(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
0003687406.tif 000007
（式中、Ｘ1〜Ｘ3のうち、少なくとも１個はＯＲ基、少なくとも１個はクロル原子であり、そして他はヒドロキシ基でもよい。ただし、Ｒは不飽和結合を有していてもよい脂肪酸残基を意味する。）
で表される塩素化グリセリドに、その分解活性を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物またはその微生物培養物を作用させることを特徴とする該塩素化グリセリドを分解する方法。
【請求項２】
式（２）
【化２】
0003687406.tif 000008
(式中、Ｒは不飽和結合を有していてもよい炭素数８以上の長鎖脂肪酸残基を意味する。）
で表される塩素化グリセリドに、脂肪酸エステル分解活性とクロロプロパノール分解活性を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物またはその微生物培養物を作用させ分解する方法。
【請求項３】
式（３）
【化３】
0003687406.tif 000009
（式中、Ｒは不飽和結合を有していてもよい炭素数８以上の長鎖脂肪酸残基を意味する。）
で表される塩素化グリセリドに、脂肪酸エステル分解活性とクロロプロパノール分解活性を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物またはその微生物培養物を作用させ分解する方法。
【請求項４】
式（４）
【化４】
0003687406.tif 000010
（式中、Ｒは不飽和結合を有していてもよい炭素数８以上の長鎖脂肪酸残基を意味する。）
で表される塩素化グリセリドに、脂肪酸エステル分解活性とクロロプロパノール分解活性を有するシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物またはその微生物培養物を作用させ分解する方法。
【請求項５】
微生物がシュードモナス（Pseudomonas）sp.OS-K-29株（FERM BP-994）である請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は下記式（１）で表される塩素化グリセリドを簡便に分解する方法に関するものである。
【化５】
0003687406.tif 000002
（式中、Ｘ1〜Ｘ3は後掲と同じものを意味する。）
これらの塩素化グリセリドは、肉類、魚肉、大豆などの脂肪を含む食物を塩酸分解して各種のスープ、ペースト、醤油などを製造する際に副生するものであり、生体に好ましい影響を与えないと考えられている。
【０００２】
【従来の技術】
塩素化グリセリドの生成に関する報告はいくつかされている（Velisek, Janら Sb. Vys. Sk. Chem-Technol. Praze, Postraviny 1982, E53, 55-65；Velisek, Janら J. Agric. Food. Chem.,(1980), 28, 1142-1144）。また、植物蛋白質プロセス中にできるクロロヒドリン類の石灰による分解も報告されている（Hirsbrunner, Pierreら WO 97-15353）。
一方、クロロプロパノールに関する分解は、本発明者らによって報告されている(特公平 1-55879、Agric. Biol. Chem., 54, 3185-3190(1990)、 J. Mol. Catalysis B, Enzymatic 4 (1998) 237-252）。しかしながら、塩素化グリセリド分解、特にここで問題となるステアリン酸のような長鎖脂肪酸の塩素化グリセリドに関する分解例は報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
塩素化グリセリドは好ましくない物質であるにも拘わらず、その温和で簡便な分解あるいは除去方法が知られていないばかりか、生体への影響や環境汚染問題などからその除去の必要性が高まっている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは塩素化グリセリドにクロロプロパノール分解菌、例えばシュードモナス（Pseudomonas）sp. OS-K-29（FERM BP-994）を作用させ、その分解を試みた。
その結果、塩素化グリセリドは、脂肪酸エステル部分を加水分解しながら、クロロプロパノールと脂肪酸を与え、さらにクロロプロパノールは脱クロル化されることが判明し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は一般式（１）
【化６】
0003687406.tif 000003
（式中、Ｘ1〜Ｘ3のうち、少なくとも１個はＯＲ基、少なくとも１個はクロル原子であり、そして他はヒドロキシ基でもよい。ただし、Ｒは不飽和結合を有していてもよい脂肪酸残基を意味する。）
で表される塩素化グリセリドにその分解活性を有する微生物、その微生物培養物またはその微生物由来の酵素を作用させることを特徴とする該塩素化グリセリドを分解する方法に関する。
【０００６】
本発明は、さらに具体的には下記式（２）、（３）、（４）
【化７】
0003687406.tif 000004
【化８】
0003687406.tif 000005
【化９】
0003687406.tif 000006
（上記式中、Ｒは不飽和結合を有していてもよい脂肪酸残基を意味する。）
で表されるいずれかの塩素化グリセリドに脂肪酸分解活性とクロロプロパノール分解活性を有する微生物、その微生物培養物またはその微生物由来の酵素を作用させことを特徴とする該塩素化グリセリドを分解する方法に関する。
上記式中のＲで表される不飽和結合を有していてもよい脂肪酸残基は、炭素数２以上のものであり、好ましい具体例としてはパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸などの炭素数８以上の長鎖脂肪酸残基を挙げることができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は常法にしたがって実施される。すなわち、式（１）の塩素化グリセリドに、その分解活性を有する微生物、その微生物培養物またはその微生物由来の酵素をその酵素の至適ｐＨ溶液中で作用させればよい。
