(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞を、培地中培養上清換算で１〜５０％（ｖ／ｖ）のノギン蛋白質の存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、これを分散後、培地中１０〜４０ng／mLの繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２及び培地中１〜１０nMのソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養してニューロスフェアを形成する神経幹細胞に誘導し、次いでこれを分化させることを特徴とする運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンの製造法。
【請求項２】
胚様体の浮遊培養期間が７〜９日間である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
得られるニューロンが、ほとんど運動ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンである請求項１又は２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から選択的に神経幹細胞、さらには選択的かつ効率的に運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳類の中枢神経系において神経幹細胞は個体の一生を通して存在し続け、多様なニューロンやグリアを生産することによって、中枢神経系の発生及び維持に寄与していると考えられている。最近、ヒトを含めた哺乳動物の脳より神経幹細胞を分離・培養する技術が開発され、様々な神経変性疾患や損傷に対する細胞移植治療への応用が期待されている。しかしながら、発生過程において、様々な内的及び外的因子による制御によって幹細胞から産生され分化する様々なタイプのニューロン、特に胚発生初期に特異的に産生される運動ニューロンなどを、in vitroで培養増幅させた神経幹細胞から生産する試みは確たる成果を上げていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、個体の全ての細胞に分化する能力を持つＥＳ細胞から発生初期の性質を保持する神経幹細胞への効率的な分化誘導手段、及びそこから運動ニューロン等の特定のニューロンを選択的に生産する技術を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者はＥＳ細胞から胚様体の形成、神経幹細胞への分化誘導及びニューロンへの分化誘導の条件について種々検討した結果、ＥＳ細胞から胚様体の形成にはＮｏｇｇｉｎ（ノギン）蛋白質の添加が特に優れており、胚様体中に出現する神経幹細胞の増幅には繊維芽細胞増殖因子(fibroblast growth factor : FGF)に加えてソニックヘッジホッグ蛋白質を添加した培地の利用が極めて効率的であり、さらにこのようにして誘導された神経幹細胞を分化させれば運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンが選択的かつ効率良く生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、胚性幹細胞を、培地中培養上清換算で１〜５０％（ｖ／ｖ）のノギン蛋白質の存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、これを分散後、培地中１０〜４０ng／mLの繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２及び培地中１〜１０nMのソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養してニューロスフェアを形成する神経幹細胞に誘導し、次いでこれを分化させることを特徴とする運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンの製造法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるＥＳ細胞としては、既に培養細胞として確立されているＥＳ細胞を使用することができる。例えば、マウス、ハムスター、ブタ、ヒト等のＥＳ細胞株を使用することができる。具体例としては、１２９／Ｏｌａ系マウス由来のＥＳ細胞、ＥＢ３、Ｅ１４ｔｇ２等が挙げられる。当該ＥＳ細胞は、血清を含むＧＭＥＭ培地等にて培養継代しておくのが好ましい。
【０００９】
ＥＳ細胞から胚様体の形成には、ノギン蛋白質を添加した培地で浮遊培養すると、ＥＳ細胞から神経幹細胞への分化誘導効率が向上する。ノギン蛋白質は、例えばアメリカツメガエルノギンを使用することができるが、アメリカツメガエルノギンの全長ｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞に導入し、一過性にノギン蛋白質を発現させた培養上清をそのまま使用してもよい。ノギン蛋白質の培地中の濃度は、この培養上清換算で１〜５０％（v/v）程度が好ましい。ＥＳ細胞の浮遊培養は、例えばＥＳ細胞を血清含有α−ＭＥＭ培地にて１×１０5 cells／mL程度の濃度で４〜８日間行えばよい。ここで血清としてはウシ血清、ブタ血清などが挙げられ、その濃度は５〜１５％、特に８〜１２％が好ましい。またα−ＭＥＭ培地には２−メルカプトエタノールを０．０１〜０．５mM、特に０．０５〜０．２mMとなるように添加するのが好ましい。培養は５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましい。
なお、ノギン蛋白質の添加は胚様体形成時、すなわち培養１〜６日目に添加しておくのが特に好ましい。
【００１０】
前記のように形成された胚様体を経由してＥＳ細胞から得られた神経幹細胞を増幅するには、繊維芽細胞増殖因子に加えてソニックヘッジホッグ蛋白質を含有する神経幹細胞増殖培地で浮遊培養する。ソニックヘッジホッグ蛋白質の添加により、神経幹細胞の運動ニューロン前駆細胞への分化誘導効率及び増殖効率が向上し、その後の分化培養により運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンへ実際に分化する。
