(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の区画された領域を有し、前記複数の区画された領域毎に、塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを配置させたオリゴヌクレオチドアレイであって、第１の相関度のオリゴヌクレオチド同士を、第１の相関度よりも低い相関度のオリゴヌクレオチド同士よりも近くに配置するという配置規則にしたがって、前記オリゴヌクレオチドが配置されたことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記オリゴヌクレオチドが特定のフェノタイプに関連するオリゴヌクレオチドであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項３】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記フェノタイプはストレス反応に関わるものであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項４】
請求項３記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記オリゴヌクレオチドは、校正用内部・外部標準遺伝子、ストレス耐性・生存に関与する遺伝子とホルモン遺伝子、サイトカイン遺伝子、細胞死を誘導する機能を有する遺伝子、グルココルチコイドなどの抗炎症に関与する遺伝子や増殖抑制遺伝子、免疫応答に関与する転写因子やシグナル分子、細胞障害を引き起こすサイトカインの誘導にかかわる転写因子やシグナル分子、増殖抑制にかかわる転写因子やシグナル分子、ストレス耐性にかかわる転写因子やシグナル分子のいずれかであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項５】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記相関度は、データベースで定められている相関度であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項６】
請求項５記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記相関度は、遺伝子相互関係スコア、リガンドとレセプターのペア情報、蛋白質蛋白質相互作用情報、遺伝子パスウェイ情報のいずれか１つ若しくは２つ以上の組合わせを用いて定められていることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項７】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記相関度は、比較する検体を用いた実験結果からの発現の程度量により、P値、FDD、SVM等の分類アルゴリズムのいずれかで統計的に算出されたものであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項８】
請求項７記載のオリゴヌクレオチドアレイにおいて、前記検体は、ある特定の疾患を有する患者由来検体と、健常者由来検体であることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項９】
複数の区画された領域を有し、前記複数の区画された領域毎に、塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを配置させたオリゴヌクレオチドアレイであって、第１の相関度のオリゴヌクレオチド同士を、第１の相関度よりも低い相関度のオリゴヌクレオチド同士よりも近くに配置するという配置規則にしたがって、前記オリゴヌクレオチドを配置したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイに対し、細胞由来のＲＮＡを標識してハイブリダイズし、前記ハイブリダイズを標識検出することを特徴とする評価方法。
【請求項１０】
複数の区画された領域を有し、前記複数の区画された領域毎に、塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを配置させたオリゴヌクレオチドアレイであって、第１の相関度のオリゴヌクレオチド同士を、第１の相関度よりも低い相関度のオリゴヌクレオチド同士よりも近くに配置するという配置規則にしたがって、前記オリゴヌクレオチドを配置したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイに対し、細胞由来のＲＮＡを標識してハイブリダイズし、前記ハイブリダイズを標識検出した結果を表示することを特徴とする表示方法。
【請求項１１】
複数の区画された領域を有し、前記複数の区画された領域毎に、塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを配置させたオリゴヌクレオチドアレイであって、第１の相関度のオリゴヌクレオチド同士を、第１の相関度よりも低い相関度のオリゴヌクレオチド同士よりも近くに配置するという配置規則にしたがって、前記オリゴヌクレオチドを配置したことを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイに対し、細胞由来のＲＮＡを標識してハイブリダイズし、前記ハイブリダイズを標識検出した結果を、オリゴヌクレオチドの相関性を定めた画面上に、再配置することを特徴とする表示方法。
【請求項１２】
複数の区画された領域を有し、前記複数の区画された領域毎に、塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを配置させるオリゴヌクレオチドアレイで、第１の相関度のオリゴヌクレオチド同士を、第１の相関度よりも低い相関度のオリゴヌクレオチド同士よりも近くに配置するという配置規則にしたがって、前記オリゴヌクレオチドが配置させるオリゴヌクレオチドアレイ作成キットであって、オリゴヌクレオチド固定用基板、前記固定用プローブ、前記プローブの配置情報、前記プローブをスポットするためのスポッター、前記スポットのアドレス情報と検出結果を表示する画面又は相関度を定めた画面を備えたコンピュータを有することを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ作成キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレスの程度を簡便に評価するためのＤＮＡアレイ及びそれを用いたストレス解析方法に関する。また、ストレスに関わらず、ある疾患に関わりを持つ遺伝子群を相関度に基づいて、オリゴヌクレオチドを基板上に配置し、遺伝子の発現状態を評価する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生活習慣病やアトピー・アレルギー疾患の増加が、今日の国民の医療負担を増大させる要因の一つとなっている。また、自殺の増加、犯罪の低年齢化、心的外傷後ストレス症候群（Ｐｏｓｔ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，  ＰＴＳＤ）患者の増加などが近年報告されている。これら生活習慣病、アレルギー疾患、自殺、犯罪、ＰＴＳＤなどの社会問題の背景として、ストレスが関与しているのは医療専門家の一致した意見である。
ストレスの定義は、生体が急激な侵襲を受けた際、個々の侵襲に対する特異的な反応に加えて、侵襲の種類によらず一定のパターンを示す非特異的反応の総体である。ストレスをもたらす刺激（ストレッサー）として、異常温度、火傷、炎症、免疫反応、騒音、電気ショック、紫外線、放射線、細菌毒素、細菌、ウイルス、手術、運動、痛覚刺激、身体拘束、低酸素、低血糖、虚血、試験、対人摩擦、肉親の死、孤独、失恋、絶望、落胆、社会不安、戦争、テロ活動、地震などがあげられる。生体ホメオスターシス維持機構の知見の増加により、生体の三大調節機構である神経、内分泌、免疫系の異常とストレスとが密接にかかわっていることが明らかとなった。
【０００３】
また、従来のオリゴヌクレオチドアレイでは、まずどの遺伝子をチップに載せるか決めてから、遺伝子に付けたアルファベット順等で、９６穴プレート等にいくつかの針を持ったスポッターでプレートに載せていく。そのため、遺伝子の並び方に規則性はあるが、実際に評価する際には、ファイルと画像でどこにどんな遺伝子を配置させたかのアドレス情報を確認するためのステップが必要であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし現状では、ストレスの程度を客観的に評価する医学生理学的な診断方法は開発されていない。例えば、カテコールアミンや副腎皮質ホルモンなどのいわゆるストレスホルモンの血中濃度を測定しても、個人差や経時的な変化が大きく、ストレス刺激に対して一律に変化するわけではないので、ストレスの程度を評価するには不十分であることが知られている。加えて、これらの限られたストレスホルモンのみを測定しても生体の反応を評価することは極めて困難である。これはストレスが複雑系の反応であり多角的な評価が必要とされるためである。一方、ストレスは社会心理学の分野でも研究され、インタビューテストやアンケート形式などの心理テストによりストレスの程度を評価する方法が開発されているが、その心理テストは生体反応を生理学的に十分に裏付けているとは言いがたい。すなわち、個人のストレスを客観的に評価する方法は極めて乏しいのが現状である。しかしストレスは、自律神経異常、内分泌異常、免疫異常、胃潰瘍・急性胃粘膜病変、精神疾患、生殖機能低下などと関連する重要現象である。専門医療機関はもとより、一般の開業医、企業や学校の診断設備、検診センター等で手軽にストレスの程度を評価することが可能となれば、それを家庭、職場、学校等における日常生活にフィードバックできるので有益である。そのような観点からストレスの程度を調べることに的を絞った診断機器の開発が求められていた。
本発明の目的は、疾患、異常、症状、例えばストレス等の程度を簡便、低コストでかつ信頼性高く調べることができる診断方法、特にはオリゴヌクレオチドアレイを提供することにある。特に、ストレスの程度を調べる上で不可欠な遺伝子群を特定することでアレイ上に載せるＤＮＡ断片の数を必要最小限とし、再現性・信頼性の高いストレス解析用アレイを提供することを目的になされたものである。また、配置の仕方に規則を作ることにより、ある疾患に関連性を持つ遺伝子同士の相関を一目で評価することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前述のように、例えばストレスは神経系、内分泌系、免疫系などの種々の臓器が関連する複雑系の反応であり多角的な評価が不可欠である。この複雑系の現象であるストレス反応を遺伝子レベルで表現すれば、複数のストレス関連遺伝子群のスイッチがオンオフされることで、ストレス関連の蛋白質量が増減し、それら蛋白質活性全体のバランスで生体機能調節がなされていると考えられる。すなわちストレス関連遺伝子群のオンオフの異常が、結果として蛋白質活性のバランスの異常となり、ストレスのような生体機能調節の異常として現れるに違いない。遺伝子のオンオフとは、例えば遺伝子発現量の増加ないしは減少により制御されている。遺伝子発現量は、メッセンジャーＲＮＡ量、もしくは蛋白質量を指標として測定することができる。現在の技術ではメッセンジャーＲＮＡ量を指標とする方が、蛋白質を指標とするより、極めて簡便に測定が行える。そこで、ストレスを簡便に評価するには、ストレスに関連する複数遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現量の増減を同時に観察すればよい。この目的には、近年開発されたＤＮＡアレイ（オリゴヌクレオチドアレイとも呼ばれる）が最も適している。
