(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリヒア属に属する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼであって、下記の変異から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除された、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ断片が染色体ＤＮＡ内に組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属またはコリネホルム細菌に属する微生物を好適な培地で培養し、この培地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンから選ばれるアミノ酸を分離することを特徴とするアミノ酸の製造方法；
（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から６２５番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、
（ｉｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から２２２番目のアルギニンをヒスチジンに、２２３番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
（ｉｉｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から２８８番目のセリンをフェニルアラニンに、２８９番目のグルタミン酸をリジンに、５５１番目のメチオニンをイソロイシンに、８０４番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
（ｉｖ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から８６７番目のアラニンをスレオニンに置換させる変異。
【請求項２】
エシェリヒア属に属する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼであって、下記の変異から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除された、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ断片とエシェリヒア属細菌またはコリネホルム細菌の細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡで形質転換されたエシェリヒア属またはコリネホルム細菌に属する微生物を好適な培地で培養し、この培地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンから選ばれるアミノ酸を分離することを特徴とするアミノ酸の製造方法；
（ｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から６２５番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、
（ｉｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から２２２番目のアルギニンをヒスチジンに、２２３番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
（ｉｉｉ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から２８８番目のセリンをフェニルアラニンに、２８９番目のグルタミン酸をリジンに、５５１番目のメチオニンをイソロイシンに、８０４番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
（ｉｖ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から８６７番目のアラニンをスレオニンに置換させる変異。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、それをコードする遺伝子及びアミノ酸の製造法に関し、詳しくは、アスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する遺伝子とその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大部分の細菌や全ての植物に見いだされる酵素である。本酵素の役割は、アスパラギン酸やグルタミン酸の生合成および、クエン酸サイクルに回転維持のためにＣ４ジカルボン酸を供給することにある。しかし、微生物を用いたアミノ酸の発酵生産において本酵素が及ぼす影響を示した報告は少なく、その重要性は明らかではない（Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455-463 (1988)、Josef, Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (1991)、Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274 (1993)）。
【０００３】
ところで、アミノ酸はタンパクの成分として細胞に普遍的に存在する化合物であるが、経済的なエネルギー代謝及び物質代謝のために、その生産は厳密に制御されている。この制御は、主としてフィードバック制御、すなわち代謝経路の下流における産物が上流の反応を触媒する酵素の活性を阻害することによる制御であり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼも、活性発現に様々な調節を受けている。
【０００４】
例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼでは、アスパラギン酸によって活性が阻害される。
【０００５】
従来、アミノ酸醗酵においては効率的な生産のために種々の技術が開発され、フィードバック制御に非感受性になった変異株を使用したロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン等の醗酵生産が行われている。しかしながら、アスパラギン酸による阻害に非感受性になったホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ変異酵素や、これをアスパラギン酸族やグルタミン酸族のアミノ酸の醗酵生産に利用するという試みは知られていない。
【０００６】
一方、大腸菌（エシェリヒア・コリ：Escherichia  coli）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子である ppc 遺伝子はすでにクローニングされ、塩基配列も決定されている（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(1984)）が、同酵素においてもアスパラギン酸による阻害が解除された変異体の報告はない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が実質的に解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びその遺伝子及びその利用法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの特定の部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、アスパラギン酸による阻害が実質的に解除されることを見いだし、そのような変異酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本願発明は、エシェリヒア属に属する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有することを特徴とする変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びこの変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列である。
