(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの重ポリペプチド鎖を含み、ラクダ科の動物に由来する、免疫グロブリンの可変領域（ＶＨＨ）からなるフラグメントであって、該重ポリペプチド鎖のそれぞれは、可変領域及び定常領域を含み、該定常領域は、第１定常ドメイン（ＣＨ１）を欠き、該免疫グロブリンは、さらに、軽ペプチド鎖を欠き、そして４５位のアミノ酸残基が、ロイシン、プロリン又はグルタミンではない、該フラグメント。
【請求項２】
４５位のアミノ酸残基が、荷電アミノ酸の中から選択されるか、又はシステイン残基である、請求項１に記載のフラグメント。
【請求項３】
化学合成によって得られたことを特徴とする、請求項１又は２に記載のフラグメント。
【請求項４】
細菌、ウイルス、寄生動物、又はタンパク質、ハプテン、炭水化物又は核酸のような抗原に対することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項５】
免疫グロブリンイディオタイプに対することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項６】
細胞レセプター又は膜タンパク質に対することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項７】
所定の基質の活性化状態を模倣する抗原に対することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項８】
触媒的活性を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項９】
トキシン、酵素、薬物又はホルモンとコンジュゲーションしていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項１０】
２つの重ポリペプチド鎖を含む重鎖免疫グロブリンをコードするヌクレオチドを含むｃＤＮＡライブラリーであって、それぞれの重鎖が、全抗原結合部位からなり、該免疫グロブリンが、可変領域（ＶＨＨ）及び定常領域を含み、該定常領域が、第一定常ドメインであるＣＨ１を欠き、該免疫グロブリンが、さらに、軽ポリペプチド鎖を欠き、そして４５位のアミノ酸残基が、ロイシン、プロリン又はグルタミンではない、下記工程：
（ａ）ラクダ科から得られる、リンパ球様細胞を含む生物学的サンプルからＢリンパ球を得ること、
（ｂ）他の核酸及びＢリンパ球の構成要素からポリアデニル化ＲＮＡを分離すること、
（ｃ）逆転写酵素と得られたＲＮＡを反応させ、対応するｃＤＮＡを得ること、
（ｄ）得られたｃＤＮＡを、重鎖免疫グロブリンのＶＨＨ配列のプロモーター、リーダー又はフレームワーク配列中に位置し、決定された制限部位を含む５’プライマー、及び、ヒンジＣＨ２、ＣＨ３の３’非翻訳領域又はポリＡテールに位置する３’プライマーと接触させること、
（ｅ）ＤＮＡを増幅すること、
（ｆ）増幅されたＤＮＡをベクター内にクローニングすること、
（ｇ）得られたクローンを回収すること
によって得られる、ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項１１】
請求項１０に記載のｃＤＮＡライブラリーであって、工程（ａ）のＢリンパ球が、決定された抗原に対して予め免疫化された動物から得られ、工程（ｇ）で回収されたクローンが、免疫化に用いた抗原に予め選択された特異性を有する、ｃＤＮＡライブラリー。
【請求項１２】
該リンパ球様細胞が、末梢リンパ球、脾臓細胞、リンパ節、その他のリンパ様組織からなる群より選択される、請求項１０又は１１に記載のｃＤＮＡライブラリー。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のフラグメントを含む、インビトロでの診断のための試薬。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のフラグメントを含む、研究に有用な試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌポリペプチド鎖が欠落している新規な分離免疫グロブリンに関する。これらの免疫グロブリンは、Ｈポリペプチド鎖及びＬポリペプチド鎖の両者からなる免疫グロブリンの分解物中には含まれないが、反対に、本発明は、免疫グロブリンのファミリーの新しいメンバー、特に免疫認識に関与することのできる新しいタイプの分子を定義するものである。これらの免疫グロブリンは、各種目的、特に病原体に対する防御又はタンパク質の発現若しくは活性の調整をはじめとする診断若しくは治療の目的に使用することができる。
【０００２】
現在提唱されている免疫グロブリンの構造は、ジスルフィド結合により結合してｙ−又はＴ−型の巨大分子を形成する２本の同一のＬポリペプチド鎖（Ｌ鎖）及び２本の同一のＨポリペプチド鎖（Ｈ鎖）の存在と関連した４本鎖モデルからなるものである。これらの鎖は、定常部と可変部とからなり、定常部は数種のドメインに細分される。２本のＨポリペプチド鎖は通常は、定常部の第１ドメイン及び第２ドメインの間に位置するいわゆる「ヒンジ部」内でジスルフィド結合により結合している。
【０００３】
免疫グロブリンのクラスを形成するタンパク質のうち、その多くは抗体であり、したがって１箇所又は数箇所の抗原結合部位を有する。
【０００４】
４本鎖モデルによると、抗体の抗原結合部位は、Ｈ鎖及びＬ鎖それぞれの可変ドメインに位置し、Ｈ鎖及びＬ鎖可変ドメインの関連を必要とする。
【０００５】
これら４本鎖モデル免疫グロブリンの定義には、Roitt. Iら(Immunology-second-Edition Gower Medical Publishing USA, 1989)が参照される。特に、４本鎖免疫グロブリンの定義、そのポリペプチド及び遺伝子構造、その可変及び定常部の定義、及び良く知られた技術による酵素分解によって得られる断片の獲得に関する箇所が、特に、参照される。
【０００６】
本発明者らは驚くべきことに、免疫グロブリンの機能的特性を有する種々の分子が、これらを天然に産する動物から分離され、その機能が、ある場合には、例えばＬ鎖の欠落のために、４本鎖免疫グロブリンの機能に関与するのとは異なる構造要素と関連していることを確立した。
【０００７】
本発明は、２本鎖モデル免疫グロブリンであって、天然の４本鎖モデル免疫グロブリンの分解、特に酵素による分解によって得られる断片にも、天然４本鎖モデル免疫グロブリンの定常若しくは可変部又はこれらの一部をコードするＤＮＡの宿主細胞における発現とも、或いは、例えばマウス、ラット又はヒトのリンパ管において生産される抗体のいずれにも対応しない免疫グロブリンに関する。
【０００８】
E.S. Ward ら（１）は、Ｈポリペプチド鎖（ＶH）又は／及びＬポリペプチド鎖（Ｖk/Ｆv）の可変ドメインに関して実験を行い、これらの可変ドメインの特定抗原との結合能を試験したことについて記載している。この目的のために、これらの特定抗原によりあらかじめ免疫化されたマウスの脾臓のゲノムＤＮＡからＶH遺伝子のライブラリーを調製した。
【０００９】
Wardらはその刊行物の中で、ＶHドメインは比較的粘着性であり、これは多分、正常にはＶκ又はＶλドメインによりキャップされている被曝疎水表面のためであろうと記載している。そこで彼らは、改良された特性を有するＶHドメインをデザインすることは可能であるはずであると想像し、更に、結合活性を有するＶHドメインは可変断片（Ｆv 断片）又は完全抗体を作るためのビルデイングブロックとして役に立つかもしれないと想像している。
【００１０】
本発明は、４本鎖モデル免疫グロブリンの異なる断片（Ｌ及びＨ鎖）及びこれらの断片の異なるドメインを修飾することにより、新たな若しくは改良された抗原結合部位又は４本鎖モデル免疫グロブリンが定義されるとの考えから始まったものではない。
【００１１】
本発明者らは、免疫グロブリンが公知の４本鎖モデルとは異なる構造を有し、このような異なる免疫グロブリンにより、研究又は産業目的の使用のための診断薬、治療薬又はその他の薬物の調製のための新しい手段が提供されると判断した。
【００１２】
本発明はしたがって、４本鎖モデル免疫グロブリンの機能的特性を示すことのできる新規免疫グロブリンを提供するものであるが、
その構造は、多くの状況では、その使用、その調製、そしてある場合ではその修飾に、より適切であると考えられる。更にこれらの分子は、他の免疫グロブリンの修飾のための先導的構造であると考えることができる。これらの免疫グロブリンにより提供される利点には、これらをより容易に調製できるとの可能性が含まれる。
【００１３】
したがって本発明は、１箇所の完全抗原結合部位又は数箇所の抗原結合部位の形成に十分な２本のＨポリペプチド鎖からなることを特徴とし、更にＬポリペプチド鎖が欠落している免疫グロブリンに関する。本発明の詳細な実施態様においては、これらの免疫グロブリンは更に、これらの免疫グロブリンが、ラクダなどの反芻動物（Camelids）（以下単にラクダという）のリンパ球又はその他の細胞から得られるようなＬ鎖の欠落した免疫グロブリンの配列を有するＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの、原核又は真核宿主細胞における発現の産物であるとの事実を特徴とする。
【００１４】
本発明の免疫グロブリンは、例えば図７に記載する配列から得ることができる。
【００１５】
Ｌ鎖の欠落した本発明の免疫グロブリンは、そのＨ鎖の可変ドメインが、４本鎖免疫グロブリンＶHのそれとは異なる特性を有するようなものである。本発明のＨ鎖免疫グロブリンのこの可変ドメインは、このＨ鎖免疫グロブリンには存在しないＣH１ドメイン又はＶLとの正常な相互作用部位を有さない。したがってこれは、溶解性及び結合部位の位置などの特性の多くにおいて、新規な断片である。我々は、明らかな理由から、本文中においては、これを、４本鎖免疫グロブリンの古典的ＶHとは区別するためにＶHHと記載する。
【００１６】
本発明によると、「完全抗原結合部位」とは、単独で抗原の認識及び完全結合をもたらす部位を意味する。これは、結合親和性の試験に関するいかなる公知の方法によっても証明することができる。
【００１７】
組換えＤＮＡの技術により調製される、又は動物から分離できるこれらの免疫グロブリンは、時に、以下のページにおいて「Ｈ鎖免疫グロブリン」と呼ばれることもある。本発明の好ましい実施態様においては、これらの免疫グロブリンは、純粋な形である。
【００１８】
最初の実施態様においては、本発明の免疫グロブリンは、原核細胞、特にE. coli の細胞において、以下の工程からなる方法により得ることができる：
ａ）例えばラクダのリンパ球から得られるＬ鎖欠落免疫グロブリンのＶHHドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をBluescriptベクター中でクローニングし、
ｂ）Ｘｈｏ部位を含む５′プライマー及び以下の配列：
TC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG を有するＳｐｅ部位を含む３′プライマーを用いて増幅した後、クローン化した断片を回収し、
ｃ）ベクターをＸｈｏ及びＳｐｅ制限酵素により消化した後、免疫ＰＢＳベクター中、ファージ中で、回収された断片をクローン化し、
ｄ）宿主細胞、特にE. coli を、ステップｃの組換え免疫ＰＢＳベクターによるトランスフェクションにより形質転換し、
ｅ）例えば、ヒトコブラクダＶHHドメインに対する抗体を用いて、
ＶHHをコードする配列の発現物を回収する。
【００１９】
別の実施態様においては、免疫グロブリンは以下の工程からなる方法によって得られる異種特異的免疫グロブリンである：
−与えられた抗原に対する所定の特異性を有し、Ｘｈｏ及びＳｐｅ部位の間にあるＶHHドメイン若しくはその一部をコードする第１のＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を得、
