(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
MDVをコードするヌクレオチド配列で感染またはトランスフェクションされている、連続的ウズラ筋肉筋原細胞株を培養することにより得られるMDV、と適当な薬剤担体とを含むワクチン。
【請求項２】
前記MDVが天然に存在するMDVである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記MDVが組換えMDVである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記MDVが、MDVの核酸配列および、該MDVの核酸配列中に挿入された少なくとも１つの異種遺伝子またはその断片を含む組換え分子である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記MDVが、そこから１つまたはそれより多くの遺伝子、制御遺伝要素、またはその断片が欠失している、MDVの核酸配列を含む組換え分子である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記欠失遺伝子がgHまたはその断片である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ＭＤＶが、血清型１、血清型２および血清型３の単独またはこれらの組合せよりなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記MDVがMDV-1 株652である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
前記細胞株が、ATCC CRL12600 である、請求項４に記載のワクチン。
【請求項１０】
ヒト以外の動物に請求項１に記載のワクチンを投与することにより疾患に対してヒト以外の動物を防御する方法であって、該ワクチンが、MDVに対する防御応答を誘導するものである、上記方法。
【請求項１１】
前記動物が鳥類である、請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高力価のマレック（Ｍａｒｅｋ）病ウイルス（ＭＤＶ）の増殖  （ｇｒｏｗｔｈ）  及び生産性  （ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）  感染を維持する連続的  （ｃｏｎｆｉｎｕｏｕｓ）  鳥類細胞株の使用に関する。本発明は、特にワクチン製造のための多量のマレック病ウイルスを効率的に増殖させるために基質として使用できる細胞株に関する。本発明は、組換えマレック病ウイルスベクター並びに、該ベクターおよびワクチンとして使用される組換えマレック病ウイルスをパッケージングするための細胞株とに関する。マレック病ウイルスベクターおよびワクチンは、マレック病ウイルスによる感染からおよび感染による疾患から鳥類を防御するために使用される。
【０００２】
【従来の技術】
マレック病  （Ｍａｒｅｋ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＤ）は、ニワトリの急性の腫瘍疾患であり、リンパ腫、内臓腫瘍、神経病変および免疫抑制を引き起こす。この疾患は世界中のいたるところに分布している。病原体は、ヘルペスウイルスであるマレック病ウイルスである。マレック病は、ブロイラー用鳥類の死亡や不良の主要な原因である［Ｃａｌｎｅｋ，  Ｂ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ、第９版、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｐｒｅｓｓ，  Ａｍｅｓ，  Ｉｏｗａ，  ｐｐ．  ３４２−３８５  （１９９１）］。
【０００３】
マレック病ウイルスには３つの血清型がある。血清型１は、すべての病原性株およびその弱毒化誘導体を含む。血清型２は天然の非病原性ニワトリウイルスからなり、血清型３（七面鳥のヘルペスウイルス（ＨＶＴ）として知られている）は、ニワトリ中で複製可能な非病原性七面鳥ウイルスを含む。３つの血清型は部分的に交差防御性であるが、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体試験、ポリペプチドパターンおよびＤＮＡ解析［Ｓｉｌｖａ，  Ｒ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｌ．  Ｆ．，  Ｖｉｒｏｌ．  ｖｏｌ．  ３６，  ｐｐ．  ３０７−３２０  （１９８４）  ；Ｐａｙｎｅ，  Ｌ．  Ｎ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．  ＆  Ｇｒａｎｏｆｆ，  Ａ．  編、ｐｐ．  ８３２−８３８  （１９９４）］並びに他の既知の方法を使用して区別することができる。
【０００４】
ＭＤＶ血清型１およびＨＶＴのＤＮＡゲノムは、それぞれ約１８０および１６７キロ塩基の線状２本鎖分子である。他のヘルペスウイルスと同様に、ＭＤＶのゲノムは、逆方向反復配列に囲まれた長いユニーク領域（ＵＬ）と短いユニーク領域（ＵＳ）からなる。３つのＭＤＶ血清型のゲノムは、完全長閉鎖環状ＤＮＡの形である。しかしゲノムはコリニアー  （ｃｏｌｉｎｅａｒ）  であるが、厳密性条件下ではＭＤＶの３つの血清型の間にはほとんど相同性がない［Ｐａｙｎｅ，  Ｌ．  Ｎ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．  ＆  Ｇｒａｎｏｆｆ，  Ａ．  編、ｐｐ．  ８３２−８３８  （１９９４）を参照されたい］。
【０００５】
マレック病ウイルスは、他のヘルペスウイルスより組換え性（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ）が小さく、このウイルスの細胞結合性  （ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒｅ）  が、親ウイルスからの組み換え体のプラーク精製をより困難にする。しかし組換えマレック病ウイルスが、血清型１［Ｓｏｎｏｄａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖ．  １４，  ｐｐ．  ２７７−２８４  （１９９６）；Ｐａｒｃｅｌｌｓ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｖ．  ６９，  ｐｐ．  ７８８８−７８９８  （１９９５）  ；Ｐａｒｃｅｌｌｓ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，  Ｖ．  ９，  ｐｐ．  ５−１３  （１９９４）；Ｐａｒｃｅｌｌｓ，  Ｍ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｖ．  ６８，  ｐｐ．  ８２３９−８２５３  （１９９４）  ；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｍ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖ．  １２，  ｐｐ．  ９５３−９５７  （１９９４）  ；Ｒｅｄｄｙ，  Ｓ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖ．  １４，  ｐｐ．  ４６９−４７７  （１９９６）］、
【０００６】
血清型２［Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｄ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌ．  Ｖ．  １９５，  ｐｐ．  ６３８−６４８  （１９９３）  ；Ｓｉｌｖａ，  Ｒ．  Ｆ．、第１４回国際ヘルペスウイルスワークショップ（抄録）（１９８９）］；および血清型３［Ｒｅｄｄｙ，  Ｓ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖ．  １４，  ｐｐ．  ４６９−４７７  （１９９６）；ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２９２４８  （１９９５）；Ｓｉｌｖａ，  Ｒ．  Ｆ．、第１４回国際ヘルペスウイルスワークショップ（抄録）（１９８９）；Ｄａｒｔｅｉｌ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌ．  Ｖ．  ２１１，  ｐｐ．  ４８１−４９０  （１９９５）  ；１９９５年に発行された米国特許第  ５，１８７，０８７号；Ｚｅｉｎｉｋ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｖ．  ７６，  ｐｐ．  ２９０３−２９０７  （１９９５）  ；ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２５６６５  、公表（１９９５）  ；Ｒｏｓｓ，  Ｌ．  Ｊ．  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  Ｖ．  ７４，  ｐｐ．３７１−３７７  （１９９３）  、Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒ，  Ｐ．  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖ．  １１，  ｐｐ．  ３４９−３５８  （１９９３）；ヨーロッパ特許第  ４３１，６６８Ｂ１号、公表（１９９５）  ；Ｍｏｒｇａｎ，  Ｒ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，  Ｖ．  ３６，  ｐｐ．  ８５８−８７０  （１９９２）  ；Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，  Ｐ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  第１３回国際ヘルペスウイルスワークショップ３２３（抄録）（１９８８）］から作成されている。
【０００７】
上記文献のすべてにおいて、ウイルスは複製コンピテントであり、初代鳥類細胞中で産生された。
市販のマレック病ウイルスワクチン（一部の１価ＨＶＴ製剤を除く）は主に、生きたマレック病ウイルス感染初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞からなる。ワクチンに使用するマレック病ウイルスを増殖させるためにマレック病ウイルス感染初代ニワトリ細胞全体を使用することに伴う大きな問題は、ＣＥＦ細胞が有効であるためには、液体窒素温度で保存し注射により投与する必要があることである。
【０００８】
マレック病ウイルス血清型は細胞培養物および感染した鳥の多くの組織中で強く細胞に結合しているため、以前から生きた全細胞ワクチンが必要とされてきた。鳥の間での感染の広がりは細胞と細胞の直接の接触により行われ、無細胞ウイルスが放出されることはほとんどまたは全くない。感染性ウイルスは羽嚢上皮（ＦＦＥ）中でのみ産生され、鳥から鳥への感染に関与している［Ｃａｌｎｅｋ，  Ｂ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，  Ｖ．  １４，  ｐｐ．  ２１９−２３３  （１９７０）  ；Ｗｉｔｔｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  Ｖ．  ４９，  ｐｐ．  １１２１−１１３０  （１９７２）；Ｅｄｉｓｏｎ，  Ｃ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  Ｖ．  ４７，  ｐｐ．  １１３−１２０  （１９７１）］。
