(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物体液の試料でタンパク分解性分解に対する活性化凝固Ｖ因子の安定性を定性検出し、また定量測定する方法において、次の工程
ａ）  試料を、正常ヒト血漿と比較して機能性Ｖ因子の含量が減少している試薬Ａと混合し、
ｂ）  試料のＶ因子活性化のための試薬Ｂを添加し、
ｃ）  試料の活性化Ｖ因子をタンパク分解性分解のための試薬Ｃを添加し、
ｄ）  Ｖａ因子残留活性を、トロンビンを形成するプロトロンビンの活性化により、測定するための試薬を添加し、
而して試料容量で表わされる総試験容量の割合が多くとも２０％であるものとする、
を包含することを特徴とする上記方法。
【請求項２】
試薬Ａがヒトまたは動物由来のＶ因子欠損血漿である請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｖ因子の欠損が機能欠損と解され、これにより実際に減少しているＶ因子の含量を有する血漿およびＶ因子を含有するものの、そのＶ因子が使用される活性化操作で活性化されない血漿の両者が可能となる請求項１または２の少なくとも一項記載の方法。
【請求項４】
血漿中のＶ因子の含量の減少が供給者の遺伝上の欠損または欠陥に因る請求項３記載の方法。
【請求項５】
血漿中のＶ因子の含量の減少が、適当な高親和性の結合パートナーへの吸着により生じる請求項３記載の方法。
【請求項６】
使用する血漿のＶ因子がＶ因子を変性する熱処理を使用することにより不活性化される請求項３記載の方法。
【請求項７】
使用する血漿の機能性Ｖ因子が、Ｖ因子またはＶａ因子を特異的に不活性化するタンパク分解酵素による処理によって減少されている請求項３記載の方法。
【請求項８】
血漿中に存在するＶ因子が試薬Ｂにより活性化されない請求項３記載の方法。
【請求項９】
Ｖ因子の活性化可能な機能含量がヒト血漿の＜１と５０％との間である請求項２記載の方法。
【請求項１０】
試料と混合後のＶ因子欠損血漿の割合が５０〜９５％の範囲にある請求項１および２記載の方法。
【請求項１１】
Ｖ因子欠損血漿がヘパリンの作用中性化のための添加物を含有することができる請求項１および２記載の方法。
【請求項１２】
Ｖ因子欠損血漿がPolybreneを２〜５０mg／リットルの間の濃度で含有する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
試料と混合する試薬がＶ因子と同一ではない個々の酵素もしくは補助因子、または酵素および補助因子のいくつかを含む水、生理食塩水、または適当な緩衝液である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
反応試薬がタンパク質Ｓの適当な濃縮物を、試料と混合後の濃度を基にして０.１〜５Ｕ／mlの濃度範囲で含有する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
反応試薬がＸ因子の適当な濃縮物を、試料と混合後の濃度を基にして０.２〜５Ｕ／mlの濃度範囲で含有する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
反応試薬が適当な濃度のプロトロンビンを、試料と混合後の濃度を基にして０.５〜１０Ｕ／mlの濃度範囲で含有する請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
試薬がりん脂質を、試料と混合後の濃度を基にした濃度が０.３〜０.００１％の範囲で含有する請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
試料と混合する試薬が請求項１４〜１７記載の添加物の１種またはそれより多くを含有する請求項１および１３〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
試料のＶ因子を直接または間接に活性化することができる請求項１記載の方法。
【請求項２０】
Ｖ因子をヒトまたは動物由来の適当に活性化する酵素を添加することにより直接活性化することができる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
トロンビンをヒト由来の酵素として使用する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
蛇毒液からのＶ因子活性化剤をヒト以外の由来の酵素として使用する請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
試料のＶ因子を、活性化部分トロンボプラスチン時間の原理に従って、界面活性剤、りん脂質およびカルシウムイオンを用いて接触相を活性化することによって凝固カスケードを作動させることにより、間接的に活性化することができる請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
試料のＶ因子を、トロンボプラスチン時間の原理に従って、トロンボプラスチン、りん脂質およびカルシウムイオンの添加により凝固カスケードを作動させることにより間接的に活性化することができる請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
試料のＶ因子を、例えば蛇カーペット・バイパー(Echis carinatus)の毒液から得られるトロンビン活性化物質の添加によりプロトロンビンを活性化することによって間接的に活性化することができる請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
試料中の活性化Ｖ因子をヒトまたは動物由来のタンパク分解酵素の添加により分解する請求項１記載の方法。
【請求項２７】
活性化Ｖ因子をヒトタンパク質Ｃにより分解する請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ヒトタンパク質Ｃを、すでに活性化された形態であるとき、供試混合物に供試混合物を基にして０.０１〜１Ｕ／mlの濃度で添加する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ヒトタンパク質Ｃを非活性化形態で加えるか、またはＶ因子欠損血漿中のタンパク質Ｃを供試混合物で最初に活性化する請求項２および２７の少なくとも一項記載の方法。
