(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり、亜鉛が３原子以上結合した亜鉛−ラクトフェリン。
【請求項２】
ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物と、亜鉛とが、炭酸および／または重炭酸を介して結合した請求項１記載の亜鉛−ラクトフェリン。
【請求項３】
ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり、亜鉛３原子以上が、炭酸および／または重炭酸  １．５分子以上を介して結合した請求項２記載の亜鉛−ラクトフェリン。
【請求項４】
ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり、亜鉛３〜  １５０原子が、炭酸および／または重炭酸  １．５〜  １５０分子を介して結合した請求項２記載の亜鉛−ラクトフェリン。
【請求項５】
亜鉛を含む溶液と、ラクトフェリン類および／またはラクトフェリン類分解物を含む溶液とを混合する亜鉛−ラクトフェリンの製造法。
【請求項６】
ｉ）炭酸、  ｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸を含む溶液と、  ｉｖ）亜鉛を含む溶液と、ｖ）ラクトフェリン類、  ｖｉ）ラクトフェリン類分解物、またはｖｉｉ）ラクトフェリン類およびラクトフェリン類分解物を含む溶液とを混合する亜鉛−ラクトフェリンの製造法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の亜鉛−ラクトフェリンを有効成分とする亜鉛強化飲食品あるいは飼料添加物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の亜鉛−ラクトフェリンを配合した飲食品および飼料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物と、亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンに関する。また、本発明は、亜鉛−ラクトフェリンを製造する方法に関する。さらに、本発明は、亜鉛−ラクトフェリンを有効成分とする亜鉛強化飲食品あるいは飼料添加物あるいはこのような亜鉛−ラクトフェリンを配合した飲食品および飼料に関する。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、亜鉛独特の金属味が消失しており、また、亜鉛に起因する酸化作用も抑制されているので、飲食品や飼料等に亜鉛を添加する際の素材として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
亜鉛は、炭酸デヒドロターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等やＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等、多くの酵素の活性発現に重要な働きを担っている。
この亜鉛は、ヒトの微量必須元素として知られており、その栄養所要量は１５ｍｇ／日といわれている［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，  Ｒｅｃｏｍｅｎｄｅｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ａｌｌｏｗａｎｃｅｓ，  １９８９，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．］。亜鉛の欠乏症については、成人の場合あまり認められていないが、１９５０年代にイランにおける貧血、性機能不全、皮膚障害等の原因が亜鉛の欠乏症であったことが知られており、また、１９６０年代にエジプトにおける皮膚障害の原因が亜鉛の欠乏症であったことが知られている［Ｐｒａｓａｄ，Ａ．Ｓ．，  Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃ．，  ｖｏｌ．４３，  ｐｐ．２８２９−２８３４，  １９８４］  。
また、子供の場合、亜鉛の軽度な欠乏症として、食欲不振や感覚障害等が知られている［Ｈａｍｂｉｄｇｅ，Ｋ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｄｉａｔ．  Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．６，  ｐｐ．８６８−８７４，  １９７２］  。特に、新生児の場合、亜鉛は重要なものであり、初乳には常乳の４倍程度の亜鉛が含まれていることが知られており  ［李家珍ら，  日本栄養食糧学会誌，  ｖｏｌ．４２，  ｐｐ．３６５−３６８，  １９８９］  、人工乳においては、亜鉛の吸収性が悪く、亜鉛を積極的に添加する必要があることも報告されている［Ｓａｎｄｓｔｏｍ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｄｉｓ．  Ｃｈｉｌｄ．，  ｖｏｌ．１３７，  ｐｐ．７２６−７２９，  １９８３］  。
【０００３】
なお、加齢と共に亜鉛の吸収効率が低下するという報告もあり［Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｉｎｃ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．３３５−３５０，  １９８９，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｌｏｎｄｏｎ］、高齢者における潜在的な需要も考慮されている。
さらに、最近では、亜鉛の不足により放射線に対する抵抗力が低下すること、インスリンに亜鉛が存在することから亜鉛の不足により糖代謝の異常につながること、皮膚障害の治療に亜鉛の投与が有効であること、火傷により身体からの亜鉛の損失が大きいこと  ［西牟田守，  食の科学，  ｖｏｌ．２０９，  ｐｐ．２４−３４，  １９９５］が示唆されており、亜鉛の積極的な摂取についても、今後の課題と考えられている。
【０００４】
