(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−６１４１であるハイブリドーマ。
【請求項２】
請求項１に記載のハイブリドーマにより産生され、ウラシルに特異的に反応し、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに交差反応しないモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２記載のモノクローナル抗体を用いて被検試料中のウラシルを検出又は定量することを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発明はさらに該モノクローナル抗体を用いることを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法に関する。
【０００２】
本発明のモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫化学的測定法によれば、血液や尿などの生体試料中に存在するウラシルを特異的に検出測定することができ、これにより、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼが遺伝的に欠損している者を選別することができる。
【０００３】
該酵素欠損者に対して、フッ化ピリミジン系抗腫瘍剤の投与は禁忌である。従って、本発明は、癌患者に対する抗腫瘍剤治療において安全な治療法を選択するツールとしての意味において特に有用である。
【０００４】
背景技術
現在、抗腫瘍剤の一つとして、フルオロウラシルなどのフッ化ピリミジン系化合物が利用されている。しかしながら、癌患者の中には、その化合物の分解系代謝に関与する酵素であるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：以下、ＤＰＤと略する。）が遺伝的に欠損している者が存在しており（白人乳ガン患者の約３％）、該ＤＰＤ欠損患者にフッ化ピリミジン系抗腫瘍剤を投与した場合には、死にいたる副作用がおこることが報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６３３，４００−４０９（１９８０））。
【０００５】
通常、生体内において、ウラシル又はチミンは、ＤＰＤの働きによって、それぞれジヒドロウラシル又はジヒドロチミンに代謝されるが、ＤＰＤ欠損患者はそれらが代謝されずに、血液又は尿中に多量のウラシル及びチミン、特にウラシルが多量に排出されることが知られている（Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２５３Ａ，１１１−１１８（１９８９））。
【０００６】
従って、フッ化ピリミジン系抗腫瘍剤を癌患者に投与する前に、血液中又は尿中のウラシル又はチミン、特にウラシルの存在を測定することができれば、予めＤＰＤ欠損癌患者を選別することができ、その結果、抗腫瘍剤の投薬量を減量または中止して重篤な副作用の発生を回避することが可能となる。
【０００７】
従来、ウラシルを測定する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法が知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，６７２（１９９５），２３３−２３９）。しかし、この方法ではサンプルの調製が煩雑で多大の手間と修練を必要とする。また、多検体を測定するには非常に長時間を要し、更に測定装置や設備等に高額の費用を必要とする等の欠点がある。従って、検出感度が高く、迅速性、簡便性及び経済性を具備した新しいウラシル測定法が求められる。
【０００８】
また、本発明の類似技術として、特公平４−２１４７９号公報にはシュードウリジン（ｐｓｅｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）に対するモノクローナル抗体を用いた免疫測定法が記載されている。ここで用いられるモノクローナル抗体は、ウラシルに対して３０〜４０％の反応性を有するが、元来進行癌患者の尿中に増加するシュードウリジンを腫瘍マーカーとして検出するために開発されたものであり、シュードウリジンに対して９５〜９９％もの高い反応性を示す。このため、かかるウラシルとシュードウリジンとの間で交差反応性を有するモノクローナル抗体を用いては、癌患者を対象としてＤＰＤ欠損者とＤＰＤを欠損していない正常者とを区別することは不可能である。
【０００９】
従って、特に癌患者においてＤＰＤ欠損者と正常者とを選別するためには、ウラシルの生体内代謝物であるジヒドロウラシル、並びに腫瘍マーカーとして用いられるシュードウリジンに対して交差反応することなく、ウラシルを特異的に検出できる方法が求められる。
【００１０】
本発明は、ウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体、並びに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とするものである。
【００１１】
本発明はさらに該抗ウラシルモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、簡便、迅速でかつ特異的なウラシルの免疫化学的測定法を提供することを目的とする。
【００１２】
発明の開示
本発明者は、免疫原としてウラシル若しくはその誘導体にシュレッパー（Ｓｃｈｌｅｐｐｅｒ）を結合した抗原を用いて抗体産生細胞を調製し、これから細胞融合技術によってハイブリドーマを作成して、該ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の特性を調べていたところ、得られたモノクローナル抗体が、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対しては反応せず、ウラシルに対して特異的に反応する性質を有していることを見出した。かかる知見に基づいて、本発明者は、更なる研究により、該モノクローナル抗体のかかる特性を利用することによって、尿中に排泄されるウラシルを、該サンプルを前処理することなく、免疫化学的測定法によって選択的に、しかも迅速かつ簡便に測定することができることを確認して本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、第一に、本発明は、ウラシルに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生しかつ分泌するハイブリドーマ、並びにその調製方法に関する。
【００１４】
具体的には、該ハイブリドーマは、ウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物を免疫原として用いて作成される動物由来の抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合させて得られるものであって、ウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する性質を有するものである。
【００１５】
なお、かかる本発明のハイブリドーマの態様として次のものが挙げられる。
（１）産生されるモノクローナル抗体が、ウラシルに反応しシュードウリジン及びジヒドロウラシルに反応しない特性を有するものである、上記ハイブリドーマ。
（２）用いられる抗体産生細胞が、インビトロで動物由来の脾細胞にウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物を接触させ、免疫化して調製されるものである、上記ハイブリドーマ。
（３）動物由来の抗体産生細胞が、マウス由来の脾細胞を起源とするものである、上記ハイブリドーマ。
（４）シュレッパーに結合するウラシル若しくはその誘導体が、ウラシル；ウラシル−４−酢酸；１−カルボキシメチルウラシル、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル又は５−フルオロ−１−カルボキシメチルウラシル等のカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体；ウラシル−５−カルボン酸、ウラシル−６−カルボン酸又はウリジン−６−カルボン酸等のカルボキシル基を有するウラシル誘導体；ウリジンジアルデヒド、ウリジン５’−リン酸、ポリウリジン酸、Ｎ−カルバミル−β−アラニン、オロチジン５’−リン酸及びウリジン５’−ジホスホグルクロン酸からなる群から選択される少なくとも１種である、上記ハイブリドーマ。
（５）シュレッパーが、スカシガイのヘモシアニン又はウシ血清アルブミンである、上記ハイブリドーマ。
（６）免疫原として用いるウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物が、ウラシル−ヘモシアニン複合体、ウラシル−ウシ血清アルブミン複合体、１−カルボキシメチルウラシル−ヘモシアニン複合体、１−カルボキシメチルウラシル−ウシ血清アルブミン複合体、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ヘモシアニン複合体、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ウシ血清アルブミン複合体、ウリジンジアルデヒド−ヘモシアニン複合体及びウリジンジアルデヒド−ウシ血清アルブミン複合体からなる群から選択される少なくとも１種である、上記ハイブリドーマ。
