(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
螢光体で標識されたポリヌクレオチド断片を分離するためのキャピラリーを含む分離手段と、
前記キャピラリーで分離される前記ポリヌクレオチド断片にレーザーを照射して、前記蛍光体から発せられる螢光を検出する検出手段と、
前記キャピラリーの端部から溶出した前記ポリヌクレオチド断片を搬送する緩衝液の流れを形成する手段と、
前記ポリヌクレオチド断片を長さ毎に採取するための採取容器を有する採取手段と、
前記ポリヌクレオチド断片を含む前記緩衝液を前記採取手段へ移送する移送手段と、
前記検出手段により検出された信号に基づいて前記採取手段を制御する制御手段とを具備し、
前記分離手段と前記移送手段は、前記移送手段から前記採取容器までの前記ポリヌクレオチド断片の移送における時間的な広がりを、前記分離手段における分離時間間隔よりも短くするものであることを特徴とするポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項２】
前記移送手段は前記キャピラリーの前記端部に対向して配置される移送管を具備するものであり、前記移送手段は前記移送管の長さを短くすることにより、または前記分離手段は電気泳動のための印加電圧を調整することにより、各々前記時間的な広がりを前記分離時間間隔よりも短くするものであることを特徴とする請求項1に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項３】
前記移送手段は、前記キャピラリーの前記端部に対向して配置される移送管を具備するものであり、前記キャピラリーで分離される前記ポリヌクレオチド断片は、前記移送管の端部の開口に搬送されるものであることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項４】
前記移送手段は、移送管と、収納容器と、前記収納容器に洗浄液を搬送する第１の管と、前記収納容器から前記緩衝液を排出する第２の管とを具備し、
前記移送管では、第１の末端は前記キャピラリーの前記端部に対向して配置されかつ前記キャピラリーで分離される前記ポリヌクレオチド断片が移送され、第2の端部は前記緩衝液を流出させるものであり、
前記収納容器は、前記第2の端部から前記緩衝液を収納しかつ底部に前記移送管が貫通し得る径を持つ細孔を有するものであり、
前記採取容器は、前記移送管の前記第２の端部が前記細孔を貫通して移送する前記ポリヌクレオチド断片を搬送されるものであることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項５】
前記レーザーが前記キャピラリ‐と前記移送管との間に照射されることを特徴とする請求項２または請求項4に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項６】
前記レーザーが前記キャピラリーに照射されることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項７】
前記キャピラリーを複数具備し、各前記キャピラリーに独立して電圧を印加する電圧印加手段を有することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【請求項８】
前記移送管の内径が前記キャピラリーの外径よりも大であることを特徴とする請求項２または請求項4に記載のポリヌクレオチド断片の分離採取装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチドの分離採取装置に関し、特に、疾病や機能に特異的な遺伝子を探索するのに好適な、特異的遺伝子断片（ＤＮＡ断片）の分離採取装置、分離採取方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生命科学やバイオテクノロジーの分野では、ＤＮＡ断片等を分離して採取することの重要性が高まっている。特に、近年のヒトゲノムをはじめとするゲノムプロジェクトの進展に伴い、個体の発現遺伝子を網羅的に分析して臓器に特異的な遺伝子や、特定機能や疾病に係わる遺伝子を抽出し、抽出した遺伝子の機能を解析する試みが活発化している。そのため、多数の試料を網羅的に分析して特定の遺伝子（ＤＮＡ）断片を効率良く分離採取できる装置が必要となっている。
【０００３】
遺伝子の発現パターン検出法のうち、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法（以下、ＤＤ法と略記する）（ヌクレイック  アシッド  リサーチ、第２５巻、第１２号、２５４１頁〜２５４２頁、１９９７年（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．１２、ｐｐ．２５４１〜２５４２（１９９７））、蛍光ディファレンシャルディスプレイ法（以下、ＦＤＤ法と略記する）（フェブスレター、３５１巻、２号、２３１頁―２３６頁、１９９４年９月（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５１（２）、２３１〜２３６、Ｓｅｐ．１９９４）、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｐｈｉｓｍ）法（ヌクレイック  アシッド  リサーチ、第２３巻、第２１号、４４０７頁〜４４１４頁（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．２１、ｐｐ．４４０７〜４４１４（１９９５））等は、電気泳動を用いたＤＮＡの長さ解析に基礎をおいている。
【０００４】
即ち、異なる生体組織（例えば、正常細胞とガン細胞）から抽出したｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を逆転写によってｃＤＮＡに翻訳し、制限酵素処理で断片化した後、任意プライマー（ＤＤ法、ＦＤＤ法の場合）、又は、選択プライマー（ＡＦＬＰ法の場合）を用いてＰＣＲ増幅を行ない、得られたＰＣＲ産物を電気泳動で長さ分離してパターンを比較する。例えば、ガン細胞の場合に特異的に強く観測されたＤＮＡ断片があれば、それを、ガン特異的遺伝子の候補と考えて、分離採取して塩基配列を決定する。決定された塩基配列を既知の遺伝子の塩基配列と照合して特異的遺伝子を同定できる。電気泳動によるＤＮＡの長さ分離、及び特異的遺伝子の分離採取は、従来以下のようになされていた。
【０００５】
分離媒体として厚さ約０．３ｍｍのスラブゲルを用いる場合には、既知の長さを持つＤＮＡ断片混合物（塩基長マーカー）を、全泳動レーンの内のいくつかで泳動させ、他の泳動レーンで、解析対象の試料ＤＮＡ（予め蛍光物質で標識されている）を泳動させる。通常、スラブゲルで塩基長解析を行なう場合、１つの泳動レーンに供給される試料ＤＮＡの総量は約１ｐｍｏｌ（ピコモル）（１０-12ｍｏｌ）、溶液の体積は、数μＬ（マイクロリットル）である。試料をスラブゲルの一端に形成されたウエルに供給した後、電圧を印加し電気泳動を行なう。
【０００６】
電気泳動後、ゲルをイメージリーダーで読みとる。イメージリーダーは、レーザーをゲル面内でスキャンし、蛍光強度をイメージングする方式が広く使用されている。この方式により、スラブゲル中のＤＮＡバンドの位置が読み取れる。
【０００７】
スラブゲル電気泳動の場合には、ゲル面内での温度分布の影響等により泳動レーンの曲がりが起こることが多いため、実際の解析ではこれらの像の歪みを補正した後、塩基長マーカーのバンド位置と試料ＤＮＡのバンド位置とを比較して試料ＤＮＡの塩基長パターンを知る。種々の試料の塩基長パターンの比較によって特異的なバンドが検出できた場合には、そのバンドをゲルから切り出してＤＮＡ断片を分離採取する。切り取ったゲル片を緩衝液に浸し、数時間〜終夜放置し、ＤＮＡ断片をゲルから溶出させる。溶出したＤＮＡ断片を精製して、配列決定反応に用いる。
【０００８】
従来技術では、ゲルから精密な大きさで特定のバンドを切り出す必要があるため、作業者の熟練を要する。また、切り出したゲルからＤＮＡ断片を抽出して精製するのに手間と長時間を必要としていた。
【０００９】
遺伝子発現計測では、個々の臓器の比較、正常組織と疾病（例えば、癌）組織の比較、親子間の比較等を、通常数１０種類以上のプライマーの組合せで行なうため、大量の試料を解析する必要がある。このため、作業効率の向上が強く求められていた。
【００１０】
