(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式ＡのＮ−(３−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピル)アルカナミドからなる新規なスフィンゴ脂質合成阻害剤。
【化１】
0003692492.tif 000004
式Ａ
（式中、Ｘは脂肪族アルキル基）
【請求項２】
一般式Ａの化合物が下記の立体構造を持つ（１Ｒ，３Ｒ）Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピル)アルカナミドであることを特徴とする請求項１に記載のスフィンゴ脂質合成阻害剤。
【化２】
0003692492.tif 000005
【請求項３】
Ｘが炭素数が７〜１５の脂肪族アルキル基であることを特徴とする請求項２に記載のスフィンゴ脂質合成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なスフィンゴ脂質合成阻害剤、特にセラミドの細胞内輸送を選択的に阻害することによりスフィンゴミエリンの合成を阻害する新規なスフィンゴ脂質合成阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スフィンゴ脂質は、哺乳動物細胞に普遍的に存在する膜脂質群であり、細胞の成長、分化およびアポトーシスにおいて重要な役割をしている。また、膜マイクロドメインの必須な構成因子として、膜輸送および細胞内情報伝達の制御に関わっていると考えられている。
哺乳動物細胞中でのスフィンゴ脂質の生合成経路は、次のように考えられている。すなわち、第１の過程は、Ｌ−セリンとパルミトイルＣｏＡとの縮合反応であり、該反応はセリンパルミトイルトランスフェラーゼで触媒され、３−ケトジヒドロスフィンゴシンを生成する。次いで、３−ケトジヒドロスフィンゴシンはジヒドロスフィンゴシンに還元される。ジヒドロスフィンゴシンはＮ−アシル化、これに続く不飽和化によりセラミド（Ｃｅｒ）を生成する。これらの反応は小胞体（ＥＲ）の細胞質側表面で起こり、セラミド（Ｃｅｒ）が形成される。次いで、セラミド（Ｃｅｒ）は、ゴルジ装置の内側に移され、次いでホスファチジルコリン（レシチン）からセラミドへホスフォコリンの転移を触媒するスフィンゴミエリン（ＳＭ）合成酵素によりＳＭに変換される。セラミド（Ｃｅｒ）は、またウリジン５’二燐酸(ＵＤＰ)−グルコースからセラミドへのグルコースの転移を触媒するグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）合成酵素によりグＧｌｃＣｅｒに変換される（これらの反応工程は図８に示す。）。
新生合成スフィンゴ脂質の生物学的合成における種々の過程（反応、転移など）に特異性を持つ阻害剤は、培養細胞および生きた動物におけるスフィンゴ脂質の代謝および機能の研究の有用な道具である。
しかしながら、ＳＭ合成に対する特異的な阻害剤は今までのところ見出されていない。また、スフィンゴ脂質の細胞内輸送を選択的に阻害する薬剤も、見出されていない。
ただし、本発明者らは、文献１および文献２において、ＣｅｒのＥＲからＳＭ合成のためのゴルジ体への輸送が欠陥したチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞変異株（ＬＹ−Ａ株）を用いた（更に、野生型タイプのＣＨＯ細胞を対照材料とした）解析の結果から、ＥＲからＳＭ合成部位へのＣｅｒの主輸送はＡＴＰ依存性経路であり、一方、ＣｅｒはＡＴＰ非依存経路により、ＧｌｃＣｅｒ合成の場に到達することをすでに明らかにしている。このことは、ＥＲからＳＭ合成部位へのＣｅｒ輸送の阻害によりＣｅｒを前駆体とするＳＭ合成が阻害されることを示している。しかしながら、Ｃｅｒの細胞内輸送を特異的に阻害する薬剤については言及されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本願発明は、新規な、ＳＭ合成に対しての選択的な阻害剤を提供することである。前記課題を解決するために、本発明者らは、前記一般式Ａで示される化合物を用いた多くの実験を経て、特にその中に前記ＳＭ合成を選択的に阻害する立体異性体が存在することを発見し、前記課題を解決できた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記一般式Ａで表される化合物からなる、新規なスフィンゴ脂質合成阻害剤であり、特に前記請求項２に記載の化学構造、特にアルキル基の長さ、および立体構造を持つ合成化合物からなる新規なスフィンゴ脂質合成阻害剤である。
【０００５】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明の新規なスフィンゴ脂質合成阻害剤となる化合物およびその合成方法は以下のとおりである。
Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロル)
アルカナミド（ＨＰＡ）化合物（アルカンは、脂肪族基、好ましくは炭素数が７〜１５のアルキル基である。）
前記化合物の合成
ＴＢＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル基）で保護された化合物１とドデカノイルクロライドとをＣＨ２Ｃｌ２溶媒中でＨＣＬの受容体となるアミンの存在下で反応させて、化合物１のアミノ基にドデカノイル基を導入した化合物２を得る。化合物２をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で（Ｐｈ）２ＣｕＬｉと反応させて、チオエステル（−ＣＯＳＥｔ）をフェニルケトン（−ＣＯＰｈ）に変換し、次いで前記保護基ＴＢＳをＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフロリド）の存在下で取り除いて、Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロル)ドデカンアミド（ＨＰＡ−１２）を得た。反応式を図９に示す。
【０００６】
得られたＨＰＡ−１２の物性；
[a]D22 -35.1 (c 0.80, CHCl3);
Mp 75.5-77.0 ーC;
IR (KBr) 3293, 2919, 2849, 1643, 1551, 1493, 1054, 746 cm-1;
1H NMR (400 MHz, CDCl3): 0.88 (t, 3H, J = 6.8 Hz), 1.26 (bs, 16H), 1.59 (bt, 2H, J = 7.2 Hz), 1.92 (ddd, 1H, J = 6.6, 8.5, 15.1 Hz), 2.03 (ddd, 1H, J = 3.6, 5.7, 14.6 Hz), 2.15 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 3.65 (ddd, 1H, J = 4.1, 11.3, 15.5 Hz), 4.01-4.08 (m, 1H), 4.79 (dd, 1H,J = 3.4, 8.8 Hz), 6.48 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.23-7.36 (m, 5H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d 14.1, 22.7, 25.7, 29.3, 29.3, 29.3, 29.5, 29.6, 29.6, 31.9, 36.8, 40.7, 50.4, 65.5, 71.8, 125.5, 127.7, 128.5, 144.2, 174.3;
HRMS 計算値：Ｃ22Ｈ37ＮＯ3(Ｍ+) 363.2273,実験値 363.2279.
【０００７】
Ｂ．一般式Ａの化合物のＳＭ合成経路における阻害剤としてのメカニズムの検討
【０００８】
１，前記検討のための実験材料
Ｌ−〔Ｕ−１４Ｃ〕セリン（１５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）および〔メチル−１４Ｃ〕コリン（５５．０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）はアマシャム ファルマシア バイオテク社（Amersham Pharmacia Biotech）から購入。６−〔Ｎ−（７−ニトロベンゼゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ〕カプロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン  (6-〔N-(7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino〕caproyl-d-erythro-sphingosine)（Ｃ６−ＮＢＤ−Ｃｅｒ）およびＮ−（４， ４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン  (N-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-pentanoyl)-d-erythro-sphingosine)（Ｃ５−ＤＭＢ−Ｃｅｒ）はモレキュラー  プローブ社（Molecular Probe,Inc.）から、Ｄ−Ｅｒｙｔｈｒｏ−［３−３Ｈ］スフィンゴシン（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はアメリカン  ラジオラベル  ケミカルズ社（American Radiolabeled Chemicals,Inc.）から、Ｄ−エリスロ−スフィンゴシンはマトレーヤ社（Ｍａｔｒａｙａ，Ｉｎｃ．）