(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子細胞中で興味あるDNA配列を発現させる方法であって、前記方法が：
種子を発育させることができる双子葉植物又はトウモロコシ植物を生育させることであって、前記植物がそのゲノム中に組み込まれている発現カセットを含む細胞からなり、前記発現カセットが、転写の５′−３′方向において操作可能に結合している成分としての、オイルボディタンパク質遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域、前記調節領域にとって異種の興味あるDNA配列、および転写終結領域からなり、種子が生産されその種子中で前記DNA配列が前記調節領域の転写制御下に発現する条件下で前記植物を生育させることを含むことを特徴とする興味あるDNA配列の発現方法。
【請求項２】
前記胚発生期が球状胚の形成から初期子葉段階までである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子が双子葉植物からのものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記胚発生期が、球状期、心臓型期、魚雷型期および子葉期からなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記双子葉植物がBrassica napusまたはArabidopsisである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記植物がArabidopsis以外の植物である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
DNA構成体であって：オイルボディタンパク質を暗号化している遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域を含むキメラ遺伝子からなり、前記調節領域が前記調節領域にとって異種の興味あるDNA配列に融合していることを特徴とするDNA構成体。
【請求項８】
前記遺伝子がBrassicaceaeの一部から得られている請求項７に記載のDNA構成体。
【請求項９】
前記転写調節領域がBrassica napusまたはArabidopsisから得られている請求項７に記載のDNA構成体。
【請求項１０】
発現カセットであって：操作可能に結合している成分としての、オイルボディタンパク質遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域、前記調節領域にとって異種の興味あるDNA配列、および転写終結領域からなることを特徴とする発現カセット。
【請求項１１】
双子葉植物又はトウモロコシ植物であって：ゲノム中に組み込まれているキメラ遺伝子を含み、前記キメラ遺伝子がオイルボディタンパク質遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域を含んでいる細胞からなり、前記転写調節領域が前記調節領域にとって異種の興味あるDNA配列に融合していることを特徴とする植物。
【請求項１２】
双子葉植物又はトウモロコシ植物の種子であって：ゲノム中に組み込まれているキメラ遺伝子を含み、前記キメラ遺伝子がオイルボディタンパク質遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域を含んでいる細胞からなり、前記転写調節領域が前記調節領域にとって異種の興味あるDNA配列に融合していることを特徴とする種子。
【請求項１３】
前記転写調節領域がBrassica napusまたはArabidopsisから得られているオイルボディタンパク質からのものである請求項１２に記載の種子。
【請求項１４】
前記種子が双子葉植物のものである請求項１２に記載の種子。
【請求項１５】
前記種子が脂肪種子である請求項１３に記載の種子。
【請求項１６】
双子葉植物又はトウモロコシ植物の種子に特異な代謝を変更させる方法であって、前記方法が：
種子を発育させることができる植物を生育させることであって、前記植物がそのゲノム中に組み込まれている発現カセットを含む細胞からなり、前記発現カセットが、転写の５′−３′方向においてオイルボディタンパク質遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域、前記調節領域にとって天然の配列以外の興味あるDNA配列、および転写終結領域からなり、種子が生産されその種子中で前記DNA配列が前記転写調節領域の転写制御下に発現する条件で前記植物を生育させることを含むことを特徴とする種子に特異な代謝変更方法。
【請求項１７】
前記変更が植物種子中で発現する内在性遺伝子の発現の減少または抑制である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記DNA配列の転写される鎖が前記細胞にとって内在性のmRNAと相補的である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
双子葉植物又はトウモロコシ植物の種子中で新規なポリペプチドを生産させる方法であって、前記方法が：
種子を発育させることができる植物を生育させることであって、前記植物がそのゲノム中に組み込まれている発現カセットを含む細胞からなり、前記発現カセットが、転写の５′−３′方向において、オイルボディタンパク質遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域、前記植物にとって外来のポリペプチドを暗号化する興味あるDNA配列、および転写終結領域からなり、種子が生産されその種子中で前記DNA配列が前記転写調節領域の転写制御下に発現する条件で前記植物を生育させることを含むことを特徴とする種子中の新規ポリペプチドの生産方法。
【請求項２０】
双子葉植物又はトウモロコシ植物の部分であって、請求項７に記載のDNA構成体を含むことを特徴とする植物部分。
【請求項２１】
前記部分が葉、茎、根、花、果実または種子である請求項２０に記載の植物部分。
【請求項２２】
単離されているDNAであって：貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節領域を含み、前記調節領域がオイルボディタンパク質から得られており、前記DNAのヌクレオチド配列が、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離DNA。
【請求項２３】
貯蔵タンパク質の蓄積に先行して胚発生期に双子葉植物又はトウモロコシ植物である宿主植物中で興味あるDNA配列を発現させる方法であって、前記方法が；
転写調節領域に作用可能に融合した興味あるDNA配列を含む構成体で前記宿主植物を形質転換することであって、前記調節領域がオイルボディタンパク質遺伝子から得られており、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含むこと；さらに種子が生産され前記興味あるDNA配列が前記調節領域の転写制御下に発現する条件で前記植物を生育させること、を含むことを特徴とする植物中の興味あるDNA配列の発現方法。
【請求項２４】
