(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列：
【化１】
0003632171.tif 000003
【化２】
0003632171.tif 000004
を、対応する下記部分的制限酵素地図：
【化３】
0003632171.tif 000005
と共に有するｅｒｂＢ−３ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその活性フラグメントであって、ｅｒｂＢ−２ポリペプチド又はｅｒｂＢポリペプチドに特異的に結合しない抗体又はその活性フラグメント。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体又はその活性フラグメント。
【請求項３】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１記載の抗体又はその活性フラグメント。
【請求項４】
前記抗体又はその活性フラグメントが検出可能な部分に接合されている、請求項１記載の抗体又はその活性フラグメント。
【請求項５】
請求項１記載の抗体又はその活性フラグメントを含む組成物。
【請求項６】
殺細胞剤に接合した、請求項１記載の抗体又はその活性フラグメントを含む組成物。
【請求項７】
ｉ）ｅｒｂＢ−３／抗体コンプレックスが形成され得る条件下で、生物学的サンプルを請求項１記載の抗体又はその活性フラグメントと接触させる工程、及び
ｉｉ）ｅｒｂＢ−３／抗体コンプレックスの存在を検出し、前記ｅｒｂＢ−３／抗体コンプレックスの存在により、前記生物学的サンプル内のｅｒｂＢ−３を検出する工程
からなる、生物学的サンプル内のｅｒｂＢ−３を検出するためのバイオアッセイ。
【請求項８】
請求項１記載の抗体又はその活性フラグメントのための特異的結合部位を提供するために十分な単離されたポリペプチドフラグメントであって、下記アミノ酸配列：
【化３】
0003632171.tif 000006
【化４】
0003632171.tif 000007
【化５】
0003632171.tif 000008
【化６】
0003632171.tif 000009
【化７】
0003632171.tif 000010
【化８】
0003632171.tif 000011
【化９】
0003632171.tif 000012
【化１０】
0003632171.tif 000013
を有するｅｒｂＢ−３ポリペプチドのフラグメントである単離されたポリペプチドフラグメント。
【請求項９】
ｉ）ハイブリッド形成が起こり得る条件下で、生物学的サンプルを単離された核酸と接触させる工程であって、前記単離された核酸は、高緊縮性ハイブリッド形成条件(high stringency hybridization conditions)下で、下記アミノ酸配列：
【化４】
0003632171.tif 000014
【化５】
0003632171.tif 000015
を、対応する下記部分的制限酵素地図：
【化６】
0003632171.tif 000016
と共に有するｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡの少なくとも一部とハイブリッドを形成し、そしてｅｒｂＢ−２ポリペプチドをコードする核酸又はｅｒｂＢポリペプチドをコードする核酸とハイブリッドを形成しない工程、
ii）ハイブリッド形成の存在を検出する工程であって、ハイブリッド形成の存在により、前記生物学的サンプル内のｅｒｂＢ−３ＤＮＡを検出する工程
からなる、生物学的サンプル内のｅｒｂＢ−３ＤＮＡの検出のためのバイオアッセイ。
【請求項１０】
前記単離された核酸が、下記アミノ酸配列：
【化７】
0003632171.tif 000017
【化８】
0003632171.tif 000018
と共に、対応する下記部分的制限酵素地図：
【化９】
0003632171.tif 000019
で示されるか、又は下記アミノ酸配列：
【化１０】
0003632171.tif 000020
【化１１】
0003632171.tif 000021
【化１２】
0003632171.tif 000022
【化１３】
0003632171.tif 000023
【化１４】
0003632171.tif 000024
【化１５】
0003632171.tif 000025
【化１６】
0003632171.tif 000026
【化１７】
0003632171.tif 000027
で示されるｅｒｂＢ−３遺伝子のヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメント、又は分析用プローブとして用いることができる前記ＤＮＡセグメントの一部分であって、前記一部分はｅｒｂＢ遺伝子内又はｅｒｂＢ−２遺伝子内のＤＮＡセグメントとはハイブリッドを形成しない、請求項９記載のバイオアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は下記の２種の関連する膜走査チロシンキナーゼにより代表される受容体タンパク質類に関する新規のタンパク質をコードする遺伝子に関する：
トリ赤芽球症ウイルスのプロウイルスＤＮＡ中で初めて確認されたガン遺伝子（ｖ−ｅｒｂＢ）の正常ヒト対立遺伝子であるｅｒｂＢ遺伝子によりコードされた上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）と；
関連遺伝子ｅｒｂＢ−２によりコードされた受容体。
特に本発明は、ここではｅｒｂＢ−３と命名される、この受容体遺伝子類の第３員のためのコード化配列をコードするＤＮＡ配列、又はその特異的な部分に関する。
特に本発明は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドを検出するための抗体及びバイオアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
上皮増殖因子受容体をコードするがん原遺伝子類は、全体の構造が密接に相同である若干数の異なる同族を構成する。最も高い相同度は、これらタンパク質の生来のチロシンキナーゼ活性にとって必須であるそれらの触媒領域にて観察される。
このような同族受容体の例は：ＥＧＦ−Ｒとガン遺伝子ｅｒｂＢ−２の関連生産物；コロニー刺戟因子１受容体（ＣＳＦ−１−Ｒ）及び関連する血小板−誘導成長因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）；インシュリン受容体（ＩＦ−Ｒ）及び関連するインシュリンー様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１−Ｒ）；及び関連するガン遺伝子ｅｐｈとｅｌｋによりコードされた受容体を包含する。
これら同族の若干における成長因子受容体が正常な成長と発達を調節するのに重要な役目をしていることは、よく確立されている。
【０００３】
ショウジョウバエにおける最近の研究は、リガンド−受容体の相互作用により媒介される発達が如何に重要かつ多機能的であるかを強調している。頻繁に発現型を変えるショウジョウバエの突然変異体の増加数は、そのようなタンパク質をコードする遺伝子における障害によるものであると同定されている。ＤＥＲと命名されているショウジョウバエのＥＧＦ−Ｒ相同染色体の遺伝子的部位は、外胚葉起源の多数の組織成分の退化を伴う複雑な発現型を発揮する接合胚致死の弱小球（ｆａｉｎｔ  ｌｉｔｔｌｅ  ｂａｌｌ）  に対立しているものとして同定された。
【０００４】
更に、他の突然変異体は、卵子又はその周辺の母体組織のいずれにおいてもＤＥＲ−機能を欠如しているように見える。かくして、ＤＥＲ受容体は、卵殻と胚の正常な形状の決定に必要な卵子と卵胞の間のリガンド−受容体の相互作用において重要な役目をするとしてもよいだろう。ＤＥＲが、両方の既知のヒトｅｒｂＢ−関連遺伝子の副本をショウジョウバエで発現しただけのものかどうかは判っていない。
【０００５】
これらの受容体分子の或るものは、新生物形成にも関与している。特に、ｅｒｂＢとｅｒｂＢ−２遺伝子の両方が、ガン遺伝子として下記の機構により活性化されるのが示され、そしてその機構とは、それら遺伝子がコードする受容体タンパク質の触媒活性を構成的に活性化する過剰発現又は突然変異を含むものである（バーグマン，Ｃ．Ｉ．，フング，Ｍ．Ｃ．  ＆  ワインバーグ，Ｒ．Ａ．，１９８６，Ｃｅｌ１  ４５：  ６４９−６５７；ジ  フィオレ，Ｐ．Ｐ．，ピーアス，Ｊ．Ｈ．，クラウス，Ｍ．Ｈ．，セガット，Ｏ．，キング，Ｃ．Ｒ．，＆  アーロンソン，Ｓ．Ａ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１７８−１８２；  ジ  フィオレ，Ｐ．Ｐ．，ピーアス，Ｊ．Ｈ．，フレミング，Ｔ．Ｐ．，ハザン，Ｒ．，ウルリッチ，Ａ．，キング，Ｃ．Ｒ．，シュレンシンガー，Ｊ．  ＆  アーロンソン，Ｓ．Ａ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：１０６３−１０７０；  ヴェル，Ｔ．Ｊ．，  ベグィノット，Ｌ．，ヴァス，Ｗ．Ｃ．，ウィリンガム，Ｍ．Ｃ．，メルリノ，Ｇ．Ｔ．，パスタン，Ｉ．  ＆  ローウイ，Ｄ．Ｒ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１４０８−１４１０）
【０００６】
