(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒質中のグルコース濃度を測定する方法において、次の工程：
グルコース含有媒質を、作用電極とカウンタ電極と基準電極とを含む電気化学的センサーと接触させる工程と；
作用電極に約0.10 Vより大きく、約0.40 Vより小さい電位を与える工程と；
センサーの作用電極においてグルコース、酸素及び水からH2O2が発生する時の電流変化率を測定する工程と；
該電流変化率をグルコース濃度値に換算する工程と
を含む方法。
【請求項２】
供給電位が約＋0.35 Vである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
グルコース含有媒質が干渉化合物をも含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
グルコース含有媒質が干渉化合物としてのアセトアミノフェンをも含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
作用電極がアノードであり、カウンタ電極がカソードである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
作用電極とカウンタ電極とが白金黒であり、基準電極がAg／AgClである、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は一般に電気化学的センサーに関し、特に詳しくは、グルコースオキシダーゼに基づく電気化学的センサーの安定化時間と、干渉化合物に対するその感受性とを減ずることによる電気化学的センサーの性能の改良方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電流測定式センサー、特に酵素によるグルコースセンサーの商品化に対する障害の一つはその安定化時間である。安定化時間とは、センサーに電位を最初に与えた後にセンサーからの電流出力が安定値に安定化する（settle)ために必要な時間量である。この時間中に、作用電極とカウンタ電極との表面の電気的二重層が充電され、ファラデー電流反応が確立される。
【０００３】
電流測定式の電気酵素的グルコースセンサーによると、安定化時間は数時間を要することがある。例えば、Koudelka等はin vivo移植後の90分間の安定化時間を報告している（Koudelka, Rohner-Jeanrenaud, Terrettaz, Bobbioni, Rooij & Jeanrenaud、「皮下移植式ミクロ組み立てグルコースセンサーのin vivo挙動」、6 Biosensors & Bioelectronics 31 (1991)）。同様に、Velho等は移植式針型グルコースセンサーの少なくとも1時間の安定化時間を報告している（Velho, Sternberg, Thevenot及びReach、「針型グルコースセンサー中の電極電位のin vitro及びin vivo安定性」、38 Diabetes 164 (1989)）。Rebrin等が製造したin vivoセンサーでは2〜4時間の安定化時間が必要であった（Rebrin, Fischer, Woedtke, Abel及びBrunstein、「糖尿病イヌにおける皮下グルコース濃度の自動化フィードバック制御」、32 Diabetologia 573 (1989)）。他の研究者によっても同様な安定化時間が観察され、報告されている。これらの安定化時間が電流測定式センサーの商品化にとって不利であること、及びこのような安定化時間が緊急治療環境における電気化学的センサーの使用を妨げることは理解することができる。
【０００４】
本発明の1態様では、センサーの作用電極の前処理によって電気酵素的グルコースセンサーの安定化時間を短縮する。このような方法は今までに開示されていないが、電極の電気化学的前処理は他の目的のために知られている。例えば、電気化学的方法を用いて、貴金属電極の表面から汚染物質を除去し、電極の感度と選択性とを高め、そしていくつかの種の化合物の酸化電位をシフトさせてきた。しかし、電流測定式グルコースセンサーの安定化時間を短縮させることを目的としたその電気化学的前処理は、このような処理によっては示唆されず、そして今までに報告されていない。
【０００５】
例えばグルコースのような特定の化合物の濃度の測定に電気化学的センサーを用いることによって経験される他の問題は、身体中の他の化合物の酸化によって生ずる“干渉”である。例えば、in vivo移植中に経験される一般的な干渉化合物には、アスコルビン酸、尿酸、システイン及びアセトアミノフェンがある。これらの干渉化合物は糖尿病患者のグルコースレベルを定量するときに、許容されない、間違った、正の偏り（positive offset)を生じうる。
【０００６】
電気酵素的グルコースセンサーに対する干渉化合物の影響を最少にするために、幾つかの方法が提案されている。例えば、再生セルロース膜又は負に帯電した酢酸セルロース膜が作用電極と電極を被覆する酵素層との間に挿入されている。これらの膜は、過酸化水素が膜層を透過することを可能にするが、例えばアスコルビン酸と尿酸のような干渉化合物は膜のサイズ排除特性および／または電荷排除特性のために通過することができない。
【０００７】
もう一つの方法では、二つの電極を用いる。一方の電極は酸化酵素によって被覆されるが、他方の電極からは酵素は変性するか又は存在しない。二つの電極からの電流出力の差を分析することによって、干渉化合物からの電流が排除される。