前記宿主が双子葉植物脂肪種子細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子が次の群から得られている請求項２４に記載の方法；
(a)  Brassica napus；
(b)  トウモロコシ；
(c)  ニンジン；および
(d)  Arabidopsis。
【請求項２６】
興味ある精製ポリペプチドを得る方法であって、；前記方法が：
双子葉植物又はトウモロコシ植物である宿主植物細胞をゲノム組み込み条件下でDNA構成体により形質転換することであって、前記DNA構成体が、オイルボディタンパク質(OBP)遺伝子から得られている、図２Aのヌクレオチド−８６７からヌクレオチド１までのヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり貯蔵タンパク質の蓄積に先立って胚発生期に興味あるDNA配列を発現させる転写調節機能を有するヌクレオチド配列、を含む転写調節領域と、前記OBP遺伝子の転写開始部位の５′側に前記遺伝子を種子中で発現させるのに十分な量の前記調節領域を含む前記OBP遺伝子の中に、読み枠を合わせて挿入された興味あるポリペプチドを暗号化する第１のDNA配列を含み、前記DNA配列の発現が前記調節領域により制御されるように前記遺伝子中の部位に前記配列を挿入して、前記DNA構成体が前記植物細胞のゲノムに組み込まれるようにすること；
前記植物を生育させて種子を生産させることであって、これにより興味ある前記ポリペプチドを前記OBP遺伝子の発現生成物と融合したタンパク質として発現させること；
前記種子の細胞からオイルボディを単離すること；
前記オイルボディを粉砕し、これにより前記融合タンパク質を放出させること；
および前記興味あるポリペプチドを精製すること；
を含むことを特徴とする興味ある精製ポリペプチドを得る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は上流DNA配列およびこれらのDNA配列を用いて発生過程の植物種子で遺伝子の発現を制御することならびにこれらのDNA配列の利用に関する。
発明の背景
植物遺伝子発現の研究では発現を制御する要素について種々の一般的結論が得られている。植物には、他の原核生物および真核生物の様な、保存または共通配列が、転写速度調節可能な遺伝子の転写開始部位上流（５′側）に含まれている。真核生物では、これらの配列には、転写開始部位の約25bp５′側に代表的に見出せるモチーフが含まれる。これらは配列TATAA/TAA/Tを有しTATAボックスと称される。このTATAボックスの役割はRNAポリメラーゼIIの転写開始を決定することである。第２の上流配列はCAATボックスと称される。代表的には、この配列は、転写開始部位の約75塩基上流で見出されさらに転写開始頻度の調節に関与する。植物の共通配列はCCAATまたは時にAGGAである場合がある。しかし、これらの他の共通配列はいずれもすべての植物遺伝子に存在する必要はない。転写開始部位の70〜90塩基上流内にあるこれらの配列モチーフおよびそのDNA前後関係はしばしばプロモータと称される。一般に、プロモータ領域の５′側および最も頻繁にはこれらの2,000塩基内ではシスで作用するエレメントであり、プロモータに種々の特性を付与し構造性あるいは非構造性の形式で転写活性を調節することができる。これらのシスで作用する配列はエンハンサ（それらが転写の増加に関与する場合）またはサイレンサ（それらが転写の減少または転写の抑制に関与する場合）と称される。エンハンサおよびサイレンサはしばしば核タンパク質が結合しまたは相互に作用する部位である。この調節核タンパク質はトランスで作用する因子と呼ばれる。これらは非構造的なあるいは調節を受ける発現のために極めて重要であると考えられる。その理由はそれらが特定の組織もしくは器官であるいは外部刺激に対して応答する際遺伝子を活性化する主要な決定因子となる場合があるからである。このタンパク質結合とエンハンサ／サイレンサとの関係で転写活性が決定される。熱、光または内因性ホルモンのような化学物質により活性化されあるいは種子、葉または花のような特定の器官で活性化される遺伝子の単離により発現調節の方法を決定する因子を分析することができる。すべてではないが、多数の研究で、所定の調節を受ける遺伝子からのプロモータおよび任意のシスエレメントと通常そのプロモータと関連のないレポータタンパク質のコーディング配列とを含むキメラ遺伝子の構成体がレポータの調節を受ける発現を上昇させることが示された。種子に特異な形式でまたは発現の他のパターンを必要とする形式で通常発現しない遺伝子の配列を種子で発現させるために種子特異遺伝子からのプロモータを用いることは少数でしか研究されていない。現在までのすべての研究では、種子特異発現用に設計されたキメラ遺伝子は種子貯蔵タンパク質調節シグナルおよびプロモータが用いられている。しかし、発現が実際に胚発生の後期段階で、すなわち胚が（双子葉植物の場合）所定の魚雷型に達した後に開始することは、貯蔵タンパク質遺伝子の発現の研究から明らかである。したがって貯蔵タンパク質が高レベルで発現しそれらの調節がしばしば転写的ではあるが、発現のタイミングおよびレベルがすべての種子に特異的な用途に対しては理想的でない場合がある。オレオシンのような、種子貯蔵タンパク質の特異性とは異なる時間的なある��は細胞内の特異性を有する他の種子特異的プロモータおよびエンハンサを特定することは興味あることである。
関連文献
次に開示する器官または組織特異調節配列は組織または器官特異発現を形質転換植物で生成するのに用いられる。調節を受ける遺伝子発現の今では”古典的な”例をあげる。レポータタンパク質に対するコーディング配列をリブロースビスリン酸カルボキシラーゼを暗号化するエンドウ遺伝子からのプロモータおよび上流配列と融合させ、非種子タンパク質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを光調節および器官特異的形式によりトランスジェニック植物で発現させることができる〔フルーア(Fluhr)、Science(1986)、232：1106〜1112〕。
セングプタ−ゴパラン(Sengupta-Gopalan)等の「Proc.Natl.Acad.Sci.USA、(1985)、82：3320〜3324」にはタバコ植物中での、インゲンマメの主要貯蔵タンパク質、β−ファゼオリンの発現が報告されている。この遺伝子は種子において正しく発現し植物の他の場所では著しく低いレベルしか発現しなかった。しかし、セングプタ−ゴパランにより用いられた構成体はキメラではなかった。天然５′フランキング配列を有する完全β−ファゼオリン遺伝子が用いられた。他の種〔ラドケ(Radke)等の「（1988）Theor.App.Genet.75：685〜694」〕または他の遺伝子〔ペレッツ−グロウ，エル．（Perez-Grau,L.）、ゴールドベルグ，アール．ビー．，（Goldberg,R.B.）の「1989、Plant Cell、１：1095〜1109」を用いたその後の研究ではアラビドプシス(Arabidopsis）およびブラシカ(Brassica)で種子特異形式による発現の忠実度が示された。ラドケ等の(1988)、上記文献は”標識”遺伝子、すなわち、完全なナピン遺伝子に加え非翻訳”標識”を含んでいるものを用いている。