（７）用いられるミエローマがマウスから得られる骨髄腫株化細胞である上記ハイブリドーマ。
（８）通商産業省工業技術院生命工学技術研究所（日本国）に寄託されているものであって、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−６１４１である上記ハイブリドーマ。
【００１６】
第二に、本発明は、上記いずれかのハイブリドーマによって産生される、ウラシルに対して特異的に反応するモノクローナル抗体に関する。好適には、ウラシルに反応し、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに反応しない特性を有するモノクローナル抗体である。
【００１７】
第三に、本発明は、上記いずれかの抗ウラシルモノクローナル抗体を用いることを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法に関する。
【００１８】
かかるウラシルの免疫化学的測定法の具体的な態様としては、上記抗ウラシルモノクローナル抗体とウラシルの存在が疑われる被検試料とを接触させ、放射性同位元素免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光抗体法又は凝集反応法のいずれかの方法を用いて、被検試料中のウラシルを検出又は定量することを特徴とする方法；
又は下記：
（ａ）ウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物からなる抗原を任意の担体に固定化した固相化物（以下、固相化抗原ともいう。）を含む反応系に、疑ウラシル含有被験試料及び上記モノクローナル抗体を配合する工程、
（ｂ）抗原−抗体複合体を形成させる条件下で、上記反応物をインキュベーションする工程、
（ｃ）固相化抗原−抗体複合体に第二抗体を反応させる工程、及び
（ｄ）第二抗体と結合した固相化抗原−抗体複合体を検出する工程
を含むウラシルの免疫化学的測定法が挙げられる。
【００１９】
まず、第一の発明である、ウラシルに対して特異的なモノクローナル抗体を合成し分泌する特性を有するハイブリドーマ、並びにその調製法について説明する。
【００２０】
本発明のハイブリドーマの調製にあたり、免疫原として用いられるウラシル若しくはその誘導体は、特に制限されないが、それ自体では免疫原性が非常に弱いため、適当なシュレッパーに結合させてウラシル（若しくはその誘導体）−シュレッパー複合体として用いられることが望ましい。
【００２１】
ここでシュレッパーとは、担体のことであり、免疫原性が非常に弱いか、またはハプテン基のように単独では抗体生産能をもたない物質（ｍａｔｅｒｉａｌ）と結合して、免疫原性を増強するか、または発現させる物質をいう。
【００２２】
シュレッパーとしては、一般には分子量の比較的大きなタンパク質が用いられるが、その他、赤血球などの細胞や、多糖体なども用いられる。シュレッパーの例としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミンなどが挙げられるが、特にＫＬＨ又はＢＳＡが好ましい。
【００２３】
本発明では、免疫原として、ウラシル−シュレッパー複合体のウラシルに替えてウラシル誘導体を用いたウラシル誘導体−シュレッパー複合体を用いることもできる。ウラシル誘導体としては、特に制限されないが、通常ウラシル−４−酢酸、１−カルボキシメチルウラシル，５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル及び５−フルオロ−１−カルボキシメチルウラシル等のように置換基としてカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体、ウラシル−５−カルボン酸，ウラシル−６−カルボン酸及びウリジン−６−カルボン酸等のように置換基としてカルボキシル基を有するウラシル誘導体のほか、ウリジンジアルデヒド、ウリジン５’リン酸、ポリウリジン酸、Ｎ−カルバミル−β−アラニン、オロチジン５’−リン酸、ウリジン５’−ジホスホグルクロン酸等を例示することができる。好適なウラシル誘導体としては、置換基としてカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体、置換基としてカルボキシル基を有するウラシル誘導体、ウリジンジアルデヒド及びウリジン５’−リン酸を挙げることができ、より好適には置換基としてカルボキシメチル基を有するウラシル誘導体及びウリジンジアルデヒドを挙げることができる。また特に好適なウラシル誘導体としては、１−カルボキシメチルウラシル、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル、ウリジンジアルデヒドを挙げることができる。
【００２４】
ウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合は、特に制限はされないが、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４  １０９０−１０９４（１９５４））または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡＲＵ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４２  ３０１−３０９（１９９４））等の公知の方法によって行うことができる。また、簡便な方法として、イムジェクト  イムノーゲン  ＥＤＣ  コンジュゲーション  キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ＥＤＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、添付のマニュアルに従って結合させる方法を挙げることもできる。
【００２５】
抗体産生細胞は、上記免疫原を常法に従って動物に接種するか又は動物細胞と接触させて、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することによって調製できる。本発明において好適にはインビトロ免疫法（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）が用いられる〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６），１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，Ｐｔ．Ｉ），２７−３３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８２），５３，２６１−２９１等〕。
【００２６】
かかるインビトロ免疫法として、具体的には、３〜１０週令の動物から脾臓を取り出して、脾臓から調製した脾細胞をインビトロで、ウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体とともにインキュベーションして感作させる方法を挙げることができる。このとき、細胞の免疫性能を高めるためにロムルチド，ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）等のムラミルジペプチド誘導体、又はリポ多糖等を用いることが好ましい。より好ましくは、ムラミルジペプチド誘導体の使用である。
【００２７】
上記脾臓の由来は特に制限されず、広くマウス、ラット、ウマ、ヤギ又はウサギ等の動物に由来する脾臓を用いることができる。すなわち、本発明で用いる抗体産生細胞の由来細胞は、上記動物の脾細胞の中から、ミエローマとの適合性等を考慮して適宜選択して用いることができる。好ましくは、マウス由来の脾細胞である。
【００２８】
上記抗体産生細胞と融合されるミエローマ細胞としては、特に制限されることなくマウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギ又はヒト等に由来するものを広く挙げることができる。好適には、用いる抗体産生細胞と同種の動物に由来するものであることが望ましく、例えばマウスに由来するミエローマ細胞を挙げることができる。
【００２９】
例えば、抗体産生細胞がマウスの脾細胞に由来する場合、その融合の相手としては、マウスから得られた骨髄腫株化細胞を用いることが好ましい。具体的には８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であり、かかるものとしては、例えばＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）〕、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１  １−７（１９８７）〕、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６）〕、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）〔Ｎａｔｕｒｅ  ２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１９４等を挙げることができる。好ましくは、Ｐ３Ｕ１細胞である。
