(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１）及び／又は（２）
【化１】
0003638425.tif 000005
で表わされる化合物にアルスロバクター属に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用せしめることを特徴とする次の式（３）
【化２】
0003638425.tif 000006
で表わされる光学活性化合物又はその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬品及び化粧品の製造中間体として有用な次の式（３）
【０００２】
【化３】
0003638425.tif 000002
【０００３】
で表わされる光学活性化合物の製造方法に関する。
【０００４】
【従来の技術】
上記式（３）で表わされる化合物は、不斉炭素を有し、アミノ基、カルボキシル基、及びアセタール基の官能基を有し、ＡＣＥインヒビターを始めとする医薬品、化粧品（ＵＳＰ．５５０８２７２）の製造中間体等として広範な活用が期待される化合物であり、産業上有用であると考えられる。
【０００５】
化合物（３）のラセミ体の製造法としては、すでにＥｓｍａｈａｎらの報告（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，３，１２３７（１９９５））がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この方法は製造工程が長く、反応操作が煩雑であり、総収率は低く、製造原価も高く、然も有害なアセチル水銀を使用するなど工業的製造に適した製造方法とはいいがたい方法である。更にこの方法で得られる化合物はラセミ体であり光学活性体ではない。
また、従来の酵素法による光学活性化合物（３）の製造方法において、無駄なく化合物（３）を得るには、目的とする絶対配置を有する光学活性体（例えばＳ−体）を得た後の反応系に残存する対掌体（例えばＲ−体）を単離し、ラセミ化し、再びこれから光学活性体を製造するなどの煩雑な工程が必要であった。
【０００７】
従って本発明の目的は、光学活性を有する化合物（３）を工業的に有利に製造する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
斯かる実状に鑑み本発明者は鋭意研究を行った結果、下記式（１）及び式（２）で表わされる化合物に、アルスロバクター属に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用せしめることにより、下記式（３）で表わされる光学活性化合物又はその塩を工業的に有利に製造し得ることを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、次の式（１）及び／又は（２）
【００１０】
【化４】
0003638425.tif 000003
【００１１】
で表わされる化合物にアルスロバクター属に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用せしめることを特徴とする次の式（３）
【００１２】
【化５】
0003638425.tif 000004
【００１３】
で表わされる光学活性化合物又はその塩の製造方法を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において、光学活性化合物（３）は、化合物（１）及び／又は（２）にアルスロバクター属に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用せしめることで得ることができる。
ここで用いる原料たる化合物（１）及び（２）は、グルタルアルデヒドモノエチレンアセタールに水系溶媒中で、シアン化水素又はその塩、アンモニア又はその塩、及び炭酸ガス、炭酸水素塩類、炭酸塩類又はカルバミン酸塩類を反応させることにより得られる。
【００１５】
以下、上記工程を詳細に説明する。
グルタルアルデヒドモノエチレンアセタール（以下、「モノアセタール体」という）は、公知の手段、例えば、グルタルアルデヒドとエチレングリコールとを反応させることにより得られる。
このモノアセタール体を水系溶媒中で、シアン化水素又はその塩、アンモニア又はその塩、及び炭酸ガス又は炭酸塩類、炭酸水素塩類もしくはカルバミン酸塩類と反応させ、式（１）で表わされる化合物を得る。この際、主生成物である化合物（１）の他に、式（２）で表わされる化合物も副生する。
【００１６】
ここで用いる水系溶媒としては、水又は含水アルコールが好ましい。また、シアン化水素の塩としては、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム等のシアン化アルカリが挙げられる。シアン化水素又はその塩は、モノアセタール体に対し、１〜１０倍当量使用することが好ましく、更に１〜２倍当量使用することが好ましい。
