(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール結合活性を有するが、コレステロールに対する酸化・異性化反応活性の低いコレステロール酸化酵素変異体と、レポーター物質とからなることを特徴とするコレステロール測定プローブ。
【請求項２】
コレステロール酸化酵素変異体が、配列番号１のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基の欠失または付加、もしくは１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有する請求項１のコレステロール測定プローブ。
【請求項３】
コレステロール酸化酵素変異体が、配列番号１のアミノ酸配列における第145番バリン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列を有する請求項２のコレステロール測定プローブ。
【請求項４】
コレステロール酸化酵素変異体が、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、ミリストイル化、イソプレニル化、またはリン酸化されたコレステロール酸化酵素である請求項１のコレステロール測定プローブ。
【請求項５】
レポーター物質が、酵素、蛍光タンパク質または蛍光物質である請求項１から４のいずれかのコレステロール測定プローブ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかのコレステロール測定プローブと被験物質とを反応させ、測定プローブに結合したレポーター物質から発せられる検出信号の変化量を測定することを特徴とするコレステロール測定方法。
【請求項７】
請求項１から５のコレステロール測定プローブを必須として含むことを特徴とするコレステロール測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、各種の生体試料や食品中に含まれるコレステロールを簡便かつ高精度に検出することのできるコレステロール測定方法とそのための材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
コレステロール（cholesterol）は典型的な動物性代謝産物である。副腎皮質ホルモン、性ホルモン、胆汁酸生合成の原料であり、また細胞膜等の生体膜や血漿リポタンパク質の構成成分である。
【０００３】
人体におけるコレステロールは、ほとんどは体内で合成されるが（約1.5〜2.0g）、食物からも約0.3g程度供給される。食品中のコレステロールは他の脂肪とともに消化・吸収され、キロミクロンに取り込まれるが、吸収されたコレステロールの大部分（80〜90%）は長鎖脂肪酸でエステル化され、このコレステロールエステルはしばしば、他の脂肪とともに血管内壁に付着し、動脈硬化症等の重い疾患の原因となる。
【０００４】
従って、生体中（例えば、生体膜や血中）のコレステロール、あるいは食品に含まれるコレステロール量を正確に把握することは、過剰コレステロールを原因とする各種疾患の予防や治療方法の方針決定にとって重要である。
【０００５】
このため、コレステロールの測定方法やそのための試薬が様々に開発されている。特に、コレステロールとの結合活性に優れたコレステロール酸化酵素を用いた測定試薬として、特開平10-080300号公報、特開平10-311833号公報、特開2001-231597号公報等が知られている。また、コレステロール酸化酵素の変異体（特開平08-242860号公報）と、この酵素変異体を用いたコレステロール測定法（特開2000-224999号公報）も知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、コレステロール測定のために、コレステロール酸化酵素を使用することが多く試みられている。このようなコレステロール酸化酵素やその変異体を使用したコレステロール測定は、コレステロール酸化酵素による基質（コレステロール）の分解、修飾などの変化を物理的な信号として検出することによって、コレステロールの測定を行うものである。
【０００７】
一方、タンパク質等を簡便かつ高精度に測定する方法としては、そのタンパク質等に対して高い親和性を有するリガンドをプローブとしてターゲットタンパク質の有無を検出したり、あるいはその濃度を定量したりする方法が広くしられているが、コレステロールに関しては、そのようなプローブは知られていない。
【０００８】
この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、コレステロールに対して高い親和性を有するプローブと、このプローブを利用して簡便かつ高精度にコレステロールを測定するための新しい測定方法を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、コレステロール結合活性を有するが、コレステロールに対する酸化・異性化反応活性の低いコレステロール酸化酵素変異体と、レポーター物質とからなることを特徴とするコレステロール測定プローブを提供する。
