(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
昆虫細胞の細胞増殖を誘導するペプチドであって、
配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のペプチドであって、前記昆虫細胞が鱗翅目昆虫の細胞であるペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載のペプチドであって、前記昆虫細胞が昆虫由来の培養細胞株ハイファイブであるペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
請求項５記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫の新規サイトカインに関する。
【０００２】
【従来の技術】
サイトカインは、生体が産生する蛋白質性のホルモン様物質であり、細胞の増殖、分化、機能発現などの様々な生体機能を調節している。一般的に、サイトカインは、そのサイトカインに対応する受容体を発現する細胞に特異的に作用する。上皮成長因子（ＥＧＦ）などの細胞増殖因子の発見を端緒に、これまで多種類のサイトカインが、主に哺乳動物から発見されている。現在、サイトカインは、再生医療をはじめ様々な基礎および応用研究において注目されている生理活性物質であり、その一部は実際に臨床（癌治療、皮膚移植等）に応用されている。
【０００３】
昆虫のサイトカインとしては、成長阻害ペプチド（GBP；  growth-blocking peptide）、麻痺性ペプチド（PP ；  paralytic peptide）、およびプラズマ細胞伸展ペプチド（PSP；  plasmatocyte-spreading peptide）を含むＥＮＦペプチド（アミノ末端が共通してGlu-Asn-Pheという配列を有していることから、その一文字標記でENFペプチドと仮称している）が現在知られている。これらのＥＮＦペプチドは、これまで鱗翅目昆虫のみにおいて同定されている。
昆虫のサイトカインについては未だよく知られてないため、有用なサイトカインを見出せる可能性が大きい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明は昆虫の新規のサイトカイン、特に、昆虫細胞の細胞増殖を誘導する有用な新規サイトカインを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記のペプチドを提供することによって本発明の課題を解決する。即ち、本発明によるペプチドは、
細胞の細胞応答を誘導するペプチドであって、
配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド；または
該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記ペプチドと同じ活性を有することを特徴とするものである。
本発明によって提供されるペプチドを総称して以後「本ペプチド」と称する。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の発明者は、最終齢幼虫のヒツジギンバエ（Lecilia cuprina）の血球細胞（血球）への活性化作用（具体的には血球凝集反応）を指標に精製を進めることによって、本ペプチドの単離に成功した。このような昆虫血球細胞を用いるアッセイ手法は、本発明によって初めて実施されたものであり新規の手法である。この手法は感度および再現性が高いので、ハエの幼虫という小さな生物を使用したにもかかわらず、本ペプチドを同定して精製することができた。
【０００７】
また、本発明の発明者は、本ペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡも取得している。このｃＤＮＡは、精製した本ペプチドの部分アミノ酸配列の情報を基に取得した。ペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡを取得する一連の手法は、当業者に周知である。即ち、最初に上記の精製したペプチドの部分アミノ酸配列を決定した。次に、そのアミノ酸配列の情報を基に各種のプライマーを作成した。次に、それらのプライマーを用いたＰＣＲクローニングによって前記遺伝子をコードする核酸断片を増幅した。次に、その核酸断片をプローブとして、ヒツジギンバエの血球細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって前記遺伝子のｃＤＮＡをクローニングした。このクローニングしたｃＤＮＡは、長さは５５５塩基対であり、そのオープンリーディングフレームは１１２のアミノ酸残基のプレ‐プロ‐ペプチドをコードしている。本ペプチドは、そのプレ‐プロ‐ペプチドのＣ末端領域に位置する一領域のアミノ酸配列を有している。
