(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫性の後部ブドウ膜炎を有する動物を処置するための、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１から選択される細胞接着分子に対して結合親和性を有する抗体を含むことを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、一般に、細胞接着分子(cell adhesion molecules）を遮断（ブロック）する方法に関する。特に、本発明は、モノクローナル抗体または合成物質を用いて細胞接着分子をブロックする方法に関する。
背景技術
細胞接着分子は、細胞の結合を媒介する表面タンパクであり、これらの分子の発現は、炎症の領域への白血球の移動を促進することができる。これらの細胞接着分子の一つである細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）は、ヒトの角膜および網膜の色素上皮（ＲＰＥ）で発現され得る〔Elner, V.M. et al., Am. J. Path.（1991）138:525-536; Kaminska, G.M. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.（1991）32（Supp):677; Forrester, J.V. et al., Curr. Eye Res.（1990）9（Supp):183-191〕。リンパ球機能関連抗原−１（lymphocyte function-associated antigen-1; ＬＦＡ−１）は、細胞接着分子のインテグリンファミリーの一員であり、ＩＣＡＭ−１のカウンターレセプターである。いくつかの眼の組織で発現され得るＩＣＡＭ−１とは対照的に、ＬＦＡ−１は、主に白血球で発現される〔Albelda, S.M. et al., FASEB J.（1990）4:2868-2880; Springer, T.A., Nature（1990）346:425-434〕。ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の相互作用は、炎症の部位へのリンパ球の移動の調節および案内において重要であると思われる。別の接着分子、内皮性白血球接着分子−１（endothelial leukocyte adhesion molecule-1;ＥＬＡＭ−１）は、Lewisラットにおけるエンドトキシン誘発ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の角膜内皮で発現される〔Whitcup, S.M. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.（1991）32（Supp):677〕。
発明の開示
本発明のゴールは、細胞接着分子が眼炎中の眼の組織で発現されていることを明らかにし、これらの細胞接着分子をブロックすることによって炎症性の眼の疾患が抑制されることを示すことである。ヒトの眼の組織に関する研究、ならびに炎症性の眼の疾患である１）エンドトキシン誘発ブドウ膜炎（ＥＩＵ）および２）実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）の二つの動物モデルにおける研究を実施した。
細胞接着分子の発現は、炎症中の他の組織において明らかにされ、これらの細胞接着分子のブロックは炎症の抑制をもたらした。いくつかの細胞接着分子は、他の研究者らによりインビボおよびインビトロの眼の組織中に明らかにされた〔Elner, V.M. et al.（1991）Am J Path 138:525-536; Kaminska et al.（1991）Invest Ophthalmol Vis Sci 32（Supp）677; Forrester et al.（1990）Curr Eye Res 9（Supp）183-191〕。
眼の炎症を有する動物の治療方法を提供することは、本発明の一般的な目的である。
動物の細胞接着分子をブロックする方法を提供することは、本発明の一般的な目的である。
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載から明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１、ＬＦＡ−１に関する免疫組織化学的染色。Ａ：網膜の脈管炎の領域における浸潤性リンパ球は、ＬＦＡ−１αに関して濃く染まる。Ｂ：これらの同じリンパ球は、ＬＦＡ−１βに関しても濃く染まる（原拡大率×２００）。
図２、ＩＣＡＭ−１に関する免疫組織化学的染色。Ａ：網膜の色素上皮は、ＩＣＡＭ−１に関して陽性に染まる（矢印）。Ｂ：炎症の領域の網膜の脈管の内皮は、ＩＣＡＭ−１に関して強く染まる（矢印）（原拡大率×４００）。
図３、ＥＬＡＭ−１に関する免疫組織化学的染色は、交感性眼炎の場合の網膜の脈管の内皮上（矢印）に現れる（ケース４）（原拡大率×４００）。
図４、ＴＮＦ−αに関する免疫組織化学的染色。網膜の炎症細胞は、ＴＮＦ−αに関して濃く染まる（矢印）（原拡大率×４００）。
図５、Salmonella typhimuriumのエンドトキシンの注射後１０時間の毛様体の光学顕微鏡像。免疫染色は、脈管内皮（矢印）および散在するレジデント細胞(scattered resident cells)でのＥＬＡＭ−１の強い発現を示す（拡大率×４００）。
