(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイシン、メチオニン及び胞子形成されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株ＬＤＴＭＩを含有する組成物を除くランチオニン含有バクテリオシン及び下記式（Ｉ）で示されるメチオニン、メチニオン類似体、ペプチド含有メチオニン残基、又はペプチド含有メチオニン類似体残基の何れかのチオエーテル安定剤からなる分解に対して安定化されたランチオニン含有バクテリオシン組成物。
式（Ｉ）：R1-S-R2
［式中R1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル
基、又は
0003692389.tif 000028
で、nは、０〜５であり、
式中、R3は、水素原子、又は
0003692389.tif 000029
であり、ｘは１〜３であり；
そしてR4は、-H, -CH3, -CH（CH3）2, -CH2CH（CH3）2,
-CH（CH3）CH2CH3, -CH2SH, -CH2CH2SCH3, -CH2OH,
-CH（OH）CH3, -CH2COOH, -（CH2）2COOH, -CH2CONH2,
-(CH2)2CONH2, -(CH2)4NH2,
0003692389.tif 000030
0003692389.tif 000031
もしくは、Ｒ3のアミノ基と結合してピロリジン環を形成する-（CH2）3-であって良く；
そして、
0003692389.tif 000032
であり、式中R5は、水素原子、アミノ基、又はヒドロキシル基であり、
そしてR6は、水素原子、又は
0003692389.tif 000033
であり、式中R7は、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、又は
0003692389.tif 000034
であり、式中、ｎ、ｘ及びR4は、上に定義したとおりである］
【請求項２】
請求項１記載の組成物は、界面活性剤も含んでなること、
を特徴とするランチオニン含有バクテリオシン組成物。
【請求項３】
請求項１記載の組成物は、キレート化剤も含んでなること、
を特徴とするランチオニン含有バクテリオシン組成物。
【請求項４】
前記界面活性剤は、ポリソルベートであること、
を特徴とする請求項２記載のランチオニン含有バクテリオシン組成物。
【請求項５】
前記キレート化剤は、ＥＤＴＡ又はクエン酸塩であること、
を特徴とする請求項３記載のランチオニン含有バクテリオシン組成物。
【請求項６】
前記チオエーテル剤は、メチオニンヒドロキシ類似体であること、
を特徴とする請求項１記載のランチオニン含有バクテリオシン組成物。
【請求項７】
メチオニンの濃度が１〜５０ｍＭの範囲にある請求項１記載のランチオニン含有バクテリオシン組成物。
【請求項８】
メチオニンの濃度が１〜１０ｍＭの範囲にある請求項１記載の組成物。
【請求項９】
濃度範囲０．１〜１０００μｇ／ｍｌのバクテリオシン、濃度範囲０．１〜１０％の界面活性剤、濃度範囲０．１〜２０ｍＭのキレート化剤、及び１ｍＭ〜５０ｍＭの濃度範囲で下記式（Ｉ）で示されるメチオニン、メチオニン類似体、ペプチド含有メチオニン残基、又はペプチド含有メチオニン類似体残基の何れかのチオエーテル安定剤を含んで成る分解に対して安定化されたランチオニン含有バクテリオシン組成物。
式（Ｉ）：R1-S-R2
［式中R1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル
基、又は
0003692389.tif 000035
で、nは、０〜５であり、
式中、R3は、水素原子、又は
0003692389.tif 000036
であり、ｘは１〜３であり；
そしてR4は、-H, -CH3, -CH（CH3）2, -CH2CH（CH3）2,
-CH（CH3）CH2CH3, -CH2SH, -CH2CH2SCH3, -CH2OH,
-CH（OH）CH3, -CH2COOH, -（CH2）2COOH, -CH2CONH2,
-(CH2)2CONH2, -(CH2)4NH2,
0003692389.tif 000037
0003692389.tif 000038
もしくは、Ｒ3のアミノ基と結合してピロリジン環を形成する-（CH2)3-であって良く；
そして、R2は、
0003692389.tif 000039
であり、式中R5は、水素原子、アミノ基、又はヒドロキシル基であり、
そしてR6は、水素原子、又は
