(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L.ラムノサス(L.rhamnosus)HN001(AGAL 寄託番号NM97/09514;1997 年８月18日) 又はL.ラムノサス(L.rhamnosus)HN067(AGAL 寄託番号NM97/01925;1998 年２月11日) のいずれかの生物学的に純粋な培養菌。
【請求項２】
L.ラムノサスHN001(AGAL寄託番号NM97/09514;1997 年８月18日) の生物学的に純粋な培養菌。
【請求項３】
L.ラムノサスHN067(AGAL寄託番号NM97/01925) の生物学的に純粋な培養菌。
【請求項４】
請求項２のL.ラムノサスHN001 、請求項３のL.ラムノサスHN067 、B.ラクチス(B.lactis)HN019(AGAL寄託番号NM97/09513;1997 年８月18日) 、又はL.アシドフィルス(L.acidophilus)HN017(AGAL 寄託番号NM97/09515;1997 年８月18日) のいずれかの生物学的に純粋な培養菌を、免疫刺激する濃度で、生理学的に適する賦形剤又は希釈剤と共に含んでいる組成物。
【請求項５】
２つ以上の前記菌株を含んでいる、請求項４の組成物。
【請求項６】
４つの前記菌株を含んでいる、請求項４の組成物。
【請求項７】
前記の生理学的に適する賦形剤又は希釈剤が食物である、請求項４〜６のいずれか１項の組成物。
【請求項８】
前記の食物が、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳のいずれかである、請求項７の組成物。
【請求項９】
医薬用であり、且つ前記の賦形剤又は希釈剤が医薬に適するものである、請求項４〜６のいずれか１項の組成物。
【請求項１０】
下記のいずれかの菌株の相同菌又は変異菌の、免疫増強作用のある、生理学的に許容される、生物学的に純粋な菌株であって、親株と同等の免疫増強作用を有する菌株：
L.アシドフィルスHN017 、
L.ラムノサスHN001 、
B.ラクチスHN019 、又は
L.ラムノサスHN067 。
【請求項１１】
請求項１〜３及び１０のいずれかの生物学的に純粋な培養菌を、免疫刺激する用量で含んで成る、自然免疫及び獲得免疫を増強するための組成物。
【請求項１２】
２つの請求項１または１０の生物学的に純粋な培養菌を、免疫刺激する用量で含んで成る、自然免疫及び獲得免疫を増強するための組成物。
【請求項１３】
３つの請求項１０の生物学的に純粋な培養菌を、免疫刺激する用量で含んで成る、自然免疫及び獲得免疫を増強するための組成物。
【請求項１４】
自然免疫及び獲得免疫を増強するための請求項４〜９のいずれかの組成物。
【請求項１５】
前記の生理学的に適する賦形剤又は希釈剤が食物である、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
前記の食物が、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳である、請求項１５の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、乳酸菌の新規な菌株、及び、免疫増強のための使用に関する。
【０００２】
背景技術
乳酸菌(LAB) を含有する製品を摂取することは、免疫増強を含む広範な健康に役立つ。多数の乳酸菌株が存在するが、その内いくつかの株のみが、健康促進作用を有する。これらの菌における酸及び胆汁酸塩に対する耐性、粘膜上皮細胞への接着性、並びに胃腸管通過後の生存性が、健康促進菌株を選択する重要な判断基準になる。これまで、少数の乳酸菌株が健康上の効果を有することが示された。
【０００３】
ニュージーランド特許248057では、小腸の粘膜上皮細胞への接着性が良い、すなわち治療に使用される乳酸菌株が知られている。この特許に記載された当該微生物は、自然免疫（貪食作用）及び獲得免疫（抗体応答及びリンパ球増殖応答）の両方を増強する。
【０００４】
食作用を含む広範な免疫応答を増強する他の乳酸菌株が求められている。
本発明の対象は、この様な要望を達成する方法であり、少なくとも、免疫増強作用を有する乳酸菌の有用な選択方法を提供することである。
【０００５】
発明の説明
従って、本発明の１つの点は、大まかに言うと、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)HN001(AGAL 寄託番号NM97/09514,1997 年８月18日付け) の生物学的に純粋な培養菌から成る。
【０００６】
本発明の別の点は、大まかに言うと、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)HN067(AGAL 寄託番号NM97/01925,1998 年２月17日付け) の生物学的に純粋な培養菌から成る。
【０００７】
本発明の別の点は、大まかに言うと、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)HN017(AGAL 寄託番号NM97/09515,1997 年８月18日付け) 、ラクトバチルス・ラムノサスHN001 、ラクトバチルス・ラムノサスHN067 、又はビフィドバクテリウム・ラクチス(Bifidobacterium lactis)HN019(AGAL寄託番号NM97/09513,1997 年８月18日付け) のいずれかの生物学的に純粋な培養菌を、免疫刺激する濃度で、生理学的に適する賦形剤又は希釈剤と共に含んでいる組成物から成る。
