(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルポニン遺伝子を有効成分として含む抗癌剤。
【請求項２】
癌の治療に用いる、請求項１記載の抗癌剤。
【請求項３】
癌転移の抑制に用いる、請求項１記載の抗癌剤。
【請求項４】
カルポニン遺伝子が配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものである、請求項１記載の抗癌剤。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列番号１の塩基配列である、請求項４記載の抗癌剤。
【請求項６】
カルポニン遺伝子が合成または天然由来の膜の中に封入されたものである、請求項１〜５のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項７】
カルポニン遺伝子がリポソームの中に封入されたものである、請求項６記載の抗癌剤。
【請求項８】
カルポニン遺伝子が、腫瘍細胞内および／または正常細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベクターに含まれたものである、請求項１〜５のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項９】
組換えベクターがプロモーターを含むものである、請求項８記載の抗癌剤。
【請求項１０】
プロモーターがアクチンプロモーターである請求項９記載の抗癌剤。
【請求項１１】
組換えベクターが約6.5kbの大きさを有し、サイトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、ラビットβ−グロビン3' 隣接領域、SV40複製オリジン、およびヒトカルポニン遺伝子を含み、下記の制限酵素地図で表される組換えベクターpCAGGC/hCNである、請求項10記載の抗癌剤。
【化１】
0003713290.tif 000012
【請求項１２】
カルポニン遺伝子を含み組換えベクターが合成または天然由来の膜の中に封入されたものである、請求項８〜11のいずれかに記載の抗癌剤。
【請求項１３】
ヒトカルポニン遺伝子を含む組換えベクターがリポソームの中に封入されたものである、請求項12記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は抗癌剤に関し、さらに詳細には、カルポニン遺伝子を利用した抗癌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の治療には外科的療法、放射線療法、化学療法など、さらにはこれらを組み合わせた集学的療法が行われ、生存率の大幅な向上が認められるにいたった。しかしながら、癌患者の生存率の更なる向上のために臨床上問題となるのは原発巣より遊離した癌細胞が、他の臓器に転移し、予後不良となることである。このようなきわめて致命的な癌転移について、現状では満足のいく治療法はなく、従って、癌転移の制圧が望まれており、癌転移に対し有効な薬剤の開発が急務となっている。癌転移の機構に関しては過去に多くの研究がなされ、特に血行性転移に関してはその詳細な機構が判明してきている。癌細胞は原発巣より遊離し、血管内に浸潤し、血流に乗り遠隔の転移先臓器まで運ばれる。ここで血管内皮細胞と接着し、細胞外基底膜構成成分を破壊しながら、血管外へ浸潤し、血管新生を伴いながら他臓器で増殖をするようになり転移が成立する（Liotta L.A. et al Cell 1991 ; 64 : 327-336）。癌転移抑制剤の開発にはこれら各ステップのいずれかを阻止すれば良いと理論的に考えることができる。事実、接着を抑制する物質（Humphries M.J. Olden K. and Yamada K. Science 1986 ; 233 : 4647-470、あるいは、Iwamoto Y. et al Science 1987 ; 1132-1134）、血管新生阻害剤（Yamaoka M. et al Cancer Reseach 1993 ; 53 : 4262-4267）、癌細胞の浸潤を抑制する物質（公開特許公報  特開平3-31214）、基底膜分解酵素の阻害物質（例えば、Irimura T. Nakajima M. and Nicolson G.L. Biochemistry 1989 ; 25 : 5322-5328、あるいは、公開特許公報  特開平5-194414）などが既に知られている。しかしながら、これらの物質は基礎実験の段階であり、実用化には至っていない。
【０００３】
一方、遺伝子導入技術の進歩と共に、遺伝子治療という新しい治療分野が確立されようとしている。癌に対する遺伝子治療には大きくわけて４通りある。第一は免疫療法の応用（例えば、Nabel G.J. at al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 ; 90 : 11307-11311、あるいはMullligan R.C. Science 1993 ; 260 : 926)、第二は自殺遺伝子を用いる方法で脳腫瘍の治療で行われている（例えば、Culver K.W. et al. Science 1992 ; 156 : 1550-1552）。第三は癌抑制遺伝子、癌原遺伝子をターゲットとする方法、第四は化学療法時の骨髄抑制を防御するために造血幹細胞に多剤耐性遺伝子を導入する方法である。