(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
信号反応の調節剤と推定される化合物のスクリーニング法であって、
(ａ)化合物を、蛍光を発することができるＲＡＣプロテインキナーゼのＰＨドメインとインキュベートすること；
(ｂ)ＰＨドメインの蛍光のリン脂質誘発調節を測定すること、ここで、該化合物の存在下の蛍光の変化は化合物とＰＨドメインの間の機能的相互作用の指標である、
の段階を含む、方法。
【請求項２】
蛍光がＰＨドメインのＮ−末端に位置するTrp残基に関連するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
蛍光残基がTrp22である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
調節剤と推定される化合物を、精製ＰＨドメインとインキュベートすることを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＰＨドメインを、細菌宿主内でＧＳＴ融合タンパク質としてコードする組換え発現ベクターを発現させ、続いてスロンビンでＧＳＴ融合タンパク質を開裂させ、ＰＨドメインを精製することにより製造する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＰＨドメインを２９０nmで励起し、蛍光を３４５nmで検出する、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＲＡＣが関与する信号伝達経路の調節剤の可能性のある化合物のスクリーニング法およびこのようは方法におけるＲＡＣ−ＰＫのプレクストリン相同ドメインの使用に関する。
キナーゼドメインがｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ(ＰＫＡ)およびＣａ2+／リン脂質依存性プロテインキナーゼ(ＰＫＣ)に密接に関連しているセリン／スレオニンプロテインキナーゼのＲＡＣサブファミリー[Jones, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 4171-4175;Jones, et al. (1991) Cell Reg. 2, 1001-1009]は、アミノ末端プレクストリン相同(ＰＨ)ドメインを含む[Haslam, et al. (1993) Nature 363, 309-310]。ヒトＲＡＣ−ＰＫαのアイソフォームがv-aktの原癌遺伝子形であり、ミリスチル化配列を提供する、アミノ末端に切断されたgag配列の付加を有する、完全ＲＡＣ−ＰＫをコードする。
ＰＨドメインは本来プレクストリンのアミノおよびカルボキシ末端に存在する内部反復である、活性化血小板の主要なＰＫＣ基質である４７kDaタンパク質として同定された[Tyers, et al. (1988) Nature 333, 470-473]。ＰＨドメインのスーパーファミリーは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ(ＲＡＣ−ＰＫ、Ｎｒｋ、βＡＲＫ、ＰＫＣμ)、チロシンプロテインキナーゼ(Ｂｔｋ、Ｔｅｃ、Ｉｔｋ)、ＧＴＰａｓｅ調節剤(ｒａｓ−ＧＡＰ、ｒａｓ−ＧＲＰ、Ｖａｖ、ＳＯＳ、ＢＣＲ)、哺乳類ホスホリパーゼＣｓの既知のもの全て、細胞骨格性タンパク質(β−スペクトリン、ＡＦＡＰ−１１０、シントロフィン)、“アダプター”タンパク質(ＧＲＢ−７、３ＢＰ２)およびキナーゼ基質(プレクストリン、ＩＲＳ−１)を含む、６０のメンバーを越える分子から成る。
ＰＨドメイン構造はβ−スペクトリン、ダイナミンおよびプレクストリンアミノ末端ドメインに関して解決されているが、その正確な機能は明らかでないままである。多くの信号伝達および細胞骨格性タンパク質におけるＰＨドメインの存在は、それをタンパク質−タンパク質相互作用に介在することを示唆する。実際、β−アドレナリン作動性受容体キナーゼ(βＡＲＫ)のＰＨドメインは、そのβ−アドレナリン作動性受容体に関するヘテロ３量体Ｇ−タンパク質のβγ−サブユニットへの結合に部分的に関与しているように思えるが、バートンのチロシンキナーゼ(Ｂｔｋ)のＰＨドメインはＰＫＣとの相互作用に介在するように思える。いくつかのＰＨドメインはホスファチジル−イノシトール−(４,５)−ビスホスフェートにインビトロで結合できることが示されているが、非常に弱い。
出願人は、本発明により、ＲＡＣ−ＰＫのＰＨドメインが高親和性でリン脂質に結合することを示し、これはＲＡＣ−ＰＫがインビボでＰＨドメインを介して膜結合している可能性を示唆する。更に、リン脂質のＲＡＣ−ＰＫ  ＰＨドメインへの結合はその内因性Ｔｒｐ蛍光を消去する。
発明の要約
本発明の第１の態様により、従って、出願人は：
(ａ)化合物を蛍光を発することができる信号伝達物質のＰＨドメインとインキュベートする；
(ｂ)ＰＨドメインの蛍光のリン脂質誘発調節の測定(化合物の存在下の蛍光の変化は化合物とＰＨドメインの間の機能的相互作用の指標である)
の段階を含む、信号反応の調節剤と推定される化合物のスクリーニング法を提供する。
発明の詳細な説明
観察される信号伝達物質のＰＨドメインのＮ−末端へのリン脂質の高親和性結合は、ＰＨドメインがこの分子の膜錨として機能することを示す。分子と細胞膜の相互作用は信号伝達経路における膜結合対との安定な相互作用に重要であり、この相互作用の中断が細胞膜からの信号伝達物質の解離を通して信号伝達効果の調製をもたらすと考えられている。調節は、例えば、分子と膜結合対のそうでない場合に安定な相互作用が刺激性相互作用である場合には下方調節であり、または相互作用が阻害性相互作用である場合においては上方調節である。
