(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ存在下にＮ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニルアラニン低級アルキルエステル（Ｂ）とを縮合させて酵素的にジペプチドを製造するに際し、基質Ｂとして、基質Ｂを水相から有機溶媒相に抽出し、当該有機溶媒相を濃縮して基質Ｂの濃度をそれの水に対する溶解度以上の濃度とした溶液を用い、これに基質Ｂのモル濃度の０．１〜２倍の基質Ａを加えた高濃度基質溶液を用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項２】
抽出用有機溶媒が、酢酸アルキルエステル、炭素数３以上のアルコール、クロロホルム又はエーテルである請求項１に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
【請求項３】
該高濃度基質溶液に水又は有機溶媒を添加して酵素を活性化する請求項１又は２に記載のアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼを利用してペプチド合成を行う際に、有機溶媒抽出および濃縮を利用して調製した高濃度基質溶液を用いるペプチド合成法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは加水分解酵素として、タンパク質、ポリペプチドの加水分解反応に利用されている。一方、加水分解反応の逆反応を利用した有用ペプチドの合成に関する研究も増加している（例えば、福井三郎編、酵素の新機能開発、７５〜１２９頁（森原和之）（講談社サイエンティフィック社刊、１９８７年）参照）。
プロテアーゼを用いたペプチド合成の代表例として、アスパルテーム前駆体、即ち、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ではＺＡＰＭと略記する。）があげられる。本物質は人工甘味料として有用なアスパルテームの誘導体である。
【０００３】
加水分解酵素を用いてペプチドを合成する場合、一般に基質濃度が高い方が反応平衡上有利である。また、高濃度基質を用いることは、反応時間の短縮、反応容器容積の低減などの効果も期待でき、製造コスト削減に対する大きな効果が見込まれる。
しかしながら、ＺＡＰＭ合成反応系における基質Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（以下ではＺＡと略記する。）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下ではＰＭと略記する。）の水に対する溶解度は低いため、反応には数十〜数百ｍＭ程度の基質溶液が用いられることが多かった。例えば、基質濃度２５〜２００ｍＭ：Nagayasuら、Biotechnol. Bioeng., 43 巻, 1108〜1117(1994)；基質濃度９〜７３ｍＭ：Oyama ら、J. Chem. Soc. Perkin  II, 356 〜360 (1981)；基質濃度１００ｍＭ：Hirataら、J. Ferment. Technol., 84巻, 246 〜267 (1997)などの報告がある。例示された論文、またはそれ以外の報告例において、有機溶媒を反応系に共存させている場合があるが、ＺＡおよびＰＭの溶解度の向上は小さく、用いられている基質濃度も水系の場合とほとんど変わりはない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、加水分解酵素（プロテアーゼ）を用い、高基質濃度でジペプチド（アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル）を合成する方法を提供することである。
本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、フェニルアラニン低級アルキルエステル（以下ではＰｈｅＯＲと略記する）水溶液よりＰｈｅＯＲを有機溶媒中に抽出後、これを濃縮することで高濃度ＰｈｅＯＲ溶液が得られることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的は以下の本発明によって達成される。即ち、本発明は、プロテアーゼ存在下にＮ−置換アスパラギン酸（Ａ）とフェニルアラニン低級アルキルエステル（Ｂ）とを縮合させ、酵素的にジペプチドを製造するに際し、基質Ｂとして、基質Ｂを水相から有機溶媒相に抽出し、当該有機溶媒相を濃縮して基質Ｂの濃度をそれの水に対する溶解度以上の濃度とした溶液を用い、これに基質Ｂのモル濃度の０．１〜２倍の基質Ａを加えた高濃度基質溶液を用いることを特徴とするアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの製造方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
次に発明の好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明の特徴は、上記の酵素を用いるアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成において、一方の基質であるフェニルアラニン低級アルキルエステル（ＰｈｅＯＲ）を、水相から有機溶媒相に抽出し、抽出液を濃縮して高濃度のＰｈｅＯＲ溶液として使用することである。