ｅｒｂＢとｅｒｂＢ−２の両方は、ヒト悪性腫瘍の原因となるように関与している。ｅｒｂＢ遺伝子の増幅又は過剰発現、又は両方の組み合わせが、扁平細胞ガンとグリア芽細胞腫において示された（リベルマン，Ｔ．Ａ．，ナスバウム，Ｈ．Ｒ．，レイゾン，Ｎ．，クリス，Ｒ．，ラックス，Ｉ．，ソレック，Ｈ．，フィットル，Ｎ．，ウォーターフィールド，Ｍ．Ｄ．，ウルリッチ，Ａ．  ＆  シュレシンガー，Ｊ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：１４４−１４７  ）。
【０００７】
ｅｒｂＢ−２の増幅と過剰発現は、ヒト乳ガンと卵巣ガンで観察されている（キング，Ｃ．Ｒ．，クラウス，Ｍ．Ｈ．  ＆  アーロンソン，Ｓ．Ａ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：９７４−９７６；  スラモン，Ｄ．Ｊ．，ゴドルフィン，Ｗ．，ジョーンズ，Ｌ．Ａ．，ホルト，Ｊ．Ａ．，ウォング，Ｓ．Ｇ．，キース，Ｄ．Ｅ．，レヴィン，Ｗ．Ｊ．，スチュアート，Ｓ．Ｇ．，ウドヴェ，Ｊ．，ウルリッチ，Ａ．＆プレス，Ｍ．Ｆ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２）。そしてｅｒｂＢ−２の過剰発現は、特に攻撃的な腫瘍の重要な予後の指示薬として報告されている（スラモン，Ｄ．Ｊ．，他．，１９８９，  上記参照）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、そのような全ての腫瘍がｅｒｂＢ−２を過剰発現しているということは見出されておらず、そして多くのヒトの腫瘍が何れかの既知のガン遺伝子に随伴していたというわけではない。
かくして、診断のための知識と方法を提供する追加のガン遺伝子を追求する必要が依然としてあり、これは最終的にはヒトのガンの合理的分子治療のためになる。
【０００９】
従来知られていなかったか又は存在することさえも予想されていなかったｅｒｂＢプロト−オンコジーン系に関連するレセプタープロテインをコードするＤＮＡセグメントを提供することが本発明の目的である。更に、ＲＮＡの発現及び前記遺伝子の異常発現がヒトの癌に含まれるかどうかを決定することが可能な前記遺伝子のプロテイン産生物のための分析法を発展させることが本発明の目的である。
【００１０】
【課題を解決するための手段・発明の実施の形態】
上記目的の遂行において、本発明らはＳａｃＩ制限酵素を用いる開裂によって産生され、約９ｋｂｐの寸法を有し、且つ減少された緊縮複合条件下でのみｖ−ｅｒｂＢ遺伝子から誘導されるプロープを用いる核酸複合化によって検出可能であるヒトゲノムＤＮＡセグメントを発見した。それ故、前記ＤＮＡセグメントは上皮増殖因子受容体遺伝子（ＥＧＦ−Ｒ）をコードするために知られている遺伝子（例えば、ｅｒｂＢ遺伝子）及び関連するｅｒｂＢ−２遺伝子に分けられる。部分的精製及び分子クローニング後の前記ＤＮＡセグメントのキャラクタリゼーションは、ｖ−ｅｒｂＢ領域は相同的に３箇所のエキソン（これは、ＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２プロテインのチロシンキナーゼドメイン内の連続領域の各々６４％及び６７％のホモロジーを有するアミノ酸配列をコードする）にマップされたということを示した。ゲノムＤＮＡクローンから誘導されるプローブは、関連するｍＲＮＡのｃＤＮＡクローン（これは、ｅｒｂＢ系の一員としてそれを同定するための構造的特徴を有する予想された１４８ｋｄトランスメンブランポリペプチドをコードしており、この新遺伝子の名称をｅｒｂＢ−３とすることを促している）を同定した。前記遺伝子は、ヒト染色体ｌ２ｑｌ１−１３にマップされていたものであり、そして上皮起源の多種の通常組織中に６．２ｋｂトランスクリプトとして発現されていることが示された。著しく高められたｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡレベルは、ヒト腫瘍細胞系中に認められた。
【００１１】
したがって、基本的態様においては、本発明はｅｒｂＢ−３遺伝子又はその独自部分をコードしたヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメントに関するものである。ｅｒｂＢ−３遺伝子の前記部分は、少なくとも１２ないし１４個のヌクレオチド（これは、ｅｒｂＢ−３遺伝子の前記部分に関してそれらに相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡセグメントを有する安定な二重体を形成するために充分である）を含む。更に、ｅｒｂＢ−３遺伝子の前記独自部分は、勿論、ｅｒｂＢ又はｅｒｂＢ−２遺伝子中に存在しない配列を有する。換言すれば、ｅｒｂＢ−３遺伝子の前記部分の配列は、何れかの他のＲＮＡセグメントの配列とは少なくとも１個のヌクレオチドを異にする。一態様において、前記ＲＮＡセグメントは、ヒトのゲノムＤＮＡフラグメント（これは、ＳａｃＩ制限酵素を用いる開裂により産生され、約９０ｋｂｐの寸法を有し、且つ実施例１に記載する如く、減少された緊縮複合条件下でのみｖ−ｅｒｂＢ遺伝子から誘導されるプローブを用いる核酸複合化によって検出可能である）によって例示された。本開示において述べられる核酸複合化法及びクローニング法の応用によって、過度の実験をすることなく、組み換えＤＮＡ分野における当業者は、ヒトｅｒｂＢ−３遺伝子以外に哺乳動物のｅｒｂＢ−３遺伝子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列からなる本発明のヒトＤＮＡフラグメントに関連するＤＮＡフラグメントを同定し且つ単離することができる。複合化法におけるプローブと同様に、ｅｒｂＢ−３遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの応用も、本フラグメントに隣接する重複しているフラグメントを順次単離することによって、すなわち染色体処理として前記分野において知られている方法によって、前記分野における当業者が全ｅｒｂＢ−３遺伝子を得ることを可能とする。
【００１２】
本開示には、ｖ−ｅｒｂＢ遺伝子のホモロジー領域内で、ヒトのゲノム９ｋｂｐＳａｃＩＤＮＡフラグメントの部分的ヌクレオチド配列が記載されている；しかしながら、本開示中の方法は、更に本発明に基づいて全９ｋｂｐヒトゲノムＤＮＡフラグメントの単離及び配列の決定を可能とする。したがって、本発明は更に、ヒトゲノムＤＮＡフラグメント（これは、ＳａｃＩ制限酵素を用いる開裂により産生され、約９ｋｂｐの寸法を有し、且つ実施例１に記載する如く、減少された緊縮複合条件下でのみｖ−ｅｒｂＢ遺伝子から誘導されるプローブを用いる核酸複合化によって検出可能である）のヌクレオチド配列、又はその独自部分を有するＤＮＡセグメントに関するものである。上記の染色体処理法の延長によって、本発明は更に、この分野における当業者が関連するＤＮＡフラグメント（これは、完全なヒトｅｒｂＢ−３遺伝子並びに例えばヒト以外の哺乳動物のｅｒｂＢ−３遺伝子からなる）の配列を決定することを可能とする。
【００１３】
本ＳａｃＩＤＮＡフラグメント又は核酸複合化のためのプローブのようなその何れかの部分の応用において、例えばイン  ビトロ  ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ；アメリカ合衆国特許第４６８３２０２  号明細書；アメリカ合衆国特許第４６８３１９５  号明細書；及びサイキ他，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−５４  参照）によって、又は分子クローニングの標準法によって、前記フラグメントは増幅される。例えば、本発明のヒトｅｒｂＢ−３ゲノムＤＮＡフラグメントのクローンは、通常のヒト胸腺ＤＮＡフラグメント（本文中でＥ３−１ゲノムクローンと称されており、本願の図２に定義された部分的制限酵素地図、並びに図３及び図４に定義された部分的ＤＮＡ配列を有している）の組み換えクローンによって例示される。ゲノムクローンＥ３−１の単離及びキャラクタリゼーションは、以下の実施例２に述べられている。
【００１４】
本発明のヒトゲノムＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の分析は、ヌクレオチド配列は、翻訳されなかったイントロン配列と翻訳されたエキソンとの間の境界を定義するスプライス部位共通配列によって接しられている３個のオープンリーディング構造をコードするということを示す（図２）。３個のエキソンの予想されたアミノ酸配列は、３箇所の領域（これは、Ｖ−ｅｒｂＢのチロシンキナーゼドメイン並びにヒトＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２プロテイン中で隣接している）に非常に類似している。更に、前記ヒトゲノムクローンの予想されたアミノ酸配列は、ヒトゲノムＤＮＡクローンから誘導されるプローブの複合化によって検出されるｍＲＮＡ種の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）中のより大きいオープンリーディング構造中に含まれる。
【００１５】
