(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、LYS2遺伝子プロモーター領域へのδ配列の挿入によりLYS2遺伝子が発現しない酵母細胞であり、かつ変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第４位Lys、第５位Gly、第26位Phe、第29位Gly、第46位Ser、第47位Gly、第66位Leu、第90位Asn、第91位Asp、第92位Asp、第94位Leu、第99位Gly、第103位Ile、第107位Glyまたは第115位Asnのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Aであり、野性型酵母に比較して３倍以上のSPT表現型変化を有するヒストンH2A変異酵母細胞。
【請求項２】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第66位Leu、第73位Asp、第74位Asn、第86位Leu、第93位Glu、第94位Leu、第103位Ile、第112位Ile、第113位Hisまたは第116位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞。
【請求項３】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第93位Glu、第112位Ile、第113位His、第115位Asn、第116位Leuまたは第117位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞。
【請求項４】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第93位Gluまたは第94位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞。
【請求項５】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、LYS2遺伝子プロモーター領域へのδ配列の挿入によりLYS2遺伝子が発現しない酵母細胞であり、かつ野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第１位Ser、第３位Lys、第５位Glu、第６位Lys、第７位Lys、第８位Pro、第10位Ser、第90位Ser、第92位Ile、第93位Ser、第105位Leu、第106位Pro、第107位Gly、第108位Glu、第111位Lys、第114位Val、第117位Gly、第118位Thr、第121位Val、第122位Thrまたは第125位Serのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Bであり、野性型酵母に比較して３倍以上のSPT表現型変化を有するヒストンH2B変異酵母細胞。
【請求項６】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第123位LysがAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Bを発現するポリヌクレオチド構築物を保有することを特徴とするヒストンH2B変異酵母細胞。
【請求項７】
野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第４位Lys、第５位Gly、第26位Phe、第29位Gly、第46位Ser、第47位Gly、第66位Leu、第90位Asn、第91位Asp、第92位Asp、第94位Leu、第99位Gly、第103位Ile、第107位Glyまたは第115位Asnのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2A。
【請求項８】
野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第66位Leu、第73位Asp、第74位Asn、第86位Leu、第93位Glu、第94位Leu、第103位Ile、第112位Ile、第113位Hisまたは第116位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2A。
【請求項９】
野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第93位Glu、第112位Ile、第113位His、第115位Asn、第116位Leuまたは第117位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2A。
【請求項１０】
野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第93位Gluまたは第94位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2A。
【請求項１１】
野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第１位Ser、第５位Glu、第６位Lys、第７位Lys、第８位Pro、第10位Ser、第90位Ser、第92位Ile、第93位Ser、第105位Leu、第106位Pro、第107位Gly、第108位Glu、第111位Lys、第114位Val、第117位Gly、第118位Thr、第121位Val、第122位Thrまたは第125位Serのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2B。
【請求項１２】
野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第123位LysがAla残基に置換されている変異型ヒストンH2B。
【請求項１３】
請求項７の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項８の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項９の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１０の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１１の変異型ヒストンH2Bをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１２の変異型ヒストンH2Bをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１９】
酵母細胞のRNA転写またはDNA複製の阻害剤に対する感受性を増強させる方法であって、請求項８の変異型ヒストンH2A、または請求項１４のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
酵母細胞のRNA転写またはDNA複製の阻害剤に対する感受性を増強させる方法であって、請求項１２の変異型ヒストンH2B、または請求項１８のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
酵母細胞の細胞分裂阻害剤に対する感受性を増強させる方法であって、請求項９の変異型ヒストンH2A、または請求項１５のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
酵母細胞の生育を低下させる方法であって、請求項１０の変異型ヒストンH2A、または請求項１６のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
酵母細胞のRNA転写またはDNA複製に影響する因子を探索する方法であって、請求項２または請求項６の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞の死亡率を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法。
