(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に配列番号１の塩基配列からなるプロモーターＤＮＡを含んでなるＤＮＡ断片と、アラゲカワラタケ由来のリグニンパーオキシダーゼ遺伝子又はマンガンパーオキシダーゼ遺伝子とを含む、組み換え体ベクター。
【請求項２】
請求項１記載の組み換え体ベクターによって形質転換された担子菌アラゲカワラタケ形質転換体。
【請求項３】
請求項２記載の形質転換体を培養し、その培養物からリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを採取することを特徴とするリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は担子菌類アラゲカワラタケから得られたプロモーター活性を有する新規ＤＮＡ断片、それを含む組換えＤＮＡおよび該組換えＤＮＡを含む形質転換体およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在まで、組換えＤＮＡ技術を用いて多様なポリペプチドを産生する系は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が中心となって行なわれている。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は宿主として適さない場合が多い。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ヒトなど高等生物由来の有用なポリペプチドを生産させる場合、活性型酵素タンパク質として生産されないことが多い。また目的ポリペプチド以外にも多数の毒性物質を産生し、目的産物の精製が非常に困難となる等の問題点がある。上記問題点を解決する手段として下等真核生物の酵母を宿主とした生産方法が盛んに研究されているが、その場合目的ポリペプチドの生産性が低いという問題点がある。そこで、ポリペプチド産生のため、より高等生物な真核生物としてアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などの糸状菌、またファネロカエート（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属やコリオラス属などの担子菌を宿主とした形質転換系が開発され、酵素タンパク質生産が検討されている。
【０００３】
担子菌類は真核生物に属するが、酵母よりも動物細胞に近縁であると考えられている［Ｔ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７０６３（１９８９）］。リグニン分解力が強いアラゲカワラタケはコリオラス属に属する担子菌類であり、本発明者らにより宿主・ベクター系が開発され、組換えＤＮＡ技術を用いて、これまで困難とされていたリグニンパーオキシダーゼ生産に成功した［特開平６−０５４６９１号参照］。しかしながら用いるプロモーター領域はアミノ酸合成系酵素遺伝子であるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子やリグニン分解に関与するフェノールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター領域であるため、生産性が低く、もしくは二次代謝産物であるため遺伝子が発現するまでに長い培養時間を要する等の問題点があり、その生産量は野性株ＩＦＯ４９１７株をリグニンパーオキシダーゼ生産用培地（低炭素・低窒素源）で生産した時と同程度であった。また、大腸菌や酵母を用いた形質転換系においてリグニンパーオキシダーゼ生産を試みた場合、活性のある状態で生産されていなかった［Ｒ．Ｌ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｎｏ．０，２６１，０８０，（１９８９）］。さらに、糸状菌トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の宿主・ベクター系を用いてフェレビア・ラデアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）由来のリグニンパーオキシダーゼ遺伝子をセロビオハイドラーゼ遺伝子のプロモーター下に連結し、酵素生産を試みたが活性型のリグニンパーオキシダーゼは生産されなかった［Ｍ．Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８５，３４３（１９８９）］。さらに他の生物種、例えば糸状菌などの遺伝子組換えによる酵素タンパク質生産系に供されているプロモーターが担子菌では機能しないことも報告されている［Ａ．Ｌｏｒｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，３５（１９８９）］。また、アスペルギラス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＡｒｇＢ遺伝子もアラゲカワラタケで機能しなかった［Ａ．Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｎ．Ｓ．Ｎ．０８／０２７，９８６（１９９３）］。そこで、担子菌アラゲカワラタケで機能する、より強力な転写活性を有するプロモーターに対する関心が高まっているが、現在までにそのようなプロモーターが取得された旨の報告はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、担子菌アラゲカワラタケ宿主・ベクター系を用いて目的とする蛋白質を大量に生産させるためのプロモーター、該プロモーターを用いた蛋白質の遺伝子系並びに該遺伝子系を用いた蛋白質の大量発現生産方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、恒常的に発現するアラゲカワラタケのグリセルアルデヒド−３−りん酸脱水素酵素（以下ＧＰＤと略す）遺伝子に着目し、アラゲカワラタケの染色体ＤＮＡ制限酵素断片からＧＰＤをコードするＤＮＡ断片をクローン化し、この遺伝子のプロモーター領域の下流に、アラゲカワラタケからクローニングされた高温誘導リグニンパーオキシダーゼ遺伝子［特開平５−２６０９７８号］またはマンガンパーオキシダーゼ遺伝子[ 特開平７−１２３５４０号] のシグナルペプチドを含む構造遺伝子を連結し、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（以下ＯＣＴと略す）欠損アラゲカワラタケ変異株に移入することにより、リグニンパーオキシダーゼ高生産株及びマンガンパーオキシダーゼ高生産株を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、目的遺伝子の発現を制御するコリオラス属アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）由来のプロモーターＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ断片である。上記目的遺伝子としては、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子又はマンガンパーオキシダーゼ遺伝子等があげられる。上記プロモーターＤＮＡ配列としては、実質的に配列番号１の塩基配列があげられる。ここで、「実質的に配列番号１の塩基配列」とは配列番号１の塩基配列並びに前記塩基配列においてその一部の塩基配列が置換、挿入又は欠失するも配列番号１の塩基配列と同一の作用・効果を有する塩基配列の全てを指すことを意味するものである。
