(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞収集システムであって、以下：
長手方向軸に沿って中央腔を規定する中空管状本体であって、該本体は、開孔部を規定する近位端、および該腔内への入口ポートを規定する遠位端を有する、中空管状本体；
該腔内に密封されて配置されるピストン；
該ピストンに作動可能に接続され、そして該本体の該近位端開孔部を通って延びる、プランジャーであって、該ピストンが、該入口ポートと連絡する可変容量チャンバーを該中央腔内に規定するよう移動可能である、プランジャー；
該本体の遠位端に取り外し可能に取り付けられた細長いカニューレであって、該細長いカニューレは、該カニューレを通って延びかつ該チャンバーと連絡する管腔を有し、そして該管腔の軸を横断して開く複数の遠位収集開孔部を有し、そして鋭利な縁部を有し、該プランジャーおよびピストンが組み合わせられて、該カニューレ管腔内で周囲圧力より高圧および低圧を生じさせるように、該チャンバー内の圧力の手動の制御を可能にし、これによって、体腔から収集開孔部を通じて該チャンバー内へと該管腔を介して、微小血管内皮細胞を含む脂肪組織を穏やかに収集することを可能にする、細長いカニューレ；
該カニューレの換わりに該本体の該遠位端に取り付け可能な、ハブアセンブリ；ならびに
該ハブアセンブリの内部に設置されたホモゲナイズ部材であって、該ホモゲナイズ部材は、複数の開孔部を備え、ここで、該チャンバー内に収集された該脂肪組織は、該脂肪組織を該チャンバーから該遠位ポートおよびホモゲナイズ部材を通じて排出することによってホモゲナイズされ得る、ホモゲナイズ部材、
を備える、システム。
【請求項２】
前記収集開孔部が、前記カニューレの周囲で周囲方向に間隔を空けている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ホモゲナイズ部材開孔部の各々が、0.2mmと３mmとの間の大きさを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記開孔部の各々が、1.0mmの大きさを有する、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記開孔部の各々が、所望のホモゲナイズの量に基づいて選択される大きさを有する、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記ホモゲナイズ部材が平坦であり、そして金属と比較してより低い電気化学的エネルギーを有する外側表面を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記ホモゲナイズ部材が、パリレンの外側コーティングを有する、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記中空管状本体、ピストン、およびプランジャーが、第１シリンジを規定し、そしてさらに、以下：
第２シリンジであって、可変容量チャンバーに導く遠位ポートを有し、該遠位ポートは、該第１シリンジの反対側にあるハブアセンブリに接続されており、該ハブアセンブリは、これによって該第１シリンジおよび第２シリンジを連結し、ここで、前記脂肪組織は、該第１シリンジから該ホモゲナイズ部材を通じて該第２シリンジへと、次いで該第２シリンジから該ホモゲナイズ部材を通じて該第１シリンジへと、該脂肪組織を注入することによってホモゲナイズされ得る、第２シリンジ、
を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１および第２シリンジの前記遠位ポートが、テーパー状の雄先端部を備え、そして前記ハブアセンブリが、該ポートと嵌合するために、対向する外向きに面したテーパー状の雌開孔部を備える、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第１および第２シリンジの前記遠位ポートが互いに面しており、そして前記ホモゲナイズ部材が平坦であり、そしてここで、前記ハブアセンブリが、２つの分離可能な部品を備え、該部品の間に、該ホモゲナイズ部材が設置されており、該部品は、協同して通路を規定し、該通路を通って、前記脂肪組織が、該ホモゲナイズ部材に対して垂直に、前記開孔部を通って通過する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ホモゲナイズ部材開孔部が、切断縁部表面を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
患者から得た脂肪組織をホモゲナイズするためのキットであって、該キットは、以下：
収集シリンジであって、第１ポートを有し、そして該収集シリンジ内に、微小血管内皮細胞を含む脂肪組織が配置される、収集シリンジ；
第２ポートを有する受け入れシリンジ；
該第１と第２ポートとの両方に取り付けられ、そして該収集シリンジと受け取りシリンジとを接続する、ハブアセンブリ；ならびに
該ハブアセンブリの内部に設置されたホモゲナイズ部材であって、該ホモゲナイズ部材は、切断縁部表面を有する複数の開孔部を備え、ここで、該脂肪組織が、該脂肪組織を該収集シリンジから該ホモゲナイズ部材を通じて該受け入れシリンジへと、次いで該受け入れシリンジから該ホモゲナイズ部材を通じて該収集シリンジへと注入することによって、ホモゲナイズされ得る、ホモゲナイズ部材、
を備える、キット。
【請求項１３】
前記開孔部の各々が、0.2mmと３mmとの間の大きさを有する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記開孔部の各々が、1.0mmの大きさを有する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記開孔部の各々が、所望のホモゲナイズの量に基づいて選択される大きさを有する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記ホモゲナイズ部材が平坦であり、そして金属と比較してより低い電気化学的エネルギーを有する外側表面を有する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
