(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする遺伝子の上流に挿入したのち、該融合遺伝子を動物細胞に導入し、次いで該動物細胞を培養して前記ＤＮＡ断片によりコードされる蛋白質と前記マーカー蛋白質との融合蛋白質を発現させ、培養液中に分泌された該融合蛋白質をそのマーカー蛋白質を指標として精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定する方法。
【請求項２】
マーカー蛋白質がウロキナーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
大腸菌用複製オリジン、動物細胞用複製オリジンとプロモーター、その下流に存在するクローニング部位に挿入された任意の分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片、その下流に、クローニング部位に挿入された遺伝子のコーディング領域とフレームが合い、マーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする領域を含むプラスミドベクター。
【請求項４】
請求項３記載のプラスミドベクターを動物細胞に導入し、分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターとの融合蛋白質を発現させ、分泌された該融合蛋白質を精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定する方法に関する。この方法により、医薬として有用な分泌蛋白質が分泌された後、どのようなＮ末端配列を有しているかを容易に決定することができる。
【０００２】
【従来の技術】
細胞が生産している生理活性蛋白質は、医薬、診断薬、バイオセンサー、バイオリアクターなど、産業界で広く利用されている。中でも分泌蛋白質は医薬品として有望なものが多い。たとえば、インターフェロン、エリスロポイエチン、血栓溶解剤など現在市販されている蛋白質医薬の多くは分泌蛋白質である。
【０００３】
分泌蛋白質はそのＮ末端にシグナル配列と呼ばれる疎水的な約２０アミノ酸残基からなる配列を有している。このシグナル配列の働きによって小包体中に蛋白質が移動した後、シグナルペプチダーゼの作用によりシグナル配列が切断・除去される。したがって実際に分泌された蛋白質は、シグナル配列を有していない。この様な分泌蛋白質を医薬として用いる際、分泌された後の蛋白質のＮ末端の配列を知る必要がある。従来、分泌蛋白質のＮ末端配列を決定するためには、目的とする蛋白質を血清中から単離するか、あるいは目的蛋白質をコードしている遺伝子を動物培養細胞内で発現させ、分泌蛋白質を単離精製した後、そのＮ末端配列を決定する方法がとられてきた。しかし、分泌された蛋白質を大量に単離精製して、そのＮ末端配列を決定するのは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を簡単に決定する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、任意のシグナル配列ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターの遺伝子と融合させたのち、動物細胞に導入すると、ＤＮＡ断片がコードする蛋白質とマーカー蛋白質の融合蛋白質が培養液に分泌されることを見いだし、これを利用することによって、培養液中に分泌された融合蛋白質をマーカー蛋白質の親和性を利用して精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定する方法を構築し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、任意の分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする遺伝子の上流に挿入したのち、該融合遺伝子を動物細胞に導入し、次いで該動物細胞を培養して前記ＤＮＡ断片によりコードされる蛋白質と前記マーカー蛋白質との融合蛋白質を発現させ、培養液中に分泌された該融合蛋白質をそのマーカー蛋白質を指標として精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定する方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、大腸菌用複製オリジン、動物細胞用複製オリジンとプロモーター、その下流に存在するクローニング部位に挿入された任意の分泌蛋白質の分泌シグナル配列を含むＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片、その下流に、クローニング部位に挿入された遺伝子のコーディング領域とフレームが合い、マーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする領域を含むプラスミドベクターを提供する。
【０００８】