【００１０】
本発明はさらに、このＤＮＡ断片を保持するエシェリヒア属又はコリネホルム細菌に属する微生物、及びこれらの微生物を好適な培地で培養し、この培地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンから選ばれるアミノ酸を分離することを特徴とするアミノ酸の製造方法を提供する。
【００１１】
尚、本明細書において、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列あるいはこれにプロモーターを含むＤＮＡ配列を、単に「本発明のＤＮＡ配列」、「変異遺伝子」あるいはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子ということがある。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、単に「変異型酵素」ともいう）は、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有するものである。
【００１４】
このような変異としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を失わないまま、上記フィードバック阻害を実質的に解除するものであればどのようなものでもよいが、例えば、その変異を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをエシェリヒア属に属する微生物の細胞内に存在させたときに、下記性質を有する化合物に対する耐性を細胞に付与する変異が挙げられる；
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを産生するエシェリヒア属に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、
前記生育阻害作用はＬ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸の存在によって回復され、かつ、
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
【００１５】
さらに具体的には、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から
▲１▼６２５番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、
▲２▼２２２番目のアルギニンをヒスチジンに、２２３番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
▲３▼２８８番目のセリンをフェニルアラニンに、２８９番目のグルタミン酸をリジンに、５５１番目のメチオニンをイソロイシンに、８０４番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
▲４▼８６７番目のアラニンをスレオニンに置換させる変異、
が挙げられる。
【００１６】
尚、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとして、大腸菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子から推定されるアミノ酸配列（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(1984)）を、配列表配列番号１に示す。
【００１７】
上記変異型酵素は、下記の本発明のＤＮＡ配列によってコードされ、このＤＮＡ配列を大腸菌等で発現させることにより生産される。
【００１８】
＜２＞本発明のＤＮＡ配列及びそれを保持する微生物
一方、本発明のＤＮＡ配列は、上記変異型酵素をコードするＤＮＡ配列であり、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ断片において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する。
【００１９】
具体的には、上記▲１▼〜▲４▼の変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、例えば、配列表配列番号１の塩基配列において、
ｉ） 塩基番号２１１１〜２１１３のＧＡＡが、ＡＡＡまたはＡＡＧに変換する変異、
ii） 塩基番号９０２〜９０４のＣＧＣがＣＡＴまたはＣＡＣに、及び９０５〜９０７のＧＡＡがＡＡＡまたはＡＡＧに各々変換する変異、
iii）塩基番号１１００〜１１０２のＴＣＴがＴＴＴまたはＴＴＣに、１１０３〜１１０５のＧＡＡがＡＡＡまたはＡＡＧに、１８８９〜１８９１のＡＴＧがＡＴＴ、ＡＴＣまたはＡＴＡに、及び２６４８〜２６５０のＧＡＡがＡＡＡまたはＡＡＧに各々変換する変異
iv） ２８３７〜２８３９のＧＣＧがＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧのいずれかに変換する変異
のいずれかを有するＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２０】
このような変異型遺伝子は、野生型酵素遺伝子あるいは他の変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と宿主に適合するベクターＤＮＡとを連結して得られる組換えＤＮＡを変異処理し、この組換えＤＮＡによる形質転換体からスクリーニングすることにより得られる。あるいは、野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子をスクリーニングしてもよい。組換えＤＮＡの変異処理には、ヒドロキシルアミン等が使用される。また、微生物自体を変異処理する場合は、通常人工突然変異に用いられている薬剤あるは方法を用いればよい。
【００２１】
上記野生型酵素遺伝子あるいは他の変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子であれば、いかなるものでもよく、塩基配列が決定されておりクローン化されていることが好ましい。クローン化されていない場合には、ＰＣＲ法等を用いて該遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅単離した後、適当なベクターを用いてクローン化することができる。
【００２２】
上記のような遺伝子として、例えば、すでにクローニングされ塩基配列も決定されている、大腸菌の遺伝子（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki, H. J.Biochem.95,909-916(1984)）が挙げられる。この遺伝子のコーディング領域の配列は、配列表の配列番号１に示したとおりである（塩基番号２３９〜２８９０）。
【００２３】
変異遺伝子を有する宿主のスクリーニングは、アスパラギン酸のアナログ化合物を用いて行うことができる。アナログ化合物としては、次の性質を有していることが好ましい。すなわち、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産するエシェリヒア属に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、前記生育阻害作用はＬ−グルタミン酸又はＬ−アスパラギン酸の存在によって回復され、かつ、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
