(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵法で生産された塩基性アミノ酸の水溶液を、該塩基性アミノ酸の等電点±０．５の範囲でルーズな逆浸透膜で濾過することを特徴とする塩基性アミノ酸の精製方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は発酵法で生産され蛋白系不純物を含む塩基性アミノ酸の精製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アルギニン等の塩基性アミノ酸が発酵法で生産されている。その精製方法としては、まず発酵液を菌体を除去してからあるいは除去せずにそのままイオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し、晶析する方法等が行なわれている。ところで、発酵液中には各種の不純物が含まれているが、そのなかには水溶性蛋白等もある。水溶性蛋白等はイオン交換樹脂に吸着されてアルカリ等の溶離剤により塩基性アミノ酸とともに溶離される。しかも晶析の際には析出してくるので除去の難しい不純物のひとつである。そこで、従来は塩基性アミノ酸の水溶液に蛋白凝固剤を加えて加熱させることにより蛋白質を凝固させこれを濾過して除去していた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
塩基性アミノ酸の大きな用途はアミノ酸輸液等の栄養剤や中和剤等としての医薬原料にあり、一般に中性〜弱酸性で使用される。ところが、塩基性アミノ酸を溶解し、中性〜弱酸性に調整されたアミノ酸等を含有する水溶液を除菌処理等のためにメンブレンフィルターで濾過すると濾過速度が大巾に低下してしまうことがあった。
【０００４】
尚、本発明でいうメンブレンフィルターは、除菌等に使用される精密濾過膜のことであり、その膜細孔径は、０．２２〜１．０μｍである。
【０００５】
本発明の目的は、塩基性アミノ酸を含む中、酸性の水溶液をメンブレンフィルターで濾過処理しても濾過性に問題を生じない塩基性アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決するべく鋭意検討の結果、塩基性アミノ酸水溶液がアルカリ性であるため、通常の精製法では蛋白等の不純物の除去が不充分になり、この残与の蛋白等の不純物が中、酸性で析出して濾過性を阻害していることを見出した。すなわち、一般に中、酸性アミノ酸はもとより塩基性アミノ酸であっても多くは塩の形で商品化されるため、その水溶液は中、酸性に調整され、濾過が行なわれる。中、酸性水溶液中では、蛋白等のコロイド性物質が凝集しやすいため、濾過によって容易に除去される。ところが、塩基性アミノ酸の場合には水溶液がアルカリ性であるために、コロイド物質の凝集性が悪く、濾材から漏出してしまうものもある。さらに、アルカリ性であるために蛋白の溶解度が高く溶存状態のものも存在している。このような挙動をする蛋白およびその他の不純物が前記の濾過性を阻害していることを見いだした。
【０００７】
従って、中、酸性側での濾過性を改善するためにはこのような挙動を示すコロイド性物質の完全な除去とアルカリ性で溶解していて中、酸性側で析出する物質の除去が必要である。
【０００８】
このような物質を除去するための手段としては、アルカリ性である塩基性アミノ酸水溶液を塩酸等の酸により中和し、その中和液をメンブレンフィルターで濾過する方法があげられる。しかし、この方法には、中和のための酸が必要であること、塩基性アミノ酸水溶液または結晶を得るためには、イオン交換樹脂操作が必要であることなど欠点があり、塩基性アミノ酸水溶液または結晶を得る手段としては適切ではない。
【０００９】
そこで、本発明者らは、輸液用の原料に使用する医薬用アミノ酸の発熱性物質除去に通常用いられており、精密濾過用のメンブレンフィルターより膜細孔径の小さい限外濾過膜（膜細孔径０．００２〜０．１μｍ）を晶析工程の前の精製工程に使用すれば、上記の不純物を除去できると考え、試験した。しかし、メンブレンフィルターより遥かに膜細孔径の小さい限外濾過膜を濾過に使用したにもかかわらず、得られた塩基性アミノ酸を溶解し、中性〜弱酸性に調整した水溶液の濾過性は、あまり改善されなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らはこれら効率よく除去する手段を開発するべくさらに検討を進めた結果、最近開発されたルーズな逆浸透膜を用いた濾過方法がこの目的に最適であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、発酵法で生産された塩基性アミノ酸の水溶液を、該塩基性アミノ酸の等電点±０．５の範囲でルーズな逆浸透膜で濾過することを特徴とする塩基性アミノ酸の精製方法に関するものである。