さらに本発明は、上記プラスミドベクターを動物細胞に導入し、分泌蛋白質とマーカー蛋白質との融合蛋白質を発現させ、分泌された該融合蛋白質を精製後、精製された融合蛋白質のＮ末端配列を決定することを特徴とする、分泌蛋白質の分泌後のＮ末端配列を決定する方法を提供する。
【０００９】
本発明は、動物細胞用プロモーター、任意の分泌蛋白質のシグナル配列ペプチドをコードするＤＮＡ断片、マーカー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター（図１）を作製し、これを動物細胞に導入してやれば、マーカー蛋白質のＮ末端に任意のシグナル配列ペプチドが付加した融合蛋白質が細胞内で合成され、目的分泌蛋白質のＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質の融合蛋白質が分泌されてくることを見いだしたことに基づいている。
【００１０】
本発明は、次の３つの工程からなる。
工程１  目的とする蛋白質のＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、マーカー蛋白質をコードする遺伝子領域を含む動物細胞用発現ベクターに組換える。
工程２  得られたベクターを動物細胞に導入して、融合蛋白質を培養液中に分泌生産させる。
工程３  培養液中に分泌された融合蛋白質を単離精製し、単離した融合蛋白質のＮ末端配列を、アミノ酸シーケンシングにより決定する。
【００１１】
工程１
目的とする蛋白質のＮ末端ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、動物細胞用発現ベクターに組換えるには、常法を用いる。すなわち、動物細胞用プロモーター、クローニング部位（制限酵素切断部位）、マーカー蛋白質をコードする遺伝子が直列に接続されたベクターを用い、この中のクローニング部位に目的とするＤＮＡ断片を挿入する（図２、方法１）。目的とする蛋白質をコードするｃＤＮＡがすでに動物細胞用発現ベクターに組換えられている場合には、シグナル配列の下流に存在する適当な制限酵素部位に、マーカー蛋白質をコードする遺伝子を挿入してもよい（図２、方法２）。
【００１２】
本発明で用いる動物細胞用発現ベクターは、大腸菌用複製オリジン、動物細胞用複製オリジンとプロモーター、その下流に存在するクローニング部位、その下流に、クローニング部位に挿入された遺伝子のコーディング領域とフレームが合い、マーカー蛋白質としてのウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター又は組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする領域を含むプラスミドベクターである。
【００１３】
マーカー蛋白質としては、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ウロキナーゼ）又は組織プラスミノーゲンアクチベーターが用いられる。これらの蛋白質由来のシグナル配列ペプチドを除去したものを用いる。
【００１４】
図３に、本発明で使用したベクターｐＳＳＤ１の構造を示す。ｐＳＳＤ１は、ＳＶ４０の複製オリジンと初期プロモーター、１６Ｓスプライシング部位、シーケンシング用ユニバーサルプライマー部位（Ｕ）、Ｔ７プロモーター、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＶ部位、ウロキナーゼの翻訳領域（１３７番目のＰｒｏから４１１番目のＬｅｕまでを含む）、ＳＶ４０のポリ（Ａ）付加シグナル、ｐＵＣ系ベクターの複製オリジン、β−ラクタマーゼ遺伝子、ｆ１ファージのオリジンを含んでいる。本ベクターを用いれば、一本鎖ファージＤＮＡ（ｃＤＮＡのアンチセンス鎖を含む）を容易に調製でき、ユニバーサルプライマーを用いて、クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列を容易に決定することができる。
【００１５】
分泌蛋白質としては、血液やリンパ液などの細胞外液の構成成分、サイトカイン、細胞外マトリックスなどが例示できる。なお、膜蛋白質も分泌シグナル配列を有するので、本発明の分泌蛋白質の範疇にはいる。膜蛋白質としては、レセプター、トランスポーター、イオンチャンネルなどが例示できる。
【００１６】
分泌蛋白質のＮ末端をコードするＤＮＡ断片は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、合成ＤＮＡいずれでもかまわない。ゲノムやｃＤＮＡの場合、適当な制限酵素による切断片を用いても良いし、適当なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により調製したＤＮＡ断片を用いてもよい。もし、ＤＮＡ断片中に開始コドンから始まるオープンリーディングフレームが存在し、マーカー蛋白質をコードする遺伝子とフレームが合っていると、これらの融合蛋白質を発現できるベクターが出来上がる。
【００１７】
工程２
工程１で作製したベクターで大腸菌を形質転換したのち、単一コロニー化し、各々から調製したプラスミド、一本鎖ＤＮＡ、あるいは一本鎖ファージを用いて、動物細胞のトランスフェクションを行なう。
