(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚表面の一部を準備処置し、所定量の酵素含有混合溶液を前記皮膚表面に塗布し、露出させ、反応溶液中のコレステロール濃度を評価し、皮膚コレステロール濃度を算出するステップを含む皮膚コレステロール測定方法であって、皮膚が混合溶液と接触する面積を、皮膚に固定されるベースを有する底のないシール式容器によって皮膚表面の前記一部に制限し、２．０−２．５ユニットのコレステロールオキシダーゼ、０．０４〜０．０６重量％のデオキシコール酸ナトリウム、及び０．１〜０．２重量％の３−（ドデシル−ジメチル−アンモニウム）−プロパンスルホネートをｐＨ＝６．８の緩衝液に加えたものを混合溶液として使用し、過酸化水素のレベルを測定することによって反応溶液中のコレステロール濃度を評価することを特徴とする皮膚コレステロール測定方法。
【請求項２】
３〜５ユニットのコレステロールエステラーゼをも組成物に加えることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
過酸化水素レベルを測定するため、ペルオキシダーゼを基質と共に反応溶液に加えた後、吸光度測定法を行なうことを特徴とする請求の範囲第１〜２項に記載の方法。
【請求項４】
過酸化水素レベルの測定を、電気化学的センサーを反応溶液に浸漬することによって行なうことを特徴とする請求の範囲第１〜２項に記載の方法。
【請求項５】
過酸化水素レベルの測定を、比色インジケーターを反応溶液に浸漬することによって行なうことを特徴とする請求の範囲第１〜２項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、医薬品、正確には生化学的方法による皮膚の検査方法に係わる。この発明は、皮膚中の遊離及び総コレステロール含有率の測定を目的として、香粧品学，薬理学，犯罪科学などにも応用できる。
背景技術
臨床的状況において、健康な組織を冒さない態様で、即ち、血液サンプルや臓器などの一部を採集することなく皮膚中のコレステロールを測定して組織コレステロールのレベルを評価することができる。
ヒトまたは動物の血管中に存在する種々の化学物質（グルコース、アルコール、乳酸塩、ヒポキサンチン）を皮膚表面において検出する方法は公知である。この方法では、シリコン表面に固定した酵素を皮下投与し、皮膚の局部を３８−４４℃に加熱し、電気化学的センサーによって皮膚表面に存在する酸素または過酸化水素の含有率の局部的変化を記録する（米国特許第４，４５８，６８６号，Ａ  ６１  Ｂ  ５／００，１９８４年７月刊行）。
この公知方法の欠点は、固定化酵素の皮下投与が複雑であり、直接組織中に過酸化水素が形成されるため、由々しい結果（ヘモグロビンからメトヘモグロビンへのトランジション）−低酸素症を誘発しかねないことである。
組織サンプルを採取してからコレステロールを抽出することによって皮膚コレステロールを測定する方法も公知である。この方法では、総コレステロールの量だけでなく、遊離及びエステル化コレステロールの量も測定できる（Ｈ．Ｂｏｕｓｉｓｓｏｕ，Ｍ．Ｔｈ．Ｐｉｅｒａｇｇｉ．Ｍ．Ｊｕｌｉａｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｏｒｔｉｃ  ａｔｅｒｏｍａｔｈｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｋｉｎ  ｂｉｏｐｓｙ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｖ．１９，ｐｐ．４４９-４５８）．
この方法を発展させたのが抽出法であり、この抽出法では、生体の皮膚の一部から直接的に組織サンプルを採取することなく、コレステロールを抽出する。エクストラクタントとしてエチル・アルコールとエーテルの混合物が使用される。エクストラクタントの入った試験管を皮膚表面に数分間固定する。皮膚表層中の脂質が溶けてエクストラクタント溶液中に移行したら、溶剤を蒸発させ、脂質相へ移行した物質を分析する（Ｙｕ．Ｍ．Ｌｏｐｕｋｈｉｎ．Ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  Ａｔｈｅｒｏｓ  ｃｌｅｒｏｓｉｓ「ａ  ｔｈｒｅｅ-ｄｒｏｐ  ｔｅｓｔ」．１９９２，Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｃｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ＵＫ）。
