(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ケイ皮酸及びフェルラ酸の硫酸塩エステルからなる群から選択される１つ以上の化合物からなる抗海洋生物付着の組成物を提供する工程と、
（ｂ）前記抗海洋生物付着の組成物を人工面に塗布する工程と
からなる人工面上の海洋生物の付着堆積を防止する方法。
【請求項２】
前記抗海洋生物付着の組成物はケイ皮酸の硫酸塩エステルを備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗海洋生物付着の組成物はｐ−スルホキシケイ皮酸を備える請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗海洋生物付着の組成物はフェルラ酸の硫酸塩エステルを備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）ケイ皮酸及びフェルラ酸の硫酸塩エステルからなる抗海洋生物付着化合物を提供する工程と、
（ｂ）前記抗海洋生物付着化合物を溶解して溶剤を生成する工程と、
（ｃ）前記溶剤を人工面に塗布する工程と
からなる人工面上の海洋生物付着堆積を防止する方法。
【請求項６】
人工面及び同人工面上における、ケイ皮酸及びフェルラ酸の硫酸塩エステルからなる抗海洋生物付着層を備えた、海洋生物付着に耐性を有する生成品。
【請求項７】
前記抗海洋生物付着層はケイ皮酸の硫酸塩エステルからなる請求項６に記載の生成品。
【請求項８】
前記抗海洋生物付着層はｐ−スルホキシケイ皮酸からなる請求項７に記載の生成品。
【発明の詳細な説明】
アメリカ合衆国政府は海軍研究局（Office of Naval Research）とシカゴ大学（University of Chicago）との間に交わされた契約第N00014−88−Ｋ−0445号に基づく本発明上の権利を有している。
人工面上の生物付着を制御することは海洋環境と接する構造物には重大な問題である。汚止め塗料から環境上有害な有機スズ化合物を除去するようになってからは、付着生物が堆積するのを制御することが米国海軍の船舶運用にとって唯一の最も費用を要する保全問題となっている。加えて、近年カワホトトギスガイの持込みが米国中で、特に五大湖地域において淡水環境における主たる生物付着害になる様相を呈している。よって、環境上安全かつ効果的な構造物用の抗付着製剤を探求することが多くの研究及び開発の主題となっている。本出願人は重要な抗生物付着特性を有する化合物（ゾステリック酸（zosteric acid））を調剤したが、これは広範な生物有機体に対してテストされた時に無毒であることはまだ実証されていない。
有機体はその表面の汚れを防止する種々の機構を発達させた。外部組織層の脱皮等の物理的手段及び／又は生体粘着を最小化する外面の生成によって付着剤の堆積を低減するものもある。潜在的に付着性である有機体及び捕食者を阻止できる二次代謝産物の生成は海洋有機体の間では比較的一般的である。しかし、この種の防御機構を実現するのに用いられる化学種は、これを加工する有機体と同程度に多様である。周知の化合物にはサポニン、テルペン及びフェノール酸等の種々の有機化合物のみならず、元素状態のバナジウム及び無機酸がある（デービスら、1989）。19世紀に適度な水溶性フェノール酸の抗生物付着特性が認識されたが、これら化合物の実用開発は効果が小さいために極めて小規模であった。
アマモは抗生物付着剤を含有する幾つかのフェノール酸及び誘導体の供給源である。幾つかのスルホン化フラボン及び多数の非スルホン化フェノール酸がアマモ組織から分離され、この中には抗生作用を有することを示したものである。フェノール酸含有の天然水抽出物は特に抗菌性を有することが認められた。これら化合物は細菌による感染、グレージング及び生物付着を防止するのに生態学的に重要であると考えられている。しかし、溶性フェノール酸の発生量の季節的ピークは生物付着の最大発生量と合致し、アマモの葉に対する生物付着の負荷が累積するのを防止するのにフェノールは効果的ではないことが示唆されている。
