(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムコイド形態およびパーコール勾配で１．０３ｇ／ｃｍ3以下の密度を有し、４μｍ以上の直径を有する莢膜を形成することができ、ならびに６×１０6  Ｄａを超える分子量を有するヒアルロン酸を生産する能力を有するストレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）の超莢膜変異株である単離株であって、
前記超莢膜変移株は、
（ｉ）ストレプトコッカス・エキを変異誘発に付して超莢膜変異株を得る段階、
（ｉｉ）パーコール勾配で１．０３ｇ／ｃｍ3以下の密度においてバンドを形成し、および４μｍ以上の直径を有する莢膜を形成することができる超莢膜変異株を、個別に、ヒアルロン酸の分解を促進する金属イオンを含まずヒアルロン酸の分解を促進する金属イオンをリアクターから放出させない培養培地中に培養する段階、
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において生産されたヒアルロン酸の分子量を測定する段階、ならびに
（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）において６×１０6  Ｄａを超える分子量を有するヒアルロン酸を生産した超莢膜変異株を選別する段階
を含む方法により選別されることを特徴とする
前記単離株。
【請求項２】
前記変異誘発が化学変異誘発である請求項１に記載の単離株。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸が８×１０6  Ｄａを超える分子量を有する請求項１に記載の単離株。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸が９×１０6  Ｄａを超える分子量を有する請求項１に記載の単離株。
【請求項５】
前記培養培地が鉄および銅を含まない請求項１から４のいずれか一項に記載の単離株。
【請求項６】
前記培養培地が５．６から５．９５の範囲のｐＨを有する請求項１から５のいずれか一項に記載の単離株。
【請求項７】
前記株の培養段階が３０℃から３５℃の範囲の温度で行われる請求項１から６のいずれか一項に記載の単離株。
【請求項８】
前記ストレプトコッカス・エキが寒天プレート上にコイドコロニーを形成しおよび液体培地中にヒアルロン酸を生産するストレプトコッカス・エキ亜種エキ（Ｓｒｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ  ｓｓ  ｅｑｕｉ）の株である請求項１から７のいずれか一項に記載の単離株。
【請求項９】
（ｉ）請求項１から８のいずれか一項に記載の単離株を、リアクター中、３０℃から３５℃の温度で、実質的にせん断力のない撹拌条件下、ヒアルロン酸の分解を促進する金属イオンを含まずヒアルロン酸の分解を促進する金属イオンをリアクターから放出させない、および５．６から６．２の範囲のｐＨを有する培養培地中にて培養して、６×１０6  Ｄａを超える分子量を有するヒアルロン酸を生成せしめる段階、
（ｉｉ）段階（ｉ）において生成したヒアルロン酸を培養培地から精製して、６×１０6  Ｄａを超える分子量を有するヒアルロン酸を得る段階
を含む、６×１０6  Ｄａを超える分子量を有するヒアルロン酸を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ストレプトコッカスの超莢膜株（supercapsulated strain）を使用する発酵による高分子量のヒアルロン酸の生産方法に関する。本発明はまた、超莢膜変異株の選別方法、上記のようなヒアルロン酸を高収量で生産する変異株に関する。
ヒアルロン酸（ＨＡ）即ちヒアルロナンは、交互に結合するＤ−グルクロン酸分子とＮ−アセチルグルコサミン分子の繰返し二糖類からなるグリコサミノグルカンである。これらの分子はβ（１，３）−Ｄ結合によって結合し、グルクロン酸に対するグルコサミンの結合はβ（１，４）−Ｄである。
