(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶から抽出したポリフェノール成分を含有するミズカビ病防止組成物。
【請求項２】
茶から抽出したポリフェノール成分がテアフラビンであることを特徴とする請求項１記載のミズカビ病防止組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、魚類のミズカビ病を防止する組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ミズカビ病は、水生菌、特に腐生カビが魚卵や魚体に寄生して起こる魚類の代表的な疾病であり、淡水域の養殖魚で大きな問題となっている。ミズカビ病の予防・治療としては、ふ化槽の魚卵の場合、腐生カビが寄生しやすい死卵を取り除くか、採卵後からマラカイトグリーン、メチレンブルー、２−アミド−３−〔（β−アミノエチル）チオ〕プロピオフェノン誘導体、ベンゾチアゾリルアゾ化合物またはホルマリンで薬浴する方法（特開昭５５−８９２５９号、特公昭６１−６００４１号）が知られており、これらのうちでマラカイトグリーンが有効な方法として使用されている。マラカイトグリーンはトリフェニールメタン系色素の一種であり、あらゆるふ化場や養殖場で使用され、その有効濃度は、魚卵では処理液中に対し５〜１０ｐｐｍ（１週間に２回、１回の処理は１時間）である。このため、全体では大量のマラカイトグリーンが使用され、その後は環境へ流出することとなる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このマラカイトグリーンに発ガン性や突然変異原性のあることが判明したため使用が禁止された。ミズカビ病の特効薬が他に皆無であることおよび中和することによりマラカイトグリーンが塩を形成し除去することが容易となるためと、使用後酸性溶液でマラカイトグリーンを中和することを条件に使用が認められている。しかしマラカイトグリーンの溶液を中和してもその毒性は変わらないことからヒトのみならず、環境汚染につながっていることは明白である。いまだにマラカイトグリーンに代わる有効な薬剤は見出されていない。またミズカビ病に感染した卵を取り除く方法も行われているがかなりの手間を要すること、死卵が発生する頃には、ふ化槽全体にミズカビが広まり他の魚卵にすでに感染している可能性が強く予防は不可能となる問題がある。このような状況下、これら薬剤に代わる安全で、ミズカビ病に対して効果的な物質の開発が強く求められている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究した結果、ツバキ科の植物等から得られるポリフェノール類、特に（＋）−カテキン，（＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキンガレート，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテキンガレート，（−）−エピガロカテキン，（−）−エピガロカテキンガレート，遊離型テアフラビン，テアフラビンモノガレートＡ，テアフラビンモノガレートＢおよびテアフラビンジガレート等の化合物が上記ミズカビ病に対し顕著な防止効果の発揮されることをはじめて見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明はポリフェノール類を含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物に関するものである。
【０００５】
ポリフェノール類が各種微生物に対して抗菌作用を示すことについては、例えば、各種乳酸菌に対する抗菌性（西山ら、農化、４９巻、１２号、６２９〜６３３頁、１９７５年）、哺乳動物の病原菌に対する抗菌性（Ryu.Eら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｚｏｏｎ、７巻、１６４〜１７０頁、１９８０年）および下痢性細菌に対する抗菌性（戸田ら、日本細菌学会誌、４４巻、４号、６６９〜６７２頁、１９８９年）などが知られている。また水産分野への茶の成分の応用として、細菌性魚病への予防・治療効果（特開平４−１０３５３７号）および魚類甲殻類の養殖用飼料、養殖方法および治療方法（特開平５−３０８９０８号）などが開示されている。上述の各種報告の中には、カビに対する抗菌性についての報告もあるが、本発明のミズカビ病の原因菌は同じ真菌類には属するものの、水中でのみ生育可能であり、その生活環、宿主への感染経路など非常に特殊であり、酸素要求性の高い通常の真菌類とは全く異なる菌類である。従って、このような特殊な魚類のミズカビ病に対して茶のポリフェノール類が、顕著な感染防止効果を発揮することはこれまで全く知られてはおらず、本発明者らがはじめて明らかにした知見である。以下、本発明について詳述する。
