(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料において、フィブリノーゲンの拮抗薬による細胞性ＧＰIIｂ／IIIａ受容体の占拠率を測定する方法であり、該拮抗薬の競合剤である抗体ＭＡｂ１を用いて試料中の占拠された受容体の数を測定し、かつ占拠又は非占拠受容体の総数を占拠または非占拠受容体に特異的ないわゆる非競合抗体ＭＡｂ２を用いて測定し、それにより試料中のＧＰIIｂ／IIIａ受容体の占拠率を推定することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
受容体の数を検量線と比較して測定することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
抗体がＧＰIIIａに対するものであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項４】
標識抗体を用いて抗体を標識することにより測定することを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
抗体を蛍光色素で標識することを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
測定を定量的サイトメトリにより行うことを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれかの項記載の方法。
【請求項７】
測定を間接定量的免疫蛍光法により行うことを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかの項記載の方法。
【請求項８】
拮抗薬：ＲＧＤペプチドの測定のために、Ｍａｂ１にモノクローナル抗体PM 6/13を、Ｍａｂ２にモノクローナル抗体SZ 21を用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
抗凝集剤：抗体７Ｅ３又はその断片の測定のために、Ｍａｂ１にモノクローナル抗体Ｐ２を、Ｍａｂ２にモノクローナル抗体PM 6/13を用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかの項記載の方法。
【請求項１０】
試験すべき試料が血液試料であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項のいずれかの項記載の方法。
【請求項１１】
試験すべき試料が血小板に富んだ試料であることを特徴とする請求の範囲第10項記載の方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項〜第11項のいずれかの項記載の方法を実施するための分析用キットであり、
−フィブリノーゲン拮抗薬の競合剤であるＧＰIIｂ／IIIａ受容体に対するモノクローナル抗体の少なくとも１種、及び
−占拠または非占拠ＧＰIIｂ／IIIａ受容体に特異的なモノクローナル抗体の少なくとも１種を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗血小板凝集化合物により、あるいはフィブリノーゲンにより占められた血小板ＧＰIIｂ／IIIａ受容体、及び遊離状態で存在する受容体を分析する方法に関する。
血小板は、恒常性バランスの平衡において重要な役割を果している。活性化シグナルは、そのレベルにおいて、形態学的及び生化学的変化の両者を、表面糖タンパク質の発現のレベルにおける変化と共に引き起こすことができる。これらの糖タンパク質は、ほとんどのリガンド受容体で、接着（例えば、フオンビルブランド(Von Willebrand)因子の受容体：ＧＰＩｂ分子）、凝集（例えば、フィブリノーゲンの受容体：ＧＰIIｂ／IIIａ分子）に関与し、一方、その他のものは血小板の活性化状態（例えば：ＧＭＰ140分子又はＰ−セレクチン）を示す。
血小板の活性化及びそれに起因する凝集は、いき値を超えると動脈の血栓性症状のような種々の病状に関与する生理学的現象である。これは、医薬品工業界が新規な抗凝集治療用分子の開発に興味をもつ理由を説明している。