−第１のＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列の特異性とは異なる所定の特異性 を有し、Ｓｐｅ及びＥｃｏＲＩ部位の間にあるＶHHドメイン若しくはその一部をコードする第２のＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を得、
−ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素により免疫ＰＢＳベクターを消 化し、
−得られた、ＶHHドメインをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を、このＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列がベクター中で連続してクローン化されるように連結し、
−宿主細胞、特にE. coli 細胞を、トランスフェクションにより形 質転換し、得られる免疫グロブリンを回収する。
【００２０】
別の実施態様においては、免疫グロブリンは以下の工程からなる方法によって得ることができる：
−所定の特異的抗原結合部位を有するＶHHドメイン若しくはその一 部をコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を得、
−開始コドン及びＨｉｎｄIII部位を有する５′プライマー並びに終止コドンを含み、ＸｈｏＩ部位を有する３′プライマーを用いて、得られたＤＮＡ又はｃＤＮＡを増幅し、
−増幅されたＤＮＡ又はｃＤＮＡを、プラスミドｐＭＭ９８４のＨｉｎｄIII（２６５０位）及びＸｈｏＩ（４０６７位）部位中に組換え、
−組換えプラスミドにより許容される細胞、特にＮＢ−Ｅ細胞をト ランスフェクションし、
−得られる生成物を回収する。
【００２１】
ＶHHドメインの領域に対して向けられた抗体により、特にＥＬＩＳＡ法により、発現の成功が証明される。
【００２２】
本発明の別の詳細な実施態様によると、免疫グロブリンはパルボウイルスにおいてクローン化される。
【００２３】
別の実施例においては、これらの免疫グロブリンは、別の所定の抗原結合部位を有する第２のＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列をプラスミドｐＭＭ９８４中で更にクローニングすることからなる方法によって得られる。
【００２４】
このような免疫グロブリンは更に、ベクターがＹｅｐ５２であり、形質転換される組換え細胞が酵母、特にS. cerevisiae である方法によって得られることを特徴とする。
【００２５】
特定の免疫グロブリンは、それが触媒活性を有し、特にそれが、
与えられた基質の活性状態を模倣する（ミミックする）抗原に対して向けられたものであることを特徴とする。これらの触媒抗体は、
その触媒機能を増大又は変更するために、その結合部位の位置で、
無作為又は指向突然変異誘発により修飾することができる。このような触媒性免疫グロブリンの調製のための一般的技術については、
Lernerら（TIBS November 1987. 427-430)の刊行物を参考とすることができる。
【００２６】
好ましい実施態様によると、本発明の免疫グロブリンは、その可変部が、４５位に、ロイシン、プロリン又はグルタミン残基とは異なるアミノ酸を含むことを特徴とする。
【００２７】
更に、このＨ鎖免疫グロブリンは、動物のリンパ球に特有の生成物でもなければ、リンパ管症を患うヒトの患者のリンパ球から得られる生成物でもない。リンパ管症において生成されるこのような免疫グロブリンは、本来モノクローナルであり、ゲノムレベルにおける病原性突然変異によるものである。これらは明らかに抗原結合部位を持たない。
【００２８】
これらの免疫グロブリンの２本のＨポリペプチド鎖は、Roitt らの定義によるヒンジ領域により結合される。
【００２９】
本発明の具体的な実施態様においては、上記で定義した分子に対応する免疫グロブリンは、抗体として作用する能力を有する。
【００３０】
本発明の免疫グロブリンの抗原結合部位は、Ｈ鎖の可変部に位置する。
これらの免疫グロブリンの個々の群においては、Ｈポリペプチド鎖はそれぞれその可変部上に抗原結合部位を含有し、これらの部位は、それと同じアミノ酸配列と対応する。
【００３１】
本発明の更なる実施態様においては、免疫グロブリンは、そのＨポリペプチド鎖が、可変部（ＶHH）及びRoitt らの定義による定常部（ＣH）を含むが、その定常部の第１のドメインが欠落していることを特徴とする。定常部の第１のドメインはＣH１と呼ばれる。
【００３２】
ＣH１ドメインを有さないこれらの免疫グロブリンは、それらの鎖の可変部が、可変部のＣ末端部においてヒンジ部と直接結合しているものである。
【００３３】
上述したタイプの免疫グロブリンは、Ｇ型免疫グロブリン及び特に、クラス２の免疫グロブリン（ＩｇＧ２）又はクラス３の免疫グロブリン（ＩｇＧ３）と定義される免疫グロブリンを含むことができる。
【００３４】
Ｌ鎖及び第１定常ドメインの欠落により、Roitt らによる酵素消化により得られる免疫グロブリン断片の名称が変化する。
【００３５】
パパイン及びペプシン消化断片にそれぞれ対応する、一方ではＦｃ及びｐＦｃの語、他方ではＦｃ′及びｐＦｃ′の語は維持される。
【００３６】
Ｆａｂ  Ｆ（ａｂ）2   Ｆ（ａｂ′）2   Ｆａｂｃ、Ｆｄ及びＦｖの語は、その本来の意味ではもはや適用されない。これらの断片は、Ｌ鎖、Ｌ鎖の可変部、又はＣH１ドメインのいずれかを有するからである。
【００３７】
パパイン消化により得られ、ＶHHドメイン及びヒンジ部からなる断片は、それらがジスルフィド結合により結合されたままでいるかどうかにより、ＦＶHHｈ又はＦ（ＶHHｈ）2 と呼ばれるであろう。
【００３８】
本発明の別の実施態様においては、上記の定義にあてはまる免疫グロブリンは、動物、特にラクダ科の動物に由来することができる。本発明者らは、ラクダに存在するＨ鎖免疫グロブリンは、４本鎖免疫グロブリンに関しては、異常抗体の生産を誘導する病理学的状態とは、関連していないことを発見した。旧世界のラクダ（Camelus bactrianus及びCamelus dromaderius ）及び新世界のラクダ（例えば、Lama Paccos, Lama Glama 及びLama Vicugna）の比較研究に基づいて、本発明者らは、Ｌポリペプチド鎖の欠落した本発明の免疫グロブリンが、あらゆる種に認められることを示した。しかし、動物によりこれらの免疫グロブリンの分子量には、違いがあると考えられる。特に、これらの免疫グロブリンに含まれるＨ鎖の分子量は、約４３kdから約４７kdまでであり、特に４５kdである。
【００３９】
有利なことに、本発明のＨ鎖免疫グロブリンは、ラクダの血液中に分泌される。
【００４０】
本発明の詳細な実施態様による免疫グロブリンは、ラクダの血清から精製により得ることができ、精製法は、実施例中に詳細に記載されている。免疫グロブリンをラクダから得る場合、本発明は、その自然の生物学的環境にはない免疫グロブリンに関する。
【００４１】
本発明によると、ラクダの血清から精製により得られるような免疫グロブリンＩｇＧ２は、以下の点を特徴とする：
−クロマトグラフィーによってプロテインＧセファロースカラムに は吸着されず、
−クロマトグラフィーによってプロテインＡセファロースカラムに 吸着され、−pH４．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸、ＮａＯＨによりpH４．５に調整）による溶離後、約１００kdの分子量を有し、
−還元後、分子量約４６kd、好ましくは４５のＨγ２ポリペプチド 鎖からなる。
【００４２】
本発明の更なる実施態様によると、ラクダの血清から精製により得られるような、ＩｇＧ３に対応する別の群の免疫グロブリンは、
以下の点を特徴とする：
【００４３】
本免疫グロブリンは、
−クロマトグラフィーによりプロテインＡセファロースカラムに吸着され、
−pH３．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸）に よる溶離後、約１００kdの分子量を有し、
−クロマトグラフィーによりプロテインＧセファロースカラムに吸着され、pH３．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸）により溶離され、
−還元後、分子量約４５Kd、特に４３から４７Kdの間の分子量のＨγ３ポリペプチド鎖からなる。
【００４４】
しかし、Ｌ鎖の欠落した本発明の免疫グロブリンはそのＨ鎖上に、定常部及び可変部を有する。定常部は種々のドメインからなる。
【００４５】
本発明の免疫グロブリンの可変部は、枠組み構造（ＦＷ）及び相補性決定部位（ＣＤＲ）、特に４個の枠組み構造及び３個の相補性部位からなる。これは、特に、この可変部自体が１箇所又は数箇所の抗原結合部位を有し、存在しないＬ鎖の可変部による寄与はないという事実のために、４本鎖免疫グロブリンとは区別される。
枠組み構造１及び４のアミノ酸配列は、それらの中に以下から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む：
枠組み構造１のドメイン
枠組み構造４のドメイン
ＣＤＲ３ドメイン
上述したように、本発明の免疫グロブリンは、そのＣH１ドメインの全体を欠落しているのが好ましい。
このような免疫グロブリンは、そのヒンジ部に関しては、Ｃ末端部においてＣH２及びＣH３ドメインからなる。
本発明の詳細な実施態様によると、免疫グロブリンの定常部は、
以下から選択されるアミノ酸配列を含むＣH２及びＣH３ドメインを含む：
ＣH２ドメイン
ＣH３ドメイン
【００４６】
興味深いことに、本発明者らは、本発明の免疫グロブリンのヒンジ部が、可変である長さを示すことを示した。これらの免疫グロブリンが抗体として作用する場合、ヒンジ部の長さは、抗原結合部位を分離する距離の決定に関与する。
【００４７】
本発明による免疫グロブリンは好ましくは、そのヒンジ部が０から５０個のアミノ酸からなることを特徴とする。
【００４８】
特に、本発明の免疫グロブリンのヒンジ部の配列は、以下の通りである。
【００４９】
短いヒンジ部はＩｇＧ３分子に対応し、長いヒンジ配列はＩｇＧ２分子に対応する。
【００５０】
Ｈ鎖免疫グロブリン由来の分離されたＶHH又はＨ鎖免疫グロブリンに対応するＶHHライブラリは、Ｈ鎖免疫グロブリンを特徴づける配列特性に基づいて、４本鎖モデル免疫グロブリンのＶHHクローニングからは区別することができる。
【００５１】
ラクダのＨ鎖免疫グロブリンＶHH部は、試験を行ったあらゆる種から得られた４本鎖免疫グロブリンから得られたＶHH部とは、多数の相違点を示す。ＶHH／ＶL 相互作用に関連する残基の位置においては、４本鎖免疫グロブリンにおいてはほぼ常にロイシンであり（９８％）、この位置における他のアミノ酸はプロリン（１％）及びグルタミン（１％）である４５位（ＦＷ）の位置において、重大な相違が認められる。
【００５２】
ラクダのＨ鎖免疫グロブリンにおいては、現在調査した配列では、４５位にロイシンが１度だけ認められている。これは、４本鎖免疫グロブリンに由来するものであろう。他の場合、この位置はアルギニン、システイン又はグルタミン酸残基により置換されている。この位置に荷電アミノ酸が存在することにより、ＶHHがより可溶性になっているはずである。
ラクダの４５位におけるような特定の残基による置換は、４本鎖免疫グロブリンのＶHHレパートリーから得られる、工学的に作り出されるＶHH部の構築には興味深いと考えられる。
【００５３】
ラクダのＶHHドメインに特異的である第２の特徴は、ＣＤＲ1３１位若しくは３３位におけるシステインと関連するＣＤＲ3 部又はＦＷ2 部４５位においてシステインが高頻度に存在することである。ＣＤＲ3 部と残りの可変ドメインとの間にジスルフィド結合を確立する可能性が、結合部位の安定性及び位置決定に関与する。