なお、反応が進行するに従い遊離する塩素イオンにより反応液のｐＨが徐々に低下するが、適当なアルカリ、例えば炭酸カルシウム溶液、水酸化ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、アンモニア水等通常、酸を中和させるためのものを利用して反応液のｐＨの範囲に保つのがよい。
本発明に使用される微生物としては、脂肪酸エステル分解活性と塩素化グリセリド（１）の塩素を分解あるいは脱離しうる活性、例えばクロロプロパノール分解活性を有するものであればよく、好ましくはシュードモナス属に属する菌株、殊にシュードモナス(Pseudomonas）sp.OS-K-29株（FERM BP-994）である。
【０００８】
本発明に係る微生物を培養するための培地組成としては、通常この微生物が生育する培地であれば、特に制限されない。例えば、炭素原としてグルコース、ガラクトース、シュークロース等の炭水化物、グリセロール、ラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール、ＲあるいはＳ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール、ラセミ体２，３−ジクロロ−１−プロパノール、Ｒ体２，３−ジクロロ−１−プロパノール等のアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸などの有機酸またはその塩、あるいはそれらの混合物を、窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩等の無機塩、さらに必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
【０００９】
また、高酵素活性を持った菌体を得るために、該菌株を培養する際に上記培地およびペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地にラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール、ＲもしくはＳ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオール、ラセミ体２，３−ジクロロ−１−プロパノールまたはＲ体２，３−ジクロロ−１−プロパノールを添加してもよい。ラセミ体２，３−ジクロロ−１−プロパノール、Ｒ体２，３−ジクロロ−１−プロパノールまたはラセミ体３−ハロゲノ−１，２−プロパンジオールを単一炭素源とする完全合成培地で培養するのも有効である。
【００１０】
本発明に係る微生物の培養も常法によればよく、例えば、ｐＨを６〜９、好ましくは６．５〜７．５、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃の範囲で好気的に１０〜９６時間行うことが好ましい。
本発明に係る微生物を塩素化グリセリドに作用させ分解するには、上記培養方法により得た微生物の１）培養液に基質を加え反応させるか、あるいは２）遠心分離等により得た菌体およびその菌体処理物（菌体破砕物または菌体抽出液）、または３）それらを常法により固定化したものを緩衝液等に混合し、これに基質を加え反応させればよい。
なお、本発明にはこの様な菌のみならず、それが産生する酵素を用いてもよい。
【００１１】
反応温度は１５〜５０℃が好ましく、反応ｐＨは６〜９で行なうのが好ましい。反応液中の基質濃度は０．１〜１５％(ｖ/ｖ)が好ましく、基質は初期に一括して加えてもよいし、分割添加してもよい。
反応は通常撹拌あるいは振盪しながら行い、反応時間は基質濃度、微生物菌体量などにより異なるが、好ましくはガスクロマトグラフィーあるいは塩素イオン分析等の分析により、残存基質量あるいは遊離させた塩素イオン濃度を測定しながら終点を決定するのがよい。
本発明は、塩素化グリセリドのバイオ分解の基本を示すものであり、本発明に係る微生物の脂肪酸エステル分解活性と脱クロル活性を利用して、実際的に食品分野を中心とするこの種の化合物の分解に利用できうるものである。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本願発明はこれらに限定して解釈されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１.
ポリペプトン1％w/v、酵母エキス1％w/v、グリセリン1％w/v 初発pH7.0からなる培地100mlを500ｍｌ容フラスコに入れ常法どおり、12１℃10分間 加圧蒸気滅菌したのち、シュードモナス（Pseudomonas）sp.OS-K-29株を28.7mg湿重菌体/ml植菌し、30℃、125回転で20時間振盪培養した。培養終了後、この培養液を遠心分離し、蒸留水で2回洗浄し、洗浄菌体とした。次いで、洗浄菌体は、0.5Ｍ燐酸バッファー（pH7.0）、100ml懸濁し、1-ステアロイルオキシ-2,3-ジクロロプロパン0.3gを加え、500ml容フラスコ中で４５℃、125回転で5時間振盪させた。  脱クロル活性は、塩素イオン計により測定した。その結果、1時間あたり22マイクロモルの塩素遊離を認めた。すなわち、5時間では、1-ステアロイルオキシ-2,3-ジクロロプロパンの7.2モル%が脱塩素化されたことを示した。
【００１３】
実施例２.
実施例１と同様にし、塩素化グリセリドを2-ステアロイルオキシ-1,3-ジクロロプロパンに変え脱クロル化活性を調べた。その結果、1時間あたり85マイクロモルの塩素遊離を認めた。
【００１４】
実施例３.
実施例１と同様にし、塩素化グリセリドを1-ステアロイルオキシ-3-クロロ-2-プロパノールに変え脱クロル化活性を調べた。その結果、1時間あたり3マイクロモルの塩素遊離を認めた。
【００１５】
実施例４.
実施例１と同様にし、塩素化グリセリドを1-ブチリルオキシ-2,3-ジクロロプロパンに変え脱クロル化活性を調べた。その結果、1時間あたり198マイクロモルの塩素遊離を認めた。
実施例５.
実施例１と同様にし、塩素化グリセリドを1-オレオイルオキシ-2,3-ジクロロプロパンに変え脱クロル化活性を調べた。その結果、1時間あたり17マイクロモルの塩素遊離を認めた。
【００１６】
実施例６.
実施例１と同様にし、塩素化グリセリドを2-オレオイルオキシ-1,3-ジクロロプロパンに変え脱クロル化活性を調べた。その結果、1時間あたり31マイクロモルの塩素遊離を認めた。
【００１７】
【発明の効果】
本発明を実施することにより簡単に塩素化グリセリドを分解することができ極めて有益である。