(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも大豆分離蛋白及び／又は脱脂粉乳を含有する蛋白質水溶液に、蛋白質分解酵素を添加し蛋白質を酵素分解させる段階と、
前記酵素処理された溶液にブドウ糖、酵母抽出物及び肉エキスからなる群より選択される少なくとも１つとイオン成分とを添加してなる溶液を用いて乳酸菌を発酵させる段階と、
前記発酵された発酵液を高速遠心分離機で分離濃縮して菌体を分離しながら蛋白質をコーティングさせる蛋白質コーティング段階と、
凍結保護剤成分を含む凍結保護剤水溶液と多糖類成分を含む多糖類水溶液の混合溶液に前記分離した菌体を混合した後、これを凍結乾燥させる多糖類コーティング段階とを含むことを特徴とする二重コーティング乳酸菌原末の製造方法。
【請求項２】
前記イオン成分として、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウムのイオン成分のうちの少なくとも一種類を使用することを特徴とする請求項１に記載の二重コーティング乳酸菌原末の製造方法。
【請求項３】
前記多糖類水溶液として、ザンタンガム、セルロース、レバンの中で少なくとも一つ以上を含めた混合溶液を使用することを特徴とする請求項１に記載の二重コーティング乳酸菌原末の製造方法。
【請求項４】
前記凍結保護剤成分として、トレハロース、マンニトール、デキストリン、脱脂粉乳のうちの少なくとも一つ以上を使用することを特徴とする請求項１に記載の二重コーティング乳酸菌原末の製造方法。
【請求項５】
前記蛋白質コーティング後、前記乳酸菌原末を凍結乾燥させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の二重コーティング乳酸菌原末の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法に関するもので、特に乳酸菌に蛋白質と多糖類を二重コーティングする蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、乳酸菌は、腸に定着して腸管運動の活性化、有害菌抑制、ビタミン及び免疫増強物質の促進等の多様な生理活性効果を発揮するが、人体の構造上、人が乳酸菌を摂取する際、腸に到達するまでには胃を経るようになっていて、胃から分泌される胃酸により乳酸菌が死滅し、乳酸菌本来の生理活性機能を発揮できなくなる場合が多い。
【０００３】
特に、従来の非コーティング乳酸菌原末の製造工程は、図１のように乳酸菌醗酵、菌体回収、凍結乾燥の過程から成るが、このような非コーティング乳酸菌粉末は空気、水分、温度条件に敏感に反応するので貯蔵及び流通の安定性と２次製品製造時の加工の安定性を確保するのは困難である。また、人及び動物が摂取する際、胃酸及び胆汁酸との直接的な接触により急激に死滅するため、腸内定着性及び乳酸菌固有の効能、効果を保障できないという問題点がある。
【０００４】
このような問題点を解決するために、乳酸菌にコーティングをして使用するようになったが、乳酸菌コーティング技術としてはカプセル剤を利用した腸溶コーティング剤や、ゼラチン、糖類、ガム類などを利用したマイクロカプセル化工程などがあるが、これらは乳酸菌体の回収工程以後にコーティング剤を投入する、本発明とは別のコーティング工程により実施されている。
【０００５】
従来の乳酸菌コーティング工程は、乾燥が完了した乳酸菌粉末にコーティング剤を添加して実施される場合が多く、一般的な工程は図１に示した通りである。すなわち、乳酸菌培養工程(Ｍ１、Ｍ２)は一般的にペプトン類、肉エキス、酵母抽出物、ブドウ糖及び無機イオンが組み合わされた醗酵培地を利用して嫌気的醗酵装置内で行われ、これらの培地成分は主に、乳酸菌が増殖する際に利用される水溶性成分のみから構成され、乳酸菌体の回収工程(Ｍ３)は遠心分離または限外濾過器を利用して行なわれ、菌体と培養余液との分離及び菌体の濃縮のみを目的としており、急速凍結及び凍結乾燥工程(Ｍ４)で乳酸菌の急激な死滅が発生するので、糖類、アミノ酸などを組み合わせた乳酸菌凍結保護剤(Ｍ５)を添加して乾燥粉末化(Ｍ６)させ、その後、乳酸菌粉末に水溶液状のコーティング剤組成物を加えて攪拌及び混合した後、凍結乾燥されるというものである。また、非常に微細な球型のビード形性能力のあるコーティング剤組成物が加えられてノズル噴射によりマイクロカプセル化工程を行なう方法もある。
【０００６】
