(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるグルコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１記載のグルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で表される塩基配列を有するグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３記載のグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
１２，１３−ジヒドロ−１，１１−ジヒドロキシ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン（ＢＥ−１３７９３Ｃ）を生産する能力を有するストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）ＢＡ１３７９３（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５０９０）を請求項４記載の組換えベクターにより形質転換することにより得られる、形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項５記載の形質転換された宿主細胞を培養し、培養物中にグルコシルトランスフェラーゼを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするグルコシルトランスフェラーゼの製造法。
【請求項８】
一般式［Ｉ］：
0003707075.tif 000019
［式中、Ｘ1及びＸ2が水酸基であり、Ｒが水素原子、メチル基、又はアミノ基である。］で表されるインドロピロロカルバゾール誘導体を、請求項５記載の形質転換された宿主細胞と培養し、その培養液から一般式［ＩＩ］：
0003707075.tif 000020
［式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＲは前記と同じ意味を有する。］で表される化合物を採取することを特徴とする、一般式［ＩＩ］で表される化合物の製造法。
【請求項９】
請求項６記載の宿主細胞を培養し、その培養物から、式［ＩＩＩ］：
0003707075.tif 000021
で表される化合物を採取することを特徴とする、式［ＩＩＩ］で表される化合物の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は医薬の分野で有用であり、更に詳細にはインドロピロロカルバゾール系の抗腫瘍性物質の製造に際し、グリコシル基の導入を円滑かつ効率的に行う方法として有用である。
背景技術
本発明者らは抗腫瘍性物質の探索研究を行って、微生物代謝物中に新規な抗腫瘍性物質BE−13793C（12,13−ジヒドロ−1,11−ジヒドロキシ−5H−インドロ［2,3−ａ］ピロロ［3,4−ｃ］カルバゾール−5,7（6H）−ジオン）を見出し、先の特許出願（特開平3−20277号）において開示した［ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオテックス（J.Antibiotics）第44巻、723〜728頁（1991年）参照］。その後、BE-13793Cに化学修飾を加えて更に優れた抗腫瘍活性を有する化合物を創製し、先の特許出願（国際公開WO91／18003及び欧州特許公開公報0545195A1）において開示した。
本発明の課題は、先の特許出願において開示した、優れた抗腫瘍効果を示すインドロピロロカルバゾール誘導体を製造する際において、インドロピロロカルバゾール系の抗腫瘍性物質に円滑にかつ効率よくグリコシル基を導入する方法を見出すことである。
発明の開示
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリコシレーションする能力を有する微生物よりグリコシルトランスフェラーゼをコードするDNAをクローニングし、この遺伝子を組み込んだベクターにより形質転換された宿主細胞で発現させることに成功し本発明を完成した。
即ち、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子（それと実質的に生物学的に同等なグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を含む）、グリコシルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子（該遺伝子と実質的に生物学的に同等な遺伝子を含む）を有する組換えベクター、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、該形質転換された宿主細胞を培養して、グリコシルトランスフェラーゼを製造する方法及びグリコシレーションされたインドロピロロカルバゾール誘導体を該形質転換された宿主細胞の培養によって製造する方法に関する。
ここに、グリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子とは、アクチノミセタレス（Actinomycetales）目に属する微生物由来のグルコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子又はそれと実質的に生物学的に同等なグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を意味する。これらの中、サッカロスリクス（Saccharothrix）属に属する微生物又はその変異株由来のグリコシルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子が好ましく、更に好適な具体例としては、サッカロスリクス・エアロコロニゲネスATCC39243株又はその変異株由来のものが挙げられる。
サッカロスリクス・エアロコロニゲネス（Saccharothrix aerocolonigenes）ATCC39243株由来のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子とは、下記の配列番号２で表される塩基配列を有するグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子である。
配列番号２
0003707075.tif 000002
0003707075.tif 000003
また、配列番号２で表されるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子によってコードされるトランスフェラーゼのアミノ酸配列は下記配列番号１に表されるアミノ酸配列である。
配列番号１
0003707075.tif 000004
0003707075.tif 000005
0003707075.tif 000006
また、グリコシルトランスフェラーゼ活性とは、例えば、一般式
0003707075.tif 000007
［式中、Ｒ、Ｘ1及びＸ2は水素原子又は置換基を示す］で表されるインドロピロロカルバゾール誘導体をグリコシレーションして、一般式
0003707075.tif 000008
［Ｘ1、Ｘ2及びＲは前記の意味を示す］で表される化合物に変換する能力を意味する。