【０００８】
干渉化合物に対するセンサー感度を減ずるためのこれらの方法は、付加的な膜および／または電極がセンサーの製造費用を高めるので、魅力的ではない。さらに、干渉化合物を排除するために特別な膜層を含めることはセンサーの反応時間を増加させ、電流出力の大きさを減ずる。
【０００９】
さらに他の方法は酵素のレドックス中心から作用電極の表面まで電子を往復運動させるために、酸素の代わりに、電子受容体として機能することができる化学物質を用いる。これらの化学物質はレドックス仲介体と呼ばれる。この種のセンサーは酸素不感受性であると報告され、嫌気性環境で機能することができる。これらの化合物は低いレドックス電位を有し、これは他の電気活性化合物による干渉の機会を減ずる。残念ながら、これらの化合物はセンサー内部に保持され難く、一部は有毒である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
それ故、電気化学的グルコースセンサーの安定化時間を短縮することによって、そして干渉化合物の存在にも拘わらず1つの目的化合物の正確な読み取り値を与える電気化学的センサーの能力を改良することによって、電気化学的センサーの実用性を改良する方法が必要である。本発明はこれらの必要性に対処する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明を簡単に説明すると、電気化学的センサーの安定化時間と干渉化合物に対する感受性との両方を減ずることによって、電気化学的グルコースセンサーの実用性を改良する方法を提供する。特に、オペレーティング電極への一定電流の供給によってセンサーのオペレーティング電極を前処理することによって、電気化学的グルコースセンサーの安定化時間が改良される。グルコース濃度の測定の実施中にセンサーを低電圧で操作することによって、干渉化合物に対する電気化学的グルコースセンサーの感受性が低下する。
【００１２】
本発明の目的の一つは、安定化時間の短い電気化学的グルコースセンサーを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、干渉化合物に対する電気化学的グルコースセンサーの感受性を減ずる、電気化学的グルコースセンサーの使用方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的と利点は下記の説明から明らかになると思われる。
【００１５】
本発明の原理の理解を容易にするために、次に、好ましい実施態様を参照して、特定の用語を用いて、この好ましい実施態様を説明する。しかし、これによって本発明の範囲の限定が意図されず、ここに説明するような、本発明の変化と他の変更、及び本発明の原理の他の応用が、本発明が属する分野に熟練した人が通常、思いつくものと解釈されることは理解されよう。
【００１６】
本発明は電気化学的グルコースセンサーの性能の改良方法に関する。本発明の1態様では、センサーを液体媒質中のグルコースの測定に用いる前にセンサーの作用電極を電流によって前処理することによってセンサーの安定化時間を短縮する。本発明の他の態様では、このようなセンサーに典型的に供給される＋0.6 Vよりも有意に低い電位で該センサーを操作することによって、干渉化合物に対するセンサーの感受性を減ずる。本発明の第3態様では、上記両方法を連続的に用いることによって、電気化学的グルコースセンサーの性能を改良する。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様に用いられる電気化学的グルコースセンサーは、Mastrototaro、Johnson、Morff、Lipson、Andrew及びAllen（「フレキシブル基体上に製造された電気酵素的グルコースセンサー」、B 5：1-4 Sensors and Actuators 139-44 (1992)）と、Johnson（「縮小型の電気酵素的バイオセンサーの製造のための生体分子の再現可能な電着」、B 5：1-4 Sensors and Actuators 85-89 (1992)）とに記載の方法に従って製造した。小型で、信頼でき、再現可能に製造することができるデバイスを開発するために積層回路製造方法を用いて、グルコースセンサーを製造する。センサーは1プレートにつき28個のセンサーを有する4”×4”プレート4枚のバッチ量で製造される。この加工機構は1992年4月28日発行の米国特許第5,108,819号に詳しく記載されており、この特許の直接関係のある部分はここに参考文献として含まれる。この製造方法を以下に要約する。
【００１８】
センサーのベース基体は50μm厚さ層のDuPont PI-2540ポリイミドである。この層は透明な4”×4”ガラスプレート上に液体ポリイミドをスピンーコーティングし、生ずる層を熱硬化することによって形成される。所望の塗膜厚さが得られるまで、この工程を繰り返すことができる。種々な粘度の数種類のポリイミドが入手可能であり、使用可能である。
【００１９】
クロム-金-クロムの三重層をプレート上にスパッター付着させ、パターン化して、グルコースセンサーの導電層を形成する。クロムは金とポリイミドとの間の接着促進剤として用いられる。金属層は標準写真平板方法を用いてパターン化する。金属の三重層がパターン化されたならば、第2写真平板工程を用いて、クロムを除去して、電極が位置を定める箇所において下方の金を暴露させる。生じる層は、1センサーにつき3個の金電極を有する28個のグルコースセンサーのクロム-金-クロム導電体を形成するようにパターン化された金属被覆から成る。
