(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
cAMP、IP3または細胞内カルシウムなどの第二メッセンジャー活性の活性化に関連し、存在する場合にＧ調節タンパクと結合し、下記アミノ酸配列を有する、実質的に純粋な形のプロスタグランジンF2αレセプター：
0003634361.tif 000006
0003634361.tif 000007
【請求項２】
レセプターが、下記アミノ酸配列を有するレセプターの、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定されるような第二メッセンジャー活性化特性、薬理特性、およびＧ調節タンパク結合特性を有するアミノ酸配列を含有する請求項１記載のレセプター：
0003634361.tif 000008
0003634361.tif 000009
【請求項３】
請求項１記載のレセプターに対する抗体。
【請求項４】
cAMP、IP3または細胞内カルシウムなどの第二メッセンジャー活性の活性化に関連し、存在する場合にＧ調節タンパクと結合するプロスタグランジンF2αレセプターをコードするDNAフラグメントであって、下記アミノ酸配列をコードするDNAフラグメント：
0003634361.tif 000010
0003634361.tif 000011
0003634361.tif 000012
【請求項５】
フラグメントが下記塩基配列を有する請求項４記載のDNAフラグメント：
0003634361.tif 000013
0003634361.tif 000014
【請求項６】
DNAフラグメントが、下記アミノ酸配列を有するレセプターの、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定される第二メッセンジャー活性化特性、薬理特性、およびＧ調節タンパク結合特性を有するレセプターのアミノ酸配列をコードする請求項４記載のDNAフラグメント：
0003634361.tif 000015
0003634361.tif 000016
【請求項７】
（ｉ）ベクター、および
（ii）請求項４〜６のいずれか１項記載のDNAフラグメント
を含む組換えDNA構築物。
【請求項８】
ベクターが真核発現ベクターである請求項７記載の組換えDNA構築物。
【請求項９】
ベクターが原核発現ベクターである請求項７記載の組換えDNA構築物。
【請求項１０】
DNAフラグメントが下記塩基配列の複数の塩基を含む請求項７記載の組換えDNA構築物：
0003634361.tif 000017
0003634361.tif 000018
【請求項１１】
請求項７〜10のいずれか１項記載の組換えDNA構築物で形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
細胞が真核細胞である請求項11記載の宿主細胞。
【請求項１３】
細胞が原核細胞である請求項11記載の宿主細胞。
【請求項１４】
DNAフラグメントが発現され、それによりレセプターが産生されるような条件下、請求項11〜13のいずれか１項記載の形質転換宿主細胞を培養し、次いで、該レセプターを単離することを含む、cAMP、IP3または細胞内カルシウムなどの第二メッセンジャー活性の活性化に関連し、Ｇ調節タンパクと結合するプロスタグランジンF2αレセプターの産生方法。
【請求項１５】
試料を請求項３記載の少なくとも１つの抗体と接触させ、次いで、レセプターおよび抗体の間で形成される複合物の存在または不在を検出する工程を含む、試料におけるF2αレセプターの存在の検出方法。
【請求項１６】
プローブと試料からのDNAフラグメントとの間でハイブリダイゼーションが生じるような条件下、試料を請求項４〜６のいずかれ１項記載のDNAフラグメントからなるDNAプローブと接触させ、次いで、プローブおよびDNAフラグメント間で形成された複合物の存在または不在を検出する工程を含む、試料におけるF2αレセプターをコードするDNAフラグメントの存在の検出方法。
【請求項１７】
レセプター機能を活性化または遮断する条件下、請求項11〜13のいずれか１項記載の宿主細胞によって産生された活性レセプターを薬物と接触させ、次いで、F2αレセプター活性の存在または不在を検出することを含むF2αレセプターと相互作用する薬物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
薬物を宿主細胞と接触させることを含む請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、一般に、レセプタータンパクの分子クローニングおよび発現、特に、例えば、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定される第二メッセンジャーの活性化に関連するプロスタグラジンF2αレセプターおよびそのフラグメントに関する。さらに、本発明は、プロスタグランジンF2αレセプターをコードするDNA配列、かかるDNA配列を含む組換えDNA分子、およびそれにより形質転換される細胞に関する。本発明は、また、F2αレセプターに対して向けられた抗体および該抗体によるF2αレセプターの検出方法に関する。本発明は、さらに、試料におけるDNAフラグメントをコードするF2αレセプターの存在の検出方法、薬物をスクリーニングするための形質転換細胞の使用、およびかかるスクリーニング方法を使用して製造された薬物に関する。