図６、Salmonella typhimuriumのエンドトキシンの注射後２２時間の２匹のラットからの角膜の光学顕微鏡像。免疫染色は、角膜内皮でのＥＬＡＭ−１の強い発現を示す。炎症細胞は、ＥＬＡＭ−１が発現されている角膜の内皮に接着している（拡大率×４００）。
図７、ａ）第１４日の検眼鏡検査、ｂ）第２１日の検眼鏡検査、およびｃ）第２１日の組織学検査。
図８、抗Ｍａｃ−１対ＩｇＧ。
図９、抗接着分子薬の眼内レンズ（水晶体）デリバリー（送達）。ａ）視神経に付着した持続性放出媒体。ｂ）抗接着分子薬でコートされた視神経。
本発明を実施する最良モード
細胞接着分子は、炎症細胞および眼の組織において発現される。炎症細胞で発現された細胞接着分子の、眼の組織で発現されたその対応するカウンターレセプターへの結合は、眼における炎症の発症を助長する。モノクローナル抗体または合成分子を用いてこれらの細胞接着分子をブロックすることにより、眼の炎症を抑制することができる。
ある態様においては、本発明は、眼の炎症を有する動物の治療方法であって、細胞接着分子に対して結合親和性を有する治療上有効な量の抗体または合成物質を、該治療が果たされるような条件下で該動物に投与することを特徴とする方法に関する。
好適な医薬的に許容可能な希釈剤、担体、および賦形剤は、当業界において充分公知である。
当業者は、いかなる特定の治療プロトコールについても投与するべき量は容易に決定し得ることを認めるであろう。好適な量は、１０μg／用量〜１０g／用量の範囲内、好ましくは１０mg／用量〜１g／用量の範囲内に入ることが期待され得る。
これらの物質は、当業界で公知の技術によって（好ましくは、全身的に、眼周囲の注射によって、または局所的に、点眼剤もしくは眼の軟膏として眼に）投与してもよい。この局所的投与は、潜在的な全身性の副作用を制限することができるが、なお眼の炎症の制御を可能にする。眼の炎症の現行の治療は、緑内障および白内障のような多数の望ましくない悪い作用を有するステロイドの使用を軸に展開するが、このことは、眼の炎症のためのこの新規な抗炎症療法により回避することができる。
ある好ましい態様においては、眼の炎症（好ましくは虹彩炎または前部ブドウ膜炎）は、外傷または疾患から生じる。接着分子をブロックするための抗体または分子は、以下のものにより送達することができる：
１．局所的点滴剤または軟膏
２．眼周囲の注射
３．全身的に、静脈内注射によりまたは経口的に。
別の好ましい態様においては、眼の炎症は、手術後の炎症である。細胞接着分子をブロックするための抗体または分子は、以下のものにより送達することができる：
１．局所的点滴剤または軟膏
２．眼周囲の注射
３．全身的に、静脈内注射によりまたは経口的に
４．房内的に(intracamerally)、前眼房または硝子体内に
５．手術中に挿入された眼内レンズ移植物に付着した貯蔵体を経て（図９Ａ）
６．手術中に挿入された眼内レンズ移植物の表面コーティングを経て（図９Ｂ）、または
７．前眼房または硝子体に縫合された眼中においた貯蔵体を経て。
また別の好ましい態様においては、炎症は、手術後の角膜移植片拒絶から生じる。細胞接着分子をブロックするための抗体または分子は、以下のものにより送達することができる：
１．局所的点滴剤または軟膏
２．眼周囲の注射
３．全身的に、静脈内注射によりまたは経口的に
４．房内的に、前眼房または硝子体内に
５．手術中に挿入された眼内レンズ移植物に付着した貯蔵体を経て
６．前眼房または硝子体に縫合された眼中においた貯蔵体を経て。
さらなる態様においては、眼の炎症は後部ブドウ膜炎である。細胞接着分子をブロックするための抗体または分子は、以下のものにより送達することができる：
１．水晶体の欠如した患者においては、局所的点滴剤または軟膏
２．眼周囲の注射
３．全身的に、静脈内注射によりまたは経口的に
４．房内的に、前眼房または硝子体内に
５．手術中に挿入された眼内レンズ移植物に付着した貯蔵体を経て
６．前眼房または硝子体に縫合された眼中においた貯蔵体を経て別の態様においては、本発明は、動物における細胞接着分子をブロックする方法であって、該分子のブロッキングが果たされるように、該細胞接着分子に対して結合親和性を有する充分な量の抗体を該動物に投与することを特徴とする方法に関する。より詳しくは、本発明は、眼の炎症中の細胞接着分子をブロックする方法に関する（好ましくは、眼の炎症は上述したとおりである）。用いる抗体の量は、当業者が決定することができる。
本発明を、制限的ではない以下の例においてさらに詳しく記載する。
例
以下のプロトコールおよび実験の詳細は、後述する例において参照される：
ケース（症例）の報告：
ケース１  生検により証明されたサルコイドーシスから発症した、虹彩の小結節を伴う両側の虹彩炎を有する２７歳の黒人女性〔Chan, C-C. et al., Arch. Ophthalmol.（1987）105:1398-1402〕。全身的および眼周囲のステロイド注射にもかかわらず、患者はルベオーシス虹彩炎とともに左眼の前部および後部部分の進行性の炎症を発症した。左眼は盲目となり、痛み、低張となり、そして摘出された。
ケース２  滲出性網膜剥離、乳頭水腫（apapilledema）、聴覚障害および白斑を伴う３０年の病歴の両側の再発性全ブドウ膜炎(panuveitis)を有する７２歳の黒人女性は、フォークト−小柳−原田症候群と診断された〔Chan, C-C. et al., Am. J. Ophthalmol.（1988）105:607-611〕。患者は、レンズ亜脱臼により引き起こされた閉塞隅角緑内障のために、右眼の周辺虹彩切除および続いて白内障摘出を受けた。右眼は、視覚障害を伴う痛みのある血管新生緑内障の発症に続いて、摘出された。
