(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液がＣ型肝炎ウイルスからの配列領域、特にＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からの配列領域を含む少なくとも１個のポリペプチドとともにインキュベートされ、そして抗体が該ポリペプチドへの結合により検出される、試料液中のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体の免疫学的測定方法において、ポリペプチドが少なくとも１個のシステイン残基を含む領域から使用され、そして抗体の測定はスルフヒドリル試薬の存在下実施される方法。
【請求項２】
ＨＣＶに対する抗体が測定される、ＨＣＶセロコンバージョンの早期認識のための方法であって、該ＨＣＶに特異的な抗体と免疫学的に反応性である、ＮＳ３領域に由来する少なくとも１つのＨＣＶポリペプチドと被検体から採取した試料をインキュベートし、還元状態で該抗体の該ポリペプチドへの結合を測定して、該検体中のセロコンバージョンを認識することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質３（ＮＳ３）領域からのポリペプチド、かかるペプチドをコードする核酸並びに免疫学的試験方法における抗原として又はヘリカーゼタンパク質としてのこのポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ肝炎といわれる病気は、多くの場合Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる。ＨＣＶはそのゲノムが約９から１０，０００個の塩基から成る一本鎖被包性の（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）ＲＮＡウイルスである。このゲノムは、構造タンパク質（コア及びエンベロープタンパク質）並びに非構造タンパク質をコードする。ＨＣＶの非構造タンパク質３（ＮＳ３）領域は、プロテアーゼ及びヘリカーゼを含む。プロテアーゼ活性は、ＮＳ３領域の第三アミノ末端（ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｈｉｒｄ）に存在する。
【０００３】
ＨＣＶの部分ヌクレオチド配列はヨーロッパ特許出願第３１８  ２１６号明細書に開示されている。この出願はのためのＨＣＶからの核酸フラグメント又はポリペプチドフラグメントの診断試験及び治療処置への使用を特許請求している。
【０００４】
ヨーロッパ特許出願第４５０  ９３１号明細書は、ＨＣＶの完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を開示している。さらに、Ｃドメインからの第１のＨＣＶ抗原及び非構造ドメインＮＳ３，ＮＳ４又はＮＳ５及びエンベロープドメインＳの１つからの少なくとも１個の他のＨＣＶ抗原を含む合成ＨＣＶ抗原の組み合わせが記載されている。ドメインＮＳ３からの好適な抗原は、ヨーロッパ特許出願第４５０  ９３１号明細書の第１図に示されるＨＣＶゲノムのアミノ酸１１９２から１４５７を含むＣ３３といわれる抗原である。
【０００５】
国際特許出願第ＷＯ９２／１１３７０号は、ＨＣＶゲノムからの種々のポリペプチドのクローニング及び配列決定並びに試験キットにおける外来タンパク質部分のないこれらのポリペプチドの使用及びワクチンとしてのこれらのポリペプチドの使用に関する。寄託番号６８４７で“ドイッチェ  ザムルング  フューア  ミクロオルガニズメン  ウント  ツェルクルツーレン  ＧｍｂＨ，マッシェルオーデル  ベーク
１ｂ，３８１２４  ブラウンシュバイク，ＢＲＤ（ＤＳＭ）  ”に、この出願に関連して寄託されたクローンＮＳ−３は、ＨＣＶのＮＳ３領域からの  ５２７個のアミノ酸のポリペプチドに関する遺伝子情報を含んでいる。
【０００６】
森らは（日本，Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ８３  （１９９２），  ２６４−２６８）、抗原としてウイルスタンパク質を使用して血中におけるウイルス抗体を検出することによるＨＣＶ感染の診断学的検出を記載している。これらのＨＣＶタンパク質は、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として大腸菌内で発現される。ＨＣＶゲノムの第１２９５番目から１５４１番目のアミノ酸を含むＮＳ３領域からのタンパク質は、高い感受性を示した。しかしながら、この融合タンパク質の欠点は、融合タンパク質部分との交差反応が生じ、これが試験反応の特異性を減少させることである。
【０００７】