従って、細胞膜に存在するリン脂質へのＰＨドメインの結合に影響する化合物は、信号反応の調節剤の可能性がある。
このような化合物は、リン脂質への親和性の増加または減少をさせる、ＰＨドメインにおける配座変化をもたらす薬剤、またはＰＨドメインの細胞膜、例えばリン脂質分子またはイノシトールホスフェートへの結合と直接競合する化合物である。
分子のＰＨドメインの効果は直接的または間接的であり得る。言い換えれば、化合物は直接ＰＨドメインと相互作用し、その膜リン脂質に対する親和性を変え得るか、またはその作用をＰＨドメインとの直接相互作用無しに、例えば、分子の他のドメインとの相互作用し、それによりＰＨドメインに影響を及ぼし、例えば、配座的変化をもたらすことにより作用し得る。ＰＨドメインに直接作用する化合物は、単離ＰＨドメインを使用してスクリーニングし得、一方それに間接的作用を有する化合物は、信号伝達分子をそのまま使用してスクリーニングしなければならない。
本発明の信号伝達分子は、ＰＨドメインを有する信号伝達経路に関与する全分子を含むが、この方法はリン脂質結合アミノ末端に蛍光基を有するＰＨドメインでのみ実施可能であることは明らかである。このような分子は、ＲＡＣ−ＰＫにおけるTrp22と相同性のＴｒｐ残基により特徴付けられる。
好ましくは、本発明の方法を、細胞内信号伝達および生育制御に関与するプロテインキナーゼおよびその基質に適応する。有利には、この方法をリン脂質結合依存的方法で、リン脂質に高親和性を示し、Trp22を介して蛍光を発するＲＡＣキナーゼおよびそのＰＨドメインに適応する。
本発明で使用する単離ＰＨドメインは、ドメインのＣ−末端の少なくとも３つの親水性アミノ酸の伸長を用いた組換え発現により下記のように製造し得る。細菌細胞培養物におけるドメインの収率および溶解性はこれにより増加することが判明する。
好ましくは、３個から１０個の間の付加アミノ酸残基がドメインのＣ−末端に存在する。有利には、３個から６個の残基を付加する。一般に、存在する残基の数が多い程、それにより付与される親水性が増加する。しかしながら、遺伝子生産物への過度な長い付加を明らかに有利に避けることにより平衡を保つ。
任意の親水性アミノ酸が本発明での使用に適している。一般に、親水性アミノ酸は、水への溶解性を改善する極性Ｒ−基を有する。このようなアミノ酸は、グリシン、セリンまたはスレオニンのような非電荷Ｒ−基もしくは陰性(酸性)に荷電したアスパラギン酸またはグルタミン酸および陽性(塩基性)に荷電したリジンまたはアルギニンのような荷電Ｒ−基を有し得る。好ましくは、しかしながら、リジン、アルギニンおよびヒスチジンのような塩基性アミノ酸である。最も好ましくはリジンである。
１個以上の付加アミノ酸を使用する時、付加アミノ酸は同一または異なり得る。例えば、３個のリジンを使用することが可能である。あるいは、二つのリジンと一つのアルギニン残基を合わせ得る。
本発明を使用する発現システムは、本質的に、下記の要求を満たすように標準方法を修飾した慣用発現システムである。実施において、本発明は細菌宿主細胞における細胞内異種ポリペプチドの製造を必要とする当分野で既知の発現システムで開始し得る。細菌宿主細胞は、異種ポリペプチドの製造に使用できることが知られている細菌細胞であり得るが、大腸菌(E. coli)および枯草菌(B. subtilis)細胞が好ましい。大腸菌が特に好ましい。
典型的に、細菌宿主細胞を異種ポリペプチドをコードするコード配列を含む発現ベクターで形質転換し、それにＣ−末端に添加する親水性アミノ酸をコードするヌクレオチドの必要な数を添加する。ヌクレオチドのコード配列への付加は、オリゴヌクレオチドリンカーの挿入または部位指向的変異誘発のような慣用法により行い得る。別の態様において、しかしながら、適当なコドンの上流に、Ｃ−末端親水性伸長をコードする必要なヌクレオチドが既に配置された発現ベクターを構築し得、異種ポリペプチドをコードする配列を慣用の制限酵素による切断および貼り付けによりその上流に直接挿入し得る。
可溶性ＰＨドメインの所得は、更に融合タンパク質の形でのその発現により増進し得る。この技術は別のポリペプチドとの融合としてのドメインの発現に関与する。通常、異種ポリペプチドのＮ−末端に融合した別のポリペプチドの最初の数個のアミノ酸のみが存在する。この融合は、混成遺伝子が発現して融合タンパク質を製造するように、ドメイン中の正確なリーディングフレームを保つことを注意してＤＮＡレベルで行う。
融合は細菌性のような天然または人工起源であり得る適当な遺伝子と行うことが可能である。従って、例えば、融合はβ−ガラクトシダーゼまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)遺伝子と行い得る。好ましくは、しかしながら、人工融合物を人工遺伝子を使用して製造する。有利には、人工遺伝子によりコードされる別のポリペプチドの組成を選択し、融合タンパク質発現生産物の溶解性を更に改善する。有利には、従って、別のポリペプチドは前記で定義のような親水性アミノ酸を含む。別のポリペプチドは、このようなアミノ酸を合理的な数で含み得るが、３個から１０個の範囲が好ましく、５個から１０個がより好ましい。有利には、別のポリペプチドは約６個のアミノ酸を含む。
好ましくは、別のポリペプチドを含むアミノ酸は塩基性である。ヒスチジンを有利には使用する。
