(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多毛管検出システムにおける１の分析試料から放出される電磁放射線を検出するためのシステムであって、
（ａ）それぞれが毛管カラムの一部内に閉じ込められた複数の分析試料体積と、
（ｂ）電磁放射線源と、
（ｃ）前記電磁放射線源からの電磁放射線を受け止めかつ該電磁放射線を選択された１の前記試料体積に反射するためのミラーと、
（ｄ）前記ミラーから反射された電磁放射線を前記毛管カラムの中心に位置する前記試料体積に集束させるための集束レンズと、
（ｅ）反射された前記電磁放射線を１の試料体積に向けるために前記ミラーを移動することにより該ミラーを制御する、前記ミラーに取り付けられたスキャナと、
（ｆ）前記試料と前記反射された電磁放射線との相互作用の結果として生じるものである前記試料体積からの試料電磁放射線を集めるためのコレクタ手段としての放物面鏡と、
（ｇ）前記試料体積からの試料電磁放射線を検出するための検出器とを含み、
前記試料体積は、前記放物面鏡の焦点近傍であって、各試料体積からの前記試料電磁放射線が前記放物面鏡により反射されて前記検出器に向けられるように位置する、検出システム。
【請求項２】
前記毛管カラムが、同一平面内の複数の並列な毛管カラムを含む毛管アレイを形成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記電磁放射線源がレーザである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記スキャナがガルボスキャナである、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記放物面鏡が、各試料体積と接触させるための前記反射された電磁放射線の第１の入口開口を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記検出器が、光電子増倍管、電荷結合素子およびホトダイオードからなるグループから選ばれる、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
（ａ）前記試料が蛍光標識を含む分析試料であり、
（ｂ）前記毛管カラムが毛管アレイを形成し、
（ｃ）前記電磁放射線源が励起放射線源であり、
（ｄ）前記試料電磁放射線が、前記蛍光標識と相互作用する前記励起放射線の結果として生じる蛍光放出であり、また
（ｅ）前記コレクタ手段が前記蛍光放出を集めるためのものである、請求項１ないし６のいずれかに記載のシステム。
【請求項８】
前記放物面鏡が、前記反射された励起放射線を受け入れるための第１の開口と、前記蛍光放出を伝導するための第２の開口とを含み、該放物面鏡が前記毛管アレイの周囲に位置する、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
さらに、選択された波長の励起放射線を前記ミラーに伝導するためのフィルタ手段を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
さらに、選択された波長の放出放射線を前記検出器に伝導するためのフィルタ手段を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１１】
さらに、前記毛管アレイにより散乱された散乱電磁放射線を遮るための手段を含む、請求項７に記載のシステム。
【請求項１２】
多毛管検出システムにおける蛍光標識を含む１の分析試料から放出される電磁放射線を検出するためのシステムであって、
（ａ）同一平面内に並列関係に配置され毛管アレイを形成する複数の毛管カラムの一部内にそれぞれ閉じ込められた複数の分析試料体積と、
（ｂ）少なくとも１つの励起放射線源と、
（ｃ）前記励起放射線源からの前記励起放射線を受け止めかつ前記励起放射線を前記試料体積に反射するためのミラーと、
（ｄ）前記ミラーから反射された電磁放射線を前記毛管カラムの中心に位置する前記試料体積に集束させるための集束レンズと、
（ｅ）反射された前記電磁放射線を１の試料体積に向けるために前記ミラーを移動することにより該ミラーを制御する、該ミラーに取り付けられたガルボスキャナと、
（ｆ）前記毛管アレイを取り巻く放物面鏡であって、該放物面鏡が反射された励起放射線を受け入れるための第１の開口と蛍光放出を伝導するための第２の開口とを含み、前記蛍光放出が、前記蛍光標識と相互作用する前記励起放射線の結果として生じる、放物面鏡と、
（ｇ）それぞれが選択波長の放出放射線を伝導することができる複数のフィルタ手段を含むフィルタ輪と、
（ｈ）前記放物面鏡により伝導された前記蛍光放出を検出するための検出器とを含み、
前記試料体積は、前記放物面鏡の焦点近傍であって、各試料体積からの前記試料電磁放射線が前記放物面鏡により反射されて前記検出器に向けられるように位置する、検出システム。
【請求項１３】
さらに、前記毛管アレイの軸線に対して直角な平面内に配置された散乱バーを含む、請求項１２に記載の検出システム。
【請求項１４】
前記検出器が光電子増倍管を含む、請求項１２に記載の検出システム。
【請求項１５】
さらに、前記検出器から受け入れた信号を処理するための計算手段を含む、請求項１２に記載の検出システム。
【請求項１６】
それぞれが複数の試料体積の１つの内部に含まれる複数の試料の存在を検出する方法であって、
（ａ）ｉ）複数の前記試料体積を収容するための複数の試料チャンネルと、
ｉｉ）電磁放射線源と、
ｉｉｉ）該放射線源からの電磁放射線を受け入れかつ前記電磁放射線を前記試料体積に反射するためのミラ−と、
ｉｖ）前記ミラーから反射された電磁放射線を前記毛管カラムの中心に位置する前記試料体積に集束させるための集束レンズと、
ｖ）該ミラーに取り付けられた、前記ミラーを制御するためのスキャナと、
ｖｉ）反射された前記電磁放射線と前記試料との間の相互作用の結果として生じる前記試料体積からの試料電磁放射線を集めるためのコレクタ手段としての放物面鏡と、
ｖｉｉ）前記試料電磁放射線を検出するための検出器とを含む、検出システムを準備すること、
（ｂ）前記電磁放射線源から前記ミラーに電磁放射線を送ること、
（ｃ）前記ミラーから反射された電磁放射線を集束レンズにより前記毛管カラムの中心に位置する前記試料体積に集束させること、
（ｄ）前記電磁放射線が前記ミラーから反射され、第１の試料体積上に焦点を合わせるように前記ミラーを整列させるべく前記スキャナを操作すること、
（ｅ）前記試料電磁放射線を前記検出器において検出することを含み、
前記試料体積は、前記放物面鏡の焦点近傍であって、各試料体積からの前記試料電磁放射線が前記放物面鏡により反射されて前記検出器に向けられるように位置する、検出方法。
【請求項１７】
前記検出工程に引き続き、さらに、
（ａ）前記電磁放射線が前記ミラーから反射され、第２の試料体積に焦点が合わされるように前記ミラーを整列させるべく前記スキャナを操作すること、および、
（ｂ）前記反射された電磁放射線と前記第２の試料体積内の試料との間の相互作用の結果として生じる試料電磁放射線を前記検出器において検出することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
一度にひとつが連続的に、前記電磁放射線が前記ミラーから反射され、前記試料体積上に焦点を合わされ、また、前記試料電磁放射線が検出されるように前記ミラーを連続して繰り返されるように整列すべく、前記スキャナを操作する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）前記試料が蛍光標識化試料であり、
（ｂ）前記検出システムが、毛管アレイを形成するように同一平面内に配列された複数の毛管カラムを含み、また、各試料体積が前記毛管カラムの一つの一部内に閉じ込められており、
