(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）から（c）のいずれかを有効成分として含有する、根の重力屈性刺激応答を改変するための薬剤。
(a)  以下の(i)または(ii)に記載のタンパク質をコードするDNA
(i)  配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(ii)  (i)に記載のタンパク質において、10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)  配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA若しくはその一部に対するアンチセンスDNA
(c)  (a)または (b)に記載のDNAを含むベクター
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の根の重力屈性刺激応答に関与する遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の根は重力が作用する方向に伸長し、この過程は重力屈性刺激応答と呼ばれている。このメカニズムは、刺激の感受、情報の伝達、根の伸長領域における不均一な細胞伸長による屈曲といった過程を経る。重力の関知は、根冠に存在するコルメラ細胞においてアミロプラストが重力方向に沈降し、その方向の小胞体を圧迫することにより重力の向きを感知していると考えられている（Kiss, J.Z., Hertel, R., and Sack, F.D. (1989) Amyloplasts are necessary for full gravitropic sensitivity in roots of Arabidopsis thaliana.Planta 177, 198-206.) 。この関知された情報は根の伸長域へ伝達され、垂直方向にオーキシンの濃度勾配が起こり、下側が上側に比べて遅く伸長することにより重力方向に曲がるとされている。しかし、それらの作用機構についての分子レベルでの解明はほとんど行われていない。
【０００３】
シロイヌナズナから様々な突然変異個体が見出されているが、そのなかでオーキシンに対しては耐性を示す変異体として単離されているaxr1〜4（ Lincoln, C., Britton, J.H., and Estelle, M. (1990) Growth and development of the axr1 mutants of Arabidopsis. Plant Cell 2, 1071-1080.  ；Timpte, C.S., Wilson, A.K., and Estelle, M. (1992) Effects of the axr2 mutation of Arabidopsis on cell shape in hypocotyl and inflorescence. Planta 188, 271-278.  ；Lawrence, H. and Estelle, M. (1995) The axr4 auxin-resistant mutants of Arabidopsis thaliana define a gene important for root gravitropism and lateral root initiation. Plant J.7, 211-220.）、aux1（Pickett, F.B., Wilson, A.K., and Estelle, M. (1990) The aux1 mutation of Arabidopsis confers both auxin and ethylene resistance. Plant Physiol.94, 1462-1466.)は重力刺激応答に異常を示すことが知られており、これらのうちaxr1（Leyser, H.M.O., Lincoln, C., Timple, C., Lammer, D., Turner, J., and Estelle, M. (1993) Arabidopsis auxin resistance gene AXR1 encodes a protein related to ubiquitine-activating Enzyme E1. Nature 364, 161-164.）とaux1（Bennett, M.J., Marchant, A., Green, H.G., May, S.T., Ward, S.P., Millner, P.A., Walker, A.R., shulz, B., and Feldman, K.A. (1996) Arabidopsis AUX1 Gene:A Permease-Like Regulator of Root Gravitropism. Science 273, 948-950.）の遺伝子が単離されている。一方、オーキシンに対する耐性を示さない重力屈性の突然変異としてagr変異体（agr-1, agr-2, agr-3）が単離された（Bell and Maher (1990) Mol Gen Genet 220: 289-293.）。また、これらに対してアレリックな変異体として、wav6-52（Okada and Shimura (1990) Science 250: 274-276.）が単離されている。また、同様な変異としてeir1-1（ Roman et al. (1995) Genetics 139: 1393-1409.）が単離されている。
【０００４】
