(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア・ニューモニエの基本小体及び網状体を含有するクラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物を可溶化し、80,000〜120,000×ｇで遠心分離し、残渣成分を取得することを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
【請求項２】
クラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物が、糖を含む緩衝液にアミドトリゾ酸を含む緩衝液を重層し、さらにクラミジア・ニューモニエ感染細胞の抽出液を重層し、遠心分離して得られる沈渣である請求項１記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
【請求項３】
クラミジア・ニューモニエの基本小体及び網状体を含有するクラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物を可溶化し、80,000〜120,000×ｇで遠心分離する工程が、クラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物に対し、アミドトリゾ酸の濃度勾配を用いる遠心分離操作を行わず、この抽出物を可溶化し、80,000〜120,000×ｇで遠心分離するものである請求項１又は２に記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・ニューモニエ感染症を診断するために有用なクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア(Chlamydia)は、宿主の細胞内でのみ生存可能な偏性細胞内寄生体である。その増殖サイクルは特殊で、形態学的には細胞外にあるクラミジア基本小体(elementary body、以下ＥＢと略す)が食菌作用により細胞内に取り込まれて空胞封入体を形成し、網様体(reticulate body、以下ＲＢと略す)に変化する 。ＲＢは増殖力はあるが感染力を欠いており、細胞内で増殖したＲＢはやがてＥＢに変化し、封入体を破り細胞壁を破壊して細胞外に出る。ＥＢは増殖力を欠くが感染力を持つ。クラミジア属には、現在４つの種（トラコマティス、シタシ、ニューモニエ及びペコラム）が確認されているが、クラミジア・ニューモニエ  （Chlamydia pneumoniae）は空気感染によってヒトに感染することが知られている。
【０００３】
近年、肺炎、気管支炎、急性上気道炎などの呼吸器感染症の原因微生物の１つとしてこのクラミジア・ニューモニエが注目を集めており、世界各地で行われた血清学的疫学調査によると、クラミジア・ニューモニエに対する抗体保有率が、欧米諸国では４０〜５０％、台湾、パナマ、イランなどでは６０％以上、日本国内でも５０〜６０％と報告され、クラミジア・ニューモニエ感染症の実態が徐々に明らかにされるにつれて関心が高まってきている。
【０００４】
クラミジア感染症の最も感度の高い血清診断法はワン(Wang)及びグレイストン(Grayston)の間接ミクロ免疫蛍光抗体測定法（マイクロ−ＩＦ法）である（トラコーマ・アンド・リレーティッド・ディスオーダーズ・コーズド・バイ・クラミジアル・エージェンツ、エクセルプタ・メディカ、アムステルダム、273-288頁 、1971年）(Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents, Excerpta Medica, Amsterdam, pp.273-288, 1971)。しかしながら、マイクロ−ＩＦ法はその試験手技が煩雑であり、しかも、標準的なマイクロ−ＩＦ法はクラミジアの精製ＥＢを必要とし、免疫蛍光反応を行うために同定用微生物の完全な形態又は構造を必要とするため、形態又は構造を変えたＥＢや破壊したＥＢを使用することができないという問題もあり、臨床検査室ではマイクロ−ＩＦ法は診断法として採用されていない。
【０００５】
一方、近年開発された酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる利点を有している。このＥＬＩＳＡを用いた抗クラミジア抗体の測定に関する報告がなされているが、そのほとんどがクラミジアのＥＢをそのまま抗原材料として用いている。そのため、精製純度の低い抗原を用いることによる非特異的反応の存在が知られている。
これは、主としてクラミジアの複雑な抗原性に起因している。クラミジアの抗原性には、属(genus)特異的抗原、種(species)特異的抗原および血清型(biobar)特異的抗原があると考えられている。
代表的なクラミジア属特異的抗原として、リポポリサッカライド(lipopolysaccharide、以下ＬＰＳと略す)が知られており、これは一部腸内細菌のＲｅミュータントＬＰＳと共通抗原性を有している。
【０００６】
また、代表的な種特異的抗原又は血清型特異的抗原としては、クラミジアＥＢの表面に存在するクラミジア主要外膜タンパク質（以下、ＭＯＭＰと略す）が知られており、クラミジア外膜タンパク質の約６０％を占めるといわれている。しかしながら、このＭＯＭＰにも属特異的抗原性の存在が知られている（コレットら、アニュアル・ミーティング・アメリカン・ソサイエティー・オブ・ミクロバイオロジー、ワシントン  ディーシー、アブストラクト、No.D-159、1986年）  （Collett et al., Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol.,Washington.D.C., Abstract No.D-159, 1986）。
【０００７】