上記のインドロピロロカルバゾール誘導体の具体的な例はＸ1及びＸ2が水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、モノ−低級アルキルアミノ基、ジ−低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アラルコキシ基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルカノイルオキシ基又は低級アルキル基であり、Ｒが水素原子、アミノ基、ホルミルアミノ基、低級アルカノイルアミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アラルコキシ基、アラルキル基又は低級アルキル基であるインドロピロロカルバゾール誘導体であり、更に好適な例は、Ｘ1及びＸ2が水酸基であり、Ｒが水素原子、低級アルキル基又はアミノ基であるインドロピロロカルバゾール誘導体である。
本発明に使用する出発原料化合物であるインドロピロロカルバゾール誘導体［Ｉ］は、公知の方法、例えばダブル・フィッシャー・インドリゼーション法［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Chem）第54巻、824〜828頁（1989年）参照］により製造することができる。また、別の方法としては、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・パーキン・トランスアクションズＩ（J.Chem..Soc.Perkin Transactions I）2475〜2480頁（1990年）に記載のインドロカルバゾールの合成法も挙げることができる。更に、テトラヘドロン（Tetrahedron）第44巻、2887〜2892頁（1988年）、又は特開平3−20277号に記載の合成法を利用することもできる。また、参考例１及び２に原料化合物の具体的製造例を示した。
次に、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のクローニング、塩基配列の決定法、一般式［Ｉ］で表されるインドロピロロカルバゾール誘導体を形質転換された宿主と培養することによって、一般式［II］で表される化合物を製造する方法及びBE−13793Cの生産菌であるストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793に該遺伝子を形質転換し、その形質転換株を培養することによる式［III］表される化合物を製造する方法等について更に詳細に説明する。
(1)グリコシルトランスフェラーゼをコードするDNAを調製する方法。
インドロピロロカルバゾール誘導体にグリコシル基を導入する微生物、例えば、サッカロスリクス・エアロコロニゲネスATCC39243株からDNAを分離し、該DNAを適切なDNA断片としたのち、適切なプラスミドベクターに組み込み、得られた組換えプラスミドで宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、インドロピロロカルバゾール誘導体、例えばBE−13793Cを12,13−ジヒドロ−1,11−ジヒドロキシ−13−（β−Ｄ−グルコピラノシル）−5H−インドロ［2,3−ａ］ピロロ［3,4−ｃ］カルバゾール−5,7（6H）−ジオン（以下、ED−110という）に変換する能力を有する形質転換体をスクリーニングすることにより、目的とするDNAを含有する形質転換体を得たのち、該形質転換体よりプラスミドを単離し、そのプラスミドから目的とするクローン化DNAを切り出すことができる。
更に具体的には、グリコシルトランスフェラーゼDNAは次の方法により調製することができる。インドロピロロカルバゾール誘導体にグリコシル基を導入する能力を有する微生物、例えば、サッカロスリクス・エアロコロニゲネスATCC39243株より自体公知の方法に従いDNAを分離する。得られたDNAを適切な制限酵素を用いて断片化し、大腸菌又は放線菌のプラスミドベクターに組み込み、DNAライブラリーを作成する。該DNAを組み込むプラスミドは、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも用いることができる。大腸菌、放線菌等のプラスミドが好ましく、放線菌のプラスミドが更に好ましい。具体例として大腸菌のプラスミドベクターとしてpBR322［ジーン（Gene）２巻，95頁（1977年）］、pUC118［メソッド・イン・ザイモロジー（Method in Enzymology）153巻，３頁（1987年）］、pUC119［メソッド・イン・エンザイモロジー（Method in Enzymology）153巻，３頁（1987年）］、放線菌のプラスミドベクターとしてpIJ702［ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）129巻，2703頁（1983年）］，pIJ922［ジーン（Gene）35巻，223頁（1985年）］，pVE28［プラスミド（PLASMID）16巻，187頁（1986年）］，pSK21−１［ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（The Journal of Antibiotics）37巻，９号，1026頁（1984年）］等が挙げられる。目的DNAをプラスミドベクターに組み込む方法としては、自体公知の方法、例えばマニアティス（Maniatis.T.）ら、モレキュラークローニング（Molecular Cloning），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）239頁，1982年及びホップウッド（Hopwood D.A）ら、ジェネティック・マニプレイション・オブ・ストレプトマイセス・ア・ラボラトリー・マニュアル（Genetic Manipulation of Streptomyces a Laboratory Manual（1985年））に記載の方法などが挙げられる。
次に、このようにして得られたプラスミドベクターを宿主に導入する。宿主としては、例えば大腸菌、放線菌等が挙げられる。上記大腸菌の例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia1 coli)MV1184［メソッド・イン・エンザイモロジー（Method in Enzymology）153巻，３頁（1987年）］，HB101［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol）41巻，459頁（1969年）］，JM109［ジーン（Gene）33巻，103頁（1985年）］等が挙げられる。放線菌の例としては、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）TK21及びその誘導体、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor），ストレプトマイセス・パブルス（Streptomyces pavulus）［ジェネテックス・マニプレイション・オブ・ストレプトマイセス・ア・ラボラトリー・マニュアル257頁〜267頁（1985年）］、ストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）［サ・ジャーナル・オブ・アンチビオティクス37巻，９号，1026頁（1984年）］、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）BA13793［ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオティクス44巻，723頁（1991年）］等が挙げられる。（なお、ストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793株は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成元年１月20日に寄託されており、その微工研受託番号は微工研菌寄第10489号（FERM P−10489）である。ついで、この菌株は平成２年３月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、その受託番号は微工研条寄第2785号（FERM BP−2785）である。）これらのうち、ストレプトマイセス・リビダンスTK21，ストレプトマイセス・モバラエンシス  BA13793、エシエリヒア・コリMV1184が好ましい。
プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、自体公知の方法に従えば良い。例えば、大腸菌を用いる場合は、マニアティス（Maniatis.T.）ら、モレキュラークローニング（Molecular Cloning）［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）239頁（1982年）］等のカルシュウムクロライド法、あるいはカルシュウムクロライド／ルビジウムクロライド法等が挙げられる。例えば、放線菌を用いる場合は、ホップウッド（Hopwood.D.A.）ら、ジェネティック・マニプレイション・オブ・ストレプトマイセス・ア・ラボラトリ・マニュアル（Genetics Manipulation of Streptomyces a Laboratory Manual（1985年））に記載のプロトプラスト法等によって行われる。上述のようにして得られた大腸菌または放線菌の形質転換体から目的とするDNAを有する菌をスクリーニングする方法としては、形質転換体を液体培養し、その培養液に、インドロピロロカルバゾール誘導体、例えばBE−13793Cを添加し、グリコシル基の導入されたED−110の検出を行えばよい。具体的には、BE-13793Cを添加した培養液をメチルエチルケトンにより抽出し、減圧乾固後テトラヒドロフランに溶解し、シリカゲルの薄層クロマトグラフィーにより、クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン＝（３：１：１）にて展開し、ED−110を生産する株を調べる方法等が挙げられる。このようにしてクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼDNAは、更に必要に応じてプラスミドベクター、例えばpBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pIJ702等にサブクローニングしてもよい。このようにして得られたDNAの塩基配列は、自体公知の方法、例えばジデオキシ法［メシング（Messing.J.）ら、ヌクレイック・アジッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）９巻，309頁（1981年）］、あるいはデアザ法［ミズサワ（Mizusawa.S.）ら、ヌクレイック・アジッド・リサーチ14巻，1319頁（1986年）］等によって決定することができる。
(2)インドロピロロカルバゾール誘導体を形質転換した宿主細胞と培養することによりグリコシレーションする方法。
インドロピロロカルバゾール誘導体にグリコシル基を導入する方法としては、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片を組み込んだプラスミドベクターにより形質転換した大腸菌又は放線菌を、自体公知の方法に従って培養し、培養液にインドロピロロカルバゾール誘導体を添加することによって行う。該微生物としては、好ましくは放線菌を宿主とした形質転換体等が挙げられる。更に好ましくは、ストレプトマイセス・リビダンスTK21等を宿主とした形質転換体等である。また、ED−110の直接発酵製造においては、BE−13793Cを生産するストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793株又はその変異処理株等を宿主とした形質転換体等が好ましい。上述の形質転換体を、自体公知の方法により培養することによってグリコシレーションされたインドロピロロカルバゾールを製造することができる。培養は例えば、炭素源として、グルコース、グリセリン、デキストリン、シュクロース、デンプン、糖蜜等を用い、窒素源としては、コーングルテンミール、綿実粉、大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキスその他、各種アンモニウム塩、硝酸塩等の無機の窒素化合物を用い、必要に応じリン酸、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、塩素または硫酸イオン等を放出し得る種々の無機塩化合物、さらに生育に必要な微量元素、各種消泡剤等を加えたものを用い、液体培養を行う。液体培養は、静置培養、撹拌培養、振盪培養または通気培養等のいずれを実施してもよいが、特に振盪培養又は深部通気撹拌培養が好ましい。ストレプトマイセス・リビダンスTK21を宿主とした形質転換体を培養する場合、培養温度は20℃〜37℃が適当であるが、好ましくは25℃〜30℃である。好ましい培地のpHは４〜８の範囲で、培養期間は、インドロピロロカルバゾール誘導体の添加を行ってから、２日間〜20日間、好ましくは７日間〜15日間である。ストレプトマイセス・モバラエンシスBA137963株を宿主とした形質転換体を培養して直接グリコシル化されたインドロピロロカルバゾール誘導体を生産させる場合は、インドロピロロカルバゾール誘導体を添加しない他は上記培養方法と同様な方法で行えばよい。
培養物からインドロピロロカルバゾール誘導体にグリコシル基が導入された化合物を採取するには、微生物の生産する代謝物を培養物から採取するために通常使用される分離手段が適宜利用される。目的の化合物は培養濾液中及び菌体中に存在するので、培養濾液又は菌体より通常の分離手段、例えば、溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着若しくは分配クロマトグラフィー法又はゲル濾過法等を単独又は組合わせて行うことにより精製できる。また高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー等も抽出精製に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpNGT206及びpNGT207の制限酵素による切断点地図である。
以下に実施例及び参考例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
(1)サッカロスリクス・エアロコロニゲネス（Saccharothrix aerocolonigenes）株の染色体DNAの調製と制限酵素による切断
