(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジン生産能を有し、以下のタンパク質であるリジンデカルボキシラーゼの活性が低下又は消失した、エシェリヒア属に属する微生物。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
活性が低下又は消失するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、配列番号３の塩基番号１００５〜３１４３の塩基配列を有する請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記リジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が破壊されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
さらに、ｃａｄＡ遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼの活性が低下又は消失した請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
前記微生物がエシェリヒア・コリである請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｌ−リジンの分解に関与するエシェリヒア・コリの新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、当該遺伝子及び／またはｃａｄＡ遺伝子として知られている他のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑えられているエシェリヒア属に属する微生物、及び該微生物を用いたＬ−リジンの製造法に関する。近年、Ｌ−リジンは、飼料添加物として需要が急増している。
背景技術
エシェリヒア・コリのＬ−リジン分解酵素として、Ｌ−リジンの脱炭酸によりカダベリンを生成する反応を触媒するリジンデカルボキシラーゼが知られており、ｃａｄＡと呼ばれるその遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするアミノ酸配列は既に報告されている（Meng，S and Bennett，G.N.，J．Bacteriol.，174，2659（1992））。また、エシェリヒア・コリのｃａｄＡ以外の遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼについては、エシェリヒア・コリの変異株において微弱な活性が検出されたという報告が２つある（Goldemberg，S.H.，J．Bacteriol.，141，1428（1980）;Wertheimer，S.J．and Leifer，Z.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，114，882（1983））。しかしながら、この活性についてはGoldemberg，S.H.が６０℃、４分間の熱処理により酵素活性が３０％ほど低下すると報告しているのに対し、Wertheimer，S.J.らはそのような現象は認められないと報告しており、第二のリジンデカルボキシラーゼの存在については確かでない。
一方、エシェリヒア・コリを用いたＬ−リジンの製造方法として、リジンアナログに耐性な変異株またはＬ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を組み込んだベクターを保有する組換え株を培養する方法が知られている（特開昭５６−１８５９６号公報）。しかしながら、リジンデカルボキシラーゼの遺伝子の発現が抑えられたエシェリヒア属微生物を用いたＬ−リジン生産についての報告は全くない。
発明の開示
本発明の目的は、エシェリヒア・コリの新規なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を取得し、この遺伝子及び／またはｃａｄＡ遺伝子の発現が抑えられたエシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌を造成し、また、これらのエシェリヒア属微生物を培養することによるＬ−リジンの製造方法を提供することである。
本発明者らは、公知のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子を破壊したエシェリヒア・コリ株を造成したところ、この菌株においてもリジンデカルボキシラーゼによるＬ−リジンの分解産物であるカダベリンがなお生成されることを見いだした。そこで本発明者らは、エシェリヒア・コリに新規なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子が存在しており、エシェリヒア属微生物を用いてＬ−リジンを発酵生産する際に大きく影響を与えるものと推定し、当該遺伝子のクローニングを試みた結果、ｃａｄＡ遺伝子とは異なる新規なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の取得に成功し、また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌においてこの遺伝子の発現を抑え、さらにまたｃａｄＡ遺伝子の発現を抑えることによりＬ−リジンの分解活性が著しく低下ないし消失し、Ｌ−リジン生産能が顕著に向上することを見いだし、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、エシェリヒア・コリ由来のリジンデカルボキシラーゼをコードする新規遺伝子（本遺伝子は「ｌｄｃ」遺伝子とい命名された。）を提供するものである。
また本発明は、Ｌ−リジン生産能を有し、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失させられているエシェリヒア属に属する微生物を提供するものである。
さらに本発明は、上記エシェリヒア属微生物を液体培地に培養し、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供するものである。
上記エシェリヒア属に属する微生物としては、ｌｄｃ遺伝子及び／またはｃａｄＡ遺伝子の発現が抑えられたことにより、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失させられている微生物が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得
