(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸から成るＩＳＤコア領域のアミノ酸配列を決定し、決定されたアミノ酸配列を、Thr His His Asp からなる配列と比較する工程を含む、ジェノタイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに対するインターフェロンによる治療の有効性の判定方法。
【請求項２】
前記ＩＳＤコア領域をコードする領域又は該コード領域に相補的な領域を少なくとも含む核酸断片を増幅し、増幅された核酸断片の塩基配列を決定することにより該増幅断片がコードするアミノ酸配列を決定する工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＳＤコア領域と、その両側にそれぞれ隣接する領域であって塩基配列決定のためのプライマーがハイブリダイズする領域とを含む核酸領域を増幅する請求項２記載の方法。
【請求項４】
決定されたアミノ酸配列が、Thr His His Asp からなる配列と何か所相違しているかを調べる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域をコードする領域又は該コード領域に相補的な領域を少なくとも含む核酸領域を増幅するために用いられ、請求項１記載の方法を行なうためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列表の配列番号１６〜１９、２４、２５のいずれかに示される塩基配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
ジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域をコードする領域及びその両側に隣接する領域を含む領域を増幅し、かつ、塩基配列決定するために兼用される、請求項１記載の方法を行なうためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列表の配列番号２０〜２３、３２〜３４のいずれかに示される塩基配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
【０００１】
本発明は、ジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ−１ｂ」ということがある）に対するインターフェロンによる治療の有効性の判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロンはＣ型慢性肝炎に対する１つの根治療法である。しかしながら、同じジェノタイプ１ｂに属するＨＣＶであっても、インターフェロン投与により根治される著効例と全く効かない無効例が存在し、また、その中間型も存在する。従来、同一のジェノタイプの属するＨＣＶのインターフェロンに対する感受性を規定している因子としては、血中ＨＣＶ量、組織学的進行度、ＨＣＶ遺伝子の多様性が示唆されているが、これらの背後にある根本的な原因は解明されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
もし、ＨＣＶ−１ｂのインターフェロン投与等の治療に対する感受性を診断することができれば、インターフェロンを投与すべきか否かを知ることができ、インターフェロンが効かないにもかかわらずインターフェロンを投与するという無駄な治療を避けることができ有利である。
【０００４】
従って、本発明の目的は、ＨＣＶ−１ｂに対する治療の有効性を判定する方法を提供することである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＣＶ−１ｂの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸の配列、特に第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸の配列がインターフェロンに対する感受性に深く関係していることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、試料中のジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸から成るＩＳＤコア領域のアミノ酸配列を決定し、決定されたアミノ酸配列を、Thr His His Asp からなる配列と比較する工程を含む、ジェノタイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに対するインターフェロンによる治療の有効性の判定方法を提供する。さらに、本発明は、ジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域をコードする領域又は該コード領域に相補的な領域を少なくとも含む核酸領域を増幅するために用いられ、上記本発明の方法を行なうためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。