(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボラ両新媒性化合物はアミジンであることを特徴とする、非共有結合相互作用により基質に可逆的に結合したボラ両新媒性化合物を含む表面コーティング。
【請求項２】
ボラ両新媒性化合物は、ボラ両新媒性化合物の陽イオン性基と基質の陰イオン性基の間の極性相互作用により、基質に可逆的に結合している、請求の範囲第１項記載の表面コーティング。
【請求項３】
ボラ両新媒性化合物と基質の間の極性相互作用はpH依存性である、請求の範囲第２項記載の表面コーティング。
【請求項４】
アミジンはビスベンズアミジンである、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の表面コーティング。
【請求項５】
ビスベンズアミジンは、２〜14個の炭素原子を有する結合基を有する、請求の範囲第４項に記載の表面コーティング。
【請求項６】
ビスベンズアミジンは、エタミジン、ペンタミジン、オクタミジン、およびデカミジンよりなる群から選択される、請求の範囲第５項に記載の表面コーティング。
【請求項７】
ビスベンズアミジンは、ペンタミジンである、請求の範囲第６項に記載の表面コーティング。
【請求項８】
化学的分離および分析における、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の表面コーティングの使用。
【請求項９】
電子工学における、請求の範囲第１〜７項までのいずれか１項に記載の表面コーティングの使用。
【請求項１０】
光電子工学における、請求の範囲第１〜７項までのいずれか１項に記載の表面コーティングの使用。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、積層表面およびさらに詳しくは表面コーティングに関する。
背景
分子認識および官能基相補性は化学センサーまたは生物センサー１、親和性クロマトグラフィー支持体２の設計と製造、または組織化超分子構造３の作成には必須である。従ってこれらの領域で分子的選択性を導入するための新しいアプローチは、重要となる可能性がある。
この意味で、分子の自己集合により形成される有機薄膜は、現在広く研究されている４。これらは、空気−水界面に形成される界面活性剤単層を固体の平らな表面に移すか、または溶液から直接、活性な界面活性剤を平らな固体表面へ自発的に吸着させて形成される、古典的なラングミュア・ブロゲット（Langmuir  Blodgett）（LB）法により作成される。これらの方法により、界面活性剤が強い側面の相互作用により保持され、表面に末端共有結合または極性結合して安定化されて結合する、組織化された層が得られる。
化学センサー
化学センサーのモデル系として、前述の有機膜はいくつかの欠点を有する：
１）そのような系で達成される高度の規則性のために、表面性質（極性、疎水性、酸性など）の良好な調節が可能になり、その結果、あるクラスの化合物の吸着を最小にする（非特異タンパク質吸着）かまたは最大にすることができる５。
２）多くのシグナル伝達法（すなわち、光学的、電気化学的、または微量重量測定原理に基づく）が入手でき、表面性質のリアルタイム観察が可能になる４。
３）ICの製造で利用されるリトグラフ法を使用して、小さな感知要素が製造できる。センサーの設計において、小型化は重要な因子である。
４）表面は合理的に設計でき、こうしてアナライト特異的リガンドまたはホストが層に取り込まれる。これにより、リアルタイムで追跡できる、特異的分子認識が可能になる6,7,8。
