(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ乳汁における全ラクトフェリン中の炎症性ラクトフェリンの含有率を求め、前記含有率が初乳分泌期においては５０％以上であることにより乳房炎であることを診断する、ウシ乳房炎の診断方法。
【請求項２】
乾乳期導入時のウシにおいて、ウシ乳汁中の、全ラクトフェリン中の炎症性ラクトフェリンの含有率を求め、
前記含有率が６０％以上であることにより乳房炎の早期治療を要することを診断する、乳房炎の診断方法。
【請求項３】
前記含有率を、生理的ラクトフェリンと炎症性ラクトフェリンの、ＣｏｎＡ親和性の違いにより求める請求項１又は２に記載のウシ乳房炎の診断方法。
【請求項４】
ウシ乳汁における全ラクトフェリン中の炎症性ラクトフェリンの含有率を求め、前記含有率の推移により、乾乳期における乳房炎治療の予後の診断をすることを特徴とするウシ乳房炎の診断方法。
【請求項５】
乾乳期導入時のウシ乳汁においてウシ乳汁中の全ラクトフェリン中の炎症性ラクトフェリンの含有率を求め、前記含有率が５０％以上であることにより、分娩後に分泌される初乳中のIgG1濃度が低値となることを予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシの乳房炎診断方法に関し、特に乾乳期ならびに初乳分泌期のウシの乳房炎診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウシ乳房炎は、乳牛において最も罹り易く、且つ、慢性化し易い疾患である。乳房炎に感染すると、牛乳の生産量の低下による経済損失ばかりでなく、酪農家にかかる労働負担が増加する。そのため、ウシの乳房炎は、酪農業を営む者にとって極めて重大な疾患の一つである。特に近年では、多頭飼育によるストレスと、搾乳機の普及による搾乳ストレスの増加により、乳房炎が多発する傾向にある。潜在性乳房炎を含めると乳房炎罹患牛は全泌乳牛の１／４にもおよび、絶えず高率の乳房が乳房炎に罹患している。
【０００３】
乳房炎の診断は、一般的に、臨床症状、薬剤残留乳やアルコール不安定乳などの異常乳検査、カリフォルニア・マスティティス・テスト（ＣＭＴ）又はＣＭＴ変法による乳汁中のｐＨや体細胞数（ＳＣＣ）検査、ＮＡＧａｓｅ活性検査などの乳汁の理化学検査、および黄色ブドウ球菌や大腸菌などの乳房炎起因菌に対する細菌検査により行われる（家畜共済における臨床病理検査要領．農林水産省経済局編，５７−７９，全国農業共済協会，東京，１９９７．）。
【０００４】
しかしながら、上記の理化学的検査は、乳汁中の細胞の数、乳汁の特有な酵素活性等の性状を利用して行われるものである。そのため、細胞成分の構成が大きく異なり、乳成分の合成能が低下し、常乳と比較して乳成分が大きく異なる乾乳期および初乳分泌期間には（日畜会報，７０，Ｊ１６９−Ｊ１７６，１９９９．）、乳房炎の診断に応用することが困難である。
【０００５】
上記以外検査としては、ラクトフェリン（以下、Ｌｆとする。）を診断マーカーとして用いた泌乳期の臨床型乳房炎の診断方法がある。これは、泌乳期にウシが臨床型乳房炎に罹患すると乳汁中のＬｆ濃度が増加することを利用するものである（家畜共済における臨床病理検査要領．農林水産省経済局編，６０，全国農業共済協会，東京，１９９７．）。
【０００６】
しかしながら、泌乳期以外の期間、すなわち、乾乳期には、ウシ乳房炎の診断マーカーとしてＬｆを利用できなかった。その理由は、乾乳導入後の乳汁中や初乳中におけるＬｆ濃度は、泌乳期の乳汁のＬｆ濃度と比較して数倍から数百倍高くなったり（日本畜産学会報，７０，Ｊ１６９−Ｊ１７６，１９９９．）、乾乳期のステージによっては泌乳期とは逆に低くなったりするため、Ｌｆ含有量により乳房炎を判断することができないからである。
【０００７】
