(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸緩衝液中で、ジチロシンとケイホルリムペットヘモシアニンと１−エチル−３−（３−ディメチルアミノプロピル）カルボジイミドとＮ−ハイドロサルフォサクシニドとを反応させ、この反応液を透析して得たことを特徴としたポリクローナル抗体の製造に用いる抗原。
【請求項２】
ジチロシンは、ほう酸緩衝液中で、Ｌ−チロシン、過酸化水素、西洋ワサビパーオキシダーゼを反応させ、その反応生成物から得たことを特徴とした請求項１記載のポリクローナル抗体の製造に用いる抗原。
【請求項３】
ほう酸緩衝液中で、Ｌ−チロシン、過酸化水素、西洋ワサビパーオキシダーゼを反応させ、その反応生成物から得たジチロシンを、リン酸緩衝液中で、ケイホルリムペットヘモシアニンと１−エチル−３−（３−ディメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びＮ−ハイドロサルフォサクシニミドとで反応させ、当該反応によって得た反応液を透析して得ることを特徴としたポリクローナル抗体の製造に用いる抗原の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は請求項２記載の抗原をＰＢＳに溶解し、この溶解液とフロイントアジュバントとによって得たエマルジョンを用いて免疫した抗体作成用の動物（ヒトを除く）の血清から得ることを特徴としたポリクローナル抗体。
【請求項５】
請求項３記載の製造方法によって得た抗原をＰＢＳに溶解し、この溶解液とフロイントアジュバントとによって得たエマルジョンを抗体作成用の動物（ヒトを除く）に注射して免疫とし、当該抗体作成用の動物（ヒトを除く）の血液の血清から得ることを特徴としたポリクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】
エマルジョンの抗体作成用の動物（ヒトを除く）への注射は、所定間隔毎に繰り返して行い、注射の度ごとに所定期間経過時にポリクローナル抗体の産出を測定し、ポリクローナル抗体の産出に変動が生じなくなるまで前記注射を繰り返すことを特徴とした請求項５記載のポリクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ジチロシン（ｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅ）を検出するポリクローナル抗体とその製造に用いる抗原を得ることを目的としたジチロシンポリクローナル抗体とその製造方法並びにこれに用いる抗原及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ジチロシンを認識する場合、ジチロシンが量的に多い時には、ジチロシンが一般的にかなり強い蛍光を持っていることを利用して、加水分解をして逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけ、蛍光検出器で分析する方法が採用されていた。また、生体のコラーゲンからジチロシンを検出するのにＧＣ−ＭＳ分析を利用する提案がなされている。
【０００３】
【発明により解決しようとする課題】
従来のジチロシンの分析に採用されていた化学的な検出方法を用いて生体内におけるジチロシンの局在性を明らかにすることは困難であった。また、ＧＣ−ＭＳ分析による定量には長時間が必要とされ、また当該分析に用いられる機器は高価であるため、多額の維持費用が必要とされ、経済的でないという問題点があった。
【０００４】
すなわち、従来、生体内におけるジチロシンの局在性を明らかにする有効な手段は提案されていなかったが、本発明は、比較的安価な費用で、なおかつ有効、適切にジチロシンを測定し、生体内におけるジチロシンの局在性を明らかにすることができる手段を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者等は、長期の研究の結果、ジチロシンを検出することのできるポリクローナル抗体を製造することに成功し、またこの抗体、すなわちポリクローナル抗体の製造に用いる抗原とその製造法を発明したものである。
【０００６】