しかしながら、これらの遺伝子治療法は原発腫瘍に対する効果は期待できるものの、抗転移効果という面からの検討はなされておらず、癌転移に対し有望と思われる遺伝子治療法は現状では未だ報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、癌転移の抑制に有効な抗癌剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、原発巣に対しても有効な抗腫瘍効果を示す抗癌剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意努力を重ねた結果、カルポニン遺伝子を直接腫瘍細胞に導入することにより、造腫瘍性が低下し、転移能が減弱することを見出し、さらにはカルポニン遺伝子を予め個体内に投与することにより、動物モデルを用いた実験的転移評価系において転移結節数が著しく減少することを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、カルポニン遺伝子を有効成分として含む抗癌剤を提供するものである。
【０００６】
特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の抗癌剤は直接腫瘍細胞にカルポニン遺伝子を導入し、発現させることにより、ラミニン受容体の減少に伴う腫瘍細胞の接着能に変化をもたらし、結果的に造腫瘍性を低下させ、転移能を減弱させるものと考えられる。また、直接、個体内にカルポニン遺伝子を導入した場合には血管壁内の平滑筋細胞を含む正常細胞でカルポニン遺伝子が発現することにより、血管壁など正常細胞の運動能、接着能を抑制し、その結果、癌細胞が血管壁外に浸潤するのを抑制するものと考えられる。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用されるカルポニン遺伝子とは、カルポニンまたはカルポニン様タンパクをコードする遺伝子をいうものとする。カルポニンは、主に哺乳類平滑筋細胞に存在するトロポニン様のタンパク質として発見され(Takahashi. K.et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986 ; 141 : 20-26)、アクチンフィラメントに結合しミオシンATPaseの活性を阻害することが知られており(Winder.S.J. et al. J. Biol. Chem. 1990 ;265 : 10148 - 10155)、平滑筋の収縮制御において重要な役割を担っていると考えられている。 チキンのカルポニンのアミノ酸配列は高橋らによって決定されている(Takahasi, K. and Nadal-Ginnard, B. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 13288)。また、カルポニン様タンパクとしては、SM22、mp20が知られており、これらのカルポニン様タンパクのアミノ酸配列は、それぞれ、Thweatt、Ayme-Southgate らによって決定されている(Thweatt, R. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 ; 187 : 1 - 7)(Ayme-Southgate, A. et al. J. Cell Biol. 1989 ; 108 : 521 - 531) 。本発明においては、上記のカルポニンまたはカルポニン様タンパクをコードする遺伝子を利用することができる。
【０００８】
また、カルポニンcDNAは、最初にニワトリ砂嚢よりクロ−ニングされ(Takahashi, K. and Nadal-Ginard, B. J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 13288)、その後ヒト、ラットのカルポニンcDNAについてもクロ−ニングの報告がなされている(Takahashi, K. et al. Japanease Circulation Journal 1992 ; 56 supplement : 40)(Shanahan, C. M. et al. Circulation Res. 1993 ; 73 : 193 -204)。本発明においては、上記のカルポニンcDNAを使用してもよい。導入する遺伝子および発現されるタンパク質の免疫的拒絶反応を最小に抑さえるために、また、治療の効果を上げるために、導入する遺伝子はヒト由来のものが望ましい。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むカルポニン遺伝子、より好ましくは、配列番号１の塩基配列を含むカルポニン遺伝子を使用する。カルポニン遺伝子は補助的なコード配列を含んでいてもよく、また、それがコードするアミノ酸配列が付加、置換、欠如されたものであっても、カルポニンと同様の機能を有するものを発現するものであればよい。本発明において使用されるカルポニン遺伝子は、公知の技術を用いて、細胞から単離精製して得られたゲノムDNAもしくはcDNAであっても、また、これらがNarang等の方法(Narang, S. A. DNA synthesis Tetrahedron 1993 ; 39 : 3)に従って化学的に合成されたものであってもよい。
【０００９】
