(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モネンシンに対する耐性を有し、Ｌ−リシンを産生するコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)CJM107(受託番号 KCCM-10227)。
【請求項２】
請求項１に記載のコリネバクテリウム・グルタミクムCJM107を発酵培地中で好気的条件下25〜35℃にて20時間にわたり振盪しながら培養することにより該微生物を活性化させ、続いて、発酵培地中で好気的条件下25〜35℃にて１〜7日間にわたって振盪しながら培養することを含むＬ−リシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｌ−リシン産生微生物及び該微生物を用いたＬ−リシンの製造方法に関する。より詳細には、本発明は抗生物質の一種であるモネンシンに対する耐性を有し、かつＬ−リシンを高収率で産生する能力を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）CJM107(KCCM-10227)、並びにこれを用いた発酵によりＬ−リシンを製造する方法に関する。
【０００２】
背景技術
Ｌ−リシンは必須アミノ酸の一種で、飼料、医薬品、食品などとして広範に利用されている。特に、家畜の糞尿に対する窒素又はリン成分の規制を強化することにより畜産廃水による環境汚染を防止しようとする動向から、最近その需要が増加している。飼料添加剤としてのＬ−リシンの市場規模は1999年に約50万トンと推定されており、年平均約10％の持続的な需要増大が予想されている。このように、Ｌ−リシンは発酵産物市場における大型品目である。従って、新規なＬ−リシン産生株の開発又は発酵工程の改善によるＬ−リシンの生産性の向上により、大きな経済的効果が得られることが期待できる。
【０００３】
今まで、コリネ型細菌に属する各種栄養要求性株、各種薬剤耐性株、各種薬剤感受性株を利用して、Ｌ−リシンが製造されてきた。Ｌ−リシンはまた、抗生物質耐性株、例えば、バシトラシン耐性株(日本国特許第1,765,413号)、サルファ系薬剤耐性株(韓国特許公開公報第81-1746号)、イツリン耐性株(日本国特許第2,578,413号)、又はリファンピシン及びストレプトマイシンなどの２種以上の抗生物質に耐性を有する株(米国特許第4,623,623号)を利用して製造されている。しかし、抗生物質であるモネンシンに対し耐性を有する株に関する報告はない。
【０００４】
発明の開示
本発明者らは、工業的に低廉にＬ−リシンを製造するため、発酵によるＬ−リシンの製造方法について広範な研究を行った。その結果、モネンシンに対する耐性を有するＬ−リシン産生コリネ型細菌を提供することにより、Ｌ−リシンの生産性を向上させることができることを見出した。
【０００５】
モネンシンは、放線菌の一種であるストレプトミセス(Streptomyces)属により産生される抗生物質であり、細菌の細胞膜機能とプロトン駆動力に作用するものとして知られている(Journal of Natural Product, 49, 35-47, 1986)。特に、モネンシンはイオノフォアとして作用して、細胞膜とプロトン駆動力を変化させて結果的に微生物の生理的特性を変化させる。
【０００６】
一方、Ｌ−リシンの効率的な産生のためには、細胞内で生合成されたＬ−リシンが、膜蛋白質であるＬ−リシンエクスポーター（exporter）によって細胞外へうまく排出されなければならない。プロトン駆動力によって細胞膜にわたって形成される膜電位が、エクスポーターによるＬ−リシンの細胞外分泌に関与していることが知られている(Eur. J. Biochem., 220，137-143，1991)。本発明者らは、このようなモネンシンの作用メカニズムから、モネンシン耐性を有するコリネ型細菌を提供することによりＬ−リシン産生能力を改善させることに成功した。
【０００７】
本発明において、コリネ型細菌には、Corynebacterium属又はBrevibacterium属に属する任意の微生物が含まれる。本発明においては、Ｌ−リシン産生能を有し、コリネ型細菌に属する限り、任意の株を親株として用いることができる。その具体的な例は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)CH77である。
