(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球計数フローセルの全血液検体の少なくとも一部の網赤血球を分析する方法において、
複数の細胞を含む全血液検体の一部と、赤血球細胞を破裂させることなく膨張させて、赤血球からヘモグロビンを除去する赤血球試薬とを組み合わせるステップと、
血球計数フローセルを前記の組み合わされた全血液検体と赤血球試薬の部分標本を通過させるステップであって、前記血球計数フローセルの検出区画を実質的に一回に１つずつ前記細胞を通過させ前記検出区画を少なくとも１本の光ビームを同時に通過させて、前記細胞を横切ることを含むステップと、
個々の細胞が前記光ビームを横切るときに個々の細胞により散乱される光を検出するステップと、
前記全血液検体中の網赤血球の比率を得るため個々の細胞により散乱された前記光を分析するステップと、
からなることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、中央光散乱角を検出することをさらに特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、個々の細胞が前記検出区画を通過するとき、個々の細胞を電子的に検知をすることをさらに特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記検出した光散乱と前記の電子的な検知を組み合わせて、前記網赤血球の比率を得ることをさらに特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記赤血球試薬を加える前に、染色試薬と前記全血液検体とを組み合わせることをさらに特徴とする方法。
【請求項６】
血球計数フローセルの全血液検体の少なくとも一部の網赤血球を分析する装置において、
複数の細胞を含む全血液検体の一部と、赤血球細胞を破裂させることなく膨張させて、赤血球からヘモグロビンを除去する赤血球試薬とを組み合わせる手段と、
血球計数フローセルを前記の組み合わされた全血液検体と赤血球試薬の部分標本を通過させる手段であって、前記フローセルは、該血球計数フローセルの検出区画を実質的に一回に１つずつ前記細胞を通過させる手段と、前記検出区画を少なくとも１本の光ビームを同時に通過させて、前記細胞を横切るようにする手段とを含む手段と、
個々の細胞が前記光ビームを横切るときに個々の細胞により散乱された光を検出する手段と、
前記全血液検体中の網赤血球の比率を得るため、個々の細胞により散乱された前記光を分析する手段と、
を具備することを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置において、中央光散乱角を検出する手段を有することをさらに特徴とする装置。
【請求項８】
請求項６に記載の装置において、個々の細胞が前記検出区画を通過するときに、個々の細胞を電子的に検知をする手段を有することをさらに特徴とする装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置において、前記検出した光散乱と前記の電子的検知とを組み合わせて、前記網赤血球の比率を得る手段をさらに有することを特徴とする装置。
【請求項１０】
請求項６に記載の装置において、前記赤血球試薬を加える前に、染色試薬と前記全血液検体とを組み合わせる手段を有することをさらに特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、一般に、粒子分析装置、特に、蛍光染色技術または材料を用いず、光散乱技術を用いた個々の赤血球細胞型、主として網赤血球の選択、識別、分画分類を行う方法と装置に関する。
背景技術
網赤血球は医学文献では、未熟赤血球（または核が抽出された脱核細胞）と定義されており、この種の細胞は、全赤血球数中に通常、０．７〜２．２％の比率で存在する。例えば、様々な形態の貧血または急性内部出血などのような疾患の診断の特定を同定または支援しようとする場合、網赤血球の決定は医学的な重要性がある。
人間の血液をスライドガラスの表面に塗抹する顕微鏡による視算検査は、網赤血球決定方法として古くから広く用いられている方法である。この方法は、時間を節約するが、実際の網赤血球数の計数を人間の眼に頼っており、しばしば網赤血球数を誤って計測してしまうことが多く、その結果、誤診につながることも少なくなかった。
顕微鏡を用いて網赤血球を決定する方法の１つは、Ｂｊｏｒｋｍａｎによる「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｕｎｔ」Ｊ．Ｃｌｉｎ．＆  Ｌａｂ．ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，４３５〜４３６，１９５８に開示されている。ここで用いた方法は、新しいメチレンブルーを用いて毛細血管血液を染色し、希釈液により赤血球細胞を固定する方法を用いている。希釈溶液は硫酸中に希釈したチオシアン酸カリウムからなっている。固定プロセスは、赤血球細胞からのヘモグロビンの溶出が伴う。ヘモグロビン数が減少すると、スライドガラスに塗抹した血液中の細胞を顕微鏡で観察したときに、小網の決定を向上させる。
自動化された網赤血球数の計数装置も市販されているが、赤血球数決定の基礎として蛍光を用いた場合周知の機器の使用の信頼性は一般的である。蛍光を用いる装置は、高価で、複雑で、メンテナンス費用も比較的高くつく。
網赤血球は、蛍光染色法と組み合わせたとき、フローサイトメータを用いて識別と分類ができることはよく知られている。このような方法の１つには、９０°または大きな角度の光散乱と組み合わせた小さな角度の光散乱を用いる方法が含まれる。
従来技術に関する文献、科学雑誌、および報告書では、光軸に対し、さまざまな角度位置で光散乱技術を用いて検体の照射と検査をする方法を図示、説明、および議論している。しかし、入手可能な文献の多くは、網赤血球の検出に蛍光、蛍光技術、および化学的方法に頼っているのが現状である。
この従来技術の例には、染色した検体の網赤血球蛍光の強さを強め、同時に、蛍光を測定したとき、Ｓ／Ｎ比を高めるため検体のバックグラウンド蛍光を低減する染料を含む試薬について記載したＫｕｒｏｄａ他による米国特許第４，９８５，１７４が含まれる。これは、黄色蛍光色素オーラミンＯを含む試薬によって達成される。
Ｇｅｒｓｈｍａｎ他による米国特許第４，３２５，７０６には、塩基性蛍光色素アクリジン・オレンジで全血液検体を処理する方法を記載しており、この方法では、検体を狭い流体力学的集中領域を持つ光学的フローサイトメータを通す。赤い蛍光光と出力散乱光が検出される。闘値との比較に基づき、闘値レベルを発展させて、網赤血球から赤血球細胞を分離する。
Ｌｅｅ他による米国特許第４，８８３，８６７には、蛍光組成に関して記載している。チアゾール・オレンジを用いることは、網赤血球の染色に効果的な染料であることが分かっている。
