(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の物質を生成しえる微生物を培地に培養し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造法において、微生物として、エッシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２５、エッシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２６およびエッシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２７から選ばれる微生物を所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換して得られる形質転換株を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
所望の物質が、酵素、生理活性ペプチド、アミノ酸、核酸関連物質、ビタミンまたは色素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
所望の物質が、ウリカーゼ、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ、13Leu-モチリン、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、スレオニン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ビオチンまたは色素である請求項１記載の方法。
【請求項４】
エッシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２５、エッシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２６およびエッシェリヒア・コリＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２７から選ばれる微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、所望の物質の効率的製造法を提供するものであり、詳しくはエッシェリヒア属に属し、酢酸耐性を有する微生物を宿主として用い、そこに所望の物質の生産に関与する遺伝情報を導入し、得られる形質転換株を培養することによる所望の物質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、大腸菌を用いて所望の物質を生産する場合には、生産物収量の向上はもとより、発酵槽の有効な運用や生産物の効率よい回収などの観点から、高密度で細胞を培養することは有効な手段である。しかし、大腸菌の場合、栄養物質の代謝に伴って酢酸を生成し、培養中に酢酸が著量蓄積するにつれて細胞の増殖が阻害されるため、高密度に培養することは困難であった。これを解決する手段としては、培養液を透析または濾過することにより培養系から酢酸を除去する透析培養法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１０３巻、３４５頁、１９７７年〕や濾過培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、３６巻、３３０頁、１９９０年〕が知られている。また、純酸素を用いて培養液中の溶存酸素を高濃度に維持することで、酢酸の生成を抑制しながら培養する方法〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、５３巻、２１１５頁、１９８９年〕や、培養液中のグルコース濃度を低濃度に保つことにより、酢酸の蓄積を抑制する方法〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、７４巻、１９６頁、１９９２年〕などが報告されている。しかしながら、これらの方法は、専用の装置を必要としたり、装置の維持や管理の複雑化の問題を伴い、工業的には有利とはいえない。
【０００３】
さらにフルオロ酢酸ナトリウムに対する耐性付与により、酢酸の生合成経路の酵素活性を低下または欠失させて酢酸の生成能を低減させる方法（公表特許公報平２−５０２０６５）も報告されているが、ピルビン酸や乳酸の蓄積が生じる〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、３８巻、１３１８頁、１９９１年〕等の問題がある。
【０００４】
酢酸耐性を有する微生物としては、アセトバクター属に属する微生物及びグルコノバクター属に属する微生物〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）  、１７２巻、２０９６頁、１９９０年〕が知られている。
しかしながら、エッシェリヒア属に属し、酢酸耐性を有する微生物及び該微生物を宿主微生物として用い、所望の物質を製造する方法については知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物を宿主微生物として、所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドを用い、形質転換することにより得られる形質転換株を用いて所望の物質の効率的な製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、所望の物質を生成しえる微生物を培地に培養し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造法において、微生物として、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物を所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換して得られる形質転換株を用いることを特徴とする方法および宿主微生物として有用なエッシェリヒア・コリに属し、酢酸に対する耐性を有する微生物を提供することができる。
【０００７】
本発明で宿主微生物として用いられる微生物としては、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物であればいずれでもよい。
耐性とは親株が生育できない濃度の酢酸の存在下で生育できる能力をいう。
本願明細書に記載の実施例においては親株が生育できない１５０ｍＭ  の酢酸存在下で生育できる変異株が例示されているが、親株よりも耐性を有する菌株であればいずれの菌株でも用いることができる。
【０００８】
