(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原又は抗体を担持した不溶性担体を用いて、担持された抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を測定する抗原抗体反応の判定方法であって、
前記測定のための試薬構成は、不溶性担体の懸濁液及び緩衝液からなる２液以上の試薬を用い、測定時にはこれらの試薬が混合されるものであり、
前記測定は２度行うものであり、
第１回目の検体測定時に反応が起こった検体に対して、試薬構成中の測定に供する緩衝液を、不溶性担体に担持したものと同じ抗体又は抗原を含む緩衝液と入れ換えたのちに第２回目の測定をし、
最初の反応に対する、前記緩衝液での反応の減少度合を測定することにより特異的反応であるか非特異的反応であるかを判定することを特徴とする抗原抗体反応の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定の分野に属し、詳しくは抗原抗体反応を利用した測定に関し、その測定結果の簡便かつ精度の高い判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応は、微量成分の検出のために、日常的に利用されている。免疫学的測定方法においては、測定された結果が抗原抗体反応によるかどうかを判定することが重要な意味を有する。例えば、特開平０２−８０９５６号公報には、スライド上等の基体表面上にて、凝集反応試薬と混合し、抗原−抗体反応の結果生じる凝集像を観察し、判定し、その後、ｐＨを３．０以下、若しくは９．０以上に変化させ、またイオン濃度を０．５Ｍ以上とし、高濃度のカオトオロピックイオンを含む化学物質を添加して、凝集が乖離するかどうかで、非特異凝集かどうかを確認する方法が開示されている。
【０００３】
また、特表平１１−５１１２５５号公報には、ＩｇＭ抗体に特異的な結合構成員を固定した固定材料を含む試薬を形成し、固相材料に結合してＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体から乖離を起こすのに充分低いｐＨとすることにより、判定する方法が開示されている。
【０００４】
免疫反応を用いる方法は、特異的な抗原−抗体反応を利用するため、測定特異性の高い方法である。しかし、検体の状態等により、非特異的凝集反応を起こす場合があり、測定結果に誤差を生じる場合がある。
【０００５】
このような問題を解決するため、抗原抗体反応か非特異的凝集反応かを確認する手段として、上記の例では、起こった反応が抗原抗体反応であった場合の抗原抗体反応の乖離条件（ｐＨの変化、イオン強度、カオトロピックイオンの変化等）により、判定しているが、このような方法においては、抗原抗体反応以外の非特異的な反応の場合も乖離が起こる場合があり、抗原抗体反応かどうかを判定できないことがある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記現状に鑑み、本発明は、非特異的凝集反応が起こったか否かにかかわらず、正確な測定結果を得ることができる免疫学的測定方法を確立することができる判定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗原又は抗体を担持した不溶性担体を用いて、担持された抗原又は抗体に対応する抗体又は抗原を測定する抗原抗体反応の判定方法であって、前記測定のための試薬構成は、不溶性担体の懸濁液及び緩衝液からなる２液以上の試薬を用い、測定時にはこれらの試薬が混合されるものであり、前記測定は２度行うものであり、第１回目の検体測定時に反応が起こった検体に対して、試薬構成中の測定に供する緩衝液を、不溶性担体に担持したものと同じ抗体又は抗原を含む緩衝液と入れ換えたのちに第２回目の測定をし、最初の反応に対する、前記緩衝液での反応の減少度合を測定することにより特異的反応であるか非特異的反応であるかを判定する抗原抗体反応の判定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明においては、不溶性担体の懸濁液、緩衝液からなる通常測定試薬構成の緩衝液と、予め不溶性担体に担持した抗体又は抗原と同様の特異性をもつ抗体又は抗原を含む緩衝液（以下、「中和緩衝液」という）とを取り替え、再測定することにより、検体中の抗原又は抗体を消費させながら再び測定する。このような手段を取ることにより、検体を別容器に移し変えたりする手間なく、抗原・抗体が消費されたかどうかを調べることができ、特異性を保ったまま、非常に簡便に抗原抗体反応の確認を行うことができる。
【０００９】
不溶性担体に吸着又は結合する、また、中和緩衝液に含有される抗原としては、蛋白質抗原、脂質抗原、ハプテン、ハプテンをキャリア（たとえばＢＳＡのような蛋白質）に結合させたもの等、免疫測定法に用いることが可能であれば、その性状は問わない。また、精製蛋白質等の場合、不溶性担体に吸着又は結合するものと同様の特異性をもつものであれば、動物種、組織等が同一由来である必要はない。
【００１０】
