(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）、Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）およびＥｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）から選択され図２に示すアミノ酸配列を有するｅｐｈ族リガンド（Ｅｆｌ）の細胞外ドメインの生物学的活性を増大させる方法であって、
（ａ）該リガンドの可溶性ドメインをエピトープ標識と共に発現させ；
（ｂ）前記標識された可溶性ドメインを抗−標識抗体に暴露させて、クラスター化されたｅｐｈ族リガンドを形成させる
ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記標識化がリガンドのＣ−末端に位置する請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
前記エピトープ標識がｃ−ｍｙｃ又は免疫グロブリンのＦｃドメインである請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
図２に示すアミノ酸配列を有するＥｆｌ−１（Ｂ６１）およびＥｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）から選択されるｅｐｈ族リガンドの可溶性ドメインの生物学的活性を増大させる方法であって、
（ａ）該リガンドの可溶性ドメインをＩｇＧのＦｃドメインと共に発現させ；
（ｂ）Ｆｃダイマーを形成させる
ことを特徴とする前記方法。
【請求項５】
請求の範囲第１、２又は３項の方法によって得られるエピトープ標識された可溶性ｅｐｈ族リガンドの抗−エピトープ抗体処理された調製物。
【請求項６】
前記エピトープ標識がリガンドのＣ−末端に位置する請求の範囲第５項に記載の調製物。
【請求項７】
前記エピトープがｍｙｃ又は免疫グロブリンのＦｃドメインである請求の範囲第６項に記載の調製物。
【請求項８】
（可溶性Ｅｆｌ）nを含み、該可溶性ＥｆｌがＥｆｌ−１（Ｂ６１）またはＥｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）の細胞外ドメインであり、ｎが２もしくはそれ以上であり、Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）およびＥｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）が図２に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする生物学的に活性なクラスター化された可溶性ｅｐｈ族リガンド。
【発明の詳細な説明】
この出願は１９９４年９月１日付け出願の「Ｅｐｈ族リガンドの生物学的活性を増大させる方法」と題する米国特許出願第０８／２９９，５６７号の部分継続出願であり、米国特許出願第０８／２９９，５６７号は１９９４年４月１２日付け出願の「Ｅｐｈ族リガンド」と題する米国特許出願第０８／２２９，４０２号の部分継続出願であり、米国特許出願第０８／２２９，４０２号は１９９４年４月４日付け出願の「Ｅｈｋ−１結合性リガンド」と題する米国特許出願第０８／２２２，０７５号の部分継続出願であり、米国特許出願第０８／２２２，０７５号は１９９３年１０月２８日付け出願の「ニューロトリフィン活性のための分析システム」と題する米国特許出願第０８／１４４，９９２号の部分継続出願であり、米国特許出願第０８／１４４，９９２号は１９９１年７月２６日付け出願の「ニューロトロフィン活性のための分析システム」と題する米国特許出願第０７／７３６，５５９号の部分継続出願であり、米国特許出願第０７／７３６，５５９号は１９９１年７月１０日付け出願の「ニューロトロフィン活性のための分析システム」と題する米国特許出願第０７／６９０，１９９号の部分継続出願である。
技術分野
本発明は、リセプタ様蛋白質チロシンキナーゼ、たとえばＥｈｋ（Ｅｈｋ−１、Ｅｈｋ−２およびＥｈｋ−３を含む）、ＥｃｋおよびＥｌｋのＥｐｈサブ族に属する蛋白質を結合する新規なリガンド、並びに生物学上活性である可溶性型のこれらリガンドを作成する方法を提供する。
発明の背景
細胞を結合することによりたとえば細胞成長、生存もしくは分化のような表現型反応を誘発するポリペプチドリガンドの能力は、しばしば経膜チロシンキナーゼを介して媒介される。各リセプタ  チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外部分は一般に、蛋白質にリガンド認識特性を付与するので、分子の最も特有な部分である。細胞外ドメインに対するリガンドの結合は細胞内チロシンキナーゼ触媒ドメインを介しシグナル導入をもたらし、生物学的シグナルを細胞内の標的蛋白質に伝達する。この細胞質触媒ドメインにおける配列モチーフの特定列は、潜在的キナーゼ基質へのアクセスを決定する［モハマジ等（１９９０）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１１巻、第５０６８〜５０７８頁；ファントル等（１９９２）、セル、第６９巻、第４１３頁］。
ＲＴＫは、リガンド結合の後に二量化または他の関連するコンホメーション変化を受けると思われ［Ｊ．シュレッシンガー（１９８８）、トレンド・バイオケミカル・サイエンス、第１３巻、第４４３〜４４７頁；ウルリッチおよびシュレッシンガー（１９９０）、セル、第６１巻、第２０３〜２１２頁；シュレッシンガーおよびウルリッチ（１９９２）、ニューロン、第９巻、第３８３〜３９１頁］；各二量化性細胞質ドメイン間の分子相互作用はキナーゼ機能の活性化をもたらす。たとえば成長因子血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）のような場合はリガンドが２種のリセプタ分子を結合するダイマーである［ハルト等（１９８８）、サイエンス、第２４０巻、第１５２９〜１５３１頁；ヘルジン（１９８９）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第８９０５〜８９１２頁］のに対し、たとえばＥＧＦの場合はリガンドがモノマーである［ウェーバー等（１９８４）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５９巻、第１４６３１〜１４６３６頁］。
高等生物における特定チロシンキナーゼ  リセプタの組織分布はリセプタの生物学的機能に関する適切なデータを与える。たとえば繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のような或る種の成長因子および分化因子に関するチロシンキナーゼ  リセプタは広く発現され、したがって組織の成長および維持において或る種の一般的な役割を演ずると思われる。リセプタのＴｒｋ  ＲＴＫ族の各構成員［グラスおよびヤンコプーロス（１９９３）、トレンズ・イン・セルラ・バイオロジー、第３巻、第２６２〜２６８頁］はより一般的に神経系の細胞に限定され、さらにＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５よりなる神経成長因子族（ノイロトロフィンとして知られる）はこれらリセプタを結合して脳および周辺部における多様なニューロン群の分化を促進する［Ｒ．Ｍ．リンドセー（１９９３）、ニューロトロフィン因子、Ｓ．Ｅ．ラフリンおよびＪ．Ｈ．ファロン編、第２５７〜２８４頁（サンジエゴ、ＣＡ；アカデミックプレス社）］。組織におけるこの種の１種のＴｒｋ族リセプタの局在は、このリセプタの潜在的な生物学的役割およびこのリセプタを結合するリガンド（ここではコグネートと称する）に対する洞察を可能にする。たとえば成体マウスにおいてｔｒｋＢは脳組織で優先的に発現することも判明したが、著量のｔｒｋＢｍＲＮＡが肺、筋肉および卵巣にも観察された。さらにｔｒｋＢ転写物は、妊娠中期および後期の胎児にも検出された。１４日令および１８日令のマウス胎児の現場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリッド化分析は、ｔｒｋＢ転写物が中枢および末梢神経系、たとえば脳、脊髄、脊髄神経節、脳神経節、交感神経系の脊椎傍トランクおよび各種の神経支配経路に局在することを示し、これはｔｒｋＢ遺伝子産生物が神経発生および早期神経発育に関与するリセプタであると共に成体神経系にて役割を演ずることを示唆する。
ＲＴＫが発現される細胞環境は、リセプタに対するリガンドの結合に際し示される生物学的反応に影響を及ぼし得る。たとえばＴｒｋリセプタを発現するニューロン細胞がそのリセプタを結合するニューロトロフィンに暴露されると、ニューロンの生存および分化が生ずる。同じリセプタが繊維芽細胞により発現されると、ニューロトロフィンに対する暴露は繊維芽細胞の増殖をもたらす［グラス等（１９９１）、セル、第６６巻、第４０５〜４１３頁］。すなわち、細胞外ドメインはリガンド特異性に関する決定因子を与えると思われ、シグナル導入が開始されると細胞環境はこのシグナル導入の表現型成果を決定する。
多くのＲＴＫ族が、その細胞内ドメインにおける配列相同性に基づいて同定されている。ＮＧＦにより利用されるリセプタおよびシグナル導入経路はｔｒｋプロトオンコジーンの産生物を含む［カプラン等（１９９１）、ネイチャー、第３５０巻、第１５６〜１６０頁；クライン等（１９９１）、セル、第６５巻、第１８９〜１９７頁］。クライン等［（１９８９）、ＥＭＢＯジャーナル、第８巻、第３７０１〜３７０９頁］は、ヒトｔｒｋプロトオンコジーンに高度に関連すると判明したチロシン蛋白質キナーゼ族のリセプタの第２構成員をコードするｔｒｋＢの分離を報告している。ＴｒｋＢはＢＤＮＦ、ＮＴ−４および小程度ではあるがＮＴ−３に結合して機能的反応を媒介する［スキント等（１９９１）、セル、第６５巻、第８８５〜９０３頁；イプ等（１９９２）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８９巻、第３０６０〜３０６４頁；クライン等（１９９２）、ニューロン、第８巻、第９４７〜９５６頁］。アミノ酸レベルにて、ｔｒｋおよびｔｒｋＢの産生物はｔｒｋに存在する１１個のシステインのうち９個を含め細胞外領域に５７％の相同性を共有することが判明した。この相同性はその各チロシンキナーゼ触媒ドメイン内では８８％まで増大することが判明した。現在、Ｔｒｋ遺伝子族はｔｒｋＣローカスを含むよう拡大されており、ＮＴ−３がｔｒｋＣのための好適リガンドであると同定されている［ランバレ等（１９９１）、セル、第６６巻、第９６７〜９７９頁；バレンズエラ等（１９９３）、ニューロン、第１０巻、第９６３〜９７４頁］。
