(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトミセス(Streptomyces)sp.Ｒ−５株を有効成分として含有してなるツツジ科植物病害防除剤。
【請求項２】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株が、ストレプトミセスsp.FERM BP-7179菌株である、請求項１記載のツツジ科植物病害防除剤。
【請求項３】
ツツジ科植物が苗であることを特徴とする、請求項１又は２記載のツツジ科植物病害防除剤。
【請求項４】
ツツジ科植物がシャクナゲであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のツツジ科植物病害防除剤。
【請求項５】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株をツツジ科植物に接種することを特徴とする、病害抵抗性ツツジ科植物の作出方法。
【請求項６】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株が、ストレプトミセスsp.FERM BP-7179菌株である、請求項５記載の作出方法。
【請求項７】
ツツジ科植物が苗であることを特徴とする、請求項５又は６記載の作出方法。
【請求項８】
ツツジ科植物がシャクナゲであることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項記載の作出方法。
【請求項９】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株を、ツツジ科植物の生育培地に接種することを特徴とする、病害抵抗性ツツジ科植物の作出方法。
【請求項１０】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株が、ストレプトミセスsp.FERM BP-7179菌株である、請求項９記載の作出方法。
【請求項１１】
ツツジ科植物が苗であることを特徴とする、請求項９又は１０記載の作出方法。
【請求項１２】
ツツジ科植物がシャクナゲであることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項記載の作出方法。
【請求項１３】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株を有効成分として含有してなるツツジ科植物のファイトアレキシン誘導剤。
【請求項１４】
ストレプトミセスsp.Ｒ−５株が、ストレプトミセスsp.FERM BP-7179菌株である、請求項１３記載のツツジ科植物のファイトアレキシン誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトミセスｓｐ．Ｒ−５株、該株を有効成分として含有してなる植物病害防除剤、該株を植物に接種することを特徴とする病害抵抗性植物の作出方法及び該株を有効成分として含有してなるファイトアレキシン誘導剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来より、花卉植物は、ハウス内で行う土壌栽培、ポット栽培、水耕栽培、礫耕栽培及びロックウール栽培、あるいは露地栽培などの様々な方法で栽培されてきた。しかし、栽培中に、植物が病原菌に侵され商品価値を失ってしまうことが少なくない。こうした病害を防除するため、様々な防除方法が講じられている。例えば、土壌栽培の場合、植物体をＴＰＮ（テトラクロロイソフタロニトリル）、キャプタン、エクロメゾール、メタラキシル、メプロニル、ＰＣＮＢ（ペンタクロロニトロベンゼン）剤などの化学農薬を用いて殺菌したり、植物病原菌の存在する土壌表層部に黒ビニールをかけ太陽熱で消毒したり、土壌深層部を臭化メチル、クロルピクリン酸など有毒ガスを発生する農薬によってガス燻蒸することが行われている。その他、水耕栽培、礫耕栽培、ロックウール栽培などの場合には、ホルマリンまたは次亜塩素酸ナトリウムによる装置全体の消毒あるいはエクロメゾールまたはＴＰＮ剤の培養液への混入が試みられている。
【０００３】
ところで、現在、シャクナゲ、カルミア等のツツジ科植物等の花卉植物の栽培は、まず、ガラスまたはプラスチック容器内の培地上で苗を生育させ、次いで土壌、バーミキュライト、水苔などの基質に移植後、屋外環境へ馴化させることにより行われている。この栽培過程において、人工培地上での苗の育成は、無菌条件下で行われるため植物病原菌に侵されることは殆どないが、馴化過程に移した途端、周囲に存在する植物病原菌に侵され、苗全体が萎凋または枯死してしまうことがある。そこで、容器から取り出した幼苗を土壌またはバーミキュライト、水苔などからなる育苗床に移植後、メタラキシル、キャプタン、バリダマイシン、ＴＰＮなどの化学農薬を苗全体に散布することが行われる。そしてさらに、これらの苗を圃場に定植した後も、各種病害防除のために、ベノミル、ＴＰＮ、マンネブ、マンゼブ、メタラキシルなどを頻繁に散布する。このような組織培養苗を利用する花卉植物の栽培は、タイ国などの東南アジアでも行われているが、病害防除のために大量の農薬が使用されるために、家庭に持ち込んだ鉢植え植物から揮発する農薬が人体に及ぼす影響が懸念されている。
【０００４】
化学農薬に依存しない植物病害防除手段として、肥培管理、抵抗性品種育成、二次伝染源の除去などが試みられているが、これらの間接的方法には限度があり、現状では化学農薬処理や病態植物の除去・焼却以外に有効な方法は知られていない。土壌消毒に用いられる臭化メチル、クロルピクリン酸などのガスは、人体に有害で空気汚染を引き起こす恐れが強い。最近の化学農薬は、規制が厳しいため毒性は低く抑えられているものの、その分、使用回数が増加し、結果的に土壌や空気等の環境汚染を招き、環境ホルモンなどの後世に影響を及ぼす深刻な問題に結び付く危険性がある。特に、反復使用は病原菌の耐性化を誘発する可能性がある。このような現状からも、人体への害が少なく且つ環境汚染を引き起こすことのない安全な植物病害防除方法が求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、人体への害が少なく且つ環境汚染を引き起こすことのない生物農薬、すなわち、ストレプトミセスｓｐ．Ｒ−５株、該株を有効成分として含有してなる植物病害防除剤、該株を植物に接種することを特徴とする病害抵抗性植物の作出方法及び該株を有効成分として含有してなるファイトアレキシン誘導剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、シャクナゲから分離した放線菌Ｒ−５株を植物体に接種することにより病害抵抗性植物を作出することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ストレプトミセスｓｐ．Ｒ−５株（例えば、ストレプトミセスｓｐ．ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７９菌株）を有効成分として含有してなる植物病害防除剤である。ここで、植物病害防除剤の投与対象植物としては、苗の状態のものが挙げられる。また、植物の種類としては、例えばツツジ科に属するもの（例えば、シャクナゲ）が挙げられる。
【０００８】
さらに、本発明は、ストレプトミセスｓｐ．Ｒ−５株（例えば、ストレプトミセスｓｐ．ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７９菌株）を植物に接種することを特徴とする、病害抵抗性植物の作出方法である。ここで、植物病害防除剤の投与対象植物としては、苗の状態のものが挙げられる。また、植物の種類としては、ツツジ科に属するもの（例えば、シャクナゲ）が挙げられる。
【０００９】