【請求項３０】
試薬の少なくとも１種がタンパク質Ｃ活性化酵素を含有し、この酵素が試料およびヒト、非活性タンパク質Ｃと接触し、後者を活性化する請求項１または２９の少なくとも一項記載の方法。
【請求項３１】
マムシ(Agkistrodon)属の蛇の毒液からの酵素をタンパク質Ｃの活性化に好ましく使用する請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
供試混合物中のＶａ残留活性を、トロンビンを形成するプロトロンビンの活性化を測定することにより測定する請求項１記載の方法。
【請求項３３】
トロンビン活性を機械的、光学的または光学機械的方法を用いてフィブリノーゲンの変換を測定することによって測定し、そしてフィブリノーゲンは試料または試料を混合する試薬から由来する請求項１および３２の少なくとも一項記載の方法。
【請求項３４】
トロンビン活性を、トロンビン特異性で色素産生基質の変換を光学的検出により測定することによって測定する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
プロトロンビンを、Ｖａ因子により刺激されることができるプロトロンビン活性化剤によって開裂する請求項１、１３〜１８および３２の少なくとも一項記載の方法。
【請求項３６】
使用されるプロトロンビン活性化剤がヒトおよびヒト以外の由来であることができる請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
Ｘ因子がヒトプロトロンビン活性化剤として使用する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ウシプロトロンビン活性化剤をヒト以外のプロトロンビン活性化剤として使用する請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
請求項１記載の工程を得られた混合物をインキュベートする期間中断するか、あるいはインキュベーション相が工程内で生じることができる請求項１記載の方法。
【請求項４０】
試薬を結合することにより、試料が３種の試薬、２種の試薬、または必要成分全てを含有する１種の試薬と接触する請求項１記載の方法。
【請求項４１】
蛇毒液からのプロトロンビン活性化剤をヒト以外のプロトロンビン活性化剤として使用する請求項３６記載の方法。
【請求項４２】
請求項３〜７のいずれか一項記載の方法に従って調製されたＶ因子欠損血漿がVIII因子を０〜４Ｕ／mlの濃度範囲で含有するか、あるいは精製VIII因子を添加することによってかかる濃度が得られるよう補完する請求項３〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
試薬が、試料と混合後０.０１〜２単位／mlの濃度範囲にある濃度でVIII因子を含有し、ここで１単位とは正常ヒト血漿１ml中に存在する量と定義される請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、活性化状態で活性化タンパク質Ｃに対する安定性が増大されている凝固Ｖ因子を特異的に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
第一に、血液中での凝固系は、血流をその供給されるべき組織に持続させることを確保するものであり；第二に、この系は創傷閉鎖を行って傷害に対して反応し、これによって生体の完全な状態を維持することを確保するものである。凝固が活性化されると、段階的にそれ自体活性化するプロテアーゼのカスケード様系によって、活性プロテアーゼトロンビンが最終的に形成される。トロンビンの形成は初めのうちは極めて低いが、タンパク質分解開裂により補因子Ｖ因子およびVIII因子をトロンビンが活性化するので、この形成はトロンビン自体により促進される。それぞれ、プロテアーゼＸａ因子およびIXａ因子と共に、これらの活性化補因子はりん脂質表面で活性酵素／補因子複合体を形成し、しかもこれらの複合体の活性は個々のプロテアーゼの活性よりも約１０００の係数で高いものである。
【０００３】
この正のフィードバック機序はほぼ爆発的に生じて大量のトロンビンを形成する。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、普通には創傷閉鎖、創傷治癒が行われる。生命の危険がある凝固の拡大、ひいては生体の血管系の閉鎖、すなわち血栓症の誘起を防止するには、活性プロテアーゼの阻害、またプロテアーゼ供給阻止が必要である。体内では、活性プロテアーゼは共有結合複合体の形成によるプロテアーゼ阻害剤で作用中性化される。プロテアーゼ供給の阻止はトロンビン自体で開始される。このためには、トロンビンは膜タンパク質トロンボモジュリンに結合し、酵素前駆体タンパク質Ｃを活性プロテアーゼＣａ（ＡＰＣ）に変換する。ＡＰＣはその一部では補因子タンパク質Ｓと共に複合体を形成し、この複合体は活性補因子VIIIａ因子およびＶａ因子をタンパク質分解で開裂し、それによって不活性化する。このようにしてＡＰＣはこれらの補因子がもたらす強力な促進効果を阻止する。
【０００４】
上述したタンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系は重要な抗凝血機序を表わしている。このことは、遺伝性または後天性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの欠乏または欠損を有する人は血栓症、殊に再発性静脈血栓症に極めて罹りやすいと言う事実によって確認された(Esmon, C. T. TCM ２：212〜219、1992年)。
【０００５】
タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓに加えて、その他の因子も系の活性に対して影響を及ぼすことができる。これらの因子にはフォンビルブラント因子および因子IXａ(Rick, M. E. 等, Clin. Med. 115：415〜421, 1990年)が含まれ、これらの因子は因子VIIIａをタンパク質分解による分解から防護することができる。後天性欠損はまたルプス抗凝血剤(Lupus anticoagulants)の形成に因ることもある。これらは、りん脂質に対向し、かつプロテアーゼ／補因子複合体のりん脂質表面への結合（適切な機能のために必要である）を阻害する抗体である(Amer, L. 等, Thromb. Res. 57巻, 247〜258頁, 1990年)。