従って、有利には、発現ベクターは融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するのに適している。このようなベクターの多くは商品として入手可能である。本発明の内容において特に有用なものは、InvitrogenのpRSETベクターのような、親水性性質の別のポリペプチドとの融合物を発現するベクターである。
親水性アミノ酸を含む別のポリペプチドの使用の利点は、融合タンパク質の両端が親水性性質であり、従って更に異種ポリペプチドの溶解性を促進することである。
融合タンパク質の一部として別のポリペプチドを含む本発明の末端に付加されたアミノ酸は、融合タンパク質で通常行われている末端消化、酵素的開裂または他の手段により、細胞培養物から異種ポリペプチドを精製する間またはその後に除去し得る。酵素的開裂の場合、末端付加物は有利には制限酵素または化学修飾剤のための開裂部位を含み、付加アミノ酸の除去を可能にする。
本発明で使用する発現ベクターは、意図される宿主細胞中での発現を達成するために必要な調節配列を含む。加えて、エピソーム状態で存在するために、プラスミド複製に必要な必須配列を含み得るか、または染色体統合のために設計し得る。
調節配列は、異種ポリペプチドをコードする配列を操作できるプロモーターを含む。例えば、ＳＶ４０、アデノウイルスまたはｈＣＭＶプロモーターのような強いウイルス性プロモーターを使用し得る。しかしながら、可溶性異種ポリペプチドの発現は、誘導可能プロモーターの使用により更に促進し得る。誘導可能プロモーターは、宿主細胞が特定の刺激を受けることにより誘導されるまで不活性かまたは低いレベルでのみ活性であるプロモーターである。その主要な利点は、異種ポリペプチド発現の誘発前に必要な細胞密度に細胞を培養することが可能となり、それにより細胞生育が完了するまで細胞への代謝物の過剰な積載を避けるということである。多くの誘導可能プロモーターが当分野で利用可能であり、一般に非必須栄養素の合成の発現を制御する細菌性プロモーターが誘導可能である。例えば、大腸菌のｔｒｐプロモーターは生育培地の低いＴｒｐ濃度で誘導される。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ(ｌａｃＺ)プロモーターは、一方、ＩＰＴＧの投与により誘導可能である。ウイルスプロモーターを使用する時、誘導性は、あるウイルスプロモーターに必要なトランスアクチベーターの供給の制御の手段により達成し得る。アデノウイルス前初期プロモーターは、例えば、Ｅ１Ａ遺伝子生産物によりトランス活性化される。
細菌培養は、通常３７℃で行い、ｌａｃＺプロモーターのような誘導可能プロモーターの誘導は、通常の培養温度で行いに得る。しかしながら、低い温度で発現を誘発することにより、生産物の収率および溶解性が増加し得ることを出願人は発見した。好ましくは、従って、誘発は３７℃より下で行う。好ましい範囲は２０から３３℃であり、２４℃が最も好ましい温度である。好ましくは、誘導温度は異種ポリペプチドが発現する間維持する。
本発明により製造した異種ポリペプチドは溶解性であるが、細胞内に位置するため、その回収は細菌細胞壁の融解および細胞融解物からの異種ポリペプチドの回収を必要とする。典型的に、遠心および続くクロマトグラフィー法によるタンパク質の精製による、粒子細胞残渣からの回収を含む、慣用の回収法を使用し得る。末端親水性アミノ酸の包含は、ポリペプチドの等電点を著しく変化し得、中性ｐＨでのカチオン交換カラムでの親和性精製を促進する。更に、親水性アミノ酸としてのヒスチジンの包含は、異種ポリペプチドのＨｉｓタグの性質により、精製をＮｉ(II)アフィニティーカラムで容易に達成し得ることを意味する。更に、純粋な異種ペプチドの製造のために、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーのような慣用の精製法を実施し得る。
少量のＰＨドメインで十分であるが、しかしながら、ＰＨドメインは、細菌細胞内でそれを単純融合タンパク質の形でコードする核酸配列を発現することにより得ることができ、それを続いて当分野で既知の方法により開裂する。例えば、ＰＨドメインをコードするＲＡＣ−ＰＫの１−１３１アミノ酸は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合物として発現され得、続いて融合タンパク質をスロンビンで開裂し、ドメインをＦＰＬＣのようなタンパク質精製法により単離する。この方法により、純粋な可溶性ＰＨドメインが相対的に低い収率で得られる。
本発明で使用するＲＡＣ−ＰＫは、１９９５年１２月１５日出願のＵＫ特許出願９５２５７０２.８(チバーガイギー・アクチエンゲゼルシャフト)の記載に従い製造し得る。あるいは、ＲＡＣ−ＰＫを組換え細胞培養物中に発現し得る。特に昆虫細胞培養を意図したバキュロウイルスベクターが特に好ましく、商品として(例えば、インビトロゲンおよびクローンテックから)広く入手可能である。昆虫細胞に感染できる他のウイルスベクターは、既知であり、例えばSindbisウイルスである(Hahn et al., (1992) PNAS (USA) 89, 2679-2683)。選択したバキュロウイルスベクター(Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42, 177-199によりレビュー)はオートグラファ・カルボルニカ(Autographa californica)多核多角体病ウイルスであるＡｃＭＮＰＶである。