から、フモニシンＢ１、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）および脂肪酸除去済みウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)はシグマ社から購入した。薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)板および高性能TＬＣ板（Silica gel 60）はメルク社から、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は和光純薬（株）（大阪、日本）から、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾイル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）は同仁化学研究所から、それぞれ購入した。
【０００９】
２，分析機器： ＴＬＣ分離した放射性脂質のイメージ解析には、富士フィルム社のＢＡＳ2000またはＢＡＳ１800イメージアナライザーを使用した。液体シンチレーション測定装置はベックマン社のモデルLs3801を、蛍光スペクトル測定装置には、日立製作所のモデルF-3000をそれぞれ使用した。蛍光顕微鏡は、カールツアイス社のアキシオバート（Axiovert）Ｓ１００ＴＶを使用した。
【００１０】
３，細胞培養方法
ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＨｅＬａ細胞はアメリカンタイプカルチャーセルコレクション（American Type Cell Collection）から購入し、本発明者らによって継代、保存しているものを使用した。膜貫通ドメイン含有型アルカリ性リン酸加水分解酵素 (PLAP-HA)を安定に発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞は、本発明者らが、過去に樹立し、論文発表したもの（文献３）を使用した。
ＣＨＯ細胞は、Ｈａｍ‘ｓＦ１２培地に１０％新生ウシ血清(NBS)とペニシリンＧ（１００単位／ｍＬ）およびストレプトマイシンサルフェート（１００μｇ／ｍＬ）を補充した細胞培養培地中、温度３３℃において、５％Ｃ０２培養器中培養した。ＨｅＬａ細胞の場合は、基本培地としてＨａｍ‘ｓＦ１２培地の代わりにダルベッコの最小必須培地を使用した。
また、ニュートリドーマ培地（１％ニュートリドーマ−ＳＰ〔ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社、Roche Molecular Biochemicals〕）および２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＨａｍ‘ｓＦ１２培地）を無血清培地として用いた。培地をＤＭＳＯまたは薬剤をＤＭＳＯに溶解したもので補う場合には、培地中のＤＭＳＯの濃度は０．０１％になるように調整した。
【００１１】
４．〔14Ｃ〕セリンおよび〔14Ｃ〕コリンを用いた脂質の代謝標識実験方法
ＣＨＯ細胞を１０％ＮＢＳ含有Ｆ１２培地５ｍＬ中に６０ｍｍ皿あたり１．０×１０6の細胞密度で播種し、３３℃で一晩培養する。次いで、ニュートリドーマ培地１．５ｍＬに培地交換し、必要ならば、種々の薬剤を加え４℃で１５分間、そして〔14Ｃ〕セリン（０．７５μＣｉ）または〔14Ｃ〕コリン（１．０μＣｉ）を加えた後３３℃において種々の時間培養する。
細胞は冷却リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬで２回洗浄後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で溶解し、そして溶解物の８００μＬおよび２０μＬは、それぞれ、脂質抽出およびタンパク質濃度の決定に用いた。
〔14Ｃ〕セリンで標識した脂質の分析のために、脂質は、ＴＬＣプレート上で、酢酸メチル／ｎ−プロパノール／クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ（25:25:25:10:9,容積比）からなる溶剤を用いて分離した。
〔14Ｃ〕コリンで標識した脂質の分析のために、脂質は、クロロホルム／メタノール／酢酸／Ｈ2Ｏ（25:15:4:2、容積比）を展開溶媒とした一次元ＴＬＣを用いて分離した。ただし、二次元ＴＬＣの場合には、一次元目に対してはクロロホルム／メタノール／Ｈ2Ｏ（65:25:4、容積比）そして二次元目に対しては１−ブタノール／酢酸／Ｈ2Ｏ（60:20:20、容積比）を展開溶媒として用いた。
プレート上で分離された放射性脂質は、イメージアナライザーで検出した。それぞれの脂質の放射能は、ＴＬＣ板からゲルを掻き取り、液体シンチレーション測定により決定し、細胞タンパク質量で補正した。
