(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、光応答性分子を結合した充填材を充填し、該充填材への光照射を可能とし、充填材への光照射によって分離特性のスイッチング制御を行うことを特徴とする光スイッチング機能を備えた高速液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境分析、臨床診断、バイオテクノロジー等の分野において、混合成分試料の分離、精製、分析、分取等で使用される高速液体クロマトグラフィーに用いるカラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
移動相に液体（溶媒）を用いるクロマトグラフィーとして、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｎａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）が知られており、この高速液体クロマトグラフィーの分析機能を表す特性として保持特性や分離特性がある。保持特性は、クロマトグラフィーのカラム中において試料成分を滞留することができる保持時間によって表すことができ、分離特性は、異なる成分を分離し区別して識別することができる特性であって、各成分のピーク相互の重なり具合を用いて表すことができる。
【０００３】
従来、分離特性は、溶離液（移動相）の種類や組成比，固定相の種類，分離温度等を調整することによって制御することができるが、瞬時に変化させることは困難である。
【０００４】
一般に、高速液体クロマトグラフィーの分離特性は、取り付けられるカラムの固定相の種類や移動相の種類，組成比によって特徴づけられる。そのため、高速液体クロマトグラフィーによって被検体の分析を行う場合には、分析を行う被検体の性質に合わせたカラムを選択し、該選択したカラムを高速液体クロマトグラフに取り付けて分析を行っている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の高速液体クロマトグラフィー用カラムでは、試料の保持時間は溶離液の種類や分離温度の調節によって制御が可能であるが、分離特性を変更するためには、分離を短時間に制御することは困難であるという問題点がある。
【０００６】
例えば、異なる分離特性による分析を繰り返して行うような場合には、異なる分離特性毎にカラムの変更を行う必要がある。そのため、取り替え作業に大きな負担が生じ、また、その作業時間によって測定時間も長時間化するという問題がある。また、取り替え作業毎に分析処理を停止する必要があるため、分析の連続性が損なわれることにもなる。
【０００７】
また、複数のカラムに性質の異なる充填材を充填しておき、バルブの切り換えによって溶出順を変更するカラムスイッチング法や、溶離液に混合物を利用するグラジエント法等の方法を用いる場合もあるが、この場合には装置の小型化が難しく大量の溶離液を必要とするという問題点がある。
【０００８】
そこで、本発明は前記した従来の高速液体クロマトグラフィー用カラムの持つ問題点を解決し、分離特性を短時間に変化させることができる高速液体クロマトグラフィー用カラムを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムは、光によって性質が変化する特性を充填材に持たせ、光の照射の有無や光の波長によって、保持時間や分離選択性等の分離特性を短時間に制御するものである。この光による分離特性の制御を行うために、本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムは、固定相に対してその分離特性を発揮する部位に光応答性分子を結合した充填材を充填し、該充填材への光照射を可能とするものであり、カラム中の充填材に対して光の照射の有無を制御したり、照射する光の波長を選択することによって分離特性のスイッチング制御を行う。
【００１０】
本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムによれば、カラム中の充填材に光を照射すると、該充填材に結合させた光応答性分子（フォトクロミック化合物）の極性や立体構造等の性質が変化して、分離特性に寄与する他の分子との結合特性が変わり、この結合特性の変化によって試料成分を分離する特性を変化させる。また、充填材へ光の照射を停止すると、光の照射で変化した光応答性分子の性質は元に戻り、試料成分を分離する特性も元に戻る。この光応答性分子の変化は光の照射に対して良好な応答性を持つため、カラムの分離特性を短時間で切り換えて光スイッチング制御を行うことができる。
