(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源、窒素源及び無機塩を含む液体培地に、トリコデルマ属に属する微生物を接種し、培養してトリコデルマ属微生物胞子を製造する方法において、炭素源としてデンプンを、窒素源として可溶性タンパク質を用い、培地のｐＨを６未満にならないように調整しながら、温度１０〜４５℃において培養したのち、培地から生成した胞子を分離、回収することを特徴とする耐熱性を有するトリコデルマ属微生物胞子の製造方法。
【請求項２】
可溶性タンパク質が大豆由来のものである請求項１記載のトリコデルマ属微生物胞子の製造方法。
【請求項３】
液体培地が、無機塩としてリン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸第一鉄を含む請求項１又は２記載のトリコデルマ属微生物胞子の製造方法。
【請求項４】
トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）である請求項１ないし３のいずれかに記載のトリコデルマ属微生物胞子の製造方法。
【請求項５】
トリコデルマ・アトロビリデが、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−２又はトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−３である請求項４記載のトリコデルマ属微生物胞子の製造方法。
【請求項６】
発酵槽中で培養する請求項１ないし５のいずれかに記載のトリコデルマ属微生物胞子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性を有するトリコデルマ属微生物胞子の製造方法、特に発酵槽のような大きな体積の装置を用いて大量生産可能な耐熱性を有するトリコデルマ属微生物胞子の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トリコデルマ属に属する微生物は、作物に病害をもたらす糸状菌類に有効な抗菌性物質又は細胞壁溶解酵素を分泌することから、微生物農薬として使用されている。
そして、このトリコデルマ属微生物を用いた病害防除用微生物農薬は、一般に固体培地による静置培養で製造された胞子を有機基材又は無機基材あるいはその両方に担持させて製剤されているが、この固体培養は、胞子を均一な培養物として得ることがむずかしい上に、雑菌が混入しやすく、しかも大規模な設備を必要とするため、工業的に大量生産する方法としては不適当である。
【０００３】
このような固体培養のもつ欠点を克服するために、液体培地とタンク培養とを組み合わせたトリコデルマ属微生物の培養方法が提案されている（米国特許第４，３２１，３２７号明細書）。
【０００４】
しかしながら、この方法は、炭素源として、ポテトデキストロースを用いる上に、抗菌性物質のクロラムフェニコールを培地に添加する必要があるため、コスト高になるのを免れず、また抗菌性物質使用による環境への負荷を生じるという問題を生じる。
【０００５】
他方、トリコデルマ属に属する微生物の安定性に関しては、培地のＣＮ比を調整することにより、トリコデルマ・ハルジアナムの胞子の保存性が改良しうること［「ワールド・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，第１３巻，第２２５〜２３２ページ（１９９７年）］や、培養時間を延長することによって、トリコデルマ・ハルジアナムの胞子に耐乾燥性が付与されること［「バイオロジカル・コントロール（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）」，第７巻，第２６７〜２７４ページ（１９９６）］などが報告されているが、耐熱性の胞子を大量に生産する方法は、現在まで知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、熱に対して安定なトリコデルマ属に属する微生物胞子を、大量かつ安価に生産しうる工業的に実施可能な製造方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、トリコデルマ属に属する微生物を、特定の炭素源と特定の窒素源を無機塩とともに含む液体培地を用い、所定のｐＨ及び温度条件下において培養することにより、その目的を達成しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、炭素源、窒素源及び無機塩を含む液体培地に、トリコデルマ属に属する微生物を接種し、培養してトリコデルマ属微生物胞子を製造する方法において、炭素源としてデンプンを、窒素源として可溶性タンパク質を用い、培地のｐＨを６未満にならないように調整しながら、温度１０〜４５℃において培養したのち、培地から生成した胞子を分離、回収することを特徴とする耐熱性を有するトリコデルマ属微生物胞子の製造方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法において用いることができるトリコデルマ属に属する微生物としては、特に限定はなく、例えばトリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ポリスポラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）などを挙げることができる。
