(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空キャピラリーの径の中心が四重極電極による電場の中心と一致するように４本の導電線とその間の絶縁線とを組み合わせてなる四重極電極により形成される中空キャピラリーに試料を含有する液体を流し、当該四重極電極による交流電場を印加することによる誘電泳動力と、キャピラリー内の流速分布の複合効果により、液体中の試料を検出、選別、計測又は分離する方法。
【請求項２】
絶縁線が透明な物質であり、導電線が白金からなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
絶縁線と導電線を組み合わせてなる四重極電極により形成される中空キャピラリーの外側が、他の物質で覆われている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料を含有する液体の媒体が、試料とほぼ同じ密度である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
中空キャピラリーの径の中心が四重極電極による電場の中心と一致するように４本の導電線とその間の絶縁線とを組み合わせてなる四重極電極により形成される中空キャピラリー。
【請求項６】
誘電泳動用である請求項５に記載の中空キャピラリー。
【請求項７】
絶縁線が透明な物質であり、導電線が白金からなる請求項５又は６に記載の中空キャピラリー。
【請求項８】
中空キャピラリーの外側が、他の物質で覆われている請求項５〜７のいずれかに記載の中空キャピラリー。
【請求項９】
芯線の周りに絶縁線と導電線を、中空キャピラリーの径の中心が四重極電極による電場の中心と一致するように４本の導電線とその間に絶縁線を配置し、絶縁線と導電線とを密着させた後、前記芯線を引き抜くことからなる、絶縁線と導電線を組み合わせてなる中空キャピラリーの製造方法。
【請求項１０】
中空キャピラリーが、誘電泳動用である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項５〜８のいずれかに記載の中空キャピラリーの途中又は出口に、試料を検出、計測又は選別若しくは分離するための装置を有している、四重極電極による交流電場を印加することによる誘電泳動力と、キャピラリー内の流速分布の複合効果により、液体中の試料を選別、計測又は分離するための装置。
【請求項１２】
検出又は計測する装置が顕微鏡である請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
顕微鏡がＣＣＤカメラを有し、ビデオシステムによるモニター装置を有する請求項１２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、四重極電極を用いた新規な誘電泳動法に関する。より詳細には、本発明は、絶縁線と導電線を組み合わせてなる四重極電極により形成される中空キャピラリーに試料を含有する液体を流し、当該四重極電極による交流電場を印加することによる誘電泳動力と、キャピラリー内の流速分布の複合効果により、液体中の試料を選別、計測又は分離する方法、及びそのための装置、並びにそのための中空キャピラリー、及びその製造方法に関する。本発明の方法によれば、媒体中に複数の物質が入り混じった混合体から特定の物質を検出、選別、計測又は分離することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ等の生体物質や環境物質の分離にはキャピラリー電気泳動が主に利用されている。しかし、大きさが４０ｋｂｐを超えるＤＮＡに対しては有効な分離法が確立されていない。また、キャピラリー電気泳動法では、表面電荷が同じである場合には、大きさの異なる粒子を分離することが出来なかった。
【０００３】
キャピラリー電気泳動法と共に、誘電泳動法が開発されてきている。
誘電泳動は、電気泳動が直流電圧を印加するのに対し、不均一交流電場を印加することで無電荷の粒子でも泳動する現象である。誘電泳動を用いた複合試料の分析に関しても報告されている（例えば、特表平１１‐５０１２１０号）。