（ｃ）前記電磁放射線が前記試料との前記反射された励起放射線の相互作用の結果としての蛍光放出であるように、前記放射線源が励起放射レーザー源であり、
（ｄ）前記検出システムが、ｉ）前記毛管アレイを取り巻く前記放物面反射鏡と、ｉｉ）前記放物面反射鏡から前記検出器に選択波長の蛍光放出を伝えるための複数のフィルタ手段を含むフィルタ輪とを含み、
（ｅ）前記検出工程が、ｉ）前記フィルタ輪を回転させること、ｉｉ）第２の波長を有しかつ前記反射された電磁放射線と前記試料との間の相互作用の結果として生じる蛍光放出放射線を前記検出器において検出すること、およびｉｉｉ）前記励起放射線を前記ミラーに送るように第２の励起放射線源を作動させることを含み、
（ｆ）前記方法が、ｉ）前記励起放射線を前記ミラーに送るように第２の励起放射線源を作動させること、およびｉｉ）第３の波長を有しかつ前記反射された電磁放射線と前記試料との間の相互作用の結果として生じる蛍光放出放射線を前記検出器において検出することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）前記毛管カラムが毛管泳動アレイ内にあり、
（ｂ）前記試料が蛍光標識化試料であり、
（ｃ）前記電磁放射線源が前記蛍光標識化試料を励起させるための第１の励起光源および第２の励起光源を含み、前記標識化試料が第１の励起可能標識、第２の励起可能標識、第３の励起可能標識および第４の励起可能標識を含み、前記標識化試料が前記毛管電気泳動アレイの毛管内に含まれており、
（ｄ）前記スキャナが、前記アレイ内の各毛管を連続的に照らすべく前記励起光源からの反射光線を移動させるために前記ミラーを制御し、また、
（ｅ）前記検出器が、ｉ）前記第１の励起光源の波長での妨害を示し、また、第１の励起可能標識から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第１のフィルタと、ｉｉ）前記第１の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第２の励起可能標識から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第２のフィルタと、ｉｉｉ）前記第２の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第３の励起可能標識から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第３のフィルタと、
ｉｖ）前記第２の励起光源の波長での妨害を示し、また、前記第４の励起可能標識から放出された信号のスペクトル領域での伝導を示す第４のフィルタと、ｖ）前記異なる毛管からの信号を受け入れるための手段であって、前記信号が前記反射された光線と前記異なる毛管内に含まれた試料との相互作用の結果として生じる、受け入れ手段とを含む、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分離された被検体を検出するための毛管電気泳動検出システムおよび方法に関する。特に、本発明は、高感度で蛍光を迅速かつ連続的に検出することができる高処理量型の多毛管蛍光検出システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
毛管電気泳動は分析および生物医学上の研究で広範な適用を見出し、また、毛管電気泳動は、合成ポリヌクレオチド、ＤＮＡ塩基配列決定フラグメント、ＤＮＡ制限フラグメント、アミノ酸、ダンシルアミノ酸の光学異性体、および、タンパク質、ウイルスおよび細菌の分離を含む荷電種の高速分離および分析に用いられている。ミセル界面動電毛管クロマトグラフィ、等電点電気泳動およびオンカラム誘導は全てＣＥカラムで実行することができる。
【０００３】
ＣＥの利点は、小さい内径（２０−２００μｍ）の毛管の使用により現れる。小径の融解石英製毛管に沿って、非常に高い電場を印加することができる。前記荷電種の電気泳動速度は、印加された電場に比例することから、ＣＥは迅速な高分離度分離を実行することができる。ジュール熱により少なからぬ熱が発生する。しかし、冷却システムと関連して使用すれば、毛管内通路の容積に対する大きい表面と、薄い毛管壁（５０−１５０μｍ）の使用とが急速な熱の散逸を可能にする。
【０００４】
近年、自動ＤＮＡ塩基配列決定が広範な注目を引いている。塩基配列決定反応の間に生じた生成ＤＮＡフラグメントを分離すべく、ＤＮＡの鎖を塩基配列決定するための現在の方法は、典型的に、サンガー・クールソン型化学反応と電気泳動法とを適用する。毛管電気泳動と、特にレーザ誘導蛍光と組み合わされたＣＥ（ＣＥ−ＬＩＦ）の検出とは迅速な荷電種の被検体の分離と、高検出感度とを提供するため、それは、ＤＮＡの塩基配列決定における分離技術として、特に興味深い。レーザ誘導蛍光を利用するため、今日のＤＮＡ塩基配列決定反応のあるものは蛍光で標識をつけたフラグメントを必要とし、また、ＣＥ−ＬＩＦ技術を用いる塩基配列決定反応生成物を分離し、検出する。
【０００５】
ＣＥ分離は迅速であるが、ＤＮＡ塩基配列決定に基づくＣＥに関連する処理量は、一般に、単一の毛管が分離システムを形成する従来のスラブゲルの処理量より少ない。この制限を解消すべく、所望の処理量を達成するために多数の毛管を平行にして用いることが提案されている。もちろん、多数の別個の光源および検出器エレメントの組み合わせにおいて使用されるときは、処理量を増大する多数の毛管のＣＥシステムは高価で扱いにくいシステムとなる。さらに、多波長モニタリングの要求が追加されるとき、前記別個の光源／検出器エレメントを取り入れることは、また、さらに複雑なものとなる。
【０００６】
共焦点蛍光スキャナを利用する多毛管ＣＥ−ＬＩＦシステムが米国特許第５，０９１，６５２号および第５，２７４，２４０号明細書に記載されている。これらのスキャナは、レーザの光路を横切る毛管の配列（アレイ）における各毛管を連続的に移動させることに依っている。選択的に、全光学ヘッドを「掃引」走査で毛管の配列を横切らせることが提案されている（ＨＰＣＥ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４）。これらの方法は、１の毛管が前記光源から移動され、また、次の毛管が前記光源に移動されるように、比較的重いシステム要素の移動を必要とする。必然的に、前記システム要素の移動に多大の時間を浪費する。これらのシステムに固有の遅れ時間の結果として、有益な分離情報を逃すおそれがある。さらに、前記光源は各毛管内に含まれる試料体積の最適部分上に存しないが毛管を横切って連続的に走査されるため、蛍光システムに起因すると考えられる検出感度はいくぶん信頼性に欠ける。
【０００７】
さらに、前記従来の多毛管検出システムでは比較的重量のある構成要素が移動されているため、機械を動かす勢いが前記光源または検出器に関して前記毛管を次第に整列しないようにする可能性がある。時間遅れの問題と同様、誤った整列は、情報の損失および／または感度の低減および検出限界の増大を導く。また、前記毛管の移動に必要な前記モータおよび機構は、前記スキャナの製造に関するコストの追加をもたらす。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、高処理量の分離システムに関して用いられる安定性ある丈夫なシステム、さらに好ましくは経済的で高感度なシステムが提供されることが望まれる。また、多数の毛管のＣＥ−ＬＩＦシステムに関して用いられる自動検出システムが提供されることが望まれる。このようなシステムは、多数の励起波長を提供し、また、単一の検出器を用いて多数の放出波長を検出する能力を有する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明は次の発見、すなわち単一光源からの電磁放射線は、単一の検出器による試料体積内の試料の連続的および反復的検出を許すように、複数の近接して配置された毛管のそれぞれにおける試料体積に向けることができる、という発見に基づく。試料体積を電磁放射源に対して連続的に移動させることを求める従来の多試料検出システムと異なり、本発明は、電磁放射線をミラーから、階段方式で各毛管と関連する試料体積に連続的に反射させることを含む。
