(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端及び３’末端のそれぞれに連結する、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される２つの非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであって、
特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、
非特異的領域のそれぞれは、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基と他の塩基との結合力が、特異的対合を形成する塩基対の結合力よりも弱いことを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記他の塩基がヒポキサンチンである請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
特異的領域の長さが６〜５０塩基であり、非特異的領域の長さが２〜２０塩基である請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
特異的領域の長さが非特異的領域の長さと等しいか又はそれ以上である請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
不溶性担体に固定化されている請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
５’末端側の領域で不溶性担体に固定化されている請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結している、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される非特異的領域とを有し、かつ、不溶性担体に固定化されているオリゴヌクレオチドであって、
特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、
非特異的領域は、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
５’末端側の領域で不溶性担体に固定化されている請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記他の塩基がヒポキサンチンである請求項９又は１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結している、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、非特異的領域は、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなるオリゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、
そのハイブリダイゼーション強度またはハイブリダイゼーションの有無により、前記試料核酸中における前記オリゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列と相補的な配列を有する標的配列の有無を判定するステップとを含むことを特徴とする核酸の塩基配列解析法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、不溶性担体に固定化されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが５’末端側の領域で不溶性担体に固定化されている請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記他の塩基がヒポキサンチンである請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結している、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、非特異的領域は、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなるオリゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、
そのハイブリダイゼーション強度を測定するステップと、
測定したハイブリダイゼーション強度に基づいて、標的配列と試料核酸中配列とのミスマッチ判別能を算出するステップとを含むことを特徴とする核酸塩基のミスマッチ判別方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、不溶性担体に固定化されている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが５’末端側の領域で不溶性担体に固定化されている請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記他の塩基がヒポキサンチンである請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、オリゴヌクレオチド及び核酸の塩基配列解析法に関し、詳しくは、核酸の塩基配列決定、感染症や遺伝病の診断、ゲノムマッピング等の核酸の塩基配列解析に使用することができるハイブリダイゼーション用プローブに好適に利用できる新規な構造を有するオリゴヌクレオチド、及びそれを用いた塩基配列解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーションによる核酸の塩基配列解析は、例えば塩基配列決定、感染症や遺伝病の診断、ゲノムマッピング等において広く行われている。また、ＳＢＨ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［Ｒ．Ｄｒｍａｎａｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，１６４９（１９９３）］、すなわちハイブリッド形成による塩基配列決定法は、高速かつ低コストな方法として実用化が期待されている。
【０００３】
これらの塩基配列解析においては、ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）によって生じたプローブと標的配列とのハイブリッドの中で、ミスマッチが存在するものと、ミスマッチがなく完全に相補的なものとを区別する技術が必要である。
【０００４】
ハイブリダイゼーション反応は、反応溶液のイオン強度、プローブ及びサンプルＤＮＡの塩基構成、反応温度・時間等多くの要因によって支配される複雑な反応であるが、短鎖長のオリゴヌクレオチドをプローブとする場合には、ミスマッチを有するハイブリッドは完全に相補的なハイブリッドと比較して不安定なことから、これらの諸条件を適当に設定することによって、完全に相補的なハイブリッドのみが検出できるような系を構築することが理論的に可能であると考えられている。
【０００５】