アンモニウム塩としては、例えば塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等が挙げられる。アンモニア又はアンモニウム塩は、モノアセタール体に対して２〜１０倍当量程度使用することが好ましく、特に２〜４倍当量程度使用することが好ましい。
【００１７】
炭酸水素塩類としては、例えば炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸水素アルカリ、炭酸水素アルカリ土類金属塩等が挙げられ、炭酸塩類としては炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸アルカリ、炭酸アルカリ土類金属塩等が挙げられ、カルバミン酸塩類としてはカルバミン酸ナトリウム、カルバミン酸カリウムなどが挙げられる。これらは、モノアセタール体に対して１〜１０倍当量使用することが好ましく、特に１〜２倍当量使用することが好ましい。
【００１８】
また炭酸水素アンモニウム、又は炭酸アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等を用い、これらの化合物にアンモニウム塩と炭酸塩等との両者の作用をさせることもできる。これらの化合物の使用量は、モノアセタール体に対して１〜１０倍当量使用することが好ましく、特に２〜４倍当量使用することが好ましい。
【００１９】
本工程の反応は、モノアセタール体に上記の３種（又は２種）の化合物を同時に反応させてもよく、或いはモノアセタール体に先ずシアン化物を反応させ次いで他の２成分を同時に反応させてもよく、或いは又先ずシアン化物を反応させ次いでアンモニウム化合物を反応させ更に炭酸化合物を反応させてもよい。特に望ましい方法は、モノアセタール体をメタノール又はエタノールなどに溶解した溶液を、又は溶解せずにそのままを、徐々に所定の反応温度に加熱した上記３種（又は２種）の化合物の水溶液又は懸濁液に添加する方法である。
高い収率を得る為には、添加終了後、更に適当な時間、攪拌を継続することが好ましい。
斯くして主生成物として化合物（１）、及び副生成物として化合物（２）を得ることができる。
【００２０】
本発明方法においては、化合物（１）又は化合物（２）を単離して用いてもよいが、微生物により上記反応で得られた両者の混合物をそのまま用いることができる場合があるので、その場合混合物を用いることが好ましい。
【００２１】
化合物（１）及び／又は化合物（２）にアルスロバクター属に属する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させることで、容易に光学活性な化合物（３）を得ることができる。
具体的には、化合物（１）及び／又は（２）の水溶液、又は化合物（１）及び（２）を得る為に反応を行った反応生成物そのものに微生物の菌体又は菌体処理物を作用させる。
微生物の菌体又は菌体処理物を作用させることにより、ヒダントイン化合物は開裂され、Ｎ−カルバモイル誘導体（ＲＳ−体）が生成され、そして逐次的に目的とする絶対配置を有する光学活性化合物（３）（Ｓ−体）が得られる。
【００２２】
本発明で使用する、化合物（１）及び（２）を光学活性化合物（３）に変換する能力を有するアルスロバクター属に属する微生物としては、例えば特公平５−１７１６号公報記載のアルスロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＰ−Ｂ−１００１（微工研菌寄第８１９０号）及びアルスロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＰ−Ｂ−１００２（微工研菌寄第８１９１号）が挙げられる。また、これら微生物より自然変異、化学変異剤による処理、紫外線や放射線照射等の方法により得られた変異株であっても化合物（１）及び（２）を光学活性化合物（３）に変換する能力を有する限り、本発明に使用することができる。
【００２３】
本発明で用いる微生物の菌体を製造するには、常法により上記微生物を培地中で培養増殖させればよい。ここで用いる培地は特に制限されず、上記微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含む通常のものでよいが、液体培地が好ましい。
【００２４】
炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース等の糖類、グリセリン、マンニット等の糖アルコール類、フマル酸、クエン酸等の有機酸等が挙げられる。
【００２５】
窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、コーンスティープリカー等の天然有機窒素源の他、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニア源、及びフマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩が例示される。また、無機塩類としては、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等が挙げられ、これらは必要に応じ適宜使用される。更に酢酸コバルトなどの有機塩類を必要により用いてもよい。
