(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球から細胞膜を除去した粗ヘモグロビン溶液に対し、分画分子量が10,000〜15,000の限外濾過膜を用いて限外濾過濃縮を行い、濃縮後のヘモグロビン溶液に、ヘモグロビン1 mol に対して0.1 g〜8.0 gのＮＡＤＨを添加することを特徴とするヘモグロビン溶液の製造方法。
【請求項２】
前記ヘモグロビン溶液について、37 ℃遮光下でインキュベーションを行い、インキュベーション開始時から50時間後にシアンメト法により測定したメトヘモグロビン生成率が、10 ％以下であることを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン溶液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、人工赤血球の原料などとして有用であるヘモグロビン溶液の製造方法に関する。
更に詳しくは、本発明は特にヘモグロビンのメト化が抑制され、酸素運搬能を長期に維持することができるヘモグロビン溶液の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビン溶液を人工赤血球の原料として利用するには、ヘモグロビンの酸素運搬能を維持するために、メトヘモグロビンの生成を抑制しなけれならない。これは、ヘモグロビンのヘム鉄（２価の状態）が酸化されて３価の状態になり（メトヘモグロビン化）、酸素の運搬能を消失するためである。
【０００３】
従来、赤血球よりヘモグロビン溶液を調製する方法として、例えば特開昭６０−２２４６２６号や特開平４−５９７３５号などが提案されている。
前記した提案のうち、特開昭６０−２２４６２６号は分画分子量の10,000の限外濾過膜を使用する方法を、また特開平４−５９７３５号は分画分子量が50,000の限外濾過膜を使用する方法を開示している。
【０００４】
しかしながら、これらの方法により製造されるヘモグロビン溶液においては、前記したメト化を抑制するために、
・  ヘモグロビンの還元物質としての電子供与体、及び
・  前記電子供与体から電子を受けとってメトヘモグロビンをヘモグロビンに還元する作用を有する電子伝達体、更には、
・  これらの反応を促進させるための酵素、
などを添加しなければならないものである。
従って、ヘモグロビン溶液の製造において、より簡便な、かつよりコストパフォーマンスの優れた方法の開発がまたれている。
なお、前記した電子伝達体として、一般的にはメチレンブルー等が使用されているが、その安全性が充分であるとは言えず、この面からも従来法の改善が要請されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記した従来技術の問題点に鑑み案出されたものである。
本発明は、赤血球を原料として細胞膜を除去した粗ヘモグロビン溶液に対して、特定の分画分子量を与える限外濾過膜を適用した場合、電子供与体を添加するのみでヘモグロビンのメト化を抑制することができるという知見をベースとするものである。
【０００６】
即ち、本発明は、赤血球を原料とし細胞膜を除去した粗ヘモグロビン溶液に対して、特定の分画分子量を与える限外濾過膜を適用し、従来のように電子伝達体や酵素などを添加せずに、電子供与体のみを添加するだけでヘモグロビンのメト化を抑制し、長期に亘り酸素運搬力を維持することができる経済的なヘモグロビン溶液の製造方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明は、赤血球から細胞膜を除去した粗ヘモグロビン溶液に対し、限外濾過濃縮を行なってヘモグロビン溶液を製造する方法において、限外濾過膜の分画分子量が10,000〜15,000であることを特徴とするヘモグロビン溶液の製造方法、更には前記のようにして調製したヘモグロビンに所定量の電子供与体を添加することを特徴としたヘモグロビン溶液の製造方法に関するものである。
以下、本発明の技術的構成を詳しく説明する。
【０００８】
まず、本発明のヘモグロビン溶液の製造方法に適用される粗ヘモグロビン溶液について説明する。
前記粗ヘモグロビン溶液は、公知の方法、例えば特開平４−５９７３５号に開示の方法により赤血球から細胞膜を除去することにより調製すればよい。以下に、その調製工程の概略を説明する。
(1).全血の採取
(2).全血は、等量の生理食塩水を添加し、遠心分離を行なうことにより、血漿、白血球、血小板等を除去する。次いで、２〜３倍量の生理食塩水を添加して遠心分離を行ない、赤血球を洗浄する。洗浄は数回繰り返すのが好ましい。
(3).得られた洗浄赤血球に２〜３倍量の蒸留水もしくは低張溶液を添加して赤血球溶血液とする。
(4).次に、赤血球溶血液より遠心分離操作、フィルター濾過などで細胞膜を除去し、粗ヘモグロビン溶液を調製する。
【０００９】
