(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のA群からD群の４群の遺伝子もしくはESTの全部の遺伝子もしくはESTの塩基配列について、その塩基配列の全部または一部を含むDNAがスポットされたDNAマイクロアレイ。
（１）エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTのうち、エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制されるかあるいは誘導される以下の分類１、分類２および分類３の遺伝子もしくはESTを含むA1〜A15からなるA群、
（分類1）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや誘導されるもの
(A1) Homo sapiens methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (XM-002234)（配列番号１）、
（分類2）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの、
(A2) asparagine synthetase (GenBank アクセッション番号L35946)（配列番号２）、
(A3) EST (GenBank アクセッション番号AA587912)（配列番号３）、
(A4) exportin (GenBank アクセッション番号AF039022)（配列番号４）、
(A5) ferritin, heavy polypeptide 1 (GenBank アクセッション番号AA102267)（配列番号５）、
(A6) glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1 (GenBank アクセッション番号M90516)（配列番号６）、
(A7) 78KD GLUCOSE REGULATED PROTEIN PRECURSOR (GenBank アクセッション番号AI878886)（配列番号７）、
(A8) Homo sapiens partial mRNA for A-type potassium channel modulatory protein 2 (GenBank アクセッション番号AJ276317)（配列番号８）、
(A9) insulin-like growth factor-binding protein 4 (GenBank アクセッション番号M62403)（配列番号９）、
(A10) methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (GenBank アクセッション番号X16396) （配列番号１０）、
(A11) phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (GenBank アクセッション番号X92720) （配列番号１１）、
(A12) protein kinase C, delta (GenBank アクセッション番号D10495) （配列番号１２）、
(A13) trefoil factor 1 (GenBank アクセッション番号X05030) （配列番号１３）、
（分類3）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(A14) argininosuccinate synthetase (GenBank アクセッション番号 AI660571)（配列番号１４）、
(A15) solute carrier family 7, member 5 (GenBank アクセッション番号XM-017410) （配列番号１５）、
（２）エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTのうち、エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制されるかあるいは誘導される以下の分類１７、分類１８および分類１９の遺伝子もしくはESTを含むB1〜B7からなるB群、
（分類17）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(B1) erbB2 (GenBank アクセッション番号M86910) （配列番号１６）、
(B2) fucosyltransferase 8 (GenBank アクセッション番号Y17977) （配列番号１７）、
(B3) Homo sapiens ,adipose specific 2 (GenBank アクセッション番号BC004471) （配列番号１８）、
(B4) insulin-like growth factor binding protein 5 (GenBank アクセッション番号L27556) （配列番号１９）、
（分類18）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(B5) Homo sapiens DNA from chromosome 19 (GenBank アクセッション番号AC004030) （配列番号２０）、
(B6) quiescin Q6 (GenBank アクセッション番号U97276) （配列番号２１）、ならびに（分類19）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの、
(B7) solute carrier family 12, member 2 (GenBank アクセッション番号XM-003745) （配列番号２２）、
（３）タモキシフェン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける以下の分類１２および分類１６の遺伝子もしくはESTを含むC1〜C11からなるC群、
（分類12）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C1) A1B1 （GenBank アクセッション番号AF137620）（配列番号２３）、
(C2) Estrogen receptor α (GenBank アクセッション番号AY033393) （配列番号２４）、
(C3) Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactocyltransferase, polypeptide1 (GenBank アクセッション番号NM-001497) （配列番号２５）、
(C4) stearoyl-CoA desaturase (GenBank アクセッション番号XM-005719) （配列番号２６）、
（分類16）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンでやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C5) cadherin 18 (GenBank アクセッション番号NM-004934) （配列番号２７）、
(C6) enolase 2 (GenBank アクセッション番号X51956) （配列番号２８）、
(C7) enolase 3 (GenBank アクセッション番号X56832) （配列番号２９）、
(C8) Human mRNA for KIAA0373 gene (GenBank アクセッション番号AB002371)（配列番号３０）、
(C9) Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 2 (GenBankアクセッション番号XM-001710) （配列番号３１）、
(C10) Homo sapiens enolase 1 (alpha) (ENO1) (GenBank アクセッション番号NM-001428) （配列番号３２）、
(C11) selenium binding protein 1 (GenBank アクセッション番号U29091) （配列番号３３）、
（４）タモキシフェン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける以下の分類８および分類１３の遺伝子もしくはESTを含むD1〜D8からなるD群、
（分類8）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D1) CDC6 homolog (GenBank アクセッション番号NM-001254) （配列番号３４）、
(D2) chromobox homolog 1 (GenBank アクセッション番号BC002609) （配列番号３５）、
(D3) Homo sapiens interleukin 2 receptor, beta (GenBank アクセッション番号XM-009962) （配列番号３６）、
(D4) Human mRNA for KIAA0008 (GenBank アクセッション番号D13633) （配列番号３７）、
(D5) Human mRNA for KIAA0101 gene (GenBank アクセッション番号D14657) （配列番号３８）、
(D6) KIAA1051 protein (GenBank アクセッション番号AB028974) （配列番号３９）、
（分類13）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンにやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D7) Homo sapiens paired basic amino acid cleaving system 4 (GenBank アクセッション番号NM-002570) （配列番号４０）、
(D8) neuropeptide Y receptor Y1 (GenBank アクセッション番号NM-000909) （配列番号４１）
【請求項２】
請求項１に記載のA1〜A15の遺伝子もしくはESTの全部および請求項１に記載のB1〜B7の遺伝子もしくはESTの全部について、その塩基配列の全部または一部を含むDNAがスポットされたDNAマイクロアレイ。
【請求項３】
請求項１に記載のC1〜C11の遺伝子もしくはESTの全部および請求項１に記載のD1〜D8の遺伝子もしくはESTの全部について、その塩基配列の全部または一部を含むDNAがスポットされたDNAマイクロアレイ。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いたタモキシフェンの効果を評価する方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いたタモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を評価する方法。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いた、該DNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に抑制する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いた、該DNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いた、該DNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導または抑制する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いた、該DNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTの発現をタモキシフェンと同様に抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いた、該DNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTの発現をタモキシフェンと同様に誘導する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイを用いた、該DNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTの発現に対してタモキシフェンと同様に作用する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
請求項１から３のいずれか１項に記載のDNAマイクロアレイ上の遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、請求項４から１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エストロゲンに応答性の遺伝子またはEST（Expressed sequence tag）の塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いて、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を評価する方法、タモキシフェンの効果を評価する方法、および未知の被験物質がタモキシフェン類似作用を有しているか否かを評価する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エストロゲンは、ステロイド性の女性ホルモンであり、乳腺や子宮など多数の臓器に対して多様な生理活性を及ぼし、またいくつかの臓器に対して発癌および癌の進行を促進することが知られている。