前記ホモゲナイズ部材が、パリレンの外側コーティングを有する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記第１および第２のポートが、テーパー状の雄先端部を備え、そして前記ハブアセンブリが、該ポートと嵌合するために、対向する外向きに面したテーパー状の雌開孔部を備える、請求項１２に記載のキット。
【請求項１９】
前記第１および第２のポートが互いに面しており、そして前記ホモゲナイズ部材が平坦であり、そしてここで、前記ハブアセンブリが、２つの分離可能な部品を備え、該部品の間に、該ホモゲナイズ部材が設置されており、該部品は、協同して通路を規定し、該通路を通って、前記脂肪組織が、該ホモゲナイズ部材に対して垂直に、前記開孔部を通って通過する、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、微小血管内皮細胞の採取方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、脂肪組織の収集方法および合成補綴具の表面に堆積する微小血管内皮細胞の初期純化方法に関する。
発明の背景
動脈硬化症の血管の疾患は、世界中で、主な死因になっている。動脈内膜切除術および経皮的なバルーン膨張などの高度な医学技術が、病理学的狭窄症の発症を治療するのにますます頻繁に適用されているが、しばしば、最も効果的な治療は、血管の閉塞部の外科手術による除去である。このような場合、虚血組織への血液の流れの回復は、血管移植片の移植に依存する。
自己由来の血管組織が、このような移植片における使用のための最も適切な材料であるが、それ以前の外科手術の介入および進行した血管の疾患により、しばしば、このような組織の入手可能性が制限される。従って、近年、合成材料から作製された血管移植片の移植が一般的になっている。商業的に入手可能な合成移植片は、非常に耐久性がよく、閉塞組織への血液の流れをうまく回復するために使用され得るが、付随するトロンボゲン形成による合併症により、その効果が低下する。特に、直径が小さい血管移植片は、正常な凝固機構によりブロックされるので、機能不全になる傾向がある。具体的には、移植片の合成表面が、フィブリンの堆積を促進し、それに付随して細胞粘着および血管の閉塞が起こる。従って、コーティングされていない合成移植片の長期的の病気の予後が比較的悪い。
コーティングされていない合成血管移植片に付随する問題を回避するために、補綴具をヒトの内皮細胞でライニングし、天然のヒトの血管に存在するようなトロンボゲン形成性でない細胞表面を生成する方法が開発されている。天然の血管の内皮ライニングは、非常に複雑で多機能の細胞表面であり、血液と下にある血管壁成分との両方と相互作用し、生理学的なホメオスタシスを維持する。動物試験によれば、合成血管移植片の内面への機能的な大血管内皮細胞のライニングの堆積により、トロンボゲン形成による閉塞の形成が減少し、血管の中の血液流れの阻害を最小にすることが示されている。しかし、大血管細胞の十分な数をドナーから採取することは、非常に困難である。
近年の分子生物学および組織培養の進歩により、大血管内皮細胞の単離およびその後の増殖が可能になった。実際、培養された大血管内皮細胞の使用は、高価であり、複雑でありそして固有の制限を受ける。１つの問題は、細胞培養技術が、技術的に高度であり、訓練された人員および実験室条件下での専門化された設備の使用を必要とする点である。しかし、最適な条件下においてさえ、培養された大血管内皮細胞の収率は低くなり得る。さらに、培養細胞を用いる代表的な接種方法には、移植片の合成表面上に、完全かつ均一に内皮細胞を堆積させるために、複雑な条件下で特別の媒体の使用が必要である。
さらに、培養細胞は、通常、移植片を受ける患者から由来するのではなく、従って、広範囲の免疫合併症を併発し得る。もし、患者の免疫応答が、減衰しない場合、移植された内皮細胞は、攻撃され、体内の防御によって移植片の表面から剥離され得る。逆に、もし、患者の免疫応答が、人工的に抑制されると、生命の危険のある日和見性感染症を発症し得る。
補綴装置の大血管内皮細胞処置の使用に付随するこれらのおよび他の合併症を考慮して、合成材料に固有のトロンボゲン形成性を減少させる別の方法が、開発されてきた。特に、ヒトの微小血管内皮細胞が、合成移植片を非トロンボゲン形成性にするために効果的に用いられ得ることが早急に認知された。
微小血管内皮細胞は、毛細血管、小動脈および小静脈から由来し、ほとんどの体内組織に豊富に存在する。内皮細胞は、脳、肺、網膜、副腎、肝臓および筋肉組織などの組織などの組織から単離され得るが、これらの細胞の供給源として脂肪組織の使用が、その豊富さ、入手可能性、およびその除去は処置される患者に悪影響を与えるべきでないという理由で好ましい。しばしば、微小血管内皮細胞は、脂肪１グラム当たり１０6個またはそれ以上の濃度で存在するので、高密度堆積方法のための材料の十分な供給源を提供する。さらに、合成移植片を処置するために使用される微小血管細胞は、通常、自己由来、すなわち、血管補綴具の受容者から採取されるので、免疫合併症は回避され得る。
代表的には、微小血管内皮細胞は、腎周組織脂肪、皮下脂肪、網（omentum）または腹膜腔に付随する脂肪などの自己由来の脂肪組織から単離される。通常、採取は滅菌条件下で行われ、一回の手順で必要量の脂肪を切除する。次いで、収集された組織は洗浄され、通常、コラーゲナーゼ、パパイン、トリプシンおよびそれらの混合物のような蛋白質分解酵素を含有する緩衝化消化溶液に移され得る。
脂肪組織は、３７℃で選択された時間消化され、結合マトリックスを破壊し、そして微小血管内皮細胞を含む細胞成分を分散する。消化に続いて、細胞成分は、細胞が豊富なペレットを提供するために、低速遠心分離によって分離され得る。このペレットは洗浄され、堆積手順に用いられるかまたは連続勾配を用いてさらに精製され得る。いずれの場合も、精製された細胞は、緩衝液で希釈され、引き続いて、合成補綴具とインキュベートし、内皮化表面を提供する。
