(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ハロゲノグルタミン酸の５位メチルエステル体を基質に用いることを特徴とする、アミノアシラ−ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法。
【請求項２】
Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位メチルエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的に脱アシル化することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
４−ハロゲノグルタミン酸の５位メチルエステル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応させることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的にＮ−アシル化することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｐＨ５〜７にて酵素反応を行なう、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタミン酸である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法を用いる、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸の製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位メチルエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｌ体を選択的に脱アシル化することを特徴とする、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
４−ハロゲノグルタミン酸の５位メチルエステル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応させることにより、Ｌ体を選択的にＮ−アシル化することを特徴とする、請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタミン酸である、請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬品原料等として有用な４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法及びそれを利用した光学活性体の製造方法に関する。
４−ハロゲノグルタミン酸、特に４−フルオロ−グルタミン酸は、例えば特公平５−３３２３０号等で開示されているように抗ガン剤等の原料として有用であることから、その光学活性体が注目されており、その効率のよい工業的製造方法の開発が望まれている。
【０００２】
【従来技術】
アミノ酸のラセミ分割方法の一手段として、アミノアシラ−ゼによる酵素反応を利用する方法が古くから知られている。また、ハロゲン化アミノ酸についても例えば、３−フルオログルタミン酸のラセミ分割方法が開示されている（J.Org.Chem.1985,50,3163-3167）。しかし、４−ハロゲノグルタミン酸ついては、これまで、アミノアシラ−ゼによるラセミ分割方法は全く報告されていない。よって当然ながら、４−ハロゲノグルタミン酸からそのＬ体を選択的に得る方法は知られていない。その替わりに例えばＬ−４−フルオログルタミン酸の製法として、以下の方法が報告されている。
▲１▼J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,475(1984)
Ｄ，Ｌ−４−Ｆ−グルタミン酸とロイシンとのジペプタイドを、ロイシンアミノペプチダ−ゼで加水分解する方法。
▲２▼Tetrahedron Letters Vol.31,No.51,7403(1990)
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを原料に用いて、化学修飾を行なう方法。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記▲１▼の方法は、酵素反応の原料となるジペプタイドを合成するために、ペプチド結合部位以外のアミノ基、カルボキシ基を保護・脱保護する必要がある等、その調製が厄介である。更に、酵素反応後に遊離してくるＬ−４−Ｆ−グルタミン酸及びＬ−ロイシン、並びに未反応のジペプチドの分離が困難である。また、上記▲２▼の方法は、多工程を要し、操作の簡便性・安全性、収率等の面で問題がある。よって、いずれの方法も工業的製法としては満足のいく方法ではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み本発明者は鋭意検討した結果、４−ハロゲノグルタミン酸をアミノアシラ−ゼを用いてラセミ分割する際に、５位カルボキシル基が遊離カルボン酸のままでは酵素反応が全く進行しないが、５位カルボキシル基をエステル化しておけば、酵素反応がスム−ズに進行しラセミ分割が達成されることを見出し、本発明を完成した。その結果、４−ハロゲノグルタミン酸のＬ体を効率よく製造することにも成功した。