【００１０】
したがって、本発明は、連続してかつ繰り返して複数の試料体積を走査し、また、各試料体積から放出する電磁放射線を検出するためのシステムを提供する。このシステムは、それぞれが試料体積を含む、共通の平面内にある複数の並列試料チャンネルと、電磁放射線源と、電磁放射線を受け止めかつ反射するように整列されたミラーと、前記ミラーから反射された電磁放射線を前記毛管カラムの中心に位置する前記試料体積に集束させるための集束レンズと、前記ミラーを移動するための手段と、前記試料体積から集められた電磁放射線を受け入れるように整列された検出器とを含む。操作の際、前記ミラーの移動手段は、前記ミラーが、前記電磁放射線源からの電磁放射線を受け止めかつ前記電磁放射線を連続的にかつ繰り返し前記試料体積に反射するように位置決められるように、前記ミラーの位置を調整する。前記試料体積から放出された放射線は検出器に集められかつ向けられ、ここで、前記試料との前記電磁放射線の相互作用に応答して信号が発生される。
【００１１】
【発明の効果】
有利なことに、本発明の検出システムは、大きいシステム要素を移動する必要性をなくし、また、予め設定された時間、選択された試料体積上に前記電磁放射線を維持することを可能とする。その結果、改良された検出感度と、より経済的なまた物理的に安定で丈夫なシステムが得られる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
好ましい実施例では、前記試料チャンネルは、毛管アレイを形成するように共面配列形態に整列された毛管電気泳動カラムからなる。各毛管カラム内の試料体積は、電気泳動媒体上で分離される蛍光標識化試料を含む。前記試料を励起させるため、前記ミラーは、前記源からの特定の波長の励起放射線を受け止めかつ所与の毛管の中心に前記励起放射線を反射するように整列される。この励起放射線は、蛍光標識化試料を励起し、前記試料との前記励起放射線の相互作用に応答して信号が形成される検出器に集められかつ向けられる蛍光放出を生じさせる。この操作は、前記アレイ内の各毛管カラムに関して連続的にかつ繰り返して行われる。本発明は、多数の毛管の使用を通して高処理量が望まれるレーザ誘導蛍光検出との組み合わせに用いられる毛管電気泳動システムにおける特別の適用を有する。多くの適用が存在することは当業者において認識されているところであるが、本発明は、ＤＮＡ塩基配列決定反応において得られる蛍光標識化ＤＮＡフラグメントの分析に関連して、説明される。
【００１３】
本発明は、多数の分離チャンネルを含む高処理量電気泳動分離装置で使用するための検出システムに向けられている。レーザ誘導蛍光検出は、典型的には、毛管電気泳動分離に引き続く高感度検出を達成するための選択の方法であるため、ここでの議論は、ＣＥ−ＬＩＦの実施例に限定する。紫外および可視検出を含む多毛管検出システムの代案が等しく適用可能であることは当業者に明らかであろう。
【００１４】
本発明の検出システムは、多数の毛管のアレイにおける各毛管に収容された試料体積に、反射された励起放射線を連続的にかつ繰り返し移動させることを含む。放出された蛍光は検出器に集められかつ届けられ、前記検出器は蛍光量によって定まる信号を発生する。前記励起放射線は、前記毛管を動かすことなしにすなわち前記放射線源を移動させて各毛管に向けられるため、大きいシステム要素は移動されない。この特徴は、改良されたシステムの信頼性および検出感度を提供する。
【００１５】
図１は、図２および図３と結合して、本発明の一実施例を示し、該実施例においては、毛管アレイ（配列）における各毛管内の試料体積中に含まれる分離された試料を励起させるため、単一のレーザが使用されている。この実施例では、優位な一の波長の放射線を提供するために単一の放射線源が用いられ、また、前記一の波長で励起可能である単一の蛍光標識が前記試料に含まれている。図１を参照すると、検出システム１０がレーザ放射線源１２と、走査手段１８上に据え付けられたミラー１６と、集束レンズ２０と、同一平面上の８つの毛管の配列であるアレイ２２と、検出器２８とを含む。レーザ光源１２は、走査手段１８によって位置決められるミラー１６に励起放射線１４を導き、その結果、励起放射線１４がミラー１６から集束レンズ２０へと反射される。図１４Ａは、図１４の一部分１Ａの拡大されたタイミング図である。図２において、集束レンズ２０が拡大して詳細に示され、該集束レンズが、前記アレイ内の選択された毛管の中心の試料体積２１の内部に焦点を合わせるように反射励起光線１７を導く。図１に示す反射された励起放射線１７は、前記試料体積内の蛍光標識化試料と相互作用し、前記試料に放出蛍光放射線３２の放出を生じさせ、該放出蛍光放射線は検出器２８に導かれまたは向けられる。検出器２８は、放出放射線３２の存在に応答して信号を提供する。符号２９で示す計算システムが、処理のために前記信号を受け取る。
【００１６】
放出放射線３２の放出に引き続き、放射線１４が前記毛管アレイのそれぞれの毛管の中心において前記試料体積に集中するように、スキャナ１８がミラー１６を介して放射光線１４を導く。このような方法で、前記アレイの各毛管の試料体積に励起光線１４が連続的に集中するように、スキャナ１８と取り付けられたミラー１６とが集束レンズ２０と結合して用いられる。
【００１７】
前記したところから、本発明の検出システムは、焦点を合わされた励起レーザ光線を一方向に向けて、毛管アレイを横切るように走査し、ついで、前記ミラーをすぐに再配置し、これにより、前記ミラーが、前記励起光線が最初の毛管の中心に集まるように整列される工程を含む走査原理を含む。ここで使用される「走査工程」とは、前記励起光線源が、予め定められた時間、前記アレイの毛管上に存し、次に、前記アレイにおける次の毛管へ急速に移動し、ここにおいてこれが再び予め定められた時間、存することを意味する。前記予め定められた時間間隔は、前記励起光線が前記アレイ中の毛管に焦点を合わされまた時間データが集められる時間間隔または時間の計測を含む。データの収集は、各毛管の試料体積についての各予め定められた時間中に行われる。
【００１８】
ガルボ・スキャナの速度は、移動時間を最小にするとともに計測時間を最大にする。この分野の専門家は、この方法が、多数の毛管のアレイの全ての毛管が単一のレーザ源と単一の検出器とのみを使用して扱われることを可能とすることを理解するであろう。段階的走査モードが利用され、試料体積が焦点を合わされた励起放射線を受けるため、最大のレーザ光量が各計測時間中に前記毛管の中心に加えられる。
【００１９】
検出システム１０は、優先的にまた追加的に、レーザ放射線源１２とミラー１６との間に配置されたフィルタ３４を含む。フィルタ３４は、蛍光標識化試料の励起に必要な波長以外の波長を有する、レーザダイオード放射線源１２により与えられる放射線を除くように機能する。フィルタ３４は、加えて、望ましくない波長の放射線により引き起こされる背景散乱を除去するのに役立つ。放出放射線３２を集めかつ平行にし、放出放射線３２を検出器２８に導くため、本検出システムは、好ましくは、高補集率の放物面鏡３６を含む。アレイ２２の各毛管は、放物面鏡３６の焦点の近傍に配置されている。反射された励起放射光線１７は、集束レンズ１２から放物面鏡３６内に配置された開口３８を通るように向けられる。各毛管からの蛍光放出放射線３２は放物面鏡３６により集められ、放物面鏡３６の出口開口３９を通して、前記レーザ光線が前記反射鏡に入る反対の側に向けられる。前記毛管アレイの軸線に直角な平面内の毛管を取り巻く強烈なレーザ光線の散乱を遮るため、黒いバー４０（散乱バー）が前記平面内に配置されている。前記蛍光放出線は一連のフィルタ３５，３７を通して導かれ、光電子増倍管２８を用いて観察またはモニタされる。これらのフィルタは、前記レーザ光源からのいかなる散乱または背景の励起放射線をも遮り、かつ、前記毛管内の励起された試料からの放出蛍光の伝導を可能とする。