本発明においては、カルポニン遺伝子そのもののみを導入することにより目的を達成しうるが、また、カルポニン遺伝子を含み、腫瘍細胞内、平滑筋細胞等の正常細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベクターを使用しても良い。本発明において使用できる組換えベクターは、カルポニン遺伝子と、該遺伝子の発現のための発現ベクターから構成される。一般的には、哺乳類細胞でタンパク質を発現させることのできるプラスミドベクターやDNAあるいはRNAのウィルスベクターを用いて、上記の発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは、発現ベクタ−の複製を可能とする複製オリジン、発現のためのプロモ−タ−、スプライスシグナル、ポリA付加シグナル、薬剤選択マ−カ−、エンハンサ−等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築することができるが、少なくともプロモーターを含むことが好ましい。発現ベクターの複製を可能とする複製オリジンには、SV40ウィルス、パピロ−マウィルス、EBウィルス(Epstein-barr virus)等をあげることができ、また発現のためのプロモーターとしてはβ−アクチンプロモ−タ−、エロンゲ−ションファクタ−１α、チミジンキナ−ゼプロモ−タ−、SV40プロモ−タ−、アデノウィルス主要後期プロモ−タ−、サイトメガロウィルスプロモ−タ−等をあげることができる。さらに、スプライスシグナル、ポリA付加シグナル、クローン選択を効率化するためにアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤撰択マーカー、細胞特異的に働くエンハンサーの他、導入遺伝子の発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。本発明において使用可能な組換えベクターを構築するうえで好ましい発現ベクターとしてはpEF-BOS (Mizushima, S. et al. Nucleic Acid Research 1990 : 18 : 5322)、pcDL-SR α296 (Takebe, Y. et al. Molecular and Cellular Biology 1988 ; 8 : 466 -472)、pCAGGS (Niwa, H. et al. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 1991 ; 108 : 193 - 200) 、pAd265SVp(A)3 (Kaufman, R. J. et al. Mol. Cell. Bio. 1985 ; 5 : 1750 - 1759)等のプラスミドあるいはウィルス等を挙げることができ、このうち、pCAGGSが特に好ましい。pCAGGSは、サイトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、ラビットβ−グロビン 3' スプライスシグナル、ラビットβ−グロビン 3' 隣接領域、SV40複製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を高い効率で発現させることができる。
【００１０】
本発明において使用可能な組換えベクターは当該技術の熟練者によく知られる技術(Maniatis, T.  et al. Molecular cloning : A laboratory manual 1989 ; Cold Spring Harbor Laboratory)を用いて、上記のような発現ベクターにカルポニン遺伝子を組込むことによって構築することができる。
【００１１】
カルポニン遺伝子、または、カルポニン遺伝子を含みかつ腫瘍細胞内および／または正常細胞内で該遺伝子を発現することができる組換えベクター（以下、「カルポニン遺伝子を含む組換えベクター」と記す。）を医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物として、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して、投与することができる。
【００１２】
また、カルポニン遺伝子、または、カルポニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封入した粒子を医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物として、溶液、懸濁液、ゲル等の形態に製剤化して、投与してもよい。カルポニン遺伝子、または、カルポニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封入することにより、該遺伝子または該組換えベクターをヌクレア−ゼによる消化から防ぐことができ、またカルポニン遺伝子を導入する細胞を傷害することなく細胞内に高効率で導入することができる。リポソ−ム(Wong, T. K. et al. Science 1980 ; 215 : 166)や脂質エマルジョン等の合成膜の他、植物細胞から取ったプロトプラスト(Schaffner, W. Proc. Natl. Acad. Sci. 1980 ; 77 : 2163)、レトロウィルスのようなウィルスキャプシド(Cone, R. D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984 ; 81 : 6349)、赤血球膜ゴ−スト(Furusawa, M. et al. Nature 1974 ; 249 : 449)等の天然由来の膜を利用することができるが、このうち、リポソームが好ましい。