【０００６】
Ｖ因子の変異体はごく最近に報告され、このものは活性化状態（Ｖａ因子）にある場合は最早ＡＰＣで不活性化され得ないか、または少なくともごく低い程度で不活性化され得るだけである(Bertina, R. M. 等 Nature 369巻, 64〜67頁, 1994年)。この欠損は「Ｆ.Ｖ疾患」とも称され、ＡＰＣで開裂される領域においてＡｒｇ ５０６をＧｌｎで置換することに因るものである。ごく最近に、血栓症の危険が増大する原因としてこの変異の重要さがいくつかの研究で確認されている。
【０００７】
この改変されたＶ因子を検出するのに、従来から２種の方法が用いられてきた。このうちの一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノム分析である。周知のとおり、この方法は精巧なものであり、専門家の実験室でのみ実施可能であり、比較的高価である。更にまた、この方法は、予め知られている変異を検出するのみである。しかし、その他の部位での変異もＡＰＣによる開裂に対してＶａ因子を安定化することが考えられる。この理由から、極めて専門家されたＰＣＲ法を補う機能試験がぜひ必要とされている。
【０００８】
この種の機能試験は、凝固研究で通常使用されているスクリーニング法である活性部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の既知の変法（Amer等、１９９０年）を基とし、すでに報告されている。この試験でＡＰＴＴを測定するには、血漿試料を例えば、シリカカオリンまたはガラスのような界面活性剤を含む試薬およびりん脂質の等容量と接触させる。この混合物を２、３分間＋３７℃でインキュベートする。この間に、カルシウム依存ではない凝固系の因子（XII因子、XI因子およびIX因子）が活性化される。カルシウムイオンを加えると、凝固カスケードの残りが活性化され、トロンビンが形成される。得られたトロンビン量を、天然基質フィブリノーゲンがクロットに変換されることによるか、または色素形成基質からの発色団の遊離により、測定する。Amer L.等（１９９０年）によるこのＡＰＴＴ変法では、活性化タンパク質Ｃをカルシウムイオンと同時に添加することを伴っている。上述の如く、ＡＰＣはVIIIａおよびＶａ補因子を破壊するので、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ系の機能効率に依存しているトロンビンの形成の減速が生じてくる。
この変法を以下ＡＰＣ時間（ＡＰＣＴ）と称する。
【０００９】
従来用いられてきた形態では、ＡＰＣＴはＡＰＣに対するＶ因子の安定性の増大を特異的に検出するのに適当ではない（実施例１参照）。活性化形態で外因的に加えられるタンパク質Ｃに加えて、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の機能効率に影響を及ぼす試料からの他のすべての上述した因子も測定結果に入ってくる。それ故、Ｖ因子の変異は、特に患者がこの因子について異型接合である場合、タンパク質Ｓでの欠損または欠陥と区別することができない。タンパク質Ｓまたはタンパク質Ｃに対する抗体もこの結果を誤って似せるものとする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の基本的な目的は、ＡＰＣによる分解に対する安定性を増大したＶ因子の検出に使用し得る方法を見い出すことにある。
この目的は特許請求の範囲に記載した実施態様を提供することによって達成される。
【００１１】
意外にも血漿を、Ｖ因子が乏しく、かつタンパク質Ｓおよび凝固Ｘ因子およびプロトロンビンを含有する試薬で希釈すると、タンパク質Ｓの影響が除かれるが、ＡＰＣに対するＶ因子の改変された安定性は測定結果に対して常に決定的なものであることが見い出された。これに加えて、ヘパリン添加試料およびマーキュラー療法中の患者からの試料を本願方法に使用することができ、これらは従来使用されていた機能試験では不可能だったものである。
最も簡単な場合、試料を希釈するのに用いる試薬はＶ因子を欠いているヒト血漿である。試料中のＶ因子を活性化した後、この因子を活性化タンパク質Ｃあるいは同様な挙動を示すプロテアーゼで破壊し、それから残留Ｖａ因子活性を測定する。
【００１２】
最も簡単な場合、試料中のＶ因子の活性化、その破壊および検出反応は活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）を添加しながら試料の凝固開始を基とするものである。Ｖ因子欠損血漿（Ｆ.Ｖ−ＤＰ）で表わされる試料容量の割合を特別な試験法に対して最適化しなければならず、この割合は５０〜９５％、好ましくは６０〜８０％である。このことは、供試混合物合計について、血漿試料容量の割合は多くとも２０％、好ましくは１０％またはそれより少ない。それで、新規な方法は、凝固因子XII、XIおよびIXをまず活性化するＡＰＴＴの変法を基にすることができる。Ｖ因子を活性化するトロンビンの形成はＡＰＣおよび塩化カルシウムの混合物を加えることにより開始される。ＡＰＣの同時の存在の結果、Ｖａ因子が不活化され、凝血形成の速度の減速を生じる。Ｖ因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合を増加させると凝固時間の延長（Ｖ因子欠損血漿が原因である）を生じるが、タンパク質Ｓ欠損による影響の低下をきたす。それでＶ因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合が一旦約７０％に達すると、正常血漿およびタンパク質Ｓ欠損血漿に対する凝固時間は同じであるが、正常血漿の凝固時間に関連する凝固時間の差異は、ＡＰＣに対する安定性が増大する改変Ｖ因子を含む同型接合または異型接合血漿中であるとすれば、増加することが実施例２で実証される。このようにして、先行技術を用いる場合よりも二つの効果を識別することが実質的に一層容易になる。
【００１３】