血中におけるＨＣＶ試験は、試験における高度の特異性及び感受性を必要とする。さらに、試験で使用される抗原は高収率で発現可能であり、かつ安定でなければならない。ＨＣＶゲノムからの既知の抗原は、上述の要件の１つ又は幾つかを満足しないという欠点を有する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このため、本発明の目的は、上記の公知技術の欠点が少なくとも部分的に除かれ、特に既知の抗原に比較して、一層高い特異性及び感受性を有し、高収率で発現可能でありかつ安定である、ＨＣＶゲノムからのポリペプチドを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この目的は、Ｃ型肝炎ウイルスのアミノ酸１２０７±１０から１４８８±１０から成り、２０未満の、好ましくは１５未満の外来アミノ酸を有するポリペプチドにより達成される。本発明のポリペプチドは、ヨーロッパ特許出願（ＥＰ−Ａ）第４５０  ９３１号明細書の第１図で言及されている番号付与において、好適には１２０７±５から１４８８±５、特に好適には１２０７±２から、１４８８±２、そして最も好適には１２０７から１４８８のＣ型肝炎ウイルスのアミノ酸を含有する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、任意のＨＣＶ単離物、例えばヨーロッパ特許出願第４５０  ９３１号明細書に記載されているようなヌクレオチド配列を有するＨＣＶ単離物に由来することができる。しかしながら、好適にはポリペプチドは、寄託番号ＤＳＭ  ６８４７で“ドイッチェ  ザムルング  フォン  ミクロオルガニズメン  ウントツェルクルツーレン  ＧｍｂＨ”（ＤＳＭ），  マッシェルオーデル  ベーク  １ｂ，  ３８１２４ブラウンシュバイクに寄託され国際出願ＷＯ９２／１１３７０にクローンＮＳ３と記載されているＨＣＶ単離物に由来する。本発明のポリペプチドは、特に好ましくは、ベクターｐＵＣ−Ｄ２６の組換え発現により得ることができる。
【００１１】
配列番号１は本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜１３は外来アミノ酸である。アミノ酸１４〜２９５はＨＣＶ起源である。本発明のポリペプチドは、特に好ましくは配列番号１及び２に示されているアミノ酸配列のアミノ酸１４〜２９５又は少なくとも９０％がこれに相同であるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明は、また、少なくとも１個のマーカー基を含む先に定義したポリペプチドに関する。試験システムで検出できるすべての既知のマーカー基、例えば直接又は間接的に検出しうるマーカー基が、マーカー基として考慮される。これに関連して、直接に検出しうるマーカー基とは、直接に検出しうる信号、即ち放射性基、酵素基、発光基、金属複合体等を生成する基として理解される。一方、マーカー基は、順番に信号発生基を有する適当な結合パートナー（ストレプトアビジン、アビジン又は抗−ハプテン抗体）と反応して検出しうる、間接的に検出できる基、例えばビオチン又はハプテン基であってもよい。マーカー基は、既知の態様で例えば二官能性スペーサーにより抗原に結合できる。マーカー基をペプチド抗原に結合させるためのかかる方法は、免疫学の領域における当業者に知られており、ここで詳細に記載する必要はない。
【００１３】
本発明のポリペプチドは好ましくは１から１２、特に好ましくは３から７個のマーカー基を有する。
【００１４】
加えて、本発明はシステイン残基から派生する１又は数個のスルフヒドリル基が共有結合的に修飾された形態で存在する上述のポリペプチドに関する。適当な共有結合的に修飾する基の例は、マレイミドジオキサオクチルアミン（ＭＡＤＯＯ）、Ｎ−メチル−マレインイミド（ＮＭＭ）、ヨード酢酸及びヨードアセトアミドである。共有結合のシステイン修飾は、特に高度に特異的な免疫反応性を生ずる。
【００１５】
直接的に又は間接的に検出可能なマーカー基は、特に好適にはポリペプチドのスルフヒドリル基に共有結合している。スルフヒドリル基にカップリングするためのＳＨ−反応性二官能性リンカーの例は、マレイミドプロピルアミン（ＭＰ）、マレイミドエチルアミン（ＭＥＡ）及びマレイミドジオキサオクチルアミン（ＭＡＤＯＯ）である。
【００１６】
