(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカンの測定方法。
工程(A)：蛋白質が、以下のステップ(1)及び(2)を経て共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相に、検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させる工程。
工程(B)：固相に固着された前記グリコサミノグリカンに結合した前記グリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出する工程。
ステップ(1)：グリコサミノグリカンの還元末端を還元した後過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させるステップ。
ステップ(2)：ステップ(1)の後、還元してアルキルアミノ結合を形成させるステップ。
【請求項２】
グリコサミノグリカン結合性蛋白質が標識されていることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であり、グリコサミノグリカン結合性蛋白質がヒアルロン酸結合性蛋白質であることを特徴とする請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
蛋白質が、血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン及びアビジンから選択される蛋白質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法によって体液中のグリコサミノグリカンを測定し、体液中のグリコサミノグリカン量と疾患とを関連づけることによる疾患の検出方法。
【請求項６】
疾患が、肝疾患、慢性関節リウマチ又は膀胱癌である請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、グリコサミノグリカンの測定キット。
(A)蛋白質が、以下のステップ(1)及び(2)を経て共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相。
(B)グリコサミノグリカン結合性蛋白質。
ステップ(1)：グリコサミノグリカンの還元末端を還元した後過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させるステップ。
ステップ(2)：ステップ(1)の後、還元してアルキルアミノ結合を形成させるステップ。
【請求項８】
グリコサミノグリカン結合性蛋白質が標識されていることを特徴とする請求項７記載の測定キット。
【請求項９】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸であり、グリコサミノグリカン結合性蛋白質がヒアルロン酸結合性蛋白質であることを特徴とする請求項７又は８記載の測定キット。
【請求項１０】
蛋白質が、血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン及びアビジンから選択される蛋白質である請求項７〜９のいずれか１項に記載の測定キット。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の測定キットの構成成分を少なくとも含む、疾患の検出キット。
【請求項１２】
疾患が、肝疾患、慢性関節リウマチ又は膀胱癌である請求項１１記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカンの測定方法及び測定キットに関する。また本発明は、疾患の検出方法及び検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
以下、本発明に最も近い技術について説明する。
特開平３−２８４６９８号公報には、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが記載されている。しかし、グリコサミノグリカンの測定や、疾患の検出に関しては記載も示唆もない。
【０００３】
特開昭６３−１５０６６９号公報には、グリコサミノグリカンの一種であるヒアルロン酸が固着された固相に、検体及びヒアルロン酸結合性蛋白質を接触させ、検体中のヒアルロン酸と固相に固着されたヒアルロン酸を競合的に反応させ、固相に固着された前記ヒアルロン酸に結合した前記ヒアルロン酸結合性蛋白質を検出する工程を少なくとも含む、検体中のヒアルロン酸の測定方法が記載されている。しかしながら、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相を用いた、グリコサミノグリカンの測定については記載も示唆もない。
【０００４】
またBlood, 83(9),2532-2540 (1994)には、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)が共有結合したヘパラン硫酸(グリコサミノグリカンの一種)が固着されたプレートに、検体を接触させ、抗ヘパラン硫酸抗体を検出する技術が記載されている。しかし、グリコサミノグリカンの測定に関しては、記載も示唆もない。
【０００５】
また特公平６−４１９５２号公報には、リウマチ等の炎症や癌等の疾患により血液中のヒアルロン酸濃度が上昇することが知られている旨記載されており、また血液中のヒアルロン酸を定量することは炎症の進行や手術後の回復の診断あるいは癌の診断等において有用である旨記載されている。その他、体液中のグリコサミノグリカン量と疾患との関連について記載されている文献等もあるが、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相を用いて体液中のグリコサミノグリカンを測定し、これと疾患とを関連づけることについては記載も示唆もない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