【０００６】
発現状態について詳しく説明する。発現状態は遺伝子形（ジェノタイプ）の一つであり、発現状態のうち発現とは、DNA上の遺伝子領域がRNAに写し取られ（転写され）るもしくは、転写されたRNAから蛋白質が翻訳される状態をいう。また発現状態のうち状態とは、遺伝子１、遺伝子２、・・・、遺伝子ｎにおいて、それぞれ発現が生じる場合をON、発現が生じない場合をOFFとすると、（ONもしくはOFF）、（ONもしくはOFF）、・・・、（ONもしくはOFF）というｎ個の並びをいう。またｎ個の遺伝子において、それぞれのRNA転写量が増加する場合UP、変わらない場合をEVEN、低下する場合をDOWNとすると、（UP、EVEN、もしくはDOWN）、（UP、EVEN、もしくはDOWN）、・・・、（UP、EVEN、もしくはDOWN）というｎ個の並びをいう。またｎ個の遺伝子のうちいずれか２個の遺伝子同士の相関度、すなわち遺伝子iの測定信号強度をX、遺伝子jの測定信号強度をYとし、N回の実験におけるXとYの平均値をそれぞれm(X)とm(Y)、標準偏差をそれぞれS(X)とS(Y)とした場合の相関係数ｒのマトリクスｒ（i, j）をいう。相関係数は例えば、下記（式１）で表される。
【０００７】
0003694674.tif 000002
前記発現状態の変化、すなわちジェノタイプの変化が原因となり、表現型（フェノタイプ）に変化が現れる。フェノタイプとはなんらかの手段で外から観測できる現象のことである。表現型とは例えば疾患、症状の種類および症状が現れる体の部位のことである。疾患とは例えば医師が経験によって診断できる糖尿病、がんなどの病態である。症状とは例えば本人が自覚できる頭痛、腹痛などである。また症状とは検査機器を用いて検出できる値の正常値からのずれ、例えば中性脂肪が基準値を超えた場合の肥満などである。例えば細胞形状の違い、細胞増殖速度の違いなど除く何らかの手段で外から観測できるものもフェノタイプに含まれる。
ＤＮＡアレイ（オリゴヌクレオチドアレイ）は、複数のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）を基板上に固定化したものである。それぞれのオリゴヌクレオチドはそれぞれ異なる遺伝子に対応している。測定に際しては、メッセンジャーＲＮＡを鋳型として逆転写酵素反応を行い、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片を合成する。その逆転写酵素反応の際に、適当な標識物質を結合ないしは鎖伸長時に取り込ませることで、ｃＤＮＡ断片を標識化する（以後、標識されたｃＤＮＡを、標識化ｃＤＮＡと呼ぶ）。基板上に固定化されたオリゴヌクレオチドは、標識化ｃＤＮＡ断片と相補結合する。オリゴヌクレオチドは基板上の異なる座標値に固定化されている。予めどの座標値にどのオリゴヌクレオチドが固定化されているかが分かれば、複数の遺伝子のそれぞれについてメッセンジャーＲＮＡの増減を、同時測定することができる。
本発明者らは、オリゴヌクレオチドアレイを用いて、ストレスの程度を評価するという目標を達成するために検討した結果、（１）校正用内部・外部標準遺伝子、（２）熱ショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，以後ＨＳＰと記載する）などのストレス耐性遺伝子とストレスにより減少する性ホルモンなどのホルモン遺伝子、（３）免疫応答・炎症反応を誘導するサイトカイン遺伝子、（４）細胞死を誘導する機能を有する遺伝子、（５）グルココルチコイド、ＴＧＦβ、ＦＧＦなどの抗炎症、創傷治癒に関与する遺伝子や増殖抑制遺伝子、（６）免疫応答に関与する転写因子やシグナル分子、（７）細胞障害を引き起こすサイトカインの誘導にかかわる転写因子やシグナル分子、（８）増殖抑制にかかわる転写因子やシグナル分子、（９）ストレス耐性にかかわる転写因子やシグナル分子などの遺伝子を数多く、少なくとも３０種類以上、より好ましくは数百種類のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド断片；プローブＤＮＡ）として、同一アレイ上に載せることが必要であることを見いだした。なお前述の（１）から（５）は生体内で特定の機能を司る機能遺伝子、（６）から（９）は機能遺伝子間のシグナル伝達を司るシグナル伝達遺伝子である。
さらに、プローブＤＮＡを基板上に固定化する際の配置を、前記（１）から（９）の遺伝子分類に基づいて行うことで、ＤＮＡアレイの測定結果を、測定者が瞬時に理解し判定できることを見出した。また、メッセンジャーＲＮＡの被検査者からの取得が比較的容易な、白血球（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）を検査の際に検体として用いることで、簡便なストレスの程度の評価が可能であることを見出し、本発明の完成に至った。以下、具体的な課題の解決手段を説明する。
本発明は、塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを、支持体上の既知の異なる位置に固定化したアレイであって、前記（１）から（９）の遺伝子の、あるいは前記遺伝子の相補配列鎖の、少なくとも２０塩基以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイである。
また、本発明は、ストレス反応において協調関係にあることが明らかな内分泌系、免疫系、神経系の3者を相互に関連づける仲介因子群と関連する遺伝子の、あるいは相補配列鎖の、少なくとも２０塩基以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイである。前述の仲介因子の例として、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ；ＣＲＨ）、サイトカインなどがある。
また、本発明は、同一の支持体上に固定化したオリゴヌクレオチドが、少なくとも２０塩基以上の塩基配列を有し、かつ、２つ以上の異なる信号伝達経路に関連する遺伝子群あるいは前記遺伝子群の相補鎖群からなり、前記遺伝子群が同一の信号伝達経路上にある、細胞膜上受容体あるいは核内受容体と転写因子との間に介在する細胞内信号伝達関連タンパク質群をコードする少なくとも２種類以上の遺伝子からなることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイである。
また、本発明は、塩基配列の異なる複数のオリゴヌクレオチドを支持体上に固定化した第一のオリゴヌクレオチドアレイを用いて、網羅的に遺伝子発現解析を行うことで発現量に変化が見られる遺伝子群及び前記遺伝子群と関連する遺伝子群を選定し、前記遺伝子群及び前記関連遺伝子群の、あるいは前記遺伝子群及び前記関連遺伝子群の相補配列鎖の、少なくとも２０塩基以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを支持体上に固定化した第二のオリゴヌクレオチドアレイを作製し、前記第二のオリゴヌクレオチドアレイを用いて遺伝子発現解析を行う遺伝子発現解析方法である。
図４は、ＤＮＡチップの一般的な構造を示した図である。図１４にＤＮＡチップを用いた測定法のフローチャートを示す。まず支持体２３にＤＮＡプローブ２１を固定化する。続いて、測定対象サンプルから抽出した遺伝子断片を蛍光標識などで標識する。この蛍光標識された遺伝子２２を、ＤＮＡプローブ２１とハイブリダイズさせる。その後、蛍光標識由来の蛍光を検出器２０で検出する。この検出の結果、各ＤＮＡプローブ２１にハイブリダイズした蛍光標識された遺伝子２２の量が得られる。これを発現分布という。
ＤＮＡプローブであるオリゴヌクレオチドはＰ値、ＦＤＤ、ＳＶＤ等で分類されている。Ｐ値は統計学で有意確率と呼ばれる値である。仮説検定において、統計量の帰無仮説からの乖離の程度を表す確率である。Ｐ値は０から１までの値をとり、この数値が小さいほど、帰無仮説からの乖離が大きい。本願明細書では帰無仮説を「遺伝子Ａ由来のＲＮＡと遺伝子Ｂ由来のＲＮＡの発現量に差がない」とする。Ｐ値が０とは遺伝子Ａ由来ＲＮＡと遺伝子Ｂ由来ＲＮＡが異なるであることを示し、Ｐ値が１とは遺伝子Ａ由来ＲＮＡと遺伝子Ｂ由来ＲＮＡが同一であることを示す。Ｐ値は例えば、ｔ検定、Ｆ検定などのパラメトリック検定、ウィルコクソン検定などのノンパラメトリック検定により求めることができる。
ディファレンシャルディスプレイ法は、異なる条件下の細胞で発現しているメッセンジャーＲＮＡの差異を見つける方法の一つである。その原理はメッセンジャーＲＮＡをオリゴｄＴプライマーで逆転写後、種々の任意プライマーと組み合わせてＰＣＲ法で増幅し、電気泳動のバンドパターンを検体ごとに比較することである。信号検出に蛍光標識を用いる場合、蛍光ディファレンシャルディスプレイ法（ＦＤＤ）とよぶ。発現しているメッセンジャーＲＮＡが既知であっても未知であってもよい。
サポートベクターマシーン（SVM）は機械学習にもとづき手書き文字、画像などの分類にもちいられる方法である。あるデータが与えられたとき、そのデータを複数のカテゴリーに分類する方法の一つである。異なる条件下の細胞で発現しているメッセンジャーＲＮＡの差異を分類することができるアルゴリズムである。SVMは教師無学習法（Supervised  Methods）に属する分類アルゴリズムの一つであり、同様の手法には、最短近接法（Nearest  Neighbor）、判別分析（Discriminant  Analysis）、ニューラルネットワーク、分類木（Classification  Tree）、ブースティング（Boosting）、バギング（Bagging）などの方法がある。本願明細書ではSVMを代表例として記載するが、他の分類法をもちいることも可能である。