発明の開示
本発明は、生物細胞検体中の細胞型を高速、高精度で自動的に分析と分離をする新規かつ有用でこれまで自明でなかった生物細胞のカウント、測定、および分画をする方法と装置を提供する。
概略的に言えば、本発明は、流体力学的に集中した粒子の流状になってヘモグロビンが除去された赤血球細胞の生物検体が、電磁放射ビーム、レーザ光などのような焦点を絞ったビーム光を通過するようにした構造的な組み合わせを提供する。光検出器は、光ビーム軸に対し適切に配置され、個々の細胞の通過を示す光出力パルスを送出する。
流動経路中の電気的導電接点は、個々の細胞の検査結果として、さらに電気パルス出力を送出することができる。適切に配置した光レセプタは、光ビーム軸に対し角度を付けて配置され、移動検体中の網赤血球を示す電気パルスを出力する。適切な電子回路を用いて、光と電子的に生成された出力パルスまたは信号とを、他の周知の細胞型から区別可能に網赤血球の特定および定量をすべく結合することができる。
本発明は、光散乱技術だけを用いておよびＣｏｕｌｔｅｒ型技術と組み合わせて網赤血球を示すデータを発生する装置と方法に関係するものである。
さらに、本発明は、特に、情報またはレーザ光の軸に対しある角度範囲でマスクしたレーザビームの出力領域に配置されているパルス発生アセンブリから得たデータを用いた新しい装置と方法を提供する。
本発明の実施において、赤血球の分離（Ｌｙｓｉｎｇ）または、赤血球細胞を破裂させることなく、球形に膨張させて、赤血球からヘモグロビンを除去する「赤血球試薬」で処理された網赤血球は、フロー装置中で光散乱により分析され、低出力レーザを照射して、分離した網赤血球の小集団として赤血球の検出と計数を行う。
効果は、例えば、１０°の小さな前方角から約１８０°を含む角度までの広範囲の光散乱角内で明白である。分析に好ましい角度は、約２０°〜６５°の範囲である。
Ｃｏｕｌｔｅｒ容積またはＤＣとして知られる低周波開口インピーダンスは、全赤血球細胞の識別とカウントをするため、また他の細胞型から網赤血球を分離するため、さらに、平均網赤血球量を得るため、同時に検知できる。
高周波または無線周波開口インピーダンスは、同時に検知して他の細胞型から網赤血球を識別できる。
【図面の簡単な説明】
本発明の好適な実施例は、例と、この明細書に添付した図面を用いて説明する。
図１は、理想化して表現した血球計数フローセルとこれに動作上関連する光検出器アセンブリを含む構成を示す図である。
図１Ａは、信号受信領域を示す、本発明を用いた光検出器アセンブリの正面図（一定の尺度ではないが）を示す図である。
図２は、本発明を実現する装置と演算電子回路を示すシステム・ブロック図である。
図３Ａ〜３Ｃは、本発明により網赤血球の分画と計数をする３つの方法を示すフローチャートである。
図４Ａ〜４Ｄは、網赤血球を含む血液検体の染色および赤血球細胞を破裂させることなく、球形に膨張させて、赤血球からヘモグロビンを除去することの効果を示すデータプロットである。
図５Ａ〜５Ｄは、網血球を含む血液検体についてさまざまな光散乱角で得られた結果を示すデータプロットである。
図６Ａ〜６Ｃと７Ａ〜７Ｇは、光または光と電子的な検知技術を用いた自動集団分類方法で得られた網赤血球分析報告を示すデータプロットである。
図８Ａ〜８Ｃ、９Ａ〜９Ｃ、１０Ａ〜１０Ｃ、および１１Ａ〜１１Ｃは、網赤血球の０．０％〜約３０％までの広範囲にわたり多くの臨床的な人間の血液検体について網赤血球分析報告を示すデータプロットである。
図１２は、本発明により得た網赤血球の比率対基準方法によって得た網赤血球の比率のプロットを示す図である。
発明の実施態様
多くの図とこの明細書中を通し、本発明により得た結果を得るため、および／または説明するためいくつの名称と略語を用いる。
「ヒストグラム」は、単一変数に関する周波数分布のグラフであり、Ｘ軸上にプロットされた変数とＹ軸上に「＃」としてプロットされた周波数の２次元線グラフとして表示され、また、ヒストグラムは、コンピュータ、あるいは、ある形態の電子回路内にグラフとして表現された抽象的な数値表としても定義されている。
「マトリックス」は、Ｘ軸上にプロットされた１変数を持つ３次元等高線グラフとして表示された２つの独立変数、Ｙ軸上にプロットされた第２変数、および等カウント等高線として表示された周波数またはカウントの周波数分布グラフとして定義されている。明確にするため、１つの等カウント等高線だけを表示して外形を示す。また、マトリックスは、コンピュータ内に、あるいは、ある形態の電子回路として表現された抽象的な数値表としても定義されている。この明細書中でマトリックスを説明するときは、Ｘ軸変数を最初に記載し、次にＹ軸変数を記載する。
「パラメータ」は、独立変数の同義語であり、以降の明細書中で述べているように本発明では、粒子分析器またはフローサイトメータで分析された細胞から得られた任意の同時的かつ独立測定に関する。ある数学的関数の２つまたはそれ以上の組み合わせは、別のパラメータを生成すると定義される。
「ゲーティング」は、フィルタ・プロセスとして定義され、１つまたはそれ以上の他のパラメータの検査中に、複数パラメータ・データから、１パラメータのヒストグラムを作成するのに用いたものである。フローセルを通過する１赤血球細胞の通過およびパラメータ・トランスデューサによる細胞測定の各イベントに対し、ゲーティングに用いられている各パラメータに対応する値または測定は、１つ、または２つの基準値あるいは闘値と比較され、闘値以下か、闘値以上か、または２つの闘値の中間にあるのか「テスト」される。もし、このテストにより、考量中の全ゲーティング・パラメータに対して正しい結果が得られるなら、イベントはヒストグラムに含まれている。ゲーティングはまたマトリックスの作成にも用いることができる。従って、ゲーティングを用いることにより、分析と複数パラメータ・データのグラフィック表示とを単純化することが可能である。
「光検出器」は、光を収集し、光検出器で受光した光量に比例して電流を発生する真空または固体の任意の種類のデバイスに関する。
「ビームダンプ」は、一般に、レーザビームとフローセル間の交差の結果、光検出器を横切る水平ラインとして現れる不要なレーザ光を除去する障害物として定義されており、もし、不要なレーザ光を遮断しないと検出した光散乱信号の品質が低下する。
「マスク」は、不要な小さな角度の光散乱情報を除去し光検出器によるこの情報の受信を防ぐ、円形または楕円形状の障害物として定義されている。
「ＤＣ」と「ＲＦ」は、開口インピーダンス細胞検知のＣｏｕｌｔｅｒ原理に関する電子的な検知パラメータである。「ＤＣ」は、細胞膜を透過しないで、細胞を電流が流れないように、直流または低周波電流を印加して得られたパルス・ピーク情報として定義されている。ＤＣパルスのピーク振幅は細胞容積の関数である。
