(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親株のコチョウランの花茎に基づき得られた親シュートから娘シュートを側生させて前記コチョウランを保存複製させる方法であって、
前記親シュートにおいて少なくとも上部１〜２枚の葉を残して、基部から葉、根を取り除く除葉／除根工程と、
前記除葉／除根処理工程後の親シュートを誘導培地にて培養し、娘シュートを側生させる培養工程と、を含むコチョウランの保存複製方法。
【請求項２】
前記除葉／除根工程において、親シュートの基部から１〜４枚の葉が除去されることを特徴とする請求項１記載のコチョウランの保存複製方法。
【請求項３】
前記誘導培地には、娘シュートの側生を促進し得る濃度の植物ホルモンが含有されていることを特徴とする請求項１又は２記載のコチョウランの保存複製方法。
【請求項４】
前記娘シュートの側生を促進し得る濃度の植物ホルモンが、１〜１５ｐｐｍのベンジルアデニンであることを特徴とする請求項３に記載のコチョウランの保存複製方法。
【請求項５】
前記培養工程において、前記親シュートが２０〜３０℃で培養されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のコチョウランの保存複製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シュート培養によるコチョウラン親株の保存・複製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コチョウランは、ラン科植物の中で最も注目されている園芸植物の一つである。従来、育種によって得られた優秀な株を絶滅させないように長期的に保存し、安定的に複製する方法として、第一に親株の花茎腋芽をＢＡ（ｂ−ベンジルアミノプリン）などの植物ホルモン剤で処理し、シュート（いわゆる高芽）を得る方法がある（Ａ．Ｔ．Ｔｓｅ，Ｒ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｐ．Ｈａｃｋｅｔｔ．１９７１．Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ｓｈｏｏｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ  ｎｏｄｅｓ．Ａｍｅｒ．ｏｒｃｈｉｄ  Ｓｏｃ．Ｂｕｌｌ．４０：８０７−８１０．）。
【０００３】
また、第二の方法としては、花茎腋芽を殺菌処理して無菌培養によってシュートを得る方法がある（Ｄ．Ｍ．Ｒｅｉｓｉｎｇｅｒ，Ｅ．Ａ．Ｂａｌｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ａｒｄｉｔｔｉ．１９７６．Ｃｌｏｎａｌ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｆｌｏｗｅｒ−ｓｔａｌｋ  ｎｏｄｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｔｈｅ  Ｏｒｃｈｉｄ  Ｒｅｖｉｅｗ．８４：４５−５２）。
【０００４】
さらに、第三の方法としては、無菌的なシュートの節を培養し、シュートを得る方法がある（Ｊ．Ｘ．Ｄｕａｎ，Ｈ．Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｚａｗａ．１９９６．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ  ｖｉａ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｏｄｅｓ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．１５：１３３−１３７．）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記第一及び第二の従来の方法では、一年に一度の開花時期にしか花茎が得られず、その上、その花茎から得られた１腋芽からは通常１シュートしか得られないことが問題であった。
【０００６】
また、上記第三の従来の方法では、複数のシュートが得られたとしても、各シュートにおいて節の生存率が低かったり、また、高濃度の植物ホルモンによって、遺伝的保存性の低いマルチシュートが発生しやすいという問題がある。
【０００７】
これらの結果から、先ず、前者の方法（第一及び第二の従来の方法）では、せっかく花茎腋芽から得られたシュートには、本来、潜在的に側生シュートとなりうる複数の腋芽を利用していないことが考えられた。また、後者の方法では、得られた腋芽を有効に利用してはいるが、その利用の仕方が、親株の保存／複製としては適当でないことが考えられた。
