(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られた酵素固定化用担体に、α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化し、ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることを特徴とするパラチノースおよびトレハルロースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを用いて、蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
パラチノース（別名：イソマルチュロース）およびトレハルロースは、グルコースとフラクトースが、それぞれα−１，６およびα−１，１で結合した甘味を有する非う蝕性の二糖類であり、近年、低う蝕原性甘味料として広く使用されている。
【０００３】
従来より、パラチノースおよびトレハルロースは、グルコースとフラクトースがα−１，２で結合している蔗糖が、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ  ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ）属等の微生物に含有されるα−グルコシルトランスフェラーゼと呼ばれる糖転移酵素と接触することによって生成されることが特開平３−１８０１７２号、特開平４−１６９１９０号、特開平５−１３０８８６号公報等で開示されている。また、パラチノースおよびトレハルロースを工業的に製造するには、２０〜６０％の蔗糖の水溶液に、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を加えて攪拌し、温度１５〜３０℃、ｐＨ６付近に管理しながら２０時間程度反応させた後、反応液から微生物を遠心分離法等にて除去し、イオン交換樹脂等により精製し得られることも知られている。しかし係る製造工程において、反応液中から微生物を除去することは、微生物と反応液の比重差が少なく、微生物のサイズも小さいことから能率が悪く、工業的には不適当である。この様な問題を解決するために、例えば特公昭６０−９７９７号公報には、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を、アルギン酸カルシウムやポリアクリルアミド、寒天等のゲルに包括したものや、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物の全細胞または破砕細胞の成分を、ＤＥＡＥ−セルロースや骨炭といった水不溶性の担体に吸着し、必要に応じてグルタルアルデヒドで架橋させたものを用いることが開示されており、特公昭５８−３６９５９号公報には、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を、アルギン酸カルシウムゲルに包括させて粒状化し、この粒状化物にポリエチレンイミンを浸透させた後、グルタルアルデヒドで架橋させたものを用いることが開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述の従来技術において、特公昭６０−９７９７号公報記載の固定化α−グルコシルトランスフェラーゼのうち、アルギン酸カルシウムゲル等に微生物を包括させたものや、特公昭５８−３６９５９号公報に記載の固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは、蔗糖溶液のｐＨが５．８以上のときや、粗精製の蔗糖に含まれるナトリウムイオン等との接触により、アルギン酸カルシウムが水溶性のアルギン酸ナトリウムに変換されて溶出し、ゲルの物理的強度が低下してしまうという欠点があった。この欠点は蔗糖溶液にカルシウム塩を添加することにより改善できるが、反応液に脱塩処理を施さなければならないという問題が新たに発生する。また、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物を包括固定させる方法は、固定化量が低い上、糖転移反応の活性を持つα−グルコシルトランスフェラーゼの高次構造の変化と、蔗糖溶液との接触が包括されることにより妨げられる立体的な障害を伴い、活性が低くなってしまうという欠点がある。更に、固定化したα−グルコシルトランスフェラーゼが失活した場合、ゲル担体を再生して繰り返し使用することができないという大きな欠点を抱えていた。
【０００５】
このような欠点を解決する有力な手段としては、特公昭６０−９７９７号公報にＤＥＡＥ−セルロース等の水不溶性の担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化する方法が開示されている。この方法であれば、固定化量を多くすることができ、α−グルコシルトランスフェラーゼの高次構造が変化しにくく、α−グルコシルトランスフェラーゼが担体の表面に固定化されるため蔗糖溶液との接触も阻害しない。しかも失活した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを熱アルカリ処理し、未使用の新たなα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化することで、担体を容易に再生させることができる。しかしこの方法で得た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは、活性の持続性が極端に悪く、初期活性や再生について満足のいくものではない。
【０００６】