さらに、一又は数個のシステイン残基が他の天然の又は人工のアミノ酸で置換された本発明のポリペプチドを使用することが好ましいかもしれない。システイン残基は好適には構造的に類縁のα−アミノ酸、例えばセリン又はα−アミノ酪酸により置換される。システイン置換は特に高い安定性をもたらす。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、既知のポリペプチドに対して驚くべき利点を有する。ヨーロッパ特許出願第４５０  ９３１号明細書に記載されているＨＣＶ配列のアミノ酸残基１１９２から１４５７を含む抗原Ｃ３３に比較して、本発明のポリペプチドは実質的に一層高い特異性を示し、ネガティブ血清において誤ったポジティブは、統計的に有意な一層低い値のを示す。国際出願第ＷＯ９２／１１３７０号に記載されているＨＣＶ配列のアミノ酸第１００７から１５３４番の領域を含む抗原ＮＳ３に比べると、本発明のポリペプチドは試験状態においてかなり高い安定性を有する。ＨＣＶのＮＳ３領域からのアミノ酸１２２７から１５２８を有するポリペプチドに比較して、本発明のポリペプチドは改善された発現効率及び一層高い感受性という利点を有している。これらの利点の故に、本発明のポリペプチドはＮＳ３領域からの全ての既知のＨＣＶ抗原よりも実質的にすぐれている。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。かかる核酸の好適な例は、ベクターｐＵＣ−Ｄ２６に外来性ＤＮＡを挿入したものである。
【００１９】
配列番号１は、また、配列番号１及び２のポリペプチドをコードする本発明の核酸のヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド４０〜８８５は、ＨＣＶに由来するポリペプチドの領域をコードする。本発明の核酸は好適には（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４０−８８５又は（ｂ）遺伝子コードの縮重の範囲内の（ａ）の配列に相当するヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明は、また、本発明の核酸の少なくとも１個のコピーを含むベクターに関する。本発明のベクターは、好適には原核ベクター、即ち、原核宿主細胞内での増殖に適当なベクターである。かかるベクターの例は、サムブルックらの“モリキュラー  クローニング．ラボラトリー  マニュアル，第２版．，  コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（１９８９）  ”、殊にその第１〜４章及び１７章に示されている。本発明のベクターは特に好適には環状プラスミドである。本発明の核酸は、好適には本発明のポリペプチドの発現を可能とするプロモーター配列の制御下にあるベクター上に存在する。本発明のベクターの好適な例は、ｐＵＣ−Ｄ２６である。
【００２１】
さらに本発明は、少なくとも１個の本発明の核酸のコピー又は本発明のベクターで形質転換された細胞に関する。この細胞は好適には原核細胞、特に好適にはグラム−陰性の原核細胞、そして最も好適には大腸菌細胞である。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、好ましくは免疫学的試験方法における抗原として使用される。一方、ポリペプチドはまた、しかしながら、ヘリカーゼタンパク質として、さらに、そのすぐれた抗原作用のゆえにＨＣＶ感染に対するワクチン製造のために使用できる。
【００２３】
本発明は、さらに試料液中のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を免疫学的に決定する方法に関し、この方法は、試料液を少なくとも一種の本発明のポリペプチドとインキュベートし、上記抗体をポリペプチドへの結合を介して検出することによって特徴づけられる。この検出方法は、いずれかの既知の試験方式を使用して、例えば単一の反応相を有する均一のイムノアッセイ又は１以上の反応相を有する不均一イムノアッセイで実施され得る。不均一試験方式は、好適には抗体の存在が反応性固相の存在時に検出される場合に使用される。
【００２４】
この試験方式の１つの態様は、いわゆる二重抗原架橋試験概念である。この方法において、試料液は本発明の少なくとも２個のポリペプチド  Ｐ１  及びＰ２  とともにインキュベートされ、その際、ポリペプチドＰ１  は（ａ）固相に結合するか又は（ｂ）固相に結合しうる形態で存在し、ポリペプチドＰ２  はマーカー基を保持する。試料液中の抗体は、固定された複合体、即ち、固相に結合している複合体により、固相又は／及び液相において、好適には固相において標識を測定することにより検出される。
【００２５】
この試験方法では、好適には、試料液を精製標識抗原Ｐ２  及び精製固相抗原Ｐ１  と混合して標識抗原、抗体及び固相−結合抗原より成る標識された不動化複合体を得る。抗体を検出するための他の試験方式に比較して、架橋試験方式は、ＩｇＭのような付加的な免疫グロブリンのクラスが検出されること、及び特異性の改善、即ち、抗−ＩｇＧ結合体との非特異的反応性が減少して、その感受性が改善される。
【００２６】