というのは、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターに特別な処理を施すこととなくそのまま用いてリポソーム中に封入することができ、また、ヒトに存在する脂質またはヒトの体内で代謝される脂質をリポソーム形成原料として用いれば、カルポニン遺伝子導入後にリポソームは代謝されて無害となる利点を有するからである。リポソ−ムを形成する原料としては、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)、N-［1-(2,3- ジオレイロキシ)-プロピル］-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)、ジラウロイルフォスファチジルコリン(DLPC)、ジオレオイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DOPE)、ジラウロイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DLPE)、ジミリストイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DMPE)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(DOPC)、ジミリストイルフォスファチジルコリン(DMPC)、N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメ−トクロライド(TMAG)等の脂質、およびこれらの混合物をあげることができる。これらの脂質は、カルポニン遺伝子DNAやカルポニン遺伝子を含む組換えベクターDNAに障害を与えることなく、これらDNAを効率よく取り込める十分な内容積を持つ大きな一枚膜リポソームを(LUV)を形成するので好ましい。例えば、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)とジオレオイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DOPE)の1：1(w/w)の混合物(Felgner, D. L. et al. Lipofection : A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure Proc. Natl. Acad. Sci.1987 ; 84 : 7413)やN-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメ−トクロライド(TMAG)とジラウロイルフォスファチジルコリン(DLPC)とジオレオイルフォスファチジルエタノ−ルアミン(DOPE)の1：2：2 (mol/mol/mol)の混合物(Koshizaka, T. et al. J.Clin. Biochem. Nutr. 1989 ; 7 : 185)等は、DNAを取り込むリポソームを形成することが知られている。上記脂質のうち、細胞毒性が低いことから、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)が特に好ましい。さらに、リポソームの表面にHVJ(Hemagglutinating virus of Japan)の糖タンパクを組み込み、あるいは共有結合させてたり、ポリエチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導入の効率が上がる。また、腫瘍細胞や平滑筋細胞へのターゲッティングの特異性を上げるために、腫瘍細胞や平滑筋細胞表面に特異的な抗体や受容体リガンドをリポソームに組み込み、あるいは共有結合させてもよい。
【００１３】
カルポニン遺伝子やカルポニン遺伝子を含む組換えベクターは、当業界の熟練者によく知られている技術を用いて、上記のような膜の中に封入することができる。例えば、Danos, O. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988 ; 85 : 6460、またはVenkatesh, L. K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990 ; 87 : 8746に記載の方法に準じてカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターをウィルスキャプシド中に封入することができる。また、カルポニン遺伝子やカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを合成膜の中に封入するためには、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを、上記のような脂質、および、水、Hepes緩衝生理食塩水(150mM NaCl/20mM Hepes.pH7.4)、トリス−塩酸緩衝液等と混合し、攪拌すればよい。さらに、、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを合成膜の中に封入する際に、ポリエチレングリコール、植物レクチン等を添加してもよい。本発明の抗癌剤において、カルポニン遺伝子と膜の比率、および、カルポニン遺伝子を含む組換えベクターと膜の比率は、カルポニン遺伝子の所望の発現量が得られるように選択されるが、膜の中にカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターが10〜50重量% の割合で含まれることが好ましい。
【００１４】