次に、本発明の前記粗ヘモグロビン溶液に適用される限外濾過濃縮について説明する。
本発明において、分画分子量が10,000〜15,000の限外濾過膜を使用する理由は、ヘモグロビンの分子量が64.450であること、分画分子量が10,000以下の場合、濃縮操作に多大の時間を要するためである。また、分画分子量が15,000以上の場合、限外濾過濃縮後のヘモグロビン溶液が、電子伝達体及び酵素などを添加しないと安定した酸素運搬能を保持し得ないためである。
即ち、本発明においては、分画分子量が10,000〜15,000の限外濾過膜で濃縮したヘモグロビン溶液自体が重要な意味をなし、更にこの系に電子供与体を添加するだけで酸素運搬能を向上させることが出来るという点に特徴を有するものである。
【００１０】
本発明において、前記した限外濾過膜による濃縮は、平膜、スパイラル、あるいはホローファイバー型の限外濾過膜を用いた限外濾過装置により行なうことができる。なお、前記限外濾過膜の素材は任意のものでよいが、セルロース系、ポリスルホン系のものが代表的なものである。
【００１１】
前記粗ヘモグロビン溶液の限外濾過濃縮の工程において、粗ヘモグロビン溶液は濃縮されるとともに脱塩される。
本発明において、前記限外濾過濃縮の工程におい、脱塩を効率化するために無機イオン等の不純物を含有していない蒸留水を粗ヘモグロビン溶液に添加し、限外濾過操作を行ない、脱塩、濃縮を行なうことができる。
前記した態様で脱塩、濃縮を行なう場合、添加する蒸留水量は、限外濾過濃縮した粗ヘモグロビン溶液に対して１０倍から２０倍程度が好ましい。
【００１２】
本発明において、前記のようにして特定の分画分子量を与える限外濾過膜を用いて脱塩、濃縮したヘモグロビン溶液は、ｐＨ緩衝液、例えばｐＨが 7.2〜8.5 の緩衝液を用いてｐＨを 7.2〜7.4 に調整される。
本発明において、前記ｐＨ領域に調整されたヘモグロビン溶液に、電子供与体を添加するだけで、酸素運搬能の持続性を向上させることができる。
本発明において、前記電子供与体としては、特にＮＡＤＨ（ニコチンアミド  アデニン  ジヌクレオチド＜還元型＞）が好ましいものである。
前記ＮＡＤＨのヘモグロビン溶液に対する添加量は、ヘモグロビンの１mol に対し、0.1 ｇ〜8.0 ｇ、好ましくは0.3 ｇ〜5.0 ｇである。
なお、ＮＡＤＨの添加量が 0.1ｇ未満のときは電子伝達経路が効果的に働かず、また 8.0ｇを越えるときはヘモグロビン溶液の粘度が上がり過ぎるので好ましくないものである。
以上のようにして調製された最終のヘモグロビン溶液は、ヘモグロビンの酸化防止という観点から、４℃に保存しておくことが望ましい。
【００１３】
本発明において、前記したように特定の分画分子量を与える限外濾過膜を使用し、更に電子供与体としてＮＡＤＨを使用した時に、優れた酸素運搬能を発現する機構について、本発明者らは以下のように推論している。
(i)   赤血球中には、ヘモグロビンの酸化を抑制する酵素系として、catalase（カタラーゼ）、glutathion peroxidase （グルタチオン  ペルオキシダーゼ）、superoxide dismutase（スーパーオキシド  ジスムターゼ）が存在しており、酸化反応によって生成したメトヘモグロビンを還元する酵素として、 NADH-cytochrome b5 reductase （ NADH チトクロム b5 レダクターゼ）が存在している。また、電子伝達体としてはcytochrome b5 （チトクロム b5 ）が存在している。それぞれの分子量を下記の表１に示す。
【００１４】
【表１】
0003713053.tif 000002
【００１５】
(ii)  そして、本発明において細胞膜除去のためのフィルター濾過操作、及び限外濾過濃縮操作後の粗ヘモグロビン溶液は、少なくとも分子量15,000から64,000（ヘモグロビンの分子量）までの分画分子量が保持されていると考えられる。このことから、本発明によって生成されたヘモグロビン溶液には、superoxide dismutase、NADH-cytochrome b5 reductase、cytochrome b5 が存在していると考えられる。
【００１６】
(iii) その結果、本発明の製造方法により調製された精製ヘモグロビン溶液において、電子供与体としてＮＡＤＨを添加した場合、図１に示されるような機構により、ヘモグロビンのメト化が効果的に抑制されていると考えられる。
即ち、図１に示されるように、ヘモグロビン溶液中にＮＡＤＨを添加すると、ＮＡＤＨは溶液中に存在しているチトクロム b5 を還元し、還元型のチトクロム b5 がメトヘモグロビンを還元するものと考えられる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例により更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のものに限定されないことはいうまでもないことである。