【００３０】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、公知の方法、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）に記載の方法、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，５１２２−５１２６（１９８１）に記載の方法又はこれらに準する方法によって行うことができる。
【００３１】
より具体的には、細胞融合は、上記抗体産生細胞及びミエローマ細胞を、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中に共存させることによって行われる。融合促進剤としては、特に制限されることなく通常用いられるもの、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等を使用することができるが〔細胞組織化学（山下修二ら、日本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）等〕、好ましくは細胞毒性が比較的少なく、融合操作が簡単なＰＥＧである。また所望により、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を併用することもできる。
【００３２】
また、上記融合促進剤を用いた融合法（例えば、前述するポリエチレングリコール法）に代えて、電気処理による融合方法（電気融合法）を適宜採用することもできる。
【００３３】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との使用比率としては、通常の方法と同様の割合を使用することができ、例えばミエローマ細胞に対して抗体産生細胞を２〜１０倍程度用いればよい。好ましくは４〜７倍程度を挙げることができる。
【００３４】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体生産能および増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択は、通常の選択用培地を用いる培養によって行うことができる。
【００３５】
ここで選択用培地としては、例えば、ミエローマ細胞株として８−アザグアニン耐性株を使用する場合には、ＨＡＴ培地を挙げることができる。かかるＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の未融合細胞等が死滅するのに十分な期間、通常３〜１０日間行えばよい。
【００３６】
かくして得られるハイブリドーマは、次いで、通常の方法に従って、目的とする抗ウラシルモノクローナル抗体を産生する株のスクリーニング、クローニングの工程に供される。
【００３７】
抗ウラシルモノクローナル抗体産生株のスクリーニングは、上記の如くして得られたハイブリドーマ群を含む培養上清の一部をとり、これを試料として、一般に抗体検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁〜第５３頁、昭和５７年３月５日）、例えば、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）を用いて、その中に含まれるウラシルを検出、確認することによって行うことができる。なお、抗体検出方法としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応及びオクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等を挙げることができるが、感度、迅速性、正確性、安全性、自動化等の観点から、ＥＬＩＳＡ法を利用することが好ましい。
【００３８】
抗ウラシルモノクローナル抗体産生株のスクリーニングは、より具体的には、例えば、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。
（ａ）抗原としてウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体を担体に吸着させ、固相化する。
（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質によりブロッキングする。
（ｃ）この中にウラシルを含む試料とハイブリドーマ培養上清液を加え、ハイブリドーマ培養上清液に含まれるモノクローナル抗体を固相化抗原及び遊離ウラシルと競合的に結合させて、固相化抗原−抗体複合体及び遊離ウラシル−抗体複合体を生成させる。
（ｄ）遊離ウラシル−抗体複合体を洗浄除去して、固相化抗原−抗体複合体に酵素で標識化された第二抗体を反応させる。
（ｅ）該酵素に対して適当な基質を用いて酵素反応させ、吸光度を測定する。
【００３９】
なお、上記（ａ）工程において、固相化抗原として用いられるウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体としては、前述する各種の免疫原を利用することができる。
【００４０】
尚、固相化抗原として、基本的には抗体産生細胞の調製に用いた免疫原と同一物を用いるのが好ましい。しかし、ウラシル又はウラシル誘導体と結合してなるシュレッパーは、固相化抗原と免疫原とで必ずしも同一でなくてもよく、例えばウラシル−ＢＳＡ複合体を免疫原として用いる一方で、ウラシル−ＫＬＨを固相化抗原に用いることも可能である。
【００４１】
抗原を固相化する担体としては、特に制限されず、ＥＬＩＳＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン又はポリビニール製のマイクロプレート又はビーズが挙げられるが、９６穴マイクロプレートを用いるのが好ましい。抗原の濃度は特に制限されず広い範囲から適宜選択できるが、通常０．０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０．０５〜５μｇ／ｍｌの範囲が適している。また、その容量は、担体として９６穴マイクロプレートを使用する場合にはウエルの底面を覆うのに十分な量であればよく、通常１ウエルあたり２０〜１５０μｌ程度が望ましい。
【００４２】
吸着条件は、特に制限はないが、通常４〜４０℃程度で１時間〜一晩程度静置する方法が適しており、好ましくは３７℃程度で２時間程度の静置である。
【００４３】
（ｂ）工程において、ブロッキングに使用されるタンパクとしては、例えば、子牛血清、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等が使用でき、好ましくは子牛血清である。ブロッキングの条件は、特に制限はないが、通常４〜４０℃程度で１時間〜一晩程度静置する方法が適しており、好ましくは３７℃程度で２時間程度の静置である。ブロッキング後、マイクロプレートを緩衝液で洗浄する。ここで用いられる緩衝液としては、特に制限はされないが、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．３〜７．７）が適している。
【００４４】
（ｃ）工程において、具体的条件としては特に制限はないが、通常室温〜４０℃程度で０．５〜３時間程度静置する方法が適しており、好ましくは３７℃程度で１時間程度である。反応後、マイクロプレートを緩衝液で洗浄する。ここで用いられる緩衝液としては、特に制限はされないが、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．７）が適している。
【００４５】
（ｄ）工程において、第二抗体としては、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＳ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、ウレアーゼなどの酵素で標識した酵素標識抗マウス免疫グロブリン抗体が使用できる。好ましくは、ＡＰ標識抗マウス免疫グロブリン抗体である。第二抗体は通常希釈して使用されるが、ウラシル−シュレッパー複合体を介してマイクロプレートに結合したモノクローナル抗体（第一抗体）に対して約１００〜１０，０００倍、好ましくは約２００〜５００倍となるように希釈した第二抗体を用いることが望ましい。その希釈には例えば１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．７）を用いることが望ましい。反応は、特に制限されないが通常約３７℃で約１時間程度行なわれ、反応後、緩衝液で洗浄する。
【００４６】
以上の反応により、第二抗体が、固相化抗原を介してマイクロプレートに結合したモノクローナル抗体に結合する。
【００４７】
（ｅ）工程において、結合した第二抗体の酵素と基質との反応によって、基質を発色させるか又は該反応系に更に発色試薬を加えて、吸光度の変化を測定する。より具体的には、例えば、第二抗体に結合させる標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として用いて酵素反応によって発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。一方、第二抗体に結合させる標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてｏ−フェニレンジアミンを使用することが望ましい。この場合、特に制限されないが、通常、発色試薬溶液を加え約２５℃で約１０分間反応させた後、４Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる方法が用いられる。発色試薬としてｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、ここで、アビジン−ビオチンシステムによる増感法を利用することもできる。