しかしながら、従来、高感度のハイブリダイゼーションを得るためにＤＮＡの塩基を化学修飾する手法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１１４６０（１９９３）］やミスマッチの判別能を高めるためのハイブリダイゼーション条件としてハイブリダイゼーション後の洗浄を低温で長時間行う方法［ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，５２７（１９９０）］が提案されているが、十分な結果が得られていない。
【０００６】
特に、プローブの末端付近にミスマッチが存在する場合のハイブリダイゼーションと、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーションとを正確かつ高感度に区別することは困難であり、これが塩基配列解析の実用化の障壁となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ハイブリダイゼーション法による核酸の塩基配列解析の精度を高めるために、高感度のハイブリダイゼーション結果が得られるとともに、末端にミスマッチを有するハイブリッドを完全に相補的なハイブリッドと明確に区別し得るオリゴヌクレオチド及び塩基配列解析法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸の標的配列にハイブリダイズするべく特定の塩基配列を有する領域の末端に、或る種のヌクレオチドからなる領域が結合されたオリゴヌクレオチドを用いれば、高感度のハイブリダイゼーション結果が得られるとともに塩基対のミスマッチが高感度で検出可能なことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端又は３’末端の少なくとも一方に連結するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであって、
特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、
非特異的領域は、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなることを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
また本発明の方法は、
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結している、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、非特異的領域は、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなるオリゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、
そのハイブリダイゼーション強度またはハイブリダイゼーションの有無により、前記試料核酸中における前記オリゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列と相補的な配列を有する標的配列の有無を判定するステップとを含むことを特徴とする核酸の塩基配列解析法である。
さらに本発明の他の方法は、
アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）から選ばれる塩基を含むヌクレオチドにより構成される特異的領域と、この特異的領域の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に連結している、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を含むヌクレオチドにより構成される非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域は、前記オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有し、非特異的領域は、特異的領域を構成するヌクレオチドに含まれる塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）以外の他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなるオリゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、
そのハイブリダイゼーション強度を測定するステップと、
測定したハイブリダイゼーション強度に基づいて、標的配列と試料核酸中配列とのミスマッチ判別能を算出するステップとを含むことを特徴とする核酸塩基のミスマッチ判別方法である。
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本明細書においていくつかの術語を用いるが、ここで用いるときそれらの術語は次の意味を有する。
【００１２】
「試料核酸」とは、塩基配列の解析を目的として本発明のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる核酸を意味し、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。「特異的領域」とは、ハイブリダイズしうる試料核酸中の標的配列と塩基配列の相補性を有し、各塩基がこの標的配列と対合を形成しうる領域を意味する。「通常の核酸を構成する塩基」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを構成するヌクレオチドに含まれる塩基、すなわちＤＮＡにあってはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類の塩基を、ＲＮＡにあってはＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（Ｕ）を意味する。「特異的対合を形成する塩基対」とは、ＡとＴもしくはＵとの間の塩基対、又はＧとＣとの間の塩基対を意味する。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的領域と、この特異的領域の両末端の少なくとも一方に連結する１または２の非特異的領域とを有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよく、またオリゴリボヌクレオチドであってもよい。
【００１４】
特異的領域は、試料核酸中の標的配列に対して相補的な特定の塩基配列を有する。「相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的である場合の他、少なくとも１塩基のミスマッチが存在する場合を含むことを意味する。特異的領域の長さは、ハイブリダイゼーションにおいてプローブとして機能しうる長さであれば特に制限されるものでないが、通常６〜５０、好ましくは６〜２０塩基対程度の長さが適当である。ハイブリダイゼーション領域ＤＮＡの塩基配列もまた特に制限されるものでなく、塩基配列の解析対称となるサンプルＤＮＡの塩基配列に応じてその配列を適宜決定することができる。
【００１５】
非特異的領域は、通常の核酸を構成する塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる他の塩基を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリゴマーからなる。上記のような塩基としては、通常核酸を構成する塩基のいずれとも同等に結合するものであることが好ましく、さらに、その結合力が特異的対合を形成する塩基対の結合力よりも弱いことがより好ましい。