背景情報
プロスタグランジンF2αレセプターは、グアニンヌクレオチド結合調節（Ｇ）タンパクを介するそれらのシグナルトランスダクション経路に関連するホルモンレセプターの大きな分類に属する。かかるレセプターは、最も集中的に研究されたレセプター系の全体にわたっている。プロスタグランジンレセプターは、従来、第二メッセンジャーの刺激に関連し、環状AMP（cAMP）、３−リン酸イノシトール（IP3）または細胞内カルシウムによって測定されると定義されており、Ｇ調節タンパクと結合する［ミュアレム（Muallem）、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）、263:769−774（1989）］。対照的に、プロスタグランジンレセプターの活性化により、アデニリルシクラーゼ活性の阻害、ホスファチジルイノシトール代謝回転の阻害およびCa2+可動化の阻害を含む種々の応答が生じる［ミュアレム、バイオケミカル・ジャーナル、263:769−774（1989）およびダンカン（Duncan）、エンドクリノロジー（Endocrinology）128:1519−1526（1991）］。レセプターの範疇において異質性を示す証拠が増えた［バラピュア（Balapure）、バイオロジー・オブ・リプロダクション（Biol.Reprod.）、41:385−392（1989）］。
２つのプロスタグランジンレセプター、すなわち、ヒトおよびマウスのトロンボキサンA2レセプターならびにマウスのプロスタグランジンE3レセプターは、従前にクローン化された［各々、ヒラタ（Hirata）、ネイチャー（Nature）349:617−620（1991）；ナンバ（Namba）、BBRC 184:1197−1203（1992）；およびスギモト（Sugimoto）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）267:6463−6466（1992）］。
プロスタグラジンF2αレセプターは、臨床治療学的観点から非常に重要である。これらのレセプターを活性化させる薬物（作用薬）は、緑内障の治療に使用され［アルム（Alm）、アーカイブズ・オフサルモロジー（Arch.Ophthalmol.）109:1564−1568（1991）］、一方、プロスタグランジンF2αレセプターを遮断する薬物（拮抗薬）は、例えば、肺および子宮における病理学的症状を治療するために治療学的に使用される。それは、可溶化レセプターで内在性プロスタグランジンF2αを滴定すること、ならびに、リガンドの精製における固定化レセプターおよびその類似物を使用することができる医薬的価値を有するものである。それらの臨床的利用性にもかかわらず、現在入手可能なプロスタグランジン2Fα作用薬および推定上の拮抗薬による１つの問題は、それらが、レセプターとの相互作用を介して作用する多くの他の薬物と同様に多くの副作用を有していることである。これらの副作用は、主に、レセプター特異性の欠落による。すなわち、用いられている薬物は、プロスタグランジンF2αレセプターとだけではなく、他のレセプターとも相互作用する。ミュアレム、バイオケミカル・ジャーナル、263;769−774（1989）を参照のこと。
臨床薬理および製薬工業の主な目標は、現在用いられているものよりも大きな効果を有するより選択的な薬物の開発である。この方法の障害は、眼組織における研究のために入手可能なプロスタグランジンF2αレセプタータンパクがあまり豊富ではないこと、および、再度薬物をスクリーニングすべきレセプターの好適な不均一モデル系の欠落である。
発明の概要
本発明は、プロスタグランジンF2αレセプターをコードするcDNAをクローニングし、これらのcDNAを含有する真核発現ベクターを構築し、一連の安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞系または機能性プロスタグランジンF2αレセプターを豊富に発現する原核細胞を産生することからなる新規アプローチによって、この問題の解決を提供するものである。プロスタグランジンF2αレセプターの均一な個体群を発現するこれらの細胞系は、製薬工業などにより使用されて、薬物をスクリーニングし、種々の生化学、生理学および薬理学技術を使用してプロスタグランジンF2αレセプターを研究することができる。