【００４８】
次いで、以上述べたスクリーニングによりウラシルに特異的なモノクローナル抗体を産生することが判明したハイブリドーマについて、クローニングを行う。
【００４９】
クローニング法としては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈する方法、軟寒天培地上に撒きコロニーをとる方法、マイクロマニピュレーターによって１個の細胞を取り出す方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータークローン」法等が挙げられる。簡単であることから限界希釈法が好適に用いられる。
【００５０】
抗体価の認められたハイブリドーマを含むウェルについて、例えば限界希釈法によりクローニングを１〜４回繰り返して、安定して抗体価が認められたものを、抗ウラシルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００５１】
上記方法によって取得される本発明のハイブリドーマは、例えば１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、例えば５×１０６細胞／ｍｌ以上において、必要に応じて凍結安定化剤として１０％ジメチルスルホキシドを用いて、凍結することによって−８０℃以下、例えば液体窒素中に−１９５℃で保存することができる。
【００５２】
本発明のハイブリドーマは、後述するようにＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、ウラシルに対して特異的反応性を有するモノクローナル抗体を産生、分泌する。更に、これらの細胞系は液体窒素中に安定に貯蔵し、それから容易に回収することができる。すなわち、本発明のハイブリドーマは、ウラシル抗原に対して反応する純粋なモノクローナル抗体の、入手容易な供給物として有用である。
【００５３】
なお、かかるハイブリドーマは、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に住所を有する通商産業省工業技術院生命工学技術研究所に、１９９７年１０月１４日に微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＵ−１」、（受託番号）「ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１４１」として寄託されている。
【００５４】
次に、第二の発明であるウラシルに特異的に反応するモノクローナル抗体について説明する。
【００５５】
当該モノクローナル抗体は、上記方法によって得られる本発明のハイブリドーマにより産生されるものである。
【００５６】
かかるモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを培養することによって調製することができる。
【００５７】
ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＥＭ等を基本培地として挙げることができる。好ましくはＲＰＭＩ１６４０である。また、該培地に細胞増殖・分化を促進させるためにウシ胎児血清、ヒトトランスフェリン等を添加し、細胞増殖の促進のために１０％ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）及び／又はエネルギー源の補給のためにＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム等を添加することが可能である。
【００５８】
ハイブリドーマの培養は、例えばＣＯ２濃度４〜６％程度及び３６〜３８℃で培養するが好ましい。大量培養は大型培養ビンを用いた回転培養等によって行われる。
【００５９】
この培養上清液をそのまま抗ウラシルモノクローナル抗体ソースとして使用することもできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、イムノグロブリン画分を集め、また所望により更に該画分を精製することによって抗ウラシルモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６０】
上記する画分の精製方法としては、特に制限されないが、ＤＥＡＥ−セファロースカラム等を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ−セファロースカラムを利用するアフィニティークロマトグラフィー等を含む高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用方法を使用することができる。
【００６１】
上述の操作により得られる本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体は、上述する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法等を利用して、その交差反応性を評価することができる。該評価は、具体的には上記ＥＬＩＳＡ法において競合反応の際にウラシルに代えて交差反応を調べる化合物をウェルに添加することによって行うことができる。
【００６２】
かかる交差反応性の評価によって、実施例で述べるように、本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体は、ウラシルに反応するものの、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対してはほとんど交差反応せず、ウラシルに対して特異性を有していることが判明した。
【００６３】
このように本発明のモノクローナル抗体は、ウラシルに対して高い反応性を有しており、さらにそれは本発明のハイブリドーマを培養することによって均一かつ大量に供給できるため、ウラシルを免疫化学的に特異的に検出測定するための試薬として有用である。また当該モノクローナル抗体は、ウラシルの精製にも用いることができる。
【００６４】
特に本発明のモノクローナル抗体が有する反応特異性は、癌患者の尿中に夾雑物質として存在し得るシュードウリジン及びジヒドロウラシルに対して反応しないというものであるため、本発明のモノクローナル抗体は、特に癌患者を対象として、ＤＰＤの欠損に起因してウラシルを尿中に排泄するＤＰＤ欠損者とＤＰＤを欠損していない正常者とを選別するのに有用である。
【００６５】
従って、本発明の第三は、上記本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を用いることを特徴とするウラシルの免疫化学的測定法である。
【００６６】
免疫化学的測定法は、抗体が抗原を特異的に認識することに起因する抗原−抗体反応に基づいて、被験試料中に含まれる抗原を検出測定する方法であり、精度、簡便性、迅速性、経済性において優れているため、生化学的試験や臨床診断等の分野で広く採用されている。
【００６７】
免疫化学的測定法としては、公知の方法を広く挙げることができ、具体的には前述するように、例えばＲＩＡ法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、血液凝集反応法等を例示することができる。好適には、ＥＬＩＳＡ法であり、その有用性については〔Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｐ，”Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＳＢＮＯ−７２０４−４２００−１（１９９０）〕に詳細に記述されている。
【００６８】
なお、各免疫化学的測定法における操作、手順は、第一抗体として本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を使用する以外は、基本的に常法に従って行うことができる。
【００６９】
本発明の免疫化学的測定法は、ウラシルの存在が疑われる被検試料を対象として、それに含まれるウラシルを特異的に検出若しくは測定（定量）するものであれば、その具体的な目的及び適用対象等を問うものではない。例えばジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）欠損者をそれを欠損しない正常者と識別する等といった臨床診断を目的とする場合は、被験試料として尿、血清、血漿等の体液が用いられる。
【００７０】
尿等の生体被験試料は、そのまま本発明の免疫化学的測定法に供することもできるが、予めイオン交換樹脂等で処理しておくこともできる。
【００７１】
本発明の免疫化学的測定法として、好適には、被験者の生体試料を本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体とともに、抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベーションする工程、及び形成された抗原−抗体複合体を検出する工程を基本的に包含する測定法を挙げることができる。かかる免疫化学的測定法の設計は、直接法、間接法、競合法、サンドイッチ法等といった本発明の技術分野で通常行われている多くの改変を伴うことができる。
