(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM P-18203である過酸化水素耐性能を持ち高い過酸化水素分解活性を有するイグジォバクテリウム(Exiguobacterium)属・T-2-2細菌株。
【請求項２】
イグジォバクテリウム(Exiguobacterium)属に属し、過酸化水素耐性を持ち高い過酸化水素分解活性を有する微生物の菌体そのものを過酸化水素を含む液体と接触させることを含む過酸化水素の分解法。
【請求項３】
イグジォバクテリウム(Exiguobacterium)属に属し、過酸化水素耐性を持ち高い過酸化水素分解活性を有する微生物から得られた細胞抽出液を過酸化水素を含む液体と接触させることを含む過酸化水素の分解法。
【請求項４】
イグジォバクテリウム(Exiguobacterium)属に属し、過酸化水素耐性を持ち高い過酸化水素分解活性を有する微生物の培養液を過酸化水素を含む液体と接触させることを含む過酸化水素の分解法。
【請求項５】
細菌の菌体タンパク質当たりの過酸化水素分解活性が、5000U/mgタンパク質以上である請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細菌の菌体タンパク質当たりの過酸化水素分解活性が、10000U/mgタンパク質以上である請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物菌体および微生物産生酵素による強力な過酸化水素含有廃水中の過酸化水素の除去法に関するものである。過酸化水素は、半導体産業界においては半導体ウエハーのエッチング、洗浄に用いられている他、繊維の晒しの工程、紙の漂白、脱墨、食品工業においては無菌充填関連プラントの殺菌、洗浄等に広く使用されてきた。本発明による過酸化水素処理法により上記産業廃水中の過酸化水素の処理が極めて高効率に行うことが可能である。
【０００２】
【従来の技術】
過酸化水素は産業界において広く使用されているが、使用後廃水中に高濃度に含まれる。過酸化水素の分解法としては、水による希釈、貝殻等を利用した曝気法、オガクズを利用した生物処理法などの対策がとられてきたが、何れも広大な処理設備を必要としたり、速度が遅い等の問題点があり、有効な方法とは言いがたいものであった。重亜硫酸ナトリウム等の還元剤と接触させる方法があるが、過酸化水素濃度を分析し当量を添加添加しなければならないことと、過剰に添加した場合還元剤が残留する欠点があり、汎用性、操作性の点で問題があり必ずしも有効な方法とは言いがたい。一方カタラーゼによる酵素法による過酸化水素の分解は、方法自体において汎用性、操作性、効率の面でも非常に優れた方法ではあるが、唯一の問題としてコストが高く、必ずしも幅広い業界で使用し得るものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在、産業界で使用されているカタラーゼは細菌の一種であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  （ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、カビの一種であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ由来のものである。これらの生物種から得られるカタラーゼは比較的温度安定性には優れているが、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ以外のものはあまり酵素一分子あたりの活性が高くない。従って現在のカタラーゼの価格はカタラーゼという酵素をより広く産業界で使用可能なほど低価格ではない。そこで本発明においては酵素活性ユニット当たりのコストを下げることを目的としている。
本発明は、このような観点からなされたものであり、カタラーゼの酵素活性ユニット当たりのコストを下げることを可能にする微生物を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前述した課題を解決するために、本発明においては従来知られているカタラーゼよりも細胞抽出液のカタラーゼの比活性および総カタラーゼ活性量が高い特徴を持つ微生物菌体そのものもしくは細胞抽出液を直接廃水中の過酸化水素除去に使うことにより、酵素精製にかかるコストをおさえることが可能であると伴に酵素活性の面のみにおいても酵素活性ユニット当たりのコストを下げることが可能であることを見いだした。
【０００５】
即ち、本願第１の発明は、イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、強度の過酸化水素分解活性を示す菌株を培養し、得られた菌体を直接過酸化水素含有廃水中に投入し、過酸化水素を分解する方法であり、本願第２の発明はイグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、強度の過酸化水素分解活性を示す菌株を培養し、得られた菌体を物理的あるいは化学的に処理して得られる菌体抽出物を直接過酸化水素含有廃水中に投入し、過酸化水素を分解する方法である。
【０００６】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）  過酸化水素耐性能を持ち高い過酸化水素分解活性を有するイグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属・Ｔ−２−２細菌株、