【００５４】
ひとつの病原性骨髄腫タンパク質（ＤＡＷ）を除いて、このようなジスルフィド結合は、４本鎖免疫グロブリンから得られる免疫グロブリンＶ領域においてはこれまで遭遇されたことがない。
【００５５】
本発明のＨ鎖免疫グロブリンは更に、粘着性ではないという特有の利点を有する。したがって、血清中に存在するこれらの免疫グロブリンは、分離された４本鎖免疫グロブリンのＨ鎖よりもはるかに凝集しにくい。本発明の免疫グロブリンは、０．５mg/ml 以上、好ましくは１mg/ml 以上、そしてより有利には２mg/ml 以上の濃度で溶ける。
【００５６】
これらの免疫グロブリンは更に、広範な抗原結合レパートリーを有し、in vivo(生体内）において親和性及び特異性成熟を受ける。
したがって、これらにより、所定の抗原に関し、定義された特異性を有する抗体の分離及び調製が可能となる。
【００５７】
本発明の免疫グロブリンの別の興味深い特性は、これらを修飾し、特にヒトにも適用され得るという点である。特に、これらの免疫グロブリンの定常部の全部又は一部を、ヒト抗体の定常部の全部又は一部と置換することが可能である。例えば、免疫グロブリンのＣH２及び／又はＣH３ドメインは、ＩｇＧγ３ヒト免疫グロブリンのＣH２及び／又はＣH３ドメインと置換することができる。
【００５８】
このようにヒト対応抗体においては、可変配列の一部、つまり結合部位において介在しない１個又はそれ以上の枠組み構造残基の一部を、ヒト枠組み構造残基又はヒト抗体の一部と置換することも可能である。
【００５９】
反対に、Ｈ鎖免疫グロブリンＶHH部の主要部（特にペプチド断片）を、例えば免疫グロブリンのより高い溶解性を達成する目的で、４本鎖免疫グロブリン由来のＶH又はＶL部に導入することができる。
【００６０】
本発明は更に、上述した免疫グロブリンの断片及び特に以下の群：
−Ｌ鎖欠落免疫グロブリンの１本のＨポリペプチド鎖に対応する断片、
−本発明の免疫グロブリンの酵素消化により得られる断片、特にパパインによる部分消化によりＦｃ断片（定常断片）及びＦＶHHｈ断片（Ｈ鎖の抗原結合部位を含有する）に至る断片若しくはその二量体Ｆ（ＶHHｈ）2、又はＦｃ断片をパパインにより更に消化することによって得られる、Ｆｃ断片のＣ末端部に対応するｐＦｃ断片に至る断片、
−その他のタンパク分解酵素により得られる相同断片、−免疫グロブリンの可変部の少なくとも１０個、好ましくは２０個 のアミノ酸の断片、又は完全可変部、特に分離されたＶHHドメイン又はヒンジジスルフィドに結合したＶHH二量体に対応する断片、
−免疫グロブリンのヒンジ部又はこのヒンジ部の少なくとも６個のアミノ酸に対応する断片、
−Ｐｒｏ−Ｘの反復配列を含むヒンジ部の断片、
−免疫グロブリンの定常部の少なくとも１０個、好ましくは２０個のアミノ酸又は完全定常部に対応する断片
より選択される断片に関する。
【００６１】
本発明はまた、少なくとも３回のＰｒｏ−Ｘの反復を含む、Ｐｒｏ−Ｘの反復配列を含む断片に関し、ここでＸは何れかのアミノ酸、そして好ましくはＧｌｎ（グルタミン）、Ｌｙｓ（リジン）又はＧｌｕ（グルタミン酸）であり、特定の反復断片は、Ｐｒｏ−Ｘの配列の１２回反復からなる。
【００６２】
このような断片は、異なる型の分子の間の連鎖として使用することができる。
【００６３】
Ｐｒｏ−Ｘ配列のアミノ酸は、あらゆる天然又は非天然アミノ酸から選択される。
【００６４】
断片は、免疫グロブリンの酵素分解により得られる。これらはまた、免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列の細胞又は生物における発現により得ることができ、或いは化学的に合成することもできる。
【００６５】
本発明はまた、Ｈ鎖免疫グロブリンクラスに属する抗イディオタイプ抗体に関する。このような抗イディオタイプは、ヒト又は動物のイディオタイプに対して生産することができる。これらの抗イディオタイプの特性は、特に、糖タンパク質又は糖脂質に対する免疫接種のためのイディオタイプワクチンとして、及び炭水化物がエピトープを決定する場合に、これらのイデイオタイプを使用することができるというものである。
【００６６】
本発明はまた、Ｈ鎖免疫グロブリンのイディオタイプを認識することのできる抗イディオタイプに関する。
【００６７】
このような抗イディオタイプ抗体は、同型抗体又は同種若しくは異種抗体のいずれかであることができる。
【００６８】
本発明はまた、以下：
より選択されるペプチド配列を含むアミノ酸配列のタンパク質の全部又は一部をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００６９】
このようなヌクレオチド配列は、遺伝子コードのデネネラシー(deneneracy)を考慮して、アミノ酸配列から推定することができる。これらは合成又は本発明の免疫グロブリンを産生する細胞から分離することができる。
このようなＤＮＡ配列を得る方法は、実施例中に記載する。
【００７０】
本発明はまた、ＲＮＡ、特にこれらのＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列を、及び対応するｃＤＮＡ配列もまた意図するものである。
【００７１】
本発明のヌクレオチド配列は更にまた、本発明の免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列を分離するための、ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーの細胞内における検出又はスクリーニングに適当であるプライマーの調製に用いることができる。
【００７２】
このようなヌクレオチド配列は、組換えベクターの調製、及びベクターに含まれるこれらの配列の、宿主細胞、特に細菌などの原核細胞又は真核細胞、そして例えばＣＨＯ細胞、昆虫細胞、ベロ(Vero)細胞などのサル細胞、又は他のあらゆる哺乳類細胞による発現に使用することができる。特に、本発明の免疫グロブリンはＬ鎖を欠落しているという事実のため、これらを真核細胞中に分泌させることが可能である。４本鎖免疫グロブリンでは必要であるＢＩＰタンパク質の形成からなる工程を用いる必要がないからである。
【００７３】
組換えＤＮＡ技術によりモノクローナル抗体又は免疫グロブリンを生産するための公知の方法が不適当であるのは、非常に多くの場合において、４本鎖免疫グロブリンの特定結合部位に対応するＶH及びＶLドメインを同時にクローン化する必要があるからである。
【００７４】
本発明によるＨ鎖免疫グロブリンを産生する動物及び特にラクダ、
並びに他の脊椎動物種は、その結合部位がＶHHドメインのみに位置するＨ鎖免疫グロブリンを産生することができる。鎖の切断又は直接クローニングにより他の種において産生されるいくつかのＨ鎖免疫グロブリンとは違って、ラクダのＨ鎖免疫グロブリンは、in vivo において広範囲な成熟を受ける。更にまた、これらのＶ部は自然に、ＶLの存在しない状態で機能するよう進化してきた。したがってこれらは組換えＤＮＡ技術によるモノクローナル抗体の産生には理想的である。特定抗原に結合するクローンの獲得は、非常に多数の組換え細胞を必要とする確率論的過程に依存しないため、はるかに広い範囲のレパートリーの試験が可能である。
【００７５】
これは、任意に選択した組織又は細胞の型から得られたＤＮＡを用いた非転位ＶHHレパートリーのレベル、或いはＢリンパ球から得られたＤＮＡを用いた転位ＶHHレパートリーのレベルにおいて行うことができる。しかし、あらかじめ適当なベクター中で増幅させまたはさせないで、抗体産生細胞からｍＲＮＡを転写及びｃＮＤＡをクローン化することはより興味深い。このため、すでに親和成熟を受けた抗体が獲得される。
【００７６】
大きいレパートリーの試験が、触媒活性を有する抗体の探索には特に有用であることが判明するはずである。
【００７７】
したがって本発明は、ヒンジ配列部分を含む方法で生成されるライブラリーを提供するものであり、ヒンジがＶHHドメインに直接結合しているので、その認識は容易である。
【００７８】
これらのライブラリーは、あらかじめＰＣＲでの増幅をしまたはしないで、リンパ球からｃＤＮＡをクローン化することによって得ることができる。ＰＣＲプライマーは、５′プライマーについてはＶHHのプロモーター、リーダー又は枠組み構造配列中に、そして３′プライマーについてはヒンジ、ＣH２、ＣH３、３′未翻訳部又はｐｏｌｙＡテール中に位置する。増幅物質のサイズの選択により、Ｈ鎖免疫グロブリンに限定されるライブラリーの構築が可能となる。
【００７９】
特定の実施例においては、ＫｐｎＩ部位が構築されており、３１３から３１９位アミノ酸(CGC CAT CAA GGT AAC AGT TGA) と対応する以下の３′プライマーを、Sestryらにより記載されており、
Ｘｈｏ部位を含むマウスＶHHプライマーと接続させて使用する。
【００８０】
これらのプライマーは、ＶHH部（マウス又はヒトサブグループIIIと関連する）、ヒンジ及びＣH２のセクションを含むラクダＨ鎖免疫グロブリンのライブラリーを産する。
【００８１】
別の実施例では、ｃＤＮＡはその５′末端でポリアデニル化され、マウスの特定のＶHHプライマーは、ヌクレオチド１２の位置に内蔵のＸｈｏＩ部位と、ポリＴプライマーによって置換される。
CTCGAGT12
ＫｐｎＩ部位を有する同じ３′プライマーを用いる。
【００８２】
この方法により、免疫グロブリンの全てのサブグループを含むライブラリーが得られる。
【００８３】
ヒンジ−ＣH２連鎖をとりまく領域をクローニングすることの興味は、γ２及びγ３の両方において、Ｓａｃ部位がヒンジの直後に存在することにある。この部位は、ＶHH及びヒンジをコードする配列を、他の免疫グロブリンのＦｃ領域、特にこの部位において同一のアミノ酸配列（Ｇｌｕ246  Ｌｅｕ247）を有するヒトＩｇＧ1及びＩｇＧ3 にグラフトすることを可能とする。
【００８４】
その例としては、本発明は、以下の工程により得られるようなＨ鎖免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列からなるｃＤＮＡライブラリーを意図する：
ａ）リンパ細胞を分離するために、特にラクダから選択される健康な動物から、リンパ細胞、特に末梢リンパ球、脾細胞、リンパ節又は別のリンパ様組織を含む試料を処理し、
ｂ）細胞の他の核酸及び成分からポリアデニル化ＲＮＡを分離し、
ｃ）対応するｃＤＮＡを得るために、得られたＲＮＡを逆転写酵素と反応させ、
ｄ）マウスの４本鎖免疫グロブリンのＶHドメインに対応する５′プライマーであって、所定の制限部位、例えばＸｈｏＩ部位を含有するプライマー及びＫｐｎＩ部位を含有するＣH２ドメインのＮ末端部に対応する３′プライマーを、工程ｃ）のｃＤＮＡと接触させ、
ｅ）ＤＮＡを増幅し、
ｆ）ベクター中、特にブルースクリプトベクターにおいて、増幅された配列をクローン化し、
ｇ）分離されたＨ鎖免疫グロブリンから得た定常ドメインをコードする配列に対応するプローブとハイブリッド形成するクローンを回収する。
【００８５】
このクローニングにより、ヒンジをコードする配列を含むＤＮＡ配列を含有するクローンが生じる。したがって、免疫グロブリンのサブクラス及び、ＦＶHHｈのＦｃ領域へのグラフトに有用なＳａｃＩ部位の特徴付けが可能となる。
【００８６】
Ｈ鎖免疫グロブリンをコードする配列は、ＣH１ドメインの欠如と適合する大きさを有するＤＮＡ配列を含むクローンを選択することによっても回収される。
【００８７】
本発明の別の実施態様によると、上記の方法の工程ｃ）及びｄ）
の間に以下の：
−ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの存在下では、その配列が免疫グロブリンのヒンジ部及びＮ末端ＶHHドメインをコードする能力を有する、オリゴヌクレオチド変性プライマーであって、ｃＤＮＡとのハイブリッド形成能及び、鋳型として使用するｃＤＮＡに相補的であるＤＮＡ配列のエクステンションの開始能を有するプライマーに該ｃＤＮＡを接触させ、
