(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
継代され脱分化したヒト関節軟骨細胞の再分化の速度を増大させる方法において、上記の継代され、脱分化した軟骨細胞を、TGF−β、およびさらに、IGFおよびインスリンからなる群から選択される成長因子で強化した培地で培養する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
TGF−βがTGF−β１である請求項１の方法。
【請求項３】
TGF−βがTGF−β２である請求項１の方法。
【請求項４】
TGF−βを0.2ないし5.0ng/ml存在させる請求項１の方法。
【請求項５】
成長因子がインスリンである請求項１の方法。
【請求項６】
成長因子がIGFである請求項１の方法。
【請求項７】
培地が規定培地である、請求項１ないし６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
インスリンがインスリントランスフェリン亜セレン酸塩（ITS）により供給される請求項５の方法。
【請求項９】
規定培地が、さらにヒト血清アルブミンを含む請求項７の方法。
【請求項１０】
培地が規定培地であり、そしてDME、ヒト血清アルブミン、インスリンおよびTGF−βを含む、請求項５の方法。
【請求項１１】
TGF−β、およびさらに、IGFおよびインスリンからなる群から選択される成長因子で強化した培地中の、継代され脱分化したヒト関節軟骨細胞からなる組成物。
【請求項１２】
TGF−βがTGF−β１である請求項11の組成物。
【請求項１３】
TGF−βがTGF−β２である請求項11の組成物。
【請求項１４】
TGF−βが0.2ないし5.0ng/ml存在する請求項11の組成物。
【請求項１５】
成長因子がインスリンである請求項11の組成物。
【請求項１６】
成長因子がIGFである請求項11の組成物。
【請求項１７】
培地が規定培地である、請求項11ないし16のいずれか１項の組成物。
【請求項１８】
インスリンがインスリントランスフェリン亜セレン酸塩（ITS）により供給される請求項15の組成物。
【請求項１９】
規定培地が、さらにヒト血清アルブミンを含む請求項17の組成物。
【請求項２０】
培地が規定培地であり、そしてDME、ヒト血清アルブミン、インスリンおよびTGF−βを含む、請求項15の組成物。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互関係
本出願は1996年７月25日に出願された米国仮出願書第60/022810号、1996年７月26日に出願された米国仮出願書第60/022711号、および1996年７月25日に出願された米国仮出願書第60/022801号に関連を有し、これらからの優先権を伴っている。
発明の背景
初め、哺乳類細胞の成功裡なin vitroでの培養には、細胞接着および増殖に必要なホルモンや成長因子を供給するための血清を生育培地へ補給することが要求された。血清は依然として哺乳類細胞の培養に広く用いられているが、その使用に関連したいくつかの問題点がある（Freshney,Serum−free media.In Culture of Animal Cells,John Wiley ＆ Sons,New York,91−99,1994）。１）血清は多くの未同定または未定量の成分を含み、従って”規定”されていない。２）血清の組成はロット毎に異なり、実験または細胞培養のその他の利用法のために標準化することが困難である。３）これらの成分の多くが細胞接着、増殖および分化に影響を与えるため、これらの条件の制御またはこれらの条件に対応する細胞の特異的な要求の研究は血清の使用によって不可能になる。４）血清の幾つかの成分は特異的な細胞種の増殖を阻害し、ある程度その増殖への効果を中和し得るため、その結果最適以下の生育となる。および、５）血清は、実験の結果に影響を与え得、または培養細胞がヒトへの移植を意図されている場合、健康への潜在的な害をもたらすウィルスを含み得る。
主として研究目的のため、生化学的に規定された培地（biochemically defined media,DM）を開発するいくつもの努力が払われてきた。DMは一般的に栄養分、成長因子、ホルモン、接着因子、および脂質を含む。正確な組成はそのためにDMが設計される特定の細胞種に合うように調節されねばならない。繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、および上皮細胞を含む幾つかの細胞種のDM中における成功裡な生育が達成されてきた（Freshney,1994に概説されている）。しかしながら、DM中における細胞の接着および増殖はしばしば最適ではない。
規定された培地の潜在的な応用は、軟骨損傷の軟骨細胞自家移植による治療の為の、成人の関節軟骨より得られた軟骨細胞の増殖である（Brittberg et al,New England Journal of Medicine,331:889−895,1994）。この手法は増殖された軟骨細胞の患者への移植を含むため、軟骨細胞の培養において血清またはその他の規定されない成分の使用を回避することが望まれるであろう。この応用の為、低濃度で播かれた成人関節軟骨細胞が飽和培養物となるまでの増殖をDMによって維持することが必要である。
何人かの研究者はDM中における非関節軟骨細胞の高濃度での増殖を報告している（Kato et al,Exp.Cell Res.,125:167−174,1980;Madsen et al,Nature,304:545−547,1983;Quarto et al,Bone,17:588,1995）。他の研究者はDM中におけるウサギおよびヒトの関節軟骨細胞の増殖を報告している（Boumedienne et al,Cell Prolif.,28:221−234,1995;Schwartz,J.Cin.Chem.Clin.Biochem.24:930−933,1986）。しかしながら、これらの例においては軟骨細胞はDM中での増殖に関して高濃度（平方センチメートル当たり20,000細胞以上）で試験された。JenningsおよびHam（Cell Biology International Reports,7:149−159,1983）は青年前期のヒトの肋骨関節より単離され、低濃度で播かれた軟骨細胞の増殖のための無血清培地を開発した。その培地はポリリジン被覆プレートの使用を必要とし、リポソーム混合物を含み、該混合物に関して著者等は”化学的規定の程度に本来的な限界”があると述べている。
DM中での関節軟骨細胞の非飽和濃度での培養の試みは成功していない。Adolphe等（Exp.Cell Res.,155:527−536,1984）はウサギ関節軟骨細胞の増殖を維持するDM（インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸塩（selenite）、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン、脳成長因子、繊維芽細胞成長因子、ヒドロコーチゾン、および現在はインシュリン様成長因子IIと呼ばれる複製刺激活性を補給したHam's F12）を開発した。しかしながら、彼らは細胞を播いた後、細胞の組織培養容器への最初の接着には血清を含む培地が必要であると報告している。
軟骨細胞はそれ自身の接着および増殖を促進する因子を生産し、分泌することが報告されている（Shen et al,Endocrinology,116:920−925,1985）。その例は塩基性繊維芽細胞成長因子（Hill et al,Growth Factors,6:277−294,1992）、インシュリン様成長因子（Froger−Gaillard et al,Endocrinology 124:2365−2372,1989）、腫瘍増殖因子（transforming growth factor）−β（Villiger,P.M.et al.,J.Immunol.,151:3337−3344,1993）、ヴィトロネクチン、およびおそらくその接着および増殖を促進する幾つかの未同定の因子を含む。関節軟骨は血管化されていない組織であり、関節中に配置された軟骨細胞は全身系の成長因子に対して限られた接触しか持たないため、これらの細胞の維持および増殖能力においては自家分泌的刺激が重要な役割を担ってい得る。我々の知るところによれば、軟骨細胞の自家分泌刺激が、DM中におけるヒト関節軟骨細胞の増殖の強化の目的で利用された例はない。
in vitroでの単層での増殖の間に関節軟骨細胞は脱分化し、分化した関節軟骨細胞により通常は生産されるマトリクス分子の合成が減少する。血清を含む培地中で増殖された細胞については、この過程は細胞を血清存在下での懸濁培養系に移すことにより逆行させ得ることが示されている（Benya and Shaffer,Cell,30:215−224,1982）。DM中で単層で増殖された細胞が関節損傷の治療のための移植（Brittberg et al,1994）を意図されるならば、これらが懸濁培養中で再分化する能力を保持することを示すことが重要である。再分化能を試験する標準的な手順は単層で増殖された細胞をアガロース中に懸濁し、硫酸化（sulfated）グリコサミノグリカンの蓄積をサフラニン−Ｏによる染色によって試験することである。
任意の医学的応用、とくにヒトおける応用のために培養された、成人関節軟骨細胞（HAC）の増殖および分化の標準化および制御の必要が存在する。
発明の概要
本発明の一つの目的は補給混合物、成分混合物、ビタミン混合物、無機塩混合物、およびアミノ酸混合物からなり、血清の使用に内在する問題を回避する規定された（無血清）細胞培養培地の開発および使用に基づく。特に、規定された培地は繊維芽細胞とくに軟骨細胞の培養において有用である。
本発明のもう一つの目的は軟骨細胞の分化を強化し、腫瘍増殖因子（TGF−β）を用いて関節特異的マトリクスの合成を強化するための方法に関する。
本発明のもう一つの目的はTGF−βおよびIGFの組み合わせを用いて軟骨細胞の分化を促進する方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明の一つの側面は、規定された細胞培養培地および関節軟骨損傷の修復のためのヒトへの移植のために培養されたヒト関節軟骨細胞（HAC）の増殖および分化の標準化および制御のための培養技術の開発に基づく。
