(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を含有すると見なされる試料内の分析物の存在を決定する方法であって、前記分析物が酵素又は触媒と反応し、その際検出可能な信号の量が検定媒体中の分析物の量の関数であり、前記検出可能な信号を電極で測定する方法において、
ａ）電極が、該電極を電解液から分離する電気絶縁ポリマーの薄膜で被覆されており、
ｂ）前記分析物との酵素又は触媒反応が直接又は間接的に前記電気絶縁ポリマー層との反応を引き起こし、反応の際にポリマー層が変態し、電極表面でのインピーダンスの測定可能な変化を惹起することを特徴とする、試料中の分析物の存在を決定する方法。
【請求項２】
電気絶縁材料がｐＨ感応性ポリマーであり、かつ反応性又は触媒種が電極被覆層の透過性を増大するために十分なｐＨ変化を惹起する請求項１記載の方法。
【請求項３】
反応性又は触媒種がｐＨ変化を惹起する反応を行う酵素である請求項１記載の方法。
【請求項４】
反応性触媒成分がウレアーゼ又はグルコースオキシダーゼである請求項２記載の方法。
【請求項５】
酵素−抗体又は酸素−抗原抱合体が特殊な免疫化学反応を介してポリマー層に又はその極近くに結合され、該ポリマー層が電極を被覆しておりかつ抱合体の酵素活性が電解液に対するポリマー層の透過性を増大させ、該ポリマー層の下にある電極によりキャパシタンス又は通過電流の変化に基づき測定する免疫検定法。
【請求項６】
作業電極に、電極が電解液にさらされると電解液の成分とレドックス反応を起こす電位を設定し、ポリマーが分解を開始した後に反応が起こり、電極と電解液が接触する請求項１記載の方法。
【請求項７】
触媒種がヒドロキシル基の生成を惹起し、該ヒドロキシル基がポリマー層と反応可能であり、それにより前記層の電解液に対する透過性を増大せしめる請求項１記載の方法。
【請求項８】
触媒種が過酸化水素産生オキシダーゼであり、かつ電解液がフェントン反応を促進することのできる種を含有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
分析物と触媒が反応することにより生成される生成物がポリマーを溶解させる請求項１記載の方法。
【請求項１０】
触媒種がアミラーゼ又はアミログルコシダーゼでありかつ誘電体がポリサッカリドからなるか又はポリサッカリドを含有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
触媒種がエンドヌクレアーゼでありかつポリマーが核酸からなるか又は核酸を含有する請求項９記載の方法。
【請求項１２】
触媒種がリパーゼでありかつポリマーが脂質からなるか又は脂質を含有する請求項９記載の方法。
【請求項１３】
酵素又は触媒がポリマー層内に存在する請求項１記載の方法。
【請求項１４】
酵素又は触媒がポリマー層に結合されている請求項１記載の方法。
【請求項１５】
酵素又は触媒がニトロセルロース膜のようなポリマー層又はその他の膜支持体に密接した別の支持体に結合されている請求項１記載の方法。
【請求項１６】
試料が水性の全血液、血清、血漿、尿又は唾液である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
生物学的成分、例えば酵素で検出される電気化学的トランスジューサを基礎とするセンサの構想は、簡単かつエレガントであり、かつ最少の試料調製で試薬不要の臨床分析の見込み提供する。この医療用途のためのアプローチの大きな利点は操作が簡単なことであり、従って測定を実施するために訓練した実験室操作員の必要性を排除する。このことは分散した実験室にセンサの設置しかつ臨床医に対する臨床情報の一層迅速な返報を可能にする。純益は適当な治療の一層迅速な設定にある［Recent Advances in Clinical Chemistry,Vol.3,Alberti,KGMM and price,CP(eds),Churchill Livingston 1985］。