すなわち、この発明が提案するポリクローナル抗体の製造に用いる抗原は、リン酸緩衝液中で、ジチロシンとケイホルリムペットヘモシアニンと１−エチル−３−（３−ディメチルアミノプロピル）カルボジイミドとＮ−ハイドロサルフォサクシニドとを反応させ、この反応液を透析して得たことを特徴としたポリクローナル抗体の製造に用いる抗原である。前記において、ジチロシンは、ほう酸緩衝液中で、Ｌ−チロシン、過酸化水素、西洋ワサビパーオキシダーゼを反応させ、この反応生成物から得たものである。ここで、前記反応生成物からジチロシンを得るには、反応生成物の成分をゲル濾過カラムで濾過後、フラクションコレクターで分画し、ＨＰＬＣで精製するという工程によったものである。なお、ジチロシンの精製は、前記工程以外に、前記反応生成物からＴＬＣを使って分画し、最終的にＨＰＬＣを用いて行うこともできるし、そのまま逆相ＨＰＬＣで分画して行うことも可能であるが、前記のように、反応生成物の成分をゲル濾過カラムで濾過後、フラクションコレクターで分画し、ＨＰＬＣで精製するという工程によるほうが簡便である。
【０００７】
また、本発明は、前記の抗原の製造方法として、ほう酸緩衝液中で、Ｌ−チロシン、過酸化水素、西洋ワサビパーオキシダーゼを反応させ、この反応生成物から得たジチロシンを、リン酸緩衝液中で、ケイホルリムペットヘモシアニンと１−エチル−３−（３−ディメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びＮ−ハイドロサルフォサクシニミドとで反応させ、当該反応によって得た反応液を透析して得ることを特徴としたポリクローナル抗体の製造に用いる抗原の製造方法を提案する。ここで、前記反応生成物からジチロシンを得る工程は、前述した工程によるものである。
【０００８】
更に、本発明が提案するポリクローナル抗体は、前記の抗原を、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、この溶解液とフロイントアジュバントとによって得たエマルジョンを用いて免疫した抗体作成用の動物（ヒトを除く一般的に抗体作成に用いられる動物のことをいう）の血清から得ることを特徴としたポリクローナル抗体である。この抗体作成用の動物（ヒトを除く）としては、例えば、ＮＺＷウサギ（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ＷｈｉｔｅＲａｂｂｉｔ）を用いることができ、この他にも、抗体作成用に用いられているウサギなど、種々の動物（ヒトを除く）を用いることが可能である。
【０００９】
前記における抗体作成用の動物（ヒトを除く）の免疫は、初回免疫として前記抗原をＰＢＳに溶解させたものとフロイント完全アジュバントとによって得られたエマルジョンを用いて行い、２回目以降の免疫は、前記抗原をＰＢＳに溶解させたものとフロイント不完全アジュバントとによって得られたエマルジョンを用いて行うものである。これは、初回免疫では、免疫反応を誘発させるため、菌体が含まれているフロイント完全アジュバントを用いるが、２回目以降の追加免疫は、新たに抗体を作るのではなく、初回免疫の時にすでに発現し、Ｂ細胞に記憶されている抗体を増やすことを目的とするものであるためフロイント不完全アジュバントを用いたのである。
【００１０】
また、前記におけるエマルジョンの抗体作成用の動物（ヒトを除く）への注射は、所定間隔毎に繰り返して行い、注射の度ごとに所定期間経過時にポリクローナル抗体の産出を測定し、ポリクローナル抗体の産出に変動が生じなくなるまで前記注射を繰り返して行ったものである。
【００１１】
【実施例１】
本発明のポリクローナル抗体の製造に用いる抗原の生成について好ましい一実施例を以下に説明する。
【００１２】
Ｌ−チロシン（０．１８ｇ）、過酸化水素（３０％溶液、１２０μｌ）、西洋ワサビパーオキシダーゼ（３mg）を２００mlのほう酸緩衝液（ＰＨ９．０）中で３５℃にて２時間反応させた。未反応の過酸化水素を適量のカタラーゼで分解させ（室温、１５分）、凍結乾燥した。これを少量の水にとかし、ゲル濾過カラム（２．２ｘ２３cm）にのせた。ゲル濾過カラムは担体としてトーソーのＨＷ−４０Ｓを使い、水で予め平衡化させておいた。サンプルをのせた後、水で溶出させてフラクションコレクターで分画し、蛍光ランプで照らして蛍光があるフラクションを集めた。
【００１３】
前記のようにゲル濾過した蛍光を有するフラクションを凍結乾燥により濃縮し、さらに分取ＨＰＬＣにより精製した。分取にはデベロシルＯＤＳ−５（２０ｘ２５０nm）を用い、溶媒は０．５％酢酸／メタノール（２９／１）とし、流速５ml／min とした。蛍光を有する主要なピークを単離し、濃縮した。
