(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ  ＮＯ：３を含む牛αラクトアルブミンをコード化するＤＮＡ配列から構成されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドをコード化する発現ベクター。
【請求項３】
乳房組織における分泌及び成熟するのに効果的なシグナルペプチドに関して暗号づけするＤＮＡ配列を用いて乳内に発現されるべき所望のタンパク質に関して暗号づけする外因性ＤＮＡ配列に操作的にリンクされた前記αラクトアルブミン制御領域としての前記配列ＩＤ  ＮＯ：３のＤＮＡ配列よりなる発現システムを含む遺伝子導入非人間哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
本発明は概略牛αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び遺伝的処理された又は遺伝子導入された乳を分泌する哺乳動物の乳における組み換えタンパク質を含むタンパク質の生産方法に関する。本発明はまた組み換えタンパク質を分泌する遺伝的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物に関する。本発明はまた優れた乳を生産する特徴を有する動物を確認するための遺伝的標識形質に係るものである。
［引用技術の参照］
ここで引用される技術の完全な文献引用のために特許請求の範囲に先んずる章を参照する。
［先行技術の説明］
αラクトアルブミンは雌牛の乳中に見出される主な乳漿タンパク質である（エイゲル他、１９８４）。「乳漿タンパク質」という用語は「乳清」において溶解可能なままな乳タンパク質またはｐＨ４．６及び２０℃における他の乳タンパク質カゼインの沈澱後の乳漿のグループを含む。αラクトアルブミンはこれらの特徴を有する。
αラクトアルブミンは通常乳中の全タンパク質の略２．５％よりなる分泌タンパク質である。αラクトアルブミンは牛移植片培養におけるホルモン調節に応じた乳腺機能の指標（アカース他、１９８１；グッドマン他、１９８３）及び乳房発育の指標（マクファデン他、１９８６）として使用されてきた。αラクトアルブミンはガラクトシル転移酵素を用いて相互に作用し合って乳糖ラクトースにおいて本質的な役割を演ずる（ブリュー．Ｋ及びＲ．Ｌ．ヒル、１９７５）。ラクトースは乳において重要な要素であり、乳容量オスモル濃度に寄与する。それは雌牛の乳において最も一定な成分である（ラルソン他、１９８５）。αラクトアルブミンは培養された乳房組織における乳汁産生の指標として役に立つ（マクファーデン他、１９８７）。よってαラクトアルブミンが乳産出を制御するのに重要なタンパク質であり乳房機能の指標として使用され得ると信じられている。
牛αラクトアルブミンのイクスプレッションは乳牛におけるポテンシャルレートリミティング過程でよい。αラクトアルブミン遺伝子のより大きい発現がなされ得る場合、より多くの乳及び乳タンパク質が生産され得た。言い換えれば、αラクトアルブミンはポテンシャル定量形質位置（ＱＴＬ）である。
［発明の要約］
本発明の目的は牛αラクトアルブミンの発現における可能遺伝子較差を検出することである。
本発明の他の目的は規定されたヌクレオチド配列を有する乳房の特定の牛αラクトアルブミンタンパク質を符号化するＤＮＡ配列を提供することである。
αラクトアルブミン制御領域を含む乳房組織において特別に活性化される構成物の一以上の複製物の合体を遺伝的処理する方法を提供することがまた本発明の目的である。
これらの目的等は本発明が目指すものであり、それは規定されたヌクレオチド配列を有する牛αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列を目指している。
本発明はまたこのＤＮＡ配列を含む発現ベクターを目指している。更に、本発明はヌクレオチド配列を有するタンパク質αラクトアルブミンを目指している。
本発明はまた哺乳動物に遺伝子的に合体されたときにその哺乳動物の雌種が所望の組み換えタンパク質をその乳中に生産することを許容する乳房の特定のαラクトアルブミン制御領域を含む発現システムを目指している。
本発明はまた牛αラクトアルブミンを符号化する規定されたＤＮＡ配列を含む遺伝子的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物を目指している。
本発明はまたαラクトアルブミンに関して暗号化するＤＮＡ配列を目指しており、それは乳房の特定のαラクトアルブミンタンパク質制御に関して暗号化する発現システムまたは乳中または乳房組織中で特別にαラクトアルブミンを活性化するあらゆる制御領域と、乳房組織中のαラクトアルブミンの分泌及び成熟を許容するシグナルペプチドに関して暗号化するＤＮＡ配列を用いて操作的にリンクしている。
本発明はまた乳中または乳房組織中で特別にαラクトアルブミンを活性化するαラクトアルブミン制御領域を含む構成物の一以上の複製物の合体を遺伝子的に処理する過程を目指している。制御領域は乳房組織内のαラクトアルブミンの分泌及び成熟を許容するシグナルペプチドに関して暗号化するＤＮＡ配列を用いて所望の組み換えタンパク質に関して暗号化するＤＮＡ配列に操作的にリンクしている。
本発明はまた外因性組み換えタンパク質の哺乳動物の乳への生産及び分泌の過程を目指している。過程は遺伝子的に処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物における乳の生産を含む。乳はαラクトアルブミン制御領域を含む発現システムによって特徴付けられる。制御領域は乳房組織内の組み換えタンパク質の分泌及び成熟におけるペプチド効果に関するシグナルに関して暗号化するＤＮＡ配列を用いて組み換えタンパク質に関して暗号化する外因性ＤＮＡ配列と操作的にリンクしている。乳は使用するために集められる。その代わりとして、乳から外因性組み換えタンパク質が分離される。
本発明はまた牛αラクトアルブミンを符号化し規定されたヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列よりなる動物を生産する優れた乳及び乳タンパク質を確認する選択特徴を目指している。
本発明はまた哺乳動物を生産する優れた乳及び乳タンパク質を確認する選択特徴を目指している。哺乳動物は哺乳動物のＤＮＡ構造における遺伝的材料によって特徴付けられる。遺伝的材料は牛αラクトアルブミンに関する少なくとも一つの所望の優性選択マーカーを符号化する。そのような標識の一つはアデノシンであり、それはαラクトアルブミンの関するＤＮＡ配列の制御領域上の−１３位置に位置する。本発明はまた前述の選択特徴を確認することよりなる動物における優れた乳及び乳タンパク質を予測する方法を目指している。
本発明は更に規定されたヌクレオチド配列を有する牛αラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列を装着することよりなる哺乳動物における乳組成変更方法を目指している。
