(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号：２または４に記載の塩基配列からなるDNAと6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件下でハイブリダイズするDNA。
【請求項２】
イネ由来である、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載のDNAの転写産物と完全に相補的な少なくとも500塩基の鎖長を有するアンチセンスRNAを発現するDNA。
【請求項４】
植物の感光性を増加させるために用いる、請求項１または２に記載のDNA。
【請求項５】
植物の感光性を低下させるために用いる、請求項３に記載のDNA。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターが導入された植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項９】
イネである、請求項８に記載の形質転換植物体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１２】
請求項８または９に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１または２に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の感光性を増加させる方法。
【請求項１４】
植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期を遅延させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項３に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させ、植物体の細胞内における、内因性の請求項１または２のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の感光性を低下させる方法。
【請求項１６】
植物の感光性を低下させることにより、日長に依存した植物の開花時期を早める、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
植物がイネである、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
植物の感光性を評価する方法であって、該植物における請求項１に記載のDNAの存在の有無を検出することを特徴とする方法。
【請求項１９】
植物がイネである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１または２に記載のDNAを含むベクターが導入された宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１または２に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項２２】
請求項２０に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項２１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項２４】
配列番号：２または４に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNA。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、植物の感光性に関与する遺伝子および該遺伝子を利用した植物の感光性の改変に関する。植物の感光性の改変は、植物の品種改良などの分野において有用である。
背景技術
イネは一般に短日で出穂が促進され、逆に長日では出穂が遅延する。従来の品種では、一般に九州や本州南部の品種は強い感光性をもち、東北や北海道の品種は感光性がないか極めて弱い。イネは感光性を失うと日長の変化によって出穂時期が変化せず、一定の生育期間を経ると、出穂する特徴を示す。このようにイネは感光性の有無により、栽培地域や栽培時期などに関する適応性が大きく変化するため、イネの感光性の改変は、イネの品種改良において重要な課題となっている。
従来、イネの品種改良における出穂期の改変は、（1）交雑による早生・晩生系統の選抜や（2）放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。しかしながら、これらの作業には長期間を要し、また変異の程度や方向性を予測できないなど多くの問題が存在していた。
ところで、イネの遺伝学の分野においては、イネの感光性を強くする遺伝子を総称して「感光性遺伝子」と呼んでいる。これまでいくつかの感光性遺伝子の存在が、突然変異や品種に内在する変異として見出されており、例えば、Se1座（第６染色体；Yokoo and Fujimaki（1971）Japan. J. Breed. 21:35-39）、E1座（第７染色体；Tsai, K.H.（1976）Jpn. J. Genet. 51:115-128、Okumoto, Y. et al.（1992）Jpn. J. Breed. 42:415-429）、E2座（不明）、E3座（第３染色体？；奥本ら、日本育種学会第９１回講演会  育雑47（別１）：31）等において感光性遺伝子の存在が示唆されている（Yamagata et al.（1986）In Rice Genetics, International Rice Research Institute, Manilla, pp351-359）。
イネ感光性遺伝子が単離されれば、これを形質転換法により任意の品種に導入することによって、それらの系統の感光性を改変させ、これによりイネの出穂期を調節することが可能であると考えられる。このため、該遺伝子を利用した品種改良は、簡便性や確実性の面で、従来の方法と比して極めて有利であると言える。