一方、タモキシフェンはトリフェニルエチレン誘導体でありエストロゲン受容体に結合しエストロゲンアンタゴニスト活性を有することが知られている。タモキシフェンは、乳癌などのエストロゲンレセプターに対し抗エストロゲン作用を示し、抗乳癌作用を発揮する。
しかし、エストロゲンの作用メカニズムは複数の経路を経る非常に複雑なものであるため、エステロゲンの作用メカニズムは十分に解明されていなかった。また、タモキシフェンの作用効果も十分に解明されていなかった。
【０００３】
エストロゲンおよびタモキシフェンの作用メカニズムの解明は、抗癌剤の開発、環境ホルモンの解析等のために望まれており、特にタモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を正確に評価する方法、タモキシフェンのエストロゲン応答性遺伝子に対する効果を評価する方法の確立が望まれていた。特にエストロゲン活性抑制効果は抗癌剤などのスクリーニングの際に重要な判断基準となるが、単独あるいは極少数の遺伝子の発現変動を基準にした評価法は存在するが、数十以上の多数の遺伝子群を用いた評価法はまだ無かった。このためタモキシフェンと同様の構造あるいは作用を示し、より作用効果が高く副作用の低い薬剤の開発やスクリーニングが可能になる評価法が必要とされていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、エストロゲンに応答性の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いて、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を評価する方法、タモキシフェンの効果を評価する方法、未知の被験物質がタモキシフェン類似作用を有しているか否かを評価する方法および該評価のための遺伝子もしくはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを含むDNAマイクロアレイの提供を課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
タモキシフェンはエストロゲンのアンタゴニストとして抗癌作用を有するが、遺伝子発現を用いてその作用を評価するときには、エストロゲン活性抑制効果により遺伝子応答が見られる場合だけでなく、構造や代謝などの反応性などに由来するタモキシフェン特有な遺伝子応答も含まれるために正確な判断が難しい。したがって、タモキシフェンの効果をエストロゲン活性抑制効果に関係する遺伝子群を用いて評価するためにはタモキシフェン独自の遺伝子に対する効果を知る必要がある。特にエストロゲンの作用メカニズムに関与する遺伝子群を明確にするために、エストロゲン活性抑制効果とタモキシフェン独自の影響に関して、共通の遺伝子、共通であるが効果の程度が異なる遺伝子、共通でない遺伝子を明らかにし、それを用いて評価法（スクリーニング法）を作成する必要が有る。
【０００６】
本発明者らは、これらの考えに基づいて、エストロゲンで刺激した場合に発現が変動する遺伝子またはESTを探索し、さらにcDNAマイクロアレイを用いて、エストロゲンとタモキシフェンの両方または一方で同時に刺激した場合の該遺伝子またはESTの発現の変動を調べた。その結果、発現量が変動する多数の遺伝子が存在し、それらの遺伝子がエストロゲンとタモキシフェンの刺激量により発現パターンが異なることを見出した。本発明者らは、エストロゲンおよび／またはタモキシフェンで細胞を刺激したときに発現が抑制される遺伝子と発現が誘導される遺伝子があることを見出し、遺伝子の発現パターンの違いから、遺伝子の新規な機能を見出した。さらに、タモキシフェンが示すエストロゲン活性抑制効果と同様のメカニズムでエストロゲン活性抑制効果を示す未知の物質は、タモキシフェンと同様の遺伝子応答を示すことが期待され、特定の遺伝子群の応答を調べることにより未知の物質のタモキシフェンと同様の効果を評価できることを見出し、これらの遺伝子を用いてタモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を評価する方法、およびタモキシフェンの効果を評価する方法、およびこれらの遺伝子を用いて未知の被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価する方法、すなわちタモキシフェン類似作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTのうち、エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制されるかあるいは誘導される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いた、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を評価する方法。
【０００８】
（２）  エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTのうち、エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制されるかあるいは誘導される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用いて該遺伝子の発現を解析することを含む、（１）の方法。
【０００９】
（３）  エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTのうち、エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制されるかあるいは誘導される遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（１）の方法。
【００１０】
（４）  エストロゲン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTのうち、エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制されるかあるいは誘導される以下の分類１、分類２および分類３の遺伝子もしくはESTを含むA1〜A15からなるA群および分類１７、分類１８および分類１９の遺伝子もしくはESTを含むB1〜B7からなるB群の１以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（１）〜（３）のいずれかの方法。
【００１１】
（分類1）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや誘導されるもの
(A1) Homo sapiens methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (XM-002234)（配列番号１）、
（分類2）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(A2) asparagine synthetase  (GenBank アクセッション番号L35946)（配列番号２）
(A3) EST  (GenBank アクセッション番号AA587912)（配列番号３）、
(A4) exportin  (GenBank アクセッション番号AF039022)（配列番号４）、
(A5) ferritin, heavy polypeptide 1   (GenBank アクセッション番号AA102267)（配列番号５）、
(A6) glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1   (GenBank アクセッション番号M90516)（配列番号６）、
(A7) 78KD GLUCOSE REGULATED PROTEIN PRECURSOR (GenBank アクセッション番号AI878886)（配列番号７）、
(A8) Homo sapiens partial mRNA for A-type potassium channel modulatory protein 2  (GenBank アクセッション番号AJ276317)（配列番号８）、
(A9) insulin-like growth factor-binding protein 4  (GenBank アクセッション番号M62403)（配列番号９）、
(A10) methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (GenBank アクセッション番号X16396) （配列番号１０）、
(A11) phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (GenBank アクセッション番号X92720) （配列番号１１）、
(A12) protein kinase C, delta   (GenBank アクセッション番号D10495) （配列番号１２）、
(A13) trefoil factor 1 (GenBank アクセッション番号X05030) （配列番号１３）、
（分類3）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(A14) argininosuccinate synthetase (GenBank アクセッション番号 AI660571)
（配列番号１４）、
(A15) solute carrier family 7, member 5 (GenBank アクセッション番号XM-017410) （配列番号１５）、
（分類17）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(B1) erbB2 (GenBank アクセッション番号M86910) （配列番号１６）、
(B2) fucosyltransferase 8  (GenBank アクセッション番号Y17977) （配列番号１７）、
(B3) Homo sapiens ,adipose specific 2 (GenBank アクセッション番号BC004471) （配列番号１８）、
(B4) insulin-like growth factor binding protein 5 (GenBank アクセッション番号L27556) （配列番号１９）、
（分類18）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(B5) Homo sapiens DNA from chromosome 19 (GenBank アクセッション番号AC004030) （配列番号２０）、
(B6) quiescin Q6 (GenBank アクセッション番号U97276) （配列番号２１）、ならびに
（分類19）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(B7) solute carrier family 12, member 2  (GenBank アクセッション番号XM-003745) （配列番号２２）
【００１２】
（５）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いた、タモキシフェンの効果を評価する方法。
（６）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用いて該遺伝子の発現を解析することを含む、（５）の方法。
【００１３】
（７）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（５）の方法。
（８）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により、その発現が影響をうける以下の分類１２および分類１６の遺伝子もしくはESTを含むC1〜C11からなるC群および分類８および分類１３の遺伝子もしくはESTを含むD1〜D8からなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（５）〜（７）のいずれかの方法。
【００１４】
（分類12）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C1) A1B1 （GenBank アクセッション番号AF137620）（配列番号２３）、
(C2) Estrogen receptor α (GenBank アクセッション番号AY033393) （配列番号２４）、
(C3) Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactocyltransferase, polypeptide1 (GenBank アクセッション番号NM-001497) （配列番号２５）、
(C4) stearoyl-CoA desaturase (GenBank アクセッション番号XM-005719) （配列番号２６）、