【０００８】
１つの態様では、その組成物は、２つ以上の前記菌株を含有する。
好ましくは、その生理学的に適する賦形剤又は希釈剤は、食物である。
好ましくは、その食物は、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳のいずれかである。
あるいは、その組成物は医薬用であり、その賦形剤又は希釈剤は、医薬に適するものである。
【０００９】
本発明には、下記のいずれかの菌株の相同菌又は変異菌の、免疫増強作用を有する、生理学的に許容される、生物学的に純粋な菌株も含まれる：
L.アシドフィルスHN017 、
L.ラムノサスHN001 、
B.ラクチスHN019 、又は
L.ラムノサスHN067 。
【００１０】
別の態様では、本発明は、大まかに言うと、自然免疫及び獲得免疫を増強する方法であって、前記の生物学的に純粋な培養菌のいずれかを、免疫刺激する用量で、哺乳動物に投与することを含んで成る方法から成る。
【００１１】
別の態様では、２又は３つの前記菌株の実質的に生物学的に純粋な培養菌を用いる。
好ましくは、その培養菌を、生理学的に適する賦形剤又は希釈剤と混合した形で投与する。
好ましくは、その生理学的に適する賦形剤又は希釈剤は、食物である。
好ましくは、その食物は、培養乳、ヨーグルト、チーズ、乳飲料又は粉乳である。
【００１２】
更に、本発明は、大まかに言うと、本明細書中で指摘した部材、要素及び特徴に、個別又は集合的に、並びに、その部材、要素又は特徴の２つ以上を組み合せたものに関する。本発明の分野における既知の等価物を有する本発明の特定な対象が本明細書に記載され、この様な既知の等価物も、独立なものとして本明細書に組み込む。
【００１３】
発明の実施態様
下記の４種類の細菌株の凍結乾燥培養菌は、Australian Government Analytical Laboratories(AGAL), The New South Wales Regional Laboratory, 1 Suakin Street,Pymble,NSW2073,Australiaに寄託されている。寄託の詳細は、以下の通りである：
0003694236.tif 000002
前記の４菌株は、自然免疫及び獲得免疫の両応答を含む広範囲な免疫応答を増強することが判明した。
【００１４】
実施例１：形態及び一般特性
菌株の分類学的特性を確認するために、RAPD分析、16S rRNAの配列決定及びSDS-PAGE分析を行った。L.アシドフィルスHN017 は、ニュージーランド特許248057のL.アシドフィルス(LC1) と遺伝子的に異なることも判明した。
【００１５】
L.ラムノサスHN067 の分類学的特性を確認するために、RAPD分析、16S rRNAの配列決定及びSDS-PAGE分析を行った。L.ラムノサスHN067 の分子レベルの特性を調べるために、種特異的プライマーPr I（順方向）5'-CAGACTGAAAGTCTGACGG-3' 及びPha II（逆方向）5'-GCGATGCGAATTTCTATTATT-3' を用いた。
【００１６】
表１及び２に、この菌株の形態及び糖発酵特性を詳細に示す。
0003694236.tif 000003
【００１７】
0003694236.tif 000004
【００１８】
実施例２：腸細胞への接着
前記菌株が人間の小腸上皮細胞に接着する性質を、分化した株化細胞(HT-29及びCaCo-2) を用いて、インビトロで検査した。カバーグラス上でHT-29 及びCaCo-2細胞を単層に増殖させ、これをマルチウエルディッシュ内に置いた。この単層培養細胞に108cfu/ml の乳酸菌培養液１mlとDMEM培地１mlとを加え、そして10%CO2/90%大気中、37℃で１時間インキュベーションした。この単層培養をPBS で４回洗浄し、メタノールで固定し、グラム染色し、そして上皮細胞に接着している細菌の数を顕微鏡で計数した。平均して20視野を観察し、その結果を表３に示す。
【００１９】
0003694236.tif 000005
【００２０】
実施例３：自然免疫及び獲得免疫の増強
マウスにおける３菌株L.ラムノサスHN001 、L.アシドフィルスHN017 及びB.ラクチスHN019 の免疫増強効果を、血液リンパ球及び腹膜マクロファージの食作用の測定、及び、ワクチン反応を擬態するために用いたタンパク質抗原に対する特異的抗原の濃度の測定から、調べた。
【００２１】
下記の実験方法を用いた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。
2.  マウスを無作為に異なる処置群に分けた（表４）。
3.  10日間、マウスに１日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を与えた。コントロールマウスには、50μl の脱脂乳のみを与えた。
4.  実験中全てのマウスに、脱脂乳粉末ベースの食事を与えた。
【００２２】
