(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多剤耐性ブドウ球菌を、アルカリ金属の水酸化物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸化物若しくは炭酸塩、又はアミンの水溶液で抽出することから成る、多剤耐性ブドウ球菌抗原の抽出方法。
【請求項２】
前記水溶液のｐＨは１１．０以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液中のアルカリ金属の水酸化物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸化物若しくは炭酸塩、又はアミンの濃度が0.05 Mないし0.5 M である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液と前記多剤耐性ブドウ球菌との混合物を２５℃〜１００℃の温度下で１〜６０分間インキュベートする請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多剤耐性ブドウ球菌（メチシリン耐性ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」ということがある）を包含する）抗原の抽出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９６０年頃ペニシリン系抗生物質の１つであるメチシリンに対して抵抗性を有する黄色ブドウ球菌が英国で報告されて以来、日本国内でも１９８０年頃からペニシリン系及びセフェム系抗生物質のβラクタム剤に抵抗性を示すＭＲＳＡの検出率が増加してきた。このＭＲＳＡはβラクタム剤のみならず他の種々の抗生物質にも抵抗性を示し、難治性で院内感染の原因菌として重要視されてきた。最近ではＭＲＳＡに有効な治療法が開発されてはいるが、副作用の問題、あるいは新たな耐性菌出現の予防の観点から、ＭＲＳＡ以外のブドウ球菌感染者を含む全ての患者に画一的にその方法を提供することは好ましくなく、ＭＲＳＡの有無を知ることにより、ＭＲＳＡ感染者あるいはＭＲＳＡ汚染箇所に対して適切な処置を行うことが重要であると考えられている。
【０００３】
ブドウ球菌感染者又は医療施設若しくは医療器具をはじめとする環境から検出されたブドウ球菌が多剤耐性菌か否かを判定する方法は、希釈法、ディスク感受性試験等の薬剤に対する抵抗性を培養によって計り知る試験方法が一般的に知られている。しかしながら、これら方法は培養時間が３５℃で１８時間〜２４時間必要であること、接種菌濃度、培養温度、培地組成あるいは使用する薬剤等によって試験成績が異なることが知られ、手技的にも熟練が必要であった。
【０００４】
ＭＲＳＡをはじめとする多剤耐性ブドウ球菌の薬剤耐性機構の本質は、ブドウ球菌のムレイン架橋酵素である４種類のペニシリン結合タンパク（ＰＢＰ１、ＰＢＰ２、ＰＢＰ３及びＰＢＰ４）に新たな代替酵素（ペニシリン結合タンパク２’（ＰＢＰ２’））が出現したことによることが知られている（Y. Utsui and T. Yokota Antimicrobial Agents and Chemotherapy Vol. 28, No. 3, p397-403 (1985)) 。すなわち、全てのブドウ球菌が共通に保有するＰＢＰ１〜４は細胞壁の構成成分であるムレインを架橋し、細胞壁を合成する酵素であるが、ペニシリン系あるいはセフェム系等のβラクタム系抗生物質により不活性化され、それら抗生物質に抵抗性を持たないブドウ球菌は細胞壁合成が不能となることによりやがて死滅する。しかしながら、ＭＲＳＡはβラクタム系抗生物質との接触によって、それらにより不活性化されない新たなペニシリン結合タンパク、すなわちＰＢＰ２’を合成し、細胞壁合成の役割を代替することにより増殖し続けることが可能となる。
【０００５】
ＭＲＳＡをはじめとする多剤耐性ブドウ球菌の産生するＰＢＰ２’を非放射性試験法によって検出しようとする試みはD.M.O'Haraら（FEBS Lett. Vol. 212, No. 2, p237-241 (1987))あるいはJ.L.Gerberdingら（Antimicrobial Agents and Chemotherapy Vol. 35, No. 12, p2574-2579 (1991)) により報告されたウェスタンブロット法による免疫学的検出法が知られている。この方法では抗原を含む細胞膜画分を超遠心分離法によって調製しており、煩雑で一般の検査施設で実施するには困難である。また、ＰＢＰ２’に対する抗体を用いた放射免疫測定法及び酵素免疫測定法等も知られているが（特開平５−３３９２８９号公報、K.Sekiguchi ら（Microbiol. Immunol. Vol. 39, p545-550, 1995)、これらの方法では、抗原の抽出を尿素を変性剤として用いて行っている。このため、その後の免疫測定において、変性剤が反応系に存在することにより、測定時間に数時間を要し、日常の検査に用いるには不便である。
【０００６】