【００２４】
上記のようなアナログ化合物を、野生型酵素を生産するエシェリヒア属に属する微生物、例えばエシェリヒア・コリＨＢ１０１の生育の阻害を指標として選択し、そのアナログ化合物に耐性な変異株をスクリーニングすれば、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する宿主が得られる可能性が高い。
【００２５】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤の一般的な構造として、Ｃ４ジカルボン酸構造をとることが必須であると提唱されている。このような観点から、本発明者は種々の化合物をスクリーニングした。エシェリヒア・コリＨＢ１０１をＬＢ培地で前培養し、DL-2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、ブロモコハク酸メソ-2,3-ジブロモコハク酸、2,2-ジフルオロコハク酸、3-ブロモピルビン酸、α-ケト酪酸、α-ケトアジピン酸、DL-スレオ-β-ヒドロキシアスパラギン酸、L-アスパラギン酸-β-メチルエステル、α-メチル-DL-アスパラギン酸、2,3-ジアミノコハク酸又はアスパラギン酸-β-ヒドラジドを含むＭ９培地（チアミン ２０μｇ／ｍｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ各３μｇ／ｍｌ含む）で本培養し、経時的に６６０ｎｍで吸光度を測定することにより、生育を調べた。
【００２６】
さらに、それらの化合物が生育阻止濃度で存在するときに、核酸（ウリジン、アデノシン各１０ｍｇ／ｄｌ）、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族のアミノ酸（Asp 0.025%、Met、Thr、Lys各0.1％)の添加により阻害が回復するか否かを調べた。
【００２７】
その結果、３種の化合物、３−ブロモピルビン酸（３ＢＰ）（化１）、アスパラギン酸−β−ヒドラジド（ＡＨＹ）（化２）、ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸（βＨＡ）（化３）を選択した。
【００２８】
【化１】
0003680324.tif 000002
【００２９】
【化２】
0003680324.tif 000003
【００３０】
【化３】
0003680324.tif 000004
【００３１】
これらのアナログ化合物による大腸菌の生育阻害を図１〜３に示す。さらに、上記阻害回復物質を単独で、あるいは２種類もしくは３種類の混合物として加えたときの、大腸菌の生育回復を図４〜６に示す。また、対照として、阻害物質非存在下で阻害回復物質を添加したときの生育を図７に示す。尚、図４〜７中、添加物１、２、３は、各々核酸、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族のアミノ酸を示す。
【００３２】
さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼに対するアナログ化合物による活性阻害を調べた。Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)に記載の方法に準じて、酵素活性を測定した。
【００３３】
ＬＢ培地で培養したエシェリヒア・コリＨＢ１０１を破砕し、懸濁液を遠心分離して上清を粗酵素液とした。酵素活性の測定は、２ｍＭホスホエノールピルビン酸カリウム、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１Ｍ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、１．５Ｕマレートデヒドロゲナーゼ、及び粗酵素を含む測定系中に、活性に影響する事が知られているアセチルコエンザイムＡを０．１ｍＭの濃度で存在させて、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。結果を図８に示す。
【００３４】
以上の結果から、上記の３種のアナログ化合物は、大腸菌の生育を阻害し、核酸単独ではこの阻害を回復できないが、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸族アミノ酸の添加により阻害を回復できることが明らかである。したがって、これらのアナログ化合物はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの選択的な阻害剤であると推定された。本発明において、後記実施例に示したように、これら３種の化合物を用いて変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する大腸菌を選択することに成功している。
【００３５】
上記化合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する形質転換体をスクリーニングし、組換えＤＮＡを回収すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。また、微生物自体を変異処理した場合には、上記化合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する変異株をスクリーニングし、該株より目的とする変異型酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、適当なベクターに連結すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。
【００３６】
このようにして変異が導入されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ断片を、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることによって、変異型酵素を生産させることができる。また、本発明のＤＮＡ断片を、宿主染色体ＤＮＡ内に組み込むことにより形質転換しても、目的の変異型酵素を産生できる。
【００３７】
宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物、例えば、大腸菌、コリネホルム細菌等が挙げられる。コリネホルム細菌は、コリネバクテリウム属細菌、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。尚、アミノ酸製造に好適な宿主については、後述する。
【００３８】
一方、ベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましい。宿主が大腸菌の場合には、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００３９】
また、宿主がコリネホルム細菌の場合に使用できるベクター及びそれを保持する宿主を以下に例示する。尚、かっこ内に国際寄託機関の寄託番号を示した。
【００４０】
0003680324.tif 000005
【００４１】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００４２】
本発明のＤＮＡ配列を上記ベクターに挿入して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するには、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を高める方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)）等、通常大腸菌の形質転換に用いられる方法を用いることができる。