従って、抗生物付着の組成を改善することが本発明の目的である。
自然発生する化合物の新しい使用方法を提供することが本発明の別の目的である。
海洋環境と接する構造物が汚損するのを防止する方法を改善することが本発明の更なる目的である。
海洋汚損に耐性を有する新しい構造用鋼材を提供することが本発明の更に別の目的である。
無毒でもある改善された抗生物付着化合物を提供することが本発明の更なる別の目的である。
海洋環境と接する構造物に海洋有機体が付着するのを阻止する新しい方法を提供することが本発明の更に別の目的である。
酸性溶液条件下にてゾステリック酸を分離する方法を改善することが本発明の更なる目的である。
海洋抗生物付着組成物としてフェノール酸の硫酸塩エステルを使用する新しい方法を提供することが本発明の別の目的である。
これら目的及び他の目的は以下の詳細な説明及び図面の簡単な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
図1Aは自然発生するゾステリック酸の化学構造を示す。図1Bは実験室で合成されたフェノール酸硫酸塩エステルを示す。図1Cは別のフェノール酸硫酸塩エステルを示す。
図2Aは互いに異なるフェノール酸硫酸塩エステルの濃度の関数としてガラススライド上の細菌密度を示す。図2Bはアシネトバクター種に対しての対照基準スライドに対する自然ゾステリック酸（黒丸）、合成p.（スルホキシ（sulfoxy））ケイ皮酸（白丸）、ｐ−（スルホキシ）フェルラ酸（白三角）及び（ジスルホキシ）カフェ酸（白四角）の抗生物付着の投与量作用を示す。図2Cはフェルラ酸（白丸）の抗生物付着の投与量の作用曲線を示す。
図３はフジツボの密度及びｐ−スルホキシフェルラ酸の濃度の関係を示す。
図４はアマモ抽出物で処理されたガラススライド及びメタノール溶剤で別個に処理された別のガラス上の細菌密度並びに時間を示す。
図５はメタノール（白丸）及び天然アマモ抽出物（黒丸）で処理されたセラミックタイル上の種々の有機体の密度を示す。
図６は種々の海洋大型水生植物から用意されたメタノール抽出物で実施された時間の関数として幾つかの細菌密度の分析評価を示す。白丸は対照基準スライド測定値である。
好ましい実施例の詳細な説明
クロマトグラフィー（セファディスク及びHPLC）の連続分離による細菌付着分析評価によって、アマモからゾステリック酸が分離された。13C−NMR、1H−NMR及び高分解能高速原子衝撃質量分析（HRFAMBS）によって、ケイ皮酸、ｐ−スルホキシケイ皮酸（図1A）、（ゾステリック酸）の硫酸エステル誘導体として精製剤が特定された。化合物は酸性条件下において加水分解する。
アマモ抽出物の抗生物付着特性の真の原因がゾステリック酸であることを立証すべく、実験室においてピリジン中のクロロスルホン酸及びｐ−クマル酸からｐ−スルホキシケイ皮酸が合成された。混合物はエタノール、水及びエタノールによって抽出され、HPLCにより精製された。生成物の構造はNMR及びHRFAMBS検査によって実証された。
ゾステリック酸が比較的単純な構造であることから、硫酸塩基が抗生物付着作用の原因であることが示唆された。生物付着作用における硫酸塩基の仮定的役割をテストすべく、反応シーケンスにおいて異なるフェノール酸前駆物質を用いて、上記のように他の類似体（図1B）が用意された。この反応による収率は全化合物につき約63％であった。図1Cに示す他の合成類似体も本発明の範囲内にある。図示した合成類似体には安息香酸硫酸塩、バニリン酸硫酸塩、ゲンチシン酸硫酸塩、没食子酸及びプロトカテク酸がある。これら基礎化合物の変形物にはカルボキシル端末を延ばして、海洋構造物上の被覆から化合物が溶解する割合を制御することが関連している。
