(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
穀類抽出液と遊離脂肪酸または極性脂肪酸エステルを基質とする溶液とを反応させたのち、メタノールを添加して停止させ、次いで固−液分離法により反応生成物を含む画分を回収し、これにＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定することを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
穀類抽出液と中性脂質を基質とする溶液とを反応させたのち、１−ブタノールを添加して停止させ、次いで固−液分離法により反応生成物を含む画分を回収し、これにＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定することを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法。
【請求項３】
基質溶液が、基質としてリノール酸またはホスファチジルコリンジリノレイルを含む溶液である請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
基質溶液が、基質としてジリノレインまたはトリリノレインを含む溶液である請求項２記載の測定方法。
【請求項５】
穀類抽出液が、大麦または麦芽の抽出液である請求項１または２のいずれかに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法に関し、詳しくはビール醸造の原料などとして用いられる穀類中に存在し、脂質の酸化反応に関与するリポキシゲナーゼ活性の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポキシゲナーゼは、不飽和脂肪酸の二重結合に酸素を添加して過酸化物を生ずる酸化還元酵素としてよく知られており、多くの分野でその活性の度合いを測定する有効な方法が研究されている。
例えば、植物の分野では、リポキシゲナーゼは特に大豆，大麦等の穀類に多く含まれている。ビールの原料であるビール大麦については、麦芽製造工程やビール醸造上の仕込工程において、ビールの品質に重要な影響を与える脂質酸化が起こるが、これはリポキシゲナーゼ（以下、ＬＯＸと称する。）が原因であることが知られている。
ＬＯＸの働きにより、脂質は脂質ヒドロペルオキシドに変化し、これらが泡持ち阻害活性を有するトリヒドロキシオクタデセン酸（藪内精三、醸造協会誌、75、273, 1980)や老化臭の原因物質と考えられるトランス−２−ノネナールの前駆体物質であると言われている。
【０００３】
発芽大麦や麦芽中の脂質に占める各種脂質の割合は、遊離脂肪酸が数％、中性脂肪が約７０％、リン脂質が約３０％であり、これら脂質の酸化はビールの品質に影響を与える重要なことであるにもかかわらず、これまでのＬＯＸ研究は遊離脂肪酸を基質としたものが大半で、脂肪酸エステルを基質とした研究は殆ど行われていなかった。
その理由として、脂質を基質とした場合の簡便なＬＯＸ活性測定法が開発されていなかったことが挙げられる。例えば、リノール酸を基質としてリノール酸ヒドロペルオキシドの生成を紫外部吸収によって測定する方法（Baxter; j. Inst. Brew., 88, 390-396, 1982)では、基質はリノール酸に限定される。
また、酵素センサーを用いて酵素消費をモニターする方法は、感度が低いために、多量の脂質が基質として必要であるが、脂肪酸エステルは非常に高価であるため、現実には使用できない。
【０００４】
さらに、従来法では、多検体を同時処理することが難しく、ＬＯＸが低い植物品種や熱安定性、ｐＨ安定性等が低い植物品種をスクリーニングすることができなかった。大豆では、酵素標識抗体を利用したリポキシゲナーゼ検出法が提案されている（Evans et al.; Crop. Sci., 34, 1529-1537, 1994)。しかし、この方法は酵素を検出する方法であって、該酵素の活性を測定することはできない。また、この方法は抗原特異性の異なるＬＯＸは検出できない等の欠点がある。
【０００５】
一方、Piazzaらは、精製大豆リポキシゲナーゼを材料として、ＦＯＸ法（Ferrous oxidation/xylenol orange method)による脂肪酸エステルの酸化活性測定法を報告している（JAOCS, 72(4), 463-466, 1995)。ＦＯＸ法とは、脂質ヒドロペルオキシドが二価鉄を三価鉄に酸化することを利用し、三価鉄とキシレノールオレンジ複合体を吸光度（波長５４０ｎｍの可視光の吸光度）を用いて定量することにより、間接的に資料中の脂質ヒドロキシペルオキシドを定量する方法である。