このような従来の乳酸菌コーティング工程は、乳酸菌体の回収及び乾燥粉末化工程以後にコーティング剤の混合攪拌又はマイクロカプセル化工程が行われるので、高価なコーティング剤及び工程追加による費用負担が生じ、またその他の微生物の混入が憂慮されるため、無菌操作に困難が生じる場合がある。また、液状コーティングした後、凍結乾燥過程において優れた生存率及び安定性を確保するために凍結保護剤及び安定剤の使用を必要とするので、材料または工程の重複が生じるという問題点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記のような問題点を解決するために考え出されたものであって、空気や水分との直接的な反応が抑制され、耐熱性、耐酸性及び耐胆汁性が強化され、生菌の安定性及び加工の安定性が増強された乳酸菌原末の製造及びこれと関連した乳酸菌コーティング工程であって、蛋白質素材を利用して低コストで迅速な製造方法により実施する蛋白質コーティング乳酸菌に、更にザンタンガム、セルロース及びレバン(levan)のような多糖類を菌株に単独、または混合使用して二重にコーティングする蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法を提供することにその目的がある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前述の目的は本発明に従い、大豆分離蛋白及び／又は脱脂粉乳の１−１０重量％水溶液を作った後、前記水溶液に、蛋白分解酵素液を、水溶液中の蛋白質の総重量に対して、０．０１−１重量％の割合で加えて、前記水溶液を酵素処理する蛋白質酵素分解工程と、前記酵素処理液に対し１−５重量％のブドウ糖、０.１−１．５重量％の酵母抽出物、０．１−１．５重量％の肉エキス及び０．０１−０．１重量％のイオン成分を添加して溶解し、醗酵管でスチーム殺菌した後、乳酸菌を培養する乳酸菌醗酵工程と、前記醗酵された醗酵液を高速遠心分離機で分離濃縮して菌体を分離し、コーティングし、回収する１次蛋白質コーティング工程と、前記回収した菌体に対して１−１０重量％の凍結保護剤成分を３５−４５重量％含有する凍結保護剤水溶液と、前記回収した菌体に対して１−１０重量％の多糖類成分を１−１０重量％含有する多糖類水溶液とを混合して使用し、前記回収した菌体をコーティングし、凍結乾燥する２次コーティング工程とを含むことを特徴とする蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法によって達成できる。
【０００９】
前記本発明による乳酸菌原末の製造方法において、蛋白分解酵素としては乳酸菌の種類によって従来から一般的に使われていた酵素であれば何れでも使用することができるが、特にプロテアーゼ‐Ｎ（アマノ社製）を用いることが好ましい。
【００１０】
そして、前記イオン成分はクエン酸アンモニウム（ammonium citrate：アンモニウムシトレート）、酢酸ナトリウム（sodium acetate：ソジウムアセテート）、リン酸二カリウム（dipotassium phosphate：ジホタシウムポステート）、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate：マグネシウムサルフェート）、硫酸マンガン（マンガンサルフェート：manganese sulfate）、塩化ナトリウム（sodium chloride：ソジウムクロライド）のイオン成分を適宜使用することが好ましい。
【００１１】
また、前記多糖類水溶液として、ザンタンガム、セルロース、レバンの中で少なくとも一つ以上を含めた混合溶液を使用することが好ましい。
【００１２】
さらに、前記１次蛋白質コーティング工程以後、凍結乾燥して製造することが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、図面の図２と図３を参照しながら、本発明の蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法を以下の通り説明する。図２は菌体回収した後、蛋白質及び多糖類を使用して二重コーティング後、凍結乾燥して製造する二重コーティング原末の製造工程図であり、図３は蛋白質コーティングして製造された乳酸菌原末に対し、多糖類水溶液を使用して２次コーティングした後、凍結乾燥して製造する二重コーティング乳酸菌原末の製造工程図である。
【００１４】