通常、所望の脂肪組織の収集は、針またはカニューレを有する収集装置に接続された吸い上げポンプの使用を伴う。例えば、本明細書で参考として援用される米国特許第5,035,708号および第4,834,703号は、必要な真空を提供するために、吸い上げポンプを用いる脂肪組織の収集を開示している。しかし、このような収集装置およびそれに付随する方法は、収集された組織の微小血管細胞成分に対して非常に荒々しい、強力な制御不可能な吸い上げを用いる傾向がある。その結果、比較的脆い細胞膜が破壊され、実質的に採取された細胞の生存率が低下し得る。このため、堆積プロセスの効率が激減する。このような収集手順は、十分な脂肪組織を提供し得るが、このような技術を用いて収集された試料には、最終的な堆積のために比較的純粋な微小血管内皮細胞の十分な濃度を確実に得るために、通常、付加的な労働集約的な調製ステップが必要である。
さらに、吸い上げポンプを用いて収集された供給源組織は、しばしば、比較的汚く、不要な体液および非脂肪細胞破片で汚染されている。比較的純粋な脂肪組織に見られるような、半透明で白い試料を得るのではなく、ポンプで生成された真空を用いて収集された試料は、しばしば、脂肪内に分散した所定濃度の結合組織または膜組織を有して血液のように見える。
取り込まれた異物が、消化用に収集された試料の最初のホモゲナイズおよび調製を含む微小血管内皮細胞単離の各ステップを妨害する。さらに、このような異物が、蛋白質分解酵素の酵素活性を直接阻害し、試料の消化が不完全になり、引き続き遠心分離によって得られた非脂肪細胞成分の収率が、それに応じて低下する。最後に、収集されペレット状になったこれらの細胞は、増加したレベルの非内皮成分を含有する。このような汚染されたペレットの使用は、細胞堆積手順の効率をさらに低下させ、そして補綴具表面上の内皮細胞の均質堆積を妨害する。その結果、患者は、十分な数の微小血管細胞を提供するために必要とされ得るより多い脂肪吸い上げに耐えなければならない。
内皮化プロセスの効率は、異物により、工程中の各ステップで低下するので、比較的きれいな試料でこの手順を開始することの重要性は明らかである。つまり、最初に収集された汚染材料の量が僅かに増加すると、合成移植片表面上の堆積に利用可能な生存微小血管内皮細胞の収率が激減し得る。最初に収集されなければならない脂肪組織の量が増加することに加えて、汚染材料に起因する細胞生存率の不可避の減少は、堆積時間を長くすること、または精製ステップの追加によって補われなければならない。それらの両方により、手順全体の操作効率が低下する。これは、細胞が、補綴装置の移植の直前に収集されなければならない場合に特に不都合であり得る。
従って、合成補綴具の移植をしようとしている患者から収集された脂肪組織から回収された生存内皮細胞の収率を改善する必要がある。つまり、脂肪標本に存在する微小血管内皮細胞は、脂肪細胞、血液細胞、結合組織および標本に存在する他の材料からより効率的に分離されるべきあり、それにより、より大量のこのような内皮細胞が、合成移植片上に堆積されるために利用可能である。
材料の収集に付随する実際の問題に加え、吸い上げポンプの使用は操作環境を複雑にし、そして脂肪組織収集装置を自由に操作する外科医の能力を妨害する。より詳しくは、収集装置は、通常、厚く扱いにくいホースを介して真空供給源に取り付けられており、収集先端部の操作性をひどく損なう。このようなポンプのために、しばしば、収集先端部における真空の強度の正確なリアルタイムの制御が不可能であり、このため、所望の供給源組織の一定の均一な採取を維持することが困難である。この利便性および正確な制御の欠如のために、必然的に、望ましくない組織を吸い上げることになり、これにより、試料の異物のレベルを増加させるか、低レベルの微小血管内皮細胞を含有する、あまり好ましくない脂肪組織の収集という結果になる。さらに、真空供給源、特に、医療手順において使用が承認された真空供給源は、通常、維持が比較的高価な複雑な器具である。
上記に述べたような関連技術の欠点を考慮して、本発明の目的は、微小血管内皮細胞を含む脂肪組織の収集のための効率的でコスト面で有利な方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、高レベルの微小血管内皮細胞を含む実質的に純粋な脂肪組織を、最小限の血液細胞、結合組織および他の異物で収集するための、信頼性ある簡便な方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、微小血管内皮細胞のその後の分離を容易にするための、脂肪組織の急速なホモゲナイズのための信頼性ある簡便な方法を提供することにある。
発明の要旨
これらのおよび他の目的は、本発明によって達成され、本発明は広範な局面で微小血管内皮細胞のような同定可能な細胞成分を含む脂肪組織の採取のための効率的な信頼性あるコスト面で有利な方法に関する。より詳しくは、本発明は、通常、細長いカニューレに取り付けられた、可変容量容器、代表的にはシリンジアセンブリを備える収集装置を用いて、生存内皮細胞の増加した集団を保存するように脂肪組織を採取する方法に関する。可変容量容器またはシリンジと流体導通関係にある細長いカニューレは、脂肪組織の結合マトリックスを破壊しながら、細胞成分に加えられる応力を最小にするような適切なサイズおよび構成の開孔部を好ましくは含む。つまり、特定の構成のカニューレの開孔部を用いて、脂肪組織を収集することによって、内皮細胞の収率が実質的に増加し得る。さらに、収集装置は、安価、軽量、操作が容易であり、そして付与された吸い上げの正確な制御が可能である。
本発明の組織採取方法は、通常、収集装置のカニューレの少なくとも一部分を患者に挿入し、そしてカニューレ先端部を脂肪組織が収集される領域へ向けることから始まる。採取手順は、好ましくは、無菌条件で行われる。必要に応じて、脂肪組織マトリックスを緩めるために、採取前に、生理食塩水溶液または他の生体適合性の液体を患者の収集領域に注入し得る。カニューレ先端部の挿入および配置に続き、プランジャーに取り付けられた移動可能なピストンを後ろに引くことによって、シリンジの中央腔に周囲圧力以下の圧力が生成される。所望であれば、プランジャーに取り付けられ、シリンジの本体と相互作用するように設計された固定機構によって、ピストンはこの引かれた形態に保持され得る。この固定機構は、オペレーターの手を解放し、収集装置の軽量さと組み合わさると、より高い操作性を提供する。いずれの場合にも、中央腔における周囲圧力以下の圧力が、選択された収集領域から脂肪組織を吸い上げ、破壊を行うカニューレの開孔部に入り、カニューレの本体を通りシリンジアセンブリの中に入る。シリンジの中央腔は、収集された組織で満たされるので、周囲圧力以下の圧力が、ゆっくりと平衡に達する。一旦、シリンジの中央腔が、比較的均質な脂肪組織で実質的に満たされると、カニューレ先端部は患者から取り出される。
