(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定するための方法において、
前記ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で上に固定化されたリポーター酵素を有する第１の固体支持体、及び前記第１の固体支持体と接触せず、前記リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものである１つの指示薬が上に固定化されている第２の固体支持体が入った装置の中に前記試料を入れる段階であって、前記試料中に存在するヒドロラーゼ活性により放出されたリポーター酵素が前記試料を通して前記第２の固体支持体へと拡散できることになるように前記試料が前記第１及び第２の固体支持体と接触するような形で前記装置の中に入れられる段階、及び
前記試料中の前記酵素的に活性なヒドロラーゼの存在を表示するものである検出可能な変化を前記指示薬が受けているか否かを観察する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記ヒドロラーゼがアスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼから成るグループの中から選択されたプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポーター酵素がペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロラーゼがアスパラギン酸プロテアーゼである、カンジダ症を検出するための請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロラーゼが酵素的に活性なチオールプロテアーゼである、トリコモナス・バギナリスを検出するための請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料に加えて、前記装置に標的ヒドロラーゼが置かれる、試料中の標的ヒドロララーゼの阻害物質を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定するための試験装置において、
間に間隙を伴い内部に面する表面をもつ第１及び第２の相対する壁により少なくとも一部が構成され、この第１の壁、第２の壁又はその両方が光透過性材料でできているレセプタクル；
前記ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で前記第１及び第２の壁のうちの１方の前記内部に面する表面上で固体支持体上に固定化されたリポーター酵素；
前記リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受けることが出来るものであり、前記第１及び第２の壁のうちの１方の前記内部に面する表面上に含まれている指示薬；及び
前記試料の導入のための前記レセプタクル内の開口部、
を含んで成る試験装置。
【請求項８】
酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによりカンジダ症の存在について試料を試験するための試験装置において、
間に間隙を伴い内部に面する表面をもつ第１及び第２の相対する壁により少なくとも一部が構成され、この第１の壁、第２の壁又はその両方が光透過性材料でできているレセプタクル；
前記アルパラギン酸プロテアーゼの作用時点で放出されるような形で前記第１及び第２の壁のうちの１つの前記内部に面する表面上で固体支持体上に固定化されたリポーター酵素；
前記リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受けることが出来るものであり、前記第１及び第２の壁のうちの１つの前記内部に面する表面上に固定化されている指示薬；及び
前記試料の導入のための前記レセプタクル内の開口部、
を含んで成る試験装置。
【請求項９】
標的ヒドロラーゼの阻害物質の存在について試料を試験するための検定用試験装置において、
間に間隙を伴い内部に面する表面をもつ第１及び第２の相対する壁により少なくとも一部が構成され、この第１の壁、第２の壁又はその両方が光透過性材料でできているレセプタクル、
前記阻害物質の存在による不活性化を受ける可能性があり、前記第１及び第２の壁のうちの１つの前記内部に面する表面上に含まれている標的ヒドロラーゼ；
前記標的ヒドロラーゼが前記阻害物質の存在により不活性化されない場合、前記標的ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で前記第１及び第２の壁のうちの１つの前記内部に面する表面上で固体支持体上に固定化されたリポーター酵素；
前記リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受けることが出来るものであり、前記第１及び第２の壁のうちの１つの前記内部に面する表面上に含まれている指示薬；及び
前記試料の導入のための前記レセプタクル内の開口部、
を含んで成る試験装置。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は一般に、試料又は標本中のヒドロラーゼ活性（すなわち加水分解酵素）の存在について検定する方法に関する。特に、本発明は、試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによりカンジダ症を検定するための方法に関する。
発明の背景
Candida albicans（カンジダアルビカンス）及びその他のカンジダ種は、一般的で医学的に重要な数多くの感染をひき起こす。例えば口腔カンジダ症は、免疫不全症患者において非常に一般的である。その上、外陰膣カンジダ症は、産科及び婦人科において最も頻繁な疾患の１つである。全ての成人女性の約４分の３がこの疾病に少なくとも１回は羅病していると見積られてきた。（De Bernardis et al.,J.Clin.Microbiol.27（11）：2598-2603(1989)）。その出現が広まっている結果として、カンジダの病因を理解するため莫大な量の研究が進められてきた。
研究の結果、カンジダ・アルビカンス及びその他のカンジダ種がヒトカンジダ症の病因として関与していることが立証され、現在一般にカンジダ症はまず最初にカンジダ・アルビカンスの存在によってひき起こされると考えられている。さらに、カンジダ・アルビカンスの毒力因子としてのアスパラギン酸プロテアーゼ又は（互換的に）酸性プロティナーゼの役割について、現在多くの証拠が存在している。カンジダ・アルビカンスの純粋培養は、精確に規定された条件下で成長させられたときにアスパラギン酸プロテアーゼを分泌するということがわかっている。同様に、症候性外陰膣炎をもつ女性から分離したカンジダ・アルビカンスの純粋菌株は、特定的に規定された培地内でひき続き成長させたときにこの酵素を放出することが知られている。
カンジダ・アルビカンス酸性プロティナーゼ抗原すなわちアスパラギン酸プロテアーゼ抗原が、外陰膣カンジダ・アルビカンスを分離した全ての女性の膣液の中に免疫学的に検出された。（De Bernardis et al.、米国微生物学会年次総会抄録中、抄録番号Ｆ−91（アナハイム、CA 1990））。しかしながらカンジダ・アルビカンス酸性プロティナーゼ抗原の濃度は、無症候性キャリヤに比べ症候性外陰膣炎患者においてはるかに高いものであった。カンジダ症をもつ女性におけるこの抗原の膣液濃度は約176±15.2ng／mlであり、一方カンジダ・アルビカンスの分離が無いつまり臨床的カンジダ症が無い女性におけるこの抗原の膣液濃度は、２ng／ml未満であった。無症候性カンジダ・アルビカンスキャリヤは中間的抗原レベル（94±18.5ng／ml）を有していた。これらの発見事実は、外陰膣カンジダ症の病因に酸性プロティナーゼ（すなわちアスパラギン酸プロテアーゼ）が関与することを強く表わしている。しかしながらカンジダ・アルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼは体温で不安定であるものとして知られている。その上、アスパラギン酸プロテアーゼ抗原の検出は、免疫学的には、酵素が酵素的に活性な形で存在したか否かを示していなかった。
カンジダ・アルビカンス酸性プロティナーゼは、細胞外アスパラギン酸プロテアーゼである。アスパラギン酸プロテアーゼは、主要なプロテアーゼクラスの１つである。これらは活性に必要とされる単数又は複数の主要なアスパラギン酸残留物を含んでいる。カンジダ・アルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼは、例えばアルブミミン、ヘモグロビン、カゼイン、免疫グロブリンＡ及びその他の多くのタンパク質を含む広範なタンパク質基質特異性を有する。この酵素は、酸性条件（すなわちpH2.5〜5.5）下で最適な形で機能し、高いpH（すなわちpH7.5）で急速に不活性化される。カンジダ・アルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼはペプスタチンにより強力に阻害されるが、チオール試薬、キレート化剤又はセリンプロテアーゼ阻害物質によって阻害されない。
数くの製薬会社及び一流の研究者達が、可能性のある治療上の使用を目的としてアスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質を研究している。しかしながらその研究努力は、アスパラギン酸プロテアーゼのための適当な酵素検定が欠如していることから困難になっている。いくつかのセリン、チオール、メタロ、酸性及びアルカリ性プロテアーゼ及びペプチダーゼについて単純な比色検定を利用することができるものの、これらはアスパラギン酸プロテアーゼには利用できない。この特定の酵素クラスの基質特異性には、複数の疎水性アミノ酸の存在が必要である。この特性は、アスパラギン酸プロテアーゼのための基質として用いられる疎水性アミノ酸が周知の通り水中に溶解しにくいことから、単純な合成色素産生基質の探究を大きく妨げてきた。その結果、アスパラギン酸プロテアーゼのための色素産生基質は市販されておらず、合成及び特徴づけがむずかしく、又水溶性が低い。これらの制限条件の最終的結果として、これらの色素産生基質により規定される酵素活性がきわめて低く、従って、アスパラギン酸プロテアーゼについての比色検定がきわめて感受性の低いものとなる。同様にしてアスパラギン酸プロテアーゼのための螢光原基質についても記述されてきたが、これらも有用性に制限のあるものである。まず第１に、上述の通り、この特定のクラスの酵素の基質特異性には、基質を比較的不溶性にするいくつかの疎水性アミノ酸の存在が必要である。第２に、これらの基質の達成可能な低い濃度においては、螢光原基質は非常に緩慢に加水分解され、かくして螢光原検定は時間のかかる作業である。さらに、数多くの生物学的供試体が、アスパラギン酸プロテアーゼについての螢光原検定と干渉しうる螢光材料を含んでいる。
アスパラギン酸プロテアーゼの検定のための適当な比色検定又は螢光原検定が欠如していることから、一般にこの特定のクラスの酵素の存在について検定するために紫外線（UV）分光光度検定が用いられる。標準的なUV分光光度検定においては、（例えばヘモグロビン又はアルブミンといった）タンパク質の溶液に対してアスパラギン酸プロテアーゼが付加され、混合物は0.5〜４時間30〜37℃でインキュベートされる。インキュベーションの後、未消化タンパク質を析出させるため冷却したインキュベーション混合物に対して低温の濃縮したトリクロール酢酸（TCA）が付加され、溶解状態の紫外線吸収ペプチドが残る。最終的に、析出した未消化のタンパク質は、冷凍温度で約１時間遠心分離でペレット化され、上清は吸引され、タンパク質の加水分解量を反映するべく280nmでその光学密度が決定される。この検定はアスパラギン酸プロテアーゼの検出のために使用できるものの、時間及び労力の両方がかかる。
従って、今日までのところ、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在を検出するための便利で単純な現場検定法は全く開発されていない。従って、本発明は、先行技術の問題点及び欠点を克服する酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定する方法に向けられている。その上、本発明の方法は同様に、その他の既知の加水分解酵素すなわちヒドロラーゼの存在について検定するためにも有用である。
発明の要約
外陰膣カンジダ症をもつ女性の膣液の中に酵素的に活性なカンジダ・アルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼが存在することが現在発見されている。さらに、試料又は標本中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在が、カンジダ症の検出及び診断のための標識として役立ちうるということも発見された。従って、試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによりカンジダ症を検出するための方法が現在開発されてきている。
この方法においては、試料例えば膣液を固体支持体と接触させる。試料を接触させる個体支持体は、その上に固定化されたリポーター酵素（すなわちシグナル生成酵素）を有する。リポーター酵素は、実際に試料中に酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼが存在する場合、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの作用時点で固体支持体から放出されるような形で、固体支持体上に固定化されている。固体支持体と接触した後の試料は指示薬と組合わされる。この指示薬は、リポーター酵素の作用時点で目に見える又は検出可能な変化（例えば変色）を受ける可能性のあるあらゆる化学的種である。試料との接触後に指示薬が検出可能な変化を受けた場合、その試料中には酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼが存在し、従ってカンジダ症が存在すると言うことができる。
本発明以前は、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼ、或いはより重要にはカンジダ症の存在について検定する迅速でかつ直接的な手段は全く存在しなかった。アスパラギン酸プロテアーゼ活性の存在について検定するためには、分光光度検定、螢光原検定及び免疫学的検定が使用されてきたが、これらの検定は時間及び労力がかかり、又、訓練されていない現場の臨床要員が使用するには適していない。同様にして、カンジダ・アルビカンスは、規定の培地中で供試体を培養することによって又は湿式顕微鏡によって検出することができる。培養手順は非常に時間のかかる（すなわち約48時間かかる）ものであり、両方の手順共、高価な機器及び広範な訓練を必要とする。以前に使用されてきた検定とは対照的に、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼひいてはカンジダ症の存在について検定するためのここで請求されている方法は、迅速、精確で、費用有効性が高く、使用が単純である。
アスパラギン酸プロテアーゼ検定の基礎となっているリポーター酵素放出技術は同様に、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモオリゴサッカリダーゼ、ヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモポリサッカリダーゼ、ヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼを含む（ただしこれらに限られるわけではない）活性なあらゆる加水分解酵素の存在について検定するのに使用することもできる。従って、試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定する方法がここに開発されたのである。
これらの方法においては、試料又は標本は、固体支持体と接触させられる。試料が接触させられる固体支持体は、その上の固定化されたリポーター酵素（すなわちシグナル生成酵素）を有する。リポーター酵素は、実際に試料上に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在する場合ヒドロラーゼの作用時点で固体支持体から放出されるような形で固定支持体上に固定化されている。固体支持体と接触した後の試料は１つの指示薬と組合される。指示薬は、リポーター酵素の作用時点で、通常は変色である検出可能な変化を受ける可能性のあるあらゆる化学的種である。指示薬中の検出可能な変化は、試料中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在するということの表示である。換言すると、指示薬における検出可能な変化の欠如は、試料に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在しないことの表示である。酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼひいてはカンジダ症についての検定の場合と同様に、試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定するためのここで請求されている方法は、迅速、精確で費用有効性がありかつ使用の簡便なものである。
その上、上述の方法の基礎となっているリポーター酵素の放出技術は同様に、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモオリゴサッカリダーゼ、ヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモポリサッカリダーゼ、ヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼの阻害物質を含む（ただしこれらに限られるわけではない）あらゆる既知の加水分解酵素の阻害物質の存在について検定するのに使用することもできる。従って試料中のヒドロラーゼ阻害物質の存在について検定する方法がここに開発されたのである。
これらの方法においては、試料又は標本を、標的ヒドロラーゼ及び固体支持体と接触させる。試料が接触させられる固体支持体は、その上に固定化されたリポーター酵素（すなわちシグナル生成酵素）を有している。リポーター酵素は、ヒドロラーゼ阻害物質が存在するために標的ヒドロラーゼが不活性化されないことを条件として標的ヒドロラーゼの作用時点で固体支持体から放出されるような形で、固体支持体の上に固定化されている。標的ヒドロラーゼ及びリポーター酵素と接触した後の試料は、指示薬と組合わせられる。この指示薬は、標的ヒドロラーゼにより固体支持体からリポーター酵素が放出された場合リポーター酵素の作用時点で、通常は変色である検出可能な変化を受ける可能性のあるあらゆる化学的種である。標的ヒドロラーゼ阻害物質が試料中に存在しない場合、標的ヒドロラーゼは支持体からリポーター酵素を放出し、かくして指示薬内の検出可能な変化が生成される。換言すると、試料中に標的ヒドロラーゼ阻害物質が存在する場合、標的ヒドロラーゼは阻害され、リポーター酵素は固体支持体から放出されず、指示薬内の検出可能な変化又は応答は生成されないことになる。前述の方法の場合と同様に、試料中のヒドロラーゼ阻害物質の存在について検定するためのここで請求されている方法は、迅速、精確で、費用有効性があり、使用の簡単なものである。
酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼ及びその他の加水分解酵素の活性の存在について検定する方法に加えて、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによりカンジダ症の存在について試料を試験するための乾燥自蔵式試験装置がここに開発された。さらに、試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定するための乾燥自蔵式試験装置も同様に開発された。これらの試験装置は、試料が内部に入れられるまでは空のスペースである内部チャンバーを伴う積層パネルの中に乾燥した形で、固体支持体上に固定化されたリポーター酵素、指示薬及び単数又は複数のその他の試薬を組合わせている、便宜上、パネルの部品及びパネル内の機能的化学物質の場所は、使用中にパネルが占めることになる確率が最も高いという理由で水平位置にパネルがある基準フレームから記述することにする。この位置にパネルがある状態で、特に、薄く平坦な構造である本発明の好ましいパネルについては、試料はパネルの上面にある開口部を通してチャンバーの中に入れられる。パネルを形成する薄層のうち、試料が導入されるときに通る薄層であるこの位置における最大の薄層はパネルの上面薄層と呼ばれ、この薄層の下部表面はチャンバーの上部表面を形成している。同様にしてパネルの最も下の薄層はパネルの底面薄層と呼ばれ、この底面薄層の上部表面はチャンバーの下部表面を形成している。これらの上面及び底面薄層の周囲に沿った薄い縁部はパネルの側縁部と呼ばれ、その上部及び下部表面の縁部に沿ったチャンバーの薄い側方端部はチャンバーの側壁と呼ばれる。同じ水平平面内で互いに隣接するいずれかの与えられた表面の領域は水平に隣接するものと呼ばれ、一方平行な水平平面を形成するべくその他の薄層全体にわたり直接貼りつけられた薄層は垂直に隣接するものと呼ばれる。
パネルの上面、底面又はその両方の薄層は、好ましくは透明な、光透過性材料で製造されている。固体支持体上に固定化されたリポーター酵素、指示薬及びその他の成分及び試験に必要な試薬は、チャンバーの上部表面上のコーティングとしてか又はチャンバーの下部表面上のコーティングとして又はその両方として、チャンバー内に単数又は複数の薄層の形で配置されている。指示薬は、存在が検出中である酵素的に活性なヒドロラーゼによって固体支持体から放出された場合にリポーター酵素の作用時点で、通常は変色である検出可能な変化を受ける可能性のあるあらゆる化学種である。指示薬を含む薄層は、チャンバーの上部表面上にあっても下部表面上にあってもよい。試験に必要な試薬のうちの単数又は複数のものが指示薬と同じ薄層内に含まれていてもよいし、或いは又同じ表面上又は反対の表面上で別々の薄層内に含まれていてもよい。本発明のいくつかの好ましい実施態様においては、指示薬は光透過性壁の下側に直接貼りつけられた薄層の中に含まれ、固体支持体上に固定化されたリポーター酵素は、反対側の壁に貼りつけられた薄層の中に含まれている。
薄層を占有する試薬は、試験を完遂するのに必要なことは試料と例えば顕色剤などの最低限の数の付加的な試薬を付加することだけであるように選択することができる。ただし特に好ましい実施態様においては、薄層に試料以外の必要な全ての試薬が含まれていることから、試験の遂行には試料の付加以外何も必要とされない。
全ての薄層は試料との接触に先立って固体層であり、指示薬を含む薄層は好ましくは、試験が設計された対象である液体試料の中で不溶性である組成物でできており、かくして指示薬は試験全体を通して薄層の中に残るようになっている。従って、水性又は水溶性の媒質中の試料については、好ましい指示薬薄層は、水中で不溶な指示薬又は水中で不溶なマトリクス内に保持された指示薬である。光透過性壁のすぐ下側で、集中した薄層の中にかくして指示薬が保持されている状態で、光透過性壁を通して検出可能である指示薬中の変化は、短時間で起こり、その結果高い感受性と急速な結果の両方がもたらされる。
本発明は、多種多様な供給源からの試料中の多様なヒドロラーゼについての試験のために適合化させて用いることが可能なものである。さらに、本発明は、多様なヒドロラーゼ阻害物質についての試験のために適合化させて用いることが可能なものである。試験には単一の反応が関与していてもよいし或いは指示薬中の検出可能な変化を完結させる一連の反応が関与していてもよく、試薬及び反応の数及びタイプは、どのヒドロラーゼが検出中であるかに応じて試験によってそれ相応に変動する。或る種の場合においては、試料が充てんされるまで１つの間隙によって分離されているように、チャンバーの上部及び下部表面の間で予め適用された反応種が分配された場合に、最良の結果が得られる。その他のケースでは、反応種を、共通の薄層の中に入れてもよいし、又は試験の信頼性の損失が全くない状態でチャンバーの上部又は下部表面上の２つ以上の全く異なる、ただし垂直に隣接する薄層の中に入れてもよい。しかしながらあらゆる場合において、薄層は、検出可能な指示薬の変化にて完結する反応が、チャンバーに試料が充てんされた時点でのみ起こるように、そして指示薬の変化がまさに起こったときそれが少なくとも光透過性壁に直ぐ隣接する薄層の中に集中しており好ましくはこれらの薄層に制限されるような形で、構成され配置されている。
本発明の好ましい実施態様においては、試験装置は、組込み型の正の対照、組込み型の負の対照又はその両方を含んでおり、それら全てが単一の標本の付加によって活性化される。これらの対照の活性化は試験の実施と同時に起こり、対照及び試験の両方を表わす検出可能な表示（例えば変色又はその欠如）は、装置に対する標本の一回の適用で達成され、光透過性壁を通して検出可能である。対照は、対照を同定しそれらを試験から区別するため装置の上部又は下部表面好ましくは上部表面上に適切な印を伴って、試験部域に水平に隣接する装置上の位置を占有している。対照自体は一般に、それ自体指示薬の中の検出可能な変化を誘発するか又は変化が起こるのを妨げることになりかつ試料が存在する場合にのみしかも試料中の疑わしいヒドロラーゼの存在又は不在とは無関係にそれを行なうような、試薬又はその他の適切な種を含むさらなる薄層で構成されている。ここでも又、これらの対照及びそれらが機能する化学的メカニズムの選択ならびにこれらの薄層を指示薬としてチャンバーの同じ表面上に置くか又は反対側の表面上に置くかの選択は、試験によって変動する。
本発明のさらなる好ましい実施態様では、試験の性能を高めるための付加的な特長を含んでいる。水ベースの試料については、試料を充てんするべき間隙に直ぐ隣接する薄層中の表面活性剤の取込みが、試料による薄層の湿潤化及びチャンバーの迅速かつ均等な充てんを促進することになる。表面活性剤は、薄層内の唯一の機能的成分であってもよいし、又は試薬と薄層内で組合わされていてもよい。好ましくは、間隙の両側は、表面活性剤を支持する薄層でライニングされている。チャンバー内への試料の直接的挿入を可能にするため、装置内には、試料導入口が含まれており、好ましい実施態様には、チャンバーの充てんをさらに容易にするため、試料導入口から離隔されたチャンバー内の単数又は複数の通気穴を含んでいる。
発明のその他の特長、目的及び利点そしてその好ましい実施態様は、以下の記述から明らかになることだろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、発明に従った試験装置例の斜視図である。
図２は、図１に示されている試験装置の一部分の側面断面図である。