このような観点から、物理的強度に優れ、再生が可能な水不溶性の担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化したもので、初期活性に優れ、活性の持続性が良好で、再生による繰り返し使用ができる担体に固定化したα−グルコシルトランスフェラーゼを用いて、パラチノースおよびトレハルロースを製造する方法の開発が強く要望されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の課題を解決すべく鋭意研究の結果、粒状多孔質キトサンに、脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させた酵素固定化担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化させることにより、優れた初期活性と良好な活性持続性が得られ、しかも失活した際、熱アルカリ処理した後に、再度α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化することによって、再生が可能で繰り返し使用ができることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明は、粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られた酵素固定化用担体に、α−グルコシルトランスフェラーゼを固定化し、ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることを特徴とするパラチノースおよびトレハルロースの製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明に用いる、粒状多孔質キトサンに脂肪族ボリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させた酵素固定化用担体は、出願人が先に特願平７−３９１７２号で出願した酵素固定化用担体の製造方法で製造することができる。
【００１０】
即ち、（Ａ）平均分子量が１０，０００〜２３０，０００の低分子量キトサンを蟻酸、酢酸、乳酸等の有機酸や塩酸、硝酸等の無機酸の酸性水溶液に溶解し、該キトサン酸性溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多孔質キトサンに、脂肪族ボリアルコールのジグリシジルエーテルを反応させて架橋粒状多孔質キトサンとし、次いで界面活性剤を用いて水中にフェニルグリシジルエーテルを懸濁し、該架橋粒状多孔質キトサンに残存するアミノ基を主体に反応させた後、充分に水洗するか、または、（Ｂ）上述と同様で得た粒状多孔質キトサンに、極性溶剤中でフェニルグリシジルエーテルを反応させ、次いで脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルを、該粒状多孔質キトサンに残存するアミノ基を主体に反応させた後、充分に水洗して酵素固定化用担体を得る。
【００１１】
ここで用いる脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとしては、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル等のポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、またはグリセロールポリグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００１２】
ここで使用されるフェニルグリシジルエーテルの量は、後に固定化するα−グルコシルトランスフェラーゼの優れた性能を発揮させるために、（Ａ）の場合は架橋粒状多孔質キトサン１Ｌに対し２０〜２００ｇ、好ましくは３５〜２００ｇ、（Ｂ）の場合は粒状多孔質キトサン１Ｌに対し５０〜２００ｇ、好ましくは７５〜２００ｇである。
【００１３】
（Ａ）に用いる界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤が挙げられる。しかし架橋粒状キトサンのアミノ基とイオン的な反発ないしは吸着が起こらない、一般に使用されている非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１４】
（Ｂ）に用いる極性溶剤としては、ジオキサン、エタノール、イソプロピルアルコール等の極性溶剤が挙げられ、これらの中から選択し使用される。
【００１５】
次に、このようにして得られた酵素固定化用担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化して、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを得る。固定化する方法としては通常の手法を採用することができる。例えば酵素固定化用担体をα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する溶液中で数時間処理し、酵素固定化用担体にα−グルコシルトランスフェラーゼを吸着させて、残留している該溶液を除去し水洗する方法，または水洗後に架橋剤溶液中で数時間処理して、酵素固定化用担体とα−グルコシルトランスフェラーゼを架橋し、残留している該溶液を除去して水洗する方法，或いは酵素固定化用担体を架橋剤溶液中で数時間処理して、架橋剤の官能基の一部と酵素固定化用担体を結合させ、残留している該溶液を除去して水洗した後、α−グルコシルトランスフェラーゼを含有する溶液中で数時間処理して、酵素固定化用担体と結合している架橋剤の未反応の官能基部分にα−グルコシルトランスフェラーゼを結合させ、残留している該溶液を除去して水洗する方法等が採用されるが、架橋剤を用いる方法が特に好ましい。
【００１６】
上述の固定化方法で用いられる架橋剤としては、酵素固定化用担体に導入された２種のグリシジルエーテルが反応していない残存アミノ基と、α−グルコシルトランスフェラーゼの有するアミノ基とを架橋する化合物、即ちイソシアネート基やエポキシ基、アルデヒド基、カルボニル基といった官能基を２個以上備えた化合物であれば良く、具体的にはヘキサメチレンジイソシアネート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド等が挙げられる。
【００１７】