しかしながら、若干の場合には、該構想は身近の患者の検査にとって好適な実地の作業装置に移行した。電気化学的方法を基礎とする市販のバイオセンサは、電位差計法か又は電流滴定法のいずれかであり、かつ特定の臨床学的に重要な分析のためのものであり、これらの技術の両者ともバイオセンサ開発のための欠点を有する。このような問題を回避しかつ分散した実験室に設置するために好適な特殊な高感度の技術を開発するために、操作中にｐＨの変化に基づき変性されかつ該被膜の下にある電極のインピーダンスにおける高感度の変化を惹起するポリマー膜を基礎とするセンサを構成する可能性を見出した。
この類型の方法に関する技術は、例えば米国特許第４３５２８８４号明細書及び欧州特許公開第０３１１７６８号明細書に開示されている。米国特許第４３５２８８４号明細書には、尿素の測定のために使用される生物活性材料を固定するためにアクリレートコポリマー被覆を有するｐＨ電極が記載されている。
この方法は、抗原、抗体及び酵素のような生物活性物質の固定を行うためだけっであって、測定プロセスには関与しない。ポリマー被膜をｐＨ電極で使用することは、運動範囲が小さくかつ感度が悪いという欠点を有する。
欧州特許公開第０３１１７５６８号明細書には、酵素抱合体を使用する均質免疫検定の１つの結果として一層導電性になる電極上に被覆した半導体ポリマーの変態が記載されている。この方法は、系に該系を撹乱することができる大きい電圧（５００ｍＶ）を印加する抵抗の測定を基礎とする。この方法は１０の一乗までの変化を惹起するに過ぎないとみなされ、従って本発明で記載する方法ほど高感度でない。
本発明においては、電極上のポリマー被膜のインピーダンス分析を基礎とし、簡単な製造及び測定技術が必要であるにすぎない新規のセンサ形態を提供する。
電極のインピーダンスは多数のファクターに対して感応する。電極インピーダンスの変化は、しばしば二重層キャパシタンスの変化により惹起される。二重層キャパシタンス（Ｃdl）は、電極の表面での金属内の素電荷と、金属と接触した溶液内の（移動性）イオン電荷との間の分離から生じる。塩化カリウムの水溶液と接触した金属（例えば金）に関しては、この分離は金属表面上に水分子の層の存在に基づく。この二重層キャパシタンスは、平板コンデンサに関しては以下の標準方程式から計算することができる：
Ｃdl＝eｏeｒＡ／ｄ            （１）
ここで、
eｒは水相の有効誘電定数、
Ａは電極面積及び
ｄは水分子の直径である。
水分子の代わりに金属と水溶液の間に絶縁ポリマー層が存在すれば、前記方程式（１）はなお成り立つが、但しｄはポリマー層の厚さを表す。
ところで、このようなポリマーにおける微小な欠陥の発生は、容易に測定することができるキャパシタンスの急激な増大を惹起することが判明した。
電極のインピーダンスは、小さいピーク・ツー・ピーク振幅の正弦波電位（典型的には＜１０ｍＶ）を電極に印加しかつ生じた正弦波電流を測定することにより確認される。使用される周波数の範囲は１０5Ｈｚ〜１０-3Ｈｚである。一般に電位と電流の間には位相差（ｑ）が存在するので、電位の電流に対する比は実質的に、大きさ（｜Ｚ｜）及び方向（ｑ）を有するベクトル量である。インピーダンス測定値は、インピーダンスベクトルの２つの成分（Ｚ′，Ｚ″）２つの成分がそれぞれに対して１つのパラメータとしての周波数でプロットされる複雑なインピーダンス面で表される。
電極インピーンスを十分に規定するためには、定常状態条件下で測定しなけらばならない。電極状態が変化すれば、インピーンスは、変加速度に依存する周波数の上の周波数で十分に規定されるにすぎない。原則として、インピーダンス測定は、定常電流が溶液中の種（species）の酸化又は還元に基づき導通する場合に行うことができる。
発明の概要
電極のインピーダンスは、多くの方法で変化させることができる。例えば電極上へのタンパク質の吸着は電極インピーダンスを変化せしめる。しかしながら、センサとして有用であるためには、インピーダンスの変化は、検出される物質に対して高度に特異的でありかつ高い選択性を与えるべきである。