【請求項２４】
酵母細胞の細胞分裂に影響を及ぼす因子をスクリーニングする方法であって、請求項３の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞の死亡率を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法。
【請求項２５】
酵母細胞の生育に影響を及ぼす因子をスクリーニングする方法であって、請求項４の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞の生育を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法。
【請求項２６】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞112の集合であって、各酵母細胞の変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第1位から第131位のAla残基以外のアミノ酸残基がそれぞれAla残基に置換された異なる変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞の集合体。
【請求項２７】
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞112の集合であって、各酵母細胞の変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第1位から第130位のAla残基以外のアミノ酸残基がそれぞれAla残基に置換された異なる変異型ヒストンH2BであるヒストンH2B変異酵母細胞の集合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、変異酵母細胞と、その用途に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、特定の１アミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AまたはヒストンH2Bと、これらの変異型タンパク質を発現し、各種有用物質のスクリーニング等に有用な変異酵母細胞に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒストン（histone）は、真核細胞の核内に広く存在し、DNAとイオン結合している塩基性タンパク質である。通常５種類の成分（H1、H2A、H2B、H3およびH4）からなっており、H1以外の成分は生物種を越えて高度に類似している。例えばヒストンH2Aの場合、出芽酵母ヒストンH2A.1（N端から45番目から120番目までの76アミノ酸配列）とヒトヒストンH2A.1（N端から44番目から119番目までの76アミノ酸配列）では89％のアミノ酸配列が一致し、相違はわずか8残基である。同様に、ヒストンH2Bの場合、出芽酵母ヒストンH2B.1（N端から36番目から127番目までの92アミノ酸配列）とヒトヒストンH2B.1（N端から33番目から124番目までの92アミノ酸配列）では82％のアミノ酸配列が一致し、相違は17残基である。ヒストンH3の場合、出芽酵母ヒストンH3（N端から1番目から119番目までの119アミノ酸配列）とヒトヒストンH3.3（N端から1番目から119番目までの119アミノ酸配列）では93％のアミノ酸配列が一致し、相違は8残基である。ヒストンH4の場合、出芽酵母ヒストンH4（N端から1番目から102番目までの全長102アミノ酸配列）とヒトヒストンH4（N端から1番目から102番目までの全長102アミノ酸配列）では92％のアミノ酸配列が一致し、相違は8残基である。これほどまでに種間で高度に保存されたタンパク質は真核生物では他に知られていない。なお出芽酵母は遺伝学的・生化学的解析が容易な真核生物種であると同時にパン酵母とも呼称され、パンをはじめとする食品類・酒類の発酵等に広く用いられる有用微生物である。また、出芽酵母と同様に真菌属に属するカンジダ菌、アスペルギルス菌、白癬菌等の有害微生物も出芽酵母と同様にヒストンを有しており、そのアミノ酸配列は出芽酵母のアミノ酸配列と極めて類似している（図１、図２）。
【０００３】
DNAはこのヒストンとの規則的な結合により折り畳まれており、両者の複合体は、ヌクレオソームという基本的な構造単位を形成する。そして、このヌクレオソームが凝集することによって染色体のクロマチン構造が形成され、このクロマチン構造を維持または特異的に構造変換することによって遺伝子発現、DNA複製、DNA修復等の染色体DNA上で生じる反応がコントロールされている。
【０００４】
一方、真核細胞を構成するタンパク質は、染色体DNA配列（ゲノム）にコードされた遺伝子から発現しており、各遺伝子の発現形態や遺伝子機能の解析、あるいは個々の遺伝子の産業的利用は、ゲノムDNAがコードする遺伝子やその転写産物を直接操作することに主眼がおかれていた。例えば、単離した遺伝子の宿主−ベクター系での発現、生物個体への外来遺伝子の導入（トランスジェニック）、あるいは生物個体における特定遺伝子の欠失（ノックアウト）等である。
【０００５】
しかしながら前記のとおり、ゲノムから適切な遺伝子発現、DNA複製、DNA修復等の反応が起こるためには染色体のクロマチン構造の維持が不可欠であり、そのためには、ヌクレオソームの規則性、さらにはヒストンの構造と機能が正常に維持されることが不可欠である。従って、ヒストンに変異を導入し、染色体の正常なクロマチン構造を変化させることによっても、遺伝子発現、DNA複製、DNA修復等をコントロールすることが可能である。例えば、Hischhorn J. N. et al.（Mol. Cell. Biol. 15:1999-2009, 1995）は、酵母細胞（Saccharomyces cerevisiae）のヒストンH2Aに変異を導入することによって、特定遺伝子の転写欠損を報告している。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明は、染色体の一方の構成要素であるヒストンに点変異を導入することによって、ゲノムDNAがコードする遺伝子やその転写産物を直接操作することなく、新たな形質を獲得した新しい酵母細胞を提供することを課題としている。
【０００７】
また、この出願の発明は、酵母または非酵母細胞に対して新たな形質を付与することのできる変異型ヒストンと、それをコードするポリヌクレオチド、さらにはこれらを材料として酵母細胞または非酵母細胞に新たな形質を導入する方法を提供することを課題としている。
【０００８】
さらにこの出願の発明は、前記の変異酵母細胞を用いた各種有用物質のスクリーニング方法、さらにはそれら有用物質のヒストンに対する作用点をスクリーニングする方法を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、かつ酵母細胞ゲノムの必須遺伝子プロモーター領域にTy配列またはδ配列が挿入されており、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第４位Lys、第５位Gly、第26位Phe、第29位Gly、第46位Ser、第47位Gly、第66位Leu、第90位Asn、第91位Asp、第92位Asp、第94位Leu、第99位Gly、第103位Ile、第107位Glyまたは第115位Asnのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞を提供する。
【００１０】
この出願は、第２の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第66位Leu、第73位Asp、第74位Asn、第86位Leu、第93位Glu、第94位Leu、第103位Ile、第112位Ile、第113位Hisまたは第116位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞を提供する。
【００１１】