しかしながら、agr変異の原因となっている遺伝子（AGR遺伝子）に関しては、いまだ単離されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物の根の重力屈性に関わるAGR遺伝子、その類似遺伝子、およびこれら遺伝子がコードするタンパク質を提供することを課題とする。また、本発明は、これら遺伝子を利用して植物の根の重力屈性刺激応答を改良することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、ポジショナルクローニングの手法を用いることにより、植物の根の重力屈性刺激応答を阻害するagr変異の原因となる単一の遺伝子を広大な染色体領域において同定し、単離することに成功した。また、本発明者らは、単離したAGR遺伝子が植物の根の重力屈性刺激応答に関与していることから、AGR遺伝子やその類似遺伝子を利用することにより、植物の根の重力屈性刺激応答を改良することが可能であることを見出した。
【０００７】
即ち、本発明は、植物の根の重力屈性に関わるAGR遺伝子、その類似遺伝子、およびこれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにこれら遺伝子を利用した植物の根の重力屈性刺激応答の改良などに関し、より具体的には、
（１）  配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または該タンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質、
（２）  配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質、
（３）  （１）または（２）に記載のタンパク質をコードするDNA、
（４）  （３）に記載のDNAを含むベクター、
（５）  （３）に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞、
（６）  （５）に記載の細胞を培養する工程を含む、（１）または（２）に記載のタンパク質の製造方法、
（７）  （３）に記載のDNA若しくはその一部に対するアンチセンスDNA、
（８）  （７）に記載のアンチセンスDNAを含むベクター、
（９）  （３）に記載のDNAまたは（７）に記載のアンチセンスDNAを発現可能に保持する形質転換植物細胞、
（１０）  （９）に記載の形質転換植物細胞を含む植物体、
（１１）  根の重力刺激応答が変化している、（１０）に記載の植物体、
（１２）  （１１）に記載の植物体の繁殖媒体、
（１３）  （１）または（２）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（１４）  （３）に記載のDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA、に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物の根の重力屈性に関与する「AGR」タンパク質に関する。本発明者らが単離した「AGR」遺伝子のcDNAの塩基配列を配列番号：２に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：３に、これら遺伝子がコードする「AGR」タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。シロイヌナズナの根の重力刺激応答に異常を示すことが知られてAGR変異には、agr1、agr2、agr3、eir1-1、wav6-52の５つが知られている。これらの変異のうち、agr1は539位のメチオニンのイソロイシンへの置換、agr2は30位のトリプトファンの終始コドンへの置換、agr3は1位のメチオニンのイソロイシンへの置換、eir1-1は第一エキソンの最初の塩基から数えて2989位のGからAへの置換（アミノ酸の置換は伴なわない）、wav6-52は541位のグリシンからグルタミン酸への置換をもたらす（実施例６）。これら変異により、agr1とwav6-52は、重力刺激応答の欠失あるいは応答の著しい低下を示し、agr2、agr3、およびeir1-1は、弱い応答を示す。これら事実は、「AGR」タンパク質がシロイヌナズナの根の重力刺激応答に重要な役割を担っていることを証明するものである。「AGR」タンパク質および「AGR」遺伝子は、シロイヌナズナの根の重力刺激応答を改変するために、もしくは改変するための標的として利用することが可能である。
【０００９】
また、本発明は、「AGR」タンパク質と機能的に同等なタンパク質に関する。機能的に同等なタンパク質を単離する方法としては、タンパク質中のアミノ酸に変異を導入する方法が当業者によく知られている。即ち、当業者であれば、公知の方法により、天然型の「AGR」タンパク質（例えば、配列番号：１に記載のタンパク質）中のアミノ酸を適宜置換などして、これと同等の機能を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもある。本発明のタンパク質には、このように天然型の「AGR」タンパク質のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Transformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」（Clontech社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。単離したタンパク質が天然型のタンパク質と「機能的に同等」とは、タンパク質が植物の根の重力屈性刺激応答において機能することを指す。タンパク質が植物の根の重力屈性刺激応答において機能するか否かは、例えば、変異株におけるタンパク質の発現による機能相補試験や、アンチセンス技術を利用したタンパク質の発現の抑制による根の重力屈性刺激応答の変化の検出により、決定することが可能である。
【００１０】