本発明は、電極表面からの絶縁ポリマー被膜の部分的又は完全な除去の結果として電極のインピーダンスの変化を惹起する酵素反応の現象を頼みにする。ポリマー変態の結果を測定する別の方法、例えば分極した電極での増大した電流の測定をもくろむこともできる。酵素又は触媒は、ポリマーと反応することができるか、又は直接ポリマー膜を加水分解することができる生成物を産生する。
前記酵素又は触媒は、ポリマー内に又はポリマーに直接結合されていてもよく、バルク（bulk）溶液中に存在するか、又は酵素標識抱合体との抗体−抗原交互作用を介してポリマーに結合されているか、又はポリマー被覆電極に密接した多孔性膜に結合されていてもよい、前記例はこの系の可能な形態を制限するものではない。
もう１つの可能な実施態様は、ｐＨを変化させ、次いでポリマーを可溶性にし、ポリマーの下にある電極への電解液の通過を可能にし、それによりインピーンスの大きな変化を惹起する酵素反応によりポリマー被膜を変態させることである。
酵素とポリマー被膜との多くの適当な組み合わせの１つは、ウレアーゼと、錠剤の腸溶皮で使用されるような材料との組み合わせである。これらの被膜は、胃の低いｐＨでは不溶性であるが、腸内のｐＨ値（ｐＨ６以上）では可溶性である。このような被膜材料の例は、セルロースアセテートヒドロゲンフタレート、メチルビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマーエステル、メタクリル酸とメタクリル酸のエステルとのアニオン性重合生成物（Roehm Pharma，西ドイツ、ダルムシュタット在のEudragit(R)）である。
１つの特殊な反応においては、ウレアーゼは、以下の反応式：
Ｈ2Ｏ＋尿素→２ＮＨ3＋ＣＯ2
ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ→ＮＨ4+＋ＯＨ-
に基づき尿素のアンモニアと二酸化炭素への分解を触媒する。
生じるｐＨ値の増大が前記材料を可溶性にする。
もう１つの実施態様は、透過性が外部媒体中のｐＨ変化によって可逆的に制御されるｐＨ感応性ポリマーを適用することである。この場合には、ポリマー、ポリ４−ビニルピリジンが電極表面に被覆されており、かつｐＨが酸性になれば、イオンに対する透過率が増大し、該透過率の増大を電極におけるインピーダンスの増大によって測定する。多くの酵素反応は、ｐＨ値を酸性にすることができる。１つの特殊な反応においては、グルコースオキシダーゼが、以下の反応式に基づきグルコースのグルコノラクトンとペルオキシドへの分解を触媒する：
グルコース＋Ｏ2→グルコノラクトン＋Ｈ2Ｏ2
該ポリマーの透過性は可逆的でありかつ多数回再使用することができる。
抗体を前記感応性ポリマーに固定すれば、免疫検定においてウレアーゼ標識抱合体を捕獲することができる。その際、結合したウレアーゼ抱合体は、局所的ｐＨ変化を生じ、該変化は抱合体捕獲地点におけるポリマーの可溶化を惹起する。極めて意想外にも、我々は、バルク溶液の緩衝能力に基づき、溶液内の重要なｐＨ変化が起こらない溶液中で局所的可溶化を起こし得ることを見出した。
また、この方法を、電極が電解液と接触するようになると、反応性成分を産生することができる電位で作業電極を分極することにより強化することも可能である。電極を−６００ｍＶでＡｇ／ＡｇＣｌに対して分極すれば、反応は、ポリマー層がまさに分解を開始して、ある程度の少量の電解液が電極と接触するまで起こらない。次いで、電極表面での酵素還元がＯＨ-を生成し、該ＯＨ-は局所的ｐＨを更に上昇させかつポリマーの分解を促進する。このことは初期の信号のかなりの増幅を生じる。
別の態様においては、フェントン（Fenton）反応と関連したグルコースオキシダーゼのようなＨ2Ｏ2産生酵素を使用することを可能にする。この反応は、一般にヒドロキシレート芳香族炭化水素のための合成有機化学で使用され、かつ極端に反応性の基ＯＨ・を生成する、例えば：
