(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ＤＦ３抗原に比して、非グリコシレートＤＦ３抗原へ優先的に結合する単クローン抗体であって、該抗体は、Ｔ7Ｒ8Ｐ9Ａ10Ｐ11Ｇ12Ｓ13(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸配列に従ったエピトープに対して特定のものであり、該エピトープは位置１１にプロリンを含み、フォルマリン処理に対して安定であることを特徴とする単クローン抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体において、前記エピトープは、Ｒ8Ｐ9Ａ10Ｐ11Ｇ12(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のアミノ酸配列中に存在することを特徴とする単クローン抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体において、前記抗体は、Ｄ6Ｒ8Ｐ9Ａ10Ｐ11Ｇ12Ｓ13(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のアミノ酸配列を有するペプチドに結合することを特徴とする単クローン抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体において、前記抗体は、ヒトガン細胞の細胞質の成分と反応することを特徴とする単クローン抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体において、前記抗体は、ＤＦ３−Ｐ単クローン抗体（ハイブリドーマＤＦ３−Ｐ(ATCC HB11017)により産生）が結合する同じエピトープへ結合することを特徴とする単クローン抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体において、前記抗体は、ハイブリドーマＤＦ３−Ｐ（ATCC HB11017）によって生成されることを特徴とする単クローン抗体。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体において、前記抗体は、浸透性管内癌細胞を含む胸細胞部には選択的に結合するが、すべて正常細胞からなる胸組織部には結合しないことを特徴とする単クローン抗体。
【請求項８】
生物学的サンプル中の未成熟ＤＦ３抗原を検出する方法において、
前記生物学的サンプルを、請求項１に記載の抗体を含む試薬のアリコートに接触させるステップと、
前記抗体と前記生物学的サンプルの構成成分との間に免疫複合体の形成を検出するステップであって、前記免疫複合体の形成は前記生物学的サンプル中に未成熟ＤＦ３抗原が存在することを示すステップと、
を含むことを特徴とする生物学的サンプル中におけるＤＦ３抗原検出方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記免疫複合体の形成は、ＥＬＩＳＡによって検出されることを特徴とする生物学的サンプル中におけるＤＦ３抗原検出方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、前記生物学的サンプルは、ヒト血液、血清、または尿であることを特徴とする生物学的サンプル中におけるＤＦ３抗原検出方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法において、前記抗体は、ハイブリドーマＤＦ３−Ｐ（ATCC HB11017）によって生成されることを特徴とする生物学的サンプル中におけるＤＦ３抗原検出方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法において、さらに、非グリコシレートＤＦ３抗原の標準量を含む制御サンプルまたはそのフラグメントを供給するステップと；
前記制御サンプルを前記試薬の第２のアリコートと接触させるステップと；
前記生物学的サンプル中における免疫複合体形成の量を前記制御サンプル中における免疫複合体形成量と比較するステップと；
を含むことを特徴とする生物学的サンプル中におけるＤＦ３抗原検出方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体を含む免疫毒素、または細胞毒素媒体に結合されたその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項１３に記載の免疫毒素において、前記細胞毒素媒体は、前記抗体または前記抗原結合フラグメントに化学的に共役されていることを特徴とする免疫毒素。
【請求項１５】
請求項１３に記載の免疫毒素において、前記細胞毒素媒体は、ペプチド結合によって前記抗原結合フラグメントに結合されたポリペプチドであって、前記免疫毒素は、遺伝子工学的に開発されたハイブリッドＤＮＡ分子の発現によって生成されることを特徴とする免疫毒素。
【請求項１６】
検出可能なラベルに結合された、請求項１の抗体を含む撮像媒体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
請求項１６に記載の撮像媒体において、前記ラベルは放射性核種であることを特徴とする撮像媒体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
請求項１に記載の単クローン抗体、及びキットを使用するための指示書を含む、免疫アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明の分野は、癌性抗原に関する。
ガンを患っている人々は、そのガンに関連する循環抗原が高いレベルを示すことが少なくない。胸部癌腫の女性たちの場合もそうである。肝臓に対して準安定なヒト胸部癌腫の膜富化抽出物に対して、単クローン抗体（ＭＡｂ）が調製された（Ｋｕｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３：２２３−２３２）。抗体はＤＦ３抗原に対して特定のものである。この抗原は、抗ＤＦ３抗体と反応する共通の特性を有する、密接な高分子量グリコプロテインの集合体である。ＤＦ３抗原は、本願に参考文献として付記した米国特許第４，９６３，４８４号及び同１７４，８３８号にも記載されている。ＤＦ３抗原は、正常分泌乳上皮細胞のアピカル境界及び低分化の悪性胸細胞の細胞質ゾルに見いだされる（Ｋｕｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３：２２３−２３２）。このアピカル及び細胞質染色パターンは、ヒト乳脂肪ｇｌｏｂｕｌｅ膜（ＨＭＦＧＭ）及び胸ガン細胞ラインに対して調製されたＭＡｂｓに対して記述されている（Ａｒｋｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２８：２３−２９；  Ｈｉｌｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３４：１９７−２０６；  Ｓｌｏａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｃａｎｃｅｒ  ４７：１７８６−１７９５；  Ｃｒｏｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：４９８０−４９８８）。ＤＦ３抗原は準安定胸ガンを患っている女性の血漿内に高レベルで見いだされるので、臨床コースをモニタするために使用されている（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ４：１５４２−１５５０；  Ｔｏｎｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：４１０７−４１２２；  Ｐｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６２：６６８−６７０）。この抗原の発現は、胸腫瘍分化及びエストロゲン受容体の状態の度合いにも相関してきている（Ｌｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｂｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ５：２６９−２７６）。