この目的を達成するために、本発明者らは、例えば、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定される第二メッセンジャーの活性化に関連するラットプロスタグランジンF2αレセプターサブタイプをコードするcDNAを単離した。このF2αレセプターをコードするcDNAを種々の真核および原核発現ベクター中に挿入し、この機能性タンパクを発現する種々の哺乳動物細胞系の構築において使用される。得られたF2αレセプター発現細胞系を使用して、放射リガンド結合および第二メッセンジャーアッセイなどの種々の技術を使用して、作用薬および拮抗薬の、F2αレセプターによる親和性および効力を研究することができる。
したがって、本発明は、cAMP、IP3または細胞内カルシウムなどの第二メッセンジャーの刺激に関連し、存在する場合にグアニンヌクレオチド結合調節（Ｇ）タンパクと結合するF2αレセプターに関する。
また、本発明は、前記プロスタグランジンF2αレセプターをコードするDNAフラグメントに関する。
また、本発明は、ベクターおよび前記DNAフラグメントからなる組換えDNA構築物または分子に関数する。
さらに、本発明は、前記組換えDNA構築物で形質転換された宿主細胞に関する。
また、本発明は、前記プロスタグランジンF2αレセプターの産生方法に関する。該方法は、DNAフラグメントをコードするF2αレセプターが発現され、プロスタグランジンF2αレセプターが産生されるような条件下で前記宿主細胞を培養することからなる。
また、本発明は、F2αレセプターに対して向けられる抗体に関する。
また、本発明は、該試料をかかる抗体と接触させることによる試料におけるF2αレセプターの存在の検出方法に関する。
さらにまた、本発明は、該試料を、F2αレセプタータンパクまたはポリペプチドをコードするDNAフラグメントからなるDNAプローブと接触させて、それにDNAフラグメントをハイブリダイズさせることによるF2αレセプターをコードするDNAフラグメントの試料における存在の検出方法に関する。
また、本発明は、前記形質転換宿主細胞を該薬物と接触させることによるF2αレセプター活性化または遮断活性についての薬物のスクリーニング方法に関する。
また、本発明は、F2αレセプター活性化または遮断活性について薬物候補をスクリーニングすることからなる、薬物の製造方法に関する。
また、本発明は、F2αレセプター活性化または遮断活性について薬物候補をスクリーニングすることにより製造される薬物に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図Ａおよび第１図Ｂは、ラットプロスタグランジンF2αレセプターの配列および他のＧタンパク結合レセプターの配列との比較を示す。
第１図Ａは、最長オープンリーディングフレームの推測されるアミノ酸配列と一緒にF2αレセプターのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列は、推定上の開始メチオニンから番号が付けられ、各ラインの左に示され、一方、各ラインの右にアミノ酸番号を示す。仮定されるＮ結合グリコシル化部位は、星印によって示される。cAMP依存性タンパクキナーゼによるリン酸化のための有効部位には、下線が引かれている。
第１図Ｂは、プロスタグランジンF2αレセプターアミノ酸配列の他の公知のプロスタグランジンレセプターの配列との比較を示す。ヒトトロンボキサンA2レセプターのアミノ酸配列（２）およびマウスプロスタグランジンE3レセプター（１）は、ラットプロスタグランジンF2αレセプター配列（３）とのホモロジーが最適になるように配置される。F2αおよび２つの他のプロスタグランジンセプター間のアミノ酸同一性は、肉太の活字で示す。推定上の膜内外（TM）領域は、破線によって示されている。
発明の詳細な説明
本発明は、例えば、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定される第二メッセンジャーの活性化に関連し、存在する場合にグアニンヌクレオチド結合調節（Ｇ）タンパクと結合するプロスタグランジンF2αレセプターに関する。本発明は、さらに、F2αレセプタータンパクの全部または一部をコードするDNA配列（フラグメント）に関する。本発明は、また、かかるDNA配列を含有する組換え構築物、それにより形質転換された細胞、ならびに該レセプター遺伝子の発現方法にも関する。また、本発明は、F2αレセプターに対する抗体および試料におけるF2レセプターの存在を検出するための該抗体の使用に関する。本発明は、さらに、試料におけるF2αレセプターをコードするDNAフラグメントの存在の検出方法に関する。本発明は、また、形質転換された細胞による薬物のスクリーニング方法にも関する。さらにまた、本発明は、かかるスクリーニング工程からなる薬物の製造方法、ならびに該方法によって製造された薬物に関する。
本発明のF2αレセプタータンパクまたはポリペプチドは、グアニンヌクレオチド結合調節タンパクを介するそれらのシグナルトランスダクションに関連するレセプターの大きな分類の１つである。詳細には、本発明のF2αレセプターは、例えば、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定される第二メッセンジャーの活性化に関連しており、存在する場合、Ｇ調節タンパクと結合する（例えば、原核系には、Ｇ調節タンパクがかけている）。
