(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースおよび／またはセルロース誘導体からなる細胞培養用多孔質担体の表面および／または内部に付着されている細胞数を算出するにあたり、該細胞培養用多孔質担体をセルロース分解酵素を用いて、温度４０〜６０℃かつｐＨ４〜６の条件下で分解することにより、付着されている細胞を遊離し、細胞数を測定することを特徴とする多孔質担体付着細胞数の測定方法。
【請求項２】
細胞培養用多孔質担体を分解酵素を用いて分解するにあたり、該分解酵素の最適ｐＨの緩衝液に不溶の不純物を予め濾過した酵素溶液を用いて分解することを特徴とする請求項１記載の多孔質担体付着細胞数の測定方法。
【請求項３】
細胞培養用多孔質担体を分解酵素を用いて分解するにあたり、蛋白質分解酵素を併用することを特徴とする請求項１または２記載の多孔質担体付着細胞数の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、バイオインダストリー分野で発展しつつある細胞固定用多孔質担体を用いた細胞培養モニター技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
三次元構造を有し、高密度培養が期待されている細胞培養用多孔質担体に付着している細胞数の算出方法としては、培養液中から分離した担体を、トリプシン処理して細胞を剥離し、算出する方法がしばしば行われている（鈴木ほか、Animal Cell Technology:Basic & Applied Aspects Vol.4(1992)）。しかしこの方法では多孔質担体の孔径によっては内部の細胞が完全に算出されていない恐れがある。また、多孔質担体の付着細胞数推定法として、培地中のグルコース消費速度を測定する方法（松村ほか、Animal Cell Technology:Basic & Applied Aspects Vol.5(1993)）がある。しかし培養環境により細胞の代謝は変化し、単位細胞当たりのグルコース消費量は必ずしも一定ではない。即ち、これらの方法は、正確性に欠け、あるいは短時間で算出できないという問題点を持ち合せている。
【０００３】
一方、細胞を付着した多孔質担体をその成分を分解する酵素で37℃、pH７（細胞生存に必要な条件）において処理し担体を分解することによって細胞を回収・移植する方法（特開平5-192135号公報）が知られているが、担体分解酵素の最適温度・pHは必ずしもこの条件ではなく、この37℃、pH７においては担体分解に時間がかかるかあるいは分解できない場合がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、多孔質担体付着細胞数を直接的に短時間でかつ正確に測定する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本発明は、細胞培養用多孔質担体の表面および／または内部に付着されている細胞数を算出するにあたり、該細胞培養用多孔質担体をその構成成分の分解酵素を用いて最適条件下で分解することにより、付着されている細胞を遊離し、細胞数を測定することを特徴とする多孔質担体付着細胞数の測定方法である。
【０００６】
本発明において、細胞培養用多孔質担体とは、多孔構造を有する、動物細胞用および微生物培養用マイクロキャリアをいい、その材質としては、例えばセルロ−ス、コラ−ゲン、ゼラチンがある。
本発明は、多孔質担体の表面及び内部に固定されている細胞数を直接的にかつ正確に測定するために、担体を、その構成成分の分解酵素を用いて最適条件下にて速やかに分解することにより固定された全細胞を遊離させたのち、細胞または細胞核数を測定することが特徴である。
【０００７】
本発明に用いる分解酵素は多孔質担体に応じて適宜選択されるが、例えば多孔質担体がセルロ−スおよび／またはセルロ−ス誘導体からなる場合にはセルロ−ス分解酵素が、多孔質担体がコラ−ゲンからなる場合にはコラ−ゲン分解酵素が、多孔質担体がゼラチンからなる場合にはゼラチン分解酵素が用いられる。また、セルロ−ス分解酵素としてはセルラ−ゼ（Penicillium 菌由来、Trichoderma 菌由来、Aspergillus 菌由来）、コラ−ゲン分解酵素としてはコラゲナ−ゼ、ゼラチン分解酵素としてはゼラチナ−ゼ、コラゲナ−ゼ等がある。