L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を摂取したマウスから得た血液リンパ球及びマクロファージでは、それらの食作用は、コントロールマウスの細胞と比べて有意に大きかった（表４）。前記菌投与マウスのリンパ球における酸素ラジカルの生産（酸化力急増）も、コントロールマウスに比べて大きかった（データ省略）。
【００２３】
0003694236.tif 000006
【００２４】
BALB/cマウスに、10日間1 日あたり109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を経口投与した。フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差（Studentsのt 検査）：*P<0.05, **P<0.01 。
【００２５】
L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を摂取したマウスでは、その血清中及び腸洗浄液中の特異的IgG 抗体濃度も、コントロールマウスに比べて高かった（表５）。
【００２６】
0003694236.tif 000007
【００２７】
BALB/cマウスに、10日間1 日あたり109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を経口投与した。０日及び７日目に、コレラ毒素（腸感染を擬態するために用いた抗原）をマウスに免疫接種した。10日目にELISA を用いて、血清中及び腸分泌液中の特異抗体の濃度を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差（Studentsのt 検査）：P*=0.08, **P<0.05, ***P<0.01。
【００２８】
実施例４：４週間の乳酸菌の補充投与後の免疫刺激効果
下記の実験方法に従って、マウスにおけるL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 の免疫刺激効果を調べた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。
2.  マウスを無作為に異なる処置群に分けた（18匹／群）。
3.  環境に順化させた後（７日間）、28日間（０日〜28日目）マウスに１日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を与えた。コントロールマウスには、50μl の脱脂乳（微生物無し）のみを与えた。
4.  実験中マウスに、脱脂乳粉末ベースの食事と無制限の水を与えた。
5.  血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用、脾臓リンパ球のNK細胞活性、T-細胞マイトジェンであるConAに対するリンパ球（脾臓細胞）の増殖応答（細胞性免疫の指標）、及び、破傷風ワクチンに対する抗体反応を測定して、免疫刺激効果を調べた。
【００２９】
表６から判るように、L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を摂取したマウスから得たリンパ球（好中球、単球及びマクロファージ）では、それらの食作用（自然免疫の指標）は、コントロールマウスのリンパ球と比べて有意に大きかった。
【００３０】
0003694236.tif 000008
【００３１】
マウス（18匹／群）に、1 日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を28日間与えた。28日目にフローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用を測定した。値は最小二乗の平均値である。対照との有意差(SAS分析）：*P<0.002, **P<0.0005。
【００３２】
28日間のL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 の摂取は、NK細胞活性、ConAに対するリンパ球増殖応答、及び破傷風ワクチンに対する抗体応答の増加も誘導した。これら全ての免疫能指標において、L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を投与したマウスは、コントロールマウスに比べてより高い応答を示した（表７）。
【００３３】
これらの結果を総合すると、より長い期間L.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を補充投与することによって、自然免疫及び獲得免疫のいくつかの現象の増強維持を誘導することができた。
【００３４】
0003694236.tif 000009
【００３５】