ケース３  ２４歳の女性が、白い線維症性の網膜下の病変および軽い硝子体炎を伴う進行性の両側の視覚障害を発症した〔Kim, M.K. et al., Am. J. Ophthalmol.（1987）104:15-23〕。患者は、全身的ステロイドおよびシクロホスファミドに対して応答しなかった。患者は、視覚が右眼で手の運動に、そして左眼で２０／２００に悪化した後、右眼の診断的摘出を受けることに決まった。組織病理学的知見に基づいて、網膜下線維症およびブドウ膜炎症候群の診断が下された。
ケース４  ３８歳の白人男性が、鈍器外傷に二次的な右の（眼）球の裂傷の６カ月後、両側の肉芽腫性ブドウ膜炎を発症した〔Chan, C-C. et al., Ophthalmology（1986）93:690-5〕。患者は交感性眼炎と診断され、右眼は、かろうじて光を知覚する視覚(bare light perception vision)であり、痛みの制御のため摘出された。
ケース５  ４５歳の白人女性が、再発性の硝子体出血および光を知覚しない視覚を合併した右眼の裂孔原性網膜剥離の手術による修復の１６カ月後、両側のブドウ膜炎を発症した〔Chan, C-C. et al., Ophthalmology（1986）93:690-5〕。交感性眼炎の臨床的診断が下され、右眼は痛みの制御のため摘出された。
ケース６  ６０歳の白人男性が、左眼の白内障摘出に続く網膜剥離のための複数の手術手順を受けた４カ月後、両側のブドウ膜炎を発症した〔Chan, C-C. et al., Ophthalmology（1986）93:690-5〕。患者は、交感性眼炎と診断され、左眼に血管新生緑内障を発症した。左眼は盲目となり、痛みの制御のために摘出された。
後部ブドウ膜炎における細胞接着分子の証明のための材料および方法
６人のブドウ膜炎患者の６個の摘出された眼は、ドライアイスおよびメチルブタン浴中で直ちに瞬間凍結し、ＯＣＴ(Miles Laboratory, Naperville, IL)中に包埋した。アイバンク（眼球銀行）の７個の正常な眼もまた瞬間凍結して、対照として用いた。全ての眼の後部部分の６ミクロンの凍結切片を調製し、アビジン−ビオチン複合体技術を用いて免疫組織化学的染色を実施した〔Hsu, S.M. et al., J. Histochem. Cytochem.（1981）29:557-580〕。一次抗体は、以下のものに対するモノクローナル抗体を含んでいた：ＩＣＡＭ−１（ＣＤ４５）（National Cancer Institute, Bethesda, MarylandのToshi Nakayama博士の好意による）、ＬＦＡ−１α（ＣＤ１１ａ）およびＬＦＡ−１β（ＣＤ１８）(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)、ＥＬＡＭ−１（Otsuka America Pharmaceutical, Inc. Research Laboratories, Rockville, MDのWalter Newman博士の好意による）、ならびにＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β(Genzyme, Boston, MA）。１〜２μg／mlのタンパク質を含有するマウスの腹水が対照の一次抗体であり、ビオチンとコンジュゲート化したウマの抗マウスＩｇＧが二次抗体であった。アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を適用し、３，３′−ジアミノベンジジン−Ｎｉ2ＳＯ4−Ｈ2Ｏ2が基質であった。残りの眼の組織は、ルーチンの組織病理学的検査のため、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
上記のモノクローナル抗体を産生するセルラインは、American Type Culture Collection(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.)に寄託され、以下のＡＴＣＣ受託番号を付与されている：抗マウスＩＣＡＭ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １８７８）；抗ヒトＬＦＡ−１βサブユニット（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ２０３）；抗ヒトＭＡＣ−１（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ２０４）；ならびに抗ＬＦＡ−１βユニットおよびＭＡＣ−１βユニット（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ２１８）。上記の抗体は以下の供給元から商業的に入手可能である：マウス抗ヒトＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、Biosource International, Camarillo, CA、カタログ番号ＣＴ−ＣＤ５４−ＵＮ；およびマウス抗ＩＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ５４）、Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N.Y.、カタログ番号ＹＳＲＴ  ＭＣＡ  ５３２；マウス抗ヒトＬＦＡ−１、Dako Corporation, Carpinteria, CA、カタログ番号Ｍ７８２；抗マウスＬＦＡ−１（ＣＤ１１）／ＭＡＣ−１、Sera-Lab, Ltd., Crowley Down, Sussex, England、カタログ番号ＭＡＳ  ５０４ｃｆ／ＭＡＳ  ５０４  ｃｅ；ウサギ抗ヒトＴＮＦ−α、Genzyme, Boston, MA、カタログ番号ＩＰ−３００；およびマウス抗ヒトＥＬＡＭ−１、Biosource International, Camarillo, CA、カタログ番号ＢＭ−ＥＬＡＭ−２。
