(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙｊ１を含み得るスギ花粉から調製したスギ花粉抽出液を８０℃で１分〜３分間加熱処理し、スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列ＤＮＰＩＤＳＣＷＲＧを認識する第一の抗体、及びスギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列ＦＴＧＨＤＤＡＹＳＤＤＫＳＭＫＶＴを認識する第二の抗体を用いてサンドイッチイムノアッセイに供することを含み、前記第一の抗体がＡｎｔｉ−ＣｒｙｊＩ  ｍＡｂ  ０２６であり、前記第二の抗体がＡｎｔｉ（ＭＡＰ）ＣｒｙＪ１である、スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１の高精度検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンの少ないスギの選抜に有用な新たなスギ花粉アレルゲンのイムノアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スギ花粉症は、スギ花粉を原因とするアレルギーで、近年、患者数の増加とともに大きな社会問題になっている。この花粉症患者が増加した理由には、車社会の発達によって増加したディーゼル排出粒子にアジュバント作用があることや、都市化に伴って生活環境が衛生になったため、人間の免疫防御システムが変化し、アレルギーになりやすくなったなどが考えられている。
【０００３】
また、直接的な原因としてスギ飛散花粉の増加が考えられる。国内では、1950年代から70年代にかけて、木材生産を向上させるためにスギの造林が急増した。現在、これらのスギが開花樹齢に達してスギの飛散花粉が増加し始めている。
【０００４】
林業サイドからのスギ花粉症対策として、花粉の少ないスギの選抜に関する研究が始まっっている。秋田県を含む東北地方では１１系統が選抜され、中でも、生長、病虫害抵抗性などを考慮して多数の候補木から選抜した精英樹から生産される種子が、広く植林に供給されてようとしている。
【０００５】
これまでは、スギ種子生産の採種園には種子生産性と遺伝的多様性を高めるために花粉生産性が高い系統を積極的に用いてきた。しかし、スギ花粉症との関係で花粉量とアレルゲン量を総合して考えれば、花粉が多くてもアレルゲンが少ない、あるいは花粉が少なくかつアレルゲンが少ない精英樹が選抜されれば、花粉症対策として有効と考えられる。
【０００６】
スギ花粉症の原因物質であるアレルゲンは、花粉の表面と内部に存在する２種類のタンパク質Cryj1（非特許文献１）とCryj2（非特許文献２）である。このスギ花粉症アレルゲンに関する研究により、Cryj1含量とCryj2含量には１％水準で有意な相関が認められることが報告されている（非特許文献３）。このことは、Cryj1を測定対象とすることによって、低アレルゲンスギの選抜が可能となることを示している。
【０００７】
Cryj1の定量は、免疫測定法の一種であるサンドイッチELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）によって行われることが一般的である。しかしながら、これまでの方法では、Cryj1を完全に定量することが出来なかった（非特許文献４、５,）。そのため、あるスギのアレルゲン性について不正確な評価を与えることがあった。
【０００８】
また、Cryj1のポリクローナル抗体で固相化したマイクロプレートに花粉抽出液を加え、反応部域が異なる２種類のマウスのモノクローナル抗体で検出する方法が報告されている（非特許文献４）。
【非特許文献１】Yasueda, H., Yui,Y., Schimizu, T. and Shida, T. J.Allergy Cli. Immunol. 71: 77-86 (1983)
【非特許文献２】Sakaguchi, M., Inoue, S., Taniai. M., Ando. S., Usui. M. and Matsuhasi, T.、 Allergy 45: 309-312 (1990)
【非特許文献３】佐々木義則, 谷口美文, 正山征洋、大分県研究時報 22: 8〜12 (1996)
【非特許文献４】後藤陽子, 近藤禎二, 井手  武, 山本恵三, 稲岡  心, 安枝  浩、第113回 日林学術講: 330 (2002)
【非特許文献５】高橋裕一, 安部悦子, 三浦直美, 荒木龍平, 安枝  浩, 阪口雅弘、  花粉誌 48: 103〜107 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、これらの方法では、依然としてCryj1の正確な量を測定するまでには至っておらず、また各系統に対して２とおりの測定が必要となり、抗体の調製に技術や時間を要する点等の問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、スギ花粉症対策として花粉の少ないスギを選抜するという試みに有効な、アレルゲンの少ない杉を的確かつ簡便に選別する方法の開発を目的として研究を重ねた結果、Cryj1の特定の部位に結合し得る抗体を組み合わせて使用することで、かかる課題を解決し得ることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、スギ花粉タンパク質Cryj1のアミノ酸配列ＤＮＰＩＤＳＣＷＲＧを認識する第一の抗体、及びスギ花粉タンパク質Cryj1のアミノ酸配列ＦＴＧＨＤＤＡＹＳＤＤＫＳＭＫＶＴを認識する第二の抗体を用いることを特徴とする、スギ花粉タンパク質Cryj1のサンドイッチイムノアッセイ方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、スギ花粉中のCryj1の全量を正確に定量することが出来、アレルゲンの少ない杉を的確かつ簡便に選別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で使用する第一の抗体は、Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列ＤＮＰＩＤＳＣＷＲＧで表される抗原決定基を認識し結合する抗体である。