表皮中のコレステロール含有率は皮膚におけるコレステロールの蓄積を反映し、大動脈中のコレステロール含有率と、また、動脈硬化症の場合なら大動脈の損傷範囲と相関する（Ｙｕ．Ｍ．Ｌｏｐｙｋｈｉｎ．Ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ「ａ  ｔｈｒｅｅ-ｄｒｏｐ  ｔｅｓｔ」，１９９２，Ｇｏｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｃｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｓ．Ａ．ＵＫ）。
従って、皮膚中のコレステロール含有率を測定することで組織中におけるコレステロール蓄積状態に関するユニークな情報が得られ、動脈硬化症（臨床前の状態）の早期診断の観点からも、動脈硬化患者の治療モニターの目的からも極めて重要である。
薬理学の分野においては、皮膚中のコレステロール測定方法によって、組織中におけるコレステロールの合成（調節ホルモン）及び種々の吸着剤による生体からのコレステロール除去に作用する薬剤の有効性の評価を行なうことが可能になる。
この公知方法の欠点は、バイオプシーを行なう必要があることと、エクストラクタント溶液を皮膚と接触させねばならないことと、分析に多大の時間を要することである。
この発明の方法に最も似ている方法として、皮膚表面の一部を準備処置し、皮膚（または他のコレステロール含有面）に、一般式Ａ−Ｃ−Ｂで表される所定量の親酵素配合体を塗布する。
式中，Ａはコレステロールと結合可能な化合物（親和化剤）、Ｃはリンク・ブリッジまたはポリマー、Ｂは対応基質の変換による呈色生成物を形成する酵素である。コレステロールの量は染料から被染色形態へのトランジション強度に基づいて測定される（米国特許第５，４８９，５１０号，  Ａ  ６１  Ｂ  １０／００，１９９６年２月刊行-プロトタイプ）．
この方法の欠点は、用途に制限があること、即ち、エステル化コレステロールは測定できず、分析感度が低く、特に、コレステロールだけでなく、その他の脂質と配合体が相互作用することである。
発明の開示
この発明の目的は、感度を高め、方法を簡略化し、用途を広げ、ヒトの皮膚及びその他の濃縮培地中に存在するコレステロールの測定精度を高めることにある。
上記目的を、皮膚表面の一部を準備処置し、界面活性剤を含む所定量の酵素水溶液を皮膚表面に塗布し、露出させ、反応溶液中のコレステロール濃度を測定して皮膚コレステロール濃度を算出する、皮膚コレステロール測定方法において、皮膚表面の一部を準備処置した後、酵素溶液及び界面活性剤と皮膚との接触面積を器具によって制限することを特徴とする皮膚コレステロール測定方法によって達成する。その場合、遊離組織コレステロール測定用の界面活性剤含有酵素溶液は下記の組成を有する（重量％）。
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総コレステロール測定のための組成は次のとおり調製する（重量％）。
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皮膚に塗布した溶液を２分間露出させて遊離コレステロールを測定し、１０分間露出させて総コレステロールを測定し、反応溶液中の過酸化水素濃度を直接測定すろことによってコレステロール濃度を評価する。界面活性剤溶液と皮膚との接触面積の制限は、底のない密閉キュベットを利用し、その基部を皮膚に固定することによっておこなう。
種々の供給源（例えば、ノカルジア・エリスロポリスのようなアミノ酸生産菌）から得られるコレステロールオキシダーゼ）を使用する。コレステロールとコレステロールオキシダーゼとが相互作用する際に発生する過酸化水素を、電気化学的センサーによって、または吸光度測定装置によって測定する。
コレステロールオキシダーゼは、分子酸素の関与と過酸化水素形成でコレステロールの酸化を促進する触媒として作用する：
コレステロール＋Ｏ2＝４-コレスチン３-ＯＨ＋Ｈ2Ｏ2