発明及び好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の１つの態様においては、試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定する方法が提供されており、この方法には、（ａ）ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で上に固定化されたリポーター酵素を有する固体支持体と前記試料を接触させる段階；（ｂ）リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものである１つの指示薬と、固体支持体と接触した後の試料を組合わせる段階；及び（ｃ）試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在を表示するものである検出可能な変化を指示薬が受けているか否かを観察する段階が含まれている。
「ヒドロラーゼ」という語は、ここでは、加水分解反応の触媒として作用する酵素のことを指すものとして用いられている。本発明の方法は、既知のあらゆる加水分解酵素の存在について検定するのに使用することのできるものである。かかる加水分解酵素すなわちヒドロラーゼには、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ又はヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。好ましい実施態様においては、本発明の方法は、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼを含むもののこれに制限されているわけではないプロテアーゼの存在について検定するために使用することができる。もう１つの好ましい実施態様においては、本発明の方法は、キチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びリゾチームを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）ホモ又はヘテロオリゴサッカリダーゼ又はホモ又はヘテロポリサッカリダーゼの存在について検定するのに使用することができる。
ここで「リポーター酵素」又は（互換的に）「標識酵素」という語は、シグナル生成酵素すなわちその活性が検出可能な変化をもたらす酵素のことを指すのに用いられている。このようなリポーター酵素としては、ぺルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミラーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。ここで請求されている方法において使用されるべきリポーターを選択する上で、リポーター酵素が、試料中に存在するあらゆるヒドロラーゼ活性により加水分解を不活性化することを含む試料中の何らかの作用物質による不活性化を受けていないことが肝要である。適切なリポーター又は標識酵素の選択は、当業者にとっては直ちに明白であろう。現在好まれているリポーター酵素は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼといったようなペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、固体支持体すなわち不溶性重合体材料、無機又は有機マトリクス、ゲル、集合体、沈殿物又は樹脂などの上に、その存在が検定中であるヒドロラーゼの作用時点でリポーター酵素が放出されるような形で、固定化されている。本発明に従った好ましい固体支持体としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ及び重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。固体支持体上のリポーター酵素の固定化は、当業者にとって既知でかつ理解しているものである従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
リポーター酵素は固体支持体に直接付着させることができる。この場合、不溶性支持体は直接、ヒドロラーゼのための基質として役立つ。例えば、キチナーゼが検出中のヒドロラーゼである場合、リポーター又は標識酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）は直接不溶性キチンに付着され得る。キチナーゼの存在下で、ホースラディッシュペルオキシダーゼが固体支持体から放出されることになる。同様にして、検出中のヒドロラーゼがセルラーゼである場合、リポーター酵素例えばホースラディッシュペルオキシダーゼは直接セルラーゼに付着され得、ヒドロラーゼセルラーゼの存在下で、ホースラディッシュペルオキシダーゼが固体支持体から放出されることになる。最後に、検出中のヒドロラーゼがリゾチームである場合、リポーター酵素例えばホースラディッシュペルオキシダーゼは細菌細胞壁ペプチドグリカンに直接付着され得、ヒドロラーゼリゾチームの存在下でホースラディッシュペルオキシダーゼが固体支持体から放出されることになる。
代替的には、リポーター酵素は、検出中のヒドロラーゼのための加水分解可能な基質であるリンカー分子の使用を通して固体支持体上に固定化され得る。このようなリンカー分子には、タンパク質、炭水化物、脂質、ペプチド、エステル及び核酸が含まれるがこれらに制限されるわけではない。固体支持体にリポーター酵素を付着させるのに使用される特定のリンカー分子は、どのヒドロラーゼが検出中であるかによって異なり、或る一定のケースにおける選択は当業者にとって直ちに明白なものとなるだろう。
「指示薬」という語はここでは、試料又は標本内に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在する場合に起こる反応又は反応の完結の結果として検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種のことを言うものとして使用されている。結果として得られる検出可能な変化は、酵素的に活性なヒドロラーゼが試料又は試料の中に存在することの表示である。
好ましい指示薬は、視覚的指示薬特に色素産生指示薬すなわち、存在が検出中である酵素的に活性なヒドロラーゼにより固体支持体から放出された場合にリポーター又は標識酵素の作用時点でそうでなければ無色の材料の中で色が形成されることを含む変色がこの視覚的変化であるような指示薬である。代替的には、リポーター酵素は、ヒドロラーゼの作用により固体支持体から放出された時点で螢光シグナル、リン光性シグナル、生体発光シグナル、化学発光シグナル又は電気化学シグナルの形成の触媒として作用することができる。付加的に言うと、リポーター酵素は、例えば凝塊、凝集、沈殿又は清澄化ゾーンといったその他の可視的又は検出可能なシグナルを生成することのできるものであってもよい。これらのケースでは、指示薬は、望まれる検出可能な変化をもたらすためリポーター又は標識酵素によって必要とされる化学的種又は基質となる。
リポーター酵素としてのホースラディッシュペルオキシダーゼと共に、視覚的指示薬として多種多様な色素産生指示薬（すなわち色原体）及び類似の効果をもつその他の種が使用可能である。本発明に従った好ましい色素産生指示薬には、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルフォン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルフォン酸を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）色原体及びヒドロペルオキシドが含まれる。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシドとグアヤックつまりその還元状態では無色でその酸化状態では深青色である色素体で構成されている。任意には、グアヤックを例えば溶剤抽出によって使用前に精製させることが可能である。いずれかの与えられたリポーター酵素のための最も適切な色素産生指示薬は、リポーター酵素が触媒として作用するか又は開始させることのできる単数又は複数の反応に応じて異なり、いずれかの与えられたケースでの選択は当業者にとっては直ちに明白となるものであろう。
視覚的指示薬が色素産生指示薬である場合、液体色原体系又は固体色原体系のいずれかを利用することが可能である。ペルオキシダーゼを検出するために液体色原体系が使用される場合、かかる系は溶剤、ヒドロペルオキシド及び例えばホースラディッシュペルオキシダーゼといったようなペルオキシダーゼの存在下でヒドロペルオキシドによって酸化され得る色原体を含むことになる。代替的には、固体色原体が使用される場合、このような系には、ヒドロペルオキシド、ペルオキシダーゼの存在下でヒドロペルオキシドにより酸化されうる色原体及び、色原体が含浸されたか又は固定化され乾燥された固体支持体を含むことになる。この系においては、Hemoccult▲Ｒ▼スライドで行なわれるように吸収しやすい紙又は支持体上に色原体を含浸させることもできるし又は代替的には、薄い層の形でプラスチック又はその他のシート上に色原体を被着させることも可能である。この後者の方法においては、色原体を、重合体材料（例えばヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース等）を含む溶液として層状化することができるだろう。色原体自体が水溶性色原体である場合、水に溶けない材料のマトリクス中にこれを捕獲することができる。代替的には、色原体自体が水に溶けない場合、単独で又は水溶性又は非水溶性重合体と組合わせた形で有機溶剤中の溶液としてこの色原体を層状化させることができる。
ペルオキシダーゼを検出するための固体色原体系の中では、固体形（例えばヒドロ過酸化チタン）でヒドロペルオキシドを提供することもできるし、原位置で生成させることもできる。例えば過酸化水素をグルコース、大気酸素及びグルコースオキシダーゼで現位置で生成することが可能である。代替的には、アルコール中の過ホウ酸ナトリウムの懸濁液を被着させた後形成された乾燥層の使用を通じて、過酸化水素を現位置で生成することができる。低いpHでは、過ホウ酸ナトリウムが自然発生的に過酸化水素を放出する。過酸化水素及びヒドロラーゼによる固体支持体からのその放出時点でのペルオキシダーゼの存在する中で、色原体は酸化されることになり、視覚的に検出可能な変色が結果としてもたらされる。この結果としてもたらされる変色は、酵素的に活性なヒドロラーゼが試料又は標本の中に存在することの表示である。
この方法及びここで請求する発明のその他の方法は、１つの試料又は標本の中の２つ以上の活性ヒドロラーゼの存在について同時に検定するために使用することができる。このような方法では、特異的ヒドロラーゼに影響されやすいものである基質リンケージを通して固体支持体上に固定化された２つ以上のリポーター酵素の混合物、及び２つ以上の指示薬及び試薬系を利用して、リポーター酵素の各々に対する検出可能な応答を生成することになる。例えば、本発明の方法を使用すると、プロテアーゼ、リパーゼ及びポリサッカリダーゼの混合物を同時に検出して一定の与えられた病原体又は疾病の過程の加水分解プロフィルを得ることが可能である。
さらに、当業者にとっては、ここで請求されている方法の反応条件（例えばリンカー分子又は架橋、固体支持体、pH、緩衝液容量、緩衝液同一性、塩など）を修正して調整してヒドロラーゼ特異性を増大させ試料中に存在する異なるヒドロラーゼの間での区別を行なうことが可能であることは直ちに明らかとなるだろう。例えば、いくつかのヒドロラーゼは低いpHで機能し高いpHで阻害されることがわかっている。これとは対照的に、その他のヒドロラーゼは高いpHで機能し低いpHで阻害される。検定のpHを調整することにより、特定のヒドロラーゼの存在を選択的に検出することが可能となる。さらに、特定の酵素阻害物質もここで請求されている方法の中でヒドロラーゼ活性を増大させる異なるヒドロラーゼの間で区別を行なうために使用することができる、ということは当業者にとって直ちに明白となるだろう。
本発明のもう１つの態様においては、試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定するための方法が提供されており、この方法には、ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で上に固定化されたリポーター酵素を有する第１の固体支持体及び、第１の固体支持体と接触せず、リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものである１つの指示薬が上に固定されている第２の固体支持体が入った装置の中に試料を入れる段階であって、この試料の中に存在するあらゆるヒドロラーゼ活性により放出されたあらゆるリポーター酵素が試料を通して第２の固体支持体へと拡散できることになるように試料が第１及び第２の固体支持体と接触するような形でこの装置の中に入れられる段階；及び試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在を表示するものである検出可能な変化を指示薬が受けているか否かを観察する段階、が含まれている。
本発明のこの方法は同様に、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ又はヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼといったヒドロラーゼを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）既知のあらゆる加水分解酵素の存在について検定するのにも利用され得る。好ましい一実施態様においては、この方法は、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）プロテアーゼの存在について検定するために使用される。
この方法におけるリポーター酵素又は標識酵素は、試料中に存在するあらゆるヒドロラーゼ活性により加水分解を不活性化させることを含めた試料中のあらゆる作用物質による不活性化を受けないあらゆるシグナル生成酵素でありうる。かかるリポーター酵素としては、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。現在好まれているリポーター又は標識酵素は例えばホースラディッシュペルオキシダーゼといったペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、存在を検出中である酵素的に活性なヒドロラーゼの作用時点で固体支持体から放出されるような形で第１の固体支持体すなわち不溶性マトリクス、ゲル又は樹脂の上に固定化されている。リポーター酵素は、固体支持体がヒドロラーゼのための基質である場合第１の固体支持体に直接付着され得、又代替的には、検出中である酵素的に活性なヒドロラーゼのための基質であるリンカー分子の使用を通して第１の固体支持体上にリポーター酵素を固定化させることもできる。かかるリンカー分子としては、タンパク質、炭水化物、脂質、ペプチド、エステル及び核酸が含まれるが、これらに制限されるわけではない。第１の固体支持体に対してリポーター酵素を付着させるのに使用される特定のリンカー分子は、どのヒドロラーゼが検出中であるかによって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者にとって直ちに明白になることだろう。第１の固体支持体上のリポーター酵素の固定化は、当業者にとって周知で理解しているものである従来の方法及び手順を使用して実施される。
本発明のこの方法においては、指示薬は、第１の固体支持体と接触していない第２の固体支持体に付着させられる。本発明に従った好ましい第１及び第２の固体支持体には、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。第２の固体支持体上での視覚的指示薬の固定化は、当業者が知っている従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
指示薬は、試料又は標本の中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在するときに起こる反応の結果又は反応の完結の結果としての検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種でありうる。指示薬中の結果として得られた検出可能な変化は、酵素的に活性なヒドロラーゼが試料中に存在することの表示である。好ましい指示薬は、視覚的指示薬であり、特に色素産生指示薬すなわち存在が検出中である酵素的に活性なヒドロラーゼにより固体支持体から放出されたときのリポーター又は標識酵素の作用時点でそうでなければ無色の材料内で色を形成することを含む変色がこの視覚的変化であるような指示薬である。
視覚的指示薬としては、多様な色素産生指示薬（すなわち色原体及び類似の効果をもつその他の種を使用することができる。本発明に従ったペルオキシダーゼ様のリポーター酵素のための好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２，２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルホン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルフォン酸のうちの１つを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）色原体及びヒドロペルオキシドを含んでいる。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシド及びグアヤック、つまりその還元状態で無色でありその酸化状態で深青色である色原体で構成されている。いずれかの与えられたリポーター酵素のための最も適切な色素産生指示薬は、リポーター酵素が触媒として作用するか又は開始させることのできる単数又は複数の反応によって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は当業者には直ちに明白なものとなるだろう。
視覚的指示薬が過酸化反応についての色素産生指示薬である場合、固体色原体系が利用され、かかる系には、ヒドロペルオキシド、ペルオキシダーゼの存在下でヒドロペルオキシドにより酸化されうる色原体及び色原体が含浸されたか固定化され乾燥された固体支持体が含まれている。この系においては、色原体を、Hemoccult▲Ｒ▼スライドで行なわれる通りに吸収しやすい紙又は支持体上に含浸させることもできるし、又代替的には薄い層の形でプラスチック又はその他のシート上に色原体を被着させることもできる。この後者の方法においては、色原体を、重合体材料（例えばヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースなど）を含む溶液として層状化することができるだろう。色原体自体が水溶性色原体である場合、水に溶けない材料のマトリクス中にこれを捕獲することができる。代替的には、色原体自体が水に溶けない場合、単独で又は水溶性又は非水溶性重合体と組合わせた形で有機溶剤中の溶液としてこの色原体を層状化させることができる。
固体色原体系においては、固体形（例えばヒドロ過酸化チタン）でヒドロペルオキシドを提供することもできるし、装置内で原位置でこれを生成することもできる。ヒドロペルオキシド及び、ヒドロラーゼによるその第１の固体支持体からの放出の時点でのペルオキシダーゼの存在する中で、色原体は酸化されることになり、視覚的に検出可能な変色が結果としてもたらされる。この結果としてもたらされる変色は、試料又は標本中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在することの表示である。
本発明のこの方法の現在好まれている実施態様においては、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼが検出中のヒドロラーゼであり、この方法には、アスパラギン酸プロテアーゼのための基質であるミオグロブリン分子を通して上に固定化されたホースラディッシュペルオキシダーゼをもちポリアクリレートである第１の固体支持体と、この第１の固体支持体とは接触しておらずセルロース誘導体でありしかもその上にヒドロキシペルオキシドとグアヤックつまりヒドロペルオキシドの存在下でホースラディッシュペルオキシダーゼの作用時点で変色を受ける色素産生基質が固定化されている第２の固体支持体を含む装置の中に試料を入れる段階であって、試料中に存在する酵素的に活性なあらゆるアスパラギン酸プロテアーゼにより放出されたあらゆるホースラディッシュペルオキシダーゼが試料を通して第２の固体支持体へと拡散できることになるように試料が、第１及び第２の固体支持体と接触するような形で装置の中に入れられる段階；及び試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在を表示するものである変性をグアヤックが受けているか否かを観察する段階、が含まれている。
前述の通り、当業者にとっては、アスパラギン酸プロテアーゼの特異性を増大させるために特定の反応条件（例えばリンカー分子の選択、固体支持体、pH、緩衝液容量、緩衝液同一性、塩など）及び特異的阻害物質を使用することができるということは直ちに明白になるだろう。例えば約2.5〜約5.0のpHでアスパラギン酸プロテアーゼについて検定することにより、数多くのチオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びアルカリ性プロテアーゼ全体にわたりアスパラギン酸プロテアーゼを選択的に検出することができる。さらにメタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ及び酸性又はアルカリ性プロテアーゼの阻害物質を付加することによって、アスパラギン酸プロテアーゼを選択的に検出することができる。
本発明のさらにもう１つの態様においては、標本中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによってカンジダ症を検出するための方法が提供されており、この方法には、（ａ）アスパラギン酸プロテアーゼの作用時点で放出されるような形で上に固定化されたリポーター酵素を有する固体支持体と試料を接触させる段階；（ｂ）リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものである指示薬と、固体支持体と接触した後の試料を組合わせる段階、及び（ｃ）試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在ひいてはカンジダ症の存在を表示するものである検出可能な変化を指示薬が受けているか否かを観察する段階、が含まれている。
本発明のこの方法において使用されるリポーター酵素又は標識酵素は、あらゆるシグナル生成酵素すなわち、試料中に存在するあらゆるアスパラギン酸プロテアーゼ又はあらゆるその他のヒドロラーゼ活性により加水分解を不活性化させることを含む試料中のあらゆる作用物質による不活性化を受けていない目で見える又は検出可能な変化をもたらす活性をもつ酵素であり得る。このようなリポーター酵素としては、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミラーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。適切なリポーター又は標識酵素の選択は、当業者にとって直ちに明白になることだろう。本発明のこの方法においては、好ましいリポーター酵素はペルオキシダーゼである。特に、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、試料中に存在しうるアスパラギン酸プロテアーゼ又はその他の数多くの周知のプロテアーゼによって容易に加水分解されないことから、現在好まれているリポーター酵素である。
リポーター酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼの作用時点で放出されるような形で、固体支持体すなわち不溶性マトリクス、ゲル又は樹脂上に固定化される。本発明に従った固体支持体には、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エススチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカルボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。請求されている発明のこの方法において現在好まれている固体支持体は、キチン、ポリアクリレート、セルロース、及びその誘導体そしてセファロースである。固体支持体上のリポーター酵素の固定化は、当業者にとって既知で理解しているものである従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
リポーター酵素は、酵素的に活性であるアスパラギン酸プロテアーゼのための加水分解可能な基質であるリンカー分子の使用を通して固体支持体上に固定化されうる。本発明のこの方法においては、このようなリンカー分子にはタンパク質及びペプチドが含まれ、タンパク質が好まれるリンカー分子である。リンカー分子がタンパク質である場合、好ましいタンパク質には、アゾカゼイン、カゼイン、Ｋ−カゼイン、免疫グロブリン、ヘモグロビン、ミオグロビン、アルブミン、エラスチン、ケラチン及びコラーゲンが含まれがこれらに制限されるわけではない。請求されている発明のこの方法の好ましい実施態様においては、リンカー分子はＫ−カゼイン、カゼイン、ヘモグロビン又はミオグロビンである。
指示薬は、試料又は供試体中に酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼが存在するときに起こる反応の結果又は反応の完結の結果として検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種であってよい。結果として得られる検出可能な変化は、試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在を表示するものであり、又試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在はカンジダ症の症状を表わしている。
好ましい指示薬は視覚的指示薬、特に色原体指示薬、すなわち、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼにより固体支持体から放出された場合のリポーター又は標識酵素の作用時点でそうでなければ無色である材料において色を形成させることを含む変色が、この検出可能な変化であるような指示薬である。代替的には、リポーター酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼの作用によって固体から放出された時点で、螢光シグナル、リン光シグナル、生体発光シグナル、化学発光シグナル又は電気化学シグナルの形成の触媒として作用することができるものであってよい。さらに、リポーター酵素は、例えば、凝塊、凝集、沈でん又は清澄化ゾーンといったその他の視覚的又は検出可能なシグナルを産生することのできるものであってよい。これらのケースにおいては、指示薬は、望ましい検出可能な変化をもたらすためにリポーター酵素によって必要とされる化学的種又は基質となる。
