(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号:２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（b）配列番号:２で表されるアミノ酸配列において１つまたは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ紫外線によってＤＮＡ中のＴＴ配列およびＴＣ配列からそれぞれ誘発されたシクロブタン型ダイマー（またはＣＰＤ）および（６−４）光化学反応物（または（６−４）ＰＰ）をＤＮＡ中で特異的に認識し、そしてそれらを５′側で切断することのできるニック活性を有する蛋白質、からなる群より選ばれる蛋白質。
【請求項２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項３】
請求項１または２に記載する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載するＤＮＡを発現ベクターに導入したベクタープラスミド。
【請求項５】
請求項３に記載するＤＮＡを発現できる状態で含む宿主細胞を、栄養培地で培養し、前記ＤＮＡの発現によって産生した蛋白質を採取することを特徴とする請求項１または２記載の蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＤＮＡ修復酵素に関する。より具体的には、本発明は紫外線によって誘発されるＤＮＡの損傷の修復に関与する酵素活性を有する蛋白質に関する。また、本発明は、かかる蛋白質をコードするＤＮＡ、およびかかる蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
進化を通じて、紫外線（ＵＶ）は生物に対して多大な影響を及ぼし、ＵＶ誘発ＤＮＡ損傷の修復は生命を維持する上で重要であった。最も重要な有毒で突然変異誘発性のＵＶ光化学反応物は、シクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）と（６−４）光化学反応物［（６−４）ＰＰ］である。これらの光化学反応物を除去する数種の解決手段が確認されている。酵素的光回復（ＰＨＲ）は、多くの微生物および高等真核細胞で使用されており、可視光のエネルギーによるフォトリアーゼを介して特異的にＣＰＤをモノマー形にもどす機構である。また、（６−４）ＰＰに作用する光回復酵素は、昆虫に存在することが知られている（Todo et al.,１９９３，Nature, ３６１，３７１−３７４）。
【０００３】
また、細菌ミクロコッカス ルテウス（Micrococcus luteus）およびＴ４ファージ感染大腸菌（Escherichia coli）では、ピリミジンダイマー・ＤＮＡグリコシラーゼ／エンドヌクレアーゼ（Ｔ４endo）がＣＰＤの生じる部位での塩基除去修復を開始することによりＣＰＤを特異的に認識し、そしてＣＰＤを除去することが知られている。ＤＮＡ由来の主要な上記２種のＵＶ光化学反応物を除去できる多機能経路は、現実には、シクロブタンダイマーより遥かに効率よく（６−４）ＰＰを修復するヌクレオチド除去修復である（例えば et al.,１９８５；Szymkowski et al.,１９９３，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，９０，９８２３−９８２７）。ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）は、多くの細菌酵母およびヒトを含む種々の原核細胞および真核細胞で発見されている。
【０００４】
３０を超える糸状菌ニュウロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）の突然変異誘発剤感受性変異株からは、ヒト細胞の色素性乾皮症（ＸＰ）または酵母サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＡＤ３エピスタシス群に類するＮＥＲ欠失突然変異株は発見されていない。
【０００５】
ところが、ＵＶに対してだけでなく化学突然変異誘発剤に対しても感受性の異常な表現型を有するｍｕｓ−１８変異細胞が見い出されている（Ishii et al.,１９９１，Mol. Gen. Genet., ２２８，３３−３９）。ＵＶ照射による突然変異細胞のＤＮＡで生じるＣＰＤは、液体に１８時間保持した後でさえも修復されないまま残る（同上）。
【０００６】
本発明者らは、独自に、ｍｕｓ−１８変異細胞はおそらくＴ４ｅｎｄｏのような酵素をコードする遺伝子中のＣＰＤ修復機構中に欠陥があるものと考えた。このような遺伝子はＮＥＲ欠失大腸菌のＵＶ感受性を補足する可能性がある。そこで、本発明者らは、ニュウロスポラ クラッサ（N. Crassa）のｃＤＮＡ発現ライブラリーを、３種のＣＰＤ修復経路（ＮＥＲ、ＰＨＲおよび組換え）のすべてを欠失している大腸菌（E. coli）に導入し、新たなＤＮＡ修復酵素が存在する可能性を検討してきた。その結果、Ｎ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株における欠失遺伝子がＣＰＤ部位と（６−４）ＰＰ部位の双方に特異的なエンドヌクレアーゼをコード化することを見い出した。
【０００７】
他方、組換え技術によって製造されたＴ４エンドヌクレアーゼはＣＰＤのみに選択的に作用するものであるが、その活性を利用して、日焼け止めクリームなどに混ぜ、皮膚ガンを予防するクリームへの用途も開発されている。
【０００８】
以上のような背景を考慮すれば、ＣＰＤと（６−４）ＰＰとの双方の除去修復に寄与しうる酵素を提供できれば、さらに有効なクリーム剤等の開発に資することができるであろう。
【０００９】
【発明の構成】
本発明は、上記のように、Ｎ. ｃｒａｓｓａの特定の遺伝子が、損傷を受けたＤＮＡのＣＰＤ部位にも（６−４）ＰＰ部位にも作用するエンドヌクレアーゼをコード化することを発見し、さらにかかる遺伝子の単離および発現に成功することによつて完成した。
【００１０】