0003692389.tif 000040
であり、式中R7は、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、又は
0003692389.tif 000041
であり、式中、ｎ、ｘ及びR4は、上に定義したとおりである］
【請求項１０】
ランチオニン含有バクテリオシン組成物中のランチオニンバクテリオシン成分を分解に対して安定化する下記式（Ｉ）で示されるメチオニン、メチオニン類似体、ペプチド含有メチオニン残基、又はペプチド含有メチオニン類似体残基の何れかの化合物の利用法。
式（Ｉ）：R1-S-R2
［式中R1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル
基、又は
0003692389.tif 000042
で、nは、０〜５であり、
式中、R3は、水素原子、又は
0003692389.tif 000043
であり、ｘは１〜３であり；
そしてR4は、-H, -CH3, -CH（CH3）2, -CH2CH（CH3）2,
-CH（CH3）CH2CH3, -CH2SH, -CH2CH2SCH3, -CH2OH,
-CH（OH）CH3, -CH2COOH, -（CH2）2COOH, -CH2CONH2,
-(CH2)2CONH2, -(CH2)4NH2,
0003692389.tif 000044
0003692389.tif 000045
もしくは、Ｒ3のアミノ基と結合してピロリジン環を形成する-（CH2）3-であって良く；
そして、R2は、
0003692389.tif 000046
であり、式中R5は、水素原子、アミノ基、又はヒドロキシル基であり、
そしてR6は、水素原子、又は
0003692389.tif 000047
であり、式中R7は、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、又は
0003692389.tif 000048
であり、式中、ｎ、ｘ及びR4は、上に定義したとおりである］
【発明の詳細な説明】
発明の背景
タンパク質及びペプチド類を外界温度で、特に希薄溶液中に、長期間安定に保つことは格別困難であり、このことは、製剤化学者にとって依然として大きな課題となっている。タンパク質やペプチド類は、いろいろな経路を経て分解するが、下記はその一部であり、これらに限定されるものではない：即ち、特にｐＨの両極端でのペプチド結合の加水分解、酸性ｐＨでの脱アミド化、アルカリ性ｐＨでの脱水及び脱硫化、芳香族側鎖のハロゲン化、硫黄含有及びインドール側鎖の酸化、チオール−ジスルフィドの再配列、反応性カルボニル化合物及びβ−ヒドロキシカルボニル化合物を用いたアマドリ再配列によるアミン基の修飾、重合、沈殿、ならびに変性である。
タンパク質又はペプチドの分解の速度は、分子中の隣接するアミノ酸残基の配列に影響されることがある；例えば、Asn-Gly配列は、脱アミド化及び介在ペプチド結合のβ−再配列を受けやすい。外界の制約を受けるが、アミノ酸配列は、分子の３次元構造を決定し、それがさらにタンパク質又はペプチドの分解速度に影響しうる。製剤の成分及びそれらの相互作用により、製剤中に外界条件を作り出すことができるが、それが、タンパク質又はペプチド分子の構造に影響を与えることが可能であり、あるいは直接分解経路に参加して該製剤中のタンパク質又はペプチドの安定性にプラスにもしくはマイナスに影響を与えることが可能である。
ナイシンは、バクテリオシンであり、特に、該分子の保全性及び官能性に必須であると信じられているランチオニン含有環構造の存在により特徴づけられるペプチドの一つの系の中のメンバーである。このペプチドの分類中の他のメンバーには、ズブチリン、ジュラマイシン、シンナマイシン、アンコベニン、Pep 5、エピダルミン、ガリダルミンなどがあるが、これらに限定されるものではない。
ナイシン及びその関連するペプチド類は、抗菌剤であり、とりわけ、ある種の細菌胞子の発芽を阻害し、発芽後成育を抑制する。なお、市販のナイシン製剤、Nisaplin（商標）は、ある種の病原体や損傷生物、特にボツリヌス中毒症の原因となる耐熱性で、胞子形成するClostridium属の菌種の成長を阻害するための食品中への直接の添加剤として、販売されている（Aplin & Barrett, Beaminster, U.K.）。さらに、ナイシン及び関連するペプチド類は、動物や人間のある種の病気の原因となるある種のバクテリアの栄養成長の形態に対して活性を有する。