標識抗原Ｐ２  は、前述のように直接的に又は間接的に検出可能なマーカー基を有する。固相抗原Ｐ１  は、例えば二官能性のスペーサーを介して固体相に直接結合しうる。しかしながら、Ｐ１  は好適には、本発明のポリペプチドの及び特異的結合システムの反応パートナーの固相中に存在する結合体である。特異的結合システムの他の反応パートナーは、固相に結合して存在する。かかる特異的結合システムの例は、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アンチビオチン、ハプテン／アンチハプテン、多糖体／レクチン及び抗体又は抗体フラグメント及びこの抗体又は抗体フラグメントに対する抗体である。抗体Ｐ１  は好適にはビオチン結合体の形態にある。
【００２７】
かかる二重抗原架橋試験において、本発明のポリペプチド抗原は、ブランクにおける増大及び抗原の集合による望ましくない信号／ノイズ比を回避するために可溶形態で使用される。この目的のために、抗原は適当な発現システム内で可溶な形態ですでに発現されているか、又は可溶な形態での発現の後で、既知の方法でインビトロにて再生される。さらに、共有結合で架橋結合された分子の凝集物の形成を回避するために、免疫試験は穏和な還元状態〔穏和な還元試薬、好適にはスルフヒドリル試薬、好ましくはＤＴＴ（ジチオスレイトール）又はＤＴＥ（ジチオ−エリスリトール）を１ミリモル／ｌから２５ミリモル／ｌの濃度範囲で添加する〕で実施することができ又は／及び好適には共有結合で修飾されたスルフヒドリル基を有する抗原又は／及び少なくとも部分的に置換されたシステイン残基を有する抗原が使用される。
【００２８】
本発明のポリペプチド抗原は、ブランクにおける増大及び抗原の凝集による好ましくない信号／ノイズ比を回避するために、二重抗原架橋試験のように可溶な形態で使用される。架橋試験方式の詳細は、ヨーロッパ特許出願第２８０  ２１１号明細書に記載されている。本明細書では、この開示を参考とする。  本発明のポリペプチドは、しかしながら、他の試験方式でも使用しうる。この例は、固定された特異抗原に結合させて特異的イノムグロブリンを認識すること及び第２の抗体との結合体を介して間接的に検出することによる間接イムノアッセイである。本発明の方法のこの態様において、試料液は（ａ）固体相に結合している又は（ｂ）固相に結合することのできる形態で存在しているポリペプチドＰ１  とともにマーカー基を有するＰ１  に対しての他の抗体とともにインキュベートされる。測定される抗体は固相中で又は／及び液相中で、好適には固相中で標識を測定することにより、間接的に検出される。この方法においては、標識された抗体と固相に結合された抗原の固定された複合体により固相上で生成される信号は、試料液中で測定されるべき抗体の濃度に間接的に比例する。
【００２９】
本発明は、さらに、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含むＣ型肝炎ウイルスに対して向けられた抗体を免疫的に測定するための試薬に関する。試薬が二重抗原架橋試験で使用される場合は、試薬は好適には少なくとも２個のポリペプチドＰ１  及びＰ２  を含んでおり、ここでポリペプチドＰ１  は（ａ）固体相に結合しているか又は（ｂ）固相に結合可能な形態で存在するものであり、ポリペプチドＰ２  はマーカー基を有する。ポリペプチドＰ１  の固相への結合は、直接結合により又は特異的な結合対手段、好ましくはストレプトアビジン／アビジン及びビオチンのいずれかにより達成できる。ポリペプチドＰ１  は、特に好ましくはビオチン結合形態で存在する。
【００３０】
もし間接的免疫試験において使用される場合には、本発明の試薬は好ましくは（ａ）固相に結合した又は（ｂ）固相に結合しうる形態で存在するポリペプチドＰ１  とマーカー基を有するＰ１  に対しての抗体を含む。本発明のポリペプチドに対する抗体の製造は、既知の方法、即ち、実験動物を相応の抗体で免疫させ、この実験動物からポリクローナル抗血清を分離することにより実施される。代わりに、抗原に対するモノクローナル抗体は、ケラー及びミルスタインの方法又はこの方法の改良法により製造することができる。抗体フラグメント又は抗体誘導体は、また、完全抗体に代えて使用できる。
【００３１】
本発明のポリペプチドの応用の他の領域は、ワクチンの製造である。このために、本発明のポリペプチドは好適には精製された形態で製造され、次いでポリペプチド溶液又は懸濁液のいずれかであってもよい注射可能な液体の形態とされる。ポリペプチドはまた、リポゾーム内にとり込ませることもできる。これらのワクチンの他の構成成分は、例えば水、塩溶液、グルコース又はグリセロールである。加えて、このワクチンは乳化剤、緩衝物質のような少量の補助物質、及び所望により免疫応答を増大するアジュバントを含む。ワクチンは通常、注射、好ましくは皮下投与又は筋肉内投与により、非経口的に投与される。
【００３２】
