(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性疲労症候群罹患が疑われる患者の末梢血液単核細胞から得られたサンプルを、自然条件下で約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌの存在について分析することを含むことを特徴とする慢性疲労症候群を検出する方法。
【請求項２】
（ａ）付加プロテアーゼインヒビターの存在下で調製した、慢性疲労症候群罹患が疑われる患者の末梢血液単核細胞から得られたサンプルと、検出可能な標識を担持する構造式（Ｉ）に従う化合物を含むプローブとを、前記標識化されたプローブ化合物と前記サンプル中の２’，５’−オリゴアデニレート結合タンパク質との共有結合物を形成するのに十分な条件下で接触させ：
構造式（Ｉ）
0003686423.tif 000004
上記式中、
ｍは０から３までの整数であり、
ｎは１から３までの整数であり、及び
各Ｒ1及び各Ｒ2は、互いに他のＲ1及びＲ2とは独立して、水素又はＮ3であり、少なくとも１つのＲ1又はＲ2がＮ3であることを条件とし、
或は前記化合物の水溶性塩である；
（ｂ）前記共有結合物を含む前記サンプルと、前記サンプル中のＲＮａｓｅ Ｌ種に結合する抗体とを接触させ；
（ｃ）前記サンプル中の前記タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し；そして
（ｄ）前記分離したタンパク質を、
（ｉ）前記標識化されたプローブ化合物と共有結合物を形成し、及び
（ｉｉ）前記抗体によって結合された
マーカータンパク質について調べ；
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量約３７ｋＤａのマーカータンパク質の存在が、慢性疲労症候群の徴候を示すことを特徴とする慢性疲労症候群を検出する方法。
【請求項３】
（ａ）付加プロテアーゼインヒビターの非存在下で調製した、慢性疲労症候群罹患が疑われる患者の末梢血液単核細胞から得られたサンプルと、検出可能な標識を担持する構造式（Ｉ）に従う化合物を含むプローブとを、前記標識化されたプローブ化合物と前記サンプル中の２’，５’−オリゴアデニレート結合タンパク質との共有結合物を形成するのに十分な条件下で接触させ；
構造式（Ｉ）
0003686423.tif 000005
上記式中
ｍは０から３までの整数であり、
ｎは１から３までの整数であり、及び
各Ｒ1及びＲ2は、互いに他のＲ1及びＲ2とは独立して、水素又はＮ3であり、少なくとも１つのＲ1又はＲ2はＮ3であることを条件とし、
或は前記化合物の水溶性塩である；
（ｂ）前記共有結合物を含む前記サンプルと、前記サンプル中のＲＮａｓｅ Ｌ種に結合する抗体とを接触させ；
（ｃ）前記サンプル中の前記タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し；そして
（ｄ）前記分離したタンパク質を、
（ｉ）前記標識化されたプローブ化合物と共有結合物を形成し、及び
（ｉｉ）前記抗体によって結合された
マーカータンパク質について調べ；
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量約３７ｋＤａのマーカータンパク質の存在、及びドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量約８０ｋＤａのマーカータンパク質の非存在が、重度の慢性疲労症候群の徴候を示すことを特徴とする重度の慢性疲労症候群を検出する方法。
【請求項４】
自然条件下において、慢性疲労症候群罹患が疑われる患者の末梢血液単核細胞から得られたサンプルを、約３０ｋＤａ及び約８０ｋＤａの分子量を有するＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在について分析することを含み、それによって、（ｉ）約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在及び約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の非存在は重度の慢性疲労症候群を示し、（ｉｉ）両方の分子量のＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在は比較的軽度の慢性疲労症候群を示す、慢性疲労症候群の相対的重度を評価する方法。
【請求項５】
慢性疲労症候群罹患が疑われる患者の末梢血液単核細胞から得られたサンプルを、自然条件下で約３０ｋＤａの分子量若しくはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約３７ｋＤａの見かけの分子量を有する２’，５’−オリゴアデニレート結合タンパク質の存在について分析することを含むことを特徴とする慢性疲労症候群を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
これは１９９６年１０月９日に出願された同時係属出願第０８／７２８，１０９号の一部継続出願である。
政府交付金関連
本明細書に記載される発明は、米国公衆衛生総局交付金Ｒ２１ ＡＩ３８３７８を受けた研究過程でなされた。米国政府は本発明にある程度の権利を有する。
発明の分野
本発明は、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）を、この疾患と関係のある特異的分子マーカーの検出によって診断することに関するものである。
発明の背景
慢性疲労症候群（ＣＦＳ）は原因不明の病気であり、突然の発症、インフルエンザ様症状、衰弱性疲労、微熱、筋痛症及び神経性認識機能障害と関連することが多い。典型的に、ＣＦＳ患者はカルノフスキー動作スコア（ＫＰＳ）の低下を示す。カルノフスキー動作試験は個人の正常活動の動作及び遂行能力を測定するものである。カルノフスキースコアは、機能しない、又は死亡患者に対するスコア＝０から、完全に正常な機能に対するスコア＝１００までの範囲である。ＣＦＳの診断は除外の一つのままである。
蓄積する多くの証拠から、ＣＦＳがマイトジェン応答、ウィルスの再活性化、異常なサイトカイン産生、正常なキラー細胞機能の低下及び代謝中間産物の変化を含む、体液免疫及び細胞免疫両方の調節障害と関係があることが示唆される。ＣＦＳに認められる臨床的及び免疫学的異常は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依存性、インターフェロン誘導性経路、すなわち２’，５’−オリゴアデニレート（２−５Ａ）合成酵素／ＲＮａｓｅ Ｌ及びｐ６８キナーゼ（ＰＫＲ）抗ウィルス防御経路における欠陥を含むことが示唆された（スハドルニク（Suhadolnik）ら、Clin. Infect. Dis. １８：Ｓ９６−Ｓ１０４（１９９４）；スハドルニクら、In Vivo ８：５９９−６０４（１９９４））。２−５Ａ合成酵素／ＲＮａｓｅ Ｌ経路は哺乳類細胞の抗ウィルス防御メカニズムの一部である；この経路は細胞増殖及び分化にも或る役割を有する（レンギエル（Lengyel）、Ann. Review Biochem. ５１：２５１−２８２（１９８２）；セン（Sen）ら、Adv. Vuirus Res. ４２：５７−１０２（１９９３））。
ｄｓＲＮＡによって活性化されるとき、２−５Ａ合成酵素はＡＴＰを、５’末端にリン酸基を有する２’，５’−結合オリゴアデニレートに変換する。生物学的活性２−５Ａは潜在性エンドリボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｌ、に結合及び活性化し、これは一本鎖のウィルス及び細胞のＲＮＡを主としてＵｐＮｐ配列の後で加水分解し、それによってタンパク質合成を阻害する。
