(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表されるオリゴチオフェン誘導体から成ることを特徴とする核酸処理剤。
【化１】
0003698570.tif 000004
（式（１）中、ｎは３から１２の整数を示し、Ｍｅはメチル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡなどの核酸に作用、結合してその分析、変性化などの処理に使用されるのに好適な核酸処理剤に関する。
【０００２】
【従来の技術と課題】
遺伝子操作技術の発達は、医学、化学、農学、生物学などの分野において基礎研究および応用の両面から多大の貢献をもたらしている。この遺伝子操作における基本的で重要な手法の一つは、ＤＮＡのような核酸の存在を分析したり、その性質（機能）を変化させることである。
【０００３】
最近、このような目的に用いられる核酸処理剤（核酸処理物質）が幾つか案出されており、その代表的なものはポリピロールまたはポリチオフェンのような合成ポリマーないしは合成オリゴマーを基本とするものである。
【０００４】
例えば、「H. K. Youssoufi 他によるJ. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 7388-7389 」および「P. Baeuerle 他によるAdvanced Materials, 1998, 3, 324-331」には、対象とするＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドで機能化されたポリピロールまたはポリチオフェンから成るＤＮＡ処理剤（ＤＮＡ検出剤）が記載されている。このＤＮＡ検出剤は、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を含むもので特定の配列のＤＮＡに対する選択性は高いが、対象とするＤＮＡが異なれば別異のオリゴヌクレオチドをポリピロールまたはポリチオフェンに付加しなければならない点において合成が面倒である。
【０００５】
この文献に見られるように、これまで知られている核酸処理剤は、ＤＮＡのような核酸に作用してそれに結合する部位と、それとは別に、核酸との結合を物理シグナルとして検出するための標識（ラベル）とを備えるようにしたものである（上述の文献の例では、オリゴヌクレオチド鎖がＤＮＡと結合し、また、ポリピロール骨格またはポリチオフェン骨格が標識部分となり、ＤＮＡと結合したときの電気化学的変化を検出している。）したがって、核酸処理剤を合成するに当たって、結合部位を構成する化学種と標識を構成する化学種を反応させる工程が少なくとも必要であり、製造が簡単でないことが多い。また、標識に応じて各種の検出法が考えられているが、放射性同位元素を用いる方法のように特別の許可を必要とし環境や生体に及ぼす影響から好ましくないものもあり、さらには、核酸が実在するような水溶液条件下での検出に適合しない系も多い。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、如上のような状況下になされたものであり、その目的は、合成が容易であり、ＤＮＡのような核酸に作用、結合してその結果を簡単に検出することのできる新しいタイプの核酸処理剤（核酸結合剤）を提供することにある。
【０００７】
かくして、本発明に従えば、上記の目的を達成するものとして、下記の一般式（１）で表されるオリゴチオフェン誘導体から成ることを特徴とする核酸処理剤が提供される。
【０００８】
【化２】
0003698570.tif 000002
式（１）中、ｎは３から１６の整数を示す。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸処理剤を構成する式（１）で表されるオリゴチオフェン誘導体は、塩酸に溶解した後、中性付近のｐＨの緩衝液に容易に溶解してＤＮＡなどの核酸に作用、結合することが確認されている。すなわち、式（１）のオリゴチオフェン誘導体は、塩酸処理によって、保護基（ＴＨＰ：テトラヒドロピラン）が脱離され且つプロトン化されて次式（２）のようなＮ−メチルアンモニウムメチルオリゴチオフェンを生じるものと推測され、その正に荷電したアンモニウム置換基を介してＤＮＡなどの核酸に結合するものと解される。