【０００６】
本発明のミズカビ病とは、水生菌、特に腐生カビが魚卵や魚体またはえらに寄生して起こる魚類の疾病を指し、例えば、サケ、マスの卵のミズカビ病、サケ、マス、アマゴ、ヤマメのミズカビ病、ウナギ、コイ、アユのワタカブリ病等である。その他クルマエビのフザリウム病、マス類の真菌性肉芽腫症、マス類稚魚の内臓真菌症、イクチオフヌス病、デルモシスチジウム症、ブランキオマイセス症等である。すなわちその病原体は、フハイカビ類、ミズカビ類、フシミズカビ類である。また対象となる魚類は、ウナギ、サケ・マス類、アユ、キンギョ、フナ、ボラ、テラピア等である。
【０００７】
本発明のポリフェノール類とは、ツバキ科植物等の葉から水、温水、熱水あるいは有機溶剤により抽出し得られるポリフェノール類を指し、特に（＋）−カテキン，（＋）−ガロカテキン，（−）−ガロカテキンガレート，（−）−エピカテキン，（−）−エピカテキンガレート，（−）−エピガロカテキン，（−）−エピガロカテキンガレート，遊離型テアフラビン，テアフラビンモノガレートＡ，テアフラビンモノガレートＢおよびテアフラビンジガレート等のポリフェノール化合物である。ポリフェノール類の調製法の一例は、特許（特開平２−６４９９号，特開昭６３−２１４１８３号）等に詳細に開示されている。また、茶葉もしくは緑茶、ウーロン茶、紅茶等のツバキ科植物を原料とした飲料製造時に多量に廃棄される抽出残渣をそのまま、または粉砕等の処理を行ったものもミズカビ病防止組成物として用いても差し支えない。さらには、他の原料起源のものもしくは化学合成品でも差し支えない。得られたこれらのポリフェノール類を本発明に用いる場合は単独で、もしくは二種以上の混合物として、さらにはポリフェノール類を含む粗抽出物でも使用できる。
【０００８】
本発明品を使用する際は、有効成分である茶抽出物をそのまま薬浴用として飼育水に溶解したりして使用することもできる。また、場合によっては本発明のミズカビ防止組成物を、そのままかまたは通常用いられている飼料に添加して経口的に投与することも有効である。また、使用方法により溶液状、粒状、粉状、ゲル状、半固形、固形などの形態で使用できる。さらには、有効成分である茶抽出物が飼育水や飼料中に溶解、または分散しやすいように界面活性剤を併用することができる。界面活性剤としては、大豆レシチン、卵黄レシチン、酵素分解レシチン、各種サポニン（キラヤ、ユッカ、ビート、茶、杜仲茶など）などの食品用の天然界面活性剤、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、などの界面活性剤が使用できる。これらの界面活性剤を併用することにより、飼育水などへの溶解・分散が向上するのはもちろん、ポリフェノール類のミズカビ病の防止効果が促進される。
本発明品の有効濃度は、ポリフェノール類換算で最終の使用濃度が１日当り0.005 〜10％が好ましく、0.005 ％より少ない投与量では効果が弱く、10％以上の濃度では魚卵のふ化や魚の成長に悪影響を及ぼす可能性があることから好ましくない。
【０００９】
【作用】
本発明の茶抽出物がいかなる作用によりミズカビ病の防止効果を示しているかはいまだ不明であるが、一般に茶の有効成分であるポリフェノール類は蛋白質結合能のあることが知られていることから、本発明のポリフェノール類もミズカビ病の原因となる各種腐生菌の細胞膜又は細胞中のタンパク質に結合し、菌の細胞壁等に損傷を与えることにより繁殖を抑制するものと推測される。
以下、実施例および試験例により詳述する。
【００１０】
【実施例】
実施例１
市販緑茶１ｋｇに水、約15リットルを加え撹拌し、80℃で３時間抽出した。濾過により得られた抽出液を濃縮乾固し、緑茶の熱水抽出物350 ｇタンニン類として１２５ｇを得た（酒石酸鉄法にてタンニン類として38％）。
実施例２
実施例１で得た熱水抽出物350 ｇに水８リットルを加え溶解後、ヘキサンおよびクロロホルムで順次分配した。分配後の水層に酢酸エチル10リットルを加えて激しく撹拌・静置後、酢酸エチル層を分離し、酢酸エチルを留去後、乾燥し酢酸エチル可溶画分70ｇを得た（タンニン類として５２ｇ）。
本酢酸エチル可溶画分の各ポリフェノール化合物の割合は（＋）−カテキン3.5％，（＋）−ガロカテキン14.8％，（−）−ガロカテキンガレート11.6％，（−）−エピカテキン7％，（−）−エピカテキンガレート4.6％，（−）−エピガロカテキン15％および（−）−エピガロカテキンガレート18.0％である。
【００１１】
実施例３