なお、実施例及び比較例において、特に明示しない限り、ヘモグロビン溶液の各調製工程は、無菌的環境下、４℃で行なったものである。
【００１８】
（実施例１）
期限切れヒト濃厚赤血球 2,500mlに等量の生理食塩水を加え、ゆるやかに混合後、遠心分離操作（2,000g×30分、4 ℃）を行い、血漿、白血球、血小板を吸引して除去し、赤血球層を得た。この操作を３回繰り返して洗浄して洗浄赤血球 2,300mlを得た。
次に、洗浄赤血球に蒸留水を２倍容量添加し、ゆるやかに混合し１時間静置した後、連続遠心操作（20,000 g）によって細胞膜を除去した。
さらに、フィルター濾過を行い、細胞膜を完全に除去した粗ヘモグロビン溶液5,000ml を得た。
前記したようにして調製した粗ヘモグロビン溶液を分画分子量10,000のスパイラル型の限外濾過膜（Amicon社製  S10Y10）を用いた限外濾過装置（Amicon社製  CH2 ）によって、限外濾過濃縮を行なった。得られたヘモグロビン溶液は、さらに１０倍容量の無機イオン等を含有していない蒸留水を添加して限外濾過操作を行い、脱塩、濃縮を行ない、精製されたヘモグロビン溶液を得た。
次に、前記精製ヘモグロビン溶液を、ｐＨ 8.0の HEPES-NaOH 緩衝液を用いてｐＨ 7.2〜7.4 に調整し、ヘモグロビン１ molに対して0.3 ｇのＮＡＤＨを添加した。
【００１９】
（比較例１）
実施例１と同様の操作を行い、赤血球から細胞膜を除去した粗ヘモグロビン溶液を得た。
次に、粗ヘモグロビン溶液を分画分子量20,000のスパイラル型の限外濾過膜（Amicon社製  S10Y10）を用いた限外濾過装置（Amicon社製  CH2 ）によって、限外濾過濃縮を行なった。得られたヘモグロビン溶液は、さらに１０倍容量の無機イオン等を含有していない蒸留水を添加して限外濾過操作を行い、脱塩、濃縮を行ない、精製されたヘモグロビン溶液を得た。
さらに、得られたヘモグロビン溶液を、ｐＨ 8.0の HEPES-NaOH 緩衝液を用いてｐＨ 7.2〜7.4 に調整し、ヘモグロビン１ molに対して0.3 ｇのＮＡＤＨを添加した。
【００２０】
（メト化抑制効果の試験1）実施例1及び比較例1で得られた、ＮＡＤＨを0.3 g含んだヘモグロビン溶液を、37 ℃遮光下でインキュベーションを行ない、インキュベーション開始時及び、10，20，30，40，50時間後のメトヘモグロビン量を測定した。メトヘモグロビン量の測定はシアンメト法（Royal Vangorcum Ltd., Assen, the Netherlands (1970)）で行った。結果を図２に示す。図２において、曲線(1)は実施例１で得られたＮＡＤＨを0.3 g含んだヘモグロビン溶液のメトヘモグロビン生成率を示し、曲線(2)は比較例１で得られたヘモグロビン溶液の結果を示している。
【００２１】
（実施例２）／（メト化抑制効果の試験２）
実施例１に準じ、精製ヘモグロビン１mol に対するＮＡＤＨの添加量が異なるヘモグロビン溶液を調製し、該ヘモグロビン溶液のメト化抑制効果について評価した。即ち、ＮＡＤＨの異なる添加量をもつヘモグロビン溶液を、３７℃遮光下でインキュベーションを行ない、インキュベーション開始時から５０時間後の夫々のメトヘモグロビン生成量を評価した。結果を図３に示す。
図３に示されるように、本発明の特限外濾過膜により精製したヘモグロビン溶液へのＮＡＤＨの添加効果は、ヘモグロビン１ molに対して 0.1ｇから発現される。なお、ＮＡＤＨ上限添加量は、溶液の粘度との関連から前記したように 8.0ｇが好ましい。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、赤血球を原料として細胞膜を除去した粗ヘモグロビン溶液に、従来技術のように電子伝達体及び酵素等を添加せずにＮＡＤＨを添加するだけで、ヘモグロビンのメト化を効果的に抑制することが可能な精製ヘモグロビン溶液が製造される。
本発明のヘモグロビン溶液は、有機リン酸体並びに塩素イオンのようなアロステリック因子を添加した後、リボソームで包埋するような人工赤血球の原料として極めて有効なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のヘモグロビン溶液におけるメト化抑制の機構を説明する図である。
【図２】  本発明のヘモグロビン溶液のメト化抑制効果を示す図である。
【図３】  本発明のヘモグロビン溶液のＮＡＤＨ添加量とメト化抑制効果の関係を示す図である。
【図１】
0003713053.tif 000003
【図２】
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【図３】
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