(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）細菌により産生され、次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ；
１．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物からβ−シアノアラニンを生成する
２．至適ｐＨ：７．０〜９．０
３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０
４．至適温度：４０〜５０℃
５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場合、７０℃まで安定
６．分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分子量３４，０００のサブユニットの二量体。
【請求項２】
補酵素としてピリドキサルリン酸を要求する請求項１記載の酵素。
【請求項３】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする請求項１記載の酵素。
【請求項４】
該細菌が工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である請求項１ないし３のいずれか１項記載の酵素。
【請求項５】
Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有するバチルス・ステアロサーモフィルス細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘導培地で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの製造法。
【請求項６】
該細菌が、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である請求項５記載の方法。
【請求項７】
工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を産生するバチルス属に属する新規細菌株、該酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ活性は、一部の植物および微生物由来のものが知られており、例えば、ホウレンソウ由来（エフ・イケガミ（F.Ikegami）ら，フィトケミストリー（Phytochemistry），第２７巻，３３８５〜３３８９頁（１９８１年）、あるいはクロモバクテリウム（Chromobacterium）属細菌由来（エム・アン（M.Anne）およびジェー・ケイ・クリストファー（J.K.Christopher）、ビオキミア・エト・ビオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta），第７８６巻，１２３〜１３２頁（１９８４年）のもの等が精製され、性質が調べられている。
【０００３】
本酵素反応生成物β−シアノアラニンは、生物学的活性を有する種々のアミノ酸誘導体の合成中間体として有用であるが、これまで報告されてきたＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼはいずれも不安定で、特に熱安定性が低く、かかる有用物質の製造には適さなかった。従って、熱安定性の高いＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの検索が急務とされていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記状況の下、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、熱安定性が非常に高いＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを産生する耐熱性のバチルス属に属する細菌を見いだし、該細菌から耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することに成功して本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）  次の性質を有する耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ；
１．作用：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとシアン化物からβ−シアノアラニンを生成する
２．至適ｐＨ：７．０〜９．０
３．安定ｐＨ：６．０〜１０．０
４．至適温度：４０〜５０℃
５．熱安定性：ｐＨ７．５において３０分保持した場合、７０℃まで安定
６．分子量：ゲル濾過にて６０，０００〜８０，０００、
（２）  補酵素としてピリドリサルリン酸を要求する（１）記載の酵素、
（３）  Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンを基質とする（１）記載の酵素、特に、
（４）  好温性のバチルス（Bacillus）属に属する細菌から得られる（１）ないし（３）いずれかに記載の酵素、
（５）  該細菌がバチルス・ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）である（４）記載の酵素、
（６）  該細菌が工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である（４）記載の酵素
を提供するものである。
【０００６】
また、本発明は、
（７）  請求項１記載のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する好温性のバチルス属に属する細菌をＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ誘導培地で培養し、ついで、該菌体から該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することを特徴とするＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの製造法、特に、
（８）  該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ産生能を有する好温性のバチルス属に属する細菌がバチルス・ステアロサーモフィルスである（７）記載の方法、
（９）  該好温性のバチルス属に属する該Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの産生能を有する細菌が、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株である（７）記載の方法を提供するものである。
【０００７】
さらに、本発明は、
（１０）  工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７７３の下に寄託されているバチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株
を提供するものである。
【０００８】
以下、さらに詳しく本発明を説明する。
本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼは、耐熱性のバチルス属に属するＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ産生能を有する細菌を培養することによって得ることができるが、該菌株の具体例としては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＣＮ３株等が挙げられる。バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株は、本発明者らが天然より単離したものであって、平成６年８月８日に工業技術院生命工学技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７７３として寄託されている。この細菌の菌学的性質は以下の通りである。
【０００９】
（ａ）形態
１．細菌の形態：細い桿菌
２．運動性：−
３．胞子：＋（楕円形）
４．グラム染色性：−
【００１０】
（ｂ）コロニー形態：７２時間培養で５ｍｍ以下の円形で、不規則、淡黄色半透明、表面は滑らかで平坦
