(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する、ＨＬＢが１３〜１４の界面活性剤を加え、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する第２工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高密度リポ蛋白（以下、「ＨＤＬ」ということがある）中のコレステロールの定量方法に関する。
【０００２】
ＨＤＬは、動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。
【０００３】
ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法としては、例えば超遠心分離によってＨＤＬを他のリポ蛋白と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその発色強度を測定する方法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的にはほとんど用いられていない。
【０００４】
ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法として現在臨床検査の領域で一般に用いられている方法は、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法である。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むため、簡便性で満足できるものでなく、また、比較的多量の検体量を必要とする。
【０００５】
一方、酵素的にＨＤＬ中のコレステロールを分別定量する方法も既に検討されている。例えば、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を抗体とポリアニオンで予め凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２４２１１０号公報）がある。しかしながら、この方法は少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要なため、限定された分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。
【０００６】
また、他の方法としては胆汁酸塩又は非イオン界面活性剤の存在下に、酵素反応を行なう方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）、さらに近年ではコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物存在下においてＨＤＬ中のコレステロールを特異的に捕える方法（特開平７−３０１６３６号公報）やＨＤＬ以外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後にＨＤＬ中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特開平８−１３１１９７号公報及び特開平８−２０１３９３号公報）が知られているが、いずれも臨床検体の一部のもので沈殿法との乖離が認められる等、特異性の点で問題となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、煩雑な分画分離操作を必要とせず、ＨＤＬ並びに低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロン（ＣＭ）等の他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬコレステロールを選択的に、簡便かつ正確に定量することができる、ＨＤＬ中のコレステロールの定量方法を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＤＬに作用するが他のリポ蛋白にはほとんど作用しない界面活性剤が存在することを見出した。そして、先ず、被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去した後、上記界面活性剤の存在下で酵素的にＨＤＬ由来のコレステロールを定量することにより、ＨＤＬ及び他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬコレステロールを選択的に、簡便かつ正確に定量することができることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次いで、前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用するＨＬＢが１３〜１４の界面活性剤を加え、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する第２工程とを含む、高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
本発明の方法に供される被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血清等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明の方法における第１工程では、被検試料中のＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去する。ここで、「消去」とは、コレステロールを分解し、かつ、その分解物が次の第２工程で検出されないようにすることを意味する。ＨＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等に含まれるコレステロールを選択的に消去する方法としては以下の方法を挙げることができる。
【００１２】
すなわち、第１の方法では、ＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において、被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼの作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロールが加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じる。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロールオキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去する。過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼの作用により、例えばＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノンを生じるフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１３】
上記第１工程は、ＨＤＬに作用する界面活性剤の非存在下において行うことにより、ＨＤＬ中のコレステロールはほとんど反応せず、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消去される。これにより、次の第２工程においてＨＤＬ中のコレステロールが選択的に定量される。
【００１４】
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼの濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜０．７Ｕ単位／ｍｌ程度が好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、ペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。また、過酸化水素と反応して無色キノンを生じる化合物の濃度は０．４〜０．８mmol/l程度が好ましい。
【００１５】
第１工程の反応は、ｐＨ５〜８の緩衝液中で行なうことが好ましく、緩衝液としてはリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッドの緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
【００１６】
第１工程で、ＨＤＬ以外のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを好ましく使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好ましい。
【００１７】
なお、第１工程の反応液中には、任意的に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液中の濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好ましい。
【００１８】
第１工程の反応温度は２５℃〜４０℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は２〜１０分間程度でよい。