Ｅｐｈ関連の経膜チロシンキナーゼは既知の最大リセプタ様チロシンキナーゼ族を含み、多くの構成員が発育中および成体の神経系における特異的発現を示す。Ｅｈｋ（ｅｐｈ相同性キナーゼ）−１および−２と称するＥｐｈ  ＲＴＫ族の２種の新規な構成員が、脳にて発現された遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくスクリーニングにより同定された［メイソンピエール等（１９９３）、オンコジーン、第８巻、第３２７７〜３３８８頁］。これら遺伝子は専ら神経系にて発現されると思われ、Ｅｈｋ−１発現が神経発育の早期に開始する。最近、この群の関連リセプタにおける新たなもの（Ｅｈｋ−３）がクローン化された［バレンズエラ等、出版中］。
ｅｌｋ遺伝子はｅｐｈサブ族にも属するリセプタ様蛋白質−チロシンキナーゼをコードすると共に、殆ど専ら脳にて発現される（精巣では低レベル）［レトウィン等（１９８８）；オンコジーン、第３巻、第６２１〜６７８頁；ロータック等（１９９１）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１１巻、第２４９６〜２５０２頁］。発現プロフィルに基づき、Ｅｌｋリセプタおよびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドは神経系における細胞と細胞との相互作用にて役割を演ずると予想される。
ＥｈｋおよびＥｌｋリセプタとは異なり、近縁のＥｃｋリセプタはより多面発現的に機能すると思われ、神経組織、表皮組織および骨格組織にて同定されており、さらにマウス胎児におけるパターン形成の原腸形成部位、頭蓋顔面部位および肢芽部位に含まれると思われる［ガンユ等（１９９４）、オンコジーン、第９巻、第１６１３〜１６２４頁］。
多数のリセプタ  チロシンキナーゼの同定はその同族リガンドの同定をずっと上回る。最良でも、この種のリセプタが発現される組織の決定は標的組織における細胞の成長、増殖および再生の調整に関する洞察を可能にする。ＲＴＫは発育に際し多くの重要な機能を媒介すると思われるので、その同族リガンドは必ず発育に重要な役割を演ずる。
１９９３年１０月２８日付け出願の米国特許同時係属出願第０８／１４４，９９２号（参考のため、その全体をここに引用する）には多数のオーファン  チロシンキナーゼ  リセプタ様分子、たとえばｔｒｋリセプタおよびインシュリン  リセプタ族に相同性である５種のこれら分子、並びにそれぞれＣＳＦ１Ｒ／ＰＤＧＦＲ／ｋｉｔ；ｒｅｔ；ｅｃｋ−α（現在ではＥｈｋ−２として知られる）；およびｅｃｋ−β（Ｅｈｋ−１）に対し相同性である他の４種の分子が記載されている。この米国特許出願には、Ｅｈｋ−１およびＥｈｋ−２を発現する細胞系統を用いてその同族リガンドを同定すべく分析する方法が記載されている。ｅｈｋは主上昇中央コリン発生核の幾つかを含め異なるニューロン集団にて発現されると思われるので、これらリセプタを結合するリガンドはこれらニューロン細胞の成長もしくは生存の促進に役割を演ずると予想された。Ｅｈｋ−１の発現は発育の早期に開始するので、この同族リガンドは胚胎発育に役割を演ずる。
既に同定されている多くのオーファン  リセプタにつき同族リガンドを同定するため多くの方式も考案されているが、この種のリガンドの極めて僅かしか同定されておらず、現在まで同定されているリガンドはその同族リセプタを結合する能力以外には活性を持たないと思われる。たとえば１９９４年５月２６日付け公開の国際特許公開ＷＯ／９４／１１０２０号はＥｃｋリセプタに結合するリガンドを記載している。特にリガンドＥＢＰ（Ｂ６１としても知られる）が記載されている。しかしながらＥｃｋリセプタに対するＢ６１の結合は開示されているが、その生物学的活性については記載されていない。同様に、Ｅｌｋリセプタを結合するリガンドに関するＰＣＴ特許公開ＷＯ  ９４／１１３８４号（１９９４年５月２６日付け公開）での説明にも拘らず生物学的活性は観察されなかった。これはリガンドが膜結合として或いは可溶性リガンドのＦｃダイマーの形態のいずれで存在するかには無関係である。しかしながらＥｌｋリセプタに関し、キメラＥＧＦＲ−Ｅｌｋリセプタ（Ｅｌｋ細胞質ドメインに融合したＥＧＦＲの細胞外ドメインを有する）がこのリセプタの酵素ドメインの機能的一体性（ＥＧＦ−刺激の自己燐酸化により測定）を示すべく使用されている［ロータックおよびポーソン（１９９３）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１３巻、第７０７１〜７０７９頁］。
発明の要点
本発明は、細胞におけるＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋおよびＥｌｋの各リセプタに結合する新規なポリペプチド  リガンドを提供する。より重要なことに、本発明は分化機能を促進すると共にリセプタ含有細胞の表現型（たとえば成長および／または増殖）に影響を及ぼすのに有用である生物学上活性な可溶性型のこれらリガンドを作成する手段を提供する。さらに本発明は、この種のポリペプチド  リガンドをコードする核酸、並びにこの種の蛋白質を産生するための原核性および真核性の両発現系をも提供する。さらに本発明はこれらリガンドに対する抗体をも提供する。
本発明によれば、ここで説明する可溶性型のリガンドを用いてＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋおよびＥｌｋリセプタ発現性細胞における生物学的反応を促進することができる。特にｅｐｈ関連リセプタに関するリガンドの「クラスター化」を生ぜしめる一般的方法につき開示し、これは不活性な可溶性リガンドを生物学上活性にするよう機能し、或いはこの種のクラスター化が存在しなければ極く低レベルの生物学上活性しか持たないようなリガンドの生物学上活性を増大させる。
さらに、ここに開示するリガンドは診断用途をも有する。本発明の特定具体例においては、その機能もしくは発現における異常性の検出方法を神経障害または他の障害の診断に用いることができる。他の具体例においては、各リガンドとその同族リセプタとの間の相互作用を操作して神経障害または他の障害を処置することができる。
図面の説明
第１図：ベクターｐＪＦＥ１４。
第２図：Ｅｈｋ−１およびＥｌｋリセプタに関するリガンドの配列比較。Ｂ６１（配列番号１）、Ｅｈｋ−１リガンド（ＥＨＫ−１Ｌ）（配列番号２）およびＥｌｋリガンド（ＥＬＫ−Ｌ）（配列番号３）の整列配列を示す。これら３種全ての配列により共有される部分を枠で囲い、少なくとも２種により共有される部分をコンセンサス  レーンで示し、太点線は保存システインを示し、星印は主たる保持領域を境界する各部分を区切る。下側文字は推定アミノ末端シグナル配列を示すと共に、ＥＬＫ−Ｌの経膜ドメイン並びにＢ６１およびＥＨＫ１−Ｌのカルボキシ末端疎水性ＧＰＩ−認識テールをも示す。
第３図：ＥＨＫ−１Ｌレコード領域のヌクレオチド配列（配列番号４）。
第４図：成体ラット組織（Ａ）および発育中の脳（Ｂ）におけるＥｆｌ−１（Ｂ６１）、Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）およびＥｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）発現のノーザンブロット分析。全ＲＮＡ（１レーン当り２０μｇ）を指定組織から分離し、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにて分画し、ナイロン膜に移した。各ブロットを32Ｐ−標識プローブ（このプローブは各ｃＤＮＡのコード領域に対し内部の制限断片から得られる）にハイブリダイズさせた。
第５図：膜結合もしくはクラスター化したリガンドによるＥｐｈ族リセプタの活性化（Ｅｌｋリセプタチロシン燐酸化により測定）。第５Ａ図：ベクター単独でトランスフェクトした比較ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−Ｍｏｃｋ）またはＥｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）をコードする発現構成物でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を用いる刺激。第５Ｂ図：非クラスター化リガンド（第２ウェルおよび第３ウェル）または抗体（第４ウェルおよび第５ウェル）によりクラスター化させたリガンドとして使用した可溶性ｍｙｃ−標識Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）での刺激。（「＋Ａｂ」は抗体でクラスター化した可溶性リガンドを示す）。比較（０ｎｇ／ｍＬ）を第１ウェルで示す。第５Ｃ図：非クラスター化リガンド（第２ウェル）または抗体によりクラスター化したリガンド（第３ウェル）として使用した可溶性ｍｙｃ−標識Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）での刺激。比較（０ｎｇ／ｍＬ）を第１ウェルで示す。第Ａ、ＢおよびＣ図における上側パネルはホスホチロシンに対する抗体で免疫ブロットした免疫沈殿物を示す。第Ａ、ＢおよびＣ図における下側パネルは、その後にストリップすると共にリセプタを認識する抗体により再プロービングして全リセプタ蛋白質を可視化させた免疫沈殿物を示す。
