(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（I）
0003686693.tif 000008
〔式中、ＲはベラクチンＡでは水素原子であり、またＲはベラクチンＢでは次式
0003686693.tif 000009
の基である〕で表わされる生理活性物質ベラクチンＡおよびベラクチンＢまたはその製薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属に属して請求項１に示した一般式（I）で表わされるベラクチンＡおよびＢを生産する菌を培養し、その培養物からベラクチンＡおよび／またはベラクチンＢを採取することを特徴とする生理活性物質ベラクチンＡおよび／またはＢの製造法。
【請求項３】
請求項１に示した一般式（I）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つあるいはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有してなるセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１に示した一般式（I）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つあるいはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有してなる抗高血圧剤。
【請求項５】
請求項１に示された一般式（I）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つあるいはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有してなる利尿剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有する新規な生理活性物質としてのベラクチン(Belactin)ＡおよびベラクチンＢならびにその製造法に関する。本発明のベラクチンＡおよびＢは医薬、動物薬、試薬等の分野への応用が期待される。
【０００２】
【従来の技術】
セリンカルボキシペプチダーゼは、活性中心にセリン残基が存在するカルボキシペプチダーゼである。セリンカルボキシペプチダーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＹおよび血小板デアミダーゼなどが知られている。
【０００３】
血小板デアミダーゼは、サブスタンスＰをはじめとするタキキニンやブラジキニンなどを分解する〔The Journal of Biological Chemistry, 265巻， 11265〜 11272頁，1990年〕。血小板デアミダーゼによって分解されるサブスタンスＰは、血栓溶解活性化作用を有することが報告されている〔Experimentia，49巻， 242〜 244頁，1993年〕。したがってセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性をもつ化合物は、抗血栓剤ならびにこれらの生理活性ペプチドの活性調節剤への応用が期待される。
【０００４】
ラット尿中には、ブラジキニンを分解するカルボキシペプチダーゼＹ様酵素が存在し、当該酵素は尿中のブラジキニンを分解することで高血圧症の発症に関与していることが報告されている〔European Journal of Pharmacology， 232巻， 181〜 190頁，1993年〕。したがってセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性をもつ化合物は尿中のブラジキニンの生理作用を増強するから、抗高血圧剤および利尿剤などへの応用が期待される。
【０００５】
また、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性をもつ既知の物質としては、ジイソプロピルフルオロリン酸〔蛋白質核酸酵素，28巻，1421〜1431頁，1983年〕、キモスタチン〔The Journal of Biological Chemistry, 265巻， 11265〜 11272頁，1990年〕およびポストスタチン〔European Journal of Pharmacology， 232巻， 181〜 190頁，1993年〕などが報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする問題点】
ジイソプロピルフルオロリン酸、キモスタチンおよびポストスタチンなどは、セリンカルボキシペプチダーゼに対する作用の特異性が低い。したがってセリンカルボキシペプチダーゼに対する特異性の高い阻害剤が望まれている。本発明の目的は、そのような特異性の高いセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有する新規な生理活性物質、その製造法およびその用途を提供することにある。
【０００７】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の期待にこたえるべく酵素阻害活性を有する物質の探索を続けていたところ、サッカロポリスポラ属に属する１菌株の培養物中にセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有する物質が生産されていることを見出し、２種の有効物質を単離することに成功した。そして、それら物質の構造を確定することに成功してそれら物質が新規物質であることを認め、ベラクチン(Belactin)ＡとベラクチンＢと命名した。これらの知見に基づいて、本発明を完成させた。本発明の目的は、新規酵素阻害物質ベラクチンＡおよびベラクチンＢならびにその製造法を提供することにある。
