(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＢ12を生産する能力を有するリゾビウム コバラミノゲヌムを培地に培養し、ビタミンＢ12を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするビタミンＢ12の製造法。
【請求項２】
培地がコバルト化合物を含有する請求項１記載の製造法。
【請求項３】
コバルト化合物がハロゲン化コバルトである請求項２記載の製造法。
【請求項４】
培地が５，６−ジメチルベンズイミダゾール化合物を含有する請求項１記載の製造法。
【請求項５】
リゾビウム コバラミノゲヌムがリゾビウム コバラミノゲヌム２７Ｂ７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４４２９）である請求項１記載の製造法。
【請求項６】
ビタミンＢ12を生産する能力を有するリゾビウム コバラミノゲヌム。
【請求項７】
ビタミンＢ12を生産する能力を有する微生物リゾビウム コバラミノゲヌム ２７Ｂ７４株（ＦＥＲＭＢＰ−４４２９）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、悪性貧血、神経疾患、メチルマロン酸尿症の治療薬などに利用され、そのほか、家禽及び／又は家畜の飼料添加物として広く利用されているビタミンＢ１２の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＢ１２の製造法に関しては、その構造の複雑さの故に、化学合成法を用いることは工業的には困難であり、現在のところ微生物による発酵製造法が用いられている。
微生物によるビタミンＢ１２の生産に関しては、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、メタノバチルス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属〔イー・ジェイ・バンダメ（Ｅ．  Ｊ．  Ｖａｎｄａｍｍｅ），  バイオテクノロジー  オブ  バイタミンズ  ピグメンツアンド  グロース  ファクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ，  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ），エルセビアー  サイエンス  パブリッシャー  エル  ティ  デー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  ＬＴＤ），１９８９，２６１−２６３頁〕、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属（特開昭５２−９４４９８）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属（特開昭５０−１３２１８６）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）属（特開昭６０−１６５９７）、ブチリバクテリウム（Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開昭６２−４４１９７）、シュードノカルジア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属（特開昭５５−９６０９１）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属（特開平１−２５７４９０）、ユウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開昭６２−４４１７２）、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開昭６２−１２２５９３）などが報告されている。さらにリゾビウム  メリロッテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、リゾビウム  ファゼオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｐｈａｓｅｏｌｉ）、リゾビウム  ジャポニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、リゾビウム  トリフォリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｉｆｏｌｌｉ）、リゾビウム  レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の各種が、  ビタミンＢ１２を蓄積することが報告されている〔プラント  フィジィオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），３８，９９−１０４（１９６３）〕。
上記リゾビウム属菌種の中で、リゾビウム  ファゼオリおよびリゾビウム  トリフォリは、リゾビウム  レグミノサルムに改称されている〔（財）発酵研究所、リスト  オブ  カルチャーズ（Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｃｕｌｕｔｕｒｅｓ）１９９２  マイクロオルガニズムス（Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ），９版，１６９頁参照〕。また、リゾビウム  ジャポニカムの一部は、リゾビウム  レグミノサルムに改称され、残りはブラディリゾビウム  ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）に再分類されている〔（財）発酵研究所、リスト  オブ  カルチャーズ（Ｌｉｓｔ  ｏｆ  Ｃｕｌｕｔｕｒｅｓ）１９９２  マイクロオルガニズムス（Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ），９版，１６９頁参照〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、一般に微生物によるビタミンＢ１２の生産量はきわめて低いものとなっている。