(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
0003634894.tif 000005
にて示される  Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン。
【請求項２】
Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェ  ニルアラニンを主成分とする抗菌剤。
【請求項３】
Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェ  ニルアラニンを主成分とする抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はセンチニクバエ成虫から分離され、合成も可能な新規化合物及びその抗菌剤及び抗腫瘍剤としての用途に係る。
本発明による化合物は一般細菌のみならず、真菌に対しても優れた抗菌活性を示し、毒性が低く、又抗腫瘍活性を示す。従って、該化合物は抗菌剤又は抗腫瘍剤の有効成分として利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
昆虫類にワクチン等を接種すると、その体液中に抗菌性の生理活性物質が出現することが知られている。本発明者はセンチニクバエ  （Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）  の幼虫及び胚由来細胞に関して各種のペプチド系抗菌性化合物の存在を発見、確認し、報告してきた  （特公平  ３  −  ７０４７３  公報等）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ペプチド系化合物を実際に医薬品として使用するためには経口投与では安定性に課題があり、注射投与にあっては抗原性の問題から、ペプチド系化合物であって上市されている医薬品の有効成分は低分子物質である場合が多い。一方、本発明者により従来発見・確認されてきたセンチニクバエ由来の抗菌性物質は分子量が  ３，０００  −  ７，０００  程度のものである。
従って、センチニクバエ由来の生理活性物質においても、分子量が更に低く、活性に富み、しかも安全性の高い物質の発見が期待されていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段及び方法】
本発明者はこのような観点に立って、センチニクバエ成虫から低分子性物質を抽出し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ５９４  （Ｓｔｒｒ）  株  （ストレプトマイシン耐性菌株）  に対する抗菌活性を指標として抗菌性を調べた結果、構成アミノ酸の数が少なく、従って低分子量であって抗菌性において優れ且つ抗腫瘍活性をも有している新規な化合物を見い出し、本発明の端緒を得た。
【０００５】
本発明による抗菌性及び抗腫瘍性化合物は式
【化２】
0003634894.tif 000002
にて示される  Ｎ−β−アラニル−５−Ｓ−グルタチオニル−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン  （以下、「５−Ｓ−ＧＡＤ」と略記する場合がある）  であって、その分子量は約  ５７０  であり、この化合物によって既述の課題が解決される。
【０００６】
上記の化合物は、センチニクバエの成虫に傷を与えて飼育した後に体液を採取するか、ホモジネート化して原料となし、これをイオンカラムクロマトグラフィー及び逆相  ＨＰＬＣ  により分離・分画処理して抗菌活性を有する画分を採取する手法により得ることができる。
尚、この化合物は上記の式に付記されているように構成アミノ酸の数が  ５  つ  と少ないのでアミノ酸の縮合合成法及び酵素処理法の両者を利用して得ることもできる。
【０００７】
本発明による化合物は毒性が低く、グラム陽性菌［Ｍ．  ｌｕｔｅｕｓ  （ＦＤＡ  １６），  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＩＦＯ  １２７３２）］、グラム陰性菌  （Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ５９４）  の増殖を  ３０μＭ  の濃  度で維持することにより  ５０％  阻害活性を示すことが確認されている。
尚、本発明による化合物は分子内にカテコール骨格を有しており、一般のカテコール類と同様に各種の腫瘍細胞に対して毒性を有しており、従って抗腫瘍活性をも示す。
【０００８】
本発明による化合物を投与するに際して、全身作用を目的とする場合は対象患者の疾患状況、年齢、性別、体重等を考慮して投与量が決定されるが、成人  １日当り  １  −  １０００ｍｇ  の範囲内、好ましくは  １０  −  １００ｍｇ  程度である。尚、局所の殺菌目的のためには、本発明による化合物が患部に少なくとも  ３０  −  １００μＭ  の  濃度で存在するような製剤形態で適時使用される。
【０００９】
【実施例等】
次に製造例及び試験例に関連して本発明を更に詳細に説明する。
製造例  １  （５−Ｓ−ＧＡＤ  の抽出及び精製）