ナイシン及び関連するペプチドバクテリオシンがキレート化剤及び／又は種々の界面活性剤と組み合わされると、そのような製剤の抗菌性ペプチドの殺菌活性がかなり改善され、今や、グラム陰性及びグラム陽性両方のバクテリアの種を初めとするはるかに広範囲のバクテリアを含むまでに広がっている（本明細書に引用により加入する米国特許第５，１３５，９１０号明細書参照）。さらに、ペプチド製剤の性能は、例えば、薬剤用の生理的条件下で、様々な医薬品添加物や製剤を意図された活性部位に放出するのを容易にするのに有用な他のキャリヤの存在によりさらに影響されうる。
ナイシン及び関連するペプチド類の製剤の十分な性能は、ペプチドが、使用及び貯蔵の条件下様々な製剤において物理的に安定であり生物学的に活性であることを要する。さらに、生物学的活性を有するペプチド類を始めとする活性剤の安定性及び保全性の要求項目は、調節用の検査の主題である。
ランチオニン含有ペプチド類の活性は比較的安定であり、極温にも耐えうると云うことは広く受け入れられて来た。ナイシン製剤、Nisaplin（商標）は、極温下、例えば、低温殺菌中及びある種の食品を缶詰にする際に用いられるレトルト温度でさえも用いられている。この明かな安定性にもかかわらず、貯蔵時に、これらのバクテリオシン分子に減成的変化が生じ、全部がそうであるわけではないが、中には生物活性の損失と云う結果を招くものもある。Chan et al.“Isolation and characterization of two degradation products derived from the peptide antibiotic nisin.”FEBS Letters, Vol.252 No.1, 2, 29-36（July 1989）によれば、噴霧乾燥された製剤Nisaplin（商標）の貯蔵時、製剤中のナイシンが分解し、蓄積した分解生成物は有機修飾因子の勾配を用いたシリカ基材の樹脂上の逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰＨＰＬＣ)により分離可能であると云うことが示されている。
タンパク質（例えばアルブミン）、アミノ酸、界面活性剤、アルコール類、炭水化物、ならびに様々な酸素及び遊離基補足剤などのように、広い範囲の多様な化合物が、溶液中のペプチド類及びタンパク質を安定化する候補としてあげられてきた。希酸又はｐＨ範囲２〜５の緩衝液中のナイシンのみの場合は、良好な安定特性を示すが、製剤中の、ランチオニン含有バクテリオシン類の殺菌活性を高めるある種の乳化剤や界面活性剤などの物質（米国特許第５，１３５，９１０号明細書参照）の中には、時とともに、該バクテリオシン類の分解も促進するものがあると云うことが見出された。
多くの一般に用いられる安定剤や酸化防止剤は、ランチオニン含有ペプチド類の分解を克服するのに殆ど効果がない。したがって、製剤中のバクテリオシン類の分解を阻止するように作用し、より長期で安定な貯蔵寿命を有する組成物を産み出す新しい物質が求められていた。
発明の開示
本発明は、安定剤として好適なチオエーテル化合物の存在により安定化されるナイシンなどのランチオニン含有ペプチドバクテリオシン類を含んでなる組成物に関する。該チオエーテル化合物は、好ましくは、式（Ｉ）：
R1-S-R2        （Ｉ）
［式中R1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、又は
0003692389.tif 000002
であり、そしてR2は、式
0003692389.tif 000003
（式中、ｎは、０〜５であり；R3は、水素原子、アミノ基、又はヒドロキシル基であり；そしてR4は、水素原子、カルボキシル基、エステル基もしくはアミド基であり、アミノ官能性はアミノ酸残基の寄与による）を有するか、あるいは、R1及びR2は一緒に結合して、硫黄とともに、チアゾリジン環を形成する］の化合物である。
好ましい態様においては、式（Ｉ）の化合物は、アミノ酸メチオニン又はその類似体である。
本発明は、さらに、溶液及び乾燥混合物中のナイシン及び他のランチオニン含有ペプチド類を安定化する方法に関わる。本発明によれば、式（Ｉ）の化合物は、ランチオニン含有バクテリオシンを分解から保護するのに十分な量が、ランチオニン含有ペプチドバクテリオシンを含んで成る組成物に添加される。該安定剤化合物は、配合時にランチオニン含有バクテリオシンに添加しても良く、あるいは、バクテリオシンとの配合の前に非バクテリオシン成分の一つ以上と一緒に予備配合しておいても良い。