濃度０．０４〜０．０６％のイオン界面活性清浄剤（デオキシコール酸ナトリウム［ＤＯＣ］と濃度０．１〜０．２％の両性イオン清浄剤、ここでは３−（ドデシル−ジメチル−アンモニウム）−プロパンスルホネート（ＤＡＰＳ）を使用すれば、理想的な速度と完成度でコレステロールの酸化を検知できる。この反応系を採用すれば、界面活性剤の抑止作用を弱めることによってコレステロールオキシダーゼの作用効果を高め、高価な清浄剤の消費量を節減することができる。このような清浄剤組成は、遊離コレステロールへのアクセスを容易にし、その酸化速度を高める。従って、遊離コレステロールの測定に、比較的低濃度のコレステロールオキシダーゼを使用することができる。測定値のキネマチック・バリエーションを利用するば、僅か４−８ｎｍｏｌ／ｍｌの反応混合物で充分であり、１０分後のコレステロール完全酸化に基づく最終時点での測定なら、反応混合物１ｍｌ当たり２０ｎｍｏｌの酵素で充分である。
光分析法を利用すれば、オキシダーゼ基質の検出可能な下限が約１０-6Ｍとなる。
コラーゲン・フィルムにコレステロールオキシダーゼを固定した電気化学的センサーを利用すれば、１０-4〜０．０８ｎＭのコレステロール濃度を測定することができる（ソビエト特許第６２２４２４号，Ｇ ０１ Ｎ ３３／１６，１９７６  Ｂｅｒｔａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８１．Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｆｉｌｍ．Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．Ｖ．１２６，ｐｐ．２３-３４）。
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２種類の清浄剤の比率を変えながら、基準コレステロール溶液中に含まれる遊離コレステロールの酸化過程で得られたデータを表１に示す。結果を表す単位として光学密度（ＣＤ）を用い、酸化反応の速度（Ｖ）をキネチック・カーブの傾斜角度で示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、底のない密閉キュベットを示す。
図２は、所定量の溶液の塗布を示す。
図３は、溶液と接触させられた電気化学的電極を示す。
発明の実施例
この発明の方法は、下記の態様で実施する。先ず、測定すべき皮膚の一部をエチルアルコールを含浸させたタンポンで拭う。拭った皮膚部分に特殊な器具を固定する。この器具は、図１に示した底のない密閉キュベットであり、図１において、１は電気化学的センサーまたは蓋体を固定するためのネジ付きキュベットであり、２は皮膚表面にキュベットを気密的に固定するためのベースである。キュベットによって、分析が行われる皮膚表面の面積（１ｃｍ2）を制限することができ、酵素と界面活性剤の混合溶液を所定量（０．１ｍｌ）を前記部分に塗布することができる。
皮膚に塗布した溶液を最長２分間にわたって露出させる。酵素と界面活性剤の混合溶液を露出させる過程で、コレステロール含有量に正比例する濃度の過酸化水素が発生する。露出後、過酸化水素を含有する溶液を、その過酸化水素濃度を測定する電気化学的電極に送る。
この発明の一実施例として、皮膚表面に直接配置したキュベット内で電気化学的電極を溶液と接触させる方法を提案する（図３）。
過酸化水素濃度を吸光度測定法を用いて測定する場合、過酸化水素を含む溶液を、現像形（ペルオキシダーゼ酵素及び基質）を収容している測光装置のキュベットへ送る。過酸化水素濃度は、これと正比例する溶液の光学密度値によって与えられる。実験室のような条件下では、測光装置を利用して液相中の過酸化水素濃度を測定するのが好ましい。実験室の外、例えば、家庭での診断には、いわゆる“ドライ”な化学技術を利用する方法を採用することができる。この方法を実施するには、紙片で形成した比色インジケーターを使用すればよく、必要な濃度範囲を完全にカバーする０．２〜２０ｍｇ／ｌの過酸化水素濃度を測定できる。
比色インジケーター（紙片）で測定する場合、キュベット内にあって皮膚表面に塗布され、露出している酵素及び界面活性剤の混合溶液に紙片を浸漬させる。浸漬後、紙片に現れる色の変化を評価するが、これもまた発生した過酸化水素の濃度によって測定するか、カラー・スケールまたはポータブル反射測光計によって測定する。