従って、本発明によれば、紫外線によってＤＮＡ中のＴＴ配列およびＴＣ配列からそれぞれ誘発されたシクロブタン型ダイマー（ＣＰＤ）および（６−４）結合生成物（または「光反応物」）［（６−４）ＰＰ］を、特異的に認識し、そしてそれらの５′側で切断することのできる酵素活性を有する蛋白質が提供される。
【００１１】
より具体的には、前記蛋白質は、後述する配列表の配列番号：１のＤＮＡ配列がコード化する蛋白質またはその誘導体である。本発明の文脈上誘導体という用語は、遺伝的および／または化学的性質の変性によって得られ、本発明の目的に沿う活性が保存されているすべての蛋白質を意味する。遺伝的および／または化学的性質の変性は、１つまたはそれ以上の残基のいずれかの突然変異、置換、欠失、付加及び／又は修飾をも意味すると理解することができる。そのような誘導体としては、例えば特に蛋白質が作用する部位への親和性を向上する目的、その生産量の増加または精製の容易化の目的、プロテアーゼへの耐性の向上または細胞膜貫通の促進の目的、その他の目的に資するように変性されたものを挙げることができる。
【００１２】
従って、本発明の蛋白質は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質それ自体およびそれから上述の少なくとも１つの目的に沿って誘導された蛋白質である。当業者は、配列番号：２のアミノ酸配列に基づき、それ自体既知のペプチド合成法により、各種誘導体を容易に製造できるであろう。また、必要な蛋白質をコードするヌクレオチド配列を適当な宿主で発現させ、必要があれば、その後さらに化学的または酵素的修飾を行って、所望の蛋白質を製造できる。
【００１３】
本発明はまた、遺伝子組換え法による前記蛋白質の製造方法も提供する。より具体的には、前記蛋白質のいずれか１種をコードするＤＮＡを発現できる状態で含む宿主細胞を、栄養培地で培養し、前記ＤＮＡの発現によって産生した蛋白質を採取する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１４】
「ＤＮＡを発現できる状態」とは、目的のＤＮＡが自律複製できるベクターに組み込まれ、しかもそれを発現させるシグナルの制御下に置かれたような状態をいう。ここでいう、シグナルとは、プロモーター、ターミネーター、分泌のためのリーダー配列等を包含するが、これらは用いる宿主細胞の種類に従って任意に選ぶことができる。
【００１５】
さらに、前記ＤＮＡはベクタープラスミドの一部を形成することができ、こうして構築されたベクタープラスミドも本発明の一態様である。
【００１６】
ベクターは自律複製性又は組込み複製性であることができる。さらに具体的には、自律複製性のベクターは選ばれた宿主における自律複製の配列を用いて製造することができる。組込みベクターについては、例えば宿主ゲノムのある領域と相同の配列を用いることにより製造することができ、相同的組み換えによるベクタープラスミドの組込みを可能にする。組換え技法による本発明の蛋白質の製造に用いることができる宿主は真核細胞または原核細胞である。適した真核宿主として動物細胞、酵母または細菌を挙げることができる。特に挙げることができる酵母はサッカロミセス（Saccharomyces）またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）属等に属する酵母である。挙げることができる動物細胞は細胞ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７などである。菌の中でさらに特定するとアスペルギルス（Aspergillus）またはトリコデルマ種（Trichoderma）属等に属するものを挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌（E. coli）、バシルス（Bacillus）等を用いるのが好ましい。
【００１７】
こうして、本発明の蛋白質は大量生産することが可能である。
【００１８】
本発明の実体およびその作用効果の理解をより容易にするため、以下に、配列番号：１で示される本発明のＤＮＡを例に添付図面を参照しながらさらに説明を加える。
【００１９】
大腸菌ＳＹ２株のＵＶ感受性を補足するＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｃＤＮＡライブラリーからの遺伝子のクローニング
野生型Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーを修復欠失Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２株に導入し、プラスミド（ｐＵＶＧ３１）を含むＵＶ耐性形質転換体を得る。このプラスミドは、ＳＹ２だけでなく、他のＥ. ｃｏｌｉ宿主のＵＶ耐性を向上させた（図１）。ｐＵＶＧ３１中の２.４ｋｂインサートのヌクレオチド配列を決定する。開始コドンは前記ｃＤＮＡの５′側に配置されるゲノムフラグメントの配列決定によって確認された（アクセス番号：Ｄ１１３９２）。前記配置は１９６８塩基の読み取り枠（ＯＲＦ）を含む。堆定アミノ酸配列は、既に報告されているＴ４ｅｎｄｏを始めとするＤＮＡ修復酵素のいずれとも異なる７４,４２１Ｍｒの蛋白質である（図２、配列番号：２）。
【００２０】
酵母レッド変異株およびヒト色素性乾皮症細胞系におけるＵＶ感受性の部分補足
他の生物体でのクローン化遺伝子によるＵＶ感受性の補足性をみるために、酵母プロモーターの後に導入し、各種のＤＮＡ修復に欠陥のあるサッカロマイセスセレビシエを形質転換した。ＮＥＲ遺伝子、ｒａｄ１およびｒａｄ２に欠陥のある２種の変異株、ならびに複製後修復欠失ｒａｄ１８株を導入プラスミドによってＵＶ耐性細胞に変換したが、野生型株のＵＶ感受性ではそのトランスフォーメーションによってＵＶ耐性をわずかに増大しただけである（図３のａ）。同様に前記ｃＤＮＡを有するヒト色素性乾皮症を補足するグループＡ（ＸＰＡ）細胞は、ヘラ（Hela）細胞のほぼ半分までＵＶ耐性を獲得した（図３のｂ）。ＨｅＬａ細胞のＵＶ耐性は、前記プラスミドの導入によって影響を受けなかった。従って、クローン化遺伝子は多様な種に由来するＤＮＡ修復欠失細胞の耐性を高める。このことは、前記ＯＲＦが細胞の他の蛋白質と独立して作用して、ＵＶ損傷の修復を開始するファクターをコードすることを示唆している。
