(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３−オキソ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンの１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンへの立体選択的還元のためのプロセスであって、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３−オキソ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンを、培地中、培地および緩衝液中、培地および溶媒中、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍに添加する工程と、得られた混合物をインキュベートする工程と、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンを単離する工程とを包含する、プロセス。
【請求項２】
前記微生物が、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０または真菌単離体Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７である、請求項１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンは、１９９５年３月３０日発行のＷＯ  ９５／０８５３２にコレステロール低下剤として開示されている。米国特許第５，６１８，７０７号は、このアゼチジノンの調製に用いられるケト中間体（４−（４−フルオロベンゾイル）酪酸またはそのフェニルオキサゾリジノン結合体）を微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓを用いて立体選択的に微生物還元して、対応のヒドロキシ中間体にすることを開示する。
【０００２】
（発明の要旨）
本発明は、カルボニル基の微生物還元のプロセスに関し、これは、培地中、培地および緩衝液中、培地および溶媒中、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中の微生物（環境中の供給源および菌株保存機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる）の使用を包含し、これにケトン化合物を添加して、所望の立体化学のヒドロキシ基を有する化合物が形成、蓄積および単離され得る。
【０００３】
特に、本発明は、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３−オキソ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンから１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンへの立体選択的還元のためのプロセスに関し、これは１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３−オキソ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンを、培地中、培地および緩衝液中、培地および溶媒中、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中の微生物に添加する工程と、得られた混合物をインキュベートする工程と、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンを単離する工程とを包含する。
【０００４】
以下の属からなる群から選択される微生物が本発明の還元において有用であることが見いだされている：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ、Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、ＮｅｕｒｏｓｐｏｒａおよびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ。上記の属の以下の種が好ましい：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ、Ｄｏｒａｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｅｍｏｎｉｔｉｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓおよびｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびｕｖａｒｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｌｉｇｎｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉおよびｓｐｅｃｉｅｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａおよびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、ｆａｓｃｉａｎｓ、ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓおよびｓｐｅｃｉｅｓ。
【０００５】