ゾステリック酸及び合成硫酸塩エステルの投与量効果は細菌付着分析評価を用いて実験室で評価された。ガラススライドに対する細菌付着を個々の化合物が抑制する能力を４桁に及ぶ密度範囲にわたりテストした。これらテストに基づき、精製ゾステリック酸がアマモ抽出物の抗生物付着特性の原因となる主たる化学剤であると結論づけるのに充分なだけ、精製ゾステリック酸は付着に対して効果的であった（図２を参照）。精製ゾステリック酸は抗生物付着の被覆に取り込まれるための化学剤とみなすのに充分な活性も有した。合成硫酸塩エステルは工業的規模の量のゾステリック酸の生成には不要な天然アマモ個体群を利用し、細菌付着を防止するのに天然ゾステリック酸と同等に効果的であった。
天然ゾステリック酸と比較し、単純なフェノール酸前駆物質は同一濃度範囲にわたり効果がなく、実際、場合によっては対照基準よりも高密度でガラススライドに細菌を引き付けたようである。本明細書中に記載の他の発明を限定することなく、硫酸塩エステルの存在がゾステリック酸の抗生物付着特性の主たる原因であることを示すと考えられる。しかし、もう１つの硫酸塩エステルを添加しても（カフェ酸二硫酸塩の場合）、化合物の抗生物付着力は増大しなかった。抗生物付着作用を起こす際の正確な作用形態は確定しないままである。しかし、海洋有機体が生成する細胞外の多糖が高度に硫酸化され、これら硫酸塩エステルが重合（即ち、にかわ／ゲル形成）において重要な役割を果たすということに留意されたい。このようにして、本発明を限定することなく、硫酸塩が固着する表面センサを遮断し、或いは細胞外のにかわの重合を抑制することによって、ゾステリック酸は原子レベルで機能できる。
上記の細菌分析評価に加えて、フジツボの付着分析評価を用い、フェルラ酸硫酸塩（FAS）の投与量効果をテストした。フジツボ分析評価におけるIC−50投与量は細菌分析評価の結果に類似し、同様の作用形態を示唆している（図３参照）。これらテストにおいて、フジツボは活性剤に晒された時に遊泳を停止したが、清浄な海水に移された時に急速に回復し、細菌と同様に激しい毒性以外の機構によって付着が防止されたことを示唆している。ガラススライド及びセラミックタイルに塗布された天然のアマモ抽出物を用い、実験室の結果が実地において反復可能であるか否かを知るために簡単なテスト（＜7d）を実施した。48時間後では、処理スライドが集積した細菌は対照基準よりも遙かに少なかった（図４参照）。双方の処理において、初期のコロニー形成相は当初の５時間内に生じたが、その後の45時間では個体群は安定していた。
天然抽出物は７日間もモスランディングハーバー（Moss Landing Harbor）の温和な環境内に置かれたセラミックタイルに、スピロービッド（spirorbid）多毛類及び群生尾索類が付着するのを防止することもできた（図５参照）。しかし、抽出物は単生尾索類には効果がなかった。この実験中、プレート上に定着するフジツボは存在しなかった。
本発明の別の態様において、アマモ抽出物の抗生物付着特性に準じる特性を他の大型水生植物も有するか否かを判断するために、他の大型水生植物から生の状態で採集された組織からメタノール抽出物が用意された。この調査には別の海草（フィロスパディックス（Phyllospadix）種）のみならず紅藻、褐藻及び緑藻の代表種も含まれた。対比目的のため、Z.マリーナ（marina）の新鮮な抽出物も用意された。先に示したように細菌付着はアマモ抽出物によって抑制されたが、他のテスト試料によって抑制されたのではない（図６）。このように、Z.マリーナは抗生物付着の防御化学に関して海洋植物の中でも幾分特殊である。更に、これらの種の多くは数多くのフェノール化合物を含有しているが、フェノール酸の硫酸塩エステルは異種類の海洋分類法の間に広汎には分布していないようである。
以下の非限定的実施例は本発明の種々の態様を示す。
例Ｉ
1990年３月（575gの乾燥重量）及び10月（1700gの乾燥重量）にカリフォルニア州モンテレーベイ（Monterey Bay）、デルモンテビーチ（Del Monte Beach）近く（北緯36゜30′40″、西経121゜52′30″）の深度５〜7mの下干潮帯床からスキューバダイバーによって海草のアマモ属マリーナL.の浮上苗条（emergent shoots）が採集された。