【００１１】
また、光応答性分子（フォトクロミック化合物）の光の照射による変化は、照射する光の波長で異なる場合がある。したがって、光応答性分子に対する応答性が異なる波長の光を充填材に照射すると、試料成分を分離する特性にも変化が生じる。そこで、所望の分離特性に対応した波長の光を選択し、該波長の光をカラムに照射することによって、目的とする分離を選択的に行うことができる。この波長に対する分離特性の変化は、波長の切り換えに対して良好な応答性を持つため、カラムの分離選択性を短時間で切り換えることができる。
【００１２】
本発明の第１の実施態様は、光照射によって充填材の保持特性を変化させるものであり、これによって、短時間でカラムにおける保持時間等の保持特性を変化させることができる。
【００１３】
本発明の第２の実施態様は、光の波長特性によって充填材の分離特性を変化させるものであり、これによって、短時間でカラムにおける分離選択性を変化させることができる。
【００１４】
本発明の第３の実施態様は、高速液体クロマトグラフィー用カラムの充填材であって、該充填材は固定相に対して分離特性を発揮する部位に、光によって性質が変化する特性を持つ光応答性分子を結合して生成することができ、この充填材をカラムに充填し、光の照射制御によって分離特性の制御が可能な高速液体クロマトグラフィー用カラムを構成することができる。
【００１５】
本発明の第４の実施態様は、光応答性分子としてアゾベンゼンを用いるものであり、シリカゲルやポリマーの担体上に化学結合させることにより、充填材を生成することができる。
【００１６】
本発明の第５の実施態様は、光応答性分子をキャピラリー電気泳動用キャピラリーに結合させ、光の照射によって分離特性を変化させるものである。
【００１７】
本発明の第６の実施態様は、光応答性分子を結合した固定相の粒子を薄層クロマトグラフィーのガラス板の面上に塗布し、光の照射によって分離特性を変化させるものである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図を参照しながら詳細に説明する。
本発明の実施の形態例について、図１の本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムに使用する充填材の構成を説明するための図を用いて説明する。
【００１９】
図１において、本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムに使用する充填材は、高速液体クロマトグラフィーの固定相を形成する担体上に、光応答性分子（フォトクロミック化合物）を化学結合させたものである。この光応答性分子は、光の照射によってその性質が変化する特性を備えた物質であり、例えば、光の照射によって分子の立体構造変化を起こす物質である。この立体構造変化は、光の照射によってエネルギー的に高い状態となって極性変化を起こす。
【００２０】
図１（ａ）において、固定相Ａに波長λ１  の光を照射すると、極性変化によって固定相Ｂに変化する。また、この固定相Ｂに対して先に照射した光の波長λ１  よりも長い波長の光あるいは熱を与えると、再び逆の極性変化によって固定相Ａに戻る。
【００２１】
固定相Ａと固定相Ｂとの間の極性変化は、前記図１（ａ）で示したように、照射する光の波長の相違によってその変化方向を変えることができ、また、光応答性分子によっては、図１（ｂ）に示すように、光を照射することによって固定相Ａから固定相Ｂへ変化させ、この照射光を停止することによって、上昇していた内部のエネルギーを光や熱の形態で放出して、光を照射する以前の固定相Ａの極性に戻すこともできる。
【００２２】
極性が異なる異性体は、他の分子との結合状態が異なるため、この異性体を含む充填材は、その極性によって分離特性が異なることになる。本発明はこの性質を利用するものである。
【００２３】
また、光変換を起こさせるために照射する光として、異なる波長の光を用いることもできる。光応答性分子の光変換は照射する波長によって異なり、極性変化の差が生じる場合がある。極性変化の差は保持特性の変化として現れ、分離を行う成分に応じて保持特性の異なる変化を得ることもできる。本発明では、この光応答性分子の照射光の波長による保持特性の違いを利用して、成分を分離して検出を行う分離選択性を変えることができ、成分によってピークの現れる順を変更したり、ピーク間の幅を変化させることができる。
【００２４】