【０００９】
市販の無細胞マレック病ウイルスワクチンは細胞培養により作製することができる。しかし無細胞マレック病ウイルスワクチンの製造は、これまで血清型３のＭＤＶのみを使用して製造されるワクチンに限定されてきた。これは、血清型３ＭＤＶのみが、マレック病ウイルスワクチンの製造のために充分な量の遊離のウイルス粒子を生成するためにである。ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）遺伝子の発現の欠如が、無細胞ウイルス粒子の放出の制限に関与しているかも知れないことが示唆されている［ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２９２４８  、公表（１９９５）；Ｔａｎ，  Ｘ  ａｎｄ  Ｖｅｌｉｃｅｒ，  Ｌ．  Ｆ．  、第１８回国際ヘルペスウイルスワークショップＡ、１４５（抄録）（１９９３）］。
ＭＤＶを増殖させるのにＣＥＦ以外に他の初代鳥類細胞（ニワトリ胚腎臓（ＣＥＫ）および鴨胚繊維芽細胞（ＤＥＦ）を含む）が使用されている。マレック病ウイルスの非病原性の血清型２と３（ただし血清型１は除く）の基質として、化学的に形質転換したＱＴ３５と呼ぶウズラ細胞株が記載されている［Ｎｉｋｕｒａ，  Ｍ．，  Ｎａｎｔａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｖ．  ５３，  ｐｐ．  ４３９−４４６  （１９９１）］。マレック病ウイルス−１の増殖を維持するとして、化学的に形質転換したＣＨＣＣ−ＯＵ２と呼ぶＣＥＦ細胞株［Ｏｇｕｒａ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｔ．，  Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｖ．  ４１，  ｐｐ．  １４１−１４３  （１９８７）］が記載されている［Ａｂｕｊｏｕｂ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｖｉｒｏｌ．，  Ｖ．  ２１４，  ｐｐ．  ５４１−５４９  （１９８５）  ］。
【００１０】
マレック病ウイルスを産生するための他の既知の方法には、腫瘍形成性または発癌性の細胞株の使用がある。マレック病ウイルスで形質転換したリンパ芽球細胞株［Ｎａｚｅｒｉａｎ，  Ｋ．  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｖ．  １６，  ｐｐ．  ５２７−５４４  （１９８７）］は、発癌性マレック病ウイルス−１に感染したニワトリのリンパ腫から得られる。ウイルスゲノムは、これらの細胞中で潜伏性または半潜伏性状態で維持され、同時に培養されたＣＥＦ細胞またはＤＥＦ細胞への感染の伝搬は、あったとしても低い頻度でしか起きない。さらにこれらのリンパ芽球株は、他のマレック病ウイルスとの重複感染に対して抵抗性である。さらにマレック病ウイルスで形質転換したリンパ芽球細胞株は、非組換え（従来の）マレック病ウイルスワクチンの産生または組換えマレック病ウイルスワクチンもしくは遺伝的に改変したマレック病ウイルスワクチンもしくはベクターの調製において、有用性を示さなかった。
【００１１】
同様に、レトロウイルスの放出、リンパ芽球細胞の遅い増殖特性、および生産性マレック病ウイルス感染の低レベルのために、発癌性鳥類レトロウイルス（鳥類白血病ウイルスおよび細網内皮症ウイルス）から得られるリンパ芽球細胞株［Ｎａｚｅｒｉａｎ，  Ｋ．  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｖ．  １６，  ｐｐ．  ５２７−５４４  （１９８７）］は、市販のマレック病ウイルスワクチンの産生または組換えマレック病ウイルスの生成に有用ではない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
すなわちワクチンの目的のためにマレック病ウイルスを高力価まで増殖させるための適当な基質に対するニーズがある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、高力価のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の増殖および生産性感染を効率的に維持する鳥類細胞株に関する。本発明はまた、高力価の天然に存在するマレック病ウイルスおよび組換えマレック病ウイルスの両方の増殖および生産性感染を維持するように操作した鳥類細胞株に関する。本発明は、ワクチン目的に適した量のマレック病ウイルスの製造方法に関する。
本発明は、一部は高力価のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の増殖および生産性感染を維持する連続的鳥類細胞株の発見に基づく。特に高力価のウイルスの増殖を維持する鳥類細胞株は、ウズラ筋肉の筋原細胞株であることが発見された。
【００１４】
本発明において、用語「ＭＤＶ」は、天然に存在するＭＤＶウイルス粒子（例えば、野生型ＭＤＶまたは天然に存在する突然変異体ＭＤＶ）または組換えＭＤＶウイルス粒子に対応するＭＤＶウイルス粒子を意味する。天然に存在するＭＤＶウイルス粒子は、野生型ＭＤＶゲノムまたは天然に存在するＭＤＶのゲノムによりコードされる。組換えＭＤＶウイルス粒子は、組換えＭＤＶゲノムによりコードされる。組換えＭＤＶゲノムは、ＭＤＶゲノムのヌクレオチド配列またはその断片を含む。そのような断片は、遺伝子産物の断片が遺伝子の活性を保持するように、少なくとも１つの遺伝子産物またはそのような遺伝子産物の断片をコードするのに充分な長さでなければならない。
【００１５】
例えば組換えＭＤＶゲノムは、その遺伝子産物がウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階に必須である遺伝子が欠失しているＭＤＶのヌクレオチド配列を含む。さらに組換えＭＤＶゲノムは、異種遺伝子または異種断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含有することができる。そのような断片は、抗原性エピトープ（例えば鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）のエピトープ）、制御配列（例えば、プロモーター配列）、またはそのような断片によりコードされるポリペプチドが遺伝子産物の活性を保持するように充分な断片を保持する遺伝子の断片を、コードするヌクレオチド配列を含有する。
【００１６】
本発明は、天然に存在するＭＤＶまたは組換えＭＤＶをコードするＤＮＡ（例えば、ＭＤＶのヌクレオチド配列）、または異種制御要素の制御下でＭＤＶのヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ、または少なくとも１つの異種遺伝子またはその断片を含有するＭＤＶのヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ、を含有する連続的鳥類細胞株を包含する。好適な実施態様において、本発明はまた、天然に存在するＭＤＶまたは組換えＭＤＶを発現するように操作されたウズラ  （ｑｕａｉｌ）細胞株を包含する。
【００１７】
本発明はまた、その遺伝子産物がウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階に必須である遺伝子またはその断片が欠失しているＭＤＶのヌクレオチド配列をコードするＤＮＡでトランスフェクションされた連続的鳥類細胞株を包含する。さらに別の実施態様において、本発明は、ウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階に必須であるＭＤＶ遺伝子またはその断片をコードするＤＮＡを含有し発現する連続的鳥類細胞株を包含する。そのようなヌクレオチド配列は、細胞自身の制御要素または異種制御要素の制御下で、構成的に  （ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）  または一時的に  （ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）発現されてもよい。本発明はさらに、構成的に活性な制御要素または誘導性制御要素の制御下で、ＭＤＶのヌクレオチド配列またはその断片を安定に発現するように操作した連続的鳥類細胞株を包含する。
【００１８】
本発明はまた、天然に存在するＭＤＶもしくは組換えＭＤＶ、またはＭＤＶで感染した細胞の溶解物もしくは成分、で感染した連続的鳥類細胞株を包含する。
ＭＤＶは、血清型１、血清型２、血清型３の単独またはこれらの組合せよりなる群から選択されてよい。
別の面において本発明は、鳥類の疾患に対する防御を誘導することができるワクチンの製造のためのＭＤＶの使用に関する。
【００１９】
好ましくは使用される連続的鳥類細胞株はウズラ細胞株であり、例えば１９９８年１１月２４日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ−ＣＲＬ１２５９９  と呼ぶＱＭ７細胞があり、これはＭＤＶの６５２株で感染されてもよい（例えば、１９９８年１１月２４日にＡＴＣＣに寄託されたＡＴＣＣ−ＣＲＬ１２６００  と命名された６５２−ＱＭ７  細胞）。好適な実施態様において、本発明は、ＭＤＶ血清型２または３を培養するための、ＱＴ３５と呼ぶ化学的に形質転換されたウズラ細胞株の使用を包含しない。
【００２０】
本発明はまた、ＭＤＶ、ＭＤＶで感染した細胞もしくはその溶解物で細胞株を感染させることにより、天然に存在するＭＤＶまたは組換えＭＤＶを連続的鳥類細胞株に導入し、感染細胞株を培養し、そしてそこから細胞成分を採取することを含んでなるＭＤＶの増殖方法を包含する。本発明はさらに、該細胞または成分から、鳥類の疾患に対する防御を誘導することができるワクチンの製剤化を包含する。
【００２１】
本発明はまた、連続的鳥類細胞株を天然に存在するＭＤＶまたは組換えＭＤＶの核酸配列をコードするＤＮＡで感染させ、細胞株を培養し、そしてそこから成分を採取することを含んでなる、ＭＤＶの増殖方法を包含する。本発明のこの面において、ＤＮＡは、天然に存在するＭＤＶのヌクレオチド配列；ＭＤＶゲノムのヌクレオチド配列またはその断片を含む組換えＭＤＶのヌクレオチド配列をコードしてもよい。そのような断片は、遺伝子産物の断片が遺伝子の活性を保持するように、少なくとも１つのＭＤＶ遺伝子産物またはそのような遺伝子産物の断片をコードするのに充分な長さでなければならない。さらに組換えＭＤＶは、異種制御要素に機能的に結合するか、または少なくとも１つの異種遺伝子もしくは断片を含有してもよい。
【００２２】
本発明はまた、その遺伝子産物がウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階に必須である遺伝子またはその断片が欠失している組換えＭＤＶをコードするＤＮＡでトランスフェクションされた、連続的鳥類細胞株を包含する。別の実施態様において本発明は、ウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階に必須であるＭＤＶ遺伝子またはその断片をコードするＤＮＡを含有し発現する、連続的鳥類細胞株を包含する。そのようなヌクレオチド配列は、細胞自身の制御要素または異種制御要素の制御下で、構成的にまたは一時的に発現されてもよい。