本発明のその他の目的は、試料液中のＣ型肝炎ウイルスに向けられた抗体の免疫学的測定のための方法であり、ここで試料液はＣ型肝炎ウイルスからの配列領域、特にＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からの配列領域を有する少なくとも１個のポリペプチドとともにインキュベートされ、そして抗体はポリペプチドへの結合により検出される。その際に、少なくとも１個のシステイン残基を有する領域からのポリペプチドを使用し、（ａ）抗体は還元状態下で測定され、（ｂ）  １又は数個のシステイン残基は共有結合的に修飾され又は／及び（ｃ）１又は数個のシステイン残基が他のアミノ酸で置換されていることを特徴とするものである。
【００３３】
ＨＣＶからの他の抗原性領域に対比して、ＮＳ３領域は特別に多くのシステイン残基の蓄積を有する。ウイルス複製の過程の間に合成されたＮＳ３タンパク質は安定であるが、生理学的緩衝状態、例えば免疫学的試験処理におけるＮＳ３抗原の使用は極めて問題であることが判明した、というのは、システイン残基の遊離のスルフヒドリル基はこれらの条件下で容易に酸化するからである。これは抗原の分子内並びに分子間の架橋をもたらし、その免疫反応性を有意に減少させる。
【００３４】
驚くべきことに、修飾されたシステイン残基をもつ又は／及び置換したシステイン残基をもつ１又は複数のＮＳ３抗原が使用されるか、又は例えばスルフヒドリル試薬を添加することにより緩和な還元状態が存在する試験方式手段により、これらのＮＳ３抗原の免疫反応を有意に改善することが可能であった。こうして、セロコンバージョンの早期認識が達成され、かつ、測定シグナルの有意な増幅が達成される。
【００３５】
本発明は、さらに、以下の実施例及び配列プロトコールにより記載される。
【００３６】
配列番号１：本発明の好適なポリペプチドのヌクレオチド配列を示す。
【００３７】
配列番号２：本発明の好適な核酸のアミノ酸配列を示す。
【００３８】
配列番号３：プライマー（１）のヌクレオチド配列を示す。
【００３９】
配列番号４：プライマー（２）のヌクレオチド配列を示す。
【００４０】
配列番号５：プライマー（３）のヌクレオチド配列を示す。
【００４１】
配列番号６：プライマー（４）のヌクレオチド配列を示す。
【００４２】
配列番号７：プライマー（５）のヌクレオチド配列を示す。
【００４３】
配列番号８：プライマー（６）のヌクレオチド配列を示す。
【００４４】
【実施例】
実施例１
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からのアミノ酸１２０７から１４８８を有するポリペプチドのクローニング及び発現
配列番号３及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列をもつプライマー（１）及び（２）を使用し、クローンＮＳ３（ＤＳＭ  ６８４７）  により開始するＰＣＲ手段により、ＤＮＡフラグメントを増幅させた。クローニングのための配列（ＢａｍＨＩ，ＢｓｐＨＩ，  ＥｃｏＲＩ制限開裂部位）並びに発現増大のためのＡＴＧコドン及びＡＡＡ（Ｌｙｓ）  コドンは、このＤＮＡフラグメントの５’末端に存在している。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ  の制限部位並びに停止コドン（ＴＴＡ）は３’末端に存在している。プライマー（１）及び（２）において、ＨＣＶに相同の領域は第１９番目のヌクレオチドで始まる。
【００４５】
こうして得られたＤＮＡフラグメントが、ＢａｍＨＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で切断されたｐＵＣ８ベクターにおいて使用された。生成したプラスミドは、ｐＵＣ−Ｄ２６と命名された。
【００４６】
プラスミドｐＵＣ−Ｄ２６で形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（ヤーニッシ−ペーロンら．，  Ｇｅｎｅ  ３３  （１９８５），  １０３）  を  １００ｍｌの媒地（Ｌ培養液／アンピシリン）中で１晩インキュベートした。翌朝、この培養物は３ｌのフラスコ内で９００ｍｌ  のＬ培養液（１０ｇ  トリプトン、１０ｇ  酵母抽出物、５ｇ  ＮａＣｌ／ｌ）／アンピシリンで２回希釈した。２ｍｌのグリセロール及び１〜２滴のシリコンの消泡用エマルジョン（Ｓｅｒｖａ  社）を添加した後で、培養物を約１８５ｒｐｍ及び３７℃で２時間振盪させた。誘導及び抗原製造は、２ミリモル／ｌの誘導物質であるイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３から４時間さらに振盪することにより達成される。次いで、バクテリアを遠心分離によりペレット状にし、さらに処理する。
【００４７】
