(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
（ＰｎＯ３ｎ＋１）（ｎ＋２）Ｈ〔式中、ｎは１５〜２０００を示す〕で表される、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が含有されてなる新生骨組織形成を促進するための骨再生材料。
【請求項２】
ポリリン酸がポリリン酸塩である請求項１記載の骨再生材料。
【請求項３】
ポリリン酸塩がポリリン酸ナトリウムまたはカリウムである請求項２記載の骨再生材料。
【請求項４】
生体適合性を有する材料からなる基材にポリリン酸が含有されてなる請求項１〜３のいずれかに記載の骨再生材料。
【請求項５】
ポリリン酸が生体適合性を有する材料に０．００１〜２０重量％含有されてなる請求項４記載の骨再生材料。
【請求項６】
生体適合性を有する材料からなる基材が、シート状に形成されてなる請求項１〜５のいずれかに記載の骨再生材料。
【請求項７】
整形外科用充填物にポリリン酸が含有されてなる請求項１または２に記載の骨再生材料。
【請求項８】
ポリリン酸にＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＴＧＦ−β、オステオポンチン及びオステオカルシンから選択される骨誘導蛋白質が混合されてなる請求項１〜７のいずれかに記載の骨再生材料。
【請求項９】
ポリリン酸に動物骨粉砕物及び鉱質消失骨気質から選択される骨誘導因子を含有する天然物質が混合されてなる請求項１〜８記載の骨再生材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新生骨組織形成を促進するための骨再生材料に関し、詳しくはその材料としてポリリン酸が使用されてなる骨再生材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨は、細胞と細胞外マトリックスからなる結合組織由来の特異化された硬化されたもので、骨のマトリックス中の他の結合組織から分化したものである。その主構成物質はヒドロキシアパタイト結晶（Ca10(PO4)6(OH)2)からなる燐酸カルシウムである。骨は、物理的応力を支え、応力から骨を防御する極めて硬い組織であるので、骨折や病理学的変化による骨の減少または損傷は、人の能力欠如を導き時間の浪費になる。現在、何らかの理由により骨が取り除かれたとき、人工骨で接続したり、身体の他の骨を使用して骨の再置換が行われたりしている。
【０００３】
また、物理的衝撃による骨の損傷（骨折）や外科手術に伴う骨の損傷の治療には、人工骨を含む各種の補綴用器具である骨の人工的中継ぎ、骨折箇所の不動化、固定化が行われており、骨が元の形と機能を取り戻すには長い時間を要し、患者の肉体的、精神的ストレスはかなり大きいのが現状である。また治癒に至るまでの課程が長ければ長いほど細菌感染の危険性にさらされる機会が増加し、完全治癒にいたらない危険もある。現在の骨格増大および再建のための選択材料には、セラミックス、複合材料、骨誘導体並びに天然および合成ホリマ−のような骨修復のための人工充填剤として機能することができる種々の材料が研究されている。
【０００４】
歯の場合、口上顎顔面部位中の骨質の骨折や喪失、あるいは病理学的・物理学的な創傷の治療において、歯を支える歯槽骨は歯の置換等で基礎になるものである。歯槽骨は細菌感染を受けやすく、一度感染または死滅させられると元のレベルまで再生しがたい。一般に、チタンを基材とした金属移植片を顎骨に挿入して人工歯を構築する移植は本来の歯の喪失に対しては有益であるが、この移植術は移植の周囲の身体の支持には不十分であり、隣接した骨構造に過度の咬合力を引き起こして、常に成功裏に行われていない。これらの問題を解決する治療法として、組織・骨の再生を促進する方法があり、欠損骨領域中の骨の再生を促進するために脱ミネラル化した骨、ヒドロキシアパタイト、他の移植代用品が使用されたりしているが十分な成果が発現されていない。
【０００５】
理想的な充填剤または移植材料は、生体適合性、滅菌性、骨誘導活性（骨形成に関して間葉細胞を骨芽細胞に表現型変換する刺激）および骨伝導活性（新生骨形成のための格子として作用）のような性質が必要である。また、充填剤は生分解性であり、免疫源性がなく、体組織的に毒性がないのが好ましい。しかし、現実にはこれらの要件を全部満たした材料はなく部分的に満たしたものがあるにすぎない。
【０００６】
【発明が解決しょうとする課題】
本発明の目的は、これら従来の骨治療手段、あるいは代替骨材料の欠点を克服するためになされたものであって、新生骨の形成を促進し、治癒、回復にいたるまでの時間を短縮することができる骨再生材料を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は直鎖縮合ポリリン酸または／およびポリリン酸塩が含有されてなる新生骨組織形成を促進するための骨再生材料である。
また、本発明は前記骨再生材料において、損傷をうけた骨の再生を促進するための材料が、生体適合性を有する材料からなる基材にポリリン酸塩が含有されてなる骨再生材料である。
更に、本発明は前記骨再生材料において、新生骨組織形成を促進するための材料が整形外科用充填物にポリリン酸が含有されてなる骨再生材料である。