例えばストレスの程度を評価するためには、ストレス応答の作用機序を高精度に解析する必要があるため、１種類の遺伝子とのみ相補的結合するはずのＤＮＡ断片が、他遺伝子とも結合すること（クロスハイブリダイゼーション）は避けなくてはならないことは自明である。これは１枚のアレイ上に固定化する遺伝子数が多くなるほど困難になる。従って、遺伝子数が５千から数万という探索用途のＤＮＡアレイで各遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションを皆無にすることは非常に困難である。ブラストアルゴリズムに基づく配列相同性の検討の結果、プローブとして用いるＤＮＡ断片の塩基長が１０００塩基以下である場合、１０００−１５００種類以下のＤＮＡ断片を同一アレイ上に載せることが好ましいことが判明した。そのため、ＤＮＡアレイを使用する目的がストレス応答の作用機序の解明であれば、ストレス応答の作用機序に関連する遺伝子のみを可能なかぎり必要最小限集め、アレイ化することが望ましい。ストレス反応と無関係の遺伝子を載せることは、プローブ作成費用の上昇、ひいてはオリゴヌクレオチドアレイの価格上昇につながり好ましくない。また、アレイのプローブとして用いるオリゴヌクレオチドの種類の数を少なく抑えることができることから、１つの種類のオリゴヌクレオチドを複数箇所にプローブとして固定することができ、複数箇所の信号強度を平均化することで信頼性を高めることができる。
【０００８】
以下に具体的な遺伝子群の配置方法を説明する。
１．バイオインフォマティクスを用いた遺伝子群の配置方法
１）遺伝子機能ごとの分類（第一分類）
例えば校正用内部・外部標準遺伝子１１、ストレス耐性や生存に関与する遺伝子やホルモン遺伝子１２、炎症・免疫応答・増殖に関与する遺伝子１３、細胞死を誘導する遺伝子１４、抗炎症・創傷治癒・増殖抑制に関与する遺伝子１５、免疫応答に関与する転写因子やシグナル分子１６、サイトカインの誘導にかかわる転写因子やシグナル分子１７、増殖抑制にかかわる転写因子やシグナル分子１８、ストレス耐性にかかわる転写因子やシグナル分子などの遺伝子１９を、本願明細書の図１もしくは図２に示すように配置する。図１は上記１１から１９を９個の固定化領域に配置した例を示す。図２は上記１１、１２と１９、１３と１６、１４と１７、１５と１８をそれぞれ５個の固定化領域に配置した例である。
各遺伝子を１１から１９のいずれに分類するかの決定は国際オントロジーコンソーシアム（http://www.geneontology.org/）が構築しているオントロジーデータベースで定義された用語に基づいて行う。各遺伝子の関連オントロジーの検索には例えば公共のオントロジーデータベース（Gene  Ontology、以後GOと略す）の一つであるPubGene（http://www.pubgene.org）などを用いることができる。このPubGeneデータベースは、Medline、OMIMなどの文献データベースの文書解析（textual analysis）により遺伝子とオントロジーとの関連づけを行っている。（Tor-Kristian  Jenssenら、A literature network of human genes for high-throughput analysis of gene expression, Nature Genetics, vol.28, pp21-28参照。）例えば熱ショック蛋白質の一つであるHSPA1Aは、PubGeneの機能分類（Functional Annotation）ではheat shock protein（GO番号0003773）、PubGeneの細胞プロセス分類（Cell  Process  Annotation）ではtranscription（GO番号0006350）、immune response（GO番号0006955）との関連が深い。また別の熱ショック蛋白質であるHSPA1Bは、PubGene機能分類ではheat shock protein（GO番号0003773）、PubGene細胞プロセス分類（Cell  Process  Annotation）ではapoptosis（GO番号0006915）との関連が深い。そのため、例えばPubGene機能分類に基づくと、HSPA1AとHSPA1Bの両者は同一のストレス耐性遺伝子であるheat shock proteinに属するので、いずれもストレス耐性や生存に関与する遺伝子やホルモン遺伝子１２に分類される。一方、PubGene細胞プロセス分類に基づくと、HSPA1Aは免疫応答１３に属するが、HSPA1Bは細胞死を誘導する遺伝子１４に属することになる。PubGeneの機能分類と細胞プロセス分類では、それぞれのオントロジーがスコア順に表示される。スコアが一番大きいものもしくは、比較的スコアが大きい数個のオントロジーを分類に用いればよい。PubGene以外でも遺伝子名から関連オントロジーを検索できるツールやデータベースであれば、いずれを用いてもよい。
２）各固定化領域内の遺伝子配置（第二分類）
一旦、１）で各固定化領域に分配された、個々の遺伝子の最終配置を決定するには、（１）文献データベースの文書検索により得られた遺伝子相互関係スコア、（２）リガンドとレセプターのペア情報、（３）蛋白質蛋白質相互作用情報、（４）遺伝子パスウェイ情報のいずれか１つ若しくは２つ以上の組み合わせを用いる。１）により、各固定化領域ごとに含まれる遺伝子リストが得られる。まずこの遺伝子リストを遺伝子名（もしくは遺伝子シンボル名）の順番にソートするか、若しくは恣意的に並べる。リスト先頭の遺伝子Aを例えば各固定化領域の角もしくは中央等の予め決められた位置に固定化する。つづいてこの遺伝子Aと相互関係の強い遺伝子を探し、仮に遺伝子Bと遺伝子Cとが相互関係が強い遺伝子だとする。これら遺伝子Bと遺伝子Cを遺伝子Aの隣に配置する。次に、既に配置が決まった遺伝子B、遺伝子Cを遺伝子名リストから取り除き、新たにリストの先頭の遺伝子Dを遺伝子A,B,C以外の位置に配置する。この遺伝子Dに対し同様の手順で相互関係の強い遺伝子E、遺伝子Fを探し、遺伝子Dの隣に配置する。この過程を繰り返し行うことで、相互関係の強いもの同士が近傍に集まり、各固定化領域内でクラスターを形成するようになる。次に、相互関係の強いものを探す方法について説明する。
（１）の文書検索による方法は、二つの遺伝子名が同一の文献データベースの同一文章内に存在する数が多いほど両者の相互関係が強いとするものであり、例えばPubGeneデータベースを用いて相互関係スコアを得ることができる。（Tor-Kristian  Jenssenら、A literature network of human genes for high-throughput analysis of gene expression, Nature Genetics, vol.28, pp21-28参照。）図７に具体例をしめす。図７中の各丸印は遺伝子を、丸印同士をつなぐ線は、相互関係があることを示している。線に並んで記載された数字は相互関係スコアを表す。この図７では相互関係スコアとは、線でつながれた二つの遺伝子がMEDLINEの同一アブストラクト文中に存在した件数を示している。図７の中央にある遺伝子ADPRTと相互関係が強いものは、TP53,CFTR,EEF2,FRA1H,SP1,DAFの６遺伝子であり、相互関係スコアは６遺伝子とも１である。スコアが同一の場合は、例えば遺伝子名をアルファベット順にソートして、上位の遺伝子から順番にADPRTの隣に配置していく。スコアが異なる場合は、スコアの大きい順番に配置していく。このPubGeneでは文献データベースとして米国NCBIのMEDLINEやOMIMを用いているが、その他の文献データベースでもかまわない。
（２）のリガンドとレセプターのペア情報に基づいて配置決定するとは、例えばinsulin-like growth factor 1 (IGF1)とinsulin-like growth factor 1 receptor(IGF1R)や、insulin(INS)とinsulin receptor(INSR)のようにタンパク質同士がリガンドとレセプターの関係にある遺伝子同士を隣に配置することである。
（３）の蛋白質蛋白質相互作用の情報に基づいて配置決定するとは、例えば米国カリフォルニア大学ロサンゼルス校のDIP（Database of Interacting Proteins）などのような、タンパク質相互作用データベースに従って配置を決めることである。（DIPについてはI Xenariosら、DIP: the database of interacting proteins, Nucleic Acid Research, vol.28, 289-291, 2000参照。）タンパク質相互作用データベースにおいても、図７と同様に相互作用するタンパク質同士が線で結合されている。相互作用の強さは、例えば解離定数（Dessociation Constant）が実験的に求められていれば、分子同士の結合力が分かるので、結合力の強い方をより相互作用が大きいと見なす。また１回の実験で確認された相互作用より、２回以上の複数回の実験で確認された相互作用を、より相互作用が強いと見なしてもよい。DIP以外のタンパク質相互作用データベースを用いてもかまわない。
（４）の遺伝子パスウェイ情報に基づいて配置決定するとは、細胞間もしくは細胞内の情報伝達に関連する遺伝子を、そのパスウェイ上の相互関係に沿って配置することである。図８に代表的なパスウェイであるMAPK（Mitogen Activated Protein Kinase）パスウェイについて示す。個々の丸印は遺伝子を、丸印と丸印をつなぐ矢印は、その矢印の方向に情報伝達が行われることを意味する。例えば図８のMos遺伝子の隣にMEK遺伝子を配置し、その隣にRaf遺伝子やERK遺伝子を配置することで、同一パスウェイに属し、かつ直接に情報伝達が行われる遺伝子ほど近傍に配置されることになる。パスウェイ情報としては、例えばパスウェイデータベース (http://www.biocarta.com/)を用いることができる。また代謝パスウェイデータベースKEGG（http://www.kegg.kyoto-u.ad.jp）などを用いて、遺伝子同士の関連情報を収集し、遺伝子の配置に反映させることができる。
本願では、遺伝子機能ごとによる分類（第一分類）をPubGeneデータベースのOntology検索機能、各固定化領域内の遺伝子配置（第二分類）をPubGeneデータベースの遺伝子相互関係検索機能を用いて行い、DNAチップの固定基板上の遺伝子配置を決定することができる。但し、PubGeneデータベースの内容は年々増大する文献情報の内容に基づいて更新されるので、新しい知見が得られるたびに、遺伝子同士の相互関係スコアが変更されることが予想される。そのため固定基板上の遺伝子配置も、文献情報の内容によって変化することがある。またPubGene以外でも上記のDIPなどの実験結果にもとづく遺伝子相互作用データベースや、信号伝達パスウェイデータベース、代謝パスウェイデータベースのいずれか、もしくはそれらの組み合わせにより、DNAチップの固定基板上の配置を決定してもよい。更に、今後新たに構築される遺伝子間の相互関係を記述するデータベースを用いてもよい。
