(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGlyから１９番目のLeuまでの欠失およびＮ−末端から４４番目のCysから５０番目のCysまでの欠失を有するアミノ酸配列からなるインターロイキン−６変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のインターロイキン−６変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡの配列を有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項５】
宿主が酵母シゾサッカロミセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換体を培地にて培養し、培養物中に請求項１に記載のインターロイキン−６変異体を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするインターロイキン−６変異体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アミノ酸配列に特定の欠失を有するインターロイキン−６変異体、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡの配列を有する発現ベクター、その発現ベクターにより形質転換された形質転換体、およびその形質転換体を用いた上記インターロイキン−６変異体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の増殖分化に関与する各種サイトカイン類が近年になって種々報告されており、医療にも応用されるにいたっている。その中でもインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、多くの研究者によってＢＳＦ−２、ＩＦＮβ２などの名称で研究されてきた。ＩＬ−６は白血球、上皮細胞、繊維芽細胞などで発現され、抗体産生細胞の増殖、分化をもたらす因子である。ＩＬ−６はＢ細胞刺激活性とともに、インターロイキン３と協同で血小板増殖活性を示すことができるトロンボポエチンとしても注目を浴びている。
【０００３】
ＩＬ−６の遺伝子配列に関する研究も多くの研究者によって行われてきたが、その中でChernajovskyらはインターフェロンベーター２と命名された２６ＫＤａ蛋白質の部分配列を明らかにした(Chernajovsky et al,1984,DNA,3,297) 。また、Zilberstein らは全長配列の決定に成功している（EMBO J.,1986,5,2529)。一方、T.HiranoらはＢ細胞刺激因子（ＢＳＦ−２）の全遺伝子配列を決定した(Hirano,T. et al. Nature,324,73-76,1986)。また、BrakenhoffらのＨＧＦの一次構造解析の結果(J.Immunol.,139,4116,1987)からＨＧＦ、ＩＦＮβ２、２６ＫＤａ蛋白質、ＢＳＦ−２が同一物質であることが明らかになっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のような多彩な生理活性を有するＩＬ−６の大量生産については、その医療上の有用性から多くの開発が進められている。しかしながら、細菌内のＩＬ−６の生産量はあまり高くない。また分子内に４個のシステイン残基があるため、分子間または分子内の望ましくない結合を自由に形成する可能性があり、特に精製時において誤ったジスルフィド結合の形成が起こることが多く、精製を難しくし、回収率を低下させている。
【０００５】
ジスルフィド結合を含まないＩＬ−６変異体としてＩＬ−６中の４個のシステイン残基をすべてセリン残基に変換してなるＩＬ−６変異体が知られている（特表平４−５０３３０１号公報参照）。この変異体は大腸菌などの細菌を用いた組み換えＤＮＡ技術で製造されている。この変異体は上記システイン残基に起因する問題点の回避はできるが、ＩＬ−６同様比較的高分子量のタンパク質であり、その発現量は十分とはいえないものであった。
【０００６】
一方従来、微生物を用いて有用タンパク質を生産させようとする場合、組み換えＤＮＡの宿主として大腸菌、枯草菌、および酵母サッカロミセス  セレビジエなどが汎用されてきた。このような宿主に、目的とする異種タンパク質をコードする構造遺伝子領域を含む発現ベクターを導入し、この発現系を用いて目的とするタンパク質を多量に製造する方法が広く検討され、既に一部のタンパク質の製造に実用化されている。
【０００７】
組み換えＤＮＡ技術を使用した有用物質の大量製造を目的とした場合、宿主細胞の選定は重要なポイントとなる。したがって、有用物質生産用宿主の選択範囲を広げておくことは重要である。現在では、上記宿主・ベクター系以外にもいくつかの系が知られている［Candida maltosa (J.Bacteriol.,167,561 (Takagi ら))、Bacillus amyloliquefa-ciens 、Acetobacter aceti 、Corynebacterium giutumicum、Pseudomonas putidaなどがある］。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記ジスルフィド結合に起因する問題点を解決し、その活性を維持ないし高めかつ低分子量化する手段、ＩＬ−６の発現量を高める方策などを提供するものである。また、そのＩＬ−６変異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための手段を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、天然のヒトＩＬ−６のアミノ酸配列の特定部分を欠失させることによりジスルフィド結合に起因する問題点の低減や十分な解決が可能となり、しかもＩＬ−６の活性を維持ないし高めることができることを見いだした。このＩＬ−６変異体は血小板増殖剤、免疫グロブリン産生刺激剤などの目的で使用することが可能である。
