(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内で、ヒスタミン受容体を有する卵母細胞の膜電位を固定する工程と、
壁面に抗原が固定されたキャピラリーで、抗原刺激をした試料を、前記キャピラリーから前記容器内に送液し、前記卵母細胞に対して添加する工程と、
前記卵母細胞の電気的応答量を検出する工程と、
前記卵母細胞を既知の複数の濃度のヒスタミンで刺激した電気的応答量と、前記濃度との関係の検量線に対し、前記試料添加後の電流応答量を当てはめてヒスタミン濃度を定量することを特徴とするヒスタミン計測方法。
【請求項２】
請求項１記載のヒスタミン計測方法において、前記試料は、全血であることを特徴とするヒスタミン計測方法。
【請求項３】
請求項１記載のヒスタミン計測方法において、さらに、（Ａ−Ｃ）／Ｂ（Ａ：抗原刺激により遊離した全血のヒスタミン濃度、Ｂ：全血中の細胞に含まれる全てのヒスタミンを放出させた全血のヒスタミン濃度、Ｃ：全血中の自然遊離ヒスタミン濃度）で求められるヒスタミン遊離率を測定する工程を有することを特徴とするヒスタミン計測方法。
【請求項４】
壁面に抗原が固定されたキャピラリーと、
ヒスタミン受容体を有する卵母細胞を保持するための穴を有する容器と、
前記容器に前記キャピラリー内の反応液を送液する送液手段と、
前記卵母細胞の膜電位を固定する手段と、
前記卵母細胞の電気的応答量を検出する手段とを有し、
前記卵母細胞を既知の複数の濃度のヒスタミンで刺激した電気的応答量と、前記濃度との関係の検量線に対し、試料添加後の電流応答量を当てはめてヒスタミン濃度を定量することを特徴とするヒスタミン計測装置。
【請求項５】
請求項４に記載のヒスタミン計測装置において、前記試料は全血であることを特徴とするヒスタミン計測装置。
【請求項６】
請求項４に記載のヒスタミン計測装置において、前記キャピラリーを所定の温度に制御する温度制御手段をさらに有することを特徴とするヒスタミン計測装置。
【請求項７】
請求項６に記載のヒスタミン計測装置において、前記所定の温度は、３０℃以上４５℃以下であることを特徴とするヒスタミン計測装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本法は試料、特に血液や細胞培養液中に存在するヒスタミンを定量する方法を提供するためのものである。計測系としては特にヒスタミンの検出にヒスタミン受容体発現卵母細胞の細胞反応を用いるものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒスタミン遊離試験法は血液中の白血球や粘膜組織中の肥満細胞を刺激し、細胞中からヒスタミンを遊離させ、遊離したヒスタミンを定量する方法である。本法はアレルギー疾患についてそのアレルゲンを特定する方法として報告されている（田部一秋：アレルギーの診断−ヒスタミン遊離試験、SRL宝函Vol.21、No.1-2、1997）。遊離ヒスタミン測定法に関しては、例えば特開平6-331619に示されたような蛍光高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法によりヒスタミンを分離後、蛍光試薬と反応させ、その蛍光量を測定する方法、または特開平10-62415や特開平10-170514に示されたような遊離ヒスタミンをガラスファイバーで分離後、蛍光試薬と反応させ、その蛍光量を測定する方法、さらにICN Pharmaceuticals社やImmunotech社から販売されている競合アッセイによるELISAなどが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の蛍光量測定によるヒスタミン遊離試験法では試料中からヒスタミンのみを分離し、分離したヒスタミンを標識し、その標識化合物の量を遊離ヒスタミン量としている。