ＢＦＡ処理細胞における〔14Ｃ〕セリンでの代謝標識のためには、細胞は１μｇ／ｍＬのＢＦＡを含有するニュートリドーマ培地中、３３℃で３０分間保温し、次いで、４℃で１５分間、１μｇ／ｍＬのＢＦＡの存在下、１μＭのＨＰＡ−１２を加えたおよび加えないもので処理した後、〔14Ｃ〕セリンを添加して、３３℃において培養した。
【００１２】
５．生きた細胞におけるＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒの代謝の解析方法
６０−ｍｍ皿中に播種したＣＨＯ細胞を一晩培養後、ニュートリドーマ培地１．５ｍＬ中で、４℃において３０分間、１μＭのＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒで標識した。Ｆ１２培地で３回洗浄後、２．５μＭのＨＰＡ−１２を添加または無添加のニュートリドーマ培地１．５ｍＬ中で、４℃において１５分間処理し、次いで３３℃で種々に時間を変えて培養した。
ＰＢＳで洗浄後、上記したように０．１％ＳＤＳで溶解した。細胞溶解物から抽出された脂質は、高性能ＴＬＣによりクロロホルム／メタノール／Ｈ2Ｏ（容量比、65:25:4）からなる溶剤を用いて分離した。Ｃ5−ＤＭＢ−ＳＭおよびＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒの定量は、ＴＬＣ板からゲルを掻き取り、クロロホルム／メタノール／Ｈ2Ｏ（1:2:0.8）で抽出し、抽出されたＤＭＢ蛍光（励起波長４８０ｎｍ、発光波長５１５ｎｍ）を測定することで定量した。
【００１３】
６．生きた細胞における〔3Ｈ〕Ｃｅｒから〔3Ｈ〕ＳＭへの変換の測定方法
生細胞における〔3Ｈ〕Ｃｅｒから〔3Ｈ〕ＳＭへの変換の測定は、文献１に記載されたものに少し変形を加えて実施した。すなわち、まず、細胞を１μＭのＤ−エリスロ−〔3Ｈ〕スフィンゴシン（０．５μＣｉ）を含むニュートリドーマ培地１．５ｍＬでパルス標識した。洗浄後、細胞を１μＭのＨＰＡ−１２を含むまたは含まないニュートリドーマ１．５ｍＬ中、４℃で１５分間処理し、次いで１００μＭのフモニシンＢ1存在下に種々の時間、３３℃において培養した。
細胞から抽出された脂質は、ＴＬＣ板上で、クロロホルム／メタノール／Ｈ2Ｏ（65:25:4、容積比）からなる展開溶媒を用いて分離し、それぞれの脂質の放射能は前記の方法により測定した。
【００１４】
７．細胞のスフィンゴ脂質およびリン脂質の含有量の決定方法
１０％ＮＢＳ含有Ｆ１２培地２０ｍＬ中に１５０ｍｍ皿当たり１．０×１０6のＣＨＯ細胞を播種し、３３℃で一晩培養した。血清を含まないＦ１２培地１０ｍＬで２回洗浄後、２．５μＭ のＨＰＡ−１２を含むまたは含まないニュートリドーマ培地２０ｍＬ中でさらに二日間培養した。培地は２４時間毎に交換した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を掻取り法によって回収し、ＰＢＳに再懸濁し、脂質を抽出した。
リン脂質解析には、抽出された脂質はＴＬＣ上で、クロロホルム／メタノール／酢酸／Ｈ2Ｏ（容量比、25:15:4:2）の溶媒を用いて分離した。
そして、リン脂質中のリン含有量は、文献４の方法により定量した。
ＧｌｃＣｅｒおよびＮ−アセチルノイラミニル ラクトシルセラミド（ＧM3）含有量は文献５に記載されたクマシー染色法で染色された脂質の染色濃度分析により決定した。
Ｃｅｒの量はｓｎ−１，２−ジアシルグリセロール アッセイ試薬キットを用いて（Amersham Pharmcia Biotech）決定した。
【００１５】
８．酵素活性測定方法
ＣＨＯ細胞から調整された膜画分を酵素源として用いた。
ＳＭ合成酵素およびＧｌｃＣｅｒ合成酵素の活性のアッセイは、文献６に記載されているように、Ｃ6−ＮＢＤ−Ｃｅｒを基質として用いて実施した。
セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性は、文献７に記載の方法により決定し、スフィンゴシン Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性は文献（８）に記載の方法を一部改変した方法により決定した。
【００１６】
９．蛍光顕微鏡下での観察方法
３５ｍｍ皿中のガラス製カバーガラス（２２−ｍｍ直径）上に生育したＣＨＯ細胞を、１μＭのＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒを含むＦ１２培地中で、４℃で３０分処理後、Ｆ１２培地１ｍＬで３回洗浄し、次いで、２．５μＭのＨＰＡ−１２を含む、または含まないニュートリドーマ培地 １ｍＬ中で４℃で１５分処理した。次いで、パルス標識した細胞を、３３℃で、１５分間培養後、ＰＢＳで洗浄し、０．１２５％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液中で、４℃で、５分間で固定した。試料は、固定後直ちに蛍光顕微鏡下で、観察および写真撮影した。