−増幅されたＤＮＡを回収する工程を加えることが可能である。
【００８８】
クローンは、数種類の発現ベクターで発現することができる。市販のベクター、イムノＰＢＳ(Immuno PBS)(Huse et al: Science (1989) 246, 1275)を用いた例として、上記の操作によりブルースクリプト(Bluescript)（登録商標）中で生産されるクローンを、同じＸｈｏＩ含有５′プライマー及びＳｐｅ部位がTC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG であるように構築されている免疫グロブリンの枠組み構造中の残基１１３−１０３に対応する新しい３′プライマーを用いて、ＰＣＲにより回収する。この操作により、イムノＰＢＳベクターのＸｈｏ／Ｓｐｅ部位におけるＶHHのクローニングが可能となる。しかし、この遺伝子の３′末端は、ベクターの認識「タグ」及び終止コドンとは一致していない。これを一致させるには、構築物をＳｐｅにより切断し、クレノーフラグメントを用いて、４個の塩基突出部を塞ぎ、その後ベクターを再連結する。更に精製するには、クローン化されたＶHHの金属精製が行われるように、マーカー（「タグ」）をポリヒスチジンと置換する。これを行うには、６個のヒスチジン及び終止コドンをコードするＳｐｅ／ＥｃｏＲＩ二重鎖オリゴヌクレオチドを、以下の両方の鎖の合成によりまず構築し、次に加熱とアニーリングを行う。
【００８９】
挿入断片（insert）を含むベクターを次にＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩにより消化して、ポリＨｉｓ／終止配列により置換することができる内在する「タグ」配列を除く。生成するＶHHは、ヒトコブラクダのＶHH部に対する抗体を用いて等しく検出することができる。実験的条件下では、ＶHH部は、イムノＰＢＳベクター中に１リットル当たりmg程度の量で生成される。
【００９０】
本発明はまた、転移免疫グロブリン遺伝子を有する細胞から得られるようなＨ鎖免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡライブラリーに関する。
【００９１】
本発明の好ましい実施態様においては、本ライブラリーは、所定の抗原によりあらかじめ免疫化された動物から得た細胞から調製される。このため、免疫化のために使用する抗原に対してあらかじめ選択された特異性を有する抗体の選択が可能となる。
【００９２】
本発明の別の実施態様においては、ｃＤＮＡの増幅は、ｃＤＮＡのクローニングの前には行わない。
【００９３】
４本鎖免疫グロブリンのＨ鎖は、それがＬ鎖と結合するまではシャペローンタンパク質（ＢＩＰ）により細胞内に捕獲されている。
シャペローンタンパク質への結合部位は、ＣH１ドメインである。
Ｈ鎖免疫グロブリンにこのドメインが存在しない場合、その分泌は、ＢＩＰタンパク質又はＬ鎖の存在とは独立している。本発明者らは更に、得られる免疫グロブリンが粘着性を有さず、従って異常に凝集しないことを認めている。
【００９４】
本発明はまた、所定の抗原に向けられたモノクローナル抗体であって、その抗体の抗原結合部位はＨポリペプチド鎖からなり、更にＬポリペプチド鎖を欠落している抗体を製造する方法であって、
−例えば、あらかじめ所定の抗原により免疫されたラクダの末梢血から得たリンパ球を、不朽細胞、そして好ましくは骨髄腫細胞により不朽化して、ハイブリドーマを形成し、
−形成された不朽化細胞（ハイブリドーマ）を培養し、所望の特異 性を有する抗体を産生する細胞を回収することからなる、抗体を製造する方法に関する。
【００９５】
抗体の製造は、あらかじめラクダを免疫化せずに行うこともできる。
【００９６】
抗体を製造する別の方法によると、ハイブリドーマ細胞の技術に頼る必要はない。
【００９７】
このような方法によると、抗体は、in vitro（生体外）で製造され、
−リンパ球、特にあらかじめ所定の抗原により免疫されたラクダの ＰＢＬから得られたＤＮＡ又はｃＤＮＡを、ベクター中、特にファージ、そしてより詳細にはフィラメント状バクテリオファージ中でクローン化し、
−抗体産生を可能とする条件下で、上記のベクターにより原核細胞 を形質転換し、
−そのＨ鎖構造に関する抗体を選択し、それらを更に抗原親和性選 択操作にかけ、
−所望の特異性を有する抗体を回収する工程からなる方法によって得ることができる。
【００９８】
本発明の別の実施態様によると、クローニングは、ベクター中、
特に細菌膜タンパク質をコードするプラスミド中で行われる。次に原核細胞を、その膜中で抗体の発現を可能とする条件下で、上記のベクターにより形質転換する。
【００９９】
陽性細胞を更に抗原親和性選択により選択する。
【０１００】
ＣH１ドメインを含まないＨ鎖抗体は、この点に関し、明確な利点を示す。ＣH１ドメインは事実、真核ベクター内に存在するＢＩＰ型シャペローンタンパク質と結合し、Ｌ鎖が存在しない限り、Ｈ鎖は、小胞体から外へ運搬されない。これは、真核細胞では、酵母細胞などの非哺乳類細胞の４本鎖免疫グロブリンの有効なクローニングは、内在するＢＩＰ型シャペローンの特性に依存し、
従って、これを成功させることは非常に困難である。この点に関し、ＣH１ドメインの欠落した本発明のＨ鎖抗体は、特徴的な利点を示す。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様においては、酵母の抗体産生又は代謝の変更のいずれかのため、酵母においてクローニングを実施することができる。例としては、Ｙｅｐ５２ベクターを使用することができる。このベクターは、選択マーカーＬｅｕ２と共に、酵母の２μの複製（ＯＲＩ）起源を有する。
【０１０２】
クローン化された遺伝子は、ｇａｌ１プロモーターの制御下にあり、したがってガラクトースにより誘導される。発現は更に、誘導前の非常に高濃度の細胞の獲得を可能とするグルコースにより抑制される。
【０１０３】
上述したようなＰＣＲによる遺伝子産生の同じ方法を用いての、
ＢａｍＨＩ部位及びＳａｌＩ部位の間のクローニングにより、E. coli におけるラクダ免疫グロブリン遺伝子のクローニングが可能となる。抗体によって得られ、酵母について提唱されているような代謝調節の例としては、サイクリン、つまり酵母の細胞周期の調節に関与するタンパク質に向けられた抗体のクローニングを挙げることができる(TIBS 16 430 J.D. McKinney, N. Heintz 1991) 。別の例は、酵母のゲノム内で誘導される（例えば、ｇａｌ１）抗体である、ＣＤ28に向けられた抗体の遺伝子工学による導入である。ＣＤ28は細胞分裂の開始のレベルに関与し、したがって、この分子に対する抗体の発現により、細胞の増殖と、バイオリアクター中又は不朽化細胞を用いての生産法の最適化の有効な制御が可能となる。
【０１０４】
本発明のまた、別の実施態様においては、クローニングベクターはプラスミド又は真核ウイルスベクターであり、形質転換される細胞は、真核細胞、特に酵母細胞、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞つまりＶｅｒｏ細胞などのサル細胞、昆虫細胞、植物細胞又は原生動物細胞である。
【０１０５】
このような場合に適用される操作に関するより詳細については、
Marks et al, J. Mol. Biol. 1991, 222:581-597を参考とする。
【０１０６】
更にまた、本発明の免疫グロブリン又はその断片から始めて、新しい免疫グロブリン又は誘導体を調製することができる。
【０１０７】
したがって、上記の定義に対応する免疫グロブリンは、所定の抗原に対して調製することができる。本発明は特に、Ｌポリペプチド鎖の欠落したモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又は、このような抗体を含み、そして所定の抗原、例えば細菌、ウイルス若しくは寄生体などの病原性物質の抗原に向けられた抗血清を提供するものである。それに対して抗体を調製することのできる抗原又は抗原性決定物質の例として、ＨＩＶウイルスの外層エンベロープ糖タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原などのウイルスのエンベロープ糖タンパク質又はそのペプチドが挙げられる。
【０１０８】
本発明の免疫グロブリンはまた、タンパク質、ハプテン、炭水化物又は核酸に向けられる。
【０１０９】
本発明による特定の抗体は、ガラクトシルα−１−３−ガラクトースエピトープに向けられる。
【０１１０】
本発明の免疫グロブリンにより更に、Ｈ鎖免疫グロブリン又はその断片と、毒素、酵素、薬物、ホルモンとの結合物などの結合生成物の調製が可能となる。
【０１１１】
例としては、骨髄腫免疫グロブリンエピトープを認識する抗原結合部位を有するＨ鎖免疫グロブリンと、アブリン（abrin)又はヤドリギレクチン毒素との結合物を調製することができる。このような構成物は、患者の特定の治療法に有用であろう。
【０１１２】
この結合物の別の有利な点は、Bacillus thuringiensis又はBacillus sphaericus の異なる血清型の毒素など、昆虫に特有の毒素を有する、昆虫の腸の抗原を認識するＨ鎖免疫グロブリンを調製することができる点である。植物にクローン化されたこのような構造物は、既存の細菌性毒素の特異性又は宿主域を増大させるために用いることができる。
【０１１３】
本発明はまた、それぞれのＨポリペプチド鎖に様々な特異性を有する抗体を提唱するものである。これらの多機能性、特に二機能性抗体は、本発明の免疫ブロブリンの２個のＨ鎖又は本発明の免疫グロブリンの１個のＨ鎖を、４本鎖モデル免疫グロブリン断片と結合させることによって調製される。
【０１１４】
本発明はまた、薬物又はホルモンなどの生物学的物質の標的に使用することができる異種特異的抗体を提供するものである。より詳細には、これらは、細胞の限られたカテゴリーにホルモン又はサイトカインを選択的に標的とするために使用することができる。例としては、インターロイキン２（ＩＬ2 ）に対するネズミ又はヒト抗体及びＣＤ4 細胞に対するＨ鎖抗体の結合物が挙げられる。これは、そのＩＬ2 受容体を喪失しているＣＤ4 細胞を再活性化するのに使用することができよう。
【０１１５】
本発明のＨ鎖免疫グロブリンは、異種特異的抗体の調製にも使用することができる。これらは上述した方法で、異なる鎖の間のブリッジを還元し、通常の方法により異なる特性を有する２種類の抗体を再酸化することにより達成されるが、２種類の抗体を、例えばイムノｐＢＳベクター中で連続クローニングすることによっても達成される。
【０１１６】
このような場合、Ｘｈｏ部位及びＳｐｅ部位の間からなるＶHHドメインに対応する第１の遺伝子を上述したように調製する。次に、
５′末端として、Ｓｐｅ部位を含有するプライマーを用い、３′末端として終止コドンとＥｃｏＲＩ部位を含有するプライマーを用い、類似した方法により第２の遺伝子を調製する。次にベクターをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位により消化し、更に両方のＶHH遺伝子をそれぞれＸｈｏ／Ｓｐｅ及びＳｐｅ／ＥｃｏＲＩにより消化させる。
【０１１７】
連結後、両方の免疫グロブリン遺伝子を連続クローン化する。両方の遺伝子の間のスペーシングは、５′ＳｐｅＩプライマー内での付加コドンの導入により増大させる。
【０１１８】
本発明の特定の実施態様においては、本発明によるＩｇＧ2 免疫グロブリンのヒンジ部は、半剛性であり、したがってタンパク質のカップリングには適当である。このような適用の場合、タンパク質又はペプチドは、各種基質、特にリガンドに、スペーサーとして用いられるヒンジ部を介して連結される。有利なことに、断片は少なくとも６個のアミノ酸からなる。