【００１４】
ＬＣ−ＭＳにより分子量を測定したところ３６１（Ｍ＋Ｈ）＋であり、理論分子量３６０と一致した。又、ＦＡＢ−ＭＳ分析によっても３６１（Ｍ＋Ｈ）＋が確認された。１Ｈ−ＮＭＲを測定したところ、文献値とほぼ同じシグナルが得られた。このことからジチロシンが単一の物質として精製できたことが確認された。
【００１５】
前記で得たジチロシン（５．４mg）とケイホルリムペットへモシアニン（７mg）、１−エチル−３―（３−デイメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１９．２mg）、Ｎ−ハイドロサルフォサクシニミド（１．８mg）とを２mlの０．１Ｍリン酸緩衝液中（ＰＨ７．４）で室温にて攪拌しつつ４時間反応させ、更に４℃で一晩反応を行った。ついでＰＢＳに対して４℃で透析し、３日間透析外液を数回交換してこの発明の抗原を得た。
【００１６】
前記において、１−エチル−３―（３−デイメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ハイドロサルフォサクシニミド（ＮＨＳ）とを共存させたのは、ジチロシンをタンパク質に結合させ、抗原を作成させるためである。ただし、Ｎ−ハイドロサルフォサクシニミド（ＮＨＳ）はエンハンサーとして働くものであるため、共存させなくても抗原を作成させることが可能であるが、その場合、結合率がかなり低くなる。
【００１７】
【実施例２】
次に本発明のポリクローナル抗体の生成について好ましい一実施例を以下に説明する。
【００１８】
前記実施例１で得た抗原を１mg／mlとなるようにＰＢＳに溶解させたもの５００マイクロリットル（μｌ）を注射器にとり、フロイント完全アジュバント７５０μｌを更にとり、別の注射器と連結させ、これを交互に動かすことによりエマルジョンを作成した。抗体作成用の動物としてＮＺＷウサギを採用し、当該ＮＺＷウサギの大腿部に数カ所、このエマルジョンを全量注射した（初回免疫）。
【００１９】
一ヶ月後、同じく前記実施例１の抗原を１mg／mlとなるようにＰＢＳに溶解させたもの５００μｌとフロイント不完全アジュバント７５０μｌとを用い、前記のように注射器を交互に動かすことによってエマルジョンを作成し、これを注射し、追加免疫とした。この追加免疫を２週間ごとに繰り返し、注射１週間後に少量採血し、抗体の産出をジチロシン−ＢＳＡに対して抗体が反応するかをＥＬＩＳＡ法によって確認した。初回免疫から追加免疫の間の間隔、追加免疫と追加免疫との間の間隔は、この実施例においては、それぞれ１カ月、２週間としたが、このような間隔で追加免疫を行うことに限定されるものではない。ただし、初回免疫は、抗体を産出させるためのものであり、通常、最初に抗原を注射してから４乃至５日で抗体が血中に表れ、次第に量が増大して１０日前後にピークとなることから、初回免疫から最初の追加免疫までは２週間以上おくことが好ましい。また、追加免疫は、前記抗体をたくさん作らせるために行うものであるが、追加免疫後、すぐには抗体は増加しないので、追加免疫後１週間おいてから採血し、採血後１週間おいてから次回の追加免疫を行うこととしたものである。
【００２０】
前記の確認によってポリクローナル抗体の産出が一定になったところで（２週間前と比較してポリクローナル抗体の産出に変動が生じなくなったところで、すなわち、ある追加免疫の１週間後に確認された抗体の産出と、当該追加免疫の２週間後に行われた次の追加免疫の１週間後に確認された抗体の産出が同一になったところで）、ＮＺＷウサギから採血し、この血液より血清を得た後、当該血清より本発明のポリクローナル抗体を得た。
【００２１】
前記のように免疫したＮＺＷウサギの血液から本発明のポリクローナル抗体を得る工程は以下のように行った。まずＮＺＷウサギの耳動脈より大量採血を行い、３７℃で１時間保温した後、４℃で一晩静置した。これを３０００回転で１０分間遠心し、得られた上清を滅菌フィルターを通した。その後アフイティカラムを通し、抗体を精製した。アフィニティカラムはファルマシア社のハイトラップＮＨＳ（１ml容量）を用い、プロトコールに従い、ジチロシン（１mg／ml）を固相化した。これに血清を通し結合した抗体を１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．０）で溶出させ、直ちに中和した後、分注しポリクローナル抗体を得て−７０℃に保存した。