（分類16）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンでやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C5) cadherin 18 (GenBank アクセッション番号NM-004934) （配列番号２７）、
(C6) enolase 2  (GenBank アクセッション番号X51956) （配列番号２８）、
(C7) enolase 3 (GenBank アクセッション番号X56832) （配列番号２９）、
(C8) Human mRNA for KIAA0373 gene (GenBank アクセッション番号AB002371) （配列番号３０）、
(C9) Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 2 (GenBank アクセッション番号XM-001710) （配列番号３１）、
(C10) Homo sapiens enolase 1 (alpha) (ENO1) (GenBank アクセッション番号NM-001428) （配列番号３２）、および
(C11) selenium binding protein 1 (GenBank アクセッション番号U29091) （配列番号３３）、
（分類8）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D1) CDC6 homolog (GenBank アクセッション番号NM-001254) （配列番号３４）、
(D2) chromobox homolog 1 (GenBank アクセッション番号BC002609) （配列番号３５）、
(D3) Homo sapiens interleukin 2 receptor, beta (GenBank アクセッション番号XM-009962) （配列番号３６）、
(D4) Human mRNA for KIAA0008 (GenBank アクセッション番号D13633) （配列番号３７）、
(D5) Human mRNA for KIAA0101 gene (GenBank アクセッション番号D14657) （配列番号３８）、
(D6) KIAA1051 protein (GenBank アクセッション番号AB028974) （配列番号３９）
（分類13）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンにやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D7) Homo sapiens paired basic amino acid cleaving system 4  (GenBank アクセッション番号NM-002570) （配列番号４０）、および
(D8) neuropeptide Y receptor Y1 (GenBank アクセッション番号NM-000909) （配列番号４１）
【００１５】
（９）  （４）のA1〜A15およびB1〜B7ならびに（８）のC1〜C11およびD1〜D8の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いた、タモキシフェンの効果を評価する方法。
（１０）  （４）のA1〜A15およびB1〜B7の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAがスポットされた、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を評価するためのDNAマイクロアレイ。
【００１６】
（１１）  （８）のC1〜C11およびD1〜D8の１つ以上の遺伝子またはESTがスポットされた、タモキシフェンの効果を評価するためのDNAマイクロアレイ。
（１２）  （４）のA1〜A15およびB1〜B7ならびに（８）のC1〜C11およびD1〜D8の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAがスポットされた、タモキシフェンの効果を評価するためのDNAマイクロアレイ。
【００１７】
（１３）  エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いて、該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に抑制する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【００１８】
（１４）  エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が抑制される以下の分類１、分類２および分類３の遺伝子またはESTを含むA1〜A15からなるA群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（１３）の方法。
【００１９】
（分類1）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや誘導されるもの
(A1) Homo sapiens methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (XM-002234)（配列番号１）、
（分類2）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(A2) asparagine synthetase  (GenBank アクセッション番号L35946)（配列番号２）
(A3) EST  (GenBank アクセッション番号AA587912)（配列番号３）、
(A4) exportin  (GenBank アクセッション番号AF039022)（配列番号４）、
(A5) ferritin, heavy polypeptide 1   (GenBank アクセッション番号AA102267)（配列番号５）、
(A6) glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1   (GenBank アクセッション番号M90516)（配列番号６）、
(A7) 78KD GLUCOSE REGULATED PROTEIN PRECURSOR (GenBank アクセッション番号AI878886)（配列番号７）、
(A8) Homo sapiens partial mRNA for A-type potassium channel modulatory protein 2  (GenBank アクセッション番号AJ276317)（配列番号８）、
(A9) insulin-like growth factor-binding protein 4  (GenBank アクセッション番号M62403)（配列番号９）、
(A10) methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (GenBank アクセッション番号X16396) （配列番号１０）、
(A11) phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (GenBank アクセッション番号X92720) （配列番号１１）、
(A12) protein kinase C, delta   (GenBank アクセッション番号D10495) （配列番号１２）、
(A13) trefoil factor 1 (GenBank アクセッション番号X05030) （配列番号１３）、
（分類3）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(A14) argininosuccinate synthetase (GenBank アクセッション番号 AI660571)（配列番号１４）、
(A15) solute carrier family 7, member 5 (GenBank アクセッション番号XM-017410) （配列番号１５）
【００２０】
（１５）  （１４）のA1〜A15の遺伝子またはESTからなるA群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用い該遺伝子の発現を解析することを含む、（１４）の方法。
（１６）  （１４）のA1〜A15の遺伝子またはESTからなるA群の１つ以上の遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（１４）の方法。
【００２１】
（１７）  （１４）のA1〜A15の遺伝子またはESTからなるA群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に抑制する作用を有する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
【００２２】
（１８）  エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が誘導される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いて、該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【００２３】
（１９）  エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が誘導される以下の分類１７、分類１８および分類１９の遺伝子またはESTを含むB1〜B7の遺伝子およびESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（１８）の方法。
【００２４】
（分類17）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(B1) erbB2 (GenBank アクセッション番号M86910) （配列番号１６）、
(B2) fucosyltransferase 8  (GenBank アクセッション番号Y17977) （配列番号１７）、
(B3) Homo sapiens ,adipose specific 2 (GenBank アクセッション番号BC004471) （配列番号１８）、
(B4) insulin-like growth factor binding protein 5 (GenBank アクセッション番号L27556) （配列番号１９）、
（分類18）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(B5) Homo sapiens DNA from chromosome 19 (GenBank アクセッション番号AC004030) （配列番号２０）、
(B6) quiescin Q6 (GenBank アクセッション番号U97276) （配列番号２１）、ならびに
（分類19）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(B7) solute carrier family 12, member 2  (GenBank アクセッション番号XM-003745) （配列番号２２）
【００２５】
（２０）  （１９）のB1〜B7の遺伝子またはESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用いて該遺伝子の発現を解析することを含む、（１９）の方法。
（２１）  （１９）のB1〜B7の遺伝子またはESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（１９）の方法。
【００２６】
（２２）  （１９）のB1〜B7の遺伝子またはESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導する作用を有する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
【００２７】
（２３）  エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が誘導または抑制される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いて、該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導または抑制する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【００２８】
（２４）  エストロゲンとタモキシフェンが混在する場合にエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合に比べ発現が誘導または抑制される以下の分類１、分類２および分類３の遺伝子もしくはESTを含むA1〜A15からなるA群ならびに分類１７、１８および分類１９の遺伝子もしくはESTを含むB１〜B7からなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（２３）の方法。
【００２９】
（分類1）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや誘導されるもの