【０１１９】
本発明によると、Ｘがアミノ酸、そして好ましくはＧｌｎ、Ｌｙｓ又はＧｌｕであるＰｒｏ−Ｘの反復配列、特に少なくとも３回、そして好ましくは１２回の反復からなる断片を、タンパク質のリガンドへのカップリング又は異なるタンパク質ドメインの組み立てに使用することが興味深い。
【０１２０】
ヒンジ部又はその断片もまた、タンパク質のリガンドへのカップリング又は様々なタンパク質ドメインの組み立てに使用することができる。
【０１２１】
カップリングのための通常の技術が適当であり、クローン化された配列の組み立てによるタンパク質工学の技術が特に参考とされる。
【０１２２】
本発明による抗体は、in vitroにおける診断のための試薬として、又は造影技術により使用することができる。本発明の免疫グロブリンは、放射性同位元素、化学的若しくは酵素マーカー、又は化学発光マーカーにより標識することができる。
【０１２３】
特に、造影技術による免疫グロブリンによる検出又は観察の場合における例としては、テクニチウム、特にテクニチウム９９などによる標識が有利である。この標識は、免疫グロブリン又はその断片によるカップリング操作による直接標識、或いはテクニチウムとの複合体の調製段階後の間接的標識に使用することができる。
【０１２４】
この他の興味深い放射活性標識としては例えばインジウム、そして特にインジウム１１１、又はヨウ素、特にＩ131、Ｉ125及びＩ123が挙げられる。
【０１２５】
これらの技術の記載には、フランス特許出願番号２６４９４８８号を参考とする。
【０１２６】
これらの出願においては、小さいサイズのＶHH断片が、組織への浸透のためには、明らかに有利である。
【０１２７】
本発明はまた、上述の抗体の抗イディオタイプと反応するモノクローナル抗体に関する。
【０１２８】
本発明はまた、Ｈ鎖免疫グロブリンがクローン化された細胞又は生物に関する。このような細胞又は生物は、所望のあらかじめ選択された特異性を有する、又は特定のレパートリーに対応するＨ鎖免疫グロブリンを生産する目的で使用することができる。これらはまた、これらを発現する細胞の代謝を変える目的で生産することもできる。Ｈ鎖免疫グロブリンをコードする配列により形質転換された細胞の代謝を変更する場合、このように生産されたＨ鎖免疫グロブリンは、アンチセンスＤＮＡと同様に使用される。アンチセンスＤＮＡは通常、例えばトリパノソーマ又はその他の病原物質の可変表面抗原などのある種の遺伝子の発現の阻害に関与する。同様に、ある種のタンパク質又は酵素の産生又は活性は、同一細胞内でこのタンパク質又は酵素に対する抗体を発現することによって阻害することができる。
【０１２９】
本発明はまた、修飾された４本鎖免疫グロブリン又はその断片であって、そのＶH部が、Ｈ鎖免疫グロブリンの特定配列又はアミノ酸、特にＶHHドメインの配列により部分的に置換されている４本鎖免疫グロブリン又はその断片に関する。４本鎖免疫グロブリンの特定の修飾されたＶHドメインは、ＶH部の４５位のロイシン、プロリン又はグルタミンが、他のアミノ酸、そして好ましくはアルギニン、グルタミン酸又はシステインにより置換されていることを特徴とする。
【０１３０】
４本鎖免疫グロブリンの更に修飾されたＶH又はＶLドメインは、対合システインの導入による、ＣＤＲループの相互連結若しくはＦＷ部への連結を特徴とし、ここでＣＤＲ部はＣＤＲ1及びＣＤＲ3の間から選択され、ＦＷ部はＦＷ2 部であり、特にここで導入されるシステインの一方は、ＦＲ2の３１、３３位又はＣＤＲ2の４５位にあり、そしてもう一方はＣＤＲ3にある。
【０１３１】
特に、対合するシステインの導入は、ＣＤＲ3 ループがＦＷ2 又はＣＤＲ１ドメインと連結し、更に特にＶHのＣＤＲ３のシステインが、ＦＷ２の３１位若しくは３３位、又はＣＤＲ２の４５位でシステインと連結するほどのものである。
【０１３２】
本発明の別の実施態様においては、植物細胞が新しい特性又は増大した特性を獲得するために、本発明によるＨ鎖免疫グロブリンにより改変することができる。
【０１３３】
本発明のＨ鎖免疫グロブリンは、ガンの遺伝子治療のために、例えば腫瘍細胞に存在するタンパク質に向けられた抗体を用いることによって、使用することができる。
【０１３４】
このような場合、１又は２種のＶHH遺伝子の発現は、パルボ又はアデノウイルス由来のベクターを用いて得ることができる。パルボウイルスは、病原性を欠くか、あるいは正常なヒト細胞にとってはほとんど病原性を示さないという事実及び、ガン細胞において容易に増殖し得るという事実を特徴とする( Russel S.J. 1990, Immunol. Today II. 196-200) 。
【０１３５】
Ｈ鎖免疫グロブリンは、例えばネズミＭＶＭウイルスの感染性プラスミド（ｐＭＭ９８４）のＨｉｎｄIII／ＸｂａＩ部位内においてクローン化され(Merchlinsky et al. 1983, J. Virol. 47, 227-232)、そしてＭＶＭ３８プロモーターの制御下におかれる。
【０１３６】
ＶHHドメインの遺伝子は、開始コドン及びＨｉｎｄIII部位を含有する５′プライマー、終止コドン及びＸｂａＩ部位を含有する３′プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅される。
【０１３７】
この構築物を次に、プラスミド内の２６５０位（ＨｉｎｄIII）及び４０６７位（ＸｂａＩ）の間に挿入する。
【０１３８】
クローニングの有効性は、トランスフェクションによりチェックすることができる。抗体を含有するベクターを次に、トランスフェクションにより許容される細胞（ＮＢ−Ｅ）中に導入する。
【０１３９】
細胞を２日後に回収し、ＶHH部の存在を、ＶHH部と反応するウサギ抗血清を用いてＥＬＩＳＡ法により決定する。
【０１４０】
更に本発明により、異なる方法による触媒抗体の調製が可能となる。基質の活性状態をミミックする成分に向けられた抗体の産生（例えば、そのホスホエステラーゼ活性を得るために、ホスファートの活性状態をミミックする成分としてのバナデート、プロテアーゼを得るために、ペプチド結合をミミックする化合物としてのホスホナート）により、触媒能を有する抗体を得ることが可能となる。
このような抗体を得るための別の方法は、抗体のクローン中で、例えばＰＣＲにより無作為突然変異誘発を行い、クローンの増殖の間に異常塩基を導入することからなる。ＰＣＲにより得られるこれらの増幅断片を次に適当なクローニング用ベクター内に導入する。細菌表面におけるこれらの発現は、酵素活性を有するクローンの、基質による検出を可能とする。これらの２種類の方法はもちろん、組み合わせても良い。最後に、構造に関して得られるデータ、例えばＸ線結晶学又はＮＭＲにより得られるデータに基づいて、修飾を指示することができる。これらの修飾は、遺伝子工学の通常の技術又は完全合成により行うことができる。本発明のＨ鎖免疫グロブリンのＶHHの利点は、これらが充分な溶解性を有するという点である。
【０１４１】
本発明のＨ鎖免疫グロブリンは更に、植物細胞、特にトランスジェニック植物において産生することができる。例としては、Ｈ鎖免疫グロブリンは、古典的な４本鎖抗体について記載されている(Hiat et al. Nature 342 76-78, 1989)ような重要な植物発現ベクターであるｐＭｏｎ５３０プラスミド(Rober et al. Meth Enzym 153 1566 1987) を用い、上述したような適当なＰＣＲプライマーを用い、正しいフェーズでＤＮＡ断片を発生させて、植物中で生産することができる。
【０１４２】
本発明の他の利点及び特徴は、以下に続く実施例及び図において明らかになるであろう。
【０１４３】
Camelus dromedarius の血清を、プロテインＧセファロースに吸着させると、かなりの量（２５−３５％）の免疫グロブリン（Ｉｇ）が、溶液中に残留し、これはアフィニティークロマトグラフィーによりプロテインＡセファロースに回収することができる（図１Ａ）。プロテインＧに吸着された分画は、低下していない見かけの分子量（ＭＷ）が１７０Kdである分子からなる固く結合した分画（２５％）と、見かけの分子量１００Kdを有するより弱く結合した分画（３０−４５％）に、別に溶離することができる（図１Ｂ）。１７０Kdの成分は還元により５０KdのＨ鎖と大きな３０KdのＬ鎖を生じる。１００Kdの分画は全体的にＬ鎖を欠落しており、還元後、４３Kdの見かけの分子量を示すＨ鎖のみからなると考えられる（図１Ｃ）。プロテインＧと結合しない分画は、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、プロテインＡカラムから第２の１００Kdの成分として溶離することができ、これは還元後、４６KdのＨ鎖のみからなると考えられる。
【０１４４】
Ｌ鎖の欠落したＨ鎖免疫グロブリンは、プロテインＡに結合する分子の７５％までを占める。
【０１４５】
３種類の免疫グロブリンはすべてプロテインＡと結合するため、
これらをＩｇＧ、つまりプロテインＧと結合するＩｇＧ1（Ｌ鎖及びＨ鎖γ１（５０Kd））、プロテインＧと結合しないＩｇＧ2 （Ｈ鎖γ２（４６Kd））及びプロテインＧと結合するＩｇＧ3 （Ｈ鎖γ３（４３Kd））とする。これらの３種類のサブ（クラス）が更に細分化される可能性もある。
【０１４６】
旧世界のラクダ（Camelus bactrianus及びCamelus dromedarius)及び新世界のラクダ（lama pacos、lama glama、lama vicugna）を比較研究した結果、試験を行ったすべての種でＨ鎖免疫グロブリンが、見かけの分子量及び比率に多少の差はあるにもかかわらず、認められることが示された。新世界のラクダは旧世界のラクダとは、
構成成分であるＨ鎖が、見かけの分子量４７Kd（図２）を有する大きなＩｇＧ3 分子（プロテインＧと結合するＨ鎖免疫グロブリン）
を有する点で異なる。
【０１４７】
ラクダの血清にはＨ鎖免疫グロブリンが豊富であることは、免疫応答においてその役割が何であるのか、及び特にこれらが抗原結合特異性を有しているのかどうか、そしてそうである場合、そのレパートリーがどの程度のものであるかとの疑問を生じさせる。この疑問は、Trypanosoma evansiに感染したラクダ(Camelus dromedarius) から得た免疫グロブリンを試験することによって解決することができる。
【０１４８】
この目的のために、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2 及びＩｇＧ3の対応する分画を、健康なラクダの血清及びカード凝集試験（３）により測定した高抗トリパノソーマ力価を有するラクダの血清から調製した。放射免疫沈降法においては、広範なレパートリーの異質性及び複合性を示す感染ラクダ由来のＩｇＧ1、ＩｇＧ2及びＩｇＧ3（図３Ａ）が、35Ｓメチオニンにより標識されたトリパノソーマ溶解産物に存在する多数の抗原と結合することが示された。
【０１４９】
ブロッティング実験では、35Ｓメチオニンにより標識されたトリパノソーマ溶解産物は、感染動物から得られたＳＤＳ  ＰＡＧＥ分離のＩｇＧ1、ＩｇＧ2及びＩｇＧ3と結合する（図３Ｂ）。
【０１５０】
このため我々は、ラクダのＨ鎖ＩｇＧ2及びＩｇＧ3が、真の抗原結合抗体であるとの結論を得た。
【０１５１】
免疫学的パラダイムによれば、広範囲な抗体レパートリーは、Ｌ及びＨ鎖可変Ｖ部レパートリーの結合によって生まれることが記載されている（６）。ラクダのＨ鎖免疫グロブリンは、このパラダイムと矛盾するようである。
【０１５２】
免疫グロブリンは、これらの極端な異質性を反映する複雑なＩ．Ｅ．Ｆ．（等電点電気泳動）パターンにより特徴づけられる。
ＩｇＧ2及びＩｇＧ3を構成する２本のＨ鎖が同一のものであるのかどうかを調べるために、等電点電気泳動（Ｉ．Ｅ．Ｆ．）パターンを、還元及び、アルキル化剤としてヨードアセトアミドを用いたアルキル化による鎖の分離前後で観察した。