典型的に、多角体がウイルス製造に必須でないため、異種遺伝子はＡｃＭＮＰＶの多角体遺伝子の少なくとも一部を置換する。異種遺伝子を挿入するため、トランスファーベクターを有利には使用する。トランスファーベクターを大腸菌宿主中で製造し、次いでＤＮＡ挿入物をＡｃＭＮＰＶに異種組換えの方法で移入する。本発明で有用なバキュロウイルス法は標準的であり当分野で既知であり、O'Reilly et al., (1994) Baculovirus expression vectors; A laboratory manual, Oxford University Press Inc., NY, USAおよびバキュロウイルスベクターキット商品の供給者(例えば、ファルミンゲン)により刊行されている文献でレビューされている。
ＰＨドメインのＴｒｐ残基の蛍光は、分子を励起させ、適当な周波数で蛍光を発するようにし、放出を追跡することにより検出し得る。例えば、ＲＡＣ−ＰＫは２９０nmで励起した時、３４５nmで蛍光を発する。タンパク質蛍光を追跡する技術は当分野で広く知られている。
本発明を説明のみの目的で、以下の実施例により更に詳述する。
比較実施例１
ＰＨドメインの発現
ＲＡＣ−ＰＫのＰＨドメインは非融合タンパク質として下記のように細菌細胞培養物中に発現される：細菌(ＸＬ１blue；ストラタジーン)を構築物ｐＲＫ−ＰＨ１１０またはｐＲＫ−ＰＨ１３１で形質転換する。ｐＲＫ−ＰＨ１１０およびｐＲＫ−ＰＨ１３１はそれぞれヒトＲＡＣ−ＰＫαのアミノ酸１−１１０および１−１３１を含む。ｐＲＫ−ｈＲＡＣ−ＰＫαのNdeI-PflMIおよびNdel-AlwNIフラグメントを単離し[Jones, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 4171-4175]、それらをｐＲＫ１７２のNdeI-EcoRI部位[McLeod et al., (1987) EMBO J. 6, 729-736]に、PflMI-EcoRIリンカー[５'オリゴ5'-GTG GCT GAC GGC CTC TGA G-3'(配列番号７)、３'オリゴ5'-AAT TCT CAG AGG CCG TCA GCC ACA GT-3'(配列番号８)]およびAlwNI-EcoRIリンカー[５'オリゴ5'-CTT GAT GAG-3'(配列番号９)、３'オリゴ5'-AAT TCT CAT CAA GCC C-3'(配列番号１０)]を使用してライゲートすることにより構築する。一般的分子生物学法は先[Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY;Davis, et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier Science Publishing Co., New York, NY]に記載のように行う。
細菌(JM109)をＬＢ培地で３７℃で、１５０rpmの回転で空気震盪機で生育させる。上記のプラスミドを担持する株の０.１ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導は、１.０のＯ.Ｄ.660nmに０−１６時間、３７℃で到達した時に開始する。培養物のアリコートを種々の時点で回収し、１容量のＰＢＳで洗浄し、分析する前まで−８０℃で貯蔵する。細胞ペレットをフレンチプレスを使用して緩衝液(ＰＢＳ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭベンズアミジン、０.１ｍＭ  ＰＭＳＦ)に融解する。次いで融解物を１２０００×ｇで遠心し、可溶性および不溶性タンパク質フラクションを分離する。不溶性ペレットを上記緩衝液に再懸濁する。可溶性および不溶性フラクションのタンパク質をクマーシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質定量アッセイを使用して定量する。タンパク質調製物を、ウサギにＲＡＣαタンパク質を皮下注射して発生させ、５０％(ＮＨ4)2ＳＯ4、続いてプロテイン−Ａ−セファロース(ファルマシア)のアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した細菌的に発現させた完全な長さのヒトＲＡＣ−ＰＫαに対して指向するポリクローナルウサギ抗血清を使用して、またウエスタンブロッティング分析に付す[Harlow, E.およびLane, D. (1988)Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY]。二次抗体は、抗ウサギ抗体に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ(アメルシャム)であり、これをＥＣＬ法(アメルシャム)を使用して、オートラジオグラフィーにより検出する。
この方法はかなりの量(〜２０mg／ｌ)のタンパク質を製造するが、完全な不溶性形である。
実施例２
ＲＡＣ−ＰＫのＰＨドメインは(Ｈｉｓ)6タグを有する融合ポリペプチドとして発現される
ｐＲＳＥＴ−ＰＨ１１０およびｐＲＳＥＴ−ＰＨ１３１は、アミノ末端(ＨＩＳ)6−タグを有するヒトＲＡＣ−ＰＫαのアミノ酸１−１１０および１−１３１のフレーム内融合物をそれぞれ含む。それらは、それぞれｐＲＫ−ＰＨ１１０またはｐＲＫ−ＰＨ１３１のNdeI-EcoRIフラグメントを、BamHI-NdeIリンカー[５'オリゴ5'-GAT CCG CTG GAG C-3'(配列番号１３)；３'オリゴ5'-TAG CTC CAG CG-3'(配列番号１４)]を使用してｐＲＳＥＴ−ＡのBamHI-EcoRIに挿入することにより構築する。