本発明の別の局面は、収集された脂肪組織が簡単にホモゲナイズされ、そして汚染物質を取り出すために水性溶液で洗浄されることを可能にする。患者からのカニューレ先端部の取り出しに続き、カニューレは、シリンジアセンブリから取り外され得る。次いで、フィルターハブに収められているフィルターが、カニューレが、予め取り付けられたシリンジアセンブリに取り付けられ得る。次いで、好適には、第１のアセンブリと同じサイズの第２のシリンジアセンブリが、フィルターハブの対向する側に取り付けられる。このように接合されると、第１のシリンジアセンブリのピストンは、実質的にシリンジ内の後方にあり、そして第２のシリンジアセンブリのピストンは、実質的に前の位置にある。プランジャーを用いて２つのピストンを移動させることによって、収集された脂肪は、試料組織の流路を横に切開するフィルターを通じて押し流されると、急速にホモゲナイズされ得る。必要に応じて内皮細胞が豊富な脂肪組織ホモゲネートから異物を分離するために、ホモゲナイズのあいだにリンス溶液を添加し得る。ホモゲナイズおよびリンスの後、ここでは、生の結合組織および他の異物を実質的に含まない収集された脂肪組織が、消化およびさらなる精製のために適切な容器に移され得る。
本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面を組み合わせて考慮される本発明の例示の好適な実施形態を読めば明らかである。図面では、同様の参照番号は、同じ構成要素または構造において類似である構成要素を示す。
【図面の簡単な説明】
図１は、プランジャーが挿入位置にある、カニューレのシリンジアセンブリへの取付けを示している、脂肪組織収集装置の斜視図である。
図２は、例示の固定機構によって引かれた位置に保持されるプランジャーを示している、脂肪組織収集装置の部分断面図である。
図３は、フィルターハブによって相互接続された２つのシリンジアセンブリの部分断面図であり、採取された脂肪組織のホモゲナイズに使用される本発明の構成を示す。
図４は、本発明によるホモゲナイズフィルターを示している、図３の４−４線に沿った断面図である。
図５は、本発明の教示に従った、微小血管内皮細胞の高収率を提供するために使用されるカニューレの先端部の部分斜視図である。
図６は、カニューレの先端部に隣接する収集開孔部の配置を示している、図５の６−６線に沿った断面図である。
図７は、脂肪組織を採取するために使用されるカニューレの実施形態の先端部分の部分斜視図である。
図８は、カニューレの先端部に隣接する収集開孔部の楕円形状および配置を示している、図７の８−８線に沿った断面図である。
図９は、脂肪組織を採取するために使用するカニューレの別の実施形態の先端部分の部分斜視図である。
詳細な説明
本発明は、多くの異なる形態において具体化され得るが、本開示が、発明の原理の例示として考えられるべきであり、例示された特定の実施形態に本発明を限定することを意図しないということを理解して、図面で示し、詳細にその特定の実施形態で記載される。特に、本発明は、広範なシリンジ本体およびカニューレの組合せが、図に示される組合せ以外にも適用されることを強調しなければならない。
さらに、本発明は、脂肪組織マトリックスに付随する任意の同定可能な細胞をも採取するために使用され得、微小血管内皮細胞の採取および単離に限定されない。本明細書で用いられる用語「同定可能な細胞成分」とは、通常使用される免疫学的、化学的または物理的分離方法または試験によって認識され得る細胞をいう。
同様に、血管補綴具の内皮形成が本発明の重要な目的であるが、当業者は、収集された細胞産物が、他の移植可能な装置を処置するために使用され得ることを理解する。内皮細胞ライニングまたは被覆を生成するために処置され得る移植片は、人工心臓、弁状補綴具および天然のまたは人工の弁小葉のような血管内装置を含むが、それだけに限定されない。本発明の、内皮細胞が豊富な脂肪組織を採取するための収集装置および方法は、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレンのような公知の合成材料、または、ヒトを含む動物供給源からの静脈、動脈、心臓弁および他の組織などの、固定されたおよび固定されていない天然に存在する材料からなる表面の処置に使用され得る。
図面を参照すると、図１および図２は、シリンジアセンブリ１２の形態で可変容量容器を本質的に備える脂肪組織収集装置１０を示す。シリンジアセンブリ１２は、管腔２６、および、微小血管内皮細胞を含む脂肪組織の相対的に均質な収集のために適切に構成された少なくとも１つの収集開孔部１６を有する細長いカニューレ１４と流体的に密な導通関係にある。シリンジアセンブリ１２は、通常、そこに密閉して配置される移動可能なピストン２２を有する、中央腔２０を規定している中空の管状本体１８を備える。好ましくは、ピストン２２は、中空の管状本体１８の後ろの開口部を通して伸びる細長いプランジャー２８に取り付けられている。プランジャー２８を手動で移動させることによって、ピストン２２は、中央腔２０の長さ方向に沿って可逆的に移動し得る。密閉リング３１が長手方向に移動するとき、それは、ピストン２２が管状本体１８の内部との良好な接触を維持することを確実にする。中空の管状本体１８の前面端部の入口ポート２４は、カニューレ管腔２６と中央腔２０との間に流体導通関係を提供する。