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは、メチオニン又はその類似体であるが、その添加は、広いｐＨ範囲で活性バクテリオシン成分を安定化し、組成物の効力又は効用を低下させることは決してない。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｐＨ６でのポリソルベート（poly-sorbate）界面活性剤T-MAZ 20の存在下でのナイシンの活性化への異なる濃度のメチオニンの効果を示す。
図２は、メチオニンで予備インキュベートしたポリソルベート（T-MAZ 20）を用いて配合したナイシンの安定性を示す。
発明の詳細な説明
ナイシンなどのランチオニン含有バクテリオシン類は、グラム陰性及びグラム陽性の生物に対する殺菌活性を示す多様な組成物に配合可能である。これらのバクテリオシン組成物は、バクテリオシンの他に、界面活性剤、乳化剤、キレート化剤、湿潤剤、ならびに、粘稠化剤、着香剤、芳香剤、研磨剤、潤滑剤などの他の薬品添加物も含有して良く、口すすぎ剤、局所消毒剤、薬剤組成物、歯磨き剤、消毒紙タオル、食品保存剤、殺菌薬、乳房内浸剤、などの広い範囲の用途に用いることができる。そのような組成物及びそれらを調製する方法は、米国特許第５，１３５，９１０に記載されているが、その開示は、引用により本明細書中に加入される。
これらの殺菌性組成物に用いられるランチオニン含有バクテリオシン類は、ナイシン、ズブチリン、ジュラマイシン、シンナマイシン、アンコベリン、Pep 5、エピダルミン、ガリダルミンからなる群から選択することができる。ランチオニンバクテリオシンは上記の群からの選択に限定されるものではないが、好ましいバクテリオシンは、ナイシンである。
そのような殺菌性組成物中でランチオニン含有バクテリオシン類と組み合わせて用いられる好適な界面活性剤は、ポリエトキレート化ソルビトールエステル類、例えばPeg(40)ソルビタンジイソステアリン酸塩、Tweens（商標）；酸化エチレン及び酸化プロピレンの重縮合物、例えば、Poloxamer類、Pluronic、F127、F68；ポリエトキレート化水素化ひまし油、例えば、Cremophor、E1、RH40；ソルビタン脂肪酸エステル類；長鎖イミダゾリン誘導体類、例えば、Miranol C2M；長鎖アルキルベタイン類、例えば、Empigon BB；長鎖アルキルアミドアルキルベタイン類、例えばコカミドプロピルベタイン；エチル−Ｎ−コシル−Ｌ−アルギネートのD,L-2-ピロリドン-5-カルボン酸塩、例えば、CAE；コカミドプロピルPGジアンモニウムクロリド、EGM Monoquat PTC；ラウラミドプロピル、例えば、Monaquat BTL；Tagat、R60、L2、O2、S2；Cetiol HE；Pyroter；Ryoto糖；Tensopol；Tegobetaine；Incromine；Solutol HS15及び酸化ラウライニンである。
本発明は、組成物及びそれらを製造する方法を提供し、それらの組成物は、ランチオニン含有バクテリオシン類を含んでなる既に開示された組成物の改良である。本発明の組成物は、さらに広範囲の殺菌剤として作用するだけでなくさらに、先行技術の組成物より長い延長された貯蔵寿命を有する。好適なチオエーテル安定剤を含有する本発明のバクテリオシン組成物は、溶液又は噴霧製剤のような乾燥組成物に製剤して良い。
ランチオニン含有バクテリオシン類を含んでなる代表的な製剤
本発明に用いられる殺菌製剤は、米国特許第５，１３５，９１０号明細書に開示されているように製剤して良い。さらに、これらの製剤は、本明細書に開示されている好適なチオエーテル化合物を添加して安定化して良く、特殊な用途の場合は、市販の用途の目的に適した配合に合わせて薬品添加物を添加して良い。代表的な製剤及び成分は下記に示す。薬品添加物の濃度及び混入は当業者が変化させて各製剤に望まれる好ましい特性を得るようにして良い。
（ｉ）下記からなる口すすぎ剤又は歯磨き剤として有用なナイシン含有製剤：
エタノール又は他のアルコール類、
ポロクサマー、ポリソルベート、又は他の乳化剤／界面活性剤、
EDTA、クエン酸塩又は他のキレート化剤、
クールミント又は他の着香剤、
グリセロール、プロピレングリコール又は他の湿潤剤、
青色染料又は他の着色剤、
サッカリン又は他の甘味剤、
ナイシン又は他のランチオニン含有バクテリオシン類、
は、ヒドロキシエチルセルロースなどの粘稠化剤及び歯磨き剤として用いるためのシリカ又はけい藻土などの研磨剤も含有していて良い。錠剤として製剤するのに有用なキサンタンガム類又はステリン酸塩類を含有していて良い。
（ｉｉ）下記からなる局所的殺菌剤として有用なナイシン含有製剤：