マウス（18匹／群）に、1 日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.アシドフィルスHN017 、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 を28日間与えた。28日目にフローサイトメトリーとD275標識Yac-1 細胞とを用いて、脾臓リンパ球のNK細胞活性を測定した。28日目に市販の細胞増殖キット(Boehringer Mannheim,Germany) を用いて、ConAに対する脾臓リンパ球の増殖応答を調べた。抗体応答を調べるために、７日目及び21日目に破傷風ワクチン（50μl/投与,CSL,Australia) をマウスに免疫接種した。ELISA によって、特異抗体濃度を決定した。このワクチン製造業者(CSL,Australia) 製の抗原を用いて、プレートをコーティングした。値は、18匹のマウスに基づく最小二乗の平均値である。対照との有意差(SAS分析）：*P<0.05 。
【００３６】
実施例５：発酵品又は非発酵品による自然免疫及び獲得免疫の増強
前記菌株L.ラムノサスHN001 を利用して作られた（発酵した）ヨーグルトの免疫増強効果を、L.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品と比較して検査した。その免疫増強効果を調べるために、（末梢血リンパ球及び腹膜マクロファージの）食作用、及びB-細胞マイトジェン(LPS) に対するリンパ球増殖応答を測定した。
【００３７】
下記の実験方法を用いた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。
2.  マウスを無作為に異なる処置群に分けた。
3.  実験中コントロールマウスには、全乳粉末ベースの食事を与えた。
4.  試験マウスには、１日あたり、L.ラムノサスHN001 を用いて作ったヨーグルト2.5g(109cfu/日) 又はL.ラムノサスHN001 を含有する全乳2.5g(109cfu/日) を、全乳粉末ベースの食事と共に10日間与えた。
結果：
L.ラムノサスHN001 を用いて作ったヨーグルト又はL.ラムノサスHN001 を含有する全乳を摂取したマウスでは、その末梢血リンパ球の食作用レベルは、コントロールマウスに比べて有意に高かった（図１）。ヨーグルト（L.ラムノサスHN001 による発酵品）又はL.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品のいずれであるかに関係なく、L.ラムノサスHN001 を投与した場合に、この増加が観察された。L.ラムノサスHN001 を用いた発酵品ヨーグルトを摂取したマウスとL.ラムノサスHN001 を含有する全乳品を摂取したマウスとの間で、食作用レベルに差は無かった。
【００３８】
前記の発酵品及び非発酵品の両方の場合で、マウスにおけるLPS に対するリンパ球増殖応答は、コントロールの場合に比べて高かった（表８）。この応答においても、L.ラムノサスHN001 による発酵品を摂取したマウスとL.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品を摂取したマウスとの間で差は無かった。
【００３９】
0003694236.tif 000010
【００４０】
L.ラムノサスHN001 によるヨーグルト（発酵品）又はL.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品のいずれかの形で109cfu(1日あたり）のL.ラムノサスHN001 を含有する乳ベースの食事で、14日間BALB/cマウスを飼育した。コントロールマウスには、乳酸菌無しの乳ベースの食事を与えた。リンパ球の増殖応答を、96時間インキュベーションにおいて、最後の16時間5-ブロモ-2'-デオキシウリジンを取り込ませ、比色定量的に測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差（Students t検査）：P=0.05。
【００４１】
これらの結果から、L.ラムノサスHN001 の補充投与によって、食作用及びリンパ球増殖を含む広範な免疫機能が増強されることが示唆される。発酵品又は非発酵品のいずれの形においても、L.ラムノサスHN001 は、免疫機能の増強に有効であり、いくつかの機能では、発酵品の方が効率が良く、他の機能では、非発酵品の方が効率が良い。
【００４２】
実施例６：L.ラムノサスHN067 による自然免疫及び獲得免疫の増強
実験１：
L.ラムノサスHN067 の免疫刺激効果を、マウスにおいて、末梢血リンパ球及び腹膜マクロファージの食作用（非特異的免疫の指標）、及び免疫抗原コレラ毒素（腸ワクチン反応を擬態するために用いる）に対する特異的抗体の濃度を測定して調べた。
【００４３】
下記の実験方法を用いた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。実験中これらのマウスを脱脂乳粉末ベースの食事で飼育した。
2.  試験群のマウス(n=6) に、10日間１日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与した。コントロールマウス(n=6) には、50μl の脱脂乳（乳酸菌無し）のみを与えた。
【００４４】
結果：
L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスの血液リンパ球及び腹膜マクロファージでは、その食作用は、コントロールマウスに比べて有意に高かった（増強された）。この結果を表９に示す。
【００４５】
0003694236.tif 000011
【００４６】