リポーター又は標識酵素としてペルオキシダーゼが使用される場合、視覚指示薬として、多様な色素産生指示薬（すなわち色原体）及び類似の効果をもつその他の種を使用することができる。本発明に従った好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルフォン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルフォン酸のうちの１つを含むもののこれらに制限されるわけではない色原体及びヒドロペルオキシドを含んで成る。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシド及びグアヤックつまりその還元状態で無色でありその酸化状態で深青色である色原体で構成されている。任意には、グアヤックを、例えば溶剤抽出によって使用に先立ち精製することができる。いずれかの与えられたリポーター酵素のための最も適切な色素産生指示薬は、そのリポーター酵素が触媒として作用するか又は開始させることのできる単数又は複数の反応によって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者にとって直ちに明白となることだろう。前述のように、視覚的指示薬が色素産生指示薬の場合、液体色原体系他は固体色原体系のいずれかを利用することが可能である。
本発明のさらにもう１つの態様においては、試料中の酵素的に活性なチオールプロテアーゼの存在について検定することによって膣トリコモナスを検出するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）酵素的に活性なチオールプロテアーゼの作用時点で放出されるような形で上に固定化されたリポーター酵素を有する固体支持体と試料を接触させる段階；（ｂ）リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものである指示薬と、固体支持体と接触した後の試料を組合わせる段階；及び（ｃ）試料中の酵素的に活性なチオールプロテアーゼひいては膣トリコモナスの存在を表示するものである検出可能な変化を指示薬が受けているか否かを観察する段階、を含んで成る。
前述の方法の場合と同様に、本発明のこの方法において使用されるリポーター酵素又は標識酵素は、あらゆるシグナル生成酵素すなわち試料中に存在するあらゆるヒドロラーゼ活性により加水分解を不活性化することを含め試料中のあらゆる作用物質による不活性化を受けない視覚的又は検出可能な変化をもたらす活性を有する酵素であってよい。かかるリポーター酵素としてはペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。適切なリポーター又は標識酵素の選択は、当業者には直ちに明白となることだろう。本発明のこの方法において、好ましいリポーター酵素はペルオキシダーゼ特にホースラディッシュペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、酵素的に活性なチオールプロテアーゼの作用時点でリポーター酵素が固体支持体から放出されるような形で、固体支持体すなわち不溶性マトリクス上に固定化されている。本発明に従った固体支持体としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。請求されている発明のこの方法において現在好まれている固体支持体としては、キチン、ポリアクリレート、セルロース及びその誘導体そしてセファロースが含まれる。固体支持体上のリポーター酵素の固定化は、当業者にとっては既知で理解しているものである従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
リポーター酵素は、酵素的に活性なチオールプロテアーゼのための加水分解可能な基質であるリンカー分子の使用を通して固体支持体上に固定化され得る。本発明のこの方法において、このようなリンカー分子にはタンパク質及びペプチドが含まれ、タンパク質が好ましいリンカー分子である。リンカー分子がタンパク質である場合、好ましいタンパク質には、アゾカゼイン、カゼイン、Ｋ−カゼイン、免疫グロブリン、ヘモグロビン、ミオグロビン、アルブミン、エラスチン、ケラチン及びコラーゲンが含まれるが、これらに制限されるわけではない。請求されている発明のこの方法の好ましい実施態様において、リンカー分子はＫ−カゼイン、カゼイン、ヘモグロビン又はミオグロビンである。
指示薬は、試料又は標本中に酵素的に活性なチオールプロテアーゼが存在する場合に起こる反応の結果又は反応の完結の結果としての検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種であってよい。結果として得られる検出可能な変化は試料中の酵素的に活性なチオールプロテアーゼの存在を表示するものであり、又試料中の酵素的に活性なチオールプロテアーゼの存在は膣トリコモナスの存在を表わしている。
好ましい指示薬は視覚的指示薬特に色素産生指示薬すなわち、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼにより固体支持体から放出されたときのリポーター又は標識酵素の作用時点で、そうでなければ無色の材料の中で色を形成させることを含む変色がこの検出可能な変化であるような指示薬である。代替的には、リポーター酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼの作用により固体支持体から放出された時点で螢光シグナル、リン光シグナル、生体発光シグナル、化学発光シグナル又は電気化学シグナルの形成を触媒することができるものであってよい。さらに、リポーター酵素は、例えば凝塊、凝集、沈でん又は清澄化ゾーンといったその他の目に見える又は検出可能なシグナルを生成することができるものであってもよい。これらのケースでは、指示薬は、望ましい検出可能な変化をもたらすためリポーター酵素によって必要とされる化学的種又は基質となる。
リポーター又は標識酵素としてペルオキシダーゼが使用される場合、視覚的指示薬として、多様な色素生産指示薬（すなわち色原体）及び類似の効果をもつその他の種を使用することができる。本発明に従った好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルホン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルフォン酸のうちの１つを含むもののこれらに制限されるわけではない色原体とヒドロペルオキシドを含んで成る。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシドとグアヤックつまりその還元状態で無色でその酸化状態で深青色である色原体で構成されている。いずれかの与えられたリポーター酵素のための最も適切な色素産生指示薬は、リポーター酵素が触媒として作用するか又は開始させることのできる単数又は複数の反応によって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者にとって直ちに明白となることだろう。前述の通り、視覚的指示薬が色素産生指示薬である場合、液体色素産生系又は固体色原体系のいずれかを利用することが可能である。
アスパラギン酸プロテアーゼ検定の場合と同様に、チオールプロテアーゼ活性及び特異性を増大させるため、或る種の反応条件及び特異的阻害物質を使用することが可能である。例えば、チオールプロテアーゼのみが機能しかくして検出されうるように、試験系に対して阻害物質（例えばアスパラギン酸プロテアーゼを阻害するためのペプスタチン、トリプシンを阻害するための大豆トリプシン阻害物質、メタロプロテアーゼを阻害するためのEDTA又はその他のキレート化剤、或いは非チオールタンパク質プロテアーゼの既知の数多くの自然発生阻害物質のいずれか）を付加することが可能である。さらに、約7.4のpHで検定することにより、数多くのチオールプロテアーゼは活性となるが、アスパラギン酸プロテアーゼは不活性化状態となる。
本発明のリポーター酵素放出技術を試料中のヒドロラーゼ阻害物質の存在又は不在を検出するためにも利用できるということに留意することが大切である。血圧調節、血液凝固、細菌複製などを含む多くの生物学的プロセスに、非常に特異的で入念に加減されたヒドロラーゼの使用が関与している。その上、数多くの薬物、殺虫剤及び除草剤などが特定のヒドロラーゼを阻害することによって機能することがわかっている。或る種の状況下では、ヒドロラーゼを阻害する治療薬の血中濃度を決定すること又は製品の中の潜在的な殺虫剤ヒドロラーゼ阻害物質汚染の存在を決定することがきわめて望ましい。これらのケースでは、従って、ヒドロラーゼ自体ではなくむしろヒドロラーゼ阻害物質を検出することが必要である。
従って、本発明のもう１つの態様においては、試料中の標的ヒドロラーゼの阻害物質の存在について検定するための方法が提供されており、この方法は、（ａ）阻害物質の存在によって標的ヒドロラーゼが不活性化されない場合、標的ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で上に固定されたリポーター酵素を有する固体支持体及び標的ヒドロラーゼと試料を接触させる段階；（ｂ）リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものである指示薬と、標的ヒドロラーゼ及び固体支持体と接触した後の試料を組合わせる段階；及び（ｃ）試料中の標的ヒドロラーゼの阻害物質の不在を表わすものである検出可能な変化を指示薬が受けているか否かを観察する段階、を含んで成る。
試料中のヒドロラーゼ阻害物質の存在を検出するため、試験系には規定量の標的ヒドロラーゼが取込まれ、試験の実施には、標的ヒドロラーゼを阻害する試料の能力を検出することが関与する。試料中に標的ヒドロラーゼ阻害物質が存在しない場合、標的ヒドロラーゼは固体支持体からリポーター酵素を放出し、かくして指示薬中で検出可能な変化が生み出されることになる。換言すると、試料中に標的ヒドロラーゼ阻害物質が存在する場合、標的ヒドロラーゼは阻害されることになり、リポーター酵素は固体支持体から放出されず、指示薬中に検出可能な変化又は応答は生成されなくなる。試料中の阻害物質が、試験系に付加された標的ヒドロラーゼを完全に阻害することは不可欠なことではない。唯一必要なのは、予想される検出可能な応答の顕著な差異を生み出すのに充分な量の標的ヒドロラーゼ阻害が起こることである。
本発明のこの方法は、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ又はヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロ−ポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼの阻害物質を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）加水分解酵素の既知のあらゆる阻害物質の存在又は不在について検定するのに使用することが可能である。好ましい実施態様においては、この方法を、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質、セリンプロテアーゼ阻害物質、チオールプロテアーゼ阻害物質、メタロプロテアーゼ阻害物質及びプロテアーゼ阻害物質及びアルカリ性プロテアーゼ阻害物質を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）プロテアーゼ阻害物質の存在について検定するために使用している。さらに好ましい実施態様においては、この方法は、例えばペプスタチン、オホマクログロブリン、ハロペリドール、遷移状態擬似体、Ｕ-81749，Ｈ-261，MV7-101，Ａ-75925，Ａ-76928及びＡ-7003といったアスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質の存在について検定するのに用いられる。Ｕ-81749，Ｈ-261，MV7-101，Ａ-75925，Ａ-76928及びＡ-7003は、文献中で以前に記述されてきた実験的薬物である。本発明のこの方法のさらに好ましい実施態様においては、ペプスタチンが、その存在を検出中のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質である。
本発明のこの方法に従うと、標的ヒドロラーゼとしては、プロテアーゼ、プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ又はヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼが含まれるがこれらに制限されるわけではない。上述の方法において使用される特定の標的ヒドロラーゼは、どの阻害物質が検出中であるかによって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者には直ちに明らかとなることだろう。例えば、ペプスタチンが検出中の阻害物質である場合には、アスパラギン酸プロテアーゼが上述の試験系内で使用される標的ヒドロラーゼとなる。
本発明のこの方法において使用されるリポーター酵素又は標識酵素は、あらゆるシグナル生成酵素、すなわち、試験系内に取込まれている標識ヒドロラーゼによる加水分解の阻害を含め試料中のいずれかの作用物質による不活性化を受けていない目に見える又は検出可能な変化をもたらす活性をもつ酵素であってよい。かかるリポーター酵素としては、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミラーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。適切なリポーター又は標識酵素の選択は、当業者には直ちに明白になることだろう。本発明のこの方法において、好ましいリポーター酵素はペルオキシダーゼ、特にホースラディッシュペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、標的ヒドロラーゼが阻害物質の存在によって不活性化されない場合に標的ヒドロラーゼの作用時点で固体支持体からリポーター酵素が放出されるような形で、固体支持体すなわち不溶性マトリクス、ゲル又は樹脂上に固定化される。本発明に従った固体支持体には、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
リポーター酵素は、酵素的に活性な標的ヒドロラーゼのための加水分解可能な基質であるリンカー分子の使用を通して固体支持体上に固定化されうる。かかるリンカー分子には、タンパク質、炭水化物、脂質、ペプチド、エステル及び核酸が含まれるが、これらに制限されるわけではない。固体支持体にリポーター酵素を付着させるのに使用される特定のリンカー分子は、試験系にどの標的ヒドロラーゼを付加するかによって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者には直ちに明らかとなることだろう。
指示薬は、試料又は標本内の阻害物質の存在によって、酵素的に活性な標的ヒドロラーゼが不活性化されていない場合に起こる反応の結果又は反応の完結の結果としての検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種であってよい。好ましい指示薬は視覚的指示薬特に色素産生指示薬、すなわち、試料又は標本中の阻害物質の存在により不活性化されていないことを条件として酵素的に活性な標的ヒドロラーゼにより固体支持体から放出されたときのリポーター酵素又は標識酵素の作用時点でそうでなければ無色の材料の中に色を形成させることを含め変色がこの視覚的変化であるような指示薬である。
視覚的指示薬としては、多様な色素産生指示薬（すなわち色原体）及び類似の効果をもつその他の種を使用することができる。本発明に従ったペルオキシダーゼ様のリポーター酵素のための好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルホン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルフォン酸のうちの１つを含むもののこれらに制限されるわけではない色原体及びヒドロペルオキシドを含んでいる。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシドとグアヤックつまりその還元状態では無色でありその酸化状態では深青色である色原体で構成されている。前述の通り、視覚的指示薬が色素産生指示薬である場合、液体色原体系又は固体色原体系のいずれかを利用することが可能である。
本発明のもう１つの態様においては、試料中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在について検定するための試験装置が提供されており、この試験装置には、間に間隙を伴い内部に面する表面をもつ第１及び第２の相対する壁により少なくとも一部が構成され、この第１の壁、第２の壁又はその両方が光透過性材料でできているレセプタクル；ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で第１の壁及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上で固体支持体上に固定化されたリポーター酵素；リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものであり、第１及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上に含まれている指示薬；及び試料の導入のためのレセプタクル内の開口部、が含まれている。
本発明のこの態様に従うと、レセプタクルは好ましくは平担で薄く、手でたやすく持つことのできるサイズのものである。従って、チャンバーは好ましくは同様に平担で浅く、幅及び長さはその深さよりもはるかに大きく、深さは実質的に一定である。チャンバーは好ましくは、上部表面及び下部表面の上の乾燥試薬コーティングと試料との間の最大限の接触を達成するため標本でのチャンバーの壁の自発的な湿潤化を促進するのに充分なほど浅いものである。このことは、試薬コーティングがチャンバーの上部表面と下部表面の両方に存在する場合に特に有利なことである。このようなケースでは、これらの表面の間の短いか定距離により、視覚的指示薬が塗布された表面とは反対の表面上の試薬が指示薬に達するために拡散する必要のある距離も最小限になることになる。
これらの考慮事項の中で、チャンバーの深さは、本発明にとって非常に重要なものではなく変動してもよい。大部分のケースにおいて、深さ約３ミルから約50ミル(0.003〜0.050インチ：0.0076〜0.127cm)、好ましくは約５ミルから約15ミル（0.005〜0.015インチ；0.0127〜0.038/cm）のチャンバーが最良の結果をもたらすことになる。いずれかの与えられた深さについて、チャンバーの側面方向寸法（すなわちその側壁間の間隔）は、装置が収容することになる試料のサイズを規定することになり、そうでなければ装置の外部表面上の目に見える試験部域のサイズ及び形状を規定するため以外重要ではない。かくして側面方向寸法は、見ることができるほど充分に大きいものの適正なサイズの標本で完全に充てんされるように充分小さいものである試験部域を提供することになる。標本のサイズは、標本のタイプ及びその供給源及びサンプリング方法と共に変動する。標準的な構造においては、チャンバーの側面方向面積が約0.1cm2〜約10cm2又は好ましくは約0.3cm2〜約３cm2の範囲になるように考えられている。標準的な構造内のチャンバーの内部容積は、同様にして変動し、大部分の試料タイプについて、約３μｌから約300μｌの範囲の容積が最も適切でかつ便利である。
本発明の試験装置は、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ−又はヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロ−ポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼを含むもののこれらに制限されるわけではないあらゆる既知の加水分解酵素の存在について検定するために使用することができる。好ましい実施態様においては、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及び酸性又はアルカリ性プロテアーゼを含むもののこれらに制限されるわけではないプロテアーゼの存在について検定するために本発明の試験装置を使用することができる。もう１つの好ましい実施態様においては、本発明の試験装置は、キチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ及びリゾチームを含むもののこれらに制限されるわけではないホモ−又はヘテロ−オリゴサッカリダーゼ又はホモ又はヘテロ−ポリサッカリダーゼの存在について検定するために本発明の試験装置を使用することができる。
試験装置内で使用されるリポーター酵素又は標識酵素は、あらゆるシグナル生成酵素すなわち、試料中に存在するあらゆるヒドロラーゼ活性による加水分解の不活性化を含め試料中のあらゆる作用物質による不活性化を受けていない検出可能な変化をもたらす活性を有する酵素であってよい。このようなリポーター酵素としては、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミラーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されているわけではない。適切なリポーター又は標識酵素の選択は、当業者には直ちに明白になることだろう。現在好まれているリポーター酵素は例えばホースラディッシュペルオキシダーゼといったペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、存在を検出中であるヒドロラーゼの作用時点で固体支持体から放出されるような形で、第１の固体支持体すなわち不溶性マトリクス、ゲル又は樹脂の上に固定化される。本発明に従った好ましい固体支持体としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。第１の固体支持体上のリポーター酵素の固定化は、当業者にとって既知であり理解しているものである従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
リポーター酵素は、第１の固体支持体に直接付着させてもよいし、或いは代替的に、検出中の酵素的に活性なヒドロラーゼのための基質である加水分解可能なリンケージをもつリンカー分子の使用を通して第１の固体支持体上にリポーター酵素を固定化させることもできる。このようなリンカー分子には、タンパク質、炭水化物、脂質、ペプチド、エステル及び核酸が含まれるが、これらに制限されるわけではない。第１の固体支持体に対してリポーター酵素を付着するために使用される特定のリンカー分子は、どのヒドロラーゼが検出中であるかによって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は当業者には直ちに明白になることだろう。
本発明の試験装置においては、指示薬は第１の固体支持体と接触していない第２の固体支持体の上に固定化される。本発明に従った好ましい固体支持体としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。第２の固体支持体上の指示薬の固定化は、当業者にとって既知の従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
指示薬は、試料又は標本中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在するときに起こる反応の結果又は反応の完結の結果としての検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種であってよい。従ってこの検出可能な変化は、試料又は標本の中に特定中の酵素的に活性なヒドロラーゼが存在することの表示である。好ましい指示薬は視覚的指示薬特に色素再生指示薬すなわち、存在が検出中であるヒドロラーゼにより固体支持体から放出されたときのリポーター又は標識酵素の作用時点で、そうでなければ無色である材料中で色を形成させることを含む変色がこの目に見える変化であるような指示薬である。代替的には、リポーター酵素は、ヒドロラーゼの作用によって固体支持体から放出された時点で螢光シグナル、リン光シグナル、生体発生シグナル、化学発光シグナル又は電気化学シグナルの形成の触媒として作用することのできるものであってよい。さらにリポーター酵素は、例えば凝塊、凝集、沈殿又は清澄化ゾーンといったその他の目に見える又は検出可能なシグナルを生成することのできるものであってよい。これらのケースにおいて、指示薬は、望ましい検出可能な変化をもたらすためリポーター又は標識酵素により必要とされる化学的種又は基質となる。
視覚的指示薬としては、多様な色素産生指示薬（すなわち色原体）及びその他の類似の効果をもつ種を使用することができる。リポーター又は標識酵素としてペルオキシダーゼが使用される場合、好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルホン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルホン酸のうちの１つを含むもののこれらに制限されるわけではない色原体及びヒドロペルオキシドを含んで成る。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシドとグアヤックつまりその還元状態で無色でありその酸化状態では深青色である色原体で構成されている。任意には、グアヤックを、使用に先立ち例えば溶剤抽出によって精製することができる。いずれかの与えられたリポーター酵素のための最も適切な色素産生指示薬は、リポーター酵素が触媒として作用するか又は開始させることのできる単数又は複数の反応によって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者には直ちに明らかとなるだろう。
視覚的指示薬が色素産生指示薬である場合、固体色原体系が利用される。この固体色原体系は、ヒドロペルオキシド、ペルオキシダーゼの存在下でヒドロペルオキシドにより酸化されうる色原体、及び色原体が含浸されるか又は固定化され乾燥された固体支持体を含んで成る。この系では、色原体を、Hemoccult▲Ｒ▼スライドで行なわれる通り吸収しやすい紙又は支持体上に含浸させることもできるし、或いは代替的に、薄い層の形でプラスチック又はその他のシート上に被着させることもできる。この後者の方法では、色原体は、重合体材料（例えばヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースなど）を含む溶液として層状化されうる。色原体自体が水溶性色原体である場合、これは水に溶けない材料のマトリクスの中に捕獲されうる。代替的に、色原体自体が水に溶けない場合、これは、単独か又は水溶性又は非水溶性重合体と組合わせた形で有機溶剤中の溶液として層状化されうる。