トロンボプラスチン時間（ＰＴ）をＡＰＴＴの代りに使用することもできる（実施例３）。ＰＴを測定するのに用いるべき試薬はトロンボプラスチン、膜結合補因子、りん脂質および塩化カルシウムからなる混合物を含有する。この混合物を試料に添加すると、VII因子がまず自触反応で開裂してVIIａ因子を形成する。VIIａ因子は補因子としてのトロンボプラスチンと共にＸ因子の活性化の原因となり、次いでＶ因子を活性化する。この場合も、活性化タンパク質Ｃをトロンボプラスチン試薬として同時に加えると、凝固時間が延長される。しかし、Ｖａ因子がタンパク分解侵襲に対して更に抵抗性を有していると、この延長は左程著しいものではない。この短い活性化経路により凝固時間が非常に短いので、トロンボプラスチンの内容物を実施例３では希釈した。得られた凝固時間の延長はＡＰＣの存在下に凝固時間の更に明瞭な延長をもたらす。これは正常血漿と改変血漿Ｖとを区別（シグナル／バックグラウンド比）する能力を改善する。実施例３では、またタンパク質Ｓ欠損により呈示される影響が、試料をＶ因子欠損血漿で希釈する程度を増大することにより作用中性化される。しかし、変法ＡＰＴＴによる場合よりも大きい程度に試料を希釈することが必要である。
【００１４】
新規な方法はまたＲＶＶＴ（ラッセルクサリヘビ毒液時間）の変法にも使用し得る。ＲＶＶＴは蛇ラッセルクサリヘビの毒液からの酵素を用いることを基としている。この毒液は、タンパク分解で開裂することにより、ヒト凝固因子ＸおよびＶを活性化するプロテアーゼを含有している。この方法はそれ自体既知であり、凝結の内外経路を迂回し、そして、ルプス診断およびＸ因子、Ｖ因子およびプロトロンビンの欠損の検出の両者に使用される(Thiagarajan, P. 等、１９８６年）。近年、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系での障害を測定するために、ＡＰＴＴを基とする試験と同様に、ＡＰＣと関連した方法が使用されている。しかし、例えばタンパク質Ｓの欠損のような他の障害は、Ｖ因子の欠損で得られると同様の効果を生じ、その結果これらの異常はこの試験により相互に区別することができないというのも事実である。対照的に、実施例４では、異常は新規な方法を用いると特異的に区別することができ、この場合Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の割合は好ましくは７５％であることが実証されている。
【００１５】
特別な区別を達成することに加えて、実施例５では、試料中のヘパリンはＦ.Ｖ−ＤＰにヘパリン作用中和化物質を加えることにより作用中和化し得ることが実証されている。このことは、標準方法（ＡＰＣＴ）と比較して、この方法の別の重要な利点である。それで、血栓症に罹っている患者に関する条件の関係を定めるのに特に関心がもたれている。しかし、これらの患者の大部分は抗凝血薬、通常ヘパリンで処置されている。
【００１６】
ヘパリン投与後、血栓症に罹っている多くの患者にマーキュラー療法を施す。マーキュラー(marcurar＝フェンプロクーモン）はビタミンＫ拮抗剤であり、この投与により凝固因子の不完全合成が誘起される。実施例６に記載の検討により、新規な方法はマーキュラー療法を受けている患者でのＦ.Ｖ欠損を検出するのに使用できる。
【００１７】
活性化タンパク質Ｃを加える代替案として、タンパク質Ｃを非活性化形態で加えるか、あるいはＶ因子欠損血漿でタンパク質Ｃを用い、次にタンパク質Ｃが活性化される。この活性化は、ドイツ特許出願Ｐ ４４ ２７ ７８５.７（実施例７参照）にも開示されているように、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られたタンパク質Ｃ活性化剤を加えることによって起こさせることができる。
【００１８】
例えばＡＰＴＴ、ＰＴおよびＲＶＶＴのような伝統的な凝固方法を用いる場合、凝固活性はクロット形成の機械的、機械光学的または光学的検出により測定する。新規な方法も例えば色素産生トロンビン基質の変換を測定することによるより最新の色素産生法と組み合わせることもできる。
【００１９】
精製凝固因子からなる試薬系をＦ.Ｖ−欠損血漿の代りに使用することができる。第一の変換体と類似して、方法の原理は、Ｖａ因子がプロトロンビン活性化での律速因子であることに基づいている。ＡＰＣが同時に存在していると活性化Ｖ因子が破壊されることとなり、結果として、凝固時間が延長される。従って、試料をＶ因子依存プロトロンビン活性化剤と接触させ、そして例えばラッセルクサリヘビの毒液から得られたＶ因子活性化剤と接触させ、そして添加プロトロンビンの活性化を例えばフィプリノーゲンの変換または色素産生方法の場合は色素産生トロンビン基質の変換のような凝固診断で知られている測定法を用いて測定する。
【００２０】
例えば塩化カルシウムりん脂質のような凝固酵素にとって重要な補因子を供試混合物に加えるのが有用である。血漿中に存在するループス抗凝固剤(lupus anticoagulant)の効果を除くために、高濃度好ましくは０.３〜０.００１％、特に好ましくは、０.００１〜０.０１％でりん脂質を加えるのもまた有用である。更に、りん脂質は、タンパク質Ｃａ活性が発現するのを確保するのに、ホスファチジルエタノールアミンをある割合で含有していなければならない(Horie, S. 等１９９４年）。試料中のタンパク質Ｓの欠損および（または）欠損に因るものである測定結果との干渉を避けるために、タンパク質Ｓを０.１〜５Ｕ／ml（供試混合物を基として）の濃度範囲、特に好ましくは１〜２Ｕ／mlの範囲で含有することも試薬系には有用である。
【００２１】
最後に、その濃度がつまるところ測定シグナルを調節する活性化タンパク質Ｃを加えることが必要である。普通、供試混合物中のＡＰＣ濃度は０.０１〜１Ｕ／mlの範囲にある。それで、この試薬系は少なくとも成分、Ｘ因子、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、凝固に必要なりん脂質、塩化カルシウム、活性化タンパク質Ｃあるいは非活性化タンパク質Ｃならびに、これとは別に、タンパク質Ｃ活性化剤を包含する。試薬系は単一試薬として組み合せて使用することもできるし、また、安定性を増大するために、例えば試薬１（Ｘ因子、タンパク質Ｓ、プロトロンビンおよびりん脂質からなる）および試薬２（活性化タンパク質Ｃおよび塩化カルシウムからなる）として別個の形態で使用することもできる。試料を試薬系と混合する。凝固は、ＡＰＴＴと同様に接触相の活性化の結果として、あるいはＲＶＶを用いるＸ因子および（または）Ｖ因子の直接活性化により、あるいは例えば活性Ｘ因子もしくは蛇カーペットバイパー(Echis carinatus）の毒液からのエカリン(ecarin)のようなプロトロンビン開裂酵素の添加によるトロンビンの僅かな活性化により開始される。ＲＶＶまたはエカリンを用いて活性化を行った場合、これらの酵素は好ましくは出発試薬として試薬２でＡＰＣおよび塩化カルシウムと一緒に使用する。次に、検出は、トロンビン特異的色素形成基質の変換によるトロンビン形成を測定することによって行うのが好ましい。