したがって、本発明はｅｒｂＢ−３遺伝子のヌクレオチド配列を有するＤＮＡセグメント（この場合、ヌクレオチド配列はｅｒｂＢ−３遺伝子又はその独自部分のアミノ酸配列をコードする）にも関するものである。換言すれば、ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列の前記部分の配列は、何れかの他のＤＮＡセグメントによってコードされた前記アミノ酸配列とは少なくとも１個のアミノ酸残基を異にする。ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列の前記部分は、少なくとも約４ないし６個のアミノ酸（これは、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドの前記部分に対して選択的な抗体のための結合部位を提供するために充分である）を含む。更に、ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列の前記独自部分は、勿論、ｅｒｂＢ又はｅｒｂＢ−２遺伝子中に存在しない配列を有する。特に、本発明は、前記アミノ酸配列又はその独自部分がヒトｅｒｂＢ−３遺伝子のポリペプチド産生物のものであるようなＤＮＡセグメントに関するものである。前記ＤＮＡセグメントは、上記ヒトゲノムＤＮＡクローンＥ３−ｌにより、並びにＥ３−６，Ｅ３−８，Ｅ３−９，Ｅ３−１１及びＥ３−１６（これらは、以下の実施例３に記載されている）とまとめて称されているヒトｃＤＮＡにより、例示されている。前記ＤＮＡセグメント（これは、ヒトｅｒｂＢ−３遺伝子の全ポリペプチド産生物のアミノ酸配列をコードする）の好ましい態様は、図４ないし図１２において定義されたヌクレオチド配列を有し且つ図４ないし図１２において定義された予想されたアミノ酸配列を有するヒトｃＤＮＡクローンＥ３−１６である。
【００１６】
本発明のＤＮＡセグメントは、以下の実施例５に記載されている如く、正常及び腫瘍組織中のｅｒｂＢ−３遺伝子の発現を検出するために有用である。それ故、更に別の観点においては、本発明は：ｉ）本発明のＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ：ＲＮＡ複合分子及び相補ＲＮＡが形成され得るような条件下で生物学的サンプルを本発明のＤＮＡセグメントと接触させる工程；及びｉｉ）得られた複合分子中に存在する本発明のＤＮＡセグメントの量を決定する工程、からなる生物学的サンプル中のｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡを検出するためのバイオアッセイに関するものである。下記実施例５に記載されている知見は、本発明の前記方法によって検出されるような増加したｅｒｂＢ−３発現は、ＥＧＦ−Ｒ（ｅｒｂＢ）遺伝子及びｅｒｂＢ−２遺伝子の場合の如く、幾つかのヒトの悪性度に関する規範となるということを示している。
【００１７】
勿論、ｅｒｂＢ−３ポリペプチド産生物に関して、本発明は本実施例（これは、ｅｒｂＢ−３遺伝子のポリペプチド産生物のアミノ酸配列もコードする）中のＤＮＡ配列以外のＤＮＡ配列を有するＤＮＡセグメントも含むということは遺伝子工学の分野の当業者によって理解されるであろう。例えば、一般的遺伝子コードを参照することによって、何れかの与えられたアミノ酸配列をコードする種々の配列を含む合成ＤＮＡセグメントを産生するために、標準的な遺伝子工学の方法が使用され得るということが知られている。ヒトｅｒｂＢ−３遺伝子のポリペプチド産生物のアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする前記合成ＤＮＡセグメントも、本発明の範囲内に入っている。更に、異なる個々のものは何れかの与えられたヒト遺伝子のための僅かに異なるＤＮＡ配列を有し得るものであり、そして幾つかの場合には、そのような突然変異性又は変性遺伝子はポリペプチド産生物の基本的機能に影響を及ぼすことなく個々のものの間で異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド産生物をコードするということが知られている。また別に、前記ポリペプチドの基本的機能に影響を及ぼすことなく、遺伝子工学的方法によって多数のアミノ酸置換体がポリペプチド産生物中に作られ得るということも知られている。したがって、本発明は更に、ヒトｅｒｂＢ−３のアミノ酸配列、又はその独自部分と少なくとも１個のアミノ酸を異にするアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、且つ何れかの他のポリペプチドのアミノ酸配列よりもヒトｅｒｂＢ−３のアミノ酸配列に大きな全般的類似性を有するＤＮＡセグメントに関するものである。前記ＤＮＡセグメントのアミノ酸配列は、少なくとも約４ないし６個のアミノ酸（これは、前記配列を含むポリペプチドの部分に対して選択的な抗体のための結合部位を提供するために充分である）を含む。好ましい態様においては、前記ＤＮＡセグメントはヒトｅｒｂＢ−３ポリペプチドの機能を実質的に有するアミノ酸配列をコードする。前記の如く、予想されたｅｒｂＢ−３ポリペプチドは、ｅｒｂＢレセプター系の一員としてそれを同定するための構造的特徴を有する１４８ｋｄトランスメンブランポリペプチドである。
【００１８】
ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列と本発明のアミノ酸配列との類似性は、配列体制により定義された分析方法及びパーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ）及びリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）により述べられたアルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４−４８）の比較によって決定された。前記比較は、アミノ酸配列の正確なホモロジーのみならず、他のもののための１個の残部の置換（これは、観察された機能を共有する進化的に関連するプロテインの系においてしばしば起こることが知られている）をも意図している。
【００１９】
更に本発明は、本発明のＤＮＡ部分とベクターからなる組換えＤＮＡ分子に関する。更に別な見方で、本発明は、本発明のＤＮＡ部分で形質転換された細胞の培養に関する。本発明のＤＮＡｓで形質転換されたこれらの宿主細胞には、高等真核生物例えば動物、植物及び昆虫の細胞と低級真核生物例えば酵母の細胞の両方、並びにバクテリア細胞例えば大腸菌（Ｂ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）  のそれを含めた原核生物の宿主が含まれる。本発明のこれらの見方は、下記実施例２及び３に記載されている組換えＤＮＡｓ及び細胞により例示される。
【００２０】
本発明のこの見方の一つの特別な具体例は、本発明のＤＮＡで形質転換された細胞、好ましくは哺乳動物細胞からなり、ここで形質転換するＤＮＡはｅｒｂＢ−３遺伝子の官能性ポリペプチドを産生すべく発現させ得る。例えばＥ３−１６ｃＤＮＡを持つｐＳＶ２ｇｐｔベクターで形質転換された哺乳動物細胞（ＣＯＳ−１）は、良く知られた方法例えばマツイら（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．）  の１９８９年２月９日に提出された米国特許出願第０７／３０８，２８２号に記載されている方法〔ピールスら（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）１９８８年，「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）  」２３９  ：６２８−６３１  ；及びマツイ（Ｍａｔｕｉ，Ｔ．）、ヘイダラン  （Ｈｅｉｄａｒａｎ，Ｍ．）、ミキ  （Ｍｉｋｉ，Ｔ．）、ポペスキュー（Ｐｏｐｅｓｃｕ，Ｎ．）、ラ  ロシェル（Ｌａ  Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ｗ．）、クラウス（Ｋｒａｕｓ，Ｍ．）、ピールス  （Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．）及びアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．）  １９８９年，「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）  」２４３  ：８００−８０４  も参照〕に従い製造される。要約すれば、ｃＤＮＡ発現プラスミドは、読み取り枠（ｔｈｅ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ）中の全ヌクレオチドを含むｅｒｂＢ−３関連ｃＤＮＡを、先に詳述したように、中に猿の肉腫ウイルス長末端繰り返し配列（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｉｎａｌ−ｒｅｐｅａｔ：ＬＴＲ）がプロモーターとして工作されているｐＳＶ２ｇｐｔベクター中に導入することにより構築される。そのような組換えベクター中の過渡発現（ｔｒａｎｓｉ−ｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ）ｅｒｂＢ−３遺伝子は、ＣＯＳ−１細胞中へのトランスフェクションにより達成される。
【００２１】