【０００８】
そこで、本発明はこれらの諸問題を解決すべく、より安定的かつ長期的に無菌的に親株を保存・複製し得るコチョウランの複製方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、親株のコチョウランの花茎に基づき得られた親シュートから娘シュートを側生させて前記コチョウランを保存複製させる方法であって、前記親シュートにおいて少なくとも上部の１〜２枚の葉を残して基部から葉、根を取り除く除葉／除根工程と、前記除葉／除根工程後の親シュートを誘導培地にて培養し、娘シュートを側生させる培養工程と、が含まれる。
【００１０】
上記発明によれば、除葉／除根工程において、親株のコチョウランの花茎に基づき得られた親シュートの基部から葉、根が取り除かれて腋芽を露出させ、培養工程において、この露出した腋芽を娘シュートにまで生育を促進させることができる。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、従来生育が困難であった親シュートの潜在的な腋芽を効率良く生育させることが可能となる。また、従来のように植物ホルモンを高濃度添加して節断片から不自然に複数のシュートを側生させたものと異なり、本発明では基本的に親シュートの腋芽から一つの娘シュートを生育させるという植物本来が有する特性に従ったものであるため、親株の遺伝的特性を保存しつつ娘シュートを複製させることが可能となる。また、本方法では、親シュートにおいて、少なくとも上部１〜２枚の葉を残して、除葉することにより、遺伝的保存性の低いマルチシュートの形成が防がれている。
【００１２】
なお、本明細書において「親シュート」の語は、娘シュートを側生し得る潜在能力を有するシュートを意味する。従って、「親株のコチョウランの花茎に基づき得られた親シュート」には、娘シュートを側生し得る潜在能力を有するものであれば、親株のコチョウランの花茎から直接腋芽し成長させたシュート、及び、この親シュートから側生させて得られた娘シュートも親シュートとなり得るため、この娘シュートをも含む。また、「娘シュート」とは、前記親シュートから側生させて得られたシュートを意味する。
【００１３】
本発明は、上記発明において、前記除葉／除根工程において、親シュートの基部から１〜４枚の葉が除かれることを特徴とする。このように親シュートの基部から１〜４枚の葉を除くことにより、各葉の葉腋に存在する潜在的な腋芽を適切に露出させ、その生育を助けることが可能となる。
【００１４】
本発明は、上記発明において、前記誘導培地に娘シュートの側生を促進し得る濃度の植物ホルモンが含有されていることを特徴とする。
【００１５】
上記発明によれば、植物ホルモンの添加により、除葉／除根工程において露出された腋芽の生育を助けて、娘シュートへの生育効率を高めることが可能となる。このように、ここで添加される植物ホルモンは、親シュートが潜在的に有している腋芽を側生させる程度の濃度であることから遺伝的な保存性を維持することが可能となる。
【００１６】
より具体的には、この娘シュートの側生を促進し得る濃度の植物ホルモンは、１〜１５ｐｐｍのベンジルアデニンである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。
【００１８】
本コチョウランの保存複製方法を適用することが可能なコチョウランの品種は、特に限定はなく、コチョウランであれば、例えば、Ｄｔｐｓ．Ｗｈｉｔｅ  Ｃａｓｔｌｅ，Ｄｔｐｓ．Ｑｕｅｖｅｄｏ，Ｄｔｐｓ．Ｚｕｍａ  Ｗｈｉｔｅ  Ｂｕｔｔｅａｆｌｙ等のドリテノプシス属や、Ｐｈａｌ．Ｚｕｍａ  Ｒａｓｃａｌ，Ｐｈａｌ．Ｚｕｍａ’ｓ  Ｐｉｘｉｅ，Ｐｈａｌ．Ｂａｌｄ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ，Ｐｈａｌ．Ａｌｆｅｎｓｏ  Ｍｏｒｅｎｏｎ等のファレノプシス属などが含まれ、また、この他の多数のコチョウラン品種や原種も含めることができる。
【００１９】
本方法では、先ず、親株のコチョウランの花茎に基づき得られた第一の親シュートを準備する必要がある。
【００２０】
第一の親シュートは、外部からの病気の侵入を防ぎ、長期に安定的に複製可能にするために、好ましくは無菌的なものとする。また、無菌的に準備したものであれば、開花株花茎から得られた親シュートを直接表面殺菌したものであってもよいが、好ましくは、コチョウランの開花株の花茎自体を無菌的に培養することによって得られる無菌的な親シュートである。この後者により準備された親シュートは、その後、前者のように表面殺菌を行わずに、直接無菌的な状態として使用することができるため、得られた親シュートにダメージを与えることを防止することができる。