この出願は、第３の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第93位Glu、第112位Ile、第113位His、第115位Asn、第116位Leuまたは第117位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞を提供する。
【００１２】
この出願は、第４の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第93位Gluまたは第94位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞を提供する。
【００１３】
この出願は、第５の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、かつ酵母細胞ゲノムの必須遺伝子プロモーター領域にTy配列またはδ配列が挿入されており、野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第１位Ser、第３位Lys、第５位Glu、第６位Lys、第７位Lys、第８位Pro、第10位Ser、第90位Ser、第92位Ile、第93位Ser、第105位Leu、第106位Pro、第107位Gly、第108位Glu、第111位Lys、第114位Val、第117位Gly、第118位Thr、第121位Val、第122位Thrまたは第125位Serのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2BであるヒストンH2B変異酵母細胞を提供する。
【００１４】
この出願は、第６の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞であって、変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第123位LysがAla残基に置換されている変異型ヒストンH2BであるヒストンH2B変異酵母細胞を提供する。
【００１５】
この出願は、第７の発明として、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第４位Lys、第５位Gly、第26位Phe、第29位Gly、第46位Ser、第47位Gly、第66位Leu、第90位Asn、第91位Asp、第92位Asp、第94位Leu、第99位Gly、第103位Ile、第107位Glyまたは第115位Asnのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Aを提供する。
【００１６】
この出願は、第８の発明として、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第66位Leu、第73位Asp、第74位Asn、第86位Leu、第93位Glu、第94位Leu、第103位Ile、第112位Ile、第113位Hisまたは第116位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Aを提供する。
【００１７】
この出願は、第９の発明として、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第65位Glu、第93位Glu、第112位Ile、第113位His、第115位Asn、第116位Leuまたは第117位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Aを提供する。
【００１８】
この出願は、第１０の発明として、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第93位Gluまたは第94位Leuのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Aを提供する。
【００１９】
この出願は、第１１の発明として、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第１位Ser、第３位Lys、第５位Glu、第６位Lys、第７位Lys、第８位Pro、第10位Ser、第90位Ser、第92位Ile、第93位Ser、第105位Leu、第106位Pro、第107位Gly、第108位Glu、第111位Lys、第114位Val、第117位Gly、第118位Thr、第121位Val、第122位Thrまたは第125位Serのいずれか１個のアミノ酸残基がAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Bを提供する。
【００２０】
この出願は、第１２の発明として、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第123位LysがAla残基に置換されている変異型ヒストンH2Bを提供する。
【００２１】
この出願は、第１３の発明として、前記第７発明の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
この出願は、第１４の発明として、前記第８発明の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
この出願は、第１５の発明として、前記第９発明の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
この出願は、第１６の発明として、前記第１０発明の変異型ヒストンH2Aをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
この出願は、第１７の発明として、前記第１１発明の変異型ヒストンH2Bをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
この出願は、第１８の発明として、前記第１２発明の変異型ヒストンH2Bをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
この出願は、第１９の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の染色体クロマチン構造または遺伝子発現形態に影響を及ぼす方法であって、前記第７発明の変異型ヒストンH2A、または前記第１３発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２８】
この出願は、第２０の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の染色体クロマチン構造または遺伝子発現形態に影響を及ぼす方法であって、前記第１１発明の変異型ヒストンH2B、または前記第１７発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２９】
この出願は、第２１の発明として、酵母細胞または非酵母細胞のRNA転写またはDNA複製の阻害剤に対する感受性を増強させる方法であって、前記第８発明の変異型ヒストンH2A、または前記第１４発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３０】
この出願は、第２２の発明として、酵母細胞または非酵母細胞のRNA転写またはDNA複製の阻害剤に対する感受性を増強させる方法であって、前記第１２発明の変異型ヒストンH2B、または前記第１８発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３１】
この出願は、第２３の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の細胞分裂阻害剤に対する感受性を増強させる方法であって、前記第９発明の変異型ヒストンH2A、または前記第１５発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３２】
