(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子が導入されたヒト以外の形質転換動物の作製方法であって、当該目的遺伝子及びその毒性を低下させるためにミトコンドリア局在シグナルペプチドに連結した蛍光蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを、パキテン期までの動物の精巣内に存在する生殖細胞中に電気穿孔法又はリポフェクション法により導入し、当該蛍光蛋白質の蛍光を指標として当該目的遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は精子の選抜を行い、当該目的遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は精子を未受精の卵母細胞に受精させ、受精させた細胞より動物個体を得る過程より成る、トランスジェニック動物の作製方法。
【請求項２】
前記動物が、哺乳類、鳥類または魚類に属するヒト以外の動物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光蛋白質が緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、青色蛍光蛋白質（Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光蛋白質（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、シアン蛍光蛋白質（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）または赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な形質転換動物の作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、哺乳動物個体に外来遺伝子を導入する方法として最も広く用いられているのは受精卵前核中へのＤＮＡ顕微注入である。この方法は、家畜を含む多くの動物種に用いられており、比較的確実な方法である。
【０００３】
しかし、この方法の遺伝子導入率は低く、一般的に、顕微操作受精卵のうち約１％の確率で遺伝子導入動物が得られる。この様に導入率が低いことから、ＤＮＡ顕微注入を大型動物に適用する場合には、非常に大きなコストが必要となる。また、染色体上での外来遺伝子の組み換え場所を制御する事はできず、ランダムに近い。
【０００４】
また、精子をＤＮＡで処理して受精させることによる遺伝子導入方法は、安定性・信頼性が低かったが、最近になってハワイ大学の柳町教授のグループから発表された結果は注目されている。即ち、マウスにおいて凍結精子とＤＮＡとを混ぜた後に卵子細胞内注入法によって顕微受精を行うことにより、高い率で遺伝子導入マウスが得られた。その方法を現在他のマウス系統や他動物種でも適用可能かどうか検討されているが、まだ適用範囲は不明である。また染色体上の挿入場所は前核注入法と同じく制御できない。
【０００５】
染色体上の標的遺伝子を外来ベクターを置き換えることによって、遺伝子破壊などを行える標的遺伝子組み換え（遺伝子ターゲッティング）は、内在遺伝子と相同部分を持つベクターを導入して、相同遺伝子組み換えを起こした物を選別することによって可能である。現在は、胚幹細胞（ＥＳ細胞）株において遺伝子導入と選別を行った後、生殖系列に寄与したキメラマウスを作り交配することによって標的遺伝子改変マウス個体が作られている。
【０００６】
この方法の効率は低く、時間とコストの両面で大きな投資が必要である。また遺伝子ターゲッティングに用いることができるＥＳ細胞株は、現在のところ数種類のマウス系統でのみ存在する。それが存在しない家畜などで現在試みられているのが、体細胞株において相同遺伝子組み換えを起こさせた後に、除核卵子への核移植による動物クローニングを行って標的遺伝子組み換え動物を作る方法であるが、その成功率などについては不明である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は低コストで効率の高い形質転換動物の作出方法を開発することである。また、家畜等の形質転換に用いる事を考えると、大型の動物に適用できる事も求められる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の方法と比較して、精巣内に存在する精子形成細胞への遺伝子導入は、生殖細胞への直接的遺伝子導入であるので、高い効率で形質転換動物の作出が実現できる可能性がある。そこで本発明者らは、精巣内精細管へＤＮＡを注入した後、電気パルス附加を行うなどの比較的簡便で短時間で実行可能な手段により、精子形成細胞への遺伝子導入を行うという方法に注目した。そして、遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞及び精子を選別し、卵母細胞と体外受精を行い、遺伝子が導入されたマウスを作出する方法を開発した。