「ＲＦ」は、細胞膜が短絡して、細胞に電流が流れるごとき高周波電流を印加して得られた測定から得たパルス・ピーク情報として定義されている。ＲＦは細胞容積と内部導電率の関数である。
「不透明」は、すべての個々の細胞測定、あるいはイベントに対する、ＤＣ信号データによりＲＦ信号データを割って得た信号又はデータとして定義されており、細胞容積とは無関係であるが内部導電率の関数である新しい細胞パラメータを生成する。
「ＬＭＡＬＳ」は、Ｌｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉａｎ  Ａｎｇｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、光ビーム軸、例えば、レーザビーム２２の軸３０から１０°〜２０°の角度範囲にわたって散乱した光検出器アセンブリ２８が受光した光である。
「ＵＭＡＬＳ」は、Ｕｐｐｅｒ  Ｍｅｄｉａｎ  Ａｎｇｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、散乱した、または、光ビーム軸、例えば、レーザビーム２２の軸３０から２０°〜６５°の角度範囲にわたり光検出器アセンブリ２８が受光した光である。
「ＲＡＬＳ」は、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ａｎｇｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、約１６０°〜１７６°の角度範囲にある光ビーム２２に対し、反対方向に位置する光検出器アセンブリで受光した光である。
「ＳＡＬＳ」は、Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｎｇｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、光ビーム軸から約９０°〜２０°の角度範囲に位置する光検出器アセンブリで受光した光である。
「ＲＬＳ」は、Ｒｏｔａｔｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、ＤＣで割ったＵＭＡＬＳの対数である。
「ＲＥＴＩＣとＲＥＴＩＣ％」は、全赤血球数の比率として示された網赤血球数を示す。
「ＲＥＦ  ＲＥＴＩＣ」は、ＮＣＣＬＳ文書Ｈ−１６Ｐに記載された顕微鏡を用いる方法論に従って得た基準網赤血球の比率である。
「ＲＢＣ」は、通常、カウント×１０6／μＬで示される絶対的赤血球数、または赤血球数である。
「ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ」は、通常、カウント×１０6／μＬで示される絶対的網赤血球数を示す。
「ＭＲＶ」は、網赤血球集団の平均ＤＣ値を測定して得た平均網赤血球容積として定義されている。
「ＲＭＩ」と「ＭＩ」は、全網赤血球数に対する高密度光散乱網赤血球数の比率として定義された網赤血球の成熟指数を示す。
「ＬＳ」は、Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒの略であり、一般に、特定角度または角度範囲を指定しない任意の光散乱を示す。
「ＬＬＳ」は、「ＬＳ」の対数として定義されており、ＬＬＳの好ましい角度または角度範囲はＬＯＧ  ＵＭＡＬＳである。
「ＲＬＳ」は、ＬＬＳ、好ましくは、上述したようにＤＣで割ったＬＯＧ  ＵＭＡＬＳである。
「ＬＳＲ」は、Ｌｏｗ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓの略である。
「ＨＳＲ」は、Ｈｉｇｈｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓの略である。ＬＳＲとＨＳＲに関するさらに詳しい説明は、本明細書中の以下の節に記載されている。
以下の説明において、光散乱角は、開口または検知区画内の生物細胞から出力される光の角度として定義されている。後述する光検出器アセンブリに衝突（入射）する散乱光の角度は、検体、希釈液、および／または流体力学的シース流流体、空気、フローセル材料の屈折率の差により、またスネルの法則で予測したようなフローセルの構成により、開口内の真の角度から離れるかもしれない。
図１は、本発明の方法とプロセスを用いる粒子分析装置の１形式の一部を示す。図１の装置には、例えば、溶融シリカなどの光学的に透明な物質からなるフローセル１０を含む。この例において、血球計数フローセル１０の内部は、生物細胞検体がこの図には示されていない周知の方法により、流体力学的に集中した流れ１４として通過、または流れる狭い、あるいはくびれた開口を除き、全体的に楕円形状である。フローセル１０の外壁表面は、平坦な１側面部１８を除き楕円形状である。
レーザ２０は、レンズ、または開口あるいは検知区画１２の小さな点にビーム22の焦点を結ぶレンズ系２４にコヒーレントな光ビーム２２を放射する。レーザ２０は任意の種類または波長である。
さらに、本発明は、光源としてレーザだけに制限されていない。フローサイトメータ分析に必要な大きさのオーダの点に光を収束できるのであれば、アーク灯などのような他の光源も用いることができる。この例において、レーザ２０は、６３２．８ｎｍで放射する０．８ｍＷの比較的低電力のヘリウム・ネオンレーザを用いている。レンズ系２４は、フローセル１０の開口１２内に水平に配置された細長い点にレーザ光ビーム２２の焦点を結ぶように設計されている２つのクロス・シリンドリカル（ｃｒｏｓｓ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ）レンズを備えている。レーザビーム２２のこのような光学的形状により、細胞や粒子がフローセル１０を流れると、細胞または粒子位置への装置の感度を低くし、放射がより一様になり、同じ細胞や粒子への光散乱レベルがより一様になる。
生物細胞が、流体力学的に集中した流れ１４を流れると、生物細胞は個々に開口１２と焦点を絞った光ビーム２２を通過し、図で点線で示されている光散乱光線２６を放射する。光検出器アセンブリ２８は、光散乱放射レセプタとして動作し、光を放射し、軸３０に集中するレーザ光の軸３０に直交する平面に位置して、光散乱光線２６を収集する。
図１は、光検出器アセンブリ２８の斜視図を示す。図１Ａは、同じ光検出器アセンブリ２８の正平面図を示す。以下の説明は図１と１Ａに関するものである。光検出器アセンブリ２８は、検出器３２の正面に位置し、平行に配置されている光起電力検出器３２、ビームダンプ３４と、検出器３２の正面に置かれ、水平に配置されているマスク３６との組み合わせを含む。マスク３６は、ビームダンプ３４の中心に配置された円形または楕円形状の構造である。マスク３６は、レーザ光ビーム軸３０と同軸に向けられている。