【００１０】
本発明は、ヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGlyから１９番目のLeuまでの欠失およびＮ−末端から４４番目のCysから５０番目のCysまでの欠失を有するアミノ酸配列からなるインターロイキン−６変異体、である。
【００１１】
本発明のＩＬ−６変異体は、２か所のシステイン残基間のジスルフィド結合によって生じているポリペプチドのループの１か所を除去することによって本来の立体構造をよく保つという特徴を有し、これにより、タンパク質の低分子化も同時に行われ医薬品としてより有効となると考えられる。
【００１２】
天然ヒトＩＬ−６は１８４個のアミノ酸残基を有するタンパク質であり、そのアミノ酸配列およびそのＤＮＡ配列は公知である。その配列を図１に示す。このアミノ酸配列において、Ｎ−末端から５番目のGlyから１９番目のLeuまでの欠失、Ｎ−末端から４４番目のCysから５０番目のCysまでの欠失、およびＮ−末端から７３番目のCysから８３番目のCysまでの欠失、の３か所（それぞれの位置を図１下線部分に示す）のうち前２か所欠失したものが本発明のＩＬ−６変異体である。
【００１３】
後述の実施例の活性データが示すように、特にＮ−末端から５番目のGlyから１９番目のLeuまでの欠失を有する（さらに、加えてＮ−末端から４４番目のCysから５０番目のCysまでの欠失を有していてもよい）ＩＬ−６変異体が高い活性を有する。Ｎ−末端から４４番目のCysから５０番目のCysまでの欠失を有するＩＬ−６変異体が次に高い活性を有する。Ｎ−末端から７３番目のCysから８３番目のCysまでの欠失（特に、この欠失に加えてさらに他の欠失の１〜２を有するもの）は特に高い活性をもたらすものではないが、この部分の欠失はタンパク質の分子量を下げてＩＬ−６変異体の製造を容易にすると考えられる。
【００１４】
本発明ＩＬ−６変異体は、Ｎ−末端から５番目のGlyから１９番目のLeuまでの欠失、およびＮ−末端から４４番目のCysから５０番目のCysまでの欠失の２つの欠失を有するＩＬ−６変異体である。
【００１５】
後述配列番号１〜７にＩＬ−６変異体７種のアミノ酸配列、およびそのＤＮＡ配列を示す。本発明のＤＮＡの配列はこの配列表の配列番号５に記載されたＤＮＡ配列に限定されるものではないが、この配列表に記載されたＤＮＡ配列が好ましい。なお、表１に実施例等で製造したＩＬ−６変異体名、欠失アミノ酸番号、および対応する配列表記載配列番号を示す。
【００１６】
【表１】
0003687105.tif 000002
【００１７】
前記したようにＮ−末端から７３番目のCysから８３番目のCysまでの欠失は特に高い活性をもたらすものではなく、活性の面からはこの部分は存在していた方がよいと考えられる。本発明ＩＬ−６変異体においてＮ−末端から７３番目のCysから８３番目のCysまでの部分のジスルフィド結合の存在による問題は、場合により前記公知の発明（特表平４−５０３３０１号公報参照）を適用することで解決できると考えられる。すなわち、この部分のシステイン残基をすべてセリン残基に変換することができる。
【００１８】
本発明のＩＬ−６変異体は、よく知られたペプチドの液相合成法や固相合成法で製造することができる。しかしその分子量が比較的高い点を考慮すると組み換えＤＮＡ技術で製造する方が有利であると考えられる。本発明者はこのような現状に鑑み、組み換えＤＮＡ技術およびＰＣＲ法を用いて上記構成アミノ酸の欠損したＩＬ−６変異体をコードするＤＮＡを構築し、菌体内での生産能、安定性の向上、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭意研究したところ、これらの目的に適う上記ＩＬ−６変異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための方法を見いだした。
【００１９】
本発明は、上記ＩＬ−６変異体を組み換えＤＮＡ技術で製造するための上記ＩＬ−６変異体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡの配列を有する発現ベクター、その発現ベクターで形質転換された形質転換体、およびその形質転換体を用いる上記ＩＬ−６変異体の製造方法に関する下記の発明である。
【００２０】
前記インターロイキン−６変異体をコードするＤＮＡ。
上記ＤＮＡの配列を有する発現ベクター。
上記発現ベクターにより形質転換された形質転換体。
上記形質転換体を培地にて培養し、培養物中に前記インターロイキン−６変異体を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするインターロイキン−６変異体の製造方法。
【００２１】
本発明者は、前記ＩＬ−６変異体の大量製造の目的のため、宿主の選択肢としてシゾサッカロミセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）［以下、S.pombeという］を用いることを見いだした。S.pombeは分裂酵母 Schizosaccharomyces属の酵母である。本酵母は酵母類の中では動物細胞に近い性質を示すことが知られており、たとえばその糖鎖については動物細胞のものと類似していることが報告されている。その結果、生物学的に高い活性を示すと共に、構造上安定な前記ＩＬ−６変異体を効率よく創生することができた。本発明は、S.pombe を宿主とする上記形質転換体、およびその形質転換体を用いた上記ＩＬ−６変異体の製造方法である。
【００２２】
本発明の組み換えＤＮＡ技術による製造方法によって、ＩＬ−６の持つ生理活性をより増強あるいは保持し、より安定な構造を持つと共に、分裂酵母により大量に発現させることが可能となった。
