(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローディン１遺伝子の発現を抑制する、または、クローディン１遺伝子を破壊することにより透過性が向上した培養皮膚。
【請求項２】
クローディン１遺伝子の発現を抑制する、または、クローディン１遺伝子を破壊することにより透過性が向上した皮膚を有する非ヒト動物。
【請求項３】
前記皮膚が請求項１記載の培養皮膚を移植したものである請求項２記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養皮膚及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬物の投与方法の一つとして、経皮投与が知られている。これは、制御された速度で長時間投与が可能である、肝臓の初回通過により効果の回避ができる、投与の中止が容易であるなどの利点により、全身循環系に薬物をデリバリーするシステムとして注目されている。しかしながら、多くの薬物の皮膚透過性は低く、全身循環系に薬物をデリバリーする目的で薬物を皮膚に投与する場合には、皮膚透過性の改善が必要である。このため、薬物を修飾してプロドラッグにしたり、吸収促進剤を使用したりすることが提案されている。
【０００３】
一方、皮膚のバリア機能に関し、細胞間接着装置の一種であるタイトジャンクションが、その機能を担っていることが知られている。タイトジャンクションで働く接着分子として、オクルディンが知られていたが、近年、タイトジャンクションを構成する分子としてクローディンと呼ばれる一群の分子が発見され、そのタイトジャンクションにおける役割が解明が期待されている（Tsukita, S. et al., Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 2:285-293, 2001）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、経皮投与の部位を提供するのに使用し得る、透過性が向上した培養皮膚を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
重症の火傷等の、皮膚の再生が必要な疾患の治療において皮膚の移植が行われており、この移植のための皮膚として人工的に培養して得られた培養皮膚が開発されている。従って、透過性が向上した培養皮膚が得られれば、それを移植することにより、経皮投与に適した部位を提供することができると考えられる。
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、クローディンファミリーの分子のうちクローディン１が皮膚におけるタイトジャンクションのバリア機能に関係していること、そしてその機能の欠失が皮膚の透過性を向上させることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
従って、本発明は、機能的なクローディン１を失うことにより透過性が向上した培養皮膚（以下、「本発明の培養皮膚」ともいう）を提供する。
【０００８】
また、本発明は、機能的なクローディン１を失うことにより透過性が向上した皮膚を有する動物（以下、「本発明の動物」ともいう）を提供する。本発明の動物が有する透過性が向上した皮膚は、例えば、本発明の培養皮膚を移植したものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
（１）本発明の培養皮膚
本発明の培養皮膚は、機能的なクローディン１を失うことにより透過性が向上していることを特徴とする。
【００１１】
クローディン１とは、タイトジャンクションを構成する膜蛋白質の一つで、分子量23kD、４つの膜貫通ドメインを有する蛋白質である。
【００１２】
本発明において、機能的なクローディン１とは、それが発現している細胞から構成される皮膚が通常のバリア機能を有するものを意味する。
【００１３】
透過性とは、薬物等の物質の透過性であり、特には、細胞間を通って皮膚を透過する物質の透過性である。透過性の向上とは、機能的なクローディン１を失っていない、対応する細胞から構成される培養皮膚に比べて透過性が向上していることをいう。
【００１４】
本発明の培養皮膚の構成は、機能的なクローディン１を失っていることの他は、通常の培養皮膚と同様でよく、機能的なクローディン１を失わせる操作を行う他は、通常の培養皮膚の製造と同様にして得ることができる。
【００１５】
本発明の培養皮膚は、表皮のみからなっていてもよいし、表皮及び真皮からなっていてもよい。培養皮膚の製造法としては、Rheinwald, JG, Cell, 6:331-344, 1975やRheinwald, JG, Method in Cell Biology, Vol. 21A:229-254, 1980に記載の方法が挙げられる。
【００１６】