【００１０】
この発明の測定プローブにおいては、コレステロール酸化酵素変異体が、配列番号１のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基の欠失または付加、もしくは１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有すること、さらに詳しくは、コレステロール酸化酵素変異体が、配列番号１のアミノ酸配列における第145番バリン残基がグルタミン残基に置換されたアミノ酸配列を有することを好ましい態様としている。
【００１１】
また、さらには、コレステロール酸化酵素変異体が、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、ミリストイル化、イソプレニル化、またはリン酸化されたコレステロール酸化酵素であることを別の好ましい態様としている。
【００１２】
さらに、このコレステロール測定プローブにおいては、レポーター物質が、酵素、蛍光タンパク質または蛍光物質であることをさらに別の態様としている。
この出願の発明は、また、前記いずれかのコレステロール測定プローブと被験物質とを反応させ、測定プローブに結合したレポーター物質から発せられる検出信号の変化量を測定することを特徴とするコレステロール測定方法と、前記いずれかのコレステロール測定プローブを必須として含むことを特徴とするコレステロール測定キットをそれぞれ提供する。
【００１３】
以下、これら発明の実施形態を詳しく説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
発明において、コレステロールの測定とは、コレステロールの有無の検出と、コレステロール量（濃度）の定量を意味する。また、測定対象であるコレステロールは、コレステロールそれ自体のほか、コレステロールエステル、LDL-コレステロール、HDL-コレステロール等のコレステロール誘導体が含まれる。
【００１５】
この発明のコレステロール測定プローブは、コレステロール酸化酵素変異体と、レポーター物質とからなることを特徴とする。
コレステロール酸化酵素変異体は、コレステロール結合活性は野生型酵素と同程度であるが、コレステロールに対する酸化・異性化反応活性（触媒活性）が低下するように人為的に改変した酵素変異体である。このような変異体は、例えば、野生型コレステロール酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号１）における１以上のアミノ酸残基の欠失、または付加、もしくは１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を有するものを使用することができる。このようなコレステロール酸化酵素変異体は、コレステロール酸化酵素をコードするポリヌクレオチド（例えば、GenBank Accession No. M31939として登録されているDNA）に変異を導入して適当な宿主−ベクター系により発現させ、得られた変異酵素のコレステロールとの結合活性および触媒活性を評価し、必要に応じてこれを繰り返し、より好ましい（すなわち、高いコレステロール結合活性と低い触媒活性を有する）変異酵素を選択することによって得られる。
【００１６】
ポリヌクレオチドへの変異導入法としては多くの方法が知られており、例えば、トランスポゾンや変異剤（mutagen）を利用する古典的な方法（Science, 229:1193-1201, 1985）、Error-prone PCR法（Technique, 1:11-15, 1985）、DNAのランダム化学合成により特定の領域をランダム配列に置き換える方法（Nature Struct. Biol. 3:446-451, 1996； Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 93:5590-5594, 1996）、セクシャルPCR法（Nature 370:389-391, 1994）などが挙げられる。
【００１７】
この発明は、配列番号１のアミノ酸配列の第145番バリン残基がグルタミン残基に置換されたコレステロール酸化酵素変異体を特に好ましい態様として提供する。
【００１８】
また、このコレステロール酸化酵素変異体には、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、ミリストイル化、イソプレニル化、またはリン酸化等の各種修飾を受けたコレステロール酸化酵素も含まれる。このような変異体は、それぞれの修飾に応じた公知の方法によって作成することができる。また、例えばコレステロール酸化酵素をコードするDNA配列を宿主−ベクター系で発現させた場合に、宿主細胞内での翻訳後のタンパク質修飾によっても得ることができる。