本発明に関して、本明細書で使用される場合、「F2αレセプター」なる用語は、広い意味で理解されるべきである。したがって、F2αレセプターは、第１図Ａに示される完全な配列を有することができるか、または、実質的に、例えば、cAMP、IP3もしくは細胞内カルシウムにより測定される同一の第二メッセンジャー特性、薬理特性、および第１図Ａに対応する分子（例えば、F2αレセプタータンパクの対立異種）のＧ調節タンパク結合特性を持つ分子のアミノ酸配列を有することができる。別法として、本発明のF2αレセプタータンパク（またはポリペプチド）は、第１図Ａに示されるタンパクの活性部分もしくは一部に対応するアミノ酸配列（または、その対立バリエーション）を有することができる。例えば、F2αレセプタータンパク（またはポリペプチド）は、第１図Ａ配列のエピトープに対応するアミノ酸配列（または、その対立バリエーション）を有することができる。
F2αレセプタータンパクまたはポリペプチドは、実質的に純粋な形態で、すなわち、実質的に、通常会合されるタンパクおよび核酸を含まない形態で存在することができる。F2αレセプタータンパクは、当該技術分野で知られているプロトコールを使用して精製されることができる。F2αレセプタータンパクは、当該技術分野で知られているプロトコールで抗原としても使用されて、それに対するモノクローナルおよびポリクローナルの両方の抗体を産生することができる。
前記のとおり、本発明は、第１図Ａに示される全アミノ酸配列をコードするDNA配列（cDNA配列を含む）（第１図Ａに示される特異的cDNA配列は、唯一の実施例である）またはそのいずれかの部分にも関する。本発明に関するDNA配列としては、また、実質的には、例えば、cAMP、IP3または細胞内カルシウムにより測定される同一の第二メッセンジャー特性、薬理特性、およびF2αレセプター（例えば、第１図Ａの配列の対立形態）のＧ調節タンパク結合特性を有するタンパク（またはポリペプチド）をコードするものも挙げられる。
さらに、本発明は、前記ベクターおよびDNA配列を含む組換えDNA構築物に関する（好都合には、第１図Ａに示されるレセプター、または、例えば、cAMP、IP3もしくは細胞内カルシウムにより測定される同一の第二メッセンジャー特性、薬理特性、およびタンパクのＧタンパク結合特性を有するレセプターをコードするDNA配列）。
該ベクターは、ウイルスまたはプラスミドベクターの形態（例えば、ラムダZAP II）を取ることができる。DNA配列は、例えば、プロモーターを含む調節素子に操作的に連結されるベクター中に存在することができる。組換え構築物は、真核もしくは原核細胞、または、好都合には、哺乳動物細胞を形質転換するのに好適であり得る。
本発明は、前記組換え構築物で形質転換された宿主細胞にも関する。該宿主は、原核（例えば、細菌）、下等真核（すなわち、酵母を含む真菌類）または高等真核（すなわち、ラットおよびヒトを含むがこれに限定されない全ての哺乳動物）であり得る。例えば、安定な形質転換は、チャイニーズハムスター卵母細胞（CHO−細胞）中に行われる。形質転換は、当該技術分野で知られている方法を使用して行うことができる。形質転換宿主細胞は、前記DNA配列（該配列は、組換え構築物の一部を構成する）ための供給源として使用され得る。組換えレセプターが発現系の形を取る場合、形質転換細胞は、前記レセプターのための供給源として使用され得る。
F2αレセプタータンパクの存在は、試料（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物由来の組織、または細胞培養物）をレセプターに対する抗体と接触させることによって、該試料において検出することができる。レセプターおよび抗体間で形成される複合物の存在または不在の検出は、当該技術分野でよく知られている方法によって行われる。F2αレセプタータンパクをコードするDNAセグメントの存在は、試料（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物由来の組織、または細胞培養物）をDNAセグメントまたはそのフラグメントからなるDNAプローブと接触させることによって、該試料中で検出することができる。当該技術分野でよく知られている方法を使用し、ハイブリダイゼーションが生じるような条件下で、プローブおよび試料からのDNAセグメント間で複合物を形成させることができる。該複合物の存在または不在の検出は、当該技術分野でよく知られている方法によって行われる。
本発明のプロスタグランジンF2αレセプタータンパクおよび核酸配列は、研究装置（例えば、レセプタータンパクメカニズムを理解し易くするため）および臨床装置（例えば、作用薬および拮抗薬をスクリーニングするためのレセプターのモデルシステムとして使用するため）の両方において使用することができる。例えば、プロスタグランジンF2αレセプターと相互作用するように設計された治療薬は、しばしば、レセプター特異性を欠いているために副作用を有する。F2αレセプターを発現する細胞系を使用して、放射リガンド結合および第二メッセンジャーアッセイなどの種々の方法を使用して作用薬および拮抗薬のF2αレセプターとの親和性および効力を研究することができる。薬物処理した細胞の活性を対照細胞と比較して、F2αレセプターの活性化または遮断を評価することができる。