【００１６】
このような塩基として具体的には、ヒポキサンチンを例示することができる。また、上記ヌクレオチドとして具体的には、ヒポキサンチンを塩基として有するデオキシリボヌクレオチドであるデオキシイノシンが挙げられる。
【００１７】
非特異的領域を構成するヌクレオチドまたはそのオリゴマーの数は、特に制限されるものでないが、通常少なくとも一つ、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜８とすることができる。
【００１８】
非特異的領域が特異的領域に連結する位置もまた特に制限がなく、特異的領域の５’末端、３’末端のいずれでもよい。さらに特異的領域の５’末端及び３’末端の両方に非特異的領域が連結されていてもよい。これらの中では後者が好ましい。
【００１９】
特異的領域の長さと非特異的領域の長さとの比は、特異的領域の長さやＧＣ含量によっても異なるが、通常、特異的領域の長さが非特異的領域の長さと等しいか又はそれ以上であることが好ましい。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドの合成法については特に限定されるものではなく、例えば、β−シアノエチルホスホアミダイト法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２  ４５３９（１９８４）］、リン酸トリエステル法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１  ５９５６（１９８４）］、ホスホン酸エステル法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４  ５３９９（１９８６）が挙げられる。特異的領域と非特異的領域との連結は、それぞれ別個に合成した後に行ってもよく、特異的領域を合成した後に非特異的領域を１ヌクレオチドずつ順次付加することにより行ってもよい。また、特異的領域と非特異的領域を同時に合成してもよい。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション用のプローブとして利用する場合には、不溶性担体に固定化された形態で使用してもよい。不溶性担体としては、ニトロセルロース、またはナイロンからなるフィルター、ガラス板、多孔質ガラス、シリカゲル、ラテックスなどが挙げられる。これらの不溶性担体に本発明のオリゴヌクレオチドを固定化する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドを用いる場合には、表面に高密度のカルボキシル基を有するナイロンフィルター上にカルボキシル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミド結合させる手法［Ｊ．Ｏｒｇ．２６  ２５２５（１９６１）］や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはアビジンを表面にコーティングした担体にビオチンーアビジン反応で結合させる方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１  ２２９１（１９７２）］、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル基を導入したシリカゲルに固定化する方法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ９  ２０３（１９８１）］が挙げられる。また、フィルター上で固定化されたオリゴヌクレオチドを作製する方法として、フォトリソグラフィーを応用した手法によって固相上で多種類のＤＮＡを同時に合成する方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１  ７６７（１９９１）］やシールされたガラス板上にＤＮＡ合成試薬を接触させることによる合成法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２  １３６８（１９９４）］等も使用することができる。
【００２２】
上記で詳述した本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸の塩基配列解析に利用することができる。すなわち本発明の核酸の塩基配列解析法は、上記オリゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、そのハイブリダイゼーション強度またはハイブリダイゼーションの有無により、前記試料核酸中における前記オリゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列と相補的な配列を有する標的配列の有無を判定するステップとを含む。本発明の方法により、ハイブリダイゼーション感度を上昇させることが可能となるとともに、完全に相補的なハイブリッドとミスマッチを有するハイブリッド、特に従来法で区別が困難であった末端ミスマッチが区別し易くなり、それによってハイブリダイゼーション法によるＤＮＡ塩基配列解析が容易になる。
【００２３】
次に、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチが存在する場合のハイブリダイゼーションと、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーションとを如何にして正確かつ高感度に区別することができるかを説明する。図１は、通常のオリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドにほぼ相補的であるがミスマッチを含む試料核酸とのハイブリッドを示す模式図である。一般的に、ミスマッチがハイブリッドの中央部に存在する場合にはハイブリダイゼーションに重大な障害となるが、ハイブリッドの末端付近にある場合には、中央部に存在する場合に比べて障害は小さい。
【００２４】
一方、上記オリゴヌクレオチドと同一の配列の特異的領域を有する本発明のオリゴヌクレオチドと上記試料核酸とのハイブリッドを模式的に図２に示す。図２においてＩはイノシンを表す。この図に示されるように、イノシンはいずれのヌクレオチドとも塩基対を形成することができるので、非特異的領域の分だけハイブリッドの長さは延長される。すなわち、通常のオリゴヌクレオチドではハイブリッドの末端に存在していたミスマッチは、本発明のオリゴヌクレオチドではハイブリッドの中央部に位置することとなる。また、ハイブリダイゼーション強度も高くなる。したがって、ミスマッチを含まないハイブリダイゼーションとミスマッチを含むハイブリダイゼーションを区別することが容易になる。非特異的領域が特異的領域の５’末端に連結されていれば、特異的領域の５’末端側のミスマッチを検出しやすくなり、非特異的領域が特異的領域の３’末端に連結されていれば、特異的領域の３’末端側のミスマッチを検出しやすくなる。さらに、非特異的領域が特異的領域の５’末端及び３’末端の両方に連結されていれば、特異的領域の５’末端側及び３’末端側のミスマッチの両方を検出することが容易となる。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションの条件は、特に限定されるものではなく、試料核酸の種類や配列、及びオリゴヌクレオチドの配列によって至適な条件は変化し得る。例えば、比較的短鎖のオリゴヌクレオチドを用いた場合は、ハイブリダイゼーション温度を低温にするなど条件を緩く設定することが望ましい。また、ＤＮＡ塩基配列中にＧＣ残基が多い場合は、ＡＴ残基が多い場合に比してハイブリッドの安定性は強まるが、この現象を相殺するためにテトラメチルアンモニウムクロライド等の４級アミンの塩を用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，１５８５（１９８５）］が効果的である。またハイブリダイゼーション溶液中に界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）等を添加する方法もハイブリダイゼーション感度の向上に効果的である（実施例Ｃ参照）。