光応答性分子には、例えばアゾベンゼンを用いることができる。アゾベンゼンは光応答性を備え、安価で化学修飾が容易な分子である。
【００２５】
以下、光応答性分子としてアゾベンゼンを用いて説明する。図２はアゾベンゼンの光による異性化の状態を示す図である。図２において、担体に結合されたアゾベンゼンは異性体を備えており、通常はトランス型で存在している。固定相上に結合されたトランス型のアゾベンゼンに対して紫外光（例えば波長が３００ｎｍの光）を照射すると、光変換によってシス型のアゾベンゼンに異性化する。これによって、アゾベンゼン分子の極性変化が生じ、保持特性等の分離特性を変化させる。シス型アゾベンゼンへの異性化は、紫外光を照射し続ける間持続する。ここで、図２に示すように、可視光のような先に照射した紫外光より長波長の光（例えば波長が３８０ｎｍより長波長の光）を照射したり、熱を与えることにより、シス型アゾベンゼンは、紫外光を照射する前の極性に戻りトランス型のアゾベンゼンとなる。このトランス型とシス型の異性体間の変換は、外部信号として光の照射の波長で制御することができる。
【００２６】
この図２に示す例は、前記図１（ａ）に示した照射する光の波長によって、極性変化の方向を制御する例である。
【００２７】
上記した光応答性分子をシリカゲルやポリマー等の担体上への化学結合により調製することによって充填材を生成することができ、この充填材を例えばスラリー法によってガラスカラムに充填して高速液体クロマトグラフィー用カラムを形成することができる。
【００２８】
また、上記光応答性分子をキャピラリー電気泳動用のキャピラリーに結合させることによって、光スイッチング機能を備えた電気泳動用キャピラリーを形成することができ、光応答性分子を結合した固定相の粒子を薄層クロマトグラフィーのガラス板の面上に塗布することによって、光スイッチング機能を備えた薄層クロマトグラフィーを形成することができる。
【００２９】
次に、光応答性分子であるアゾベンゼンを固定相に結合して、本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムに使用する充填材を形成する例を、担体としてシリカゲル，およびポリマー系を用いた場合について図３，４，５で示す。
【００３０】
図３はシリカゲルの担体にアミドを合成したシリカゲル−アミド結合固定相の例を説明するための図であり、図４はシリカゲルの担体にエーテルを合成したシリカゲル−エーテル結合固定相の例を説明するための図であり、図５はポリマー系の担体にアゾベンゼンを結合したポリマー系固定相の例を説明するための図である。
【００３１】
図３において、シリカゲル−アミド結合固定相の生成においては、始めにシリカゲルを担体とする固定相を調製し、このシリカゲルにアミノプロピルジメチルエトキシシランをトルエンを溶媒とし、温度制御等の制御（図３中のΔの符号）を行って反応させる。次に、この反応物にフェニルアゾベンゾイルクロリドをトルエン溶媒下でＥｔ３Ｎを加えて反応させてシリカゲル担体アミドを生成する。
【００３２】
図４において、シリカゲル−エーテル結合固定相では、始めにｐ−ヒドロキシアゾベンゼンとアリルブロマイドをアセトン溶媒でＫ２ＣＯ３と１８−クラウン−６を加えて反応させてエーテルを得る。このエーテルとメチルジクロロシランを、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶媒下でＨ２ＰｔＣｌ６・６Ｈ２Ｏ  を加えてヒドロシリル化反応によりシリル化する。次に、このシリル化した反応物をベンゼン溶媒下でＥｔ３Ｎ  を加えて反応させてシリカゲル担体エーテルを生成する。なお、この例では、エーテルの生成について示しているが、既成のエーテルを用いても行うことができる。上記図３，４に示すように、アゾベンゼンのシリカゲル担体への固定化を行うことができる。
【００３３】
次に、図５を用いてアゾベンゼンのポリマー系担体への固定化例について説明する。図５において、アゾベンゼンのポリマー系担体への固定化では、始めにアクリル酸クロリドとｐ−アミノアゾベンゼンをＥｔＯＡｃ（エトキシ酸）溶媒下でＥｔ３Ｎ  を加えて反応させてアミノ化してアゾベンゼンモノマーとし、このアゾベンゼンモノマーを用いてソープフリ−重合法によりポリマー固定相（図５中のＡＺＰ−ＤＶＢ）を調製する。
【００３４】
また、別の調製である２段階重合法では、ポリスチレン種粒子（図５中のＰＳｔ）を重合して担体ポリマーとし、先に生成しておいたアゾベンゼンモノマーをジビニルベンゼンと共に該ポリスチレン種粒子に膨潤重合させることによって固定相（図５中の中心にＰＳｔを含むＡＺＢ−ＤＶＢ）を生成することができる。なお、アゾベンゼンモノマーの重合において、ジビニルベンゼンは架橋剤として用いられている。
