(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置特異性を有する油脂分解酵素を固定化用担体に吸着固定化した後、乾燥せずに直接反応基質と接触させてエステル化反応を行う部分グリセライドの製造方法。
【請求項２】
固定化用担体として多孔性の陰イオン交換樹脂を用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
固定化の前処理として、担体を脂溶性脂肪酸若しくは脂溶性脂肪酸誘導体で処理する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
反応基質と接触させた後の固定化酵素中の水分が40〜60重量％である請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
エステル化反応を２回以上繰り返して行う請求項１〜４の何れか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素を用いた脂肪酸とアルコールとのエステル化反応に関する。
【０００２】
【従来の技術】
油脂のエステル交換、及び脂肪酸とアルコールのエステル化を主目的とする反応用の酵素として、リパーゼと呼ばれている油脂分解酵素を担体に固定化した固定化酵素が用いられている。これらの反応は、加水分解を抑制するため、できるだけ低水分濃度（1000ppm 以下）で行うことが有利であるため、固定化酵素の調製時から担体に数％の水分しか与えないように強制的に乾燥を行っている。
しかし、固定化酵素の乾燥工程では吸着した酵素の失活が起こり易く、実際の活性発現時に吸着時の最大活性を発現しない場合が多い。
特開昭６０−１３４０９０号公報には、固定化後に脂肪酸誘導体の接触下で固定化酵素を乾燥させて活性発現を高めることが記載されているが、この方法では固定化酵素の乾燥に高価な設備が必要である上に、緩慢乾燥の条件設定等が複雑であり、実用的・効率的でない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
以上の状況において、活性発現を十分に発し、さらに酵素の脱離や失活を抑えたエステル化用固定化酵素を調製し、エステル化反応を促進することが望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
この課題を解決するため本発明者が検討した結果、担体上に吸着した酵素に対し安定な状態を与える必要があり、このためには、反応基質と酵素とを、酵素の固定化後に速やかに接触させることが有効であることを見出した。
即ち本発明は、位置特異性を有する油脂分解酵素を固定化用担体に吸着固定化した後、乾燥せずに直接反応基質と接触させてエステル化反応を行う部分グリセライドの製造方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
エステル化反応の場合、脱水下で反応をシフトさせながら反応を行うため、反応を行いながら同時に脱水系を利用して固定化酵素に残存する過剰な水分を除くことが可能である。油脂分解酵素を固定化用担体に吸着固定化した後、乾燥せずに直接反応基質と接触させて行う初発のエステル化反応では、この過剰な水分を除去するための余分な反応時間がかかってしまうが、従来行われている固定化酵素の乾燥時間に比べれば非常に短時間で済む。更に、この初発の反応で生じる生成物の組成や品質に関しては、２回目以降の反応で生じる生成物と遜色はない。この初発のエステル化反応において、酵素に対して必要な活性発現水分になるまでの時間は、使用する固定化酵素の量、脱水系の能力にもよるが、概ね１時間程度である。２回目以降の反応に関しては、初発の反応で過剰な水分が除去されているため、初発の反応で要した水分除去の時間は不要である。
【０００６】
本発明で使用する担体としては多孔性の陰イオン交換樹脂が良い。樹脂の粒子径は400 〜1000μｍのものが望ましく、細孔径は100 〜1500Åのものが望ましい。樹脂の材質としては、フェノールホルムアルデヒド系、ポリスチレン系、アクリルアミド系、ジビニルベンゼン系等が挙げられる。特にフェノールホルムアルデヒド系樹脂が望ましい。この細孔が酵素吸着に大きな表面積を与え、より大きな吸着量を得ることができる。
【０００７】