(A1) Homo sapiens methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (XM_002234)（配列番号１）、
（分類2）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(A2) asparagine synthetase  (GenBank アクセッション番号L35946)（配列番号２）
(A3) EST  (GenBank アクセッション番号AA587912)（配列番号３）、
(A4) exportin  (GenBank アクセッション番号AF039022)（配列番号４）、
(A5) ferritin, heavy polypeptide 1   (GenBank アクセッション番号AA102267)（配列番号５）、
(A6) glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1   (GenBank アクセッション番号M90516)（配列番号６）、
(A7) 78KD GLUCOSE REGULATED PROTEIN PRECURSOR (GenBank アクセッション番号AI878886)（配列番号７）、
(A8) Homo sapiens partial mRNA for A-type potassium channel modulatory protein 2  (GenBank アクセッション番号AJ276317)（配列番号８）、
(A9) insulin-like growth factor-binding protein 4  (GenBank アクセッション番号M62403)（配列番号９）、
(A10) methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (GenBank アクセッション番号X16396) （配列番号１０）、
(A11) phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (GenBank アクセッション番号X92720) （配列番号１１）、
(A12) protein kinase C, delta   (GenBank アクセッション番号D10495) （配列番号１２）、
(A13) trefoil factor 1 (GenBank アクセッション番号X05030) （配列番号１３）、
（分類3）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(A14) argininosuccinate synthetase (GenBank アクセッション番号 AI660571)（配列番号１４）、
(A15) solute carrier family 7, member 5 (GenBank アクセッション番号XM-017410) （配列番号１５）、
（分類17）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの
(B1) erbB2 (GenBank アクセッション番号M86910) （配列番号１６）、
(B2) fucosyltransferase 8  (GenBank アクセッション番号Y17977) （配列番号１７）、
(B3) Homo sapiens ,adipose specific 2 (GenBank アクセッション番号BC004471) （配列番号１８）、
(B4) insulin-like growth factor binding protein 5 (GenBank アクセッション番号L27556) （配列番号１９）、
（分類18）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの
(B5) Homo sapiens DNA from chromosome 19 (GenBank アクセッション番号AC004030) （配列番号２０）、
(B6) quiescin Q6 (GenBank アクセッション番号U97276) （配列番号２１）、ならびに
（分類19）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(B7) solute carrier family 12, member 2  (GenBank アクセッション番号XM-003745) （配列番号２２）
【００３０】
（２５）  （２４）のA1〜A15の遺伝子もしくはESTからなるA群およびB１〜B7の遺伝子もしくはESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用い該遺伝子の発現を解析することを含む、（２４）の方法。
（２６）  （２４）のA1〜A15の遺伝子もしくはESTからなるA群およびB１〜B7の遺伝子もしくはESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（２４）の方法。
【００３１】
（２７）  （２４）のA1〜A15の遺伝子もしくはESTからなるA群およびB１〜B7の遺伝子もしくはESTからなるB群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子もしくはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導または抑制する作用を有する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
（２８）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が抑制される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、該遺伝子またはESTの発現をタモキシフェンと同様に抑制する物質をスクリーニングする方法。
【００３２】
（２９）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が抑制される以下の分類１２および分類１６の遺伝子またはESTを含むC1〜C11遺伝子からなるC群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（２８）の方法。
【００３３】
（分類12）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C1) A1B1 （GenBank アクセッション番号AF137620）（配列番号２３）、
(C2) Estrogen receptor α (GenBank アクセッション番号AY033393) （配列番号２４）、
(C3) Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactocyltransferase, polypeptide1 (GenBank アクセッション番号NM-001497) （配列番号２５）、
(C4) stearoyl-CoA desaturase (GenBank アクセッション番号XM-005719) （配列番号２６）、
（分類16）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンでやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C5) cadherin 18 (GenBank アクセッション番号NM-004934) （配列番号２７）、
(C6) enolase 2  (GenBank アクセッション番号X51956) （配列番号２８）、
(C7) enolase 3 (GenBank アクセッション番号X56832) （配列番号２９）、
(C8) Human mRNA for KIAA0373 gene (GenBank アクセッション番号AB002371) （配列番号３０）、
(C9) Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 2 (GenBank アクセッション番号XM-001710) （配列番号３１）、
(C10) Homo sapiens enolase 1 (alpha) (ENO1) (GenBank アクセッション番号NM-001428) （配列番号３２）、および
(C11) selenium binding protein 1 (GenBank アクセッション番号U29091) （配列番号３３）
【００３４】
（３０）  （２９）のC1〜C11の遺伝子またはESTからなるC群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用い該遺伝子の発現を解析することを含む、（２９）の方法。
（３１）  （２９）のC1〜C11の遺伝子またはESTからなるC群の１つ以上の遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（２９）の方法。
（３２）  （２９）のC1〜C11の遺伝子またはESTからなるC群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子またはESTの発現をタモキシフェンと同様に抑制する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
【００３５】
（３３）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が誘導される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、該遺伝子またはESTの発現をタモキシフェンと同様に誘導する物質をスクリーニングする方法。（３４）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が誘導される以下の分類８および分類１３の遺伝子またはESTを含むD1〜D8からなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（３３）の方法。
【００３６】
（分類8）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D1) CDC6 homolog (GenBank アクセッション番号NM-001254) （配列番号３４）、
(D2) chromobox homolog 1 (GenBank アクセッション番号BC002609) （配列番号３５）、
(D3) Homo sapiens interleukin 2 receptor, beta (GenBank アクセッション番号XM-009962) （配列番号３６）、
(D4) Human mRNA for KIAA0008 (GenBank アクセッション番号D13633) （配列番号３７）、
(D5) Human mRNA for KIAA0101 gene (GenBank アクセッション番号D14657) （配列番号３８）、
(D6) KIAA1051 protein (GenBank アクセッション番号AB028974) （配列番号３９）
（分類13）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンにやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D7) Homo sapiens paired basic amino acid cleaving system 4  (GenBank アクセッション番号NM-002570) （配列番号４０）、および
(D8) neuropeptide Y receptor Y1 (GenBank アクセッション番号NM-000909) （配列番号４１）
【００３７】
（３５）  （３４）のD1〜D8の遺伝子またはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用い該遺伝子の発現を解析することを含む、（３４）の方法。
（３６）  （３４）のD1〜D8の遺伝子またはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（３４）の方法。
【００３８】
（３７）  （３４）のD1〜D8の遺伝子またはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子またはESTの発現をタモキシフェンと同様に誘導する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
（３８）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が抑制または誘導される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、該遺伝子またはESTの発現にタモキシフェンと同様に作用する物質をスクリーニングする方法。
【００３９】
（３９）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が抑制または誘導される以下の分類１２および分類１６の遺伝子もしくはESTを含むC1〜C11遺伝子からなるC群ならびに分類８および分類１３の遺伝子もしくはESTを含むD1〜D8からなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（３８）の方法。