開発された新しい治療法における好ましい標的は、血小板上に特異的に発現するＧｐIIｂ／IIIａ受容体である。血小板の活性化が生じると、この受容体は非常に高い親和性でフィブリノーゲン及びその他の接着タンパク質に結合し、これにより血小板が互いに凝集する。
ＧＰIIｂ／IIIａ受容体は、細胞接着の現象に関与する様々の分子から構成されるインテグリンからなるグループに属する。インテグリンは、α／βヘテロ二量体であり、そのβ−サブユニットにより７つのファミリーに分類される。約20個のインテグリンが現在知られており、その中の９つがアミノ酸配列Ｒ−Ｇ−Ｄを介してそのリガンドに結合する。
ＧＰIIｂ／IIIａ（αIIβ３）はβ３インデグリンファミリーの一員である。これは、特に血小板上に、そして、多量に内皮細胞上に存在するビトロネクチン受容体（αVβ3）と同じβサブユニット（しかし、αサブユニットは異なる）を有する。IIｂ及びIIIａサブユニットは国際命名法によれば、それぞれCD 41及びCD 61グループに分類される。
抗血小板ＧＰIIｂ／IIIａ抗凝集剤は次の２つの異なるクラスに属する：ａ）フィブリノーゲンのアンタゴニスト（拮抗薬）であるモノクローナル抗体（ReoProとして市販されている、CD 61のエピトープに対するヒト型７Ｅ３モノクローナル抗体のＣ７Ｅ３Ｆａｂを含む）、ｂ）血小板受容体リガンドに共通のＲＧＤ配列（Arg-Gly-Asp）またはそれに近いＫＧＤ配列を有する、インデグレリン（integrelin）型の環状ペプチド、及びラミフィバン（lamifiban）又はチロフィバン（tirofiban）型のペプチドミメティックス（peptidomimetics）。現在開発されているこれらの物質は非経口経路による場合のみ活性である。経口経路で投与しうる別の分子は開発中である。しかし、これらの新規な分子は副作用を引起し、治療される患者において、注入部や内部の部位で出血を生じさせる結果となる。長期間循環系に残る性質をもつこれらの新しい分子に対して、現在解毒剤はない。従って、抗血小板治療においては、投与する薬剤の治療用量を適用できるだけでなく、治療の監視中、拮抗薬により占められるＧＰIIｂ／IIIａ受容体の数に関する情報を直ちに利用でき、抗凝集効果を得るために十分な量の結合拮抗薬を維持しながら出血性の合併症を制御しうることが重要である。
従って、本発明は、試験試料において、フィブリノーゲンの拮抗薬によるＧＰIIｂ／IIIａ受容体の占拠率を測定する方法に関し、該拮抗薬の競合剤である抗体（ＭＡｂ１）を用いて占拠された受容体の数を測定し、かつ占拠又は非占拠受容体の総数を占拠または非占拠受容体に特異的ないわゆる非競合抗体（ＭＡｂ２）を用いて測定し、それにより試料中のＧＰIIｂ／IIIａ受容体の占拠率を推定することを特徴とする。
占拠率（occupation）とは、血液試料中における、受容体総数と比べた、抗凝集剤に占拠されたフィブリノーゲンに対する血小板受容体ＧＰIIｂ／IIIａの、絶対値での定量と、割合の両方を意味し、割合については経時的にその変動を調べる。
また、治療の監視においてはこの測定をくり返す必要がなく投薬の前に受容体の総数を測定することができる。
また、受容体の数を測定すると具体的に述べた場合、これは単に半定量的測定であってもよい。
もちろん、受容体の数を正確に測定することが望ましい場合は、検量線を伴う検量系を供給することが必要である。
本発明に関して用いられる抗ＧＰIIｂ／IIIａ抗体は好ましくはＧＰIIIａ（CD 61）サブユニットのエピトープに対する。
これらは、より詳しくは、Immunotech社から市販されている抗体SZ 21及びＰ２；及びCymbus社から市販されている抗体PM 6/13である。
これは、1997年６月５日にLMBP 1662CBの番号でBelgian Coordinated Collection of Microorganisms（ＢＣＣＭ）に寄託されたモノクローナル抗体P18（この寄託は条文により当業者が利用しうるだけである）であってもよい。
抗体PM 6/13はCymbus Bioservices社（英国）から市販されており、Immunotech社（フランス）から市販されているIgG1 SZ 21型の抗CD 61、及びIgG1型の抗CD 61である。同社から市販されているＰ２については、これは抗CD 41 IgG1である。