図１５は、バイオインフォマティックスを用いた遺伝子群配置法によるＤＮＡチップ作成の概略図である。図１６にそのフローチャートを示す。まずインターネット等のネットワークより接続可能な公共データベース３７もしくはインハウスデータベース３８より遺伝子情報を取得する。取得された遺伝子情報により本願明細書に開示された方法を用いて支持体２３上の各ＤＮＡプローブ２１の配置を決定するが、この配置決定は例えばネットワーク接続コンピュータ３９などを用いた計算処理等により行う。支持体２３上へのＤＮＡプローブ２１配置は、例えばスポッター３０により行う。スポッター３０の動作規則から逆算して、先に決定された支持体２３上のＤＮＡプローブ２１配置が実現されるように、スポッティング用プローブを格納した９６穴もしくは３８４穴プレート４２上のＤＮＡプローブ２１の配置を計算する。ＤＮＡプローブがストックとして別のプレート群４０に格納されている場合は、分注ロボット４１を用いて、プレート４２に移し変えを行う。この分注ロボット４１は、予め決定された支持体上のプローブ配置を実現するために計算された、スポッティング用プローブ配置になるようにプレート４２に対し分注を行う。最後にスポッター３０を用いて、プレート４２に格納されているＤＮＡプローブ２１を支持体２３上にスポットし、ＤＮＡチップが作成される。
２．実験結果に基づく遺伝子群の配置方法
前記１．では実験結果によらずに、バイオインフォマティックスを用いてDNAチップ固定基板上の遺伝子配置を決定する具体例を示した。本節では、実験結果を用いて遺伝子配置を決定する方法を示す。
１）チップもしくはFDDによるデータ取得
まず、比較したい２種類の検体を採取し、それぞれからRNAを抽出する。比較したい２種類の検体とは例えば、ある疾患を有する患者由来検体と、健常者由来検体である。検体とは、組織、血液、細胞などのRNAを含む対象であればいずれでもよい。個人差を考慮するためには、患者由来検体と健常者由来検体をそれぞれ複数、できる限り多く用意することが望ましい。この２種類の検体群それぞれの遺伝子発現状態をDNAチップもしくはFDDにより解析する。DNAチップは、例えばｃDNAクローンを鋳型としてPCR増幅したDNA断片をプローブとして用いるｃDNAチップでも良いし、米国アフィメトリックス社のようにオリゴチップでも良い。可能な限りの遺伝子発現状態を解析するためにはDNAチップの遺伝子プローブ数はできるだけ多いことが望ましい。例えばヒトの遺伝子は３万から４万個、オールタナティブスプライシングを含めた転写産物の総数は約１０万個と考えられているので、数万個の遺伝子プローブが搭載されたDNAチップを用いることが理想である。このように多数の遺伝子プローブが搭載されたDNAチップを用いることができない場合は、例えばFDDを用いて転写産物の遺伝子発現状態を解析することができる。
図１７は、実験結果に基づく遺伝子群配置法によるＤＮＡチップ作成の概略図である。図１８にそのフローチャートを示す。まずＦＤＤ法やＤＮＡチップ法などにより実験データ４６を取得する。この実験データをコンピュータ４７で解析して得られた遺伝子情報により本願明細書に開示された方法を用いて支持体２３上の各ＤＮＡプローブ２１の配置を決定する。この配置決定以降の手順は、図１５，図１６に示したバイオインフォマティックスを用いたＤＮＡチップ作成と同一である。
２）統計解析にもとづく遺伝子配置
前記のDNAチップもしくはFDDなどの方法を用いて比較対象である２種類の検体の発現状態を測定した後、その測定結果に基づいて本願明細書におけるDNAチップの固定基板上の配置を決定する方法を示す。２種類の検体がそれぞれ複数ある場合、測定結果の統計解析にもとづき遺伝子の固定基板上の配置を決定する。DNAチップ実験から得られる生データは、比較対象となる２種類の検体由来それぞれの信号強度と、その２種類の信号強度の比率である。例えば検体１をCy3蛍光色素、検体２をCy５蛍光色素で標識した場合は検体１由来Cy３蛍光強度、検体２由来Cy5蛍光強度、Cy5／Cy3蛍光強度比の3者が得られる。またFDD実験から得られる生データは検体１を電気泳動したレーンのバンド濃さ、検体２を電気泳動したレーンのバンド濃さ、それぞれのバンド濃さの比率が得られる。例えば検体１と検体２を同一色素（例えばCy3）で標識すると、検体１由来Cy3蛍光強度と検体２由来Cy３蛍光強度、および両蛍光強度比が得られる。測定結果の統計解析は（１）蛍光強度比もしくは（２）検体１由来蛍光強度と検体２由来蛍光強度を用いて行う。
表３９に2種類の検体を用いた実験結果を（１）の蛍光強度比に基づいて解析した例を示す。表３９は左列から、遺伝子名（Unigeneのシンボル名）、蛍光強度比の平均値、標準偏差、CV値（標準偏差／平均値）である。表３９では検体１を３人の健常人末梢血由来CD3プラス細胞（Ｔ細胞）、検体２を３人の健常人末梢血由来CD3マイナス細胞（Ｔ細胞以外のリンパ球細胞）とし、検体１と検体２とで発現状態の蛍光強度比が３倍以上異なる遺伝子群を平均値順に掲載した。表３９は遺伝子数が数千のDNAチップを用いた結果であるので、表３９以外にも数千個の遺伝子について同様の値があり、平均値の昇順もしくは降順に一意に並べることができる。尚、蛍光強度比は、表３９（１）ではＣＤ３マイナス細胞／ＣＤプラス細胞を、表３９（２）ではＣＤプラス細胞／ＣＤマイナス細胞を表している。新しく作成するDNAチップでは、数千個の遺伝子全てもしくは一部を、蛍光強度比の平均値の昇順もしくは降順に、DNAチップの固定化基板に各遺伝子プローブを配置することができる。例えば蛍光強度比が２倍以上であった、すなわち検体１と検体２の遺伝子発現の差が２倍以上あった遺伝子を数千個の遺伝子から選択して、プローブ配置を行うことができる。
【０００９】
【表３９】
0003694674.tif 000003
図５に配置規則の例を示す。図５では、色の濃さが蛍光強度比の平均値の大きさに比例している。図５（１）はDNAチップ基板の角を起点として対角線方向に順に配置する例である。図５（２）はDNAチップ基板の中央を起点として同心円上に配置する例である。図６は１枚のDNAチップ基板上に図５の配置を複数並べた例である。図６（１）は図５（１）を４つ並べた様子を、図６（２）は図５（２）を４つ並べた様子を示す。図６は、１．で記したバイオインフォマティックスを用いて機能による分類を行った後に、最終配置を実験結果にもとづいて行う場合に相当する。
表４０に表３９と同一の２種類の検体を用いた実験結果を（２）の検体１由来蛍光強度と検体２由来蛍光強度に基づいて解析した例を示す。表４０は左列から、遺伝子名（Ｕｎｉｇｅｎｅのシンボル名）、ｔ検定により得られた統計値であるｔ値、ｔ値から得られた有意確率Ｐ値である。有意確率Ｐ値について昇順に、0.003以下の遺伝子群を掲載した。表４０は遺伝子数が数千のＤＮＡチップを用いた結果であるので、表４０以外にも数千個の遺伝子について同様の値があり、ｔ値もしくはｐ値の昇順もしくは降順に一意に並べることができる。新しく作成するＤＮＡチップは、数千個の遺伝子全てもしくは一部を、ｔ値もしくはｐ値の昇順もしくは降順に、ＤＮＡチップの固定基板に各遺伝子プローブを配置することができる。ｔ検定以外に、例えば順位和検定などの他の検定方法を用いて得られる他の統計値を用いても同様のことができるので、その統計量を用いて各遺伝子プローブをＤＮＡチップの固定基板上に配置してもよい。
【００１０】
【表４０】
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また、新しく作成するDNAチップでは、数千個の遺伝子全てもしくは一部を、ｔ値の昇順もしくは降順に、DNAチップの固定化基板に各遺伝子プローブを配置することができる。例えば有意確率ｐ値が０．２以下であった、すなわち検体１と検体２の遺伝子発現の差がゼロであったと仮定して場合、その仮定が誤りである確率が２０％の遺伝子を数千個の遺伝子から選択して、プローブ配置を行うことができる。FDDの結果からも表３９や表４０と全く同様な手順で、プローブ配置を決定することができる。また統計解析以外でも機械学習の分野で有名なサポートベクターマシン（SVM）アルゴリズムにより、各遺伝子に対応する重み行列の要素（ｗi）を求め、ｗi昇順もしくはwi降順にプローブ位置を決定してもよい。また統計解析、機械学習以外でも、実験結果に基づき各遺伝子を順位付ける方法があれば、それらの方法を用いても同様にプローブ配置を決定することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
さてストレスがどのような影響を生体に及ぼすかについては、神経系、免疫系、内分泌系に関連する数多くの遺伝子が関与すると考えられるが、その詳細は明らかでなかった。そこで、数多くの遺伝子/ＥＳＴをプローブとするアレイを作り、ストレスによる遺伝子発現プロファイルの変化をヒト末梢血サンプルについて調べ、ストレス負荷量の増加とともに発現量が大きく変化する遺伝子をリストアップすることとした。アレイのプローブとして１５０００種類の遺伝子/ＥＳＴをＩＭＡＧＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍより購入しスクリーニング用ＤＮＡプローブアレイを作製した。代表的なストレス刺激として、運動ストレスと胃潰瘍ストレスを選択した。
運動ストレスについては、被検査者が自転車エルゴメーターを用いて、個人の最大酸素摂取量（ＶＯ２ＭＡＸ、単位時間あたりに血中に摂取できる酸素の最大値）を１００％とした場合の相対値で８０％（８０％ＶＯ２ＭＡＸ）程度の負荷を６０分継続して与えた。実測された被検査者の場合、この８０％ＶＯ２ＭＡＸは、自転車エルゴメーター強度で、約１８０ワットに相当した。運動時の脈拍数は、１５０〜１７５拍／分であった。なお乳酸性作業閾値（ＬＴ；ｌａｃｔａｔｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）は約６０％ＶＯ２ＭＡＸ、心拍数で１１０〜１３０拍／分付近に相当するので、８０％ＶＯ２ＭＡＸで６０分という運動負荷は、運動ストレスを負荷する場合に十分な強度を有すると考えられた。運動終了から５分以内に末梢血を５０ｃｃ採血し、白血球からメッセンジャーＲＮＡを抽出して、所定の方法により逆転写反応を行いｃＤＮＡ合成した。逆転写反応の際、蛍光色素Ｃｙ−５で標識されたｄＣＴＰを用いて蛍光標識したｃＤＮＡを合成した（標識化ｃＤＮＡ：運動ストレス負荷）。一方、運動ストレス負荷前に、予め同一被検査者から、末梢血を５０ｃｃ採血しておき、同一手順によりメッセンジャーＲＮＡを抽出し、Ｃｙ−３で標識されたｄＣＴＰを用いて逆転写反応を行いCＤＮＡ合成した（標識化CＤＮＡ：コントロール）。
運動ストレス負荷とコントロールのそれぞれの標識化CＤＮＡを等量混合し、前記スクリーニング用ＤＮＡプローブアレイにかけて所定の条件下でハイブリダイゼーションを行い、洗浄後レーザースキャナで各スポットの蛍光強度を測定して、運動ストレス負荷とコントロール間の発現遺伝子の種類、量を評価した。両者の発現量を比較して２倍以上その発現量が変化した遺伝子を、表１に示した。なお、表1に示した発現量の増加量は、種々の刺激を加えても発現量が一定していると考えられるβアクチン、ＨＰＲＴ，ＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子の発現量が一定であるとして規格化している。