【０１５３】
このアルキル化剤は、分子内に付加電荷を導入しないため、Ｈ鎖ホモ二量体の還元及びアルキル化により生じるモノマーは、二量体と実質的に同じ等電点を示すが、これらがＨ鎖ヘテロ二量体由来のものである場合、モノマーは多くの場合、異なるＩ．Ｅ．Ｆ．パターンを示すのに十分に異なる等電点を示すであろう。
【０１５４】
還元及びヨードアセトアミドによるアルキル化により、観察されるパターンは、Camelus dromedarius のＩｇＧ2及びＩｇＧ3については変化せず、これらの分子がそれぞれ、その由来する非還元分子と同じ位置に移動する２本の同一なＨ鎖からなることを示している。
【０１５５】
反対に、ＩｇＧ1のＩ．Ｅ．Ｆ．パターンは還元後に完全に変化した。これは、各分子の等電点はＬ鎖とＨ鎖の等電点の結合によって決定され、分離後は各々異なった位置へ移動するからである。
【０１５６】
これらの知見により、Ｈ鎖のみにより広範囲なレパートリーが生じることが示され、Ｌ鎖の、有用な抗体レパートリーへの寄与に関する疑問が示される。この必要性を否定するのであれば、他のどのような役割を、Ｌ鎖は果たしているのであろうか。
【０１５７】
正常では、哺乳類の免疫グロブリンから分離したＨ鎖は、かなり凝集する傾向にあるが、Ｈ鎖のＣH１ドメインに結合するＬ鎖（８、９）によってのみ溶解される。
【０１５８】
ヒト及びマウスにおいては、多数の突発性又は誘導された骨髄腫により、Ｈ鎖のみからなる病理学的免疫グロブリンが産生される（Ｈ鎖病）。このような骨髄種タンパク質のＨ鎖では、ＣH１及びＶHHドメインが欠失している（１０）。十分な長さのＨ鎖が、このような病理学的免疫グロブリンにおいてＨ鎖の分泌を引き起こさない理由は、Ｉｇの合成には、シャペローンタンパク質、免疫グロブリンＨ鎖結合タンパク質、又は正常ではＬ鎖によって置換されている（１２）ＢＩＰ（１１）が関与するとの事実に由来すると考えられる。４本鎖モデル免疫グロブリンのＬ鎖の根本的な役割は、献身的なＨ鎖シャペローンのそれであり、Ｌ鎖レパートリーの出現は、
進化におけるおまけにすぎないという可能性もある。
【０１５９】
ラクダのγ2 及びγ3 鎖は、正常な哺乳類のγ鎖よりもかなり短い。これは、ＣH１ドメインに欠失が起きたことを示唆している。
旧世界及び新世界のラクダのγ2 及びγ3 免疫グロブリンのサイズの違いは、いくつかの進化の段階において、特にＣH１ドメインにおいて欠失が起きたことを示唆している。
II  ラクダのＨ鎖免疫グロブリンには、ＣH１ドメインが欠落している。
【０１６０】
Ｈ鎖免疫グロブリンの一次構造を研究する際に従った方針は、タンパク質とｃＤＮＡの配列決定の組み合わせである。タンパク質配列決定は、各免疫グロブリンに特徴的な配列の範囲を認識するのに必要である。Ｈ鎖可変部レパートリー由来の免疫グロブリンのＮ−末端は、ＶHHサブグループ（Ｈ鎖の可変部）に関する情報をもたらすだけであり、クラス又はサブクラス認識に使用することはできない。これは、配列データは、内部の酵素又は化学的切断部位から得なければならないことを意味している。
【０１６１】
パパインによる消化と、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせにより、各種断片の分離が可能となり、ＩｇＧ３の一般的構造に関する情報が得られた。
【０１６２】
アフィニティークロマトグラフィーによりプロテインＡセファロースに精製されたラクダ(Camelus dromedarius) のＩｇＧ３は、
パパインにより部分的に消化され、消化物はプロテインＡセファロースにより結合分画及び非結合分画に分離された。これらの分画を、還元及び非還元条件下でＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した（図４）。
【０１６３】
結合分画は２個の成分、つまり２８Kdの成分と１４．４Kdの成分を、未切断又は部分切断物質の他に含有していた。これらはゲル電気泳動により（分離用１９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから）非還元条件下で良好に分離され、更に電気溶離（５０nM重炭酸アンモニウム中、バイオラッド(BioRad)電気溶離装置を用い、０．１（重量／容積）％ＳＤＳ）により精製した。これらの電気溶離された分画を凍結乾燥後、９０％エタノールを添加し、混合し、混合物を−２０℃で一夜インキュベートすることによって、タンパク質を沈澱させることによって、残存するＳＤＳを除去した（１４）。沈降したタンパク質を遠心分離（１５，０００rpm、５分間）によりペレットに集め、タンパク質配列決定に用いた。Ｎ−末端配列は、アプライドバイオシステム(Applied Biosystem) ４７７Ａパルス液体タンパク質シクエンサーの自動エドマン(Edman) ケミストリーを用いて行った。アミノ酸は、アプライドバイオシステム１２０ＰＴＨ分析装置を用いて、そのフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体として確認した。化学物質及び試薬は全てアプライドバイオシステムから購入した。クロマトグラフィーのデータの分析は、アプライドバイオシステムソフトウエアバージョン１．６１を用いて行った。
全ての場合、コンピューターによる配列分析は、ＰＴＨ分析装置からのクロマトグラムの直接検分により確認した。タンパク質配列決定のための試料は、５０（容量／容量）％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２８Kd断片）又は１００％ＴＦＡ（１４Kd断片）のいずれかに溶解した。２，０００pmol（２８Kd断片）又は５００pmol（１４Kd断片）に相当する溶解したタンパクの試料は、ＴＦＡ処理のグラスファイバーディスクに適用された。グラスファイバーディスクは、バイオブレーン(BioBrene)（３mg）で被覆し、使用前に一回前循環させた。
【０１６４】
２８Kd断片のＮ−末端配列決定により、γＣH２ドメインのＮ−末端部と相同である配列、従って、Ｆｃ断片のＮ−末端と相同である配列が得られる。１４．４Kd断片のＮ−末端配列は、γＣH２の最後のリジン及びγＣH３ドメインのＮ−末端部と対応する（表１）。パパイン断片の分子量（ＭＷ）及びそのＮ−末端配列の確認により、γ３Ｈ鎖のＣH２及びＣH３ドメインの大きさは正常であり、欠失がＣH１又はＶHHドメインのいずれかに発生し、短縮されたγ３鎖が生成したとの結論が導かれた。プロテインＡセファロースと結合しない分画は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより拡散する３４及び１７Kdの２個のバンドを含み、これらがこの分子の可変Ｎ−末端部由来であることを示している（図４）。
【０１６５】
還元により、１７Kdの単一の拡散バンドが認められ、３４Kdは、
１７Kd成分がジスルフィド結合した二量体であることが示される。
この３４Kdの断片は明らかに、ヒンジとＮ−末端ドメインＶHHを含有している。
【０１６６】
タンパク質配列に関するデータは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのＰＣＲによる増幅を可能とする変性オリゴヌクオチドプライマーを構築するのに使用することができる。
【０１６７】
ラクダ脾インプリント細胞より得た細胞は、ウサギの抗ラクダ免疫グロブリン血清と反応し、したがって脾は少なくとも１種の免疫グロブリンクラスの合成の部位であることが示されている。
【０１６８】
したがってｃＤＮＡは、ラクダ脾ｍＲＮＡから合成された。ＲＮＡの分離条件は、以下のとおりである：総ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアナート法によりヒトコブラクダの脾から分離した（１５）。ｍＲＮＡは、オリゴＴ−常磁性ビーズにより精製した。
【０１６９】
ｃＤＮＡの合成は、１μg のｍＲＮＡ鋳型、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素（ベーリンガーマン(BOERHINGER MAN)）を用いて得る。第二鎖のｃＤＮＡは、供給者より与えられた条件に従ってＲＮＡｓｅ  Ｈ及びE. coli ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて得る。
【０１７０】
関連配列は、ＰＣＲにより増幅した：ｃＤＮＡ５ngを、鉱物油（シグマ(Sigma)）に重ねた反応混合物（pH８．３のトリス(Tris)−ＨＣｌを１０mM、ＫＣｌを５０mM、ＭｇＣｌ2 を１５mM、ゼラチンを０．０１％（重量／容積）、各ｄＮＴＰを２００μM 、及び各プライマーを２５pmol）１００μl 中でＰＣＲにより増幅した。
【０１７１】
ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ部位を含有し、更にｐＵＣ  １８中にクローン化されたプライマーを変性する。変性とアニーリング（９４℃で５分間、５４℃で５分間）の一巡後、Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ２単位を反応混合物に加えてから、９４℃で１分間（変性）、５４℃で１分間（アニーリング）及び７２℃で２分間（伸長）の増幅の３５周期を受けさせた。ＶHH及びＣH２ドメインの間のＤＮＡ配列（＃７２クローン）を増幅させるには、アニーリング温度を６０℃に上昇させた以外は、同じ条件でＰＣＲを行った。
【０１７２】
試験を行った１個のクローン（＃５６／３６）は、２８Kd断片の配列に等しいＣH２ドメインのＮ−末端部に対応する配列を有していた。この配列データを利用した結果、正確な３′プライマーの構築と、ＶHHのＮ−末端部及びＣH２ドメインの間の領域のクローニングが可能となった。
【０１７３】
マウスのＶHH（１６）と対応し、ＸｈｏＩ制限部位を含む５′プライマーを、ＫｐｎＩ部位が挿入された３′プライマーと組み合わせて使用し、かつその増幅配列は、ｐブルースクリプト(pBluescript) （登録商標）中でクローン化した。２個の内在ＨａｅIII部位を示したクローン（＃５６／３６）は、この酵素により消化されて、ＰＣＲ陽性クローンを認識するプローブを産生した。
【０１７４】
増幅後、ＰＣＲ生成物を、１．２％（重量／容積）アガロースゲルによりチェックした。ＰＣＲ生成物の洗浄は、フェノールクロロホルム抽出と、その後のＨＰＬＣ（ゲンパックファックス(GEN-PAC FAX) カラム、ウオーターズ(Waters)）及び最後に適当であればマーメイド(MERMAID) 又はジェネクリーン(GENECLEAN) IIキット、ＢＩＯ  １０１を用いた精製の過程を含んだ。これらの精製の工程後、増幅されたｃＤＮＡを、＃５６シリーズのクローンについてはＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ及び＃７２シリーズのクローンについてはＸｈｏＩ及びＫｐｎＩにより消化させた。最後のフェノール−クロロホルムによる抽出を、ｐＵＣ  １８（＃５６シリーズのクローン）又はｐブルースクリプト(pBluescript) （登録商標）（＃７２シリーズのクローン）への連結の前に行った。
【０１７５】
得られたクローンはすべて、これらが完全なＶHH及びＣH１部を有している場合に予想される８６０塩基対よりも小さかった。ＶHH部のＮ−末端に対応する部分的な配列データにより、２０クローン中３クローンが同一であり、非依存性ではない可能性があることが明らかになった。得られた配列は、ヒトサブグループIII並びにネズミサブグループIIIａ及びIIIｂと相似している（表２）。
【０１７６】