【００２２】
なお、本発明のジチロシンを検出するポリクローナル抗体は、前記の免疫したＮＺＷウサギの血液を凝固させた血清の中に含まれているので、この血清の中から本発明のポリクローナル抗体を得る工程は、前述したものに限られない。ただし、前記方法のようにアフィニティ精製を行うと、種々の特性を有する抗体の中から特にジチロシンを強く認識する抗体を選択することができ、より付加価値を高めることができるという利点がある。また、抗体以外の血清中に含まれているアルブミンなどの種々の成分を取り除くことができ、バックグラウンドの低い実験結果が得られるという利点もある。
【００２３】
【試験例１】
ジチロシンに対する抗体が生成していることの証明として、カップリング試薬としてカルボジイミドではなく、グルタルアルデヒドを用いてジチロシンをタンパク質に結合させたものに対しても、抗体が結合することを競争的ＥＬＩＳＡにより確認するため以下の試験を行った。
【００２４】
ジチロシンをＫＬＨと同様にカルボジイミドで結合させた「ＤＴ−ＢＳＡ」のみならず、ジチロシンをグルタルアルデヒド処理した「ＤＴ―ｇｌｕ−ＢＳＡ」について抗体との結合を調べた。
【００２５】
なお、グルタルアルデヒドによる結合は以下のように行った。ジチロシン（３．６mg）とＢＳＡ（５mg）を１．８mlの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、攪拌しつつグルタルアルデヒド（２０％溶液、２００μｌ）を一滴ずつ添加した。その後、更に室温で一晩攪拌したのち、４℃で水に対して２日間透析した。
【００２６】
ＥＬＩＳＡは以下のようにして行った。予め、ＥＬＩＳＡのプレートに０．０１mg／mlのＤＴ−ＢＳＡを５０μｌ添加し、４℃で一晩静置した。同時に５０μｌのサンプル（ｉｎ  ＰＢＳ）と５０μｌのａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１／５００となるように１％ＢＳＡ入りＰＢＳに溶かしたものを混ぜ、４℃で一晩反応させた（抗体最終濃度１／１０００）。翌日、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０入りのＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３回、水で３回洗った後、４％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（２００μｌ）で３７℃１時間ブロッキングした。上記したと同じように洗った後、昨晩より反応させたサンプルを９０μｌ、添加し、３７℃で２時間反応させた。洗った後、２次抗体として、アルカリフォスターゼ標識抗ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体を１／５０００（ｉｎ  ＴＰＢＳ）となるように１００μｌ添加し、１時間３７℃で反応させた。洗った後、ｐ−ニトロフェニルリン酸（１８mg／１０ml）入りの１０％ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）を１００μｌ添加し、発色を行い、４０５nmの吸光度を測定した。競争ＥＬＩＳＡの場合は結合率として表示した。
【００２７】
この結果を図１に表す。これより、ジチロシンをＫＬＨと同様にカルボジイミドで結合させた「ＤＴ−ＢＳＡ」のみならず、ジチロシンをグルタルアルデヒド処理した「ＤＴ―ｇｌｕ−ＢＳＡ」についても濃度依存的に抗体に結合することが確認できる。
【００２８】
すなわち、この試験によって、本発明のポリクローナル抗体は、ジチロシンのタンパク質結合に用いていた試薬、すなわち、１−エチル−３―（３−デイメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ハイドロサルフォサクシニミド（ＮＨＳ）とを用いずに、ケイホルリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のアミノ基とジチロシンのアミノ基とをグルタルアルデヒドで結合させたものを認識するものであることが確認できた。これによって、本発明のポリクローナル抗体は、ジチロシンのタンパク質結合に用いた試薬（ＥＤＣとＮＨＳ）に由来する副産物に対して認識するものではないことが確認されたわけである。