【０００９】
尚、山崎らは、組織化学染色によって検出できるＬａｃＺマーカー遺伝子をマウス精巣に注入し、電気パルス附加を行った２カ月後においても少数ながらマーカー遺伝子を発現する精子形成細胞の集団が精巣内に存在していた、という結果を報告している（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，５９，１４３９−１４４４（１９９８））。しかし、外来遺伝子の染色体への組み込みを確認することや、遺伝子導入マウス個体の作出は行っていない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、外来遺伝子を生殖細胞の減数分裂の前段階又は最中に挿入する事を試みた。その手段としては、マウス精巣中の精原細胞又は精母細胞への電気穿孔法を用いた。卵細胞内精子注入法によるインビトロ受精に用いる、遺伝子導入された精母細胞、精子細胞又は精子を検出して選択するために、本発明者らはＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）マーカー遺伝子及びＹｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＹＦＰ）マーカー遺伝子等の蛍光蛋白質の遺伝子を用いた。
【００１１】
本発明者らは、１４日齢のマウスの精巣の精細管にＤＮＡを注入し、電気穿孔法のパラメーターの最適化を行った。そして、生殖細胞において広範囲に発現しているＧＦＰ／ＹＦＰの蛍光は、最大１週間まで安定であった。一週間以上経過すると、蛍光を有する細胞は減少した。
【００１２】
遺伝子導入の１８−２０日後に、精細管において蛍光を発現する精子のクラスターを得た。その様な精子を、卵細胞内精子注入法に使用した結果、体全体に蛍光を有する胎児及び子を得た。サザンブロッティング解析の結果、その様な蛍光を有する個体において、染色体に遺伝子が導入されている事が示された。本方法において、得られた個体の８分の７以上が形質転換しており、体全体にマーカー遺伝子を発現している事が見られた。それは、形質転換が非常に高い頻度で起こっており、遺伝子導入は精子形成細胞において既に起こっていることを示している。
【００１３】
本発明の方法では、パキテン期の第一次精母細胞までの、精子形成細胞しか含まれていないマウスを用いている。すなわち、減数分裂の初期において、生殖細胞へ外来ベクターを導入するという新たな遺伝子導入方法である。それは、相同染色体の間で相同遺伝子組み換えが頻繁に起こる時期であり、高い確率で標的遺伝子組み換えが起こる可能性が大きい。上述した山崎らの論文は、４週齢から６週齢のマウスを用いているが、それと比較して幼若マウスを用いる本発明の方法においては、遺伝子導入の効率が増加している。
【００１４】
この様な形質転換方法は、蛍光マーカー遺伝子と結合させることにより、他の遺伝子を導入するためにも用いる事ができる。この電気穿孔法は非常に簡単であり、大型家畜を含む種々の動物に用いることができる。本発明は、生殖細胞に外来遺伝子を直接導入する方法を開くものである。この哺乳動物の形質転換の代替え方法は、種々の新たな可能性を開く、有用な方法を切り開くものである。
【００１５】
本発明の方法は、実験動物及び家畜における、形質転換と遺伝子ターゲッティングの、効率の良い方法となり得る。後者の可能性は、病気に関係する原因遺伝子を破壊する事により、ヒトの病態モデルを作成するのに重要である。さらに、主要組織適合性遺伝子を入れ換えることにより、器官及び組織移植のためのドナー動物を開発するためにも重要である。
【００１６】
本発明の特徴として、以下の点が挙げられる。
（１）生きたままで遺伝子発現が確認できるマーカー遺伝子を用いることにより、遺伝子が組み込まれた精子を、蛍光観察で選別する事が可能である。