安定性および製造の容易性の点から、選択性を導入するのに単純な化学的方法が好ましい。クニタケ（Kunitake）ら７は、空気−水界面での自己集合性グアニジウム両親媒性化合物を、アデノシンリン酸の選択的吸着に使用できることを証明した。ATPの結合は、水素結合したイオン対によりATPのリン酸基に結合した３つのグアニジン基が関与すると考えられている。ラングミュア・ブロゲット法によるこれらの層の固体表面への移動は、リン酸塩生物分子用のセンサー作成のための可能なアプローチとして示唆された。しかし、LB膜の安定性の悪さがしばしば問題になっている。従って、安定性、製造の容易性、規則性および小型化の可能性などの本質的利点のために、平らな表面への安定な化学吸着単層の使用がより重要になっている。これらのうち、特に金表面９へのチオールの化学吸着により形成されるSAMが、広く研究されている。Au（III）表面を希アルキルチオール溶液に暴露すると、６角形の充填されたすべてトランスのアルキル層が急速に形成され、これは、安定な金−イオウ結合と、金表面とアルキル鎖との傾角が約30℃であることを特徴とする。多くの異なる官能基が選択できる。アナライト選択的界面の作成において、センサー界面にしばしば不可逆的にコーティングが付与され、コーティングの再生を防いでいる。強く結合したアナライトの場合は、これは表面の再使用可能性を制限することもある。この意味で、センサー界面に化魚結合できる化学的選択的コーティングは、重要である。
多層構造
規則正しい構造を有する多層は、光電子工学（遠距離通信）、分子電子工学および化学的検知4,10での応用が始まっているため、活発な研究の焦点となっている。これらは、両新媒性化合物の疎水性部分への機能単位（双極子、ドナーアクセプター対、発色団）の導入により、達成できる。得られる多層の安定性問題のために、新しい代替法を開発する必要がある。自発的自己集合法は、ますます普及している。ここで、通常互いに相補的な２つの２官能性構成ブロックを、固体基質の上で繰り返し自己集合させる。そのような１つの系において、デチャー（Decher）らは、交互に荷電したボラ両新媒性化合物（bolaamphiphile）（２つの末端極性基を有する両新媒性化合物）と多電解質10dの連続的吸着に基づく多層形成法を記載した。これは、合計の厚さが数千Åまでの多層の作成が可能であり、従って膜に塊様の性質を与える。さらに、このような膜は、分極可能な双極子の非中心対称配向を可能にするため、これらの性質は非線形光学に理想的である。これらの膜の作成の１つの目標は、界面の隙間を減らし、こうして高密度の機能性単位を達成することである。残念ながら、これは、形成される層を不安定化する作用がある。従ってこれらの例において、構成ブロック（両新媒性化合物）は、30Åより大きい。方向を持った強い頭部の基の相互作用に基づく系は、より小さな両新媒性化合物の使用を可能にする。
遺伝子解析
通常使用する遺伝子解析は、複雑な混合物中に微量に存在する特異的DNAまたはRNA配列の検出に依存する。現在の分析法では通常、時間のかかる標識および分離工程11を使用し、従って迅速なDNA配列決定に依存する領域（すなわち、HUGO、法医学解析、診断薬）における障害になっている。従って直接的で迅速な配列決定の代替法が、開発中である。これらはしばしば、目的の配列に特異的にハイブリダイズすることができるあらかじめ合成されたプローブオリゴヌクレオチドを使用する12。魅力的なアプローチは、固体表面に結合したプローブを使用する、ハイブリダイゼーションの直接追跡（すなわち、光学的、電気化学的、または重力的シグナル伝達による）である（図３）13。特に興味深いのは、これらの方法と、各々が別々の検知要素である異なる一連のプローブ配列の製造を可能にするマイクロリトグラフ法との、組合せである。しかし、上記の系において、プローブは通常支持体に共有結合しており、追加の化学的工程を必要とする。表面へのプローブの可逆的結合法は、ある標的DNAに対する多くのプローブのハイブリダイゼーション性質の迅速な走査にとって魅力的であろう。
タンパク質吸着