スターチ・無機塩寒天培地（ISP4，ディフコ社製）で斜面培養したサッカロスリクス・エアロコロニゲネスATCC39243株をトリプトケイスソイブロス（Tryptocase Soy Broth：これより後TSBと略する）培地（ベクトン  ディキンソン社）110mlを含む500ml容の三角フラスコ１本に接種し、28℃、３日間回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。この培養液2mlをTSB培地に0.8％グリシンを添加した培地に接種し、同様な方法で２日間培養した。上記培養液20mlを遠心し集菌した。菌体はTEG緩衝液（50mMトリス塩酸（pH8.0）−10mM EDTA・2Na−50mMグルコース）にて２回遠心洗浄した。洗浄菌体をTEG緩衝液にて10mlに再懸濁し、更にリゾチーム（シグマ社）溶液（12mg／mlの濃度でTEG緩衝液に溶解）5mlを加え、37℃にて１時間反応させた。10％ドデシル硫酸ナトリウムを2ml加えて溶菌後、TE緩衝液（10mMトリス塩酸（pH8.0）−1mM EDTA・2Na）で飽和したフェノール／クロロホルム（１：１）及び、クロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）にて交互に処理を行った。水層をとり、1mg／mlリボヌクレアーゼＡ（RNaseA，シグマ社）を水層の１／10容量加え、37℃で１時間保温した。この溶液と等容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を加えて処理をした後、水層をオートクレーブ済みのビーカーに移し、１／10容量の3.3M酢酸ナトリウムを加え、２倍量の冷エタノールを加えながら、ガラス棒に巻つけた。巻つけたDNAを75％エタノールにて洗浄後、乾燥させ、0.1倍のSSC緩衝液（0.15M塩化ナトリウム，0.015Mクエン酸ナトリウム（pH7.0））9mlに溶解させた。溶解されたDNA溶液に、１／10容量の3.3M酢酸ナトリウムを入れ、0.54容量のイソプロパノールを加えながら、ガラス棒に巻きつけた。75％エタノールにて洗浄、乾燥後、適当な量のTE緩衝液に溶解した。
次にこの染色体DNA 50μｇに対し、20unitsのSau3AI（宝酒造社製）制限酵素を加え、Ｈ緩衝液（50mMトリス塩酸（pH7.5），10mM塩化マグネシウム，1mMジチオスレイトール，100mM塩化ナトリウム）にて37℃、１分間反応させた。なお、以後に使用する制限酵素は全て宝酒造社製を使用した。反応後、フェノール処理、エーテル抽出により制限酵素を失活させる。次いでこれを1.0％アガロース−100mMトリスほう酸−2mM EDTA・2Na（pH8.3）中で電気泳動を行い、その約２〜10Kbpの大きさのDNA画分をジーンクリーンII（GENECLEAN II，BIO 101社製）を使い抽出した。
(2)プラスミドベクターDNAへの染色体DNA断片の挿入
放線菌のプラスミドベクターpIJ702を保持する放線菌ストレプトマイセス・リビダンスTK21株をチオストレプトン25μｇ／mlを加えた前記のTSB培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ４本に植菌し、28℃、３日間回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。この培養液440mlを集菌し、前記のTEG緩衝液にて遠心洗浄した。洗浄菌体に2mg／mlのリゾチームを含むTEG緩衝液50mlを加え、37℃で30分間放置した。これに50mlの0.2NNaOH−１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を加え０℃で５分間放置した後、50mlの2.55M酢酸カリウム（pH4.8）を加え、０℃で10分間放置後、遠心分離し、上清を得た。上清をフェノール処理後、水層に３／５容量のポリエチレングリコール6000（PEG−6000）−2.5M塩化ナトリウム溶液を加え、０℃で１時間放置後、遠心してDNAを沈殿させた。この沈澱物を4mlの前記のTE緩衝液に溶かした後、エチジウムブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけプラスミドDNAを得た。得られたpIJ702プラスミドを制限酵素BglIIで消化後バクテリア由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）2unitsにて65℃、30分間保温した。次いで、フェノール処理、エーテル抽出によりアルカリフォスファターゼを除いた。フォスファターゼ処理したプラスミドDNA 1.0μｇと(1)で得られた染色体DNA断片５μｇを混合し、DNA結合キット（DNA Ligation kit.宝酒造社製）にて連結を行った。
(3)ストレプトマイセス・リビダンスTK21株の形質転換
ストレプトマイセス・リビダンスTK21株の形質転換は、ホップウッド（Hopwood.D.A.）ら、ジェネティック・マニプレイション・オブ・ストレプトマイセス・ア・ラボラトリー・マニュアル（Genetic Manipulation of Streptomyces a Laboratory Manual）を一部改変して行った。即ち、イースト・麦芽寒天培地（ISP2，ディフコ社製）にて斜面培養したストレプトマイセス・リビダンスTK21株のスラントより、前記のTSB培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ１本に植菌し、28℃、３日間回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。この培養液2mlをTSB培地に0.5％グリシンを添加した培地に植菌して20時間、同様な方法で培養した。この培養液40mlに含まれる菌体を集めた後、0.35M P3培地（11.98％シュークロース，0.4％塩化ナトリウム，0.1％塩化マグネシウム６水和物，0.074％塩化カルシウム２水和物，0.573％Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸緩衝液（TES，Dotite社製，pH7.2））にて遠心洗浄を２回行った。次に、洗浄菌体に、0.35M PWP培地（11.98％シュークロース，0.4％塩化ナトリウム，0.2％塩化マグネシウム６水和物，0.294％塩化カルシウム２水和物，0.573％TES緩衝液（pH7.2））20mlを加え、よく混合後、最終濃度が10mg／mlになるようにリゾチームを加えた。30℃にて60分間保温後、菌糸を除くために滅菌済みの脱脂綿を通した後に遠心した。沈澱を0.35M PWP培地にて２回遠心洗浄してから、プロトプラストが109〜1010個／mlになるように0.35M PWP培地で濃度を調整した。100μｌのプロトプラスト溶液にDNAを連結したプラスミドベクターの溶液を加え、更に、0.35M PWP培地に30％の濃度にPEG−2000を加えた溶液を0.5ml加え、混合した。１分後、5mlの0.35M PWP培地を加え、遠心集菌した。次いで、適当量の0.35M PWP培地にプロトプラストを懸濁し、この100μｌずつを0.35M R3寒天平板培地（11.98％シュークロース，0.81％塩化マグネシウム６水和物，0.05％塩化カリウム，0.22％塩化カルシウム２水和物，0.02％リン酸２水素カリウム，１％グルコース，0.4％ポリペプトン，0.04％イーストエキストラクト（ディフコ社製），0.573％TES緩衝液（pH7.2），2.2％寒天）に塗布し、28℃で一夜培養した。この0.35M R3寒天平板培地に、チオストレプトン250μｇ／mlを含むメラニン生産軟寒天培地（0.2％グルコース，1.0％イーストエキストラクト，0.05％Ｌ−チロシン，0.5％塩化ナトリウム，0.4％寒天）2.5mlを重層した。重層後、28℃で更に１週間培養した。
(4)目的遺伝子の検出方法
