(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインと結合し得る受容体であるＬＤＬ受容体関連蛋白質を、ミッドカインと結合させる方法であって、ヒトの生体内において行う場合を除く、前記方法。
【請求項２】
ミッドカイン依存性の細胞生存を抑制するために、ＬＤＬ受容体関連蛋白質との結合活性を有するヘパリン、ＥＤＴＡ及びＲＡＰ（受容体関連蛋白質）からなる群から選択された物質を添加することを特徴とする、ミッドカイン依存性の細胞生存を抑制する方法であって、ヒトの生体内において行う場合を除く、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミッドカインと結合し得る受容体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ミッドカインは、軸索の生存を促進し、好中球と神経細胞との遊走を促進し、胎児神経細胞や表皮細胞のフィブリノーゲン分解活性を有する、ヘパリン結合性の成長因子である。
これらの活性に対応するミッドカインの信号系は、ほとんど理解されていない。二つのクラスのトランスメンブランプロテオグリカンが、ミッドカインに対して高い親和性をもって結合することが知られている。即ち、シンデカンおよび受容体チロジンフォスファターゼζである。本発明者は、以前に、受容体チロジンフォスファターゼζが、ミッドカインに媒介された神経細胞の遊走に係わっていることを示している[Maede et al.  (J. Biol. Chem.) 274, 12474- 12479 (1999)] 。ヘパリン硫酸塩プロテオグリカンのヘパリン様ドメインを認識することも、ミッドカインによって促進される軸索細胞の生存と、表皮細胞中のフィブリノーゲン分解活性の促進とに対して重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらのプロテオグリカンが、ミッドカインによって伝達される信号のトランスダクションに対して充分であるかどうかを結論できる段階ではない。プロテオグリカンは、ミッドカインからの信号の一部を受容しているらしいが、信号の他の部分は他の物質が受容しているかもしれない。
【０００４】
本発明の課題は、ミッドカインに対して結合し、ミッドカインからの信号を伝達する活性を有する細胞表面の分子（受容体蛋白質）を同定することである。
【０００５】
また、本発明の課題は、この同定した受容体蛋白質を利用し、ミッドカインからの信号伝達を促進して、ミッドカイン依存性の細胞生存を促進する方法、およびミッドカインからの信号伝達を阻害することによって、ミッドカイン依存性の細胞生存を抑制する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ミッドカインに対して結合する細胞表面の受容体蛋白質を同定するために、レクチンアフィニティークロマトグラフィーとミッドカインアフィニティークロマトグラフィーとを組み合わせて使用してみた。なぜなら、これまでのところ同定されてきたトランスメンブレン蛋白質はプロテオグリカンに属しており、従って今回検出しようとする受容体も、幾らかはレクチンに結合するのではないかと期待したからである。
【０００７】
この結果、本発明者は、ミッドカインが、約５００ｋＤａの低分子量リポ蛋白質（ＬＤＬ）受容体関連蛋白質に結合することを発見した。この蛋白質は、Herz et al. (EMBO J.） 7, 4119- 4127 (1988) およびKieger et al. (Annu. Rev.Biochem. ) 63, 601-637 (1994) に記載されているものである。
【０００８】
なお、ＬＤＬ受容体関連蛋白質自体は、前述の論文等に記載されている固有名詞であり、一種類の蛋白質を示すものとして当業界において周知慣用であり、複数のＬＤＬ受容体関連蛋白質のうちの一つを示すものではない。ＬＤＬ受容体関連蛋白質は、５００ｋＤａの細胞膜蛋白質であり、ＬＤＬ受容体と類似の構造を有しており、α２−マクログロブリン結合能がある。この結合にはカルシウムイオンが必要である。
【０００９】
このように、約５００ｋＤａのＬＤＬ受容体関連蛋白質がミッドカインからの信号伝達を担うことを解明したことにより、ミッドカイン依存性の細胞の生存促進の制御が可能となる。実際に、本発明者は、約５００ｋＤａのＬＤＬ受容体関連蛋白質との結合活性を有する物質、例えばＲＡＰを使用することによって、ＬＤＬ受容体関連蛋白質のミッドカインとの結合を阻害し、ミッドカイン依存性の細胞の生存を阻止できることを実証した。また、これと同じ原理に基づいて、約５００ｋＤａのＬＤＬ受容体関連蛋白質との結合活性を有する物質を系から除去することによって、ミッドカインとＬＤＬ受容体関連蛋白質との結合を促進し、これらの間の信号伝達を促進し、これによってミッドカイン依存性の細胞の生存を促進することができる。