この出願は、第２４の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の生育を低下させる方法であって、前記第１０発明の変異型ヒストンH2A、または前記第１６発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００３３】
この出願は、第２５の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の染色体クロマチン構造または遺伝子発現形態に影響を及ぼす因子をスクリーニングする方法であって、前記第１発明または第５発明の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞のSPT表現型を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法を提供する。
【００３４】
この出願は、第２６の発明として、酵母細胞または非酵母細胞のRNA転写またはDNA複製に影響する因子を探索する方法であって、前記第２発明または第６発明の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞の死亡率を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法を提供する。
【００３５】
この出願は、第２７の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の細胞分裂に影響を及ぼす因子をスクリーニングする方法であって、前記第３発明の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞の死亡率を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法を提供する。
【００３６】
この出願は、第２８の発明として、酵母細胞または非酵母細胞の生育に影響を及ぼす因子をスクリーニングする方法であって、前記第４発明の変異酵母細胞に候補因子を導入する工程を含み、変異酵母細胞の生育を変化させる候補因子を目的因子として同定することを特徴とする方法を提供する。
【００３７】
この出願は、第２９の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞112の集合であって、各酵母細胞の変異型ヒストンH2Aが、野生型ヒストンH2AのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１における第1位から第131位のAla残基以外のアミノ酸残基がそれぞれAla残基に置換された異なる変異型ヒストンH2AであるヒストンH2A変異酵母細胞の集合体を提供する。
【００３８】
この出願は、第３０の発明として、野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有する酵母細胞112の集合であって、各酵母細胞の変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２における第1位から第130位のAla残基以外のアミノ酸残基がそれぞれAla残基に置換された異なる変異型ヒストンH2BであるヒストンH2B変異酵母細胞の集合体を提供する。
【００３９】
この出願は、第３１の発明として、ヒストンH2Aに作用を及ぼす因子の、ヒストンH2Aに対する作用点をスクリーニングする方法であって、前記第２９発明の酵母細胞集合体を構成する各ヒストンH2A変異酵母細胞のそれぞれに因子を導入し、因子の作用が変化した酵母細胞が発現する変異型ヒストンH2Aの置換アミノ酸部位をその因子の作用点として同定することを特徴とする方法を提供する。
【００４０】
この出願は、第３２の発明として、ヒストンH2Bに作用を及ぼす因子の、ヒストンH2Bに対する作用点をスクリーニングする方法であって、前記第３０発明の酵母細胞集合体を構成する各ヒストンH2B変異酵母細胞のそれぞれに因子を導入し、因子の作用が変化した酵母細胞が発現する変異型ヒストンH2Bの置換アミノ酸部位をその因子の作用点として同定することを特徴とする方法を提供する。
【００４１】
以下、各発明について実施形態を詳しく説明する。
【００４２】
【発明の実施の形態】
第１発明から第６発明の変異酵母細胞は、それぞれ、本来の野生型ヒストンH2A遺伝子およびヒストンH2B遺伝子を欠損しており、ヒストンH2AおよびヒストンH2Bのいずれか一方の１アミノ酸残基がアラニン残基に置換された変異型ヒストンH2AまたはヒストンH2Bを発現するポリヌクレオチド構築物（発現ベクター）を保有することを特徴としている。
【００４３】
野生型ヒストンH2A遺伝子およびヒストンH2B遺伝子を欠損した酵母細胞（以下、「H2A/H2B欠損酵母細胞」と記載する。この記載において「/」は"and"を意味する）は、公知の標的遺伝子置換法を用いた遺伝子ノックアウトによっても作成することができるが、好ましくは、MATa his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 ura3-52  lys2-128δ  Δ(hta1-htb1)::LEU2 Δ(hta2-htb2)::TRP1+ pSAB6
の遺伝型で示される出芽酵母FY406株（Hirschhorn J.N. et al., Mol. Cell. Biol. 15:1999-2009, 1995）を使用することができる。このFY406株は、ゲノム中の野生型ヒストンH2A遺伝子２種、野生型ヒストンH2B遺伝子２種を欠損しており、ヒストンH2A遺伝子とヒストンH2B遺伝子を１種ずつ保有し、URA3遺伝子を保有するpSAB6プラスミド（以下、「H2A/H2B野生型プラスミド」と記載する。この記載において「/」は"and"を意味する）を保有することで生育している。
【００４４】
このようなH2A/H2B欠損酵母細胞に、アラニン点変異を含むヒストンH2Aタンパク質またはヒストンH2Bタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングした構築体（具体的にはプラスミド。以下、「H2A-H2B変異型プラスミド」と記載する。この記載において「-」は"or"を意味する）を導入する。H2A-H2B変異型プラスミドはHIS3遺伝子を保有している。FY406株がHIS3遺伝子を機能喪失しているため、ヒスチジンを含まない培地では生育できないが、このH2A-H2B変異型プラスミドを保有することにより生育可能となる。このH2A-H2B変異型プラスミドを導入したH2A/H2B欠損酵母株をA株と呼ぶ。A株を、1mg/mlの濃度の5-Fluorootic Acid（5-FOA）および0.05mg/mlの濃度のウラシルを含有する寒天プレート上に塗布する。出芽酵母内ではURA3遺伝子の働きがあると、5-FOAは致死的な中間体に代謝されることから、上記プレート上では生育することができない。一方URA3遺伝子の働きがない出芽酵母は細胞内でウラシルを生合成できないが、上記プレートのように外来的にウラシルを添加すればプレート上で生育することができる。A株はゲノム中のURA3遺伝子を機能喪失しているものの、H2A/H2B野生型プラスミドがURA3遺伝子を保有しているため、H2A/H2B野生型プラスミドが細胞内に保持されている限り上記プレート上では生育できない。しかし、プラスミドは一般に親細胞の分裂と共に娘細胞に分配されるが、低頻度で片方の娘細胞に分配されず宿主細胞から脱落することが知られている。A株の場合でも同様の現象が確認され、上記プレート上に塗布した場合でも一部のコロニーが生育する。この株をB株と呼ぶ。B株はゲノム中のヒストンH2A遺伝子およびヒストンH2B遺伝子を欠損しており、H2A-H2B変異型プラスミドを保有する株である。即ちＢ株は、ヒストンH2AまたはヒストンH2Bの特定の１アミノ酸だけを選択的にアラニンに置換した出芽酵母株として樹立される。
【００４５】