【００２０】
次に、このプレートを1.2μm厚さの光画像形成性(photoimageable)ポリイミド絶縁層（DuPont PI-2703D）によって被覆し、この層をパターン化して、下方の金電極の活性領域を暴露する。各プレート上に液状のポリイミドをスピン-コーティングする。次に、この層を予備焼成し、UVに暴露させて層をパターン化し、噴霧現像し(spray developed)、すすぎ洗いし、熱硬化する。
【００２１】
これらのプレートを蒸留脱イオン（DI）水中に8〜24時間浸漬して、ガラスプレートからセンサーのシートを剥離する。この操作は水を沸騰させることによって促進することができる。ガラスプレートから完全に剥離されたならば、センサーシートを1枚につき7センサーから成る“1／4シート”に切り分ける。次に、これらのセンサーの顕微鏡検査を実施して、どのデバイスが構造的に完全であるかを判定する。欠陥のあるセンサーは適切に記録し、以後の操作に進めない。
【００２２】
センサーの作用電極とカウンタ電極とを白金黒によって電気めっきし、基準電極はAg／AgClによってめっきする。次に、以下に述べる電着方法を用いて、作用電極上にグルコースオキシダーゼを再現可能に付着させる。この方法は1992年11月24日発行の米国特許第5,166,063号に述べられており、この特許の直接関係のある部分はここに参考文献として含まれる。この製造方法を以下に要約する。ウシの血清アルブミンを同時に付着させるが、これはより安定な層を生ずる。この層をグルタルアルデヒド溶液中で架橋させる。センサー全体を異なる透過性の生体適合性外膜によって被覆する。この特有の(proprietary)膜は酸素に対してグルコースよりも2〜3桁大きく透過性であり、“酸素効果”を補償する。この膜を溶剤溶液中に溶解し、センサーシート上にスピン-コーティングし、風乾させる。
【００２３】
基本的センサー製造の最終工程は個々のセンサーの切り離しである。現在、各センサーは小刀の刃を用いて手でシートから切り離されている。センサーの移植される部分はその最終形状において約2.5 cm長さ、0.28 mm幅、0.06 mm厚さである。
【００２４】
電極に酵素被膜を電着させるために、溶剤としてリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）を用いて、グルコースオキシダーゼの5重量％溶液を調製する。グルコースオキシダーゼを撹拌によって溶解する際に、グルコースオキシダーゼを変性させる可能性がある、溶液の泡立ちを防止することが重要である。電着槽にこの溶液を充填し、酵素を付着させるべき電極とカウンタ電極との両方を槽中に沈める。ガルバノスタットへの電気的接続を形成し、5 mA／cm2の一定電流密度が電極表面に生ずるように電流を供給する。電極表面に正の電荷を生ずる方向に、電流の流れを配向させて、負に荷電したグルコースオキシダーゼ分子を引き付ける。電流を2分間供給する。作用電極の実際の電圧はインピーダンスによって変化する。酵素溶液から電極を取り出し、脱イオン蒸留水中に撹拌せずに5秒間沈めて、残留グルコースオキシダーゼを除去する。この後に、リン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）中に2.5容量％のグルタルアルデヒドを含む溶液中にこの電極を30分間沈めて、グルコース分子を共に共有結合的に架橋させ、水に不溶な層を形成する。グルタルアルデヒドの架橋はグルコースオキシダーゼが溶液中に戻るのを防止する。この電極を再び脱イオン蒸留水中に5秒間沈めて、30分間風乾させる。バイオセンサーの酵素要素はこの時点において機能的である。
【００２５】
本発明の1態様では、センサーの作用電極を測定を行う環境に配置した後に、この電極に電流を供給することによって、センサーの作用電極を前処理する。問題の物質の存在又は濃度の測定にセンサーを用いる前にセンサーの1個以上の電極に制御された電流を供給する。電流は電極の安定化時間を有意に減ずるために充分な密度で、充分な時間供給する。一定電流を一定電流密度で供給することが好ましい。しかし、供給時間にわたる電流と密度との僅かな変化が許容されること、及びパルス電流、傾斜(ramping)電流、又は循環電流が使用可能であることは察知されよう。
【００２６】
時間と電流量とは、このような前処理を行わない場合の安定化時間を減ずるように選択される。典型的には、少なくとも約20％の安定化時間短縮が特に望ましく、ある種のセンサーの達成可能な安定化時間短縮は実質的にこれ以上である。安定化時間の如何なる短縮も有益であり、本発明によって含まれる。ここでさらに説明するように、安定化時間は場合によって2〜3時間から約5〜10分間までに短縮される。安定化時間のこのような短縮は、例えば急性病治療環境において、特に重要になる可能性がある。特定のセンサーに付随する問題、すなわち組織内でのその操作又は適当な装着に関する問題がある場合にも、有用性が注目される。他の場合には、ことによると必要な24時間から1時間への安定化時間短縮が非常に有益である。
【００２７】
現在までの実験では、負電流を用いること及びこの電流を一定密度で供給することが好ましい。約0.1 mA／cm2〜約1.0 mA／cm2の電流密度を有する負電流が好ましく、今までに用いたセンサーでは約0.5 mA／cm2の電流密度が最も好ましい。典型的に約1分間〜約10分間の時間、電流は供給され、約2分間の前処理時間が最も好ましい。