本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｄｃ）を含むＤＮＡ断片の取得は、エシェリヒア・コリの入手可能な株、例えばＫ−１２株またはその誘導株から以下のようにして行うことができる。
まず、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２由来のＷ３１１０株の染色体ＤＮＡよりポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（以下、ＰＣＲ法と記す）を用いて公知のリジンデカルボキシラーゼの遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子を得る。ｃａｄＡ遺伝子の塩基配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を、各々配列番号５及び配列番号６に示す。このｃａｄＡ遺伝子と類似の配列を有するＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡライブラリーよりプラスミドベクターやファージベクターを用いる方法によりクローニングし、このＤＮＡ断片に新規なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子が含まれていることを確認する。目的とする遺伝子が含まれていることの確認は、ＰＣＲ法により調製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。
かくして得られるＤＮＡ断片に含まれる遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定される。まず、上記ＤＮＡ断片をエシェリヒア・コリ菌体内で自律増殖可能なプラスミドベクターと連結して組換えＤＮＡを作成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。得られた形質転換体を液体培地に培養し、増殖した菌体から組換えＤＮＡを回収する。回収した組換えＤＮＡに含まれるＤＮＡ断片の全塩基配列をダイデオキシ法（Sanger，F．et al，Proc．Natl．Acad．Sci.，74，5463（1977））により決定し、ＤＮＡの構造解析を行い、プロモーター、オペレーター、ＳＤ配列、開始コドン、終止コドン、オープン・リーディング・フレームなどの存在位置を決定する。
本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子は、配列表配列番号３に示されるＤＮＡ断片の全塩基配列の１００５〜１００７番目のＡＴＧから３１４１〜３１４３番目のＧＧＡに至る配列を有する。本遺伝子は、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする。この新規なリジンデカルボキシラーゼとｃａｄＡ遺伝子のコードするリジンデカルボキシラーゼとのホモロジーは、６９．４％であった。
本発明の遺伝子は、配列表配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラーゼをコードするものであればよく、その塩基配列は上記のものに限定されない。さらに、本発明の遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼは、前記アミノ酸配列において、リジンデカルボキシラーゼ活性を実質的に損なわない１つまたは複数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有していてもよい。このような欠失、挿入又は置換を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリの変種、自然突然変異株又は人為突然変異株、エシェリヒア・コリ以外のエシェリヒア属微生物から取得され得る。また。欠失、挿入又は置換を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする変異遺伝子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子をインビトロ変異処理、あるいは部位特異的変異処理することによっても取得され得る。これらの突然変異処理は、後述するような当業者に周知の方法によって行うことができる。
ただし、ここにいう１つまたは複数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有するリジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子とは、「ｌｄｃ遺伝子」に由来し、ｌｄｃ遺伝子と実質的に同一とみなすことができるものをいうのであって、由来の異なる遺伝子にまで拡張することを意図するものではない。「複数個」が如何なる範囲であるかを具体的に規定することはできないが、例えば配列番号３に示すアミノ酸配列と２００アミノ酸残基以上異なるタンパク質をコードするｃａｄＡ遺伝子は本発明の遺伝子と異なるものであり、配列番号３に示すアミノ酸配列と２、３個アミノ酸残基が異なっても同等のリジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が本発明の遺伝子に包含されることは、当業者に容易に理解されるであろう。
＜２＞リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑制されたエシェリヒア属微生物の造成
本発明のエシェリヒア属微生物は、細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性が低下又は消失させられているエシェリヒア属に属する微生物である。エシェリヒア属微生物としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性の低下又は消失は、例えば、上記の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｄｃ）と公知のｃａｄＡのいずれか一方あるいは両方の発現を抑えることによって行われる。また、これらの遺伝子によりコードされるリジンデカルボキシラーゼ酵素の構造を改変して、比活性を低下又は消失させることによっても細胞中のリジンデカルボキシラーゼ活性を低下又は消失させることができる。