【００７２】
より具体的には、ヒト尿サンプルを被験試料とする固相化ＥＬＩＳＡ法を例にすると、ウラシルの検出測定法は例えば次の方法で行うことができる。
【００７３】
まず、本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を任意の担体に固相化しておき、抗原と無関係な蛋白質により、該抗体で覆われていない固相表面を覆う。該表面を洗浄後、被験試料としての尿サンプルと酵素標識抗原、例えば酵素で標識されたウラシル（又はその誘導体）−シュレッパー複合体を加え、競合反応させる。これに酵素基質を加え、被験試料の添加による吸光度の減少を測定する。具体的には、被験試料の添加による吸光度の減少の有無を測定することにより尿サンプル中のウラシルの存在の有無が判定でき、また被験試料の添加による吸光度の減少の程度を測定することによって、予め既知量のウラシルを用いて作成した標準線から、尿サンプル中のウラシルの量を定量することができる。
【００７４】
また、すでに述べた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において、ウラシルを含む試料の代わりに尿サンプルを、またハイブリドーマ培養上清液の代わりに本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を用いる方法を用いることもできる。かかる間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によれば、本発明のモノクローナル抗体は、被験試料中のウラシルの量を、１００〜１０００μｇ／ｍｌの範囲で測定できる。
【００７５】
上記免疫化学的測定法を実施するに際しては、本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を含有する試薬キットを利用することが簡便である。
【００７６】
従って、本発明は、上記本発明の抗ウラシルモノクローナル抗体を含むウラシルの免疫化学的測定用の試薬キットに関連するものでもある。
【００７７】
具体的には、被検試料中のウラシルを検出又は定量するために用いられる試薬キットであって、上記いずれかのモノクローナル抗体を少なくとも含むことを特徴とするウラシルの免疫化学的測定用試薬キット、または上記いずれかの抗ウラシルモノクローナル抗体に加えて更にウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの結合物を含むことを特徴とするウラシルの免疫化学的測定用試薬キットである。なお、ここで被検試料としては尿サンプルが好適に用いられる。
【００７８】
本発明の試薬キットは、抗ウラシルモノクローナル抗体を有効成分として含むことを特徴とするものであるが、当該有効成分に加えて、固相担体、標識剤、標識剤に応じた基質（検出用試薬）、抗原、二次抗体（例えば抗マウスイムノグロブリンなど）の中から選択される少なくとも一乃至五を組み合わせたもののセットであってもよい。なお、ここで抗原として、好適にはウラシル若しくはその誘導体とシュレッパーとの複合体が挙げられる。また固相担体、標識剤、標識剤に応じた基質（検出用試薬）、二次抗体としては、前述するものを用いることができる。
【００７９】
セット中に標識剤が含まれる場合は、該標識剤は予め二次抗体等の任意成分にコンジュゲートされていてもよい。なお、標識剤としては放射性同位元素、酵素、蛍光物質などの種々の化合物が挙げられるが、操作性等の種々の観点から酵素が好ましい。
【００８０】
さらに、当該試薬キットには、測定の実施の便宜のために、適当な抗体若しくは抗原の希釈液、反応希釈液、緩衝駅、洗浄剤、基質溶解剤、反応停止液、固相吸着抑制剤等が含まれていてもよい。
【００８１】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の説明のために実施例を記載するが、当該実施例はなんら本発明の技術的範囲を制限するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１
１：免疫原の調製
イムジェクト  イムノーゲン  ＥＤＣ  コンジュゲーション  キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ＥＤＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ウラシルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させ、ウラシル−ＢＳＡ複合体又はウラシル−ＫＬＨ複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
（Ａ）ウラシル−ＢＳＡ複合体の作製
１）キットに添付されているＢＳＡを注射用水（大塚製薬工場社製）２００μｌに溶解した。
【００８２】
２）ウラシル２ｍｇをキットに添付されている緩衝液（５００μｌ）に溶解させた。
【００８３】
３）１）の溶液に２）の溶液を加えた。
【００８４】
４）３）の溶液をキットに添付の１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１０ｍｇに加えた。
【００８５】
５）４）の溶液を室温で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【００８６】
６）５）で得られた溶液をキットに添付されているＤ−ソルト  デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、ウラシル−ＢＳＡ複合体溶液とした。
【００８７】
７）得られた複合体について、蛋白質分解酵素で分解し、その分解物をＨＰＬＣを用いて分析することにより複合体の組成を求めた。その結果、ＢＳＡ：ウラシル（モル比）＝１：０．１６〜０．７２であることが確認された。
（Ｂ）ウラシル−ＫＬＨ複合体の作製
１）キットに添付されているＫＬＨを注射用水（大塚製薬工場社製）２００μｌに溶解した。
【００８８】
２）ウラシル２ｍｇをキットに添付されている緩衝液（５００μｌ）に溶解させた。
【００８９】
３）１）の溶液に２）の溶液を加えた。
【００９０】
４）ＥＤＣ１０ｍｇを注射用水１ｍｌに溶解させ、その溶液の５０μｌを３）の溶液に加えた。
【００９１】
５）４）の溶液を室温で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【００９２】
６）５）で得られた溶液をキットに添付されているＤ−ソルト  デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、ウラシル−ＫＬＨ複合体溶液とした。
【００９３】
７）得られた複合体について、蛋白質分解酵素で分解し、その分解物をＨＰＬＣを用いて分析することにより複合体の組成を求めた。その結果、ＫＬＨ：ウラシル（モル比）＝１：２であることが確認された。
２：インビトロ免疫法による免疫細胞（抗体産生細胞）の作製
（Ａ）脾細胞の調整
ＢＡＬＢ／ｃマウス２匹から脾臓を摘出し、直径６ｃｍのプラスチックシャーレに入れた。このプラスチックシャーレにＲＰＭＩ１６４０培地を５ｍｌ注ぎ入れ、摘出した脾臓を洗った。別に５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を入れた直径６ｃｍのプラスチックシャーレを２枚用意し、この中でさらに２回洗った。以上の洗浄操作をさらにクリーンベンチ内で同様に繰り返した。最後に移したシャーレの中で脾臓をつぶし、脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させた。この細胞懸濁液を１５ｍｌの遠心管に移し、１０００ｒｐｍ、室温で７分間遠心し、上清を取り除いた。沈殿した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍｌに懸濁させ、そのまま３分間室温で静置した。遠心管の底に沈んだ組織片を吸い取らないように細胞懸濁液を５０ｍｌの遠心管に移した。以上の操作で調製した細胞を次のインビトロ免疫法に用いた。
（Ｂ）インビトロ免疫法
（Ａ）で調製した脾細胞の細胞数を血算板を用いて算定し、生細胞で１×１０７細胞／ｍｌになるよう、ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した。この細胞懸濁液を６ウェル平底プレートに２．５ｍｌ／ウェルで播いた。そこに２５０μｇ／ｍｌのノピア（登録商標、一般名：ロムルチド、第一製薬製）を１００μｌ／ウェルで加え混和し、上記１：（Ｂ）で得られ、系列希釈したウラシル−ＫＬＨ複合体溶液を１００μｌ／ウェル加え混和した後、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間静置した。
【００９４】
なお、系列希釈は、２５００ｎｇ／ｍｌ，５００ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ，２０ｎｇ／ｍｌ，４ｎｇ／ｍｌとなるように行った。
【００９５】
その後、４０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を２．５ｍｌ／ウェル加え、混和し、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養し、感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）を得た。