【００２８】
この電気（ガルヴァーニ）的前処理を実施する場合に、前処理済みセンサーの安定化時間は約2時間から約10分間までに短縮される。安定化時間のこの短縮は、2時間の安定化時間を許容することができない緊急治療事態において特に高く評価される。
【００２９】
本発明の他の態様では、電気化学的グルコースセンサーを、このようなセンサーに通常供給される0.6 Vよりも有意に低い電位を用いて操作する。約0.3 V〜約0.4 Vの電位によってセンサーを操作すると、例えばアセトアミノフェンのような化合物の酸化によって生ずる電流が有意に減少し、それによって体内のこのような化合物によって生ずる干渉が最少になり、グルコース反応の大きさに有意な影響を及ぼさないことが判明している。
【００３０】
【実施例】
次に、上記方法を用いる特定の実施例を述べる。好ましい実施態様をさらに詳しく説明するために、これらの実施例を記載すること及びこれらの実施例によって本発明の範囲の限定が意図されないことを理解すべきである。
【００３１】
実施例1
未処理電気化学的グルコースセンサーを、その“正常な”安定化時間に関して次の手順で評価した。この実施例では、センサーの安定化時間をin-vitroで測定した。
【００３２】
グルコースセンサーは、上記で略述した手順に従って、クリーンルーム設備において製造した。得られたセンサーは白金黒の作用電極とカウンタ電極、及びAg／AgCl基準電極を有した。作用電極の表面積は約0.1 mm2であった。作用電極の表面に約5μm厚さの、グルコースオキシダーゼとウシ血清アルブミンとから成る層を電着させ、グルタルアルデヒドによって架橋させた。
【００３３】
これらの3電極の表面上に、特有の外膜物質を塗布した。しかし、本発明は膜もしくはいずれかの特定の膜の使用に限定されず、選択した膜は単に、この実施例に用いる電極に対して好ましい実施態様として選択したものである。
【００３４】
この外膜は酸素とグルコースとに対して透過性の均質な膜であり、ジイソシアネートとポリ（エチレンオキシド）と脂肪族ジオールとの反応生成物として製造されるポリウレタンから成るものであった。この種の膜は1991年10月4日に出願された、「電気化学的グルコースセンサーのための親水性ポリウレタン膜」なる名称の米国特許出願第07／771,658号に述べられている。この参考文献の直接関係ある部分は参考文献としてここに含まれる。このようなポリマーはそれらの乾量の10〜50％の水を吸収することができ、かつ約4000までの酸素拡散係数／グルコース拡散係数の比を有する。
【００３５】
全てのin vitro実験は37℃において実施し、この温度をPolystatR浸漬サーキュレーターと水浴とによって維持した。出力は2チャンネルストリップチャート記録計に記録したか、又はアナログ／ディジタル（A／D）変換可能なデータ収集ボードを含むパーソナルコンピュータに集積し、記録した。データを同時にモニターに表示し、通常のソフトウェアパッケージを用いてハードディスクに記録した。
【００３６】
全てのin vitro実験は支持電解質溶液としてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて実施した。この溶液は25℃において7.4のpHを有した。このPBSに防腐剤としてアジ化ナトリウム（1.5 mM）を加えた。グルコース溶液（10,000 mg／dl）ストックはデキストロースから調製し、使用前に一晩放置して、変旋光を生じさせた(mutarotate)。ストック溶液のアリコートをPBSに加えて、正常な生理レベルに近似する、100 mg／dlのグルコース濃度を有する溶液を形成した。in vivo注入に用いた無菌グルコース溶液（0.5 g／ml）は入手したままで使用した。
【００３７】
未処理センサーの正常な安定化時間を試験するために、センサーをグルコース溶液中に入れ、このセンサーに電位を供給した。時間に関する電流の変化を記録し、図2におけるようにグラフに表した。さらに詳しくは、この試験を100 mg／dlのグルコース溶液中、37℃において実施し、＋0.6 Vの電位を供給した。上述したように、このグルコース濃度は正常な生理レベルにほぼ等しく、該電位はこのようなセンサーに通常用いられる電位と同じであった。
【００３８】
図2は、センサーが初期分極後に安定化する際のセンサー電流出力の時間に関する変化のグラフである。このグラフから知ることができるように、このセンサーは＋0.6 V電位の供給後の約1.5時間目に完全に安定化するように思われる。図2の作成に用いたセンサーと同じ方法で製造された他のセンサーは、イヌ、ウサギ及びヒトの皮下組織に移植した場合に、安定化に2〜4時間を要することが判明した。
【００３９】
実施例2
電気化学的グルコースセンサーを下記手順に従って前処理して、安定化時間を短縮した。この実施例では、前処理の効果をin vitroで測定した。
【００４０】
グルコースセンサーは上記で略述したように製造した。他の装置と試薬も実施例1に述べたように用意した。
【００４１】
電気（ガルヴァーニ）的前処理を評価するために、センサーがグルコース溶液中に在る時に、一定電流を2分間供給した。次に、直ちにセンサーに電位を供給し、安定化時間を測定した。詳しくは、電位を与える前に、センサーを約-0.5 mA／cm2（-516 nA）の一定電流で2分間処理した。試験は100 mg／dlグルコース溶液中、37℃において実施し、電極の前処理後に＋0.6 Vの電位を供給した。