本発明者等は、平面で四重極電極を作成し、交流電場中での粒子の挙動を報告してきた（H.Watarai, et al., Langmuir, Vol.13, 2417,1997）。しかしながら、平面の四重極電極による誘電泳動では、その場に存在する粒子の誘電率や粒径による挙動を観察することはできたが、粒子を実質的に分離するには不十分であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、４０ｋｂｐを超えるような大きな物質であっても分離可能な新規な誘電泳動法を提供するものである。また、本発明は電荷が無い物質や、表面電荷が同じ物質を検出、計測、選別又は分離するため四重極電極を用いた誘電泳動法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、平面の四重極電極による誘電泳動について検討し、これをキャピラリーに発展させたところ、平面の四重極電極による誘電泳動では得られなかった、層流によるキャピラリー内の流速分布との複合効果により、液体中の試料をより効率的に選別、計測又は分離することができることを見出した。
【０００６】
即ち、本発明は、絶縁線と導電線を組み合わせてなる四重極電極により形成される中空キャピラリーに試料を含有する液体を流し、当該四重極電極による交流電場を印加することによる誘電泳動力と、キャピラリー内の流速分布の複合効果により、液体中の試料を検出、選別、計測又は分離する方法に関する。
また、本発明は、絶縁線と導電線を組み合わせてなる四重極電極により形成される中空キャピラリー、及びその製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記中空キャピラリーの途中又は出口に、試料を検出、計測又は選別若しくは分離するための装置を有している、四重極電極による交流電場を印加することによる誘電泳動力と、キャピラリー内の流速分布の複合効果により、液体中の試料を選別、計測又は分離するための装置に関する。
【０００７】
すでに報告されている平面の四重極電極による誘電泳動では、キャピラリーに交流電圧を印加すると内部に電場勾配が生じる。高周波条件では粒子が電場強度の小さい所へ泳動する力（負の誘電泳動力)が加わり、粒子はキャピラリーの中央部に集まる。低周波条件では電場強度の大きい所へ泳動する力(正の誘電泳動）が加わり、粒子の位置が変化し、キャピラリーの壁際に移動することが観察されている。
【０００８】
本発明はこれをさらにキャピラリーに発展させ、キャピラリー中の液体の流れによる力、例えば層流分布と前記平面の四重極電極による誘電泳動を組み合わせたものである。キャピラリー内は流速が法線方向では異なり、この層流分布と誘電泳動との複合効果で分離が可能になる。この際の誘電泳動力が正になるか負になるかは周波数、粒子の誘電率に依存する。そして、四重極電極にかけられる電圧は誘電力の大きさを変える。
【０００９】
まず、本発明のキャピラリーの製造例を説明する。
図１は本発明のキャピラリーの製造例を示す。図１の丸印は導電線１であり、二重丸印は絶縁線２であり、横に長い四角は弱い接着性を有するやわらかい薄いもの３を示す、例えばグラシン紙や表面に弱い接着性を付したフィルムなどであり、以下の説明においては、グラシン紙３として説明する。実施例１の斜線入りの丸印は芯線４を示す。
まず図１の上段の左側にあるように絶縁線２の両側に導電線１を配し、これをグラシン紙３に弱く接着させ、その上に芯線４及び絶縁線２を配置する。次に図１の中段の左側にあるように、さらにグラシン紙３を置き、この上に絶縁線２の両側に導電線１を配置させ、この全体を全体が丸くなるように紐、紙又はフィルムなどで固定化する。固定化できたら、導電線１と絶縁線２の間にある２枚のグラシン紙３を抜き取る。そうすると図１の下段の左側のようになり、この周囲をエポキシ系などの接着剤で固着し、次いで芯線４を抜き取ると中空のキャピラリーを得ることができる。
【００１０】
