(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)からなる群より選ばれるいずれか１つの、菌類の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位配列を増幅するためのプライマー。
(a) 5'-AAGGCNCCNCG(C/T)CCNATGAAC-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるChHMG1プライマー、
(b) 5'-CTNGGNGTGTA(C/T)TTGTAATTNGG-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるChHMG2プライマー、
(c) 5'-CC(C/T)CG(C/T)CC(C/T)CC(C/T)AA(C/T)GCNTA(C/T)AT-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるNcHMG1プライマー、
(d) 5'-CGNGG(A/G)TT(A/G)TA(A/G)CG(A/G)TA(A/G)TN(A/G)GG-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるNcHMG2プライマー。
【請求項２】
以下の(a)と(b)、または(c)と(d)の組み合わせからなる、菌類の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位配列を増幅するためのプライマーセット。
(a) 5'-AAGGCNCCNCG(C/T)CCNATGAAC-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるChHMG1プライマー、
(b) 5'-CTNGGNGTGTA(C/T)TTGTAATTNGG-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるChHMG2プライマー、
(c) 5'-CC(C/T)CG(C/T)CC(C/T)CC(C/T)AA(C/T)GCNTA(C/T)AT-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるNcHMG1プライマー、
(d) 5'-CGNGG(A/G)TT(A/G)TA(A/G)CG(A/G)TA(A/G)TN(A/G)GG-3'の塩基配列からなるオリゴマーであるNcHMG2プライマー。
【請求項３】
請求項２に記載のプライマーセットを用いて、菌類の各菌株由来のＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行い、その結果によって交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位配列が増幅される菌株と増幅されない菌株とに分類し、その分類に基づいて各菌株の交配型を識別することを特徴とする、菌株の交配型を識別する方法。
【請求項４】
前記菌株がヘテロタリックな菌類である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーセットが請求項２に記載の(a)と(b)の組み合わせからなるプライマーセットであり、かつ前記菌類がLoculoascomyctesに属する菌類である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーセットが請求項２に記載の(a)と(b)の組み合わせからなるプライマーセットであり、かつ前記菌類がCochloboulus、Bipolaris、Setosphaeria、Pyrenophora、MycosphaerellaおよびAlternariaのうちのいずれか１つに属する菌類である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーセットが請求項２に記載の(c)と(d)の組み合わせからなるプライマーセットであり、かつ前記菌類がPyrenomycetesに属する菌類である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーセットが請求項２に記載の(c)と(d)の組み合わせからなるプライマーセットであり、かつ前記菌類がNeurospora、Podospora、Cryphonectria、NectriaおよびGaeumannomycesのうちのいずれか１つに属する菌類である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項９】
請求項２に記載のプライマーセットを用いて、菌類由来のＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行うことを特徴とする、菌類の交配型遺伝子を単離する方法。
【請求項１０】