好ましくは、シリンジアセンブリ１２は、入口ポート２４を規定しているテーパー状の先端部３０を有するToomey型シリンジ（Sherwood Medical Co.,St.Louis,Missouri）である。Toomey型シリンジは、カニューレまたは他の取付部の交換の容易さにより好適であるが、ネジ型コネクター、カテーテル先端部またはluerロックなどの他の型の接続機構を有するシリンジアセンブリも本発明に用いられ得る。代表的には、シリンジアセンブリ１２の中空の管状本体１８は、ポリプロピレンまたは他の剛直なポリマー組成物のような安価な非反応性材料から形成される。もちろん、当業者は、シリンジアセンブリ１２のサイズおよび流体容積は、収集される脂肪組織の量に基づいて変化し得ることを認識する。しかし、明らかな理由により、シリンジアセンブリ１２は、１回の収集手順で脂肪組織の所望の量を採取するに十分な容量であることが好ましい。平均的な細胞堆積手順に必要な量の内皮細胞を提供するために必要とされる脂肪組織の容量は、２０ml〜５０ml程度であるので、好適なシリンジ容量は約６０mlである。大部分の商業的に入手可能なシリンジの側面にある目盛り３２は、収集された脂肪量をモニターする簡単な方法を提供する。
必要に応じて、シリンジアセンブリ１２には、プランジャー２８および取り付けられたピストン２２を引かれた形態に保持するために、中空の管状本体１８の後ろで、環状フランジ３８に可逆的に係合するプランジャーフランジ４８に取り付けられる固定機構３４が設けられている。この構成は図２に示されている。図１に示すように、プランジャー２８およびピストン２２が実質的に前方位置にあるとき、中空の管状本体１８の内面は固定機構３４のショルダー３８に作用し、それを閉鎖位置に維持する。しかし、プランジャー２８が引かれ、ショルダー３８がもはや制限を受けないある所定の点を通過すると、固定機構３４は、この機構材料の弾性的な記憶により開く。開放位置にあるとき、固定機構３４のショルダー３６は、環状フランジ３８およびプランジャーフランジ４８と係合するように配置され、それによって、プランジャー２８が、中空の管状本体１８に再び入るのを防ぐ。しかし、プランジャー２８は、手動で固定機構３４を圧縮し、ショルダー３６の直径を、それらが環状フランジ３８との係合を解き、そして中空の管状本体１８中に簡単にスライドするところまで減少させることによって、前方の位置に簡単に移動させ得る。様々な固定機構が本発明に用いられ得るが、１つの特に適切な装置は、商標名Grazer-Grams Lock（Gram Medical,Costa Mesa,California）で販売されている。様々なシリンジサイズに対して得られることに加えて、これらの固定機構は、単一のショルダーの態様で入手可能である。
収集装置１０の最後の主な構成要素は、管腔２６、近位端部および遠位カニューレ先端部４０を有するカニューレ１４である。異なる長さおよび直径を有する多数の商業的に入手可能なカニューレが本発明に用いられ得、様々なシリンジアセンブリと共に用いられ得る。本明細書中の教示に従って用いられる場合、特に好適で、かつ比較的高い収率を提供するカニューレが、商標名Mercedes（Grams Medical,Costa Mesa,California）で販売されており、そして内径が約１mm〜８mmの範囲である。特に好適な内径は、１.５mm〜４mmの範囲である。一般に、再殺菌および再利用の容易さのために、ステンレス鋼のような金属合金から形成されるが、これらのカニューレの表面は、収集された細胞成分に対する応力を減らすために、生体適合性のポリマーでコーティングされ得る。
カニューレ１４の一般的な構成は、異なる実施形態に対して比較的一貫しており、すなわち、一般的に少なくとも１つの管腔２６を有して細長い構成であるが、使用し得るカニューレの他の特性は、著しく変化し得る。例えば、図１および図２に示すような、カニューレ１４の近位端部におけるカニューレ接続部４２は、テーパー状の先端部３０を有するシリンジと着座しそして着脱可能に係合する。当業者は、シリンジアセンブリと同様に、選択されたシリンジアセンブリ１２と係合するように適合されている限り、多くの型のカニューレ接続部が、本発明の教示に従って用いられ得ることを認識する。例えば、luerコネクター、カテーテルコネクター、ネジ型コネクターおよび圧縮継ぎ手を有するカニューレが、それらが、選択されたシリンジアセンブリのコネクターと適合する限り、脂肪組織の採取に用いられ得る。さらに、シリンジアセンブリに永久的に取り付けられ、収集装置を形成しているカニューレもまた本発明の範囲内であり、そして同様の結果で使用され得る。
操作する医師の所望に依存して変化し得る、本発明のカニューレの別の重要な特徴は、収集開孔部の構成および位置である。例えば、図５、図６、図７、図８および図９はすべて、収集開孔部の異なる構成を示す。本発明によれば、収集開孔部の形状および構成は、相対的に均質な収率を提供するために、採取のあいだに、脂肪組織のマクロ構造および結合成分を破壊する応力を課すことが望ましい。さらに、収集開孔部は、任意の非破壊組織によるブロックに抵抗するために十分に大きくあるべきで、それにより、患者からのカニューレの取り出しおよび採取手順の中断が必要である。このような考察に基づくと、収集開孔部は、１mm〜４mmの範囲が好適であり、より好適には、１.５mm〜３mmの範囲である。
図５の開孔部の構成は、開孔部４２に細長い組織切断縁部を示し、これが実質的に細胞収率を増加させる。対照的に、図７および図９に示すような丸いまたはあまり急ではない開孔部縁部は、組織の結合マトリックスを十分に破壊する組織切断縁部を提供しないようであり、その結果、試料組成はあまり均質ではなく細胞収率は低い。組織切断開孔部構成は、採取された組織のマクロ結合構造を破壊するが、それらは脂肪組織マトリックス内に分散される繊細な細胞成分に対して、必ずしも、応力または剪断力を課すとは限らない。収集開孔部４２および収集開孔部４６の丸い縁部は、これらの望ましくない剪断力を減少させるのに役立つが、それらは実質的に均質な組織の収集を提供せず、従って、全体的な細胞の収率を低下させる。
様々な構成およびサイズの収集開孔部が、本発明の方法で用いられ得るのと同様に、異なる開孔部配置スキームおよびカニューレ形状が用いられ得る。例えば、収集開孔部を遠位カニューレ先端部４０に近い位置に限る必要はない。このような配置では、収集領域がより正確に測定され得るので、試料の純度が高まり得るが、先端部からさらに離れて配置される開孔部も同様に作用し得る。同様に、カニューレ１４、および、さらに管腔２６は本質的に円筒形である必要はない。例えば、より楕円形である他の形状が、図６に示す完全な円筒形と同じ細胞収率を提供し得る。従って、シリンジアセンブリと同様に、広範囲のカニューレ形状、サイズおよび構成が本発明の範囲内であり、個々のオペレーターの選択に基づいて選択され得る。