【００４２】
図3は前処理済み電極の安定化時間のグラフであり、＋0.6 Vにおける初期分極の直後からの、時間に関する電流出力を示す。このグラフから知ることができるように、100 mg／dlグルコース溶液中で前処理済みセンサーの安定化時間は10分間未満であった。
【００４３】
センサーに供給される電流量と電流の流れの方向は、電気（ガルヴァーニ）的前処理後のセンサーの安定化時間に基づいて最適化した。センサーの作用電極に電流を供給する時間の長さは、試験を通して、2分間に一定に維持した。供給電流が負である時にこの前処理は有益であることが判明した。実験に用いたポテンシオスタット／ガルバノスタットは米国極性協定(American Polarity Convention)に従うものであるので、作用電極はアノードであった。センサーのカウンタ電極は前処理中にカソードとして用いられた。センサーに正の電位を与える場合にも作用電極はアノードであるので、作用電極に負電流を供給することの有益な効果は理論に適っている。逆に言えば、例えばClark酸素電極のような、作用電極における還元反応に基づくセンサーは正電流を用いる電気（ガルヴァーニ）的前処理から利益を得ることが仮定される。
【００４４】
供試センサーの性能に基づいて、電流密度も最適化した。5.0 mA／cm2の密度はセンサーにとって高すぎ、金属導電体の振動(rippling)を生ずることが判明した。図2に示すように、0.5 mA／cm2の電流密度の2分間供給では有益な結果が観察された。
【００４５】
実施例3
電気化学的グルコースセンサーを下記手順に従って前処理して、安定化時間を短縮した。この実施例では、前処理の効果をin vivoで測定した。
【００４６】
グルコースセンサーは上記で略述した手順に従ってクリーンルーム設備中で製造した。付加的な装置と試薬も上記in vitro実施例に述べたように用意した。
【００４７】
これらの試験に用いた動物モデルは目的交配した雑種(purpose-bredmixed breed)イヌ（16-22 kg）であった。流体の注入を行うための静脈カニューレと、分析用の血液サンプルを採取するための動脈カニューレとを動物に外科的に移植した。センサーの移植中とこの方法の評価中に、これらのイヌをペントバルビトールナトリウムによって麻酔した。
【００４８】
移植前に、予め熱シールして閉じた先端11を有する二重腔ポリエチレンカニューレ10の内側の第1腔にセンサーを挿入した。このカニューレの壁に開口12を切り開け、センサーの電極13、14、15の活性表面を移植後の周囲組織に暴露させた（図1参照）。カニューレの第2腔には、移植中に剛性を与えるために一本の27ゲージ針体を充填した。全センサーアセンブリを2.5 MRadでのEビーム照射によって滅菌した。
【００４９】
センサーをイヌの腹部の皮下に移植した。18ゲージ針（3.8 cm長さ）を皮下組織に挿入し、直ちに取り出して、センサーのためのトンネルを形成した。このトンネルにセンサーを挿入した後に、27ゲージ針体をカニューレから取り出し、センサーを皮膚にテープで固定した。あつらえのコネクターを用いて、センサーの3本のリードとの電気的接続を形成した。
【００５０】
移植後に、-500 nA（0.5 mA／cm2）の電流を作用電極に2分間供給した。この前処理後、直ちに＋0.6 Vの電位をセンサーに与えた。図3に示すように、このセンサーの安定化時間は5分間未満であった。
【００５１】
センサーが安定化したならば、無菌グルコース溶液のボラス（イヌ体重1 kgにつきグルコース50 g）の静脈内注射によってイヌの血中グルコース濃度を上昇させて、適切なセンサー機能を実証した。図4はボラス注射後のセンサーの適切な機能を説明する。このイヌから取り出した後のセンサーの顕微鏡検査はこの処理の不利な影響がないことを示した。特に、導電体の離層又は膜の泡立ちは観察されなかった。この手順をイヌにおいて24個のセンサーを用いて、さらにウサギにおいて4個のセンサーを用いて繰り返して成功した。全ての場合に、前処理済みセンサーについて約15分間未満の安定化時間が観察された。
【００５２】
前記実施例から、一定電位を与える前に一定電流を供給することがセンサーの安定化時間を短縮することを知ることができる。この有益な効果は一定電位を与えた未処理センサーの安定化中の電流の指数関数的な低下によると仮定される。例えば、未処理センサーの作用電極を通過する電流は、電気（ガルヴァーニ）的処理工程中の比較センサーの作用電極を通過する電流よりも有意に少ない。特に、図2から、分極後の最初の2分間中に未処理センサーの作用電極において測定される電流量は、2分間の前処理工程中に比較電極に供給される500 nAよりもはるかに少ないことが分かる。作用電極表面の電流量は二重層が形成され、電極が分極される速度を制御するように思われる。
【００５３】
同様に製造し、前処理したセンサーに関しても、in vitro試験とin-vivo試験に用いた場合に安定化時間の差が観察されることも知ることができる。例えば、図3は10分間に僅かに満たないin vitro安定化時間を示すが、イヌに移植したセンサーでは約5分間の安定化時間が観察された（図4参照）。この差は異なる環境における個々の電極間のインピーダンスの差によると仮定される。
【００５４】