【００２２】
更に、活性化タンパク質Ｃを用いる代りに、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られる活性化剤（この毒液は商品名ProtacR で商業上入手可能である）のような適当な活性化剤を用いて供試混合物中でまず活性化される非活性化タンパク質Ｃを使用することができる。それで、このような試薬系は例えば試薬１（タンパク質Ｓ、Ｘ因子、タンパク質Ｃ、プロトロンビンおよびりん脂質を含有する）および試薬２（ProtacR ＲＶＶ、塩化カルシウムおよびトロンビン基質を含有する）からなる。試薬１は単にＶ因子欠損血漿であってもよく、この場合りん脂質は試薬２に含められる。内因性タンパク質Ｃの効果を拡充するために、試薬２を分割することもでき、試料および試薬１の混合物を試薬２ａ（ProtacR およびりん脂質からなる）と共にタンパク質Ｃを活性化させるためにプレインキュベートした後、ＲＶＶおよび塩化カルシウムを含む試薬２ｂを加えて凝固反応およびＶ因子安定性の検出反応を開始させることができる。この場合、りん脂質の添加は任意であり、そして色素産生性基質を更に加えるか否かは所望の評価技術にのみかかっている。
【００２３】
更にまた、精製因子からなる試薬系において、Ｘ因子は例えば蛇毒液から得られる活性化剤のようなヒト以外のＶａ因子依存性プロトロンビン活性化剤（詳しくは、Rosing, J. およびTans, G. 1991年参照）で置換することができる。このものは活性化タンパク質Ｃと組み合せて、または供試混合物で活性化されるタンパク質Ｃと組み合せて活性化タンパク質Ｃに因るタンパク分解性分解に対する安定性が増大している血漿試料中のＶ因子を特定して検出するのに適している。それで試薬系は次の成分からなっていてよい。試薬１はタンパク質Ｓ、タンパク質Ｃ、プロトロンビンおよびりん脂質からなり、また試薬２はProtacR ＲＶＶまたはＲＶＶ−Ｖ（Ｖ因子のみを活性化するＲＶＶからのプロテアーゼ）、Ｖ因子依存性プロトロンビン活性化剤、塩化カルシウムおよびトロンビン基質からなり、あるいはまた試薬３としてトロンビン基質からなる。
【００２４】
ＡＰＴＴを基とする試薬系は実施例８に述べるように試料中のVIII因子の濃度に依存している。意外にも、生理学的濃度（０.７〜１.４単位／ml）でVIII因子を含有しているＶ因子欠損血漿は、VIII因子を含有していない欠損血漿よりも試料中のVIII因子の濃度に左程依存していないことが見い出された。これによって、高含量でVIII因子を有する正常血漿と正常含量でVIII因子を有するＶ因子疾患血漿とを区別することが一層容易になる。この理由に因り、Ｖ因子欠損血漿および（または）VIII因子を０〜４Ｕ／mlの濃度、特に好ましくは０.７〜１.３Ｕ／mlの濃度で含有しているか、またはそのように補完した試薬を、ＡＰＴＴを基とする試薬系で使用するのが好ましい。
【００２５】
【実施例】
次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、特許請求の範囲を限定するものではない。
次の略号を使用する。
ＡＰＣＴ    活性化タンパク質Ｃ時間
ＡＰＣＶ    Ｖ因子欠損血漿と試料とを混合した時の活性化タンパク質Ｃ時間
ＡＰＴＴ    活性化部分トロンボプラスチン時間
Ａｒｇ      アルギニン
Ｆ.Ｖ−ＤＰ ヒトＶ因子欠損血漿
Ｆ.Ｖ疾患   Ｖ因子中の５０６位でのアミノ酸交換Ａｒｇ→Ｇｌｎ
Ｇｌｎ      グルタミン
ＰＣ−ＤＰ  ヒトタンパク質Ｃ欠損血漿
ＰＳ−ＤＰ  ヒトタンパク質Ｓ欠損血漿
ＲＶＶＴ    ラッセルクサリヘビ毒液時間
ＳＨＰ      標準ヒト血漿（正常ヒト血漿のプール）
Tris        トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
【００２６】
実施例１
Ｆ.Ｖ疾患または類似の欠損症の機能的検出に関する先行技術の限界
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke；Behringwerke A.G., Marburgから入手）を用いて測定した。試薬はすべてBehrinhwerke AGから入手した。ＳＨＰを健康供血者からの血漿プールとして用いた。
ＡＰＴＴは次のプロトコールに従って測定した。ヒト胎盤から得られたりん脂質５mlについて、PathromtinR １バイアルを界面活性剤としてカオリンの懸濁液５mlに溶解した。塩化カルシウム溶液（２５mM）を使用前＋３７℃に加温した。次のものを測定管に連続して注入した。
PathromtinR     １００μｌ
血漿試料        １００μｌ
混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、塩化カルシウム溶液１００μｌを加えて凝固時間が開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。
【００２７】
ＡＰＣＴは、Behringwerkeから入手したＡＰＣ感作試薬を用いて測定した。ＡＰＴＴのときと同様にして活性化試薬を調製した。出発試薬は塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Ｃからなり、これを蒸留水５mlに溶解し、使用前に＋３７℃に加温した。
次のものを測定管に連続して注入した。
PathromtinR     １００μｌ
血漿試料        １００μｌ
混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、出発試薬１００μｌを加えて凝固時間が開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。
【００２８】
ＡＰＴＴおよびＡＰＣＴは次のとおりのヒトクエン酸添加血漿で測定した。すなわち、健康供血者（ＳＨＰ）からのプール、タンパク質Ｃ欠損血漿（ＰＣ−ＤＰ）またはタンパク質Ｓ欠損血漿（ＰＳ−ＤＰ）、および同型接合Ｆ.Ｖ疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠損、すなわち血漿中のＶ因子の約５０％が無傷の形態で存在し、約５０％がＦ.Ｖ疾患形態で存在している欠損に擬するために、同型接合Ｆ.Ｖ疾患血漿をＳＨＰと１：１で混合した。