胸ガン細胞及びヒトの乳内のＤＦ３の発現は不均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）であるという発見は、遺伝子の多形現象の可能性を示唆するものであった（Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３６１０；Ｈｉｌｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：７８６；  Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８３、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．４７：２６３）。実際、族メンバー内（ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ）の中での研究では、ＤＦ３抗原の電気泳動の不均一性は、単一の場所における多数の対立遺伝子の共有性（ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ）発現によって決定されることが明かにされている（Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  ｂｌｏｏｄ  ７１：４３６）。このタンパク質に対するｃＤＮＡクローンの符号化の配列解析によれば、高度に保存された（Ｇ＋Ｃ）富化  ６０  ベース対タンデム反復が明かにされている（Ｓｗａｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：８２；  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２３２０；Ｇｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２８２０）。ＭＡｂ  ＤＦ３及びＳＭ−３などの他のＭＡｂｓによって認識されたｅｐｉｔｏｐｅｓに対するこれらの反復コードは（Ｂｕｒｃｈｅｌｌｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５４７６）、そのままのグリコプロテイン及び非グリコシレート  プロテインコードに対して調製された（Ｓｉｄｄｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２３２０；Ｇｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６３：１２８２０；Ｂｕｒｃｈｅｌｌ他、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５４７６）。さらに、これらの抗体は、タンデム反復のフレーム内配列に従って調製されたある種の合成ペプチドと反応する（Ｇｅｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１２８２０；  Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：２８３４）。
発明の概要
ＤＦ３抗原上のエピトープと結合する新規な単クローン抗体が発見された。本発明の単クローン抗体は、悪性乳上皮内の細胞表面上に発現したＤＦ３抗原の成熟形態ではなく、非グリコシレート、脱グリコシレートまたは未成熟形態のＤＦ３抗原、またはそのフラグメントに対して優先的に結合する。非グリコシレートＤＦ３抗原は、共有結合された炭水化物のいかなる部分からも解放されたＤＦ３ポリペプチドとして定義される。ＤＦ３ポリペプチドは、２０アミノ酸残基反復領域ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）の少なくとも一の複写を含むポリペプチドである。脱グリコシレート  ＤＦ３抗原は、部分的にグリコシレートされているが、細胞表面に発現された成熟ＤＦ３抗原としての炭水化物部分の同一の完全コンティンジェント（ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｔ）を含まないＤＦ３ポリペプチドであると定義される。未成熟ＤＦ３抗原は、ＤＦ３ポリペプチドを含有し、それがＭＡｂ  ＤＦ３と結合する親和性よりも高い親和性を有する本発明のＭＡｂに結合するプロテインまたはグリコプロテインであると定義される。非グリコシレート、脱グリコシレート、及び未成熟のＤＦ３抗原は、ＤＦ３ポリペプチドの反復領域を含有し、そして細胞質、及びある種の状況下では胸ガン細胞の細胞膜内に存在すると考えられている。
本発明は、成熟ＤＦ３抗原と比較して、非グリコシレートＤＦ３抗原に対して優先的に結合するＭＡｂであることを特徴とするものである。この優先結合は、ＭＡｂは完全グリコシレート成熟ＤＦ３抗原に対してよりも、非グリコシレートＤＦ３抗原に対して著しく高い親和性を有するＭＡｂであることを意味する。好適には、本発明に係かるＭＡｂは、それが成熟ＤＦ３抗原に対して結合するときの親和性よりも少なくとも１０倍（好ましくは少なくとも５０倍、さらに好ましくは少なくとも１００倍）高い親和性を有する非グリコシレートＤＦ３抗原と結合する。
本発明のＭＡｂは、好適には非グリコシレートＤＦ３抗原の反復領域上のエピトープに結合する。このエピトープは、ペプチド（１−２０）と呼ばれるペプチドの一部内に含有されている（このペプチドは、次の配列をもつ：  ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１））。望ましくは、ペプチド（６−１３  ：  ＤＴＲＰＡＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２）またはペプチド（７−１３）：  ＴＲＰＡＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３）と呼ばれるペプチドの一部内に含有された非グリコシレートＤＦ３抗原上のエピトープと結合する。より好適には、ＭＡｂは、ペプチド（６−１３）から位置７におけるスレオニンを差し引いたＤＲＰＡＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４）に結合し、さらに好適には、ＭＡｂはアミノ酸配列ＲＰＡＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５）によってペプチド（８−１２）に結合する。ペプチド（１−２０）は、ＤＦ３抗原のＭＡｂ  ＤＦ３結合部位を包囲する２０個のアミノ酸を含有した合成ペプチドである。アミノ酸は、ペプチドのアミノからカルボキシ端末へ１−２０の番号が付されている。ペプチド（６−１３）は、その配列がペプチド（１−２０）内のアミノ酸の下位組を現す合成ペプチドである（すなわち、ペプチド（１−２０）のアミノ酸６−１３）。ここで、アミノ酸６は、アミノ酸端末にあり、アミノ酸１３は、ペプチド（６−１３）のカルボキシ端末にある。配列ＲＰＡＰＧは、ペプチド（１−２０）のアミノ酸番号８から始まっている。
しかし、他の好適な実施例においては、本発明に係るＭＡｂはヒトガン細胞の細胞質成分と反応する。抗体は、具体的には、浸透性管内ガン細胞を含有したフォルマリン固定胸部組織セクションと結合するが、ＭＡｂはすべてが正常細胞からなる胸部組織セクションにはかなりの程度まで結合しない（すなわち、ＭＡｂはガン細胞含有サンプルに対して選択的に結合するのであり、正常細胞のみを含むサンプルには結合しない）。ＭＡｂはまた、細胞ラインＺＲ−７５−１及びＭＣＦ−７を含むある種のヒト胸部ガン細胞ラインの細胞膜経も結合することが可能である。より好適には、抗体は、ハイブリドマＤＦ３−Ｐによって生成される。これは、アメリカンタイプ培養集合体（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  番号第  ＨＢ１１０１７）から得ることができる。本発明に係るＭＡｂは、また、ＤＦ３−Ｐ  ＭＡｂが非グリコシレート抗原に結合する親和性と同じまたはそれよりも高い（好ましくは少なくとも１０倍高い）親和性で非グリコシレートＤＦ３抗原と結合可能である。
