(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲンジボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において、205位のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている発光持続性の向上した変異型ルシフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１記載のルシフェラーゼをコードする変異型ルシフェラーゼ遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の変異型ルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から変異型ルシフェラーゼを採取することを特徴とする変異型ルシフェラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異型ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び変異型ルシフェラーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ルシフェラーゼは、発光素であるルシフェリンの酸化を触媒して、これを発光させる発光酵素である。そして、ルシフェリンの発光の際にＡＴＰ等の物質を必要とする、ホタル、ヒカリコメツキ、鉄道虫等由来の甲虫類のルシフェラーゼは、当該性質に基づいて、上記ＡＴＰ等の微量定量に利用されている。また近年、遺伝子組み換えにより、大量に生産できるようになったため、ルシフェラーゼは発光遊具としても利用されている。
【０００３】
しかしながら、一般的に甲虫類ルシフェラーゼは、反応直後発光量がピークに達したのち急激に発光量が減少するため、長時間反応によるＡＴＰ等の高感度定量を行うことが困難であった。また、発光遊具として利用する場合も、発光持続性の向上が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発光が長時間安定して持続する変異型の甲虫類ルシフェラーゼを提供することを主たる課題とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者等は、上記課題に基づき鋭意検討した結果、甲虫類ルシフェラーゼにおける特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変換することにより、上記課題を解決し得る変異型甲虫類ルシフェラーゼを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、発光持続性の向上した変異型ルシフェラーゼであり、さらに、本発明は、このルシフェラーゼのアミノ酸配列をコードしている変異型ルシフェラーゼ遺伝子である。
【０００７】
また、本発明は、上記変異型ルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡである。
また、本発明は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体である。
さらに、本発明は、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から変異型ルシフェラーゼを採取することを特徴とする変異型ルシフェラーゼの製造法である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、遺伝子の改変による変異型ルシフェラーゼが提供される前提として、甲虫類のルシフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡを調製することが必要である。
甲虫類のルシフェラーゼ遺伝子の種類は、提供が企図される変異型ルシフェラーゼ遺伝子の種類に応じて用いられる。そして、甲虫類由来のものであれば、如何なるものでも用いることが可能であり、例えばヘイケボタル、ゲンジボタル又はアメリカボタル由来のもの、さらにはヒカリコメツキムシ由来、鉄道虫由来等のルシフェラーゼ等が挙げられる。
【０００９】
これらの遺伝子等は、すでに公知の方法に従って調製される。例えば、野生型ゲンジボタルのルシフェラーゼ遺伝子及びその組み換え体ＤＮＡは、特開平1-51086号公報に記載の方法により調製することが可能である。
本発明において、「ゲンジボタル又はヘイケボタルのルシフェラーゼの205位と同等位置のアミノ酸」とは、甲虫類のルシフェラーゼのアミノ酸配列を、ゲンジボタル又はヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、ゲンジボタル又はヘイケボタルのルシフェラーゼの205位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
【００１０】
具体的には、既製のアミノ酸の相同性の解析用ソフト、例えば、Micro GenieTM（ベックマン社製）により、甲虫類のルシフェラーゼのアミノ酸配列と、 ゲンジボタル若しくはヘイケボタルのルシフェラーゼのアミノ酸配列との相同性を比較することにより決定される。当該アミノ酸としては、例えば、グリシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
さらに、本発明において、「酸性アミノ酸」としては、アスパラギン酸又はグルタミン酸等を挙げることができる。そして、これらの中でも、アスパラギン酸は、特に好ましいものとして挙げることができる。
甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行い得る。
【００１２】
すなわち、甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００１３】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異を甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.5〜12Ｍの上記薬 剤濃度において、20〜80℃の反応温度下で10分間以上、好ましくは10〜180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。