特に、本発明は、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３−オキソ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン（下記の式ＩＩ）のカルボニル基の微生物還元のためのプロセスに関し、これは上記化合物を培地中、培地および緩衝液中、培地および溶媒中、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中の微生物に添加する工程であって、特にここで、微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０または真菌単離体Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７である工程と、得られた混合物をインキュベートする工程と、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン（以下の式Ｉ）を単離する工程とを包含する。
【０００６】
微生物および真菌単離体の生存培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９の収集物に寄託されており、ここで微生物には受託番号ＡＴＣＣ  ２０２２１０が付与され、真菌単離体には受託番号ＡＴＣＣ  ７４４８７が付与されている。寄託された培養物が、培養物が寄託された日から３０年間、または寄託された培養物に対する最後の要請後５年間、または本出願をもとにして発行された特許の存続期間のうちの長い方の間に紛失、破壊または生存しなくなったならば、培養物は、通知によって、本出願の出願人または譲受人によって差し替えられる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０およびＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７は、本出願の係属中、米国特許商標庁長官によって、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１２２の下にその権利を有すると認められる者に入手可能であり、そして本出願に基づく特許が一旦許可されたら、制限無く、公衆に入手可能となる。微生物および真菌単離体の使用は、米国特許法に依存する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、微生物を用いて以下の立体特異的還元を行う方法に関する。
【０００８】
【化１】
0003679715.tif 000002
微生物還元は、上記式ＩＩのケトン物質を、微生物を含む、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒との混合物に添加することによって行われる。インキュベーションは、約２０℃と約４０℃との間の範囲の温度、好ましくは３０℃で行われ得、他方、反応の初期ｐＨ値は約５．０と約９．０との間の範囲、好ましくは７．０に調節される。
【０００９】
反応中の式ＩＩの初期濃度は、約０．５ｇ／ｌと約１０．０ｇ／ｌとの間で変化し得、好ましくは２〜４．０ｇ／ｌである。
【００１０】
適切な発酵培地、緩衝液および溶媒は当業者に公知である。発酵培地は、典型的には、炭素源および窒素源またはそれらの混合物を含み、当該分野で公知の酵母抽出物、栄養ブロス、デキストロース（セレロース）、ジャガイモデキストリン、大豆粉、ペプトンおよび他の成分のような成分を用いる。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ７で０．１Ｍ）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ビス−トリス（ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン）、ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジン−ジエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）およびＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）緩衝液（例えば、ｐＨで７０．１Ｍ）である。典型的な溶媒は、アセトニトリル、アセトン、エチルエーテル、イソプロパノール、ｔ−ブタノール、イソアミルアルコール、ｐ−ジオキサン、イソプロピルエーテル、ジメチルスルホキシド、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、トルエン、テトラヒドロフランおよびＣＨ2Ｃｌ2である。好ましくは、微生物還元は発酵培地中で行われる。
【００１１】
キラル還元反応の持続時間は、約１８時間から約９６時間まで変化し得、好ましくは約４８〜７２時間である。
【００１２】
還元反応の終了時、式Ｉのヒドロキシ化合物は、周知の方法で、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）のような有機溶媒を用いて抽出され得る。樹脂への吸着、クロマトグラフィー、および当該分野で公知の他の物理的方法もまた、式Ｉのヒドロキシ化合物を抽出するために用いられ得る。
【００１３】
多数の微生物を研究して、式ＩＩのケトン化合物を還元するか否かを決定した。このような微生物の多くは、所望の特異性または生産性を提供しなかった。
【００１４】
以下の実施例は、本発明の還元における微生物の評価、ならびに式Ｉのヒドロキシ化合物のミリグラム量の調製を例証する。
【００１５】
（実施例１）
式Ｉの化合物の生産のための合成前駆体として使用する式ＩＩの化合物の立体選択的微生物還元の同定のための一般的方法を以下、説明する。
【００１６】