【００１７】
１０．細胞における糖タンパク質のＥＲからゴルジ体への輸送活性の測定方法膜貫通ドメイン含有アルカリ性リン酸加水分解酵素を安定に発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞を用い、本発明者らがすでに文献（１）に記載した方法に準じて行った。
【００１８】
１１．細胞生存率の測定方法
１０％ＮＢＳ含有Ｆ１２培地５００μＬ中にＣＨＯ細胞を、４８−穴培養皿の穴当たり２．０×１０4で播種し、３３℃で一晩培養した。次いで、種々の濃度のHPA類を含むニュートリドーマ培地５００μＬ中で、３３℃で２４時間培養後、細胞の生存率を文献９に記載のようにＭＴＴを用いて決定した。
【００１９】
１２．タンパク質濃度の測定
ピアース社（Pierce）ＢＣＡアッセイ試薬キットで測定した。ＢＳＡを標準として用いた。
【実施例】
【００２０】
１．Ｎ−(３−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピル)アルカナミド（ＨＰＡ類）のＣＨＯ細胞中における新生ＳＭ合成に対する効果
図１Ａに示すような、化学的に合成された一連のＮ−(３−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピル)アルカナミド（ＨＰＡ類）の哺乳動物細胞中でのスフィンゴ脂質生合成に対する効果を試験した。そのために、まず、ＣＨＯ細胞における〔１４Ｃ〕セリンを用いた脂質代謝標識実験を、２．５μＭのＨＰＡ類の存在下で行った。様々なアシル鎖長のＨＰＡ類（Ｎ−アシル鎖の炭素数が、３のＨＰＡ−３、８のＨＰＡ−８、１２のＨＰＡ−１２および１６のＨＰＡ−１６）のうち、ＨＰＡ−１２によって〔１４Ｃ〕ＳＭの生成が強く阻害された（図１Ｂ）。ＨＰＡ−３，−８および−１６の阻害効果は、ＨＰＡ−１２比べてかなり弱かった（図１Ｂ）。
【００２１】
なお、２．５μＭの濃度では、これらの試薬は、前記ＭＴＴ試薬を用いたアッセイによれば、細胞の生存率に影響しなかった。
また、ＨＰＡ−１２は、〔14Ｃ〕ホスファチジルセリン（ＰＳ）および〔14Ｃ〕ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の生成にも影響しないことから、ＨＰＡ−１２の〔14Ｃ〕ＳＭ生成阻害は非特異的な脂質代謝障害によるものではない。
【００２２】
２時間の〔14Ｃ〕セリンによる脂質の代謝標識では、ＨＰＡ−１２濃度が０．１μＭにおいても〔14Ｃ〕ＳＭの形成を有意に阻害し、約１μＭで阻害効果は最大値に達した（図２Ａ）。
ＨＰＡ−１２の濃度が１０μＭでは、ＣＨＯ細胞に対して高い毒性を持ち（データ未添付）、試薬濃度が１０μＭ以上では代謝標識試験をすることができなかった。５時間までの代謝標識経過を調べたところ、１μＭのＨＰＡ−１２を用いた場合、〔14Ｃ〕ＳＭの形成は、全ての標識時間を通して、試薬を添加しない比較レベルに対して約３０％までに阻害した（図２Ｂ）。
【００２３】
〔14Ｃ〕セリンによる〔14Ｃ〕Ｃｅｒおよび〔14Ｃ〕ＧｌｃＣｅｒの代謝標識もＨＰＡ−１２は有意に阻害したが、ＧｌｃＣｅｒおよびＣｅｒ合成に対する阻害効果は、ＳＭ合成に対するものに比べてより弱かった（図２Ｂ）。公知の文献１で述べられているように、ＣｅｒのＳＭへの変換が阻害されると、スフィンゴシン塩基の新合成は未知の機構により抑制されるものと考えられる。よって、〔14Ｃ〕セリンからのＣｅｒおよびＧｌｃＣｅｒの形成がＨＰＡ−１２によって幾分阻害されるのは、この試薬の、ＣｅｒからＳＭへの変換阻害を介した二次的効果によるものと考えられる。
【００２４】
２．生きた細胞におけるＣｅｒからＳＭへの変換に対するＨＰＡ−１２の効果
ＣｅｒからＳＭへの変換過程に対するＨＰＡ−１２の効果を特異的に調べるために、〔3Ｈ〕スフィンゴシンを用いた標識実験を行った。細胞を１５℃で〔3Ｈ〕スフィンゴシン標識すると、〔3Ｈ〕スフィンゴシンは効率的にＮ−アシル化されて〔3Ｈ〕Cerと変換するが、さらに〔3Ｈ〕ＳＭへは変換されない（文献２）。そこで、〔3Ｈ〕スフィンゴシンを用いた低温標識で〔3Ｈ〕Ｃｅｒを生産させた後、４℃で、１５分間１μＭのＨＰＡ−１２で細胞を処理し、更に３３℃で、１時間まで、追跡保温した。追跡保温の間、〔3Ｈ〕スフインゴシンからの〔3Ｈ〕Ｃｅｒの新規合成は、スフィンゴシンＮ−アシルトランスフェラーゼの阻害剤であるフモニシン（fumonisin）Ｂ1により阻害しておいた。この実験条件下で、１μＭのHPA−１２は〔3Ｈ〕ＳＭ形成を約５０％阻害したが、〔3Ｈ〕ＧｌｃＣｅｒの形成は阻害せず、むしろやや増加させた（図３、●が１μＭのＨＰＡ−１２を添加した場合を示す。）。これらの結果は、生きた細胞中においては、ＨＰＡ−１２はＣｅｒからＳＭへの変換は阻害するが、ＧｌｃＣｅｒへの変換は阻止しないことを示している。
【００２５】
３．ホスファチジルコリン生合成に対するＨＰＡ−１２の効果