ｅｒｂＢ−３遺伝子の安定な発現は哺乳動物の発現ベクター例えばｐＺＩＰＮＥＯＳＶＸベクター〔セプコ（Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．）、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｅ．）及びムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．）  １９８４，「セル（Ｃｅｌｌ）」３７：１０５３−６２  〕ででも得ることができる。例えば真核生物の発現ベクターはｃＤＮＡクローンＥ３−ｌ６に由来する完全長ｅｒｂＢ−３コード化配列をクローン化することにより、合成オリゴヌクレオチドを持つＤＮＡ断片に適合するｐＺＩＰＮＥＯＳＶＸベクターＤＮＡのＢａｍＨＩ部位中に工作された。ＮＩＨ３Ｔ８細胞は、組換え発現ベクターＤＮＡ（ＬＴＲｅｒｂＢ−３）１μｇでトランスフェクションされ、耐性標識抗生物質Ｇ４１８で選択された。ｅｒｂＢ−３の発現を検知するため、ポリクローナルウサギ抗血清が、ｅｒｂＢ−３コード化配列の予測されたカルボキシル末端内の合成ペプチド（アミノ酸位置１１９１−１２０５）に対して引き起こされた。図１８に示されているようにイムノブロット分析はｅｒｂＢ−３蛋白質の検知を導いた〔図１８（Ａ）〕。ｅｒｂＢ−３蛋白質検知の特異性は、抗血清を同族ペプチドで予備培養することにより示された。更に通常の１８０ｋｄ  ｅｒｂＢ−３蛋白質は、組換えｅｒｂＢ−３発現ベクターでトランスフェクションされた細胞中のポリクローナル抗血清のみで特異的に検知されたが、ベクターでトランスフェクションされなかった対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞では陰性であった。安定にトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ｅｒｂＢ−３特異配位子の潜在的候補のテスト、生物学的活性の分析並びに天然のｅｒｂＢ−３蛋白質に対して引き起こされるモノクローナル抗体の発生のためのｅｒｂＢ−３受容体蛋白質源として有用である。ｅｒｂＢ−３特異液体は、ｅｒｂＢ−３受容体蛋白質の自己ホスホリル化の検知、ＤＮＡ合成の刺激又はＬＴＲｅｒｂＢ−３トランスフェクシヨン処理ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換された発現型の導入により同定される。
【００２２】
代わりに、ｅｒｂＢ−３受容体一族（ｆａｍｉｌｙ）例えば３２Ｄ細胞系：生存及び増殖のためのインターロイキンー３（１１−３）に通常依存するマウス造血細胞系をベースとする系の受容体の機能性発現のために、他の形質転換された細胞系が利用できる。最近の研究は、これらの細胞中のＥＧＦ−Ｒのための発現ベクターの導入がＥＧＦマイトジェンシグナルでの効果的なカップリングを導き、それにより３２Ｄ細胞の生存及び成長の維持においてＥＧＦ−Ｒの配位子にＩ１−３と置換することを許している。ＥＧＦ−Ｒについて記載されている公知の方法〔例えばピールスら（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）  １９８８年，前記文献〕を採用することにより、本発明のＥ３−１６ｃＤＮＡが発現して３２Ｄ細胞中に機能性受容体を産生し、次いでそれはこれらｅｒｂＢ−３受容体の生物学的機能例えば第２メッセンジャーへのそれらの配位子の結合能力及びカップリング能力を試験するために有用となる。かくして本明細書記載の発現方法と本発明のＤＮＡｓ特には好ましいＥ３−１６ｃＤＮＡクローンを用いることにより、当分野の通常の技術者は過度の実験をすることなくｅｒｂＢ−３調節プロセスのメカニズムを決定するために、本発明の範囲内に入る細胞系を構築することができる。従って本発明はまた、ｉ）配位子であるか疑わしい分子と機能性ｅｒｂＢ−３受容体を産生する細胞により産生されたｅｒｂＢ−３受容体を接触させる段階；及びｉｉ）それらのｅｒｂＢ−３受容体により仲介された生物学的活性の量を測定する段階からなる、ｅｒｂＢ−３受容体により仲介された活性に影響を及ぼす能力についてｅｒｂＢ−３受容体の配位子の潜在性同族体をテストするためのバイオアッセイにも関する。
【００２３】
種々の標準組換え系、例えば上記のもの並びに当分野で公知の他のものは、当分野で知られている受容体蛋白質単離法を用いる新規ｅｒｂＢ−３受容体蛋白質の大量生産にも適当である。それ故、本発明は少なくとも図５ないし図１２に確定されたアミノ酸配列部分を有する単離されたポリペプチドも含む。
【００２４】
本発明は更に図５ないし図１２に確定されたアミノ酸配列を有するヒトｅｒｂＢ−３ポリペプチドの非反復部分（ｕｎｉｑｕｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ）に特異な抗体又はその非反復部分を含む。本発明のこの具体例において、その抗体は自然のままでモノクローナル又はポリクローナルであり、天然、組換え又は合成化学源由来のｅｒｂＢ−３受容体関連ポリペプチド又はペプチドを用いて発生させられる。それらの抗体は特異的に、そんなポリペプチドの配列を含むｅｒｂＢ−３蛋白質に結合する。言い換えればこれらの抗体はｅｒｂＢ−３受容体蛋白質にのみ結合し、ｅｒｂＢ（ＥＧＦ−Ｒ）又はｅｒｂＢ−２蛋白質には結合しない。また本発明の好ましい抗体は、蛋白質がその自然の（生物学的に活性な）配座（ｃｏｆｏｒｍａｔｉｏｎ）  にあるときｅｒｂＢ−３蛋白質に結合する。本発明の抗体の断片、例えば抗原結合活性を保持し当分野で良く知られた方法により製造され得るＦａｂ又はＦ（ａ    ｂ）’断片も本発明の範囲内に入る。更に本発明は、本発明の抗体又はその活性な断片の製薬組成物を含み、それは当分野で良く知られているポリペプチド投与用製薬組成物を製造するための物質及び方法を用いて製造され得、そして過度の実験をすることなく本発明の抗体の投与に即応用され得る。
【００２５】
これらの抗体及びその活性断片は、例えば新規ｅｒｂＢ−３受容体を特異的に検知又は精製するために用いることができる。そのような抗体は、高レベルのｅｒｂＢ−３受容体を伴う組織に薬物を標的投与するために当分野で公知の種々の方法において、例えばかかる抗体と殺細胞剤のコンプレックスで適当な腫瘍を処置することにおいても使用することができる。従って、本発明は更に、ｉ）ｅｒｂＢ−３受容体に特異的な抗体又は該抗体の活性断片を治療剤に結合させる段階；及びｉｉ）得られたコンプレックスを高レベルのｅｒｂＢ−３受容体を有する細胞を持つ個体（但し、ヒトは除く）に効果的な量で及び効果的な経路で投与してそれら細胞上のｅｒｂＢ−３受容体に抗体を結合可能にする段階からなる、高レベルのｅｒｂＢ−３受容体を有する細胞への治療剤の標的投与方法に関する。
【００２６】
本発明の抗体の例としてｅｒｂＢ−３蛋白質に特異的に結合する抗体を含有するウサギ抗血清が挙げられる。そのような受容体特異性抗血清は、配列中に６又はそれ以上のアミノ酸を有するｅｒｂＢ−３アミノ酸配列の非反復部分を発現している合成ペプチドに対して生じ、上記配列はｅｒｂＢ−３ポリペプチドのこの部分に特異な抗体のための結合部位を十分に提供する。更に、ｅｒｂＢ−３アミノ酸配列のこの非反復部分は、それぞれのｃＤＮＡ配列により予測されるように勿論ｅｒｂＢ又はｅｒｂＢ−２アミノ酸配列中に存在しない配列を包含する。本発明のｅｒｂＢ−３特異抗ペプチド抗体の例として、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドの予測された配列中のアミノ酸位置１１９１−１２０５を発現している配列（シングルレターアミノ酸コードで）ＥＤＥＤＥＥＹＥＵＭＮＲＲＲＲを有する合成ペプチドに対して生じたポリクローナルウサギ血清中の抗ペプチド抗体が挙げられる。この抗血清を伴うｅｒｂＢ−３ポリペプチドの特異的検知はヒトｅｒｂＢ−３ｃＤＮＡを持つ発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞中に示される〔図１８（Ａ）及び図１８（Ｂ）参照〕。
【００２７】
ペプチドに対する抗体は、標準ペプチド免疫化法に従いペプチドを化学的に合成し、それらを担体蛋白質に結合させ、そしてそのペプチドを完全フロイントアジュバントと一緒にウサギに注射することにより製造される。例えばペプチドは、標準法〔メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．）１９６３，「ジャーナル  オブ  アメリカン  ソサイエティ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．）」８５：２１４９〕により固相シンセサイザー上で合成される。粗ペプチドはＨＰＬＣにより精製され、担体、キーホールリムペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）  又は牛のチログロブリンに例えば良く知られた方法〔例えばラーナーら（Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）１９８１年，「プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，）」７８：３４０３〕によりマレイミド連鎖を通じてアミノ末端システインを担体にカップリングさせることにより結合される。一つの標準ペプチド免疫学的方法において、ウサギは同体積の完全フロイントアジュバント中のｅｒｂＢ−３ペプチド−担体コンプレックス１００μｇで免疫され、次いで１０〜１４日間隔で完全フロインゴアジュバント中の結合ペプチド１００μｇで追加免疫される。１０〜１４日間隔の同量投与での付加的な追加免疫は、例えば日常的ＥＬＩＳＡ分析による測定で抗ペプチド抗体力価がプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）  に到達するまで続けられる。
【００２８】