使用する抗体の対は、主として、用いる抗凝集剤の型による。実際、ReoPro及びＲＧＤ型のペプチドはＧＰIIIａの異なる部位に結合する抗凝集剤である。
ReoProはフィブリノーゲンに対する部位に近似した部位を有し、立体障害によりその結合を阻害する。一方、ＲＧＤペプチドはフィブリノーゲンと同じ部位を有し、ＲＧＤ配列に対して直接結合する。
このため、ReoProにより占められる受容体の測定に最も適した製品はImmunotech社の競合抗体Ｐ２及び、Cymbus社の非競合抗体PM 6/13からなる対であり、一方、ＲＧＤペプチドの場合には、競合抗体はCymbus社の抗体PM 6/13であり、非競合抗体はImmunotech社の抗体SZ 21である。実際、抗体PM 6/13は、抗凝集剤がReoProである場合は非競合抗体であるが、抗凝集剤がＰＧＤペプチドである場合は競合抗体となる。
前述のモノクロナール抗体を用いる測定は、好ましくは定量的サイトメトリ（cytometry）によるものであるが、特にElisaにより示唆されるの他の方法又は別の種類の方法を考えてもよい。
好ましくは測定を、特に、定量的方法と組み合わせてもよい間接的免疫蛍光法を用いて蛍光色素（fluorochrome）で標識した抗体の助けにより特異的抗体を出現させることにより行う。
いわゆるサイトメトリ、または間接定量的免疫蛍光法（いわゆるＩＱＩＦ法）は既知であり、詳細については再度記述しない（P.Poncelet et al.,1985,J.Imunol.Methods 85,65-74）。
用いる試料は好ましくは生物学的試料であり、殊に血液試料、クエン酸ナトリウム又はサイトレート・テオフィリン・アデノシン・ジピリダゾール（citrate theophilline adenosine dipyrridanol）（ＣＴＡＤ）（血小板機能の阻害剤）で集めた全血の試料であるか、あるいは血小板に富んだ画分、血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）もしくは結合血小板等である。
特異的抗体の対について上に述べたが、その他の抗体を用いることも可能であり、特に、「白血球タイピングＶ、白血球識別抗原；米国ボストンで1993年11月３−７月に開催された第５回国際研究集会及び会議の会報、Vol.2、オックスフォード大学出版、1995」において挙げられた一覧から選択してもよい。というのは、抗ＧＰIIｂ／IIIａ競合抗体については、ＧＰIIｂ／IIIａ複合体のエピトープに対する抗体であり、ＧＰIIｂ／IIIａへの結合率が飽和濃度で用いる抗血小板凝集剤の存在下で少なくとも50％、好ましくは75％減少するが、その結合が血小板に対する抗凝集剤の結合を阻害すべきでない抗体が選択されるからである。
非競合抗ＧＰIIｂ／IIIａ抗体については、結合率が抗血小板凝集剤の存在下及び不在下で15％以上は変化しないＧＰIIｂ／IIIａの対のエピトープに対する抗体であろう。
本発明はまた、上述の方法を行うための分析キットに関し、このキットは以下のものを含むことを特徴とする：
−フィブリノーゲン拮抗薬に対する競合剤であるＧＰIIｂ／IIIａ受容体のモノクローナル抗体の少なくとも１種
−占拠されたまたはされないＧＰIIｂ／IIIａ受容体に対して特異的なモノクローナル抗体の少なくとも１種。
ＧＰIIｂ／IIIａ受容体などの表面抗原の定量法の原理をここに簡単に述べる。
定量すべき細胞性抗原部位を、間接免疫蛍光において、調査すべき抗原に特異的なｍＡｂ、好ましくはＩｇＧ型で、特にマウス起源のものの結合により標識し、これは蛍光色素と結合した抗−マウスＩｇＧポリクローナルによって現れる。フローサイトメトリにおいて得られる蛍光の強度は不定の単位であるが、これは抗原の発現の細胞性レベルに密接に関連している。サイトメトリのデータの標準化は、各免疫標識中の、試料試験管と平行して処理された検量用物質の導入により行われる。この検量用物質は、増加および限定範囲量のＩｇＧ型ｍＡｂで被覆したラテックスビーズからなる。この検量用物質の分析により細胞当たりの抗原の絶対数に蛍光強度を関係づける検量系の調製が可能となる。
以下の実施例は本発明の特徴及び利点を実証することを可能にする。