【００２０】
図３は、図１の前記放物面鏡をより詳細に示す。放物面鏡４１０内に配置された毛管アレイ４００が示され、また、散乱バー４２０の向きが示されている。フィルタ４３０，４４０と検出装置４５０とが、後に詳述する光子カウンタ４６０とスキャナ制御装置４７０との関係において示されている。また、毛管電気泳動の流体マニホルド４８０を含む流体管理システムの構成要素も後述する。
【００２１】
本発明によれば、放射線源１２は、所望の放出波長または波長スペクトルを有する電磁放射線の任意の源である。当業者は、所望の放出特性を得るために各蛍光標識が異なる励起エネルギまたは励起波長を必要とすることを認識する。本発明の目的のため、放射線源は、優先的に、前記試料中で蛍光を励起するのに適する特徴的な励起波長を有するレーザダイオードである。スキャナ１８は、ガルボスキャナ（ｇａｌｖｏ  ｓｃａｎｎｅｒ）のような非常に小さい正確な運動が可能である装置とすることができる。このようなスキャナは、これらが非常に急速で正確な運動が可能である、定位置への回転運動サーボモータであるため、本発明の実施に特に適する。ミラー１６は、励起放射線１４を受け止めかつ反射することができる平面鏡である。
【００２２】
明確のためまた図１に示すように、この実施例は同一面上に並列に配置された８つの毛管からなる毛管アレイを用いる。このアレイは、焦点を定められた励起光線１７が前記毛管の長さに対して直角であるように配置されている。前記毛管はシリカで形成されまた特定の適用に応じて変えることができる寸法を有する。適切な毛管の寸法は毛管電気泳動方法で用いられる寸法に特有のものであり、２０ｃｍおよび５００ｃｍ間の長さと、２０μｍおよび５００μｍ間の直径とを含む。好ましい毛管は、５０μｍの比較的大きい壁厚を有する。各毛管は、電気泳動領域にポテンシャルを与える単一の高電圧電源に接続されている。前記励起光線が前記試料体積に入るためまた前記放出光線が前記試料体積を離れるため、各カラムは、ＣＥの適用において用いられるシリカ製毛管に典型的である前記試料体積を取り巻く透明な「窓」を含む。
【００２３】
本発明の実施に適する検出器は、限定されるものではないが、電荷結合素子、電子なだれホトダイオード、ホトダイオードおよび光電子増倍管を含む、電磁放射線から信号を発生するように使用される種々の装置のうちの任意のものからなる。好ましい検出器は、光子計数モードで操作される光電子増倍管である。選択的に、直流平均化検出の形態を本検出システムにおいて用いることができる。直流平均化検出は、ゲート時間で適当な信号割り当てを行うには十分早いが、実験に基づく光電流からの正確なＤＣ光レベルの取り出しを可能とするに十分に長い時間定数を未だ保つ増幅器バンド幅を含む。この検出モードは光子計数の成果を提供しないが、多少のコスト削減を提供する。直流平均化は、また、ＤＮＡ塩基配列決定より過度の要求が少ない適用について、高い光レベルでの優れた成果を提供する。
【００２４】
本発明の他の実施例は、蛍光放出の波長により互いに異なる多数の試料を検出することを含む。この実施例は、２以上の蛍光標識の使用と、２以上の波長の蛍光放出を励起しかつ検出する能力とを含む。４つの異なる蛍光染料まで明確にするため、異なる励起波長と放出波長とを有するこれらのそれぞれが前記検出システムに組み入れられている。予想されるように、多数の蛍光標識を励起させる能力は、必要とされる全範囲の励起放射線波長を提供するために１以上の励起放射線源を必要とする。同様に、多数の放出放射線波長を検出するための能力は、特定の波長の放出放射線が特定の時間間隔で前記検出器において利用可能であるように、正確に計時されたフィルタ移動が必要である。
【００２５】
ここに記載した多毛管および多波長検出システムは、４つのヌクレオチド塩基のそれぞれがその独自の蛍光標識の放出波長により特定されるＤＮＡ塩基配列決定反応において得られるＤＮＡフラグメントを検出するための特定の適切なシステムを提供する。４つの色のＤＮＡ塩基配列決定反応と、該反応から生じるＤＮＡフラグメントの次の分離は既知であり、ここではその詳細を議論しない。
【００２６】
４色のＤＮＡ塩基配列決定反応における使用に適する検出システムを示す概略が図４に示されている。図４の検出システム１００は、異なる波長の２つの励起放射光線１３０，１３２を提供するために２つのレーザ光線源１１０Ａ，１１０Ｂを必要とする４つの異なる蛍光標識の検出を意図する。レーザ光線源１１０Ａは、第１および第２の蛍光染料に起因すると考えられる試料蛍光を励起させることができる。同様に、レーザ光線源１１０Ｂは、第３および第４の蛍光染料に起因すると考えられる試料蛍光を励起することができる。
【００２７】
操作の間、レーザ励起放射線源１１０Ａが作動され、結合ミラー１３４がレーザ励起光線１３０を線源１１０Ａからミラー１３６上に導く。前記したように、反射された励起光線１３７は集束レンズ１３８と放物面鏡１６０の開口１３９とを経て毛管アレイ１４０内の最初の毛管の試料体積に至る。前記最初の毛管の試料体積からの蛍光放出放射線は集められ、フィルタ輪１２０を通過する。図５は、フィルタ輪１２０の正面図を提供する。図４および図５を参照すると、放出放射線は、レーザ光線源１１０Ａの波長で光を遮るようにかつ前記最初の蛍光染料により放出された蛍光を伝導するように選択された最初（第１）のフィルタ１７０に通される。前記第１のフィルタ１７０により伝導された蛍光は検出器１５０で検出され、処理のために計算手段１６０に伝えられる。次に、モータ１２１がフィルタ輪１２０を回転させ、二番目（第２）のフィルタ１７２を蛍光放出光線中におく。第２のフィルタ１７２は、レーザ光源１１０Ａの波長の光は遮るが、第２の蛍光染料により放出される蛍光は通すように設計されている。第２のフィルタ１７２により伝導された蛍光は検出器１５０により測定される。
【００２８】
検出器１５０が、前記アレイの最初の毛管内の前記第１および第２の蛍光染料に起因すると考えられる蛍光放出を検出した後、レーザ光源１１０Ａの動作が停止され、レーザ光線源１１０Ｂが稼動される。該レーザからの光線は、前記したように、前記最初の毛管上に導かれる。励起された毛管からの蛍光が集められ、レーザ光源１１０Ｂへの切り替えと同期して適所に回転されるフィルタ輪１２０に配置された三番目（第３）のフィルタ１７４を通過する。第３のフィルタ１７４は、レーザ光源１１０Ｂの波長において励起放射線を遮るが、第３の蛍光染料の蛍光放出放射線を通すように設計されている。前記第３のフィルタにより伝導された蛍光放出線は検出器１５０で検出され、その検出信号が処理のために計算手段（図示せず）に伝えられる。次に、モータ１２１がフィルタ輪１２０を回転させ、四番目（第４）のフィルタ１７６を前記蛍光放出放射光線中におく。第４のフィルタ１７６は、レーザ光源１１０Ｂの波長の光は遮るが、第４の蛍光染料による蛍光放出光線は通すように設計されている。前記第４のフィルタにより伝導された蛍光は測定される。
【００２９】
４つの染料のそれぞれに対応する測定が行われた後、レーザ光源１１０Ｂの稼動が停止され、ミラー１３５が、反射された励起放射光線１３７を前記アレイの二番目（第２）の毛管上に導くようにガルボ・スキャナ１３５がミラー１３６を移動し、前記第１のレーザ光源が稼動を停止される。
【００３０】