ｌｄｃ遺伝子及び公知のｃａｄＡ遺伝子の発現を抑えるための手段としては、例えば、これらの遺伝子のプロモーター配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、プロモーター活性を低下させることによって転写レベルで遺伝子の発現を抑える方法がある（M．Rosenberg and D．Court，Ann．Rev．Genetics 13（1979）p.319、P．Youderian，S．Bouvier and M．Susskind，Cell 30（1982）P．843-853参照）。また、これらの遺伝子の発現は、ＳＤ配列と開始コドンとの間の領域中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによって、翻訳レベルで抑えることができる（J．J．Dunn，E．Buzash-Pollert and F．W．Studier，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，75（1978）P.2743参照）。また、リジンデカルボキシラーゼ酵素の比活性を低下又は消失させるには、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のコーディング領域の中の塩基配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによってコーディング領域を改変または破壊する方法がある。
塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせる遺伝子としては、ｌｄｃ遺伝子及びｃａｄＡ遺伝子に加え、コードするリジンデカルボキシラーゼ活性を実質的に損なわない１つまたは複数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を有するｌｄｃ遺伝子またはｃａｄＡ遺伝子でもよい。
遺伝子中に塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせるには、具体的には、部位特異的変異法（Kramer，W．and Frits，H．J.，Methods in Enzymology，154，350（1987））や、次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤により処理する方法（Shortle，D．and Nathans，D.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，75，270（1978））が挙げられる。
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加または逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて１本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つようにしておく。この後１本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子に変異を導入し、改変または破壊することができる同様な手法には、リコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology，Stockton press（1989））がある。
また、化学薬剤処理を用いる方法は、目的の遺伝子を含むＤＮＡ断片を直接次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等で処理することによりＤＮＡ断片中にランダムに塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ変異を導入する方法である。
以上のようにして取得した変異が導入されて改変または破壊された遺伝子を、エシェリヒア属微生物の染色体上の正常な遺伝子と置換することにより、細胞中のｌｄｃ遺伝子及び／またはｃａｄＡ遺伝子の発現を抑えることができる。遺伝子の置換の方法としては、相同性組換えを利用した方法（Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory press（1972）;Matsuyama，S．and Mizushima，S.，J．Bacteriol.，162，1196（1985））がある。相同性組換えは、エシェリヒア属微生物が一般的に持つ能力であり、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体を染色体上に組み込む。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により変異が導入された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ変異が導入されて改変または破壊された遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
遺伝子の置換を行うエシェリヒア属微生物は、Ｌ−リジン生産能を有する微生物である。Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア属微生物、例えばエシェリヒア・コリ菌株は、Ｌ−リジン生産能を有しない株に変異処理を施し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、ＡＥＣと記す）等のリジンアナログに対する耐性を付与することにより取得することができる。変異処理の方法としては、エシェリヒア・コリの菌体にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンや亜硝酸等の化学薬剤による処理、あるいは紫外線、放射線照射等の処理を施す方法がある。このような菌株の具体例としては、エシェリヒア・コリ  ＡＪ１３０６９  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９０）が挙げられる。本菌株は、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２由来のＷ３１１０株にＡＥＣ耐性を付与することによって育種されたものである。尚、エシェリヒア・コリ  ＡＪ１３０６９は、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９０として寄託され、平成７年９月２９日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２５２が付与されている。