一方、多剤耐性ブドウ球菌の産生するＰＢＰ２’をコードする遺伝子ｍｅｃＡをＰＣＲ法によって遺伝子工学的に検出し、試験菌株における該遺伝子の保有状況を以てＭＲＳＡの鑑別を行う方法についても知られている（生方ら、J. Clin. Microbiol., Vol. 30, p.1728-1733 (1992)) 。しかしながら、この遺伝子の保有状況は必ずしもブドウ球菌の多剤耐性を反映しているとは限らず、遺伝子を保有しているにもかかわらず多剤耐性を獲得していないブドウ球菌が存在することが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、迅速、簡便にＭＲＳＡをはじめとする多剤耐性ブドウ球菌の抗原を抽出することができ、かつ、抽出された抗原を抗原として用いる免疫測定法により高感度に多剤耐性ブドウ球菌抗原を検出又は定量することができる、多剤耐性ブドウ球菌抗原の抽出方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の塩基性物質の水溶液を抽出用液として用いることにより上記本発明の目的を達成することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、多剤耐性ブドウ球菌を、アルカリ金属の水酸化物若しくは炭酸塩、アルカリ土類金属の水酸化物若しくは炭酸塩、又はアミンの水溶液で抽出することから成る、多剤耐性ブドウ球菌抗原の抽出方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いることができるアルカリ金属水酸化物及びアルカリ土類金属水酸化物の例として、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウム及び水酸化バリウムを挙げることができ、これらのうち、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムが好ましい。また、アルカリ金属炭酸塩及びアルカリ土類金属炭酸塩の例として、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ルビジウム、炭酸セシウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ストロンチウム及び炭酸バリウムを挙げることができ、これらのうち炭酸リチウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。また、本発明の方法に用いることができるアミンの例として、水酸化アミンを挙げることができる。
【００１１】
抗原の抽出に用いられる水溶液（以下、「抽出用水溶液」ということがある）のｐＨは１１．０以上が好ましく、１２．０〜１３．５がさらに好ましい。なお、ＭＲＳＡの浮遊液等を抽出処理する場合には、菌体液と抽出液の混合物のｐＨが１１．０以上であることが好ましい。また、抽出用水溶液中の上記塩基の濃度は０．０５Ｍないし０．５Ｍが好ましい。
【００１２】
抗原の抽出は、検体を上記抽出用水溶液で抽出処理することにより行うことができる。抽出温度は、２５〜１００℃が好ましく、抽出時間は１分〜６０分程度が好ましいが、これより長くても差し支えない。抽出温度が高いほど抽出時間は短くてよく、例えば１００℃ならば１〜３分程度でよく、９５℃ならば５分〜１０分程度でよく、２５℃〜３７℃程度ならば６０分程度が好ましい。
【００１３】
上記の方法により抽出された抗原を検体として用い、かつ、抗ＰＢＰ２’抗体（ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい）を用いて通常の免疫測定法を行うことにより、抗原、ひいてはＭＲＳＡを検出又は定量することができる。
【００１４】
免疫測定に供する前に、抗原を含有する抽出液を適当な緩衝剤又は酸、好ましくはリン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム又は酢酸等を用いて中和し、そのｐＨを６〜８に下げることが好ましい。また、検体から抗原が抽出された後、細胞残屑、粒状物及び他の不溶物を除去することが好ましい。それらの除去は遠心分離、フィルターろ過等により行うことができる。
【００１５】
細胞残屑、粒状物及び他の不溶物を除去した検体は、抗原抗体反応を利用した公知の免疫測定法により検出又は定量することができる。このような方法として、ラテックス凝集法、比濁法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、ゲル内沈降反応、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、蛍光抗体法等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。なおこれらの免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、当業者が容易に行うことができる。
【００１６】
これらの免疫測定法に用いる抗体としては、ＭＲＳＡのＰＢＰ２’に対する抗体又はその抗原結合性断片（Fab フラグメントやF(ab')2 フラグメント）が好ましい。このような抗体は市販されており、また、ＰＢＰ２’を抗原として公知の方法により容易に調製することができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１  ラテックススライド凝集法によるＭＲＳＡの検出
(1) 免疫原として用いる抗原の調製