グルタルアルデヒドを用いた反応は、通常０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％のグルタルアルデヒド溶液を、酵素固定化用担体１容量に対して０．１〜１０倍容量、好ましくは０．５〜２倍容量加え、室温にて１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜４時間処理して架橋させる。
【００１８】
上述の固定化方法で用いられるα−グルコシルトランスフェラーゼは、蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを生成する糖転移活性を持つものであれば特別限定されるものではなく、例えばプロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ）属やセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ  ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ）属等の微生物を含有する培養液を、ホモジナイザーによって破砕して得た未精製のα−グルコシルトランスフェラーゼや、これを液体クロマトグラフィー等の手法によって、不純物を除いた精製α−グルコシルトランスフェラーゼが挙げられるが、工業的には操作が簡便な未精製のα−グルコシルトランスフェラーゼを用いることが好ましい。
【００１９】
次に上述で得た固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを、蔗糖溶液に接触させるが、その方法については特別限定されるものではなく、例えば蔗糖溶液の入った攪拌設備のある容器に固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを添加し一定時間攪拌処理する方法や、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼをカラムに充填し、このカラムに蔗糖溶液を通液させる方法等が挙げられる。工業的には連続処理が可能な後者の方法が好ましい。この場合に用いられる蔗糖溶液の濃度は１〜６０％、好ましくは２０〜６０％、ｐＨは４〜８、好ましくは５〜７、温度は５〜６０℃、好ましくは１５〜４０℃、通液速度（空間速度）は０．１〜５．０ｈｒ−１、好ましくは０．２〜２．０ｈｒ−１で処理する。この様な方法で固定化α−グルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることにより、所望のパラチノースおよびトレハルロースを含有するシロップが得られる。得られたシロップは必要に応じて中和処理、脱塩処理、結晶化処理、イオン交換樹脂を用いた通常の液体クロマトグラフィー処理等により、パラチノースとトレハルロースの混合製品や高純度のパラチノース製品、及び高純度のトレハルロース製品といった製品を得ることができる。
【００２０】
ここで使用する固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは、蔗糖溶液との接触により、徐々に糖転移活性が低下していく。そこで使用限界以下に低下した場合は、通常の担体結合法による固定化酵素の再生方法により、酵素固定化用担体を繰り返し使用することができる。即ち使用限界以下に活性が低下した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼ１容量に対し０．１〜５Ｎ、好ましくは０．５〜１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を０．５〜１０倍容量加え、４０〜９０℃、好ましくは６０〜８０℃に加温し、１０分〜２４時間、好ましくは３０分〜４時間処理して、固定化されているα−グルコシルトランスフェラーゼを分解し、水洗除去した後、再度上述の如く新たなα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化する。
【００２１】
本発明は、酵素固定化用担体として粒状多孔質キトサンに、脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られたものを用いることにより、物理的強度と初期活性に優れ、活性の持続性が良好で、再生による繰り返し使用が可能な担体を用いた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを得ることができる。しかも、ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼを用いることによって、反応液の脱塩処理が不要となり、連続的に高い生産性をもって蔗糖からパラチノースおよびトレハルロースを製造することができる。
【００２２】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明は、この範囲に限定されるものではない。なお、パラチノースおよびトレハルロースの定量は次の方法により行った。
【００２３】
パラチノースおよびトレハルロースの定量方法
反応溶液を次に示す高速液体クロマトグラフ操作条件で注入し、高速液体クロマトグラムを得、パラチノースおよびトレハルロースのピークと内部標準物質のピークとの面積比から算出した。
〈高速液体クロマトグラフ操作条件〉
カラム：ＥＲＣ−ＮＨ１１７１  ６×２００ｍｍ（エルマ光学社製）
移動層：アセトニトリル８０：水２０
流  速：１ｍｌ／分
検出器：示差屈折計
感  度：８〜１６×１０−５    （ＲＩＵＦＳ）
注入量：２０μｌ
【００２４】
（実施例１）
脱アセチル化度７９％、平均分子量４６，０００のキトサン２１０ｇを３．５％酢酸水溶液２，７９０ｇに溶解した。該キトサン酸性溶液を７％水酸化ナトリウム、２０％エタノール、７３％水によりなる凝固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質に凝固再生後、中性になるまで十分水洗し、平均粒径１ｍｍの粒状多孔質キトサン３，０００ｍｌ（湿潤）を得た。得られた粒状多孔質キトサンの１，５００ｍｌに水１，５００ｍｌとエチレングリコールジグリシジルエーテル７．５ｇを加えて８０℃で１時間反応させた。反応終了後、十分水洗し架橋粒状多孔質キトサン１，４７０ｍｌを得た。