この特定の色原体系では、固体形（例えばヒドロ過酸化チタン）でヒドロペルオキシドを提供することもできるし、或いは装置内で現位置で生成させることもできる。例えば、試験装置の内部に面する表面上で乾燥グルコース及びグルコースオキシダーゼを層状化することにより現位置で過酸化水素を生成させることが可能である。代替的には、試験装置の内部に面する表面上にアルコール中の過ホウ酸ナトリウムの懸濁液を層状化させることにより現位置で過酸化水素を生成させることができる。低いpHでは、過ホウ酸ナトリウムが自然発生的に過酸化水素を放出する。ヒドロラーゼにより第１の固体支持体から放出された時点でのペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）及び過酸化水素の存在下で、色原体は酸化され、視覚的に検出可能な変色が結果としてもたらされることになる。前述の通り、結果として得られたこの変色は、試料又は標本の中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在することの表示である。
当業者にとっては、ヒドロラーゼ活性及び特異性を増大し試料中に存在しうる異なるヒドロラーゼの間での区別を行なうべく、ここで請求されている試験装置の反応条件（例えば固体支持体及びリンカー分子、pH、緩衝液容量、緩衝液同一性、塩など）を修正及び調節することが可能であるということは直ちに明白となるだろう。さらに、当業者には、ヒドロラーゼ活性及び特異性を増大させるため又は試料中の異なるヒドロラーゼの間での区別を行なうため、ここで請求されている試験装置に対して特異的酵素阻害物質を付加することができるということも直ちに明らかとなるであろう。
試験装置には、標本がチャンバーに入れられるときに通る試料導入口が具備されている。この導入口は好ましくは、視覚的指示薬の変化がそれを通して観察される同じ壁すなわち光透過性壁の中にある。導入口は、試料をその供給源から搬送するのに用いられる移送装置を収容するように形作られることになり、導入口は、使用される可能性のあるさまざまなタイプの移送装置のいずれにでも適合するように変動させることができる。移送装置の例としては、注射器、ピペット、綿棒、及び翼鏡がある。当業者ならその他のものもすぐに思いつくだろう。一般に円形導入口が適当であるが、綿棒といった移送装置のためには、導入口は、より容易に標本を放出するべくそれに沿って移送装置をかき取ることができる真直ぐな縁部を含んでいてもよい。
試験装置の好ましい実施態様には、チャンバーを充てんしかくして全ての試薬を標本と接触した状態におくのに必要とされる流動的移動をさらに促進する付加的な特長が含まれている。かかる特長の１つは、空気の漏出を可能にするためチャンバー内に単数又は複数の通気元を内含させることにある。この通気穴は、標本によって湿潤化される表面積を最大限にするため試料導入口から適切な距離がとられることになる。チャンバー内で試験部域に水平に隣接する位置に標本により活性化された正及び負の対照が含まれている装置においては、偽った又はあいまいな読取りをことごとく避けるため標本が両方の対照に確実に到達しこれらを充てんするように、通気穴を配置することになる。以下で論述する通り、装置の１つの好ましい配置は、正及び負の対照が、各々試験部域とまさに共通の境界を共有しているにもかかわらず、互いと共通の境界を共有しないように、対照部域の間に試験部域を置くというものである。この配置では、試料導入口は最も適切には、試験部域のすぐ上の壁の中の１つの場所に置かれ、１つの通気穴は、これらの部域の外側端部又はその近くで２つの対照部域の各々より上に置かれ、かくして標本はまず最初に試験部域を充てんしその後で両方の制御部域を充てんするようになっている。
本発明の好ましい実施態様において流動的な移動を促進するもう１つの特長は、チャンバーの内部表面に沿って表面活性剤を置くことである。この作用物質は、チャンバーの上部表面と下部表面のいずれか一方；好ましくは両方に沿って存在してよく、表面上に最も内側の薄層又はコーティングを含む支持体マトリクス内の乾燥溶質として含まれていてよい。場合によっては、薄層は同様に試験反応に参与する単数又は複数の試薬も含むことになる。又その他のケースでは、表面活性剤は薄層の唯一の機能的構成成分となる。
表面活性剤は、大部分の生物学的標本と同様に、水ベースである標本のために有用となる。適当な表面活性剤は、固体形状にされうるものであり、表面活性効果をもつ多様な物質を使用することができる。物質は一般に洗剤、湿潤剤又は乳化剤であり、陰イオン、陽イオン、双性イオン及び非イオン物質を含め、化学構造及び電子特性において大幅に変動するものである。例を挙げると、亜硫酸アルキル−アルコキシ、スルホン酸アルキルアリル、グリセロール脂肪酸エステル、ラノリンベースの誘導体、ポリオキシエチレンアルキルフェノール、ポリオキシエチレンアミン、ポリオキシエチレン脂肪酸及びエステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコール及びエーテル、ポリ（エチレングリコール）脂肪酸及びエステル、ポリオキシエチレン脂肪エステル及び油、ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレン縮合物及びブロック重合体、ソルビタン脂肪酸エステル、スクシネートのスルフォ誘導体、アルキルグルコシド及びコール酸誘導体、がある。これらのクラスのいくつかに入る製品の商品名はLubrol，Briy，Tween，Tergitol，Igepal，Triton，Teepol及びその他数多くのものである。
指示薬と試薬薄層の両方の固体薄層の形成は、液体形で薄層材料を塗布しその後続いて乾燥又はその他の固化を行なうことによって行なわれる。物質の液体形は、例えば、溶液、懸濁液又は物質の硬化していない液体状態であり得、従って固化段階というのは溶剤の蒸発又は物質の硬化が考えられる。問題の物質は、例として以下に記すさまざまな目的のいずれかのために又はこれらの目的全てを同時に達成するために、付加的な材料と組合わせることができる：
（１）液体の粘度を修正することにより表面に対する液体の塗布を容易にする。
（２）経時的に又はその上に付加的な層を塗布した時点で均質にとどまり崩壊又は造粒することのない連続した平滑な固体層を形成する一助となる。
（３）上に塗布されるべき層内で使用される溶剤で層の溶解度を修正するか、又は下に塗布された層を溶解しない溶剤内で可溶な層を作る。
これらの目的の１つ又は全てに役立つよう好まれる添加剤は、可溶性重合体材料である。その例としてはセルロース及びさまざまなセルロース誘導体があり、望ましい溶解性特性を達成するため適切に置換が選択される。水性又はその他の水ベースの試料のために設計された試験装置については、指示薬薄層は、好ましくは、水中に溶けない固体材料のマトリクス内に保持された指示薬を含んでいる。こうして、指示薬が薄層から外へ、光透過性表面から離れるように移動するのを妨げることができる。しかしながら代替的には、指示薬自体は水中に溶けず、それ自体、無傷な状態にとどまることになる凝集性の薄層を形成する。
正の対照指示薬、負の対照指示薬又はその両方が装置内に含まれている発明の実施態様のためには、各々の対照について単数又は複数の付加的な試薬が包含されることになる。
これらの付加的な試薬は、既存の薄層の１つの中でこの薄層の水平に規定された部分の中に取り込まれるか又は既存の薄膜の水平に規定された部分全体にわたり別々の垂直に隣接する薄層として塗布されることになる。従って、チャンバー内のそれらの位置のため、これらの付加的な試薬は、互いから及び試験部域から水平に離隔した対照部域を構成する。
正又は負の対照のための適切な試薬の選択は、全体的試験が向けられているヒドロラーゼ、ヒドロラーゼの存在を検出するために用いられる視覚的指示薬のタイプそして、試薬が正の対照又は負の対象のいずれとして役立つことを意図されたものであるかによって左右されることになる。既知の化学を利用することにより、適切な試薬の選択は、当業者にとって大部分のケースにおいて明白なものとなるだろう。例えば、正の対照のための試薬は、ヒドロラーゼ自体の試料であっても、ヒドロラーゼの類似体であっても、又は指示薬内の検出可能な変化を完結させる反応又は反応シーケンスを開始させるか又は誘発する平行な作用様式をもつその他のいずれの種であってもよい。この試薬を含む薄層は、標本が存在するまで試薬が検出可能な変化を開始又は誘発せず、標本中の酵素的に活性なヒドロラーゼの存在又は不在とは無関係にそれを行なうことを条件として、チャンバーの上部又は下部表面のいずれかの上にくる。同様に、負の対照のための試薬は、反応又は反応シーケンスを防止又は遮断しかくして試料又は標本の中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在するか否かにかかわらず、検出可能な変化が起こるのを妨げる、変性、阻害又はその他の形で不活性化する作用物質といったような阻害種でありうる。
両方の対照共、標本が試験装置に適用された時点で活性化される。いくつかのケースにおいて、これは、その他の試薬を含む薄層と同じ表面上で薄層内に対照試薬を置くことによって最も効果的に達成される。その他のケースでは、対照試薬と残りの試薬が空隙によって分離されるように、その他の試薬を支持するものと反対側のチャンバー表面上の薄層内に対照試薬が置かれた場合に最良の結果が達成される。好ましい実施態様においては、装置の対照部域は、試験部域内で用いられるものと同じ薄層のうちの１つ又は複数のものの水平に輪郭どりされた区分の中に取り込まれているか又はこのような水平に輪郭どりされた区分全体にわたり別の薄層として塗布された、対照試薬が付加された状態で、試験部域内で用いられた全ての構成成分及び試薬を含むことになる。対照部域のための鮮明な境界を達成し、対照試薬が試験部域を活性化又は非活性化しないようにするため、対照試薬がそのそれぞれの対照部域から外に側方に拡散する可能性を最小限におさえるか又は無くするように、対照部域を試験部域から分離している境界において薄層内に不連続性を置くことが往々にして有益である。これらの不連続性は、上部表面、下部表面又はその両方に沿って層内に存在していてよい。
上述の通り、対照は好ましくは、試験に用いられるものと同じ標本試料によって活性化される。これは、さまざまな部域の間に障害物の無い流動的な連絡が保たれた状態で、全て試験装置内の同じチャンバー内に含まれた試験部域の拡張部分として対照部域を配置することによって、都合よく行なわれる。正及び負の対照部域の両方が内含されている好ましい実施態様においては、対照部域は、２つの間に位置づけされている試験部域によって互いから分離されている。一回の塗布で全ての部域を充てんすることは、上述の試料導入口及び通気穴の配置により達成できる。検出可能な変化又はその不在は装置の光透過性壁を通して検出可能であることから、正及び負の対照としての部域の同定は、装置の外部表面上に適切な印を置くことによって都合よく達成される。
光透過性壁は、指示薬薄層を支持するのに充分剛性でかつ不活性であり、それでもなお指示薬内に変化が起こった時点で直ちにそれを示すよう充分光を透過するあらゆる材料であってよい。半透明の又は透明の材料、好ましくは非吸収性の材料も使用できるが、透明材料が好ましい。この用途に適した透明な重合体材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート（例えば、Mylar▲Ｒ▼）及びポリカーボネート（例えば、Lexan▲Ｒ▼）がある。装置の反対側の（すなわち底面の）壁は同様にして透明又は半透明の材料で作られていてよいが、試験結果ならびに正及び負の対照の視覚化が装置の片側からのみ必要とされることから、不透明な材料でできていてもよい。底面積が透明である場合、試験部域、対照部域又はその両方の中の変化の上面積を通しての検出は、色のコントラストを強めるためカラー又は反射性材料で底面壁のいずれかの表面に対して印刷又はコーティングを適用することにより増強できる。
試験装置はさまざまなやり方で形成できる。チャンバーの形状を規定するための適切なカットアウト及び試料導入口及び通気穴のための穴を伴って、重合体材料シートを合わせて積層することが可能である。チャンバーの深さならびにその形状及び側面方向寸法は、このとき中央シートの厚みにより規定されることになり、一方穴の位置は上面シートによって制御されることになる。シートが層状材料の形に組立てられる前に、必要に応じて上面シート、底面シート又はその両方に対して指示薬及び試薬コーティングを適用することができる。次に例えばヒートシールによって又は接着剤の使用を通してといった従来のあらゆる手段によりシートを合わせて固定することができる。
装置を形成する特に好ましい方法は、チャンバーの内部表面内で恒常な深さのくぼみ又は押し跡を含むよう、機械的又は化学的にエンボシング又はその他の加工がシートの一区分に施された状態で、透明又はその他の形で光を透過する重合体材料の単一のシートを使用することである。このくぼみはシートの片方の半分上に位置づけされ、もう１方の半分には試料導入用穴及び通気穴が具備されている。指示薬及び試薬のコーティングは、シート上の適切な場所で施され、このとき穴を含む半分がもう一方の半分の上に折り畳まれて閉鎖されたチャンバーを形成しかつチャンバーの上部及び下部表面を表わす部域の適正なアライメントを達成する。シートの向かい合う表面は、前段落の層状材料の場合と同様に合わせて接着される。
２つの半分を合わせて接着させるための好ましい方法は、感熱性、感圧性、水ベース又は溶剤ベースの接着剤の使用によるものである。この接着剤は、試薬との接触を避けるためチャンバーに対して周辺の部域に制限されていてもよいし、或いは又、指示薬及び試薬コーティングの適用に先立って塗布されて、シートの全表面をカバーすることもできる。後者の場合、適切な接着剤は、透明で不活性で、その上に適用されるべき層によって湿潤化されうる又はその他の形でこの層と相溶性のある接着剤となる。この応用分野に適した多くのタイプの接着剤が存在し、最も適切な選択肢は、その上に適用されるべき層に応じて系毎に変わる。
本発明のさらにもう１つの態様では、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによりカンジダ症の存在について試料を試験するための試験装置が提供されており、この試験装置は、間に間隙を伴い内部に面する表面をもつ第１及び第２の相対する壁により少なくとも一部が構成され、この第１の壁、第２の壁又はその両方が光透過性材料でできているレセプタクル；アスパラギン酸プロテアーゼの作用時点で放出されるような形で第１及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上で固体支持体上に固定化されたリポーター酵素；リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものであり、第１及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上に固定化されている指示薬、及び試料の導入のためのレセプタクル内の開口部、を含んで成る。
この試験装置内で使用されるリポーター酵素又は標識酵素は、試料中に存在するあらゆるアスパラギン酸プロテアーゼ活性又はその他のヒドロラーゼ活性による加水分解を含め試料中のあらゆる作用物質による不活性化を受けないあらゆるシグナル生成酵素でありうる。かかるリポーター酵素には、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミラーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。現在好まれているリポーター酵素は、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼといったペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼの作用時点で放出されるような形で、第１の固体支持体すなわち不溶性マトリクス、ゲル又は樹脂の上に固定化されている。リポーター酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼのための基質である加水分解可能なリンケージを有するリンカー分子の使用を通して固体支持体上に固定化されうる。この試験装置においては、このようなリンカー分子としてはタンパク質及びペプチドが含まれており、好ましいリンカー分子はタンパク質である。リンカー分子がタンパク質である場合、好ましいタンパク質としては、アゾカゼイン、カゼイン、Ｋ−カゼイン、免疫グロブリン、ヘモグロビン、ミオグロビン、アルブミン、エラスチン、ケラチン及びコラーゲンが含まれるがこれらに制限されるわけではない。この試験装置の好ましい実施態様においては、リンカー分子はＫ−カゼイン、カゼイン、ヘモグロビン又はミオグロビンである。
本発明のこの試験装置においては、指示薬は、第１の固体支持体と接触していない第２の固体支持体上に固定化されている。本発明に従った好ましい固体支持体としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。第２の固体支持体上の指示薬の固定化は、当業者にとって既知の従来の方法及び手順を用いて行なわれる。
指示薬は、試料又は標本中に酵素的に活性なヒドロラーゼが存在するときに起こる反応の結果又は反応の完結の結果としての検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種でありうる。結果として得られた検出結果な変化は、試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在を表示するものであり、一方試料中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在は、カンジダ症の存在を表わしている。好ましい指示薬は視覚的指示薬特に色素産生指示薬すなわち、その存在を検出中である酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼにより固体支持体から放出されたときのリポーター又は標識酵素の作用時点でそうでなければ無色である材料の中で色が形成されることを含む変色がこの検出可能な変化であるような指示薬である。
視覚的指示薬としては、多様な色素産生指示薬（すなわち色原体）及びその他の類似の効果をもつ種を使用することができる。使用中の放出可能なリポーター酵素がペルオキシダーゼである場合の本発明に従った好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチアゾリン−６−スルホン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルホン酸のうちの１つを含むもののこれらに制限されるわけではない色原体とヒドロペルオキシドを含んで成る。特に好ましい色素産生指示薬は、その還元状態で無色でありその酸化状態で深青色であるグアヤックとヒドロペルオキシドで構成されている。
視覚的指示薬がペルオキシダーゼ又はプソイドペルオキシダーゼのための色素産生指示薬である場合、固体色原体系が利用され、かかる系は、ヒドロペルオキシド、ペルオキシダーゼの存在下でヒドロペルオキシドにより酸化され得る色原体及び、色原体が含浸されるか固定化され乾燥された固体支持体を含んで成る。この系において、色原体は、Hemoccult▲Ｒ▼スライドで実施されているように吸収しやすい紙又は支持体上に含浸されていてもよいし、或いは代替的に、薄い層の形でプラスチック又はその他のシート上に被着されてもよい。後者の方法においては、色原体は、重合体材料（例えばヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロースなど）を含む溶液として層状化されることになる。色原体自体が水溶性色原体である場合、水に溶けない材料のマトリクス内にこれを捕獲させることができる。代替的には、色原体自体が水に溶けないものである場合、単独で又は水溶性又は非水溶性重合体との組合わせの形で有機溶剤中の溶液としてこれを層状化させることができる。
この固体色原体系において、ヒドロペルオキシドを固体形（例えばヒドロ過酸化チタンなど）で提供することもできるし、又は、試験装置内で現位置で生成することもできる。酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼにより第１の固体支持体から放出された時点でのヒドロペルオキシド及びペルオキシダーゼの存在下で、色原体は酸化され、視覚的に検出可能な変色が結果としてもたらされることになる。前述のように、結果としてもたらされるこの変色は、試料又は標本中の酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在の表示であり、一方この酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在はカンジダ症の存在を表わしている。
本発明の最後の態様においては、標的ヒドロラーゼの阻害物質の存在について試料を試験するための試験装置が提供され、この試験装置は、間に間隔を伴い内部に面する表面をもつ第１及び第２の相対する壁により少なくとも一部が構成され、この第１の壁、第２の壁又はその両方が光透過性材料でできているレセプタクル；阻害物質の存在による不活性化を受ける可能性があり、第１及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上に含まれている標的ヒドロラーゼ；標的ヒドロラーゼが阻害物質の存在により不活性化されない場合、標的ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で第１及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上で固体支持体上に固定化されたリポーター酵素；リポーター酵素の作用時点で検出可能な変化を受ける可能性のあるものであり、第１及び第２の壁のうちの１方の内部に面する表面上に含まれている指示薬；及び試料の導入のためのレセプタクル内の開口部、を含んで成る。
試料中のヒドロラーゼ阻害物質の存在を検出するためには、試験を実施する直前又は好ましくは試験装置の製造中に試験装置内に規定量の標的ヒドロラーゼを取り込む。試験の実施には、標的ヒドロラーゼを阻害する試料の能力を検出する作業が関与している。標的ヒドロラーゼ阻害物質が試料中に存在しない場合、標的ヒドロラーゼは固体支持体からリポーター酵素を放出させることになり、かくして指示薬中で検出可能な応答が生成される。換言すると、標的ヒドロラーゼ阻害物質が試料中に存在する場合、標的ヒドロラーゼは阻害され、リポーター酵素は固体支持体から放出されず、阻害物質中に検出可能な変化又は応答は生成されない。試料中の阻害物質が試験装置に付加された標的ヒドロラーゼを完全に阻害することは、不可欠なことではない。唯一必要とされるのは、予想される検出可能な応答の顕著な差を生成するのに充分な量の標的ヒドロラーゼ阻害が起こることである。試験装置の正及び負の対照要素は、完全に阻害された標的ヒドロラーゼ及び阻害を受けていない標的ヒドロラーゼの外観を例示するべく比較応答を提供している。
この酵素放出技術の感応性は、試験装置内に規定量の標的ヒドロラーゼを取込むことによって必要に応じて調整可能である。同様に望ましい場合、試料中のあらゆる阻害物質に対する標的ヒドロラーゼの露出時間は、標的ヒドロラーゼを固定化されたリポーター酵素から物理的又は化学的に分離することによって調節可能である。例えば、時限放出マトリクス、pH分解可能なコーティング又は比較的緩慢に溶解するその他の放出制御型材料の中の固定化されたリポーター酵素をコーティングすることにより、固定化されたリポーター酵素に対する標的ヒドロラーゼの時間的アクセスを制御することが可能である。代替的には、標的ヒドロラーゼは、試料中に存在しうるあらゆる阻害物質に直接アクセス可能である場所又は化学的形態で存在し得る。従って、標的ヒドロラーゼは、固定化されたリポーター酵素にアクセスする前にまず、阻害が起こるのに充分な時間阻害物質に対し露出され得る。固定化されたリポーター酵素に対するアクセスを時間的に調節することが可能であるため、試験結果は、緩慢に作用する阻害物質の存在さえ検出することができる。
本発明のこの試験装置は、プロテアーゼ又は（互換的に）プロティナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ又はヘテロオリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼの阻害物質を含むもののこれらに制限されるわけではない加水分解酵素の既知のあらゆる阻害物質の存在又は不在について試料を試験するのに使用することができる。好ましい実施態様においては、この試験装置は、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質、セリンプロテアーゼ阻害物質、チオールプロテアーゼ阻害物質、メタロプロテアーゼ阻害物質、酸性プロテアーゼ阻害物質及びアルカリ性プロテアーゼ阻害物質を含むもののこれらに制限されているわけではないプロテアーゼ阻害物質の存在について検定するのに使用される。さらに好ましい実施態様においては、この試験装置は、例えばペプスタチン、オホマクログロブリン、ハロペリドール、遷移状態擬似体、Ｕ-81749，Ｈ-261，MV7-101，Ａ-75925，Ａ-76928及びＡ-7003といったアスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質の存在について検定するために使用される。Ｕ-81749，Ｈ-261，MV7-101，Ａ-75925，Ａ-76928及びＡ-7003は、以前に文献中に記述されてきた実験的薬物である。本発明のこの試験装置のさらに一層好ましい実施態様においては、ペプスタチンが、存在を検出中のアスパラギン酸プロテアーゼ阻害物質である。
本発明のこの試験装置に従うと、標的ヒドロラーゼとしては、プロテアーゼ、プロティナーゼ、ペプダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ又はヘテロ−オリゴサッカリダーゼ、ホモ又はヘテロポリサッカリダーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ及びエステラーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。この試験装置内で使用される特定の標的ヒドロラーゼは、どの阻害物質が検出中であるかによって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は当業者には直ちに明白となることだろう。例えばペプスタチンが検出中の阻害物質である場合には、アスパラギン酸プロテアーゼが前述の試験装置内で使用される標的ヒドロラーゼとなる。その上、標的ヒドロラーゼの適切な濃度、試験装置内の標的ヒドロラーゼの幾何学的場所及び適切な時限及び制御放出技術及びマトリクスは、当業者にとって既知のものである。