【００１２】
【表１】
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運動ストレスにより、バゾプレッシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ、ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）などの視床下部−下垂体後葉系のホルモン関連遺伝子、副腎皮質刺激ホルモン（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＡＣＴＨ）受容体遺伝子、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ；Ｃｏｒｔｉｓｏｌ）関連遺伝子の発現量増加が見られた。また、モノアミンオキシダーゼ（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）などのカテコールアミン関連遺伝子の発現量増加が見られた。また、インターロイキン６（ＩＬ６）などのサイトカイン遺伝子、ＮＦ−κＢなどの転写因子、熱ショック蛋白質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種であるＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０の発現増加も観察された。加えて、Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅの減少といったプロトンポンプ遺伝子の変化、ＧＡＤＤ３４といったアポトーシス関連遺伝子の発現増加が見られた。
胃潰瘍ストレスについては、胃潰瘍の患者から採取した末梢血５０ｃｃからメッセンジャーＲＮＡを抽出して、所定の方法により逆転写反応を行いCＤＮＡ合成した。逆転写反応の際、蛍光色素Ｃｙ−５で標識されたｄＣＴＰを用いて蛍光標識したCＤＮＡを合成した（標識化CＤＮＡ：胃潰瘍ストレス）。一方、胃潰瘍を罹患していない健常な被検査者から、末梢血を５０ｃｃ採血し、同一手順によりメッセンジャーＲＮＡを抽出し、Ｃｙ−３で標識されたｄＣＴＰを用いて逆転写反応を行いCＤＮＡ合成した（標識化CＤＮＡ：コントロール）。
胃潰瘍ストレスとコントロールのそれぞれの標識化CＤＮＡを等量混合し、前記スクリーニング用ＤＮＡプローブアレイにかけて所定の条件下でハイブリダイゼーションを行い、洗浄後レーザースキャナで各スポットの蛍光強度を測定して、胃潰瘍ストレスとコントロール間の発現遺伝子の種類、量を評価した。両者の発現量を比較して２倍以上その発現量が変化した遺伝子を、表２に示した。なお、表２に示した発現量の増加量は、種々の刺激を加えても発現量が一定していると考えられるβアクチン、ＨＰＲＴ，ＧＡＰＤＨなどのハウスキーピング遺伝子の発現量が一定であるとして規格化している。
【００１３】
【表２】
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胃潰瘍ストレスにより、ＣＲＨなどの視床下部−下垂体前葉系のホルモン関連遺伝子、ＡＣＴＨ、グルココルチコイド関連遺伝子の発現量増加が見られた。その一方、バソプレッシンなどの視床下部−下垂体後葉系の発現量の変化はあまり見られなかった。そして、運動ストレスと同様にＩＬ６などのサイトカイン遺伝子、熱ショック蛋白質の一種であるＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０の発現増加も観察された。また、信号伝達遺伝子であるＥＲＫ６や転写因子であるＪＵＮの発現増加が見られた。そしてプロスタグランジンといった抗炎症関連遺伝子の発現増加も見られた。
運動ストレスと胃潰瘍ストレスのいずれかにおいて、２倍以上発現量が変化した遺伝子の中に視床下部−下垂体系ホルモン（ＣＲＨ、バソプレッシン、オキシトシン）や、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）や副腎皮質ホルモン（グルココルチコイド）の関連遺伝子が含まれているのは、視床下部が興奮した結果、下垂体、副腎皮質などが活性化されたことを反映している。この視床下部−下垂体−副腎皮質系（Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）を以後、ＨＰＡ系とよぶ。またカテコールアミン関連の遺伝子が含まれているのは、視床下部−交感神経−副腎髄質系（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ  Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌａｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：以後、ＳＡＭ系とよぶ）が活性化されたことを反映している。更に、これらＨＰＡ系、ＳＡＭ系の内分泌系により産生されたホルモンが血液中に分泌され、血球上のホルモン受容体と結合することにより、Ｇ蛋白質やアデニレートシクレース、ＮＦ−κＢなどといった、細胞内の信号伝達関連遺伝子の発現増加が生じ、最終的にサイトカイン遺伝子の発現が起こったと理解される。そして、細胞レベルのストレス反応の一環として、熱ショック蛋白質などのストレス蛋白質発現量の増加が起こったと理解される。また副腎皮質ホルモン（グルココルチコイド）によりグルココルチコイド受容体が活性化したことで、カルシウム経路のアポトーシスが誘導されたと理解される。まったく異なる２つのストレス刺激において、類似の遺伝子群の発現が変化したことは、これら一群の遺伝子発現強度の変化を観察すれば、複雑系であるストレス反応を解析する際に有用であることを示唆する。すなわち、ストレスの程度を解析するには、（１）校正用内部・外部標準遺伝子、（２）ＨＳＰなどのストレス耐性・生存に関与する遺伝子とホルモン遺伝子、（３）サイトカイン遺伝子、（４）細胞死を誘導する機能を有する遺伝子、（５）グルココルチコイドなどの抗炎症に関与する遺伝子や増殖抑制遺伝子、（６）免疫応答に関与する転写因子やシグナル分子、（７）細胞障害を引き起こすサイトカインの誘導にかかわる転写因子やシグナル分子、（８）増殖抑制にかかわる転写因子やシグナル分子、（９）ストレス耐性にかかわる転写因子やシグナル分
子などの遺伝子を、それぞれ必要最小限、固定化したＤＮＡアレイが最も適している。
また前記（１）から（９）の分類ごとに支持体上のプローブ固定化領域を分けることで、測定者が目視により測定結果をパターン認識できる。もしプローブ固定化領域を遺伝子の機能ごとに分けなければ、蛍光信号取得後に、コンピュータ等を用いたスポットの並び替え、数値プロット、グラフ表示などの結果表示工程が必要となる。それに対して、予めプローブ遺伝子をその機能により分類しその分類に従って基板上に配置しておくことで、蛍光信号を取得してそのまま画面表示することのみにより、測定者は瞬時にストレスの程度を判定できるので、装置構成の単純化、低コスト化をより容易に達成できる。校正作業は、例えば複数のアレイを作成した際の製造ばらつきをなくすために必要である。校正用のオリゴヌクレオチドを、校正用内部・外部標準遺伝子と呼ぶ。校正用内部標準遺伝子とは、例えばハウスキーピング遺伝子のことである。ハウスキーピング遺伝子は、細胞の生存に必要な構成タンパク質やエネルギー代謝系の酵素などをコードしている遺伝子であり、分化の異なるどのような細胞でも発現していると考えられる遺伝子である。例えば、βアクチン、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、αチューブリン、トランスフェリン受容体、ユビキチンなどである。白血球等の被検査者サンプルに予め含まれているので、校正の際、内部標準となる。なお内部標準とは、外部から加えなくても予めサンプル中に存在しており、校正の際に標準となるものである。校正用外部標準遺伝子とは例えば、ヒトには存在しない、植物、微生物、昆虫などの遺伝子配列のことである。例えばシロイヌナズナ遺伝子、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、ファイアフライルシフェラーゼ（Ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子などである。白血球等の被検査者サンプルには含まれていないので、測定時に外部から、既知濃度の外部標準遺伝子を加えることで、校正の際、外部標準となる。なお外部標準とは、予めサンプル中に存在していないので、外部から別途加えることで校正の際に標準となるものである。
ストレス耐性遺伝子は、熱ショックなどの物理的、環境的要因によるストレス負荷時に誘導されてくるタンパク質である。例えば、ストレス蛋白質の一種であるＨＳＰは細胞を高温にさらすことで発現される。このＨＳＰは、高温暴露という外部刺激だけでなく、細胞に変性蛋白質を直接注入する方法によっても発現増加する（Ａｎａｔｈａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓｓｅｒｖｅｓ  ａｓ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌｓａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２，２５２−２５４，１９８６）。つまりＨＳＰは神経系、内分泌系、免疫系などの生体システムによらず細胞内に生じる変化により発現する蛋白質である。またＨＳＰの一種、ＨＳＰ７０はプログラム細胞死とよばれるアポトーシスを抑制する働きを有することが知られている（Ｍｏｓｓｅｒ，Ｄ．Ｄ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｓｐ７０  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７，５３１７−５３２７，１９９７）。アポトーシスはウイルス感染、酸化ストレス、放射線、抗がん剤などにさらされた細胞で出現する細胞死の形態である。過剰なストレスが細胞にかかることでアポトーシスが誘導されるが、ＨＳＰ７０は細胞にストレス耐性を持たせ、細胞死を抑制する働きがある。ＨＳＰが発現した細胞では、引き続き直接の原因となったストレスに加え、他のストレスに対しても抵抗性を示す（交叉抵抗性）ことから、ＨＳＰは細胞自体が有するストレス反応処理機構であると考えられる。細胞レベルのストレスの程度を評価するにはストレス蛋白質の発現増加、発現抑制の程度を知ることが極めて有用である。ストレス蛋白質だけでも３０種類以上が知られているので、本発明のオリゴヌクレオチドアレイでも、少なくともストレスタンパク質を含め、オリゴプローブを約３０種類以上固定化することが望ましい。ストレスタンパク質には、例えばＨＳＰ２７（Ｓｍａｌｌ  ＨＳＰ）、ＨＳＰ４０（Ｈｄｊ１）、ＨＳＰ４７、ＨＳＰ６０／ＨＳＰ１０，ＨＳＣ７０、ＨＳＰ７０．ｍｔＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０．ＨＳＰ１００（ＧＲＰ９５）、ＨＳＰ１５０（ＯＲＰ１５０）、Ｂｉｐ（ＧＲＰ７８）．ＴＲｉＣなどがある。