前記４つの染料のそれぞれについての測定が前記第２の毛管において行われるまで、前記した順序が繰り返される。この順序は、前記アレイの毛管のそれぞれについて繰り返される。前記アレイの毛管のそれぞれにおける４つの染料のそれぞれについての測定が行われた後、前記ガルボ・スキャナが、ミラー１３６が反射された光線を前記アレイの第１の毛管上に導くべく配置されるように、ミラー１３６を移動させる。次に、データの収集が完了するまで、全部の順序が繰り返される。
【００３１】
当業者には、前記した説明が、毛管アレイに含まれる多数の毛管のそれぞれにおける多数の蛍光染料のそれぞれについての検出データを有利に提供することが理解されよう。各蛍光信号は、前記ガルボ・スキャナの位置決めを前記光子カウンタのゲート周期と同期させることにより、そのそれぞれの毛管に割り当てられる。この方法では、各試料体積中の前記蛍光試料の位置および同一性は、前記分析順序の間のどの時間間隔においても確認することができる。ガルボ・スキャナ、ミラーおよび集束レンズの組み合わせは、急速な試料体積の励起および検出を可能にする。実際、毛管の移り変わりを生じさせるために必要な時間の長さは４００／１００００００秒のオーダにある。フィルタ輪の回転は、前記検出器に対し、予め定められた時間間隔における所望波長の放射線を濾光しかつ通すための便利な手段を提供する。他のフィルタ手段は、限定されるものではないが、本発明の実施には、調子を合わせることができる液晶フィルタが適当である。このような調子を合わせることができる液晶フィルタは、これが伝導機能に対して変更および／または追加の便宜を図ることができるため、興味ある濾光選択である。これは、また、前記光学システムの回転要素を除去する。
【００３２】
光電子増倍管および回転フィルタは、ホトダイオードまたは電荷結合検出器（ＣＣＤ）のいずれかと結合した回折格子と置き換えることができる。
【００３３】
また、光の発出および蛍光の補集についてのいくつかの代案もまた本発明において使用されることに留意されるべきである。これらの代案は、専用のレーザおよび各毛管のための検出器の使用、画像光学、発散エレメントおよびＣＣＤ（電荷結合素子）のアレイ検出器の使用、励起のための光ファイバ切替え装置の使用、励起のためのバイナリ光学ビームスプリッタの使用、波長可変の液晶発光フィルタの使用、および、励起のための回転フェーセットミラーの使用を含む。
【００３４】
前記したように、試料成分がこれらの電気泳動分離に引き続いて容易に検出され得るように標識として前記試料成分に付することができる蛍光染料は、本発明における使用に有益である。所与の適用のための蛍光染料の選択は、関心のある試料成分、検出システムの形態、特定のレーザおよび検出器の利用可能性等に依存する。典型的には、蛍光標識はその励起要件および発光または放出特性に合うように選択される。さらに、前記蛍光標識または標識の組み合わせの異なる特性に合わせて、異なるレーザおよびフィルタまたはレーザおよびフィルタの異なる組み合わせが求められることは、当業者には明らかであろう。理想的には、本発明の多蛍光染料システムで利用される蛍光標識は、共通の励起放射線波長を利用することができるものであり、また、これらの分析が可能であるように十分に異なる波長の放出放射線を提供するものである。蛍光標識および標識付け化学はこの分野で周知のことであり、また、ここではさらに詳説することはしない。種々の蛍光染料および蛍光標識が商業的に入手可能であり、多くの場合、これらは活性化形態で購入することができる。これは、試料の電気泳動分離に先立つ該試料への付着のための調整手段を提供する。
【００３５】
有利なことに、本発明の検出システムは、各毛管が前記レーザ励起光線および検出器に関して最適な位置にあるように前記毛管を整列させるように使用することができる。参照によりここに組み入れられている同時係属米国出願番号０８／４０９，５５７がこのような整列方法を記載している。本発明において使用される毛管が前記参照特許出願において教示された方法に従って整列されると、これらは十分な時間、整列を維持される。これは、前記毛管を走査するために大きい構成要素を移動させることに依存しないためである。このような大きい移動は構成部品の誤整列をしばしば生じさせ、これが、感度の低下を招き、また信号の全損に導くことがある。
【００３６】
先に説明したように、本発明の好ましい適用は、サンガー・クールソンＤＮＡ塩基配列決定反応化学から生じる蛍光で標識付けられたＤＮＡフラグメントの分析である。ＣＥに基づく分離をＤＮＡ塩基配列決定への適用に成功裏に適用するため、非常に低い検出限界が求められることは、当業者には理解されよう。本発明は、これらの低検出限界を提供し、また、有利なことには、試料のハイスループットをもたらす。
【００３７】
ＤＮＡ塩基配列決定に基づくＣＥ／ＬＩＦを使用すると、１０ｐＭ（１兆分の１モル）内の範囲の蛍光標識濃度の検出限界を示し得る光学システムが、標準規模の配列決定反応から引き出す順序を与えるのに十分な信号対雑音比を有する電気泳動図を生じさせる。以下の実施例において、信頼性のあるＤＮＡ塩基配列決定データを提供する本検出システムの能力が示される。
【００３８】
【実施例】
実施例１
この実験では、本発明の多毛管検出システムの性能が、サンガー・クールソンＤＮＡ塩基配列決定反応から得られたＤＮＡフラグメントの分析において明らかにされる。配列決定反応は、Ｄ６７３として知られた標識化された蛍光を含むプライマのヌクレオチドを利用することを含む。Ｄ６７３の構造は図６に示されている。この蛍光標識は、約６３９ｎｍの励起放射線で励起され、その発光または放出放射線の最大は６７３ｎｍで生じる。
【００３９】
前記実験を行うために用いられるシステムは、図７に一般的なレイアウトの形態で示されている。赤色ダイオードレーザ２００（６３９ｎｍ、１．３ｍＷ、モデルＴＳＸ−１、Ｕｎｉｐｈａｓｅより購入）の出力光線がレーザ線路フィルタ２１０（６４０ｎｍ、７ｎｍ  ＦＷＨＭ（全幅、最大の半分）  Ｂａｒｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓより供給）を介して方向付けられ、また、ガルバノメータスキャナ（モデルＧ１２０ＤＴ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．により供給されている。）の回転制限駆動軸に固定された小さい鏡２３０（モデルＭ０５４０Ｖ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．により供給されている。）で９０゜で反射される。前記操作ミラーで反射された光線２３５は平凸レンズ２４０（モデル４１３４０、Ｏｒｉｅｌ，Ｉｎｃ．により供給されている。）を通るように方向付けられ、直径２．５４ｃｍ（１インチ）の放物面鏡２５０（モデル１５８７、カリフォルニア州  トーランスのＣａｒｌｅｙ，Ｉｎｃ．により供給されている。）の側部にある開口２４５を通るように焦点を合わせられている。この光線は、８つの融解石英製の毛管（ＴＳＰ１００２００、アリゾナ州  フェニックスのＰｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により供給されている。）であって放物面鏡２５０の焦点に関して直線状のアレイ２５５に保持された毛管の任意の一つの中心に焦点を合わされている。前記焦点を合わされた光線は前記毛管の内径内を通り、前記反射鏡の反対の側部の第２の穴２６５を経て前記反射鏡を励起する。
【００４０】
前記毛管の内径内で生じる蛍光の放出光線は、放物面鏡２５５により集められ、平行にされる。前記放出光線は、符号２６０で一まとめにして示された一連の光学フィルタ、すなわち（１）前記レーザ光の波長での高い拒絶性を有するロングパスフィルタ（Ｂａｒｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ製の６５０ｎｍロングパスカスタム）と、（２）バンドパスフィルタ（Ｏｒｉｅｌ，  Ｉｎｃ．製の６８０ｎｍ、１０ｎｍ  ＦＷＨＭ）とからなる光学フィルタを経て検出される。濾光された放出光は、次に、両凹レンズ（図示せず）を使用する縦形光電子増倍管２７０（Ｈａｍａｍａｔｓｕにより供給されるモデルナンバーＣ３１０３４，  ＲＣＡまたはモデル４６３２）上に焦点を合わされる。