免疫組織化学的染色は、二人のマスクされた（隠された）観察者が解釈し、正常の対照眼と比較した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片もまた、二人のマスクされた観察者が解釈し、病理学的診断を確認した。組織病理学的発見は、次いで免疫組織化学的染色が記録された領域と相関させた。
エンドトキシン誘発ブドウ膜炎における内皮性白血球接着分子−１の発現を明らかにするための材料および方法
２００ｇの重さの雌のLewisラット５９匹(Charles River, Wilmington, MA）に、Salmonella typhimuriumエンドトキシン（ＬＰＳ）(Difco, Detroit, Michigan)１００μgを１つの肉趾に注射することにより、３回の別々の実験においてＥＩＵを誘発した。全ての動物は、研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ決議（ARVO Resolution on Use of Animals in Research）にしたがって取り扱った。眼を、手術用顕微鏡下で炎症の臨床的徴候に関して検査した。次いで動物を屠殺し、注射時から注射後４８時間までに２時間の間隔で両眼を摘出した。片眼は、ルーチンの組織病理学のために緩衝化した１０％ホルマリン中に置いた。もう片方の眼は、ＯＣＴ(Miles Laboratory, Naperville, Illinois)中に包埋し、瞬間凍結した。
ホルマリン固定した眼は、メチルメタクリレート中に包埋し、３ミクロン厚の切片を、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。免疫組織化学的染色は、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）法〔Kim, M.K. et al., Curr. Eye Res.（1986）5:869〕を用いて、５ミクロンの凍結切片について実施した。一次抗体には、ＯＸ６（抗ＲＴ１Ｂ抗体）(Sea-lab, Westbury, NY)およびＥＬＡＭ−１（ラットＥＬＡＭ−１と交差反応する抗ヒトＥＬＡＭ−１、M.P. Bevilacqua博士の好意による）が含まれていた。１〜２μg/mlのタンパク質を含有するマウスの腹水が対照の一次抗体であり、ビオチンとコンジュゲート化したヤギ抗マウスＩｇＧが二次抗体であった。スライドは、二人のマスクされた観察者が採点した。免疫組織化学的染色の度合いは、正常眼と比較され、以前に記載されたスケールにしたがって採点された〔Kim, M.K. et al., Curr. Eye Res.（1986）5:869〕。
例１
後部ブドウ膜炎における細胞接着分子の発現
病理学的診断は、６つ全てのケースにおいて臨床的診断と調和した。３つの眼（ケース４、５および６）は、交感性眼炎と一致する組織病理学的発見を示し、他の３つの眼は、サルコイドーシス（ケース１）、フォークト−小柳−原田症候群（ケース２）、および網膜下線維症およびブドウ膜炎症候群（ケース３）と診断された。ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１は、ブドウ膜炎の６つのケース全てにおいて発現されていたが、対照の眼のどれにおいても発現されていなかった（表１）。ＬＦＡ−１αおよびＬＦＡ−１βの両方が、ほとんど全ての炎症細胞、特にブドウ膜炎を有する眼を浸潤するリンパ球で発現されていた（図１：ＡおよびＢ）。細胞は、抗ＬＦＡ−１β抗体でより濃く染まるようである。ＩＣＡＭ−１は、ケース２〜６のＲＰＥで均一に発現されており（図２Ａ）、ケース１のいくつかのＲＰＥ細胞で発現されていた。ＩＣＡＭ−１は、炎症を有する６つ全ての眼の炎症の領域の網膜および脈絡膜中の血管の内皮（図２Ｂ）、および網膜のグリア（神経膠）細胞（ケース２、３および６）でも発現されていた。ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１は、対照の眼のどの細胞においても構成的に発現されていなかった。ＥＬＡＭ−１は、活性な交感性眼炎を有する一つの眼の脈管内皮でのみ発現されていたが（ケース４）（図３）、他のいかなるブドウ膜炎の眼または対照の眼のどれにおいても発現されていなかった。
ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βに関する免疫組織化学的染色の結果も、表１に列挙する。ブドウ膜炎を有する全ての眼は、炎症の領域においてＴＮＦ−αに関して陽性に染色された（図４）。ブドウ膜炎の６つの眼のうち４つは、ＴＮＦ−βに関して弱い染色を示し（ケース１、２、３および６）、２つのブドウ膜炎の眼はＴＮＦ−βに対する抗体で何ら染色を示さなかった。対照の眼のどれも、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βに関して陽性に染色されなかった。