Ｈ2Ｏ2＋Ｆｅ2+→Ｆｅ3+＋ＯＨ-＋ＨＯ・
前記ヒドロキシル基は、有機種に遭遇するまで残存するに過ぎないほど反応性である。この場合には、ＨＯ基と反応する構造要素を含有するポリマー被膜が選択される。ヒドロキシル基の導入は、二重層キャパシタンスの著しい増大を惹起する被膜の可溶性を強化する。
実施例
以下の実施例は、本発明を更に説明するものである。該実施例は説明の目的のためであって、本発明の限界を規定しようとするものではない。
一般的機構
スクリーン印刷により形成した平面炭素電極（直径１ｍｍ）に、以下のようにしてセルロースアセテートフタレート（ＣＰＡ）（Kodak）を被覆した：
ＣＰＡの試料７０ｍｇをジエチルフタレート可塑剤３０ｍｇと混合し、アセトン４００ｍｇに加えて、粘性溶液を製造した。次いで、この溶液のアリコート５μｌを作業電極に施しかつ空気中で室温で乾燥させた。
被覆した電極のキャパシタンスを周波数応答分析器（Schlumberger）を使用して塩化ナトリウム１５０ミリモルl-1（ｐＨ４）で測定し、炭素電極のキャパシタンスと比較した。次いで、被覆した電極を塩化ナトリウム１５０ミリモルl-1（ｐＨ６．５）に１５分間曝し、キャパシタンスを再測定した。
0003713516.tif 000002
被覆した電極を溶液にｐＨ６．５で曝した場合、電極のキャパシタンスの１６０倍の増大が生じた。
金棒電極（直径４ｍｍ）に以下のようにしてセルロースアセテートフタレート（ＣＰＡ）（Kodak）を被覆した。
電極を１：８ｗ／ｗＣＡＰ／３０％ジエチルフタレート可塑剤／アセトン混合物を使用して１回浸漬被覆し、室温で３０分間乾燥させた。
被覆した電極のキャパシタンスを周波数応答分析器（Schlumberger）を使用して塩化ナトリウム１４０ミリモルl-1（ｐＨ４）で、銀／塩化銀基準及び金対電極を使用した３電極配置で測定した。被覆した電極を５分後と１時間後に測定した。ｐＨ４溶液をセルから除き、塩化ナトリウム１４０ミリモルl-1（ｐＨ６．５）と入れ替え、キャパシタンスを３０分間隔で測定した。
0003713516.tif 000003
これらの結果は、第１図にグラフで示されている。
腸溶皮、ＣＰＡ及びEudragit S 100ポリマーのｐＫａ値を塩基に対する水溶液中の固体の滴定により計算した。両者のポリマーのｐＨ感受性は酸エステル基の脱プロトン化の直接的結果であるので、該ｐＫａ値はポリマーの分解ｐＨに相応する。ＣＰＡのｐＫａはほぼ６．０及びEudragit S 100のｐＫａはほぼ７．０であった。
ウレアーゼを使用したセルロースアセテートフタレート被膜の分解
棒状金電極（直径４ｍｍ）にＣＰＡを前記と同様に被覆しかつガラスセル内に挿入した。緩衝溶液は、塩酸（０．１Ｍ）を使用してｐＨ４．８に調整したＥＤＴＭ（０．５ｍＭ）、塩化ナトリウム（１４０ｍＭ）、尿素（１６ｍＭ）であった。
ｐＨ４．８で３０分後と６０分後にキャパシタンスを測定し、次いでウレアーゼ（１ｍｇｍｌ-1溶液２０μｌ）を添加し、キャパシタンスを９０、１２０及び１５０分後に測定した。
0003713516.tif 000004
これらの結果は図２にグラフで示されており、酵素ウレアーゼを使用することによりＣＡＰポリマー被膜を分解し、ひいてはｐＨの変化を惹起しかつ電極キャパシタンスの１０の四乗の多き変化を生じることが可能であることを確認される。
ウレアーゼを使用したEudragit S 100ポリマーの分解
棒状金電極（直径４ｍｍ）を、ジブチルフタレート可塑剤２０％ｗ／ｗ及びTween 80 ５％ｗ／ｗを含有するアセトン中のEudragit S 100（Roehm Pharma）２０％ｗ／ｗを使用して２回浸漬被覆し、かつアセトンで飽和した雰囲気内に１５分間置いた。次いで、電極を取り出しかつ室温で３０分間乾燥させた。