本発明の蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法は、醗酵培地中に含まれている蛋白質コーティング剤により１次コーティングして、多糖類水溶液を使用して再びコーティングする二重コーティング方法であり、蛋白質酵素分解工程と乳酸菌醗酵工程と１次蛋白質コーティング工程と２次コーティング工程からなるものである。
【００１５】
前記蛋白質酵素分解工程(Ｓ１)では、醗酵培地として使われる脱脂粉乳と大豆分離蛋白を各々単独、または混合して１−１０重量％水溶液を調製した後、乳酸菌株に基づいて、蛋白質の重量に対し０．０１−１重量％の蛋白分解酵素溶液を加えて酵素処理する。ここで、脱脂粉乳と大豆分離蛋白の酵素処理加水分解物は、乳酸菌増殖に利用される水溶性または低分子量のペプチド成分と、乳酸菌体の捕集及びコーティングに使われる半水溶性または高分子量のペプチド成分とに分けられる。
【００１６】
前記乳酸菌醗酵工程(Ｓ２)では酵素処理液の重量に対し１−５重量％のブドウ糖、０．１−１．５重量％の酵母抽出物、０.１−１.５重量％の肉エキス、０．０−０．１重量％のクエン酸アンモニウム（ammonium citrate：アンモニウムシトレート）、酢酸ナトリウム（sodium acetate：ソジウムアセテート）、リン酸二カリウム（dipotassium phosphate：ジホタシウムポステート）、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate：マグネシウムサルフェート）、硫酸マンガン（マンガンサルフェート：manganese sulfate）、塩化ナトリウム（sodium chloride：ソジウムクロライド）などのイオン成分を添加して溶解させ、嫌気的醗酵管でスチーム殺菌後に乳酸菌を培養する。
【００１７】
前記１次蛋白質コーティング工程(Ｓ３)では、醗酵された醗酵液を15,000ｒｐｍ以上の高速遠心分離機で分離及び濃縮する。この時、醗酵液中に残存する蛋白質成分が菌体と共に沈積しながら菌体を捕集及び包含するコーティング作用が発生する。ここで、加水分解物組成は、乳酸菌種の生理特性により蛋白質の濃度及び酵素処理率を加減することによって、高い乳酸菌増殖効果をもたらすことが可能である。更に、加水分解物組成は、急速凍結時には菌体を包含して氷晶（アイスクリスタル）の形成から菌体を防御するので、凍結保護剤としての効果も同時に有するようになる。
【００１８】
前記２次コーティング工程(Ｓ４)では、回収された菌体に対して凍結保護剤の重量として１−１０重量％のトレハロース、マルトデキストリン、マンニトール及び/又は脱脂粉乳成分を３５−４５重量％水溶液として組成して、回収菌体に対して１−１０重量％のザンタンガム、セルロース及びレバンを各々単独、または混合して１−１０重量％水溶液を調製して加圧殺菌した後に、回収菌体及び凍結保護剤水溶液と混合して、撹拌機で撹拌して均質化させた後、凍結乾燥する。あるいは、蛋白質コーティング後に凍結乾燥された蛋白質コーティング乳酸菌原末に対して１−１０重量％のトレハロース、マルトデキストリン、マンニトール及び／又は脱脂粉乳水溶液を３５−４５重量％の濃度で組成して乳酸菌原末に対して１−１０重量％のザンタンガム、セルロース及びレバンを各々単独、または混合して１−１０重量％水溶液に調製して、加圧殺菌後に蛋白質コーティングされた乳酸菌原末と混合して、撹拌機で撹拌して均質化させた後、凍結乾燥(Ｓ３-１)して２次コーティング(Ｓ４)する。多糖類水溶液に均質化された蛋白質コーティング乳酸菌は凍結乾燥後に多糖類が保有した強力な接着力により菌体間の結合が発生して非常に緻密な構造をもった菌塊を形成し、原末の粉砕工程を経て４０−１２０メッシュの一定の粒度を持つようになる。
【００１９】
ここで、前記２次コーティング剤に使われる多糖類は、特有の粘着性により各菌体を結合して菌塊を形成させており、親水性をもつので１次コーティング剤である蛋白質との結合はもちろん、その他の水溶性の糖類、アミノ酸成分の凍結保護剤及び乳酸菌安定剤との併用使用ができるという長所がある。特に、水溶液状態の時の多糖類材料は、酸性の条件であると溶解度が極めて低く、中性以上のpHでは容易に解離及び溶出されるため、酸性の条件での乳酸菌の安定性及び腸内定着性が非常に良好となる。
【００２０】
このような二重コーティング方法を使用して製造された製品の実施例は下記の通りである。
【００２１】