【００４０】
（分類12）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C1) A1B1 （GenBank アクセッション番号AF137620）（配列番号２３）、
(C2) Estrogen receptor α (GenBank アクセッション番号AY033393) （配列番号２４）、
(C3) Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactocyltransferase, polypeptide1 (GenBank アクセッション番号NM-001497) （配列番号２５）、
(C4) stearoyl-CoA desaturase (GenBank アクセッション番号XM-005719) （配列番号２６）、
（分類16）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンでやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの
(C5) cadherin 18 (GenBank アクセッション番号NM-004934) （配列番号２７）、
(C6) enolase 2  (GenBank アクセッション番号X51956) （配列番号２８）、
(C7) enolase 3 (GenBank アクセッション番号X56832) （配列番号２９）、
(C8) Human mRNA for KIAA0373 gene (GenBank アクセッション番号AB002371) （配列番号３０）、
(C9) Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 2 (GenBank アクセッション番号XM-001710) （配列番号３１）、
(C10) Homo sapiens enolase 1 (alpha) (ENO1) (GenBank アクセッション番号NM-001428) （配列番号３２）、および
(C11) selenium binding protein 1 (GenBank アクセッション番号U29091) （配列番号３３）、
（分類8）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D1) CDC6 homolog (GenBank アクセッション番号NM-001254) （配列番号３４）、
(D2) chromobox homolog 1 (GenBank アクセッション番号BC002609) （配列番号３５）、
(D3) Homo sapiens interleukin 2 receptor, beta (GenBank アクセッション番号XM-009962) （配列番号３６）、
(D4) Human mRNA for KIAA0008 (GenBank アクセッション番号D13633) （配列番号３７）、
(D5) Human mRNA for KIAA0101 gene (GenBank アクセッション番号D14657) （配列番号３８）、
(D6) KIAA1051 protein (GenBank アクセッション番号AB028974) （配列番号３９）
（分類13）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンにやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの
(D7) Homo sapiens paired basic amino acid cleaving system 4  (GenBank アクセッション番号NM-002570) （配列番号４０）、および
(D8) neuropeptide Y receptor Y1 (GenBank アクセッション番号NM-000909) （配列番号４１）
【００４１】
（４０）  （３９）のC1〜C11の遺伝子もしくはESTからなるC群ならびにD1〜D8の遺伝子もしくはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットしたDNAマイクロアレイを用い該遺伝子の発現を解析することを含む、（３９）の方法。
（４１）  （３９）のC1〜C11の遺伝子もしくはESTからなるC群ならびにD1〜D8の遺伝子もしくはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをターゲットとしたリアルタイムPCRにより該遺伝子の発現を解析することを含む、（３９）の方法。
【００４２】
（４２）  （３９）のC1〜C11の遺伝子もしくはESTからなるC群ならびにD1〜D8の遺伝子もしくはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子またはESTの発現にタモキシフェンと同様に作用する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
（４３）  タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が影響される遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、該遺伝子またはESTの発現に対してタモキシフェンと同様に作用する物質をスクリーニングする方法。
【００４３】
（４４）  （２４）のA1〜A15の遺伝子もしくはESTからなるA群およびB１〜B7の遺伝子もしくはESTからなるB群ならびに（３９）のC1〜C11の遺伝子もしくはESTからなるC群およびD1〜D8の遺伝子もしくはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAを用いる、（４３）の方法。
（４５）  （２４）のA1〜A15の遺伝子もしくはESTからなるA群およびB１〜B7の遺伝子もしくはESTからなるB群ならびに（３９）のC1〜C11の遺伝子もしくはESTからなるC群およびD1〜D8の遺伝子もしくはESTからなるD群の１つ以上の遺伝子またはESTの塩基配列の全部または一部を含むDNAをスポットした、該遺伝子またはESTの発現に対してタモキシフェンと同様に作用する物質をスクリーニングするためのDNAマイクロアレイ。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４４】
【発明の実施の形態】
１．本発明の方法に利用し得る遺伝子の取得
（１）エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子のうち、エストロゲンおよびタモキシフェンの両方で刺激を受けた場合とエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合とで、発現が異なる遺伝子またはESTの取得
本発明の遺伝子は、エストロゲン類似活性を有する化学物質による刺激により、発現が影響を受ける遺伝子の中から選択することができる。ここで、本明細書でエストロゲンは、17βエストラジオールをいい、エストロゲン類似活性を有する化学物質として、エストロン、エストリオール、ジエチルスチルベストロール（DES）、ビスフェノールA、ノニルフェノール等がある。
【００４５】
遺伝子の選択は、エストロゲン応答性の細胞をエストロゲンで刺激を行い、該細胞の遺伝子の発現プロファイルをエストロゲンで刺激していない該細胞との遺伝子の発現プロファイルと比較することにより行うことができる。ここで、用いる細胞として、ヒト乳癌細胞や子宮内腫瘍細胞等が挙げられ、例えば、ヒト乳癌細胞MCF-7を用いることができる。エストロゲンによる刺激は、例えば細胞を適当な培地で培養し、該培養細胞にエストロゲンを数nMから数十μMの濃度で添加し、さらに数日間培養することにより行うことができる。
【００４６】
発現プロファイルは、例えばDNAチップを用いた方法、DNAマイクロアレイを用いた方法、cDNAサブトラクション法(cDNA subtraction)、ディファレンシャルディスプレイ法（differential display）、SAGE（serial analysis of gene expression）、ATAC-PCR、Taq Man PCRなどのリアルタイムPCR等により行うことができる。本発明の遺伝子の選択方法としては、包括的な発現解析という点で、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いて行うのが望ましい。DNAチップは、あらかじめ配列が分かっている遺伝子DNAまたはESTを基板上にピンヘッドあるいはインクジェットなどを用いてスポッティングするか、あるいは光リソグラフィにより適当な基板上に合成して作製することができる。この際、DNA配列情報は、GenBank等のDNAデータベースから得ることができる。DNAマイクロアレイは、ヒト細胞からcDNAクローンを得て、PCRによりcDNAを増幅させて、適当な基板上に貼り付けて作製することができる。
これらの方法による解析は、例えば「DNAマイクロアレイと最新PCR法」、細胞工学別冊、  ゲノムサイエンスシリーズ１、村松正明、那波宏之監修、2000年3月16日発行、秀潤社等の記載に従って行うことができる。
【００４７】
ここで、DNAマイクロアレイとは、基板上にDNAを整列（アレイ）固定化させたデバイスを総称していう。基盤の大きさや載せるDNAの密度によって、DNAマクロアレイやDNAマイクロアレイに分けられるが、本発明においては、DNAマクロアレイもDNAマイクロアレイも含めてDNAマイクロアレイと呼ぶ。また、整列させるDNAの数にも限定はなく、基板上に少なくとも１つのDNAがスポットされている限りDNAマイクロアレイに含まれる。さらに、DNAマイクロアレイにおいては、基板上にスポットしたDNAを標識したサンプルDNAとハイブリダイズさせるが、この標識方法も限られず、蛍光標識、放射性同位体による標識等を含む。
【００４８】
例えば、本発明の遺伝子を以下のようにしてcDNAマイクロアレイを利用して選択することができる。最初にヒトESTまたは完全長cDNAを得る。ヒト細胞からcDNAライブラリーを作製して得ることもできるし、また市販の遺伝子セットを利用してもよい。得られたcDNAおよびESTをプローブDNAとして、市販のアレイ機を用いてスライドガラス上にスポットする。用いるスライドガラスは、例えばポリLリシン処理したものを用いる。固定化に用いるDNAは例えば3×SSCに溶解させスポットする。その濃度には限定はないが、濃度0.5μg/μl〜1μg/μl以上が望ましい。例えば4cm2のスライドガラスならば、直径約100〜400μmでスポットすることにより、1枚当たり10000種類以上のDNAを固定化することができる。固定化を行った後には、リハイドレーション（rehydration）、コハク酸によるブロッキング等により後処理を行う。
【００４９】
次いで、エストロゲンで刺激した細胞およびエストロゲンで刺激しない細胞からmRNAを抽出し、該mRNAから標識cDNAを作製する。mRNAの調製は、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム法などにより全RNAを抽出した後、オリゴdT−セルロースやポリU−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（A）+RNA（mRNA）を得ることにより行える。このようにして得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマーおよび逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成する際にcDNAを標識すればよい。標識は、蛍光色素で行い、エストロゲンで刺激した細胞から得られたcDNAおよびエストロゲンで刺激しない細胞から得られたcDNAをそれぞれ異なる蛍光色素で標識すればよい。蛍光色素としては、例えば、Amersham Pharmacia Biotech社のCy3（赤色）およびCy5（緑色）が挙げられる。
【００５０】
適当なハイブリダイゼーション溶液中のそれぞれの蛍光色素で標識したcDNAをマイクロアレイ上にスポットしたDNAとハイブリダイゼーションさせる。この際のハイブリダイゼーション条件は、所望の感度に応じてハイブリダイゼーション溶液の塩濃度を変化させたり、反応温度を変化させることにより適宜選択することができる。
【００５１】