また、一部の微生物においては、利用できうる炭素源が限定されていたり（メタノール資化性菌など）、嫌気条件など特殊な培養条件を必要としたり（プロピオン酸菌、アセトバクテリウム属、メタン生成菌など）、増殖速度が低いために長時間の培養時間を必要とする（メタン生成細菌、プロピオン細菌など）など、工業的製造法としては限定された条件でのみ可能なものが多く、更に改良された工業的製法の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、安価かつ効率的なビタミンＢ１２の工業的製造法を提供するものである。  本発明者らは、一般に発酵生産に広く用いられているグルコース、シュクロースなどを炭素源とし、かつ、同じく一般に広く用いられている発酵生産条件である通気撹拌培養法を用いて、ビタミンＢ１２を効率よく発酵生産する方法を開発するために、新たに高いビタミンＢ１２の生産能を有する新種菌株リゾビウム  コバラミノゲヌム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｏｂａｌａｍｉｎｏｇｅｎｕｍ）２７Ｂ７４を兵庫県の土壌から分離し、さらに鋭意研究を重ね、得られた知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、
（１）ビタミンＢ１２を生産する能力を有するリゾビウム  コバラミノゲヌムを培地に培養し、ビタミンＢ１２を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするビタミンＢ１２の製造法、
（２）培地がコバルト化合物を含有する前記（１）記載の製造法、
（３）コバルト化合物がハロゲン化コバルトである前記（２）記載の製造法、
（４）培地が５，６−ジメチルベンズイミダゾール化合物を含有する請求項１記載の製造法、
（５）リゾビウム  コバラミノゲヌムがリゾビウム  コバラミノゲヌム  ２７Ｂ７４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２９）である前記（１）記載の製造法、
（６）ビタミンＢ１２を生産する能力を有するリゾビウム  コバラミノゲヌム、および
（７）微生物リゾビウム  コバラミノゲヌム  ２７Ｂ７４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２９）に関する。
【０００５】
本発明において、ビタミンＢ１２は、補酵素型ビタミンＢ１２〔例、アデノシルコバラミン，メチルコバラミン（メチル型コバラミン）〕、シアノ型ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）またはヒドロキソ型ビタミンＢ１２（ヒドロキソコバラミン）のいずれであってもよい。
土壌中より分離した優れたビタミンＢ１２生産能を持つ、リゾビウム  コバラミノゲヌム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｏｂａｌａｍｉｎｏｇｅｎｕｍ）２７Ｂ７４（ＩＦＯ  １５５４３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２９）の形態学的性質、各培地における生育状態及び生理学的性質等について以下に示す。
（Ａ）形態学的性質（肉汁寒天培地で、２８℃、２４時間生育した場合）
１．細胞の形態  ：桿菌
２．細胞の大きさ：０．５−０．８μｍ×１−２．８μｍ
３．胞子の有無  ：なし
４．運動性      ：あり
（肉汁液体培養、２８℃、１６時間生育後の観察）
５．グラム染色性：陰性
６．抗酸性      ：なし
（Ｂ）各培地における生育状態
【表１】
0003611881.tif 000002
（Ｃ）生理学的性質
【表２】
0003611881.tif 000003
（Ｄ）各種糖類の利用性
【表３】
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【０００６】
また、上記糖類からのガス及び酸の生成は１４日間培養後認められなかった。
以上に掲げた各性質をバージーズ（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ）  マニュアル  オブ  システマティック  バクテリオロジー（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１版（１９８４）の記載をもとに分類したところ、これらの菌はリゾビウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）菌であると同定した。この菌について、ＤＮＡのＧＣ含量を求めたところ、６３．４％であった。さらに、キノン類の抽出及び分析を行った結果、すべて、コエンザイムＱ−１０を持っていた。また、菌体脂肪酸組成の結果は、ヒドロキシ脂肪酸として、３−ヒドロキシ脂肪酸１４：０、１６：０、１８：０（炭素数：二重結合数）を有しており、その割合は、６６：１７：７であった。直鎖脂肪酸は、１６：０、１８：０、１８：１を有しており、１８：１が最も多かった。リゾビウム属の多くは上記のような菌体脂肪酸組成を示すことはすでに知られている。しかし直鎖脂肪酸２１：１及び１９：０を同定株は有していないこと、またＬ−アラビノースから酸の生成が認められない点において従来知られているリゾビウム属細菌とは性質が、異なっている。さらに、ＤＮＡホモロジー解析をエザキ（Ｅｚａｋｉ）らの方法〔エザキ  エト  アール（Ｅｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．），  インターナショナル  ジャーナル  オブ  システマティック  バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），３９，２２４−２２９（１９８９）〕により、従来より知られているリゾビウム属保存株と比較して行った。その結果を以下に示す。
【０００７】
【表４】