図２は図面に変わる写真であり、完成間近の中空キャピラリーの断面を撮影したものである。写真で黒く写っているのが導電線として使用されている白金線であり、それの隣接して灰色の丸いのが絶縁線として使用されているガラス管であり、中心部の灰色のものが芯線として使用されているフロロカーボン線である。使用されているガラス管の内径は１３０μｍ、長さが３０ｍｍであり、白金線は外径が約１００μｍ、長さ５０ｍｍで電気化学測定用の白金線であり、フ口口カーボン線は外径が１５０μｍ、長さが５０ｍｍ以上のものである。このフロロカーボン線の太さが完成する中空キャピラリーの径を決める。
【００１１】
得られた中空キャピラリーを用いた本発明の装置の例を図３に示す。図３において、ファンクションジェネレーターとオシロスコープ３１より中空キャピラリー３４の四重極電極に交流電圧を供給し、試料を含む液体をマクロシリンジポンプ３２より台３３の上に設置された中空キャピラリー３４に供給する。
図３の右上に中空キャピラリー部分の拡大図を示す。図４は中空キャピラリー４４へ試料を供給する装置を拡大したものである。試料を含む溶液が試料溶液供給ポンプ４１より供給され、溶液が溶液ポンプ４２より供給され、バルブ４３で両者を混合し濃度を調整する。試料濃度が調整された試料溶液は中空キャピラリー４４の入口４５より中空キャピラリー４４の内部に供給され、出口４６より排出される。顕微鏡３５（図３）により観察は入口４５から出口４６の間の任意の場所で行うことができる。
【００１２】
中空キャピラリー中の試料の挙動は図３における顕微鏡３５で観察され、観察された画像はＣＣＤカメラ３６で撮影され、ＣＣＤカメラ３６からの画像はビデオシステム３７で記録され、またモニターすることができる。さらにパソコン３８を連結して画像を処理することもできる。
【００１３】
本発明の四重極電極による誘電泳動法の原理を図５により説明する。
図５の右側は本発明の中空キャピラリーの断面における試料粒子の挙動を示したものであり、四重極電極による交流電場を印加することによる同心円状に作用する誘電泳動力を示している。負の誘電泳動を受ける場合には試料粒子は四重極中心５１に向かう力（図５中では黒矢印で示されている。）を受け、正の誘電泳動を受ける場合には試料粒子は四重極中心５１と反対の方向への力（図５中では白矢印で示されている。）を受ける。この断面においては先に報告した平面の四重極電極による挙動と同じである。なお、正の誘電泳動を受けるか、負の誘電泳動を受けるかは交流電場の周波数により決められ、低周波領域では正の誘電泳動を受け、高周波領域では負の誘電泳動を受ける。
図５の左側は本発明の中空キャピラリーの縦断面における試料粒子の受ける力を示したものであり、上下方向に前記した誘電泳動による力を受け、流速方向（図５では左側への方向）に層流による力を受ける。この層流による力は中心部ほど大きく、周辺部では小さくなる。
【００１４】
次に試料として、粒径１５μｍ、密度１．０５ｇ／ｃｍ３のポリスチレンラテックス粒子を用い、溶液として１８．７５％の尿素水溶液を使用して実験した。水溶液を１８．７５％の尿素水溶液としたのは、試料のポリスチレンラテックス粒子と同じ密度に調整するためであり、これにより重力による影響を少なくすることができるからである。調製された１８．７５％の尿素水溶液は、ｐＨが７．７２で電気伝導度（σｍ）が５４．４ｍＳ／ｍであった。
この試料溶液を流速１５μｌ／時間で中空キャピラリーに供給した。顕微鏡の対物レンズは５倍で観察した。
３０．５ｍｍの長さの中空キャピラリーを通過する時間を測定すると、正の誘電泳動では４００秒以上を要したのに対して、負の誘電泳動では７０〜１７０秒であった。
【００１５】
交流周波数を１ＭＨｚとして、負の誘電泳動における電圧の影響を調べた。電圧を２〜２０Ｖに変化させたときの粒子の出口における中心からの変位を測定した結果を図６に示す。
電圧が低い場合には誘電泳動による影響が少なく、粒子は層流により中心部に集まるが、電圧を上げるにしたがって粒子は周辺部に泳動されて来ることがわかる。
次に、同様に交流周波数を１ＭＨｚとして、負の誘電泳動における粒子の速度に与える電圧の影響を調べた。電圧を２〜２０Ｖに変化させたときの粒子の速度を調べた結果を図７に示す。電圧が低いときは約３８０μｍ／ｓであった粒子の速度が電圧を上げると共に遅くなり、２０Ｖでは約半分の約２００μｍ／ｓとなった。このように電圧を調整することにより試料の速度を制御することができることがわかった。