ｐＲＳＥＴ−ＰＨ１１２はアミノ末端(ＨＩＳ)6−タグと共にヒトＲＡＣ−ＰＫαのアミノ酸１−１１２のフレーム内融合物を含む。これは、ｐＲＫ−ｈＲＡＣ−ＰＫαのNdeI-PflMIフラグメントを、BamHI-NdeIリンカー(上記参照)およびPflMI-EcoRIリンカー[５'オリゴ5'-GTG GCT GAC GGC CTC AAG AAG TGA G-3'(配列番号１８)；３'オリゴ5'-AAT TCT CAC TTC TTG AGG CCG TCA GCC ACA GT-3'(配列番号１５)]を使用してｐＲＳＥＴ−ＡのBamHI-EcoRI部位へサブクローニングすることにより構築する。
発現条件は、細菌株JM109(DE3)、BL21(DE3)pLysSおよびBL21(DE3)pLysE(インビトロゲン)を(ＨＩＳ)6−タグタンパク質の製造に使用した意外、比較実施例１に記載の通りであった。
ｐＲＳＥＴ構築物(ｐＳＲＥＴ−ＰＨ１１０、ｐＲＳＥＴ−ＰＨ１１２およびｐＲＳＥＴ−ＰＨ１３１)は部分的に(〜２０％)可溶性のタンパク質(〜２mg／ｌ)を著しい量で製造する。株BL21(DE3)pLysEは、BL21(DE3)pLysSのものと別な結果をもたらす。しかしながら、株JM109(DE3)は、低い溶解性の少ないタンパク質を製造し、ＢＬ２１株と同程度誘導可能ではない。
実施例３
pRSET-PHQ116KKKは、アミノ末端(ＨＩＳ)6−タグ、カルボキシル末端への３個のリジンの付加および内部メチオニンを有するヒトＲＡＣ−ＰＫαのアミノ酸１−１１６のフレーム内融合を含み、アミノ酸数６３はグルタミンに変異している。これは、PvuII-BbsIリンカー[５'オリゴ5'-CTD CAA AAG ACG G-3'(配列番号１６)；３'オリゴ5'-CGC TCC GTC TTT TGC AG-3'(配列番号１７)]を、PvuII-BbsIで消化したｐＲＳＥＴ−ＰＨ１３１に挿入することにより構築する。PflMI-EcoRIリンカー[５'オリゴ5'-GTG GCT GAC GGC CTC AAG AAG CAG AAG AAG AAG TGA G-3'(配列番号１８)；３'オリゴ5'-AAT TCT CAC TTC TTC TTC TGC TTC TTG AGG CCG TCA GCC ACA GT-3'(配列番号１９)]を次いで得られたプラスミドのPflMI-EcoRIに挿入する。用いるｐＲＳＥＴベクターのＣ−末端の差異を表１に示す。
0003695760.tif 000002
pＲＳＥＴ発現構築物の間の差異の要約は、種々のカルボキシ末端因子を含む。
実施例３に記載の発現条件を使用して、pRSET-PHQ116KKKは著しい(〜５mg／ｌ)量の殆ど可溶性の生産物を製造する。３７℃と比較して２４℃での誘導はまた生産高および収率を増加させる。製造は２４℃での誘導で２時間後付近にピークに達する。
２４℃で２時間誘導することによるpRSET-PH116KKKで形質転換したBL21(DE3)pLysSでの大規模な(２０Ｌ)製造を使用し、〜１００mgのタンパク質を精製する。(ＨＩＳ)6タグの存在は下記のようなNi(II)アフィニティーカラムでの精製を可能にする：プラスミドpRSET-PHQ116KKKを担持するBL21(DE3)pLysS細胞由来のタンパク質の可溶性フラクションを０.１ｍＭ  ＩＰＴＧで２４℃、２時間誘導後に単離し、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.２、１.０Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭベンズアミジンに溶解し、０.１ｍＭ  ＰＭＳＦをカラムで流す。５mlハイ−トラップ金属キレーティングカラム(ファルマシア)を、Ni(II)イオンを含むように、製造者が記載のように製造する。カラムにサンプルを流した後、各５床容量の平衡緩衝液(２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.２、１.０Ｍ  ＮａＣｌ)、アンモニア緩衝液(２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.２、１.０Ｍ  ＮａＣｌ)、低ｐＨ緩衝液(２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３.５、０.５Ｍ  ＮａＣｌ)および最後にストライプ緩衝液(２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７.２、１.０Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ)で連続して洗浄する。次いで溶出フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
これは約５０倍の精製を成す。融合タンパク質の高い等電点(pl  ９.６)は、下記のようにカチオン交換カラムの使用を可能にし、タンパク質を更に５０倍濃縮する：サンプルを緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.０、０.１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ)で透析により平衡化し、同じ緩衝液で平衡化したハイ−ロード−Ｓ−カチオン交換カラム(ファルマシア)に流す。次いでタンパク質が上記緩衝液中の０.１から１.０ＭのＮａＣｌ上行性直線勾配で溶出する。カラムをＦＰＬＣシステム(ファルマシア)に結合させる。回収フラクションを次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