【００４３】
また、コリネホルム細菌の形質転換法としては、上記の細胞を塩化カルシウムで処理する方法、または細胞がＤＮＡを取込可能な特定の成長時期に取り込む方法（Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチリスに関する報告）がある。さらに、プラチミドＤＮＡを容易に取り込むＤＮＡ受容体のプロトプラストまたはスフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブチリス、アクチノマイセス及び酵母について知られている（Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979)、Bibb et al., Nature, 274, 398, (1978)、Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）。 その他、特開平２−２０７７９１号公報にコリネホルム細菌の形質転換法が開示されている。
【００４４】
本発明のＤＮＡ配列を上記宿主内で発現させるには、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で効率よく働くプロモーターを用いてもよく、本発明のＤＮＡ配列がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを含んでいる場合は、これをそのまま用いてもよい。また、コリネホルム細菌を宿主とする場合は、公知のブレビバクテリウム属細菌由来のｔｒｐプロモーター（特開昭６２−２４４３８２号公報）等を使用することもできる。
【００４５】
また、上記のように、本発明のＤＮＡ配列を自立複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドとして宿主に保持させてもよいが、本発明のＤＮＡ配列を、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972)）を用いた方法で微生物の染色体に組み込んでもよい。また、コリネホルム細菌の染色体に本発明のＤＮＡを組み込むには、特開平５−７４９１号公報に開示される温度感受性プラスミドが利用できる。
【００４６】
上記のようにして本発明のＤＮＡ配列で形質転換された微生物を培養し、このＤＮＡ配列を発現させると、変異型酵素が得られる。このようにして得られた変異型酵素が、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除されているかどうかは、酵素反応系にアスパラギン酸を添加して活性を測定することにより、明かとなる。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡ配列は、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除された変異酵素をコードしているので、このＤＮＡ配列を有する微生物を、以下に示すように、アスパラギン酸族やグルタミン酸族のアミノ酸の効率的な醗酵生産に利用することができる。
【００４８】
後記実施例で得られた変異型酵素遺伝子を保持するエシェリヒア・コリＡＪ  １２９０７、ＡＪ  １２９０８、ＡＪ  １２９０９、ＡＪ  １２９１０は、平成５年８月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７７として寄託されており、平成６年７月１１日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されている。
【００４９】
＜３＞アミノ酸の製造方法
本発明のＤＮＡ配列を保持する微生物を好適な培地で培養し、生じたアミノ酸を分離することにより、アミノ酸を製造することができる。このようなアミノ酸として、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンが挙げられる。
【００５０】
以下に、本発明のＤＮＡ配列を導入し各アミノ酸の製造に使用するのに好適な宿主及び培養法を例示する。
【００５１】
（１）本発明のアミノ酸の製造方法に好適な宿主
(i)Ｌ−リジン製造に好適な宿主
本発明によるＬ−リジン製造に用いる宿主として、エシェリヒア属細菌、好ましくはＬ−リジン生産性の大腸菌が挙げられる。具体的には、リジンアナログに耐性を有する変異株が例示できる。このリジンアナログは、エシェリヒア属の微生物の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的に解除されるようなものである。例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ Ｐ−５０８４として寄託されている。特開昭５６−１８５９６号公報第４７１頁左下欄参照）が挙げられる。
【００５２】
一方、コリネホルム細菌の種々の人工変異株が、Ｌ−リジン生産菌として用いられており、これらを本発明に使用することができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。ＡＥＣ耐性変異株、その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号，特公昭５６−６４９９号），ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン，Ｌ−プロリン，Ｌ−セリン，Ｌ−アルギニン，Ｌ−アラニン，Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号），ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム，α−アミノ−ラウリルラクタム，キノイド，Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株，オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラ−ゼ）または呼吸系酵素の阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号，特開昭５０−３１０９３号，特開昭５２−１０２４９８号，特開昭５３−８６０８９号，特開昭５５−９７８３号，特開昭５５−９７５９号，特開昭５６−３２９９５号，特開昭５６−３９７７８号，特公昭５３−４３５９１号，特公昭５３−１８３３号），イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号，特開昭５６−８６９２号），フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号，特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許出願第３３３４５５号参照）。
【００５３】
リジン製造に用いる具体的なコリネホルム細菌としては、次のものが挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12031 (FERM BP-277) 特開昭60-62994号公報第525頁左下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC39134 特開昭60-62994号公報第473頁右下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463 (FERM P-1987) 特公昭51-34477号公報参照
また、以下に示すコリネホルム細菌の野生株も同様に本発明に使用することができる。
【００５４】
0003680324.tif 000006
【００５５】
(ii)Ｌ−スレオニン製造に好適な宿主
エシェリヒア・コリ B-3996   (RIA 1867)     特表平3-501682号公報参照