【００２３】
本発明の発現ベクターは、ＩＬ−６変異体をコードするＤＮＡ配列に加え、さらに真核細胞宿主内において機能する複製開始点、および動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域を含むことが好ましい。さらにこの動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域はＳＶ４０あるいはサイトメガロウイルス由来のプロモーター領域であることが好ましい。また、本発明の発現ベクターは、さらに加えてネオマイシン耐性遺伝子領域、LEU ２遺伝子領域、およびURA ３遺伝子領域の少なくとも１種を含むことが好ましい。ＩＬ−６変異体をコードするＤＮＡ配列を除き、このような遺伝子領域を有する発現ベクターやその構築手段としてはたとえば本発明者らの発明にかかわる特開平５−１５３８０号公報に記載されている。
【００２４】
本発明の発現ベクターで形質転換される宿主の微生物としては、前記分裂酵母S.pombe に限られず、大腸菌などの細菌、分裂酵母S.pombe 以外の酵母、あるいは動物細胞などのいずれでもよい。しかし、前記のように分裂酵母S.pombe が最も好ましい。
【００２５】
次に本発明を実施例をもって具体的に説明するが、実施例は具体的認識を得るために挙げたものであり、本発明を限定するものではない。
【００２６】
【実施例】
以下の実施例、参考例において使用した方法やキットは特に言及しない限り以下のものを使用した。
ＤＮＡの精製および回収：ガラスビーズ法（旭硝子（株）製「ＤＮＡ  ＰＲＥＰ」（商品名）使用）。
ライゲーション：ライゲーションキット（宝酒造（株）販売）を使用。
【００２７】
「参考例１」
［ベクターpRL2M の作製］
公知の方法で調製したベクターpcD4B （特開平５−１５３８０号公報参照）を制限酵素SacIで消化後、末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化し、さらに制限酵素BamHI で消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収した。さらにアガロースゲル電気泳動後、ガラスビーズ法によって約4500塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
【００２８】
別に、やはり公知の方法で調製した、ヒトリポコルチンＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクターpcDlipoI（特開平５−１５３８０号公報参照）を制限酵素XmnIおよびBamHI で消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈殿によって核酸分画を回収した。さらにアガロースゲル電気泳動後約1300塩基対に相当するＤＮＡを精製した。
【００２９】
両ＤＮＡをライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５（東洋紡（株）販売）を形質転換した。得られた形質転換体よりベクターを調製し、目的とするベクターpRL2L （図２）を持った形質転換体をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。
【００３０】
このリポコルチンＩ発現ベクターpRL2L を制限酵素EcoRI およびHidIIIで消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約5000塩基対に相当するバンドを切出して精製した。別に、公知のベクターpUC19 を制限酵素EcoRI およびHidIIIで消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動より約60塩基対に相当するバンドを切出し、ゲルから抽出精製した。
【００３１】
これら両者の断片をライゲーションの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpRL2M （図３）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。
【００３２】
「参考例２」
［ベクターpTL2M の作製］
ベクターpRL2M をテンプレートとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3'およびオリゴデオキシリボヌクレオチド5' CTAGAATTCACATGTTTGAAAAAGTGTCTTTATC 3'を合成プライマーとして、Taqポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。制限酵素SpeIおよびEcoRIで末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約600塩基対に相当するバンドを切出し、ガラスビーズ法で精製した。
【００３３】
別に、ベクターpRL2M を制限酵素SpeIおよびEcoRI で消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約4500塩基対に相当するバンドを切出して精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL2M （図４）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。
【００３４】
「参考例３」
［ヒトＩＬ−６遺伝子のクローニング］