不溶性担体に吸着又は結合する、また、中和緩衝液に含有される抗原としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれもが用いることが可能であり、また、その酵素消化断片を使用することもできる。また、不溶性担体に吸着、結合する抗体が必ずしも同一の種由来の抗体である必要はなく、また、一方がモノクローナル抗体で、もう一方がポリクローナル抗体であってもかまわない。
【００１１】
測定系は、ラテックス懸濁液、緩衝液等からなる構成であれば、液数を問わない。すなわち、緩衝液を２種類以上、ラテックス懸濁液を２種類以上に分割した試薬構成でも差し支えない。また、測定時に最低ラテックス懸濁液１種と緩衝液１種の計２種類以上であれば、保存時に緩衝液を２種類以上、ラテックス懸濁液を２種類以上の複数に分割しておく保存方法も本発明を妨げるわけではない。
【００１２】
中和率も数値に限定はない。判定を容易にするためには、判定基準として中和率を５０％以上の高値とできるほうが好ましいが、力価の高い抗体、精製度の高い抗原等が手に入りにくい場合においても、中和の有無が判別できれば本発明を妨げるものではない。
【００１３】
【実施例】
以下に、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をさらに詳細に述べる。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）  ＨＢｓ抗原測定試薬への適用−１
１）第１試薬（緩衝液）の調製
（１）通常測定用第１試薬の調製
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）を１重量％含有するリン酸−食塩緩衝液（０．０５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、以下、０．０５ＭＰＢＳともいう）に、平均分子量５０万のポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、以下、ＰＥＧともいう）を１．０重量％の濃度になるように溶解した。上記溶液１Ｌに対し、更に、正常ウサギ血清を３．０μＬ添加し、通常測定用第１試薬を調製した。
（２）中和用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳに、ＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解した。上記溶液１Ｌに対し、更に、抗ＨＢｓ抗血清（ウサギ）（特異抗体力価８０００ＩＵ／ｍＬ（メディエースＨＢｓ抗体（積水化学工業社製）にて測定）を３．０μＬ添加し、中和用第１試薬を調製した。
【００１４】
２）第２試薬（抗ＨＢｓ抗体感作ラテックス液）の調製
抗ＨＢｓウサギ抗体（精製品）を１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、リン酸−食塩緩衝液（０．０３６Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）、０．1M ＮａＣｌ、以下、０．０３６ＭＰＢＳともいう）１．２５ｍＬに、平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１ｍＬと０．０３６ＭＰＢＳとを添加し、３０℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳを添加し、３０℃にて６０分間攪拌した後、４℃にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄した。洗浄操作は３回行った。得られた沈殿物にＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳ１００ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．１％（Ｗ／Ｖ）の抗ＨＢｓ抗体感作ラテックス液を調製した。これを第２試薬とした。
【００１５】
３）ＨＢｓ抗原測定試薬
ＨＢｓ抗原測定試薬としては、通常測定、即ち、ＨＢｓ抗原の測定の際には、通常測定用第１試薬と第２試薬とを用いた。また、中和試験、即ち、ＨＢｓ抗原の確認試験の際には、中和用第１試薬と第２試薬とを用いた。
【００１６】
４）標準ＨＢｓ抗原液、中和試験用検体
標準品としてＨＢｓ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／ｍＬ濃度で含むヒト血清を使用した。
また、検体として、ＨＢｓ抗原陽性血清：Ａ〜Ｅ、及び、偽陽性血清Ｆ〜Ｊを使用した。ここで偽陽性血清とは、健常人から採取された血清であるが、通常試験にて陽性と判定されたものである。
【００１７】
５）通常測定方法
（１）検量線の作成
検体２０μＬと通常測定用第１試薬１５０μＬとを混合し、３７℃で適時保存した後、第２試薬１５０μＬを添加攪拌した。この後、１分後及び５分後の波長７５０ｍｍでの吸光度を測定し、この差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定には日立７１５０形自動分析装置を使用した。
予め、標準品について測定を行って検量線を作成しておき、以下の測定では検体の吸光度変化量を上記検量線に代入して、検体中のＨＢｓ抗原量を算出した。
【００１８】
（２）検体の測定
ＨＢｓ抗原陽性血清及び偽陽性血清を検体として、上記５）−（１）の測定方法に従って、ＨＢｓ抗原量を測定した。結果を表１に示した。