【００１９】
この発明のコレステロール測定プローブに結合一体化するレポーター物質としては、具体的には、酵素、蛍光タンパク質、蛍光物質等である。さらに具体的には、酵素としては、例えば、基質と特異的に結合して反応を触媒する能力を有するものであれば特に制限はないが、例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等が挙げられる。これらの酵素活性による基質の分解、修飾などの変化を物理的な信号として検出することができる。
【００２０】
また、蛍光タンパク質としては、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）やその変異体（EGFP）等が挙げられる。外来性の蛍光物質としては、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、NBD（7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole）系列などの蛍光色素が挙げられる。これらの蛍光が周囲の環境によって敏感に変化するため、その変化を物理学的手法で検出することができる。
【００２１】
なお、この発明のコレステロール測定プローブは、前記のコレステロール酸化酵素変異体とレポーター物質とが結合一体化したものであってもよい。レポーター物質として前記の標識酵素や蛍光タンパク質を用いる場合には、例えばそれぞれのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結して、変異酵素−標識酵素の融合タンパク質、あるいは変異酵素−蛍光タンパク質融合タンパク質として発現させるようにすればよい。蛍光色素をレポーター物質とする場合には、例えば、ヘモグロビンのヘムを蛍光色素で修飾するなどの方法による非共有結合を介した方法や、変異酵素のシステイン残基を蛍光色素で化学的に修飾するなどの方法による共有結合を介した方法等により両者を結合一体化することができる。あるいはまた、コレステロール酸化酵素変異体とレポーター物質とは別体であって、コレステロール測定時に一体化するような形態であってもよい。例えば、コレステロール酸化酵素変異体に特異的に結合するリガンド（例えば、抗体）をレポーター物質で標識化し、コレステロール測定の際に、コレステロール酸化酵素変異体と標識抗体とを混合させるようにしてもよい。
【００２２】
この発明のコレステロール測定方法は、前記のコレステロール測定プローブと被験物質とを反応させ、測定プローブのレポーター物質から発せられる検出信号の変化量を測定することによって、被験物質に含まれるコレステロールを検出、定量することを特徴とする。
【００２３】
被験物質としては、各種の生体由来の試料（細胞、血液）、あるいは各種食品等である。また、測定されるコレステロールは、コレステロールそれ自体のほか、コレステロールエステル、LDL-コレステロール、HDL-コレステロール等が含まれる。
【００２４】
この測定方法の一つの態様は、前記のコレステロール酸化酵素変異体と被験物質とを反応させ、さらにコレステロール酸化酵素変異体に対するリガンドを結合させ、この抗体に標識化されたレポーター物質から発せられる検出信号（蛍光強度や酵素活性）の変化を公知の手段で測定することである。コレステロール酸化酵素変異体に対するリガンドは例えば、野生型コレステロール酸化酵素またはその変異体を抗原として公知の方法により作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
【００２５】
この測定方法の別の態様は、コレステロール酸化酵素変異体とレポーター物質とが一体化したコレステロール測定プローブを被験物質に反応させ、このプローブのレポーター物質が発する信号の変化を公知の手段で測定する。
【００２６】
なお、この測定方法において、「検出信号の変化」は信号「強度」の増大・減少の他に、信号の「性質」の変化も含まれる。具体的には、吸光度、蛍光強度などの増大・減少以外に、蛍光波長のシフトなどが挙げられる。
【００２７】
この発明のコレステロール測定キットは、前記のコレステロール測定プローブを必須として含むことを特徴とするものであり、上記のコレステロール測定方法に使用することができる。この様な測定キットは、通常のレセプタータンパク質とリガンドとの反応を利用した測定キットと同様の構成によって提供される。すなわち、この発明の測定キットは、少なくとも前記のコレステロール測定プローブを含み、さらに任意の要素として、希釈液、洗浄液、陽性コントロール用のコレステロールを含んでいてもよい。
【００２８】
この測定キットを用いてコレステロールの有無を検出する場合には、例えば被験物質にプローブを添加した時としない時でそのレポーター物質の信号強度を比較するか、必要に応じて陽性コントロールを用いた場合のレポーター物質の信号強度等と比較すればよい。また、コレステロールの濃度を定量する場合には、例えば適当な試料により検量線を作成し、これに基づき定量すればよい。