ここで請求されているその他の試験装置の場合と同様に、この特定の試験装置において使用されるリポーター酵素又は標的酵素は、あらゆるシグナル生成酵素すなわち、試験装置内に存在する標的ヒドロラーゼによる加水分解の不活性化を含め試料中のあらゆる作用物質による不活性化を受けていない目に見えるか又は検出可能な変化をもたらす活性を有する酵素、であってよい。かかるリポーター酵素としては、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミラーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ及びグルクロニダーゼが含まれるが、これらに制限されるわけではない。適切なリポーター又は標識酵素の選択は、当業者には直ちに明白になることだろう。本発明のこの試験装置においては、好ましいリポーター酵素は、ペルオキシダーゼ、特にホースラディッシュペルオキシダーゼである。
リポーター酵素は、試料中の阻害物質の存在により標的ヒドロラーゼが不活性化されない場合に標的ヒドロラーゼの作用時点で放出されるような形で、固体支持体すなわち不溶性マトリクス、ゲル又は樹脂上に固定化される。本発明に従った固体支持体には、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド又はその誘導体、キチン、セファロース、オキシランアクリルビーズ、重合体ジアルデヒド、でんぷん、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ウシ原皮粉末、細菌細胞壁ペプチドグリカン又はそのフラグメント、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及び管理多孔ガラスが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
前述の通り、リポーター酵素を、酵素的に活性な標的ヒドロラーゼのための加水分解可能な基質であるリンカー分子の使用を通して固体支持体上に固定することが可能である。かかるリンカー分子としては、タンパク質、炭水化物、脂質、ペプチド、エステル及び核酸が含まれるが、これらに制限されるわけではない。固体支持体に対してリポーター酵素を付着させるのに使用される特定のリンカー分子は、どの標的ヒドロラーゼが試験装置内に取り込まれているかによって異なり、いずれかの与えられたケースにおける選択は、当業者には直ちに明らかとなることだろう。
指示薬は、試料又は標本内の阻害物質の存在によって酵素的に活性な標的ヒドロラーゼが不活性化されない場合に起こる反応の結果又は反応の完結の結果としての検出可能な変化を受けるあらゆる化学的種でありうる。好ましい指示薬は視覚的指示薬、特に色素産生指示薬すなわち、試料又は標本中の阻害物質の存在によって不活性化されていないことを条件として酵素的に活性な標的ヒドロラーゼにより固体支持体から放出されるときのリポーター又は標識酵素の作用時点で、そうでなければ無色である材料内で色が形成されることを含む変色が、この目に見える変化であるような指示薬である。
視覚的指示薬としては、多様な色素産生指示薬（すなわち色原体）及び類似の効果をもつその他の種を使用することができる。本発明に従ったペルオキシダーゼ様のリポーター酵素のための好ましい色素産生指示薬は、グアヤック、２−２′−アジノ−ビス（３−エチル−ベンチジアゾリン−６−スルホン酸）、テトラメチルベンチジン、フェノール、４−アミノアンチピリン及び４，５−ジヒドロキシナフタレン−２，７−ジスルホン酸のうちの１つを含むもののこれらに制限されるわけではない色原体とヒドロペルオキシドを含んで成る。特に好ましい色素産生指示薬は、ヒドロペルオキシドとグアヤックすなわちその還元状態で無色でその酸化状態で深青色である色原体で構成されている。前述の通り、視覚的指示薬が色素産生指示薬である場合、液体色原体系又は固体色原体系のいずれかを利用することが可能である。
ヒドロラーゼの存在について検定するための試験装置の構造、その構成及びその好ましい実施態様に関する前出の論述が、酵素的に活性なアスパラギン酸プロテアーゼの存在について検定することによりカンジダ症の存在について試料を試験するための試験装置、及び標的ヒドロラーゼの阻害物質の存在について試料を試験するための試験装置に対しても完全にあてはまるものである、ということを理解すべきである。
本発明は試験装置のいずれかの特定の構成に制限するよう意図されたものではないが、実物大で描かれているものでない添付図面は、かかる装置の１つをどのように構成できるかを示している。
図１は、指示薬及び試薬が塗布される前そしてチャンバーが封じ込められる前の装置の支持体構造を斜視図で表わしている。支持体構造は、シートを各々同じ長さ及び幅をもつ２つの半分13，14に分離する折り目を構成するスコアライン12を伴う、比較的剛性ある透明で化学的に不活性なプラスチック材料の単一のシート11で構成されている。下半分13は相対する側に延びる２つの矩形拡張部分16，17を伴う中心の円15から成る複合形状の押込部を含んでいる。上半分14は、試料導入口として役立つ中央の穴18及び通気穴として役立つ２つの側方穴19，20を含む３つの穴を内含している。２つの通気穴19，20は円形であり、一方試料導入口18は移送装置として用いられる綿棒からの標本のかさ取りを容易にするため１本の直線縁部を伴う円形となっている。穴は、プラスチックがスコアライン12で折畳まれ上半分14が下半分13と接触するように置かれたとき、試料導入口18が押込部の円形部分15の中心より上にあり通気穴19，20が各々の最も外側の縁部で２つの矩形拡張部分16，17より上にくるように、位置づけられている。２つの矩形拡張部分16，17は装置の正及び負の対照部域を表わしている。
図１の装置の数多くの変形態様が考えられる。２つの半分13，14を、さまざまな理由で異なる長さ、幅、又はその両方をもつものにすることができる。唯一の重要な特長は、下半分の中の押込部と上半分の中の穴が、スコアラインで２つの半分が折り畳まれたときに適切な見当合せ状態となるような形でスコアラインとの関係において位置づけされているということである。もう１つの例として、構造の下半分の中の矩形拡張部分16，17は、上半分内の通気穴19，20と整合するよう円形（又は半円形）部域で終結してもよい。通気穴自体はどんな形状のものであってもよい。実際、試料導入穴18とは異なる形状で作られている通気穴は、試料をどこに導入するかについてのユーザーの混同を防ぐという利点をもつ。
図２は、コーティングが施され２つの半分が互いの上に折畳まれ互いに対して密封された後のチャンバー31を断面図で示す、図１の装置の側面断面図である。透明な重合体の２つの半分13，14の各々の内部表面は、それぞれ接着剤32，33でコーティングされている。上部接着剤層33のすぐ下には、視覚的指示薬34を含む層があり、その下には試薬層35がある。視覚的指示薬層34及び試薬層35の両方がチャンバーの全長及び幅を拡張し、試料導入口18をとり囲みチャンバーの全部域内に延びることができる、ということがわかるだろう。
チャンバーの試験及び対照部域は、チャンバーの下部壁13上のコーティングの水平な場所によって構成されている。負の対照のための試薬はチャンバーの２つの矩形拡張部分（図１参照）のうちの１方16の下部表面を占有する１つのコーティング36の中に含まれており、負の対照のための試薬は、同様にもう１つの矩形拡張部分17の中に位置づけられた第２のコーティング37の中に含まれている。代替的には、対照のための試薬は、チャンバーの下部表面上ではなく上部表面上に置くこともできる。これは、実際にはいくつかの検定について好ましいものである。チャンバーの中央円形部分15（図１参照）の下の下部表面の部分は、試験反応において使用される付加的な試薬を含んでいてもよいし試薬を全く含まなくてもよい１つの層38でコーティングされる。かくして、閉鎖された装置の上面から見ると、円形試験部域41には矩形の負の対照部域42及び矩形の正の対照部域43が側面を接している。３つのセグメント36，37，38は、これらのセグメントの中味の間の拡散又はその接触を遅延させるか又は最小限におさえるため、間隙又は不連続性44，45によって分離され得る。下部層の不連続性44，45のすぐ上方で視覚的指示薬及び試薬層34，35のうちのいずれか又は両方の中に、同様の不連続性を置くこともできる。視覚的指示薬及び試薬層の中の不連続性はさらに、対照の構成成分又はその他の試薬が対照部域から試験部域へと拡散するのを防ぐことになる。層35，36，37，38の最も内側に向いた層は全て、存在するあらゆる試薬に加えて、チャンバーを充てんするべく上部及び下部表面に沿って標本の迅速かつ完全な拡がりを促進するための湿潤剤又は洗剤を含んでいてよい。場合によっては、タンパク質の一層により同じ効果が達成される。
本発明のいくつかの実施態様においては、試薬は、空気又は空中の湿分に長く露呈された時点で劣化する傾向をもつ。図２に示されている装置においては、これは、湿分不透過性でかつ空気不透過性である薄い材料シート46によって予防されている。このシートは、試料噴射口及び両方の通気穴をカバーし、装置がいつでも使用できる状態になるまでチャンバー内部を環境から密封し、使用できる状態になった時点でシートは容易にひき剥される。特に水又は空気に対する感受性が高い材料については、同様に装置の底面上に湿分及び空気不透過性のシートを置くことが望ましい可能性があり、シートは常時付着されていてもよいし又はひき剥すこともできる。装置を完全にとり囲む袋の中に装置を入れることにより、湿分及び空気に対するさらなる保護を達成することができる。
上述の通り、図１及び２に示されている装置の寸法の各々は、その配置及び形状と同様変動しうる。しかしながら標準的な例は、支持体シートが厚み５ミル（0.005インチ、0.0127cm）のMylar 5であり、接着剤層が厚み２ミル（0.002インチ、0.0051cm）の低密度ポリエチレンであり、間隙幅47が7.5ミル（0.0075インチ、0.019cm）、試験部域が直径５／16インチの円（面積：0.0766平方インチ、0.494cm2）、負及び正の対照部域が各々１／８インチ×１／16インチ（面積：0.0078平方インチ、0.0504cm2）であるものである。この例中の通気穴は各々円形で、これら及び試料導入穴の直径は各々１／８インチ（0.32cm）である。チャンバー容積は約12μｌである。
本発明の試験装置は、生物学的供給源その他を含む広範な供給源からのヒドロラーゼの存在について試料を試験するために有用である。血液、血清、血漿、尿、尿道排出物、涙、膣液、頭部滲出液、脊髄液及び唾液といった体液、ならびに食物、池やスイミングプールの水及び液体廃棄物などの非体液流体が、その例である。
実施例
１．製造
Ａ．臭化シアン活性化でされた固体の支持体の製造
１．材料
ａ．固体の不溶性支持体（セファロース（Sepharose）4B、キチン、及びシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20〔Sigma Chemical Co.から購入した〕）
ｂ．蒸留水及び蒸留水で調製した氷
ｃ．4.0ＭのNaOH
ｄ．固体のCNBr
ｅ．カップリング緩衝液（0.5ＭのNaClを含有する0.1ＭのNaHCO3）
ｆ．磁気撹拌モーター及び撹拌棒；pHメーター；化学的ヒュームフード
２．手順
10mlの冷蒸留水を５ｇの洗浄した湿った固体の支持体に添加し、そしてこの混合物を10℃〜15℃に冷却した。懸濁液のpHを4.0ＭのNaOHで10.8に調節し、そして湿った固体の支持体の１ｇにつき100mgの固体の粉砕したCNBrを添加した。必要に応じて4.0ＭのNaOHの添加により、pHを10.8に維持し、そして懸濁液の温度を活性化の間に18℃〜20℃に増加した。pHを10.8に維持するために、4.0ＭのNaOHのそれ以上の添加が必要でなくなったとき、活性化が完結したと考えた。この時において、砕いた氷を添加して反応混合物を冷却し、そして懸濁液を前もって冷却した焼結漏斗で濾過した。反応混合物の中に残る残留CNBr及びシアン化物を不活性化する固体の硫酸第一鉄を含有する吸引フラスコの中に、濾液を集めた。固体の支持体を１リットルの冷蒸留水及び１リットルのカップリング緩衝液で吸引下に洗浄し、そして湿ったペーストとして４℃において貯蔵した。
Ｂ．〔カッパ−カゼイン−HRPO〕接合体の製造（ヒドラジン法）
１．材料
ａ．カッパ−カゼイン及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRPO）ヒドラジド〔Sigma Chemical Co.から購入した〕。
ｂ．蒸留水及び蒸留水で調製した氷
ｃ．緩衝液：
ｉ．50mMの２−〔モルホリノ〕エタンスルホン酸〕（MES）緩衝液、pH6.0
ii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム、pH9.0、
ｄ．固体の過ヨウ素酸ナトリウム
ｅ．100mMのホルムアルデヒド
２．手順
ａ．カッパ−カゼインの過ヨウ素酸塩の活性化
20mgのカッパ−カゼインを２mlのMES緩衝液の中に溶解し、そして8.6mgの固体の過ヨウ素酸ナトリウムを溶液に添加した。この混合物を室温において暗所でローター上で30分間インキュベートした。次いで反応混合物をほぼ300mlの50mMのMES，pH6.0に対して室温においてほぼ45分間透析し、その後透析流体を置換し、そして透析をさらに45分間続けた。
ｂ．カッパ−カゼインへのHRPOの共有結合
５mgのHRPOヒドラジド（ほぼ175単位／mgのタンパク質）を活性化し、透析したカッパ−カゼインに添加し、そして混合物を室温において撹拌しながら４時間インキュベートした。200μｌの100mMのホルムアルデヒドを混合物に添加し、そしてインキュベーションを室温においてさらに30分間続けた。２mlの１Ｍの冷酢酸塩緩衝液、pH4.0を添加し、そして接合体を４℃において30分間沈殿させた。ペレットを遠心により取り出し、２mlの100mMのホウ酸塩緩衝液、pH9.0の中に再溶解し、そして使用するまで４℃において貯蔵した。
Ｃ．臭化シアン活性化支持体への〔カッパ−カゼイン−HRPO〕接合体（ヒドラジド法）の結合
１．材料
ａ．〔カッパ−カゼイン−HRPO〕接合体（製造Ｂ）
ｂ．蒸留水
ｃ．緩衝液：
ｉ．カップリング緩衝液（0.5ＭのNaClを含有する0.1ＭのNaHCO3）
ii．1.0Ｍのトリス緩衝液、pH8.0
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iv．0.5ＭのNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH9.0
d.臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）4B及びシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20（製造Ａ）
ｅ．臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）6MB（Sigma Chemical Co.から）
２．手順
ａ．臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）4B及びシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20
製造Ｂに記載するようにHRPOのヒドラジドから製造した２mlの〔カッパ−カゼイン−HRPO〕接合体を３mlのカップリング緩衝液で希釈し、そして１ｇの湿った臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）4Bまたはシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）に添加した。この懸濁液を室温において２時間転倒混合した。固体の支持体をカップリング緩衝液及び水で洗浄し、そして３mlの1.0Ｍのトリス緩衝液、pH8を添加した。この懸濁液を室温において２時間インキュベートして、固体の支持体上の残留する活性部位を不活性化した。各々がpH4.0の酢酸塩緩衝液及び引き続くカップリング緩衝液から成る、３回の洗浄サイクルを使用して、結合しない物質を支持体から除去した。蒸留水を使用する最終の洗浄を使用し、そして湿った懸濁液を使用するまで４℃において貯蔵した。
ｂ．商品活性化セファロース（Sepharose）6MB（Sigma Chemical Co.）
湿ったゲル（１ｇの湿った重量）を、前述したように使用前に、200mlの１mMのHClで洗浄した。
ｃ．活性化キチン
上のＡに記載する手順を使用したが、ただし１ｇの代わりに500mgの湿った活性化キチンを使用した。
Ｄ．セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRPO）アルデヒドの製造
１．材料
ａ．HRPO，II型、200単位／mg（Sigma Chemical Co.から）
ｂ．20mMの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液、pH5.0
ｃ．固体の過ヨウ素酸ナトリウム
ｄ．バイオゲル（Biogel▲Ｒ▼）Ｐ−30球形ポリアクリルアミドゲル、Bio-Radから購入した
２．手順
25.7mgの固体の過ヨウ素酸ナトリウム（40ミリモル）を３mlのMES緩衝液中の30mgのHRPOに添加した。この溶液を暗所で室温において連続的に回転しながら30分間インキュベートした。この溶液をMES緩衝液中のＰ−30カラムに通過させて過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、そして着色したHRPOを３mlの合計の体積で集めた。HRPOアルデヒドは所望のタンパク質（ヘモグロビン、ミオグロビン、又はカゼイン）に直ちにカップリングした。
Ｅ．臭化シアン活性化固体の支持体へのヘモグロビン及びミオグロビンの結合
１．材料
ａ．固体の不溶性支持体
ｉ．臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）6MB（Sigma Chemical Co.から）
ii．シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20（製造Ａに記載するような）
ｂ．蒸留水
ｃ．緩衝液：
ｉ．カップリング緩衝液（0.5ＭのNaClを含有する0.1ＭのNaHCO3）
ii．1.0Ｍのトリス緩衝液、pH8.0
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iv．0.5ＭのNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH9.0
ｖ．水中の0.1パーセント（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒドの溶液
２．手順
５mlのカップリング緩衝液の中に溶解した100mgのヘモグロビン又はミオグロビンを１ｇの湿った固体の支持体に添加した。この懸濁液を室温において２時間転倒混合した。固体の支持体をカップリング緩衝液及び水で洗浄し、そして３mlの1.0Ｍのトリス緩衝液、pH8を添加し、そしてこの懸濁液を室温において２時間インキュベートして、固体の支持体上の残留する活性部位を不活性化した。各々がpH4.0の酢酸塩緩衝液及び引き続くホウ酸塩緩衝液から成り、両方が塩化ナトリウムを含有する、３回の洗浄サイクルを使用して、結合しない物質を支持体から除去した。ミオグロビン誘導支持体について、蒸留水を使用する最終の洗浄を使用し、そして湿った懸濁液を使用するまで４℃において貯蔵した。ヘモグロビン誘導支持体について、５mlの0.1％のグルタルアルデヒド溶液を上の手順から生ずる湿った懸濁液に添加し、そして懸濁液を４℃において一夜インキュベートした。各々がpH4.0の酢酸塩緩衝液及び引き続くホウ酸塩緩衝液pH8.0から成る、３回の洗浄サイクルを使用して、結合しない物質を支持体から除去した。蒸留水を使用する最終の洗浄を使用し、そして湿った懸濁液を使用するまで４℃において貯蔵した。
Ｆ．ヘモグロビン又はミオグロビン誘導支持体へのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRPO）アルデヒドの結合
１．材料
ａ．製造Ｄに記載するように製造したHRPOアルデヒド
ｂ．製造Ｅに記載するように製造したヘモグロビン又はミオグロビン誘導固体の支持体
ｃ．100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
ｄ．1.0ＭのNaCl
ｅ．蒸留水
２．手順
製造ＤにおいてＰ−30カラムから受け取られた３mlのHRPOアルデヒド（30mg）を、製造Ｅに記載する１ｇのヘモグロビン又はミオグロビン誘導固体の支持体に添加した。懸濁液を４℃において16時間インキュベートし、次いで室温において４時間インキュベートした。各々が蒸留水及び1.0ＭのNaClから成る、３回の洗浄サイクルを使用して、ステップから結合しない物質を除去した。次いで固体の支持体を５mlの100mMのシアノホウ水素化物と４℃において一夜インキュベートした。蒸留水を使用する最終の洗浄を実施し、そして湿った懸濁液を使用するまで４℃において貯蔵した。
Ｇ．アルデヒド活性化シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20の製造
１．材料
ａ．シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20〔Sigma Chemical Co.から）
ｂ．蒸留水
ｃ．固体の過ヨウ素酸ナトリウム
ｄ．20mMの重炭酸ナトリウム、pH9.5
２．手順
固体の過ヨウ素酸ナトリウム（428mg）を10mlの蒸留水の中に懸濁した１ｇのシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）に添加した。この混合物を室温において２時間連続的に回転した。ペレットを遠心により取り出し、10mlの蒸留水で５回洗浄し、そして10mlの20mMの重炭酸ナトリウム、pH9.5で１回洗浄した。この樹脂を製造後直ちに使用した。
Ｈ．アルデヒド活性化シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20へのヘモグロビン及びミオグロビンの共有結合
１．材料
ａ．アルデヒド活性化シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20（製造Ｇ）
ｂ．蒸留水
ｃ．100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
ｄ．ヒトヘモグロビン及びウマ心臓ミオグロビン（両方共Sigma Chemical Co.から）
ｅ．緩衝液：
i．20mMの重炭酸ナトリウム、pH9.5
ii．50mMのエタノールアミン、pH9.5
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMのトリス緩衝液、pH8.0
iv．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
v．20mMのMES緩衝液、pH5.0
２．手順
９mlの重炭酸ナトリウム、pH9.5の中に溶解した50mgのミオグロビン又はヘモグロビン１mlのアルデヒド活性化シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20（製造Ｇ）に添加した。この懸濁液を室温において一夜回転し、そしてペレットを遠心により取り出した。ペレットを10mlの水で洗浄した。９mlの50mMのエタノールアミン、pH9.5を添加し、この混合物を室温において１時間連続的に回転した。ペレットを遠心により単離し、そして10mlの酢酸塩緩衝液、トリス緩衝液、及びMES緩衝液の各々で順次に洗浄した。20mlの100mMのシアノホウ水素化ナトリウムの水溶液を添加し、そしてこの混合物を室温において連続的に回転しながら１時間インキュベートし、次いで４℃において一夜インキュベートした。一夜のインキュベーション後、誘導支持体を10mlの蒸留水のアリコートで５回洗浄しそして10mlのアリコートのMES緩衝液で２回洗浄した。
Ｉ．アルデヒド活性化シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20上に固定化されたヘモグロビン又はミオグロビンへのHRPOアルデヒドの共有結合
１．材料
ａ．ヘモグロビン又はミオグロビン誘導シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20（製造Ｈ）
ｂ．蒸留水
ｃ．100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
ｄ．緩衝液：
ｉ．0.5ＭのNaClを含有する100mMのトリス緩衝液、pH8.0
ii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iii．20mMのMES緩衝液、pH5.0
ｅ．アルデヒド活性化HRPO（製造Ｄ）
２．手順
２mlのMES緩衝液、pH5.0の中に溶解した20mgの脱塩HRPOアルデヒド（製造Ｄ）を１ｇのヘモグロビン又はミオグロビン誘導シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20（製造Ｈ）に添加し、そしてこの懸濁液を室温において１時間回転し、次いで４℃において一夜インキュベートした。この支持体を遠心により単離し、そして10mlのアリコートの蒸留水で２回洗浄した。20mlの100mMのシアノホウ水素化ナトリウムを添加し、そしてこの懸濁液を４℃において60時間インキュベートした。ペレットを次の各々で順次に２回洗浄した：蒸留水；酢酸塩緩衝液；トリス緩衝液；及びMES緩衝液。
Ｊ．商用エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃアクリルビーズへのヘモグロビンの共有結合
１．材料
ａ．オキシランアクリルビーズ（エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ，Sigma Chemical Co.から）
ｂ．ヒトヘモグロビン（IV型、Sigma Chemical Co.から）
ｃ．緩衝液及び溶液
ｉ．0.1％のアジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）を含有する1.0Ｍのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5
ii．1.0ＭのNaCl
iii．５％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノール、0.5ＭのNaOHでpH8.0に調節した
iv．100mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.4
ｖ．500mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.4
vi．3.5Ｍのチオシアン酸ナトリウム
vii．リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（0.15ＭのNaClを含有する0.01Ｍのリン酸ナトリウム、pH7.2）
ｄ．蒸留水
２．手順