また、Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリ菌株は、Ｌ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても育種することができる。導入される遺伝子は、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ等、Ｌ−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子であり、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素のようにＬ−リジンによるフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。遺伝子を導入、増強するには、エシェリヒア・コリ細胞内で自律複製可能なベクターに遺伝子を連結して組換えＤＮＡを作成し、それでエシェリヒア・コリを形質転換する方法があり、その他にトランスダクション、トランスポゾン（Berg，D．E．and Berg，C．M.，Bio/Technol．1，417，（1983））、Ｍｕファージ、（特開平２−１０９９８５号）または相同組換え（Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab．（1972））を用いた方法で宿主染色体に組み込むこともできる。
遺伝子の機能が破壊されたエシェリヒア属微生物を取得するその他の方法としては、当該遺伝子を有するエシェリヒア属微生物の菌体にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンや亜硝酸等の化学薬剤による処理、あるいは紫外線、放射線照射等の処理を施すことにより遺伝的に変異させる方法もある。
後述の実施例においては、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能が破壊されたエシェリヒア・コリ株の造成は、そのコーディング領域の一部を欠失させ、代わりに薬剤耐性遺伝子を挿入したリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を、上記の相同性組換えを利用した方法により、エシェリヒア・コリの染色体上のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子と置換することにより行った。
なお、１つの菌株において本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子とｃａｄＡ遺伝子のいずれか一方のみの発現を抑えることもできるし、両方の発現を抑えることもできる。また、Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア属微生物においてリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を抑えてもよいし、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を抑えたエシェリヒア属微生物に上記の方法によりＬ−リジン生産能を付与してもよい。
＜３＞リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑制されたエシェリヒア属微生物を用いたＬ−リジンの生産
上記のようにして取得したリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現が抑制されたエシェリヒア属微生物を培養することにより、培養液中に著量のＬ−リジンが生成蓄積される。Ｌ−リジンの蓄積量は、公知のｃａｄＡ遺伝子の発現を抑えることだけでも増加するが、本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を抑えることは、Ｌ−リジンの蓄積量の向上により有効であり、また、ｃａｄＡ遺伝子と本発明の新規遺伝子の両方の発現を抑えた菌株を用いることにより、Ｌ−リジンの生産にとって最も好ましい結果が得られる。
Ｌ−リジン生産のために使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ1、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、あるいはアンモニアガス等を使用することができる。
培養終了後、発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常のイオン交換樹脂法、沈澱法、その他の公知の方法を組み合わせることにより適宜実施できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５の構造を示す図である。
図２は、新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含む温度感受性プラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５の構造と、同遺伝子の遺伝子の一部がクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む断片で置換されたプラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５Ｃｍの構築を示す図である。
図３は、正常なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子保有株ＷＣ１９６、及びリジンデカルボキシラーゼ遺伝子破壊株ＷＣ１９６Ｃ、ＷＣ１９６Ｌ及びＷＣ１９６ＬＣ株におけるＬ−リジン分解活性の比較を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
（１）新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
国立遺伝学研究所（日本国静岡県三島市谷田１１１１）より入手したエシェリヒア・コリ  Ｋ−１２のＷ３１１０株の菌体から、通常の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。一方、Meng，S and Bennett，G.N.，J．Bacteriol.，174，2659（1992）に記載されているｃａｄＡ遺伝子の塩基配列（配列番号５参照）に基づいて、配列表配列番号１及び２に示すような合成ＤＮＡプライマー２本を通常の方法で合成した。これらはそれぞれｃａｄＡ遺伝子の５′−末端上流部分及び３′−末端部分に相同な配列を有する。この染色体ＤＮＡとＤＮＡプライマーを用いてエルリッチらの方法（PCR Technology，Stockton press（1989））に従ってＰＣＲ法を行い、ｃａｄＡ遺伝子の大部分を含む２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をランダムプライマーラベリングキット（宝酒造社製）および［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャムジャパ社製）を用いてラベルしハイブリダイゼーション用のプローブを作製した。