第６図：Ｅｃｋリセプタキメラにより媒介されるＢＡＦ細胞における成長反応の誘発。Ａ．刺激をＣＯＳ細胞で産生された可溶性Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）により、その後のクラスター化と共に或いはクラスター化なしに行った。Ｂ．刺激をＣＯＳ細胞で産生された可溶性Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）により、その後のクラスター化と共に或いはクラスター化なしに行った。
第７図：クラスター化されたがダイマーでないリガンドによるＥＬＫリセプタ  チロシン燐酸化の誘発。レーンＡ：抗−ヒト抗体なしのｍｏｃｋ  ＣＯＳ上澄。レーンＢ：抗−ヒト抗体。レーンＣ：架橋性抗体なしのＥＬＫ−Ｌ−Ｆｃ。レーンＤ：架橋性抗体。可溶性Ｆｃ−標識ＦＬＫリガンド（ＥＬＫ−Ｌ−Ｆｃ）をＣＯＳ細胞上澄として産生させると共に、非クラスター化ダイマー  リガンドまたは抗体によりクラスター化されたリガンドとして使用した。リガンド濃度は、ｅｌｉｓａ分析を用いてＦｃエピトープの量を定量化することにより推定した。リガンドのクラスター化は、抗−ヒト抗体を添加すると共に室温にて細胞刺激前に１時間インキュベートすることにより行った。レポータ細胞は、ＥＬＫでトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞とした。細胞を血清フリーの培地にて４〜６時間にわたり飢餓させ、次いで４０分間にわたり次のように刺激した：刺激に続き細胞を可溶化させると共に、リセプタを認識する抗体で免疫沈澱させた。免疫沈殿物をホスホチロシンに対する抗体で免疫ブロットした。
第８図：ＥＣＫリセプタ  キメラにより媒介されるＢＡＦ細胞における成長反応の誘発。各刺激を可溶性のトリプルｍｙｃ−標識ＥＨＫ１リガンド（ＥＨＫ１Ｌ−ｍ３）およびＣＯＣ細胞で産生されたトリプルｍｙｃ−標識Ｂ６１（Ｂ６１−ｍ３）により、その後の抗−ｍｙｃおよび抗−マウス抗体でのクラスター化と共に或いはそれなしに行った。ＥＣＫリセプタの触媒ドメインはＢＡＦ細胞における成長反応を媒介しないので、リセプタ  キメラ（ここでＥＣＫリセプタのエクトドメインをＦＧＦリセプタの細胞質ドメインに融合される）をＢＡＦ細胞に導入してレポータ細胞系統を作成した。
第９図：ＥＣＫリセプタ  キメラにより媒介されるＢＡＦ細胞における成長反応の誘発。各刺激は、ＣＯＳ細胞で産生された可溶性のＥＨＫ１−Ｌ−ＦｃおよびＢ６１−Ｆｃにより、その後の抗−ヒト抗体でのクラスター化と共に或いはそれなしに行った。
発明の詳細な説明
Ｅｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋおよびＥｌｋを用いる分析システムの利用は、ここに説明するようにこれらレポータに対する同族リガンドの発見をもたらした。この種のリガンドはインビトロにおけるニューロン、表皮または他のリセプタ含有細胞の各集団の成長および生存を促進するのに有用である。
一層詳細に以下説明するように、本出願人は発現クローン化によりＥｈｋ−１およびＥｌｋリセプタを結合する１種もしくはそれ以上の新規なリガンドを見出した。さらに本出願人は従来同定されているリガンドＢ６１［ホルツマン等（１９９０）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１０巻、第５８３０〜５８３８頁］もＥｈｋ−１に結合すること並びにＢ６１とＥｈｋ−１との両リガンドもＥｈｋ−２を結合することを突き止め、さらにＥｈｋ−３リセプタおよびＥｃｋリセプタを新たに見出した。
ここに説明する新規なリガンドをＥｆｌ（Ｅｐｈ経膜チロシンキナーゼ族リガンド）と命名する。１９９４年４月１２日付け出願の同時係属米国特許出願第０８／２２９，４０２号および１９９４年４月４日付け出願の米国特許出願第０８／２２５，０７５号に最初に記載された新規なＥｈｋ−１結合性リガンドＥｆｌ−１およびＥｆｌ−２は同一であって、ここではＥｆｌ−２と再命名する。Ｅｈｋ−１、Ｅｈｋ−２およびＥｈｋ−３、並びにＥｃｋリセプタを結合する他のリガンドはＥｆｌ−４と同定されており、Ｂ６１はＥｆｌ−１と今回命名された。Ｂ６１（Ｅｆｌ−１）およびＥＨＫ−１Ｌ（Ｅｆｌ−２）のアミノ酸配列、並びにＥｌｋ結合性リガンドＥｆｌ−３の配列［これは同時係属出願第０８／２２９，４０２号に記載され、ＰＣＴ／ＵＳ  ９３／１０８７９号（１９９４年５月２６日付けでＷＯ  ９４／１１０２０号として公開）で公開］を第２図に示す。この新規なリガンドＥｆｌ−４をコードするプラスミドｐＪＦＥ１４をブダペスト条約の規定に基づき１９９４年１０月２１日付けで第７５９２１号として寄託した。
ここで用いる場合Ｅｆｌ−１、Ｅｆｌ−２、Ｅｆｌ−３およびＥｆｌ−４は、アミノ酸残基が暗黙変化（silent change）をもたらす配列内の残基につき置換された機能上均等な分子を包含する。たとえば配列内の１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を機能的均等物として作用する同様な極性を持った他のアミノ酸で置換して、暗黙変化をもたらすことができる。配列内のアミノ酸の置換は、このアミノ酸が属するクラスの他の構成員から選択することができる。たとえば非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを包含する。極性の中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを包含する。陽帯電（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。陰帯電（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。さらに本発明の範囲には、同一もしくは同様な生物学的活性を示す蛋白質またはその断片もしくは誘導体および翻訳時または翻訳後にたとえばグリコシル化、蛋白質分解、抗体分子もしくは他の細胞リガンドに対する結合などにより様々に改変される誘導体も包含される。
Ｅｆｌを発現する細胞は自然にそうすることもでき、或いは遺伝子操作して上記のようにこれらリガンドを産生させることもでき、これにはトランスジェニック動物などを介しここに説明したＥｆｌをコードする核酸の適する発現ベクターへのトランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションを行う。ＥＦｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）をコードするｃＤＮＡを含有したベクターをブダペスト条約の規定に基づき１９９４年４月４日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＥｈｋ−１Ｌ２Ｂ４およびＥｈｋ−１Ｌ３Ｂ１を含むｐＪＦＥ１４として寄託し、それぞれＡＴＣＣ番号第７５７２８号および７５７２９号が付与された（これらベクターによりコードされたリガンドは同一である）。Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）をコードするｃＤＮＡを含有したｐＪＦＥ１４ベクターをブダペスト条約の規定に基づき１９９４年４月１２日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにｅｆ１−３を含むｐＪＦＥ１４として寄託し、ＡＴＣＣ番号第７５７３４号が付与された。Ｅｆｌ−４をコードするｃＤＮＡを含むｐＪＦＥ１４ベクターをブダペスト条約の規定に基づき１９９４年１０月２１日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＥｆｌ−４をコードするｐＪＦＥ１４として寄託し、ＡＴＣＣ番号第７５９２１号が付与された。
本発明は、上記の寄託プラスミドに含まれるＤＮＡ配列、並びにたとえばサムブルック等、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第２版、第１巻、第１０１〜１０４頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）に規定されたような適度な厳密性（stringency）の条件下でＥｆ１配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。したがって、本発明により考えられる核酸は前記寄託物に含まれる配列、この種の配列にハイブリダイズすると共にＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋもしくはＥｌｋリセプタを結合する核酸の配列、並びに遺伝子コードの結果として上記配列の変質種であるがＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｅｈｋ−３、ＥｃｋもしくはＥｌｋリセプタを結合するリガンドをコードするような核酸配列を包含する。
さらに本発明は可溶性型、切断型および標識型における、ここに説明したリガンドの使用をも包含する。