診断目的のために、細胞中のF2αレセプターcDNAの発現は、公知の方法を使用して測定することができる。これを行うために、F2αレセプターに対する抗体（F2αレセプタータンパクの全部または一部を生産し、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたはネズミなどの種々のタイプの動物にこれらを注射することによって調製される）を使用することができる。
本発明を、以下にさらに詳細に説明し、F2αレセプターについてのcDNAクローンの単離および特徴付けに関する以下の非限定的実施例において説明する。
プロスタグランジンF2αレセプターについてのcDNAクローンの単離および特徴付け
（ｉ）プロスタグランジンF2αレセプターcDNAのクローニングおよび配列決定分析：
例えば、cAMP、IP3または細胞内カルシウムによって測定される第二メッセンジャー活性化に関連するプロスタグランジンF2αレセプター（簡素化のために、以下、FP−レセプターと称することもある）をクローン化するために、PCR法を使用して、ラット黄体から精製したmRNAからcDNA配列を選択的に増幅した。ヒツジおよびウシの黄体が、このレセプターサブタイプを発現することが従前に判明していた［バラピュア（Balapure）、バイオロジー・オブ・リプロダクション（Biol.of Reproduction）41:385−392（1989）ならびにオルリッキィ（Orlicky）、プロスタグランジンズ・ロイコトリエンズ・アンド・エッセンシャル・ファティ・アッシズ（Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids）41:51−61（1990）］。市販のcDNAライブラリーを使用して、ラット黄体からcDNAを得た。予めクローン化した７つの膜内外レセプタースーパーファミリーメンバーの第２および第７および第３および第６膜内外領域から誘導された非常に変質した一対のプライマーを用いて、PCR増幅を行った。このプロセスの結果、いくつかのcDNAフラグメントの増幅を生じた。
これらのフラグメントは、まず、DNA配列分析によって特徴付けられた。これらのフラグメントのうちの１つは、関連する予めクローン化されたＧタンパク結合レセプターに対して相当の配列ホモロジーを示すことが判明し、次いで、それを使用して、全長クローンを単離するためにラット黄体cDNAライブラリーをスクリーニングした。約1.7〜3.3kbの範囲の挿入サイズを有する24のcDNAクローンを単離した。その全ては、サザン分析について32P標識PCRプローブで強くハイブリダイズした。約3kbの挿入を有するこれらのクローンのうちの１つを配列決定し、該配列のコード化領域において関連レセプターに対して55％を超えるアミノ酸配列ホモロジーを示すことが判明した。該ホモロジーは、異なるレセプターおよび異なる種、ヒト対ラットであるにもかかわらず、全ての組合せにおいてほぼ同一である。該ヌクレオチドおよびクローンFRについて推測されるアミノ酸配列を第１図Ａに示す。このcDNAにおける最長オープンリーディングフレームは、40.65kDaの理論分子量を有する366残基タンパクをコードする。
コザック（Kozak）のコンセンサス開始配列［コザック（Kozak）、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、12:857−872（1984）］と同様のこのリーディングフレームにはATGを有する隣接配列があるが、１位のMetコドンは、実際には、最も起こりそうな位置を提供する（第１図Ａ）。
翻訳されたタンパクの疎水性分析により、３つの細胞外ループおよび３つの細胞内ループによって連結された膜内外スパンニングドメインを表すように記される約20〜25疎水性残基の７つのクラスターが明らかになる。このパターンは、他のクローン化Ｇタンパク結合レセプターについて見れるものと同様である。ここで、NH2末端は、細胞外であることを提案されており、COOH末端は、細胞形質中に突出する［ドールマン（Dohlman）、バイオケミストリー（Biochemistry）、26:2657−2664（1987）］。NH2末端は、Ｎ連結グリコシル化のための２つのコンセンサス部位を含有するが、一方、予想された第３の細胞形質ループは、それを示す。cAMP依存性タンパクキナーゼによるリン酸化のためのコンセンサス認識部位は、細胞形質ループおよびカルボキシ末端において見つけられる。さらに、長いCOOH末端は、調節リン酸化のためのさらなる部位を表すことも可能ないくつかのセリン残基を含有する。これらのリン酸化は、膜内外シグナル化の調節およびレセプターの脱感作のために提案される［シブリィ（Sibley）、セル（Cell）、48:913−922（1987）］。