【００２３】
そのような細胞株は、マレック病ウイルスの核酸配列をコードするＤＮＡでそのような操作した鳥類細胞株を感染させ培養して、組換えＭＤＶを産生するのに使用してもよい。例えば、欠失遺伝子は、複製の１つの必須物質であり得る。さらに詳しくは、欠失遺伝子は、マレック病ウイルスまたはその断片のｇＨ遺伝子であり得る。本発明の別の実施態様において、ＭＤＶで感染したかＭＤＶを発現するように操作した細胞から得られた細胞溶解物またはその成分で、鳥類細胞株を感染させ培養することにより、第２世代ＭＤＶが産生される。
【００２４】
本発明において、鳥類細胞株は、天然に存在するかもしくは組換えＭＤＶをコードするＤＮＡを一時的に発現するように操作されるか、または天然に存在するかもしくは組換えＭＤＶをコードするＤＮＡを安定して発現するように操作されてもよい。本発明の別の好適な実施態様において、鳥類細胞株はウズラ筋肉の筋原  （ｍｙｏｂｌａｓｔ）  細胞株である。
ＭＤＶは、血清型１、血清型２、血清型３の単独またはこれらの組合せよりなる群から選択されてよい。
【００２５】
別の面において本発明は、ＭＤＶが、鳥類の疾患に対する防御を誘導することができるワクチンの製造のために使用されるウイルスである上記方法に関する。
好ましくは使用される連続的鳥類細胞株はウズラ筋肉の筋原細胞株であり、例えば１９９８年１１月２４日にＡＴＣＣに寄託された細胞株ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１２５９９  のような、ＭＤＶの６２５株で感染したウズラ筋肉の筋原細胞株である。他の適切な株の例には、ＭＤＶ−１株５８４ＡおよびＭｄ５がある。ＭＤＶ−１株６５２は、１９９８年１１月２４日にＡＴＣＣに寄託された細胞株ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１２６００  のような６５２株で感染したウズラ筋肉の筋原細胞株がある。
【００２６】
本発明は、無細胞にするためにＭＤＶ−１ウイルスの極端な細胞結合性を改変するためにワクチンとして使用するのに安全な弱毒化ＭＤＶ−１組換え体の作成、およびウイルスを産生するための連続的細胞株の作成に関する。
別の実施態様において本発明は、ワクチンとして使用するための組換えマレック病ウイルスおよびウイルスベクターの操作に関する。さらに別の実施態様において本発明は、組換えマレック病ウイルスベクター、および突然変異マレック病ウイルス遺伝子をコードするかまたはマレック病ウイルスの血清型からの遺伝子の組合せをコードするように操作されたウイルスに関する。
【００２７】
得られた発現生成物および／またはキメラウイルス粒子は、ワクチン製剤で使用することが有利である。本発明の発現生成物およびキメラウイルス粒子は、鳥類を悩ます広範囲の病原体に対するワクチンを作製するために操作される。特に本発明のキメラウイルス粒子は、抗ＡＬＶ（鳥類白血病ウイルス）を作製するように操作され、ここでＡＬＶからの免疫原性ポリペプチドは、ＭＤＶとＡＬＶの両方に対する免疫応答を誘発することができるワクチンを作製するためにＭＤＶのゲノム中に操作される。
【００２８】
さらに、ワクチンで使用するための本発明のキメラベクター中に作製することができる異種遺伝子配列には、特に限定されないが、ＭＤＶの他の血清型、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）、および鳥類インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）から得られる配列がある（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  （編）、１９８１，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  、その全体を参照することにより本明細書の一部とする）。
【００２９】
ワクチンは、血清型１、血清型２、血清型３の単独またはこれらの組合せよりなる群から選択されるＭＤＶから構成されてよい。好ましくはワクチンは、マレック病ウイルスにより感染したかまたはトランスフェクションされた鳥類細胞株を使用して産生される。
【００３０】
本発明のさらに別の面は、上記方法を使用して産生される組換えＭＤＶである。組換えＭＤＶは、例えばウイルス複製に必要な遺伝子のような１つまたはそれ以上の遺伝子が欠失している、天然に存在するＭＤＶの核酸配列を含む。そのような必須の遺伝子の例としては、ＭＤＶゲノムの糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）遺伝子またはその断片がある。得られる障害された（複製欠陥）ウイルスは、ウイルス複製に必須の遺伝子を含有するように従って欠失遺伝子の発現生成物を含有するように遺伝子操作した相補的な細胞株が、障害されたウイルスを増殖させるのに利用できるなら、単一のサイクルについて感染性である。障害ウイルスの産生およワクチンとしてのその利用は、ＰＣＴ出願ＧＢ９１／０１６３２  （公報番号ＷＯ９２／０５２６３）に記載されている（これはその全体を参照することにより本明細書の一部とする）。
【００３１】
本発明のさらに別の面は、複製に必須の天然に存在するＭＤＶの遺伝子（例えばｇＨ）を発現することができる遺伝子操作した鳥類細胞株を含有し、そして障害されたＭＤＶウイルスを複製することができる細胞株である。
本発明のさらに別の面は、上記方法を使用して産生されるＭＤＶベクターである。ＭＤＶベクターは、組換えＭＤＶおよび１つまたはそれ以上の異種遺伝子もしくはその断片を含む。ＭＤＶベクターは任意に、配列番号２に記載の核酸配列を含む３’フランキング領域を有する。
【００３２】
またＭＤＶベクターは任意に、配列番号１に記載の核酸配列を含む５’フランキング領域を有することができる。さらにＭＤＶベクターは、配列番号２に記載の核酸配列を含む３フランキング領域と配列番号１に記載の核酸配列を含む５フランキング領域との両方を有することができる。
本発明のさらに別の面は、上記方法により産生されたＭＤＶを含むワクチンを動物に投与することにより、疾患に対して動物を防御する方法に関する。好ましくは動物は鳥類である。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明は、天然に存在するマレック病ウイルス（ＭＤＶ）および組換えマレック病ウイルスの産生、遺伝子操作したＭＤＶおよびＭＤＶベクターの産生のための連続的鳥類細胞株の使用、ＭＤＶで感染またはトランスフェクションさせた連続的鳥類細胞株、およびそのような方法を使用して産生されたＭＤＶおよび／または他の疾患を引き起こす物質による疾患に対して動物を防御することができるワクチン、の産生のための連続的鳥類細胞株の使用法を提供する。また、ＭＤＶによる感染に対して防御するために、ＭＤＶワクチンおよびＭＤＶベクターで産生したワクチンを動物に投与する方法が提供される。
【００３４】
本発明のＭＤＶワクチンの製造は、説明のためであって、決して限定目的でないが、以下の段階に分類される：（ａ）組換えＭＤＶ鋳型の作製；（ｂ）天然に存在するＭＤＶおよび組換えＭＤＶの生産性感染を維持するための鳥類細胞株の操作；並びに（ｃ）ワクチンとして製剤化されるＭＤＶ、細胞培養物、溶解物または溶解物の成分のレスキュー。本発明はまた、組換えＭＤＶをコードするヌクレオチド配列を含むワクチン製剤を包含する。説明を明瞭にするために本発明を、ＭＤＶ株６５２血清型１を使用して実施例で説明するが、ＭＤＶの任意の血清型が使用できる。
【００３５】
本発明において用語「ＭＤＶ」は、天然に存在するＭＤＶウイルス粒子（例えば、野生型ＭＤＶまたは天然に存在する突然変異体ＭＤＶ）、または組換えＭＤＶウイルス粒子に対応するＭＤＶウイルス粒子を意味する。天然に存在するＭＤＶウイルス粒子は、野生型ＭＤＶゲノムまたは天然に存在するＭＤＶのゲノムによりコードされる。組換えＭＤＶウイルス粒子は、組換えＭＤＶゲノムによりコードされる。組換えＭＤＶゲノムは、ＭＤＶゲノムのヌクレオチド配列またはその断片を含む。そのような断片は、遺伝子産物の断片が遺伝子の活性を保持するように、少なくとも１つの遺伝子産物またはそのような遺伝子産物の断片をコードするのに充分な長さでなければならない。
【００３６】
例えば組換えＭＤＶゲノムは、その遺伝子産物がウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階に必須である遺伝子が欠失している、ＭＤＶのヌクレオチド配列を含む。さらに組換えＭＤＶゲノムは、異種遺伝子または異種断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含有することができる。そのような断片は、抗原性エピトープ、制御配列、またはそのような断片によりコードされるポリペプチドが遺伝子産物の活性を保持するように充分な断片を保持する遺伝子の断片をコードするヌクレオチド配列を含有する。ＭＤＶはまた、組換え法で産生したマレック病ウイルス（組換えマレック病ウイルス）またはその断片を含む。
【００３７】
本発明は、ウイルス複製またはウイルスの生活環のある別の段階（感染の開始、およびウイルス粒子のパッケージングを含む）に必須である遺伝子および遺伝子領域中の欠失および／または突然変異を含有する、組換えマレック病ウイルスを包含する。本発明のこの面において、ＭＤＶゲノムの欠失および／または突然変異は、必須の遺伝子産物の発現を排除または低下させるのに、および／または必須の遺伝子産物の活性を排除または低下させるのに充分である。標的となるＭＤＶ遺伝子の例は、特に限定されないが、ｇＨ、ｇＢ、ｇＤおよびキャプシド遺伝子を含む。本発明のこの面において、ＭＤＶゲノムの必須領域は、弱毒化表現型を有する組換えＭＤＶを作成するために標的とされる。
【００３８】
本発明の別の実施態様は、ＭＤＶゲノムの必須または非必須領域の欠失および／または突然変異を含有する組換えマレック病ウイルスを包含する。ＭＤＶゲノム中のそのような領域は、キメラＭＤＶベクターを作成するために任意の異種ヌクレオチド配列で置換されてよい。実質的に任意の異種遺伝子配列を、ワクチンで使用するためのＭＤＶベクター中に作製することができる。本発明のこの面において、異種遺伝子配列は、宿主の細胞性および／または体液性免疫応答を増強または活性化するのに役立つ遺伝子産物、または種々の病原体に対する防御性免疫応答を誘導するエピトープまたは中和抗体に結合する抗原をコードする遺伝子産物を包含してもよい。
【００３９】
例えばワクチンで使用するための本発明のキメラベクター中に作製することができる異種遺伝子配列は、特に限定されないが、ＭＤＶの他の血清型、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）、および鳥類インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）から得られる配列がある（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  （編）、１９８１，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  、その全体を参照することにより本明細書の一部とする）。
【００４０】