さらに、本発明は、ストレプトミセスｓｐ．Ｒ−５株（例えば、ストレプトミセスｓｐ．ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７９菌株）を有効成分として含有してなるファイトアレキシン誘導剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、従来の化学物質を有効成分とする植物病害防除剤とは異なり、放線菌Ｒ−５株を有効成分とする植物病害防除剤である。本発明の植物病害防除剤の有効成分となる放線菌Ｒ−５株は以下のようにして分離することができる。
【００１１】
１．植物体からの放線菌の分離
放線菌Ｒ−５株の分離源としては、野外で生育させたシャクナゲ、カルミアなどのツツジ科の植物が挙げられる。放線菌Ｒ−５株は、例えば、以下のようにして植物体から分離することができる。すなわち、野外で土壌栽培したシャクナゲの組織（例えば、葉、茎、根など）の一部を水道水等で洗浄後、次亜塩素酸等に浸漬することにより殺菌処理する。次いで、滅菌水で十分濯いだ後、エタノール溶液（例えば、７０％エタノール）等に浸漬し再度殺菌処理する。植物小片を十分乾燥後、放線菌分離用平板培地上に置床し、適当な条件下で培養する。ここで、放線菌分離用の培地としては、ＩＭＡ−２培地、ＹＭＡ培地、ＹＭＰＧ培地、Ｂｅｎｎｅｔｔ−マルトース培地、グルコースアスパラギン寒天培地などが挙げられる。また、これらの培地には必要に応じて、抗生物質を添加することができる。
【００１２】
次いで、培地上に置床した植物小片から伸長した放線菌の菌糸を、新鮮な培地に移植し培養することにより、放線菌を純粋分離する。分離された放線菌は、滅菌済グリセロール溶液（例えば、２０％グリセロール）中に懸濁し、凍結保存することができる。なお、本発明においては、Ｒ−１株〜Ｒ−１７株とそれぞれ命名された１７株の放線菌が分離された。その１７株の中の１株がＲ−５株である。
【００１３】
２．分離された放線菌の抗菌力の検定
放線菌の抗菌力は、以下のように対峙培養法を用いて、検定することができる。「対峙培養法」とは、同一の平板培地上に、抗菌力検定対象の放線菌（以下、試験放線菌ともいう）と該放線菌の抗菌力の有無及び大きさを示す菌（以下、抗菌力指標菌ともいう）とを植菌し培養することにより、試験放線菌が抗菌力指標菌の生育にどのような影響を及ぼすかを調べる培養法をいう。具体的には、抗菌力指標菌と上記１において分離された放線菌とを、適当な距離（例えば、４〜５ｃｍ）を離して、同一の平板培地上に植菌し培養する。対照としては、別の平板培地上に抗菌力指標菌のみを植菌し培養するものとする。培養後、対峙培養した平板培地及び対照の平板培地上での抗菌力指標菌の生育を比較し、抗菌力指標菌の生育阻止帯幅を下表に従って評価する。なお、抗菌力指標菌としては、植物病害をもたらすフィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）やペスタロチオプシス（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）属に属する真菌などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本発明においては、上記１において分離されたＲ−１株〜Ｒ−１７株の１７株の放線菌の中で、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）及びペスタロチオプシス属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）に属する真菌に対する抗菌力はＲ−５株が最も強力であった。
【００１４】
【表１】
0003629212.tif 000002
【００１５】
３．放線菌の分類学的同定
分離した放線菌は、形態学的特徴、培養性状、生理学的性状などから分類学同定を行うことができる。なお、本発明において、分離されたＲ−５株は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する放線菌と同定された。Ｒ−５株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成１２年３月１日付で、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７６４として寄託されている。その後、この寄託は、平成１２年６月２日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１７９としてブタペスト条約に基づく国際寄託へ移管された。
【００１６】
４．植物病害抵抗性植物の作出
本発明において分離された放線菌Ｒ−５株は、植物病原菌の増殖阻害活性を有し、該放線菌を植物に接種することによって、病害抵抗性植物を作出することができる。
【００１７】
（１）  放線菌Ｒ−５株菌体懸濁液の調製
放線菌Ｒ−５株菌体懸濁液の調製は、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず上記１において分離された放線菌Ｒ−５株を、液体培地又は固体培地中で増殖させる。液体培地中で増殖させた場合、培養物を遠心分離することによって菌体を回収し、菌体を所望の濃度になるように適当な緩衝液中に懸濁することにより調製する。一方、固体培養の場合、培養物に緩衝液を加え、固体培地表面に増殖しているコロニーを十分懸濁後、一旦遠心分離により菌体を回収する。次いで先と同様に菌体を所望の濃度になるように適当な緩衝液に懸濁することにより調製する。
【００１８】
（２）  放線菌Ｒ−５株接種対象植物の育成
放線菌Ｒ−５株接種の対象となる植物は、園芸の分野において通常用いられる手法によって育成することができる。ここで、対象植物としては、双子葉植物、単子葉植物に限らずあらゆる植物が挙げられる。具体的には、ツツジ科、ツバキ科、バラ科植物など園芸用の花卉植物が挙げられる。これらの植物は、人工光の下でハウス内であるいは自然光の下で野外で育成することができる。なお、本発明においては、植物体に放線菌を接種するため、無菌的に育成することが好ましい。
【００１９】
例えば、シャクナゲを育成する場合、まずシャクナゲの花蕾を採取し、エタノール、次亜塩素酸等に浸漬することにより表面を殺菌する。次いで、クリーンベンチ内で、この蕾から小花を切り取り、花卉植物の採芽用培地に植え付ける。１〜２か月間、人工光照射下（約４０００〜５０００ルクス、１２〜１４時間／日）、２０〜２５℃の培養室で無菌的に培養することにより、小花梗にカルスを形成させる。さらに１〜２か月間培養を続けることにより、茎、葉をもった幼植物を形成させることによって、放線菌接種用の植物を育成する。次いで、幼植物をクリンーベンチ内で容器から取り出し、それぞれの幼植物を無菌的に分け、新鮮な花卉植物組織培養苗増殖用培地に植え付け、さらに人工光光照射下（約４０００〜５０００ルクス、１２〜１４時間／日）、２０〜２５℃の培養室で無菌的に培養することによって、放線菌接種用の植物を得る。
【００２０】
（３）  植物への放線菌の接種
植物への放線菌Ｒ−５株の接種は、例えば、以下のようにして行うことができる。上記（１）において調製した放線菌懸濁液を、無菌的に育成した植物（例えば、苗）の生育培地表面に塗布する。塗布された放線菌は、培地上で増殖し、同培地上の植物体へと感染し、植物体の下方から上方へと次第に生息範囲を拡大する。これにより、植物は、表面等が放線菌フローラに覆われた状態となり、植物病原菌などの外敵に対し抵抗性を有するようになる。上記の放線菌接種方法以外にも、植物体への菌体懸濁液の塗布、噴霧などにより、放線菌を植物体へ直接接種することも可能である。
【００２１】
（４）  放線菌Ｒ−５株を接種した植物の育成
放線菌Ｒ−５株を接種した植物は、以下のようにして育成することができる。すなわち、上記（３）において放線菌を接種した植物体をクリンーベンチ内で容器から取り出し、無菌的にそれぞれの個体に分け、培養器内の花卉植物組織培養苗植え込み用培地に植え付け、光照射（約４０００〜５０００ルクス、１２〜１４時間／日）、２０〜２５℃の培養室で、３０〜４０日培養することによって幼苗を生育させる。
