(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純な糖が醗酵供給原料の成分となっている、キサンタンガムを製造するための醗酵方法であって、その糖の一部がマンノースであることを特徴とする方法。
【請求項２】
糖が、マンノースと、場合により少量のその他の糖類を含有するグルコースとの混合物である請求項１の方法。
【請求項３】
マンノースとグルコースとの混合物が５ないし６０重量％のマンノースを含み、そして残余がグルコースおよび、場合により、少量のその他の糖類である請求項２の方法。
【請求項４】
マンノースとグルコースとの混合物が２０ないし４５重量％のマンノースを含み、そして残余がグルコースおよび、場合により、少量のその他の糖類である請求項３の方法。
【請求項５】
マンノースとグルコースとの混合物がグルコースのエピ化によって製造されたものである請求項２ないし４のいずれか一つの方法。
【請求項６】
マンノースとグルコースとの混合物がグルコースのエピマー化から生じたラフィネート流であり、そして５ないし１５重量％のマンノースを含有する請求項５の方法。
【請求項７】
醗酵方法がキサンタンガムの製造方法である請求項１ないし６のいずれか一つの方法。
【請求項８】
キサンタンガムがＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓによる醗酵方法で製造される請求項７の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、醗酵用の供給原料、特にマンノースからなる供給原料、より詳しくは、キサンタンガムを製造するための醗酵方法においてこのような供給原料を使用することに関する。
【０００２】
【従来技術】
これまでの５０年間において、醗酵方法は、これ以外の方法では工業的な規模で合成できない複雑な有機分子の製造にとって益々重要になってきた。エタノールおよび酢酸のような単純な製品を製造するためには、古典的な醗酵方法が知られていて、利用されてきたけれども、食品、化学薬品および医薬品の産業のための複雑な製品を製造するための微生物による醗酵方法が開発されたのはほんの最近に至ってからに過ぎない。
【０００３】
典型的な醗酵方法には、適当な供給原料上で特定の微生物を培養することによってその微生物の数を増やし、そしてこの醗酵方法の所望の生成物の一部または全部を製造することが含まれている。それの一つの例は、適当な培地上でＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを育てて所望の代謝生成物であるキサンタンガムを製造することである。キサンタンガムは、Ｄ- グルコース、Ｄ- マンノースおよびＤ- グルクロン酸を含有する複雑な多糖類であって、食品、医薬品および化学薬品の工業で利用する上で優れたレオロジー特性を備えている。
【０００４】
より最近となって、微生物による醗酵方法の範囲が、遺伝子工学処理された微生物の使用によって拡大され、そして動物細胞の培養によって、醗酵に応答性のある酵素が、例えば、ヒト抗血友病因子ＶＩＩＩのような糖タンパク質の製造において提供される醗酵方法も付加的に案出されてきた。
【０００５】
微生物または細胞の培養による醗酵方法のための供給原料は一般に炭水化物、窒素源および種々のミネラルを含んでいる。炭水化物は、このような糖類を代謝プロセスで使用する前に、例えば微生物が単純な糖に分解できるデンプンまたはマルトデキストリンのような複雑な物質であることができる。しかしながら、より頻繁には、醗酵供給源は、マルトースまたは、より普通にはグルコースのような単純な糖から直接製造される。例えば、上記のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの醗酵における炭水化物成分としてグルコースを使用することは慣用技術となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
キサンタンガムにおけるように、所望の生成物がマンノース単位を含む或る種の醗酵方法においては、醗酵原料の炭水化物成分の一部としてマンノ−スを使用することによって所望の代謝物の増大した収量が得られるということを見い出した。マンノースはグルコースのエピマーであるが、比較的入手しにくいためにグルコースよりも高価である。しかしながら、マンノースのコストが高くつにも拘かわらず、本発明者等は、従来醗酵に使用されていたグルコースの一部を置き換えるのが、特にこの置換物が以下に述べるようなマンノースとグルコースとの比較的高価でない混合物である場合には、高価な供給源の競合物よりも通常価値の高い生成物を高い収率で生成するために、経済的になり得るということを見い出した。本明細書でマンノースと称しているものは全てＤ- マンノースを指している。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、単純な糖が醗酵供給原料の一成分となっていて、その糖の一部がマンノースであることを特徴とする、マンノース単位を含む生成物を製造するのための醗酵方法である。