【００２１】
上記第一の親シュートから娘シュートとなる腋芽を形成させるために、親シュートは除葉／除根処理が施される。この除葉処理は、葉の根本に存在する潜在的な腋芽を露出させることができるように葉が取り除かれれば、取り除く葉の枚数は適宜調整することができる。例えば、親シュートにおいて４枚程度葉が生育している場合には、基部から順次下方に位置する１〜３枚程度の葉を取り除くことができる。但し、親シュートの全ての葉を取り除いた場合には、遺伝的保存性が低いマルチシュートやＰＬＢを形成する傾向があるため、上部の若い葉を少なくとも１〜２枚残すことがよい。
【００２２】
また、葉を取り除く場合には、葉先だけを取り除くのではなく、腋芽を露出させることができるように、葉の根本から完全に葉を取り除くことが望ましい。また、この除葉処理とともに、親シュートから根が取り除かれる。これら除葉／除根処理の操作は、取り除く葉、根をそれぞれ根本から取り去ることができれば、特に処理操作には限定は無いが、例えば次の通り操作することができる。
【００２３】
先ず、準備した親シュートを粗調整として、滅菌メスで根が切除され、さらに約３ｃｍ以上の大きめの葉、すなわち除去すべきシュート基部より１〜４枚の葉の葉先側２／３程度が切除される。次に、この除去すべき葉が根本から完全に切除される。
【００２４】
上記除葉／除根工程後の親シュートは、娘シュートの側生のため、誘導培地を用いて培養が行われる。
【００２５】
この培養工程で用いることができる誘導培地は、親シュートから娘シュートを側生し得るものであれば特に限定はなく、例えば、１／２ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＶ培地などの組織培養葉培地を用いることができる。この誘導培地には、支持体が添加され、この支持体としては、ジェランガムや寒天のようなゲル化剤を用いることができる。この支持体として寒天を用いる場合には、０．６〜１．０％、好ましくは０．７％となるように添加することができる。
【００２６】
また、誘導培地には、糖類、天然有機物、植物ホルモンなどを添加することがよい。この誘導培地に添加する糖類としては、多糖類、単糖類、糖アルコール類（例えば、蔗糖やソルビトール等）などが挙げられる。例えば、誘導培地に蔗糖を添加する場合には、０．５〜３％の濃度となるように、より好ましくは１％となるように添加することができる。また、他の糖類についても、この蔗糖の濃度を考慮して、添加濃度を設定することができる。
【００２７】
また、上記天然有機物としては、ココナツウォータ、新鮮バナナ、新鮮ジャガイモなどが挙げられる。この天然有機物として、ココナツウォータを用いた場合には、５〜２５％となるように、好ましくは１０％となるように添加することができる。他の天然自然物を添加する場合も、このココナツウォータの濃度を考慮して適宜、添加量を決定することができる。
【００２８】
さらに、上記誘導培地に添加する植物ホルモンとしては、ベンジルアデニンなどが挙げられる。上記植物ホルモンを誘導培地に添加する場合には、娘シュートの側生を促進し得る濃度で添加することが好ましく、例えば、上記ベンジルアデニンの場合には、１〜１５ｐｐｍとなるように、好ましくは、５ｐｐｍとなるように添加することができる。
【００２９】
上記の通り調整された誘導培地に親シュートを置床して培養を行う。親シュートを誘導培地に置床する場合には、除葉処理などが済んだ親シュートの基部を誘導培地に接するように行う。
【００３０】
また、置床後の親シュートの培養は、１８〜３０℃の範囲内、好ましくは、２８℃の温度条件下で行われる。また、この培養の際には、親シュートは、一日中連続して、もしくは一日当たり１６時間程度照明下に置かれる。この照明の照度は、５００〜５０００ｌｕｘ、好ましくは、２０００〜３０００ｌｕｘとすることができる。このような条件下で、通常３０〜９０日間、親シュートを培養することにより娘シュートが側生されるが、側生された娘シュートの形成能は、品種間で差があるため、上記範囲内で品種に応じた適切な培養期間を定めることができる。また、必要であれば、この範囲外の培養期間を定めることもできる。
【００３１】
上記培養により側生した娘シュートは、滅菌メスで親シュートの接着部より切り出され、この切り出された娘シュートから植物体が再生される。この娘シュートの植物体への再生には、通常の方法、例えば、通常の育苗用培地や無菌播種用培地に切り出された娘シュートを移植し、明るさと通気性を一定に保つことにより幼植物体に成長させることができる。