ヒアルロン酸にはいくつかの源があり、その分子量は源によりかなり異なる。関節滑液で見出されるＨＡの分子量は約100〜800万であり、ヒトの臍帯では分子量約360〜450万であり、雄鶏とさかのＨＡは非常に大きい値、例えば1200〜1400万まで又はもっと大きいこともあり得る。ヒアルロン酸の化学組成は、その源にかかわらず同一であり、ヒアルロン酸は非免疫原性であるので、医学においていくつかの適用がある（BrimacombeとWebber(1964)。ＨＡの有効性は、分子量に相関する弾性特性と粘性特性の独特の組合せの結果である。そのため、早くからできるだけ高分子量を得ることに関心があった。
それ故、文献には、非常に高分子量のＨＡの多数の例があるが、これらの値は、非常にしばしば源の原料に関する値である。しかし、雄鶏のとさかのような生物システムで生産されるＨＡは、タンパク質及び、例えばコンドロイチン硫酸などの他のグリコサミノグリカンに結合しているので、広範囲にわたって精製する必要があるということに注意すべきである。非常に高性能の精製及び滅菌方法が開発されたとしても、これらの工程で分子量が減少し、大部分の場合に、最終生成物の分子量がかなり小さいことは不可能である。
現在、市販の主要なＨＡ製品は、分子量が約350万のHealon▲Ｒ▼（ファルマシアＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）である。この製品は、米国特許第4141973号の開示内容に基づく方法により雄鶏とさかから調製される。同一源から、分子量約500万のＨＡ製品Healon▲Ｒ▼ＧＶ（ファルマシＡＢ）が調製される。これらの分子量は滅菌製品の分子量であり、このことは、滅菌工程前の製品は、それぞれの分子量が約500万、約700万であるに違いないことを意味する。
例えば眼科などのいくつかの医学的処置におけるＨＡの有用性が十分に証明されているにもかかわらず、高分子量のＨＡ製品はほとんど市販されていない。この理由の一つは、恐らくは上記の源、特に雄鶏とさかからＨＡの分子鎖をあまりに大きく分解させずに純品を得るために複雑な精製方法が必要だからである。それ故、よく制御され、簡単な精製方法が適用できる代替の源又は生産システムが必要である。
種々の細菌システムにおけるＨＡ生産に関する多数の論文と特許出願が発行されてきた。ＨＡのバイオテクノロジーによる生産における細菌の使用が、いくつかの理由、即ち技術的、経済的、倫理的理由から提唱されてきた。Streptococcus種による生産が50年以上前から知られたが、開示されたシステムの大部分はストレプトコッカスのＡ群とＣ群に関するようである。例えば、ヒトの病原体であるStreptococcus pyogenes（Ａ群）の莢膜株（Kendallら，（1937））、動物の病原体であるStreptococcus equiとStreptococcus equisimilis（Ｃ群）の莢膜株である。これらの病原体における主要な莢膜多糖としてのヒアルロン酸の合成は、宿主防御を逃れる一つの方法である（Robertsら(1989)）。
細菌におけるＨＡ合成の生化学によると、今までに知られている限りは２つの遺伝子の作用がある。即ち、内在性膜タンパク質であるシンターゼをコードするＡであり、ＵＤＰ−グルコースをＵＤＰ−グルクロン酸に変換するＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＢである。更に、ＵＤＰ−グルコースはＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンに変換される必要がある。後者は細胞壁生合成に必要である（Doughertyとvan de Rijn(1992,1993)及びde Angelisら(1993)参照）。合成の制御、例えば何がＨＡ合成を開始させ、何がＨＡ合成を終了させるのかについてほとんど知られていない。しかし、合成の化学量論によりフィード(feed)と培地の組成のある種のガイドラインが与えられる。