本発明はまた、ヒト胸組織、他のガン組織、血液、血清、尿などの生物学的サンプル内の非グリコシレート、脱グリコシレート、または未成熟ＤＦ３抗原を検出する方法であることを特徴とする。この方法は、サンプルをＭａｂのアリコートで培養するステップと、たとえばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫ソルベント  アッセイ）などを用いて抗体及びサンプルの成分から成る免疫複合体の形成を検出するステップと、を含む。このような免疫複合体の形成は、サンプル中に非グリコシレート、脱グリコシレート、または未成熟ＤＦ３抗原が存在していることを示す。より好適には、本発明方法は、さらに、非グリコシレートＤＦ３抗原の標準量を含有した制御サンプルを供給するステップと、制御サンプルをＭＡｂで培養するステップと、生物学的サンプル中の免疫複合体の形成量を、制御サンプル中の免疫複合体の形成量と比較するステップと、を含む。
本発明はまた、ヒトのガン（例：  胸ガン、肺ガン、または卵巣ガン）を診断する方法を含み、該方法は、固定組織セクションなどの生物学的サンプルをそれぞれに検出可能ラベルが添加された本発明のＭＡｂで培養するステップと、サンプルへの境界のレベルを検出する方法を含み、背景レベルを遥かに超えるラベル量の検出は、患者がその組織にガンを持っていることの指標となる。
本発明は、また、本発明のＭＡｂまたはその抗原結合フラグメントが細胞毒性媒体に結合された免疫毒素であることを特徴とする。この細胞毒性媒体は、好ましくは、ＭＡｂへ化学的に共役されるか、あるいはペプチドによってＭＡｂへ結合されそして遺伝子工学技術によって生成されるポリペプチドである。
この免疫毒素は、経静脈注射または他の適当なルートなどによって患者へ免疫毒素を投与することによって、胸または他のＤＦ３−Ｐ−抗原発現腫瘍をもつヒトを治療するために使用することができる。
また、本発明には、本発明のＭＡｂから成る撮像（イメージング）エージェントまたはその抗原結合フラグメントが含まれる。これは、放射性核種などの検出可能ラベルへ結合される。この撮像エージェントは、腫瘍（例：  胸腫瘍、肺腫瘍または卵巣腫瘍）をもつと疑われる患者へ撮像媒体を投与することによって、その場で腫瘍を検出するために使用することが可能である。患者内における組織へ向かう検出可能ラベル（好ましくは、放射線撮像によって検出される放射性核種）が検出されることは、患者がその部位に腫瘍をもつことを示す。
本発明はまた、本発明のＭＡｂ、ＭＡｂのＤＦ３抗原への結合を検出するための試薬、及びキットを使用するための指示を含む免疫アッセイキットであることを特徴とする。
また、本発明は、胸、肺、卵巣または他の部位のガンをもつヒトを治療するための方法を含む。この方法は、本発明のＭＡｂを患者に投与するステップを含み、このＭＡｂは放射性核種へ結合される（例：  化学的な手段によって）。放射性核種は、それが接触する細胞を殺すことのできるものが望ましい。たとえば、90Ｙｉ（Ｙｉｔｔｒｉｕｍ）などのα−分子エミッタなどである。ＭＡｂは、ＭＡｂ特定エピトープを発現する細胞と結合するが、それが放射性核種に対してそのように結合されるので、放射性核種は細胞と接触してそれを殺す作用を果たす。
本発明はまた、生理学的受容可能キャリア内において本質的にエピトープＲＰＡＰＧから成る分子を含むワクチンと、このワクチンの免疫化量をヒトへ導入することによってヒトを免疫化させるための方法を含む。このような分子は、また付加アミノ酸配列または他の部分を含み、これによってたとえばワクチンの安定性または免疫発生性が促進される。
詳細説明
まず、各図面について説明する。
図面
図１は、免疫ブロット解析によるＭＡｂｓ  ＤＦ３−Ｐ及びＤＦ３の反応性を示す。パネルＡ：  ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ。  パネルＢ：  ＭＡｂ  ＤＦ３。  レーン１：  ミルクからのＭＡｂ親和性純化ＤＦ３抗原。  レーン２：  ＺＲ−７５−１細胞からの抽出。  レーン３:  ＺＲ−７５−１培養上清からのＭＡｂ  ＤＦ３親和性純化ＤＦ３抗原。レーン４：  ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ親和性純化ＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテイン。各プロテインは、３−１０％のポリアクリルアミド傾度（ｇｒａｄｉｅｎｔ）ゲル内で電気泳動され、ニトロセルロース紙へ転写され、そしてＭＡｂｓ  ＤＦ３及びＤＦ３−Ｐとの反応性が解析される。
図２は、ＭＡｂｓ  ＤＦ３−Ｐ及びＤＦ３の非グリコシレートＤＦ３抗原との反応性を示す。ＺＲ−７５−１組織培養上清からのＭＡｂ  ＤＦ３親和性純化抗原は、酵素脱グリコシレート後に、免疫ブロット解析によってモニタされた。パネルＡ：  ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ；  パネルＢ：ＭＡｂ  ＤＦ３。レーン１：  非消化ＤＦ３抗原。  レーン２：  ２時間にわたり１５ｍＵニューラミニダーゼによって処理された抗原。レーン３  ：２時間にわたりニューラミニダーゼによりそして２時間にわたり２ｍＵ  Ｏ−グリカナーゼによって処理された抗原。  レーン４：  ２時間にわたりニューラミニダーゼそして１０時間にわたりＯ−グリカナーゼによって処理された抗原。
図３は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐのペプチド（１−２０）への結合上における合成ペプチドの競合効果を示す。ペロキシダーゼ共役  ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐは、指定された濃度のペプチド（１−１０）（△）、ペプチド（１１−２０）（○）、ペプチド（１１−２０−１０）（■）そしてペプチド（１−２０）（□）によって１時間にわたり室温で前培養され、その後ペプチド（１−２０）で被覆されたウェルへ付加された。更に室温で１時間経過後、ウェルは洗浄され、ＯＰＤによって現像された。
図４は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ及びＤＦ３結合部位のエピトープマッピングを示す。２０アミノ酸タンデムの模式的表現は、競合アッセイ（上部パネル）内で使用される配列及び合成ペプチドを反復している。これらのアッセイ（下部パネル）では、ペロキシダーゼ共役  ＭＡｂｓ  ＤＦ３−Ｐ（□）及びＤＦ３（■）は、指定された濃度のペプチド（６−１３）（Ａ）、ペプチド（５−１３、マイナス７）（Ｂ）、及びペプチド（５−１３、マイナス１１）（Ｃ）で前培養され、その後ペプチド（１−２０）−被覆ウェルに付加される。洗浄後、各ウェルはＯＰＤにより現像された。
図５は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐによってペプチド（１−２０）へのペロキシダーゼ共役  ＭＡｂ  ＤＦ３の結合の抑制を示すグラフである。ペプチド（１−２０）で被覆されたウェルは、指定された濃度の非共役  ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐによって４時間にわたって室温で前培養された。洗浄後、ペロキシダーゼ共役  ＭＡｂ  ＤＦ３は、その後１時間にわたって付加され、その後ＯＰＤによる現像によって反応性が決定された。
