(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ファフィアロドチーマ属に属する酵母を含有してなることを特徴とする肝機能賦活改善剤。
【請求項２】
ファフィアロドチーマ属に属する酵母を含有してなることを特徴とする魚類の肝機能賦活改善剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な肝機能賦活改善剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳類、魚類の別を問わず、肝臓は解毒作用や糖，蛋白質，脂質の代謝調節、貯蔵等の種々の重要な役割を果たしている生体内における最も重要な臓器の一つである。このため、肝臓に障害を受けると生体にとって致命的な結果に陥ることが多い。かかる肝障害の原因としてはウイルス感染、有害物の摂取等、そして特に人間ではアルコールの過剰摂取が考えられ、これらにより脂肪肝、肝炎、肝硬変等の各種の肝疾患が惹き起こされることが知られている。
【０００３】
かかる肝疾患は人間においては勿論、近年においては家畜や養殖魚においても大きな問題となっている。例えば、近年の養殖技術の進歩により、銀鮭、虹鱒、ハマチ、鯛、ウナギ、鮎等の多くの種類の魚が養殖されている。そして、現実の養殖現場では過密な飼育条件の下で、多量の食餌を養殖魚に短期間に、かつ大量に与える傾向があるため、魚にストレスがたまったり、肝臓肥大等による肝機能障害が起こりがちであり、大きな問題となっている。
【０００４】
人間においては、上記肝障害は自覚症状を伴わないことが多く、発見が遅れ、その結果として重度の肝臓障害に陥ることが多い。そこで、現在は健康診断の一環として、血液中のＧＯＴ（グルタミン酸オキザロ酢酸アミノ基転移酵素）、（ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素）等を測定することで肝機能を把握し、上記肝臓病を予測する方法が広く行われている。
【０００５】
現在、肝機能改善剤としては、抗ヒスタミン剤、ＡＴＰ、アルギニン−塩酸塩、グルタチオン等が使用されている。そしてさらに、茶葉の抽出物（特開平２−300836号公報）やストレプトコッカス属の菌体（特開昭61−221124号公報) 等の肝機能改善剤としての利用も検討されている。
しかしながら、上記のいずれもその効果は十分ではない。
【０００６】
よって、肝機能を賦活する薬剤や肝機能低下を予防する薬剤の開発が各方面から期待されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術に鑑み、本発明が解決すべき課題は新たな肝機能賦活改善剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、ファフィアロドチーマ属に属する酵母の菌体等を投与することにより、肝臓肥大を抑止すると共に、肝機能の状態の主な指標として用いられている被投与体の血中のＧＯＴ値、ＧＰＴ値、及びＴＢＡ値（脂質の過酸化物量を表す数値であり、過酸化物量が多いということは肝機能が低下していることを示すと考えられる）が著しく改善されることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ファフィアロドチーマ属に属する酵母を含有してなることを特徴とする肝機能賦活改善剤、特にファフィアロドチーマ属に属する酵母を含有してなることを特徴とする魚類の肝機能賦活改善剤を提供することにある。
以下に本発明について説明する。
ファフィアロドチーマ属に属する酵母は、菌体内にカロテノイド色素、特にアスタキサンチンを多量に蓄積することで知られる担子菌に属する酵母である（International Jornal of Bacteriology Vol.26,p286-291(1976)) 。そして、かかる酵母は、現在各種の微生物寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）, Institute For Fermentation,Osaka（ＩＦＯ）等から公知酵母株として入手することが可能である。本発明においては、上記寄託機関から入手したファフィアロドチーマ属に属する酵母株をそのまま用いることが可能である。当該酵母株としては、例えば、ＩＦＯ 10129株、ＡＴＣＣ 24202株等を挙げることができる。さらに、当該酵母株にミューテーションをかけ又は遺伝子工学的若しくは蛋白工学的手法により形質転換等した酵母株を用いることができる。
【００１０】
上記ミューテーションの手段としては、通常公知の当該手段、例えば紫外線の照射；放射線の照射；ニトロソグアニジン等の遺伝子変異を誘発する薬剤の使用等を広く用いることができる。また、これらのミューテーションの手段を複数組み合わせて用いることも勿論可能である。
また上記遺伝子工学的手法としては、例えば亜硝酸による Segment-directed mutagenesis(Hirose,S.,Takeuch,K.＆ Suzuki,Y.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,79,7258-7262(1982))；合成オリゴヌクレオチドによる Site-directed mutagenesis(Hirose,S.,Takeuch,K.,Hori,H.,Hirose,T.,Inayama,S.＆Suzuki,Y.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,81,1394-1397(1984)；Kramer,W.＆Fritz,H.-J.,Methods in Enzymol.,154,350-367(1987)；Kunkel,T.A.,Roberts,J.D.＆Zakour,R.A.,Methods in Enzymol.,154,367-382(1987)等) を挙げることができる。
