(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繭又は生糸から得た純度が９０％以上で平均分子量が２万以上１０万以下の水溶性セリシン加水分解物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
有効成分が食品、食品添加物、化粧品又は外用薬に使用される請求項１記載の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、食品、化粧品、医薬品等の分野に於いて利用可能な新規抗酸化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医学や生化学等の分野の研究によると、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病、癌、脳卒中などの生活習慣病（成人病）や、シミ、ソバカス、ニキビ、湿疹などの皮膚障害の原因の少なくとも一部は、生体内で生成、蓄積される過酸化脂質に起因しているといわれている。
このような問題を解消するものとして、従来、植物、海産物、微生物等の天然物中から抽出された抗酸化剤や化学的に合成された抗酸化剤が知られている。例えば、天然抗酸化物質として、ビタミンＥ（トコフェロール）、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、または生体内の酵素であるＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）様物質が抗酸化剤として利用されている。
また、合成抗酸化物質として、ＢＨＡ（ブチルヒドロキシアニソール）、ＢＨＴ（ブチルヒドロキシトルエン）等のフェノール系誘導体が抗酸化剤として知られている。
【０００３】
しかしながら、天然の抗酸化剤の場合、例えばＳＯＤは精製が困難であるため著しく高価であり、酵素系タンパク質であることから、加熱によって失活する欠点もある。他の抗酸化性タンパク質も知られているが、いずれもこのＳＯＤと同様の欠点がある。
また、合成抗酸化剤は、安全性の面で問題があり、特にＢＨＡには発癌性が疑われている。また、食用の場合、使用量・使用範囲を制限されているものが多い。
通常、天然・合成の抗酸化剤の多くは脂溶性であり、天然抗酸化剤の場合、例えばビタミンＥやβ−カロチンは生体内で優れた過酸化脂質抑制効果を有するが、水に溶けにくいため適用範囲が制限されるという問題がある。水溶性の天然の抗酸化剤は限られており、例えばビタミンＣ、グルタチオン、尿酸、およびＳＯＤなどがある。
しかしながら、ビタミンＣとグルタチオンは、金属イオンの存在下でプロオキシダント（酸化促進剤）として作用する場合があり、条件によっては脂肪の過酸化をむしろ促進する欠点がある。尿酸は水溶性ではあるが水に溶けにくく、生体内で蓄積すると痛風や腎結石の原因ともなる。
さらに、ビタミンＣに匹敵する高い過酸化脂質抑制効果を有する天然の水溶性抗酸化剤は、ほとんど見つけられていないという問題もあった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、水溶性で、熱を加えても失活せず、人体に対し安全で、ビタミンＣに匹敵する過酸化脂質抑制効果を有する新規抗酸化剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、繭又は生糸から得た純度が９０％以上で平均分子量が２万以上１０万以下の水溶性セリシン加水分解物を有効成分とする抗酸化剤である。
非加水分解物としてのセリシンは、繭又は生糸から一般的に行われる抽出方法で得ることができる。例えば以下のようにして純度９０％以上の高精製度の単一タンパク質の状態で抽出できる。
即ち、繭又は生糸に含有されるセリシンを、水によって抽出し、例えば後述の（１），（２）のいずれかの方法で回収する。
セリシンの加水分解物は、繭又は生糸から一般的に行われる抽出方法で得ることができる。例えば以下のようにして純度９０％以上の高精製度のタンパク質（ペプチド）の状態で抽出できる。
即ち、繭又は生糸に含有されるセリシンを、酸、アルカリ、あるいは酵素によって部分加水分解して抽出してから、例えば次の（１），（２）のいずれかの方法で回収する。
（１）  メタノール、エタノール、ジオキサン等の水溶性有機溶媒を混合してセリシンを析出させた後、これを濾別乾燥して、セリシンを粉体として得る。
（２）  特開平４−２０２４３５号公報に提案されているように、限外濾過膜、あるいは逆浸透膜に付した後、乾燥することによりセリシン粉体を得る。
かくして得た平均分子量が２万以上１０万以下の水溶性セリシン加水分解物は抗酸化剤としての使用意図に応じて粉末状、水溶液状等適宜の形態で用いられる。
【０００６】
食品、食品添加物、化粧品、外用薬、医薬品等に従来の抗酸化剤と同様に添加されうる。例えば食品、食品添加物、化粧品、外用薬等におけるセリシンの添加量は通常０．１〜５０重量％、好ましくは０．５〜５重量％程度である。セリシンは毒性がなくまた水溶性にも優れるため多量に添加ないし摂取しても特段の問題は生じない。