水平ビームダンプ３４は、中心よりその外端が大きいまたは広い蝶ネクタイ状の形状をとりえる。水平ビームダンプ３４は、水平方向に引伸しあるいは平坦にして、細胞や粒子がフローセル１０を流れたとき、細胞または粒子位置に対する装置の感度を低く抑えるため、レーザビームの形状を成形する状態に光学系を適合させるのに用いている。このような光学的形状の採用により、光散乱信号出力を電子的に用いるため、より一様な光出力信号を出力する。
図１と１Ａにおいて、光検出器３２は、円形帯４２によって２つの区画３８、４０に分割されている。光検出器３２の大きさ、区画３８と４０の大きさ、マスク３６の大きさの結果として、およびフローセル１０に対する光検出器アセンブリ２８の距離の結果として、内部区画３８は、約１０°〜２０°の角度範囲で散乱したＬＭＡＬＳ光を受光する。外部区画４０は、２０°〜６５°の角度範囲で散乱したＵＭＡＬＳ光を受光する。
この説明のため、赤血球細胞は、図１に示すフローセル１０の開口１２を通って１つずつ通過すると見なされる。赤血球細胞または他の粒子がどのようにしてフローセル１０に入るのか、また細胞の複数パラメータ・データをどのようにして得て、分類、処理するのかという方法に関する装置の詳しい全体な説明は、共有の米国特許第５，１２５，７３７に記載されている。
図２は、本発明を実現する粒子分析装置、またはフローサイトメータのブロック図を示しており、この図には図１と図１Ａおよび上述した構成要素を含む。レーザ２０は、開口またはフローサイトメータ１０の検知区画１２の小さな点にビーム２２の焦点を結ぶレンズまたはレンズ系２４に、コヒーレントなビーム２２を放射する。ビーム２２は血球計数フローセル１０を透過して、光検出器アセンブリ２８のマスク３６とビームダンプ３４に衝突（入射）する。希釈液中の赤血球細胞は、ライン４４を通ってフローセル１０に入り、検体導入管４６を通って流れる。シース流体４８は、細胞５０を流体力学的に集中させられ、開口１２を個々に通過させる。細胞が開口１２から放出された後、第２シース５２は、その細胞を検体出力管５４と廃棄室５６に導く。細胞５０が開口１２にあって、焦点を絞ったレーザビーム２２で照射されたとき、細胞は多方向に光を散乱する。いくつかの光散乱光線５８、６０、６２、および６４が点線で図に示されている。
光検出器アセンブリ２８の光検出器３２は、２つの区画３８と４０を含む。２つの区画３８と４０の角度範囲は、光検出器３２の大きさ、フローセル１０に対する光検出器３２の距離と位置、およびマスク３６の直径によって決定される。内部区画３８は、約１０°〜２０°の角度範囲で散乱したＬＭＡＬＳ光線５８を収集し、ＬＭＡＬＳパルス６８を出力するプリアンプ６６に供給される信号を生成する。外部区画４０は、約２０°〜６５°の角度範囲で散乱されたＵＭＡＬＳ光線を収集し、ＵＭＡＬＳパルス７２を出力するプリアンプ７０に供給される信号を生成する。光検出器７４は、レーザビーム２２の軸３０に垂直に配置され（図の平面に垂直）、約９０°〜２０°の角度範囲で散乱されたＳＡＬＳ光線６２を収集し、ＳＡＬＳパルス７８を出力するプリアンプ７６に供給される信号を生成する。光検出器対８０は、レーザビーム２２の周囲に対称的に配置され、レーザビーム２２に対し反対方向に散乱されたＲＡＬＳ光線６４を収集し、約１６０°〜１７６°の角度範囲でＲＡＬＳパルス８４を出力するプリアンプ８２に供給される信号を生成する。
電子パルス発生装置８６は、ＲＦとＤＣ信号の電流発生源、検出、および増幅手段を提供する。発振検出器８８からの無線周波電流とＤＣ発生源からの直流は、結合回路９２で結合され、電極対９４と９６に供給される。電極９４と９６は、周知の方法で開口１２の反対側のフローセル１０に位置している。電流はライン９８を介して結合され、開口１２を流れる電流を形成する。開口１２を横切る粒子または細胞５０は、開口１２のインピーダンスを一時的に変化させ、開口を通る電流のＲＦとＤＣ成分を変調する。ＲＦ電流の変調はフィルタで除去され、結合回路９２を通って発振検出器８８に供給される。発振検出器は、ＲＦパルス１０２を出力するＲＦプリアンプ１００へ、検出したパルスを供給する。
同時に、インピーダンスの変化による直流電流の変調は、フィルタで除去され、結合回路９２を通ってＤＣプリアンプ１０４に供給され、ＤＣプリアンプからＤＣパルス１０６を出力する。電子パルス発生装置８６の上述した説明は、好ましい形態であり、「Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅａｃｔａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ」と題された、共有者の米国特許第４，７９１，３５５に詳細に記載されている。電子パルス発生装置８６には、実質的に同じ結果をもたらすことができる他の任意の設計を含むことができる。本発明のある実施例では、ＤＣだけを用いてＲＦ電流を用いていないので、従って、これらの場合、電子パルス発生装置８６は、ＤＣ発生源９０とＤＣプリアンプ１０４だけを含む必要がある。
「パルス・プロセッサ」モジュール１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、および１１８はそれぞれ、増幅器、ローパスフィルタ、ハイパスフィルタ、およびベースライン・レストラを含む。「ピーク検出器」モジュール１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、および１３０はそれぞれ、パルスピーク振幅に比例している一定電圧「値」を供給する。対数増幅器（ログアンプ）モジュール１３２、１３４、１３６、および１３８は、切り換えて出力として、入力を対数変換した、または変換しない線形入力を供給する回路である。アナログ／デジタル・コンバータ（ＡＤＣ）１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、および１５４は、さらなる処理のためコンピュータ１５６にデータを供給する。
ＤＣパルス１０６は、パルス・プロセッサ１１０とピーク検出器１２２に供給され、ＡＤＣ１４４に供給されるラインのＤＣ値を生成し、ＡＤＣ１４４は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。ＲＦパルス１０２は、パルス・プロセッサ１０８とピーク検出器１２０に供給され、ＡＤＣ１４０に供給されるライン１６０のＲＦ値を生成し、ＡＤＣ１４０は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。デバイダ・モジュール１６２は、ＲＦ値をＤＣ値で割って、ＡＤＣ１４２に供給されるライン１６４の不透明値を生成し、ＡＤＣ１４２は、デジタル化した値をコンピュータ１５６に供給する。