請求項２に記載のプライマーセットを用いて、菌類由来のＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行い、増幅された交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位配列の塩基配列を比較することを特徴とする、菌類の進化を推測する方法。
【請求項１１】
前記菌類がヘテロタリックな菌類である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記菌類がホモタリックな菌類又は完全世代を形成しない菌類である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記菌類がCochloboulus、Bipolaris、Setosphaeria、Pyrenophora、Mycosphaerella、Alternaria、Neurospora、Podospora、Cryphonectria、NectriaおよびGaeumannomycesからなる群から選択される少なくとも１つに属する菌類である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、菌類の交配型遺伝子上に存在する特定の塩基配列を増幅するためのプライマーに関する。より詳細には、菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックスを）増幅するためのプライマー、このプライマーを用いた菌類の交配型の識別方法、およびこのプライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を用いた菌の進化の推測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
菌類は分類学上菌界と呼ばれるが、この菌類は、通常その生活環のほとんどを単相（n ）で経過する。しかし、これらのうちには、細胞融合や核融合によって複相（２n ）のステージを作り、組み換え等の後単相（n ）に戻るものがある。こうした複相世代は完全世代と称される。
菌類は、完全世代を形成するか否かで２つのグループに分けることができる。１つは、完全世代を形成するsexualなグループであり、他の１つは完全世代を形成しないasexual なグループである。sexualなグループは、完全世代の形成方法によって、さらに２つのグループに分けることができる。すなわち、２つの交配型の株の交配により完全世代を形成するヘテロタリックなグループと、交配を必要としないホモタリックなグループとに分けられる。
【０００３】
これらヘテロタリックな菌類のうち数種から交配型を決定する交配型遺伝子が単離されている。こうした交配型遺伝子が単離された菌類としては、Cochliobolus heterostrophus 、Neurospora crassa およびPodospora anserina等を挙げることができる。そして、これらの菌類からはMAT1とMAT2、mta-1 とmtA-1 、mat+とmat-という相対立する２つずつの交配型遺伝子が単離され、これらの塩基配列およびアミノ酸配列が決定され、報告されている。
【０００４】
既報の交配型遺伝子の塩基配列情報より、２つの交配型遺伝子の片方の上に共通してＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックス）が存在すること、および塩基配列がその一部で比較的類似していることが明らかになった。ＨＭＧボックスが存在するのは、上記のC. heterostrophus ではmat2、N. crassa ではmta-1 、そしてP. anserina ではmat+(FPR1)の上である。こうした交配型遺伝子の片方の上に存在するＨＭＧボックスのアミノ酸配列を図２に示す。図２中にこれらの配列に共通する部分を枠を付けて示したが、塩基配列もその一部で比較的類似している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、これまでは、数種の交配型遺伝子上のＨＭＧボックスの塩基配列およびアミノ酸配列が明らかにされたに過ぎない。菌類の交配型遺伝子を得るためには、膨大な時間を要し、またも煩雑な操作が必要であった。さらに、交配型遺伝子の全長や周囲のクローニング、あるいはシークエンシングを行うことも困難であった。
【０００６】
また、ヘテロタリックな菌類の交配型の相違を調べて、こうした菌類の交配型の検定、あるいは識別をすることができないという問題点があった。この結果、菌類の完全世代であるきのこなどを交配する場合には、交配型の異なる２つの株が必要であるが、交配型の識別ができないために生産効率を挙げることが難しかった。
さらに、交配が不可能な菌類、すなわち、ホモタリックな菌類およびasexual な菌類では、交配型遺伝子の存在を調べることもできず、単離を行うこともできなかった。