【０００７】
さらに、本発明は、上記ＤＮＡ断片及び目的遺伝子を含む組み換え体ベクターである。
上記目的遺伝子としては、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子、リグニンパーオキシダーゼ遺伝子又はマンガンパーオキシダーゼ等が挙げられる。ただし目的遺伝子としては、上記３種類に限定されるものではなく、いずれの目的遺伝子も使用することができる。
【０００８】
さらに、本発明は、上記組み換え体ベクターによって形質転換された担子菌アラゲカワラタケ形質転換体である。
さらに、本発明は、上記コリオラス属担子菌形質転換体を培養し、その培養物からリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを採取することを特徴とするリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼの製造方法である。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる染色体ＤＮＡの供与体はアラゲカワラタケであり、具体的には例えばＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓＩＦＯ４９１７株である。
本菌株から染色体ＤＮＡを調製するには、Ｙｅｌｔｏｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，１４７０（１９８４）］等、通常の染色体ＤＮＡの抽出方法が用いられる。
【００１０】
次に、得られた染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を行なった後、ショ糖密度勾配超遠心法で分画して１０ｋｂｐ〜２５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得る。同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージＤＮＡに、上記で得られたＤＮＡ断片を挿入して染色体遺伝子ライブラリーを作製する。前記ファージＤＮＡとしては例えばＥＭＢＬ３［Ａ−Ｍ，Ｆｒｉｓｈａｕｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０，８２７（１９８３）］が用いられる。挿入後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージを行ない、染色体ＤＮＡライブラリーとする。またサブクローニングには常用のクローニングベクター、好ましくは大腸菌クローニングベクター、例えば、ｐＵＣ系ベクター、例えばｐＵＣ１８［Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］を用いる。
【００１１】
上記で得られた染色体遺伝子ライブラリーからのＧＰＤ遺伝子の単離にあたっては、他生物種から単離されているＧＰＤ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて作製した合成ＤＮＡをプローブとして用い、プラーク・ハイブリダイゼーションを行なう。単離されたＧＰＤ染色体遺伝子を含む断片は図１で表される制限酵素地図から成っていた。
【００１２】
このＧＰＤ染色体遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクターに挿入し、塩基配列はＳａｎｇｅｒらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］により決定することができる。上記クローニングベクターとしては、好ましくは細菌クローニングベクター、特に大腸菌クローニングベクターであるｐＵＣ系クローニングベクター、例えばｐＵＣ１８が用いられる。
【００１３】
次に、後記の実施例３で詳細に述べるようにＯＣＴ遺伝子の構造遺伝子部分をレポーター遺伝子として連結し、ＯＣＴ欠損アラゲカワラタケ変異株に移入することによりＧＰＤ遺伝子のプロモーター活性を有する必要領域を決定することができる。
ＯＣＴ構造遺伝子としては、例えば特開平６−０５４６９１号公報に記載されているものが用いられる。なお、この構造遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＲ１により形質転換された大腸菌であるＪＭ１０９／ｐＵＣＲ１は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６７９として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１４】
さらに、アラゲカワラタケのＯＣＴｃＤＮＡ遺伝子は特開平６−０５４６９１号公報に記載されている。この構造遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＲＭにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９／ｐＵＣＲＭは、ＦＥＲＭ  Ｐ−１３４２４として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
次に、後記実施例５で詳しく述べるように上記ＧＰＤプロモーター領域の下流にリグニンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分又はマンガンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分を連結し、遺伝子組換えによりリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを大量に生産することができる。
