(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列をコードするｃＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２記載のｃＤＮＡを含有するクローニングベクター。
【請求項４】
配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１または２記載のｃＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターを保有する形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体により生産され、請求項１又は請求項２に記載のｃＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列からなる請求項８記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８または９記載のポリペプチドを発現させるための条件下で請求項７記載の形質転換体を培養することからなるポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
請求項８または９記載のポリペプチドを抗原として調製した抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、日本産アコヤガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｆｕｃａｔａ）の外套膜組織（外套膜上皮細胞）が産生する新規なポリペプチド遺伝子のｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡを含有するベクター、前記ベクターで形質転換された宿主細胞、それにより生産されるポリペプチド、その製造方法、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、前記ポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは分解ペプチドを含有する化粧品に関する。
【０００２】
［発明の目的］
細胞からは、その維持、増殖および成長等に関連した様々な因子が産生されている。例えば、アコヤガイ外套膜上皮細胞からは、貝殻形成に係わる因子、および生体防御に係わる因子、その他、多くの因子が産生されている。本発明者等はこの点に着目し、ある種の細胞（例えば、アコヤガイ外套膜上皮細胞）が産生している新規な因子（ポリペプチド）を見出すべく鋭意検討を行った。
【０００３】
また、化粧品の新たな原料の開発あるいは真珠養殖におけるピースの新たな選別方法（当該ポリペプチドを多く含有するピースを選り分ける方法）の開発をも目的とする。
【０００４】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
従来、ある特定のポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培養液中に目的とするポリペプチドを確認し、次いでポリペプチドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングするという方法、あるいはその生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的に用いられていた。
【０００５】
しかし、アコヤガイ外套膜上皮細胞が産生する因子に関する情報は極めて少なく、また、不溶性を示すものが多いことが、その単離、精製および生物活性の確認を困難なものとしている。
【０００６】
一方、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを迅速に行うことができるようになった。また、遺伝子からその遺伝子の機能を固定するリバースジェネティクス(Reverse Genetics)の諸方法の発展も著しい。
【０００７】
そこで、本発明者等は、これらの方法を用いて新規なポリペプチドを見出すことにした。すなわちアコヤガイ外套膜上皮細胞等からｍＲＮＡを単離し、これを出発原料としてｃＤＮＡを得、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。その結果、新規なポリペプチドをコードするＤＮＡを見出すことに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
核酸配列データベース(EMBL-GDB Rel.41) 、蛋白質データベース(SWISS-PROT Rel.30) に登録されている既知のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を調査したが、同一は無論、相同性の高いものも無かった。従って本発明のＤＮＡ、ポリペプチドは全く新規なものであることが確認された。
【０００９】
ここで、アコヤガイ外套膜上皮細胞が分泌するポリペプチドについて説明する。アコヤガイはその外面を強固な殻で覆い、外敵等から身を守っている。一種の生体防御を担うこの殻は、外套膜上皮細胞により作られることが知られている。貝殻は主に炭酸カルシウムの結晶とポリペプチドより構成する。さらにアコヤガイ貝殻は３層からなる構造上の差異が存在し、外側から、殻皮層、稜柱層、真珠層と呼ばれる。この構造上の違いはポリペプチドの違いによるものと考えられている。
【００１０】
現在までに知られている、各層を構成するポリペプチドの違いは、そのアミノ酸組成の違いのみである。これは、大部分のポリペプチドが水やその他、殆どの溶媒に不溶なためであり、このことがこれらポリペプチドの解析を遅らせる要因となっている。
【００１１】
これらポリペプチドの内、真珠層を構成するポリペプチドは、昔から様々な薬、例えば、風邪薬、胃薬等として利用されており、現在でも一部地域において利用されている。また昔から現在に至るまで化粧品有効成分としても利用されている。
【００１２】
また、貝殻構造上の真珠層は、宝石として広く人々に親しまれている真珠と同等であるとみなされている。真珠は多種の貝殻でできた丸い核を、アコヤガイ外套膜の組織片であるピースとともにアコヤガイ生殖腺内に移植して、およそ１〜３年で出来上がる。