彼らは、該酵素と基質を一定時間反応させた後、クロロホルム・メタノール抽出し、生成したヒドロペルオキシドを分離し、クロロホルム層を窒素を吹き付けて乾燥し、再度メタノールに溶解し、ＦＯＸ法に使用される試薬（以下、ＦＯＸ試薬という。）と反応させてＬＯＸ活性を測定している。このため、この方法では、乾燥・溶解に時間がかかり、多検体を処理するには適さない等の多くの問題を抱えている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、上記の問題を解決し、穀類粗抽出液、特に大麦または麦芽より抽出した抽出液のＬＯＸ活性をより簡便な方法で、しかも短時間で測定することのできるＬＯＸ活性の測定方法を提供することである。
本発明者らは、係る課題を解決すべく検討を重ね、ＦＯＸ法を利用したＬＯＸの活性測定方法を開発し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、穀類抽出液と遊離脂肪酸または極性脂肪酸エステルを基質とする溶液とを反応させたのち、メタノールを添加して停止させ、次いで固−液分離法により反応生成物を含む画分を回収し、これにＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定することを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法である。
請求項２記載の本発明は、穀類抽出液と中性脂質を基質とする溶液とを反応させたのち、１−ブタノールを添加して停止させ、次いで固−液分離法により反応生成物を含む画分を回収し、これにＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定することを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法である。
請求項３記載の本発明は、基質溶液が、基質としてリノール酸またはホスファチジルコリンジリノレイルを含む溶液である請求項１記載の測定方法である。
請求項４記載の本発明は、基質溶液が、基質としてジリノレインまたはトリリノレインを含む溶液である請求項２記載の測定方法である。
請求項５記載の本発明は、穀類抽出液が、大麦または麦芽の抽出液である請求項１または２のいずれかに記載の測定方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、穀類中のＬＯＸ活性の測定方法に関するものであり、この方法は、穀類の種子や発芽種子あるいは穀類加工品を適当な緩衝液を用いて抽出したものに、基質として脂肪酸もしくは脂肪酸エステルを含む溶液を加えて反応させた後、反応生成物にＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定するものである。詳しくは、穀類抽出液と基質溶液を所定時間反応させたのち、メタノールまたは１−ブタノールを添加して反応を停止させ、反応生成物である脂質ヒドロペルオキシドを含む画分を分離し、ＦＯＸ試薬と混合して吸光度を測定する。
【０００９】
本発明において穀類としては、大麦が好適であり、その種子や発芽種子またはそれらの加工品が対象とされ、具体的には大麦の麦芽や緑麦芽等が挙げられる。
また、基質としては、遊離脂肪酸や中性脂質または極性脂質等の脂肪酸エステルを用いることができ、中でもリノール酸、ホスファチジルコリンジリノレイル、ジリノレインおよびトリリノレインが好ましい。
次に、ＦＯＸ試薬とは、キシレノールオレンジ、硫酸アンモニウム鉄（II) ６水和物、硫酸および２，６−ジ−ｔ−ブチルｐクレゾールをメタノールに溶解して調製したもので、例えばキシレノールオレンジ７．２ｍｇ、硫酸アンモニウム鉄（II) ６水和物９．８ｍｇ、硫酸６９μＬおよび２，６−ジ−ｔ−ブチルｐクレゾール８８ｍｇを９０％メタノール１００ｍＬに溶解することにより調製された試薬である。
【００１０】
以下に、本発明のＬＯＸ活性の測定方法について説明する。
まず、原料の穀類をモルトミル等の粉砕機で粉砕し、得られた粉砕物に緩衝液を加え、０〜５０℃の温度、好ましくは室温（２０℃）で５〜６０分間、好ましくは１０分間攪拌して抽出する。次いで、攪拌物を急冷したのち、適当な手段により濾過して抽出液を得る。必要に応じて、この抽出液を遠心分離などの固−液分離を行い、得られた上清を再び濾過する。
【００１１】
このようにして得た穀類抽出液に基質溶液を加えて反応させる。このとき、基質は界面活性剤、乳化剤、緩衝液などと混和して用いる。
一定時間反応させた後、反応を停止する。反応停止は、基質としてリノール酸やホスファチジルコリンジリノレイルのような遊離脂肪酸や極性脂肪酸エステルを使用した場合は、メタノールを用いて行い、ジリノレインやトリリノレインのような中性脂質を基質として用いた場合は、１−ブタノールを添加して反応を停止させる。