【００１８】
発現ベクターを動物細胞に導入するには、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム法、エレクトロポレーション法等を用いることが出来る（例えば実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、１９９１、参照）。あるいは、一本鎖ファージを調製した後、これを用いてトランスフェクションを行なえば、より容易に遺伝子を動物細胞に導入することができる［Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋａｔｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：９３５−９３９（１９９３）］。
【００１９】
動物細胞としては、ベクターに組み込まれた複製オリジンやプロモーターが働くものであればいかなるものでもかまわない。本発明のベクターを用いる場合、ＣＯＳ７、ＣＨＯ細胞等が例示できる。該分泌蛋白質が実際分泌されている細胞を用いることもできる。
【００２０】
発現ベクターを導入した動物細胞を適当な条件下で培養した後、培養上澄を調製する。この中にマーカー蛋白質が分泌されているかどうかは、用いたマーカー蛋白質の検出法を用いて調べる。酵素の場合には、対応する酵素活性検出法を用いる。マーカー蛋白質に対する抗体がある場合には、これを用いて酵素免疫アッセイを行なえばよい。実施例で用いた場合に分泌されるウロキナーゼは、人工基質ペプチドを用いる方法やフィブリンプレート法により検出できる。大量のサンプルを手軽に、しかも微量のサンプルで検出できるという点で、実施例に例示したフィブリンプレート法が適している。
【００２１】
工程３
もしマーカー蛋白質が培養液中に検出された場合には、目的蛋白質のＮ末端ペプチドとマーカー蛋白質の融合蛋白質が分泌されていることになる。したがって、大量スケールで培養後、アフィニティークロマトグラフィー、すなわちマーカー蛋白質に対して特異的に結合する物質を固定化したゲル担体を詰めたカラムに培養液を通すことにより、該融合蛋白質を容易に単離精製することができる。単離精製された融合蛋白質のＮ末端の決定は、アミノ酸シーケンサーを用いて容易に行なうことができる。
【００２２】
【実施例】
次に実施例により発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２３】
ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ.  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。
【００２４】
シグナル配列クローニング用ベクターの作製
プラスミドｐＵＣ１９（ファルマシア社）１０μｇを１００単位のＳｃａＩ、ついで１００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからオリジンを含む大きい断片を単離精製した。プラスミドｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２に記載）１０μｇを１００単位のＳｃａＩ、ついで１００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからｆ１オリジンを含む小さい断片を単離精製した。両者の断片をライゲーション後、大腸菌ＨＢ１０１の形質転換を行なった。形質転換体から単離したプラスミド１０μｇを１００単位のＰｖｕＩＩ、ついで１００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからオリジンを含む大きい断片を単離精製した。
【００２５】
プラスミドｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２に記載）１０μｇを１００単位のＡｃｃＩで消化した後、クレノウ断片処理によって平滑末端化し、ついで１００単位のＰｓｔＩで消化した後、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ゲルからＳＶ４０オリジンを含む小さい断片を単離精製した。両者の断片をライゲーション後、大腸菌ＨＢ１０１の形質転換を行なった。形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素地図から目的とするプラスミドｐＫＡ１Ｕであることを確認した。すなわち、ｐＫＡ１Ｕは、ｐＫＡ１が有していたｐＢＲ３２２由来のオリジンを、ｐＵＣ由来のオリジンに置き換えたものである。
【００２６】
ｐＫＡ１Ｕ  １μｇをＢｓｔＸＩ１０単位で消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりその末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりリン酸化ＢｇｌＩＩリンカーを接続した。このものをＢｇｌＩＩ２０単位で消化後、Ｔ４リガーゼにより環化し、ｐＫＡ１ＵＢを構築した。ｐＫＡ１ＵＢ１μｇを、２０単位のＥｃｏＲＶ、２０単位のＫｐｎＩで消化した後、大腸菌Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼにより末端のリン酸基を除去した。