【００１５】
なお、アラゲカワラタケのＯＣＴ活性を欠損している栄養要求性変異株ＯＪＩ−１０７８、高温誘導リグニンパーオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組換え株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  ｂｌｕｅ／ｐＢＳＬＰＯＧ７、マンガンパーオキシダーゼ遺伝子を含む大腸菌組換え株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＳＬＰＯＧ１及びアラゲカワラタケ由来ＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域を含む大腸菌組換え株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＧＰＤは工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ  Ｐ−１２６７７、ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４９３３及びＦＥＲＭ  Ｐ−１５０１５として寄託されている。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１．染色体遺伝子ライブラリーの作製
アラゲカワラタケ（ＩＦＯ４９１７株）の平板寒天培養から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グルコース・ペプトン培地（グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ＫＨ2ＰＯ4０．１％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０５％、りん酸でｐＨ４．５に調製）２００ｍｌに植菌し、２８℃で７日間回転振盪培養を行なった。菌体を集菌後、１Ｌの滅菌水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。
【００１７】
この凍結菌体５ｇを乳鉢を用いて粉砕した。粉砕した菌体を遠心管に移し、Ｌｙｓｉｓ緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌさらにプロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌとなるように添加）１０ｍｌを加え、５５℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、フェノール抽出、クロロホルム抽出を行ない、抽出した水層部分にエタノールを徐々に添加しＤＮＡが析出したところで染色体ＤＮＡを巻取り、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。
【００１８】
得られた染色体ＤＮＡ１００μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分分解し、５〜２０％ショ糖密度勾配超遠心分離（３０，０００ｒｐｍ，１８時間）により分画し、１０〜２５ｋｂｐ断片区分を集めた。この断片区分を東洋紡社製ファージλＥＭＢＬ３−ＢａｍＨＩアームにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、得られたファージＤＮＡをＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ギガパックゴールドを用いてパッケージング後、大腸菌Ｐ２３９２株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に感染せしめ染色体ＤＮＡライブラリーとした。
実施例２．染色体遺伝子ライブラリーからのＧＰＤ遺伝子の単離
上記染色体ＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーションによりＧＰＤ遺伝子を含むクローンの選抜を行なった。この一連の操作は常法［Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ／２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）］により行った。
プラークハイブリダイゼーションに用いたプローブは次の配列を持つ合成オリゴマー
0003694928.tif 000002
を32Ｐで放射能標識したものである。
【００１９】
この結果、約４０，０００個のプラークの中から４個の陽性クローンを選抜することができた。陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージＤＮＡを各種制限酵素で消化し、上記２種の合成ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）、且つＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化して得られた断片中に単一のＤＮＡバンドとして３．８ｋｂｐにハイブリダイズするクローンが認められた。
【００２０】
上記ＤＮＡ断片３．８ｋｂｐをアガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクターｐＵＣ１８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩサイトにサブクローン化し、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）へ形質転換した。サブクローン化したＤＮＡを大量に調製し、超遠心操作（５０，０００ｒｐｍ，１６ｈｒｓ，１５℃）で精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定はシーケナーゼキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて行った。
【００２１】
翻訳開始点から下流に８５０番目までの塩基配列を配列番号２に示す。その結果、上記塩基配列の範囲内においてアラゲカワラタケ由来ＧＰＤ遺伝子は６つのイントロンにより分断されていた。イントロンを除いた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号３に示す。このアミノ酸配列は、これまで報告されているＧＰＤ遺伝子と高い類似性が認められた。
【００２２】