それゆえ、乾乳期と初乳分泌期間中のウシ乳房炎の診断は、臨床症状および上記の細菌検査のみで対応せざるをえないのが現状である。
【０００８】
一般に、乾乳期における発症後の臨床症状は、泌乳期と比較して重篤な症状を示すものが多く、特に、乾乳導入後早期と分娩直後にはより重篤な乳房炎が多発することが知られている。また、乾乳期に乳房炎に罹患すると、乾乳経過が遅延する。これにより、母ウシ乳腺の発育が遅れ、その結果として、出産した母牛によって飼育された子牛にも、その発育不全や種々の細菌やウイルスによる感染性下痢症を誘起しやすくなる（日畜会報，７１，Ｊ２７９−Ｊ２８５，２０００．）。
【０００９】
そのため、従来は、乾乳期にける有効な診断マーカーがなかったため、乾乳期の乳房炎の早期発見および防除を困難なものとし、乾乳期間中ならびに分娩前後での重篤な乳房炎の発症を招いていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ウシ乳房炎の診断するための診断方法を提供することを課題とする。より詳しくは、泌乳期、乾乳期および初乳分泌期等の泌乳ステージにかかわらず、乳房炎を診断する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、泌乳ステージにかかわらず、乳房炎発症後もしくは慢性化した後、ウシ乳汁中のＬｆは、従来報告されている分子種と比較して、分子量が小さく、コンカナバリンＡ（以下、ＣｏｎＡとする。）の親和性が弱く、糖含量が約倍量であって、等電点が酸性領域にあり、さらに、炎症誘起作用のあることを発見し、本発明を完成するに至った。そして、炎症時に出現するＬｆ分子種を「炎症性Ｌｆ」、健康乳汁中に多く含まれ、ＣｏｎＡとの親和性の強く、過去の報告（ラクトフェリン、食品新素材有効利用技術シリーズＮｏ．６、菓子総合技術センター）にある分子量や等電点を示すＬｆを「生理的Ｌｆ」と呼称することとした。
【００１２】
すなわち、本発明は、ウシ乳房炎により出現するラクトフェリン（以下、Ｌｆとする。）分子種を測定することによるウシの乳房炎診断方法を提供する。
【００１３】
本発明は、ウシ乳房炎により出現するＬｆ分子種を測定することによる乾乳期ならびに初乳分泌期のウシの乳房炎診断方法を提供する。
【００１４】
上記のＬｆ分子種の測定とは、Ｌｆの分子量の測定、ＣｏｎＡの親和性の測定、糖含量の測定及び等電点の測定を包含する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、炎症性Ｌｆ分子種を測定することによりウシ乳房炎を診断する方法である。
【００１６】
Ｌｆ分子種の測定とは、具体的には、乳房炎により出現するＬｆ分子種の、分子量の測定；ＣｏｎＡとの親和性の測定；Ｌｆの糖含量の測定；および等電点（ｐｌ）である。これらの測定のうち、１種の測定を行うことにより乳房炎を診断しても、２種以上行うことにより乳房炎を診断してもよい。２種以上の測定を行うことにより、乳房炎診断結果をより信頼性の高いものにすることができる。
【００１７】
また、炎症性乳房炎を測定しモニターすることにより、乳房炎発症時の診断ばかりでなく、治療後の予後の経過観察や、乳房炎の慢性化の診断、更に、乾乳期間中の乳腺の健康状態を観察することへの応用が可能である。
【００１８】
以下に測定例を示し説明するが、本発明は、これらの測定方法に限定されるものではない。
【００１９】
Ｌｆの分子量の測定は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以下、ＳＤＳ  Ｐａｇｅ）を行った後、ウエスタンブロッティング法により行うことができる。
【００２０】