細菌によるＨＡ生産システムの開発に関する努力は、細菌の選別と適当な培養培地に集中してきた。莢膜中の実際の分子量はやや大きいかも知れないということが文献に記載されているけれども（van de Rijn(1983)参照）、莢膜野生型株は、発酵培養液に約500万を超える分子量のＨＡを放出しないことは早くから明白であった。しかし、特許を含む文献と市販のサンプルから判断すると、細菌生産ＨＡの分子量は、現在雄鶏とさかから生産されるものよりずっと小さい（上記参照）。文献に示される高分子量値（所望の結果を表す）と実際に得られた値にしばしば非常に明白な差があるということを更に注意すべきである。
細菌システムで得られた最大値は約400万であるようである。例えば、米国特許第4784990号（Bio-Technology General）200〜350万のＨＡ、国際公開第9208799号（Fermentech）100〜300万のＨＡ、日本特許第2058502号（Chisso Corp）200〜300万のＨＡ、日本特許第63129991号と第63028398（電気化学工業(株)）200〜400万のＨＡ、欧州特許第144019号（Miles Laboratories,Mobay Chemical Corp）200〜400万のＨＡを参照。
更に、上記の値は、滅菌されなかったＨＡ産物に関するということを注意すべきである。それ故に、これらの原料は、滅菌後、上記のHealon▲Ｒ▼製品と同等の分子量を有するＨＡ製品の製造に使用できないことは明白である。
ストレプトコッカスの全ての株は耐気性嫌気性生物である。即ち、酸素の存在下で生育できるが、電子受容体として酸素を利用できない。それ故、空気の重要性に関する、先行論文と特許における考察又は推測は、ＨＡ生産について決定的に重要なパラメーターを与えないように考えられる。
ＨＡ生産の適切な培地と条件は、生産に関する論文の大部分で考察されている。この分野の特許又は特許出願の更なる例として、日本特許第63141594号と第63123392号（電気化学工業(株)）、米国特許第4897349号（MedChem Products Inc）を挙げることができる。
上記の多数の刊行物にかかわらず、高分子量のＨＡ産物のための有効な細菌による生産システムの必要性が依然としてある。この関連での、“高分子量”は600万を超える値、特に800万を超える値、とりわけ900万を超える値又はより大きい値を意味する。何故ならば、このような原料は、Healon▲Ｒ▼ＧＶ型製品の製造に適しているであろうからである。
本発明者は今や、高分子量のＨＡがストレプトコッカスの超莢膜変異株により生産されることを発見した。本発明の一面は、発酵システムにおける上記のような株の使用であり、次に精製して、分子量が600万を超える、特に800又は900万を超えるＨＡを得ることである。
本発明の別の一面は、適切な超莢膜細菌株の調製と選別である。
実験は主に、寒天プレートでムコイドコロニーを形成し、液体培地でＨＡを生産する野生型S.equi ss equi ＣＣＵＧ 22971に基づいた。この種から、無莢膜対照変異株と超莢膜変異株を得た。パーコール勾配で、無莢膜変異株は密度1.09ｇ／cm3、ムコイド野性型は密度1.05ｇ／cm3、超莢膜株は密度1.03ｇ／cm3未満、より正確には約1.03-1.02ｇ／cm3でバンドを形成した（明細書の実験の部分を参照）。
本発明で使用する細菌株はストレプトコッカスであり、特にＡ群及びＣ群のストレプトコッカスであり、更に特に、最適条件下での生育中の細胞の位相差顕微鏡とインジアインク染色から判断して莢膜野生型株の大きさの少なくとも約２倍の莢膜を有する超莢膜種であって、密度1.03ｇ／cm3以下、例えば1.02-1.03ｇ／cm3の範囲でバンドを形成し、600万を超える、特に800万を超える又は最も好ましくは900万を超える分子量のＨＡを生産するStreptococcus equi ss equiの変異株である。