なお、得られたアラゲカワラタケ由来ＧＰＤ遺伝子を含む大腸菌形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＣＨＧＰＤは工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５０１５として寄託されている。
実施例３．ＧＰＤ遺伝子制御領域に支配されるＯＣＴ構造遺伝子の連結
担子菌アラゲカワラタケ用のＯＣＴ発現選択マーカー用プラスミドｐＧＰＲＧはＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域の下流にＯＣＴ染色体遺伝子（特開平６−０５４６９１；ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６７９）の構造遺伝子領域を連結し、本来のＯＣＴ遺伝子からプロモーター領域を置換した選択マーカー遺伝子とした。
【００２３】
具体的にはＧＰＤ染色体遺伝子ＥｃｏＲＩ且つＢａｍＨＩ消化により得られる３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をファージベクターＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、これを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、一本鎖ファージＤＮＡを調製した。次に、図２断片１に示すＤＮＡプライマーをフォスフォアミダイド法により合成し、上記一本鎖ファージＤＮＡにアニーリングを行い、プライマー伸長法によりＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域だけを合成し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で切断することにより０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製した（断片１）。この塩基配列は配列番号１である。
【００２４】
一方、ＯＣＴの成熟型酵素をコードしている遺伝子領域を取り出すため、プラスミドｐＵＣＲ１（特開平６−０５４６９１号公報；ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６７７）を制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造社製）で切断し、次にＭｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造社製）により突出部分を削り込み平滑末端とし、約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片２）。
【００２５】
大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ（宝酒造社製）で切断し、上記２種類のＤＮＡ断片を混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から上記断片１及び断片２の２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＲＧと命名した（図２）。
実施例４．アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）形質転換法
ａ．一核菌糸培養
直径６mm前後のガラスビーズを約３０個入れた５００ｍｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地（シュークロース１％、麦芽エキス１％、酵母エキス０．４％）１００ｍｌを分注して滅菌後、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）ＯＪＩ−１０７８の平板寒天培地から直径５mmの寒天片をコルクボーラーで打ち抜きＳＭＹ培地に植菌し、２８℃で７日間静置培養した（前培養）。
【００２６】
ただし、菌糸を細分化するために、１日に１〜２回振り混ぜた。次に、１Ｌ容の三角フラスコにＳＭＹ培地２００ｍｌを分注し、さらに回転子を入れ、滅菌後、前培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、全量を植菌し、２８℃で培養した。なお、スターラーで１日２時間撹拌することにより菌糸を細分化した。この培養を４日間行なった。
【００２７】
ｂ．プロトプラストの調製
上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ  ＭｇＳＯ4、５０ｍＭマレイン酸バッファー（ｐＨ５．６））で洗浄した。次に湿菌体１００ｍｇあたり１ｍｌの細胞壁分解酵素液に懸濁し、緩やかに振盪しながら２８℃で４時間インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使用した。即ち、セルラーゼ・オノズカ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＯＮＯＺＵＫＡ  ＲＳ）（ヤクルト社製）５ｍｇ、ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３４）（ノボ社製）１０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｌに溶解して酵素液として用いた。
【００２８】
ｃ．プロトプラストの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラストを上記浸透圧調節溶液で１回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００ｘｇ、５分間）し、上清を除去し、４ｍｌの１Ｍシュークロース（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ６．３）で再懸濁後、遠心操作を繰り返し、上記１Ｍシュークロース溶液で２回洗浄した。沈澱物に１Ｍソルビトール溶液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カルシウムを加えた溶液５００μｌに懸濁し、プロトプラスト溶液とした。この溶液を４℃で保存した。
【００２９】
プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて直接検鏡により求めた。全ての遠心操作はスウィングローターで１，０００ｘｇ、５分間、室温下で行った。
ｄ．形質転換