ＣＦＳにおける２−５Ａ合成酵素／ＲＮａｓｅ Ｌ経路に関するこれまでの研究は、次のような統計的に顕著な調節異常、すなわち、２−５Ａ合成酵素は圧倒的にその活性型で存在し、生物活性２−５Ａレベルは上昇し、ＲＮａｓｅ Ｌ活性は上げ調節されることを明らかにした（スハドルニクら、Clin. Infect. Dis.同上；スハドルニクら、In Vivo、同上）。セリン−トレオニンキナーゼ、ＰＫＲの発現は、ＣＦＳでは下げ調節される（スハドルニクら、In Vivo、同上）。ＰＫＲはｅＩＦ−２のリン酸化によってタンパク質翻訳の開始を調節する。
これらの努力にもかかわらず、ＣＦＳの明確な分子マーカーは確認されていない。必要とされるのは、決定的なＣＦＳ診断の基礎となり得る明瞭なＣＦＳ分子マーカーによる生化学的試験法である。
略語
本明細書には次のような略語が用いられる：
ＡＭＰ：アデノシン５’−一リン酸；
２−アジド−ＡＭＰ：２−アジドアデノシン５’−一リン酸；
８−アジド−ＡＭＰ：８−アジドアデノシン５’−一リン酸；
２，８−アジド−ＡＭＰ：２，８−ジアジドアデノシン５’−一リン酸；
２−５Ａ：２’，５’−オリゴアデニレート、すなわち（２’→５’）−ホスホジエステル結合を有するアデニル酸と、５’−三リン酸とのオリゴマー；
ＣＦＳ：慢性疲労症候群（chronic fatigue syndrome）；
ｄｓＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ；
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay）；
ｅｔｈｅｎｏ−ＡＭＰ：Ｎ1Ｎ6−エテノアデノシン５’−一リン酸；
ＧＳＴ：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジンエタンスルホン酸；
ＰＢＭＣ：末梢血液単核細胞；
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩液；
ｐ3Ａ3：（２’→５’）ホスホジエステル結合を有するアデニル酸と５’−三リン酸との三量体；
ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）：５’−Ｏ−ホスホリル−アデニリル−（２’→５’）−アデニリル−（２’→５’）−８−アジドアデノシン；
ｐｏｌｙ（Ｕ）−３’−ｐＣｐ：３’末端に結合したシトシン残基を有するポリウリジル酸；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；
発明の概要
慢性疲労症候群を検出する方法は、患者サンプルを、約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌの存在について分析することを含む。
一実施例によると、その方法は、（ａ）患者サンプル中のタンパク質を非変性条件下で分子量によって分画化し、（ｂ）分画化したタンパク質を、約３０ｋＤａのタンパク質がＲＮａｓｅ Ｌ活性を有することについて分析することを含む。ＲＮａｓｅ Ｌ活性の分析は、例えば２８Ｓ及び／又は１８ＳＲＮＡの加水分解による特異的開裂生成物（ＳＣＰ）の形成を検出すること、又はｐｏｌｙ（Ｕ）−３’−ｐＣｐの加水分解を検出することを含む。
他の実施例によると、本発明は：
（ａ）付加プロテアーゼインヒビターの存在下で調製した患者サンプルと、検出可能な標識を担持する構造式（Ｉ）に従う化合物を含むプローブとを、前記標識化されたプローブ化合物とサンプル中の２’，５’−オリゴアデニレート結合タンパク質との共有結合物を形成するのに十分な条件下で接触させ：
0003686423.tif 000002
上記式中、
ｍは０から３までの整数、
ｎは１から３までの整数、及び
各Ｒ1及び各Ｒ2は、互いに他のＲ1及びＲ2とは独立して、水素又はＮ3であり、少なくとも１つのＲ1又はＲ2がＮ3であることを条件とし、
或は前記化合物の水溶性塩である；
（ｂ）前記共有結合物を含むサンプルと、サンプル中のＲＮａｓｅ Ｌ種に結合する抗体とを接触させ；
（ｃ）前記サンプル中のタンパク質をゲル電気泳動で分離し；そして
（ｄ）前記分離したタンパク質を、
（ｉ）標識化されたプローブ化合物と共有結合物を形成し；及び
（ｉｉ）前記抗体によって結合された
マーカータンパク質について調べ、；
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量約３７ｋＤａのマーカータンパク質の存在が、慢性疲労症候群の徴候を示す、
ことを含んで成る、慢性疲労症候群を検出する方法を含む。
更に他の実施例によると、本発明は、：
（ａ）患者サンプルと、検出可能な標識を担持する構造式（Ｉ）に従う化合物を含むプローブとを、前記標識化されたプローブとサンプル中の２’，５’−オリゴアデニレート結合タンパク質との共有結合物を形成するのに十分な条件下で接触させ；
0003686423.tif 000003
上記式中、
ｍは０から３までの整数、
ｎは１から３までの整数、及び
各Ｒ1及び各Ｒ2は、互いに他のＲ1及びＲ2とは独立して、水素又はＮ3であり、少なくとも１つのＲ1又はＲ2がＮ3であることを条件とし、
或は前記化合物の水溶性塩である；
（ｂ）前記共有結合物を含むサンプルと、サンプル中のＲＮａｓｅ Ｌ種に結合する抗体とを接触させ；
（ｃ）前記サンプル中のタンパク質類をゲル電気泳動によって分離し；そして
（ｄ）前記分離したタンパク質を、
（ｉ）標識化されたプローブ化合物と共有結合を形成し、及び
（ｉｉ）前記抗体によって結合された
マーカータンパク質について調べ；
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量約３７ｋＤａのマーカータンパク質の存在、及びドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量約８０ｋＤａのマーカータンパク質の非存在が、重度の慢性疲労症候群の徴候を示す、
ことを含んで成る、重度の慢性疲労症候群を検出する方法を含む。
本発明の更なる実施例によると、慢性疲労症候群の相対的重度を評価する方法が提供され、その方法は、自然条件下において患者サンプル中を、約３０ｋＤａ及び約８０ｋＤａの分子量を有するＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在について分析することを含む。約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在、及び約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の非存在は、重度の慢性疲労症候群を示す。両方の分子量のＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在は、比較的軽度の慢性疲労症候群を示す。この分析は（ａ）患者サンプル中のタンパク質類を非変性条件下で分子量によって分画化し；そして（ｂ）分画化したタンパク質を、約３０ｋＤａ及び約８０ｋＤａのタンパク質がＲＮａｓｅ Ｌ活性を有することについて分析することによって行うことができる。
図の説明
図１は、２−５Ａ光プローブ、［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）、と共にインキュベートし、ＵＶ照射し、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗体と共にインキュベートした末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物から集めたタンパク質Ａ−セファロース結合タンパク質の分画化（１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びオートラジオグラフィーを示す。Ｐ＝患者；Ｃ＝対照。レーン１、４−９：ＣＦＳ患者；レーン２、３：代表的健常者対照群。リボソームＲＮＡ開裂試験で測定したＲＮａｓｅ Ｌ活性：レーン１−９においてそれぞれ７９、５４、３７、７３、５９、２５３、１２７、＞５００及び２５３。
