(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における骨修復を増強すること、ならびに哺乳類における骨移植片への隣接骨の結合または移植した人工器官への骨の内部成長を増強することのうち一つ以上のための医薬を調製するための、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：１８、配列番号：２３、配列番号：３３、および配列番号：４５から構成される群から選択される活性剤の使用。
【請求項２】
哺乳類における骨修復を増強するための医薬を調整するための、請求項１記載の使用。
【請求項３】
哺乳類における骨移植片への隣接骨の結合または移植した人工器官への骨の内部成長を増強するための医薬を調整するための、請求項１記載の使用。
【請求項４】
哺乳類における軟骨修復を増強すること、ならびに哺乳類における骨または他の組織への軟骨移植片を付着および固定することのうち一つ以上のための医薬を調製するための、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：３１、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、および配列番号：４４から構成される群から選択される活性剤の使用。
【請求項５】
哺乳類における軟骨修復を増強するための医薬を調製するための、請求項４記載の使用。
【請求項６】
哺乳類における骨または他の組織への軟骨移植片を付着および固定するための医薬を調製するための、請求項４記載の使用。
【請求項７】
活性剤の濃度が、約０．１ｎｇ／ｋｇと約１．０ｍｇ／ｋｇとの間にある請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
（ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：１８、配列番号：２３、配列番号：３３、および配列番号：４５から構成される群から選択される少なくとも１つの活性剤の、哺乳類における骨修復、または骨移植片への隣接骨の結合もしくは移植した人工器官への骨の内部成長を増強するのに有効な量、
（ｂ）骨の形態発生蛋白質−２、骨の形態発生蛋白質−４、骨の形態発生蛋白質−６、骨の形態発生蛋白質−７、形質転換成長因子−ベータ、インシュリン様成長因子、および甲状腺傍ホルモンから選択される少なくとも１つの化合物の、哺乳類における骨修復、または骨移植片への隣接骨の結合もしくは移植した人工器官への骨の内部成長を増強するのに有効な量、および
（ｃ）医薬上許容しうる担体、
を含む医薬組成物。
【請求項９】
（ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：３１、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、および配列番号：４４から構成される群から選択される少なくとも１つの活性剤の、哺乳類における軟骨修復を増強する、または骨もしくは他の組織への軟骨移植片を付着、固定するのに有効な量、
（ｂ）骨の形態発生蛋白質−２、骨の形態発生蛋白質−４、骨の形態発生蛋白質−６、骨の形態発生蛋白質−７、形質転換成長因子−ベータ、インシュリン様成長因子、および甲状腺傍ホルモンから選択される少なくとも１つの化合物の、哺乳類における軟骨修復を増強する、または骨もしくは他の組織への軟骨移植片を付着、固定するのに有効な量、および
（ｃ）医薬上許容しうる担体、
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連文献）
本発明は、１９９８年７月１３日に提出された米国仮出願番号第６０／０９２，６５３号の一部継続および１９９９年３月８日に提出された米国仮出願番号第６０／１３０，８５５号の一部継続である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、骨および軟骨の修復、再生、および移植のための方法、組成物、およびキットに関する。
【０００３】
（発明の背景）
修復、治癒および増大の自然の機構は、骨と軟骨で類似する（米国特許番号第５，６８６，１１６号）。修復、治癒および増大は、十分に定義されていない複雑な一連の事象を必要とするが、特に自然に生じる因子が、これらの目的を達成するために必要とされることが知られている。このような因子は、損傷を受けた領域に放出されるかまたは浸透し、そして腫れた領域のマトリックス形成および再モデル化を刺激する骨および軟骨における骨芽細胞および軟骨細胞およびぞうげ芽細胞を刺激する（ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７巻：７９３−７９８頁（１９８９年））。
【０００４】
生きている骨組織は、骨マトリックスおよびミネラルの再吸収および沈着の過程によって連続して補給されている。この一過性で空間的に結合した、骨の再モデル化と称される過程は、２つの細胞集団である破骨細胞および骨芽細胞に主に付随される。（米国特許番号第５，６５６，５９８号、全体的にここに参照して組込まれる）。再モデル化過程は、破骨細胞が、骨髄、または骨表面に対する循環から調達されるか、または骨の円板型ポケットを移動するときに開始される。骨マトリックスおよびミネラルは、骨髄から再吸収された骨表面に補充される一群の骨芽細胞に順次変換される。軟骨細胞は、軟骨細胞に分化する局所間葉（間質）前駆体から由来する。
【０００５】
新たな骨は、３つの基本的機構：骨形成、骨伝導および骨誘導によって形成されうる。（米国特許番号第５，４６４，４３９号、全体的にここに参照して組込まれる）。骨形成性移殖では、生育可能な骨芽細胞および骨芽周囲細胞は、それらが、１方の体の配置から、骨形成の中心を樹立する別の配置に移動される。網状骨および骨髄移植片は、このような生育可能な細胞を供する。ＴＧＦ−ベータは、骨芽細胞の増殖およびマトリックス合成を刺激し（Ｃｅｎｔｒｅｌｌａら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６２巻：２８６９−２８７４頁（１９８７年））、そして破骨細胞の形成および活性を阻害し（Ｃｈｅｎｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５巻：６８３−５６８７頁（１９８８年）；Ｋｉｅｂｚａｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．３巻：４３９−４４６頁（１９８８年））、そして生体内で局所の骨形成を刺激すること（Ｊｏｙｃｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０巻：２１９５−２２０７頁（１９９０年）；ＮｏｄａおよびＣａｍｉｌｌｉｅｒｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２４巻：２９９１−２２９４頁（１９８９年））が示された。骨成長を刺激することが報告されている他の因子としては、形態発生蛋白質（ＷＯ８８／００２０５号）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１３巻：Ｅ３６７−７２頁、１９８６年）および甲状腺傍ホルモン（Ｊ．Ｂｏｎｅ＆Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１巻：３７７−３８１頁、１９８６年）が挙げられる。
【０００６】
形態発生蛋白質ファミリーの構成員は、軟骨および骨形成の誘導に有用であることが示された。例えば、ＢＭＰ−２は、ラットの異所性移殖片モデル（米国特許番号第５，０１３，６４９号参照）で；イヌでの下顎欠損（Ｔｏｒｉｕｍｉら、Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．、１１７巻：１１０１−１１１２頁（１９９１年）参照）で；およびヒツジでの大腿節欠損（Ｇｅｒｈａｒｔら、Ｔｒａｎｓ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  Ｓｏｃ、１６巻：１７２頁（１９９１年））で；生体内で新たな軟骨および／または骨組織の形成を誘導できることが示された。ＢＭＰ−４、−６および−７（Ｗｏｚｎｅｙ、細胞および分子生物学、１３１−１６７頁（アカデミック・プレス社、１９９３年）で、骨形態発生蛋白質およびそれらの遺伝子発現、参照）を含めたＢＭＰファミリーの他の構成員は、骨形成活性を有することも示されている。ＢＭＰ蛋白質は、軟骨を含めた多様な他の組織での誘導性および／または分化相乗作用活性を例示することも示された。（米国特許番号第５，７００，７７４号、全体的にここに参照して組込まれる）。
【０００７】
皮膚骨または異種遺伝子型の貯蔵骨の大型セグメントの移殖では、直接骨形成は生じない。むしろ、骨伝導は、死んだ骨が、血管の内部成長、続いて移殖片の再吸収および新たな骨の沈着のための足場として作用するところで起こる。しかし、この過程は、非常に遅く、これにより大型セグメントの欠損を再構成するのにしばしば数年を要する。
【０００８】
骨誘導は、適切な刺激因子による骨への接触性組織の表現型の変換である。この概念が示す通り、骨の形成は、非骨格部位でさえ誘導されうる。この型の移殖片が、特に、２週間以内に宿主骨に組込まれるので、骨誘導は、骨伝導より好まれる。対照的に、骨伝導移殖片は、移殖後１年と同じくらいの長さ、組込まれないことが分かった。骨誘導に適切な環境を供するために、その容積を通して骨形成を誘導する能力があるのみでなく、生物適合性、非炎症でもあり、そして体に結局再吸収され、そして新たな自然の骨に置換される能力を保有する材料が、選択されるべきである。
【０００９】
異常な骨細胞機能に関連した病理学上の条件の中でも、骨粗鬆症、変形性関節症、パジェット病、骨石灰脱失症、骨軟化症、歯周病、多発性骨肉種または他の形態の癌から生じる骨損失、他の医療処置（ステロイドのような）の副作用から生じる骨損失、および骨マスの年齢に関連した損失である。不適切な有機マトリックスマスは、骨折が、毎日の生活の最小の外傷から生じうるように骨格不全の危機に個人を置く。その骨折の不十分な修復または治癒がある限り、このような骨折は、明らかな病気または病的状態を起す。特定の病理学的条件では、破骨細胞依存性の再吸収は、骨芽細胞によって制御されないが、しかし癌細胞によって誘導され、それにより生物または宿主の免疫細胞に感染する。それらの疾病条件で、骨の再吸収は、骨形成をはるかに越える。このように促進された破骨細胞活性は、骨格マスの総損失を付随して、しばしば、カルシウムの血液濃度の形態でカルシウム恒常性における付随の撹乱を伴って、骨中の無機鉱物からカルシウムの過剰放出を引起す。（米国特許番号第５，６８６，１１６号、全体的にここに参照して組込まれる）。
【００１０】