HACは初め、１平方センチメートル当たり3000細胞の濃度で細胞を播き、10％血清を補給されたダルベッコの改変イーグル培地（Dulbeccos Modified Eagles Medium（DMEM））中で１日接着させ、血清を含む培地を除去し、表１に記載された様々な濃度の補給物とともにDMEM基本培地により再給餌されることで培養された。その後２から３日毎にDMを新しいDMと完全に交換することで再給餌された。これらの条件下では細胞の増殖を誘導することは出来ないので、異なる基本培地が試され、DMEM:RPMI 1640:Ham's F12が1:1:1の比率の場合（DRF）に補給物を加えたものが上記のように播かれた細胞の増殖の促進に効果的であった。DRF＋補給物（以下、完全DRFまたはcDRFと呼ぶ）中で培養されたHACは血清補給培地中での培養により達成された最終濃度と等しいまたはそれ以上の最終濃度を達成した。しかしながら、細胞濃度が低い初めの数回の集団倍化の間には、10％血清中におけるものと比べて増殖速度は遅かった。我々は、cDRFの１日前に細胞に血清を供給すること無しでの細胞増殖を示した。しかしながら、これらの培養物の初期の成長は遅く、一定しなかった。代替的な補給物および異なる濃度の補給物を試験する更なる実験は、いかなる段階にも血清を含まずに、DMに直接播かれたHACの精力的な生育を一貫して補助する培養系を生産することに失敗した。
再給餌時に培地を完全に交換する代りにcDRFを半分だけ交換した場合、軟骨細胞によって分泌された因子がそれ自身の増殖を強化するのではないかと考えた。HACがcDRF中での生育に要求される因子（群）を分泌するならば、細胞濃度が希薄なときに分泌される当該因子の量は必要限界量に近くと思われる。これは初期培養における遅い生育および上記の実験で観察された一定しない結果を説明し得る。部分再給餌の方法（下記）と共にcDRF培地を用いる事で、我々はを血清またはその他のいかなる規定されない成分の完全な不在の元で短期間の培養の後に予期しなかった大量のHACを得た。以下に示す実施例においては、cDRFの体積は富血清培地に比べて少なく用いたが、そのようにすれば、おそらく培地中の分泌された因子の濃度を増加させ、さらなる増殖を促進させ得ると考えたためである。後の実験によれば、体積の減少は必須でなく、部分的再給餌の実行を維持する間により大きな体積を用いることでより最適な結果が得られ得ることが判明している。
我々はcDRF中での増殖の後に懸濁培養されたHACはサフラニン−Ｏにより陽性に染色されるコロニーを形成することを示した。これはDM中での増殖の間に細胞が軟骨細胞の分化の指標である硫酸化グリコサミノグリカンの生産能を失わなかったことを示す。cDRF中で増殖された軟骨細胞は、再分化する能力を保持しているため、軟骨損傷の治療を目的とした自家移植に適し得る。
cDRFの組成
cDRFと名づけられた培地は全て商業的に入手可能で化学的に規定された基本培地および増殖補給物から成る。cDRFはAdolphe et al（1984）により開発されたDMの修飾物である。基本培地に対する補給物としてCollaborative Biomedical Products（（CBP）Bedford,Massachusetts）より購入されたインシュリントランスフェリン亜セレン酸塩（ITS）、Sigma（St.Louis,Missouri）より購入されたハイドロコーチゾン、塩基性繊維芽細胞成長因子（FGF）、CBPより購入されたフィブロネクチンおよび両方ともGenzyme Corporation（Cambridge,Massachusetts）より入手できるインシュリン成長因子（IGF）が本明細書に記載された培地の目的の達成において特に有用であることを発見した。
0003638614.tif 000002
cDRFの調製法
全ての材料は再構成され、希釈され、供給者により推奨されたように保存される。３つの基本培地、即ちGibco BRL,Grand Island,New York,Cat＃11965−084（表２）として購入されたDMEM、Gibco BRL,Cat＃11875−051（表２）として購入されたRPMI DMEM、及びGibco BRL.Cat＃11765−021（表２）として購入されたHam's F12は1:1:1の比率で混合され、本明細書においては以後DRFと呼ばれる（表３）。ITS、BioWhit−takerより購入されたペニシリン／ストレプトマイシンおよびハイドロコルチゾンはDRF中に希釈され、この培地は２−８℃で２週間まで保存される。塩基性FGF、IGFおよびフィブロネクチンは、細胞培養に用いられる当日に完全DRF培地（cDRF）調製のため希釈される。
0003638614.tif 000003
0003638614.tif 000004
0003638614.tif 000005
0003638614.tif 000006
0003638614.tif 000007
0003638614.tif 000008
0003638614.tif 000009
関節軟骨は24時間以内に死亡した最近罹患したヒト提供者（年齢幅29−53）の大腿骨関節より採取され、２−８℃において４日間まで等張培地中で保存された。軟骨細胞（HAC）は0.1％コラーゲナーゼ/DMEM中での一晩の消化により軟骨より放出された。残った軟骨はさらに0.1％コラーゲナーゼ/0.25％トリプシン/DMEM中で４時間消化された。放出された細胞の初代培養は、10％ウシ胎児血清、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補給されたDMEM（富血清培地）中で増殖された。飽和に近い状態になったときに、細胞は10％DMSO/40％血清/50％DMEM中で凍結された。
２代目の細胞を用いて行われた実験については、凍結された初代培養物のアンプルが溶かされ、初めの接種のために下記の培地によりすすがれた。３代目において行われた実験については細胞は２代目を通じて富血清培地中で増殖され、トリプシン処理により採取され、示された接種培地中で洗浄された。
以下の開示は脱分化したヒト関節軟骨細胞に対する再分化および軟骨マトリクス形成過程の増強のためのコラーゲンマトリクスおよびサイトカインTGF−βの利用を記載する。これらの発見は、サイトカインが他の研究者により示されたように軟骨組織より新規に放出された軟骨細胞（初代細胞）の形質を単に保持する（1,2）というのみならず、本出願は、継代により脱分化したヒト細胞から、マトリックス中において、サイトカインが分化した軟骨細胞の表現型の再発現を増強することを示した点で、新規のものである。サイトカインおよびその再発現に対する効果を見つけた研究者も、サイトカインをコラーゲンマトリクス中において用いていない。再発現の研究はアガロースマトリクス中におけるウサギ細胞（3,4）またはヒト軟骨細胞の増殖に対する因子の効果（５）に中心を置かれており、特に分化に中心を置かれていなかった。本開示はサイトカインの使用が細胞の再分化を増強し、コラーゲンスポンジ環境において新しい軟骨特異的マトリクスが合成される速度を速めることを初めて示すものである。この事実は、この系の新しい組織を再生し、増大した機械的負荷を支持し、関節表面を再生する能力を増強し得る。
本開示はin vitroでの単層での増殖の結果脱分化した正常成人関節軟骨細胞の懸濁物中での、軟骨細胞分化の指標であるC IIの再発現を可能にする、完全に規定された培地を記載する。TGF−β１またはβ２およびIGF−１がこの分化過程における成長因子の必要性を満たすことが発見された。規定された培地中でのこの成長因子の組み合わせは軟骨細胞の自家移植（Bittberg et al,1994）の手順の改善に対して潜在的に応用し得る。これは移植に先立つ軟骨細胞の分化を開始させることに用いられ得る。この成長因子の組み合わせは軟骨損傷に対する移植を意図されたマトリクス中に設置された軟骨細胞の分化を刺激するための補給物として用いられ得る。
実施例１
cDRFによる部分的再給餌の概念を試験するためにこの新規の手法による軟骨細胞の生育を既知の培養条件、即ちウシ胎児血清（FBS）中での培養またはFBS中で１日培養した後cDRF中で完全に再給餌しつつ培養したものにおける生育と比較した。31歳の提供者由来の３継代目のヒト軟骨細胞（HC31細胞）は下記の条件１、２および３のもとで培養された。
培養条件１（FBS/完全再給餌）
上記のように調製された軟骨細胞は、5mlの10％FBS/DMEM中で、１平方センチメートル当たり3,000細胞の濃度で、10平方センチメートルの３つの培養皿に播かれ、接種の１日後およびその後２−３日毎に5mlの10％FBS/DMEMによって再給餌された。再給餌毎に全ての培地が除かれ、5mlの新しい培地と交換された。
培養条件２（FBS−cDRF/完全再給餌）
軟骨細胞は10％FBS/DMEM中での１日の後、全ての再給餌がcDRFによってなされた点を除き、条件１と同様に培養された。
培養条件３（FBS−cDRF/部分再給餌）
軟骨細胞は10％FBS/DMEM中での１日の後に全ての培地が除かれ3mlのcDRFと交換され、その後の各再給餌の際には、用いられたcDRFのうち1.5mlを除去して、1.5mlの新しいcDRFと交換することにより部分再給餌が達成された点を除き条件１と同様に培養された。
細胞は接種の７および13日後に回収され、試料は血球計によって数えられた。表４における結果は、cDRFによる部分的再給餌の条件下での７日および13日後における細胞収量が、完全な再給餌におけるものと比較して顕著に増大したことを示す。
0003638614.tif 000010
実施例２
接種後１日間における血清の使用を除去できるか否かを決定するための一つの条件を負荷して実施例１を繰り返した。
培養条件４（cDRF/部分的再給餌）
軟骨細胞は5mlの富血清培地の代りに3mlのcDRF中に播かれ、各再給餌の際に用いられたcDRFのうち1.5mlが1.5mlの新しいcDRFと交換された点を除いて条件１と同様に培養された。
細胞は接種後７日目に回収された。表５に示された結果は繰り返された３つの条件においては実施例１のものと概して同様な結果を示した。興味深いことに、cDRFへの細胞の直接の接種を部分的再給餌と組み合わせた、もう一つの培養条件によって、より多量の細胞が得られた。
0003638614.tif 000011
実施例３