"human peripheral blood monocyte (LPS-activated)" (CLONETECH社製) のｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ−６ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドプローブ法により単離した。ＤＮＡプローブは T.Hirano ら(Hirano,T. et al. Nature,324,73-76,1986)により決定されたヒトＩＬ−６の遺伝子配列に基いて、ＤＮＡ自動合成機（Model 381A、アプライドバイオシステム社) を用いて合成した。
【００３５】
合成したＮ端プローブは、
5' CAA CAC CAG GAG CAG CCC CAG GGA GAA GGC AAC TGG ACC GAA GGC GCT 3'
（上記文献中の塩基配列 No.52-99 に対応するアンチセンス）であり、
合成したＣ端プローブは、
5' ATG ACA ACT CAT CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC 3'
（上記文献中の塩基配列 No.598-645 に対応する) である。
【００３６】
ｃＤＮＡライブラリーは "λgt 10"をクローニングベクターとして作成されたものであるので、感染大腸菌として "Ｃ600"を用い、プラークハイブリダイゼーションにより単離した。具体的な単離方法は CLONETECH社の添付マニュアルに従った。
【００３７】
まず大腸菌 "Ｃ600"の単一コロニーを10mlのＬＢ培地（0.5% yeast extract,1%peptone,1%NaCl ）で一晩培養後、ＳＭバッファー (0.1M NaCl,8mM MgSO4・7H2O,50mM Tris-HCl pH7.5,0.01%ゼラチン) で 1/105希釈したファージライブラリー0.1ml に、ＳＭバッファー 0.3ml、 "Ｃ600" 0.6mlを加え、37℃で20分間振蘯した後、３mlのＬＢアガロースを加え混合後ただちにＬＢプレート（90mmシャーレ) にまき、10枚分作成した。37℃で一晩静置したところ１プレートに約１万プラーク出現した。
【００３８】
４℃で１時間放置後ニトロセルロースフィルターをプレートにのせレプリカをとった。次いで1.5M NaCl/0.5M NaOH 溶液、1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl pH 8.0溶液に浸し、次いでＳＳＣ（0.15M NaClと0.015Mクエン酸ナトリウムを含むpH7.0 のバッファー）で３回洗浄し、風乾させた後 80 ℃、真空で乾燥させた。ハイブリダイゼーション溶液で２時間室温放置後、10万cpm の32ＰラベルのＣ端プローブをハイブリダイゼーション溶液に加え65℃一晩放置、翌日ＳＳＣで60℃で10分、50℃で30分３〜４回フィルターを洗浄し、100-200cpmになるまで繰り返した。最後に風乾し、オートラジオグラフィーを行った。
【００３９】
２回目、３回目のスクリーニングも同様の方法で行った。ただし、２回目、３回目のスクリーニングではＮ端、Ｃ端プローブの両方を用いた。３回目のスクリーニング後に、ＩＬ−６を持つシングルプラークを爪楊枝で取り、ＳＭバッファー１mlに懸濁し、ＬＢプレート上にまき、全面溶菌させた。ＳＭバッファー４mlを加えてファージを採取し、４mlのＮＺＹＣＭ培地で大腸菌 "Ｃ600"に感染させた。これからMolecular Cloning の方法に従ってファージＤＮＡを単離した。これをEcoRI で切断後、ＩＬ−６ｃＤＮＡインサートを単離し、市販のpUC19 （宝酒造（株）販売）をEcoRI で切断したものとこのＩＬ−６ｃＤＮＡインサートを連結し、pAG9-8-1を作成した。
【００４０】
「参考例４」
ヒトＩＬ−６の発現ベクターの作製
参考例３で製造したヒトＩＬ−６ｃＤＮＡ全長を含むベクターpAG9-8-1をテンプレートとし、オリゴデオキシリボヌクレオチド 5' ATCGCATGCCAGTACCCCCAGGAGAAGA 3' およびオリゴデオキシリボヌクレオチド 5' TGAAAATCTTCTCTCATCCG 3' を合成プライマーとして、Taq ポリメラーゼを用いたＰＣＲによって目的断片を増幅した。
【００４１】
制限酵素SphIおよびHindIII で末端を調節し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動により約1000塩基対に相当するバンドを切出し、ガラスビーズ法で精製した。別に、参考例２で作製したベクターpTL2M を制限酵素AflIIIおよびHindIII で消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約5000塩基対に相当するバンドを切出してで精製した。これら両者の断片をライゲーションの後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26m（図５）をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。
【００４２】
「例１」
ＩＬ−６変異体(IL-6a')遺伝子およびその発現ベクター（pTL26a')の作製
以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。
1) 5' GCATGCCAGTACCACCAACCTCTTCAGAACGTATTGACAAACAGATTCGGTACATCCT 3'
2) 5' CGTACGGTCATGGTGGTTGGAGAAGTCTTGCATAACTGTTTGTCTAAGCCATGTAGGAGC 3'
【００４３】
１）と２）を各々リン酸化した後（宝酒造（株）販売  タカラ  カイネーションキットを使用）、クレノー(KLENOW)バッファーを用いて70℃、20分でアニーリングした。また参考例４にて作製したベクターpTL26mを制限酵素TaqI、およびEcoRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約900 塩基対に相当するバンドを回収（ガラスビーズ法による、以下同様）した。