（２）精巣へ遺伝子導入されたオスマウスを交配させるのではなく、遺伝子が組み込まれている精子を用いた体外受精を行うことにより、遺伝子導入個体を非常に高率で作成することに、はじめて成功した。マーカー蛋白質により、遺伝子が組み込まれた生殖細胞を生きたまま選抜する事が可能であり、このために高い確率で形質転換動物を作出できる。
（３）精子形成過程がまだ初期の段階にある子供マウスの精巣を選んで遺伝子導入を行った。
（４）マーカー蛋白質（ＧＦＰやＹＦＰ）は、精子形成過程で細胞毒性を示すらしく、蛍光を発現する精子形成細胞は遺伝子導入後１週から３週にかけて、急激に減少して消失することも多い。この細胞毒性を少なくするために、ミトコンドリア局在シグナルペプチドを連結したＹＦＰ遺伝子を選んで導入した。
【００１７】
本発明は、以下の過程より構成される、トランスジェニック動物の作成方法を提供する。
以下の記載した本発明の概要を、図１に示す。
（１）目的遺伝子及び蛍光蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを、動物の精巣内の生殖細胞に導入する。
（２）蛍光蛋白質の蛍光を指標として、目的遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は精子の選抜を行う。
（３）目的遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は精子を、未受精の卵母細胞に受精させる。
（４）受精させた卵を生育させる。
【００１８】
本発明の方法を用いて、種々の哺乳動物の形質転換体を作成する事が可能である。本発明の方法は哺乳類のみならず、鳥類または魚類等にも適用する事ができる。本方法は雄動物の精細管に外来遺伝子を導入するという方法を採用しているため、精細管及びそれに類するものを有する限り、任意の動物に適用する事が可能である。更に、本発明の方法により作製されたトランスジェニック動物も、本発明の範囲内である。
【００１９】
また、外来遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞又は精子を選抜するためのマーカーとして、種々の蛍光蛋白質を使用することが可能である。好適な蛍光蛋白質の例として、緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、青色蛍光蛋白質（Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光蛋白質（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、シアン蛍光蛋白質（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明の方法を用いて、種々の外来遺伝子を導入する事ができる。理論的には、本発明の方法を用いて任意の遺伝子を導入する事が可能である。本発明の方法を用いて外来遺伝子を導入することにより、家畜の品種改良を行うことができる。例えば、成長ホルモンの遺伝子を導入して、脂肪分の少ない高品質の肉質を有する家畜を作出する事が可能である。病原性ウイルスに対する耐病性を有する家畜動物の作出が、現在求められているが、病気にかかりにくい様に家畜の品質改良を行うことが可能である。また、乳汁の分泌に関与する遺伝子を導入する事により、大量の乳汁を生産するウシを作出する事が可能である
【００２１】
本発明の方法を用いて、動物に種々の物質の生産を行わせることが可能である。例えば、インシュリン、成長ホルモンやα−アンチトリプシン等、有用物質や医薬品を生産する様に、形質転換した動物を作出する事が可能である。これらの生理活性物質が大量に生産される事により、当該形質転換動物に障害が起こる場合には、乳腺細胞において当該遺伝子発現させ、生産された後にすぐに体外に分泌させる事も可能である。
【００２２】
現在、ヒトの組織適合性抗原遺伝子を発現させた動物を作成して、臓器移植のドナーとして使用する事が検討されている。本発明の方法を用いて、ドナー動物自身の組織適合性抗原遺伝子を欠損させてヒトの遺伝子と置き換えれば、臓器移植のドナーとして、非常に適した動物を作出することができる。
【００２３】
【実施例】
（プラスミドＤＮＡの作成）
ｐＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ発現ベクターは、サイトメガウイルスエンハンサー、ニワトリベーターアクチンプロモーター、ウサギベーターグロビンポリアデニレーションシグナルを有するｐＣＡＧＧＳベクターのＥｃｏＲＩ部位へｐＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＮｈｅＩ−ＮｏｔＩ断片由来のＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ遺伝子をサブコローニングすることにより構築した。ｐＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ発現ベクターの調製は、大腸菌ＪＭ１０９に発現ベクターをトランスフェクションし生育させた後、ＱＩＡＧＥＮ  ＰｌａｓｍｉｄＭｅｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。マウス生殖細胞へ遺伝子導入するＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ遺伝子は、ｐＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏベクターより制限酵素ＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出した。
【００２４】
（ＤＮＡの注入及びエレクトロポレーション）
生後１４日齢  オスＩＣＲマウスをネブタール溶液で麻酔して、精巣を顕微鏡下で露出した。マイクロピペットを精巣網に挿入し、そこから１００−１２０μｇ／ｍｌのＤＮＡ／ＨＢＳ（ＨＢＳ：Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ）溶液としたＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ  ＤＮＡを、精細管に６−１０μｌ注入した。
【００２５】
ＤＮＡを注入した後、電子パルス発生機（エレクトロスクエアポレーターＴ８２０；ＢＴＸ，サンディエゴ，カリフォルニア）を用いて電子パルスを発生させた。電子パルス発生機をグラフパルス解析機（オプティマイザー５００；ＢＴＸ）に接続し、パルスを検出した。そしてモニター出力付抵抗測定装置（ＭＢＸ−４，（株）テーアールテック）を用いて、パルスの方向を、プラス又はマイナスの方向にコントロールした。ピンセット型の電極で精巣をはさみ、スクエア電子パルスを３０−５０Ｖで、プラス方向に４回、マイナス方向に４回連続してアプライした。それぞれのパルスの長さは５０ｍ秒であった。電子パルス処理の後に、筋肉と皮膚を縫い、解析又は卵子細胞内注入法に使用する生殖細胞を採取するまでマウスを飼った。
【００２６】
（精子の採取）
ＣＡＧ−ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏ  ＤＮＡを注入したオスマウス（ＩＣＲ）より、電子パルス処理１８−２０日後に精巣を単離し、結合組織性の薄膜を除去した。ＹＦＰを励起する光源と適当なフィルターを備えた顕微鏡下で、ピンセットを用いてＹＦＰを発現している精子を含む精細管を採取し、スライドガラスに置きカバーガラスで覆って、４８８ｎｍの励起下、ＣＣＤ顕微鏡で、ＹＦＰを発現している精子を調べた。ＹＦＰを発現している精子を含む精細管を、５．６ｍＭグルコース、５．４ｍＭ乳酸ナトリウム及び１％ＰＶＰ (ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ: 分子量３６０、０００  和光純薬）を添加した冷却ダルベッコＰＢＳの中に置いた。ハサミを用いて小片に切断し、０．５ｍｇ／ｍｌのトリプシン／ＰＢＳ溶液で分散させた。精子と他の精子形成細胞とを、穏やかにピペッティングを行う事により、培地中に分散させた。細胞懸濁液を、Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ（ＣＺＢ：Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．８６，６７９，１９８９参照）で２回洗浄した。
【００２７】
（卵母細胞の調製）
７週齢から１０週齢のＢ６Ｄ２Ｆ１メスマウスを、セロトロピン（（株）帝国臓器製薬）とゴナトロピン（（株）帝国臓器製薬）を連続的に投与し、排卵を誘発した。ゴナトロピンを注入して１６−１８時間後、卵管から卵母細胞を採取した。Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢに溶解した０．１％ヒアルロニダーゼ（４４０Ｕ／ｍｇ：シグマケミカルズ）を用いて、５％の二酸化炭素の存在下で、３７℃で２分間処理を行うことにより、卵母細胞を遊離させた。