また、機能に同等なタンパク質を単離するための、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern 1975 J. Mol. Biol. 98:503、Maniatis et al. Molecular Cloning  Cold Spring harbor Laboratry Press参照）やPCR技術（島本功、佐々木卓治  監修、「植物のPCR実験プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社  1995年４月10日発行参照）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「AGR」遺伝子の塩基配列（配列番号：２）もしくはその一部をプローブとして、「AGR」遺伝子の塩基配列（配列番号：２）の一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、これと高い相同性を有するDNAを単離して、該DNAから「AGR」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離された「AGR」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。ここで「同等の機能を有する」とは、上記と同様に、タンパク質が植物の根の重力屈性刺激応答において機能することを指す。ハイブリダイズ技術やPCR技術により得られるタンパク質は、機能的観点から、「AGR」タンパク質とアミノ酸配列において45％以上の相同性を有することが好ましく、60％以上の相同性を有することがさらに好ましく、75％以上の相同性を有することがさらに好ましく、90％以上の相同性を有することがさらに好ましく、95％以上の相同性を有することがさらに好ましい。このようなタンパク質を単離するための植物としては、例えば、根菜類の大根、コンニャク、ニンジン、ゴボウ、レンコンなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００１１】
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、天然のタンパク質としての他、遺伝子組み換え技術を利用して調製した組み換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、下記の方法により調製された組み換えタンパク質をウサギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（CNBr活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合させてカラムを作製し、得られたカラムを利用して植物のタンパク質抽出液を精製することにより調製することが可能である。一方、組み換えタンパク質は、常法、例えば、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、該形質転換細胞から精製することにより調製することが可能である。組み換えタンパク質を生産するために用いられる細胞としては、例えば、植物細胞、大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、細胞内で組み換えタンパク質を発現させるためのベクターとしては、例えば、植物、酵母細胞用にはプラスミド「pBI121」や「pBI101」（Clontech社製）、大腸菌用にはプラスミド「pET Expression system」（Stratagene社製）や「GST gene fusion Vectors」（Pharmacia社製）、ほ乳類細胞用にはプラスミド「pMAM」（Clontech社製）、昆虫細胞用にはプラスミド「pBacPAK8.9」（Clontech社製）などが挙げられる。ベクターへのDNAの挿入は、常法、例えば、Molecular Cloning（Maniatis et al. Cold Spring harbor Laboratry Press）に記載の方法により行うことができる。また、宿主細胞へのベクターの導入は、常法により宿主細胞に応じてエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法で行うことが可能である。得られた形質転換細胞からの本発明の組み換えタンパク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクトマトグラフィー、ゲルろ過、SDS電気泳動、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組み換えタンパク質をグルタチオンS-トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。
【００１２】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするDNAに関する。本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムDNA、cDNA、化学合成DNAなどが含まれる。ゲノムDNAは、例えば、文献（Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. 5:69 (1985)）記載の方法に従って調製したゲノムDNAを鋳型として、本発明のDNAの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてPCR（Saiki et al. Science 239:487(1988)）を行うことにより調製することが可能である。また、cDNAであれば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning  Cold Spring harbor Laboratry Press）により植物からmRNAを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムDNAやcDNAは、常法によりゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のDNAの塩基配列（例えば、配列番号：２に記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。なお、得られたDNAの塩基配列は、例えば「シークエンサーModel373」（ABI社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。
