(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸組成が以下の表１に示すとおりのものであることを特徴とする、体外受精用培地組成物：
【表１】
0003660026.tif 000020
【請求項２】
初期胚の培養に使用される、請求項１に記載の体外受精用培地組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体外受精用培地組成物、とくに卵子の培養や受精卵である初期胚の培養の際に使用したり卵子や精子の前処理に使用する体外受精用培地組成物に関する。本発明の培地組成物は、とくに初期胚の発育促進および質的安定化に有効であるため初期胚の培養に適している。
【０００２】
【従来の技術およびその課題】
いわゆる体外受精-胚移植法は、イン・ビトロ（in vitro）において卵子と精子を受精させ発生した胚を女性の体内に移植する方法であるが、これは、１９７８年にイギリスのエドワード（Edwards）らがヒト出産例を世界で初めて報告して以来、近年の発生工学の進歩に伴い、我が国においても急速に発展、普及し、今日では不妊症対策の上で、必要不可欠な手段となっている。
【０００３】
しかしながら、本法によって妊娠に至る例は今なお少なく、完全に確立された方法とは言いがたい。この原因として、男性因子不妊症患者における低受精率も挙げられるが、移植卵の着床率が低いことが主たる原因であると言われている(森  崇秀他，日本産科婦人科学会雑誌，第45巻，397頁(1993年);Cohen,J.et al.，VIIIth World Congress on in vitro Fertilization and Alternate Assisted Reproduction Kyoto, September, 12-15(1993年),World Collaborative Report(1991年))。
【０００４】
かかる低着床率の原因としては、技術的要因の他に、培養中における胚の質の低下に起因するところが大きいと考えられている(井上正人，臨床婦人科産科，第48巻，148頁(1994年))。すなわち、哺乳類の卵子は爬虫類や鳥類と異なって、卵内に卵白に相当する部分がなく、そのため卵自体の栄養保持量はもともと少ない。そこで、体外受精の初期胚においては、透明帯を介して外界である培地から栄養因子を摂取する必要がある。ところが、従来から体外受精に用いられてきたハムＦ−１０（Ham's F-10)培地、ＭＥＭ(Minimum Essential Medium)培地、ダルベッコ−ＭＥＭ培地などの合成培地は、本来、体外受精を目的として組成されたものではなく、組織培養で使用されている培地をそのままか、あるいは若干改変を加えて流用しているに過ぎず、初期胚に対する培地としては、栄養組成上、最適なものとは云い難い。
【０００５】
最近、栄養学的観点からヒトの体外受精用の培地として、ヒト卵管液の電解質組成に近似した組成を有するＨＴＦ培地（Human Tubal Fluid Medium)が開発され(Quinn,P.J.et al.，Fertility and Sterility，第44巻，493頁(1982年))、市販されており、従来主流であったハムＦ−１０培地から移行しつつある。しかしながら、このＨＴＦ培地も主成分としての電解質とエネルギー源としてのブドウ糖しか含んでいないため、アミノ酸などの成分を含むハムＦ−１０培地と比較して組成上はむしろ後退したといえる。事実、かかる培地を使用しても、培養中の胚の質的低下を有意に改善して着床率を向上させることはできない。
【０００６】
この欠点を補うため、例えば加熱処理により非働化された女性血清を培地中に添加して胚への栄養補給を図る方法が採用されている。血清は、動物由来細胞の培養に際し必須因子となる蛋白質、炭水化物、脂質、ビタミンおよびミネラルの５大栄養素の他に、成長因子なども含有しており、これが、胚培養に対し血清を添加する根拠である。
【０００７】
しかしながら、体外受精−胚移植実施時に血清は必ずしも必要ではないという報告(Menezo,Y.et al.，Fertility and Sterility，第42巻、750頁(1984年))や、血清の添加によって却って胚の発育が抑制されたという報告(Mehita,et al.，Biology of Reproduction，第43巻，600頁(1990年))がなされており、また血清自体は、採取に手間がかかると同時にウイルスなどが混入する危険性も併せ持つことから、体外受精卵用培地の添加物として好ましくない。
【０００８】