【００２８】
（卵母細胞への精原細胞の注入）
単離した精子を、微滴（２μｌ）の１２％ＰＶＰ  Ｈｅｐｅｓ−ＣＺＢ中に移した。標準的なフィルターセットを備えた（ＢＰ４７０−４９０及びＢＡ５１５）蛍光顕微鏡（ＬＥＩＣＡ  ＭＩ  ＡＰＯ  Ｌｅｉｃａ）で、ＹＦＰの発現を検出した。ＹＦＰを発現している精子とＹＦＰ陰性精子を分離し、その後一つのＹＦＰ陽性精子をインジェクションピペットで吸引し、単離した。インジェクションピペットには、ピエゾエレクトリックピペットのドライビングユニットが取り付けられている。１回または数回のピエゾパルスを精子の首の部分かけて、精子の頭部と尾部とを分離した後、頭部のみを卵母細胞へ注入した。精子が乾燥しないように、全ての注入操作はＨｅｐｅｓ−ＣＺＢ中で、室温において１時間内に行った。精子を注入した卵母細胞はＣＺＢの中で、５％の二酸化炭素下、３７．５℃でインキュベートし、４−６時間後に試験した。２つの前核及び二次極体を有する受精卵を、正常に受精したものと見做した。
【００２９】
（胚転移）
受精させた卵は、４時間から６時間培養した後には二次極体と２つの前核が認められた。ＩＣＲメスマウスを、精管を切除したオスと１８時間前に交尾させて擬制妊娠を作製し、そのメスマウスの卵管に正常な胚を移した。各卵管に移した胚の数は１０−１５個であった。レシピエントのメスを妊娠１２．５日目に解剖し、胎児のＹＦＰの発現を明視野又は励起光を用いた蛍光顕微鏡で調べた。もう一匹のメスのレシピエントは、１９．５−２０．５日目に帝王切開を行なった。生きた胎児と死んだ胎児の双方について調べ、生きた胎児は、仮親に生育させた。
【００３０】
（組織化学的解析）
精巣と胚を、２．５％ホルムアルデヒド中で、４℃で２−４時間固定した。ＹＦＰ励起光源と適切なフィルターを備えた顕微鏡の下で、ＹＦＰを発現している精細管をピンセットを用いて取り出し、スライドガラスにのせ、カバーガラスで覆った。ＹＦＰを発現している生殖細胞を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検出した。励起波長は４８８ｎｍであり、５１０ｎｍから５２５ｎｍのバンドパスフィルターで検出を行った。
【００３１】
（サザンブロット解析）
ＹＦＰ陽性精子由来の胎児（胎齢１２．５日目）のDNA をサザンブロッティングで解析した。ゲノミックＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩにより消化し、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動を行った後、ブロッティング膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+ ナイロンメンブレン）に転写した。その後、32P-dCTPで標識したＥＹＦＰ遺伝子をプローブ（７４０ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片）に用い、６５℃で１８時間、ハイブリダイゼーションを行った。膜の洗浄は、（１）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、ＳＤＳ: ドデシル硫酸ナトリウム）  室温  （２）１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ  ６５℃  （３）０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ  ６５℃  （４）０．１×ＳＳＣ/0.1% SDS ６５℃  の順番で行い、ＢＡＳ２０００イメージアナライザーで解析を行った。
【００３２】
（遺伝子導入の確認）
ＤＮＡ濃度、電圧、時間及びパルス回数の様な種々のパラメーターを変化させてエレクトロポレーションを行い、遺伝子導入の最適条件を検討した。ＧＦＰ／ＹＦＰ遺伝子の導入は、蛍光を標識として確認を行った。ＧＦＰ／ＹＦＰ遺伝子を導入した後、１５−１８日目に精巣より細胞を分離し、精母細胞と精子細胞の存在を検討した結果を、図２から図７に示す。図２から図４は精母細胞、図５から図７は精子細胞の結果である。図２と図５は明視野像、図３と図６は蛍光像、図４と図７は明視野像と蛍光像を重ね合わせた像を示す。図６と図７の結果より、遺伝子導入して１５−１８日後には、ＧＦＰ遺伝子が導入され、精子細胞まで分化した細胞の存在が確認された。