本発明はこの間接的なヒスタミン定量法に対して、ヒスタミン受容体を用いることにより直接ヒスタミンを定量する方法を提供するものである。またヒスタミン受容体を用いることにより、試料中にヒスタミン誘導体やヒスタミン類似物質など夾雑物が混入、あるいは非常に微量しかヒスタミンが含まれていない場合においても、特異性高くヒスタミンを認識する方法を提供するものである。また特異性の高い受容体を用いることにより試料を精製するなどの煩雑な操作を必要とせずに簡便にヒスタミンを定量する方法を提供するものである。さらにヒスタミンを直接認識することが可能で、特異性の高い受容体を用いることにより、ヒスタミンの標識、精製などが不要になるためより短い測定時間でヒスタミンを定量する方法を提供するものである。
【０００４】
さらに検出方法はヒスタミン受容体発現卵母細胞がヒスタミンを認識した時の細胞の生理的反応を直接電気信号に変換し行う。細胞反応はミリ秒以下で起こることが知られており、ヒスタミンの検出時間は1秒以内で行うことが可能となる。すなわち、他の検出方法と比較して、極めて迅速にヒスタミンの有無を判断できる方法を提供するものである。
【０００５】
ここで一般的にヒスタミン遊離試験に対して要求される機能・課題をまとめると、以下の項目に要約される。
【０００６】
（1）標識化合物ではなく、ヒスタミンを直接定量できること。
【０００７】
（2）試料の前処理なしで測定できること。
【０００８】
（3）迅速に結果が得られること。
【０００９】
（4）特異性の高い測定方法であること。
【００１０】
そこで本発明は以上に述べた課題を達成するためのヒスタミン遊離試験法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明のヒスタミン遊離試験法は予めヒスタミン受容体を発現させた細胞に対し抗原刺激後の全血を添加し、その細胞反応を検出することから成っている。採血された全血に抗原を一定量添加し、10-30分間程度、37℃で反応させる。なお、反応時間はあくまでも目安にすぎず、アレルギー反応の最適化により変る場合がある。この際、軽く振とうさせることが望ましい。この間にヒスタミン受容体発現細胞を既知の複数の濃度のヒスタミンで刺激し、細胞の反応量とヒスタミン濃度間の濃度−応答曲線（検量線）を求めておく。抗原刺激後の全血でヒスタミン受容体発現細胞を刺激しその反応量を検量線にあてはめ、抗原刺激後の全血に含まれるヒスタミン濃度を定量する。なおヒスタミン遊離率は抗原刺激後の全血のヒスタミン濃度を全血を凍結融解することにより、血中の細胞に含まれるヒスタミンを放出させた全血に含まれるヒスタミン濃度を定量した値で割ることによって求める。また抗原の代わりに緩衝液を加えて、同一条件下においた全血を用いて血液中の細胞からのヒスタミンの自然遊離濃度を求める（コントロール）。この手法を用いることにより20-50分間程度でヒスタミン遊離試験を行うことが可能になる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のヒスタミン遊離試験法は予めヒスタミン受容体を発現させた細胞に対し抗原刺激後の全血を添加し、その細胞反応を検出することから成っている。以下では細胞反応検出法としてヒスタミン受容体を介する塩素イオンチャネルの応答の電気生理学的検出法を用いて説明するが、必ずしも塩素イオンチャネル応答や電気生理学的検出法に限定されるべきものではなく、特開平9-242377に示したようにその他の受容体刺激に由来する細胞応答やその検出方法を含むものである。
【００１３】
以下、図面を用いて本発明の実施例を説明する。
【００１４】
