(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性グルカンを産生する微生物の培養液又は水不溶性グルカンを構成成分とする微生物菌体含有溶液を、0.175 〜3.5 w/w%の酸化物及びｐＨを10〜12.5にせしめる水酸化物で同時に処理することを特徴とする、水不溶性グルカンの精製方法。
【請求項２】
水不溶性グルカンが、レンチナン、酵母グルカン、セルロースから選択される請求項１記載の精製方法。
【請求項３】
当該培養液又は当該微生物菌体含有溶液の微生物含量が2.0 ×106 〜4.0 ×109 個／mlである請求項１記載の精製方法。
【請求項４】
当該培養液又は当該微生物菌体含有溶液の粘度が400 〜10,000 cpsである請求項１記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水不溶性グルカンを産生する微生物の培養液又は水不溶性グルカンを構成成分とする微生物菌体含有溶液より水不溶性グルカンを精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水不溶性グルカンは天然系繊維として食品素材（特開昭60-105460 、特開昭62-83854号) 、人工皮膚（J.D.Fontana et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 24/25, p.253-264, 1990)、製紙（特開昭63-295793 号) 、制ガン剤（特公昭40-22398、特公昭47-37002号) 等に利用されている。
【０００３】
水不溶性グルカンは、酢酸菌、担子菌、酵母菌等を通気攪拌培養、静置培養、固体培養等をすることによって得られるが、培養液には培地成分由来の不純物や、生産菌の培養によって生成される低分子、高分子の不純物が存在するために、水不溶性グルカンをこれらから分離、分画、精製する必要がある。精製方法としては、多糖類を精製する通常の方法で行われ、不純物の除去は、例えば遠心分離、酸又はアルカリ溶液や熱水による抽出、有機溶媒による沈殿、透析、イオン交換クロマトグラフィー（特公昭42-2918 号) 、第４級アンモニウム塩として沈殿除去する方法（特公昭43-20567号) 、第４級アンモニウム化合物の特定塩基性ｐＨ領域で分別沈殿する方法（特公昭47-37002号) 等により行われている。また、培養液には、固液分離性を悪くし、濾過の際に目的物質中に不純物又は水溶性グルカンを残留させる原因となる粘性の増加、生産菌の残留、着色などの問題がある。よって、水不溶性グルカンを培養液から精製するには、不純物の除去に加え、着色物質の除去（特公昭53-44563号) 、高分子粘性物質の除去など、複雑な工程を経なければならないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、複雑な工程を経ることなく、工業的に安価で且つ効率的な水不溶性グルカンの精製方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、水不溶性グルカンを産生する微生物の培養液又は水不溶性グルカンを構成成分とする微生物菌体含有溶液から水不溶性グルカンを効率的に精製するためには、当該液の液性改善が重要であることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、当該液を水酸化物及び酸化物で同時に処理することで、生産菌の細胞破壊、脱色及び粘度低下が同時に達成され、水不溶性グルカンを効率的に精製できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、水不溶性グルカンを産生する微生物の培養液又は水不溶性グルカンを構成成分とする微生物菌体含有溶液を、0.175 〜3.5w/w% の酸化物及びｐＨを10〜12.5にせしめる水酸化物で同時に処理することを特徴とする、水不溶性グルカンの精製方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の精製方法の対象となる水不溶性グルカンは、具体的には、酢酸菌の産生するバクテリア・セルロース、担子菌の構成成分であるレンチナン、酵母菌の表層構造である酵母グルカン等が挙げられる。
【０００８】
本発明に用いられる水不溶性グルカン産生又は構成菌は、特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ ATCC 18824, ATCC 9763, ATCC 26615, ATCC 15248, IFO 555等、アセトバクター・キシリナム IFO 3288, ATCC 10821, ATCC 31174、あるいはアセトバクター・パストリアヌス ATCC 23766、同ライセンス ATCC 23765、サルシナ・ベントリクリ、バクテリウム・キシロイデス、シュードモナス属細菌、アグロバクテリウム属細菌、及び真正担子菌類等の担子菌がある。
【０００９】