【００１４】
紫外線照射を行なう場合においても、上記の通り常法に従うことができる（現代化学、pp24〜30、1989年６月号）。
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、サイト−スペシフィック  ミュータジェネシス (Site-Specific Mutagenesis)として知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res, vol.12, pp9441-9456 （1984）：Kramer, W. et al., Methods Enzymol, vol.154, pp350-367（1987）：Bauer, C. E. et al., Gene, vol.37, pp73-81 (1985)）, Eckstein法（Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Res, vol.13, pp.8749-8764 (1985)：Taylor, J. W. et al., Nucleic Acids Res, vol.13, 8765-8785 (1985) ：Nakamaye, K. L. et al., Nucleic Acids Res, vol.14, pp.9679-9698 (1986)） 、Kunkel法（Kunkel. T. A., Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., vol.82, pp488-492 (1985)：Kunkel. T. A. et al., Methods Enzymol, vol.154, pp.367-382 (1987)）等が挙げられる。
【００１５】
また、一般的にポリメラーゼ  チェイン  リアクション（Polymerase Chain Reaction）として知られる手法を用いることもできる（David, W. L. et al., Technique, Vol.1, No.1, pp.11-15,(1989)） 。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の改変甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。
【００１６】
上記方法により得られる所望の甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Maxam-Gilbert, Meth.Enzym., vol. 65, pp.499-560(1980)〕やＭ13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎮終結法〔Messing et al., Gene, vol. 19., pp.269-276(1982)〕等により行い得る。
【００１７】
上述の如くして得られた甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換・形質導入をすることができる。
例えば、宿主として、エッシェリア属に属する微生物、例えば大腸菌（E.coli）JM101（ATCC 33876）、大腸菌（E.coli）DH１（ATCC 33849）、大腸菌（E.coli）HB 101（ATCC 33694）等を選択する場合には、ハナハン（Hana-han）の方法〔ディーエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ Cloning）、第１巻、第109 〜135頁（1985）〕等により形質転換するか、あるいは「モレキュラー・クロ ーニング（Molecular Cloning）、第256〜268頁、コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）(1982)」記載の方法等により形質導入することにより形質転換株あるいは形質導入株を得ることが可能である。
【００１８】
そして、上記菌株より変異型甲虫類ルシフェラーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、変異型甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、変異型甲虫類ルシフェラーゼ生産能を有する菌株を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えばピー・グーリー(P.Guerry)等の方法〔ジェイ. バクテリオロジー(J.Bacteriology)第116巻、第1064〜1066頁(1973年)〕、デー・ビー・クレウ ェル(D.B.Clewell)の方法〔ジェイ. バクテリオロジー（J.Bacteriology）第110巻、第667〜676頁(1972年)〕、等により得ることができる。
【００１９】
そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡより変異型甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素、例えばEcoRI及びPstＩを温度30〜40℃、好ましくは37℃程度で1〜24時間、好ましくは2時間程度作用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)、第150頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー (Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)記載の方法〕で処理することにより得ることができる。
【００２０】
上記のようにして得られた変異型甲虫類ルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、変異型甲虫類ルシフェラーゼ生産能を有する菌株を用いて変異型甲虫類ルシフェラーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００２１】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００２２】
