(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性ＤＮＡ合成酵素。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２のＤＮＡを含むクローニングベクター。
【請求項４】
大腸菌ＨＭＳ174（ＤＥ3）/pＤＰ320（FERM P-16052）が保有する組換え体プラスミドpＤＰ320。
【請求項５】
請求項２のＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離・精製することを特徴とする耐熱性ＤＮＡ合成酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＤＮＡ鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等に用いる新規な耐熱性ＤＮＡ合成酵素と、この酵素をコードするＤＮＡ配列、並びにこのＤＮＡ合成酵素の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡ polymerase）は１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成を触媒する酵素の総称である。ＤＮＡの塩基配列決定や試験管内でのＤＮＡ増幅などには必須の酵素であるが、特にＰＣＲ(Polymerase chain reaction) においては、その一連の反応サイクルを自動化する上で「耐熱性ＤＮＡ合成酵素」は不可欠である。
【０００３】
このような耐熱性ＤＮＡ合成酵素としてはＴaq、Ｐfu、ＫOD等が知られており、それぞれの特性に応じて使い分けられている。しかしながら、これら既存の耐熱性ＤＮＡ合成酵素を用いたＰＣＲ等のＤＮＡ合成の場合には、鋳型となるＤＮＡ鎖によっては、合成されるＤＮＡ鎖の伸長が途中で停止してしまい、鋳型ＤＮＡ鎖の全領域の増幅や、その塩基配列の決定が困難もしくは不可能となるという問題を有していた。また、合成停止による不完全なＤＮＡ断片がＰＣＲ産物中に混入する場合には、目的とする増幅断片を精製しなけらばならないという不都合も存在した。
【０００４】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＤＮＡ鎖をＰＣＲ等により合成、増幅するに際して、合成鎖の伸長を途中で停止させることなく、鋳型ＤＮＡ鎖の全長を効率よく増幅することのできる新規な耐熱性ＤＮＡ合成酵素を提供することを目的としている。
またこの発明は、この耐熱性ＤＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡ配列と、このＤＮＡ配列の発現産物として耐熱性ＤＮＡ合成酵素を製造する方法を提供することを目的としてもいる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性ＤＮＡ合成酵素（請求項１）を提供する。
またこの発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（請求項２）と、このＤＮＡを含むクローニングベクター（請求項３）を提供する。このようなクローニングベクターとしては、大腸菌ＨＭＳ174（ＤＥ3）/pＤＰ320（FERM P-16052）が保有する組換え体プラスミドpＤＰ320（請求項４）をも提供する。
【０００６】
さらにまた、この発明は、上記請求項２のＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換した細胞を培養し、培地中に産生された目的酵素を単離・精製することを特徴とする耐熱性ＤＮＡ合成酵素の製造方法（請求項５）を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
この発明の耐熱性ＤＮＡ合成酵素は、具体的には、ピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＰfuＤＮＡ合成酵素を公知の変異遺伝子作成法 (Strategies, vol 9, p3-4,1996) によって遺伝子工学的に改変した酵素である（以下、この発明の耐熱性ＤＮＡ合成酵素を「改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素」と記載することがある）。この酵素の作成は以下のとおりに行なった。すなわち、ＰfuＤＮＡ合成酵素の遺伝子は塩基配列が公知であるため、その両端に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、上記細菌のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によりＰfuＤＮＡ合成酵素の遺伝子を調製した。この遺伝子ＤＮＡ断片をベクターにクローニングし、上記文献に記載の方法により変異させた。遺伝子の変異は、ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列の一部がＫODＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列に置き変わるように塩基を置換させた。ＰfuＤＮＡ合成酵素とＫODＤＮＡ合成酵素は、アミノ酸配列が約８０％相同であり、ＰＣＲの際に同様の合成停止を生じさせるが（図１）、ＫODＤＮＡ合成酵素の伸長速度はＰfuＤＮＡ合成酵素のそれの６〜10倍である。そこで、ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸残基をＫODＤＮＡ合成酵素のアミノ酸残基に置換することによって、合成鎖の伸長停止が改善され、しかも伸長速度の速い酵素が得られる可能性があるからである。そして、このようにして変異させた遺伝子を大腸菌で発現させ、その発現産物を回収し、精製することによってこの発明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を得た。