（ii）プロスタグランジンF2αレセプタークローンについてのアミノ酸配列の特徴付け
種々のプロスタグランジンレセプターの配列を有するcDNAクローンについての推測されるアミノ酸配列の比較を第１図Ｂに示す。これから分かるように、最も高い同一性の領域は、予想される膜内外スパンニングドメイン内で生じると思われる。これらの領域内で、FPレセプタータンパクは、ラットプロスタグランジンE3およびトロンボキサンA2レセプター、マウスおよびヒトと最も高い配列同一性を示す。これらのレセプターのうち、NH2およびCOOH末端ならびに細胞外ループおよび細胞内ループは、有意に、より逸脱している。FPの第３推定膜内外ドメイン内で、配列決定された全ての生体アミンレセプターと共通しているアスパラギン酸残基は保存されていない［ストレイダー（Strader）、FASEB J.、3:1825−1832（1989）］。さらにまた、FPの第５膜内外スパンニングドメインは、カテコールアミンレセプターの間で保存されない２つのセリン残基を含有し、カテコール基を有するアゴニストリガンドの認識について決定的である［ストレイダー、FASEB J.、3:1825−1832（1989）］。
さらにまた、F2αレセプターをコードする配列から誘導されたプライマーを、用いて、F2αレセプターを発現すると予想されるヒト組織由来のcDNAライブラリー中でPCRを使用して、正しいサイズのフラグメントが見つけられ、これは、それらの間で同一の制限フラグメントを示した。該組織は、例えば、眼、卵巣、子宮および腎臓であった。
これらの観察は、本発明のF2αレセプターcDNAクローンが内的プロスタグランジンリガンドに対するレセプターをコードすることを示唆する。
実施例
新規Ｇタンパク結合レセプターについてのcDNAクローンの単離および特徴付け
FP−レセプターをクローン化するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を使用して、ラムダZAPcIIベクター［ストラータジーン（Stratagene）、カダログ番号936504］中でラット黄体cDNAライブラリーからのcDNA配列を増幅した。該ライブラリーの１×106pfuを増幅し、モレキュラー・バイオロジー（Molecular Biology）（1990）1.13.1−1.13.3におけるカレント・プロトコールズ（Current Protocols）の記載に従って、ラムダDNAを調製した。ラムダDNA 50ngを、25μｌの総反応容量で、各々１μＭの２つのプライマー：
0003634361.tif 000002
およびdNTP 200μＭおよびTaq DNAポリメラーゼ［パーキン・エルマー−セタス（Perkin Elmer−Cetus）、米国］を用いてPCR増幅を45サイクル行った。使用されたタイミングは、摂氏95度で45秒（第１サイクルにおいては３分）、摂氏50度で３分、摂氏72度で３分であった。摂氏72度工程は、各サイクルについて６秒延長された。該反応精製物を、１％LMPアガロース［アメリカ合衆国カリフォルニア州リッチモンドのバイオラド・ラボラトリーズ（BioRad Laboratories）、カダログ番号162−0020］において電気泳動によって精製した。ゲルから個々のバンドを切り取り、前記と同一の２つのプライマー、すなわち：
0003634361.tif 000003
を各々100μＭ、およびdNTP 200μＭおよびTaq DNAポリメラーゼ2,5uを用いて総反応容量20μｌでPCR増幅を20サイクル行った。使用されたタイミングは、前記タイミングと同一であった。
TAクローニングキット［アメリカ合衆国、インビトロジェン・コーポレイション（Invitrogen Corporation）、カダログ番号K2000−１］の指示に従って、反応生成物をベクターPCR1000に連結した。得られたプラスミドは、pKGE858と称される。プラスミドDNAのミニ調製物は、キアジーン−チップ（Quiagene−tip）100キット［ドイツ国、ディアジーン−ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング（Diagene−GmbH）］を用いて行った。当該技術分野でよく知られている方法に従って挿入配列決定を行った。したがって、cDNA挿入は、M13マルチプルクローニング部位上の領域と相同のプライマーを用いて配列決定した。全cDNA配列を明らかにするために、遺伝子歩行ストラテジーを使用した。全ての配列分析は、Taq・ダイ・ジオキシ・ターミネーター・サイクル配列決定キット（Taq Dye Dioxy Terminator cycle sequencing kit）のためのアプライド・バイオシステム（Applied Biosystem）のプロトコールに従って、アプライド・バイオシステム・モデル（Applied Biosystem Model）373A DNA配列決定システム［アメリカ合衆国、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド（Applied Biosystems Inc.）