【００２６】
核酸の塩基配列の解析をハイブリダイゼーションによって行う場合、試料核酸または本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかが標識されていることが好ましい。標識化の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ラジオアイソトープや蛍光色素を用いる手法等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションの結果は、各種標識法に即した方法によって測定することができる。
【００２７】
本発明の塩基配列解析の応用例としては、ハイブリダイゼーション法を用いたＤＮＡ塩基配列の決定［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１３  １３７８（１９９２）］や感染症及び遺伝的疾患の診等、巨大ゲノムＤＮＡのマッピング等に応用可能である。感染症の診断法としては、例えば、被験者の血液等よりＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡに対して各種病原体固有の配列から本発明の方法によりＤＮＡプローブを作製し、ハイブリダイゼーション反応を行い、病原体の存在を検出する方法が挙げられる。遺伝的疾患の診断法としては、遺伝病の原因遺伝子に特異的な配列をもとに本発明の方法によりオリゴヌクレオチドを作製し、被験者より得た染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行い、その遺伝子中の変異の有無を検出する。巨大ゲノムＤＮＡのマッピングはゲノムＤＮＡ解析プロジェクト等には必須の技術であるが、ゲノムバンクに対して本発明の方法で作製した多数のＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションを行うことで各クローンのゲノム上での配置が決定できる［第１６回日本分子生物学会年会  講演要旨集  １３３４（１９９３）］。ＤＮＡ塩基配列の決定は、従来、ＤＮＡを化学的に分解する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４  ５６０（１９７７）］やＤＮＡ合成酵素による方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４５４６３（１９７７）］が用いられているが、ハイブリダイゼーション法を用いたＤＮＡ塩基配列の解析法（ＳＢＨ；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、近年注目されている手法である［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０  １６４９（１９９３）］。ＳＢＨ法は、適当なハイブリダイゼーション条件を設定することで、目的の長鎖ＤＮＡに対して、それと完全に相補的なオリゴＤＮＡプローブのみを選択的にハイブリダイズさせ、特異的にハイブリダイズしたオリゴＤＮＡプローブのデータを集積し解析することで、目的の長鎖ＤＮＡの塩基配列を決定する技術である。
【００２８】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）や塩基配列決定などにおけるポリメラーゼ反応のプライマーとしての利用も期待される。
【００２９】
【実施例】
実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明は何等限定されるものではない。
【００３０】
【実施例Ａ】
ハイブリダイゼーション強度の測定
（Ａ）オリゴヌクレオチドの合成
アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ；ＡＢＩ社）製のＤＮＡ合成装置（装置名３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）によって表１に示す配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、比較対象用オリゴヌクレオチド、及び試料ＤＮＡを合成した。尚、以下のオリゴヌクレオチドＮｏ．は配列表の配列番号に相当する。
【００３１】
【表１】
0003626782.tif 000002
【００３２】
上記オリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡの合成は標準のプロトコール通りに行い、５’末端の保護基であるトリチル基は除かないサイクルにて合成を終了した。上記（９）の試料ＤＮＡをＯＰＣカートリッジ（ＡＢＩ社製）を用いて精製を行った。上記（１）〜（９）のオリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡを濃縮乾固した後、（１）〜（８）については０．５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）に、（９）についてはＴＥ緩衝液に懸濁し、２６０ｎｍの吸光度測定により定量し、１ｎｍｏｌ／μｌに調整した。
【００３３】
（Ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化
オリゴヌクレオチドの固定化は、表面に高密度の陰イオン性カルボキシル基を有するナイロン膜にアミノ修飾オリゴヌクレオチドのアミノ基をアミド結合させることにより、以下の通り行った。
【００３４】
バイオダインＣ（商標；ポール社製）膜を０．１Ｎ  ＨＣｌによりすすぎ、酸性化した後、２０％ＥＤＣ（１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩）に室温１５〜３０分間浸した。脱イオン水及び０．５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）で軽くすすいだ後、ドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にセットした。０．５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）に懸濁されたアミノ修飾オリゴヌクレオチドを１５分間室温で膜と反応させた。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水）／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０によりすすいだ膜を、０．１Ｎ  ＮａＯＨにて１０分間処理し、脱イオン水で軽くすすいだ後風乾した。