次に、作製したプローブとエシェリヒア・コリ／ジーンマッピングメンブラン（宝酒造社製）を用いて通常の方法（Molecular Cloning（2nd edition），Cold Spring Harbor Laboratory press（1989））によりハイブリダイゼーションを行った。エシェリヒア・コリ／ジーンマッピングメンブランには、小原らのライブラリー（エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡのラムダファージライブラリー：Kohara，Y，et al，Cell，50，495-508（1987）参照）が吸着している。ハイブリダイゼーションの際に、プローブの洗浄の条件を弱くし（２×ＳＳＣ、５５℃、３０分）、ｃａｄＡ遺伝子と類似の配列を持つラムダファージクローンをスクリーニングした。その結果、ｃａｄＡ遺伝子領域を含むクローン（２１Ｈ１１、５Ｇ７）の強いシグナルの他に、Ｅ２Ｂ８、６Ｆ５Ｈ、１０Ｆ９の３つのクローンに弱いシグナルを認めることができた。Ｅ２Ｂ８、６Ｆ５Ｈ、１０Ｆ９の３つのラムダファージクローンの挿入配列はエシェリヒア・コリの染色体上で互いに重なりながら連続している。そこで、小原らのライブラリー（Kohara，Y，et al，Cell，50，495-508（1987））に属する６Ｆ５ＨのラムダファージＤＮＡを通常の方法により分離し、さらに、各種制限酵素で切断し、上記プローブを用いて先程と同様な方法によりサザンブロットハイブリダイゼーションを行ったところ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断された約５ｋｂｐのＤＮＡ断片中にｃａｄＡ遺伝子と類似の配列が存在していることが明らかとなった。
そこで、この６Ｆ５ＨのラムダファージＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる約５ｋｂｐの断片とプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＨｉｎｄＩＩＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合物でエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、アンピシリンを５０ｍｇ／Ｌ添加した完全平板培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水１Ｌに含む）上で生育したアンピシリン耐性株より、６Ｆ５ＨのラムダファージＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる約５ｋｂｐの断片が挿入されたプラスミドを保有する菌株を取得した。その菌体からプラスミドを抽出し、プラスミドｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５を取得した。プラスミドｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５の構造を図１に示す。
なお、このプラスミドを保持するエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５は、ＡＪ１３０６８と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６８９として寄託され、平成７年９月２９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２５１が付与されている。
（２）新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列の決定
取得したｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５の制限酵素ＣｌａＩ部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位の領域の塩基配列をMolecular Cloning（2nd edition），Cold Spring Harbor Laboratory press（1989）に記載の方法に従って決定した。その結果、配列表配列番号３に示す塩基配列を有することが明らかになった。このＤＮＡ配列中には配列表配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームが含まれている。
（３）Ｌ−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリの取得
エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０を完全培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水１Ｌに含む）で３７℃、４時間培養して得た菌体を２００μｇ／ｍｌの濃度のＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン溶液中で３７℃、３０分変異処理し、洗浄後、ＡＥＣを５ｇ／Ｌ添加した最少平板培地（リン酸水素二ナトリウム７ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、グルコース５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２５ｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含む）に塗布した。３７℃、４８時間培養して出現したコロニーを分離することによりＡＥＣ耐性株を取得した。この中の一株であるＷＣ１９６株はＬ−リジン生産能を有していた。なお、ＷＣ１９６株はＡＪ１３０６９と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６９０として寄託され、平成７年９月２９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２５２が付与されている。
（４）新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能を破壊したＷＣ１９６株の造成