しかしながら、イネにおいてその感光性に関与する遺伝子を単離したという報告は、いまだなされていない。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な植物の感光性遺伝子、特にイネ由来の感光性遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変し、これにより植物の開花時期を改変することを目的とする。さらに、本発明は、植物の感光性の評価方法を提供することをも目的とする。
本発明者等は、植物の中でも、特に出穂時期を改変する簡便な方法の開発が望まれているイネに着目し、その感光性に関与する遺伝子を単離すべく鋭意研究を行なった。
イネにおいては、日本晴とKasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座（QTL）の一つであるHd1が、第６染色体上に座乗することが知られている。また日本晴の遺伝的背景をもつHd1領域（Kasalathの対立遺伝子）の準同質遺伝子系統を利用した解析から、Hd1遺伝子座が感光性遺伝子座であることが明らかとなっている（Lin et al.（1999）Abstract for Plant Genome VII. p160、矢野 他、育種学雑誌  第47巻（別２）p224）。さらに染色体上の位置から、Hd1は既報の感光性遺伝子座Se1と同じ遺伝子座である可能性が示唆されているが、直接的な証拠はなかった。
本発明者らは、このようにその存在自体は知られているが、いまだ同定されていない感光性遺伝子Hd1を単離するために、まず、連鎖解析および酵母人工染色体（YAC）クローンによるHd1遺伝子領域の整列化を行なった。
具体的には、Hd1遺伝子単離に不可欠である、大規模分離集団の連鎖解析を行った。連鎖解析にはプールサンプリング法を用いた。また、イネゲノム解析研究において作出されたYACクローンの整列化地図を利用して、Hd1遺伝子座近傍に存在するYACクローンを特定した。さらに特定されたYACクローンY4836の末端断片を単離し、RFLPマーカーとして解析することにより、YACクローンY4836がHd1遺伝子領域を含むことを明らかにした（図１）。
さらにHd1遺伝子の候補領域を絞り込むために、本発明者等は、P1由来人工染色体（PAC）クローンによるHd1遺伝子領域の整列化を行なった。具体的には、上記解析により見出されたHd1遺伝子の存在領域に近接するDNAクローンを利用して、それらの塩基配列を含むと考えられるPACクローンを日本晴のゲノムライブラリーから２個選抜した。さらに、それらのクローンをPCRにより調査したところ、選抜したPACクローンの１つP0038C5が、S20418およびY4836Rに対応する塩基配列を有し、Hd1遺伝子座を完全に含むことが明らかとなった（図１）。
本発明者等は、PACクローンP0038C5の塩基配列解析を行なった結果、Hd1候補遺伝子が存在すると考えられる領域を約12kbにまで絞り込むことに成功した。この候補領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行い、イネのESTとして捕足されているパーオキシダーゼS2539ならびに長日条件で開花を促進する機能を有するアラビドプシスのCO（ジンクフィンガードメインを有する転写調節遺伝子であると考えられている）と非常に高い類似性を示す領域を見出した。
ジンクフィンガードメインをもつ予測遺伝子をHd1遺伝子の候補とし、さらに解析を進めたところ、Kasalathの候補遺伝子領域（ORF）内には11箇所（挿入、欠失および塩基置換）の変異が認められた（図２）。また、Hd1と同じ遺伝子座であると推定されているSe1に関する突然変異系統HS66およびHS110ならびにそれらの原品種銀坊主の候補遺伝子領域について解析を行ったところ、Se1遺伝子をもつ銀坊主の塩基配列は日本晴と比べて新たな36bpの塩基配列および１塩基置換が見い出されたが、その他は完全に一致していた。突然変異系統HS66およびHS110では銀坊主の配列と比較して変異が認められた（図２）。これらの結果から、ジンクフィンガードメインをもつ候補遺伝子がHd1遺伝子の有力な候補であると判断した。
また、Hd1候補遺伝子の発現解析を行なったところ、Hd1遺伝子領域をKasalathの染色体断片に置換した準同質遺伝子系統（NIL(Hd1)）では、日本晴に比べて発現量が著しく減少していた。銀坊主では、日本晴と同様に転写産物が検出されたが、突然変異系統であるHS66およびHS110では、銀坊主と異なるサイズの転写産物が検出された。候補遺伝子の転写産物と圃場での到穂日数との関係をみたところ、正常（日本晴および銀坊主）な転写産物が認められた場合は、到穂日数は増加し、異常な転写産物が認められた場合は減少した（表１）。以上の結果から、候補遺伝子領域がHd1遺伝子であり、Se1遺伝子座がHd1候補遺伝子座と同じであると考えられた。
このHd1候補遺伝子がイネに感光性を付与する機能を有することを確認するために、該遺伝子を含むゲノム領域を、日本晴のもつ感光性遺伝子領域をKasalath型に置換して感光性を消失させた系統に導入して、発現させた。その結果、候補遺伝子が組みこまれている個体では、短日条件で出穂が促進された。一般に、感光性が強い場合、短日条件では出穂が促進されることから、Hd1候補遺伝子が感光性を強める機能をもつことが判明した。
即ち、本発明者らは、植物の感光性に関与する遺伝子を単離することに成功すると共に、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変させることが可能であること、さらには該遺伝子を利用して植物の感光性を評価することが可能であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には、
（１）  植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｃ）配列番号：２または４に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
（２）  イネ由来である、（１）に記載のDNA、
（３）  （１）または（２）に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