【００２９】
得られた凝固時間およびＳＨＰで得られた凝固時間と比較したＡＰＣＴの差異を表１に示す。ＡＰＴＴについての値はいずれもＡＰＣＴを実施するのに必須の正常範囲（≦４０）内にある。ＡＰＣＴにおいて、正常血漿で得られる凝固時間よりも短いこれらの凝固時間は病的である。このことはタンパク質Ｃ欠損の場合には適用されない。ＡＰＣＴでは活性化タンパク質Ｃを外因で加えるために、試料中のタンパク質Ｃは試験には効果を有するもとがない。一方、タンパク質Ｓの欠損は凝固時間の短縮を生じ、この時間はこの場合異型接合Ｆ.Ｖ疾患欠損の場合よりも更により顕著である。ＡＰＣＴの短縮は同型接合Ｆ.Ｖ疾患の場合最も著しい。タンパク質Ｓ欠損の効果と同型接合Ｆ.Ｖ疾患の効果との間にごく僅かの差異のみがある。実際のところ、この差異は更に一層ぼんやりとしてくる。その理由はＶ因子およびVIII因子の連続変性があり、その程度は血液サンプルの除去と測定との間に経過する時間に左右される。この因子変性により、観察される凝固時間の短縮を防げるような凝固時間の延長が生じる。
従って、従来利用可能な方法、すなわちＡＰＣＴは活性化タンパク質Ｃに対する安定性が増大するＦ.Ｖ疾患またはＶ因子中の類似の欠損を特異的に検出するのに適していない。
【００３０】
【表１】
0003687864.tif 000002
【００３１】
実施例２
修正ＡＰＴＴに基づく新規な方法の最適化
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke；Behringwerke AG，Marburgから入手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。ＳＨＰを健康供血者からの血漿プールとして用いた。
【００３２】
凝固時間を測定するために、PathromtinR ５ml入りの１バイアルをカオリン懸濁液５mlに溶解した。出発試薬はＡＰＣ感受性試薬（塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Ｃを含有）からなり、蒸留水５mlに溶解し、使用前＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１mlに溶解した。
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料      ｘμｌ
Ｆ.Ｖ−ＤＰ   ｙμｌ
PathromtinR   １００μｌ
【００３３】
混合物を次いで＋３７℃で３分間インキュベートし、そして凝固時間は出発試薬１００μｌを加えて開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。容量ｘおよびｙを総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるように、選択した。凝固時間は次のとおりのヒトクエン酸添加血漿で測定した：健康供血者（ＳＨＰ）からのプール、タンパク質Ｃ欠損血漿（ＰＣ−ＤＰ）またはタンパク質Ｓ欠損血漿（ＰＳ−ＤＰ）、および同型接合Ｆ.Ｖ疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠損、すなわち血漿中のＶ因子の約５０％が無傷の形態で存在し、約５０％がＦ.Ｖ疾患形態で存在する欠損に擬するために、同型接合Ｆ.Ｖ疾患血漿をＳＨＰと１：１で混合した。
【００３４】
得られた凝固時間ならびにＳＨＰで得られた凝固時間と関連した凝固時間の差異を表２に列記する。Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の比が増大するにつれた、Ｖ因子の欠損が増大するために、凝固時間がより長くなる。しかしながら、ＳＨＰとＰＣ−ＤＰとの差異が事実上変わらないままである間、ＳＨＰとＰＣ−ＤＰとの隔たりは連続して低減し、また供試混合物中のＦ.Ｖ−ＤＰの比が一旦約７０％に達すると、差異は最早や検知できなくなる。従って、試料中のタンパク質Ｓの欠損がＦ.Ｖ−ＤＰ中のタンパク質Ｓで十分になくなることになる。しかし、同型接合または（擬似）異型接合Ｆ.Ｖ疾患欠損を有する血漿は正しく反対の挙動とする。これらの場合、ＳＨＰで得られた凝固時間と比較した凝固時間の差異が増加する。それ故、新規な方法はＰＳ欠損の効果をなくするだけでなく、Ｆ.Ｖ疾患によって生じる効果を増巾することが可能である。このことはまた、血漿試料を比較的長期間保存することに因る障害により、従前の方法を用いた事例の如く（実施例１）ＰＳ欠損とＦ.Ｖ欠損との差異が容易にはあいまいなものとならないことを意味している。更に、ＰＳ効果が当然になくなるので、抗−ＰＳ自己抗体がこの方法で作用中性化されることが期待される。更に、ＰＣまたはＰＣ／ＰＳりん脂質複合体に対する自己抗体は、試料をＦ.Ｖ−ＤＰで高度に希釈する場合、希釈の結果としてほとんど検出し得るものではない。
【００３５】
【表２】
0003687864.tif 000003
【００３６】
実施例３
修正トロンボプラスチン時間に基づく新規な方法の最適化
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A. Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。ＳＨＰを健康供血者から血漿プールとして用いた。
凝固時間を測定するために、ThromboplastinR 、ヒト胎盤からのＰＴ試薬を製造業者の指示に従って蒸留水に溶解し、この溶液を次に５０mM tris／ＨＣｌ、０.０１％Phospholipon-25（大豆からのりん脂質混合物）、１０mM塩化カルシウム、０.４Ｕ／ml ＡＰＣからなるpH７.４の緩衝液で１：２０００に希釈した。使用前試薬を＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１mlに溶解した。
【００３７】
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料    ｘμｌ
Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ
ThromboplastinR  １：２０００  １００μｌ
混合物を次いで＋３７℃で３分間培養し、そして凝固時間は出発試薬１００μｌを加えて開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。
容量ｘおよびｙを、総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるように、選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの０μｌを含有する可変体がトロンボプラスチン時間に基づくＡＰＣＴの可変体に対応する。凝固時間を実施例２と同じ試料で測定した。
表３には、得られた凝固時間およびＳＨＰで得られた凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記する。
【００３８】
Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の比が増大するにつれて、Ｖ因子の欠損が増大するために凝固時間が長くなる。しかし、Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の比が７５％となったとしても、タンパク質Ｓの効果を完全に作用中性化することはできず、その結果更に高い濃度を使用しなければならなくなる。更に、緩衝化物質、イオン強度およびりん脂質濃度を適切に選択することによって、反応性を最適化する余地がなお存在する。それにも拘らず、ＰＳ−ＤＰおよび同型接合と異型接合Ｆ.Ｖ疾患双方についての凝固時間の差異が更に大きくなること、およびそれ故に、新規な方法を用いた場合、ＰＴを基にしていたとしても、タンパク質Ｃ／ＰＳ系の２種の障害に差異を生じることがより容易となることがわかる。
【００３９】
【表３】
0003687864.tif 000004
【００４０】
実施例４
修正ＲＶＶ時間に基づく新規な方法の最適化
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入手）を用いて測定した。オーストラリア、Gradiporeからの試薬LA-ConfirmR をＲＶＶ試薬として用いた。その他の試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。
凝固時間を測定するために、LA-ConfirmR ２ml入りの１バイアルをＡＰＣ感受性試薬（塩化カルシウムおよび活性化タンパク質Ｃを含有）からの出発物質２mlに溶解し、そしてこの溶液を使用前＋３７℃に加温した（＝ＲＶＶ／ＡＰＣ試薬）。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１mlに溶解した。
【００４１】
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料    ｘμｌ
Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ
そして凝固時間はＲＶＶ／ＡＰＣ試薬１００μｌを加えて開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。容量ｘおよびｙを、総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるように、選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの０μｌを含有する可変体がトロンボプラスチン時間に基づくＡＰＣＴの可変体に対応する。凝固時間を実施例２と同じ試料で測定した。
【００４２】
表４に、得られた凝固時間およびＳＨＰで得られた凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記する。その他の試験可変体の如く（実施例２および３）、試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が増加するらにつれて、凝固時間が更に長くなる。タンパク質Ｃ欠損血漿は常にＳＨＰと比べると長くなっている。ＳＨＰとタンパク質Ｓ欠損血漿との差異はＦ.Ｖ−ＤＰの割合の増加に伴って小さくなるけれどもＦ.Ｖ疾患の効果はより大となる。ＰＴに基づく試験可変体（実施例３）と同様に、タンパク質Ｓ欠損はここに列記されているＦ.Ｖ−ＤＰの割合を用いては完全に作用中性化されず、その結果Ｆ.Ｖ−ＤＰの割合は７０％よりも大であるように選択されなければならない。しかし、Ｆ.Ｖ疾患（同型接合または異型接合のいずれでも）を有する血漿とタンパク質Ｓ欠損または欠陥を有する血漿との差異は更に顕著なものとなり、その結果更にＲＶＶＴを基として新規な方法により、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の他の障害から活性化タンパク質Ｃに対してより安定なＶ因子を識別する能力が増大される。
【００４３】
【表４】
0003687864.tif 000005
【００４４】
実施例５
Ｖ因子欠損血漿に添加することによるヘパリンの作用中性化
ヘパリンはHoffman-La Roche, Grenzach-Wyhlen, (LiquemineR 25000)から入手し、PolybreneはEga-Chemie, Steinheimから入手した。その他の試薬および装置はBehringwerke AGから入手した。
【００４５】
ヘパリンを標準ヒト血漿およびＶ因子疾患欠損を有する血漿に加え、試料容量中７５％のＦ.Ｖ−ＤＰ割合を用いて、実施例２に記載の如く、凝固時間を新規な方法で測定した。更に、Polybreneを１０μｇ／mlの比で試料中のヘパリンの作用中性化のためにＶ因子欠損血漿に加えた。表４には、ヘパリン０〜２Ｕ／mlの存在下様々の試験可変体で得られた凝固時間を列記する。Ｆ.Ｖ−ＤＰがヘパリン作用中性化添加物を含有していない場合、ヘパリンが０.２Ｕ／mlより高い濃度で存在すると、凝固時間はヘパリン無しの試料の時間よりも著しくはずれたものとなる。Ｆ.Ｖ−ＤＰにPolybrene １０μｌ／mlを添加すると、２Ｕ／mlまでのヘパリンの存在下でもＶ因子欠陥を測定することが可能となる。このことは、先行技術とは対照的に、ヘパリン添加試料中でも、Ｆ.Ｖ疾患欠損が測定可能となることを証するものである。
【００４６】
【表５】
0003687864.tif 000006
【００４７】