本発明の抗癌剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内投与等の全身投与の他に、癌原発巣に対して、または、癌種に対応した予想転移部位に対して、局部注射、局部塗布、経口投与、経皮投与等の局所投与を行うことができる。さらに、本発明の抗癌剤の投与にあたっては、カテーテル技術、遺伝子導入技術または、外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることもできる。
【００１５】
有効成分である、任意に膜内に封入されたカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを医薬的に許容できる賦形剤とともに医薬組成物として、従来の製剤上の慣用技術に従って、製剤化することができる。医薬的に許容できる賦形剤としては、希釈剤、充填剤、滅菌した水性媒体および種々の無毒性有機溶媒を挙げることができる。また、この医薬組成物に、製剤上許容しうるもの、例えば、安定剤、緩衝剤、等張剤を適宜組み合わせ、あるいは選択して添加することができる。ここで、安定剤の例として、グルコース、マンニトール等の糖類、グリシンなどのアミノ酸類、HSA、BSA、あるいはゼラチン等が、緩衝剤の例として、トリス緩衝剤、PBS緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、あるいはHEPES緩衝剤等が、等張剤の例として、塩化ナトリウムなどの塩類、グルコース、マンニトール等の糖類があり、これらの水溶液に有効成分を溶解、もしくは懸濁した製剤を用いることができる。また、遺伝子導入の効率をあげるために、ポリエチレングリコールやDMSO等を添加することもできる。
【００１６】
カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封入することなく用いる場合には、リン酸カルシウム共沈法(Graham, F.L .et  al. Virology 1973 ; 52 : 456)、DEAE-デキストラン法(McCutchan, J. H. et al. J. Natl. Cancer Inst. 1968 ; 41 : 351)等を用いたインビボ(in vivo)トランスフェクションを局部に適用したり、または、カルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを局所血管内などに適用することにより、カルポニン遺伝子を腫瘍細胞、あるいは、血管平滑筋細胞などの正常細胞内に導入することができる。また、カルポニン遺伝子やカルポニン遺伝子を含む組換えベクターを膜の中に封入して用いる場合には、静脈内への注入により、カルポニン遺伝子を腫瘍細胞あるいは血管内皮などの正常細胞内に導入することができる。
【００１７】
本発明の抗癌剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、一般に、成人では一日当たりカルポニン遺伝子の重量にして、約20mg〜600mgの範囲が適当である。
本発明の抗癌剤は哺乳類の平滑筋細胞に存在するカルポニンをコードする遺伝子を有効成分とすることから、毒性が低く安全性が高いと考えられる。また、カルポニン遺伝子を平滑筋培養細胞に導入することによって、c-フォス(c-fos)のようなプロトオンコジ−ンの発現を抑制することも知られていることから、本発明の抗癌剤は発癌性の点においても安全性が高いと考えられる。さらに、本発明の抗癌剤はカルポニン遺伝子またはカルポニン遺伝子を含む組換えベクターをリポソーム等の膜の中に封入することにより、細胞毒性がさらに低減される。
本発明を、以下の実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
【実施例】
Ａ．癌細胞に直接カルポニン遺伝子を導入した場合の造腫瘍性低減効果の確認試験
【００１９】
１．ヒトカルポニンcDNAのクロ−ニング
日本人の肝臓癌患者（男子、54才）のヒト大動脈より、Chirgwin(Chirgwin, J. M. et al. Biochemistry 1977 ; 18 : 5294 - 5299)らの方法に従いRNAを単離し、精製した。さらにこのRNAからオリゴテックスTM−dT30<Super>（カタログ番号9021B,宝酒造社製）を用いてpoly(A)+RNAを精製した。poly(A)+RNA から、ZAP-cDNA 合成キット（カタログ番号200400,ストラタジ−ン社製）とギガパックR Iゴ−ルド（カタログ番号200216,ストラタジ−ン社製）を用いてヒト大動脈λZAPR-cDNAライブラリ−を作成した。このライブラリ−からの組換え体をナイロンメンブレンフィルタ−HybondTM-N+ （カタログ番号RPN.137B,アマシャム社製）にプレ−トし、ニワトリカルポニンcDNA(Takahashi, K. and Nadal-Ginard, B.  J. Biol. Chem. 1991 ; 266 : 13284 - 13288)をプロ−ブとして、プラ−クハイブリダイゼ−ションをおこない陽性クロ−ンを得た。陽性クロ−ンをf1ヘルパ−ファ−ジR408,VCSM13で感染させることによって、pBluescript SK-(Takahashi, K. et al. Japanese Circulation Journal 1992 ; 56 supplement1: 40)にサブクロ−ニングし、そのなかで最長のクロ−ンを選択し、pBluescript SK-hCNとした。これをシ−クエネ−スR  Version 2.0 DNA シ−クエンシングキット（カタログ番号70781, USB社製）を用いてシ−クエンスした。得られたヒトカルポニンcDNAの塩基配列は、配列表の配列番号１に示す。