グリコサミノグリカンを、より高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できる方法が提供できれば、グリコサミノグリカンの測定方法として極めて実用性が高く、このような測定方法及び測定キットが望まれていた。またこのような測定方法及び測定キットが提供できれば、体液中のグリコサミノグリカンの量に変化が生じる疾患の検出も極めて容易になる。
【０００７】
すなわち本発明は、グリコサミノグリカンの極めて実用的な測定方法及び測定キット、並びに疾患の検出方法及び検出キットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相を用いることにより、グリコサミノグリカンを従来の方法よりも高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカンの測定方法（以下、「本発明測定方法」ともいう）を提供する。
工程(A)：蛋白質が、以下のステップ(1)及び(2)を経て共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相に、検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させる工程。
（この工程において、グリコサミノグリカン結合性蛋白質に対して、検体中のグリコサミノグリカンと固相に固着されたグリコサミノグリカン（蛋白質と共有結合したもの）とが競合的に反応して結合する。）
工程(B)：固相に固着された前記グリコサミノグリカンに結合した前記グリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出する工程。
ステップ(1)：グリコサミノグリカンの還元末端を還元した後過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させるステップ。
ステップ(2)：ステップ(1)の後、還元してアルキルアミノ結合を形成させるステップ。
【００１０】
また本発明は、本発明測定方法によって体液中のグリコサミノグリカンを測定し、体液中のグリコサミノグリカン量と疾患とを関連づけることによる疾患の検出方法（以下、「本発明検出方法」ともいう）を提供する。
【００１１】
また本発明は、下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、グリコサミノグリカンの測定キット（以下、「本発明測定キット」ともいう）を提供する。
(A)蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相。
(B)グリコサミノグリカン結合性蛋白質。
【００１２】
また本発明は、本発明測定キットの構成成分を少なくとも含む、疾患の検出キット（以下、「本発明検出キット」ともいう）を提供する。
【００１３】
本発明において、グリコサミノグリカン結合性蛋白質は標識されていることが好ましい。また、グリコサミノグリカンはヒアルロン酸であり、グリコサミノグリカン結合性蛋白質はヒアルロン酸結合性蛋白質であることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
＜１＞本発明測定方法
本発明測定方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中のグリコサミノグリカンの測定方法である。
工程(A)：蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相に、検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させる工程。
工程(B)：固相に固着された前記グリコサミノグリカンに結合した前記グリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出する工程。
【００１６】
本発明測定方法で用いることができる「蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカン」は、蛋白質とグリコサミノグリカンとが直接的又は間接的に共有結合している限りにおいて限定されない。両者が直接的に結合している物質には、グリコサミノグリカンと蛋白質が、非蛋白性のスペーサー化合物を介して共有結合している物質（グリコサミノグリカン−スペーサー化合物−蛋白質）も含まれる。両者が間接的に共有結合している物質としては、例えば蛋白質に結合性を有する非蛋白性の物質（例えばビオチン等）をグリコサミノグリカンに共有結合させ、これとアビジン等の蛋白質とを結合させたような物質（例：グリコサミノグリカン−ビオチン−アビジン）等が例示される。なお、ビオチンとアビジンの間の結合は共有結合ではないが、これら両者が結合してなる複合体（ビオチン−アビジン）は極めて安定であることから、実質的に一つの蛋白質とみなすことができる。なお、ここでは直接的に共有結合しているものが好ましい。
【００１７】
蛋白質が共有結合する位置は、グリコサミノグリカンの鎖の末端であることが好ましい。
【００１８】
蛋白質としては、その蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが後述の固相に固着でき、かつ反応時や洗浄時の条件下においても遊離しないものである限りにおいて特に限定されないが、アミノ基を多く含有する蛋白質、又は分子量が５，０００以上の蛋白質が好ましい。なお、これら２つの性質を併有する蛋白質、すなわちアミノ基を多く含有し、かつ分子量５，０００以上の蛋白質が特に好ましい。
【００１９】