【００２５】
次に表１に示した配合で所定量のフェニルグリシジルエーテルと非イオン性界面活性剤、商品名ニューポールＰＥ６４（三洋化成工業（株）製）を水１００ｍｌに加え、夫々攪拌機で十分攪拌して懸濁液を得た。
次いで架橋粒状多孔質キトサン各１００ｍｌを該懸濁液１００ｍｌに加え、７０℃で４時間攪拌し反応させた。反応終了後、反応残液を除去し水で十分に洗浄し、酵素固定化用担体（担体Ａ〜Ｇ）各９７ｍｌを得た。
【００２６】
【表１】
0003632242.tif 000002
【００２７】
蔗糖３０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺菌し、プロタミノバクター・ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ５７４．７７を接種して、温度２８℃、通気量１３．０Ｌ／ｍｉｎ  ，攪拌速度３５０ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得た。遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー３．６Ｌを得た後、該スラリーの全量をホモジナイザーで粉砕処理し、プロタミノバクター・ルブルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液３．３Ｌを得た。
【００２８】
担体Ａ〜Ｇをそれぞれ２５ｍｌ秤量し３．０％のグルタルアルデヒド水溶液２０ｍｌに加えて２５℃で２時間処理した後、水洗し、未反応のグルタルアルデヒドを十分除去した。ついでグルタルアルデヒド処理した各酵素固定化用担体をプロタミノバクター・ルブルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液各８８ｍｌに、温度２５℃にて３時間攪拌した後、水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＡ＊  〜Ｇ＊  夫々２５ｍｌを得た。
【００２９】
ここで得られた固定化αグルコシルトランスフェラーゼＡ＊  〜Ｇ＊  夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これの夫々に、ｐＨ５．６の４２％蔗糖（グラニュー糖）水溶液を、２５℃に調製してポンプにより１２．６ｍｌ／ｈｒ  の流速でカラム上部より供給し、カラム下部から出てくる反応溶液を初期より一定間隔でサンプリングして、反応液中のパラチノースおよびトレハルロースの含有量を測定し、パラチノースおよびトレハルロースの含有量が反応初期の半分になるまでこの反応を行った。このときまでに要した日数を半減期とすると共に、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を、測定した含有量から算出した。
【００３０】
更にここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＡ＊  〜Ｇ＊  に、夫々０．５Ｎの水酸化ナトリウム溶液１００ｍｌを加え、７０℃に加温して４時間処理した後、再度同様の固定化方法で未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化した。これらを再度上述のカラムに充填し、上述の蔗糖溶液を供給し、カラム下部から出てくる初期の反応溶液をサンプリングして、反応溶液中のパラチノースおよびトレハルロースの含有量を測定した。ここで測定したパラチノースおよびトレハルロースの含有量が再生固定化の前の初期の含有量と較べた割合を再生率として算出した。その結果を表２示す。
【００３１】
【表２】
0003632242.tif 000003
【００３２】
表２から明らかなように、本発明の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多く、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼの活性の持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産できた。
【００３３】
（実施例２）
実施例１で得られた粒状多孔質キトサンを１，５００ｍｌ秤量し、含有する水をイソプロピルアルコールで十分に置換除去した。表３に示した如く、所定量のフェニルグリシジルエーテルを夫々イソプロピルアルコール１００ｍｌに加えて溶解し、該溶解液に粒状多孔質キトサン各１００ｍｌを加え、７０℃で４時間反応させた。
【００３４】
反応終了後、反応残液を除去しイソプロピルアルコールで洗浄後、水洗した。次いで夫々水１００ｍｌにエチレングリコールジグリシジルエーテル０．５ｇを加えて溶解し、該溶解液に、フェニルグリシジルエーテルを所定量反応させた粒状多孔質キトサンを入れ、８０℃で２時間反応させた。反応終了後、十分水洗し酵素固定化用担体（担体Ｈ〜Ｍ）各９７ｍｌを得た。
【００３５】
【表３】
0003632242.tif 000004
【００３６】
担体Ｈ〜Ｍを夫々２５ｍｌ秤量し３．０％のグルタルアルデヒド水溶液２０ｍｌに加えて２５℃で２時間処理した後、水洗し、未反応のグルタルアルデヒドを十分除去した。ついでグルタルアルデヒド処理した各酵素固定化用担体を、実施例１で得たプロタミノバクター・ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ５７４．７７由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液各８８ｍｌに、温度２５℃にて３時間攪拌した後、水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＨ＊  〜Ｍ＊  夫々２５ｍｌを得た。
【００３７】
ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＨ＊  〜Ｍ＊  夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これの夫々に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出した。更にここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＨ＊  〜Ｍ＊  を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表４示す。
【００３８】
【表４】
0003632242.tif 000005
【００３９】
表４から明らかなように、本発明の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多く、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼの活性の持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産できた。
【００４０】
（実施例３）
（１）  蔗糖３７５ｇ、ペプトン１５０ｇ、肉エキス４５ｇ、酵母エキス７５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水３０ｇおよび塩化ナトリウム４５ｇからなるｐＨ７の培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺菌し、セラチア・ブリムチカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ）ＡＴＣＣ１５９２８を接種して、温度２８℃、通気量７．５Ｌ／ｍｉｎ  ，攪拌速度４００ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー２．５Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してセラチア・ブリムチカ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液２．３Ｌを得た（酵素液１）。
【００４１】
（２）  蔗糖６０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス１ｇ、酵母エキス１ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ）ＭＸ−２３２を接種して、温度２８℃、通気量０．２５Ｌ／ｍｉｎ  ，攪拌速度４６０ｒ．ｐ．ｍで４８時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．２０Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してアグロバクテリウム・ラジオバクター由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．１８Ｌを得た（酵素液２）。
【００４２】
（３）  蔗糖１００ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、シュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５を接種して、温度２８℃、通気量１．２Ｌ／ｍｉｎ  ，攪拌速度４３０ｒ．ｐ．ｍで６０時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．１５Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してシュードモナス・メソアシドフィラ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．１４Ｌを得た（酵素液３）。
【００４３】
（４）  蔗糖５０ｇ、コーンスチープリカー３０ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇを水に溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地をジャーファーメンターに入れて殺菌し、クレブシェラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＡＴＣＣ３３２５７を接種して、温度２８℃、通気量１．０Ｌ／ｍｉｎ  ，攪拌速度１４０ｒ．ｐ．ｍで２４時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得、遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー０．２５Ｌを得た。次に該スラリーの全量をホモジナイザー処理してクレブシェラ・テリゲナ由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液０．２０Ｌを得た（酵素液４）。
【００４４】
実施例１で得られた酵素固定化用担体Ｄと実施例２で得られた酵素固定化用担体Ｊを夫々２５ｍｌ秤量し、これらを上述の方法で得た酵素液１〜４夫々１００ｍｌに加え、室温で２時間攪拌し後、吸着後の残留酵素液を除去した。次いで２．５％グルタルアルデヒド水溶液各２５０ｍｌに入れ１時間処理後、充分に水洗して固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４およびＪ１，Ｊ２，Ｊ３，Ｊ４夫々２５ｍｌを得た。
【００４５】
ここで得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１〜Ｄ４、Ｊ１〜Ｊ４夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これの夫々に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出した。更にここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＤ１〜Ｄ４、Ｊ１〜Ｊ４を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表５示す。