（４）  （１）または（２）にDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
（５）  植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）または（２）に記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
（６）  植物の感光性を増加させるために用いる、（１）または（２）に記載のDNA、
（７）  植物の感光性を低下させるために用いる、（３）から（５）のいずれかに記載のDNA、
（８）  （１）から（５）のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
（９）  （８）に記載のベクターが導入された植物細胞、
（１０）  （９）に記載の植物細胞を含む形質転換植物体、
（１１）  イネである、（１０）に記載の形質転換植物体、
（１２）  （１０）または（１１）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（１３）  （１０）から（１２）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（１４）  （１０）または（１１）に記載の形質転換植物体の製造方法であって、（１）または（２）に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
（１５）  （１）または（２）に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の感光性を増加させる方法、
（１６）  植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期を遅延させる、（１５）に記載の方法、
（１７）  植物体の細胞内における、内因性の（１）または（２）のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の感光性を低下させる方法、
（１８）  （３）から（５）のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させる、（１７）に記載の方法、
（１９）  植物の感光性を低下させることにより、日長に依存した植物の開花時期を早める、（１７）または（１８）に記載の方法、
（２０）  植物がイネである、（１５）から（１９）のいずれかに記載の方法、
（２１）  植物の感光性を評価する方法であって、該植物における（１）に記載のDNAの存在の有無を検出することを特徴とする方法、
（２２）  植物がイネである、（２１）に記載の方法、
（２３）  （１）または（２）に記載のDNAを含むベクターが導入された宿主細胞、
（２４）  （１）または（２）に記載のDNAによりコードされるタンパク質、
（２５）  （２３）に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、（２４）に記載のタンパク質の製造方法、
（２６）  （２４）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（２７）  配列番号：２または４に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNA、を提供するものである。
本発明は、イネ由来のHd1タンパク質をコードするDANを提供する。日本晴のHd1ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：２に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。また、銀坊主のHd1ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：４に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。
Hd1は日本晴とKasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座（QTL）の一つであり、第６染色体上に座乗することが明らかとなっていた。また日本晴の遺伝的背景をもつHd1領域の準同質遺伝子系統を利用した実験から、Hd1遺伝子座は感光性遺伝子座であることが知られていた。Hd1遺伝子は、短日条件において播種から出穂までに必要な日数（到穂日数）を減少させる作用をもち、長日条件では増加させる作用をもつ。すなわち日本晴のHd1遺伝子は感光性を強めて、圃場における栽培（長日条件に近い）では晩生化させる作用をもつ。このようにHd1遺伝子は、植物の感光性に関与する遺伝子として、これまでイネ第６染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていたが、その同定および単離には至っていなかった。本発明者らは、複雑なステップを経て遂にその存在領域を解明し、単一の遺伝子として該遺伝子を単離することに初めて成功した。
現在、日本のイネの品種改良においては、出穂期の調節は重要な育種目標である。特に寒冷地では秋の低温が早く到来することから、出穂期の調節は冷害の回避のために重要であり、一方、西南暖地においては、大規模稲作地帯における収穫作業の集中を回避するためにも早生化あるいは晩成化が期待されている。
Hd1タンパク質は、植物の感光性を強める作用を有していることから、該タンパク質をコードするDNAで植物を形質転換することにより、植物の晩生化（開花時期の遅延化）を引き起こすことが可能である。一方、アンチセンス法やリボザイム法などを利用して該DNAの発現制御を行うことにより、感光性を低下させ、植物の開花時期を早めることが可能である。従って、Hd1タンパク質をコードするDNAを有していない品種には、遺伝子組換えにより該DNAを導入し、有している品種にはアンチセンスやリボザイムなどを利用して該DNAの発現を制御することにより、植物の開花時期の多様化を図り、植物の新品種育成を行なうことができる。