ＥＤＴＭ０．２ｍＭ、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、ｐＨ５．８及び尿素範囲５〜５０ｍＭからなる緩衝液１ｍｌを入れたガラスセルを使用した。初期とウレアーゼ添加（０．１ｍｇｍｌ-1）後のキャパシタンス値を求めた。時間の関数としてのインピーダンスの変化率は尿素濃度に依存した。１０分後のキャパシタンスの初期のキャパシタンスに対する比（Ｃｆ／Ｃｏ）は、第３図に尿素濃度の関数として示されている。これは明白に、尿素はこの方法により測定することができかつ信号の大きな変化が含まれることを示している。
尿素濃度に基づくEudragit S 100ポリマーの限界／時間分解
ステンレススチールディスク（直径１０ｍｍ）に、Eudragit S 100ポリマーをスプレーした。該ポリマー組成は、アセトン１．７ｇ中に溶解したEudragit S 100（Roehm Pharma）１．１ｇからなっていた。該混合物にジブチルフタレート０．２５ｇ及びTween 80 ０．３ｇを添加した。これを圧搾空気シリンダ（２０ｌｂｆ／ｉｎ2）に取り付けたスプレーノズルを使用してステンレススチール電極の表面に塗布した。最適なスプレー条件は、塗布の間に３０分間の乾燥を伴うポリマーの２回の塗布であることが立証された。
０．３８ｃｍ2の免疫色素膜（Pall Biosupport）に、ＰＢＳ中のウレアーゼ５ｍｇｍｌ-1を、４℃で１６時間膜の表面に５０μｌを塗布することによりローディングした。該膜をＮａＣｌ１４０ｍＭ，ＥＤＴＡ０．２ｍＭ溶液で洗浄した。
膜をポリマー電極の表面に置き、ガスケットを膜／電極の表面に被せ、かつ電気化学セル内に入れた。該セルにＮａＣｌ１４０ｍＭ，ＥＤＴＡ０．２ｍＭ，ｐＨ５．８溶液を充填した。
ポリマー被膜の保全性を試験するために、周波数範囲２０ｋＨｚ〜１０ｍＨｚにわたってインピーダンス測定を実施した。該被膜の試験の終了後に、適当な量の尿素を添加することにより実験を開始した。キャパシタンスを、ポリマー被膜が分解するまで、２０ｋＨｚの周波数で時間と共に追跡した。
第４図及び第５図に示されている結果は、明らかに尿素の限界測定の基準を示している。
有機金属電極上のポリ（４−ビニルピリジン）（ＰＶＰ）被膜
酸性ｐＨで分解すると見なされるポリマー被膜としてのＰＶＰの使用を試験するために実験を実施した。
有機金属金電極に、ポリマー（Aldrich，Chem．Co．，UKからメタノール中で提供）を浸漬被覆し、次いで該電極を乾燥のために１６時間放置した。
次いで電極の試験を以下のようにして実施した：
インピーダンス測定を周波数範囲２０ｋＨｚ〜１６時間Ｈｚにわたり測定し、かつキャパシタンス値を２０ｋＨｚで計算した。該電極を０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を充填したセルに入れ、初期キャパシタンス測定を行った。次いで６０分後の値を測定した。引き続き、緩衝液を０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ５．８と入れ替えた。５分後と３０分後にキャパシタンス測定を行った。最後に、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６を再導入し、更にキャパシタンス測定を５分後と３０分後に行った。
第６図は明らかに、ポリマー被膜の絶縁特性のｐＨ依存性及びこのｐＨの可逆性特性を示す。
ポリマー分解を基礎としたビオチン免疫検定
免疫検定原理を説明するためにモデル実験を実施した。
アビジン被覆膜を以下のようにして調製した：５×５試験片をＨ2Ｏを使用して湿潤し、次いでWhatman No.1フィルタ紙片の上に置き、ＰＢＳ，ｐＨ７．４中の５ｍｌ-1アビジン溶液１４０ｍｌで飽和させた。１時間後、該膜をＰＢＳ中で濯ぎかつＰＢＳ中の０．１％グルタルアルデヒド１０ｍｌを添加した。２時間後、該膜を水及びＰＢＳ中で濯いだ。