【００１９】
６）中和試験方法
上記５）−（２）の通常測定で陽性と判定された検体について中和試験を実施した。
ＨＢｓ抗原陽性血清及び偽陽性血清を検体として、通常測定用第１試薬を中和用第１試薬に交換した以外は上記５）−（１）と同様に、測定を実施した。結果を表１に示した。また、表中の中和率は、下記式に従い算出した。
【００２０】
【数１】
0003692055.tif 000002
【００２１】
７）結果の判定
結果の判定は以下の基準に従った。
（１）通常測定
・測定値が８ＩＵ／ｍＬ未満・・・陰性
・測定値が８ＩＵ／ｍＬ以上・・・陽性
（２）中和試験
・中和率が５０％未満・・・陰性
・中和率が５０％以上・・・陽性
【００２２】
（実施例２）  ＨＢｓ抗原測定試薬への適用−２
実施例１の通常測定用第１試薬及び中和用第１試薬の調製を以下のように行った以外は、実施例１と同様に行った。結果を表１に示した。
１）第１試薬（緩衝液）の調製
（１）通常測定用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳに、ＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解した。上記溶液１Ｌに対し、更に、０．０３６ＭＰＢＳを８．０μＬ添加し、通常測定用第１試薬を調製した。
（２）中和用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳに、ＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解した。上記溶液１Ｌに対し、更に、抗ＨＢｓウサギ抗体（精製品、緩衝液：０．０３６ＭＰＢＳ）（蛋白濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ、特異抗体力価：５３００ＩＵ／ｍＬ（メディエースＨＢｓ抗体（積水化学工業社製）にて測定）を８．０μＬ添加し、中和用第１試薬を調製した。
【００２３】
【表１】
0003692055.tif 000003
【００２４】
（比較例１）
通常測定用第１試薬の調製を以下のように行い、また、実施例１の中和用第１試薬に代えて下記１）−（２）の確認試験用第１試薬を用いて試験を実施した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表２に示した。
【００２５】
１）第１試薬（緩衝液）の調製
（１）通常測定用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳに、ＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解し、通常測定用第１試薬を調製した。
（２）確認試験用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有するホウ酸Ｎａ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．１５）に、ＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解し、確認試験用第１試薬を調製した。
【００２６】
（比較例２）
通常測定用第１試薬の調製を以下のように行い、また、実施例１の中和用第１試薬に代えて下記１）−（２）の確認試験用第１試薬を用いて試験を実施した以外は、実施例１と同様に行った。結果を表２に示した。
【００２７】
１）第１試薬（緩衝液）の調製
（１）通常測定用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有する０．０５ＭＰＢＳに、ＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解し、通常測定用第１試薬を調製した。
（２）確認試験用第１試薬の調製
ＢＳＡを１重量％含有するホウ酸Ｎａ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．１５）に、ＮａＣｌを０．５Ｍの濃度になるように、またＰＥＧを１．０重量％の濃度になるように溶解し、確認試験用第１試薬を調製した。
【００２８】
【表２】
0003692055.tif 000004
【００２９】
実施例１及び２においては、ＨＢｓ抗原陽性血清について５検体とも通常試験では８ＩＵ／ｍＬ以上を示し、中和率も５０％を超えたため、陽性と判定された。一方、偽陽性血清については５検体とも通常試験では８ＩＵ／ｍＬを超えたが、中和率が５０％未満であるため、陰性と判定された。
比較例１及び２においては、ＨＢｓ抗原陽性血清について５検体とも通常試験で８ＩＵ／ｍＬ以上を示し、中和率も５０％を超えたため、陽性と判定された。しかし、偽陽性血清については５検体とも通常試験では８ＩＵ／ｍＬを超え、更に５検体中４検体は中和率も５０％以上になったため、陽性と判定されてしまった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明は上述の構成よりなるので、検体を別容器に移しかえたりする手間なく、抗原及び／又は抗体が消費されたかどうかを調べることができ、非常に簡便に抗原抗体反応の中和試験を行うことができる。