【００１３】
このことから、宝石としての真珠の価値に大きく影響する色、巻に対して、これらポリペプチドが非常に重要な役割を果たしていることがうかがえる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の通りである。すなわち、
（請求項１）配列番号１の塩基配列をコードするｃＤＮＡ。
【００１５】
（請求項２）配列番号２の塩基配列をコードするｃＤＮＡ。
【００１６】
（請求項３）請求項１または２記載のｃＤＮＡを含有するクローニングベクター。
【００１７】
（請求項４）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【００１８】
（請求項５）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
【００１９】
（請求項６）請求項１または２記載のｃＤＮＡを含有する発現ベクター。
【００２０】
（請求項７）請求項６の発現ベクターを保有する形質転換体。
【００２１】
（請求項８）請求項７の形質転換体により生産され、請求項１又は請求項２に記載のｃＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【００２２】
（請求項９）配列番号３のアミノ酸配列からなる請求項８のポリペプチド。
【００２３】
（請求項１０）請求項８または９記載のポリペプチドを発現させるための条件下で、請求項７に記載の形質転換体を培養することからなるポリペプチドの製造方法。
【００２４】
（請求項１１）請求項８または９記載のポリペプチドを抗原として調製した抗体。
【００２５】
【発明の実施の形態】
上記において、配列番号１（または２）で示される塩基配列を有するＤＮＡ（請求項４、５）とは、一般に、ＤＮＡの９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％が配列番号１（または２）で示される塩基配列を有するＤＮＡであることを意味する。またそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる（同様の作用効果が得られる）。
【００２６】
配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡがコードするポリペプチド、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、一般にポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを意味する。またそれらのホモローグのフラグメントとは一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同なものであり、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記載される（同様の作用効果が得られる）。
【００２７】
配列番号１または２で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０、または１００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される（同様の作用効果が得られる）。
【００２８】
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなるクローニングまたは発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子等からなるプラスミド、ウイルス、またはファージベクターが挙げられる。ベクターは一つまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ(in vitro)に於いて例えば、ＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【００２９】
さらに、本発明には、配列番号１または２で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む、本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫、昆虫細胞または哺乳動物細胞（直接生体に導入する場合は非ヒト。）が挙げられる。
【００３０】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。培養は本発明のポリペプチドが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行われることが好ましい。
【００３１】
本発明のＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
【００３２】
また、本発明のＤＮＡ、そのホモローグまたはフラグメントは、ノーザン(Northern)解析のプローブとして、あるいはＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) のプライマーとして利用することで、各固体間での本ポリペプチドの発現量、その他の比較が可能となる。
【００３３】
本発明は、本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さらに本発明は、本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは、その断片を抗原として用い、通常のハイブリドーマの技術により製造することができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物、例えば、ラットやウサギ等（非ヒト）に本発明のポリペプチドを接種し血清を回収するといった通常の方法により製造することができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号３で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
【００３５】