【００２０】
２．組換えベクターpcDL-SRa296/hCNの構築
上記１．で調整したpBluescript SK- hCNを制限酵素EcoRI および Kpn I（ベーリンガーマンハイム社製）で消化し、約1300bpのヒトカルポニンcDNA断片を0.8%アガロ−スゲル電気泳動により分離し、プレップ−A−ジ−ン DNA精製キット（カタログ番号732-6010,バイオラッド社製）を用いて精製した。このDNA断片を、同じ制限酵素で処理したプラスミドpcDL-SRα296(Takebe, Y. et al. Molecular and Cellular Biology 1988 ; 8 466 -472)とT4 DNAリガ−ゼを用いてライゲ−トした。この反応液を用いてE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換株培養液よりプラスミドを精製して、制限酵素EcoRI および Kpn Iで処理したところ、この消化によってヒトカルポニンcDNA約1300bpを含む断片と、pcDL-SRα296プラスミドの断片を生じることから、目的のプラスミドであることが確認された。
図１にヒトカルポニンcDNAを含む組換えベクターpcDL-SRα296/hCNの制限酵素地図を示す。組換えベクターpcDL-SRα296/hCNの大きさは約4.7kbである。
【００２１】
３．B16メラノーマ細胞へのカルポニン遺伝子のトランスフェクション
上記２で得られた組換えベクターを、リポフェクション法により、マウスB16メラノーマ細胞の低転移株B16G6 (Tanaka  H. et al. Cancer Research 1988; 48: 1456-1459)に導入した。
上記２．で構築した発現ベクターpcDL-SRα296/hCN 30μｇとpSV-neo 耐性プラスミド３μｇをHepes 緩衝生理食塩水250μlに溶解した。これとは別に、N-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェート(DOTAP)(ベーリンガーマンハイム社製)(1 mg/ml) 70 μl をHepes 緩衝生理食塩水で希釈し250 μl とした。これら両溶液500μl を混合し室温で20分以上インキュベートすることにより、pcDL-SRα296/hCNAをリポソーム中に封入した粒子を得た。さらに10％血清を含むDMEM培地14mlを加えて混合した後、B16 メラノーマ細胞の培養容器に加え、37℃で18時間培養を行った。10％血清を含むDMEM培地を加え、さらに48時間培養を継続した。継代(1:40)した後、カルポニン遺伝子を組み込んだマウスB16G6 メラノーマのサブクローンをゲネテシン500μg/mlを培地に加え選択した。
【００２２】
４．トランスフェクションした細胞の造腫瘍性
上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかのサブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現したサブクローンhCN:8-3とhCN:2-1の1x106個をC57BLマウスの皮下に移植し、経日的（16日後、22日後、28日あるいは29日後）に腫瘍の生着と腫瘍経の大きさを測定した。対照として、トランスフェクトしていないB16G6細胞を移植した。
その結果を図３の写真に示す。この結果を数値化し、まとめたものを表１に示す。対照群では16日目で既に全例のマウスで腫瘍の生着が認められるのに対し、8-3クローン移植群では全く腫瘍の生着を認めず、2-1クローン移植群では６匹中１匹に腫瘍の生着を認めただけであった。28日あるいは29日後でも8-3クローン移植群は５匹中２匹に、2-1クローン移植群では６匹中３匹に腫瘍の生着を認めただけであった。さらには腫瘍の大きさも対照群に比較してこれら二つのクローン移植群では有意に低下していた。
【００２３】
【表１】
0003713290.tif 000002
【００２４】
５．トランスフェクションした細胞の転移能
試験例１
上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかのサブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現したサブクローンhCN:8-3とhCN:2-1の1x106個をC57BLマウスの尾静脈内に移植した。対照として、トランスフェクトしていないB16G6を同じ細胞数でC57BLマウスの尾静脈内に移植した。21日間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたB16G6の結節を計測し、対照群と比較した。その結果を図４の写真に示す。この結果を数値化し、まとめたものを表２に示す。対照群では転移形成が認められたが、8-3、2-1両クローン移植群では有意な転移結節数の低下を認めた。
【００２５】
【表２】
0003713290.tif 000003
【００２６】
試験例２
上記３でトランスフェクションしたB16G6のいくつかのサブクローンのうちヒトカルポニン遺伝子産物を高発現したサブクローンhCN:8-3の1x106個をC57BLマウスの尾静脈内に移植した。対照として、ヒトカルポニン遺伝子を含まない発現ベクターpcDL-SRα296 をトランスフェクトしたB16G6を同じ細胞数でC57BLマウスの尾静脈内に移植した。21日間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたB16G6の結節を計測し、対照群と比較した。その結果を表３に示す。対照群では転移形成が認められたが、8-3クローン移植群では有意な転移結節数の低下を認めた。