かくして本明細書に記載された一般的に公知の免疫学的方法を含めた本開示の教唆に従い、当分野の通常の技術者はｅｒｂＢ−３特異抗体を得ることができ、そしてそれを多様な免疫学的分析に、例えば正常組織若しくは腫瘍組織における以上に高いか低い兆候の診断的検知のために使用することができる。従って本発明はまた生物学的サンプル中のｅｒｂＢ−３抗原を検知するための、ｉ）上記サンプルと、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドに特異的な本発明の抗体とを、上記抗体と上記抗原の特異コンプレックスが形成されるような条件下で接触させる段階；及びｉｉ）それらコンプレックスの形態中に存在する上記抗体の量を測定する段階からなるバイオアッセイにも関する。
【００２９】
【実施例・発明の効果】
本発明は、以下の特別の具体例と実施例の詳細な説明及びそれに含まれる図面を参照することにより、もっと容易に理解されるであろう。
【００３０】
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、正常ヒト胸腺（列１）、ヒト乳ガン株ＭＤＡ−ＭＢ４６８（列２）及びＳＫ−ＢＲ−３（列３）からのＤＮＡ中のｖ−ｅｒｂＢ−関連ＤＮＡフラグメントの検出を示す。ハイブリッド形成は低められた緊縮性条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）  〔図１（Ａ）〕又は中程度の緊縮性条件〔図１（Ｂ）〕で行われた。矢印はＥＧＦ−Ｒ遺伝子（ｅｒｂＢ）及びｅｒｂＢ−２のものとは異なる新規な９キロ塩基対（ｋｂｐ）ｅｒｂＢ−関連制限フラグメントを指示している。
【００３１】
図２はｅｒｂＢ−３のゲノム及びｃＤＮＡクローニングを示す。λＥ３−１のゲノム９ｋｂｐのＳａｃＩ挿入物内でのｖ−ｅｒｂＢ相同の領域をプラスミドｐＵＣ（ｐＥ３−１）中にサブクローン化し、そしてヌクレオチド配列分析に供した。３種の予測エキソンが黒ヌリボックスで発現されている。ｅｒｂＢ−３ｃＤＮＡクローンは正常ヒト胎盤（斜線を付した棒）及び胸部腫瘍細胞株ＭＣＦ−７（白ヌキ棒）からのｍＲＮＡのオリゴｄＴ−供与ライブラリィから単離された。全ヌクレオチド配列は正常ヒト胎盤からのｅｒｂＢ−３相補的ＤＮＡ上の両方の鎖、及びｐＥ３−１６上の５’ＸｈｏＩ  部位の上流に対して決定された。コード化配列は黒ヌリ棒で示され、そして３種の特徴付けられたゲノムエキソンのスプライス結合部は垂直な白色線により示されている。ｃＤＮＡ地図中の黒ヌリ線は非翻訳配列を表す。制限部位：Ａ＝ＡｃｃＩ，Ａｖ＝ＡｕａＩ，Ｂ＝ＢａｍＨＩ，Ｂｇ＝ＢｇＩＩＩ，Ｅ＝ＥｃｏＲＩ，Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｋ＝ＫｐｎＩ，Ｍ＝ＭｓｔＩＩ，Ｐ＝ＰｓｔＩ，Ｓ＝ＳａｃＩ，Ｓｍ＝ＳｍａＩ，Ｓｐ＝ＳｐｅＩ。
【００３２】
図３及び図４は、ＥｃｏＲＩ部位からＰｓｔＩ部位への１．５ｋｂｐ領域にある、ヒトゲノムＤＮＡクローンＥ３−１から誘導されたヒトｅｒｂＢ−３遺伝子におけるｖ−ｅｒｂＢ相同の領域のヌクレオチド配列を示す。この領域はスプライス結合コンセンサス配列（下線）に隣接した３つの読み枠を含む。３つのエキソンの予測アミノ酸配列は相当するＤＮＡ配列の上に３文字コードで示されている。
【００３３】
図５ないし図１２はｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す。
図１３ないし図１５はｅｒｂＢ−３ポリペプチドとその他の受容体様チロシンキナーゼとの予測アミノ酸配列の比較を示す。アミノ酸配列は１文字コードで示され、そして左側に番号が付されている。推定上の細胞外ドメイン（細い斜線）はアミノ末端の予測シグナル配列（太い斜線）とポリペプチド内の単一疎水性トランスメンブラン領域（太い斜線）との間に伸びている。細胞外ドメイン中の２つのシステインクラスター（Ｃｙｓ）及びポリペプチドの細胞質部分内の予測チロシンキナーゼドメイン（ＴＫ）は濃い斜線により囲まれている。ＴＫドメインのアミノ末端の推定上のＡＴＰ結合部位は丸で囲まれている。カルボキシル末端ドメイン（ＣＯＯＨ）内の可能性のある自己リン酸化部位は星印により示されている。可能性のあるＮ結合グリコシル化部位（・−）はアミノ酸配列の上に表記されている。個々のドメインにおけるｅｒｂＢ−３のｅｒｂＢ−２、ＥＧＦ−Ｒ、ｍｅｔ、ｅｐｈ、インシュリン受容体（ＩＲ）及びｆｍｓとのアミノ酸相同の百分率は下に列挙されている。１６％より低い同一性は（−）で表記されている。
【００３４】
図１６はｅｒｂＢ−３のゲノム遺伝子座の帰属がヒト染色体遺伝子座１２ｑｌ３に対して行われたことを示す。全体で１４２粒が４００バンドのイデオグラムに局在していた。ダイアグラムに示されるように、染色体１２の特定の標識が観察され、この場合、５１粒のうち３８粒がバンドｑｌ３に局在していた。
【００３５】
図１７（Ａ）及び図１７（Ｂ）はヒト乳ガン細胞株中の高められたｅｒｂＢ−３転写レベルを示す。ＡＢ５８９乳房上皮細胞（列１）、並びに乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４１５（列２）及びＭＤＡ−ＭＢ４５３（列３）からの全細胞ＲＮＡを１０μｇ含むノーザンブロットをｅｒｂＢ−３  ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた〔図１７（Ａ）〕。シグナル減衰に続いて、同一ブロットをヒトβ−アクチンｃＤＮＡプローブと再びハイブリッド形成させた（Ｇｕｎｎｉｎｇ，  Ｐ．，  Ｐｏｎｔｅ，  Ｐ．，  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．，  Ｅｎｇｅｌ，  Ｊ．，  Ｂｌａｕ，  Ｈ．  ＆  Ｋｅｄｅｓ，  Ｌ．，  １９８３，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：７８７−７９５  ）。
【００３６】
図１８（Ａ）及び図１８（Ｂ）はｅｒｂＢ−３−特異的抗ペプチド抗血清により検出されるようなｃＤＮＡセグメントにより形質転換された細胞中のヒトｅｒｂＢ−３ポリペプチドの発現を示す。細胞溶菌液（各サンプル１００μｇ）を電気泳動し、そしてウエスタンブロッティングによる分析のためにニトロセルロース膜に転写した。図１８（Ａ）は抗血清でのｅｒｂＢ−３ポリペプチドの検出を示す。図１８（Ｂ）は相同ペプチドでの抗血清の予備培養を示す。抗体ブロッキングは結合特異性を示す。列１：ＬＴＲｅｒｂＢ−３発現ベクター１μｇで形質転換させたＮＩＨ３Ｔ３細胞の選択培養液。列２：対照ＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【００３７】
膜スパンチロシンキナーゼのｅｒｂＢ  ＥＧＦ受容体ファミリーの第三のメンバーの同定及びその全長コード化配列のクローニングが本実施例に記載されている。ＥＧＦ受容体のものに類似している明らかな構造ドメインの存在はリガンドに対する細胞外結合部位の実在を示唆する。ｅｒｂＢ−３受容体とＥＧＦ受容体との細胞外ドメインの構造的関連性はＥＧＦ様リガンドの増加するメンバーの１種又はそれ以上（Ｓｈｏｙａｂ，  Ｍ．，  Ｐｌｏｗｍａｎ，  Ｇ．  Ｄ．，  ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｖ．  Ｌ．，  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ｊ．  Ｇ．  ＆  Ｔｏｄａｒｏ，  Ｇ．  Ｊ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ    ２４３：１０７４−１０７６  ）がｅｒｂＢ−３生成物と相互作用することを示す。従って、ｅｒｂＢ−３遺伝子は、ＥＧＦ−Ｒ及び、ｅｒｂＢ−２遺伝子に対して知られているように、正常及び新生物プロセスの両方において重要な役割を演じていることが期待される。
【００３８】
ＥＧＦ受容体及びｅｒｂＢ−２との広範囲の線上対応性の相同にもかかわらず、予測されたｅｒｂＢ−２内の明白な領域、コード化配列は比較的高い程度の相違を示した。例えば、そのカルボキシル末端ドメインはｅｒｂＢ−２又はＥＧＦ−Ｒとの顕著な線上対応性の同一スコアを示さなかった。カルボキシル末端での相違はまた、それぞれ１４８キロダルトン（ｋｄ）、１３８ｋｄ及びｌ３１ｋｄの見積分子量を有するｅｒｂＢ−３、ｅｒｂＢ−２及びＥＧＦ−Ｒの３種のペプチド間の大きさのわずかな違いの原因を示している。予測ｅｒｂＢ−３タンパク質の最も保存された領域を発現するチロシンキナーゼドメイン内で、ＡＴＰ結合部位に比べカルボキシル末端により近接している２９個のアミノ酸の短いストレッチは、それぞれ２８及び２５位にある予測されたｅｒｂＢ−２及びＥＧＦ−Ｒコード化配列の領域と異なっていた。それらの細胞質ドメインにおけるより高度に相違するそのような領域はこれらの密接に関連する受容体様分子に対して異なる機能的特異性を付与するように思われる。従って、ｅｒｂＢ−３遺伝子の発現における突然変異又はその他の変更はｅｒｂＢ及びｅｒｂＢ−２遺伝子における欠損と関連するものとは異なるガン又は遺伝子疾患を起こすかもしれない。
【００３９】
染色体地図作成によりｅｒｂＢ−３はヒト染色体１２のｑｌ１−１３遺伝子座に位置決めされた。一方、関連ＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２遺伝子はそれぞれ染色体部位７ｐ１２−１３及び１７ｐ１２−２１．３に位置決めされている。従って、各遺伝子は異なるホメオボックス及び異なるコラーゲン鎖遺伝子座を含む領域に位置していることが明らかである。ケラチンＩ型及びＩＩ型遺伝子はまた、それぞれ１２及び１７の領域に位置し、それぞれｅｒｂＢ−３及びｅｒｂＢ−２の異なる局在と一致している。従って、本発明のＤＮＡセグメントは、１２ｑｌ１−１３遺伝子座近傍の染色体異常と関連するあらゆる遺伝子性疾患の遺伝子地図作成の一助をなす新規プローブを提供する。