ＵＭＡＬＳパルス７２は、パルス・プロセッサ１１２とピーク検出器１２４に供給され、ログアンプ１３２を通ってＡＤＣ１４８に供給されるライン１６６のＵＭＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１４８は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。デバイダ・モジュール１６８は、ログＵＭＡＬＳ値をＤＣ値で割って、ＡＤＣ１４６に供給されるライン１７０のＲＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１４６は、デジタル化した値をコンピュータ１５６に供給する。ＬＭＡＬＳパルス６８は、パルス・プロセッサ１１４とピーク検出器１２６に供給され、ログアンプ１３４を通ってＡＤＣ１５０に供給されるライン１７２のＬＭＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１５０は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。ＳＡＬＳパルス７８は、パルス・プロセッサ１１６とピーク検出器１２８に供給され、ログアンプ１３６を通ってＡＤＣ１５２に供給されるライン１７４のＳＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１５２は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。ＲＡＬＳパルス８４は、パルス・プロセッサ１１８とピーク検出器１３０に供給され、ログアンプ１３８を通ってＡＤＣ１５４に供給されるライン１７６のＲＡＬＳ値を生成し、ＡＤＣ１５４は、デジタル化したパルス・ピーク値をコンピュータ１５６に供給する。
網赤血球の計数に用いた試薬装置は、赤血球細胞、チオシアン酸カリウム、および硫酸からなる網赤血球をゴースト化する液を含む。この赤血球をゴースト化する溶液は赤血球細胞を破裂させることなく、球状に効果的に膨張させ、赤血球細胞からヘモグロビンを溶出させる、即ち赤血球をゴースト化する機能を有する溶液のことである。以下ではこのような溶液を単に「赤血球ゴースト化溶液」と呼び、またこのような溶液を用いた赤血球試薬を単に「赤血球ゴースト化試薬」と呼ぶ。さらに、このような赤血球ゴースト化溶液は、固定特性を持っているので、膨張して球状になった細胞をそのままの状態に保持する。
生網赤血球は、不規則な形状であり、０°〜９０°の角度範囲で光ビームに曝したとき、フローサイトメータ中で予測し難い光散乱情報を生成する。球状に膨張した赤血球細胞は、検体中の赤血球数を決定する基礎を形成する再生可能な光散乱情報を生成する。
膨張した赤血球細胞からのヘモグロビンの除去は本発明の基本的な事柄である。ヘモグロビン数を減少させると、小網の特定を向上させ、網赤血球の流動血球計数を可能にする。
赤血球ゴースト化溶液による処理プロセスは温度に影響されることが分かっている。特に、５５°Ｆ以下の温度では赤血球ゴースト化溶液による処理プロセスの進行が遅くなり、赤血球ゴースト化溶液による処理プロセスが開始するのに長い時間を要することが明らかになっている。その結果として、血液検体を約３０秒の間約５５°〜９０°Ｆの温度で赤血球ゴースト化溶液と混合することが好ましい。
赤血球ゴースト化溶液のＰＨは、約１．０〜３．０の範囲、好ましくは、１．０〜２．０の範囲になければならない。さらに、酸性赤血球ゴースト化溶液は、ヘモグロビンを溶解して、赤血球細胞からのヘモグロビンの除去を容易にする。チオシアン酸カリウムを用いるとき、硫酸は混合して用いる好ましい酸であるとが知られている。特に、硫酸のように作用しない他の酸としては、塩酸と硝酸を含む。チオシアン酸カリウムの好ましい濃度は、約１．０〜６．０ｇ／ｌで、硫酸は約０．７〜３．０ｇ／ｌである。
赤血球ゴースト化溶液の浸透圧は、迅速になるように制御しなければならないが、赤血球細胞の膨張は制御される。赤血球ゴースト化溶液の浸透圧は、７５〜１１０ミリオスモル、好ましくは８２〜１０５ミリオスモルの範囲にある。浸透圧により、赤血球細胞を膨張させ、赤血球ゴースト化溶液との混合液から３０秒間でヘモグロビンが溶出する。もし、浸透圧が７５ミリオスモル以下である場合、赤血球細胞は、完全な細胞膜を保持しないで崩壊する。特に、浸透圧が低いと赤血球細胞に損傷を与え、その結果、網赤血球数の計数が信頼性のないものになる。もし、浸透圧が十分でないと、赤血球細胞は網赤血球の区別をしにくくするヘモグロビンを溶出しない。
本発明の好適な実施例において、赤血球ゴースト化溶液による処置の前に網赤血球の染色を行う。網赤血球染色の機能は、フローサイトメータの光散乱計数用の網赤血球の輪郭をよりくっきりとさせることである。網赤血球染色は、網赤血球のリボ核酸（ＲＮＡ）細胞内に沈澱する非蛍光染料である。適切な染料の例としては、新しいメチレン・ブルーとブリリアント・クレシル・ブルーが含まれる。網赤血球の測定に非蛍光染料を用いると、蛍光染料を用いる他の成分の分析に血液検体を用いることができるようになる。特に、網赤血球の計数に沈澱ＲＮＡ染料を用いると、適合性のある蛍光染料を同じアッセイに用いて、網赤血球染色の蛍光を妨害することなく、血液検体の他の成分を調べることができる。
好ましい網赤血球染料は、新しいメチレン・ブルーの水溶液からなる。水溶性の新しいメチレン・ブルー溶液は、アルカリＰＨが約７．０〜８．５の範囲、好ましくは７．０〜８．０の範囲である。水溶性の新しいメチレン・ブルー溶液は、染色濃度が０．２〜２．０ｇ／ｌ、好ましくは、０．４〜１．２ｇ／ｌである。さらに、染色溶液の浸透圧は、約１２０〜１６０ミリオスモルの範囲、好ましくは１３０〜１５０ミリオスモルの範囲である。
高い温度では染色反応時間が短くなり、低い温度では長い染色時間を要することが分かっている。反応の好ましい温度範囲は、６０°〜９０°Ｆの間である。この温度範囲を用いれば、染料が赤血球細胞と十分に反応するのに必要とする時間は、少なくとも５分である。
網赤血球の血液検体を分析する好適な方法では、抗凝固性の血液を用いる。使用した抗凝固薬は、リン酸二水素カリウム塩、リン酸三水素カリウム塩、および二ナトリウム塩などのようなＥＤＴＡ塩である。
細胞の染色は、血液検体のアルカリ度を上げ、染料混合液のＰＨを７．０〜７．５の範囲にすると向上することが分かっている。しかし、染色部位を指定することはできず、網赤血球の区別を向上させない。むしろ、染色は光散乱信号を高いチャネルにオフセットする。
その上、網赤血球染色は、防腐剤として抗菌剤を含まなければならない。好ましい抗菌剤は、プロピルパラベン、メチルパラベン、およびその混合剤である。特に、好ましい抗菌剤は、０．３ｇ／ｌの濃度のポリピルパラベンと０．５ｇ／ｌの濃度のメチルパラベンの混合剤である。
以下の染色試薬と赤血球ゴースト化試薬の特殊な例は、図４〜１２に示す結果を得るのに用いている。
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図３Ａ〜３Ｃは、網赤血球の分類と計数をするための、血液検体の調合と分析装置または方法の各種動作を示す。
