(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯繊維芽細胞を構成成分として含有する培養真皮の表面に、臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯上皮細胞を播種し、培養重層化させることを特徴とする移植用培養皮膚重層シートの製造方法において、前記臍帯上皮細胞の培養重層化は、ＭＣＤＢ１５３培地とＤＭＥＭ培地を、容積比４対１で混合した混合培地で培養することを特徴とする移植用培養皮膚重層シートの製造方法。
【請求項２】
さらに、混合培地に上皮成長因子、インシュリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、下垂体エキスおよびウシ胎児血清を含む請求項１に記載の移植用培養皮膚重層シートの製造方法。
【請求項３】
臍帯付属組織細胞から分離された臍帯上皮細胞を、ＭＣＤＢ１５３培地とＤＭＥＭ培地を、容積比４対１で混合した混合培地で培養することを特徴とする臍帯上皮細胞の培養方法。
【請求項４】
さらに、混合培地に上皮成長因子、インシュリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、下垂体エキスおよびウシ胎児血清を含む請求項５に記載の臍帯上皮細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臍帯付属組織細胞、例えば臍帯細胞、胎盤細胞、卵膜細胞などを含有する培養皮膚に関する。具体的には、各種組織再構成のための皮膚移植及び細胞治療あるいは再生医療等に利用される人工培養皮膚に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚は生体と外部環境との間の界面として、生体内部の液体を保持し、水中では摩擦を減じたり、体温を一定に維持したり、生体内部を物理的な損傷から保護するという働きをもっている。
脊椎動物の皮膚は、真皮(dermis)と呼ばれる中胚葉に由来する結合組織層と、その上に載置される外胚葉に由来する重層に並ぶ表皮(epidermis)とから構成されている。
培養皮膚とは、健常皮膚片(上皮片)から採取した上皮細胞ならびに繊維芽細胞をin vitroで培養して皮膚構造の一部を構築したものである。患者自身の健常皮膚片(上皮片)から採取した細胞を用いたものを自家培養皮膚、他人の皮膚(上皮片)から採取した細胞を用いたものを同種培養皮膚とよばれている。
培養皮膚は、重度熱傷、糖尿病性下肢潰瘍や静脈潰瘍の治療、形成外科手術後の瘢痕治療などに適用される。培養皮膚は、単に創傷面を被覆するだけでなく、創傷治癒に必要な成長因子などを分泌あるいは供給するという点でも有効である。
現在、ヒト機能性上皮細胞の供給源として、新生児及び成人陰茎部の包皮や口腔粘膜由来上皮細胞と皮膚由来の繊維芽細胞、コラーゲン、フィブリン、ヘパリン、シリコンなどのマトリックスを構成材料にした培養皮膚が報告されている（特開昭６２−２４６３７１、特開平４−３３２５６１、特開２０００−１２５８５５、特開２０００−１５７６２４、特許第３１０５３０８号、日経バイオ年鑑２０００）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記細胞の由来となる組織の上皮細胞は、細胞の分化度及び加齢度の進んだものであり、短い分裂寿命及び分化の可塑性が小さい。また、個体差による細胞集団の回収及び健常組織の不安定性や組織の大きさにばらつきがあるという問題や、手術時の余剰組織を提供することに対する倫理的な問題がある等、未解決要因が他数存在する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト胎児由来臍帯付属組織から回収できる細胞を使用して、生着性の高い培養再構成皮膚を作製することを課題として、種々鋭意検討した結果、本発明を完成するに到った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）臍帯付属組織細胞を含有する培養皮膚、
（２）臍帯付属組織細胞が臍帯細胞である上記１記載の培養皮膚、
（３）表皮層または真皮層の構成成分として臍帯細胞を含有する培養皮膚、
（４）臍帯細胞が臍帯上皮細胞または臍帯筋繊維芽細胞である上記２または３記載の培養皮膚、
（５）臍帯細胞が臍帯組織から分離・培養された臍帯上皮細胞または臍帯組織から分離・培養された臍帯筋繊維芽細胞である、上記２または３記載の培養皮膚、