【００４０】
正常な細胞増殖のオートクライン並びにパラクラインエフェクターに対する証拠がある。前者は、細胞増殖を刺激する同一細胞により産生される因子であり、一方、後者の因子はその因子により影響を受けるものとは違う細胞により分泌される。しかしながら、オートクライン成長因子の固有の形質転換効力は、成長因子がパラクライン経路により標的細胞集合体に最も一般的に作用することを示唆する。ｅｒｂＢ−３遺伝子発現のこの概観は、上皮及び神経外胚葉誘導の細胞におけるその正常発現を示す。上皮組織の異なる細胞型における３種のｅｒｂＢ受容体様遺伝子の比較分析は、ケラチノサイトが３種全ての遺伝子を発現することを示した。これに対し、メラノサイト及びストロマ繊維芽細胞はそれぞれＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−３転写物を特異的に欠如していた。従って、メラノサイト及びストロマ繊維芽細胞はそれぞれ、上皮組織において近傍に存在するその他の細胞型により発現されるＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−３生成物に対するパラクライン成長因子の源であり得る。
【００４１】
ｅｒｂＢ及びｅｒｂＢ−２の両方が時々ヒト悪性疾患に関連することがわかっているので、ｅｒｂＢ−３転写物がヒト乳ガン細胞株の重要な画分中に過剰発現されているという今回の発見（実施例５）は、ＥＧＦ−Ｒ受容体ファミリーのこの新しいメンバーがいくつかのヒト悪性疾患において重要な役割を演じていることを示す。
【００４２】
実施例１：ｅｒｂＢプロトガン遺伝子ファミリーに関連したヒトＤＮＡフラグメントの同定
新規ｅｒｂＢ関連遺伝子を検出するために、ヒトゲノムＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで切断し、そしてプローブとしてｖ−ｅｒｂＢでのサザンブロット分析に供した。正常乳房上皮細胞ＡＢ５８９（Ｗａｌｅｎ，  Ｋ．  Ｈ．  ＆    Ｓｔａｍｐｆｅｒ，  Ｍ．  Ｒ．，  １９８９，  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．  ３７：２４９−２６７  ）及び不死化ケラチノサイトＲＨＥＫ（Ｒｈｉｍ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｊａｙ，  Ｇ．，  Ａｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｐ．，  Ｐｒｉｃｅ，  Ｆ．  Ｍ．，  Ｓａｎｆｏｒｄ，  Ｋ．  Ｋ．  ＆    Ａａｒｏｎｓｏｎ，  Ｓ．  Ａ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２５０−５２）は以前記載されている。正常ヒト上皮メラノサイト（ＮＨＥＭ）及びケラチノサイト（ＮＨＥＫ）はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  から入手された。ヒト胚繊維芽細胞（Ｒｕｂｉｎ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｏｓａｄａ，  Ｈ．，  Ｆｉｎｃｈ，  Ｐ．  Ｗ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｗ．  Ｇ．，  Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，  Ｓ．，  ＆    Ａａｒｏｎｓｏｎ，  Ｓ．  Ａ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：８０２−８０６）及び乳ガン細胞株ＳＫ−ＢＲ−３，ＭＤＡ−ＭＢ４６８，ＭＤＡ−ＭＢ４５３及びＭＤＡ−ＭＢ４１５（Ｋｒａｕｓ，  Ｍ．  Ｈ．，  Ｐｏｐｅｓｃｕ，  Ｎ．  Ｃ．，  Ａｍａｂａｕｇｈ，  Ｓ．  Ｃ．  ＆    Ｋｉｎｇ，  Ｃ．  Ｒ．，  １９８７  ＥＭＢＯ．  Ｊ．  ６：６０５−６１０  ）の供給源は記載されている。核酸ＲＮＡハイブッド形成のために、ＤＮＡ及びＲＮＡを以前記載されたようにニトロセルロース膜に転写した（Ｋｒａｕｓ  等，同上）。高い厳密性ハイブリッド形成は５０％ホルムアミド及び５×ＳＳＣ中４２℃で操作された。フィルターを０．１×ＳＳＣ中５０℃で洗浄した。ＤＮＡの低められた厳密性ハイブリッド形成は３０％ホルムアミド中で行われ、次に０．６×ＳＳＣ中での洗浄され、一方、中程度の厳密性は４０％ホルムアミド中でのハイブリッド形成及び０．２５×ＳＳＣ中での洗浄により行われた。図１に示された特定の結果に対して、ＤＮＡはＳａｃＩで制限され、そしてトリ赤芽球症プロウイルスＤＮＡ（Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍ，  Ｂ．，  Ｆｒａｎｓｈｉｅｒ，  Ｌ．，  Ｍｏｓｃｏｖｉｃｉ，  Ｃ．  ＆    Ｂｉｓｈｏｐ，  Ｊ．  Ｍ．，  １９８０，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５７５−５８５）における上流のＢａｍＨＩ  部位からＥｃｏＲＩ部位に及ぶｅｒｂＢ遺伝子のガン遺伝子ウイルス体、ｖ−ｅｒｂＢに特異的なプローブとハイブリッド形成させた。
低められた厳密性ハイブリッド形成において、４つのＳａｃＩ制限フラグメントが検出された。２つは、ＥＧＦ−Ｒ遺伝子増幅を含むことが知られている乳ガン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４６８〔図１（Ａ），列１，２〕中での増幅によるＥＧＦ−Ｒ遺伝子フラグメントと同定され、そして１つは、増殖されたｅｒｂＢ−２を有することが知られている別の乳ガン細胞株ＳＫ−ＢＲ−３中の高められたシグナル強度に起因するｅｒｂＢ−２特異的遺伝子フラグメントと同定された〔図１（Ａ），列１，３〕。しかしながら、単一９ｋｂｐＳａｃＩフラグメントは正常ヒト胸腺、ＳＫ−ＢＲ−３及び高レベルのＥＧＦ−Ｒを有する株Ａ４３１からのＤＮＡ中に等しいシグナル強度を示した〔図１（Ａ）〕。ハイブリッド形成の厳密性を７℃ずつ上げたとき、このフラグメントはハイブリッド形成しなかったが、ＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２特異的制限フラグメントはプローブとしてのｖ−ｅｒｂＢで依然として検出された〔図１（Ｂ）〕。これらを考え併せると、上記の発見は、９ｋｂｐＳａｃＩフラグメント内の新規ｖ−ｅｒｂＢ関連ＤＮＡ配列の特異的検出を示唆した。
【００４３】
実施例２：ｅｒｂＢに関連したヒトＤＮＡフラグメントのクローニング
その他の特徴付けのために、正常ヒトゲノムライブラリィを８ないしｌ２ｋｂｐフラグメントに対して富化したＳａｃＩ切断胸腺ＤＮＡから調製した。便宜上、バクテリオファージλｓｅｐ６−１ａｃ５がＬ．  Ｐｒｅｓｔｉｄｇｅ及びＤ．  Ｈｏｇｎｅｓｓ（スタンフォード大学）から入手された。ファージλ又はその他のゲノムから誘導される別の多くのクローニングベクターが当業界で十分公知である標準組換えＤＮＡ法に従ってこのＤＮＡフラグメントのクローニングのために使用され得る。精製ファージＤＮＡをｃｏｓ末端連結、ＳａｃＩでの制限、及び１０−４０％ショ糖連続グラジエント中での分画に供した。ゲノムライブラリィが８ないし１２ｋｂｐの分子量範囲にある正常ヒト胸腺ＤＮＡのＳａｃＩ制限フラグメント（ショ糖グラジエント沈殿により単離）と精製ファージアームとの連結により調製された。低められた緊縮性条件下でｖ−ｅｒｂＢにより検出された１０の組換えクローンは、高い厳密性でヒトＥＧＦ−Ｒ又はｅｒｂＢ−２ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成しなかった。９ｋｂｐ挿入物を有する代表的クローンの制限地図に示されるように、ｖ−ｅｒｂＢ相同の領域は、ＥｃｏＲＩ部位から下流のＰｓｔＩ部位に及ぶ１．５ｋｂｐセグメントへのハイブリッド形成分析により位置決めされた。