図６は、ＭＡｂｓ  ＤＦ３及びＤＦ３−Ｐのフォルマリン固定されたパラフィン埋設組織との反応性を示す写真の集合を示す。ＭＡｂ  ＤＦ３（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）及びＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ（パネルＢ，Ｄ，Ｆ）は、還元ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ（パネルＡ、Ｂ）及び２個の異なる浸透性管内ガン（パネルＣ−Ｆ）のセクションで培養された。組織セクションは、免疫ペロキシダーゼ技術を用いて、ＭＡｂｓ  ＤＦ３及びＤＦ３−Ｐによって染色された。矢印は、ＭＡｂ  ＤＦ３を染色するが、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ（パネルＣ、Ｄ）は染色しない腫瘍に近接した正常な管部をハイライトしている。
図７は、ＭＡｂｓ  ＤＦ３及びＤＦ３−Ｐに対する結合部位を示す模式図である。
実験データ
物質及び方法：
ＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテインの純化
ＤＦ３抗原タンデム反復配列（３０９ベース対）を含有するλｇｔｌｌファージで感染されたＥ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｙ  １０８９の培養は、ＬＢ媒体内で３２℃で成長された（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２３２０−２３２３）。融合プロテインの発現は、１０ｍＭのイソプロピルチオ−β  Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘起された。１、２時間にわたる誘起の後、バクテリアは遠心分離によって収穫され、ＴＥＰバッファ（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＭＳＦ）を含有した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）内で再懸濁され、−７０度で冷凍され、そして１０−１５分間にわたってソニケーションによって細胞溶解（ｌｙｓｅ）された。１０分間にわたって１０，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清は収集され、セファクリルＳ−３００コラムへ適用された。ＭＡｂ  ＤＦ３をもちいたウエスタン・ブロット解析によって決定された、ＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテインを含有したフラクションがプールされ、ＭＡｂ  ＤＦ３親和性コラムへ適用され、そして３  Ｍ  ＭｇＣｌ2によって溶出された。
免疫化及びハイブリドーマの生成
生後８週間のＢａｌｂ／ｃのネズミが、ＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテインの経腹膜及びその後経静脈注射によって免疫化された。ハイブリドーマは、免疫脾臓細胞とｍｕｒｉｎｅ  ＮＳ  １  ミエローマ細胞ライン（Ｋｕｆｅｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３：２２３−２３２）との融合によって調整され、酵素結合免疫イミュノ  ソルベント  アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってスクリーンされた。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ピッツバーグ，ＰＡ）は、０．１Ｍ  ボレートバッファ、ｐＨ８．０内で一夜にわたり３７℃で５μｇ／ｍｌの合成ペプチド（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）；  ペプチド（１−２０））で被覆された。プレートは、ブロッキングバッファ（０．０１８  Ｍ  フオスフェートバッファード（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ）  サリン（ＰＢＳ）内の１％ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）により１時間にわたって培養された。ウェルは洗浄され、ハイブリドーマ上清（５０μｌ）により３７℃で２時間にわたり培養され、再度洗浄され、マウスＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に対するペロキシダーゼ共役ヤギ抗体により１時間にわたり室温で培養され、そして０．０１２％過酸化水素を含有した０．１Ｍクエン酸  バッファ（ｐＨ４．５）内で、５．５μＭ  Ｏ−フェニレン  ダイアミン（ＱＰＤ；  Ｓｉｇｍａ）により現像された。反応性は、Ｍｉｎｉｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ）によって４９０ｎｍでモニタされた。アイソタイピングは、ＢｉｏＲａｄ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（リッチモンド、ＣＡ）によって行われた。
競合アッセイ
合成ペプチドは、順次ＰＢＳ内で希釈され、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有したＰＢＳ内でペロキシダーゼ共役ＭＡｂによって１時間にわたって培養され、そしてペプチド（１−２０）によって被覆されたウェルへ１時間にわたって室温で添加された。あるいは、Ｔｗｅｅｎバッファ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５  Ｍ  リン酸カリウム、ｐＨ８．０）／０．５％ＢＳＡ内の飽和濃度の非共役ＭＡｂが、ペプチド（１−２０）被覆ウェルへ４時間にわたって室温で添加された。プレートは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄された。Ｔｗｅｅｎ  バッファ／０．５％ＢＳＡ内のペロキシダーゼ共役ＭＡｂは、その後１時間にわたり添加及び培養された。各プレートは、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄され、ＯＰＤで現像された。
ＤＦ３抗原の酵素デグリコシレーション
ＺＲ  ７５−１細胞培養上清からの親和性純化ＤＦ３抗原（５０μｇ）（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：２５７−２６１；  Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２６１０−３５１６）は凍結乾燥され、７μｌ  ０．５％  ＳＤＳ、０．１Ｍβ−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）内で５分間にわたって沸騰させることによって変性され、そして２１μｌ  ５０ｍＭ  ソジューム（ｓｏｄｉｕｍ）  アセテート、ｐＨ５．０内で１５ｍＵニューラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によって培養された。２時間後、ｐＨは、２０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4によって６．５へ調整され、その後２ｍＵ  ｅｎｄｏ−α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ（Ｏ−グリカナーゼTM、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）が、２−１０時間にわたって添加された。培養は、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μＭ  ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）及び１μＭペプスタイン、０．３μＭプロテイニン、１００μＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡの存在下で、３７℃で実行された。
結果
ＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテインによる免疫化によって、ＥＬＩＳＡによってペプチド（１−２０）と反応したＤＦ３−Ｐと命名されたＩｇＧ２ａ  ＭＡｂが生成された。この抗体は、免疫不ロット解析によって更に特徴化された。もしＭＡｂ  ＤＦ３−ＰのＤＦ３抗原との反応がＨＭＦＧＭからＭＡｂ  ＤＦ３親和性クロマトグラフィーによって純化されたならば、それはほとんど存在しない（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：２５７−２６１；  Ｓｅｋｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：３６１０−３５１６）（図１Ａ、レーン１）。これに対して、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐは、ＺＲ−７５−１胸部癌細胞の抽出物と反応した（図１Ａ、レーン２）。この反応性は、約１７０Ｋｄのプロテインに優性的に対抗した（図１Ａ、レーン２）。これらの発見がＭＡｂ  ＤＦ３−ＰはＺＲ−７５−１細胞抗原と反応することを示す一方、ＭＡｂ  ＤＦ３親和性クロマトグラフィーによってＺＲ−７５−１培養上清から純化されたＤＦ３抗原に対するＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの結合は、ほとんど見られなかった（図１Ａ、レーン３）。しかしながら、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐは、１３０Ｋｄ  ＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテイン及びバクテリア抽出物中に存在するいくつかの小さいフラグメントには結合した（図１Ａ、レーン４）。これらの発見は、ＭＡｂ  ＤＦ３で得られたものと比較された。この抗体は、ＨＭＦＧＭ及びＺＲ−７５−１培養上清から純化されたＤＦ３抗原と反応された（図１Ｂ，レーン１及び３）。更に、ＭＡｂ  ＤＦ３がＺＲ−７５−１細胞抽出物とも反応する一方、反応性のパターンは、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐで得られたパターンとは異なった（図１Ｂ，レーン２）。ＭＡｂ  ＤＦ３は、またＤＦ３／β−ガラクトシダーゼ融合プロテインとも反応したが、この信号の強度はＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐに対して発見されたものよりも小さかった（図１Ｂ、レーン４）。
以前の研究では、ＤＦ３の核となるプロテインは、明らかに約１７０ＫｄのＭｒを有することが示されていた（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４９：２８３４−２８３９）。ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐによる発見は、従って、この抗体がＤＦ３グリコプロテインの前駆体との選択的な反応性を示す可能性があることを示唆した。この問題に決着をつけるため、ＺＲ−７５−１培養上清からＭＡｂ  ＤＦ３親和性クロマトグラフィーによって純化されたＤＦ３抗原は、ニューラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼによって消化された。ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの非消化ＤＦ３抗原（図２Ａ、レーン１）との、またはニューラミニダーゼ（図２Ａ、レーン２）との処理後における検出可能は反応性は存在しなかった。これに対して、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの反応性は、ＤＦ３抗原の処理後は、ニューラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼ双方に対して明らかであった。事実、幅広い反応性の類似パターンが、純化された抗原をこれらの酵素に対して２時間または１０時間さらした後に、得られた（図２Ａ、レーン３及び４）。これらの発見は、ＭＡｂ  ＤＦ３によって得られたものとは異なっていた。ＤＦ３抗原に対するこの抗体（図２Ｂ、レーン１）の結合は、ニューラミニダーゼ単独での処理後では発見不可能であり（図２Ｂ，レーン２）、ニューラミニダーゼ及びＯ−グリカナーゼ双方へさらすことによって、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐによって確認されたものよりもより高い分子量をもつ幾つかの種が検出された（図２Ｂ，レーン３及び４）。同時に、これらの結果は、ＭＡｂ  ＤＦ３−ＰはＤＦ３ペプチドと反応するが成熟グリコプロテインとは反応せず、他方ＭＡｂ  ＤＦ３はおもにグリコシレートされたプロテインと反応することを明らかにした。
ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ反応性の一層の特徴化は、エピトープマッピングによってアプローチされた。ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐはペプチド（１−２０）に結合するという事実は、反応性エピトープはこの反復領域に存在することを示した。この仮説を確証するため、その領域の部分を表すより小さな合成ペプチドを用いて、ペプチド（１−２０）へ結合するＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐに対して競合された。Ｄｅｃａｍｅｒ（１−１０）（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡ；  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：６）及びｄｅｃａｍｅｒ（１１−２０）（ＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：７）は、最大８００μｇ／ｍｌまでの濃度で、検出可能な競合効果は得られなかった（図３）。さらに、ｄｏｄｅｃａｍｅｒ（１１−２０−１０）は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐのペプチド（１−２０）への結合に対して無効であった（図３）。このアッセイにおいてペプチド（１−２０）が完全にＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの結合をブロックするという発見により（図３）、これらの結果は、この抗体に対するエピトープは、アミノ酸１０及び１１またはそれらの近傍に存在することを示した（図４、上部パネル）。さらに、同様の結果がＭＡｂ  ＤＦ３に対しても得られたという発見は、これらの抗体は同じ領域で結合することを示すものであった。
ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐエピトープをより正確にマップするため、追加の競合研究が、幾つかのオクタマー（ｏｃｔａｍｅｒｓ）にわたるアミノ酸１０及び１１を用いて実施された（図４、上部パネル）。ペプチド（６−１３）は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ及びＭＡｂ  ＤＦ３双方のペプチド（１−２０）への結合をブロックする効果があった（図４Ａ）。これに対して、アミノ酸５から１３にわたるが位置７においてスレオニンを欠くペプチドは、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの結合を効果的にブロックしたが、ＭＡｂ  ＤＦ３に対してはそうではなかった（図４Ｂ）。これらの結果は、アミノ酸７はＭＡｂ  ＤＦ３の結合に必要であるが、この残基はＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐによって定義されたエピトープには関わっていないことを示すものであった。加えて、位置１１においてプロリンを欠くアミノ酸５から１３にわたるペプチドは、ＭＡｂ  ＤＦ３−ＰまたはＤＦ３のいずれの結合に対しても検出可能な効果を持たない（図４Ｃ）。