【００２７】
【表３】
0003713290.tif 000004
【００２８】
Ｂ．カルポニン遺伝子を静脈内投与した場合の転移抑制効果の確認試験
１．ヒトカルポニンcDNAのクロ−ニング
上記のビトロ試験Ａの１と同様にして、ヒトカルポニンｃＤＮＡをクローニングし、pBluescript SK-hCNを得た。
【００２９】
２．組換えベクターpCAGGS/hCNの構築
上記１．で調整したpBluescript SK- hCNのヒトカルポニンcDNA5'側にXho I制限酵素部位を挿入するために、このプラスミドを制限酵素Sam I（ベーリンガーマンハイム社製）で直線化し、アニーリングしたXho Iリンカー（ベーリンガーマンハイム社製）とT4 DNA リガーゼ（宝酒造社製）を用いてライゲートした。この遺伝子を導入し発現させるために用いたベクタ−の構築は下記のようにしておこなった。この反応液を用いてE.coli DH5α株（ライフテクノロジー社より入手）を形質転換し、形質転換株培養液よりプラスミドを精製して、制限酵素Xho Iで処理したところ、Xho I消化によってヒトカルポニンcDNA 1522bpを含む断片と、pBluescript SK-プラスミドの断片を生じることから、目的のプラスミドであることが確認された。
【００３０】
次に、このプラスミドを制限酵素XhoIで処理し、0.8%アガロ−スゲル電気泳動により配列番号1に示されたヒトカルポニンcDNA1522bpを含む断片を分離し、プレップ−A−ジ−ン DNA精製キット（カタログ番号732-6010,バイオラッド社製）を用いて精製した。このDNA断片を、制限酵素Xho Iで処理したプラスミドpCAGGS(Niwa, H. et al.  Gene 1991 ; 108 : 193 - 200)とT4 DNAリガ−ゼを用いてライゲ−トした。この反応液を用いてE.coli DH5α株を形質転換し、形質転換株培養液よりプラスミドを精製して、ヒトカルポニンcDNAの挿入及びプロモーターに対するヒトカルポニンcDNAの方向性を確認するために、制限酵素Xho I及びPst I（ベ−リンガ−マンハイム社製）で処理したところ、Xho I消化によってヒトカルポニンcDNA 1522bpを含む断片、及びPst I消化によりヒトカルポニンcDNA 3'側とラビットb-グロビン3'隣接領域を含む約1270bpの断片を生じることから、ヒトカルポニン発現のための組換えベクターであるプラスミドpCAGGS/hCNであることが確認された。プラスミドpCAGGS/hCNを組み込んだ大腸菌DH5αをEscherichia coli DH5α(pCAGGS/hCN)と命名して、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６年８月31日に寄託した（受託番号：FERM BP-4789）。
【００３１】
図２にヒトカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCNの制限酵素地図を示す。組換えベクターpCAGGS/hCNの大きさは約6.5kbである。
【００３２】
３．カルポニン遺伝子による遺伝子治療剤の調製
上記２．で構築した発現ベクタ−を効率よく個体内に導入するために、発現ベクタ−のリポソ−ムによる被覆をおこなったが、その調製方法は下記のとおりであった。
【００３３】
上記２．で構築した発現ベクタ−pCAGGS/hCN 100μgをHepes緩衝生理食塩水100μlに溶解した。この溶液とN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)（ベ−リンガ−マンハイム社製）(1mg/ml) 200μlを混合し室温で20分以上インキュベ−することにより、pCAGGS/hCNをリポソ−ム中に封入した粒子を得た。
また、対照実験のために、上記２．で構築した組換えベクタ−pCAGGS/hCN の代わりにプラスミドpCAGGSを用いて、上記の操作を繰り返すことにより、プラスミドpCAGGSをリポソ−ム中に封入した粒子を得た。
【００３４】
４．カルポニン遺伝子による癌転移抑制効果
試験例１
マウスの腫瘍であるB16メラノーマより選択されたB16高転移株B16G10 (Tanaka et al.Cancer Reserch 48  1456-1459, 1998)を使用した。癌転移抑制作用の評価はFidlerらの方法に従って行った（Poste, G and Fidler, I.J., Nature 1980 ; 283; 1329-145) 。C57BLマウス（8〜12週令、メス）に組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、リポソーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を投与した。一週間飼育を行った後、フラスコ内で増殖させたB16G10 をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりはがし、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり1x106個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス尾静脈より移植し、さらに21日間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたB16G10の結節を計測し、対照群と比較した。その結果を図５および表４に示す。組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では著明な転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を抑制していることが確認できた。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