上記の６Ｆ５ＨのラムダファージＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる約５ｋｂｐの断片と温度感受性のプラスミドｐＭＡＮ０３１（Yasueda，H．et al，Appl．Microbiol．Biotechnol.，36，211（1991））のＨｉｎｄＩＩＩ切断物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。この反応混合物でエシェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリンを５０ｍｇ／Ｌ添加した完全平板培地の培地上で３７℃、２４時間培養し、生育したアンピシリン耐性株より６Ｆ５ＨのラムダファージＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる約５ｋｂｐの断片が挿入されたプラスミドを保有する菌株を取得した。この菌体からプラスミドを抽出し、プラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５を取得した。プラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５をＥｃｏＲＶで切断して約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を除き、ついでｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）をＡｃｃＩで切断して得られる約１ｋｂｐのクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ断片をＴ４リガーゼを用いて挿入して、プラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５Ｃｍを構築した。以上の操作の結果、新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能が破壊されたＤＮＡ断片を持つプラスミドを構築することができた。プラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５の構造及びプラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５Ｃｍを図２に示す。
次に、このプラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５Ｃｍの温度感受性の性質を利用した一般的な相同性組換えの手法（Matsuyama，S．and Mizushima，S.，J．Bacteriol.，162，1196（1985））でＷＣ１９６株の染色体上の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能が破壊されたＤＮＡ断片に置換した株を造成した。すなわち、プラスミドｐＴＳ６Ｆ５ＨＨ５ＣｍでＷＣ１９６株を形質転換し、最初３０℃でアンピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性株を取得する。次にこの株より４２℃でアンピシリン耐性かつクロラムフェニコール耐性株を取得し、さらにこの株より３０℃でアンピシリン感受性かつクロラムフェニコール耐性株を取得することにより、上記のようなＷＣ１９６株の染色体上の新規なリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能が破壊されたＤＮＡ断片に置換した株を造成し、この株をＷＣ１９６Ｌ株と命名した。
（５）ｃａｄＡ遺伝子の欠損したＷＣ１９６株及びＷＣ１９６Ｌ株の造成
公知のリジンデカルボキシラーゼの遺伝子であるｃａｄＡが破壊されたエシェリヒア・コリとして、既にエシェリヒア・コリ  Ｋ−１２由来のＧＮＢ１０１８１株（Auger，E.A．et al，Mol．Microbiol.，3，609（1989）参照：本菌株は、E．coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）等から入手できる）等が知られている。この菌株ではｃａｄＡ遺伝子の領域が欠損していることが明らかにされている。そこで、このＧＮＢ１０１８１株のｃａｄＡ遺伝子欠損の形質をＰ１ファージを用いた一般的な方法（A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1992））によりＷＣ１９６株に形質導入してＷＣ１９６Ｃ株を造成した。ＷＣ１９６株のｃａｄＡ遺伝子が欠損していることはサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。また、以上と同様な方法により、ＷＣ１９６Ｌ株よりｃａｄＡ遺伝子が欠損したＷＣ１９６ＬＣ株を造成した。
実施例２
（１）ＷＣ１９６株、ＷＣ１９６Ｃ株、ＷＣ１９６Ｌ株及びＷＣ１９６ＬＣ株のＬ−リジン分解活性の確認
造成した上記４株をＬ−リジン生産用培地（グルコース４０ｇ、硫酸アンモニウム１６ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マンガン４〜５水和物１０ｍｇ、硫酸鉄・７水和物１０ｍｇを水１Ｌに含み、水酸化カリウムでｐＨを７．０に調整後、さらに３０ｇの別殺菌した炭酸カルシウムを加える）を用いて３７℃で１７時間培養した。回収した菌体を生理食塩水で２回洗浄し、Ｌ−リジン分解検定用培地（リン酸水素二ナトリウム・１２水和物１７ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩１０ｇを水１Ｌに含む）に懸濁して３７℃で３１時間培養した。
培養液中の残存Ｌ−リジン量の経時的な変化を図３に示す。なお、Ｌ−リジンの定量はバイオテックアナライザーＡＳ−２１０（旭化成社製）を用いて行った。ＷＣ１９６株では顕著なＬ−リジンの分解が認められたが、公知のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子を欠損させたＷＣ１９６Ｃ株では分解活性がやや低下しており、新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能を破壊したＷＣ１９６Ｌ株及びＷＣ１９６ＬＣ株ではＬ−リジンの分解が認められなかった。なお、培養３時間目くらいまでにいずれの菌株においても培養液中の残存Ｌ−リジンが減少するが、これは菌体内にＬ−リジンが取り込まれるために起こる現象であり、分解によるものではない。
（２）ＷＣ１９６株、ＷＣ１９６Ｃ株、ＷＣ１９６Ｌ株及びＷＣ１９６ＬＣ株によるＬ−リジンの生産
上記のＬ−リジン生産用培地で上記４株を３７℃で２０時間培養し、培養液中に生成蓄積したＬ−リジン及びカダベリンの量を測定した。なお、Ｌ−リジンの定量は上記のようにバイオテックアナライザーＡＳ−２１０を、カダベリンの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いて行った。