酵母、糸状菌、および細菌のシード培養物を、２５ｍｌまたは５０ｍｌのＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％デキストロース；ｐＨ５．５）、ＳＩＭ６（３．５％大豆粉、５％ジャガイモデキストリン、０．５％セレロース、２ｍｇ／ｍｌ塩化コバルト、０．５％炭酸カルシウム；ｐＨ６．０）およびＮＹＣ（０．８％栄養ブロス、２％酵母抽出物、１．１％セレロース；ｐＨ７．０）培地を各々入れた１２５ｍｌまたは３００ｍｌのフラスコを３０℃で７２時間、攪拌（１７５〜２５０ｒｐｍ）し、その後、フラスコの発酵物中に接種（４％ｖ／ｖ）して（酵母および糸状菌については２５ｍｌＹＰＤ／１２５ｍｌフラスコ、または細菌については２５ｍｌＮＹＣ／１２５ｍｌフラスコ）、これを攪拌（２５０ｒｐｍ）しながら３０℃でインキュベートして、増殖させた。全ての発酵物中で、培地のｐＨは接種の前に調節したが、培養物の増殖およびケトン還元の間は制御しなかった。還元は、増殖の２４時間後、エタノール中に溶解した式ＩＩのケトン化合物（２５ｍｇ／ｍｌ）を０．５〜１．０ｇ／ｌ、直接培養物に添加することによって開始させた。基質との４８時間のインキュベーションの後に、ＥｔＯＡｃ（１：１）で抽出した発酵ブロスの試料を逆相ＨＰＬＣで分析した。一定の還元活性を示し、この手順を用いて発酵を繰り返した後も、顕著な基質の分解を示さなかった培養物を、更にキラルＨＰＬＣで分析して、生成物のアルコールの立体配置を決定した。式ＩＩのケトンを、１．０ｇ／ｌで還元して、高エナンチオマー過剰率で式Ｉ（Ｓエナンチオマー）のヒドロキシ化合物を与えることができる培養物を表１にまとめる。
【００１７】
（表１．１．０／ｌで化合物ＩＩを化合物Ｉに選択的に還元できる微生物）
【００１８】
【表１】
0003679715.tif 000003
（実施例２）
実施例１で用いたものよりも高い濃度で化合物ＩＩを還元できるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０または真菌単離体Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７による式ＩＩのケトン化合物の還元についての発酵パラメーターの研究のための一般的方法を以下に説明する。
【００１９】
シード培養物の増殖およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０およびＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７を利用した生物変換を、２５ｍｌのＮＹＣ、ＹＰＤ、ＳＩＭ６またはＴＧＰ（１％Ｔａｓｔｏｎｅ１５４、２％グリセロール、１％リン酸水素二カリウム、ｐＨ７．０）培地を入れた１２５ｍｌフラスコ中で、３０℃で２４〜７２時間攪拌（２５０ｒｐｍ）し、その後、２５ｍｌの生物変換培地を入れた１２５ｍｌフラスコ中に接種（４％ｖ／ｖ）して、表２および３にまとめたようにして、行った。全ての発酵物中で、培地のｐＨは接種の前に調節したが、培養物の増殖およびケトン還元の間は制御しなかった。還元は、増殖の２４〜４８時間後、エタノールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した式ＩＩのケトン化合物（２５〜５０ｍｇ／ｍｌ）を１〜１０ｇ／ｌ、直接培養物に添加することによって開始させた。細胞濃縮物を用いた生物変換においては、増殖の２４〜４８時間後に培養物を遠心分離（８０００ｒｐｍ×１０分）で単離し、そして記載したように、ケトンの添加の前に新鮮な培地に再懸濁した。基質との４８〜９６時間のインキュベーション後に、ＥｔＯＡｃ（１：１）またはＴＢＭＥ（１：１）で抽出した発酵ブロスの試料を逆相ＨＰＬＣで分析して、収率を評価した。キラルＨＰＬＣによる分析を行って、Ｓエナンチオマー生成物（式Ｉの化合物）が高エナンチオマー過剰で選択的に合成されることを確認した。
【００２０】
（表２．Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０の生産性に対する生物変換パラメーターの影響）
【００２１】
【表２】
0003679715.tif 000004
エタノールに溶解した式ＩＩのケトン化合物（２５〜５０ｍｇ／ｍｌ）は、増殖の２４時間後に、記載したように１〜１０ｇ／ｌで添加した。
【００２２】
（表３．Ｇ．ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７の生産性に対する生物変換パラメーターの影響）
【００２３】
【表３】
0003679715.tif 000005
ＤＭＳＯに溶解した式ＩＩのケトン化合物（２５〜５０ｍｇ／ｍｌ）は、増殖の２４〜４８時間後に、２〜１０ｇ／ｌで添加した。ＴＮＣ培地：１％Ｔａｓｔｏｎｅ１５４、２％ＮＺ−アミン、３％セレロース、ｐＨ５．５。ＴＮ２Ｃ培地：６％セレロースを含むＴＮＣ培地。
【００２４】
（実施例３）
式ＩＩのケトン化合物の立体選択的還元由来の式Ｉのヒドロキシ化合物のミリグラム量を、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０２２１０および真菌単離体Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７４４８７を用いて、表２および３にまとめた条件を使用して複数のフラスコ発酵で調製した。インキュベーションの７２〜９６時間後、各培養物の発酵ブロスをプールし、その後、遠心分離して、生成物の大部分を含む細胞と残余の基質とを単離した。細胞ペレットをＴＢＭＥで抽出した（１０〜２０容量／湿潤重量）。無水ＭｇＳＯ4をＴＢＭＥ抽出物に添加して残余の水を除去し、この抽出物を濾過し、そして濾液を蒸発によって濃縮した。
【００２５】
抽出物濃縮物を、１０−２０ＧＦシリカプレート（２０ｃｍ×２０ｃｍ×１０００ミクロン）を用いた分取薄層クロマトグラフィーによる精製に供し、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（５０：５０）の溶液で展開した。所望の生成物と共に移動する物質を各シリカプレートから掻き取り、プールし、そしてＴＢＭＥでシリカから溶離し、これを次に蒸発乾固した。４５０〜６００ｍｇの式ＩＩのケトン化合物由来の約１７０ｍｇの生成物を各培養物の生物変換から単離した。単離された物質が所望の式Ｉのヒドロキシ化合物であることを、逆相およびキラルＨＰＬＣ、ＮＭＲ、および質量スペクトル分析によって確認した。