【００１３】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするDNA若しくはその一部に対するアンチセンスDNAに関する。本発明のアンチセンスDNAは、本発明のタンパク質の発現が抑制された植物体の作製に利用することができる。本発明のアンチセンスDNAが、アンチセンス効果を発揮するためには、本発明のDNAと100％相補的である必要はない。本発明のタンパク質の発現を抑制することが可能であれば、相補性が高くなくともよい。アンチセンスDNAは、本発明のDNAと好ましくは90％、さらに好ましくは95％の相補性を有する。また、アンチセンス効果を発揮するためには、本発明のアンチセンスDNAは、少なくとも15bp、好ましくは100bp以上、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有する。
【００１４】
また、本発明は、上記本発明のDNAまたはアンチセンスDNAが挿入されたベクターに関する。本発明のベクターとしては、組み換えタンパク質の生産に用いる上記したベクターの他に、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のタンパク質またはアンチセンス遺伝子を発現させるためのベクターも含まれる。このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などが挙げられる。本発明のベクターは、本発明のタンパク質を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al. 1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23:567）などが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol．Biol．30：387）やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Aguan et al. 1993 Mol. Gen Genet. 240:1）、高温によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta 193:57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1406）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624）などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００１５】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された形質転換細胞に関する。本発明のベクターが導入される細胞には、組み換えタンパク質の生産に用いる上記した細胞の他に、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はなく、例えば、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの細胞が挙げられる。本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood et al. 1993 Transgenic Res. 2:218、Hiei et al. 1994 Plant J. 6:271）、エレクトロポレーション法（Tada et al. 1990 Theor. Appl. Genet 80:475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri et al. 1991 Theor. Appl. Genet 81:437）、パーティクルガン法（Sanford et al. 1987 J. Part. Sci. tech. 5:27）などの方法を用いることが可能である。
【００１６】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられ、ジャガイモであればVisserら（Theor. Appl. Genet 78:594 (1989)）の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99:12(1971)）の方法が挙げられる。また、シロイヌナズナの場合には、胚軸カルストランスフォーメーション法
（KazuhitoAkama, Hideaki Shiraishi, Shozo Ohta, Kenzo Nakamura, Kiyotaka Okada and Yoshiro Shimura; Efficient transformation of Arabidopsis thaliana: comparison of the efficiencies with various organs, plant ecotypes and Agrobacterium strains」「Plant Cell Reports (1992)12:7-11）が挙げられる。
【００１７】
これにより作出された植物体またはその繁殖媒体（例えば、種子）から育成した植物体は、本発明のタンパク質の発現量の増加または低下により、根の重力刺激応答が正常の個体と比較して変化しうる。従って、これにより植物の根の生育方向を制御し、植物の土壌への根の定着率を高めたり、また収穫作業を容易にするなどの目的のために根の屈性を制限させることが可能である。