化粧料や外用薬における剤型としてはクリーム、乳液、ファウンデーション、パック、ローション状、ゲル状、溶液状、スティック状等がある。またこれらには適宜の成分、例えば油剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、顔料、ｐＨ調製剤、他の薬効成分、紫外線吸収剤、香料等を配合しうる。また医薬品として経口投与することもできる。この場合の投与量も特に制限されないが前記した生活習慣病においては例えば１０〜１０００ｍｇ／日程度が投与される。
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【０００７】
【実施例】
〔実施例１〕
生糸からなる絹織物１Ｋｇを、水５０Ｌ（リットル）中で９５℃にて２時間処理し、セリシンを抽出した。得られた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、凝集物を除去した後、濾液を逆浸透膜により脱塩し、濃度０．２％の無色透明のセリシン水溶液を得た。この水溶液をエバポレーターを用いてセリシン濃度約２％にまで濃縮した後、凍結乾燥を行って、純度９５％以上、平均分子量１００，０００のセリシン粉体（以下、セリシンＨ）１００ｇを得た。
【０００８】
〔実施例２〕
生糸からなる絹織物１Ｋｇを、０．２％炭酸ナトリウム水（ｐＨ１１〜１２）５０Ｌ中で９５℃にて２時間処理し、セリシン加水分解物を抽出した。得られた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、凝集物を除去した後、濾液を逆浸透膜により脱塩し、濃度０．２％の無色透明のセリシン加水分解物抽出液を得た。この抽出液をエバポレーターを用いてセリシン濃度約２％にまで濃縮した後、凍結乾燥を行って、純度９０％以上、平均分子量２０，０００のセリシン加水分解物粉体（以下、セリシンＬ）１００ｇを得た。
【０００９】
〔試験例１〕
（１）ラット脳ホモジネート液の調製
冷凍保存したラット脳１ｇに０．０７５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を９ｍｌ加え、氷冷下でホモジナイズした（以下、ホモジネート液）。
（２）生体内過酸化脂質抑制試験
このホモジネート液０．５ｍｌに、それぞれセリシンＬとセリシンＨを含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍｌ加え、３７℃で２時間インキュベートした。このときのそれぞれのセリシンの最終濃度は０．０２〜０．５％とした。インキュベーション直前と２時間のインキュベーション後のそれぞれ０．５ｍｌを採取し、ＴＢＡ（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）法によって過酸化脂質量の指標であるＴＢＡＲＳ（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）を測定した。セリシンの抗酸化能は、セリシンを添加しない場合のＴＢＡＲＳ量とセリシンを添加した場合のＴＢＡＲＳ量から次の式１によって計算し、インキュベーションによる過酸化脂質増加の抑制率として表した。本試験例と以下に示す試験例２〜５ではいずれの場合も、３回試験を繰り返し、得られた値の平均値で結果を示した。
式１        抑制率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：過酸化脂質抑制剤（抗酸化剤）を添加したときのＴＢＡＲＳ量の増加値
Ｂ：過酸化脂質抑制剤（抗酸化剤）を添加しないときのＴＢＡＲＳ量の増加値
【００１０】
ＴＢＡ法
試料０．５ｍｌに８％トリクロル酢酸溶液２．５ｍｌと０．６７％チオバルビツール酸溶液２．０ｍｌを加え、十分に混和した後、沸騰水浴中で１５分間加熱した。ついで、２０００ｘｇで１０分間遠心分離を行った後、その上澄み液の５３５ｎｍにおける吸光度を測定し、ＴＢＡＲＳ量を求めた。標準として１，１，３，３−テトラエトキシプロパンを用いた。
【００１１】
0003610358.tif 000002
表１のようにセリシンＬ、セリシンＨの両方で抗酸化能が存在することが確認された。この結果より、いずれの分子量のセリシンでも抗酸化能が存在することが確認された。
【００１２】
〔試験例２〕
（１）ラット脳ホモジネート液の調製
試験例１と同様に行った。
（２）生体内過酸化脂質抑制試験
ホモジネート液０．５ｍｌに、それぞれセリシンＬ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、牛血清アルブミンを含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍｌ加え、３７℃で２時間インキュベートした。セリシンＬ、アスコルビン酸、およびアルブミンの最終濃度は０．０１％〜１．０％とした。インキュベート後に試験例１と同様にＴＢＡ法によってＴＢＡＲＳ量を測定し、それぞれ添加物の抗酸化能を求めた。