ベクター中へのＤＮＡ断片の挿入につき当業者に知られた任意の方法を用いてＥｆｌをコードする発現ベクターを作成することができ、これには適する転写／翻訳制御シグナルおよび蛋白質コード配列を使用する。これら方法はインビトロ組換ＤＮＡおよび合成技術、並びにインビボ組換（遺伝子組換）を包含する。Ｅｆｌをコードする核酸配列またはそのペプチド断片の発現は、蛋白質もしくはペプチドが組換ＤＮＡ分子で形質転換された宿主にて発現されるよう、第２の核酸配列により調整することができる。たとえば、ここに説明したＥｆｌの発現は当業界で知られた任意のプロモータ／エンハンサー要素により制御することができる。リガンドの発現を制御すべく使用しうるプロモータは限定はしないがスキント等により記載された長末端リピート［（１９９１）セル、第６５巻、第１〜２０頁］；ＳＶ４０早期プロモータ領域［ベル、イストおよびチャンボン（１９８１）、ネイチャー、第２９０巻、第３０４〜３１０頁］、ＣＭＶプロモータ、Ｍ−ＭｕＬＶ５′末端リピート、ラウス肉腫ウィルスの３′長末端リピートに含まれるプロモータ［ヤマモト等（１９８０）、セル、第２２巻、第７８７〜７９７頁］、ヘルペス  チミジンキナーゼ  プロモータ［ワグナー等（１９８１）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７８巻、第１４４〜１４４５頁］、メタロチオエイン遺伝子の制御配列［ブリンスター等（１９８２）、ネイチャー、第２９６巻、第３９〜４２頁］；原核性発現ベクター、たとえばβ−ラクタマーゼ  プロモータ［ビラ−カマロフ等（１９７８）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７〜３７３１頁］もしくはｔａｃプロモータ［デボアー等（１９８３）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、第２１〜２５頁、さらに「組換細菌からの有用な蛋白質質」、サイエンチフィック・アメリカン（１９８０）、第２４２巻、第７４〜９４頁参照］；酵母もしくは他の真菌類からのプロモータ要素、たとえばＧａｌ  ４プロモータ、ＡＤＨ（アルコール  デヒドロゲナーゼ）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリ性ホスファターゼ  プロモータ、並びに組織特異性を示すと共にトランスジェニック動物で用いられている以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞にて活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域［スイフト等（１９８４）、セル、第３８巻、第６３９〜６４６頁；オルニッツ等（１９８６）、コールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム・クオンタチブ・バイオロジー、第５０巻、第３９９〜４０９頁；マクドナルド（１９８７）、ヘパトロジー、第７、第４２５〜５１５頁］；膵臓β細胞にて活性であるインシュリン遺伝子制御領域［ハナハン（１９８５）、ネイチャー、第３１５巻、第１１５〜１２２頁］、リンパ様細胞にて活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域［グロスシェドル等（１９８４）、セル、第３８巻、第６４７〜６５８頁；アダムス等（１９８５）、ネイチャー、第３１８巻、第５３３〜５３８頁；アレキサンダー等（１９８７）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第７巻、第１４３６〜１４４４頁��、睾丸細胞、胸細胞、リンパ様細胞およびマスト細胞にて活性であるマウス哺乳類腫瘍ウィルス制御領域［レダー等（１９８６）、セル、第４５巻、第４８５〜４９５頁］、肝臓にて活性であるアルブミン遺伝子制御領域［ピンカート等（１９８７）、ジーン・アンド・ディベロップメント、第１巻、第２６８〜２７６頁］；肝臓にて活性であるα−フェト蛋白質遺伝子制御領域［クルムラウフ等（１９８５）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第５巻、第１６３９〜１６４８頁；ハンマー等（１９８７）、サイエンス、第２３５巻、第５３〜５８頁］；肝臓にて活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域［ケルセイ等（１９８７）、ジーン・アンド・ディベロップメント、第１巻、第１６１〜１７１頁］；骨髄性細胞にて活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域［モグラム等（１９８５）、ネイチャー、第３１５巻、第３３８〜３４０頁；コリアス等（１９８６）、セル、第４６巻、第８９〜９４頁］；脳における乏突起膠細胞にて活性であるミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域［リードヘッド等（１９８７）、セル、第４８巻、第７０３〜７１２頁］；骨格筋にて活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域［シャニ（１９８５）、ネイチャー、第３１４巻、第２８３〜２８６頁］、並びに視床下部にて活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域［メーソン等（１９８６）、サイエンス、第２３４巻、第１３７２〜１３７８頁］を包含する。
したがって本発明によれば、ここに説明したＥｆｌ−コード性核酸を含む細菌もしくは真核性宿主にて複製しうる発現ベクターを用いて宿主をトランスフェクトすることによりこの種の核酸の発現を指令してＥｆｌ蛋白質を産生させ、次いでこれを微生物学上活性な形態で回収することができる。ここで使用する生物学上活性な形態は、適切なリセプタ（たとえばＥｈｋ−１もしくはＥｌｋ）に結合すると共に異なった機能を生ぜしめ或いはリセプタを発現する細胞の表現型に影響を及ぼしうる形態を包含する。この種の生物学上活性な形態は、たとえばＥｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタのチロシンキナーゼ  ドメインのホスホリル化または細胞ＤＮＡ合成の刺激を包含する。
遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３種の一般的手法により同定することができる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在もしくは不存在、および（ｃ）挿入された配列の発現。第１の手法において、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたｅｆｌ遺伝子に対し相同性である配列を含んだプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化によって検出することができる。第２の手法において、組換ベクター／宿主系は、ベクターにおける外来遺伝子の挿入により生じた或る種の「マーカー」遺伝子機能（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける咬合体形成など）の存在もしくは不存在に基づいて同定および選択することができる。たとえばｅｆｌ遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されれば、挿入物を含有する組換体はマーカー遺伝子機能の不存在により同定することができる。第３の手法において、組換発現ベクターは組換体により発現された外来遺伝子産生物を分析して同定することができる。この種の分析はたとえばｅｆｌ遺伝子産生物の物理的もしくは機能的性質に基づくことができ、たとえば検出可能な抗体もしくはその１部で標識しうるＥｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタまたはその部分に対するリガンドの結合またはＥｆｌ蛋白質もしくはその１部に対し産生された抗体への結合によって行うことができる。
Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）リガンドは、従来同定されたリガンドＢ６１（ここではＥｆｌ−１と称する）に対し或る程度の相同性を有すると思われる［ホルツマン等（１９９０）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１０巻、第５８３０〜５８３８頁］。Ｂ６１と同様に、Ｅｆｌ−２は認識配列をコードしてＧＰ１結合することにより細胞内ドメインを欠如しうると思われるＣ−末端疎水性配列で終端する。事実、ホスホリパーゼＣでのＥｆｌ−２発現性細胞の予備処理はＥｈｋ−１リセプタ体結合を減少させると思われ、したがってこれら蛋白質がＰＩ結合されることを確認する。Ｅｆｌ−３はホスホリパーゼＣにより細胞表面から切断されず、細胞質ドメインを有する通常の経膜蛋白質を含むと思われる。
ここに説明したリガンドは動物細胞発現系で膜結合型として産生させることができ、或いは可溶性型で発現させることができる。可溶性型のリガンドは、当業界で知られた方法を用いて発現させることができる。一般的に使用される手法は、一方が蛋白質のＮ−末端にまたがり、他方が蛋白質の疎水性セグメントに対し直ぐ上流の領域にまたがるオリゴヌクレオチド  プライマーの使用を含み、これはＧＰＩ−結合認識ドメインまたは蛋白質の経膜ドメインのいずれかを示す。Ｃ−末端領域にまたがるオリゴヌクレオチドは、疎水性ドメインの前に停止コドンを含むよう改変される。２種のオリゴヌクレオチドを用いて、膜結合でなく分泌される蛋白質をコードする遺伝子の改変型を増幅させる。或いはベクターにおける便利な制限部位を用いてＧＰＩ−結合認識ドメインもしくは経膜ドメインを除去する改変配列を挿入することができ、かくして分泌型の蛋白質を発現しうるベクターをもたらすことができる。このように産生された可溶性蛋白質はＮ−末端から疎水性ＧＰＩ認識ドメインもしくは経膜ドメインに先立つ領域までの蛋白質の領域を含む。
本出願人は、本発明により産生された可溶性リガンドがｅｐｈサブ族におけるリセプタに結合するが、この種の可溶性リガンドはしばしば殆どもしくは全く生物学上活性を示さないことを突き止めた。この種の可溶性リガンドは本発明によればリガンド「クラスター化」によって活性化される。ここで用いる「クラスター化」は、ここに説明したリガンドにおける可溶性部分のマルチマーを形成するため当業者に知られた任意の方法を意味する。
