(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＰデアミナーゼ阻害試験およびＡＴＰレベル測定で化合物を試験し、そしてＡＭＰデアミナーゼ活性の測定可能な減少およびＡＴＰの測定可能な増加が観察される場合、次にそれを植物に対するインビボの試験に付してインビボの除草活性を確認することからなり、この測定可能な減少は前記化合物の濃度が１００μＭ以下で酵素試料に対して試験した時のＡＭＰデアミナーゼ活性の少なくとも２５％の減少である、潜在的な除草剤を識別する方法。
【請求項２】
測定可能な減少が、試験に付される化合物の濃度が１００μＭ以下で酵素試料に対して試験した時のＡＭＰデアミナーゼ活性の少なくとも５０％の減少である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＴＰの測定可能な増加が、試験に付される化合物の濃度が１０ｍＭ以下で蒸散流により植物に施した時のＡＴＰ抽出量の対照値の少なくとも１．５倍の増加である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＡＴＰの測定可能な増加が、試験に付される化合物の濃度が１０ｍＭ以下で蒸散流により植物に施した時のＡＴＰ抽出量の対照値の少なくとも２．０倍の増加である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アデノシンデアミナーゼ阻害試験およびＡＴＰレベル測定で化合物を試験し、そしてＡＭＰデアミナーゼ活性の測定可能な減少およびＡＴＰの測定可能な増加が観察される場合、次にそれを植物に対するインビボの試験に付してインビボの除草活性を確認することからなり、この測定可能な減少は試験に付される化合物の濃度が１００μＭ以下で酵素試料に対して試験した時のアデノシンデアミナーゼ活性の少なくとも２５％の減少である、植物中でＡＭＰデアミナーゼ阻害剤に代謝されうる潜在的な除草剤を識別する方法。
【請求項６】
測定可能な減少が、試験に付される化合物の濃度が１００μＭ以下で酵素試料に対して試験した時のアデノシンデアミナーゼ活性の少なくとも５０％の減少である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＡＴＰの測定可能な増加が、試験に付される化合物の濃度が１０ｍＭ以下で蒸散流により植物に施した時のＡＴＰ抽出量の対照値の少なくとも１．５倍の増加である請求項５または６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は潜在除草剤（potential herbicides）を識別する方法、およびAMPデアミナーゼの阻害物質またはプロ阻害物質の除草剤としての使用に関する。
コホルマイシンおよび炭素環式コホルマイシンは除草活性を有することが以前に報告されている（それぞれ、IsaacらのJ. Antibiotics 44, 729（1991年）およびBushらのphytochem. 32, 737（1993年））。
コホルマイシンはアデノシンデアミナーゼ酵素、EC3,5,4,4の強力な阻害剤であることが知られている（NakamuraらのJ. Am. Chem. Soc. 96, 4327（1974年））。コホルマイシンはまた、関連の酵素AMPデアミナーゼ、EC3,5,4,6の阻害剤でもあるが、非常に強力な阻害作用を達成するためにはリボースの5'位のリン酸化が必要である（FriedenらのBiochem., 19, 5303（1980年）；MerklerらのBiochem., 29, 8358（1990年））。
アデノシンデアミナーゼの阻害剤はガンの化学療法において、自己免疫疾患の免疫抑制剤として、また酵素の作用により不活性にすることのできるウイルス性疾患およびガンの治療におけるアデニンヌクレオシド類似体の活性を高める能力において興味深いものである〔GilbertsonおよびSircarの「総合医化学」（Hansch C., Sammes P.G. およびTaylor J.B. 編、第２巻、第449頁）〕。