新しく乾燥され、すり砕かれたアマモの葉の３つのMeOH抽出物（20℃）から組み合わせた乾燥残留物が、ヘキサンと10％のMeOH水溶液との間に分配される前にH2Oによって抽出された。そして、MeOH相は40％のMeOH水溶液に希釈され、CH2Cl2によって抽出された。これら画分の生物検定法により抗生物付着活性が主にH2O抽出物に局限されていることが示された。水性抽出物の凍結乾燥により、セファディクスLH−20コラム（42cm×3.2cmの外径、MeOH）上にバッチ式に３つの色帯に分離される吸湿性の固体が得られた。対生物活性は黄色帯に集中したが、これはHPLCによって無機塩及び他の不純物を除去した後にゾステリック酸（１）であると特定された。ゾステリック酸（１）の酸分解に至る種々の画分を用いて予備実験が行われたため、３月の採集物から量的な計算はしなかった。しかし、10月の採集物は1700gの乾燥生物量から66mgのゾステリック酸（１）を生成した。
全フェノール酸硫酸塩（天然及び合成）の最終的精製はHPLC（リージス（Regis）ODS変則コラム、25cm×10mmの内径;RI検出器;MeOH溶媒の90％水溶液（５〜７には100％のH2O）;1000psi）によって実施された。TLC  Rf値（シリカゲル;BuOH−HOAC−H2O（4:1::1）;UV検出）は準試料１（0.63）であり、他の類似体の生成値は（0.29）−（0.83）であった。
例II
顕微鏡用ガラススライドのつや消し端部（4.5cm2の面積）を候補画分によって処理し、即ちMeOHに溶解した精製化合物で処理し、次いで、アシネトバクター種（アマモの葉面から分離された付着性海洋細菌）のクローンでテストした。対照基準用スライドはMeOH溶剤のみにより処理された。30mlの無菌かつ0.2mmでろ過された海水（filtered seawater,FSW）及び対数増殖期にある液体培養からの細菌の接種原を含有する50mlのねじ込み口金式プラスチックチューブ中にスライドを入れた（最終的な細菌濃度は約106細胞ml-1であった。）。チューブは蓋をされ、処理面を下向きにして回転攪拌器上に水平に配置された。スライドは20分間隔で取り外され、ヘキスト（Hoechst）（2287号、シグマ社（Sigma Co.））により着色され、つや消し領域における細胞密度はエピフルオレスンス（1000x）を用いて計数した。処理スライド上に付着した細菌の密度は各時点において対照基準スライドに正規化された。４時間の時系列における全データから密度毎に（対照基準のMeOHに対する）平均密度を計算した。
フジツボ付着分析評価は準試料１の類似体及び対照基準の溶剤（MeOH）によって処理されたペトリざらにおいて実施された。次に、ペトリざらはFSWで満たされ、フジツボ属アムピトリーテー（Balanus amphitrite）の反応能を有するキュプリス型幼虫が添加された。24時間後、各ペトリざらにおける付着キュプリス型幼虫の数が決められ、当初の添加数に正規化された。密度毎に10個の複製ペトリざらを分析した。
例III
準試料１の合成は以下のようであった。ClSO3H（0.2ml）は20℃で攪拌しながらピリジン（0.5ml）中の２（200mg）に滴下された。氷水が添加され、酸性水混合物がEt2Oによって抽出され、塩基性化され、Et2Oによって抽出され、真空下にてH2Oが除去された。残留物はH2Oによって紛砕され、中和され、真空下にて乾燥され、MeOHによって紛砕された。HPLCによって精製されたMeOH可溶性残留物は準試料１（63％）に対して187mg生成された。他の類似体にも同様の収率が得られた。
例IV
全ての質量スペクトルはHRFAB（高分解能高速原子衝撃）では検出不能であった。使用マトリックスはチグリセロール／グリセロールであった。NMR＊割当は交換可能である。