該細菌株の生産方法は、ランスフィールドのＣ群ストレプトコッカスの野生型株、例えば現在最も好ましい株、S.equi ss equi ＣＣＵＧ 22971などの細菌株を変異誘発させ、特に固体培地で化学変異誘発させる段階を含む。この方法は、液体培地でのより煩わしい変異誘発方法を避け、莢膜はまた変異原性で毒性の化学物質に対して保護するという点で超ムコイドコロニーの生育を促進し、密度勾配中での超莢膜細胞のより小さい密度によって密度勾配において最終的に富化（enrichment）及び選別を促進する。Streptococcus equiは、いくつかの他の化膿性で溶血性のストレプトコッカスと共に現在分類されるウマの病原菌であり、ランスフィールドＣ群に属する。ヒト又は動物に病原性の他のＣ群ストレプトコッカスは、主に炭水化物発酵パターンからS.equisimilis又はS.zooepidemicusとして分類されている。これらの株の分類学的関係は、今まで満足のいくように研究されなかった。それらは、Berger's Manual of Systematic Bacteriology第１版でタクソンStreptococcus種として分類されただけである。対照的に、S.dysgalactiaeはα−溶血性であり、正当な種として認められた。それは、S.equisimilisと最も関係が深い可能性がある。S.zooepidemicusはS.equiの亜種ということがまた提案された。それ故、Streptococcus equiはS.equi ss equiと命名されるべきである。
ＨＡの生産方法は以下の段階を含む。（ｉ）600万を超える、特に800又は900万を超える分子量のＨＡを生産する能力を有する超莢膜ストレプトコッカス株を選別する段階、（ii）温度35℃以下、好ましくは30〜35℃の範囲で、特に31〜33℃で、ｐＨ値約6.2以下、例えば5.6〜6.2、好ましくは5.80〜5.95の範囲で適切な培地の存在下、バイオリアクターで該株を培養する段階、（iii）粗混合物から生成物を精製する段階。
使用する培地は、ヒアルロン酸の連続的合成を可能としなければならないし、細胞の生育速度を最適化しようと試みるならば現れる非莢膜細胞を選別してはいけない。培地は、鉄及び銅イオンなどのＨＡの分解を促進するいずれの金属イオンを含むべきでないし、リアクターから放出させるべきでない。
一般的に、培地の組成は２つの必要条件を満たすべきである。即ち、（ｉ）ストレプトコッカスの細胞の構築のために基本元素（Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｈ，Ｐ，Ｓ）と必要な生長因子を正しい割合で供給すること、及び（ii）十分な量と正しい割合でＨＡ合成のための元素と化合物を供給すること。フィード（feed）の組成も必要条件（ii）を満たすべきである。生育培地の組成は微生物細胞の組成から、フィード組成はＨＡ合成の化学量論から計算された。発酵槽培養の基本的液体培地を表Ｉに示す（下記の実験部分も参照）。
0003720361.tif 000002
リアクターには、広範囲の乱流を起すいかなる型のバッフルも内部構成部材も装着させるべきでないし、撹拌は、例えば、せん断力を発生させないでよく混合できる気体上昇又は他のタイプの回転翼（impeller）によって非常に温和な方法でされねばならない。このことは、非常に高い分子量を得るために決定的に重要であるが、米国特許第4784990号での勧告“強く撹拌しながらストレプトコッカス属の微生物を生育させること……”に反している。
種々の代替の培養法を試験し、例えばバッチ培養、流加培養、半連続流加培養、連続培養が有効であることが知見された。
培  地
使用した標準寒天プレートはBlood Agar,ＢＡ（the Central Bacteriological Laboratory，ＬＵにおいてウマ血液から調製）、Bacto Todd Hewitt Agar，ＴＨＡ（Difco）、及びバクトトリプトン（Difco）10ｇ／ｌ、バクト酵母エキス（Difco）１ｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム（Merck，PA）1.6ｇ／ｌ、炭酸水素ナトリウム（Merck，PA）2ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（Merck，PA）0.1ｇ／ｌ、バクトアガー（Difco）20ｇ／ｌ、スクロース（BDH）8ｇ／ｌから作製されたＴＹＳＡであった。初めの試験用の液体培地は、上記のバクト酵母エキスを補充したTodd Hewitt Broth（Difco）であった。
変異誘発