【０００８】
第１の本発明の要旨とするところは、下記の一般式（Ｉ）
0003686693.tif 000002
〔式中、ＲはベラクチンＡでは水素原子であり、またＲはベラクチンＢでは次式
0003686693.tif 000003
の基である〕で表わされる生理活性物質ベラクチンＡおよびベラクチンＢまたはその製薬学的に許容し得る塩を提供するものである。
【０００９】
ベラクチンＡおよびＢはその製薬学的に許容し得る塩の形態にあってもよく、このような塩としてはたとえば塩酸、硫酸、リン酸などの製薬学的に許容し得る無機酸、あるいは酢酸、メタンスルホン酸などの製薬学的に許容し得る有機酸との酸付加塩があげられる。
【００１０】
さらに第２の本発明は、サッカロポリスポラ属に属する上記一般式（Ｉ）のベラクチンＡおよびＢの生産菌を培養し、その培養物から酵素阻害物質ベラクチンＡおよび／またはベラクチンＢを採取することを特徴とするベラクチンＡおよび／またはベラクチンＢの製造法にある。
【００１１】
〔Ｉ〕ベラクチンＡの物理化学的性状を次に記載する。
（１）色および形状：薄黄色粉末
（２）分子式：Ｃ17Ｈ21ＣｌＮ2 Ｏ4 
（３）マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ(positive)  ｍ／ｚ  353(Ｍ＋Ｈ）+ 
ＦＡＢ−ＭＳ(negative)  ｍ／ｚ  351(Ｍ−Ｈ）- 
（４）比旋光度：〔α〕D 25＝−30.2°（ｃ 0.5，クロロホルム）
（５）融点：42.5〜44.5℃
（６）紫外部吸収スペクトル（メタノール）：ＵＶ  λmax,  nm（ε）
213(22,000), 256(9,300), 340(3,500)
（７）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図１に示す。
【００１２】
（８） 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準、重クロロホルム溶媒中）：
【表１】
0003686693.tif 000004
【００１３】
〔上の表における化学シフト（δH ）にはそれぞれのシグナルの由来する 1Ｈの数、結合パターン、および結合定数をHz単位で記載した〕。
【００１４】
（９）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準，重クロロホルム溶媒中）：
【表２】
0003686693.tif 000005
【００１５】
（10）溶解性：酢酸エチル、クロロホルム、メタノールに可溶で、水に難溶である。
（11）薄層クロマトグラフにおけるＲｆ値：0.45
シリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製，Art.5715）を用い、展開溶媒としてトルエン−酢酸エチル（２：１）を使用した。
【００１６】
〔II〕ベラクチンＢの物理化学的性状を次に記載する。
（１）色および形状：白色粉末
（２）分子式：Ｃ23Ｈ31ＣｌＮ2 Ｏ9 
（３）マススペクトル：ＦＡＢ−ＭＳ(positive)  ｍ／ｚ  515(Ｍ＋Ｈ）+ 
ＦＡＢ−ＭＳ(negative)  ｍ／ｚ  513(Ｍ−Ｈ）- 
（４）比旋光度：〔α〕D 23＝−87.0°（ｃ 0.5，メタノール）
（５）融点： 150.0〜 153.0℃
（６）紫外部吸収スペクトル（メタノール）：ＵＶ  λmax,  nm（ε）
215(22,300), 257(13,300), 337(4,050)
（７）赤外部吸収スペクトル：添付図面の図２に示す。
【００１７】
（８） 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準、重水含有重アセトニトリル溶媒中）：
【表３】
0003686693.tif 000006
【００１８】
〔上の表における化学シフト（δH ）にはそれぞれのシグナルの由来する 1Ｈの数、結合パターン、および結合定数をHz単位で記載した〕。
【００１９】
（９）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＴＭＳを内部基準，重アセトニトリル溶媒中）：
【表４】
0003686693.tif 000007
【００２０】
（10）溶解性：酢酸エチル、アセトニトリル、メタノールに可溶で、水に難溶である。
（11）薄層クロマトグラフにおけるＲｆ値：0.42
シリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製，Art.5715）を用い、展開溶媒としてクロロホルム−メタノール−精製水(100：20：１) を使用した。
【００２１】
ベラクチンＡおよびＢのカルボキシペプチダーゼ阻害活性は下記の方法で測定できる。