【００４１】
光電子増倍管２７０は、光子計数モードで操作される。光電流パルスは、モデルＳＲ４４５高速前置増幅器およびモデルＳＲ４００弁別器（ＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により供給されている。）を用いて電圧に変換され、増幅され、識別され、次に計数器（カウンタ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓにより供給されるモデル３６１５ヘックススケール）に送られる。Ｄ／Ａ変換器の出力端（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓにより供給されたモデル２１１１２，  １２ビットＤＡＣ）を介した光子計数のゲートおよびガルボ制御が、デジタル遅延／パルス発生器（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．により供給されるモデルＤＧ５３５）を用いて同調または同期される。ＰＣコンピュータとのコミュニケーションは、並列レジスタ（ＤＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により供給されるモデルＰＲ−６０４）、ＣＡＭＡＣコントローラカード（ＤＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により供給されるモデル６００２）およびＰＣアダプタカード（ＤＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により供給されるモデルＰＣ−００４）を用いて行われる。
【００４２】
８毛管アレイ２５５が、放物面鏡２５０の下方に配置された高圧流体マニホルド（図７には図示せず）に接続されている。前記高圧流体マニホルドの配置は図３に示されており、符号４８０で示されている。この流体マニホルドは、ゲル取り替えモードにおいて、ゲルシリンジポンプから前記毛管にポリアクリルアミド分離ゲルを通し、あるいは、ゲル除去モードにおいて、前記毛管の端部を通して廃棄のために出させる。また、流体マニホルド１３は、ある意味では、高圧回路接地が前記マニホルド塊内の金属製フィッティングである「出口緩衝剤容器」としての役割をなす。前記毛管アレイの入口端部は、マイクロタイタ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートの上方に配置された毛管ハーネスに接続されている。
【００４３】
高電圧電源２８５の出力端は、電流モニタ室２９０内の８つの独立した通路に分けられている。データの取得は、周波数を直接測定することにより、または、周波数−電圧変換を行い、次いで電圧を測定することにより行われる。
【００４４】
前記検出システムは、２Ｈｚのアレイ走査速度を得るために０．５秒ごとに毛管アレイ走査を生じさせることにより操作される。パルス発生装置（図示せず）は、ミラー２３０が新たな毛管に励起放射線を再び向けるように、前記ガルボスキャナをトリガする各パルスで１６Ｈｚのパルス列を発する。前記パルス発生装置は、それぞれの新たなミラー位置に従う短時間の遅れを設定し、次に、各毛管のドエル時間について光子計数間隔をゲートする。表１にはこの実験のための適切なタイミングパラメータが載っている。
【００４５】
【表１】
一色タイミングパラメータ
0003626956.tif 000002
【００４６】
３つの理由から、操作の光子計数モードにおいて、近赤外線拡張光電子増倍管２７０が用いられた。光子計数が、１０００分の１秒当たりの光子のカウント数が１００ないし４００のオーダである分析システムで使用される光のレベルのための最良の結果を与えるため、このモードが好ましい。また、光子計数が非常に早い検出モードであり、これが、検出信号が適当な毛管およびスペクトルチャンネルに迅速に割り当て可能でなければならない走査の実行に容易に適合させる。第３に、光子の計数は、ガルボ段階走査と同調させるために非常に都合のよい検出モードである。
【００４７】
前記塩基配列決定反応から得られたＤ６７３による標識化ＤＮＡフラグメントは、今説明したシステムに前記反応試料を入れることにより分離された。図８は、前記ガルボ走査システムを用いて測定された８つの電気泳動図を示す。（毛管４は、電流がこの操作の早い時期に消失したため、このプロットに表示されていない。）これらの電気泳動図に示されたデータは、ＤＮＡ塩基配列決定フラグメントをサイズ範囲３５ないし３２３塩基を超えて分離した結果を示す拡張されたスケールである。本発明の検出システムは優れた信号対雑音比を提供した。これらの結果は、各毛管における試料体積に段階的に励起放射線を移動するための方法に基づくガルボスキャナと組み合わされたこの実験に使用された走査パラメータがＤＮＡ塩基配列決定フラグメントの高感度検出を提供することを示す。
【００４８】
この実験の経過の間、前記ガルボスキャナが、ここに記載された形態における１ないし８つの毛管の範囲を超えて非常に多目的に使用可能であることが証明された。例えば、前記ガルボスキャナは、８つの全ての毛管または全ての特定順番の任意数の毛管を走査することを必要としない。また、最適な使用率を維持する間、任意数の毛管に向けるために順序のタイミングを変更することは簡単な事項である。４つおよび８つの毛管の両アレイを提供することは、この方法を用いる簡単な事項である。
【００４９】
ミラーの移動を正確に制御し、励起光線を毛管の試料体積に導く前記ガルボスキャナの能力は例外である。毛管から毛管への推移（２００μｍの距離）に要する時間は１００万分の４００秒であり、サイクルを繰り返すための帰還走査は１０００分の１秒であった（毛管１から毛管８、または約１４００μｍ）。実際にガルボスキャナとミラーとを移動させるために使われる走査時間の割合は０．７９％であり、これに対し、試料のドエルとデータ収集とに使われる実際の時間の割合は９９．２４％であった。
【００５０】
実施例２
次の実施例は、本発明の検出システムを利用する４つの蛍光標識の検出を明示する。重要なのは、この実験では、光子の計数検出のためのゲートする時間間隔が４つのファクタのうちの少なくとも１つにおいて低減され、その結果、計測時間の実質的な減少と、潜在的な性能低下とが生じた。前記４つの蛍光標識は、前記のまた図６に示すＤ６７３と、図９に示す、６５０ｎｍのレーザラインで励起可能でありまた７１５ｎｍの放出放射線を有するＤ７１５と、図１０に示す、７５０ｎｍのレーザ光で励起可能でありまた７７５ｎｍの放出放射線を有するＤ７７５と、図１１に示す構造を有し、７５０ｎｍのレーザ光で励起可能でありまた８２０ｎｍの放出放射線を有するＤ８２０とを含む。当業者には、これらの４つの蛍光標識の組み合わせが、２つのレーザ光源システムと単一の検出器とを用いて励起されまた検出される塩基配列決定反応から分離されたＤＮＡフラグメントの検出を可能とすることは理解されよう。すなわち、約６５０ないし７５０の範囲の励起放射を与える２つのレーザ光源を選択しかつ６７３ｎｍから８２０ｎｍまでの蛍光放出を検出することができる検出器を提供することにより、本発明の検出システムは効果的に前記分離されたＤＮＡフラグメントを励起させかつ検出することができる。
【００５１】
予備的には、多数の蛍光標識を励起し、検出することは、各毛管のドエルのための測定時間の低減を必要とするため、信号対雑音比に依存する、低減された測定時間の効果が実施例１で述べた単一の蛍光標識を用いて詳細に調べられた。これは、単一の蛍光標識実験と関連するゲートする時間間隔を、４つの蛍光標識実験（約１０００分の１０秒）のそれを真似るために単に減少させることにより行われた。