【０００５】
即ち、本発明は、代表的には以下の方法を提供する。
(1) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体を基質に用いることを特徴とする、アミノアシラ−ゼによる酵素反応を利用する４−ハロゲノグルタミン酸のラセミ分割方法。
(2) Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的に脱アシル化する、上記(1)の方法。
(3) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応させることにより、Ｄ体及びＬ体のいずれか一方を選択的にＮ−アシル化する、上記(1)の方法。
(4) ５位カルボキシエステル体が低級アルキルエステルである、上記(1)〜(3)のいずれかの方法。
【０００６】
(5) ｐＨ５〜７にて酵素反応を行なう、上記(1)〜(4)のいずれかの方法。
(6) ４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタミン酸である、上記(1)〜(5)のいずれかの方法。
(7) 上記(1)〜(5)のいずれかの方法を用いる、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸の製造方法。
(8) Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体に、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｌ体を選択的に脱アシル化する、上記(7)の製造方法。
(9) ４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体を、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応させることにより、Ｌ体を選択的にＮ−アシル化する、上記(7)の製造方法。
(10) ４−ハロゲノグルタミン酸が４−フルオログルタミン酸である、上記(7)〜(9)のいずれかの製造方法。
【０００７】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明において、４−ハロゲノグルタミン酸とは、４位の水素原子１個がハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）で置換されたグルタミン酸のラセミ体（Ｄ・Ｌ体）を意味する。
４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体とは、４−ハロゲノグルタミン酸の５位のカルボキシル基におけるエステル体を意味する（以下、単に、５位カルボキシエステル体ということもある）。この場合も、そのラセミ体（Ｄ・Ｌ体）を意味する。
【０００８】
本発明のラセミ分割方法は、具体的には以下の２つの方法を包含するが、好ましくは方法１である。
（方法１：脱アシル化）
Ｎ−アシル−４−ハロゲノグルタミン酸の５位カルボキシエステル体（以下、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体という）を基質原料に用いて、アミノアシラ−ゼを作用させることにより、Ｄ体、Ｌ体のいずれか一方を選択的に脱アシル化すれば、両者が分離可能な状態になる。即ち、酵素反応終了後の反応液には、脱アシル化により生成した５位カルボキシエステル体の一方の光学活性体、脱アシル化されなかったＮ−アシル−５−カルボキシエステル体の他方の光学活性体、及び場合により未反応のラセミ体が含まれる。
【０００９】
即ち、例えば、４−ハロゲノグルタミン酸のＬ体（以下、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸という）を選択的に得たい場合には、好ましくは、基質原料のＬ体に特異的に作用し、Ｌ体を選択的に脱アシル化するアミノアシラ−ゼを用いればよい。そうすることにより、５位カルボキシエステル体のＬ体（以下、Ｌ−５−カルボキシエステル体という）及びＮ−アシル−５−カルボキシエステル体のＤ体を含む反応液が得られる。
本方法における酵素反応はアミドの加水分解であるので、溶媒としては水が適当である。
アシル基としては、使用するアミノアシラ−ゼによりＤ体またはＬ体のいずれか一方が選択的に脱アシル化されるものであれば公知のものを幅広く使用でき、ホルミル、低級アルカノイル（アセチル、クロロアセチル、プロピオニル、ブチリル等）、アロイル（ベンゾイル、トルオイル等）等が例示される。
【００１０】
（方法２：アシル化）