本発明のHd1タンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、感光性遺伝子を有するイネ品種（例えば、日本晴、銀坊主）からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２、４）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２、４）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、感光性遺伝子を有するイネ品種（例えば、日本晴、銀坊主）から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
本発明は、配列番号：１または３に記載のHd1タンパク質（日本晴、銀坊主）と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「Hd1タンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質が植物の感光性を増加させる機能を有することを指す。このようなDNAは、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、最も好ましくはイネ由来である。
このようなDNAには、例えば、配列番号：１または３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.& Fritz,H.-J.（1987）Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のHd1タンパク質をコードするアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のHd1タンパク質（配列番号：１または３）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
あるDNAが植物の感光性を増加させるタンパク質をコードするか否かは以下のようにして評価することができる。最も一般的な方法としては、該DNAが導入された植物を、日長が変更できるグロースチャンバーで栽培して調べる手法である。すなわち短日（一般的には9〜10時間）条件と長日（14〜16時間）条件で栽培し、播種から開花するまで（イネであれば播種から穂が出るまで）に必要な日数を比較する方法である。該日数が長日と短日で変わらないかほとんど同じ場合は感光性がないと判断する。感光性がある場合は、長日での開花までの日数は短日より大きくなり、その差の大きさを感光性の程度とみなすことができる。グロースチャンバーが利用できない場合には、自然日長の圃場あるいは温室における栽培試験で検定可能である。すなわち温室に20日おきに播種し、温度を保って自然日長下で栽培し、それぞれの開花日を測定する。イネにおいては、一般に８月〜２月に播種した場合は、感光性の大きな品種の出穂は促進され、逆に４月から７月では遅延する。一方、感光性の小さな品種では到穂日数は播種期の移動に影響されずに変化が小さい。
配列番号：１または３に記載のHd1タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M.（1975）Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al.（1985）Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al.（1988）Science, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Hd1遺伝子の塩基配列（配列番号：２または４）もしくはその一部をプローブとして、またHd1遺伝子（配列番号：２または４）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からHd1遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるHd1タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、Hd1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１または３）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=50、wordlength=３とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本発明のDNAは、例えば、組み換えタンパク質の調製や感光性が改変された形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A.（1970）Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D.（1983）Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間のにちに血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
本発明のDNAを利用して感光性が増加した形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明者等により単離された感光性遺伝子Hd1は、イネの感光性を強める作用を有し、その結果、出穂期を遅らせる効果を有するが、この遺伝子を任意の品種に導入し発現させることによりそれらの系統の出穂期を調節することが可能である。この形質転換に要する期間は、従来のような交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わない点で利用である。イネにおいて、出穂期を調節する遺伝子はこれまで単離・同定の報告はなされておらず、このような手法は本発明により初めて可能となった。