【００１８】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質に結合する抗体に関する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。本発明の抗体の調製は当業者に公知の方法（例えば、Molecular cloning(Maniatis et al.cold Spring harbor Laboratry Press)に記載の方法）により行うことができる。本発明の抗体の調製を行う場合には、本発明のタンパク質全体を免疫する方法の他に、部分ペプチドを免疫して調製することも可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに用いることが可能である。
【００１９】
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNAに関する。本発明のタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、配列番号：２または３に記載の塩基配列からなるDNAが挙げられる。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のタンパク質をコードするDNAに実質的にハイブリダイズし、他のタンパク質をコードするDNAに実質的にハイブリダイズしないことを指す。このようなDNAは、例えば、本発明のタンパク質をコードするDNAを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。
【００２０】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、DNAの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Molecular cloning (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press)」）に記載されている。また、シロイヌナズナの寒天培地や土壌を用いた育成、交配、ゲノムDNAの調製は実験書（例えば「島本功、岡田清孝  監修、「モデル植物の実験プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４）秀潤社  1996年４月1日発行」）に記載されている。
【００２１】
[実施例１]  agr変異体の単離
重力屈性の突然変異としてagr変異体として、agr-1, agr-2, agr-3（Bell and Maher (1990) Mol Gen Genet 220: 289-293.）、wav6-52（Okada and Shimura (1990) Science 250: 274-276.）が単離されていが、eir1-1（Roman et al. (1995) Genetics 139: 1393-1409.）をwav6-52と交配してアレル検定を行ったところ、両者がアレルの関係であることが判明した。
【００２２】
[実施例２]  AGR遺伝子座のマッピング
agr変異系統は化学突然変異剤EMSで処理されたランズバーグ種の集団より得られているので、コロンビア種と交配し、そのF2世代における同変異の分離を分子マーカーと比較することにより、AGR遺伝子座のおおよその位置を決定した。その結果、同遺伝子座は、分子マーカーmi69とmi70の間に存在することが判明した。具体的には、次のようにして行った。
【００２３】
F2種子を0.8%(w/v)次亜塩素酸ナトリウム、0.2% TritonX-100に10分間浸漬し、よく洗浄して滅菌を行い、0.5×アラビドプシス栄養塩溶液（下記）を含む1.5％寒天培地（約40ml、栄研２号角形シャーレ（縦10cm  横14cm  高さ1.5cm））に１プレートで26個を播種した。プレートは23℃ 16hr light /8hr dark の恒温室に10枚程度ずつまとめて垂直に立てて置き、４日後90゜回転させて、根が重力に応答しない個体（agr変異体）を土に移植した。
【００２４】
アラビドプシス栄養塩溶液は、1M KNO3（5ml）、1M MgSO4（2ml）、1M Ca(NO3)2 （2ml）、20mM Fe・EDTA（2.5ml）、微量要素液（70mM H3BO3, 14mM MnCl2, 0.5mM CuSO4, 1mM ZnSO4, 0.2mM NaMoO4, 10mM NaCl, 0.01mM CoCl2）（1ml）、1M K-PO4緩衝液(pH5.5)（20mlの1M K2PO4と480ml 1M KH2PO4を混合）（2.5ml）を混合して、イオン交換水を985ml加えて作製した。
【００２５】
F2植物体からのゲノムDNAの調製にはCTAB 法を用いた。まず、agr植物体より、展開した葉数枚を、エッペンドルフチューブの中にいれ液体窒素にて凍結後、十分にすりつぶした。500μlの CTAB バッファー（0.1M Tris-HCl（PH8.0）,20mM EDTA,1.4M NaCl,2％ セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(cetyltrymethylammonium bromide),0.2％ 2-メルカプトエタノール）を加え、60℃で30分保温した。500μlのクロロホルム：イソアミルアルコール溶液（24：1）を加え15分間室温で振った後、3000rpm で10分間遠心分離した。水層を新しいエッペンドルフチューブに移し、2/3量のイソプロパノールを加え、3000rpmで10分間遠心した。上澄みを捨て、70％エタノールを500ml加え15000rpmで数分遠心し、再び上澄みを捨て、ペレットを減圧乾燥した。乾燥後、0.5ml のTE（10mg/ml RNaseAを含む）に溶かした。フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールをそれぞれ25：24：1で混合した混液500μlを加えて混合し、15000rpm、4℃ で10分間遠心した。水層を新しいエッペンドルフチューブに移し、再びフェノール・クロロホルム抽出を行った。水層に、1/10量の酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを加え、エタノール沈殿を行った。200μlの70％エタノールを加えペレットを洗浄した後、減圧乾燥させた。100μlのTEに溶かし、アガロースゲル電気泳動で濃度測定をした後、以後の実験に用いた。