培養皮膚において、機能的なクローディン１を失わせる操作は、クローディン１遺伝子を対象とすることの他は、遺伝子の発現を抑えるのに通常に使用される方法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、リボザイムを含むアンチセンス核酸を用いるアンチセンス法が挙げられる。選択した方法に依存するが、操作は、培養皮膚に対して行ってもよいし、培養皮膚調製前の細胞に対して行っても良い。
【００１７】
また、皮膚の細胞に分化し得る幹細胞が得られていれば、この幹細胞においてクローディン１遺伝子を破壊し、クローディン１遺伝子を破壊した幹細胞から培養皮膚を得ることにより、機能的なクローディン１を失っている培養皮膚を得ることができる。
【００１８】
遺伝子の破壊とは、遺伝子を改変することにより、遺伝子産物が生じないようにしたり、機能を失った遺伝子産物が生じるようにしたりすることをいう。遺伝子の破壊の方法としては、遺伝子ターゲティングにより破壊する方法が挙げられる。
【００１９】
本発明の培養皮膚においては、それを構成する細胞の全てがクローディン１を欠失している必要はなく、培養皮膚全体として透過性が向上する程度の割合の細胞がクローディン１を欠失していればよい。また、クローディン１を欠失している細胞は、完全にクローディン１を欠失している必要はなく、培養皮膚全体として透過性が向上する程度に機能的なクローディン１の発現が抑制されていればよい。
【００２０】
本発明の培養皮膚を移植し、その移植した皮膚に経皮投与を行うことにより、薬物を投与する際に、濃度を低くすることができて経済的である上、特に薬物が刺激性の場合、皮膚への刺激を抑えることができる。
【００２１】
（２）本発明の動物
本発明の動物は、機能的なクローディン１を失うことにより透過性が向上した皮膚を有する動物である。
【００２２】
動物の種類は、特に制限されず、げっ歯類（ラット、マウス等）、ブタなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の動物は、通常には、透過性が向上した皮膚を、薬剤投与に適した部位及び範囲に有すればよい。
【００２４】
本発明の動物が有する透過性が向上した皮膚は、局所的に、アンチセンス法等により機能的なクローディン１を失わせたものであってもよく、また、本発明の培養皮膚を移植したものであってもよい。
【００２５】
本発明の培養皮膚の移植は、異種移植、同種移植及び自家移植のいずれでもよく、本発明の動物の使用目的により適宜選択される。移植の方法は、通常の培養皮膚の移植法に従って行うことができる。
【００２６】
本発明の動物は、透過性が向上した皮膚の部位に薬物を投与することにより、薬物が効率的に全身循環系にデリバリーされるため、実験動物として有用である。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００２８】
【実施例１】
クローディン１ノックアウトマウスの作製
（１）ターゲッティングベクターの構築
Furuse et al., J. Cell Biol. 141:1539-1550 (1998)に記載のマウスクローディン１の塩基配列（GenBank accession no. AF072127）を基に、マウスの遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、マウスクローディン１遺伝子クローンpSK-N2を得た。得られたpSK-N2に、SacI及びSalI処理、及び、平滑末端化を順次施して得られるDNAフラグメントをpLox-neo（(財)癌研究会 癌研究所 野田哲生博士より分与）のSmaI部位に挿入し、クローディン１遺伝子の5'末端の塩基配列を含むベクターＡを得た。また、pSK-N2のSacI-HindIIIフラグメントをpBluescript SK-のSacI-HindIII部位に挿入した。得られたベクターに、EcoRI処理、平滑末端化、及び、HindIII処理を順次施して得られたフラグメントと、pMC2DT-A（(財)癌研究会 癌研究所 野田哲生博士より分与）に、XhoI処理、平滑末端化、及び、HindIII処理を順次施して得られたフラグメントとを結合させ、クローディン１遺伝子の3'末端の塩基配列を含むベクターＢを得た。ベクターＢに、SacI処理、平滑末端化、及び、SalI処理を順次施して得られたフラグメントを、ベクターＡに、SlaI処理、平滑末端化、及び、XhoI処理を順次施して得られたフラグメントと結合させ、ターゲティングベクターを得た。ターゲティングベクターとＤＮＡゲノムとの間における相同領域の対応関係を図１に示す。
【００２９】
（２）ターゲッティングベクターのES細胞への導入及び相同組換え体の選別
ターゲティングベクターをNotIで切断して直鎖上のDNA(1 mg/ml)とした。マウス(A129)胚性幹細胞（ES細胞）としてはJ1を用い、直鎖ターゲッテイングベクター（100μg /100μl）をES細胞（1x107 cells/400μl）へエレクトロポレーション（250 V、960μF、室温）によりトランスフェクションし、培養1日後よりG418（175μg/ml）を含んだ培地で7日間培養した。生じたES細胞コロニーの一部からDNAを抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、ターゲッテイングベクターにふくまれない部分の3'側のゲノムDNAをプローブとして、HindIII消化した抽出DNAに対しサザンブロット解析を行うことにより、野生型の6.8 Kbに対して、3.9 KbのDNA断片が検出されるものを組換え体と同定した。