ニトロソグアニジン（Sigma）による化学変異誘発（Cerda Olmedo IE及びHanwalt PC(1968)）を使用した。野生型株をＴＹＳＡプレートに塗り広げた。ニトロソグアニジンの数個の結晶を中心に置いた。インキュベーション後、透明な阻害ゾーンがニトロソグアニジンの結晶のまわりで明白であった。ゾーンの端に近接しているところで生育しているムコイドコロニーを選別し、それについて更なる試験を行なった。
勾配遠心分離
ＴＨＢ中での生育後、該生物を遠心分離で回収し、0.15Ｍ塩化ナトリウムで一度洗浄し、塩化ナトリウムに再懸濁した。0.15Ｍ塩化ナトリウム中の25-50％パーコール10mlを固定型アングルローターで15000gav、４℃で30分間遠心して、パーコール勾配を予め形成した。密度マーカービース（Pharmacia LKB Biotechnology AB,ウプサラ、スウェーデン）を内部密度値標準として加えた。細胞懸濁液50μｌを予め形成された勾配液の各々に加え、その後スイングローターで500〜16000gav、４℃で20分間遠心した（Percoll:Methodology and applications.Pharmacia Laboratory Separation Division）。
ＨＡ分子量の評価
ルーチンに使用した方法の一つは、雄鶏とさかから調製した種々の分子量のＨＡ参照品（Pharmacia Ophthalmics）を使用する比較電気泳動を含む。約1.1-1.2mg／ml含むように参照品を希釈し、フリーザー中に−20℃で保存した。0.7-0.9％アガロースを使用して、ゲルを作製した。緩衝液はリン酸−EDTA（2000ml、10倍濃縮液はＮａ2ＨＰＯ4 57.5ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4 13.1ｇ、Ｎａ2ＥＤＴＡ 3.7ｇを含む）であった。参照品とサンプルをブロモフェノールブルー／グリセロールと混合し、ゲルにかけた。20mAの一定電流で、サンプルをウェルからゲルに進入させ、その後約20時間、30Ｖの一定電圧をかけて、ゲル電気泳動を行った。最後にゲルをトルイジンブルーＯ溶液（0.4％）で30分間染色した。ゲルを３％ＨＡｃで15分間、１％ＨＡｃで15分間（３〜４回）脱色した。
使用した別の方法はSEC-Lalls（サイズ排除クロマトグラフィー−低アングルレーザー光散乱）であった。約600万まで上記２つの方法でよく一致し、より大きい値では変動は約10％であった。
超莢膜株
高分子量ヒアルロン酸の生産に好ましいシステムを選別するために、上記の段階を含む多数の一連の実験を行ない、基本的段階は超莢膜化する必要のある細菌の選別であることが知見された。この特徴は勿論種々のパラメーターを使用して記載できるが、本発明者らは、本発明の株の定義として選別株がバンドを形成する密度値を使用することに決めた。上記のように該株は密度1.03ｇ／cm3以下、例えば1.02-1.03ｇ／cm3の範囲でバンドを形成する。勿論この定義は、密度勾配遠心分離以外の方法を株の選別のために使用する場合にも有効である。
超莢膜株はまた、高度にムコイド性のコロニー形態を有する。８ｇ／ｌスクロースを含むＴＹＳＡに塗布したときは、非常に大きな（直径＞＞５mm）ねばねばしたコロニーが生育する。位相差顕微鏡で測定すると、莢膜の厚さは、莢膜株よりも超莢膜株の場合にずっと大きい。細胞の直径は1.0±0.2μmであるが、莢膜の直径は＞＞４μmである。以下で更に考察する２つの超莢膜株であるＨ22とその誘導株Ｈ22ＮＯは両方とも非溶血性であり、それぞれ約750万と約950万までの分子量のＨＡを生産することが知見された。
本発明の超莢膜化は更に、細胞丸ごとの近赤外スペクトルの多変量データ解析で測定できる。本方法のサンプルの解析は周知の技術であり、例えばJolliffe IT(1986)、Massartら（1990）、Boxら（1978）、Mark及びWorkman（1991）、Marshall及びVerdun（1990）、Kalias及びLang（1994）を参照されたい。