組織および器官特異的発現については、転写開始域の上流配列を用いて、遺伝子操作により植物に導入する遺伝子に組織／器官特異性を与えることができることを示す種々の例がある。例には種子特異遺伝子を調節する操作が含まれる〔ラドケ等の(1988)、上記文献；ブストス(Bustos)等の(1989)、「Plant Cell、１：839〜853」〕。両方の例で、種子タンパク質のコーディング配列の上流配列がレポーター標識（RNAまたはタンパク質としての）に結合しさらに種子特異性がレポータの発現に付与された。これらはオレオシンよりむしろすべての貯蔵タンパク質遺伝子であった。種子貯蔵タンパク質はオレオシンとは異なる時間的発現パターンを有する。
種子特異発現を上昇させることがあるDNAモチーフはその後の多くの研究の目的とされた。マルコッティ(Marcotte)等は〔マルコッティ，ダブリュ．アール．、ラッセル，アイ．エス．（Russel,I.S.）、クワントラノ，アール．エス．（Quantrano,R.S.）、1989、「Plant Cell、１：969〜976」小麦のEm遺伝子を研究して種子特異発現のための共通配列であり得る”Emボックス”と称するモチーフを提案した。興味あることに、EM-2と称されるこれらのボックスの１つは単子葉植物（トリチシン−コムギ）および双子葉植物（β−コングルチニン−ダイズ）からの他の貯蔵タンパク質遺伝子で見出されるものと類似している。ハッゾポウロス(Hatzopoulos)等（1990、「Plant Cell、２：457〜467」）はニンジン脂質ボディタンパク質遺伝子の胚特異発現を起こす配列を研究した。多数のAT豊富なモチーフを確認し、これのモチーフはおそらくDNAse処理中に消化されるのをトランスで作用するタンパク質により防ぐ。しかし、確認されたモチーフは他の種子特異遺伝子のための共通モチーフであることは示されなかった。
デクレルク(DeClercq)等「Plant Physiol.、(1990)、94：970〜979」はArabidopsis 2Sアルブミンのプロモータを用いarabidopsisおよびブラジルナッツ2Sアルブミンからのコーディング配列と結合させた。融合は低い保存を示す領域で行われた。タバコおよびBrassica napusの形質転換は種子特異発現を生じ修飾貯蔵タンパク質の蓄積を修正した。発現のレベルはすべての細胞タンパク質の0.05％〜0.3％であった。
外来配列のこの種の種子特異発現の他の例は、種子におけるロイエンケファリンの発現である。種子特異発現を得るために、2Sアルブミンを暗号化するキメラDNA配列およびロイエンケファリン（ペンタペプチド）を暗号化する短いオリゴヌクレオチドが天然タンパク質の第６および第７システインの間のアルブミンコーディング配列に含まれる〔バンデルケルホフ(Vanderkerhove)等の「Bio/Technology、(1989)７：929〜932〕。さらにこの遺伝子は種子特異形式により発現し種子のg当たり50ｎモルまでロイエンケファリンを蓄積する。
オイルボディタンパク質とこれらと関連する上流領域を暗号化するゲノムクローンが２種、メイズ〔トウモロコシ、ボウマンバス(Bowman-Vance)およびフアング(Huang)、「(1987)J.biol.Chem.、262：11275〜11279」；およびキュ(Qu)およびフアング、「(1990)J.biol.Chem.、265：2238〜2243〕ならびにニンジン〔ハッゾポウロス等の「(1990)Plant Cell、２：457〜467」について報告されている。またcDNAおよびゲノムクローンが１種の培養脂肪種子、Brassica napus〔マーフィ(Murphy)等の「(1991)Biochem.Biophys.Acta、1088：86〜94」；ならびにリー(Lee)およびフアングの「(1991)Plant Physico 96：1359〜1397」〕について報告されている。発生過程の種子でのこれらオイルボディタンパク質遺伝子の発現には種々の報告がある。トウモロコシの場合には、オイルボディタンパク質アイソホルムを暗号化する遺伝子の転写が種子の発生の極めて初期に始まり受粉後18日で容易に検出された。双子葉植物のような非内乳種子では受粉後。双子葉植物、Brassica napus（カノーラ）のような非内乳種子では、オイルボディタンパク質遺伝子の発現は発生過程の種子ではコーンより一層遅延して起こると思われる〔マーフィ(Murphy)等の「(1989)、biochem.J.、258：285〜293」〕。
発明の開示
種子特異形式で異種遺伝子を発現させるオイルボディタンパク質の転写調節配列および随意に付随する５′非翻訳リーダ配列を活用するための方法および組成物を説明する。方法には調節配列および調節配列の本来のオープンリーディングフレーム以外のDNA配列を含むDNA構成体で植物細胞を軽質転換させ、形質転換細胞から植物を生じさせ、種子が形成され調節領域の転写制御の下にDNA配列が発現する条件下にこの植物を増殖させる工程が含まれる。これらの配列は種子が生む生成物(seed-borne product)の発現が改良され、増強されまたは抑制されるのに必要な分野で有用となる。またこれらの方法を用いて外来タンパク質を含む改良種子を生成させ種子の本質的価値を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
図１はオレオシン調節配列、開始コドン、発現させる外来DNAオレオシンターミネータおよびアンピシリン耐性遺伝子を含むベクターpPAW4を示す。
図2Aは18KDaのオイルボディタンパク質を暗号化するArabidopsisゲノムクローンのDNA配列を示す。オープンリーディングフレームには短いイントロン（印を付した）が介在し２つのエキソンが翻訳されその際のIUPAC一文字アミノ酸コードを示す。
図2BはArabidopsis 18KDaオイルボディタンパク質コーディング配列を含むアグロバクテリウムEMBL3ゲノムライブラリからの制限フラグメントを示す。コーディング領域のおおよその位置を強調している。
図３はすべてのRNAをノザンブロット分析しオレオシンmRNAの発生過程の発現に対する10μMのABAの作用を示す。A)プローブとして50ng32PdCTP標識0B990（比活性109dpm/μgDNA）を用いた（レーン当たり70μg）。心臓型(H)：（13日）、魚雷型(T)（17日）、および子葉型(C)（21〜25日）段階の小胞子誘導胚を48時間10μM ABAで処理（＋）および未処理（−）。ブロットを70℃で20分間コダックXAR5フィルムに曝した。種々のレーンで明らかに異なったサイズのmRNAは種々のmRNA調製物中のデンプン量の影響である。すべてのレーンは0D 260測定およびEtBr染色により判定するのに等しく負荷した。B)図3Aのものを4.5時間曝した。C)デンシトメータを走査することにより決定したmRNA蓄積の相対強度。
図４はオレオシンの組織特異性を示す。根(R)、カルス(Ca)、子葉(Co)、葉(L)、および24日開花後接合子胚(E)の50μgポリ(A)+RNAを50ngの32PdCTP標識0B990（比活性108dpm/μgDNA）を用いて探索した。
