(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）水系媒体中の酵素を、カルボキシル基含有ビニルモノマーを３０〜８０重量％およびアルデヒド基含有ビニルモノマーを５〜６０重量％含有するモノマーを重合して得られる酵素吸着剤であって、水系媒体中、ｐＨ１１以上では溶解し、ｐＨ３以下では不溶化する酵素吸着剤に吸着させる工程、および（２）前記酵素吸着剤に酵素を吸着させた後、前記水系媒体のｐＨを３以下にすることにより前記酵素吸着剤を水不溶化する工程を含み、
該カルボキシル基含有ビニルモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸およびクロトン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーであり、アルデヒド基含有ビニルモノマーが、アクロレインおよびメタクロレインからなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーであることを特徴とする水系媒体からの酵素の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素吸着剤による酵素の分離方法に関するものである。さらに詳しくは、水素イオン濃度（ｐＨ）の変化によって、水溶性或いは水不溶性の可逆形態を取ることができる酵素吸着剤による酵素の分離方法に関する。本発明の分離方法は、水系媒体中から容易に酵素を分離・回収することができ、また核酸と酵素を含む混合物から酵素を選択的に除去することができ、従って核酸の精製にも利用することができるものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体触媒である酵素反応が種々の産業分野にて利用されるようになっており、例えば繊維の風合いや手触りの向上のために酵素処理が広く一般的に実施され、また製紙の分野ではパルプの処理にも用いられている。従来、繊維およびパルプなど固体状の基質を処理する場合に用いられる酵素の多くは、水溶液に可溶な状態の酵素を使用するものであって、通常アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素を用いて実施されている。
【０００３】
これら酵素は、一般的に比較的高価であり、それを効率よく再利用できれば経済的であるばかりでなく、また酵素処理液から酵素を分離・回収することは、水質汚染などの環境問題を解決することからも重要である。しかしながら、酵素処理後、酵素のみを反応液から回収することは技術的に非常に困難である。また、プロテアーゼなど蛋白質分解酵素のような酵素は酵素同士の反応や失活が起こり易いという問題もある。
【０００４】
特開平６−３４１０６７号公報には水溶性ポリマーに固定化した酵素、具体的には水溶性ポリマーであるメチルビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体にアミラーゼなどの酵素を固定化した固定化酵素で繊維を処理することが開示されている。
【０００５】
また、特開平６−２４０２９７号公報には、水溶性ポリマーであるメチルビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体にタンパク質分解酵素とそれ以外の消化酵素を結合して洗浄用助剤として用いることが開示されている。
しかしこれらの方法は、酵素と水溶性ポリマーの結合が不十分でありかつ酵素活性が低いという問題がある。その上、酵素の固定化方法としてこれらの方法は、水溶性カルボジイミドのような比較的高価な結合用試薬を多量に用いることが必須であり、経済性の点で問題があるのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来の技術的課題を解決するためになされたもので、高価な結合用試薬を用いることなく効率的に酵素を分離でき、酵素反応効率および耐久性にも優れたｐＨ応答性を有する酵素吸着剤による酵素の分離方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、前記本発明の目的は、（１）水系媒体中の酵素を、カルボキシル基含有ビニルモノマーを３０〜８０重量％およびアルデヒド基含有ビニルモノマーを５〜６０重量％含有するモノマーを重合して得られる酵素吸着剤であって、水系媒体中、ｐＨ１１以上では溶解し、ｐＨ３以下では不溶化する酵素吸着剤に吸着させる工程、および（２）前記酵素吸着剤に酵素を吸着させた後、前記水系媒体のｐＨを３以下にすることにより前記酵素吸着剤を水不溶化する工程を含み、
該カルボキシル基含有ビニルモノマーが、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸およびクロトン酸からなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーであり、アルデヒド基含有ビニルモノマーが、アクロレインおよびメタクロレインからなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーであることを特徴とする水系媒体からの酵素の分離方法により達成される。
本願発明における吸着とは物理的結合および化学的結合の両方を含むものである。
【０００８】