新たな骨形成を指示する方法は知られているが、骨成長が促進される改善方法が必要とされる。例えば、骨粗鬆症のために最近認可された治療剤は、逆再吸収性である。そのように、それらは、いずれの型（脊椎および／または股関節骨折で減少した骨密度）の樹立骨粗鬆症を示す患者に、またはＩＩ型骨粗鬆症を示す患者に有効でない。さらに、最近用途で骨粗鬆症についての最も許容される予防剤は、乳癌または子宮内膜癌の病歴を有する女性、または骨粗鬆症を示す男性については許容しうる治療剤でないエストロゲン療法である。
【００１１】
同様に、骨移殖片の首尾よい移植および機能は、移殖片への隣接骨の結合に依存する（米国特許番号第５，６８６，１１６号）。このような結合は、移殖片と移殖片に最も近い骨の間の干渉で新たなマトリックス成分の形成による骨修復を必要とする。骨と、移殖片へのヒトに設置される人工関節装置のおよそ１０パーセントの骨が、非結合のため機能不全に陥る。生じた不能力は、デバイスの再手術および再移殖をしばしば必要とする。さらに、全骨折の５から１０パーセントは、決して修復されない。これらの非治癒の骨折を手当てする多くの方法が、提案されたが、申し分ないと立証されたものはまだない。上記の全てに基づいて、骨成長が促進されたことを供する改善方法の当業界における必要性が明らかに存在する。
【００１２】
軟骨は、マトリックス内に埋設される細胞から構成される特定の型の密集接触性組織である。数種の軟骨がある。（米国特許番号第５，７３６，３７２号、全体的にここに参照して組込まれる）。コラーゲン性繊維を含む均質性マトリックスを有する半透明な軟骨が、関節性軟骨に、肋骨軟骨に、鼻の中隔に、喉頭および気管に見られる。関節性軟骨は、骨の関節性表面を覆う硝子様の軟骨である。肋骨軟骨は、真肋および胸骨を接着する。繊維性軟骨は、コラーゲン繊維を含む。黄色軟骨は、喉頭蓋、外耳、および耳管で最初に知見される軟骨細胞を支持する弾性繊維のネットワークである。軟骨は、有機化合物コラーゲン、ヒアルロン酸（プロテオグリカン）、軟骨産生の起因である軟骨細胞から最初に構成される細胞外マトリックスから作られる組織である。これらの有機マトリックス構成要素内に捕われたコラーゲン、ヒアルロン酸および水は、軟骨の特徴的な弾性特性および強さを生む。軟骨細胞は、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンを産生する。ＩＩ型コラーゲンは、骨中に見られない一方で、Ｉ型コラーゲンは、骨中に見られる（米国特許番号第５，６８６，１１６号）。内在性成長因子ＴＧＦベータおよびＢＭＰは、新たな軟骨および骨形成の両方を誘導することが先に示されている。Ｗｏｚｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：１５２８−１５３３頁（１９８８年）およびＳｐｏｒｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０５巻：１０３９−１０４５頁（１９８７年）。
【００１３】
軟骨では、コラーゲン合成が、移殖片と人工器官デバイスの首尾よい結合のためと同様に、修復、治癒および増大のために必要とされる。（米国特許番号第５，６８６，１１６号）。コラーゲンは、軟骨の建築学上の整合性に起因する主要な構造蛋白質である。したがって、軟骨細胞の適切な供給は、軟骨の修復、治癒、および増大のために十分な量のコラーゲンを産生するために必須である。オステオネクチン、フィブロネクチンおよびプロテオグリカンのような他の非コラーゲン蛋白質は、軟骨修復にとっても重要である。
【００１４】
軟骨に隣接する関節空間に見られる滑液細胞のような細胞は、軟骨代謝に重要な役割を果す。滑液細胞は、軟骨を破壊する能力のあるコラゲナーゼのような金属結合プロテイナーゼを産生する。ＴＧＦベータは、金属結合プロテイナーゼの細胞放出（およびおそらく合成）を阻害すること、そして新たなマトリックス成分を産生する軟骨細胞（軟骨形成細胞）を誘導すること、および軟骨修復、治癒および増大を引起すように軟骨破壊性酵素の産生を阻害することが知られている。Ｓｐｏｒｎら、（１９８７年）。甲状腺傍ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）におけるマウス欠損は、異常な軟骨突然変異を示し、それによりＰＴＨｒＰが、軟骨細胞発生および突然変異についての必須の因子であることを示すことも示されている（米国特許番号第５，７００，７７４号）。
【００１５】
軟骨移殖は、鼻形成術のような再構築または整形手術でしばしば使用される。軟骨細胞増殖およびコラーゲン合成を増加し、そしてその結果、軟骨破棄を阻害し、そして軟骨修復を増強する方法について当業界で必要性がある。このような方法は、それに限定されないが、軟骨移殖片および軟骨移植片の治癒を含めた軟骨修復の臨床的利用性を増加させる。
【００１６】
上記方法のうちのいくつかは、制限された成功を伴い適合したが、骨および軟骨修復、治癒および増大を増強し、そして骨および軟骨移植片の付着および固定を増強する改善方法の当業界での必要性が残る。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は、１）骨および軟骨修復；２）骨および人工器官移植；３）骨または他の組織への軟骨の付着および固定を増強する方法、キットおよび組成物；および軟骨細胞の増殖のための方法、細胞培養用培地およびキットを提供する。それらの全てが、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片またはその類似体またはＡＩＩＡＴ２２型レセプターアゴニストの投与を含む。
【００１８】
本発明のこれらの概念および他の概念は、次の詳細な説明の点で明らかになる。
【００１９】
（好ましい実施の態様の詳細な説明）
全ての文献、特許および特許出願は、全体的に参照してここに組込まれる。
【００２０】
この出願の中で、特に規定されない限り、利用される技術は、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１年、アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｆｎｚｙｍｏｌｏｇｙにおける「蛋白質精製に対する指針」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒら、アカデミック・プレス社、１９９０年）；ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｋｏｌｓ）：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、アカデミック・プレス社、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年））、動物細胞の培養：基礎的技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９８７年、リス社．ニューヨーク州ニューヨーク）、遺伝子転写および発現プロトコル、１０９−１２８頁、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、ヒューマナ・プレス社．ニュージャージー州クリフトン、およびアンビオン１９９８カタログ（アンビオン、テキサス州オースチン）のようないくつかのよく知られている文献のいくつかに見ることができる。
【００２１】
ここに定義される場合、語句「骨修復を増強する」は、骨再モデル化、骨形成、骨伝導および／または骨誘導を介して新たな骨形成の速度を増加させることに該当する。本発明の哺乳類における骨修復を増強する方法としては、骨形成を刺激するもの、および骨損失を逆行させるものが挙げられる。したがって、その方法は、（１）予防的に作用して衰弱および／または不健全な状態の発生を避けるのに十分な多量の物質を有する目的物を供するのに；または（２）疾病状態および／または疾病状態の徴候、および衰弱および／または不健全な状態を緩和または排除するために十分な量の物質を有する目的物を供するために使用されうる。
【００２２】
ここに使用される場合、語句「軟骨修復を増強する」は、軟骨損傷、裂け目、奇形または欠陥の治癒および再生、および軟骨組織に対する損傷を避ける上での予防的用途を包含する。
【００２３】
本発明は、骨粗鬆症、変形性関節症、パジェット病、骨石灰脱失症、骨軟化症、歯周病、多発性骨肉種または他の形態の癌から生じる骨損失、他の医療処置（ステロイドのような）の副作用から生じる骨損失、および骨マスの年齢に関連した損失のような衰弱した骨になる骨折、欠陥、および障害を患っている哺乳類における骨修復を増強する方法の必要性を満たす。さらに、種々の人工器官のデバイスへの骨の内部成長は、おおいに増強されて、その結果そのような人工的部品が、自然の骨様の架橋を通して周囲の骨格組織に堅くそして永続的に固定されうる。
【００２４】
本発明は、さらに、軟骨細胞の増殖を促進し、そしてそれにより軟骨修復で使用するためのコラーゲンの合成を増大させることによって、哺乳類での軟骨の修復を増強する方法の必要性を満たす。このような方法は、軟骨の治癒における、例えば、ヒトおよび他の動物における関節性軟骨、裂け目、奇形または他の軟骨欠陥における用途を示す。その方法は、軟骨性組織に対する損傷を予防する上での予防的用途、並びに骨または他の組織に対する軟骨の固定が改善される上での、および軟骨組織に対する欠陥を修復する上での用途を有する。本発明の化合物によって誘導されるデノバ軟骨様組織形成は、誘導された先天的な外傷、または他の臓器の他の軟骨欠陥の修復に寄与し、そして軟骨の付着または修復についての手術で有用でもある。本発明の方法および組成物は、関節炎および他の軟骨欠陥の治療に有用でもありうる。本発明の方法は、軟骨組織を治癒または再生することが望みうる他の適応にも使用しうる。このような適応としては、制限なしに、関節性軟骨に対する損傷の再生または修復が挙げられる。本発明の方法は、軟骨形成細胞を引きつけるか、軟骨形成細胞の成長を刺激するか、または軟骨形成細胞および軟骨細胞の先祖の分化を誘導する環境を提供する。
【００２５】
本発明の方法およびキットは、軟骨細胞（軟骨形成細胞）の増殖を促進するために改善された化学的に定義された培地をも提供する。別の実施の態様では、本発明の組成物および方法は、細胞の軟骨細胞の表現型および生存性を維持するために、関節性軟骨細胞のような軟骨細胞セルラインを処置するのに使用することができる。したがって、処置され細胞集団は、遺伝子療法の用途としても有用である。
【００２６】