現在、胚の発育を抑制する因子として最も注目されているものに活性酸素がある。これは、体外(イン・ビトロ)では生体内に比し酸素と直接触れる機会が多いため、酸化的なストレスにより胚の発育が抑制されるとの考えに基づくものである(Whitten,W.，Advanced in the Biosciences，第6巻，129頁(1971年);Quinn,P.J.et al.，Journal of Experimental Zoology，第206巻，73頁(1978年))。このため、培地中にスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)やエデト酸(EDTA)やタウリンなどを添加して、かかる酸化的ストレスの回避によって胚の発育を促進させる試みが報告されている(Abramczuk,J.et al.，Developmental Biology，第61巻,378頁(1977年);Nonozaki,T.et al.，Journal of Assisted Reproduction and Genetics，第9巻，274頁(1992年))。
【０００９】
他方、有効成分は未知ではあるが、卵管上皮細胞を用いた共培養が胚の発育に有効であるという報告(Xu,K.P.et al.，Journal of Reproduction and Fertility，第94巻，33頁(1992年))や、胚の発育を直接的に促進する要因としてのインスリン様成長因子などの成長因子関与の報告もなされている(松井基純他，哺乳動物卵子学会誌，第11巻，132頁(1994年))。
【００１０】
しかしながら、かかる共培養の有効性はせいぜい培地の解毒作用程度のものであって、胚栄養的な作用を示す証拠は何一つないという分析もある(Bavister,B.D.，Human Reproduction，第7巻，1339頁(1992年))。いずれにせよ、体外受精用の培地並びに当該培地に添加物を添加するための従来法は、前記したスーパーオキシドジスムターゼやＥＤＴＡなどの添加の試みも含め、いずれの方法も単にイン・ビトロでの胚の発育停止を部分的に回避させるに過ぎず、加えて、実際の胚培養の際には、最適の培地を胚の発育段階に応じてその都度選択し、適宜交換して培養する必要があり、非常に不便であった。
【００１１】
したがって、当該分野では精子や卵子の処理／前処置並びに体外受精-胚移植時の初期胚の発育に適した栄養学的組成を有し、かつ、初期胚のあらゆる発育段階に対応でき、なおかつ、ウイルスなどの有害物質の混入のおそれがない安全な合成培地の開発が要望されていたのである。
【００１２】
【発明の概説】
本発明者らは、かかる要望に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、蛋白質合成を司るアミノ酸組成に着目し、卵胞液に含まれるアミノ酸組成に相当するアミノ酸組成物を体外受精用培地組成物として使用した場合、体外受精-胚移植時の初期胚の発育が著しく促進されるという事実を見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至ったのである。
【００１３】
すなわち、本発明は、卵胞液に含まれる２１種類のアミノ酸を必須成分とする体外受精用培地組成物を提供する。２１種類の当該アミノ酸は、２１名の体外受精適用患者に排卵誘発剤を投与したのちに、当該患者から卵胞液を採取し、これを、常法によって分析することにより決定したものである（以下の表２参照）。具体的には、当該アミノ酸にはＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−タウリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンおよびＬ−シスチンが包含される。
【００１４】
【表２】
0003660026.tif 000002
0003660026.tif 000003
【００１５】
表２において、Ｆ群は卵胞液について患者２１人の実測値の平均値であり、F-Max群およびF-Min群は、それぞれ患者２１人の実測値のうちの最大値および最小値である。さらに、Ｓ群は、血清について患者２１の実測値の平均値である。
なお、これら２１種類のアミノ酸すべてを含有しそしてこれらのアミノ酸のみを含有する培地は、当該分野においてこれまで、全く存在しない。たとえば、以下の表３および表４に示すごとく本発明の従来技術に相当する１７種の代表的な合成培地は、ＮＣＴＣ１３５培地を除きいずれも、卵胞液に含まれるアミノ酸であるタウリンを含んでいない。一方、ＮＣＴＣ１３５培地は卵胞液には含まれていないヒドロキシプロリンを含んでいる。したがって、これら先行技術の培地組成は、本発明の新規なアミノ酸組成を開示も示唆もしていない。