さらにまた、菌類の分類や進化の過程の推測などの点に関しても問題が残されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
以上のような課題を解決すべく、本発明の発明者は鋭意研究を進め、菌類の片方の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位が保存性が高く、塩基配列に一部で類似することを見い出し、これに基づいて本発明を完成したものである。
すなわち、本発明の第一の態様は、菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅するためのプライマーである。また、上記プライマーは図１に示す塩基配列からなるオリゴマーであることを特徴とする。
【０００８】
本発明の第二の態様は、菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅するためのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ホモタリックまたは完全世代を形成しない菌類から交配型遺伝子を単離する方法である。また、上記単離方法で使用される前記プライマーが、図１に示す塩基配列からなるオリゴマーであることを特徴とする。
本発明の第三の態様は、菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅するためのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記菌類の片方の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅することによって菌類の交配型を識別する方法である。また、上記識別方法で使用されるプライマーは図１に示す塩基配列からなるオリゴマーであることを特徴とする。
【０００９】
本発明の第四の態様は、菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅するためのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記菌類の片方の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅する工程と、前記増幅されたＤＮＡ結合部位を比較する工程とを有する菌の進化の推測方法である。上記菌の進化の推測方法において使用されるプライマーは、図１に示す塩基配列からなるオリゴマーであることを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を具体的に説明する。
本発明において用いられる菌類は、sexualなグループに属する菌類、asexual なグループに属する菌類のいずれをも使用することができる。特に、asexual なグループに属する菌類およびsexualなグループに属する菌類のうち、ホモタリックな菌類を使用することができるという利点を有する。
【００１１】
本発明においては、上記菌類の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位を所定の塩基配列からなるＤＮＡオリゴマーを設計、作製し、これをプライマーとして所定のＰＣＲ条件の下で増幅する。菌類の片方の交配型遺伝子上に共通して存在するＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックス）のアミノ酸配列を図２に示す。図２中、Ch MAT2 はCochliobolus heterostrophus の交配型遺伝子であるMAT2を表わし、以下同様に、Ncmt a-1はNeurospora crassa のmt a-1、PaFPR1はPodospora anserinaのmat+(FPR1)、SpmatMc はSchizosaccharomyces pombe のmat-(Mc)、そしてHuSRY はhuman のSRY を表わす。枠を付けた部分は、これら５種類の各交配型遺伝子上のアミノ酸配列の類似性の高い部分を示す。上記プライマーは、完全世代を形成するグループに属する菌類に存在する交配型遺伝子の片方の交配型遺伝子上にあり、上記のようにアミノ酸配列からそれらの塩基配列が明らかにされたＨＭＧボックスの塩基配列を元に作製することができる。Cochliobolus spp.(Loculoascomycetes 綱) あるいはNeurospora crassa(Pyrenomycetes 綱) の交配型遺伝子上にあるＨＭＧボックスの塩基配列（図２）などを、好適に使用することができる。
【００１２】
上記プライマーは、ＨＭＧボックスの塩基配列を増幅させることができるものであればよく、特に長さは限定されないが、ターゲット遺伝子を特異的に増加させやすいとの理由から18〜30塩基程度であることが好ましい。特に、21〜23塩基程度にすると、上記プライマーの設計に使用した菌類のＨＭＧボックスの塩基配列とある程度共通部分を有する他の菌類のＨＭＧボックスの増幅にも使用できるプライマーを得ることができる。