更にまた、本発明は前記骨再生材料において、ポリリン酸に骨誘導蛋白質または／および骨誘導因子を含有する天然物質を混合してなる骨再生材料である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ポリリン酸は、オルトリン酸が脱水縮合して得られる直鎖縮合ポリリン酸が挙げられ、特に一般式が（ＰｎＯ３ｎ＋１）（ｎ＋２）Ｈで表され、２個以上のＰＯ４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造をした直鎖縮合ポリリン酸が挙げられる。ポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造をしたものがポリリン酸塩である。金属としてはナトリウム、カリウム等が挙げられる。ｎは１５〜２０００である。
【０００９】
生体適合性を有する材料からなる基材としては、生体適合性を有する合成高分子、天然材料等からなるシ−ト、フイルム、繊維、多孔体等が挙げられる。ポリリン酸は、これらの材料に混合されたり、基材の表面にコ−チングされたり、繊維および多孔体に含浸されたりして使用される。合成高分子としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリカ−ボネ−ト、セルロ−ス、ポリアミド、ポリフッ化エチレン、ポリウレタン等のような生体非吸収高分子、あるいはポリグリコ−ル酸、ポリラクチド、コラ−ゲン、ポリビニルアルコ−ル、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、酢酸ピニルと不飽和カルボン酸共重合体等のような生体吸収性高分子等が挙げられる。これらの生体適合性を有する材料にポリリン酸が含有されてなるが、生体適合性を有する材料に含有されるポリリン酸の含量は、 0.001〜20重量％、好ましくは 0.005〜10重量％、更に好ましくは１〜５重量％である。ポリリン酸の含量が20重量％を超えると、細胞が壊死する傾向があり、 0.001重量％未満であると、骨再生効果が少ない。
【００１０】
また、整形外科用充填物は、整形外科領域で骨充填剤として使用されている人工骨成分であって、ヒドロキシアパタイト、第２リン酸カルシウム、第３リン酸カルシウム、第４リン酸カルシウム等が挙げられる。また、骨誘導蛋白質としては、ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３等の骨形態形成蛋白質(Bone Morphogenetic Protein)，ＴＧＦ−βのような形質転換成長因子（Transforming Growth Factor）、オステオポンチン、オステオカルシン等が挙げられる。更に、骨誘導因子を含む天然物質としては、動物骨粉砕物、鉱質消失骨基質等が挙げらる。骨誘導因子を含む天然物質は、骨誘導蛋白質と併用してポリリン酸に混合してインプラントまたはデバイスとして局所投与することができる。この場合、投与物質は発熱性物質を含まない、生理的に許容できる形態で骨損傷部位への供給に適した粘稠性形態で封入または注射される。それによって、骨損傷部位に硬骨、軟骨構造を形成し、最適状態で体内に再吸収されることができるマトリックスが形成される。
【００１１】
本発明の骨再生材料は、ポリリン酸を含有した骨原性製剤として、閉鎖骨折、複雑骨折の縮小、人工関節の固定改善等の予防的用途に使用される。また、骨原性製剤によって新たに骨形成が誘導され、先天的、外傷性、腫瘍切除による欠損箇所の修復に使用されたり、美容形成外科、歯周病の処置、他の歯修復プロセス等に使用されたりする。更に、本発明の骨再生材料は、シ−ト、フイルム、繊維、多孔体等の生体適合性を有する材料からなる基材の表面に、ポリリン酸を含有した材料がコ−チングされて使用される。
【００１２】
【実施例】
以下、本発明の一例を実施例にて説明する。
【実施例１】
白兎（ニュ−ジランド産、体重３kg）を麻酔注射をして大腿骨を露出させた。滅菌したドリル（直径３mm）を用いて、ドリルの先端が大腿骨の中の軟組織に達するまで大腿骨頭と大腿骨の末端である関節丘付近に２つの穴をあけた。１cm×１cmのコラ−ゲンテ−プ（CollaTape 、Calcitec社製）に30μl の２％ポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）水溶液をしみこませ、無菌的に乾燥させた。そのコラ−ゲンテ−プを白兎の右脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。また、対照品として滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プを左脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。この状態で切開部分を縫合し、１週間および２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の状態を観察した。観察のため摘出した大腿骨を10％ホルマリンで固定した。
【００１３】
図１および図２は、１週間後の穴の部分を縦方向に切断し実体顕微鏡で観察したものである。図１は滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したもの、図２はポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものである。図１の滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プでは新生骨の形成は全く観察されなかったが、図２のポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プは穴の底縁周辺に相当量の新生骨の形成が確認され軟組織にまで伸びているのが観察された。
【００１４】