【００２１】
クローン化遺伝子とｍｕｓ−１８変異との関係
クローン化された遺伝子とＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異との関係を調べた。Ｎ. ｃｒａｓｓａのゲノムライブラリーに由来する全ｃＤＮＡ領域にわたるＤＮＡを単離し、このゲノムフラグメントをｍｕｓ−１８変異細胞に導入した。２種の形質転換体はＵＶに対して同じ耐性を示した（図４）。さらに、我々は反復誘導点突然変異誘発（repeat-enduced point mutation：ＲＩＰ）を使用して野生型株のｍｕｓ−１８遺伝子を不活化した。ＲＩＰは重複ＤＮＡ配列を減数分裂前（premeiotically）に不活化するようなＮ. ｃｒａｓｓａの一般的な応答を利用する（Selker et al，１９８７，Cell, ５１，７４１−７５２；Selker and Garrett，１９８８，Proc. Natl. Acad. Sci USA，８５，６８７０−６８７４）。野生型細胞とクローン化ゲノム遺伝子で形質転換した野生型細胞との間の交雑からの２つの子孫はｍｕｓ−１８変異株と同様なＵＶ感受性を示した（図５）。これらのクローン中では内因性遺伝子と導入ｍｕｓ−１８遺伝子のどちらもＲＩＰによって不活化されたことを示す。最後に、野生型とｍｕｓ−１８変異株のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション分析は、変異株ゲノムに欠失を含む変化を示す（図６）。これらの結果から、前記クローン化された遺伝子はＮ. ｃｒａｓｓａ変異株ｍｕｓ−１８中で欠失しているものとの結論を出した。我々はクローン化された遺伝子をｍｕｓ−１８遺伝子と称する。
【００２２】
Ｅ. ｃｏｌｉからのｍｕｓ−１８蛋白質の精製
８個のアミノ酸残基をコードする標識（tag）を３′末端でｍｕｓ−１８遺伝子に融合させ、修復欠失ＳＹ２宿主細胞で発現させた。この組換え遺伝子は前記宿主に標識をもたない遺伝子と同等のＵＶ耐性を付与した。組換え蛋白質を、標識に対する抗体を利用し、そしてＵＶ照射プラスミドに対するニック（切断）活性を指標に精製した。クローン化ｃＤＮＡのＯＲＦにおける堆定アミノ酸配列は連続するヒスチジン配列を数ケ所含んでる。従って、まず、細胞抽出物をＮｉ2+ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロースカラムにかけた。次いで、ホスホセルロース、さらにヘパリンセファロースのアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＵＶ照射プラスミドに対してニック活性を有する画分のＳＤＳ−ゲル電気泳動を図７のａとｂに示す。ベクタープラスミドで形質転換された細胞由来の同様な溶離画分は、このような活性を示さなかった（図７のａ）。ゲル電気泳動から判断すると、最終的な画分は９５％を超える純度であった。ＦＬＡＧに対する抗体は図７のｃに示される約７４ＫＤの精製蛋白質を認識した。こうして、ｍｕｓ−１８だけの遺伝子産物がＵＶ照射ＤＮＡにニックを導入するものと判断した。精製蛋白質はＵＶ照射プラスミドに対するニック反応に際してＭｇ++だけでなくＡＴＰも必要とする（図７のｄ）。
【００２３】
ＵＶ照射プラスミドおよび合成オリゴヌクレオチドにおける精製ｍｕｓ−１８蛋白質の基質およびニック活性部位の決定
ｍｕｓ−１８蛋白質（Ｍｕｓ−１８）によって切断（ニック）されるヌクレオチド配列を同定する目的で、Ｍｕｓ−１８により線状化プラスミドを処理した。このプラスミドがＵＶを照射されている場合に限って前記蛋白質はニック（切れ目）を導入した（図８）。Ｍｕｓ−１８によるＵＶ照射ＤＮＡの処理によってＴＣ、ＴＴ、ＣＣおよびＣＴ配列において異なる濃度のＤＮＡバンドを形成した。図８のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でのＤＮＡフラグメントの移動速度を見ると、Ｍｕｓ−１８により生成したものは、配列マーカーより遅く移動している。矢印ａおよびｂによって示されるＴＣおよびＴＴ配列のバンドの位置は、ＰＡＧＥの上部におけるジピリミジン配列マーカーの最初のヌクレオチド配列付近にあり、そしてｃおよびｄにより示されるＰＡＧＥの下部における二番目のヌクレオチドより後ろにある。これは、化学的な塩基の分解で得られた３′リン酸を有するＤＮＡとは対照的に、Ｍｕｓ−１８は前記ジピリミジンの５′に隣接した部位でＤＮＡを切断し、３′−ＯＨを放出させることを意味する。
【００２４】
Ｍｕｓ−１８によって切断されたＤＮＡの損傷を同定し、損傷を受けた部位へどのようにニック（切れ目）が導入されるかを分析するために、ＴＣとＴＴの２種のジピリミジン配列だけを含む５４ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用した。標識プラスミドで得られた上記結果を考慮すると、ＮｓｉＩおよびＮｌａＩＩＩの２種の制限酵素に対する開裂部位が、それぞれＴＣおよびＴＴ配列の５′に隣接した位置に導入されている。５′または３′末端で標識されそしてその相補オリゴヌクレオチドとアニールするこのオリゴヌクレオチドが、ＵＶ照射後Ｍｕｓ−１８に対する基質として使用された。５′末端標識ＤＮＡ（Ｍｕｓ−１８によりＴＣまたはＴＴ部位にニックを入れた）は、Ｔ４ｅｎｄｏで開裂したものより早く泳動した（図９のｂ、レーン１および２）。（６−４）ＰＰまたはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いるＰＨＲは、それぞれＴＣ（レーン３）またはＴＴ（レーン５）におけるバンドを殆ど消失するが、Ｔ４ｅｎｄｏによって生成したバンドはＣＰＤに対するフォトリアーゼを用いるＰＨＲによって完全に消失した（レーン６）。Ｍｕｓ−１８で切断された３′末端標識ＤＮＡは、Ｔ４ｅｎｄｏで切断されたものよりわずかに遅く泳動した（図９のｃ、レーン１および２）。これは５′末端標識ＤＮＡを用いて得られたものに相当し、Ｍｕｓ−１８がＴ４ｅｎｄｏで切断された部位の５′部位で単一のニックを導入することを示す。