特異的遺伝子断片（ＤＮＡ断片）の分離採取を自動化した装置として、例えば、特開平７―１８１１６４号公報（第１の従来技術）に記載の装置では、分離媒体を充填したキャピラリー又はスラブゲルを用いて、試料ＤＮＡを電気泳動分離して、シースフロー中に溶出したＤＮＡ断片を緩衝液と共に移送管で容器に移送して容器に採取する。シースフロー中に溶出したＤＮＡ断片の検出信号に同期させて容器を移動させて、所望の断片を自動的に採取している。
【００１１】
なお、特開平６−１３８０３７号公報（第２の従来技術）に記載の装置では、蛍光標識したＤＮＡを検出する光学セル内で、第１のキャピラリーと第２のキャピラリーとを対向させ、第１のキャピラリーから溶出したＤＮＡ断片を第２のキャピラリーに移動させており、第２のキャピラリーの内径を第１のキャピラリーの内径に比較して大きくして、容易且つ確実にＤＮＡ断片を第２のキャピラリーに導いている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
特開平７−１８１１６４号公報（第１の従来技術）には、装置の基本的な構成要素が開示されているが、ＤＮＡ断片の分離採取の性能（特に、ＤＮＡ断片の分離精度、ＤＮＡ断片の採取に要する時間）を決める重要な要素である、移送管の具体的な構造、緩衝液の流速等についての具体的な開示はない。更に、特開平６−１３８０３７号公報（第２の従来技術）には、ＤＮＡ断片の分離採取に関する記載は何もない。
【００１３】
本発明の目的は、特開平７−１８１１６４号公報（第１の従来技術）に開示される装置を改良して、ＤＡＮ断片の分離採取に要する所要時間を短縮し、高い分離能を実現する特異的遺伝子断片の分離採取装置を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者は、特開平７−１８１１６４号公報（第１の従来技術）に開示されている分離採取装置を詳細に検討した結果、分離採取の性能は、移送管でのＤＮＡ断片の移送過程に大きく影響されることを発見した。即ち、移送管内での緩衝液の流れは、緩衝液の粘性のためにポアズイユ流れとなり、移送管の中心部に比較して移送管の管壁の近傍では遅くなり、緩衝液の流れは、移送管の管軸に垂直な断面内で速度分布を持つ。移送管の管軸に垂直な断面内に、ＤＮＡ断片が一様に注入される時、分子量が大きいため拡散係数が小さいＤＮＡ断片は、緩衝液の流れの速度分布（速度差）の影響を大きく受け、ゲルで分離され緩衝液に流出したＤＮＡ断片のバンドが時間的に広がって行く。ＤＮＡ断片（数十〜１００塩基長）の典型的な拡散係数Ｄの大きさは１０-5ｍｍ2／ｓｅｃである。
【００１５】
移送管の内径をｒ、移送管内の緩衝液の平均流速をｕとする時、移送管内でのＤＮＡ断片の時間的な広がりΔｔｐは、ガスクロマトグラフや液体クロマトグラフの理論で良く知られている分離カラムの効率を示す指標である理論段高さＨを表わすＧｏｌｅｙの式（数１）（船坂、池川編、「最新ガスクロマトグラフイー（Ｉ）基礎編」、第３６頁−第４６頁（廣川書店））（但し、移送管（細管）の内径をｒ、移送管（細管）内の液（緩衝液）の平均流速をｕ、分配係数をｋとする）の導出方法を参考にして可能である。
【００１６】
【数１】
Ｈ＝２Ｄ／ｕ＋（１＋６ｋ＋１１ｋ2）ｒ2ｕ／｛２４Ｄ（１＋ｋ）2｝…（数１）  Ｇｏｌｅｙの式（数１）に於いて、単純な管内流れを考える時には、分配係数を、ｋ＝０とすれば良く、（数１）は、（数２）となる。上記のパラメータＨは、緩衝液に流出したＤＮＡ断片の移送管の長さ方向での空間的広がりの標準偏差をσ、移送管の長さをＬとする時、（数３）により定義される。
【００１７】
【数２】
Ｈ＝（２Ｄ／ｕ＋ｒ2ｕ／（２４Ｄ）                             …（数２）
【００１８】
【数３】
Ｈ＝σ2／Ｌ                                                   …（数３）
ＤＮＡ断片の拡散係数Ｄが小さいため、（数２）の第１項は無視できる。従って、（数２）及び（数３）から計算される移送管内で生じる時間幅Δｔｐは、近似的に（数４）となる。即ち、δ関数の分布幅を持つＤＮＡ断片が移送管の入り口に一様に注入される時、位相管の出口では、ＤＮＡ断片の移送管の長さ方向での空間的広がりの幅はσとなり、Δｔｐは（数４）により表わされる。
【００１９】
【数４】
Δｔｐ＝σ／ｕ＝ｒ√｛Ｌ／（２４ｕＤ）｝                      …（数４）
移送管の管軸に垂直な断面内に一様にＤＮＡ断片が入射された場合には、（数４）に於いて、Ｌを変化させた実験からΔｔｐが√（Ｌ）に比例すること、及び、ｕを変化させた実験からΔｔｐが√（ｕ~1）に比例することが確認でき、（数４）が良く成立することを実験的に確認した。
【００２０】
移送管内でのバンドの広がりを小さくするには、移送管の長さＬを短く、移送管の内径ｒを小さく、移送管内での緩衝液の流速ｕを大きくすれば良いことが分かるが、これらの値には現実的な制約がある。現実的な制約を把握して最適値を採用することにより、分離採取に要する時間が可能な限り短く且つ高い分離能を可能とする特異的遺伝子断片の分離採取装置を実現できる。また、ポアズイユ流れの影響を低減するため、移送管の中心付近で移送されたＤＮＡ断片のみを採取する機構や、液滴によるＤＮＡ断片の気流を用いる移送機構等により、時間広がりを小さくできる。
【００２１】
サイズが異なる隣接するＤＮＡ断片が検出されるまでの泳動時間差は、分離媒体であるキャピラリーの長さ、泳動電圧により決定されるが、移送機構により生じるＤＮＡ断片のバンドの時間的広がりを、上記の泳動時間差に比較して小さくなるように設定することにより、所望のＤＮＡ断片を分離して採取できる。
【００２２】
分離媒体を充填したキャピラリーを用いてＤＮＡ断片を分離するキャピラリー泳動分離装置では、キャピラリーの放熱特性が良く、高電圧での泳動が可能であり、スラブゲルに比較して高速の長さ解析が可能である。この特性を生かし、キャピラリー泳動分離装置に分離採取機構を付加すれば、高速且つ簡便な分離採取が実現できる。また、スラブゲルと異なり、調製した試料のごく一部（通常、約１０ｎＬ（ナノリットル））しかキャピラリーに注入されない。試料と塩基長マーカーとを別々にキャピラリーに注入することにより、調製した試料を汚染させることがないので、調製した試料を多くの目的のために使用でき、解析全体で見れば試料調製コストが低減できる。
【００２３】
本発明の特異的遺伝子断片の分離採取装置は、螢光体で標識されたＤＮＡ断片を泳動分離する分離媒体が充填された単数又は複数のキャピラリーを含む分離手段と、キャピラリーで分離されたＤＮＡ断片にレーザーを照射して、蛍光体から発する螢光を検出する検出手段と、キャピラリーの泳動終端に対向して間隙をおいて第１の末端が配置され、分離されたＤＮＡ断片が第１の末端の開口に移送される移送管を含む移送手段と、キャピラリーから溶出したＤＮＡ断片を第１の末端の開口に搬送する緩衝液のシースフローを形成する手段と、移送管により移送されたＤＮＡ断片の長さ毎に分別して採取する採取容器を持つ採取手段と、検出手段により検出された信号に基づいて採取手段を制御する手段とを具備し、以下の特徴を有する。
【００２４】
（１）移送管の長さが５ｃｍから１５ｃｍの範囲にあり、移送管の内径が５０μｍから１００μｍの範囲にあり、移送管の内部を流れる緩衝液の流速が約１０ｍｍ／ｓｅｃである。
【００２５】
（２）移送管の第２の末端で、移送管により移送されたＤＮＡ断片を含む緩衝液の液滴を形成する手段と、液滴を気流により採取容器に搬送する手段とを有する。
【００２６】
（３）移送管の第２の末端が配置され第２の末端から流出する緩衝液を収納し、底部に移送管が貫通し得る径を持つ細孔を有する収納容器と、収納容器に洗浄液を搬送する第１の管と、収納容器から緩衝液を排出する第２の管とを具備し、移送管の第２の末端が細孔を貫通して、移送管により移送されたＤＮＡ断片が、採取容器に搬送される。
【００２７】
（４）レーザーは間隙、又はキャピラリーに照射される。
【００２８】
（５）キャピラリーを複数具備し、各キャピラリーに独立して泳動電圧を印加する電圧印加手段を有する。
【００２９】
（６）キャピラリーを複数具備し、各キャピラリーに独立して泳動電圧を印加する電圧印加手段を有し、検出手段により検出された信号に基づいて、電圧印加手段は泳動電圧を電気泳動中に変更する。
【００３０】
（７）移送管の長さが５ｃｍから１５ｃｍの範囲にあり、移送管の内径がキャピラリーの外径の約１０倍であり、移送管の内部を流れる緩衝液の流速が０．３ｍｍ／ｓｅｃから１ｍｍ／ｓｅｃの範囲である。
【００３１】