（２）  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２０３である（１）の細菌株、
（３）  イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、過酸化水素耐性を持ち高い過酸化水素分解活性を有する微生物の菌体そのものを過酸化水素を含む液体と接触させることを含む過酸化水素の分解法、
（４）  イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、過酸化水素耐性を持ち高い過酸化水素分解活性を有する微生物から得られた細胞抽出液を過酸化水素を含む液体と接触させることを含む過酸化水素の分解法、
（５）  イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、過酸化水素耐性を持ち高い過酸化水素分解活性を有する微生物の培養液を過酸化水素を含む液体と接触させることを含む過酸化水素の分解法、
（６）  細菌の菌体タンパク質当たりの過酸化水素分解活性が、５０００Ｕ／ｍｇタンパク質以上である（３）〜（５）のいずれかの方法、及び
（７）  細菌の菌体タンパク質当たりの過酸化水素分解活性が、１００００Ｕ／ｍｇタンパク質以上である（３）〜（５）のいずれかの方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、過酸化水素耐性能を有し高い過酸化水素分解活性を有するイグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌株であり、イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属・Ｔ−２−２株が挙げられる。
またこれらの菌株の変種又は変異株でもよい。
【０００８】
過酸化水素耐性能を有し高い過酸化水素分解活性を有するイグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌株は、菌株を過酸化水素を含有する条件下で培養し増殖することを指標に、さらにその菌体そのもの又は菌体抽出液を、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する活性を指標に選択することができる。過酸化水素耐性は、例えば培養した菌株液に一定濃度の過酸化水素を添加し、一定時間後の生菌数をカウントすることにより試験することができる。過酸化水素を分解する活性は通常行われているカタラーゼの活性測定法により行うことができる。例えば、菌体を破壊し遠心分離により未破壊の菌体を取り除いた菌体抽出液を適当な緩衝液を混合した過酸化水素溶液と混合し、分光光度計により過酸化水素濃度の減少を測定することにより、過酸化水素を分解する活性を調べることができる。過酸化水素を分解する活性は、例えば２０℃にて１分間に過酸化水素を１μｍｏｌ分解する活性を１単位（１Ｕ：ユニット）として表すことができる。菌体抽出液中の単位タンパク質当たりの過酸化水素を分解する活性を比較することにより所望の細菌株を得ることができる。さらに一定数の細菌中からの菌体抽出液中の全活性量（Ｓ活性値）によって選択し、所望の細菌株を得ることができる。
【０００９】
例えば、本発明の細菌株として菌体抽出液中のタンパク質１ｍｇ当たりの活性値が２０００Ｕを超えるものが好ましく、さらには５０００Ｕを超えるもの、特には１００００Ｕを超えるものが好ましい。
【００１０】
本発明のイグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）    Ｔ−２−２株は本発明者が北海道留萌市の食品加工場より分離した菌株であり、過酸化水素溶液に添加し過酸化水素を分解する活性を指標に選択した。その細菌学的性質は下記の通りである。
（１）形態学的特性
グラム染色：陽性
芽胞：無し
運動性：有
菌形：球桿菌
（２）培地における生育特性
色調；オレンジ色、形；円形、表面；平滑
（３）化学分類学的特性
主要なイソプレノイドキノン：メナキノン−７  （ＭＫ−７）
ＤＮＡのＧ＋Ｃ  ｍｏｌ％：４６．７
【００１１】
（４）生理・生化学的特性
オキシダーゼ試験：陽性
カタラーゼ試験：陽性
尿素分解：陰性
ＯＮＰＧ試験：陽性
硫化水素の産生：陰性
メチルレッド試験：陽性
ＶＰ試験：陰性
インドール産生：陰性
フェニルアラニンのデアミナーゼ試験：陰性
硝酸塩の還元：陰性
Ｎａ＋要求性：陰性
デンプン分解：陽性
ゼラチン分解：陽性
カゼイン分解：陽性
キチン分解：陰性
アルギン酸分解：陰性
エスクリン分解：陰性
Ｔｗｅｅｎ  ２０の分解：陰性
Ｔｗｅｅｎ  ２０の分解：陰性
Ｔｗｅｅｎ  ２０の分解：陰性
Ｔｗｅｅｎ  ２０の分解：陰性
各温度における生育
−１℃：−
４℃：＋
３０℃：＋
４０℃：−
【００１２】
以下の基質から酸を産生した。
Ｄ−フルクトース、Ｄ−マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、ラフィノース、マンニトール、Ｄ−セロビオース、グリセロール。
以下の基質から酸を産生しなかった。
Ｌ−アラビノース、シュークロース、Ｄ−キシロース、イノシトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、トレハロース、ラクトース。