その後、反応物から反応生成物である脂質ヒドロペルオキシド含有画分を分離する。具体的には、遠心分離法、その他の固−液分離法により固体と液体を分離し、遊離脂肪酸や極性脂肪酸エステルを基質として用いた場合は、上清画分を回収する。一方、中性脂質を基質として用いた場合は、反応停止剤である１−ブタノール画分を回収する。
【００１２】
次いで、脂質ヒドロペルオキシド含有画分にＦＯＸ試薬を加えて混合し、室温で３０〜９０分間、好ましくは３０分間放置する。その後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。
得られた測定値を予め作成した検量線と照合してＬＯＸ活性を求める。検量線の作成は、クメンヒドロペルオキシドを適当な緩衝液で希釈して調製した標準クメンヒドロペルオキシド溶液をＦＯＸ試薬と混合し、この混合物を上記と同様にして吸光度を測定することによって行う。
【００１３】
【実施例】
次に、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
２種類の大麦Ａ，Ｂの製麦過程の大麦（成熟種子）、緑麦芽（発芽１，６日目）、焙燥麦芽（焙燥１，２，３，１２時間）および麦芽を凍結乾燥したもの各２０ｇを、ＥＢＣモルトミルで粉砕し、得られた粉砕物１ｇに対して１０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、室温で１０分間攪拌した。攪拌後、氷浴上で０℃まで急冷し、濾布を用いて濾過した。
このようにして得た穀類抽出液を４℃で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ）し、得られた上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。
【００１４】
続いて、氷浴上で該抽出液５００μＬを０．８ｍｍ厚のガラス試験管にとり、これに６７μＬの０．１Ｍ  デオキシコール酸ナトリウムと１Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。次に、２５℃に設定したインキュベーター内で１０秒間保温後、４０ｍＭの基質溶液を終濃度２ｍＭとなるように加えて、酸化反応を開始した。
なお、基質として、リノール酸（ＬＨ）、ホスファチジルコリンジリノレイル（ＰＣ）、ジレノレイン、トリリノレインの４種類を用いた。このうち、リノール酸を用いた場合には、リノール酸１ｇを秤量し、これに４０ｍＭとなるように１％  Tween 20を加えて攪拌し、エマルジョンを形成させたものを該基質溶液として使用した。また、基質としてホスファチジルコリンジリノレイル、ジリノレイン、トリリノレインを用いた場合には、それぞれ４０ｍｇを秤量し、これに４０ｍＭとなるように１％デオキシコール酸ナトリウムと１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて攪拌し、エマルジョンを形成させたものを基質溶液として使用した。
【００１５】
反応を開始してから３０分経過したのち、反応を停止した。反応停止は、基質としてリノール酸またはホスファチジルコリンジリノレイルを用いた場合は、１００％メタノールを６６８μＬ加えることにより行い、氷浴上で２０分間静置した。その後、反応物を４℃で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ）して上清を回収し、これをサンプルとして用いた。
また、基質としてジリノレインまたはトリリノレインを用いた場合は、６６８μＬの１−ブタノールを添加して反応を停止させた後に、６６８μＬのクロロホルムを加えて激しく攪拌し、次いで４℃で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ）を行って１−ブタノール画分を回収し、これをサンプルとして用いた。
【００１６】
このようにして得た各サンプル２０μＬを、マイクロタイタープレートに移した後、ＦＯＸ試薬を２００μＬ添加し、室温で３０分間放置した。その後、５４０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダー（バイオラッド社製）で測定した。
なお、ＦＯＸ試薬は、キシレノールオレンジ７．２ｍｇ、硫酸アンモニウム鉄（II）６水和物９．８ｍｇ、硫酸６９μＬおよび２，６−ジ−ｔ−ブチルｐクレゾール８８ｍｇを、９０％メタノール１００ｍＬに溶解することにより、測定時に随時調製した。
また、標準クメンヒドロペルオキシド溶液は、クメンヒドロペルオキシド５０ｍｇをメタノールで１０ｍＭとなるように溶解し、これを上記酵素抽出液で０．１ｍＭから１ｍＭとなるように希釈して調製した。予め、これを用いて、上記と同様にして５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