異なる２セットのＣH２タンパク質配列に対応するクローンが得られた。第一の配列セット（＃７２／４１）は、γ３Ｈ鎖の２８Kdパパイン断片のタンパク質配列により得られるそれと同一のＮ−末端ＣH２部、３個のシステインを含有する短いヒンジ部、及びヒンジに隣接する、Ｊ小遺伝子（minigenes)によりコード化される枠組み構造（ＦＲ４）残基と対応する可変部を有していた。ＣH１ドメインは完全に欠落している。このｃＤＮＡは、γ３鎖と対応する（表４）。
【０１７７】
１個の非常に相関した配列（＃７２／１）においては、２５９位のプロリンがトレオニンにより置換されている。
【０１７８】
ＣH３及びＣH２の残存部に対応する配列は、ＫｐｎＩ制限部位が５′末端に挿入されているポリＴをＫｐｎＩプライマーとして用いた、ｃＤＮＡのＰＣＲにより得られた。γ３鎖の全体的な配列は、分子量（ＭＷ）と対応し、これはＳＤＳ
【０１７９】
ＰＡＧＥ電気泳動により得られたデータと良く一致している。
【０１８０】
このγ３鎖の配列は、ＣH１ドメインが欠落していること、ヒンジにＶHHドメインが隣接していること以外は、他のγ鎖との相似性を示す。
【０１８１】
１個又は３個全部のシステインは、２本のγ３鎖を共に保持するのに関与しているのであろう。
【０１８２】
これらの結果により、配列及びパパイン切断に基づくＩｇＧ３分子のモデルを定義することが可能となった（図５）。
【０１８３】
パパインは、ヒンジのジスルフィドの各端及びＣH２とＣH３の間において分子を切断することができる。非還元状態下では、ＩｇＧ３のＶHHドメインは、ジスルフィド結合した二量体又はパパイン切断部位に依存したモノマーとして分離することができる。
【０１８４】
クローン＃７２／２９の第二のセットは、ＣH２に関してはわずかに異なる配列を有し、可変ドメインが直前にある非常に長いヒンジを特徴としていた。このヒンジ部は、γ３ヒンジと相同である配列中のＣ−末端部において３個のシステインを有している。このようなクローンの第二のセットは、ＩｇＧ２のサブクラスを示すことができる。γ３の定常部及び又、推測上のγ２については、ほとんどのクローンが、γ２又はγ３に特異的な配列を示し、同一である。しかし、＃７２／１などのいくらかのクローンは、わずかな相違を示す。例えばクローン＃７２／１の場合、２か所のヌクレオチドの相違が検出されている。
【０１８５】
いくつかのＶHH部ｃＤＮＡは現在では、プライマー由来のＮ−末端部における短いストレッチの他は、全体的又は部分的に配列決定されている。
【０１８６】
大部分は翻訳により、内部ＶHH部内のジスルフィド架橋残基である２２位及び９２位の、特徴的なＨ鎖Ｓｅｒ21Ｃｙｓ22及びＴｙｒ90Ｔｙｒ91Ｃｙｓ92配列を示す。これらのクローンはすべて、仮定のヒンジ配列の直前にある可変部の枠組み構造４（ＦＲ４）残基に対応する配列を有する（表３）。この配列は、Ｊ小遺伝子により生成されるものであり、多くの場合ヒト及びネズミのＪ小遺伝子によりコードされている配列と相似している。
【０１８７】
Ｃｙｓ92部及びＶHH部のＣ−末端部の間の配列の長さは、可変であり、決定された配列においては、長さを変えるＪ及びＤ小遺伝子の再配列から予想されるように、２５個から３７個のアミノ酸の範囲で可変である。
【０１８８】
非病理学的状態におけるこれらのＨ鎖免疫グロブリンの単独での存在によって、いくつかの重要な質問が提議されている。まず、これらは真の抗体であるのか？
【０１８９】
トリプトソーマに感染したラクダから得られたＨ鎖免疫グロブリンは、これらの実施例のパートＩで示したように、多数の寄生体抗原と反応する。これは、ラクダの免疫系が、単一のＶHHドメインからなる多数の結合部位を発生させていることを意味する。これは、ＰＣＲにより得られたＨ鎖免疫グロブリンのＶHH部の多様性により確認される。
【０１９０】
第二の疑問は、「これらがどのように分泌されるか？」である。
４本鎖モデル免疫グロブリンからなる免疫グロブリンＨ鎖の分泌は、正常状態では起きない。シャペローンタンパク質、Ｈ鎖結合タンパク質又はＢＩＰタンパク質が、Ｈ鎖が分泌されるのを妨げる。
分泌が起きるのは、Ｌ鎖が小胞体中でＢＩＰタンパク質と置き換わる時だけである（１３）。
【０１９１】
いわゆる「Ｈ鎖疾患」を有するヒト又はマウスの血清に認められるＨ鎖二量体は、ＢＩＰ部位をかくまうと考えられているＣH１ドメインを欠落している（１４）。このドメインが存在しない場合、
ＢＩＰタンパク質はもはや結合することができず、Ｈ鎖の移動は妨げられない。
【０１９２】
ラクダにおいてＩｇＧ分子全体の２５％から５０％を占めるＨ鎖及びＬ鎖からなるＩｇＧ１クラスが存在することによって、どのように成熟しどのようにクラスの切替が起きるのか、及びＬ鎖がどのような役割を果たすのかに関する問題が生じる。ラクダのＨ鎖はＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて調べたところ、異常に大きく、異質であると考えられる。
【０１９３】
分離されるドメインの最大の大きさは４０Åであり、従来のＣH１及びＶHHをもつＩｇＧの結合部位の間で得られる最大スパンは、１６０Å（２ＶHH＋２ＣH１）のオーダーであろう（１９）。
２種類の型の、すでに配列決定されているＬ鎖の欠落したＨ鎖抗体におけるＣH１ドメインの欠失は、結果として、この最大スパンの変更を有する（図６）。ＩｇＧ３においては、ＶHH部の末端間の最も遠く離れた距離は、８０Åのオーダーであろう（２ｖHH）。これは、凝集又は架橋結合を行うには、厳しい限度である。ＩｇＧ２においては、１２回反復するＰｒｏ−Ｘ（ここでＸは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＧｌｕである）の配列からなり、ヒンジジスルフィド架橋をＮ−末端に位置させているヒンジの極端に長いストレッチにより補償される。反対に、ヒトＩｇＧ３においては、配列の重複の結果生じたことが明らかである非常に長いヒンジは、２個の結合部位間距離の増大には寄与していない。このヒンジはジスルフィドブリッジが点在しているからである。
【０１９４】
単一のＶHHドメインにより又、Ｆｃドメインに対する結合部位の回転自由度がかなり大きくなる。
【０１９５】
単一の抗体産生細胞又は発現クローニング（１５）により産生されるＨ鎖抗体におけるＣH１の欠失によって生じたであろう骨髄腫Ｈ鎖とは違って、ラクダＨ鎖抗体（Ｌ鎖の欠落した）は、正常な免疫学的環境において出現し、これらがＢ細胞成熟にともない、特異性及び親和性における選択的精製を受けたのであろうと予想される。
E. coli より得たラクダＶHH２１（図７のＤＲ２１）タンパク質の発現及び精製
【０１９６】
クローンは、数種の発現ベクターにおいて発現することができる。市販のベクターであるイムノ(Immuno)ＰＢＳ(Huse et al: Science (1989) 246, 1275)を用いた例としては、上述の操作によりブルースクリプト（登録商標）において産生されたクローンが、
同一のＸｈｏＩを含有する５′プライマー、及びＳｐｅ部位がTC TTA ACT AGT GAG GAG ACG GTG ACC TG であるように構成されている免疫グロブリンの枠組構造における残基１１３−１０３に対応する新規３′プライマーを用いて、ＰＣＲにより回収されている。
この操作により、イムノＰＢＳベクターのＸｈｏ／Ｓｐｅ部位におけるＶHHのクローニングが可能となった。しかし、遺伝子の３′末端は、ベクターの認識「タグ」及び終止コドンと一致しなかった。
これを達成するには、構築物をＳｐｅにより切断し、４塩基の突起物をクレノー断片を用いて詰め、その後ベクターを再連結した。
−発現ベクタープラスミドｉｐＢＳ（イムノＰＢＳ）（層細胞）は、プロモーターｐＬＡＣによる制御下で、E. coli における免疫グロブリン鎖の発現に用いられるペル(pel) Ｂリーダー配列、
リボゾーム結合部位及び終止コドンを含む。更に、Ｃ−末端デカペプチドタグの配列も含む。
−ｉｐＢＳ−ＶHH２１プラスミドをもつE. coli JM101 を、アンピシリン１００μg/ml及びグルコース０．１％を含むＴＢ培地１ｌ中３２℃で発育させた。ＯＤ550 １．０でＩＰＴＧ  １mM（最終濃度）の添加により、発現を誘発した。２８℃で一晩誘発した後、４，０００ｇで１０分間（４℃）遠心分離することにより細胞を集め、ＴＥＳ緩衝液（pH８．０のトリス−ＨＣｌ  ０．２M、ＥＤＴＡ  ０．５mM、ショ糖０．５M）１０ml中に再懸濁した。懸濁物を氷上に２時間保持した。周辺質タンパク質を、水により１：４容積／容積に希釈したＴＥＳ緩衝液２０mlの添加による浸透ショックにより除去し、１時間氷上に保持し、その後１２，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。上清の周辺質分画を、pH８．８のトリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌ  ５０mMにより透析し、ファストＱセファロースフロー（ファルマシア(Pharmacia))カラムに適用し、上述の緩衝液により洗浄し、緩衝液中で５０mMから１M  ＮａＣｌのグラジエントにより溶離した。
【０１９７】
ＶHHタンパク質を含有する分画を更に、ＰＢＳ緩衝液（pH７．２の０．０１Mホスフェート、０．１５M  ＮａＣｌ）により平衡化したスーパーデックス(Superdex)７５カラム（ファルマシア(Pharmacia)）により精製した。精製されたＶHHタンパク質の収量は、細胞培養物１ｌ当たり２〜５mgとまちまちである。
−分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉ）により分析した。ラクダＶHH抗 体断片の陽性確認は、精製ラクダＩｇＧＨ3に対して得られたウサギ抗体及び抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ複合物（II）を用いたウエスタンブロット分析法により行った。
【０１９８】
タンパク質標準物質（ファルマシア）としては、ＩＰＴＧ−誘導ＪＭ１０１／ｉｐＢＳＶHH２１  １mlより調製された周辺質タンパク質を用いた。図８においては、Ｃ及びＤは、ファストＳセファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた分画（Ｃ：ＮａＣｌ  ６５０mMで溶離、Ｄ：ＮａＣｌ  ７００mMにより溶離）、Ｅ及びＦはスーパーデックス(Superdex)７５カラムクロマトグラフィーにより得られた分画を示す。
【０１９９】
ここに示されたように、主な不純物はイオン交換クロマトグラフィーにより除去され、残存する不純物の大部分は、ゲルろ過により除去される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】プロテインＡ及びプロテインＧセファロース（ファルマシア(Pharmacia) を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるラクダＩｇＧの特徴付け及び精製（Ａ）は、Calemus dromedarius 血清の吸着及び非吸着分画の還元後のＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質の特性を示す。プロテインＡに吸着され、ＮａＣｌ  ０．１５M酢酸０．５８％により溶離された分画は、還元（レーンｃ）により、それぞれ５０、４６及び４３Kdの３本のＨ鎖成分及びＬ鎖を示す（レーンａ中ウサギＩｇＧ）。アルブミン結合部を削除するよう処理されたプロテインＧセファロース(Pharmacia) 誘導体に吸着され、pH２．７の０．１M  ｇｌｙ  ＨＣｌにより溶離された分画（レーンｅ）は、
非吸着分画（レーンｆ）中で回収される４６KdのＨ鎖を欠落している。これらの成分のいずれも、プロテインＡに吸着されない分画には存在せず（レーンｄ）、レーンｂは、分子量マーカーを含む。