２個の１ｌの培養物からのバクテリアのペレットを  ２００ｍｌの５０ミリモル／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、０．２ｍｇ／ｍｌリソチーム及び２ミリモル／ｌのジチオエリスリトール（ＤＴＥ）中に再懸濁させた。続いて、ＥＤＴＡ（最終濃度：１５ミリモル／ｌ）、フェニルメチルスルホニル  フルオリド（最終濃度：１ミリモル／Ｌ  ）と４ｍｇのＤＮアーゼを添加した。懸濁物は磁気攪拌器で数分間混合し、水浴中３７℃で４５分間インキュベートした。
【００４８】
その後、トリトン−Ｘ１００（最終濃度：１％）を添加し、磁気攪拌器で３０分間攪拌した。−２０℃において一晩凍結し、そして解凍した後で、３７℃で細胞を少なくとも１時間攪拌し、必要ならば音波処理した（ｓｏｎｉｆｉｅｄ）  。３７℃でのインキュベーション及び／又は超音波処理は、溶解した細胞の懸濁液の粘度が有意に減少する迄、続けられた。
【００４９】
続いて、３５，０００ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した。得られたペレットは３０ｍｌの５０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、２ミリモル／ｌ  ＤＴＥ、１５０ミリモル／ｌ  ＥＤＴＡ及び１．５％  ＯＧＰ（オクスチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、Ｂｉｏｍｏｌ社）中で再懸濁した。この懸濁物を室温で磁気攪拌器にて少なくとも３時間激しく攪拌し、続いて３５，０００ｇ及び４℃で２０分間遠心した。
【００５０】
このペレットを  １００ｍｌの８モル／ｌ  尿素、２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、２ミリモル／ｌ  ＤＴＥ中に溶解し、攪拌した。ここで溶解した抗原は、次に処理する迄−２０℃で凍結できる。
【００５１】
タンパク質は、室温で実施された以下に記載するクロマトグラフィー工程で精製された。抗原は各クロマトグラフィー工程の間は−２０℃で保存された。
【００５２】
最初のクロマトグラフィー工程は、２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５、８モル／ｌ尿素、２ミリモル／ｌＤＴＥ緩衝液を有するＱ−セファロース  ファーストフロー  カラム（ファルマシア）で実施された。これは、ＮａＣｌ勾配（０から０．７モル／Ｌ  ）で溶出させた。空（ｖｏｉｄ）容積及び分画物は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ手段により試験した。本発明のポリペプチドは最初のメインピークに存在する。ポジティブの分画物はプールされ、１０倍容量の４モル／ｌ  尿素、２ミリモル／ｌ  ＤＴＥ、２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．３  に対して１晩透析した。
【００５３】
２番目のクロマトグラフ工程において、同じカラムが使用された。カラム緩衝液は、最初のクロマトグラフ工程の後で使用された透析用緩衝液であった。これをＮａＣｌ勾配（０から０．５モル／ｌ  ）、次いで１モル／ｌ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨ  ｐＨ  １３、４モル／ｌ  尿素を使用して溶出した。
【００５４】
ポジティブな分画物をプールし、上述の同一の緩衝液に対して１晩透析した。
【００５５】
最後に、Ｓ−セファロース  ファースト  フロー  カラム（ファルマシア）でクロマトグラフを行った。緩衝液及び溶出条件は先のクロマトグラフ工程のものと同一であった。
【００５６】
抗原は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて約４１ＫＤａ  の大きさを有している。収率は、培養媒地リットル当たり約１０ｍｇの抗原であった。
実施例２
ＨＣＶ  ＮＳ３領域からの他の抗原と比較した本発明の抗原の発現
以下の抗原を発現させた：
ａ）本発明の抗原Ｄ２６（アミノ酸１２０７から１４８８）
ｂ）抗原Ｃ３３（ヨーロッパ特許出願第４５０  ３９１号のアミノ酸１１９２から１４５７）
ｃ）抗原Ｄ２７（アミノ酸１２２７から１５２８）
ｄ）抗原ＮＳ３（アミノ酸１００７から１５３４）
寄託されたクローンＮＳ−３（ＤＳＭ  ６８４７）  を使用して、抗原ＮＳ３を発現させた。抗原Ｃ３３及びＤ２７のクローニング及び発現は、実施例１に記載された方法に従って実施された。Ｃ３３に対するアミノ酸１１９２から１４５７及びＤ２７に対するアミノ酸１２２７から１５２８のコード領域は、クローンＮＳ−３からのプラスミドｐＵＣ−Ｎ３で開始するＰＣＲを使用する標準方法により増幅させた。