【００３５】
（Ｃ）試料ＤＮＡの標識化
試料ＤＮＡの標識化は［γ−３２Ｐ］ＡＴＰによって、５’末端を放射性ラベルした。反応は、ＤＮＡ５’末端標識キット（ＭＥＧＡＬＡＢＥＬＴＭ；宝酒造社製）により行った。
【００３６】
（Ｄ）ハイブリダイゼーション反応
前記のオリゴヌクレオチド固定化フィルターと、放射性標識した試料ＤＮＡとを、５×  ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム・７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）／０．１％  （ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液中にて、４〜１０℃  １時間〜一晩ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション反応後、２×  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ緩衝液にて、４〜１０℃、５分間の洗浄を３回行った。風乾した後、オートラジオグラフィーにて、各ドットの放射線量を測定し、ハイブリダイゼーション強度を算出した。
【００３７】
その結果を表２に示す。結果は対照とした比較例のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度を１とする相対値で示した。特異的領域の配列が異なる場合にハイブリダイゼーション量も変化するが、イノシン（非特異的領域）の導入によりいずれの場合もハイブリダイゼーション量が増大することが判明した。結合の種類及び数が全く同じ場合では、イノシンを３’、５’両末端に導入した場合の方が５’末端のみにイノシンを導入した場合よりもハイブリダイゼーション量が高いことが判明した。３’、５’両末端にイノシンを導入することで、高感度のハイブリダイゼーションが実現される。
【００３８】
【表２】
0003626782.tif 000003
【００３９】
【実施例Ｂ】
ミスマッチの判別
（Ａ）オリゴヌクレオチドの合成
アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ；ＡＢＩ社）製のＤＮＡ合成装置（装置名３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）によって表３に示す配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、比較対象用オリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡを、上記実施例Ａの（Ａ）と同様の方法で合成した。
【００４０】
0003626782.tif 000004
【００４１】
（Ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化
実施例Ａの（Ｂ）と同様にして行った。
（Ｃ）試料ＤＮＡの標識化
実施例Ａの（Ｃ）と同様にして行った。
（Ｄ）ハイブリダイゼーション反応
実施例Ａの（Ｄ）と同様にして行った。
（Ｅ）ミスマッチ判別能の計算
ハイブリダイゼーション反応によって得られた結果より、ミスマッチ判別能を算出した。ミスマッチ判別能とは、下記のＤ値（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を指標とする概念であり、ミスマッチの区別し易さをさす。
【００４２】
【数１】
0003626782.tif 000005
【００４３】
試料ＤＮＡと完全に相補的な配列のハイブリダイゼーション量とは、対照例の配列のハイブリダイゼーション量を指し、ミスマッチを有する配列のハイブリダイゼーション量とは、その対照例に対応する比較例あるいは実施例の配列のハイブリダイゼーション量を指す。Ｄ値は、対照例の配列に対する比較例あるいは実施例の配列のハイブリダイゼーション量の比である。即ち、対照例の配列のＤ値は１であり、比較例及び実施例に関してはＤ値が高ければその配列が対照例の配列と区別し易い（ハイブリダイゼーション量が対照例に対して小さい）ことを表す。
【００４４】
表４に各配列のＤ値を示す。イノシンを導入したオリゴヌクレオチドの方がＤ値が高く、特に３’，５’両末端にイノシンを導入したオリゴヌクレオチドの方がＤ値が高い。ミスマッチの判別能は、イノシンを導入したオリゴヌクレオチド、特に３’，５’両末端にイノシンを導入したオリゴヌクレオチドが優れていることが判明した。
【００４５】
【表４】
0003626782.tif 000006
【００４６】
【実施例Ｃ】
界面活性剤のハイブリダイゼーション反応への影響
（Ａ）ＤＮＡの合成
アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ；ＡＢＩ社）製のＤＮＡ合成装置（装置名３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）によって表５に示す配列を有する本発明のオリゴヌクレオチド、比較対称用オリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡを、上記実施例Ａの（Ａ）と同様の方法で合成した。
【００４７】
【表５】
0003626782.tif 000007
【００４８】
（Ｂ）ＤＮＡの固定化
実施例Ａの（Ｂ）と同様にして行った。
（Ｃ）ＤＮＡの標識化
実施例Ａの（Ｃ）と同様にして行った。
（Ｄ）ハイブリダイゼーション反応
前記のオリゴヌクレオチド固定化フィルターに対して、放射性標識した試料ＤＮＡを、５×  ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム・７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）／７％  Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム緩衝液中にて、４〜１０℃１時間〜一晩ハイブリダイゼーション反応させた。ハイブリダイゼーション反応後、２×  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ緩衝液にて、４〜１０℃、５分間の洗浄を３回行った。また、対照実験として、同様に作製したオリゴヌクレオチド固定化フィルターに対して、５×  ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム・７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）緩衝液中にて、４〜１０℃  １時間〜一晩ハイブリダイゼーション反応させた。ハイブリダイゼーション反応後、２×  ＳＳＣ緩衝液にて、４〜１０℃・５分間の洗浄を３回行った。風乾した後、オートラジオグラフィーにて、各ドットの放射線量を測定し、ハイブリダイゼーション強度を算出した。
【００４９】