【００１０】
これらの中で、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハマタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）が好ましいが、特にトリコデルマ・アトロビリデ、具体的にはトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−２、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−３が好適である。
【００１１】
本発明方法においては、前記トリコデルマ属に属する微生物の培養を、炭素源としてデンプンを、また窒素源として可溶性タンパク質を用いた液体培地で行うことが必要である。
このデンプンの種類については特に制限はなく、例えばトウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、小麦デンプン、タピオカデンプンなど、いずれも用いることができるが、操作性を考慮すると、可溶性の馬鈴薯デンプンが好適である。
また、可溶性タンパク質としては、特に大豆由来のものが好ましい。この大豆由来の可溶性タンパク質は、公知方法（例えば特開平７−２６４９９３号公報参照）により製造することができ、既に「ハイニュートＳＭＰ」や「ハイニュートＳＭＳ」［それぞれ不二製油（株）製，商品名］などとして市販されている。
一方、これらの炭素源及び窒素源とともに用いる無機塩としては、炭酸やリン酸の塩類、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムなどの金属塩があるが、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸第一鉄の組合せが好適である。
【００１２】
本発明方法においては、培養は、一般に実験室で使用している坂口フラスコや三角フラスコと振とう機を用いる振とう培養や、ジャーあるいはタンクなどの発酵槽による培養のいずれでもよいが、特にｐＨの調整が容易なジャー及びタンクなどの発酵槽による培養が好ましい。
【００１３】
本発明方法においては、まず、前記のデンプン、可溶性タンパク質及び無機塩を含む液体培地に、トリコデルマ属に属する微生物を接種し、培地のｐＨが６未満にならないように調整しながら、１０〜４５℃の範囲の温度において培養する。
この際、これまでの方法では、一般的に最初のｐＨを５〜７に調整して培養を開始させる。そして、培養が進行するに伴い、ｐＨは酸性側に移行するが、特にｐＨ調整をしないで、そのまま培養を進めるのが普通である。これに対し、本発明方法においては、培養中の培地のｐＨを６未満にならないように、好ましくは６〜９の範囲、より好ましくは６〜７の範囲、最も好ましくは６〜６．５の範囲に調整して培養を進める。培養温度は１０〜４５℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲で選ばれる。また、培養期間は２〜２０日程度、好ましくは３〜１５日、特に好ましくは４〜１０日である。
【００１４】
培地のｐＨを６未満にならないように調整するには、ｐＨメーターで培養期間中の培地のｐＨをモニターし、適時アルカリを添加して行うことができる。連続的にｐＨをモニターできない場合には、一定間隔でｐＨを測定し、ｐＨが６未満になったならば、アルカリを添加してｐＨ６以上に調整する。ｐＨの調整に使用するアルカリは、水溶液中でアルカリ性を呈する物質であればよく、特に制限はなく、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水などが使用できる。なお、培養終了後は後続処理の便宜上、ｐＨを調整してもよいが、特に調整の必要はない。
【００１５】
ここで、本発明方法の具体的な培養例においては、まずオートクレーブなどにおいて滅菌された３質量％デンプン、０．３質量％ハイニュートＳＭＰ、０．１質量％リン酸二水素カリウム、０．０５質量％硫酸マグネシウム、０．０５質量％塩化カリウム、０．００１質量％硫酸第一鉄を含む液体培地でトリコデルマ属微生物を液体培養し、これを前培養物とする。
【００１６】
次いで、得られた前培養物をｐＨを６に調整した３質量％デンプン、０．３質量％ハイニュートＳＭＰ、０．１質量％リン酸二水素カリウム、０．０５質量％硫酸マグネシウム、０．０５質量％塩化カリウム、０．００１質量％硫酸第一鉄、０．１質量％プロナールを含む液体培地を仕込んだジャーファーメンター又はタンクに植菌し、２７℃で通気及び撹拌しながら７日間培養する。
【００１７】
このようにして得られたトリコデルマ属微生物の培養物は、十分量の胞子を含んでおり、公知の方法、例えば遠心分離あるいはろ過などの操作により、胞子を分離、回収することにより、目的の耐熱性を有するトリコデルマ属微生物胞子が得られる。
該胞子は、微生物資材あるいは微生物農薬などとして使用することができる。
【００１８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