このような微生物は所望の物質の生産に一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に対して、通常用いられる変異誘起処理を施した後、親株が生育できない濃度の酢酸を含有する適当な寒天平板培地上に塗布し、生育した変異株を取得し、得られた変異株を、酢酸を含有した適当な培養液で振盪培養し、細胞増殖量を測定し、親株と比較して生育の良好な菌株を、酢酸耐性株として選択することにより得られる。
【０００９】
より具体的には、まず所望の物質の生産に一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に通常の変異誘起処理、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、ＵＶ照射、γ線照射による変異処理などを行い、得られた細胞を緩衝液で適当に希釈し、親株が生育できない濃度（１５０ｍＭ）  の酢酸を含んだ適当な寒天平板培地上で培養し、生じたコロニーを変異株として分離する。
【００１０】
親株としては、所望の物質の生産に一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物であればいずれでもよく、とくに大腸菌が好ましい。例えば、具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ    ｃｏｌｉ）  ＭＭ２９４株、ＭＣ１０００株、ＭＣ１０６１株、ＬＥ３９２株、Ｗ３１１０株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＤＨ５α株［モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊ．サムブルック、Ｅ．Ｆ．フリッチ、Ｔ．マニアチス著、コールドスプリングハーバー出版社、１９８９年）、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョン（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ、Ｔ．Ｊ．シルハリー、Ｍ．Ｌ．バーマン、Ｌ．Ｗ．エンクイスト著、コールドスプリングハーバー出版社、１９８４年）］などがあげられる。
【００１１】
得られた変異株を適当な液体培地で培養し、親株より生育が良好でかつ培養後のｐＨの低下が少ない株を本発明の変異株として選択する。
このようにして得られる変異株の例として、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ）ＨＮ００２０株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）  ＨＮ００７４株および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）  ＨＮ０１２４株があげられる。これらの菌株はいずれもフルオロ酢酸に感受性を示す。該菌株は、平成５年９月２８日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ブダペスト条約に基づいて、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２５およびＦＥＲＭ  ＢＰ−４４２７としてそれぞれ寄託されている。
【００１２】
このような変異株は親株が酢酸を著量生成する培養条件下においても、酢酸の生成量が親株と比べて低減しており、またこの際、変異株の培養終了時における培養液のｐＨの低下が少ないことから、培養液中へのピルビン酸や乳酸の蓄積量も少ないものと考えられる。従って、これらの変異株を用いることにより特殊な培養装置の使用や複雑な培養管理技術を必要とせず、容易に細胞を高密度に培養できる。
【００１３】
上記のようにして得られる変異株を宿主微生物として用い、所望の物質の生産に関与する遺伝子をベクターに導入して構築される組換え体プラスミドを該宿主微生物に導入し、得られる形質転換株を培地に培養することにより所望の物質を生産することができる。
本発明における所望の物質の製造法は、所望の物質を生産する能力を有する微生物由来の該物質の生産に関与する遺伝子をクローニングし、構築された該遺伝子を保有する組換え体プラスミドを用いることにより、微生物によって生産されるいずれの物質の製造にも広く応用できる。具体的な物質としては、例えば、ウリカーゼ、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼなどの酵素、１３Ｌｅｕ−モチリン、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）  などの生理活性ペプチド、スレオニンなどのアミノ酸、フラビンアデニンジヌクレオチドなどの核酸関連物質、ビオチンなどのビタミン、カロチノイドなどの色素などがあげられる。
【００１４】
所望の物質を生産する能力を有する微生物の染色体からの該物質の生産に関与する遺伝子の単離は、常法、例えばカレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｕｎｒｏｌｏｇｙ）  、９６巻、１９８２年に記載の方法に従っておこなうことができる。
得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで組換え体プラスミドを構築する。ベクターとしてはエッシェリヒア属に属する微生物を宿主とすることが可能なベクターであればよい。
【００１５】
遺伝子のベクターへの組み込みは、常法に従って、たとえば染色体及びベクターを適当な制限酵素で切断し、遺伝子ＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ断片を調製したのち、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することによりおこなう。
具体的な組換え体プラスミドの例としては、ウリカーゼの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＵＴ１１８（ＥＰ−Ａ−５４５６８８）、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐｔｒｃＮＭＡＰＨ（特開平４−７１４８９）、１３Ｌｅｕ−モチリンの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＭＴＯＩ４（特開昭６３−７１１９５  ）、Ｇ−ＣＳＦの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＣｆＢＤ２８（特開昭６３−２６７２９２）、スレオニンの生合成遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＥｔｈｒ１（特開昭６０−３０６９３）などがあげられる。
【００１６】