なお、日本人の場合、亜鉛については穀類からの摂取が主といわれているが、近年、穀類の摂取割合が減少していることから亜鉛不足も心配される。
一方、亜鉛は油脂の劣化を促進することが知られており、食品中に単に添加した場合、過酸化脂質生成が問題となる。特に、食品中の油脂は、食材の口当たりを滑らかにする等、食感を決定し、風味の面でも、食品の美味しさを引き出す最も重要な要因の一つであり、油脂を除いて食品の安定性を評価することはできない。したがって、亜鉛を添加することによる油脂の劣化が大きな問題になる。
【０００５】
油脂は、保存中に劣化し、加熱処理中にも劣化する。劣化した油脂は、風味の悪化や異臭が認められるだけではなく、その摂取は多くの疾病の原因ともなる。劣化した油脂には商品価値が無く、油脂の劣化防止対策は油脂の利用上不可欠なものとなっている。油脂の劣化による過酸化物生成の原因となるものに、光、空気、ミネラルの存在等がある。その中でも、亜鉛、銅、鉄、マンガン、ニッケル等の重金属は油脂の酸化を特に促進する。そのため、油脂の精製技術において、ミネラルの除去工程は重要であると考えられている。食品に含まれる金属中では銅が最も酸化を促進し、亜鉛、鉄がこれに次ぐといわれる。
このように、飲食品や飼料等に亜鉛を強化することで、亜鉛を補給することができると考えられるが、現在のところ、亜鉛による飲食品や飼料等の劣化を防止することができないことや亜鉛に由来する独特の金属臭が生じること等から、亜鉛の飲食品や飼料等への添加は難しい状況にある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような飲食品あるいは飼料に添加したときの亜鉛の欠点を改善することを目的とするものである。すなわち、本発明は、亜鉛に由来する独特の金属臭がなく、長期間安定で、耐熱性を有し、さらに、飲食品や飼料等に添加した場合に起こる飲食品や飼料等の劣化を防止する働きを有する亜鉛−ラクトフェリンを提供することを課題とする。
また、本発明は、このような亜鉛−ラクトフェリンを製造する方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、このような亜鉛−ラクトフェリンを有効成分とする飲食品あるいは飼料添加物及びこれらを配合した飲食品および飼料を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
これまでに、ラクトフェリン類と亜鉛との結合を報告したものは、ラクトフェリン１分子に亜鉛１原子が結合するというもののみである［Ｓｈｉｎｇｈ，Ｈ．，  Ｆｌｙｎｎ，Ａ．  ａｎｄ  Ｆｏｘ，Ｐ．Ｆ．，  Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．５６，  ｐｐ．２３５−２４８，  １９８９］  。また、トランスフェリンと亜鉛との結合を報告したものも、トランスフェリン１分子に２原子以下の亜鉛が結合するというもののみである［Ａｉｓｅｎ，Ｐ．  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｄ．Ｃ．，  “Ｉｒｏｎ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｉｒｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  ｐｐ．２３９−３７１，  Ｖ．Ｃ．Ｈ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９］  。すなわち、ラクトフェリン類１分子に３原子以上の亜鉛が結合することは未だに知られていなかった。
【０００８】
本発明者らは、ラクトフェリン類に結合する亜鉛量を高めることについて、鋭意研究を進めたところ、炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンを利用することにより、通常知られているラクトフェリン類の金属結合部位の数よりも遙かに多量の亜鉛を結合させることができることを見出した。すなわち、ラクトフェリン類を含む溶液と亜鉛を含む溶液とを混合すると、ラクトフェリン類と亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンを形成することを見出し、さらに、ｉ）炭酸、  ｉｉ）重炭酸、またはｉｉｉ）炭酸および重炭酸を含む溶液と、  ｉｖ）亜鉛を含む溶液と、ｖ）ラクトフェリン類を含む溶液とを混合すると、炭酸および／または重炭酸を介してラクトフェリン類と亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンを形成することを見出した。そして、この亜鉛−ラクトフェリンは、亜鉛を多く含有し、亜鉛独特の金属臭がなく、長期間安定で、しかも耐熱性を有し、さらに亜鉛による飲食品や飼料等の劣化を防止することができることを見出した。
【０００９】
また、ラクトフェリン類に代え、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素により、あるいは、酸やアルカリにより分解したラクトフェリン類分解物を用いても同様の亜鉛−ラクトフェリンが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、このようなラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物と亜鉛とが結合した亜鉛−ラクトフェリンである。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛が３原子以上結合している。また、本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛が３原子以上が、炭酸および／または重炭酸  １．５分子以上を介して結合している。この亜鉛−ラクトフェリンはその溶液を常温で少なくとも１ケ月間は沈澱を生じず、加熱しても沈澱を生じないという性質を有し、飲食品や飼料等に配合しても亜鉛による品質の低下を生じさせない。