アミノ酸６−１４にわたるが位置１３においてセリンを欠くペプチドは、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの結合をブロックし、且つＭＡｂ  ＤＦ３のペプチド（１−２０）との反応性に限定された効果を示した。これらの発見は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐ及びＤＦ３エピトープ双方がアミノ酸１１を含み、従ってこれらは重複しているいことを示している。この問題は、さらに、これらの抗体がペプチド（１−２０）への結合に際して競合するものであるかどうかを決定することによって、さらに追求された。事実、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐがペロキシダーゼ共役  ＭＡｂ  ＤＦ３のこのペプチドへの結合をブロックするという発見（図５）は、ＤＦ３−Ｐ及びＤＦ３エピトープの類似性をさらに裏付けている。これまでの研究では、ＭＡｂ  ＤＦ３は正常乳上皮のアピカル境界と反応することが明らかにされていた（Ｋｕｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３：２２３−２３２）。この特徴的なアピカル染色パターンは、還元乳房形成術（ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ）から得たフォルマリン固定パラフィン埋設正常乳組織内のＭＡｂ  ＤＦ３によって検出可能であった（図６Ａ）。これに対して、この組織がＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐと染色することはほとんどなかった（図６Ｂ）。同様の結果が、２個の別個の乳房形成術（ｍａｍｍｏｐｌａｓｔｙ）試料からも得られた。他の研究は、胸の浸透性管内癌に対して実施された。ＭＡｂ  ＤＦ３のパターン（図６Ｃ及びＥ）は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐにより得られたものとは相違していた（図６Ｄ及びＦ）。ＭＡｂ  ＤＦ３染色はアピカルかつ細胞質に対して生じたが、他方ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐとの反応性は細胞質内では優性的であった。腫瘍近傍の正常管のセクションは、ＭＡｂ  ＤＦ３で染色したが、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐではしなかった（図６Ｃ及びＤ；  矢印）。さらに、腫瘍のあるセクションは、ＭＡｂ  ＤＦ３よりもＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐでより強く染色した。ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐで染色した９個の浸透性管内癌と一のその場の管内癌のうち、すべてが腫瘍細胞の大部分と検出可能な反応性を示し、正常成分の染色はわずかであった。
ＤＦ３抗原及びこの族の高分子量グリコプロテインの関連メンバーは、ヒト胸部癌や他のある種の癌に変態的に発現する。これらのグリコプロテインは、変質乳上皮の細胞質内で高レベルで検出可能である。脈追いラベリング及び免疫沈澱実験によって、核プロテインの合成はサイズとして１６０−２２０Ｋｄの範囲であることが確認された（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：２８３４−２８３９；  Ｈｉｌｋｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂｕｉｊｓ、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：４２１５−４２２２）。成熟グリコプロテインは、いくつかの低分子量前駆体を介して発生する。この文脈では、成熟は、小胞体内におけるプロテインバックボーンのタンパク質開裂（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）及びＯ結合グリカン（ｇｌｙｃａｎｓ）の添加を含むようになる（Ｈｉｌｋｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂｕｉｊｓ，  １９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：４２１５−４２２２）。拡張Ｏ−グリコシレーションは、主に成熟グリコプロテインの見掛け分子量の増大の主要因であるが、他方他の発見もまた、Ｎ結合グリカンの存在を裏付けている（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：２８３４−２８３９；  Ｈｉｌｋｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂｕｉｊｓ、１９８８、Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：４２１５−４２２２）。最近の研究では、悪性胸細胞からの純化されたＤＦ３グリコプロテインの炭水化物構造は、ヒトの乳内の関連抗原に対して得られたものとは相違していることが明かにされている（Ｈｕｌｌ他、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１：２６１−２６７）。ＢＴ−２０胸ガン細胞からのＤＦ３グリコプロテインの主要炭水化物成分は、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮａｃ）であるが、一方この構造は関連ミルクグリコプロテイン内では検出不可能である（Ｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍｕｎ．，１：２６１−２６７）。これらの発見は、プロテイン核のグリコシレーションが、変質細胞により生成された抗原と選択的に反応するＭＡｂｓを調製する機会を与えると考えられる。
胸ガン細胞ラインＺＲ−７５−１及びＭＣＦ−７によって得られた予備データによれば、未成熟ＤＦ３抗原は胸ガン細胞の表面に発現するが、その量は成熟ＤＦ３抗原の場合よりも少ない。さらに、未成熟ＤＦ３抗原は、ある種の肺癌や卵巣ガン細胞とも関わっていることが見いだされており、これはそれがこれらの種類のガン及び胸ガンのマーカーになっていることを示している（データは不図示）。
本発明は、ＤＦ３プロテイン上のエピトープに結合するが、成熟グリコプロテインとの反応性は小さい抗体に関するものである。重要なことは、ＤＦ３−ＰエピトープはＭＡｂ  ＤＦ３によって定義されたものと類似しているが、相違している。ＤＦ３及びＤＦ３−Ｐエピトープ双方はアミノ酸６−１３内に存在しており、１１にプロリン残基を有するが（図７）、ＭＡｂ  ＤＦ３は非グリコシレートペプチドとは弱くしか反応せず、その結合は炭水化物部分の存在下で著しく高められる（Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２５７；  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２３２０；  Ａｂｅ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：２８３４）が、これはおそらく位置７におけるスレオニン及び／または位置１３におけるセリンにおけるグリコシレーションによるものと思われる。これに対して、このグリコシレーションは、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐの結合を抑制する。このように、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐは、非グリコシレートＤＦ３エピトープ（アミノ酸６−１３）及びＤＦ３エピトープのグリコシレーション部位（残基７及び１３）を欠くアミノ酸８−１２の双方に結合可能である。ＤＦ３−Ｐエピトープは、それに他のＭＡｂ（ＳＭ−３）が結合することが示されたエピトープとは、配列ＰＤＴＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：８）を有するペプチド（１−２０）のアミノ酸５−９によって定義される点で、異なる（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ他，１９８９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４４：６９１）。ＤＦ３−ＰとＳＭ−３エピトープとの間の他の相違は、ＤＦ３−Ｐエピトープはフォルマリンによる変性に対する耐性を有するが、ＳＭ−３  エピトープは敏感であり、フォルマリンとの接触によって変性する（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５４７６）。