得られた組換え体プラスミドの宿主微生物への導入は、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法によって行う。
得られる形質転換株としては、大腸菌（  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＨＮ００２１株、大腸菌ＨＮ００２７株、大腸菌ＨＮ００２８株、大腸菌ＨＮ００７５株、大腸菌ＨＮ０１２５株があげられる。
【００１７】
上記のようにして得られた形質転換株の培養は、以下のように行う。すなわち、該微生物を炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地において、好気的条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えばよい。
培地に用いる炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資化可能なものであればいずれでも使用できる。
【００１８】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸などのアミノ酸などが使用できる。
【００１９】
無機物としては、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。
用いる微生物が、アミノ酸、核酸、ビタミンなどの特定の栄養物質を生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添加する。
【００２０】
培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜４２℃で１〜４８時間行う。培地のｐＨはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中性付近に保つことが望ましい。
上記の方法により培養することにより生成した目的物質の定量は、下記のごとく行う。すなわち、培養終了後、培養液から大腸菌細胞を遠心分離などの方法で集め、適当な緩衝液に懸濁する。この懸濁液、またはこれより調製した無細胞抽出液をレムリら（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７巻、６８０頁、１９７０年）の方法に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液で染色し、目的物質の生産量を、クロマトスキャナーで測定することにより定量する。無細胞抽出液の調製は、超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、フレンチプレス処理などにより破砕することにより行う。また、目的物質がそれぞれの活性を有している場合には、無細胞抽出液中の物質の活性を測定することにより、その生産量を定量してもよい。
【００２１】
以下に本発明の実施例を示す。
【００２２】
【実施例】
実施例１．大腸菌ＭＭ２９４株からの酢酸耐性株の造成
大腸菌ＭＭ２９４株を、３０ｍｌのＬＢ培地（バクトトリプトン  １０ｇ／ｌ、バクトイーストエキストラクト  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ）を含む３００ｍｌ三角フラスコに植菌し、３７℃で３時間振盪培養して得られた対数増殖期の細胞を、トミー製冷却遠心機ＲＤ−２０ＩＶ（ローターＮｏ．４）を用いて４℃で１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して回収した。これを、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン  ０．５ｍｇ／ｍｌを含有するＴＭ緩衝液〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略）  ６．０５７ｇ／ｌ、マレイン酸  ５．８０４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４    １ｇ／ｌ、クエン酸ソーダ  ０．５ｇ／ｌ、ｐＨ６．０〕に懸濁し、３５℃で６０分間振盪して変異処理を行った。この細胞を集めて洗浄した後、無菌水で細胞数がおよそ１０５個／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液を、１．５％の寒天を含有するＭＣＧＡ培地〔グルコース  ５ｇ／ｌ、酢酸アンモニウム  １１．５６２ｇ／ｌ（１５０ｍＭ  酢酸）  、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １５．１４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４    ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／ｌ  、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２４ｇ／ｌ、カザミノ酸  ５ｇ／ｌ、ビタミンＢ１  ４μｇ／ｍｌ〕からなる平板培地上に０．１ｍｌずつ塗布し、３５℃で２日間培養し、出現したコロニーを変異株として単離した。取得した変異株を、１０ｍｌのＭＣＧＡ培地を含有した試験管（直径２４ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養して、培養終了後、分光光度計により各培養液について５５０ｎｍの波長で濁度（ＯＤ５５０）を測定した。その結果、親株であるＭＭ２９４株と比較して、生育が良好な変異株を選択した。
【００２３】
次に、この変異株を１０ｍｌのＭＣＧ培地（グルコース  １０ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １５．１４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２４ｇ／ｌ、カザミノ酸  ５ｇ／ｌ、ビタミンＢ１  ４μｇ／ｍｌ）  を含有する試験管（直径２４ｍｍ）  に植え、３０℃で２４時間振盪培養した。培養終了後、生育が良好で、培養液のｐＨの低下が少なかった菌株を選択し、大腸菌ＨＮ００２０株と命名した。
【００２４】
第１表に、親株であるＭＭ２９４株とＨＮ００２０株のＭＣＧＡ液体培地における生育能を比較した結果を示すが、ＨＮ００２０株は親株よりも良好な生育を示した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
ＨＮ００２０株を、種々の濃度の酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育を調べた。結果を第２表に示す。ＨＮ００２０株は、１５０ｍＭの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地でも生育を示し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