ＳＭはホスファチジルコリン（ＰＣ）からＣｅｒへのホスホコリンの転移により合成され、該反応はＳＭ合成酵素により触媒される。ＨＰＡ−１２によるＣｅｒからＳＭへの変換の阻害は、ＰＣの合成の阻害によることの可能性を試験するために、〔14Ｃ〕コリンを用いて脂質の代謝標識を行った（図４）。１μＭのＨＰＡ−１２の存在下または非存在下で、３３℃で、４時間、〔14Ｃ〕コリンを用いてインキュベーションを行った後、〔14Ｃ〕ＰＣのレベルは、試薬処理および未処理細胞のほぼ中間で、ほとんど等しかったが、一方、試薬処理細胞中の〔14Ｃ〕ＳＭのレベルは比較例のレベルの約半分であった。
このことから、上記可能性、すなわち、ＨＰＡ−１２によるＣｅｒからＳＭへの変換の阻害はＰＣの合成の阻害によることの可能性は除外された。
【００２６】
４．ＨＰＡ−１２がコリン含有代謝物に変換されないことの証拠
ＨＰＡ−１２の存在する際にのみ特異的な放射性バンドは、一次元の〔14Ｃ〕コリン標識脂質のＴＬＣパターン（図４）中にも、二次元分析（データ未添付）中にも観察されないことから、ＨＰＡ−１２自身は、コリン含有代謝物に変換されないと考えられる。
【００２７】
５．ＨＰＡ−１２による細胞ＳＭ含有量の減少
ＨＰＡ−１２が、実際、細胞中のＳＭの含有量に影響するかどうかを調べるために、２．５μＭのＨＰＡ−１２の添加または無添加培地中で２日間培養した細胞中の種々の脂質の含有量を定量した（表１）。
【００２８】
【表１】
0003692492.tif 000002
【００２９】
ＨＰＡ−１２は全リン脂質のレベルには影響しなかった。すなわち、試薬未処理および処理細胞中における全リン脂質の含有量は、それぞれ２８８±３および３１５±２ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。しかしながら、ＨＰＡ−１２処理細胞中のＳＭの含有量は、試薬の存在しない比較例のレベルよりも〜３０％少かった。ＨＰＡ−１２処理細胞中のＳＭの減少量はＰＣの量の増加により相殺されているものと考えられる（表１）。一方、ＨＰＡ−１２処理は、ＧｌｃＣｅｒおよびＧM3の含有量は、それぞれ〜１５０％および〜１２０％まで増加させた（表１）。２つの間（処理と未処理の間）ではセラミド含有量に関しては有意の差はなかった（表１）。これらの結果は、ＨＰＡ−１２はＣｅｒからＳＭへの変換は阻害するが、ＧｌｃＣｅｒへの変換は阻止しないという上述した結論と合致している。
【００３０】
６．ＨＰＡ−１２はＳＭ合成酵素およびその他のスフィンゴ脂質合成おける鍵酵素に対する阻害剤ではないことの証拠
我々は、ＨＰＡ−１２が、ＣＨＯ細胞膜画分を酵素源とするＳＭ合成酵素およびＧｌｃＣｅｒ合成酵素の活性を阻害するかどうかを、蛍光性のＣｅｒ類似体であるＣ6−ＮＢＤ−Ｃｅｒを反応基質にして調べた。ＳＭ合成およびＧｌｃCer合成の酵素活性は、ＨＰＡ−１２によって、たとえ高濃度の（２０μＭ）ＨＰＡ−１２に曝しても、阻害されなかった（表２）。Ｃ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒを反応基質に用いた場合でもＳＭ合成酵素活性の阻害は観察されなかった（データ未添付）。
更に、２０μＭＨＰＡ−１２は、ＣＨＯ細胞から調整した膜成分中において、セリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびスフィンゴシン−Ｎ−アシルトランスフェラーゼの活性に対して影響しなかった（データ未添付）。
したがって、ＨＰＡ−１２は新生ＳＭ合成酵素中におけるこれら鍵酵素に対する阻害剤ではない。
【００３１】
【表２】
0003692492.tif 000003
【００３２】
７．ＢＦＡ処理細胞におけるＨＰＡ−１２のＳＭ合成に対する効果
本発明者らは、次いで、ＨＰＡ−１２がＥＲからＳＭ合成部位へのＣｅｒ輸送を阻害する可能性を調べた。
もしこの可能性が正しければ、ＢＦＡ処理によってＥＲ（ここにＣｅｒ合成酵素が存在する）とゴルジ体（ここにＳＭ合成酵素が存在する）とを融合させた場合には、ＨＰＡ−１２のＳＭ生成阻害効果を抑制することが推測される。
実際、ＢＦＡで前処理してＥＲをゴルジ体に融合させた場合、１μＭのＨＰＡ−１２は〔14Ｃ〕セリン由来のＳＭ形成を阻害しなかった（図５）。
これらの結果は、ＨＰＡ−１２はＣｅｒのＥＲからＳＭ合成酵素が存在する部位への輸送過程を阻害することを示している。
【００３３】
８．生きた細胞におけるＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒの再分配および代謝へのHPA−１２の効果