【００１１】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、溶液中で反応させる必要があるが、使用するラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物、あるいは亜鉛のいづれか一方が固体状態であってもよい。また、反応溶液中の炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンのモル濃度を高く保つために、予め溶解しきれない量の炭酸塩および／または重炭酸塩を溶液中に含有させておいてもよいし、反応途中の溶液中に、炭酸塩および／または重炭酸塩、および／または、炭酸溶液および／または重炭酸溶液を添加してもよい。さらに、ｐＨ調整剤として、塩酸や水酸化ナトリウム等を使用してもよい。
【００１２】
本発明において使用するラクトフェリン類としては、ヒトやウシ等の哺乳類の乳等の分泌液から分離されるラクトフェリンを例示することができる。さらに、血液や臓器等から分離されるトランスフェリンや卵等から分離されるオボトランスフェリン等もラクトフェリンと同様に使用することができる。これらのラクトフェリン類については、既に大量に調製する方法がいくつも知られており、どのような方法で調製されたラクトフェリン類でもよい。また、ラクトフェリン類は、完全に単離されている必要はなく、他の成分が含まれていても構わない。さらに、遺伝子操作により、微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等から生産されたラクトフェリン類を使用することも可能である。そして、ラクトフェリン類をトリプシン、ペプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素により、あるいは、酸やアルカリにより分解したラクトフェリン類分解物をも使用することができる。
【００１３】
また、本発明において使用することのできる亜鉛としては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、炭酸亜鉛、グルコン酸亜鉛等を例示することができる。そして、ラクトフェリン類と結合させるために添加する亜鉛の量は、ラクトフェリン類１モルに対して、亜鉛イオンとして３モル以上、好ましくは３０モル以上、より好ましくは６０モル以上であり、上限は  ３００モルである。ラクトフェリン類と結合させるために添加する亜鉛の量が  ３００モルを越えると、製造中や保存中に沈澱が生じたり、ラクトフェリン類と亜鉛とが完全に反応せず、亜鉛がイオンの状態で溶液中に残存したりするので好ましくない。
【００１４】
さらに、本発明において使用することのできる炭酸または重炭酸としては、炭酸水、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム等の塩類を溶解した溶液、あるいは、それらの混合溶液等を例示することができる。なお、耐熱性の亜鉛−ラクトフェリンを製造するには、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度が低いとラクトフェリン類と亜鉛との結合が充分に行われないので、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度を亜鉛イオンのモル濃度に対し少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上とする必要がある。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、上記の原材料に加え、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸等をｐＨ調整剤として使用することができるし、また、糖質、蛋白質、脂肪等の物質が含まれていても構わない。前記反応はｐＨ７〜９で行われる。そして、上記原材料を加えると通常はｐＨ７〜９となるので、特にｐＨ調整剤を使用する必要はないが、前記ｐＨの範囲を大巾に逸脱した場合は、ｐＨ調整剤によって前記ｐＨの範囲に調整される。
【００１５】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを飲食品あるいは飼料に配合するに際し、配合量等に特に制限はなく、物理的に可能な量を飲食品および飼料等に配合することができる。また、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを油脂を含む食品１ｋｇに対し５０〜３００ｇ程度配合してもこの食品の劣化は見られないので、油脂や油脂を含む飲食品、飼料等に本発明の亜鉛−ラクトフェリンを直接配合しても問題はない。したがって、大豆油、菜種油、綿実油、ゴマ油、サフラワー油、オリーブ油、トウモロコシ油等の植物油や魚油、乳脂、豚脂等の動物油、さらにはビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＤ等の脂溶性ビタミン等の酸化され易い物質に直接配合することも可能である。しかし、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの油脂への分散性を考慮すると、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの配合量は、好ましくは油脂１ｋｇに対し１００ｇ以下が適当である。もちろん、亜鉛の過剰摂取を避けるよう、栄養学的見地から適正に本発明の亜鉛−ラクトフェリンの配合量を決定する必要がある。なお、アメリカでの基準値は、亜鉛の一日の所要量は成人で１５ｍｇとされているので、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを飲食品に配合するに際しては、亜鉛の一日の摂取量が１５ｍｇ以下となるよう配合することが望ましいといえる。さらに、アスコルビン酸等の水溶性の酸化され易い物質を含む飲食品、飼料等に本発明の亜鉛−ラクトフェリンを直接配合しても問題はない。なお、飲食品、飼料等を製造するに際し、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを配合する時期については特に制限はなく、製造工程の適宜の段階で配合すればよい。
【００１６】