１−プロパノール、エタノール又は他のアルコール類、
ポリソルベート又は他の乳化剤／界面活性剤、
ポリエチレングリコール、グリセロール又は他の湿潤剤、
EDTA、クエン酸塩又は他のキレート化剤、
ナイシン又は他のランチオニン含有バクテリオシン類、
水適量
は、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルセルロース、アルギネート類、又はシリコーン類などの粘稠化剤も含有していて良い。さらに、芳香剤を含有して良い。
（ｉｉｉ）下記からなる脱臭剤として有用なナイシン含有製剤：
１−プロパノール、エタノール又は他のアルコール類、
ポリソルベート又は他の乳化剤／界面活性剤、
プロピレングリコール、グリセロール又は他の湿潤剤、
EDTA、クエン酸塩又は他のキレート化剤、
芳香剤、
ナイシン又は他のランチオニン含有バクテリオシン類、
水適量。
（ｉｖ）下記からなる乳房炎を治療するための乳房内浸剤として有用なナイシン含有製剤：
ポリソルベート又は他の乳化剤／界面活性剤、
EDTA、クエン酸塩又は他のキレート化剤、
グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール又は他の湿潤剤、
ナイシン又は他のランチオニン含有バクテリオシン類、
水適量。
チオエーテル安定化化合物
本発明のチオエーテル安定剤は、広範囲の界面活性剤、キレート化剤、乳化剤及び湿潤剤と配合する場合のナイシンなどのバクテリオシン類の安定性を高めるのに有効である。異なる成分が、異なる程度の随伴分解を示すが、本発明のチオエーテル安定剤の添加は、ランチオニン含有バクテリオシンがそのような成分と配合される全ての状況において有益な効果を示すことが予期される。チオエーテル安定剤は、湿潤剤のグリセロール又はソルビトールと組み合わされたキレート化剤を有する広範囲の製剤中のナイシンの安定性も増大させる。
本発明によれば、前記ランチオニン含有ペプチド組成物は、一般に、１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲、好ましくは、３０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌの範囲のペプチド濃度、０．１％〜１０．０％の範囲の界面活性剤濃度、及び１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲のチオエーテル安定剤化合物の濃度を有するであろう。多くの場合、１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲の安定剤濃度が有効成分の初期の効力を維持するのに十分であろう。
いかなる好適なチオエーテル安定剤化合物もこれらのバクテリオシン製剤用に用いても良いが、下記の式（Ｉ）：
R1-S-R2        （Ｉ）
［式中R1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、又は
0003692389.tif 000004
であり、そしてR2は、式
0003692389.tif 000005
（式中、ｎは、０〜５であり；R3は、水素原子、アミノ基、又はヒドロキシル基であり；そしてR4は、水素原子、カルボキシル基、エステル基又はアミド基であり、アミノ官能性はアミノ酸残基の寄与による）を有するか、あるいは、R1及びR2は一緒に結合して、硫黄とともに、チアゾリジン環を形成する］で表される安定化化合物を用いることが好ましい。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、メチオニン、その類自体、又は関連するチオエーテル化合物である。本発明に使用するための好適な化合物は、メチオニン、メチオニンヒドロキシ類似体、メチオニンメチルエステル、メチオニンエチルエステル、チアゾリジン、及びランチオニンである。本発明のある態様においては、チオエーテル安定化化合物は、メチオニンもしくはメチオニン類似体残基に富むペプチド又は重合体であって良い。
本発明のさらなる態様においては、チオエーテル安定剤は、下記の式（ＩＩ）：
R1-S-R2        （ＩＩ）
［式中R1は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、又は
0003692389.tif 000006
で、nは、０〜５であり、
式中、R3は、水素原子、又は
0003692389.tif 000007
であり、xは１〜３であり；