５位カルボキシエステル体を基質原料に用いて、アミノアシラ−ゼ存在下でアシル化剤と反応させることにより、Ｄ体、Ｌ体のいずれか一方のアミノ基を選択的にアシル化すれば、両者が分離可能な状態になる。即ち、酵素反応終了後の反応液には、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体のいずれか一方の光学活性体、アシル化されなかった５位カルボキシエステル体の他方の光学活性体、及び場合により未反応のラセミ体が含まれる。
【００１１】
即ち、例えば、Ｌ−４−ハロゲノグルタミン酸を選択的に得たい場合には、好ましくは、基質原料のＬ体に特異的に作用し、Ｌ体を選択的にアシル化するアミノアシラ−ゼを用いればよい。そうすることにより、Ｎ−アシル−５−カルボキシエステル体のＬ体、及び５位カルボキシエステル体のＤ体を含む反応液が得られる。
本方法における酵素反応は脱水反応に相当するので、溶媒系中に水は本来不要であるが、例えば、ｐＨ調節のための少量の水は含まれていてもよい。
アシル化剤としては、アミノアシラ−ゼをできるだけ失活させずに、基質原料のアミノ基を選択的にアシル化できるものであれば特に制限されないが、好ましくは、酢酸エチル、ハロゲン化酢酸エチル、ハロゲン化プロピオン酸エチル等のエステル型構造を有する試薬である。
【００１２】
上記いずれかの方法により酵素反応を行なった反応液を、公知の物理化学的分離手段（例えば、カラムクロマトグラフィ−、等電点晶析、分液操作等）で後処理することにより単離される光学活性体を、所望により、公知のエステル加水分解反応及び／又は脱アシル化反応を行なうことにより、目的の４−ハロゲノグルタミン酸の光学活性体が得られる。尚、該酵素反応中または反応溶液の後処理中に、エステル体が加水分解されることもある。
【００１３】
尚、上記いずれの方法においても、５位カルボキシエステル体のエステルとしては、好ましくは、低級アルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、イソプロピルエステル、ｔ−ブチルエステル、ｎ−ペンチルエステル、ｎ−ヘキシルエステル等のＣ１〜Ｃ６アルキルエステルが例示されるが、より好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキルエステル、特に好ましくはメチルエステルである。
【００１４】
アミノアシラ−ゼとしては、原料基質のラセミ体に対する反応の選択性があるものであれば特に制限されない。
例えば、４−ハロゲノグルタミン酸のＬ体を選択的に得たい場合には、好ましくは、５位カルボキシエステル体またはそのＮ−アシル体のＬ体に対して特異的に作用するアミノアシラ−ゼを使用すればよく、通常、Acylase Iに分類されて いるものが好適である。そのようなものとしては、例えば、豚腎由来のアミノアシラ−ゼ、Aspergillus oryzae由来のアミノアシラ−ゼ、または特開昭６３−２２１８８号や特開平３−２２４４８３号等に記載のものが使用できる。また、アミノアシラ−ゼは固定化されたものを使用してもよい。
【００１５】
（酵素反応条件）
上記いずれの方法においても、アミノアシラ−ゼによる酵素反応の条件は、基質原料及びアミノアシラ−ゼの種類により若干異なり一概には規定できないが、酵素の至適ｐＨ、至適温度、酵素基質及び分離生成する光学活性体の安定性等を考慮することにより、最適条件を設定することが可能である。
例えば、Ｌ体を収率よく得るためには、好ましくは、ｐＨ約５〜７、温度約１０〜４０℃である。ｐＨ調節用のアルカリ試薬としては、NH4OH、LiOH、Ca(OH)2、KOH、NaOH等が例示される。また、反応時間は通常数時間〜数十時間である。 但し、Ｌ−４−フルオログルタミン酸エステルは、アルカリ性条件下では極めて不安定なため、酵素反応終了後は直ちに反応溶液のｐＨを下げ、好ましくは、ｐＨ３〜４に調節するのが望ましい。
また、通常、基質原料の濃度は約０．５〜１０％、好ましくは約１〜５％である。
【００１６】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（略号）
D,L-FGlu：４-フルオログルタミン酸（ラセミ），
D,L-FGlu-Me：４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体（ラセミ），
L-FGlu：４-フルオログルタミン酸（Ｌ），
L-FGlu-Me：４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体（Ｌ），
Ac-L-FGlu：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸（Ｌ），
Ac-D,L-FGlu-Me：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル 体（ラセミ），
Ac-L-FGlu-Me：Ｎ-アセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチルエステル体 （Ｌ），
ClAc-D,L-FGlu-Me：Ｎ-クロロアセチル-４-フルオログルタミン酸の５位メチル エステル体（ラセミ），