ところで、ＭＯＭＰ以外のクラミジア外膜抗原は主として属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の存在するものもある。例えば、飯嶋らは、クラミジア・ニューモニエのＥＢを用いたイムノブロット法により、クラミジア・ニューモニエの分子量４０ＫダルトンのＭＯＭＰが属特異的であり、分子量４３Ｋダルトン、４６Ｋダルトン及び５３Ｋダルトンのタンパク質が種特異的であり、さらに、分子量９８Ｋダルトンのタンパク質もおそらく種特異的であることを報告している（飯嶋ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、583-588頁、1994年）（Y. Iijima et al., Journal of Clinical Microbiology,p.583-588(1994)）。
【０００８】
上述したように、クラミジアのもつ抗原性は非常に複雑であるため、クラミジア・ニューモニエ感染者が有する抗クラミジア抗体もクラミジアの複雑な抗原性に対応した多様性を示し、感染者によってそのパターンは異なる。従って、クラミジア・ニューモニエＥＢ自体のような精製純度の低い抗原を用い、ＥＬＩＳＡを利用して抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定しようとすると、種特異的抗原と属特異的抗原が混在する抗原を使用して抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定することになり、抗原と検体中の抗クラミジア・ニューモニエ抗体の非特異的反応が生じ、抗クラミジア・ニューモニエ抗体を特異的かつ高精度に測定することができなかった。
【０００９】
一方、これまで抗原材料として使用されてきたクラミジア・ニューモニエの精製ＥＢは、宮下らの方法（宮下ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、30巻、2911-2916頁、1992年（Miyashita et al., J. Clin. Microbiol., Vol.30, p.2911-2916(1992)））によって取得することができるが、この方法では、得られる精製ＥＢが量的に充分ではなかった。従って、精製ＥＢをさらに精製して抗原材料を得ることは困難であった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１、２及び３記載の発明は、種特異性の高いクラミジア・ニューモニエ抗原を、簡易に、大量に製造することができるクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法を提供するものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記（１）〜（３）に関する。
（１）クラミジア・ニューモニエの基本小体及び網状体を含有するクラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物を可溶化し、遠心分離し、残渣成分を取得することを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
（２）クラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物が、糖を含む緩衝液にアミドトリゾ酸を含む緩衝液を重層し、さらにクラミジア・ニューモニエ感染細胞の抽出液を重層し、遠心分離して得られる沈渣である前記（１）記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
（３）クラミジア・ニューモニエの基本小体及び網状体を含有するクラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物を可溶化し、遠心分離する工程が、クラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物に対し、アミドトリゾ酸の濃度勾配を用いる遠心分離操作を行わず、この抽出物を可溶化し、遠心分離するものである前記（１）又は（２）に記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、クラミジア・ニューモニエの基本小体及び網状体を含有するクラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物は、糖を含む緩衝液にアミドトリゾ酸を含む緩衝液を重層し、さらにクラミジア・ニューモニエ感染細胞の抽出液を重層し、遠心分離した後の沈渣として取得することができる。
糖としては、例えば、ショ糖を使用することができる。
アミドトリゾ酸としては、例えば、アミドトリゾ酸のナトリウム塩を使用することができる。アミドトリゾ酸のナトリウム塩は、例えば、血管造影剤「ウログラフィン」（シェーリングＡＧ社商品名）として市販されている。
緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸緩衝液（pH７．２）を使用することができる。
【００１３】
クラミジア・ニューモニエ感染細胞の抽出液としては、例えば、クラミジア・ニューモニエを感染させて培養した培養細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して得られた上清を使用することができる。
クラミジア・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株(金本ら、感染症学雑誌、66巻、第５号、637-641頁(1992年)）を用いることができる。
【００１４】
クラミジア・ニューモニエを感染させる培養細胞としては、例えば、ＨＬ細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭｃＣｏｙ、Ｌ細胞等を使用することができる。