【００２７】
ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０のｃＤＮＡライブラリー（特開平４−１１７２９２に記載）から任意に選択したクローンの塩基配列決定の結果、ウロキナーゼの完全長ｃＤＮＡを含むクローンｐＫＡ１−ＵＰＡが得られた。
【００２８】
ヒトウロキナーゼ活性ドメインのＮ末端（１３７番目のＰｒｏから１４２番目のＧｌｕ）に相当するｃＤＮＡの配列及びウロキナーゼ３’非翻訳領域の配列を有する次の２種類の合成ＤＮＡオリゴマーをＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム社）を用いて合成した。
SSD1       5'-GGCGATATCCCTCCTCTCCTCCAGAAG-3'
SSD2       5'-CGCGGTACCAGCAAGAAAGCGGGTGG-3'
【００２９】
これらの合成オリゴマーをプライマーとしてＰＣＲ反応を行ない、ウロキナーゼ活性ドメインｃＤＮＡ を増幅した。すなわち、ｐＫＡ１−ＵＰＡのＰｓｔＩ消化物より単離した１．２ｋｂｐの断片１ｎｇを鋳型に、各々１．８ナノモルのＳＳＤ１およびＳＳＤ２をプライマーとして３０サイクルのＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ 生成物を４０単位のＥｃｏＲＶおよび３０単位のＫｐｎＩにより消化後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約８６０ｂｐの断片を単離した。これらの断片を前項のベクター断片に４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＳＳＤ１を構築した。
【００３０】
腫瘍壊死因子由来シグナル配列ペプチド／ウロキナーゼ融合蛋白質の発現ベクター構築
ｐＳＳＤ１  １μｇを１０単位のＥｃｏＲＶで完全に消化した後、２単位のＥｃｏＲＩで３７℃、４５秒間の部分消化を行ない、大腸菌Ｃ７５アルカリフォスファターゼにより末端リン酸基を除去した。
【００３１】
ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＡ１−ＴＮＦ（特開平４−１１７２９２に記載）1μｇ のＢａｌＩおよびＥｃｏＲＩ消化物を１．５％ アガロースゲル電気泳動にかけ、約５００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲルより単離した。この断片とベクター断片のＴ４ＤＮＡリガーゼ反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体の有するプラスミドを解析し、ウロキナーゼｃＤＮＡ中の２ヵ所のＥｃｏＲＩ部位が無傷であり、かつウロキナーゼｃＤＮＡ５’側上流にＴＮＦｃＤＮＡ 断片が挿入されているものを選択し、ｐＳＳＤ１−ＴＮＦとした（図４）。
【００３２】
形質転換用サンプルは以下のように調製した。プラスミドｐＳＳＤ１−ＴＮＦを有する大腸菌ＪＭ１０９形質転換株のグリセロールストックから滅菌つまようじで少量を採取し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＹＴ２ｍｌに植菌した。３７℃で１時間３０分培養後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７懸濁液５０μｌ を加え、さらに１６時間培養した。この培養液について１５、０００回転、５分間の遠心を２回繰返し、大腸菌体を完全に除去した上澄を得た。この上澄１．２ｍｌに対して２０％ポリエチレングリコール、２．５ＭＮａＣｌ溶液０．３ｍｌを添加し充分に混合し、室温にて１０分間静置後、１５、０００回転、１０分間の遠心を行ない、沈澱を回収した。得られた沈澱を１２０μｌのトリス−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁し、この懸濁液を形質転換に用いた。
【００３３】
ＣＯＳ７細胞のトランスフェクションおよび培養上澄の調製
サル腎臓由来培養細胞ＣＯＳ７は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。２ｘ１０6個のＣＯＳ７細胞を培養ボトル（ヌンク社、培養面積１７５平方ｃｍ）に撒き、３７℃で２０〜２２時間培養した。培地除去後、リン酸緩衝液で細胞表面を洗浄し、さらに５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）を含むＤＭＥＭ（ＴＤＭＥＭ）で再度洗浄した。前項に述べたファージ懸濁液２０μｌを０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥデキストラン含有ＴＤＭＥＭ１５ｍｌに混合し、この液をＣＯＳ７細胞に加え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。３時間後、１０ｍＭクロロキンを１５０μｌ添加し、さらに２時間培養した。この液を除去し、ＴＤＭＥＭで細胞表面を洗浄後、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ４０ｍｌを加え、５％ＣＯ2存在下、３７℃で２日間培養した。培養液を除去し、リン酸緩衝液１０ｍｌで細胞表面を洗浄した。この洗浄は２回繰返した。この後、血清を含まないＤＭＥＭ４０ｍｌを加え、さらに３日間培養した。培地を回収し、遠心（５、０００ｒｐｍ、１０分、４℃）およびろ過（３ＭＭろ紙）により浮遊細胞などを除去した。この培養上澄に、塩化ナトリウムを終濃度０．５Ｍとなるように加えた。