（ａ）カルボキシペプチダーゼＹの酵素阻害活性の検定は、カルボキシペプチダーゼＡ〔Journal of Antibiotics，37巻， 682〜 684頁，1984年〕の酵素阻害活性の測定法の変法で行った。すなわち、10mMのヒプリル−Ｌ−フェニルアラニン（ペプチド研究所製）0.01ml、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5) 0.05ml、検体としてベラクチンを含む水溶液 0.034mlを加えた混合液に、カルボキシペプチダーゼＹ（オリエンタル酵母工業社製） 0.05mg/mlと牛アルブミン１mg/ml を含む水溶液を 0.006ml加えて、37℃、45分間反応させた。１Ｎ苛性ソーダの 0.006mlを加えて反応を停止し、10分後に0.36Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2) の0.05mlを加え、次いで２％塩化シアヌルのメチルセロソルブ溶液0.15mlを加えて発色させ、室温に10分放置後 405nmにおける吸光度（ａ）を測定した。同時に検体を含まないで同様に測定した時の吸光度（ｂ）を測定した。なお、この時それぞれに対する盲検の吸光度（ａ′），（ｂ′）を測定した。酵素活性阻害率（％）を計算式〔１−（ａ−ａ′）／（ｂ−ｂ′）〕×100 により計算した。50％阻害率を示す検体の濃度をIC50の値とした。
この定量法でベラクチンＡおよびベラクチンＢは、それぞれ0.18μg/mlおよび0.65μg/mlの濃度でカルボキシペプチダーゼＹを50％阻害した。
【００２２】
（ｂ）ラット尿管尿におけるブラジキニンの分解阻害活性の検定は、European Journal of Pharmacology， 232巻， 181〜 190頁（1993年）に記載の方法の改良法で行った。12〜14週齢の雄のＳＤラットの尿管から採取した尿管尿 0.01ml に検体としてのベラクチンを加えて20分間加温したのち、１μmole/ml のブラジキニン（ペプチド研究所製）を含む0.85％の塩化ナトリウム溶液0.03mlを加えて37℃で45分間反応させ、 0.1％のトリフルオロ酢酸と10％のアセトニトリルを含む水溶液 0.5mlを加えて反応を止めた。反応液をポアーサイズ0.45μm のメンブレン（日本ミリポア社製）に通した後、そのうち0.05mlを高速液体クロマトグラフィーのカラムに注入しブラジキニンの分解を測定した。
【００２３】
すなわち 1.2ml/minの流速でＡ液(0.1％のトリフルオロ酢酸を含む15％のアセトニトリル水溶液）を用いて平衡化したShodex Asahipak ODP-50−6Dカラム（昭和電工社製）に吸着させ、さらに３分間Ａ液で洗浄したのち、Ａ液からＢ液(0.1％のトリフルオロ酢酸、50％のアセトニトリル水溶液）への37分間の直線濃度勾配の条件下で溶出し、 210nmにおける吸光度を測定した。反応液中のブラジキニンとＣ末端のアルギニン残基が切断された des-Arg９−ブラジキニンの濃度は、クロマトグラフィーのピークの面積を測定し、基準物質（ともにペプチド研究所製）を用いた外部標準法によって定量できる。
【００２４】
上記の試験法にしたがって、37℃で20分間加温したラットの尿管尿に上記のとおりブラジキニンを含む水溶液を加え、37℃で45分間反応させ、その後に上記のとおりトリフルオロ酢酸とアセトニトリルを含む水溶液の添加により反応を停止させて得られた反応液を上記の条件の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のカラムに注入し、上記のとおり溶出して溶出液の 210nmにおける吸光度を測定した。この場合に測定された吸光度の変化と滞留時間（分）との関係を表わす曲線図を添付図面の図３（ａ）に示す。この場合、ブラジキニンは当初濃度0.75μmole/ml で存在したが、37℃で45分間の反応で分解されて0.32μmole/ml の濃度に減少したことが測定した吸光度曲線から認められた。また、ブラジキニンの分解により0.10μmole/ml の濃度の des-Arg９−ブラジキニンが生成されたことが認められた。
【００２５】
他方、ベラクチンＡを添加して加温したラットの尿管尿に、上記のとおりのブラジキニンを含む水溶液を加えて最終的に 100μg/mlの濃度のベラクチンＡを含む水溶液を、上記の条件で反応させた。そののちに上記と同様に反応停止させて得られた反応液を上記の条件でHPLCにかけ溶出し、そして溶出液の 210nmにおける吸光度を測定した。この後者の場合に測定された吸光度の変化と滞留時間（分）との関係を表わす曲線図を添付図面の図３（ｂ）に示す。
後者の場合に測定された吸光度曲線によると、ブラジキニンの分解で生じた   des-Arg９−ブラジキニンの生成は0.01μmole/ml 以下に阻害され、ブラジキニンの残存量は0.42μmole/ml となりブラジキニンの分解が抑制されたことが認められた。
【００２６】
第２の本発明による方法で使用されるベラクチンＡおよびＢの生産菌の一例としては、本発明者らにより分離された放線菌サッカロポリスポラ属 MK19-42F6株がある。
【００２７】
MK19-42F6株の菌学的性状を次に記載する。
１．形態
気菌糸は、いびつなかぎ状〜ループ状を呈し、ビーズ状に分断する。気菌糸には円筒形〜長円形の胞子の連鎖を認め、その表面はとげ状である。胞子の大きさは約 0.5〜 0.6× 0.9〜 1.2ミクロンである。輪生枝および胞子のうは認められない。基生菌糸は断片化する。
【００２８】
２．各種培地における生育状態
色の記載について〔  〕内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル(Container Corporation of America のcolor harmony manual) を用いた。
【００２９】
（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（32℃培養）
うす黄［２ca, Lt Ivory］〜うすだいだい［３ca, Pearl Pink〜３ea, Lt Melon Yellow ］の発育上に、白の気菌糸をわずかにうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