実施例２を３系統のヒト関節軟骨細胞を加えて繰り返した。表６の結果は部分的再給餌が完全な再給餌より一貫して有意に高い効率をもたらすことを示す（条件３対２）。予期しなかったことに、部分的再給餌がどちらに対しても行われた場合、規定された培地への直接の接種は血清中での接着を凌駕した（条件４対３）。１つの株を除いて、規定された培地による部分再給餌は10％FBSによる完全な再給餌を用いた培養を凌駕した。
0003638614.tif 000012
実施例２および３においては７日目の時点での結果だけが示されているが、３つの実施例を組み合わせると、１代目の細胞を解凍し、規定された無血清の培地に直接播き、半分量ずつ再給餌することで、培養することで２週間以内に１平方センチメートル100,000細胞以上の細胞濃度を一貫して達成することが出来ることを強く示唆する。
実施例４
我々は実施例２を繰り返した。さらにFBS中で培養された軟骨細胞に対して部分的再給餌法が利点をもたらすかどうかを調べるためのもう一つの条件を付加した。
培養条件５（FBS/部分的再給餌）
各再給餌の際に半分の培地が除かれ、新しい培地と交換された点を除いて条件１と同様に、軟骨細胞が培養された。
表７の結果はcDRFが用いられた場合には部分的再給餌が完全な再給餌より明らかに優れていることを示す前記の実施例に再び一致した。対照的に、冨血清培地が用いられた場合は部分的再給餌法は細胞収量を増加させず、減少させ得た。
0003638614.tif 000013
実施例５
cDRF中での部分的再給餌法による単層の培養によって増殖された後の軟骨細胞の再分化能を評価するために、それらのアガロース中でサフラニン−Ｏに結合するコロニー（Saf−Ｏ陽性コロニー）を形成する能力を評価した。上記のように調製されたHC31軟骨細胞株は解凍され、２代目において225平方センチメートル組織培養フラスコ（T225）中に１平方センチメートルあたり2,200細胞の細胞濃度で、T225あたり100mlのcDRFに播かれた。cDRF中の細胞は50ml（全体積の２分の１）を除き、50mlの新しいcDRFと交換することで再給餌された。再給餌は播かれた１日後およびその後２−３日毎に行われた。正の対照として同時進行の培養物がT225あたり60mlの10％FBS/DMEM中に播かれた。10％FBS/DMEM中の細胞は用いられた培地の全量を除き、60mlの新しい10％FBS/DMEMと交換することで再給餌された。それぞれの条件当たり４つのT225が播かれた。
播かれてから12および14日後に培養条件当たり２つのT225からトリプシン処理によって細胞が回収された。回収時に細胞は10％FBS/DMEM中に1mlあたり2.5X105細胞の濃度で懸濁され、４％の低融点アガロースと1:1で混合された。4mlの細胞／アガロース懸濁物が60mm組織培養皿（P60）中の固化した高融点アガロースの2mlの層のうえに播かれた。接種は２回または３回行われた。固化の後、培養物には5mlの10％FBS/DMEMが重ねられた。培養物は平衡化の２−３時間後およびその後２−３日毎に、固定されるまで再給餌された。
アガロース培養での３週間の後に細胞は10％ホルマリン中で固定され、サフラニン−Ｏで染色された。直径２μｍ以上のSaf−Ｏ陽性コロニーが顕微鏡を用いて数えられた。それぞれの対応する単層の条件に対して、それぞれ２つのP60からの４平方mmずつの10の格子区画がランダムに数えられた。
表８の結果は、cDRF中で増殖されたHACのアガロース中での懸濁の後にサフラニン−Ｏコロニーを形成する能力は、FBS中で増殖された細胞のそれと統計的に異ならないことを示す。14日目の単層培養物から得られた結果の方が試料誤差が小さく、類似性が明瞭である。FBSまたはcDRFのいずれの単層培養において14日後に起こるコロニー数の減少は、飽和後の状態で細胞を単層培養において維持することの結果で有ろう。
0003638614.tif 000014
実施例６
初代軟骨細胞は31歳男性の大腿骨頭由来の軟骨組織から単離された。細胞は単層で前培養された。３代目において細胞はＩ型コラーゲンスポンジマトリクス（Instat,Johnson＆Johnson）に107細胞/mlの濃度で播かれ、10％ウシ胎児血清（血清対照）、１％ITS＋培地補給物（無血清対照）または１または5ng/ml（”低量”または”高量",Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA）のTGF−β１とともにITS＋を補給したDME培地中で培養された。DME培地は標準的に入手可能であり、ピルビン酸ナトリウム無しで多量のグルコースを含むものが好ましい。細胞の分化状態はＩ型およびII型コラーゲンおよび軟骨特異的プロテオグリカンであるアグリカンに対する32P標識されたmRNAプローブを用いたRNase防御（Hybspeed RPA Kit,Austin TX）法による遺伝子発現解析により決定された。
マトリクスの蓄積はサフラニン−O/fast green染色およびII型コラーゲンおよびコンドロイチン硫酸塩に対するモノクローナル抗体染色を用いて調べられた。
単層細胞のmRNA解析は、接種時の軟骨細胞において、痕跡的なII型コラーゲンを付随するＩ型コラーゲンの発現およびアグリカンの発現を示した。Ｉ型コラーゲンへの負の制御を同時に伴った、II型コラーゲン発現に対する正の制御が高量のTGF−βを補給されて培養された試料および血清対照培養物について一貫して観察された。無血清条件及び低量TGF−β条件では、Ｉ型コラーゲンの緩和な負の制御のみが観察された。Ｉ型およびII型コラーゲンの発現の同時に起こる挙動は分化した軟骨細胞形質の再発現と一致している。４週間目までに、RNase防御法により示された再分化のレベルの増大は高量のTGF−β中で培養された試料においてその他のグループの培養物よりも多いことが観察された。８週間目には高量のTGF−β条件のもとで培養された試料は、８週間目においてマトリクスの全深度において強いプロテオグリカン染色を示すことが免疫染色および組織学的染色により示された。低量のTGF−βと血清、および無血清対照群においては、新規のマトリクス染色はスポンジマトリクスの周辺または隔離されたポケットに限定されていた。本研究は継代を経たヒト軟骨細胞がＩ型コラーゲンスポンジ環境においてその分化した表現型を再発現し得ることを示した。再分化のレベルは遺伝子発現およびマトリクスの蓄積レベルの両方において示された。TGF−βはこの過程を再分化の速度および新しいマトリクスの蓄積量を増大させることで調節した。
実施例７
飽和状態またはほぼ飽和状態の、第三継代のヒト大腿部関節丘の軟骨細胞をトリプシン処理によって採集し、106細胞/mlの濃度でアルギン酸ビーズ中に懸濁した。以下に記載した各々の実施例について、アルギン酸内の細胞は、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン（基本培地）および指示された付加的な補充物を補充した25mM HEPES緩衝化DMEMにおいて、９％CO2で37℃培養した。補充物の保存および希釈は供給者の推奨の通りに遂行した。各々の培養に対して、8mlのアルギン酸ビーズ（800万個の細胞）を150cm2フラスコ内で40mlの指示された培地で保温した。培養は２−３日毎に再給餌した。指示された時点において、細胞をアルギン酸から開放し、沈澱化し、冷凍および保存した。RNAは細胞の沈澱から単離し、定量をおこなった。コラーゲンＩ型（C I）、コラーゲンII型（C II）、アグリカン（Agg）の各mRNAの量に対する異なる培養条件の効果は、内部標準として18S rRNA（18S）の検出を用いたRnase保護分析により決定した。Rnase保護分析に用いたRNAプローブは、C I,C I  I,Agg,および18Sに対するヒト遺伝子のcDNA断片を含む鋳型から転写した。アルギン酸内での細胞の培養はGuoら、Connective Tissue Research,19:277−297,1989に従いおこなった。RNAの単離は、Qiagen社（Chatworth,カリフォルニア州）より購入したQiashredder（商標）およびRNeasy（商標）キットを用いて製造者の指示に従いおこなった。Rnase保護分析はAmbion社（Austin,テキサス州）より購入したHybspeed（商標）RPAキットを用いて製造者の指示に従っておこなった。
アルギン酸培養およびRnase保護分析の実験計画案
概略
I.  単層での軟骨細胞の増殖（１−２週間）
II.  アルギン酸内における軟骨細胞の培養（１週間−６カ月）
A.  細胞のアルギン酸ビーズへの接種
B.  再給餌
C.  アルギン酸ビーズからの細胞の収集
中断点
III.  細胞内RNAの単離、定量および分注（１−２日;1セットのRNA調製当たり１日）
A.  単離
B.  定量
C.  分注
中断点
D.  アガロースゲルにおけるRNA試料の視覚化（RNA分解の評価）
中断点
IV.  RNase保護分析（１−５日）
A.  アンチセンス方向にT7プロモーターを有する特異的cDNA鋳型の調製（FBにて行う）
第１日：
B.  cDNAからアンチセンスの放射性RNAプローブを調製するためのcDNAからのインビトロ転写反応、それに続けて行なうcDNA鋳型を除去するためのDnase処理（ハイブリッド形成工程の３日以内、好ましくは前日に行なうべきである）
C.  放射性プローブのゲル精製
D.  アンチセンスプローブを用いた細胞内RNAの共沈（ハイブリッド形成工程の前日に行なうべきである）
第２日：
E.  アンチセンスプローブを用いた細胞内RNAのハイブリッド形成およびssRNAを除去するためのRNase処理
F.  保護されたRNAの電気泳動
G.  ホスホイメージャーによる定量
軟骨細胞の分化に対するＲ＆Ｄ研究のために、我々はアルギン酸ビーズ内での軟骨細胞の培養と、それに続くRnase保護分析を用いて軟骨特異的遺伝子発現の検出をおこなった。以下に詳細を記載した手順は、以下の典拠に由来する。
アルギン酸培養:Guoら（1989）Connective Tissue Research 19:277−297
RNAの単離:RNeasy Total RNAキット（Qiagen,カタログ＃74104）の便覧
インビトロ転写反応:MAXIscript T7インビトロ転写反応キット（Ambion,カタログ＃1314）の取扱説明書
RNase保護分析:Hybspeed RPAキット（Ambion,カタログ＃1412）の取扱説明書
詳細な実験計画
I.  アルギン酸内での軟骨細胞の培養（１週間−６ケ月）