図３Ａは、網赤血球の分類と計数を行う２つの方法または装置の動作をステップまたはフローチャートで示す。両動作において、ステップ１８０の全血液検体は、赤血球ゴースト化試薬１８２で処理される。赤血球ゴースト化混合液は、ステップ１８４で孵置され、ステップ１８６でフローサイトメータで分析される。第１オプションにおいて、フローサイトメータからのデータは、ステップ１８８で少なくともＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％とＲＭＩを生成する。第２オプションにおいて、フローサイトメータからのデータは、ステップ１９０でＤＣを持つ少なくともＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶおよびＲＭＩを生成する。両オプションによって、ステップ１９２と１９４でＲＥＴＩＣ−ＡＢＳはＲＥＴＩＣ％にＲＢＣを掛けて得られる。
図３Ｂは、網赤血球の分類と計数をする２つの他の方法または装置の動作を示す。両動作において、全血液検体すなわち部分２００は、染色試薬２０２によって処理される。染色した血液混合液は、ステップ２０４でゆっくりと攪拌され、ステップ２０６で孵置される。ステップ２０８の染色した血液混合液は、ステップ２１０で赤血球ゴースト化試薬で処理される。赤血球ゴースト化混合液はステップ２１２で孵置され、ステップ２１４でフローサイトメータで分析される。再び、第１オプションとして、フローサイトメータからのデータは、ステップ２１６で少なくともＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％とＲＭＩを生成する。第２オプションにおいて、フローサイトメータからのデータは、ステップ２１８でＤＣを持つ少なくともＬＳを用いて分類され、ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶおよびＲＭＩを生成する。両オプションによって、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳは、ステップ２２０と２２２でＲＥＴＩＣ％にＲＢＣを掛けて得られる。
図３Ｃは、網赤血球の分類と計数をするさらに他の２つの方法または装置の動作を示す。両方の場合において、ステップ２３０の５０μＬの全血液をステップ２３２の１００μＬの染色試薬＃１で処理する。染色した血液混合液をステップ２３４で５秒間静かに攪拌して、ステップ２３６で５分間孵置する。ステップ２３８の染色した血液混合液の２μＬ部分を、ステップ２４０の２ｍＬの赤血球ゴースト化試薬＃１で処理する。赤血球ゴースト化混合液をステップ２４２で３０秒間孵置して、ステップ２４４にてフローサイトメータで分析する。第１オプションにおいて、ステップ２４６でフローサイトメータからのデータを少なくともＵＭＡＬＳを用いて分類し、ＲＥＴＩＣ％とＲＭＩを生成する。第２オプションにおいて、ステップ２４８でフローサイトメータからのデータは、ＤＣを持つ少なくともＵＭＡＬＳを用いて分類して、ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶおよびＲＭＩを生成する。両方のオプションによって、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳは、ＲＥＴＩＣ％にＲＢＣを掛けて得られる。
図４Ａ〜４Ｄは、図２に示すような粒子分析器またはフローサイトメータで分析された赤血球の染色および赤血球ゴースト化の効果を示す。４つの図のそれぞれは、マトリックス、すなわち染色試薬と赤血球ゴースト化試薬をいろいろに組み合わせて調合した、同じ全血液検体のＵＭＡＬＳ対ＤＣ（Ｘ軸のＬＯＧ  ＵＭＡＬＳとＹ軸のＤＣ）の２次元ドットプロットである。ＬＭＡＬＳ、ＳＡＬＳ、およびＲＡＬＳなどのような他の光散乱角測定も用いることができるが、ＵＭＡＬＳが好ましい。図４Ａは、染色試薬または赤血球ゴースト化試薬を含むどのような処理を施すことなく、本発明の共有者により販売された血液分析の希釈液として広く用いられている平衡電解溶液中に全血液検体を希釈させて得られたデータ・パターンを示す。この溶液の１つが本発明の共有者によりＩＳＯＴＯＮ▲Ｒ▼IIの名称で販売されている。
図４Ａにおいて明らかなように、ＬＯＧ  ＵＭＡＬＳで識別可能な１つの集団２６０だけがあり、一塊まりの成熟赤血球と網赤血球から構成される。図４Ｂは、全血液検体を赤血球ゴースト化試薬を用いないで、染色試薬だけと用いて得たデータ・パターンを示す。図４Ｂのデータ・パターンは、ＬＯＧ  ＵＭＡＬＳによって識別されたように、成熟赤血球と網赤血球の１つの集団２６２を示す図４Ａのデータ・パターンに酷似している。図４Ｃは、全血液検体を染色試薬を用いないで、赤血球ゴースト化試薬でのみ処理して得たデータ・パターンを示し、網赤血球の集団２６４を右側に示す。すなわち成熟赤血球２６６より高いレベルのＬＯＧ  ＵＭＡＬＳを示す。図４Ｄは、全血液検体を染色試薬と赤血球ゴースト化試薬両方で処理して得られたデータ・パターンであり、網赤血球の集団２６８を右側に示す。すなわち成就赤血球２７０より高いレベルのＬＯＧ  ＵＭＡＬＳと図４Ｃの網赤血球集団２６４よりよく分離されたＬＯＧ  ＵＭＡＬＳを示す。
図４Ａ〜４Ｄに示すデータとその説明から、蛍光を用いずに光散乱を用いて網赤血球の識別と計数をする最少要件は、血液検体を赤血球ゴースト化試薬で処理することだと結論できる。また、血液検体を染色試薬と赤血球ゴースト化試薬で処理すると、蛍光を用いずに光散乱を用いて網赤血球の識別と計数をする最適な構成が得られると結論できる。
図５Ａ〜５Ｄは、染色試薬と赤血球ゴースト化試薬で処理して、図２の粒子分析器またはフローサイトメータを用いさまざまな光散乱角で分析して得た結果を示す。４つの図のそれぞれは、網赤血球集団２８０を成熟赤血球集団２８２の右側に持つＸ軸の光散乱測定対Ｙ軸のＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ａは、ＬＯＧ  ＬＡＭＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ｂは、ＬＯＧ  ＵＭＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ｃは、ＬＯＧ  ＳＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ｄは、ＬＯＧ  ＲＡＬＳ対ＤＣのデータ・マトリックスを示す。図５Ａ〜５Ｄに示すデータとその説明から、少なくとも赤血球ゴースト化試薬で処理された網赤血球は、光散乱を分析することにより、識別と計数ができ、光散乱は、蛍光を用いることなしに、任意のさまざまな角度で収集できることが示されている。ＵＭＡＬＳは好ましい光散乱角であり、本明細書の残り全体を通してもっぱら用いられる。