また、本発明の特異的遺伝子断片の分離採取装置は、螢光体で標識されたＤＮＡ断片を泳動分離する分離媒体が充填されたキャピラリーを含む分離手段と、キャピラリーで分離されたＤＮＡ断片にレーザーを照射して、蛍光体から発する螢光を検出する検出手段と、ＤＮＡ断片を収納する試料容器を保持する第１の溶液保持部と、塩基長マーカーを収納するマーカー容器を保持する第２の溶液保持部と、ＤＮＡ断片と塩基長マーカーと別々にしてキャピラリーに注入する注入手段と有することに特徴がある。
【００３２】
また、本発明の特異的遺伝子断片の分離採取装置は、螢光体で標識されたＤＮＡ断片を泳動分離する分離媒体が充填されたキャピラリーを含む分離手段と、キャピラリーで分離されたＤＮＡ断片にレーザーを照射して、蛍光体から発する螢光を検出する検出手段と、キャピラリーの泳動終端から溶出したＤＮＡ断片を搬送する緩衝液のシースフローを形成する手段と、ＤＮＡ断片を長さ毎に分別して採取する採取容器を持つ採取手段と、ＤＮＡを含む緩衝液を採取手段へ移送する移送手段と、検出手段により検出された信号に基づいて採取手段を制御する制御手段とを具備し、採取容器までの移送中でのＤＮＡ断片の移送手段による時間的な広がりを、分離手段に於けるＤＮＡ断片の分離時間差よりも小さくすることに特徴があり、移送手段は、キャピラリーの泳動終端に対向し間隙をおいて末端が配置される移送管を具備し、キャピラリーで分離されたＤＮＡ断片が移送管の末端の開口に搬送される。
【００３３】
本発明の特異的遺伝子断片の分離採取方法は、螢光体で標識されたＤＮＡ断片を含む試料ＤＮＡと、ＤＮＡ断片を標識する蛍光体と異なる種類の蛍光体で標識された塩基長マーカーとを別々にして、分離媒体が充填されたキャピラリーに注入する工程と、ＤＮＡ断片、及び塩基長マーカーとを電気泳動分離する工程と、キャピラリーで分離されたＤＮＡ断片、及び塩基長マーカーにレーザーを照射して、複数種類の蛍光体から発する螢光を検出して、試料ＤＮＡの電気泳動パターンを得る工程とを有することに特徴がある。
【００３４】
また、本発明の特異的遺伝子断片の分離採取方法は、螢光体で標識されたＤＮＡ断片を含む複数の試料ＤＮＡの各試料ＤＮＡと、ＤＮＡ断片を標識する蛍光体と異なる種類の蛍光体で標識された塩基長マーカーとを別々にして、分離媒体が充填された複数の各キャピラリーに注入する工程と、ＤＮＡ断片、及び塩基長マーカーとを電気泳動分離する工程と、キャピラリーで分離されたＤＮＡ断片、及び塩基長マーカーにレーザーを照射して、複数種類の蛍光体から発する螢光を検出して、各試料ＤＮＡの電気泳動パターンを得る工程と、各試料ＤＮＡの電気泳動パターンに基づいて選択されたＤＮＡ断片を含む試料ＤＮＡを、スラブゲルを用いる電気泳動により電気泳動分離する工程と、電気泳動分離された選択されたＤＮＡ断片のバンドを、スラブゲルから採取する工程とを有することに特徴がある。
【００３５】
【発明の実施の形態】
図１は、第１の実施例の分離採取装置の構成を示す図である。分析対象である試料ＤＮＡは公知の技術を用いて、予め蛍光体で標識しておく。分離媒体を充填した複数のキャピラリー１０の各々に対応した複数の試料容器１６が形成された試料保持部１２が配置され、各キャピラリーに対応する各試料容器１６から試料が各キャピラリーに注入される。分離媒体として、架橋ポリアクリルアミドゲル（４％濃度、５％架橋度、尿素７ｍｏｌ濃度）を用いたが、試料ＤＮＡの長さ、必要とする分離能、分析の所要時間等の条件により、他の種類の分離媒体の使用も可能である。
【００３６】
図２は、分離採取装置の試料注入部の構成を示す断面図である。キャピラリー１０の試料注入端は、緩衝液漕１１内の電気泳動用の緩衝液２１（ＴＢＥ緩衝液に７ｍｏｌ濃度で尿素を混合）に浸された状態に置かれる。試料注入時には、試料台１３（図１）を移動させて、キャピラリー１０の試料注入端を試料容器１６の試料液１８に浸す。試料容器１６の底部には電極２０が設けられ、高電圧電源１９により、短時間（１０ｓｅｃ〜３０ｓｅｃ）電圧を、電極２０と光学セル部７（図１）内部に配置された電極（図示せず）との間に印加して、試料をキャピラリー１０の試料注入端に注入する。試料を注入した後、キャピラリー１０の先端を、緩衝液漕１１に戻し、高電圧電源１９を用いて電極２０と光学セル部７（図１）内部に配置された電極との間に一定の電圧（キャピラリー１ｃｍ当り２５Ｖ〜３００Ｖ）印加して、キャピラリー１０の中でＤＮＡ断片を電気泳動して長さ分離する。電圧の印加、及び試料台１３の移動（垂直及び水平方向での移動）は、パーソナルコンピュータ３（図１）で全て制御される。
【００３７】
ＤＮＡ断片は、キャピラリー１０の内部で長さの短い断片から順に、キャピラリーの試料注入端から光学セル部７の方向に泳動して、光学セル部７の内部に挿入配置されたキャピラリー１０の他方の末端から溶出する。光学セル部７の内部には、キャピラリー１０の軸方向と平行に緩衝液の流れ（シースフロー）が形成されている。キャピラリー１０の他端から流出したＤＮＡ断片は、シースフローによって、光学セル部７の内部に照射されているレーザー２８の光軸を横切って、移送管１４に移動する。移送管１４の末端はキャピラリー１０の末端と一定の間隙をおいて対向して共軸に配置されている。光学セル部７の構成の詳細は後述する（図５〜図８、及び図１０）。
【００３８】
光学セル部７の内部の上記の間隙を、レーザー源１からのレーザー２８で同時に照射して、複数のキャピラリー１０の末端から溶出したＤＮＡ断片を同時に計測できる。光学セル部７の内部にシースフローを形成する緩衝液は、電気泳動用のＴＢＥ緩衝液にＤＮＡ断片の吸着の防止のために界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を０．０２％混合して使用し、緩衝液導入口８から落差で光学セル部７の内部に供給され、複数の移送管１４から排出される。ＤＮＡ断片は、シースフローの流れに乗って移送管１４の中に入る。移送管１４の内部を移動したＤＮＡ断片は、各移送管１４に対応して設置されたフラクションコレクタ１５の容器に緩衝液と共に入る。
【００３９】
フラクションコレクタ１５は、キャピラリー１０の本数と同数設ける。各フラクションコレクタの移動は、各駆動機構１７によって制御される。所望のＤＮＡ断片を採取するためのフラクションコレクタ１５の移動は、ＤＮＡ断片を標識する蛍光体が発する蛍光を、レンズ４ａ、４ｂ、像分割プリズム５、バンドパス干渉フィルタ６ａ、６ｂを通して２次元検出器２により検出し、検出信号をパーソナルコンピュータ３によって解析し、所望のＤＮＡ断片を判断してコントローラ９に信号を送ることにより制御される。各駆動機構１７はコントローラ９からの信号で制御されている。
【００４０】
遺伝子の発現計測を行なう場合には、ＤＮＡ断片長を試料毎に比較する必要が生じる。ＤＮＡ断片の末端部の塩基配列の情報が予め得られているＡＦＬＰ法では、ＤＮＡ断片の長さが分かると、そのＤＮＡ断片がどのような遺伝子の断片に存在するかが分かる場合もある。従って、試料に含まれるＤＮＡ断片の長さを複数の試料の間で比較すること、又は、ＤＮＡ断片長の絶対値を知ることは、極めて重要である。しかし、キャピラリーの長さ及び内径のバラツキ、充填されている分離媒体の性質のバラツキ、注入された試料の量や組成のバラツキ等により、各キャピラリーの泳動時間は、同じ長さのＤＮＡ断片であってもずれる場合が多い。これらのバラツキを補正するため、全ての試料に同一の塩基長マーカー（マーカーＤＮＡ）を混合し、マーカーＤＮＡの泳動時間との比較から、各試料に含まれるＤＮＡ断片の長さを解析する。
【００４１】
マーカーＤＮＡと試料ＤＮＡとは異なる蛍光体で標識する。例えば、マーカーＤＮＡはＴＡＭＲＡ（蛍光分布のピーク波長５８５ｎｍ）で、試料ＤＮＡはＲＯＸ（蛍光分布のピーク波長６０５ｎｍ）で標識する。各蛍光体の蛍光波長分布に合わせた波長特性を持つバンドパ干渉スフィルタ６ａ、６ｂ、像２分割プリズム５を用いて、冷却ＣＣＤカメラ等の高感度２次元検出器２によって、レーザーが照射された位置に形成された蛍光像を所定の時間間隔で観測して、各キャピラリー毎、各蛍光体毎の電気泳動パターン（蛍光強度の時間変化）を計測する。レンズ４ａ、４ｂは、２次元検出器（高感度撮像管）２の像面に上記の蛍光像を結像させる。データ収集と解析、及び試料容器の移動制御、キャピラリーへの電圧の印加の制御はパーソナルコンピュータ３が行なう。計測終了後、各キャピラリー毎に、マーカーＤＮＡのピーク位置と、既知の塩基長値との対応を表わす較正曲線を作成し、較正曲線を用いて実際の試料ＤＮＡの電気泳動パターンを較正して、塩基長分布を知ることができる。
【００４２】
図３は、分離採取装置で得られた電気泳動パターンの例を示す図であり、２３は試料ＤＮＡの電気泳動パターン、２４はマーカーの電気泳動パターンである。