【００２５】
図９のｄは、ＴＣまたはＴＴ配列でＭｕｓ−１８により切断された５′末端ＤＮＡが、ＮｓｉＩまたはＮｌａＩＩＩによる消化後に生じたものと、それぞれ同じ位置まで泳動した（レーン１〜３）。切断されたＤＮＡはｄｄＴＴＰと共に末端デオキシトランスフェラーゼに対する基質として働き、追加のヌクレオチドをもたらし（レーン４〜６）、３′ＯＨ末端の存在を示す。３′標識されそしてＭｕｓ−１８切断ＤＮＡフラグメントの移動度も前記制限酵素により生成されたものと同じであった（図９のｃ、レーン１〜３）。ウシ腸フォスファターゼ（ＣＩＰ）により切断されたＤＮＡの後処理はすべてのＤＮＡの移動をわずかに遅らせた。Ｍｕｓ−１８により切断されたＤＮＡの５′末端にリン酸が存在することを示す。
【００２６】
Ｎ. ｃｒａｓｓａ ＵＶ感受性変異株におけるｍｕｓ−１８遺伝子と突然変異
上述のように、Ｎ. ｃｒａｓｓａ由来のｃＤＮＡライブラリーとＵＶ感受性 Ｅ. ｃｏｌｉの補足性により、新規な真核ＤＮＡ修復遺伝子が単離された。ｍｕｓ−１８遺伝子は高度に親水性のカルボキシ末端を有する蛋白質をコード化する。特に興味深いのは、図２の下線を引いた太字で示される配列４ｘＬｙｓ−２ｘＧｌｙ−２ｘ（Ｌｙｓ Ａｒｇ）である。この配列は、ＤＮＡと密接に相互作用するペプチドであるプロタミンのカルボキシ末端で見い出された配列［ニジマスのプロタミンＩＡにおける６ｘＡｒｇ−２ｘＧｌｙ−４ｘＡｒｇ（Ando and Watanabe,１９６９，Int. J. Protein Res.,１，２２１−２２４）］に類似する。この配列中に各種の欠失を伴うｍｕｓ−１８遺伝子は、Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２宿主細胞のＵＶ感受性の補足活性に影響を及ぼし、遺伝子産物の酵素的機能においてその配列が重要な役割を担うことを示唆する。
【００２７】
Ｎ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株における変異を以下の３種の方法で同定した。一つは、野生型遺伝子（ＲＩＰ）の導入によるｍｕｓ−１８株におけるＵＶ感受性の補足性であり、もう一つは、野生型ＤＮＡと変異ゲノムＤＮＡを用いるサザン分析の比較である。サザン分析から、その変異はｍｕｓ−１８遺伝子を含有するゲノムフラグメントの一部に欠失を伴うことがわかる。
【００２８】
精製Ｍｕｓ−１８により生じるニック
ｍｕｓ−１８遺伝子は、ＣＰＤと（６−４）ＰＰの両者に対してニック活性を有する蛋白質をコード化する。Ｍｕｓ−１８は、ＵＶ誘発ＣＰＤおよび（６−４）ＰＰに隣接した５′位にニックを導入し、損傷を有するＤＮＡ鎖の一本鎖の破壊をもたらすことを示す（図１０）。Ｍｕｓ−１８の基質はＴＴ、ＴＣ、ＣＣおよびＣＴ配列において生じたピリミジンダイマー類を包含する。図８に示されるニックバンドの強度変化は、ＵＶによる損傷の程度の相違および／またはＭｕｓ−１８による修復の選択性の相違に起因すると思われる。高ＵＶ用量（３ｋＪ／ｍ2）をそれぞれ前記プラスミドおよびオリゴヌクレオチドに照射するとＴＣ配列において比較的多量の（６−４）ＰＰを生成する。ＤＮＡに低用量のＵＶ照射を行った後、前記蛋白質によってＴＴ部位が優先的に切断される。前記蛋白質によるＵＶ誘導ダイマー類間のニック活性の優先性は確認していないが、ＣＰＤと（６−４）ＰＰ間で前記蛋白質による認識に差があるものと思われる。チミン−チミンダイマーにおけるニックの導入のためには、種々の鎖長の合成ＤＮＡを用いた分析から判断すると、Ｍｕｓ−１８は（６−４）ＰＰに対するよりも損傷に対してより長いフランキング配列を必要とする。これは、Ｍｕｓ−１８は異なる化学構造をもつ各種のＵＶ誘導ダイマーをどの程度まで認識するか、ということが次の解明すべき問題点となることを示唆する。
【００２９】
ｍｕｓ−１８遺伝子による宿主細胞におけるＵＶ感受性の補足
Ｍｕｓ−１８の研究から生じる他の興味ある問題点は、どの程度のニック部位が細胞中でその後処理されるかにある。大腸菌、酵母およびヒト細胞に導入されたｍｕｓ−１８遺伝は、これらの宿主細胞のＵＶ生存率を同じように高める。この点で、Ｍｕｓ−１８は、酵母ｒａｄ突然変異体およびヒトＸＰ細胞にＵＶ耐性を付与しうるＴ４ｅｎｄｏと似ている（Valerie et al.,１９８６，Mole. Cell. Biol.，６，３５５９−３５６２）。各種の修復欠失宿主細胞におけるＵＶ感受性補足は、ほんの部分的であって、野生型細胞のＵＶ耐性には到達しなかった。酵母細胞では、完全なＮＥＲ活性を有する複製後修復欠損ｒａｄ１８変異株、ならびに２種のＮＥＲ変異株（ｒａｄ１およびｒａｄ２）［これらはそれぞれＤＮＡ損傷の５′および３′位におけるニック活性を欠いている（Bardwell et al.,１９９４，Science，265，２０８２−２０８５；Harrington and Lieber,１９９４，Genes Dev., ８，１３４４−１３５５）］は、ｍｕｓ−１８遺伝子によって同じ程度にＵＶ耐性を高める（図３）。これらの結果は、これらの生物における切断機構と独立した修復経路によってさらに処理されることを示唆する。
【００３０】
Ｍｕｓ−１８の役割とその分布