ＤｉＺｅｒｅｇａへの米国特許番号第５，０１５，６２９号（その開示全体は、参照してここに組込まれる）では、上記増大に十分である量でアンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）のこのような組織への使用を特徴とする、創傷組織の治癒の速度を増大する方法が記述されている。創傷組織へのＡＩＩの使用は、創傷治癒の速度を明らかに増大し、それによりいっそう迅速な再上皮形成および組織修復が導かれる。語句ＡＩＩは、配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１］を示すヒトおよび他の種に存在するオクタペプチドに該当する。アンギオテンシンの生物学的形成は、血漿基質アンギオテンシノゲンにおけるレニンの作用によって開始される（Ｃｌｏｕｓｔｏｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２巻：２４０−２４８頁（１９８８年）；Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３巻：３６０３−３６０９頁；Ｏｈｋｕｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０巻：２１９６−２２００頁（１９８３年）；各々の文献は、その全体的にここに組込まれる）。そのように形成された物質は、ＡＩからＣ末端のＨｉｓ−Ｌｅｕ残基を除去するアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）［配列番号：３７］によってＡＩＩに変換されるアンギオテンシンＩ（ＡＩ）と呼ばれるデカペプチドである。ＡＩＩは、公知昇圧剤であり、そして市販で入手可能である。
【００２７】
研究は、ＡＩＩが、創傷修復に関与している培養細胞中での有糸分裂誘発および化学走性を増大し、そして成長因子および細胞外マトリックスのそれらの放出を増大もすることを示した（ｄｉＺｅｒｅｇａ、米国特許番号第５，０１５，６２９号；Ｄｚａｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２１巻Ｓ７（補追ＩＩＩ）１９８９年；Ｂｅｒｋら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ１３巻：３０５−１４頁（１９８９年）；Ｋａｗａｈａｒａら、ＢＢＲＣ  １５０巻：５２−９（１９８８年）；Ｎａｆｔｉｌａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３巻：１４１９−２３頁（１９８９年）；Ｔａｕｂｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：５２６−５３０頁（１９８９年）；Ｎａｋａｈａｒａら、ＢＢＲＣ  １８４巻：８１１−８頁（１９９２年）；ＳｔｏｕｆｆｅｒおよびＯｗｅｎｓ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７０巻：８２０頁（１９９２年）；Ｗｏｌｆら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０巻：９５−１０７頁（１９９２年）；ＢｅｌｌおよびＭａｄｒｉ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７巻：７−１２頁（１９９０年））。さらに、ＡＩＩは、ウサギの角膜の眼およびニワトリの漿尿膜モデルにおける脈管形成性であることが示された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．  １０５巻：１４１頁（１９８５年）；ＬｅＮｏｂｌｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９５巻：３０５−６頁（１９９１年））。さらに、ＡＩＩおよびアンギオテンシンＩＩＩ類似体およびその断片は、創傷治癒に有効であることが示された。（米国特許番号第５，６２９，２９２号；国際出願番号ＷＯ９５／０８５６５号；国際出願番号ＷＯ９５／０８３３７号；国際出願番号ＷＯ９６／３９１６４号；全文献は、全体的にここに組込まれる）。
【００２８】
先行の研究では、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）およびＡＩＩの両方が、ただ骨芽細胞の存在下でのみ、骨の切片上でインキュベートされた破骨細胞によって生体外で骨再吸収を刺激すること、それによりアンギオテンシンＩＩの効果は、直接的でなく、むしろ骨芽細胞関連の細胞における一次ホルモン性相互作用によって指示されることが示唆される。（Ｈａｔｔｏｎら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５２巻：５−１０頁（１９９７年））。骨の再吸収のＡＩ刺激は、ＡＣＥ阻害剤によって阻害され、それにより、ＡＩからのＡＩＩの形成は、骨の再吸収の刺激に起因したことが示唆される。ＡＩもＡＩＩのいずれも、破骨細胞形成におけるいかなる影響をも示さないことが示された。したがって、この研究では、局所骨破壊が、骨の再吸収のＡＩＩ刺激によって指示されうることが示唆される。
【００２９】
他の研究は、単離された表現型で未成熟な骨芽細胞の一次培養における生体外でのＤＮＡおよびコラーゲン合成のＡＩＩ刺激が、胎仔ラットの頭蓋冠およびヒト成人の海綿質の骨膜から由来したことを示した。（Ｌａｍｐａｒｔｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７５巻：８９−９８頁（１９９８年））。直接的ＡＩＩ効果で、成熟骨芽細胞表現型を示す一次細胞集団で検出されたものはなく、そしてＡＩＩ応答性骨芽細胞の前駆体細胞を通した間接的効果が提案された。細胞の骨芽細胞の豊富な集団における類似の生体外研究は、類似の効果を示した一方で、成熟骨芽細胞増殖の刺激を除外しない。（Ｈｉｒｕｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３０巻：１７６−１７８頁（１９９７年））。別の研究は、ＡＩＩが、ラットの頭蓋冠の骨芽細胞の分化および骨形成の速度を落とす可能性があることを示した。（Ｈａｇｉｗａｒａら、Ｊ．ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５６巻：５４３−５５０頁（１９９８年））。
【００３０】
上記研究の全てに基づいて、アンギオテンシノゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片またはその類似体またはＡＩＩＡＴ２２型レセプターアゴニストの使用が、骨および軟骨修復を増強する上で有効であるか、または軟骨細胞の増殖およびコラーゲン合成を促進する上で有効である可能性はない。
【００３１】
我々の実験室における先の研究では、ＡＩＩおよびＡＩＩ類似体および断片のクラスが、間葉の幹細胞の増殖を刺激し、それは、骨および軟骨を作る細胞生み出すことが示された。（１９９８年１月２３日に提出された米国特許出願番号第０９／０１２，４００号、全体的に参照してここに組込まれる）。
【００３２】
ＡＴ２レセプターに選択性のあるペプチドアゴニスト（ＡＩＩは、ＡＴＲ１よりＡＴ２について１００倍高い親和性を示す）が同定された。このペプチドは、ｐ−アミノフェニルアラニン６−ＡＩＩ［「（ｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅ）６−ＡＩＩ」］、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：３６］（式中、Ｘａａはｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅである）である（ＳｅｔｈおよびＫｉｍ、ＢＢＲＣ  １６９巻：９９７−１００６頁（１９９０年））。このペプチドは、試験された実験的モデルにおけるＡＴ２アンタゴニストに匹敵する結合特性を付与する（Ｃａｔａｌｉｏｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５６巻：９３−９７頁（１９９４年）；Ｂｒｙｓｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２５巻：１１９−１２７頁（１９９２年））。
【００３３】
ＡＩＩレセプターおよびＡＩＩレセプターアンタゴニストの効果は、血管損傷および修復の２つの実験的モデルで試験され、そしてＡＩＩレセプターサブタイプ（ＡＴ１およびＡＴ２）の両方が、創傷治癒で役割を果すことが示唆される（Ｊａｎｉａｋら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２０巻：７３７−４５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３９巻：１２９１−１２９６頁（１９９１年）；Ｋａｕｆｆｍａｎら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．４９巻：２２３−２２８頁（１９９１年）；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １３巻：７８３−７８６頁（１９９２年）；Ｋｉｍｕｒａら、ＢＢＲＣ  １８７巻：１０８３−１０９０頁（１９９２年））。
【００３４】
多くの研究は、ＡＩＩ（１−７）（ＡＩＩ残渣１−７）またはそれらの活性を評価するＡＩＩの他の断片に焦点を合わした。ＡＩＩ（１−７）は、ある程度引出すが、しかしＡＩＩによって引出される全範囲の効果ではない。Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２５巻：５７−６２頁（１９９２年）；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９巻（補追ＩＩ）：ＩＩ−４９―ＩＩ−５５（１９９２年）；ＥｄｗａｒｄｓおよびＳｔａｃｋ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．２６６巻：５０６−５１０頁（１９９３年）；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．２６５巻：６６４−６７３頁（１９９１年）；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １７巻：１１１５―１１２０頁（１９９１年）；Ｐｏｒｔｓｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１１巻：６５２−６５４頁（１９９４年）。
【００３５】
以降に定義される通り、本発明によって使用するための好ましいクラスのＡＴ２アゴニストは、アンギオテンシノゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片または類似体、またはＡＩＩの位置６に対応する位置にｐ−ＮＨ−Ｐｈｅを有するＡＩＩＡＴ２２型レセプターアゴニストを含む。ペプチド剤に加えて、必要なＡＴ２アゴニスト活性を示す種々の非ペプチド性剤（例えば、ペプチド擬似体）は、本発明による使用についてさらに意図される。
【００３６】
本発明による活性ＡＩＩ類似体、ＡＩＩの断片および特に目的のその類似体は、一般式Ｉ