【００２６】
分子マーカーの一種であるCAPSマーカー（Konieczny, A., and Ausubel, F.M. (1993) A produce for mapping Arabidopsismutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4, 403-410.）のなかで、DFRとLYF3aを用いて、上記のF2植物のゲノムDNAをPCRで解析したところ、agr変異は、この両マーカーの間に位置することが判明した。さらに、別のCAPSマーカーTSB1、10A10でF2個体を解析したところ、436染色体中、TSB1で7、10A10で19染色体でまだ組み換えが見出され、この2つのマーカーにAGR遺伝子は挟み込まれていることがわかった。なお、PCR反応液としては、「1×amplification buffer（Takara社）,125μM dNTPs,500ng プライマー（F及びR）,1U EX Taq（Takara社）,50ng ゲノムDNA／反応溶液100μl」を用いた。
【００２７】
さらに同遺伝子座を絞り込むために、RFLPマーカーであるmi69、mi70、mi418をCAPS化した。すなわち、これらのRFLPマーカーの両端をシークエンスし、その配列をもとに、PCRプライマーを作製した。ランズバーグとコロンビアのゲノムDNAを鋳型に、PCR反応を行い、制限酵素で処理し、5％アクリルアミドゲルで電気泳動した。その結果、それぞれAfa I、Mbo I、Nla IIIでランズバーグとコロンビア間でRFLPが検出された。これらのマーカーを用いて、TSBI、10A10で染色体組換えを示すF2個体を調べた。mi69で1個体（個体番号30）、mi70で1個体（個体番号124）、mi418で2個体（個体番号124、238）が、まだAGRとマーカー間で染色体組換えを示した。以上の結果から、最終的にAGR遺伝子はRIマップ上での距離が1.1cMとされている、mi69、mi70の二つのマーカーで挟み込むことができた。
【００２８】
[実施例３]  AGR遺伝子座を含むゲノムDNAコンティグの作製
AGR遺伝子は分子マーカーmi69、mi70の間に存在することが分かったので、このマーカー間を物理的につなぐゲノムDNA断片をYACライブラリーおよびP1ライブラリーから単離した。具体的には、両マーカーをプローブにして、CIC YACライブラリーをスクリーニングし、mi69及び、mi70両方でハイブリダイズする2クローン（CIC9-2E、CIC9-3F）とmi70のみハイブリダイズする1クローン（CIC9-9C）を得た。両方でハイブリダイズしたクローンを含む酵母染色体をパルスフィールドゲル電気泳動し、mi69とmi70でハイブリダイズすることでYACサイズを推定した。その結果9-2Eと9-3Fの両クローンともYACのインサートサイズが約600kbの大きさであることがわかった。従ってAGR遺伝子が存在する可能性のある領域を600kb以下という物理的距離に置き換えることができた。
【００２９】
さらに、80ー100kbのゲノムDNAの断片がクローン化されているP1ライブラリー（Yao-Guang Liu, Norihiro Mitsukawa, Alejandro Vazquez-Tello and Robert F. Whittier (1995) Generation of a high-quality P1 library of Arabidopsis suitable for chromosome walking. Plant J. 7, 351-358.）をスクリーニングし、mi69でハイブリダイズしたクローン8個（＃Ω13K、＃I19K、＃V21D、＃P10I）と、mi70でハイブリダイズしたクローン8個（＃Q1D、＃R1I、＃U2A、＃J2I、＃N2J、＃S5P、＃S8P、＃F24I）を得た。得られたP1クローン間の制限酵素断片の比較より、マーカー近傍のP1クローンコンティグを作成した。この時点で、mi69、mi70で得られたP1クローンがオーバーラップしておらず、＃Ω13K、＃P10I、＃R1I、＃U2Aの4クローンがそれぞれのコンティグの末端と判断された。
【００３０】
コンティグの方向を決定するため、CIC9-2Eより構築したコスミドライブラリーより、YACの両アームとの境界領域を含むクローンをスクリーニングした。ついで、その植物由来の配列をプローブにP1クローンにハイブリダイズさせた。その結果、レフトアームに近接するゲノム断片が＃Ω13Kにハイブリダイズし、＃P10Iとはハイブリダイズしなかった。従って mi69側に関しては、＃Ω13K側が外向きと判明した。しかし、ライトアーム側は未知のP1クローンにハイブリダイズし、mi70にハイブリダイズした8個のP1クローンにはハイブリダイズしなかったためP1コンティグの方向を決定することができなかった。そこで、mi69側については＃P10Iから、mi70側については＃R1I、＃U2Aの両方からウォーキングすることとした。＃P10Iで４個（＃T2F、＃N7M、＃H17M、＃H19M）、＃I1Rで2個（＃R10O、＃T20I）、＃U2Aで3個（＃S19F、＃Ω19M、＃J24B）、それぞれのコンティグ末端とハイブリダイズする新しいクローンを得た。プローブ中の反復配列などにより間違って染色体歩行する危険性が考えられるため、新しく取得したP1クローンをBam H Iで分解したYAC9-2Eにハイブリダイズさせた。そのハイブリダイズパターンとP1クローンのBam H I制限酵素切断バンドパターンとを比較し、そのP1 DNA領域がまちがいなくYAC9-2E DNA中に存在することを確かめた。