【００５７】
プライマー（３）及び（４）が、配列番号５及び配列番号６に示されているヌクレオチド配列を有するＣ３３のために使用された。配列番号７及び配列番号８に示されているヌクレオチド配列を有するＤ２７に対してプライマー（５）及び（６）が使用された。ＨＣＶに相同の領域は、プライマー（３）及び（５）においてはヌクレオチド番号１９で始まり、プライマー（４）及び（６）においてはヌクレオチド番号１３で始まる。
【００５８】
制限酵素ＢａｍＨＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で処理し、次いでアガロースゲル電気泳動で精製した後で、増幅したＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩ  及びＨｉｎｄＩＩＩ  で開裂したベクターｐＵＣ８に挿入した。ｐＵＣベクターで発現された抗原は両方とも、Ｎ末端に１３個の非ＨＣＶ−コード化外来アミノ酸の領域を有している（Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ）。
【００５９】
その後、このプラスミドで  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換させた。Ｃ３３抗原をコードするＤＮＡフラグメントを受け入れたクローンは、約３４ｋＤａ  （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分子量をもつ抗原を発現する。抗原Ｄ２７をコードするＤＮＡフラグメントを有するクローンにおいては、４８ｋＤａ  の帯が見い出された。
【００６０】
Ｃ３３の場合には、全タンパク質中のそのパーセントは約１０％であり、本発明のポリペプチドＤ２６とほぼ同じ程度である。５％又はそれ以下の範囲のかなり少量の発現がＤ２７について見られる。
【００６１】
Ｄ２６、Ｄ２７及びＣ３３を発現するクローンの溶解物がＳＤＳゲルにおいて同時に分離され、ニトロセルロース上に移された。種々のＨＣＶ−ポジティブ血清と１：１００  の希釈度で１晩インキュベートした後、結合抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体−パーオキシダーゼ接合体及び３，３’−ジアミノベンジジンテトラクロリド（ＤＡＢ）／過酸化水素との呈色反応により検出された。
【００６２】
強力にポジティブである血清を有するすべてのＨＣＶ抗原セグメントにおいて、良好な反応性が見い出された。ポジティブ度が弱いＮＳ３−ＨＣＶ血清の場合には、Ｃ３３抗原は本発明の抗原に比較してある場合には同程度であり、他の場合には僅かに弱い反応性を示す。しかしながら、Ｄ２７の場合には、弱いＮＳ３−ポジティブ血清とかなり弱まった呈色反応が見い出された。
実施例３
ＨＣＶのＮＳ３領域からの種々の抗原の特異性及び感受性の検討
ＮＳ−３領域から得られる種々の抗原の反応性を、間接試験コンセプトを使用して、全部で  ９６０個のネガティブ血清において比較して評価した。この評価において、本発明の抗原Ｄ２６は、それ自体有意に減少した数の誤ったポジティブ結果を示す参照抗原Ｃ３３に比較して、有意にすぐれた特異性を有していることが見い出された。
【００６３】
0003632027.tif 000002
さらに、証明されたＨＣＶ状態の２０個の血清における間接試験コンセプトを使用して、種々のＮＳ３構築物の反応性が比較評価された。抗原Ｄ２７の減少した感受性は、構築物ＮＳ３（アミノ酸１００７から１５３４）、Ｃ３３、Ｄ２６及びＤ２７に匹敵する感受性であることが見い出された。
【００６４】
0003632027.tif 000003
実施例４
ＨＣＶのＮＳ３領域からの抗原の安定性についての検討
間接試験コンセプトを使用して、抗原ＮＳ３及びＤ２６の安定性を比較評価した。抗原ＮＳ３は、本発明の抗原Ｄ２６に比較して有意に劣った安定性しか有しないことが見い出された。抗原の安定性は、３７℃で７２時間インキュベートした後で調査した。
【００６５】
0003632027.tif 000004
実施例５
還元剤の存在下又は非存在下でのＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼ抗原の反応性の検討
セロコンバーション時間は、２０ミリモル／ｌ  のＤＴＴの存在時又は非存在時に生理的条件におかれたＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼ抗原で異なる時間ごとに回収された血清試料の反応性に基づいて試験した。
【００６６】
試験コンセプトは、すべてのイムノグロブリンのクラス−非依存性認識のための二重抗原架橋試験であり、この場合電気化学的マーカー基（ルテニウム金属複合体）を有する抗原及び固体相に結合可能な抗原（ビオチン化抗原）が使用された。