(3)の方法により得られたチオストレプト耐性、メラニン非生産株約5000株について、グリコシルトランスフェラーゼ活性の有無を検索した。活性は基質のBE−13973CがED−110に変換される活性として測定した。即ち、形質転換株を、糖付加培地（0.5％グルコース，8.0％デキストリン，0.25％Ｌ−スレオニン，0.3％イーストエキストラクト，0.1％硫酸マグネシウム７水和物，0.2％炭酸カルシウム，0.05％塩化カルシウム，0.0002％硫酸第１鉄，0.00004％塩化第２銅，0.00004％塩化マンガン，0.00004％塩化コバルト，0.00008％硫酸亜鉛，0.00008％ほう酸ナトリウム，0.00024％モリブデン酸アンモニウム，（pH7.2））5mlを含む試験管にチオストレプトンを最終濃度20μｇ／mlになるように加えた培地に植菌し、28℃にて３日間振盪培養機上で（毎分300回転）培養した。培養後、メタノール／テトラヒドロフラン（２：１）に溶かしたBE−13793Cを最終濃度40μｇ／mlになるように加え、更に28℃で２日間同様な方法で培養した。この培養液にメチルエチルケトン5mlを入れて抽出した。メチルエチルケトン層を減圧濃縮し、乾固後、少量のテトラヒドロフランに溶解し、薄層クロマトグラフィー（TLC）を行った。薄層プレートは、シリカゲル（キーゼルゲル60，メルク社製）を用い、展開溶媒はクロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン（３：１：１）にて行った。この場合、Rf値は、BE−137963Cは0.73、ED−110は0.36であるので薄層上で識別できる。このようにして約5000株の形質転換株を調べたところ、そのうちの１株にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する形質転換株を認めた。この形質転換株は後述のようにpNGT206プラスミドを有するので、便宜上ストレプトマイセス・リビダンスTK21（pNGT206）と称する。pNGT206プラスミドがグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。
(5)組換えプラスミドの分離と解析
(4)で得られたストレプトマイセス・リビダンスTK21株（pNGT206）より(2)の方法に従ってpNGT2506プラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドを種々の制限酵素で切断し、制限酵素切断地図を作成した。その結果を第１図に示す。挿入DNAの長さは、4.15Kbpであった。
(6)pNGT206からpNGT207の取得
(5)で得られたpNGT206プラスミドに制限酵素PstIを反応させ、1.0％アガロース中で電気泳動し、7.95KbpのDNA断片をジーンクリーンII（GENECLEAN II）にて抽出した。抽出したDNA断片をDNA Ligation KitにてpIJ702プラスミドベクターに連結し、(3)の方法により、ストレプトマイセス・リビダンスTK21株に形質転換し、チオストレプトン耐性の形質転換株を得た。この形質転換株がグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することを(4)に記載の方法で確認した。上記のようにして得られた株はストレプトマイセス・リビダンスTK21株（pNGT207）株と名づけ、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号FERM P−14365）。この菌株は平成７年５月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、その受託番号はFERM BP−5091である。また、pNGT207プラスミドの制限酵素地図を図１に示した。挿入DNA断片の長さは、2.85Kbpであった。
(7)pNGT207プラスミドよりサブクローンプラスミドの作成及び塩基配列の決定
まずpNGT207プラスミドに制限酵素XhoIを反応させ、1.0％アガロース中で電気泳動し、1.9KbpのDNA断片をジーンクリーンII（GENECLEAN II）にて抽出した。抽出したDNA断片を大腸菌プラスミドベクターpUC119（宝酒造社製）をSalIで消化したものと混合してDNA Ligation kitにて連結した。連結後、この組換えプラスミドで、大腸菌MV1184株を形質転換した。大腸菌MV1184株の形質転換は、以下に示す方法にて行った。まず大腸菌MV1184株を、100mlのSOB培地（２％トリプトン（ディフコ社製），0.5％イーストエキストラクト，10mM塩化ナトリウム，2.5mM塩化カリウム，10mM塩化マグネシウム，10mM硫酸マグネシウム）に植菌し、37℃、一夜振盪培養した。その培養液0.6mlを同様のSOB培地に植菌し、37℃で培養する。培養液の550nmの吸光度が1.1になったら、50mlを遠心集菌する。16mlのTFB溶液（10mM ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（pH6.3），100mM塩化カリウム，45mM塩化マンガン，10mM塩化カルシウム，3mM塩化コバルト）に懸濁し、０℃で10分間放置する。放置後、遠心集菌し、3.8mlのTFB溶液に再懸濁し、更に133μｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で15分間放置する。放置後、133μｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で５分間放置する。この液100μｌに対し前記のDNA連結を行った混合液を加え、０℃で１時間放置する。42℃、45秒間熱処理後、SOB培地400μｌを加え、37℃で１時間振盪培養する。振盪後、100μｌをアンピシリン（100μｇ／ml）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクシド（Ｘ−gal 40μｇ／ml）とイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（23.8μｇ／ml）を含むＸ−Galプレート（1.0％トリプトン，0.25％塩化ナトリウム，1.5％寒天）に塗布し、37℃で一夜静置培養し、アンピシリン耐性の白色コロニーの大腸菌形質転換株を選択した。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し精製した。組換えプラスミドの精製は、(2)の方法に従って行った。但し、大腸菌のプラスミドDNAを精製する場合、形質転換株の培養はアンピシリン100μｇ／mlを含む２倍のYT培地（0.8％バクトトリプトン，0.5％イーストエキストラクト，0.5％塩化ナトリウム（pH7.6））110mlを含む500ml容の三角フラスコ１本を用い、37℃、一夜回転振盪培養機（毎分200回転）上で行った。
図１に示したpNGT207のXhoI断片1.9Kbpはグリコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白をコードするが、この塩基配列を、大腸菌プラスミドベクターpUC118（宝酒造社製）及びpUC119を使って、塩基配列決定キット（BcaBESTTM Dideoxy Sequencing Kit，宝酒造社製）にて決定した。
(8)グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の構造解析について
得られた塩基配列データは、DNAの解析プログラムGCG（Genetic Computer Group社製のプログラム）によって解析した。決定した塩基配列は、1898塩基対からなり、285番目のATGから始まり、1529番目のTGAで終わる1245塩基対のオープン・リーディング・フレームが存在し、414アミノ酸残基からなる蛋白をコードする。