【００３３】
（精巣中におけるＧＦＰ／ＹＦＰ遺伝子の発現）
精巣及び精細管における遺伝子発現の検討を行った。図８と図９は遺伝子導入後２日目の精巣の写真であり、図８は蛍光像を、図９は明視野像を示す。図１０と図１１は精細管の蛍光図であり、図１０は遺伝子導入後２日目の精細管を、図１１は１８−２０日後の精細管を示す。図１２と図１３は、図１１の精細管を分離し、そこから単離された細胞を示す。
【００３４】
本発明においては、未成熟な精子形成細胞に遺伝子を導入することを目的として、精巣の生殖細胞へのトランスフェクトを、可能な限り早期に行った。１３日齢または１４日齢において精細管の中央空洞が開くために、この時期より、遺伝子を精細管へ注入する事が可能であった。生後１３日齢から１４日齢の精巣には精原細胞及び第一次精母細胞のみが存在する事が、組織化学的検討により示されている。
【００３５】
生殖細胞及びセルトリ細胞において、ＧＦＰ／ＹＦＰの蛍光は広範囲に検出された（図８）。エレクトロポレーションの後、７日間は蛍光を有する生殖細胞の数は変わらなかったが、その後に急激に減少した。セルトリ細胞は強い蛍光を維持し、精細管に沿って散在し、単独の細胞として存在していた。対照的に、蛍光を有する残りの生殖細胞は、２０ないし５０個の細胞の塊として存在していた。解離した精細管を解析した結果、第一次精母細、精子細胞及び精子において、蛍光が確認された（図１０、図１１）。それらは、いくつかのクラスターのグループとして存在しており、少数の精母細胞、精子細胞及び精子より構成されていた。
【００３６】
遺伝子導入の１８日から２０日後の精巣では、精細管において蛍光を有する精子のクラスターが存在していた（図１２）。その様な精子のクラスターの形成は、比較的まれであった。それは、遺伝子導入が比較的まれであるか、ＧＦＰ／ＹＦＰが毒性を有している事のいずれかを示している。実際に、ＧＦＰで遺伝子導入して１４日後の精巣において、異常なまたは退化した蛍光を発する生殖細胞を見かけた。その様なＧＦＰの毒性は、培養細胞においても報告されている。本発明において、その様な毒性を低下させるために、ミトコンドリア局在シグナルを結合させたＹＦＰを用い、その様なＹＦＰを用いた時にのみ、蛍光を有する精子が得られた。
【００３７】
（卵細胞内精子注入法により受精した卵の発生）
更に、蛍光を発する精子を含んでいる精細管の断片を切り出し、トリプシン溶液で、それらを解離させた。蛍光を発する精子を取り出し、それらを用いて卵母細胞へ精子を注入した。この様にして精子を注入した受精卵の発生について、まとめた結果を表１に示す。表１において示された数はそれぞれ、受精卵、胚、胎児、子の数を示す。最初に、３つの受精卵を４８時間から７２時間培養して８細胞期の胚を作成した。図１４は蛍光像を、図１５は明視野像を示す。上述した８細胞期の早期胚はすべて、図１４で見られる様に蛍光蛋白質の発現を示した（表１：実験１のＤ）。
【００３８】
次に、２匹の仮親マウスの卵管に１１個（１匹に５個、他の１匹に６個）の受精卵を移植した（表１：実験２）。その結果仮親は妊娠し、移植した胚より胎児が生育した。５個の受精卵を移植した仮親から発生した３匹の胎児について、１２．５日目に調べた。図１６は胎児の蛍光像を、図１７は明視野像を示す。その結果  図１６で見られる様に３匹の胎児のうち２匹の体において、ＹＦＰが全体的に発現している事が観察された（表１：実験２のＥ）。
【００３９】
更に６個の受精卵を移植した仮親からは、２匹の生きた子（Ｆ０世代）が得られ、その２匹はＹＦＰの蛍光を発した（表１：実験２のＦ）。得られた個体の尾部の蛍光像を図１８に、明視野像を図１９に示す。図１８より、尾部全体に蛍光が観察された。別の仮親に６個の受精卵を移植し行った実験３においても、生まれた３匹の子は全て、蛍光を発した（表１：実験３のＦ）。
【００４０】
更に、形質転換したＦ０世代のマウスからＦ１世代のマウスへ、導入遺伝子が世代間で伝達されるか検討を行った。オスとメスの形質転換Ｆ０マウスから生まれたＦ１世代を得て検討を行ったところ、蛍光を有するＦ１世代の個体に対する、蛍光を有さないＦ１世代の個体の比は約１：１であった（表１：実験２及び実験３のＧ）。この結果は、本発明の方法により作製した形質転換動物へ導入した形質は子孫に遺伝することを示している。また、その子孫は形質転換しない個体と比較して、明らかな毒性や発生上の不利が存在しないことを示している。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