図２は、健常者（パネルＡ）及びＣＦＳ患者（パネルＢ及びＣ）からのＰＢＭＣ抽出物の自然（非変性）条件下における分析的ゲル透過ＨＰＬＣ分画化の結果を示す。分画化に先立って、抽出物を［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）で光標識化した。各ＰＢＭＣ抽出物から集めた分画群のアリコートをとり、シンチレーションスペクトロメトリーによって放射能を測定した。パネルＤ、Ｅ、及びＦはパネルＡ、Ｂ、及びＣと同じ健常者（パネルＤ）、及びＣＦＳ患者（パネルＥ及びＦ）からのＰＢＭＣ抽出物の分析的ゲル透過ＨＰＬＣ分画化の結果を示し、この場合はその後に自然（非変性）条件下で分画群のＲＮａｓｅ Ｌ活性を分析した。各分画のアリコートをｐ3Ａ3並びにポリ（Ｕ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐの存在下で分析した。２−５Ａ結合、又は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性は分画０−１５０では検出されなかった。分子量マーカーは矢印で示される。健常者対照群のＰＢＭＣ抽出物（パネルＡ及びＤ）は図１、レーン２にも記載されている。図２、パネルＢ及びＥのＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物は図１、レーン１にも示されている。図２、パネルＤ及びＦのＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物は図１、レーン８にも示されている。
図３は、プロテアーゼインヒビターの存在（＋）又は非存在（−）下で調製し、２−５Ａ光プローブ、［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）で光アフィニティ標識化し、組換えヒト８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗体で免疫沈降した、ＰＢＭＣ抽出物（１００μｇのタンパク質）から集めたタンパク質の分画化（１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。光アフィニティ標識化された、免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、リンイメージング（phosphorimaging）によって定量した。２−５Ａ結合タンパク質の分子量を示している。レーン１、２：ＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物；レーン３、４：健常者対照群のＰＢＭＣ抽出物。
発明の詳細な説明
生物学的活性２−５Ａは潜在性エンドリボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ Ｌ、に結合し、これを活性化する。活性化されたＲＮａｓｅ Ｌは一本鎖のウィルス及び細胞ＲＮＡを加水分解し、それによってタンパク質合成を阻害する。健常者からの細胞抽出物は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を有する約８０ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質を含むことが確認された。それら抽出物は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を有する４２ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質も含み得る。一方、ＣＦＳ患者は、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を有する独特な３０ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質を有することが証明されている。「ＲＮａｓｅ Ｌ活性」とは、ＲＮａｓｅ ＬのＲＮＡ基質の加水分解におけるＲＮａｓｅ Ｌの酵素活性を意味する。
一群の被験ＣＦＳ患者のＰＢＭＣは、分子量約８０ｋＤａ及び約３０ｋＤａにおいて、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性を有する２−５Ａ結合タンパク質を含んでいた。患者の細胞抽出物の調製時に付加プロテアーゼインヒビターが存在しない場合は、約４２ｋＤａの分子量においても２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を有する２−５Ａ結合タンパク質が認められた。約８０ｋＤａ種の存在は比較的重くないＣＦＳと一致した。他の一群のＣＦＳ患者のＰＢＭＣは約３０ｋＤａにおいてのみ、２−５Ａ結合活性及び２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性を有した。このプロフィールはより重症のＣＦＳと一致した。疾患状態の重度とは関係なく、ＣＦＳ患者は約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ種の存在によって確認することができ、これはＣＦＳを患わない者には常に存在しない。特異的な、これまでに知られていない約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ種の自然（native）条件下での検出は、初めてＣＦＳの正確かつ絶対的な生化学テストを可能とする。同様に、自然でない（non-native）条件下での、約３７ｋＤａ種の検出はＣＦＳと関連する。
本発明によると、ＣＦＳ疾患と考えられる個体からサンプルを採取し、約３０ｋＤａの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌの存在を分析する。サンプルは適切なＲＮａｓｅ Ｌ含有細胞のいずれから取ってもよい。血液、或は、血清又は血漿等の血液の分画も用いることができる。ＲＮａｓｅ Ｌは単核細胞に相当な濃度で存在する。従って、サンプルのための好ましい細胞源はＰＢＭＣを含む。サンプルは、遠心分離によって細胞を集め、細胞を破壊し、細胞残屑を除去し、無細胞抽出物を得ることで調製し得る。次に、その抽出物中の約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌの存在について試験する。
本発明の実施例によると、ＰＢＭＣをヘパリン化血液から、フィコール−ハイペイク（Ficoll-Hypaque）密度勾配遠心分離によって分離し、スハドルニクらの方法（Biochemistry ２２：４１５３−４１５８（１９８３））によって細胞質抽出物を調製する。ＲＮａｓｅ Ｌ活性のロスを避けるために、細胞質抽出物の調製は血液採取の約２時間以内に始めるべきである。手短に、ヘパリン化全血をＰＢＳで１：１に希釈する。希釈した血液の２容量を密度１．０８０のフィコール−ハイペイク（ボイム（Boyum）、Scand. J. Clin. Lab. Invest. ９７：１−１０９（１９６８））１容量上に重ね、２０℃で３０分間、１０００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣ層を除去し、５容量のＰＢＳで１回洗浄する。分離したＰＢＭＣを５ｍＬの赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、５分間氷上に保持し、ＰＢＳで２回洗浄した。分離したＰＢＭＣを０．５％ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０を含む緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭジチオトレイトール）の０．１又は０．２ｍｌ（細胞体積の約１０倍量）に再懸濁し、氷上に１０分間保持し、細胞を溶解する。細胞質抽出物は２５℃、８０００ｇで６分間遠心分離することによって得られる。無細胞抽出物は２５μｌ又は５０μｌアリコート毎に−７０℃で無期限に保存できる。