第３段階は１ｌセファクリルＳ−３００ＨＲゲル濾過カラム(ファルマシア)での精製である。サンプルを限外濾過ユニット(ファルマシア)を使用して５ml(５mg／ml)に濃縮し、次いで２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.０、０.２Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴで平衡化したカラムに付す。タンパク質を同じサンプルで溶出し、フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
ゲル濾過カラムでのこの第３の精製段階は、ほぼ均質な調製物を製造する。精製タンパク質をヒトＲＡＣ−ＰＫα特異的ポリクローナル抗血清を使用したウエスタンブロット分析により興味の対象のタンパク質であることを確認する。精製タンパク質の末端ペプチド配列決定は、１０アミノ酸が予定された配列と同じであることを示す。
実施例４
ＧＳＴ融合物としてのＲＡＣ−ＰＫ  ＰＨドメインの製造
一般分子生物法を先[Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY;Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,441頁, 第２版, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, NY;Davis, et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology. Elsebier Science Publishing Co., New York, NY]に記載のように行う。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)融合ベクターｐＧＥＸ−２Ｔをピー・マシアス博士(FMI, Basel, Switzerland)から得る。pRKPH131はヒトＡＣ−ＰＫα(配列番号１および２)のアミノ酸１−１３１を含む。それは、pRK-hRAC-PKαからNdeI-AlwNIフラグメントを単離し[Jones, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 4171-4175]、AlwNI-EcoRIリンカー[５'オリゴ5'-CTT GAT GAG-3'(配列番号３)、３'オリゴ5'-AAT TCT CAT CAA GCC C-3'(配列番号４)]を使用してｐＲＫ１７２のNdeI-EcoRI部位にライゲートすることにより構築する。
pRSET-PH131はヒトＲＡＣ−ＰＫαのアミノ酸１−１３１をアミノ末端(ＨＩＳ)6−タグと共にフレーム内に含む。それは、pRK-pRK-PH131を、BamHI-NdeIリンカー[５'オリゴ5'-GAT CCG CTG GAG C-3'(配列番号５)；３'オリゴ5'-TAG CTC CAG CG-3'(配列番号６)]を使用して、pREST-A(インビトロゲン)のBamHI-EcoRI部位に挿入することにより構築する。
pGEX-PH131はヒトＲＡＣ−ＰＫαのアミノ酸１−１３１をＧＳＴと共にフレーム内に含む。それは、pRSET-PH131のBamHI-EcoRIフラグメントを、ｐＧＥＸ−２ＴのBamHI-EcoRI部位にサブクローニングすることにより構築する。
発現ベクターをコードするGST-RAC-PK融合タンパク質は、下記のように大腸菌細胞中で発現される：細菌(JM109)をＬＢ培地で３７℃で空気震盪機中で１５０rpmで回転させながら生育させる。上記のプラスミドを担持する株の０.１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導を、培養がＯ.Ｄ.660nmが０.８に、２５℃、３時間で到達した時に開始する。細胞ペレットをフレンチ・プレスを使用して緩衝液(ＰＢＳ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭベンズアミジン、０.１ｍＭ  ＰＭＳＦ)に融解する。次いで、融解物を１２０００×ｇで５分、４℃で遠心し、可溶性および不溶性タンパク質フラクションを分離する。ＧＳＴ融合タンパク質は沈殿するか、またはアガロースに結合したグルタチオンに結合し、洗浄し、グルタチオンで溶出してスロンビンで処理してＧＳＴ融合ペプチドを除去し、標準法によりＦＰＬＣでＭｏｎｏ−Ｑで濃縮する。
JM109中に構築されたpGEX-PH131は可溶性タンパク質を製造し、それは容易に精製可能であるが、収率は高くない(２００μg／ｌ)。
実施例５
ＲＡＣプロテインキナーゼの製造
完全な長さのヒトＲＡＣ−ＰＫαをバキュロウイルスシステムで発現させ、精製する。簡単に、Ｓｆ９細胞をpVL1392-hRAC-PKαと野生型バキュロウイルスAcMNPV  ＤＮＡとの共トランスフェクションによりバキュロウイルスを構築し、制限希釈により精製し、ドット−ブロットハイブリダイゼーションにより検出する。精製ウイルスをＳｆ９細胞中にヒトＲＡＣ−ＰＫαを製造するのに使用する。ヒトＲＡＣ−ＰＫαを連続したアニオン交換、ホスホセルロースおよびゲル濾過クロマトグラフィーで精製する。