ＰＢＰ２’産生ＭＲＳＡを２００μｇ／ｍｌセフチゾキシム、２％ＮａＣｌ含有トリプティックソイブロスを用いて３２℃、２０時間培養し、集菌した。菌は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁、続いてリゾスタフィン処理の後、超音波で菌を破砕し、100,000 x g 、１時間の超遠心沈渣を採取した。沈渣をシェーガーらの方法（H. Schagger et al., Anal. Biochem. vol.166,p368-379(1987))に準じて電気泳動し、７８ｋｄ付近に泳動される蛋白質を集め、これを抗原とした。
【００１９】
(2) 抗体調製
(1) で得られた抗原１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に５週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、２週間後同抗原５０μｇをフロイント不完全アジュバントで追加免疫を行った。さらに２週間後、同抗原２５μｇを静脈に注射し、その３日後に脾臓細胞を摘出した。摘出された脾臓細胞はケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol.256,p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３）と融合し、抗ＰＢＰ２’抗体産生ハイブリドーマを確立した。確立した細胞をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによってＩｇＧを精製し、これをモノクローナル抗体とした。
【００２０】
(3) 抗体感作ラテックスの調製
支持体として直径０．３μｍのポリスチレン製球状粒子（市販品）を用いた。(2) により得られたモノクローナル抗体とポリスチレン製球状粒子を各々リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．０）に溶解し、抗体とポリスチレン製球状粒子の重量比が１：１０となるように抗体を支持体に固定化した。これをリン酸緩衝生理食塩液で洗浄し、牛血清アルブミンでブロッキングを行ったものを抗体感作ラテックスとした。
【００２１】
(4) 抗原抽出法
寒天培地にて純培養された菌から、定量白金耳を用いて１白金耳（約６ｘ１０6 細胞）の菌を採取し、マイクロ遠心チューブに分注された０．１Ｎ  ＮａＯＨ（ｐＨ１２．５）１００μｌに懸濁した。菌懸濁液を沸騰水中で３分間煮沸し、室温にて放冷後、０．５Ｍ  KH2PO4液２５μｌを菌懸濁液に添加して中和した。その後、1500 x gで５分間遠心し、上清を検体とした。
【００２２】
(5) 免疫測定法
検体５０μｌをマイクロピペットでとり、ラテックススライド凝集板上で抗体感作ラテックス液２５μｌと混和した。３分間攪拌後、凝集の有無を観察し、凝集の認められたものを陽性、認められないものを陰性とした。
【００２３】
(6) 参照菌株
(i) ＰＣＲ法及びウェスタンブロット法にてＭＲＳＡかつＰＢＰ２’産生の確認された以下の菌株をＭＲＳＡ参照株とした。
0003638731.tif 000002
【００２４】
(ii)ＰＣＲ法及びウェスタンブロット法にてＭＳＳＡかつＰＢＰ２’非産生の確認された以下の菌株をＭＳＳＡ参照株とした。
0003638731.tif 000003
【００２５】
(7) 感度
ＭＲＳＡ参照株ANJ-10について(4) の方法に従って菌の処理を行い、検体を生理食塩液で２倍段階希釈を行った。それらを各々検体として(5) の方法に従って試験し、凝集像を観察したところ、１：８倍まで凝集を認めた。結果を下記表１に示す。
【００２６】
【表１】
0003638731.tif 000004
【００２７】
(8) 再現性
ＭＲＳＡ参照株ANJ-10、ＭＳＳＡ参照株FDA209P について(4) の方法に従って菌の処理を行い、検体を生理食塩液で２倍段階希釈を行った。(5) の方法により測定した。６回試験したところ、良好な再現性を示し、終末価は全て１：８倍を示した。結果を下記表２に示す。
【００２８】
【表２】
0003638731.tif 000005
【００２９】
(9) 特異性
ＭＲＳＡ参照株ANJ-10、ANJ-12及びANJ-131 、ＭＳＳＡ参照株ATCC25923、 FDA209Pについて(4) の方法に従って菌を処理し、(5) の方法に従って試験したところ、ＭＲＳＡ参照株では陽性、ＭＳＳＡ参照株では陰性を示した。結果を下記表３に示す。
【００３０】
【表３】
0003638731.tif 000006
【００３１】
(10)相関性
液体希釈法又はディスク感受性法にて判定された黄色ブドウ球菌臨床分離株２１９株について(5) の方法に従って試験したところ、以下に示すように従来の薬剤感受性と良好な相関を示した。従来法と一致しなかった１株については、ＰＣＲ法によるＭＲＳＡ特異遺伝子ｍｅｃＡの検出を行ったところＭＳＳＡと判定された。結果を下記表４に示す。
【００３２】
【表４】
0003638731.tif 000007
＊ＰＣＲ法ではＭＳＳＡ
【００３３】
実施例２  酵素免疫測定法によるＭＲＳＡの検出
(1) 抗体固相マイクロプレートの調製
支持体として９６ウェルのポリスチレン製マイクロプレート（市販品）を用いた。実施例１において得られたモノクローナル抗体を５０ｍＭ炭酸緩衝液で１０００倍に希釈し、その１００μｌをウェルに加えて４℃、１８時間放置し、抗体を固定化した。これをリン酸緩衝生理食塩液で洗浄し、牛血清アルブミンでブロッキングを行ったものを抗体固相マイクロプレートとした。
【００３４】
(2) 抗体調製