A.  細胞のアルギン酸ビーズへの接種
材料
軟骨細胞の単層培養、PBSに接種されるべきアルギン酸培養8mlあたり、800万個以上の細胞、20ml/T150
トリプシン/EDTA（T/E）,T150あたり20ml
トリプシン処理した細胞の洗浄用のDMEM10％FBS,T150あたり30ml
0.15M NaCl/25mM HEPES,pH7.4（等張塩溶液），単層細胞のT150フラスコあたり〜30ml＋アルギン酸培養8mlあたり〜200ml
1.2％アルギン酸/0.15％NaCl/25mM HEPES,pH7.4,室温に温めたもの，アルギン酸培養あたり8ml
配合（100mlあたり）：
100ml等張塩溶液を含むガラスのビーカーをポリトロン混合機の下に置く。ポリトロンの末端を溶液に挿入し、1.2グラムのアルギン酸（Improved Kelmer,Kelco社より）を非常にゆっくりと加える最中、高速で運転させ、ビーカーを動かす。アルギン酸が完全に溶解したと思われる後（〜10−15分）、磁気撹拌棒を加え〜30分間撹拌する。30分間高圧滅菌し、0.45ミクロンのフィルター、次に0.22ミクロンのフィルターに通し、冷凍庫で６ケ月に至るまで保存する。
0.1M  CaCl2/25mM HEPES,pH7.4,アルギン酸培養8mlあたり80ml
アルギン酸内での軟骨細胞の培養用の培地、アルギン酸培養8mlあたり40ml
注意：基本培地はアルギン酸ビーズの安定性に影響を与える；もし基本培地としてDME以外の何かを使用している場合は、ビーズの安定性を試験する予備実験がなされている必要がある。Guoら、（1989）Connective Tissue Res.9:277を参照せよ。
22ゲージの針および10mlのシリンジ、アルギン酸培養あたり１個
25mM HEPES−緩衝化DMEM、アルギン酸培養8mlあたり120ml
T75組織培養フラスコ、アルギン酸培養あたり１個
NaCl中に細胞を懸濁させるためのプラスチックボトル、アルギン酸培養の一組あたり１個、１セットあたり最大６個のアルギン酸培養（単層T150培養あたり〜50−60mlの容量）
125mlボトル、アルギン酸培養あたり１個
70ミクロンフィルター、アルギン酸培養あたり１個
手順
細胞の0.1M CaCl2への露出が延長するのを避けるために、一つの単層培養から一時に〜６個のアルギン酸培養（〜4800万個の細胞）のみを準備する。
１）上に列挙した全ての材料を準備し、EXXXX及び増殖培地を予め保温する。
２）採集すべきT150あたり20mlのT/Eを温める。
３）各々のT150単層培養フラスコから培地を吸い取り、20mlのPBSを各々に加え、吸い取る。
４）T150あたり20mlのT/Eを加え、〜２分間保温し、細胞を懸濁し、フラスコの底を30mlのDMEM10％FBSですすぐ。
５）円錐形チューブに移し、細胞を沈澱させ、各々25mlの等張塩溶液に再懸濁し、１個のプラスチックボトルにまとめる。
６）一連の空のチューブを30mlの等張塩溶液ですすぎ、細胞懸濁液に加える。
細胞懸濁液の総体積を記述すること。
７）血球計数器において計測するために、細胞の〜1mlの試料を採り、血球計数器の穴に満たす。
８）細胞の収量および回収時の単層培養の密度を記録する。
９）800万個の細胞を50mlの円錐形チューブ（アルギン酸培養または時点あたり１個）に分配し、1000rpmで８分間沈澱させる。
10）１個のチューブから、上清を吸い取り、Ｔ＝Ｏと標識を付し、液体窒素に浸し、細胞の沈澱を即座に−80度で凍結させる（単層培養のRNA試料のため）。
11）8mlの1.2％アルギン酸溶液を各々の残りの細胞沈澱に加え、ピペットでおよそ30回上下に吸い取り再懸濁する（気泡を持ち込まないように）。
12）各々の細胞／アルギン酸懸濁液に対して、
（ｉ）５回ピペットで上下することにより再度混合し、10mlピペットを用いて、懸濁液を22ゲージの針を装着した10mlシリンジに移す。
（ii）プランジャーで蓋をし、逆さにして、泡を除去するためにプランジャーを押すおよび叩くことによって空気を除去する。
（iii）プランジャーで蓋をし、逆さにして、泡を除去するためにプランジャーを押すおよび叩くことによって空気を除去する。
（iv）アルギン酸ビーズを室温で５−15分間硬化させるが、それ以上は硬化させない。
（ｖ）70μｍフィルターを通してCaCl2を廃液バケツに注ぎ、100mlの等張塩溶液で２回、70μｍフィルターおよび廃液バケツを用いて60ml DMEMにより２回洗浄する。
13）各々のチューブのビーズを20mlの各々の培地に再懸濁し、標識を付したT162に移し、残留したビーズをさらに20mlでゆすいでフラスコに注ぐ（T162あたり〜800万個の細胞、または〜1mlより幾分少ない量をシリンジへの移動の間に失う）。
14）緩く蓋をしたフラスコを保温機の中に置く。
B.再給餌、２−３日毎
各々のアルギン酸培養に対して：
１）フラスコを立て、ビーズがフラスコの一角に安定化するように傾ける。
２）50mlピペットを用いて、ビーズの上から培地を除去する（〜25−30ml）。
３）50mlピペットをフラスコの底に正しく立て、フラスコの底部をゆっくり平らに横たえる。
４）ビーズをピペットの中に引き込むのを避けるため、ピペットの先端とフラスコの底が接触したまま、フラスコからピペットにすべての培地を引き取る。
５）ピペットを培地の表面の上から持ち上げ、ビーズがピペットの先端に付着しているか調べる。ピペットの先端に付着したビーズはすべて取り払う。
６）培地をバケツに廃棄する。
７）40mlの前保温した新鮮な培地をビーズに加える。
８）次の培養について繰り返す。各々の培養に対して、別々のピペットを使用すること。
C.アルギン酸ビーズからの細胞の回収および：
ｉ）細胞収量の決定
ii）RNase保護分析のための凍結細胞沈澱の回収
iii）抗体染色のためのサイトスピンスライドの調製
材料、アルギン酸培養当たりの量
標識を付した50mlの円錐形チューブ、１
50mlピペット、１
70ミクロン−孔フィルター、１
0.15M NaCl/25mM HEPES,pH7.4−175ml
55mMクエン酸Na/100mM NaCl/25mM HEPES,＜pH7.4〜45ml
（各々の培養毎に標識を付した）計測のための試料用微小遠心管、１
トリプシン/EDTA std作業用溶液、100μｌ
血球計数器,1
サイトスピンアリコートのための標識を付した15mlチューブ、１
標識を付したサイトスピンローディングおよびスライド構築物≧６
４％パラホルムアルデヒド、200ml（１週間以内に使用すること。きつく栓をして４℃で保存すること）
注意：パラホルムアルデヒドは有毒である。
200mlを調製するために：
ｉ）有毒ガス用フードの中で、加熱板を用いて、200ml PBS＋200μl 2N NaOHを70−75℃に温める;80℃より高温に加熱しないこと。
ii）加熱を止め、8gのパラホルムアルデヒドを加え、磁器撹拌棒で溶液が透明になるまで撹拌する（１時間未満）。
パラホルムアルデヒドの塵を除去したことを確認すること。
iii）pHを試験する;pHは７から7.5の間であること。
iv）有毒ガス用フードの中で、Whatman濾紙＃１を通して濾過する。
70％EtOH,200ml
PBS,200ml
サイトスピンスライドを浸すための容器
サイトスピンスライドを保存するための容器
方法
１）顕微鏡下でビーズの写真を撮る
２）30mlピペットを用いて、各々のフラスコの細胞を別々の50ml円錐形チューブに移す。
３）0.15M NaCl/25mM HEPESを用いて３回洗浄する
ｉ）70ミクロンフィルターを用いて液体を廃液バケツに排出する。
ii）0.15M NaCl/25mM HEPESを円錐形チューブの45mlの印まで注ぎ加える。
iii）排水および注水をさらに２回、および排水をさらに１回繰り返す。
４）55mMクエン酸Na/100mM NaCl/25mM HEPESを50mlの印まで加え、繰り返し緩やかに５−８分逆さにする（ビーズが目測で検出されなくなってから〜１分間）。
５）卓上IEC（またはMistral）遠心機で1000rpmで８分間遠心する。
６）上清を吸い取り、20mlの0.15M NaCl/25mM HEPESに再懸濁する。
７）よく混合し、100μｌを、計測用に（工程11）100μｌのT/Eを含む微小遠心チューブに移し、チューブを37℃の恒温水槽の中に置く。
８）細胞数を計測する（工程７より、２個の血球計数器の穴／試料）
−−サイトスピンにかけない培養由来の細胞試料は、最終工程の後に計数できる。
細胞数を記録する
培養あたりの細胞収量＋（カウント数/5箇所の視野）
（20）（２）（104）/5＝（カウント数/5箇所の視野）（80,000）
９）サイトスピン用に、各々の培養から細胞を15mlチューブに分注する。スライドあたり50,000細胞で充分であり、培養あたり少なくとも６枚のスライドである。
10）30mlの0.15M NaCl/25mM HEPESを工程６の懸濁液に加える。
11）1000rpmで８分間遠心する。
12）上清を吸い取り、「即座に」細胞沈澱を−80℃で凍結させる。
理想的には、液体窒素またはドライアイス／エタノール浴槽において細胞を瞬間凍結させ、保存のため−80℃に移動させるのが好ましい。緩やかな凍結は細胞内RNAの分解をもたらす。
13）サイトスピン用に、細胞のアリコートを50,000細胞/500μｌに希釈する。
14）500μｌの試料（50,000細胞）をサイトスピンローディング装置に載せる（細胞培養あたり少なくとも６個の試料）。
15）サイトスピン装置を800rpmで５分間回転させる（プログラム＃１）。
16）組織培養フード内で１−２分間風乾させる。
17）４％パラホルムアルデヒド内で５分間固定する。
18）スライドを取り出し、PBSに２分間移す。
19）スライドを取り出し、70％EtOHに３分間移す。
20）フード内で15分間または完全に乾燥するまで風乾させる。
21）−80℃で保存する。解答した後はすぐに、４％パラホルムアルデヒドで２分間固定し、PBSですすぐ。
中断点：−80℃で保存した細胞沈澱内のRNAは「無期限に」安定である。
III.細胞内RNAの単離、定量、分注、およびゲル電気泳動（１−２日;1組のRNA調製あたり１日）
RNA調製あたりの単離、定量、および分注のための材料
手袋
高圧滅菌された、標識を付した微小遠心チューブ、１
RNeasy Total RNAキット、Qiagen社
溶解緩衝液RLT:600μｌ