【００１９】
続く第２工程では、前記第１工程の産物に、ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する。ここで、「ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤」とは、当該界面活性剤の存在下においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ等の酵素を作用させた場合に、ＨＤＬ中のコレステロールは反応する（反応率７０％以上、好ましくは９０％以上）が、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど反応しない（反応率３０％以下、好ましくは２０％以下）こととなる界面活性剤を言う。このような界面活性剤としては、親水性親油性バランス（ＨＬＢ）が１３〜１４の界面活性剤を挙げることができ、中でも、ＨＬＢが１３〜１４の非イオン界面活性剤、とりわけ、ポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。ここでいう、誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物等を挙げることができる。また、ポリアルキレンオキサイド誘導体の中でもポリエチレンオキサイド誘導体が最も好ましい。また、複数の界面活性剤を混合することによりＨＬＢを上記の範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤のＨＬＢの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀口博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
【００２０】
好ましい界面活性剤の具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４〜３５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２１】
第２工程における界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．０５〜３重量％が好ましく、さらには０．１〜１．５重量％が好ましい。
【００２２】
上記界面活性剤の存在下において、被検試料中のＨＤＬコレステロールを酵素的に定量することができる。すなわち、第１工程では、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールが大部分消去されるが第２工程での反応との相乗効果によりＨＤＬ中のコレステロールのみが定量される。
【００２３】
コレステロールの酵素的な定量方法自体はこの分野において周知であり、例えば第１工程と同様、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用によりコレステロールエステル及び遊離型コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素を定量することにより行なうことができる。過酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等により測定することにより行なうことができる。キノン色素は、例えば過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）を反応させることにより形成される。これにより形成されるキノン色素は、ＤＡＯＳを用いた場合には波長５９３ｎｍに最大吸収を有し、ＨＤＡＯＳを用いた場合には波長５８３ｎｍに最大吸収を有する。キノン色素を生成する化合物の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、例えば４−アミノアンチピリンでは好ましくは０．１〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１．５ｍＭであり、ＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳでは好ましくは０．１〜１．５ｍＭ、さらに好ましくは０．４〜１．０ｍＭである。また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．４〜５Ｕ／ｍｌが好ましい。なお、第２工程の好ましい反応条件（反応温度、反応時間、緩衝液、ｐＨ）は、第１工程の好ましい反応条件と同じである。
【００２４】
なお、第１工程において、生じた過酸化水素をカタラーゼで分解する場合には、第２工程ではこのカタラーゼを阻害する必要があるので、第２工程において例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を用いてカタラーゼを阻害する。
【００２５】
実施例
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記例において、「％」は特に断りがない限り「重量％」を示す。
【００２６】
参考例１
既知濃度の精製ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はＣＭを含む試料を用い、花王（株）製非イオン性界面活性剤エマルゲン９１１（ポリオキシエチレンノニルエーテル、ＨＬＢ１３．７）、エマルゲンＢ６６（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１３．２）、又はエマルゲンＢ６６とエマルゲンＡ９０（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１４．５）の混合物の存在下で各リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量した。この操作は具体的に次のように行なった。
【００２７】
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０、コレステロールエステラーゼ０．５Ｕ／ｍｌ、コレステロールオキシダーゼ０．４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ０．５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン１．０ｍｍｏｌ／ｌ、ＨＤＡＯＳ  ０．５ｍｍｏｌ／ｌに、エマルゲン９１１若しくはエマルゲンＢ６６を０．１重量％、又はエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物（９／１）１．３重量％を含む試薬を調整し、試料２０μｌに試薬２．０ｍｌを混和し、３７℃、１０分間反応させた後、６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】
その結果、コレステロールの反応率（コレステロール中の定量されたコレステロールの割合）は、ＨＤＬ中のコレステロールが約９５％、その他のリポ蛋白中のコレステロールが約１８〜２２％であった。
【００２９】
このことから、エマルゲン９１１、エマルゲンＢ６６、及びエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物は、本発明で言う「高密度リポ蛋白に特異的に作用する界面活性剤」に該当する。
【００３０】
実施例１
次の組成から成る第１及び第２試薬を調製した。
第１試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０                              100 mmol/l
ＨＤＡＯＳ                                                0.7 mmol/l
コレステロールエステラーゼ                                0.8 U/ml
コレステロールオキシダーゼ                                0.5 U/ml
カタラーゼ                                                80 U/ml
塩化マグネシウム                                          10 mmol/l
第２試薬
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０                              100 mmol/l
４−アミノアンチピリン                                    4.0 mmol/l
ペルオキシダーゼ                                          2.4 U/ml
アジ化ナトリウム                                          0.1%
花王（株）製エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ１３．２）            0.3%
【００３１】