実施例２で得られた酢酸エチル可溶画分10ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒、クロロホルム：メチルアルコール、20： 1，10： 1，ｖ／ｖ）、セファデックスＬＨ−20カラムクロマトグラフィー（溶媒，メチルアルコール）、リサイクルＨＰＬＣ（日本分析工業製ＬＣ−908 ，ＧＳ−320 カラム，溶媒メチルアルコール）を順次用いることにより、（＋）−カテキン0.3ｇ，（＋）−ガロカテキン1.22ｇ，（−）−ガロカテキンガレート0.9 ｇ，（−）−エピカテキン0.5ｇ，（−）−エピカテキンガレート0.38ｇ，（−）−エピガロカテキン1.2ｇ，および（−）−エピガロカテキンガレート1.5ｇのポリフェノール化合物を得た。
実施例４
市販緑茶１ｋｇを85℃の熱水20リットルで30分撹拌しながら抽出し、茶葉を濾過により除き17リットルの抽出液を得た。この液を限外濾過装置（ＤＤＳ社製，膜タイプＧＲ−８１ＰＰ、分画分子量6000）を用いて通過液15リットルを得た。濃縮残液に水５リットルを加え同様に操作し、通過液６リットルを得た。両液を合わせ逆浸透膜（ＤＤＳ社製，膜タイプＨＣ−50）により濃縮し１リットルとし、35％のタンニン類を含む本発明品233 ｇを得た。
【００１２】
実施例５
実施例４で得られた濃縮品を吸着樹脂（Duolite S-876 ，住友化学社製）を充填したカラムに流し吸着させ、脱イオン水で洗浄後、樹脂の５倍量の50％エタノールにて溶出し、減圧濃縮によりエタノールを留去し、濃厚水溶液となし、その後常法により凍結乾燥し、74.5％、タンニン類を含む本発明品70ｇを得た。
得られたタンニン類の成分組成は、（＋）−カテキン3.5％，（＋）−ガロカテキン14.8％，（−）−ガロカテキンガレート11.6％，（−）−エピカテキン7 ％，（−）−エピカテキンガレート4.6％，（−）−エピガロカテキン15％および（−）−エピガロカテキンガレート18.0％である。
実施例６
市販のインスタント紅茶100 ｇを熱湯３リットルで１時間抽出後、室温にまで冷却し濾過により抽出液を得た。抽出液に等量のクロロホルムを加え分画する。分画により得た水層部を等量のメチルイソブチルケトンにて抽出し、得られたメチルイソブチルケトン層を濃縮乾固し粗テアフラビンとして本発明品2.5ｇを得た。
【００１３】
実施例７
実施例１で得られた緑茶の熱水抽出物１００ｇを、２％キラヤサポニン液２００ｍｌに溶解後、スプレードライして本発明品１０１ｇを得た。
実施例８
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに、２％ユッカサポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４５ｍｌを得た。
【００１４】
実施例９
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに、２％の茶サポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。
実施例１０
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに、２％のビートサポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。
【００１５】
実施例１１
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに、２％杜仲茶サポニン液２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。
実施例１２
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに、１％グリセリンモノカプリル酸エステル液２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。
【００１６】
実施例１３
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに、１％のポリグリセリン脂肪酸エステル液（太陽化学社製、商品名サンソフトＱ−１４Ｓ）２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。
実施例１４
実施例２で得られた緑茶の酢酸エチル可溶画分５０ｇに１％ショ糖脂肪酸エステル液２００ｍｌを加え、ホモミキサーで乳化し本発明品２４０ｍｌを得た。
【００１７】
試験例１．急性毒性試験
ｄｄｙ系マウスを１群10匹として、各群に生理的食塩水に懸濁した実施例５および６で得られた本発明品を恒温（23±1 ℃）、恒湿（55±5 ％）の条件下で経口投与し、リッチフィールド・ウイルコックンソン（Litchfield-wilcoxon ）法によりＬＤ５０を求めた結果、それぞれ雌で3.1 および3.5 ｇ／ｋｇ以上、雄で５および5.5 ｇ／ｋｇ以上であった。