示された試験は、クエン酸ナトリウム（又はＣＴＡＤ）で集めた全血の試料において行う。CYTOQUANT Ｇｐモデルにおいて、標識は全血において直接行われ、洗浄工程は必要ない。この試験では、１試料につき３つのパラメーターが調べられた（３個の試験管）：血液を陰性対照ｍＡｂ（非特異的標識）、ｍＡｂ  Ｍａｂ１及びｍＡＢ  ＭＡｂ２と接触させて置く。検量系を蛍光を発するＡｂの存在下で、第２の標識工程中、１つの試験管に加える。次いで、免疫標識による蛍光強度をサイトメーターで読む。この蛍光強度は血小板に結合した特異的ｍＡｂの数に比例する。検量線の作成後に、蛍光強度を血小板当たりの結合ｍＡＢの絶対値（数）に変換する。
結果を以下のようにして表わす：
−血小板当たりのＧＰIIｂ／IIIａ分子の総数（ＭＡｂ２値）
−抗凝集分子により占められたＧＰIIｂ／IIIａ分子の数（ＭＡｂ２−ＭＡｂ１差）
このように、同時に２つのパラメーターを調べればよい。
実施例１
フィーシビリティ（feasibility）位相の間、ＧＰIIｂ／IIIａに特異的な各種ｍＡｂをReoProの存在下及び不在下で血小板上において試験した。
基底状態及びＡＤＰでの活性化後の血小板におけるReoProの飽和濃度の測定
プロトコール１
特異的ｍＡｂを種々の希釈のReoProで置換することにする間接免疫蛍光試験
１−材料
−ReoPro  2mg/ml、0.1％PBS BSA中で50μg/ml→0.75μg/ml希釈
−ＡＤＰ  Ｓｔａｇｏ  0.2μM
−ＤＤＡＦ
２−方法
−混合  vol/vol  ＰＲＰ／ReoProの希釈物（混合物１）
ＰＲＰ／ＰＢＳ緩衝液（混合物２）
室温で15分間インキュベーション
−混合  vol/vol  混合物１／ＰＢＳ
混合物１／ＡＤＰ  0.2μM
混合物２／ＰＢＳ
混合物２／ＡＤＰ  0.2μM
室温で５分間インキュベーション
−各混合物に４mlのＰＢＳ  ＢＡを添加
3000rpmで10分間遠心分離
上清の除去
−ペレット＋100μl ＤＤＡＦ（ヒツジ抗マウスＦＩＴＣ試薬）
室温で15分間インキュベーション
0003713716.tif 000002
注意、ReoPro希釈物と同数の混合物１試験管がある。
ReoProは、一定のヒトＩｇＧ部分と結合した免疫反応性マウスＦｖ部分を有するキメラＦ（ａｂ）型Ａｂである。第２の試薬、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇビツジポリクローナルは、弱いが分析可能なシグナルを得るのに十分な程度にReoPro分子に結合する。飽和濃度は１μg/mlからである。
ＡＤＰによる血小板活性化ReoProの結合を変化させない。
試験の結果を図１に示す。
ReoProの結合に対して一方では相補的であり、他方では競合剤であるｍＡｂの同定
プロトコール２
１−材料
−ReoPro  2mg/ml、0.1％PBS BSＡ中で10μg/mlに希釈
−10μg/mlのＭＡｂ CD 41及びCD 61（抗ＧＰIIｂ／IIIａ及び抗ＧＰIIIａ）
−ＤＤＡＦ（ヒツジ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ）
２−方法
−混合  vol/vol  ＰＲＰ／ReoPro  10μg/ml
ＰＲＰ／PBS BSA  0.1％
室温で５分間インキュベーション
−２つの混合物の洗浄（＋4ml  PBS BSA  0.1％、3000rpmで10分間遠心分離、上清の除去）
ペレット＋PBS BSA（vol＝ＰＲＰの最初の容量）
−各混合物20μl＋試験すべき各ＭＡｂ20μl
室温で10分間インキュベーション
−＋100μl ＤＤＡＦ 1/100
室温で10分間インキュベーション
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ＧＰIIｂ／IIIａ（CD 41及びCD 61）に対して驚異的な９種のｍＡｂを試験した（表１参照）。
【表１】
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試験は薬剤の不在下（100％）、及びフィブリノーゲンの結合を阻害する抗凝集剤の飽和濃度の存在下で全血において行った。