１具体例において、「クラスター化」されたｅｆｌはたとえばＩｇＧのＦｃドメインを用いて本発明により作成されたダイマーであり［アルホ等（１９９１）、セル、第６７巻、第３５〜４４頁］、ジスルフィド結合ホモダイマーとしての可溶性リガンドの発現をもたらす。他の具体例において、分泌型のリガンドはそのＣ−末端にエピトープ標識を持って構成され、次いで抗−標識抗体を用いてリガンドを凝集させる。
さらに本発明は、マルチマーとして存在し或いはマルチーを形成する他の「処理（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」リガンド分子をも包含する。たとえば細胞外ドメインのダイマーを、ロイシン  ジッパーを用いて処理することができる。ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシン  ジッパー  ドメインは１：１の化学量論量で安定なヘテロダイマーを形成することが示されている［ブッシュおよびサソーネ−コルシ、トレンズ・ジェネチックス、第６巻、第３６〜４０頁（１９９０）；ゲンツ等、サイエンス、第２４３巻、第１６９５〜１６９９頁（１９８９）］。ｊｕｎ−ｊｕｎホモダイマーが生成することも示されているが、これらはｊｕｎ−ｆｏｓヘテロダイマーよりも約１０００倍低い安定性である。ｆｏｓ−ｆｏｓホモダイマーは検出されていない。ｃ−ｊｕｎもしくはｃ−ｆｏｓのロシン  ジッパー  ドメインは、上記リガンドの可溶性もしくは細胞外ドメインのＣ−末端にてキメラ遺伝子の遺伝子処理により枠内融合される。これら融合は直接とすることができ、或いはたとえばヒトＩｇＧのヒンジ領域のような柔軟性リンカードメインまたは小アミノ酸（たとえばグリシン、セリン、スレオニンもしくはアラニン）よりなるポリプチド  リンカーを種々の長さおよび組合せで用いることもできる。さらに、キメラ蛋白質をＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ６）により標識して金属キレートクロマトグラフィーにより急速精製したり或いは抗体を入手しうるエピトープにより標識してウエスタンブロット、免疫沈澱またはバイオアッセイにおける活性欠失／阻止での検出を可能にすることもできる。
或いはマルチマーは、リガンドの可溶性もしくは細胞外部分に続きｈｌｇＧのＦｃドメイン、次いで上記したｃ−ｊｕｎもしくはｃ−ｆｏｓ  ロイシン  ジッパーよりなる分子を遺伝子処理すると共に発現させて作成することもできる［コステルニー等、ジャーナル・イミュノロジー、第１４８巻、第１５４７〜１５５３頁（１９９２）］。これらロイシン  ジッパーは主としてヘテロダイマーを形成するので、これらを用いて所望に応じヘテロダイマーの形成を促すことができる。ロイシン  ジッパーを用いて説明したキメラ蛋白質に関し、これらは金属キレートもしくはエピトープで標識することもできる。この標識されたドメインを金属−キレート  クロマトグラフィーにより及び／或いは抗体により急速精製してウエスタンブロット、免疫沈澱またはバイオアッセイにおける活性欠失／阻止で検出しうるよう使用することができる。
本発明の他の具体例において、マルチマー可溶性  リガンドは柔軟性リンカーループを用いキメラ分子としての発現により作成される。キメラ蛋白質をコードするＤＮＡ構成物は、柔軟性ループにより互いに直列（「ヘッド対ヘッド」）で融合した２個もしくはそれ以上の可溶性もしくは細胞外ドメインを発現するよう設計される。このループは全体として人工的（たとえば所定間隔にてセリンもしくはスレオニンにより中断されるポリグリシンリピート）とすることができ、或いは天然蛋白質（たとえばｈｌｇＧのヒンジ領域）から「借用」することもできる。ループの長さおよび組成を変化させるよう分子を処理して、所望の特性を有する分子の選択を可能にすることもできる。特定の理論に拘束されるものでないが、本出願人はリガンドの膜付着がリガンドのクラスター化を容易化させてリセプタのマルチマー化および活性化を促進するものと信ずる。すなわち本発明によれば、可溶性リガンドの生物学的活性は溶液にて膜関連リガンド  クラスター化を模倣して得られる。すなわち、生物学的に活性なクラスター化された可溶性ｅｐｈ族リガンドは（可溶性Ｅｆｌ）nを含み、ここで可溶性ｅｆｌはｅｐｈ族リセプタを結合するリガンドの細胞外ドメインであり、ｎは２もしくはそれ以上である。ここに説明したＥｆｌ−１、Ｅｆｌ−２およびＥｆｌ−３は全て本発明の方法により生物学上活性にされる。それぞれの場合、当業者はクラスター化の成功がたとえばここに説明したような生検を用いる生物学的活性の分析を必要とすることを了解するであろう。たとえば第５図に示したように、レポータ細胞を発現するリセプタを膜型のリガンドＢ６１、Ｅｆｌ−２およびＥｆｌ−３を過剰発現するＣＯＳ細胞で刺激することによりリセプタ燐酸化が顕著に誘発されるという事実にも拘らず（第５Ａ図、レーン１および２）、可溶性型のこれらリガンドを用いて観察しうる燐酸化は得られない（第５Ｂ図、レーン２および３、並びに第５Ｃ図、レーン２）。しかしながら、分泌型のリガンドをｍｙｃ標識すると共に抗体を使用して各リガンドをクラスター化させれば、従来不活性の可溶性リガンドはＥｌｋおよびＥｈｋ−１リセプタを発現するレポータ細胞におけるリセプタ  チロシン燐酸化を強く誘発する（第５Ｂ図、レーン４および５、第５Ｃ図、レーン３）と共にＥｃｋリセプタキメラを発現するレポータ細胞における増殖をも誘発する（第６Ａ図）。
幾つかの場合は生物学的活性を誘発させるのにリガンドの二量化にて充分であるが、第７図に示したデータは或る場合ここで説明した方法をどのように用いて特定クラスター化技術の能力を判定するかを示す。Ｅｌｋリガンドにつき第７図に示したように、Ｆｃを用いる可溶性リガンドの二量化は生物学的反応を達成するのに不充分であると思われる（第７図、レーンＣ）。しかしながら、抗−Ｆｃ抗体を用いて本発明によりリガンドをさらにクラスター化させれば、生物学的活性の相当な増加が生じた（レーンＤ）。
リガンドＢ６１の場合、クラスター化なしに得られた可溶性リガンドにつき低レベルの生物学的活性が得られると思われる。この種の低レベルの生物学的活性は低レベルの「自己クラスター化」によって生じ得る。しかしながら本出願人は或る程度の生物学的活性を有するたとえばＢ６１のようなｅｆｌの場合にも活性を本発明にしたがうクラスター化により増大させうることを示した。
本発明の細胞は、Ｅｆｌを天然型で或いはここに説明したように標識Ｅｆｌもしくはクラスター化Ｅｆｌとしての可溶性型で一時的または好ましくは構成的かつ永久的に発現することができる。
組換因子は、その後に安定かつ生物学上活性な蛋白質を形成させうる任意の技術により精製することができる。たとえば限定はしないが、これら因子は可溶性蛋白質として或いは封入体として細胞から回収することができ、そこから８Ｍグアニジウム塩酸塩および透析によって定量的に抽出することができる。因子をさらに精製するには慣用のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーもしくはゲル濾過を用いることができる。
本発明の他の具体例においては組換ｅｆｌを用いて相同組換により内生遺伝子を失活または「ノックアウト」することができ、これによりｅｆｌ蛋白質欠失細胞、組織または動物を形成することができる。たとえば限定はしないが、組換ｅｆｌを処理して挿入突然変異体（たとえばｎｅｏ遺伝子）を含ませることができ、これは天然ｅｆｌ遺伝子を失活させる。この種の構成物は、適するプロモータの制御下で、たとえば胚幹細胞のような細胞中へ、たとえばトランスフェクション、トランスダクション、インジェクションなどの技術により導入することができる。この構成物を含有する細胞を次いでＧ４１８耐性により選択することができる。次いで、無傷（intact）ｅｆｌを欠如した細胞をたとえばサウザンブロッチングもしくはノーザンブロッチングまたは発現の検定により同定することができる。無傷ｅｆｌを欠如した細胞を次いで早期胚細胞に融合させて、この種のリガンドを欠失したトランスジェニック動物を発生させることができる。この種の動物と内生ｅｆｌを発現する動物との比較は、発育および維持におけるリガンドの役割を説明するのに役立つ。この種の動物を用いて、特定ニューロン集団などをインビボ過程で一般にリガンドに依存して規定することができる。
さらに本発明は、たとえば診断用途にてリガンドを検出するのに有用である上記Ｅｆｌに対する抗体をも提供する。ここに説明したリガンドに対する抗体は、本発明によるクラスター化を達成するにも有用である。内生リガンドが存在する場合、抗体自身は存在するリガンドを活性化させることにより治療剤として作用しうる。
これらＥｆｌに指向させるモノクローナル抗体を作成するには、細胞系統の連続培養により抗体分子を産生させる任意の技術を用いることができる。たとえば最初にコーラーおよびミルスタインにより開発されたハイブリドーマ技術［（１９７５）、ネイチャー、第２５６巻、第４９５〜４９７頁］、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術［コツボール等（１９８３）、イミュノロジー・ツデイ、第４巻、第７２頁］およびヒト  モノクローナル抗体を産生させるためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［コール等（１９８５）、「モノクローナル抗体および癌療法」、アランＲ．リス・インコーポレーション、第７７〜９６頁］などが本発明の範囲内である。