３：細胞融合
（Ａ）ミエローマ細胞の調整
ミエローマとして８−ダザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株化細胞であるＰ３Ｕ１細胞を用いた。Ｐ３Ｕ１細胞は予め１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で２日おきに継代培養しておいた。
【００９６】
継代培養１日目のＰ３Ｕ１細胞を５０ｍｌ遠心管に移し、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上清液を取り除き、沈殿したＰ３Ｕ１細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。かかる操作で調製したミエローマ（Ｐ３Ｕ１細胞）を細胞融合に用いた。
（Ｂ）感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）の調整
上記２：（Ｂ）で５日間培養し、免疫した脾細胞（抗体産生細胞）をピペツトで懸濁し、プレートに付着していない脾細胞を５０ｍｌの遠心管にひとまとめにして回収した。これを１０００ｒｐｍ、４℃で７分間遠心した。上清液を取り除き、沈殿した細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。以上の操作で調製した感作細胞群を次の細胞融合に用いた。
（Ｃ）細胞融合
（Ａ）で調製したＰ３Ｕ１細胞と（Ｂ）で調製した感作細胞群の細胞数を数え、Ｐ３Ｕ１細胞（細胞数）：感作細胞群（細胞数）＝１：５の割合で混和し、室温にて１５分間静置した。その後、１０００ｒｐｍ、室温で遠心し（７分間）、上清を除去した。遠心管をたたいて沈殿した細胞をほぐした。ほぐれた細胞の入った遠心管を回転させながら、１０秒間、総細胞数２×１０８個あたり１ｍｌ容量の５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を添加し、そのまま５０秒間回転を続けた。引き続き遠心管を回転させながら、１５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３分間で添加し、さらに２５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を１分間で添加した。遠心管のスクリューキャップを閉じ、上下に２〜３回転倒させ、内容液を均一にし、１０００ｒｐｍ、室温で７分間遠心した。上清を取り除き、沈殿を１０％牛胎児血清を含むＨＡＴ培地に懸濁させた（感作細胞として１．６×１０６個／ｍｌとした）。この細胞懸濁液を２００〜２５０μｌ／ウェルとなるように９６穴平底プレートにまいた。３７℃、５％ＣＯ２下で静置しながら、１２日間培養した。
４：ハイブリドーマの選択
３：で得られたハイブリドーマ細胞について、以下の操作を行った。
（Ａ）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
９６穴イムノプレートに１：（Ａ）で得られたウラシル−ＢＳＡ複合体２０μｇ／ｍｌ（ＢＳＡ換算）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で２時間放置した。放置後、０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（和光純薬工業製、Ｔｗｅｅｎ２０相当品）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．３〜７．７、日水製薬製；以下、ＰＢＳ−Ｔと称する。）で７回洗浄した後、６０％子牛血清２００μｌを入れ、３７℃で２時間放置した。
【００９７】
その後ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄後、ウェルに、
（ｉ）３：で得られたハイブリドーマ培養上清液３０μｌとＰＢＳ３μｌとを混合し、３７℃で１時間反応させた液、
（ｉｉ）予めハイブリドーマ培養上清液３０μｌと１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解させたウラシル溶液３０μｌとを混合し、３７℃で１時間反応させた液、または
（ｉｉｉ）１μｇ／ｍｌ正常マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を、それぞれ５０μｌ／ウェルの割合で入れ、３７℃、１時間放置した。次いで該ウェルをＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、１％ＢＳＡで３００倍希釈したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗マウス多価免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌになるようにｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業社製）を基質緩衝液に溶解した溶液を１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で３０分放置した後、２Ｎ  ＮａＯＨ５０μｌ／ウェル入れてプレートミキサーで混合して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【００９８】
なお、吸収率は、以下の式により計算した。
【数１】
0003686977.tif 000002
（ｉ）ＯＤＰＢＳ            ：ハイブリドーマ培養上清をＰＢＳのみで前処理した時のＥＬＩＳＡの吸光度
（ｉｉ）ＯＤｕｒａｃｉｌ    ：ハイブリドーマ培養上清をウラシルで前処理した時のＥＬＩＳＡの吸光度
（ｉｉｉ）ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ：正常マウスＩｇＧのみで処理した時のＥＬＩＳＡの吸光度
上記測定により、測定感度の高いものを選別した。
（Ｂ）上記スクリーニングによる選別の結果、５種のモノクローナル抗体産生細胞（３Ｃ１０、１Ｃ４、４Ｅ３、３Ｄ５、１Ｃ５）が得られた。そのうちの１つである４Ｅ３を「Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＵ−１」として、ブタペスト条約に基づき、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（受託番号：微工研条寄第６１４１号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６１４１））。
５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。
【００９９】
具体的には、４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの細胞数を数え、０．８個／０．２５ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまき込み、ＣＯ２濃度５％、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【０１００】
得られたクローンを４：（Ａ）に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、数個のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマがウラシルに特異的な抗体を産生する細胞としてクローン化された。
６：抗ウラシルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの保存
得られたハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ１６４０培地において１×１０７細胞／ｍｌとなるように調製し、クライオチューブ（ヌンク社製）に１ｍｌずつ分注した。これを−９０℃のディープフリーザーで凍結後、液体窒素中に保存した。
実施例２  モノクローナル抗体の調製及びその評価
実施例１の４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ「Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＵ−１」の細胞数を数え、０．８個／０．２５ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（ベーリンガー社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまき込み、ＣＯ２濃度５％、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【０１０１】
得られたハイブリドーマ培養上清液を用いて、実施例１の４：（Ａ）に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法に準じて、本発明のモノクローナル抗体ＳＵ−１の反応性を調べた。
【０１０２】
