(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
加工段階において問題を惹起するほど高い粘度を生じるような、少なくとも０．１ｇ／ｌの核酸を含む水性プレパレーションから生成物を回収する方法において、核酸を前記段階の前および中に５℃〜８０℃未満の条件で過酸化物と接触させることによる核酸分解工程を含み、ここで過酸化物は、水性プレパレーションから生成物を回収するための処理を容易にするために、核酸を分解し、そして該水性プレパレーションの粘度を下げるために用いる、前記方法。
【請求項２】
固体粒子と、少なくとも０．１ｇ／ｌの核酸とを含む水性プレパレーションの粘度を制御することを含む方法であって、核酸を５℃〜８０℃未満の条件で過酸化物によって分解し、固体粒子を分離することを含む前記方法。
【請求項３】
粘度の低下後にポリヒドロキシアルカノエートをプレパレーションから分離する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プレパレーションが５８０／秒の剪断速度において１０ｍＰａ．ｓより大きい初期粘度を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
水性プレパレーションが細胞溶解物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
プレパレーションが細菌細胞溶解物である請求項５記載の方法。
【請求項７】
プレパレーションが細胞をアニオン界面活性剤によって溶解することによって調製される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アニオン界面活性剤の濃度が０．５〜１０％ｗ／ｖである請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞からポリヒドロキシアルカノエート又は多糖ポリマーを回収する方法であって、当該ポリマー以外の細胞物質の分解工程を含み、分解の第１段階において細胞物質を５℃〜８０℃未満の条件で過酸化物によって分解する前記方法。
【請求項１０】
過酸化物の濃度（過酸化水素換算して表現）が０．５〜２０％ｗ／ｖである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１５〜３５℃の範囲内において実施される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
過酸化物が過酸化水素として供給される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ｐＨが６〜８である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヒドロキシアルカノエートポリマーがポリヒドロキシブチレート／バレレートポリマーである請求項３〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は核酸の分解に関する。核酸分解は、バイオテクノロジー又は発酵加工に由来する製品を一般的に含む多くのプロセスにおける有用な又は本質的な段階である。
ますます増加する数の重要な製品がしばしば微生物細胞において、産業的プロセスで、細胞内的に生産される。問題の生成物を取り出すために、宿主細胞を分解又は溶解することが一般に必要である。このような溶解に関する問題の１つは、目的生成物と同様に、細胞から分解媒質(disruption medium)中に核酸が放出されることである。核酸は、放出されると、溶液中でほどけて、網状組織を形成する；これは細胞溶解物の粘度を上昇させる。この高い粘度は、ごく若干を挙げても、混合、固体／液体分離、ポンピング及び吸着プロセスに不利に影響しうるので、下流加工段階において問題になりうる。核酸のこの性質のために、細胞分解を含むプロセスは、その後の加工段階を効果的に又は実際に完全に実施しうるために核酸の分解方法を必要とする。