【００１７】
実施例１（方法１）
ClAc-D,L-FGlu-Me（erythro:threo=16:1）３１ｇを蒸留水に懸濁し、２Ｎ NH4OHにてｐＨを６．０に調整しつつ、蒸留水にて全量を２Ｌとした。この溶液に、豚腎臓由来のアミノアシラ−ゼＩ（Sigma製）を０．３ｇ添加し、２８℃にて緩 やかな撹拌を行ない乍ら４時間反応した。反応中は、ｐＨを２Ｎ NH4OHにて６．０に維持した。
酵素反応終了後、酢酸を５０ｍｌ添加してｐＨを約３．５に下げ、陽イオン交換樹脂（DOWEX 50W-X8，室町化学工業）８００ｍＬのカラムを通過（１００ｍＬ／分）させ、酵素反応により生成したL-FGlu-Me及びL-FGluを吸着させた。蒸留 水４Ｌにてカラムを洗浄後、１ＮNH4OHにて溶出した。溶出液をＨＰＬＣで測定 したところ、L-FGluの含量は９．６ｇであった（L-FGlu-Meの形で吸着されたも のも、L-FGluとして溶出されていると考えられる）。
更に、陰イオン交換樹脂（AG1-X4, Bio-Rad製)４００ｍＬにL-FGluを１００ｍＬ／分の流速で吸着させ、蒸留水４Ｌで洗浄後、１Ｎ ぎ酸にて溶出させた。Ｔ ＬＣにより、L-FGlu溶出各分を確認した後、濃縮乾固し、８．３ｇのL-FGluを得た。総収率７６％、光学純度９９．２％であり、erythroとthreoの比率は原料と同じであった。
尚、用いたアミノアシラ−ゼＩ（Sigma製）の至適ｐＨは約７、至適温度は約 ４０〜４５℃であった。
【００１８】
実施例２（方法１）
ClAc-D,L-FGlu-Me（erythro:threo=1:4）３６．６ｇを蒸留水に懸濁し、実施 例１と同様の方法で４．５時間反応させた後、同様に分離精製を行ない、６．０ｇのL-FGluを得た（収率６４％）。erythroとthreoの比率は原料と同じであった。
【００１９】
実施例３（方法２）
D,L-FGlu-Me（erythro:threo=1:1）４０．３ｍｇを、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，０．１ｍＭ ＣｏＳＯ4及び３．３Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮａ含有）０．３ｍＬと酢酸エチル９．７ｍＬの混液中に懸濁し、実施例１で用いたアシラ−ゼＩを４．９ｍｇ添加し、３０℃で１９時間、緩やかに撹拌した。濃塩酸０．１５ｍＬを添加して反応を停止した後、減圧濃縮により酢酸エチルを除去し、水１０ｍＬ添加後、不溶性物質を遠心分離により除去した。この反応溶液を、実施例１で用いた陽イオン交換樹脂２ｍＬカラムで処理することにより、Ac-L-FGlu-MeとAc-L-FGluを集めた。これらを塩酸で加水分解することにより、最終的にL-FGluを ６．２ｍｇ得た。
【００２０】
実施例４（方法１）
Ac-D,L-FGlu-Me（erythro:threo=1:1）３ｇを、蒸留水１５０ｍＬに添加し、 ２Ｎ ＮＨ4ＯＨにてｐＨを６．５に調整した。この溶液に豚腎由来のアシラ−ゼＩ（Sigma社）を１４．２ｍｇ添加し、２８℃にて緩やかな撹拌を行ないながら ４時間反応した。反応中、ｐＨは２Ｎ ＮＨ4ＯＨで６．５になるよう調節した。酵素反応終了後、酢酸を５ｍＬ添加してｐＨを下げた後、反応液を陽イオン交換樹脂（DOWEX 50W-X2，室町化学工業）８０ｍＬのカラムで処理した。最終的に得られたL-FGluは、０．４１ｇ（収率６５％）であった。
【００２１】
実施例５（方法１）
キトパ−ルBCW3001（富士紡績）２００ｇに１５％グルタルアルデヒド５００ ｍＬを添加し、室温で２時間反応させた。反応終了後、蒸留水５００ｍＬによる洗浄を４回繰り返すことにより、活性化したキトパ−ルBCW3001を調製した。
一方、アミノアシラ−ゼ「アマノ」（天野製薬）４０ｇを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）６００ｍＬに懸濁し遠沈上澄を調製した後、活性化したキトパ−ルBCW3001と混合し、室温で２時間緩やかな撹拌を行なった。カップリング反応終 了後、蒸留水及び５０ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、更に５０ｍＭのＮ−アセチルグルタミン酸で洗浄することにより、アシラ−ゼの固定化酵素を調製した。
次に、この固定化酵素１１．１ｇを使用して、実施例４と同様に酵素反応を行なうことにより、最終的にL-FGluを０．４２ｇ（収率６６％）得た。
【００２２】
比較例１（遊離カルボン酸による検討）
Ac-D,L-FGluを原料に用いて実施例１と同じ条件で酵素反応を行なったが、反 応の進行は認められなかった。更に反応液をカラムクロマトで処理したが、光学活性体は得られなかった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明方法により、４−ハロゲノグルタミン酸をアミノアシラ−ゼを用いて効率よくラセミ分割することができる。その結果、例えばそのＬ体を簡便に収率よく高い光学純度で得ることができる。