よく知られているように、一つのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類が知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００３６】
配列番号１で示される本発明のＤＮＡには、配列番号３で示されるポリペプチドをコードする全ての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産が向上することがある。
【００３７】
配列番号２で示される本発明のＤＮＡは、配列番号１で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表す。
【００３８】
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行われる。すなわち、
(I) 本発明のポリペプチドを産生するアコヤガイ外套膜組織からｍＲＮＡを分離し、
(II)該ｍＲＮＡから１本鎖ＤＮＡ（ファーストストランド）、次いで２本鎖ＤＮＡ（セカンドストランド）を合成し（ｃＤＮＡの合成）、
(III) 該ｃＤＮＡを適当なファージベクターに組み込み、
(IV)パッケージングの後、得られた組み換え感染性ファージを宿主細胞に感染させ（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(V) 得られたｃＤＮＡライブラリーを特異プローブでスクリーニングし、
(VI)得られたクローンについて、その全長をシークエンスすることによって作製することができる。
【００３９】
説明を加えると、工程(I) は、アコヤガイ外套膜を材料として、Chomczynski,P.等の方法［Anal.Biochem.,162,156(1987) に記載。］に従って行われる。
【００４０】
(II)、(III) および(IV)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変したGubler & Hoffman法［Gene.,25,263(1983)に記載。］に準じて行われる。(III) の工程で用いられるファージベクターとしては多数知られているが（例えば、λgt10, λgt11）、ここで言うファージベクターには、ヘルパーファージを感染させることでプラスミドに変換できるファージベクター(Phagemid)も含まれる。
【００４１】
(V) の工程は、Molecular Cloning ［Sambrook,J,.Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)］に記載の方法に従って行われる。
【００４２】
(VI)の工程のシークエンシングはマキサム・ギルバート(Maxam-Gilbert) 法やジデオキシ・ターミネーター法により行われる。
【００４３】
このようにして得られたＤＮＡは、（Ａ）その塩基配列を可能な読み枠においてアミノ酸配列に変換し、（Ｂ）得られたアミノ酸配列から、疎水性プロファイルを調製し、さらに開始コドン（ＡＴＧ）のすぐ後ろにある（分泌蛋白は、そのＮ末端に高疎水性領域のシグナルペプチドを有している）高疎水性領域の存在を確認し、さらに（Ｃ）該ＤＮＡが全長あるいはほぼ全長であることを確認する必要がある。
【００４４】
上記の確認操作中、（Ｃ）はノーザン(Northern)解析により行われる。配列番号１および２で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は化学合成によって、あるいはＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction) 法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本発明のＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、本発明のＤＮＡを必要量得ることができる。
【００４５】
本発明のポリペプチドを取得する方法としては、（１）生体または培養細胞から単離精製する方法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法等が挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
【００４６】
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
【００４７】
例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）で発現させる場合には、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡを適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９等）に挿入して、発現ベクターを作製する。あるいは、市販の発現ベクター（例えば、ｐＫＫ２２３−３：ファルマシア、ｐＥＴベクター：Stratagene、ｐＴＶベクター：Takara等）に、配列番号１で示されるＤＮＡを接続して作製することもできる。
【００４８】
大腸菌としては、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５株などが使用できるがこれに限定されるものではない。
【００４９】
次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。またバクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとの融合蛋白(fusion protein)として生産し、目的とするポリペプチドを得ることもできる。
【００５０】
また、昆虫または昆虫細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号１あるいは２で示されるＤＮＡを適当なベクターに挿入してトランスファーベクターを作製する。次に、バキュロウイルス(Autographa california NPV) のプロモーターを持つベクターとともにコ・トランスフェクトして組み換えウイルスを作製する。得られた組み換えウイルスを、適当な昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、あるいはＴｎ５細胞等）あるいは昆虫体内（例えば、カイコ等）に導入し、目的とするポリペプチドが生産される。