具体的には、Ｋａｗａｓｈｉｍａら（Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，    ９８巻、１１０〜１１７頁、１９９２年）により報告され、「Ａｎｔｉ−Ｃｒｙｊ１  ｍＡｂ０２６」としてアサビビール薬品株式会社から市販されている抗スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１モノクローナル抗体である。
【００１４】
また、本発明で使用する第二の抗体は、スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列ＦＴＧＨＤＤＡＹＳＤＤＫＳＭＫＶＴで表される抗原決定基を認識し結合する抗体である。特に、当該アミノ酸配列からなる合成ペプチドを抗原として誘導され、「Ａｎｔｉ（ＭＡＰ）Ｃｒｙｊ１」として株式会社エル・エス・エルから市販されている抗スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１モノクローナル抗体である。
【００１５】
本発明では、Cryj1を含む花粉抽出液は、予めこれを加熱処理、好ましくは８０℃以上で加熱処理することが好ましい。５０℃以下の加熱処理では、Cryj1と本発明で使用する第二の抗体との反応性は低くなる傾向にある（図１）。また、加熱処理の時間は、短くても長くても本発明で使用する抗体とCryj1との反応性を低下させる恐れがある。具体的には、加熱処理の時間としては１〜３分が、短時間（例えば３０秒間程度）あるいは長時間（５分以上）の何れに対しても、反応性の点で有利である（図２）。
【００１６】
また、本発明のイムノアッセイ方法、特に第一及び第二の抗体にそれぞれ上記の好ましい２種の抗体を使用したイムノアッセイ方法は、精製Cryj1を対照とした場合、１５０ｎｇ／ｍＬのCryj1まで、比色定量において直線性を示す（図３）。この直線性は、スギの代表的な３系統、すなわち雄勝１号、雄勝９号、及び平鹿１号から得られるいずれの場合においても、花粉抽出液量４〜５μｌ／ｗｅｌｌの範囲において確認することができる。この結果は、ごく少量のスギ花粉からでもCryj1を有効に検出し測定できることを意味する。
【００１７】
以下、非限定的な実施例により、本発明をさらに詳述する。
【実施例】
【００１８】
スギ精英樹より採取し４℃で冷蔵保存した花粉20mgに１mLの0.125M NaHCO3を加え、４℃１時間で抽出し、15,000rpm、10分の遠心分離を行ったのち、得られた上清100μLをエッペンドルフチューブに分注し、80℃で２分間の加熱処理をウオーターバスで行って、スギ花粉アレルゲンを調製した。
【００１９】
第一の抗体としての一次抗体（マウスモノクローナル抗体anti-Cryj1 m Ab 026、Hayashibara製）を、TBS（20mM Tris-HCl (pH7.5)、500mM NaCl）で100倍希釈した100μLを、4℃で１晩、マイクロプレートに吸着させた。ブロッキングは５%BSA（アルブミンフリー, Sigma製）を含む200μLのTBSで一昼夜行った。TBSで３回洗浄後、抽出液の上清を0.125M NaHCO3で希釈し、マイクロプレートに100μLを分注し、4℃で１晩おいた。TBSで3回洗浄後、第二の抗体としての二次抗体（ウサギモノスペシフィックポリクローナル抗体Anti (MAP) Cryj1、LSL）を37℃で１時間、あるいは４℃で一晩、反応させた。
【００２０】
TTBS（0.05% Tween 20を含むTBS）で3回、さらにTBSで3回洗浄後、0.2%BSAを含むTBSで1,000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギヤギIgG抗体（Cappel）を、37℃で１時間反応させた。TTBSで3回、さらにTBSで3回洗浄後、BluePhosキット（KPL）で発色および発色反応を停止し、655nmの吸光度をマイクロプレートリーダー（Model 550, Biorad）で測定した（図４）。
【００２１】
この方法により、スギ精英樹より採取した花粉は、１ｇあたり９３〜６３０μｇのＣｒｙｊ１を含むことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、スギ花粉抽出の加熱処理の処理温度と本発明の方法における検出感度との関係を示す。
【図２】図２は、スギ花粉抽出の加熱処理の処理時間と本発明の方法における検出感度との関係を示す。
【図３】図３は、精製Cryj1を用いた場合の本発明の検出感度を示す。
【図４】図４は、本発明によるCryj1の定量結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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