ヒストンH2Aタンパク質またはH2Bタンパク質の１アミノ酸残基をアラニン残基に置換する方法は、オリゴヌクレオチドと一本鎖DNAのハイブリダイゼーションに基づいたKunkel法（Kunkel, T. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985およびKunkel, T. A., et al. Methods in Enzymology 154:367, 1987）に基づいて行うことができる。すなわち、dut、ungの遺伝型で示される大腸菌（BW313、CJ236等）は、dUTPase（Dut）とUracil-DNA glycosylase（Ung）を欠損している。そのため、DNA中のチアミン（T）の一部がデオキシウラシル（dU）に置き換わったDNAを合成する。この大腸菌を宿主菌として、変異導入の目標となるヒストンH2AまたはH2B遺伝子をクローニングしたプラスミドの一本鎖DNAを調製する。ヒストンH2A遺伝子およびヒストンH2B遺伝子は、例えば公知の配列情報（H2A：GenBank Accession No. CAA88505.1; H2B:GenBank Accession No. CAA88504.1等）に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて酵母cDNAをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR増幅する方法等によって得ることができる。また、入手可能な公知のクローンを利用することもできる。
【００４６】
この一本鎖DNAに対して、目的残基をアラニンで置換するように設計したオリゴヌクレオチドを試験管内でハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼ反応とDNAリガーゼ反応により相補DNA鎖を合成する。このDNAをung+の大腸菌株（DH5α等）に導入すると、もとのdUの含まれているDNA鎖はUngによって分解を受けるが、試験管内で合成された相補DNA鎖は分解されずに複製される。このようにして変異を導入した側のDNA鎖が選択的に増幅され、アラニン点変異を含むヒストンH2Aタンパク質またはヒストンH2Bタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした変異導入プラスミドを得ることができる。
【００４７】
また、第１発明および第５発明の変異酵母細胞は、前記のとおりの構成に加えて、酵母細胞ゲノムの必須遺伝子プロモーター領域にTy配列またはδ配列が挿入されている。このような出芽酵母株は、例えばlys2-128δの遺伝型で示される。前記の出芽酵母FY406株はこのlys2-128δの遺伝型を有してもいる。これはゲノム中のLYS2遺伝子のプロモーター領域にδ配列の挿入が起こり、LYS2遺伝子の発現が起こらなくなった株であることを意味している。このような株は培地上にリジンを含有しないと生育することはできない。しかし、ある遺伝子の発現の量的または質的な変化が生じるとlys2-128δの遺伝型を持つ株でもリジンを含有しない培地上で生育できるようになる。このような表現型をsuppressor of Ty (SPT)表現型と呼ぶ（Winston, F. and Carlson, M. Trends Genet. 8:387-391, 1992）。第１発明および第５発明の変異酵母細胞はリジンを含有しない培地で生育することから、SPT表現型を示すことが確認された。SPT表現型をもたらす遺伝子変異には、ヒストンをはじめとしてゲノムのクロマチン構造の維持または変換過程に関わる分子をコードする遺伝子変異が数多く報告されていることから、SPT表現型は細胞内におけるゲノムのクロマチン構造の変化や遺伝子発現形態の変化を検出する重要な指標である。従って、この第１発明および第５発明の変異酵母細胞は、ヒストンH2AおよびH2Bのそれぞれ特定のアミノ酸点変異が染色体クロマチン構造や遺伝子発現形態にどのような影響を及ぼすかを調べる系として有用である。また、染色体クロマチン構造や遺伝子発現形態に影響を及ぼす因子を探索する系（第２５発明）としても有用である。さらに、これらの変異酵母細胞が保有する変異型H2Aタンパク質および変異型H2Bタンパク質（第第７発明、第１１発明）、あるいはこれらの変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（第１３発明および第１７発明）は、酵母または非酵母細胞の染色体クロマチン酵素や遺伝子発現形態を変化させるために使用することができる（第１９発明、第２０発明）。
【００４８】
なお、この出願の発明において、「因子」とは、未知および既知の化合物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を含有する。また、この発明のスクリーニング方法では酵母細胞に加えて「非酵母細胞」を対象とするが、これは、前記のとおりヒストンの構造（アミノ酸配列）が種間を越えて高度に保存されており、酵母以外の種においても酵母での知見が確実に適用できるためである。さらに、非酵母細胞は、培養細胞（インビトロ）だけでなく、生物個体内の生細胞（インビボ）をも対象とする。
【００４９】
一方、第２−４発明および第６発明の変異酵母細胞は、それぞれ特定の条件に対して野生型酵母細胞とは異なる表現型を示す酵母細胞である。
【００５０】
第２発明および第６発明の変異酵母細胞は、6アザウラシル（6-azauracil:6AU）に対して野生型よりも有意に高い感受性を有する細胞株として特定された。6AUは細胞内のヌクレオチド濃度を変化させることによってRNA転写やDNA複製に影響を与える薬剤である（Nakanishi T. et al. J Biol. Chem. 270:8991-8995, 1995、Hampsey M. Yeast 13：1099-1133, 1997）。従って、これらの変異酵母細胞は、RNA転写またはDNA複製に影響を及ぼす因子に対して敏感に反応するため、それらの因子を探索する系（第２６発明）として有用である。さらにこれらの変異酵母細胞が保有する変異型H2Aタンパク質および変異型H2Bタンパク質（第８発明、第１２発明）、あるいはこれらの変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（第１４発明および第１８発明）は、酵母または非酵母細胞のRNA転写またはDNA複製の阻害剤に対する感受性を増強させるために使用することができる（第２１発明、第２２発明）。
【００５１】
第３発明の変異酵母細胞は、TBZ（Thiabendazole）およびBenomyl（Methyl 1-(butylcarbamoyl)-2-benzimidazolecarbamate）に対して野生型よりも有意に高い感受性を有する細胞株として特定された。TBZおよびBenomylはともに細胞内の微小管重合を阻害することで細胞分裂を阻害する生理活性を有している（Hampsey M. Yeast 13:1099-1133, 1997）。従って、これらの変異酵母細胞は、細胞分裂に影響を及ぼす因子に対して敏感に反応するため、それらの因子を探索する系（第２７発明）として有用である。さらにこれらの変異酵母細胞が保有する変異型H2Aタンパク質（第９発明）、あるいはこの変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（第１５発明）は、酵母または非酵母細胞の細胞分裂の阻害剤に対する感受性を増強させるために使用することができる（第２３発明）。
【００５２】
第４発明の変異酵母細胞は、野生型よりも生育の程度が低い細胞株として特定された。従って、これらの変異酵母細胞は、生育の程度に影響を及ぼす因子に対して敏感に反応するため、それらの因子を探索する系（第２８発明）として有用である。さらにこれらの変異酵母細胞が保有する変異型H2Aタンパク質（第１０発明）、あるいはこの変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（第１６発明）は、酵母または非酵母細胞の生育を低下させるために使用することができる（第２４発明）。
【００５３】