【００３４】
培養上澄のアッセイ
２％ウシフィブリノーゲン（マイルス社）、０．５％アガロース、１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌに１０単位のヒトトロンビン（持田製薬）を加え、直径９ｃｍ のプレート中で固化させ、フィブリンプレートを調製した。トランスフェクションしたＣＯＳ７細胞の培養上澄１０μｌをフィブリンプレートに載せ、３７℃、１５時間インキュベートした。その結果、溶解円の形成が観測され、ウロキナーゼ融合蛋白質の分泌が観測された。
【００３５】
ウロキナーゼ抗体固定化カラムの調製
臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）０．５ｇに１ｍＭ塩酸を加え、室温、１５分間膨潤させ、体積１．５ｍｌのゲルを得た。このゲルを、グラスフィルターＧ４上で、１ｍＭ塩酸で洗浄し、さらにカップリング緩衝液Ａ（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．５、０．５Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄した。このゲルに、カップリング緩衝液Ａ５ｍｌに溶解したヒト低分子ウロキナーゼ抗体（ヤギ由来、ｂｉｏｐｏｏｌ社）５ｍｇを加え、４℃、１６時間反応させた。上澄を除去した後、このゲルにブロッキング緩衝液（１Ｍグリシン、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０）４ｍｌを加え、室温にて４時間、反応させた。上澄を除去した後、ゲルをカップリング緩衝液Ａおよびカップリング緩衝液Ｂ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、０．５Ｍ塩化ナトリウム）で、交互に４回洗浄した。さらに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄し、カラム（エコノカラム、直径１ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ社）に充填し、４℃に保存した。
【００３６】
融合蛋白質の単離精製
前項に述べた低分子ウロキナーゼ抗体固定化カラムに、カラム体積の１０倍量以上の０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、平衡化を行なった。このカラムに培養ボトル４本分のＣＯＳ７細胞培養上澄をかけ、培養上澄中の融合蛋白質をカラムに吸着させた。この後、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、流出液の２８０ｎｍの吸収がバックグラウンド程度に低下するまで洗浄した。次に２．５Ｍチオシアン酸カリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を流し、その流出液を０．５ｍｌずつ分画した。各分画のウロキナーゼ活性をフィブリンプレート法により測定した。
【００３７】
融合蛋白質のＮ末端配列決定
ウロキナーゼ活性の検出された分画をひとつにまとめ、これを１ｍｌづつ０．２Ｍ炭酸アンモニウムで平衡化したＮＡＰ１０カラム（ファルマシア社）にかけ、１．５ｍｌの０．２Ｍ炭酸アンモニウムで溶出した。得られた溶出液をまとめ、スピードバックにより数十μｌ程度まで濃縮した。この濃縮液をアミノ酸シーケンサー（ＡＢＩ、モデル４７７Ａ）で解析し、そのＮ末端配列を決定した。その結果、得られた融合蛋白質のＮ末端配列は、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓと解読された。この配列は、ホルボールエステルで刺激したＨＬ−６０細胞の培養上澄から精製されたＴＮＦ−αのＮ末端配列［Ｂ．Ｂ．Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２３４５−２３５４（１９８５）］と完全に一致した。
【００３８】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１成熟蛋白質のＮ末端配列決定
（１）融合蛋白質発現ベクターの構築