【図１Ｂ】（Ｂ）及び（Ｃ）  分画溶離により、５０及び４３KdのＨ鎖を含有する免疫グロブリンを分離することができる。C. dromadariusの血清５mlをプロテインＧセファロースカラム５mlに吸着させ、カラムをpH７．０の２０mMリン酸緩衝液により広範囲に洗浄する。pH３．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸）による溶離によって、１００Kdの成分が溶離され、これを還元することによって４３KdのＨ鎖（レーン１）が得られる。カラムの溶離液の吸収が、バックグラウンドのレベルにまで低下した後、pH２．７の緩衝液（０．１MグリシンＨＣ）により１７０Kdの第２の免疫グロブリン成分が溶離される。この分画を還元することによって、５０KdのＨ鎖及び板状のＬ鎖バンド（レーン２）が得られる。
プロテインＧに吸着されない分画を次にプロテインＡセファロースカラム５mlに供する。洗浄及びpH３．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸）による溶離後、４６KdのＨ鎖のみからなる、１００Kdの第３の免疫グロブリンが得られる（レーン３）。
【図１Ｃ】（Ｂ）及び（Ｃ）  分画溶離により、５０及び４３KdのＨ鎖を含有する免疫グロブリンを分離することができる。C. dromadariusの血清５mlをプロテインＧセファロースカラム５mlに吸着させ、カラムをpH７．０の２０mMリン酸緩衝液により広範囲に洗浄する。pH３．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸）による溶離によって、１００Kdの成分が溶離され、これを還元することによって４３KdのＨ鎖（レーン１）が得られる。カラムの溶離液の吸収が、バックグラウンドのレベルにまで低下した後、pH２．７の緩衝液（０．１MグリシンＨＣ）により１７０Kdの第２の免疫グロブリン成分が溶離される。この分画を還元することによって、５０KdのＨ鎖及び板状のＬ鎖バンド（レーン２）が得られる。
プロテインＧに吸着されない分画を次にプロテインＡセファロースカラム５mlに供する。洗浄及びpH３．５の緩衝液（０．１５M  ＮａＣｌ、０．５８％酢酸）による溶離後、４６KdのＨ鎖のみからなる、１００Kdの第３の免疫グロブリンが得られる（レーン３）。
【図２Ａ】還元前（Ａ）及び還元後（Ｂ）にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析したプロテインＡ（Ａレーン）及びプロテインＧ（Ｇレーン）へのCamelus bactrianus、Lama vicugna、Lama glama及びLama pacosの免疫グロブリン
異なる種から得られた血清１０μl を、pH８．３の免疫沈降緩衝液（ＮａＣｌ０．２M、トリス(Tris)  ０．０１M；
ＥＤＴＡ  ０．０１M、トリトン(Triton)Ｘ１００  １％、卵白アルブミン  ０．１％）４００μl に懸濁したプロテインＡ又はプロテインＧセファロース１０mgを含むエッペンドルフ(Eppendorf) （登録商標）管に加えた。管をゆっくりと４℃で２時間回転させた。遠心分離後、ペレットを緩衝液で３回、そしてトリトン及び卵白アルブミンを除いた緩衝液で１回洗浄した。次にペレットを、ペレット当たり７０μl のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料溶液中に、還元剤としてジチオトレイトールと共に又は用いずに再懸濁した。１００℃で３分間沸騰させた後、管を遠心分離し、上清を分析した。
試験を行った全ての種において、非還元分画（Ａ）は、約１７０Kdの分子の他に、約１００Kdのより小さな主要成分を含んでいた。
還元試料（Ｂ）においては、成分としてＨ及びＬ鎖が検出される。
あらゆる種において、Ｈ鎖成分（アステリスク＊により強調）は、
プロテインＡから溶離した物質中に存在するが、プロテインＧから溶離した物質中には存在しない。
【図２Ｂ】還元前（Ａ）及び還元後（Ｂ）にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析したプロテインＡ（Ａレーン）及びプロテインＧ（Ｇレーン）へのCamelus bactrianus、Lama vicugna、Lama glama及びLama pacosの免疫グロブリン
異なる種から得られた血清１０μl を、pH８．３の免疫沈降緩衝液（ＮａＣｌ０．２M、トリス(Tris)  ０．０１M；
ＥＤＴＡ  ０．０１M、トリトン(Triton)Ｘ１００  １％、卵白アルブミン  ０．１％）４００μl に懸濁したプロテインＡ又はプロテインＧセファロース１０mgを含むエッペンドルフ(Eppendorf) （登録商標）管に加えた。管をゆっくりと４℃で２時間回転させた。遠心分離後、ペレットを緩衝液で３回、そしてトリトン及び卵白アルブミンを除いた緩衝液で１回洗浄した。次にペレットを、ペレット当たり７０μl のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料溶液中に、還元剤としてジチオトレイトールと共に又は用いずに再懸濁した。１００℃で３分間沸騰させた後、管を遠心分離し、上清を分析した。
試験を行った全ての種において、非還元分画（Ａ）は、約１７０Kdの分子の他に、約１００Kdのより小さな主要成分を含んでいた。
還元試料（Ｂ）においては、成分としてＨ及びＬ鎖が検出される。
あらゆる種において、Ｈ鎖成分（アステリスク＊により強調）は、
プロテインＡから溶離した物質中に存在するが、プロテインＧから溶離した物質中には存在しない。
【図３Ａ】健康な又はTrypanosama evansiに感染したCamelus dromedarius から得た血清より、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2及びＩｇＧ3を調製し（ＣＡＴＴ力価  １／１６０）（３）、放射免疫沈降又はウエスタンブロッティング法により抗トリパノソーマ活性について分析した。
（Ａ）35Ｓメチオニンにより標識したTripanosome evansi抗原溶解産物（５００，０００カウント）を、プロテイナーゼ阻害剤として０．１M  ＴＬＣＫを含むpH８．３の免疫沈降緩衝液２００μl 中に、血清１０μl 又はＩｇＧ1、ＩｇＧ2若しくはＩｇＧ3  ２０μg を含有するエッペンドルフ管に加え、４℃で１時間、ゆっくりと回転させた。次に管に、pH８．３の同じ緩衝液２００μl に懸濁したプロテインＡセファロース１０mgを加え、４℃で更に１時間インキュベートした。
洗浄及び１５，０００rpmで１２秒間遠心分離した後、各ペレットを、ＤＴＴを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料溶液７５μl に再懸濁し、１００℃で３分間加熱した。エッペンドルフミニヒュージ(Eppendorf minifuge)中１５，０００rpmで３０秒間遠心分離した後、上清５μl を放射活性測定に供し、残りをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びフルオログラフィーにより分析した。試料５μl 当たりのカウントを、各ラインに記す。
【図３Ｂ】（Ｂ）健康及びトリパノソーマ感染動物より得たＩｇＧ1、ＩｇＧ2及びＩｇＧ3２０μg を、前還元又は加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離した試料を次に、ニトロセルロース膜に電気移動させ、膜の一部をポンソーレッド(Ponceau Red) により染色し、タンパク質物質を局在化させ、残りをＴＳＴ緩衝液（トリス(Tris)１０mM、ＮａＣｌ  １５０mM、トウイーン(Tween) ０．０５％）中、１％卵白アルブミンと共にインキュベートして、
タンパク質結合部位をブロックした。
ブロック後、膜を広範囲にＴＳＴ緩衝液により洗浄し、35Ｓにより標識したトリパノソーマ抗原により２時間インキュベートした。
広範囲に洗浄した後、膜を乾燥し、オートラジオグラフィーにより分析した。バックグラウンド及び非特異的結合を避けるため、標識したトリパノソーマ溶解産物を４５μミリポアフィルターによりろ過し、ニトロセルロース膜に吸着させた健康なラクダ免疫グロブリン及び卵白アルブミンと共にインキュベートした。
【図３Ｃ】（Ｂ）健康及びトリパノソーマ感染動物より得たＩｇＧ1、ＩｇＧ2及びＩｇＧ3２０μg を、前還元又は加熱せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。分離した試料を次に、ニトロセルロース膜に電気移動させ、膜の一部をポンソーレッド(Ponceau Red) により染色し、タンパク質物質を局在化させ、残りをＴＳＴ緩衝液（トリス(Tris)１０mM、ＮａＣｌ  １５０mM、トウイーン(Tween) ０．０５％）中、１％卵白アルブミンと共にインキュベートして、
タンパク質結合部位をブロックした。
ブロック後、膜を広範囲にＴＳＴ緩衝液により洗浄し、35Ｓにより標識したトリパノソーマ抗原により２時間インキュベートした。
広範囲に洗浄した後、膜を乾燥し、オートラジオグラフィーにより分析した。バックグラウンド及び非特異的結合を避けるため、標識したトリパノソーマ溶解産物を４５μミリポアフィルターによりろ過し、ニトロセルロース膜に吸着させた健康なラクダ免疫グロブリン及び卵白アルブミンと共にインキュベートした。
【図４Ａ】プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製したラクダＩｇＧ3をパパインにより部分消化し、プロテインＡセファロースにより分離する。
精製ＩｇＧ3１４mgを、ＥＤＴＡ２mMを含有するpH７．０の０．１Mリン酸緩衝液中に溶解した。これらを、５．１０4Mシステインにより活性化されたマーキュリーパパイン（タンパク質に対する酵素比１％）と共に３７℃で１時間消化させた。その消化物は、過剰のヨードアセトアミド（４．１０2 M）を添加してブロックした（１３）。エッペンドルフ(ependorf)遠心分離機中、１５００rpmで５分間、消化物を遠心分離後、パパイン断片をプロテインＡセファロースカラム上で結合（Ｂ）及び非結合（ＮＢ）
分画に分離した。結合分画をpH１．７の０．１MグリシンＨＣｌ緩衝液によりカラムから溶離した。
【図４Ｂ】プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィーにより精製したラクダＩｇＧ3をパパインにより部分消化し、プロテインＡセファロースにより分離する。
精製ＩｇＧ3１４mgを、ＥＤＴＡ２mMを含有するpH７．０の０．１Mリン酸緩衝液中に溶解した。これらを、５．１０4Mシステインにより活性化されたマーキュリーパパイン（タンパク質に対する酵素比１％）と共に３７℃で１時間消化させた。その消化物は、過剰のヨードアセトアミド（４．１０2 M）を添加してブロックした（１３）。エッペンドルフ(ependorf)遠心分離機中、１５００rpmで５分間、消化物を遠心分離後、パパイン断片をプロテインＡセファロースカラム上で結合（Ｂ）及び非結合（ＮＢ）
分画に分離した。結合分画をpH１．７の０．１MグリシンＨＣｌ緩衝液によりカラムから溶離した。
【図５】Ｌ鎖を欠落したＩｇＧ３分子モデルの構造図
【図６】・Ｈポリペプチド鎖を有し、Ｌ鎖を欠落した免疫グロブリンの、通常の４本鎖モデル免疫グロブリンに関する構造図・ヒンジ部の表示
【図７Ａ】ラクダＨ鎖免疫グロブリンの１７のＶHHＤＮＡ配列
【図７Ｂ】ラクダＨ鎖免疫グロブリンの１７のＶHHＤＮＡ配列
【図７Ｃ】ラクダＨ鎖免疫グロブリンの１７のＶHHＤＮＡ配列
【図７Ｄ】ラクダＨ鎖免疫グロブリンの１７のＶHHＤＮＡ配列
【図８】  E. coli からのラクダＶHH２１タンパク質の発現及び精製Ｉ  ラクダにおけるＨ鎖抗体
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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