食品添加物または飼料添加物として使用するときは、このような亜鉛−ラクトフェリンを単独で用いてもよいし、あるいは必要な担体、増量剤、その他の食品添加物等と混合して用いてもよい。
【００１７】
次に試験例を示し、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの特徴を説明する。
【試験例１】
本試験例では、亜鉛−ラクトフェリン中の重炭酸と亜鉛との比率が耐熱性に及ぼす影響について示す。
（Ａ溶液）各モル濃度に調整した重炭酸ナトリウムを含む水溶液１リットル
（Ｂ１溶液）塩化亜鉛  １００ミリモルを含む水溶液  ０．２リットル
（Ｂ２溶液）ラクトフェリン１ミリモルを含む水溶液  ０．８リットル
Ｂ１溶液とＢ２溶液とを混合してＢ溶液を作成した後、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌し亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。そして、０．０５モル／リットルのイミダゾールおよび０．１５モル／リットルの食塩を含む  ｐＨ７．５の液状食品を模倣した緩衝液  （以下、模擬緩衝液という）  で、亜鉛濃度が  ３．６ミリモル／リットルとなるまでこれらの溶液を希釈し、９０℃で１０分間加熱して沈澱の有無を観察した。
【００１８】
【表１】
0003606665.tif 000002
【００１９】
以上の結果、重炭酸／亜鉛が  ０．５以上で耐熱性が認められた。
従来より、ラクトフェリン、鉄および重炭酸塩を混合すると鉄飽和型ラクトフェリンが生成することが知られている。ラクトフェリンは、Ｎロープと呼ばれる領域とＣロープと呼ばれる類似した領域との二つの領域で構成されている。そして、鉄は、このラクトフェリンの二つの領域それぞれに１原子結合する。すなわち、Ｎロープでは、  Ａｓｐ６０，  Ｔｙｒ１９２，  Ｔｙｒ１９２，  Ｈｉｓ２５３の４個のアミノ酸残基に１個の鉄イオンが結合し、さらに、この鉄イオンに１個の重炭酸イオンが結合している。また、Ｃロープのでの鉄結合部位は、  Ａｓｐ３９５，  Ｔｙｒ４３５，  Ｔｙｒ５２８，  Ｈｉｓ５９７  である［Ｂ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．２０９，  ｐｐ．７１１−７３４，  １９８９］  。したがって、通常、鉄飽和型ラクトフェリンというのは、ラクトフェリン１モル当たり鉄イオンが２モルと重炭酸イオンが２モル結合している。この鉄飽和型ラクトフェリンは、鉄が結合していないラクトフェリンに比べると若干安定性が増すが、６５℃以上で加熱すると沈澱してしまう。この欠点を解決するために、本発明者らは、鉄がラクトフェリンに３原子以上結合した鉄−ラクトフェリン結合体  ［特開平６−２３９９００号公報］  や鉄−ラクトフェリン複合体  ［特願平７−  ８６０２３号］  を開発している。
【００２０】
【試験例２】
本試験例では、亜鉛−ラクトフェリンが、ラクトフェリン１分子当たり３原子以上の亜鉛を結合できることを示す。以下のようにして、試料１〜４を調製し試験を行った。
試料１：亜鉛の終濃度が０．９９ミリモル／リットルおよびラクトフェリンの終濃度が１３．２マイクロモル／リットルとなるよう塩化亜鉛水溶液とラクトフェリン水溶液とを混合し試験例１と同様にして亜鉛とラクトフェリンが結合した亜鉛−ラクトフェリンを調製した。
【００２１】
試料２：亜鉛の終濃度が０．９９ミリモル／リットルおよびラクトフェリンの終濃度が１３．２マイクロモル／リットルとなるよう試験例１に示した方法により重炭酸を介して亜鉛とラクトフェリンが結合した亜鉛−ラクトフェリンを調製した。
【００２２】
試料３：ラクトフェリンをトリプシン（シグマ社）  で分解したラクトフェリン分解物、すなわち、ラクトフェリンに対しトリプシン１重量％を添加し、リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）中で３７℃、３時間加水分解した後、分画分子量  １，０００カットの透析膜により透析することにより得られる分子量  １，０００以上のラクトフェリン分解物を使用し、亜鉛の終濃度が０．９９ミリモル／リットルおよびラクトフェリン換算でラクトフェリン分解物の終濃度が１３．２マイクロモル／リットルとなるよう試験例１に示した方法により重炭酸を介して亜鉛とラクトフェリン分解物が結合した亜鉛−ラクトフェリン分解物を調製した。
【００２３】
試料４：亜鉛の終濃度が１．９８ミリモル／リットルとなるよう塩化亜鉛水溶液を調製した（対照）。
【００２４】
試料１〜４の各試料を分子量  １，０００カットの限外濾過膜（ミリポア社）に１ｍｌ添加して脱塩し、リテンテート量が  ０．２ｍｌになったところで１ｍｌ加水して脱塩することを繰り返し、総計６ｍｌ加水した。このようにして得られたリテンテートおよびパーミエートについて、発光分光分析機（ＩＣＰ）で亜鉛含量を測定した。また、リテンテート亜鉛残存率を次式により求めた。
リテンテート亜鉛残存率（％）＝｛リテンテート亜鉛総量÷（リテンテート亜鉛総量＋パーミエート亜鉛総量）｝×１００
さらに、各試料について９０℃で１０分間の処理を行い、その後の沈澱の有無を観察することにより耐熱性を確認した。その結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
0003606665.tif 000003
【００２６】
この表にみられるように、試料４では殆ど全ての亜鉛がパーミエートに移行しており、使用した亜鉛が分子量  １，０００カットの膜を透過していることが判った。一方、試料２では殆ど全ての亜鉛がリテンテートに残存しており、亜鉛がラクトフェリンと結合し分子量  １，０００カットの膜を透過していないことが判った。また、試料１では亜鉛が殆ど結合していないことから、ラクトフェリン類と亜鉛とを結合させるには、試料２を調製する方法によらなければならないことが判る。
【００２７】
【試験例３】
亜鉛−ラクトフェリンの元素分析
亜鉛−ラクトフェリンは試験例２と同様にして作製した。また、対照として、ウシラクトフェリン（東洋紡）標品を１％になるように水に溶解したものを作製した。これらを、分画分子量１万の透析膜を用いて、超純水に対して５日間透析して、無機塩類を除去した。得られた溶液を凍結乾燥した後、さらに真空乾燥を行い、試料粉末を調製した。試料は鉄含量を測定するために発光分光分析機（ＩＣＰ）  により、また炭素、窒素量をＣＨＮ  元素分析機により分析した。分析結果は、試料１から試料２の値を引いた差で示した。
