(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アムリノンを有効成分として含有することを特徴とする移植後の免疫拒絶反応抑制剤。
【請求項２】
当該移植が臓器移植である請求項１に記載の免疫拒絶反応抑制剤。
【請求項３】
当該臓器移植が心移植である請求項２に記載の免疫拒絶反応抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、臓器移植等の後の免疫拒絶反応を抑制するための免疫拒絶反応抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アムリノンは強心作用を有する化合物であり、その化学名は、５−アミノ−（３，４’−ビピリジン）−６（１Ｈ）−オンである。アムリノンの強心作用は、例えば、特公昭６０−３２６３０号に記載されている。そして、有効成分にアムリノンを含有する急性心不全治療剤は既に製造、販売されている。急性心不全治療剤としては例えば山之内製薬（株）の登録商標「カルトニック」が挙げられる。
アムリノンの強心作用の作用機序には、細胞内情報伝達物質たる細胞内ｃＡＭＰの蓄積が関与していると考えられている。より詳しくは、アムリノンは、ＩＩＩ型ホスホジエステラーゼを抑制して、細胞内ｃＡＭＰを蓄積することにより、強心作用を示すと提案されている。ここで、ホスホジエステラーゼ（以下、ＰＤＥという。）は、細胞内アデノシンサイクリック  ３’，５’−モノフォスフェート（ｃＡＭＰ）の分解酵素であり、Ｉ〜ＩＶ型の４つの異なるタイプに分けられる。
【０００３】
また、アムリノンがエンドトキシンショックにおける腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)の産生を抑制することから、炎症抑制の作用を有することが示唆されている（Circulatory Shock 36, 200-207(1992)）。更に、アムリノンがトロンビン誘発による血小板起因成長因子（ＰＤＧＦ）様蛋白質に関連する可能性が報告されている（Shaddy R.E., Paisley J.E., Hansen J.C., Diatric Research 30, 4, 351-354(1991)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アムリノンが移植後の免疫拒絶反応を抑制することは今までに知られていなかった。また、免疫拒絶反応を抑制する作用機序は、強心作用、炎症抑制作用等の作用機序と異なると一般に考えられるので、アムリノンが免疫拒絶反応を抑制することは予見することができなかった。
【０００５】
通常の移植では多少の組織適合性抗原の不一致は避けられず、移植を成功させるためには、免疫拒絶反応を抑制することが必須となる。免疫拒絶反応抑制剤としては、サイクロスポリンや副腎皮質ステロイド薬等が知られている。サイクロスポリンは、Ｔ細胞の活性化を阻害することにより免疫反応を抑制し、また、副腎皮質ステロイド薬は、Ｔ細胞の数を減少させ、リンパ球の核酸代謝を阻害してその機能を押さえ、マクロファージの遊走や代謝を抑制して免疫反応を押さえるものである。しかし、これらの薬剤は腎毒性や高血圧等の副作用があるので、副作用がより少ない免疫拒絶反応抑制剤の開発が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明では、サイクロスポリンや副腎皮質ステロイド薬等の薬剤とは全く構造の異なる免疫拒絶反応抑制剤を提供することを目的とする。
即ち、本発明によれば、アムリノンを有効成分として含有することを特徴とする移植後の免疫拒絶反応抑制剤が提供される。
また、この移植が臓器移植であることが好ましく、この臓器移植が心移植であることが更に好ましい。
【０００７】
【作用】
移植には、臓器移植、皮膚移植等が含まれる。これらの移植のときに、一般に免疫拒絶反応が起きるからである。ただし、角膜の移植は含まれない。角膜には血管がないため、免疫拒絶反応を誘発し難いからである。
移植は臓器移植であることが好ましく、臓器移植には、心移植、腎移植、骨髄移植、肝移植、膵移植等が含まれる。また、臓器移植の中でも、心移植であることが更に好ましい。
【０００８】
本免疫拒絶反応抑制剤は、経口又は非経口に適用される。経口で適用する場合は、１〜数回に分けて1.0〜20.0mg/kg/day、好ましくは2.0〜5.0mg/kg/dayを投与する。
非経口で適用する場合は、好ましくは静脈内投与である。静注のときには、１〜数回に分けて0.5〜10.0mg/kg/dayを投与する。また、点滴静注のときには、0.05〜3.0mg/kg/hrを投与する。又は単回の静注0.5〜10.0mg/kg に続き、点滴静注0.05〜3.0mg/kg/hrを行ってもよく、好ましくは静注単回 1.0〜1.5mg/kgに続き、点滴静注 0.3〜1.2mg/kg/hrを行ってもよい。
なお、急性心不全において現在臨床に用いられているアムリノンの投与方法、投与量を参考までに示すと、単回1.0mg/kgの静注及び0.3〜0.9（好ましくは0.6）mg/kg/hrの点滴静注である。