【０００８】
＜本ペプチドの特長＞
本ペプチドは、これまで報告されている種々のサイトカインの中で最も低分子量（アミノ酸１９残基）である。従って、本ペプチドを、ペプチド性のサイトカインと定義してもよい。アミノ酸１９残基からなるペプチドは、化学合成法による合成が可能である。一方、これまで見つかっている哺乳動物のサイトカインの中で最も小さいものは上皮成長因子（ＥＧＦ）であるが、この因子であってもアミノ酸５０残基程度からなるものである。５０残基程度のペプチドを化学合成によって大量に調製することは、現在の技術水準では不可能である。
【０００９】
以上のように、本ペプチドは、これまでのサイトカインにおいては達成されなかった技術的な困難性を克服したサイトカインである。
＜発明の概要＞
本発明は、下記のペプチドを提供する。本発明によって提供されるペプチド（即ち、本ペプチド）は、即ち、
細胞の細胞応答を誘導するペプチドであって、
配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド；または
該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記ペプチドと同じ活性を有するペプチド；である。従って、本ペプチドは、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、同一の活性を具備する複数の他のペプチドとを含む。
【００１０】
また、本発明は、前記本ペプチドをコードする核酸をも提供する。更に、本発明は、前記核酸を含む組換えベクターをも提供する。なお更に、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体をも提供する。ペプチドのアミノ酸配列の情報を基に、前記核酸、前記組換えベクター、および前記形質転換体を取得し、且つそれらを使用する技術は、当業者に周知の技術である。配列番号１記載のアミノ酸配列は、図１においても示される１９残基からなる配列であり、即ち、N末端から順にThr-Ile-Leu-Ser-Ala-Pro-Ser-Asn-Cys-Gln-Gln-Thr-Asp-Phe-Lys-Gly-Arg-Cys-Leuで表される配列である。
【００１１】
「細胞応答」という用語は、本ペプチドを細胞に作用させた際に発生する該細胞の生理的な反応を示す用語である。従って、本ペプチドを作用させる対象となる細胞の種類に応じて、例えば増殖、分化、遊走、殺菌物質等の分泌などの様々な細胞応答が想定される。
「細胞応答を誘導する」という用語は、本ペプチドが、対象となる細胞のある種の細胞応答を新規に発生させるか、または既に発生している細胞応答を増強させることを意味する用語である。
本ペプチドの好適な態様において、細胞応答は、「細胞凝集」および「細胞増殖」である。
以下、「細胞凝集」および「細胞増殖」について説明する。
【００１２】
［細胞凝集］
本ペプチドは、ヒツジギンバエ（Lecilia cuprina）の血球細胞（hemolymph）に細胞凝集を発生させる生理活性をもとに精製された生理活性ペプチドである。
「細胞凝集」という用語は、より具体的には、本ペプチドの作用によって細胞の接着性が高進することを意味する用語である。従って、本ペプチドが具備する作用のうち、少なくとも１つは、細胞の接着性を高進させるシグナル伝達経路を活性化させる作用である。
【００１３】
前記シグナル伝達経路の活性化は、例えば以下の（ａ）および／または（ｂ）を本ペプチドの添加の前後で観察して、（ａ）および／または（ｂ）の水準が添加の前後で変化したかどうかを比較することにより検出することができる。
（ａ）細胞塊の形成：本ペプチドの作用する対象となる細胞が互いに接着して凝集し、複数の該細胞からなる細胞塊を形成した状態。
（ｂ）異物への付着：本ペプチドが作用する細胞以外の他の物質に対する接着性が高進した状態。前記他の物質としては、例えば、培養皿などの非生物物質、細菌などの病原体を含む生物体、該生物体に由来する蛋白質などの生体物質などが想定される。
【００１４】
