン3'−N,N−ジイソプロピル−（２−シアノエチル）ホスホロアミダイトを用いて、Millipore8800自動合成機で行った。合成サイクルは以下のようであった。活性化剤の組成は表２に記載する通りである。合成は600Å孔径、80−120メッシュのCPGサポートを使用し、及び5'−スクシニルチミジンを用いる60−70μmol/g装填で行った。カップリングサイクルは表12に示す。
実施例6.リン脂質（PL）及びPEG修飾VEGF核酸リガンドの薬物動態学的特性
表２に示す配列のうち、配列VT30.44を選んでさらに研究史、NX31838と命名し直した。20及び40K  PEGとコンジュゲートしたVEGF核酸リガンドNX31838の薬物動態学的特性をスプラーグ・ドーレイラットで試験した（分子性状についての記載は図１を参照）（配列番号:8及び９）。同様の研究をPL脂質とコンジュゲートしたNX31838について、リポソーム製剤と遊離医薬として行った（分子性状についての記載は図1Hを参照）（配列番号:8及び９）。各研究において、260nmにおけるUV吸収と吸光係数0.037μｇオリゴ/mlに基づいて溶液濃度1.0mg/mlでオリゴヌクレオチドをPBSに希釈した。全ての研究で９匹のラットにボーラス尾静脈注射によって1.0mgオリゴヌクレオチド/kg動物体重を投与し、２分から24時間の様々な時間で血漿サンプルを採取した。血漿サンプル及び品質対照サンプルをハイブリダイゼーションアッセイにより分析した。ハイブリダイゼーションアッセイでは、酸化鉄（FeO）ビーズにコンジュゲートしたVEGF核酸リガンドの５‘−末端に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチド（FeO−スペーサー−3'−ｄ（GCC TTA GTC ACT T−5'）（配列番号:137）ここでスペーサー＝（dT）８）と、5'−末端にビオチン２分子を含む検出オリゴヌクレオチド（ビオチン−ビオチン−5'−ｄ（スペーサー−CGG ATG TAT AAG CA−3'）ここでスペーサー＝（dT）８）（配列番号:138）を用いた。VEGF核酸リガンドNX31838を含む血漿サンプルと一緒に捕捉及び検出プローブをインキュベートした後、ビーズにハイブリダイズしたビオチンオリゴヌクレオチドの量を、発光基質としてCSPD−Sapphireを用いるストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼで定量した。
ボーラス注射後の時間を関数とする遊離、PEG20K及びPEG40K  VEGF核酸リガンド（NX31838）（配列番号:8及び９）の血漿濃度のデータを図６にまとめた。40K  PEGコンジュゲートは360分の単指数関数的（monoexponential）ｔ1/2で浄化されたが、20K  PEG型ははるかに迅速に浄化され、核酸リガンドの95％が49分のアルファｔ1/2で浄化され、５％が192分のベータｔ1/2で浄化された。これはサイズが浄化値（clearance）とって重要であることを示している。PEG−コンジュゲートした核酸リガンドと比較して、遊離（非コンジュゲート）NX31838は数分のｔ1/2で非常に迅速に血漿から浄化された。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、オリゴヌクレオチドに適切な官能基を導入することにより有意に増加した。
ボーラス注射後の時間を関数とするリポソーム付き又はリポソーム無しで調製されたPL脂質コンジュゲート化VEGF核酸リガンド（配列番号:5）の血漿濃度のデータを図７にまとめた。リポソームは実施例7Aに記載の方法で核酸の存在下に音波処理して作製し、内側と外側にオリゴヌクレオチドを含む。リポソーム製剤は遊離の薬剤よりもはるかにゆっくりと浄化され、ベータｔ1/2はそれぞれ1161分及び131分であった。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血漿濃度はリポソーム製剤によって有意に増加した。
実施例7.NX31838PL−リポソーム複合体の調製
A.薄層化（filming）によるリポソーム調製