先行技術では、例えば上記プロセスのような産業的プロセスにおいて核酸を分解する試みが今までになされてきた。１つの可能性は例えばヨーロッパ特許出願第０１４５２３３号に開示されるように熱を用いることであり、この出願においては“熱ショック”プロセスが細胞又は細胞溶解物を１５０℃以上のような高温に短時間（一般には数秒間又は数分間）加熱することを含む。このプロセスは有効ではあるが、かなりエネルギー集約的であり、水性媒質を液体形で１００℃よりも有意に高く加熱しなければならない場合には費用のかかる装置の使用を明らかに必要とする。
熱を用いる代わりに、化学的又は生物学的作用剤の添加によって核酸を分解又は除去することができる（例えば沈殿によって）。ヌクレアーゼは、核酸を加水分解し、細胞溶解物にこの目的のために加えることができる酵素である。とはいっても、ヌクレアーゼの精製製剤は高価である。例えばポリエチレンイミンのような沈殿剤はヌクレアーゼよりも有意に安価であり、細胞溶解物の大部分(bulk)から核酸を効果的に除去することができる。
核酸の化学的分解は細胞溶解物から核酸を除去するために選択すべき経路であるが、有効であり、安価であり、重要なことには、その使用後に不利な残渣を残さない試薬を見い出すことに問題がある。
過酸化物が特に有効で、適切な核酸分解剤として使用可能であることが今回判明し、本発明が取り組むのはこの発見である。この核酸分解がその分子量の実質的な減少を含み、これが核酸の粘度増強性を実質的に減ずると考えられる。本発明の第１態様によると、加工段階において問題を惹起するほど高い粘度を生じるような、充分な量の核酸を含む水性プレパレーション(preparation)から生成物を回収する方法であって、前記段階の前及び中に核酸を過酸化物と接触させることによる核酸分解工程を特徴とする前記方法を提供する。
本発明の第２態様によると、水中に溶解した、少なくとも０．１ｇ／ｌ（グラム／リットル）、例えば０．５〜２０ｇ／ｌの核酸を含む溶液中の核酸を過酸化物と接触させることによって分解する方法を提供する。
本発明の第３態様によると、固体粒子と、少なくとも０．１ｇ／ｌ、例えば０．５〜１０ｇ／ｌの核酸とを含む水性プレパレーションの粘度を制御することを含む方法であって、核酸を過酸化物によって分解し、固体粒子を分離することを含む方法を提供する。
本発明の第４態様によると、細胞から多糖又はポリヒドロキシアルカノエートポリマーを細胞から回収する方法であって、前記ポリマー以外の細胞物質の分解を含み、分解の第１段階において細胞物質を過酸化物によって分解する方法を提供する。
核酸は細胞中に見い出される形態の核酸のいずれでもよい。それ故、ＤＮＡとＲＮＡの両方の分解が本発明によって考慮される。種々な形態のＲＮＡを扱うことができる（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ）。
核酸の水性プレパレーションは溶液であることができる。しかし、生物学的系では、核酸はタンパク質又は他の化学種と充分に結合している。核酸の水性プレパレーションが細胞溶解物、特に、例えば細菌細胞溶解物のような微生物細胞溶解物である場合に、本発明は特別な用途を有する。
過酸化物は簡単には過酸化水素であるか、又は過酸化水素の発生源であることができる。この発生源は例えば過酸化物塩であるか又は使用現場で(in situ)過酸化水素の過酸化物アニオンを発生する他の手段であることができる。過酸化水素は水溶液として入手可能であり、典型的には３５％ｗ／ｖ水溶液として供給される。本発明に用いる過酸化物の濃度は受容可能な時間内に所望の分解度に達するために充分である任意の濃度である。例えば、濃度（過酸化水素として表現）は０．１〜２０％ｗ／ｖの範囲であることができる。通常は、濃度は０．５〜１０％ｗ／ｖの範囲内であり、実際には、しばしば１〜５％ｗ／ｖである。