第７発明から第１２発明は、それぞれ、前記の各変異酵母細胞が発現する変異型ヒストンH2Aタンパク質および変異型ヒストンH2Bタンパク質である。これらの変異型タンパク質は、配列番号１および２の配列情報と、各アミノ酸置換に基づいて、公知の化学合成法によってペプチドを合成する方法によっても得ることができるが、好ましくは、前記の各変異酵母細胞を公知の方法で培養し、その培養物から公知の手段で目的タンパク質を単離精製する方法によって取得することができる。あるいはまた、各変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド（第１３発明から第１８発明。以下、「変異型ポリヌクレオチド」と記載する）を適当な発現ベクターに連結することによって、インビトロ転写翻訳系や、非酵母細胞（微生物、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等）の培養物から、変異型タンパク質を単離精製することができる。
【００５４】
例えば、変異型タンパク質をインビトロ転写翻訳系で発現させる場合には、前記の変異型ポリヌクレオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ転写翻訳系に添加すれば、目的とする変異型タンパク質をインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが例示できる。
【００５５】
変異型タンパク質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記の変異型ポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、変異型タンパク質を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的の変異型タンパク質を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。
【００５６】
さらに、変異型タンパク質を真核細胞で発現させる場合には、前記の変異型ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成する。このベクターを真核細胞内に導入して培養すれば、目的とする変異型タンパク質を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞HEK293T、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００５７】
この発明の変異酵母細胞または形質転換細胞で発現させた変異型タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００５８】
なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明の変異型タンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、メチル化などである。
【００５９】
以上のとおりにして得た変異型ヒストンH2AおよびH2B、およびそれらをコードする変異型ポリヌクレオチドは、前記のとおりの第１９発明から第２４発明に使用することができる。なお、これらの方法発明において、変異型タンパク質を被検細胞に導入するには、これら変異型タンパク質の構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこの変異型タンパク質を混合し、例えばマイクロインジェクション法により細胞内に導入する。あるいは、最近開発された脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Therapy Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米国）等）を採用すれば、生物個体内の生細胞に変異型タンパク質を導入し、その作用をインビボで発揮させることもできる。
【００６０】
また、変異型ポリヌクレオチドを細胞内に導入する場合には、変異型ポリヌクレオチドを保有する構築体（発現ベクター）を、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法で細胞に導入する方法を採用することができる。また、発現ベクターを中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込むことによって、遺伝子治療の手法により変異型ポリヌクレオチドを生体内に導入発現させることもできる。
【００６１】
第２９発明および第３０発明は、変異型ヒストンH2Aタンパク質または変異型ヒストンH2Bを発現する変異酵母細胞の集合である。これらの酵母細胞集団は、それぞれが異なるアミノ酸点変異を有する変異型タンパク質を発現するため、ヒストンH2AまたはヒストンH2Bに作用を及ぼす因子（公知の因子や、前記の第２５〜２８発明で同定された新規因子）が、ヒストンのどのアミノ酸残基に対して作用するかを特定するための系（第３１発明、第３２発明）として有用である。そして、このような作用点の解明は、特定の動物種に対してのみ作用する薬剤（例えば細胞毒性薬剤）を選択するために有効である。すなわち、ヒストンは前記のとおりに種間を越えて高度に保存されているが、図１、図２に示したように、酵母（sce）ヒストンは、ヒト（hum）ヒストンに比べて、アスペルギウス（asp）、カンジダ・アルビカンス（cal）等の菌類のヒストンとの相同性が高い。従って、例えば、ヒトヒストンに特有のアミノ酸残基に置換した酵母ヒストンの毒性薬剤感受性が低下したとすれば、この薬剤は、ヒト細胞には影響を与えず、酵母や菌類に対してのみ薬効を示すものと判断することができる。
【００６２】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００６３】
【実施例】
実施例１
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、かつ酵母細胞ゲノムの必須遺伝子プロモーター領域にδ配列が挿入されており、変異型ヒストンH2Aタンパク質と野生型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有するヒストンH2A変異酵母細胞を作成した。変異型ヒストンH2Aタンパク質は、野生型ヒストンH2Aタンパク質のN端領域アミノ酸配列を示した配列番号１の各アミノ酸残基をそれぞれAla残基に置換した変異型ヒストンH2Aタンパク質である。
【００６４】
具体的には、Kunkel法に従って配列番号１のアラニン残基以外の各アミノ酸残基をそれぞれアラニン残基に置換した変異型ヒストンH2Aと野生型ヒストンH2Bをそれぞれコードするポリヌクレオチドを保有するプラスミドを酵母細胞FY406株に導入した。この株をA株と呼ぶ。A株を、1mg/mlの濃度の5-Fluorootic Acid（5-FOA）および0.05mg/mlの濃度のウラシルを含有する寒天プレート上に塗布した。出芽酵母内ではURA3遺伝子の働きがあると、5-FOAは致死的な中間体に代謝されることから、上記プレート上では生育することができない。一方URA3遺伝子の働きがない出芽酵母は細胞内でウラシルを生合成できないが、上記プレートのように外来的にウラシルを添加すればプレート上で生育することができる。A株はゲノム中のURA3遺伝子を機能喪失しているものの、H2A/H2B野生型プラスミドがURA3遺伝子を保有しているため、H2A/H2B野生型プラスミドが細胞内に保持されている限り上記プレート上では生育できない。しかし、プラスミドは一般に親細胞の分裂と共に娘細胞に分配されるが、低頻度で片方の娘細胞に分配されず宿主細胞から脱落することが知られている。A株の場合でも同様の現象が確認され、上記プレート上に塗布した場合でも一部のコロニーが生育した。この株をB株と呼ぶ。B株はゲノム中のヒストンH2A遺伝子およびヒストンH2B遺伝子を欠損しており、アラニン点変異を含むヒストンH2Aタンパク質および野生型ヒストンH2Bタンパク質をコードする遺伝子をクローニングしたプラスミドを保有する株である。
【００６５】