図３Ａ〜３Ｃに示す方法および本明細書中を通して、ＲＢＣを取得するステップは、２つの異なった方法で実現できる。図２を参照すると、第１の方法には、網赤血球の分類と計数をするために処理および分析された同じ血液検体の絶対的成熟赤血球数のカウントと、開口または検出区画１２を横切るときの赤血球細胞５０の計数が含まれる。ＤＣ、ＲＦ、ＬＭＡＬＳ、ＵＭＡＬＳ、ＳＡＬＳおよびＲＡＬＳなどのような任意の同時に測定されたパラメータは、絶対的成熟赤血球数ＲＢＣを得るのに用いることができる。ＤＣはＲＢＣを得るのに好ましいパラメータである。ＲＢＣを得る第２の方法は、他の装置、粒子分析器、またはフローサイトメータ（例えば、本発明の共有者により販売されているＣＯＵＬＴＥＲ▲Ｒ▼ＳＴＫＳなど）を用いることであり、これらの装置は、例えば、図２の網赤血球細胞分析器、または他の機器の一部かも知れない装置に物理的に接続できる。第１または第２の方法のいずれかを用いて得たＲＢＣ、ＲＢＣおよびＲＥＴＩＣ％の結果は、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳを計算するため結合される。
図６Ａ〜６Ｃと図７Ａ〜７Ｇは、図３Ａ〜３Ｃのいずれかの方法で生成されるデータに適用可能なデータ分類方法を示す。図３Ｃの方法には、血液検体の染色試薬＃１と赤血球ゴースト化試薬＃１による処理と、例えば、図２に示すような粒子分析器の少なくともＵＭＡＬＳにより処理した試料の分析を含み、本発明を実施する最適な構成と図６Ａ〜１２に示す網赤血球データを提供する。
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、少なくともＬＬＳとＤＣの組み合わせを用いて網赤血球の分類と計数を行う数多くのデータ分類方法を示す。図６Ａに示す分類方法により、境界２９０は、成熟赤血球集団２９４、２９６、２９８およびＤＣを用いる白血球３００から、血小板集団２９２を分離する。ＬＬＳを用いると、境界３０２は、網赤血球２９６、２９８から、成熟赤血球２９４を分離する。境界３０４は、白血球３００から網赤血球２９６、２９８を分離する。境界３０６はＨＳＲ２９８からＬＳＲ２９６を分離する。従って、図６Ａから、ＬＬＳとＤＣの組み合わせを用いて、および血液検体を染色試薬と赤血球ゴースト化試薬で処理すると、血小板２９２、白血球３００、成熟赤血球２９４および網赤血球２９６、２９８の分類ができ、網赤血球２９６、２９８をＬＳＲ２９６とＨＳＲ２９８に小分類できることが結論できた。
ここに説明した分類を行う他の方法は、１次元ヒストグラムを一度に１つずつ分析し、上述した「ゲーティング」技術を適用することである。
１．図６ＣのＤＣヒストグラムを用い、成熟赤血球と白血球を含む１つのピーク３０８から血小板集団２９２を分離する谷、すなわち境界２９０を見つける。
２．連続した分析から血小板２９２を効果的に除去する図６Ｃの境界２９０より大きいＤＣ値のゲーティングをし、図６ＢのＬＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用いて以下のステップを実行する。
ａ）網赤血球２９６、２９８から成熟赤血球２９４を分離する境界３０２を見つけ、ヒストグラムの始まり（一番左）から境界３０２までの間の成熟赤血球２９４の数をカウントする。
ｂ）白血球３００から網赤血球２９６、２９８を分離する境界３０４を見つけ、境界３０２から境界３０４の範囲の網赤血球２９６、２９８をカウントする。
ｃ）ＨＳＲ２９８からＬＳＲ２９６を分離する境界３０６を見つけ、境界３０２から境界３０６の範囲のＬＳＲ２９６をカウントし、境界３０６から境界３０４の範囲のＨＳＲ２９８をカウントする。
３．図６Ｃの境界２９０より大きいＤＣ値をゲーティングし、境界３０２より大きいＬＬＳ値と図６Ｂの境界３０４より小さいＬＬＳ値をゲーティングし、網赤血球のＤＣヒストグラム（図示せず）だけを作成し、これらの網赤血球の統計的分析をして、平均ＤＣ値を得る。
４．次の結果を計算する。
ａ）全赤血球＝成熟赤血球＋網赤血球を計算する
ｂ）ＲＥＴＩＣ％＝（網赤血球／全赤血球）＊１００を計算する
ｃ）ＭＲＶ＝平均ＤＣ＊キャリブレーション係数を計算する
ｄ）ＲＭＩ＝ＨＳＲ／網赤血球を計算する
５．上述したようにＲＣＢを得て、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ＝ＲＥＴＩＣ％＊ＲＢＣを計算する
網赤血球の分類と計数をする他の方法はＬＬＳの使用だけを含む。
１．図６Ｂに示すようなＬＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用いて次のステップを実行する。
ａ）赤血球２９６、２９８から成熟赤血球２９４を分離する境界３０２を見つけ、ヒストグラムの始まり（一番左）から境界３０２の範囲の成熟赤血球２９４をカウントする
ｂ）白血球３００から赤血球２９６、２９８を分離する境界３０４を見つけ、境界３０２から境界３０４の範囲の網赤血球２９６、２９８をカウントする
ｃ）ＨＳＲ２９８からＬＳＲ２９６を分離する境界３０６を見つけ、境界３０２から境界３０６の範囲のＬＳＲ２９６をカウントし、境界３０６から境界３０４の範囲のＨＳＲ２９８をカウントする
２．次の結果を計算する
ａ）ＲＥＴＩＣ％＝（網赤血球／全赤血球）＊１００を計算する
ｂ）ＲＭＩ＝ＨＳＲ／網赤血球を計算する
３．上述したようにＲＢＣを得て、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ＝ＲＥＴＩＣ％＊ＲＢＣを計算する
ここに説明した方法の欠点は、血小板は分析から除外されておらず、ＲＥＴＩＣ％と他の結果を歪めさせる結果になるかも知れないこということである。好ましい方法は、個々の血液細胞の光散乱測定で得たＤＣまたは細胞容積の他の同等の測定を必要とし、これにより小網を、赤血球分析から血小板を識別して除去することができる。
図７Ａ〜７Ｇは、少なくともＬＬＳとＤＣの組み合わせ、好ましくは、ＬＬＳ、ＤＣ、ＲＬＳ、および不透明の略語である「ＯＰ」の組み合わせを用いて、網赤血球の分類と計数をする数多くのデータ分類方法を示す。適用可能であれば、図６Ａ〜Ｃに用いているように同じ参照番号を用いる。
図７Ａの分類方法により、境界２９０は、血小板２９２を網赤血球集団２９４、３１０、およびＤＣを用いている白血球３００から分離する。ＬＬＳを用いて、斜めの境界３１２は、網赤血球３１０から成熟した赤血球２９４を分離する。境界３０４は、白血球３００から網赤血球３１０を分離する。従って、図７Ａから、ＬＬＳとＤＣの組み合わせを用いて、および血液検体を染色試薬と赤血球ゴースト化試薬で処理すると、血小板２９２、白血球３００、成熟赤血球２９４、および網赤血球３１０の分類と計数が行えることが結論できた。さらに、次のような結果が報告できた。ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶ、およびＲＢＣを得ることによりＲＥＴＩＣ−ＡＢＳが得られた。