天然セラミドのＥＲからゴルジ装置へのＡＴＰ依存性輸送の活性は、蛍光性Ｃｅｒ類似体であるＣ5−ＤＭＢ−ＣｅｒのＥＲからゴルジ体への再分配の分析から定性的に評価することができることを本発明者らは、すでに明らかにしている（文献１）。ＨＰＡ−１２がＣｅｒ輸送を阻害する可能性を調べるために、ＣＨＯ細胞におけるＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒの挙動へのＨＰＡ−１２の影響を調べた。ＥＲを含む種々の細胞内器官膜のパルス標識のために、細胞は４℃で、３０分間Ｃ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒに曝し、次いで２．５μＭのＨＰＡ−１２の存在下または非存在下で、更に４℃で１５分間処理した。次いで、パルス標識した細胞はＣ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒの再分配のために、３３℃で、１５分間追跡した。追跡前は、ＨＰＡ−１２処理および未処理細胞は、本質的に同じ細胞内ＤＭＢ蛍光のパターンを示し、それは細胞内器官膜の全体にほぼ均一に分布していた。一方、パルス標識細胞を追跡したとき、ゴルジ体領域へのＤＭＢ蛍光の蓄積は明らかに未処理細胞に比べて、ＨＰＡ−１２処理細胞の方が低かった。Ｃ5−ＤＭＢ−Ｃｅｒの再分配の阻害と一致し、Ｃ5−ＤＭＢ−ＣｅｒのＣ5−ＤＭＢ−ＳＭへの変換もＨＰＡ−１２処理細胞では〜５０％阻害された（データ未添付）。
【００３４】
９．Ｃｅｒ輸送の阻害剤となる、ＨＰＡ−１２の特定の立体異性体の同定
ＨＰＡ−１２は炭素原子Ｃ−１およびＣ−３の位置（前記一般式Ａ）に２つのキラル炭素を持っている、したがって、４つの立体異性体を含む、すなわち、（１Ｓ，３Ｒ）、（１Ｒ，３Ｓ）、（１Ｒ、３Ｒ）および（１Ｓ，３Ｓ）の４つの立体異性体である（図６Ａ）。我々は、ＨＰＡ−１２のＳＭ形成を阻害する活性は特定の立体異性体によるものであるかどうかを決定した。
このために、本発明者らは、４つの異性体を先ず２つのサブグループに分けた、すなわち、１つのグループは（１Ｒ，３Ｒ）および（１Ｓ，３Ｓ）−ＨＰＡ−１２からなり（ａ）、他のグループは（１Ｓ，３Ｒ）−および（１Ｒ、３Ｓ）−ＨＰＡ−１２からなる（ｂ）。２つのグループを化学合成し、〔14Ｃ〕セリンを用いた代謝標識におけるそれらの活性を調べた。
前者（ａ）のサブグループが特にＳＭ合成を強く阻害した（図６Ｂ）。
このように、次いで本発明者らは（１Ｒ，３Ｒ）−ＨＰＡ−１２および（１Ｓ，３Ｓ）−ＨＰＡ−１２を別々に調製し、それらの活性を調べた。
（１Ｒ，３Ｒ）型はＳＭの新合成を強く阻害したが、（１Ｓ，３Ｓ）型は中程度しか阻害しなかった（図６Ｂ）。
構造および活性との関係の類似のパターンが、生きた細胞におけるＣ5−ＤＭＢ−ＣｅｒのＣ5−ＤＭＢ−ＳＭへの変換においても観察された（図６Ｃ）。
さらに、ＨｅＬａ細胞を用いた場合でも、（１Ｒ，３Ｒ）−ＨＰＡ−１２はＳＭ合成を阻害した（図６Ｄ）
これらの結果は、ＨＰＡ−１２の４つの立体異性体の中で、（１Ｒ，３Ｒ）型がＣｅｒからＳＭへの変換に対して特に強い活性を持つこと、そして（１Ｒ，３Ｒ）−ＨＰＡ−１２の活性はＣＨＯ細胞だけでなく他の動物細胞でも作用することを示している。
【００３５】
１０．タンパク質のＥＲからゴルジ体への輸送活性に対する(１Ｒ,３Ｒ)−ＨＰＡ−１２の効果
膜貫通ドメイン含有型アルカリ性リン酸加水分解酵素 (ＰＬＡＰ−ＨＡ)を安定に発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞を用い、この糖タンパク質のＥＲからゴルジ体への輸送に対する(１Ｒ,３Ｒ)−ＨＰＡ−１２の効果を調べた。ＥＲ膜で新合成されたＰＬＡＰ−ＨＡの糖鎖が、ゴルジ体に局在する糖鎖修飾酵素によってエンドグリコシダーゼＨ（EndoH）耐性型に成熟化することを、ゴルジ体への到達の指標とした。新合成されたＰＬＡＰ−ＨＡのエンドグリコシダーゼＨ耐性型への成熟化速度は、２．５μＭの(１Ｒ,３Ｒ)−ＨＰＡ−１２で影響されなかった（図７：未処理＝Noneとの対比から）。図７において、Ｒは耐性型、Ｓは感受性型、切断型を意味し、この変化を時間を追って追跡（Chase-time,分）した結果を示す。この結果から、(１Ｒ,３Ｒ)−ＨＰＡ−１２は、タンパク質のＥＲからゴルジ体への輸送は阻害しない。
【００３６】
【発明の効果】
以上述べたように、前記一般式Ａで表される化合物は、ＳＭ合成部位へのＣｅｒ輸送経路を選択的に阻害する、という優れた効果がもたらされる。
【００３７】
明細書中引用文献リスト
文献１：
Masayoshi Fukasawa, Masahiro Nishijima and Kentaro Hanada (1999) Genetic evidence for ATP-dependent endoplasmic reticulum-to-Golgi apparatus trafficking of ceramide for sphingomyelin synthesis in Chinese hamster ovary cells. Journal of Cell Biology 144, 673-685.