【００１６】
以上の結果から、負の誘電泳動を受ける場合（周波数が１ＭＨｚ）の、ポリスチレンラテックス粒子の出口の位置とその速度との関係を各電圧においてプロットしたものを図８に示す。図８の白丸印は２Ｖのとき、白三角印は４Ｖのとき、白四角印は８Ｖのとき、黒丸印は１２Ｖのとき、黒三角印は１６Ｖのとき、黒四角印は２０Ｖのときをそれぞれ示す。電圧が上がるにしたがってポリスチレンラテックス粒子の速度は遅くなり、出口中心部からの位置が変位してくることがわかる。
【発明の実施の形態】
【００１７】
本発明の中空キャピラリーの内径は０．０１ｍｍから１ｍｍで好ましくは０．０５ｍｍから０．３ｍｍであり、この内径は製造時に使用する芯線の太さによって決定されるので、芯線の外径を選定することにより必要な内径を有する本発明の中空キャピラリーを得ることができる。
本発明の中空キャピラリーにおける絶縁線と導電線は任意に組み合わせることができるが、四重極電極を形成できるように導電線を配置することが必要である。前記した例では４本の絶縁線と４本の導電線の組み合わせであったが、８本の絶縁線と４本の導電線の組み合わせであってもよい。
【００１８】
絶縁線の材質としては、絶縁体であればよいが、試料の観察を容易にするために透明なものが好ましい。例えば、石英、ガラス、透明プラスチックなどを使用することができる。絶縁線は通常の線状のものであればよいが、中空のものであってもよい。その外径としては、前記した中空キャピラリーの内径を形成することができる程度であればよく、例えば５〜５００μｍ、好ましくは１０〜２００μｍ程度である。
導電線としては、導電性の材料であればよく、銅、銀、白金などを使用することができる。電気化学の分野で使用される白金線が好ましい。その外径としては、前記した中空キャピラリーの内径を形成することができる程度であればよく、例えば５〜５００μｍ、好ましくは１０〜２００μｍ程度である。
【００１９】
芯線は、本発明の中空キャピラリーの製造時に使用されるものであるから、特に材質に制限はないが、引き抜いた後に絶縁線や導電線に傷を付けたり、また引き抜き時に微粉を発生しないものが好ましい。
本発明の中空キャピラリーを製造するときに使用される接着剤としては、エポキシ系などの通常の市販のものを使用することができる。また、接着剤に代えて金属やプラスチックなどで固定化することもできるが、絶縁線と導電線との間に隙間ができないように留意する必要がある。
【００２０】
本発明の中空キャピラリーは、径の中心が四重極電極による電場の中心と一致するように製造することが重要である。
四重極電極にかける交流電圧は２から９０Ｖ、好ましくは２〜４０Ｖ、周波数は１ｋＨｚから１０ＭＨｚ、好ましくは１ｋＨｚ〜１ＭＨｚである。
試料溶液の媒体としては、水が好ましいが、これに限定されるものではなく、各種の有機、無機の溶媒を使用することができる。媒体は、そのまま使用してもよいが、試料との関係において、密度、浸透圧、ｐＨなどを調整して使用するのが好ましいが、交流電場に支障がある物質の添加は好ましくない。
【００２１】
以上のように、本発明は、四重極電極による誘電泳動と流体の層流との効果を複合させて、媒体中の試料粒子を粒子の電荷とは関係無く、その粒径、誘電率などに応じて検出し、計測し、選別し、また分離することができる新規な誘電泳動法を提供するものである。
本発明の試料粒子としては、前記したプラスチック粒子に限定されるものではなく、誘電泳動を受けるものであればどのようなものであってもよい。例えば、有機化合物からなる粒子、ＤＮＡやＲＮＡ、白血球、細胞のような生体物質、無機粒子など広範囲のものに本発明の方法に適用することができる。前記した実験で使用された１５μｍのポリスチレンラテックスは、約５０ｋｂｐのＤＮＡに相当する大きさのものであり、前記の実験によりこの程度のＤＮＡであっても本発明の方法により充分分離できることが示された。
【００２２】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  中空キャピラリーの作成