図５はABAの使用に対する発生過程のオイルボディタンパク質剛性感受性を示す。評価された10,000dpmを対照（レーンＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）およびABA処理（レーンＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）の一組の試料について１つのウエル当たりに負荷した。すべての試料を２日間ABAで処理し、ついで1.85MBq/mL[35S]メチオニンで４時間標識した。レーンＡおよびＢの、10日培養物を62μmのスクリーンでふるい分け球形の胚を得た。レーンＣおよびＤの、13日培養物を125μmのスクリーンでふるい分けハート段階の胚を得た。レーンＥおよびＦの、17日培養物を250μmのスクリーンでふるい分けトルペドから初期の子葉までの胚を得た。レーンＧおよびＨの、25日培養物を500μmのスクリーンでふるい分け子葉段階の胚を得た。
発明の詳細な説明
本発明によれば、種子、特に胚発生の初期相で、植物表現型を調節することができるDNA構成体を提供する。このDNA構成体は種子において転写を調節するために、後期球状段階から胚成熟（子葉型段階）までの活性遺伝子からの５′非翻訳配列を用いる。オイルボディタンパク質遺伝子の下流域およびその転写開始調節下の開始領域は植物細胞のゲノムに転写カセットを結合することができるよう調製される興味あるDNA配列である。種子特異転写開始領域の下流にある多数のクローニング部位が結合構成体を効果的な形式で種々のDNA配列として用いることができるように含むのが有用である。
特にオイルボディタンパク質遺伝子、好ましくは双子葉植物オイル種子で発現されるオイルボディタンパク質遺伝子の調節配列は興味深い。オイルボディタンパク質はオイル（トリアシルグリセリド）または貯蔵タンパク質よりかなり遅く蓄積することが報告されている。この遅延発現は胚発生の初期相中に遺伝子の発現を改良するのに任意のプロモータを用いることができないので種子特異発現についてこれらの遺伝子と関連するこれらプロモータの価値を限定する。しかし、驚くべきことに、双子葉植物の脂肪種子中のこれら遺伝子の発現が従来信じられているものより著しく早く起こることが見出された。したがって、これらの遺伝子のプロモータおよび上流要素は貯蔵タンパク質の蓄積に先立つ胚発生の相中の代謝を改良することを含む種々の用途に有用である。
オイルボディタンパク質は分類学上の種々の広範な種で確認されている〔例えば、モレアウ(Moreau)等の「Plant Physiol.(1980)、65：1176〜1180」；キュ等の「Biochem.J.、(1986）23557〜65」を参照〕。これらのタンパク質はオイルボディに特異的に局在し栄養組織の細胞小器官に見出されない。Brassica napus（ナタネ）では発生過程の種子のオイルボディに関連する少なくとも３種のポリペプチドが存在する〔テイラー等の「(1990)、Planta、181：18〜26」〕。オイルボディ関連タンパク質の数およびサイズは種によって異なる場合がある。例えば、トウモロコシでは、オイルボディに見出される免疫学的に区別される４種のポリペプチドが存在する〔ボウマンバンスおよびフアング、「1988、J.biol.Chem.、263：1476〜1481」。オレオシンは交互に親水性、疎水性および親水性領域を含むことが示された〔ボウマンバンスおよびフアング、「1987、J.biol.chem.、262：11275〜11279」。トウモロコシ、ナタネおよびニンジンからのオレオシンのアミノ酸配列が得られた。キュおよびフアング、「1990、J.biol.chem.、265：2238〜2243」、ハッゾポウロス等の「1990、Plant Cell、２：457〜467」をそれぞれ参照。ナタネのような脂肪種子では、オレオシンはすべての種子タンパク質の８％（テイラー等の「1990、Planta、181：18〜26）〜20％（マーフィ等の「1989、biochem.J.、258：285〜293」含む場合がある。かかるレベルは多く種子貯蔵タンパク質について見出されるものに一致する。
初期胚発生に関連する転写開始領域、特に貯蔵タンパク質の期間先行発現は、種子の初期発生において、この領域が興味あるDNA配列の転写を所望のレベルにするので特に興味深い。通常の植物胚発生は代表的に一連の決まった相を通して進行する。双子葉植物種子については、胚発生は次の相を含む：球状段階、心臓型段階、魚雷型段階、および子葉型段階。この分野のためには、これらの用語の定義がレイ(Ray)、スティーブス(Steaves)、およびフルツ(Fultz)により「Botany、(Saunders College Publishing)、17章、294頁」に記載されている。通常、転写開始領域は種子の形成初期に発現される遺伝子から得ることができる。転写開始領域は後期球状段階から子葉型段階までその活性を保持するのが望ましく、さらに胚発生の球状段階から心臓型、魚雷型および子葉型段階まで活性に維持するのが好ましい。得ることができるとは天然のオイルボディタンパク質遺伝子転写開始領域配列に十分に類似したヌクレオチド配列を有する転写開始領域が種子の形成初期の転写のために提供されることを意味する。この配列は自然に発生させる、合成するあるいは部分的に合成してもよい。
オイルボディタンパク質からの転写開始領域は一般に転写の５′〜３′方向に、転写開始領域、興味あるDNA配列および転写終結領域を含むカセットに提供され、このカセット中で転写調節領域を実施可能に結合し植物細胞中で機能させる。また１種以上のイントロンを存在させてもよい。各操作後に、最終的構成体で用いるDNAを限定し最終的構成体で用いる他のDNAに実施可能に結合し、それぞれの部分的構成体を同一または異なるプラスミド中でクローニングすることができる。好適例では、適合する制限部位を有するコーディング配列をオイルボディタンパク質遺伝子のコドン番号１に対応する位置に結合させることができる。この置換の概略図を図１に示す。組換えコーディング配列がオイルボディタンパク質遺伝子のコーディング配列を完全に置き換えその３′末端でオイルボディタンパク質遺伝子ターミネータおよびポリアデニル化信号により保護されるような方法で挿入することができる。あるいはまた、ポリメラーゼ鎖成長反応による増幅を行って制限部位により有効に保護された転写開始領域を含むDNAフラグメントを生成することができる。これらの増幅したフラグメントは、興味あるポリペプチドのためのコーディング配列に、転写または翻訳融合において結合し、例えば、興味のあるポリペプチドのコーディング配列がPCR増幅フラグメントの転写開始領域の制御下に転写されるキメラ遺伝子を生成することができる。
転写開始領域は宿主細胞に対し天然のものあるいは相同のもの、または宿主細胞に対し外来のものもしくは異種のものでよい。外来とは転写開始領域が転写開始領域を含む構成体が挿入される野生型宿主に見出されないことを意味する。一般に、調節配列はオイルボディタンパク質遺伝子の翻訳開始の５′側に1.5KbまでのDNAを含む。この配列は所望のタンパク質の最初のコドンに対応する位置で特定部位の突然変異誘発により〔クンケル  ティーエー(Kunkel TA)の「Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82：488〜492」〕または適当な制限部位がN-末端コドン近くで見出される場合連結させて有用なリンカーオリゴヌクレオチドを導入することにより改良することができる。