蛋白質として具体的には、例えば血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）等）、卵白アルブミン、カゼイン、アビジン、ポリアミノ酸（ポリリジン等）等が例示されるが、血清アルブミンが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。
【００２０】
蛋白質を共有結合させるグリコサミノグリカンは、測定対象のグリコサミノグリカンと同一のグリコサミノグリカンを用いる。グリコサミノグリカンとしてはヒアルロン酸（以下、ＨＡともいう）、コンドロイチン硫酸（以下、ＣＳともいう）、デルマタン硫酸（以下、ＤＳともいう）、ケラタン硫酸（以下、ＫＳともいう）、ヘパラン硫酸（以下、ＨＳともいう）、ヘパリン（以下、Ｈｅｐともいう）等が例示されるが、例えばＨＡを測定対象とする場合は、ＨＡに蛋白質を共有結合させたものを用いる。同様に、例えばＨＳを測定対象とする場合は、ＨＳに蛋白質を共有結合させたものを用いる。測定対象とするグリコサミノグリカンは特に限定されないが、ＨＡが好ましい。よって蛋白質を共有結合させるグリコサミノグリカンもＨＡが好ましい。また、蛋白質を共有結合させるグリコサミノグリカンの分子量も特に限定されないが、低分子量のものが好ましい。例えば、ＨＡを蛋白質に共有結合させる場合、当該ＨＡの重量平均分子量は１万〜１０万程度のものが特に好ましい。
【００２１】
蛋白質とグリコサミノグリカンとを共有結合させる方法（蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンの製造方法）は、グリコサミノグリカンの還元末端を還元した後過ヨウ素酸酸化して遊離ホルミル基を導入し、これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成後、トリメチルアミンボラン等の還元剤を用いて還元し、共有結合させる方法である。これにより生じる共有結合は、アルキルアミノ結合(-CH2-NH-)である。
【００２８】
このような方法で製造される「蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカン」は、固相に固着して用いられる。
【００２９】
固相としては、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着可能な水不溶性の固相である限りにおいて、その形状、材質等は限定されない。
【００３０】
固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックス等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００３１】
これらの固相に蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００３２】
物理的吸着法として具体的には、例えば次の方法が挙げられ、かつ好ましい。
蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンを、ｐＨ７〜９程度の緩衝液(例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)、炭酸緩衝液等)に溶解して固相に加え、４℃で一晩静置して固着させる方法。
【００３３】
なお、この後にブロッキング物質を固相に添加して、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００３４】
以上の方法で、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相を製造することができる。
【００３５】
工程(A)は、このようにして製造された固相に、検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させる工程からなる。
【００３６】
検体としては、測定対象とするグリコサミノグリカンが含有されているか、含有されている可能性があるものである限りにおいて限定されない。また検体は予め精製されている必要もない。すなわち検体中に、測定対象とするグリコサミノグリカン以外のグリコサミノグリカンや、その他の各種蛋白質等が含有されていても、本発明測定方法では測定対象とするグリコサミノグリカンを特異的に測定することができる。
【００３７】
検体として具体的には、グリコサミノグリカン溶液、細胞培養上清、体液等が例示される。これらの中でも体液が好ましい。体液としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、関節液、胸水、腹水、骨髄液、脊髄液等が例示されるが、血清及び血漿が特に好ましい。
【００３８】
本明細書において「グリコサミノグリカン結合性蛋白質」とは、グリコサミノグリカンに結合する性質を有する蛋白質を意味する。同様に本明細書においては、例えばＨＡに結合する性質を有する蛋白質を「ＨＡ結合性蛋白質」、ＨＳに結合する性質を有する蛋白質を「ＨＳ結合性蛋白質」のように記載する。
【００３９】
本発明測定方法において、グリコサミノグリカン結合性蛋白質は、測定対象とするグリコサミノグリカンに結合する性質を有する蛋白質を用いる。
【００４０】
例えばＨＡを測定対象とする場合は、ＨＡ結合性蛋白質を用いる。同様に、例えばＨＳを測定対象をする場合は、ＨＳ結合性蛋白質を用いる。
【００４１】
グリコサミノグリカン結合性蛋白質として具体的には以下のものが例示されるが、各グリコサミノグリカンに結合する性質を有する蛋白質である限りにおいてこれらに限定されるものではない。
【００４２】
(1)ＨＡ結合性蛋白質：