【００１０】
約５００ｋＤａのＬＤＬ受容体関連蛋白質との結合活性を有する物質としては、後述のＲＡＰ（受容体関連蛋白質）、ヘパリン、ＥＤＴＡなどを例示できる。また、ミッドカインに細胞の生存を依存する細胞としては、神経細胞（ニューロン）、大腸ガン細胞、ウィルムス腫瘍細胞をはじめとする各種の上皮性腫瘍細胞（胃ガン、子宮ガン、肺ガンなどの癌細胞を含む）が挙げられる。
【００１１】
【実施例】
（ミッドカイン）
組み換え体ヒトミッドカインを酵母菌（pichia  pastoris GS 115)中で発現させ、精製して均一にした。製造者のインストラクションに従って、８ｍｌのＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）へと４０ｍｇのミッドカインを結合させることによって、ミッドカイン−寒天を調製した。
【００１２】
（ミッドカインおよびリチナス  コミュニス  アグルチニン（ＲＣＡ）への結合活性を有する糖蛋白質の分離）
３０匹の妊娠したマウスから得た１３日齢のマウス胎児（約６５ｇ）を、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニル  フルオリド（ＰＭＳＦ）とプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（５０ｍｌに１錠）とを含有するｐＨ７．５の１０ｍＭのトリス−塩酸３００ｍｌ（緩衝液Ａ）中でホモジナイズさせた。このホモジネートを、０．５Ｍのショ糖、０．１ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのｍｇＣｌ２および２ｍＭのＣａＣｌ2 を含有する等量の緩衝液Ａと混合した。この混合物を、８００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで８０００×ｇで１０分間遠心分離して核蛋白質およびミトコンドリアフラクションを除去し、上澄み液を１１００００×ｇで１．５時間４℃で超遠心分離した。８ｍＭのＣＨＡＰＳ、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．１Ｍのショ糖中を含有する緩衝液Ａ１５０ｍｌによって、この錠剤を４℃で２時間抽出した。この抽出物を、再び１１００００×ｇで１時間超遠心分離した。この上澄み液を、０．２ＭのＮａＣｌを含有する８ｍＭのＣＨＡＰＳ（緩衝液Ｂ）を含むｐＨ７．５の１０ｍＭのトリス塩酸によって平衡状態とされたＱセファロースファーストフロフーカラム（６ｍｌ）へと適用した。このカラムを、０．５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ｂ１０カラム容量を用いて溶出させた。上記した手順を４回繰り返し、１３０匹の妊娠したマウスからの胎児から得た材料を合わせた。吸収されていないフラクションと、０．５Ｍ  ＮａＣｌによって溶出したフラクションとを合わせ、ＲＣＡ１２０−寒天のカラムへと適用した（豊年株式会社、日本国、１×１２．８ｃｍ）。このカラムは、０．１５ＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＣＨＡＰＳおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含有するｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を用いて平衡状態にした。これと同じ緩衝液によって洗浄した後に、結合した糖蛋白質を、０．１Ｍのラクトースを含有する同じ緩衝液を用いて溶出させた。この溶出物を、２ｍｌのミッドカイン−寒天と混合し、４℃で終夜回転震とうした。次いで、これをカラム内へと充填し、０．１５ＭのＮａＣｌを含有する２０カラム容量の緩衝液Ｂによって洗浄し、２ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液Ｂ６カラム容量によって溶出させた。
【００１３】
（部分ペプチド配列の決定）