コレステロール１モルに対してDSPC2モルの割合で脂質を組み合わせた。水に溶解したNX31838PLを脂質に1:50（w/w）の割合で加えた。クロロホルム：メタノール：水（1:3:1）の溶液で溶媒和とすることによって物質を組み合わせた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去すると脂質と混合されたNX31383PLの不均一フィルムが残った。このフィルムを９％スクロース溶液中に脂質ベースで50mg/mLで水和し、25mMリン酸ナトリウムでpH7.4にバッファー化した。溶液を激しく混合し、65℃に加熱し、得られる白色ミルク様溶液を75mLアリコートで音波処理して脂質を単膜（unilamellar）リポソームに組み立てた。リポソーム形成の進行は、溶液が透明になることを目で観察し、次に粒子分析機（Leeds ＆ Northrup Microtrack UPA 150,Horsham,PA）を用いる動的光散乱による粒子サイズ測定により追跡できる。リポソームのサイズは50−70nm（容積重量分布法による）の範囲にある。
B.受動アンカーリングによるリポソーム調製
あらかじめ形成された（“空の（empty）”）リポソーム中にscNX−287（分子性状については図1C参照）が自然に導入されるか試験した。DEAEアッセイ（遊離の核酸リガンド／グリセロール脂質複合体の除去のため）を用いる予備試験の結果、以下の２つの重要な知見が示唆された:1）装填が達成された；そしてさらに重要なことは、２）室温、24時間で核酸リガンド／グリセロール脂質複合体の実質的に完全な装填が観察された。装填に及ぼす温度の影響を決定するために更に詳しい研究を行った。温度は導入率に劇的な影響を及ぼすことが観察された。室温、24時間で完全な装填が達成されたが、高温（67℃）ではたった数分で完全な導入が達成された。これは、予め形成したリポソーム中に核酸リガンド／親油性化合物複合体を迅速かつ効率よく導入する方法であることが判明した。
次にゲル濾過クロマトグラフィーによってリポソーム会合型から遊離のscNX−278を分離した。”空の"2:1  DSPC:コレステロールリポソーム中へのscNX−278の装填を用いて予備試験を行った。22℃でSuperdex S−200カラムを用いてクロマトグラムを作った。22時間にわたって、空のリポソーム集団中へのscNX−278の漸次的導入がピーク領域のシフトとして観察された（データ示さず）。この結果はDEAEアッセイのデータとよく関連する。
追加のscNX−278が音波処理したオリゴ−リポソーム中に装填されるか試験するためにさらに研究を行った。オリゴ−脂質を脂質と共溶解し、２つを一緒に共音波処理することによってscNX−278の音波処理製剤を調製した。得られるリポソームはscNX−278を完全に導入したことを示した。この音波処理製剤を次に、追加の遊離scNX−278で受動アンカーリングを２回実施してそれ以上のscNX−278が導入されるかを観察した。１回目の受動アンカーリングでは65℃、１時間のインキュベーション後に遊離のscNX−278の全てがリポソーム中に受動アンカーリングされた。追加のscNX−278を受動アンカーリングさせる２回目の試みは不完全装填に終わった。
これらの実験から得られる鍵となる知見は、核酸リガンド／親油性化合物複合体は音波処理したオリゴ−リポソーム中に高濃度で受動アンカーリングされうるが、追加の核酸リガンド／親油性化合物複合体を吸収するリポソームの容量（capacity）を越えうるということである。２回の受動装填（約3mg脂質−オリゴ/50mg脂質まで）の後に、いくらかの遊離の脂質−オリゴが残っているのでリポソームは明らかに追加のオリゴ−脂質を吸収する”容量”に達する。これらのデータはDEAEスピン−カラム分析で確認した（データ示さず）。以下の結論が導かれる:1）音波処理したリポソームは核酸リガンド／親油性化合物複合体を導入する追加の容量をもっている；そして２）100％核酸リガンド導入が音波処理によって達成できる。
NX31838PL（分子性状については図1Eを参照）で次の研究を行った。NX31838はリポソーム中に導入されると、VEGFターゲットに対する薬物動態学的（実施例６参照）及び生物分布が改良されるので極めて興味深い。受動アンカーリングによるNX31838のリポソーム中への導入をよりよく理解するためにいくつかの研究を行った。
NX31838PLの動力学的研究によると、この分子の受動アンカーリングはあまりに速いので文献公知のいかなるクロマトグラフィー法（これらはいずれも最低数分の作動時間を必要とする）によっても測定不能であると考えられることを示唆していた。