さらに、本発明は、ジェノタイプ１ｂに属するＣ型肝炎ウイルスの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸から成るＩＳＤ領域をコードする領域及びその両側に隣接する領域を含む領域を増幅し、かつ、塩基配列決定するために兼用される、上記本発明の方法を行なうためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の判定方法によりＨＣＶ−１ｂに対する治療の有効性が判定されるインターフェロンは、特に限定されず、例としてインターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンベータ及び天然型インターフェロンαを挙げることができる。
【０００９】
本願発明者らは、多数のＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎患者の血清試料中のＨＣＶ−１ｂのアミノ酸配列を決定し、これらとインターフェロン投与の有効性との関係を綿密に比較検討した結果、ＨＣＶ−１ｂの第２２０９番目から第２２４８番目のアミノ酸（本明細書において、この領域を「ＩＳＤＲ」（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）又は「ＩＳＤ領域」と言う）の配列、特に第２２１７番目から第２２２０番目のアミノ酸（本明細書において、この領域を「ＩＳＤコア領域」という）の配列がインターフェロン感受性に深く関係しており、この領域を調べることによりインターフェロン投与の有効性が判定可能であることを見出した。なお、ＨＣＶ−１ｂのアミノ酸配列及びそのナンバリングはＫａｔｏ，  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９９０；８７  ９５２４−８に記載されている。
【００１０】
すなわち、野生型のＨＣＶ−１ｂでは、上記ＩＳＤＲのアミノ酸配列が配列表の配列番号１に示す配列であり、この場合にはインターフェロン投与が無効である（著効率０％）ことを見出した。また、ＩＳＤＲのアミノ酸配列が、配列番号１で示す配列からはずれるほどインターフェロン投与が著効となる確率が大きく、４個以上のアミノ酸残基が相違する場合には、７０症例を調査した下記実施例では、インターフェロン治療の著効率が１００％に達した。相違するアミノ酸残基の数が１〜２個の場合（３個の場合はなかった）はこれらの中間であり、下記実施例では著効率は１３％であった。また、２０症例について調べた別の実施例では、相違するアミノ酸残基数が３以上で著効率１００％、１〜２で著効率約１３％、野生型で無効率１００％（著効率０％）となった。なお、ここで言う、アミノ酸残基の相違の態様としては、置換のみならず、挿入、欠失及び終止コドンとなったものも含まれる。
【００１１】
従って、試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤＲのアミノ酸配列を決定し、これを配列番号１に示す配列と同一か否かを調べることにより、インターフェロン治療が有効となる可能性があるか否かを知ることができる。さらに、配列番号１の配列との相違アミノ酸数を数えることにより、インターフェロン治療が著効となる確率も見積もることができる。
【００１２】
さらに、インターフェロン治療が著効となる場合のＩＳＤＲの部分配列の例が明らかになった。これらの配列を配列表の配列番号２〜１４に示す。従って、試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤＲのアミノ酸配列が、配列番号２〜１４の配列のいずれかと同じであれば、インターフェロン治療が著効となる可能性が高いと判定される。
【００１３】
上記ＩＳＤＲの中でも、第２２１７番目から第２２２０番目までの４個のアミノ酸（本明細書において、この領域を便宜的に「ＩＳＤコア領域」という）の配列が特に重要であることが見出された。ＩＳＤコア領域が野生型の場合、すなわち、Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  （配列番号１５）の場合には、インターフェロン治療が無効であり、ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列がこの配列と相違しているとインターフェロン治療が著効になる可能性がある。そして、ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列が野生型の配列と異なるアミノ酸残基の数が増えるほどインターフェロン治療が著効になる可能性が高くなる。合計５６症例を調べた下記実施例では、ＩＳＤコア領域の４個のアミノ酸のうち、３個以上が異なる場合にはインターフェロン治療の無効率は０％（著効率１００％）、２個の場合は１６．７％、１個の場合には６２．５％、野生型の場合には１００％であった。