ＨＡ結合性のプロテオグリカン（例えば、軟骨プロテオグリカン、軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、軟骨プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ消化物（特許第２７３２７１８号）等）、プロテオグリカンのコア蛋白質（例えば、軟骨プロテオグリカンのコア蛋白質等）、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン、ＣＤ４４、これらの蛋白質のＨＡ結合部位を含む部分蛋白質、あるいは該部分蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質、ＨＡを認識する抗体(特開平９−１２６００号公報参照)等。（特に軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、さらにはウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物が好ましい。なお、ウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ヒアルロン酸バインディングプロテイン」として生化学工業株式会社から販売されている。）
【００４３】
(2)ＨＡ以外のグリコサミノグリカンに結合性の蛋白質：
ＨＡ以外のグリコサミノグリカンに対する各種モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ＨＩＰ(ＨＳ結合性蛋白質）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）等のグリコサミノグリカン結合性成長因子、フィブロネクチン等のグリコサミノグリカン結合性蛋白質等。例えば、ＫＳ結合性のものとして、モノクローナル抗体5D4、ＣＳ結合性のものとして、モノクローナル抗体CS-56、MC21C、MO225、1-B-5、2-B-6および3-B-3、ＤＳ結合性のものとして、モノクローナル抗体6-B-6およびヘパリンコファクターII、ＨＳ結合性のものとして、モノクローナル抗体10-E-4、3-G-10、HepSS-1およびHK-102並びにＨＩＰ（子宮上皮ＨＳ結合性蛋白質）及びＦＧＦ、Ｈｅｐ結合性のものとして、ＦＧＦ、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンチトロンビンIII、ヘパリンコファクターII、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニン。（なお、ここに挙げたモノクローナル抗体は生化学工業株式会社から販売されている。）
【００４４】
これらのグリコサミノグリカン結合性蛋白質の由来は特に限定されない。例えば天然材料から分離した蛋白質であってもよく、遺伝子工学的手法により製造した組換え蛋白質であってもよい。
【００４５】
なお、グリコサミノグリカン結合性蛋白質は標識物質で標識されていることが、工程(B)において検出が容易であることから好ましい。
グリコサミノグリカン結合性蛋白質の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位元素等が挙げられるが、通常蛋白質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等（「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法(Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照)、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭63-17843号公報記載の方法等から適宜選択できる。
【００４６】
なお、ビオチンで標識されたウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ビオチン標識ヒアルロン酸バインディングプロテイン」として生化学工業株式会社から販売されている。
【００４７】
また、グリコサミノグリカン結合性蛋白質が予め標識されたものでなく、工程(B)においてグリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出する際に、例えば、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を認識する標識された抗体とグリコサミノグリカン結合性蛋白質とを反応させることにより最終的に標識され得る態様であってもよい。
【００４８】
前記固相（蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相）に検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を接触させると、グリコサミノグリカン結合性蛋白質に対して、検体中のグリコサミノグリカンと固相に固着されたグリコサミノグリカン（蛋白質と共有結合したもの）とが競合して結合する。
【００４９】
蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相への検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質の接触方法は、当該固相、検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質の３者が接触する限りにおいて特に限定されないが、本発明方法は、グリコサミノグリカンのグリコサミノグリカン結合性蛋白質に対する競合反応を利用し、かつ検体中のグリコサミノグリカンを測定する方法であるので、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を最後に接触させるか、少なくとも検体とグリコサミノグリカン結合性蛋白質とを接触させると同時又は後に前記固相に接触させることが好ましい。具体的には下記の態様が例示される。なお下記の態様はあくまで例示であり、本発明測定方法がこれらに限定されるものではない。前記３者を接触させる順序や方法は、例えば下記の態様を参考にして当業者が適宜決定することができる。