ＬＦＡ−１は、ブドウ膜炎を有する６つの眼の炎症細胞の大部分で強く発現されていた。ＬＦＡ−１は、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８としても知られ、細胞接着分子のインテグリンファミリーの一員であり、Ｔリンパ球を含む白血球で発現されている〔Springer, T.A., Nature（1990）346:425-434; Dustin, M.L. et al., J. Immunol.（1986）137:245-254; Rothlein, R. et al., J. Immunol.（1986）137:1270-1274〕。各インテグリン分子は、アルファとベータのサブユニットから構成されている。ＣＤ１１ａ抗体はＬＦＡ−１のアルファサブユニットに対して向けられており、ＣＤ１８抗体はベータサブユニットに対するものである。Ｔ細胞レセプターの連結は、抗原特異的な要領で、リンパ球のＬＦＡ−１の活性化を引き起こす〔Turner, J.M. et al., Cell（1990）60:755-765〕。これは、細胞接着分子の発現が、細胞が適切なカウンターレセプターを探し出してそれと接触することを可能にした後に、血液細胞が、炎症の部位で活性化されるまで妨害されずに循環することを可能にする、重要な機序であり得る。
ＬＦＡ−１のカウンターレセプターはＩＣＡＭ−１である。白血球のみで発現されるＬＦＡ−１とは対照的に、ＩＣＡＭ−１は、複数の細胞で見出される〔Kishimoto, T.K. et al., Adv. Immuno.（1989）46:149-182〕。眼においては、ＩＣＡＭ−１は角膜内皮および培養ＲＰＥで構成的に弱く発現されている可能性がある〔Elner, V.M. et al., Am. J. Path.（1991）138:525-536; Forrester, J.V. et al., Curr. Eye Res.（1990）9（Supp):183-191〕。ＩＣＡＭ−１は、ＲＰＥ、網膜および脈絡膜の脈管内皮、ならびに活性なブドウ膜炎の臨床的および組織病理学的証拠がある眼の網膜のグリア細胞（ミュラー細胞）で強く発現されていることが見出された。
ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の発現は、標的細胞に対する白血球の結合に重要であるように思われる。ＬＦＡ−１を発現する活性なブドウ膜炎を有する６つの眼における炎症細胞は、ＩＣＡＭ−１を発現するレジデント細胞に隣接して位置していた。ＩＣＡＭ−１は、ブドウ膜炎を有する６つ全ての眼の脈管内皮およびＲＰＥで中程度〜顕著に発現されており、リンパ球は、ＩＣＡＭ−１を発現する細胞に隣接してのみ見出された。ケース２〜６においては、ＩＣＡＭ−１はＲＰＥで顕著に均一に発現されており、隣接する脈絡膜はＬＦＡ−１を発現するリンパ球で浸潤されていた。これに対して、ＩＣＡＭ−１は、ケース１のＲＰＥでは均一に発現されておらず、隣接する脈絡膜には少数のリンパ球が観察された。これらの発見は、ＩＣＡＭ−１の発現が、脈絡膜および網膜中への炎症細胞の移動に必要であり、組織の損傷に導く、後の細胞−細胞相互作用に重要であり得ることを示唆する。Forresterおよび同僚らは、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対する抗体が、リンパ球−ＲＰＥ相互作用をほぼ完全に阻害するであろうことを明らかにしており、ＩＣＡＭ−１に対するＬＦＡ−１の結合が、血液−ＲＰＥ界面での自己反応性または活性化リンパ球の網膜への初期の接触に関与する主要な接着機序であることを示唆する〔Liversidge, J. et al., Immonology（1990）71:390-396〕。Elnerおよび仲間は、同様に、ＩＣＡＭ−１に媒介される角膜の内皮への好中球の結合が、ＩＣＡＭ−１に対する抗体によってブロックされることを明らかにした〔Elner et al.（1991）Am. J. Path. 138:525-536〕。白血球の結合は、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１に対する抗体によっては完全にはブロックされず、他の細胞−細胞相互作用が細胞接着において重要であることを示唆する。例えば、ＩＣＡＭ−２もＬＦＡ−１のリガンドであり、細胞結合のために重要である〔Springer, T.A., Nature（1990）346:425-434〕。
ある重要な論点は、接着分子発現の調節に関する。サイトカインの分泌、特に浸潤性Ｔリンパ球によるものは、おそらく重要な調節機能を果たす。異なる細胞は、どのサイトカインがＩＣＡＭ−１発現を誘導するかについて変化するが、ガンマ−インターフェロン、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子は、ＩＣＡＭ−１の強い誘導を引き起こす〔Kaminska, G.M. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.（1991）32(Supp):677; Springer, T.A., Nature（1990）346:425-434; Kishimoto, T.K. et al., Adv. Immuno.（1989）46:149-182; Liversidge, J. et al., Immunology（1990）71:390-396; Springer, T.A. et al., A. Rev. Immun.（1987）5:223-252; Dustin, M.L. et al., J. Cell Biol.（1988）107:321-331; Norris, D.A., J. Invest. Dermatol.（1990）95:111S-120S〕。