【０００８】
好ましくは、醗酵供給原料の糖成分は、マンノースとグルコースとの混合物であり、より好ましくは、５ないし６重量％のマンノース、特に２０ないし４５重量％のマンノースを含み、そして残余が、その他の糖類、例えばマルトースも少量存在してよいけれども、主としてグルコースである混合物である。マンノースは、触媒、例えばモリブデン化合物の存在下でグルコースをエピマ−化することによって製造することができる。このエピ化反応の生成物はマンノースとグルコースとの混合物であって、典型的には約３０重量％のマンノースを含有し、そして特に本発明による醗酵供給原料として使用されるような混合物である。エピマ−化供給原料としてグルコースシロップ、例えば９０％またはそれ以上のグルコースと、マルトースのようなグルコースオリゴマーとの混合物を使用することもでき、その場合醗酵供給源は少量のグルコースオリゴマーも含有する。エピマ−化生成物はマンノースと、グルコースおよびマンノースからなる共生成物のラフィネート流とを分離するために、例えばクロマトグラフにより処理してもよい。このようなラフィネート流は５ないし１５重量％のマンノースを含んでいてもよく、本発明方法の供給原料として使用することもできる。これの代わりに、所望の醗酵生成物が比較的マンノース単位に富む場合には、エピマ−化生成物にマンノースを添加するか、あるいは生成物をクロマトグラフにより富化して適当な醗酵供給原料を製造することができる。マンノース単位とグルコース単位の両方を含む醗酵生成物を製造するためには、マンノース／グルコース混合物を使用することが特に有効である。
【０００９】
本発明による醗酵供給原料は、使用される微生物が特にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓである場合、醗酵方法によってキサンタンガムを製造するのに殊に有効である。本明細書中で以下に続く実施例に示される通り、このような醗酵方法においてグルコースの一部をそれと当量のマンノースで置き換えると、キサンタンガムの収量が３０重量％以上改善することができる。
【００１０】
本発明による醗酵方法は、醗酵の開始時に全ての供給原料を添加するバッチ式で行うか、あるいは醗酵の間を通して供給原料を漸次添加し、そしてマンノースと、それ以外の単純な糖、例えばグルコースとをそれぞれ別々に、または好ましくは一緒に添加する半連続式で行うことができる。
【００１１】
【実施例】
ここで、以下の実施例によって本発明を更に説明する。
実施例１〜４
以下の醗酵において、使用された微生物は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ＮＲＲＬ  １４５９−１４（ＬＭＧ  ５７４）タイプｔ１であった。
【００１２】
醗酵用の接種物を調製するために予備培養培地を使用した。この培地は次の組成を有していた。
（これらの実施例における全ての百分率は重量によるものである。）
麦芽エキス                      ０．３％
酵母エキス                      ０．３％
バクト−ペプトン                ０．５％
（窒素源）
燐酸水素二カリウム              ０．５％
硫酸マグネシウム                ０．０２％
【００１３】
２０分間１２０℃に加熱する滅菌の前に硫酸を添加することによって、この溶液をｐＨ７に調整した。
グルコースまたはマンノース３０％とグルコース７０％グルコースとの混合物のいずれかの２％の溶液とした上記溶液に、１２０℃で２０分間加熱することによって別に滅菌された２０％の炭水化物原料溶液を加えた。
【００１４】
このようにして調製された１００ｍｌの予備培養培地にＲｅｖｃｏ管から微生物Ｘａｎｔｈｏｍｏｍａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを接種し、そしてロータリーテーブル上で２８℃において２日間培養した。
【００１５】
実施例において使用された醗酵培地は、
麦芽エキス                      ０．３％
酵母エキス                      ０．３％
バクト−ペプトン                ０．５％
（窒素源）
燐酸二水素カリウム              ０．５％
硫酸マグネシウム                ０．０２％
を含んでいた。
【００１６】
この溶液を滅菌前にｐＨ７に調整した。
醗酵培地の炭水化物成分はグルコースまたは３０％マンノース／７０％グルコース混合物であった。グルコースまたはグルコース／マンノース混合物を１００ｍｌの水に溶解して各々１％、１．５％、２％および３％の濃度とした。