ヘモグロビン（125mg）を５mlのアジ化ナトリウムを含有する1.0Ｍのリン酸塩緩衝液、pH7.5の中に溶解し、そして１ｇのエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃに添加した。この混合物を室温において撹拌しないで72時間インキュベートした。支持体を、1.0ＭのNaClで３回洗浄し、そして蒸留水で５回洗浄した。支持体を前もってpH8.0に調節した2.5mlのメルカプトエタノールと混合し、そしてこの懸濁液を室温において一夜放置した。ビーズを蒸留水で10回洗浄し、小型の焼結ガラスの漏斗上に配置し、そして50mlの次の各々で順次に洗浄した：0.5Ｍのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5；0.1Ｍのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5；3.5Ｍのチオシアン酸ナトリウム；及び最後に大きい体積のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（0.15ＭのNaClを含有する0.01Ｍのリン酸ナトリウム、pH7.2）。誘導ビーズを室温において２時間、次いで４℃において一夜回転しながら0.1％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒドで処理し、次いで蒸留水で洗浄した。
Ｋ．ヘモグロビン誘導エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ（製造Ｊ）へのHRPOアルデヒド（製造Ｄ）の共有結合
１．材料
ａ．HRPOアルデヒド（製造Ｄ）
ｂ．ヘモグロビン誘導エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ（製造Ｊ）
ｃ．100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
ｄ．1.0ＭのNaCl
ｅ．蒸留水
２．手順
３mlのMES緩衝液中の30mgのHRPOアルデヒド（製造Ｄ）を１ｇのヘモグロビン誘導エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ（製造Ｊ）に添加した。この懸濁液を４℃において16時間、次いで室温において４時間インキュベートした。各々が蒸留水及び1.0ＭのNaClから成る、３洗浄サイクルを使用して、支持体から結合しない物質を除去した。次いで固体の支持体を５mlの100mMのシアノホウ水素化物と４℃において60時間インキュベートした。最後の洗浄を蒸留水で実施し、そして湿った懸濁液を４℃において使用するまで貯蔵した。
Ｌ．ポリマーのジアルデヒドへのカゼイン−HRPOの共有結合
１．材料
ａ．２mlの100mMのホウ酸塩緩衝液、pH9.0の中に溶解したヒドラジド法（製造Ｂ）により製造された25mgのカッパ−カゼイン−HRPO接合体
ｂ．ポリマーのジアルデヒド（Sigma Chemical Co.から）
ｃ．緩衝液：
ｉ．100mMのエタノールアミン、pH9.5
ii．0.5ＭのNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH9.0
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iv．50mMのMES緩衝液、pH6.0
ｄ．100mMのホルムアルデヒド
ｅ．100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
２．手順
１つの変更を加えて２mlのカッパ−カゼイン−HRPO接合体を製造Ｂに記載するように製造した：ホルムアルデヒド処理を省略した。この溶液を３mlのMES緩衝液と混合し、そしてこの溶液を１ｇのポリマーのジアルデヒドに添加した。この懸濁液を室温において６時間回転し、そして４℃において一夜インキュベートした。200μｌの100mMのホルムアルデヒドを懸濁液に添加し、そしてこの混合物を室温において１時間インキュベートした。この樹脂を遠心により取り出し、水で洗浄し、そして３mlの100mMのエタノールアミン、pH8.5の中に再懸濁させた。室温において回転しながら２時間インキュベートした後、樹脂を酢酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、及び水で順次に洗浄した。次いで固体の支持体を５mlの100mMのシアノホウ水素化物と４℃において一夜インキュベートした。最後の洗浄を蒸留水で実施し、そして湿った懸濁液を使用するまで４℃において貯蔵した。
Ｍ．エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）ＣアクリルビーズへのHRPO標識化（アルデヒド法）全カゼイン又はカッパ−カゼインの結合
１．材料
ａ．オキシランアクリルビーズ（エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ，Sigma Chemical Co.から）
ｂ．ウシ全カゼイン又はカッパ−カゼイン（Sigma Chemical Co.から）
ｃ．緩衝液及び溶液
ｉ．0.5ＭのNaClを含有する100mMの重炭酸ナトリウム、pH8.5
ii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMのトリス緩衝液、pH8.0
iv．20mMのMES緩衝液、pH5.0
ｖ．水中の５％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノール
vi．水中の200mMのホウ水素化ナトリウム
ｄ．蒸留水
２．手順
ａ．エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃビーズへのカゼイン又はカッパ−カゼインの共有結合
100mMの重炭酸ナトリウム緩衝液、pH8.5中に全カゼイン又はカッパ−カゼイン（10mg／ml）を含有しかつ0.5ＭのNaClを含有する溶液の２mlを、水の中に懸濁させた１mlのエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃビーズに添加した。この混合物を室温において回転しながら48時間インキュベートした。ペレットを遠心により単離し、そして９mlの酢酸塩緩衝液及びトリス緩衝液で順次に洗浄し、次いで９mlのアリコートのMES緩衝液で２回洗浄した。10mlの５％のメルカプトエタノールを添加し、そしてこの混合物を室温において回転混合しながら一夜インキュベートした。カゼイン誘導支持体を遠心により単離し、そして９mlのMES緩衝液で４回洗浄した。
ｂ．エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ上に固定化されたカゼインのHRPOによる標識化
３mlのアルデヒド活性化HRPO（製造Ｄ）を上のＡからのカゼイン誘導エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃに添加し、そしてこの混合物を回転しながら室温において１時間、そして４℃において60時間インキュベートした。ペレットを遠心により単離し、そして２つのアリコートの水で洗浄した。ホウ水素化ナトリウムの水溶液（５ml）をペレットに添加し、そしてこの懸濁液を室温において６時間インキュベートした。ペレットを遠心により単離し、そして９mlのアリコートの酢酸塩、トリス、酢酸塩、及びMES緩衝液で順次に洗浄した。
Ｎ．ポリマーのジアルデヒドへのミオグロビン−HRPOの共有結合
１．材料
ａ．２mlの重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.5の中に溶解した30mgのウマ心臓ミオグロビン
ｂ．ポリマーのジアルデヒド（セルロースジアルデヒド、Sigma Chemical Co.から購入した）
ｃ．緩衝液：
ｉ．50mMのエタノールアミン、pH9.5
ii．0.5ＭのNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iv．50mMのMES緩衝液、pH6.0
ｖ．0.5ＭのNaClを含有する100mMのトリス緩衝液、pH8.0
ｄ．100mMのホルムアルデヒド
ｅ．水中の100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
２．手順
ａ．ポリマーのジアルデヒドへのミオグロビンの共有結合
２mlのミオグロビン溶液を１mlのポリマーのジアルデヒドの懸濁液と混合し、そしてこの懸濁液を室温において一夜回転した。樹脂を遠心により分離し、そして10mlのアリコートの水で２回洗浄した。９mlのエタノールアミン溶液を添加し、そして懸濁液を室温において回転しながら１時間インキュベートした。樹脂を遠心により単離し、そして10mlのアリコートの酢酸塩、トリス、及びMES緩衝液で順次に洗浄した。20mlのシアノホウ水素化ナトリウムを添加した。この懸濁液を４℃において一夜インキュベートした。ミオグロビン誘導ポリマーのジアルデヒドを10mlのアリコートの水で５回洗浄し、そしてMES緩衝液で２回洗浄した。
ｂ．HRPOアルデヒド（製造Ｄ）によるミオグロビン誘導ビーズの標識化
２mlのHRPOアルデヒド（製造Ｄ）を樹脂に添加し、そしてこの懸濁液を室温において回転しながら１時間インキュベートし、そして４℃において一夜インキュベートした。次いで樹脂を遠心により単離し、10mlのアリコートの水で２回洗浄し、20mlのシアノホウ水素化ナトリウムの中に懸濁させ、そして４℃において60時間インキュベートした。樹脂を遠心により単離し、10mlのアリコートの水で２回洗浄し、次いで順次に10mlのアリコートの酢酸塩／NaCl及びトリス／NaCl緩衝液で２回洗浄した。最後に、樹脂を10mlのMES緩衝液で洗浄し、そして使用するまで４℃において貯蔵した。
Ｏ．HRPO標識化キチンの製造及びキチナーゼをアッセイするためのその使用
１．材料
ａ．臭化シアン活性化キチン（製造Ａ）
ｂ．HRPO（Sigma Chemical Co.からのII型、78単位／mg）
ｃ．キチナーゼ（EC３．２．１．14、ストレプトマイセス・グリシウス（Streptomyces grsius）から単離しそしてSigma Chemical Co.から購入した）
ｄ．緩衝液：
ｉ．500mMのトリス／MES緩衝液、pH5.4
ii．カップリング緩衝液、0.5ＭのNaClを含有する100mMの重炭酸ナトリウム
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iv．0.5ＭのNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム緩衝液、pH8.0
ｖ．1.0Ｍのトリス緩衝液、pH8.0
ｅ．ABTSアッセイ混合物：40μｌの25mg／mlのABTS（２，２′−アジノ−ジ〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸、ジアンモニウム塩〕；10μｌの１％（ｖ／ｖ）過酸化水素；950μｌの水
２．手順
ａ．HRPO誘導キチンの製造
500mgの臭化シアン活性化キチン（製造Ａ）を５mlのカップリング緩衝液の中に懸濁させ、５mgのHRPOを添加し、そしてこの懸濁液を室温において２時間転倒混合した。固体の物質を蒸留水及びカップリング緩衝液で洗浄した。３mlの1.0Ｍのトリス、pH8.0緩衝液を支持体に添加し、そしてこの懸濁液を室温において２時間撹拌した後、３回順次に酢酸塩及びホウ酸塩緩衝液で洗浄し、そして最後に水で洗浄した。
ｂ．キチナーゼのアッセイ
50mgのHRPO標識化キチンを200μｌのMES/トリス緩衝液の中に懸濁させた。50μｌのキチナーゼの溶液（50単位／ml）を添加し、そしてこの混合物を37℃において４時間インキュベートした。反応混合物を遠心してキチンを沈殿させ、そして懸濁液の10μｌのアリコートを100μｌのABTSアッセイ混合物と混合した。キチン結合HRPOのキチナーゼを触媒とする解放は、溶液中の緑色の発生により検出された。
Ｐ．臭化シアン活性化セファロース−カゼイン又はカッパ−カゼイン−HRPOアルデヒドの製造
１．材料
ａ．臭化シアン活性化セファロース（製造Ａ）
ｂ．カップリング緩衝液（0.5ＭのNaClを含有する0.1Ｍの重炭酸ナトリウム）中の10mg／mlにおけるカゼイン又はカッパ−カゼイン
ｃ．緩衝液及び溶液：
ｉ．50mMのエタノールアミン、pH9.5
ii．0.5ＭをNaClを含有する100mMのホウ酸ナトリウム、pH9.0
iii．0.5ＭのNaClを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0
iv．20mMのMES緩衝液、pH5.0
ｖ．0.5ＭのNaClを含有する100mMのトリス緩衝液、pH8.5
vi．水中の100mMのホウ水素化ナトリウム
ｄ．HRPOアルデヒド（製造Ｄ）
２．手順
２mlのカゼイン又はカッパ−カゼイン溶液を１mlの臭化シアン活性化セファロースに添加し、そしてこの懸濁液を室温において回転しながら２時間インキュベートした。７mlのエタノールアミン溶液を添加し、そしてこの混合物を１時間室温においてインキュベートした。樹脂を遠心により単離し、そして順次に９mlのアリコートの酢酸塩及び塩化ナトリウムを含有するトリス緩衝液で洗浄し、次いで９mlのMES緩衝液で２回洗浄した。
３mlの脱塩HRPOアルデヒド（製造Ｄ）を添加し、そしてこの混合物を室温において１時間回転し、次いで４℃において一夜インキュベートした。樹脂を遠心により単離し、そして10mlの水で２回洗浄した。樹脂を10mlのホウ水素化ナトリウムの中に懸濁させ、そして混合物を室温において２時間インキュベートした。最後に、樹脂を遠心により単離し、そして順次に９mlの0.5ＭのNaClを含有する次の緩衝液の各々で洗浄した：酢酸塩；トリス；酢酸塩；及びトリス。樹脂を最後に９mlのMES緩衝液で洗浄し、そして使用するまで４℃においてMES緩衝液の中に貯蔵した。
Ｑ．微粉砕されたエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃアクリルビーズ（Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ）へのミオグロビン及びウシ血清アルブミンの共有結合及びセイヨウワサビペルオキシダーゼへの引き続く共有結合（アルデヒド法）
工程１：エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃアクリルビーズ（Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ）へのミオグロビン及びウシ血清アルブミンの共有結合
１．材料
ａ．オキシランアクリルビーズ（Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ，Sigma Chemical Co.からの150ミクロンのビーズ）
ｂ．ウマ心臓ミオグロビン（IV型）又はウシ血清アルブミン（Sigma Chemical Co.から）
ｃ．緩衝液及び溶液
ｉ．0.1％のアジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）を含有する1.0Ｍのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5
ii．1.0ＭのNaCl
iii．５％（ｖ／ｖ）のメルカプトエタノール、0.5ＮのNaOHでpH8.0に調節した
iv．100mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5
ｖ．500mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5
vi．3.5Ｍのチオシアン酸ナトリウム
vii．リン酸緩衝生理食塩水（PBS）0.15ＭのNaClを含有する0.01Ｍのリン酸ナトリウム、pH7.2
ｄ．蒸留水
２．手順
１ｇのオキシランアクリルビーズを乳鉢及び乳棒で微粉末に手で粉砕した。ミオグロビン又はウシ血清アルブミン（125mg）を５mlのアジ化ナトリウムを含有する1.0Ｍのリン酸塩緩衝液、pH7.5の中に溶解し、そして１ｇの微粉砕したエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃに添加した。この混合物を撹拌しないで室温において72時間インキュベートした。遠心を使用して、支持体を1.0ＭのNaClで３回洗浄しそして20mlの蒸留水で５回洗浄した。支持体を前もってpH8.0に調節した。2.5mlのメルカプトエタノールと混合し、そして懸濁液を室温において一夜放置した。ビーズを10回、遠心を使用して、蒸留水で洗浄し、そして順次に50mlの次の各々で洗浄した：0.5Ｍのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5；0.1Ｍのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5；3.5Ｍのチオシアン酸ナトリウム；及び最後に大きい体積のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（0.15ＭのNaClを含有する0.01Ｍのリン酸ナトリウム、pH7.2）。
工程２：セイヨウワサビペルオキシダーゼを使用する共有結合の標識化（アルデヒド法）
セイヨウワサビペルオキシダーゼアルデヒド（製造Ｄ）を使用して、製造Ｆを使用する上の工程１からの上のミオグロビン又はアルブミン誘導アクリルビーズを標識化した。
Ｒ．グルタルアルデヒドを使用するHRPOへのシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20ミオグロビンのカップリング
１．材料
ａ．臭化シアン活性化シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20に共有結合したミオグロビン（製造Ｅ）
ｂ．0.5ＭのMES緩衝液、pH5.0
ｃ．水中の１％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド
ｄ．HRPO−ヒドラジド（Sigma Chemical Co.,200単位／mg）
ｅ．100mMのホルムアルデヒド
ｆ．100mMのシアノホウ水素化ナトリウム
ｇ．0.5ＭのNaCl
２．手順
１mlのグルタルアルデヒド溶液を１ｇのミオグロビン接合シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20に添加し、そして懸濁液を室温において30分間回転しそして水で洗浄した。２mlの100mMのMES緩衝液中の５mgのHRPOヒドラジドを洗浄した樹脂に添加し、そして懸濁液を室温において４時間回転した。200μｌの100mMのホルムアルデヒド溶液を添加し、そして混合物を室温において30分間インキュベートした。樹脂を水で洗浄し、５mlの100mMのシアノホウ水素化ナトリウムの中に懸濁させ、そして４℃において一夜インキュベートした。次いで樹脂を蒸留水及び0.5ＭのNaClで洗浄し、そして使用するまで湿ったペーストとして貯蔵した。
Ｓ．グアヤク溶液及びグアヤクシートの製造
１．グアヤク、ヒドロキシプロピルセルロース溶液（すなわち、グアヤクのインキ）
150ｇの粉末状グアヤクを660mlの加温し、撹拌したエタノールの中に溶解する。生ずる溶液に、1330mlの蒸留水を添加し、そして生ずる懸濁液を室温に放冷した。２時間後、上澄み液をデカンテーションし、そして残留する懸濁液を保持した。
250mlのエタノール中のヒドロキシプロピルセルロースの10％（ｗ／ｗ）溶液を追加の250mlのエタノールと混合し、そして生ずる溶液をグアヤクスラリーに添加する。グアヤク残留物が完全に溶解するまで混合物を撹拌する。
２．グアヤクシート
マイラー（Mylar）／ポリエチレンのラミネート（７ミルのマイラー／３mlのポリエチレン）の10インチ×10インチのシートのポリエチレン側上に、１mlの上のグアヤク溶液をピペットで適用する。グアヤク溶液をシートの表面の上に標準の巻いた針金の試験棒により広げ、そして室温において乾燥させる。
Ｔ．ナトリウム過ホウ素酸塩懸濁液（すなわち、ナトリウム過ホウ素酸塩のインキ）の製造
20ｇの微粉砕した固体ナトリウム過ホウ素酸塩を、十分な体積の無水アルコール中のヒドロキシプロピルセルロース溶液の10％（ｗ／ｗ）溶液と混合して、１リットルの懸濁液を生成する。
II．実験
実験Ｉ
この実験は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）培養物の中に解放されるアスパラギン酸プロテアーゼ（aspartic protease）による〔セファロース−カゼイン−HRPO〕及び〔セファロース−カッパ−カゼイン−HRPO〕からのHRPOの解放を含む。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化セファロース）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．まず共有結合したカゼイン又はカッパ−カゼイン（製造Ｐ）で誘導しそして引き続いてHRPOアルデヒド（製造Ｄ）で標識化された臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）4B（製造Ａ）
２．Journal of General Microbiology,（1983）129：431-438に記載されているように液体培養において増殖及び成長させたアスパラギン酸プロテアーゼ生産性カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（ATCC 28366）培養物
３．グアヤク層状シート（製造Ｓ）
４．緩衝液及び溶液
ａ．20mMの過酸化水素
ｂ．500mMのMES緩衝液、pH6.0
Ｂ．手順
10mg（湿潤重量）〔セファロース−カゼイン−HRPO〕接合体（又はカッパ−カゼイン同等体）を300μｌの活性な分泌されたアスパラギン酸プロテアーゼを含有するカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）培養物、あるいは20分間沸騰させてアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化した300μｌの同一のカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）培養物の中に懸濁させた。この混合物を室温において15分間回転させ、そしてこの懸濁液を遠心して固体の接合体及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞を沈降させた。
８μｌの透明な上澄み液を10μｌの過酸化水素溶液及び10μｌのMES緩衝液と混合した。20μｌの各溶液をグアヤク層状シートの表面に添加し、そしてシートを青色の形成について実験した。
0003705441.tif 000002
Ｃ．結果
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）処理セファロース−タンパク質−HRPO上澄み液を添加したグアヤク層状シート上の区域において、暗い青色が形成した。沸騰した培養物で処理したセファロース−タンパク質−HRPO上澄み液を添加した区域において、色は見られなかった。
0003705441.tif 000003
Ｄ．解釈
活性アスパラギン酸プロテアーゼはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞が加水分解したセファロース結合のカゼイン又はカッパ−カゼインにより成長培地の中に分泌され、可溶性の活性HRPOを解放した。遠心はセファロース結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOのみを溶液の中に残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒し、青色を生成した。それゆえ、グアヤク層状シート上の青色の形成は、アスパラギン酸プロテアーゼを検出する便利な方法を提供する。
培養物の沸騰はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞により成長培地の中に分泌されたアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化した。それゆえ、セファロース結合カゼイン又はカッパ−カゼインは加水分解されず、そして可溶性の活性HRPOは支持体から解放されなかった。遠心はセファロース結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを溶液の中に残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、そしてわずかに検出可能な青色が形成した。支持体からのHRPOの解放は、単に成長培地の中に存在する塩類又は他の化合物によるHRPOの非特異的解放の結果ではなかった。
実験II
この実験は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）培養物の中に解放されるアスパラギン酸プロテアーゼによる〔エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃアクリルビーズ−カゼイン−HRPO〕接合体及び〔エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃアクリルビーズ−カッパ−カゼイン−HRPO〕接合体からのHRPOの解放を含む。
Ａ．材料：（エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼Ｃ）活性化アクリルビーズ）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．オキシランアクリルビーズ（エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ）をカゼイン又はカッパ−カゼイン（製造Ｍ）で処理し、そして引き続いてHRPOアルデヒド（製造Ｄ）で標識化した
２．Journal of General Microbiology,（1983）129：431-438に記載されているように液体培養において増殖及び成長させたアスパラギン酸プロテアーゼ生産性カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（ATCC 28366）培養物
３．グアヤク層状シート（製造Ｓ）
４．緩衝液及び溶液
ａ．20mMの過酸化水素
ｂ．500mMのMES緩衝液、pH6.0
Ｂ．手順
10mg（湿潤重量）〔エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ−カゼイン−HRPO〕接合体（又はカッパ−カゼイン同等体）を300μｌの分泌された活性なアスパラギン酸プロテアーゼを含有するカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）培養物、あるいは20分間沸騰させてアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化した300μｌの同一のカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）培養物の中に懸濁させた。この混合物を室温において15分間回転させ、そしてこの懸濁液を遠心して固体の接合体及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞を沈降させた。