活性なブドウ膜炎を有する眼におけるガンマ−インターフェロンの存在、および交感性眼炎および特発性ブドウ膜炎を有する眼における網膜および脈絡膜中の優性なＴ細胞浸潤は、以前に報告されていた〔Hooks, J.J. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.（1988）29:1444-1451〕。Wakefieldおよび同僚はまた、ブドウ膜炎を有する患者からの虹彩生検における増加したレベルのガンマ−インターフェロンを明らかにしていた〔Wakefield, D. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.（1991）32(Supp):1186〕。ガンマ−インターフェロンのように、ＴＮＦ−αは発現分子を誘導し、白血球の結合に導くことができる。ＴＮＦ−β（リンホトキシン）は、ＴおよびＢリンパ球により産生される関連サイトカインであるが、接着分子発現の誘導においてより活性が低い可能性がある〔Broudy, V.C. et al., J. Immunol.（1987）138:4298-4302; Locksley, R.M. et al., J. Immunol.（1987）139:1891-1895〕。
ＴＮＦ−αは、全てのブドウ膜炎の眼における炎症の領域に存在した。そして、隣接する脈管内皮でのＩＣＡＭ−１の発現を増加させていた可能性がある。これに対し、ブドウ膜炎の６つの眼のうち４つは、より活性の低いＴＮＦ−βについて弱く染色された。
ＩＣＡＭ−１は眼の炎症を有する全ての眼において発現されていたが、ＥＬＡＭ−１は、初期の活性な交感性眼炎を有する一つの眼の脈絡膜の血管で弱く発現されていたのみであった。このケースの組織病理学は、脈絡膜を浸潤する好中球を示した。ＥＬＡＭ−１は、サイトカイン活性化内皮により発現される細胞表面の糖タンパクであり、主に好中球に結合する〔Bevilacqua, M.P., Science （1989）243:1160-64〕。Lewisラットの肉趾へのエンドトキシン注射の１０時間後の角膜内皮でのＥＬＡＭ−１発現、およびそれに続く好中球の結合が明らかにされた。ＥＬＡＭ−１の発現はヒヒの皮膚中への局所的なエンドトキシン注射の２時間後に起こり、注射後９時間までに欠如していた〔Munro, J.M. et al., Lab. Invest.（1991）64:295-299〕。ＥＬＡＭ−１の、この初期の一時的な発現は、なぜＥＬＡＭ−１発現がこれらの長引く炎症を有する眼に存在しないのかを説明し得る。
調べた６つの眼は、網膜および脈絡膜に主に関与するリンパ球の浸潤の組織病理学的証拠を有していた。交感性眼炎、ＶＫＨ、サルコイドーシス、および網膜下線維症症候群は、全て眼の自己免疫疾患であると推定されている。いくつかの場合には、網膜Ｓ−抗原および光レセプター間結合タンパク(interphotoreceptor binding protein)のような網膜抗原に対する免疫反応が原因であり得るが、これらの障害における眼の炎症の原因学は、未知のままである。ブドウ膜炎において眼中に炎症細胞が移動する機序もまた、よく解明されていない。ＲＰＥ、グリア細胞および脈管内皮におけるＩＣＡＭ−１の発現ならびにこれらのＩＣＡＭ−１を発現する細胞に隣接するＬＦＡ−１を強く発現するリンパ球の存在の証明は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用が、これらの場合の眼の炎症の発症において重要であることを示唆する。ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対する抗体は、白血球の結合を有意に阻害することができ、これらの接着分子に対するモノクローナル抗体は、急性呼吸困難症候群および髄膜炎の動物モデルにおいて炎症性の損傷を減少した〔Ismail, G. et al., Blood（1987）69:1167-1174; Tuomanen, El. et al., J. Exp. Med.（1989）170:959-968〕。ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体は、ブドウ膜炎のいくつかの場合においてもまた、有効な抗炎症療法を提供することができる。
0003679112.tif 000002
例２
エンドトキシン誘発ブドウ膜炎における内皮性白血球接着分子−１の発現
炎症の臨床的および組織病理学的証拠は、注射後１６時間に起こった。炎症の臨床的徴候としては、虹彩の充血および前眼房におけるフィブリン性の滲出液が挙げられた。病理学的検査では、好中球および単球が、虹彩および毛様体に見られた。タンパク質様の物質、フィブリン破砕物（デブリス）および好中球は、前眼房において顕著であり、多数の好中球が角膜の内皮に接着していた。
ＥＩＵの誘発に続く眼の前部部分におけるＭＨＣクラスII抗原およびＥＬＡＭ−１の発現に関する経時的経過（タイムコース）を、表２に示す。エンドトキシン注射の時点で、ＭＨＣクラスII抗原は、虹彩および毛様体の支質の一つか二つのレジデント細胞で弱く発現されていた。ＬＰＳ注射の４時間後、ＭＨＣクラスII抗原は、虹彩および毛様体の上皮および支質細胞で発現されていた。注射後８時間には、ＭＨＣクラスII抗原は角膜内皮で発現され、ＭＨＣクラスII抗原は注射後４８時間に眼の組織に残っていた。
ＥＬＡＭ−１は、いかなる眼の組織においても構成的に発現されているようには見えなかったが、ＬＰＳの注射の１０時間後、虹彩および毛様体の支質および脈管内皮で最初に発現された（図５）。ＥＬＡＭ−１は、後に、注射の２２時間後、角膜内皮で発現されていた（図６）。この時、好中球は前眼房に存在し、多数が、ＥＬＡＭ−１が発現されている角膜内皮に接着していた。注射後２４時間と４８時間の間に、角膜内皮ならびに毛様体および虹彩の細胞でのＥＬＡＭ−１の発現は、次第に消滅した。