【００１１】
（ｃ）生理学的性質
１．生育：３７℃では生育せず、４５℃、５５℃および６７℃で生育
２．細胞内小球体：−
３．リトマスミルク：分解
４．３％ＮａＣｌでの生育：−
５．５％ＮａＣｌでの生育：−
６．７％ＮａＣｌでの生育：−
７．ｐＨ５．７での生育：−
８．グルコースからの酸生成：＋
９．グルコースからのガス生成：−
１０．卵黄反応：試験条件下で生育せず
１１．カゼイン分解：＋
１２．ゼラチン分解：−
１３．チロシン分解：−
１４．デンプン加水分解：＋
１５．ＮＯ3-からＮＯ2-への変換：＋
１６．コーザー培地でのクエン酸利用：−
１７．メラーのアルギニンジヒドロラーゼ：−
１８．ＯＮＰＧ：＋
１９．酸キシロースＰＷＳ：＋
２０．ＤＮａｓｅ：−
２１．カタラーゼ：＋
２２．オキシダーゼ：＋
【００１２】
以上の菌学的性質に基づいて、バージーの細菌分類書（Bargy's Manual of Systematic Bacteriology）によって分類し、ＣＮ３株をバチルス・ステアロサーモフィルスと同定した。
【００１３】
上記菌株の培地としては、特別な培地を用いる必要はなく、通常の培地を用いればよい。炭素源としては、グルコース、マルトース、デンプン、デキストリン等の糖類、グルタミン酸等のアミノ酸類、あるいはフマル酸、リンゴ酸等の有機酸、もしくはグリセロール、窒素源としては、ポリペプトン、酵母エキス、大豆粉加水分解物等の天然窒素源、無機塩としてはＮａＣｌ、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等、また、微量金属成分としては塩化カルシウム、ホウ酸、硫酸銅、ヨウ化カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等を使用することができる。
【００１４】
本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを得るための好適な培地組成の一例を次に示す。ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グリセロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、およびＬ−セリン０．１％。
【００１５】
培養のｐＨは６．５約〜約７．５、好ましくは７．２、培養温度は約４０℃〜約７０℃、好ましくは５０〜６０℃であり、１２時間〜４８時間、好ましくは２４時間好気的または振盪しながら培養を行う。本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼは、このようにして培養した細菌から該酵素を単離することにより得ることができる。
【００１６】
上記培養液から本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離するには、既知の精製法を単独または併用して利用することができる。例えば、培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、これを超音波処理またはダイノミル（Dyno-mill）処理により破砕した後、遠心分離により無細胞抽出液を得る。これを硫安分画し、透析等による脱塩処理等を行い、ついで、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行って本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを単離することができる。また、本発明酵素が耐熱性酵素であるために、例えば７０℃、３０分の熱処理を行うことにより精製効率を高めることができる。
【００１７】
また、本発明の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼを用いてシステイン、Ｌ−セリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ホスホリル−Ｌ−セリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−セリンまたはβ−クロロ−Ｌ−アラニンと11Ｃまたは13Ｃあるいは14Ｃで標識したシアン化物とを、例えばリン酸カリウム緩衝液等の水性媒体中で接触させて反応せしめ、臨床診断や生化学的研究に使用する11Ｃまたは13Ｃあるいは14Ｃで標識されたβ−シアノアラニンまたはその誘導体あるいは塩を合成することができる。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株の培養
ポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％，グリセロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％（ｐＨ７．２）からなる培地をそれぞれ８ｍｌずつ試験管（２．５Ｘ２０ｃｍ）２本に分注し、１２０℃、２０分殺菌、冷却後、バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株を一白金耳ずつ接種し、６０℃、２４時間振盪培養して、種培養液とした。前記と同じ組成の培地に消泡剤（旭電化社アデカノールＫＧ−１２６）０．０１％（ｖ／ｖ）を添加した培地１．６リットルを２リットル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分殺菌、冷却後、これに上記の種培養液１６ｍｌ（試験管２本分）を接種し、６０℃、２７時間、１．６リットル／分の通気量と３００ｒｐｍの撹拌速度の条件で培養し、前培養液とした。次にポリペプトン１％、酵母エキス０．２５％、グリセロール０．１％、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、Ｌ−セリン ０．１％（ｐＨ７．２）からなる培地１６０リットルを２００リットル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、３０分殺菌、冷却後、上記の前培養液１．６リットルを接種し、６０℃、２４時間、１２０リットル／分の通気量と２００ｒｐｍの撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、シャープレス（ＫＳ型超高速遠心分離機、（株）関西遠心分離機製作所製）による遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を８等分し（２０リットル分ずつ）、それぞれ適当量の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０、０．１ｍＭジチオスレイトール含有）に懸濁して、−８０℃で凍結保存した。これを解凍し、以後の酵素の製造に用いた。
【００１９】
バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株からの耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの単離
凍結菌体６０リットル分を全量が約２０００ｍｌになるように上記緩衝液に懸濁した後、ダイノミルにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、無細胞抽出液２１００ｍｌを得た。
この無細胞抽出液に硫安を４０％飽和になるように添加し、一晩放置後、析出した沈澱物を遠心分離により除き、得られた上澄液に再度硫安を９０％飽和になるように添加して５時間放置し遠心分離により沈澱物を得た。この沈澱物を、０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し透析膜を用いて同緩衝液にて脱塩した。脱塩液１０６５ｍｌに終濃度７０％になるようにあらかじめ−８０℃に冷却したエタノールを添加し、遠心分離により沈澱物を得た。これを同緩衝液に懸濁し、７０℃で３０分の熱処理を行った。遠心分離で沈澱を除去した後、上澄液をあらかじめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ５００カラム（直径６．０Ｘ高さ１８ｃｍ）に通して酵素を吸着させ、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイトールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分を集めた。