（遺伝子の染色体への導入）
卵細胞内精子注入により作成した胎児及び子のＤＮＡサンプルを得て、サザンブロッティングを行った。図２０において、Ｅ−１からＥ−３のレーンは胎児のサンプルを解析した結果であり、Ｅ−１は蛍光を有しない精子由来のサンプル、Ｅ−２及びＥ−３は蛍光を有する精子由来のサンプルである。Ｅ−２及びＥ−３において、ＹＦＰの遺伝子を示すバンドがブロッティングの中央に認められ、遺伝子が導入されていることが認められた。
【００４３】
一方図２０において、Ａ−１とＡ−２のレーンは、産まれた子のサンプルを解析した結果を示す。Ａ−１とＡ−２は共に、蛍光を有する精子より産まれた子のサンプルであり、ＹＦＰの遺伝子を示すバンドがブロッティングの上部に認められ、やはり遺伝子が導入されていることが示された。ＹＦＰの遺伝子は、単独又は多数のコピーとして検出された。以上の結果から、導入された遺伝子は胎児の染色体に導入されている事が示された。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、動物の精巣へ外来遺伝子を導入し、マーカー遺伝子を指標として遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞及び精子を選択し、未受精卵と受精させる事を特徴とする、新規の形質転換動物の作製方法が与えられた。本方法は、目的とした遺伝子が導入された精母細胞、精子細胞及び精子を選抜できるために、低い費用で効率よく形質転換した動物を作成する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の形質転換動物の作製方法の概略を示す模式図である。
【図２】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後の、精巣より分離した精母細胞の明視野像を示す写真である。
【図３】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後の、精巣より分離した精母細胞の蛍光像を示す写真である。
【図４】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後の、精巣より分離した精母細胞の明視野像と蛍光像を重ね合わせた写真である。
【図５】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後の、精巣より分離した精子細胞の明視野像を示す写真である。
【図６】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後の、精巣より分離した精子細胞の蛍光像を示す写真である。
【図７】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って１５−１８日後の、精巣より分離した精子細胞の明視野像と蛍光像を重ね合わせた写真である。
【図８】  ＹＦＰ遺伝子の導入を行って２日後の、精巣の蛍光像を示す写真である。
【図９】  ＹＦＰ遺伝子の導入を行って２日後の、精巣の明視野像を示す写真である。
【図１０】  ＧＦＰ遺伝子の導入を行って２日後の、精細管の蛍光像を示す写真である。
【図１１】  ＹＦＰ遺伝子の導入を行って１８−２０日後の、精細管の蛍光像を示す写真である。
【図１２】  ＹＦＰ遺伝子の導入を行って１８−２０日後の、精細管より単離した細胞の明視野像と蛍光像を重ね合わせた写真である。
【図１３】  ＹＦＰ遺伝子の導入を行って１８−２０日後の、精細管より単離した細胞の明視野像を示す写真である。
【図１４】  ＹＦＰ遺伝子の導入精子と受精した、８細胞期の胚の蛍光像を示す写真である。
【図１５】  ＹＦＰ遺伝子の導入精子と受精した、８細胞期の胚の明視野像を示す写真である。
【図１６】  １２．５日目の胎児の蛍光像を示す写真である。
【図１７】  １２．５日目の胎児の明視野像を示す写真である。
【図１８】  得られた個体の尾部の蛍光像を示す写真である。
【図１９】  得られた個体の尾部の明視野像を示す写真である。
【図２０】  ＹＦＰ遺伝子の検出を行った、ブロッティングの結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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