2mlの収集チューブ、標識付き:1
2mlの収集チューブ内の遠心カラム、１
洗浄緩衝液RW1:700μｌ
洗浄緩衝液RPE濃縮液:200μｌ（または既にエタノールで希釈してあるならば1ml）
1.5mlの収集チューブ、標識付き:1
ベータメルカプトエタノール（BME）、６μｌ
2mlの収集チューブ内のQIAシュレッダー（Qiagen社）、１単位
70％エタノール/30％DEPC−処理したH2O、600μｌ
100％エタノール、800μｌ（RPEがまだ希釈されていない場合、RPE濃縮液を希釈するため。）
DEPC−処理したdH2O/0.1mM EDTA,50−200μｌ（RNAの収量に依存する）
P2,P20,P200,およびP1000用の、Rnaseを含まない噴霧防止型のピペットチップ
650μｌのシリコン前処理された、Rnaseを含まない微小遠心チューブ（Sorenson社）、５
保存用のねじ蓋の微小遠心チューブ:1
分光光度計およびUV Silica Ultra Microcell（Beckman社、カタログ＃514261）
キャピラリーUV"キュベット”、光路長0.5nm（Beckman社、カタログ＃514262）
手順
A.  単離
１）RNeasy便覧（付属）のp7の注意書きを参照する；これはRNAの分解、キット構成物の取扱い、RNeasyキットの各種制限に関する重要な注意書きを含む。
２）手順を通してRNA試料を識別するためにチューブ／カラムに標識を付ける；最初の細胞／溶解緩衝液懸濁液の移動に使用する1.5mlの高圧滅菌された微小遠心チューブ、RNA試料あたり１個
2mlの採集チューブにおけるQIAシュレッダーカラム、RNA試料あたり１個
2mlの採集チューブにおけるRNeasy遠心カラム、RNA試料あたり１個
RNeasyキットに由来する2ml採集チューブ、RNA試料あたり１個
RNeasyキットに由来する1.5ml採集チューブ、RNA試料あたり１個
dH2O/EDTAに溶解したRNAアリコートの保存用の、650μｌのRnaseを含まないシリコン前処理されたチューブ、RNA試料あたり５個
EtOH内のRNAの保存用のねじ蓋の微小遠心チューブ、RNA試料あたり１個
−80℃での試料保存用のコンテナに標識を付ける。
３）RNeasy kitからの溶解緩衝液RLTの1mlあたり10μｌのBMEを加える。溶解緩衝液RLTは保存時に沈澱を形成する可能性がある。再溶解させるために温める。
４）細胞の溶解および均質化：（RNeasy工程1bおよび２）
−80℃から細胞の沈澱を取り出す（アルギン酸ビーズからの細胞の採集を参照のこと）。
即座に600μｌのRLT緩衝液＋BME（工程４）を直接各々の細胞沈澱に加える；最初に溶解緩衝液を加えずに細胞を解凍させるとRNAの分解を導く。
ピペッティングにより混合して、標識を付した1.5mlの微小遠心チューブに移す。
各々のチューブを高速で30秒間ボルテックスする。
微小遠心機において一瞬遠心する。
ピペットで簡単に混合し、QIAシュレッダーに移す。
微小遠心機で１分間最高速度で遠心する。溶解液（流出液）に不溶性の物質が見られるときは、溶解液を３分間最高速度で微小遠心し、残りの工程に対してはその上清のみを使用する。この２回目の微小遠心は現在のところ必然的なものではない。
５）RNeasy工程3:
１試料あた１倍量の体積（600μｌ）の70％エタノール/DEPC−dH2Oを加え、ピペッティングで混合する。この溶解液は遠心してはならない。
６）細胞溶解液の遠心カラムへの適用：（RNeasy工程４）
600μｌの溶解液をRNeasy遠心カラムに移す。10,000rpm（〜8,000Xg）で15秒間微小遠心する。流出液を廃棄する。残留した溶解液を同一のカラムに移して上と同様に微小遠心する。
７）遠心カラムにおけるRNAの精製：（RNeasy工程５）
700μｌの洗浄緩衝液RW1を遠心カラムに加え、上記のように遠心し、流出液を廃棄する。問題解決手引（Rneasy説明書のp23）に従い、RW1の添加後、遠心する前に５分間カラムを静置させるとDNAの混在を減少させることが可能である。
８）遠心カラムにおけるRNAの更なる精製：（RNeasy工程６および７）：
１倍量の体積の洗浄緩衝液RPE濃縮液（RNeasyキット）を、RPE緩衝液が既にエタノールで希釈されていない場合は４倍量の100％エタノール（室温）と共に混合する。
上で使用した遠心カラムを新規の2ml採集チューブに移す;RNAはまだカラムに存在している。500μｌの洗浄緩衝液RPE/エタノール（1:4）を遠心カラムに加える。
上と同様に遠心カラムを微小遠心する。
流出液を廃棄する。
500μｌの洗浄緩衝液RPE/エタノール（1:4）を再び同じ遠心カラムに加える。
最高速度で２分間微小遠心する。
流出液を廃棄してチューブに採集する。遠心カラムの外側のエタノールを調べ、必要ならばキムワイプで除去する。残ったエタノールは次以降の工程の妨げとなる可能性がある。上で使用した遠心カラムをキットとともに供給された1.5ml採集チューブに移す。
９）遠心カラムからのRNAの溶出：（RNeasy工程８）
１試料あたり30μｌのDEPC−処理した水/0.1mM EDTAを注意深く、ピペットの先端が膜に接触しないように、しかし膜全体が確実に湿るように、直接遠心カラムの膜に添加する。
8,000Xgで60秒間微小遠心する。
20μｌのDEPC−処理した水/0.1mM EDTA、および同じ遠心カラムおよび採集チューブを用いて、上の溶出を繰り返して、RNA溶出物を総計50μｌ得る。
定量および分注の間、全ての試料を氷上に置く。
B.  波長260におけるUV吸光度によるRNAの定量
１）各々のRNA試料３μｌを57μｌのDEPC−処理したH2Oに移す。（20倍希釈）
２）短い（容積60μｌ）1cm光路長の石英キュベット（4thflr,1MTNRDにおいて入手可能）において、DEPC−処理したH2Oブランクに対して、260nmおよび280nmにおいて試料を読み取る。
読み取り値を記録する。
260nm,1cm光路長における1.0D単位＋40μg/ml RNA、および20倍希釈を計算した後、800μg/mlに変換する。この読み取り値は50μｌの試料に対する総収量40μpgに相当するであろう。
筆者の収量は一般的に8mlのアルギン酸培養から〜８〜80μｇの範囲であり、培養の条件に依存している。しかし、筆者がこれらの調製を終了して以来、アルギン酸からの細胞の収集のための方法は、細胞の収量の改善を意図して修飾されている（特に、アルギン酸ビーズを溶解した後の細胞の遠心の間のｇ−力は〜５倍に増加している）。
A260/A280が＋1.7から2.0ならば「高度に純粋な」RNAを示し、2.0が理想である。低い比であれば蛋白質の混在を示す。一般的に、その比は2.0に近いものである。320nmにおける読み取り値は炭水化物の存在を示す。
C.  分注
１）500μg/ml以上の濃度のRNAに対しては、DEPC−dH2O/0.1mM EDTAを加えることにより500μg/mlに希釈する。最終濃度を記録する。
２）各RNA試料に対し、1.0μｇに等しい容量を計算する。
３）各５つの650μｌの前シリコン化した無RNaseの小遠心チューブに1.0μｇを分注する。
４）RNAが残っていれば、スクリュー蓋無RNase1.5ml小遠心チューブに移し、1/10容量の１％SDSおよび2.5倍容量以上の無水エタノールを加え、撹拌、および−80℃で保存する。
５）全分注の容量および濃度を記録する。
６）全分注を−80℃で保存する。
注意：
ｉ）DEPC−dH2O/0.1mM EDTA中の1.0μｇのRNAの分注：アガロースゲルでのRNAの可視化、またはRNase防御検定のためには、1.0μｇまたはそれ以下のRNAが用いられる。分注の容量は小さく（２μｌ程度）、冷凍庫中の試料の乾燥の可能性のために水性溶液中に保存された1.5μｇの分注を溶解後より大きな容量へ希釈されるまで、分注しないこと。一度に1.0μｇの分注を使用し、溶解後はいかなる未使用RNAも破棄すること。RNeasyハンドブックによれば、−80℃または−20℃で水中に保存されたRNAは最低一年は安定である。
ii）残りのエタノール中で保存されたRNA:エタノール中で保存された試料は長期の安定保存を許す。このRNAは溶液ではなく、懸濁として扱われるべきである。この懸濁から分注を得る前には、これらは十分に撹拌されるべきである。
理想的には、RNAを沈澱させ、エタノールを除き、水性溶液に再溶解し、使用前に再定量する方が望ましい。
中断点
Ｄ  アガロースゲル上でのRNA試料の可視化（RNA分解の評価）
材料
アガロース、Molecular Biology Grade（SeaKem GTG）,1ゲルあたり0.4g、１ゲルあたり14試料。
37％ホルマリン
オートクレーブしたdH2O、ゲルあたり約250ml
10×MOPS
組成
0.2M MOPS
50mM  酢酸ナトリウム
10mM  EDTA
pH.7
オートクレーブ
電気泳動装置およびトレイ（およそ30mlゲル容量）、くし（14歯、厚い）、電源RNA試料、１分注1.0μｌ各々−80℃で保存、ゲルあたり13試料まで用いる。RNAラダー、0.24−9.5kb＠１μg/μｌ、ゲルあたり２μｌ（各バンド約0.33μｇ）
沈殿が必要な場合：
DEPC−H2O/0.1mM EDTA
DEPC−H2O/0.1mM EDTA,3M酢酸ナトリウム、pH5.2〜50μｌ
100％エタノール、室温
真空乾燥装置
650μｌチューブ用ヒートブロック、65℃
長−チップ用ピペットマンチップおよびパスツールピペット（RNA沈殿の乾燥に使用）
１×RNA泳動緩衝液、試料あたり12μｌまで
配合
0.75mlホルムアミド（−20℃保存）
0.15ml 10×MOPS
0.24ml 37％ホルムアルデヒド
0.1ml dH2O、無RNase
0.1mlグリセロール
80μl 10％（w/v）ブロモフェノールブルー
1mg/mlEtBr,
カメラ／ポラロイドフィルム/UV照射装置
手順
アガロースゲル調製
１）40mlの１％アガロース/1.9％ホルムアルデヒド/1×MOPSゲルの調製：
34mlのオートクレーブしたdH2Oと4mlの10×MOPSと0.4gのアガロースを混合し、電子レンジで温めアガロースを溶解させ、50℃にさます。
毒ガスフードのなかで、37％ホルムアルデヒド2mlを加え、緩やかに混合し、清潔なトレイとくし中に流し込む
効果まで30分必要である、ゲル化したのち速やかに泳動緩衝液を加える。