次いで、膜ディスクをビオチンスタンダード（ＰＢＳ中０〜１００μｇｍｌ-1（ｐＨ７．４）２００μｌ）及びビオチンウレアーゼ（Biogenesis，ＵＫ）抱合体（ＰＢＳ中１／５０希釈（ｐＨ７．４）２００μｌ）で室温で２時間インキュベートした。次いで、該膜を取り出し、水中で２回、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ中で１回濯いだ。次いで、該膜を電気化学セル内の、Eudragit S 100ポリマー被覆したステンレススチール・ディスクの上に置き、インピーダンス分析を実施した。
セル中の９００μｌ ＮａＣｌ／ＥＤＴＡ溶液に１Ｍ尿素１００μｌを添加しかつピペットで混合することにより尿素濃度を調整した。尿素を添加した後インピーダンスを１時間モニターし、１５分毎にインピーダンス値からキャパシタンス測定を行った。
0003713516.tif 000005
本発明に基づく電気化学的検定は、当業者に公知の多くの異なった形態で使用することができる。
例えば当業者に公知の任意の方法で、測定すべき分析物と分析物酵素抱合体又は分析物類縁酵素抱合体が競合する電極に抗体を固定することが可能である。
サンドウィッチ形態のためには、分析物に対する第１の抗体を電極表面に固定しかつ酵素で標識した第２の抗体を溶液中に依存させる。
競合形態のためには、捕獲抗体を固相に固定し、かつ次いで固相の抗体部位に対して競合する標識抗体と非標識抗原を含有する試料を添加する。表示される標識の量は、試料内の抗原の量に反比例する。
競合形態においては、該溶液はビオチン標識分析物又は分析物のビオチン標識類似体を含有する。アビジンとの酵素抱合体も該溶液中に存在するか、又はビオチン標識分析物又は分析物類似体と、固定した抗体で測定すべき分析物との捕獲反応ごに加えることができる。アビジン／ビオチンの代わりにほかの結合対、例えばＩｇＧ：抗ＩｇＧも同様に使用することができる。
分析物と分析物の類似体が抗酵素抗体と抱合される競合検定も可能である。また溶液中には、測定される分析物及び遊離酵素も存在し、この場合発生信号は測定される分析物濃度に反比例する。
また、サンドウィッチ形態又は競合形態のいずれかを、固相が被覆管又はマイクロセルのいずれかの場合に使用することができる。この形態では、ポリマー被覆電極を被覆管又はマイクロセルに浸漬し、そこでサブストレートとの酵素抱合体反応がポリマーを変態させる。
もう１つの形態では、分析物と、分析物又は分析物の類似体と酵素の酵素抱合体との間の競合は、分析物に対する抗体が表面に固定されたウィック（吸収性層）又は毛細管通路内で実施することができる。ウィック又は毛細管通路を通過した後、結合しなかった分析物の酵素抱合体は、抗酵素抗体が固定された電極と接触する。発生される信号は、存在する分析物の濃度に比例する。
図面の説明
本発明は、第１〜６図により説明する。
第１図は、（ａ）非被覆金電極、（ｂ）ＣＡＰ被覆金電極（ｐＨ４．０）及び（ｃ）ｐＨ６．５の緩衝液に浸漬した後のＣＡＰ被覆電極からのキャパシタンス結果を示す。
第２図は、時間の関数としてのＣＡＰ被覆金電極のキャパシタンス及びウレアーゼ（100ｍｇ／ｍＬ２０μｌ）添加の効果を示す。
第３図は、異なった分析物（尿素）濃度に関するキャパシタンスを示す。
第４及び５図は、時間に関する分析物（尿素）濃度に基づくポリマー被覆電極の分解を示す。
第６図は、時間の経過に伴うポリ（４−ビンイルピリジン）被覆電極に対する溶液ｐＨの作用を示す。該電極はｔ＝０分で炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６内にあり、（ａ）で、電極はＮａＣｌ／ＥＤＴＡｐＨ５．８（ｔ＝６０分）中にあり、その後（ｂ）炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中に戻した場合のキャパシタンスである。
【図１】
0003713516.tif 000006
【図２】
0003713516.tif 000007
【図３】
0003713516.tif 000008
【図４】
0003713516.tif 000009
【図５】
0003713516.tif 000010
【図６】
0003713516.tif 000011