一般に、植物はアデノシンデアミナーゼを含有しないと考えられている〔HollomanのProc. Brit. Crop Conf. Pests Diseases, 251（1979年）；BatlersらのPhysiol. Plant Pathol., 27, 65（1985年）；BradyおよびHegartyのNature, 209, 1027（1966年）；StaubらのJ. Am. Soc. Hort. Sci., 110, 426（1985年）；Le FlochらのPlant Sci. Lett., 27, 309（1982年）〕。したがって、コホルマイシンの除草活性はこの酵素を阻害するというその知られている能力によるものではない。関連の酵素AMPデアミナーゼは植物において細胞内アデニレートエネルギー装填の維持の役割を有することが報告されているが（Raymondらの「植物の生化学」、第２巻、第５章、第129ページ、Davis D.D. 編（1987年））、我々の知っている限りでは、植物に関してこの理論を支持するような直接の実験的証拠は公表されていない。コホルマイシンはCatharanthus roseusの浮遊培養においてアデニンヌクレオチドの量を混乱させることが報告されているが、AMPデアミナーゼの阻害は直接、証明されていない（YabukiおよびAshiharaのBiochim. Biophys. Acta. 1073, 474(1991年)）。また、コホルマイシンはアデノシンデアミナーゼにおけるその効果およびAMPデアミナーゼに対するその5'−リン酸誘導体の効力と比較した場合、この酸素の比較的弱い阻害剤であることが知られている。
本発明者らは炭素環式コホルマイシンの強力な除草活性が植物中の化合物のリン酸化およびその後のAMPデアミナーゼ酵素（EC3,5,4,6）の阻害によるものであることを見い出した。この作用の様式は除草剤に関して以前に開示されていない。
発明の開示
本発明者らは炭素環式コホルマイシンが哺乳動物のアデノシンデアミナーゼの強力な阻害剤であることを示した（試験例１）。
エンドウの実ばえ(pea seedlings)からの粗製脱塩ホモジネートによる14C−アデノシンの代謝の研究は文献値よりアデノシンデアミナーゼが存在しないことを示した。しかしながら、関連の酵素、AMPデアミナーゼは明らかに存在していた（試験例２）。
炭素環式コホルマイシンをエンドウの実ばえに蒸散流により施すと、AMPデアミナーゼの抽出可能レベルが急速に減少した（試験例３）。
炭素環式コホルマイシンは植物のAMPデアミナーゼの比較的弱い阻害剤に過ぎなかったが、その5'−リン酸誘導体は強力な阻害剤であった（試験例４）。
上記の観察結果は炭素環式コホルマイシンが植物中でリン酸化され、このリン酸化誘導体が観察された酵素活性レベルの減少をひき起こしたことを示唆している。さらに、リン酸化がインビボで起こるという証拠は3H−炭素環式コホルマイシンをエンドウの実ばえに蒸散流により施し、生成した代謝物を監視することにより得られた。真正の炭素環式コホルマイシン−5'−リン酸を用いた共クロマトグラフィーにより得られる化合物が生成していることがわかった。さらに、この化合物はAMPデアミナーゼを含有する可溶性タンパク質フラクションに結びついて単離することができ、5'−リン酸誘導体が植物中で酵素を阻害することの有力な証拠が得られた（試験例５）。
AMPデアミナーゼは細胞内アデニレートのエネルギー装填の維持の役割を有することが報告されている（Raymondらの「植物の生化学」、第11巻、第５章、第129頁、Davis D.D. 編（1987年））。
本発明者らは酵素が阻害されると得られる協力な除草効果の点から見て植物に対するこの酵素の重要性を明確に証明した。アデニレートのエネルギー装填の維持のその役割はアデニレートレベルにおける炭素環式コホルマイシンの使用効果の分析結果からも明らかであった。試験例６に示されるように、AMP抽出可能レベルの著しい上昇は明らかであった。このATPレベルの上昇はAMPデアミナーゼの阻害剤に独特のものであるらしくこれは例えば標準的な除草剤のクロルスルフロンでは示されなかった。