若干の場合融合タンパク質、特にオイルボディタンパク質と融合するタンパク質として興味あるDNA配列を発現させるのが好ましい。興味あるDNA配列を通常の技術によりオイルボディタンパク質コーディング配列に挿入することができ、オイルボディタンパク質コーディング配列とともにフレーム中で、キメラ遺伝子の転写が融合タンパク質を生成させる。融合タンパク質は図２Ａに示すようなArabidopsisオイルボディタンパク質のアミノ酸44〜122のためのコーディング領域、またはArabidopsis以外の種のオイルボディタンパク質からの同等の領域を含み、このことが望ましい場合オイルボディに輸送するために提供するのが好ましい。
他の種からオイルボディタンパク質コーディング配列を単離するために、少なくとも２つの方法を用いることができる。第１の方法は他の植物のゲノムライブラリー中のプローブとして実施例に記載のArabidopsisクローンを用いることである。このクローンは密接に関連する種、特に、本質的にすべてのアブラナ科植物からのオレオシンクローンと良好にハイブリダイゼーションする。Arabidopsisとは進化論的に異なる種、例えば、ナス科、マメ科およびすべての単子葉植物に対し、他の方法にはArabidopsisクローンのようなオレオシンクローンの遺伝子生成物に対して生じた抗体の利用が含まれる。この抗体は、例えばλgt11を用いて種子誘導cDNA発現ライブラリをスクリーニングするのに用いることができる；ヒューン(Huynh)等の(1985)「cDNA Cloning、Vol.1、A Practical Approach、Ed. Grover IRL Press、pp. 49〜78」。この方法により新しい種のオレオシンのcDNAクローンを得て次いで標準的DNAハイブイダイゼーション技術を用いてその種のゲノムライブラリをからゲノムクローンを単離するのに用いることができる。
興味あるDNA配列は興味あるペプチド、例えば、酵素またはゲノム配列と相補的な配列を暗号化する任意のオープンリーディングフレームでよく、このゲノム配列は少なくとも１種のオープンリーディングフレーム、イントロン、非コーディングリーダ配列、または相補的配列が転写、mRNA処理、例えばスプライシングもしくは翻訳を阻害する任意の他の配列でよい。興味あるDNA配列は合成し、天然のものから誘導しあるいはそれらを組み合わせることにより合成することができる。興味あるDNA配列の性質に依存して、植物に好ましいコドンを有する配列を合成するのが望ましい場合がある。植物に好ましいコドンは特定の興味ある種で最も多くの量発現されるタンパク質に最も高い頻度で現れるコドンから決定することができる。
興味あるDNA配列は任意の多種組換えタンパク質を暗号化する場合がある。この方法により発現することがある組換えタンパク質の例には抗凝固物質、例えばヒルジン、インターロイキン群のもののようなリンフォカイン、ゴナドトロピン関連ホルモンのようなペプチドホルモン、多鎖または単鎖抗体のような免疫学的反応物質およびプロテアーゼ、リパーゼおよびポリグルカン加水分解酵素のような多種の産業上有用な酵素が含まれる。
用いる終結領域は第１に便利なものである。その理由は終結領域が比較的交換可能であると考えられるからである。終結領域は興味あるDNA配列とともに天然のものでよく、あるいは他の供給源から誘導してもよい。有用な終結配列は入手可能でオイルボディタンパク質遺伝子ターミネータの３′末端および５′調節領域が得られる同一の遺伝子からのポリアデニル化信号を含む。あるいはまた、異なるターミネータおよびポリアデニル化信号、例えば、Agrobacteriumのノパリン合成遺伝子のターミネータを用いて、同様の結果を得ることができる。
発現カセットは他に形質転換細胞の確認および／または形質転換細胞の選択のための手段を含む場合がある。例えば組換え遺伝子は構造上発現する選択可能なマーカ、例えば抗生物質耐性もしくは除草剤耐性またはバイオルミネセンスもしくは着色特性を形質転換細胞に付与する遺伝子のような、スクリーニング可能なマーカのための遺伝子と結合することができる。
５′末端でオイルボディタンパク質プロモータによりおよび３′末端でターミネータにより保護された興味あるDNA配列はAgrobacterium Tiもしくはバイナリープラスミド、またはマイクロインジャクション、エレクトロポレーション、PEG媒介取り込みもしくはバイオリスティック法を介して植物細胞にDNAを直接取り込むのに用いるための単一クローニングプラスミド（例えば、pUC19、pBR322）を含む適当な形質転換ベクターに導入することができる。これらの方法は植物形質転換の分野の当業者によく知られている。例えば、ホルシュ(Horsch)等の「(1985)、Science、227：1229〜1231」；ニューハウス(Newhaus)およびスパンゲンベルグ(Spangenberg)の「(1990)、Physiol.Plant、79：213〜217」；およびサンドフォード(Sandford)等の「(1990)、Physiol.Plant、79:206〜209」を参照。
形質転換植物は形質転換法を両立する標準的再生プロトコル〔例えば：モロネイ(Moloney)等の「(1989)、Plant Cell Rep.、８：238〜242」を参照〕を用いて形質転換細胞から得ることができる。
上述のように構成した、発現カセットは発生過程の種子で本質的に優先して発現する。したがって適当な融合ペプチドで形質転換した植物細胞を通常の方法により植物体に成長させ種子を実らせることができる。例えば、マックコーミック(McCormick)等の、「Plant Cell Rep.(1986)５：81〜84」を参照。２以上の世代を成長させ同一の形質転換株または異種の株と授粉し、所望の表現型特性を有するハイブリッドが得られたことを確認して、目的の表現型が安定に維持され遺伝することを保証し次いで種子を興味あるペプチドの単離または新規な表現型特性を有する種子を提供するのに用いるために収集する。次に再生植物を非組換え植物と同様に生育チャンバ、温室または農場で培養しmRNAのレベルおよびしばしばポリポエプチドまたはタンパク質のレベルで組換え遺伝子の種子特異発現を示す。
ポリペプチド／タンパク質がそれ自体有効であり得これを抽出しさらに、所望の場合、なお一層精製することができる。あるいはまたポリペプチド／タンパク質またはmRNA自体を用いて発生過程の種子に新規な生化学的表現型を付与することができる。新規な表現型には種子タンパク質または種子油組成を変化させ、予め存在する所望の生成物または特性を高めおよび望ましくない遺伝子生成物をアンチセンス、リボザイムもしくは同時抑制技術〔イザント(Izant)およびウェイントラウブ(Weintraub)の「(1984)、Cell  36：1007〜1015」、アンチセンス；ハゼルホフ(Hazelhoff)およびゲルラッハ(Gerlach)の「(1988)、Nature 334：585〜591」、リボザイム；ナポリ(Napoli)等の「(1990)、Plant Cell、２：279〜289」、同時抑制〕を用いて抑制するような変更を含むことがある。