ＤＮＡ配列とそれを使用する様々な方法は酪農業者、人工受精組織、遺伝的標識会社、及び受精卵移植及びクローニング会社等が利用するのに潜在的に有益であろう。
この遺伝的標識の利用は優れた核移植受精卵の確認及びクローンするための優れた受精卵の確認を含む。
本発明はまた種雄の後代検定において補助的役割を果たす。規定されたＤＮＡ配列は乳生産及び乳タンパク質生産の見地から可能な優良種雄を確認するための遺伝的標識として使用され得る。これは優秀な乳牛の購入の信頼性を向上させる。
本発明はまた種雄選択及び選択的淘汰等の農業経営管理決定において補助的役割を果たす。生理的標識は雌牛の血統に加えて将来の生産性能を決定するにあたって補助的役割を果たす。この情報から、本発明のαラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列を用いて若雌牛を購入または保有し、適当な配列無しに若雌牛を淘汰することを考慮することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の牛αラクトアルブミンの部分限定マップの図である。配列は５’フランキング領域の２．０キロベース、暗号づけ領域の１．７キロベース及び３’フランキング領域の８．８キロベースを含む。Ｈｐａ  Ｉとの消化は全ての５’フランキング領域を含む２．８キロベース断片を産出する。
図２はプラスミドＡラクＰｒｏ／ｐＩＣ  ２０Ｒのマップの外形図を示す。ゲノミッククローンのＨｐａ  Ｉ断片はｐＩＣ  ２０ＲのＥｃｏＲＶ部位に装着される。Ｈｐａ  Ｉ断片は５’フランキングＤＮＡの２．１ｋｂ、ａラクトアルブミンのシグナルペプチド暗号づけ領域及び成熟ａラクトアルブミンタンパク質を符号化する８ベースを含む。配列に対して様々な遺伝子を付着するために６個のユニーク酵素部位が利用できる。
図３はプラスミドｐＩＣ  ２０ＲのＥｃｏＲＶ部位においてク  ローンされたαラクトアルブミン５’フランキング領域の詳細マップ図である。（配列ＩＤ  ＮＯ：１，配列ＩＤ  ＮＯ：２）
図４は８．０キロベースＢｇｌ  ＩＩ断片の詳細マップ図である。
図５は牛αラクトアルブミンタンパク質の制御／エンハンサー領域のヌクレオチド配列（配列ＩＤ  ＮＯ：３）を示す。
図６は牛αラクトアルブミン−牛βカゼイン遺伝子構成物を含むプラスミドのマップの外形図である。
図７は４つのヌクレオチド配列突然変異の３つをかこむ、推定ステロイド反応要素に関する本発明米国牛配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：４），人間配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：５）及びフランス牛（配列  ＩＤ  ＮＯ：６）の間並びにＲＮＡポリメラーゼ結合領域に関する本発明米国牛配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：７），人間配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：８）及びフランス牛（配列  ＩＤ  ＮＯ：９）の間の牛αラクトアルブミンタンパク質の５’フランキング領域における人間と牛との遺伝子の配列比較を示す。
図８は牛αラクトアルブミン５’フランキング配列を人間αラクトアルブミン配列の同じ領域と比較したＤＯＴＰＬＯＴTMグラフである。
図９は牛αラクトアルブミン５’フランキング配列をてんじくねずみαラクトアルブミン配列の同じ領域と比較したＤＯＴＰＬＯＴTMグラフである。
図１０は牛αラクトアルブミン５’フランキング配列をラットαラクトアルブミン配列の同じ領域と比較したＤＯＴＰＬＯＴTMグラフである。
図１１は３つのαラクトアルブミン遺伝子導入マウスラインの  各々において見た発現レベルを示すグラフである。
図１２はＭｎＩＩ消化されたＰＣＲ生成物の４％ニューシーブ  オートラジオグラフィックゲルである。
図１３は図１２における各データと更に３つの遺伝子型の各々の関する平均値との散布区分を示す図である。
［好ましい実施例の詳細な説明］
説明において次の用語を使用する：
遺伝的処理、操作または変更：  細胞の外で生成された核酸分子をあらゆるウイルス、細菌性プラスミドまたは他のベクターシステムに装着しそれによってそれらの合体をそこではそれらは通常発生しないがそれらは少なくとも宿主生体の寿命の間に連続して増殖することができる宿主生体へ許容することによる材料の新たな組み合わせの構成体。この用語は遺伝子導入変化を組み入れるが、ゲノ  ミック配列の操作は永続的でなくてはならないということはない、即ち、遺伝的処理は直接操作される動物のみに影響を及ぼす。
遺伝子導入動物：新たなＤＮＡ配列を卵の付加によって生殖細胞系へ導入することによって生産される永続的遺伝的処理された動物。
発明に関してあらゆる哺乳動物を使用することは本発明の範囲内である。哺乳動物の例は雌牛、羊、やぎ、マウス、雄牛、らくだ、水牛、ラマ、及びブタを含む。好ましい哺乳動物は大量の乳を生産し長い乳分泌期間を有するものを含む。
本発明は牛αラクトアルブミンを符号化する遺伝子を目指している。この遺伝子は分離され特徴付けられている。遺伝子の５’フランキング領域は遺伝的処理された哺乳動物を生産するにおいて乳房の特定の制御領域として使用するための６ベクターにクローンされている。この制御領域の調節のより深い理解のために５’フランキング領域の２．０キロベースが配列されている。αラクトアルブミン５’フランキング配列は遺伝的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物の乳において新規で有用なタンパク質の発現を促進することができたであろう処理遺伝的構成物に関する有用な乳房に特有な「制御／エンハンサー複合体」として作用する。この結果、乳生産及び乳中のタンパク質組成が増加し、乳及び／または乳中のタンパク質組成が変化し、遺伝的処理されたまたは遺伝子導入された哺乳動物の乳中で様々なタンパク質が生産される。このようなタンパク質はインシュリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、リポコルチン、凝固因子ＶＩＩＩ及びＩＸ、インターフェロン、コロニー刺激因子、インタールケンス、ウロキニーゼ、セルラーゼ等の工業酵素、ヘミセルラーゼ、パーオキシダーゼ、及び熱安定エクザイムを含む。
αラクトアルブミン遺伝子はそれが乳房の特有なタンパク質５’制御領域であるためその過程において好ましい遺伝子である。それはまた全ての乳タンパク質の乳分泌制御を最も厳しく作用させる。更に、それは他の乳タンパク質から独立して調節され乳分泌動物によって多量に生産される。
［全配列］