【００４４】
アニーリングを終えた上記ＤＮＡフラグメントとゲルより抽出したフラグメント（Taq1,EcoR1フラグメント）をベクターpUC19 のマルチクローニングサイトのEcoR1 、SphIサイトに挿入（ライゲーション) した。ＩＬ−６をコードしている部分のシークエンスを確認後、EcoRI およびSphIにて消化し、フェノール抽出、エタノール沈澱の後、アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対に相当するバンドを回収した。
【００４５】
一方、参考例２で作製したベクターpTL2M を制限酵素SphIとSpeIにて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約650 塩基対のバンドを回収した。さらにpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対のバンドを回収した。これら回収したフラグメント３本をライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26a' をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。IL-6a'の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号１のとおりである。
【００４６】
「例２」
ＩＬ−６変異体(IL-6C1)遺伝子およびその発現ベクター（pTL26C1)の作製
以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。
1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3'
2)5' TGTCTCCTTTCTCAGGGCTGA 3'
3)5' GAAAGCAGCAAAGAGGCACTG 3'
4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
【００４７】
参考例４にて作製したベクターpTL26mをテンプレートとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチング処理（宝酒造（株）販売  タカラ  ブランチングキットを使用、以下同様）をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿を行った。さらに制限酵素SpeIにて消化した後アガロースゲル電気泳動を行い、約750 塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＡとした。
【００４８】
一方上記プライマー３）、４）を用いて上記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行い約1600塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＢとした。
【００４９】
これらとは別に参考例２で作製したベクターpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本をライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26C1 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。IL-6C1の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号２のとおりである。
【００５０】
「例３」
ＩＬ−６変異体(IL-6C2)遺伝子およびその発現ベクター(pTL26C2)の作製
以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。
1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3'
2)5' TCCATCTTTTTCAGCCATCTT 3'
3)5' CTGGTGAAAATCATCACTGGT 3'
4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
【００５１】
参考例４にて作製したpTL26mをテンプレートとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチング処理をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿を行った。さらに制限酵素SpeIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約840 塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＡとした。
【００５２】
一方上記プライマー３）、４）を用いて上記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行い約1500塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＢとした。
【００５３】
これらとは別に参考例２で作製したベクターpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本をライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26C2 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。IL-6C2の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号３のとおりである。