【００２８】
【表３】
0003606665.tif 000004
【００２９】
以上の結果から亜鉛−ラクトフェリンでは通常のラクトフェリンと比較して、亜鉛が多く結合していることがわかる。また、炭素数も通常のラクトフェリンよりも増加していることが確認できる。本試験例の場合、炭酸およびまたは重炭酸以外には炭素源となるものがないため、炭素数の増加は炭酸およびまたは重炭酸によるものとわかる。このことから、亜鉛−ラクトフェリンではラクトフェリン、亜鉛、炭酸およびまたは重炭酸が存在することがわかった。
【００３０】
【試験例４】
塩濃度の低い領域では、通常のラクトフェリンでも耐熱性を有することが知られている  ［特開平４−８２６９号公報］  。本試験例では、次の亜鉛−ラクトフェリンの試料Ａ〜Ｃを調製し、その耐熱性を調べた。その結果、本発明の亜鉛−ラクトフェリンは塩濃度の高い領域でも耐熱性を有することが判明した。
試料Ａ：試験例１と同様に調製した。
試料Ｂ：試料Ａを分子量分画１０，０００カットの限外濾過膜（アドバンテック社）で脱塩、濃縮し、ラクトフェリンとして  ２５０マイクロモル／リットルとなるよう超純水で希釈した。なお、この時の電気伝導度は  ０．２ミリジーメンス／センチメートルであった。
試料Ｃ：試料Ｂを模擬緩衝液（ｐＨ  ７．０）で４倍に希釈し、さらに塩濃度を高めるために３０ミリモル／リットルとなるよう食塩を添加した。
これらの各試料をネジ口付き試験管に密封した後、９０℃で１０分間加熱し、ラクトフェリンの沈澱生成の有無を目視で判定した。そして、沈澱生成が認められないものを０、沈澱生成がやや認められるものを１、沈澱生成が多いものを２とした。その結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
0003606665.tif 000005
【００３２】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、塩濃度が低い領域においては勿論、塩濃度が高い領域においても耐熱性を有することが判る。
【００３３】
【試験例５】
本試験例では、ラクトフェリンを対照として、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを試験例１と同様に調製し、保存安定性を調べた。なお、保存安定性を試験するに際しては、電気伝導度を５０ミリジーメンスとなるよう食塩で調整して行った。遠心処理した各試料を密封し、９０℃で１０分間加熱した後、３７℃で保存し、保存１ヵ月後、沈澱生成の有無を目視で判定した。そして、沈澱生成が認められないものを０、沈澱生成がやや認められるものを１、沈澱生成が多いものを２とした。その結果を表５に示す。
【００３４】
【表５】
0003606665.tif 000006
【００３５】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、９０℃で１０分間の熱ストレスを与えた後も、常温で高い保存安定性を有していることが判る。したがって、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを配合した飲食品を製造するに際し、加熱殺菌等の製造工程に特に制限を設ける必要はない。例えば、加熱殺菌については、通常実施されている工程に従って処理すれば良く、６５℃で３０分間加熱する低温殺菌や  １２０℃で２〜３秒間の加熱、  １４０〜  １５０℃で３〜５秒間の加熱、あるいはレトルト殺菌も可能である。また、凍結乾燥のみでなく、噴霧乾燥で亜鉛−ラクトフェリン粉末を製造することができる。そして、これらの亜鉛−ラクトフェリンは亜鉛が含まれているので、亜鉛欠乏症を起こし易い、乳児や高齢者等の飲食品、医薬品、動物用飼料等の素材として特に有用である。
【００３６】
【試験例６】
本試験例では、本発明の亜鉛−ラクトフェリンの酸化安定性を調べた。
試験例１で調製した亜鉛−ラクトフェリンの凍結乾燥粉末を魚油６ｇに添加し、ランシマット（メトローム社）  装置により温度８０℃で強制劣化試験を行った。また、対照として塩化亜鉛を魚油６ｇに添加した試料についても同様に試験した。なお、亜鉛−ラクトフェリンの凍結乾燥粉末および塩化亜鉛は、ウルトラディスパーサー（ヤマト社）  で魚油に分散させた。表６に各試料の組成を示す。
【００３７】
【表６】
0003606665.tif 000007
【００３８】
本試験例では、魚油の劣化度を酸化誘導期の長さ（時間）  で表した。その結果を表７に示す。
【表７】
0003606665.tif 000008
【００３９】
塩化亜鉛を魚油に添加した試料では、試験開始直後から激しい魚油の劣化が認められた。一方、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを魚油に添加した試料では、亜鉛を添加しているにも係わらず、亜鉛無添加の試料と酸化誘導期は変わらなかった。したがって、亜鉛−ラクトフェリンの形態で亜鉛を添加することにより、亜鉛に起因する魚油の劣化を完全に抑制できることが判る。
【００４０】
【試験例７】
本試験例では、試験例１で調製した亜鉛−ラクトフェリンの噴霧乾燥粉末を大豆油６ｇに添加し、ランシマット（メトローム社）  装置により温度  １２０℃で強制劣化試験を行った。また、対照として塩化亜鉛を大豆油６ｇに添加した試料についても同様に試験した。なお、亜鉛−ラクトフェリンの噴霧乾燥粉末および塩化亜鉛は、ウルトラディスパーサー（ヤマト社）  で大豆油に分散させた。表８に各試料の組成を示す。
【００４１】
【表８】
0003606665.tif 000009
【００４２】
本試験例でも、魚油の劣化度を酸化誘導期の長さ（時間）  で表した。その結果を表９に示す。
【表９】
0003606665.tif 000010
【００４３】