【００５０】
態様(1)：蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相に検体を添加して接触させ、次いでこれにグリコサミノグリカン結合性蛋白質を添加して接触させる。
【００５１】
態様(2)：検体に、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相を添加して接触させ、次いでこれにグリコサミノグリカン結合性蛋白質を添加して接触させる。
【００５２】
態様(3)：蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相に、検体及びグリコサミノグリカン結合性蛋白質を同時に添加して接触させる。
【００５３】
態様(4)：検体に、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を添加して接触させてインキュベートし、次いでこれを蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相に添加して接触させる。
【００５４】
なおこれら３者を接触させた後、十分に競合反応させるために、約０℃〜約４５度、例えば３７℃程度でインキュベートすることが好ましい。インキュベートの時間は、前記３者が十分に反応できる限りにおいて特に限定されないが、３０分〜１時間程度を例示することができ、かつ好ましい。
【００５５】
また反応後、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着した、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカン及びこれに結合したグリコサミノグリカン結合性蛋白質が遊離しない条件で行われる。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液(例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等)を用いることが好ましい。
【００５６】
以上の工程(A)を経た後、工程(B)に移行する。
工程(B)は、固相に固着された「蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカン」に結合したグリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出する工程である。
【００５７】
前記した通り、本発明測定方法はグリコサミノグリカン結合性蛋白質に対する、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカン（固相に固着されている）と検体中のグリコサミノグリカンとの競合反応を利用しているので、固相に固着された前記グリコサミノグリカンに結合したグリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出することにより、検体中のグリコサミノグリカンを測定することができる。
【００５８】
すなわち、固相に固着された前記グリコサミノグリカンに結合したグリコサミノグリカン結合性蛋白質の検出量が多ければ、検体中のグリコサミノグリカン量が少ないと判定される。逆に、固相に固着された前記グリコサミノグリカンに結合したグリコサミノグリカン結合性蛋白質の検出量が少なければ、検体中のグリコサミノグリカン量が多いと判定される。
【００５９】
固相に固着された「蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカン」に結合したグリコサミノグリカン結合性蛋白質の検出は、グリコサミノグリカン結合性蛋白質に特異的に反応する抗体を用いて行ってもよく、また工程(A)においてグリコサミノグリカン結合性蛋白質を標識物質で標識したものを用いた場合には、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。
【００６０】
例えば、標識物質にビオチンを使用した場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとストレプトアビジンとを結合させ、次いでストレプトアビジン等を結合させた酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００６１】
本発明測定方法において、検体中のグリコサミノグリカン濃度は、予め既知濃度のグリコサミノグリカン標準液を用いてグリコサミノグリカン濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線を作成しておき、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを用いることにより求めることができる。
【００６２】
＜２＞本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明測定方法によって体液中のグリコサミノグリカンを測定し、体液中のグリコサミノグリカン量と疾患とを関連づけることによる疾患の検出方法である。
【００６３】
本発明検出方法による検出対象となる疾患は、体液中のグリコサミノグリカン量に変化が生じるような疾患である限りにおいて特に限定されない。
【００６４】
検出対象となる疾患に応じて、検体として用いる体液の種類、及び測定するグリコサミノグリカンの種類を適宜選択することができる。
【００６５】
また、体液中のグリコサミノグリカン量と疾患との関連づけ、及びこれによる疾患の検出も、検出対象となる疾患に応じて適宜行うことができる。
【００６６】