インキュベーション期間の時間と温度は、核酸の分解が受容可能な程度に生ずるように選択される。一般的に述べると、使用温度が高ければ高いほど、インキュベーションに必要な時間は短くなる。温度の上限は問題のバイオ分子を損傷しないという望みと、過酸化水素の有意な量を駆除若しくは分解しないという必要性とによって左右される。温度の下限は、分解反応速度が温度によって低下すると予想することができるので、反応の速度論によって単に支配される。時間に関するかぎり、インキュベーション時間の上限は都合によって決定されるが、下限は核酸の測定可能な量を分解するために充分な長さのインキュベーションを保証する必要性によって決定される。典型的な温度は５〜１００℃の範囲であり、好ましくは５〜５０℃であるが、しばしば１５〜３５℃である。室温付近の温度（２０〜２５℃）が実際に有用である。典型的な反応時間は、主として温度に依存して、５分間から５日間までの範囲であるが、実際にはしばしば１時間から２日間までの範囲である。実際には、１０〜２０時間のインキュベーション時間が好ましい。実際に有効であると判明している組合せの１つは、室温における１６時間の反応時間である。しかし、より短い反応時間が望ましい場合には、例えば９０℃までのより高い温度が好ましい。
本発明によって、細胞溶解物中の核酸を分解するために過酸化物を用いる予定である場合には、過酸化物を細胞溶解剤と組合せて用いることができる。適当な細胞溶解剤は界面活性剤、特に、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなアニオン界面活性剤を含む。或いは、細胞を適当な溶解剤で溶解した後に、過酸化物を加えることができる。用いる細胞溶解剤の濃度は当然その性質に依存するが、目安として、ＳＤＳは０．１〜２０％ｗ／ｖ、例えば０．５〜２０％ｗ／ｖ、典型的に約１〜５％ｗ／ｖの濃度で用いられる。細胞溶解剤を用いない場合には、過酸化物分解を触媒する、存在するタンパク質を変性させるために好ましくは充分な高温に細胞をさらすことが好ましい。この手段によって、プロセスに供給すべき過酸化物量を減ずることができる。
水性環境のｐＨは特に重要であるとは思われないが、微生物細胞又は他の細胞に由来する水性プレパレーションでは一般にほぼ中性である。本発明は特にｐＨ感受性であるとは思われないので、４〜９のｐＨ範囲が実際に適切であると考えられるが、一般にはｐＨは６〜８の範囲内である。
本発明は、上述したように、細胞内で産生される物質の取り出しに特別の用途を有する。細菌細胞又は他の微生物細胞から化合物を取り出すことがしばしば望ましいが、本発明の有用性は高分子の回収に制限されない。本発明は例えばポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）及びポリヒドロキシブチレート／バレレート（ＰＨＢ／Ｖ）コポリマーのようなポリヒドロキシアルカノエートを含むバイオポリマーの取り出しに特別の用途を有する。ポリヒドロキシアルカノエートポリマーは、多様な天然の生物又は遺伝子操作(engineered)生物、特に細菌又は他の微生物、例えばアルカリジェンス(Alcaligenes)、アチオロジウム(Athiorhodium)、アゾトバクター(Azotobacter)、バチルス(Bacillus)、ノーカルディア(Nocardia)、シュードモナス(Pseudomonas)、リゾビウム(Rhizobium)及びスピリルム(Spirillum)属の微生物において自然に又は誘導によって、産生されることができる。好ましいポリヒドロキシアルカノエート産生種には、アルカリジェンス  オイトロフス(Alcaligenes eutrophus)、ハイドロジェノモナス  オイトロファ(Hydrogenomonas eutropha)Ｈ−１６、アルカリジェンス  ラタス(Alcaligenes latus)及び種々なシュードモナス種がある。ポリヒドロキシアルカノエートポリマーの産生に関する文献の中の内容豊富な参考文献には、ヨーロッパ特許出願第００６９４９７号、米国特許第Ａ４１０１５３３号、ヨーロッパ特許出願第０１４４０１７号、ヨーロッパ特許出願第０１４５２３３号及びヨーロッパ特許出願第０３９２６８７号がある。
ポリヒドロキシアルカノエートの取り出しにおける核酸分解剤としての例えば過酸化水素のような過酸化物の使用は、核酸分解を例えば約２０℃のような比較的低い温度において実施することができるという利益を有し、先行技術の熱ショック方法を凌駕する省エネルギーを表すので、ポリヒドロキシアルカノエートポリマーが低温においてあまり損傷されないのは当然である。この場合に、ヨーロッパ特許出願第０１４５２３３号に述べられているタンパク質分解酵素及び／又は洗剤可溶化及び／又は他の工程を、この資料に述べられているように、用いることができる。