細胞の生存に関与する遺伝子は、ストレスタンパク質のほかに、例えば細胞周期の調節を司るサイクリン(ｃｙｃｌｉｎ)とサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ、Ｃｙｃｌｉｎ―Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ）、ＣＤＫ阻害因子(ＣＫＩ,ＣＤＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)、例えばサイクリンＡ, サイクリンＢ, サイクリンＤ, サイクリンＥ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、などが挙げられる。
ホルモンとは内分泌腺などで産生され、血液中に分泌されて標的器官まで運ばれ、微量でも特異的な生理作用を発揮する有機化合物を意味する。代表的な内分泌系として（ａ）ＨＰＡ系、（ｂ）ＳＡＭ系、（ｃ）自律神経―膵内分泌系、（ｄ）視床下部―交感神経―レニン・アンギオテンシン系、（ｅ）視床下部―下垂体後葉系、（ｆ）オピオイドペプチド系がある。ホルモン関連遺伝子は、例えば、バソプレッシン（ＡＶＰ）、バソプレッシン受容体（ＡＶＰＲ）、ＣＲＨ，ＣＲＨ受容体（ＣＲＨＲ）、ＭＣ２Ｒ、ＲＥＮ、ＴＨ、ＴＳＨＢ，ＴＳＨＲなどがある。
サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）は血球細胞が細胞の増殖と分化を誘導する因子として分泌する生理活性ペプチドの総称である。サイトカインはホルモンと比較して分泌された近傍で働く点、その血中濃度はホルモンに匹敵するかもしくはそれ以下の低濃度である点が異なる。主なサイトカインとして、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ，  ｍａｃｒｏｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、幹細胞因子（ＳＣＦ，  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ，  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）が挙げられる。
ストレスにより細胞死を誘導する機能を有する遺伝子のほとんどはアポトーシス関連遺伝子であると考えられる。なぜなら生体においておこる細胞死はほとんどがアポトーシスと呼ばれる細胞死であるためである。アポトーシスの起こる経路には、カルシウム経路、死のシグナル経路、セラミド経路、ミトコンドリア経路、ＤＮＡ障害経路がある。カルシウム経路は、ホスファジルイノシトール３リン酸レセプター、カルモジュリン、ＡＬＧ２，カルパインなどの遺伝子が関与する。死のシグナル経路は、ＴＮＦα、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＤＤ，  ＦＡＤＤ，ＲＡＩＤＤ  ＦＡＤＤ，  ＲＩＰ，  ＲＡＩＤＤ、 ＣＡＳＰ８，ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ３、ＴＲＡＭＰ，  ＴＲＡＩＬなどが関与していることが知られている。セラミド経路には、ＳＡＰＫ（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）／ＪＮＫ（Ｊｕｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｎ  ｋｉｎａｓｅ）が関与している。ミトコンドリア経路は、Ｂａｘ２（Ｂｃｌ−２  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｂｃｌ−２，  Ｂｃｌ−ｘＬ、カスパーゼ遺伝子が関与している。ＤＮＡ障害経路では、ｐ５３、ｐ２１、ｐ５１、ｐ７３、ＭＤＭ２遺伝子等が関与している。
グルココルチコイドなどの抗炎症に関与する遺伝子や増殖抑制遺伝子として、シトクロムＰ４５０遺伝子１１Ｂ１（ＣＹＰ１１Ｂ１）、ＣＹＰ１１Ｂ２，ＣＹＰ１７，ＣＹＰ２１Ａ２、グルココルチコイド調節因子結合タンパク質（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＭＥＢ）、グルココルチコイド抑制因子（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＧＲＬＦ）、ミオシリン（ｍｙｏｃｉｌｉｎ：ＭＹＯＣ）、グルココルチコイド受容体α（ＮＲ３Ｃ１）、プロオピオメラノコルチン（ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ；ＰＯＭＣ）、プロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｇ/Ｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）などがある。
免疫応答、サイトカイン誘導、増殖抑制、ストレス耐性に関与する転写因子やシグナル分子には例えば、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ転写因子、ＮＦκＢ転写因子、ＪＵＮ遺伝子、１４−３−３ｎ遺伝子などがある。また多くの信号伝達では、タンパク質がリン酸化という化学的な変化を受けることで活性化し、これが隣接する別のタンパク質をリン酸化するという反応が次々とおこることで信号が伝わっていくという機構が一般的である。信号伝達経路をパスウエイと呼び、経路上の代表的なタンパク質の名前を付けて区別することが一般的である（命名方法はｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍを参照した）。たとえば、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ＡＴＭ（ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ）、ＢＣＲ（Ｂ  ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体関連）、ＣＸＣＲ４（ケモカイン受容体関連）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、  ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ−ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、  ＦｃＥｐｓｉｌｏｎ（Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ    ＩｇＥ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）ａｌｐｈａ、ＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）ｇａｍｍａ、ＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１）、ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−２、−３、−４、−５、−６、−１８、ＮＦκＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  κＢ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ｐ５３、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、  ＰＬＣ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ）、  ＳＯＤＤ（ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎｓ）、  ＴＣＲ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＴＧＦβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）、ＴＮＦＲ１（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）、  ＴＮＦＲ２（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）、ＴＰＯ（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、  Ｗｎｔ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ／ｉｎｔ−１）が知られている（たとえばｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍ）。これらのパスウエイ上のキーとなるタンパク質をコードする遺伝子をアレイ上にプローブとして載せることにより、ストレス刺激により誘導される信号伝達経路を同定することができる。特に、信号伝達経路上の１つのタンパク質機能に障害があることが原因で慢性ストレス症候群に罹患している場合には、信号伝達がどこで中断したのかを明らかにすることで、治療方針を決定することができる。
さらに、ストレスの有無を一目で理解できるようにオリゴヌクレオチド群を配置したDNAチップの他の例を示す。本実施例は、実験結果に基づいて遺伝子群の配置を行った例の１つである。
試験において過度の緊張を覚えた者１名（患者A）と、同一の試験を受験したがそれほどの緊張を覚えなかった者5名（コントロールA,B,C,D,E）から、試験前１週間と試験後５時間後にそれぞれ末梢血を１０ｃｃ採取し、それぞれのリンパ球からトータルRNAを採取した。過度の緊張を覚えた患者Aとその他のコントロール５名は専門医のインタビューテストによっても、ストレスの程度が有意に異なっていた。過度の緊張を覚えなかった5名についてはインタビューテストによって、ストレス状態でないことが確かめられている。なお、数千個の遺伝子が搭載されたDNAチップ実験で、コントロールAからEの試験前1週間と試験後５時間の発現状態を比較したところ、コントロールAからEの試験前と試験後の発現状態の差は小さかった。試験前の蛍光強度と試験後の蛍光強度との相関値（R２乗値）は、０．９４〜０．９７であった。コントロールAのスキュッタープロットを図１０（１）に示す。ちなみに同一のサンプル同士の相関は０．９９なので、この０．９４〜０．９７という値は、試験前と試験後の発現状態変化がそれほど大きくないことを示す。数千個の遺伝子に対し、コントロールAからコントロールEの５人の蛍光強度比の平均値を求め、昇順に並べた。そしてチップ基板上の右上隅から左下隅に向かって、図１１の規則に従って遺伝子プローブを配置した。図１１の各四角は、遺伝子プローブの固定化される位置で、四角内の数字は１から順に蛍光強度比（Cy5／Cy3比）が大きい遺伝子を、図１１の矢印の順に配置することを示している。この図１１の配置では、図の右上にCy5／Cy３比が大きい遺伝子が、図の左下にＣｙ3／Ｃy５比が大きい遺伝子が集中して固定化されることになる。コントロールAからコントロールEの５人のRNAを図１１のDNAチップで測定して得られたパターンを図１２に示す。図１２では、遺伝子発現変化の大きい遺伝子、すなわちＣｙ５／Ｃｙ３比もしくはＣｙ３／Ｃｙ５比が大きい遺伝子ほど濃い色で示してある。図１２の（１）から（５）がそれぞれコントロールAからEのパターンを示している。５名とも、右上と左下が濃い色で、その中間が薄い色という、ほぼ同様のパターンを示していることが分かる。一方、患者Aを図１１のDNAチップで測定して得られたパターンを図１３に示す。図１３は右上と左下に濃い色が少なく、明らかに異なるパターンであることが一目で分かる。患者Aの試験前の蛍光強度と試験後の蛍光強度との相関値（R２乗値）は、０．８８（図１０（２）参照）で、コントロールの5名とは明らかに異なり、図１２と図１３に示したパターンの相違として観察された。