これらの結果はAMPデアミナーゼの阻害が炭素環式コホルマイシンの作用の様式であることを確立するものである。これは新しい除草作用様式であり、その発見は同じ酵素の標的を直接、またはその後の植物中での活性阻害物質への代謝（“間接阻害剤”）により阻害する新しい化学物質を識別する機会を切り開くものである。
したがって、本発明はまた、候補の除草剤を直接除草剤に対するAMPデアミナーゼ阻害試験または植物中での変換を必要とする阻害剤に対するアデノシンデアミナーゼ試験で試験することからなる潜在的な除草剤を識別する方法を提供する。
本発明はさらに、植物中でAMPデアミナーゼの阻害剤である化合物の除草剤としての使用を提供するが、但しこの化合物は一般的な酵素阻害剤ではなく、また以前から除草活性を有することが知られている化合物ではなかったものである。
この用途において、AMPデアミナーゼ阻害剤は100μM以下で酵素試料に対して試験した時にAMPデアミナーゼの測定可能な減少をもたらすものである。「測定可能な減少」とは一般に、この割合で少なくとも25％の減少、好ましくは少なくとも50％の減少を意味する。
この用途において、間接阻害剤は植物中でAMPデアミナーゼの阻害物質に変換されるものである。幾つかの間接阻害剤は100μM以下で酵素試料に対して試験した時にアデノシンデアミナーゼの測定可能な減少をもたらす。「測定可能な減少」とは一般に、この割合で少なくとも25％の減少、好ましくは少なくとも50％の減少を意味する。
AMPデアミナーゼ試験は内在の除草活性を識別するが、その後インビボの除草活性を確認するために慣用の試験を使用することが必要である。もちろん、これは植物中の代謝による活性化を必要とするすべての間接阻害剤に対して不可欠である。炭素環式コホルマイシンで処理して得られる典型的な徴候は頂端分裂組織における生長停止、その後のペイリング（paling）およびネクロ−シスである。これらの徴候は無関係な作用様式を有する他の除草剤（例えばクロルスルフロン）によりひき起こされるものと同様であるため、候補の化合物がAMPデアミナーゼの阻害によりその除草活性を示すことはATP抽出可能レベルを測定することにより確認できる。我々の信じる限りでは、ATPレベルの増加はそれらの作用様式がAMPデアミナーゼの阻害による除草剤と特異的に関連がある。この場合、活性化合物は10mM以下で蒸散流により植物に施した時にATP抽出可能レベルの測定可能な増加をもたらすものである。「測定可能な増加」とは一般に、対照値の少なくとも1.5倍までの増加、好ましくは対照値の少なくとも2.0倍までの増加を意味する。
〔試験例〕
〔試験例１〕哺乳動物のアデノシンデアミナーゼ阻害検定
適当な酵素源はシグマ化学会社により供給される子牛の腸粘膜アデノシンデアミナーゼである。使用する試験法は供給者により提供されるプロトコルに従い、基質のアデノシンを使用した時の265nmにおける吸収量の減少を測定する。基質を添加する前に、酵素および阻害剤を10分間プレインキュベートした。基質濃度が60μMである場合、これらの条件下で炭素環式コホルマイシンは25nMで50％の阻害率を与えた。
〔試験例２〕粗製植物ホモジネートにおけるアデニル酸代謝経路