何れの場合も、一旦、収集開孔部が選択され組み立てられると、脂肪組織および同定可能な細胞成分の実際の採取を開始し得る。全ての手順は無菌状態で行われるのが好ましい。収集装置１０は、予め組み立てられ予め滅菌され得るか、または使用直前に操作領域で組み立てられ得る。代表的には、固定機構３４を有さないシリンジアセンブリ１２は、廃棄可能で予め滅菌されそして予めパッケージされた形態で商業的に入手可能である。逆に、カニューレ１４は、代表的には、再利用可能であり、そしてその場で洗浄されパッケージされそして再び滅菌される。従って、着脱可能に係合され得る使用可能な構成要素の選択に続いて、シリンジアセンブリ１２およびカニューレ１４は、通常、患者への挿入の直前に、収集装置１０を形成するように係合される。シリンジアセンブリ１２がカニューレ１４に取り付けられるのとほぼ同時に、任意の固定機構３４がプランジャーフランジ４８を介してプランジャー２８に取り付けられ得る。好ましくは、固定機構３４は、不注意な試料汚染の可能性を減少させるために、カニューレ１４と係合する前に取り付けられる。
任意の予備ステップとして、生理食塩水または他の生体適合性の溶液が、所望の材料を採取する前に、脂肪収集領域に注入され得る。液体のその領域への注入が、脂肪マトリックスを破壊し、そして結合組織の癒着を減少させるようである。この破壊を助けるために、流体を注入された組織は、強くマッサージされるか、または他の外力を受け得る。当業者には理解されるように、採取前の注入された生理食塩水の実際の容量、注入の領域および注入の時間は、患者の年齢および健康状態、採取される組織の量ならびに脂肪収集領域の位置のような操作の状況に依存する。代表的には、数ミリリットルの溶液が、採取が行われる約３０分〜１時間前に注入される。標準的なシリンジおよび注入針がこの手順に用いられる。それは、回収された試料の均質性を改善させるようであるが、十分な微小血管内皮細胞収率が、流体の追加または採取前の外力の付加なしに得られ得る。
脂肪組織の採取の準備が整ったと考えられると、カニューレ１４の少なくとも一部分が、患者の中の採取される脂肪組織の近くに挿入される。カニューレ１４の代表的なサイズおよびその相対的に平滑な遠位先端部４０を考慮すると、通常、挿入用の小さな切開部が患者の皮膚に形成される。挿入に続いて、遠位カニューレ先端部４０、より詳しくは、開孔部または複数の開孔部１６が、脂肪組織が採取される領域まで進む。上記のように、脂肪組織は、通常、腎周組織脂肪、皮下脂肪、網または腹膜腔に付随する脂肪から取られる。収集装置１０の軽量および相対的に小さなサイズを考慮すると、操作する医師は、ほとんど問題なく、思いどおりにカニューレ１４を案内し、そしてそれを適切な位置に正確に配置する。
患者の体内へのカニューレ１４の挿入および配置の間に、プランジャー２８および移動可能のピストン２２は、中空の管状本体１８に完全に挿入されることに留意することが重要である。つまり、移動可能なピストン２２の前面５０が、入口ポート２４に隣接する中空の管状本体１８の前端部に対して、同一平面上に着座する。同時に、任意の固定機構３４が、中空の管状本体１８の内面によって、閉鎖位置に保持される。十分に前方位置にある移動可能なピストン２２によって実質的な量の流体および他の体内の材料が、カニューレ１４およびシリンジアセンブリ１２に入るのを防ぐ。カニューレ１４が適切に配置され、そして医師が開孔部１６を取り囲む脂肪組織の採取を開始する用意が整うまで、移動可能なピストン２２はこの形態で保持される。
微小血管内皮細胞が豊富な脂肪組織の採取を開始するために、周囲圧力以下の圧力がカニューレ１４に付与される。代表的には、プランジャー２８および取り付けられたピストン２２が、オペレーターによって、中空の管状本体１８に沿ってゆっくりと引かれる。所望であれば、任意の固定機構３４が、引かれた形態および周囲圧力以下の圧力を維持するために、環状フランジ３８に係合し得る。ピストン２２の前面５０および中空の管状本体１８によって規定される密封された容量の増加により、シリンジアセンブリ１２中に周囲圧力以下の圧力が生成される。これが、今度は、入口ポート２４を通じて、中央腔２０と緊密な流体導通関係にあるカニューレ１４の管腔２６に吸い上げを生成する。収集先端部で均一な高い吸い上げ力を維持していた先行技術の吸い上げポンプとは違って、本発明は、簡単かつ即座に調節可能な穏やかな周囲圧力以下の圧力を提供する。収集装置１０の「感じ」または採取されている脂肪組織の外観を判断して、オペレーターは、プランジャー２８が中空の管状本体１８から引かれる量を調節することによって、開孔部１６に付与される吸い上げを弱め得る。プランジャー１８を押すことによって吸い上げが減少し、その一方それをさらに引くことによって（ピストン２２の中空の管状本体１８への密封可能な配置を維持しながら）、開孔部での吸い上げが急速に増加する。あるいは、オペレーターは、開孔部１６で安定な吸い上げを維持するために、単に、固定機構３４に依存し得る。
簡単に制御可能な周囲圧力以下の圧力は、開孔部１６に特徴的な好適な組織切断と組み合わさって、加工のためのより清潔なより均質な脂肪組織を提供する。妨害する結合組織は、細胞成分の統合性を維持しながら破壊するのが好ましい。さらに、オペレーターがカニューレ１４の位置を簡単にかつ効率的に調節し得るので、汚染度がより高い領域を回避し得、得られる組織の純度がさらに高まり得る。万一、開孔部１６またはカニューレ１４の妨害の問題があれば、オペレーターは、わずかに前へプランジャー２８を押して、カニューレおよび開孔部へ陽圧を付与することによって、その妨害を除去し得る。最後に、プランジャーがオペレーターの直接制御下にあるので、収集される脂肪組織の量は、より精密に制御され得る。