第一に、蛋白質コーティングされたLactobacillus acidophilus CBT-LH原末の生産は、脱脂粉乳4Kg及び大豆分離蛋白2Kgを水100Kgに懸濁させた後に低速撹拌機、温度調節装置及びpH調節装置が装着された酵素処理槽で５５℃の温度、初期pH７.０の条件で蛋白分解酵素剤（アマノ社製品、プロテアーゼ-N）１.０２gを１００mlの水に溶解させて添加し、pHが６.０に低下するまで加水分解した。この加水分解溶液にブドウ糖５Kg、肉エキス１Kg、酵母抽出物０.５Kg、リン酸二カリウム（dipotassium phosphate：ジホタシウムホスフェート）５０g、クエン酸アンモニウム（ammonium citrate：アンモニウムシトレート）５０ｇ、酢酸ナトリウム（sodium acetate：ソジウムアセテート）５０g、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate：マグネシウムサルフェート）１０g及び硫酸マンガン（マンガンサルフェート：manganese sulfate）１０gを添加して溶解させ、２００Ｌ容量の嫌気的醗酵管に移送して１２１℃で１５分間殺菌し、種菌２Ｌを接種してアンモニアでpHを６.０に維持しながら１２時間醗酵した。醗酵液を６０L/Hrの流速で連続式遠心分離機で移送させながら、菌体と残存している蛋白成分を沈積させて回収した。トレハロース１Kg、マンニトール１Kg及びマルトデキストリン１Kgから組成された凍結保護剤水溶液１０Lを加圧殺菌して調製し、１０gのザンタンガム、１０gのセルロース及び１０gのレバンを溶解させた多糖類水溶液３Lを加圧殺菌して、回収菌体、凍結保護剤水溶液及び多糖類水溶液を混合した後に撹拌機で５,０００ｒｐｍで撹拌して均質化させ、−５５℃の冷凍庫で急速凍結した後、さらに０℃から４０℃の間の操作条件で凍結乾燥した。遠心分離沈積過程で半水溶性の残存している蛋白成分は菌体を包含し、水溶性ペプチド成分は菌体の細胞壁に沈着して蛋白質コーティングを形成しており、多糖類成分は菌体間の結合により非常に緻密な構造をもった菌塊を形成した。ザンタンガム、セルロース及びレバンの混合組成物による二重コーティング乳酸菌（試験区）は非コーティング乳酸菌（対照区）に比べて優れた加速試験安定性、耐酸性、耐胆汁性を示した。これによる試験結果は(表１)の通りである。
【００２２】
なお、加速試験とは、長期保存試験の貯蔵条件を外れた短期間の加速条件下で食品又は医薬品などの安定性などを評価するための試験のことである。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
第二に、蛋白質コーティングされたStreptococcus thermophilus(KCCM 12020)CBT-ST原末の生産は、脱脂粉乳6Kgを水100Kgに懸濁させてから低速撹拌機、温度調節装置及びpH調節装置が装着された酵素処理槽で５５℃の温度、初期pH７.０の条件で蛋白分解酵素剤（アマノ社製品、プロテアーゼ-N）6gを１００mlの水に溶解させて添加し、pHが６.２に低下するまで加水分解した。この加水分解溶液にブドウ糖4Kg、肉エキス０.５Kg、酵母抽出物０.５Kg、リン酸二カリウム（dipotassium phosphate：ジホタシウムホスフェート）５０g、クエン酸アンモニウム（ammonium citrate：アンモニウムシトレート）５０g 、酢酸ナトリウム（sodium acetate：ソジウムアセテート）５０g、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate：マグネシウムサルフェート）２０g及び硫酸マンガン（マンガンサルフェート：manganese sulfate）５gを添加して溶解させ、２００L容量の嫌気的醗酵管に移送して１２１℃で１５分間殺菌し、種菌２Lを接種してアンモニアでpHを６.０に維持しながら１２時間醗酵した。醗酵液を６０L/Hrの流速で連続式遠心分離機に移送させながら、菌体と残存する蛋白成分を沈積させて回収した。トレハロース０.５Kg、マンニトール０.５Kg、マルトデキストリン０.５Kg及び脱脂粉乳１.５Kgから組成し加圧殺菌して調製した凍結保護剤水溶液１０Lと、ザンタンガム１５g 及びセルロース１５gを加えて溶解させ加圧殺菌して調製した多糖類水溶液３Lとを菌体沈積物と混合して撹拌機で５,０００ｒｐｍで撹拌して均質化させ、−５５℃の冷凍庫で急速凍結した後、さらに０℃から４０℃の間の操作条件で凍結乾燥した。表２に示すように、脱脂粉乳による蛋白質コーティング及びザンタンガム、セルロースの混合組成による二重コーティング乳酸菌（試験区）は、非コーティング乳酸菌（対照区）に比べて優れた加速試験安定性、耐酸性、耐胆汁性を示した。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