なお、実施例及び比較例で使用するトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−２及びトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−３は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６５１０、ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５１１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０２１として寄託されている。
【００１９】
実施例１
デンプン３６ｇ、ハイニュートＳＭＰ３．６ｇ、リン酸二水素カリウム１．２ｇ、硫酸マグネシウム０．６ｇ、塩化カリウム０．６ｇ、硫酸第一鉄０．０１２ｇを１．２リットルの蒸留水に溶解し、５００ｍｌ容の三角フラスコ１２本に１００ｍｌずつ分注後、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。滅菌後冷却した上記培地を含む三角フラスコにトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１株を植菌し、２７℃で５日間振とうして前培養を行った。
【００２０】
デンプン３．６ｋｇ、ハイニュートＳＭＰ３６０ｇ、リン酸二水素カリウム１２０ｇ、硫酸マグネシウム６０ｇ、塩化カリウム６０ｇ、硫酸第一鉄１．２ｇ、プロナール１２０ｇを１２０リットルの水道水を入れた２００リットルタンクに加え、緩やかに撹拌しながら、蒸気滅菌を行った。冷却後、培地のｐＨを１０質量％アンモニア水で６に調整し、三角フラスコ１２本分の前培養液を植菌口より投入して培養を開始した。培養条件は、温度２７℃、撹拌２２５ｒｐｍ、通気ＶＶＭ＝１で行った。培養期間中、培養液のｐＨをｐＨメーターでモニターし、ｐＨが６未満となった場合に、１０質量％アンモニア水を注入してｐＨを調整した。このようにして、７日間培養を行った。
【００２１】
実施例２
実施例１と同様の方法により、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−２株の培養を行った。
【００２２】
実施例３
実施例１と同様の方法により、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−３株の培養を行った。
【００２３】
比較例１
市販のポテトデキストロース培地（ディフコ社製）２８．８ｇを１．２リットルの蒸留水に溶解し、５００ｍｌ容の三角フラスコ１２本に１００ｍｌずつ分注後、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。滅菌後、冷却した上記培地を含む三角フラスコにトリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−１株を植菌し、２７℃で５日間振とうして前培養を行った。
【００２４】
市販のポテトデキストロース培地（ディフコ社製）２．８８ｋｇとプロナール１２０ｇ及び水道水１２０リットルを２００リットルタンクに入れ、緩やかに撹拌しながら蒸気滅菌を行った。冷却後、三角フラスコ１２本分の前培養液を植菌して培養を開始した。温度２７℃、撹拌２２５ｒｐｍ、通気ＶＶＭ＝１で、７日間培養を行った。
【００２５】
比較例２
比較例１と同様の方法により、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−２株の培養を行った。
【００２６】
比較例３
比較例１と同様の方法により、トリコデルマ・アトロビリデＳＫＴ−３株の培養を行った。
実施例１〜３及び比較例１〜３で培地に生産された胞子数を希釈平板法で得られたコロニー形成数（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ，ｃｆｕ）で求め、その結果を表１に示す。なお、希釈平板法でｃｆｕを求める方法は次のように行った。
１質量％グルコース、０．５質量％ペプトン、０．１質量％リン酸二水素カリウム、０．０５質量％硫酸マグネシウム、０．０５質量％デオキシコール酸ナトリウム、０．００３質量％ローズベンガル、２質量％寒天を含むｐＨ６．８の寒天培地が入ったシャーレに滅菌水で順次希釈した被検液を均一に塗布し、２７℃で２日間培養を行った。２日後に形成されるコロニー数を計測してｃｆｕを求めた。
【００２７】
【表１】
0003610006.tif 000002
【００２８】
試験例１
耐熱性について調べるために、５０℃で処理し、処理後の生存菌数をｃｆｕで求めた。ここにいう耐熱性とは、５０℃で処理した場合に、一般的な糸状菌用の培地であるポテトデキストロース液体培地で培養した胞子と比較して、生存率（処理後の生存菌数／処理前の生存菌数）×１００が２．５倍以上の値を示すことを意味する。
【００２９】
実施例１〜３及び比較例１〜３で得られた培養液を、菌糸を除去するためにガーゼでろ過後、遠心分離処理し、胞子を集めた。集めた胞子を蒸留水で洗浄後、胞子濃度が２×１０６／ｍ１となるように滅菌水に懸濁した。胞子懸濁液を５０℃の湯浴に保持し、２０分及び４０分後に液をサンプリングして加熱処理した胞子懸濁液のｃｆｕを求めた。その結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
0003610006.tif 000003
【００３１】
【発明の効果】
本発明方法によれば、微生物農薬などとして有用な耐熱性を有するトリコデルマ属徴生物の胞子を大量かつ安価に生産することができる。