【００５１】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号１あるいは２で示されるＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その細胞中に目的とするポリペプチドが生産される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００５２】
本発明のポリペプチドは化粧品への適用が可能となる。すなわち、本発明のポリペプチドを、通常使用されている他成分と混合して化粧品用組成物とすることができる。また、例えばＰＣＲ法により、真珠養殖におけるピースの新たな選別方法（当該ポリペプチドを多く含有するピースを選り分ける方法）の開発も可能になる。
【００５３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００５４】
実施例１（ｍＲＮＡの分離精製）
アコヤガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｆｕｃａｔａ）の外套膜上皮細胞［前記アコヤガイは、今日において、国内外において容易に入手可能である。なお、これの外套膜上皮細胞は凍結保存に耐えられず、また、その他の保存方法、保存条件下（培地等）も未だ見出されていないことから、現在のところ、分離した状態では（細胞としては）生存できない。これを理由に、工業技術院生命工学工業技術研究所の特許微生物寄託センターによってこの細胞の受託が拒否された。受託拒否証明書入手済（識別のため表示：Ｐ．ｆｕｃａｔａ−Ｍ０１）。またアコヤガイ自身の受託も認められなかった。上記したアコヤガイ（Ｐｉｎｃｔａｄａ  ｆｕｃａｔａ）は、出願人自らが保管しており譲渡可能である］の約３ｇを用い、Chomczynski,P.等の方法［Anal.Biochem.,162,156(1987) に記載。］に従い、全ＲＮＡを分離した。
【００５５】
すなわち、４Ｍ  ＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシル、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）中で組織をホモジナイズし、フェノール／クロロホルム抽出を２回した後、イソプロパノールを加え、遠心（１０，０００×ｇ、１０分）して、沈殿中に約２００μｇの全ＲＮＡを回収した。さらにこれから、オリゴ（ｄＴ）ラテックス粒子（ＴＡＫＡＲＡより販売）を使い、ｍＲＮＡを分離し、２．５μｇのPoly（Ａ）＋ＲＮＡを精製回収した。
【００５６】
実施例２（ｃＤＮＡライブラリーの作製）
ｃＤＮＡライブラリーは、Gubler & Hoffman法［Gene.,25,263(1983)に記載］の変法にて作製した。
【００５７】
すなわち、実施例１で分離精製したPoly（Ａ）＋ＲＮＡ２．５μｇから、ランダムヘキサマープライマー、およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、逆転写酵素により１本鎖ＤＮＡ（ファーストストランド）を合成した。続いて２本鎖ＤＮＡ（セカンドストランド）を合成した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより未反応のプライマーおよびＲＮＡを除き、ＥｃｏＲＩアダプターのライゲーションを行った。再度、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより未反応のアダプターを除き、ｃＤＮＡフラクションを回収した。
【００５８】
以上のｃＤＮＡ合成ステップは、タイムセーバーｃＤＮＡ合成キット(Time Saver cDNA Synthesis kit、Pharmacia 社より販売）を用いて行った。
【００５９】
上記で作製したｃＤＮＡとλgt10ファージベクターをライゲーションした後、ラムダイン(In vitro Packaging Kit LAMBDA IN 、ニッポンジーン社より販売）を用いてパッケージングを行い、常法によりそのタイターを確認した。その結果、インディペンデントクローン数５．５×１０5 pfu のｃＤＮＡライブラリーが得られた。
【００６０】
実施例３（クローニング）
実施例２で得たｃＤＮＡライブラリーより、１０ｃｍ×１４ｃｍのＬＢプレートに約１０，０００pfu ／プレートの密度となるよう調製した。一方、本発明者らが既に得たデータをもとに、依頼合成（バイオロジカ社より販売）により２０mer の合成ヌクレオチドを作製し、これを［λ−32Ｐ］アデノシン三燐酸とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてアイソトープ標識し、標識プローブを作製した。次に、Molecular Cloning ［Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)］に記載の方法に従ってプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、多数の陽性クローンを得た。
【００６１】
実施例４（クローンの解析）
さらに得られたファージクローンのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、その中の１つをプローブとして常法に従いサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。その結果、１２クローン中、８クローンが同一クローンであった。同一ではない４クローンのうち３クローンは同じサイズを示したが、残り１クローン（クローンＣ２−５）はより大きなサイズを示した。
【００６２】
さらにこのクローンＣ２−５をプローブとして前記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、３つの陽性クローンを得た。これらクローンはそれぞれｐＵＣ１１８プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、常法によりプラスミドＤＮＡを分離精製した。