【０００９】
上記製剤は常法により容易に製造される。例えば、経口の場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤の何れであってもよい。また、製剤に用いる担体、賦形剤としては、通常経口剤に用いられるものであれば何れでもよく、固体又は液体のいずれであってもよい。例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、スターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアガム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール等やその他常用のものが挙げられる。また、保湿剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、付香剤、防腐剤等を含有してもよい。
注射剤の場合は、アンプル入り注射剤、凍結乾燥製剤の何れでもよく、製剤に用いる担体、賦形剤としては、通常注射剤に用いられるものであればいずれでもよい。例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、オレイン酸エチル等その他常用のものが挙げられる。また、保湿剤、懸濁剤、防腐剤等を含有してもよい。
【００１０】
好ましい注射剤の処方例を以下に示す。
アムリノンを乳酸塩とし、その５０ｍｇ（遊離塩基換算）と、ピロ亜硫酸ナトリウム２．５ｍｇ及びＤ−ソルビトール３１５ｍｇとを注射用水１０ｍｌ中に含有するアンプル入り注射剤を製造した。なお、ｐＨは乳酸又は水酸化ナトリウムで適宜３．５〜４．５に調節した。
【００１１】
【発明の効果】
本発明の免疫拒絶反応抑制剤は、移植の後に起きる免疫拒絶反応を抑制することができ、副作用も少ない。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明をマウスを用いた心移植の実施例により詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例により制限されるものではない。
［動物］
以下の実施例には、ＤＢＡ２マウス（Ｈ−２ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）及びＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（Ｈ−２ｋ）が用いられ、これらのマウスとして、雄、７〜９週齢のものが選ばれた。
【００１３】
［移植］
ＤＢＡ２マウス（Ｈ−２ｄ）を心臓のドナーとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）を心臓のレシピエントとして用いた。異所性心移植はＣｏｒｒｙ等の方法を改良して行った。虚血時間は通常４５分から６０分で、生着率は約８０％であった。実験手技上の問題で起こる７２時間以内の脱落例は実験から除外した。移植心の生着は毎日復部を触診し、心電図で確認した。拒絶日は心泊停止の日とした。
アムリノンを０．５Ｎ乳酸に溶解してから、蒸留水で希釈して最終濃度５ｍｇ／ｌにした。薬物は１日に１回１０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇを経口で投与した。投与は心移植の日に開始して移植片が拍動している間は６０日間続けた。
【００１４】
［病理組織学的検討］
移植してから５日後にマウスを殺した。移植片は心室の周囲が最大になるように横方向に切断して、１０％ホルマリンで固定した。移植組織はパラフィンに包埋して、次いでヘマトキシリン(hematoxyline)及びエオシン(eosin)で染色した。病理組織学的観察は、背景データを知らない観察者によりスコアを付けることにより行った。細胞湿潤、壊死、心筋炎症は、０（なし）、１（微少）、２（少）、３（標準）、４（激しい）のスケールで採点した。
【００１５】
［細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性の測定］
細胞障害性Ｔリンパ球の培養及び測定は文献に記載された方法に準じて行った（Kruisbeek A.M. Isolation and Fractionation of Mononuclear Cell Populations. In:Coligan J.E., Druisbeek A.M., Margulies D.H., Shevachi E.M. Strober W.(eds)  Current Protocols in Immunology.  New York: Green Publishing Associates and Wiley-Interscience;1991: 3.1. 1-5  及び  Wunderlich J., Shearer G., Induction and Measurement of Cytotoxic T Lymphocyte Activity. In Coligan J.E., Druisbeek A.M., Margulies D.H., Shevachi E.M. Strober W.(eds) Current Protocols in Immunology.  New York: Green Publishing Associates and Wiley-Interscience;1991: 3.11. 1-7)。