本発明の第５実施態様によると、核酸分解剤としての過酸化物の使用を提供する。本発明の第２態様の好ましい特徴には、第１態様と同様に、必要に応じて変更が加えられる。
次に、下記実施例によって、本発明を説明する。
実施例１
アルカリジェンス  オイトロフスの菌株をグルコースとプロピオン酸との混合物の水性培地中でのリン制限下でのバッチ培養において増殖させて、ヒドロキシバレレートのモル含量１１％を含む（ポリマーの残部はヒドロキシブチレートである）ヒドロキシブチレート（ＨＢ）／３−ヒドロキシバレレート（ＨＶ）コポリマー７１％を含む細胞１０１ｇ／ｌ含有培養物を得た。
ＰＨＢ／Ｖコポリマーを含む細胞サンプルを脱イオン水中で遠心分離を用いて３回洗浄した。ボーリン(Bohlin)ＶＯＲ流動計（同心円筒形型）によって測定した懸濁液粘度は５８０／秒として１．８ｍＰａ．ｓであると判明した。
ｐＨ７のＳＤＳの２％ｗ／ｖ添加を用いて、細胞を溶解した。これは懸濁液の粘度を同じ装置で測定して、５８０／秒において９０ｍＰａ．ｓに顕著に増加させた。充分な３５％ｗ／ｖＨ2Ｏ2を加えて、３％ｗ／ｖの溶液中の濃度を得た。２０℃における１６時間後に、懸濁液の粘度を再び測定したところ、５８０／秒において２．５ｍＰａ．ｓであり、オリジナルの溶解前懸濁液の値に近いことが判明した。
比較例
過酸化水素を加えなかった以外は、上記実施例の操作を繰り返した。その代わりに、ＳＤＳ後に添加物を加えずに、細胞溶解物を２０℃において１６時間放置した。この時間の終わりの粘度は５８０／秒において５０ｍＰａ．ｓであり、これは最初の溶解後値から低下したが、実際の用途のために粘度の重大な低下ではない。
実施例２
アルカリジェンス  オイトロフスのＮＣＩＭＢ４０２１４菌株を９０ｃｍ3有効容量の発酵器中で増殖させた。培養物を下記成分（濃度ｇ／ｌ、ｐＨ７及び３０℃）を含む培地中でインキュベートした：
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ２．２
Ｋ2ＳＯ4                        ３．０
Ｎａ2ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ             ０．１８
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ０．１８
グルコース                    １３．０
微量元素                        ３．０ｍｌ
リン酸                          ６．５ｍｌ（１．１Ｍ）
培地のリン酸塩含量を制限した２４時間後に、グルコース及びプロプオン酸をそれぞれ３００ｋｇ／時及び５４ｋｇ／時の速度でさらに４８時間にわたって発酵器に加えた。この時間後に、細胞を回収した。
これは、ヒドロキシバレレートのモル含量９％を含む（ポリマーの残部はヒドロキシブチレートである）ヒドロキシブチレート（ＨＢ）／３−ヒドロキシバレレート（ＨＶ）コポリマー７５．４％を含む細胞１４５ｇ／ｌ含有培養物を生じた。この細胞は核酸３％を含有した。
培養物のｐＨを“８８０”水酸化アンモニウムによって７に調節し、ＳＤＳを３％の濃度になるように加えた。培養物の粘度の顕著な増加が生じた。過酸化水素溶液（３５％ｗ／ｖ）を６％ｗ／ｖの濃度になるように培養物に加えた。この培養物を室温において１６時間撹拌した。この培養物を脱イオン水によって遠心分離と再懸濁とによって５回洗浄した。次に、この培養物を５％ｗ／ｖの濃度の過酸化水素によって８０℃において３時間処理した。今や精製されたＨＢ／ＨＶコポリマーを脱イオン水中で３回洗浄し、６０℃において２４時間オーブン乾燥させた。コポリマーの損失はセントレート(centrate)の混濁度(turbidity)によって評価して低いと判定された。
ポリマーの黄色度指数（ＹＩ）をＡＳＴＭ方法Ｄ１９２５−７０によって測定し、３０であると判明した。
このことは約０．４％のタンパク質含量を実証し、物質全体は少なくとも９９％のコポリマーであると考えられる。生成物は実質的に無臭であった。分子量は９００，０００ダルトンより大であった。それ故、これは高純度かつ高分子量の生成物であり、プラスチック材料としての使用に非常に適すると考えられる。