【００２９】
【試験例２】
チロシンの類縁体との交差性を競争的ＥＬＩＳＡにより検討した。遊離のジチロシン（Ｄｉｔｙｒ）以外に、Ｌ−Ｔｙｒ（チロシン）、Ｌ−Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、３、４―ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（ドーパ；Ｄｏｐａ）、ｏ−ホスホチロシン（ホスホチロシン；Ｐ−Ｔｙｒ）、３−クロロチロシン（クロロチロシン；Ｃｌ−Ｔｙｒ）、３−ニトロチロシン（ニトロチロシン；Ｎｉｔｒｏ−Ｔｙｒ）、３―アミノチロシン（アミノチロシン；Ａｍｉｎｏ−Ｔｙｒ）を競争物質として検討した。
【００３０】
サンプルをＥＬＩＳＡプレートにまいた後、４℃で一晩放置し、翌日ＴＰＢＳと水で洗い、４％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅで、３７℃にて１時間ブロッキングした。洗った後、一次抗体として、アフィニティ精製抗体を０．３６μｇ／ｍｌとなるように０．５％ＢＳＡ入りＰＢＳで希釈した液を、１００μｌずつ加え、３７℃で２時間保温した。洗った後、２次抗体として、アルカリフォスターゼ標識抗体ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（ＴＰＢＳにて１／５０００希釈）を１００μｌ加え、３７℃で１時間保温した。発色は、試験例１で述べたように、ｐ−ニトロフェニルリン酸を発色剤として用いた手法にて行い、吸光度４０５ｎｍを測定した。
【００３１】
この試験の結果を図２に表す。
【００３２】
これより、プレートにまいたｄｉｔｙｒｏｓｉｎｅ−ＢＳＡと抗体との結合性をジチロシンのみが濃度依存的に阻害し、他の化合物は全く影響しなかった。このことから、本発明のポリクローナル抗体は、遊離ジチロシンに対して非常に特異性が高く、類似した構造であっても認識しないこと、また、本発明のポリクローナル抗体は、遊離ジチロシンの定量法に応用できることが立証された。
【００３３】
前記試験例１の結果、本発明のポリクローナル抗体は結合試薬に対する抗体ではなかったことが確認されているので、この試験例２の結果と合わせると、本発明のポリクローナル抗体がジチロシンの定量に有効であることが確認できる。
【００３４】
【試験例３】
ミエロペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼによって、タンパク質にジチロシンが生成することが知られている。そこで、まずはじめに、ｈｏｒｓｃｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）により修飾されたＢＳＡにおけるジチロシン検出を行った。反応は（１）ほう酸緩衝液（ｐＨ９．０）中でＢＳＡ（１mg／ml）にＨＲＰ（０．１mg／ml）と過酸化水素（３ｍＭ）を加えたもの、（２）ＢＳＡにＨＲＰと過酸化水素、Ｌ−Ｔｙｒ（０．２ｍＭ）を加えたもの、をそれぞれ、室温で１時間保温した。ついで適量のカタラーゼを加えて過酸化水素を分解して４℃で一晩透析した。得られたタンパク質をＥＬＩＳＡプレートにまき、ＥＬＩＳＡにより抗体との結合性を調べた。その結果、Ｌ−Ｔｙｒの存在下で抗体陽性物質の生成が確認された。Ｌ−Ｔｙｒの非存在下では抗原物質は生成しなかった。なお、この試験において、コントロールには、未修飾のＢＳＡを用いた。この結果を図３に表す。
【００３５】
化学的にこれら修飾タンパク質を酸加水分解してジチロシンの定量を行った結果、ｎａｔｉｖｅ  が０、ＨＲＰ／Ｈ２  Ｏ２  が０．０１６ｍｏｌ／ｍｏｌ  ｏｆ  ＢＳＡ、ＨＲＰ／Ｈ２  Ｏ２  ／Ｌ−Ｔｙｒ  が０．１３ｍｏｌ  ｏｆ  ｍｏｌ  ＢＳＡとなり、８倍程度、Ｌ−Ｔｙｒを含む系の方がタンパク質にジチロシンが多く存在していることが明らかとなった。
【００３６】
この結果より、ペルオキシダーゼによりタンパク質に生じたジチロシンが、本発明の抗体によって認識されることが立証され、このことから、生体を構成するタンパク質成分に存在するジチロシンを本発明のポリクローナル抗体を用いて定量できることが立証された。
【００３７】
【試験例４】