プロテアーゼインヒビターは例えばミニ−コンプリート（Mini-Complete）（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル錠（ベーリンガー/マンハイム）等を、製造者の指示書に従って任意に細胞質抽出物に加えることができる。ミニ−コンプリート（商標）インヒビターは、アプロチニン、ロイペプチン、ペファブロック（商標）ＳＣ及びＥＤＴＡを含む。診断試験用細胞抽出物の調製に関連してここに用いられる表現「付加プロテアーゼインヒビター」は、細胞抽出物に天然に生ずるプロテアーゼインヒビター以外に、外から加えられるプロテアーゼインヒビターを意味する。抽出物が「付加プロテアーゼインヒビターの存在下で調製される」という場合、抽出物中に存在するプロテアーゼ活性を実質上完全に阻害するのに十分なプロテアーゼインヒビターの量を意味する。
次に、無細胞抽出物について、約３０ｋＤａのＣＦＳ患者のＲＮａｓｅ Ｌの存在を分析する。種々のＲＮａｓｅ Ｌ型の分子量に関する「約」とは、分子が、記載されている分子量を±１ｋＤａの範囲内で有することを意味する。細胞抽出物を、自然の、非変性条件下で分子量によって分画化する。次に、約３０ｋＤａの分画について、分画中のＲＮａｓｅ Ｌに結合し、それを活性化できる２−５Ａ、又はその類似体の存在下で、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を分析する。「自然（native）条件」とは、サンプル中のＲＮａｓｅ Ｌ種活性を実質上保存するプロセスによって分画化することを意味する。本質的には、自然条件とは、タンパク質を変性しない条件であり、最も限定的には、酵素類を変性しない条件である。タンパク質を分子量によって分画化するための非変性条件は、当業者には周知である。タンパク質の分子量による非変性分画化は、ゲル濾過高性能液体クロマトグラフィーによって最も好適に実施される。この目的のためのカラムクロマトグラフィー材料の一つは、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー（ピスカタウェイ、ＮＪ）から供給されるスーパーデックス（ＳＵＰＥＲＤＥＸ）２００である。この材料は分子量１５ｋＤａから２００ｋＤａの範囲のタンパク質を効果的に分画化する。
約３０ｋＤａの分子量分画の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性は多数の異なるＲＮａｓｅ Ｌ分析によって測定することができる。ＲＮａｓｅ Ｌ活性の分析は、コア−セルロースアッセイの形をとってもよい（シルバーマン（Silverman）ら、Anal. Biochem. １４４：４５０−４６０（１９８５）、参考としてここに引用して援用する）。それは２−５Ａ結合分子を２−５Ａコア−セルロース上に固定し、部分的に精製し、サンプル中のＲＮａｓｅ Ｌ活性を、ｐｏｌｙ（Ｕ）［32Ｐ］ｐＣｐから酸可溶性フラグメントへの変換によって測定することを含む。
或は、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性をリボソームＲＮＡ開裂分析及び、高度に特異的な特異的開裂生成物（ＳＣＰｓ）によって検出してもよい（スハドルニクら、Clin. Infect. Dis.、同上、参考としてここに引用して援用する）。従って、サンプルをＬ９２９細胞（無損傷の２８Ｓ及び１８ＳのリボソームＲＮＡ源）のＲＮａｓｅ Ｌ欠乏サブクローンの細胞質抽出物（１分析（アッセイ）につきタンパク質１４０μｇ）と共に３０℃で６０分間インキュベートする。総ＲＮＡを抽出し、変性し、１．８％アガロースゲル上で電気泳動によって分析する。臭化エチジウム染色後、ＲＮＡバンドを紫外線光によって可視化する。ＲＮａｓｅ Ｌ活性によるＳＣＰｓ形成は、ゲル写真の濃度計追跡（デンシトメトリックトレーシング）によって定量し、インキュベーション時間の最後に残存する基質（２８Ｓ及び１８ＳのｒＲＮＡ）に対する反応生成物（ＳＣＰｓ）の比として表される。ＳＣＰｓの議論のために、レシュナー（Wreschner）らのNature ２８９：４１４−４１７（１９８１）を参照。この全開示は参考としてここに引用して援用する。
更に他の方法によると、約３０ｋＤａの分子量分画の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を、放射標識化された基質などの適切に標識化されたＲＮａｓｅ Ｌ基質の加水分解を分析することによって測定してもよい。例えば、タンパク質分画中のＲＮａｓｅ Ｌ活性を、その分画をｐ3Ａ3の存在下で基質ｐｏｌｙ（Ｕ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐと接触させ、その後シンチレーションスペクトロメトリーによって放射能を分析するという測定で決定してもよい。
約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌの検出に加えて、正常な個体の細胞に存在する約８０ｋＤａ種の存在の分析に同じ方法を利用することができる。約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の存在及び約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の非存在は、その患者が重い、又は進行したＣＦＳに患っていることを示す。患者サンプル中に両方の分子量のＲＮａｓｅ Ｌ分子が存在することは、比較的軽い又は比較的進行していないＣＦＳに患っていることを示す。細胞抽出物が３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌのみを含み、８０ｋＤａの２−５Ａ分子を含んでいない、ＣＦＳにより重度に非機能である患者は、一般に、カルノフスキー動作スコア（ＫＰＳ）が６０以下であることを特徴とする。これらの患者では健常者対照群及び比較的軽度のＣＦＳ患者に認められる約４２ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ種も欠如している。細胞抽出物が約３０ｋＤａ及び約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ種の両方を含むＣＦＳ患者は一般にＫＰＳが６０であることを特徴とする。
分子量による分画化の別法として、患者サンプルのタンパク質を、硫酸アンモニウム等の塩類、及びアセトン又はブチルアルコール等の溶媒を用い、その後のジエチルアミノエチル−セルロースクロマトグラフィーを行う伝統的な方法によって部分的に精製してもよい。この方法は電荷に基づくタンパク質分離をおこす。ＲＮａｓｅ Ｌの３０ｋＤａ及び８０ｋＤａ型は総電荷の差に基づいて、この方法によって分離できる。
重度ＣＦＳ患者を確認するために用い得る、本発明の他の実施例によると、細胞抽出物を２−５Ａアジド類似体を含む光プローブで光アフィニティ標識化し、その後、ＲＮａｓｅ Ｌ抗体で免疫沈降し、分子量分画化を行う。この方法は、２−５Ａ結合、ＲＮａｓｅ Ｌ免疫応答性タンパク質を特異的に確認し、ＲＮａｓｅ Ｌ抗体とは免疫応答するが、２−５Ａ結合タンパク質ではないタンパク質類を除外する。この方法は、その抗体と免疫応答しない２−５Ａ結合タンパク質も除外する。