【０００８】
本発明において、多孔質担体の分解は最適条件下で行われることが肝要である。最適条件は、用いる分解酵素により適宜決定されるが、市販のセルロース分解酵素の場合には多くの最適温度は４０〜６０℃であり、５０℃前後では30分以内に多孔質担体を完全分解することができる。また、最適温度では細胞に対し致死的ダメージを与えるが、細胞数算出に当たっては細胞の生存を維持する必要はないので問題はない。さらにセルロ−ス分解酵素の場合には、pH４〜６で行うのが好ましい。
【０００９】
本発明において、多孔質担体の分解は分解酵素を最適pHの緩衝液に溶解して調整された酵素液を添加し、最適温度の温浴中で振とうすることによって行われる。
本発明においては、細胞培養用多孔質担体を分解酵素を用いて分解するにあたり、該酵素の最適pHの緩衝液に不溶の不純物を予め濾過した酵素溶液を用いることが好ましい。これは、光学顕微鏡観察下で血球計算盤を用いて細胞または細胞核の数を測定する際に、酵素不純物由来の侠雑粒子が存在すると、細胞（核）を速やかに識別することが困難になるためである。濾過の方法としては例えば加圧濾過等がある。
【００１０】
特に、市販のセルロース分解酵素の純度は様々だが、純度が低い製品を用いる場合は、緩衝液に不溶の不純物が多く含まれているため、それらを濾過によって除去してから用いることが好ましい。
さらに、本発明においては、細胞培養用多孔質担体を分解酵素を用いて分解するにあたり、蛋白質分解酵素を併用することが好ましい。セルロース及びセルロース誘導体からなる未使用の多孔質担体は、セルロース分解酵素をその最適pHの緩衝液に溶解して調製された酵素液を添加し、最適温度の温浴中で振とうすることによって最短時間で分解できる。しかし実際に細胞培養に使用した多孔質担体は、セルロ−ス分解酵素だけでは同様には分解されない場合もある。多孔質担体上の培養細胞が高密度に増殖し、多孔質担体の有効表面が広く細胞に覆われてくるにつれて分解されにくくなる。そこで、多孔質担体表面の細胞を分散する蛋白質分解酵素で前処理したのち、セルロース分解酵素処理することにより、最大数の細胞が多孔質担体に付着した状態でも、短時間で完全に多孔質担体は分解される。この際、蛋白質分解酵素と担体分解酵素を同時に添加してもその効果に影響がなければ、同時に添加して操作を簡略化することができる。また、顕微鏡観察下での侠雑粒子には酵素由来物のほかに、担体分解産物がある。これは担体表面に細胞などが付着していることによる担体の分解不十分によるものだが、酵素分解時に蛋白質分解酵素を併用することによって防ぐことができる。
【００１１】
本発明の測定法において、多孔質担体に付着している細胞数を測定する方法としては、多孔質担体分解後、例えば、遊離した細胞を光学顕微鏡観察下で血球計算盤によって単位体積あたりの細胞数を算出する、または遊離した細胞をさらにクエン酸とクリスタル紫を含む水溶液で処理して細胞核を遊離した後、光学顕微鏡観察下で血球計算盤によって単位体積あたりの細胞核数を算出する等の方法がある。
【００１２】
上記からわかるように、本発明の方法を用いることにより、多孔質担体、特にセルロ−ス多孔質担体に固定されている細胞数の測定が、サンプリング後数十分で可能になった。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例１、２で用いたセルラーゼ溶液は、予め０．２２μｍ孔のポリビニリデン性フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）をテルモシリジン（テルモ株式会社製）に連結して加圧濾過したものである。また、本発明のプロセスフローの概略を図３に示した。
【００１４】
【実施例１】
100ml スピナーフラスコで、セルロースを材質とする旭化成マイクロキャリア（旭化成，直径200 μm ，孔径30μm ）を0.5g/lの密度に、10％仔牛血清（HyClone ）を含むe-RDF 培地（極東製薬株式会社製）に懸濁し、遺伝子組換えCHO 細胞（IL-4生産株）を２×105cells/ml の密度に接種して37℃で撹拌培養を行った。