最近、ミエロペルオキシダーゼがジチロシンをＬ−Ｔｙｒと過酸化水素の存在下で生成すること、動脈硬化病巣に活性型のミエロペルオキシダーゼが存在していること、また、ミエロペルオキシダーゼがＬＤＬを酸化しうることが報告されている。また、動脈硬化病巣にジチロシンが存在していることがＧＣ−ＭＳ分析により明らかとなっている。このことから動脈硬化発症において、ミエロペルオキシダーゼが関与している可能性が高いと考えられる。今後、動脈硬化発症のマーカーとなりうる可能性のある血中ＬＤＬのジチロシン定量を行う上でも、「ＬＤＬ」のジチロシンを検出定量することは重要であると思われる。
【００３８】
そこで、ＬＤＬのジチロシン定量をサンドイッチＥＬＩＳＡにより行うことにした。本発明のポリクローナル抗体（３．６μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）を１００μｌプレートにまき、室温で２時間おき、更に１％ＢＳＡでブロッキングした（室温、２時間）。ここにサンプル（ＬＤＬ）を添加し、４℃で一晩反応させた後、更に抗ヒトａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ−１００抗体（ヤギ、１／５０００  ｉｎ  ＴＰＢＳ）を作用させ、３７℃で２時間反応した。また、アルカリフォスファターゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（１／１００００  ｉｎ  ＴＰＢＳ）を更に作用させ、ＬＤＬ中のジチロシンの検出を行った。サンプルとしては、ｎａｔｉｖｅ  ＬＤＬ、ＬＤＬをミエロペルオキシダーゼ／Ｌ−Ｔｙｒ／過酸化水素で処理したもの（ＭＰＯ／Ｈ２  Ｏ２  ／Ｌ−Ｔｙｒ）、ＬＤＬをミエロペルオキシダーゼ／過酸化水素処理したもの（ＭＰＯ／Ｈ２  Ｏ２  ）、ＬＤＬを過酸化水素／Ｌ−Ｔｙｒ処理したもの（Ｈ２  Ｏ２  ／Ｌ−Ｔｙｒ）を用いた。量はミエロペルオキシダーゼ：１．１  ｕｎｉｔ／ｍｌ、Ｌ−Ｔｙｒ：０．２ｍＭ、過酸化水素：２００μＭ、ＬＤＬ：０．５mg／mlとした。反応は０．１Ｍリン酸緩衝液中（ｐＨ７．４）（１００μＭのＤＴＡ含む）、室温で１時間行い、ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ（最終濃度１ｍＭ）入りのＰＢＳで反応を停止した後、直ちにＰｈａｒｍａｃｉａ社のＰＤ−１０ゲル濾過カラムにのせ、タンパク質と低分子化合物を分画した。得られたＬＤＬを０．０８mg／mlに調整し、サンドイッチＥＬＩＳＡに用いた。結果は、ＬＤＬのみのサンプルの値をブランクとして用いた。その結果、ミエロペルオキシダーゼ／過酸化水素／Ｌ−Ｔｙｒ系で処理したＬＤＬのみにジチロシンの生成が確認された（図４）。
【００３９】
この結果より、本発明のポリクローナル抗体は、動脈硬化発症のマーカーとなり得るＬＤＬ中のジチロシンを定量する方法に応用できることが立証された。
【００４０】
【発明の効果】
この発明によれば、生体内におけるジチロシンを、有効かつ適切に、定量することのできる抗体、すなわち生体内におけるジチロシンを、有効かつ適切に、定量することのできるポリクローナル抗体を提供することができる。
【００４１】
前記ポリクローナル抗体の製造に用いる抗原は、西洋ワサビパーオキシダーゼを用いて容易に製造することができ、また前記ポリクローナル抗体はこの抗原を用いて免疫したウサギの血清から高収量で製造することができるので、比較的安価な費用で、生体内におけるジチロシンを定量することのできるポリクローナル抗体を提供できる。
【００４２】
また、この発明の抗体、ポリクローナル抗体を用いれば、有効かつ適切にジチロシンを定量することができるので、ジチロシンが存在している生体内の動脈硬化病巣を容易に特定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗原に対するジチロシンの蛋白結合効果を示すグラフ。
【図２】ＥＬＩＳＡ競合法による抗ジチロシン抗体のチロシン類縁物の交差性を示すグラフ。
【図３】Ｌ−チロシン／過酸化水素の存在下における西洋ワサビパーオキシダーゼ修飾蛋白の抗原物質の形成を示すグラフ。
【図４】ミエロベルオキシダーゼ修飾ＬＤＬにおけるジチロシンの形成を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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