培養細胞は公知の手法により培養することができる。培養方法としては、例えば、培地を含む組織培養容器（ポリスチレン、ガラス等で作られたフラスコなど）に培養細胞を入れ、炭酸ガス（ＣＯ2）雰囲気下（炭酸ガス濃度：例えば、３〜１０％）、適温（例えば、３６．５〜３７．５℃）で数日間（例えば、１〜７日間）保温する方法を利用することができる。培養細胞としてＨＬ細胞を用いる場合は、培地としては、例えば、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有させたイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ  Minimum Essential Mediun(ＭＥＭ)、以下、イーグル  ＭＥＭという）を使用することができる。
【００１５】
なお、クラミジア・ニューモニエの感染を容易にするため、例えば、予め、カバーグラスが静置されている組織培養容器（ポリスチレン製組織培養プレート等）に、増殖した培養細胞を分注し、適温（例えば、３６．５〜３７．５℃）で１〜７日間程度培養することにより、培養細胞の単層を形成させておくことが好ましい。
また、培養細胞の培養にあたり、クラミジア・ニューモニエの封入体が効率よく形成される点から、細胞の増殖を抑制することが好ましい。
細胞増殖を抑制する方法としては、例えば、細胞に放射線を照射する方法（irradiation）、細胞培養の際に化学物質（5-iodo-2-deoxyuridine（ＩＵｄＲ）、サイトカラシン（Cytochalasin）Ｂ、エミタイン（Emetine）、シクロヘキシミド（Cycloheximide）等）を添加させた培地を使用する方法などが挙げられるが 、クラミジア・ニューモニエの封入体形成の効率が高い点から、シクロヘキシミドを添加させた培地を使用する方法が好ましい。
【００１６】
培養細胞を破砕又は溶解する方法としては、例えば、培養細胞をホモジナイザーにかける方法、培養細胞に超音波を照射する方法、培養細胞を細胞溶解液に懸濁して保温する方法等を利用することができる。細胞溶解液としては、例えば、プロテイネースＫ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びＲＮＡ分解酵素を含有するトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）を利用することができる。
【００１７】
クラミジア・ニューモニエ感染細胞の抽出液を重層した後の遠心分離の条件としては、例えば、４０，０００〜５０，０００×ｇ、好ましくは４３，０００×ｇで、４０〜１２０分間、好ましくは６０分間遠心分離する条件を採用することができる。
遠心分離して得られた沈渣は粗精製ＥＢであり、ＥＢだけでなくＲＢも含んでいると考えられる。
【００１８】
クラミジア・ニューモニエの基本小体及び網状体を含有するクラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物に対し、アミドトリゾ酸の濃度勾配を用いる遠心分離操作を行わず、この抽出物を可溶化し、遠心分離し、残渣成分を取得する操作において、前記抽出物に対するアミドトリゾ酸の濃度勾配を用いる遠心分離操作としては、前記抽出物含有溶液１容を、アミドトリゾ酸３５〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度勾配をもつ０．０３３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．２）３容の上に重層し、４３，０００×ｇ、６０分間遠心分離し、遠心分離後の中間層の濁った部分を回収する操作が挙げられる。この操作は、粗精製ＥＢから精製ＥＢを取得する操作であり、本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法はこの操作を必要としないものである。
【００１９】
クラミジア・ニューモニエ感染細胞抽出物を可溶化する方法としては、例えば、前記沈渣を、イオン性界面活性剤を含有する緩衝液に懸濁し、保温する方法が挙げられる。この方法は、抗原を容易に製造でき、かつ、得られる抗原が良好な抗原性を示す点から好ましい。前記イオン性界面活性剤としては、得られる抗原が良好な抗原性を示す点から、アニオンサルコシン界面活性剤が好ましく、サルコシル（Sarcosyl、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）が特に好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）を使用することができる。保温操作は、例えば、３６．５〜３７．５℃で３０分間〜２時間静置する方法を使用することができる。なお、可溶化操作の際に、デオキシリボ核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ）及びリボ核酸分解酵素（ＲＮａｓｅ）等のヌクレアーゼを反応させ、核酸を分解することが好ましい。また、沈渣とイオン性界面活性剤が充分に反応できるようにするため、保温操作の前に懸濁液に超音波を照射して沈渣を懸濁液中に充分分散させておくことが好ましい。
【００２０】
可溶化後の遠心分離の条件としては、例えば、８０，０００〜１２０，０００×ｇ、好ましくは１００，０００×ｇで、４０〜１２０分間、好ましくは６０分間遠心分離する条件を採用することができる。