エシェリヒア・コリ AJ 12349 (FERM P-9574)  特開平2-458号公報第887頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12351 (FERM P-9576)  特開平2-458号公報第887頁右下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12352 (FERM P-9577)  特開平2-458号公報第888頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11332 (FERM P-4898)  特開平2-458号公報第889頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12350 (FERM P-9575)  特開平2-458号公報第889頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12353 (FERM P-9578)  特開平2-458号公報第889頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12358 (FERM P-9764)  特開平2-458号公報第890頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12359 (FERM P-9765)  特開平2-458号公報第890頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11334 (FERM P-4900)  特公平1-29559号公報第201頁６欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11333 (FERM P-4899)  特公平1-29559号公報第201頁６欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11335 (FERM P-4901)  特公平1-29559号公報第202頁７欄参照
【００５６】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11188 (FERM P-4190) 特開昭60-87788号公報第473頁右上欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11682 (FERM BP-118) 特公平2-31956号公報第230頁８欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11683 (FERM BP-119) 特公平2-31956号公報第231頁10欄参照
【００５７】
(iii)Ｌ−メチオニン製造に好適な宿主
Ｌ−メチオニン製造には、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11457 (FERM P-5175)  特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11458 (FERM P-5176)  特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11459 (FERM P-5177)  特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11539 (FERM P-5479)  特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11540 (FERM P-5480)  特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11541 (FERM P-5481)  特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11542 (FERM P-5482)  特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
【００５８】
(iv)Ｌ−アスパラギン酸製造に好適な宿主
Ｌ−アスパラギン酸製造には以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 3859 (FERM P-2799) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3860 (FERM P-2800) 特開昭51-61689号公報第524頁 左上欄参照
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ 3877 (FERM P-2803) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 3876 (FERM P-2802) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
【００５９】
(v)Ｌ−イソロイシン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ KX141 (VKPM-B4781)（特開平4-330275号公報４５段落参照）が、コリネホルム細菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12404 (FERM P-10141)（特開平2-42988号公報第603頁左下欄参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ 12405 (FERM P-10142)（特開平2-42988号公報第524頁左下欄参照）が挙げられる。
【００６０】
(vi)Ｌ−グルタミン酸製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 12628 (FERM P-12380) '93年フランス特許公開No. 2 680 178号参照
エシェリヒア・コリ AJ 12624 (FERM P-12379) '93年フランス特許公開No. 2 680 178号参照
【００６１】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12745 (FERM BP-2922) 特開平3-49690号公報第561頁右下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12746 (FERM BP-2923) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12747 (FERM BP-2924) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12748 (FERM BP-2925) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21492 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
【００６２】
(vii)Ｌ−アルギニン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11593 (FERM P-5616) 特開昭57-5693号公報第468頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11594 (FERM P-5617) 特開昭57-5693号公報第468頁右上欄参照