【０００８】
実際には、この発明の発明者等は、上記の方法により数多くの改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を作成し、それぞれについてＤＮＡ合成実験をおこない、伸長したＤＮＡ鎖を電気泳動的に解析することによって、従来酵素に比べて合成鎖の伸長停止が著しく改善されたＤＮＡ合成酵素を得、この発明を完成させた。
このＤＮＡ合成酵素は、配列番号１に示したアミノ酸配列を有しており、このアミノ酸配列は、従来公知のＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列のうち、表１に示すアミノ酸残基が置換された新規な配列である。そして、この新規酵素を用いてＰＣＲ等のＤＮＡ合成を行なった場合には、下記の実施例に示すように、従来のＤＮＡ合成酵素を用いた場合に生じる合成停止がほぼ完全に解消される。もちろん従来酵素によって効率よく増幅されるＤＮＡ鎖は同様に効率良く増幅することができる。
【０００９】
【表１】
0003679536.tif 000002
【００１０】
また、この改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素をコードするＤＮＡ配列としては、上記の酵素作成過程で得られたＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の変異遺伝子を例示することができる。この変異遺伝子は組換え体プラスミドpＤＰ320にクローニングされており、このpＤＰ320は大腸菌ＨＭＳ174(ＤＥ3)に導入され、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている (寄託番号FERM P- 16052)。ただし、この発明のＤＮＡ合成酵素はそのアミノ酸配列が配列番号１であることを必要かつ充分な要件とするものであり、そのような酵素をコードする遺伝子は、配列番号１の各アミノ酸残基に対応する塩基コドンをつなぎ合わせたＤＮＡ配列として適宜にデザインすることができる。
【００１１】
以下、実施例を示し、この発明のＤＮＡ合成酵素についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の作成
（１）ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子のクローニング
ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の塩基配列（Nucleic Acids Research, vol.21, p259-265, 1993) に従ってＰＣＲプライマーを合成し、ピロコッカスフリオサス (P. furiosus)のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって目的遺伝子を増幅し、これを大腸菌用の発現ベクターにクローニングした。詳細は以下のとおりである。
【００１３】
P.furiosus DSM3638を上記文献に記載された方法で培養した。先ず、文献記載の培地を調製し、高温加圧滅菌ののち、蜜素ガスを吹き込み、植菌して95℃で15時間静置培養した。200mlの培養掖から遠心分離により約0.5mgの菌体を得た。集菌体を緩衝液Ａ（10mMトリス−ＨＣＬ，pH8.0, 1mMＥＤＴＡ, 100mM Ｎacl ）に懸濁し、10% ＳＤＳを１ml加え、撹拌の後、プロテイナーゼＫを0.5mg 加えて55℃で60分反応させた。反応液を順次フェノ一ル抽出、フェノ一ル／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出し、エタノールを加えてＤＮＡを不溶化し、回収した。得られたＤＮＡを１mlのＴＥバッファー（10mMトリス−ＨＣｌ，pH8.0，１mMＥＤＴＡ）に溶解し、0.5mgのＲＮase Ａを加えて37℃で60分反応させたのち、再度フェノール抽出、フェノ一ル／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出し、エタノ一ル沈殿でＤＮＡを回収してＴＥバッファ−に溶解させ、約0.3mgのＤＮＡを得た。
【００１４】
次いで、目的のＤＮＡ合成酵素遺伝子をＰＣＲ増幅するために、既知の配列データをもとに配列番号２および３に示す２種のプライマ−ＤＮＡを合成した。すなわち、フォアードプライマー配列中には目的遺伝子の開始コドンＡＴＧおよび制限酵素ＮcoＩ配列(5'-CCATGG-3')を導入し、リバースプライマーは終止コドンの下流の適当な位置に結合するように設計した。ＰＣＲは、P.furiosusＤＮＡ２μgとプライマー各10pmolを用い、ＬＡＴaq（宝酒造）と添付のバッファー条件で、50μlの反応系で行った。サイクル条件は、酵素を加える前に93℃／３分を行い、94℃／0.5 分、55℃／0.5 分、72℃／1.0 分を３０サイクルした。増幅したＤＮＡ断片を精製し、ＮcoＩで処理した後、同じくＮcoＩで切断後に平滑末端化し、さらにＮcoＩ処理した発現ベクターｐＥＴ15−ｂのＴ７プロモーター下流に組み込んだ。この発現ベクターをｐＤＰＷＴ100とし、挿入遣伝子の塩基配列を確認した。
（２）ＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子の改変
クローン化したＰfuＤＮＡ合成酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターｐＤＰＷＴ100に対して、期待する変異を含んだオリゴヌクレオチド（配列番号４および５）とプロメガ社の突然変異導入キットを用い、公知の方法 (Strategies, vol 9, p3-4,1996) に従って改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素の遺伝子を、発現ベクターｐＤＰＷＴ100上で作成し、発現ベクターｐＤＰ320 を構築した。なお、この改変型遺伝子の塩基配列を決定することにより、改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素のアミノ酸配列（配列番号１）を確認した。