クラミジア・ニューモニエＥＢと比べ、クラミジア・ニューモニエＲＢは壊れやすいため、前記可溶化及び遠心分離操作によってクラミジア・ニューモニエＲＢは分解され、その分解物は遠心分離後に上清画分側に含まれるようになると考えられる。従って、得られた残渣成分は、クラミジア・ニューモニエＥＢから細胞質と細胞質膜が欠落した細胞壁、即ち、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分としていると考えられる。このクラミジア・ニューモニエ外膜の断片はクラミジア・ニューモニエ外膜複合体（Chlamydia outer membrane complex、以下、ＣＯＭＣという）と呼ばれている。このクラミジア・ニューモニエ外膜には、分子量約３０Ｋダルトン、約３７Ｋダルトン、約４０Ｋダルトン、約４３Ｋダルトン、約４６Ｋダルトン、約５３Ｋダルトン、約６０Ｋダルトン、約９８Ｋダルトンのタンパク質及びその他の微量のタンパク質が含有される。
【００２１】
得られた残渣成分は、クラミジア・ニューモニエに特異的なクラミジア・ニューモニエ抗原として使用することができる。
なお、この残渣成分に可溶化剤を反応させて得られた反応物もクラミジア・ニューモニエ抗原として用いることもできる。前記可溶化剤としては、例えば、前記イオン性界面活性剤とは異なった界面活性剤等が挙げられ、このような界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。得られた反応物には、前記残渣成分の可溶化物又は分解物が含有される。
前記残渣成分及び反応物は、抗クラミジア・トラコマティス抗体や抗クラミジア・シタシ抗体と非特異的反応がほとんどなく、クラミジア・ニューモニエ抗原として種特異性が高く、従って、臨床上問題となる疑陰性がほとんどなく、疑陽性も低いと考えられる。
前記残渣成分及び反応物の中では、これらの効果が顕著に優れ、再現性にも優れる点から、クラミジア・ニューモニエ抗原として、クラミジア・ニューモニエ外膜を中心成分とする前記残渣成分自体を使用することが好ましい。
【００２２】
本発明のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法は、種特異性の高いクラミジア・ニューモニエ抗原を、簡易に、大量に製造することができ、得られた抗原は、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬やクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬の材料などに有効に利用される。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１  クラミジア・ニューモニエ粗精製ＥＢの調製及び粗精製ＥＢからのクラミジア・ニューモニエ外膜画分の調製
（１）クラミジア・ニューモニエ粗精製ＥＢの調製
クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株(金本ら、感染症学雑誌、66巻、第５号、637-641頁(1992年)）を用いた。
予めＹＫ−４１株を感染させ、４日間培養したＨＬ細胞（ポリスチレン製組織培養プレート（６ウェル）中に設置）に、ＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）を１ml／ウェルの割合で加え、シリコンゴム片を用いてプレートからＨＬ細胞を剥離させ、ＨＬ細胞含有ＳＰＧ液を回収した。
【００２４】
回収した液をＳＰＧ液で４８倍に希釈し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、ＹＫ−４１株浮遊液（１０5IFU/ml）とした 。
【００２５】
一方、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ)添加イーグルＭＥＭ培地中で増殖したＨＬ細胞の約８×１０4cells/ml浮遊液４mlを６穴培養プレートに分注後 、細胞の単層形成のため３６℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2インキュベーター内で３日間培養した。これに前記ＹＫ−４１株浮遊液（１０5IFU/ml）２mlを接種し、遠心吸着（９００×ｇ、６０分）を行った。吸着後、接種液を吸引除去し、シクロヘキシミド（１μg/ml）添加１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ添加イーグルＭＥＭ培地４ｍｌを加え、さらに３６℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2インキュベーター内で４日間培養した。その後、感染細胞をプレートからシリコンゴム片を用いて剥離し、感染細胞懸濁液を回収した。また、この際、６穴培養プレートに１３mm径カバーグラスを入れておき、感染細胞を剥離する直前に取り出し、カルチャーセットにより染色し、感染率を確認した。
【００２６】
上記感染培養細胞懸濁液をホモジナイザーにかけて細胞を破砕した後、２０℃１０分間遠心し上清液を回収した。この上清液２容を、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む０．０３３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．２）１容に３０％（ｗ／ｖ）ウログラフィン(シェーリングＡＧ社商品名)を含む０．０３３Ｍトリス−塩酸緩衝液(pH７．２)２容を重層した上にさらに重層し、４３，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心分離し、沈渣として粗精製ＥＢを得た。
【００２７】
（２）サルコシル不溶性のクラミジア・ニューモニエ外膜画分の取得