NX31838PL分子の方向性を決定する（すなわち、核酸リガンド成分がリポソームから外側へ向かって進むのか、あるいはリポソームの水性中心に向かって進むのか）ために、外部から導入したRNaseを用いてリポソームから外側へ進んでいる核酸リガンド成分を全て選択的に切断した。受動アンカーリングしたNX31838PLリポソームの場合、全ての核酸リガンドがRNaseにさらされた。Triton X−100処理の後には追加の消化は全く観察されなかった。これらの結果は、受動装填されたNX31838PLは、核酸リガンド成分がリポソームから外側へ向けて進むように方向付けられていることを示唆する。もしも受動アンカーリングされたNX31838PLリポソームをRNase Iで前消化し、次いでDEAEカラムにかけると、約99％の核酸リガンドがカラムに捕捉されるが、一方同じサンプルをRNase Iで前インキュベーションせずにDEAEにかけると、ほぼ100％のオリゴがDEAEに結合することなくカラムを通過することができる。リポソームがDEAEからオリゴを保護するのである。リポソームは核酸リガンドと高い親和性で会合してDEAE基にさらされるのを大きく減少するので、DEAEから核酸リガンド成分を保護するように作用する。
最後に、リポソームアンカーリング型から遊離の核酸リガンド／親油性化合物複合体を分離するための新規方法を開発する一部として、NX31838.05PLをRNase Iで消化した。切断されたオリゴは脂質尾部を除去した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓ−1000樹脂）を用いて容易に分離できるが、完全な核酸リガンド／親油性化合物複合体は同じ条件下でリポソームと共溶出される。このデータは、核酸リガンド／親油性化合物複合体が溶液中で遊離状態のときには多分ミセルを形成していることを示唆する。このためカラムの空間容積（void volume）中でリポソームと共溶出する結果となる。脂質尾部の除去により、ゲル濾過媒体中への侵入が可能になり、サイズ分画されて適切に貯蔵される。
実施例8.VEGF核酸リガンド複合体のin vivo有効性−皮膚血管透過性アッセイ
NX31838核酸リガンドのいくつかの異なる製剤が皮膚血管の透過性においてVEGFで誘発された変化を弱くさせる（attenuate）能力をもつかを上述した方法（Senger et al.,（1986）Cancer Research 46:5629−5632）を少し修飾して行った（マイルスアッセイ）。簡単に述べると、成人雌モルモット（３匹／実験）をイソフルランで麻酔して、背側と側方後ろ領域の毛をクリッパーで除去した。エバンスブルー染料（2.5mg/モルモット）を静脈内投与した。注射溶液（PBS、VEGF、NX31838製剤、及び抗−VEGFモノクローナル抗体）を30分前に調製し、表記の最終濃度で指示する場合には共混合した。各溶液を毛を刈った領域に描いた格子状パターン内にランダムに皮内注射した（二重に注射／モルモット;40μl/部位）。モルモットを麻酔から快復させ、皮内注射の完了30分後にCO2にさらして殺した。皮膚を回収して皮下組織を除いて、透視した。カラーCCDカメラ（Hitachi Denshi KP−50U,Japan）とImage−Pro Plusソフトウエア（Version 3.1,Media Cybernetics,Silver Springs,MD）を用いて画像を得た。各皮膚サンプルについて、光学密度と関連領域について、分析する各注射部位の強度を正規化した。
図8A−Ｃは、実施例7Aで記載したリポソーム製剤中でのNX31838−20K  PEG、NX31838−40K  PEG、NX31838−PLについて、VEGF−誘導された血管漏出（vascular leakage）の核酸リガンド弱体化（attenuation）の結果を示す。全ての製剤は100nMという低濃度でPBS対照レベルまで、又はこの近くのレベルまで血管漏出を有意に減少することができた。30nMでは、核酸リガンドのブロック効果は失われた。NX31838−PLリポソーム製剤はこの濃度で評価しなかったが、100nMにおけるブロック効果を減少したようであった。このモデル系で抗−VEGFモノクローナル抗体も評価したところ、100nMまで同様に有効であり、30nMでは活性を失った。従って、このモデル系では試験した各種製剤形のNX31838がVEGFタンパク質の機能的効果の１つをブロックするという点において抗体と等しく有効であることを示唆している。