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
（式中、Ｒ１およびＲ２は、一緒に式
Ｘ−ＲＡ−ＲＢ−、
［式中、Ｘは、Ｈまたは１個から３個までのペプチド基であるか、または存在せず、
ＲＡは、Ｈ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボン酸）、Ａｌａ、Ｍｅ２Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ、Ｇｌｕ（ＮＨ２）、Ｇｌｙ、Ａｓｐ（ＮＨ２）およびＳｕｃから適切に選択され、
ＲＢは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、シトロン、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓから適切に選択される］
で表される基を形成する；
Ｒ３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒから構成される群から選択される；
Ｒ４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒおよびアザＴｙｒから構成される群から選択される；
Ｒ５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｖａｌ、およびＧｌｙから構成される群から選択される；
Ｒ６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７は、ＰｒｏまたはＡｌａである；および
Ｒ８は、末端Ｔｙｒ基としてＲ４を含む配列を除外しながら、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒから構成される群から選択されるか、または存在しない）
で表される配列中の基Ｒ１−Ｒ８の少なくとも３つの隣接のアミノ酸から構成される配列を含む。
【００３７】
本発明の実施に有用なＡＴ２アゴニストのカテゴリー内に入る化合物としては、Ｒ６がｐ−ＮＨ２−Ｐｈｅであるという制限について上に規定されるＡＩＩ類似体が挙げられる。
【００３８】
ＲＡ−ＲＢについての特に好ましい組合せは、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｕ−Ｌｙｓである。このクラスの特に好ましい実施の態様としては、以下のものが挙げられる：ＡＩＩ、ＡＩＩＩまたはＡＩＩ（２−８）、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：２］；デス１−ＡＩＩＩまたはＡＩＶとしても知られるＡＩＩ（３−８）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：３］；ＡＩＩ（１−７）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ［配列番号：４］；ＡＩＩ（２−７）、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ［配列番号：５］；ＡＩＩ（３−７）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ［配列番号：６］；ＡＩＩ（５−８）、Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：７］；ＡＩＩ（１−６）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ［配列番号：８］；ＡＩＩ（１−５）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ［配列番号：９］；ＡＩＩ（１−４）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ［配列番号：１０］；およびＡＩＩ（１−３）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ［配列番号：１１］。他の好ましい実施の態様としては、Ａｒｇ−ノルＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１２］およびＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ノルＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１３］が挙げられる。本発明の範囲内に含まれるさらに別の好ましい実施の態様は、配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：３１］を有するペプチドである。ＡＩＩ（６−８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１４］およびＡＩＩ（４−８）、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１５］も試験し、そして有効でないことが分かった。
【００３９】
軟骨細胞増殖、コラーゲン合成、軟骨修復および骨または他の組織への軟骨の付着および固定のための方法の特に好ましい実施の態様では、本発明の活性化合物は、以下の一般式：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｒ６
（式中、Ｒ１は、水素、Ｇｌｙ、およびＡｓｐから構成される群から選択される；
Ｒ２は、Ａｒｇ、シトロン、またはオルニチンから構成される群から選択される；
Ｒ３は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、およびノルＬｅｕ、またはＰｒｏから構成される群から選択される；
Ｒ４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、およびＡｌａから選択される；
Ｒ５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびノルＬｅｕから構成される群から選択される；および
Ｒ６は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅであるか、または存在しない）
を含むものから選択される。
【００４０】
このクラスの化合物の最も特に好ましい実施の態様は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１３、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：１２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、および配列番号：４５から構成される群から選択される。
【００４１】
骨修復および骨および人工器官の移植のための方法の特に好ましい実施の態様では、本発明の活性化合物は、以下の一般式：
Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｒ１−Ｒ２−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｒ２
（式中、Ｒ１は、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびノルＬｅｕから構成される群から選択される；
Ｒ２は、ＴｙｒおよびＴｙｒ（ＰＯ３）２から選択される；および
Ｒ３は、Ｐｈｅであるか、または存在しない）
を含むものから選択される。
【００４２】
このクラスの化合物の最も特に好ましい実施の態様は、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：２４、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：４１、および配列番号：４５から構成される群から選択される。
【００４３】
本発明による得に興味深い別のクラスの化合物は、一般式ＩI
Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８
（式中、Ｒ２は、Ｈ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、シトロン、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓから構成される群から選択される；
Ｒ３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒから構成される群から選択される；
Ｒ４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒ、Ａｌａ、およびアザＴｙｒから構成される群から選択される；
Ｒ５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｖａｌ、およびＧｌｙから構成される群から選択される；
Ｒ６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである；
Ｒ７は、ＰｒｏまたはＡｌａである；および
Ｒ８は、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒから構成される群から選択される）
で表されるものである。
【００４４】
一般式ＩＩの化合物の特に好ましいサブクラスは、式
Ｒ２−Ｒ３−Ｔｙｒ−Ｒ５−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１６］
（式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ５は、先に定義される通りである）
を示す。特に好ましいのは、式Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｙ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：２］で表されるアンギオテンシンＩＩＩである。他の好ましい化合物としては、構造式Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１７］およびＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｙ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号：１８］で表されるペプチドが挙げられる。断片ＡＩＩ（４−８）は、反復試験では有効でなかった。これは、Ｎ−末端にある露出したチロシンによると考えられる。
【００４５】