図1はヒスタミン受容体発現卵母細胞を用いたヒスタミン定量法の概略図である。緩衝液を満たした本体部分1にヒスタミン受容体発現卵母細胞2を置く。3M KClを充填し、塩化銀でコ−ティングした銀線をつないだ2本のガラス電極3、4を卵母細胞2に刺入する。電極3からのリードアウトは外部電極5との電位差として差動増幅器6、および記録装置7に送られ、記録される。差動増幅器は、電極3から差動増幅器6に送られたシグナルと固定電位の差分の電流を電極4を通して卵母細胞に加える。このように膜電位固定した卵母細胞にヒスタミン8をピペット9などにより滴下するとに細胞の電流応答10を得ることができる。
【００１５】
図2は上記の手法で得られたヒスタミン濃度と細胞応答の関係について示したものである。ヒスタミン濃度20-200nMの範囲においてヒスタミン濃度と電流変化量、すなわち細胞の電流変化量は正の相関関係にある。つまり細胞の電流変化量から試料中に含まれるヒスタミン濃度を求めることができる。
【００１６】
図3は血液中のヒスタミンによる細胞の電流応答を示したものである。ヒスタミン受容体発現卵母細胞にヒスタミン含有血液を添加するとＡに示したような細胞の電流変化がある。一方、ヒスタミンを含まない血液を添加するとＢに示したように電流変化は起こらない。つまり、Ａで示した電流変化は血液中の他の狭雑物ではなく、ヒスタミンに反応して引き起こされたものである。すなわち本法では、血液中のヒスタミンを分離・精製・標識することなく、そのままの形で定量することができる。
【００１７】
実施例1
図4は本法をアレルギー診断に適用する際の基本プロトコルを示した図である。採血された全血11に例えばスギ花粉などの抗原12を一定量添加し、10-30分間程度、37℃で反応させる。抗原刺激により、血液中好塩基球13よりヒスタミン8が放出される。この間にヒスタミン受容体発現卵母細胞を既知の複数の濃度のヒスタミンで刺激し、図2と同様な細胞の電流変化量とヒスタミン濃度間の濃度−応答曲線（検量線）を求めておく。抗原刺激後の全血をピペットなどで採取し、ヒスタミン受容体発現細胞を刺激する。その電気的応答量を検量線にあてはめ、抗原刺激後の全血に含まれるヒスタミン濃度を定量する。なおヒスタミン遊離率は、抗原刺激により遊離した全血のヒスタミン濃度をA、凍結融解法により血中の細胞に含まれる全てのヒスタミンを放出させた全血のヒスタミン濃度をB、コントロールとして抗原の代わりに緩衝液を加えて、血中の細胞から自然遊離ヒスタミン濃度をCとして、（A-C）/Bによって求める。
【００１８】
この手法を用いることにより、特開平10-62415や特開平10-170514の手法による3時間、ELISA法による4時間と比較して測定時間が30分程度と短かくなる。また作業行程も4ステップと他の手法と比較してきわめて少ない。さらにヒスタミン濃度を直接測定するための標準ヒスタミン以外の試薬類を必要とせず、コストの削減が図れる点も特徴の一つである。
【００１９】
実施例2
図5は本法を用いて全血中及び抗原（スギ花粉）刺激により血液中の細胞から血漿中に遊離したヒスタミン濃度を定量した結果である。遊離ヒスタミン量から緩衝液のみで刺激した際に遊離したヒスタミン量（コントロール）分を差し引いた値を、全血を凍結融解して得られたヒスタミン量で割ることにより、抗原刺激によるヒスタミン遊離率を求めた。一般のヒスタミン遊離試験において特定の抗原刺激によるヒスタミン遊離率が10％以上であるとき、その検体のアレルギー反応はポジティブであると考えられている。つまり検体1と3はスギ花粉に対してアレルギー反応が起こっていると考えられる。これらの結果は従来法であるHRT試験および被験者の自覚症状と一致した。
【００２０】
実施例3
図６に全血を用いたアレルギー検査を行うための実際の反応容器を示す。本容器は卵母細胞を固定しガラス電極3、4で電流変化を計測する部分、卵母細胞を一定容量の緩衝液に浸すためと、容器内部を洗浄するための排水路の部分、さらにアレルギー反応を起こさせた血液を卵母細胞に添加する部分からなる。
【００２１】