なお、図１に示す分離採取装置の構成では、キャピラリー１０を光学セル部７の下部に、移送管１４を光学セル部７の上部に配置しているが、緩衝液漕１１、キャピラリー１０、試料保持部１２、試料台１３を光学セル部７の上部に、移送管１４、フラクションコレクタ１５を光学セル部７の下部に配置し、シースフローを図１の上部から下部の方向に形成する構成としても良い。また、フラクションコレクタ１５と試料導入部を概略同一水平面内に配置し、同一水平面の上又は、下の位置に検出器系（レンズ４ａ、４ｂ、像分割プリズム５、バンドパス干渉フィルタ６ａ、６ｂ、検出器２）を配置することもできる。
【００４３】
図４は、第２の実施例の分離採取装置の構成を示す図である。第２の実施例の分離採取装置では、１本のキャピラリー、１つの試料容器を保持する試料保持部１２、１つのフラクションコレクタ１５を使用する以外は、図１と同じ装置構成である。
【００４４】
次に本実施例の装置を構成する各部について詳述する。
【００４５】
図５は、分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第１の構成例を示す断面図である。図５（ａ）はレーザー２８の光軸に沿った方向での光学セル部、及び移送手段の断面図、図５（ｂ）はレーザー２８の光軸に垂直な方向での光学セル部、及び移送手段の断面図を示す。
【００４６】
光学セル部保持具２５は、光学セル３３を保持すると共に、キャピラリー支持具２６ａ、及び移送管支持具２６ｂを保持する。キャピラリー１０の外径は２００μｍ、内径は７５μｍである。キャピラリー１０を支持具２６ａの上に並べて固定し、先端を揃えて切断する。移送管１４の外径、及び内径は、キャピラリー１０と同じく２００μｍ、７５μｍである。移送管１４を支持具２６ｂの上に並べて固定した後、先端を揃えて切断する。このように形成した、キャピラリーアレイと移送管のアレイとを、石英製の光学セル３３内で、１ｍｍの間隙を持たせて同軸に対向させて配置する。
【００４７】
キャピラリー１０から溶出したＤＮＡ断片をレーザー２８で確実に照射し、ＤＮＡ断片がキャピラリー１０から対応する移送管１４に１対１で確実に流入するようにするため、図５（ｂ）に示す石英製の光学セル３３の内部の幅はキャピラリー１０の外径寸法よりも約数μｍ大きくし、上部、及び下部からキャピラリーアレイ、及び移送管のアレイを、光学セル３３の内部２９まで差し込む構造とする。また、支持具の位置を光学セル部保持具２５に対して、位置決め用のピン２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄで合わせる構造とする。緩衝液は、光学セル部保持具２５に設けられた導入口８から導入され、複数の移送管１４から排出される。
【００４８】
光学セル３３内での緩衝液の流速分布の一様性を上げ、キャピラリーアレイの両側の位置にでも、シースフローが均一の流速となるように、以下の構成（構成Ａという）を採用した。１６本のキャピラリーを用い（即ち、泳動レーンの数は１６）、キャピラリーと交互に、キャピラリーの外径と同じ外径２００μｍを持つガラス棒を配置した。両側のキャピラリーの外側に更に９本ずつガラス棒を余分に配置した。２４本の移送管を用い、移送管と交互にガラス棒を配置し、両側に、更に、１本ずつガラス棒を余分に配置した。隣り合うキャピラリー（又は、移送管）とガラス棒との間隔は０．４ｍｍとした。この時、キャピラリーとガラス棒との４９本からなるアレイの横幅、移送管とガラス棒との４９本からなるアレイの横幅は、０．４×４８＝１９．２ｍｍである。光学セル３３のレーザーが照射される方向の幅を２４ｍｍとした。キャピラリー１０（又は、ガラス棒）と移送管１４（又は、ガラス棒）との間隙は１ｍｍとした。キャピラリー１０（又は、ガラス棒）、及び移送管１４（又は、ガラス棒）は、光学セル３３の端面からそれぞれ３ｍｍだけ、光学セル３３の内部２９に挿入されている（光学セル３３の高さは７ｍｍである）。
【００４９】
以上説明した構成で、主要なパラメータは、移送管の長さ、内径、及び外径、緩衝液の流速、移送管とキャピラリーの間隙（ギャップ）、隣接して配列するキャピラリーの間隔である。以下、これらのパラメータの適正範囲について説明する。
【００５０】
キャピラリーの配列間隔を小さくすると、多くのキャピラリーを用いてＤＮＡ断片を同時に検出できる。標準的に入手可能な２次元検出器（例えば、冷却ＣＣＤカメラ）の有効検出面の幅は約２５ｍｍであり、等倍率（１：１）の光学系を用いた場合には、光学セル部の横幅（レーザーが照射される方向での幅）もほぼ同じ約２５ｍｍの大きさにする必要がある。
【００５１】
外径２００μｍのキャピラリーを最密に並べたとして、同時に使用して測定可能なキャピラリーは最大１２５本となるが、実際には、キャピラリーと移送管の変形等のため、光学セル３３内でキャピラリーと移送管の先端の共軸位置合せの精度を０．１ｍｍ以下にすることは困難な場合が多い。実際には、キャピラリーとガラス棒を交互に配置する構成で、キャピラリーと移送管の先端の位置合せの精度を０．１ｍｍ以下として、配列可能なキャピラリーの本数は約４０本が上限であり、この時、隣接するキャピラリー間隔は０．３ｍｍであった。
【００５２】
キャピラリーと移送管の先端で形成される間隙（ギャップ）の大きさは０．５ｍｍから２ｍｍが適当である。間隙が小さい場合には、キャピラリー、移送管の切断面の平坦性のバラツキのため、レーザーの一部が、キャピラリー及び移送管の先端で散乱し、ＤＮＡ断片を検出する際のバックグラウンドが増加することがある。
【００５３】
また、ギャップが約０．５ｍｍより小さい場合には、ＤＮＡ断片を移送管の入り口に近い部位で検出せざるを得ず、移送管の入り口付近では、流速が大きくなっているため、レーザーのＤＮＡ断片への照射時間が短くなるため、ＤＮＡ断片の検出感度が低下する。逆に、ギャップが大きすぎる場合には、キャピラリーの端部と移送管の端部との共軸位置合せを精度良く行なうことが困難であり、ＤＮＡ断片のバンドの広がりのため、ＤＮＡ断片が隣接する移送管内部に入る場合がある。
【００５４】
キャピラリー１０、移送管１４の光学セル３３内への挿入長（光学セル３３の端面からキャピラリー１０、移送管１４の先端までの長さ、即ち、光学セル部の内部２９で露出するキャピラリー１０、移送管１４の部分の長さ）は、３ｍｍ〜５ｍｍが妥当な値である。光学セル部の緩衝液の導入口の近傍では、緩衝液の流れの断面積が大きく変化するために、緩衝液の流れが完全な層流状態を形成する迄に、所定のある長さ（助走距離）が必要なため、挿入長が短すぎると、シースフローの速度の一様性が悪く、ＤＮＡ断片の分離能、検出感度がキャピラリー間でばらつく原因となる。ガラスキャピラリーの機械強度がさほど強くないため、光学セル部への挿入等に伴う変形が生じやすいため、挿入長が長すぎると、キャピラリーの端部と移送管の端部との位置合せを精度良く行なうことが困難であり、合わせ精度が低下する。従って、上記の挿入長と上記のギャップの和で決まる光学セル３３の高さは約６．５ｍｍ〜１２ｍｍが妥当な値である。
【００５５】
以下、移送管の内径、長さ、緩衝液（シースフロー）の流速の条件を検討する。移送管の中を流れるＤＮＡ断片の時間的な広がりΔｔｐは、（数１）に従い変化し、ＤＮＡ断片が移送管を移動する時にＤＮＡ断片の広がり（分離の劣化）を防止するは、先に説明した通り、移送管の長さＬを短く、移送管の内径ｒを小さく、緩衝液の流速ｕを大きくすれば良い。しかし、移送管の長さＬ、移送管の内径ｒ、緩衝液の流速ｕを変化させる際には、何れの場合も現実的には制約がある。
【００５６】
光学セル部内での緩衝液の流速ｕを大きくすると、移送管での緩衝液の流速を大きくできるが、ＤＮＡ断片の検出感度が低下するという問題が生じる。
【００５７】
１６本のキャピラリー、２４本の移送管を使用する先に説明した構成Ａでは、移送管内の緩衝液の平均流速を約１０ｍｍ／ｓｅｃとした場合、光学セル部内での緩衝液の流速は０．２１ｍｍ／ｓｅｃとなった。この時、ＤＮＡ断片の検出感度は、試料濃度として０．０１ｆｍｏｌ／μＬ（フェムトモル／マイクロリットル）（即ち、１０-9ｍｏｌ濃度）であった。この検出感度は、ＤＤ法、ＡＦＬＰ法等の遺伝子の発現計測に十分適用可能な検出感度である。
【００５８】