微生物の培養に用いられる培地は、水不溶性グルカン産生又は構成菌の種類（酢酸菌、酵母菌、担子菌）によって異なるが、当該菌に対して当業界で通常用いTられる培地が使用され、合成培地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチド、無機塩（Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ等）等が例示される。天然培地としては、炭素源として各種糖類、アミノ酸、有機酸、窒素源としては大豆蛋白質、蛋白質加水分解物、酵母エキス、肉エキス等が例示される。  培養液のｐＨは、弱酸性が好ましく、通常5.0 〜6.5 がよい。培養温度は、20〜35℃、培養時間は24〜216 時間程度が例示される。
培養は通気攪拌培養、静置培養、固体培養のいずれの方法でも可能である。
【００１０】
こうして、通常、上記微生物の培養によって得られた培養液又は微生物菌体含有溶液の性状は、微生物含量が2.0 ×106 〜4.0 ×109 個／ｍｌ、粘度が400 〜10,000 cpsであり、また着色度（430nm での吸光度) は0.4 〜7.0 である。
当該培養液又は当該微生物菌体含有溶液は、必要に応じて水等で希釈し、以下に述べる水酸化物及び酸化物に付することができる。当該培養液又は当該微生物菌体含有溶液に水酸化物や酸化物等を添加した処理液量は当該培養液又は微生物菌体含有溶液量を約１〜10倍希釈することで本発明の目的とする効果を発揮することができる。その理由は、処理時の均一性を保ち、酸化物が局所的に不均一に反応することを防止するためである。当該培養液又は当該微生物菌体含有溶液に水酸化物や酸化物等を添加した当初の処理液の微生物量が4.0 ×109 個／ｍｌより多く、又は粘度が10,000cps より大きく、又は着色度（430nm での吸光度) が7.0 を越える場合は、未反応物が残存することから望ましくないので、希釈する必要がある。
【００１１】
本発明の水不溶性グルカンの精製方法は、上記微生物の培養によって得られた培養液又は微生物菌体含有溶液に、水酸化物及び酸化物を所定の濃度添加し、50〜70℃、好ましくは55〜65℃にて、８〜24時間、好ましくは14〜18時間、攪拌処理することによって行う。
【００１２】
本発明の精製方法に使用する水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
当該水酸化物は、0.1 〜10w/w%、好ましくは0.5 〜３w/w%の水不溶性グルカンを含む培養液又は微生物菌体含有溶液にｐＨが10〜12.5、好ましくは10.2〜12.2になる様に添加する。
ｐＨが10未満になるように当該水酸化物を添加した場合は、処理液の粘度、菌の細胞破壊や着色度が本発明ほど改善されない。また、ｐＨが12.5を越えると、着色度の改善が低下する。
【００１３】
本発明の精製方法に使用する酸化物としては、過酸化物、塩素系酸化物等が挙げられる。
過酸化物としては、具体的には、過酸化水素、過酸化ナトリウム等が例示され、塩素系酸化物としては、具体的には、サラシ粉、亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム等が挙げられる。
当該酸化物は、同培養液又は微生物菌体含有溶液に、実質的に0.175 〜3.5 w/w%、好ましくは0.175 〜3.0w/w% の濃度になるよう添加する。
0.175w/w% 未満の場合は、脱色が不充分であり、また3.5w/w% を越える場合は別の着色が観察される等、好ましくない。
【００１４】
本発明の精製方法に使用する水酸化物及び酸化物の添加方法は、特に限定されない。すなわち、水酸化物の添加後に酸化物を加えても良いし、又は酸化物を添加後に水酸化物を添加しても良い。また、水酸化物と酸化物を同時に添加しても良いし、交互に添加しても良い。但し、水酸化物及び酸化物を添加する際の反応液の温度は30℃以下に維持することが望ましい。反応液の温度を上げる場合は、水酸化物及び酸化物を全量添加後が好ましい。水酸化物や酸化物の急激な添加は酸素やアンモニアガスの急激な発生等をもたらし、本発明の効果を低減させる。
【００１５】
上記の精製工程を経て得られた培養液又は微生物菌体含有溶液は処理前に比較して、その正常細胞数は少なくとも1/5 ×10-5以下に減少し、着色度は1/1.3 〜1/3 、粘度は1/1.7 〜1/10にそれぞれ低減する。
ここで、正常細胞数とは、微生物の培養によって得られた培養液又は微生物菌体含有溶液の微生物は水酸化物や酸化物等により破壊されるが、その際、細胞が破壊されずに残存した数をさす。そして、細胞の生死ではなく、細胞の形態が維持されているものをさす。
以上の本発明の精製方法による、培養液又は微生物菌体含有溶液の液性の改善状況を下表に示す。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
1)粘度：＋＋＋（高），＋＋（中），＋（低）
2)菌の細胞破壊：＋＋＋（極めて効果有り），＋＋（有り），＋（少し有り），−（なし）