ハイブリダイゼーション後、スライドグラス上の蛍光パターンを蛍光顕微鏡、蛍光検出器（例えば、CHIP READER(商標)（VERTEK社製））等により観察または測定することにより、エストロゲンで刺激した細胞およびエストロゲンで刺激しない細胞の発現プロファイルを解析することができる。例えば、エストロゲンで刺激した細胞から得られたcDNAを赤色のCy3で標識し、エストロゲンで刺激しない細胞から得られたcDNAを緑色のCy5で標識した場合、エストロゲンで刺激した細胞のみで発現する遺伝子を固定化したマイクロアレイ上のスポットは赤色蛍光を発し、エストロゲンで刺激しない細胞のみで発現する遺伝子を固定化したマイクロアレイ上のスポットは緑色蛍光を発し、両細胞で発現する遺伝子を固定化したマイクロアレイ上のスポットは赤と緑の合成色蛍光を発する。エストロゲンで刺激した場合のCy3の蛍光（赤色蛍光）強度がエストロゲンで刺激しない場合のCy5の蛍光（緑色蛍光）強度よりも大きい結果を示すスポットに固定化したDNAはエストロゲン刺激により発現が高まる遺伝子であり、エストロゲンで刺激した場合のCy3の蛍光強度がエストロゲンで刺激しない場合のCy5の蛍光強度よりも小さい結果を示すスポットに固定化したDNAはエストロゲン刺激により発現が抑制される遺伝子である。DNAマイクロアレイ上の各スポットのCy3の蛍光強度とCy5の蛍光強度を測定し、例えばCy3/Cy5比を計算し、該比を指標にこれらの遺伝子またはESTについてエストロゲンの効果を評価することができる。この際、DNAマイクロアレイには内部標準遺伝子をスポットしておく。内部標準遺伝子とハイブリダイズし得るDNAであって、Cy3またはCy5で標識したものをサンプルに添加してハイブリダイゼーションを行う。各スポット上のCy3/Cy5比を計算するときに、内部標準遺伝子のCy3/Cy5比で標準化することにより、各スポットのCy3/Cy5比を補正することができる。
【００５２】
選択した遺伝子およびESTを、発現プロファイルにより以下のように分類することができる。
A群：エストロゲンとタモキシフェンの混在により、エストロゲンのみが存在する場合よりも発現量が抑制されるもの。
B群：エストロゲンとタモキシフェンの混在により、エストロゲンのみが存在する場合よりも発現量が誘導されるもの。
【００５３】
さらに、細胞刺激に用いるエストロゲンおよびタモキシフェンの濃度を変えることにより、発現変動に要する各物質の濃度によりさらにA群およびB群の各遺伝子およびESTを細分類することができる。
例えば、A群の遺伝子またはESTとして以下のものが挙げられ、さらに5μMおよび10nMのタモキシフェンにより発現が抑制されるか否かで以下のように細分類される。このことは、遺伝子によりタモキシフェンが該遺伝子に対するエストロゲンの効果を競合抑制する程度、およびタモキシフェンの該遺伝子への影響の程度が異なることを示す。以下の遺伝子またはESTの名称の後ろのかっこ内には、GenBankのアクセッション番号を示す。なお、遺伝子データベース上で、遺伝子の名称（Definition）は変更されることがあるので、本明細書に記載したアクセッション番号の遺伝子であるかぎり、データベース上の名称が変更されたとしても、本発明に利用する遺伝子に含まれる。
【００５４】
（分類1）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや誘導されるもの。
Homo sapiens methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (XM-002234)
【００５５】
（分類2）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの。
asparagine synthetase  (L35946)
EST  (AA587912)
exportin  (AF039022)
ferritin, heavy polypeptide 1   (AA102267)
glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1   (M90516)
78KD GLUCOSE REGULATED PROTEIN PRECURSOR (AI878886)
Homo sapiens partial mRNA for A-type potassium channel modulatory protein 2  (AJ276317)
insulin-like growth factor-binding protein 4  (M62403)
methylene tetrahydrofolate dehydrogenase (X16396)
phosphoenolpyruvate carboxykinase 2 (X92720)
protein kinase C, delta   (D10495)
trefoil factor 1 (X05030)
【００５６】
（分類3）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く抑制され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの。
argininosuccinate synthetase ( AI660571)
solute carrier family 7, member 5 (XM-017410)
また、B群の遺伝子も同様に以下のものが挙げられる。
【００５７】
（分類17）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで変化のないもの。
erbB2 (M86910)
fucosyltransferase 8  (Y17977)
Homo sapiens ,adipose specific 2 (BC004471)
insulin-like growth factor binding protein 5 (L27556)
【００５８】
（分類18）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみでやや抑制されるもの。
Homo sapiens DNA from chromosome 19 (AC004030)
quiescin Q6 (U97276)
（分類19）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンに強く誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの。
solute carrier family 12, member 2  (XM-003745)
【００５９】
このようにして、得られたエストロゲン刺激により発現が変動する遺伝子またはESTをスライドガラス上にスポットして、DNAマイクロアレイを作製する。
本発明において、上述の遺伝子またはESTには、上述の遺伝子もしくはESTだけでなく上述の遺伝子もしくはESTの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAも含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いDNA同士、すなわち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００６０】
さらに、上述の遺伝子またはESTの全長を用いてもよいし、一部断片を用いてもよい。一部断片を用いる場合その部分配列の位置は限られず、各遺伝子またはESTの連続した部分配列を用いればよい。また断片の長さも限られない。
また、これらの遺伝子およびESTを固定化したDNAマイクロアレイとして、例えばインフォジーンズ(InfoGenes)社製のInfoArray（商標）を用いることができる。
【００６１】
上述の細胞を、エストロゲンおよびタモキシフェンの一方または両方で刺激して、刺激しない細胞との発現プロファイルを上記方法で取得したエストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子を固定化したDNAマイクロアレイを用いて比較することにより「エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子のうち、エストロゲンとタモキシフェンの両方で刺激を受けた場合とエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合とで、発現が異なる遺伝子またはEST」を取得することができる。エストロゲンおよびタモキシフェンによる刺激は、両物質を適当濃度混在させた培地で前記細胞を数日間培養することにより行うことができる。
【００６２】
（２）タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子またはESTの取得
１．（１）における、エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子またはESTの取得方法において、エストロゲンの代わりにタモキシフェン類似活性を有する化学物質を用いることにより、「タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子またはEST」を得ることができる。さらに、１．（１）で得たエストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子を固定化したDNAマイクロアレイを用いることにより、エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子のうち、タモキシフェンにより発現が変動する遺伝子またはESTを得ることができる。ここで、タモキシフェン類似活性を有する化学物質としてタモキシフェン、トリフェニルエチレン、クロミフェン、トレミファイン、ICI182,780等が挙げられる。ただし、タモキシフェンを含め多くのエストロゲンアンタゴニストにはエストロゲン活性抑制効果だけでなく、様々な程度のアゴニスト活性も有するため、タモキシフェンによって発現が変動した遺伝子またはESTは、それがタモキシフェンの持つアンタゴニスト効果によるものかあるいはアゴニスト効果によるものかを厳密に記述することは困難である。したがって、被験物質を与えることによって示される遺伝子またはESTの示す変動がタモキシフェンによって示される変動と類似か否か、あるいは類似の程度によってその効果を評価する必要がある。
【００６３】
タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子またはESTは、次のように分類することができる。
C群：タモキシフェンの存在により発現量が抑制されるもの。
D群：タモキシフェンの存在により発現量が誘導されるもの。
【００６４】
さらに、細胞刺激に用いるエストロゲンおよびタモキシフェンの濃度を変えることにより、発現変動に要する各物質の濃度によりさらにC群およびD群の各遺伝子およびESTを細分類することができる。
例えば、C群の遺伝子またはESTとして以下のものが挙げられ、さらにエストロゲンおよびタモキシフェン（5μM）で同時に刺激した場合、およびタモキシフェン単独（10nM）で刺激した場合に発現が抑制されるか誘導されるかで以下のように細分類される。このことは、遺伝子によりタモキシフェンが該遺伝子に対するエストロゲンの効果を競合抑制する程度、およびタモキシフェンの該遺伝子への影響の程度が異なることを示す。以下の遺伝子またはESTの名称の後ろのかっこ内には、GenBankのアクセッション番号を示す。
【００６５】
（分類12）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの。
A1B1 （AF137620）
Estrogen receptor α (AY033393)
Homo sapiens UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactocyltransferase, polypeptide1 (NM-001497)
stearoyl-CoA desaturase (XM-005719)
【００６６】
（分類16）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンでやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く抑制されるもの。
cadherin 18 (NM-004934)
enolase 2  (X51956)
enolase 3 (X56832)
Human mRNA for KIAA0373 gene (AB002371)
Homo sapiens tumor-associated calcium signal transducer 2 (XM-001710)
Homo sapiens enolase 1 (alpha) (ENO1) (NM-001428)
selenium binding protein 1 (U29091)
同様にD群の遺伝子またはESTとして以下のものが挙げられる。
【００６７】
（分類8）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンで変化がなく、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの。
CDC6 homolog (NM-001254)
chromobox homolog 1 (BC002609)
Homo sapiens interleukin 2 receptor, beta (XM-009962)
Human mRNA for KIAA0008 (D13633)
Human mRNA for KIAA0101 gene (D14657)
KIAA1051 protein (AB028974)
【００６８】
（分類13）エストロゲンとの競合で5μMタモキシフェンにやや誘導され、10nMタモキシフェンのみで強く誘導されるもの。