移送管の長さＬを短くするには、フラクションコレクタを小さくする必要がある。フラクションコレクタの各容器の大きさと、フラクションコレクタの駆動系の構成から考えて、１本のキャピラリー当りのフラクションコレクタの配置に約３ｍｍ〜５ｍｍの幅は必要である。光学セル３３の横幅が約２５ｍｍ、キャピラリー１０と移送管１４とを１対１に対応させＤＮＡ断片が隣接する移送管に混入しないようにするためには、構成Ａに於いて、移送管の配列の間隔は０．６ｍｍ〜０．８ｍｍが適当であり、１本〜５本のキャピラリーを使用する時、移送管の配列の全幅は、０ｍｍ〜３．２ｍｍとなる。この時、フラクションコレクタの配置に要する全幅は、３ｍｍ〜２０ｍｍとなり、移送管の長さが約５０ｍｍ以上あればフラクションコレクタにつなぐことができる。
【００５９】
しかし、更に、多数のキャピラリーを使用する場合、例えば、１６本のキャピラリーを使用する場合には、フラクションコレクタの全体の配置に要する全幅は４５ｍｍ〜６０ｍｍとなり、長さ５０ｍｍ〜１００ｍｍの移送管が必要となる。構成Ａに於いて、使用できるキャピラリー１０の最大本数は約４０本であり、この時、フラクションコレクタの全体の配置に要する全幅は１２０ｍｍ〜１５０ｍｍであり、長さ１００ｍｍ〜１５０ｍｍの移送管が必要であった。
【００６０】
移送管の内径ｒを小さくすると圧力損失が増大するため、緩衝液の流速を所望の値にするには、圧力を大きくする必要がある。一般に、圧力損失は管の内径の４乗に比例する。落差で生成可能な圧力は約０．１気圧（１ｍの落差の場合）までが現実的であり、それ以上の落差を得るには装置全体が大型化することになり好ましくない。
【００６１】
あり、約０．１気圧以上の圧力を落差で生成させることは難しい。緩衝液のより大きな流速を得るには、送液用のポンプを使用することもできるが、わずかに発生する脈流が測定データに強度変動を生じさせる場合があり好ましくない。内径７５μｍ、長さ１０ｃｍの移送管を用いた場合、落差が０．５ｍ以内で移送管内の緩衝液の流速１０ｍｍ／ｓｅｃを得ることができた。この時、移送管の中を流れるＤＮＡ断片の時間的な広がりΔｔｐは、半値幅で約１０ｓｅｃとなった。実際の分取では、この時間（約１０ｓｅｃ）が、電気泳動での所望のＤＮＡ断片と他のＤＮＡ断片とが分離検出される時間間隔（即ち、所望のＤＮＡ断片が検出された時刻と、他のＤＮＡ断片が検出された時刻との差で与えられる時間間隔）に比べて短くなるように泳動条件（泳動の際に印加する電圧、キャピラリー長さ）を調整する必要がある。
【００６２】
図６は、分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第２の構成例を示す斜視図である。なお、図６〜図８、及び図１０で示す光学セル部７は、図５に於ける、光学セル３３とその保持具２５、キャピラリー及び移送管の支持具２６ａ、２６ｂが一体となった構成を、細部の構成を省略して示す。図６に示す光学セル部７の構造では、移送管内を流れるＤＮＡ断片の時間的広がりを減少させるために、移送管１４の内径をキャピラリーの外径よりも大きくする。光学セル部内でのキャピラリー１０の端部の中心位置は、移送管と同じ外径の支持管３０を用いて、移送管１４の入り口面の中心に合うように配置されている。移送管１４の中心付近を流れるＤＮＡ断片だけをフラクションコレクタの容器３５に採取するために、移送管１４の出口付近の内部の中心位置には、内径７５μｍの補助管３１ａを配置している。各移送管を流れた緩衝液は、排出管３２を流れて廃棄される。以上説明した構成では、移送管のほぼ中央付近をＤＮＡ断片が流れるために、ポアズイユ流れによる壁面付近の緩衝液の流速の低下が、ＤＮＡ断片の採取に影響を与えにくくできる。ＤＮＡ分子の拡散係数が小さいため、移送管の中心付近を流れるＤＮＡ断片は、中心付近にとどまる。
【００６３】
図６に示す構成では、移送管１４の内径を２ｍｍ、外径を３ｍｍ、キャピラリー１０の内径を約７５μｍ、外径を２００μｍとした。移送管内部での緩衝液の流速は、移送管内部の温度分布により生じる熱対流の影響を受けない範囲で、できるだけ小さいことが望ましく、ここでは０．３ｍｍ／ｓｅｃとした。この時、各移送管を流れる流量は、約１μＬ／ｓｅｃとなる。光学セル部の大きさを図５の構成と同じく２５ｍｍ（レーザーが照射される方向での幅）にすると、外径３ｍｍの移送管を最大密に並べても８本が限界である。従って、図６に示す構成は、より多数のキャピラリー使用する場合には、適用困難となる。８本の移送管を使用する場合に、光学セル部内の流速は０．１ｍｍ／ｓｅｃとなり、ＤＮＡ断片の検出感度は十分確保できた。光学セル部内の流速を約１ｍｍ／ｓｅｃまで大きくしても、ＤＮＡ断片の検出感度は十分であった。なお、図６に示す構成でも、移送管の長さは極力短いことが望ましく、フラクションコレクタの１本のキャピラリー当りの幅を５ｍｍに設計し、移送管の長さを５ｃｍとした。
【００６４】
図７は、分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第３の構成例を示す斜視図である。図７に示す構成では、図６に示す構成と同様に、移送管１４の内径をキャピラリーの外形に比較して大きくしてあるが、光学セル部７の内部では、キャピラリーの外径及び内径と同じ、外径及び内径を持ち長さ約１０ｍｍの短い補助移送管３１ｂを配置してＤＮＡ断片を採取している。移送管内に流す緩衝液（緩衝液）を導入管３４から導入して、シースフローを移送管１４の内部に形成して、移送管の中心部で採取されたＤＮＡ断片を移動させ補助移送管３１ａを通して、フラクションコレクタの容器３５に採取する。緩衝液は排出管３２から排出される。移送管１４に緩衝液の導入管３４、排出管３２を配置するので位相手段の構造が少し複雑となる。反面、光学セル７の構造は図６に示す構成よりも単純にできる。
【００６５】
図８は、分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第４の構成例を示す斜視図である。図８に示す構成では、ガラスロッド４８に挾まれる移送管３６ａ、３６ｂを、各キャピラリー１０に対向させて、光学セル部７の内部に間隙をおいて配置する。ガラスロッド４８、移送管３６ａ、３６ｂ、キャピラリー１０は、同じ外形を持つ。図８に示す構成では、電気浸透流を用いて、光学セルの内部でＤＮＡ断片が流れる移送管を切りかえて、ＤＮＡ断片を分離採取する。電気浸透流では、移送管の壁表面の電荷により、緩衝液と壁表面との界面に電気二重層が発生し摩擦のない層流が得られる。移送管３６ａ、３６ｂのガラス内壁面は電気的にマイナスに帯電するように表面処理しておくと、移送管３６ａ、３６ｂの内部に於いて、相対的にプラスに帯電するので、移送管３６ａ、３６ｂの出口側にマイナスの電圧を印加して、光学セル部から移送管３６ａ、３６ｂの出口への電気浸透流を起こすことができる。この場合、光学セル部７は、電気泳動及び移送の両方に共通のアース電位に置かれる。移送管の出口に電圧を印加するため、フラクションコレクター１５の各容器３５には、予め緩衝液溶液を保持しておき、フラクションコレクター１５の各容器３５の底部に電極（図示せず）を配置する。
【００６６】
所望のＤＮＡ断片を検出した場合には、フラクションコレクタ１５の容器３５の底部に設けた電極（図示せず）に電圧を印加して、移送管３６ａの出口側に電圧を印加すると、光学セル部７の内部の緩衝液は、移送管３６ｂよりも移送管３６ａに多く流れる。従って、ＤＮＡ断片をフラクションコレクタ１５の容器３５側に導くことができる。次いで、移送管３６ａへの電圧の印加を停止し、容器３７内の電極３８に電圧を印加することにより、移送管３６ｂに電圧を印加して、ＤＮＡ断片を移送管３６ｂに導く。容器３７に蓄積されたＤＮＡ断片、緩衝液は廃棄する。移送管３６ａに印加した電圧を０にしても、落差で緩衝液は流れ続けるため、一旦移送管３６ａに入ったＤＮＡ断片はフラクションコレクタ１５の容器３５に採取できる。
【００６７】
図９は、分離採取装置の移送手段の第５の構成例を示す断面図である。図９に示す構成では、図５に示す移送管１４の出口側を保持し、ガス導入口４０を持つ移送管保持部材４２ａに、内部に移送管１４の末端部を通過させる中空部を持つ円錐状部材３９を保持する円錐状部材保持部材４２ｂを結合し、ガス導入口４０からガス（Ｎ2、空気）を流し、円錐状部材３９の先端の開口部４３から噴出させる。移送管１４で移送されたＤＮＡ断片は、開口部４３から噴出するガスの流れで液滴４１の状態となり、ガスの流れで搬送され、カバー４４の移動により液滴４１の、フラクションコレクタの採取用容器３５への採取が制御される。
【００６８】
移送管１４の先端は、開口部４３から２ｍｍ〜３ｍｍ突出させて配置する。円錐状部材３９の先端でのガス流速を約１０ｍ／ｓｅｃにして、液滴４１のサイズを約０．１μＬにできる。先に説明した移送管内での緩衝液の流速１０ｍｍ／ｓｅｃでは、キャピラリーの内径７５μｍの場合、流量は約４５ｎＬ／ｓｅｃなので、ほぼ２ｓｅｃ毎に１回の液滴の噴霧が起こる。所望のＤＮＡ断片が検出された場合のみ、カバー４４をはずし、一定時間容器に液滴を採取する。それ以外は、カバー４４の上面に設けた溝４５に液滴をため、廃棄用の容器（図示せず）に捨てる。フラクションコレクタには複数の容器３５を、各移送管１４に対してそれぞれ設けているので、所望の複数のＤＮＡ断片を採取できる。