【００６３】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 12144 (FERM P-7642) 特公平5-27388号公報第174頁４欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 12145 (FERM P-7643) 特公平5-27388号公報第174頁４欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 21493 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21659 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
【００６４】
(viii)Ｌ−プロリン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11543 (FERM P-5483) 特開昭56-144093号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11544 (FERM P-5484) 特開昭56-144093号公報第435頁左下欄参照
【００６５】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11225 (FERM P-4370) 特開昭60-87788号公報第473頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11512 (FERM P-5332) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11513 (FERM P-5333) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11514 (FERM P-5334) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11522 (FERM P-5342) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11523 (FERM P-5343) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
【００６６】
（２）培養法
上記宿主を培養する方法は、従来のアミノ酸生産菌の培養方法と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである。
【００６７】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。尚、アミノ酸等の栄養要求性変異株を宿主に使用する場合は、その株が要求するアミノ酸等の栄養素を培地に適宜加える必要がある。以下に、アミノ酸製造に用いる培地として、リジン製造用の培地の一例を表１に示す。尚、炭酸カルシウムは別個に殺菌後、他成分に添加する。
【００６８】
【表１】
0003680324.tif 000007
【００６９】
培養は、好気的条件下で培地のｐＨ及び温度を適宜調節しつつ、実質的にアミノ酸の生成蓄積が停止するまで行われる。こうして培養液中に蓄積されたアミノ酸を採取するには、通常の方法を適用できる。
【００７０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【００７１】
【実施例１】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の取得
すでにクローニングされ、塩基配列も決定されているホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をベクタープラスミドｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位に挿入して得られたプラスミドｐＳ２を用いて、変異型遺伝子の作製を行った。ｐＳ２は、薬剤耐性マーカー遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子を有する（Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984）。
【００７２】
ｐＳ２ＤＮＡを、ヒドロキシルアミン処理溶液（２０μｇ／ｍｌ ｐＳ２ＤＮＡ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４Ｍヒドロキシルアミン）で、７５℃、２時間処理した。ヒドロキシルアミン処理は、ｐＨの影響を受けるので、水酸化ナトリウムでｐＨを６．０に調整した１Ｍヒドロキシルアミン・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８０μｌと、０．１Ｍ リン酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１００μｌと、２μｇのｐＳ２ＤＮＡを含むＴＥ（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）緩衝液とを混合し、最終的に水で２００μｌとした。
【００７３】
上記条件は、処理後のｐＳ２でエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換したときに、アンピシリン含有培地での形質転換体の生存率が処理前の０．２％となる条件である。
【００７４】
ヒドロキシルアミン処理したｐＳ２でエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリンを含む平板培地に塗布し、約１００００コロニーの形質転換体を得た。これらを液体培地に懸濁し、アスパラギン酸のアナログ化合物である３−ブロモピルビン酸（３ＢＰ）、アスパラギン酸−β−ヒドラジド（ＡＨＹ）、ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸（βＨＡ）のいずれかを最小阻止濃度付近の濃度で含む平板培地に、培地１枚あたり１０3〜１０5個となるように塗布し、生育するコロニーを選択した。
【００７５】
こうして得られたアナログ化合物耐性株１００株から、The Journal of Biochemistry, Vol.67, No.4, 1970に記載の方法に準じて、各々の生産するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを粗精製し、アナログ化合物による活性阻害を調べた。酵素活性の測定は、前記と同様にして行った。
【００７６】
さらに、アナログ化合物により活性を阻害されない変異型酵素を生産する菌株からプラスミドを単離し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損変異株であるエシェリヒア・コリＰＣＲ１（Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984）に導入し、変異型酵素を産生することを確認した。
【００７７】
こうして、変異型酵素遺伝子を有する５株の形質転換体を得た。これらの遺伝子の塩基配列を決定した結果、２株については同一の変異を有しており、４種類の変異型遺伝子が得られた。これらを保持する形質転換体は、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０８、ＡＪ １２９０９、ＡＪ １２９１０と命名され、平成５年８月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７７として寄託されており、平成６年７月１１日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されている。また、これらの保持するプラスミドは、各々順にｐＢＰ５、ｐＨＡ１９、ｐＢＰ１２２、ｐＲ６と名付けた。各々のプラスミドに含まれるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が有する変異を、表２に示す。表中の数字は、配列番号１におけるヌクレオチド番号またはアミノ酸番号を表す。