８μｌの透明な上澄み液を10μｌの過酸化水素溶液及び10μｌのMES緩衝液と混合した。20μｌの各溶液をグアヤク層状シートの表面に添加し、そしてシートを青色の形成について実験した。
0003705441.tif 000004
Ｃ．結果
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）処理〔エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ−タンパク質−HRPO〕上澄み液を添加したグアヤク層状シート上の区域において、暗い青色が形成した。沸騰した培養物で処理した〔エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ−タンパク質−HRPO〕上澄み液を添加した区域において、色は見られなかった。
0003705441.tif 000005
Ｄ．解釈
活性アスパラギン酸プロテアーゼはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞が加水分解したエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ結合のカゼイン又はカッパ−カゼインにより成長培地の中に分泌され、可溶性の活性HRPOを解放した。遠心はエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOのみを溶液の中に残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒し、青色を生成した。それゆえ、グアヤク層状シート上の青色の形成は、アスパラギン酸プロテアーゼを検出する便利な方法を提供する。
培養物の沸騰はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）細胞により成長培地の中に分泌されたアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化した。それゆえ、エウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ結合カゼイン又はカッパ−カゼインは加水分解されず、そして可溶性の活性HRPOは支持体から解放されなかった。遠心はエウパーギット（Eupergit▲Ｒ▼）Ｃ結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼを可溶化HRPOを溶液の中に残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、そしてわずかに検出可能な青色が形成した。支持体からのHRPOの解放は、単に成長培地の中に存在する塩類又は他の化合物によるHRPOの非特異的解放の結果ではなかった。
実験III
この実験は、ペプシン及びアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からのアスパラギン酸プロテアーゼによる〔セファロース−ヘモグロビン−HRPO〕又は〔セファロース−ミオグロビン−HRPO〕からのHRPOの解放を含む。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化セファロース）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．まず共有結合したヘモグロビン又はミオグロビン（製造Ｅ）で誘導しそして引き続いてHRPOアルデヒド（製造Ｄ及びＦ）で標識化された臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）4B（製造Ａ）。接合体を室温において100mMのシアノホウ水素化ナトリウムで一夜処理し、そして使用前0.5ＭのNaClで洗浄した。
２．被検溶液：ａ．アルペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からの商業的に入手可能なアスパラギン酸プロテアーゼ（ＸIII）（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（２mg／ml、水中）（すべてはSigma Chemical Co.から購入した）
３．商業的に入手可能なヘモクルト（Hemoccult▲Ｒ▼）の形態のグアヤク含浸紙（SmithKline Diagnosticsから）
４．緩衝液及び溶液
ａ．200mMのリン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.02％（ｖ／ｖ）の過酸化水素
ｂ．100mMの酢酸塩緩衝液、pH4.0
Ｂ．手順
40mg（湿潤重量）〔セファロース−ヘモグロビン−HRPO〕（又はミオグロビン同等体）接合体を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0の中に懸濁させ、そして25μｌの被検溶液を添加した。懸濁液を室温において15分間インキュベートし、そして遠心して固相の接合体を除去した。５μｌの上澄み液をグアヤクのスライドに添加し、次いで５μｌの過酸化水素溶液を添加した。
0003705441.tif 000006
Ｃ．結果
アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上澄み液の試料を添加したグアヤク含浸シート上の区域において、暗い青色が形成した。BSA単独のみ（２mg／ml）を含有する上澄み液のアリコート又は緩衝液を添加した区域において、非常に弱い色のみが見られた。
0003705441.tif 000007
Ｄ．解釈
活性なアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）のアスパラギン酸プロテアーゼ及びペプシン、すなわち、豚の胃からのアスパラギン酸プロテアーゼは、セファロース結合ヘモグロビン又はミオグロビンを加水分解して、可溶性の活性HRPOを解放した。遠心はセファロース結合HRPOを沈降させ、酵素が可溶化したHRPOのみを溶液の中に残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒し、青色を生成した。それゆえ、グアヤク層状シート上の青色の形成は、活性なアスペルギルス（Aspergillus）のアスパラギン酸プロテアーゼ又はブタのペプシンを検出する便利な方法を提供する。
BSA又は緩衝液のいずれもアスパラギン酸プロテアーゼ活性をもたない。それゆえ、セファロース結合ヘモグロビン又はミオグロビンは加水分解されず、そして可溶性の活性HRPOは支持体から解放されなかった。遠心はセファロース結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを溶液の中に残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、そしてわずかに検出可能な青色が形成した。
実験IV
この実験は、ペプシン及びアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からのアスパラギン酸プロテアーゼによる〔セファロース−カゼイン−HRPO〕又は〔セファロース−カッパ−カゼイン−HRPO〕からのHRPOの解放を含む。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化セファロース）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．臭化シアン活性化セファロース（Sepharose）4B（製造Ａ）をカッパ−カゼイン−HRPO又はカゼイン−HRPO（ヒドラジド法）（製造Ｂ及びＣ）と反応させた
２．被検溶液：ａ．アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からの商業的に入手可能なアスパラギン酸プロテアーゼ（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（２mg／ml、水中）（すべてはSigma Chemical Co.から購入した）
３．商業的に入手可能なヘモクルト（Hemoccult▲Ｒ▼）の形態のグアヤク含浸紙（SmithKline Diagnosticsから）
４．緩衝液及び溶液
ａ．200mMのリン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.02％（ｖ／ｖ）の過酸化水素
ｂ．100mMの酢酸塩緩衝液、pH4.0
Ｂ．手順
40mg（湿潤重量）〔セファロース−カゼイン−HRPO〕（又はカッパ−カゼイン同等体）接合体を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0の中に懸濁させ、そして25μｌの被検溶液を添加した。懸濁液を室温において15分間インキュベートし、そして遠心して固相の接合体を除去した。５μｌの上澄み液をグアヤクのスライドに添加し、次いで５μｌの過酸化水素溶液を添加した。
0003705441.tif 000008
Ｃ．結果
アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上澄み液の試料を添加したグアヤク含浸シート上の区域において、暗い青色が形成した。BSA単独のみ（２mg／ml）を含有する上澄み液のアリコート又は緩衝液を添加した区域において、非常に弱い色のみが見られた。
0003705441.tif 000009
Ｄ．解釈
活性なアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）のアスパラギン酸プロテアーゼ及びブタのペプシンは、セファロース結合カゼイン又はカッパ−カゼインを加水分解して、可溶性の活性HRPOを解放した。遠心はセファロース結合HRPOを沈降させ、酵素が可溶化したHRPOのみを溶液の中に残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒し、青色を生成した。それゆえ、グアヤク層状シート上の青色の形成は、アスパラギン酸プロテアーゼ又はブタのペプシンを検出する便利な方法を提供する。
BSA又は緩衝液のいずれもアスパラギン酸プロテアーゼ活性をもたない。それゆえ、セファロース結合カゼイン又はカッパ−カゼインは加水分解されず、そして可溶性の活性HRPOは支持体から解放されなかった。遠心はセファロース結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを溶液の中に残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、そしてわずかに検出可能な青色が形成した。
実験Ｖ
この実験は、ペプシン及びアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からのアスパラギン酸プロテアーゼによる〔キチン−カッパ−カゼイン−HRPO〕からのHRPOの解放を含む。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化キチン）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．臭化シアン活性化キチン（製造Ａ）をカッパ−カゼイン−HRPO（ヒドラジド法）（製造Ｂ及びＣ）と反応させた
２．被検溶液：ａ．アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からの商業的に入手可能なアスパラギン酸プロテアーゼ（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（２mg／ml、水中）（すべてはSigma Chemical Co.から購入した）
３．商業的に入手可能なヘモクルト（Hemoccult▲Ｒ▼）の形態のグアヤク含浸紙（SmithKline Diagnosticsから）
４．緩衝液及び溶液
ａ．200mMのリン酸塩緩衝液、pH7.0中の0.02％（ｖ／ｖ）の過酸化水素
ｂ．100mMの酢酸塩緩衝液、pH4.0
Ｂ．手順
40mg（湿潤重量）〔キチン−カッパ−カゼイン−HRPO〕接合体を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0の中に懸濁させ、そして25μｌの被検溶液を添加した。懸濁液を室温において15分間インキュベートし、そして遠心して固相の接合体を除去した。５μｌの上澄み液をグアヤクのスライドに添加し、次いで５μｌの過酸化水素溶液を添加した。
0003705441.tif 000010
Ｃ．結果
アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）からのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上澄み液の試料を添加したグアヤク含浸シート上の区域において、暗い青色が形成した。BSA単独のみ（２mg／ml）を含有する上澄み液のアリコート又は緩衝液を添加した区域において、非常に弱い色のみが見られた。
0003705441.tif 000011
Ｄ．解釈
活性なアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）のアスパラギン酸プロテアーゼ及びブタのペプシンは、シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20結合ヘモグロビン又はミオグロビンを加水分解して、可溶性の活性HRPOを解放した。遠心はシグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20結合HRPOを沈降させ、酵素が可溶化したHRPOのみを溶液の中に残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒し、青色を生成した。それゆえ、グアヤク層状シート上の青色の形成は、アスパラギン酸プロテアーゼ又はブタのペプシンを検出する便利な方法を提供する。
BSA又は緩衝液のいずれもアスパラギン酸プロテアーゼ活性をもたない。それゆえ、シグマセル（Sigmacell▲Ｒ▼）20結合ヘモグロビン又はミオグロビンは加水分解されず、そして可溶性の活性HRPOは支持体から解放されなかった。遠心はキチン結合HRPOを沈降させ、アスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを溶液の中に残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、そしてわずかに検出可能な青色が形成した。
実験VI
この実験は、アスペルギルス属Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ、及びペプシンによる〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20ヘモグロビン−HRPO〕又は〔SIGMACELL▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン−HRPO〕からのHRPOの放出に関する。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20（試料Ａ）を先ず共有結合ヘモグロビン又はミオグロビンで誘導し（試料Ｅ）、その後HRPOアルデヒドで標識したもの（試料Ｄ−Ｆ）。抱合体を室温で100mMシアノホウ水素化ナトリウムで一夜処理して、使用前に0.5Ｍ NaClで洗浄した。
２．試験溶液：ａ．市販のAspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（水中に２mg／ml）（すべてSigma Chemical Co.より購入）。
３．市販のHemoccult▲Ｒ▼スライド形態のグアヤク含浸紙。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．200mMリン酸塩緩衝液、pH7.0に溶解した0.02％（ｖ／ｖ）過酸化水素。
ｂ．100mM酢酸塩緩衝液、pH4.0。
Ｂ．手順
〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ヘモグロビン−HRPO〕（又はミオグロビン等価物）抱合体40mg（湿重量）を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0中に懸濁し、試験溶液25μｌを加えた。懸濁液を室温で15分間インキュベートし、遠心分離して固相抱合体を取り出した。上清５μｌをグアヤクスライドに加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えた。
0003705441.tif 000012
Ｃ．結果
Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上清試料を加えた領域のグアヤク含浸シート上に暗青色が生じた。BSA（２mg／ml）後の上清アリコート又は緩衝液を加えた領域に、極くかすかな色だけが観察された。
0003705441.tif 000013
Ｄ．説明
活性Aspergillus saitoiアスパラギン酸プロテアーゼ及びブタのペプシンは、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合ヘモグロビン又はミオグロビンを加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離は、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中に酵素可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク層化シート上の青色は、アスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを検出するのに便利な方法を提供する。
BSAも緩衝液もアスパラギン酸プロテアーゼ活性を示さない。そこでSigmacell▲Ｒ▼ 20結合ヘモグロビン又はミオグロビンは加水分解されなかったし、可溶性活性HRPOは支持体から放出されなかった。遠心分離はSigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、かろうじて検出可能な青色が生成された。
実験VII
この実験は、アスペルギルス属Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ、及びペプシンによる〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20カッパ−カゼイン−HRPO〕からのHRPOの放出の一例である。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20）（HRPOヒドラジドカップリング法）
１．臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20（試料Ａ）をカッパ−カゼイン−HRPOと反応させたもの（ヒドラジド法）（試料Ｂ及びＣ）。
２．試験溶液：ａ．市販のAspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（水中に２mg／ml）（すべてSigma Chemical Co.より購入）。
３．市販のHemoccult▲Ｒ▼スライド形態のグアヤク含浸紙。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．200mMリン酸塩緩衝液、pH7.0に溶解した0.02％（ｖ／ｖ）過酸化水素。
ｂ．100mM酢酸塩緩衝液、pH4.0。
Ｂ．手順
〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−カッパ−カゼイン−HRPO〕抱合体40mg（湿重量）を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0中に懸濁し、試験溶液25μｌを加えた。懸濁液を室温で15分間インキュベートし、遠心分離して固相抱合体を取り出した。上清５μｌをグアヤクスライドに加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えた。
0003705441.tif 000014
Ｃ．結果
Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上清試料を加えた領域のグアヤク含浸シート上に暗青色が生じた。BSA（2.0mg／ml）後の上清アリコート又は緩衝液を加えた領域に、極くかすかな色だけが観察された。
0003705441.tif 000015
Ｄ．説明
活性Aspergillus saitoiアスパラギン酸プロテアーゼ及びブタのペプシンは、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合カッパ−カゼインを加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離はSigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中に酵素可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク層化シート上の青色生成は、アスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを検出するのに便利な方法を提供する。
BSAも緩衝液もアスパラギン酸プロテアーゼ活性を示さない。そこでSigmacell▲Ｒ▼ 20結合カッパ−カゼインは加水分解されなかったし、可溶性活性HRPOは支持体から放出されなかった。遠心分離はSigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、かろうじて検出可能な青色が生成された。
実験VIII
この実験は、アスペルギルス属Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ、及びペプシンによる〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−カッパ−カゼイン−HRPO〕（ヒドラジド法）又は〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン／ヘモグロビン−HRPO〕（アルデヒド法）からのHRPOの放出の一例である。
Ａ．材料：（臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20）
１．臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20（試料Ａ）をカッパ−カゼイン及びHRPOと反応させたもの（ヒドラジド法）（試料Ｂ）。あるいは臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20をヘモグロビン又はミオグロビンで誘導し（試料Ｅ）、次いでHRPOアルデヒドとカップリングさせた（試料Ｄ）。
２．試験溶液：ａ．市販のAspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（水中に２mg／ml）（すべてSigma Chemical Co.より購入）。
３．市販のHemoccult▲Ｒ▼スライド形態のグアヤク含浸紙。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．200mMリン酸塩緩衝液、pH7.0に溶解した0.02％（ｖ／ｖ）過酸化水素。
ｂ．100mM酢酸塩緩衝液、pH4.0。
Ｂ．手順
〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−カッパ−カゼイン−HRPO〕抱合体40mg（湿重量）を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0中に懸濁し、試験溶液25μｌを加えた。懸濁液を室温で15分間インキュベートし、遠心分離して固相抱合体を取り出した。上清５μｌをグアヤクスライドに加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えた。
0003705441.tif 000016
Ｃ．結果
Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上清試料を加えた領域のグアヤク含浸シート上に暗青色が生じた。BSA（2.0mg／ml）後の上清アリコート又は緩衝液を加えた領域に、極くかすかな色だけが観察された。
0003705441.tif 000017
Ｄ．説明
活性Aspergillus saitoiアスパラギン酸プロテアーゼ及びブタペプシンは、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合カッパ−カゼインを加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離は、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中に酵素可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク層化シート上の青色生成は、アスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを検出するのに便利な方法を提供する。
BSAも緩衝液もアスパラギン酸プロテアーゼ活性を示さない。そこでSigmacell▲Ｒ▼ 20結合カッパ−カゼインは加水分解されなかったし、可溶性活性HRPOは支持体から放出されなかった。遠心分離はSigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、かろうじて検出可能な青色が生成された。
実験IX
この実験は、カンジダアルビカンスCandida albicans培養中に放出されるアスパラギン酸プロテアーゼによる〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ヘモグロビン−HRPO〕又は〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン−HRPO〕からのHRPOの放出の一例である。
Ａ．材料：（アルデヒド活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．アルデヒド活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20（試料Ｇ）を先ず共有結合ヘモグロビン又はミオグロビンで誘導し（試料Ｈ）、次いでHRPOアルデヒドで標識したもの（試料Ｄ及びＦ）。
２．Journal of General Microbiology,（1983）129：431-438に記載されているように液体培養中で増殖、成長させたアスパラギン酸プロテアーゼ産生カンジダアルビカンスCandida albicans（ATCC 28366）培養。