【００２２】
植物を培養器から取り出した後、乾燥を避けるために水中で１本ずつ分離し、大きさごとに容器に入れる。次いで、発根促進のためにインドール酪酸（ｉｎｄｏｌｅ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）溶液に数時間浸漬した後、例えば、育苗用土を入れたセルトレイにピンセットで幼植物を１本ずつ挿すように植え込む。ここで、育苗用土としては、ピートモス（和泉農材社製）、パーライト（三井金属工業）、バーミキュライト（日東蛭石社製）、サチュライト〔界面活性剤〕（オーシャン貿易社製）、ＦＦＣ２０００〔土壌改良活性剤〕（ＦＦＣジャパン社製）などを適当量配合したものが挙げられる。
【００２３】
次いで、幼植物の移植を終えたセルトレイを密閉したビニルトンネルに入れ、自動ミストで水を補給する。例えば、シャクナゲの場合、約２週間で発根する。１か月後にトンネルのビニルを徐々に解放して湿度の低い外気にならす。２か月で馴化が終了し、日光が十分当たり、通気性のある施設に移動し、苗を成長させる。１０〜１５日間隔で液肥を与え、約６か月で植物病害抵抗性セル成型苗として出荷することができる。
【００２４】
５．本発明の植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤
本発明において分離されたＲ−５株は、植物に対しては病原性を示さず、反対に植物に植物病害抵抗性を付与することができるため、植物病害防除剤の有効成分として使用することができる。また、Ｒ−５株は、植物病原菌が植物に感染したときに、抗菌活性を有するアントシアン系色素の赤色色素（ファイトアレキシンの一種）の植物体内での誘導合成を促進することができるため、ファイトアレキシン誘導剤の有効成分としても使用することができる。
【００２５】
植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤の製造に使用するＲ−５株は、固体培養法、液体培養法あるいはフスマなどの資材培養法等の公知の培養法によって増殖させたものを用いればよく、生細胞を得ることができる限り、培地の種類、培養条件等に制限はない。
【００２６】
Ｒ−５株を有効成分として含有する植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤は、Ｒ−５株の胞子又は培養菌体を水などの液体に単に懸濁することにより製造することもできるが、他の成分を配合し、液剤、粉剤、粒剤等の製剤として製造することもできる。他の配合成分としては、液体担体、固体担体、界面活性剤（乳化剤、分散剤、消泡剤等）、補助剤等が挙げられる。より具体的には、液体担体としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。また、固体担体としては、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート等が挙げられる。補助剤としては、カルボキシメチルセルロース、ポリオキシアチレングリコール、アラビアゴム、デンプン、乳糖などが挙げられる。
【００２７】
また、本発明の植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤を水系溶媒を担体とする液剤として製造する場合、溶媒中でのＲ−５株菌体の水和性を向上させるために、水溶性高分子を添加することも可能である。水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。さらに、Ｒ−５株の植物への付着性を良好し、製剤中でのＲ−５株の安定性を向上させるために、キシログルカン、グアーガムなどの多糖類を配合させることもできる。
【００２８】
本発明の植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤にＲ−５株の含有量は、液剤の場合、０．０１〜１０重量％、粒剤では０．０１〜５０重量％、粉剤では０．０１〜５０重量％であるが、これらの濃度は適宜変更してもよい。粒剤及び粉剤の場合には、使用に際して水で希釈して、製品重量の１００〜５０００倍希釈で使用することができ、好ましくは５００〜１０００倍希釈で使用することができる。
【００２９】
本発明の植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤は、噴霧法、ミスト法、ダスト法、散布法、注入法、塗布法等により、植物に直接投与してもよく、あるいは目的の植物の生育している培地又は土壌に投与してもよい。
本発明の植物病害防除剤及びファイトアレキシン誘導剤の使用量は、その使用方法により異なるが、例えば、噴霧法の場合、シャクナゲ１個体当たり、有効成分量で０．１〜１０ｇ噴霧するのが好ましい。
【００３０】
本発明の植物防除剤の防除対象となる植物病原菌としては、ペスタロチオプシス属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）やフィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）に属する真菌が挙げられる。具体的には、ペスタロチオプシス属（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ）する真菌としては、ペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）、ペスタロチオプシス・ロンギセタ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｌｏｎｇｉｓｅｔａ）、ペスタロチオプシス・ポプリニグレ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｐｏｐｕｌｉ−ｎｉｇｒａｅ）などがあり、これらの菌は、ツツジ科、ツバキ科、バラ科植物など広範な花卉植物および樹木の葉に葉枯病を引き起こす。ここで、「葉枯病」とは、植物の葉に褐色の斑点または斑紋状の壊死部を生じ、激甚となると落葉に結びつく病害である。葉が汚れるため花卉植物では商品価値を損なう病害である。
【００３１】
フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）に属する真菌としては、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）、フィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）、フィトフトラ・メガスパーマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィトフトラ・ニコチアーナ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、フィトフトラ・パラジディチカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）などがあり、これらの菌は、ナス科、ツツジ科、ユリ科、ウリ科、イネ科植物など広範な植物の根、茎の地際部、葉に疫病を引き起こす。ここで、「疫病」とは、植物の組織を急速に軟化、腐敗させ、植物体全体を枯死させる蔓延力が極めて強い伝染病をいう。
【００３２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕抗菌力を有する放線菌の分離
（１）  植物からの放線菌の分離