【００７８】
【表２】
0003680324.tif 000008
【００７９】
尚、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０９は、５００μｇ／ｍｌの３ＢＰを含む培地で、ＡＪ １２９０８は、１０００μｇ／ｍｌのβＨＡを含む培地で、ＡＪ １２９１０は、５００μｇ／ｍｌのＡＨＹを含む培地で選択されたものである。
【００８０】
【実施例２】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
上記４株の形質転換体の産生するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼについて、アスパラギン酸に対する感受性を調べた。これらの菌株は、宿主由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠損しているので、産生するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、プラスミド由来のものである。
【００８１】
アスパラギン酸に対する感受性は、既知の方法（Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Biochem.,68,747-750(1970)）に従って調べた。すなわち、活性測定系中に、活性に影響することが知られているアセチルコエンザイムＡを０．１ｍＭあるいは１ｍＭの濃度で存在させて、各形質転換体及びｐＳ２を保持する大腸菌が産生する酵素の活性を測定したところ、アスパラギン酸に対する感受性は、図９、１１のように測定された。
【００８２】
この結果から、アスパラギン酸が高濃度になると、野生型の酵素は活性を失うのに対し、本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、活性を実質的に保持し続けていることが明らかである。
【００８３】
【実施例３】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−スレオニンの発酵生産
エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌としてはＢ−３９９６株（特表平3-501682号公報）が現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの評価を行うにあたり、Ｂ−３９９６を宿主として用いることにした。このＢ−３９９６株は、Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding に、登録番号 RIA 1867 のもとに寄託されている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしてはｐＢＰ５を選び、実験に供した。
【００８４】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離した。対照として、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＳ２でエシェリヒア・コリＢ−３９９６を同様に形質転換した。
【００８５】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６及びその形質転換体を、それぞれ表３の組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ坂口フラスコに接種して３７℃にて４０時間培養し、Ｌ−スレオニンの生産量を調べたところ、表４に示す結果を得た。尚、前記培地は、グルコースとＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、及びそれ以外の成分とに２分し、ＫＯＨでpH7.0 に調整した後に、１１５℃で１０分間オートクレーブし、これらを混合した後に別殺菌したＣａＣＯ3を３０ｇ／ｌ添加した。
【００８６】
【表３】
0003680324.tif 000009
【００８７】
【表４】
0003680324.tif 000010
【００８８】
この結果から明らかなように、本発明のＤＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＢ−３９９６は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＢ−３９９６よりもスレオニン生産能が向上した。
【００８９】
【実施例４】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−グルタミン酸の発酵生産
エシェリヒア・コリ グルタミン酸生産菌としては、特開平４−１１４６１号公報に示されるエシェリヒア・コリＡＪ １２６２８が、現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを評価するにあたり、ＡＪ １２６２８を宿主として用いることにした。ＡＪ １２６２８株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に登録番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８５３のもとに寄託されている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしてはｐＢＰ５を選び、実験に供した。
【００９０】
エシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
【００９１】
エシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
【００９２】
し、これらを混合した後に別殺菌したＣａＣＯ3を３０ｇ／ｌ添加した。
【００９３】
【表５】
0003680324.tif 000011
【００９４】
【表６】
0003680324.tif 000012
【００９５】
この結果から明らかなように、本発明のＤＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ １２６２８は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ １２６２８よりもグルタミン酸生産能が向上した。
【００９６】
【実施例５】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したコリネホルム細菌によるリジンの生産
変異型遺伝子をコリネホルム細菌に導入して発現させるために、ブレビバクテリウム属細菌由来のプロモーターの取得を行い、変異型遺伝子に連結し、発現型プラスミドを作製した。さらに、これをブレビバクテリウム属細菌に導入し、Ｌ−リジンの製造を行った。
【００９７】
＜１＞ブレビバクテリウム属細菌由来アスパルトキナーゼ（ＡＫ）遺伝子の取得ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）野生株ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCR（polymerase chain reaction；White,T.J. et al. ;Trends Genet., 5,185(1989)参照）によりＡＫ遺伝子を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にしてＡＫ遺伝子をコードする約1643bpの領域を増幅すべく、23merのオリゴヌクレオチド（配列番号２）及び21merのオリゴヌクレオチド（配列番号３）を合成した。
【００９８】