エンドウ（Pisum sativum L var Onward）を25℃で10日間、16時間／８時間の明／暗サイクルにおいて土中で生長させた。表土の近くで実ばえを収穫し、ワーリングブレンダー（１分間、最高速度）を使用してトリス−HCl（0.1Ｍ、５Ｍ NaOHでpH7.4にした）、0.1mMのジチオトレイトールおよび0.4Ｍのスクロースを含有する２容量の氷冷緩衝液中で均質化することにより粗製ホモジネートを調製した。ホモジネートを６層のモスリンを通過させ、そして均質化緩衝液で予め平衡させたセファデックス（登録商標）PD10カラム（1.5cm×８cm）上で2.5mlを脱塩した。同じ緩衝液を使用してタンパク質を溶離した。分析物は250μlの全容量において50mMのトリス−HCl（pH6.5）、50mMのKCl、0.05％（w／v）のBSAおよび100mgのタンパク質を含有した。表示がある場合にはATP（５mM）もまた含有した。〔14C〕アデノシン（500μM、0.2μCi）を加えて検定を開始した。25℃で10分間インキュベートした後、0.25mlの氷冷HClO4（0.4Ｍ）を加えて反応を停止した。沈殿したタンパク質を遠心分離（13,000ｇ、２分間）により除去し、得られる0.4mlの上澄みを予め２容量のメタノール、次に２mlの0.4Ｍ HClO4で洗浄したフェニルシラン結合シリカゲルカラム（500mg）に装荷した。試料を４mlの0.4Ｍ HClO4で溶離した。溶出液のpHを氷上で５Ｍ KOHを用いて5.5〜7.0に調整した。中和した抽出物を遠心分離（13,000ｇ、２分間）し、Gyrovap（登録商標）中で蒸発乾固した。次に、試料を0.5mlの10mM HCl中に再び溶解し、遠心分離（13,000ｇ、２分間）してからHPLC分析を行った。スフェリソルブ（登録商標）カラム（25cm×0.46cm）、溶媒１：95：５の10mM KH2PO4：メタノール；溶媒２：88：12の10mM KH2PO4：メタノール、pH5.3、６分毎のステップ変化、流速：１ml／分での逆相クロマトグラフィーにより生成物を分析した。
下表に示したデータを見てわかるように、アデノシンデアミナーゼ活性は検出されなかった。実際に、ATPを加えないとアデノシンの代謝は全く認められなかった。適当なキナーゼの作用から予想されるように、ATPの添加はリン酸化化合物AMP、ADPおよびATPの生成をもたらした。IMPの生成は多分、AMPデアミナーゼの作用によるものであり、また少量のイノシンはその後の脱リン酸化によるものである。
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〔試験例３〕AMPデアミナーゼの抽出可能レベルについての炭素環式コホルマイシンの効果
エンドウの実ばえを地表の高さの近くで切り取り、その茎をすぐに蒸留水で洗浄し、２mlの化合物溶液または水（対照）を含有する１mlのキュベット中に直立させた。茎の基部から切片（約２mm）を切り取り、木部にエアロックが形成しないようにそれを浸漬した。実ばえを室温（約20℃）において空気の流れる明るい所でインキュベートした。時々、それぞれの実ばえを抽出し、AMPデアミナーゼのレベルを乳棒および乳鉢を使用して２容量の氷冷クエン酸塩緩衝液（0.1Ｍ、pH７）、0.5mMのジチオトレイトール中に抽出することにより測定した。ホモジネートを６層のモスリンを通過させ、そして30mMのクエン酸塩（pH7.1）、50mMのKClおよび0.5％（w／v）のBSA（試験緩衝液）で予め平衡させたセファデックスゲルろ過カラム（1.5cm×８cm）に装荷した。検定緩衝液を使用してタンパク質を溶離し、直接酵素検定に使用した。試験はアンモニアの放出（McCulloughのClinica Chimica Acta, 17, 297(1967年)）に基づき、また0.5mlの全容量において60mMのクエン酸塩緩衝液（５Ｍ NaOHでpH7.1にした）、100mMのKCl、0.1％（w／v）のBSAおよび５mMのAMPを含有した。50μlの抽出物を加えて反応を開始した。０〜60分の間、15分の間隔で420μlの試薬１（0.1Ｍのフェノール、0.17mMのナトリウムニトロプルシド）、すぐその後に275μlの試薬２（500mlの全容量において0.125ＭのNaOH、0.38ＭのNa2HPO4および５mlのHOCl）を加えて反応を停止した。55℃で60分間インキュベートした後、625nmにおいて溶液の吸光度を測定した。