実施例６
ＲＡＣ−ＰＫ  ＰＨドメインの蛍光
実施例１に従い得た精製ＰＨドメインを１.４μＭの濃度で、１０ｍＭ  Ｈepes／ＮａＯＨ、ｐＨ７.０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で２５℃でインキュベートする。５.０nmのスリット広および６.５nmの放出スリット広を使用して、２９０nmで励起した時、約８００ＲＵのピーク蛍光が３４５nmで観察される。
実施例７
リン脂質およびイノシトールホスフェートが蛍光を減少させる
実施例３と同様の条件下で、RAC-PK  PHドメインを種々の濃度のリン脂質およびイノシトールホスフェートとインキュベートし、蛍光を測定する。ピーク蛍光は３４５nmのままであるが、脂質の濃度に従って減少する。全ての場合、達成可能な最大の消去は３０％である。Ptd-Ins(3,4,5)トリホスフェートの場合、上記の範囲のＨepes／ＭｇＣｌ2でインキュベートした１００ｎＭ  ＲＡＣ−ＰＫ  ＰＨドメインの３４５nm蛍光の証拠は、０μＭでの０から最大６μＭでの実質上１００％までの範囲である。信号減少から、脂質およびイノシトールホスフェートの分離定数を計算でき、表１に示す通りである。
0003695760.tif 000003
配列表
(１)一般的情報：
(ｉ)出願人：
(Ａ)名称：チバーガイギー・アクチエンゲゼルシャフト
(Ｂ)通り：クライベックシュトラーセ１４１番
(Ｃ)都市：バーゼル
(Ｅ)国：スイス
(Ｆ)郵便番号(ＺＩＰ)：４００２
(Ｇ)電話番号：＋４１  ６１  ６９  １１  １１
(Ｈ)ファックス番号：＋  ４１  ６１  ６９６  ７９  ７６
(Ｉ)テレックス：９６２  ９９１
(ii)発明の名称：スクリーニング法
(iii)配列の数：
(iv)コンピューター読み取り可能形式：
(Ａ)媒体タイプ：フロッピーディスク
(Ｂ)コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ互換性
(Ｃ)オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
(Ｄ)ソフトウエア：ＰatentＩn  Ｒelease  ＃１.０, Ｖersion  ＃１.３０  (ＥＰＯ)
(２)配列番号１の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：２６１０塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(vi)起源：
(Ａ)生物：ホモ・サピエンス
(vii)直接の起源：
(Ｂ)クローン：ヒトＲＡＣ−ＰＫα
(ix)配列の特徴：
(Ａ)特徴を表す記号：ＣＤＳ
(Ｂ)存在位置：１９９..１６４１
(xi)配列の記載：配列番号１：
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0003695760.tif 000006
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0003695760.tif 000008
(２)配列番号２：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：４８１アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列の記載：配列番号２：
0003695760.tif 000009
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0003695760.tif 000011
(２)配列番号３の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：９塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号３：
0003695760.tif 000012
(２)配列番号４の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１６塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号４：
0003695760.tif 000013
(２)配列番号５の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１３塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号５：
0003695760.tif 000014
(２)配列番号６の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１１塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号６：
0003695760.tif 000015
(２)配列番号７の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１９塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号７：
0003695760.tif 000016
(２)配列番号８の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：２６塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号８：