第三に、蛋白質コーティングされたBifidobacterium longum(ATCC 15707)CBT-BG原末の生産は、大豆分離蛋白２Kgを水１００Kgに懸濁させた後に低速撹拌機、温度調節装置及びpH調節装置が装着された酵素処理槽で５５℃の温度、初期pH７.０の条件で蛋白分解酵素剤（アマノ社製品、プロテアーゼ-N）5.4gを１００mlの水に溶解させて添加し、pHが６.２に低下するまで加水分解した。この加水分解溶液にブドウ糖４Kg、肉エキス０.５Kg、酵母抽出物０.５Kg、カゼインペプトン１Kg、リン酸二カリウム（dipotassium phosphate：ジホタシウムホスフェート）５０g、リン酸水素二カリウム（potassium phosphate：ポッタシウムホスフェート）５０g、硫酸マグネシウム（magnesium sulfate：マグネシウムサルフェート）１０g、塩化ナトリウム（sodium chloride：ソジウムクロライド）１g及び硫酸マンガン（マンガンサルフェート：manganese sulfate）１０gを添加して溶解させ、２００Ｌ容量の嫌気的醗酵管に移送して１２１℃で１５分間殺菌し、種菌２Lを接種してアンモニアでpHを６.０に維持しながら１５時間醗酵した。醗酵液を６０L/Hrの流速で連続式遠心分離機に移送させながら、菌体と残存する蛋白成分を沈積させて回収し、予め殺菌したトレハロース０.５Kg、マンニトール０.５Kg、マルトデキストリン０.５Kg及び脱脂粉乳１.５Kgで組成された凍結保護剤水溶液１０Lを加え、撹拌機で５,０００ｒｐｍで撹拌して均質化させ、−５５℃の冷凍庫で急速凍結した後、さらに０℃から４０℃の間の操作条件で凍結乾燥した。乳酸菌凍結乾燥粉末１００gと、水３Ｌに１５gのザンタンガムと１５gのセルロースを加えて溶解させ加圧殺菌した多糖類コーティング組成物とを混合した後、撹拌機で５,０００ｒｐｍで撹拌して均質化させ、−５５℃の冷凍庫で急速凍結した後、さらに０℃から４０℃の間の操作条件で凍結乾燥した。表３に示すように、大豆分離蛋白による蛋白質コーティング及びザンタンガム、セルロースの混合組成による二重コーティング乳酸菌（試験区）は、非コーティング乳酸菌（対照区）に比べて優れた加速試験安定性、耐酸性、耐胆汁性を示した。
【００２７】
【表３】
0003720780.tif 000004
【００２８】
このように、本発明により製造された二重コーティング乳酸菌原末は、非コーティング乳酸菌に比べて非常に優れた貯蔵安定性と耐酸性、耐胆汁性、耐熱性をもつ。
【００２９】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、菌株によって各種の凍結保護剤及び安定剤などと混合して使用でき、水溶液上での均質化及び凍結乾燥工程のみで二重コーティングされた乳酸菌体を獲得できるために、別途に設備を使用する必要なく製造工程を維持することができる。また、乾燥する前の回収菌体または乾燥菌体にすべて適用できるため、工程の融通性及び互換性が大きい。更に、菌体の生存率は５０−９０％となり乳酸菌原末の回収率を特に改善することができ、生産性が向上する。また更に、この工程により生産される二重コーティング乳酸菌原末は耐熱性、耐酸性、耐胆汁性、貯蔵安定性が大きく改善され、人体に投与する時には腸内定着性が非常に優れ、乳酸菌固有の生理活性機能の発揮が卓越しているので使用者の使用上の効率性を良好にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は従来のコーティング乳酸菌の製造工程図である。
【図２】図２は本発明の蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造工程図である。
【図３】図３は本発明の蛋白質及び多糖類を利用した二重コーティング乳酸菌原末の製造方法の更なる実施例を示す工程図である。
【図４】図４は本発明に係る方法により製造された二重コーティング乳酸菌原末の形状を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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