【００２６】
培地に更に化合物（１）及び（２）を少量添加すれば、変換活性の高い菌体が得られる場合がある。
【００２７】
培養条件も格別の制限はなく、例えば培地のpHは５〜９、好ましくは６〜８．５の範囲内に調節し、菌株を接種した後、温度２０〜３５℃、好ましくは２６〜３０℃の範囲内で適当に制御しながら通気攪拌下、１６〜７２時間程度培養を行えばよい。
【００２８】
斯くして得られる菌体等を適当な水性媒体中において化合物（１）及び／又は（２）に作用せしめる本発明方法により光学活性化合物（３）が効率よく生成される。
【００２９】
化合物（１）及び／又は（２）に作用せしめる菌体等としては、菌体を含む培養液をそのまま用いてもよい。また、菌体を一旦培養液より分離して洗浄又は洗浄せずに用いてもよい。菌体処理物としては、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体破砕物等が挙げられる。更には、菌体をポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、光架橋樹脂などの高分子に包括させて固定化した固定化菌体として使用してもよい。
【００３０】
本発明の変換反応は、例えば化合物（１）及び／又は（２）と上記培養物とを水溶媒体中に共存せしめることによっても実施することができる。
【００３１】
本発明方法において、アルスロバクター属に属する微生物として、上述のアルスロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＰ−Ｂ−１００１（微工研菌寄第８１９０号）又はアルスロバクター  エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＰ−Ｂ−１００２（微工研菌寄第８１９１号）を使用した場合、当該微生物の特異な能力から、化合物（１）及び（２）は、それぞれＲ−体、Ｓ−体、ＲＳ−体の何れであっても目的とする光学活性化合物（３）（Ｓ−体）に転換することができる。
【００３２】
すなわち、化合物（１）（ＲＳ−体）を原料としても、化合物（２）（ＲＳ−体）を原料としても、各々に作用する別種の微生物を使用する必要はなく、化合物（１）（ＲＳ−体）を原料とする場合、その製造の際に副生した化合物（２）（ＲＳ−体）を除去する必要もなく、更に化合物（２）（ＲＳ−体）を原料とする場合、Ｒ−体の化合物（２）が反応系に混入するのを防止する等の措置、又は反応後残存するＲ−体の化合物（２）を単離回収、ラセミ化するなどの煩雑な工程処理も必要としない。
このように、当該菌体又は菌体処理物を用いれば、化合物（１）又は化合物（２）のＲ−体、Ｓ−体、ＲＳ−体或いはそれらの任意の組合わせからなる混合物を原料として、目的とする光学活性化合物（３）（Ｓ−体）を得ることができる。
【００３３】
菌体又は菌体処理物の使用量は所与の反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められるが、一般的に洗浄湿潤菌体の場合は反応液１dl当たり１〜５０ｇ程度が好ましい。
化合物（１）及び／又は（２）の濃度は、反応混合物全量（重量）の０．１〜３０％が好ましく、特に好ましくは０．１〜１０％である。溶解度以上の化合物（１）及び／又は（２）を反応系に添加しても、不溶解分は反応進行に伴い溶解し、逐次光学活性化合物（３）（Ｓ−体）に転換されて行く為反応に支障はない。
更に、固定化菌体をカラムに充填した反応器に原料溶液を流下させる方法により反応を行えば、化合物（１）のみでなく、化合物（２）の高濃度な物を原料として使用できるため、殺菌操作を行う場合も含め操作を容易かつ高濃度で効率良く行うことができ、好ましい。
【００３４】
本反応は、pH６〜１１の範囲が好ましく、特に６．５〜９．５の範囲で行うのが好適である。pHの範囲は、リン酸緩衝液、アンモニウム緩衝液等の通常使用されている緩衝液で調整すればよい。反応温度は１０〜５０℃が好ましく、特に３０〜４０℃の範囲に調節するのが好適である。
更に、反応液に鉄、マンガン、コバルト等の無機イオン又は亜硫酸ナトリウム等の還元性物質を添加、或いは窒素ガスの吹き込みを行うと、反応速度が増大ないし培養物の酵素活性を安定化することができ、また、菌体の反応液からの回収、反応への再使用が可能になるので好ましい。無機イオンは０．１〜１０mMになる様に添加するのが好ましい。かくして、１０〜１００時間程度反応を行うことにより、化合物（１）及び／又は（２）より光学活性化合物（３）が容易に且つ効率的に得られる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
参考例１
攪拌装置、温度計、冷却装置を備えた三頸フラスコに、重炭酸アンモニウム５０ｇ、青化ソーダ１２ｇ、及び水５００mlを加え攪拌溶解し、この溶液に、４０℃で１時間をかけてグルタールアルデヒドモノエチレンアセタール３５ｇを滴下し、４０℃で５時間攪拌した。反応後、濃縮し析出してきた結晶を濾取し、シリカゲル（２，０００ｇ、メルク社製、Ａｒｔ．Ｎｏ．７７３４、溶出液；クロロホルム：メタノール＝９：１→４：１）を用いるカラムクロマトにより精製し、化合物（１）４１ｇ及び化合物（２）４ｇを得た。