乳タンパク質牛αラクトアルブミンを符号化する遺伝子は牛ゲノミックライブラリから分離された（ウォイチック、１９８２）。チャロン２８ラムダライブラリは牛αラクトアルブミンｃＤＮＡ  （ハーレー、１９８７）及び７７０ベースペアαラクトアルブミンポリメラーゼ連鎖反応産出物を使用して厳密に調べられた。ポジ  ティブラムダクローンは装着された牛配列の１２．５キロベースを含み、５’フランキング（制御／エンハンサー）領域の２．０キロベース、１．７キロベース暗号づけ領域及び３’フランキング領域の８．８キロベースからなる。クローンの部分限定図を図１に示す。
シグナルペプチド暗号づけ領域に沿った２．０キロベースを含む２．８キロベースＨｐａ  Ｉ断片はプラスミドｐＩＣ  ２０ＲのＥｃｏＲＶ部位にクローンされた。そのプラスミドは図２の外形図に示される。
２．０キロベース５’フランキング制御領域、１．７キロベース暗号づけ領域、３’フランキング領域の３．０キロベース、ラムダＤＮＡの１．２キロベースを含む８．０キロベースＢｇｌ  ＩＩ断片はまた分離された。８．０キロベース断片のマップの関して図４を参照されたし。遺伝子導入マウスがＢｇｌ  ＩＩ断片を使用して生産された。
［制御／エンハンサー領域］
２．０キロベース５’フランキング領域がベクターＰｉｃ  ２０Ｒ及びブルースクリプトＫＳ＋へクローンされた。ｐＩＣ  ２０ＲのＥｃｏＲＶ部位においてクローンされたαラクトアルブミン５’フランキング制御領域の図が図２及び図３に示される（配列  ＩＤ  ＮＯ：１，配列  ＩＤ  ＮＯ：２）。
シグナルペプチド暗号づけ領域の下流に存する構成物のマルチプルクローニング部位は様々な遺伝子がαラクトアルブミン制御領域に付着することを許容する。よってこのベクターは遺伝子の特定の暗号化された配列の容易な付着を許容する。それは乳中のタンパク質の発現に必要な全ての要素、即ち、乳房の特定な制御領域、乳房の特定のシグナルペプチド暗号づけ領域及び乳腺に割け入ることができる成熟したタンパク質のシグナルペプチド接合部位を含む。ベクターはまたクローニングを容易にするために多数のユニーク制限酵素部位を含む。この制御領域への遺伝子の付着はこれらの構造物が哺乳動物に配置されたときに遺伝子の乳房の発現を許容する。これらのベクターはまた乳分泌する動物の乳へ発現されたタンパク質が適当に移動することを許容するαラクトアルブミンシグナルペプチド暗号づけ配列を含む。
制御領域構造物は遺伝子導入マウスにおける所望のタンパク質の乳房の発現を促進した。１ｍｇ／ｍｌを超える牛αラクトアルブミンレベルが例２に述べられた如くに観察された（後  述）。細菌性リポーター遺伝子クロラムフェニコールアセチル転移酵素ばかりでなく牛βカゼイン遺伝子に付着された２．０キロベースを含む構造物（ボウジング、Ｊ．他、１９８８）が我々の研究所で生成された。図６は牛αラクトアルブミン牛βカゼイン遺伝子構造物を含むプラスミドの図である。牛βカゼイン遺伝子を含むゲノミックＤＮＡ配列は牛αラクトアルブミン５’フランキング配列の５’フランキング配列に付着された。そのベクターは５’フランキングＤＮＡの略１００ベースペアに沿ったβカゼインのポリアデニル化部位を含む。５’フランキングＤＮＡの１００ベースペアはにおいて−１００位置牛αラクトアルブミン５’フランキング領域に付着される。その構造物はβカゼインの近位プロモータ要素とαラクトアルブミンの遠位制御領域要素とを使用する。βカゼイン構造物は例に示される如く遺伝子導入マウスの生産に使用されてきた。
制御／エンハンサー領域の制御の理解のために５’フランキング領域の２．０キロベースが配列された。その配列の一本鎖複製物を図５に記載する（配列ＩＤ  ＮＯ：３）。配列は下線が付されたシグナルペプチド暗号づけ領域と共に５’から３’迄が記載されている。
［調節配列］
牛αラクトアルブミンの５’フランキング領域内に含まれる潜在調節配列が確認された。３’フランキング領域内の他にイントロン内に可能調節領域がある。個々の雌牛の乳及び乳タンパク質生産に関することのあった個体郡において可能配列較差に関して疑わしい制御領域の部分が検査された。αラクトアルブミンの調節領域における較差はαラクトアルブミンｍＲＮＡの発現における較差に導かれることが予想される。ｍＲＮＡの増加された細胞性含量は結果的に最終的に乳及び乳タンパク質生産の増加に到る乳糖合成における随伴増加と共にαラクトアルブミンタンパク質の発現を増加させる。この種の機構はαラクトアルブミンによる乳及び乳タンパク質生産上の主な遺伝子効果と考えて良いであろう。この変化は乳及び乳タンパク質生産における変化に相関的ではなく因果的にリンクしていると見られる。相関的にリンクされた形質は量的形質上の直接衝撃を有する知られていない遺伝子座と密接に連体しているものである。
知られていない品種のフランス雌牛（バイオレット他、１９８  ７）及び米国ホルスタインの間の配列較差が５’フランキング領域内の４つの位置で見出された。確認された一つの配列はそれがステロイドホルモン反応要素であったということを示すであろう配列を有する。他の二つの較差はＲＮＡポリメラーゼ結合領域内で注目され４番目は遺伝子のシグナルペプチド暗号づけ領域内で注目された。これらの配列と哺乳類の遺伝子の知られた制御配列との関係の故に、全ての異形は生産されたｍＲＮＡの量の調節において必要とされると予想されるであろう領域で発生する。更に、３つの領域へ結合する因子において発生する遺伝的異形がまた変化を引き起こすと予想されるであろう。
図７は推定ステロイド反応要素に関する（夫々配列  ＩＤ  Ｎ  Ｏ：４，配列ＩＤ  ＮＯ：５，及び配列  ＩＤ  ＮＯ：６）及びＲＮＡポリメラーゼ結合領域に関する（夫々配列  ＩＤ  ＮＯ：７，配列  ＩＤ  ＮＯ：８，及び配列ＩＤ  ＮＯ：９）本発明米国牛配列，人間（ホール他、１９８７）及びフランス牛（バイオレット、１９８７）の間の５’フランキング領域内で観察された配列突然変異体を示す。全ての異形はこの領域を人間αラクトアルブミン遺伝子の同じ領域と比較することによって分かる如く遺伝子の高度に維持された部分において発生する。図７はまた牛遺伝子が異なるその部分が牛と異なる人間の遺伝子の部分と同じであることを示す。これらのデータはそのベースが潜在的に重要な制御領域の部分であることを示す。
転写の最初から−１３位置、即ちシグナルペプチド暗号づけ領域から１３ベースにおける突然変異体の２つの間の明快な鑑別を提供する方法が考案された。その２つの突然変異体は（αラク（−１  ３）Ａ）及び（αラク（−１３）Ｂ）と名付けられる。αラク（−１３）Ａ遺伝子型は−１３位置におけるアデニンベースでありαラク（−１３）Ｂ遺伝子型は−１３におけるグアニン、チミンまたはシトシンベースの内の何れかである。それらは特定の制限酵素（ＭｎｌＩ）を使用した増幅されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の単純な制限酵素消化物を用いて確認され得る。制限酵素ＭｎｌＩの特定性の故に制限分析はこれらの異なる可能性を区別することができない。αラク（−１３）Ａ対立遺伝子はゲル上で観察されるより小さい帯域を提供する余分なＭｎｌＩ部位を−１３位置に含む。