形質転換を行い抽出する必要がある新規種子タンパク質またはペプチドを生成する場合、低濃度の界面活性剤、例えば変性を起こさない量のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、トリトンX-100、ツイーン20、MEGA-8または所望のタンパク質を不可逆的に不活化しないことが知られている他の任意の界面活性剤を用いまたは用いずに水溶液抽出により行うことができる。タンパク質またはポリペプチドを抽出するために、乾燥種子を手であるいは機械的な粉砕機で粉砕してスラリ水溶液または懸濁水溶液を生成する。これは50,000Ｘgのような遠心分離により３相に分離する（粒子、水溶性物質、および疎水性物質）。生成物の性質に応じて、これらの相のそれぞれをさらに精製しその後可溶化し、硫酸アンモニウムを用いて選択的に沈澱させあるいはカラムクロマトグラフィー、例えば、イオン交換、ゲル濾過またはアフィニティ媒体を用いて精製することができる。
ここに記載した調節配列のための理想的な宿主はアブラナ科植物であるが、遺伝子の比較的高い保存オレオシンを与える広範な種類の植物種でこれらのプロモータを用いることができる。これらのプロモータを使用する主な障壁は単子葉植物と双子葉植物種の間にある。単子葉植物でこの特異的発現を含む形質転換には、単子葉植物オレシン調節配列を用いる必要がある。双子葉植物種子特異発現には、双子葉植物オレオシン調節配列を用いる必要がある。記載した配列を広範な種類、一般にBrassica属およびアブラナ科のすべての種類を含む双子葉植物で用いることができる。またナス科植物、例えばタバコおよびトマトはこれらの配列を認識し発生過程の種子で発現の正しい調節を示す。
所望のタンパク質をすべての胚組織で発現できるが、異なった細胞内発現を胚軸および子葉の種々の組織で検出することができる。本発明は変化させたポリペプチドもしくは新規組換えペプチドの蓄積により、または代謝工程の結合もしくは削除により植物種子の本質的価値を改良することを含む、種々の用途を有する。この最も簡単な例では、本発明の使用によりタンパク質の質を改良する（例えば、必須または微量アミノ酸の濃度を高める）ことができ、脂肪酸組成を変更することにより脂質の量を改良し、または炭水化物組成を改良しあるいは高めることができる。実施例にはハウチワマメまたはブラジルナッツで見出されるようなイオウを豊富に含むタンパク質を、含硫アミノ酸基が不足する種子で発現させることが含まれる。あるいはまた、トリグリセリド（貯蔵脂質）の脂肪酸比を変えることができる脂肪アシルコエンザイムＡ(COA)トランスフェラーゼ酵素を発現させることができる。組換えタンパク質を種子中に蓄積させる場合、さらにタンパク質は医薬として、産業上または栄養的価値を有するペプチドでよい。この場合には、ペプチドは種子から抽出され、意図した用途に適当なものとして、粗または精製形態で使用することができる。タンパク質は植物界に全く外来性のもの、例えば動物ホルモン、酵素、リンフォカイン、抗凝固物質などの種子中で発現することができるものでよい。異種タンパク質はその後種子から抽出することができ部分的にまたは完全に精製した後実験、栄養または医薬の目的に用いることができる。
次に示す実施例は例示として提供したものでこれに制限されるものでない。
実  施  例
実施例１
Arabidopsisからのオイルボディタンパク質遺伝子をファージλEMBL3A中のArabidopsis thaliana v．コロンビアゲノムライブラリからのクローンに存在する15kbの挿入物においてB. napusオレオシンクローンとハイブリダイゼーションさせることにより単離した。オレオシンタンパク質翻訳開始領域の約868塩基対５′側を含む1.8kbフラグメントをプラスミドベクターにサブクローニングした。Arabidopsis 18KDaオレオシン遺伝子をpPAW4（図１参照）と称されるベクター中のNcolおよびKpn1部位により保護された1803bpのフラグメントとして適切にクローニングする。種々の外来／他の遺伝子を用いる一般的用途用にそのフラグメントを発現カセットに改造するために、２種の改良を行う必要がある。第１に、部位特異的突然変異誘発（クンケル、前記文献）を用いて−２、−１および＋４位置の突然変異を不適正オリゴヌクレオチドにより導入する。必要な突然変異はＡからＴ（−２）、ＡからＣ（−１）およびＧからＡ（＋４）である。これらの突然変異は−２〜＋４位置にBspH1部位を作成する作用を有する。BspH1部位(T/CATGA)にはATG開始コドンが含まれNco1切断に一致する中断した末端を与える。第２の改良には天然のオレオシンのコーディング配列のほとんどを含む658bpフラグメントを放出するEcoRVおよびMsc1による消化が含まれる。このことは切断部位に平滑末端を生じさせ、ベクターおよびEcoRV-Msc1フラグメントからの補足的な配列の分離に際し、ベクタ−プロモータ−ターミネータ結合を再環状化することができる。この再環状化は元の1803Kbフラグメントに見出せない制限部位を含むオリゴヌクレオチドリンカーの存在下に行う。
再環状化の際に、オレオシン遺伝子のすべての上流配列、転写開始部位およびBspH1部位に付着させた開始コドンを含むプラスミドを得た。この下流31塩基は１種以上の独特の制限部位を含む短いポリリンカーである。任意のDNA配列をこのカセットに導入するために外来配列は開始ATG位置にBspH1またはNco1部位を有するか、または含むよう改良する必要がある。タンパク質として発現すべき配列について、これらは”キャップ”部位と開始コドンとの距離の維持を保証する。
挿入すべきDNA配列はプラスミドでは見出されない制限部位の付着端で終結させる必要がある。発現カセットに介在させたポリリンカーをこの部位を用いて選択することができる。BspH1でおよび外来配列の３′末端のための適当な制限酵素を用いてプラスミドを消化することは所望のDNAフラグメントの指向的なクローニングに影響を及ぼすことができることを保証する。適当な連結条件を用いることにより、BspH1および所望のDNAフラグメントと一致する部位を有するプラスミド発現カセットを相互にインキュベーションし図１に示すような連結した生成物を生成する。
次にNco1−Kpn1からの完全な構成体を刺激し、Agrobacteriumプラスミドのような適当な植物形質転換ベクターに導入する。Bin 19のような通常のAgrobacteriumプラスミド〔ベバン(Bevan)の「Nucl.Acid Research(1984)、12：8711〜8721」に構成体を導入するために、プラスミドpPAW4に１種の付加的制限部位を用いることが必要になる場合がある。１つのモデルにおいてプラスミドはSma1およびKpn1を用いて切断することができる。次に得られた精製フラグメントをKpn1オリゴヌクレオチドリンカーに連結しさらにKpn1で消化した。これはBin 19に導入する非指向的Kpn1フラグメントを提供する。あるいはまた、この構成体をKpn1およびBamH1で刺激し同一の制限酵素で切断する前にpBIN 19に指向的に連結する。得られたAgrobacteriumバイナリープラスミドを３分節系交配〔ディッタ(Ditta)等の「(1980)、PNAS、77：7347〜7351」〕またはコンピテントAgrobacteriumのDNA形質転換〔アン(An)の「(1988)、Plant Mol.biology Manual、A3  １〜19、Kluwer Academic、Dordrecht、Netherlands」〕により武装解除したAgrobacterium株に移動させる。