以上のとおりにして、ヒストンH2Aの特定の１アミノ酸だけを選択的にアラニンに置換したヒストンH2A変異酵母細胞131株を樹立した。
実施例２
野生型ヒストン遺伝子H2AおよびH2Bを欠失し、かつ酵母細胞ゲノムの必須遺伝子プロモーター領域にδ配列が挿入されており、野生型ヒストンH2Aと変異型ヒストンH2Bとを発現するポリヌクレオチド構築物を保有するヒストンH2B変異酵母細胞を作成した。変異型ヒストンH2Bが、野生型ヒストンH2BのN端領域アミノ酸配列を示した配列番号２のアラニン残基以外の各アミノ酸残基をそれぞれアラニン残基に置換した以外は、実施例１と同一の方法で作成した。
実施例３
実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞を用いて、SPT表現型の変化を調べた。
【００６６】
具体的には、実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞と野生型出芽酵母をそれぞれ培地上で生育させ、遠心分離操作および水による洗浄操作より培地成分を除去した株をそれぞれリジンを含有する培地およびリジンを含有しない培地上に塗布した。塗布の方法は、あらかじめ顕微鏡観察により計数した細胞濃度に基づいて、１スポット当たり約10万細胞、約3万細胞、約1万細胞、約3000細胞、約1000細胞、約300、約100細胞、約30細胞になるように段階的に希釈し、それぞれ5μlのスポットとして塗布した。このプレートを30度で約２日〜４日間保温し、各培地上での生育状況を観察した（Hartzog GA et al. Mol Cell Biol. 16:2848-2856, 1996参照）。生育状況の一例は図３に示したとおりである。この図３に示した例では、第４位LysをAlaに置換したH2A変異酵母（FA004#1[K4A]）はリジンを含有しない培地でも良好に生育し（右図）、SPT表現型を示している。
【００６７】
作製した112種類のH2A変異酵母細胞のうち、SPT表現型を示した変異酵母のアミノ酸置換部位と、SPT表現型の程度は表１に示したとおりである。作成した112種類のヒストンH2A変異酵母細胞のうち、表１に示した15種類の変異型ヒストンH2Aを発現する酵母細胞が、野生型酵母細胞に比べて、少なくとも３倍以上のSPT表現型の変化を示した。
【００６８】
これら15種類のヒストンH2A変異酵母細胞は、変異型ヒストンH2Aの発現によりヌクレオソームおよび染色体クロマチン構造を変化させることによって、遺伝子発現形態を改変していることが確認された。従って、これらのヒストンH2A変異酵母細胞を使用することによって、遺伝子発現形態に影響を及ぼす因子を探索することが可能であることが確認された。また、各々の変異型ヒストンH2Aまたはそれらを個々にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞の遺伝子発現形態を改変することが可能であることが確認された。
【００６９】
【表１】
0003705768.tif 000002
【００７０】
実施例４
実施例２で作成したヒストンH2B変異酵母細胞を用いて、実施例３と同様の方法によりSPT表現型の変化を調べた。生育状況の一例は図４に示したとおりである。この図４では、実施例５において良好なSPT表現型を示したH2A変異酵母（FA004#1[K4A]）を正のコントロールとして表示している。この図４に示した例では、117位Gly、118位Thr、121位ValをそれぞれAlaに置換した変異型ヒストンH2Bを発現する変異酵母細胞が、それぞれ異なった程度でSPT表現型を示している。
【００７１】
作製した112種類のH2B変異酵母細胞のうち、SPT表現型を示した変異酵母のアミノ酸置換部位と、SPT表現型の程度は表２に示したとおりである。作成した112種類のヒストンH2B変異酵母細胞のうち、表２に示した21種類の変異型ヒストンH2Bを発現する酵母細胞が、野生型酵母細胞に比べて、少なくとも３倍以上のSPT表現型の変化を示した。
【００７２】
これら21種類のヒストンH2B変異酵母細胞は、変異型ヒストンH2Bの発現によりヌクレオソームおよび染色体クロマチン構造を変化させることによって、遺伝子発現形態を改変していることが確認された。従って、これらのヒストンH2B変異酵母細胞を使用することによって、遺伝子発現形態に影響を及ぼす因子を探索することが可能であることが確認された。また、各々の変異型ヒストンH2Bまたはそれらを個々にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞の遺伝子発現形態を改変することが可能であることが確認された。
【００７３】
【表２】
0003705768.tif 000003
【００７４】
実施例５
実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞を使用して、6AUに対する各細胞の感受性を調べた。
【００７５】
具体的には、実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞と野生型酵母細胞をそれぞれ培地上で生育させ、遠心分離操作および水による洗浄操作により培地成分を除去した株をそれぞれ1mg/mlの濃度の6AUを含有する培地および6AUを全く含有しない培地上に塗布した。塗布の方法は、あらかじめ顕微鏡観察により計数した細胞濃度に基づいて、１スポット当たり約10万細胞、約3万細胞、約1万細胞、約3000細胞、約1000細胞、約300細胞、約100細胞、約30細胞になるように段階的に希釈し、それぞれ5μlのスポットとして塗布した。このプレートを
30度で約２日〜４日間保温し、各培地上での生育状況を観察した。生育状況の一例を図５に示した。この図５に示した例では、65位Gluおよび66位LysをそれぞれAla残基に置換した変異型ヒストンH2Aを発現する変異酵母細胞が6AUに対して有意に高い感受性を示した。
【００７６】
作製した112種類のH2A変異酵母細胞のうち、6AUに対して感受性を増強した変異酵母のアミノ酸置換部位と、6AU感受性増強の程度は表３に示したとおりである。作成した112種類のヒストンH2A変異酵母細胞のうち、表３に示した10種類の変異型ヒストンH2Aを発現する酵母細胞が、野生型酵母細胞に比べ、少なくとも３倍以上の6AU感受性を示した。
【００７７】
これら10種類のヒストンH2A変異酵母細胞は、変異型ヒストンH2Aの発現によって、6AUに対する感受性を増強させていることが確認された。6AUは細胞のRNA転写およびDNA複製の阻害剤であることから、これらのヒストンH2A変異酵母細胞は、6AUと同様の作用を有する因子を高感度で探索するための系として有用であることが確認された。また、各々の変異型ヒストンH2Aまたはそれらを個々にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞の6AUまたは類似因子に対する感受性を増強することが可能であることが確認された。
【００７８】
【表３】
0003705768.tif 000004
【００７９】
実施例６
実施例２で作成したヒストンH2B変異酵母細胞を使用し、実施例５と同様にして6AUに対する各細胞の感受性を調べた。酵母細胞の生育状況の一例を図６に示した。この図６に示した例では、123位LysがAlaに置換された変異型ヒストンH2Bを発現する変異酵母細胞が、6AUに対する感受性を増強させている。
【００８０】
この変異酵母細胞の6AUに対する感受性増強の程度は表４に示したとおりである。作成した112種類のヒストンH2B変異酵母細胞のうち、表４に示した1種類の変異型ヒストンH2Bを発現する酵母細胞が、野生型酵母細胞に比べ、300倍以上の6AU感受性を示した。
【００８１】
このヒストンH2B変異酵母細胞は、変異型ヒストンH2Bの発現によって、6AUに対する感受性を増強させていることが確認された。従って、このヒストンH2B変異酵母細胞は、6AUと同様の作用を有する因子を高感度で探索するための系として有用であることが確認された。また、変異型ヒストンH2Bまたはそれをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞の6AUまたは類似因子に対する感受性を増強することが可能であることが確認された。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