ＤＮＡの適切な領域を増幅するために、関心の配列をフレームするオリゴヌクレオチドが合成された。これらのオリゴヌクレオチドはそれらの特定化学特徴の故に選択された。これらのオリゴヌクレオチドはαラクトアルブミン遺伝子のフレームされた部分を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応において使用された。オリゴヌクレオチドは次の配列を有する：
αラク配列１（配列  ＩＤ  ＮＯ：１０）
0003698369.tif 000002
αラク配列２（配列  ＩＤ  ＮＯ：１１）
0003698369.tif 000003
制限断片分析（サンブロック、Ｊ．他、１９８９）がいくつかの牛品種から動物を検査するために使用された。多くの品種において、即ち、ジャージー、ガーンジー、ブラウンスイス、シンメンタル及びブラーマン種において、二つの遺伝子型の内のたった一つが見出される。これはαラク（−１３）Ｂ遺伝子型である。しかし、牛品種の内の最も有名で高度の乳生産をする品種、ホルスタインにおいて、この位置に二つの遺伝子型が発生する。Ａ遺伝子型の頻度はランダムなサンプルにおいて２７％であったが、Ｂ遺伝子型の頻度は７３％であった。ホルスタインは現在使用されている雄親の系統を検査することによって判断された如く米国ホルスタイン個体郡において最近の三年間で発生したとみられる別個の遺伝子型のみではなく他の品種において見出された遺伝子型の両方を含む。この遺伝子型は伝統的な動物選択を使用するために知られないで選択されてきたとみられる。同種及び異種の動物がホルスタイン個体郡内で見出される。遺伝子型（αラク（−１３））は乳及び乳タンパク質生産との相関に関して検査されてきた。加えて３つの異形が牛個体におけるそれらの較差の頻度及びそれらの乳及び乳タンパク質生産との相関を判断するために検査されている。これらの遺伝子型の可能な連関がまたＤＮＡ配列を使用して検査されている。この技術の最終的な姿はαラクトアルブミンに関して最適な調節遺伝子型を確認し動物をそれらの個々の特徴を用いて選択するということである。
［４つの遺伝的突然変異体の検出と選択］
αラク（−１３）異形が発生する配列の領域はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サンブロック他、１９８９）及び開発した次の二つのプライマーを使用して増幅され得る。各プライマーはαラクトアルブミン遺伝子の特定の部分の増幅を許容する。記載されたプライマーの組み合わせは下に記載したプライマー位置のいかなる二つの間においても使用され得る。
0003698369.tif 000004
特定の領域の増幅の後、ＤＮＡは配列較差の検出のために制限酵素を用いて消化されまたは配列される。αラク（−１３）異形の場合、配列較差は制限酵素ＭｎｌＩ（５’ＣＴＣＣ  ３’認識部位）を使用して調べられる。ＰＣＲ  ＤＮＡ産物はＭｎｌＩを用いて消化され染色体の多型を観察するために４％ニューシーブアガロースゲル上に流される。
全ての４つの異形を含む６５０ベースペア配列はユニーク配列技術を使用して検査されている。ＰＣＲはαラクトアルブミン５’フランキング領域の７７０ベースペア部分を増幅するために最初に使用されている。次に他のＰＣＲ反応が最初の反応の部分と次に示すプライマー（夫々配列  ＩＤ  ＮＯ：１０及び配列  ＩＤ  ＮＯ：１１）とを使用して行われる：
0003698369.tif 000005
上に記載されたプライマーは両方のＭ１３  ＤＮＡ配列プライマーのみではなくαラクトアルブミン遺伝子の部分も含む。そのプライマーはＰＣＲ  ＤＮＡ産物上の両方の方向において実行されるべきＤＮＡ配列を許容するよう設計されている。最終的なＰＣＲ産物は４つの遺伝的突然変異体、二つのＭ１３配列プライミング領域及び５つの［ダミーベース］を含むαラクトアルブミンの領域をＭ１３プライマー結合において補助的役割を果たすように最後に含むであろう。
［種間のαラクトアルブミンの５’フランキング領域の高度に維持された部分の比較］
牛αラクトアルブミン配列を人間（図８）、てんじくねずみ（図９）、及びラット（図１０）の同じ領域と比較するＤＯＴＢＬＯＴTMグラフ図８乃至１０を参照されたし。図８（人間）の領域は８１９ベースペアに及ぶ。その配列は略７００ベースペアに高度に維持される。図９（てんじくねずみ）の領域は１３８１ベースペアに及ぶ。その配列は略７００ベースペアに高度に維持されるがそこで拡散する。図１０（ラット）の領域は１３３７ベースペアに及ぶ。その配列は略７００ベースペアに高度に維持されるがそこで拡散する。制御領域内の種較差は配列の非維持領域で発生すると予想されるであろう。
［牛αラクトアルブミンの他の牛タンパク質遺伝子との比較］
αラクトアルブミン５’フランキング領域を用いて高度に維持された他の牛乳タンパク質遺伝子（αｓ１及びαｓ２カゼイン、βカゼイン、Ｋカゼイン、及びβラクトグロブリン）の５’フランキング領域の部分が確認された。これらの領域内の配列較差はまた最終的なタンパク質生産ばかりではなくｍＲＮＡ生産においても効果を有することが予想される。これらの高度に相同な２例を下に記載する。
遺伝子の同じ領域に対応する牛βカゼイン配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：１８）と比較された（−１６１）−（−１１５）からの牛αラクトアルブミン配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：１７）。類似パーセントは４６ベースに関して６９％である。
0003698369.tif 000006
シグナルペプチドコード領域の開始から（−１５４５）乃至（−１４８５）からの牛αラクトアルブミン配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：１９）が遺伝子の同じ領域に対応する牛βカゼイン配列（配列  ＩＤ  ＮＯ：２０）と比較された。類似パーセントは６９ベースに関して７５％である。
0003698369.tif 000007
その含まれたデータは遺伝的処理された哺乳動物の分野で使用される様々な制御／エンハンサー及び遺伝子ばかりでなく牛αラクトアルブミン遺伝子が乳牛産業において選択用道具として有用となるであろうことを示している。我々がクローンした制御領域は我々の乳及び乳タンパク質生産及び配列異形データによって示される如くの「高発現遺伝子型」ばかりではなく遺伝的処理された哺乳動物において遺伝子を発現するために必要な調節要素を含む。これらの事実によってこれは産業及び調査分野の双方で有用な遺伝子となる。これらの技術の他の乳タンパク質への適用はβカゼイン、αｓ１及びαｓ２カゼイン及びＫカゼイン遺伝子及びβラクトグロブリン遺伝子に対応する様々な遺伝子型の選択を許容するであろう。
［暗号づけ領域］
αラクトアルブミンタンパク質の暗号づけ領域１．７キロベース配列を含む。
［３’フランキング領域］