前記と同じ滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プとポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プを用いて、１週間および２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の要すを組織学的に観察する目的で大腿骨の穴の部分の組織サンプルの一部を取り出し、10％EDTAで２ケ月間処理し脱石灰化を行った。脱石灰化を行ったサンプルは、種々の濃度のエタノ−ルと最終段階としてキシレンで脱水しパラフィンで包埋した。包埋したサンプルを５μm の厚さで切片を切り、Azan染色を行い顕微鏡下で観察した。１週間後の組織状態について、滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものを図３、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものを図４に示した。
【００１５】
滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものでは、図３で明らかなように、コラ−ゲンテ−プ（Ｃ）は繊維状組織（Ｆ）に覆われ、緻密骨（Ｂ）の骨内膜由来の骨小柱（ＴＢ）がその繊維性組織に接近しつつあった。これに対し、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した図４のものでは、コラ−ゲンテ−プは殆ど吸収され、繊維状組織（Ｆ）に置換していた。また、緻密骨（Ｂ）由来ではなく、穴中の新生繊維状組織に由来する未熟な繊維状骨小柱の塊（＊）が既に繊維状組織中の６ケ所に確認できた。
【００１６】
次に、２週間後の状態については、滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものは図５に、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものは図６に示した。滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものでは図５に示すように、穴の両端は骨小柱（TB）によってつながっているが、コラ−ゲンテ−プ（Ｃ）は完全に吸収されておらず、骨内膜由来の骨小柱(TB)がコラ−ゲンテ−プ（Ｃ）を取り囲んで仮骨を形成していた。これに対し、ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理したものは、図６に示すようにコラ−ゲンテ−プはほぼ完全に吸収され確認できなかった。また、新たに形成された１次骨である骨小柱が互いに接着しコラ−ゲンテ−プと置換していた。コラ−ゲンテ−プと置換した新生繊維組織に由来する骨小柱（＊）は、骨内膜由来の骨小柱と結合し、２つの異なった起源の骨小柱によって仮骨が形成され、それらが穴の両端を繋ぐ形で穴を修復していた。
【００１７】
【実施例２】
実施例１と同様にして白兎の大腿骨に穴をあけ、脱ミネラル化したヒトの骨粉砕物（粒径 250〜300 μm)10mgに、２％ポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）水溶液30μl をしみこませ無菌的に乾燥させた。その骨粉砕物を白兎の右脚の大腿骨にあけた穴につめた。また、対照品として滅菌水をしみこませた骨粉砕物を白兎の左脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。この状態で切開部分を縫合し、実施例１と同様な方法で２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の様子を組織学的に観察した。図７は、滅菌水をしみこませた骨粉砕物で処理した顕微鏡写真の結果で、穴は主に骨粉(DB)と繊維状組織(F) によって満たされ、まばらに新生骨小柱が観察される程度であった。図８は、ポリリン酸水溶液をしみこませた骨粉砕物で処理した顕微鏡写真の結果で、穴は新生骨小柱（＊）および骨粉(DB)で満たされていた。
【００１８】
【実施例３】
実施例１と同様にして白兎の大腿骨に穴をあけ、コラ−ゲンテ−プに種々の鎖長のポリリン酸ナトリウム塩（Polyphosphate glass, Sigma社製）の２％水溶液30μl をしみこませ、無菌的に乾燥させた。そのコラ−ゲンテ−プを白兎の右脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。また、対照品として滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プを白兎の左脚の大腿骨にあけた穴に詰めた。この状態で切開部分を縫合し、２週間後の大腿骨部の穴における新生骨再生の様子を組織学的に観察した。使用したポリリン酸ナトリウム塩の鎖長は、リン酸基に換算して(1) 平均鎖長15(Na17P15O46) (2)平均鎖長 25 (Na27P25O76)(3) 平均鎖長 35 (Na37P35O106) (4) 平均鎖長 65 (Na67P65O196) であった。
いずれのポリリン酸を使用して行った実験においても新生骨形成は促進され、ポリリン酸の鎖長に影響されないで新生骨形成は促進された。
【００１９】
【実施例４】
ポリリン酸の骨分化誘導効果を確かめるために、正常ヒト骨芽細胞(Bio Whittaker社製）を培養し、ポリリン酸添加時の細胞の骨分化の度合いを、アルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を指標として測定することにより、in vitroの系で評価した。