ｅｒｂＢに関連した新規ヒトゲノムＤＮＡフラグメントのクローンの一部のヌクレオチド配列はジデオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，  Ｎｉｃｋｌｅｎ，  Ｓ．  ＆    Ｃｏｕｌｓｏｎ，  Ａ．  Ｒ．，  １９７７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５４６３−６７  ）により鋳型としてスーパーコイルプラスミドＤＮＡを用いて両方のＤＮＡ鎖に対して決定された。ヌクレオチド配列はインテリジェネティクス（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ）  ソフトウエアを用いて組み立てられ、そして翻訳された。アミノ酸配列比較はＮＣＩアドバンスト・サイエンティフィック・コンピューティング・ラボラトリーのコンピュータで実行されるピアソン及びリップマンによる並列プログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｗ．  Ｒ．  ＆    Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  １９８８，  同上）を用いて行われた。予測タンパク質における疎水性及び親水性領域はカイト及びドゥーリトルに従って同定された（Ｋｙｔｅ，  Ｊ．  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｒ．  Ｆ．，  １９８２，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５−１３２）。ヌクレオチド配列分析により、ＥｃｏＲＩからＰｓｔＩの１．５ｋｂｐセグメントにおけるｖ−ｅｒｂＢ相同の領域がスプライス結合コンセンサス配列に隣接した３つの読み枠を含むことが示された（図３及び図４）。これら３つの読み枠の予測アミノ酸配列のその他の公知タンパク質とのコンピュータによる比較はｖ−ｅｒｂＢのチロシンキナーゼドメイン、並びにヒトＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２タンパク質において連続している３つの領域に６４％ないし６７％の最高の同一スコアを示した。更に、新規遺伝子中の３つの特徴付けられたエキソンの全てのスプライス結合部はｅｒｂＢ−２で保存されていた。その他の公知チロシンキナーゼとのアミノ酸配列相同は３９％ないし４６％の範囲で非常に低かった。
単一６．２ｋｂ特異的ｍＲＮＡは１５０ｂｐＳｐｅＩ−ＡｃｃＩエキソン含有フラグメントをプローブとして用いるヒト上皮細胞のノーザンブロット分析により同定された（図２）。使用された厳密性バイブリッド形成条件下で、このプローブは５ｋｂのｅｒｂＢ−２ｍＲＮＡも、６ｋｂ及びｌ０ｋｂのＥＧＦ−ＲｍＲＮＡも検出しなかった。これらの発見の全ては、本研究が、ｅｒｂＢ−３と仮に表記されている、ｅｒｂＢプロトガン遺伝子ファミリーの新しい機能的メンバーを同定したことを示唆した。
【００４４】
実施例３．ヒトｅｒｂＢ−３遺伝子のｍＲＮＡについてのｃＤＮＡｓのクローニンク及び特徴付け
ｅｒｂＢ−３コード化配列の全体を特徴付けようと努力して、重複ｃＤＮＡクローンを、遺伝子−特異的ゲノムエキソン又はｃＤＮＡ断片をプローブとして利用して、知られたｅｒｂＢ−３発現を持つ源からのオリゴｄＴ−プライマー化ｃＤＮＡライブラリーから単離した。簡単に、λｇｔｌｌ中のオリゴｄＴ−プライマー化ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをクローニング技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により得た。ＭＣＦ−７ｃＤＮＡを、リンカー−プライマー及びＭｏ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を含むオリゴｄＴを使用した５μｇポリＡ’ＲＮＡからの第一鎖合成、続いてＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮａｓｅＨを用いた第二鎖合成そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により製造した。二重鎖ｃＤＮＡを特定のリンカー受容体ヌクレオチドを使用してλｐＣＥＶ９のＳｆｉＩサイトヘー方向的にクローンした（Ｍｉｋｉ，  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｉ，  Ｔ．，  Ｈｅｉｄａｒａｎ，  Ｍ．  Ａ．  ＆  Ａａｒｏｎｓｏｎ，  Ｓ．  Ａ．，  １９８９，  Ｇｅｎｅ  ８３：１３７−１４６；参照  １９８９年７月２８日に出願されたＭｉｋｉ等の米国特許出願  Ｎｏ．０７／３８６，０５３）。プラク精製に続いて、ファージＤＮＡインサートを別の特徴付けのためにｐＵＣ−ベースのプラスミドベクターの中にサブクローンした。クローンは最初に制限分析及びｍＲＮＡへのハイブリッド形成により特徴付け、そして続いてヌクレイチド配列分析を受けさせた。１．３ｋｐｂないし４．３ｋｐｂの範囲の分子量を有するインサートを持つｐＥ３−６、ｐＥ３−８、ｐＥ３−９及びｐＥ３−１１と名付けられたクローンをヒト胎盤ライブラリーより単難する一方、５ｋｐｂインサートを含むｐＥ３−１６クローンを、ブローブとしてｐＥ３−ｌｌの最上流コード化配列によりＭＣＦ−７ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得た。クローンｐＥ３−８、ｐＥ３−９、ｐＥ３−ｌｌ及びｐＥ３−１６は、ポリＡ範囲（図２）において終結する同一の３’末端を含んでいた。
ｅｒｂＢ−３の完全なコード化配列は、位置４６から位置４１２６での枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ）末端コドンまで延びる４０８０ヌクレオチドの長い単一読み取り枠の中に含まれていた。位置１００での最上流ＡＴＧコドンは、ヌクレオチド位置４３にて枠内停止コドンがそれより先んじておりかつ真正の開始コドンのためのＫｏｚａｋ基準を満足するので、開始コドンらしいものであった。読み取り枠は１４８ｋｄポリペプチドを予測する１３４２コドンを含むものであった。末端コドンより下流では、多数の多数の停止コドンが全ての枠内に存在した。図１３ないし図１５に示すように、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドの演繹されたアミノ酸配列は、ＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２に関して最も近いトランスメンブランレセプターチロシンキナーゼを予測するものであった。ｅｒｂＢ−３の疎水性シグナル配列は、１９個のアミノ末端アミノ酸残基よりなると予測された。位置１９のグリシンと位置２０のセリンとの間のこのシグナル配列の開裂は、ｌ４５ｋｄの見積もり分子量を有する１３２３個のアミノ酸のプロセスポリペプチドを生じさせる。２１個のアミノ酸を包含する単一疎水性メンブランスパニング領域は、６７８個のアミノ酸よりなる細胞質領域から６２４個の細胞外領域を分離するコード化配列の中で同定された（図１３ないし図１５）。
推測上のｅｒｂＢ−３配位子−結合領域は、予測されたｅｒｂＢ−２及びＥＧＦ−Ｒタンパク質とそれぞれ、アミノ酸配列が４３％及び４５％同一であった。細胞外領域の中で、プロセスｅｒｂＢ−３ポリペプチドの５０個全てのシステイン残基は、保存されそしてＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２と比較した場合に同様に間隔を保っていた。４７個のシステイン残基はそれそれ２２個及び２５個のシステインを含む二つのクラスターに編成されていた、構造につき折り紙付きのこのチロシンキナーゼレセプター亜科（参照、例えばＹａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｉｋａｗａ，  Ｓ．，  Ａｋｉｙａｍａ，  Ｔ．，  Ｓｅｍｂａ，  Ｋ．，  Ｎｏｍｕｒａ，  Ｎ．，  Ｍｉｙａｊｉｍａ，  Ｎ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｔ．  ＆  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，  Ｋ．，  １９８６，  Ｎａｔｕｒａ  ３１９：２３０−２３４）。１０個の潜在的Ｎ−結合グリコシル化サイトはｅｒｂＢ−３細胞外領域内に位置していた。ＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２タンパク質との比較において、これらグリコシル化サイトのうちの５個及び２個はそれぞれ、保存された。これらの中て、トランスメンブラン領域に近いほうのサイトは３個全てのタンパク質の中で保存された（図１３ないし図１５）。
細胞質領域の中で、位置７０２から９７８までの２７７個のアミノ酸のコアはＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２のチロシンキナーゼ領域と最も広範な相同を示した。この域において、それぞれ６０％又は６２％のアミノ酸残基は同一でありそして９０％又は８９％のものは保存された。この範囲のアミノ酸相同はチロシンキナーゼの最小触媒領域と合致する（Ｈａｎｋｓ，  Ｓ．  Ｋ．，  Ｑｕｉｎｎ，  Ａ．  Ｍ．  ＆  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｔ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４２−５２）。他のチロシンキナーゼとは、重要さのより低い相同であった（図１３ないし図１５）。ＡＴＰ−結合サイトについて一致した配列ＧｘＧｘｘＧ（Ｈａｎｋｓ，  Ｓ．  Ｋ．等，１９８８，上述）はアミノ酸位置７１６ないし７２１にて同定された。この配列並びにカルホキシル末端に向かう２１個のアミノ酸残基の所在を定める残基は、３個のｅｒｂＢ−関連レセプター間に保存された。一まとめに考えると、これらの発見はアミノ酸位置７０２ないし９７８間の領域をｅｒｂＢ−３タンパク質の推測上の触媒領域として定めるものであった（図１３ないし図１５）。