他の実施例
本発明の他の実施例は、後述の特許請求の範囲及び下記の説明の範囲にある。非グリコシレートＤＦ３抗原特定単クローン抗体を生成するハイブリドーマは、胸ガン細胞からの抽出物、純化または準純化非グリコシレートまたは脱グリコシレートＤＦ３抗原、あるいはペプチド（１−２０）、ペプチド（６−１３）、またはペプチド（８−１２）などの非グリコシレートまたは脱グリコシレートＤＦ３抗原のフラグメントを用いてネズミまたは他の動物を免疫化することによって上述のようにして調製することができる。このようにして得られた単クローン抗体は、ＭＡｂ  ＤＦ３−Ｐのための上述した処理を用いて、アッセイ及び特徴化することが可能である。たとえば、ＤＦ３抗原またはそのフラグメントへの結合は、ペプチドフラグメントなどを用いた競合抑制研究であるＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロッテイング技術によって査定することができる。本発明のＤＦ３抗原免疫アッセイは、免疫アッセイに関する当業者にとって周知の任意の標準免疫アッセイ処理を用いることができ、これらの処理はＥＬＩＳＡに限定されるものではなく、放射線免疫アッセイ、フルオロ免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及び競合免疫アッセイなどが含まれる。免疫アッセイが、２個またはそれ以上の抗体分子によって、非グリコシレート、脱グリコシレート、または未成熟ＤＦ３抗原にサンドイッチ状にはさむことによって該抗原を検出するような場合には、両抗原分子が該抗原状に同じタイプの決定子に対して特定のものとすることができ（ＤＦ３抗原の各分子には、少なくとも２個のそうした決定子タイプが存在する）、または抗原上の異なる種類の決定子に結合することもできる。他の各アッセイは、免疫アッセイ分野の当業者にとって周知である直接競合アッセイなどの非サンドイッチ型フォーマットに基づくことができる。
本発明にかかる免疫アッセイは、免疫アッセイキットへ組み込むことができる。このキットは、非グリコシレートＤＦ３抗原へ優先的に結合可能な単クローン抗体と；  この結合を検出及び測定するための手段と；  そしてこのキットを使用するための指示と、を含む。このキットは、上述したような任意の適切なタイプの免疫アッセイを使用することができる。たとえば、このキットには免疫アッセイのための試薬を含むことができ、患者からのサンプル（例：  固定された組織試料、または血液、血しょう、または尿素などの体液）がまず非グリコシレートＤＦ３と優先的に結合するＭＡｂと反応し、第２の抗体がその後添加される。該第２抗体は、第１抗体のＦｃ部へ結合可能であり、また基板と反応可能なインジケータ酵素への境界を有する。非境界抗体は、混合物から除去され、また酵素が反応する基板が付加される。基板は、酵素との反応後、検出可能で測定可能な変化を受ける。このようにして、基板中の変化の度合いは、サンプル中におけるＤＦ３抗原の量の直接的なものさしとなる。
本発明の免疫毒素は、非グリコシレートＤＦ３抗原に対して特定の単クローン抗体を、免疫毒素生成分野における当業者にとって通常の技術を用いて、任意数の毒性物質化学的に共役することによって調製することができる。抗体をプロテイン毒素（たとえば、ジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素Ａ、またはリチンなどの植物毒素）へ共役するための典型的な方法は、ジスルフィド結合によって交差結合することである（例：  Ｃｈａｎｇｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：１５１５−１５２２，１９７７）またはｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  分子（例：  Ｃａｗｌｅｙ他、Ｃｅｌｌ  ２２：  ５６３−５７０、１９８０）。また、Ｓｔｅｖｅｎｓ他、米国特許第４，８９４，２２７号を参照。あるいはまた、免疫毒素は、毒素（またはその毒素部分）及び抗体（またはそのＤＦ３−結合部分）双方を符号化するために処理されたハイブリッドＤＮＡの発現によって調製することもでき、この場合こうしたハイブリッドの生成に関する当業者にとって使用できる方法で行うことができる（Ｍｕｒｐｈｙ，米国特許第４，６７５，３８２、及びＣｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４５３８−４５４２、１９８７；双方とも本願に参考文献として添付した）。免疫毒素のＤＦ３結合部を符号化するＤＮＡ配列は、本発明のＤＦ３−特定抗体の可変軽鎖（ＶL）アミノ酸配列及び可変重鎖（ＶH）配列に基づく。Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８の方法を用いて、結合ペプチドによってＶHへ結合されたＶLを符号化するＤＮＡ配列は、プロテイン毒素（または、Ｍｕｒｐｈｙ、米国特許第４，６７５，３８２号などによって開示されたその毒素部分）を符号化するＤＮＡ配列に構成され、結合される。このような操作は、ここにのべたような開示に基づき、遺伝子工学分野における当業者であれば通常のものである。結果として得られた免疫毒素は、薬理学分野の標準処理にしたがって、抗ガン剤として使用されるようにフォーミュレートされる。
本発明にかかる単クローン抗体の生体内におけるＤＦ３発現主要を検出及び位置決めするために有用な撮像媒体を生成するために検出可能なラベルと組み合わせることも可能である。そのようなラベルを抗体へ添加する方法は、当業者に周知であり、特に実験の必要なく容易に達成可能である。このような媒体の潜在的な有用性は、例えばＤＦ３特定腫瘍細胞を免疫ホスト（ヌードマウスなど）内へ注入し、本発明の撮像媒体がそうした注入細胞によって生成された腫瘍を検出可能にラベルするかどうかを決定する、などによってアッセイ可能である。
本発明の単クローン抗体は、また当業者によって周知の方法を用いて発光放射性核種と組み合わせることも可能である。このような複合体は、それが接触する細胞を殺すことが可能である。胸、肺、または他の部位の癌をもつ患者は、生理学的に需要可能なキャリア内に懸濁された複合体を経静脈、または腫瘍部位における局部注射によって、患者へ投与することによって、抗体複合体で治療することができる。ＭＡｂが結合するエピトープを発現する腫瘍細胞は、その後の放射性核種との接触によって殺される。
本発明のさらに他の使用によれば、単クローン抗体が結合するエピトープは、発生したガンから患者を保護し、あるいは患者のガン免疫系を刺激してガン細胞を的にした抗体を生成するよう刺激するための、ワクチンとして有用である。エピトープは、ヒトへの接種のための生理学的に受容可能なキャリア内に懸濁可能である。適切な投与量及び投与方法の決定は、当業者の能力範囲にある。
デポジット
特許手続きのための微生物のデポジットの国際協定の規定に基づき、ハイブリドマＤＦ３−Ｐのデポジットは、米国ＭＤ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅのアメリカンタイプ培養収集（ＡＴＣＣ）に行われた。このデポジットに対して、ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＨＢ１１０１７が付された。