【００１７】
醗酵槽は２リットルの容量を有し、そして上記の滅菌された培地１．３リットル、プラス、グルコースまたはマンノース／グルコース混合物溶液１００ｍｌ、プラス、予備培養接種物１００ｍｌを含有していた。温度を２９℃に保持し、通気速度を１．５ｖｖｍ（毎分３リットル）とし、そして攪拌速度を８５０ｒｐｍとした。
【００１８】
各醗酵を１８時間続け、その時間後にキサンタンガムの製造量を測定し、そして残留糖類の量を測定した。キサンタンガムの測定は、醗酵培地をそれの３倍の容量のイソプロパノールで希釈し、そして沈澱したキサンタンガムを濾別することによって行った。沈澱物を二容量のイソプロパノールで洗浄し、濾過し、そしてオーブン中４０℃で一晩乾燥させた後、キサンタンガムを秤量した。
【００１９】
キサンタンガムの沈澱およびイソプロパノールの蒸発の後に培地の高圧液体クロマトグラフィーによって残留糖類は測定した。
醗酵の結果は次の通りであった。
0003644695.tif 000002
上記の結果から判るように、グルコース単独と比較されたマンノース／グルコース混合物に関する４つの比較対の実験の全てにおいで収率の増加が得られ、最大の増加百分率は実施例４における３４％であった。
【００２０】
実施例５および実施例６
実施例１ないし実施例４と同様に、使用した微生物は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ＮＲＲＬ  １４５９−１４（ＬＭＧ  ５７４）タイプｔ１であった。
【００２１】
予備培養培地を使用して醗酵用の接種物を調製した。この培地は次の組成を有していた。（これらの実施例における全ての百分率は重量によるものである。）
麦芽エキス                      ０．３％
酵母エキス                      ０．３％
バクト−ペプトン                ０．５％
（窒素源）
燐酸水素二カリウム              ０．５％
硫酸マグネシウム                ０．０２％。
【００２２】
１２０℃で２０分間加熱する滅菌の前に硫酸を添加することによって、この溶液をｐＨ７に調整した。
グルコースの２％の溶液とした上記溶液に、１２０℃で２０分間加熱することによって別に滅菌された２０％炭水化物原料溶液を加えた。
【００２３】
このようにして調製された１００ｍｌの予備培養培地にペトリ皿からＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを接種し、そしてロータリーテーブル上で２８℃において２日間培養した。
【００２４】
実施例で使用された醗酵培地は、
硝酸アンモニウム                １．１４４ｇ／ｌ
燐酸二水素カリウム              ２．８６６ｇ／ｌ
塩化マグネシウム                ０．５０７ｇ／ｌ
硫酸ナトリウム                  ０．０８９ｇ／ｌ
クエン酸一水和物                ２．３    ｇ／ｌ
硼酸                            ０．００６ｇ／ｌ
塩化第二鉄                      ０．０２４ｇ／ｌ
炭酸カルシウム                  ０．０２０ｇ／ｌ
塩化亜鉛                        ０．０３０ｇ／ｌ
濃塩酸                          ０．１３ｍｌ
を含んでいた。
【００２５】
この溶液を滅菌前に５規定水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に調整した。
醗酵培地の炭水化物成分はグルコースまたは３０％マンノース／７０％グルコース混合物であった。グルコースまたはグルコース／マンノース混合物を１００ｍｌの水に溶解して３％の濃度とした。
【００２６】
醗酵槽は２リットルの容量を有し、そして上記の滅菌された培地１．３リットル、プラス、グルコースまたはマンノース／グルコース混合物溶液１００ｍｌ、プラス、予備培養接種物１００ｍｌを含有していた。温度を２９℃に保持し、通気速度を１．５ｖｖｍ（毎分３リットル）とし、そして攪拌速度を８５０ｒｐｍとした。醗酵の間中、２規定の水酸化カリウム水溶液を添加することによってｐＨ７に制御した。
【００２７】
６．６日の醗酵後、全ての糖類が消費された時、醗酵培地をそれの３倍容量のイソプロパノールで希釈し、そして沈澱したキサンタンガムを濾別することによって、製造されたキサンタンガムを測定した。二容量のイソプロパノールで沈澱物を洗浄し、濾過し、そしてオーブン中４０℃で一晩乾燥させた後、キサンタンガムを秤量した。
【００２８】
醗酵の結果は次の通りであった。
0003644695.tif 000003