3)着色度：＋＋＋＋（着色），＋＋＋（やや着色），＋（脱色），−（十分脱色）
【００１８】
【実施例】
以下実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明をこれらによって何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕（ナタデココの精製）
表２に示す培地を１Ｌ容ガラスジャーファーメンターに300ml 加え、オートクレーブで120 ℃、20分間加熱殺菌した。放冷後、これにアセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）ATCC 31174を接種し、均一に分散し、30℃で96時間静置培養して培養液を得た。この培養液はナタデココを10g/L の濃度〔日本分析化学会編；分析化学便覧p.998 (1961)記載の方法でセルロースとして定量〕で含有し、正常細胞数は1.3 ×109個／ml（トーマ血球計で測定）、粘度は5000cp（10g/L のナタデココを水に均一に懸濁して測定した粘度；Ｂ型粘度計で測定）、着色度は0.92（430nm での吸光度を測定）であった。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
1) Salt mixture:
FeSO4・7H2O    361 mg/L
CaCl2・2H2O    1.47 g/L
NaMoO4・2H20   24.2 mg/L
ZnSO4・7H2O    173 mg/L
MnSO4・5H2O    139 mg/L
CuSO4・5H2O      5 mg/L
【００２１】
2) Vitamine Mixture:
イノシトール           200mg/L
ニコチン酸               40g/L
ピリドキシン塩酸塩       40g/L
チアミン塩酸塩           40g/L
パントテン酸カルシウム   20g/L
リボフラビン             20g/L
ｐ−アミノ安息香酸       20g/L
葉酸                   200γ/L
ビオチン               200γ/L
【００２２】
▲１▼  処理法１−Ａ
上記の培養液100ml に水100ml を加えて均一に分散し、遠心分離し、等量の水にて２回洗浄を行い、粗ナタデココを得た。これに、pHが13になる様に27%NaOH 水溶液を添加して均一に懸濁後、60℃で14時間攪拌処理した。処理物の粘度は1580cp（Ｂ型粘度計で測定）で、正常細胞数は２×105個／ml（トーマ血球計で測定）、着色度は5.2 （430nm での吸光度を測定）であった。処理後、ナタデココを遠心分離にて回収し、100ml の水で2 回洗浄し、精製ナタデココ0.70ｇ（乾物重量）を得た。
【００２３】
▲２▼  処理法１−Ｂ
上記の培養液100ml に、pHが12.2になる様に27%NaOH 水溶液を、また0.35w/w%になる様にH2O2を加え、60℃で４時間攪拌処理した。処理物の粘度は500cp で、細胞は全て破壊され、着色度は0.3 （430nm での吸光度を測定）であった。処理後、ナタデココを遠心分離にて回収し、100ml の水で2 回洗浄し、精製ナタデココ 0.96gを得た。
表３に上記の各処理法によるナタデココの回収率、純度、及び着色度の測定結果を示した。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
1)  日本電色工業株式会社製、色差計Ｚ−３００Ａにて測定した。黄色の着色度を示し、＋側は色が濃く−側は薄いことを示す。
2)  白色度を示し、０は黒色、 100に近づく程白色であることを示す。
白色標準板の白を100%とし、波長457nm における試料（固形）の白色度を測定（色に関する事柄、及びＺ−３００Ａユーザーズマニュアル、日本電色工業株式会社）。
【００２６】
▲３▼  処理法１−Ｃ
上記の培養液を下記表４の各条件で処理し、同表に結果を併せて示した。
【００２７】
【表４】
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【００２８】
〔実施例２〕（バクテリア・セルロースの精製）
実施例１と同様な培地でアセトバクター・キシリナムATCC 31174を通気攪拌培養し、培養液を得た。この培養液は15g/L の濃度でバクテリア・セルロースを含有し〔日本分析化学会編；分析化学便覧p.998 (1961)記載の方法でセルロースとして定量〕、正常細胞数は1.3 ×109個／ml（トーマ血球計で測定）、粘度は5000cp（Ｂ型粘度計で測定）、着色度は0.92（430nm での吸光度を測定）であった。
【００２９】
この培養液100ml に水100ml を加えて均一に分散した後、pHが10.5, 12.0, 12.5になる様に27%NaOH 水溶液を加え、それぞれのpH値において同時に0.175 w/w%、0.7w/w% 、1.05w/w%になる様にH2O2を加え（処理法２−Ａ〜Ｉ）、均一に懸濁し、60℃で４時間撹拌処理した。同様に、pHが12.0になる様に27%NaOH 水溶液のみを加え（処理法２−Ｊ）、又は1.05w/w%になる様にH2O2のみを加え（処理法２−Ｋ）、処理した。これらの各処理物の分析結果を表５に示す。