７％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質を分離した。クーマッシーブリリアントブルーによって軽く染色した蛋白質のバンドを切除し、ローゼンフェルド他が記載した方法と実質的に同様に、トリプシンによってゲル消化した（(Rosenfeld, J.  他 (Anal. Biochem.) 203, 173 - 179, (1992)) 。得られたペプチドを逆相カラム上で分離した。逆相カラム（Ｍｏｎｉｔｅｒ  Ｃ１８，  １×１５０ｍｍ）は、アセトリトリルの濃度が直線的に傾斜しており、０．１％のＴＦＡを５０μ／分の流速で流し、「ＭＡＧＩＣ  ２００２」を用いた。得られたペプチドのアミノ酸配列の分析を、「４９４Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ」（アプライドバイオシステムズ社）を用いて実施した。
【００１４】
（ＬＤＬ受容体関連蛋白質および受容体関連蛋白質（ＲＡＰ））
ＬＤＬ受容体関連蛋白質を冷凍ヒト胎盤から分離した（Ashcom, J. D. 他 (J. Cell Biol. )110、1041-1048 (1990)：Moestrup, S. K. 他,(J. Biol. Chem.)265, 12623-12628 (1990))。受容体関連蛋白質( ＲＡＰ)/ＬＤＬ受容体関連蛋白質と関連するヘパリン結合蛋白質−44を、ヘパリン−寒天カラムを通すことによって除去した。ＲＡＰのないＬＤＬ受容体関連蛋白質を、クロラミンＴ法によって125 Ｉ標識した。簡単に言うと、１０μｇの精製ＬＤＬ受容体関連蛋白質を、Ｎａ125 Ｉによって１分間４℃でクロラミンおよびＰＢＳの存在下にインキュベートした。次いで、重メタ炭酸ナトリウムによってこの反応を停止させ、脱塩クロマトグラフィーをＰＤ−１０カラムに基づいて実施した（ファルマシア  バイオテック社）。こうして調製した特定の試料の放射線活性は１．２×１０8 ｃｐｍ／μｇ）であった。
【００１５】
ヒトミッドカインに対する125 Ｉ−ＬＤＬ受容体関連蛋白質の結合を測定した。この測定においては、「ｐｒｏ−ｂｉｎｄ」アッセイプレートのウエルに５０μｌの５μｇ／ｍｌのヒトミッドカインのｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸溶液を４℃で終夜コートした。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲＡＰ有効蛋白質を製造し、精製する前に、マウスＲＡＰ／ＨＢＰ−４４の暗号領域を発現ベクター（ｐｐｍ比ＧＥＸ−５Ｘ１）へと挿入した。１７日齢のマウス胎児の能皮質からの神経細胞のミッドカイン依存性の生存に対する、ＧＳＴ−ＲＡＰの作用を測定した。
【００１６】
ブラッシン／メガリンを、ＩＣＲマウスの腎臓の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−可溶化膜フラクションから、ＲＣＡ−寒天およびＧＳＴ−ＲＡＰ−寒天アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００１７】
（結果）
ミッドカインへの結合能力を有するＲＣＡ結合糖蛋白質を、ＲＣＡ−寒天およびミッドカイン−寒天についてのアフィニティークロマトグラフィーによって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、これらの蛋白質は幾つかのバンドに分離された（図１）。各バンドの部分ペプチド配列の決定の結果、ほとんどの同定が可能になった（表１）。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
これらの中では、ＬＤＬ受容体関連蛋白質（前述のＨｅｒｚ他）と神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）はトランスメンブレン糖蛋白質である。エンタクチンは、細胞結合活性を有する細胞外糖蛋白質である。エンタクチン−２は関連蛋白質である。アクチン、チューブリンおよび熱衝撃蛋白質９０β／ＨＳＰ８４は糖蛋白質ではなく、トランスメンブレン糖蛋白質の細胞質性のテイルと関連しているように見える。
【００２０】
本ＬＤＬ受容体関連蛋白質は、ＬＤＬ受容体類に属している。この類はエンドサイトーシス受容体であるけれども、最近の研究によれば、少なくともこれらのうち幾つかは信号受容体として機能する。超低密度リポ蛋白受容体（ＶＬＤＬＲ）およびアポリポ蛋白質Ｅ受容体２（ＡｐｏＥＲ２）は、リーリンに対する受容体であり、神経細胞の遊走を制御している。従って、我々は、本ＬＤＬ受容体関連蛋白質が、ミッドカインに対する信号受容体の成分として機能している可能性を調査した。
【００２１】