【００６９】
フラクションコレクタ１５の各容器の開口部の直径が６ｍｍの場合、確実に噴霧液滴を採取するには、移送管の先端から、容器の開口部までの距離は約５ｃｍ以内にする必要があった。移送管の長さを５ｃｍにしても、フラクションコレクターまでの距離は１０ｃｍに長くできる。従って、移送管１４で直接にＤＮＡ断片を移送するよりも、フラクションコレクターの大きさを大きくでき、その結果一度に多数のキャピラリーを用いる分取が可能となる。移送管内を流れるＤＮＡ断片の時間的広がりは、緩衝液の移送管内での流速が１０ｍｍ／ｓｅｃの時、半値幅で約５ｓｅｃとなる。従って、２液滴を採取すれば、ほぼ所望のＤＮＡ断片のみを採取できる。
【００７０】
図１０は、分離採取装置のＤＮＡ断片検出部の構成例を示す斜視図である。図１０の構成では、複数のキャピラリー１０にレーザー２８を直接に同時に照射してＤＮＡ断片を検出する（オンカラム検出方式：例えば、特開平９−２８８０８８号公報を参照）。検出されたＤＮＡ断片は、更に、キャピラリー１０の先端まで泳動し、光学セル部７の内部に溶出する。光学セル部７の構造は、図５に示す構成と同様な光学セル部を使用できる。ＤＮＡ断片を検出した時刻から、キャピラリー先端部からＤＮＡ断片が溶出するまでの時間が経過した後に採取を行なう。なお、レーザーをスキャンして全てのキャピラリーを照射しても良い。
【００７１】
図１０に示す構成では、キャピラリー１０と交互にロッドレンズ４６を配置し、キャピラリー１０とロッドレンズ４６を並べたアレイを石英製の部材４７に固定する。レーザー２８をアレイに貫通させて、各キャピラリー１０を泳動したＤＮＡが検出できる。各キャピラリー１０から溶出したＤＮＡは、図５に示す構成とと同様に、各キャピラリー１０に対向する移送管１４によって、フラクションコレクタの容器３５に導かれる。ガラスロッド４８は、キャピラリー１０と移送管１４との位置合わせのために用いる。ガラスロッド４８はロッドレンズ４６と同じ形状、材質のものを使用できる。図１０に示す構成では、ＤＮＡ断片の検出感度が光学セル部内の緩衝液の流速によらないため、緩衝液の流速を大きくして、ＤＮＡ断片の移送管での時間広がりを低減できる。また、緩衝液のわずかな脈流はＤＮＡ断片の検出性能に影響しないため、送液ポンプを用いて緩衝液の流速を大きくできる。
【００７２】
次に、フラクションコレクタの構成について説明する。ＤＤ法等の発現計測手法で検出された特異的ＤＮＡは、塩基配列決定により同定する。この時、通常、採取したＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅する。試料中のＤＮＡ断片の濃度は、平均的には、１０ｆｍｏｌ／μＬ〜０．１ｆｍｏｌ／μＬである。実際にキャピラリーに注入される試料体積は約０．０１μＬなので、ＤＮＡ断片の絶対量は１０-18ｍｏｌ〜１０-16ｍｏｌである。この量はＰＣＲ反応で十分増幅可能な量である。従って、キャピラリ電気泳動を用いた分取は十分に実用性がある。
【００７３】
図１１は、分離採取装置のフラクションコレクタの第１の構成例を示す断面図である。図１１に示す構成では、フラクションコレクターの採取用容器として、広く使用されている容積０．２ｍｌのＰＣＲ反応チューブ４９を９ｍｍピッチに配置して使用した。ＰＣＲ反応チューブは、チューブホルダ５１に乗せている。複数のキャピラリーからＤＡＮ断片を採取する場合には、図１１に示す構成を紙面に垂直方向に必要数並べて準備すれば良い。空気圧駆動のシリンダーを１レーン当り２本（５０ａ、５０ｂ）用い、空気圧駆動のシリンダー５０ａで上下（Ｚ軸）方向の駆動を行ない、空気圧駆動のシリンダー５０ｂで前後（Ｘ軸方向）の駆動を行なう。ｘ軸方向の駆動に関しては、短いシリンダーのストロークに対して大きな送りを実現するため、各チューブホルダ５１をスライド架台５２で連結し、１本のチューブホルダ５１を押すと、スライド架台５２全体が移動する構成とした。偶数番目のチューブに所望のＤＮＡ断片を含む緩衝液を採取、奇数番目のチューブに、不要な緩衝液が採取されるように駆動する。予め、各チューブ４９にはミネラルオイル５３を入れておき、移送管１４先端での液切れを良くしている。  図１１に示す構成のフラクションコレクタを、図５の構成の光学セル部と組み合わせた場合には、約２０ｓｅｃ間で約１μＬの緩衝液の採取ができる。予め偶数番目のチューブにＰＣＲ用の緩衝液を入れておくと、採取したＤＮＡ断片が自動的にチューブに入るので、ポリメラーゼやプライマを添加した後、直ちにＰＣＲ反応装置に設置し、ＰＣＲ反応を行なうこともできる。
【００７４】
図１、図４、図６〜図１０、及び図１２に示すフラクションコレクタの採取用容器３５として、ＰＣＲ反応チューブ４９を使用できる。
【００７５】
キャピラリー１０の本数の増加に従い、フラクションコレクターの小型化が望まれる。フラクションコレクターの小型化に従い、容器４９の体積では、不要な緩衝液を保持するに十分でなくなる。
【００７６】
図１２は、分離採取装置のフラクションコレクタの第２の構成例を示す断面図である。図１２に示す構成では、余剰の緩衝液を効果的に処理することが可能である。図５に示す移送管１４は、図１２に示す基板６２に固定されており、移送管１４の先端部に、底部に移送管の外径と略同一で若干大きい内径の細孔５５を持つ液溜め５４を設ける。液溜め５４は、移送管１４が貫通し、スムーズに動くに十分な内径を持つ穴５６を有し、液溜め５４内に、洗浄液として純水を供給する細管５９の先端と、液溜め５４内の緩衝液及び洗浄液を排出する細管６０の先端とが配置され、細管６０はアスピレータにつながっている。
【００７７】
ＤＮＡ断片を採取しない場合には、移送管１４の先端は、液溜め５４内に保持されている水（移送管から流出する緩衝液も含む）の中に浸っている。ＤＮＡ断片を採取するときは、フラクションコレクタ１５が駆動機構６１により持ち上げられ、同時に、液溜め５４もガイド５７ａ、５７ｂに沿って持ち上がる。移送管１４は基板６２に固定されているため、液溜め５４が上昇すると、移送管１４の先端は、細孔５５を抜けてフラクションコレクター１５に保持されている容器３５に入る状態となる。この状態を一定時間だけ保持して、所望のＤＮＡ断片が入った緩衝液を採取する。採取が終了しフラクションコレクターが下がると、液溜め５４は、バネ５８ａ、５８ｂの復元によりガイド５７ａ、５７ｂに沿って下がり元の位置に戻る。水平方向の駆動機構６４によって、所望のＤＮＡ断片が検出されると、容器３５を１つ順に送った後に、駆動機構６１により上記の動作を繰り返す。
【００７８】
洗浄液、又は純水の供給は、可能な限り移送管１４の先端を清浄に保持し、コンタミネーションを防止するためである。アスピレータにつながる細管６０の先端６３ｂの位置は、純水を供給する細管５９の先端６３ａの位置より高くする。先端６３ｂの高さは、細孔５５の大きさに応じて水が漏れない高さに調整する必要がある。図１２に示す構成では、移送管１４の外径を２００μｍとし、細孔５５の径３００μｍのとき、先端６３ｂの高さを細孔５５の位置から測って５ｍｍ以下に調整したところ、細孔５５から液漏れなく、安定した動作が得られた。
【００７９】
図１３は、分離採取装置を用いたＤＮＡ断片（特異的遺伝子）の分離採取の工程の例を示す図である。先ず、１回目の電気泳動により電気泳動パターンを取得する（工程６６）。電気泳動パターンを基に、分離採取条件を設定する（工程６７）。複数の試料を複数のキャピラリーで分析し、図３で示すようなスペクトル（電気泳動パターン）を複数得て、試料間で比較して、特徴的なＤＮＡ断片を選定する。この時、図３に示すようなスペクトル表現は、多数の試料の比較に不向きである。
【００８０】
図１４は、分離採取装置を用いて特異的遺伝子断片を検出するのに好適な画面表示例を示す図である。図１４に模式的に示すように、各レーンのＤＮＡバンドの強度を、例えば、２５６階調の濃淡のバーで表示し並べて、出力装置の表示画面に表示して比較を容易にする。図１４に示す例は、スラブゲルをイメージリーダーで読み取った結果と類似であるが、各キャピラリー毎にマーカーＤＮＡで較正されているため、より精度の高い塩基長の比較ができる。図１４に示す例では、例えば、レーン番号５、及び９には、他のレーン番号には存在しない特徴的なバンド（特異遺伝子）７０、７１が存在する。画面上で、このバンド７０、７１を指定すると、自動的に採取の条件が設定される。