実施例７
実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞を使用して、TBZまたはBenomylに対する各細胞の感受性を調べた。
【００８４】
具体的には、実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞と野生型出芽酵母をそれぞれ培地上で生育させ、遠心分離操作および水による洗浄操作により培地成分を除去した株をそれぞれ25μg/mlの濃度のTBZを含有する培地、10μg/mlの濃度のBenomylを含有する培地、および薬剤を含有しない培地上に塗布した。なお、薬剤を含有しない培地においてもTBZおよびBenomylの水溶化のために用いた溶媒のDMSOを等量含有させた。塗布の方法は、あらかじめ顕微鏡観察により計数した細胞濃度に基づいて、１スポット当たり約10万細胞、約3万細胞、約1万細胞、約3000細胞、約1000細胞、約300細胞、約100細胞、約30細胞になるように段階的に希釈し、それぞれ5μlのスポットとして塗布した。このプレートを30度で約２日〜４日間保温し、各培地上での生育状況を観察した。図７はTBZ含有培地における生育状況の一例であり、図８はBenomyl含有培地における生育状況の一例である。これらの図に示した例では、65位Gluまたは93位のGluがアラニンに置換された変異型ヒストンH2Aを発現する変異酵母細胞が、TBZまたはBenomylに対する感受性を増強させている。
【００８５】
作製した112種類のH2A変異酵母細胞のうち、TBZまたはBenomylに対して感受性を増強した変異酵母のアミノ酸置換部位と、感受性増強の程度は表５（TBZ）および表６（Benomyl）に示したとおりである。作成した112種類のヒストンH2A変異酵母細胞のうち、表５および表６に示した７種類の変異型ヒストンH2Aを発現する酵母細胞が、野生型酵母細胞に比べ、TBZまたはBenomylに対して少なくとも10倍以上の感受性を示した。
【００８６】
これら７種類のヒストンH2A変異酵母細胞は、変異型ヒストンH2Aの発現によって、TBZまたはBenomylに対する感受性を増強させていることが確認された。TBZまたはBenomylは細胞分裂阻害剤であることから、これらのヒストンH2A変異酵母細胞は、TBZまたはBenomylと同様の作用を有する細胞分裂阻害因子を高感度で探索するための系として有用であることが確認された。また、各々の変異型ヒストンH2Aまたはそれらを個々にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞分裂阻害因子に対する感受性を増強することが可能であることが確認された。
【００８７】
【表５】
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【００８８】
【表６】
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【００８９】
実施例８
実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞を使用して、各細胞の生育の程度を調べた。
【００９０】
具体的には、実施例１で作成したヒストンH2A変異酵母細胞と野生型酵母細胞をそれぞれ培地上で生育させ、遠心分離操作および水による洗浄操作により培地成分を除去した株を通常酵母が生育可能な栄養豊富寒天培地上に塗布した。塗布の方法は、あらかじめ顕微鏡観察により計数した細胞濃度に基づいて、１スポット当たり約10万細胞、約3万細胞、約1万細胞、約3000細胞、約1000細胞、約300細胞、約100細胞、約30細胞になるように段階的に希釈し、それぞれ5μlのスポットとして塗布した。このプレートを30度で約３日〜５日間保温し、培地上での生育状況を観察した。
【００９１】
結果は表７に示したとおりである。作成した112種類のヒストンH2A変異酵母細胞のうち、表７に示した２種類の変異型ヒストンH2Aを発現する酵母細胞が、野生型酵母細胞に比べ、生育の程度を1/10以下に低下させた。
【００９２】
これら２種類のヒストンH2A変異酵母細胞は、変異型ヒストンH2Aの発現によって、生育の程度を有意に低下させていることが確認された。従って、これらのヒストンH2A変異酵母細胞は、細胞の生育に影響を及ぼす因子を高感度で探索するための系として有用であることが確認された。また、各々の変異型ヒストンH2Aまたはそれらを個々にコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞の生育を抑制することが可能であることが確認された。
【００９３】
【表７】
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【００９４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、染色体の一方の構成要素であるヒストンに点変異を導入することによって、ゲノムDNAがコードする遺伝子やその転写産物を直接操作することなく、新たな形質を獲得した新しい酵母細胞株が提供される。
【００９５】
また、この出願の発明によって、酵母細胞または非酵母細胞に新たな形質を導入する方法、各種有用物質のスクリーニング方法、さらにはそれら有用物質のヒストンに対する作用点をスクリーニングする方法が提供される。
【００９６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒストンH2Aの種間の配列相同性を示したアミノ酸配列図である。「.」は最上段のアミノ酸と同一であること、「*」は最上段に示したアミノ酸が全種で保存されていること、数字はアミノ酸配列のN端からの位置を示す。
【図２】ヒストンH2Bの種間の配列相同性を、図１と同様に示したアミノ酸配列図である。
【図３】実施例５におけるヒストンH2A変異酵母細胞の65時間培養後の生育状況である。左図はヒスチジンを含有しない培地、右図はヒスチジンとリジンを含有しない培地における酵母細胞の生育状況である。A〜Hは1μl中の細胞数（A:約20,000、B:約6,000、C:約2,000、D:約600、E:約200、F:約60、G:約20、H:約6）である。
【図４】実施例６におけるヒストンH2B変異酵母細胞の64時間培養後の生育状況である。左図はヒスチジンを含有しない培地、右図はヒスチジンとリジンを含有しない培地における酵母細胞の生育状況である。細胞数（A〜H）は図３と同一。
【図５】実施例７におけるヒストンH2A変異酵母細胞の65時間培養後の生育状況である。左図は6AUを含有しない培地、右図は6AU(1mg/ml)を含有する培地における酵母細胞の生育状況である。細胞数（A〜H）は図３と同一。
【図６】実施例８おけるヒストンH2B変異酵母細胞の65時間培養後の生育状況である。左図は6AUを含有しない培地、右図は6AU(1mg/ml)を含有する培地における酵母細胞の生育状況である。細胞数（A〜H）は図３と同一。
【図７】実施例９におけるヒストンH2A変異酵母細胞の46時間培養後の生育状況である。左から、薬剤非含有培地、DMSO含有培地、DMSO+TBZ(25μl/ml)含有培地、DMSO+TBZ(100μl/ml)含有培地における酵母細胞の生育状況である。細胞数（A〜H）は図３と同一。
【図８】実施例９におけるヒストンH2A変異酵母細胞の46時間培養後の生育状況である。左から、薬剤非含有培地、DMSO含有培地、DMSO+Benomyl(10μl/ml)含有培地、DMSO+Benomyl(500μl/ml)含有培地における酵母細胞の生育状況である。細胞数（A〜H）は図３と同一。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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