【０００８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
モネンシン耐性株は、107〜108／mLの親株を、化学的突然変異誘発物質であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（最終濃度500μg／mL）で、30℃にて30分間処理し、親株が増殖できない濃度のモネンシンを含有する最小寒天平板培地で増殖する株を分離することにより得ることができる。本発明の変異株は、このようにして得られたモネンシン耐性株をさらに培養し、Ｌ−リシン産生能力を比較して、向上されたＬ−リシン産生能力を有する株を選別することにより得ることができる。
【００１０】
上述した親株及びそれから誘導されたモネンシン耐性株は、下記の特性を有する。
【００１１】
親株：Ｓ−(２−アミノエチル)システイン−耐性、アミノヒドロキシ吉草酸−耐性、メチルリシン−耐性、アジ化ナトリウム−耐性、ホモセリン漏出性及びロイシン要求性を有するコリネバクテリウム・グルタミクムCH77(KFCC10881)。
【００１２】
変異株：Ｓ−(２−アミノエチル)システイン−耐性、アミノヒドロキシ吉草酸−耐性、メチルリシン−耐性、アジ化ナトリウム−耐性、ホモセリン漏出性及びロイシン要求性、そしてさらにモネンシン耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミクムCJM107(KCCM-10227)。
【００１３】
前記モネンシン耐性株、コリネバクテリウム・グルタミクムCJM107は、ブタペスト条約に基づき、大韓民国微生物寄託センター(KCCM)（住所：韓国ソウル市西大門区弘済１洞361‐21裕林ビル）に、2000年11月15日付けで、受託番号KCCM-10227として寄託された。
【００１４】
親株であるCH77と本発明の変異株であるCJM107のモネンシンに対する耐性を以下のような方法で試験した。Luria-Bertani(LB)液体培地で細胞を16時間増殖させた。次に、該細胞を滅菌生理食塩水で２回洗浄した後、適宜に希釈して7,000μg／Lのモネンシンを含有する最小寒天平板培地[蒸留水１Ｌあたり(pH7.0)、ブドウ糖10g、(NH4)2SO4 2g、尿素2g、KH2PO4 1g、K2HPO4 3g、MgSO4・7H2O 0.5g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・7H2O 10mg、ビオチン100μg、チアミン・HCl 100μg、CaCl2・2H2O 100μg、Na2B4O7・10H2O 80μg、(NH4)6MoO27・4H2O 40μg、ZnSO4・7H2O 10μg、CuSO4・7H2O 10μg、MnCl2・4H2O 10μg、FeCl3・6H2O 1mg、寒天 20g、所望によりＬ−ロイシン 0.1g、所望によりＬ−トレオニン 0.1g、所望によりＬ−メチオニン 0.1g]で4日間培養した。各株の増殖度を以下の表１に示した。
【００１５】
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本発明に使用する微生物を培養するために、アミノ酸発酵に通常利用される培地を用いることができる。即ち、使用する株によって吸収されうる炭素源、窒素源、無機塩、増殖因子などを含有している限り、いずれの培地も利用することができる。炭素源としては、糖蜜、ショ糖、ブドウ糖、果糖のような炭水化物などを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウムなどの無機窒素源、及び酵母抽出物、酵母加水分解物、大豆粉酸加水分解物、ペプトン、コーンスティープリカーなどの有機窒素源を用いることができる。無機化合物としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができる。さらに、所望により、ビオチン及びチアミンなどのビタミン、並びにロイシン、ホモセリン、メチオニン、トレオニンなどのアミノ酸を使用することができる。
【００１６】
培養は好気的条件下で、例えば、25〜35℃の培養温度で振盪培養又は通気攪拌深部培養により行うことができる。培地のpHは６〜８の範囲であり、好ましくは中性付近に維持する。培地のpHは、炭酸カルシウム、尿素又はアンモニアを利用して調整できる。通常、１〜７日間の培養後にＬ−リシンが培養液中に生成及び蓄積される。培養完了後に培養液を硫酸又は塩酸で処理し、続いて、イオン交換樹脂による処理、濃縮、塩析及び等電点電気泳動を併用して培養液からＬ−リシンを回収することができる。