前記血球細胞は、細胞性免疫を担う細胞であり、脊椎動物における異物攻撃を担当する白血球に相当する。白血球は、通常は血管壁に接着することなく体内を循環しているが、病原体が侵入した場合には血管壁に接着し、そこから組織に浸潤してその病原体が侵入した感染部位に到達する必要がある。更に、特に食細胞などの白血球は、病原体に接着し、その病原体を殺菌する。このような細胞の接着性の高進（即ち、細胞凝集の発生）が白血球の機能を果たすための重要な細胞応答であることとの類似性を考慮すれば、本ペプチドの細胞凝集作用は、昆虫における免疫作用に一定の役割を果たしている可能性も示唆される。
【００１５】
［細胞増殖］
「細胞増殖」という用語は、上述のとおり本ペプチドを細胞に作用させた際に生じる細胞応答の一形態を意味する用語である。より具体的には、「細胞増殖」は、本ペプチドの作用によって細胞分裂が生じ、本ペプチドが作用しない条件と比較して細胞数が増加することを意味している。前記細胞分裂は、細胞分裂に至るシグナル伝達経路が活性化し、前記経路の活性化の途上で生じるＤＮＡ複製などを経た後に達成される現象である。従って、「細胞増殖」は、本ペプチドの作用によってＤＮＡ複製が生じ、本ペプチドが作用しない条件と比較して細胞内のＤＮＡ合成が増加することをも意味している。
【００１６】
《対象となる細胞》
本ペプチドが対象とする細胞は、このペプチドを作用させた際に細胞増殖を生じる細胞であればよく、特にその由来は限定されない。従って、哺乳類に由来する細胞などであってもよいが、好ましくは昆虫の培養細胞であり、より好ましくは鱗翅目昆虫の培養細胞であり、更に好ましくは蛾（Trichoplusia ni）の卵細胞に由来する培養細胞株であるハイファイブ（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）である。
【００１７】
《培養条件》
培養条件は、培養液に添加される血清の代わりに本ペプチドを用いる以外は、培養する対象となる細胞を培養する場合に用いられる通常の条件を使用すればよい。その際、本ペプチドの濃度は、各種の濃度条件を設定した予備実験を行って条件に応じて選択すればよいが、一般的には０〜１０００ｎＭの範囲、好ましくは０．１〜１０００ｎＭの範囲、より好ましくは１〜１０００ｎＭの範囲、更に好ましくは１０〜１００ｎＭの範囲で使用すればよい。
【００１８】
前記ハイファイブ細胞をインビトロで増殖させる条件は、例えば下記の条件などを使用することができる。即ち、
培養液：グレース培地（ＧＩＢＣＯ社、  米国）
ペプチドの濃度：１０〜１００ｎＭ
温度条件：２５℃
の条件で培養すればよい。
【００１９】
《適  用》
本ペプチドの好適な対象である昆虫細胞を培養する技術は、医薬、殺虫剤などを開発している業界で用いられている。例えば、培養した昆虫細胞は、バキュロウイルスなどによる発現系を利用して有用物質をその細胞内で生産する目的、またその細胞への殺虫剤などの薬物の感受性を検査する目的などにも使用されている。
【００２０】
＜本ペプチドの調製法＞
本ペプチドは、例えばｔ−Ｂｏｃ法、Ｆ−ｍｏｃ法などの公知のペプチドの化学合成法に従って合成することができる。また、ペプチドを化学合成する会社に依頼して合成することもできる。また、以下の実施例に記載される「細胞凝集アッセイ」に記載された血球細胞を凝集させる活性を指標にしてヒツジギンバエ（Lecilia cuprina）の血球細胞から精製することができる。その精製方法としては、公知の蛋白質およびペプチドを精製する方法を使用して精製できるが、例えば、以下の実施例の「ペプチドの調製」の記載にしたがって精製することができる。
本発明を以下の実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
＜ペプチドの調製＞
［昆  虫］
ヒツジギンバエ（Lecilia cuprina）を、16時間の明期および８時間の暗期からなる光周期条件下において、ブタの肝臓を与えて２５℃で飼育した。
【００２２】
［精製法］
孵化後２４〜３６時間経過したヒツジギンバエの３齢幼虫から、全血液を１ｍｌの氷冷５０％アセトン中に直接採取した。採取した血液（約１．５ｍｌの希釈した血球）を即座に遠心分離（２０,０００ｇ、  １０分間、  ４℃）し、その上清をSpeed-Vacで乾燥させ、これを粗精製ペプチドとした。
【００２３】