センチニクバエ成虫  （１０，０００  匹）  に対して免疫応答を誘発させるために、微  生物  （大腸菌）  を付着させた針を用いて刺し、２４  時間後に酸性抽出を行った。  この抽出液を  ＯＤＳ−ＡＭ  １２０−Ｓ  ５０−カートリッジ  （ＹＭＣ）  を用いて精製した。
溶出は  ０．０５％  ＴＦＡ  （トリフルオロ酢酸）  を含有するアセトニトリルを用いて行った。抗菌性分子の有無はグラム陰性菌  ［Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ５９４  （ｓｔｒｒ）  を用いて液体中での増菌阻害活性を調べることによりモニターした。幾つかの画分が抗菌活性を示したが、本例においては  ＴＦＡ  酸性下で  １０％  アセトニトリルにて溶出した画分に焦点をおい処、この画分は  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ５９４  （ｓｔｒｒ）  に対して抗菌活性  を示した。
抗菌活性を有する上記の画分を逆相  ＨＰＬＣ  用の  ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  （Ｒ＆Ｄ  Ｒ−ＯＤＳ−５  Ｓ−５１２０Ａ  Ｃ−１８）  カラムにアプライした。溶出は流速  １ｍｌ／ｍｉｎ  で、４０分間をかけて０．１％  ＴＦＡ  含有アセトニトリルの濃度を  ０  −  ４０％  に上昇させることにより行った。次に、この逆相  ＨＰＬＣ  で得られた活性画分を用いて順相  ＨＰＬＣ  （Ｃａｒｂｏｎ−５００）を行った。この場合における溶出条件は流速  １ｍｌ／ｍｉｎで、６０分間かけて  ０．１％ＴＦＡ  を含有するアセトニトリルの濃度を  ０  −  ３０％  に上昇させることであった。  次に最終段階として更に逆相  ＨＰＬＣ  を行うことにより活性分子の  １  つを  ３ｍｇ  を得た。この物質を  １Ｈ−ＮＭＲ  スペクトル  に供した処、単一の物質であることが判  明した。
【００１０】
試験例  １  （５−Ｓ−ＧＡＤ  の物理化学的特性及び化学構造）
４％  チオグリコール酸含有  ６Ｎ−ＨＣｌ  中において  １３５℃  で  ３  時間加水分解した  後に  ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−８５００  アミノ酸自動分析装置によりアミノ酸組成を分析し、ＪＥＯＬＪＭＳ−ＳＸ  １２０Ａ  質量分析計を用い且つ  ｍ−ニトロベンジルアルコール−グリセロールマトリクスを用いた  ＦＡＢ  モードによりポリエチレングリコールを内部標準とし  て高分解能  Ｍａｓｓ  スペクトルを測定し、パルスフィールドグラディエントシステムを備えた  Ｖａｒｉａｎ  ＵＮＩＴ  Ｙ  ｐｌｕｓ  ５００  分光計を用いて  ＮＭＲ  スペクトルを測定し、Ｖａｃｕｕｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ＥＳＣＡ  （ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）  ＬＡＢ  を用いて元素分析が行われた。
これらの分析の結果、５−Ｓ−ＧＡＤ  は分子量が  ５７４．１９  （理論分子量  ：  ５７４．１８０４）  であり、１  分子当り硫黄原子  （Ｓ）  を  １  個有しており、分子式は  Ｃ２２Ｈ３１Ｏ１１Ｎ５Ｓ  にて表わされ、β−アラニン  （β−Ａｌａ）  と  ＤＯＰＡ  とシステイン  （Ｃｙｓ）  とグリシン（Ｇｌｙ）  とグルタミン酸  （Ｇｌｕ）  との  ５  個のアミノ酸により構成されており、その化学構造は既述の式にて示されるものであることが判明した。
【００１１】
試験例  ２  （抗菌活性）
指標微生物として種々の菌を  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｄｉｆｃｏ）  中で増殖させた。  指標増殖期の各微生物細胞を集め、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ  と  ０．２％  ＢＳＡ  を含有する  １０ｍＭ燐酸緩衝液  （ｐＨ  ６．０）  中に懸濁させ、分光光度計  （Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２１００）  で  ６００ｎｍの吸光度が  ０．３  となるようにし、更に上記の  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ  を用いて  ３００倍に希釈した。０．０５％  ＢＳＡ  を含有する  １００ｍＭ  燐酸緩衝液で希釈した試料  （５−Ｓ−  ＧＡＤ）  １０μｌ  を  ９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ  に添加し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２５９４  （ｓｔｒｒ）液  １００μｌ  も添加して  ３７℃  で  ５  時間保持した。微生物の増殖は  １００ｍＭ  燐酸緩衝液  １００μｌ  で希釈した後に  ６００ｎｍ  における吸光度の増加により評価した。