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２７Ｂ７４株は、いずれの株とも同一種としての相同性を示さなかった。従って本株をリゾビウム属に属する新種菌株であると結論し、該種名をコバラミノゲヌム（ｃｏｂａｌａｍｉｎｏｇｅｎｕｍ）と称することとした。本明細書において、ＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号）への寄託番号、また、ＦＥＲＭ  ＢＰ番号は工業技術院生命工学技術研究所（ＦＲＩ  茨城県つくば市東１丁目１番３号）へのブタペスト条約に基づく寄託番号である。
リゾビウム  コバラミノゲヌム  ２７Ｂ７４は１９９３年９月２日にＩＦＯへ受託番号ＩＦＯ  １５５４３、１９９３年９月２９日にＦＲＩへ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２９としてそれぞれ寄託されている。
【０００８】
上記のようにして得られたビタミンＢ１２生産菌の培養には、通常の微生物の培養と同様の方法が用いられる。すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機物、金属塩、あるいは、酵母エキス、酵母菌体、リボ核酸などの物質などのほかに、必要に応じてアミノ酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用いられる。例えば炭素源としては、グルコース、シュークロス、マルトース、ソルビトール、でんぷん、でんぷん糖化液、糖蜜などの炭水化物、ピルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸などの各種有機酸、エタノール、メタノールなどのアルコール類、ベタイン、コリン、モノエタノールアミンなどのアミン類などが用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーンスチープリカー、大豆粉、尿素などの有機窒素源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩や、アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素源が、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。その他の栄養源としては、酵母エキス、酵母菌体、リボ核酸などの物質などのほかに、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩などの無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。さらに、培地には、必要に応じてシリコンオイルなどの消泡剤、ポリアルキレングリコールエーテルなどの界面活性剤などを添加することができる。また、ビタミンＢ１２の前駆体としてコバルト化合物、または５，６−ジメチルベンズイミダゾール化合物を加えることが好ましい。これらの化合物により培地中のビタミンＢ１２の収量が増大する。コバルト化合物は、コバルト源またはその前駆体であればいずれも用いられる。コバルト化合物としては、例えばハロゲン化コバルト（例、塩化コバルト，臭化コバルト等）、硝酸コバルト、硫化コバルト、酢酸コバルト、硫酸アンモニウムコバルト、炭酸コバルト、４−シクロヘキシル酪酸コバルト、２−エチルヘキサン酸コバルト、水酸化コバルト、リン酸コバルト、酸化コバルトまたはチオシアン酸コバルト等が挙げられる。また、５，６−ジメチルベンズイミダゾール化合物は、５，６−ジメチルベンズイミダゾール源またはその前駆体であればいずれも用いられる。５，６−ジメチルベンズイミダゾール化合物としては、例えば５，６−ジメチルベンズイミダゾール、ニコチンアミド、ニコチネートアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮａＡＤ）、ニコチネートモノヌクレオチド（ＮａＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）またはニコチン酸等が挙げられる。
【０００９】
培養は通常、好気的条件下に行われる。具体的には、例えば振とうあるいは通気撹はん深部培養等により行われる。培地のｐＨは通常約４ないし９の範囲が好ましい。培養中にｐＨの変動が観察される場合には、これを好ましい範囲に修正するために、酸（例、硫酸，塩酸，酢酸等）、アルカリ（例、炭酸カルシウム，水酸化ナトリウム，アンモニアガス，アンモニア水等）を適宜添加してもよい。培養温度は、通常約２０℃ないし４５℃の範囲から使用される微生物の生育及びビタミンＢ１２の蓄積に好適な温度が選択される。培養は実質的にビタミンＢ１２蓄積量が最大になるまで行われるが、通常約２日間ないし１０日間の培養で目的を達することができる。
リゾビウム  コバラミノゲヌムに属するビタミンＢ１２生産菌は、他の細菌の場合と同様に、たとえば紫外線、放射線などの照射、単細胞分離、種々の変異処理、その他の慣用の手段により変異させることができ、このような変異株あるいは自然に得られる突然変異株であっても、上記した分類学的性状との比較において実質的に別種とするに足らず、しかもビタミンＢ１２を生産する能力を有するものは、すべて本発明方法に利用し得る。
【００１０】
培養物からビタミンＢ１２及びビタミンＢ１２各成分を分離、採取するにはすでに公知にされている通常の精製手段、例えば、フェノール、ブタノールなどを用いた溶媒抽出法や、沈殿法、イオン交換樹脂やシリカゲル、活性炭などによるクロマトグラフィー法などの分離精製法が用いられる〔ジェイ  フローレント  アンド  エル  ニネット（Ｊ．  Ｆｌｏｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｎｉｎｅｔ），バイタミン（Ｖｉｔａｍｉｎ）Ｂ１２ミクロービアル  テクノロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  エイチ  ジェイ  ペプラー  アンド  デー  パールマン（Ｈ．  Ｊ．  Ｐｅｐｐｌｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｐｅｒｌｍａｎ）編，アカデミック  プレス  エヌ  ワイ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．），４９７−５１９頁（１９７９年）〕。