ＭＤＶゲノムへの外来遺伝子配列の挿入は、外来遺伝子によるウイルスコード領域の完全な置換または部分的置換により行われる。完全な置換は、おそらくＰＣＲ指令突然変異誘発を介して行うことが最適であろう。簡単に説明すると、ＰＣＲ−プライマーＡは、５’から３’末端に：ユニークな制限酵素部位、例えばクラスＩＩＳ  制限酵素部位（すなわち、「シフター（ｓｈｉｆｔｅｒ  ）」酵素；これは特異的配列を認識するが、その配列の上流または下流でＤＮＡを切断する）；ＭＤＶ遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドのストレッチ；および外来遺伝子産物のカルボキシ末端コード断片に相補的なヌクレオチドのストレッチを含有するであろう。
【００４１】
ＰＣＲ−プライマーＢは、５’から３’末端に：ユニークな制限酵素部位；ＭＤＶ遺伝子に相補的なヌクレオチドのストレッチ；および外来遺伝子産物の５’コード断片に対応するヌクレオチドのストレッチを含有するであろう。外来遺伝子のクローン化コピーを有するこれらのプライマーを使用してＰＣＲ反応を行なった後、ユニークな制限部位を使用して生成物を切り出しクローン化してもよい。クラスＩＩＳ  酵素による消化と精製したファージポリメラーゼによる転写により、外来遺伝子挿入を有するＭＤＶ遺伝子の正確な非翻訳末端を含有する分子が作成されるであろう。
【００４２】
組換えＭＤＶは、マレック病ウイルスの核酸配列の例えば置換、挿入、反転、付加、および欠失、並びにこれらの任意の組合せ（例えば、ＭＤＶゲノムの非必須領域または必須領域が、これらの領域が発現されないように欠失または突然変異しているマレック病ウイルスの欠失突然変異体、例えば遺伝子ノックアウトまたはミスセンス突然変異体）を含むことは理解されている。このような変化は、自然界でも起き、またはそのような変化を引き起こすための従来の組換え法を使用して遺伝子操作される。
【００４３】
組換えマレック病ウイルスまたはその断片の産生および操作は、当該分野の技術内にあり、特にＭａｎｉａｔｉｓｅｔ  ａｌ．，  １９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（編）、１９９５、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  、サンジエゴ；およびＥｒｌｉｃｈ（編）、１９９２、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  、ニューヨーク（これらのすべてはその全体を参照することにより本明細書の一部とする）に記載の組換え技術に従って行うことができる。
【００４４】
組換え法を使用する種々の組換えマレック病ウイルスおよびマレック病ウイルスベクターの調製は公知である。例えば１９９３年７月２７日発行の米国特許第  ５，２３１，０２３号は、ＭＤＶのＤＮＡゲノムの非必須領域中への異種遺伝子の挿入により調製されるマレック病ウイルスウイルスベクターを記載している。
本発明はまた、コード配列の発現を指令する制御要素に機能的に結合した前記の任意のコード配列を含有するＤＮＡ発現ベクター、および宿主細胞中でコード配列の発現を指令する制御要素に機能的に結合した前記の任意のコード配列を含有する遺伝子操作した宿主細胞を包含する。
【００４５】
本明細書において制御要素は、特に限定されないが、非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を指令し制御する当業者に公知の他の要素を含む。本発明の好適な実施態様において、ウズラ細胞株中で活性であるかまたはＭＤＶにより誘導される制御要素が使用され、これは本出願人により証明されるように、単純ヘルペスウイルス−１  （ＨＳＶ−１）のｇＤのプロモーター要素、ＩＬＴＶのｇＧプロモーター要素、ＩＬＴＶのｇＣプロモーター要素、ＰＲＶのｇＸプロモーター要素、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターを含む。
【００４６】
ＭＤＶゲノムまたはその断片は、当該分野で公知の方法を使用して組換えＤＮＡ技術により産生される。ＭＤＶコード配列および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを作製するのに、当業者に公知の方法を使用することができる。これらの方法には、例えば組換えＤＮＡ技術、合成法、およびインビボ遺伝子組換えがある。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  （前述）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９（前述）に記載の方法を参照されたい。あるいは、例えばシンセサイザーを使用して、ＭＤＶ遺伝子産物配列をコードすることができるＲＮＡを化学的に合成してもよい。例えば”Ｏｌｙｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  、１９８４、Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．  編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  、オックスフォード（これはその全体を参照することにより本明細書の一部とする）に記載の方法を参照されたい。
【００４７】
本発明において、用語「ＭＤＶベクター」は、１つまたはそれ以上の機能性ペプチド（例えば抗原）の発現に必要な適当な制御配列を含有する発現ベクターを包含する。本発明のＭＤＶベクターの例には、パッケージング細胞株中のＭＤＶゲノムの発現を増強するように設計されたＭＤＶ制御要素または異種制御要素の制御下で、ＭＤＶゲノムまたはその断片を発現するものがある。本発明の好適な実施態様において、ウズラ細胞株中で活性であるかまたはＭＤＶにより誘導される制御要素が使用され、これは本出願人により証明されるように、単純ヘルペスウイルス−１  （ＨＳＶ−１）のｇＤ遺伝子のプロモーター要素、ＩＬＴＶのｇＧプロモーター要素、ＩＬＴＶのｇＣプロモーター要素、ＰＲＶのｇＸプロモーター要素、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＲＳＶプロモーターを含む。
【００４８】
本発明はまた、弱毒化表現型を有するウイルス粒子を与える組換えＭＤＶベクターを包含し、その１例は、必須の遺伝子が突然変異されているかおよび／または欠失しており、その結果複製欠陥ＭＤＶを与える組換えＭＤＶである。ＭＤＶゲノムまたはその断片は、野生型ＭＤＶのヌクレオチド配列、遺伝子が改変されたＭＤＶまたはその断片（必須遺伝子領域の欠失または異種配列の挿入を含む）のヌクレオチド配列を包含してもよい。
【００４９】
本発明のこの面の好適な実施態様は、ｇＨ遺伝子全体が欠失しているかまたはｇＨ遺伝子産物の発現を防ぐのに充分な大きさのその断片、またはｇＨ遺伝子が突然変異を受けている（例えば、ｇＨ遺伝子産物の発現を防ぐようなミスセンス突然変異体）組換えＭＤＶゲノムである。本発明のこの面のさらに別の好適な実施態様は、キャプシド遺伝子全体が欠失しているかまたはキャプシド遺伝子産物の発現を防ぐのに充分な大きさのその断片、またはキャプシド遺伝子が突然変異を受けている（例えば、キャプシド遺伝子産物の発現を防ぐようなミスセンス突然変異体）組換えＭＤＶゲノムである。
【００５０】
ＭＤＶはまた、ＭＤＶのゲノムの核酸配列内に位置する挿入領域内に取り込まれた異種遺伝子を含む組換えＭＤＶを包含することが理解される。本発明のこの面の好適な実施態様において、ＭＤＶゲノムは、ＭＤＶによる感染に対してより完全な防御作用を付与するために鳥類に投与される多価ワクチンを与えるように、ＭＤＶの３つの血清型の１つまたはそれ以上の抗原性ペプチドを発現するように操作される。例えば、ＭＤＶの血清型１のＭＤＶゲノムは、血清型ＭＤＶ２および３のｇＢ遺伝子産物の抗原決定基をさらにコードするように操作されてよい。さらに別の実施態様において、異種遺伝子および遺伝子断片は、他の鳥類の疾患を引き起こす物質の抗原をコードしてもよい。異種遺伝子および断片を含有する組換えマレック病ウイルスの調製法は、当該分野の技術の範囲内にあり、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ  ａｌ．  および前記の他の文献に記載の組換え法に従って行われる。
【００５１】
本発明のさらに別の実施態様において、ＭＤＶベクターは、組換えＭＤＶのヌクレオチド配列と、ＭＤＶもしくは他の鳥類の疾患を引き起こす物質（例えば、ＡＬＶ）の抗原をコードする１つまたはそれ以上の異種遺伝子とを、含有するように操作されてよい。さらに別の実施態様において、異種遺伝子および遺伝子断片は、他の鳥類の疾患を引き起こす物質の抗原をコードしてもよい。さらに別の実施態様において、本発明のＭＤＶベクターは、鳥類の細胞性免疫応答を増強して、投与されたワクチンの全体的な防御作用を増強することが知られている異種タンパク質をコードするように操作されてよい。
【００５２】
本発明のＭＤＶベクター中に操作されるＭＤＶおよび異種遺伝子は、当業者の技術範囲の組換え法を使用して操作され、本発明の連続的鳥類細胞株中で発現することができ、そして適当な形に製剤化され鳥類に投与されると、組換えマレック病ウイルスおよび／または異種遺伝子産物の両方に対する免疫応答を誘発する。充分に機能性のプロモーターは、ＭＤＶベクターが異種遺伝子を発現できるように、異種遺伝子に結合すべきである。プロモーターは、組換えＭＤＶベクターに感染した細胞中で転写を指令することができる任意の真核生物、原核生物、またはウイルスプロモーターである。このようなプロモーターの調製と使用は公知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  および前記の他の文献に記載の組換え法に従って行われる。
【００５３】
本発明は、ＭＤＶを産生することができるかまたはＭＤＶベクターの産生に有用な連続的鳥類細胞株（例えば、ネコ腎細胞およびウズラ細胞株）を感染およびトランスフェクションし、かつ培養することによる、ＭＤＶおよびＭＤＶベクターの製造法を包含する。このような細胞株中で産生されたＭＤＶは、次に当業者に公知の単離法を使用して単離することができる。「感染」または「トランスフェクション」とは、細胞へのウイルスのＤＮＡまたはその断片の移動を意味する。遺伝子移動法は、当該分野の範囲内にあり、例えばＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  、第２版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎ．  Ｙ．  に記載されている。
【００５４】
本発明は、高力価のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の増殖および生産性感染を効率的に維持する連続的鳥類細胞株、特にウズラ筋肉筋原細胞に関する。本発明はまた、ウイルスの複製に必要なＭＤＶ遺伝子産物を発現するように操作されたウズラ筋肉筋原細胞を包含する。本発明のこの面において、このような細胞株は、組換えＭＤＶベクター中の欠失されたかまたは突然変異された必須のウイルス遺伝子および遺伝子領域を補足するために、「補足細胞株」と呼ばれる。
【００５５】
本発明の補足細胞株は、組換えＭＤＶベクターから欠失している遺伝子または遺伝子領域を発現するように操作されてよい。本発明のこの面において、細胞株は、特に限定されないが、ｇＨ、ｇＢ、ｇＤまたはキャプシドタンパク質を含むＭＤＶ遺伝子産物を発現するように操作されてよい。細胞株は、構成的に活性なまたは誘導性の制御要素の制御下で、一時的にまたは安定にＭＤＶ遺伝子産物を発現するように操作される。本発明の好適な実施態様において、ウズラ細胞株中で活性であるかまたはＭＤＶにより誘導される制御要素が使用され、これは本出願人により証明されるように、ＨＳＶ−１のｇＤのプロモーター要素、ＩＬＴＶのｇＧおよびｇＣのプロモーター要素、ＰＲＶのｇＸのプロモーター要素、ＳＶ４０プロモーター要素、ＣＭＶプロモーター要素およびＲＳＶプロモーター要素を含む。