（６）臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯繊維芽細胞を構成成分として含有する培養真皮の表面に、臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯上皮細胞を培養重層化させてなる移植用培養皮膚重層シート、
（７）臍帯付属組織細胞から分離培養された臍帯上皮細胞を培養重層化させてなる上皮シート、
（８）臍帯付属組織細胞から分離培養された臍帯繊維芽細胞を構成成分として含有する培養真皮、
（９）下記工程、
▲１▼臍帯付属組織を蛋白質分解酵素に浸漬し、臍帯付属組織の結合を緩める工程、
▲２▼臍帯付属組織を物理的に剥離させる工程、及び
▲３▼臍帯付属組織を蛋白質分解酵素により細胞レベルまで分離する工程
を含む臍帯上皮細胞の分離方法、
（１０）蛋白質分解酵素がデイスパーゼ、トリプシンおよびコラゲナーゼからなる群から選択される酵素である上記９記載の分離方法、
（１１）臍帯付属組織細胞から分離された臍帯上皮細胞を培地で培養することを特徴とする臍帯上皮細胞の培養方法、
（１２）培地がヒト上皮細胞増殖用培地を含む上記１１記載の培養方法、
（１３）細胞外接着物で被覆した培養容器中の培地で培養する上記１１記載の培養方法、
（１４）細胞外接着物が、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される上記１３記載の方法、
（１５）臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯繊維芽細胞を構成成分として含有する培養真皮の表面に、臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯上皮細胞を播種し、培養重層化させることを特徴とする移植用培養皮膚重層シートの製造方法、及び
（１６）コラーゲンゲル及び臍帯繊維芽細胞からなる真皮層の表面に、臍帯付属組織細胞から分離・培養された臍帯上皮細胞を播種し、培養重層化させることを特徴とする移植用培養皮膚重層シートの製造方法に関する。
【０００６】
【発明の実施の態様】
本発明において、臍帯付属組織細胞とは、例えば臍帯細胞、胎盤細胞、卵膜細胞などを意味する。臍帯細胞とは、潜在的自己再生活性および分化可塑性能力を保持する胎児性細胞の継続的供給源として、出産に伴い不要となるヒト胎児性付属器である臍帯の構成細胞である。胎盤細胞とは胎児性の繁性絨毛膜と母体側の床脱落膜より形成される楕円形扁平の臓器細胞である。その臓器の胎児面側は羊膜に覆われている。卵膜細胞とは、外層より脱落膜、絨毛膜、羊膜の順に形成され、子宮内で胎児などを被包している膜成分細胞である。羊膜とは卵膜の内面、胎盤の胎児面側を覆う半透明の薄膜であり、その羊膜上皮は臍帯表面，即ち臍帯上皮組織や胎児皮膚部分への移行を示す。羊膜は５つの層からなり、単層の上皮細胞層と繊維芽細胞層を含み、絨毛膜は４つの層からなり、繊維芽細胞層を含む。
【０００７】
本発明において使用する臍帯細胞とは、臍帯組織から分離された臍帯上皮細胞および臍帯筋繊維芽細胞を含む。
一般に、臍帯組織（出産前胎児組織）は臍帯上皮（最外層を含む）と臍帯筋繊維芽細胞を内包するワルトン膠質、２本の臍帯動脈と１本の臍帯静脈から構成され、体内では成長過程にあり、臍帯上皮は活発に成長しつつある体表皮膚上皮の一部であることから、成人皮膚と異なり老化が進んでいない再生上皮幹細胞を多く含む組織である。このことは高いテロメラーゼ活性及び長いテロメア長によって裏付けられている。このテロメアによって細胞の分裂寿命（加齢）が遅延され、長期生着する移植皮膚の作製が可能になる。
さらに細胞の老化遅延効果は細胞不死化遺伝子の導入によって極めて容易に実現することが出来、その効果は成人皮膚細胞に比べて著しく高いことも知られている（〜数百倍）。このことからも臍帯上皮細胞の潜在的分裂能力が極めて高いことが明らかである。
しかしながら、不死化遺伝子の導入は細胞の改変を伴うため、不死化臍帯上皮による培養皮膚シートの作製には、導入遺伝子を細胞から除去する操作を組み合わせることを制限しない。さらに、その実現は例えば既知のアデノ-cre-Lox系を用いて応用することを制限しない。
さらに臍帯の表層は胎児の表皮とつながっているため、臍帯の細胞は成人皮膚の細胞と同等かそれ以上の再生能力をもつ可能性が高い。
さらに胎児由来の細胞であるため、細胞の分裂寿命が長く、潜在的増殖能が高いという利点をもつ。
【０００８】