【００１１】
上記ファフィアロドチーマ属に属する酵母株の培養は、通常の酵母の培養に用いられる糖類を炭素源とし、さらに有機窒素源を添加した培地を用いて行うことができる。かかる炭素源としては、ブドウ糖、マルトース、ショ糖、転化糖、糖蜜等を用いることができる。また、有機窒素源としては、例えばペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、綿実粉、CSL(コーンスティープリカー)等を用いることができる。
【００１２】
培養温度は20〜30℃の範囲で行うことができるが、特に24℃付近が好ましい。また、培養時間は培養温度その他の培養条件によっても異なるが、通常好ましくは１〜８日間程度である。
上記培養後は、ファフィアロドチーマ酵母の菌体を、遠心分離等の通常公知の集菌手段を用いて集菌することができる。
【００１３】
本発明において、「ファフィアロドチーマ属に属する酵母を含有して」とは、上記に従って得た酵母菌体をそのまま含有することのみならず、生物的、化学的若しくは物理的手段によって破砕した当該酵母菌体や当該酵母菌体の抽出物等を含有することも意味する。酵母菌体をそのまま本発明肝機能賦活改善剤の有効成分として用れば、当該肝機能賦活改善剤の製造工程を単純化することが可能であるという利点があるが、その反面酵母菌体当たりの肝機能賦活改善効果の増大を考慮すれば、生物的、化学的若しくは物理的手段により破砕した酵母菌体や当該酵母菌体抽出物を本発明肝機能賦活改善剤の有効成分として用いるのが好ましい。
【００１４】
上記菌体の破砕手段としては、通常公知の酵母菌体をβ1,3-グルカナーゼを主体とした酵素剤処理等の生物的手段；0.2N程度の水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液処理等の化学的手段を用いることができる。これらの処理手段の中では、処理コスト及び処理の確実性という点でアルカリ処理が好ましい。
さらに、物理的酵母菌体の破砕手段としては、通常公知の菌体の当該破砕手段、例えば湿式ガラスビーズ粉砕機等のガラスビーズによる粉砕機やマントンガーリン等の高圧粉砕機による破砕等の機械的処理手段等を採用することができる。そして、これらの中では粉砕処理が確実であるという点において、湿式ガラスビーズ粉砕機を用いた粉砕処理を採用するのが好ましい。
【００１５】
酵母菌体抽出物の抽出手段としては、溶媒抽出等の通常公知の抽出手段を用いることができる。かかる溶媒抽出は、例えば水、油脂類、アルコール類、アセトン又はこれらの混液等を用いた通常公知の溶媒抽出手段を採用することができる。また、かかる抽出物を本発明肝機能賦活改善剤の有効成分として用いる場合には、当該抽出物を通常公知の方法により濃縮した濃縮物を用いるのが好ましい。
【００１６】
なお、上記菌体等は培養直後の湿潤な菌体でもよく、また乾燥菌体であっても構わない。
本発明の肝機能賦活改善剤を投与する対象は、哺乳類であると魚類であるとを問わない。また、哺乳類に属する動物種も魚類に属する具体的な魚の種類も問わないが、魚類に投与する場合は、養殖魚、例えば養殖されている銀鮭、虹鱒、ハマチ、鯛、ウナギ、鮎等に投与するのが現実的である。
【００１７】
なお、投与する対象に応じてその製剤形態及び投与形態を選択することができる。
すなわち、上記酵母菌体を魚類、特に養殖魚に投与する場合には、上記のようにして得た、ファフィアロドチーマ属に属する酵母菌体、当該粉砕物及び／又は当該抽出物を本発明肝機能賦活改善剤としてそのまま与えてもよいが、通常食餌に添加して与えることができる。その添加量は食餌に対して0.01重量％以上、好ましくは0.1重量％以上である。
【００１８】
かかる魚類の肝機能賦活改善剤を魚類に投与することで、飽食により肥大化した肝臓を正常の大きさに戻し、また上昇したＧＯＴ値等の肝機能を表すパラメーターを正常値へと改善することが可能である。また、ファフィアロドチーマ属に属する酵母を哺乳類、特に人間に投与する場合には、当該酵母を有効成分として肝機能賦活改善剤とすることができる。当該肝機能賦活改善剤は、酵母菌体若しくは当該菌体破砕物を製剤化してそのまま肝機能賦活改善剤として用いることができる。また、当該酵母菌体と共に適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製して用いることができる。当該製剤担体としては、使用形態に応じて製剤を調製する場合に通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用することができる。製剤組成物形態は、これが上記酵母菌体等を肝機能賦活改善作用を効果的に奏する形態で含有する状態である限りにおいて特に限定されない。例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であってもよいし、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態とすることも可能である。また、当該液剤等を使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることも可能である。