【００８１】
図１３に示すように、分離採取の条件が設定された後に、再度、電気泳動測定を行ない測定中に採取するＤＮＡ断片を判定し（工程６８）、フラクションコレクタを駆動してＤＮＡ断片を採取する（工程６９）。工程６８と工程６９は、各キャピラリー毎に、指定された分離採取すべきピーク数だけ繰り返す。
【００８２】
１回目と２回目の電気泳動測定は、同じ電気泳動条件とすることが望ましいが、塩基長に変換した後のピークパターンが大きく変化しない範囲であれば、泳動条件を変えても良い。特に、１回目は泳動速度を速く、２回目（分離採取時）には泳動速度を遅くして、ゲルによる分離の時間を大きくすることにより、分離の精度を上げるようにすれば、全体として測定時間の短縮ができる。工程６８では、工程６７で指定されたＤＮＡのピークを、電気泳動を行ないながら判断する。この判断の仕方は、１回目の測定データから得た所望のピークの泳動時間やマーカーピークとの泳動時間差を利用できる。また、ピーク数や１回目の測定データとの相関係数を利用する等、ピークパターンから判断することもできる。
【００８３】
図１５は、分離採取装置を用いたＤＮＡ断片の分離採取の所要時間を短縮する工程を示す図である。図１５に示す手順では、図１３に示す分離採取の工程に於いて、ＤＮＡ断片の採取のための２回目の電気泳動中に、印加電圧を変更する工程７２と、採取後に印加電圧を復帰させる工程７３を追加し、ＤＮＡ断片の採取時は、分離精度を上げるため泳動速度を遅く（低い泳動電圧とする）、ＤＮＡ断片の採取以外の時は、泳動速度を速く（高い泳動電圧とする）ので電気泳動分離に要する時間を短縮できる。
【００８４】
図１６は、第３の実施例の分離採取装置であり、ＤＮＡ断片の分離採取の所要時間を短縮可能とする分離採取装置の構成を示す図である。図１６に示す構成では、泳動用の緩衝液漕７４を溝状に複数に分割した構造とし、キャピラリー１０の末端を１本ずつ各溝に配置する。また、電極７５を各溝に配置する。図１５に示す工程７２、及び工程７３では、各キャピラリーで所望のＤＮＡ断片が検出されると、各々独立に泳動電圧を変更する。
【００８５】
変形実施例では、異なる蛍光体で標識した複数の試料を１本のキャピラリーで電気泳動して、一方の試料のみに存在するＤＮＡ断片を検出される蛍光強度の差分から検出して自動的に分離採取することもできる。１回の測定で測定と分取を同時に行なうので、全体の測定時間を短縮できる。ＤＮＡ断片の採取後、データを再度解析して、有意と判断したＤＮＡ断片についてその分画を採取し、ＰＣＲ増幅後、シーケンシングを行なう。
【００８６】
別の変形実施例では、キャピラリー電気泳動で消耗する試料量は、約数１０ｎＬであり、試料注入時に用いる試料溶液の体積（数μＬ）に比較して無視できる量（数１０ｎＬ）であるので、残りの試料を再度用いて別の分析を実行できる。この時、試料の汚染を防ぐため、マーカーＤＮＡと試料ＤＮＡとを混合せず、マーカーＤＮＡと試料ＤＮＡと独立に、図２と同様にしてキャピラリーに注入する。  図１に示すように、分離採取装置には、全てのキャピラリーに共通して注入される分子量マーカー溶液１８’を収納するマーカー容器１６’を保持するマーカーＤＮＡ保持部１２’と、キャピラリー毎に異なる試料ＤＮＡ溶液１８を収納する試料容器１６を保持する試料保持部１２とが配置されている。図２を用いて説明した試料注入操作を、電極２０、２０’を切り換えて２回繰り返して、マーカーＤＮＡと試料とを別々に各キャピラリーに注入した後、電気泳動を行ない、図３に示したような電気泳動パターンを得る。電気泳動パターンの解析時には、必要に応じてマーカーＤＮＡの注入から試料の注入までの時間的なずれを補正する。  更に、別の変形実施例では、以上説明した電気泳動パターンの結果のみを用いて、特異的ＤＮＡ断片を検出した後、特異的なＤＮＡ断片を含む試料のみを選択し、従来技術と同様にして、スラブゲル電気泳動とバンド切り出しにより分離採取もできる。この方法では、完全な自動化は不可能であるが、ＤＤ法の場合、特異的ＤＮＡ断片が得られる試料数は、全ての調製した試料数よりもかなり少ない場合が多いので、従来技術を用いる分離採取のための試料のスクリーニングという実用的な価値がある。
【００８７】
本発明では、ＤＮＡ断片と共に塩基長マーカーが泳動分離され、制御手段は、塩基長マーカーが検出された時刻を基準として分離採取するＤＮＡ断片を判別して、ＤＮＡ断片による検出信号に基いて採取手段を制御して、所望のＤＮＡ断片を他のＤＮＡ断片と分離して採取できる。以下に詳細を説明する。
【００８８】
図１７は、本発明の実施例の分離採集装置の分離採集するＤＮＡ断片を、塩基長マーカーを用いて判定する方法を示す図である。先ず、第１回目の測定によって、マーカーとサンプルを混合するか又は２回に分けてキャピラリーに注入し、マーカーの電気泳動パターン図１７（ａ）と、サンプルの電気泳動パターン図１７（ｂ）とを同時に取得しておく。次いで、再度注入操作を行ない２回目の測定を行なうが、この際には、１回目の測定データを基に、マーカーのピークを参照して分離採集するピークを自動的判定する。図１７（ｃ）、（ｄ）は、それぞれ２回目の測定に於けるマーカーの電気泳動パターン及びサンプルの電気泳動パターンを示す。図１７（ａ）の１００、１０１、１０２はマーカーのピークを示し、１０３、１０４、１０５はサンプルのピークを示す。また、図１７（ｃ）（ｄ）中の１００’、１０１’、１０２’、１０３’、１０４’、１０５’は、２回目の測定で検出されるピークで、それぞれ１回目の測定で検出されたピークに対応する。なお、ピーク１０１は、分離採集を指定されたピーク１０５の時間基準となるピークであり、ピーク１０１’は、分離採集を判定する時間基準となるピークであり、ピーク１０５’は分離採集するピークである。
【００８９】
１回目の測定後、１０５のピークの分離採集が指定された場合には、２回目の測定に於いてマーカーのピーク１０１の検出された時間を基準に、（Ｔ−Ｔ１）、（Ｔ＋Ｔ２）の時間範囲でピークを判定し、コントローラ９（図１）を起動するための信号を発生する。ここで、ピーク判定の時点は、ピークの最高点としても良く、また、予め設定したしきい値を越えた時点等にしても良い。またここで、時間Ｔは１回目の測定によって計測されたピーク１０１と１０５の時間差であり、Ｔ１、Ｔ２は予め設定された値である。Ｔ１、Ｔ２の値はできるだけ小さい方が、所望のピーク１０５以外の混入を防ぐ意味で望ましいが、１回目の測定と２回目の測定の再現性や隣接するピークの分離状態に応じて、通常Ｔの０．５％から５％程度の値を設定する。
【００９０】
また、１回目の測定と２回目の測定とは、泳動条件（ゲルキャピラリーの長さ、分離媒体、泳動電圧）を同一にするのが望ましいが、予め、種々の条件でマーカーの電気泳動パターンを取得しておき、そのデータを利用することもできる。つまり、１回目の測定で得たマーカーピーク１０１と分離採集するピーク１０５の時間差Ｔを２回目の泳動条件に対応する値Ｔ’に変換し、（Ｔ−Ｔ１）、（Ｔ＋Ｔ２）の範囲でピークを判定する。この方法は、１回目の測定で大量のサンプルをスクリーニングし、分離採集したいピークが存在するサンプルのみを選択した後に、２回目の測定を行なって分離採集する場合には、特に有効である。即ち、１回目の測定では、高泳動電圧、短いキャピラリーで高速にピークパターンを取得し、分離採集を行なう２回目の測定では、低い泳動電圧や長いキャピラリーを用いて低速の泳動を行ない高い分離能で分離採集を行なう。従って、分離採集の分離能を損なうことなく、全体としての作業効率を向上できる。
【００９１】
また、図１７に於いて、ピーク１０５の判定の基準には、泳動時間がピーク１０５の直前のマーカーピーク１０１を用いたが、ピーク１０５よりも泳動時間の早いものであれば、例えば、ピーク１００を用いることもできる。
【００９２】
しかし、測定上のノイズや解析処理のスピード等の問題点がない限りは、できるだけ直前のマーカーピークを判定の基準に用いる方が、ピーク１０５の判定間違いを防止できる。
【００９３】
また、図１７（ｃ）に於いて、２回目の測定でのマーカーピークの判定には、予め、種々の測定条件によって測定し保存しておいたマーカーのピークパターンとその泳動時間との対応のデータを用い、所定のマーカーピークが所定の泳動時間範囲に検出されているか否かを判定することにより、ノイズ等の測定上のエラーの影響を少なくして、マーカーピークを正確に認識できる。更に、ＡＦＬＰ法では、ＰＣＲ反応時に末端塩基が選択されているため、予め分離採集すべきピークの塩基長が推定できるような場合もある。この場合には、１回目の測定をしなくても、マーカのピークパターンのデータから容易に所望のＤＮＡ断片のマーカピークに対する遅れ時間Ｔが推定できるため、都合が良い。