【００５６】
特に好適なアプローチにおいて、ＭＤＶウイルス遺伝子を発現するように操作された細胞は、所望の遺伝子型を含有する感染性キメラウイルスを産生するようになり、こうして選択系の必要性を排除する。理論的には、ＭＤＶの遺伝子の任意の１つを外来配列により置換することができる。しかしこの同一視の必要な部分は、欠陥ウイルス（正常なウイルス遺伝子産物が欠失しているかまたは変化しているため欠陥を有する）を増殖させる能力である。この問題を避けるために多くの可能なアプローチが存在する。１つのアプローチでは、突然変異タンパク質を有するウイルスは、同じタンパク質の野生型を構成的に発現するように限定されている細胞株中で増殖することができる。
【００５７】
こうして細胞株はウイルス中の突然変異を補完する。任意のＭＤＶ遺伝子を構成的に発現する形質転換された細胞株を作製するのに、同様の方法を使用することができる。ウイルスタンパク質を発現するように作製されるこれらの細胞株は、組換えウイルス中の欠陥を補完するために使用でき、従ってこれを増殖させることができる。あるいは組換えウイルス（すなわち、鳥類細胞株）を増殖させるのに、ある天然の宿主範囲系が利用できる。組換えウイルスを増殖させる第３のアプローチは、野生型ウイルスとの同時培養である。これは、単に組換えウイルスを取り、これと別の野生型ＭＤＶウイルス（好ましくはワクチン株）とにより細胞を同時感染させることにより行われる。野生型ウイルスは、欠陥のあるウイルスの遺伝子産物を補完し、野生型と組換えウイルスの両方の増殖を可能にする。
【００５８】
長期の高収率の組換えタンパク質の産生のために、安定な発現が好ましい。例えばＭＤＶ遺伝子産物を安定に発現する鳥類細胞株が操作される。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御されるＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作した細胞を補強された  （ｅｎｒｉｃｈｅｄ）  培地中で１〜２日間増殖させ、次に選択培地に交換する。
【００５９】
組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対して耐性を提供し、細胞が、その染色体中にプラスミドが安定に組み込まれ、増殖して増殖巣を生成し、これを次にクローン化し拡張して細胞株にすることを可能にする。この方法は、本明細書に記載のｇＤおよびｇＨ発現細胞株のような細胞株を操作するのに使用するのに有利である。本発明のさらに別の実施態様において、組換えＭＤＶおよび制御要素をコードするＤＮＡ配列が宿主細胞に提供され、当業者に公知でかつＣｈａｐｐｅｌ  の米国特許第  ４，２１５，０５１号；Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ  のＷＯ９１／０６６６７（これらはその全体を参照することにより本明細書の一部とする）に記載の相同的組換えにより宿主ゲノム中に導入される。
【００６０】
多くの選択系が利用でき、特に限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３  ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  １９６２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２６  ）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子が、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞中で使用できる。
【００６１】
また抗代謝物耐性を以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメソトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５６７  ；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５３７  ）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２  ）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ．  Ｍｏ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１  ）；およびｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）。本発明の別の実施態様において、標的遺伝子の発現を検出するために本明細書に記載の緑の蛍光遺伝子を使用することができる。
【００６２】
本発明はまた、ＭＤＶまたはＭＤＶベクターで感染した連続的鳥類細胞株を包含する。ＭＤＶで感染またはトランスフェクションするための鳥類細胞株は、鳥類ウイルスを含まない連続的細胞株が特徴である。好ましくは鳥類細胞株は、ウズラ細胞株である。これらの細胞株は、Ｃｅｌｉｓ，  Ｊｕｌｉｏ編、１９８４，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、に記載の既知の細胞培養法を使用して培養し維持してもよい。当業者は、これらの細胞の種々の培養条件（具体的な栄養物質についての培地の調製、酸素、圧力、二酸化炭素、および血清レベルの低下を含む）を選択し最適化することができる。
【００６３】
本発明の好適な鳥類細胞株はウズラ細胞株であり、より好ましくはウズラ筋肉の筋原  （ｍｙｏｂｌａｓｔ）  細胞株である。本発明において任意のウズラ筋肉の筋原細胞株が使用でき、例えば１９９８年１１月２４日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたウズラ細胞株ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１２５９９  がある。好適な実施態様において本発明は、ＭＤＶ血清型２または３を培養するための、ＱＴ３５と呼ぶウズラ細胞株を包含しない。好適な実施態様において、ＱＭ７と呼ぶ細胞株が、本発明のＭＤＶベクターおよびウイルスを培養するために使用される。本発明のさらに別の好適な実施態様において、１９９８年１１月２４日にＡＴＣＣに寄託された細胞株ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１２６００  と呼ぶ、ＭＤＶ株６５２で感染させたウズラ細胞株ＱＭ７が使用される。
【００６４】
本発明で使用するための鳥類細胞株は、当業者に公知の既知の細胞培養法を使用してクローン化することができる。細胞を培養し、市販の培地を使用して細胞の増殖に適した既知の条件下で単一の細胞から拡張することができる。
例えば、使用するまで凍結した本発明の細胞株は、約３７℃の温度で加熱し、次に３％胎児牛血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）のような適当な増殖培地に添加することができる。細胞は、約５％の二酸化炭素を含有する加湿インキュベーター中で約３７℃の温度で、コンフルエントになるまでインキュベートすることができる。
【００６５】
細胞を継代するために、増殖培地を除去し、次に０．０５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを細胞に加えることができる。細胞は離れ、遠心分離管中に細胞懸濁液が採取され、遠心分離して細胞ペレットにされる。トリプシン溶液を除去し、細胞ペレットを新しい増殖培地に再度懸濁することができる。次に細胞は、追加の増殖容器中でさらに増殖させて所望の密度にすることができる。
本発明において連続的細胞株は、インビトロで少なくとも１５継代維持することができる不死化細胞を包含する。
【００６６】
感染とトランスフェクションは、ＭＤＶにより感染した細胞と共に同時培養することにより起こり、ここでＭＤＶは、非組換え、組換え、遺伝子操作したまたはＭＤＶベクターである同時培養に使用される細胞は、ＭＤＶ感染細胞（例えば、ＣＥＦ細胞またはＤＥＦ細胞）、リンパ芽球細胞、末梢血単核細胞、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞、ウズラ細胞、および実施例に記載のウズラ細胞のクローンでもよい。あるいは鳥類細胞株は、当業者に公知の方法（例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン、リポフェクチン、および電気穿孔法）を使用して、鳥類細胞株中に、精製ＭＤＶ  ＤＮＡまたはＭＤＶ感染細胞からのＤＮＡを導入することにより、ＭＤＶで感染させることができる。好ましくはＤＥＦまたはＣＥＦ  ＭＤＶ感染細胞が、本発明の連続的鳥類細胞株を感染させるために使用される。ＭＤＶ感染したＣＥＦ、ＤＥＦ、リンパ芽球、末梢血単核細胞、ＣＨＣＣ−ＯＵ２細胞およびウズラ細胞は、当業者に公知である。
【００６７】
例えば、次に鳥類細胞株を、約５０〜約８０％コンフルエンスになるまで増殖させて、そしてＭＤＶで感染した細胞を半コンフルエントな細胞に加えて、ＭＤＶで感染させることができる。次に、培地を２〜３日毎に交換して細胞を約３７℃の温度で１週間インキュベートすることができる。次に細胞を、上記のようにトリプシン処理して分離することができる。感染細胞は、細胞変性作用（ＣＰＥ）、感染細胞増殖巣の生成、およびＭＤＶ特異抗体を用いる間接蛍光抗体（ＩＦＡ）により追跡することができる。ＭＤＶ特異抗体は、既知のモノクローナルハイブリドーマ法［Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８８）］を使用して産生することができる。次に、ＭＤＶ感染細胞の凍結ストックは使用するまで保存することができる。
【００６８】
本発明はまた、連続的細胞株（例えば、ウズラ細胞株）を感染させ、感染した細胞株を培養してＭＤＶに対するワクチンとして有用な抗原を生成させることにより産生されるＭＤＶを含む、ワクチンの製造法に関する。次にＭＤＶ感染細胞は、ＭＤＶに対するワクチンとして使用するか、またはこれらの細胞から単離された無細胞ＭＤＶをワクチンとして使用することができる。
【００６９】
本発明はさらに、ＭＤＶと、ＭＤＶ以外の鳥類の疾患を引き起こす物質に対して有用な、ＭＤＶ以外の異種遺伝子を発現することができる、１つまたはそれ以上の異種タンパク質またはポリペプチドとを含むＭＤＶベクターで、連続的鳥類細胞株（例えば、ウズラ細胞株）をトランスフェクションまたは感染することにより産生されるＭＤＶを含むワクチンの製造法に関する。
【００７０】
さらに本発明は、複製欠陥ＭＤＶと、ＭＤＶ以外の鳥類の疾患を引き起こす物質に対して有用な、ＭＤＶ以外の異種遺伝子を発現することができる、１つまたはそれ以上の異種タンパク質またはポリペプチドの遺伝子もしくはその一部とを含むＭＤＶベクターで、連続的鳥類細胞株をトランスフェクションすることにより産生されるワクチンの製造法に関する。
【００７１】
さらに本発明は、複製欠陥ＭＤＶと、ＭＤＶ以外の鳥類の疾患を引き起こす物質に対して有用な、ＭＤＶ以外の異種遺伝子を発現することができる、１つまたはそれ以上の異種タンパク質またはポリペプチドの遺伝子もしくはその一部とを含むＭＤＶベクターで、連続的鳥類細胞株をトランスフェクションすることにより産生されるワクチンの製造法に関する。