【００３１】
＃R1Iとハイブリダイズしたクローン＃T20IはYAC CIC 9-2EのRFLPマーカーmi418ともハイブリダイズしたので、CIC 9-2Eクローンの外側と判断した。したがってmi70側のP1コンティグ＃U2Aが内側と考えられた。そこで、＃U2Aとハイブリダイズしたクローン＃J24Bの末端をさらにクローニングしこの末端とハイブリダイズする４クローン（＃U3L、＃V4C、＃R4K、＃F19K）得た。また、mi69側で、＃P10Iの末端にハイブリダイズしたクローン中で、コンティグの一番端のクローン＃H17Mの末端プローブでさらにスクリーニングしたところ、mi70側からウォークしてきたクローンである＃U3Lが得られた。このことより、mi69からmi70の間のP1クローンコンティグがつながったと判断した。
【００３２】
つながったことを植物ゲノム上で確認するため、＃T2Fと＃U3Lの内側の端でPCRプライマー「3LU13-I」（配列番号：４／GTAATCCATGAGAAAAACTTCG）、「2FT-I」（配列番号：５／TCGAATGTGACAATGTTGTGG）を作製し、YAC CIC 9-2Eクローンと植物ゲノムをテンプレイトにPCRを行い、どちらのテンプレートを用いても2.5kbのフラグメントを得た。
【００３３】
つづいて、AGR遺伝子の存在する可能性のある領域をさらに絞り込むため、P1クローンコンティグ上で新しいCAPSマーカーを作製した。これらのCAPSマーカーを用いてmi69及びmi70で染色体組換えを示す個体を解析した。AGR遺伝子は、マーカー2FT-32と、24BJ-9のあいだの約165kb以内に存在していることが判明した。
【００３４】
YACクローンCIC 9-2E 580kbを含む総酵母染色体DNAを植物に直接形質転換可能なバイナリーコスミドであるpOCA28にサブクローニングした。 YACクローンを用いた理由としては、ゲノムサイズがアラビドプシスゲノムの約1/6の15Mbであり、容易にDNA の大量抽出ができることなどのためである。一般的にはパルスフィールドでYACを分離後、切り出し、YACDNAからライブラリーを作製するが、総酵母染色体を用いる方法でも30個に1個はYAC由来のコスミドクローンとなり、実験に支障はない。この方法により大きさ約10万クローンのコスミドライブラリーを作製した。また、P1クローンの＃U3L及び＃J24Bからもそれぞれ2万及び1万の大きさをもつコスミドライブラリーを作製した。＃U3Lの制限酵素地図をもとにして選んだプローブで、＃U3Lのコスミドライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングして得たクローンを制限酵素の切断パターンの比較から、重なりを確認し、約10kb間隔で、＃U3Lクローンのコスミドコンティグができた。
【００３５】
上記のコスミドライブラリーの作製はつぎの手順で行った。すなわち、P1クローン（＃U3L、＃J24B）とYACクローン9-2Eそれぞれ 400ngをSau3AI（1/128unit）、37℃、反応液120μlで反応させた。時間は5分、10分、15分で行った。電気泳動で確認して、コスミドライブラリーを作るのに適したサイズ(15-20kb)に部分分解した。ここで、インサート同士がライゲイションしないように、dATP及びdGTPを基質として加え、クレノウ断片で、37℃、20分、反応させ部分的平滑末端化を行った。次にpOCA28（400ng）を37℃、2時間、Sal I処理を行いインサートとライゲイションできるように、dCTP、dTTPを基質に加え部分的平滑末端化を行った。部分的平滑末端化の反応液としては、「インサート(P1クローン#U3L、#J24B 及びYACクローンCIC 9-2E)部分分解物またはベクター(pOCA 28)Sal I分解物 100ng,10×L buffer 20μl,10mM dATP、dGTP(インサートの場合) 5μl,dCTP、dTTP(ベクターの場合) 5μl,クレノウ断片 2μｌ／反応溶液200μl」を用いた。このインサートとベクター各々100 ngを用いてライゲイション反応した。反応はLigation Kit Ver 1（Takara社）を用い、等量のB液を加え、さらに2倍量のA液を加えて26℃ 10 分間行った。さらに、Gigapack II XL Packaging Extract（STRATAGENE社）を用いて、インビトロパッケージングを行った．反応は4μｌのDNAをpackaging extractに加え、次に10μlのsonic extractをpackaging extractに加え、泡立たないように液を混ぜ合わせ，軽く遠心してチューブの底に集めて、22℃で2時間行った。反応後、SMバッファー500μlを加え、さらに20μlクロロホルムを加えた。この液を穏やかに遠心し上澄みを新しいチューブに移して4℃で保存し、packaging solution として以後の実験に用いた。コスミド感染用の大腸菌としてVCS257を用いた。2×YT+10mM MgSO4 + 0.2％マルトース培地でVCS257 を培養し、培養液を遠心し、沈澱を10mM MgSO4でOD600が0.5になるように懸濁した。この懸濁液100μlに、単一コロニーが単離できるタイターになるように、SMバッファーで希釈したpackaging solution を加え37℃で15分静置した。2×YT 1mlを加え、37℃で30分250rpm 振とう培養した。これを2×YT+1.5％agar+終濃度30μg/mlのスペクチノマイシンを含むプレートにまいた。