界面および特に固体／液体界面でのタンパク質の挙動は、生物学的液体に表面を接触させた時に起きるプロセスを決定するのに特に重要である。従って吸着されたタンパク質の型およびその構造（コンフォメーション）の知識は、移植物の組み込み、血液適合性および歯垢形成の分野で、活発に研究されている分野である。重要な問題は、目的のコンフォメーション／配向で「正しいタンパク質」を選択的に吸着することができることである。溶液の条件を変えること以外に、この方法の重要な手段は、官能基に関連して表面（基のタイプと密度）を変化させることである。これらのパラメータの迅速で便利な調節法は、上記応用に関して表面を最適化するのに、非常に有用な手段となるであろう。センサーに応用するための酵素の固定化に関して、同様の考察が表面の修飾に当てはまる。
本発明
本発明は、非共有結合相互作用により基質に可逆的に結合した両新媒性化合物を含むことを特徴とする、表面コーティングを提供する。
好適な実施態様において、
両新媒性化合物は、両新媒性化合物の陽イオン性基と基質の陰イオン性基との間の極性相互作用により、基質に結合している；
両新媒性化合物と基質の間の極性相互作用はpH依存性である；
両新媒性化合物はボラ両新媒性化合物である；
両新媒性化合物は、アミジン類から選択される；
両新媒性化合物は、ビスベンズアミジン類から選択される；
両新媒性化合物はペンタミジンである；
表面コーティングは、化学的分離と分析に使用される；
表面コーティングは、電子工学で使用される；および
表面コーティングは、光電子工学で使用される。
特に好適な実施態様において、両新媒性化合物は、ビスベンズアミジン類（好ましくは約２〜14個の炭素原子を有する結合基、特に好ましくはペンタミジン）から選択される、いわゆるボラ両新媒性化合物（非極性結合基により結合した、２つの極性基を有する両新媒性化合物）であって、ここで陽性に荷電した極性アミジニウム基の１つは、陰性に荷電した基（好ましくは、基質のカルボキシル基）に、極性相互作用により可逆的に結合する。基質への両新媒性化合物の結合の可逆性は、pH依存性であり、基質上の酸性基のpK値に関係する。普通このpK値は、約２〜約６の範囲であり、カルボン酸については約4.5である。カルボキシル基で基質に結合した、アミジン類の特殊なケースの場合（例えば、ペンタアミジン）は、これは、実質的にすべての両新媒性化合物（アミジン）は、pHが約７〜8.5で基質に結合しており、pHが約３またはそれ以下で表面から放出されることを意味する。
一般に、本発明は、特に化学的分離および分析、電子工学および光電子工学で使用される。例として、使用分野は以下のものがある：
生物学的分子、例えばリン酸塩生物学的分子の選択的吸着。特にこの選択的吸着は、化学センサーおよび検出装置で使用できる；例えば、活性のある配向／コンフォメーションで表面に結合した酵素に基づくセンサー。こうしてセンサーの感受性／選択性が最適化できるであろう。このスイッチ能力は、他の標的分子のための固定化酵素のタイプの迅速な再生または置換に利用できるであろう；
生物学的物質との適合性を促進または阻害、例えば、手術に関連する拒絶の阻害；骨移植物の内成長の促進；
歯垢成長を阻害するための、または歯の回復性物質の接着を改良するための、歯のコーティングとして；
リン脂質に結合するマトリックスとして、および生物膜のモデルを提供するために；
本発明に従って、血液に接触する表面をコーティングすることにより血液の凝固を阻止し、その結果血液と適合性になる；
担体の表面に本発明のコーティングを提供することによる薬剤の投与であり、ここで両新媒性化合物は薬剤に結合し、結合はpH依存性であり、その結果薬剤はpHに依存して放出される；
本発明はまた、吸着による活性成分の消失を最小にするために、投与容器チューブまたはポンプを表面修飾するのに使用することができる。
別の使用分野はクロマトグラフィー、さらに詳しくはカラムクロマトグラフィーであり、ここでカラムまたはその充填剤は、本発明の表面コーティングによりコーティングされる。コーティングは、クロマトグラフィーにより分離される物質に親和性を有する両新媒性化合物（または、両新媒性化合物に結合する物質）を含む。クロマトグラフィー法は、例えば汚染血液の精製法を構成し、ここで汚染物質はコーティングに結合する。上記したように、コーティングの親和性は好ましくは可逆性でpH依存性であり、その結果カラムは容易に再生できる。