この粗精製ペプチドを、０．０５％  トリフルオロ酢酸（CF3COOH）に再溶解した。これを逆相  C１８  HPLCカラム(Capcell Pak C18 UG120; 4.6 x 150 mm、  Shiseido 社、  日本)を使用し、０〜５０％  CH3CN（０．０５％  トリフルオロ酢酸水溶液中に含まれる）によるグラジエント溶出によって流速１ｍｌ／分で分離した。次に生理活性（即ち、血球を凝集させる活性）を示した溶出物を、Speed-Vacで濃縮し、遠心濾過機(Ultrafree-MC  5,000 ダルトンカットオフ、ミリポア社、  米国)により濾過した。その濾過物を、逆相  C４  HPLCカラム（Mightysil RP-4 GP; 4.6 x 250 mm、  関東化学、  日本）を使用し、５〜２５％  CH3CN（０．０５％  トリフルオロ酢酸水溶液中に含まれる）によるグラジエント溶出によって流速１ｍｌ／分で分離した。生理活性の認められた分画を、逆相  Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（Mightysil RP-18 GP; 4.6 x 250 mm、  関東化学、  日本）を使用し、１０〜４０％  CH3CN（０．０５％  トリフルオロ酢酸水溶液中に含まれる）によるグラジエント溶出によって流速０．５ｍｌ／分で分離した。生理活性を有する分画を、逆相  C４  HPLCカラム（Protein-RP; 4.6 x 250 mm、  ＹＭＣ社、  日本）を使用し、１０〜４０％  CH3CN（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液中に含まれる）によるグラジエント溶出法によって流速１ｍｌ／分で更に分離した。最終の精製工程を、２本連結したC１８  HPLCカラム（Mightysil RP-18 GP; 4. 6 x 500 mm、  関東化学、  日本）を使用し、１８〜３３％  CH3CN（０．０５％  トリフルオロ酢酸水溶液中に含まれる）によるグラジエント溶出によって流速０．５ｍｌ／分で実施した。生理活性を有する分画を保存した。
本ペプチドは、以上のように精製され、公知の適切なペプチドの保存方法に従って使用時まで保存される。
【００２４】
＜機能解析に使用する血球の調製＞
血液（hemolymph）を、脱皮後２４〜３６時間経過したヒツジギンバエの３齢幼虫から抗凝固溶液(98 mM  NaOH、  186 mM  NaCl、  17 mM Na2‐EDTA および 41 mM クエン酸、  pH 4.5)中に採血した。４００ｇ、１分間の遠心で沈降させた血球を再び抗凝固溶液に懸濁し、これを４℃で３０分間インキュベーションした後、遠心分離（４００ｇ、  １分間）して血球を集めた。集めた血球を、Ex-cell 400 メディウム （JRH バイオサイエンス社、  米国）中に懸濁した。
【００２５】
＜ペプチドの機能解析＞
本ペプチドの活性を、以下のように試験した。
［細胞凝集アッセイ］
《方  法》
上記の「機能解析に使用する血球の調製」に記載のとおりに調製した血球を用いて、本ペプチドの細胞凝集を誘導する能力を検定した。９６ウェルの培養皿中の各ウェルに、５μｌの試験物質（１０ｎＭの最終濃度）と、３０μｌの血球懸濁液とを分注して、1 x 10４細胞／ウェルの細胞濃度に調製した。前記試験物質は、本ペプチド（１０ｎＭの最終濃度）または牛血清アルブミン（１０ｎＭの最終濃度）の何れかである。この混合物を倒立位相差顕微鏡（Olympus IX-70）で観察して細胞凝集を検定した。前記試験物質と前記血球とを混合し、その混合物を１時間培養する間に如何なる細胞凝集も生じなかった場合、前記試験物質の細胞凝集させる活性は欠如していると判定した。
【００２６】
《結  果》
単離したヒツジギンバエ血球細胞に１０ｎＭの前記試験物質を作用させ約２０分インキュベーションした後の血球細胞像を図２に示す。図２において、等濃度の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したコントロールでは細胞凝集は発生せず、個々の血球細胞が散在しているが、サイトカインとして本ペプチドを作用させた細胞では顕著な細胞凝集が発生した。
【００２７】
［細胞増殖アッセイ］
《方  法》
昆虫の培養細胞株ハイファイブ細胞を、インビトロゲン社（インビトロゲン社、  オランダ）から購入し、５％ウシ胎児血清を含有するグレース培地中で維持した。対数増殖期にある前記細胞を以下の処理に使用した。