すなわち、本発明の酵素吸着剤による酵素の分離方法は、水系媒体中で酵素を容易に吸着することができる。酵素吸着剤と酵素は強固に結合している。また、酵素吸着剤は、水系媒体中において水素イオン濃度（ｐＨ）の変化により水溶性と水不溶性の可逆形態を有している。従って、本発明に用いる酵素吸着剤は、酵素反応処理が終了した後、ｐＨをコントロールすることにより不溶化させ、例えば遠心分離により容易に回収し、再使用することができる。
【０００９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の酵素吸着剤に使用される共重合体は、カルボキシル基含有ビニルモノマーおよびアルデヒド基含有ビニルモノマーを主たるモノマー成分として形成された共重合体（以下、「特定重合体」という）である。
特定共重合体を形成するカルボキシル基含有ビニルモノマーの具体例としては、例えばアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸モノマーが挙げられる。これらは全モノマー当り１５〜９５重量％、好ましくは３０〜８０重量％使用することができる。カルボキシル基含有ビニルモノマーが１５重量％より少ないとｐＨ１１より高いｐＨの条件でも溶解させることができず、また９５重量％より多いとｐＨ３より低いｐＨでも共重合体は不溶化しないため回収できなくなる。これらカルボキシル基含有ビニルモノマーはそれぞれ単独で用いるだけでなく、二種類もしくはそれ以上併用することもできる。
【００１０】
一方、特定共重合体の形成に使用されるアルデヒド基含有ビニルモノマーの具体例としては、例えばアクロレインおよびメタクロレインが代表的に挙げられる。アルデヒド基含有ビニルモノマーの使用される量は全モノマー当り２〜８０重量％、好ましくは５〜６０重量％である。アルデヒド基含有ビニルモノマーが２重量％より少ないと酵素に結合する効率が不十分となり、また８０重量％より多いと高ｐＨでもポリマーが溶解しないため好ましくない。
【００１１】
本発明における特定共重合体を形成しているモノマーは、カルボキシル基含有ビニルモノマーおよびアルデヒド基含有ビニルモノマーが前記割合である限り、他のモノマーがさらに含有されていてもよい。
【００１２】
かかる他のモノマーの具体例としては、例えばスチレン、エチルビニルベンゼン、α−メチルスチレン、フルオロスチレン、ビニルピリジンなどの芳香族ビニル化合物；メチルアクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、β−アクリロイルオキシエチルハイドロジエンフタレート、Ｎ,Ｎ′−ジメチルアミノエチルアクリレート、グリシジルアクリレート、２−ヒドロキシアクリレートなどのアクリル酸エステル化合物；メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、メトキシジエチレングリコールメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、Ｎ,Ｎ′−ジメチルアミノエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジエンフタレートなどのメタクリル酸エステル化合物；ブタジエン、イソプレンなどの共役二重結合化合物；酢酸ビニルなどのビニルエステル化合物；４−メチル−１−ペンテンなどのα−オレフィン化合物；Ｎ−メチロールアクリルアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチレンビスアミドなどのアミド化合物；アクリロニトリル、メタクリロニトリルなどのシアン化ビニル化合物；スチレンスルホン酸塩、イソプレンスルホン酸塩などスルホン化化合物などを挙げることができる。これらの他のモノマーは一種または二種以上のいずれでも使用される。
【００１３】
本発明における特定共重合体の重合方法は、特に制限されないが、好ましくはラジカル重合により得ることができ、その形式は溶液重合、乳化重合または懸濁重合いずれでも良い。最も好ましい重合方法は溶液重合であり、その際重合溶媒としては、少なくとも一種の有機溶剤が使用される。
有機溶剤の具体例としては、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、テトラヒドフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、トルエンなどが挙げられる。これらは一種または二種以上組み合わせて用いることができる。また、重合中にポリマーが析出しない範囲で水を組み合わせることもできる。
【００１４】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤が使用でき、その例としてはアゾイソブチロニトリルのようなアゾ系開始剤、ベンゾイルパーオキサイドなどの有機過酸化物を使用することができる。重合後、水および水酸化ナトリウムなどを滴下してｐＨを７以上にコントロールした後減圧蒸留などの方法で脱溶剤することにより共重合体の水溶液を得ることができる。
本発明における特定重合体のポリスチレン換算重量平均分子量は、通常１,０００〜３０,０００が適当である。
【００１５】
本発明における特定共重合体は、水系媒体中、ｐＨ１１以上では溶解しており、ｐＨ３以下では不溶化し水から析出する。ｐＨ１１以上でも共重合体が溶解しない場合は、共重合体が溶解した状態で酵素を吸着することができず、一方ｐＨ３以下で不溶化しない場合はｐＨを制御して酵素を回収することができないため酵素を再利用できないという問題がある。
【００１６】