本発明者らが分析した限りでは、ＵＶ誘発損傷以外のＤＮＡ損傷部にＭｕｓ−１８がニックを導入するとの根拠は得られなかった。これはＵＶに選択的な感受性であるｍｕｓ−１８変異株の表現型とよく一致する。Ｎ. ｃｒａｓｓａは存在するとしてもＵＶ損傷に対して非常に効率の悪いＮＥＲはもたない。（Ishi et al.,１９９１，Mol. Gen. Genet.，２２８，３３−３９）。従って、この生物体では、ｍｕｓ−１８遺伝子がＵＶ誘発損傷、特に（６−４）ＰＰに対するＮＥＲに代って働く可能性がある（下記参照）。最近、ＮＥＲの完全に欠失したスキゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）は、ＤＮＡ中のＣＰＤおよび（６−４）光化学反応物の相当な修復能を依然として維持していることが報告された（MaCready et al.,１９９３，Mol. Microbiol.，１０，８８５−８９０）。より最近になって、Ｓ. ｐｏｍｂｅの細胞抽出物の酵素活性がＭｕｓ−１８と同様な様式でＴＴおよびＴＣダイマーにニックを導入することが報告された（Bowman et al.,１９９４，Nucleic Acids Res.，２２，３０２６−３０３２）。非常に効率よくＣＰＤフォトリアーゼ活性を獲得するＮ. ｃｒａｓｓａ（Yajima et al.,１９９１，Nucleic Acids Res.，１９，５３５９−５３６２；Eker et al.,１９９４，Photochem. Photobiol.，６０，１２５−１３３）とは対照的に、Ｓ. ｐｏｍｂｅはそのような活性をまったくもたない（Yasui et al.,１９８９，Mutat. Res.，２１７，３−１０）ので、Ｍｕｓ−１８の相同蛋白質はＵＶ誘発ＣＰＤの修復をサポートする可能性がある。従って、Ｍｕｓ−１８とその相同蛋白質は進化上密接な関係を有する生物Ｎ. ｃｒａｓｓａとＳ. ｐｏｍｂｅのＵＶ誘発ＤＮＡ損傷の除去またはＰＨＲの欠損をそれぞれ償うものと思われる。同様な酵素が他の生物にも分布している可能性はある。
【００３１】
ここに、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａのＵＶダイマー エンドヌクレアーゼと命名したｍｕｓ−１８の精製蛋白質は、Ｔ４エンドヌクレアーゼが哺乳類細胞に残存するＣＰＤの分析に使用されるように、細胞のＵＶ損傷を同定する道具としても有用であろう。すべてのピリミジン ダイマーまたはＣＰＤフォトリアーゼとの組み合わせ使用によって、未修復（６−４）ＰＰを同定することもできる。
【００３２】
【実施例】
材料および方法
菌株および細胞系
発現のために、Ｎ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡを、Ｅ. ｃｏｌｉ ＳＹ２株（ＪＭ１０７ △ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｕｖｒ Ａ：：Ｋｍr △ｒｅｃ Ａ：：Ｙｅｔr）（Yasuhira and Yasui,１９９２，J. Biol. Chem.，２６７，２５６４４−２５６４７）へのクローニングに使用した。ＳＹ１株（△ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｕｖｒＡ：：Ｋｍr）、ＫＹ２９（△ｐｈｒ：：Ｃｍr △ｒｅｃ Ａ：：Ｔｅｔr）およびＫＹ２０（△ｐｈｒ：：Ｃｍr）も、クローン化遺伝子で形質転換した。ＫＹ２０およびＫＹ２９は、K. Yamamoto 博士（東北大理学部）より得た。使用した酵母サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、ＧＲＦ１８（野生型、ｌｅｕ２）、ｙａ１０３１（ｒａｄ１  ｌｅｕ２）、ｙａ２−２（ｒａｄ２  ｌｅｕ２）およびｙａ１８−１（ｒａｄ１８  ｌｅｕ２）であった。これらの菌株はＧＲＦ（Dr. G. R. Fink，マサチューセッツ工科大学より得た）以外は、本発明者らによって樹立された。ＸＰＡ細胞系、ＸＰ１２ＲＯＳＶは、Dr. K. Tanaka（大坂大学細胞工学センター：田中亀代次博士）より得た。
【００３３】
ｃＤＮＡおよびゲノムのライブラリー
ラムダＺＡＰ（Orbach et al.,１９９０，J. Biol. Chem.，２６５，１０９８１−１０９８７）に構築されたＮ. ｃｒａｓｓａのｃＤＮＡライブラリーは、Dr. M. S. Sachs上記文献を参照のことより入手した。Ｅ. ｃｏｌｉ用発現ライブラリーにｉｎ ｖｉｔｒｏ切断によって転換した。ゲノムライブラリーは、λ ＥＭＢＬ３にＥｃｏ ＲＩ消化ＤＮＡを導入することにより野生型Ｎ. ｃｒａｓｓａから作製した。
【００３４】
Ｎ. ｃｒａｓｓａ ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニングおよび配列決定
ＳＹ２細胞における相補性によるフォトリアーゼ遺伝子の単離方法（Yasuhiraおよび Yasui,１９９２，J. Biol. Chem.，２６７，２５６４４−２５６４７）を改良して使用した。既述すれば、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換したＳＹ２細胞の一昼夜培養物１００μｌを、４種の抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、クロムフェニコールおよびテトラサイクリン）を含むＬＢプレート上で０.１Ｊ／ｍ2の用量でＵＶ照射し、一昼夜インキュベートした。生存しているコロニーを、抗生物質添加ＬＢ培地中に集め、さらに培養した。細胞懸濁液をＬＢプレートに塗布し、さらなるＵＶ照射に供した。３度の選択後、数個の生存コロニーを、ＵＶ耐性について試験した。
【００３５】
クローン化ｃＤＮＡプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングし、クローン化ｃＤＮＡの全配列を含む４.７ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩフラグメントを単離した。２４２２ｂｐを含む完全ｃＤＮＡとＯＲＦの上流配列を含む１ｋｂ鎖長にゲノムフラグメントのヌクレオチド配列を決定した。
【００３６】
大腸菌、酵母およびヒトＸＰＡ細胞系におけるクローン化遺伝子の発現のためのプラスミドの構築およびトランスフォーメーション
Ｅ. ｃｏｌｉでのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のために、前記クローン化ｃＤＮＡ由来のコーディング配列をｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）のｔａｃプロモーターの後に導入した。
【００３７】