皮膚表面におけるコレステロール量の測定は、コレステロールオキシダーゼ酵素とコレステロールとの酸化反応中に発生する過酸化水素量によって測定できるだけでなく、反応中の酸素消費量によって、さらには、酸化したコレステロール−コレステノンの値によっても測定できる。利便性や簡便性の点では、過酸化水素測定に基づく方法が好ましい。
遊離コレステロールだけでなく、エステル化コレステロールの測定も診断にとって重要である。両者の比率が種々の疾病に応じて異なるからである。エステル化コレステロールを測定することによって，遊離及びエステル化コレステロールの合計である総コレステロールの測定を行なうことができるからである。このため、発明者らは，膵臓組織及び微生物から得たコレステロールエステラーゼ酵素によるコレステロールエステルの酵素加水分解を行なった。皮膚表面上に存在するエステル化コレステロールを測定するため、酵素としてのコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと界面活性剤との混合溶液を皮膚表面に塗布した。溶液を１０分間露出させた後、上述した方法の一つで過酸化水素を測定した。
例１
電気化学的センサーによる健常なボランチャーにおける遊離コレステロールの測定。手のひらの皮膚表面（母指球）に、図１に示したキュベットを載置する。キュベットは、酵素と界面活性剤の混合溶液０．１ｍｌを皮膚表面１ｃｍ2に固定することができる。先ず，皮膚表面をエチルアルコール溶液で拭い、キュベットを載置してから、下記組成（重量％）の溶液をキュベットに注入する。
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溶液を皮膚表面上に２分間放置した後、溶液の０．０５ｍｌを取出し、電気化学的センサーの測定面に供給する。５秒後、結果−発生した過酸化水素の量に比例する現在値を読み取る。換算装置により、皮膚表面における遊離コレステロール値をμｍｏｌ／ｌまたはμｇ／ｃｍ2単位で液晶スクリーンに表示することができる。
方法（４）を利用してコレステロールを測定することによって、１個、２個または３個の着色点を検出することができる。こらら２つのテストを同時に行なった結果を表２に示す。表２から明らかなように、皮膚に含まれる遊離コレステロールの偏差が１０．１から５．５μｍｏｌ／ｌまでほぼ２倍の変化を示すテスト番号１〜３，５の場合の陽性反応を１個の＋マークで表し、コレステロール濃度９．３μｍｏｌ／ｌのテスト番号４の場合は反応を２個の＋マークで表した。
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例２
臨床的に虚血性心疾患（ＩＨＤ）と呼称される狭窄性動脈硬化症患者の遊離コレステロールの測定。例１に述べた方法によれば、ＩＨＤ患者の皮膚における遊離コレステロールのレベルは、１８．７〜３５．８μｍｏｌ／ｌの範囲である（表３参照）。
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例３
特殊な紙片による遊離コレステロールの測定。手のひら（母指球）の皮膚表面にキュベットを載置することによって、酵素と界面活性剤との混合溶液０．１ｍｌを皮膚表面１ｃｍ2に固定することができる。先ず、皮膚表面をエチルアルコール溶液で拭う。キュベットを配置した後，コレステロールオキシダーゼと界面活性剤との混合溶液を注入する。２分間放置した後、特殊紙片を溶液に浸漬する。皮膚の遊離コレステロール含有量を、較正カラー・スケールによって、または、反射測光計の指示値によって算出する。
例４
皮膚コレステロールの総コレステロール（遊離及びエステル化の合計）の測定。手のひらの皮膚表面にキュベットを載置して、所定量の下記溶液を皮膚表面に固定する。
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キュベットを特殊な蓋体で閉鎖した後、この例の場合、１０分間で蒸発が起こり、溶液が濃縮される。対照グループでは、平均して総コレステロール含有量が遊離コレステロール値よりも１０〜２０％多い。即ち、エステル化コレステロール値は、総皮膚コレステロールの１０〜２０％である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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