これらの条件下、１時間の処理によりAMPデアミナーゼの抽出可能レベルは１分間につき生の重量（fresh weight）１ｇあたり19μモルのアンモニア放出の対照値の20〜30％まで減少した。
〔試験例４〕植物のAMPデアミナーゼの阻害試験
エンドウの実ばえを試験例２に記載のようにして生長させた。実ばえを地表の高さの近くで収穫し、ワーリングブレンダー（１分間、最高速度）を使用して0.1mMのジチオトレイトールおよび0.4Ｍのスクロースを含有する２容量の氷冷リン酸塩緩衝液（pH7.5）中で均質化した。次の操作はすべて４℃で行った。ホモジネートを６層のモスリンを通してろ過し、100,000ｇで20分間遠心分離して細胞の壊死組織片を除去した。得られる上澄みに、絶えず撹拌しながら40％（w／v）の硫酸アンモニウムを加えた。沈殿物を遠心分離（12,000ｇ、15分間）により集め、30mlのリン酸塩緩衝液（pH7.5）、0.1mMのジチオトレイトールに溶解し、次に２ｌの同じ緩衝液で一晩透析した。一晩の透析中に生成した不溶物を遠心分離(7,000ｇ、10分間)により除去した。上澄みを予め0.1Ｍのリン酸塩緩衝液(pH7.5)で平衡させたホスホ−セルロースカラム（1.5×８cm）に装荷した。装荷後、カラムを14mlのリン酸塩緩衝液（0.1Ｍ、pH7.5）で洗浄し、酵素を0.6Ｍのリン酸塩緩衝液（pH7.5）で溶離した。上記の試験例３に記載のアンモニア放出試験を使用して活性を測定した。
10分間のプレインキュベーション期間および640μMの基質濃度を使用して、炭素環式コホルマイシンは120μMで活性を50％阻害した。対照的に、炭素環式コホルマイシン5'−リン酸は20nMで50％阻害した。
〔試験例５〕炭素環式コホルマイシンの植物中の代謝
エンドウの実ばえを試験例２に記載のようにして育て、試験例３に記載のようにして収穫し、次に10μM（400Ci／モル）の〔3H〕炭素環式コホルマイシンを蒸散流により与えた。インキュベーション後、対になった実ばえを液体窒素で急速に凍結し、粉砕して微粉末にし、そして２mlの氷冷0.4Ｍ HClO4に抽出した。最終試料を10mMのHClの代わりに0.5mlの水に再び懸濁したことを除けば、上記の試験例２に記載のようにして抽出物のHPLC分析を行った。パルチシル（登録商標）SCXカラム（8.0cm×0.46cm）、0.05ＭのNH4H2PO4、pH2.6；流量２ml／分でのカチオン交換クロマトグラフィーにより〔3H〕炭素環式コホルマイシンおよび〔3H〕炭素環式コホルマイシン5'−リン酸を分離した。
４時間のインキュベーション後、本物の炭素環式コホルマイシン5'−リン酸を用いた共クロマトグラフィーにより主要な代謝物が得られた。代謝物を同定するための別の証拠はアルカリ性リン酸塩処理が代謝物の炭素環式コホルマイシンへの完全な再変換をもたらすという事実から明らかであった。
上記のように処理した植物を試験例３に記載の酵素抽出プロトコルに従って抽出すると、放射能もまたAMPデアミナーゼを含有するタンパク質フラクションと関連していた。タンパク質の変性およびその後のHPLC分析はすべての放射能が炭素環式コホルマイシン5'−リン酸と関連していることを示した。
〔試験例６〕ATP抽出可能レベルの測定
エンドウを試験例１に記載のようにして育て、試験例３に記載のようにして蒸散流により炭素環式コホルマイシンに曝露した。それぞれの実ばえを液体窒素で急速に凍結した。乳棒および乳鉢を使用して凍結組織を粉砕して微粉末にし、次に１mlの氷冷0.4Ｍ HClO4を加えた。凍結酸を粉砕して微粉末状組織にし、混合物を溶かし、氷上で15分間インキュベートした。抽出物を遠心分離（4,000rpm、５分間）した。
ルシフェラーゼ試験により、LUMACバイオカウンターM2500（6370 AC Landgraaf）を使用してATPの測定を行った。試料を水で１：10,000に希釈し、100μlを製造業者の使用説明書に従って試験した。
４時間の処理後、100μMの炭素環式コホルマイシンはATP量を生の重量１ｇあたり333ｎモルのATPの対照値の約２倍まで増大した。