【００３５】
次に、上記で示した光応答性分子を結合した固定相による保持特性の光照射による変化の一例について図６〜図１１を用いて示する。なお、図６はシリカゲル−アミド結合固定相の順相系による保持能ｋ’を示す図であり、図７はシリカゲル−エーテル結合固定相の逆相系による保持能ｋ’を示す図であり、図８はシリカゲル−エーテル結合固定相の逆相系による保持能ｋ’の再現性を示す図であり、図９はソープフリー重合法によるポリマー系固定相の逆相系による保持能ｋ’を示す図であり、図１０はシード重合法によるポリマー系固定相の逆相系による保持能ｋ’を示す図であり、図１１はシード重合法によるポリマー系固定相の逆相系による保持能ｋ’の再現性を示す図である。
【００３６】
また、図６〜図１１に示す分析は、以下の分離条件で測定を行っている。カラムは、カラム長が１０ｃｍあるいは１５ｃｍ，内径が１ｍｍあるいは１．５ｍｍで、両端にステンレス製のカラムジョイントを結合させたガラス製毛細管を用い、カラム温度は３０℃とし、検出には２５４ｎｍの波長の紫外光を用い、ホールドアップタイム測定にはアセトニトリルを用いている。また、移動相は、順相系では０．５％  ２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（イソプロピルアルコール）のヘキサン溶液を用い、逆相系ではメタノールを用いている。流量は、カラムにかかる圧力に応じて０．０５から０．２０ｍｌ／ｍｉｎの範囲としている。
【００３７】
図６に示す保持能ｋ’は、アミノプロピルシリカにアゾベンゼン部位を導入した固定相の光照射による変化を示している。なお、移動相には０．５％  ２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（イソプロピルアルコール）のヘキサン溶液を用い、流量は０．０５ｍｌ／ｍｉｎ  とし、ｏ−Ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ（ｏ−テルフェニル），Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ（フェナントレン），Ｂｅｎｚｙｌ  ｃｉｎｎａｍａｔｅ（ケイ皮酸ベンジル），ｔｒａｎｓ−Ｓｔｙｌｂｅｎｅ（トランススチルベン），２−Ａｃｅｔｈｙｌ  ｆｌｕｏｒｅｎｅ（２アセチルフルオレン）の各成分の保持能ｋ’について紫外光に対する照射前と照射後の変化を示している。図６によれば、紫外光の照射によって、各成分とも保持能ｋ’が高まることが確認される。
【００３８】
図７に示す保持能ｋ’は、前記したシリカゲル−エーテル結合固定相において、アゾベンゼン骨格とスペーサーとの間をエーテル結合とした固定相とし、極性を抑えた固定相を用いた場合の例であり、この固定相によって、Ｐｙｒｅｎｅ（ピレン），Ｐｅｒｙｒｅｎｅ（ペリレン），Ｓｕｄａｎ  ＩＶ（スダンＩＶ）の各成分を分離した場合の保持能ｋ’を示している。図７は逆相系の場合であり、前記した図６とは紫外光に対する保持能ｋ’は逆の特性を示している。この保持能ｋ’では、特にＳｕｄａｎ  ＩＶ（スダンＩＶ）の成分に対しては比較的強い保持力を示し、紫外光照射後に大きな保持能ｋ’の変化が得られる。
【００３９】
図８は、前記図７と同様のシリカゲル−エーテル結合固定相を用いて、紫外光と可視光を順次照射したときのＳｕｄａｎ  ＩＶ（スダンＩＶ）の成分の保持能ｋ’の変化を示している。これにより、照射する波長によって異なる保持能ｋ’を得ることができ、また、波長変化による保持能ｋ’の変化については充分な再現性が得られることを確認することができる。
【００４０】
図９はアゾベンゼン骨格を持つモノマーとジビニルベンゼンを用い、ソープフリー重合法により生成したポリマー系固定相を用い、前記したシリカゲル系固定相と同様にして、Ｐｙｒｅｎｅ（ピレン），Ｃｈｒｙｓｅｎｅ（クリセン），Ｐｅｒｙｌｅｎｅ（ペリレン），Ｔｅｓｔｏｓｔｒｏｎ（テストステロン），Ｂｒｕｃｉｎｅ  （ブルシン）の各成分について保持能ｋ’を求めたものである。これによって、ポリマー系固定相においても、シリカゲル系固定相と同様の紫外光に対する保持能ｋ’のと変化をえることができる。
【００４１】