【００９４】
以上の説明では、塩基長マーカーを用いて採取手段を制御する方法について説明したが、塩基長マーカーを用いずに採取手段を制御することも可能であり、所望のＤＮＡ断片を他のＤＮＡ断片と分離して採取できる。以下に詳細を説明する。  図１８は、本発明の実施例の分離採集装置の分離採集するＤＮＡ断片を、塩基長マーカーを用いないで判定する方法を示す図である。図１８には、サンプルのピークパターンそのものを基準に分離採集すべきピークを判定する方法を示す。図１８（ａ）、（ｂ）はぞれぞれ、１回目、２回目の測定に於ける電気泳動パターンを示す。１回目の測定に於いて分離採集するピーク１１３を指定すると、同時に分取するピークに先行する基準ピークを１ないし複数（図１８（ａ）中では１１０、１１１、１１２）選定する。なお、ピーク１１３は、分離採集を指定されたピーク、ピーク１１２は、分離採集を判定する時間基準となるピークであり、ピーク１１３’は、分離採集するピーク、ピーク１１２’は、分離採集を判定する時間基準となるピークである。選択した基準ピークを、図１７（ｃ）で示したマーカのピークと同じように扱う。即ち、分取ピーク１１３の直前の基準ピーク１１２との泳動時間差Ｔを用い、２回目の測定（図１８（ｂ））では、基準ピーク１１２が検出された後、経過時間が（Ｔ−Ｔ１）と（Ｔ＋Ｔ２）の間で分取ピーク１１３を判定する。この際、基準ピーク１１２を他のピークと取り違えることなく正確に判定するために、１１０、１１１のピークについても、１回目測定で得たピーク１１０、１１１の泳動時間を用いて、その泳動時間に対して２回目の測定に於いて所定の時間範囲内で検出されたピークを１１０、１１１と判定する。また、マーカーを基準とする方法（図１７）とサンプル自身を基準とする方法（図１８）は併用することも可能であり、ピークパターンに応じて強度が強く且つ隣接するピークとの分離が良いものを選ぶことにより、分取ピークをより確実に判定できる。
【００９５】
【発明の効果】
本発明によれば、特異的な発現遺伝子のＤＮＡを自動的に、且つ必要な分離能で分離採取できるため、遺伝子の発現計測を基礎にした病因遺伝子や機能特異的遺伝子の探索を高効率化できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例の分離採取装置の構成を示す図。
【図２】本発明の実施例の分離採取装置の試料注入部の構成を示す断面図。
【図３】本発明の実施例の分離採取装置で得られた電気泳動パターンの例を示す図。
【図４】本発明の第２の実施例の分離採取装置の構成を示す図。
【図５】本発明の実施例の分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第１の構成例を示す断面図。
【図６】本発明の実施例の分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第２の構成例を示す斜視図。
【図７】本発明の実施例の分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第３の構成例を示す斜視図。
【図８】本発明の実施例の分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第４の構成例を示す斜視図。
【図９】本発明の実施例の分離採取装置の光学セル部、及び移送手段の第５の構成例を示す断面図。
【図１０】本発明の実施例の分離採取装置のＤＮＡ断片検出部の構成例を示す斜視図。
【図１１】本発明の実施例の分離採取装置のフラクションコレクタの第１の構成例を示す断面図。
【図１２】本発明の実施例の分離採取装置のフラクションコレクタの第２の構成例を示す断面図。
【図１３】本発明の実施例の分離採取装置を用いたＤＮＡ断片の分離採取の工程を示す図。
【図１４】本発明の実施例の分離採取装置を用いて特異的遺伝子断片を検出するのに好適な画面表示例を示す図。
【図１５】本発明の実施例の分離採取装置を用いたＤＮＡ断片の分離採取の所要時間を短縮する工程を示す図。
【図１６】本発明の第３の実施例の分離採取装置であり、ＤＮＡ断片の分離採取の所要時間を短縮可能とする分離採取装置の構成を示す図。
【図１７】本発明の実施例の分離採集装置の分離採集するＤＮＡ断片を、塩基長マーカーを用いて判定する方法を示す図。
【図１８】本発明の実施例の分離採集装置の分離採集するＤＮＡ断片を、塩基長マーカーを用いないで判定する方法を示す図。
【符号の説明】
１…レーザー源、２…２次元検出器、３…パーソナルコンピュータ、４ａ、４ｂ…レンズ、５…像分割プリズム、６ａ、６ｂ…バンドパス干渉フィルタ、７…光学セル部、８…緩衝液導入口、９…フラクションコレクタ駆動機構のコントローラ、１０…キャピラリー、１１…緩衝液漕、１２…試料保持部、１２’…マーカーＤＮＡ保持部、１３…試料台、１４…移送管、１５…フラクションコレクタ、１６…試料ＤＮＡを収納する試料容器、１６’…分子量マーカーを収納するマーカー容器、１７…フラクションコレクタ駆動機構、１８…試料ＤＮＡ溶液、１８’…分子量マーカー溶液、１９…高電圧電源、２０…電極、２１…電気泳動緩衝液、２２、２０’…電極、２３…試料の電気泳動パターン、２４…マーカーの電気泳動パターン、２５…光学セル部保持具、２６ａ、２６ｂ…キャピラリー及び移送管の支持具、２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ…支持具２６ａ、２６ｂの光学セル部保持具に対する位置合わせ用ピン、２８…レーザー、２９…光学セルの内部、３０…キャピラリーの位置決め用支持管、３１ａ…移送管１４の補助管（フラクションコレクタ側）、３１ｂ…移送管の補助管（光学セル部側）、３２…移送管内を流れた緩衝液の排出管、３３…光学セル、３４…移送管内を流れる緩衝液の導入管、３５…フラクションコレクタの採取用容器、３６ａ…移送管（採取用）、３６ｂ…移送管（廃棄用）、３７…廃棄用の容器、３８…電極、３９…円錐状部材、４０…ガス導入口、４１…液滴、４２ａ…移送管保持部材、４２ｂ…円錐状部材保持部材、４３…円錐状部材の開口、４４…カバー、４５…溝（移送管から流出する緩衝液の廃棄用流路）、４６…ロッドレンズ、４７…キャピラリーの支持具（オンカラム検出部）、４８…ガラスロッド、４９…採取用チューブ、５０ａ…上下駆動用エアシリンダ、５０ｂ…水平方向駆動用エアシリンダ、５１…採取用チューブのホルダ、５２…架台、５３…ミネラルオイル、５４…液溜め、５５…細孔、５６…孔（移送管１４の貫通用）、５７ａ、５７ｂ…ガイド、５８ａ、５８ｂ…バネ、５９…純水を供給する細管、６０…アスピレータへの配管、６１…上下駆動機構、６２…移送管の固定用部材、６３ａ…純水の供給口、６３ｂ…アスピレータへの吸い込み口、６４…水平方向の送り機構、６６、６７、６８、６９…工程名、７０、７１…特異的なＤＮＡ断片、７２、７３…工程名、７４…緩衝液漕、７５…電極、１００、１０１、１０２…１回目の測定で得られたマーカーのピーク、１０３、１０４、１０５…１回目の測定で得られたサンプルのピーク、１００’、１０１’、１０２’…２回目の測定で得られたマーカーのピーク、１０３’、１０４’、１０５’…２回目の測定で得られたサンプルのピーク、１１０、１１１、１１２、１１３…１回目の測定で得られたサンプルのピーク、１１０’、１１１’、１１２’、１１３’…２回目の測定で得られたサンプルのピーク。
【図１】
0003713970.tif 000002
【図２】
0003713970.tif 000003
【図３】
0003713970.tif 000004
【図４】
0003713970.tif 000005
【図５】
0003713970.tif 000006
【図６】
0003713970.tif 000007
【図７】
0003713970.tif 000008
【図８】
0003713970.tif 000009
【図９】
0003713970.tif 000010
【図１０】
0003713970.tif 000011
【図１１】
0003713970.tif 000012
【図１２】
0003713970.tif 000013
【図１３】
0003713970.tif 000014
【図１４】
0003713970.tif 000015
【図１５】
0003713970.tif 000016
【図１６】
0003713970.tif 000017
【図１７】
0003713970.tif 000018
【図１８】
0003713970.tif 000019