（２）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、32℃培養）
うす黄［２ca, Lt Ivory〜３ca, Pearl Pink］の発育上に、白〜うすだいだい［５ba, Shell Pink〜４ca, Flesh Pink］の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、32℃培養）
無色〜うす黄色［３ba, Pearl ］の発育上に、白〜茶白［５cb〜３cb, Sand］の気菌糸を着生し、溶解性色素は暗い赤紫〜紫灰を呈する。
（４）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、32℃培養）
無色〜うす黄色［３ca, Pearl Pink］の発育上に、白〜灰白［ｃ，Lt Gray ］の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は暗い茶色味を帯びる。
（５）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、32℃培養）
無色の発育上に、白〜灰白［ｂ，Oyster White］の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められない。
【００３０】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン 1.0％、イースト・エキス 0.2％、ひも寒天 3.5％、 pH7.0）を用い、10℃、20℃、24℃、30℃、32℃、37℃および50℃の各温度で試験した結果、10℃、20℃、50℃を除き、そのいずれの温度でも生育したが、生育至適温度は37℃付近と思われる。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地；32℃培養）
培養後８日目頃より水解性が認められ、その作用は強い方である。
【００３１】
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培地７；いずれも32℃培養）
いずれの培地においても陰性である。
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９；32℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、ラムノース、ラフィノース、イノシトール、Ｄ−マンニトールを利用して発育し、シュクロース、Ｄ−フルクトースはおそらく利用する。Ｄ−キシロースはおそらく利用しない。
【００３２】
以上の性状を要約すると、 MK19-42F6株は、その形態上、気菌糸はいびつなかぎ状〜ループ状を呈し、ビーズ状に分断する。気菌糸には円筒形〜長円形の胞子の連鎖を認め、その表面はとげ状である。輪生枝及び胞子のうは認められない。基生菌糸は断片化する。種々の培地で、無色〜うす黄の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色味を帯びるが、スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４）においては暗い赤紫〜紫灰を呈する。この菌株の生育至適温度は37℃付近で、放線菌としては高い方である。スターチの水解性は強く、メラニン様色素は生成しない。
【００３３】
ところで、 MK19-42F6株は、菌体成分として、細胞壁タイプはIV型（meso−ジアミノピメリン酸、アラビノース、ガラクトースを含有）、全菌体中の糖パターンはＡ型（アラビノース、ガラクトースを含有）である。全菌体を用いたグリコレートテストで、細胞壁のアシルタイプはアセチル型を示した。リン脂質は    ＰIII 型（フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルメチルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトールを含有し、未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）である。ミコール酸は含有せず、主要なメナキノンは MK-９(H4)で、 MK-10(H4)も認められる。脂肪酸は、 anteiso−17：０、 iso−15：０、 iso−16：０、 iso−17：０を主成分とする。
【００３４】
以上の結果を総合すると、 MK19-42F6株は、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora) 属〔文献，Lacey, J. and M. Goodfellow, Journal of General Microbiology, 88巻，75−85頁，1975年〕に属すると考えられる。そこでサッカロポリスポラ属の既知菌種を検索した結果、近縁の種として、胞子の表面がとげ状を呈する２種、サッカロポリスポラ・エリスラ(Saccharopolyspora  erythraea)〔文献１，Shirling, E.B. and D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology,  22 巻， 292− 293頁，1972年；文献２，Labeda, D.P.,International Journal of Systematic Bacteriology,  37巻，19−22頁，1987年〕及びサッカロポリスポラ・スピノサ(Saccharopolyspora  spinosa)〔文献，Mertz,F.P. and R.C. Yao, International Journal of Systematic Bacteriology, 40 巻，34−39頁，1990年〕があげられた。これらの菌株を入手次第、実地に比較検討する予定であるが、現時点では MK19-42F6株をサッカロポリスポラ・エスピー  (Saccharopolyspora sp.) MK19-42F6 とする。