診断用途もしくは治療用途のためのモノクローナル抗体はヒト  モノクローナル抗体もしくはキメラ  ヒト−マウス（もしくは他の動物）モノクローナル抗体とすることができる。ヒト  モノクローナル抗体は当業界で知られた任意多くの技術により作成することができる［たとえばテング等（１９８３）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、第７３０８〜７３１２頁；コツボール等（１９８３）、イミュノロジー・ツデイ、第４巻、第７２〜７９頁；オルソン等（１９８２）、メソッズ・エンチモロジー、第９２巻、第３〜１６頁］。キメラ抗体分子は、マウス抗原結合性ドメインをヒトコンスタント領域と共に含有して作成することができる［モリソン等（１９８４）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８１巻、第６８５１頁；タケダ等（１９８５）、ネイチャー、第３１４巻、第４５２頁］。
当業界で知られた各種の方法を、ここに説明したＥｆｌのエピトープに対するポリクローナル抗体を産生させるべく使用することができる。抗体の産生には、各種の宿主動物をＥｆｌまたはその断片もしくは誘導体の注射により免疫化することができ、宿主動物は限定はしないがウサギ、マウス、ラットなどを包含する。各種のアジュバントを用いて宿主動物に応じ免疫学的反応を増大させることができ、限定はしないがフロインド（完全もしくは不完全）、ミネラルゲル（たとえば水酸化アルミニウム）、表面活性物質、たとえばリソレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール  インペット  ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びに潜在的に有用なヒト  アジュバント、たとえばＢＣＧ（バシル・カルメッテ−ゲラン）およびコリネバクテリウム・パルブムを包含する。
選択されたＥｆｌエピトープに対する抗体の分子クローンは公知技術により作成することができる。組換ＤＮＡ法［たとえばマニアチス等（１９８２）、モレキュラ・クローニング、ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク参照］を用いて、モノクローナル抗体分子もしくはその抗原結合領域をコードする核酸配列を作成することができる。
抗体分子は公知技術、たとえば免疫吸収もしくは免疫親和性クロマトグラフィー、たとえばＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ法またはその組合せなどにより精製することができる。
本発明は、抗体分子およびこの種の抗体分子の断片を提供する。分子のイジオタイプを含有する抗体断片は公知技術により発生させることができる。たとえば、この種の断片は限定はしないが次のものを包含する：抗体分子のペプシン切断により産生させうるＦ（ａｂ′）2断片；Ｆ（ａｂ′）2断片のジスルフィド架橋を還元して発生させうるＦａｂ′断片；および抗体分子をパパインと還元剤とで処理して発生させうるＦａｂ断片。
さらに本発明は神経障害に羅患した患者の処置方法をも提供し、この方法は患者を有効量の１種もしくはそれ以上のＥｆｌ、そのペプチド断片またはＥｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタに結合しうる誘導体で処置することからなっている。
Ｅｈｋ−１に対する同族リガンドの有力な治療用途が米国特許出願第０８／１４４，９９２号に示唆されている。成体脳において、ｅｈｋ−１の細胞局在は遺伝子が主としてニューロンで発現されると共に明確なニューロン集団にてその最高発現レベルに達することを示し、これら神経集団は主上昇中央コリン発生性核（脚間領域、嗅結節および側部扁桃）、並びにモノアミン作用性核（銹斑、背部縫線および黒質）を包含する。Ｅｈｋ−１プローブは前脳の腹側外側領域における梨状皮質、対角バンドの水平脚、吻側角膜および灰白鞘と脳縦条とに関連するニューロン、海馬体、ＣＡ３およびＣＡ２における錐体ニューロン（ＣＡ１にて若干弱い）、上側丘体、並びに脳縦条のレトロスプレニアル皮質およびニューロンを著しく強調した。
成体ラット脳にて、Ｅｈｋ−１は脚間核および黒質、底部および側部扁桃および背部縫線に関連したニューロンリッチ密度を著しく強調することが見られる。Ｅｈｋ−１プローブは小脳の顆粒層、小脳のパーキニエ細胞および嗅覚バルブにおける僧帽細胞に顕著にハイブリダイズすることができた。
Ｅ１３胚において、ｅｈｋ−１転写物は身体におけるよりも頭にてずっと豊富である。生後１日（Ｐ１）まで各バンドは脳にてその最高レベルに達し、成体脳にて若干低下する。Ｅｈｋ−１バンドはＰ１から成体への移行期に際し小脳試料にて低下し、これは成体の全脳における主たる発現部位が主として小脳の外側に位置することを示唆する。
より長い暴露は、ｅｈｋ−１神経特異性バンドが海馬体星状細胞の一次培養物からのＲＮＡでも検出しうることを示す。これは、ｅｈｋ遺伝子がグリアでなく主としてニューロンで発現することを現場でのＲＮＡハイブリッド試験が示すため予想外である。種々の確認された細胞系統における検査が示したところでは、ｅｈｋ−１は種々の神経上皮腫および神経芽細胞腫系統を包含するニューロン由来細胞にて主として発現される。
さらにＥｌｋリセプタも主として脳で発現される。したがって、ここに説明したＥｌｋ結合性リガンドは異なる機能の誘発を支援し及び／或いはたとえば神経細胞の成長および／または生存のような表現型に影響を与えて、このリセプタを発現するものと思われる。
ノーザンブロット分析（第４図）は、Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）の幅広い分布と異なり、Ｅｆｌ−２（ＥＨＫ−１Ｌ）およびＥｆｌ−１（Ｂ６１）につき制限かつ逆（reciprocal）パターンの発現を示した。Ｅｈｋ−１と同様にＥｆｌ−２も殆ど専ら中枢神経系で発現され、ただしＥｈｋ−１発現が殆ど検出しえない皮膚にて高度に発現することが顕著な例外である。これに対し、Ｅｆｌ−１（Ｂ６１）は主として非ニューロン組織で発現される（第４Ａ図；より長い暴露は大抵の神経構造体にて低レベルのＢ６１を示す）。脳および精巣においてのみ発現されるＥｌｋリセプタとは異なり、Ｅｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）はニューロン組織および非ニューロン組織の両者にて広く発現される。脳においてＥｆｌ−１およびＥｆｌ−３の両者（Ｅｆｌ−２は含まず）の発現は発育早期にて実質的に高く、次いで低下する（第４Ｂ図）。Ｅｆｌ−１およびＥｆｌ−３の場合と同様に、他の神経系特異性リセプタチロシンキナーゼのリガンド（たとえばＴｒｋリセプタのニューロトロフィン  リガンド）も非ニューロン組織にて発現され［メソンピエール等（１９９０）、サイエンス、第２４７巻、第１４４６〜１４５１頁；メソンピエール等（１９９０）、ニューロン、第５巻、第５０１〜５０９頁］、これは明かにリガンドがこれら組織を神経刺激する軸索過程のための標的由来因子として作用するからである［Ｈ．ソエネン（１９９１）、トレンズ・ニューロサイエンス、第１４巻、第１６５〜１７０頁］。Ｅｆｌ−１およびＥｆ１−３の非ニューロン的発現も、これらが非神経細胞により発現されるＥｐｈリセプタ族の構成員（たとえばＥｃｋ）のリガンドとして作用する可能性を高める。
さらに本発明は、ここに説明したＥｆｌ、そのペプチド断片または誘導体を適する薬理キャリヤ中に含む医薬組成物をも提供する。
Ｅｆｌ蛋白質、ペプチド断片もしくは誘導体は全身的または局部的に投与することができる。当業界で知られた任意適する投与方式、たとえば限定はしないが静脈内、胸部内、動脈内、鼻腔内、経口的、皮下、腹腔内の投与または局部注射もしくは外科移植を用いることができる。遅延放出処方も可能である。
神経変質病／神経外傷に関する理解が一層明瞭になるので、内生Ｅｆｌの作用を減少させるのが有利であることも明かとなる。したがって神経系外傷の分野において、限定はしないがＥｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタと相互作用するための細胞結合リガンドと競合しうるような可溶性型のＥｆｌを包含するＥｆｌ拮抗剤を与えることが望ましい。或いは可溶性型のＥｈｋ、ＥｃｋもしくはＥｌｋリセプタ（たとえば後記実施例１に記載するように産生される「リセプタ体」として発現）は、リガンドを結合して失活させることにより拮抗剤として作用しうる。この種の拮抗剤を全身的でなく外傷部位に局部的に投与することが望ましい。Ｅｆｌ拮抗剤を与える移植体の使用も望ましい。
代案として、或る種の症状はＥｆｌ反応性の増大から利点を受ける。したがって、この種の症状を有する患者においてはＥｆｌの個数もしくは結合親和性を増大させることが有利である。これはＥｆｌ、Ｅｆｌ発現性細胞またはＥｈｋ−１もしくはＥｌｋリセプタのいずれかを用いる遺伝子療法によって達成することができる。適する細胞におけるこの種の組換蛋白質の選択的発現は、組織特異性もしくは誘発性プロモータにより或いは組換遺伝子を有する複製欠失ウィルスでの局部注射により制御されるコード遺伝子を用いて達成することができる。
実施例１：ＥＨＫ−１結合性リガンドの発現クローン化
ＣＯＳ−７細胞を、１０％の胎児牛血清（ＦＢＳ）とそれぞれ１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグルタミンとを含有するデュルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ2の雰囲気下に培養した。ヒト神経芽細胞腫の細胞系統、すなわちＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ジュン・ビードラー、ソロラン−ケッタリングから入手）を、１０％ＦＢＳと（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグルタミンとを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）にて培養した。