本発明では、高活性を発現するような吸着状態にするため、固定化の前処理として、担体を脂溶性脂肪酸若しくは脂溶性脂肪酸誘導体で処理することが好ましい。使用する脂溶性脂肪酸若しくは脂溶性脂肪酸誘導体としては炭素数８〜18のものが望ましい。例えば該脂肪酸としては、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸等の直鎖飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸等の不飽和脂肪酸、リシノール酸等のヒドロキシ脂肪酸、もしくはイソステアリン酸等の分岐脂肪酸が挙げられる。脂肪酸誘導体としては、炭素数８〜18の脂肪酸と水酸基を有する化合物とのエステルが挙げられ、１価アルコールエステル、多価アルコールエステル、リン脂質、あるいはこれらのエステルに更にエチレンオキサイドを負荷した誘導体等が例示される。１価アルコールエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル等が、多価アルコールエステルとしては、モノグリセライド、ジグリセライド、及びそれらの誘導体、あるいはポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
これらの脂肪酸及びその誘導体はいずれも常温で液状であることが工程上望ましい。またこれらは単一で用いても良いが、組み合わせることで一層の効果が発揮される。これらの誘導体は水性媒体中で化学的、もしくは油脂分解酵素で加水分解され、脂肪酸を生成するためと考えられる。
これらの脂溶性脂肪酸及びその誘導体と多孔性陰イオン交換樹脂の接触法としては、水もしくは有機溶剤中にこれらをそのまま加えても良いが、分散性を良くするために溶剤に脂溶性脂肪酸又はその誘導体を一旦分散・溶解させた後、水に分散させた多孔性陰イオン交換樹脂に加えても良い。この時の有機溶剤としてはクロロホルム、ヘキサン、エタノール等が挙げられる。脂溶性脂肪酸及びその誘導体と多孔性陰イオン交換樹脂の比率は、多孔性陰イオン樹脂１重量部（乾燥重量）に対し、脂溶性脂肪酸及びその誘導体0.01〜１重量部、特に0.05〜0.5 重量部が好ましい。接触温度は０〜100 ℃、好ましくは20〜60℃が良い。接触時間は、５分〜５時間程度で良い。
【０００８】
本発明で使用する油脂分解酵素は、モノグリセライドやジグリセライド等の部分グリセライドを調製する場合は、位置特異性を有するリゾプス(Rizopus) 属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、クロモバクテリウム(Chromobacterium) 属、ムコール(Mucor) 属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、ジオトリケム(Geotrichum)属、ペニシリウム(Penicillium) 属、キャンディダ(Candida) 属等の微生物起源のリパーゼ及び膵臓リパーゼ等の動物リパーゼが挙げられる。また高エステル化率でトリグリセライドを得るためには位置特異性のない（ランダム型）のリパーゼが良く、微生物起源ではシュードモナス(Pseudomonas) 属、及びキャンディダ(Candida) 属等が良い。
【０００９】
固定化を行う温度は酵素の失活が起きない０〜60℃、好ましくは５〜40℃が良いが、酵素の特性によって選ぶことができる。また酵素溶液のｐＨは、酵素の変性が起きない範囲であれば良く、ｐＨ３〜９が望ましい。これも温度同様酵素の特性によって決めれば良い。これらのｐＨを維持する緩衝液としては、特に限定しないが、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等がある。
【００１０】
固定化の際の酵素溶液中の酵素濃度は、固定化効率の点から酵素の溶解度以下で且つ十分な濃度である事が望ましい。また必要に応じて不溶部を遠心分離で除去し、上澄を使用することも出来る。また固定化担体と酵素の比率は固定化担体１重量部に対して、酵素0.05〜10重量部、特に0.1 〜５重量部でが好ましい。
【００１１】
酵素と上記の如く処理した担体の接触は、酵素液中に担体を分散させて攪拌する方法や、カラム等の充填塔に担体を封入してポンプ等で酵素液を循環させる方法があるが、これらの何れでもよい。吸着固定化された固定化酵素は、物理的方法で充分水を切った状態で反応基質と接触させ、エステル化反応を行う。このとき固定化酵素中の水分は用いる担体の種類によっても異なるが、通常20重量％以上、好ましくは40〜60重量％の範囲にある。