【００６３】
そこで、得られたクローンＣ２−５のノーザンブロット解析を行った。すなわち、アコヤガイ各組織より抽出した全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動後、ナイロンメンブレン上にブロッティングした。Ｃ２−５のｃＤＮＡインサートをプローブとしてハイブリダイズさせると、外套膜にのみ特異的で、約３５００ｂの位置に発現しているバンドが認められた。
【００６４】
実施例５（シークエンシング）
プラスミドは図１で示される構造となっているので、Ｍ13系フォワードプライマー(Foward primer) およびリバースプライマーを用いシークエンスを行った。これによりクローニングされたｃＤＮＡの５′側および３′側からヌクレオチド配列を読むことができる。また、ｃＤＮＡの内部を読むため、常法に従いディレーションクローンを作製した。ＤＮＡのシークエンシングはSanger,F等のジデオキシ・ターミネーター法に基づいた、ブカベストシークエンシングキット（BcaBEST Dideoxy Sequencing Kit,TAKARA 社より販売）を用い行った。
【００６５】
このようにして得られたシークエンスデータは、GENETYX のＤＮＡシークエンス連結プログラムを用いて、連続したシークエンスに編集し、配列番号２に示す塩基配列を得た。このｃＤＮＡ全長シークエンスデータからオープンリーディングフレームを決定し、さらにアミノ酸に翻訳して配列番号３に示す配列を得た。
配合表（配合番号４）にｃＤＮＡの全塩基配列とこれにコードされるタンパク質のアミノ酸一次配列を示した。
【００６６】
実施例６（完全長ｃＤＮＡの構築）
実施例５のシークエンス結果をもとに、２つの陽性クローンからＳａｃＩ切断部位を利用してｐＵＣ１１８ベクター中で完全長のＣ２−５蛋白のｃＤＮＡを構築した。
【００６７】
このようにして構築されたクローニングベクターを導入した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株）が、工業技術院生命工学工業研究所の特許寄託センターに国際寄託されている（識別表示：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＫ００２、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９３７、（国内寄託［ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６８７］からブダペスト条約に基ずく国際寄託へ移管した））。
【００６８】
実施例７（形質転換菌の作製）
実施例６でＣ２−５蛋白のｃＤＮＡをサブクローニングしたｐＵＣ１１８プラスミドベクターを、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、Ｃ２−５蛋白のｃＤＮＡを調製して、これを発現プラスミドｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社より販売）に組み込んだ。この発現ベクターを大腸菌ＪＭ１０９に導入して形質転換菌を得た。
【００６９】
実施例８（ポリペプチドの製造）
実施例７で得た形質転換菌を１リットルのアンピシリン含有Ｌ−ブロース中で吸光度が０．６になるまで培養した後、ＩＰＴＧ（を０．５ｍＭになるように加え、さらに７時間培養を続けた。
【００７０】
次いで、菌体を集菌した後、超音波処理し、菌体破砕物を除いた上清をグルタチオンセファロース(Pharmacia社より販売）を混ぜ、グルタチオンセファロースをリン酸衝撃液で洗浄した後、５ｍＭのグルタチオンを含むリン酸緩衝液でＣ２−５蛋白を遊離させた。この蛋白をリン酸緩衝液で透析した後、一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて分析した結果、純度９０％以上のＧＳＴ融合蛋白が合成されていた。
【００７１】
実施例９（抗体の作製）
実施例８で精製したＣ２−５蛋白を、完全フロイントアジュバンドとともに家兎に２週間おきに３回皮下接種した後、その血清を採取した。
【００７２】
この血清は、ウエスタンブロティング法を用いて試験したところ、約１，０００倍の希釈でもＣ２−５蛋白に対する抗体として使用可能であることが確認された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、未知の有用なポリペプチドを効率的に大量生産することができる。このポリペプチドは、化粧品用原料として用いることができる。
【００７４】
また、真珠養殖におけるピースの新たな選別方法の開発が可能となる。
【００７５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２２１４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：アコヤガイ(Pinctada Fucata)
細胞の種類：外套膜上皮細胞
配列
ATGAAGTTAC TGGTGGTTCT CACCACCCTC GTGGGCTTTA GCTCAGCACT AAGTTTCGGT   60
TGTAATTACA GACCAGTATT AGGCTTCAAT TCACAGTATA TGCTGGGAGG ACTAAGACTT  120
TTCTGTATGC CTGCCATGGT TTATGATCCA TGGGCATGTG GTTGCGTTTC GGCATGGAGC  180
AGTGCAGGTC TTTACGGTGT CGGAGGGGGC GGAGGCGCCT GGGGAGCTGG CGGTGCTGGA  240
GGAGCCGACG GCGGACGCGG CGGCGGCGGT GGAGATTGGG AATATGACTA TGATGACGAC  300
AGCGATGACG ATGATGAATG GGACTGGGAT GATGACGGTG GAATGGGAGC TGGCGCCGGA  360
GGTGGTGCTG GTGGTGGTGC CGGAGGTGGT GCTGGTGCTG GTGCTGGAGC AGGCGCAGGA  420