【００１２】
本発明の方法が適用される塩基性アミノ酸は、その種類は問わないが、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−ヒスチジン等である。本発明の方法が特に威力を発揮するのは水溶液のアルカリ性が高くかつ晶析によって精製しうるものであり、この点でＬ−アルギニンとＬ−リジン、Ｌ−オルニチンが好適であり、Ｌ−アルギニンが特に好ましい。
【００１３】
塩基性アミノ酸水溶液の性状としては、発酵液のように菌体等の多量の浮遊物を含むものは濾過効率が悪いためある程度精製したものがよい。好ましいものの例としては、発酵液から塩基性アミノ酸をカチオン交換樹脂に吸着させて非吸着液を分離後当該塩基性アミノ酸を水酸化ナトリウム水溶液等で溶離した溶離液、この溶離液を活性炭等により脱色後濾過した脱色液、この溶離液から塩基性アミノ酸を晶析して得た粗結晶を溶解した水溶液、この粗結晶水溶液を活性炭等により脱色・濾過した脱色液、この粗結晶水溶液に蛋白凝固剤を添加後活性炭等により脱色・濾過した脱色液等がある。塩基性アミノ酸水溶液のｐＨは当該アミノ酸の等電点付近であり、等電点±０．５の範囲である。水溶液の塩基性アミノ酸濃度としては、当該塩基性アミノ酸の熱分解温度と使用するルーズな逆浸透膜の耐用温度から勘案した操作温度を設定し、この温度に対する当該アミノ酸の飽和溶解度より低い濃度が適当であるが、操作性の点から飽和溶解度に近い濃度が好ましい。例えば、４０℃でＬ−アルギニン水溶液をルーズな逆浸透膜濾過を行う場合は、Ｌ−アルギニンの４０℃における飽和溶解度が約３５ｇ／ｄｌであるので、Ｌ−アルギニンの濃度は、２０〜３０ｇ／ｄｌ程度が好ましい。
【００１４】
ルーズな逆浸透膜とは、分画分子量が限外濾過膜と逆浸透膜の中間に位置する膜であり、一般に分画分子量が数百〜数千の膜のことをいうが、食塩の阻止率でその分画性能を表現することも多い。本発明において使用するルーズな逆浸透膜はその食塩の阻止率が、１％〜５０％程度、好ましくは５％〜３０％程度の範囲にあるものである。材質としては酢酸セルロース系、ポリアミド系、ポリベンズイミダゾール系、ポリスルホン系などのものがある。
【００１５】
濾過条件としては、温度は５〜９５℃程度、好ましくは２０〜６０℃程度である。圧力は、使用するルーズな逆浸透膜の耐用圧力以下であれば良いが、圧力が低すぎると濾過速度が遅くなってしまい、効率的でないので、効率を考慮して設定することが好ましい。通常は、５〜１００ｋｇ／ｃｍ２位である。濾過装置には市販品をそのまま用いればよい。
【００１６】
【作用】
発酵法で生産され蛋白系不純物を含む塩基性アミノ酸の水溶液をルーズな逆浸透膜で濾過することにより、コロイド粒子、分画分子量以上の水溶性蛋白等は濾過されずに残り、塩基性アミノ酸は膜を通過して両者が分離される。
【００１７】
【実施例】
実施例１
特開平２−１８６９９５号公報の実施例に記載の方法に準じて、ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＪ１２４２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２７）を培養し、Ｌ−アルギニン発酵液２５ｋｌ（Ｌ−アルギニン含量７５０ｋｇ）を調製した。この発酵液を塩酸でｐＨ６．５〜７に調整後遠心分離機で菌体を分離した。次に除菌液を陽イオン交換樹脂（三菱化成ＳＫ１Ｂ、樹脂量：６ｋｌ）に通液しＬ−アルギニンを吸着させた後、水８ｋｌで水押しした。引続き、１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を通液しＬ−アルギニンを溶離した。溶離液を減圧下で１ｋｌまで濃縮後１０℃まで冷却し、Ｌ−アルギニン２水和物を晶析した。得られた結晶を遠心分離機で分離し、粗結晶（Ｌ−アルギニン２水和物）６００ｋｇが得られた（Ｌ−アルギニン含量：４８０ｋｇ）。この粗結晶６００ｋｇに純水を加え２５００ｌとし６０℃に加熱し溶解した。この溶解液に蛋白凝固剤サニゾールの１０％水溶液を０．５ｌ添加し、１時間攪拌しながら放置した。次いで、活性炭６ｋｇを加え、更に４５分間攪拌しながら放置した。次に、セライトをプレコートした小型セラミックフィルターにフィードし、フィード終了後さらに６０℃の純水５００ｌを加え、引き続き濾過してフィルター内の溜まりを置換回収した。こうして得られた脱色液の液量は３０００ｌであった。