酵母でのｍｕｓ−１８遺伝子の発現のために、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＫＴ１０プラスミド（Dr. M. Nakafuku，東京大学）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの後に導入した。酵母細胞を Hinnen et al（１９７８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ７５，１９２９−１９３３に記載の方法で形質転換した。
【００３８】
ヒトの細胞で発現するために、ｐｃＤＮＡＩ（INVITROGEN）のＣＭＶプロモーターの後に導入した。Ｇ４１８耐性マーカーを担持するプラスミドと一緒にＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（GIBCOBRL）によって細胞をトランスフェクションした。選択はＧ４１８（WAKO）を用いて行った。各種用量でのＵＶ照射後のコロニー形成能を形質転換された大腸菌、酵母およびヒト細胞について測定した。データは、最低２回の独立した実験の平均値によった。ｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製用として、８個のアミノ酸残基の標識［ＦＬＡＧ（KODAK）］を停止コドンの前のコーディング配列の末端へＰＣＲによって結合した。前記標識を有するｃＤＮＡをｐＫＫＥＮＳ［ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）の誘導体］のｔａｃプロモーターの後に導入し、ｐＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧを得た。
【００３９】
Ｎ．ｃｒａｓｓａのトランスフェクションおよび反復誘発点突然変異（ＲＩＰ）
全ｍｕｓ−１８遺伝子を担持する４.５ｋｂのＥｃｏ ＲＩゲノムＤＮＡフラグメントを、ハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＢ）と結合し、ｍｕｓ−１８変異細胞に導入した。通常、数コピーのＤＮＡがＮ．ｃｒａｓｓａのゲノム中へ組込まれる。反復誘発点突然変異（ＲＩＰ）によりｍｕｓ−１８遺伝子を不活化するために、２つのｍｕｓ−１８遺伝子をもつＮ. ｃｒａｓｓａ野生型株を逆の接合型を有する野生型株と交雑させた。既に報告されている方法（Selker and Garrett,１９８８，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，８５，６８７０−６８７４）を使用した。
【００４０】
Ｎ．ｃｒａｓｓａの野生型株のおよびｍｕｓ−１８変異株のＤＮＡのサザン分析
野生型株およびｍｕｓ−１８変異株由来のゲノムＤＮＡを常法により単離し、制限酵素で消化し、そしてニトロセルロースフィルター上にブロットした。ＤＮＡプローブを、Ｅｃｏ ＲＩで消化することにより全ｍｕｓ−１８遺伝子を含有するクローン化ゲノムＤＮＡから調製した。ハイブリダイゼーションは非放射性ＤＮＡ標識化と検出キット（Boehringer）を用い、製造業者の説明書に従って行った。
【００４１】
大腸菌宿主細胞からのｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製
ＰＫｍｕｓ−１８ＦＬＡＧまたはベクタープラスミドを含むＳＹ２細胞を、カルベニシリンを強化したＬＢ培地１ｌ中のＯＤが０.５になるまで増殖させた。３７℃で５時間１ｍＭのＩＰＩＧで発現を誘導した後、細胞を音波処理緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ８.０）２０ｍｌ中に集め、０℃で５分間音波処理して崩壊させた。細胞残滓を遠心（４℃、２０分間４３０００×ｇ）により除去した。粗抽出物を３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）カラムにかけ、０.３ＭのＮａＣｌを含有する１５ｍＭのイミダゾールから溶出する画分を集めた。この画分をバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ，ｐＨ７.５および１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈しＮａＣｌ濃度を０.２Ｍに調節し、次いで０.２Ｍ ＮａＣｌ−バッファーＡで平衡化したホスホ−セルロースカラム（ベッド容積１.５ｍｌ）にのせた。Ｍｕｓ−１８は０.３５Ｍ ＮａＣｌ−バッファーＡで溶離した。次に、その画分を予め０.２Ｍ ＮａＣｌ−バッファーＡで平衡化したヘパリンセファロースカラム（ベッド容積０.３ｍｌ）にのせた。ｍｕｓ−１８−ＦＬＡＧ蛋白質は、０.４Ｍ ＮａＣｌ−バッファーＡで溶離した。９７％均等性を有するｍｕｓ−１８−ＦＬＡＧ蛋白質７２μｇが得られた（図７のａ）。この精製蛋白質を−２０℃において２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.５ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび４０％グリセロール中で保存し、特記しない限り、この溶液をすべての実験で使用した。
【００４２】
プラスミド切断アッセイおよび精製Ｍｕｓ−１８の単位の定義
閉環プラスミドＤＮＡを０.２μｇ／μｌのＤＮＡ濃度で０.１ｋＪ／ｍ2または１ｋＪ／ｍ2のＵＶ照射を行い、これらをそれぞれ標準アッセイまたは単位の定義に使用した。３７℃で３０分間、前記ｍｕｓ−１８含有画分を総量１０μｌの至適反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７.９、０.１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴおよび１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）中０.１μｇのＤＮＡと混合した。反応を１０分間６５℃で加熱することにより停止し、０.７５％アガロースゲルで分析した。ｍｕｓ−１８ニック活性の１単位は、１００μｌの反応容積中で３７℃にて６０分以内にＵＶ照射ｃｃＤＮＡ（１ｋＪ／ｍ2）をｏｃＤＮＡへ変換するのに必要な量として定義した。精製Ｍｕｓ−１８の比活性は１μｇ当り７８０単位であった。Ｔ４ｅｎｄｏでは、２０ｍＭのＥＤＴＡを含むがＭｇＣｌ2を含まないＭｕｓ−１８に使用した緩衝液を使用した。