マウスの脾臓を取り出し、シングル細胞浮遊液を調製した。赤血球は、ＡＣＫ溶解バッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ4Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭＮａ2ＥＤＴＡ；ｐＨ＝７．４）で溶解したのち、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍの高比重溶液の上に重曹、遠心して（２５℃、２０分、１５００ｇｆ）リンパ球画分から除去した。細胞障害性細胞は、７×１０6のＣ５７ＢＬ／６脾細胞（レシピエントの系）をｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣ（２５μｇ／ｍｌ、シグマ社、セントルイス、ミズーリ、アメリカ合衆国）で処理した５×１０6のＤＢＡ２刺激細胞（ドナーの系）と５日間培養することによって誘導した。細胞障害活性は細胞障害性細胞を51ＣｒラベルしたＤＢＡ２標的脾細胞（ドナー）又はＣ３Ｈ／Ｈｅ標的細胞（第３者の群）に加え、細胞溶解性を測定することにより評価した。なお、この両細胞とも予めリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で２日間刺激しておいた。ＤＢＡ２標的脾細胞（ドナー）に加えたときの結果を図４（Ａ）に示し、一方、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ標的細胞（第３者の群）に加えたときの結果を図４（Ｂ）に示す。
標的細胞（Ｔ）とＣ５７ＢＬ／６エフェクター細胞（Ｅ）との比が１００：１、５０：１、２５：１となるように、標的細胞（１．７×１０4）とＣ５７ＢＬ／６エフェクター細胞とを、三幅対で丸底の９６穴組織培養プレートに２００μｌ／穴（ｗｅｌｌ）で培養した。５％ＣＯ2を含む湿った空気で３７℃４時間培養後、各々の穴から１００μｌずつ採取し、放射活性を自動ガンマシンチレーションカウンターで測定した。自然遊離した放射活性は総取り込み量の３０％以下であった。特異的細胞障害活性は次のように算出した。
【００１６】
0003720400.tif 000002
【００１７】
ここで、ｃｐｍとは、自動ガンマシンチレーションカウンターで測定した１分当たりのカウントである。最大ｃｐｍは51Ｃｒラベルした標的細胞を０．１％トリトンで処理して得た。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、アムリノンは０．５Ｎ乳酸溶液に溶解し蒸留水で希釈し最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、０．０２５Ｎ乳酸溶液に調製した。薬物は共培養液中に５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。対照には溶媒を同様に添加した。また、比較のために細胞障害性を惹起しない非感作細胞を対照とした。
【００１８】
［サイトカインの測定］
混合培養は反応細胞：刺激細胞の比を７：５として、上述のように行った。総リンパ球数は１×１０7／穴に調製した。培養上清中のマウスＩＬ−２、ＩＦＮ−γ濃度はＥＬＩＳＡキット（エンドゲン社、ボストン、マサチューセッツ、アメリカ合衆国）で測定した。キットの検出感度は、ＩＬ−２について３ｐｇ／ｍｌ以下であり、ＩＦＮ−γについては１５ｐｇ／ｍｌ以下であった。上清は培養後１２時間及び２４時間に採取した。
【００１９】
以下、実験結果を記載する。
［移植片生着に対するアムリノンの作用］
図１は対照群とアムリノン処理移植片の生着率を示す。未処理のＣ５７ＢＬ／６マウスレシピエント（ｎ＝６）は平均１０．５日でＤＢＡ２の移植心を拒絶した。アムリノンの１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ及び４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのときは、生着期間がそれぞれ１２日及び２２日に延長した。アムリノンの投与が４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのときは、生着期間の延長は有意（ｐ＜０．０１）であった。一方、アムリノンの投与が１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのときは、生着期間がわずかに延長したが有意なものではなかった。
【００２０】
［組織学的検討］