本発明の酵素吸着剤により吸着することのできる酵素としては、特に制限されないが、例えばアミノペプチターゼ、キモトリプシン、パパイン、ウロキナーゼ、ウレアーゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、プロテアーゼ、グルコースフォスファターゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、リゾチーム、セルラーゼ、インベルターゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、各種制限酵素（エンドデオキシリボヌクレアーゼ）などの加水分解酵素；リシンラセマーゼ、ＵＤＰガラクトースエピメラーゼ、グルコースイソメラーゼ、乳酸ラセマーゼ、リシンアミノムターゼなどの異性化酵素；グリシンメチルトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、リシンアセチルトランスフェラーゼ、グルタミルトランスフェラーゼ、フォスフォリラーゼ、ヘキソキナーゼ、フォスフォグリセロムターゼ、グルタミン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチターゼ、クレアチンホスホキナーゼなどの転移酵素；アルコールデハイドロゲナーゼ、アルデヒドデハイドロゲナーゼ、フマレートリダクターゼ、ラクテートデハイドロゲナーゼ、グルコースデハイドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ニコチネートデハイドロゲナーゼ、ハイドロキシルアミンオキシダーゼ、グルタチオンデハイドロゲナーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポオキシゲナーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼなどのような酸化還元酵素；オルニチンデカルボキシラーゼ、リシンデカルボキシラーゼ、エノラーゼ、トリプトファンシンセターゼ、アデニレートシクラーゼなどのリアーゼ；ｔＲＮＡシンセターゼ、アセチルＣｏＡシンセターゼ、グルタミンシンセターゼなどのリガーゼを挙げることができる。
【００１７】
本発明の酵素吸着剤は酵素を保持するための担体として使用することができる。
この場合、酵素吸着剤と酵素の結合方法は、酵素吸着剤が溶解でき、かつ酵素の活性に悪影響しないｐＨの水性媒体中で混合するのみで達成できる。
酵素吸着剤と酵素の混合割合は、酵素吸着剤の組成、酵素の種類や純度などにより異なるが、酵素吸着剤１００重量に対して、酵素は、通常１〜１００重量部、好ましくは２〜２０重量部である。
また、本発明において、酵素吸着剤に結合する酵素の割合は５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上である。
吸着した酵素の水溶液のｐＨの調整は、それ自体公知の如何なる方法によっても実施できる。すなわち、酸性にするためには塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ほう酸などの無機酸、或いは酢酸、クエン酸、しゅう酸、乳酸などの有機酸を、一方アルカリ性にするためには水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、エタノールアミンなどのアミンなど用いることができる。ｐＨ調整において、高濃度の酸やアルカリを用いると局所的に酵素が失活する恐れがあるので、０.１〜２Ｎ程度の濃度で調整することが好ましい。
【００１８】
本発明の酵素吸着剤による酵素の分離方法は、ｐＨの制御という簡単な手段によって酵素を水不溶化して溶液から分離・回収できる特徴を有するため、核酸を精製する目的にも使用することができる。
具体的には、微生物や組織、細胞、血液など生体組織を超音波処理などの処理により無細胞化後、酵素吸着剤が溶解する条件のｐＨとし、酵素吸着剤を添加する。次にｐＨを下げて酵素吸着剤に吸着した酵素を析出させ遠心分離することにより酵素などのタンパク質を、脂質など水不溶性物質と共に沈降分離でき、核酸を含む上清から分離することができる。本発明によれば、短時間で核酸の精製が可能となるため、遺伝子解析におけるＰＣＲ法などにも応用できる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
メタクリル酸６０ｇとアクロレイン４０ｇとをメタノール１５０ｇに溶解し、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル２ｇを加え７０℃で２０時間重合した。重合転化率は９２％であった。次いで、水酸化ナトリウム２０ｇと水４００ｇを添加し、減圧蒸留によりメタノールおよび残留モノマーを除去した後、ｐＨ調整剤と調整水を添加して固形分濃度１０重量％、ｐＨ＝７の共重合体（特定重合体１）水溶液を得た。
得られた共重合体水溶液１００μＬに、ｐＨ７のリン酸緩衝液１０ｍＬに１０ｍｇ溶解したセルラーゼ（Tricoderma reesei、Sigma 製）の溶液１ｍＬを添加し、４℃、２時間混合して共重合体とセルラーゼを結合し、修飾された酵素を得た。
その後、ｐＨ２.６の酢酸緩衝液を添加して修飾された酵素を析出させた後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄した後、ｐＨ５の酢酸緩衝液２ｍＬ添加し再溶解した。その後またｐＨ２.６の緩衝液を添加することにより修飾された酵素を析出させ遠心分離した後上清を廃棄し、再びｐＨ５の緩衝液１ｍＬを添加し溶解させた。