１０6個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液１００μｌに対し、実施例３で作製したプラスミドｐＧＰＲＧ２μｇを添加し、３０分間氷冷した。つぎに、液量に対し等量のＰＥＧ溶液（５０％  ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。つぎに、０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行ない、形質転換体を得た。この時における形質転換効率は３００コロニー／μｇ形質転換ＤＮＡであった。なお、プラスミドベクターｐＵＣ１８だけのＤＮＡ供与体を用いた対照実験では形質転換体は全く得られなかった。
実施例５．リグニンパーオキシダーゼ発現プラスミドの構築
上記実施例３で作製したＤＮＡ断片１（担子菌アラゲカワラタケ用のＧＰＤ遺伝子のプロモーター）の下流にリグニンパーオキシダーゼ染色体遺伝子（特開平５−２６０９７８号；ｐＢＳＬＰＯＧ７；ＦＥＲＭ  Ｐ−１２６８３）の構造遺伝子領域を連結し、発現プラスミドとした。
【００３０】
具体的にはリグニンパーオキシダーゼの構造遺伝子部分を取り出しはプラスミドｐＢＳＬＰＯＧ７を基礎として図３の断片３に示すプライマーを用いて実施例３と同様にプライマー伸長法によりＤＮＡ断片を作製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりリグニンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分からなる１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片３）。
【００３１】
さらに大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、実施例３記載のＤＮＡ断片（断片１）と上記ＤＮＡ断片（断片３）の２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から断片１及び断片３の２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＨＬＧと命名した（図３）。
実施例６．リグニンパーオキシダーゼを高分泌生産するアラゲカワラタケ形質転換体の作製
実施例５で得たｐＧＰＨＬＧを用いてアルギニン要求性アラゲカワラタケ（ＯＪＩ−１０７８）を形質転換する場合、選択マーカーとしてアラゲカワラタケ由来のＯＣＴ遺伝子保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導入すること（ＰＥＧ法、もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体ｐＧＰＨＬＧ／ＯＪＩ−１０７８を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状にかかわらず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
【００３２】
約１０6個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し上記実施例５で作製したプラスミド２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％  ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最少軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行ない、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンパーオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
実施例７．形質転換株の培養およびリグニンパーオキシダーゼの活性測定
上記実施例６で得られた形質転換株（ｐＧＰＨＬＧ／ＯＪＩ−１０７８）を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのグルコースペプトン液体培地（グルコース２０ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4１ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．５ｇ／ｌ、りん酸でｐＨ４．５に調製）に５ｍｍの寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した（前前培養）。その後、菌体をワーリングブレンダーで破砕し、さらに２日間グルコースペプトン培地で２８℃で振盪培養を継続した（前培養）。次に、菌体を集菌し、菌体を新鮮なグルコースペプトン液体培地５０ｍｌに再懸濁し、新しい５００ｍｌ容三角フラスコへ移し、２８℃で静置培養を実施した。得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
【００３３】
活性測定法は８ｍＭベラトリルアルコール２５μｌ、０．５Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）５０μｌ、酵素液４００μｌ、２．７ｍＭ過酸化水素２５μｌを充分に混合し、反応の結果生じるベラトルアルデヒドの３１０ｎｍの吸光度を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にベラトリルアルコールをベラトルアルデヒドへ変換する酵素活性が静置培養開始５日目で３００〜５００ユニット／ｍｌの範囲で認められた。ここで酵素活性単位は１分間にベラトルアルデヒド１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。
実施例．８  マンガンパーオキシダーゼ発現プラスミドの構築
担子菌アラゲカワラタケ用のＧＰＤ遺伝子のプロモーターの支配下にさらされたマンガンパーオキシダーゼ発現用プラスミドｐＧＰＭＰＧは実施例３で作製したＤＮＡ断片１の下流にマンガンパーオキシダーゼ染色体遺伝子（特開平７−１２３５４０；ｐＢＳＭＰＯＧ１；微工研菌寄第１４９３３号）の構造遺伝子を連結し、発現プラスミドとした。
【００３４】
具体的にはマンガンパーオキシダーゼの構造遺伝子部分の取り出しはプラスミドｐＢＳＭＰＧ１を基礎として図４の断片４に示すプライマーを用いて実施例３と同様にプライマー伸長法によりＤＮＡ断片を作製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりマンガンパーオキシダーゼ構造遺伝子部分からなる２．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（断片４）。
【００３５】