【０００７】
ＰｈｅＯＲの濃縮溶液を得るためには、先ずＰｈｅＯＲを水または緩衝液に溶解する。次に、この水溶液のｐＨを４〜８、望ましくは６〜７に調整する。これを有機溶媒に接触させ、常法により溶媒抽出を行う。
本発明に用いる溶媒は、水と二相を形成する有機溶媒であれば特に制限されず、例えば、酢酸アルキルエステル、炭素数３以上のアルコール、クロロホルム、エーテルなどが好ましいものとして挙げられる。
【０００８】
抽出操作後、有機溶媒相を取り出し、常法により脱水操作を行った後に、減圧濃縮等のＰｈｅＯＲの分解が少ない方法により濃縮を行う。濃縮方法は特に制限されない。
例えば、ＰｈｅＯＲとしてＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ）を用いた場合、ＰＭの０．１Ｍ水溶液（ｐＨ＝７）およびクロロホルムを用いて、上記抽出操作を行った場合、水溶液中のＰＭの約９９重量％はクロロホルム相に抽出される。このＰＭ抽出液を減圧濃縮装置を用いて２０〜４０倍に濃縮してもＰＭの析出は見られず、得られた濃縮液は、ＰＭの濃度が２〜４Ｍとなる。ここで、ＰＭ析出が発生しない原因は明確ではないが、本濃縮液が安定した過飽和状態となっているのではないかと推察される。
本発明においては、ＰｈｅＯＲの濃縮液の濃度は、ＰｈｅＯＲの水に対する溶解度以上の濃度であり、濃度が高ければ高いほど目的物質（アスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステル）の合成量が増加するので好ましい。
【０００９】
上記濃縮液にＮ−置換アスパラギン酸として、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸（ＺＡ）およびプロテアーゼを加えることで速やかなペプチド合成が行われる。
本発明においては、ＰｈｅＯＲに対するＮ−置換アスパラギン酸の添加濃度は特に限定されないが、ＰｈｅＯＲのモル濃度に対し、０．１〜２倍程度が好ましい。
【００１０】
また、本発明に用いるプロテアーゼとしては、サーモライシン、サーモアーゼなどのバチルス属起源の金属プロテアーゼが好ましく、ストレプトマイセス属起源または緑濃菌起源の金属プロテアーゼなども使用することができる。酵素濃度は、合成反応が促進される濃度であれば特に限定されない。
本発明における反応温度は４０〜６０℃が好ましく、これ以外の温度でもペプチド合成は行われるが、実用的な速度は得られ難い。また、基質濃度が上記の濃度を下回らない量の水、グリセロール、エステル等の有機溶媒の添加は酵素活性を向上させる場合がある。
【００１１】
本発明でアスパルチルフェニルアラニン低級アルキルエステルの合成に使用されるＮ−置換アスパラギン酸としては、例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸、ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸、アセチルアスパラギン酸などが、また、フェニルアラニン低級アルキルエステルとしては、例えば、フェニルアラニンメチルエステル、フェニルアラニンエチルエステル、フェニルアラニンブチルエステル、フェニルアラニンプロピルエステルなどが挙げられる。
【００１２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。文中の％は特に断らない限り重量基準である。
【００１３】
実施例１
ＰＭ０．１Ｍ水溶液（ｐＨ７．０）３００ｍｌおよびクロロホルム３００ｍｌを分液ロートに入れ、充分に振とうを行った。静置後、クロロホルム相を取り出した。ここで、９９％のＰＭはクロロホルム相に抽出されていた。これを減圧濃縮装置により３５倍に濃縮した。濃縮溶液中のＰＭ濃度は３．５Ｍとなった。この濃縮溶液１．０ｍｌ（ＰＭ分７５３ｍｇ）にＺＡ２００ｍｇ、サモアーゼ（大和化成株式会社製）１００ｍｇを加え、５０℃で反応を行った。反応８時間後１２７ｍｇのＺＡＰＭを得た。
【００１４】
実施例２
実施例１で用いた反応液に水１００μｌを加え、実施例１と同様の操作を行った。反応８時間後４７３ｍｇのＺＡＰＭを得た。
【００１５】
実施例３
実施例１で用いたクロロホルムの代わりにジエチルエーテルを用いる以外は実施例２と同様にしてＺＡＰＭの合成を行った。反応８時間後３６３ｍｇのＺＡＰＭを得た。
【００１６】
実施例４
実施例１で用いたＰＭの代わりにフェニルアラニンエチルエステルを用いて、実施例２と同様の操作を行った。反応８時間後４４１ｍｇのペプチド（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル）を得た。
【００１７】
実施例５
ＺＡ添加量を６００ｍｇとし、実施例２と同様の操作を行った。反応８時間後９８３ｍｇのＺＡＰＭを得た。
【００１８】
【発明の効果】
以上の本発明により、基質の溶解度を越えた高濃度基質を用いたペプチド合成が可能となる。また、反応器容積の縮小化が可能となり、例えば、５Ｍ濃度の基質を用いた場合では１００ｍＭ濃度の基質を用いた場合の５０分の１の反応器容積で製造を行うことが可能となるから、単位反応器容積あたりのペプチド合成量を向上させることも可能である。