【００４３】
プラスミドＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチドを基質として使用する除去アッセイおよびニック部位の決定
ＣＰＤに対するアナシスティス ニデュランス（Anacystis nidulans）フォトリアーゼ（Eker et al.,１９９０，J. Biol. Chem., ２６５，８００９−８０１５）および（６−４）ＰＰに対するドロソフィラ メラノガスター（Drosophila melanogaster）フォトリアーゼ（Todo et al.,１９９３，Nature, ３６１，３７１−３７４）は、それぞれ Dr. A. P. M. Eker および Dr. Todo から入手した。Ｔ４ｅｎｄｏは、Dr. K. Valerie および Dr. K. de Riel から入手したｔａｃプロモーターの後にｄｅｎ Ｖ遺伝子をもつ大腸菌から精製した。ＰＨＲは、室温で１.５時間１０ｃｍからの蛍光を用いる透明チュ−ブで行った。Ｍｕｓ−１８蛋白質およびＴ４ｅｎｄｏは１時間３７℃で使用した。図８に示されるニック部位の分析のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをＸｂａＩで消化し、脱リン酸化し、次いでγ−32ｐ−ＡＴＰで標識した。標識されたＤＮＡをＳａｃＩで消化し、ＰＡＧＥ後５％の中和ゲルから単離した。ＤＮＡの半分に３ＫＪ／ｍ2のＵＶ（２５４ｎｍ、５Ｊ／ｍ2ｓ）を照射し、次いでＭｕｓ−１８で処理した。マキサム・ギルバート法（Maxam and Gilbert,１９７７，Methods Enzymol.，６５，４９９−５６０）後、塩基の化学的破壊を標識されたＤＮＡの別の半分に行った。
【００４４】
２種のジピリミジン配列（下線部）を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：３）
５′−ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＧＣＡ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＡＧＣ−３′
を合成し、１５％アクリルアミドゲルを用いるＰＡＧＥで精製した。５′または３′部位を、それぞれポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いるγ−32ｐ−ＡＴＰまたはターミナル デオキシトランスフェラーゼ（TdT，Boehringer)を用いるα−32ｐ−ｄｄＡＴＰで標識した。
【００４５】
適正な大きさのＤＮＡを再度ＰＡＧＥ（１５％ゲル）で精製し、相補鎖にアニールさせた。ＵＶ照射（３ｋＪ／ｍ2）後、Ｍｕｓ−１８で処理し、制限酵素で消化した未照射ＤＮＡと共にＰＡＧＥ（１５％ゲル）で分析した。ＴｄＴまたはウシ腸フォスファターゼ（宝酒造）を使用して、それぞれコールドｄｄＴＴＰを有する３′末端にヌクレオチドを加えるかまたはニツクＤＮＡの５′未満のリン酸を除去した。実験では、１０ｆｍｏｌのＤＮＡに対して３５ｕ（単位）のＭｕｓ−１８を常に使用した。配列およびニツク部位を、ＰＡＧＥ後、ＢＡＳ ２０００ Image Analyzer（富士フィルム）によって分析した。
【００４６】
【発明の効果】
皮膚ガンの予防や治療の目的で使用しうる新規ＤＮＡ修復酵素およびその製造方法が提供される。本酵素の具体的な使用態様としては、日焼け止めクリームなどに混合使用すること等が期待される。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
【表２】
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【００４９】
【表３】
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【００５０】
【表４】
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【００５１】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎ．ｃｒａｓｓａからクローン化されたｃＤＮＡの発現により各種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株におけるＵＶ耐性の向上を示すグラフである。ＵＶ照射後のベクタープラスミド（白ぬき印）またはｐＵＶＧ３１（黒ぬり印）で形質転換したＥ. Ｃｏｌｉ ＳＹ２（ｐｈｒ ｕｖｒＡ ｒｅｃＡ）株（三角印）、ＳＹ１（ｐｈｒ ｕｖｒＡ）株（四角印）、ＫＹ２９（ｐｈｒ ｒｅｃＡ）株（逆三角印）およびＫＹ２０（ｐｈｒ）（丸印）の生存曲線。
【図２】クローン化された遺伝子の堆定アミノ酸配列を一文字表記で示す。１９８６ｂｐ ＯＲＦから堆定される堆定アミノ酸配列が示される。下線を引いた太字のアミノ酸配列は、プロタミンで見い出されたものと同一の配列を示す。
【図３】酵母とヒト細胞系の生存曲線を示すグラフである。ａはサッカロマイセス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のＵＶ照射後に、ベクタープラスミドｐＫＴ１０−ＬＥＵ２（黒ぬり印）またはそのベクター中にクローン化したｃＤＮＡを有するプラスミド（白ぬき印）で形質転換したＧＲＦ１８（野生型）株（逆三角印）、ｙａ１０３１（ｒａｄ１）株（丸印）、ｙａ２−２（ｒａｄ２）株（三角印）およびｙａ１８−１（ｒａｄ１８）株（四角印）。
ｂはベクターｐｃＤＮＡ（白ぬき印）またはそのベクターのＣＭＶプロモーターの後にクローン化したｃＤＮＡを有するプラスミドで形質転換したＸＰＡ細胞系。ＵＶ耐性レベルは、白ぬき三角印による前記ベクタープラスミドで形質転換したヘラ（ＨｅＬａ）細胞に関して示す。