さらなる使用分野は、液体からの物質の抽出、例えば物質（金）に対する親和性を有する両新媒性化合物を提供することによる、汗からの金の抽出がある。親和性は好ましくは可逆性（例えば、pH依存性）であり、抽出装置は再生できる。
さらに別の使用分野は、DNA配列の解析であり、以下で詳述される。
【図面の簡単な説明】
本発明を、添付の図面を参照して、さらに詳細に記載する。
図１は、基板表面で可逆的に自己集合した両新媒性化合物の略図である。
図２は、酸性の基板表面、酸性基板表面での２塩基性両新媒性化合物の自己集合、および両新媒性化合物へのATPの結合、を提供する方法の略図である。
図３は、DNA−ハイブリダイゼーション測定法の略図である。
本発明は、可逆的に自己集合した両新媒性化合物に基づく修飾された表面および表面修飾法を記載する（図１）。極性の頭部の基（Ａ）を含有する両新媒性化合物は、方向性を有する非共有結合により、下の表面と強くかつ可逆的に相互作用することができ、組織化された規則的な層が形成される。これは、反対側（Ｂ）に別の末端官能基を付加することができる。単層の安定性は、例えば媒体中のpHを選択することにより調節することができる。これは、ある表面の迅速な官能基化に使用できる、層形成のスイッチを可能にする。Ｂを正しく選択することにより、この方法を使用して、例えば分子認識、方向性を有する結晶化、分離または多層形成のための、好ましい性質を有する表面を設計することができる。多層の形成において、頭部の基の強い相互作用は、これまで使用されてきたものより小さな構成ブロックの使用を可能にする。異なる頭部の基のレギオ異性体を使用することにより、表面に対する両新媒性化合物の傾角を調整することができる。さらに層の厚さを、両新媒性化合物の長さに調整することができる。これらの性質は、前記の光電子工学的応用において重要である。
両新媒性化合物が核酸に結合できるなら、これらは層に取り込まれてよい。例えば２塩基性DNA結合薬剤は、酸性表面で自己集合する（図２）。次にこの変換した表面に、表面に可逆的に結合した１本鎖のプローブオリゴヌクレオチドを加える（図３）。標的配列を含有する遺伝子を加えることにより、層の厚さに観察可能な変化が見られる。この過程は、２本鎖DNAを安定化する薬剤の能力によりさらに増強される。分析後、酸性表面は、pHを下げることにより再生され、高いpHで次の分析が可能になる。あるプローブ配列について、この方法は、種々のDNA結合性薬剤とds−DNAの間の相互作用（塩基特異性）の研究のために使用できる。
表面コーティング層の変化（例えば、厚さまたは重さ）は、種々の方法（例えば、偏光解析法、表面プラズモン共鳴（SPR）、クォート微量天秤法（QCM）、またはインピーダンスのような電気化学的検出法）により検出できる。
いくつかの非限定例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。
例１
メルカプトウンデカン酸で修飾した金電極を、エタノール中のメルカプトウンデカン酸の1mM溶液から、チオールを少なくとも12時間吸着し、次にエタノールで洗浄し、窒素流下で乾燥して、調製した。こうして、カルボキシル基を有する基板表面が調製された。この方法の後に、偏光解析法（入射角68゜とHeNeレーザー光λ＝633nmを使用する、ルドルフ（Rudolf）薄膜偏光解析装置43603−200E）を行い、13Åの厚さの増加が得られ、充分詰まった密な単層が形成されたことを示していた。pH8.5で、２塩基性薬剤であるペンタミジン（PAM）の2.5mM水溶液を修飾された電極の存在下で加えると、二重層のキャパシタンス測定値が20％低下し、厚さが約21Å増加した。これは、酸性層（PAM−表面）の上に充分詰まった第２の単層が形成されたことを示す。アデノシン三リン酸（ATP）をPAM−表面に添加すると、さらに厚さが約15Å増加した。アデノシン一リン酸（ATP）を添加しても、膜の厚さは増加しなかった（図２を参照）。