マウス（６匹／群）を、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は投与せずに、乳ベースの食事で10日間飼育した。フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用を測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差である。対照との有意差(SAS分析）：*P=0.0005, **P=0.0001 。
【００４７】
経口的に接種したコレラ毒素抗原に対する特異的抗体の血清中及び腸洗浄液中の濃度も、L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスの方が、コントロールマウスと比べて有意に高かった（表10）。
【００４８】
0003694236.tif 000012
【００４９】
BALB/cマウスを、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は投与せずに、乳ベースの食事で10日間飼育した。０日目と７日目にマウスに、腸感染を擬態する抗原であるコレラ毒素（10μg/投与）を経口で接種した。10日目に血清中及び腸分泌液中の抗体レベルを、ELISA で測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差である。対照との有意差(SAS分析）：*P=0.02, **P=0.0039 。
【００５０】
実験２：
マウスにおけるL.ラムノサスHN067 の免疫刺激効果を、下記の方法で調べた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。実験中これらのマウスに脱脂乳粉末ベースの食事及び無制限の水を与えた。
2.  ７日間環境に順化させた後、14日間、群１のマウス(n=20)に１日あたり50μl の脱脂乳中109cfuのL.ラムノサスHN067 を与えた。コントロールマウス（群２n=20）には、微生物無しの脱脂乳を与えた。
3.  血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用、並びに、フィトヘマグルチニン(PHA) 及びリポ多糖(LPS)(各々T-及びB-細胞のマイトジェンである）に対する脾臓リンパ球の増殖応答を測定して、免疫刺激効果を調べた。
【００５１】
結果：
L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスの血液リンパ球及び腹膜マクロファージでは、その食作用（自然免疫の指標）は、コントロールマウスに比べて有意に高かった（表11）。
【００５２】
0003694236.tif 000013
【００５３】
BALB/cマウスを、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は投与せずに、乳ベースの食事で14日間飼育した。14日目にフローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、血液リンパ球と腹膜マクロファージの食作用を測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差である。対照との有意差(SAS分析）：*P=0.002, **P=0.0001。
【００５４】
L.ラムノサスHN067 を14日間摂取したマウスでは、PHA 及びLPS に対するリンパ球の増殖応答も、コントロールマウスと比べてより高かった（表12）。
【００５５】
0003694236.tif 000014
【００５６】
BALB/cマウスを、1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN067 を経口投与して又は投与せずに、乳ベースの食事で14日間飼育した。14日目に市販の細胞増殖キット(Boehringer Mannheim,Germany) を用いて、PHA 及びLPS に対する脾臓リンパ球の増殖応答を測定した。値は最小二乗の平均値(LSM) ±標準誤差である。対照との有意差(SAS分析）：*P<0.08, **P<0.01 。
【００５７】
要するに、L.ラムノサスHN067 を摂取したマウスでは、リンパ球の食作用、経口免疫接種に対する抗体応答、並びに、T-及びB-細胞のマイトジェンに対するリンパ球増殖応答を含む広範な宿主免疫応答が、有意に増強した。血液リンパ球（好中球と単球）及びマクロファージは、自然免疫の主要な効果器であり、そして微生物感染に対する防御の主役である。また、インビトロのマイトジェン（T-及びB-細胞のマイトジェン）に対するリンパ球増殖応答と、個体の免疫能力との相関が良く知られている。従って、これらの結果は、L.ラムノサスHN067 の補充投与によって、自然免疫及び獲得免疫のいくつかの機能を増強することができる。
【００５８】
実施例７：L.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌による自然免疫及び獲得免疫の増強