以下のようにして、放線菌をポット植えのシャクナゲ苗（品種さきがけ）の葉、茎または根から分離した。すなわち、まずポット植えのシャクナゲ（品種さきがけ）の葉、茎または根から採取した約１×２ｍｍ２の小片を水道水流水でよく洗浄した。これらの小片を０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０に数秒間浸漬した後、１％次亜塩素酸に５分間浸漬し、殺菌蒸留水で数分間よく洗浄した。続いて、７０％エタノールに１分間浸漬した後、クリーンベンチ内で表面を十分乾燥させた。
【００３３】
このように表面殺菌した植物小片をシャーレ中の抗生物質添加放線菌分離平板培地（ＩＭＡ−２）上に置き、３０℃の培養噐の中で１カ月培養した。なお、ＩＭＡ−２培地および添加した抗生物質溶液の組成は、それぞれ表２及び表３の通りである。ＩＭＡ−２培地は、各成分を上流水に溶解後１２０℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。また、ＩＭＡ−２培地１０００ｍｌに対し、抗生物質溶液を１０ｍｌ添加した。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
【表３】
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【００３６】
ＩＭＡ−２培地に置床した植物小片の表面から伸長してきた放線菌の菌糸を殺菌したガラス細管先端で採取し、新たに用意したＩＭＡ−２平板培地に移植し、３０℃で数日間培養した。培地上で生育したコロニーを個別に、別のＩＭＡ−２培地上のメンブランフィルター（Ｍｉｘｅｄ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｅｓｔｅｒ，  ｆ  ０．２  ｍｍ，  Ａｄｖａｎｔｅｃ）に植え付け、３０℃で１週間培養した。メンブランフィルターを除去後の培地表面に生育した形状が異なるコロニーを別個に２０％グリセロールに懸濁し、−８０℃のフリーザーで使用まで保存した。合計１７菌株が得られ、それらをＲ−１〜Ｒ−１７株と命名した。
【００３７】
（２）  花卉植物組織培養苗の増殖用培地上で生育可能な株の選択
保存した１７菌株を新たに用意したＩＭＡ−２平板培地に移植し、３０℃で数日間培養した。次いで、花卉植物組織培養苗の増殖用培地上に各菌株を植え付け、２５℃で培養して菌の生長を調べた。なお、花卉植物組織培養苗の増殖用培地（以下、花卉植物増殖用培地ともいう）の組成は表４の通りである。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
Ｒ−１株〜Ｒ−１７株の生長度の結果を表５に示した。表５に示したように、１７菌株のうち、組織培養苗増殖用培地上で生長可能な放線菌株は、Ｒ−１、４、５、６、８、９、１０、１１、１３、１４の１０菌株であった。
【００４０】
【表５】
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【００４１】
（３）  分離した放線菌の植物病原菌に対する抗菌力の検定
上記（２）において選択された１０菌株の放線菌の、植物病原菌フィトフトラ菌およびペスタロチオプシス菌に対する抗菌力について、該植物病原菌との対峙培養により検定した。すなわち、シャーレ内のＩＭＡ−２平板培地上にやや距離（約５ｃｍ）を置いて、上記放線菌と植物病原菌フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５及びペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５をそれぞれ接種し、２８℃で培養した。次いで、放線菌の菌叢と植物病原菌の菌叢との間に形成された生長阻止帯の幅を測定することによって、放線菌による前記植物病原菌に対する抗菌力を測定した。なお、対照としては病原菌のみを接種したＩＭＡ−２平板を設定した。表６に結果を示した。表６からも明らかなように、１０菌株の放線菌の中でＲ−５株がフィトフトラ菌およびペスタロチオプシス菌の双方に対して最も強い抗菌力を示すことが分かった。
【００４２】
【表６】
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【００４３】
〔実施例２〕分離された放線菌の分類学的同定
（１）  Ｒ−５株の形態学的特徴
実施例１において得られたＲ−５株の胞子の形態学的特徴を走査電子顕微鏡を用いて観察した。すなわち、まずＩＭＡ−２平板培地上で７日間３０℃で培養したＲ−５株を、寒天培地ごとくりぬき試料台にはりつけ、試料台ごと液体窒素に浸漬して凍結させた。次いで、試料を走査電子顕微鏡クライオシステムに装着し、金蒸着を施した後、走査電子顕微鏡（日立製作所製Ｓ４０００型）で観察した。観察したＲ−５株の胞子の像を図１に示す。図１に見られるように、Ｒ−５株は、１０〜５０個の胞子が直線状に連なり、全体として螺旋状をなす胞子を有し、各胞子は０．４〜０．６×０．３〜０．４μｍの大きさで、楕円形の表面平滑であることがわかった。
【００４４】
（２）  各種培地上でのＲ−５株の性状
Ｒ−５株について、インターナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ：ＩＳＰ）推奨のシャーリングらの方法［Ｓｈｉｒｌｉｎｇ，  Ｅ．  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６（３）：３１３−３４０（１９９６）］及び「放線菌の同定実験法」［日本放線菌学会編、１９７２年］に準じ、培地上の性状及び生理学的性状を検討した。すなわちＲ−５株を、ＩＳＰ−２培地（酵母エキス・麦芽寒天培地）、ＩＳＰ−３培地（オートミール寒天培地）、ＩＳＰ−４培地（スターチ・無機塩寒天培地）及びＩＳＰ−５（グリセリン・アスパラギン寒天培地）上に生育させたときの基生菌糸、基生菌糸裏面、気菌糸及び拡散性色素の性状、並びにスターチの加水分解能やメラニン合成等の生理学的性状について調べた。各種培地上での性状を表７に、生理学的性状を表８に示した。なお、表７中のカッコ内の数字は「新色名辞典、第４版」［財団法人日本色彩研究所編、日本色研事業株式会社発行、１９９８年］に基づく色調番号を示す。表７に示したように、Ｒ−５株はいずれの培地上でも良好に生育し、基生菌糸は黄色系、成熟した粉状の菌叢は灰色から黒褐色を呈し、黄色系色素を形成した。
【００４５】
【表７】
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【００４６】
【表８】
0003629212.tif 000009
【００４７】
（３）  Ｒ−５株の菌体成分の化学分類学的性質
放線菌の同定実験法［日本放線菌学会編、ｐｐ６２−７０、１９８５］ならびにスタネックら  ［Ｓｔａｎｅｃｈ，  Ｊ．  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２８：２２６−２３１（１９７４）］に記載の薄層クロマトグラフィー法により、全菌体の酸加水分解物を分析した結果、ＬＬ型のジアミノピメリン酸、グリシン、ガラクトースの存在が確認された。
上記の形態的性状、化学分類学的性状等から、Ｒ−５株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する放線菌と同定された。
【００４８】
〔実施例３〕シャクナゲ組織培養苗の放線菌処理及び放線菌処理培養苗の電子顕微鏡観察
（１）  Ｒ−５株の菌体懸濁液の調製
Ｒ−５株を、ＩＭＡ−２液体培地に植菌し３０℃で１２時間振盪培養した。得られた培養物から菌体を回収し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて３〜４ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌの菌体濃度になるようにＲ−５株菌体懸濁液を調製した。
【００４９】
（２）  シャクナゲの器官からの幼植物形成