【００３０】
【表５】
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【００３１】
表５に示す各処理を行ったバクテリア・セルロースを遠心分離にて回収し、100ml の水で3 回洗浄し、精製バクテリア・セルロースを得た。各処理における回収率、純度、着色度を表６に示す。
【００３２】
【表６】
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【００３３】
〔実施例３〕（バクテリア・セルロースの精製）
実施例２と同様な方法で得たアセトバクター・キシリナムの培養液を表７、８の条件（３−Ａ〜Ｉ）、（３’−Ａ〜Ｉ）で60℃、４時間処理し、同表に結果を併せて示した。
【００３４】
【表７】
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【００３５】
【表８】
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【００３６】
表７、８に示す各処理を行ったバクテリア・セルロースを遠心分離し、100ml の水で３回洗浄し、精製バクテリア・セルロースを得た。表７、処理区３−Ａ〜Ｃ、及び表８、処理区３’−Ａ〜Ｃはいずれも純度は99% 以上であった。一方、対照区（表７、処理区３−Ｄ〜Ｈ、及び表８、処理区３’−Ｄ〜Ｇ）及び無処理区（表７、処理区３−Ｉ、表８、処理区３’−Ｈ）は、70% 以下であった。
【００３７】
〔実施例４〕（酵母グルカンの精製）
グルコース50g/L 、硫安3g/L、酵母エキス2g/L、ペプトン2g/L、リン酸一カリウム10g/L 、硫酸マグネシウム2g/L、塩化カルシウム0.7g/Lよりなる培地を硫酸にてpH5.5 に調整後、1L容ガラスジャーファーメンターに300ml 加え、オートクレーブで120 ℃、20分間加熱殺菌した。放冷後、これにサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) IFO 555 を接種し、通気攪拌しながら30℃で30時間培養し、培養液を得た。培養液100ml にpHが12になる様に27%NaOH 水溶液を加え、70℃で4 時間処理したもの（４−Ａ）と、培養液100ml にpHが12になる様に27%NaOH 水溶液を加え、同時にH2O2を0.35 w/w% になる様に加えて70℃で4 時間処理したもの（４−Ｂ）についてそれぞれの培養液の粘度、残存する正常細胞数、着色度を観察した結果、粘度は４−Ａ：420cp 、４−Ｂ：95cp、正常細胞数は４−Ａ：2.6 ×107 個/ml 、４−Ｂ：1.2 ×105 個/ml 以下、着色度（430nm での吸光度) は４−Ａ：0.85、４−Ｂ：0.1 であった。
【００３８】
４−Ａ，Ｂ両処理法による処理物を100ml の水で6 回洗浄し、凍結乾燥して乾燥物をそれぞれ４−Ａ：0.5g、４−Ｂ：0.12g を得た。それぞれを2N硫酸で100 ℃、8 時間加水分解して遊離したグルコースをグルコースアナライザーで分析して酵母グルカンの純度を測定した結果、４−Ａ：48% 、４−Ｂ：85% であった。
【００３９】
〔実施例５〕（レンチナンの精製）
生しいたけ300gにpHが12になる様に27%NaOH 水溶液を加えた水溶液を60℃4 時間処理したもの（５−Ａ）と、pHが12になる様に27% NaOH水溶液を加えさらに0.35w/w%となる様にH2O2を加えた水溶液を60℃で4 時間処理したもの（５−Ｂ）について、それぞれ粘度、細胞の破壊状態、着色度について観察した結果、表９の通りであった。
【００４０】
【表９】
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【００４１】
*) 顕微鏡下で細胞形を観察し、細胞が全く変形していない場合を(-) 、10% 以内の変形を(+) 、10〜50% の変形を(++)、50% 以上の変形を(+++) で表示した。
これらを遠心分離して不溶物を回収し、水で6 回洗浄した後、凍結乾燥品を５−Ａ：1.8g、５−Ｂ：0.3gを得た。
これらを10mgずつとり、2ml の2N H2SO4中に均一の懸濁し、100 ℃で8 時間加水分解して遊離したグルコースをグルコースアナライザーで分析してレンチナンの純度を比較した結果、５−Ａ：32% 、５−Ｂ：80% であった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば、水不溶性グルカンを産生する微生物の培養液、又は水不溶性グルカンを構成成分とする微生物菌体含有溶液について、生産菌の細胞破壊、脱色及び粘度低下を同時に行うことができ、水不溶性グルカンを複雑な工程を経ることなく、工業的に安価で且つ効率的に精製することができる。