文献２：
Kentaro Hanada, Masahiro Nishijima, Yuzuru Akamatsu and Richard E. Pagano (1995) Both sphingolipids and cholesterol participate in the detergent insolubility of alkaline phosphatase, a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, in mammalian membranes. Journal of Biological Chemistry 270, 6254-6260.
文献３：
Tomoko Funakoshi, Satoshi Yasuda, Masayoshi Fukasawa, Masahiro Nishijima and Kentaro Hanada (2000) Reconstitution of ATP- and cytosol-dependent transport of de novo synthesized ceramide to the site of sphingomyelin synthesis in semi-intact cells. Journal of Biological Chemistry 275, 29938-29945.
文献４：
George Rouse, A. N. Siakotos and Sidney Fleischer (1966) Quantitative analysis of phospholipids by thin-layer chromatography and phosphorus analysis of spots. Lipids 1, 85-86.
文献５：
Kentaro Hanada and Masahiro Nishijima (2000) Selection of mammalian cell mutants in sphingolipid biosynthesis. Methods in Enzymology 312, 304-317.
文献６：
Kentaro Hanada, Mio Horii and Yuzuru Akamatsu (1991) Functional reconstitution of sphingomyelin synthase in Chinese hamster ovary cell membranes. Biochimica et Biophysica Acta 1086, 151-156.
文献７：
Kentaro Hanada, Tomoko Hara, and Masahiro Nishijima (2000) Purification of the serine palmitoyltransferase complex responsible for sphingoid base synthesis by using affinity-peptide chromatography techniques. Journal of Biological Chemistry  257, 8409-8415.
文献８：
Elaine Wang and Alfred H. Merrill, Jr. (2000) Ceramide synthase. Methods in Enzymology 311, 15-21.
文献９：
Kentaro Hanada, Tomoko Hara, Masayoshi Fukasawa, Akiko Yamaji, Masato Umeda and Masahiro Nishijima (1998) Mammalian cell mutants resistant to a sphingomyelin-directed cytolysin: Genetic and biochemical evidence for complex formation of the LCB1 protein with the LCB2 protein for serine palmitoyltransferase. Journal of Biological Chemistry 273, 33787-33794.
【図面の簡単な説明】
【図１】  ４種類のＨＰＡ類（Ｒの炭素数が、２のＨＰＡ−３、７のＨＰＡ−８、１１のＨＰＡ−１２および１５のＨＰＡ−１６）の構造（Ａ）, 放射性セリンによる脂質代謝標識におけるＨＰＡ類の阻害効果の比較（Ｂ）
【図２】  ＨＰＡ−１２の濃度とＳＭ新合成阻害効果の関連（Ａ）、１μＭのＨＰＡ−１２の存在および非存在下での放射性セリンによる脂質代謝標識の経時変化（Ｂ）
【図３】  細胞におけるＣｅｒからＳＭまたはＧｌｃＣerへの変換過程に対するＨＰＡ−１２の効果
【図４】  ＨＰＡ−１２によるＰＣの合成阻害特性の有無の測定
【図５】  ＥＲとゴルジ体とを融合させた細胞におけるＳＭ生成に対するＨＰＡ−１２の影響
【図６】  ＨＰＡ−１２の４種類の立体構造異性体および天然型セラミドの構造(Ａ), ＳＭ新合成阻害剤としてのＨＰＡ−１２の立体構造との関連(B,C), ＨｅＬａ細胞におけるＳＭ新合成阻害剤としての(１Ｒ,３Ｒ)−ＨＰＡ−１２の効果(Ｄ)
【図７】  タンパク質のＥＲからゴルジ体への輸送活性に対する(１Ｒ,３Ｒ)-ＨＰＡ−１２の効果
【図８】  ＳＭまたはＧｌｃＣｅｒまでの生合成経路
【図９】  ＨＰＡ−１２の合成経路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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