３．グアヤク層化紙（試料Ｓ）。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．20mM過酸化水素。
ｂ．500mM MES緩衝液、pH6.0。
Ｂ．手順
〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−タンパク質−HRPO〕抱合体10mg（湿重量）を300μｌの分泌されたアスパラギン酸プロテアーゼを含有するカンジダアルビカンスCandida albicans培養か、又は20分間煮沸してアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化させた300μｌの同一カンジダアルビカンスCandida albicans培養中に懸濁した。混合物を室温で15分間回転させて、懸濁液を遠心分離して固体抱合体及びカンジダアルビカンスCandida albicans細胞を沈殿させた。
透明上清80μｌを過酸化水素溶液10μｌ及びMES緩衝液10μｌと混合した。各溶液20μｌをグアヤク層化シート表面に加えて、シートを青色生成に関して調べた。
0003705441.tif 000018
Ｃ．結果
カンジダアルビカンスCandida albicans処理Sepharose−タンパク質−HRPOを加えた領域のグアヤク層化シート上に暗青色が生じた。煮沸培養処理Sepharose−タンパク質−HRPOを加えた領域に発色は観察されなかった。
0003705441.tif 000019
Ｄ．説明
カンジダアルビカンスCandida albicans細胞により成長培地中に分泌されるアスパラギン酸プロテアーゼは、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合タンパク質を加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離はSepharose結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク層化シート上の青色生成は、アスパラギン酸プロテアーゼを検出するのに便利な方法を提供する。
培養を煮沸すると、カンジダアルビカンスCandida albicans細胞により成長培地中に分泌されるアスパラギン酸プロテアーゼが不活性化された。そこでSigmacell▲Ｒ▼ 20結合タンパク質は加水分解されなかったし、可溶性活性HRPOは支持体から放出されなかった。遠心分離はSigmacell▲Ｒ▼ 20結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、かろうじて検出可能な青色が生成された。支持体からのHRPOの放出は、成長培地中に存在する塩又は他の成分によるHRPOの非特異的放出の結果であるだけではなかった。
実験Ｘ
この実験は、ペプシン及びAspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼによる〔高分子ジアルデヒド−カッパ−カゼイン−HRPO〕からのHRPOの放出の一例である。
Ａ．材料：（高分子ジアルデヒド）（HRPOヒドラジドカップリング法）
１．Sigma Chemical Co.からの市販の高分子ジアルデヒドをカッパ−カゼイン−HRPOと反応させた（ヒドラジド法）もの（試料Ｂ及びＬ）。
２．試験溶液：ａ．市販のAspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ（30mg／ml，0.6単位／mg）；ｂ．ペプシン（１mg／ml，2900単位／mg）；及びｃ．ウシ血清アルブミン（BSA）（水中に２mg／ml）（すべてSigma Chemical Co.より購入）。
３．市販のHemoccult▲Ｒ▼スライド形態のグアヤク含浸紙。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．200mMリン酸塩緩衝液、pH7.0に溶解した0.02％（ｖ／ｖ）過酸化水素。
ｂ．100mM酢酸塩緩衝液、pH4.0。
Ｂ．手順
〔高分子ジアルデヒド−カッパ−カゼイン−HRPO〕抱合体40mg（湿重量）を75μｌの酢酸塩緩衝液、pH4.0に懸濁し、試験溶液25μｌを加えた。懸濁液を室温で15分間インキュベートし、遠心分離して固相抱合体を取り出した。上清５μｌをグアヤクスライドに加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えた。
0003705441.tif 000020
Ｃ．結果
Aspergillus saitoiからのアスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを含有する上清試料を加えた領域のグアヤク含浸シート上に暗青色が生じた。BSA（2.0mg／ml）後の上清アリコート又は緩衝液を加えた領域に、極くかすかな色だけが観察された。
0003705441.tif 000021
Ｄ．説明
活性Aspergillus saitoiアスパラギン酸プロテアーゼ及びブタペプシンは、高分子ジアルデヒド結合カッパ−カゼインを加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離は高分子ジアルデヒド結合HRPOを沈殿させて、溶液中に酵素可溶化HRPOだけを残した。化溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク層化シート上の青色生成は、アスパラギン酸プロテアーゼ又はペプシンを検出するのに便利な方法を提供する。
BSAも緩衝液もアスパラギン酸プロテアーゼ活性を示さない。そこで高分子ジアルデヒド結合カッパ−カゼインは加水分解されなかったし、可溶性活性HRPOは支持体から放出されなかった。遠心分離は高分子ジアルデヒド結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、かろうじて検出可能な青色が生成された。
実験ＸＩ
この実験は、カンジダアルビカンスCandida albicansからのアスパラギン酸プロテアーゼによる〔高分子ジアルデヒド−ミオグロビン−HRPO〕からのHRPOの放出の一例である。
Ａ．材料：（高分子ジアルデヒド）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．Sigma Chemical Co.からの市販の高分子ジアルデヒドをミオグロビンと反応させ（試料Ｎ）、次いでHRPOアルデヒドと反応させたもの（試料Ｎ）。
２．Journal of General Microbiology,（1983）129：431-438に記載されているように液体培養中で増殖、成長させたアスパラギン酸プロテアーゼ産生カンジダアルビカンスCandida albicans（ATCC 28366）培養。
３．グアヤク層化紙（試料Ｓ）。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．20mM過酸化水素。
ｂ．500mM MES緩衝液、pH6.0。
Ｂ．手順
〔高分子ジアルデヒド−ミオグロビン−HRPO〕抱合体10mg（湿重量）を300μｌの分泌されたアスパラギン酸プロテアーゼを含有するカンジダアルビカンスCandida albicans培養か、又は20分間煮沸してアスパラギン酸プロテアーゼを不活性化させた300μｌの同一カンジダアルビカンスCandida albicans培養中に懸濁した。混合物を室温で20分間回転させて、懸濁液を遠心分離して固体抱合体及びカンジダアルビカンスCandida albicans細胞を沈殿させた。
透明上清80μｌを過酸化水素溶液10μｌ及びMES緩衝液10μｌと混合した。各溶液20μｌをグアヤク層化シート表面に加えて、シートを青色生成に関して調べた。
0003705441.tif 000022
Ｃ．結果
カンジダアルビカンスCandida albicans処理高分子ジアルデヒド−ミオグロビン−HRPOを加えた領域のグアヤク層化シート上に暗青色が生じた。煮沸培養処理ジアルデヒド−ミオグロビン−HRPOを加えた領域に発色は観察されなかった。
0003705441.tif 000023
Ｄ．説明
カンジダアルビカンスCandida albicans細胞により成長培地中に分泌される活性アスパラギン酸プロテアーゼは、高分子ジアルデヒド−ミオグロビンを加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離は高分子ジアルデヒド結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク層化シート上の青色生成は、アスパラギン酸プロテアーゼを検出するのに便利な方法を提供する。
培養を煮沸すると、カンジダアルビカンスCandida albicans細胞により成長培地中に分泌されるアスパラギン酸プロテアーゼが不活性化された。そこで高分子ジアルデヒド結合ミオグロビンは加水分解されなかったし、可溶性活性HRPOは支持体から放出されなかった。遠心分離は高分子ジアルデヒド結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。過酸化水素によるグアヤクの酸化は触媒されず、かろうじて検出可能な青色が生成された。支持体からのHRPOの放出は、成長培地中に存在する塩又は他の成分によるHRPOの非特異的放出の結果であるだけではなかった。
実験ＸII
この実験は、膣液検体による〔Sepharose 6MB−カッパ−カゼイン−HRPO〕からのHRPOの放出に関する。
Ａ．材料：（市販の臭化シアン活性化Sepharose 6MB）（HRPOヒドラジドカップリング法）
１．Sepharose 6MB−カッパ−カゼイン−HRPO抱合体（試料Ｃ）。
２．標準Dacronスワブに採取した膣液標本。検体は使用直前まで凍結した。検体を解氷し、特に取り付けた管中で遠心分離してスワブから未希釈膣液を抽出させた。各スワブからの全検体を試験した。必要な場合は、蒸留水を検体に加えて最終容積を75μｌとした。
指示された場合には、臨床的に陰門膣カンジダ症が認められない女性から採取した膣液検体にカンジダアルビカンス培養（例えば実施例１参照）25μｌを加えた。
３．グアヤク含有濾紙（市販のHemoccult▲Ｒ▼試験スライド）。
４．緩衝剤及び溶液
ａ．６mM過酸化水素。
ｂ．250mMグリシルグリシン、pH3.0。
Ｂ．手順
〔Sepharose−カッパ−カゼイン−HRPO〕抱合体30mg（湿重量）を75μｌの処理又は未処理膣液中に懸濁した。懸濁液を室温で15分間インキュベートし、遠心分離して固体抱合体及び他の破片を沈殿させた。
透明上清５μｌをグアヤク含浸紙に加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えて、青色生成に関してシートを調べた。
0003705441.tif 000024
Ｃ．結果
陰門膣カンジダ症に感染した女性からの膣液上清を加えた領域のグアヤク含浸紙上に暗青色が生じた。対照女性からの膣液上清を加えたグアヤク含浸紙の領域には発色は認められなかった。さらに増殖中のカンジダアルビカンス培養からの培地を補充しておいた正常女性の膣液上清を加えた領域のグアヤク含浸紙上には強青色が生じた。
0003705441.tif 000025
Ｄ．説明
臨床的に陰門膣カンジダ症が立証された女性からの膣液は、Sepharose 6MB結合カッパ−カゼインをpH3.0で室温で15分で加水分解し、可溶性活性HRPOを放出するアスパラギン酸プロテアーゼを含有した。遠心分離はSepharose 6MB結合HRPOを沈殿させて、溶液中に放出された可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは市販のHemoccult▲Ｒ▼スライドの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにHemoccult▲Ｒ▼スライド上の青色生成は、膣液中のカンジダ由来アスパラギン酸プロテアーゼを、したがって陰門膣カンジダ症を検出するための迅速且つ便利な方法を提供する。
陰門膣カンジダ症でない正常女性からの膣液はアスパラギン酸プロテアーゼを含有せず、Sepharose 6MB結合カッパ−カゼインをpH3.0で室温で15分で加水分解できず、可溶性活性HRPOを放出できなかった。遠心分離はSepharose 6MB結合HRPOを沈殿させて、溶液中に放出された可溶化HRPOを残さなかった。HRPO触媒がなければ市販のHemoccult▲Ｒ▼スライドの酸化は起きず、青色は生じなかった。したがってHemoccult▲Ｒ▼スライド上に青色が生じないことが、膣液中のカンジダ由来アスパラギン酸プロテアーゼを有さない正常女性を、したがって陰門膣カンジダ症を有さない女性を検出するための迅速且つ便利な方法を提供する。
最後に、カンジダアルビカンス培養からの培地を陰門膣カンジダ症を有さない正常女性からの膣液に加えた場合、Sepharose 6MB結合カッパ−カゼインの加水分解はpH3.0で室温で15分で起こり、可溶性活性HRPOが放出された。遠心分離はSepharose 6MB結合HRPOを沈殿させて、溶液中に放出された可溶化HRPOを残した。可溶性HRPOは過酸化水素による市販のHemoccult▲Ｒ▼スライドの酸化を触媒し、青色を生じた。したがってHemoccult▲Ｒ▼スライド上の青色生成は、カンジダアルビカンス細胞により成長培地中に放出されたアスパラギン酸プロテアーゼが、正常女性からの膣液に加えた場合でも迅速且つ便利に検出され易いことを立証する。
実験ＸIII
この実験は、膣液検体による〔Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ−ミオグロビン−HRPO〕及び〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン−HRPO〕からのHRPOの放出に関する。
１．正常膣液
２．臨床的に陰門膣カンジダ症と診断された女性からの膣液
Ａ．材料：（臭化シアン活性化Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビンHRPO）（試料Ａ及びＩ）及び（Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ−ミオグロビンHRPO）（試料Ｑ）（HRPOアルデヒドカップリング法）
１．ミオグロビン−HRPOアルデヒドとカップリングした微細研削オキシランアクリルビーズ（試料Ｑ）。
２．ミオグロビン−HRPOアルデヒドとカップリングしたSigmacell▲Ｒ▼ 20（臭化シアン活性化、試料Ａ）（試料１）。
３．標準Dacronスワブで採取した膣液標本。検体は使用直前まで凍結した。検体を解氷し、特に取り付けた試験管中で遠心分離してスワブから未希釈膣液を抽出させた。各スワブからの全検体を試験した。
４．グアヤク含有濾紙（市販のHemoccult▲Ｒ▼試験スライド）。
５．緩衝剤及び溶液
ａ．６mM過酸化水素。
ｂ．250mMグリシルグリシン、pH3.0。
ｃ．1.0Ｍ酢酸塩緩衝液、pH4.0。
Ｂ．手順
Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ結合ミオグロビン−HRPO抱合体20mg（湿重量）を未希釈膣液及び10μｌの１Ｍ酢酸塩緩衝液中に懸濁した。懸濁液を室温で10分間インキュベートし、遠心分離して固体抱合体及び他の破片を沈殿させた。
透明上清５μｌをグアヤク含浸紙に加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えて、青色生成に関してシートを調べた。
Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合ミオグロビン−HRPO抱合体20mg（湿重量）を未希釈膣液及び10μｌの250mM酢酸塩緩衝液中に懸濁した。懸濁液を室温で10分間インキュベートし、遠心分離して固体抱合体及び他の破片を沈殿させた。
透明上清５μｌをグアヤク含浸紙に加え、その後過酸化水素溶液５μｌを加えて、青色生成に関してシートを調べた。
0003705441.tif 000026
Ｃ．結果
陰門膣カンジダ症に感染した女性からの膣液を加えた領域のグアヤク含浸紙上に暗青色が生じた。対照からの膣液上清を加えたグアヤク含浸紙の領域には発色は認められなかった。
0003705441.tif 000027
Ｄ．説明
カンジダアルビカンス細胞により臨床的カンジダ症女性の膣液中に分泌された活性アスパラギン酸プロテアーゼは、Sigmacell▲Ｒ▼ 20結合タンパク質及びEupergit▲Ｒ▼ Ｃ結合タンパク質をともに加水分解して、可溶性活性HRPOを放出した。遠心分離はポリマー結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOだけを残した。可溶性HRPOは過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒して、青色を生じた。ゆえにグアヤク含浸紙上の青色生成は、膣液中のアスパラギン酸プロテアーゼ検出し、それにより陰門膣カンジダ症を検出するための便利で且つ有効な方法を提供する。
活性アスパラギン酸プロテアーゼは、対照女性、即ち臨床的カンジダ症でない女性の膣液中には認められない。したがって対照女性からの膣液検体はポリマー結合タンパク質を加水分解できず、いずれの支持体からも可溶性活性HRPOを放出できなかった。遠心分離はポリマー結合HRPOを沈殿させて、溶液中にアスパラギン酸プロテアーゼ可溶化HRPOを残さなかった。HRPOが欠如した場合、対照検体からの上清は過酸化水素によるグアヤクの酸化を触媒できず、青色を生じることできなかった。したがってグアヤク含有紙上の青色不生成は、陰門膣カンジダ症に感染していない女性を同定するための便利な方法を提供する。
実験ＸIV
この実験は、〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン−HRPO〕におけるいくつかの微生物プロテアーゼの示差加水分解活性に関する。
Ａ．材料
１．〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン−HRPO〕（試料Ｅ及びＦ）
２．アスパラギン酸プロテアーゼ産生カンジダアルビカンス（ATCC 28366）培養。
３．膣トリコモナスTrichomonas vaginalis（ATCC 3001）培養。
４．食塩溶液中のMobiluncus curtisii懸濁液（ATCC 35241）。
５．緩衝剤及び溶液
ａ．0.02％過酸化水素溶液。
ｂ．リン酸カリウム緩衝液、pH7.5，300mM。
ｃ．酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0，100mM。
６．グアヤク含浸紙（市販のHemoccult▲Ｒ▼試験スライド）。
Ｂ．手順
基質〔Sigmacell▲Ｒ▼ 20−ミオグロビン−HRPO〕20mgを75μｌの適切な緩衝液（下表参照）中に懸濁し、その後25μｌの細胞培養／懸濁液を加えた。反応液を10〜30分間インキュベートし、その後標本を遠心分離して固相抱合基質及び細胞破片を取り出した。反応上清５μｌをグアヤクスライドに加えて、過酸化水素溶液５μｌで発色させた。反応条件及び発色を以下の表に報告する。
0003705441.tif 000028
Ｃ．結果
緩衝液とともにpH4.0又はpH7.5で30分間インキュベートした試験管からの反応上清をグアヤクスライドに加えて過酸化水素で発色させた場合、発色は生じなかった。カンジダアルビカンスCandida albicans（pH4.0及びpH7.5）、膣トリコモナスTrichomonas vaginalis（pH4.0及びpH7.5）又はMobiluncus curtisii（pH4.0及びpH7.5）からの煮沸培養に関しては同様の結果が観察された。カンジダアルビカンス培養はpH4.0で10分間インキュベーション後に強青色を生じたが、しかしpH7.5で30分後では生じなかった。膣トリコモナスはpH7.5で30分間インキュベーション後に強青色を生じたが、しかしpH4.0で30分間インキュベーション後には発色がかろうじて検出できたにすぎなかった。Mobiluncus curtisiiはpH4.0でもpH7.5でも30分では青色を生じなかった。
0003705441.tif 000029
Ｄ．説明
室温で30分間インキュベーション中のpH7.5の300mMリン酸塩緩衝液又はpH4.0の100mM酢酸塩緩衝液により固体支持体からHRPOは放出されない。同様に、カンジダアルビカンスCandida albicans、膣トリコモナスTrichomonas vaginalis又はMobiluncus curtisiiの煮沸上清は、室温で30分間インキュベーション中にpH7.5又はpH4.0でHRPOを放出しない。しかしながらカンジダアルビカンス培養はpH4.0で10分で固体支持体からHRPOを放出するが、しかしpH7.5では30分間インキュベーションでもHRPOを放出できなかった。これはカンジダアルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼの確定されたpHプロフィールと一致しており、即ち低pHでは活性であるが高pHではあまり活性でないか又は不活性である。逆に膣トリコモナス培養は30分間のインキュベーション期間にpH7.4で支持体からHRPOを容易に放出するが、しかしpH4.0ではかろうじて検出できる量のHRPOを放出する。このふるまいは膣トリコモナスの公知のpHプロフィール（即ち高pHで活性で、低pHではほとんど活性でないか又は不活性である）と一致する。最後に、プロテアーゼを排出することが知られていないMobiluncus curtisiiは、30分間のインキュベーション期間でもpH4.0又はpH7.5でもHRPOを放出できない。
したがって異なるpH条件下で試験を実施することにより、３種類の微生物間の区別ができる：カンジダアルビカンスのみはpH4.0で室温で10分で発色を生じる；膣トリコモナスだけが30分でpH7.5で発色を生じる；そしてMobiluncus curtisiiはpH7.5又はpH4.0で30分で発色を生じない。
実験ＸＶ
この実験は、基質〔Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ−ミオグロビン−HRPO〕における種々の微生物プロテアーゼ及びそれらの阻害剤の活性に関する。
Ａ．材料
１．粉末化〔Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ−ミオグロビン−HRPO〕（試料Ｑ）。
２．Sigma Chemical Co.から購入した市販のアスパラギン酸プロテアーゼ（ＸIII型。Aspergillus saitoiから採取。0.6単位／mg活性）。
３．トリプシン（セリンプロテアーゼ）（ウシ膵臓から採取。2900単位／mg活性。U．S．Biochemicalsより購入）２mg/ml。
４．パパイン（チオールプロテアーゼ）（パパイアアラテックスから採取。12単位／mg活性。Sigma Chemical Co.から購入）２mg／ml。
５．アスパラギン酸プロテアーゼ産生カンジダアルビカンス（ATCC 28366）培養。
６．エタノール中の50mM塩酸トシルリシンクロロメチルケトン（TLCK）（Sigma Chemical Co.）。
７．微生物源からのペプスタチンＡ（Sigma Chemical Co.より購入）２mg／ml。エタノールに溶解。
８．緩衝剤及び溶液
ａ．リン酸カリウム緩衝液、pH7.0，200mM。
ｂ．リン酸カリウム緩衝液、pH7.4，100mM。
ｃ．酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.0，100mM。
ｄ．0.02％過酸化水素溶液。
ｅ．無水エタノール。
９．グアヤク含浸紙（市販のHemoccult▲Ｒ▼試験スライド）。
Ｂ．手順
本検定は２つの部分から成る。第一は基質〔Eupergit▲Ｒ▼ Ｃ−ミオグロビン−HRPO〕上の異なるプロテアーゼの活性を調べることである。酵素及び対照（15分間煮沸した酵素）を20mgの基質及び緩衝液（量は下表参照）とともに検定前に15分間インキュベートする。第二の部分では、酵素をそれぞれの阻害剤及び適切な緩衝液とともに15分間予備インキュベートする。次にこれらを基質に加えて室温でさらに15分間インキュベートする。
いずれの場合も、反応混合物を遠心分離して固相抱合体を取り出す。上清（５μｌ）をHemoccult▲Ｒ▼スライドに加えて、過酸化水素溶液５μｌで発色させる。
0003705441.tif 000030
Ｃ．結果
１．パート１：緩衝液のみをpH4.0又はpH7.5で含入する試験管からの反応上清は、グアヤクスライドに加えて過酸化水素発色剤で発色させた場合、検出可能な最淡発色しか生じなかった。煮沸トリプシンpH7.4、煮沸カンジダ培養pH4.0、及び煮沸パパインpH7.4を含入する試験管からの反応上清に関して同じ結果が観察された。強青色は、pH7.4の不煮沸トリプシン、pH4.0の不煮沸カンジダ培養及びpH7.0の不煮沸パパインで生じた。
２．パート２：セリン及びチオール型プロテアーゼの両方を阻害し得るプロテアーゼ阻害剤であるTLCKは、トリプシン（セリンプロテアーゼ）及びパパイン（チオールプロテアーゼ）の両方による発色を阻害する。アスパラギン酸プロテアーゼの公知の阻害剤であるペプスタチンは、カンジダアルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼによる発色を阻害する。
0003705441.tif 000031
0003705441.tif 000032
Ｄ．説明
セリンプロテアーゼであるトリプシンはpH7.4で固相基質を加水分解して可溶性HRPOを放出し、このHRPOが発色グアヤク上での青色生成を触媒した。同じことがpH4.0のカンジダアルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼ、及びpH7.0のパパイン（チオールプロテアーゼ）に関しても言えた。煮沸すると各酵素によるHRPO放出が妨げられた。したがって３つの異なる型の酵素は各々、適切な反応条件下で支持体から可溶性HRPOを加水分解により放出できた。緩衝液も熱不活性化酵素も可溶性HRPOを放出しなかったが、これはHRPO放出が単に成長培地又はインキュベーション混合物中の塩等によって引き起こされる非特異的放出でなかったことを示す。
セリン及びチオール型プロテアーゼの両方を阻害し得るプロテアーゼ阻害剤であるTLCKは、トリプシン（セリンプロテアーゼ）及びパパイン（チオールプロテアーゼ）の両方による発色を阻害する。アスパラギン酸プロテアーゼの公知の阻害剤であるペプスタチンは、カンジダアルビカンスアスパラギン酸プロテアーゼによる発色を阻害する。したがって公知の特異的酵素阻害剤又は特定の種類の酵素の阻害剤の存在下でインキュベーションを実施することにより、加水分解酵素の特異性が得られる。
以上、本発明の説明のために述べてきた。本発明の精神及び範囲を逸脱しない限りにおいて、操作条件、材料、手順及び本明細書中に記載した方法及び試験具についての他のパラメーターをさらに修正し又は置き換え得ることは、当業者には容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
0003705441.tif 000034