【００２９】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
1.  材料と方法
1.1.  変異型コレステロール酸化酵素およびその抗体
Streptomyces sp. SA-COO（J. Bacteriol. 171(1):596-601, 1989 ）に由来するコレステロール酸化酵素遺伝子を、文献（Protein Eng. 11(11):1075-1081, 1998）の記載と同様の方法により変異させ、コレステロール酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号１）における第145番バリン残基をグルタミン残基に置換した変異型酵素V145Qを作成した。野生型およびV145Q酵素の発現および精製は文献（Protein Eng. 11(11):1075-1081, 1998）記載の方法により行ったが、Escherichia coliの培養のみ18℃15時間の条件下で、最終濃度10mMのisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）を用いた誘導後に発現、精製を行った。酵素純度の評価は、Laemmli（Nature 227:680-685, 1970）の方法により10%(w/v)アクリルアミドを含むゲル上でSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により行い、CoomassieブリリアントブルーR-250を用いて染色した。抗コレステロール酸化酵素ポリクローナル抗体は、オスウサギに対し、Freundの完全アジュバント（Calbiochem社）中で乳化した精製野生型酵素200mgを用いた免疫を行うことにより産生した。2週間後、このウサギにFreundの不完全アジュバント（Calbiochem）中で乳化した200mgの精製コレステロール酸化酵素を追加免疫した。その2週間後に、このウサギから採血を行い、5時間37℃で凝固させることによって血清を得た。標準ウエスタンブロッティングを行い、この酵素に対する抗コレステロール酸化酵素抗体の免疫反応を確認した（Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratoriy, Cold Spring Harbor, New York, 1988）。
1.2.  リポソームの調製
巨大リポソーム（Giant liposome）の調製は基本的には文献（Biophys. J. 64:676-685, 1993; Biophys. J. 71:3242-3250, 1996）の記載に従った。すなわち、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンをクロロフォルム中で重量比19:1となるよう混合し、10mg/mlの対照脂質溶液を調製した。ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールをクロロフォルム中で重量比15:1:4となるよう混合し、10mg/mlのコレステロール含有脂質溶液を調製した。ガラス試験管中に入れた脂質混合液100mlをN2ガス流で乾燥させてクロロフォルムを除去した。試験管底部に形成された脂質薄層に、室温で0.1Mスクロースを4ml穏やかに添加した。37℃2時間のインキュベーション後、巨大リポソームを含むこの溶液を0.1Mグルコースで希釈し、フルオレセインニソチオシアネート（FITC）で標識した変異酵素V145Qを用いた反応に適用した。
1.3.  免疫染色
高張条件：10%胎仔ウシ血清を含むDMEM中で育成したECV304細胞と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを、最終濃度が0.45Mスクロースとなる高張条件下で37℃5分インキュベーションした。この媒質に精製コレステロール酸化酵素を最終濃度が10ng/mlとなるように5分37℃条件で添加した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて洗浄した後、カバーグラス上の細胞を4%パラホルムアルデヒドを用いて室温・1時間の条件で固定し、PBSで3回洗浄（各10分）、そして0.1Mグリシンで15分間処置した。細胞はPBSで2回洗浄し（各5分）、PBSに溶解した5%スキムミルクを用いてブロックした。
正常条件：ECV304細胞は10%胎仔ウシ血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で育成し、4%パラホルムアルデヒドを用いて1時間・室温条件で固定、PBSで3回洗浄し（各１０分）、0.1Mグリシンを用いて15分間処理を行った。カバーグラス上の細胞はPBSを用いて2回洗浄し（各5分）、精製コレステロール酸化酵素を最終濃度が30ng/mlとなるように加えて60分37℃の条件でインキュベーションした。PBSを用いてリンスした後、細胞を冷却メタノールで3分-20℃の条件で固定し、PBSを用いて3回洗浄し（各5分）、PBSに溶解した5%スキムミルクを用いてブロックした。