組換えBin 19を有するAgrobacteriumを用いて任意の可能な植物、例えば、Brassica sp.を標準組織片同時培養により形質転換する〔ホルシュ等の、前記文献〕。形質転換した細胞をカナマイシンを含む培地で、pbin 19のT-DNA周辺の間にも含まれる同時トランスファ抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）を用いて選択する。これらの形質転換細胞を誘導し標準法により植物体に再生する〔例えば、ナタネのような脂肪種子。モロネイ等の「Plant Cell Rep.、(1989)、８：238〜242」を参照〕。再生植物は花を付けさらに自家受粉（または他家受粉でもよい）することができる。構成体の外来DNAが翻訳し得る生成物を暗号化する場合、この生成物を成熟種子の抽出水溶液、その後の遠心分離（100,00Ｘgで30分）によるスラリーの画分から単離することができる。所望の生成物に依存して、得られた３種の相の任意の１種を分割することができる。この生成物はペレットとして、水溶液相としてまたは遠心分離した試料の表面で油膜として局在する場合がある。
あるいはまた、生成物を抽出する必要がない場合がある。それは発現の目的が種々の代謝を変更することにあり従って種子の表現型が変化する（例えば、種子のサイズまたは色を変え、種子の脂肪酸基の比を変化させまたは種子をあまり有用でないものにしあるいは有効でないものにする特定の代謝工程を禁止することである）。かかる代謝工程には存在すると種子の価値または望ましさを低下させる反栄養副産物の生成が含まれる場合がある。かかる場合、種子、それ自体、単に通常の方法にしたがって収集され用いられる。
実施例２
操作可能にβ−グルクロニダーゼ(GUS)のコーディング配列に結合したArabidopsisオレオシン遺伝子の５′転写開始領域からの種々の量のDNA配列を含む多数の構成体をPCR法を用いて調製した。これら構成体は含まれるオレオシン５′領域の量にしたがって命名されている、例えば、2,500構成体は約2,500塩基対のオレオシン５′領域を含む。これら構成体をBrassica napusおよびタバコに導入し、β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現を以下に詳細に記載したように測定した。５種の形質転換Brassica napus植物中の構成体、2,500、1,200、800、600および200構成体のGUS発現結果を表Ｉに示す。陰性対照（形質転換していない植物）も示す。形質転換タバコ植物中の２種の構成体、2,500および800構成体のGUS発現結果を表IIに示す。表IIIはトランスジェニック胚中のオレオシンプロモータの発現発生タイミングを示す。
これら構成体は制限酵素消化、連結およびポリメラーゼ鎖成長反応(PCR)を含む標準分子生物学的技術を用いて作製した。用いた技術の例示として、800構成体の作製を詳細に説明する。
GUSコーディング配列に結合するのに構造的に適したArabidopsisオレオシン遺伝子の５′転写開始領域からの約800塩基対を含むDNAフラグメントを得るために、PCR法を基とした方法を用いた。これには発現分析に望まれる正確な配列を増幅するためにポリメラーゼ鎖成長反応の使用が含まれる。必要なPCR増幅を行うために、次の配列を有する２種のオリゴヌクレオチドプライマを合成した〔ミリゲンバイオサーチ(Milligen-Biosearch)、Cyclone DNA synthesizer〕：
0003660354.tif 000002
斜体の塩基は図２Ａに示した配列のヌクレオチド位置-833〜-817に対応する。このプライマ中のこの配列の追加のヌクレオチド５′側はオレオシン遺伝子と一致しない、しかし、増幅生成物の５′末端にPst1部位を配置するために含む。Pst1部位は下線を付した。
第２の（３′）プライマを次の配列を有するように合成した：
0003660354.tif 000003
このプライマには図２Ａに記載した塩基-13〜-30配列と正確な相補的な（斜体で示す）配列を含む。また、５′末端にさらに13塩基が含まれる。この配列はオレオシン遺伝子と相補的でないが、増幅生成物の３′末端に、２種の（オーバラッピング）制限部位、Sma1およびBamH1を提供するのに添加され、PCRフラグメントのクローニングを促進する。
これら２種のプライマをPCR増幅反応に用いて５′末端でPst1部位、３′末端でSam1およびBamH1部位を有するオレオシン遺伝子の−833〜−13ヌクレオチド配列を含むDNAフラグメントを作製した。PCR増幅は酵素Taqポリメラーゼ(Perkin-Elmer-Cetus社製）を用い、酵素製造会社により推奨された条件を用い、92℃（変性）１分、55℃（アニーリング）１分および72℃（エロンゲーション）１分の温度プログラムで行った。テンプレートは図２Ｂ、パネル上部、に示すオレオシンゲノムクローンであり、これは元のλライブラリ中に単離体が約15キロベースのArabidopsis DNAを含む。
増幅生成物（OLEO p800）を0.7%のアガロース上でゲル精製し、ボゲルスタイン(Vogelstein)およびギレスピ(Gillespie)のガラスビーズ法(Preparative and analytical purification of DNA from agarose.「Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1979 76：615〜619」）を用いて回収しPst1で消化した。消化した生成物をゲル精製しDNAポリメラーゼ  クレノウフラグメントを用いて末端を満たしSma1で切断して平滑端を生成する。これはpUC19のSma1中でクローニングされプラスミドpUC OLEOp800を生じた。挿入体（図２Ｂに示す−649に対応する位置）中のAcc1部位不斉位置を用いてpUCベクターへの挿入を両方向で選択することができた。挿入体を有するクローンが配向するので増幅フラグメントの５′の最末端（転写の方向）はpuC19クローニングベクター中の独特のHindIII部位に近くさらに増幅フラグメントの３′の最末端はpUC19クローニングベクター中の独特のEcoRI部位に近い。
次に得られたプラスミドをBamH1で切断してBamH1部位により保護されたフラグメントOLEOp800を生成した。このフラグメントBamH1−OLEO800をHspGUS1559と称するBamH1消化プラスミドのBamH1部位中でクローニングする。HspGUS1559はAgrobacterium中のバイナリベクターとして用いられ、熱ショックプロモータ（BamH1部位により保護された）、β−グルクロニダーゼオープンリーディングフレームおよびノパリンシンターゼターミネータ〔pB1221から誘導した、ジェファーソン  アールエー(Jeffersonn RA、「クローニングベクター1988、Eds.Pouwels P.,Enger−WALK BE,Brammer WJ.,ELSEVIRE Science Pub BV,Amsterdam section VII,Aill」を含む挿入体を用いてベクターpCGN 1559〔マクブリッジ(MacBride)およびサマーフェルト(Summerfeldt)の「1990、Plant Molecular biology、14、269〜276」〕から誘導した。HspGUS1559のBamH1消化により熱ショックプロモータが放出しその場所に任意の他のBamH1フラグメントが挿入される。BamH1−OLEOp800フラグメントをこの部位に連結してAgrobacterium pOLEOp800GUS1559を得る。このプラスミドを用いてE. coliを形質転換し増幅したプラスミドを上述したような〔ロガーズ(rogers)等の「1988、Plant Molecular biology Manual、A2：１〜12、Eds.Gelvin S. and Schilperoort,R. Kluwer Academic、Dordrecht、Netherlands」〕エレクトロポレーションによりAgrobacterium（EHA 101株）に導入した。