ＣＯＳ細胞で発現されたｐＪＦＥ１４ベクターにてＳＨＳＹ５Ｙ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ヒトＥｆｌ  ｃＤＮＡクローンを得た。ＣＯＳ細胞で発現されたｐＪＦＥ１４ベクターにてヒト骨髄肉腫１４３Ｂ細胞系統ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ヒトＥｆｌ−４  ｃＤＮＡクローンを得た。第１図に示したようにｐＪＦＥ１４ベクターはベクターｐＳＲαの改変型である［タケベ等（１９８８）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第４６６〜４７２頁］。ｐＪＦＥ１４ベクターにおける２つのＢＳＴＸ１制限部位を用いてライブラリーを作成した。
ＣＯＳ−７細胞に、ＤＥＡＥ−デキストラン  トランスフェクション法によりｐＪＦＥ１４ライブラリーまたは比較ベクターのいずれかを一時的にトランスフェクトさせた。要約すれば、ＣＯＳ−Ｍ５細胞をトランスフェクションの２４時間前に１００ｍｍプレート１枚当り１．０×１０6細胞の密度で塗沫した。トランスフェクションのため、細胞を４００μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストランと１μＭのクロロキンと２ｍＭのグルタミンと１μｇの適するＤＮＡとを含有する血清フリーのＤＭＥＭにて３７℃で３〜４時間にわたり５％ＣＯ2の雰囲気下に培養した。トランスフェクション培地を吸引すると共に、１０％ＤＭＳＯを含む燐酸塩緩衝塩水で２〜３分間かけて置換した。このＤＭＳＯ「ショック」の後、ＣＯＳ−７細胞を１０％のＦＢＳとそれぞれ１％のペニシリンおよびストレプトマイシンと２ｍＭのグルタミンとを含むＤＭＥＭに４８時間入れた。
スクリーニングをＥｈｋ−１リセプタ体を用いる表面染色の直接的検出によって行い、このリセプタ体はＩｇＧ１コンスタント領域に融合したＥｈｋ−１の細胞外ドメインで構成された。このリセプタ体は次のように作成した：ヒンジ領域から開始すると共に分子のカルボキシ末端まで延びるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を、ヒトＩｇＧ１の公開配列に対応するオリゴヌクレオチドでのＰＣＲにより胎盤ｃＤＮＡからクローン化させた。便利な制限部位をもオリゴヌクレオチドに一体化させて、ＰＣＲ断片を発現ベクター中にクローン化させることができた。全長リセプタを有する発現ベクターを制限酵素切断により或いはＰＣＲ手法により改変させて、経膜および細胞内ドメインを制限部位（これら部位はヒトＩｇＧ１断片のこれらの部位へのクローン化を可能にする）で置換した。これは、リセプタ  エクトドメインをそのアミノ末端として有すると共にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をそのカルボキシ末端として有する融合蛋白質を発生させるよう行った。リセプタ体を作成する代案方法についてはグッドウィン等（１９９３）、セル、第７３巻、第４４７〜４５６頁に記載されている。
要約すれば、ＣＯＳ細胞の１００ｍｍ皿に１μｇのＳＨＳＹ５ＹライブラリープラスミドＤＮＡをトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後、細胞をＥｈｋ−１  ＩｇＧと共に３０分間インキュベートして検定した（ＣＯＳ細胞上澄の形態で）。次いで各細胞をＰＢＳで２回洗浄し、メタノールで固定し、次いでＰＢＳ／１０％子牛血清／抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体と共にさらに１０分間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をａｌｋ−ｐｈｏｓ基質にて３０〜６０分間にわたりインキュベートした。次いで皿を表面染色細胞の存在につき顕微鏡検査した。各染色細胞につき、これを包囲する小区域をプラスチック  ピペット先端により皿から掻取り、次いでプラスミドＤＮＡを再生させて細菌細胞をエレクトロポレートすべく使用した。これらエレクトロポレーションから得られた培養物より作成されたプラスミドＤＮＡを用いて第２回の集積につきＣＯＳ細胞をトランストした。第２回目は標準的なパンニング技術を用いて行った。第２回目の集積（ｅｎｒｉｃｍｅｎｔ）の後、単一の細菌集落を釣り上げ、これら集落から作成されたプラスミドＤＮＡをこれらによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞におけるＥｈｋ−１染色を誘発する能力につき試験した。
ＳＹ５Ｙライブラリーからの３種のクローンを同定し、これらはＥｈｋ−１リセプタ体への結合を示した。第１のものはＢ６１と同定された。同一であって、ここではＥｆｌ−２と命名した第２および第３のクローンは相違すると思われるが、部分ヌクレオチド配列決定により判定してＢ６１に関連すると思われ、これらがＢ６１族の構成員であることを示唆する。これら３種全てのリガンドは膜結合していると思われる。さらにＢ６１と同様に、Ｅｆｌ−２はＧＰＩ−結合している。
ヒト骨髄肉腫細胞系統由来のライブラリーは、Ｅｆｌ−４をコードするクローンをもたらした。このリガンドはＥｈｋ−１、Ｅｈｋ−２およびＥｈｋ−３、並びにＥｃｋの各リセプタを結合するがＥｌｋリセプタを結合しない。
実施例２：新規なＥＦＬのクローン化
Ｂ６１とＥｆｌ−２との間の相同性の領域を用いて、米国特許出願第０８／１４４，９９２号に記載されたように他のＥｆｌを同定することができる。たとえば第２図は、これら２種の配列相同性の領域を示し、これらはそれぞれ単一文字のアミノ酸配列、すなわちＶ（Ｆ／Ｙ）ＷＮＳＳＮ（配列番号５）およびＮＤＹ（Ｖ／Ｌ）ＤＩ（Ｉ／Ｙ）ＣＰＨＹ（配列番号６）を有し、ここで括弧内の文字は推定Ｅｆｌ−２蛋白質と比較してヒトおよびラットのＢ６１で相違する残基を示す。次いで、これら保存蛋白質領域に対応する変質オリゴデオキシヌクレオチドを、胚芽および成体脳を含め各種の組織から作成されたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を開始させるべく設計し使用することができる。次いで、得られた増幅ＤＮＡ断片をプラスミド中への挿入によりクローン化させ、ＤＮＡ配列決定にかけることができ、次いでこれら配列を公知Ｅｆｌの配列と比較することができる。
実施例３：ＥＬＫ結合性リガンドの発現クローン化
ＣＯＳ−７細胞を、１０％の胎児牛血清（ＦＢＳ）とそれぞれ１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグルタミンとを含有するデュルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ2の雰囲気下に培養した。ヒト神経上皮腫系統ＣＨＰ１００（入手）を１０％ＦＢＳと（Ｐ／Ｓ）と２ｍＭのグルタミンとを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）にて培養した。
ＣＯＳ細胞で発現されたｐＪＦＥ１４ベクターにてＣＨＰ１００  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ヒトＥｆｌ  ｃＤＮＡクローンを得た。このベクターは第１図に示したようにベクターｐＳＲα［タケベ等（１９８８）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第４６６〜４７２頁］の改変型である。このライブラリーは、ｐＪＦＥ１４ベクターにおける２つのＢＳＴＸ１制限部位を用いて作成した。
ＣＯＳ−７細胞にｐＪＦＥ１４ライブラリーまたは比較ベクターのいずれかをＤＥＡＥ−デキストラン  トランスフェクション法により一時的にトランスフェクトさせた。要約すれば、ＣＯＳ−Ｍ５細胞をトランスフェクションの２４時間前に１００ｍｍプレート１枚当り１．０×１０6細胞の密度で塗沫した。トランスフェクションのため、細胞を４００μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストランと１μＭのクロロキンと２ｍＭのグルタミンと１μｇの適するＤＮＡとを含有する血清フリーのＤＭＥＭにて３７℃で３〜４時間にわたり５％ＣＯ2の雰囲気下に培養した。トランスフェクション培地を吸引し、１０％ＤＭＳＯを含む燐酸塩緩衝塩水で２〜３分間かけて置換した。このＤＭＳＯ［ショック］の後、ＣＯＳ−７細胞を１０％のＦＢＳと１％のそれぞれペニシリンおよびストレプトマイシンと２ｍＭグルタミンとを含むＤＭＥＭに４８時間入れた。
Ｅｈｋ−１リセプタ体を用いる表面染色の直接的検出によりスクリーニングを行い、前記リセプタ体はＩｇＧ１コンスタント領域に融合したＥｌｋの細胞外ドメインで構成した。このリセプタ体を次のように作成した：ヒンジ領域から開始すると共に分子のカルボキシ末端まで延びるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を、ヒトＩｇＧ１の公開配列に対応するオリゴヌクレオチドでのＰＣＲを用いて胎盤ｃＤＮＡからクローン化させた。さらに、便利な制限部位をオリゴヌクレオチドに一体化させてＰＣＲ断片を発現ベクター中にクローン化させることもできる。全長リセプタを有する発現ベクターを制限酵素切断により或いはＰＣＲ手法により改変させて経膜ドメインおよび細胞内ドメインを、ヒトＩｇＧ１断片をこれら部位にクローン化させうる制限部位で置換した。これは、リセプタ  エクトドメインをそのアミノ末端として有すると共にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分をそのカルボキシ末端として有する融合蛋白質を発生させるよう行った。リセプタ体を作成する代案方法についてはグッドウィン等（１９９３）、セル、第７３巻、第４４７〜４５６頁に記載されている。