上記式で、アミノ酸残基についての標準の３文字略号が使用される。対照に対する指示の不在下で、Ｌ−型のアミノ酸が意図される。他の残基は、以下の通りに略記される。
【００４６】
【表１】
0003686335.tif 000002
ＡＩＩおよびその類似体は、ガンマまたはベータ回転のいずれかに適合することが示唆された（Ｒｅｇｏｌｉら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２６巻：６９頁（１９７４年）。一般に、位置Ｒ３、Ｒ５およびＲ７にある中性の側鎖は、レセプターへの結合および／または固有の活性に一次的に起因する位置Ｒ４、Ｒ６およびＲ８にある活性基の間に適切な距離を維持するのに関与しうることが分かる。位置Ｒ３、Ｒ５およびＲ８にある疎水性側鎖は、ペプチドの全形態で重要な役割をも果し、および／または仮定的疎水性ポケットの形成に寄与しうる。
【００４７】
位置Ｒ２にあるアミノ酸上の適切な側鎖は、標的レセプターについての化合物の親和性に寄与し、および／またはそのペプチドの形態に重要な役割を果しうる。この理由のため、ＡｒｇおよびＬｙｓは、Ｒ２として特に好ましい。
【００４８】
本発明の目的のために、Ｒ３は、Ｒ５（ガンマ反転モデルにある）またはＲ６（ベータ反転モデルにある）との線状または非線状の水素結合の形成に関与しうることが分かる。Ｒ３も、ベータ逆平行構造（可能な構造として提案もされている）で第一の反転に関与する。一般式Ｉ中の他の位置と対照的に、ベータおよびガンマ分岐は、この位置で等しく有効であるようである。さらに、単独の水素結合は、比較的安定な形態を維持するのに十分でありうる。したがって、Ｒ３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒから適切に選択されうる。
【００４９】
Ｒ４に関しては、形態の分析では、この位置にある（並びにＲ３およびＲ５にある）側鎖が、レセプターの占有および刺激に必須であると思われる疎水性クラスターに寄与することが示唆されている。したがって、Ｒ４は、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）２、ホモＳｅｒ、Ｓｅｒ、およびアザＴｙｒから構成されるのが好ましい。この位置で、Ｔｙｒは、フェノール性水酸基から得られる水素を受け入れる能力のあるレセプター部位と水素結合を形成しうる場合、特に好ましい（Ｒｅｇｏｌｉら、上記（１９７４年））。Ｒ３も、適切にはＡｌａでありうる。
【００５０】
位置Ｒ５では、β脂肪族または脂環式鎖を有するアミノ酸が特に望ましい。したがって、Ｇｌｙが、位置Ｒ５で適切である場合、この位置にあるアミノ酸は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ノルＬｅｕ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択されることが好ましい。
【００５１】
本発明による特に興味深いアンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、断片およびその類似体では、Ｒ６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅである。ヒスチジンのイミダゾール環の特徴的な特性（例えば、生理学的ｐＨでのイオン化、プロトンドナーまたはアクセプターとして作用する能力、芳香族特性）は、Ｒ６としてその特定の利用性に寄与すると考えらえる。例えば、形態的モデルは、Ｈｉｓが、Ｒ７の配向性に影響を及ぼすことによって逆平行構造の水素結合形成（ベータモデルで）に、または第二の反転に関与しうることを示唆する。同様に、Ｒ７は、Ｒ８の最も望ましい配向性を供するためにＰｒｏであるべきであると現在考えられる。位置Ｒ８では、疎水性環および陰イオン性カルボキシル末端の両方が、レセプターに対する目的の類似体の結合の上で特に有用であるように見える。したがって、Ｔｙｒおよび特にＰｈｅは、本発明の目的として好ましい。
【００５２】
特に目的の類似体としては、以下のものが挙げられる。
【００５３】
【表２】
0003686335.tif 000003
本発明のポリペプチドは、任意の従来の方法によって合成されうるが、それは、それに限定さることなく、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）、２版、ピエールス・ケミカル社．、イリノイ州ロックフォード（１９８４年）および固相合成に関してはＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ホルモン性蛋白質およびペプチド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、２巻、アカデミック・プレス社、ニューヨーク（１９７３年）および溶液合成に関してはＥ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、１巻、アカデミック・プレス社、ニューヨーク（１９６５年）に規定されるものが挙げられる。前述の協定の開示は、ここに参照して組込まれる。
【００５４】
一般に、これらの方法は、成長しているペプチド鎖への保護アミノ酸の連続添加に関与する（米国特許番号第５，６９３，６１６号、全体的に参照してここに組込まれる）。正常には、第一のアミノ酸のアミノまたはカルボキシル基のいずれか、および任意の反応性側鎖基が保護される。その後、この保護アミノ酸は、内部固形支持体に付着されるか、または溶液中で利用され、そして配列の次のさらに適切に保護されたアミノ酸を、アミノ酸結合の形成になじみ易い条件下で添加する。全ての所望のアミノ酸が、適切な配列に繋げられた後、保護基および任意の固形支持体を除去して、粗ポリペプチドを供する。ポリペプチドを脱塩し、そして好ましくはクロマトグラフィーで精製して、最終生成物を得る。
【００５５】
好ましくは、製造業者の指示に従って、アプライド・バイオシステムズ・モデル４３０Ａペプチド合成装置（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスター・シティー）で働きうるように、標準固相方法論にしたがって、ペプチドを合成する。固相方法論または液相のいずれかによる、ペプチドまたはペプチド擬似体を合成する他の方法は、当業者によく知られている。
【００５６】
１つの態様では、本発明は、アンギオテンシノゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片または類似体、またはＡＩＩＡＴ２２型レセプターアゴニスト（以降、「活性剤」に該当する）の投与を特徴とする、哺乳類における骨および軟骨の修復、治癒、および増大を増強する方法およびキットを提供する。化合物は、単独で、または骨および／または軟骨の修復、治癒、および増大を増強する他の化合物と組合せて投与することができるが、それに限定されずに、骨形態発生蛋白質−２、骨形態発生蛋白質−４、骨形態発生蛋白質−６、骨形態発生蛋白質−７、形質転換成長因子−ベータ、インシュリン様成長因子、および甲状腺ホルモンが挙げられる。
【００５７】
活性剤は、従来の医薬上許容しうる担体、アジュバント、およびベヒクルを含有する用量単位処方で、経口で、非経口で、吸入スプレーによって、直腸で、または局所でを含めた任意の適切な経路によって投与しうる。このようなベヒクルは、そこに埋設された本発明の化合物を有するベヒクルとしてタンタルまたはヒドロキシアパタイトの足場を含みうる。一方、高分子基質は、米国特許番号第５，４４３，５１５号；第５，１７１，２７３号；第５，６０７，４７４号；第４，９１６，２０７号；および第５，３２４，７７５号に開示される高分子基質のような骨または軟骨への化合物送出のために使用することができる。全ての文献は、全体的にここに組込まれる。ここで使用される場合、語句非経口としては、局所（すなわち、骨の中の位置）、皮下、静脈内、動脈内、筋内、基質内、腱内、脊椎内、頭蓋内、胸内の注入技術または腹腔内が含まれる。
【００５８】
本発明の活性剤は、人工器官装置の表面上のコーティングに組込むこともできる。このようなコーティングは、適切な期間、骨付着を増強するのに十分な速度で活性剤の拡散をゆっくりにさせる高分子から構成されうる。適切なコーティングとしては、それに限定されないが、ヒドロキシアパタイト、メタクリレートおよびリン酸トリカルシウムが挙げられる。さらに、高分子コーティングは、骨の内部成長が所望される人工器官装置上の部位にのみ使用しうる。骨移殖片を、移植片に活性剤を染み込ませるように移殖前に洗浄剤またはゲルで被覆、または浸漬または浸すことができる。処置を必要としない組織および臓器への薬の露出を減らす場合、移殖の部位または移殖片それ自身のいずれかへの活性剤の局所または局部投与が、好ましい。
【００５９】
活性剤は、固形形態（顆粒、粉末または坐剤を含めた）で、または液体形態（例えば、溶液、懸濁液、または乳液）で、作成しうる。本発明の化合物は、多様な溶液で使用されうる。本発明による用途として適切な溶液は、無菌であり、十分な量のペプチドを溶解させ、そして目的の法とに有害でない。この点で、本発明の化合物は、非常に安定であるが、しかし、強酸および塩基によって加水分解される。本発明の化合物は、有機溶媒に、およびｐＨ５−８での水性溶液に溶解性がある。
【００６０】
活性剤は、無菌化のような従来の医薬上の操作にかけることができ、および／または防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などのような従来のアジュバントを含みうる。
【００６１】
投与については、活性剤は、投与の例示経路のために適切な１つまたはそれ以上のアジュバントと日常的に組み合わされる。化合物は、ラクトース、ショ糖、スターチ粉末、アルカノール酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、および／またはポリビニルアルコールと混合され、そして錠剤化、または従来の投与のために封入されうる。選択的に、本発明の化合物は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド性溶液、エタノール、コーン油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、および／または種々の緩衝液に溶解されうる。他のアジュバントおよび投与の態様は、製薬業界でよく知られている。担体または希釈剤としては、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような時間遅延材料を単独で、またはワックス、または当業界でよく知られる他の材料と共に含みうる。
【００６２】
局所投与に適切な処方としては、皮膚を通しての浸透に適切な液体または半液体製品（例えば、塗布剤、ローション、軟膏、クリームまたはペースト）、および眼、耳または鼻への投与に適切な液滴が挙げられる。
【００６３】