本発明の他の実施態様では、干渉化合物の影響を最少にするために、電気化学的グルコースセンサーを低い電位において操作する。グルコースセンサーは典型的に約＋0.6 Vの電位において操作されるが、問題の物質以外の化合物の酸化からの干渉電流がこのような電位において観察されることがある。従って、グルコースに対するセンサーの感度に不利な影響を与えずに、干渉化合物の酸化によって発生する電流を最少にする、電気化学的センサーの使用方法を開発することが有利である。従って、本発明のこの第2態様では、例えばアセトアミノフェンのような干渉化合物の酸化を最少にするために、約＋0.4 V未満の電位においてセンサーを操作する。この方法によってグルコース酸化に対するセンサー感度は損なわれないが、アセトアミノフェン酸化に対するセンサー感度は有意に低下することを知ることができる。
【００５５】
実施例4
干渉化合物の影響を最少にするために、電気化学的グルコースセンサーを低い電位において操作する。この方法は特に、アセトアミノフェンの影響を最少にすることができるために評価された。この実施例では、この方法の効果をin vitroにおいて測定した。
【００５６】
グルコースセンサーは前述したように製造した。付加的な装置と試薬も上記実施例で述べたように用意した。
【００５７】
全てのin vitro実験はPBS溶液を充填した100 mlビーカー中にセンサーを入れ、このビーカーを37℃にセットした恒温水浴中に入れることによって実施した。グルコース溶液（100 mg／dl）とアセトアミノフェン溶液（4 mg／dl）は各化合物の濃縮溶液をPBSに加えることによって調製した。このグルコース濃度は正常な生理的グルコースレベルに大体等しいが、このアセトアミノフェン濃度は正常生理的レベルの2倍である。
【００５８】
最初に、PBS溶液とグルコース溶液とにおけるセンサーからの電流出力を＋0.60 Vと＋0.35 Vとの供給電位を用いて調べた。表1は各々の電位又は溶液濃度が変化した後に安定化するまでの充分な時間量後の2種の電気化学的グルコースセンサーからの電流出力を示す。これらの試験は、100 mg／dlグルコース溶液中ではセンサーからの電流出力がほぼ等しいことを示す。このことは、＋0.35 Vの低い供給電位が過酸化水素の電気化学酸化曲線のプラトーにまだ存在することを実証する。
【００５９】
【表１】
0003715910.tif 000002
【００６０】
表1は、センサーの一つでは37℃、PBS中で基底電流が＋0.60 Vと＋0.35 Vの電位の供給によるものであることを示す。＋0.35 Vの供給電位によって観察される低い電流はオーム（Ohm）の法則によって説明することができる。
【００６１】
＋0.35 Vの供給電位によって観察される肯定的な結果をさらに調べるために、循環式ボルタンメトリーを用いて、最適供給電位を選択した。図5は生理的グルコース溶液と、生理的レベルの約2倍のアセトアミノフェン濃度を有するアセトアミノフェン溶液とのボルタモグラムの前方スキャン部分を示す。アセトアミノフェンの増強されたレベルを用いて、電流シグナルを増幅し、可能な治療有効レベルを模倣した。PBS溶液からの基底ボルタモグラムをグルコースとアセトアミノフェンのボルタモグラムから差し引いた。これらのボルタモグラムはグルコース酸化の好ましいプラトーと、高い供給電位におけるアセトアミノフェン酸化による電流レベル上昇との両方を説明する。
【００６２】
グルコースを検出し、かつ干渉化合物、特にアセトアミノフェンの影響を最少にするための最適供給電位の選択を、アセトアミノフェン酸化電流／グルコース酸化電流の比を供給電位の関数として調べることによって実施した。図6は供給電位が＋0.3 Vから＋0.7 Vまで変化する時のこの比を説明する。このグラフから、＋0.6 Vの供給電位が、＋0.35 V電位を供給した場合に生じるよりも、干渉化合物の酸化からの電流をより多く生ずることが分かる。しかし、約＋0.4 V未満のような低い電流レベルでは、アセトアミノフェン酸化によって生ずる電流がグルコース酸化によって生ずる電流に比べて有意に大きくはない。それ故、このグラフは、他の化合物からの干渉を最少にするために約＋0.4 V未満の電圧を用いることの実用性を実証する。
【００６３】
このセンサーの顕著に長い72時間寿命にわたるセンサー機能の長期間安定性もその満足できる性能にとって重要である。センサーの長期間安定性はin vitro又はin vivoのいずれかの1回のキャリブレーションが全試験期間にわたって正確であるために必要である。しかし、このセンサーの顕著に長い寿命にわたって変動（ドリフト）が観察されないとは思われない。むしろ、このようなドリフトが妥当なかつ予測可能な範囲内であることのみが必要である。＋0.60 Vの電位を供給された電気化学的グルコースセンサーの長期間ドリフトは72時間の試験期間にわたって5％未満であることが今までに判明している。
【００６４】
実施例5
約＋0.35 Vの電位におけるセンサー操作の長期間安定性を実証するために、センサーを37℃においてグルコース溶液（100 mg／dl）中に沈め、＋0.35 Vの供給電位において90時間操作した。このセンサーの長期間ドリフトを観察し、この期間にわたって記録した。
【００６５】
図7は上記のように操作したセンサーからの電流出力を示す。このグラフから分かるように、これらの条件下でのこのセンサーの長期間ドリフトは5％未満であった。このような長期間ドリフトは許容される範囲であり、Ag／AgCl基準電極の電位のドリフトが過酸化水素酸化のプラトーから、作用電極によって見られる“実際の”電位を移動させるほどに実質的に充分でないことを実証する。このドリフトが作用電極によって見られるその電位を過酸化水素酸化のプラトーから移動させるほど実質的な大きさであるならば、センサー出力の負のドリフトが観察された筈である。