Homo sapiens paired basic amino acid cleaving system 4  (NM-002570)
neuropeptide Y receptor Y1 (NM-000909)
【００６９】
このようにして、得られた遺伝子またはESTをスライドガラス上に固定化して、DNAマイクロアレイを作製する。
本発明において、上述の遺伝子またはESTには、上述の遺伝子もしくはESTのみならず上述の遺伝子もしくはESTの塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAも含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いDNA同士、すなわち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それにより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００７０】
２．タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果、タモキシフェンの効果、または被験物質のタモキシフェン類似の効果の評価のためのDNAマイクロアレイ
上述の遺伝子およびESTの全長配列または一部配列を適当な基板上に固定化することにより、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果の評価、タモキシフェンの効果、または被験物質のタモキシフェン類似の効果の評価に用いるためのDNAマイクロアレイを作製することができる。
【００７１】
固定基板としては、ガラス板、石英板、シリコンウェハーなどが挙げられる。基板の大きさとしては、例えば3.5mm×5.5mm、18mm×18mm、22mm×75mmなどが挙げられるが、これは基板上のDNAプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。DNAの固定化方法としては、DNAの種類及び担体の種類に応じて適当な方法が選択される。例えば、固定化するDNAがcDNAやPCR産物の場合、DNAの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させたり、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入したDNAを共有結合により結合させることもできる固定化は、上述のようにアレイ機を用いて行えばよい。このさい固定化する遺伝子またはESTとして全長を用いてもよいし、一部断片を用いてもよい。一部断片を用いる場合その部分配列の位置は限られず、各遺伝子またはESTの連続した部分配列を用いればよい。また断片の長さも限られない。A群〜D群の遺伝子の全長DNAまたはその断片を固定化すればよい。１枚のスライドガラスにA群〜D群のすべての遺伝子またはESTを固定化してもよいし、群ごとに固定化してもよいし、各群から少なくとも１つの遺伝子またはESTを選択して固定化してもよい。
【００７２】
３．タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果、タモキシフェンの効果、または被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価する方法。
（１）エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子のうち、エストロゲンとタモキシフェンの両方で刺激を受けた場合とエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合とで、発現が異なる遺伝子もしくはEST、（２）エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子のうち、タモキシフェンで刺激を受けた場合に発現が反動する遺伝子もしくはEST、および（３）タモキシフェン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子もしくはESTを用いて、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果、タモキシフェンの効果または作用が未知の被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価することができる。
【００７３】
ここで、未知のエストロゲン活性抑制物質をスクリーニングするためには、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果を基準にすればよい。これは、タモキシフェンが示すエストロゲン活性抑制効果と同様のメカニズムでエストロゲン活性抑制効果を示す未知の物質は、タモキシフェンと同様の遺伝子応答を示すことが期待され、特定の遺伝子群の応答を調べることにより未知の物質のタモキシフェンと同様の効果を評価できることを意味する。すなわち、タモキシフェンの有するエストロゲン活性の抑制効果を多数のエストロゲン応答性の遺伝子群の発現を基に評価し、未知の物質の該遺伝子群の発現に対する効果をタモキシフェンで得られた結果と比較することにより、未知の物質の効果を評価することができる。本発明において、遺伝子の発現に基づいてタモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果およびタモキシフェン効果を評価することはタモキシフェンの効果を未知の物質の効果の評価の基準として用い得ることに意義がある。
【００７４】
ここで、「タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果の評価」とは、エストロゲンおよびタモキシフェンで刺激した場合の前記（１）の遺伝子またはESTの発現を解析することにより、タモキシフェンがどの遺伝子またはESTの発現をどの程度抑制または誘導し、エストロゲン活性を抑制するかを決定することをいう。また、「タモキシフェンの効果の評価」とは、タモキシフェンで刺激した場合の前記（２）または（３）の遺伝子またはESTの発現を解析することにより、タモキシフェンがどの遺伝子またはESTの発現をどの程度抑制しまたは誘導するかを決定することをいう。また、「被験物質のタモキシフェン類似の（タモキシフェン様）効果の評価」とは、エストロゲンおよび被験物質で刺激した場合の前記（１）の遺伝子またはESTの発現を解析し、被験物質が該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に抑制する効果または被験物質が該遺伝子またはESTがエストロゲンに応答するのをタモキシフェンと同様に誘導する効果を有するか否かを決定する方法であり、該方法によりエストロゲン遺伝子とエストロゲンとの応答を抑制または誘導することによりタモキシフェンと類似の作用を有する物質をスクリーニングすることができる。さらに、「被験物質のタモキシフェン類似の（タモキシフェン様）効果の評価」とは、被験物質で刺激した場合の前記（２）または（３）の遺伝子またはESTの発現を解析することにより、被験物質がタモキシフェンと同様に前記遺伝子またはESTの発現を抑制したかまたは誘導したかを決定することもいい、該方法により直接あるいは間接にエストロゲン応答性遺伝子に働きかけ、タモキシフェン類似の作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００７５】
例えば、上述のA群の遺伝子またはESTを用いることにより、被験物質が、これらの遺伝子またはESTがエストロゲンに応答しようとするのをタモキシフェン様に抑制したか否かの評価が行える。また、タモキシフェン類似物質がタモキシフェンと同じ挙動を示したか評価できる。また、B群の遺伝子またはESTを用いることにより、これらの遺伝子またはESTにおいて、被験物質がエストロゲンとの協調によって発現量をタモキシフェン様に誘導されたか否かの評価が行える。また、タモキシフェン類似物質がタモキシフェンと同じ挙動を示したか評価できる。また、C群の遺伝子またはESTを用いることにより、被験物質がこれらの遺伝子またはESTの発現量をタモキシフェン様に抑制したか否かの評価が行える。また、タモキシフェン類似物質がタモキシフェンと同じ挙動を示したか評価できる。さらに、D群の遺伝子またはESTを用いることにより、被験物質がこれらの遺伝子またはESTの発現量をタモキシフェン様に誘導させたか否かの評価が行える。また、タモキシフェン類似物質がタモキシフェンと同じ挙動を示したか評価できる。
【００７６】
従って、タモキシフェン単独、タモキシフェンとエストロゲンならびに被験物質とエストロゲンで刺激した場合の上記遺伝子の発現を各群ごとに調べることにより、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果、タモキシフェンの効果または作用が未知の被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価することができる。但し、各群の遺伝子の発現の変動がタモキシフェンもしくは被験物質のエストロゲン活性抑制効果によるものなのかあるいはタモキシフェンもしくは被験物質の独自の遺伝子に対する影響なのか厳密に区別するのは困難なので、総ての群の遺伝子について発現を調べるのが好ましい。ただし、遺伝子はその機能によって分類できるが、それぞれの機能に関しても遺伝子間で全く互換可能のもの、同様の機能を示すにも係わらず互換性のないもの、あるいは全く機能が異なるため互換性のないものに分類でき、さらに、互換可能な場合でも機能の効率（活性）が異なる場合も有り、明確に機能と活性を記述することは現時点では不可能である。したがって、機能や活性の種類による分類ではなく、薬剤に対する遺伝子発現の応答の程度により分類することが好ましく、特にエストロゲン活性抑制効果に関しては、エストロゲンに対する競合作用及びそれぞれの薬剤の構造などに起因すると考えられる遺伝子発現に対する影響をもとに分類するのが好ましい。
【００７７】
１．（１）の方法により選択したA〜D群の遺伝子およびESTは、エストロゲンおよびタモキシフェンにより発現が影響される遺伝子であり、エストロゲンのみで培養細胞を刺激した場合の発現プロファイルとエストロゲンと被験物質の両方で刺激した場合の発現プロファイルを解析することにより、該被験物質がタモキシフェンと同様にエストロゲン活性を抑制する効果を有するか否かを決定することができる。例えば、エストロゲンのみで刺激した場合に発現が増大する遺伝子またはESTが、エストロゲンと被験物質の両方で刺激した場合に発現の増大が認められない場合、その被験物質はエストロゲン活性抑制効果を有すると評価することができる。
【００７８】
さらに、上述のようにA群〜D群の各群の遺伝子は、さらにエストロゲンおよびタモキシフェン（5μM）で同時に刺激した場合、およびタモキシフェン単独（10nM）で刺激した場合に発現が抑制されるか誘導されるかで上述のように細分類される。このことは、遺伝子によりタモキシフェンが該遺伝子に対するエストロゲンの効果を競合抑制する程度、およびタモキシフェンの該遺伝子への影響の程度が異なることを示す。被験物質が細分類群（A群については、分類１、２、３、B群については分類１７、１８、１９、C群については分類１２および１６、D群については分類８および１３）の各遺伝子またはESTの発現を抑制するか、誘導するかを調べることにより、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制以外のエストロゲン活性の抑制の影響を除くことができ、より精密に被験物質のスクリーニングを行うことができる。また、上述のA群〜D群の各群の遺伝子は、エストロゲンおよびタモキシフェン（5μM）で同時に刺激した場合、およびタモキシフェン単独（10nM）で刺激した場合の遺伝子の応答を元に分類されているが、その根拠として、10nMエストロゲンはエストロゲン効果を評価する際の基準濃度であり、それに対する競合抑制活性を示すタモキシフェンの濃度は5μM程度である。したがって、競合反応においてはこの条件を基準にした。また、タモキシフェン独自の影響を見るにはエストロゲンと同じ10nMでの遺伝子応答を基準にした。これらの濃度は一つの例であり、同様の遺伝子機能が期待できる範囲でのそれぞれエストロゲン及びタモキシフェンの濃度の範囲を含む。また、被験物質の濃度に関しても同様である。
【００７９】
タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果、タモキシフェンの効果および被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価するためには、A群〜D群の遺伝子またはESTを総て用いれば最も正確に評価できるが、一部の遺伝子またはESTを用いてもよい。以下に、被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価する場合についてどの遺伝子またはESTを用いれば、どのような効果を有する物質をスクリーニングできるかについて示す。
【００８０】