【００７２】
ワクチンの製造に有用なかつ本発明の方法を使用して製造される、他の鳥類の疾患を引き起こす物質の例には、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）、および鳥類インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）がある（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  （編）、１９８１，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  、を参照されたい。その全体を参照することにより本明細書の一部とする）。１つまたはそれ以上の異種タンパク質およびポリペプチドを含有する本発明の方法を使用して産生されたＭＤＶは、１価または多価ワクチンとして役立つ。このようなワクチンは、ワクチンの製造の分野で当業者に公知の方法により製造される。
【００７３】
本発明において、細胞株またはその一部（例えば細胞溶解物）を含むワクチン調製物は、細胞株が他のウイルスや病原体を含まないことを確認するために試験すべきである。特に、動物（例えば鳥類）に投与されるワクチンとして処方される細胞株は、レトロウイルスの存在について試験すべきであり、そのような測定法は当業者に公知の方法（例えば、逆転写酵素測定法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ）を使用して行うことができる。さらに細胞株は、市販の測定法を使用して鳥類病原体の存在について測定すべきである。
【００７４】
本発明はさらに、ＭＤＶによる感染に対する防御のために、動物にＭＤＶワクチンおよびＭＤＶベクター産生ワクチンを投与する方法を含む。ＭＤＶ発現ＭＤＶおよび／または１つまたはそれ以上の異種タンパク質もしくはポリペプチド（鳥類免疫応答を増強するのに役立つものを含む）または鳥類の疾患を引き起こす物質のタンパク質もしくはポリペプチドは、動物（例えば、そのような疾患を引き起こす物質に対して感受性のニワトリや七面鳥）を予防接種するのに使用することができる。本発明の方法を使用して産生されるＭＤＶまたは他の抗原による予防接種により、防御性免疫応答が得られ、その結果接種された動物は、これらの疾患を引き起こす物質による以後の感染から防御されるであろう。
【００７５】
組換えウイルス生ワクチンまたは不活性化組換えウイルスワクチンを製剤にすることができる。宿主中での増殖により、自然の感染で起きるものと同様の種類と程度の刺激が延長され、従って実質的に長期の免疫を付与するため、生きたワクチンが好ましい。そのような組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、ニワトリ胚の細胞培養物または尿膜中でウイルスを増殖させ次に精製する従来法を使用して行われる。
【００７６】
この点で、ワクチンを目的とする遺伝子操作したＭＤＶ（ベクター）の使用は、これらの株の弱毒化特性の存在が好ましい。トランスフェクションに使用される鋳型中への適当な突然変異（例えば欠失）の導入は、弱毒化特性を有する新規ウイルスを提供することがある。例えば欠失突然変異体に、温度感受性または低温適応に関連する特異的ミスセンス突然変異を作成することができる。これらの突然変異は、低温または感受性突然変異に関連する点突然変異より安定であり、復帰変異は極めて低いであろう。
【００７７】
あるいは、「自殺」性を有するキメラウイルスを作製してもよい。そのようなウイルスは、宿主内でわずかに１回または数回の複製をするのみであろう。ワクチンとして使用される時、この組換えウイルスは限定された複製サイクルを行い、充分なレベルの免疫応答を誘導するが、動物宿主ではそれ以上進まず疾患を引き起こさないであろう。１つまたはそれ以上のＭＤＶ遺伝子が欠如しているかまたは突然変異ＭＤＶ遺伝子を有する組換えウイルスは連続的に複製されないであろう。欠陥ウイルスは、そのような遺伝子を永久に発現する細胞株中で産生することができる。必須遺伝子が欠如したウイルスはこれらの細胞株中で複製されるが、動物宿主に投与された時、１ラウンドの複製を完成することができない。
【００７８】
産生される非感染性ウイルス粒子以外に、そのような調製物は、（このうまくいかないサイクル中で）充分な数の遺伝子を転写および翻訳して免疫応答を誘導することができる。あるいは、これらの調製物が不活性化（死滅）ウイルスワクチンとして作用するように、多量の株を投与することができる。不活性化ワクチンについて、ウイルス成分として発現される異種遺伝子産物を発現して、遺伝子産物がウイルス粒子と結合することが好ましい。本発明のさらに別の実施態様において、ＭＤＶの抗原決定基または異種ウイルス抗原決定基を含むサブユニットワクチンが、ワクチンとして製剤化される。そのような調製物の利点は、これらは未変性のタンパク質を含有し、死滅ウイルスワクチンの製造に使用されるホルマリンまたは他の物質を用いる処理による不活性化を受けないことである。
【００７９】
本発明のこの面の別の実施態様において、不活性化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅」させるための従来法を使用して調製される。不活性化ワクチンは、感染性が破壊されているという点で「死んでいる」。理想的にはウイルスの感染性は、その免疫原性を損なうことなく破壊される。不活性化ワクチンを調製するために、キメラウイルスはニワトリ胚の細胞培養物または尿膜中で増殖され、ゾーン超遠心分離により精製され、ホルムアルデヒドまたはプロピオラクトンにより不活性化され、プールされる。得られるワクチンは通常筋肉内に接種される。
【００８０】
本発明のさらに別の実施態様において、弱毒化表現型を有する組み換え体ＭＤＶをコードするヌクレオチド配列、またはＭＤＶおよび／または異種抗原決定基を含有する組み換え体をコードするヌクレオチド配列が、ワクチンとして製剤化されてよい。この実施態様において、ワクチン組成物は、弱毒化表現型を有するか、および／またはＭＤＶおよび／もしくは制御配列に機能的に結合した異種抗原決定基を含有する組み換え体ＭＤＶをコードするＤＮＡを含むことができる。本発明のこの面において目的のＤＮＡは、ＤＮＡの発現を促進する制御要素（すなわち、プロモーターまたは増強要素）の制御下で発現ベクター中に操作される。
【００８１】
ある好適な実施態様において、プロモーター要素は細胞特異的であり、あらかじめ決められた細胞中でのみＤＮＡの実質的な転写を可能にする。ＤＮＡは裸のＤＮＡ（米国特許第  ５，６７９，６４７号、その全体を参照することにより本明細書の一部とする）として直接宿主中に導入されるか、またはＤＮＡの取り込みを促進する他の物質（ウイルスベクターを含む）、免疫化を促進する物質（例えば、ブピビカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ  ）および他の局所麻酔薬（米国特許第  ５，５９３，９７２号、その全体を参照することにより本明細書の一部とする）、サポニン（米国特許第  ５，７３９，１１８号、その全体を参照することにより本明細書の一部とする）、および陽イオン性ポリアミン（国際出願公報ＷＯ９６／１００３８  号、その全体を参照することにより本明細書の一部とする）との組成物中で製剤化される。
【００８２】
不活性化ウイルスは、免疫学的応答を増強するために適当なアジュバントとともに製剤化される。そのようなアジュバントには、特に限定されないが、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム；界面活性剤、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン；ペプチド；オイルエマルジョン；および有用な可能性のあるアジュバント、例えばＢＣＧおよびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）がある。
【００８３】
本発明の細胞株およびその成分は、中性または塩の形でワクチン中に処方されてよい。薬剤学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）および無機酸（例えば、ＨＣｌまたはリン酸）、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸など）と形成される塩がある。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第２鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から得られる。
【００８４】
ワクチンが投与される患者は、好ましくは鳥類、最も好ましくは家禽（例えば、ニワトリまたは七面鳥）、鳥類ではない動物（ウシ、ウマを含むがこれらに限定されない）  である。
本発明のワクチン製剤は、本発明の有効な免疫量の細胞株およびその成分および薬剤学的に許容される担体または賦形剤を含む。ワクチン調製物は、有効免疫量の１つまたはそれ以上の抗原、および薬剤学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００８５】
薬剤学的に許容される担体は当該分野で公知であり、特に限定されないが、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、およびこれらの組合せを含む。そのような許容される担体の１つの例は、１つまたはそれ以上の安定剤（例えば、安定化した加水分解したタンパク質、乳糖など）を含有する生理的にバランスした培地である。担体はより好ましくは無菌である。製剤は投与型に分割できるべきである。
【００８６】
所望であれば組成物はまた、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有してもよい。この組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、除放性製剤、または散剤であってよい。経口製剤は、薬剤学的グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含有してもよい。
一般的に成分は、例えば密封容器（例えば、活性物質の量を示すアンプルまたは袋）中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物のような単位投与型で、別々にまたは混合して提供してもよい。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合されるように無菌希釈剤のアンプルを提供することができる。
【００８７】
上記のワクチン製剤を導入するために多くの方法が使用でき、これらには特に限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、および鼻内経路がある。ワクチンが設計される病原体の自然の感染経路を介してキメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい。ＭＤＶワクチンの免疫力価は、ワクチンで免疫後に試験動物中の免疫応答を追跡することにより測定することができ、例えば、体液性（抗体）応答および／または細胞性免疫は免疫応答の指標と見なされる。本発明のワクチンの有効用量（免疫量）は、動物モデル試験系で得られた用量応答曲線から外挿される。以下の例は、本発明をさらに例示するが、決してこれを限定するものではない。
【００８８】