骨および軟骨修復を活性剤で増強するための投与計画は、損傷の型、年齢、体重、性別、個人の医療状況、症状の重篤度、投与の経路、および使用される特定の化合物を含めた種々の因子に基づいている。したがって、投与計画は、広範に変化しうるが、しかし、標準法を用いて医師によって日常的に投与されうる。０．１ｎｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の桁の活性剤の用量レベルは、ここに開示される用途の全ての方法に有用である。
【００６４】
例として、化合物が、タンタルまたはヒドロキシアパタイトのような骨および／または軟骨のために使用される足場に埋設される活性剤で骨および軟骨修復を促進するための投与計画は、充填されるべき骨の容積に基づいているのであって、治療されるべき対象の体重に基づいてはいない。欠陥に基づいて計算された、対象に投与されるべき特定の用量体積の決定に続いて、個々の用量が準備される。最終の送出薬製品は、１部（２０％）の活性剤（約．００１μｇ／ｍｌと約５ｍｇ／ｍｌの間の濃度で）から４部（８０％）の希釈剤の比で防腐性の条件下で混合される。
【００６５】
治療計画は、治療されるべき疾病によって変化もし、損傷の型、年齢、体重、性別、個人の医療状況、症状の重篤度、投与の経路、および使用される特定の化合物を含めた種々の因子に基づいている。例えば、活性剤は、３０日までの間、骨粗鬆症の患者に投与される。療法は、上に記述される通り投与で毎日１から６回投与される。
【００６６】
好ましい実施の態様では、活性剤は、皮下に投与される。活性剤の有効成分の適切な皮下の用量は、骨または軟骨修復を増強するのに十分な時間、毎日２回、投与される約０．１ｎｇ／ｋｇと約１０ｍｇ／ｋｇの間であるのが好ましい。さらに好ましい実施の態様では、活性剤の濃度は、約１００ｎｇ／ｋｇ体重と約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重の間にある。最も好ましい実施の態様では、活性剤の濃度は、約１０μｇ／ｋｇ体重と約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重の間にある。この投与計画は、必要とされるアゴニストの量を最小限にしつつ、本発明の治療的利益を最大限にする。このような使用法は、費用並びに可能な害のある副作用を最小限にする。
【００６７】
皮下投与については、有効成分は、１０％ｗ／ｗと同じくらい包含しうるが、０．０００１％から１０％ｗ／ｗ、例えば１％から２重量％の処方を包含でき、好ましくは５％ｗ／ｗ未満、そしてさらに好ましくは０．１％から１％の処方を含みうる。
【００６８】
本発明の別の好ましい実施の態様では、活性剤は、骨または軟骨損失または修復の部位に局所で投与される。適切な局所用量および処方における有効成分濃度は、皮下投与について記述される通りである。
【００６９】
別の好ましい実施の態様では、活性剤は、骨再吸収の部位にある歯肉組織で、または非癒合性骨破損の部位に手術で移殖された足場での被膜送出を介するように、骨または軟骨修復の所望の部位に投与される。処方における適切な用量および有効成分濃度は、皮下の投与について記述される通りである。
【００７０】
本発明の１つの実施の態様では、生体外法は、単離した細胞集団を、アンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片およびその類似体および／またはＡＩＩＡＴ２２型レセプターアゴニストと接触させながら、対象からの骨芽細胞集団の単離、および対象への骨芽細胞集団の連続再注入を介して骨修復を増強するために表される。骨芽細胞集団を単離するための方法は、記述されている（Ｈｉｒｕｍａら、１９９７年；Ｌａｍｐａｒｔｅｒら、１９９８年）。好ましい実施の態様では、ヒトの骨細胞は、骨折により股関節部置換を受けている患者から得られる大腿骨頭の管状骨断片の副産物から培養され、そしていくつかの連続したコラゲナーゼ消化期間まで、１ｍｇ／ｍｌＩＩ型コラゲナーゼ溶液（ワーシントン・ダイアグノスチック・システムズ）を用いて、消化期間当たり２０分間、処置される。
【００７１】
本発明の別の実施の態様では、生体外または生体内法は、単離された細胞集団を活性剤に接触させながら、対象から軟骨細胞集団を単離すること、および対象への軟骨細胞集団の連続した再注入を介して、軟骨修復を増強することについて表される。軟骨細胞集団の単離は、記述されている。Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１００巻、４７７−４８５頁（１９８５年）；米国特許番号第４，６４２，１２０号；第５，０５３，０５０号；および第５，７３６，３７２号、各々、全体的に参照してここに組込まれる）。
【００７２】
好ましい実施の態様では、自己のまたは同質の骨髄が、腸骨稜または大腿管から骨生検針で吸い出すことによって得られる。（米国特許番号第５，０５３，０５０号）。吸出した細胞を、０．２５％トリプシンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に注入し、１７、１８および２０ゲージの針を通して連続して吸出して、単独の細胞懸濁液に達する。細胞を、５０−１００×１０６細胞の密度で、１００ｍｍ組織培養皿に載せ、１５％Ｆ．Ｃ．Ｓ．（胎仔ウシ血清）を有するＢＧＪｂ培地（ＧＩＢＣＯ）で育成する。培地を、毎日、または細胞の増殖速度によって要求される通り交換する。培地は、約０．１ｎｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌ活性剤の間で補足される。細胞は、毎週予備培養され、そして５−６回予備培養した後、ほとんど純粋な繊維芽間質細胞集団が達成される。その後、この細胞集団をトリプシン処理し、そして３−８×１０６細胞／ｍｌの培地の密度で懸濁培養を付け加え、そしてその培地に毎日加えた１０％Ｆ．Ｃ．Ｓ．および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸ナトリウムを有するＦ−１２培地中の軟質寒天上で培養する。繊維芽間質細胞は、すぐに凝集を開始し、そして３−７日後、細胞のほとんどは、３０−６０細胞の凝集にある。全ての凝集は、分析のために組織化学的および免疫組織化学的プローブを使用することによって決定される通り、軟骨細胞表現型を発現する。
【００７３】
軟骨細胞から由来する骨髄が好ましいが、自己または相同の起源の軟骨細胞、または相同の収容軟骨細胞、または任意の他の先祖細胞を使用することができる。この当初の処方は、軟骨形成性表現型を発現する集団の精製、増殖および増幅を含むことが分かりうる。さらに詳細には、増殖細胞は、骨髄間質細胞、胚性収容軟骨細胞、および任意の未分化間葉細胞を含むクラスから得られる。
【００７４】
好ましい実施の態様では、軟骨細胞における本発明の活性剤の増殖性効果は、非増殖細胞中でより増殖細胞中でより高い濃度で存在することが知られている蛋白質に対して指示された抗体に対する反応性によって評価され、それにより限定されないが、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、またはサイクリン；ザイムド・ラボラトリーズ、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ）が挙げられる。生育可能な細胞は、トリパン・ブルー排除アッセイのような技術を使用して同定することもできる。対象に再注入されるべき細胞を、洗浄して培養液の全ての軌跡を除去し、適切な培地に再懸濁し、そしてその後、ペレット化させ、そして数回洗浄する。最終の洗浄後、細胞を、適切な培地中のｍｌ当たり０．７×１０６および５０×１０６細胞の間で再懸濁し、そして以下に記述される通り投与する。
【００７５】
一方で、骨および軟骨細胞中でのマトリックス成分合成における活性剤の効果は、全体的にここに参照して組込まれる米国特許番号第５，６８６，１１６号に記述される通り、２つのマトリックス蛋白質の濃度を測定することによって、臓器培養中および単離細胞中で決定される。Ｉ型コラーゲンは、骨および軟骨の主要なマトリックス・蛋白質である。コラーゲンは、ほとんど全体的に、プロリン、ＯＨ−プロリン、アラニンおよびグリシンから構成される。したがって、新たな骨コラーゲン合成は、３Ｈ−Ｐｒｏの取込みを、続いて３Ｈ−ＯＨ−Ｐｒｏの外観を測定することによって測定でき、そしてそれは、コラーゲンへのその組込みに続いてプロリンを変換させることによって形成される。オステオカルシンは、破骨細胞を骨に引きつけて、骨分解を開始するための細胞シグナルであるべきと考えられ、そして新たに石化する骨の形成をゆっくりまたは遅らせると考えられる骨特異的マトリックス・蛋白質である。Ｐｒｉｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：７７３４−７７３８（１９８２年）。したがって、オステオカルシン合成が減少したのは、骨修復に関連する。
【００７６】
任意の滑液細胞（軟骨形成）細胞が使用されうる。好ましい実施の態様では、正常な滑液細胞に存在する多くの特性を維持する恒久的軟骨セルラインであるセルラインＨＩＧ−８２が使用される。Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２４巻：１０１５−１０２２頁（１９８８年）。
【００７７】
滑液細胞は、２４−４８時間活性剤にさらし、その後、総細胞性ＲＮＡは、標準手段によって単離される。（分子クローニング：実験室マニュアル（ＭＯｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年））。Ｉ型コラーゲンについてのｍＲＮＡの検出は、それに限定されないが、Ｉ型コラーゲンまたはオステオカルシンに特異的なプライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮＡのノーザンブロッティング、続いてＩ型コラーゲンまたはオステオカルシンのためのプローブを用いたハイブリダイゼーションを含めた当業界で標準の技術を介して行うことができる。（分子クローニング：実験室マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年））。
【００７８】
選択的に、Ｉ型コラーゲン合成の発現は、米国特許番号第５，６８６，１１６号に記述される通り、臓器培養中で決定される。好ましい実施の態様では、新生仔ラットから得た頭蓋冠（頭蓋）骨を、生存性を維持する栄養性培地を有する無菌の培養皿に載せる。この状態で、構造組織は、新たなマトリックス成分（主に骨特異性コラーゲン）を形成することによって成長するが、この成長は、非常に遅い。Ｋｒｅａｍら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１１６巻：２９６−３０２頁（１９８５年）。２１日齢の胎仔ラットから得た片側頭蓋冠を、種々の濃度でアンギオテンシノゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片およびその類似体および／またはＡＩＩＡＴ２２型レセプターアゴニストの存在および不在下で４８時間インキュベートする。３Ｈ−Ｐｒｏを、インキュベーションの最後の１８時間に添加する。ＡＩＩが、胎仔ラットの片側頭蓋冠中のプロリン（Ｐｒｏ）およびヒドロキシプロリン（ＯＨ−Ｐｒｏ）の濃度を増加させることを示す結果は、ＡＩＩが、正常な骨培養系中のＩ型コラーゲン合成の濃度を増加できることを示す。