【００１１】
繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としては、ＦＧＦ−２が好ましい。培地中のＦＧＦ−２の含有量は１０〜４０ng／mLが好ましい。また、ソニックヘッジホッグ蛋白質としては、例えばマウスソニックヘッジホッグ蛋白質が好ましい。培地中のソニックヘッジホッグ蛋白質の含有量は１〜１０nMが好ましい。
【００１２】
培地としては、上記成分の他にグルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレン、ヘパリン等を添加したＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を用いるのが特に好ましい。培養は５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましい。培養時間は７〜９日間が好ましい。
【００１３】
上記の浮遊培養により、ニューロスフェア（neurosphere）と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊が形成する。
【００１４】
得られたニューロスフェアは、神経幹細胞のみに由来するものであり、前記培養法による分化誘導効率は極めて高いことがわかる。
【００１５】
このようにして得られた神経幹細胞を、通常の分化培地で培養すれば、運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンのみが分化誘導される。ここで分化誘導培地としては、グルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、（すなわち、神経幹細胞増殖用培地からＦＧＦとヘパリンを除いた培地）を用いるのが好ましい。このとき、ソニックヘッジホッグ蛋白質は存在しても、なくてもよい。培養は５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で５〜７日間行うのが好ましい。
【００１６】
従来のＥＳ細胞から分化誘導された神経系細胞は、ニューロンだけでなく、多量のグリア細胞などを含んでおり、その利用価値は極めて制限されていた。これに対し、本発明により得られたニューロンは、ほとんど運動ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンのみである。
【００１７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１８】
Ａ．材料及び方法
（１）マウスＥＳ細胞の培養継代と胚様体の形成
１２９／Ｏｌａ系マウス由来のＥＳ細胞、Ｅ１４ｔｇ２ａ及びそのＯｃｔ３／４遺伝子座にブラストシジン耐性遺伝子を挿入し未分化ＥＳ細胞を選択できるＥＢ３は、１０％仔牛胎児血清、非必須アミノ酸、１mMピルビン酸ナトリウム、０．１mM２−メルカプトエタノール及び１０００Ｕ／mL白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor、LIF）を含むGlasgow minimum essential medium(GMEM)培地にて定法（５％ＣＯ2，３７℃、以下、単に「培養」というときは、この条件）によって培養継代した。
ＥＳ細胞からの胚様体（Embryoid body：EB）の形成は以下のようにして行った。ＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシン−１mM  ＥＤＴＡ処理及びその停止を行い、ピペッティングによって分散させた細胞を、１０％仔牛胎児血清及び０．１mM２−メルカプトエタノールを含むα−ＭＥＭ培地で満たしたバクテリア用培養皿中に１×１０5 cells／mLの濃度で播種し、ノギン蛋白質（アフリカツメガエルNogginの全長cDNAをCOS7細胞に導入し、一過性に発現させた培養上清）存在下及び非存在下で４〜８日間浮遊培養してＥＢを形成させた。
【００１９】
（２）ＥＢからの神経幹細胞の選択的培養による分離
上記のようにして形成されたＥＢは培養液とともに遠心チューブに移し、１０分間静置することによってチューブ底に集め上清を除去しＰＢＳ中に再懸濁し、再び１０分間静置する。上清を除去した後、ＥＢは０．２５％トリプシン−１mMＥＤＴＡ溶液中に再懸濁し３７℃で５分間インキュベートし、１０％仔牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で蛋白質分解反応を停止させた後、ピペットで細胞を分散させた。分散させた細胞はα−ＭＥＭ培地にて遠心操作により２回洗浄し、グルコース（０．６％）、グルタミン（２mM）、インスリン（２５μｇ／mL）、トランスフェリン（１００μｇ／mL）、プロジェステロン（２０nM）、プトレシン（６０μＭ）、塩化セレン（３０nM）、ＦＧＦ−２（２０ng／mL）、ヘパリン（２μｇ／mL）を添加したDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）：Ｆ１２（１：１）培地中（神経幹細胞増殖培地）に、あるいはそこへさらにマウスソニックヘッジホッグ蛋白質mouse sonic hedgehog1(5nM)を加えた培地に５×１０4 cells/mLの濃度で播種し、７〜９日間浮遊培養することによって、ニューロスフェア（neurosphere）と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊を形成させた（neurosphere法）。これらニューロスフェアは上記の神経幹細胞増殖培地よりＦＧＦ−２とヘパリンを除いた分化培地で遠心洗浄した後、そのままあるいはピペッティングにより分散させた細胞を、分化培地で満たしたポリ−Ｌ−オルニチン（poly-L-ornithin）でコートした培養皿に播種し、ソニックヘッジホッグ蛋白質（５nM）存在下あるいは非存在下で５〜７日間培養することによって分化させた。また上記のようにして得たニューロスフェアを再び単一細胞に分散し、神経幹細胞増殖培地で７日間継代培養し２次ニューロスフェアを形成させ、これらも上記と同様に分化させる。
【００２０】