３’フランキング領域は所望の組換えタンパク質に関してＤＮＡ配列暗号づけの下流の８．８キロベースフランキング領域を含む。この領域は発現システムのＲＮＡ転写を明白に安定させ、よって発現システムから所望のタンパク質の産出を増加させる。
［操作］
上記の発現システムは公知技術の方法で用意され得る。例は従来のリンカー、制限部位他を使用した様々な結紮技術を含む。これらの発現システムはより大きいプラスミドの部分であることが好ましい。
分離と浄化の後、発現システムまたは構造物は遺伝的に変更されるべき遺伝子プールに付加される。
遺伝的処理された哺乳動物に関する方法は公知技術である。動物の遺伝的処理及び遺伝子導入変化の教科書的記述に関してアルバート、Ｂ．他、１９８９及びレウィン、Ｂ．１９９０を参照されたし。簡単に説明すると、遺伝的処理は発現ベクターの構造を含みよってｃＤＮＡクローンまたはゲノミック構造が直接ＤＮＡ転写に関して強いプロモータとして作用するＤＮＡ配列に接続される。遺伝的処理によって、乳房組織等の哺乳類細胞は有用なタンパク質の大量な生産を引き起こす。
本発明の目的に関して、「遺伝的処理」という用語は単一系統変化、即ち、生殖細胞系永続性無しの影響を及ぼされた動物の寿命の間のみの遺伝的変化、を含む定義リスト内で前に定義した。その構造物は乳腺及び哺乳類幹細胞等の哺乳類腺において遺伝的に合体され得る。
遺伝的処理はまた遺伝子導入変化、即ち、影響を及ぼされた動物及びあらゆる子孫のゲノミック構造への遺伝子配列の永続的装着、を含む。哺乳動物を遺伝子導入によって変化させることは発育している動物の細胞中に保存されるべき構造物の一以上の複製物を発生させるために受精した哺乳類の卵の前核へＤＮＡ構造物を顕微注射することを含む。遺伝子導入された動物において、処理された遺伝子はその動物の生殖細胞系に永続的に装着される。遺伝的処理された哺乳動物はそこで乳房組織内の組み換えタンパク質の分泌及び成熟において効果的なシグナルペプチドに関するＤＮＡ配列暗号づけを用いて組み換えタンパク質に関する外因性ＤＮＡ配列暗号づけに操作的にリンクするαラクトアルブミン制御領域よりなる発現システムによって特徴付けられる。哺乳動物の乳へ組み換えタンパク質を生産及び分泌するため、遺伝子導入哺乳動物は乳を生産することが許容されなければならず、その後に乳が集められる。そこで乳は標準の製造工程において使用されればよい。外因性組み換えタンパク質はまた知られた技術によって乳から分離され得る。
［選択特徴］
図１のαラクトアルブミン制御／エンハンサー配列はまた優れたまたは優良な乳を生産する哺乳動物を確認するための選択特徴として重要である。現在、乳牛産業におけるそれらは系統情報にたよるのみであり、それはしばしば哺乳動物、特に牛種における乳及び乳タンパク質を予測するために役に立たない。生理的標識の乳及び乳タンパク質生産を判断するための手段としての研究はいくらかの興味を持たれている。乳牛において研究されたもっとも一般的な生理的標識形質はホルモン、酵素、及び異なる血液代謝産物である。免疫性システムの成分がまた研究されてきた。乳産出に関する可能な標識形質として記載された形質は放射性サイロキシン、血液尿素窒素、成長ホルモン、インシュリン様成長因子及びインシュリン、及びグルコース及び遊離脂酸である。これらの技術は乳牛における乳及び乳タンパク質生産の予測においていくらかの効果が見られるが、現在これらの特徴を予測する他の信頼できる手段が無い。
本発明は遺伝的材料が牛αラクトアルブミンに関して支配的な選択マーカーを符号化する哺乳動物の遺伝的構造において発生するＤＮＡである遺伝された遺伝的材料よりなる優れた乳及び乳タンパク質を生産する哺乳動物を確認するための選択特徴を提供する。
ここで開示されたＤＮＡ配列は優良乳生産哺乳動物に関する特徴標識として役に立つ。
下の例ではここで開示された発明を述べるが、本発明がこの例の限定及び範囲に限定されるというように理解されることは全く無い。
例
例１：αラク（−１３）異形研究。
ＵＷ郡の範囲内で広い範囲の乳及び乳タンパク質生産能力の哺乳動物を提供するために４２哺乳動物が階層的にランダムな方法で選ばれた。
ＤＮＡはウィスコンシンマディソン郡の大学における４２ホルスタイン乳牛雌牛のランダムなサンプルから知られた技術の過程に  よって分離された。各哺乳動物は前に述べた如くにＭｎｌＩ消化ＰＣＲ産物の４％ニューシーブゲルを用いてαラクトアルブミン（−１３）異形に関して遺伝子型が検出された。
この個体郡における遺伝子頻度はαラク（−１３）Ａに関しては２８％でありαラク（−１３）Ｂに関しては７２％である。各々の区別された遺伝子型は図１２でゲル上に示される。図１２のゲルに関する説明を次に示す：
レーン１        分子量標準
レーン２〜３    異種接合                αラク（−１３）ＡＢ
レーン４：      同型接合                αラク（−１３）ＢＢ
レーン５        異種接合                αラク（−１３）ＡＢ
レーン６        同型接合                αラク（−１３）ＢＢ
レーン７        同型接合                αラク（−１３）ＡＡ
レーン８        異種接合                αラク（−１３）ＡＢ
４２哺乳動物の遺伝的能力の分析はαラク（−１３）対立遺伝子によって引き起こされまたαラク（−１３）対立遺伝子へリンクされた可能な主な遺伝子効果を示す。３つの遺伝子型の各々の平均値ばかりではなく各データ点の散布図が図１３に示される。ホルスタイン雌牛が乳に関するそれらの予想された伝達能力を用いて比較された。
データはαラク（−１３）Ａ遺伝子型は乳及び乳タンパク質生産に好ましいということを示している。下に示す表１は下に記載した形質に関する各遺伝子型間で観察された乳及び乳タンパク質生産能力における較差の統計的関連を示す。分散とＴ試験（ＬＳＤ）の分析がデータに対して行われた。全ての生産産出形質はαラク（−１３）Ａ対立遺伝子と正相関であった。乳タンパク質パーセンテージはαラク（−１３）Ａ対立遺伝子と負相関であった。
0003698369.tif 000008
例２．牛αラクトアルブミン遺伝子イクスプレッションの調節の研究のための遺伝子導入マウスの生産。
［ゲノミックライブラリスクリーニング］
乳タンパク質牛αラクトアルブミンを符号化する遺伝子は牛ゲノミックライブラリから分離された（ウォイコック、１９８２）。ゲノミックライブラリは次の過程によってスクリーンされた。略１，５００，０００ラムダプラークがマニアティス他（１９８９）に  よって記載された過程を用いてナイロン膜から移転した。αラクトアルブミンｃＤＮＡ（ハーレー、１９８７）または７７０ベースペアＰＣＲ産物がａ−Ｐ３２標識ｄＣＴＰを用いてニックトランス  レート（ＢＲＬ）された。ブロットは夜通し（６５Ｃ）で予め交雑されその後６５Ｃで１６時間交雑された。ブロットは６５Ｃで洗浄（２Ｘ  ＳＳＣ  １％  ＳＤＳで２回、０．１Ｘ  ＳＳＣ  ０．  １％  ＳＤＳで一回）されオートラジオグラフィーのためにコダック  Ｘ−ＯＭＡＴフィルム上に載置される。αラクトアルブミン遺伝子を含む８．０キロベース断片が図４に示す如く浄化された。８．０キロベース断片は５’フランキング領域の２．１キロベース、１．７キロベース暗号づけ領域及び３’フランキング領域の２．６キロベースを含んでいた。