例２
例１に記載のPAM−表面は、pHを３に下げることにより除去することができ、こうしてPAM層の厚さに対応して厚さが低下する。再度pHを上げることにより、厚さが元々の値まで増加し、層形成の可逆性を示している。低pHでATPまたはAMPを加えても、膜の厚さの増加は見られなかった。
例３
エタノール溶液からチオールを吸着することにより、メルカプトプロピオン酸で修飾した金電極を調製した（基板表面）。pH8.5で、修飾電極の存在下で２塩基性薬剤であるペンタミジン（PAM）を加えると、厚さが13Å増加した。これは、酸性層（PAM−表面）の上に第２の単層が形成されたことを示す。アデノシン三リン酸（ATP）をPAM−表面に添加すると、さらに厚さが約20Å増加した。アデノシン一リン酸（ATP）を添加しても、膜の厚さは増加しなかった。
例４
例１および３のように調製したPAM−表面は、他のリン酸含有分子（NAD補助因子、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド三リン酸、イノシトールリン酸、ホスホタンパク質など）の分子認識のために使用することができる。例えばイノシトールテトラリン酸を加えると、厚さがさらに20Å増加し、イノシトール二リン酸のみを加えると厚さが約10Å増加した。リン酸化タンパク質は、こうして分析することができる。
例５
層の厚さを、両新媒性化合物のサイズに調整することができる。例えばエタミジン（18Å）、ペンタミジン（21Å）、オクタミジン（26Å）のシリーズでは、測定された厚さは分子サイズに近かった。
例６
例１および３に記載のようなPAM表面は、オリゴヌクレオチドに結合することができ、大幅な厚さの増加を与える（図３）。例えば、10塩基を含有するオリゴヌクレオチドは、最大30Åの厚さの増加を与えた。この層の厚さはpH2で０であり、pHを8.5に戻すと再生された。
例７
例５に記載の相補的なプローブで修飾した表面に、検出すべきヌクレオチド塩基の配列を含有する遺伝子を加えることにより、層の厚さの低下が観察された（図３）。これは、プローブと遺伝子が充分相補的な時にのみ観察された。すなわち、標的配列に対して１つまたはそれ以上のミスマッチを含有するプローブを使用することにより、層の厚さがさらに増加するのが観察された。
例８
両新媒性化合物が芳香族ビスアミジンであるエタミジンである例１に記載の表面。この表面は、オリゴヌクレオチドを加えると厚さの増加は小さかった。
例９
DNA多層の形成のための方法の使用。オクタミジンとチミジンの10量体を使用することにより、全体の厚さ80Åが観察された。
例10
エタノール溶液からチオールを吸着することにより、メルカプトヘキサデカン酸（MHA）で修飾した金電極を調製した。デカミジン（DAM）をこの表面に加えると、偏光解析法で測定した時50Åの厚さの増加が得られた。
pH7.8で陽性の真の電荷を有するタンパク質であるリゾチームの吸着後、純粋なホウ酸緩衝液で洗浄すると、さらに30Å増加した。純粋なMHA表面に吸着すると、対応する厚さの増加は55〜60Åであった。
比較のために、pH8.8で陰性の真の電荷を有するタンパク質であるフィブリノゲンを吸着すると、吸着と緩衝液で洗浄後、厚さが、MHA−DAM表面に対して75Å、そして純粋なMHA表面に対して48Å増加した。
すなわち、本発明の上記表面コーティングの親和性（非修飾MHA表面に比較して）は、異なるタンパク質により異なり、リゾチームよりフィブリノゲンに対して高かった。
0003629036.tif 000002
【図１】
0003629036.tif 000003
【図２】
0003629036.tif 000004
【図３】
0003629036.tif 000005