GCAGGAGCAG GTGCTGGACT CGGACTTGGA TTGGGCGGAG GTCTCGGAGG TGGACTTGGC  480
GGACTTGGAG GTCTTGGCGG ACTTGGCGGT GGAGACGATT TATTTGATTT AGATTTCGAT  540
GATCTTGGTG CAGCTCTTGC CCTCGGTGGA GCTGGTGGAG CTGGAGGTGC TGCTGCTGCT  600
GCTGCAGCTG CCGCTGCTGC CGCCGGGGGT GGAGTTGGTG GAGCTGCTGC CGCAGCCGCA  660
GCCGCTGCTG CCGCTGCAGG AGGAGGCGCA GGTAGACTTG GAGGAGCTGC TGCTGCAGCC  720
GCAGCCGCTG CTGCCGCTGC AGGAGGCGCA GGTGGACTTG GAGGACTCGG TGGCGGACTT  780
GGAGGACTCG GTGGCGGACT TGGAGGCCTC GGAGGTCTTG GTGGCCTCGG AGGATATGGA  840
GGATCTGCTG CTGCCGCTGC TGCTGCTGCC GCCGCTGCTG CCGGAGGTGG AGGACTCGGT  900
GGTGTTGGTT TCTACGGTGG ACGAGGAGGT AGACGCGGTC GAGGAAGAGG AGGCCGCAGA  960
CGTGCTGCTG CTGCCGCTGC TGCAGCTGCC GCCGCAGCCG CTGGTGGTGG CGGAGGAGGT 1020
GGAGGTGGTG GAGGAGGAGG CGGAGGCGCT GGTGCTGCCG CTGCCGCTGC AGCCGCTGCT 1080
GCATCTGCTT CAGCTTCTAG ACAAATGAGT GGTATAAGGG ACGCATTAGG AGACATTAAA 1140
GACCTTCTCA GGAGTAATGG AGCCTCTGCA AAAGCCTCTG CTAAAGCATC AGCAGTAGCA 1200
AGCACAAAAT CTCAAATTGA CGATTTGAAG GATGTCTTAA AGGATCTTGC AGGTCTATTG 1260
AAAAGCTCAG CATCTGCTTC AGCATCTGCA TCTGCATCAG CTTCAGCTGG AGGTGGAGGC 1320
GGTGGTGGTA ACGGAGGTGG TAACGGAGGA GGAGGCGGCG GTGGAGCTGG AGCTCTAGCT 1380
GCTGCTCTCG CTGCTGCAGG AGCCGGAGGT GGACTTGGAG GTGGAGGCGG AGGCGGAGCT 1440
TTAGCCGCTG CACTAGCTGC TGCTGGTGCA GGTGGAGGAG GTTTTGGTGG ACTTGGAGGA 1500
CTAGGCGGTC TTGGTGGGGG ATCTGCCGCA GCTGCTGCAG CCGCTGCCGC TGCTGCATCA 1560
GGTGGTGGAG GAAGAGCACT TAGAAGGGCT TTGAGAAGAC AAATGCGTGG AGGTGGATCC 1620
GCTGCTGCCG CTGCTGCTGC TGCTGCAGCT GCTGCTGGAG GTGGATGGGG AGGTGGAATG 1680
GGTGGAGGAT TCGGAGTAGG TCTCGGTGGA GGATTCGGAG GAGGATTTGG TGGTGGATCA 1740
TCAGCAGCAG CTGCTGCCGC TGCTGCAGCC GCCGCTGGAT TTGGTGGAGG TGGACGAAGA 1800
GGTAGAGGTA GAGGACGTGG AGGCGATGGC GACGGTAACG GAGCTAGTGC TGTAGCTGCA 1860
GCCGCCGCCG CTGCTGCTGC TGCTGGAGGA TCTGCTGCTG ATGTTGCCGC TGCCGCTGCT 1920
GCAGCCGCAG CTATGTACGG TGACGGTGCT GATGGACCTG ATTTCGATAA TGGATTCGGT 1980
GGTGGAAACG GAAATGGAGG TGGCGGATCT GGTGGTGGCG GATCCGGCGG AGGTGGATCC 2040
GGTGGCGGAT CTGGAGGTGG CGGTGGATCT GGTGGATCAG GCGGTGGCGG CGGATCTGGT 2100
GGTTCAGGCG GTGGCGGATC AGGCGGCGGT GGAAACAATG GATGGGGAAA TAACGGCAAC 2160
AATAAATATG ACGATGATGA CTGTGATGAA TATGGTAACC CTATTAGAAG GGGG       2214
【００７６】
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：３３３１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  to  ｍＲＮＡ
起源
生物名：アコヤガイ(Pinctada Fucata)
細胞の種類：外套膜上皮細胞
配列の特徴：ｍＲＮＡ
存在位置：１．．３３３１
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
TCGGATCTCC CCACACAACA TAGATAGAGG ATATCCGCCT GGGTTCACAA TGAAGTTACT   60
GGTGGTTCTC ACCACCCTCG TGGGCTTTAG CTCAGCACTA AGTTTCGGTT GTAATTACAG  120
ACCAGTATTA GGCTTCAATT CACAGTATAT GCTGGGAGGA CTAAGACTTT TCTGTATGCC  180
TGCCATGGTT TATGATCCAT GGGCATGTGG TTGCGTTTCG GCATGGAGCA GTGCAGGTCT  240
TTACGGTGTC GGAGGGGGCG GAGGCGCCTG GGGAGCTGGC GGTGCTGGAG GAGCCGACGG  300
CGGACGCGGC GGCGGCGGTG GAGATTGGGA ATATGACTAT GATGACGACA GCGATGACGA  360