［遺伝子導入マウス］
成熟したＣ５７Ｂ６  Ｘ  ＤＢＡ２Ｊ  Ｆ１  （Ｂ６Ｄ２）雌が前核顕微注入のための受精卵を産出するために過剰排卵（ＰＮＳＧ及びｈＣＧ）しＩＣＲまたはＢ６Ｄ２雄と交配した。卵はレイツ顕微操作器とニクソン倒立顕微鏡を用いて顕微注入された。４０正常出現２細胞胚胎が各擬受胎宿主に移転された。（ウィスコンシンマディソン  バイオテクノロジーセンター  遺伝子導入マウス設備、ジャン  ハイデマン博士）。
［ＰＣＲを用いた遺伝子導入マウスのスクリーニング］
尾ＤＮＡがコンスタンチニ他（１９８６）によって記載された方法を用いて抽出された。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が１０ｍｌ  １０ｘ  ＰＣＲ反応緩衝液（プロメガ会社、マディソン、ＷＩ．）、各２００ｍＭ  ｄＮＴＰ（ファルマシア  Ｉｎｔｌ．、ミル  ウォーキー、ＷＩ．）、各１．０μｍプライマー（上流プライマー  ２５ｍｅｒ  −７１２〜−６８７（５’ＣＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＴＡＧＴＧ  ３’）（配列  ＩＤ  ＮＯ：１  ４）、下流プライマー  ２０ｍｅｒ  ＋３９〜＋５９（５’ＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＡ  ３’）（配列  ＩＤ  Ｎ  Ｏ：１５）、１ユニットタックＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ会社、マディソン、ＷＩ．）及び１ｍｇ  ゲノミックＤＮＡを用いて行われた。体積は２回蒸留した無菌水を用いて１００ｍｌに調整され反応は重い鉱油で上敷きされた。サンプルは３０サイクル（９４Ｃ  ２分、５０Ｃ  １．５分、７２Ｃ  １．５分）を受けさせた。産物はエチディウム臭素を用いて１％アガロースゲルに調整された。
［マウス搾乳］
マウスはそれらの一腹子から４時間分離されそして麻酔をかけられた（０．０１ｍｌ／ｇ  体重  Ｉ．Ｐ．  ３６％プロピレングリコール、１０．５％エチルアルコール（９５％），４１．５％無菌水、及び１２％ペンタバルビトール（５０ｍｇ／ｍｌ）の注射）。麻酔をかけられた後マウスは０．３Ｉ．Ｕ．オキシトシンにＩ．Ｍ．を注射され小さい真空搾乳機を用いて搾乳された。５１匹の生きた子の内の３匹はポリメラーゼ連鎖反応を用いて遺伝子導入のものであることが確認された。３つのαラクトアルブミン遺伝子導入マウス系統の各々において観察される発現レベルを示すグラフに関する図１１を参照されたし。
［ＥＬＩＳＡ］
一つの系統からの第２世代の哺乳動物が搾乳され次の過程によって牛ａラクトアルブミンに関してＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）が行われた：
１．ヌンクイミューノプレートＩＦマキシトープ上に各ウェル  （０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液内、ｐＨ９．６）毎に１／４０ｋ牛ａラクトアルブミン抗血清１００ｍｌを塗布。
２．洗浄緩衝液（ＰＢＳ内０．０２５％ツイーン２０  ｐＨ７．２）を用いて４ｘ洗浄。
３．５０ｍｌ分析緩衝液（０．０４Ｍ  ＭＯＰＳ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ，０．１％  ゼラチン、０．０  ５％  ツイーン２０，０．００５％  クロルヘキサダイン  ディグルコナーテ、ローペプティン５０ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ７．４）を付加。
４．５０ｍｌ標準及びサンプルを三倍で付加。
５．５０ｍｌ  １／１００ｋ希釈したαラクトアルブミン  ビオチン接合体を付加。
６．４Ｃで夜通しインキュベート。
７．洗浄緩衝液を用いて４ｘ洗浄。
８．１００ｍｌ  １／１０ｋ分析緩衝液希釈されたエクストラビンディンペルオキシダーゼ（シグマ）を付加。ＲＴで２時間イン  キュベート。
９．洗浄緩衝液を用いて４ｘ  ２回洗浄。
１０．１２５ｍｌ  新鮮基質緩衝液（２００ｍｌ  テトラメチルベンジンダイン  ２０ｍｇ／ｍｌ）ＤＭＳＯ，６４ｍｌ  ０．５Ｍ過酸化水素、１９．７６ｍｌアセテートナトリウム、ｐＨ４．８）を付加。
１１．ＲＴで１２分インキュベート。
１２．基質反応を停止させるために５０ｍｌ  ０．５Ｍ硫酸を付加。
１３．吸光度をＥＩＡ自動読取器で４５０ｎｍマイナス６００ｎｍで読み取る。
牛αラクトアルブミンが１．０ｍｇ／ｍｌのレベル迄及びそれ以上濃縮したマウス乳に存していた。発現は次の過程にてウェスタンブロッティングによって判断された。１４％ＰＡＧＥゲルがイモビリンＰ膜（ミリポア）へ移転され、それは０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１％ゼラチン、０．０５％ツイーン２０，ｐＨ＝７．２でブロックされそして抗牛αラクトアルブミン（１／２０００希釈）を用いて２時間室温でインキュベートされた。ゲルは２回（２分）ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液を用いて洗浄されそして室温で２時間ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを用いてインキュベートされ、引き続いて洗浄緩衝液を用いて３回洗浄されそして２回蒸留水を用いて一回洗浄された。ゲルは基室溶液（２５ｍｇ  ３，３’ジアミノベンジダイン、Ｈ2中の１ｍｌ１％  ＣｏＣｌ2、４９ｍｌ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４及び０．０５ｍｌ  ３０％Ｈ2Ｏ2）内に位置し発色現象の間に観察された。膜は空気乾燥された。
本発明はここに示され記載された個々の構造及び配列に限定されることはなく引用文献目録に続く特許請求の範囲の範囲内で改良された形が容認されることが理解される。
引用文献の目録
アカース、Ｒ．Ｍ．他、１９８１，「ペリパーチュリエント雌牛における乳分泌の黄体刺激ホルモン調節及び乳房上皮細胞の生化学的鑑別」。内分泌学、１０９：２３。
アルバート、Ｂ．他、細胞の分子生物学（第２版），ガーランド出版会社、ニューヨーク、２６５〜２７１頁。
ボウジング、Ｊ．他、１９８８，「牛ベータカゼイン遺伝子の完全ヌクレオチド配列」、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４  １：５２７−５３７。