【００３７】
化合物（１）
融点  １１２℃
元素分析：Ｃ9Ｈ14Ｎ2Ｏ4
計算値：Ｃ；５０．７６，Ｈ；６．７２，Ｎ；１３．１２
実測値：Ｃ；５０．６６，Ｈ；６．７８，Ｎ；１３．０８
【００３８】
化合物（２）
融点  １７７℃
元素分析：Ｃ9Ｈ17Ｎ3Ｏ4
計算値：Ｃ；４６．７９，Ｈ；７．６２，Ｎ；１７．９２
実測値：Ｃ；４６．５８，Ｈ；７．８３，Ｎ；１７．７８
【００３９】
実施例１
（１）種菌の培養
グルコース１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ポリペプトン５ｇ／ｌ、肉エキス２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ／ｌ及びＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ／ｌを含有しpHを７．０に調節した液体培地を、５００ml容三角フラスコに２００ml分注し、滅菌後アルスロバクター  エスピー  ＤＰ−Ｂ−１００１株を一白金耳接種し、２８℃２４時間振とう培養した。
【００４０】
（２）本培養、菌体作製
（１）と同じ液体培地に０．１５％の化合物（１）を添加した培地を調整し、（１）で得られた培養液を４ml接種し、２８℃で２４時間振とう培養した。培養液から、１８，０００Ｇ、１０分間の遠心により菌体を集め、生理食塩水により１回洗浄し、湿菌体を得、酵素反応に用いる洗浄菌体とした。
【００４１】
（３）酵素反応
（２）で得られた洗浄菌体１０ｇを精製水５０mlに懸濁したものに、０．８ＭＮＨ4ＯＨ−Ｃｌ（pH８．０）、４mM  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び４mM  ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏを含有する緩衝液２５mlを加え、参考例１において反応後濃縮し析出してきた結晶を濾取した物１００ｇ／ｌの懸濁液２５mlを加え、窒素気流を吹き込み、３７℃で４８時間保温し反応を行った。
反応終了後、菌体を遠心分離により除き、遠心上精を濃縮しアルコールを添加して晶析させた。結晶を濾取し乾燥してＬ−α−アミノアジピン酸−γ−セミアルデヒドエチレンアセタール２．０ｇを得た。
【００４２】
融点  ２６９℃（分解）
元素分析：Ｃ8Ｈ15ＮＯ4
計算値：Ｃ；４６．７９，Ｈ；７．６２，Ｎ；１７．９２
実測値：Ｃ；４６．５８，Ｈ；７．８３，Ｎ；１７．７８
旋光度〔α〕D20＋４．２（ｃ＝５，Ｈ2Ｏ）
【００４３】
実施例２
（１）種菌の培養、菌体作製
グルコース１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ポリペプトン５ｇ／ｌ、肉エキス２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．４ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ／ｌ及びＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ  ０．０１ｇ／ｌを含有し、pHを７．０に調節した液体培地を、５００ml容三角フラスコに２００ml分注し、滅菌後アルスロバクター  エスピー  ＤＰ−Ｂ−１００２株を一白金耳接種し、２８℃７２時間振とう培養した。
培養液から、１８，０００Ｇ、１０分間の遠心により菌体を集め、生理食塩水により１回洗浄し、湿菌体を得、酵素反応に用いる洗浄菌体とした。
【００４４】
（２）酵素反応
（１）で得られた洗浄菌体１０ｇを精製水５０mlに懸濁したものに、０．８ＭＮＨ4ＯＨ−Ｃｌ（pH８．０）、４mM  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び４mM  ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏを含有する組成の緩衝液２５mlを加え、参考例１において反応後濃縮し析出してきた結晶を濾取した物１００ｇ／ｌの懸濁液２５mlを加え、窒素気流を吹き込み、３７℃にて４８時間保温し反応を行った。
反応終了後、菌体を遠心分離により除き、遠心上精を濃縮しアルコールを添加して晶析させた。結晶を濾取し乾燥してＬ−α−アミノアジピン酸−γ−セミアルデヒドエチレンアセタール２．０ｇを得た。
【００４５】
融点  ２６９℃（分解）
元素分析：Ｃ8Ｈ15ＮＯ4 
計算値：Ｃ；４６．７９，Ｈ；７．６２，Ｎ；１７．９２
実測値：Ｃ；４６．６３，Ｈ；７．７５，Ｎ；１７．８２
旋光度〔α〕D20＋４．２（ｃ＝５，Ｈ2Ｏ）
【００４６】
【発明の効果】
医薬品及び化粧品の製造中間体として有用な光学活性化合物（３）を工業的に有利に製造することができる。