実施例１．ＭＤＶ感染を効率的に維持するＱＭ７細胞
この試験ではＱＭ７細胞は、高力価でＭＤＶ−１増殖を維持することができる細胞株として同定された、ＱＴ６繊維肉腫細胞株から得られたジャパニーズウズラ筋肉筋原細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１２５９９）である。
ＭＤＶの６５２および５８４Ａ単離株は、非常に悪性のＭＤＶ単離体である［Ｗｉｔｔｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，  Ｖ．  ４１，  ｐｐ  １４９−１６３  （１９９７）  ］。ＱＭ７細胞を、継代１１でＭＤＶで感染させたＤＥＦ接種物である６５２／ＤＥＦで感染させた。
【００８９】
ＭＤＶ−１の生産性感染（株６５２）を、増殖巣の形成を定量してＣＰＥ（細胞変性作用）と、ＩＦＡ測定法でＭＤＶウイルスタンパク質（ｇＢおよびｐｐ３８）を検出することにより追跡した（図１）。大きな強く染色した感染巣を検出した。感染は、６５２／ＱＭ７感染細胞を、それぞれ接種された（５０〜６０％コンフルエンス）非感染ＱＭ７細胞に接種することにより維持される。
【００９０】
６５２／ＱＭ７感染巣は視覚的に検出できるほど充分大きく、抗体染色を必要としなかった。ＱＴ６繊維肉腫細胞株もまた、生産性ＭＤＶ感染を維持する能力について試験した。しかしＱＴ６細胞株は、ＭＤＶの増殖のためのあまり効率的な宿主ではなかった。
この結果は、ＱＭ７細胞はＭＤＶ−１による感染を効率的に維持することを示すが、ＱＭ７細胞のＭＤＶ−１感染をさらに性状解析し最適化するために、６つの異なる増殖条件（２つの血清濃度、３つの分離比）を試験した。結果を以下に要約する。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
【表２】
0003626409.tif 000003
【００９３】
これらの結果は、  ６５２／ＱＭ７  感染の最適な増殖条件が、分離比１：１０で３％胎児牛血清を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で感染細胞を培養することであることを示す。分離比が１：２０に拡大すると力価は明らかに落ちた。継代７〜継代１０まで力価は一定であった。
【００９４】
ＱＭ７と  ６５２／ＱＭ７  細胞での逆転写酵素測定法
市販の非放射性逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ）を使用して、逆転写酵素活性について細胞株を試験した。細胞溶解物、清澄化上清、およびゲルろ過ペレットを、ＤＥＦ、  ６５２／ＤＥＦ、ＱＭ７、  ６５２／ＱＭ７  およびＮＹＵ細胞（陽性対照として）から調製した。すべて試料は三重測定で行い、結果は２つのＲＴ測定を示す。ＨＩＶ−１  ＲＴを使用して標準曲線を作成した。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
ＮＹＵ細胞を、既知のレトロウイルスＲＴ活性について内部陽性対照として選択した。これらの結果が証明するように、ＮＹＵ細胞から得られた超遠心分離ペレットおよび細胞溶解物は、ＲＴ活性について強い陽性結果を与える。ＱＭ７、  ６５２／ＱＭ７  、ＤＥＦおよび  ６５２／ＤＥＦ  細胞は、この測定法（感度は少なくとも２０ピコグラム）で逆転写酵素活性について明らかに陰性であった。これらの結果は、すべての４つの細胞株はレトロウイルス粒子を持たないことを示している。
【００９７】
鳥類外来ウイルス試験
米国農務省試験９ＣＦＲ１１３．３７「ニワトリ胚接種試験による病原体の検出」を使用して、ＱＭ７細胞を鳥類病原体の存在についても試験し、鳥類病原体が無いことがわかった。簡単に説明すると、ＱＭ７細胞懸濁液をニワトリ胚で感染させた。鳥類の外来ウイルスが存在すれば、ニワトリ胚が障害されるであろう。
【００９８】
ＭＤＶ−１  （６５２）  ＤＮＡ  のトランスフェクションはＱＭ７細胞中の生産性溶解性感染を導く
６５２／ＱＭ７  感染細胞から裸のＤＮＡを単離し、ＣａＰＯ４  トランスフェクション法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈキット）を使用して非感染ＱＭ７細胞でトランスフェクションした。２〜３日毎に培地を交換して７日間インキュベート後、トランスフェクションプレート上に多くの感染巣が見られる。これらの増殖巣は、６５２／ＱＭ７感染細胞と同時培養して確立した増殖巣から区別できない。この結果は、ＭＤＶ−１がＱＭ７細胞中で複製および生産性に増殖することができることを明瞭に証明し、  ６５２／ＱＭ７  増殖巣が汚染された接種物に由来する可能性を排除している。
【００９９】
実施例２．ＱＭ７細胞中の異なるプロモーター活性
ＱＭ７細胞中で活性のあるプロモーターを証明するために、およびさらにＭＤＶ感染の過程で活性化または誘導されるプロモーターを同定するために、以下の実験を行なった。異なるプロモーター（ｐＳＶ４０＋エンハンサー、ＰＳＶ４０、ｐＣＭＶ、ｐＲＳＶ）を含有するルシフェラーゼレポーター作製体（ｐＧｌ３ベース、Ｐｒｏｍｅｇａ  ）を、それぞれＱＭ７およびＤＥＦ細胞にトランスフェクションした。７２時間後、細胞溶解物を採取し、ルシフェラーゼ活性を異なる希釈で測定した。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
これらの結果は、これらの異なるプロモーター（ｐＣＭＶ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ４０およびｐＳＶ４０＋エンハンサー）がＱＭ７細胞中で非常に活性があることを示唆する。さらにｐＲＳＶはこれらの鳥類細胞中で特に強いプロモーターである。
【０１０２】
誘導性条件下でプロモーターの強さを試験するために、種々のＭＤＶ−１ウイルス誘導性プロモーター作製体を  ６５２／ＱＭ７  にトランスフェクションした。ルシフェラーゼレポーター遺伝子から発生したルシフェラーゼ活性を測定した。対照として使用したｐＣＭＶプロモーター以外に、５つの異なるウイルスプロモーターを試験した：ＭＤＶ−１のｇＨ遺伝子プロモーター要素（ＭＤ５株）；ＩＬＴＶのｇＧおよびｇＣ遺伝子のプロモーター要素；ＰＲＶのｇＸ遺伝子プロモーター要素、並びにＨＳＶ−１のｇＤプロモーター。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
これらの結果は、ＨＳＶ−１からのプロモーターｐｇＤは高度に誘導され、ＱＭ７細胞のＭＤＶ感染においてウイルス誘導性プロモーターとして活性があることを示唆した。ｐＣＭＶプロモーターはまた、ウイルス感染ＱＭ７細胞中で活性である。
【０１０５】
実施例３．インビボ病原性試験
６５２／ＱＭ７  感染細胞を、インビボ病原性試験でニワトリのマレック病を引き起こす能力について試験した。
各群３０羽の１日令のヒヨコに、（１）非感染ＱＭ７細胞混合物；（２）細胞培養継代３の６５２感染ＱＭ７細胞；（３）細胞培養継代３の６５２感染ＱＭ７細胞；（４）細胞培養継代７の６５２感染ＱＭ７細胞；（５）細胞培養継代７の６５２感染ＱＭ７細胞を、腹腔内に接種した。鳥に、１羽当たり  ２５０〜７５０  ＴＣＩＤ５０のＭＤＶを接種した。ウイルスの力価を、８０％アセトンで固定した２次ＤＥＦ細胞の単層について感染の６〜８日後にＴＣＩＤ５０法を使用して測定し、上記のＩＦＡにより調べた。
【０１０６】
感染および非感染細胞を、約５％二酸化炭素を有する加湿インキュベーター中で約３７℃の温度で、抗生物質と適量の胎児牛血清（感染細胞については３％、非感染細胞については１０％）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ）中で増殖させた。
鳥が試験中に死んだ場合は鳥を剖検して、ＭＤＶ感染の症候について調べた。生存している鳥から組織学的試験のために、腎臓、脾臓、肝臓および脳を採取した。
６５２感染細胞を注射したすべてのヒヨコは、非常に病原性の強いＭＤＶの古典的な症候を示し、これらの鳥の大部分はＭＤで死んだ。非感染細胞群は、実験の期間中（８週令）ＭＤの症候を示さなかった。結果を表６に示す。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
組織（腎臓、脾臓、肝臓、心臓および脳）の組織学的評価は、感染群の生存している鳥のマレック病と一致した病変を明らかにした。細胞対照群または陰性群の鳥ではそのような病変は見られなかった。
これらのインビボ実験は、ＱＭ７細胞中で増殖させたＭＤＶ−１  （６５２）  は非常に病原性が強いことを証明し、ＱＭ７細胞が高力価のＭＤＶ−１ウイルスの感染を増殖させるための良好な宿主であることを確認した。
【０１０９】
実施例４．ｐＣＲ３．１ｇＨ作製体の調製
マレック病ウイルス株ＭＤ５から２．６ｋｂの糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離し、市販のＰＣＲ試薬系（ＧＩＢＣＯ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  、カタログ番号１０１９８−０１８）を使用して、上方ＰＣＲプライマー５’−ＧＧＧＧＧ  ＴＡＣＣＡ  ＡＧＵＧ  ＣＡＴＴＧ  ＧＡＴＧＧ  ＣＴＡＣＡ  ＴＡ−３’  （配列番号：３）および下方プライマー５’−ＧＧＧＧＣ  ＴＡＧＣＴ  ＴＡＡＡＧ  ＡＴＣＧＴ  ＣＧＴＡＣ  ＡＧＧＣＴ  ＣＡＡ−３’  （配列番号：４）を使用して、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）によりｐＣＲ２  ＴＡクローニングベクター（ＴＡクローニングベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，  米国、から入手できる、カタログ番号Ｋ２０００−１）中にクローン化した。ｇＨ遺伝子を既知の方法を使用して配列決定した。ｇＨ遺伝子の配列は、Ｓｃｏｔｔｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  第７０巻、ｐｐ．  １１８５−１１９０  （１９９３）により記載されている。
【０１１０】
次にＭＤＶ  ｇＨ遺伝子を、複クローニング部位中のＫｐｎＩとＸｈｏＩ部位を使用してｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．  、米国、カタログ番号Ｋ３０００−０１）  中にサブクローニングした。ベクターｐＣＲ３．１は、効率的な哺乳動物発現のためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターと、ベクターを含有する細胞の陽性選択を可能にするネオマイシン耐性遺伝子とを含有する真核生物発現ベクターである。
【０１１１】
ベクターｐＣＲ３．１は、以下の特徴を有する：ＣＭＶプロモーター塩基１〜５９６；推定転写開始塩基５２０〜６２５；１７プロモーター／プライミング部位塩基６３８〜６５７；複クローニング部位塩基６７０〜７８５；ｐＣＲ３．１逆プライミング部位塩基７９７４１５；ＢＧＨポリアデニル化部位塩基７９６〜１０１０；ＣｏｌＥ１開始塩基１１００〜１７７３；ＳＶ４０プロモーターと開始塩基３１７８〜３５１５；ｐＧｒｅｅｎｌａｎｔｅｒｎ−２  プラスミド、ＧＩＢＣＯ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．米国、から入手できる（図５を参照）。
【０１１２】