シャクナゲの花蕾を採取し、７０％エタノールに３０秒間浸漬後、２％次亜塩素酸に１０分間浸漬して表面殺菌した。クリーンベンチ内で、この蕾から小花を切り取り、表９の花卉植物の採芽用培地に植え付けた。１〜２か月間、光照射（約４０００ルクス、１０時間／日）、２５℃の培養室で無菌的に培養することにより、小花梗にカルスを形成させた。さらに１〜２か月間培養を続けることにより、茎、葉をもった幼植物を形成させた。
【００５０】
【表９】
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【００５１】
（３）  幼植物の花卉植物組織培養苗増殖用培地への移植
上記（２）において得られた幼植物をクリンーベンチ内で容器から取り出し、それぞれの幼植物を無菌的に分け、新たに調製した表４の花卉植物組織培養苗増殖用培地に植え付けた。光照射（約４０００ルクス、１０時間／日）、２５℃の培養室で無菌的に培養した。
【００５２】
（４）  シャクナゲ幼植物のＲ−５株での処理
上記（３）のシャクナゲ幼植物の生育している花卉植物組織培養苗増殖用培地の表面に上記（１）のＲ−５株菌体懸濁液１ｍｌをクリーンベンチ内で無菌的に滴下し、シャクナゲ幼植物の茎基部がＲ−５株菌体に接触するように培地表面全体にひろげた。次いで、光照射（約４０００ルクス、１２時間／日）、２５℃の人工気象器の中で１週間生育させた。
【００５３】
（５）  走査電子顕微鏡観察
以下のようにして、Ｒ−５株処理シャクナゲ幼植物を走査電子顕微鏡で観察した。まず、人工気象器内で１週間生育させた上記（４）のＲ−５株処理シャクナゲ幼植物を容器から取り出し、茎、葉に切り分けた。これらを０．２％タンニン酸含有５％グルタルアルデヒド中に浸漬し、６時間室温固定した。さらに、２％タンニン酸含有５％グルタルアルデヒド中に６時間浸漬した後、十分水洗し、１％四酸化オスミウムで１２時間固定した。試料を十分水洗した後、３０、５０、７０、９０、９５、１００％エタノールに順次２０分間ずつ浸漬して試料を脱水した。１００％エタノールを酢酸イソアミルに置換し、臨界点乾燥器で試料を乾燥し、金蒸着を試料に施した後に、走査電子顕微鏡で観察した。
【００５４】
図２及び図３は、茎の表面で生育しているＲ−５株の様子を示す走査電子顕微鏡写真である。図２に見られるように、菌糸は茎表面のワックス層上を伸長し、随所でワックス層下にもぐっていた。また、図３に見られるように、茎表面で生育しているＲ−５株の菌糸からは胞子鎖が形成されていた。胞子は連鎖状に連なり、全体では螺旋状であった。胞子は、０．４〜０．６×  ０．３〜０．４μｍの大きさで球形ないしは楕円形をし、表面は滑らかであり、実施例２（１）において観察されたＩＭＡ−２培地上の胞子鎖および胞子の様相と一致していた。また、葉についても同様の観察を行ったところ、同様な結果が得られた。以上の結果から、シャクナゲ幼植物を生育させた花卉植物増殖用培地の表面に、Ｒ−５株を植菌すると、１週間以内に茎、葉の表面でＲ−５株が菌糸生長及び胞子形成をすることが分かった。
【００５５】
（６）  蛍光顕微鏡観察
以下のようにして、Ｒ−５株処理シャクナゲ幼植物を蛍光顕微鏡で観察した。まず、人工気象器内で１週間生育させた上記（３）のＲ−５株処理シャクナゲ幼植物を容器から取り出し、葉から約１×２ｍｍ２の小片を調製した。この小片を０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０に数秒間浸漬した後、１％次亜塩素酸に５分間浸漬し、殺菌蒸留水で数分間よく洗浄した。続いて、７０％エタノールに１分間浸漬した後、クリーンベンチ内で表面を十分乾燥させた。このように表面殺菌した植物小片をシャーレ中の抗生物質添加ＩＭＡ−２平板培地上に置き、３０℃の培養噐の中で約１週間培養した。葉小片をガラス瓶に入れたＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００含有３％フォルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中に浸漬し、３時間減圧浸透した。十分水洗した後、さらに１％四酸化オスミウムで１２時間固定した。試料を十分に水洗した後、３０、５０、７０、９０、９５、１００％エタノールに順次２０分間浸漬して試料の脱水を行った。ヒストレジン樹脂に包埋した後、窒素を充填して１晩冷蔵庫（４℃）で固化させた。葉の小片を含む樹脂を、ガラスナイフ装着のミクロトームを用い、厚さ０．７μｍの超薄切片を切り出した。切片をガラススライド上におき、電熱板上でスライドガラスを５０〜６０℃に温めて切片をガラススライドに貼り付けた。切片上に０．０１％アクリジンオレンジ液を滴下し、カバーガラスをかけてＵＶ照射蛍光顕微鏡で観察した。
【００５６】
図４は、葉の内部で増殖するＲ−５株の様子を示す蛍光顕微鏡写真である。黄橙色の蛍光を発しているのがＲ−５株である。図４に見られるように、Ｒ−５株は、葉の内部、特に葉肉組織の細胞内部ならびに細胞縫合部で増殖し、培養中に葉内部から葉の外側に流れ出ていた。以上の結果から、シャクナゲ幼植物が生育している花卉植物増殖用培地の表面をＲ−５株で処理すると、１週間以内にＲ−５株は葉の内部に侵入し、特に葉肉組織の細胞内部ならびに細胞縫合部で増殖することが分かった。
【００５７】
〔実施例４〕放線菌処理したシャクナゲ幼植物体における放線菌の分布
放線菌で処理後、一定時間経過したシャクナゲ幼植物体における当該放線菌の分布状態を、植物体の各部位からの放線菌の再分離によって調べた。すなわち、実施例３（３）と同じ手順によりシャクナゲ幼植物を生育させた花卉植物増殖用培地の表面にＲ−５株を接種後、幼植物を光照射（約４０００ルクス、１２時間／日）、２５℃の人工気象噐の中で８日間生育させた。生育開始１日後から８日目まで毎日、一部の幼植物をクリーンベンチ内で容器から取り出し、茎を葉節ごとに葉付の茎を切り離した。この小片を０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０に数秒間浸漬した後、１％次亜塩素酸に５分間浸漬し、殺菌蒸留水で数分間よく洗浄した。次いで、７０％エタノールに１分間浸漬後、クリーンベンチ内で表面を十分乾燥させた。このように表面殺菌した各葉節小片をシャーレ中の抗生物質添加ＩＭＡ−２平板培地上に置き、３０℃の培養噐の中で約１週間培養することにより、培地上にＲ−５株が生育してくるか否かを観察することによって、Ｒ−５株の再分離割合を調べた。表１０に植物体の各部位における再分離の割合を示した。表１０中の分数は、分母が供試個体数であり、分子はＲ−５株が分離された個体数である。
【００５８】
【表１０】
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【００５９】
表１０からも明らかなように、培地表面に接種したＲ−５株は、図５のように、時間の経過とともに植物体の上部へと生息範囲を拡大していき、放線菌接種後８日目には、第５節以上の部位にも接種した放線菌が繁殖していることが分かった。
【００６０】
〔実施例５〕植物病原菌抵抗性を有するシャクナゲの作出
（１）  植物病原菌の調製
ポテトデキストロース寒天培地の斜面培地上で保存しておいたペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５を、ポテトデキストロース寒天平板培地に植菌し、２５℃で培養噐で１週間培養した。前記植物病原菌は菌糸を伸長させ、白色菌叢を形成した。寒天培地上に生育した菌叢を、クリーンベンチ内で寒天ごと直径４ｍｍのディスク状に切り取り、これを以下の実験の植物病原菌の接種源として用いた。
【００６１】
（２）  シャクナゲ幼植物への病原菌の接種