前記細胞をグレース培地のみからなる培養液中で二日間培養した後、以下の２群の実験群に分けた。即ち、試験物質として０〜１０００ｎＭの本ペプチドを含有する新規サイトカイン群、および試験物質として０〜１０００ｎＭのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するコントロール群である。次に両群を、各試験物質と０．５μＣｉの［3Ｈ］チミジンとを含有するグレース培地中で３２時間培養した。次に両群の細胞をリン酸緩衝塩類溶液(8 mM  Na2HPO4、  1.5mM  KH2PO4、  137 mM  NaCl、  2.7 mM  KCl、  pH 7.2)で３回洗浄した。次に両群の細胞に０．３ＮのＮａＯＨを１００μｌ添加して細胞を溶解した。次に、その溶解した細胞を液体シンチレーションカウンター（Aloka LSC-5100、  アロカ社、  日本）を使用して、培養中に各群の細胞に取り込まれた［3Ｈ］チミジンの放射性カウントを測定した。
【００２８】
《結  果》
前記ハイファイブ細胞に本ペプチドを作用させた前記新規サイトカイン群においては、細胞への［３Ｈ］チミジンの取り込みがペプチド濃度依存的に増加した（図３）。しかしながら、ＢＳＡで処理したコントロール群では、［３Ｈ］チミジンの取り込みはＢＳＡ濃度依存的に変化しなかった（図３）。
【００２９】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、細胞を増殖させる生理活性を有し且つ化学合成可能な、新規で有用なサイトカインを提供できる等、顕著な効果を得ることができる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  President of Hokkaido University
<120>  A novel bioactive peptide isolated from the insect
<130>  A000301086
<160>  3
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Lecilia cuprina
<400>  1
Thr Ile Leu Ser Ala Pro Ser Asn Cys Gln Gln Thr Asp Phe Lys Gly
1               5                   10                  15
Arg Cys Leu
<210>  2
<211>  57
<212>  DNA
<213>  Lecilia cuprina
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(57)
<223>
<400>  2
acg att tta agc gct cct tcc aat tgt caa caa aca gat ttt aaa ggt       48
Thr Ile Leu Ser Ala Pro Ser Asn Cys Gln Gln Thr Asp Phe Lys Gly
1               5                   10                  15
cgt tgt tta                                                           57
Arg Cys Leu
<210>  3
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Lecilia cuprina
<400>  3
Thr Ile Leu Ser Ala Pro Ser Asn Cys Gln Gln Thr Asp Phe Lys Gly
1               5                   10                  15
Arg Cys Leu
【図面の簡単な説明】
【図１】本ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】本ペプチドまたはＢＳＡ（コントロール）で処理した後のヒツジギンバエ幼虫の血球細胞の顕微鏡写真である。
【図３】本ペプチドまたはＢＳＡ（コントロール）で処理した昆虫培養細胞株ハイファイブへの［３Ｈ］チミジンの取り込みを示すグラフである。
【図１】
0003718720.tif 000002
【図２】
0003718720.tif 000003
【図３】
0003718720.tif 000004