【００３５】
なお、 MK19-42F6株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成６年７月５日、FERM P-14414として受託された。
【００３６】
MK19-42F6株は、他の放線菌に見られるようにその性状が変化し易い。例えば、 MK19-42F6株の、またはこの株に由来する突然変異体（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ベラクチンＡおよびベラクチンＢの少くとも一方を生産する菌は全て本発明に使用できる。
【００３７】
ベラクチンＡ及びＢ生産菌の培養は次のように実施できる。
【００３８】
本発明の方法では、前記の生産菌を通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。炭素源としては、グルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等を使用しうる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用しうる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することは有効である。また、菌の発育を助け、ベラクチンＡおよびＢの生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。
【００３９】
ベラクチン生産菌の培養法としては、好気的条件での培養法、特に深部培養法が最も適している。培養に適当な温度は15〜37℃であるが、多くの場合26〜30℃付近で培養する。ベラクチンＡおよびＢの生産は培地や培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培養のいずれにおいても通常１〜10日間でその蓄積が最高に達する。培養中のベラクチンＡおよびＢの蓄積量が最高になった時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製する。
【００４０】
ベラクチンＡおよびＢの精製は次のように実施できる。
本発明によって得られるベラクチンＡおよびＢの培養物からの採取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば、溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈澱法等を単独でまたは適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、培養液中に蓄積されたベラクチンＡおよびＢは、酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒で抽出できる。菌体よりはメタノール、アセトン等の有機溶剤で抽出後、抽出液を減圧濃縮し、培養濾液と同様の方法でさらに溶媒抽出できる。ベラクチンＡおよびＢを更に精製するには、シリカゲルあるいはYMC-GEL ODS-A60-200/60（株式会社山村化学研究所製）等を用いる吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは向流分配法などを行うとよい。
【００４１】
以上のような方法により、あるいはこれらを適宜組み合わせることにより、高純度のベラクチンＡおよびＢが得られる。
【００４２】
ベラクチンＡおよびＢの急性毒性を調べるために、ベラクチンＡまたはＢをマウスに腹腔内投与して２週間観察した結果、100mg/kgの投与でも毒性を示さなかった。
【００４３】
第１の本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩は、そのセリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有することからセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤として利用できる。
【００４４】
したがって、第３の本発明によると、前記の一般式（I）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するセリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤が提供される。
【００４５】
さらに、ベラクチンＡおよびＢはセリンカルボキシペプチダーゼに対して高い特異性で酵素阻害活性を有することにより抗高血圧剤または利尿剤として利用できる。
【００４６】
それゆえ、第４の本発明によると、前記の一般式（I）で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗高血圧剤が提供される。
【００４７】
また、第５の本発明によると、前記の一般式で表わされるベラクチンＡおよびＢの少なくとも１つまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する利尿剤が提供される。
【００４８】