ブリュー、Ｋ．及びＲ．Ｌ．ヒル、１９７５、「ラクトース生合成」、Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７２：１０５。
エイゲル、Ｗ．Ｎ．他、１９８４，「雌牛の乳のタンパク質の命名：第５版」。Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，６４：１５９９。
グッドマン、Ｇ．Ｔ．他、１９８３，「ビトロにおいて培養された牛乳房細胞からのアルファラクトアルブミン分泌のホルモン調  節」、内分泌学、１１２：１３２４。
ホール、Ｌ．他、１９８７，「人間αラクトアルブミンの構成及び配列並びに乳分泌の源」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４２：７３５−７４２。
ハーレー、Ｗ．Ｌ．及びＬ．Ａ．シュルター、１９８７，「牛αラクトアルブミンｃＤＮＡの分子クローニング及びヌクレオチド配列」、遺伝子、６１：１１９−１２２。
ラルソン、Ｂ．Ｌ．，１９８５，「乳の生合成及び細胞分泌」、Ｉｎ：乳分泌、１２９〜１６３頁、Ｂ．Ｌ．ラルソン編、アイオワ州大学出版、Ａｍｅｓ。
ローウィン、Ｂ．，１９９０，遺伝子  ＩＶ，オックスフォード大学出版、ニューヨーク、６９１〜７０２頁。
マクファーデン、Ｔ．Ｂ．他、１９８７，「牛血清におけるアルファラクトアルブミン：上部発育との関係及び機能」、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，７０：２５９。
サンブロック、Ｊ．他、１９８９，分子クローニング−研究所マニアル（第２版），コールドスプリングハーバー研究所出版。
バイオレット、Ｊ．他、１９８７，「牛αラクトアルブミン遺伝子の完全ヌクレオチド配列：そのラットカウンターパートとの比  較」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉ，６９：６０９−６２０。
ウォイコック、Ｒ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１  ０：７１９７−７２１０（１９８２）。
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ＢＬＥＣＫ，ＧＲＥＧＯＲＹ  Ｔ．
ＢＲＥＭＥＬ，ＲＯＢＥＲＴ  Ｄ．
（ｉｉ）発明の名称：牛アルファ−ラクトアルブミンを符号化するＤＮＡ配列及び使用方法
（ｉｉｉ）配列数：２０
（ｉｖ）連絡アドレス：
（Ａ）受信人：アンドリュース、シェールズ、スターク及びサワル
（Ｂ）通り：スート１１００，ウィスコンシンアベニュー、１００Ｅ
（Ｃ）町：ミルウォーキー
（Ｄ）州：ＷＩ
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：５３２０２−４１７８
（ｖ）コンピュータ読出可能形式
（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパーチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５
（ｖｉ）現在のアプリケーションデータ：
（Ａ）アプリケーション番号：
（Ｂ）ファイリング期日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）代理人情報
（Ａ）名称：サラ、チャールズ  Ｓ
（Ｂ）登録番号：３０，４９２
（Ｃ）参照／事件番号：Ｆ．３２６２−１
（ｉｘ）電話情報
（Ａ）電話：（６０８）２５５−２０２２
（Ｂ）ファックス：（６０８）２５５−２１８２
（Ｃ）テレックス：２６８３２  ＡＮＤＳＴＡＲＫ
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２６ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１：
0003698369.tif 000009
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：２情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：８８ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：２：
0003698369.tif 000010
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：３情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２０４４ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：シグナルペプチド暗号づけ領域
（Ｂ）位置：１９４３．．２０４３
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ａラクトアルブミンに関する遺伝性制御領域
（Ｂ）位置：１９６６
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：推定ステロイド反応要素
（Ｂ）位置：１４３３．．１４６６
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）名称／キー：ＲＮＡポリメラーゼ結合領域
（Ｂ）位置：１９６１．．１９７８
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：３：
0003698369.tif 000011
0003698369.tif 000012
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：４情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１４ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：４：
0003698369.tif 000013
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：５情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１５ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：５：
0003698369.tif 000014
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：６情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１５ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：６：
0003698369.tif 000015