【００１０】
【化３】
0003698570.tif 000003
【００１１】
このように、本発明の核酸処理剤を用いれば、アンモニウム置換オリゴチオフェン（ポリチオフェン）が、核酸に結合する部位とその結合を検出する標識の両方として機能する。したがって、本発明の核酸処理剤は、結合部位と標識とにそれぞれ相応する別異の化学種を導入するための格別の反応工程を必要とせず、図１に示されるような比較的単純な工程により合成することができ、また、核酸処理剤と核酸の相互作用（結合）の検出も簡単である（後述の実施例参照）。
【００１２】
本発明の説明に関連して用いる核酸とは、一般的には、ＤＮＡおよびＲＮＡを指称するが、ＤＮＡやＲＮＡと同様のホスホジエステル結合を有する天然または合成の類縁化合物にも本発明の核酸処理剤を適用することができる。式（１）のオリゴチオフェン誘導体から成る本発明の核酸処理剤は、上述したように、塩酸処理することにより、生理的条件に相応する水溶液中でこれらの核酸に作用し結合する。すなわち、ｐＨ７近傍においてＤＮＡのような核酸はそのリン酸部位が負に荷電（アニオン）するが、本発明の核酸処理剤から得られるアンモニウム置換オリゴチオフェンは該条件下で正に荷電（カチオン）している〔ｐＫａ（ＭｅＮＨ4 + ）＝１0.８〕ので、静電的相互作用により両者が結合するものと理解される。この相互作用は、ＵＶ法（紫外線吸収スペクトル法）やＣＤ法（円二色性スペクトル法）のような分光学的手段により検出することができる。
本発明のオリゴチオフェン誘導体は、式（１）においてｎが３〜１２であればＤＮＡなどの核酸に作用、結合し得ることが確認されているが、ｎが小さい方が検出感度も高くて好ましく、ｎが３〜４のポリチオフェン誘導体が特に好ましい。
【００１３】
本発明の核酸処理剤は、特定の核酸配列に対してではなく、ＤＮＡのような核酸の配列に対して非特異的に応答することが確認されている。アデニンおよびチミンを含有するＤＮＡに対する応答の方が、グアニンおよびシトシンを含有するＤＮＡに対する応答よりも高いことも見出されている。
【００１４】
このように本発明の核酸処理剤は、ＤＮＡのような核酸と結合することができ、その結合は分光学的手段により検出することができるので、核酸の存在を検出する分光試薬ないしはセンサー（定性および定量）として利用することができる。さらに、本発明の核酸処理剤は、ＤＮＡのような核酸と結合して該核酸を変性化することにより（例えば、その核酸を含む遺伝子の発現や細胞の増殖が抑制されるようにする）、各種の医薬品や試薬等の研究や開発に使用できる可能性も有している。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明の特徴を実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１：オリゴチオフェン誘導体の合成
図１に示す反応工程に沿って、以下のように本発明の核酸処理剤を構成するオリゴチオフェン誘導体（１）を合成した。
【００１６】
３−メチル−チオフェン（イ）の２位および４位を、臭素化剤として２倍等量のＮＢＳ（Ｎ−ブロモサクシンイミド）（４７％）および触媒として酢酸を用い臭素化して２，４−ジブロモチオフェン（ロ）を得た（工程Ｉ）。この臭素化チオフェン（ロ）にＮＢＳ／ＡｉＢＮ（２，２’−アゾビスイソブチロニトリル）を用いて３位がブロモメチル化された化合物（ハ）を得た（工程II）。次に、ＣＨ3 ＮＨ2 ／メタノール（４０％）を用い化合物（ハ）のブロモメチル基をアミノメチル基にした化合物（ニ）（工程III)を得た。
【００１７】
このアミノメチル誘導体（ニ）を２−クロロＴＨＰ（テトラヒドロピラン）／ｐ−ＴｏｓＯＨ（ｐ−トルエンスルホン酸）（７８％）を用いて保護することによりポリマー前駆体（ホ）を得た（工程IV）。このポリマー前駆体（ホ）にリチウム化剤としてブチルリチウムを用いてリチウム付加した後、架橋剤としてＺｎＣｌ2 を添加し、さらに、架橋触媒としてＮｉ（ｄｐｐｐ）Ｃｌ2 〔ｄｐｐｐは１，３−ビス（ジフェニルフォスフィノ）を示す〕を添加し重合反応（クロスカップリング反応）を行うことにより、所望のオリゴチオフェン誘導体（１）を得た（工程Ｖ）。