その結果を表６に示す。結果は、界面活性剤（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）を用いた場合の背景の放射線量を１とする相対値で示した。ハイブリダイゼーション反応にＮ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムを添加させるとフィルターへの非特異的な吸着によるバックグラウンドのシグナルを低下させる効果とともに、ハイブリダイゼーション強度が増大し、結果としてハイブリダイゼーション感度の向上が認められた。
【００５０】
【表６】
0003626782.tif 000008
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、ハイブリダイゼーション感度を上昇させることが可能となるとともに、完全に相補的なハイブリッドとミスマッチを有するハイブリッド、特にハイブリッドの末端部でのミスマッチが区別し易くなり、それによってハイブリダイゼーション法によるＤＮＡ塩基配列解析が容易になる。
【００５２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000009
【００５３】
配列番号：２
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000010
【００５４】
配列番号：３
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000011
【００５５】
配列番号：４
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000012
【００５６】
配列番号：５
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000013
【００５７】
配列番号：６
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000014
【００５８】
配列番号：７
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000015
【００５９】
配列番号：８
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000016
【００６０】
配列番号：９
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000017
【００６１】
配列番号：１０
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000018
【００６２】
配列番号：１１
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000019
【００６３】
配列番号：１２
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000020
【００６４】
配列番号：１３
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000021
【００６５】
配列番号：１４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000022
【００６６】
配列番号：１５
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000023
【００６７】
配列番号：１６
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000024
【００６８】
配列番号：１７
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000025
【００６９】
配列番号：１８
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000026
【００７０】
配列番号：１９
配列の長さ：８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000027
【００７１】
配列番号：２０
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000028
【００７２】
配列番号：２１
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000029
【００７３】
配列番号：２２
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000030
【００７４】
配列番号：２３
配列の長さ：１２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000031
【００７５】
配列番号：２４
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000032
【００７６】
配列番号：２５
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000033
【００７７】
配列番号：２６
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000034
【００７８】
配列番号：２７
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000035
【００７９】
配列番号：２８
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000036
【００８０】
配列番号：２９
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000037
【００８１】
配列番号：３０
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000038
【００８２】
配列番号：３１
配列の長さ：１６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000039
【００８３】
配列番号：３２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000040
【００８４】
配列番号：３３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000041
【００８５】
配列番号：３４
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000042
【００８６】
配列番号：３５
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド
配列
0003626782.tif 000043
【図面の簡単な説明】
【図１】通常のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリッドを示す模式図。
【図２】本発明のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリッドを示す模式図。
【図１】
0003626782.tif 000044
【図２】
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