【００５２】
前記４つの蛍光標識試験システムは、図４に示すような光学レイアウトを有する２つのダイオードレーザが励起放射線源として使用されたことを除き、図７に示すものと類似のシステムにおいて行われた。加えて、図７に符号２６０で集合的に示された前記フィルタは、図５に示すようなフィルタ輪で置き換えた。前記２つのダイオードレーザは、Ｕｎｉｐｈａｓｅにより供給された６５０ｎｍ、１．３ｍＷレーザおよび同様にＵｎｉｐｈａｓｅにより供給された７５０ｎｍ、１．３ｍＷレーザである。
【００５３】
実施例１で説明したように、前記毛管の内径内で発生する蛍光放出線は、前記放物面鏡により集められ、平行にされる。この放出線は、フィルタ輪に含まれた光学フィルタを介して方向づけられる。前記フィルタ輪は４つの象限を含む。前記象限のそれぞれは、次のように、異なるフィルタからなる。
【００５４】
象限１のフィルタは６５０ｎｍのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ６７３により放出された蛍光の範囲で高い伝導性または透過性を有する。
【００５５】
象限２のフィルタは、６５０ｎｍのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ７１５により放出された蛍光の範囲で高い透過性を有する。
【００５６】
象限３のフィルタは、７５０ｎｍのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ７７５により放出された蛍光の範囲で高い透過性を有する。
【００５７】
象限４のフィルタは、７５０ｎｍのレーザ波長で高い除去性を有し、また、Ｄ８２０により放出された蛍光の範囲で高い透過性を有する。
【００５８】
操作上、６５０ｎｍレーザが毛管を照らすために作動され、また、前記フィルタ輪がレーザ光線中に象限１をおくために回転される。次に、濾光された放出線が両凸レンズを用いる縦形光電子増倍管の光電陰極に焦点を合わせられ、Ｄ６７３に対応する読み取りが行われる。次いで、前記フィルタ輪が、象限２が前記レーザ光線中におかれるように回転され、Ｄ７１５に対応する読み取りが行われる。次に、前記６５０ｎｍレーザがそのスイッチを切られ、７５０ｎｍレーザがそのスイッチを入れられる。次いで、前記フィルタ輪が、象限３が前記レーザ光線中におかれるように回転され、Ｄ７７５に対応する読み取りが行われる。次に、前記フィルタ輪が、象限４が前記レーザ光線中におかれるように回転され、Ｄ８２０に対応する読み取りが行われる。前記ガルボスキャナの操作のためのタイミングダイアグラムが図４に示されている。
【００５９】
前記光電子増倍管は実施例１で説明した光子計数モードで操作され、また、全ての他の点において、前記毛管システムおよびマニホルドの操作は前記したとおりである。
【００６０】
ＤＮＡフラグメントは、前記した４つの蛍光標識のそれぞれでオリゴヌクレオチドプライマに標識付けを行うことにより、サンガー・クールソン型の塩基配列決定反応において生じる。塩基配列決定をされたＤＮＡ鋳型はｍＭ１３ｍｐ１８であった。分離されたフラグメントは、前記したシステム上にある。図１２は、単一の毛管から４つのチャンネルのそれぞれから得られた電気泳動図を示す。そのデータは、本発明の検出システムが多数の蛍光標識の励起を生じさせることができ、また、これらの効果的な電気泳動分離と同時の同じ多数の蛍光標識の放出を検出することができることを明示する。
【００６１】
実施例３
多数の蛍光標識された被検体の識別における本発明の検出システムの性能を評価するため、前記４つの蛍光標識（Ｄ６７４，Ｄ７１５，Ｄ７７５，Ｄ８２０）のそれぞれの「識別特性」が得られた。前記識別特性は、本発明のシステムの前記フィルタ輪が、残りの３つの蛍光標識に起因すると考えられる蛍光放出を除去する程度を示す。前記実験は、２．６ｎＭのＤ６７３、４．３ｎＭのＤ７１５、６．９ｎＭのＤ７７５および２．９ｎＭのＤ８２０の溶液を分析することを含む。
【００６２】
したがって、図１３を参照すると、データが象限１における前記フィルタ輪での測定時間の間に集められるとき、Ｄ６７３が測定される。図１３は、象限１に集められたデータが優位的にＤ６７３の信号であることを示す。同様に、象限２において、前記信号が、優位的に、該データにより支持されるＤ７１５信号である。１０００分の１０．６秒当たりの高いカウント数から、この実験がこれらの蛍光標識の効果的識別を明示し、また、Ｄ６７３、Ｄ７１５、Ｄ７７５について１兆分の１モルの検出限界を明示している。
【００６３】
明らかに、本発明の検出システムでのこれらの使用を伴う高感度検出は、これらの蛍光標識が多毛管ＣＥ−ＬＩＦに基づく分離での使用に適していることを示す。
【００６４】
ＤＮＡ塩基配列決定反応における共通の標識化方法は、蛍光標識でジデオキシターミネータを標識化することを含む。塩基配列決定反応から生じるＤＮＡフラグメントは、次に、これらの終末において標識化される。前記４つ蛍光標識について得られた前記データは、（Ｄ６７３−ｄｄＡＴＰ、Ｄ７１５−ｄｄＵＴＰおよびＤ７７５−ｄｄＧＴＰ）のような標識化ジデオキシターミネータがＤ６７３−ｄｄＡＴＰおよびＤ７１５−ｄｄＵＴＰについて１兆分の１の検出限界で観察することができ、また、Ｄ７７５−ｄｄＧＴＰについての２０ｐＭ検出限界を達成することができる。有利なことに、これらの蛍光標識が、サンガー・クールソン塩基配列決定反応に組み入れるジデオキシターミネータに組み入れられ得ることは知られている。したがって、本発明の検出システムにおけるこれらの使用を伴う前記高感度検出は、これらの蛍光標識が、多毛管ＣＥ−ＬＩＦに基づく、本発明の検出システムを使用するＤＮＡフラグメントの分離での使用に適することを示す。
【００６５】
本発明は、先に示しまた説明したおよび単に図示した特定の実施例に限定されない。種々のまた多数の他の配列または装置が、当業者により、この発明の精神および範囲から離れることなく工夫されよう。例えば、本発明の検出システムは、燐光を発する標識、化学発光標識または電気化学発光標識に基づく検出に適用可能である。
【００６６】
本発明の検出システムには、ＤＮＡ塩基配列決定反応から生じるＤＮＡフラグメントの分離および検出に加えて、多数の適用における有用性がある。次の議論において、多数の適用例が説明され、これらの全ては本発明の高い処理量および検出感度特性により利益を受ける。
【００６７】
ここで説明した検出システムを備える高処理量のＣＥ−ＬＩＦのための１適用例は、ＤＮＡ増幅生成物（例えば、ＰＣＲ生成物）の分析を含む。増幅されたＤＮＡの存在についての簡単な検定は、非特定のＤＮＡ増幅の可能性のため、受け入れられない。
【００６８】
増幅されたＤＮＡの存在について分析するための最近の１方法は、ハイブリッド形成プローブの使用を含む。その多くの有利なハイブリッド形成にもかかわらず、骨の折れる洗浄工程に時間を要し、また、液体操作のような自動化は精巧な装置を必要とする。加えて、それらに与えられている前記プローブおよびフォーマットのコストはこのやり方を高価なものにする。本発明の高処理量検出システムを用いる自動化されたＣＥ−ＬＩＦによる直接のＤＮＡサイズの分析は、ハイブリッド形成に基づく検定より迅速であり、安く上がる。このような適用のための本発明の検出システムの利用は、試料および標準が、これらを区別するために異なる蛍光標識を用いて、並列に共に処理されることを可能にする。
【００６９】
本発明の高処理量の多毛管検出システムの他の有用な魅力ある適用は、ＨＬＡタイピング（ＨＬＡ  ｔｙｐｉｎｇ）に関する。ＨＬＡタイピングは、器官および骨髄の移植と、配列特異プライマ（ＳＳＰ）がドナー当たり６０ＰＣＲほどの反応を必要とすることにより一般に特徴づけられた座の間の最適な識別とのために求められる。したがって、分離、サイズの決定および遺伝子型の帰属を自動化することが大いに望まれている。ＨＬＡ多形性も、また、法医学上の父性の決定および個の特定のための有用なマーカーを提供する。