【００５４】
「例４」
ＩＬ−６変異体(IL-6C3)遺伝子およびその発現ベクター(pTL26C3)の作製
以下のようなオリゴＤＮＡを合成した。
1)5' TTGACTAGTTATTAATAGTA 3'
2)5' TCCATCTTTTTCAGCCATCTT 3'
3)5' CTGGTGAAAATCATCACTGGT 3'
4)5' TAGCGGAGTGTATACTGGCT 3'
【００５５】
例２にて作製したpTL2C1をテンプレートとして上記プライマー１）、２）を用いてＰＣＲを行った。クロロホルム処理、エタノール沈殿の後ブランチング処理をし、フェノール、クロロホルム処理、エタノールを沈殿をした。その後Ｔ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてカイネーション処理を行いエタノール沈殿を行った。さらに制限酵素SpeIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約800 塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＡとした。
【００５６】
一方上記プライマー３）、４）を用いて、参考例４にて得たベクターpTL26mをテンプレートとして上記と全く同様のことを行いアガロースゲル電気泳動を行い約1500塩基対に相当するバンドを回収し、これをフラグメントＢとした。
【００５７】
これらとは別に参考例２で作製したベクターpTL2M をSpeIおよびEcoRI にて消化し、フェノール抽出、エタノール沈殿の後アガロースゲル電気泳動より約960 塩基対のバンドを回収した。この回収したフラグメントおよび上記フラグメントＡとフラグメントＢ３本をライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26C3 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。IL-6C3の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号４のとおりである。
【００５８】
「例５（実施例）」
ＩＬ−６変異体(IL-6a'C1)遺伝子、およびその発現ベクター(pTL26a'C1)の作製
【００５９】
例１にて得たpTL26a'を制限酵素SpeIとTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約680塩基対に相当するバンドを回収した。また例２にて得たpTL26C1を制限酵素EcoRIとTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約880 塩基対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製したベクターpTL2M を制限酵素SpeIとEcoRIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に相当するバンドを回収した。
【００６０】
これら３本のフラグメントをライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするpTL26a'C1 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターである事を確認した。IL-6a'C1の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号５のとおりである。
【００６１】
「例６」
ＩＬ−６変異体(IL-6a'C2)遺伝子、およびその発現ベクター(pTL26a'C2)の作製
【００６２】
例１にて得たpTL26a'を制限酵素SpeIとTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約680塩基対に相当するバンドを回収した。また例３にて得たpTL26C2を制限酵素EcoRIとTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約870塩基対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製したベクターpTL2Mを制限酵素SpeIとEcoRIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に相当するバンドを回収した。
【００６３】
これら３本のフラグメントをライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26a'C2 をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。IL-6a'C2の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号６のとおりである。
【００６４】
「例７」
ＩＬ−６変異体(IL-6a'C3)遺伝子、およびその発現ベクター(pTL26a'C3)の作製
【００６５】
例１にて得たpTL26a' を制限酵素SpeIとTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約680塩基対に相当するバンドを回収した。また例４にて得たpTL26C3を制限酵素EcoRIとTaqIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約850塩基対に相当するバンドを回収した。さらに参考例２で作製したpTL2Mを制限酵素SpeIとEcoRIにて消化したのちアガロースゲル電気泳動を行い、約4400塩基対に相当するバンドを回収した。これら３本のフラグメントをライゲートした後、大腸菌ＤＨ５を形質転換して目的とするベクターpTL26a'C3をスクリーニングした。部分塩基配列の確認および制限酵素地図の作製から目的のベクターであることを確認した。IL-6a'C3の構造遺伝子部分およびアミノ酸配列は配列表配列番号７のとおりである。