得られた粗精製ＥＢを２％（ｗ／ｖ）サルコシル、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ(ethylene diamine tetraacetic acid)及び０．１４Ｍ食塩を含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（サルコシル緩衝液）（pH８．０)に懸濁し、２０kHz、６０秒間超音波処理し、３７℃で１時間反応後、１００，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心分離した。遠心分離後、得られた沈渣を再度少量の上記サルコシル緩衝液に懸濁し、１００，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心分離した。遠心分離後、沈渣を取得し、過剰のサルコシルを除くため、この沈渣をＰＢＳ(pH８．０)で２回洗浄した。次に、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを各々２．５μg/mlに溶解した１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH８．０）に上記沈渣を懸濁し３７℃で２時間反応後、１００，０００×ｇ、４℃で６０分間遠心分離した。残渣中に残存するＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを除くため、得られた残渣をＰＢＳ（pH８．０）で２回洗浄し、残渣成分（サルコシル不溶性のクラミジア・ニューモニエ外膜画分）を得た。
【００２８】
得られた残渣成分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動させ、残渣成分に含まれる各タンパク質の分子量を測定した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、「ラエムリ、ユーケー、ネーチャー、227巻、680-685頁、1970年」（Laemuli,U.K.Nature,227,680〜685,1970）の方法に準じ、４〜２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配アクリルアミドゲル中で行なった。泳動緩衝液は１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２Ｍグリシン含有０．０２５Ｍトリス緩衝液を用いた。泳動試料は、あらかじめ残渣成分（タンパク質濃度約５００μg/ml）６０μｌにサンプル処理液（４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー含有０．１２５Ｍトリス緩衝液(pH６．８)）６０μｌと還元剤として２−メルカプトエタノール１２μｌを加えて９５℃で５分間処理したものを、１ウエル当り１０μｌ用いた。また、電気泳動条件は４０ｍＡで約１時間行なった。分子量マーカーには、カレイドスコープ・プレステインド・スタンダード(Kaleidoscope Prestained Standard）（バイオラッド社製商品名)を用い、前記と同じ条件で泳動し、その移動度から各試料のタンパク質の分子量を決定した。
【００２９】
また、染色は、銀染色キットワコー（商品名、和光純薬工業(株)製）を用いて銀染色により行なった。
図１にこのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターン図を示す。図１中、各矢印はそれぞれ、１：約９８Ｋダルトン、２：約６０Ｋダルトン、３：約５３Ｋダルトン、４：約４６Ｋダルトン、５：約４３Ｋダルトン、６：約４０Ｋダルトン、７：約３７Ｋダルトン、８：約３０Ｋダルトンの分子量のタンパク質を示す。
【００３０】
比較例１  クラミジア・ニューモニエ精製ＥＢの調製及び精製ＥＢからのクラミジア・ニューモニエ外膜画分の調製
上記実施例（１）で得られた粗精製ＥＢをＳＰＧ液に懸濁し、その懸濁液１容を、ウログラフィン３５〜５０％（ｗ／ｖ）の濃度勾配をもつ０．０３３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．２）３容の上に重層し、４３，０００×ｇ、２０℃で６０分間遠心分離し、遠心分離後の中間層の濁った部分として精製ＥＢを得た。
得られた精製ＥＢを用い、上記実施例（２）記載の方法に従い、残渣成分（サルコシル不溶性のクラミジア・ニューモニエ外膜画分）を取得した。
【００３１】
評価
（Ａ）クラミジア・ニューモニエ外膜画分の収量の比較
粗精製ＥＢから得られたサルコシル不溶性のクラミジア・ニューモニエ外膜画分と、精製ＥＢから得られたサルコシル不溶性のクラミジア・ニューモニエ外膜画分について、タンパク質量をそれぞれ定量し、収量を比較した。結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
表１の結果は、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢを得てからクラミジア・ニューモニエ外膜画分を得る方法と比べ、本発明の製造法のように、クラミジア・ニューモニエの粗精製ＥＢから直接クラミジア・ニューモニエ外膜画分を得る方法の方が、クラミジア・ニューモニエ外膜画分の収量が極めて多い（１０倍）ことを示している。
【００３４】
（Ｂ）抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法
クラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として用いる抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に従い、次のようにして行った。
【００３５】