【００１９】
なお、前記製剤はいずれも常法に従って調製することが可能である。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
〔実施例１〕酵母の培養
ファフィアロドチーマＩＦＯ 10129株を、予め121℃で20分間滅菌したグルコース４％，ペプトン 0.3％，CSL １％，硫酸アンモニウム 0.1％，リン酸一カリウム 0.1％からなる培地100mlに１白金耳を植え、23℃で５日間培養した。培養した菌体は、遠心分離で集菌した後、凍結乾燥した。
【００２１】
培養液５l より、乾燥菌体50gが得られた。
〔実施例２〕酵母のアルカリ処理
ファフィアロドチーマＩＦＯ 10129株を、予め121℃で20分間滅菌したグルコース４％，ペプトン 0.3％，CSL １％，硫酸アンモニウム 0.1％，リン酸一カリウム 0.1％からなる培地100mlに１白金耳を植え、23℃で５日間培養した。
【００２２】
培養した菌体は、遠心分離で集菌した後、0.1N水酸化ナトリウム中で室温で１時間処理し、硫酸でpHを５に調整した後、水で洗浄後スプレードライアーで乾燥した。培養液５l より、乾燥菌体約40gが得られた。
なお、実施例１及び本実施例２において得られた酵母の組成は、以下に表１に示すごとくであった。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
〔実施例３〕酵母の機械処理
実施例１で得られた乾燥酵母菌体50g を湿式ガラスビーズ粉砕機（ダイノミル・シンマルエンタープライズ社製）で粉砕し、水で洗浄した後、これを乾燥し、破砕菌体38g を得た。
〔試験例１〕
実験動物は、２週間予備飼育した体重およそ100gの虹鱒を１群15尾ずつ、４グループに分けた。
【００２５】
飼育用餌料は、表２に示す餌料を基本餌料とし、セルロースの替わりに第３群には実施例２で調製した酵母菌体20gを、第４群には実施例３で調製した酵母菌体20gを加えた。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
虹鱒の飼育は、30cm×40cm×60cmの水槽で、飼育期間中の平均水温を16℃とし、第１群は１日当たりの魚体重の1.4％の餌料を与える制限給餌を行った。第２群、第３群、第４群は、一日あたり魚体重の２％程度の飽食給餌を行った。
飼育61日後に、各群10尾について魚体重、肝臓重量、血清中のＧＯＴ，ＧＰＴ，ＴＢＡ値の測定を行い、結果を表３に示した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
表中、＊は第２群に比べて優位差有り（P<0.05) 。
制限給餌を行った第１群に比べ、飽食給餌を行った第２群は明らかに肝臓肥大及び肝機能値の低下が観察された。しかし、ファフィアロドチーマ属酵母を添加した飼料を与えた第３群及び第４群では明らかな肝機能数値の改善が観察された。
〔実施例４〕酵母の培養
ファフィアロドチーマＩＦＯ 10129株を、予め121℃で20分間滅菌したグルコース４％，ペプトン 0.3％，CSL １％，硫酸アンモニウム 0.1％，リン酸一カリウム 0.1％からなる培地100mlに１白金耳を植え、23℃で５日間培養した。
【００３０】
培養した菌体は、遠心分離で集菌した後、0.1N水酸化ナトリウム中で室温で１時間処理し、硫酸でpH５に調整した後、水で洗浄後スプレードライアーで乾燥した。培養液10lより、乾燥菌体約80gが得られた。
〔実施例５〕酵母抽出液の調整
実施例４で得た酵母菌体40gに、水−メタノール混液（１：９）200mlを加え、ホモジェナイザーで粉砕した後、さらに時々振盪しながら３時間放置した。酵母菌体を遠心分離で除いた後、上清液を減圧下で濃縮し、油状物質約10gを得た。
〔参考例１〕パン酵母の調製
市販のパン酵母（Saccharomyces cereviciae) 湿潤品を蒸留水に懸濁後、湿式ガラスビーズ粉砕機（ダイノミル）で粉砕した後、これを水洗浄してこれを乾燥した。
【００３１】
上記湿潤酵母500gより乾燥酵母約150gを得た。
〔試験例２〕
実験動物は、２週間予備飼育した体重およそ100gの虹鱒を１群15尾ずつ、４グループに分けた。
飼育用餌料は、前記表２に示す餌料を基本餌料とし、第２群には前記実施例４で調製した酵母菌体20gを、第３群には前記実施例５で調製した酵母抽出物10gを、第４群には前記参考例１で調製したパン酵母20gを加えた。
【００３２】
飼育は、30cm×45cm×60cmの水槽で、飼育期間中の平均水温を14℃とし、１日当たり魚体重の2.0％程度の飼料を１日当たり２回に分け、飽食給餌を行った。飼育65日後に、各群10尾について魚体重、肝臓重量、血清中のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＴＢＡ値の測定を行い、その結果を表４に示した。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
表中、＊は第１群に比べて優位差有り（P<0.05) 。
酵母を添加しなかった第１群、パン酵母乾燥物を添加した第４群に比べ、ファフィアロドチーマ属酵母菌体又はその抽出物を添加した第２群及び第３群では、明らかな肝機能数値の改善が観察された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、本発明は、新規の肝機能賦活改善剤、特に魚類に用いる肝機能賦活改善剤が提供される。