所望量の均質な脂肪組織の採取および収集装置１０の圧力平衡に続いて、カニューレ１４が、患者の最初の挿入部位から、好適には、無菌状態を維持しながら取り出される。先に議論したように、収集された脂肪組織の実際の量は、必要とされる微小血管内皮細胞の数および収集装置１０の容積を含む多数の要因に依存する。代表的な容量は約１０ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲であり、平均容量は約４０ｍｌ〜約６０ｍｌの範囲である。もちろん、当業者は、より小さなまたはより大きな容量が、本発明の方法を用いて、微小血管内皮細胞または他の細胞成分の精製のために収集され得ることを認識する。カニューレ１４が患者から取り出された後、通常、洗浄および再滅菌のために採取された組織を含んでいるシリンジアセンブリ１２から外される。
この時点で、採取された組織は、さらに加工されまたは後の使用のために貯蔵され得る。貯蔵のために、通常、組織は、それを採取ポート２４を通じ、次いで冷却され得る別の容器に射出することによって、シリンジアセンブリ１２から取り出される。加工のためには、収集された組織は、同様に、本明細書に参考として援用される、同時継続中の米国特許出願第08/086,778号に記載されているような微小血管細胞単離装置に移され得る。次いで、所望の同定可能な細胞成分は、消化および他の先に議論された手順を用いて、脂肪組織から分離される。
あるいは、本発明の教示に従って、採取された脂肪組織は、リンスおよびホモゲナイズのために、シリンジアセンブリ１２を用いてさらに加工され得る。例えば、水または他の水性溶液が、収集された試料を含む中央腔２０に注入され撹拌され得る。その後、好適には、シリンジスタンド（図示せず）で混合物を沈降させ、そして分離する。脂肪細胞および圧倒的に多数の微小血管内皮細胞を含む付随する組織は浮遊し、その一方結合組織、赤血球および他の異物は、沈むかまたは水性溶液に溶解する。次いで、リンスされた脂肪細胞および付随する組織は、デカンテーションされ得る。もちろん、この工程は、必要な回数だけ繰り返され得る。
別の手順では、採取された組織は、同時にホモゲナイズとリンスを行い得る。図３を参照すると、採取された組織を含むシリンジアセンブリ１２は、フィルターハブアセンブリ６０に着脱可能に取り付けられる。好適には、シリンジアセンブリ１２と同じサイズの第２のシリンジアセンブリ２１２がフィルターハブアセンブリ６０の対向する側に着脱可能に取り付けられる。明確化のために、先にシリンジアセンブリ１２に用いられた参照番号が、以下の議論において用いられる。シリンジアセンブリ２１２の対応する構成要素は、同じ参照番号の頭に２を有して用いられる。
図示される実施形態において、シリンジアセンブリ１２および２１２は、それらのそれぞれの前端部に配置されるテーパー状の先端部３０および２３０を有するToomey型のシリンジである。しかし、先に議論したように、多くの型のコネクターが、本発明の教示に従って用いられ得る。従って、フィルターハブアセンブリ６０と着脱可能に係合すれば、任意のタイプの先端部も用いられ得る。
フィルターハブアセンブリ６０は、着脱可能に係合され得る雄ネジ６６および雌ネジ６８を用いて係合され得る雄ハブ６２および雌ハブ６４を備える。そのように係合されると、雄ハブ６２および雌ハブ６４は、協動して通路７０を規定する。通路７０は、テーパー状の先端部３０とテーパー状の先端部２３０と着脱可能に係合するようにされた対向する面に開口部を有するフィルターハブアセンブリ６０を横切り、それによってシリンジアセンブリ１２およびシリンジアセンブリ２１２が、互いに密封された流体導通関係で配置される。図４により明確に示されるように、フィルター部材７４は、フィルターが、係合している雄ハブ６２と雌ハブ６４によって課された圧縮力によって定位置に置かれるので、それを横切っている通路７０の軸上に配置される。通路７０を横切ることによって、フィルター７４が、それを通じる組織または流体のいかなる流れも阻止する。フィルター部材７４に隣接する弾性グロメット７２により、確実に、ハブアセンブリ６０が密閉して係合される。
フィルター部材７４は、矢印線７８が示す中央部分を有する平らな半径方向に円盤状である構造である。中央部分７８に位置する多数のフィルター開孔部８０は、フィルター７４の厚さを横切り、それによって材料の通過を可能とする。例示の実施形態は、約１ｍｍの直径を有するフィルター開孔部８０を有する、外径が２４ｍｍのフィルター部材７４を用いる。図４は、また、フィルター部材７４を囲んでいる雌ハブ６４を示す。もちろん、当業者は、所望のホモゲナイズの量に依存して、他の開孔部直径が用いられ得ることを認識する。
代表的には、フィルター部材７４は、ステンレス鋼のような、耐久性の再滅菌可能な金属合金から形成される。しかし、先に議論したように、脂肪組織を加工するための金属構成要素の使用は、金属合金が本質的に高い表面エネルギーを有するので、生存微小血管内皮細胞の収率にとって不都合であり得る。従って、もし、フィルター７４が、表面エネルギーの低い材料から形成されるか、または、金属が用いられる場合、パリレンなどの材料でコーティングされるのが好ましい。低い表面エネルギーは、つまり、その材料は、金属に比べて電気化学的エネルギーが低いということを意味する。本発明を実施するために用いられ得る低い表面エネルギーおよび良好な生体適合性を有する材料の例は、ポリエチレン、パリレン、ポリプロピレン、ナイロンおよび他のフルオロポリマーを含むが、これに限らない。
選択された開孔部１６のサイズおよび形態は、脂肪組織の相対的に均質な試料を生成するが、脂肪マトリックスの結合組織を破壊するためのさらなるホモゲナイズが、もし穏やかに行われれば、細胞収率を改善し得る。上で示したように、収集された脂肪材料は、採取に続いて、シリンジアセンブリ１２に保持される。この材料は、その天然の採取された状態であり得るかまたは上記のようにリンスされ得る。必要に応じて、液体が、収集された材料に添加され得る。通路７０を横切って配置されるフィルター部材７４を有するフィルターハブアセンブリ６０が、テーパー状の先端部３０に着脱可能の係合される。シリンジアセンブリ２１２は、同様に、シリンジアセンブリ１２の対向する側のフィルターハブアセンブリ６０に取り付けられる。このように接続されると、シリンジアセンブリ１２は、通路７０を通じてシリンジアセンブリ２１２と密封された流体導通関係にある。