また、１０ｍｌのＭＣＧ培地を含有する試験管（直径２４ｍｍ）にＭＭ２９４株とＨＮ００２０株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。その後ＨＰＬＣを用い、蓄積した有機酸を調べたところ、酢酸以外には見いだせず、酢酸の蓄積量も親株に比較して低下していた。
酢酸の生成量を比較した結果を第３表に示すが、ＨＮ００２０株は、親株であるＭＭ２９４株と比較して良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減していた。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
実施例２．酢酸耐性株ＨＮ００２０株を用いたウリカーゼ生産
実施例１で取得した、ＨＮ００２０株にウリカーゼ発現用の組換えプラスミドｐＵＴ１１８（ＥＰ−Ａ−５４５６８８）を用いて形質転換した。ＨＮ００２０株のコンピテントセルは、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１６６巻、５５７頁、１９８３年に記載の方法に従って調製した。形質転換は、ｐＵＴ１１８を含む溶液１μｌと２１０μｌのコンピテントセルを混合し、氷上に３０分間静置後、４２℃で９０秒間熱処理をし、その後、氷中に２分間保った。これに８００μｌのＳＯＣ培地（２％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイーストエキストラクト、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ  グルコース）を加えて、３７℃で１時間振盪培養した後に、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地上に１００μｌずつ塗布した。これを３７℃で１晩培養することにより生じたコロニーを、形質転換体として取得した。これらの形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＵＴ１１８であることを確認して、この組換え型大腸菌をＨＮ００２１株と命名した。
（１）ＨＮ００２１株のフラスコ培養
ＨＮ００２１株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌ三角フラスコに植菌し、３３℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞を、３ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ８ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ０．２ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １．２５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４    ０．２ｇ／ｌ）に懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社、ＣＥＬＬ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ２００）にて細胞を破砕した。破砕液を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、回収した上清を、無細胞抽出液とした。
【００３１】
なお、本発明において、ウリカーゼの生産量は無細胞抽出液中のウリカーゼ活性として示した。
ウリカーゼ活性は、基質となる尿酸の紫外部吸収（２９３ｎｍ）の吸光度の減少量を測定し、これに基づいて算出した。具体的には、３ｍｌの反応液〔５０ｍＭ  ほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１２５μＭ  尿酸〕中に、ウリカーゼを含む０．１５μｇ／ｍｌの蛋白質濃度の無細胞抽出液を添加し、２５℃で３分間反応させた。本反応中の２９３ｎｍの吸光度の変化（ΔＯＤ）を測定し、次式によりウリカーゼの単位（Ｕ）を算出した。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌｅの尿酸を分解する酵素量を１Ｕとする。
【００３２】
【数１】
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【００３３】
その結果、第４表に示すように、ＭＭ２９４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主とした場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
（２）ＨＮ００２１株のジャーファーメンターを用いた培養
得られたＨＮ００２１株をジャーファーメンターを用いて培養する場合には、高密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、１７巻、２２７頁、１９７５年〕が好適であり、以下のように行った。なお、下記のいずれの培地においても、プラスミドを安定に組換え型大腸菌中に保持させるために、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。前培養として、ＨＮ００２１株を１％のグルコースを含有する１００ｍｌの培地Ａを含む１リットルの三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。
【００３６】
次に、５リットル容量の発酵槽に、１．８リットルの培地Ａを封入し、１２０℃で２０分間蒸煮滅菌した。その後、滅菌した１０％  グルコース、２．４％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４％  ビタミンＢ１を含む溶液１００ｍｌを発酵槽に添加した後、ＨＮ００２１株を培養した前記培養物を植菌した。
【００３７】
【表５】
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【００３８】
培養は１４％アンモニア水を用いてｐＨ６．８に調整しつつ、攪拌（５００ｒｐｍ）、通気（２リットル／ｍｉｎ）し、３３℃で２４時間行った。また、７０％グルコース溶液を連続的に発酵槽に添加することにより、培養液中のグルコース濃度がそれぞれ０．５％、１％、２％になるように保った。さらに、生育にともない、ＯＤ５５０が５０になった時に、培地Ｂを、１リットルの培地Ａに対して１００ｍｌの割合で添加した。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