各サンプル中の脂質ヒドロペルオキシド量は、前記の測定値を検量線と照合することによって求め、ＬＯＸ活性を算出した。
【００１７】
基質としてリノール酸（ＬＨ）またはホスファチジルコリンジリノレイル（ＰＣ）を使用したときの結果を図示した。図１は大麦Ａ、図２は大麦Ｂのそれぞれの製麦過程における脂質ヒドロペルオキシドの生成量の経時的変化を示す。なお、ジリノレイン、トリリノレインを基質として使用した場合も、同様の傾向が認められた。
【００１８】
この結果、発芽前の大麦にはＬＨ酸化活性のみ存在することが明らかとなった。さらに、発芽後、ＬＨ酸化活性に加えてＰＣ酸化活性も誘導されることが分かった。
また、本発明によるＬＯＸ活性の測定時間は、従来の方法と比べて、大幅に短縮された。Piazzaの方法では、反応生成物であるヒドロペルオキシドの抽出のためにクロロホルム層の分離（１〜２分）と窒素を吹き付けることによる乾燥（３〜６分）と、再度メタノールに溶解する操作（１〜２分）が必要であるが、これは１検体当たり最低５〜１０分を要する。本発明によれば、この操作を省略することができ、たとえば１００検体を処理するのに約８〜１６時間短縮できる。
【００１９】
実施例２
ＥＢＣディスクミルで粉砕した麦芽３．５３ｇに、５０℃に加温しておいた水道水１０ｍＬを加え、５０℃のインキュベーター上で３０秒間攪拌した。攪拌後に氷浴上で４℃となるまで急冷し、濾布を用いて濾過した。次いで、濾過液を４℃で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ）し、得られた上清を０．４５μｍのフィルターで濾過し、穀類抽出液を得た。
【００２０】
続いて、実施例１と同様に反応液を調製した。基質としてリノール酸を用い、反応温度０℃，２５℃，５０℃におけるリノール酸ヒドロペルオキシド生成量を実施例１と同様の方法により定量した。
また、５０℃で２０分間の熱処理による酵素失活を試験した。抽出液を５０℃で２０分間処理した後、同様に２５℃のリノール酸ヒドロペルオキシド生成量を実施例１と同様の方法で定量した。
【００２１】
結果を図３、４に示した。図３は、麦芽を原料とし、酵素反応の温度条件を変化させた場合のリノール酸ヒドロペルオキシド生成量の経時的な変化を示したものである。また、図４は、５０℃で２０分間の熱処理を行った場合のリノール酸ヒドロペルオキシド生成量の経時的な変化を示したものである。
【００２２】
図３から明らかなように、０℃と２５℃で酵素反応を行ったときは、反応時間に比例してリノール酸ヒドロペルオキシドの生成量が増加した。これに対して、５０℃で酵素反応を行ったときは、反応時間の経過とともにリノール酸ヒドロペルオキシドの生成量が徐々に低下する傾向を示した。
また、初期の酵素活性（反応速度）は５０℃，２５℃，０℃の順に高いことが明らかとなった。さらに、０℃と２５℃で酵素反応を行ったときは、反応開始４０分後にはリノール酸ヒドロペルオキシドは、ほぼ同じレベルに達することが明らかとなった。
【００２３】
また、図４から明らかなように、５０℃で２０分間の熱処理を行っても、熱処理をしていないものと同様に、リノール酸ヒドロペルオキシドの生成量が反応時間に比例して増加することが明らかとなり、麦芽ＬＯＸは５０℃、２０分間の熱処理では殆ど失活しないことが分かった。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の測定方法によれば、原料穀類の品質、麦芽品質やビール品質に重要な影響を与える酵素リポキシゲナーゼの活性測定を従来法に比べて簡便、かつ短時間に行うことができる。
また、本発明は酵素リポキシゲナーゼを欠失する品種のスクリーニングに応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  基質としてリノール酸またはホスファチジルコリンジリノレイルを用いたときの大麦Ａの製麦過程におけるヒドロペルオキシド生成量の経時的変化を示した図である。
【図２】  基質としてリノール酸またはホスファチジルコリンジリノレイルを用いたときの大麦Ｂの製麦過程におけるヒドロペルオキシド生成量の経時的変化を示した図である。
【図３】  麦芽を原料として用い、酵素反応の温度条件を変化させた場合のリノール酸ヒドロペルオキシド生成量の経時的な変化を示した図である。
【図４】  ５０℃で２０分間の熱処理を行った場合のリノール酸ヒドロペルオキシド生成量の経時的な変化を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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