塩化亜鉛を大豆油に添加した試料では、試験開始直後から激しい大豆油の劣化が認められた。一方、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを大豆油に添加した試料では、亜鉛を添加しているにも係わらず、亜鉛無添加の試料と酸化誘導期は変わらなかった。したがって、亜鉛−ラクトフェリンの形態で亜鉛を添加することにより、亜鉛に起因する大豆油の劣化を完全に抑制できることが判る。このように、食用油脂の種類に係わらず亜鉛に起因する油脂の劣化を完全に抑制できる。
さらに、魚油および大豆油の同様の試料について４０℃オーブン保存試験を行った。すなわち、経時的にサンプリングし、過酸化物価（ＰＯＶ）を測定したが、ランシマット試験と同様の傾向が見られた。本発明の亜鉛−ラクトフェリンによる油脂劣化の抑制は、あらゆる温度域で見られることが判る。
【００４４】
【発明の実施の形態】
本発明のラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛が３原子以上結合している亜鉛−ラクトフェリン、あるいは、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物１分子当たり亜鉛３原子以上が、炭酸および／または重炭酸  １．５分子以上を介して結合している亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、ラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物、亜鉛、炭酸および／または重炭酸を混合することにより行うが、この反応については溶液中で行う必要がある。ただし、使用するラクトフェリン類またはラクトフェリン類分解物、あるいは亜鉛のいずれか一方が固体状態であっても良い。また、反応溶液中の炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンのモル濃度を高く保つために、予め溶解しきれない量の炭酸塩および／または重炭酸塩を溶液中に含有させておいてもよいし、反応途中の溶液中に、炭酸塩および／または重炭酸塩、および／または、炭酸溶液および／または重炭酸溶液を添加してもよい。
【００４５】
そして、ラクトフェリン類と結合させるために添加する亜鉛の量は、ラクトフェリン類１モルに対し、亜鉛イオンとして３モル以上、好ましくは３０モル以上、より好ましくは６０モル以上であり、上限は  ２００モルである。また、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度が低いとラクトフェリン類と亜鉛との結合が充分に行われないので、炭酸および／または重炭酸溶液の濃度を亜鉛イオンのモル濃度に対し少なくとも２倍以上、好ましくは５倍以上とする必要がある。
【００４６】
さらに、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを製造するに際しては、上記の原材料に加え、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸等をｐＨ調整剤として使用することができるし、また、糖質、蛋白質、脂肪等の物質が含まれていても構わない。
【００４７】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンを飲食品あるいは飼料添加物として用いるときは、これらの水溶液、粉末単独、あるいは担体、増量剤その他の公知の添加物と混合したものを用いてもよい。
本発明の亜鉛−ラクトフェリンの使用に際し、配合量等に特に制限はなく、物理的に可能な量を飲食品および飼料等に配合することができる。また、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを油脂や油脂を含む飲食品、飼料等に直接配合しても問題はない。しかし、亜鉛−ラクトフェリンの油脂への分散性を考慮すると、亜鉛−ラクトフェリンの配合量は、好ましくは油脂１ｋｇに対し１００ｇ以下が適当である。さらに、アスコルビン酸等の水溶性の酸化され易い物質を含む飲食品、飼料等に本発明の亜鉛−ラクトフェリンを直接配合してもよい。なお、飲食品、飼料等を製造するに際し、本発明の亜鉛−ラクトフェリンを配合する時期については特に制限はなく、適宜、製造工程中に配合すればよい。
【００４８】
次に、実施例を示し、本発明を詳しく説明する。
【実施例１】
ラクトフェリン（ＤＯＭＯ社製）を１０マイクロモル含む水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして  １．５ミリモル含む水溶液（Ｂ溶液）１リットルを調製した後、Ａ溶液にＢ溶液を加え、ラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液を分子量  ５，０００カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮し、さらに、亜鉛濃度が１３ｍｇ／１００ｍｌとなるよう希釈した。そして、この亜鉛−ラクトフェリン溶液の官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００４９】
【実施例２】
重炭酸ナトリウムを  １．２モルとラクトフェリン（ＤＯＭＯ社製）を１０マイクロモル含む水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして  １．５ミリモル含む水溶液（Ｂ溶液）１リットルを調製した後、Ａ溶液にＢ溶液を加え、ラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液を分子量  ５，０００カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮し、さらに模擬緩衝液（ｐＨ  ８．９）で亜鉛濃度が２６ｍｇ／１００ｍｌとなるよう希釈した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。さらに、官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００５０】
【実施例３】