（３）免疫染色による分化ニューロン及びグリア細胞の同定
上記のようにして分化させたニューロンやグリア細胞は蛍光抗体を使った免疫染色の定法によって同定した。運動ニューロンはマウス抗Ｉｓｌ−１モノクローナル抗体、ヤギ抗ＣｈＡＴポリクローナル抗体及びマウス抗β−III tubulinモノクローナル抗体を使って、ＧＡＢＡ作動性ニューロンはウサギ抗ＧＡＤ６７ポリクローナル抗体を使って同定した。グリア細胞は、アストロサイトをウサギ抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体で、オリゴデンドロサイトをマウス抗０４モノクローナル抗体を使って同定した。
【００２１】
Ｂ．実験結果
（１）ＥＢからの神経幹細胞の選択的培養法による分離精製
まずＥＢの形成によるＥＳ細胞の初期分化において、神経幹細胞が培養のどの時期に出現してくるのかを検討した。具体的には、培養４〜８日のＥＢを単一細胞に分散し、神経幹細胞培地にて７日間培養し、ニューロスフェアを形成させた。これらニューロスフェアは分化培地に移し分化させ、その分化能を検定するとともに、継代することによって自己複製能も検定した。
【００２２】
図１には、浮遊培養によるＥＢの形成開始後６及び８日後、ＥＢを単一細胞に分散し、神経幹細胞の選択的培養（neurosphere法）を行った結果を示した。なお得られたニューロスフェアの数はＥＢ中に出現した神経幹細胞の数とした。その結果、本方法で同定される（ニューロスフェアを形成できる）神経幹細胞は、ＥＢの培養４日目まではほとんど検出できず、培養６日目で全細胞中０．２５％、８日目で１．１％と次第に増加していくことが分かった。
【００２３】
図１に示したように６日目のＥＢから得たニューロスフェアを、分化条件で７日間培養し、その分化能を免疫染色によって検定した。その結果を図２〜４に示す。ニューロンのマーカーであるβ−III−tubulinとグリア細胞のマーカーであるＧＦＡＰ及び０４の抗体による３重免疫染色を行ったところ、全てのニューロスフェアがほぼβ−III−tubulinを発現するニューロンのみで構成されており、グリア細胞は検出されなかった（図２）。そして、それらのニューロンは少なくともＩｓｌ−１及びＣｈＡＴを発現する運動ニューロン（図３の丸い部分及び繊維状部分）とＧＡＤ６７を発現するＧＡＢＡ作動性ニューロン（図４の繊維状部分）を含んでいた。
【００２４】
また、得られたニューロスフェアを、継代培養することによって２次ニューロスフェアを得、それらを分化条件で７日間培養し、分化能を免疫染色によって検定した。その結果、全てのニューロスフェアはグリア細胞を含んでおり（図５）、そのうち８４．２％はニューロンとグリア細胞の両方を含んでいた（図６）。図５は、β−III−tubulin（細く明確な繊維状）、ＧＦＡＰ（β−III−tubulinのまわりの部分）及び０４（GFAPのさらに外側の部分）の３重免疫染色結果である。
【００２５】
その結果、これらのneurosphereを単一細胞に分散、継代培養し新たなニューロスフェアを形成させ分化させると、それらのクローンの多くはニューロンとグリア細胞の両方を含むようになり、実際の中枢神経系の発生においてグリア細胞が後期に出現するように、ＥＢから分離した神経幹細胞も継代培養によって多分化能を示すようになることが分かった。
【００２６】
（２）ノギン蛋白質による神経幹細胞の分化誘導の効率化
ノギン蛋白質をＥＢ形成時（６日間）に添加することによって神経幹細胞の分化誘導の効率化を試みた。ノギンは、アフリカツメガエルノギンの全長ｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターに組み込みＣＯＳ７細胞に導入し、一過性に発現させた培養上清をノギン溶液とし、発現ベクターのみを導入したＣＯＳ７細胞の培養上清を対照とした。図７に示すように、ノギン培養上清の量に依存してＥＢ中で分化誘導されるニューロスフェアを形成する神経幹細胞の数は増加し、１／１０倍容でピークに達した。
【００２７】
（３）ソニックヘッジホッグ蛋白質による運動ニューロン分化の効率化
ＥＢ由来神経幹細胞からの運動ニューロン産生及び分化の効率化をめざし、ソニックヘッジホッグ蛋白質を神経幹細胞増殖時、すなわちＥＢ由来の初代培養ニューロスフェアの形成時に添加し、その効果を検討した。運動ニューロンは、ニューロスフェアを単一細胞に分散し、分化培地で５日間培養後、Ｉｓｌ−１及びβ−III−tubulinの二重免疫染色を行うことによって同定し、その数を定量化した。その結果図８に示したように、５nMのソニックヘッジホッグによって運動ニューロンの産生は倍増した。なお、神経分化時に分化培地にソニックヘッジホッグを加えてもその効果は認められなかった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明方法によればＥＳ細胞より少なくとも運動ニューロンとＧＡＢＡ作動性ニューロンがシステマチックかつ効率的に生産できることが分かった。選択的にニューロンが得られれば筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病、そしてアルツハイマー病などの移植治療に適用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】胚様体の培養日数とニューロスフェア形成との関係を示す図である。
【図２】ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図である。染色部はβ−III−tubulinを発現し、ニューロンであることを示す。
【図３】ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図である。
【図４】ニューロスフェアを免疫染色した結果を示す図である。
【図５】ニューロスフェア継代培養後の免疫染色結果を示す図である。
【図６】ニューロスフェア継代培養後のニューロンとグリア細胞の比率を示す図である。
【図７】ノギン蛋白質の添加効果を示す図である。
【図８】ソニックヘッジホッグ蛋白質の添加効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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