上記の遺伝子の配列を持つオリゴヌクレオチドをプローブとしてアレイ上に載せるためには、遺伝子配列のどの部分の配列をプローブとするかを決める必要がある。その際考慮しなければならないのが、融解温度(Ｔｍ, ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ)とクロスハイブリダイゼーションである。ＤＮＡアレイ上に固定化された各ＤＮＡ断片と試料由来ＤＮＡ断片間での、ハイブリダーゼーションを高精度（ないしは高ストリンジェント、ｈｉｇｈｌｙ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）に行うためには、ハイブリダイゼーション温度(Ｔｈ, ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ)と固定化ＤＮＡ断片のＴｍの関係が重要であり、固定化ＤＮＡ断片の融解温度とハイブリダイゼーション温度との差異が３０℃を超えないことが必要である。また、クロスハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ配列同士のホモロジーが高いために生じるので、クロスハイブリダイゼーションを防ぐためには、固定化ＤＮＡ断片と、試料由来のＤＮＡ断片のうち固定化ＤＮＡ断片と本来ハイブリダイズしないＤＮＡ断片との相同性が十分低いことが必要である。さらには、ミニヘアピン構造をとるような配列や、ヒト遺伝子の場合にＡｌｕ配列として知られているような繰り返し配列と相同性が有意に高い部分が含まれないことが望ましい。また、１枚のアレイ上に固定化する遺伝子配列同士のホモロジーを計算するのみならず、ＤＮＡ配列とＧＥＮＢＡＮＫ等の対象となる生物種の遺伝子配列とのホモロジーを計算する必要もある。ＤＮＡアレイ上に固定化するＤＮＡ断片候補の配列と、測定対象試料に含まれている可能性のある遺伝子群のＤＮＡ配列とを比較して、ホモロジーが有意に高いＤＮＡ配列は、固定化ＤＮＡ断片としては選択しないことが望ましい。
プローブとして固定化するＤＮＡ断片は、市販のCＤＮＡライブラリをテンプレートしてＰＣＲ反応により合成することができる。これを所定の濃度（０．１−１．０μG/μL）になるよう調整し、スポッターを用いて、あらかじめポリリジンあるいはアミノシランをコートしたスライドガラス上にスポットすることでオリゴヌクレオチドアレイを作製できる。
上記オリゴヌクレオチドアレイを用いてストレスの程度を調べるには、以下の手順で行うことができる。まず予め、ストレス症状が見られないボランティア数名のおのおのから末梢血を採取し、白血球細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出する。例えば、複数名のメッセンジャーＲＮＡを混合することで、健常人の平均的なメッセンジャーＲＮＡのプールができる。このメッセンジャーＲＮＡのプールのことを、本願明細書の以下の記述では、ユニバーサルコントロール（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）と記載する。次に被検査者の末梢血を採血し、白血球細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出する。オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により被検査者末梢血のメッセンジャーＲＮＡについては、Cｙ５−ｄＣＴＰを用いて標識化ｃＤＮＡを合成する。またユニバーサルコントロールのメッセンジャーＲＮＡについては、Cｙ３−ｄＣＴＰを用いて標識化ｃＤＮＡを合成する。被検査者ｃＤＮＡ（Cｙ５標識）とユニバーサルコントロールｃＤＮＡ （Cｙ３標識）を混合して同一の前記オリゴヌクレオチドアレイにかけ、所定の温度、時間の間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション温度は４５−７０℃、ハイブリダイゼーション時間は６−１８時間が好ましい。ハイブリダイゼーション後、蛍光スキャナーにより各遺伝子をスポットした箇所のCｙ５とCｙ３のそれぞれの蛍光強度を比較し、両者での発現量の差を求めることができる。なお、白血球のなかで３〜７％を占める単球のみからメッセンジャーＲＮＡを取り出すか、もしくは白血球のなかで２５〜３３％を占めるリンパ球のみからメッセンジャーＲＮＡを取り出すことで、よりストレスの程度を反映した解析ができると期待される。なぜなら単球はマクロファージという自然免疫系の重要細胞へ、リンパ球はＴ細胞、Ｂ細胞という獲得免疫系の重要細胞へと分化する能力を有するためである。さらに、これらの白血球は、骨髄での成熟、末梢血での滞留時間、寿命などの細胞回転（動態）が異なるため、多形核白血球（好中球；NEUTROPHIL）を用いた急性期の生体応答、単球を用いた短期間の反応、および、リンパ球を用いた比較的長期間の生体応答を区別して評価できる可能性がある。
本発明を用いて、1被検査者の日常生活におけるストレスの程度の変化を調べた例を記す。（１）校正用内部・外部遺伝子、（２）ＨＳＰなどのストレス耐性・生存に関与する遺伝子とホルモン遺伝子、（３）サイトカイン遺伝子、（４）細胞死を誘導する機能を有する遺伝子、（５）グルココルチコイドなどの抗炎症に関与する遺伝子や増殖抑制遺伝子、（６）免疫応答に関与する転写因子やシグナル分子、（７）細胞障害を引き起こすサイトカインの誘導にかかわる転写因子やシグナル分子、（８）増殖抑制にかかわる転写因子やシグナル分子、（９）ストレス耐性にかかわる転写因子やシグナル分子などをコードする７９３種類の遺伝子（表３乃至表３８）を、前章「課題を解決するための手段」に記載した根拠にもとづき、キーワード検索などで、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＵｎｉＧｅｎｅより選定した。
【００１４】
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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次に、１．遺伝子配列ファイルの読み込み工程、２．塩濃度・ハイブリダイゼーション等の実験条件の入力工程、３．固定化ＤＮＡ断片の長さ範囲の入力工程、４．  固定化ＤＮＡ断片の融解温度を計算し、その融解温度がある一定の範囲を外れているＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程、５．  特異な高次構造をとる短配列や短繰り返し配列のあるＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程、６．Ａｌｕ配列などの反復配列とのホモロジーの高いＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程、７．他遺伝子配列とのホモロジーの高いＤＮＡ断片を候補リストから除外する工程等からなるアルゴリズムに従って、特異性が高く、Ｔｍが揃ったオリゴヌクレオチドプローブ７９３本を設計した。設計した７９３の配列をオリゴヌクレオチド合成装置で一本ずつ合成した。それら７９３種類のヒト遺伝子プローブと、３種類のヒトに存在しないオリゴヌクレオチド配列（ラムダＤＮＡ、ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ）を校正用外部標準遺伝子として加えた７９６種類のオリゴヌクレオチドを以下に開示する方法でガラス基板上に固定化した。
まず、市販のスライドガラス（Ｇｏｌｄ  Ｓｅａｌ  Ｂｒａｎｄ社製）をアルカリ溶液（水酸化ナトリウム；５０ｇ、蒸留水；１５０ｍｌ、９５％エタノ−ル；２００ｍｌ）に室温で２時間浸した。その後、スライドガラスを蒸留水中に移し３回リンスしてアルカリ溶液を完全に除去した。続いて、洗浄したスライドガラスを１０％のポリ−Ｌ−リジン（シグマ社製）水溶液に１時間浸した後、スライドガラスを引き出しマイクロタイタ−プレ−ト用遠心機を用いて５００ｒ．ｐ．ｍ．で１分間遠心してポリ−Ｌ−リジン水溶液を除去した。次に、スライドガラスを吸引式恒温機に入れ、４０℃で５分間乾燥させスライドガラス上にアミノ基を導入した。さらに、アミノ基が導入されたスライドガラスを１ｍＭのＧＭＢＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）ジメチルスルホキシド溶液に２時間浸した後、スライドガラスをジメチルスルホキシドで洗浄してスライドガラス表面にマレイミド基を導入した。そしてＤＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いてチオ−ル基が導入されたオリゴヌクレオチドを合成した後、高速液体クロマトグラフィでオリゴヌクレオチドを精製した。次に、合成・精製された濃度２μＭのオリゴヌクレオチド１μｌとＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ，−２−エタンスルホン酸；１０ｍＭ、ｐＨ６．５）４μｌと添加剤（エチレングリコ−ル）５μｌを混合してスポッティング溶液を作成した。調整されたスポッティング溶液をスポッタ（日立ソフト社製  ＳＰＢＩＯ  ２０００）を用いてスライドガラス上の任意の点にスポッティングした後、スライドガラスを室温で２時間放置してスライドガラス上にオリゴヌクレオチドを固定化した。
その際、ＤＮＡアレイの測定結果を測定者が目視により瞬時に理解し判定できることを意図して、図１もしくは図２に開示した配置でプローブを固定化した。プローブ配置は前記（１）から（９）の遺伝子分類に基づいて行った。