固相アッセイに際して、125 Ｉ−標識したＬＤＬ受容体関連蛋白質は（ヒト胎盤から分離したもの）は、ミッドカインと、３．５ｎＭの解離定数で結合することを発見した（図２）。従って、ミッドカインの本ＬＤＬ受容体関連蛋白質に対する結合は、比較的に強いものである。この結合は、ヘパリンによって完全に阻害され、ＥＤＴＡによって強く阻害され、受容体関連蛋白質（ＲＡＰ）によって、容量依存的に阻害される（図３）。ＧＳＴ（５０μｇ／ｍｌ）は効果がなかった。ＲＡＰは、ＬＲＰの合成にく係わっており、その作用を阻害することが知られている。
【００２２】
次いで、我々は、ブラッシン／メガリンがミッドカインに同様の親和性をもって結合するかどうかを調査した。これらは、ＬＤＬ受容体に属する高分子量蛋白質である。ブラッシンの入手量が少量であったので、ミッドカイン−寒天に対するアフィニティークロマトグラフィーの点を調査した（図４）。このカラムからのＬＤＬ受容体関連蛋白質を完全に溶出させるのに、２０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．５ＭのＮａＣｌが必要であったけれども（レーン５、１０）、２０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．５ＭのＮａＣｌまたは０．３ＭのＮａＣｌ（レーン４）がこのカラムからのブラッシンの完全な溶出には充分であった。従って、ＬＤＬ受容体関連蛋白質は、ブラッシよりも強くミッドカインに結合している。
【００２３】
ミッドカインは、抗アポトーシス機構によって胎児の神経細胞の生存を促進する。この活性は、外部からＧＳＴ−ＲＡＰ融合蛋白質を添加することによって阻止されるように見えたが、しかしＧＳＴの添加によっては阻止されなかった（図５）。ミッドカインを添加しない神経細胞に対しては、ＧＳＴ−ＲＡＰも、ＧＳＴも、細胞死を促進しなかった。むしろ、これらは生存率を行く物高くする結果となった（図５）。この結果が示唆するところによれば、本ＬＤＬ受容体関連蛋白質は、ミッドカインの信号を受容し、神経細胞の生存を促進している。
【００２４】
本ＬＤＬ受容体関連蛋白質は、ＬＤＬ受容体複合体に密接に関連する５００ｋｄの膜蛋白質としてクローニングされており、多リガンドエンドサイトーシス受容体であることは示されている。そのリガンドには、α−マクログロブリン−プロテアーゼ複合体、アポＥ−含有リポ蛋白質および幾つかのクーニック型プロテアーゼインヒビタードメインを有する蛋白質が挙げられる。本ＬＤＬ受容体関連蛋白質は、脳内において豊富に形質発現しており、アポＥ−依存軸索細胞の生存を媒体している。この機構は明らかになっていない。本ＬＤＬ受容体関連蛋白質の細胞質性のテイルは、二つのＮｐｘＹモチーフを含んでおり、ｍＤａｂ１と相互作用する。実際、ＬＤＬ受容体関連蛋白質の仲間の中で、本ＬＤＬ受容体関連蛋白質はｍＤａｂ１と相互作用することが最初に示された。
【００２５】
我々は、ミッドカインが本ＬＤＬ受容体関連蛋白質に結合し、ＲＡＰが、ミッドカインに依存する胎児神経細胞の生存を阻止することを発見した。神経細胞中の本ＬＤＬ受容体関連蛋白質の豊富さのために、我々は、上記の実験においてＲＡＰが本ＬＤＬ受容体関連蛋白質の機能を阻止するものと考えている。ＬＤＬ受容体関連蛋白質の変種がアルツハイマー症の発病に係わっているとの報告もあり、またミッドカインが患者の痴呆プラーク中に局在化しているとの報告もあるので、本発明はアルツハイマー症などの神経細胞の消失を伴う疾患の治療に有用であると考えられらる。特に軸索細胞の増殖，生存の確保に有効である。
【００２６】
また、ミッドカインは、表皮細胞のフィブリノーゲン分解活性に係わっているので、この活性の阻止あるいは促進に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ミッドカインへの結合能力を有するＲＣＡ結合糖蛋白質の分離の結果を示す。
【図２】  本ＬＤＬ受容体関連蛋白質のミッドカインとの結合活性を示すグラフである。
【図３】  本ＬＤＬ受容体関連蛋白質とミッドカインとの結合の阻害の程度を示すグラフである。
【図４】ミッドカイン−寒天に対するアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。
【図５】  胎児の神経細胞の生存に対する各物質の添加の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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