【００１６】
【表３】
0003660026.tif 000004
【表４】
0003660026.tif 000005
上記表３および表４において、記号ａ）、ｂ）およびｃ）は前記表２と同じであり、記号＊は遊離塩基としてのアミノ酸を意味する。
【００１７】
【発明の詳説】
本発明の培地組成物は、好ましくは２１種類のアミノ酸を以下の表５に示すアミノ酸濃度(mg/l)で含有する：
【表５】
Ｌ−フェニルアラニン                ０.６９〜１３.８
Ｌ−トリプトファン                  ０.６７〜１３.５
Ｌ−リジン                          ２.４４〜４８.８
Ｌ−スレオニン                      １.４８〜２９.５
Ｌ−バリン                          １.６６〜３３.１
Ｌ−メチオニン                      ０.２１〜  ４.３
Ｌ−イソロイシン                    ０.４５〜  ９.０
Ｌ−ロイシン                        ０.７９〜１５.８
Ｌ−プロリン                        １.１７〜２３.４
グリシン                            １.１６〜２３.２
Ｌ−アラニン                        ２.６６〜５３.２
Ｌ−チロシン                        ０.７７〜１５.４
Ｌ−ヒスチジン                      １.６３〜３２.５
Ｌ−アルギニン                      １.１２〜１０００
Ｌ−タウリン                        ０.３９〜  ７.８
Ｌ−アスパラギン酸                  ０.０９〜  １.７１
Ｌ−セリン                          ０.７８〜１５.５
Ｌ−アスパラギン                    ０.９７〜１９.５
Ｌ−グルタミン酸                    １.３６〜２７.２
Ｌ−グルタミン                      ２.６１〜１０００
Ｌ−シスチン                        ０.１４〜  ２.７
【００１８】
上記表５に関し、各アミノ酸における上限値（L-フェニルアラニンでは13.8)は、前記表２の平均値（Ｆ群）×約２であり、同様に、下限値（L-フェニルアラニンでは0.69）は平均値（Ｆ群）×約０.１である。ただし、Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミンについては上限値が１０００である。上記表５の濃度範囲のアミノ酸を含む各培地は、後記実施例および試験例からいずれも体外受精用培地組成物として有用であることが理解される。
【００１９】
前記したごとく、本発明は２１種のアミノ酸組成を選択したこと自体、体外受精用培地組成物として特徴を有するものであり、加えて、当該アミノ酸濃度範囲についても従来からの細胞培養用培地のアミノ酸組成に比し、相対的に低濃度であるという特徴を有し、とくにメチオニン、ロイシン、アスパラギン酸およびシスチンの含量が少ない点が、注目される。
【００２０】
本発明の培地組成物に必須のアミノ酸は、遊離形のみならず、薬理学的に許容される塩の形（例えばナトリウム塩やカリウム塩などの金属塩、塩酸塩や硫酸塩などの鉱酸塩、酢酸塩や乳酸塩などの有機酸塩もしくは含水塩）で使用することが出来る。また、加水分解されて遊離アミノ酸に変換され得るもの、たとえばエステル体、Ｎ−低級アルカノイル体のようなＮ−アシル体、ジ−もしくはトリペプチドのようなオリゴペプチドなどとして使用されてもよい。なお、シスチンはその一部または全部をシステインで代替することができる。
【００２１】
本発明の体外受精用培地は、２１種の前記アミノ酸類のほか、必要に応じて糖質、電解質、ビタミン類、微量金属元素、ホルモン、細胞成長因子、脂質またはその構成成分、担体蛋白質、細胞外基質成分(接着因子)、還元物質などを配合することができる。
【００２２】
前記糖質としては、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、トレハロースなどを、電解質としては、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、乳酸ナトリウムなどを、ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ類、ビタミンＥ、ニコチン酸、ビオチン、葉酸などを、微量金属元素としては、亜鉛、鉄、マンガン、銅、ヨウ素、セレン、コバルトなどをそれぞれ例示することができる。