【００１３】
上記プライマーの塩基配列を修飾して、他の菌類のＨＭＧボックスの増幅にも使用できるプライマーとするためには、他の菌類の遺伝子上にあるＨＭＧボックスの塩基配列を以下のようにして推定してこれらを用いる。すなわち、図２から推定される菌類のＨＭＧボックスの共通部分を、上述したC. heterostrophus とN. crassa のＨＭＧボックスのアミノ酸を基本にし、上記プライマーのこの部分に対する塩基配列を仮定する。ついで、各アミノ酸の第三コドンの一般化等により修飾すべき部分を確定し、プライマー全体の塩基配列を決定して、他の菌類のＨＭＧボックスの増幅にも使用できるプライマーを設計することができる。
【００１４】
こうしたプライマーは、ＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成することができる。このようにして得られたプライマーを脱塩し、プライマーとして使用する。
このようにして得たプライマーと、所望の菌類の染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、所定の条件でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なう。例えば、10mMのTris-HCl(pH8.3) 、50mMのKCl 、2.5mM のMgCl2 、 0.2 μM のdNTPs 、 2μM のプライマー、0.25μl のmpli Taq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer社）および約20mgの菌類の染色体ＤＮＡを含む50μl の混合液を用いて、以下の温度条件で30サイクル程度行う。90℃  ２分、（94℃  １分，47-55 ℃  30秒，72℃  １分）×30〜35サイクル、72℃  １分。
【００１５】
以上のようにして、菌類の交配型遺伝子上に存在するＨＭＧボックスを増幅させることができ、これによって交配型遺伝子の一部をクローンし、塩基配列を決定する。特に、本発明のプライマーを用いると、従来、交配型遺伝子が存在するかどうかを調べることもできず、交配型遺伝子を単離することもできなかった交配が不可能な菌類、すなわち、ホモタリックな菌類あるいはasexual な菌類について、これらの菌類が交配型遺伝子上にＤＮＡ結合部位を有するかを調べることが可能となるという利点がある。
【００１６】
さらに、これらのＤＮＡ結合部位から増幅されたＤＮＡ断片に関するデータに基づいて、TAIL-PCR法などの様々な方法を採用することにより、上記交配型遺伝子のさらに長い部分をクローンすると、交配型遺伝子の全長が得られる。ここでTAIL-PCR法とは、Liu ら(Genomics,25:674,1995)が報告した方法で、既知配列情報に従ってデザインした特異プライマーとランダムプライマーを利用して既知配列の外側の所望のＤＮＡ断片を得る方法である。
【００１７】
すなわち、決定されたＨＭＧボックスの塩基配列に従って上流、下流方向に複数の20〜25塩基の特異プライマーをデザインし、これと14〜16塩基のランダムプライマー（ＡＤプライマー）を用いて、表４の条件で複数回ポリメラーゼ連鎖反応を行うことでＨＭＧボックス外側の遺伝子を上流、下流それぞれ増幅させることができ、より長い遺伝子配列を得ることができる。
所望の菌類の交配型遺伝子から増幅されたＤＮＡ断片についてクローンした後、ジデオキシ法、マクサムギルバート法などを用いてこれらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。すなわち、ＤＮＡ断片をクローンしたベクター上あるいは増幅に用いた特異プライマーにより増幅された断片を電気泳動で分離、あるいはＤＮＡを特異的に切断しながら電気泳動で分離して、塩基配列を決定する。
【００１８】
本発明のプライマーを使用すると、ヘテロタリックな菌類の片方の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位が増幅されるので、ここでＤＮＡ結合部位が増幅される株と増幅されない株とに分けることができる。したがって、増幅される株とされない株とでは交配型が異なることになり、この相違を利用してこれら菌類の交配型を識別する。特に、交配型の異なる２つの株の交配を行う必要がある場合には、交配型を容易に識別できるので、こうした場合に好適である。
さらに、各種の菌から上記のようにして増幅し、こうして得られたＤＮＡ結合部位の塩基配列を比較することにより、菌類の分類、進化の過程を推測する。すなわち、塩基配列やアミノ酸配列の相違の度合を時間軸で計算することで、菌の近縁性や種としての分化時期を数的に導くことにより、この推測を行う。
【００１９】
【実施例】
（実施例１）プライマーの調製
（１）プライマーの設計