【００３１】
細胞は抗コレステロール酸化酵素抗体を用いて15時間4℃の条件下で反応を行い、PBSで３回洗浄し（各10分）、ローダミン結合二次抗体（Cappel）を加えて3時間室温条件下でインキュベーションした。３回のPBSによる洗浄後（各５分）、試料をPermaFluor（Themo Shandon）を用いて包埋した。蛍光映像の撮影はAxiophot顕微鏡（Carl Zeiss）上の冷却CCDカメラ（MetaView）あるいはLMS410共焦点レーザスキャニング顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて行った。
2.結果
2.1.  リポソームのコレステロール測定
変異体コレステロールオキシダーゼは巨大リポソーム内部のコレステロールに対し特異的に結合した。この実施例では、アミノ酸置換（V145Q）を有するコレステロール酸化酵素変異体を用いた。この変異型V145Qを選択した理由は、野生型酵素と比べて酸化-異性化活性のレベルが低く（1/4）、それにも関わらずコレステロールに対する正常な結合活性を保持しているためである。このため、V145Qはコレステロールにいったん結合するとすぐには解離しない。アフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製した野生型およびV145Q酵素には、硫酸ドデシルナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル中で分子量約55kDaとなる単一バンドが含まれ、これは野生型酵素に対し作成した抗体を用いて特異的に検出された（図１）。精製V145Qの膜上コレステロールに対する結合能力を調べるために、単層リポソームを調整し、FITCラベルしたV145Qと共にインキュベートした。図２に示すように、変異型酵素はコレステロール含有巨大リポソームに結合するが、コレステロール非含有リポソームには結合しない。これらの結果から、V145Qを用いて単層リポソーム上のコレステロールを特異的に検出できることが確認された。
2.2.  細胞膜のコレステロール測定
コレステロール酸化酵素変異体は、原形質膜上コレステロールに安定結合するが、膜コレステロールは急速に細胞内オルガネラ中に内在化されるため、細胞内への取り込みにより検出シグナルが増加する可能性がある。従って、エンドサイトーシスによる取り込みを抑えることが、原形質膜上コレステロールのみを特異的に検出するためには必要になる。そこで、ECV304細胞を高張溶媒中でインキュベートし、細胞内への取り込みを抑えた状態でコレステロール酸化酵素変異体と反応させた。その結果、原形質膜中コレステロールに対して変異酵素V145が安定結合することが確認された（図３）。
【００３２】
さらに、コレステロール特異的な試薬であるmethyl-β-cyclodextrinは、コレステロールを原形質膜から除去する（J. Biol. Chem. 270:17250-17256, 1995; J. Biol. Chem. 271:16026-16034, 1996）が、このmethyl-b-cyclodextrinを用いて細胞膜よりコレステロールを除去すると、変異酵素V145Qおよびその抗体の組み合わせにより検出されるシグナルが減衰した（図3）。これらの結果からも、V145Qが原形質膜上コレステロールに特異的に結合することが確認された。
【００３３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、生体試料や食品中に含まれるコレステロールを簡便かつ高精度に測定することが可能となる。この発明は、コレステロールが原因となる疾患の予防や診断、治療法の方針決定等に有用である。
【００３４】
【配列表】
0003705763.tif 000002
0003705763.tif 000003
0003705763.tif 000004
0003705763.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】野生型コレステロール酸化酵素（pCO117）とコレステロール酸化酵素変異体（V145）のSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング分析の結果である。
【図２】巨大リポソームに含まれるコレステロールにコレステロール酸化酵素変異体が結合することを示した顕微鏡写真である。
【図３】高張および低張条件下で、それぞれmethyl-β-cyclodextrinで処理した場合と処理しない場合の免疫染色の結果を示す。
【図１】
0003705763.tif 000006
【図２】
0003705763.tif 000007
【図３】
0003705763.tif 000008