放線菌で処理したシャクナゲ幼植物体の植物病原菌に対する抵抗性を調べるために、放線菌で処理したシャクナゲ幼植物体に植物病原菌を接種した。すなわち、実施例３（３）の手順によりシャクナゲ幼植物を生育させた花卉植物増殖用培地の表面にＲ−５株を接種後、幼植物を約４０００ルクス、１２時間／日の光照射条件下、２５℃の人工気象噐の中で１週間生育させた。次いで、Ｒ−５株で処理したシャクナゲ幼植物の上位第４葉節の葉一枚の上に、上記（１）において調製した接種源ディスク１個を載せた。対照区として、Ｒ−５株で処理していないシャクナゲ幼植物の上位第４葉節の葉一枚の上にも同様に、接種源ディスク１個を載せた。次いで、Ｒ−５株処理および無処理のシャクナゲ幼植物を、約４０００ルクス、１２時間／日の光照射条件下、２５℃の人工気象噐の中で２週間生育させた。
【００６２】
（３）  植物病原菌を接種したシャクナゲ幼植物の発病状態
Ｒ−５株で処理していないシャクナゲ幼植物の写真を図６（Ａ）に、Ｒ−５株で処理したシャクナゲ幼植物の写真を図６（Ｂ）に示した。図６（Ａ）矢印と図６（Ｂ）矢印との比較から明らかなように、Ｒ−５株で処理していないシャクナゲ幼植物（図６（Ａ）、矢印）では、病原菌を接種した葉は菌糸に覆われ、褐色に変色していたのに対し、Ｒ−５株で処理したシャクナゲ幼植物（図６（Ｂ）、矢印）は、病原菌を接種した葉のみ（図６（Ｂ）、三角印）が菌糸に覆われ、褐色に変色しただけで、菌糸はその葉にとどまり、上下の茎、葉には進展しなかった。
【００６３】
さらに、Ｒ−５株で処理しなかったシャクナゲ幼植物（対照区）及びＲ−５株で処理したシャクナゲ幼植物（Ｒ−５株処理区）を７日及び１４日後に苗を観察し、病徴程度を４段階（無病徴、接種葉のみ褐変、接種葉及び上下位葉と茎の一部が褐変、苗が枯死）で評価した。結果を表１１に示した。
【００６４】
【表１１】
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【００６５】
表１１に示したように、７及び１４日目における苗の枯死は、対照区では、１４日後には、５４％に達したのに対し、Ｒ−５株処理区では枯死した苗はなかった。    以上のことから、シャクナゲ組織培養苗をＲ−５株で処理することによって、ペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）による病害の進展を顕著に抑制することが可能であることが判明した。
【００６６】
〔実施例６〕  根腐病に対する耐病性試験
培養土〔ピートモス：バーミキュライト＝７：３（ｖ／ｖ）〕１０ｇとイオン交換水５０ｍｌをプラスチックポット（６ｃｍ×６ｃｍ×９ｃｍ）に入れ、高圧滅菌（１２１℃で２０分間、さらに２４時間後に１２１℃で２０分間）して滅菌土とした。ここに、ポテトデキストロース寒天培地で１０日間培養した根腐病菌フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５の菌叢から打ち抜いた直径６ｍｍの菌糸片ディスク３０個を混ぜ合わせた。さらに、等量の滅菌土をこの病原糸状菌を混ぜた培養土の上に敷きつめ、汚染土とした。Ｒ−５株の菌液でシャクナゲ苗が生育している花卉植物増殖用培地表面を処理し、約４０００ルクス、１２時間／日の光照射条件下、２５℃で１０日間培養後、シャクナゲ苗を抜き取った。この苗を１ポットあたり５本ずつ汚染土に植え、蓋をして、先と同様約４０００ルクス、１２時間／日の光照射条件下、２５℃で培養した。また、無処理の苗を同様の手順で汚染土に植え、対照区とした。２週間後に苗を観察し、病徴程度を３段階〔無病徴（健全）、苗の一部分が褐変化、苗が枯死〕に評価した。
【００６７】
結果を図７に示した。図７から明らかなように、無処理区では、培養土移植２週間後には約４０％の苗が完全に枯死し、健全な苗は約６０％しか存在しなかった。一方、Ｒ−５株処理区では、約１１％の苗で茎または葉の一部分が褐変化し、約８％の苗が完全に枯死したものの、約８０％が健全であった。以上のことから、シャクナゲ組織培養苗をＲ−５株で処理することによって、フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）による根腐病の進展を顕著に抑制することが可能であることが判明した。
【００６８】
〔実施例７〕放線菌処理によるファイトアレキシンの誘導
Ｒ−５株のファイトアレキシン誘導効果について、ファイトアレキシンの一種のアントシアン系赤色色素の生成に注目して調べた。すなわち、まず実施例３（３）と同じ手順によりシャクナゲ幼植物を生育させた。次いで、＜１＞無処理の植物体、＜２＞Ｒ−５株で処理後、上位第４葉節の葉一枚の上に、実施例５（１）において調製した植物病原菌ペスタロチオプシス・シドウィアナ含有ディスク１個を載せたもの、及び＜３＞無処理のものの上位第３葉節の葉一枚の上にペスタロチオプシス・シドウィアナ含有ディスク１個を載せたものを設定した。次いで、光照射（約４０００ルクス、１２時間／日）、２５℃の人工気象噐の中で１週間生育させた。各植物体の状態を図８に示した。図８からも明らかなように、無処理の植物体（図８中、Ａ）は、茎が緑色であるのに対し、Ｒ−５株で処理後、植物病原菌を接種したもの（図８中、Ｂ）は、茎が鮮明な赤色に変化しており、また無処理のものに植物病原菌を接種したもの（図８中、Ｃ）は若干赤色に変色していた。
【００６９】
次いで、実施例５の手順により、シャクナゲ苗が生育している花卉植物増殖用培地をＲ−５株の菌液で処理し、２５℃で１２時間光照射下で培養した。処理２、４、６、８、１０日後にシャクナゲ苗を回収し、イオン交換水で洗浄後、キムワイプで表面を拭き取った。これらの苗１ｇをそれぞれ５０ｍｌの０．５Ｎ  ＨＣｌ−メタノールに浸漬し、４℃、暗黒下で２４時間静置後、濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．１）で濾過し、得られた濾液をアントシアニン粗抽出液とした。また、無処理の苗からも同様の手順でアントシアニンの抽出を行った。５Ｎ  ＨＣｌ−メタノール３００μｌと３Ｎ  ＨＣｌ−メタノール１００μｌの混合した液の波長５３０ｎｍの吸光度（Ａ５３０）を測定してブランクとした。次に、それぞれのアントシアニン粗抽出液３００μｌと３Ｎ  ＨＣｌ−メタノール１００μｌを混合し、吸光度Ａ５３０を測定した。さらに、粗抽出液中に含まれるアントシアニンを脱色するために、アントシアニン粗抽出液３００μｌと過酸化水素水１００μｌを混合し、１５分間置いて脱色した液の吸光度吸光度Ａ５３０を測定した。このようにして測定したアントシアニン脱色前の吸光度から脱色後の吸光度を差し引いた値を、アントシアニン量を示す吸光度とした。
【００７０】
結果を図９に示した。無処理の苗のアントシアニン量を示す吸光度Ａ５３０は約０．０６であった。一方、Ｒ−５株で処理した苗では、アントシアニン量を示す吸光度Ａ５３０は、日数とともに徐々に増加し、１０日後には無処理苗の約４倍にあたる０．２１となった。以上より、Ｒ−５株でシャクナゲ苗に処理することによって、シャクナゲ体中にアントシアニン（すなわちファイトアレキシン）を誘導できることが判明した。
【００７１】
〔実施例８〕  Ｒ−５株由来抗生物質の抽出
Ｒ−５株の菌液でシャクナゲ苗が生育している花卉植物増殖用培地の表面を処理し、約４０００ルクス、１２時間／日の光照射条件下、２５℃で１０日間培養した。この花卉植物増殖用培地２１９．３ｇおよびシャクナゲ苗１２．１７ｇからの抗生物質の抽出を試みた。また、対照区として、Ｒ−５株で無処理の花卉植物増殖用培地（２２１ｇ）と苗（８ｇ）から同様の手順で抽出した。まず、花卉植物増殖用培地から抜き取ったＲ−５株処理または無処理シャクナゲ苗を、イオン交換水でよく洗った後、乳棒・乳鉢を用いて液体窒素中で凍結磨砕した。これをフラスコに移し、２００ｍｌのメタノールを加えて一晩撹拌した後、脱脂綿で濾過した。次に、濾液に半量程度のヘキサンを加えてよく撹拌し、分液ロートで分液後、メタノール層を回収した。この手順を４回繰り返し、濾液中に含まれる葉緑素を除去した。得られたメタノール層をエバポレーターで乾固し、壁付着物を酢酸エチルで回収した後、イオン交換水を加えて分液した。回収した酢酸エチル層に硫酸ナトリウムを適量加えて脱水した後、脱脂綿で濾過した。ろ液をエバポレータ−で濃縮し、アセトンで溶出後、再びエバポレーションした。この手順を２回繰り返し、得られた乾物の乾燥重を測定した後、１ｍｇ（乾物重）／ｍｌになるようにＨＰＬＣ用メタノールを加えた。これをコスモナイスフィルター（ナカライ、φ０．４５μｍ）で濾過し、ＨＰＬＣ分析〔カラム（４．６×１０  ｍｍ、Ｒａｉｎｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）、アセトニトリル：リン酸緩衝液＝６０：４０、サンプル注入量２５μｌ、  流速１．０ｍｌ／分〕した。