出願人の被譲渡人であるＤａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．は、ＡＴＣＣはデポジットのパーマネンスを可能とするデポシトリーであり、特許が付与された場合には公衆がそれにアクセスできるものであることを表明する。デポジットされた物質の公衆への使用可能性へのすべての制約は、特許が付与された時点で取り返し不可能にに除去される。この物質は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ１．１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１２２の下において権限を与えられたコミッショナーによって決定された者への特許出願の係属中に、使用可能である。デポジットされた物質は、それを生存可能に保存するために必要なすべての処置をもって維持され、デポジットされた物質のサンプルの供給に対する最も新しい要求後少なくとも５年間の期間にわたって非汚染状態におかれる。いずれの場合においても、デポジットの日後少なくとも３０年間または特許の有効期間中、のいずれかの長い方の期間である。出願人の被譲渡人は、デポジットの状態のために要求されたときには、デポジトリーがサンプルを準備することができない場合には、デポジットを取り替える義務を持つことを承認する。
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：              Ｋｕｆｅ，Ｄｏｎａｌｄ
（ｉｉ）発明の名称：        ガン関連抗原に対する特定抗体
（ｉｉｉ）配列数：          ８
（ｉｖ）通信アドレス：
（Ａ）宛先人：              Ｆｉｓｈ  ＆  Ｒｉｃｈａｒｄｏｓｏｎ
（Ｂ）通り：                ２２５  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｓｔｒｅｅｔ
（Ｃ）市：                  Ｂｏｓｔｏｎ
（Ｄ）州：                  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
（Ｅ）国：                  Ｕ．Ｓ．Ａ．
（Ｆ）ＺＩＰ：              ０２１１０−２８０４
（ｖ）コンピュータ読込形態：
（Ａ）媒体タイプ：          ３．５”デイスケット，１．４４Ｍｂ
（Ｂ）コンピュータ：        ＩＢＭ  ＰＳ／２  Ｍｏｄｅｌ  ５０Ｚまたは５５ＳＸ
（Ｃ）作動システム：        ＩＢＭ  Ｐ．Ｃ．ＤＯＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３０）
（Ｄ）ソフトウェア：        ワードパーフェクト（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０）
（ｖｉ）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）前出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（ｖｉｉｉ）代理人情報：
（Ａ）氏名：                Ｆｒａｓｅｒ，Ｊａｎｉｓ  Ｋ．
（Ｂ）登録番号：            ３４，８１９
（Ｃ）整理番号：            ００５３０／０５９００１
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話：                （６１７）５４２−５０７０
（Ｂ）ファックス：          （６１７）５４２−８９０６
（Ｃ）テレックス：                    ２００１５４
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                ２０
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １：
0003698370.tif 000002
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                ８
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２：
0003698370.tif 000003
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                ７
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３：
0003698370.tif 000004
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                ７
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４：
0003698370.tif 000005
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                ５
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５：
0003698370.tif 000006
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                １０
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６：
0003698370.tif 000007
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                １０
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７：
0003698370.tif 000008
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：                ５
（Ｂ）タイプ：              アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：
（ｘｉ）配列記述：          ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８：
0003698370.tif 000009
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0003698370.tif 000011
【図２Ａ】
0003698370.tif 000012
【図２Ｂ】
0003698370.tif 000013
【図３】
0003698370.tif 000014
【図５】
0003698370.tif 000015
【図４Ａ】
0003698370.tif 000016
【図４Ｂ】
0003698370.tif 000017
【図４Ｃ】
0003698370.tif 000018
【図４Ｄ】
0003698370.tif 000019
【図６Ａ】
0003698370.tif 000020
【図６Ｂ】
0003698370.tif 000021
【図６Ｃ】
0003698370.tif 000022
【図６Ｄ】
0003698370.tif 000023
【図６Ｅ】
0003698370.tif 000024
【図６Ｆ】
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【図７】
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