実施例６
マーキュマー（＝フェンプロクーモン）療法を受けている患者の血漿中のＦ.Ｖ欠損の測定
マーキュマーまたはヘパリンを投与されていない患者からの９本の血漿および血栓症に伴うマーキュマー療法を受けている患者からの６本の血漿のＡＰＣＴを、実施例２による血漿試料のＡＰＣＶの如く、７５％の試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合を用いて、実施例１に従って測定した。
【００４８】
得られた凝固時間を表６に列記する。結果をＳＨＰで得られた凝固時間（＝１００％）に関連して％に換算した。両方の試験で、１００％限界以下にある試料は正である。両方の試験で、非マーキュマー投与血漿は正であった。すなわち、１００％限界より下にあることがわかった；対照的に、マーキュマー投与血漿はいずれもＡＰＣＴで負であったが、６本のうち５本の血漿は新規な方法（ＡＰＣＶ）ではこの限界よりも明らかに下であった。Ｆ.Ｖ−ＤＰと混合した結果、マーキュマー投与血漿中のすべての欠損、ビタミンＫ依存性酵素を置換する。これらの血漿を正常の血漿と混合した場合にも、凝固時間が短縮された（表６）。しかし、このようにして置換が行われている試料を用いるＡＰＣＴで正の試料を同定可能とするのには、これは十分ではない。従って新規な方法は従来の方法よりもすぐれている。
【００４９】
【表６】
0003687864.tif 000007
【００５０】
実施例７
添加Ｖ因子欠損血漿中タンパク質Ｃの活性化によるＦ.Ｖ欠損の測定
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke；Behringwerke A.G., Marburgから入手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。
凝固時間を測定するために、Behringwerkeからのタンパク質Ｃ試薬用のタンパク質活性化物質試薬１バイアルをPathromtinR SL（シリカをベースとするＡＰＴＴ試薬；５.５ml）１バイアルの内容物に溶解した。この試薬および塩化カルシウム溶液（２５mM）を使用前に＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１mlに溶解した。
次のものを測定管に連続して注入した。
血漿試料    ｘμｌ
Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ
タンパク質Ｃ活性化物質／PathromtinR SL混合物１００μｌ
【００５１】
次に混合物全体を３分間＋３７℃でインキュベートし、そして出発試薬１００μｌを加えて凝固時間を開始させた。凝固時間を４０５nmで測定した。
容量ｘおよびｙを総容量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるように選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの０μｌを含む可変体は、ドイツ特許出願Ｐ ４４ ２７ ７８５.７に記載の如く、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の障害についての新規なスクリーニング試験に相当する。凝固時間は実施例２と同じ試料で測定した。
【００５２】
表７には、得られた凝固時間およびＳＨＰで得られた凝固時間に関連した凝固時間の差異を列記する。その他の試験可変体の如く（実施例２〜４）、試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が増大するにつれて、凝固時間が更に長くなった。Ｆ.Ｖ−ＤＰの割合が増大するにつれてＳＨＰとタンパク質Ｓ欠損血漿との差異がより小さくなるが、Ｆ.Ｖ疾患の効果はより大となる。タンパク質Ｓの不足の効果は、試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が７０％であるときに、作用中性化される。これらの結果は、実施例２〜４で実証した新規な方法の適用と同等の状態にあるが、この場合活性化タンパク質Ｃを添加しなかったけれども、代りに非活性化タンパク質Ｃを加え、次に供試混合物中で活性化した。
【００５３】
【表７】
0003687864.tif 000008
【００５４】
実施例８
VIII因子をＶ因子欠損血漿に添加することによるＡＰＴＴ依存法での試料中のVIII因子の効果の低減
凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer A, Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。BeriateR、すなわちBehringwerkeからのヒトVIII因子の濃縮物をVIII因子の源として用いた。
試験は、試料とＶ因子欠損血漿とを２５：７５の比で混合して、実施例２に記載の方法で実施した。加熱不活性化ヒト血漿をＶ因子欠損血漿として用いた。Ｖ因子およびVIII因子共にこの不活性化で破壊された。比較のために、この血漿を溶解後BeriateR を用いて１単位／mlの濃度にVIII因子を補完した。更に、ＳＨＰをBeriateR からVIII因子を補完し、その結果ＳＨＰ中のVIII因子の含量は１〜４単位／mlとなった。異型接合Ｖ因子疾患欠損を伴うヒト血漿を比較のために新規な方法で測定した。
【００５５】
表８には、凝固時間およびVIII因子補完を伴うかまたは伴わないＶ因子欠損血漿を用いて得られた、VIII因子１単位／ml含有ＳＨＰで得られた凝固時間に関連して凝固時間の差異を列記する。VIII因子を含有しない欠損血漿を用いると、正常血漿での凝固時間は血漿中のVIII因子の含量が増加するにつれて短くなり、Ｖ因子疾患欠損を伴うが、VIII因子の正常な含量を有する血漿で得られる凝固時間に近くなる。一方、Ｖ因子欠損血漿がすでにVIII因子１Ｕ／mlを含有していると、試料中のVIII因子の含量に因る凝固時間の短縮は無視してよいものとなる。
このことは、ＡＰＴＴを基とする試験デザインでは、VIII因子の添加によるか、あるいはVIII因子含有試薬の使用によるVIII因子のレベルの上昇に因って試料が誤って正と同定されるのを防止し得ることを実証するものである。
【００５６】
【表８】
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