付加プロテアーゼインヒビターの非存在下で調製された健常者の細胞抽出物の光標識化／免疫沈降／分画化、及び比較的軽度の症状のＣＦＳ患者の細胞抽出物の光標識化／免疫沈降／分画化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて概算分子量８０ｋＤａ及び３７ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質を検出する。付加プロテアーゼインヒビターの非存在下で、約４２ｋＤａの概算分子量を有する２−５Ａ結合タンパク質も検出される。重度ＣＦＳ症状の患者では、この方法は約３７ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質を検出する。約８０ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質は認められない。約４２ｋＤａのタンパク質は、付加プロテアーゼインヒビター非存在下でもやはり認められない。健常者の細胞抽出物を付加プロテアーゼインヒビターの存在下で調製する場合、細胞抽出物の光標識化／免疫沈降／分画化で約３７ｋＤａ及び約４２ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質は認められない。
従って、光標識化／免疫沈降／分画化方法は、約８０ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質の非存在を検出し、それによって重度ＣＦＳ患者を確認することに利用することができる。ここで、付加プロテアーゼインヒビター非存在下で細胞抽出物を調製した場合には、健常者と比較的軽度ＣＦＳ症状のＣＦＳ患者とを区別するのに、この分析を用いることはできないことを念頭に置く。細胞抽出物を健常者から付加プロテアーゼインヒビターの存在下で調製する場合は、約３７ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質は認められない。一方、プロテアーゼインヒビターの存在下で調製したＣＦＳ患者の抽出物には３７ｋＤａの分子が認められる。こうして、抽出物を付加プロテアーゼインヒビターの存在下で調製する場合には、光標識化／免疫沈降／分画化方法は、ＣＦＳと正常細胞抽出物とを区別することに利用することができる。
これまでの光標識化／免疫沈降／分画化方法は付加プロテアーゼインヒビターの非存在下で調製した健常者の細胞抽出物中の約３７ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質を検出することができるが、健常者において検出された分子は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を欠如していることを理解されたい。
光標識化／免疫沈降／分画化分析に用いる光プローブは、上記の構造式（Ｉ）に従って、２−５Ａ分子のアデニン残基の１つ以上の２−又は８−水素のどちらか又は両方がアジド基によって置換されている、２−５Ａの類似体（アナログ）を含む。細胞抽出物中の２−５Ａ結合タンパク質の光標識化は、抽出物と標識化された光プローブ（例えば放射標識化された）とを、光プローブと２−５Ａ結合タンパク質との共有結合物を十分形成する条件下で接触させることを含む。一般に、これは抽出物と光プローブとの混合物の低強度紫外光下におけるインキュベーションによって達成される。光プローブとして使用するための２−５Ａアジド類似体の調製は、米国特許第４，９９０，４９８号（酵素合成）及びチャルバラ（Charubala）ら、Helv. Chim. Acta. ７２：１３５４−１３６１（１９８９）（化学合成）に記載されている。両文書の全開示は参考としてここに引用して援用する。２−５Ａアジド類似体は効果的にＲＮａｓｅ Ｌに結合し、これを活性化する。感光性アジド基のために、２−５Ａアジド類似体は低強度紫外光にさらすと容易に反応性ニトレンラジカル（nitrene radical）中間体（Ｃ−Ｎ）を形成する。ニトレンラジカル中間体は生物学的分子と反応し、生物学的分子を共有結合的に光標識化する。ＲＮａｓｅ Ｌに結合後の２−５Ａアジド類似体のその場（in situ）光活性化はＲＮａｓｅ Ｌ活性を妨害しない（米国特許第４，９９０，４９８号、図２を参照）。
構造式（Ｉ）に従う２−５Ａアジド類似体は、２−アジドアデニリル−（２’→５’）２−アジドアデニリル−（２’→５’）２−アジドアデノシンの場合のように、単一のアジド−ＡＭＰ種（例えば、２−アジド−ＡＭＰ）のオリゴマー；２−アジドアデニリル−（２’→５’）８−アジドアデニリル−（２’→５’）２−アジドアデノシンの場合のように２−アジド−ＡＭＰ及び８−アジド−ＡＭＰ両方のオリゴマー；２−アジドアデニリル−（２’→５’）２−アジドアデニリル−（２’→５’）２−アジドアデノシンの場合のようにＡＭＰ及び２−アジド−ＡＭＰ或は８−アジド−ＡＭＰのオリゴマー；又はモノマーＡＭＰ、２−アジド−ＡＭＰ、８−アジド−ＡＭＰ又は２，８−アジド−ＡＭＰのいずれかのいかなる組み合わせから（但し、このようなモノマーの少なくとも１つはアジド−ＡＭＰ種であるという条件で）生成するオリゴマーを含むことができる。
本発明の実施に用いる構造式（Ｉ）の２−５Ａアジド類似体は、好ましくは三量体（ｎ＝１）である。５’−リン酸化の好適程度は一リン酸化である（ｍ＝１）。特に好ましいのは１つ以上の８−アジドアデニリル残基、特に２’−末端ヌクレオチドが８−アジドアデノシンである２−５Ａアジド類似体を含むオリゴマー、例えば５’−Ｏ−ホスフォリル−アデニリル−（２’→５’）−アデニリル−（２’→５’）−８−アジドアデノシンである。
２−５Ａアジド類似体は、その確認を可能にする検出可能標識を担持するのが好ましい。例えば、その標識は32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ又は15Ｎ等の放射標識を含む。32Ｐは最も強いβ−粒子放出体であり、従って好ましい。或は、標識は、強く蛍光を発するエテノ基を１つ以上含んでもよい。１つ以上のアデニン核の炭素−６にあるアミノ基をエテノ基に変換し、Ｎ1Ｎ6−エテノアデニンを形成することができるし、又は少なくとも１つのモノマーがエテノ−ＡＭＰを含む場合、蛍光オリゴマーを新たに（de novo）エテノ−ＡＭＰから、又はエテノ−ＡＭＰ、アジドＡＭＰモノマー及びＡＭＰモノマー類の組み合わせから合成してもよい。スハドルニクら、J. Biol. Chem. ２５２：４１２５−４１３３（１９７７）を参照。この全開示は参考としてここに引用して援用する。生物学的分子の検出のための他の標識が当業者に知られている。
２−５Ａアジド類似体で光標識化した後、細胞抽出物をＲＮａｓｅ Ｌポリクローナル抗体と結合させる。免疫沈降段階のための抗体は、ヒト組換え８０ｋＤａに対するポリクローナル抗血清を含むことができ、その抗血清は約３０ｋＤａのＣＦＳのＲＮａｓｅ Ｌを認識することもできる。組換えヒト８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌは公知の全長ｃＤＮＡから、標準的組換え技術によって発現させることができる（ゾウ（Zhou）ら、Cell ７２：７５３−７６５（１９９３）、これは参考としてここに引用して援用する；遺伝子バンク配列、アクセッションナンバー（受け入れナンバー）Ｌ１０３８１、参考としてここに引用して援用する）。組換えヒト８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗血清は、動物を組換えタンパク質で免疫し、公知の技術によって抗血清を取得する。