一方、感光性が低下した形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAの発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のタンパク質をコードするDNAの発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis,（1986）Proc.Natl.Acad.USA.83:5372)。その後、タバコやベチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der Krolら（1988）Nature 333:866)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリポソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座２核酸IV遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人,pp.319-347,1993)。
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRANの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子,（1990）蛋白質核酸酵素,35:2191)。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,(1988）FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRAN配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたｈUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら,(1988）FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子,(1990）蛋白質核酸酵素,35:2191、M.Koizumiら,（1989）Nucleic Acids Res. 17:7059)。例えば、Hd1遺伝子のコード領域（配列番号：２または４）中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRANのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Natue 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.KikuchiおよびN.Sasaki（1992）Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池洋,（1992）化学と生物30:112)。
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分は配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら,（1990）Protein Eng. 3:733、A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、C.A.GrosshansおよびR.T.Cech（1991）Nucleic Acids Res. 19:3875、K.Tairaら（1991）Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.YuyamaらBiochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr.Biol.7:R793,1997, Curr.Biol.6:810,1996)。例えば、Hd1遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、Hd1遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からHd1変異体の形質を有する植物、即ち感光性が低下した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した手法により決定できる。
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Tokiら（1995）Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K.（1995）In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.）pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al（1992）Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al.（1991）Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al.（1994）Plant J. 6: 271-282.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
このようにして作出された感光性が改変された植物体は、野生型植物体と比較して、その開花時期が変化している。例えば、Hd1タンパク質をコードするDNAが導入された植物体は、その感光性の増加により、圃場条件下において開花時期が遅延し、一方、アンチセンスDNAなどの導入によりHd1タンパク質をコードするDNAの発現が抑制された植物体は、その感光性の低下により、開花時期が早まる。このようにHd1遺伝子の発現を制御することにより、植物の開花時期を調節することができる。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、その出穂時期を調節することができ、生育環境に適応したイネ品種の育成の上で非常に有益である。