例えば検出対象とする疾患が、体液中のグリコサミノグリカン量が増加するような疾患の場合は、体液中のグリコサミノグリカン量が健常なヒト（当該疾患がないヒト）の体液中のグリコサミノグリカン量に比して増加するので、本発明測定方法で測定されたグリコサミノグリカン量が健常人の体液中の量に比して多い場合には、「当該疾患である」、又は「当該疾患である可能性が高い」と関連づけられ、これにより当該疾患を検出することができる。
【００６７】
また例えば検出対象とする疾患が、体液中のグリコサミノグリカン量が減少するような疾患の場合は、体液中のグリコサミノグリカン量が健常なヒト（当該疾患がないヒト）の体液中のグリコサミノグリカン量に比して減少するので、本発明測定方法で測定されたグリコサミノグリカン量が健常人の体液中の量に比して少ない場合には、「当該疾患である」、又は「当該疾患である可能性が高い」と関連づけられ、これにより当該疾患を検出することができる。
【００６８】
また上記のような体液中のグリコサミノグリカン量が増加又は減少するような疾患を検出対象とする場合において、本発明測定方法で測定されたグリコサミノグリカン量が健常人の体液中のグリコサミノグリカン量と同等であれば、「当該疾患でない」、又は「当該疾患である可能性は低い」と関連づけることができる。
【００６９】
また本発明検出方法においては、上記疾患の有無のみでなく、上記疾患の程度の検出も含まれる。例えば個人の体液中のグリコサミノグリカン量を本発明測定方法により定期的に測定し、グリコサミノグリカン量が健常人のレベルから離れる傾向にある場合には「上記疾患が進行している」、又は「上記疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。また本発明測定方法で測定されたグリコサミノグリカン量が健常人のレベルに近づく傾向にある場合には、「上記疾患が改善方向にある」、又は「上記疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また本発明測定方法で測定されたグリコサミノグリカン量が健常人のレベルの範囲内で変化しない場合には、「健常性に変化がない」、又は「健常性に変化がない可能性が高い」と関連づけることができ、グリコサミノグリカン量が健常人のレベルの範囲外で変化しない場合には、「上記疾患の程度に変化がない」、又は「上記疾患の程度に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
【００７０】
なお、上記疾患の検出基準となるグリコサミノグリカン量は、グリコサミノグリカン標準品濃度と標識物質の検出結果との関係について作成した検量線を用いて求めたグリコサミノグリカン濃度であっても良く、また当該検量線を用いずに健常なヒト（上記疾患がないヒト）の体液中のグリコサミノグリカン量に対する比であっても良い。
【００７１】
本発明検出方法において用いることができる体液、測定対象とするグリコサミノグリカン(表中では「ＧＡＧ」と示す)、これにより検出できる疾患、当該疾患に伴う体液中のグリコサミノグリカン量の変化の例をまとめて表１に示す。
【００７２】
なお表１はあくまで例示であり、本発明検出方法がこれらに限定されるものではない。
【００７３】
【表１】
0003698563.tif 000002
【００７４】
例えば肝疾患の検出を行う場合、血清又は血漿中のＨＡを本発明測定方法により測定し、このＨＡ量が健常なヒト（肝疾患がないヒト）の血清又は血漿中のＨＡ量に比して増加している場合には、「肝疾患である」、又は「肝疾患である可能性が高い」と関連づけることができる。
【００７５】
なお本発明検出方法は、本発明測定方法によって血清又は血漿中のＨＡを測定し、血清又は血漿中のＨＡ量と肝疾患とを関連づけることにより肝疾患を検出する方法であることが好ましい。
【００７６】
また本発明検出方法は、本発明測定方法によって尿中のＨＡを測定し、尿中のＨＡ量と慢性関節リウマチ（以下、ＲＡともいう）、肝疾患又は膀胱癌とを関連づけることによりＲＡ、肝疾患又は膀胱癌を検出する方法であることが好ましい。
【００７７】
＜３＞本発明測定キット
本発明測定キットは、下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、グリコサミノグリカンの測定キットである。
(A)蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相。
(B)グリコサミノグリカン結合性蛋白質。
【００７８】
(A)の固相及び(B)の蛋白質についての説明は、＜１＞本発明測定方法と同様である。
【００７９】
本発明測定キットは、上記(A)及び(B)を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度のグリコサミノグリカン標準品、標識物質の検出試薬、グリコサミノグリカン結合性蛋白質を標識する試薬、あるいはグリコサミノグリカン結合性蛋白質を検出する試薬（標識された、当該蛋白質に対する抗体等）等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
【００８０】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００８１】
本発明測定キットを用いたグリコサミノグリカンの測定は、上記＜１＞の本発明測定方法に従って行うことができる。
【００８２】
＜４＞本発明検出キット
本発明検出キットは、本発明測定キットの構成成分を少なくとも含む、疾患の検出キットである。本発明検出キットの構成成分等の説明は、上記＜３＞の本発明測定キットと同じである。
【００８３】
本発明検出キットを用いた疾患の検出は、上記＜２＞の本発明検出方法に従って行うことができる。
【００８４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
初めに、本実施例中で使用した材料及びその入手先並びに高速液体クロマトグラフィーの条件等をまとめて説明する。
【００８５】
（材料）
イムノプレート（ナルジェヌンク社製）