【００１４】
従って、試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤコア領域のアミノ酸配列を決定し、これを配列番号１５に示される野生型の配列と同一か否かを調べることにより、インターフェロン治療が有効となる可能性があるか否かを知ることができる。さらに、配列番号１５の配列との相違アミノ酸数を数えることにより、インターフェロン治療が著効となる確率も見積もることができる。
【００１５】
なお、本願発明者らは、ＨＣＶ−１ｂのアミノ酸配列のうち、上記ＩＳＤＲ（ＮＳ５Ａ領域中に存在）の他に、超可変領域（ＨＶＲ）にも各症例毎にアミノ酸の変異が見られることを観察した。ＨＶＲはＨＣＶ−１ｂの株により配列が高頻度で異なっていることが知られている領域である。しかしながら、ＨＶＲにｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  しかなくても（すなわちコードされるアミノ酸配列は同じでも）インターフェロン感受性が異なるＨＣＶ−１ｂが存在し、また、配列とインターフェロン感受性との関連が見られないことから、ＨＶＲがインターフェロン感受性を直接決定している可能性はないと判断した。従って、インターフェロン感受性は、上記ＩＳＤＲにより決定されることが明らかになった。
【００１６】
ＨＣＶ−１ｂゲノムの塩基配列は既に公知であるので、ＩＳＤＲ又はＩＳＤコア領域のアミノ酸配列を決定することは常法により容易に行うことができる。例えば、ＩＳＤＲ又はＩＳＤコア領域をコードする領域又は該コード領域に相補的な領域を少なくとも含む核酸断片を増幅し、増幅された核酸断片の塩基配列を決定し、その塩基配列に基づきコードされるアミノ酸配列を決定することができる。核酸の増幅は、例えば周知のＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により行うことができる。ＰＣＲ法自体はこの分野において周知であり、それを行うためのキットや装置も市販されている。また、塩基配列の決定も、ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法等により、市販のシーケンサーを用いて行うことができる。なお、ＨＣＶのゲノムはＲＮＡであるので、ＰＣＲによるＩＳＤ領域の増幅は、先ず、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを増幅することにより行うことができる（ＲＴ−ＰＣＲ）。また、異なるプライマー対を用いてＰＣＲを２回又はそれ以上行うことにより増幅の特異性をさらに高めることができる。
【００１７】
増幅に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＨＣＶ−１ｂゲノムのＩＳＤＲ又はＩＳＤコア領域を特異的に増幅できるものであれば特に限定されるものでなく、通常１５〜４０塩基程度の長さを有する。本発明は、このようなプライマーをも提供するものである。
【００１８】
従来、増幅産物の塩基配列を決定する場合には、目的の領域のみを増幅し、得られた増幅産物の端部に塩基配列決定用のプライマーをハイブリダイズさせて塩基配列を決定している。本発明でもこの方法を適用することが可能である。しかしながら、ＩＳＤＲは症例毎に変異している可能性の大きな領域であるから、ＩＳＤＲ内部に塩基配列決定用のプライマーをハイブリダイズさせようとするとうまく塩基配列が決定できない場合もある。従って、ＩＳＤＲをその両側にそれぞれ隣接する領域と共に増幅し、ＩＳＤＲの外部の領域に塩基配列決定用のプライマーをハイブリダイズさせることが好ましい。このような増幅に用いられるプライマーの具体例として、配列番号１６〜２５で示される配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができるがこれに限定されるものではない。これらのうち、配列番号２０〜２３で示されるものは、増幅用プライマーと、配列番号２６で示される配列又は配列番号２７で示される配列を有する塩基配列決定用プライマーを結合したものであり、これらは、増幅用プライマー及び塩基配列決定用プライマーとして兼用することができる。上記増幅用プライマーに結合される塩基配列決定用プライマーとしては、上記のものの他に配列番号２８〜３１に示される塩基配列を有するものも挙げられる。従って、増幅及び塩基配列決定兼用プライマーとしては、例えば配列番号２８で示される塩基配列決定用プライマーと配列番号２４で示される増幅用プライマーとを結合して得られる、配列番号３２で示されるプライマー；配列番号２９で示される塩基配列決定用プライマーと配列番号２５で示される増幅用プライマーとを結合して得られる、配列番号３３で示されるプライマー；及び配列番号３１で示される塩基配列決定用プライマーと配列番号２４で示される増幅用プライマーとを結合して得られる、配列番号３４で示されるプライマーを挙げることができる。なお、下記実施例においては、配列番号３４で示されるプライマーはその５’末端がビオチン標識されたものである。これらの具体的なプライマーは下記実施例において用いられるので、各プライマーの名称と配列番号を下記表１にまとめておく。