ＲＮａｓｅ Ｌ抗体は、無損傷の抗体、又は抗原と結合できるその断片（フラグメント）、限定されるものではないが例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントなどを含み得る。従って、ここに用いる用語「抗体」は無損傷の抗体分子、及び抗原結合能力を保有するそのフラグメントを含む。ＲＮａｓｅ Ｌ抗体によって形成される抗原−抗体複合体の確認を補助するために標識化された二次抗体を任意に用いることができる。その二次抗体はＲＮａｓｅ Ｌに、又は一次ＲＮａｓｅ Ｌ抗体に結合できる。標識化された二次抗体は、一次ＲＮａｓｅ Ｌ抗体がウサギ抗体である場合は例えばヒツジ−、ヤギ−、又はマウス抗ウサギＩｇＧを含み得る。
二次抗体上の標識は物理的又は化学的手段によって検出される。このような標識は放射標識；蛍光、紫外線吸収又は光吸収標識等の発色団標識；及び酵素標識を含む。例えば、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ及び14Ｃ等の適した放射性同位体を標識として用いることができる。ＥＬＩＳＡにおいては標識はアルカリホスファターゼ等の酵素であり、これは、色源基質（chromogenic substrate）を開裂して発色団開裂産物を放出する。アルカリホスファターゼの場合、基質は例えばフェノールフタレイン一リン酸又はｐ−ニトロフェニルホスフェートを含む。
免疫沈降後、抽出物中で形成された、抗体、光プローブ及び２−５Ａ結合タンパク質を含む複合体を、タンパク質Ａ−樹脂（Protein A-resin）（例えばタンパク質−Ａアガロース）に吸着し、洗浄し、そしてタンパク質類を樹脂から溶出することで精製する。溶出したタンパク質混合物をゲル電気泳動によて分画化し、光プローブ又は抗体に担持されている標識の検出によって、光標識化／免疫沈降した２−５Ａ結合タンパク質を可視化する。標識化されたバンドの分子量を既知の分子量標準と比較して決定する。
本発明の実施は下記の非限定的な例によって説明される。非変性条件下で試験した全てのＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物は、約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌの存在によって特徴づけられ、全健常者対照群はこの低分子量のＲＮａｓｅ Ｌを欠如していた。つまり、約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ ＬはＣＦＳ症状の分子マーカーである。ここに示したデータは、約３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌマーカーの存在によって特徴づけられるのに加えて、ＣＦＳの最も重度の例が、約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ種の非存在によって特徴づけられることも示す。比較的軽度の症状を示すＣＦＳ患者は約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ種ならびに３０ｋＤａ種も保有する。つまり、得られたデータに基づくと、８０ｋＤａ及び３０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌ分子の発生パターンはＣＦＳの臨床像の重度と相関関係にある。
同様な結果が、２−５Ａ結合タンパク質の変性条件下におけるアジド−光標識化、免疫沈降、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画化で達成された。見かけ分子量約３７ｋＤａにて２−５Ａ結合タンパク質を検出し、８０ｋＤａでは検出しないことは、重度のＣＦＳに一致し、一方、両方のバンドの存在は、比較的軽度のＣＦＳ症状に相当する。
例１
変性条件下におけるアジド光アフィニティ標識化及び免疫沈降によるＣＦＳマーカー分子の確認
Ａ．研究の被験者及び対照
研究の被験者は、１９８８年の疾患管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention：ＣＤＣ）ガイドライン（ホルムス（Holmes）ら、Ann. Intern. Med. １０８：３８７−３８９（１９８８））に沿って、これまでにＣＦＳ診断基準を満たすと診断された患者と、健常者対照群である。患者及び対照群はネバダ及びノースカロライナの診療所から選択された。患者及び対照群の選択の基準及び研究開始時の臨床的変数はスハドルニクらによって記載されたものである（スハドルニクら、Clin. Infect. Dis. １８：Ｓ９６−Ｓ１０４（１９９４））。血液サンプリング時に、選択した症状を自己評価症状チェックリストで評価した。疲労レベルをカルノフスキー動作スコア（ＫＰＳ）を用いて評価した（平均ＫＰＳ＝５６）。年齢及び性別が相当する１０名の対照被験者を募った。各ＣＦＳ患者及び健常者対照群の病歴を調べ、身体検査を行った。対照群の年齢分布はＣＦＳ患者の年齢分布から著しく異ならなかった（ＣＦＳ患者の平均年齢＝４６歳；対照群の平均年齢＝４１．７歳）。対照群全員に面接したところ、特に慢性疲労又はその他の顕著な症状を否定した。又、身体検査の結果は正常であった。研究は地方の倫理委員会（Institutional Review Boards）の承認を受けた。インフォームドコンセントを各患者及び対照群から得た。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をヘパリン化血液（５０ｍｌ）からフィコール−ハイペイク密度勾配遠心分離によって分離し、細胞質抽出物はスハドルニクらが以前に報告したように（Biochemistry ２２：４１５３−４１５８（１９８３））調製した。この全開示はここに参考として引用して援用する。細胞質抽出物をプロテアーゼインヒビターを添加せずに調製した。
Ｂ．組換えヒトＲＮａｓｅ Ｌポリクローナル抗体の産生
全長ヒトＲＮａｓｅ Ｌ ｃＤＮＡは、ゾウらのCell ７２：７５３−７６５（１９９３）に記載され（その全開示は参考としてここに引用して援用する）、遺伝子バンクアクセッションナンバーＬ１０３８１として含まれる（これも参考としてここに引用して援用する）。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質法を用いて、ＲＮａｓｅ Ｌポリクローナル抗体の産生に必要な、精製した組換えヒト８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌを得た。ＧＳＴ−ＲＮａｓｅ Ｌ融合タンパク質は、ソボル（Sobol）ら、J. Biol. Chem. ２７０：５９６３−５９７８（１９９５）に記載の方法に従って大腸菌（E. coli）における発現によって得た（この全開示は参考としてここに引用して援用する）。組換えヒト８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗体は、ニュージーランド白ウサギにおいて、高度に精製した組換えヒトＧＳＴ−ＲＮａｓｅ Ｌ融合タンパク質で免疫することによって得た。免疫前の血清を用意し、対照（免疫前血清）として確保した。最初の接種は１日目に、等量の完全フロインドアジュバントと混合した１００μｇのＧＳＴ−ＲＮａｓｅ Ｌで行われた。１４、２１、４９及び８４日目に、不完全フロインドアジュバントと混合した５０μｇのＧＳＴ−ＲＮａｓｅ Ｌ（５０％自然及び５０％熱変性タンパク質）で追加免疫した。抗体産生のための血液サンプルを、追加免疫後に、１２０、１５０及び１８０日後に採取した。ＧＳＴ−ＲＮａｓｅ Ｌ融合タンパク質を、ヒトトロンビンで加水分解した後、ＲＮａｓｅ Ｌを製造者の仕様書に従ってグルタルアルデヒド活性化カートリッジ（ワットマン）に共有結合させた。水素化ホウ素ナトリウムをカラムをとおして循環させ、ＲＮａｓｅ Ｌに結合していないグルタルアルデヒドを還元した。ＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清をグルタルアルデヒドカラムをとおして室温で１時間循環させ、製造者の仕様書に従って溶出した。ＲＮａｓｅ Ｌポリクローナル抗体は、ソボルら（同上）の記載したように、ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）抽出物、及び大腸菌（E. coli）発現組換えＧＳＴ−ＲＮａｓｅ Ｌ融合タンパク質を用いて、ウェスタンブロッティングにより特徴づけた。