【００７０】
ＨＬＡタイピングに関する他の適用は、ハイブリッド植物分析において共通の、多形性遺伝地図作成を経る遺伝子型である。この適用において、高多形性（異なる固体間で長さがしばしば変わり得る）でありまたゲノム（例えば、好ましい特質）の関心ある部分と関連する短い部分が特定され、また、前記可変部分の側にある高度に保護された順序（全ての固体において同じである順序）にハイブリッド形成するプライマが前記可変部分を増幅するために用いられる。一組の多形性位置から得られたサイズ情報は、雑種内の異なる遺伝子の親の起源についての情報を提供し、また、さらなる分析のための個体の選定を可能にする。前記一組の多形性位置は、並列に、高処理量を求めて、または異なる蛍光標識が各プライマ対に用いられている場合は同時に（多重通信されて）、多色能力を求めて、分析することができる。
【００７１】
法医学的な同定および遺伝スクリーニングにおけるＤＮＡ増幅の適用増大の趨勢がある。しかし、これらのテストの多くの重大な関連は、結果の正確性に対する過度の要求をならべる。増幅技術の有用性を確立する導入局面において、第２の技術によりスクリーニングを介して得られる結果の確認が求められる。ＤＮＡ増幅生成物のスクリーニングを介して得られる結果の最終確認は、問題の試料のＤＮＡの順序を直接に決定する。しかし、ＤＮＡの塩基配列を決定することは労働集約的であり、日常の作業のために基礎的研究所を除き必要な多くの工程の自動化が必要とされる。自動ゲル取り替えを有し、ここで説明した高処理量システムと結合された毛管を基礎とする装置は、これらの要求の多くを満たす。
【００７２】
研究利用に対する診断用アッセイにＤＮＡを導入する利点の一つは、一般に、選別される増幅生成物の正常配列が既知であることである。これは、自動化された装置に委ねられた要求を非常に少なくする。前記装置内にＤＮＡ配列の基準パターンであって、後にスクリーニングにより選択されたＤＮＡ試料の塩基配列決定から選ばれるパターンと自動的に比較される基準パターンを作ることができることが期待される。２つのパターンにおける相違を認識するタスクは、未知の配列を呼び出すことより困難は少ない。加えて、本質的に同一の配列が繰り返し検査されるため、標識化プライマを使用することができ、これが典型的に、他の標識化方法に比べて優れた配列決定結果を生じさせる。
【００７３】
ＣＥ−ＬＩＦ検出を利用する均一系の競合法免疫アッセイは、本発明の検出システムから潜在的利益をもつ他の応用である。競合法免疫アッセイは、次の式により一般的に表わすことができる。
Ａｇ  ＋  Ａｇ＊  ＋  ＡＢ  →  Ａｇ−ＡＢ  ＋  Ａｇ＊−ＡＢ  ＋  Ａｇ＊
Ａｇ  ＝血清試料内の抗原（標本のためのジゴキシン）
Ａｇ＊＝プローブ試薬として合成された標識化抗原
ＡＢ  ＝抗原に対する抗体（制限された量）
【００７４】
より詳細には、また、ＣＥ−ＬＩＦ、ジゴキシン標識化テトラメチルローダミン（蛍光分子）による同種の競合する免疫検定の標本としてジゴキシン検定を使用して、電荷搬送媒体としてオリゴヌクレオチドを使用して、免疫化学反応を精査するための種として用いられる。ジゴキシンに対する抗体の付加が、Ａｇ＊−ＡＢ複合体の形成物を生じさせる。ＬＩＦシステムを用いると、検出することができる２つの種、すなわち自由な蛍光標識化ジゴキシン（Ａｇ＊）と、蛍光標識化ジゴキシンに結合された抗体（Ａｇ＊−ＡＢ）とが存在する。医療環境では、多数の試料が同時に分析され、本発明の高処理量特性により分析時間が低減され、また、感度が高められる。
【００７５】
有利なことに、本発明は、モデルシステムとしてジゴキシンおよびテオフィリンを使用して例示することができる多数の被検体の免疫検定システムにおいて特に有用である。生物学的流体中にジゴキシン（Ｄ）とテオフィリン（Ｔ）とを含む試料は、ジゴキシン（Ｆａｂ）とテオフィリン（Ｍ−Ａｂ）とに対する限定量の抗体を有する蛍光標識化ジゴキシン（Ｄ＊）と蛍光標識化テオフィリン（Ｔ＊）に対して競合する。Ｄ＊およびＴ＊の量は、前記生物学的流体中に存在するジゴキシンとテオフィリンとの量に直接関連する。当業者には、本発明の検出システムが、ＣＥ−ＬＩＦ分離および検出を使用する多数の被検体検定において要求される高感度と高い試料処理量とを提供することができることが理解されよう。
【００７６】
前記した本発明の特定の実施例の説明は、明確にするためまた記述のために表わされている。これらは、完全であることまたは開示された正確な形態に本発明を限定することを意図するものではなく、さらに、前記の教示に照らして多くの変更および種類が有り得る。本発明の範囲はここに添付の請求の範囲およびこれと均等のものにより規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の多毛管検出システムの概略図である。
【図１Ａ】図１の線１Ａ−１Ａに沿って得られた断面図である。
【図２】走査ミラー、レンズおよび毛管アレイの向きを示す図である。
【図３】放物面鏡およびアレイの概略図であり、また、毛管へ入る流体を制御するための流体マニホルドを示す。
【図４】本発明の多毛管検出システムの概略図である。
【図５】本発明の実施に有用なフィルタ輪の詳細を示す。
【図６】蛍光標識Ｄ６７３の構造を示す。
【図７】本発明の検出システムを使用するための全体的なシステムのレイアウトを示す。
【図８】ＤＮＡ塩基配列決定反応から得られたＤＮＡフラグメントを分析するために本発明の検出システムを利用して得られた一組の電気泳動図である。
【図９】蛍光標識Ｄ７１５の構造を示す。
【図１０】蛍光標識Ｄ７７５の構造を示す。
【図１１】蛍光標識Ｄ８２０の構造を示す。
【図１２】本発明の検出システムを用いて得られた４つの電気泳動図である。
【図１３】各蛍光標識からの放出についての複数組の並列データを得る間に４つの異なる蛍光標識のそれぞれについて得られた蛍光の識別特性を示す。
【図１４】２Ｈｚの走査速度での８毛管、４実験のタイミング図を示す。
【図１４Ａ】図１４の一部分１Ａの拡大されたタイミング図である。
【符号の説明】
１０    検出システム
１２    電磁放射線源
１３、４８０    流体マニホルド
１４    励起放射線
１６、１３６、２３０    ミラー
１７    反射励起光線
１８    スキャナ・走査手段
２０、１３８    集束レンズ
２１    試料体積
２２、１４０、２５５、４００    毛管アレイ
２８、１５０    検出器／光電子増倍管
２９    計算システム
３２    放出蛍光放射線
３４、３５、３７、２６０、４３０、４４０    フィルタ
３６、１６０、２５０、４１０    放物面鏡
３８    第１の開口
３９    第２の開口
４０、４２０    散乱バー
１００    検出システム
１１０Ａ、１１０Ｂ、２００    レーザ光線源
１２０    フィルタ輪
１２１    モータ
１３０    励起放射光線
１３２    励起放射光線
１３４    結合ミラー
１３５    ガルボ・スキャナ
１３７、２３５    反射された励起光線
１３９    開口
１７０    第１のフィルタ
１７２    第２のフィルタ
１７４    第３のフィルタ
１７６    第４のフィルタ
２１０    レーザ線路フィルタ
２４０    平凸レンズ
２４５    開口
２６５    第２の穴
２７０    縦形光電子増倍管
２８５    高電圧電源
２９０    電流モニタ室
４５０    検出装置
４６０    光子カウンタ
４７０    スキャナ制御装置
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４Ａ】
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