ＣｏｎＡとの親和性の測定は、ＣｏｎＡ二次元免疫泳動法により行うことができる。具体的には、ＣｏｎＡ二次元免疫電気泳動法によるＣｏｎＡ親和性の異なるＬｆのピーク高、もしくは、ピーク面積を算出し比較することで、乳汁中Ｌｆ中の炎症性Ｌｆの含有率を測定できる。また、あらかじめ乳汁中の全Ｌｆ濃度を、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）法や、酵素抗体法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）などの方法で測定しておくことで、算出された炎症性Ｌｆの含有率から、炎症性Ｌｆの含有濃度を知ることができる。炎症性Ｌｆの特異抗体、もしくは、モノクローナル抗体を作成することで、ＳＲＩＤ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、免疫比濁法および免疫比朧法（ネフェロメトリー法）などの、抗原抗体反応を利用した各種測定法での応用が可能である。
【００２１】
Ｌｆの糖含量の測定については、市販の糖含量測定キットを用いて解析することができる。糖タンパクであるＬｆの糖鎖構造と密接な関係にある、シアル酸の含量は、１％Ｌｆ溶液を０．１Ｎの塩酸で処理した後、２０％水酸化ナトリウムで中和し、ＳＤＳ  Ｐａｇｅにより測定してもよい。
【００２２】
等電点の測定は、アクリルアミドを用いた平板等電点電気泳動法により測定することができる。
【００２３】
（試験例１）
乾乳期における乳房炎発症後のウシ分房、５分房から得られた乳汁中のＬｆについて、分子量、ＣｏｎＡ親和性、糖含量、シアル酸含量及び等電点を測定した。これと比較するために健康ウシ分房（５分房）内の乳汁中Ｌｆについても同様の測定を行った。各測定方法については、以下の通りである。
【００２４】
Ｌｆ分子量については、ＳＤＳ  Ｐａｇｅとウェスタン  ブロッティング法により測定した。具体的には、ウシＬｆ抗体を結合させたアフィニティーカラムを作成し、ウシ乳汁中Ｌｆを分離した。次に、分離したＬｆが１２．５％の濃度となるようにポリアクリルアミドゲルを作成し、定法に従い泳動した。その後、分離Ｌｆを泳動したポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｉｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に、転写装置（バイオラッド社製、トランスブロッドＳＤシステム）によりブロッティングした。このＰＶＤＦ膜に、ウシＬｆウサギアフィニティー抗体と反応させ、その後、ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ標識山羊抗体と反応させた。そして、適当な基質試薬と反応させ発色させた。
【００２５】
ＣｏｎＡ親和性は、ＣｏｎＡ二次元免疫電気泳動法を用いて行った。具体的には、一次元目はＣｏｎＡ（生化学工業社製）を０．５ｍｇ／ｍｌ加えた１．２％アガロースで、９Ｖ／ｃｍにて１．５時間行った。その後、二次元目の泳動は、抗ウシＬｆウサギ血清と０．４％のα−Ｄメチルマンノシドを加えたアガロースで１５時間行った。泳動の終了したアガロースは、乾燥した後、ブロムチモールブルーにより染色した。
【００２６】
Ｌｆ中の糖含量は糖含量キット（Ｐｉｅｒｓｅ社製、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて測定した。
【００２７】
Ｌｆ中のシアル酸含量は、１％Ｌｆ溶液を０．１Ｎの塩酸で処理した後、２０％水酸化ナトリウムで中和し、ＳＤＳ  Ｐａｇｅにより測定した。
【００２８】
等電点は、アクリルアミドを用いた平板等電点電気泳動法により測定した。具体的には、市販の等電点電気泳動用アクリルアミドゲル（ファルマシア社製、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ  ＰＡＧｐｌａｔｅ）を用い、マルチパーパス電気泳動システム（ファルマシア社製）により行った。