【００４６】
【表５】
0003632242.tif 000006
【００４７】
表５から明らかなように、本発明の方法で得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼはいずれの微生物由来のα−グルコシルトランスフェラーゼに対しても、パラチノースおよびトレハルロースの生成量が多く、活性の持続性や再生処理も極めて良好であり、蔗糖溶液からパラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産できた。
【００４８】
（比較例１）
実施例１と同様の酵素固定化用担体の製造方法において、フェニルグリシジルエーテルを反応させなかったもの（担体Ｏ）と、ＤＥＡＥ−セルロース（担体Ｐ）を用い、実施例１で得られた酵素液を実施例１と同様の方法で固定化し、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ＊  、Ｐ＊  を得た。
【００４９】
得られた固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ＊  、Ｐ＊  夫々２０ｍｌを直径１０ｍｍ×高さ３０ｃｍのカラムに充填し、これらの夫々に、実施例１と同様の方法でｐＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期、半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出した。更に、ここで半減期に達した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ＊  、Ｐ＊  を、実施例１と同様の方法で水酸化ナトリウム溶液処理後、再度未使用のα−グルコシルトランスフェラーゼを夫々固定化し、再度上述のカラムに充填して上述の蔗糖溶液を供給し、反応溶液をサンプリングして再生率を算出した。その結果を表６示す。
【００５０】
【表６】
0003632242.tif 000007
【００５１】
表６から明らかなように、固定化α−グルコシルトランスフェラーゼＯ＊  、Ｐ＊  を用いた本発明以外の方法は、パラチノースおよびトレハルロースの生産性が実施例１，２と比較して低く、活性の持続性や再生処理も劣るものであった。
【００５２】
（比較例２）
蔗糖３０ｇ、ペプトン１０ｇ、肉エキス３ｇ、酵母エキス５ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２水２ｇおよび塩化ナトリウム３ｇに水を溶解して１Ｌとし、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．５〜７．０に調製した培地１５Ｌを３０Ｌのジャーファーメンターに入れて殺菌し、プロタミノバクター・ルブルム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｒｕｍ）ＣＢＳ５７４７７を接種して、温度２８℃、通気量１３．０Ｌ／ｍｉｎ  ，攪拌速度３５０ｒ．ｐ．ｍで１６時間培養してα−グルコシルトランスフェラーゼ活性の高い培養液を得た。遠心分離してα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体のスラリー３．６Ｌを得た後、該スラリーの全量をホモジナイザーで粉砕処理し、プロタミノバクター・ルブルム由来のα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する酵素溶液３．３Ｌを得た。
【００５３】
ここで得たα−グルコシルトランスフェラーゼを含有する微生物菌体の破砕物溶液２．５Ｌを、２．５Ｌの４％アルギン酸ナトリウム水溶液と混合し、直径０．６ｍｍの細孔を多数有するダイスを取り付けた円筒形の押し出し機に入れ、空気圧をかけて混合溶液を細孔より下方へ押し出した。押し出し機の下方には、０．１５Ｍ塩化カルシウム溶液１０Ｌを入れた２０Ｌ容の容器を置き、攪拌機によって溶液を攪拌しておき、上方から落下する混合溶液の液滴を受けた。１０分で混合溶液を押し出し、そのまま塩化カルシウム溶液を２時間攪拌して、微生物菌体破砕物含有アルギン酸ゲル４ｋｇを得た。
【００５４】
次に３０％ポリエチレンイミン２７０ｇを約３Ｌの水で希釈してから、希塩酸で中和してｐＨ５．５に調製し、総量を４ｋｇとした後、先に調製した微生物菌体破砕物含有アルギン酸ゲル４ｋｇを投入し、１０分間ゆるやかに攪拌した後、瀘過してゲルを回収し、０．５％グルタルアルデヒド溶液１０Ｌにゲルを加えて３０分間攪拌後、水洗してアルギン酸ゲルに微生物菌体破砕物が包括された固定化α−グルコシルトランスフェラーゼ３．３ｋｇを得た。
【００５５】
これを実施例１と同様の方法でＰＨ５．６の４２％蔗糖水溶液を通液し、実施例１と同様の方法で半減期，半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計を測定または算出したところ、半減期が２１０日，半減期までに生成したパラチノースおよびトレハルロースの総計は１２．５ｋｇであった。
【００５６】
この様に従来技術の方法は、本発明の方法に較べると、パラチノースおよびトレハルロースの生産性が低く、活性の持続性も劣るものであった。また、この固定化方法では再生ができない為、失活した固定化α−グルコシルトランスフェラーゼは廃棄せざるを得なかった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の方法は、物理的強度に優れた粒状多孔質キトサンに脂肪族ポリアルコールのジグリシジルエーテルとフェニルグリシジルエーテルを反応させて得られた酵素固定化用担体を用い、これにα−グルコシルトランスフェラーゼを固定化させることにより、初期活性と活性の持続性に優れ、再生による繰り返し使用が可能な固定化α−グルコシルトランスフェラーゼが得られ、該固定化−αグルコシルトランスフェラーゼに蔗糖溶液を接触させることによって、パラチノースおよびトレハルロースを効率良く生産することができるという優れた効果を発揮する。