実施例9.VEGF核酸リガンド複合体のin vivo有効性−角膜ポケットモデル
VEGF核酸リガンド（NX31838）製剤のVEGF−誘導した角膜脈管形成減少能を正常駆血ラット角膜で試験した。簡単に述べると、95％エタノール中の12％バイオポリマーにタンパク質又は担体溶液を加えることによって、約30時間前にバイオポリマー（Hydon）ペレット±VEGFタンパク質（3pmol）を調製した。塩酸ケタミン（50mg/kg）及びキシラジン（10mg/kg）を腹腔内注射して成人スプラーグ・ドーレイラット（200−240g）を麻酔した。次に左目に塩酸テトラカインを局所投与して局部麻酔し、希釈ポビドン−ヨウ素液を適用し、次いで等張食塩溶液でリンスした。中央角膜（mid−cornea）に垂直部分厚さの切開を行った。中央間質ポケットを縁の1.5mm内に至るまで側方眼角に向けて後ろ側に切り取った。次いでペレットを挿入してポケットの後ろ端に押しやった。残っている空気を穏やかにマッサージしてポケットから除去した。クロラムフェニコール眼科用溶液を目に１滴入れた。動物をひっくり返して右目にこの処置を繰り返して同じタイプのペレットを挿入した。それぞれの目にペレットの挿入が完了したら、各動物にPBS（核酸リガンド製剤群と匹敵する容積）又は核酸リガンド（10mg/kg）を指示通り１日２回静脈内投与した。５日目に、各動物を麻酔して、解剖顕微鏡（KAPS,Germany）にセットした35mmカメラ（Minolta X9）で写真を撮った。血管成長の最大長さ（０−５）、移植ペレット近くの血管成長密度（１−４）及び血管形成を起こした目の円周（０−１）を測定することによって血管形成応答について各目を評価した。長さ＊密度＊円周の結果で血管形成インデックスを決定した。
核酸リガンド製剤がVEGF−誘導した血管形成をブロックする能力を図9A−Ｃに示す。血管透過性変化のブロックにおいてはその他の製剤と等しく有効であったにもかかわらず、NX31838−20K  PEGは正常駆血角膜における血管形成応答の弱体化では無効であった。しかしながら、NX31838−40K  PEG及びリポソームNX31838−PLはいずれも65−70％で血管形成レベルを有意に減少した。この違いは核酸リガンドそれぞれの薬物動態学プロフィールによるものと思われる。
統計学的分析：マイルス（Miles）アッセイ及び角膜血管形成モデルの群はDunnett比較を用いるRank ANOVAによって比較した。
実施例10.腫瘍モデルにおけるVEGF核酸リガンドのin vivo有効性
ヒト腫瘍異種移植モデル:VEGF核酸リガンドNX31838−40K  PEGが固形腫瘍増殖に及ぼす能力を、ヌードマウスの皮下腫瘍モデルで試験した。A673ヒト横紋筋肉腫腫瘍細胞を組織培養で増殖し、回収して、ヌードマウスの脇腹の腋領域近くに1x107個の生細胞を皮下移植した。試験化合物による処置は12時間後に開始し、実験の間中続けた。化合物は１日２回10及び40mg/kgで腹腔内投与した。陰性対照は乱雑化アプタマー（scrambled aptamer）配列であるNX31917−40K  PEG（分子性状については図1R参照）を１日２回40mg/kg投与からなり、陽性対照は抗−VEGF抗体Mab.26503.11（R ＆ D Systems,Lot＃ LD03）を100μg/マウスを週に２回投与からなっていた。核酸リガンド−処置群及び抗体処置群はいずれも乱雑化配列陰性対照群と比べて腫瘍増殖を有意に遅らせた（図11）。腫瘍増殖阻害率（TGI）は、40mg/kg及び10mg/kg BID群では75％及び80％であり、モノクローナル抗体処置群では83％であった（表８）。40mg/kg投与群と10mg/kg投与群では有意な差がなかったので、14日以後は40mg/kgの投与を行わなかった。図11に見られるように、投与終了の数日後に腫瘍増殖は速くなり、陰性対照群の増殖速度と同様になったが、10mg/kg核酸リガンド群及び抗体処置群は低い速度で増殖し続けた。