第１の本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩は、抗高血圧剤または利尿剤あるいはその他の医薬として使用する場合、製薬学的に許容できる通常の固体または液体状の担体と混和することにより医薬組成物として製剤できる。
【００４９】
したがって、本発明の抗高血圧剤と利尿剤は、ベラクチンＡおよびＢまたはその製薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有し、かつこれと混和された製薬学的に許容できる固体または液体状の担体を含有する医薬組成物の形であることができる。
【００５０】
本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩は、医薬として用いる場合は、一般に経口的または非経口的に投与できる。
【００５１】
ベラクチンＡおよびＢまたはその製薬学的に許容できる塩は、賦形剤あるいは担体と混合して注射剤、経口剤または坐剤などの製剤の形で投与される。賦形剤および担体としては製薬学上許容されるものが選ばれ、その種類および組成は投与経路や投与方法によって決まる。たとえば、液状担体として水、アルコールもしくは大豆油、ゴマ油、ミネラル油などの動植物油、または合成油などが用いられる。固体担体としてはマルトース、シュクロースなどの糖類、リジンなどのアミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、シクロデキストリンなどの多糖類、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。
【００５２】
注射剤として製剤する場合には、液状担体は一般に生理食塩水、各種緩衝液、グルコース、イノシトール、マンニトールなどの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類であることができる。また、イノシトール、マンニトール、グルコース、マンノース、マルトース、シュクロースなどの糖類、フェニルアラニンなどのアミノ酸類などの賦形剤とともに凍結乾燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、たとえば滅菌水、生理食塩水、ブドウ糖液、電解質溶液、アミノ酸などの静脈投与用液体に溶解して使用できる。
【００５３】
製剤された組成物中におけるベラクチンＡおよびＢの含量は製剤型により種々異なるが、通常は 0.1〜 100重量％、好ましくは１〜90重量％である。たとえば注射液の場合には、通常 0.1〜５重量％の含量でベラクチンＡおよびＢを含むようにすることがよい。経口投与の場合には、前記固体担体もしくは液状担体とともに錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤などの形態で用いられる。錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤の場合、一般にベラクチンＡおよびＢの含量は３〜 100重量％、好ましくは５〜90重量％であり、残部は担体である。
【００５４】
本発明によるベラクチンＡおよびＢまたはその塩の投与量は、患者の年齢、体重、症状、治療目的などにより決定される。しかし、その投与量は動物試験の結果など種々の状況を勘案して総投与量が一定量を超えない範囲で、連続的または間欠的に投与できる。一定の条件下における投与の適量と回数は専門医の決定による。
【００５５】
以下に本発明の実施例を示すが、ベラクチンＡおよびＢの性状が本発明によって明らかにされたので、それらの性状にもとずきベラクチンＡおよびＢの製造法を種々考案することができる。従って本発明は実施例に限定されるものではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明によって明らかにされたベラクチンＡおよびＢの性状にもとずいて公知の手段を施してベラクチンＡおよびＢを生産、濃縮、抽出、精製する方法をすべて包括する。
【００５６】
実施例１（ベラクチンＡの製造）
種培地として、グリセリン 2.0％、エスサンミート 1.5％、リン酸二カリウム 0.1％、塩化コバルト六水和物0.0005％の組成からなる培地を用いた。なお、滅菌前のpHは１Ｍのリン酸一カリウムを加えて 6.2に調整した。
【００５７】
前記の種培地(110ml) を分注した 500ml容三角フラスコを 120℃で20分間滅菌し、これに MK19-42F6株（FERM P-14414) の斜面寒天培養の１白金耳を接種し、毎分 180回転の回転式振盪器を用いて27℃で２日間振盪培養した。培養終了後、培養液を濾過し、濾液と菌体に分別した。
【００５８】
つぎに、得られた５Ｌの培養濾液に５Ｌの酢酸エチルを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、濃縮して褐色の粗物質を得た。菌体には２Ｌのメタノールを加え、よく攪拌して濃縮したのち、３Ｌの精製水と３Ｌの酢酸エチルを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、濃縮乾固して褐色の粗物質を得た。上記のように濾液と菌体から得られた褐色の粗物質、計 422.5mgを50mlのクロロホルム−メタノール(100：１) 混合溶媒で懸濁したのち、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製，Art.7734）、45mlのカラムにかけ、クロロホルム−メタノール(100：１) 混合溶媒 200mlで溶離し、活性画分を含む溶離液を減圧下に濃縮乾固し薄い褐色の粗物質39.9mgを得た。