Cochliobolus spp.(Loculoascomycetes 綱) およびNeurospora crassa(Pyrenomycetes 綱) の交配型遺伝子上には、多くの微生物で保存性の高いＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックス）が存在する。Cochliobolus spp. のC. heterostrophus の一方の交配型遺伝子上の MAT2 およびN. crassa のそれのmt a-1の交配型遺伝子上にあるＨＭＧボックスの位置を図３に示した。
これらの配列を基に、このＤＮＡ結合部位のインナーフラグメントを増幅するために、21-23merの２組のオリゴマーのセット、ChHMG1およびChHMG2、NcHMG1およびNcHMG2をＰＣＲプライマー用に設計した。
【００２０】
セット１
ＣｈＨＭＧ１  ＡＡＧＧＣＮＣＣＮＣＧＹＣＣＮＡＴＧＡＡＣ
ＣｈＨＭＧ２  ＣＴＮＧＧＮＧＴＧＴＡＹＴＴＧＴＡＲＴＴＮＧＧ
セット２
ＮｃＨＭＧ１  ＣＣＹＣＧＹＣＣＹＣＣＹＡＡＹＧＣＮＴＡＹＡＴ
ＮｃＨＭＧ２  ＣＧＮＧＧＲＴＴＲＴＡＲＣＧＲＴＡＲＴＮＲＧＧ
【００２１】
セット１および２において、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの混合あるいはイノシンとの混合であることを、Ｙは、ＣとＴとの混合、ＲはＡとＧとの混合であることを示す。上記プライマーの塩基配列の一部をこのように一般化させることにより、菌類に広く応用することが可能となる。
（２）プライマーの合成
上記セット１および２に示すオリゴマーのセットは、常法に従って作製した。このようにして得られたオリゴマーをプライマーとして用いて、下記の条件でＰＣＲを行い、各種の菌のＤＮＡ結合部位を増幅した。
【００２２】
（実施例２）セット１のプライマーを用いたＰＣＲによる各種の菌のＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックス）の増幅
（１）使用した菌類
表１に示す、交配型遺伝子未知の病原菌19種を使用した。Cochloboulus spp. 、Mycosphaerella zeae-maydis、Neurospora crassa 、Bipolaris sacchariおよびSetosphaeria rostrata およびPodospora anserinaはCornell 大学のDr.O.C.Yoder、Setosphaeria turcicaはDr.N.Keller 、Pyrenophora teres は、Dr.T.Peever 、Pyrenophora tritici-repentisはDr.D.Kalb 、Alternaria alternataは児玉基一朗博士、Nectria haematococcaはDr.Van Etten、Cryphonectria parasiticaはDr.B.Marra、Gaeumannomyces graminis はDr.G.Bryanより入手した。
【００２３】
（２）ＰＣＲ条件
ＰＣＲ条件は以下の通りである。
10mMのTris-HCl(pH8.3), 50mM のKCl, 2.5mMのMgCl2 , 0.2 μM のdNTPs, 2μM のセット１のプライマー、0.25μl のAmpli Taq DNA ポリメラーゼ（Perkin-Elmer社）、および約20ngの上記表１に示す菌類の染色体ＤＮＡを含む50μl の混合液を使用した。
上記混合液を90℃で２分、（94℃で１分，47−55℃で30秒，72℃で１分）を30〜35サイクル、ついで72℃で１分の条件で増幅させた。
（３）増幅結果
使用した各種の菌のＨＭＧボックスの増幅結果を表１に示す。
【００２４】
（実施例３）セット２のプライマーを用いたＰＣＲによる各種の菌のＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックス）の増幅
（１）使用した菌類
表１に示す、交配型遺伝子未知の病因菌19種を使用した。これらの菌は、実施例２と同様にして入手した。
（２）ＰＣＲ条件
実施例２と同様の条件で行った。
（３）増幅結果
使用した各種の菌のＨＭＧボックスの増幅結果を、実施例２の結果と共に表１に示す。
【００２５】
【表１】
0003718755.tif 000002
【００２６】
＋は増幅されたことを示し、−は増幅されなかったことを示す。
以上の結果より、セット１は Loculoascomyctes に属する菌類（図11）および近縁の菌類、セット２は Pyrenomycetesに属する菌類および近縁の菌類の交配型遺伝子上のＨＭＧボックスを増幅させることが明らかになった。
【００２７】
（実施例４）セット１およびセット２のプライマーを用いたときのＰＣＲのまとめ
セット１およびセット２のプライマーを用いたときにＨＭＧボックスが増幅される各菌の交配型、交配性状、およびそれらの塩基配列の増幅が既に報告されているかどうかを表２に示す。
【００２８】
【表２】
0003718755.tif 000003