TGATGAATGG GACTGGGATG ATGACGGTGG AATGGGAGCT GGCGCCGGAG GTGGTGCTGG  420
TGGTGGTGCC GGAGGTGGTG CTGGTGCTGG TGCTGGAGCA GGCGCAGGAG CAGGAGCAGG  480
TGCTGGACTC GGACTTGGAT TGGGCGGAGG TCTCGGAGGT GGACTTGGCG GACTTGGAGG  540
TCTTGGCGGA CTTGGCGGTG GAGACGATTT ATTTGATTTA GATTTCGATG ATCTTGGTGC  600
AGCTCTTGCC CTCGGTGGAG CTGGTGGAGC TGGAGGTGCT GCTGCTGCTG CTGCAGCTGC  660
CGCTGCTGCC GCCGGGGGTG GAGTTGGTGG AGCTGCTGCC GCAGCCGCAG CCGCTGCTGC  720
CGCTGCAGGA GGAGGCGCAG GTAGACTTGG AGGAGCTGCT GCTGCAGCCG CAGCCGCTGC  780
TGCCGCTGCA GGAGGCGCAG GTGGACTTGG AGGACTCGGT GGCGGACTTG GAGGACTCGG  840
TGGCGGACTT GGAGGCCTCG GAGGTCTTGG TGGCCTCGGA GGATATGGAG GATCTGCTGC  900
TGCCGCTGCT GCTGCTGCCG CCGCTGCTGC CGGAGGTGGA GGACTCGGTG GTGTTGGTTT  960
CTACGGTGGA CGAGGAGGTA GACGCGGTCG AGGAAGAGGA GGCCGCAGAC GTGCTGCTGC 1020
TGCCGCTGCT GCAGCTGCCG CCGCAGCCGC TGGTGGTGGC GGAGGAGGTG GAGGTGGTGG 1080
AGGAGGAGGC GGAGGCGCTG GTGCTGCCGC TGCCGCTGCA GCCGCTGCTG CATCTGCTTC 1140
AGCTTCTAGA CAAATGAGTG GTATAAGGGA CGCATTAGGA GACATTAAAG ACCTTCTCAG 1200
GAGTAATGGA GCCTCTGCAA AAGCCTCTGC TAAAGCATCA GCAGTAGCAA GCACAAAATC 1260
TCAAATTGAC GATTTGAAGG ATGTCTTAAA GGATCTTGCA GGTCTATTGA AAAGCTCAGC 1320
ATCTGCTTCA GCATCTGCAT CTGCATCAGC TTCAGCTGGA GGTGGAGGCG GTGGTGGTAA 1380
CGGAGGTGGT AACGGAGGAG GAGGCGGCGG TGGAGCTGGA GCTCTAGCTG CTGCTCTCGC 1440
TGCTGCAGGA GCCGGAGGTG GACTTGGAGG TGGAGGCGGA GGCGGAGCTT TAGCCGCTGC 1500
ACTAGCTGCT GCTGGTGCAG GTGGAGGAGG TTTTGGTGGA CTTGGAGGAC TAGGCGGTCT 1560
TGGTGGGGGA TCTGCCGCAG CTGCTGCAGC CGCTGCCGCT GCTGCATCAG GTGGTGGAGG 1620
AAGAGCACTT AGAAGGGCTT TGAGAAGACA AATGCGTGGA GGTGGATCCG CTGCTGCCGC 1680
TGCTGCTGCT GCTGCAGCTG CTGCTGGAGG TGGATGGGGA GGTGGAATGG GTGGAGGATT 1740
CGGAGTAGGT CTCGGTGGAG GATTCGGAGG AGGATTTGGT GGTGGATCAT CAGCAGCAGC 1800
TGCTGCCGCT GCTGCAGCCG CCGCTGGATT TGGTGGAGGT GGACGAAGAG GTAGAGGTAG 1860
AGGACGTGGA GGCGATGGCG ACGGTAACGG AGCTAGTGCT GTAGCTGCAG CCGCCGCCGC 1920
TGCTGCTGCT GCTGGAGGAT CTGCTGCTGA TGTTGCCGCT GCCGCTGCTG CAGCCGCAGC 1980
TATGTACGGT GACGGTGCTG ATGGACCTGA TTTCGATAAT GGATTCGGTG GTGGAAACGG 2040
AAATGGAGGT GGCGGATCTG GTGGTGGCGG ATCCGGCGGA GGTGGATCCG GTGGCGGATC 2100
TGGAGGTGGC GGTGGATCTG GTGGATCAGG CGGTGGCGGC GGATCTGGTG GTTCAGGCGG 2160
TGGCGGATCA GGCGGCGGTG GAAACAATGG ATGGGGAAAT AACGGCAACA ATAAATATGA 2220
CGATGATGAC TGTGATGAAT ATGGTAACCC TATTAGAAGG GGGTAAATTA TTTGACATTA 2280
TCCGCCATTT GACTCATTTT TCTTAGTTCT CTATGTTTTA TACTTCACCT TAGATTGTTT 2340
TAGTTTGATT GAATAAATTA TGTTTTCGAT ATAAATTTTT TTTAAATTAA ATTAAACTTT 2400
ATTAGTTGAC CTGTAAACTT TTTCATGGAG TTATAATCTA AGGAACAAAA AACATACATA 2460
ATATGTTCAG TATTGTGGTA AAGCACCTGT ACCGCAAACA CAATCACCTC TATACATGTA 2520
TACAAAATCA GTAATGCTGA CAAAATCTTC TACACTCTCA CCTACACACT CGCACACAGT 2580
CCTCTTACAT ACACAGCACT ATAATATCCT GAACATGAAG TTTGTGTTGA TAAAAAGTTC 2640
AGAAAAATCT CCCCTACATC ACCTGATCTT TCACTGAAAA TTTACGACAA GTATTGAAAA 2700