【００６７】
この試験の結果は、次表に示される。２０ミリモル／ｌ  のＤＴＴの存在下では、３８日以前にセロコンバージョンを認識することが可能であったことが判明した。加えて、改善された信号強度がＤＴＴの存在下で見られた。
【００６８】
【表１】
0003632027.tif 000005
【発明の効果】
修飾されたシステイン残基をもつ又は／及び置換したシステイン残基をもつ１又は複数のＮＳ３抗原が使用されるか、又は例えばスルフヒドリル試薬を添加することにより緩和な還元状態が存在するＨＣＶに対する免疫学的試験方法により、これらのＮＳ３抗原の免疫反応を有意に改善することが可能である。また、かかる方法により、セロコンバージョンの早期認識が達成され、かつ、測定シグナルの有意な増幅が達成される。
【００６９】
【配列表】
（１）一般情報：
（ｉ）  出願人：
（Ａ）名称：ロシュ  ダイアグノスティックス  ゲーエムベーハー
（ｉｉ）  出願の名称：Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からの組換え抗原
（ｉｉｉ）  配列の数：８
（ｉｖ）  コンピュータ  リーダーブル  フォーム
（Ａ）データキャリア：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
（Ｃ）操作  システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン  リリース  ＃１．０、
バージョン  ＃１．２５（ＥＰＡ）
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：８８５  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：両方
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｖｉ）  最初の起源：
（Ａ）微生物：Ｃ型肝炎ウイルス
（ｖｉｉｉ）  ゲノム内の位置
（Ａ）染色体／セグメント：ＮＳ３
（ｉｘ）  特徴：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）ロケーション：１．．８８５
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．１：
【００７０】
【化１】
0003632027.tif 000006
0003632027.tif 000007
【００７１】
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９５  アミノ酸
（Ｂ）型  ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：タンパク質
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．２：
【００７２】
【化２】
0003632027.tif 000008
【００７３】
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．３：
【００７４】
【化３】
0003632027.tif 000009
【００７５】
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．４
【００７６】
【化４】
0003632027.tif 000010
【００７７】
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．５
【００７８】
【化５】
0003632027.tif 000011
【００７９】
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．６
【００８０】
【化６】
0003632027.tif 000012
【００８１】
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．７：
【００８２】
【化７】
0003632027.tif 000013
【００８３】
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）  配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３  塩基対
（Ｂ）型  ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）  分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）  配列の記述：配列ＩＤ  ＮＯ．８
【００８４】
【化８】
0003632027.tif 000014