【００６６】
下記実施例では、干渉化合物の影響を最少にするために低電位において電気化学的グルコースセンサーを操作する。特に、この方法をアセトアミノフェンの干渉影響を最少にすることができることに関して評価する。これらの実験において、この方法の効果をin vivoにおいて測定する。
【００６７】
これらの試験に用いた動物モデルはニュージーランド白ウサギであった。流体の注入を促進するための静脈カニューレと、分析用の血液サンプルを採取するための動脈カニューレとをウサギに外科的に移植した。移植部位の選択に動物の正常な姿勢を考慮することができるように、センサーの挿入前に動物を回復させた。
【００６８】
移植前に、予め熱シールして閉じた先端を有する二重腔ポリエチレンカニューレの一つの腔にセンサーを挿入した。このカニューレの壁に開口を切り開け、センサーの活性電極表面を移植後の周囲組織に暴露させた（図1参照）。カニューレの第2腔には、移植中に剛性を与えるために一本の27ゲージ針体を充填した。
【００６９】
センサーを肩甲骨の間又は最後方肋骨近くの腰筋部上方の皮下組織内に移植した。移植部位はセンサー挿入前に局部麻酔薬のリドカインによって準備した。18ゲージ針（3.8 cm長さ）を皮下組織に挿入し、直ちに取り出して、センサーのためのトンネルを形成した。このトンネルにセンサーを挿入した後に、27ゲージ針体をカニューレから取り出し、センサーを皮膚に縫合した。センサーの移植中及びデータの回収中にウサギは拘束箱(restrainer)内に保持した。
【００７０】
あつらえのコネクターを用いて、センサーの3本のリードとの電気的接続を形成した。＋0.60 V又は＋0.35 Vの電位を供給した。この試験では、前処理工程を用いず、その代わりに、最初の分極後約2時間センサーを安定化させた。これは該局部麻酔薬の効果を沈静させるための充分な時間を可能にした。
【００７１】
各グルコース注入試験の期間を通して、動脈血サンプルを15分間隔で採取した。サンプルを遠心分離させ、得られた血漿のグルコース濃度を測定した。血液サンプル採取時のセンサーからの電流出力を記録し、以後の分析に用いた。2種類の速度（15 mg／kg／分と30 mg／kg／分）において無菌グルコース溶液を一定に静脈内注入することによって、ウサギの血中グルコース濃度を上昇させた。
【００７２】
in vivo移植前にセンサー上のグルコースオキシダーゼを変性させることによって、干渉化合物の酸化のみによるセンサーから発生する実際の電流量を測定した。この酵素は沸騰水中に5分間沈めることによって不活化させた。この不活化は生理的グルコース溶液中でのin vitro試験によって実証した。このセンサーに対するアセトアミノフェンの影響は、ウサギにおいて約15 mg／dlの濃度を生ずるようなボラスの注入によって試験した。このグルコース濃度レベルは正常な生理的レベルの約7倍である。
【００７３】
実施例6
ウサギの皮下組織中に事前にキャリブレートした（in vitro）センサーを移植することによって、該センサーのin vivo性能を評価した。正常な基底グルコース濃度レベルにおいて定常な電流出力に達してから、濃縮グルコース溶液を注入して、血中グルコースレベルを評価した。in vitro試験からのキャリブレーション式を用いて、皮下組織中のセンサーからの電流を見かけのin vivoグルコース濃度に換算した。次に、この血漿グルコース濃度を、動脈血サンプルの採取時にセンサーによって表示された見かけのグルコース濃度と相互に関連づけた。
【００７４】
図8は、血漿グルコース濃度対＋0.60 Vの供給電位によってセンサーから導出された見かけのグルコース濃度の相互関係プロットである。このセンサー性能は3変数の中の2変数に関して許容されると思われる。勾配は1.0にほぼ等しく（m＝0.97）、反応は実際に線形である（R2＝0.98）。残念ながら、Y-切片値（b＝30.98 mg／dl）によって実証される正の偏りが存在する。この偏りは100 mg／dlの生理的グルコースレベルに対して約30％の誤差を生じ、これは大抵の臨床医によって許容されると考えられる10％誤差よりも明らかに大きい。
【００７５】
図9は、供給電位を＋0.35 Vに設定した以外は、図8と同様な相互関係プロットである。この実験は図8に表したデータの作成に用いたウサギと同じウサギを用いたので、in vivoで検出される干渉化合物の濃度は各試験において同じであると想定することができた。このセンサーのin vivo性能は、偏り（Y-切片）が3 mg／dlに減少し、線形相互関係と、ほぼ同じ勾配とが保持されたので、許容されるものであった。この実験は、in vivoで干渉化合物の酸化によって生じた電流を、付加的な排除膜、電極、酵素又は仲介体を用いずに、許容レベルに減ずることができることを示唆する。さらに、血漿グルコース値とセンサーによって皮下組織中で測定されたグルコース濃度との間で示された良好な相互関係は、皮下組織中でのグルコース値監視の有効性と正確さとを実証する。
【００７６】
実施例7
この仮定をさらに試験するために、上記実験に用いたセンサーと同じセンサーを沸騰水中に入れて、グルコースオキシダーゼを変性させた。このプロセスによって酵素を不活性にし、センサーによって発生する電流がグルコースによるものではないことを確実にした。従って、出力はバックグラウンドと干渉酸化電流とのみの組合せである。