ＨＡ（ヒト臍帯由来；重量平均分子量約１００万；生化学工業株式会社製）（以下、ＨＡ−Ｈという）
ＨＡ（重量平均分子量約３万）（以下、ＨＡ−Ｌという）
［ＨＡ−Ｌは、鶏冠由来のヒアルロン酸（重量平均分子量約１００万；生化学工業株式会社製）１００ｇに、ヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼ（生化学工業株式会社販売）２０００ユニットを加え、４０℃で２０時間消化し、エタノール沈殿により分離精製した。］
ＢＳＡ（生化学工業株式会社販売）
ビオチン標識ヒアルロン酸バインディングプロテイン（以下、ビオチン標識ＨＡＢＰという；生化学工業株式会社製）
ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識アビジン（以下、HRP標識アビジンという；フナコシ社製）
ヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）
【００８６】
ＢＳＡが共有結合したＨＡ（ＨＡ−ＢＳＡ）は、以下の方法で製造した。
50mg/mlのＨＡ−Ｌ溶液30mlに、２mg/mlの水素化ホウ素ナトリウム15mlを加え、室温で一晩攪拌した後、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。これをリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0) 30mlに溶解し、0.2Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液 16.5mlを添加し、遮光し氷浴中で１時間反応させた後、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。これを25mMリン酸カリウム緩衝液(pH9.0) 30mlに溶解し、2.5mg/mlのＢＳＡ溶液６mlを加え、室温で１時間反応させ、更に10mg/mlのトリメチルアミンボラン溶液48mlを加え、室温で２日間反応させた後、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。
【００８７】
（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件等）
カラム：ＹＭＣゲルＰＡ１２０ＡＳ−５（アミノプロピル基結合シリカゲル；株式会社ワイエムシィ）
溶離液：０〜100mMの硫酸ナトリウム溶液の直線濃度勾配
温度：室温
流速：0.5mL/分
検出：ΔDi-HA(後述)を２−シアノアセトアミドを用いてポストラベル化し、生成する蛍光物質を蛍光検出計によって測定した。
【００８８】
【実施例１】
＜ＨＡの定量及び検量線の作成＞
イムノプレートのウェルにＨＡ−ＢＳＡ溶液(25μg/ml)又はＨＡ−Ｈ溶液(100、30、又は10μg/ml)を200μl加え、４℃で一晩静置して固相化した。その後１％ＢＳＡ溶液でブロッキングし、このプレートを洗浄液(0.05％の Tween 20を含むＰＢＳ)で洗浄した。
【００８９】
このプレートに、種々の濃度(5〜640 ng/ml)のＨＡ−Ｈ水溶液を100μl加え、更にビオチン標識ＨＡＢＰ溶液(50 ng/ml)を100μl加えて37℃で１時間反応させた。
【００９０】
プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識アビジン溶液(1μg/ml)を200μl加えて37℃で30分間反応させた。その後再度洗浄し、1.4 mMオルトフェニレンジアミン溶液を150μl加えて発色させた。３Ｎ硫酸を50μl添加して反応を停止させ、492nmの吸光度を測定し、検量線を作成した。結果を図１に示す。
【００９１】
図１に示す通り、ＨＡを直接固相化する方法では、100μg/mlのＨＡで固相化した場合でもＨＡ濃度10ng/mlと320ng/mlの二点間の吸光度差は0.4以下となり十分な感度差が得られなかった。これに対し、ＨＡ−ＢＳＡを用いた場合、上記吸光度差は1.0以上となり十分な感度差を得ることが出来た。
【００９２】
この結果から、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンが固着された固相を用いる方法は、蛋白質が共有結合していないグリコサミノグリカンが固着された固相を用いる方法(従来法)に比して顕著に感度が高く、しかも定量性良く測定できることが示され、また極めて簡便な方法であることが示された。また、蛋白質に共有結合させるグリコサミノグリカンとして低分子化したものを用いることができるため、少量の高分子のグリコサミノグリカンを有効に利用でき、安価な測定が可能である。
【００９３】
【実施例２】
＜固相化されたＨＡ量の測定＞
100μg/ml又は20μg/mlのＨＡ−ＢＳＡ溶液及びＨＡ−Ｈ溶液を調製し、96ウェルのイムノプレートに100μlづつ分注し、４℃で一晩静置して固相化した。
イムノプレートの各ウェルを300μlの洗浄液で３回洗浄した後、各ウェルにヒアルロニダーゼＳＤ溶液(2.5 mU/ml)を100μlを加えて、37℃で２時間インキュベートし、固着したＨＡを分解した。
【００９４】
ＨＡの分解により生じた不飽和二糖（2-acetamido-2-deoxy-3-O-(4-deoxy-α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid)-D-glucose；ΔDi-HAともいう)を高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により定量し、この量を固相化されたＨＡ量(固相化ＨＡ量)とした。結果を表２に示す。
【００９５】
なお、各試料はそれぞれ７ウェル用いて測定し、表２には固相化HA量の平均値及び標準偏差並びに変動係数を示した（変動係数＝（標準偏差／平均値）×１００（％））。
【００９６】
【表２】
0003698563.tif 000003