【００１５】
培養期間中毎日、マイクロキャリアを懸濁した培養液１mlを採取し、分離したマイクロキャリアに400U/ml セルラーゼ（SIGMA ，Penicillium 菌由来，C-0901，pH５酢酸緩衝液に溶解）0.5ml および0.25％トリプシン（0.2 ％EDTA含有）0.5ml を添加し、50℃温浴中でマイクロキャリアが完全分解するまで振とうした。分解に要した時間は、細胞密度が低い時は20分程度、細胞が高密度になりマイクロキャリア表面を覆っているような場合には40分程度であった。
【００１６】
マイクロキャリア分解後、クエン酸２％とクリスタル紫0.2 ％を含む水溶液を、最終体積が２mlになるよう添加し、試験管ミキサーで５秒間振とうしたのち、光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ株式会社製、倒立型システム顕微鏡）の観察下、血球計算盤を用いて細胞数を算出した。その結果、図１のような細胞増殖曲線が得られた。
【００１７】
【実施例２および比較例１〜２】
100ml スピナーフラスコで、セルロースを材質とする旭化成マイクロキャリア（旭化成，直径200 μm ，孔径30μm ）を0.5g/lの密度に、10％仔牛血清（HyClone ）を含むe-RDF 培地（極東製薬株式会社製）に懸濁し、遺伝子組換えCHO 細胞（IL-4生産株）を５×104cells/ml の密度に接種して37℃で撹拌培養を行った。
【００１８】
培養期間中毎日、３本の遠沈管（▲１▼〜▲３▼）にマイクロキャリアを懸濁した培養液１mlずつを採取しマイクロキャリアを分離したのち、▲１▼は400U/ml セルラーゼ（SIGMA ，Penicillium 菌由来，C-0901，pH５酢酸緩衝液に溶解）0.5ml および0.25％トリプシン（0.2 ％EDTA含有）0.5ml を添加し、50℃温浴中でマイクロキャリアが完全分解するまで振とうした（実施例２）。▲２▼は200U/ml セルラーゼ（SIGMA ，Penicillium 菌由来，C-0901，pH7.4 リン酸緩衝液に溶解）1.0ml を添加し、37℃温浴中でマイクロキャリアが完全分解するまで振とうした（比較例１）。▲３▼は0.25％トリプシン（0.2 ％EDTA含有）1.0ml を添加し、37℃で５分間インキュベイトしたのち試験管ミキサーで30秒振とうした（比較例２）。
【００１９】
▲３▼はそのまま、▲１▼と▲２▼はその後クエン酸２％とクリスタル紫0.2 ％を含む水溶液を最終体積が２mlになるよう添加し試験管ミキサーで振とうしたのち、実施例１と同様にして、血球計算盤で細胞数を算出した。
その結果得られた増殖曲線を図２に示す。図２からわかるように、▲３▼のトリプシンのみによるマイクロキャリアからの細胞剥離は著しく不充分であった。▲２▼の、従来知られていた37℃，pH7.4 でのセルラーゼ処理によるマイクロキャリア分解にはおよそ1.5 〜２時間を要し、▲１▼の方法（分解時間20分）に比べて時間がかかりすぎるうえ、分解後にも細胞算出を妨げる粒子が残存し、細胞数算出は不可能であった。本発明の方法（▲１▼）では、すみやかにマイクロキャリアは分解し、容易に細胞数の算出が行え、図２のような対数増殖曲線が得られた。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、多孔質担体に固定されている細胞数を、サンプリング後わずか数十分で、正確に算出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１において算出されたＣＨＯ細胞増殖曲線である。
【図２】本発明の実施例２および比較例２において算出されたＣＨＯ細胞増殖曲線である。
【図３】本発明のプロセスフローの概略を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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