得られたAgrobacterium株(EHA 101×p0LE0p800GUS1559)を用いてBrassicanapus植物をモロネイ等の方法〔モロネイ，エム．エム．、ウォーカー，ジェイ．エム(Walker,J.M.）、シャルマ，ケイ．ケイ．（Sharma,K.K.）の「(1989)、Plant Cell Reports、８：238〜242」〕によりまたはタバコ植物をホルシュ等の方法〔ホルシュ等の「Science (1985)、227：1299〜1302」〕により形質転換した。得られたトランスジェニック植物に種子を実らせ、さらにGUS発現アッセイ〔ジェファーソン，アール．エー．の「(1987)、Plant Mol.Biol.Rep．５、387〜405」〕を発生過程の種子について、および対照として非再生性の植物部分について行った。記載したGUS発現は約５種の異なるトランスジェニック植物のそれぞれからおよそ５種の種子から得た平均値である。
他の構成体は−2,500フラグメント、−1,200フラグメント、−600フラグメントまたは−200フラグメントを増幅するために適切なプライマを用いて上述のものと同一のPCR法により調製した。Brassica napusでGUS酵素の比活性としての結果を表Ｉに示す。タバコの結果を表ＩＩに示す。
これらの結果は800構成体に用いた−833〜−813のオレオシンフラグメントがトランスジェニックBrassica napusの胚で心臓型階段のような早い時期にレポータ遺伝子の種子特異的発現を指示するのに十分な情報を含み、ArabidopsisオレオシンプロモータがArabidopsis以外の植物で転写を指示することができることを示す。またこれらの試験はこのプロモータ構成体に存在する配列が転写において、アブシジン酸の添加に応じた天然オレオシンプロモータの特性を高めるために必要なシスエレメントを含むことを示す。
ここで説明した種子特異発現がオレオシン遺伝子の３′末端の天然ターミネータとの相互作用に依存しないことに注意する必要がある。この例では、３′オレオシンターミネータをAgrobacteriumのノパリンシンターゼ遺伝子から誘導したターミネータにより置換した。したがって、800構成体の配列は付随的な配列と無関係に所望の発現プロファイルを作動させるのに十分である。
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この明細書に記載したすべての文献および特許出願は個々の文献および特許出願が参考として記載するために本質的にさらに別々に指摘された場合と同一の範囲に対して参考として組み入れる。
本発明は十分に記載されており、当業者であれば添付した請求の範囲の真意または範囲を逸脱することなく種々の改良および変更を行うことができることは明らかである。
配列表
(1) 一般的情報：
(i) 出願人：
(A) 名称：ユニバーシティ  テクノロジ  インターナショナル、インコーポレーション
(B) 通り：ノースウエスト州、2,500ユニバーシティ  ドライブ、ES620
(C) 都市：カルガリー
(D) 州：  アルバータ
(E) 国：  カナダ
(F) 郵便番号：T2N 1N4
(G) 電話：403-220-5261
(H) テレファックス：403-289-9311
(A) 氏名：マウリス  エム．、モロニー(Moloney,Maurice M.)
(B) 通り：ノースウエスト州、131エッジヒル  プレース
(C) 都市：カルガリー
(D) 州：  アルバータ
(E) 国：  カナダ
(F) 郵便番号：T3A 2S4
(ii)発明の名称：調節シグナルとしてのオイルボディタンパク質シス要素
(iii) 配列の数：３
(iv)通信先：
(A) 受信人：スマート  アンド  ビガー(Smart & Biggar)
(B) 通り：メトカルフェ  ストリート900−55
(C) 都市：オタワ
(D) 州：  オンタリオ
(E) 国：  カナダ
(F) 郵便番号：K1P 5Y6
(v) コンピューター判読可能形態：
(A) 媒体形式：3.5″ディスケット、1.44 Mb
(B) コンピューター：IBM PS/2モデル50Zまたは55SX
(C) オペレーティングシステム：MS-DOS（バージョン5.0）
(D) ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン5.1）
(vi)本出願のデータ：
(A) 出願番号：PCT/CA/93/00141
(B) 出願日：02/04/93
(C) 分類：
(vii) 前出願のデータ：
(A) 出願番号：07/862,355
(B) 出願日：1992年４月２日
(A) 出願番号：CA92/00161
(B) 出願日：1992年４月15日
(A) 出願番号：07/659,835
(B) 出願日：1991年２月22日
(viii)代理人／代行業者の情報
(A)氏名：ジョイ  ディーー．、モロー(Morrow,Joy D.)
マイケリン  エル．、グラベレ(Gravelle,Michelone L.)
デビッド  エル．コーン(Conn,Devid L.)
(C) 参照番号：75236-1-
(iv)遠距離通信情報：
(A) 電話：(613)232-2486
(B) 電話ファックス：(613)232-8440
(C) テレックス：053-3731
(2) 配列番号：１の情報：
(i) 配列特性：
(A) 長さ：1803
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の型：二本鎖
(D) トポトジー：直線
(xi)配列の記載：配列番号：１：
0003660354.tif 000007
0003660354.tif 000008
(2) 配列番号：２の情報：
(i) 配列特性：
(A) 長さ：22
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の型：二本鎖
(D) トポトジー：直線
(xi)配列の記載：配列番号：２：
0003660354.tif 000009
(2) 配列番号：３の情報：
(i) 配列特性：
(A) 長さ：31
(B) 種類：核酸
(C) 鎖の型：二本鎖
(D) トポトジー：直線
(xi)配列の記載：配列番号：３：
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【図１】
0003660354.tif 000011
【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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