結果を表１に示す。ｃａｄＡ遺伝子を破壊したＷＣ１９６Ｃ株ではＷＣ１９６株に比べて、また、新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能を破壊したＷＣ１９６Ｌ株ではＷＣ１９６株及びＷＣ１９６Ｃ株に比べて、Ｌ−リジンの蓄積が向上する一方、Ｌ−リジンの分解物であるカダベリンの蓄積が減少した。両方のリジンデカルボキシラーゼの遺伝子の機能を破壊したＷＣ１９６ＬＣ株ではさらにＬ−リジンの蓄積が向上し、Ｌ−リジンの分解物であるカダベリンの蓄積が検出されなかった。
0003692538.tif 000002
実施例３
Ｌ−リジンの分解活性がなくなったエシェリヒア・コリ  ＷＣ１９６ＬＣを新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むｐＣ６Ｆ５ＨＨ５で形質転換し、アンピシリン耐性株を取得した。ＷＣ１９６ＬＣ株ＷＣ１９６ＬＣ／ｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５株を５ｇ／ＬのＬ−リジンを添加したＬ−リジン生産用培地で３７℃で１６時間培養し、生成するカダベリンの量を測定した。
結果を表２に示す。ＷＣ１９６ＬＣ株はＬ−リジンをカダベリンに転換することはできなかったが、ＷＣ１９６ＬＣ／ｐＵＣ６Ｆ５ＨＨ５株はＬ−リジンをカダベリンに転換する能力を持っていた。
0003692538.tif 000003
産業上の利用可能性
本発明の新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリにおいてＬ−リジンの分解に関与する。Ｌ−リジン生産能を有し、上記遺伝子及び／またはｃａｄＡ遺伝子の発現が抑えられているエシェリヒア属細菌を培養することにより安価かつ効率的にＬ−リジンを製造することができる。
配列表
（1）一般情報
（i）出願人：味の素株式会社
（ii）発明の名称：新規リジンデカルボキシラーゼ遺伝子及びＬ−リジンの製造法
（iii）配列数：６
（iv）連絡先：
（A）宛名：
（B）番地：
（C）市：
（D）州：
（E）国：
（F）ZIP：
（v）コンピュータ読取り可能形式
（A）媒体：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC互換
（C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：FastSEQ Version 1.5
（vi）現行出願データ
（A）出願番号
（B）出願日
（C）分類
（viii）代理人／事務所情報
（A）名前：
（B）登録番号：
（C）整理番号：
（ix）通信情報
（A）電話番号：
（B）ファクシミリ番号：
（2）配列番号１の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：20bases
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:1:
0003692538.tif 000004
（2）配列番号２の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：20bases
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列：SEQ ID NO:2:
0003692538.tif 000005
（2）配列番号３の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：3269base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
（B）株名：Ｗ３１１０
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1005..3143
（xi）配列：SEQ ID NO:3:
0003692538.tif 000006
0003692538.tif 000007
0003692538.tif 000008
0003692538.tif 000009
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0003692538.tif 000011
（2）配列番号４の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：713amino acids
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：SEQ ID NO:4:
0003692538.tif 000012
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（2）配列番号５の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：2145base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：二本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
（B）株名：ＣＳ５２０
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1..2145
（xi）配列：SEQ ID NO:5:
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0003692538.tif 000017
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（2）配列番号６の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：715amino acids
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：SEQ ID NO:6:
0003692538.tif 000021
0003692538.tif 000022
0003692538.tif 000023
0003692538.tif 000024
【図１】
0003692538.tif 000025
【図２】
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【図３】
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