【００９７】
表２に示す通り、ＨＡ−ＢＳＡを固相化した場合、ＨＡを直接固相化した場合に比して顕著に固相化ＨＡ量が高かった。このことから蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンを用いると、極めて効率的かつ多量にグリコサミノグリカンを固相化できることが示された。
【００９８】
また表２に示す通り、ＨＡ−ＢＳＡを固相化した場合、固相化ＨＡ量の変動係数も非常に低かった。この結果から、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンを用いると、固相へのグリコサミノグリカンの固着量のばらつきを抑制できることが示され、これによりグリコサミノグリカンを正確に、再現性・定量性良く測定できるものと考えられる。
【００９９】
【実施例３】
＜ＨＡの添加回収試験＞
イムノプレートのウェルにＨＡ−ＢＳＡ溶液(25μg/ml)又はＨＡ−Ｈ溶液(100μg/ml)を200μl加え、４℃で一晩静置して固相化した。ＢＳＡでブロッキングした後、ＨＡ−Ｈ(終濃度100、200又は400ng/ml)を添加した血清(以下、ＨＡ添加血清ともいう)の２倍希釈液、又は実施例１で使用した種々の濃度(5〜640ng/ml)のＨＡ−Ｈ溶液を100μl加え、更にビオチン標識ＨＡＢＰ溶液(50 ng/ml)を100μl加えて１時間反応させた後、実施例１と同様に反応を行い、ＨＡ添加血清のＨＡ量を測定して添加回収率を求めた。ＨＡ添加血清を使用した場合の結果を表３に示す。
【０１００】
【表３】
0003698563.tif 000004
【０１０１】
表３に示すように、ＨＡを直接固相化した場合は、濃度 200及び 400ng/mlのＨＡ添加で回収率が150％を超える結果となり、測定の正確性が劣っていた。これに対してＨＡ−ＢＳＡを固相化した場合は、いずれの濃度のＨＡ添加でも90〜120％の範囲内で回収率が得られ、極めて正確性が高いことが示された。また、ＨＡ−ＢＳＡを固相化した場合、ＨＡ添加血清の測定値は、相当する濃度のＨＡ溶液を用いたときの測定値とほぼ一致し、血清中の各種成分の影響を受けずにＨＡのみを特異的に測定できることが確認された。
【０１０２】
この結果から、蛋白質が共有結合したグリコサミノグリカンを用いると極めて特異的かつ正確にグリコサミノグリカンが測定できることが示された。
【０１０３】
【実施例４】
＜肝疾患患者血清中のＨＡ測定＞
健常人及び肝疾患患者の血清を検体として、実施例３と同様の方法で検体中のＨＡの測定を行った。なお血清は２倍希釈した液を測定に供した。結果を図２に示す。
【０１０４】
図２に示すように、肝疾患患者の血清中のＨＡ量は、健常人の血清に比較して有意に高値であった。
【０１０５】
【実施例５】
＜慢性関節リウマチ、肝疾患及び膀胱癌の各疾患患者尿中のＨＡ測定＞
健常人の尿並びに慢性関節リウマチ（ＲＡ）、肝疾患及び膀胱癌の各疾患患者の尿を検体として、実施例３と同様の方法で検体中のＨＡの測定を行った。なお尿は10倍希釈した液を測定に供した。結果を図３に示す。なお、尿量に個人差があるため、測定値は尿中のクレアチニンの量に対する比として表した。
【０１０６】
図３に示すように、ＲＡ、肝疾患及び膀胱癌の各疾患患者の尿中のＨＡ量は、いずれも健常人の尿に比較して有意に高値となった。
【０１０７】
【実施例６】
＜本発明測定キット及び本発明検出キットの作成＞
以下の構成からなる本発明測定キット及び本発明検出キットを作成した。
１．ＨＡ−ＢＳＡがウェルに固着されたイムノプレート(９６ウェル) １枚
２．ビオチン標識ＨＡＢＰ  １本
３．ＨＲＰ標識アビジン    １本
４．発色剤(オルトフェニレンジアミン) １本
５．反応停止液(３Ｎ硫酸) １本
６．ＨＡ標準液  １セット
ＨＡ標準液１(  5ng/ml)  １本
ＨＡ標準液２( 10ng/ml)  １本
ＨＡ標準液３( 20ng/ml)  １本
ＨＡ標準液４( 50ng/ml)  １本
ＨＡ標準液５(100ng/ml）１本
ＨＡ標準液６(200ng/ml)  １本
ＨＡ標準液７(500ng/ml)  １本
ＨＡ標準液８(800ng/ml)  １本
【０１０８】
【発明の効果】
本発明測定方法は、グリコサミノグリカンを高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できる方法であり、非常に実用性が高い方法である。また本発明検出方法は本発明測定方法を応用したものであり、種々の疾患を極めて簡便に検出できるので、非常に実用性が高い方法である。また本発明測定キット及び本発明検出キットは、本発明測定方法及び本発明検出方法を利用するキットであるので、これを用いてグリコサミノグリカンを高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定でき、また種々の疾患を極めて簡便に検出できる。
【０１０９】
また本発明測定キット及び本発明検出キットは、その構成が単純であり、構成試薬も少なく、かつグリコサミノグリカンを低分子化して用いることができるため、安価に提供することができる。
【０１１０】
本発明は、明細書中で説明した種々の疾患の検出のみならず、状態の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、医薬品開発の評価等へも応用することができ、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＡ−ＢＳＡ又はＨＡを固相化したプレートを用いた場合のＨＡの検量線を示す。
【図２】  ＨＡ−ＢＳＡを固相化したプレートを用いた、血清中のＨＡの測定結果を示す。
【図３】  ＨＡ−ＢＳＡを固相化したプレートを用いた、尿中のＨＡの測定結果を示す。
【図１】
0003698563.tif 000005
【図２】
0003698563.tif 000006
【図３】
0003698563.tif 000007