試験例２
C57BLマウス（8〜12週令、メス）に組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を300μl尾静脈より投与した。対照として、リポソーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同量投与した。一週間飼育を行った後、フラスコ内で増殖させたB16G10 をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりはがし、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり1x106個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス尾静脈より移植し、さらに21日間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたB16G10の結節を計測し、対照群と比較した。その結果を表５に示す。組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では著明な転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を抑制していることが確認できた。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
試験例３
マウスの肝細胞癌であるG5F5を用いてヒトカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN の転移抑制効果を検討した。癌転移抑制作用の評価はFidlerらの方法に従って行った。C57BLマウス（8〜12週令、メス）に組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、リポソーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同量投与した。三日間飼育を行った後、フラスコ内で増殖させたG5F5をトリプシン・EDTA溶液で培養容器よりはがし、この細胞をPBS溶液で生細胞として1mlあたり2x107個となるように懸濁した。この細胞液の0.1mlをマウス尾静脈より移植した。腫瘍細胞移植一週間後、二週間後にさらに、組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子、または、組換えベクタ−pCAGGS/hCN のみを300μl尾静脈より投与した。対照として、リポソーム化試薬であるN-［1-(2,3- ジオレオイロキシ)-プロピル］-N,N,N- トリメチルアンモニウムメチルサルフェ−ト(DOTAP)を同量投与した。さらに一週間飼育した後、開胸して肺を摘出し、肺表面に形成されたG5F5の結節を計測し、対照群と比較した。組換えベクタ−pCAGGS/hCN をリポソーム中に封入した粒子を投与した群では著明な転移結節数の減少が認められ、ヒトカルポニンcDNAを含む組換えベクターpCAGGS/hCN は肺への癌転移を抑制していることが確認できた。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の抗癌剤により、癌細胞の造腫瘍性を低下させ、転移能を減弱させることができる。従って、本発明の抗癌剤は、癌の治療および予防、特に癌転移の抑制に極めて有効である。
【００４０】
【配列表】
【００４１】
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0003713290.tif 000008
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【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトカルポニンcDNAを組込んだ発現ベクタ−であるpcDL-SRα296/hCNのプラスミドの構造を示す図である。
【図２】図２は、ヒトカルポニンcDNAを組込んだ発現ベクタ−であるpCAGGS/hCNのプラスミドの構造を示す図である。
【図３】図３は、ヒトカルポニン遺伝子を導入することにより形質転換したB16メラノーマ細胞の造腫瘍性を示す生物の形態の写真である。
【図４】図４は、ヒトカルポニン遺伝子を導入することにより形質転換したB16メラノーマ細胞の転移能を示す生物の形態の写真である。
【図５】図５は、B16 メラノーマ細胞の実験的転移に対するヒトカルポニン遺伝子による遺伝子治療の結果を示す生物の形態の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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