２）ゲルあたり250mlの泳動緩衝液の調製:1×MOPS/1.9％ホルムアルデヒド212.5ml dH2O
25ml 10×MOPS
12.5ml 37％ホルムアルデヒド
電気泳動のためのRNA試料の調製
３）８μｌまたはそれ以下の試料（＞125μg/l以下）１μｇに対し、18μｌの１×RNA泳動緩衝液あたり１μｌエチジウムブロマイドをあわせ、１×RNA泳動緩衝液/EtBr混合液を最終容量24μｌになるように加える。
すべての残りの試料は沈殿される。（次の工程）
４）４μｌ以上の１μｇの試料に対し、エタノール沈殿による試料の濃縮の必要がある。
ｉ）各RNA試料を、最終容量18μｌになるようにDEPC−H2O/0.1mM EDTAで希釈する。
ii）２μｌの3M酢酸ナトリウムを加え、撹拌し、50μｌの100％エタノールを各試料に加える。
iii）再撹拌し、室温において15分間、最高速度で微小遠心する。RNAペレットのあるチューブの位置を確かめる。
iv）長ピペットチップでペレットを吸い込まぬよう、上清を吸引する。30秒間最高速度で微小遠心し、残りのエタノールを回収し、上清を吸引し、４分間真空乾燥機で乾燥させる。
ｖ）23μｌの１×RNA泳動緩衝液あたり１μｌのエチジウムブロマイドをあわせ、各ペレットに24μｌを加える。
５）RNAラダー：各泳動を行うゲル毎に２μｌのRNAラダーの分注を作成し、10μｌの１×RNA泳動緩衝液を加える。
６）RNAラダーを含む全RNA試料を65℃で１分間ヒートブロック中で加熱し、20秒間４−５の設定で撹拌し、試料がチューブの側面についている場合、瞬間的に微小遠心を行い、65度で15分間加熱し、氷上で速やかに冷却する。
ゲル電気泳動
８）瞬間遠心し、各試料を穴あたり12μｌのせ、ゲルあたり、１穴RNAラダーをのせる。泳動するRNAラダーを除く試料は穴あたり0.5μｇであり、RNAラダーは穴あたり２μｇである（約0.33μg/バンド）。試料の残りは再泳動の必要のある場合に備えて凍結する。
９）泳動ゲル：
100V、約85mA
泳動  約１時間（ブロモフェノールブルーがゲルの３分の２位の長さまで泳動されるまで泳動する）
10）遮蔽のある写真箱装置を用い、UV箱においてゲルの撮影を行う（1/8秒,f−停止＝4.5）
写真は、帳面に保存する。18Sおよび28SリボソーマルRNAは明確に見えるべきである。ぼやけた下向きのリボソーマルRNAのにじみはRNAの分解を示している。定量および分注が適切になされているなら、バンドの輝度は試料間で同等であるべきである。
中断点
IV RNase防御検定（１−５日）
A.  アンチセンス方向のT7プロモーターを伴う特異的cDNA鋳型の調製：
Francois Binetteは、Ambionにより供給された18SrRNAを除き、これらの研究で用いたすべてのヒトcDNA鋳型をPCR技術を用い合成した。これらのcDNAは、T7RNAポリメラーゼおよび放射線活性ヌクレオチド三リン酸を添加したとき、アンチセンス方向にヒト遺伝子から放射線活性RNAの合成を推進する方向に、約20bpのT7ファージプロモーターと結合される。プローブの位置及びサイズを示すFrancoisのヒト遺伝子地図を添付する。
これらの実験に現在入手可能なひとcDNA鋳型は以下の遺伝子の部分を含む：
コラーゲン１型：軟骨細胞の脱分化マーカー
アグレカン、コラーゲンII型およびIX型：軟骨細胞の分化マーカー
コラーゲンＸ型：軟骨細の胞肥大マーカー
１日目：
B.  cDNAから放射線活性アンチセンスRNAプローブを調製するための、cDNAからのin vitroでの転写、とそれに続くcDNA鋳型除去のためのDNase処理。
ハイブリッド形成の工程の３日以内に行わなければならない、好ましくはハイブリッド形成の前日に行うべきである。
背景の付加的情報、キットの内容、付加的手順、および問題解決手引きは、MAXIscriptTM（Ambion）の教本を参照されたい。
プローブは電気泳動で分離するくらいに大きさが異なれば、RNase防御検定はいくつかのプローブの組み合わせで行われることが可能である。しかし、RNase防御検定に用いるために混合する前に、各プローブは個別のチューブで転写され、ゲルの異なるレーンからゲル精製されなければならない。上に示した鋳型からプローブを調製するのに加え、18SrRNA鋳型はRNase防御検定毎に転写されねばならない。おそらく、18SrRNAの量は細胞間で等しく、成長状態に独立であり、ゆえにRNase防御検定に用いた全細胞性RNA量の比較の標準となる。
サイズマーカーRNAもまた、各RNase防御検定で用いられるべきである。他のプローブと異なり、これらは使用の２カ月程度前に転写でき、ゲル精製される必要もない。
材料、プローブあたりの量
MAXIscripTMT7（Ambion,Cat＃1314）in vitro転写キットより
（95年11/1以後のキットに対し）
10×転写緩衝液、２μｌ
ATP溶液、10mM,1μｌ
GTP溶液、10mM,1μｌ
UTP溶液、10mM,1μｌ
T7RNAポリメラーゼ（5U/μｌ）＋RNase阻害剤（5U/μｌ）、２μｌ
DNase I（無RNase）2U/μｌ、１μｌ
２×ゲル泳動緩衝液、22μl:
0.05mMに希釈したAmbionMAXIscriptキットのCTP溶液、３μｌ［α−32P］−CTP、3000Ci/ミリモル、10mCi/ml、５μｌ（サイズマーカーの転写には１μｌだけ使用）これは、使用の３日以内に配達されるよう注文するべきである（配達日は月曜、金曜）。
pT−７ヒトcDNA鋳型（FBにより行われた100μl PCR rxnから）、５μｌ（〜0.5−1.0μｇ）の各pT7 18S rRNAアンチセンス対照鋳型、0.5μg/μｌ（Ambion Cat＃7338）（"R"）、２μｌ全pT7RNAサイズマーカー鋳型、１μｌ（２カ月以内に転写されないとき）DEPC−処理済水、13μｌまでの無RNase、ネジ式蓋1.5mlチューブ（各プローブ毎に標識しておく）、1.5mlチューブ用のヒートブロックを一つは37℃、もう一方は95℃。
プレキシガラス放射線遮蔽板
手順
１）ヒートブロックの一つを37℃に、そしてもう一方のヒートブロックを95℃にセットする。
２）［α−32P］−CTPを冷凍庫から室温に移動する。
３）ポリメラーゼおよびDNase I以外のすべての試薬を机上で室温に溶かす。
４）転写緩衝液およびXTP溶液を少し撹拌し、遠心する。
５）無RNase1.5mlチューブに以下に示す成分を加える。（＃はμｌを表す）
鋳型および、ポリメラーゼ以外のすべての成分は、一つにあわせることが可能である。そして、13μｌの分注に分け、各々の１本のチューブに入れて、鋳型を加えるようにする。チューブ当たり、１つの鋳型を加えて、次にポリメラーゼを加える。
32P−CTPの添加により始まるすべての手順は、プレキシガラス放射線遮蔽板を用い、行われなければならない。
室温で化合物は混合し、氷上では行わない。
0003638614.tif 000015
６）30−60分の間37℃ヒートブロックで保温する。
この間、４％アクリルアミドゲルの調製をする（後述のＣ章参照）
７）各反応に１μｌのDNase（キット）を添加し、ピペッティングにより混合し、15分間37℃で保温する。
８）21μｌの２×ゲル泳動緩衝液を添加し、95℃で２−３分間加熱する。
この工程に先立ち、ゲルの用意をする。：加熱が長過ぎるとSDS中での凝集形成を導き、電気泳動中にゲルへの侵入を不可能にする。
ブロックからヒートブロック中のチューブをゲルへの添加のために直接外す。
サイズマーカーを転写した場合、この時点で凍結できゲル精製の必要はない。
C.  放射線活性プローブのゲル精製
材料
Marathonゲルミックス４（４％アクリルアミドに対し前混合、8.3M尿素ゲル）、２枚のゲルあたり15ml
過硫酸アンモニウム（APS）、10％（１日以内に調製）、90μｌ
泳動緩衝液;1×TBE,〜300ml
ゲル注入装置
40μｌ容量穴のくし（10歯,0.75mm厚）
放射線室内ゲル電気泳動装置
微量チップピペットマンチップ
放射線室内電気泳動電源
プラスチックラップ
BIOMAX Rフィルム（Kodak,Cat＃895 2855）
無RNase1.5mlチューブ、プローブあたり１＋混合プローブ用１
溶出緩衝液（0.5M酢酸アンモニウム、0.2％SDS、1mM EDTA）、プローブあたり300μｌ
清潔な一枚刃剃刀
シンチレーション溶液（Optiphase"HighSafe"）、プローブあたり5ml
シンチレーションバイアル、プローブあたり１
シンチレーションカウンター、P32を計測するように設定する
手順
１）ゲル注入装置をきれいに掃除して組み立てる。
２）Marathonゲルミックス４を室温まであたため、APSを添加し、溶液を振り混ぜ、10mlピペットを用いゲルを注入する。
３）くしを刺し、固定し、くしの歯の上端までゲルが来るまでゲル溶液をさらに加える。
４）ゲルの固化後（30分以内）装置からプレート−ゲル−背面ユニットを外し、蒸留水でプレートを洗浄する。くしを外し、穴を２−３回洗浄する。洗浄の間、水をゆする。
５）電気泳動装置にプレート−ゲル−背面ユニット導入する。
６）緩衝液漏れを確かめながら上部緩衝液タンクに１×TBEを加え、下部緩衝液タンクにも加える。
７）in vitro転写物（Ｉ節）から試料を加える直前に、P1000を用い上部緩衝液タンクの緩衝液で穴を洗浄する。
８）95℃ヒートブロック内の各試料から、30μｌずつ各穴に、各試料間に空の穴がはさまれるようにしてのせる。
９）電源を入れ、125Vで約１時間、または速い色素がおよそゲルの2/3まで流れるまでゲルを泳動する。電圧は早く泳動するために200Vまで上げることができる。
10）ゲル電気泳動装置からプレート−ゲル−背面ユニットを外し、すべての成分を水で念入りに洗浄する。
11）ガラス板を外し、背面からゲルの接着を外す。
12）プラスチックラップでゲル／背面を包み、ゲルとフィルムの方向を考え（ゲルを正確にフィルムの左上に合わせる;1層のプラスチックラップでフィルムの感光しない側をゲルと離す）Ｘ線フィルムに60秒感光させる。
13）フィルムを現像し、ガイドとしてフィルムを用い、それぞれのプローブを含む４本のバンドのゲル上の位置を、ゲル上のプラスチックラップにペンで直接に印することで記す。フィルムをＸ線フィルムバインダーで保存する
14）剃刀で、目的のプローブを含むゲルの各バンドを切り落とし、プラスチックラップをはがし、個別の1.5m無RNaseチューブの溶出緩衝液300μｌ中に入れる。