絶縁線として径１３０μｍ、長さ３０ｍｍのガラス管、導電線として径が１００μｍ、長さ５０ｍｍで電気化学測定用の白金線、芯線として外径１５０μｍ、長さ５０ｍｍ以上のフ口口カーボン線を使用した。接着性の弱いグラシン紙を間に挟み、図１の様に三層に重ね、紐で円状に結わえて、グラシン紙を引き扱いた。
次に、市販のエポキシ系接着剤で周囲を固めた。このときの断面の写真を図２に示す。このとき、充分にセンタリングができていることを確認する。
最後に、フロロカーボン線を引き抜いて中空キャピラリーを製造した。
【００２４】
実施例２  装置の組立
図３に示す装置を組み立てた。試料溶液の供給は図４に示す装置を用いた。
キャピラリー出口で粒子の通過時間を観測した。顕微鏡下で観測し、同時にＣＣＤカメラで撮像しこれをビデオシステムで記録し、モニターした。
【００２５】
実施例３  試料の調製
粒径１５μｍのポリスチレンの完全球を、尿素が１８．７５％になる水溶液に分散させた。１８．７５％の尿素水溶液としたのは、密度をポリスチレンに合わすためであり、この水溶液の密度は１．０５ｇ／ｃｍ３であった。
【００２６】
実施例４  ポリスチレンラテックスのフロー試験
実施例３で調製した試料溶液を流速１５μｌ／ｈで中空キャピラリーに流し、交流周波数は１ＭＨｚで、交流電圧が２０Ｖまでで実験を行った。交流電圧は高いほど泳動が大きくなる。
交流電圧に依存する測定結果を図６〜８に示す。
負の誘電泳動の場合には中央に寄せられ、キャピラリーのフローに乗り、７０から１７０秒で出口に達したことが観察され、正の誘電泳動の時は壁際に押され４００秒以上かかつている。負の時に粒子がキャピラリーの壁際に押し寄せられ、粒子の速度が遅くなり、このように粒子を他の粒子と区別して分離できることがわかった。
これらの結果をまとめものが図８である。実質的な中心は＋４２．６μｍの所にある。これはキャピラリー作成のセンタリングによる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明は、四重極電極による誘電泳動とキャピラリー中の流れによる層流とを組み合わせた新規な誘電泳動法を提供するものである。本発明の方法により、誘電率と粒径などのパラメーターにより、電荷を持たない粒子や表面電荷が同じである粒子を効率よく、かつ簡便な手段で検出、計測、選別又は分離することができる。本発明の方法により、従来の方法では分離が困難であった比較的大きな粒子をも分離することが可能となった。また、本発明の方法は、生体細胞を分離することもでき、白血球、細胞、ＤＮＡ等の生物・医学のみならず、マイクロカプセルや微粒子の工学分野での応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の中空キャピラリーの製造方法を例示するものである。
【図２】図２は、本発明の中空キャピラリーの断面を示す、図面に変わる写真である。
【図３】図３は、本発明のキャピラリー誘電泳動法の装置の例を示すものである。
【図４】図４は、本発明の装置における試料溶液の供給装置の例を示すものである。
【図５】図５は、本発明のキャピラリー誘電泳動法の原理を説明するためのものである。
【図６】図６は、負の誘電泳動条件下（交流周波数が１ＭＨｚ）での粒子の出口位置の電圧依存性の実験結果を示したグラフである。横軸は電圧（Ｖ）、縦軸は出口位置の変位（μｍ）である。
【図７】図７は、負の誘電泳動条件下（交流周波数が１ＭＨｚ）での粒子の速度の電圧依存性の実験結果を示したグラフである。横軸は電圧（Ｖ）、縦軸は速度（μｍ／ｓ）である。
【図８】図８は、負の誘電泳動条件下（交流周波数が１ＭＨｚ）の、ポリスチレンラテックス粒子の出口の位置とその速度との関係を各電圧においてプロットしたグラフである。図８の白丸印は２Ｖのとき、白三角印は４Ｖのとき、白四角印は８Ｖのとき、黒丸印は１２Ｖのとき、黒三角印は１６Ｖのとき、黒四角印は２０Ｖのときをそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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