この実験では、生菌又は加熱死菌の形での前記菌株L.ラムノサスHN001 の免疫刺激効果を調べた。免疫機能に対する効果を、末梢血リンパ球の食作用の測定によって調べた。体液性免疫に対するL.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌の効果を、コレラ毒素を免疫接種したマウスにおいて生産された特異的抗体の濃度を測定することによって調べた。
【００５９】
下記の実験方法を用いた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。
2.  マウスを無作為に異なる処置群に分けた。
3.  実験中コントロールマウスに、脱脂乳粉末ベースの食事を与えた。
4.  試験マウスに、14日間、脱脂乳粉末ベースの食事と共に１日あたり109cfuのL.ラムノサスHN001 の生菌又は加熱死菌を与えた。
5.  飼育０日目と７日目に、コレラ毒素によってマウスを経口で免疫接種した。
【００６０】
結果：
L.ラムノサスHN001 の投与によって、マウスの末梢血リンパ球の食作用レベルは、コントロールマウスに比べて有意に増強された（図２）。L.ラムノサスHN001 が生菌であるか又は加熱死菌であるかに関係なく、この増強が観察された。L.ラムノサスHN001 の生菌を摂取したマウスと、その加熱死菌を摂取したマウスとの間で、食作用レベルに差は無かった。
【００６１】
L.ラムノサスHN001 の生菌及び死菌の両投与によって、血清及び粘膜中の抗体は、コントロールマウスに比べてより多く誘導された。しかし、その応答レベルは、L.ラムノサスHN001 の生菌を投与した場合の方が有意により大きかった（表13）。
【００６２】
0003694236.tif 000015
【００６３】
14日間乳ベースの食事で飼育しながら、BALB/cマウスに1 日あたり109cfuのL.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌を経口投与した。コントロールマウスには乳酸菌を与えなかった。０日及び７日目に、コレラ毒素をマウスに免疫接種した。14日目にELISA を用いて、血清及び腸分泌液中の抗体応答を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差（Studentsのt 検査）：P*=0.05,***P=0.0005 。
【００６４】
これらの結果から、L.ラムノサスHN001 の生菌及び加熱死菌は両方共、マウスの自然免疫及び獲得免疫の機能を増強することが示唆される。
【００６５】
実施例８：B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 の抗感染活性
下記の目的のために実験を行った：
1.  胃腸の病原体であるサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)に対する、B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 による防御効果を調べること、
2.  マウスにおけるS.ティフィムリウム感染の防御において、B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 による免疫刺激の働きを決定すること。
【００６６】
抗感染活性を、肝臓及び脾臓への細菌の転移測定によって調べた。免疫増強効果を、食作用（末梢血リンパ球及び腹膜マクロファージ）並びにT-細胞のマイトジェン(PHA) に対するリンパ球の増殖応答の測定によって調べた。
【００６７】
下記の実験方法を用いた：
1.  重さ20-30gの６〜７週齢のBALB/cマウスを用いた。
2.  マウスを無作為に４つの異なる処置群に分け、個室に入れた。
3.  実験中全てのマウスに脱脂乳粉末ベースの食事を与えた。
4.  攻撃の７日前から毎日、試験マウスに１日あたり109cfuのB.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 を与え始めて、試験期間中継続した。
5.  ７日目から５日間、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 を投与したマウス、及び乳酸菌を投与していないコントロールマウスに、１日あたり8x105cfuのサルモネラ・ティフィムリウム(ATCC1772)を経口投与（攻撃）した。
6.  非感染コントロール群には、S.ティフィムリウムを与えなかった。
7.  攻撃後６日目に、これらのマウスを用いて、肝臓及び脾臓への細菌の転移並びに免疫機能の測定を行った。
【００６８】
結果：
B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスでは共に、S.ティフィムリウムだけを与えたマウスに比べて、肝臓及び脾臓への細菌の転移レベルは有意に低かった（図３）。
【００６９】
攻撃感染によって、食作用は有意に抑制された（図４）。S.ティフィムリウムだけを与えたコントロールマウスの食作用は、非感染コントロールマウスに比べて有意に低かった。しかし、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスの末梢血リンパ球の食作用は、S.ティフィムリウムの感染によって影響されなかった。このことは、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 が補充投与され、且つS.ティフィムリウムによって攻撃されたマウスと、正常な非感染コントロールマウスとの食作用レベルが同様であったことから判る。