次いで、プランジャー２８は、採取された脂肪組織およびテーパー状の先端部３０によって規定される採取ポート２４から添加された任意の液体を放出するために、中空の管状本体１８中に前方向に押される。次いで、射出された材料は、フィルター部材７４のフィルター開孔部８０を通過する通路７０を横切り、その後シリンジアセンブリ２１２によって受け入れられる。脂肪組織が、適切なサイズのフィルター開孔部８０を押し通されるので、結合マトリックスは、付随する同定可能な細胞成分を過度の剪断力に曝すことなく破壊される。これが、今度は、収集された材料の粘性を低下させ、異物を簡単に除去させ、および試料のその後の消化が改善し、そして内皮細胞の最終的な収率を増大させる。濾過され採取された脂肪組織が、テーパー状の先端部２３０を通ってシリンジアセンブリ２１２に入るにつれ、陽圧の転置によりプランジャー２２８が中空管２１８の後方に押しやる。もちろん、シリンジアセンブリ２１２からシリンジアセンブリ１２へ組織を移動させるためにこの操作を逆にすることによって、この手順が繰り返され得る。
本発明の方法によって提供される微小血管内皮細胞の改善された収率が、以下の制限されない実施例で説明される。
実施例１
ヒト脂肪組織を白人女性の腿部から収集した。様々なサイズおよび形態の開孔部を有する４つの異なる商業的に入手可能なカニューレを用いて、実験の約３０〜６０分に行う採取手順で腿から脂肪を引き抜いた。次いで、各型のカニューレによって収集された試料を別々に加工した。
各場合において、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水で簡単に脂肪組織をリンスした。次いで、採取された材料の試料の１つを、１ｍｍのフィルター開孔部を間に挟んだフィルター部材を有する２つのシリンジの間に組織を走行させることによってホモゲナイズした。次いで、１０グラムの各脂肪試料および１０ｍｌのコラゲナーゼ溶液（４ｍｇ／ｍｌ、Boehringer Mannheim）を５０ｍｌのErlenmeyerフラスコ中で組み合わせ、そして撹拌器に置き毎分１００サイクルで２０分間３７℃でインキュベートした。
次いで、得られた消化スラリーを１５ｍｌの円錐形の遠心分離管に注ぎ、そして１８００ｒｐｍで７分間遠心分離した。
内皮細胞および赤血球が、円錐形の遠心分離管の底に沈殿した。暗色のコラゲナーゼ溶液が中間層を形成し、そして不溶性の脂肪および付随する脂肪組織が遠心分離管の上部にプラグを形成した。暗色のコラゲナーゼ溶液と脂肪の両方を廃棄した。
ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水中の１０ｍｌの０.１％ウシ血清アルブミンを用いて、内皮細胞ペレットを再懸濁し、新たな滅菌した円錐形の遠心分離管にプールし、そして１８００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして内皮細胞ペレットを、ヒト血液血清で芝付け（Sodding）するためにＦＤＡ認可媒体であるPlasma-Lyte▲Ｒ▼（Baxter Healthcare Corporation）中の１４％ヒト血清で再懸濁した。
各場合においてこの溶液の最終容量は約９ｍｌであった。得られた内皮細胞懸濁液の各々の０.２ｍｌを、Isoton▲Ｒ▼溶液（Baxter Scientific Products）で２０ｍｌに希釈した。各懸濁液の細胞収率および細胞のサイズをCoulter Multisizer IIを用いて測定した。細胞収率を脂肪単位グラム当たりに回収された（７.７８μｍより大きい）細胞の数と定義した。この時点で細胞の生存率を詳細に調べなかったが、細胞の収率を設計の適切性の指標として用いた。ウエルプレート上の単離された細胞の粘着性を調べると、場合に応じてかなり良好な結果が得られた。
異なるシリンジおよびカニューレの形態の結果を以下の表１に示す。
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これらのデータは、明らかに、本発明の方法の使用による、同定可能な細胞収率の改善を示している。特に、この結果は、適切な開孔部サイズおよび形態の選択が、所与の脂肪組織供給源からの微小血管内皮細胞の収率を増加させ得ることを示している。例えば、直径３ｍｍのかなり丸い開孔部を有するCurret Specialの使用は、直径３ｍｍの、輪郭をはっきり付けた組織切断縁部を備えた開孔部を有するMercedesを用いて得られた生存細胞成分の約半分しか生産しなかった。さらに、カニューレ直径単独が、細胞収率を増大させる決定的な基準ではないことに留意することが重要である。これは、３.７ｍｍのMercedesまたは３ｍｍのCurret Specialのいずれの使用も、組織破壊能力がより良い開孔部を有する１.５ｍｍのLuerロックカニューレによって提供される生存細胞の約７０％しか提供しなかった事実によって示される。最後に、このデータは、本発明の教示に従って採取された脂肪組織をホモゲナイズすることによって、微小内皮細胞収率が実質的に増大させ得ることを示す。例えば、試料を同一の３.７ｍｍのMercedesカニューレを用いて収集し、１ｍｍのフィルター開孔部を有するフィルター部材を通じて試料を４回通過させることにより脂肪組織をホモゲナイズする場合、生存細胞の収率が４０％以上増大した。このような細胞収率の増大は、成功した内皮細胞形成と、生命を脅かす血餅の形成に到達し得る合成移植片の不完全なコーティングとの相違であることが容易に証明される。
当業者は、本発明がその精神または中心思想から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得ることをさらに認識する。本発明の上記の説明が、単にその例示の実施形態を開示しているという点で、他の改変例が、本発明の範囲内にあると認識されることを理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に詳細に記載された特定の実施形態に制限されない。むしろ、本発明の範囲および内容を限定する添付の請求項を参照すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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