(9)ストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793株へのpNGT207プラスミドの形質転換法
チオストレプトン25μｇ／mlを含むISP4培地に斜面培養したストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793株を、TSB培地110mlを含む500ml容の三角フラスコに植菌し、28℃、３日間回転振盪培養機（毎分180回転）上で培養した。更にその培養液2mlをTSB培地に0.8％のグリシンを添加した培地にて28℃、２日間同上の条件にて培養した。培養液40mlを遠心し集菌後、滅菌した0.5M P3培地（17.1％シュークロース，0.4％塩化ナトリウム，0.1％塩化マグネシウム６水和物，0.074％塩化カルシウム２水和物，0.573％TES緩衝液（pH7.2））にて遠心洗浄を２回行った。次に洗浄菌体に滅菌した0.5M PWP培地（17.1％シュークロース，0.4％塩化ナトリウム，0.2％塩化マグネシウム６水和物，0.294％塩化カルシウム２水和物，0.573％TES緩衝液（pH7.2））20mlを加え、よく混合後、最終濃度が750μｇ／mlになるようにリゾチームを加え、更にアクロモペプチダーゼ（和光純薬（株）製）を500μｇ／mlになるように加えた。37℃、１時間保温後、菌糸を除くために、滅菌済みの脱脂綿を通し、通過後を遠心した。0.5M PWP培地にて２回遠心洗浄後、プロトプラストが109〜1010個／mlになるように0.5M PWP培地で濃度を調整した。100μｌのプロトプラスト溶液に適当量のプラスミドpNGT207を加え、更に、0.5M PWP培地に30％PEG2000を溶かした溶液を0.5ml加えて混合した。１分後、5mlの0.5M PWP培地を加え、遠心洗浄した。適用量の0.5M PWP培地にプロトプラストを懸濁し、100μｌずつを0.5M R3寒天平板培地（17.1％シュークロース，0.81％塩化マグネシウム６水和物，0.05％塩化カリウム，0.22％塩化カルシウム２水和物，0.02％リン酸２水素カリウム，１％グルコース，0.4％ポリペプトン，0.04％イーストエキストラクト，0.573％TES緩衝液（pH7.2），1.0％ゲランガム）に塗布し、37℃に保温した。0.5M R3低融点アガロース培地（0.5M R3平板培地のゲランガムの代わりに低融点アガロース（ナカライ（株）製）0.4％を添加した培地）2.5mlを重層し、28℃、２日間培養した。この0.5M R3平板培地にチオストレプトン250μｇ／mlを含むメラニン生産軟寒天培地を2.5ml重層した。重層後、28℃で更に２週間培養した。
得られた形質転換ストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793（pNGT207）は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号FERM P−14364）。この菌株は平成７年５月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、その受託番号はFERM BP−5090である。
実施例２
ストレプトマイセス・リビダンスTK21（pNGT207）形質転換株によるED−110の製造法
チオストレプトン25μｇ／mlを含むISP2培地に斜面培養したストレプトマイセス・リビダンスTK21（pNGT207）株を、2.0％グルコース、４％可溶性でんぷん、0.3％イーストエキストラクト、0.5％ポリペプトン、1.0％コーングルテンミール、0.2％硫酸アンモニウム、0.2％塩化ナトリウム、0.2％炭酸カルシウム、（pH7.2）からなる培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ１本にて28℃、２日間回転振盪培養機（毎分180回転）上で培養した。更にこの培養液1mlずつを2.0％グルコース、6.0％可溶性でんぷん、0.3％イーストエキストラクト、0.5％ポリペプトン、1.0％ソーラフラワー（日清製粉社製）、0.2％塩化ナトリウム、0.2％硫酸アンモニウム、0.2％炭酸カルシウム、0.01％硫酸第１鉄７水和物（pH7.2）からなる培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ２本に接種し、同上の条件で培養した。２日間培養した時点で、１フラスコあたりBE−13793C 120mgを含むメタノール／テトラヒドロフラン（１：１）混液1mlを添加し、同上条件上で更に７日間培養した。
上記培養液を濾過して得られた菌体を200mlのテトラヒドロフランで２回抽出した。抽出液を合わせて濃縮乾固した後、水200mlを加え、酢酸エチル200mlによる抽出を２回行った。得られた酢酸エチル層を合わせて、濃縮乾固し、残渣をシリカゲル（キーゼルゲル60，メルク社）を用いたカラムクロマトグラフィー（2.0×40cm）に付した。展開溶媒は、クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン（４：１：１）を用い、目的の化合物を含むフラクションを濃縮乾固した。次いで、残渣を少量のメタノールに溶解してから、セファデックスLH20（ファルマシア社）を用いたカラムクロマトグラフィー（1.5×60cm）に付し、メタノールで溶出した。目的の化合物のみを含むフラクションを濃縮乾固することにより、表題化合物12.0mgを得た。
Rf値：0.51（メルク社製  キーゼルゲル60F254，展開溶媒：クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン＝２：１：１）
HPLC：Rt6.18分（カラム：クロマトレックスODS，内径4.6mm，長さ250mm，検出：UV305nm，流速：1.0ml／分，移動層：メタノール／水＝３：１）
FAB−MS（m／z）：519［M］+
1H−NMR(400MHz,DMSO−d6),δ(ppm)：11.0(1H,s),10.9(1H,s),10.3(1H,brs),9.93（1H,brs),8.69(1H,d,J＝7.8Hz),8.51(1H,d,J＝7.8Hz),7.17(2H,t,J＝7.8Hz),7.05(1H,d,J＝9.3Hz),7.01(1H,d,J＝7.8Hz),6.99(1H,d,J＝7.8Hz),5.41(1H,d,J＝5.9Hz),5.34(1H,brs),5.20(1H,d,J＝5.4Hz),4.89(1H,brs),4.02(2H,m),3.74(1H,m),3.63(2H,m,),3.41(1H,m)
実施例３
ストレプトマイセス・リビダンスTK−21（pNGT207）株による式
0003707075.tif 000009
で表される化合物の製造法