本発明は、また、植物の感光性を評価する方法を提供する。本発明者等は、Hd1遺伝子の転写産物と圃場での到穂日数との関係をみたところ、正常（日本晴および銀坊主）な転写産物が認められた場合は、到穂日数は増加し、異常な転写産物が認められた場合は減少した（実施例５）。このことは、植物における感光性の程度が、機能的なHd1タンパク質を発現するか否かが一つの要因となって決定されていることを示すものである。本発明の植物の感光性を評価する方法は、この知見に基づくものであり、植物が機能的なHd1タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かを検出することを特徴とする。
植物が機能的なHd1タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かは、例えば、ゲノムDNAのHd1に相当する領域の構造上の違いを多型として検出することにより評価することが可能である。
本発明の方法による植物の感光性の評価は、例えば、植物の交配による品種改良を行なう場合において利点を有する。例えば、感光性の形質の導入を望まない場合に、感光性を有する品種との交配を避けることができ、逆に、感光性の性質の導入を望む場合に、感光性を有する品種との交配を行なうことができる。また交雑後代個体から望ましい個体を選抜する際にも有効である。植物の感光性の有無を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本発明の感光性の評価方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得ると言える。
また、本発明は、配列番号：２または４に記載の塩基配列からなる本発明のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNAを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる２本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列が相補配列であればよい。このようなDNAは、本発明のDNAの検出や単離を行なうためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、Hd1遺伝子領域の詳細な連鎖地図、YACならびにゲノミッククローンの整列化地図を示したものである。
Aは、1505個体の分離集団を利用して作成した連鎖地図を示したものである。
Bは、酵母人工染色体（YAC）クローンの整列化地図を示したものである。
Cは、P1由来人工染色体（PAC）クローンの整列化地図を示したものである。
Dは、Hd1遺伝子の候補領域と予測される遺伝子ならびにそれらの類似性検索結果を示したものである。
図２は、Hd1候補遺伝子領域の塩基配列の比較を示す図である。日本晴および銀坊主は機能を有するHd1遺伝子を、Kasalathは機能が低下したか消失した遺伝子をもつ。HS66およびHS110は銀坊主のγ線照射により誘発されたSe1遺伝子座の感光性を失っている突然変異系統である。四角で囲んだ領域は遺伝子予測の結果、エクソンと推定された領域を示す。検出された変異部位の上部の数字は、挿入あるいは欠失した塩基数を示す。
図３は、形質転換による相補性検定に用いたベクターを示す図である。
図４は、Hd1候補遺伝子領域を含む7.1kbのゲノムDAN断片を導入した形質転換個体群における出穂までに要する日数の変化を示す図である。
図５は、Hd1候補遺伝子領域を含む7.1kbのゲノムDNA断片を導入した形質転換個体の自殖後代（T1）における出穂までに要する日数を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］高精度連鎖解析および酵母人工染色体（YAC）クローンによるHd1遺伝子領域の整列化
マップベースクローニングに不可欠な大規模分離集団によるHd1領域の詳細な連鎖解析を行った。連鎖解析用の集団はHd1領域が分離する日本晴とKasalathの戻し交雑後代BC3F3世代を用いた。連鎖解析にはプールサンプリング法を用いた。すなわちHd1領域が分離するBC3F3約8000個体を圃場に栽培して、出穂期を調査し、分離個体の中からHd1遺伝子座のKasalathホモ個体と推定される早生個体1505個体を選抜した。選抜した個体の葉を５個体で一つのプールとし、DNAを抽出して、Hd1領域に生じた組み換え染色体を有する個体を選定した。組み換え個体の選抜に用いたRFLPマーカーはR1679およびP130である。その結果、Hd1とR1679およびP130の間にそれぞれ９個および２個の組み換え個体を選抜した（図１）。
Hd1近傍に存在すると考えられるDNAマーカーを用いてさらに詳細な連鎖解析を行ったところ、Hd1遺伝子座はRFLPマーカーS20481およびP130との間に位置づけられ、S2539との間には組み換え個体は見出されなかった（図１）。Hd1遺伝子のゲノム候補領域を絞り込むために有用な組み換え個体を、S20481との間に１個体、P130との間に２個体見出した。
イネゲノム研究において作出されたYACクローンの整列化地図の情報をもとにHd1遺伝子座近傍に存在するDNAマーカーC235、S20481およびS2539の塩基配列を有するYACクローンを特定した。さらに特定されたYACクローンY4836の末端断片をカセット法により単離し、RFLPマーカーとして解析したところ、末端クローンY4836RはRFLPマーカーP130と共分離した。したがって、YACクローンY4836はHd1遺伝子領域を含むことが明らかとなった（図１）。
［実施例２］P1由来人工染色体（PAC）クローンによるHd1遺伝子領域の整列化