さらに大腸菌ベクターｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株の中から２種類のＤＮＡ断片が同時に挿入されているプラスミドを単離し、これをｐＧＰＭＰＧと命名した（図４）。
【００３６】
実施例９．マンガンパーオキシダーゼを高分泌生産するアラゲカワラタケ形質転換体の作製
実施例８で得たｐＧＰＭＰＧを用いてアルギニン要求性アラゲカワラタケ（ＯＪＩ−１０７８）を形質転換する場合、選択マーカーとしてアラゲカワラタケ由来のＯＣＴ遺伝子を保持するプラスミド（ｐＵＣＲ１）を同時に導入すること（ＰＥＧ法、もしくはエレクトロポーレーション法など）により形質転換体ｐＧＰＭＰＧ／ＯＪＩ−１０７８を得た。ここで、形質転換に供与することができるＤＮＡは環状、もしくは直鎖状にかかわらず、目的とする形質転換体を得ることができた。以下に形質転換条件を記す。
【００３７】
約１０6 個／１００μｌ濃度のプロトプラスト溶液を１００μｌに対し実施例５で作製したプラスミド２μｇを環状、もしくは直鎖状で添加し、さらに選択マーカーとしてｐＵＣＲ１を０．２μｇ添加し、３０分間氷冷した。
次に、等量のＰＥＧ溶液（５０％  ＰＥＧ３４００、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．４））を加え、３０分間氷冷した。０．５Ｍシュークロースおよびロイシンを含む最小軟寒天培地（寒天１％）に混合してプレートに撒いた。上記プレートを２８℃で４日間培養を行い、形質転換体を得た。さらに上記形質転換株からＤＮＡを調製し、目的とするリグニンパーオキシダーゼ発現プラスミドが組み込まれていることをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
実施例１０．形質転換株の培養およびマンガンパーオキシダーゼの活性測定
上記実施例９で得られた形質転換株（ｐＧＰＭＰＧ／ＯＪＩ−１０７８）を５００ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌのグルコース・ペプトン液体培地（グルコース２０ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．５ｇ／ｌ、りん酸でｐＨ５．０に調製）に５０ｍｍ2 の寒天片を５個接種し、２８℃で６日間、振盪下で培養した（前前培養）。その後、菌体をワーリングブレンダーで破砕し、菌体液１０ｍｌを新鮮なグルコースペプトン培地１０ｍｌを含む直径９ｃｍのシャーレへ植菌し、２８℃で１０日間静置培養を行い菌体マットを形成させた。次に、菌体を集菌し、ワーリングブレンダーにより菌体を破砕洗浄後、新鮮な改変グルコースペプトン液体培地（グルコース２０ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 １ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．５ｇ／ｌ、０．２ｍＭ  ＭｎＳＯ4 りん酸でｐＨ５．０に調製）２０ｍｌに再懸濁し、新しい２００ｍｌ容三角フラスコへ移し、２８℃で静置培養を実施した。得られる培養液を遠心分離し、その上清を得た。
【００３８】
活性測定法は０．５Ｍマロン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５０μｌ、酵素液４４５μｌ、１０ｍＭ過酸化水素５μｌ、１ｍＭ  ＭｎＳＯ4 １００μｌを充分に混合し、反応の結果生じるＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体の２７０ｎｍの吸光度増加を時間を追って記録することにより行い、上記培養上清中にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体を生成する酵素活性が静置培養開始７日目で５μｍｏｌ／ｍｌ／ｍｉｎで認められた。ここで酵素活性単位は１分間にＭｎ（ＩＩＩ）マロン酸複合体１μｍｏｌ増加させる活性を１ユニットとした。一方、同条件下で培養した供与ＤＮＡを含まないＯＪＩ−１０７８株の培養上清には本活性は認められなかった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、これまで遺伝子組換え技術による酵素の大量生産が困難とされていたリグニンパーオキシダーゼ又はマンガンパーオキシダーゼを、アラゲカワラタケの形質転換系において活性のある形で、さらに高生産させるための新規なＤＮＡ断片を提供するものである。
【００４０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：９２２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）
株名：ＩＦＯ４９１７
配列の特徴
860-866    TFIID site
配列：
0003694928.tif 000003
【００４１】
配列番号：２
配列の長さ：８５０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源
生物名：アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）
株名：ＩＦＯ４９１７
配列の特徴
1-850      P CDS
7-63       intron
87-153     intron
159-216    intron
287-350    intron
567-630    intron
749-813    intron
配列：
0003694928.tif 000004
【００４２】
配列番号：３
配列の長さ：１６０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）
株名：ＩＦＯ４９１７
配列の特徴
1-160    P mat peptide
配列：
0003694928.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はアラゲカワラタケのグリセルアルデヒド−３−りん酸脱水素酵素遺伝子の染色体上の制限酵素地図である。
【図２】図２は実施例３に示したアルギニン要求性アラゲカワラタケ変異株へのために使用されるプラスミドｐＧＰＲＧの構築図である。
【図３】図３は実施例５に示したリグニンパーオキシダーゼ発現プラスミドｐＧＰＨＬＧの構築図である。
【図４】図４は実施例８に示したマンガンパーオキシダーゼ発現プラスミドｐＧＰＭＰＧの構築図である。
【図１】
0003694928.tif 000006
【図２】
0003694928.tif 000007
【図３】
0003694928.tif 000008
【図４】
0003694928.tif 000009