要約すれば、ＣＯＳ細胞の１００ｍｍ皿に１μｇのＣＨＰ１００ライブラリープラスミドＤＮＡをトランスフェクトさせた。トランスフェクションの２日後、細胞をＥｌｋ−ＩｇＧと共に３０分間インキュベートして検定した（ＣＯＳ細胞上澄の形態で）。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、メタノールで固定し、次いでＰＢＳ／１０％子牛血清／抗−ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体と共にさらに３０分間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞をａｌｋ−ｐｈｏｓ基質にて３０〜６０分間にわたりインキュベートした。次いで皿を表面染色細胞の存在につき顕微鏡検査した。各染色細胞につき、これを包囲する小区域をプラスチック  ピペット先端により皿から掻取り、次いでプラスミドＤＮＡを再生すると共に細菌細胞をエレクトロポレートすべく使用した。これらエレクトロポレーションから得られた培養物より作成したプラスミドＤＮＡを用いて第２回目の集積につきＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。第２回目は標準的なパンニング技術を用いて行った。第２回目の集積の後、単一の細菌集落を釣り上げ、これら集落から作成されたプラスミドＤＮＡをこれらによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞におけるＥｌｋ染色を誘発させる能力につき試験した。
Ｅｌｋリセプタ体に対する結合を示すと同定されたクローンを１９９４年４月１２日付けでＡＴＣＣに寄託し、第７５７３４号と指定された。
実施例４：可溶性ＥＦＬの活性化
ベクター単独（ＣＯＳ−Ｍｏｃｋ）でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはＥｆｌ−３発現ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞のいずれかを増殖させ、これら細胞を皿からＰＢＳ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡにより脱着させ、ペレット化させ、次いでＰＢＳに再懸濁させることにより、膜結合したＥｆｌの分析を行った。細胞をレポータ細胞系統の頂部に積層した。
それぞれＣ−末端にｍｙｃエピトープを用いて標識した可溶性Ｅｆｌ−３およびＢ６１［スタール等、サイエンス、第２６３巻、第９２〜９５頁（１９９４）］をＣＯＳ細胞上澄として産生させると共に、非クラスター化リガンドとして或いは抗体によりクラスター化させたリガンドとして使用した。スロットブロットにおけるｍｙｃエピトープの量を定量することによりリガンド濃度を推定した。リガンドクラスター化は、抗−ｍｙｃ  モノクローナル抗体と抗−マウス  ポリクローナル抗体とを添加すると共に細胞を刺激する前に３７℃にて１時間にわたりインキュベートすることにより行った。レポータ細胞系統はＥｌｋでトランスフェクトされた３Ｔ３繊維芽細胞（第５Ａ図および第５Ｂ図）またはＥｈｋ−１でトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞（第５Ｃ図）とした。１０ｃｍ皿におけるレポータ細胞を血清フリー培地にて４〜６時間にわたり飢餓させ、次いで上記したように１５分間にわたり刺激し、次いで可溶化させると共にリセプタを認識する抗体で免疫沈殿させた。免疫沈澱物をホスホチロシンに対する抗体で免疫ブロットし（第５図、上側パネル）、次いで剥離させると共にリセプタを認識する抗体で再プローブして全リセプタ蛋白質を可視化させた（第５図、下側パネル）。
Ｅｃｋリセプタ  キメラにより媒介されたＢＡＦ細胞における成長反応の誘発を測定するため、各刺激をＣＯＳ細胞で産生された可溶性Ｅｆｌ−１およびＢ６１により、その後のクラスター化と共に或いはクラスター化なしに行った。２日間の刺激の後、生体染料ＭＴＴ（３−｛４，５−ジメチルチアゾール−２−イル｝−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロマイド）を４時間かけて添加し、次いで従来記載されているように可溶化させると共に光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより生存細胞の個数を評価した［イプ等（１９９３）、ニューロン、第１０巻、第１３７〜１４９頁］（第８図）。第９図に示したデータは、ＣＯＳ細胞で産生されてその後に抗Ｆｃ抗体でクラスター化させた或いはクラスター化させなかった可溶性Ｅｈｋ−１Ｌ−ＦｃおよびＢ６１−Ｆｃを用いて行ったＭＴＴ分析からの結果である。Ｅｃｋリセプタの触媒ドメインはＢＡＦ細胞における成長反応を媒介しないので、リセプタ  キメラ（ここでは、ＥｃｋリセプタのエクトドメインをＦＧＦリセプタの細胞質ドメインに融合させた）をＢＡＦ細胞に導入してレポータ細胞系統を作成した。
第５Ｂ図、レーン２および３、並びに第５Ｃ図、レーン２に示したように、リセプタ燐酸化により判定してリガンド誘発のリセプタ活性化は可溶性型のＥｆｌ−３もしくはＢ６１を用いて観察されなかった。しかしながらリセプタ燐酸化は、リセプタ発現レポータ細胞を膜結合型の前記リガンドを過剰発現するＣＯＳ細胞で刺激することにより顕著に誘発された（たとえば第５Ａ図、レーン１および２）。この相違点を説明するため、膜付着がリガンドのクラスター化を促進し、次いでリセプタのマルチマー化および活性化を促進すると推定した。溶液におけるリガンドのクラスター化を模倣するため、分泌型のリガンドをＣ−末端に添加されたエピトープ標識を用いて作成した：次いで標識に対する抗体を用いてリガンドを凝集させた。この種のクラスター化は、従来不活性の可溶性リガンドによりＥｌｋおよびＥｈｋ−１レポータを発現するレポータ細胞にてリセプタ  チロシン燐酸化を強度に誘発することができる（第５Ｂ図、レーン１〜５および第５Ｃ図、レーン１〜３）。同様に、第７図に示すようにＥｆｌ−３（ＥＬＫ−Ｌ）に関しリガンドの二量化では生物学的活性を誘発するのに不充分であるのに対し、マルチマーは顕著な活性を有した。これらの結果は、ここに説明したように特定の各リガンドに関する限りクラスター化の特定メカニズムの効果を評価する必要性を示す。
この種のクラスター化の効果は、リセプタの燐酸化を測定して判定することができる。或いは、適するリセプタもしくはリセプタ  キメラ（たとえばＥｃｋリセプタキメラ）を発現するレポータ細胞での増殖を実験で用い、その結果を第６図に示す。
投与量−反応の各試験は、クラスター化が少なくとも１００倍大の能力をもたらすと共に低濃度のリガンド（他のリセプタ族に関するリガンドで見られる反応［イプ等、ニューロン、第１０巻、第１３７〜１４９頁］と比較）で飽和反応をもたらすことを燐酸化分析（Ｅｌｋリガンドにつき試験、データ示さず）および増殖分析（Ｅｆｌ−１およびＢ６１につき試験、第６図）の両者にて示す。非クラスター化Ｂ６１の小さい効果（第６Ｂ図）は、高濃度の可溶性Ｂ６１がＥｃｋチロシン燐酸化を誘発させうるという最近の知見［バートレー等、ネイチャー、第３６８巻、第５５８〜５６０頁（１９９４）］を思い出させる。この試験では、１〜２ｍｇ／ｍＬ濃度のＢ６１においても飽和は達成されなかった。これらの効果は、可溶性リガンド自身が自然に或いは精製の結果として二量化もしくは凝集する弱い能力に起因するのであろう。可溶性リガンドは、二価もしくは多価であるためリセプタを活性化させると思われる［Ｊ．シュレシンガーおよびＡ．ウルリッチ、ニューロン、第９巻、第３８３〜３９１頁（１９９２）］。或る種のリガンドは２個の異なるリセプタ結合性部位を有するモノマーであるのに対し、他のリガンドは共有結合もしくは非共有結合したダイマーとして二価性を達成する。本発明の結果は、恐らく一価であるため可溶性リガンドとして無効であると思われるがクラスター化により溶液で人工的に活性化しうる新規な種類のリガンドを規定する。これらリガンドは、リセプタを凝集すると共に活性化する膜付着に依存すると思われる。拡散を二次元に制限することにより、膜付着は簡単にリガンド−リガンド衝突の傾向を増大させることによりリガンド二量化或いは一層激しいリガンドのクラスター化、特に溶液にて極く弱くしか相互作用しないリガンドのクラスター化を促進する。あるいは、細胞表面リガンドのクラスターを形成させるには特異的メカニズムが存在する。さらに、リガンド−リセプタ対はリガンド支持細胞とリセプタ支持細胞との接触区域に蓄積すると思われる。
これら側方凝集作用は全てリセプタのマルチマー化および活性化に寄与しうる。ＥＰＨ関連のニューロン発現されたＮＵＫリセプタが細胞と細胞との接触区域に一時的に集中するという観察［ヘンケマイヤー等、オンコジーン、第９巻、第１００１〜１０１４頁（１９９４）］は、１つの膜に結合したリガンドと他の膜に結合したリセプタとの間の相互作用が側方凝集を促進するという可能性を裏付ける。
微生物の寄託
以下の微生物を、ブダペスト条約の規定に基づきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド州２０８５２に寄託した。
受託番号
ｅｆｌ−２を有するｐＪＦＥ１４      ７５７２８
ｅｆｌ−３を有するｐＪＦＥ１４      ７５７３４
ｅｆｌ−４を有するｐＪＦＥ１４      ７５９２１
以上、本発明を例示の目的で詳細に説明したが、本発明の範囲はこれら特定実施例のみに限定されず、多くの改変をなしうることが当業者には了解されよう。本明細書には各種の引例を引用したが、その開示を参考のためここに引用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
0003686084.tif 000007
【図６】
0003686084.tif 000008
【図７】
0003686084.tif 000009
【図８】
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【図９】
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