【００７９】
別の実施の態様では、本発明は、本発明の活性剤の投与によって生体内で骨または軟骨修復を増強する方法を包含する。１つの実施の態様では、本発明の化合物は、マウスの右頭蓋上の皮下組織に注入する。対照ベヒクルは、１％ＢＳＡで補足したＰＢＳである。ヘパリンは、５０単位／ｍｌの用量で投与する。動物を、１４日目に犠牲にし、そして骨成長は、組織形態学によって測定する。
【００８０】
定量のための骨サンプルを、隣接組織から取り出し、そして２４−４８時間、１０％緩衝フォルマリンに固定し、１−３週間、１４％ＥＤＴＡで石灰質を除去し、等級アルコールを通して加工し、そして流動ワックスに埋設する。頭蓋および大腿骨の３ミクロンの切片を作製する。個々の切片は、骨形成および骨再吸収上の活性剤の効果の組織形態学的評価のために選択される。切片は、顕微鏡画像をデジタル化プレートに直接跡をつけるために取り付けたカメラを用いて測定する。骨変換は、頭蓋の注入および非注入側の両方にある４つの隣接１×１ｍｍフィールドを越えて、２００ｍｕ  ｍ離れて収集された切片上で測定される。新たな骨は、層構造よりむしろそのウォーブンによって同定され、そして破骨細胞および骨芽細胞は、それらの特有な形態学によって同定される。組織形態学のソフトウエア（骨測定、オステオメトリックス社、アトランタ）を使用して、デジタライザー入力を加工して、細胞数および特性領域または周囲を測定する。
【００８１】
一方で、本発明の活性剤は、無傷の動物で骨芽細胞機能を高めるのに使用されうる。好ましい実施の態様では、異常な骨芽細胞活性についてのモデルである離乳しているスプレーグ−ドーリーのラットを、製造業者の指示による通り、リン酸およびビタミンＤ−欠乏食餌（食餌、番号８００３９、テクラッド、ウイスコンシン州マディソン）で世話をする。食餌中の動物は、暗所に維持して、デノバ・ビタミンＤ合成を防止もする。このような条件に置かれた動物は、異常な骨形成および総骨マスに際立った欠陥を示す。
【００８２】
食餌中の離乳しているラットの１群を、２１日間、１日おきに、皮下注射として付与され、約０．１ｎｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間で処置する。その食餌中の１群は、未処理のままにし、そして対照として役割を果した。その食餌中でないおよび活性剤で処置していない１腹の対照は、血液サンプルを、アルカリ性ホスファターゼ活性の測定についての食餌中の動物を犠牲にするときに供給する。犠牲により、長い骨を、連続分析のための食餌中の動物から取り出される。
【００８３】
血清のアルカリ性ホスファターゼ活性は、アルカリ性ホスファターゼ活性のレベルが上昇していることが、実験動物での異常な骨転換の証拠であるように、骨芽細胞活性の信頼性のある指標として使用される。血清のアルカリ性ホスファターゼ活性は、Ｌｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０７巻：１９−３７頁（１９５４年）の方法により、血清サンプルによるリン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解によって測定される。際立って上昇した血清のアルカリ性ホスファターゼ活性は、異常な骨芽細胞活性を示す。対照的に、骨細胞の機能の正常化は、対照動物に比較して、血清のアルカリ性ホスファターゼ活性のレベルが減少すること、および骨マス（骨の灰重量の測定を介して試験された）が増加することによって立証される。
【００８４】
一方、成体ウサギの大腿−膝蓋骨における全厚みの関節性軟骨欠陥モデルを使用して、全体的に参照してここに組込まれる米国特許番号第５，７００，７７４号に記述される通り軟骨および骨修復に影響を及ぼす本発明の化合物の能力を評価する。成体ニュージーランドの白色ウサギを麻酔し、無菌の手術のために準備する。関節性軟骨を通し、そして内在する肋軟骨下の骨への３×３ｍｍの傷が、膝関節の膝蓋骨溝に穴をあける。傷は、空のままであるか、またはコラーゲン海綿（対照）で、または約０．１ｎｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間の活性剤に浸漬されたコラーゲン海綿で満たされるかである。切り目を閉じ、そして動物を、４週間、それらのケージ内で自由に移動させる。４週間後、動物を慈悲深く安楽死させ、そして関節性軟骨／肋軟骨下の骨の傷を、修復組織の組織建築、量および品質について組織学的に評価する。ノーザン分析を、別の表現型決めについて行った。
【００８５】
別の実施の態様では、歯および整形外科の移殖片を、本発明の化合物で被覆することができる。一般に、移殖片デバイスを、２ｍｇ／ｍｌ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの範囲にある濃度で溶解された本発明の活性剤で被覆する。移殖片の多孔性末端を、溶液に漬け、そして空気乾燥させ（または凍結乾燥させ）るか、骨の部位にすぐに移殖させる。コーティング溶液の粘度は、所望の場合、０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌまでの最終濃度でヒアルロネートを添加するか、または他の医薬上許容しうる賦形剤を添加することによって増大される。選択的に、活性剤を含む溶液を、２ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの最終コラーゲン濃度まで、コラーゲンゲルまたはヒトコラーゲン（例えば、ザイデルムの登録商標コラーゲン・インプラント、コラーゲン社、カリフォルニア州パロアルト）と混合させて、ペーストまたはゲルを形成し、そしてその後、それを使用して、移殖デバイスの多孔性末端を被覆する。被覆した移殖デバイスを、直ぐに骨の部位に入れるか、または空気乾燥させ、そして移殖片への新たな骨形成を最大限にする一方で、移殖部位への軟質組織の内部成長を最小限にする目的で移殖前にＰＢＳで再水和する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、キットが骨または軟骨修復のための活性剤の有効量、および治療剤として有効量の活性剤を使用するための指示を包含することを特徴とする、骨または軟骨修復を増強するキットを提供する。好ましい実施の態様では、キットは、さらに、上に記述されるそれらのアジュバントのような医薬上許容しうる担体を含む。別の好ましい実施の態様では、患者への活性剤の送出のための手段を含む。このようなデバイスとしては、それに制限されないが、シリンジ、マトリックス性またはミセル性溶液、包帯、創傷包帯剤、高分子足場、コラーゲンベヒクル、エアゾールスプレー、液体フォーム、経皮性パッチ、局所投与剤、ポリエチレングリコール高分子、カルボキシメチル・セルロース製品、晶質製品（例えば、生理食塩水、リンガーのラクテート溶液、リン酸緩衝生理食塩水など）、粘弾性物、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールが挙げられる。送出する手段は、有効量の活性剤を含有するか、または化合物から分離されるかのいずれかでありうるが、それは、その後、使用時に送出のための手段に使用される。
【００８７】
キットは、さらに、骨または軟骨の修復、再生、および増大のために有効な量の別の化合物を含むことができ、そしてそれは、それらに限定されないが、骨の形態発生蛋白質−２、骨の形態発生蛋白質−４、骨の形態発生蛋白質−６、骨の形態発生蛋白質−７、形質転換成長因子−ベータ、インシュリン様成長因子、および甲状腺傍ホルモンが挙げられる。キットは、都合により、医薬上許容しうる担体を含有しうる。
【００８８】
本発明の別の態様では、軟骨細胞の増殖について改善された細胞培養用培地が提供され、そしてここで、改善は、軟骨細胞増殖を刺激するのに有効量の活性剤を細胞培養用培地に添加することを特徴とする。軟骨細胞の成長を指示できる任意の細胞培養用培地が、本発明に使用できる。このような細胞培養用培地としては、それに限定されないが、イーグル基本培地、ダルベッコ改質イーグル培地、イスコフの改質ダルベッコ培地、マッコイ培地、最小必須培地、Ｆ−１０ニュートリエント・ミックスチャー、登録商標オプチ−ＭＥＭ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ．）減少血清培地、ＲＰＭＩ培地、およびマクロファージ−ＳＦＭ培地またはそれらの組合せが挙げられる。
【００８９】
改質された細胞培養用培地は、濃縮（すなわち、１０Ｘ）または非濃縮形態のいずれかで供給でき、そして液体、粉末または凍結乾燥物のいずれかとして供給しうる。細胞培養は、化学的に定義されるか、または血清補足物を含みうる。培養培地は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（メリーラント州ゲーサーズバーグ）およびシグマ（ミズーリー州セントルイス）のような多くの源から市販で入手可能である。
【００９０】
別の実施の態様では、本発明の方法は、軟骨細胞表現型および生存の細胞を維持するために、関節性軟骨細胞のような軟骨細胞セルラインを処理するのに使用されうる。したがって、処理された細胞集団は、遺伝子療法用途のために有用でもありうる。
【００９１】
別の好ましい実施の態様では、キットは、さらに、無菌の容器を含む。無菌の容器は、細胞培養用フラスコ、回転ボトルまたは遠心管のような密封された容器、または細胞培養用プレートまたはマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；イリノイ州ネーパービル）のような密封されない容器を含む。
【００９２】
別の好ましい実施の態様では、キットは、さらに、再構築細胞成長培地中の封入物のための抗生物質補足物を含む。適切な抗生物質補足物としては、それに限定されないが、アクチノマイシンＤ、登録商標フンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、カナマイシン、ネオマイシン、ニスタチン、ペニシリン、ストレプトマイシン、またはそれらの組合せ（ＧＩＢＣＯ）が挙げられる。
【００９３】