これらの結果は、ＥＬＡＭ−１が誘導可能な細胞接着分子であり、ＥＩＵの開始時に虹彩および毛様体の脈管内皮細胞で発現されたこと、および炎症のピーク時に角膜内皮で発現されたことを示唆する。ＥＬＡＭ−１は、細胞表面糖タンパクであり、サイトカイン活性化内皮により発現され、好中球に主に結合する〔Bevilacqua, M.P. et al., Science（1989）243:1160〕。より最近には、Pickerらは、皮膚に宿る(skin-homing）メモリーＴリンパ球がＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合することを示し〔Picker, L.J. et al., Nature（1991）349:796〕、Shimizuらは、ＥＬＡＭ−１がネイティブなＴ細胞よりもメモリーＴ細胞の内皮へのより大きい接着に貢献することを示した〔Shimizu, Y. et al., Nature（1991）349:799〕。Munroらは、ヒヒの皮膚での局所的なエンドトキシン応答における好中球の徴集に対するＥＬＡＭ−１の役割を研究した〔Munro, J.M. et al., Lab. Invest.（1991）295:295〕。対照の皮膚の内皮はＥＬＡＭ−１を発現しなかったが、エンドトキシン注射の２時間後、好中球の広範な接着および管外遊出を併発した。続いて減少したＥＬＡＭ−１発現は、９時間までに欠如した。
ＥＬＡＭ−１はエンドトキシンの注射の８時間後に眼において最初に発現され、注射後２４時間と４８時間の間に次第に消滅した。しかしながら、エンドトキシンはラットの肉趾に注射されたのであり、したがって、結果として生じた眼の炎症は局所的なエンドトキシン応答ではなかった。このことは、おそらく眼におけるＥＬＡＭ−１の発現の遅延を説明する。毛様体および虹彩の脈管内皮でのＥＬＡＭ−１発現は、好中球が組織病理学的に同定され得る以前に起こっていて、好中球の徴集における役割を示唆しており、好中球はＥＬＡＭ−１発現に続いて角膜内皮に接着した。角膜および脈管内皮は、異なる胎児組織から由来している。角膜内皮は、頭側の神経堤細胞から発生し、眼の血管の内皮は、中胚葉から由来する。それにもかかわらず、Elnerおよび同僚は、角膜内皮および角膜支質ケラチノサイトでの細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現を明らかにし、ＩＣＡＭ−１に対する抗体が細胞培養および角膜全体の角膜内皮への好中球の結合を有効にブロックすることを示した〔Elner, V.M., Am. J. Path.（1991）138:525-536〕。
眼の前眼房における好中球の蓄積および角膜内皮に対する白血球の接着は、眼の炎症の重要な臨床的徴候である。以前の研究は、ＩＣＡＭ−１が角膜内皮に対する好中球の結合において重要であることを示した。これは、眼の組織におけるＥＬＡＭ−１の発現を明らかにした最初の研究である。ＥＬＡＭ−１は、構成的には発現されていなかったが、ＥＩＵの誘発後の角膜内皮ならびに虹彩および毛様体の脈管内皮に出現した。
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例３
エンドトキシン誘発ブドウ膜炎における炎症を防ぐためのＭＡＣ−１に対するモノクローナル抗体の使用
グラム陰性細菌の細胞壁のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）成分の局所的または全身的注射は、眼を含むいくつかの器官において炎症を生じる〔Rosenbaum, J.T. et al.（1980）Nature 286:611; Bhattacherjee, P. et al.（1983）Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24:196; Cousins, S.W. et al.（1984）Exp. Eye Res. 39:665〕。ラット、マウスおよびウサギの種を含むある種の動物の肉趾へのＬＰＳの注射は、虹彩の充血を特徴とする前部ブドウ膜炎、ならびに前部ブドウ膜および前眼房における炎症細胞のタンパク質の蓄積の増加を生じる。この炎症のプロセスは、エンドトキシン誘発ブドウ膜炎（ＥＩＵ）と呼ばれ、眼の炎症の動物モデルとして用いられる。ＥＩＵは、全身的な脈管透過性の増加〔Cousins, S.W. et al.（1984）Exp. Eye Res. 39:665; Cousins, S.W. et al.（1982）Infect. Immun. 36:730; Howes et al.（1970）Arch. Ophthal. 84:360〕、抗体およびインターフェロン産生の変化〔Steeg et al.（1982）J. Immunol. 129:2402; Uchiyama et al.（1978）J. Immunol. 121:2340; Maehara, N. et al.（1977）Infect. Immun. 15:78〕、ならびに眼におけるプロスタグランジンおよびＣ５ａの増加したレベル〔Rosenbaum, J.T. et al.（1984）Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25:1184〕と関連している。細胞接着分子は、ＥＩＲ中に眼の構造で発現されている。ＥＩＵ中に、ＨＬＡクラスII抗原は、角膜、虹彩、毛様体、および網膜の色素上皮で発現され、ＥＬＡＭは、虹彩、毛様体および角膜内皮の細胞で発現されている〔Kim, M.K. et al.（1986）Curr. Eye Res. 5:869〕。
Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）は、炎症の領域への好中球および単球の移動に重要な細胞接着分子である。Ｃ３Ｈ−ＨｅＮマウスにおけるエンドトキシン誘発ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の発症に対する、Ｍａｃ−１に対するモノクローナル抗体（Hugh Rosen博士の好意による）を用いる治療の効果を研究した。２つの別々の実験において、２００μgのSalmonella typhimuriumエンドトキシンを一つの後肉趾に注射することにより、全部で４８匹のマウスにＥＩＵを誘発した。エンドトキシン注射の時点に、２４匹のマウスは、５００μgの抗Ｍａｃ−１抗体の腹腔内注射を受け、２４匹の対照マウスは、５００μgのラットＩｇＧの腹腔内注射を受けた。エンドトキシン注射の２４時間後にマウスを屠殺し、両眼を摘出した。右眼はルーチンの組織病理学のために処理し、左眼は免疫組織化学のために瞬間凍結した。眼の組織病理学的切片は、二人のマスクされた観察者が、０（炎症なし）から４＋（重度の炎症）のスケールで採点した。眼の炎症の平均得点±標準偏差は、Ｍａｃ−１に対する抗体で処理したマウスについては０．５４±０．０８であり、対照マウスについては２．４８±０．１６であった（ｐ＜０．００１）。これらのデータは、Ｍａｃ−１に対する抗体がマウスにおけるエンドトキシン誘発ブドウ膜炎の発症を抑制することを示し、抗Ｍａｃ−１抗体が急性の眼の炎症の治療に有用である可能性があることを示唆する。
したがって、細胞接着分子に対する抗体を、眼の炎症の治療に用いることができる。この例においては、炎症を防ぐためにＭＡＣ−１に対する抗体が用いられたが、広く一連のこれらの分子をブロックする物質を用いて同様の結果を得ることができる。この例においては、抗体は全身的に投与されたが、処置は、眼の周辺の注射により、または点眼剤もしくは眼の軟膏の形態で局所的に、投与することができる。
例４
実験的自己免疫ブドウ膜炎の治療
１８匹のＢ１０．Ａマウスを、５０μgのＩＲＢＰおよび０．２５mgのフロイント完全アジュバントを用いて、上記の乳剤を０．１ml各腿に注射することにより免疫した。動物は、０．１ml生理食塩水中の０．５μgの百日咳トキシンの腹腔内注射をも受けた。次いで動物を、それぞれ０．２５mgの抗ＩＣＡＭ−１抗体、抗ＬＦＡ−１抗体、およびラットＩｇＧを含有する腹腔内注射を毎日受ける、３つの群に分けた。これらのマウスの（眼）底を、ＩＲＢＰの注射の後１４日および２１日に、解剖顕微鏡下で検査した。全ての動物をＩＲＢＰ注射の２１日後に屠殺した。片方の眼は、ルーチンの組織病理学のために４％グルタールアルデヒド中に２０分間置き、次いで緩衝化された１０％ホルマリン中に移した。もう一方の眼は、ＯＣＴ中で直ちに瞬間凍結した。
ラットＩｇＧで処理した対照群の１匹のマウスは、実験の第２日に死亡した。第１４日の底検査による眼の炎症の臨床的得点は、抗ＩＣＡＭ−１抗体で処理したマウスについては０、抗ＬＦＡ−１抗体で処理したマウスについては０、およびラットＩｇＧで処理した対照マウスについては２．０５であった（ｐ＝０．００３）（図７Ａ）。第２１日の底検査による眼の炎症の臨床的得点は、抗ＩＣＡＭ−１抗体で処理したマウスについては０．２３、抗ＬＦＡ−１抗体で処理したマウスについては０．１７、およびラットＩｇＧで処理した対照マウスについては１．９５であった（ｐ＝０．００１）（図７Ｂ）。全てのマウスは注射後２１日に屠殺し、組織病理学による眼の炎症の得点は、抗ＩＣＡＭ−１抗体で処理したマウスについては０．１７、抗ＬＦＡ−１抗体で処理したマウスについては０．２３、およびラットＩｇＧで処理した対照マウスについては１．３であった（それぞれｐ＝０．７５およびｐ＝０．２６４、図７ＣおよびＤ）。炎症の差異および組織学的採点は統計学的に有意ではなかったが、より多数の動物を試験する場合に期待し得る統計的有意性への確実な傾向があった。
ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体の腹腔内注射で毎日処理したマウスは、ラットＩｇＧの腹腔内注射で処理した対照の動物と比較した場合、ＩＲＢＰでの免疫後１４日および２１日後の検眼鏡検査に基づく眼の炎症の臨床的証拠を、より少なく発症した。眼の炎症の検眼鏡的証拠は、軽症であったのみでなく、処理マウスにおいては遅れて発症した。組織病理学もまた、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１をブロックするために抗体で処理したマウスは、対照マウスよりも軽い眼の炎症を発症することを示した。この研究は、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体で処理した動物が、実験的自己免疫ブドウ膜炎の誘発に続いて眼の炎症を発症することを示す。
本明細書において上に言及した全ての刊行物は、参照によりその全体をここに包含する。
前述した発明は、明確さおよび理解を目的として幾分詳細に記載してきたが、この開示の読了から、当業者は、本発明および付記した請求の範囲の真の範囲から逸脱することなく形態および細部における種々の変更をなし得ることを認めるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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