Hd1遺伝子座近傍のRFLPマーカーS20481（増幅ゲノム断片0.7kb）、およびS2539（増幅ゲノム断片1.9kb）をSTS化したプライマーセットを用いて、イネゲノム解析研究において作成された日本晴ゲノムのPACクローンライブラリー（平均インサート長112kb，18432クローン；イネゲノムの約4.5倍に相当）のスクリーニングを行った。STS化に用いたプライマーは、S20481については「配列番号：5/ 5'-GGA CTG GGT GAA GAA GAT-3'」と「配列番号：6/ 5'-CCT TGT CCT CTC CTC TTG-3'」、S2539については「配列番号：7/ 5'-GTA GAG TGA TGA CAA AAT GAC AA-3'」と「配列番号：8/ 5'-GGA CTG AGA TGG AAT GTG CT-3'」を用いた。その結果、P0676F10およびP0038C5の２つのクローンが選抜された。さらにこれらのPACクローンがRFLPマーカーY4836RおよびP130に対応する塩基配列を有するか否かをPCRにより調査した。その結果、PACクローンP0038C5はY4836Rに対応する塩基配列を有することが明らかとなり、Hd1遺伝子座を完全に含むことが明らかとなった（図１）。
［実施例３］塩基配列解析による候補遺伝子領域の特定
Hd1遺伝子を含むと考えられるPACクローンP0038C5の塩基配列解析を行なった。塩基配列の解析はP0038C5のインサートDNA（ベクターを含む）を超音波で断片化し、2kbおよび5kbの平均インサート長のサブライブラリーを作成した。このサブライブラリーから任意に選んだ2000個のクローンの塩基配列を解析し、コンピューターソフトPhred/Phrapによりアセンブルを行なった。連鎖解析により特定した候補遺伝子領域内の塩基配列情報を利用して、さらに新たなCAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）マーカーを作成し、候補領域の絞り込みを行った。Hd1遺伝子はプライマーとして、CAPSマーカー1b（制限酵素SspI）「配列番号：9/ 5'-AAG CAA GCA GAA AGT AAA GAG-3'」および「配列番号：10/ 5'-GAA ACA ATA GTA GAC CGA GCA-3'」、1c（制限酵素HindIII）「配列番号：11/ 5'-GAC CCA TCC GCC GCC TAC TCT-3'」および「配列番号：12/ 5'-GCA GGT CGT GAA ACA ATC GGT-3'」、1d（制限酵素HaeIII）「配列番号：13/ 5'-ATT GAG ATG GTA TTG CGG AAG A-3'」および「配列番号：14/ 5'-CAC ATC GTG CCT TCA AGC TG-3'」、および1e（制限酵素Sau3AI）「配列番号：15/ 5'-ACA AGG ACG AGG AGG TGG AC-3'」および「配列番号：16/ 5'-GCT GCT GCT CTT GCT GTT CA-3'」、と共分離し、1a（制限酵素Sau3AI）「配列番号：7」および「配列番号：8」、および1f（制限酵素NcoI）「配列番号：17/ 5'-CCA GGA AGT TTG AGA AGA CA-3'」および「配列番号：18/ 5'-TGC ATT CTG ATG CTT GAT TA-3'」との間にそれぞれ１個体の組み換え個体を検出した（図１）。従って、候補ゲノム領域を約12kbまで絞り込むことができた。この候補領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行ったところ、イネのESTとして補足されているパーオキシダーゼS2539ならびにアラビドプシスのCOと非常に高い類似性を示す領域が見い出された。アラビドプシスのCO遺伝子は長日条件で開花を促進する機能を有する遺伝子であり、ジンクフィンガードメインを有する転写調節遺伝子であると考えられている。
［実施例４］Hd1候補遺伝子の塩基配列解析
イネのEST S2539は、日本晴およびHd1の準同質遺伝子系統におけるRT-PCRによって、転写産物量が変化していなかった。したがってジンクフィンガードメインをもつ予測遺伝子をHd1遺伝子の候補とし、さらなる解析を進めた。KasalathのHd1候補遺伝子の塩基配列を決定するために、KasalathのゲノムDNAから作成したコスミドライブラリーから候補遺伝子を含むクローンno.47を選抜した。選抜したコスミドクローンを利用して、KasalathのHd1候補遺伝子領域12kbの塩基配列を決定した。Kasalathの候補遺伝子領域（配列番号：19）のORF内には11箇所（挿入、欠失および塩基置換）の変異が認められたが、そのうち最も大きな変異は予測されるエクソン内の36bpの挿入および33bpの欠失であった（図２）。
一方、Hd1と同じ遺伝子座であると推定されているSe1に関する突然変異系統HS66およびHS110ならびにそれらの原品種銀坊主の候補遺伝子領域の塩基配列の解析を行った。日本晴の塩基配列をもとにHd1遺伝子領域を増幅できるプライマーを作成し、該当領域をクローン化して塩基配列を解析した。その結果、Se1遺伝子をもつ銀坊主の塩基配列には、Kasalathの配列に見い出された36bpの挿入配列および１塩基置換が認められたが、その他は一致していた。突然変異系統HS66（配列番号：20）では、銀坊主と比較して、予測されるエクソン内に43bpの欠失、HS110（配列番号：21）ではイントロン内に433bpの挿入が認められた（図２）。
以上の結果によりジンクフィンガードメインをもつ候補遺伝子がHd1遺伝子のより有力な候補であると判断した。またSe1遺伝子座はHd1遺伝子座と同じである可能性が示唆された。
［実施例５］Hd1候補遺伝子の発現解析
日本晴およびHd1遺伝子領域をKasalathの染色体断片に置換した準同質遺伝子系統（NIL(Hd1)）に対して、候補遺伝子のRT-PCRを行った。すなわち採取した葉から全RNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、Hd1遺伝子内に設計したイントロンを含むプライマー（配列番号：22/ 5'-TTC TCC TCT CCA AAG ATT CC-3'（センス鎖）、配列番号：23/ 5'-CAT ACG CCT TTC TTG TTT CA-3'（アンチセンス鎖））によってPCRを行った。鋳型に用いたRNA量の評価はアクチンの遺伝子内断片を増幅できるプライマー（配列番号：24/ 5'-TCC ATC TTG GCA TCT CTC AG-3'（センス鎖）、および配列番号：25/ 5'-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3'（アンチセンス鎖））を用いたPCRによって行った。その結果、Hd1座にKasalathの遺伝子をもつ日本晴の準同質遺伝子系統の候補遺伝子の転写産物量は日本晴に比べて著しく減少し、かつその大きさもわずかに小さくなっていた（表１）。