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ１）の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＡ１−ＰＡＩ１［Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  １５０：２４３−２５０（１９９４）］１μｇ のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｔｕＩ消化物を１．５％ アガロースゲル電気泳動にかけ、約９００ｂｐのｃＤＮＡ断片をゲルより単離した。この断片をｐＳＳＤ１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片と連結した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体が有するプラスミドを解析し、ウロキナーゼプロテアーゼドメインｃＤＮＡ５’側上流にＰＡＩ１ｃＤＮＡ 断片が挿入されているものを選択し、ｐＳＳＤ１−ＰＡＩ１とした。
【００３９】
（２）融合蛋白質の発現
ｐＳＳＤ１−ＰＡＩ１を有するｆ１ファージ粒子を上記の方法に従ってＣＯＳ７細胞に導入し、融合蛋白質を発現させた。３日間培養後、培地を回収し、５０００ｒｐｍ、５分間の遠心により培養上澄を得た。
【００４０】
（３）融合蛋白質の部分精製
上述した低分子ウロキナーゼ抗体固定化カラムに、カラム体積の１０倍量以上の１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を流し、平衡化を行なった。このカラムに培養ボトル４本分のＣＯＳ７細胞培養上澄をかけ、培養上澄中の融合蛋白質をカラムに吸着させた。この後、１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を流し、流出液の２８０ｎｍの吸収がバックグラウンド程度に低下するまで洗浄した。次に１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有０．３％アンモニア水（ｐＨ１１．５）を流し、その流出液を２ｍｌずつ分画し、分画後直ちに酢酸を添加し、ｐＨを中性付近に調整した。各分画のウロキナーゼ活性をフィブリンプレート法により測定した。
【００４１】
（４）融合蛋白質のＮ末端アミノ酸配列決定
活性の検出された分画をひとつにまとめ、これを遠心型濃縮装置（セントリコン-10）により０．１ｍｌ程度まで濃縮した。この濃縮液にトリクロロ酢酸を終濃度１０％となるように加え、蛋白質の沈澱物を得た。この沈澱物を、電気泳動用サンプルバッファー（６０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０２５％ブロムフェノールブルー、１４ｍＭメルカプトエタノール）に溶解後、ＳＤＳーポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動終了後、ゲルをトランスファーバッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、１５％メタノール）中に２０分間浸した。セミドライブロッティング装置（ザルトリウス社製）を用い、カソードバッファー（２５ｍＭトリス、４０ｍＭεーアミノカプロン酸、２０％メタノール、ｐＨ９．４）に浸した濾紙３枚、ゲル、メタノールおよびトランスファーバッファーに浸したＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）、アノードバッファー＃２（２５ｍＭトリス、１０％メタノール、ｐＨ１０．４）に浸した濾紙２枚、アノードバッファー＃１（０．３Ｍトリス、１０％メタノール、ｐＨ１０．４）に浸した濾紙１枚の順に重ね、８０ｍＡ、２時間通電し、ブロッティングを行なった。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、染色液（０．２％クーマシーブリリアントブルー、４５％メタノール）で５分間染色し、９０％メタノールで脱色後、乾燥した。この膜から、目的とする融合蛋白質に該当するバンドを切取り、アミノ酸シーケンサーによる解析に供した。その結果、融合蛋白質のＮ末端にＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの配列が確認された。この配列はＰＡＩ１の仮想シグナル切断部位からの配列に一致していた。
【発明の効果】
本発明により、医薬として有用な分泌蛋白質が分泌された後、どのようなＮ末端配列を有しているかを、該分泌蛋白質を単離精製することなく、該分泌蛋白質をコードしているｃＤＮＡを用いて容易に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  融合遺伝子の構造を示す図である。
【図２】  融合遺伝子を作製する工程を示す図である。
【図３】  ｐＳＳＤ１の構造を示す図である。
【図４】  ＴＮＦ−αシグナル配列ペプチド／ウロキナーゼ融合蛋白質ｃＤＮＡの構造を示す図である。
【図１】
0003698464.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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