ウシラクトフェリン  ９０ｇと塩化亜鉛６水和物  ５２ｇを１０リットルの水に溶解し、撹拌機で撹拌しながら重炭酸ナトリウム５ｇを添加し、亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液から重炭酸ナトリウムを除去するために分子量  ５，０００カットの限外濾過膜（ミリポア社製）  で脱塩および濃縮し、脱イオン水を加えて容量を１０リットルとした。そして、この亜鉛−ラクトフェリン溶液（溶液１）中の亜鉛量および濃縮を開始した直後の透過液（溶液２）中の亜鉛量を誘導結合プラズマ発光分光分析器（ＩＣＰ）で測定したところ、溶液１中の亜鉛量は９２ｍｇ／１００ｍｌであり、溶液２中の亜鉛量は  ０．１ｍｇ以下／１００ｍｌであった。
【００５１】
【実施例４】
硫酸亜鉛を亜鉛イオンとして  １．５ミリモル含む溶液（Ａ溶液）  ０．２リットル、トランスフェリン（アポ型、高純度、牛血漿製、和光純薬工業）を１０マイクロモル含む溶液（Ｂ溶液）  ０．８リットルを調製した後、Ａ溶液とＢ溶液を混合し、トランスフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−トランスフェリン溶液を調製した。この亜鉛−トランスフェリン溶液を分子量  ５，０００カットの限外濾過膜で脱塩および濃縮し、さらに、模擬緩衝液（ｐＨ  ６．８）で亜鉛濃度が２６ｍｇ／２００ｍｌとなるよう希釈した。そして、この亜鉛−トランスフェリン溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。
【００５２】
【実施例５】
炭酸ナトリウムを  ０．５モルおよび重炭酸カリウムを  ０．７モル含む水溶液１リットルを酢酸でｐＨ  ８．３に調製し、Ａ溶液を調整し（Ａ溶液）、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして  ０．７ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液）  ０．２リットル、オボトランスフェリン（タイプＩＶ、粗卵白製、無亜鉛、シグマ社）１ｇの０．０１Ｎ  塩酸溶液にトリプシン（シグマ社）  ２０ｍｇを添加し、３７℃で１時間加水分解したオボトランスフェリン分解物８００ｍｇ（オボトランスフェリン１０マイクロモルに相当する重量）  を含む水溶液  ０．８リットル（Ｂ２溶液）を調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、このＢ１溶液とＢ２溶液の混合液をＡ溶液に加えてオボトランスフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−オボトランスフェリン溶液を調製した。この亜鉛−オボトランスフェリン溶液を分子量  ５００カットの透析膜で脱塩し、さらに、模擬緩衝液（ｐＨ  ６．２）で亜鉛濃度が２６ｍｇ／２００ｍｌとなるよう希釈した。そして、この亜鉛−オボトランスフェリン溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。また、この亜鉛−オボトランスフェリン溶液中の亜鉛量をＩＣＰで測定したところ、オボトランスフェリン分解物８ｍｇ当たり、０．１１ｍｇの亜鉛が結合していることが判った。
【００５３】
【実施例６】
重炭酸ナトリウムを  １．０モル含む水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして１ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液）    ０．２リットル、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）を１０マイクロモル含む水溶液（Ｂ２溶液）    ０．８リットルを調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、このＢ１溶液とＢ２溶液の混合液をＡ溶液に加えてラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。なお、この亜鉛−ラクトフェリン溶液のｐＨを  ８．５に維持するため、随時水酸化ナトリウムを添加した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液については脱塩せずに、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却した。なお、この状態で沈澱生成は全く認められなかった。さらに、この亜鉛−ラクトフェリン溶液を３７℃で１ヵ月保存し、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。
【００５４】
【実施例７】
炭酸ナトリウムを  １．０モル含む水溶液１リットルを２Ｎ塩酸でｐＨ  ８．０に調整した溶液（Ａ溶液）、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして１ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液）    ０．２リットル、ウシラクトフェリン（ＵＬＮ社製）  を１０マイクロモル含む水溶液（Ｂ２溶液）    ０．８リットルを調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、このＢ１溶液とＢ２溶液の混合液をＡ溶液に加えてラクトフェリンに亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン溶液については脱塩せずに、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却した。なお、この状態で沈澱生成は全く認められなかった。さらに、この亜鉛−ラクトフェリン溶液を３７℃で１ヵ月保存し、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。また、官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００５５】