【００３０】
（３）キメラマウスの作製
C57Bl/6♂マウスと同系の♀マウスとを交配させ、翌日膣栓が見られたマウスを受精後0.5日として受精3.5日目に子宮灌流法により胚盤胞期の胚を得た。
【００３１】
得られた胚盤胞へ、相同組み換えしたES細胞を、倒立顕微鏡（日本光学工業,東京）下で、マイクロマニピュレータ（マニピュレータにジョイスティック3次元油圧マイクロマニピュレータを装着：ナリシゲ,東京）、マイクロインジェクター（ナリシゲ,東京）、インジェクションピペットおよびホールディングピペットを用いてマイクロインジェクションした。また、インジェクション用ディッシュには、Falcon 3002（Becton Dickinson Labware）に培地5μlの液滴およびES細胞を浮遊させた液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用いた。
【００３２】
精管結紮雄マウスと正常雌マウスとを交配させて偽妊娠マウスを作成し、ES細胞クローンをマイクロインジェクションした操作卵を移植した。偽妊娠マウスにペントバルビタールナトリウム（Nembutal：Abbott Laboratories）にて全身麻酔をかけ、両けん部を約1cm切開して卵巣および卵管を露出し、実体顕微鏡下で卵巣嚢をピンセットで切開し子宮を露出させ、次いで子宮あたり7〜8個の操作卵を送り込んだ。その後、腹腔に戻し両切開部をクリップした。
【００３３】
操作卵を移植し妊娠したマウスは、体毛色が茶色いキメラマウスを出産した。得られたキメラマウスの生殖細胞がES細胞由来であることを確認するために、C57bL/6Jマウスと交配して産仔を確認したところ、全ての産仔の体毛色が茶色であり、キメラマウスの生殖細胞はES細胞由来であることが確認された。
【００３４】
（４）ノックアウトマウスの性質の検討
得られたキメラマウスを交配させ、産仔を得た。
産仔の遺伝子型を、PCRによって生じるDNA断片のサイズにより確かめた。マウスの尾を2-3mm程度切り、プロテイナーゼK (0.2 mg/ml)によって消化（55℃、一晩）した。以降、ゲノムDNAを常法に従って抽出し、蒸留水100-200μlにて溶解してPCRのテンプレートとした。組み換えベクターに含まれる配列と、クローディン１遺伝子の2つの部位に基づいてプライマーを設計し（それぞれ配列番号１並びに配列番号２及び配列番号３）、PCRを行うと変異を起こした遺伝子は200bp（配列番号１、配列番号２）、野生型の遺伝子は500bp（配列番号１、配列番号３）のPCR産物を生じ、これにより各個体の遺伝子型を同定した。
また必要に応じて、サザンブロット解析によっても遺伝子型を確認した。マウスの尾より抽出したゲノムDNAをHind IIIにより切断し、上記（２）と同様にサザンブロット解析を行った。
【００３５】
クローディン１のノックアウトマウス（破壊されたクローディン１遺伝子のホモ接合体）は、生後、徐々に被覆が皺を呈して干からびたような様子を示し、生後１日以内に死亡した。クローディン１のノックアウトマウスを含む産仔の体重を測定したところ、クローディン１のノックアウトマウスに著しい体重の減少が見られた（図２）。
【００３６】
このような著しい体重の減少は、皮膚のバリア機能に異常を有するマウスで観察されることが報告されており（Nat. Genet., 22(4):356-360 (1999)）、クローディン１のノックアウトマウスの体重の減少も、皮膚からの水分蒸散過多によると推定された。この推定を確認するため、受胎後18.5日に、帝王切開により摘出した同腹胎仔を用いて、Hordmannらの方法（Development, 125:1541-1552(1998)）により皮膚の透過性をアッセイした。具体的には、胎仔をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、標準5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β,D-ガラクトピラノシド(X-Gal)溶液(pH 4.5に調整した他はBonnerol, C. et al., Guide to Techniques in Mouse Development (ed. P.M. Wasserman and M.L. DePamphlis) 451-469, San Diego: Academic Pressに記載のものと同じ)に浸け、発色が認められるまで（２時間から一晩）30℃でインキュベートした。この結果、クローディン１のノックアウトマウスのみが染色された。
【００３７】
以上から、機能的なクローディン１を失った皮膚は、物質の透過性が高まっていることが確認された。
【００３８】
【実施例２】