図７Ｂに示した分類方法は、得られた結果を拡張、洗練するため図７Ａに示した今説明した方法と組み合わされる。図７Ｂに示すデータ・パターンは、ＲＬＳがＸ軸に表示されデータが回転し、および図７Ａの白血球３００が分析からゲーティングで阻止または除外されるという例外を除き、図７Ａのパターンと同じである。図７Ｂにおいて、境界２９０は成熟赤血球３１４、３１６、３１８から血小板２９２を分離する。境界３２０は網赤血球３１６、３１８から成熟赤血球３１４を分離する。境界３２２はＨＳＲ３１８からＬＳＲ３１６を分離する。ＲＬＳパラメータと共に動作する利点は、見つけた境界３２０、３２２は、Ｘ軸とＹ軸に完全に直交していることである。図７Ｂの境界３２０は、図７Ａに投影されたとき、斜めのライン３１２として現れる。従って、ＬＬＳとＤＣと一緒に用い、染色試薬と赤血球ゴースト化試薬で処理した血液検体を分析するのに用いる回転パラメータＲＬＳは、網赤血球の分類と計数の好ましい方法を提供し、次のような結果を得る。ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶ、ＲＭＩ、およびＲＢＣ、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳを得るとにより得られた。
図７Ｃに示す分類方法は、得られた結果をさらに洗練するため、図７Ａ〜７Ｂに示す今説明した方法と組み合わされる。図７Ｃは、ＯＰ対ＤＣのマトリックスを示す。境界２９０は、ＤＣで分離された他のすべての細胞集団３２４、３２６からなる血小板２９２を分離する。境界３２８は、血小板または血小板の塊まり３２６から赤血球と白血球を含む集団を分離する。血小板の塊まり３２６は容易に識別され阻止される。すなわち図７Ｃに示すように不透明を用いて行われる引き続く分析から除去される。図７Ａを参照すると、血小板の塊まりは、識別されず不透明によりゲーティングにより阻止されない場合、成熟赤血球２９４と網赤血球３１０に重なって、ＲＥＴＩＣ％と他の結果をゆがめてしまう。血小板の塊まりは滅多に現れることはないが、網赤血球の分析に影響を与えてはいけない。このため、ＤＣ、ＬＬＳ、およびＲＬＳと共に用いられ、染色試薬と赤血球ゴースト化試薬で処理された血液検体の分析に用いられるＯＰパラメータは、網赤血球の分類と計数の好ましい方法を提供し、次のような結果が得られる。ＲＥＴＩＣ％、ＭＲＶ、ＲＭＩ、およびＲＢＣ、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳを得ることにより得られる。
図７Ａ〜７Ｃに示された今説明した分類を行う別の方法は、図７Ｄ〜７Ｇの１次元ヒストグラムを一度に１つずつ分析し、上述した「ゲーティング」技術を適用することである。
１．図７ＥのＤＣヒストグラムを用いて、赤血球、白血球、および血小板の塊まりを含む単一のピーク３３０から血小板２９２を分離する境界２９０を見つける。
２．連続した分析から効果的に血小板２９２を除去する図７Ｅの境界２９０より大きいＤＣ値をゲーティングし、図７ＧのＯＰヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用いて、血小板の塊まり３２６から赤血球と白血球３２４を分離する境界３２８を見つける。
３．連続した分析から効果的に血小板２９８を除去する図７Ｅの境界２９０より大きいＤＣ値のゲーティングと、連続した分析から効果的に血小板の塊３２６を除去し、図７ＤのＬＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用いて、白血球３００から赤血球２９４、３１０を分離する境界３０４を見つける。
４．連続した分析から効果的に血小板２９２を除去する図７Ｅの境界２９０より小さいＤＣ値のゲーティングと、連続した分析から効果的に血小板の塊まり３２６を除去する図７Ｇの境界３２８より小さいＯＰ値のゲーティングと、連続した分析から効果的に白血球３００を除去する図７Ｄの境界３０４より小さいＬＬＳ値をゲーティングして、図７ＦのＲＬＳヒストグラムを作成し、このヒストグラムを用いて、次のステップを実行する。
ａ）成熟赤血球集団３１４のピークを見つける
ｂ）正規確率関数曲線を成熟赤血球ピーク３１４にあてはめる
ｃ）あてはめた曲線と残りのデータが等しい確率で重なるチャネルを計算して、網赤血球３１６、３１８から成熟赤血球３１４を分離する境界３２０を見つけ、ヒストグラムの始まり（一番左）から境界３２０までの範囲の成熟赤血球３１４をカウントする
ｄ）ＨＳＲ３１８からＬＳＲ３１６を分離する境界３２２を見つけ、境界３２０から境界３２８の範囲のＬＳＲ３１６をカウントし、境界３１８からヒストグラムの最大（一番右）の範囲のＨＳＲ３１８をカウントする
５．図７Ｅの境界２９２より大きいＤＣ値をゲーティングし、図７Ｇの境界３２８より小さいＯＰ値をゲーティングし、図７Ｄの境界３０４より小さいＬＬＳ値をゲーティングし、図７Ｆの境界３２０より大きいＲＬＳ値をゲーティングして、網赤血球だけのＤＣヒストグラム（図示せず）を作成し、これらの赤血球の統計的分析を行い、平均ＤＣを得る。
６．次の結果を計算する。
ａ）全赤血球＝成熟赤血球＋網赤血球を計算する
ｂ）ＲＥＴＩＣ％＝（網赤血球／全赤血球）＊１００を計算する
ｃ）ＭＲＶ＝平均ＤＣ＊キャリブレーション係数を計算する
ｄ）ＲＭＩ＝ＨＳＲ／網赤血球を計算する
７．上述したようにＲＢＣを得て、ＲＥＴＩＣ−ＡＢＳ＝ＲＥＴＩＣ％＊ＲＢＣを計算する。
図８Ａ〜８Ｃ、図９Ａ〜９Ｃ、図１０Ａ〜１０Ｃ、および図１１Ａ〜１１Ｃは、図３Ｃの赤血球処理方法により調合し、図２に示すように装置により、少なくともＵＭＡＬＳとＤＣで分析し、図７Ａ〜７Ｇに示す方法により分類した人間の血液検体の例を示す。図８〜１１のそれぞれのプロットは、境界と集団の数を除き７Ａと同じように描かかれている。実際の網赤血球分類は、図６Ａ〜１１Ｃに示されている。
図１２は、Ｘ軸にプロットされた「基準％」とＹ軸にプロットされた「ＲＥＴＩＣ％」の人間の血液検体に対する相関について検討した結果研究を示す。「基準％」は、提案したＮＣＣＬＳ規格Ｈ１６−Ｐに略述した基準方法によって得た網赤血球の比率である。「ＲＥＴＩＣ％」は、上述したように好ましい方法と装置によって得られた結果である。点線の４５°の線３３２は、完全に適合したデータ、すなわち１．０の相関係数を示す。実際に最適合したデータは実線３３４で示されている。線間の差は０．９５の相関係数を示す。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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