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表２のように、セリシンの抗酸化能のレベルは、強力な抗酸化能を持つといわれるビタミンＣに匹敵するものであることが確認された。また、ビタミンＣの場合は０．０１％の低い濃度域では、酸化を促進する欠点が見られたが、セリシンの場合は、このような現象は見られなかった。
【００１３】
〔試験例３〕
（１）ラット脳ホモジネート液の調製
試験例１と同様に行った。
（２）生体内過酸化脂質抑制試験
ホモジネート液０．５ｍｌにそれぞれセリシンＬとセリシンＨを含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍｌ加え、３７℃で２時間インキュベートした。また、予めセリシンＬとセリシンＨを含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２時間沸騰水浴中で加熱した物３．５ｍｌをホモジネート液０．５ｍｌに加え、３７℃で２時間インキュベートした。セリシンの最終濃度は０．５％とした。試験例１と同様にＴＢＡ法によってＴＢＡＲＳ量を測定し、過酸化脂質増加の抑制率を求めた。
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セリシンＬ、セリシンＨを２時間沸騰水浴中で加熱した後、抗酸化能を測定しても、加熱する前の抗酸化能と殆ど変化がなかった。この結果より、セリシンの抗酸化能は、加熱によっても失活しないことが分かった。
【００１４】
〔試験例４〕
（１）ラット脳ホモジネート液の調製
試験例１と同様に行った。
（２）生体内過酸化脂質抑制試験
ホモジネート液０．５ｍｌにセリシンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３．５ｍｌ加え、３７℃で２時間インキュベートした。セリシンＬの最終濃度は０．１％あるいは０．２５％とした。インキュベート後に０．５ｍｌ採取し、これに２．５ｍｌのエチルエーテル／エタノール（１：３，ｖ／ｖ）を加えて、１分間激しく振とうした。ついで、１０００ｘｇで５分間遠心分離し、上層の２３４ｎｍにおける吸光度を測定して過酸化脂質量（共役ジエン）の指標とした。ここでも〔試験例１〕と同様にセリシンの抗酸化能を過酸化脂質増加の抑制率（％）として表した。
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試験例１〜３ではＴＢＡＲＳを過酸化脂質量の指標としたが、試験例４では共役ジエンを過酸化脂質の指標とした。これら異なる指標両者においても、セリシンには、強力な抗酸化能が存在することが確認された。
【００１５】
〔試験例５〕
１６０μＭアラキドン酸、１５０μＭ  ＦｅＣｌ３  ，１．０ｍＭアスコルビン酸ナトリウムおよび０．３％セリシンを含む１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、トリクロル酢酸とチオバルビツール酸混合液（１５％トリクロル酢酸、０．３７５％チオバルビツール酸および０．２５Ｎ塩酸を含む）を２ｍｌ加えよく攪拌した。ついで、０．１％牛血清アルブミンを１ｍｌ加え、沸騰水浴中で１５分間加熱した。ついで遠心分離した後、上澄み液の５３５ｎｍの吸光度を測定し、ＴＢＡＲＳ量を求めた。標準として１，１，３，３−テトラエトキシプロパンを用いた。本試験でもセリシンを添加しない場合との比較からセリシンの抗酸化能を示した。
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試験例１〜４は生体成分系を用いた例であるが、試験例５は純粋な化合物からなる系を実験系として用いた例である。これら異なる実験系を用いた場合においても、セリシンには抗酸化能が存在することが確認された。
試験例４および試験例５の結果より、セリシンの抗酸化能の存在は、より信頼性の高いものであり、特定の実験系でのみ見られる現象ではないことを示唆している。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の抗酸化剤は、水溶性であるため油脂含量の低い製品にも用いることができ、しかもビタミンＣに見られる低濃度域での過酸化脂質促進作用が無く高い過酸化脂質抑制効果を持つ。
また、本発明の抗酸化剤は天然物由来のタンパク質系抗酸化剤としての特性をもち、生体内ではプロテアーゼにより容易に加水分解されるので、蓄積性が無く高い安全性を有し、食品、化粧品、医薬品などの分野で、広く抗酸化剤として利用できるものであり、しかも、加熱処理を行っても抗酸化能が不活性化しないという特徴がある。
更に、本発明の抗酸化剤は、繭又は生糸の溶媒抽出物から、容易にしかも単一のタンパク質としては高い純度で抽出できるため、安価に得られ、しかも水溶液の色が無色透明であるので、消色する必要が無く、複雑な処理工程を必要としないという大きな利点がある。