TAGCAGAAAG AAAACGGGAA ATTGAGAAGT TTTCTATAAA AAACAATCGG AACAATGACT 2760
GGAATGACAA GGATGAAAAT AATGATAACT TACATTAATT AAGGCCCCAA TAATCTCTCT 2820
ATTTTCAAAC TTTTTTTTCA AATGTTCTCT CTAACTCACT TGCATCTATG TGGAAATTCA 2880
CATACTATAC TAAATTACCA CAAGTATCAA GGTTTCACAA CCTCTCATGC CTTCATGGCA 2940
GACCATGCTG GGTATTTGTC TAACAATGCC TCATAAATAC ATAAAACTAA CTAACAAAAT 3000
AGGTCAGTCT GTAACAAATT ATTAATGCAC CATTATTGCA TTTTCTAAAA CAAAGCATAC 3060
ACTGGATATT GGCAGACAAA ATGTTGTTAT TGGATACCTT TCCATTCTAT CTAGACACTT 3120
GCTTTCCACA AGTCATCATA AATAAATCCC CCCTATCCCA AATGTCAATG GAATGCCCCA 3180
ACCCTTCCCC CATAATTTTA AAACCTAGAA TAAATTAAAA CATCTATAGT TCGTCATGAT 3240
CATCTTTCTT ATCATCCTCT TCTTCTTCCT CCTCCTCCTT CTTCTTCTTC CTCCTCCTCA 3300
GGTTCTTGGC TGCCTGCTCC TTCCTTGCCA A                                3331
【００７７】
【配列表】
配列番号：３
配列の長さ：７３８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：たんぱく質
起源
生物名：アコヤガイ(Pinctada Fukata)
細胞の種類：外套膜上皮細胞
配列の特徴
特徴を表わす記号：ｐｅｐｕｔｉｄｅ
存在位置：１．．７３８
特徴を決定した方法：Ｅ
0003713568.tif 000002
0003713568.tif 000003
0003713568.tif 000004
0003713568.tif 000005
【００７８】
【配列表】
配列番号：４
配列の長さ：３３３１
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ  to  ｍＲＮＡ
起源
生物名：アコヤガイ(Pinctada Fucata)
細胞の種類：外套膜上皮細胞
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：５０．．２２６３
特徴を決定した方法：Ｐ
0003713568.tif 000006
0003713568.tif 000007
0003713568.tif 000008
0003713568.tif 000009
0003713568.tif 000010
TAAATTATTT GACATTATCC GCCATTTGAC TCATTTTTCT TAGTTCTCTA TGTTTTATAC 2323
TTCACCTTAG ATTGTTTTAG TTTGATTGAA TAAATTATGT TTTCGATATA AATTTTTTTT 2383
AAATTAAATT AAACTTTATT AGTTGACCTG TAAACTTTTT CATGGAGTTA TAATCTAAGG 2443
AACAAAAAAC ATACATAATA TGTTCAGTAT TGTGGTAAAG CACCTGTACC GCAAACACAA 2503
TCACCTCTAT ACATGTATAC AAAATCAGTA ATGCTGACAA AATCTTCTAC ACTCTCACCT 2563
ACACACTCGC ACACAGTCCT CTTACATACA CAGCACTATA ATATCCTGAA CATGAAGTTT 2623
GTGTTGATAA AAAGTTCAGA AAAATCTCCC CTACATCACC TGATCTTTCA CTGAAAATTT 2683
ACGACAAGTA TTGAAAATAG CAGAAAGAAA ACGGGAAATT GAGAAGTTTT CTATAAAAAA 2743
CAATCGGAAC AATGACTGGA ATGACAAGGA TGAAAATAAT GATAACTTAC ATTAATTAAG 2803
GCCCCAATAA TCTCTCTATT TTCAAACTTT TTTTTCAAAT GTTCTCTCTA ACTCACTTGC 2863
ATCTATGTGG AAATTCACAT ACTATACTAA ATTACCACAA GTATCAAGGT TTCACAACCT 2923
CTCATGCCTT CATGGCAGAC CATGCTGGGT ATTTGTCTAA CAATGCCTCA TAAATACATA 2983
AAACTAACTA ACAAAATAGG TCAGTCTGTA ACAAATTATT AATGCACCAT TATTGCATTT 3043
TCTAAAACAA AGCATACACT GGATATTGGC AGACAAAATG TTGTTATTGG ATACCTTTCC 3103
ATTCTATCTA GACACTTGCT TTCCACAAGT CATCATAAAT AAATCCCCCC TATCCCAAAT 3163
GTCAATGGAA TGCCCCAACC CTTCCCCCAT AATTTTAAAA CCTAGAATAA ATTAAAACAT 3223
CTATAGTTCG TCATGATCAT CTTTCTTATC ATCCTCTTCT TCTTCCTCCT CCTCCTTCTT 3283
CTTCTTCCTC CTCCTCAGGT TCTTGGCTGC CTGCTCCTTC CTTGCCAA              3331
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクローニングベクターの一実施例を示す構成図である。
【図１】
0003713568.tif 000011