濃度100 mg/dl の精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はＣＭをそれぞれ含む４種類の試料各４μｌに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μｌを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１００μｌを３７℃で５分間反応させ、反応液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計算して捕捉率とした。
【００３２】
この方法では、第１工程で生じた過酸化水素がカタラーゼにより分解され、一方、第２工程で生じた過酸化水素はＨＤＡＯＳ及び４−アミノアンチピリンと反応してキノン色素が生じる。結果を下記表１に示す。
【００３３】
【表１】
表１
0003644490.tif 000002
【００３４】
表１に示されるように、上記方法によれば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００３５】
実施例２
被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例１と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。一方、「臨床検査」、23, 121(1979) に記載された沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図１に示す。
【００３６】
図１に示されるように、両方法による定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明らかになった。
【００３７】
実施例３
第１試薬及び第２試薬として下記の組成を有するものを用いることを除き、実施例１と同じ操作を行った。
【００３８】
第１試薬
ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０                              50 mmol/l
ＤＡＯＳ                                                  1.5 mmol/l
コレステロールエステラーゼ                                0.8 U/ml
コレステロールオキシダーゼ                                0.5 U/ml
ペルオキシダーゼ                                          1.0 U/ml
第２試薬
ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０                              50 mmol/l
４−アミノアンチピリン                                    4.0 mmol/l
花王（株）製エマルゲン９１１（ＨＬＢ１３．７）            0.3%
【００３９】
この方法では、第１工程で生じた過酸化水素がペルオキシダーゼの作用でＤＡＯＳと反応して無色キノンが生じ、第２工程で発生した過酸化水素は同じくペルオキシダーゼの作用で第１工程の残存ＤＡＯＳ及び第２工程で加えた４−アミノアンチピリンと反応してキノン色素を生じる。結果を下記表２に示す。
【００４０】
【表２】
表２
0003644490.tif 000003
【００４１】
表２に示されるように、上記方法によれば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００４２】
実施例４
被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例３と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。実施例２と同様に、沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図２に示す。
【００４３】
図２に示されるように、両方法による定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明らかになった。
【００４４】
実施例５
次の組成から成る第１及び第２試薬を調製した。
第１試薬
ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０                                  100 mmol/l
ＨＤＡＯＳ                                                0.7 mmol/l
コレステロールエステラーゼ                                0.8 U/ml
コレステロールオキシダーゼ                                0.5 U/ml
カタラーゼ                                                100 U/ml
塩化マグネシウム                                          18 mmol/l
第２試薬
ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０                                  100 mmol/l
４−アミノアンチピリン                                    4.0 mmol/l
ペルオキシダーゼ                                          2.4 U/ml
アジ化ナトリウム                                          0.1%
花王（株）製エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ１３．２）            1.17%
花王（株）製エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ１４．５）        0.13%
【００４５】
濃度100 mg/dl の精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はＣＭをそれぞれ含む４種類の試料各４μｌに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μｌを混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１００μｌを５分間反応させ、反応液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計算して捕捉率とした。
【００４６】
この方法では、第１工程で生じた過酸化水素がカタラーゼにより分解され、一方、第２工程で生じた過酸化水素はＨＤＡＯＳ及び４−アミノアンチピリンと反応してキノン色素が生じる。結果を下記表３に示す。
【００４７】
【表３】
表３
0003644490.tif 000004
【００４８】
表３に示されるように、上記方法によれば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００４９】
実施例６
被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例５と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。一方、「臨床検査」、23, 121(1979) に記載された沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図３に示す。
【００５０】
図３に示されるように、両方法による定量結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明らかになった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、煩雑な分画分離操作を必要とせず、ＨＤＬ並びにＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等の他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬを選択的に、簡便かつ正確に定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１実施例の方法により測定したＨＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図である。
【図２】本発明の他の１実施例の方法により測定したＨＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図である。
【図３】本発明のさらに他の１実施例の方法により測定したＨＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図である。
【図１】
0003644490.tif 000005
【図２】
0003644490.tif 000006
【図３】
0003644490.tif 000007