組織学的検討はＣ５７ＢＬ／６に移植してから５日後の移植ＤＢＡ心について行った。アムリノン４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで処理した移植片を対照群と比較した。光学顕微鏡で観察した写真を図２に示す。図２（ａ）も図２（ｂ）も１００倍に拡大したものである。
図２（ａ）は、アムリノン未処理の移植心についての写真である。単核細胞の広範な浸潤が観察される。一方、図２（ｂ）はアムリノン未処理の移植心についての写真である。図２（ａ）と比較すると、アムリノン処理の移植片の炎症は明きらかに軽度であった。
図３に、５日間生着した移植片で検討した組織学的結果を示す。細胞浸潤の程度は未処理群に比べアムリノン処理群で有意（ｐ＜０．０５）に軽度であった。従って、アムリノンが免疫拒絶反応の一種である炎症反応を抑制したことが分かる。なお、バーは、平均±標準偏差を示す。
【００２１】
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＴＬ活性に対するアムリノンの作用］
移植片の拒絶を抑制する作用機序を明らかにするため、ＣＴＬに対するアムリノンの作用を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞（レシピエント）のＤＢＡ２脾細胞（ドナー）に対する特異的溶解作用を測定し、その結果を特異的細胞障害活性として図４（Ａ）に示す。一方、Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞（レシピエント）のＣ３Ｈ／Ｈｅ脾細胞（第３者）も同様に測定し、その結果を図４（Ｂ）に示す。
図４（Ａ）において、非感作のＣ５７ＢＬ／６細胞と比べて、薬物疑似処理の対照エフェクター細胞、即ち、アムリノンの代わりに溶媒処理したいわゆるコントロールに該当する細胞は、５日間のＭＬＣでＤＢＡ２標的細胞に対する溶解活性が上昇した。一方、５μｇ／ｍｌのアムリノンで処理したエフェクター細胞のＣＴＬ活性はＥ：Ｔ比２５：１、５０：１、１００：１で有意に低下していた。しかしながら、２．５μｇ／ｍｌの処理では溶解活性の抑制作用を示さなかった。
【００２２】
次に図４（Ｂ）では、Ｃ５７ＢＬ／６エフェクター細胞は、ＭＬＣに使用しない第３の細胞系（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）を標的細胞とした場合には、殆ど細胞溶解活性を示さなかった。このことは、ＭＬＣによって誘導された細胞溶解活性はＤＢＡ２に特異的であることを示唆する。
即ち、アムリノン５μｇ／ｍｌの投与によりドナー細胞に特異的である細胞障害活性（ＣＴＬ活性）が有意に低下した。これは in vivo においてもアムリノンが細胞障害性Ｔリンパ球の産生を抑制しうることを示唆するものである。ヒト血漿中のアムリノンの治療的な濃度は０．６−６．４μｇ／ｍｌであると考えられる。
なお、図４で、★はｐ＜０．０５で有意であることを示し、★★はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【００２３】
［インターロイキン（ＩＬ）−２及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γの産生に対するアムリノンの作用］
異種の一方向反応性ＭＬＣの上清中におけるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの濃度を培養してから１２時間後及び２４時間後に測定した。アムリノンは培養上清中に５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γのレベルはアムリノンによって１２時間後及び２４時間後で有意に抑制された。
【００２４】
即ち、アムリノン５μｇ／ｍｌの投与により、免疫応答で産生されるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの濃度が有意に抑制された。このことから、アムリノンにより免疫拒絶反応が抑制されることが判明した。
更に、アムリノン処理群のＩＦＮ−γレベルはキットの検出限界以下であった。このことから、アムリノンの抑制作用はＩＬ−２よりもＩＦＮ−γに対してより顕著であることが判明した。
なお、図５で、★はｐ＜０．０５で有意であることを示し、★★はｐ＜０．０１で有意であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】移植片生着率（％）についてのアムリノンの効果を示すグラフである。
【図２】心移植を受けたマウスの心臓断面という生物の形態の写真である。
（ａ）アムリノン未処理のとき。（ｂ）アムリノン処理のとき。
【図３】心移植の組織学的スコアを示すグラフである。
【図４】アムリノンによる特異的細胞障害活性を示すグラフである。
【図５】アムリノンによるインターロイキンー２及びインターフェロン−γの産生抑制を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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