【００１３】
本発明のイグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）    Ｔ−２−２株のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅して得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べ、その結果に基づき類似した塩基配列とアラインメントを取り近隣結合法により系統樹を作成したところ、イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属することが判明した。
イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）    Ｔ−２−２株は産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所にて平成１３年２月１３日付けにて、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２０３号として寄託されている。
【００１４】
本発明において使用するのに適した液体培地を以下に例示する。
カゼインペプトン            ８  ｇ
酵母エキス                  ３  ｇ
グルタミン酸ナトリウム      ５  ｇ
蒸留水                      １  Ｌ
ｐＨ  ７．５
【００１５】
本発明の細菌株は、過酸化水素を分解するのに用いることができる。特に過酸化水素含有廃水中の過酸化水素を分解するのに用いることができる。細菌そのものを過酸化水素を含む廃水に添加してもよいし、菌体抽出液を廃水に添加してもよい。また、細菌株の培養液を廃水に添加してもよい。さらに細菌株そのもの又は菌体抽出物を透析膜等の袋に収納してこの袋を廃水中に入れてもよい。この際、廃水の温度、ｐＨ等をカタラーゼの活性を保持する条件範囲に調整することが望ましい。例えば、温度は２０〜５０℃が望ましく、ｐＨは６〜１０が望ましい。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１  細胞抽出液を用いた過酸化水素分解試験
イグジォバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  Ｔ−２−２株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏ−ｌｙｔｉｃｕｓ）、シュードモナス  フローレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ），アエロモナス  ハイドロフィーラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アルカリゲネス  フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）をそれぞれ対数期後期から定常期まで同じスケールで培養し、遠心分離（１０，０００  ｘ  ｇ，  １５分）  で集菌後フレンチプレス（２０，０００  ｌｂ／ｉｎ２）  で菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離（１０，０００  ｘ  ｇ，  １５分）  することにより未破壊の菌体を取り除いた液を菌体抽出液とした。３０  ｍＭの過酸化水素溶液を５０  ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）中で調整し、この１  ｍｌを１  ｃｍ光透過の石英セルに入れ、反応基質としてして用いた、反応は粗酵素液（細胞抽出液）数μｌマイクロシリンジで投入することによって開始し、過酸化水素濃度の減少を分光光度計により２４０  ｎｍを経時的にモニターし、減少の初速度を見積もることによって活性値を計算した。反応は２０℃にて行った。活性の単位として１分間に過酸化水素を１μｍｏｌ分解する活性を１  Ｕ（ユニット）とした。
【００１７】
その結果、細胞抽出液中のタンパク当たりの活性値は以下の様な結果が得られた。
0003610373.tif 000002
【００１８】
次に細胞抽出液中の全活性量を見積もったところ以下の様な結果が得られた。
0003610373.tif 000003
【００１９】
【発明の効果】
（１）Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−２−２株より得られる細胞抽出液は一般的な細菌種の細胞抽出液と比較して２桁以上高いタンパク当たりの活性値を示したことから、細胞抽出液の投入量を大幅に低減出来る。
（２）Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−２−２株より得られる細胞抽出液は一般的な細菌種の細胞抽出液と比較して１桁以上高いＳ活性値を示したことから、酵素活性ユニット当たりのコストを下げることが可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔ−２−２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づく系統的位置。
【図１】
0003610373.tif 000004