【００１７】
発明を実施するための最良の形態
以下では本発明を実施例により具体的に説明する。
【００１８】
実施例１
下記シード培地25mlを含有する250mLコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミクムCH77及びCJM107を接種し、振盪しながら(220 rpm)、30℃で20時間培養した。下記の生産培地25 mLを含有する250 mLコーナーバッフルフラスコに１mLのシード培地を接種し、振盪しながら(220 rpm)、32℃で96時間培養した。培養終了後HPLCによりＬ−リシンの量を測定した。コリネバクテリウム・グルタミクムCH77及びCJM107の培養液中の、塩酸塩としてのＬ−リシンは、それぞれ47g／L、51g／Lであった。
【００１９】
シード培地(pH 7.0)
粗糖50g、ペプトン10g、酵母抽出物10g、尿素5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg及びチアミン・HCl 1000μg(プロセス水１Ｌあたり)。
【００２０】
生産培地(pH 7.0)
糖蜜又は前処理糖蜜(還元糖として)50g、粗糖50g、酵母抽出物4g、(NH4)2SO4 40g、尿素4g、KH2PO4 1g、NaCl 2.5g、MgSO4・7H2O 1g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・5H2O 10mg、ビオチン100μg、塩酸チアミン200μg、CaCO3 40g、所望によりＬ−ロイシン 0.4g、所望によりＬ−トレオニン 0.1g、所望によりＬ−メチオニン 0.1g(プロセス水１Ｌあたり)。
【００２１】
実施例２
糖蜜及び粗糖を含有する培地でCJM107株を培養した。培養後、リシン発酵培養液１Ｌに硫酸又は塩酸を添加して、pHを2.0に調整し、それによってCa2+イオンをCaSO4又はCaCl2に変換した。続いて、培養液を、アンモニウムイオン形態で再生された陽イオン交換樹脂(Dianion SK-1B、SK-1BL)上に、上流方向に流して吸着させた。次に脱塩水で洗浄して樹脂層内に残存する細胞集団を除去した後、2N水酸化アンモニウムで溶出することによって、Ｌ−リシンの濃縮画分を回収した。回収された画分を濃縮した後、濃縮物をpH 5.0に調整し、20℃に冷却することによってＬ−リシンの結晶を生成させた。
【００２２】
結晶化が完了した後に得られたスラリーを遠心分離して、一次湿性生成物を得た。母液を再び回分式で濃縮して結晶化すると、二次湿性生成物が得られた。一次及び二次湿性生成物を合わせて乾燥すると、98.5％のＬ−リシンを含む乾燥生成物46gが得られた。
【００２３】
実施例３
前処理糖蜜及び粗糖を含有する培地でCJM107株を培養した。培養後、Ｌ−リシン発酵培養液１Ｌに硫酸を添加して、pHを2.0に調整することにより、Ca2+イオンをCaSO4に変換した。続いて、培養液を、アンモニウムイオン形態で再生された陽イオン交換樹脂(Dianion SK-1B、SK-1BL)上に、上流方向に流して吸着させた。次に脱塩水で洗浄して樹脂層内に残存する細胞集団を除去した後、2N水酸化アンモニウムで溶出することによって、Ｌ−リシンの濃縮画分を回収した。回収された画分を濃縮した後、濃縮物をpH 5.0に調整し、20℃に冷却することによってＬ−リシンの結晶を生成させた。
【００２４】
結晶化が完了した後に得られたスラリーを遠心分離して、一次湿性生成物を得た。母液を再び回分式で濃縮して結晶化すると、二次湿性生成物が得られた。一次及び二次湿性生成物を合わせて乾燥すると、99％のＬ−リシンを含む乾燥生成物47gが得られた。
【００２５】
産業上の利用の可能性
本発明により、人工的突然変異を用い、モネンシンに対する耐性を有するＬ−リシン産生コリネ型細菌を作成することによって、Ｌ−リシンの発酵濃度及び収率が向上された。即ち、モネンシンに対する耐性及びＬ−リシン産生能力を有するコリネ型細菌は、Ｌ−リシンの製造に非常に有用である。
【００２６】
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