実施例２：改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素の大腸菌での発現と精製
実施例１（２）で作成した改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素の遺伝子を次のとおりに大腸菌で発現させ、精製した。
【００１５】
実施例１（２）で作成した改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素遺伝子をもつ発現ベクターｐＤＰ320 を大腸菌ＨＭＳ173(ＤＥ３）株に導入し、終濃度0.1mMのＩＰＴＧを含んだＬＢ培地で14時間培養し、酵素を大腸菌体内に発現誘導した。遠心して菌体を集めた後、150mM Ｔris/ＨＣl(pH7.5)、2mM ＥＤＴＡ、0.24mM ＡＰＭＳＦおよび0.2%のＴween20を含む緩衝液で超音波処理を行いながら、改変型ＰｆｕＤＮＡ合成酵素を抽出した。この粗抽出液を80℃、15分の熱処理を行うことで大腸菌由来のＤＮＡ合成酵素を失活させると共に、この発明のＤＮＡ合成酵素の部分精製を行なった。部分精製画分は50mMＴris/ＨＣl(pH7.5)、１mMＥＤＴＡ、0.2%Ｔween20、7mM 2-mercaptoethanol および10% glycerolの緩衝液に対し透析した。この段階で改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素に特異的なＤＮＡ合成活性を検出した。
実施例３：改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素によるプライマー伸長反応
実施例２で部分精製した改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用い、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖のプライマー伸長反応を試験した。
【００１６】
20mMＴris/ＨＣl(pH8.0)、２mM ＭgＣl2、50μg/mlＢＳＡ、0.1%Ｔriton Ｘ-100、１mMの各cold dNTPs(0.1mM for dCTP)、[α-32P] dCTPの10μCiとＭ13(-21)のプライマーをアニールさせた0.63μgのpBLUESCRIPT プラスミドを含む反応液20μlに、上記の部分精製酵素画分１μgを入れ、75℃で１分および３分間反応させた。伸長したＤＮＡ鎖を８M ureaを含んだポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、イメージアナライザ−によりそのパターンを解析した。また、対照として、従来の野性型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用いて、同様のＤＮＡ合成を行なった。
【００１７】
結果は図２に示したとおりである。従来の野性型ＰfuＤＮＡ合成酵素を用いた場合には、合成停止による不完全はＤＮＡ鎖の存在を示すバンドが少なくとも１０個観察されたが、この発明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成では、これらのバンドは消失した。一方、1000ベース近傍の良く伸長したＤＮＡ鎖の蓄積には差は見られなかった。
【００１８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、ＤＮＡ鎖をＰＣＲ等によって増幅するに際して、合成鎖の伸長を途中で停止させることなく、鋳型ＤＮＡ鎖の全長を効率よく合成、増幅することのできる新規な耐熱性合成酵素が提供される。これによって、ＤＮＡ鎖の試験管内での合成や増幅、塩基配列の決定等を簡便かつ高精度で行なうことが可能となる。
【００１９】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：775
配列の型：アミノ酸
配列の種類：タンパク質
配列
0003679536.tif 000003
0003679536.tif 000004
0003679536.tif 000005
0003679536.tif 000006
配列番号：２
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003679536.tif 000007
配列番号：３
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003679536.tif 000008
配列番号：４
配列の長さ：66
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003679536.tif 000009
配列番号：５
配列の長さ：66
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003679536.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＰfuＤＮＡ合成酵素とＫODＤＮＡ合成酵素のプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。
【図２】従来のＰfuＤＮＡ合成酵素（野性型）とこの発明の改変型ＰfuＤＮＡ合成酵素のプライマー伸長活性を示す電気泳動の結果である。
【図１】
0003679536.tif 000011
【図２】
0003679536.tif 000012