試験例２．細胞毒性試験
ＭＡ104 細胞（サル腎細胞）を1.2 ×１０5 ｃｅｌｌ／ｔｕｂｅになるように10％ＦＣＳ含有ＢＨＫｃｅｌｌ培地（抗生物質無添加）に添加した。これに実施例５および６で得た本発明品を５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび0.5 μｇ／ｍｌになるように添加し、37℃で４日間培養し、細胞増殖を調べた。その結果、増殖曲線は生理的食塩水だけを加えたコントロールと同様であり細胞毒性は全く認められなかった。
【００１８】
試験例３．変異原性試験
実施例５および６で得られた本発明品を用いサルモネラ（ネズミチフス菌）におけるヒスチジン要求性から非要求性への復帰試験を目的とするエームス（Ａｍｅｓ）テストを行った。検定菌として、サルモネラ・チフィリウムＴＡ100 およびＴＡ98を用い、直接試験と代謝活性試験を実施した。その結果、直接試験と代謝活性試験における変異コロニーの増加は認められず、変異原性を有しない（陰性）と判断された。
試験例４
実施例５で得られた本発明品のサケ受精卵のふ化に対する毒性試験を実施した。目合い５ｍｍ（１０×２０×１０ｃｍ）のバスケットに実施例５の本発明品を５０、２０、１０、１、０．１、０ｇ／リットルとなるように処理溶液を調整し、それぞれにサケ受精卵５０粒入れ、１回当たり１時間浸漬し、この操作を１週間間隔で４回繰り返して処理した。浸漬処理後、流水条件に戻しふ化まで観察し、ふ化率より毒性の有無を判定した。結果を表１に示した。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
表１より明らかなように本発明の有効成分であるポリフェノール化合物はサケ受精卵のふ化に何等影響を及ぼさず、ふ化後の稚魚にも異常は認められなかった。
試験例５
実施例１、２、４〜１４で得られた本発明品のサケ受精卵のミズカビ病に対する防止試験を実施した。目合い５ｍｍ（１０×２０×１０ｃｍ）のバスケットを多数用意し、それぞれにサケ受精卵５０粒と故意に衝撃を与えてへい死させた死卵５０粒を混合してセットした。死卵を加えたのはミズカビを自然発生させるためである。流水量毎分約２００ｍｌ中にバスケットを設置して受精卵を１時間インキュベートし感染させた。実施例１、２、４〜１４で得られた本発明品の濃度を２０、１０、５、２、１、０．４、０．２、０．１、０ｇ／リットルとした処理溶液を調整し、各濃度ごとに２バスケットを設けた。各溶液にバスケットごと１回当り１時間浸漬し、この操作を１週間間隔で４回繰り返して処理した。浸漬処理後、流水条件に戻し、５週間インキュベートしてミズカビ病の発生状況をふ化まで観察した。なお、供試した受精卵は卵質の差をできるかぎり小さくするために１尾のサケから採卵したものを受精直後から用いた。ミズカビ病の防止効果はふ化率から判断し、結果の表示は予め加えた死卵数を計数から除き、２バスケットの合算で行った。結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
表２に結果より、本発明の茶成分はミズカビ病に対する防止効果は明かである。
試験例６
実施例５で得られた本発明のポリフェノール類のフナに対する毒性を試験した。本発明の茶成分を１、０．１、０．０１、０ｇ／リットルとした処理溶液を調整し、１群１０尾のフナ（体重平均３０ｇ）を各濃度の溶液に浸漬処理し、経時的に魚の行動を観察し、さらに１時間後の生存数を測定した。結果を表３に示した。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
表３から明らかなように０．０１〜１ｇ／リットルの濃度の溶液への浸漬では魚の行動および生存に影響を及ぼさなかった。
試験例７
実施例５で得られた茶成分を用いシラスウナギのミズカビ病に対する防止試験を行った。シラスウナギ１００尾をミズカビ病の発生した飼育水に約１時間浸漬感染後、実施例５で得られたポリフェノール類を０．５、０．２、０．１、０．０５、０ｇ／リットル濃度とした処理溶液中に２０尾づつ、１時間浸漬し通常の飼育水に戻した。その後、ミズカビ病の発生状況を目視もしくは顕微鏡にて観察し、ミズカビ病発生率にて表示した。結果を表４に示す。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
表４の結果より、本発明の茶抽出物はウナギのミズカビ病に対する防止効果は明らかである。
本発明の実施態様を挙げれば以下の通りである。