チオストレプトン20μｇ／mlを含むISP2斜面寒天培地に培養したストレプトマイセス・リビダンスTK21（pNGT207）株を8.0％MS3600、0.5％グルコース、0.25％Ｌ−スレオニン、0.3％イーストエキストラクト、0.1％硫酸マグネシウム水和物、0.2％炭酸カルシウム、0.0002％硫酸第一鉄、0.00004％塩化第二銅、0.00004％塩化マンガン、0.00004％塩化コバルト、0.0008％硫酸亜鉛、0.00008％ホウ酸ナトリウム、0.00024％モリブデン酸アンモニウム、0.5％３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸からなる培地（滅菌前pH7.2）110mlを含む500ml容の三角フラスコ２本に接種し、28℃で３日間、回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。この培養液2mlずつを同上成分からなる培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ100本に接種し、28℃で回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。３日間培養した時点で１フラスコあたり、参考例１、式［VI］で表される化合物10mgを含むメタノール／テトラヒドロフラン（３：１）混液1mlを添加し、同上条件下で更に11日間培養した。
上記培養液を濾過して得られた菌体を5Lのメタノールで２回抽出した。得られた抽出液を濃縮することによりメタノールを除去し、水1Lを加えて酢酸エチル1.5L、1L、0.5Lで順次抽出した。酢酸エチル層を合わせて濃縮乾固し、残渣をシリカゲル（キーゼルゲル60、メルク社）を用いたカラムクロマトグラフィー（2.5×40cm）に付した。クロロホルム／メタノール（５：１）1.5Lで洗浄後、同溶媒系（３：１）にて溶出した。目的の化合物を含むフラクションを濃縮乾固し、残渣を少量のエタノールに溶解してから、セファデックスLH20（ファルマシア社）を用いたカラムクロマトグラフィー（３×60cm）に付し、エタノールで展開した。目的の化合物を含むフラクションを濃縮乾固することにより、表題の化合物250mgを得た。
Rf値：0.19（メルク社製  キーゼルゲル60F254，展開溶媒；クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン＝３：１：１）
HPLC：Rt20.0分（カラム：クロマトレックスODS，内径4.6mm，長さ250mm，検出：UV305nm，流速：1ml／分，移動層：50％から100％メタノールまで，30分のリニアグラジェント）
FAB−MS（m／z）：534［M＋H］+
1H−NMR：(400MHz,DMSO−d6),δ(ppm)：11.2(1H,s),9.76(2H,brs),8.88（1H,d,J＝8.3Hz),8.80(1H,d,J＝8.8Hz),7.18(1H,d,J＝2.0Hz),6.98（1H,d,J＝2.0Hz),6.83（1H,dd,J＝8.3,2.0Hz),6.80(1H,dd,J＝8.8,2.0Hz),5.98(1H,d,J＝8.8Hz),5.87（1H,t,J＝3.4Hz),5.35(1H,d,J＝4.9Hz),5.13（1H,d,J＝3.9Hz),4.95(1H,d,J＝4.4Hz),4.01(1H,dd,J＝10.7,3.4Hz),3.91(2H,m),3.77(1H,m),3.51(2H,m),3.15(3H,s)
実施例４
ストレプトマイセス・リビダンスTK−21（pNGT207）株による式
0003707075.tif 000010
で表される化合物の製造法
チオストレプトン25μｇ／mlを含むISP2培地に斜面培養したストレプトマイセス・リビダンスTK21（pNGT207）を、2.0％グルコース、４％可溶性でんぷん、0.3％イーストエキストラクト、0.5％ポリペプトン、1.0％コーングルテンミール、0.2％硫酸アンモニウム、0.2％塩化ナトリウム、0.2％炭酸カルシウム（pH7.2）からなる培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ１本にて28℃、２日間回転振盪培養機（毎分180回転）上で培養した。更にこの培養液1mlずつを2.0％グルコース、6.0％でんぷん、0.3％イーストエキストラクト、0.5％ポリペプトン、1.0％ソーヤフラワー（日清製粉社製）、0.2％塩化ナトリウム、0.2％硫酸アンモニウム、0.2％炭酸カルシウム、0.01％硫酸第１鉄７水和物（pH7.2）からなる培地110mlを含む500ml容の三角フラスコ10本に接種し、同様な条件下に２日間培養した時点で１フラスコあたり、参考例２、式［VII］で表される化合物10mgを含むジメチルスルホキシド溶液0.5mlを添加し、同上の条件下で更に７日間培養した。
上記培養液を濾過して得られた菌体を500mlのテトラヒドロフランで抽出した。抽出液を濃縮乾固した後、水200mlを加え、酢酸エチル200mlによる抽出を２回行った。酢酸エチル層を合わせて濃縮乾固し、残渣をシリカゲル（キーゼルゲル60、メルク社）を用いたカラムクロマトグラフィー（2.0×35cm）に付した。
クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン／25％アンモニア水（20：10：10：１）700ml次いで同様の溶媒系（20：40：10：１）250mlで洗浄後、同様の溶媒系（30：60：５：２）にて溶出した。目的の化合物を含むフラクションを濃縮乾固した後、少量のメタノール／テトラヒドロフラン（１：１）溶液に溶解し、セファデックスLH20（ファルマシア社）を用いたカラムクロマトグラフィー（1.5×25cm）に付した。展開溶媒は、メタノール／テトラヒドロフラン（４：１）を用いた。溶出液を濃縮乾固することにより17.6mgの表題化合物の粗精製物を得た。さらにこのうち10mgを2.5mlのテトラヒドロフランに溶解し、メタノール5mlを加えて４℃にて15時間放置することにより、表題の化合物4.3mgを得た。
Rf値：0.28（メルク社製  キーゼルゲル60F254，展開溶媒：クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン＝３：１：１）
HPLC：Rt17.5分（カラム：クロマトレックスODS，内径4.6mm，長さ250mm，検出：UV305nm，流速：1ml／分，移動層：50％から100％メタノールまで，30分のリニアグラジェント）
FAB−MS（m／z）：535［M＋H］+
1H−NMR(400MHz,DMSO−d6),δ(ppm)：10.9(1H,s),10.4(1H,s),10.0(1H,s),8.73(1H,d,J＝7.8Hz),8.55(1H,d,J＝7.8Hz),7.19(2H,t,J＝7.8Hz),7.05(1H,d,J＝9.3Hz),7.02(1H,d,J＝7.8Hz),6.90(1H,d,J＝7.8Hz),5.42（1H,d,J＝5.9Hz),5.34(1H,brs),5.22(1H,brs),4.96(2H,brs),4.91(1H,d,J＝4.9Hz),4.01(2H,m).3.74(1H,m),3.63(2H,m),3.39(1H,m)
実施例５
ストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793（pNGT207）形質転換株によるED−110の製造法
斜面培養した形質転換株ストレプトマイセス・モバラエンシスBA13793（pNGT207）を、0.1％グルコース、2.0％デキストリン、1.0％コーングルテンミール、0.5％魚粉、0.1％酵母エキス、0.1％塩化ナトリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.05％塩化カルシウム、0.0002％硫酸第一鐵、0.00004％塩化第二銅、0.00004％塩化マンガン、0.00004％塩化コバルト、0.00008％硫酸亜鉛、0.00008％ホウ酸ナトリウム、0.00024％モリブデン酸アンモニウム、0.5％３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸からなる培地（滅菌前pH7.2）110mlを含む500ml容の三角フラスコ１本に接種し、28℃で３日間、回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。