0003660967.tif 000002
この大きさの違いはゲノム塩基配列において認めれた欠失に対応するものであった。さらにSe1に関する突然変異系統HS66およびHS110ならびにそれらの原品種「銀坊主」に対して、同様なRT-PCRによる発現解析を行った。銀坊主では日本晴と同様に転写産物が検出されたが、HS66では転写産物量は銀坊主と変わらないが、やや小さな転写産物が増幅された。サイズの減少の程度は、ゲノム塩基配列の解析において観察された43bpの欠失と一致していた。一方、HS110では、RT-PCRによる増幅産物が単一でなく、銀坊主と同じ大きさや著しく大きな転写産物が増幅されていた（表１）。これらの増幅産物をクローン化し、塩基配列を調べたところ、日本晴と同じ増幅産物の他に、433bpの挿入配列の一部を含む産物が見出された。従ってHS110では、433bpのイントロンへの挿入により、スプライシングが正常に行われていない可能性が示唆された。
候補遺伝子の転写産物と圃場での到穂日数との関係をみたところ、正常（日本晴および銀坊主）な転写産物が認められた場合は、到穂日数は増加し、異常な転写産物が認められた場合は減少した。またHS110では、正常な転写産物がわずかに認められたが、到穂日数も銀坊主に比較して減少するものの、HS66と比較した場合、わずかに増加していた（表１）。この結果から、HS110はSe1座の機能を完全に失ってはいないことが示唆される。
塩基配列の解析結果ならびに発現解析の結果を総合して考えると、候補遺伝子領域がHd1遺伝子であることならびにSe1遺伝子座はHd1候補遺伝子座と同じであることが強く示唆された。
［実施例６］形質転換による候補遺伝子の機能の同定
Hd1の候補領域として特定されたゲノム領域7.1kbApaI断片および3.5kbHindIII断片（図１）を、アグロバクテリウムを介して形質転換可能なベクターpPZP2H-lac（図３）に組み込んだ。これらの断片を含むベクターならびにベクターのみを用い、土岐らの方法（（1997）Plant Mol. Biol. Rep. 15:16-21）により形質転換を行なった。形質転換する系統として、日本晴の遺伝的背景をもち、日本晴のもつ感光性遺伝子Hd1およびHd2領域をKasalath型に置換して、感光性を消失させた系統NIL(Hd1/Hd2)を用いた。形質転換の結果、7.1kb断片を組み込んだベクターでは52個体、3.5kb断片を組み込んだベクターでは44個体、ベクターのみでは19個体のハイグロマイシン耐性個体を得た。
候補遺伝子に特異的なプライマー（配列番号：14（センス鎖），配列番号：15（アンチセンス鎖））を用いて、導入を試みた領域が組み込まれたか否かをPCR法により調査した。その結果、7.1kb断片および3.5kb断片の導入を試みたすべての形質転換体について候補遺伝子が組み込まれれていることが示唆された。
これらの個体を、自然日長条件の隔離温室（７月中旬に培養室から隔離温室に移す。つくば市）ならびに短日条件（10時間照明）のグロースチャンバーに移し、出穂までの所要日数を調査したところ、自然日長条件では、7.1kb断片を導入した個体群のなかに、出穂が著しく促進された個体が出現した（図４）。また短日条件のグロースチャンバーでは7.1kb断片とベクターのみの個体の出穂日に明瞭な差が認められ、7.1kb断片を導入した個体の出穂がベクターのみを導入した個体と比較して７〜14日早くなった。一方、3.5kbのゲノム断片を導入した系統はベクターのみの個体と同様な出穂日となった。
これらの結果から、候補遺伝子領域（7.1kb）には、短日条件で出穂を促進する作用を有することが確認された。一般に、感光性が強い場合、短日条件では出穂が促進されることから判断して、導入したゲノム断片は感光性を強める機能をもつことが判明した。
さらに、短日条件で出穂が促進された個体から１コピーの導入遺伝子をもつと推定される１個体を選抜し、その自殖後代を同じく短日条件（10時間の明条件、14時間の暗条件）で栽培した。その結果、自殖後代の到穂日数には大きな変異が認められ、晩生３個体は導入遺伝子を保有せず、それら以外の早生個体は導入遺伝子を保有していた（図５）。最も早生となった４個体は、PCRによる調査から、導入遺伝子ホモ型であると考えられた。以上の結果から、導入した候補遺伝子が短日条件で出穂を促進するHd1遺伝子の機能を有することが立証された。
産業上の利用の可能性
本発明によりイネの感光性遺伝子が提供された。本発明の遺伝子はイネに感光性を付与し、これにより出穂期を調節する機能を有するため、イネの品種育成に大きく貢献し得る。特に、本発明の遺伝子を用いればイネの出穂期を変化させることができ、栽培地域や栽培時期に適応したイネ品種育成に有用である。また、本発明の遺伝子を用いるイネの品種育成は、短期間で高い確実性をもって目的の植物体を得ることができる点で、従来の方法より有利である。
また、本発明により植物の感光性の評価方法が提供された。従来の評価方法は、特定の遺伝子の存在を調べるための検定系統に対象品種を交配して、それらの後代の出穂期の分離から、遺伝子の有無を推定するものであり、１品種について結論を出すために、２〜３年と多大な労力を要した。本発明の方法では、播種後２週間程度経過した苗の一部を採種して、DNAを抽出し、これを解析することにより判定できる。感光性遺伝子をもつかどうかが判定できれば、その品種の後代における感光性の程度を交配の前に推定でき、交配母本の選定や選抜のための有用な情報となる。また、このマーカーは選抜集団の各個体の感光性遺伝子の有無を上記の方法で容易に判定できることから選抜マーカーとしても利用できる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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