【００２３】
ホルモンとしては、インスリン、ハイドロコーチゾン、デキサメサゾン、トリヨードサイロニンなどを、細胞成長因子としては、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、成長ホルモンなどを、脂質またはその構成成分としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの必須不飽和脂肪酸、コレステロール、エタノールアミン、コリンなどを、担体蛋白質としては、血清アルブミン、トランスフェリンなどを、細胞外基質成分(接着因子)としては、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチンなどを、還元物質としては、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、還元型グルタチオンなどをそれぞれ例示できる。
【００２４】
また本発明の培地組成物には、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンなどの抗生物質、アンホテリシンＢ、ナイスタチンなどの抗かび剤などを適宜添加してもよい。
【００２５】
さらに、本発明の培地は、公知の平衡塩類溶液や培地類と混合して使用することもできる。平衡塩類溶液としてはタイロード液、クレブス・リンゲル重炭酸塩液、アール液、ハンクス液、ダルベッコ−リン酸緩衝液またはこれらの修正液などが挙げられ、培地類としては１９９培地、ＢＭＥ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＭＥＭ培地、マッコイ−５Ａ培地、ウェイマウス培地、トロウィルＴ−８培地、ハム培地、ライボビッツＬ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、ウィリアムス−Ｅ培地、ケイン・アンド・フット（Kane and Foote）培地、ＭＣＤＢ１０４培地、ブリンスター（Brinster）培地、ｍ−タイロード培地、ＢＷＷ培地、ウイッテン（Whitten）培地、ＴＹＨ培地、ホップス・アンド・ピット（Hoppes & Pitts）培地、ｍ−ＫＲＢ培地、ＢＯ培地、Ｔ６培地、ＨＴＦ培地、ＧＰＭ培地またはこれらの修正培地などが挙げられる。
【００２６】
本発明の培地組成物は、常法によって構成成分を配合することで製造することができ、その製品形態は、通常液体形であるが、適宜、固体培地または半固体培地として使用してもよい。好ましくは、本発明の培地は、常法により無菌の溶液、用時希釈型の無菌濃縮液または用時溶解型の無菌の凍結乾燥剤の形態で製造、供給される。この際、必要に応じて公知の方法により、ｐＨ調整剤、安定化剤、賦形剤などの無害の製剤学的添加剤を使用してもよい。ｐＨ調整剤としては、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウムなどが、安定化剤としてはＨＥＰＥＳ(Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸)、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウムなどが例示される。また、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬を添加してもよい。
【００２７】
なお、本発明の培地組成物は、糖質（とくに還元糖とアミノ酸類）またはカルシウムもしくはマグネシウム塩化合物と炭酸水素塩化合物の相互作用による配合変化を避けるために、配合成分の一部を分離して別の容器に充填したキット形態として供給することもできる。例えば、(１)アミノ酸類、(２)炭酸水素ナトリウム以外の電解質および糖質、(３)炭酸水素ナトリウムの３製剤からなる組合わせ製剤、または(１)アミノ酸類、炭酸水素ナトリウム以外の電解質および糖質、(２)炭酸水素ナトリウムの２製剤からなる組合わせ製剤とする。
【００２８】
本発明の培地組成物は、あらゆる哺乳類の卵子または初期胚の培養または精子の調製または培養に使用できるが、とくにヒトの初期胚の培養に適しており、胚の発育促進および質的安定化を図ることが可能である。
【００２９】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらに限定されるものではない。
実施例１