３日徹夜した直後の被検査者から末梢血を５０ｃｃ採取し、直ちに白血球細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出して、−８０℃で保存した。１週間十分休養をとった後の同被検査者から５０ｃｃ末梢血を採取し、同一の方法でメッセンジャーＲＮＡを抽出した。徹夜直後のメッセンジャーＲＮＡをＣｙ５−ｄＣＴＰを用いた逆転写反応によりＣｙ５で標識したCＤＮＡを合成した。十分休養をとった後のメッセンジャーＲＮＡをＣｙ３-ｄＣＴＰを用いた逆転写反応によりＣｙ３で標識したCＤＮＡを合成した。
Ｃｙ５標識CＤＮＡとＣｙ３標識CＤＮＡを等量混合した後、前記オリゴヌクレオチドアレイにかけハイブリダイゼーションを６２℃、１２時間行った。洗浄後スキャナー（ＧＳＩ−Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００）により各スポットの蛍光強度を測定した。測定後の画像を図３に示す。なおプローブ固定化配置は図２のように行った。Ｃｙ５蛍光強度/Ｃｙ３蛍光強度（徹夜/休養）の値が大きいほど、図３では黒が濃く表示されている。睡眠不足により免疫強度が低下することが経験上知られているが、図３によると、図２で示した炎症に関する遺伝子の多くと、細胞死に関する遺伝子が発現していることがわかる。３日徹夜をすることで、急性疲労の状態となり免疫系の遺伝子発現が起こったり、アポトーシスが生じたりしたものと考えられる。またストレス応答の一環としてＨＳＰなどのストレス耐性遺伝子の発現増加も一部見られる。
ストレス以外の疾患に関わる遺伝子群について
ストレス以外にも、ヒトがんの発生、浸潤、転移の要となる遺伝子、例えば、がん遺伝子、がん抑制遺伝子、増殖因子、転写因子、サイトカイン、アポトーシス、細胞周期調節、ＤＮＡ修復遺伝子等を固定化したDNAチップを用いたがんの診断を行うことができる。中でも、がん遺伝子群とハイブリダイズするプローブ群と、がん抑制遺伝子の転写産物とハイブリダイズするプローブ群をそれぞれ、支持体の対極に位置させることで、がん遺伝子とがん抑制遺伝子との相互関係の直感的理解を容易にすることができる。
評価方法
RNAを標識してｃDNAにする方法
細胞や組織から抽出されたトータルRNAもしくはメッセンジャーRNAに対し、オリゴｄTプライマーなどのプライマーを起点に、逆転写酵素を用いた逆転写反応によりｃDNAを合成する。そのｃDNA合成の際に、例えばCy3-ｄCTP、Cy3-dUTP、Cy５-ｄCTP、Cy５-dUTPなどの蛍光物質を結合させたデオキシヌクレオチドを溶液に加えておくことで、蛍光標識がｃDNAに取り込まれる。この蛍光標識を取り込んだｃDNAを、DNAチップ基板に固定化されたプローブとハイブリダイズさせることで、各遺伝子のRNA量の分布を蛍光量により測定することができる。
細胞や組織から抽出されたトータルRNAもしくはメッセンジャーRNAが少量の場合は、ＲＮＡ増幅法を用いて標識を行う。増幅法としては、例えばＴ７もしくはＳＰ３ポリメラーゼ酵素反応を用いたＴ７もしくはＳＰ３増幅法を用いる。Ｔ７増幅法の場合、Ｔ７配列とＴ塩基が数十個ならんだ配列をもつＴ７ｄＴプライマーを逆転写反応の際の起点とする。逆転写反応の結果合成されたｃＤＮＡの末端にはＴ７配列がついている。このＴ７配列を認識してｃＤＮＡに相補なＲＮＡを合成するのが、Ｔ７を用いたインビトロ転写反応である。このインビトロ転写反応により、数十倍から数百倍にＲＮＡを増幅することができる。このＲＮＡ増幅法により得られたＲＮＡに対し、前記、RNAを標識にしてｃDNAを作る方法と同様にして蛍光標識を取り込んだｃＤＮＡを合成することができる。この蛍光標識を取り込んだｃDNAを、DNAチップ基板に固定化されたプローブとハイブリダイズさせることで、各遺伝子のRNA量の分布を蛍光量により測定することができる。
チップ製造方法
スポッターを用いてDNAチップ上にオリゴヌクレオチド群を配置する場合、オリゴヌクレオチド群を予め９６穴プレートもしくは３８４穴プレートに格納しておく必要がある。スポッターの設定により９６穴プレートもしくは３８４穴プレートのどの穴が、DNAチップ上のどの座標に配置されるかは異なる。そこで本願明細書のようにDNAチップ上の配置をバイオインフォマティックスもしくは実験結果に基づいて予め決定してある場合、スポッター設定から、９６穴プレートもしくは３８４穴プレートにおけるオリゴヌクレオチド群の格納位置を定めておく必要がある。従来は９６穴プレートにおけるオリゴヌクレオチド群の格納位置によりＤＮＡチップ上のオリゴヌクレオチド群の位置が定められたが、本願明細書では、反対にＤＮＡチップ上のオリゴヌクレオチド群の位置により９６穴プレートにおけるオリゴヌクレオチド群の格納位置が定まる。
表示方法
１．リアル表示
Cy5標識の蛍光強度値とCy３標識の蛍光強度値を、その強度に応じて擬似カラーで表示する。もしくはCy５標識を赤、Cy３標識を緑に擬似カラー表示する。擬似カラー画像に、複数の区画ごとを区切る境界線を重ね合わせた表示を行うこともできる。左右反転、上限反転、回転などの変換を行うことも可能である。蛍光強度に応じた高さを有する棒グラフ表示、棒グラフをプローブ固定化位置にあわせて整列した３次元棒グラフ表示を行うこともできる。
２．バーチャル表示
２つ以上のＤＮＡチップを一枚に表示することができる。例えば、個々のプローブの平均値、ばらつき（標準偏差）の大きさ、あるプローブとその他のプローブの相関係数などを擬似カラーで、相関係数の大きさの順に表示することもできる。表示の際、予めコンピュータに登録されたプローブの位置情報を元に、再配置を行って表示することができる。
ＤＮＡチップ作成キット
完成されたＤＮＡチップとしてではなく、ＤＮＡチップ作成キットとして半製品で提供することもできる。例えば図９のように、ＤＮＡ固定用基板、基本プローブセット、基本プローブセットの配置情報、スポッター、コンピュータなどの一式をキットして提供することができる。半製品として提供することで、キットとして提供されている基本プローブセットに加えて、後から望みのプローブを新たに追加することができる。ユーザーは追加されたプローブ個々にその遺伝子機能分類や発現状態を設定し、コンピュータに入力する。すると、基本プローブセットの配置情報に格納されている遺伝子機能分類、発現状態と新たに追加されたプローブセットの遺伝子機能分類、発現状態とがマージされる。このマージされた遺伝子機能分類、発現状態にもとづき、コンピュータでリアル表示、バーチャル表示を行うことができる。
このように、本発明のアレイを用いることで、ストレスの程度を評価することができる。神経系、内分泌系、免疫系の３者に種々の変化が起こり、かつ相互に密接に関連することで複雑なストレス反応が生じると考えられる。血液中の特定のホルモン量を測定するといった従来法は、例えば内分泌系のみに着目した測定をしているにすぎず、神経系、内分泌系、免疫系の３者の相互作用を無視していた。このため従来法よるストレスの程度の評価は、ホルモン量の個人差が大きいなどの理由から、ストレスの程度と相関関係を得ることが困難であった。この従来法の欠点を鑑み、本発明においては神経系、内分泌系、免疫系のそれぞれの変化のみならず、神経系、内分泌系、免疫系の３者がどのように相互作用しているのかを知ること、とくに三者間の相互作用の強弱（バランス）に着目したことにより本発明を完成するに至った。
【００１５】
【発明の効果】
本発明は、上記ストレス応答に関する検討結果をもとに完成されたものであって、本発明のオリゴヌクレオチドアレイを用いることで、疾患、異常、症状（ストレス）の程度を、個々の遺伝子だけでなく、神経系、内分泌系、免疫系それぞれのバランスの変化に着目して簡便に調べることができる。特に、「生と死」、「炎症と抗炎症」という２つの座標軸を考慮して個々の遺伝子を基板上に配置したことで、直感的な結果の解釈を行えるように配慮した。また、本発明のアレイではあらかじめストレス応答に深くかかわるオリゴヌクレオチドプローブを絞り込んでいるため、アレイのプローブとして用いるオリゴヌクレオチドの種類の数を少なく抑えることができることから、価格低減が可能である。また１つの種類のオリゴヌクレオチドを複数箇所にプローブとして固定すれば、複数箇所の信号強度を平均化することで信頼性を高めることができる。また、遺伝子群の配置の仕方に規則を作ることにより、ある疾患に関連性を持つ遺伝子同士の相関を一目で評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】基板へのプローブＤＮＡ配置例（その１）。
【図２】基板へのプローブＤＮＡ配置例（その２）。
【図３】本発明におけるストレス評価の例。
【図４】ＤＮＡチップの一般的な構造例。
【図５】配置規則の例。
【図６】１枚のＤＮＡチップ基板上に複数配置並べた例。
【図７】遺伝子の相互関係スコアの例。
【図８】遺伝子間パスウェイの例。
【図９】ＤＮＡチップ作成キットの例。
【図１０】（１）コントロールのスキャッタープロット。
（２）患者のスキャッタープロット。
【図１１】配置規則の例。
【図１２】コントロールＡ〜Ｅの蛍光パターン。
【図１３】患者の蛍光パターン。
【図１４】ＤＮＡチップを用いた測定法のフローチャート。
【図１５】バイオインフォマティクスを用いた遺伝子配置法によるＤＮＡチップ作成の概略図。
【図１６】バイオインフォマティクスを用いた遺伝子配置法によるＤＮＡチップ作成のフローチャート。
【図１７】実験結果に基づく遺伝子群配置法によるＤＮＡチップ作成の概略図。
【図１８】実験結果に基づく遺伝子群配置法によるＤＮＡチップ作成のフローチャート。
【符号の説明】
１.基板、２．プローブＤＮＡ固定化領域、１１  ．ハウスキーピング遺伝子プローブＤＮＡ、１２  ．ストレス耐性・生存に関与する遺伝子やホルモンのプローブＤＮＡ、１３  ．炎症・免疫応答・増殖に関与する遺伝子プローブＤＮＡ、１４  ．細胞死を誘導する遺伝子プローブＤＮＡ、１５  ．抗炎症・創傷治癒・増殖抑制に関与する遺伝子プローブＤＮＡ、１６  ．免疫応答に関与する転写因子やシグナル分子のプローブＤＮＡ、１７  ．サイトカインの誘導に関与する転写因子やシグナル分子のプローブＤＮＡ、１８  ．増殖抑制に関与する転写因子やシグナル分子のプローブＤＮＡ、１９  ．ストレス耐性に関与する転写因子やシグナル分子のプローブＤＮＡ、２０．蛍光検出器、２１．ＤＮＡプローブ、２２．蛍光標識された遺伝子、２３．支持体、２４．発現状態によるプローブ配置の一例、２５．遺伝子、２６．相互関係スコア、２７．遺伝子、２８．遺伝子間パスウェイ、２９．試薬、３０．スポッター、３１．スポッター制御コンピュータ、３２．チップ（作成途上）、３３．チップ（完成後）、３４．蛍光検出器、３５．蛍光検出器制御コンピュータ、３６．配置情報ファイル、３７．公共データベース、３８．インハウスデータベース、３９．ネットワーク接続コンピュータ、４０．プローブストック、４１．分注ロボット、４２．スポッティング用プローブ、４６．実験データ、４７．実験データ解析コンピュータ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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