同じ腫瘍モデルを使ってさらに研究を行った。ここではVEGF核酸リガンドNX31838−40K  PEGの新しいバッチ（NX31838.04及びNX31838.07と命名）を比較し、また投与量を10mg/kg BIDから少なくして3mg/kg BID及び1mg/kg BIDとした滴定（titration）実験を行った。１日１回10mg/kgについても同様に実験を行い、またVEGF核酸リガンドNX31838−PLのリポソーム形を10mg/kg BIDで行った。図12及び表９に見られるように、いずれの実験でも同程度の腫瘍増殖阻害が達成された。VEGF核酸リガンドのいずれのバッチも１日２回の投与スケジュールで比較したときは同等であり、旧バッチと新バッチのTGI値はそれぞれ61％及び70％であった。さらに、１日１回投与（SID）は１日２回投与と同様に有効であった。しかしながら、この実験で用いた滴定スキームでは有効投与量に達しなかった。
VEGF核酸リガンドのさらに下方滴定が腫瘍増殖に関して用量応答関係を示すかどうかについて第３の実験を行った。この実験ではVEGF核酸リガンドを0.03mg/kgという無効用量近くまで下方滴定した。相対的腫瘍増殖阻害を図13に示し、表10にまとめた。
３つの期に達していない（unstaged）腫瘍研究に加えて、期に達した（staged）腫瘍研究を行った。ここではVEGF核酸リガンドによる処置の開始前に腫瘍を樹立して200±100mm3に達せさせた。NX31838−40K  PEG（10mg/kg）とmAb26503（R ＆ D Systems）（１週２回100μｇ）の投与群ではそれぞれ59％及び69％の腫瘍増殖阻害を達成した（図14、表11）。これらの集積的研究では、VEGF核酸リガンドがA673腫瘍の樹立を遅らせること、ならびにいったん腫瘍が樹立されたら腫瘍増殖を阻害できることを示している。
カポジ肉腫モデル：ヌードマウスにおけるカポジ肉腫セルラインKSY−１の皮下増殖に及ぼすNX31838−40K  PEGの効果を試験した。KSY−１細胞は培養においてVEGFアンタゴニストによって阻害されるという点でユニークな腫瘍セルラインである。KSY−１細胞を培養で増殖し、集めて、これをマウスの後ろ脇腹に皮下注射した（2x107個細胞／マウス）。３群のマウス（１群４匹）をNX31838−40K  PEG（30mg/kg）、NX31917−40K  PEG（30mg/kg）（分子性状については図1R参照）又はPBSのいずれかを実験の間中、12時間毎に腹腔内注射して処置した。処置は腫瘍細胞移植の１日後に開始した。PBS−処置群とNX31917−40K  PEG−処置群の腫瘍増殖は同等であったが、腫瘍増殖のかなりの阻害がNX31838−40K  PEG−処置群で観察された（図16）。NX31838−40K  PEGはKSY−１腫瘍の増殖を実験終了時（22日目）に65％（PBS−処置群と比較して）又は69％（NX31917−40K  PEG−処置群と比較して）阻害した。
実施例11:ウサギにおけるVEGF核酸リガンドNX31838＋40K  PEGの硝子体内薬物動態学
ニュージーランド白ウサギに、40mPEGとコンジュゲートしたVEGF核酸リガンドNX31838を0.5mg/目で硝子体内投与することによって処置した。40K  PEGは実施例５に記載の方法でVEGF核酸リガンドにコンジュゲートし、得られる複合体は図1Hに示すものである（配列番号:8）。ウサギはそれぞれの目にNX31838−40K  PEGを硝子体内投与した。動物毎の投与間の時間は15分を超えなかった。血液及び硝子体サンプルを表７に記載するように採取した。
血漿及び硝子体サンプルの分析は二重ハイブリダイゼーションアッセイを用いて行った。このアッセイでは、96ウエルプレートに付着した捕捉プローブとビオチン化した検出プローブの２つのハイブリダイゼーションプローブを用いる。捕捉プローブは核酸リガンドの5'末端とハイブリッドを形成する。このアッセイは全長核酸リガンドに対して極めて特異的かつ感受性であり、陽性シグナルを生じる。現在の定量限界は血漿５μｌ中で約2fmoleである。
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【図１Ｍ】
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【図１Ｑ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図１Ｒ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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