実施例１(1) で得られた抗原１００μｇをフロイント完全アジュバントと共に家兎に免疫し、２週間毎に同抗原１００μｇをフロイント不完全アジュバントと共に追加免疫した。８週間後に採血、血清を分離後、陰イオン交換クロマトグラフィーによりＩｇＧを精製し、これをポリクローナル抗体とした。
【００３５】
(3) ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
(2) で得られたウサギポリクローナル抗体に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（市販品）をナカネらの方法（Nakane,P.K., et al., J. Histochem., 22, 1084-1091 (1974)) に従って付着し、0.01% チメロサール防腐剤、0.5%牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩液に溶解し、使用時まで冷蔵保存した。
【００３６】
(4) 測定法
実施例１(4) により得られた検体５０μｌを抗体固相マイクロプレートのウェルに滴下し、さらにリン酸緩衝生理食塩液５０μｌを加えて３７℃で３０分間放置した。その後、0.05% Tween20 （商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液でウェル内を洗浄し、続いて0.05% Tween 20（商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液で１００倍に希釈されたペルオキシダーゼ標識抗体１００μｌを加えて３７℃で３０分間放置した。放置後、再び0.05% Tween20 （商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液でウェル内を洗浄し、0.018%過酸化水素水、38 mg/mlオルトフェニレンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．９）１００μｌを加えて室温に放置した。１０分間放置後、1.5 N H2SO4 を１００μｌ加えて攪拌し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が０．２以上示すものを陽性、それ以下を陰性とした。ＭＲＳＡ参照株では陽性、ＭＳＳＡ参照株では陰性を示した。結果を下記表５に示す。
【００３７】
【表５】
0003638731.tif 000008
【００３８】
実施例３  ウェスタンブロット法によるＭＲＳＡの検出
(1) 抗原抽出法
寒天培地にて純培養された菌から、定量白金耳を用いて１白金耳（約６ｘ１０6 細胞）の菌を採取し、マイクロ遠心チューブに分注された０．１Ｎ  ＮａＯＨ（ｐＨ１２．５）１００μｌに懸濁した。菌懸濁液を３７℃で６０分間インキュベートし、０．５Ｍ  KH2PO4液２５μｌを菌懸濁液に添加して中和した。その後、1500 x gで５分間遠心し、上清を検体とした。
【００３９】
(2) ウェスタンブロット法
検体をシェーガーらの方法（上掲）に準じて電気泳動した。このとき、実施例１(1) において精製された抗原を対照抗原として同時に泳動した。泳動後、トービンらの方法（Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 76,p.4350-4354(1979)の方法に準じてニトロセルロース膜（市販品）上に泳動された抽出抗原を固定化した。固定化後、ニトロセルロース上の蛋白非固定化部分は１％スキムミルクでブロッキングを行った。
【００４０】
(3) 免疫検出法
実施例１(2) で得られたモノクローナル抗体を0.05% Tween 20（商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液で１５００倍に希釈し、上記ニトロセルロース膜に滴下した後、室温に１時間放置した。その後、0.05% Tween 20（商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液でニトロセルロース膜を洗浄し、未反応のモノクローナル抗体を除去した。続いて0.05% Tween 20（商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液で５０００倍に希釈されたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（市販品）を滴下して室温で３０分間放置した。放置後、再び0.05% Tween 20（商品名）を含むリン酸緩衝生理食塩液でニトロセルロース膜を洗浄し、ブランドら（Brand et al., Biotechniques vol.8,p58-60(1990)) の方法に従って、テトラメチルベンチジンをニトロセルロース膜上に滴下した。室温で約１０分間放置して発色させた後、精製水でニトロセルロース膜を洗浄して反応を停止させた。対照抗原の移動位置７８ｋｄと同じ泳動位置に発色のバンドが認められるものを陽性、認められないものを陰性とした。結果を下記表６に示す。
【００４１】
【表６】
0003638731.tif 000009
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、迅速、簡便にＭＲＳＡの抗原を抽出することができ、かつ、抽出された抗原を抗原として用いる免疫測定法により高感度にＭＲＳＡを検出又は定量することができる、ＭＲＳＡ抗原の抽出方法が初めて提供された。