【００１８】
この脱色液を従来法、比較例としての限外濾過（ＵＦ）法および本発明法（Ｌ−ＲＯ法）で処理してそれぞれ精製結晶を得た。
【００１９】
〔従来法〕
脱色液１０００ｌを０．５μｍのフィルターで濾過後、減圧下（６８０ｍｍＨｇ）で３００ｌまで濃縮晶析した。濃縮液を晶析缶に移し、攪拌しながら１０℃まで冷却して晶析した後、結晶を分離した。分離結晶は少量の脱パイロジェン水で洗浄した。
【００２０】
得られたＷｅｔ精製結晶は１７０ｋｇであった。
【００２１】
次に、Ｗｅｔ精製結晶をコニカルドラヤーに仕込、減圧下（７２０ｍｍＨｇ）で温度を６５〜９５℃まで段階的に上げ１２時間かけて乾燥した。
【００２２】
得られた乾燥精製結晶は１３６ｋｇであった。
【００２３】
〔ＵＦ法〕
脱色液１０００ｌを限外濾過膜（「ＮＴＵ−３２５０」（日東電気工業（株）製品，分画分子量（蛋白）約６０００）を使用し、下記のＵＦ条件で濾過した。
【００２４】
（ＵＦ条件）
圧    力        ２ｋｇ／ｃｍ２  
循環流量        １０ｌ／ｍｉｎ
温    度        ２５〜３０℃
【００２５】
脱色液の濃縮濾過は、濃縮液（被処理液）が２．５ｌになるまで行い、その後１０ｌの純水でダイアフィルトレーションを行うことで残存Ｌ−アルギニンを置換回収した。透過液液量は１０１０ｌであった。
【００２６】
この透過液を従来法の０．５μｍのフィルターの濾液と同様に操作し乾燥結晶を取り上げた。
【００２７】
得られた乾燥精製結晶は１３５ｋｇであった。
【００２８】
〔Ｌ−ＲＯ法〕
脱色液１０００ｌをスルホン酸基を含有する荷電性合成樹脂製のルーズな逆浸透膜（「ＮＴＲ−７４１０」（日東電気工業（株）製品，食塩阻止率１０％））を使用し、下記のＬ−ＲＯ条件で濾過した。
【００２９】
（Ｌ−ＲＯ条件）
圧    力        １０ｋｇ／ｃｍ２  
循環流量        １０ｌ／ｍｉｎ
温    度        ２５〜３０℃
【００３０】
脱色液の濃縮濾過は、濃縮液（被処理液）が２．５ｌになるまで行い、その後１０ｌの純水でダイアフィルトレーションを行うことで残存Ｌ−アルギニンを置換回収した。透過液液量は１０１０ｌであった。
【００３１】
この透過液を従来法の０．５μｍのフィルターの濾液と同様に操作し乾燥結晶を取り上げた。
【００３２】
得られた乾燥精製結晶は１３６ｋｇであった。
【００３３】
上記の３つの方法で得られた乾燥精製結晶を下表の条件で濾過し濾過性を比較した。ｐＨ調整は、２Ｎ  ＨＣｌ水溶液を用いて行い、濾過性評価は、濾過に必要な時間を測定することで行った。その評価結果を表１に示す。
【００３４】
（濾過性評価の条件）
圧      力：２ｋｇ／ｃｍ２  
濃      度：５ｇ／ｄｌ
温      度：３０℃
液      量：１．４ｌ
フィルター：ミリポア０．２２μｍＧＳ
ｐ  Ｈ  ：１１，７，５，３
【００３５】
（濾過性評価の結果）
【表１】
0003617091.tif 000002
【００３６】
従来法結晶とＵＦ法精製結晶は、中、酸性、特にｐＨ３、で濾過性が極端に悪化した。それに対して、Ｌ−ＲＯ法精製結晶は、中、酸性側での濾過性の悪化がなかった。
【００３７】
尚、Ｌ−ＲＯ処理する事によって濾過性改善ばかりではなく、同時に発熱性物質、等の除去率もさらに改善された。
【００３８】
実施例２
実施例１と同様に処理してつくった脱色液１０００ｌを無電荷のルーズな逆浸透膜（「ＨＲ−２０」（東レ（株）製品，食塩阻止率１５％））を使用し、下記Ｌ−ＲＯ条件で濾過した。
【００３９】
（Ｌ−ＲＯ条件）
圧    力        ２５ｋｇ
循環流量        １２ｌ／ｍｉｎ
温    度        ２０〜２５℃
【００４０】
脱色液の濃縮濾過は、濃縮液（被処理液）が２．５ｌになるまで行い、その後１０ｌの純水でダイアフィルトレーションを行うことで残存Ｌ−Ａｒｇ・Ｂａｓｅを置換回収した。透過液液量は１０２０ｌであった。
【００４１】
この透過液を従来法の０．５μｍのフィルターの濾液と同様に操作し乾燥を結晶取り上げた。
【００４２】
得られた乾燥精製結晶は１３２ｋｇであった。
【００４３】
上記の方法で得られた乾燥精製結晶を実施例１と同じ条件で濾過し濾過性を評価した。その結果を表２に示す。
【００４４】
（濾過性評価の結果）
【表２】
0003617091.tif 000003
【００４５】
【発明の効果】
本発明の方法により、アルカリ性溶液状態で精製が行なわれる塩基性アミノ酸を中、酸性状態で濾過しても濾過速度低下の問題がなくなる。