【００２９】
ＣｏｎＡ二次元免疫電気泳動法による泳動像を図１に、それ以外については表１に示す。なお、図１の（Ａ）は正常乳汁中Ｌｆ、（Ｂ）は慢性乳房炎乳汁中Ｌｆ、（Ｃ）は急性乳房炎乳汁中Ｌｆに関する。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
これらの結果から、乳房炎発症後のウシ由来のＬｆは、健康ウシ由来のＬｆと比較して、分子量が低く、糖含量が高く、シアル酸含量が高く、等電点が低く、ＣｏｎＡ親和性が低い、炎症性Ｌｆ分子種が増加していることが理解される。
【００３２】
（試験例２）
炎症時に出現する炎症性Ｌｆを、ウシＬｆアフィニティー抗体を結合させたアフィニティーカラムで、炎症性乳汁中からＬｆを分離し、さらにＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）により、ＣｏｎＡ親和性の低い、炎症性Ｌｆを分離した。そして、この炎症性Ｌｆを、乾乳期の健康なウシ乳房内に１００ｍｇ投与した。
【００３３】
これと比較するために、今度は、ウシ健康時に存在するＣｏｎＡ親和性の強いＬｆを分離し、これをウシ乳房内に同量投与した。また、対照として、生理食塩水をウシ乳房内に同量投与した。
【００３４】
各乳房内の乳汁について、白血球を中心とした体細胞数、炎症性サイトカインのＴＮＦα及び急性相反応蛋白のα１酸性糖蛋白（α１ＡＧ）を以下の方法で測定した。
【００３５】
体細胞（ＳＣＣ）数は、乳汁を２０ｍＭエチレンビス４酢酸ナトリウム加リン酸生理緩衝液（ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）で洗浄後、ヨウ化プロピディウムを用い染色した後、フローサイトメーター（ファックスキャリバー、日本ベクトンディッキンソン社製、東京）により測定した。
【００３６】
特に、ＳＣＣ中の白血球数は、乳汁をリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、細胞をＣｙｔｏｓｐｉｎ（Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．，  Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、スライドグラス上に付着させた後，ギムザ染色を行い顕微鏡下で細胞数を計測した。
【００３７】
ＴＮＦα濃度は市販のヒト用ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ  ＴＥＣＨＮＥ社製、ＵＳＡ）にて測定した。
【００３８】
α１ＡＧ濃度は一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）法（メタボリックエコバイオシステム研究所、ウシα１ＡＧプレート）を用いた。
【００３９】
ＳＣＣ数については図２に、白血球数については図３に、ＴＮＦα濃度については図４に、α１ＡＧ濃度については図５に示す。
【００４０】
これらの結果によると、炎症時に出現するＬｆを投与された分房は、投与後日数０．５日にＳＣＣ数及び白血球数が急激に増加し、投与後日数２日までＴＮＦα濃度及びα１ＡＧ濃度が増加した。これにより、炎症性Ｌｆが確認された。
【００４１】
（試験例３）
ウシ胎児血清を１０％加えたＲＰＭＩ１６４０培地に、５μｇ／ｍｌとなるよう炎症性Ｌｆを添加し、この培地で、健康なウシの脾臓から分離した白血球を３日間培養した。そして、その培養上清中に産生されたＬｆについてＣｏｎＡニ次元免疫電気泳動より解析した。この結果を図６に示す。なお、図６において、（Ａ）は生理的刺激、（Ｂ）は炎症性Ｌｆ刺激、（Ｃ）はＳＥＣ刺激によるウシ脾臓白血球の産生するＬｆのＣｏｎＡ二次元免疫泳動像である。