【００２９】
以上より、セット１のChHMG1プライマーにより、Loculoascomycetes 綱に属するSetosphaeria turcicaなどのヘテロタリックな菌の片方の交配型株、Mycosphaerlla zede-maydis などのホモタリックな菌の全株、asexual なAlternaria alternataの一部の株から、各々約270bp のＤＮＡ断片が増幅された。また、セット２のNcＨＭＧプライマーにより、Pyrenomycetes 綱に属すNectria haematococca、Gaumannomyces graminisなどから、各々約270bp のＤＮＡ断片が増幅されたことが明らかになった。
各ＤＮＡ結合部位をクローニング・シークエンシングし、塩基配列を決定した。
【００３０】
（実施例５）ＨＭＧボックスのクローニングと塩基配列の決定
（１）クローニング・シークエンシング
ＨＭＧボックスのクローニングは、常法に従って行った。すなわち、ＰＣＲで増幅させた断片をインビトロゲン社の販売するｐＣＲIIベクターに挿入した後、このベクターでコンピタントセルを形質転換し、ブルースクリプト選択とコロニーハイブリダイゼーションによりクローニングを行い、図４に示すような菌類から各々のＨＭＧボックスを増幅した。
【００３１】
（２）塩基配列の決定
得られたＨＭＧボックスの塩基配列をｐＣＲIIベクター上のプライマーM13(-20)、M13(-40)、Ｔ７、M13Reverse、Ｓｐ６などを用い、ＡＢＩシークエンサーを用いて決定した。結果を図４に示す。
図４中の略号は下記表３の通りである。
【００３２】
【表３】
0003718755.tif 000004
【００３３】
この増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列は、既報のＨＭＧボックスのものと相同性が高かった。上記の菌について得られたＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて、推定アミノ酸配列を決定し、図５に示した。これらの菌のあいだにおけるこのＤＮＡ断片のアミノ酸配列の相同性も高いことが示された。
【００３４】
（３）遺伝的解析
S. turcicaを用いて、以下のようにして遺伝的解析を行った。すなわち、２つの交配型MAT1、MAT2の親株NK22とNK72を交配して得た９株の子孫について、親株と戻し交配して交配型を調べるとともに、各々の染色体ＤＮＡを用いて、ChHMG1とChHMG2プライマーによりＰＣＲを行った結果を図８に、また、制限酵素消化した染色体ＤＮＡを0.6 ％アガロースゲルで分離し、ニトランプラス膜へ移し、クローンした断片とハイブリダイズさせたサザンブロットの結果を図９に示す。
【００３５】
図８に示したように、ＰＣＲにより、12R ８、12R13 、12R16 、12R17 および、12R20 でNK72と同じバンドが検出された。
交配により、各子孫の交配型は、12R4:MAT1 、12R6:MAT1 、12R7:MAT2 、12R8:MAT2 、12R13:MAT2、12R16:MAT2、12R17:MAT2、12R20:MAT1、12R35:MAT1であることが判明した。
交配型と図８および図９の結果の断片の存在が同調するため、得られたＤＮＡ断片が交配型遺伝子上にあることが確認された。
【００３６】
（４）TAIL-PCRによる遺伝子の取得
実際にホモタリックな菌類であるMycosphaerella zeae-maydisについて、交配型遺伝子を調べた。この株の菌糸を凍結乾燥し、フェノール法でＤＮＡを抽出し、ＰＥＧ沈殿法により染色体ＤＮＡを精製した。
ChHMG1とChHMG2とをプライマーとして用いたＰＣＲによりＨＭＧボックスを増幅し、得られた塩基配列データに基づいて、M. zede-maydisからTAIL-PCR法で、交配型遺伝子により、長い部分をクローンした。TAIL-PCRの条件は、表４に示した通りである。
【００３７】
【表４】
0003718755.tif 000005
【００３８】
以上のようにしてTAIL-PCRをおこなったところ、ＨＭＧボックス周囲の上流2.5 kb、下流1.5 kbが得られ（図７）、さらに上流にCochliobolus heterostrophus のMAT1相同部位が検出された。
また実際にTAIL-PCRによりPyrenophria teres +ve 株よりＨＭＧボックス周囲の1721bpの配列を得た（図10）。この断片はCochliobolus heterostrophus MAT2と一部相同で、交配型遺伝子と考えられた。
以上、新規な交配型遺伝子取得法の可能性を示した。
【００３９】
（実施例６）菌類の識別
上記のようにして得た菌のＨＭＧボックスの塩基配列を比較して、下記表５に示すように識別を行った。
【００４０】
【表５】
0003718755.tif 000006
【００４１】
表中、（８／８）などの記載は、何株中何株が陽性であったかを示す。