さらに具体的には、例えば、培養物を遠心分離して、菌体を得た後、無機酸（例、塩酸，硫酸等）または有機酸（例、酢酸，酒石酸等）を用いることによりｐＨを約５．０に調整後、シアンイオンを添加して加熱することによりシアノ型として水中へ抽出する。また、ビタミンＢ１２をメチル型または補酵素型として得る場合には、常法により菌体から暗所でアルコール類（例、エタノール，プロパノール等）、ケトン類（例、アセトン，メチルエチルケトン等）などを用いて抽出する。菌体よりビタミンＢ１２を抽出するとき、所望により菌体を自体公知の方法により破砕することも有効である。
【００１１】
【実施例】
以下の実施例により、本発明についてさらに具体的に説明する。実施例中の％および比は特にことわりのない限り、容量％および容量比をそれぞれ示す。
実施例１
１％（重量％）ショ糖を含んだ肉汁液体培地５ｍｌを、綿栓付試験管に分注した後、加熱殺菌した。この培地に予め肉汁寒天培地上で３０℃、３日間生育させたリゾビウム  コバラミノゲヌム２７Ｂ７４（ＩＦＯ  １５５４３、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２９）を一白金耳量接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。〔表５〕に示す組成の培地２０ｍｌを２００ｍｌ容フラスコにいれ加熱滅菌した後、これに上記培養物１．０ｍｌを接種し、毎分２３０回転のロータリーシェーカー上で３０℃、６日間培養した。
上記と同様の方法で得られた培養物１リットルから遠心分離により菌体を集めた。得られた菌体を酢酸バッファーに懸濁してｐＨ５．０に調整し、さらに、これにＫＣＮを最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように添加した後、１００℃、１５分加熱した。冷却後、遠心分離により沈殿物を除き、ビタミンＢ１２抽出液を得た。抽出液のビタミンＢ１２量を高速液体クロマトグラフィー法で定量した。カラムはＯＤＰ−５０  ４．６×１５０ｍｍ（旭化成社製）を使用し、カラムからのビタミンＢ１２の溶出には、４０ｍＭ酢酸アンモニウム：アセトニトリル＝８８：１２を用いた。また溶出液中のビタミンＢ１２含量は、３６１ｎｍにおける吸光度の測定により求めた。その結果、上記培養物には、２２μｇ／ｍｌのビタミンＢ１２が生成していたことが認められた。
次に上記のビタミンＢ１２抽出液を活性炭カラムにかけて、ビタミンＢ１２を吸着させた。カラムを蒸留水により洗浄した後、吸着物を４０％アセトンで溶出した。ビタミンＢ１２画分を集めて、減圧下に濃縮した後、ダウエックス５０のカラムにかけた。カラムを水洗した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）により吸着物を溶出した。ビタミンＢ１２画分を集めて、中和した後、再度活性炭カラムにかけた。カラムを蒸留水により洗浄した後、吸着物を４０％アセトンで溶出した。ビタミンＢ１２画分を集めて減圧下に濃縮した後、これにアセトンを加えて、ビタミンＢ１２を晶出させたところ、１６．５ｍｇのビタミンＢ１２（シアノ型）結晶が得られた。
【００１２】
【表５】
0003611881.tif 000006
【００１３】
実施例２
補酵素型でビタミンＢ１２各成分を得るために、実施例１で得られた培養物１リットルから遠心分離により菌体を集めた。暗所でエタノール（ＣＮ無添加）濃度が８０％となるように調整し、得られた菌体を８０℃で２０分間加熱抽出した。抽出液のエタノールを減圧下に除き、水溶液を得た。得られた水溶液をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８（ウォーターズ社製）を用いて脱塩処理した後、補酵素型ビタミンＢ１２の同定を高速液体クロマトグラフィー法により行った。カラムはＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ  １８（５×２５０ｍｍ）（メルク社製）を使用し、カラムからの溶出には、８５ｍＭリン酸（ｐＨ３．０）とアセトニトリルによるグラジェント法を用いた。アセトニトリルの濃度は、０％（溶出開始時）から５０％（溶出開始２５分後）になるようにした。また、溶出液中の補酵素型ビタミンＢ１２含量は、３６１ｎｍにおける吸光度の測定により求めた。その結果、上記培養物には、アデノシルコバラミン（Ａｄｏ−Ｂ１２）（１８μｇ／ｍｌ）、メチルコバラミン（ＣＨ３−Ｂ１２）（２．５μｇ／ｍｌ）およびヒソロキソコバラミン（ＯＨ−Ｂ１２）（１．０μｇ／ｍｌ）が生成していたことが認められた。
【００１４】
比較例
実施例１と同様にして、リゾビウム  メリロッテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＩＦＯ  １４７８２，リゾビウム  ガレガエ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｅｇａｅ）ＩＦＯ  １４９６５，リゾビウム  フアクイー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈｕａｋｕｉｉ）ＩＦＯ  １５２４３，リゾビウム  レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＩＦＯ  １３３３７，リゾビウム  レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）ＩＦＯ  １４７８４，リゾビウム  ロッテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）ＩＦＯ  １３３３６およびリゾビウム  トロピシー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ）ＩＦＯ  １５２４７を３０℃、６日間培養した。得られた培養物から実施例１記載の方法を用いて、抽出液のビタミンＢ１２含量を定量した。その結果を〔表６〕に示す。
【表６】
0003611881.tif 000007
【００１５】
【発明の効果】
本発明により、工業的に安価に、容易に、効率的にビタミンＢ１２が製造できる。