第１主要コンポーネント（the first principal component）（PC1）は莢膜化の程度に関連する。ＣＣＵＧ 23255、ＣＣＵＧ 27365、ＣＣＵＧ 27366（ここでは参照株という）などの弱莢膜株で測定した第１主要コンポーネントと比較して、超莢膜株は、0.4以上、好ましくは0.5より大、特に0.7より大の第１主要コンポーネントを有する。この主要コンポーネントの絶対値は株のタイプに依存する。試験すると、変異株Ｈ22（下記）は第１主要コンポーネント0.3±0.1を有し、Ｈ22ＮＯの対応値は＋0.4±0.05であった。同一の実験条件下、参照株のPC1は−0.2〜−0.3であった。
サンプル調製は、37℃で血液寒天での生育、数個のコロニーの0.9％、ＮａＣｌ  1.5mlへの溶解、その後、細胞懸濁液  100μｌを対物レンズ上で25×25mmに広げ、クリーンベンチで乾燥することを含む。ＮＩＲスペクトルは、InfraAlyzer 500、Bran & Luebbeを使用して反射率モード（1100-2500nm）で集めた。
実施例１
超莢膜変異株S.equi ss equi Ｈ22株を、大きな表面積をもつ改変回転翼を装えたBraun Melsungen発酵槽中の培地1000ml容量での流加培養で培養した。培養温度は33℃で、炭酸ナトリウム溶液の添加によりｐＨを6.0に維持した。対数期の初め（4時間目）にフィードを開始し、３時間続けた。フィード速度は希釈速度Ｄ＝0.02ｈ-1に対応した。このフィード速度は、他の実験で知見された最大分子量のためには最適ではない。培地組成は上記表Ｉのものであった。フィードはスクロース25ｇ／ｌ、グルコース10ｇ／ｌ、マンノース0.1ｇ／ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 ３ｇ／ｌ、酵母エキス４ｇ／ｌを含んでいた。
0003720361.tif 000003
実施例２
S.equi ss equi Ｈ22株を、以下のトリプトンをベースとした培地（濃度ｇ／ｌ）を用いて、温度37℃で空気上昇型リアクターで培養した。
0003720361.tif 000004
生育が始まった時、以下の組成物（濃度ｇ／ｌ）の“フィード”を加えた：酵母エキス（3）、トリプトン（8）、Ｋ2ＨＰＯ4（5）、スクロース（350）。
フィード容量は1100mlで、それを10時間で加えた。リアクターの操作容量は4500mlで、それをレベルチューブ（level tube）に連結し高速で作動するポンプにより一定に維持した。半連続培養操作の時間中、２Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3の添加によりｐＨ値を7.1に保った。それから空気を止め、主にＨＡ分解をモニターするために、リアクター中の変化を更に24.5時間追跡した。最も興味深いパラメーターの解析により、次の結果を得た。
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それ故、フィード速度もｐＨも、高分子量生成に最適ではなかったけれども、分子量は600万を超えた。
実施例３：超莢膜株Ｈ22ＮＯの連続培養研究
本実験では、温度33℃、ｐＨ6.0、一定の希釈速度0.10ｈ-1を使用した。本実験で使用した、各種の定常状態での培地を以下のように変化させた。
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連続培養の結果は次の通りであった。
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各種の定常状態の分子量は大きく、最大値は9.1ＭＤａであったことが結果から明白である。この特定例の収量はかなり小さかったが、他の一連の実験では、最高約350mg／ｌが達成された。リン酸レベルを増加させてもより高収量は得られないが、代わりに分子量の増加が観察される。このことは、収量と分子量の間に逆の関係がしばしばあるという知見を証明している。
培養の１週間の間、該株は安定に非溶血性であった。
新規超莢膜株が、以前に細菌システムで達成されたものよりずっと大きい分子量のＨＡを生産できることは、上記の実験から明白である。それ故、ＨＡ生産の非常に有望な道具が開発された。
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