【００６６】
「例８（実施例）」
ＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の発現
【００６７】
S.pombe のロイシン要求性株、leu1-32h-(ATCC38399)を最少培地で0.8×107細胞数／mlになるまで生育させた。集菌、洗菌後109細胞数／mlになるように0.1モル酢酸リチウム（pH5.0)に懸濁し、30℃で60分間インキュベートした。その後、上記懸濁液 100μl にベクターpAL7（Okazaki,K.et.al. Nucleic Acids Res.18,6485）をPstIで切断したＤＮＡを１μｇ、例１〜７で得たベクター各々２μｇをＴＥ（トリスEDTA）15μlに溶かして加え、50%(W/V)ポリエチレングリコールPEG4000水溶液を290μl加えよく混合したのち30℃で60分間、43℃で15分間、室温で10分間の順にインキュベートした。
【００６８】
遠心によりPEG4000 を除去し、培養液１μl に懸濁した。このうち 100μl を分取し、 900μl の培養液を加えて、32℃30分間インキュベートした。うち 300μl を最少寒天培地にスプレッドした。32℃で３日間インキュベートし、形質転換体をＧ４１８（ネオマイシン）を含むプレートに移し、さらに32℃で５日間培養した。得られたものがＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の形質転換体である。
【００６９】
これらの形質転換体を２％グルコース、１％イースト抽出液、２％ペプトン、およびＧ４１８を 200μg/mlを含む液体培地（ＹＰＤ培地）50mlで32℃、３日間培養した。その培養液から菌体を 106細胞/ml 程度になるようにＹＰＤ培地１リットルに植える。32℃、３日間培養した後集菌、洗菌し、50ミリモルNaCl、５ミリモルＥＤＴＡを含む50ミリモルトリス塩酸緩衝液(pH7.5) に懸濁し、超音波破砕を行った。超音波破砕後１％ＳＤＳ存在下に80℃、10分間熱処理した後、遠心分離して上清を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥという）（ＴＥＦＣＯ16％ゲルを使用）によって発現の様子を調べた。
【００７０】
ヒトＩＬ−６およびＩＬ−６変異体に相当する分子量15,000〜21,000附近の位置にコントロールS.pombe/pTL2M （コントロール）からの抽出液には見られない明瞭なバンドが検出できた（図６）。各ＩＬ−６変異体の発現量は、デンシトメーターにて測定したところ、どれも全菌体タンパク質の10wt％以上であり、中でもIL-6C1およびIL-6a'C1については25wt％と発現量が増大していることが確認された。また、ヒトＩＬ−６特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ヒトＩＬ−６であることを確認した（図７）。
【００７１】
図６は各変異体を発現している酵母粗抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図であり、１〜９の各レーンは以下の通りである。
１；S.pombe ／pTL2M   （コントロール）
２；S.pombe ／pTL26m
３；S.pombe ／pTL26a'
４；S.pombe ／pTL26a'C1
５；S.pombe ／pTL26a'C2
６；S.pombe ／pTL26a'C3
７；S.pombe ／pTL26C1
８；S.pombe ／pTL26C2
９；S.pombe ／pTL26C3
【００７２】
図７は各変異体を発現している酵母粗抽出液のウエスタンブロッティング図であり、１〜９の各レーンは以下の通りである。
１；S.pombe ／pTL2M   （コントロール）
２；S.pombe ／pTL26m
３；S.pombe ／pTL26a'
４；S.pombe ／pTL26a'C1
５；S.pombe ／pTL26a'C2
６；S.pombe ／pTL26a'C3
７；S.pombe ／pTL26C1
８；S.pombe ／pTL26C2
９；S.pombe ／pTL26C3
【００７３】
「例９（実施例）」
酵母で発現されたＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の精製
【００７４】
例８で発現されたＩＬ−６およびＩＬ−６変異体は以下のようにして精製した。ＩＬ−６およびＩＬ−６変異体を発現している酵母は、50ミリモルNaCl、1.5ミリモルＥＤＴＡを含むトリス塩酸(pH7.5)バッファーに懸濁、1,000回転５分の遠心上清を、さらに15,000回転20分の遠心で沈渣を得た。この分画を6Mグアニジン塩酸にて可溶化した後、バイオゲルｐ６によって脱塩した。ボイドボリューム分画を直接ＨＰＬＣを用いた逆相カラムクロマトグラフィーにチャージし精製ＩＬ−６およびＩＬ−６変異体を得た。
【００７５】
0.1％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む水溶液にて吸着させた後30％アセトニトリルを含む 0.1％ＴＦＡ水溶液にてカラムを洗った。その後80％まで上昇させてＩＬ−６およびＩＬ−６変異体を溶出させた。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＥＦＣＯ16％ゲルを使用）により検定することができクマシーブリリアントブルー染色により、それぞれ唯一のバンドを確認した（図８）。
【００７６】
図８は精製された各ＩＬ−６変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図であり、１〜８の各レーンは以下の通りである。