例IIIからのゾステリック酸は（Ｍ−１）-242.9963、C9H7O6S、Δ0.0mmuであった。APT及び13C  NMR（62.5MHz、CD3OD−D2O）はδ176.5（s,C−１）、153.5（s,C−７）、140.8（d,C−３）、134.3（s,C−４）、130.2（2C,d,＊Ｃ−５）、125.8（d,C−２）、122.9（2C,d,＊Ｃ−６）であった。1H  NMR（300MHz,CD3OD−D2O）はδ7.59（2H,d,j＝8.7Hz,＊Ｈ−５）、7.34（1H,d,j＝16.2Hz,H−３）、7.27（2H,d,j＝8.4Hz,＊Ｈ−６）、6.44（1H,d,j＝16.2Hz,H−２）であった。
ゾステリック酸メチルエステルは（Ｍ−１）-257.0118、C10H9O6S、Δ0.2mmuの計算値であった。13C  NMR（75MHz、CD3OD）はδ167.8、154.5、144.3、130.7、128.9（2C）,121.2（2C）,116.5,50.8であった。1H  NMR（300MHz,CD3OD）はδ7.65（d,j＝15.9Hz）、7.57（d,j＝8.7Hz）、7.31（d,j＝8.7Hz）、6.45（d,j＝15.9Hz）、3.72（ｓ）であった。
準試料１を合成したものは（Ｍ−１）-242.9958、C9H7O6S、Δ0.5mmuの計算値であった。NMRスペクトラムはゾステリック酸と同一であった。
例Ｖ
準試料１の別の類似体の質量スペクトルは（Ｍ−2H＋Na）-360.9285、C9H6NaO10S2、Δ1.5mmuの計算値であった。13C  NMR（62.5MHz、D2O）はδ176.5,144.9,144.3,140.3,135.3,127.4,124.4,123.3,123.1であった。1H  NMR（250MHz,D2O）はδ7.81（br  ｓ）、7.62（br  ｓ）、7.45（d,j＝16.0Hz）、6.61（d,j＝16.0Hz）であった。使用マトリックスはグリセロールのみであった。
例VI
準試料１混合物の２つの類似体の混合物の質量スペクトルは（Ｍ−１）-258.9888、C9H7O7S、Δ2.4mmuの計算値であった。13C  NMR（62.5MHz、D2O）はδ177.0,176.7,151.0,149.4,141.2,140.9,140.1,135.4,128.9,128.1,127.2,125.7,124.1,123.5,123.0,121.4,118.8,117.0であった。1H  NMR（250MHz,D2O）はδ7.74（ｓ）、7.59（d,j＝2.0Hz）、7.56（ｓ）、7.42−7.35（ｍ）、7.30（d,j＝3.2Hz）、7.22（d,j＝1.9Hz）、7.18（d,j＝2.0Hz）、7.15（d,j＝2.0Hz）、7.03（d,j＝8.4Hz）、6.53（d,j＝18.3Hz）、6.41（d,j＝14.8Hz）であった。使用マトリックスはグリセロールのみであった。
別の類似体準試料は（Ｍ−１）-273.0083、C10H9O7S、Δ1.4mmuの計算値であった。13C  NMR（62.5MHz、CD3OD）はδ175.6,153.1,143.5,140.2,134.8,126.3,123.5,121.2,112.5,56.6であった。1H  NMR（250MHz,CD3OD）はδ7.40（d,j＝8.3Hz）、7.30（d,j＝15.9Hz）、7.14（d,j＝1.9Hz）、7.02（dd,j＝8.4,1.9Hz）、6.40（d,j＝15.9Hz）、3.83（ｓ）であった。
【図１Ａ】
0003606526.tif 000002
【図１Ｂ】
0003606526.tif 000003
【図５Ｂ】
0003606526.tif 000004
【図１Ｃ】
0003606526.tif 000005
【図２Ａ】
0003606526.tif 000006
【図２Ｂ】
0003606526.tif 000007
【図２Ｃ】
0003606526.tif 000008
【図５Ａ】
0003606526.tif 000009
【図５Ｃ】
0003606526.tif 000010
【図３】
0003606526.tif 000011
【図４】
0003606526.tif 000012
【図６】
0003606526.tif 000013