２回の水不溶化−可溶化操作の後のセルラーゼを、Ｌｏｗｒｙ法で定量したところ、セルラーゼの回収率は９１％であった。またカルボキシメチルセルロースを基質としてセルラーゼの活性を測定したところ相対活性８９％であった。
【００２１】
実施例２〜３および比較例１〜３
実施例１において、メタクリル酸（ＭＡＡと略す）、アクロレイン（ＡＬと略す）、メチルメタクリレート（ＭＭＡと略す）を表１に示した組成に変更する以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0003718840.tif 000002
【００２３】
試験例１
（１）ヒト白血球の癌細胞であるＫ５６２細胞を１重量％牛胎児血清を含むＰＲＭ１−１６４０培地で培養した。培養懸濁液１ｍＬ当り５０万の細胞となった時点で、１ｍＬの培養懸濁液をサンプリングチューブに取り、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。細胞に対し１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.２を添加した後、超音波処理により無細胞化し、試料とした。
（２）実施例１で合成したｐＨ７、固形分濃度１０重量％の特定共重合体（１）水溶液としたもの１００μＬを上記試料に添加し、４℃で２時間酵素と共重合体を結合した後、ｐＨ３の酢酸緩衝液を１ｍＬ添加し修飾酵素を不溶化し沈澱させた。その後３０分間遠心分離を行い脂質など水不溶性物質と共に酵素等のタンパク質を沈降させて、精製された核酸を含む上清を得た。以上のように精製された核酸に制限酵素を作用させた結果、制限酵素による反応は阻害されなかった。
【００２４】
試験例２
試験例１（１）で得た無細胞化したＫ５６２細胞溶解液を、それぞれ０.５ｍＬ、３本の２ｍＬ遠心チューブに取り、ｐＨ５の１０ｍＭリン酸緩衝液で２ｍＬまで希釈した。この希釈液の中にエイズウィルスＤＮＡを組み込んで培養したヒト白血球（ＮＹ１０株）から取ったＨＩＶ−１ＤＮＡをチューブ１、２、３に、０分子、１０分子、５０分子分それぞれ加えた。ボルテックス後、各チューブに実施例１で合成した固形分濃度１０重量％の特定共重合体１水溶液を２μＬ添加し、室温で５分間回転攪拌した（１０ｒｐｍ）。
次いで、ｐＨ３の酢酸緩衝液を添加し共重合体を析出させた後３,０００ｒｐｍで３分間遠心し、核酸のみを上清とし回収した。上澄をピペットで別の遠心チューブに移し取り、２５μＬのポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応溶液を加えて、ＰＣＲ反応を行った。
【００２５】
ＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりである。
0003718840.tif 000003
【００２６】
プライマー  ＳＫ１４５Ａの配列は
５’ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ  ３’
プライマー  ＳＫ４５１Ａの配列は
５’ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ  ３’
であって、これらをアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成器３８１Ａ型を用いて、メーカーマニュアルに従って合成し、ＨＰＬＣで精製品を得た。
【００２７】
なお、ＰＣＲ反応はPERKIN ELMER CETUS 社製のサーマルサイクラー モデルＪＰ２０００を用いて、次のプログラムで増幅反応を行った。
９４℃    ０.５分
５５℃    １.０分
７２℃    １.５分
３０サイクル
７２℃    ７分
上記１回目のＰＣＲ法による増幅反応の生成物を５μＬ取り、同様なプログラムでＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の反応を行った。その時のＰＣＲ法の反応液の組成はプライマー  ＳＫ１４５Ａの代わりにＳＫ１４５（タカラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１を使用した以外は同様に行った。
【００２８】
ＰＣＲ法およびＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の反応増幅産物を２重量％のアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムプロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。その結果を表２にまとめて示す。
この結果により、本発明による修飾された酵素を用いることにより、ＤＮＡのみ回収することができるためＰＣＲ法に利用できることがわかった。
【００２９】
【表２】
0003718840.tif 000004
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、高価な結合用試薬を用いることなく、酵素と混合するのみで酵素を吸着することができる。また、本発明に用いる酵素吸着剤は、ｐＨをコントロールするのみで不溶化し反応系から分離できるため再利用が可能となる。また本発明に用いる酵素吸着剤はｐＨ、熱の変化、酸、アルカリに対しても耐久性が増すという効果もある。本発明の酵素吸着剤による酵素の分離方法は、核酸の精製が効率よくできる効果もあるため遺伝子解析におけるＰＣＲ法等へも応用できる。