【００１２】
反応基質としては、炭素数２〜22の脂肪酸が挙げられる。これらは飽和、不飽和の何れでもよく、また直鎖の他、分岐、共役二重結合等を含んでいても良い。また、構造異性体を含んでも良く、特に限定されるものではない。単一脂肪酸組成を有するエステルや部分グリセライド、トリグリセライドを調製する場合は、これらの脂肪酸を単独で用いることができ、また、２種類以上混合して用いてもよい。更に、脂肪酸としては、１種以上の植物油・動物脂を完全分解または部分分解したものも使用できる。一方、アルコールとしては、炭素数１〜22の１価のアルコール及び２価以上のアルコールが挙げられる。反応基質に関しては、目的とするエステル化物の調製が可能になるように上記の脂肪酸とアルコールを組み合わせて使用すればよく、特定のものの使用に限定されない。
【００１３】
エステル化の反応方法は、減圧脱水法、グリセリン脱水法、モレキュラーシーブ等の脱水剤を用いた脱水反応法等の公知の方法でよい。また、固定化酵素は、攪拌式反応器、充填塔反応器、流動床反応器の何れに使用してもよい。
【００１４】
【発明の効果】
本発明によれば、固定化酵素上の酵素に対して安定な状態を与え、極力乾燥による酵素の失活を抑えることで、吸着した酵素が持つ最大限の活性が引き出され、長期間に渡り、効率的で安定なエステル化反応を行うことができる。
【００１５】
【実施例】
実施例１
Duolite A-568 （ダイヤモンドシャムロック社製）10ｇをＮ／10のＮａＯＨ溶液100cc 中で１時間撹拌した。濾過した後100cc のイオン交換水で洗浄し500mM の酢酸緩衝液（ｐＨ７）100cc でｐＨの平衡化を行った。その後50mMの酢酸緩衝液（ｐＨ７）100cc で２時間ずつ２回ｐＨの平衡化を行った。この後、濾過を行い担体を回収した後、エタノール50ccでエタノール置換を30分行った。濾過した後、リシノール酸を10ｇ含むエタノール50ccを加え30分間、リシノール酸を担体に吸着させた。その後、濾過し、担体を回収し、50mMの酢酸緩衝液（ｐＨ５）50ccで30分ずつ４回洗浄し、エタノールを除去し、濾過して担体を回収した。その後、市販のリパーゼ（リ・リパーゼ  長瀬産業（株）製）10ｇを50mMの酢酸緩衝液（ｐＨ７）90ccに溶解した酵素液と５時間接触させ、固定化を行った。濾過し、固定化酵素を回収して、50mMの酢酸緩衝液（ｐＨ７）100cc で洗浄を行い、固定化していない酵素や蛋白を洗浄した。以上の操作はいずれも20℃で行った。固定化後の酵素液の残存活性と固定化前の酵素液の活性の差より固定化率を求めたところ、98％であった。
次いで、大豆油を分解して生成した脂肪酸を100 ｇ加え、良く攪拌した後、グリセリンを16ｇ添加し、40℃、減圧下（13Pa以下）でエステル化反応を行った。反応時間４時間で反応油中のＤＧ（ジグリセライド）収率（ジグリセライド含有率＋トリグリセライド含有率）は63％に達した。この反応の後、反応終了油を濾別して固定化酵素を全量回収し、上記の大豆油分解脂肪酸100 ｇとグリセリン16ｇを添加し、同反応を更に２回繰り返した。その結果、この２回の繰り返し反応とも、反応時間２時間で反応終了油中のＤＧ収率は62％となった。以上の繰り返し反応において、ＤＧ収率約62％反応時の反応油中の各成分組成を表１に示した。
【００１６】
比較例１
実施例１で調製した固定化酵素を、実施例１に示した大豆油分解脂肪酸の添加なしに40℃で一昼夜減圧乾燥（133Pa 以下）した。乾燥後の水分量は約２％であった。この固定化酵素10ｇを用いて、実施例１と同様にエステル化反応を行い、３回繰り返し反応を行った。その結果、何れの反応でも反応３時間でＤＧ収率は62〜63％であった。以上の繰り返し反応において、ＤＧ収率約62％反応時の反応油中の各成分組成を表１に示した。
【００１７】
【表１】
0003720205.tif 000002
【００１８】
尚、上記例で反応終了油中の成分比は、サンプルをトリメチルシリル化してガスクロマトグラフィーで分析した結果である。
上記の実施例１と比較例１との対比より、本発明方法により固定化酵素の乾燥を行わずに反応を行った場合は、反応時間の短縮ができ、生成物の品質は損なわれないことが判明した。それぞれの酵素のエステル化の活性を比較したところ、反応基質で処理したものは150 ％（対乾燥品）の活性を発現したことになる。