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：７情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１８ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：７：
0003698369.tif 000016
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：８情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１７ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：８：
0003698369.tif 000017
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：９情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：１８ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：９：
0003698369.tif 000018
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１０情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４３ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１０：
0003698369.tif 000019
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１１情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４３ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１１：
0003698369.tif 000020
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１２情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２１ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１２：
0003698369.tif 000021
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１３情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２４ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１３：
0003698369.tif 000022
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１４情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２５ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１４：
0003698369.tif 000023
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１５情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２０ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１５：
0003698369.tif 000024
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１６情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２０ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１６：
0003698369.tif 000025
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１７情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４６ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１７：
0003698369.tif 000026
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１８情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：４５ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１８：
0003698369.tif 000027
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：１９情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：６９ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：１９：
0003698369.tif 000028
（２）  配列  ＩＤ  ＮＯ：２０情報：
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：５５ベースペア
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖状態：単一
（Ｄ）トポロジー：リニア
（ｉｉ）分子形式：ＤＮＡ（ゲノミック）
（ｘｉ）配列記載：配列  ＩＤ  ＮＯ：２０：
0003698369.tif 000029
【図１】
0003698369.tif 000030
【図２】
0003698369.tif 000031
【図３】
0003698369.tif 000032
【図４】
0003698369.tif 000033
【図５Ａ】
0003698369.tif 000034
【図５Ｂ】
0003698369.tif 000035
【図６】
0003698369.tif 000036
【図７】
0003698369.tif 000037
【図８】
0003698369.tif 000038
【図９】
0003698369.tif 000039
【図１０】
0003698369.tif 000040
【図１１】
0003698369.tif 000041
【図１２】
0003698369.tif 000042
【図１３】
0003698369.tif 000043