結果は、下記の表に示される通りであり、又  ５−Ｓ−ＧＡＤ  は  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ５９４（ｓｔｒｒ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ  （ＦＤＡ  １６）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ  （ＩＦＯ  １２７３２）    に対してそれぞれ  ０．０３μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ  の濃度で阻害作用を示した。
尚、抗菌スペクトルに特異性は余り認められず、グラム陰性菌、陽性菌の何れに対しても  ５−Ｓ−ＧＡＤ  は活性を示すことが判る。
【００１２】
【表１】
0003634894.tif 000003
【００１３】
製造例  ２  （５−ｓ−ＧＡＤ  の合成）
ｔ−ブトキシカルボニル−ｂ−アラニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと  Ｌ−ｂ−３，４−  ジヒドロキシフェニルアラニン  （ＤＯＰＡ）  とをジクロロメタン、トリエタノールアミン、シアン化メチル及びジメチルフルオリドの存在下に反応させ、次いで反応混合物に  １Ｎ−ＨＣｌ  を添加して酸性条件下に酢酸エチルを用いて抽出処理を行った。酢酸エチル層については減圧下に濃縮して析出する結晶を濾取した。
得られた結晶を溶解し、  ＨＰＬＣ  により  精製して  β−アラニル−ＤＯＰＨ  を合成し  た。
尚、この  β−アラニル−ＤＯＰＨ  は液相ペプチド合成法により調製することもできる。
得られた  β−アラニル−ＤＯＰＨ  を  １Ｈ−ＮＭＲ  により同定した上で、グルタチオンと共に  １０Ｍ  燐酸緩衝液  （ｐＨ  ６．５２）  に溶解し、チロシナーゼ  （ＥＣ  １．１４．１８．１）  にて処理した。
反応溶液を  ６Ｎ−ＨＣｌ  にて  ｐＨ  １  となし、ＨＰＬＣ  により分離・精製すれば、所望  の  ５−Ｓ−ＧＡＤ  が得られる。
合成された  ５−Ｓ−ＧＡＤ  の  １Ｈ−ＮＭＲ  スペクトルは単一の化合物であることを示し、当該スペクトルは製造例  １  において言及したものと実質的に同一であった。
【００１４】
試験例  ３  （抗菌活性）
上記の製造例  ２  において合成された  ５−Ｓ−ＧＡＤ  と、既述の製造例  １  により得  られた抽出・精製  ５−Ｓ−ＧＡＤ  に関する抗菌活性を  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ５９４  （ｓｔｒｒ）  の増  殖抑制により調べた結果は、図  １  に示される通りであり、両者の抗菌活性は実  質的に等しかった。
この結果並びに製造例  １  及び  ２  において言及した  １Ｈ−ＮＭＲ  スペクトルに関する測定結果から、抽出・精製により得られた物質と合成により得られた物質とは実質的に同一であると判断された。
【００１５】
試験例  ４  （抗腫瘍活性）
本発明による化合物は  ＤＯＰＡ  を構成アミノ酸の  １  つとしており、該  ＤＯＰＡ  は  分子内にカテコール構造を有し、このカテコール構造を有する化合物は一般に腫瘍細胞に対し毒性を示すことが知られている。
従って、５−Ｓ−ＧＡＤ  の構造から判断すると該化合物も抗腫瘍活性を有することが期待されたので、５−Ｓ−ＧＡＤ  が腫瘍細胞に対し毒性を示すか否かを調べるために、合成  ５−Ｓ−ＧＡＤ  を用いて  ＭＴＴ  法により種々の腫瘍細胞系に関して調べた。
即ち、５７０ｎｍ  における吸光度の減少により抗腫瘍活性を評価したのである。この  ＭＴＴ  法とは  ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミド  （ＭＴＴ）  が生存細胞の  ＤＮＡ  に結合すれば  ＵＶ  吸収を生じるこ  とを利用するものである。
結果は下記の表に示される通りであり、この表において活性は  ＩＣ５０  として表わされており、これはコントロールと比較して細胞の増殖を  ５０％  阻害し得る濃  度を示している。
【００１６】
【表２】
0003634894.tif 000004
【００１７】
試験例  ５  （急性毒性）
雄性マウスを実験動物とし、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ  の割合で  ７  日間にわたり静脈内投与して挙動を含む一般症状を観察したが、異常は認められず、死亡例もなかった。従って、本発明による化合物は毒性がない又は極めて低いものであることが判明した。
【００１８】
【発明の効果】
本発明による化合物は抗菌及び抗腫瘍活性が高く且つ毒性が低い点において優れている。従って抗菌剤や抗腫瘍剤の有効成分として利用することができる。該化合物は、体表に傷をつけたセンチニクバエの体液から抽出・精製により得ることができ、又構成アミノ酸数が  ５  つであるので合成も容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】抽出・精製及び合成により各々得られた本発明による化合物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ５９４  （ｓｔｒｒ）  の細胞増殖に与える影響を調べた結果を示すグラフであ  る。
【図１】
0003634894.tif 000006