細胞が新生骨を形成する際に、骨芽細胞のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性が上昇する性質はよく知られており、この活性の上昇が新生骨形成の指標となる。正常ヒト骨芽細胞を10,000 cells/cm2で35mmカルチア−デイッシュに撒き、10％子牛血清を含む骨芽細胞基本培地(Bio Whittaker社）で48時間培養した。その後１mMのポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）を含む培養液と交換し、細胞のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を１日毎に測定した。また、ポリリン酸を含む培養液は、測定開始後３日毎に交換した。
【００２０】
アルカリ性フオスフアタ−ゼ活性は下記の方法で測定した。
細胞をPBS[20mM Na3PO4 緩衝液(pH 7.0)と150mM NaClの混合液]で洗浄後、トリプシンEDTAにてデイッシュより剥離し、PBSに懸濁した。遠心分離により細胞を分離し、上清液を除去した。この細胞を含有する液１mlのTBS[20mM Tris-HCl(pH 7.5)と150mM NaClの混合液〕に懸濁した。超音波細胞破砕装置を用いて細胞を破砕した後、この懸濁液を再度遠心分離し、その上清液を粗酵素液とした。粗酵素液中の蛋白濃度（Ａ）をバイオラッド・プロテインアッセイキット(BIORAD社製）を用いて測定した。次に、1.2M Tris-HCl(pH 8.2)と20mM p-Nitrophenyl phosphate disodiumを１：１の比で混合した基質溶液に、粗酵素液を適当量加え、28℃で所定時間（Δｔ）反応させ、2M K2HPO4を加えて反応を停止させた後、410nmの吸光度（Ｂ）を測定して、以下の式に従ってアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を算出した。
【００２１】
【数１】
0003695511.tif 000002
【００２２】
培養時間を増やしていった際におけるポリリン酸ナトリウム塩のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性の経時変化を図９に示す。
【００２３】
【比較例１】
実施例４で使用したポリリン酸ナトリウム塩（平均鎖長75）の代わりに、リン酸ナトリウム緩衝液を、リン酸濃度に換算してポリリン酸と同濃度培養液に加えて所定時間培養し、アルカリ性フオスフアタ−ゼ活性を測定した。
リン酸ナトリウム緩衝液のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性の経時変化を図９に示す。
図９から明らかなように、ポリリン酸処理した実施例４の細胞は、１週間後から顕著な酵素活性の上昇がみられたが、リン酸緩衝液で処理した比較例１の細胞は顕著な酵素活性の上昇はみられなかった。すなわち、細胞にポリリン酸を添加することによって骨芽細胞の分化（骨形成）が促進されたことを示している。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の骨再生材料を、物理的衝撃による骨折や損傷、外科手術によって損傷した骨の治療に、新生骨の形成を促進し、治癒、回復にいたるまでの時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴の顕微鏡の実体を示す図面に変わる写真である。
【図２】  ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴の顕微鏡の実体を示す図面に変わる写真である。
【図３】  滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図４】  ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した１週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図５】  滅菌水をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図６】  ポリリン酸水溶液をしみこませたコラ−ゲンテ−プで処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図７】  滅菌水をしみこませた骨粉砕物で処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図８】  ポリリン酸水溶液をしみこませた骨粉砕物で処理した２週間後の大腿骨の穴における新生骨再生の様子を組織学的に顕微鏡で観察した図面に変わる写真である。
【図９】  ポリリン酸ナトリウム塩およびリン酸ナトリウム緩衝液のアルカリ性フオスフアタ−ゼ活性の経時変化。
【図１】
0003695511.tif 000003
【図２】
0003695511.tif 000004
【図３】
0003695511.tif 000005
【図４】
0003695511.tif 000006
【図５】
0003695511.tif 000007
【図６】
0003695511.tif 000008
【図７】
0003695511.tif 000009
【図８】
0003695511.tif 000010
【図９】
0003695511.tif 000011