【００７７】
表2はそのグルコースオキシダーゼ層が不活化された典型的なセンサーからのin vivo電流を示す。＋0.60 Vの電位によって発生する“基底”電流は、表1に示すような、PBS中で通常見られるin vitro基底電流値よりも高い。約3.5 nAのこの差は作用電極における干渉物の酸化によると考えられる。これに反して、供給電位を＋0.35 Vに減じた場合には、この同じセンサーは0.6 nAの電流出力を有した。この電流値は、表1に示した＋0.35 Vに対するPBS中でのin-vitro基底電流値にほぼ等しく、供給電位の低下が干渉化合物の酸化からの寄与と生ずる誤差とを減少させることをさらに実証する。
【００７８】
【表２】
0003715910.tif 000003
【００７９】
実施例8
ウサギの静脈カニューレ中にアセトアミノフェンボラスを注入し、センサーの反応を監視することによって、さらに証拠が得られた。このボラスはウサギ中のアセトアミノフェン濃度を約15 mg／dlだけ高めたが、この値は正常な生理的レベルの約7倍である。すなわち、この薬物の一部が皮下組織中への拡散前に代謝される可能性を考慮して、大きいボラスを投与した。表2に示すように、アセトアミノフェンの同じ注入後のセンサーからの電流出力の増加は、2種類の供給電位値では全く異なるものであった。＋0.60 Vの供給電位値でのアセトアミノフェンボラスによる電流の増加は、＋0.35 Vのみの電位をセンサーに供給した場合に測定される電流の増加の約18倍であった。
【００８０】
上記実施例は、in vivo用途に設計された電流測定式電気化学的グルコースセンサーでは供給電位を＋0.60 Vから＋0.35 Vに減ずることによって、グルコースに対する反応に影響を与えることなく、干渉化合物の影響を大きく減ずることができることを示す。これは付加的な膜層、電極、酵素又は仲介体を必要とすることなく、達成される。in vitroで実施した実験は、この方法がアセトアミノフェンの影響を減ずるために有効であることを実証した。生物学的に生ずる干渉物の全てを含めたin vivo実験は、この研究結果を実証した。
【００８１】
基本的発明を変更することなく、上記実施態様に述べた本発明に適合する幾つかの変更が考えられ、本発明に含められる。それ故、本発明を上記実施例において例示し、詳述したが、これらの実施例は例示と見なすべきであり、かつ性格において非限定的であると考えるべきである。好ましい実施態様を示し、説明したが、本発明の要旨に含まれる、あらゆる変化及び変更が保護されるように意図されることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、好ましい１態様による本発明の電気化学的グルコースセンサーの透視図である。
【図２】  図2は、37℃の100 mg／dlグルコース溶液中の未処理センサーによる+0.60 Vでの初期分極直後からの、時間に関する電流出力を示す、未処理電極の“正常”安定化時間のグラフである。
【図３】  図3は、37℃の100 mg／dlグルコース溶液中の前処理済みセンサーによる+0.60 Vでの初期分極直後からの、時間に関する電流出力を示す、前処理済み電極の安定化時間のグラフである。センサーは電位の供給の前に一定電流（-516 nA）によって2分間処理した。
【図４】  図4は、麻酔したイヌの皮下組織中に移植された前処理済みセンサーによる+0.60 Vでの初期分極直後からの、時間に関する電流出力のグラフである。このセンサーの適切な機能を実証するために、分極後10分間後に静脈グルコースボラスを注入した。
【図５】  図5は、37℃のグルコース溶液（100 mg／dl）とアセトアミノフェン溶液（4 mg/dl）中で5 mV／秒において+0.3 Vから+0.7 Vまでをスキャンすることによって作成したボルタモグラムの前方スキャン部分を示す。PBS緩衝液のためのバックグラウンドスキャンは各ボルタモグラムから差し引いた。
【図６】  図6は、供給電位の範囲にわたるアセトアミノフェン酸化電流／グルコース（過酸化水素）酸化電流の比のグラフである。
【図７】  図7は、+0.35 Vの電位を供給する場合のセンサーの長期間性能安定性を説明する、37℃の100 mg／dlグルコース溶液中のセンサーによる時間に関する電流出力のグラフである。
【図８】  図8は、血漿グルコース濃度／+0.60 Vの電位の供給時のセンサーによって測定される皮下グルコース濃度の相関プロットである。
【図９】  図9は、血漿グルコース濃度／+0.35 Vの電位の供給時のセンサーによって測定される皮下グルコース濃度の相関プロットである。
【符号の説明】
10.  二重腔ポリエチレンカニューレ
12.  開口
13.  電極
14.  電極
15.  電極
【図１】
0003715910.tif 000004
【図２】
0003715910.tif 000005
【図３】
0003715910.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
0003715910.tif 000009
【図７】
0003715910.tif 000010
【図８】
0003715910.tif 000011
【図９】
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