以下の表６に示す組成成分からなる培地を製造した。なお、用いたアミノ酸濃度は、前記した表２のＦ群（卵胞液の実測値についての平均値）に相当する。
まず、当該組成の成分のうち、アミノ酸類を注射用水に溶解して定量した後、孔径０.２２μmのメンブランフィルター(ミリポア製、マイレックスGV)を用いて濾過滅菌した。この溶液を１００ml容のガラス製バイアル瓶に無菌的に充填し、常法により凍結乾燥(共和製、RLC-301BS)してアミノ酸製剤(１)を得た。別に、下記表６の成分のうち、炭酸水素ナトリウム以外の電解質・糖質類を注射用水を用いて調製した後、１００ml容のガラス製バイアル瓶に無菌的に充填し、密封して常法により加熱滅菌し、電解質・糖質製剤(２)を得た。また、炭酸水素ナトリウムを注射用水を用いて調製し、１００ml容のガラス製バイアル瓶に無菌的に充填し、空間部の空気を窒素で置換した後、密封して常法により加熱滅菌して炭酸水素ナトリウム製剤(３)を得た。アミノ酸製剤(１)、電解質・糖質製剤(２)および炭酸水素ナトリウム製剤(３)を無菌的に混合して下記表６の濃度に調製し、さらに、終濃度０.５％のウシ血清アルブミン(シグマ製)を添加し、目的の体外受精用培地を得た。
【００３０】
【表６】
0003660026.tif 000006
0003660026.tif 000007
【００３１】
実施例２
組成成分のうち、アミノ酸の濃度を下記表７のとおりとした他は、実施例１と同様にして製造した。なお用いたアミノ酸濃度は、前記表２のＳ群（血清の実測値についての平均値）に相当する。
【表７】
0003660026.tif 000008
【００３２】
実施例３
組成成分のうち、アミノ酸の濃度を下記表８のとおりとした他は、実施例１と同様にして製造した。なお用いたアミノ酸濃度は、前記表２のＦ群（卵胞液の実測値についての平均値）×０.１に相当する（以下、この濃度を含む培地群を「Ｆ０.１群」とよぶ）。
【表８】
0003660026.tif 000009
【００３３】
実施例４
組成成分のうち、アミノ酸の濃度を下記表９のとおりとした他は、実施例１と同様にして製造した。なお用いたアミノ酸濃度は、前記表２のＦ群（卵胞液の実測値についての平均値）×２に相当する（以下、この濃度のアミノ酸を含む培地群を「Ｆ２群」とよぶ）。
【表９】
0003660026.tif 000010
【００３４】
実施例５
グルタミンの濃度を１０００mg／ｌとした他は、実施例１と同様にして製造した。
実施例６
アルギニンの濃度を１０００mg／ｌとした他は、実施例１と同様にして製造した。
実施例７
グルタミンおよびアルギニンの濃度をそれぞれ１０００mg／ｌとした他は、実施例１と同様にして製造した。
【００３５】
実施例８
組成成分のうち、電解質と糖質の組成および濃度を下記表１０のとおりとした他は、実施例１と同様にして製造した。
【表１０】
0003660026.tif 000011
【００３６】
実施例９
組成成分のうち、電解質と糖質の組成および濃度を下記表１１のとおりとした他は、実施例１と同様にして製造した。
【表１１】
0003660026.tif 000012
【００３７】
実施例１０
組成成分のうち、電解質と糖質の組成および濃度を下記表１２のとおりとした他は、実施例１と同様にして製造した。
【表１２】
0003660026.tif 000013
【００３８】
試験例１
（１）マウス前核期胚の採取
ＩＣＲ系雌性マウス(日本ＳＬＣ、日本クレア)にＰＭＳＧ(妊馬血清性性腺刺激ホルモン、帝国臓器製薬、セロトピン(商標))を５国際単位腹腔内に投与後、更に４８時間後にｈＣＧ(ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、帝国臓器製薬、ゴナトロピン(商標)1000)を５国際単位腹腔内に投与して過排卵を誘発させた後、同系の雄性マウスと一夜同居させて交配せしめ、翌朝に膣栓の認められた雌性マウスから前核期胚を０.５％ウシ血清アルブミンを含むＨＴＦ培地(実施例１のアミノ酸を除いた培地)の小滴中に採取した。
次いで、０.１％のヒアルロニダーゼ処理により顆粒膜細胞を除去した後、０.５％ウシ血清アルブミンを含有する新鮮なＨＴＦ培地の小滴中を移動させることにより前核期胚を洗浄して変性卵を除去した。この胚を検体とし、直ちに以下の実験に供した。
【００３９】
（２）前記実施例１および２の培地のマウスの胚発育に及ぼす効果