そしてR4は、-H, -CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2SH, -CH2CH2SCH3, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2COOH, -(CH2)2COOH, -CH2CONH2, -(CH2)2CONH2, -(CH2)4NH2,
0003692389.tif 000008
0003692389.tif 000009
もしくは、R3のアミノ基と結合してピロリジン環を形成する-(CH2)3-であって良く；
そして、
R2は、
0003692389.tif 000010
であり、式中R5は、水素原子、アミノ基、又はヒドロキシル基であり、
そしてR6は、水素原子、又は
0003692389.tif 000011
であり、式中R7は、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子を含むアルコキシ、又は
0003692389.tif 000012
であり、式中、n、x及びR4は、上に定義したとおりである］により定義されることが好ましい。
チオエーテル安定化化合物は、また、製剤の意図された用途に好適でなければならない。チオエーテル安定化化合物のあるものは、ナイシンの分解に対して保護するが、しかし、そのような化合物の有用性は、その香り、毒性、又は発ガン性の故に限定されることがある。かくして、チオエーテル安定化化合物は、また、特殊な市販の用途に好適であるように、そして矯正不可能な有害な特性を有しないように選択されなければならない。
下記に述べる例は、組成物の界面活性剤、キレート化剤又は湿潤剤成分と連関した分解に対してランチオニン含有ペプチド類を安定化するのに、本発明のチオエーテル安定化化合物及び好ましくは式（Ｉ）の化合物、例えば、メチオニン及び関連する化合物が有効であるが、一般に用いられる酸化防止剤は、そうではないことを証明している。データは、安定剤は、物理的保全性を維持するのみならず、有効成分であるペプチド類の生物活性を妨害することがないということを示す。
ナイシンの安定性を測定する方法
ナイシンの安定性は、多くの方法により測定して良い。本願の実施例中で用いられた方法は、下記の（ｉ）分析的逆相高圧液体クロマトグラフィー及び（ｉｉ）最小阻止濃度検定法である。
ｉ）分析的逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）。溶液中の被検体（ナイシン）をナイシンが結合する傾向を有する親水性のビーズのカラムに通した。次ぎに、カラム中を流れる溶液を、ついにはナイシンがビーズから放出されカラムから溶出されるに至るまで、アセトニトリル濃度を上げることにより徐々により親水的にした。カラムからナイシンが出てくるのを、溶出液による２１０ｎｍの光の吸収を測定することにより検出した。
カラムから出てくるアミン含有成分をフルオレサミンと反応させることにより第２の検出システムを、ＲＰＨＰＬＣと一緒に用いることもできる。フルオレサミンに基づいたシステムの有利な点は、それがアミン含有成分（ナイシンは４つのアミン基を有する）にのみ感受性を有するという点である。これにより、他の成分が２１０ｎｍでの吸収によりナイシンの検出を妨害する複雑な製剤中のナイシンの分析が可能になる。
ｉｉ）ナイシン溶液の最小阻止濃度（ＭＩＣ）の推定。これは、溶液中のナイシンの官能活性を、標的とする細菌の集団を殺菌する又はその成長を妨げるその能力をテストすることにより測定するものである。
検査されるべきナイシンの溶液の２倍の希釈の系列を作成した。５μｌのこれらの溶液のアリコートをペトリ皿中の栄養寒天培地のゲル上で成長した標的細菌（Staphylococcus aureus）の菌叢上にピペットで滴下した。該ペトリ皿に蓋をし、３７℃で一晩（〜１６時間）インキュベートした。ナイシンの濃度が十分高く、細菌の成長を防止するところに、細菌叢の浄化ゾーンがある。検査中のナイシン溶液の活性は細菌の成長を阻止する最低ナイシン濃度（最小阻止濃度）として与えられる。
実施例１
ナイシンを含有する口すすぎ製剤を、どの成分がナイシンの分解に関連しているかを決定するために様々な代替成分を用いて配合した。各成分が順番に省略されている製剤の系列が作成された。これらの製剤は及びそれらの成分は、表１に記載してある。残留ナイシン濃度はμｇ／ｍｌで示した。初期のナイシン濃度は、３００μｇ／ｍｌであった。
１０ｍでのＨＣｌのナイシンの基準溶液も、省略が全くない完全な製剤として作成した。室温で３日インキュベートした後で、製剤をＲＰＨＰＬＣで分析しナイシンの分解の程度を測定した。