【００７２】
苗を抜き取ったＲ−５株処理または無処理の花卉植物増殖用培地は、４００ｍｌのメタノールを加えて一晩撹拌した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３分）し、上清を回収した。得られた上清をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥した。これに、イオン交換水と酢酸エチルを加えてよく撹拌し、分液ロートで酢酸エチル層のみを回収した。次に、硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、脱脂綿でろ過し、回収したろ液をロータリーエバポレーターで濃縮した。これにアセトンを加え、ロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた乾燥物の乾燥重を測定した。つぎに、１ｍｇ（乾燥物の乾物重）／ｍｌとなるようにＨＰＬＣ用メタノールに溶かした後、コスモナイスフィルターでろ過してＨＰＬＣで分析〔カラム（４．６×１０  ｍｍ、  Ｒａｉｎｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）、アセトニトリル：リン酸緩衝液＝６０：４０、サンプル注入量２５μｌ、流速１．０ｍｌ／分〕した。
【００７３】
結果を表１２に示した。Ｒ−５株処理したシャクナゲ苗および花卉植物増殖用培地からの抽出液をＨＰＬＣ分析したところ、それぞれから保持時間約１２．８分に、ＵＶ極大吸収２４１、４２７（ショルダー）、４４３ｎｍをもつピークが検出された。これらを既知の抗生物質同定システムを用いて解析すると、いずれもアクチノマイシンに属する抗生物質であることが明らかとなった。また、検出された濃度は、それぞれ２４μｇ／ｍｌ（シャクナゲに含まれる水分）と７μｇ／ｍｌ（培地に含まれる水分）であった。これらの抗生物質濃度は、ペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５とフィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５の菌糸生長を有意に抑制するのに充分な濃度である。
【００７４】
【表１２】
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【００７５】
〔実施例９〕  Ｒ−５株が生産する抗生物質の特定
Ｒ−５株胞子懸濁液をＩＭＡ−２液体培地に接種し、３０℃で４日間振盪培養（振盪数：２００ｒｐｍ）した。高圧滅菌したＡ−３Ｍ生産培地〔グルコース５ｇ、グリセロール２０ｍｌ、可溶性デンプン２０ｇ、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎ  Ｏｉｌ  Ｃｏ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ）１５ｇ、酵母抽出物  ３ｇ、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０  ｒｅｓｉｎ（三菱化学）１ｇ、イオン交換水  １０００ｍｌ〕１００ｍｌにＲ−５株培養液を接種し、さらに３０℃で６日間振盪培養した。これに１００ｍｌのアセトンを加え、３０℃で２時間振盪抽出した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、上清を回収した。この上清をロータリーエバポレーターで濃縮し、酢酸エチルを加えてよく撹拌した後、分液ロートで水層と酢酸エチル層に分液した。さらに、この酢酸エチル層をエバポレーターで完全に濃縮し、アセトンで溶出後、再びエバポレーターで完全に濃縮した。これに、メタノールを加えて溶出後、ＨＰ−１０９０ＨＰＬＣを用いて、既知抗生物質同定システムで解析するとともに、得られた各ピーク画分のミクロコッカス・ルーテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１とサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ−１００に対する抗菌活性を検定した。
【００７６】
結果を表１３に示した。Ｒ−５株を培養したＩＭＡ−２液体培地からの抽出液を既知の抗生物質同定システムを用いてＨＰＬＣ分析したところ、保持時間１１分（ピーク１）にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ−１００対して、２２．１３８分（ピーク２）にミクロコッカス・ルーテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１に対して抗菌活性を示すピークが検出された。ピーク１のＵＶ吸収を解析すると、約３１０、３２５、３４０、３５６ｎｍに特徴的な極大吸収をもつことが明らとなった。このことから、このピーク１はポリエン抗カビ抗生物質であることが判明した。また、ピーク２は、約２４４、４２７（ショルダー）、４４３ｎｍに特徴的な極大吸収をもつことから、アクチノマイシンに属する抗生物質であることが判明した。以上の結果から、Ｒ−５株はポリエン抗カビ抗生物質およびアクチノマイシンに属する抗生物質をＩＭＡ−２液体培地中に生産することが明らかとなった。
【００７７】
【表１３】
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【００７８】
〔実施例１０〕病原糸状菌の抗生物質感受性検定
Ｒ−５株が生産することがわかったアクチノマイシンに属する抗生物質及びポリエン抗カビ抗生物質に対する病原糸状菌の感受性を検定した。まず、約４５℃に冷ましたジャガイモ・蔗糖寒天培地に、０．１、１、１０μｇ／ｍｌの濃度になるようにアクチノマイシンＤ又はアンホテリシンＢ（ポリエン抗カビ抗生物質）を溶かし、固化させた。これに、ジャガイモ・蔗糖寒天培地で７日間前培養したフィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５またはペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５のコロニーより打ち抜いた直径６ｍｍの菌糸片ディスクを接種し、３日間、経時的にそれぞれの菌叢直径を測定した。
【００７９】
結果を図１０〜１３に示した。図１０はフィトフトラ・シンナモミのアクチノマイシンＤ感受性を、図１１はフィトフトラ・シンナモミのアンホテリシンＢ感受性を、図１２はペスタロチオプシス・シドウィアナのアクチノマイシンＤ感受性を、図１３はペスタロチオプシス・シドウィアナのアンホテリシンＢ感受性をそれぞれ示している。なお、図中、◆は０．１μｇ／ｍｌ、■は１μｇ／ｍｌ、▲は１０μｇ／ｍｌ、×は０μｇ／ｍｌの抗生物質濃度の場合を示している。これらの図から明らかなように、ペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５はアンホテリシンＢに対する感受性が強く、０．１μｇ／ｍｌで菌叢生育が完全に抑制された。またアクチノマイシンＤに対しては感受性が弱かったものの、１０μｇ／ｍｌでは有意に抑制された。一方、フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５は、アンホテリシンＢにはほとんど感受性がなく、アクチノマイシンＤに対して感受性を示した。本菌の菌叢生育は、アクチノマイシンＤによって濃度依存的に抑制され、１０μｇ／ｍｌでほぼ完全に生長が停止した。