実施例１で得られた培地(Ｆ群)、実施例２で得られた培地(Ｓ群)および対照としてのＨＴＦ培地(Ｃ群)につき、６０mm径の培養皿(コーニング製)に各培地の１００μlのスポットをミネラルオイル下に作製し、炭酸ガス培養器(タバイ製、ＢＮＡ−１２０Ｄ)を用いて培養気相下に一夜放置して予め平衡化した後、実験例で採取した６〜２９個の胚を移し、３７℃、５％ＣＯ2気相下で培養した。培養１、３、４、５および６日目の胚の発育状態を倒立顕微鏡(ニコン製、DIAPHOT-TMD)を用いて１００倍の倍率により観察し、２細胞から脱出胚に到るまでの各発育段階に達した胚数を計測した。得られた結果を表１３に示す。
【表１３】
0003660026.tif 000014
【００４０】
表１３に示すごとく、Ｃ群(HTF培地)では、２細胞期以後の胚の発育は著明に抑制されたが、本発明のアミノ酸組成を有する培地で培養した群では、いずれも桑実胚以降の胚の発育は著明に増加し、胚発育促進効果が認められた。
【００４１】
試験例２
実施例３および４の培地の胚発育に及ぼす効果
実施例３で得られた培地(Ｆ０.１群)および実施例４で得られた培地(Ｆ２群)につき、ＨＴＦ培地(Ｃ群)を対照とし、試験例１と同様に操作し、胚の発育状態を観察した。得られた結果を表１４に示す。
【表１４】
0003660026.tif 000015
【００４２】
表１４に示すごとく、試験例１の結果と同様に本発明のアミノ酸組成を有する培地で培養した群は、いずれも桑実胚以降の胚の発育は著明に増加し、胚発育促進効果が認められた。
【００４３】
試験例３
実施例１の培地と従来からの培地についての比較試験
ＨＴＦ培地(Ｃ群)、ＨＴＦ培地にハムＦ−10培地と同一のアミノ酸組成を添加した群(Ｈam群)、ＨＴＦ培地にＭＥＭ培地と同一のアミノ酸組成を添加した群(ＭＥＭ群)およびＨＴＦ培地にダルベッコ−ＭＥＭ培地と同一のアミノ酸組成を添加した群(ＤＭＥＭ群)を対照として、試験例１と同様に操作し、実施例１で得られた培地(Ｆ群)と胚の発育状態を比較した。得られた結果を表１５に示す。
【００４４】
【表１５】
0003660026.tif 000016
【００４５】
上記表１５に示すごとく、本発明のアミノ酸組成を有する培地で培養した群は、いずれの対象群に比較しても桑実胚以降の胚の発育が良好ないしは良好な傾向が認められた。
【００４６】
試験例４
胚発育に対する高含量グルタミンおよびアルギニンの効果
胚発育に対するグルタミンおよびアルギニンの効果を検討する目的で、実施例５で得られた高グルタミン含有培地(F-Gln群)、実施例６で得られた高アルギニン含有培地(F-Arg群)、実施例７で得られた高グルタミン・高アルギニン含有培地(F-Gln，Arg群)および実施例１で得られた培地(Ｆ群)について、ＨＴＦ培地(Ｃ群)を対照とし、試験例１と同様に操作して、胚の発育状態を観察した。得られた結果を表１６に示す。
【００４７】
【表１６】
0003660026.tif 000017
表１６から明らかなように、グルタミンおよび／またはアルギニンを高濃度で添加した培地は、対照群に較べ、胚の発育を有意に促進または促進する傾向が認められた。
【００４８】
試験例５
胚発育に対する必須アミノ酸および非必須アミノ酸の効果
実施例１で得られた培地(Ｆ群)から非必須アミノ酸成分を除いた培地(FE群)およびＦ群から必須アミノ酸成分を除いた培地(FNE群)をそれぞれ実施例１に準じて調製し、前記Ｃ群を対照とし、各群につき試験例１と同様に操作して、胚の発育状態を観察した。得られた結果を表１７に示す。
【００４９】
【表１７】
0003660026.tif 000018
【００５０】
上記表１７から明らかなように、Ｆ群と比較してＦＥ群は、桑実胚以後の発育が有意に抑制された。一方、ＦＮＥ群はＦ群と比較して胚盤胞期までの発育には差はなかったが、発育後期の脱出胚への移行は有意に抑制された。このことは、発育初期は非必須アミノ酸が重要な役割を果たし、発育後期では全アミノ酸が胚の発育に関与していることを示唆している。
【００５１】
試験例６
胚発育に対する電解質組成の影響
胚の発育に対する電解質組成の影響を検討するために、実施例１で得られた培地(Ｆ群)ならびに実施例８〜１０で得られた培地につき、試験例１と同様に操作して、胚の発育状態を観察した。得られた結果を表１８に示す。
【００５２】
【表１８】
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表１８から明らかなように、Ｆ群と比較して実施例８、９および１０では差異は認められなかった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の培地は、２１種のアミノ酸を必須成分として含有する組成物であって、哺乳類の卵子または初期胚の培養あるいは精子の調製または培養に使用でき、とくにヒトの初期胚の培養に適し、体外受精時の胚の発育促進および質的安定化の改善に優れた技術的効果を奏するものである。