具体的には、ウラシル−ＢＳＡ複合体（１０μｇ／ｍｌ）を５０μｌづつ９６穴イムノプレート（イムノプレートＩ、Ｎｕｎｃ社製）に分注し、３７℃で２時間放置した後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有したＰＢＳ−Ｔを２００μｌ／ウエル用いて、合計７回洗浄した。次いで、ブロッキングとして、上記ウェルに３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜静置した後、ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄して、プレートを調製した。
【０１０３】
一方、（ｉ）３０μｌのハイブリドーマ培養上清にＰＢＳを３０μｌ加えたもの、（ｉｉ）３０μｌのハイブリドーマ培養上清にウラシル（３０−１０００μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳを３０μｌ加えて３７℃で１時間放置したもの、または（ｉｉｉ）１μｌ／ｍｌの正常マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を、それぞれ５０μｌ／ウェルの割合で上記の抗原を吸着させた９６穴プレートに添加し、３７℃１時間放置した。次に、これをＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウス抗体（二次抗体、Ｓｉｇｍａ社製）５０μｌ／ウェルを添加し、３７℃で１時間放置した。次にＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、酵素基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ９．８）を１００μｌ／ウェル加え、３７℃で３０分間放置した。次いで、２Ｎ  ＮａＯＨを５０μｌ／ウェル加え、反応を停止させ、プレートリーダーで４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０４】
なお、吸収率は前述の式により求めた。
【０１０５】
結果を図１に示す。図からわかるように、ウラシルの量を１００〜１０００μｇ／ｍｌの範囲で検出できることが分かった。
実施例３  交差反応性試験
実施例２と同様にして、他のウラシル系化合物と本発明のモノクローナル抗体（ＳＵ−１）との反応性を調べた。具体的には、実施例２において、ウラシルとの阻害を調べるために行った（ｉｉ）の工程で、ウラシル（１ｍｇ／ｍｌ）の代わりに、シュードウリジン、ジヒドロウラシル、チミン、シトシン（１ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ用いて、同様にして実験を行って、ウラシル系化合物と本発明のモノクローナル抗体（ＳＵ−１）との反応性を調べた。結果を表１に示す。
【表１】
0003686977.tif 000003
【０１０６】
この結果から分かるように、本発明のモノクローナル抗体は、ウラシルに対し特異的に反応し、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対しては全く反応性を示さなかった。
実施例４  免疫原としてウラシル誘導体−シュレッパー複合体の使用−１
１：免疫原（１−カルボキシメチルウラシル−シュレッパー複合体）の調製
実施例１と同様にして、イムジェクト  イムノーゲン  ＥＤＣ  コンジュゲーション  キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ＥＤＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、１−カルボキシメチルウラシルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させ、１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体又は１−カルボキシメチルウラシル−ＫＬＨ複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
【０１０７】
１）１−カルボキシメチルウラシル６ｍｇを、１．５ｍｌ容量のｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−ｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）に溶解した。
【０１０８】
２）ＢＳＡ又はＫＬＨ１０ｍｇを１ｍｌのｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【０１０９】
３）２）で調製したＢＳＡ又はＫＬＨ溶液２００μｌに、１）の１−カルボキシメチルウラシル溶液５０μｌ及び１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１２５μｌ（ＫＬＨの場合は５０μｌ）を加えた。
【０１１０】
４）３）の溶液を３７℃で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【０１１１】
５）４）で得られた溶液をゲル濾過カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５）にかけて、未反応の１−カルボキシメチルウラシルと低分子物質を除去した。
【０１１２】
６）５）で得られた溶液をＤ−ソルト  デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ（またはＫＬＨ）複合体溶液とした。
【０１１３】
７）複合体の確認は、１−カルボキシメチルウラシルのピリミジン骨格構造に由来するＯＤ２７０ｎｍの吸光度を分析することにより行った。その結果、ＢＳＡ又はＫＬＨ１分子あたりにそれぞれ４．９８個又は２２．９個の１−カルボキシメチルウラシルが結合したと推定された。
２：インビトロ免疫法による免疫細胞（抗体産生細胞）の作製
（Ａ）脾細胞の調整
実施例１の２：に記載する方法に従って、ＢＡＬＢ／ｃマウスから無菌的に脾臓を摘出し、脾細胞を単離して１×１０７細胞／ｍｌ（血清非含有ＲＰＭＩ１６４０培地、日水製薬製）の濃度に調製し、この細胞懸濁液を６ウェル平底プレートに２．５ｍｌ／ウェルで播いた。そこに最終濃度２５μｇ／ウェルになるようにＲＰＭＩ１６４０培地で希釈したＭＤＰ１００μｌ（２５０μｇ／ｍｌ）及び１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体（系列希釈終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で１５分間静置した後、４０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を２．５ｍｌ／ウェル加え、混和し、３７℃、５％ＣＯ２下で４〜５日間培養し、感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）を得た。
３：細胞融合  細胞融合に用いるミエローマとして実施例１と同様にＰ３Ｕ１細胞を、また感作Ｂ細胞（抗体産生細胞）として上記の感作Ｂ細胞を更に実施例１の３：に従って調製した感作細胞群を用いた。
【０１１４】
細胞融合は、実施例１と同様にポリエチレングリコール法を用いて行った。具体的には、Ｐ３Ｕ１細胞と感作細胞群とを細胞数が１：５の割合になるように混和し、５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）を添加し、穏やかに混ぜた。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培地に分散させ、遠心分離（１０００ｒｐｍ、室温、７分間）して細胞を沈殿させて上清を取り除いた。これを１０％ＦＢＳ含有ＨＡＴ培地で希釈し（感作細胞として１．６×１０６個／ｍｌ）、この細胞懸濁液を２５０μｌ／ウェルとなるように９６穴平底プレートにまき、３７℃、５％ＣＯ２下で静置培養した。
４：ハイブリドーマの選択
上記の静置培養に用いたＨＡＴ培地では細胞融合したハイブリドーマのみが増殖しコロニーを形成する。これを利用して、上記静置培養の１０〜１４日後に得られたハイブリドーマについて、その培養上清中に目的の性質を有する抗体が産生されているか否かを、免疫抗原を用いたＥＬＩＳＡ法を用いてスクリーニングした。
（Ａ）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
９６穴イムノプレートに１：で得られた１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体１０μｇ／ｍｌ（ＢＳＡ換算）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で２時間放置した。放置後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業製）を含むＰＢＳ（日水製薬製、ＰＢＳ−Ｔ）で７回洗浄した後、ブロッキングとして３％ＢＳＡ含有ＰＢＳを２００μｌ／ウェル添加し、４℃で終夜静置し、更にＰＢＳ−Ｔで３回洗浄して、抗原吸着プレートを調製した。
【０１１５】