0003692389.tif 000013
表１の製剤のＲＰＨＰＬＣクロマトグラムの検査により、全ての製剤が１０ｍＭのＨＣｌ中の基準に対して促進されたナイシンの分解を示したが、分解は、ポリソルベート界面活性剤／乳化剤又はグリセロール湿潤剤が省略された製剤中において最小化されることが明らかになった。
ＥＤＴＡ及び湿潤剤グリセロールを含んで成る口すすぎ剤として有用なナイシンの製剤も調製されＲＰＨＰＬＣで分析された。これらの検査により、製剤中のＥＤＴＡ及びグリセロール両方の同時の存在に依存したナイシンの分解のソースが明らかになった。どちらの化合物も他方が存在しない場合は問題がなかった。
幾つかのソースからのグリセロール及びソルビトールならびに幾つかの代替キレート化剤をスクリーニングした（表２及び表３）。これらの製剤中のナイシンの安定性に効果を有しないグリセロール又はソルビトールのいずれのソースも見つからなかったが、クエン酸塩はＥＤＴＡより優れていたとは云え検査されたキレート化剤のいずれも問題を除去するものではなかった。
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実施例２
一つの特定の界面活性剤／乳化剤と関連したナイシンの分解をさらに分析するために、できるだけ多くのメーカから原料を得た。可能な場合には、各メーカから多数の生産バッチを入手した。その性質がポリソルベートと密接に類似していると信じられる他の乳化剤又は界面活性剤ならびに非類似の界面活性剤もテストされた。ナイシンを含有する口すすぎ製剤をこれらの化合物の各々を用いて調製し、インキュベーションの後に、試料を分析してナイシンの安定性を評価した。メーカ及びテストされた多数の成分のバッチを表４に列挙した。
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異なるメーカから得られた乳化剤／界面活性剤の存在下におけるナイシンの安定性には大きな相違が観察された；ナイシンの安定性は同一の製品の異なるバッチを用いた場合にも顕著に相違した。しかし、テストされた広範囲に亘るリストの界面活性剤の全てが、乳化剤／界面活性剤を省略した対照製剤に対してある程度ナイシンの分解を促進した。
この分解の一つの可能な説明は、製剤添加物の製造工程中の物質の導入である。例えば、ポリソルベートの外見を改善するために、製品を良く知られた酸化剤である過酸化物を添加して漂白することがある。ポリソルベート中の残留過酸化物の存在がナイシンの不安定性をもたらしているというのは極めてあり得ることに思われた。ナイシンは過酸化物にさらすと急速に分解することが分かった（表５）。ナイシンは、ＥＤＴＡの存在により部分的に保護された。過酸化物の検定を用いて明細書に述べたナイシン製剤に用いられたポリソルベートの様々なバッチをスクリーニングしたが、残留過酸化物のレベルとナイシンの安定性の間には何の関係も見出すことができなかった。さらに、漂白段階の直前及び直後のMazer Chemicalsの製造バッチから取られた試料はナイシンの安定性への効果において同等であることが見出された。かくして、製造中に添加される過酸化物は、分解の動作主ではなさそうである。
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実施例３
多くの一般に用いれる酸化防止剤を実施例２で説明した方法を用いて製剤中のナイシンを保護するその能力についてテストした。テストされた各化合物及びその組合せを表６に示した。テストされた化合物のいずれもナイシンの満足すべき保護をもたらさなかった。実際、リスト中の化合物の中には、安定性の問題をさらに悪化させるものもあった、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、アスコルビン酸塩、亜硫酸ナトリウム。
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実施例４