なお、培地の初発pHは、pH7〜9に調整するのが適当である。また培養は20〜42℃、好ましくは37℃前後で4〜24時間、好ましくは4〜8時間で、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、該培養物より変異型甲虫類ルシフェラーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
【００２３】
例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又は、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
【００２４】
上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えばセファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることができる。
【００２５】
このようにして、所望の変異型甲虫類ルシフェラーゼを得ることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
〔実施例１〕
ゲンジボタルルシフェラーゼｃＤＮＡ及びゲンジボタルルシフェラーゼ発現プラスミドpＧＬｆ37を特開平3-285683号公報実施例記載の方法で取得した。
この組み換え体プラスミドpＧＬf37ＤＮＡ30μgをヒドロキシルアミン溶液〔0.8M 塩酸ヒドロキシルアミン／0.1M リン酸緩衝液(pH6.0)／1mM ＥＤＴＡ〕100μＬに溶解し、65℃で2時間変異処理したのち、常法によりエタノール沈澱を行い沈澱物を回収した。この沈澱物をＴＥ緩衝液〔10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)／1mM ＥＤＴＡ〕に溶解し、ハナハン(Hana-han)の方法〔ディーエヌエイ・クローニング(ＤＮＡ Cloning)、第１巻、第109〜135頁(1985)〕により、大腸菌JM 101株(ATCC 33876)を形質転換し、ＬＢ-amp寒天培地〔バクトトリプトン１％(W/V),  酵母エキス0.5％(W/V), NaCl 0.5％(W/V), アンピシリン(50μg／ml)及び1.4％(W/V)寒天〕に接種し、37℃で培養した。12時間後、出現してきたコロニーをＬＢ-amp培地〔バクトトリプトン1％(W/V),酵母エキス0.5％(W/V), NaCl 0.5％(W/V),及びアンピシリン (50μg／ml)〕3ml中、37℃で18時間振盪培養を行った。この培養液0.5mlを10mlの上記ＬＢ-amp培地に接種し、37℃で4時間振盪培養したのち、8000r.p.m.で10分間の遠心分離操作により湿潤菌体を夫々20mgずつ得た。
【００２７】
回収した菌体を、0.1M KH2PO4(pH 7.8)、2mMＥＤＴＡ、1mMジチオスレイトール、及び0.2mg／mlプロタミン硫酸からなる緩衝液0.9mlに懸濁し、更に、これに、10mg／mlのリゾチーム溶液100μＬを添加し、氷中に15分間放置した 。次に、この懸濁液を、メタノール、ドライアイス浴中で凍結し、次いで温度25℃に放置し、完全に解凍した。更に、12000r.p.m.で5分間遠心分離操作を行うことにより、上清として粗酵素１mlを得た。
【００２８】
このようにして得られた変異型ルシフェラーゼを含む粗酵素液10μlを特開平1-141592号公報記載の方法で反応させ、ルミノメーター（アロカ社製、ルミネッセンスリーダーBLR-201）により、発光パターンを1分間測定した。その結果、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼより長時間発光が持続するものを得た。更に、この粗酵素液を特開平1-141592号公報記載の方法で精製し、上記の方法で発光パターンを測定した結果、野生型ゲンジボタルルシフェラーゼより長時間発光が持続することが判明した。以上の如くして得られた変異型ルシフェラーゼをコードする遺伝子の組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮＡをpGLf37-205Dと命名し、該組み換え体プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌、すなわち大腸菌(E.coli)JM101(pGLf37-205D)は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4929として寄託されている。
【００２９】
なお、このようにして得られた変異型ホタルルシフェラーゼは、野生型ホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列において205位のグリシンがアルパラギン酸に置換されたものである。精製した本酵素を特開平1-141592号公報記載の方法（但し、pH8.5 ）で反応させ、発光量を測定したところ、20秒間で15.4Kcount/mg protein、60秒間で32.6Kcount/mg proteinであった。
【００３０】
なお、対照として野生型ホタルルシフェラーゼについても特開平1-141592号記載の方法で反応させたところ、ミリグラム当たりの発光量は、20秒間で14.4Kcount、60秒間で23.9Kcountであった。
上記より明らかな如く本発明は、対照に比べ長時間発光が持続することが判明した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により発光持続性の向上した変異型ルシフェラーゼ、このルシフェラーゼのアミノ酸配列をコードしている変異型ルシフェラーゼ遺伝子、上記変異型ルシフェラーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体並びに、上記形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から変異型ルシフェラーゼを採取することを特徴とする変異型ルシフェラーゼの製造法が提供された。そして、本発明の方法により、変異型ルシフェラーゼを効率よく生産することができるので、本発明は産業上極めて有用である。