【００４２】
この結果から、白血球自身が、乳房炎の起因菌であるブドウ球菌性エンテロトキシン−Ｃ（ＳＥＣ）および炎症性Ｌｆそのものの刺激により、炎症性Ｌｆを産生することが理解される。
【００４３】
（測定例１）
初乳分泌期、乾乳直前期、乾乳前期、乾乳中期および乾乳後期において、臨床型乳房炎を発症した分房の乳汁中Ｌｆ濃度を、ＳＲＩＤ法によって測定した。その結果を表２に示す。
【００４４】
これらの結果によると、乳汁中のＬｆ濃度は、健康牛乳汁に比べて低値を示すケースが認められ、従来法である泌乳期の乳房炎診断項目である乳汁中Ｌｆ濃度の測定では、乾乳期乳房炎の診断が困難であることが明らかとなった。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
なお、表２中のｎは、サンプル数を示す。
【００４７】
さらに、これら乳汁について、ＣｏｎＡを含むアガロースで一次元目の泳動を行い、二次元目の泳動に牛Ｌｆ抗体を含ませたアガロースで泳動するＣｏｎＡ二次元免疫電気泳動を行った。そして、ＣｏｎＡ親和性の異なるＬｆのピークの高さから、生理的Ｌｆと炎症性Ｌｆの含有比率を算出したところ。泌乳ステージにかかわらず、乳房炎乳汁中に高率に炎症性Ｌｆが含有されることが明らかとなった。この結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
これらの結果によると、初乳分泌期に於いては５０％、乾乳期於いては約６０％の炎症性Ｌｆ含有率で臨床型乳房炎と診断されることが判明した。
【００５０】
ここで、炎症性Ｌｆ含有率（％）＝炎症性Ｌｆピーク高÷（生理的Ｌｆピーク高＋炎症性Ｌｆピーク高）×１００とする。
【００５１】
従来から用いられているＣＭＴおよびＣＭＴ変法以外の検査方法である乳汁中Ｌｆ濃度の測定による方法でも、乾乳期ならびに初乳分泌期の乳房炎診断が困難である。これに対し、上記の乳汁中Ｌｆの炎症性Ｌｆ含有率による診断は、乾乳期の乳房炎を診断することが可能であることを示す。
【００５２】
（測定例２）
乾乳期に乳房炎を発症し、抗生物質（商品名：セファゾリンＤＣ「ミタカ」、三鷹製薬（株）社製）により治療後に乳房炎が改善した５症例と、改善しなかった３症例について、ＳＲＩＤ法による乳汁中Ｌｆの濃度の測定と、ＣｏｎＡ二次元免疫電気泳動による乳汁中の炎症性Ｌｆ含有率の算出を行った。
【００５３】
なお、乳房炎治癒の診断は、乳房の臨床症状（腫脹、硬結、発熱など）の解消と、起因菌の消失により判定した。起因菌の消失の検査は、ブドウ球菌寒天培地、５％に綿羊血液を加えたトリプトソーヤ寒天培地、そしてＤＨＬ寒天培地に乳汁を塗抹し、３７℃で所定の時間培養し、菌の集落の有無により判定した。その結果を表４及び５に示す。
【００５４】
表中の「乳房臨床症状」について、乳房の腫脹、硬結、発熱が解消していれば（−）、解消していなければ（＋）と評価し、「起因菌保有」については起因菌の集落が見られれば（＋）、見られなければ（−）と評価した。
【００５５】
これらの結果によると、乳房炎の改善した症例では、乳房炎症状と起因菌数の低減と共に、乳汁中の炎症性Ｌｆ含有率が優位に低下した。また、全例で乾乳期の乳房炎診断値であった炎症性Ｌｆ含有率６０％未満の値を示した。特に、症例３では１．９２％の極低値まで低下した。しかしながら、症例５では、５７．８％までの低下に留まっていた。
【００５６】
一方、乳房炎症状の改善や起因菌数が低下しなかった症例では、炎症性Ｌｆ含有率も全例で７０％以上の高値で推移し、特に、症例３では治療後３日目の値（６８．９％）より高く、７１．５％まで増加していた。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