エストロゲンにエストロゲン応答性の遺伝子またはESTが応答するのを、タモキシフェンと同様に抑制する物質のスクリーニングには、A群に属する遺伝子またはESTの１つ以上を用いればよく、A群の細分類（分類１、２、３）に属する遺伝子またはESTからそれぞれ１つ以上の合計３つ以上の遺伝子またはESTを用いるのがさらに好ましい。エストロゲンに遺伝子またはESTが応答するのを、タモキシフェンと同様に誘導する物質のスクリーニングには、B群に属する遺伝子またはESTの１つ以上を用いればよく、B群の細分類（分類１７、１８、１９）に属する遺伝子またはESTからそれぞれ１つ以上の合計３つ以上の遺伝子またはESTを用いるのがさらに好ましい。タモキシフェンと同様にエストロゲン応答性の遺伝子またはESTがエストロゲンに応答することを抑制または誘導する物質を広くスクリーニングするには、A群の１つ以上の遺伝子もしくはESTならびにB群の１つ以上の遺伝子もしくはESTを用いればよい。この際、A群の各細分類およびB群の各細分類の遺伝子またはESTのそれぞれを１つ以上合計６つ以上の遺伝子またはESTを用いてもよく、より正確にスクリーニングできる。
【００８１】
タモキシフェンと同様にエストロゲンに応答性の遺伝子またはESTの発現を抑制する物質のスクリーニングには、C群に属する遺伝子またはESTの１つ以上を用いればよく、C群の細分類（分類１２、１６）に属する遺伝子またはESTからそれぞれ１つ以上の合計２つ以上の遺伝子またはESTを用いるのがさらに好ましい。タモキシフェンと同様にエストロゲンに応答性の遺伝子またはESTの発現を誘導する物質のスクリーニングには、D群に属する遺伝子またはESTの１つ以上を用いればよく、D群の細分類（分類８、１３）に属する遺伝子またはESTからそれぞれ１つ以上の合計２つ以上の遺伝子またはESTを用いるのがさらに好ましい。C群の遺伝子もしくはESTの１つ以上ならびにD群の遺伝子もしくはESTの１つ以上を用いれば、タモキシフェンと類似の活性を有する物質を広くスクリーニングできる。この際、C群の各細分類およびD群の各細分類の遺伝子またはESTのそれぞれを１つ以上合計４つ以上の遺伝子またはESTを用いてもよく、より正確にスクリーニングできる。
【００８２】
さらに、A群の遺伝子もしくはESTの１つ以上、B群の遺伝子もしくはESTの１つ以上、C群の遺伝子もしくはESTの１つ以上ならびにD群の遺伝子もしくはESTの１つ以上を用いれば、広くタモキシフェン類似の作用を有する物質をスクリーニングでき、用いた遺伝子またはESTの発現プロファイルによりその物質の作用がわかる。この際、A群の各細分類からそれぞれ1つ以上、B群の各細分類からそれぞれ1つ以上、C群の各細分類からそれぞれ1つ以上およびD群の各細分類からそれぞれ1つ以上の合計１０個以上の遺伝子またはESTを用いれば、より正確にスクリーニングできる。
【００８３】
エストロゲン類似活性を有する化学物質により発現が変動する遺伝子のうち、エストロゲンとタモキシフェンの両方で刺激を受けた場合とエストロゲン類似活性を有する化学物質のみが存在する場合とで、発現が異なる遺伝子またはESTをスポットしたDNAマイクロアレイを用いることにより、タモキシフェンのエストロゲン活性抑制効果、タモキシフェンの効果または作用が未知の被験物質のタモキシフェン類似の効果を評価することができる。また、該遺伝子またはESTをターゲットとしたリアルタイムPCR等によっても評価することができる。
【００８４】
例えば、DNAマイクロアレイを用いて行う場合、上述の遺伝子およびDNAならびに内部標準遺伝子を固定化したDNAマイクロアレイを用いて以下のように行う。上述の細胞をタモキシフェンもしくは被験物質およびエストロゲンの一方または両方で刺激する。刺激は、細胞を適当な培地で培養し、該培地にタモキシフェンもしくは被験物質およびエストロゲンの一方または両方を添加しさらに培養することにより行える。添加する濃度に限定はないが、数nMから数十μM添加すればよい。次いで、該培養細胞からmRNAを抽出し、蛍光色素で標識したcDNAを作製する。この際、例えば被験物質とエストロゲンの両方で刺激した細胞から作製したcDNAをCy3で標識し、エストロゲンのみで刺激した細胞から作製したcDNAをCy5で標識する。該標識cDNAをマイクロアレイとハイブリダイズさせ、各スポット上のCy3とCy5の蛍光を測定することにより、各スポット上の遺伝子またはESTの発現量がわかりどの遺伝子がどの程度発現が抑制されまたは誘導されたかを決定することができ発現プロファイルを得ることができる。被験物質で得られた発現プロファイルとタモキシフェンの発現プロファイルを比較することにより被験物質がタモキシフェン類似の効果を有するかどうかわかる。このように、培養細胞における発現プロファイルを解析することにより、タモキシフェンまたは被験物質の効果を評価することができる。
【００８５】
被験物質とエストロゲンの両方で刺激したときにエストロゲンのみで刺激した場合に比べ、上述のA群の遺伝子またはESTの発現が抑制された場合には、該被験物質は、エストロゲンの活性をタモキシフェンと同様に抑制する物質であると評価できる。また、B群の遺伝子またはESTの発現が誘導された場合には、該被験物質はエストロゲンの活性をタモキシフェンと同様に誘導する物質であると評価できる。
【００８６】
また、被験物質で刺激したときに、上述のC群の遺伝子またはESTの発現が抑制された場合には、該被験物質はタモキシフェンと同様の効果を示す物質であると評価でき、D群の遺伝子またはESTの発現が誘導された場合にも、該被験物質はタモキシフェンと同様の効果を示す物質であると評価できる。
【００８７】
リアルタイムPCRによる解析は、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した機器、例えばロッシュ社製のLightCycler(商標)により行うことができる。リアルタイムPCRにより、PCR増幅産物の生成過程をリアルタイムで検出解析することが可能になる。PCR産物を蛍光色素で標識するため、正確な定量が行えるので、本発明の方法に適する。
【００８８】
リアルタイムPCRは、LightCycler（ロシュ・ダイアグノスティックス社）とそれ用のホットスタート反応溶液キットLightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて行うことができる。以下に本キットを用いた手順を説明する。まず初めにプライマー混合液と鋳型となるcDNA溶液を82℃で5分間熱処理し、氷中で急冷する。次に、H2O 12.6 mL、MgCl2 2.4 mL、10×Light Cycler Mix 2.0mL、鋳型cDNA 1.0mLを混合し、混合溶液を作成する。作成した混合溶液19mLをキャピラリーに分注し、そこにプライマー混合液（10 pmol/mL）を1mL加え、キャピラリーにふたをする。キャピラリーを遠心用アダプターにのせたまま遠心を1900rpmで10〜15秒間行う。これをLightCyclerのカローセルにセットし、リアルタイムPCRを行う。以上の操作はできるだけ氷上もしくは4℃で保管しておいた遠心用アダプター上で行う。解析は、LightCycler Software Ver.3.3（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて行うことができる。
【００８９】
【実施例】
以下に、本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
細胞培養は次のように行う。まずMCF7細胞を液体培地（例えばGibcoBRL社製  商品名RPMI Medium 1640に シグマ社製 Fetal Bovine Serumを10%の濃度で含むもの）で培養する。更にエストロゲン（17βエストラジオール）の影響を無くすためにチャコール処理を施したFetal Bovine Serumを10%の濃度で含む液体培地で5日間培養する。 次に影響を調べようとする化合物（例えば対照区はethanol;コントロール、実験区は10nMエストロゲン(E2) +5μMタモキシフェン(TAM)）をそれぞれ上記培養細胞中に添加し、引き続きチャコール処理を施したFetal Bovine Serumを10%の濃度で含む液体培地中で72時間培養する。
【００９０】
対照区および実験区からプローブを調製するため、各培養細胞より全量mRNAを抽出する(例えば、Miltenyi Biotec社製、商品名MACS)。抽出した全量mRNAを逆転写酵素（例えば、GibcoBRL社製、SuperScript Reverse Transcriptase）および標識dNTP（例えば、アマシャムファルマシアバイオテク社製、Cy3-dUTP、Cy5-dUTP）でcDNAサンプルを調製する。例えば対照区から抽出した全量mRNAを鋳型とするcDNAをCy5-dUTPで標識し、実験区から抽出した全量mRNAを鋳型とするcDNAをCy3-dUTPで標識しプローブとする。
【００９１】
調製したプローブをInfoArray  （InfoGenes社製  1枚当たり内部標準遺伝子27個を含む204個のエストロゲン応答遺伝子またはESTが2ブロックスポットされているマイクロアレイ）とハイブリダイズさせ、その後ハイブリダイズしたcDNAを検出器（例えばVERTEK社製  商品名CHIP READER ）で読み取り、Cy3とCy5の蛍光強度を測定する。
【００９２】
Cy3とCy5の蛍光強度を解析し定量を行う。解析は次のように行う。まず内部標準遺伝子のCy3/Cy5比の平均値を計算する（この時、非常に低い蛍光強度しかもたないスポットは計算から除外する）。  各遺伝子またはESTスポットのCy3/Cy5比を計算する（この時も、非常に低い蛍光強度しかもたないスポットは計算から除外する）。各遺伝子またはESTスポットのCy3/Cy5比を内部標準遺伝子のCy3/Cy5比の平均値で標準化する。
【００９３】
【表１】
0003713461.tif 000002
0003713461.tif 000003
0003713461.tif 000004
0003713461.tif 000005
【００９４】
表1の説明
タモキシフェン効果およびタモキシフェンによるエストロゲン活性抑制効果の評価に供した遺伝子またはESTの全リスト。27の対照遺伝子またはESTは陰影で示した。
【００９５】
（各カラムの説明）
Gene Name：データベース（GenBank, EMBL, DDBJ）に登録されている名前。ただし、省略形、通称名も含む。
Accession No.：上記データベースにおけるアクセッション番号。
10nM E2 Raw DATA：MCF7細胞に10nMエストロゲンを作用させた時の値。
10nM E2 +5μM TAM Raw DATA：MCF7細胞に10nMエストロゲンと5μMタモキシフェン（TAM）を同時に作用させた時の値。
10nM E2 / 10nM E2 +5μM TAM：MCF7細胞に10nMエストロゲンを作用させた時の値とMCF7細胞に10nMエストロゲンと5μMタモキシフェン（TAM）を同時に作用させた時の値の商。
10nM TAM：10nMタモキシフェン（TAM）のみをMCF7細胞に作用させた時の値。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
表2の説明
表1を以下の基準に従って各遺伝子またはESTを19項目に分類した。１）表1において（10nM E2 / 10nM E2 +5μM TAM）の値が3.00以上のもの、すなわちエストロゲン10nMとタモキシフェン5μMを競合させてMCF-7細胞に作用させた結果から、タモキシフェン5μMによって強く抑制されたもの、（10nM E2 / 10nM E2 +5μM TAM）の値が2.99以下1.50以上のもの、すなわちやや抑制されたもの、（10nM E2 / 10nM E2 +5μM TAM）の値が1.49以下、-1.49以上のもの、すなわち変化の無かったもの、（10nM E2 / 10nM E2 +5μM TAM）の値が-1.50以下 -1.90以上のもの、すなわちやや誘導されたもの、（10nM E2 / 10nM E2 +5μM TAM）の値が-2.00以下のもの、すなわち強く誘導されたもの。
【００９８】
１）上で分類した項目それぞれをタモキシフェン10nMだけをMCF-7細胞に作用させた結果から次の基準に従って更に分類した。表1において（10nM TAM）の値が-2.00以下のもの、すなわちタモキシフェン10nMによって強く抑制されたもの、（10nM TAM）の値が-1.90以上-1.50以下のもの、すなわちタモキシフェン10nMによってやや抑制されたもの、（10nM TAM）の値が-1.49以上1.49以下のもの、すなわちタモキシフェン10nMによって変化のないもの、（10nM TAM）の値が1.50以上1.99以下のもの、すなわちタモキシフェン10nMによってやや誘導されたもの、（10nM TAM）の値が2.00以上のもの、すなわちタモキシフェン10nMによって強く誘導されたもの。この基準に従って分類した結果合計19項目に分類された。
【００９９】
【発明の効果】
実施例に示したように、本発明の遺伝子またはESTはエストロゲンまたはタモキシフェンで刺激した場合に特定の発現パターンを示す。被験物質によりこれらの遺伝子またはESTの発現が、エストロゲンの存在下または非存在下に抑制されるかまたは誘導されるかを調べることにより、被験物質がエストロゲン活性を抑制するか、タモキシフェン類似活性を有するか否かを決定することができる。
【０１００】
【配列表】
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