一方、（ｉ）ハイブリドーマ培養上清３０μｌにＰＢＳ３０μｌを加えて３７℃で１時間放置したもの、（ｉｉ）ハイブリドーマ培養上清３０μｌにウラシル（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ３０μｌを加えて３７℃で１時間放置したもの、または（ｉｉｉ）１μｇ／ｍｌ正常マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を、それぞれ５０μｌ／ウェルの割合で、上記で調製した抗原吸着９６穴プレートに添加し、３７℃で１時間放置した。次いで、該ウェルをＰＢＳ−Ｔで７回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識抗マウス多価免疫グロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｌ／ウェル入れ、３７℃で１時間放置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌになるようにｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（和光純薬工業社製）を基質緩衝液（ｐＨ９．８）に溶解した溶液を１００μｌ／ウェル入れ、３７℃で３０分放置した後、２Ｎ  ＮａＯＨ５０μｌ／ウェル入れてプレートミキサーで混合して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１６】
吸収率は、実施例１の方法に従って求めた。
【０１１７】
上記スクリーニングによる選別の結果、３種のモノクローナル抗体産生細胞（３Ｈ５、５Ｃ９及び５Ｄ１０）が得られた。
５：クローニング
上記で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを公知慣用の限界希釈法を用いて、クローニングした。
【０１１８】
具体的には、４：で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの細胞数を数え、０．８個／０．２５ｍｌ／ウェルで１０％ＦＢＳ及び１０％ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（登録商標、ベーリンガーマンハイム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いてまき込み、ＣＯ２濃度５％、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【０１１９】
得られたクローンを４：に記載する方法と同様のＥＬＩＳＡ法を用いて選別を行った。その結果、数個のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマがウラシルに特異的な抗体を産生する細胞としてクローン化された。
実施例５  免疫原としてウラシル誘導体−シュレッパー複合体の使用−２
１：免疫原（ウリジンジアルデヒド−シュレッパー複合体）の調製
実施例１と同様にしてイムジェクト  イムノーゲン  ＥＤＣ  コンジュゲーション  キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ＥＤＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ウリジンジアルデヒドにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合させ、ウリジンジアルデヒド−ＢＳＡ複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
【０１２０】
１）ＢＳＡ２００μｇを０．５ｍｌの０．３Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解した。
【０１２１】
２）ウリジンジアルデヒド２ｍｇを０．５ｍｌの０．３Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解し、そのうちの１０７μｌを上記１）で調製したＢＳＡ溶液に加えた。
【０１２２】
３）２）で調製した溶液を４℃で一晩攪拌した。
【０１２３】
４）これにウリジンジアルデヒドの１．５当量（２．６６μｍｏｌ）のＮａＢＨ４を加え、氷上で３時間静置した。
【０１２４】
５）次いで、更にウリジンジアルデヒドの１．５当量（２．６６μｍｏｌ）のＮａＢＨ４を加えて、再び４℃で一晩攪拌した。
【０１２５】
６）酢酸を用いてｐＨ４．５に調整し、該溶液をゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５）にかけて、未反応のウリジンジアルデヒドと低分子物質を除去した。
【０１２６】
７）６）で得られた溶液をＤ−ソルト  デキストラン脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、ウリジンジアルデヒド−ＢＳＡ複合体溶液とした。
【０１２７】
８）複合体の確認は、ウリジンジアルデヒドのピリミジン骨格構造に由来するＯＤ２６０ｎｍの吸光度を分析することにより行った。その結果、ＢＳＡ１分子あたり２７．８個のウリジンジアルデヒドが結合したと推定された。
【０１２８】
かかる複合体は、実施例４と同様にハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の取得に利用することができる。
実施例６  免疫原としてウラシル誘導体−シュレッパー複合体の使用−３
１：免疫原（５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−シュレッパー複合体）の調製
実施例１と同様にしてイムジェクト  イムノーゲン  ＥＤＣ  コンジュゲーション  キット（Ｉｍｍｊｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ＥＤＣ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させ、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ（又はＫＬＨ）複合体を調製した。具体的には、次の方法によって調製した。
【０１２９】
１）５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル４ｍｇを、１ｍｌ容量のｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−ｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ４．７）に溶解した。
【０１３０】
２）ＢＳＡ（又はＫＬＨ）１０ｍｇを１ｍｌのｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。
【０１３１】
３）２）で調製したＢＳＡ（又はＫＬＨ）溶液２００μｌに、１）の５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル溶液５０μｌ及び１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１２５μｌ（ＫＬＨの場合は５０μｌ）を加えた。
【０１３２】
４）３）の溶液を３７℃で２時間放置後、１０，０００ｒｐｍで、５分間遠心し、沈殿物を除いた。
【０１３３】
５）４）で得られた溶液をＤ−ソルト  デキストラン  脱塩化カラム（Ｄ−ｓａｌｔ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ）に添加し、溶出液を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅで分画した。それぞれの画分の２８０ｎｍおよび２６０ｎｍにおける吸収を測定し、最初のピーク画分を集め、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ（またはＫＬＨ）複合体溶液とした。
【０１３４】
６）複合体の確認は、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシルのピリミジン骨格構造に由来するＯＤ２８０ｎｍの吸光度を分析することにより行った。その結果、５−ブロモ−１−カルボキシメチルウラシル−ＢＳＡ複合体に関して、ＢＳＡ１分子あたりに７．３１個のウリジンアルデヒドが結合したと推定された。
【０１３５】
かかる複合体は、実施例４と同様にハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の取得に利用することができる。
【０１３６】
産業上の利用可能性
本発明のモノクローナル抗体は、ウラシルに対して特異的に反応することより、試料中のウラシルを簡便、迅速、且つ選択的に測定することができる。更に当該モノクローナル抗体は、シュードウリジン及びジヒドロウラシルに対しては全く反応性を示さないので、ヒト尿試料を検査することにより、ＤＰＤ欠損者の選定に有用であり、これは特にフッ化ピリミジン系抗腫瘍剤の投与が禁忌であるＤＰＤ欠損癌患者のスクリーニングに極めて有用である。
【０１３７】
本発明は、癌患者に対する抗腫瘍剤治療において安全な治療法を選択する方法並びにそれに用いられるツールを提供する。
【０１３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で得られた本発明のモノクローナル抗体について、ウラシルに対する反応性を間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べた結果を示す図である（実施例２）。横軸はウラシルの量（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は吸収率（％）を示す。
【図１】
0003686977.tif 000004