本発明の別の目的は、本発明の方法に使用するための成分として活性剤を含む医薬組成物を提供することである。組成物は、活性剤を、骨または軟骨の移植、修復および再生を増強もする、それに限定されないが、骨の形態発生蛋白質−２、骨の形態発生蛋白質−４、骨の形態発生蛋白質−６、骨の形態発生蛋白質−７、形質転換成長因子−ベータ、インシュリン様成長因子、および甲状腺傍ホルモンを含めた化合物または化合物類と一緒に、医薬上許容しうる担体と一緒に含む。この語句としては、活性剤および他の化合物の生物学的活性の効力に干渉しない任意の担体が含まれ、そしてそれは、投与される宿主に毒性がない。医薬組成物の用量および投与は、上記の通り、損傷の型、年齢、体重、性別、個々の医療上の症状、症状の重篤度、投与の経路、および使用される特定の化合物を含めた種々の因子に基づいて、治療されるべき疾病によって変化する。したがって、投与計画は、広範に変化できるが、しかし標準法を使用する医師によって日常的に決定できる。
【００９４】
本発明は、それに限定されないが、骨粗鬆症、変形性関節症、パジェット病、骨石灰脱失症、骨軟化症、歯周病；多発性骨髄腫および他の形態の癌から生じる骨損失；他の医療処置（ステロイドのような）の副作用から生じる骨損失；骨マスの年齢に関連した損失；関節性軟骨裂傷、変形および他の軟骨傷を含めた広範で多様な障害および損傷を患っている哺乳類における骨および軟骨修復を増強する方法の必要性を満たす。
【００９５】
実施例１．ウサギの軟骨細胞の培養の方法
軟骨細胞を、成体ウサギの膝関節の軟骨から単離し、そしてＯｋａｚａｋｉら（Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５巻：１８１−１８６頁、１９９６年）の方法によって培養した。簡略には、軟骨体外移殖組織を、小片（およそ１．５ｍｍ対１．５ｍｍ）に切った。その組織片を、連続して、１０分間０．０５％ヒアルノニダーゼ（４１５Ｕ／ｍｇ蛋白質）中で、１５分間、０．２％ＩＩＩ型トリプシン（１０，０００Ｕ／ｍｇ蛋白質、シグマ）および０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡで、そして３０分間、０．２％Ｉ型コラゲナーゼ（１３６Ｕ／蛋白質、シグマ）で３７℃で消化させた。その後、サンプルを洗浄し、そして、１０％胎仔ウシ血清、３．５ｍｇ／ｍｌグルコース、０．２％Ｉ型コラゲナーゼおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で富化したダルベッコの改質イーグル培地で、空気中５％ＣＯ２の中で３７℃で一夜インキュベートした。
【００９６】
このインキュベーションの後、細胞を回収し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で１回洗浄した。その後、細胞を血球計数計で計数し、そして１０％胎仔ウシ血清および抗生物質で補足したハムのＦ１２中１×１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。１０ｍｌアリコート量の細胞を、コラーゲンで被覆した２５ｃｍ２フラスコ（ラット尾部腱から単離したコラーゲンで被覆された）に移し、そして空気中５％ＣＯ２の中で３７℃でインキュベートした。培養の開始の５から７日後、細胞を、空気中５％ＣＯ２の中で３７℃で、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で剥がした。剥離後、その細胞をリン酸緩衝生理食塩水で一回洗浄し、１０％胎仔ウシ血清および抗生物質で補足したハムのＦ１２中２００細胞／ｍｌに再懸濁した。その後、２００マイクロメーターの細胞を、９６穴マイクロタイタープレートのコラーゲン被覆ウエルに分別し、そして粘着させ、その後、表３に列記されるＡＩＩおよびＡＩＩ類似体および断片ペプチド１０μｇ／ｍｌを、そのウエルに添加し、培養開始後１、２、および３日に、軟骨細胞増殖におけるそれらの効果を評価した。ギムザ染色で細胞を染色することによって、細胞数を定量し、そして顕微鏡を介して検出される核の数を計数した。データ（図１−４）は、ＡＩＩおよびＡＩＩ類似体および断片が全て、軟骨細胞増殖を促進することを示す。
【００９７】
【表３】実施例１で使用された類似体／断片の名称
名称            略称                   配列                配列番号
GSD 37B         Orn2-AII               D(Orn)VYIHPF        配列番号38
GSD 28          Ile8-AII               DRVYIHPI            配列番号39
GSD 24B         Pro3-AII               DRPYIHPF            配列番号31
GSD 22A         Ala4-AIII               RVYAHPF            配列番号18
GSD 36          Gly1-AII               GRVYIHPF            配列番号42
GSD 38B         Citron2-AII            D(Citron)VYIHPF     配列番号43
1GD             Ala4-AII(1-7)          DRVAIHP             配列番号40
2GD             Pro3-AII(1-7)          DRPYIHP             配列番号41
3GD             Pro3Ala4-AII(1-7)       DRPAIHP             配列番号44
AIII            AII(2-8)                RVYIHPF            配列番号2
AII(1-7)                               DRVYIHP             配列番号4
AII                                    DRVYIHPF            配列番号1
実施例２．骨治癒
雌のスプレーグ−ドーリーのラットが、ケタミン／ロンパンで筋内麻酔を受け、そして手術部位を剃り、そしてベタジン・スクラブ、続いて７０％エタノールでこすり洗うことによって無菌の手術を準備した。その後、ラットを、外科医に面する側面臥位の位置にある無菌領域に載せた。その後、剃った脚を、ベタジン溶液で覆い、そして防腐をかけた。皮膚の切り目を、右中央の骨幹の長い軸に平行に行った。筋肉を、顔面に沿って分離して、脛骨を露出させた。その後、直径１．４ｍｍの傷を、中軸の皮質の側面側から穴をあけて、その結果、傷は、骨髄を介して、一方の皮質側から他方に伸長した。注射のために無菌の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を、使用して、組織残骸および骨断片の手術領域を清浄した。ヒドロン高分子溶液（ベヒクル：１０％ヒドロン、６０％エタノール、１％ポリエチレングリコール高分子）またはヒドロン高分子溶液中のペプチド（１ｍｇ／ｍｌでのＡＩＩ、ＡＩＩ（１−７）、または９ＧＤ）のいずれかを、骨の傷に注いで、傷に高分子（およそ０．１ｍｌの高分子）を充填した。切れ目を、連続Ｕ字縫合を用いて３−０ビクリル縫合糸で閉じた。その動物を、麻酔から回復させ、無痛覚のためにブプロネックスを付与し、そして安楽死が７日後になるまで自由に運動させた。
【００９８】
全体観察によって、本発明のペプチドを受けた傷は、さらに完全に、石灰化し始めた新たな組織で充填された。対照の傷の大半は、新たな組織で充填されたのは５０％未満であり、そしてその組織の硬化は、観察されなかった。これらのデータは、本発明のペプチドが、新たな骨組織の形成を促進することを示す。
【００９９】
全体評価後、筋肉組織を、骨から取除き、そして骨を、固定のためにホルマリンに入れた。１０％緩衝ホルムアルデヒド中で２日後、その組織を、６時間、３：１に希釈した脱石灰化溶液（ラピッド・ボーン・デカル（Ｒａｐｉｄ  Ｂｏｎｅ  Ｄｅｃａｌ）、アメリカン・マスターテック・サイエンティフィック社、カリフォルニア州ロディ）に入れた。脱灰後、骨を、長い軸に沿って半分に切り、パラフィンに埋設し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１００】
組織切片の顕微鏡評価は、全体観察を確認した。７日目に、傷がヒドロン（プラセボ）で充填した傷は、自然で炎症であると観察された細胞の大半で充填されたゆるいフィブリンフィラーを有した。偶然に、間葉臓器または血管のものであると思われる細胞は、損傷の部位に見られた。ペプチドで処置した動物の全てで、膨大な血管を有する広範囲にわたる間質細胞の内部成長が観察された。およそ５０％のペプチドで処置した動物では、新たな骨の外観を伴う組織が観察された。これらのデータは、新たな骨形成を促進するこれらのアンギオテンシン・ペプチドの能力を明らかに指示する。
【０１０１】
【表４】実施例２で使用された類似体／断片の名称
AII(1-7)                               DRVYIHP             配列番号4
AII                                    DRVYIHPF            配列番号1
9GD             ノルLeu3-AII(1-7)      DR(ノル)YIHP        配列番号45
本発明は、操作の正確な詳細に、または示され、そして明らかな修飾および等価物が、当業者に明らかであるように、記述された正確な化合物、組成物、方法、手段または実施の態様に限定されるべきでなく、そしてしたがって、本発明は、付随の請求項の全範囲によってのみ限定されるべきであると理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、軟骨細胞増殖におけるＡＩＩ、ＡＩＩＩおよびＧＳＤ３７Ｂ（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒線である。
【図２】  図２は、軟骨細胞増殖における本発明のＡＩＩ、ＧＳＤ３６、ＧＳＤ３７Ｂ、ＧＳＤ３８ＢおよびＧＳＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒線である。
【図３】  図３は、軟骨細胞増殖におけるＡＩＩ、１ＧＤ、２ＧＤ、および３ＧＤ（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒線である。
【図４】  図４は、軟骨細胞増殖における本発明のＡＩＩ、ＡＩＩ（１−７）、ＧＳＤ２２Ａ、ＧＳＤ２２Ａ、ＧＳＤ２４Ｂ、およびＧＳＤ２８（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示す棒線である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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