Ｃ．変性条件下におけるＰＢＭＣ抽出物中の２−５Ａ結合タンパク質のアジド光アフィニティ標識化及び免疫沈降
２−５Ａアジド光プローブ、ＡｐＡｐ（８−アジドＡ）の化学合成、［γ−32Ｐ］ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを用いる５’−一リン酸化による［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）の生成、及びＰＢＭＣ抽出物中の２−５Ａ結合タンパク質の光標識化は、チャルバラ（Charubala）ら、Helv. Chim. Acta. ７２：１３５４−１３６１（１９８９）の記載と同様とした。この全開示は参考としてここに引用して援用する。２−５Ａ結合タンパク質の光標識化は、付加プロテアーゼインヒビターの非存在下で調製したＰＢＭＣ抽出物（１００μｇのタンパク質）を２−５Ａ光プローブ［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）（６０μＣｉ／ｎｍｏｌｅ、５μＣｉ）と共にインキュベーション（３０分間、４℃）した後、ＵＶ照射（８０００ワット／ｃｍ2、３０秒、０℃）することにより達成した。光標識化混合物をアフィニティ精製ＲＮａｓｅ Ｌポリクローナル抗体（２４μｇのタンパク質）、タンパク質Ａ−セファロース（３０μｌ）及び１００μｌのリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）と合一し、混合物を４℃で１時間回転させた。ＰＢＳで３回洗浄後、樹脂を４０μｌのタンパク質溶解化溶液と混合し、５分間沸騰させ、遠心分離した（１０，６００×ｇ、５分、室温）。上澄液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化した。アジド−光標識化／免疫沈降された２−５Ａ結合タンパク質を乾燥ゲルのオートラジオグラフィーによって可視化した。合一したアジド光標識化／免疫沈降方法は、ＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗体とは免疫応答するが２−５Ａ結合タンパク質とは免疫応答しないタンパク質は除去し、ＲＮａｓｅ Ｌに対するポリクローナル抗体に免疫応答しない２−５Ａ結合タンパク質も除去する。
Ｄ．結果
この実験の変性条件下では、分子量８０ｋＤａ、４２ｋＤａ及び３７ｋＤａを有する３種類の２−５Ａ結合タンパク質が健常者対照群のＰＢＭＣに（図１、レーン２、３）、及びＣＦＳ患者のＰＢＭＣの一群に（図１、レーン１、４、５）に認められた。しかし、光アフィニティ標識化／免疫沈降は、ＣＦＳ患者のＰＢＭＣの第二の群には推定分子量３７ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質一つのみが認められ、８０ｋＤａ又は４２ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質は認められなかった（図１、レーン６、７、８、９）。レーン１、４、５によって表わされる患者は比較的軽度のＣＦＳ症状が特徴であった。レーン６、７、８、９によって表わされる患者はより重度のＣＦＳ症状が特徴であった。つまり、研究結果は本研究では患者のＣＦＳ症状の重度と相関する。
約３７ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質は、ＰＢＭＣ抽出物調製及び処理中に、約８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌのプロテアーゼ仲介減成からは生じない。リンイメイジャー分析（phosphorimager analysis）による定量は、ＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物中の３７ｋＤａにおいて認められるタンパク質バンドはプロテアーゼインヒビターの存在下でも非存在下でも等しい強度であることを証明し、約３７ｋＤａのタンパク質が安定であることを示している。
例２
アジド光アフィニティ標識化によるＣＦＳマーカー分子の確認及び自然（非変性）条件下における２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性の分析
Ａ．自然条件における分析的ゲル透過ＨＰＬＣによる、ＰＢＭＣ抽出物中の２−５Ａ結合タンパク質の分子量の推定
ＣＦＳ患者又は健常者対照群からのＰＢＭＣ（２００μｇのタンパク質）の抽出物を、［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）（１０９μＣｉ／ｎｍｏｌ、１０μＣｉ）の存在下で４℃にて３０分間インキュベートし、紫外線照射し（８０００ワット／ｃｍ2、３０秒、０℃）、スーパーデックス２００（ハイロード１６／６０）ゲル濾過カラム（ファルマシアバイオテック  インコーポレイテッド）上にロードし、室温で、２５ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．４）、８０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び１４ｍＭ β−メルカプトエタノールで、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、０．５ｍｌ分画群を集めた。各分画中の２−５Ａ結合タンパク質（類）に共有結合した［32Ｐ］アジド２−５Ａ光プローブを、Tmアナリティクス（Analytics）６８９５型シンチレーションスペクトロメーターを用い、セレンコフ（Cerenkov）照射（50％効率）シンチレーションスペクトロメトリーによって定量した。スーパーデックス２００カラムはミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、炭酸脱水酵素、大豆トリプシンインヒビターで校正した（それぞれ２２０、１１６、９７．４、６８、４４、３１、及び２１．５ｋＤａ）。
Ｂ．自然条件下における分析的ゲル透過ＨＰＬＣによるＰＢＭＣ抽出物中の２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性
健常者対照群及びＣＦＳ患者からのＰＢＭＣ抽出物（２００μｇのタンパク質）を、前節に記載したように、自然条件下でスーパーデックス２００ゲル濾過カラム上で分画化した。各分画のアリコート（５−２０μｌ）中のＲＮａｓｅ Ｌ活性を、ｐ3Ａ3（１×１０-8Ｍから１×１０-7Ｍ）を含む反応混合物（１５−３０μｌ）中でポリ（Ｕ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐ（２０，０００ｄｐｍ）の加水分解によって測定した（ソボルら、同上）。非特異的ＲＮａｓｅ活性は、ｐ3Ａ3非存在下で、反応混合物（１５−３０μｌ）中のポリ（Ｃ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐ（１４，０００ｄｐｍ）の加水分解によって測定した。放射能測定はシンチバース（Scintiverse）Ｉ（フィッシャー）（＞９９％効率）を用いて達成した。