asexual 、ホモタリックなものでも、ＨＭＧボックスを含む交配型遺伝子を持つことが判明した。
【００４２】
（実施例７）菌類の進化の推測
実施例１〜５のようにして得た塩基配列をPAM250 residue weight table によるクラスター法で解析した結果の例を図12に示す。実施例２〜５で使用した菌類の進化の過程は図12に示したように推測された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、交配型遺伝子未知の菌類の片方交配型遺伝子上のＤＮＡバインディングドメインをクローニング、シークエンシングすることが可能であった。これを元に、ウオーキングやＴＡＩＬ−ＰＣＲなどでその交配型遺伝子の全長及び周囲を容易にクローニング、シークエンシングすることができる。また、その情報を元にもう片方の交配型遺伝子全長をクローニング、シークエンシングすることもできる。
さらに、本発明のプライマーを用いると、これまで菌類の交配型遺伝子を得るのに、デイスラプション等で非常に時間がかかっていたが、短時間のうちに交配型遺伝子を得ることができる。
【００４４】
また、菌類の交配型の検定、識別を行うことができる。ヘテロタリックな菌類の片方の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位が増幅されるため、増幅される株、増幅されない株で交配型が異なる。したがって、これを利用して種々の菌類の交配型の検定あるいは識別が可能である。
このため、きのこなどの菌類の完全世代を交配するさいに必要な交配型の異なる２つの株を確実に選ぶことができ、交配が容易になり、生産効率も上昇する。したがって、本発明は、ヘテロタリックな菌の交配型はいにおいて、その交配型の識別に有用である。さらに、良好な形質を持った株の育種にも必須とさる交配のための重要な情報は重要を得ることができる。
【００４５】
さらに、本発明の単離方法を使用することにより、従来、交配型遺伝子の存在を調べることもできず、また、それらの単離も不可能であった交配が不可能な菌類（ホモタリックな菌およびasexual な菌）での交配型遺伝子の存在を調べること、およびそれら交配型遺伝子の単離が可能となる。加えて、そのような情報を用いて、交配型遺伝子の全長を取得することもでき、菌類の交配能、homothallicity、asexualityのメカニズム解析に利用できる。
完全世代を作れない菌に完全世代を作らせることも可能になり、従来培地上で菌糸状しかとり得なかった菌にきのこ等の生産も可能となる。
さらにまた、増幅されるＤＮＡ結合部位の塩基配列を比較することで、菌類の分類、進化過程を推測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプライマーの２つのセットの塩基配列を示す図である。
【図２】配列が既知となっている５種の菌類のＨＭＧボックスのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】  C. heterostrophus のMAT2およびN. Crassa のmt a-1の遺伝子上におけるＨＭＧボックスの位置、および各々のプライマーの位置と方向を示す図である。
【図４】実施例４で使用した22種類の菌のＨＭＧボックスの塩基配列のアライメントを示す図である。
【図５】実施例４で使用した22種類の菌のＨＭＧボックスのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図６】ＨＭＧボックス（277bp ）の塩基配列をベースに周囲の遺伝子をTAIL-PCRにより取得する方法を示したものであり、得られた産物（≡）が正しいものかどうかを211bp の増幅で確認できることを示した図である。
【図７】ホモタリックな菌であるMycosphaerella zeae-maydisのTAIL-PCRによる交配型遺伝子のクローニングを示す図である。
【図８】 Setosphaeria turcica の親株と交配した子孫とにおける交配型遺伝子の保有をChHMG1とChHMG2プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図９】 Setosphaeria turcica の親株と交配した子孫とにおけるｇＤＮＡのサザンブロットの結果を示す電気泳動写真である。
【図１０】  P. teres +veのスプライスされた仮のオープンリーディングフレームの転写を示す図である。
【図１１】本文中で用いたLoculoascomycetes およびPyrenomycetes の分類（The Fungi 1973に従う）の分類学的位置を示す図である。
【図１２】ＨＭＧボックスの塩基配列から推定した進化の系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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