15）2.5−３時間37℃でゲルを溶出緩衝液中で保温して、最速で１分間微小遠心する。
16）10mlのシンチレーション溶液をおのおの４つのラベルしたシンチレーションバイアルに加える。
17）３μｌ（全量の１％）を各溶出から個別のシンチレーションバイアルに加える。
18）P32プログラムによって、シンチレーションカウンターで放射線活性を測定し、CPMを記録する。
19）各プローブに対し、25,000カウントになるようにμｌで容量を計算する。
20）上で各プローブ全部で25,000nCPMとなるよう計算した量で、プローブを１つの1.5ml無RNaseチューブに合わせる。ここでｎは、このプローブ混合液で行うRNase防御検定の数（対照実験を含む）に等しい。
放射線のエネルギーによりRNAの崩壊が起こるため、プローブは３日以内に用いるべきであり、すぐ使用する方がより好ましい。
21）個々の未使用プローブを放射性活性物質用冷凍庫に戻す。
遮蔽コンテナを用いる。
D.  細胞性RNAのアンチセンスプローブとの共沈殿
ハイブリッド形成工程の前日に行われるべき
材料
"P＋”と標識した650μｌ無RNAチューブ１本（プローブに対する対照;RNase処理されていないもの）
"P−”と標識した650μｌ無RNAチューブ１本（対照;RNase処理したプローブ）Hybspeed RPAキット（Ambion）から：
溶出緩衝液、RNase防御検定をする試料あたり〜130μｌ
Hybspeed RPAキット（Ambion）の酵母RNA、試料あたり10μｌ
Hybspeed RPAキットの5M酢酸アンモニウム、試料あたり０〜13μｌ
Ｃ節の放射線活性混合プローブ、試料あたり、プローブあたり25,000cpmプローブすべき各細胞性RNA試料の1.0μｇ分注（各々650μｌ無RNaseチューブに分注）
理想的にはこれは、用いるプローブが標的とするRNAを含むことが前の検定で判明している細胞性RNA（陽性対照）の一つまたは多数の分注、および軟骨特異的遺伝子を発現しないことの知られた繊維芽細胞由来RNA（陰性対照）の分注を含むべきである。
冷却100％エタノール、試料あたり375μｌ
手順
１）（ｎ＋２）10μｌ酵母RNA＋（ｎ＋２）130μｌ溶出緩衝液を一つのチューブに合わせる。
ここで、ｎ＝すべての対照を含めて、10μｌ以下の容量の試料の＃である。
２）上記混合に対し、（ｎ＋２）ｙμｌのＣ節のプローブ混合物を加える。
ここで、ｎ＝すべての対照を含めて、10μｌ以下の容量の試料の＃であり、ｙμｌ＝25,000cpmの各プローブを含むプローブ混合物の容量である。
３）（140＋ｙ）μｌを以下に加える。：
Ｐ＋と標識した空チューブに
Ｐ−と標識した空チューブに
RNA試料の容量が10μｌを越えない場合、細胞性RNA試料を含む各々のチューブに加える。
４）10μｌを超えている容量の各RNA試料に対し、
1/10容量の5M酢酸アンモニウム，
10μｌの酵母RNA、
全量140μｌまで増やすのに十分な溶出緩衝液、
ｙμｌ（上記参照）の混合プローブ、を加える。
５）簡単に試料を撹拌し、375μｌ（約2.5倍容量）の冷却100％エタノールを加え、約40回撹拌する。
６）すべてのチューブおよび未使用のプローブを「放射線活性」冷凍庫に置き、１時間または一晩の間共沈殿をさせる。
２日目：
E.  細胞性RNAとアンチセンスプローブのハイブリッド形成および、ssRNA除去のためのRNase処理
背景についての更なる情報、キットの構成成分、付加的手順、および問題解決指針に関しては、HybspeedTMRPA（Ambion,Cat＃1412）の手引書を参照されたい。
材料
650μｌチューブに対し３つのヒートブロック、95,68,37℃に設定する（放射活性遮蔽板の側で）。
Hybspeed RPA（Ambion,Cat＃1412）キットより：
RNase分解緩衝液、細胞性RNAおよびプローブ対照試料あたり100μｌ
ハイブリッド形成緩衝液、細胞性RNAおよびプローブ対照試料あたり10μｌ
ゲル泳動緩衝液II、細胞性RNAおよびプローブ対照試料、およびサイズマーカーに対し10μｌ
ゲルに対し１レーンはサイズマーカーを泳動されるべきである。；試料数に依存して１または２のゲルが泳動されるだろう（ゲルあたり最大10レーン）
RNaseA/T1混合液（酵素：使用まで冷凍庫で保存し、速やかに冷凍庫へ戻す）、試料あたり１μｌ）
不活性／沈殿混合液（使用まで冷凍庫に保存）、細胞性RNAおよびプローブ対照試料あたり150μｌ
細胞性RNAおよび冷凍庫で一晩保存したプローブを含む共沈殿チューブ
（Ｄ節）
冷室における遠心
延長ピペットマンチップ（良質チップ）
放射線活性廃棄用真空フラスコ
放射線遮蔽板（研究室内）
１％SDS、ピペットチップ洗浄用に数ml用いる。
70％エタノール、−20℃で保存、細胞性RNAおよび対照試料プローブあたり300μｌ
タイマー
手順
これらの手順は研究室（放射線室の必要はない）において行われる。
プレキシガラス放射線遮蔽板の後で手順は行われ、放射線活性ごみ箱を用いる。
保温時間および温度に注意すること。
１）ヒートブロックおよび水槽を前保温する（これらは互いに隣接させておくべきである）。
２）RNase消化緩衝液を37℃に前保温する。
３）ハイブリッド形成緩衝液およびゲル泳動緩衝液を室温でとかす。
４）ペレットRNA沈殿：冷凍庫より一晩共沈殿チューブを出し（Ｄ節）、最速で15分間、冷室中で微小遠心する。ペレットの位置がわかるようにチューブを並べる。
５）延長ピペットマンチップ（良質）を用い、上清（エタノール）を放射線活性廃棄用真空フラスコへ注意深く吸引する。
ペレットに触れない。各チューブ間にピペットマンチップを１％SDSで洗浄する。
６）RNAペレットを洗浄する：各ペレットに、ゆっくり（ペレットがはがれないように）300μｌ冷却70％エタノールを加える。〜４回ほどゆっくりと振り混ぜ、最速で５分間冷室に置いて微小遠心する。
７）遠心中、必要量のハイブリッド形成緩衝液を分注し、95℃に前加熱する。
８）再び吸引し、ペレットを吸い込まぬようチューブの側面よりできる限りエタノールを除去する。
９）ペレットを95℃ヒートブロックに置き、10μｌの前加熱したハイブリッド形成緩衝液を各チューブに加える。
10）溶解：各試料を完全に20秒間撹拌し、撹拌後すぐに各チューブを95℃に戻す。（速やかに行い、１度に２つのチューブを撹拌する）
各々を10秒間再撹拌し、速やかに95℃に各試料を戻す。
”共沈殿したプローブ＋RNAの再溶解はHybspeed Systemの感度を最大化するために重要である。泡が生じても気にする必要はない。”
11）ハイブリッド形成:95℃２−３分加熱後、速やかにチューブを68℃水槽に移し、10分間保温する。
”試料の温度が低下することは許されない”
12）10分間のハイブリッド形成の間、除去RNaseA/T1を分注し、撹拌および簡単に微小遠心を行い、100μｌのRNase消化緩衝液（緩衝液は37℃に前保温された）毎に１μｌを加えることにより100:1に希釈する。元のRNaseを冷凍庫に戻す。希釈されたRNaseを簡単に撹拌し、遠心する。希釈したRNaseおよび未使用消化緩衝液を37℃に保つ。”氷上に置いてはならない”。"P＋”試料のために100μｌのRNaseを含まない消化緩衝液が必要である。
13）非ハイブリッド形成ssRNAの消化:10分のハイブリッド形成のあと、一度に１チューブ68℃水槽から直接37℃のブロックに移し、速やかに100μｌの希釈し37℃に前保温したRNaseを加える。
例外項:"P＋”と標識したチューブに対し（Ｄ節参照）希釈したRNaseを加えない。代わりに、RNaseを含まない100μｌの消化緩衝液を加える。この試料は電気泳動の間未消化プローブの動向を示すだろう。
14）上記のようにすべてのチューブを処理した後、各チューブを撹拌し37℃に30分間戻す、初めの15分の後再撹拌する。この保温の間電気泳動のためのゲルの注入を行う。（以下参照）
15）30分のRNase処理の後、各チューブに150μｌの冷却した不活性化／沈殿混合液を加える。
簡単に撹拌、微小遠心を行う。チューブを−20℃の冷凍庫に最低15分間移す（数時間放置可能）。
F.  保護されたRNAの電気泳動
最高９試料（マーカーのレーンを含まない）当たり１つのゲルを注ぐ。
４％アクリルアミド/8.3M尿素ゲルあたりの材料
PAGE1配列決定用ゲルキット（Boehringer Cat＃100688）より：
成分1:アクリルアミド：ビスアクリルアミド（19:1）/8.3M尿素、1.6ml
成分2:希釈剤、8.3M尿素、7.4ml
10XTBE/8.3M尿素（Boehringer Cat＃100919）、1.0ml
過硫酸アンモニウム（APS）、10％（一日以内に準備）70μｌ
TEMED 10μｌ
ランニング緩衝液:1XTBE、〜300ml
ゲル注入装置
櫛（10歯、0.75mmの太さ）
ゲル電気泳動装置
小チップピペットマンチップ
電気泳動動力供給
プラスチックラップ
BIOMAX MRコダックフィルム
（Ｂ節に記載されたように転写された）放射性RNAサイズマーカー
不活性化／沈澱混合物中における試料
長ピペットマンチップ（小チップ）
放射性廃棄物のために設計された真空フラスコ
HybSpeed RPAキットによるゲルローディング緩衝液II、１試料あたり10μｌ
650μｌチューブセットのための90℃でのヒートブロック
方法
１）４％アクリルアミド/8.3M尿素ゲルを注ぐ：節Ｃの１−５工程に従う。
２）O Thaw放射性サイズマーカーおよびゲルローディングバッファー
３）非活性化／沈澱混合物から試料を冷却器から取り除き、冷却された部屋で最高速度で15分間遠心にかける。
４）遠心分離中、プレート−ゲル接続ユニットを装置から取り除き、蛇口の蒸留水でプレートをすすぐ。くしを取り除き、ウェルを２から３回すすぎ、すすぎとすすぎの間、水を振って落とす。
５）プレート−ゲル接続ユニットを電気泳動装置に設置する。
６）1XTBEを漏出を阻止しながら上の槽に加え、さらに下の槽にも加える。
７）15分の遠心分離の後、長ピペットマンチップ（小チップ）を用いて注意深く、上清（エタノール）を放射性廃棄物のために設計された真空フラスコのなかに吸出する。
ペレットに触れてはならない。各チューブにおいてピペットマンチップを１％S DS中ですすぐ。
８）最高スピードで30秒遠心し、再び吸出する。
「残余の上清はゲル中のバンドの異常な泳動をひきおこす」
９）10μｌのゲルローディング緩衝液を加え、激しくボルテックスで懸濁し、簡単に遠心を行う。