ＭＤＶ−１  ｇＨの５’フランキング領域は、ＧｅｎｅＢａｎｋ，  米国、から入手でき、８９４〜１９２５位にＴＫ遺伝子を含有する。ｐＧｒｅｅｎｌａｎｔｅｒｎ−２  プラスミドは、クラゲのグリーンフルオレセンスプロテイン（ｇｆｐ）（これは、ｇＨ欠失組換えウイルスの作成プロセス中でマーカータンパク質として使用される）をコードする遺伝子を有する。グリーンフルオレセンスプロテイン遺伝子のＣＭＶプロモーターの上流にある、ｐＧｒｅｅｎｌａｎｔｅｒｎ−２  プラスミドのＮｓｉ１部位は、Ｔ４ポリメラーゼで処理されて、Ｐｍｅ１末端を含有する５’ｇＨフランキング領域と結合するための平滑末端を形成する。
【０１１３】
ＭＤＶ−１  ＢａｍＨＩ  断片Ｆ（これはｇＨ３’フランキング領域を含む［Ｆｕｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １０２−１０９  （１９８４）］）を含有するプラスミドを、Ｔａｍｐａ  Ｂａｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｓｉｔｉｔｕｔｅ  （米国フロリダ州）のＭｅｉｈａｎ  Ｎｏｎｏｙａｍａ  博士から得た。約２．４ｋｂの領域（以後「３’フランキング領域」と呼ぶ）のＤＮＡ配列を配列番号２に示す。ＭＤＶ−１  ｇＨ３’フランキング領域を、ＰＣＲクローニング（上のプライマー：５’−ＡＡＧＡＴ  ＴＴＴＴＣ  ＣＣＡＡＧ  ＴＣＣ−３’  （配列番号：５）、下のプライマー：５’−ＴＣＧＴＣ  ＧＡＡＴＡ  ＡＴＧＴＧ  ＡＴＣ−３’）（配列番号：６）により得て、上記ｐＧｒｅｅｎｌａｎｔｅｒｎ−２  プラスミド（Ｎｓｉ１部位に挿入されたＭＤＶ．１  ５’フランキング領域を有する）中にクローン化した。３フランキング領域をＮａｅＩ部位（全グリーンフルオレセンスプロテイン遺伝子の下流）に挿入した（図６）。
【０１１４】
ＱＭ７細胞中のｇＨおよびｇＤタンパク質の安定な発現
以下に説明するように、ＭＤＶ  ｇＨまたはＭＤＶ  ｇＤを安定に発現するＱＭ７細胞を作成した。プラスミド作製体ｐＣＲ３  ｇＨ−ＨＡおよびｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ  （容易に検出できるようにＨＡ標識をｇＨとｇＤ遺伝子のＣ末端に結合した）を、一時的にＱＭ７細胞中にトランスフェクションした。各糖タンパク質の発現を、抗ＨＡモノクローナル抗体を使用して免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）により証明した（図３）。
【０１１５】
さらにプラスミド作製体：ｐＣＲ３ｇＨ−ＨＡ  、ｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ  をＱＭ７細胞中に安定にトランスフェクションし、ｇ４１８耐性細胞のプールを得た。９６ウェルプレートを使用して希釈することにより単一の細胞クローンを得た。ｇＨ−ＨＡ  およびｇＤ−ＨＡ  タンパク質の両方の発現を、ＨＡモノクローナル抗体を使用して免疫蛍光測定法で視覚化した。さらに細胞を３５Ｓ（ＴｒａｎｓＬａｂｅｌ、ＩＣＮ  ）で代謝的に標識し、細胞溶解物をＨＡ抗体で免疫沈降させた。ｐＣＲ３ｇＨ−ＨＡ  作製体でトランスフェクションした細胞から得られた溶解物中にのみ、約９０ｋＤのバンドが存在した。
【０１１６】
ｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ  作製体でトランスフェクションした細胞から得られた溶解物中にのみ、約５０ｋＤのバンドが存在した（図４）。ＱＭ７細胞中のｇＨとｐＣＲ３ベクターから発現されたｇｄタンパク質のサイズは、その予測されるサイズと良く一致する。すなわちこれらの結果は、ＱＭ７細胞が操作されて、ウイルス複製に必要なＭＤＶタンパク質を発現することを証明する。いくつかの単一の細胞クローンは非常に豊富なｇＨ−ＨＡ  タンパク質発現を有する。これらの細胞株はｇＨ機能を補足させるのに良好な候補である。さらにＱＭ７細胞中にｐＣＲ３ｇＨ−ＨＡ  およびｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ  をＱＭ７細胞中に同時トランスフェクションすることにより、ｇＨとｇＤタンパク質を同時に発現するＱＭ７細胞を樹立した。
【０１１７】
実施例５．ｇＨ欠失を有する組み換えＭＤＶ
ｇＨ  ｇｆｐ＋ＭＤＶ−１  組み換え体の予備的同定
プラスミド作製体ｐＧＬ２／５’−３’ｇｆｐは、選択マーカーとしてｇｆｐ（グリーンフルオレセンスプロテイン）を含有する（図６）。これはまた、ｇｆｐをｇＨ遺伝子で置換するための相同的組換えのための、ｇＨ遺伝子の５’および３’フランキング領域を含有する。
【０１１８】
ｐＧＬ２／５’−３’ｇｆｐを、  ６５２／ＱＭ７  で感染したｇＨ−ＨＡ  産生細胞中にトランスフェクションした。トランスフェクションの４日後、培養物を２回継代し、毎回新鮮なｇＨ−ＨＡ  産生細胞を加えた。感染した全培養物を、ＦＡＣＳによりｇｆｐを発現する細胞についてソートした。ソートした細胞（これはｇｆｐ＋である）を２ウェルプレート中で培養した。６日間インキュベーション後、数個の表現型増殖巣が見られた。さらにこれらの増殖巣は紫外線下で緑色であり、これらが  ｇｆｐ＋ｇ−ＭＤＶ−１  候補であることを示唆していた。
【０１１９】
ＭＤＶ−１  の細胞結合性のために、  ｇｆｐ＋ｇＨ組み換え体をその野生型から精製することはむずかしいことである。しかし２回の培養継代後、多くのものが緑でなくなり、野生型ウイルスが分離されたことを示していた。選択マーカーを使用して培養物をもう一度ＦＡＣＳでソートすると、緑の増殖巣がソートされ、陽性の  ｇｆｐ＋ｇＨ−ＭＤＶ−１クローンを示していた。  ｇｆｐ＋ｇＨ組み換え体は精製されており、ＰＣＲとサザン解析によりさらに解析されるであろう。
【０１２０】
ｇＨ遺伝子欠失ウイルスからグリーンフルオレセンスプロテイン遺伝子を除去するための第２の組換え工程で、ＭＤＶ以外のウイルスからの異種遺伝子を随時挿入してもよい。例えば、ニワトリインターフェロン遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス、または伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスなどがあり、これらはグリーンフルオレセンスプロテイン遺伝子を置換することができる。親の緑色の増殖巣に対して白色のウイルスプラークの存在は、ｇＨ遺伝子が欠失しておりグリーンフルオレセンスプロテイン遺伝子が除去されている新しい組換えＭＤＶ−１ウイルスを含有する。
【０１２１】
多くの文献が引用されており、その全開示内容は参照することにより本明細書の一部とする。
本発明の具体的な実施態様は、その範囲を限定することはなく、本発明の個々の面の単純な例示であり、機能的に同等の方法および成分は本発明の範囲内である。前記説明と添付の図面から、本明細書に記載したもの以外の本発明の種々の修飾は当業者に明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内にあると考えられる。
【０１２２】
【配列表】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＤＶ−１（６５２）／ＱＭ７感染巣の免疫蛍光およびＣＰＥ（細胞変性作用）を示す。ＱＭ７細胞は、３％ＦＢＳ（胎児牛血清）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２  中で  ６５２／ＤＥＦで７日間感染させた。次に、感染した細胞を８０％アセトンで固定し、ＭＤＶ−１  特異的モノクローナル抗体（抗ｇＢおよび抗ｐｐ３８）で染色した。陰性対照（ＤＥＦで同時に培養したＱＭ７）の染色は完全に陰性であった。上のパネル、６５２／ＱＭ７増殖巣の免疫蛍光；下のパネル、６５２／ＱＭ７  感染巣のＣＰＥ。
【図２】図２は、マレック病ウイルスｇＨ遺伝子の挿入体を含有するｐＣＲ３．１ベクターの地図である。ＭＤＶ−１  の２．６ｋｂのｇＨ遺伝子は、ＰＣＲ法によりＭｄ５染色からクローン化した。次にこれを、ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．  、カタログ番号Ｋ３０００−０１）の複数クローニング部位中にクローン化した。
【図３】図３は、ＭＤＶ−１  ｇＨおよびｇＤタンパク質の免疫蛍光検出を示す。ＱＭ７細胞を、それぞれｐＣＲ３ｇＨ−ＨＡ  およびｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ（ＨＡ標識を有するｇＨおよびｇＤ遺伝子）でトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を８０％アセトンで４８時間固定し、ＨＡに対するモノクローナル抗体（Ｂａｂｃｏ  Ｍａｂ  、カタログ番号ＭＭＳ−１０１Ｒ）で染色した。パネルＡ、ＱＭ７細胞中の  ｇＨ−ＨＡ；パネルＢ、ＱＭ７細胞中のｇＤ−ＨＡ  。
【図４】図４は、ＭＤＶ−１  ｇＨおよびｇＤタンパク質の免疫蛍光分析を示す。ＱＭ７細胞を、それぞれｐＣＲ３ｇＨ−ＨＡ  およびｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ（ＨＡ標識を有するｇＨおよびｇＤ遺伝子）で安定にトランスフェクションした。Ｇ４１８耐性細胞を選択し、クローン化した。次にこれらの細胞を、３５Ｓ−Ｍｅｔ（ＴｒａｎｓＬａｂｅｌ，  ＩＣＮ  ）で５時間代謝的に標識し、溶解緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  免疫沈降キット）で溶解した。ＨＡに対するモノクローナル抗体（Ｂａｂｃｏ  Ｍａｂ  、カタログ番号ＭＭＳ−１０１Ｒ）と共にインキュベートした後プロテインＧセファロースを使用した。レーン１〜３、ｐＣＲ３ｇＨ−ＨＡ  でトランスフェクションしたＧ４１８耐性細胞のプール；レーン４〜６、ｐＣＲ３ｇＤ−ＨＡ  でトランスフェクションしたＧ４１８耐性細胞のプール；レーン７および８、ｇＨ−ＨＡ  発現細胞の単一細胞クローン；レーン９および１０、ｇＤ−ＨＡ発現細胞の単一細胞クローン。
【図５】図５は、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ２プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ）の地図である。
【図６】図６は、  ｐＧＬ／５’−３’ｇｆｐプラスミドの地図である。このプラスミドでは、２ｋｂ長のＭＤＶ−１  （Ｍｄ５）  ５’ｇＨフランキング領域を、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ２の改変ＮｓｉＩ部位に挿入し、２ｋｂ長のＭＤＶ−１  （Ｍｄ５）  ３’ｇＨフランキング領域を、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ２の改変ＮａｅＩ部位に挿入した。
【図７】図７は、ｇｆｐ＋組換えＭＤＶ−１  ウイルスの同定を示す。プラスミドｐＧＨ２／５’−３’  を６５２／ＱＭ７  感染細胞中にトランスフェクションした。ウイルス感染の細胞変性作用が明瞭に見えた時、細胞を２回継代した。次に、細胞懸濁液を、グリーンフルオレセンスプロテイン発現についてＦＡＣＳソーターに通過させた。ｇｆｐ＋ソートした細胞を、１２ウェルプレートに広げた。上のパネル、ｇｆｐ＋感染巣は紫外線下で視覚化された；下のパネル、通常の光の下でのウイルスＣＰＥを有する同じ増殖巣。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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