ある範囲での硫黄含有化合物による２５μｇ／ｍｌのナイシンの安定化を、プロピレングリコール、１−プロパノール、及びＥＤＴＡ又はクエン酸塩のいずれかを有するポリソルベート（T-MAZ 20、Mazer Chemicals）を含んで成る局所殺菌剤として有用な製剤中で評価した。これらの実験の実行をスピードアップするために、製剤は“ストレスを与えられた”条件下、即ち両方ともいかなる発生する分解効果をも加速することを意図したものであるｐＨ６及び４０℃という条件下に置いた。製剤中のナイシンの安定性は、ＲＰＨＰＬＣで評価した。表７、表８、及び表９中のデータによれば、チオエーテル化合物、Ｌ−及びＤＬ−メチオニン、ＤＬ−メチオニンメチル−もしくはエチルエステル類、ならびにＤＬ−メチオニンヒドロキシ類似体は全てナイシンを分解から安定化することができると云うことが示されている。より少ない程度であるが、ナイシンは、チオエーテル化合物チアゾリジン及びランチオニンによっても安定化された。二硫化物化合物のシスチン及び酸化されたグラタチオン、システイン酸、メチオニンスルホキシド及びメチオニンスルホン、ならびにスルフヒドリル化合物システインはナイシンを分解から安定化しなかった。さらに、二塩基アミノ酸リジンはナイシンを安定化しなかった。
ポリソルベートの代わりに他の乳化剤／界面活性剤を用いた局所殺菌剤として有用な製剤中のメチオニンによるナイシンの安定化をテストした。製剤は２５μｇ／ｍｌのナイシンを用いて調製されｐＨ６に滴定された。それらを４０℃で３日間インキュベートし、次いでＲＰＨＰＬＣで分析した。表１０中のデータは、メチオニンもBrij、Tergitol、Tyloxapol、及びTritonを含有する製剤中のナイシンの安定性を高めることを示している。
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実施例５
一連のテストを行って、０〜５ｍの範囲の濃度のメチオニンとともにポリソルベート界面活性剤、T-MAZ 20を含有する局所殺菌製剤中のナイシンの安定化に要するメチオニン濃度を測定した。これらの製剤中のナイシンの安定性をポリソルベートが省略された製剤中のナイシンの安定性と比較した（図１）。
メチオニンを１０ｍＭ又は５０ｍＭ含有する１０％溶液として示された時間予備インキュベートしたポリソルベートT-MAZ 20を用いて、ナイシンを含有する局所殺菌製剤も調製した。様々な予備インキュベーション混合物を調製して異なる予備インキュベーション時間に付した。予備インキュベーションに続いて、処理された混合物をナイシンと混ぜ合わせた時に１０倍に希釈し、T-MAZ 20が１％そしてメチオニンが１ｍＭ又は５ｍＭのいずれかの組成物にした。試料を次に４０℃で１２日間インキュベートし、次にナイシンをＲＰＨＰＬＣで分析した。結果を図２に示す。
予備インキュベーションによる安定化に与えられる有利な点は無いようであるが、そのような成分予備インキュベーション製造法は製造の効率などの面で他の利点を提供することがある。
実施例６
口すすぎ剤として有用な安定化ナイシン製剤を実施例１のようにして調製し他が、それは、下記の表１１に示した濃度のａ）ポリソルベート、ｂ）グリセロール又はソルビトール、ｃ）ＥＤＴＡ又はクエン酸、及びｄ）メチオニンを含んで成るものであった。
製剤をｐＨ４．０に調節し、４０℃で貯蔵した。１カ月後、試料をＲＰＨＰＬＣで分析した。推定されたナイシン濃度を表１１に示す。製剤中の初期ナイシン濃度は、１００μｇ／ｍｌであった。
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実施例７
脱臭剤として有用な安定化ナイシン製剤をｐＨ３．５のポリソルベートT-MAZ 20を用いて製剤し、４０℃で３カ月間インキュベートし、３カ月後ＲＰＨＰＬＣで分析した。結果を表１２に示した。
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ポリソルベートT-MAZ 20及び０、１、３又は５ｍＭのメチオニンを用いた脱臭製剤も調製した。製剤はｐＨ３．５、４．５、又は６．０に滴定し、４０℃でインキュベートした。試料をＲＰＨＰＬＣで、５日後、１８日後、及び６０日後に分析した。推定された残留ナイシン濃度を下記の表１３に示す。
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実施例８
局所殺菌剤として有用な安定ナイシン製剤をｐＨ３．５で調製し、４０℃でインキュベートした。試料をＲＰＨＰＬＣで、２カ月後、４カ月後、及び６カ月後に分析した。６カ月時に、試料はＭＩＣ検定法でも活性を測定した。ＲＰＨＰＬＣ及びＭＩＣ検定法のデータを表１４に示す。
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【図１】
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【図２】
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