１；IL-6（コントロール）
２；IL-6C1
３；IL-6C2
４；IL-6C3
５；IL-6a'
６；IL-6a'C1
７；IL-6a'C2
８；IL-6a'C3
【００７７】
「例１０（実施例）」
ＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の生物学的活性
【００７８】
（１）７ＴＤ１細胞の増殖活性測定
100μl の培養液（ＲＰＭＩ１６４０：GABCO 社製）中にサンプルを10倍ずつ希釈したものをつくり、その中で２×103 個の７ＴＤ１細胞( マウス−マウスハイブリッド) を37℃で４日間培養した。その後ＭＴＴ（細胞増殖測定キット：CHEMICON社製）を用いて、細胞数を測定した。
【００７９】
（２）ＨｅｐＧ２からのフィブリノーゲンの産生
２×105個のＨｅｐＧ２細胞（ヒトヘパトーマ）を24穴プレートにて１マイクロモルのデキサメタゾン、２％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含んだＭＥＭ培地を用いて24時間培養した後、種々の濃度のサンプルを含んだ上記培地(500μl)に交換して18時間培養した後、同じサンプルを含んだ培地(400μl)で交換しさらに６時間培養したところで培養を終え、培地に産生されたフィブリノーゲン濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００８０】
（３）巨核球の増殖促進活性測定
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨より骨髄細胞を採取し、10％ Horse serumを含んだイスコフ液にて45分間処理して接着細胞を除去した後、２倍ずつ希釈した試料を含んだ 100μl のイスコフ液に105 の細胞を含んだ 100μl のイスコフ液を添加し、６日間、37℃にて培養した。培養終了後培養、上清を除去した後 180μl の細胞破砕液（0.2% Triton X-100/1mM EDTA、0.12M NaClを含んだ50mM HEPESバッファー pH7.5) を添加し、さらに20μl のアセチルチオコリン（終濃度0.56mM）を添加して室温にて３時間放置した。その後各20μl を96穴プレートに分注し、そこに20μl の0.4mM ７−ジエチルアミノ−３−（４’−マレイミジルフェニル）−４−メチルクマリンを加えさらに160 μl の希釈溶液（0.2% TritonX-100、1mM EDTAを含んだ50mM酢酸ナトリウム pH5.0）を添加後、蛍光強度を測定した(390 nmEX 、450nm EM）。
【００８１】
（１）〜（３）に示した方法を用いてＩＬ−６およびＩＬ−６変異体の生物学的活性を測定した。その結果を表２に示す。表２中の各数値は最大活性の50％を示すに必要な試料の濃度を表す。
【００８２】
これからIL-6a'、IL-6C1、IL-6a'C1については、天然型の活性と同等あるいはそれ以上（２〜８倍）の活性を持ちながら低分子化に成功したことがわかる。Cys 44からCys 50までのジスルフィド結合により形成された領域、およびGly ５からLeu 19の領域は活性には直接影響のないことがわかった。IL-6C2、IL-6C3、IL-6a'C2、IL-6a'C3については、生物学的活性が有意に減少している。Cys 73とCys 83との間に形成されたジスルフィド結合は天然のＩＬ−６［表２中「(IL-6)」で示す］の安定化に重要な役割を果たしていることを示している。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
以上の結果をまとめると、Ｎ−末端付近の15アミノ酸、および／またはCys −Cys によってできるペプチドループを欠落させることにより天然型と同等あるいはそれ以上の活性を保ちつつ低分子量化することに成功した。IL-6C1、IL-6a'C1については、産生量の増大に成功した。発現に都合の悪いコドンを持ったアミノ酸が除去されたためと考えられる。IL-6a'以外の変異体に関しては精製効率が向上したが、これはCys の持つＳＨ基によるジスルフィド結合が除去されたため、３次構造形成時における誤りが減少したためであろう。またCys の持つＳＨ基によるジスルフィド結合が除去されたために酸化／還元のどちらの状態にも安定に存在できることが示唆される。さらに酵母を用いて生産すれば大腸菌にて生産された場合と異なり、発熱などの副作用の原因となる大腸菌由来の不純物がなく安全性が高い。
【００８５】
【発明の効果】
天然のＩＬ−６に比較して、低分子量のＩＬ−６変異体が得られ、その構造上の安定性が向上した。しかも、天然型と同等あるいはそれ以上の生理活性を保持しているＩＬ−６変異体を得ることができた。
【００８６】
また、組み換えＤＮＡ技術を用いてこのＩＬ−６変異体を製造することができた。すなわち、酵母S. pombe内で発現することができる新規なベクターを用いてS. pombeにより効率よくこのＩＬ−６変異体を産生させることができ、またその産生量を増大させることができた。
【００８７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＩＬ−６のアミノ酸配列
【図２】pRL2L のベクター構成図
【図３】pRL2M のベクター構成図
【図４】pTL2M のベクター構成図
【図５】pTL26mのベクター構成図
【図６】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図
【図７】ウエスタンブロッティング図
【図８】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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