なお、本発明において、培地中の酢酸の生成量は、細胞を遠心分離により除いた後、培養上清をガスクロマトグラフィー法（日立２３６−５０型、カラム；ＰＥＧ−６０００（ＳＵＰＰＯＲＴ：Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ）、カラム長；１ｍ、カラム温度；１７０℃、キャリアガス；ヘリウム、流量；６０ｍｌ／分、検出器；ＦＩＤ）により定量した。
【００４１】
第７表にそれぞれのグルコース濃度における、培養開始２４時間後の菌株の生育量、酢酸蓄積量およびウリカーゼ生産量の結果を示すが、親株であるＭＭ２９４株を宿主として用いた場合には、高濃度の酢酸の蓄積が認められるが、ＨＮ００２０株を宿主として用いたＨＮ００２１株の場合には、いずれの糖濃度での培養においても、親株と比較して酢酸の蓄積量が低減し、細胞をより高密度に培養することが可能であった。さらに、ウリカーゼの生産量は、ＨＮ００２０株を宿主とした場合は、ＭＭ２９４株を用いた場合よりも増大した。従って、酢酸耐性株を宿主として利用することにより、培養中に煩雑な糖濃度の制御を必要としなくとも、細胞を高密度に培養できるだけでなく、培養液当たりのウリカーゼ生産量も高く、効率良くウリカーゼを生産させることが可能である。
【００４２】
【表７】
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【００４３】
実施例３  ＨＮ００２０株を用いたアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産
実施例１で取得した、ＨＮ００２０株にアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ発現用の組換えプラスミドｐｔｒｃＮＭＡＰＨ（特開平４−７１４８９）を実施例２に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐｔｒｃＮＭＡＰＨであることを確認して、この組換え型大腸菌をＨＮ００２７株と命名した。
【００４４】
ＨＮ００２７株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、２８℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から無細胞抽出液を取得し、プロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて、蛋白質濃度が０．２ｍｇ／ｍｌになるように調製した。サンプル処理液〔ＳＤＳ  ０．９２ｇ、β−メルカプトエタノール  ２ｍｌ、グリセロール  ４．０ｇ、トリス  ０．３ｇおよび０．１％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルー溶液  ２ｍｌを水に溶解して、塩酸でｐＨ６．８に調製し、全量を２０ｍｌにする〕と等量混合し、１００℃で２分間処理した後、１４％ポリアクリルアミドゲル（１４ｃｍ×１１ｃｍ）に１０μｌをのせて、４０ｍＡで２時間泳動した。泳動後、ゲルを染色液（クマシーブリリアントブルー  Ｒ２５０  ０．２５ｇ、メタノール  １２５ｍｌ、酢酸  ２５ｍｌ、水１００ｍｌ）に浸し、３時間染色した後、脱色液（メタノール  １００ｍｌ、酢酸  １００ｍｌ、水  ８００ｍｌ）に浸し、１２時間脱色した。染色後のポリアクリルアミドゲルをクロマトスキャナー（島津製作所、クロマトスキャナーＣＳ−９３０）を用い、５６０ｎｍの波長を測定することにより、無細胞抽出液中の総蛋白質量に対するアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの含量を測定した。
【００４５】
その結果、第８表に示すように、ＭＭ２９４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主とした場合の方が、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産量が増大した。
【００４６】
【表８】
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【００４７】
実施例４  ＨＮ００２０株を用いた１３Ｌｅｕ−モチリンの生産
実施例１で取得した、ＨＮ００２０株に１３Ｌｅｕ−モチリン発現用の組換えプラスミドｐＭＴＯＩ４（特開昭６３−７１１９５）を実施例２に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＭＴＯＩ４であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ００２８株と命名した。
【００４８】
ＨＮ００２８株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３５℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。
得られた細胞を、濁度（ＯＤ５５０）が８．５になるようにＰＢＳ緩衝液に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この菌体破砕物から調整した試料を、１４％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、泳動後のゲルを染色して、クロマトスキャナーを用いて、全菌体蛋白質量に対する１３Ｌｅｕ−モチリンの含量を測定した。
【００４９】
その結果、第９表に示すように、ＭＭ２９４株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００２０株を宿主とした場合の方が、１３Ｌｅｕ−モチリンの生産量が増大した。
【００５０】
【表９】
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【００５１】
実施例５  大腸菌ＭＣ１０００株からの酢酸耐性株の造成
大腸菌ＭＣ１０００株から、実施例１に記載した方法と同様の方法で、目的変異株を取得し、ＨＮ００７４株と命名した。
ＨＮ００７４株を、種々の濃度の酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育を調べた。
【００５２】
その結果、第１０表に示すように、ＨＮ００７４株は、１５０ｍＭの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地でも生育を示し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
【００５３】
【表１０】