Ｃ．結果
自然条件下で分析した健常者対照群のＰＢＭＣ抽出物において、２−５Ａ結合及び２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性が８０ｋＤａ及び４２ｋＤａに認めらた（図２、パネルＡ及びＤ）。ＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物の一群において、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性を有する３種類の２−５Ａ結合タンパク質が認められた。この群においては、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性を有する２−５Ａ結合タンパク質は８０ｋＤａ、４２ｋＤａ及び３０ｋＤａ（図２、パネルＢ及びＥ）、又は８０ｋＤａ、４２ｋＤａ及び３０ｋＤａに認められた。ＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物の第二の群において（図１、レーン６、７、８、９に示される）、２−５Ａ結合又は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性は８０ｋＤａ又は４２ｋＤａには認められなかったが、しかし、２−５Ａ結合又は２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性は、３０ｋＤａに認められた（図２、パネルＣ及びＦ）。ＰＢＭＣ抽出物に認められる２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ酵素活性が非特異的ＲＮａｓｅ活性によるものではないことを示すために、ポリ（Ｃ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐを対照試験に用いた。いずれの分画にもポリ（Ｃ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐの加水分解は認められず、これは２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌが存在する付加的な証拠となる。［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）光プローブの特異性は、真正のｐ3Ａ3との競合実験によって確認された（データは示さず）。更に、ポリ（Ｕ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐの加水分解は、ＲＮａｓｅ Ｌのアロステリック活性化因子（アロステリックアクチベーター）である２−５Ａの存在しない場合は認められなかった。
変性条件下及び自然条件下で認められる分子量の差を説明する先行文献に基づくと、変性条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で３７ｋＤａに認められる２−５Ａ結合タンパク質は、自然条件下で認められる３０ｋＤａのタンパク質と合理的に一致する（ソマヴィル（Somerville）ら、J. Bacteriol. １１７：３８３７−３８４２（１９９５））。
例３
免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質のタンパク質加水分解に対する安定性
ＰＢＭＣ抽出物をプロテアーゼインヒビターの存在下及び非存在下で調製し、その抽出物の調製及び処理中に起こり得るタンパク質加水分解による減成の影響を評価した。プロテアーゼインヒビターの存在下における細胞質抽出物の調製は製造者の指示書に従った（ミニ−コンプリート（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル錠、ベーリンガー／マンハイム。アプロチニン、ロイペプチン、ペファブロク（商標）ＳＣ及びＥＤＴＡを含む）。（スハドルニクら、Clin. Infect. Dis.、同上。）アジド光プローブ、［32Ｐ］ｐＡｐＡｐ（８−アジドＡ）、をその２−５Ａ結合タンパク質に共有結合させ、更に組換えヒト８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌポリクローナル抗体による免疫沈降によって精製した。光アフィニティ標識化された、免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にリンイメージャー分析によって定量した。プロテアーゼインヒビターの存在下で調製したＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物は、８０ｋＤａの２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌに加えて、３７ｋＤａにおいて低分子量の免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質を含んでいた（図３、レーン１）。プロテアーゼインヒビターの非存在下で調製した同じＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物の光アフィニティ標識化及び免疫沈降は、８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌに加えて、３７ｋＤａ及び４２ｋＤａに免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質を表わした（図３、レーン２）。リンイメージャー分析による定量は、ＣＦＳ患者のＰＢＭＣ抽出物において、３７ｋＤａに認められるタンパク質バンドがプロテアーゼインヒビターの存在下でも非存在下でも等しい強度のものであることを示し、これは３７ｋＤａのタンパク質が安定であることを示す（図３、レーン１及び２）。プロテアーゼインヒビターの存在下で調製した健常者対照群のＰＢＭＣの抽出物中には、８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌのみが検出された（図３、レーン３）。プロテアーゼインヒビターの非存在下で調製された同じ抽出物中では、８０ｋＤａのＲＮａｓｅ Ｌが７０％減少した（図３、レーン３及び４を比較）。しかし、３７ｋＤａの免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質は、プロテアーゼインヒビターの存在下又は非存在下で調製した、この健常者対照群のＰＢＭＣ抽出物中に検出されなかった（図３、レーン３及び４）。試験した少数の健常者対照群のＰＢＭＣ抽出物では、免疫応答性２−５Ａ結合タンパク質が５０ｋＤａに認められたが、３７ｋＤａには認められなかった（図３、レーン４）。しかし、５０ｋＤａの２−５Ａ結合タンパク質は、ポリ（Ｕ）−３’−［32Ｐ］ｐＣｐの加水分解によって測定したとき、２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅ Ｌ活性を示さなかった（データは示さず）。
合成法、調製法及び分析法に関連して引用された参考文献は全て本明細書に参照して援用する。
本発明はその精神又は本質的特徴から逸脱することなく他の特殊な形で実施され得る、従って本発明の範囲を示すには、以上の説明よりも、添付の請求の範囲を参照すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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