この培養液2mlずつを、0.2％グルコース、4.0％デキストリン、1.5％コーングルテンミール、0.15％酵母エキス、3.0％魚粉、0.1％塩化ナトリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.05％塩化カルシウム、0.0002％硫酸第一鉄、0.00004％塩化第二銅、0.00004％塩化マンガン、0.00004％塩化コバルト、0.00008％硫酸亜鉛、0.00008％ホウ酸ナトリウム、0.00024％モリブデン酸アンモニウム、0.5％３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸からなる培地（滅菌前pH7.2）110mlを含む500ml容の三角フラスコ３本に接種し、28℃で回転振盪機（毎分180回転）上で17日間培養した。
上記培養液を濾過して得られた菌体を500mlのテトラヒドロフランで２回抽出した。抽出液を合わせて濃縮乾固した後、水300mlを加え、酢酸エチル300mlによる抽出を２回行った。得られた酢酸エチル層を合わせて濃縮乾固し、残渣をシリカゲル（キーゼルゲル60、メルク社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（2.0×40cm）に付した。展開溶媒は、クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン（４：１：１）を用い、目的の化合物を含むフラクションを濃縮乾固した。次いで残渣を少量のメタノール／テトラヒドロフラン混液に溶解し、セファデックスLH20（ファルマシア社）を用いたカラムクロマトグラフィー（φ1.5×60cm）に付した。
展開溶媒は、メタノール／テトラヒドロフラン（５：１）を用いた。目的の化合物ED−110を含むフラクションを濃縮乾固後、エタノールを展開溶媒とする、セファデックスLH20（ファルマシア社）を用いたカラムクロマトグラフィー（1.5×60cm）に付した。溶出液を濃縮乾固することにより、ED−110 68.3mgを得た。なお、上記シリカゲルクロマトグラフィーのBE−13793Cを含むフラクションを濃縮乾固することにより、287.5mgのBE−13793Cを得た。こうして得られたED−110の物性は実施例２におけるストレプトマイセス・リビダンスTK−21（pNGT207）株により得られたED−110の物性データと同一である。
参考例
式
0003707075.tif 000011
で表される化合物の製造法
a)エチルマグネシウムブロマイド（EtMgBr）のテトラヒドロフラン溶液（0.93モル，6.9ml）を45℃に加温し、これに６−メトキシインドール（949mg）のトルエン溶液（7.8ml）を添加した。40分後に2,3−ジブロモ−Ｎ−メチルマレイミド（388mg）のトルエン溶液（7.8ml）を40分間を要して滴下により添加し、次いで２時間還流した。反応液を氷冷し、20％クエン酸水溶液を添加後、酢酸エチルで抽出し、有機溶媒層を減圧下に濃縮し、残留物をセファデックスLH−20のカラムクロマトグラフィーを行って、メタノールで展開することにより、2,3−ビス−（６−メトキシ-1H−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミド415mgを得た（収率72％）。
b)参考例１のa)において得られた2,3−ビス−（６−メトキシ−1H−インドール−３−イル）−Ｎ−メチルマレイミド410mgと、2,3−ジクロロ−5,6−ジシアノ−1,4−ベンゾキノン（DDQ）255mgと、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を乾燥ベンゼン150mlに添加し、45分間アルゴン気流下で還流した。反応液を冷却後、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで飽和食塩水で洗浄した後、減圧下に濃縮した。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン＝30：１：１）に付し、次いでクロロホルム／メタノール（10：１）で展開することにより、トリメチルアルチリアフラビンＣ 250mgを得た（収率62％）。
c)参考例１のb)において得られたトリメチルアルチリアフラビンＣ 250mgと、ピリジン塩酸塩2.2gとの混合物を封管中180℃で90分間加熱した。反応物を冷却し、N,N−ジメチルホルムアミドと1N塩酸とで希釈後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、次いで飽和食塩水で洗浄後、減圧下に濃縮乾固し、残留物をセファデックスLH−20のクロマトグラフィー用カラムにかけ、メタノールで展開することにより、表題の式［VI］で表される化合物（６−メチルアルチリアフラビンＣ）131mgを得た（収率56％）。
FAB−MS（m／z）：372［M＋H］+
1H−NMR(300MHz,DMSO−d6),δ(ppm)：11.35(2H,s),9.73(2H,s),8.70(2H,d,J＝8.6Hz),7.04(2H,d,J＝2.0Hz),6.78(2H,dd,J＝8.6,2.0Hz),3.14(3H,s)
参考例２
式
0003707075.tif 000012
で表される化合物の製造法
BE−13793C 0.52gを抱水ヒドラジン（和光純薬）3mlに溶解し、室温に１時間撹拌した。濃塩酸を溶液が酸性になるまで加え、生じた沈殿を濾取し、精製水で洗浄後、減圧下に乾燥することにより、表題の式［VII］で表される化合物0.53gを得た（収率98％）。
Rf値：0.63（メルク社製  キーゼルゲル60F254，展開溶媒：クロロホルム／メタノール／テトラヒドロフラン＝３：１：１）
HPLC；19.1分（カラム：クロマトレックスODS，内径4.6mm，長さ250mm，検出：UV305nm，流速：1ml／分，移動相：50％から100％メタノールまで，30分間のリニアグラジエント）
FAB−MS（m／z）：373［M＋H］+
1H−NMR(400MHz,DMSO−d6),δ(ppm)：11.6(2H,s),10.2(2H,s),8.44(2H,d,J＝7.8Hz),7.14(2H,t,J＝7.8Hz),6.98(2H,d,J＝7.8Hz),4.90(2H,s)
産業上の利用可能性
本発明により、インドロピロロカルバゾール誘導体のグリコシレーションが簡便かつ経済的となった。
［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：414
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列：
0003707075.tif 000013
0003707075.tif 000014
0003707075.tif 000015
配列番号：２
配列の長さ：1245
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DAN
起源生物名：サッカロスリスクエアロコロニゲネス（Saccharothrix aerocolonigenes）
株名：ATCC 39243
0003707075.tif 000016
0003707075.tif 000017
0003707075.tif 000018
【図１】
0003707075.tif 000022