次に、実際の測定方法に関して詳細に説明する。水路14より卵母細胞用の緩衝液を流し容器を満たし、その後水路15より真空ポンプ等で余分な液を排出する。これにより卵母細胞を浸すために十分な液を常に一定量に保つことができる。ヒスタミン受容体のmRNAを導入後2-3日培養した卵母細胞2をその溶液に静かに沈め、卵母細胞用穴16に固定する。ガラス電極3を卵母細胞に刺し卵母細胞の膜電位をチェックする。次に、ガラス電極4を卵母細胞に刺し、膜電位を-60mVに固定する。
【００２２】
その後図4で示した操作により調整した全血11をピペット9で卵母細胞2に静かに添加する。全血11にはヒスタミン遊離反応により放出されたヒスタミン8が含まれている。そのヒスタミンが卵母細胞２を刺激することにより、電流変化を測定することができる。その電流変化量の大きさより全血中のヒスタミン量を定量することができる。
【００２３】
ヒスタミン遊離反応を起こさせた全血をピペット9で添加する方法以外に、本容器の一部に全血のヒスタミン遊離反応をするための部品を取付け、全血のヒスタミン遊離反応からその反応に伴なうヒスタミン放出量の定量までを連続的に計測することも可能である。5-20mLの微量な血液をガラスキャピラリー17に直接注入する。このガラスキャピラリー17の内壁にはすでに花粉などの抗原12がコートしてある。そのガラスキャピラリー17を卵母細胞反応容器に付属されているヒーター部分18に刺し込む。このヒーター部分１８は温度制御部（図示せず）により所定の温度に設定されている。そのガラスキャピラリー17を37℃で約30分間ほど温め、ヒスタミン遊離反応を起こさせる。本実施例ではガラスキャピラリー１７を37℃に温めたが、ヒスタミン遊離反応を起こる３０〜４５℃範囲であればよい。その反応後、コック19を開きガラスキャピラリー17の内部の全血11を卵母細胞2に送付手段（図示せず）により添加し電流反応を測定する。
【００２４】
一連の卵母細胞の反応を測定した後、ガラス電極3、4を卵母細胞2から抜き取り、排水路20から吸引により溶液と共に卵母細胞2を排出する。水路15より洗浄水を流し排水路20より排出する。これらの操作を3-4回繰り返し、容器内部の汚れを流す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明ではヒスタミンの検出にヒスタミン受容体発現細胞を用いることにより、標識化合物としてではなく、ヒスタミンを直接定量できることから作業工程及び用いる試薬数を最小限にすることができる。そのため、コストおよび測定時間を削減することが可能になる。さらにこれらの特徴より、全血中の遊離ヒスタミンを前処理なしに短時間で定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒスタミン受容体発現卵母細胞を用いたヒスタミン定量法の概略図。
【図２】ヒスタミン濃度と細胞応答の関係（検量線）を示す図。
【図３】血液中のヒスタミンによる細胞応答を示す図。
【図４】ヒスタミン遊離試験法プロトコルを示す図。
【図５】本法による血中ヒスタミン濃度の測定値を示す表形式の図。
【図６】アレルギー検査用容器を示す図。
【符号の説明】
1・・・本体部分、2・・・ヒスタミン受容体発現卵母細胞、3・・・ガラス電極、4・・・ガラス電極、5・・・外部電極、6・・・差動増幅器、7・・・記録装置、8・・・ヒスタミン、9・・・ピペット、10・・・細胞応答、11・・・血液（全血）、12・・・抗原などヒスタミン遊離物質、13・・・好塩基球、14・・・緩衝液注水溝、15・・・水路、16・・・卵母細胞用穴、17・・・ガラスキャピラリー、18・・・ヒーター部分、19・・・コック、20・・・排水溝。
【図１】
0003707303.tif 000002
【図２】
0003707303.tif 000003
【図３】
0003707303.tif 000004
【図４】
0003707303.tif 000005
【図５】
0003707303.tif 000006
【図６】
0003707303.tif 000007