【図４】ＵＶ生存性に対するＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導入の影響を示すグラフである。クローン化ｃＤＮＡをカバーするＮ. ｃｒａｓｓａのゲノムフラグメントの導入によるｍｕｓ−１８変異株のＵＶ感受性の相補性を表す。クローン化されたゲノム遺伝子は、ハイグロマイシン耐性マーカー（ｈｙｇ Ｂ）を担持するｐＵＶＥＥ１誘導体のトランスフェクションまたはｈｙｇ Ｂを担持するプラスミドｐＣＳＮ４４とｐＵＶＥＥ１の同時トランスフェクションによって導入された。前者（黒ぬり四角印）または後者（黒ぬり逆三角印）の方法によって得られたハイグロマイシン耐性形質転換体、ならびに野生型（白ぬき丸印）細胞およびｍｕｓ−１８変異株（印ぬき三角印）細胞のＵＶ感受性を示す。
【図５】ＵＶ生存性に対するＮ. ｃｒａｓｓａのｍｕｓ−１８変異株または野生型細胞へのクローン化遺伝子導入の影響を示すグラフである。ＲＩＰによって不活化されたｍｕｓ−１８遺伝子を有する細胞のＵＶ感受性を示す。野生型細胞を、ｐＵＶＥＥ１で形質転換した細胞と交雑した。交雑から得られた、２種の子孫を試験した。野生形（白ぬき丸印）細胞、ｐＵＶＥＥ１で形質転換された野生型（黒ぬり四角印）、ｍｕｓ−１８変異株（白ぬき三角印）および２種の子孫（黒ぬり逆三角印）のＵＶ感受性を示す。
【図６】図４と図５に関連するｍｕｓ−１８変異細胞におけるゲノムＤＮＡの転位を示すものであり、サザンハイブリダイゼーションの結果を示すゲル電気泳動図である。前記クローン化遺伝子をカバーするＥｃｏ ＲＩ（レーン１および２）およびＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３および４）で消化したゲノムＤＮＡに対する野生型（レーン１および３）およびｍｕｓ−１８変異株（レーン２および４）から、それぞれ調製したゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションである。
【図７】Ｅ. ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺伝子産物の精製の各段階におけるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）による分析結果を示す図に代わる写真である（ａ）。ｂはニック活性分析による同図に代わる写真である。
Ｅ. ｃｏｌｉ形質転換体由来のｍｕｓ−１８遺伝子産物のＦＬＡＧに対する抗体を用いた精製画分の各段階におけるウェスタンブロットの結果を示す電気泳動図に代わる写真である（ｃ）。
図中のＶおよびＭは、それぞれベクタープラスミドおよびｍｕｓ−１８遺伝子を含む細胞抽出物由来の画分を示す。粗抽出物からの上澄（Ｓ）またはＮｉ−ＮＴＡ（Ｎ）、フォスフォセルロース（Ｐ）およびヘパリンセファロース（Ｈ）カラム由来のＭについてのニック活性を有する画分およびＶについての同画分の分析結果である。
ｄは、Ｍｕｓ−１８のフォスフォセルロース画分におけるニック活性のＭｇ++依存性を示す電気泳動図に代わる写真である。この反応混合物中には、ＡＴＰは含まれていない。
【図８】Ｍｕｓ−１８のニック活性に対する基質の決定を示すための電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写真である。Ｍｕｓ−１８で処理した５′末端標識プラスミド（ＵＶ照射または未照射）のＰＡＧＥである。一試行実験のＰＡＧＥはパネルの左側から右側に示されている。ａ、ｂ、ｃおよびｄについては、発明の詳細な説明を参照されたい。
【図９】基質決定およびＭｕｓ−１８により導入されたニックの性質を示す電気泳動（ＰＡＧＥ）図に代わる写真である。ａは、２種のジピリミジン配列を含有する合成オリゴヌクレオチドＮＮ３の構造である。ＮｓｉＩとＮｌａＩＩＩ酵素の認識配列およびニック部位を、それぞれ下線および矢印によって示す。上部にはヌクレオチドの数を示している。ｂはＰＨＲと共にそしてＰＨＲを伴わずＭｕｓ−１８（Ｍｕｓ）またはＴ４ｅｎｄｏ（Ｔ４）で切断した５′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。相補性オリゴマーとアニールさせたＮＮ３をＵＶ照射し、そしてＭｕｓ−１８（レーン１）またはＴ４ｅｎｄ（レーン２）で処理した。ＵＶ照射しそしてアニール化したＤＮＡを（６−４）フォトリアーゼ（レーン３およびレーン４）またはＣＰＤフォトリアーゼ（レーン５およびレーン６）で光回復させ、次いでＭｕｓ−１８（レーン３およびレーン５）またはＴ４ｅｎｄ（レーン４およびレーン６）で処理した。ｃはＭｕｓ−１８またはＴ４ｅｎｄｏで切断した３′末端標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。ＵＶ照射後、ＤＮＡをＭｕｓ−１８（レーン１）またはＴ４ｅｎｄｏ（レーン２）で処理した。ｄはＭｕｓ−１８または制限酵素で切断した５′末端標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果を示す。ＵＶ照射ＤＮＡをＭｕｓ−１８（レーン２）で切断し、ｄｄＴＴＰの存在下でＴｄＴで処理した（レーン５）。ＰＡＧＥにおける移動度を比較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ（レーン１）またはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で消化し、そしてｄｄＴＴＰを組み入れたもの（それぞれ、レーン４およびレーン６）である。ｅはｍｕｓ−１８蛋白質で切断した３′標識ＮＮ３のＰＡＧＥ分析結果である。ＵＶ照射ＤＮＡをｍｕｓ−１８蛋白質（レーン２）で、次いでＣＩＰ（レーン５）で処理した。移動度を比較する目的で、未損傷ＤＮＡをＮｓｉＩ（レーン１）またはＮｌａＩＩＩ（レーン３）で処理し、次いで脱リン酸化した（それぞれレーン４およびレーン６）。
【図１０】ＵＶ誘発ピリミジンダイマーにおけるＭｕｓ−１８で誘導される除去モデルを示す概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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