10）試料をヒートブロックで３−４分間90℃まで熱する。注記：長すぎる加熱は試料をゲルのウェルにひっかかりやすくする。
11）試料を加える直前に、P1000を用いて上部の槽の緩衝液でウェルをすすぐ。
12）90℃のヒートブロック中の試料を用いて、ウェルあたり８μｌの各試料をロードする。
例外：
マーカー:1μｌを９μｌのゲルローディング緩衝液に希釈し、ウェルに１μｌだけ流す。マーカーは加熱される必要はない。マーカーは減衰するので（半減期＝２週間）、それに応じてロードされるマーカーの量を増加すること。
"P＋”コントロールプローブ試料:1μｌだけロードする。
ローディングの注意：可能ならば、最終レーンの使用を避け、マーカーレーンと隣接試料との間に空のウェルを残すこと。
13）動力供給を接続し、ゲルを125Vで、速い染色液がゲルの末端に近くなるまで泳動する。
14）プレート／ゲル／接続ユニットを電気泳動装置から取り除き、全ての成分を完全に蛇口の水ですすぐ。
15）ガラスプレートを取り除く。
16）ゲルを接続プレートからWharman紙に移し、ゲル乾燥器の上で乾燥させる。
G.  ホスホイメジャー
１）消去されたホスホイメジャーカセット中でゲルを曝し、格子上のゲルの位置を記録する。
２）１−４日間の照射の後、イメージを走査し、バンドを定量する。
アグリカン（Agg）（Doege et al.,J.Biol.Chem.266:894−902,1991）の部分的配列を含むDNA断片およびコラーゲンのタイプＩおよびII（Kuivaniemi et al.,Bio chem J.252:633−640,1988およびBaldwin et al.,Biochem J.262:521−528,1989）がヒト軟骨細胞cDNAライブラリーのPCR増幅によって生産された。数百塩基対（bp）によって隔てられた各遺伝子におけるコーディング配列を示す組み合わされたオリゴヌクレオチドがPCRのためのプライマーとして用いられた。T7RNAポリメラーゼプロモーターの、後の追加のための他の配列（CAGTGCCAT）は、下流のプライマーの5'末端に含まれる。上流および下流の配列を伴った各々5'から3'への方向で示すプライマーの配列は以下の通りである：
ｉ）CCATGCAATTTGAGAACT（SEQ ID No:1）および
ii）551bpのアグリカン遺伝子配列（Agg551）を生産するための、ACAAGAAGAGGACACCGT（SEQ ID No:2）
iii）CCATGCAATTTGAGAACT（SEQ ID No:3）および
iv）Agg207を生産するためのCTTCGATGGTCCTGTCGTTCAG（SEQ ID No:4）
ｖ）GCGGAATTCCCCCAGCCACAAAGAGTC（SEQ ID No:5）および
vi）タイプIIコラーゲン（C I）遺伝子の261bpのためのCGTCATCGCACAACACCT（SEQ ID No:6）および
vii）GTCCCCGTGGCCTCCCCG（SEQ ID No:7）および
viii）タイプIIコラーゲン遺伝子（C II）の307bpのためのCCACGAGCACCAGCACTT（SEQ ID No:8）。
増幅された断片は、増殖と保存のためにpCRscriptベクター（Stratagene,La Jolla California）に挿入された。アンチセンスプローブの転写のための鋳型を生産するために、これらの単離されたcDNA断片を用いて第二のPCR増幅が行われた。プライミング反応のために、上に示された個々の上流プライマーが各々最初のPCR増幅に用いられた同じアンカー配列（下線部）を含むT7プロモーター配列と組み合わされた。
GGAATTCTTAGATAATACGACTCACTATAGGGCAGTGCCAT（SEQ ID No:9）；各々上流のT7プロモーターに結合している、80bpの18S rRNA遺伝子または316bpのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）遺伝子を含むDNA鋳型がAmbion（Austin,Texas）によって供給された。鋳型として使用する前に、プロモーターに連結したGAPDH配列がDde1による分解によって149bpに縮小された。
上記の鋳型からのin vitro転写はMaxiscriptTMキット（Ambion）を用いて製造業者の指示に従って行われた。全長のプローブは7M尿素、４％ポリアクリルアミド1XTBEゲル上の電気泳動による転写反応から精製され、さらにオートラジオグラフィー、全長転写物に対応するバンドのゲルからの切断、および37℃で２時間（MaxiscriptTMキットによって供給された）プローブ溶離緩衝液中への受動的拡散が行われた。プローブの活性は、シンチレーション集計によって定量された。
RNAase保護分析がHybspeedTMRPAキット（Ambion）を用いて製造業者の指示に従って行われた。要約すると、放射線標識されたアグレカンのためのアンチセンスRNAプローブおよびタイプＩおよびIIのコラーゲンが結合させられ、過剰のプローブを用いて軟骨細胞から単離されたRNAとハイブリッド結合処理された。18S rRNAまたはGAPDHのためのプローブもまた全RNAへ標準化するために個々のハイブリダイゼーション混合物の中に含まれた。ネガティブコントロールのためには、酵母のRNAだけがプローブと結合させられた。ポジティブコントロールのためには、プローブが、４つ全てのプローブに相補する配列を含むことが知られているRNA試料にハイブリッド結合処理された。RNaseA/RNaseT1混合物を用いた分解が、ハイブリッド結合していないRNAを崩壊させるために行われた。分解から保護された、ハイブリッド結合したRNAは上に記載されたように電気泳動で分離させられ、オートラジオグラフィーまたはフジフィルムBAS−1500ホスホイメジャーを用いて視覚化された。タイプＩおよびIIのコラーゲン遺伝子を示すホスホイメージ上のバンドがMacBAS version 2.4ソフトウェアを用いて定量された。ネガティブコントロール（軟骨細胞RNAのない）の対応する位置からのシグナルは差し引いた。
アルギン酸培養液中の細胞は上に記載された規定培地の中で生育させられ、次のように補給試料を与えられた。
培養1:1XITS＋
培養2:1XITS＋および0.2ng/mlTGF−β１
培養3:1XITS＋および1.0ng/mlTGF−β１
培養4:1XITS＋および5.0ng/mlTGF−β１
細胞は、７日および21日目に、RNA単離のために回収された。
７日培養由来のRNAについてのRNase保護分析の結果は、TGF−β１の非存在下（培養１）で、C IのmRNAが大量であるのに対してC IIまたはAggのmRNAはほとんどないか全く検出されなかった。0.2ng/mlのTGF−β１の付加により（培養２）、大量のC Iはそれほど変化しなかったのに対し、軟骨細胞分化マーカーC IIおよびAggの明らかな大量のmRNAの誘導ががおこった。より高いTGF−β１の濃度（培養３および４）の追加は、量依存的なC IIおよびAggの増加とC Iに関する無変化を示した。21日目に回収された培養も同じ結果をもたらした。別の実施例において、我々は、抗TGF−Ｂモノクローナル中和抗体の100倍モル過剰は、培養３のために記載された培養補給試料とともに含まれるとき、培養１の結果と同じ結果をもたらしたことを示した。このことは実際上、分化活性はTGF−β１調製品の汚染という可能性を除く。
実施例８
実施例７の培養１、３および４のための培養条件が繰り返された。並行して行った同じ培養液において、TGF−β２がTGF−β１の代わりに用いられた。TGF−β１およびβ２培養液からの結果は実施例７からの対応する培養液と同じであり、TGF−β１およびβ２がこの培養系において軟骨発生誘導に関して同じ特性を持つことを示唆する。
実施例９
アルギン酸の中に埋め込まれた軟骨細胞が、ITS＋および1ng/mlのTGF−β２を補給された基礎培地中で１、２、４、７、および21日間培養された。ネガティブ・コントロールとして、細胞は21日についてIGS＋だけを補給された基礎培地中で培養された。これらの培養液のRNA分析は、最初の７日を通じてC IIおよびAggのRNAの増加の一般的傾向（アグリカンにおける約５倍の増加およびC IIにおける約40倍の増加）を示した。21日目に、多量のC IIおよびAggのmRNAが目にみえて少なくなったが、一日目に比べると高いままであった。
実施例10
付録Ｃにおいて示されたように、1XITS＋は6.25μg/mlのインシュリンを含むいくつかの成分の混合物である。この実施例は上の実施例においてITS＋におけるインシュリンがTGF−βを介するC IIおよびAggの誘導に役割を果たしたかどうか決定するために行われた。第二に、もしインシュリンが役割を果たしていたならば、我々はそれがIGF−Ｉによって置き換えられうるかどうかを見たいと望んだ。実施例７における培養３の培養条件が繰り返された。並行して行った培養では、ITS＋培地をインシュリンを省略して調製するか、またはインシュリンを10ng/mlのIGF−Ｉに置換した。７日の培養の結果はインシュリンおよびIGF−Ｉの不在下で、1ng/mlのTGF−βはC IIの発現もAggの発現も誘導しなかった。しかしながら、培養に6.25μg/mlのインシュリンの代わりに10ng/mlのIGF−Ｉを付加することは、TGF−β１の媒介するこれらの軟骨細胞発生マーカーの誘導を、実施例７の条件３のそれに匹敵するレベルにまで回復させた。このことは、低親和力でインシュリンと結合するIGF受容体（Schmid,1995）は、TGF−βの媒介する軟骨細胞発生がおこるためには活性化されなければならないことを示唆する。さらに、インシュリンよりも約600倍低い濃度でのIGF−Ｉの使用は、分化に影響を与える汚染要素の可能性を実質的に減少させる。
別の実施例で、ITS＋の他の成分が省略されるかまたは置換された。我々は、トランスフェリンおよび亜セレン酸が重大な結果をもたらすことなく除去されることができ、ヒト血清アルブミンはウシ血清アルブミンにとってかわることができることを発見した。
結論として、1ng/mlのTGF−β１またはβ２、10ng/mlのIGF−Ｉ、1mg/mlのヒト血清アルブミンを補給された基礎培地を含み、またさらに５μg/mlのリノレン酸を含む完全規定培地は、脱分化したヒト軟骨細胞に懸濁培養液中で軟骨細胞分化のマーカーであるC IIおよびAggを再発現させるよう誘導する。