【００１９】
【表１】
0003629372.tif 000002
【００２０】
ＩＳＤＲ又はＩＳＤコア領域のアミノ酸配列が、配列番号１又は１５に示す野生型のものと一致しているか否かを調べる方法は、上記のようにこれらの領域のアミノ酸配列を決定する方法に限定されるものではない。例えば、野生型ＩＳＤＲ又はＩＳＤコア領域と特異的に反応するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、試料中のＨＣＶ−１ｂが野生型か否かを判定することもできる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）  ＲＮＡの精製
７０例のＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎患者血清各１００μｌにＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、ＢＩＯＴＥＸ  ＬＡＢ社製）９００μｌ、クロロホルム１５０μｌを加え、２ｍｌのエッペンドルフチューブ中１５秒間攪拌後、４℃で５分間放置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、これにイソプロパノールを６５０μｌ加え攪拌し、１５分間放置後、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、沈殿を得た。さらに１ｍｌの７５％エタノールを加え攪拌後１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し上清を捨てた。この操作をさらに２回繰り返した後、得られた沈殿を乾燥した。
【００２３】
（２）  ｃＤＮＡ合成
精製したＲＮＡに５ｘＲＴバッファー２μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、ランダムプライマー（２６０ｎｍにおける吸光度５、以下、このような場合「５  Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍ」と記載）１μｌ、ＤＥＰＣ処理水２μｌを加え、攪拌後、３７℃で４５分間加温しｃＤＮＡ合成を行った。
【００２４】
（３）  １回目のＰＣＲ
ＰＣＲはホットスタート法により行った。すなわち、０．６ｍｌのＰＣＲチューブにｌｏｗｅｒ  ｍｉｘ  （プライマーＨＣＶ−９とプライマーＨＣＶ−１０各２．５  Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍを０．５μｌずつ、１０ｍＭｄＮＴＰ  １μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ、滅菌ＭＱ水５μｌ）を１０μｌとり、ａｍｐｌｉｗａｘ１００（商品名、パーキンエルマー社製）を１粒加え、９０℃で１分間加温後、２５℃で３分間放置し膜を作った。この膜の上にｕｐｐｅｒ  ｍｉｘ  （１０ｘＰＣＲバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ（ｐＨ８．３））５μｌ、滅菌ＭＱ水３５μｌ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、プロメガ社製）０．２μｌ）と先のｃＤＮＡを１μｌ加え、以下のプログラムでＰＣＲを行った。
サーマルサーキュラーＰＪ９６００（商品名、パーキンエルマー社製）を用いた場合：
９４℃  ２０秒（変性）
５５℃  ２０秒（アニーリング）
７７℃  ２０秒（伸長）
３５サイクル
サーマルサーキュラーＰＪ２０００又は４８０（商品名、パーキンエルマー社製）を用いた場合：
９４℃  ６０秒（変性）
５５℃  ６０秒（アニーリング）
７７℃  ６０秒（伸長）
３５サイクル
【００２５】
（４）  ２回目のＰＣＲ
ＰＣＲはホットスタート法により行った。すなわち、０．６ｍｌのＰＣＲチューブにｌｏｗｅｒ  ｍｉｘ  （プライマーＨＣＶ−Ｅ−ＳとプライマーＨＣＶ−Ｅ−ＡＳ各２．５  Ｏ．Ｄ．２６０ｎｍを０．５μｌずつ、１０ｍＭｄＮＴＰ  １μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３μｌ、滅菌ＭＱ水５μｌ）を１０μｌとり、ａｍｐｌｉｗａｘ１００（商品名、パーキンエルマー社製）を１粒加え、９０℃で１分間加温後、２５℃で３分間放置し膜を作った。この膜の上にｕｐｐｅｒ  ｍｉｘ  （１０ｘＰＣＲバッファー５μｌ、滅菌ＭＱ水３５μｌ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、プロメガ社製）０．２μｌ）と先の１回目のＰＣＲ産物を１μｌ加え、１回目のＰＣＲと同じプログラムでＰＣＲを行った。
【００２６】
（５）  ＰＣＲ産物の精製
クイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）（商品名、ベーリンガーマンハイム社製）を用いて２回目のＰＣＲ産物を精製した。
【００２７】
（６）  塩基配列決定
ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法を用い、３７３Ａオートシークエンサー（商品名、パーキンエルマー社製）で塩基配列を決定した。反応はＰＲＩＳＭキット（商品名、パーキンエルマー社製）を用い、反応混合物９．５μｌ、配列番号２６で示される塩基配列を有する塩基配列決定用プライマーＳ  ３．２ｐｍｏｌ、精製した２回目のＰＣＲ産物を５．０μｌ、ＭＱ水４．５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ中で、以下のプログラムでＰＣＲを行った。すなわち、サーマルサーキュラーＰＪ９６００（商品名、パーキンエルマー社製）を用いて９６℃  １５秒、５０℃  １秒、６０℃  ４分間で２５サイクル行った後、４℃で次の操作まで放置した。上記反応液２０μｌをクイックスピンカラムＧ５０（ＴＥ）で精製後、乾燥し、３７３Ａオートシークエンサー（パーキンエルマー社製）で６％アクリルアミド（１９：１）を用い電気泳動を行い、ＩＳＤＲを含む断片の塩基配列決定を行った。得られた塩基配列をアミノ酸に変換後、ＩＳＤＲの４０アミノ酸について、配列番号１に示す野生型のＩＳＤＲと比較した。
【００２８】
一方、各患者にはインターフェロンαを６カ月間にわたり総投与量５１６〜８８０ＭＵで投与した。治療後６カ月間にわたり、血中ＨＣＶ−ＲＮＡの存否及びＧＰＴ値（ＵＶ法）を測定した。血中ＨＣＶ−ＲＮＡ濃度はｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ（Ｌａｎｃｅｔ，  １９９３，  ３４１：１５０１−１５０４）により測定した。また、ＧＰＴ値は、ＪＳＣＣ準拠処方試薬を使用し、測定温度３７℃で測定した。治療後６カ月間にわたり、血中ＨＣＶ−ＲＮＡ陰性、ＧＰＴ正常となったものを著効、それ以外を無効とした。
【００２９】
結果を図１及び図２に示す。図１及び図２から明らかなように、ＩＳＤＲが野生型のものは著効率が０％であり、野生型とアミノ酸が１個又は２個異なっているものは著効率が１３％であり、４個以上異なっているものは著効率が１００％であった。なお、年令、性別、組織型インターフェロンの総投与量、治療前のＧＰＴ値には有意の差は認められなかった。従って、ＩＳＤＲの配列が野生型と同じか否かを調べることにより、インターフェロン治療が無効か否かを知ることができる。また、野生型と異なるアミノ酸残基の数を調べることにより、インターフェロン治療が著効を示す確率を見積もることができる。
【００３０】
また、上記検査により判明した著効例のＩＳＤＲのアミノ酸配列のＮ末端から４０アミノ酸残基のアミノ酸配列を配列番号２〜１４に示す。試料中のＨＣＶ−１ｂのＩＳＤＲのアミノ酸配列がこれらの配列のいずれかと同じ場合には、インターフェロン治療が高い確率で著効を示すものと考えられる。
【００３１】
実施例２
７７例のＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎患者について、実施例１と同様な検査を行った（なお、インターフェロンの総投与量は３２４ＭＵ以上）。決定されたアミノ酸配列のうち、上記ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列を配列番号１５に示される配列、すなわち、Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  と比較し、変異しているアミノ酸残基の数を調べた。結果を表２及び表３に示す。なお、表２中、「変異型」とは、ＩＳＤコア領域の配列が野生型のものとはアミノ酸１つでも異なっているものを意味する。
【００３２】
【表２】
表２
0003629372.tif 000003
【００３３】
【表３】
表３
0003629372.tif 000004
【００３４】
表２及び表３から、ＩＳＤコア領域のアミノ酸配列が野生型の場合、インターフェロン治療が無効であることがわかる。また、野生型と相違するアミノ酸数が増えるほどインターフェロン治療の無効率が減少し、３個以上相違する場合には無効率が０％となることがわかる。
【００３５】
実施例３
２回目のＰＣＲに用いるプライマーを変更することを除き、実施例１と同様な検査を行った。２回目のＰＣＲには、ＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｓ及びＨＣＶ−ＩＳＤＲ−ＡＳを用いた。実施例１と同様、ＩＳＤＲを含む断片が増幅され、その塩基配列が決定された。
【００３６】
実施例４
２回目のＰＣＲ及び塩基配列決定に用いるプライマーを変更することを除き、実施例１と同様な検査を行った。２回目のＰＣＲには、ＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｔ７及びＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｒ２２を用いた。塩基配列決定には、Ｔ７２０及びＲ２２を用いた。実施例１と同様、ＩＳＤＲを含む断片が増幅され、その塩基配列が決定された。