【００１８】
得られたポリチオフェン誘導体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 質量分析法により分析したところ、モノマー単位の数（ｎ）は３から１２（分子量は約６５０〜２５００）であることが見出された：ｍ／ｚ＝２５４４（１２）、２３２５（１１）、２１３７（１０）、１９２６（９）、１７１６（８）、１５０４（７）、１２７９（６）、１０７０（５）、８６０（４）、６５１（３）。（  ）内はｎの数を表す。
【００１９】
実施例２：オリゴチオフェン誘導体を用いる核酸分析
実施例１で得られたオリゴチオフェン誘導体を塩化メチレン（ＣＨ2 Ｃｌ2 ）を用いるソックスレー抽出（４８時間）により精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析したところ、ｍ／ｚ＝７９６であり、ｎ＝３〜４であることが確認された。このオリゴチオフェン誘導体0.２ｍｇ（モノマー単位として１０-3−１０-4ｍｍｏｌ）をＨＣｌに溶解させたところ、色が赤から黄色に変化した。これを蒸発乾固して黄かっ色の固形分を得た。該固形分を0.０１ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 ／ＮａＨ2 ＰＯ4 緩衝液（ｐＨ＝6.８）の３ｍｌに溶かした。式（１）のオリゴチオフェン誘導体の最大吸収波長が４４０ｎｍ（塩化メチレン中）であったのに対し、上記のように塩酸処理したオリゴチオフェン誘導体の緩衝溶液の紫外吸収スペクトルを測定したところ、最大吸収波長は３８５ｎｍに変化していた。これは、（１）のオリゴチオフェン誘導体の保護基（ＴＨＰ基）の脱離によりアンモニウム塩が生成し、カチオン間の静電反撥によりオリゴチオフェン骨格の共役系が弱まったためと推測される。
上記のようにＨＣｌに溶解させ、蒸発乾固して得られた固形分をリン酸緩衝液（ｐＨ＝6.８）に溶かして得られた溶液に、以下の３種類のＤＮＡサンプルを添加し、ＵＶ（紫外線）吸収スペクトルおよびＣＤ（円二色性）スペクトルの測定を行った。
【００２０】
（１）ウシ胸腺ＤＮＡ（２００〜６０００塩基対、平均２０００塩基対）：濃度２×１０-5〜２×１０-4Ｍｂｐ。
（２）ポリｄＧｄＣ／ｄＣｄＧ  ＤＮＡ（平均分子量6.８×１０5 、平均１０４７塩基対）：1.２×１０-5〜１０-4Ｍｂｐ。
（３）ポリｄＡｄＴ／ｄＴｄＡ  ＤＮＡ（平均分子量3.５×１０6 、平均５３７１塩基対）：3.２×１０-5〜1.６×１０-4Ｍｂｐ。
【００２１】
スペクトル測定の結果を図２〜図４に示す。図２はウシ胸腺ＤＮＡ、図３はポリｄＧｄＣ／ｄＣｄＧ  ＤＮＡ、図４はポリｄＡｄＴ／ｄＴｄＡについての結果をそれぞれ示す。各図において上方はＵＶ吸収スペクトル、下方はＣＤスペクトルの測定結果である。また、各図を見やすくするため、濃度が大きくなる方向に矢印を付している。
【００２２】
これらの図に示されるように、ＤＮＡの濃度が増大するに従ってＵＶ吸収スペクトルおよびＣＤスペクトルの明瞭な変化が認められ、保護基が脱離されプロトン化された本発明のオリゴフェオチン誘導体（１）はＤＮＡと作用し、該ＤＮＡを検出し得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸処理剤を構成するオリゴチオフェン誘導体を合成する反応スキームを示す。
【図２】本発明の核酸処理剤にウシ胸腺ＤＮＡを添加した場合のＵＶ吸収スペクトルおよびＣＤスペクトルの測定結果を示す。
【図３】本発明の核酸処理剤にポリｄＧｄＣ／ｄＣｄＧ  ＤＮＡを添加した場合のＵＶ吸収スペクトルおよびＣＤスペクトルの測定結果を示す。
【図４】本発明の核酸処理剤にポリｄＡｄＴ／ｄＴｄＡ  ＤＮＡを添加した場合のＵＶ吸収スペクトルおよびＣＤスペクトルの測定結果を示す。
【図１】
0003698570.tif 000005
【図２】
0003698570.tif 000006
【図３】
0003698570.tif 000007
【図４】
0003698570.tif 000008