この結果から、乾乳期の乳房炎において、その治療の予後観察に有効なマーカーであることが示された。
【００６０】
（測定例３）
乾乳導入時に、測定例２と同様の方法により、泌乳牛の乳汁中のＬｆ濃度と炎症性Ｌｆ含有率を測定した。また、同泌乳牛の分娩後の初乳中ＩｇＧ１濃度を測定した。その結果を表６及び７に示す。
【００６１】
これらの結果によると、臨床上健康で、乾乳導入時の炎症性Ｌｆ含有率が５０％未満（平均４１．８％）の分房１１例では（表６）、乾乳期間中の乳房炎発症は確認されなかった。また、分娩後の初乳中の炎症性Ｌｆ含有率も乾乳導入時と殆ど変わらず、平均で４１．３％の含有率であった。しかしながら、分娩後１例で乳房炎の発生が確認され（症例３）、この分房の分泌した初乳では炎症性Ｌｆ含有率は４８．８％と、若干高い値であった。更に、初乳中の免疫グロブリンの主成分であるＩｇＧ１濃度は、平均で９．６２ｍｇ／ｍｌを示し、乳房炎発症分房の初乳では６．２２ｍｇ／ｍｌと若干低値であったが、多くの分房では１０ｍｇ／ｍｌ前後のＩｇＧ１濃度が確認された。
【００６２】
一方、乾乳導入時に炎症性Ｌｆ含有率が５０％を越えていた分房（１０例、表７）では、その多くが、初乳中でも５０％を超える含有率を示し、５０％未満の値を示した分房は１例のみであった。また、乾乳期間中の乳房炎発症が４例認められ、更に、分娩後にも３例発症していた。更に、初乳中のＩｇＧ１濃度も多くの検体で低値であった（平均４．４２ｍｇ／ｍｌ）が、炎症性Ｌｆ濃度が５０％未満の値を示した症例３で、６．１２ｍｇ／ｍｌと、この群では最も高い値を示した。
【００６３】
これらの結果によると、乾乳導入早期から乳腺が炎症を起こしているものでは、次回分娩時の乳腺の再生・分化、初乳中のグロブリンの合成にまで影響があることが理解される。また、この結果から、本発明による乾乳期間中のモニタリングは、この様に炎症を起こしている乳腺の早期発見と早期治療に有効な診断法であることが理解される。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
【表７】
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【００６６】
【発明の効果】
本発明によると、泌乳牛の泌乳期は勿論のこと、乾乳期ならびに初乳分泌期での乳房炎の早期診断が可能となる。
【００６７】
また、抗生物質などの薬剤による治療の予後経過の診断と、乳房炎の再発を早期に診断できる。
【００６８】
さらに、本発明により、乾乳期での乳腺の状態をモニターすることで、早期に治療対策を立てることができ、分娩後の初乳分泌を円滑に行うことができる。
【００６９】
本発明による乳汁中の炎症性Ｌｆの測定は、牛以外の動物においても応用が可能である。
【００７０】
また、乳汁以外にもＬｆが炎症性疾患で体液中に増加することが知られていることから、その様な疾患でも本発明は応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣｏｎＡ二次元免疫電気泳動法によるウシ乳汁中Ｌｆの泳動像である。
【図２】乾乳期牛乳房内への炎症性Ｌｆ投与後の乳汁中体細胞数の経時変化を示す図である。
【図３】乾乳期牛乳房内への炎症性Ｌｆ投与後の乳汁中体多形核白血球数の経時変化を示す図である。
【図４】乾乳期牛乳房内への炎症性Ｌｆ投与後の乳汁中ＴＮＦα濃度の経時変化を示す図である。
【図５】乾乳期牛乳房内への炎症性Ｌｆ投与後の乳汁中α１ＡＧ濃度の経時変化を示す図である。
【図６】生理的Ｌｆ、炎症性ＬｆならびにＳＥＣ刺激によるウシ脾臓白血球の産生するＬｆのＣｏｎＡ二次元免疫泳動像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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