0003695760.tif 000017
(２)配列番号９の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：９塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号９：
0003695760.tif 000018
(２)配列番号１０の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１６塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１０：
0003695760.tif 000019
(２)配列番号１１の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：３４塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１１：
0003695760.tif 000020
(２)配列番号１２の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：３４塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１２：
0003695760.tif 000021
(２)配列番号１３の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１３塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１３：
0003695760.tif 000022
(２)配列番号１４の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１１塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１４：
0003695760.tif 000023
(２)配列番号１５の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：３２塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１５：
0003695760.tif 000024
(２)配列番号１６の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１３塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１６：
0003695760.tif 000025
(２)配列番号１７の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１７塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１７：
0003695760.tif 000026
(２)配列番号１８の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：３７塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１８：
0003695760.tif 000027
(２)配列番号１９の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：４４塩基対
(Ｂ)配列の型：核酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ｃＤＮＡ
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号１９：
0003695760.tif 000028
(２)配列番号２０の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１２アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２０：
0003695760.tif 000029
(２)配列番号２１の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１４アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２１：
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(２)配列番号２２の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：３２アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２２：
0003695760.tif 000031
(２)配列番号２３の情報：
(ｉ)配列の特徴：
(Ａ)配列の長さ：１８アミノ酸
(Ｂ)配列の型：アミノ酸
(Ｃ)鎖の数：一本鎖
(Ｄ)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(iii)ハイポセティカル配列：ＮＯ
(iv)アンチセンス：ＮＯ
(xi)配列の記載：配列番号２３：
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