上記のいずれかのクラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として、担体固定用緩衝液（１リットル中にＮａＨＣＯ3  ２．９３ｇ及びＮａ2ＣＯ3  １．５９ｇを含む）でタンパク質濃度５μg/mlに調整し、９６穴ポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し４℃で１晩反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（pH７．２）（以下０．０５％  （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳと略す）３００μｌで各ウエルを３回洗浄して未吸着抗原を除去した。次に、５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング緩衝液（「ブロッキング／希釈用緩衝液」（ＫＰＬ社製商品名）を蒸留水で２倍に希釈した溶液）２５０μｌを各ウエルに加えて３７℃で１時間反応させ、抗原固定化プレートを作製した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ  ２５０μｌで各ウエルを２回洗浄し、次いで０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで希釈した希釈検体血清１００μｌを上記各ウエルに加えて３７℃で１時間反応させた後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ  ２５０μｌで各ウエルを３回洗浄した。
【００３６】
次いで、アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（標識抗体）を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１μg/mlに希釈して各ウエルに１００μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ  ２５０μｌで各ウエルを３回洗浄した。次に、アルカリフォスファターゼの基質であるｐ−ＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）ジエタノールアミン溶液（酵素反応基質、濃度１mg/ml）１００μｌを各ウエルに加え、室温で１０分間反応させた後、３Ｎ  ＮａＯＨ溶液２５μｌ（反応停止液）を加えて反応を停止させ、マイクロタイタープレートリーダー（コロナ電気(株)製、商品名ＭＴＰ−１２０形）で吸光度（４０５nm）を測定した。
【００３７】
（Ｃ）クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分のヒト血清に対する感度及び特異性
対照試験法として行った間接マイクロ−ＩＦ法により特定した、クラミジア・ニューモニエ抗体陽性者血清５５検体及び陰性ヒト血清６６検体を用い、前記  （Ｂ）の方法に従って抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定し、感度及び特異性を調べた。クラミジア抗体測定用検体試料液としては、ヒト血清を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２００倍に希釈したものを用いた。間接マイクロ−ＩＦ法は「クラミジア感染症の基礎と臨床」第62〜91頁（昭和63年２月20日に金原出版から発行）に記載された方法に従い、次のようにして行った。
【００３８】
クラミジア・ニューモニエ  ＴＷ−１８３株を用い、上記比較例１と同様にして精製ＥＢを取得した。得られた精製ＥＢを、３％ノーマルヨークサック(Normal York Sac)と混合し、スライドグラス上に近接させて点置した。点置後、スライドグラスにアセトンを添加し、精製ＥＢを固定した。
ヒト血清試料を０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで２倍、４倍、８倍等と２倍ずつ希釈し、試料溶液を得た。この試料溶液を順に前記ＥＢに添加し、３７℃で３０分間保温した後、試料溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでスライドグラスを洗浄した。
抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲート（シグマイムノケミカルズ社製蛍光抗体）を前記ＥＢに添加し、３７℃で３０分間保温した後、試料溶液を除去し、Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでスライドグラスを洗浄した。得られたスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察し、蛍光の有無を調べ、蛍光が確認された最大の希釈倍率を求め、これを力価とし、力価１６をカットオフ値とした。
【００３９】
また、抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定のための抗原として比較例１で得られたクラミジア・ニューモニエの精製ＥＢを用い、前記（Ｂ）の方法に従って抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定し、ヒト血清に対する感度及び特異性を調べた。結果を図２及び表２に示す。
【００４０】
図２は、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果（吸光度）と、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢを用いたマイクロ−ＩＦ法の結果（力価）との相関を比較したグラフであり、縦軸は酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸はマイクロ−ＩＦ法の血清希釈倍数（力価）を示す。