【００７０】
B.ラクチスHN019 及びL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスでは共に、S.ティフィムリウムだけを与えたコントロールマウスに比べて、PHA に対するリンパ球増殖応答は有意に高かった（図５）。B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 を摂取したマウスと、非感染コントロールマウスとの間で、応答の有意な差は無かった。
【００７１】
これらの結果を総合すると、B.ラクチスHN019 又はL.ラムノサスHN001 の補充投与によって、腸の病原体、例えばサルモネラ・ティフィムリウムに対する防御を誘導できることが示唆される。感染抵抗性の増強は、免疫機能の増強に依る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例５に記した通り、末梢血リンパ球の食作用に対する、L.ラムノサスHN001 による発酵品、又はL.ラムノサスHN001 を含有する非発酵品のマウスへの補充投与の効果を示す。発酵品又は非発酵品中に109cfu(1日あたり）のL.ラムノサスHN001 を含有する乳ベースの食事で、14日間BALB/cマウスを飼育した。フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、末梢血リンパ球の食作用を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差(ANOVA, SAS プログラム）：**P<0.0001。
【図２】図２は、実施例７に記した通り、末梢血リンパ球の食作用に対する、L.ラムノサスHN001 の生菌又は加熱死菌のマウスへの補充投与の効果を示す。乳ベースの食事を与え、且つ109cfu(1日あたり）のL.ラムノサスHN001 の生菌又は加熱死菌を経口投与して、14日間BALB/cマウスを飼育した。フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、末梢血リンパ球及び腹膜マクロファージの食作用を測定した。値は平均±標準誤差である。対照との有意差(ANOVA, SAS プログラム）：**P<0.0001。
【図３】図３は、実施例８に記した通り、S.ティフィムリウム(S.typhimurium) で攻撃したマウス内の細菌転位に対する、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 のマウスへの補充投与の効果を示す。補充投与無しのBALB/cマウス、又はB.ラクチスHN019 若しくはL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスを、S.ティフィムリウムによって経口攻撃し、その後毎日補充投与を行った。攻撃６日後、マウスを無痛死させ、細菌転位を観察するために、その肝臓と脾臓を回収した。その臓器から得た組織縣濁液をMacConkey アガープレート上で24〜48時間培養してから、計数を行った。値は平均±標準誤差である。対照との有意差(ANOVA, SAS プログラム）：*P<0.05 。
【図４】図４は、実施例８に記した通り、S.ティフィムリウムで攻撃したマウスの末梢血リンパ球の食作用に対する、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 のマウスへの補充投与の効果を示す。補充投与無しのBALB/cマウス、又はB.ラクチスHN019 若しくはL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスを、S.ティフィムリウムによって経口攻撃し、その後毎日補充投与を行った。攻撃６日後、フローサイトメトリーとフルオレセインイソチオシアネート標識大腸菌とを用いて、末梢血リンパ球の食作用を測定した。異なる上付き文字を記した値（平均±標準誤差）は、有意差を示す(ANOVA, SAS プログラム）：P<0.01。
【図５】図５は、実施例８に記した通り、S.ティフィムリウムで攻撃したマウスの脾臓リンパ球の増殖応答に対する、L.ラムノサスHN001 又はB.ラクチスHN019 のマウスへの補充投与の効果を示す。補充投与無しのBALB/cマウス、又はB.ラクチスHN019 若しくはL.ラムノサスHN001 を補充投与したマウスを、S.ティフィムリウムによって経口攻撃し、その後毎日補充投与を行った。攻撃６日後、脾臓リンパ球の増殖応答を、96時間インキュベーションにおいて、最後の16時間5-ブロモ-2'-デオキシウリジンを取り込ませ、比色定量的に測定した。異なる上付き文字を記した値（平均±標準誤差）は、有意差を示す(ANOVA, SAS プログラム）：P<0.01。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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