本発明において使用する臍帯上皮細胞とは、臍帯最外層を覆う１〜３層程度の上皮層中の円柱上皮細胞を分離した後、培養して増殖させたものである。
臍帯上皮細胞を分離する方法は、下記工程を含む。
▲１▼臍帯付属組織を蛋白質分解酵素に浸漬し、臍帯付属組織の結合を緩める工程、
▲２▼臍帯付属組織を物理的に剥離させる工程、及び
▲３▼臍帯付属組織を蛋白質分解酵素により細胞レベルまで分離する工程。
本発明の臍帯上皮細胞は、臍帯付属組織、例えば臍帯組織を蛋白質分解酵素などで処理することにより、上皮組織片を分離した後、さらに、トリプシン−ＥＤＴＡなどの溶液で細胞レベルにまで分離するように処理することが好ましい。蛋白質分解酵素としては、フィブロネクチン、コラーゲンタイプＩ、IVを分解する酵素であるディスパーゼ、トリプシンおよびコラゲナーゼなどが例示される。臍帯組織（上皮片）を物理的に剥離させる段階では、メス、ピンセット、ブラシなどの器具を用いる。
【０００９】
本発明において臍帯上皮細胞を培養する培地としては、特に制限はないが、臍帯上皮細胞以外の上皮細胞または繊維芽細胞のための培地を含む培地が使用できる。このような培地としては、動物細胞用培地、例えば、MCDB153(Sigma)、keratinocyte-SFM(GIBCO)，Defined keratinocyte-SFM(GIBCO)，EpiLife-KG2(クラボウ)，HuMedia-KG2(クラボウ)，HuMedia-KB2(クラボウ)，DMEM(Sigma)，RPMI1640(GIBCO) Medium106S(クラボウ)などが挙げられる。特にＭＣＤＢ１５３培地(含サプリメント)とＤＭＥＭ培地(ＦＢＳを０〜１０％含有)を４対１（容量比）で混合した培地(MCDB153-1/4)を作製して用いることが好ましい。
また、本発明における培養容器としては、培養皿、培養フラスコ、メンブレン、カバーガラス上などが例示される、通常、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、TC処理ポリカーボネート、混合セルロースエステル、親水処理PTFE(IWAKI,NUNC,CORNING,FALCON)製であり、その表面が細胞外接着物で被覆した容器であることが好ましい。前記細胞外接着物としては、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチンからなる群から選択される。上皮細胞はその下の結合組織と基底膜を介して接しているため、特にその基底膜成分のコラーゲンタイプＩ、IVで被覆された培養容器を用いることが好ましい。
本発明における培養条件としては、約３７℃、１００％湿度、５％炭酸ガスの存在下であることが好ましいが、これらの条件に制限されない。
【００１０】
また、本発明に使用する臍帯筋繊維芽細胞とは、臍帯内部のワルトン膠質中に含まれる筋繊維芽細胞を分離し、培養して増殖させたものである。
臍帯繊維芽細胞とは、臍帯付属組織に含まれる繊維芽細胞を分離し、培養して増殖させたものである。
臍帯繊維芽細胞を分離する方法としては、臍帯付属組織、例えば臍帯組織から移植片培養法を用いて臍帯繊維芽細胞を分離する方法が用いられる。
移植片培養法とは、生体から取り出した組織の小片を培養する方法で、組織片から遊出・増殖してくる細胞を得ることができる。
臍帯組織から分離した臍帯筋繊維芽細胞は、培養容器中の培地で培養する。具体的には、臍帯筋繊維芽細胞は、臍帯上皮細胞を分離した後の臍帯組織から臍帯内の血管を除いた後、組織片培養法を用いて分離し、培養することが好ましい。具体的には、例えば、臍帯組織をメスなどで約１〜５ｍｍ角の小組織に細断した後、ＤＭＥＭ培地(ＦＢＳを１０％含有)を含む培養容器に５〜１０日間静置し、組織周辺から遊走及び分裂増殖する臍帯筋繊維芽細胞をトリプシン−ＥＤＴＡなどの溶液を用いて分離し、ＤＭＥＭ培地(ＦＢＳを１０％含有)培地でさらに５〜３０日間培養する方法がある。
本発明において臍帯筋繊維芽細胞に対して使用する培地としては、特に制限はないが、例えば、DMEM(Sigma)，RPMI1640(GIBCO)， Medium106S(クラボウ)が例示され、特に、ＤＭＥＭ培地(１０％ＦＢＳ含有)を用いることが好ましい。
本発明における培養容器としては、培養皿、培養フラスコ、カバーガラス上などが例示される。本発明における培養条件としては、約３７℃、１００％湿度、５％炭酸ガスの存在下であることが好ましいが、これらの条件に制限されない。
【００１１】