【実施例８】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリン溶液を亜鉛濃度が１０ｍｇ／２００ｍｌとなるよう生乳２０リットルに添加し、均質化した後、  １５０℃で４秒間滅菌処理し、直ちに４℃に冷却して  ２５０ｍｌ容紙容器に無菌充填した。そして、３７℃で３ヶ月保存した後、この亜鉛−ラクトフェリン添加乳を遠心分離して沈澱生成の有無を調べたところ、沈澱生成は全く認められなかった。また、大腸菌数および一般細菌数共に０であった。さらに、対照として生乳を同様の条件で滅菌し、保存したものを用い官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味やその他の風味異常を感じたものはいなかった。
【００５６】
【実施例９】
ラクトフェリン（ＤＭＶ社製）１ｇを  ０．２モル酢酸緩衝液（ｐＨ  ４）に溶解し、ペプシン（シグマ社）２６，０００ユニットを添加して３７℃で２時間反応させた後、水酸化ナトリウムでｐＨ  ７．５とした。次に、この溶液にトリプシン（シグマ社）  ２００，０００ユニットを添加して３７℃で１０時間反応させ、ラクトフェリン分解物を得た。なお、電気泳動で確認したところ、このラクトフェリン分解物の分子量は５０，０００および３０，０００であった。
重炭酸ナトリウムを  １．３モル含む溶解していない塩が沈澱している水溶液（Ａ溶液）１リットル、塩化亜鉛を亜鉛イオンとして  １．２ミリモル含む水溶液（Ｂ１溶液）  ０．２リットル、上記のラクトフェリン分解物を分解前のラクトフェリンとして１０マイクロモル含む溶液（Ｂ２溶液）  ０．８リットルを調製した後、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合し、良く撹拌しながらＡ溶液にＢ１溶液とＢ２溶液の混合液を加えてラクトフェリン分解物に亜鉛が結合した亜鉛−ラクトフェリン分解物溶液を調製した。この亜鉛−ラクトフェリン分解物溶液をネジ口付き試験管に密封し、９０℃で１０分間加熱した後、室温まで自然冷却し、３７℃で保存した。保存１か月後、沈澱生成の有無を目視で判定したところ、沈澱生成は全く認められなかった。さらに、官能評価試験を実施したところ、パネラー１０名中、金属味を感じたものはいなかった。
【００５７】
【実施例１０】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、常法に従って以下の配合の亜鉛およびビタミンＥ含有  １５０ｍｇカプセルを打ち抜き法により製造した。
配合比
カプセル用溶液
ゼラチン                      ４５％
グリセリン                ２２％
水                                  ３３％
原料組成
ビタミンＥ                ３５％  （２００ＩＵ）
亜鉛−ラクトフェリン      ２０％
小麦胚芽油                            ４０％
乳化剤                                      ５％
このカプセル剤は、健康食品として用いられる。
このカプセル剤については、３７℃で３ヶ月保存した後も油脂の異臭や亜鉛の金属味は全くなかった。
【００５８】
【実施例１１】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、常法に従って以下の配合の亜鉛およびβ−カロチン含有  ２００ｍｇカプセルを打ち抜き法により製造した。
配合比
カプセル用溶液
ゼラチン                      ４５％
グリセリン                  ２２％
水                                  ３３％
原料組成
β−カロチン              ３５％  （２，０００ＩＵ）
亜鉛−ラクトフェリン        ８％
小麦胚芽油                            ５３％
乳化剤                                      ４％
このカプセル剤については、３７℃で３カ月保存した後も油脂の異臭や亜鉛の金属味は全くなかった。
【００５９】
【実施例１２】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、亜鉛添加マーガリンを製造した。すなわち、融点４２℃の大豆硬化油１０％、大豆白絞油４０％およびパーム油２５％からなる油脂に乳化剤としてグリセリン脂肪酸エステル（エステル価６０）０．５％を添加した油相に、脱脂粉乳１％、亜鉛−ラクトフェリン  ０．５％（亜鉛０．０７％相当量）  、乳酸  ０．１％および水２３．３％を添加し、油中水型乳化物を得た。そして、この油中水型乳化物をマーガリン製造機で冷却、固化および練圧することによりマーガリンを製造した。また、比較例として、亜鉛−ラクトフェリンの代わりに硫酸亜鉛０．３５％および水２３．５％で同様にマーガリンを製造した。これらのマーガリンについて１５℃で保存試験を行い、製造直後および保存６カ月の過酸化物価（ＰＯＶ）を測定した。その結果を表１０に示す。
表に示されるように、亜鉛−ラクトフェリンを添加したマーガリンの劣化は完全に抑制されていることが判る。
【００６０】
【表１０】
0003606665.tif 000011
【００６１】
【実施例１３】
実施例２のようにして調製した亜鉛−ラクトフェリンを使用し、亜鉛添加マヨネーズを製造した。すなわち、卵黄  １５ｇ、サフラワー油９０ｍｌ、食酢１５ｍｌ、食塩２ｇ、からし０．５ｇ、コショウ０．５ｇ、砂糖１．５ｇおよび亜鉛−ラクトフェリン  ０．５％を材料としてマヨネーズを製造した。また、比較例として、亜鉛−ラクトフェリンの代わりに硫酸亜鉛を添加したマヨネーズを製造した。これらのマヨネーズについて１５℃で保存試験を行い、製造直後および保存６カ月のＰＯＶを測定した。その結果を表１１に示す。
亜鉛−ラクトフェリンを添加したマヨネーズの劣化は完全に抑制されていることが判る。
【００６２】
【表１１】
0003606665.tif 000012
【００６３】
【発明の効果】
本発明の亜鉛−ラクトフェリンは、亜鉛独特の金属味が消失し、また、亜鉛に起因する酸化作用が抑制された状態で、飲食品や飼料に亜鉛強化のために添加することができる。また、簡単な方法で亜鉛を多量に含む状態で調製することができ工業的に有利である。従って、亜鉛強化飲食品あるいは飼料添加物として有用である。