(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を用いてヒアルロン酸もしくはその塩を生産する際にアミノ態窒素を０．０１％〜０．０４％（％は重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％）含有する培地で培養し、培養液中に高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を蓄積させ、ついで該培養液を１０℃以下の温度で分離精製処理することを特徴とする高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【請求項２】
得られるヒアルロン酸もしくはその塩の分子量が３００万以上である請求項１記載のヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【請求項３】
微生物がストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）のなかから選ばれた１種以上である請求項１記載の高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【請求項４】
アミノ態窒素が微生物、植物もしくは動物由来の物質である請求項１記載の高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、化粧品等広範囲に利用される高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を微生物による発酵法で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸もしくはその塩はその分子量により特有の生理作用を有する。このため化粧品、医薬品等の分野でその目的にあった分子量のヒアルロン酸もしくはその塩が使用されている。近年、特に医薬向けのヒアルロン酸もしくはその塩には平均分子量２５０万以上、好ましくは３００万以上のものが使用されるようになってきている。ヒアルロン酸もしくはその塩の工業的規模での製造法は、抽出法と発酵法とに大きく分けられる。前者すなわち抽出法では高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩が得られるもののその操作が煩雑であり、一方後者の発酵法は前者に比べ操作は簡単であるものの高分子量のものが得られにくいという欠点がある。
【０００３】
これまで発酵法による高分子量のヒアルロン酸もしくはその塩の製造法はヒアルロン酸生産株を変異処理してヒアルロニダーゼ非生産性にした微生物を培地に培養する方法（特開昭６０−１３３８９４号公報，特開昭６２−２５７３９３号公報、特開平６−３１９５８０号公報）、培養時のｐＨをアルカリ側に調整して高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を製造する方法（特開昭６３−２８３９８号公報）、培地の炭素源としてグルコースのほかにフルクトースを添加して培養する方法（特開平６−３１９５７９号公報）やウリジンを添加して培養する方法（特開平６−３１９５８０号公報）が提案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれまでの方法に比べて容易にかつ安定して高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を取得できる製造法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するための本発明の手段は、ヒアルロン酸生産菌を培養する際に、窒素源として使用するアミノ態窒素の濃度を低濃度に維持することによりその菌が有するヒアルロニダーゼ様活性を抑制し、それにより培養段階で高分子量のヒアルロン酸もしくはその塩を製造し、ついで該培養液を１０℃以下の温度で精製処理して、分子量２５０万以上、好ましくは３００万以上の高分子量ヒアルロン酸もしくはその塩を製造するものであり、本発明でいう高分子量とは、分子量２５０万以上、好ましくは３００万以上をいう。
【０００６】
本発明に使用するヒアルロン酸生産菌としては、ヒアルロン酸生産能を有する微生物であればとくに制限はなく、ストレプトコッカス属、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・デイスガラクテイエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）等を挙げることができる。
【０００７】
本発明で培地に添加する窒素源としては、通常、微生物培養に使われる有機体窒素源、例えば酵母エキス、肉エキス、ポリペプトン、大豆ペプトン等であれば特に制限はない。また、添加される窒素源の濃度は、アミノ態窒素換算で０．０１％〜０．０４％（以下、％はことわりのない限りすべて重量（ｇ）／容量（ｄｌ）％を表す）である。
以上
【０００８】
本発明に用いる培地の窒素源を除いた培地成分はヒアルロン酸生産菌を培養するのに通常用いられる培地を用いればよく、例えばグルコース３．０％、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％を含む成分でｐＨ６．０〜８．５に調整されたものを用いることができる。
【０００９】
本発明の培養では通気攪拌培養や振盪培養のいずれを用いてもよく、また、培養温度は２０℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３８℃である。
【００１０】
培養時間は２０時間〜３０時間であり、培養液の粘度上昇がみられなくなった時点で培養を停止し、得られた培養液を１０℃以下の温度で分離精製処理することにより、目的の高分子量のヒアルロン酸もしくはその塩が得られる。該塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩が一般的である。
なお、本発明で分離精製処理とは、得られた培養液を遠心分離等により菌体を除去したのち、その上澄み液にエタノール等の貧溶媒を添加してヒアルロン酸もしくはその塩を析出、沈殿させる処理のことをいい、該分離精製処理を１０℃以下の温度で行うものである。
【００１１】
【実施例】
以下にその実施例を示す。
ヒアルロン酸もしくはその塩の分子量は極限粘度を薬局方粘度測定法または粧原基粘度測定法第１法によって測定し、その数値を用いて下記の式より算出した値である。
［η］＝０．０００４０３  ｘ  Ｍ  ０．７７５
［η］：    極限粘度（ｄｌ／ｇ）
Ｍ    ：  分子量（ダルトン）
【００１２】
実施例１、比較例１〜３
炭素源としてブドウ糖２．０％、窒素源はアミノ態窒素量として酵母エキスを、その他の塩類として、リン酸１カリウム０．３％、リン酸２カリウム０．２％、チオ硫酸ナトリウム０．０１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１％、亜硫酸ナトリウム０．００２％、塩化コバルト０．００１％、塩化マンガン０．００１％および消泡剤として大豆油０．０２％を添加した培地に、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス  ＦＥＲＭＢＰ８７８（微工研条寄  第８７８号）を接種し、ｐＨを６．０〜８．５になるように調製しながら、温度３７℃で培養した。培養終了後、該培養液を１０℃以下に冷却し、遠心分離により菌体を除去したのち、その上澄みを１０℃以下に冷却したエタノールで２回沈殿処理するという精製処理を行い、最後に沈殿を２０℃で真空乾燥して、表１記載の分子量を有する精製ヒアルロン酸のナトリウム塩を得た。また、比較例１〜３として、比較例１は精製処理の温度を２５℃とする以外は実施例１に準拠して、比較例２はアミノ態窒素の添加量を０．１０５％とし、精製処理温度を２５℃とする以外は実施例１に準拠して、比較例３はアミノ態窒素の添加量を０．１７５％とし、精製処理温度を２５℃とする以外は実施例１に準拠して、表１に記載の分子量を有する精製ヒアルロン酸のナトリウム塩のそれぞれを得た。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、ヒアルロン酸発酵時に低濃度のアミノ態窒素を添加して培養し、ついで該培養液を１０℃以下の温度で精製処理することにより、高分子量のヒアルロン酸もしくはその塩を容易にかつ安定して製造することができる。