【００３６】
[実施例４]  AGR遺伝子座のファインマッピング
約165kbの領域内にAGR遺伝子座が存在していることが判明したが、この長い領域には多数の遺伝子が存在していると予想されるので、ファインマッピングを行うことによって、さらに領域を狭めた。具体的には、コロンビア種の野生株とagrのアレル（wav6-52）を交配し、得られた種子を育成し、自殖させ、F2世代の種子を得た。このF2種子からagr変異形質を示す２４７個体を選抜した。このようにして選抜した個体を第５染色体の分子マーカーを用いてファインマッピングしたところ、AGR遺伝子は２つの分子マーカーで挟み込まれる領域内（約80kb）に絞り込むことができた（図１）。
【００３７】
[実施例５]  AGR遺伝子の単離
AGR遺伝子座が位置している領域の内、約60kbを４つの形質転換可能なコスミドクローンでカバーした。これら４つのコスミドクローンをagr変異株（eir1-1）に形質転換したところ、そのうちのひとつのクローン（クローン番号５）を導入した場合に形質転換植物は野生型形質に回復した。従って、このクローン内（約20kb）にAGR遺伝子が存在すると考えられた。５番コスミドクローンからDNAを調製し、適当な制限酵素で切断しプラスミドベクターにサブクローニングを行い、塩基配列の決定を行った。その結果、この約20kbの領域に３つの比較的長いオープンリーディングフレームが予想された。このうちの一つの配列をeir1-1の対応する領域と比較したところ、第６エクソンのスプライシング部位において変異が認められた。そこで、この領域の塩基配列を野生株において確定するとともに、他の４つのアレルに関してもゲノムの塩基配列を比較した。その結果、いずれにおいても塩基配列上の変異が認められることから、同オープンリーディングフレームがAGR遺伝子のコーディング領域であることが判明した。
【００３８】
[実施例６]  AGR遺伝子の構造解析
ARG遺伝子には9つのエクソンから構成される新規の遺伝子であった。AGR遺伝子はARG遺伝子がコードするタンパク質は647のアミノ酸残基からなり、アミノ末端とカルボキシ末端に膜を貫通すると考えられる領域が見出さた。5つのアレルにおける変異はeir-1以外の4つはアミノ酸の置換であった。agr-3においては開始メチオニンがイソロイシンに変異していた。このアレルは、重力を弱く感受することから、タンパク質が欠損しているとは考えられず、下流に位置するメチオニンが開始コドンとして読まれたために、弱いながらも重力を関知すると考えられる。agr-2はやや重力を関知するが、この場合は30番目のトリプトファンが停止コドンに変異していた。この場合も、下流に位置するメチオニンが開始コドンとして読まれたと考えられる。agr-1では539番目のグリシンがアスパラギン酸に、wav6-52では541番目のグリシンがグルタミン酸に変異しており、これらのアレルの根は重力に対しほとんど応答しなかった。
【００３９】
アミノ末端とカルボキシ末端の予想される膜貫通領域に相同なアミノ酸配列も持つ遺伝子は現在までのところアラビドプシスに7つ（T26J12 (BAC)、F22K20 (BAC)、T17P20 (BAC)、MQK4 (P1)、121L8T7 (EST)、35D8T7 (EST)、158K17T7 (EST)）、イネに3つ（RICR2985A (EST)、C26920 (EST)、C27713 (EST)）見つかっているが、全長に渡り相同なアミノ酸配列を持つ遺伝子は報告されていない。
【００４０】
[実施例７]  AGRcDNAの単離
cDNAは、シロイヌナズナのmRNAよりRT-PCR法を用いて単離し、その塩基配列を決定した（配列番号：２）。具体的には、シロイヌナズナから抽出したmRNAおよびRT-PCRキット（TaKaRa社のTaKaRa One Step RNA PCR Kitなど）を用い、ゲノム塩基配列から予想される第一エクソンと第六エクソンに位置する下記のプライマー「配列番号：６／5-AAATGATCACCGGCAAAGAC-3」、「配列番号：７／5-AAACATAGCCATTCCAAGACC-3」を用いてcDNAを増幅させ、プラスミドにサブクローニングを行った後に複数のプラスミドの塩基配列を決定した。
【００４１】
また、5'側と3'側はClonetech社のMarathon PCR Kitを用い、race法を用いて増幅させた。具体的には、シロイヌナズナより抽出したmRNAをテンプレートとし、5'側に関しては、第一エキソン由来の2種類のプライマー「配列番号：８／5-TGGTCCGGTGTGAATATCCC-3」、「配列番号：９／5-TCATAGCAACGTATAGCGGC-3」を用い、3'側に関しては、第3エキソン由来のプライマー「配列番号：１０／5-GTTCAATCGTCACGAGAGCG-3」、および第5エキソン由来のプライマー「配列番号：１１／5-TCCTAGGAAACAGCAGATGCC-3」を用いてcDNAを増幅させ、プラスミドにサブクローニングを行った後に複数のプラスミドの塩基配列を決定した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、植物の根の重力屈性刺激応答に関与する新規なタンパク質および遺伝子、並びに該遺伝子の発現を調節することにより根の重力屈性刺激応答が改変された植物が提供された。植物の根の重力屈性刺激応答の改変により、植物の根の生育方向を制御しうるため、例えば、植物の根の土壌への定着率の向上や、収穫作業を容易にするための農作物の根の屈折の制御などを行うことが可能である。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】シロイヌナズナ第5番染色体におけるAGR遺伝子座近傍の物理的地図を示す。
【図１】
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