］で行った。生じた主なデータは、アメリカ合衆国マジソンのジェネティクス・コンピューター・グループ・インコーポレイテッド（Genetics Computer Group Inc.）からの配列分析プログラムを使用してVAXコンピューターで処理した［デヴェロー（Devereux）、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）12（１）:387−395（1984）］。挿入のうちの１つは、関連レセプターとホモロジーの配列を示すことが判明した［ヒトトロンボキサンA2レセプターおよび他のクローン化プロスタグランジンレセプター；ヒラタ（Hirata）、ネイチャー（Nature）349:617−620（1991）、スギモト（Sugimoto）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）267:6463−6466（1992）、およびナンバ（Namba）BBRC 184:1197−1203（1992）］。次いで、この挿入を、ラット黄体cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用して、全長クローンを単離した。ラムダZAP IIベクターにおいて構築されたラット黄体cDNAライブラリーからの組換え体１×106を前記挿入を用いてスクリーニングした。前記で得られたプラスミドpKGE858のBot I/Hind III 600bpフラグメントからなるプローブを、アマーシャムズ・メガプライム（Amershams Megaprime）DNA標識化系［英国のアマーシャム（Amersham）、RPN1607］で標識した。ニトロセルロースフィルター［ハイボンド（Hybond）−Ｎ、英国のアマーシャム］を、摂氏65度で16時間、前記プロ−ブを用いて、10％（w/v）硫酸デキストラン、１％ドデシル硫酸ナトリウム、1M塩化ナトリウムおよび100μg/ml音波処理サーモン精子DNA［ドイツ国、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）］中でハイブリダイズした。フィルターの高ストリンジェンシー洗浄を、摂氏65度で30分間、２×SSCおよび１％ドデシル硫酸ナトリウムで行った。有効にハイブリダイズするファージクローンは、さらに、初期スクリーニングにおけると同一のプローブを使用して再スクリーニングすることによって精製された。25の有効にハイブリダイズする精製ファージクローンは、イー・コリ（E.coli）XL1−ブルー（Blue）［アメリカ合衆国のストラータジーン（Stratagene）］において拡大され、得られたフ���ージストックを使用して、ストラータジーン・プロトコールに従って、ヘルパーファージR408を使用するファージミド（phagemid）排除によってcDNA含有pBluescriptプラスミドを調製した。キアジーン−チップ100［ドイツ国のディアジーン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング（Diagene GmbH）］を用いてプラスミドDNAを調製し、さらに、制限分析によって分析した。当該技術分野でよく知られているDNA配列決定法により、最長挿入を有する４つのプラスミドを分析した。これらの挿入のうちの１つのDNA配列を第１図Ａに示す。
同一のものを発現すると予想される組織中でF2αレセプターを検出するため、膜内外（TM）領域VIおよびVIIにおいてF2αレセプターをコードする配列から誘導されたプライマーを使用した。TM VIにおけるプライマー配列は、
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であり、TM VIIにおける主な配列は、
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であった。増幅生成物は、173bpの大きさを有した。PCR反応は、前記のとおり行われた。ヒトフラグメントにおいて固有である制限酵素Hae IIIでフラグメントを切断することによって、各々、100および73bpの大きさを有する２つのバンドを得た。cDNAライブラリーからのフラグメントは、全て、これらの特徴を示した。
本明細書中に前記した全ての文献の全内容は、出典明示により明細書の記載とする。
前記発明は、明確さおよび理解のためにある程度詳細に説明したが、形および詳細の様々な変化を本発明の真の範囲から逸脱せずになすことができることは、この説明の知識から当業者には明白であろう。
【図１Ａ（２）】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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