表２は、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果（吸光度）と、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢを抗原として用いた酵素免疫測定法の結果（吸光度）を比較した表であり、表中の数値はマイクロ−ＩＦ法で判定した結果との一致率（％）とその検体数を示す。
なお、各試験のカットオフ値は、陰性ヒト血清６６検体の吸光度の平均値に標準偏差を加えた値とした。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
図２の結果は、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として用いた抗クラミジア・ニューモニエ抗体測定法の測定結果が、従来のマイクロ−ＩＦ法の測定結果と極めて良好な相関関係があることを示している。
また、表２の結果は、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢを抗原として用いた場合と比べ、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として用いる場合の方が、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果（吸光度）とマイクロ−ＩＦ法の結果の一致率が高いことを示している。特に、臨床上問題になる疑陰性がなく、このことは、臨床的有用性が高いことを示している。
【００４３】
（Ｄ）クラミジア・ニューモニエの粗精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分とクラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を用いた抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定結果の相関関係
クラミジア・ニューモニエの粗精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分とクラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分をそれぞれクラミジア・ニューモニエ抗原として用い、前記（Ｃ）と同様にして間接マイクロ−ＩＦ法で特定されたクラミジア・ニューモニエ抗体陽性者血清９５検体を用い、前記（Ｂ）の方法に従って抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定し、これら２種類のクラミジア・ニューモニエ外膜画分を用いて得られた抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定結果の相関を調査した。結果を図３に示す。
【００４４】
図３の結果は、両者の測定結果の相関が極めて高いことを示す。このことから、本発明の製造法により得られたクラミジア・ニューモニエ抗原は、精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ抗原と同様に、特異性の高いクラミジア・ニューモニエ抗原として利用できると考えられる。
【００４５】
【発明の効果】
請求項１、２及び３記載のクラミジア・ニューモニエ抗原の製造法は、種特異性の高いクラミジア・ニューモニエ抗原を、簡易に、大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】サルコシル不溶性のクラミジア・ニューモニエ外膜画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４〜２０％濃度勾配アクリルアミドスラブゲル）パターン図であり、各矢印はそれぞれ、１：分子量約９８Ｋダルトン、２：分子量約６０Ｋダルトン、３：分子量約５３Ｋダルトン、４：分子量約４６Ｋダルトン、５：分子量約４３Ｋダルトン、６：分子量約４０Ｋダルトン、７：分子量約３７Ｋダルトン、８：分子量約３０Ｋダルトンのタンパク質を示す。
【図２】クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を抗原として用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果（吸光度）と、クラミジア・ニューモニエの精製ＥＢを用いたマイクロ−ＩＦ法の結果（力価）との相関を比較したグラフであり、縦軸は酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸はマイクロ−ＩＦ法の血清希釈倍数（力価）を示す。
【図３】クラミジア・ニューモニエの粗精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分とクラミジア・ニューモニエの精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分をそれぞれクラミジア・ニューモニエ抗原として用い、酵素免疫測定法を利用した抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定結果の相関を比較したグラフであり、縦軸は抗原として精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を用いた場合の酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度、横軸は抗原として粗精製ＥＢから得られたクラミジア・ニューモニエ外膜画分を用いた場合の酵素免疫測定法の４０５nmの吸光度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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