ReoPro（10μg/ml、最終）又はＰＢＳの存在下で予備インキュベーションした血小板で得られた定量値を比較した。ReoProの存在下及び不在下でその出現が10％を以上は変動しないｍＡｂ PM 6/13、及び飽和濃度で用いたReoProの存在下でその出現が95％以上減少するｍＡｂ P18を選択した。
表１は全血で試験した同じ抗体で得られた結果を示す。
ＰＭ１６／１３−P18の対を用いる利点は、抗凝集剤の不在下で、２つのｍＡｂに対して匹敵しうる反応が血小板でみられることにある。
ReoProの予備インキュベーション濃度を変動させると、プロトコール３による用量／応答実験において、図２に示されるように、P18の結合は抗凝集剤の結合に反比例する。
結論
特異性：Ｍａｂ１クローンP18（CD 61、抗ＧＰIIIａ）
Ｍａｂ２クローンPM 6/13（CD 61、抗ＧＰIIIａ）
供給源：クローンP18（ｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ）  INSERM
クローンPM6/13（Ｍａｂ  IgG1）  Cymbus
ヒツジ（Ｆａｂ）'2抗マウス全Ｉｇ−ＦＩＴＣ試薬、ＤＤＡＦ、が最も適当なポリクローナル試薬である。
図３は精製ｍＡｂ CD 61 P18及びPM 6/13についての血小板における飽和の検討である。
プロトコール３
１−材料
−ReoPro  ２mg/ml、PBS BSＡ  0.1％中の200μg/mlから0.09μg/mlまでの３倍希釈物
−ｍＡｂ  P18：Ａｓｃｉｔｅ  1/800
−ｍＡｂ  PM 6/13：10μg/ml
−ＤＤＡＦ
−ＰＲＰ
２−方法
−ＰＲＰ中のReoProの各調製物の1/10希釈
室温で５分間インキュベーション
−洗浄（PBS BSＡ 0.1％中、3000rpm 10分間）
−ペレット＋PBS BSＡ 0.1％（ＰＲＰの最初の容量と同容量）
−20μl血小板調製物＋20μl ｍＡｂ  P18、PM 6/13及びＩｇＧ、陰性対照
室温で10分間インキュベーション
−各免疫標識及びCYTOQUANT  ＧＰ型の検量系40μlで＋100μl Ｄ  ＤＡＦ 1/100
室温で10分間インキュベーション
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実施例２
同様の測定を以下を用いて行った：
Ｍａｂ２としてPM 6/13、及び
Ｍａｂ１としてP18、
抗凝集剤として各種濃度のReoProを有する全血でのインビトロモデルにおいて。
結果を図４にまとめた。
実施例３
同様の分析を以下を用いて行った：
Ｍａｂ２としてP18、
Ｍａｂ１としてPM 6/13、
抗凝集剤として各種濃度のＲＧＤペプチドを用いるインビトロモデルにおいて。
結果を図５にまとめた。
実施例２及び３においては、使用した薬剤（ReoProもしくはＲＧＤペプチド）は、１〜50μg/mlの希釈系を得るためにリン酸緩衝液中で希釈する。５μlを全血45μlと混合する（1/10希釈）。インキュベーションは室温で30'間行い、緩衝液150μlを加える。
希釈した全血20μlずつに、10または20μg/mlで試験されるｍＡｂ 20μlを加える。
インキュベーション及びＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＡｂの添加の後に、サイトメトリ分析を行う。
血小板に結合されたｍＡｂ分子の数をＩＱＩＦ法に従い、ラテックスビーズを用いてプロットされた検量線を用いて算出する。
実施例４
ReoProで治療した患者でインビボ試験を行った。
この場合はReoProを添加しない。全血を集める（生理的緩衝液中1/4希釈した20μl）。
10μg/mlのｍＡｂ（P18又はPM 6/13）20μlを加える。インキュベーションを室温(RT)で10分間行う。次いで試薬20μlを加え、インキュベーション（10分間、室温）および適宜希釈後にサイトメーターを読む。
図６は受容体の総数に対する注射後の遊離受容体の数を示す。48時間後、遊離受容体の数は依然50％より少ない。
用いるｍＡｂは全受容体の測定についてはPM 6/13、遊離受容体の測定についてはP18である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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