この活性画分に硫安を８０％飽和になるように添加し、一晩放置後遠心分離により沈澱物を得た。この沈澱物を０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、調製電気泳動（７．５％ポリアクリルアミドゲル）にかけた。泳動後、ゲル中の活性のある部分を切り出し、これを磨砕して同緩衝液を用いて酵素を抽出した。
この活性画分に３０％飽和になるように硫安を添加し、あらかじめ３０％飽和硫安と０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径２．５Ｘ高さ１２ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ、この平衡化緩衝液で洗浄後、この緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分を集めた。
この活性画分に硫安を３０％飽和になるように添加し、あらかじめ３０％飽和硫安と０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したオクチルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５Ｘ高さ１０ｃｍ）に通し、酵素を吸着させ、この平衡化緩衝液で洗浄後、この緩衝液から０．１ｍＭジチオスレイトールを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出して活性画分を集めた。ここで得られた酵素標品は電気泳動的に単一であることが確認された。上記精製結果を下記表１にまとめた。ステップ８において、当初の無細胞抽出液に比べて２１８倍に純化されていた。
【００２０】
【表１】
0003694335.tif 000002
【００２１】
バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株の耐熱性Ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの諸性質
酵素活性測定：１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、水８０μｌ、０．８ｍＭピリドキサールリン酸２０μｌ（終濃度０．０８ｍＭ）、５０ｍＭ Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２０μｌ（終濃度５．０ｍＭ）、１００ｍＭシアン化カリウム２０μｌ（終濃度１０ｍＭ）および酵素液５０μｌからなる反応液（全量２００μｌ）を４５℃で１０分インキュベートした後、沸騰水浴中に２分間置いて反応停止し、ついで、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液をＨＰＬＣにかけ、酵素反応で生成したβ−シアノアラニンを定量することにより行った。かかる条件下で、１分間に１μｍｏｌのβ−シアノアラニンを生成する酵素活性を１ユニットと定義する。ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（４．６Ｘ２５０ｍｍ）(ジーエルサイエンス株式会社製）、溶出液：１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）／ＣＨ3ＣＮ（８５／１５）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：蛍光検出機（Ｅｘ：３４５ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ）、カラム温度：４０℃、サンプルボリューム：１０μｌであった。
【００２２】
（１）至適ｐＨ
ｐＨ６．０から１０．０の範囲の各ｐＨ下で、上記活性測定法により活性測定を行った（活性測定用反応液における緩衝液を以下のものに代えて反応を行った）。使用緩衝液は、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜６．５）、２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．０〜８．０）、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９．０）および２０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ−ＮＨ4ＯＨ（ｐＨ８．５〜１０．０）であった。結果を図１に示す。図１より、本酵素の至適ｐＨは８．０であることがわかった。
【００２３】
（２）安定ｐＨ
また、本酵素を２０ｍＭ濃度の緩衝液に溶解し、６０℃、３０分保持した後、残存活性を測定した。使用緩衝液は、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５〜５．５）、ＭＥＳ（ｐＨ６．０〜７．０）、ＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．０〜８．０）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９．０）、ＮＨ4Ｃｌ−ＮＨ4ＯＨ（ｐＨ８．５〜１０．５）およびグリシン／ＫＣｌ−ＫＯＨ（ｐＨ１０．０〜１０．５）であった。結果を図２に示す。図２の結果より、本酵素の安定ｐＨは６．０〜１０．０であることがわっかった。
【００２４】
（３）至適温度
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素を溶解し、２０℃から８０℃までの範囲で上記酵素活性測定法により活性測定した。結果を図３に示す。図３より、本酵素の至適温度は４５℃であることがわかった。
【００２５】
（４）熱安定性
２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に本酵素を溶解し、４０℃から９５℃までの各温度で３０分間酵素を処理し、残存活性を調べた。結果を図４に示す。図４より本酵素は熱安定性が非常に高く、７０℃まで安定であることがわかった。
【００２６】
（５）分子量およびサブユニット
液体クロマトグラフィーによるＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（２０Ｘ３００ｍｍ、東ソー株式会社製）カラムを用いたゲル濾過により、分子量は７０，０００と算出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は３４，０００と算出され、本酵素は同一サブユニットの２量体酵素であると考えられた。
【００２７】
（６）基質特異性
前記活性測定用反応液において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに代えて種々の化合物を用いて活性を測定することにより、基質特異性を調べた。本酵素の基質特異性は高く、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン以外にはＬ−システインに対してわずかに作用した（Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを１００％とした場合の相対活性は４．８％）。なお、以下のアミノ酸は基質にならなかった。ＤＬ−ホモセリン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−セリン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、熱安定性の非常に高いＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ、該酵素を産生する細菌株、該酵素の製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】  バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】  バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの至適温度を示す図である。
【図４】  バチルス・ステアロサーモフィルスＣＮ３株のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの熱安定性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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