（１）ポリフェノール類を含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（２）ポリフェノール類が茶の熱水抽出物である前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
（３）ポリフェノール類が茶の熱水抽出物の酢酸エチル可溶成分である前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
（４）ポリフェノール類が（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキンおよび（−）−エピガロカテキンガレートである前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
（５）ポリフェノール類が（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピカテキンおよび（−）−エピガロカテキンである前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
（６）ポリフェノール類が（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキンガレート、および（−）−エピガロカテキンガレートである前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
（７）ポリフェノール類が（−）−エピガロカテキンガレートである前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
（８）緑茶の熱水抽出物に大豆レシチンまたは卵黄レシチンを併用することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（９）緑茶の熱水抽出物および酵素分解レシチンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１０）（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキンガレートおよびキラヤサポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
【００２７】
（１１）（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキンガレートおよびユッカサポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１２）（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピガロカテキン、（−）−エピガロカテキンガレートおよび茶サポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１３）ポリフェノール類およびビートサポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１４）ポリフェノール類およびビートサポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１５）ポリフェノール類および杜仲茶サポニンを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１６）ポリフェノール類およびグリセリン脂肪酸エステルを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１７）ポリフェノール類およびポリグリセリン脂肪酸エステルを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１８）ポリフェノール類およびショ糖脂肪酸エステルを含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（１９）茶の粉末を含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。
（２０）緑茶の抽出残渣を含有することを特徴とするミズカビ病防止組成物。（２１）ミズカビがフハイカビ類、ミズカビ類、フシミズカビ類である前記（１）記載のミズカビ病防止組成物。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のミズカビ病防止組成物は魚卵や魚体に発生するミズカビ病を防止する。しかも、その有効成分が通常われわれが飲用に供している茶の成分であることからその安全性は極めて高く、マラカイトグリーン等の毒性が懸念されている状況において本発明品をミズカビ病の防止に使用することは産業上有用であると考えられる。