ＤＮＡの合成は、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）を用いて、常法に従って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。
【００９９】
増幅した1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshita, S. et al.;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅したＡＫ遺伝子断片と接続した。
【０１００】
ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色体より増幅されたＡＫ遺伝子断片の接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13869由来のＡＫ遺伝子を有するプラスミドをp399AKYと命名した。
【０１０１】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＡＫ遺伝子の塩基配列の決定
ＡＫプラスミドp399AKYを調製し、ＡＫ遺伝子の塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74,5463(1977)などがある）によった。結果を配列表配列番号４に記す。同ＤＮＡ断片は２つのオープン・リーディング・フレームをもち、これらはおのおの、ＡＫのαサブユニットとβサブユニットに対応する。各々のオープン・リーディング・フレームに対応するアミノ酸配列を、配列番号４及び配列番号５に示す。
【０１０２】
＜３＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミドの作製
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミドであるｐＳ２、及び取得した変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミドであるｐＢＰ５より、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む約４．４ｋｂのSalI断片を抽出し、大腸菌に汎用されているプラスミドベクターｐＨＳＧ３９９のSalIサイトに導入した。作製したプラスミドを、野生型をｐＨＳ２、変異型をｐＨＢＰ５と各々命名した。
【０１０３】
ｐＨＳ２およびｐＨＢＰ５をブレビバクテリウム中で発現するプラスミドとすべく、ブレビバクテリウム中で機能するプロモーター、及びプラスミドの複製起点の導入を行った。プロモーターとしては、クローン化したＡＫ遺伝子のプロモーター領域と推定される、塩基配列の１番目のNruIサイトから２０７番目のApaLIサイトまでを含む遺伝子断片をp399AKYより抽出し、ｐＨＳ２およびｐＨＢＰ５の構造遺伝子の約６０ｂｐ手前にあるAvaIサイトに転写方向が順方向となるよう挿入した。
【０１０４】
更に、ベクター上にあるサイトにブレビバクテリウム中でプラスミドの自律増殖を可能にする遺伝子断片、すなわちプラスミドの複製起点を導入した。プラスミドの複製起点を含む遺伝子断片は、ブレビバクテリウム用ベクターｐＨＣ４（特開平５−７４９１号公報段落番号１０参照、同プラスミドを保持するエシェリヒア・コリAJ 12036は工業技術院微生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号FERM P12215が付されている）より抽出し、両末端の制限酵素部位をリンカーの導入によりPstIサイトに改変した。
【０１０５】
この断片を、ブレビバクテリウムのプロモーターを付加したプラスミドの、ベクター部分であるPstIサイトに導入した。構築した発現型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを、ｐＳ２に由来する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドをｐＨＳ２Ｂ、ｐＢＰ５に由来する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドをｐＨＢＰ５Ｂと各々命名した。
【０１０６】
＜４＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミドを用いたＬ−リジンの生産
作成したｐＨＳ２Ｂ、ｐＨＢＰ５Ｂを各々ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌であるＡＪ ３４６３（特公平51-34477号公報参照）に導入した。遺伝子の導入は、電気パルスを用いた形質転換法を用いた（特開平２−２０７７９１号公報参照）。宿主及び形質転換体を表７の組成のリジン生産培地にて７２時間、３１．５℃にて振蘯培養を行った。前記培地は、表に記載の成分のうちＣａＣＯ3以外を１ｌの水に添加し、KOHを用いてpH8.0に調整後、115℃、15分間オートクレーブした後、乾熱滅菌したＣａＣＯ3をさらに添加して調製した。培養後の培地中のＬ−リジンの蓄積量を表８に示す。
【０１０７】
【表７】
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【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
この結果に示されるように、本発明のＤＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６３は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６３よりもリジン生産能が向上した。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ配列は、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードし、このＤＮＡ配列を保持する微生物は、前記酵素を産生する。
【０１１１】
本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、アスパラギン酸による活性阻害を実質的に受けないので、アスパラギン酸により生合成の調節を受けるアミノ酸の醗酵生産等に利用することができる。
【０１１２】
【配列表】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ３−ブロモピルビン酸による生育阻害を示す図。
【図２】  アスパラギン酸−β−ヒドラジドによる生育阻害を示す図。
【図３】  ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸による生育阻害を示す図。
【図４】  ３−ブロモピルビン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図５】  アスパラギン酸−β−ヒドラジドに対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図６】  ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図７】  生育に与える生育回復因子の影響。
【図８】  生育阻害物質のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性に対する阻害を示す図。
【図９】  本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
【図１０】  本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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