【００３７】
実施例５
２０例のＣ型慢性肝炎患者血清（インターフェロン無効例１０、著効例１０）を用い、１回目のＰＣＲまでは実施例１と同様に行った。２回目のＰＣＲでは、プライマーとしてＨＣＶ−ＩＳＤＲ−４０−Ｂ及びＨＣＶ−ＩＳＤＲ−Ｒ２２を用い、その他は実施例１と同様に行った。２回目のＰＣＲ後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で５０μｌのＰＣＲ産物を２０μｌダイナビーズ（Ｍ２８０ストレプトアビジン；商品名、ベリタス社製、５０μｌのＴＮＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）でバッファー置換したもの）と混合し、３７℃で３０分間放置した。磁石を用い、５０μｌのＴＮＥでビーズを２回洗った。これに０．２ＮのＮａＯＨ  １０μｌを加え攪拌し、１０分間放置した。磁石を用いビーズと上清を分離し、上清１０μｌは３μｌのＨＣｌと１μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）で中和した。ビーズはＴＥで１回洗い、１３μｌのＭＱ水に溶解した。中和した上清はプライマーＴ７２０で、ビーズはＲ２２を用いて塩基配列決定を行った。塩基配列決定は、ＡＵＴＯ  ｒｅａｄ  １０００（商品名、ファルマシアバイオテク社製）及びＡＬＦｒｅｄオートシークエンサー（商品名、ファルマシアバイオテク社製）を用い、常法で行った。得られた塩基配列をアミノ酸配列に変換後、ＩＳＤＲ配列と比較した。インターフェロン無効例では、野生型配列と比べ変異はなく、著効例では３〜６のアミノ酸の変異が検出された。従って、変異が全くなければ無効例、変異が３以上で著効例と診断できた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、ＨＣＶ−１ｂに対するインターフェロン治療が有効か否かの判定が可能になった。本発明により、インターフェロン治療が無効な患者に対してインターフェロン治療を行うという無駄がなくなる。従って、本発明はＨＣＶ−１ｂによるＣ型慢性肝炎の治療に貢献するものと期待される。
【００３９】
【配列表】
0003629372.tif 000005
0003629372.tif 000006
【００４２】
0003629372.tif 000007
【００４３】
0003629372.tif 000008
【００４４】
0003629372.tif 000009
【００４５】
0003629372.tif 000010
【００４６】
0003629372.tif 000011
【００４７】
0003629372.tif 000012
【００４８】
0003629372.tif 000013
【００４９】
0003629372.tif 000014
【００５０】
0003629372.tif 000015
【００５１】
0003629372.tif 000016
【００５２】
0003629372.tif 000017
【００５３】
0003629372.tif 000018
【００５４】
0003629372.tif 000019
【００５５】
0003629372.tif 000020
【００５６】
0003629372.tif 000021
【００５７】
0003629372.tif 000022
【００５８】
0003629372.tif 000023
【００５９】
0003629372.tif 000024
【００６０】
0003629372.tif 000025
【００６１】
0003629372.tif 000026
【００６２】
0003629372.tif 000027
【００６３】
0003629372.tif 000028
【００６４】
0003629372.tif 000029
【００６５】
0003629372.tif 000030
【００６６】
0003629372.tif 000031
【００６７】
0003629372.tif 000032
【００６８】
0003629372.tif 000033
【００６９】
0003629372.tif 000034
【００７０】
0003629372.tif 000035
【００７１】
0003629372.tif 000036
【００７２】
0003629372.tif 000037
【００７３】
0003629372.tif 000038
【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＳＤＲの配列とインターフェロン投与の効果を示す図である。
【図２】ＩＳＤＲの配列とインターフェロン投与の効果を示す図である。
【図１】
0003629372.tif 000039
【図２】
0003629372.tif 000040