本発明において作製する培養皮膚とは、生体皮膚の表皮層と真皮層をモデルとして作製される２層培養皮膚であり、臍帯細胞を表皮層または真皮層の構成成分として含有する。
臍帯細胞のうち、臍帯上皮細胞は表皮層中に、臍帯筋繊維芽細胞は真皮層中に存在することが好ましい。表皮層とは臍帯上皮細胞を４〜１０層に重層化することによって作製することが可能である。一方、真皮層は臍帯筋繊維芽細胞を担体、好ましくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスなどと用いて作製することが好ましい。
【００１２】
本発明において作製する上皮シートとは、生体皮膚の表皮層をモデルとして作製される培養表皮であり、臍帯上皮細胞を４〜１０層に重層化することによって作製することが好ましい。
【００１３】
本発明において作製する培養真皮とは、生体皮膚の真皮層をモデルとし、臍帯筋繊維芽細胞を担体、好ましくはコラーゲンなどの細胞外マトリックス-などとを用いて作製することが好ましい。特殊な試験法において、in vivo環境内に繊維芽細胞のみを移植したとき、その繊維芽細胞が増殖し、さらにコラーゲンを産生することにより真皮様組織を形成しうるが、通常in vitro環境内においては、繊維芽細胞のみでは真皮層は形成されない。
細胞外マトリックスとしては、コラーゲン不織布、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートなどが例示される。
これらの担体に代えて、生体吸収性基材(グリコサミノグリカン、グリコール酸、乳酸、キチン、ポリグラクチン、コンドロイチン硫酸、フィブリノーゲン)なども使用可能である。
担体を用いる培養真皮の製造法としては、担体内または担体上に繊維芽細胞を播種して生着させ、１〜４週間培養して作製する方法や、ゲル状の担体の場合、溶液の状態で繊維芽細胞と混合した後ゲル化させ、１〜４週間培養して、ゲル内に繊維芽細胞を内包した培養真皮を作製する方法が挙げられる。
培養真皮は、厚さは、0.5〜3mm、形状は滑らかなシート状であることが好ましい。
【００１４】
本発明の移植用培養皮膚重層シートは、分離および培養された臍帯繊維芽細胞を構成成分として含有する培養真皮の表面に、分離および培養された臍帯上皮細胞を培養重層化させた上皮シートが積層されてなる。
または、移植用培養皮膚シートはコラーゲン溶液から作製されたコラーゲンゲルと臍帯繊維芽細胞からなる真皮層の表面に、分離および培養された臍帯上皮細胞を培養重層化させた上皮シートが積層されてなる。
上記した培養真皮または真皮層の表面に、分離および培養された臍帯上皮細胞を培養重層化させるには、真皮層の表面に分離された臍帯上皮細胞または一度培養した臍帯上皮細胞を播種して培養し、さらに多層に重ねる。このような重層化は、上皮細胞分化因子の添加、上皮層の空気暴露の条件にて培養を続けることによって達成される。
【００１５】
移植用培養皮膚重層シートにおいて、真皮層は、厚さは、通常0.5〜3ｍｍであり、上皮層の数は,4〜10層で、厚さは、通常0.1〜1ｍｍである。
真皮層および上皮層には、さらに、血管内皮細胞、神経細胞、造血幹細胞、血管誘導因子、上皮細胞分化因子、上皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子を含有させてもよい。
本発明の培養皮膚は、潜在的分裂能力が高く、比較的抗原性が低く、継続的な供給を受けられる胎児由来臍帯組織の細胞により主に構成されており、糖尿病性下腿潰瘍、重度熱傷などへの治療に適用される。
【００１６】
【実施例】
次に、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。
％は特記ない限り重量％を示す。
実施例１  臍帯上皮細胞の分離および培養
出産後に摘出された臍帯（長さ30〜60cm、直径9〜15mm）をＨＢＳＳ(Hanks' balanced salt solutions)またはＰＢＳ(Phosphate-Bufferd Saline solution)を用いて、３回よく洗浄し、付着血液などを除いた。臍帯の両端部分をそれぞれ糸で縛り、下記組成を有する培地（MCDB153-1/4培地）で蛋白質分解酵素「dispase（BECTON DICKINSON製）」を２０％になるように希釈した溶液中に、上記臍帯の両端部分（各２cm）のみは、該溶液に浸漬しないよう糸で吊り下げて浸漬し、４℃にて２５〜５０時間静置した。
培地：ＭＣＤＢ１５３−１／４培地