【００５９】
この粗物質を20mlのトルエン−酢酸エチル（20：１）混合溶媒に溶解し、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製，Art.7734）、45mlのカラムにかけたのち、トルエン−酢酸エチル（20：１）、トルエン−酢酸エチル（10：１）各 200mlの混合溶媒で洗浄後、 200mlのトルエン−酢酸エチル（６：１）混合溶媒で溶離し、活性画分を減圧下に濃縮乾固した。
【００６０】
次に、これを酢酸エチル−メタノール（４：１）混合溶媒に溶解し、あらかじめ同混合溶媒で充填したセファデックスLH20（ファルマシア社製）、 350mlのカラムにかけ、 350mlの同混合溶媒で溶離した。得られた活性画分を減圧下に濃縮乾固したのち、少量のベンゼンに溶解して凍結乾燥を行うことにより純粋なベラクチンＡの黄薄色粉末19.4mgを単離した。
【００６１】
実施例２（ベラクチンＢの製造）
ベラクチンＡの場合と同様に MK19-42F6株（FERM P-14414) を培養した後、培養液を濾過し、濾液と菌体に分別した。さらに、得られた培養濾液５Ｌに酢酸エチル５Ｌを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、濃縮して褐色の粗物質を得た。菌体にはメタノール２Ｌを加え、よく攪拌して濃縮したのち、精製水３Ｌに懸濁した。次に酢酸エチル３Ｌを加え、よく攪拌して有効成分を抽出したのち、濃縮乾固して褐色の粗物質を得た。上記のように濾液と菌体から得られた褐色の粗物質、計 422.5mgをクロロホルム−メタノール(100：１) 50mlで懸濁後、あらかじめ同混合溶媒で充填したシリカゲル60（メルク社製，Art.7734）、45mlのカラムにかけ、クロロホルム−メタノール(100：１)200ml、クロロホルム−メタノール（50：１） 200ml、クロロホルム−メタノール（30：１） 200mlで順々に洗浄したのち、クロロホルム−メタノール（10：１） 200mlで溶離した。活性画分を含む溶離液は減圧下に濃縮乾固し褐色の粗物質95.8mgを得た。
【００６２】
この粗物質を25％のアセトニトリル水溶液に溶解し、あらかじめ毎分６mlの流速で同混合溶媒により平衡化したHPLC用カラム（Shiseido Capcellpak C18 SG120 φ20×250mm 、株式会社資生堂社製）に注入し、同混合溶媒で５分間洗浄したのち、 100分間で25％から50％のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配法により溶離した。
【００６３】
さらに、得られた活性画分を減圧下で濃縮し、L.L.N.モデルＮＭＦ（三鬼エンジニアリング社製）による遠心液液分配クロマトグラフを用いて精製を行った。すなわちクロロホルム−メタノール−水（５：６：４）の溶媒系の上層を固定相液とし下層を移動相液として20℃、遠心部の回転数を毎分 700回転、移動相液の流速を毎分５mlの条件で展開し、移動相液を 250ml送液したのち、固定相液を逆方向に送液して固定相中の移動度の低いものから順に溶離した。得られた活性画分を減圧下に濃縮し、少量のメタノールを含む精製水に溶解したのち凍結乾燥を行って、純粋なベラクチンＢの白色粉末15.7mgを単離した。
【００６４】
ベラクチンＡおよびＢの培養工程中の追跡は、カルボキシペプチダーゼＹに対する酵素阻害活性の測定で行ない、また精製工程中での追跡は、酵素阻害活性に加えて展開溶媒としてトルエン−酢酸エチル（２：１）あるいはクロロホルム−メタノール−水(100：20：１) によるシリカゲル薄層クロマトグラフ（メルク社製，Art.5715）を用いて行った。
【００６５】
実施例１で得たベラクチンＡと実施例２で得たベラクチンＢはそれぞれに前述した物理化学的性状を有する。
【００６６】
【発明の効果】
本発明のベラクチンＡおよびＢ物質は、セリンカルボキシペプチダーゼ阻害活性を有しており、新しい薬理作用を有する薬剤としての有用性が期待される。尿中におけるブラジキニンの分解を抑制することから、利尿剤あるいは抗高血圧剤などとして有用性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベラクチンＡの赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠法）である。
【図２】ベラクチンＢの赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠法）である。
【図３】（ａ）尿管尿にブラジキニンを添加して一定時間で反応させた後に反応を停止させて得られた反応液中のブラジキニンの残存量と生成した des-Arg９−ブラジギニンの量とを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定した場合における溶出液の吸光度(210nm) の変化と滞留時間（分）との関係を示す曲線図である。
（ｂ）尿管尿にブラジキニンとベラクチンＡ(100μg/ml) とを添加して反応させた後に反応を停止させて得られた反応液中のブラジキニンの残存量と生成した des-Arg９−ブラジキニンの量を同様にHPLCで測定した場合における溶出液の吸光度(210nm) の変化と滞留時間（分）との関係を示す曲線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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