クローディン１ノックアウトマウスの皮膚の移植
出産直後のマウス皮膚を採取し、これをヌードマウスの背に移植した。１ヶ月後に移植皮膚を採取し、固定した。これより組織切片を作製してヘマトキシリン・エオシン染色によって顕微鏡下で観察した。
【００３９】
結果を図３に示す。図中、左の写真は野性型マウス由来の移植皮膚、右の写真はノックアウトマウス由来の移植皮膚を示す。移植されたノックアウトマウスの皮膚を、移植された野性型マウスの皮膚と比較すると、肥厚が認められたが、移植されたノックアウトマウスの皮膚が生着することが確認された。
【００４０】
次に、移植された皮膚の透過性をトレーサー浸透アッセイにより評価した。
出産直後のマウスの背中に50μlのトレーサー液（10 mg/ml Sulfo-NHS-LC-biotin（ピアス社製）及び1 mM CaCl2を含むリン酸バッファー）を皮下注射する。30分後、皮膚組織を採取し、凍結切片を作製し、蛍光ラベルしたストレプトアビジンによりビオチンを検出すると同時に、抗オクルディン抗体による蛍光抗体染色によってタイトジャンクションを染色した。これを蛍光顕微鏡下で観察した。結果を図４に示す。左列(a〜c)の写真が野性型マウス由来の皮膚を示し、右列(d〜f)の写真がノックアウトマウス由来の皮膚を示す。上段(a及びd)の写真はトレーサー(NHS-LC-ビオチン)による染色結果、中段(b及びe)の写真はオクルディンに対する染色結果、下段(c及びf)の写真は両染色結果を重ねたものを示す。図中、scは角質層を示す。
【００４１】
オクルディンの点状の染色（図中、矢印で示す）は、顆粒層におけるタイトジャンクションの位置を示している。トレーサーは、顆粒細胞の細胞膜間を浸透し、顆粒細胞の細胞膜が染色されているが、野性型マウス由来の皮膚では、タイトジャンクションで浸透が止まっており、一方、ノックアウトマウス由来の皮膚では、タイトジャンクションを超えて浸透していることが分かる。なお、角質層のトレーサーによる染色はバックグランドである。
【００４２】
この結果から、ノックアウトマウスの皮膚では、タイトジャンクションは形成されるものの、クローディン１が無いために漏れやすくなっていると考えられる。従って、機能的なクローディン１を失った皮膚を、正常な皮膚を透過できない物質が透過することができ、また、正常な皮膚を透過できる物質についても、機能的なクローディン１を失った皮膚では透過性が向上すると考えられる。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、薬剤等の物質の透過性が向上した培養皮膚が提供される。
【００４４】
【配列表】
<110>  エーザイ株式会社(Eisai Co., Ltd.)
<120>  透過性が向上した皮膚及びそれを有する動物
<130>  P-9168
<160>  3
<210>  1
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  1
gatcgagtct agaggagcat gc                                            22
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  2
gtcaacagtc tgagtgtatc cg                                            22
<210>  3
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  primer
<400>  3
ggcatgcata gacaggagta tc                                            22
【図面の簡単な説明】
【図１】  ターゲティングベクターとＤＮＡゲノムとの間における相同領域の対応関係を示す。
【図２】  出産後の産仔の体重の経時変化を示す。＋／＋は正常なクローディン１遺伝子のホモ接合体、＋／−は正常なクローディン１遺伝子と破壊されたクローディン１遺伝子のヘテロ接合体、−／−は破壊されたクローディン１遺伝子のホモ接合体を示す。体重は、出産時の体重を基準にした百分率で示す。
【図３】  移植した皮膚の組織写真を示す。左の写真(wt)は野性型マウス由来の移植皮膚、右の写真(KO)はノックアウトマウス由来の移植皮膚を示す。
【図４】  移植した皮膚の染色写真を示す。左列(a〜c)の写真が野性型マウス由来の皮膚を示し、右列(d〜f)の写真がノックアウトマウス由来の皮膚を示す。上段(a及びd)の写真はトレーサー(NHS-LC-ビオチン)による染色結果、中段(b及びe)の写真はオクルディンに対する染色結果、下段(c及びf)の写真は両染色結果を重ねたものを示す。図中、scは角質層を示し、矢印は、オクルディンの点状の染色を示す。
【図１】
0003718174.tif 000002
【図２】
0003718174.tif 000003
【図３】
0003718174.tif 000004
【図４】
0003718174.tif 000005