（MCDB153培地とDMEM(含0〜10%FBS)培地を４：１で混合した培地）
MCDB153培地（SIGMA）への添加物は下記の通りである。
0003728750.tif 000002
DMEM(SIGMA)培地への添加物は下記の通りである。
牛胎児血清(FCS)        最終濃度        ０〜１０％
【００１７】
浸漬した臍帯を取り出し、上記ＭＣＤＢ１５３−１／４培地中にて、メス、ピンセットおよびブラシを用いて臍帯上皮片を剥離し、その上皮片の懸濁液を遠心分離して上皮片のみを回収した。次に０．１％トリプシン−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に約１０分間浸漬し、メッシュ（オープニング７０μｍ）を通して臍帯上皮細胞を単離し、遠心して臍帯上皮細胞（約１０６個）を回収した。
回収した臍帯上皮細胞を上記ＭＣＤＢ１５３−１／４培地に懸濁し、培養器（コラーゲンタイプIVで被覆された培養皿）に播種して、該培養器をインキュベータ内に置き、５％ＣＯ２の存在下に３７℃で培養した。
培養器内で臍帯上皮細胞は、培養器上に約８０％生着し、２日目から増殖を始めた。
【００１８】
実施例２  臍帯筋繊維芽細胞の分離および培養
実施例１において臍帯上皮細胞を分離した後、残された臍帯組織からメス、およびピンセットを用いて臍帯組織中の血管を取り除いた。血管を除いた後の臍帯組織をメス、ピンセットを用いて、約５ｍｍ角の細片に切断した。細片を培養皿内に静置し、一面が培地で浸かる程度、ＤＭＥＭ培地(10％FCSを含む)を加えた。
約１週間後、組織細片の周辺に臍帯筋繊維芽細胞が生え出してくる様子が観察された後、ＤＥＭＥ培地(含10%FCS)約５ｍｌを臍帯組織が十分浸る程度、加えた。
その後、十分臍帯筋繊維芽細胞が増殖してから、臍帯組織を取り除き、０．１％トリプシン−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液によって臍帯筋繊維芽細胞（約１０６個）を回収した。次にＤＭＥＭ培地(含10%FCS)に懸濁し、新しい培養皿に播種して、インキュベータ内にて５％ＣＯ２の存在下に３７℃にて培養した。
培養器内で臍帯筋繊維芽細胞は、培養器上にほぼ全て生着し、２日目から増殖を始めた。
【００１９】
実施例３  分離培養した臍帯上皮細胞の増殖
実施例１と同様に分離した臍帯上皮細胞を下記３種類の培地（Ａ，Ｂ，Ｃ）を用いて培養した。
MCDB153-1/4(0%cx-FCS,0%FCS)培地-----------（Ａ）
Keratinocyte-SFM培地(GIBCO)--------------（Ｂ）
Defined Keratinocyte-SFM培地(GIBCO)------（Ｃ）
臍帯上皮細胞の継代は、該細胞がサブコンフルエントになった状態で０．１％トリプシン−０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液によって該細胞を回収し、細胞数をカウントした後、もとの３倍量の培養器に播種しなおした。
その細胞増殖曲線を図１に示す。
【００２０】
実施例４  分離培養した臍帯上皮細胞の分化誘導
酵素抗体(免疫ペルオキシターゼ)法を用いて、臍帯上皮細胞に対するInvolucrin,cytokeratin14の免疫染色を行った。一次抗体は、以下のものを用いた。
MONOCLONAL ANTI-INVOLUCRIN CLONE SY5(SIGMA)
Keratin 14,clone RCK107(SANBIO)
表皮角質層のマーカーであるInvolucrinは臍帯上皮層において、また培養下の臍帯上皮細胞において発現が確認された。
また上皮基底層のマーカーであるKeratin 14は、培養下の臍帯上皮細胞において発現が確認された。
【００２１】
実施例５  分離培養した臍帯上皮細胞の潜在的分裂能力（Telomere&Telomerase）
テロメアとは、真核生物の染色体末端に見られる独特の構造で、細胞分裂毎にテロメア長は短くなる。テロメレースとはテロメア繰り返し配列を合成する酵素で、テロメレース活性のある細胞ではＤＮＡの複製毎におきるテロメア配列の短縮がテロメレースによって補われ、テロメア配列は安定化している。これまでの研究からテロメア長は細胞の老化度を測る細胞分裂時計と考えられている。
高感度で能率的なPCR法を用いたテロメレース活性検出法であるＴＲＡＰ(Telomeric Repeat Amplification Protocol) 法を用いて、臍帯上皮細胞のテロメレース活性を測定した。