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【００５４】
また、１０ｍｌのＭＣＧ培地を含有する試験管（直径２４ｍｍ）にＭＣ１０００株とＨＮ００７４株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、酢酸の生成量を比較した。
その結果、第１１表に示すように、酢酸耐性株ＨＮ００７４株は、親株であるＭＣ１０００株と比較して、良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減した。
【００５５】
【表１１】
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【００５６】
実施例６  ＨＮ００７４株を用いたウリカーゼの生産
実施例５で取得した、ＨＮ００７４株にウリカーゼ発現用の組換えプラスミドｐＵＴ１１８を実施例２に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＵＴ１１８であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ００７５株と命名した。
【００５７】
ＨＮ００７５株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３３℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から、無細胞抽出液を取得し、培養液当たりのウリカーゼ生産量を測定した。
その結果、第１２表に示すように、ＨＮ００７５株は、ＭＣ１０００株を宿主とした組換え型大腸菌よりも生育が良好であった。さらに、ＭＣ１０００株を宿主とした場合よりも、ＨＮ００７４株を宿主とした場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
【００５８】
【表１２】
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【００５９】
実施例７  大腸菌ＮＹ４９株からの酢酸耐性株の造成
大腸菌ＮＹ４９株から、実施例１に記載した方法と同様の方法で、目的変異株を取得し、ＨＮ０１２４株と命名した。
ＨＮ０１２４株を、種々の濃度の酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地に塗布し、３３℃で２日間培養し生育を調べた。
【００６０】
その結果、第１３表に示すように、ＨＮ０１２４株は、１５０ｍＭの酢酸を含むＭＣＧＡ寒天培地でも生育を示し親株より高い酢酸耐性度を示した。
【００６１】
【表１３】
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【００６２】
また、１０ｍｌのＭＣＧ培地を含有する試験管（直径２４ｍｍ）にＮＹ４９株とＨＮ０１２４株を植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、酢酸の生成量を比較した。
その結果、第１４表に示すように、酢酸耐性株ＨＮ０１２４株は、親株であるＮＹ４９株と比較して良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減した。
【００６３】
【表１４】
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【００６４】
実施例８  ＨＮ０１２４株を用いたヒト顆粒球コロニー刺激因子の生産
実施例７で取得した、ＨＮ０１２４株に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）発現用の組換えプラスミドｐＣｆＢＤ２８（特開昭６３−２６７２９２）を実施例２に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＣｆＢＤ２８であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ０１２５株と命名した。
【００６５】
組換え型大腸菌ＨＮ０１２５株を、３０ｍｌのＭＣＧ培地を含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３３℃で２４時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により細胞を回収した。
得られた細胞から、無細胞抽出液を取得し、培養液当たりの顆粒球コロニー刺激因子の生産量を測定した。
【００６６】
その結果、第１５表に示すように、ＨＮ０１２５株は、ＮＹ４９株を宿主とした組換え型大腸菌よりも生育が良好であった。さらに、ＮＹ４９株を宿主とした場合よりも、酢酸耐性株ＨＮ０１２５株を宿主とした場合の方が、顆粒球コロニー刺激因子の生産量が増大した。
【００６７】
【表１５】
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【００６８】
実施例９  ＨＮ００２０株を用いたＬ−スレオニンの生産
実施例１で取得した、ＨＮ００２０株に大腸菌のＬ−スレオニン生合成遺伝子を保有する組換え体プラスミドｐＥｔｈｒ１（特開昭６０−３０６９３）を実施例２に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ｐＥｔｈｒ１であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をＨＮ０３１０株と命名した。
【００６９】
ＨＮ０３１０株を、ＭＣＧ培地組成中グルコース濃度を２０ｇ／ｌに増強したＭＣＧＧ培地３０ｍｌを含む３００ｍｌの三角フラスコに植菌し、３５℃で４８時間振盪培養を行い、１０，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により培養液上清を得た。
得られた培養液上清をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィーアミノ酸分析システム）で分析し、生成したＬ−スレオニンの量を定量した。
【００７０】
その結果、第１６表に示すように、ＨＮ０３１０株は、ＭＭ２９４株を宿主とした組換え型大腸菌よりも生育が良好であった。さらに、ＭＭ２９４株を宿主とした場合よりも、酢酸耐性株ＨＮ００２０株を宿主とした場合の方が、スレオニンの生産量が増大した。
【００７１】
【表１６】
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【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、組換え型大腸菌による所望の物質の生産において、容易に高密度に細胞を培養することができると同時に効率よく所望の物質を製造することができる。