ｅｒｂＢ−３のうち、ＥＧＦ−Ｒ又はｅｒｂＢ−２のいずれかと比較して最も分化した領域は、３６４個のアミノ酸よりなるカルボキシル末端であった。この領域は、高い程度の親水性及びプロリン及びチロシン残基の頻繁な発生を示した。これらチロシン残基の中で、位置１１９７，１１９９及び１２６２のものは、推測上のホスホリル化サイトについて一致した配列と最も近似して合うものであった。ペプチド配列ＹＥＹＭＮは、チロシン１１９７及び１１９９を取り囲むか、位置１２６０ないし１２６４で繰り返されそして両方の所在で荷電された残基により包囲されていた。但し、高い局在親水性の周囲である。この観察は、チロシン１１９７，１１９９及び１２６２がｅｒｂＢ−３タンパク質の自動ホスホリル化サイトの候補者らしいものと示す。
【００４５】
実施例４：ヒトｅｒｂＢ−３遺伝子の染色体地図作り
ｅｒｂＢ−３遺伝子の染色体位置を  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法（Ｐｏｐｅｓｃｕ，  Ｎ．  Ｃ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｃ．  Ｒ．  ＆  Ｋｒａｕｓ，  Ｍ．  Ｊ．，  １９８９，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ    ４：３６２−３６６  ）により、アミノ末端ｅｒｂＢ−３コード化配列を含む  ３Ｈ−標識プラスミドを用いて決定した。１１０個のヒト染色体スプレッド全てを各染色体の同定のためのＧバンドの前に及び続いてその後に調べた。１４２個の組織全てを４００−バンド表意文字の上に局在した。染色体１２の特異的な標識化が観察されるとともに、５１個の組織のうちの３８個のものはバンドｑｌ３に局在された（図１６）。従って、ｅｒｂＢ−３のゲノム位置は１２ｑ１３であると指定された。染色体１２のこの域において、黒色腫−関連の抗原ＭＥ４９１、ヒストン遺伝子及びラクトアルブミンについての遺伝子を含むいくつかの遣伝子は既に地図作りされている。
【００４６】
実施例５．正常及び悪性ヒト細胞におけるｅｒｂＢ−３発現
発現の形式を研究するために、多くのヒト組織をｅｒｂＢ−３転写のために査定した。６．２ｋｂ  ｅｒｂＢ−３特異ｍＲＮＡは、満期の胎盤、生後まもない皮膚、胃、肺、腎臓及び脳において観察された一方、皮膚繊維芽細胞、骨格筋又はリンパ球様細胞において検出できなかった。分析された胎児組織の中で、ｅｒｂＢ−３転写は肝臓、腎臓及び脳において発現されたが、胎児心臓又は胎芽肺繊維芽細胞においては発現されなかった。これらの観察は上皮組織及び脳におけるｅｒｂＢ−３の特恵的発現を示すものである。
またｅｒｂＢ−３発現は、表皮ケラチン細胞、腺上皮細胞、メラニン細胞及び繊維芽細胞を含んで、正常ヒト上皮組織より導かれた個々の細胞集団において研究された。比較のためにＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２転写のレベルを分析した。表１に示すように、ｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡレベルは表皮ケラチン細胞において相対的に高く、これら細胞におけるｅｒｂＢ−２及びＥＧＦ−Ｒのそれと匹敵し得るものであった。各転写についてのより低いか、同様の発現レベルは、腺上皮に由来する細胞において検出された。これらの発見は鱗状上皮及び腺上皮における３個全てのレセプター様分子の成長規則的役割と一致するものであった。ＥＧＦ−Ｒ及びｅｒｂＢ−２転写はまた正常繊維芽細胞において容易に観察された一方、同し細胞は検出可能なｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡを欠いていた。対照的に、正常ヒトメラニン細胞は、ヒト表皮ケラチン細胞と匹敵するレベルでｅｒｂＢ−３及びｅｒｂＢ−２の両方を発現するが、検出可能なＥＧＦ−Ｒ転写を欠いていた。従って、これらレセプター様分子の発現形式は表皮組織より導かれた特別の細胞集団において異なっていた。
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複製ノーサンブロットはｅｒｂＢ−３、ｅｒｂＢ−２及びＥＧＦ−Ｒについて当量（ｃｐｍ）の、同等の特異活性のプローブでそれぞれ、ハイブリッド形成された。相対的シグナル強度は次の通り評価した。：−  検出不可能、（＋）  弱い陽性、＋  陽性、＋＋  強い陽性。
悪性プロセスにおけるｅｒｂＢ−３の巻き込まれの証拠を探すために、ｅｒｂＢ‐３ｍＲＮＡレベルを一連のヒト腫瘍細胞ラインにおいて査定した。ｅｒｂＢ−３転写は３８個の癌のうち３６個においてまた１２個の肉腫のうちの２個において検出され、一方造血源の７個の腫瘍細胞ラインは測定可能なｅｒｂＢ−３ｍＲＮＡを欠いていた。正常サイズ転写の顕著に高められたレベルはヒト乳癌より導かれた７個の腫瘍細胞ラインのうちの６個において観察された。サウザンブロット分析により、雑な遺伝子転位又は増幅のいずれも該細胞ラインにおいて検出された。図１７（Ａ）は、対照ＡＢ５８９非悪性ヒト乳房上皮細胞（レーン１）及び二つの代表的なヒト乳房腫瘍ライン、ＭＤＡ−ＭＢ４１５（レーン２）とＭＤＡ−ＭＢ４５３（レーン３）を用いたサウザンブロット分析の結果を示す。ヒトβ−作用プローブを用いた同しフィルタのハイブリット形成〔図１７（Ｂ）〕により、実際レベルのｍＲＮＡを各レーンにおいて確かめた。デンシトメータ走査は、各腫瘍細胞ラインにおけるｅｒｂＢ−３転写が対照細胞ラインのそれより１００倍以上に高められていることを示した。したがって、ｅｒｂＢ族のこの新しい族員の過発現は、ＥＧＦ−Ｒ遺伝子及びｅｒｂＢ−２遺伝子の場合のように、ヒト悪性種において重大な役割を演じるらしい。
【００４７】
背景技術の記載及び本発明の開示を完全なものにするために、これまでに本明細書において確認された刊行物、特許及び特許明細書の各々は、ここに本明細書の中に参考に組み入れられる。
前述の発明は明快さ及び理解の目的のためにいくらか詳細に記載されてきた。また、形式及び詳細における種々の変更及び組合せは本発明の範囲から逸脱することなく行なうことができることは、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、正常ヒト胸腺（列１）、ヒト乳ガン株ＭＤＡ−ＭＢ４６８（列２）及びＳＫ−ＢＲ−３（列３）からのＤＮＡ中のｖ−ｅｒｂＢ−関連ＤＮＡフラグメントのサザンブロット分析の結果を示す図である。
【図２】図２はｅｒｂＢ−３のゲノム及びｃＤＮＡクローニングを示す部分的制限酵素地図である。
【図３】図３は、ＥｃｏＲＩ部位からＰｓｔＩ部位への１．５ｋｂｐ領域にある、ヒトゲノムＤＮＡクローンＥ３−１から誘導されたヒトｅｒｂＢ−３遺伝子におけるｖ−ｅｒｂＢ相同の領域のヌクレオチド配列を示す第一の図である。
【図４】図４は、ＥｃｏＲＩ部位からＰｓｔＩ部位への１．５ｋｂｐ領域にある、ヒトゲノムＤＮＡクローンＥ３−１から誘導されたヒトｅｒｂＢ−３遺伝子におけるｖ−ｅｒｂＢ相同の領域のヌクレオチド配列を示す第二の図である。
【図５】図５は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第一の図である。
【図６】図６は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第二の図である。
【図７】図７は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第三の図である。
【図８】図８は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第四の図である。
【図９】図９は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第五の図である。
【図１０】図１０は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第六の図である。
【図１１】図１１は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第七の図である。
【図１２】図１２は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ポリペプチドの予測アミノ酸配列を示す第八の図である。
【図１３】図１３は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドとその他の受容体様チロシンキナーゼとの予測アミノ酸配列の比較を示す第一の図である。
【図１４】図１４は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドとその他の受容体様チロシンキナーゼとの予測アミノ酸配列の比較を示す第二の図である。
【図１５】図１５は、ｅｒｂＢ−３ポリペプチドとその他の受容体様チロシンキナーゼとの予測アミノ酸配列の比較を示す第三の図である。
【図１６】図１６は、ｅｒｂＢ−３のゲノム遺伝子座の帰属がヒト染色体遺伝子座１２ｑｌ３に対して行われたことを示す図である。
【図１７】図１７は、ヒト乳ガン細胞株中の高められたｅｒｂＢ−３転写レベルのサウザンブロット分析の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、ｅｒｂＢ−３−特異的抗ペプチド抗血清により検出されるようなｃＤＮＡセグメントにより形質転換された細胞中のヒトｅｒｂＢ−３ポリペプチドの発現の、ウエスタンブロッティングによる分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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