特定の遺伝子またはＤＮＡ断片をフィルター上に検出する方法であるサザンブロット法を用いて臍帯上皮細胞のテロメア長を測定した。
その結果、ヒト皮膚表皮細胞テロメア長が８〜１０(kbp)であるのに対して、ヒト臍帯上皮細胞テロメア長は約１３(kbp)と大きく上回った。この結果により、ヒト臍帯上皮細胞の分裂寿命がヒト皮膚上皮細胞に比べて大いに長いことが示された。
また臍帯上皮細胞にテロメレース活性も検出されたため、細胞分裂時のテロメア長の短縮を補うことが可能であり、さらに長い分裂寿命をもつ細胞であることが示唆された。
【００２２】
実施例６  分離培養した臍帯上皮細胞の不死化感受性
臍帯上皮細胞の初代培養２〜５日目の細胞増殖の活発な時期に、リポフェクション法を用いて、SV40のLarge T抗原遺伝子の導入によって、臍帯上皮細胞の不死化を行なった。
遺伝子導入後、継代数30代(約10ヶ月)以上の長期増殖能を確認できた。
【００２３】
実施例７  臍帯筋繊維芽細胞を用いた培養真皮の作製
・ゲル調整用溶液の作製
２倍濃度のMCDB153培地(2×MCDB)          16ml
２倍濃度のDMEM培地(2×DMEM)              4ml
牛胎児血清(FＣS)                              2.4ml
抗生物質：Gentamicin                         50μl
Fungizone                          50μl
カセイソーダ(1M NaOH)                      100μl
以上を混合し、氷冷しておく。
・臍帯筋繊維芽細胞懸濁液の調整
臍帯筋繊維芽細胞の培養容器に０．１％トリプシン−０．１ｍM  EDTA溶液で細胞を分散させ回収した。その一部を取り、２×106 / 11mlの濃度になるようにDMEM培地(含10%FBS)に懸濁し、氷冷した。
・コラーゲン混合液の調整
ゲル調整用溶液へコラーゲン溶液(3mg/ml,pH3.0)を6.6ml添加し、緩やかに均一に混合した。その混合液に臍帯筋繊維芽細胞懸濁液を添加し、均一に混合した。・培養真皮の作製
角型(85×125mm)の培養器にコラーゲン混合液を流し込み、37℃、５％CO2 で２〜５時間インキュベートしてゲル化させて、臍帯筋繊維芽細胞を内包した培養真皮を作製した。
その組織断面像を図２に示す。
【００２４】
実施例８  臍帯細胞を用いた培養皮膚の作製
実施例８にて作製した培養真皮を２層式の培養器(Transwell,corstar)上層部（φ24mm）に移し、その培養真皮上に臍帯上皮細胞を5×104/ cm2播種し、MCDB153-1/4(0.4%cx-FCS,10%FCS)にて約10日培養した。次に真皮部のみを培地に浸し、上皮部を空気暴露して約10日培養することにより、上皮を重層化させて、培養皮膚を作製した。
その組織断面像を図３に示す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明において、出産後、母体並びに胎児から自然分離後、通常、廃棄されるべき臍帯の構成細胞を再生医療などに再利用することは、社会的倫理的側面及び法的規制からの制約が少ないことと、さらに正常分娩による胎児由来祖織であるため、供給される細胞が疾病の伴う手術時摘出される余剰組織からでなく、明白な随伴病変を持たない正常な胎児性ヒト細胞が継続的に安定な供給が得られるという著しい利点がある。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】臍帯上皮細胞増殖曲線
Ａ：ＭＣＤＢ１５３−１／４（０％ｃｘ−ＦＣＳ）培地
Ｂ：Keratinocyte-ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）
Ｃ：Defined Keratinocyte-ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で、グラフ中のプロットは継代した培養日数を示す。
【図２】培養真皮断面像
作製した培養真皮組織の断面ＨＥ染色像で、細長い形状や粒状に観察されるのが臍帯筋繊維芽細胞である。
【図３】培養皮膚断面像
作製した培養皮膚組織の断面ＨＥ染色像で、培養真皮上に数層に重層化した上皮層が観察される。
【図１】
0003728750.tif 000003
【図２】
0003728750.tif 000004
【図３】
0003728750.tif 000005