また、図１０はシード重合法によるポリマー系固定相を用い、ｔｒａｎｓ−Ｓｔｙｌｂｅｎｅ（トランススチルベン），Ｐｙｒｅｎｅ（ピレン），Ｃｈｒｙｓｅｎｅ（クリセン），Ｔｅｓｔｏｓｔｒｏｎ（テストステロン），Ｂｒｕｃｉｎｅ  （ブルシン）の各成分について保持能ｋ’を求めた例である。この例によれば、Ｔｅｓｔｏｓｔｒｏｎ（テストステロン），Ｂｒｕｃｉｎｅ  （ブルシン）等のステロイドでは、紫外光照射後においても保持能ｋ’に大きな変化はなく、Ｐｙｒｅｎｅ（ピレン），Ｃｈｒｙｓｅｎｅ（クリセン）等の比較的大きい多環芳香族化合物では保持能ｋ’に比較的大きい変化が得られる。これは、アゾベンゼンの光異性化による極性の変化に加えて、立体配座の変化による試料分子の立体認識性の変化が保持挙動に影響しているためと考えられる。
【００４２】
図１１は、前記図１０と同様のシード重合法によるポリマー系固定相を用いて、紫外光と可視光を順次照射したときのｔｒａｎｓ−Ｓｔｉｌｂｅｎｅ（トランススチルベン）の成分の保持能ｋ’の変化を示している。これにより、シリカゲル系固定相と同様に、照射する波長によって異なる保持能ｋ’を得ることができ、また、波長変化による保持能ｋ’の変化については充分な再現性が得られることを確認することができる。
【００４３】
なお、前記図６〜図１１において、光照射による保持能の変化はクロマトグラフィーによる分析に充分な程度に短時間に行われる。
【００４４】
前記例では、アゾベンゼンを用いて説明しているが、光照射によって極性や立体構造等を変化させる光応答性分子（フォトクロミック化合物）として前記したアゾベンゼンに限らず、その他の光応答性分子（フォトクロミック化合物）を使用することもできる。また、移動相条件を含む分離条件やアゾベンゼン基の担体への固定化条件を最適化することによって、保持能の変化を増大することができる。
【００４５】
本発明の実施態様によれば、アゾベンゼンを光応答性分子として生成した充填材を用いた高速液体クロマトグラフィー用カラムでは、紫外光照射によって逆相系では保持能を増大させることができ、順相系では保持能を減少させることができる。
【００４６】
本発明の実施態様によれば、多環芳香族化合物、ステロイドの成分に対する保持能の変化を光の照射および照射する光の波長で制御することができる。
【００４７】
本発明の実施態様によれば、カラムから溶出する試料成分の順番を短時間で変更させ、従来実施してきたカラムスイッチング法やグラジエント溶出法と比較して、小型化、省資源化、および迅速化が可能となり、環境分析、臨床診断、バイオテクノロジー等の分野において高い有用性を備える。
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムによれば、分離特性を短時間に変化させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の高速液体クロマトグラフィー用カラムに使用する充填材の構成を説明するための図である。
【図２】アゾベンゼンの光による異性化の状態を示す図である。
【図３】シリカゲルの担体にアミドを合成したシリカゲル−アミド結合固定相を説明するための図である。
【図４】シリカゲルの担体にエーテルを合成したシリカゲル−エーテル結合固定相を説明するための図である。
【図５】ポリマー系の担体にアゾベンゼンを結合したポリマー系固定相を説明するための図である。
【図６】シリカゲル−アミド結合固定相の順相系による保持能ｋ’を示す図である。
【図７】シリカゲル−エーテル結合固定相の逆相系による保持能ｋ’を示す図である。
【図８】シリカゲル−エーテル結合固定相の逆相系による保持能ｋ’の再現性を示す図である。
【図９】ソープフリー重合法によるポリマー系固定相の逆相系による保持能ｋ’を示す図である。
【図１０】シード重合法によるポリマー系固定相の逆相系による保持能ｋ’を示す図である。
【図１１】シード重合法によるポリマー系固定相の逆相系による保持能ｋ’の再現性を示す図である。
【符号の説明】
Ａ，Ｂ…固定相
【図１】
0003632969.tif 000002
【図２】
0003632969.tif 000003
【図３】
0003632969.tif 000004
【図４】
0003632969.tif 000005
【図５】
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【図６】
0003632969.tif 000007
【図７】
0003632969.tif 000008
【図８】
0003632969.tif 000009
【図９】
0003632969.tif 000010
【図１０】
0003632969.tif 000011
【図１１】
0003632969.tif 000012