【００８０】
〔実施例１１〕  Ｒ−５株が生産する二次代謝産物の抗菌活性検定
Ｒ−５株胞子懸濁液をＩＭＡ−２液体培地に接種し、３０℃で４日間振盪培養（×２００ｒｐｍ）した。高圧滅菌したＡ−３Ｍ生産培地〔グルコース  ５ｇ、グリセロール  ２０ｍｌ、可溶性デンプン  ２０ｇ、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｓｏｕｔｈｅｒ  Ｃｏｔｔｏｎ  Ｏｉｌ  Ｃｏ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ）１５ｇ、酵母抽出物  ３ｇ、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０  ｒｅｓｉｎ（三菱化学）１ｇ、イオン交換水  １０００ｍｌ〕１００ｍｌにＲ−５株培養液を接種し、さらに３０℃で６日間振盪培養した。これに１００ｍｌのアセトンを加え、３０℃で２時間振盪抽出した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、上清を回収した。この抽出液上清に浸漬したろ紙ディスク（直径５ｍｍ）をクリーンベンチ内で風乾した後、細菌、酵母及び糸状菌プレート上に置いて、それぞれ３７℃、３０℃及び２５℃で一晩培養した。これにより、ろ紙ディスク周辺に形成された生長阻止円の直径を測定した。また、上記の検定に用いた各種細菌、酵母および糸状菌プレートは以下のように調製した。すなわち、４種類の細菌懸濁液〔エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＮＩＨＪ  ＪＣ−２、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ−４５、スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）２０９Ｐ  ＪＣ−１又はミクロコッカス・ルーテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ９３４１を滅菌水に懸濁〕１ｍｌを、約４５℃に冷ました５０ｍｌのニュートリエントアガー（Ｎｕｔｒｅｉｎｔ  ａｇａｒ；Ｄｉｆｃｏ）とよく混ぜ合わせ、シャーレに分注し、固化させた（細菌プレート）。２種類の酵母〔カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）Ａ９５４０又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓ−１００〕と７種の糸状菌〔フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Ｐｙ−３、リゾクトニア・ソラニー（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）ＰＥ−７５、フザリウム・アベナセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ）Ｆｕ−２０、スクレロチニア・ホモエオカルパ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａ）Ｓｃ−８、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．４１００８３又はペスタロチオプシス・シドウィアナ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｓｙｄｏｗｉａｎａ）ＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５〕は、それぞれジャガイモ・蔗糖液体培地（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ）に接種し、２５℃で３日間振盪培養（振盪数：２００ｒｐｍ）した。また、糸状菌の場合は、培養後に磨砕した。こうして得られた酵母培養液または磨砕した糸状菌菌体１ｍｌを、約４５℃に冷ましたジャガイモ・蔗糖寒天培地  ５０ｍｌとよく混ぜ合わせて、シャーレに分注・固化させた（それそれ酵母プレートおよび糸状菌プレート）。
【００８１】
結果を表１４に示した。抗菌活性検定の結果、細菌では、グラム陽性菌であるバチルス・スブチリスＭ−４５、スタフィロコッカス・オーレウス２０９Ｐ及びミクロコッカス・ルーテウスＡＴＣＣ  ９３４１に対して直径２８〜３９ｍｍの生長阻止円を形成したが、グラム陰性菌のエッシェリヒア・コリＮＩＨＪ  ＪＣ−２には活性を示さなかった。酵母に対しては、供試したカンジダ・アルビカンスＡ９５４０及びサッカロマイセス・セレビシエＳ−１００の両菌株に対して直径約２５ｍｍの生長阻止円を形成した。また、病原糸状菌では、鞭毛菌亜門に属するフィトフトラ・シンナモミＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５５６５及びピシウム・アファニデルマタムＰｙ−３、不完全菌亜門に属するボトリチス・シネレアＭＡＦＦ  Ｎｏ．４１００８３（完全世代が存在すれば、子のう菌亜門）、フザリウム・アベナセウムＦｕ−２０（完全世代が存在すれば、子のう菌亜門）及びリゾクトニア・ソラニーＰＥ−７５（完全世代が存在すれば、担子菌亜門）、子のう菌亜門に属するペスタロチオプシス・シドウィアナＭＡＦＦ  Ｎｏ．３０５７５５及びスクレロチニア・ホモエオカルパＳｃ−８のいずれの供試菌に対しても直径３０ｍｍ以上の生長阻止円を形成した。このことから、Ｒ−５株がＩＭＡ−２液体培地中に生産する抗生物質は、グラム陽性細菌、酵母および糸状菌といった幅広い微生物種に対して抗菌活性を示すことが明らかとなった。
【００８２】
【表１４】
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【００８３】
【発明の効果】
本発明により、ストレプトミセスｓｐ．Ｒ−５株、該株を有効成分として含有してなる植物病害防除剤、該株を植物に接種することを特徴とする病害抵抗性植物の作出方法及び該株を有効成分として含有してなるファイトアレキシン誘導剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒ−５株の胞子を示す走査電子顕微鏡写真である。
【図２】茎の表面で生育するＲ−５株の様子を示す走査電子顕微鏡写真である。
【図３】茎の表面で生育するＲ−５株の様子を示す走査電子顕微鏡写真である。
【図４】葉の内部で生育するＲ−５株の様子を示す蛍光電子顕微鏡写真である。
【図５】シャクナゲ上でのＲ−５株の経日的推移を示した図である。
【図６】Ｒ−５株で処理しない場合及び処理した場合のシャクナゲの発病状態を示す写真である。
【図７】Ｒ−５株で処理しない場合及び処理した場合のシャクナゲの根腐病徴の程度を示すグラフである。
【図８】Ｒ−５株で処理しない場合及び処理した場合のシャクナゲの茎色の様子を示す写真である。
【図９】Ｒ−５株で処理後のシャクナゲのアントシアニン量の経時的変化を示すグラフである。
【図１０】フィトフトラ・シンナモミのアクチノマイシンＤ感受性を示すグラフである。
【図１１】フィトフトラ・シンナモミのアンホテリシンＢ感受性を示すグラフである。
【図１２】ペスタロチオプシス・シドウィアナのアクチノマイシンＤ感受性を示すグラフである。
【図１３】ペスタロチオプシス・シドウィアナのアンホテリシンＢ感受性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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