【００３２】
このように上記一連の工程により親シュート以外に、遺伝的に保存された１個体又はそれ以上の娘シュートを複製させることが可能となり、また、これらはそれぞれ植物体に生育させることができる。また、ここで得られた娘シュートもまた親シュートとなって潜在的に腋芽を側生させ得る能力を有する。
【００３３】
この娘シュートが有している腋芽を側生させる能力を引き出すためには、上記のように２〜３ヶ月間培養し生育させた後、これを親シュートとして上記一連の工程（除葉／除根工程、誘導培地を用いた培養工程）を繰り返す。
【００３４】
詳細には、切り出した娘シュートを移植する育苗培地は、例えば、ＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｖ＆Ｗ培地等の基本培地を用いることができる。またこの培地には、例えば、新鮮バナナ５０〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１００ｇ／ｌ、蔗糖０．５〜３％、好ましくは１％、活性炭０．５５〜２％、好ましくは０．１％を添加することがよい。また、この培地の支持体として寒天を０．５〜０．８％、好ましくは、０．６％となるように添加し、培地を固めることがよい。
【００３５】
また、育苗条件として、温度を２０〜２８℃、好ましくは、２３〜２６℃に維持し、照明を８〜２４時間、好ましくは、１６時間継続して照射する。また、この照明の照度は、２００〜５０００ｌｕｘ、好ましくは２０００〜３０００ｌｕｘとすることができる。
【００３６】
このような条件で生育された娘シュートは、次の娘シュートを側生させる親シュートにまで成長する。このように娘シュートを生育させ、これを親シュートとして利用して順次、娘シュートを生成させることにより、親株のコチョウランの特性を遺伝した幼植物体を多数得ることが可能となる。また、これと同時に、品種としての親株を次々と継代させ、品種を長期に保存することが可能となる。
【００３７】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］  除葉処理における娘シュートの側生率への影響
本実施例では、コチョウランの一種、Ｄｔｐｓ．Ｑｕｅｖｅｄｏの花茎腋芽を培養して得られた苗由来の無菌的な４〜５枚の葉を有する親シュートを用いた。なお、花茎腋芽の調整・培養方法は田中法（Ｍ．ＴＡＮＡＫＡ，１９８７．ＳＴＵＤＩＥＳ  ＯＮ  ＴＨＥ  ＣＬＯＮＡＬ  ＰＲＯＰＡＧＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＨＡＬＡＥＮＯＰＳＩＳ  ＴＨＲＯＵＧＨ  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＣＵＬＴＵＲＥ．ＭＥＭＯＩＲＳ  ＯＦ  ＦＡＣＵＬＴＹ  ＯＦ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ，ＫＡＧＡＷＡ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ．ＮＯ．４９：１−８５）を用いた。
【００３９】
試験区として図１に示すように、未処理の親シュート（Ｉ）を粗調整した粗調整処理区（ＩＩ）、および粗調整した後に基部より順次３〜４枚までの葉を根本から切除し、上部の若い葉を１〜２枚残した除葉処理区（ＩＩＩ）を設けた。
【００４０】
シュート培養用培地として、Ｂ５培地に蔗糖１％、ココナツウオーター１０％、ベンジルアデニン（ＢＡ）１ｐｐｍをそれぞれ添加して、寒天０．７％で固形化したものを準備した。
【００４１】
上記培地に各処理区の親シュートを置床し、２５℃で２０００ｌｕｘの１６時間証明下で培養し、２ヶ月後に側生率の調査を行った。その結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
0003611484.tif 000002
表１に示すように、第二処理区のように除葉処理を行った結果、２９％の割合で娘シュートが側生した。一方、粗調整のみ行った第一処理区では娘シュートの側生が認められなかった。
【００４３】
この結果から、除葉／除根処理のみにより、娘シュートの側生を促進させることができることが示された。
【００４４】
［実施例２］  誘導培地中に添加された植物ホルモンの濃度の影響
次に、実施例１の除葉処理したシュートを用い、植物ホルモンの含有濃度の異なる誘導培地で娘シュートの側生を試みた。
【００４５】
ここで用いたシュート誘導培地は、次の通り調整した。誘導培地は、Ｂ５培地に蔗糖１％、ココナツウオーター１０％、ベンジルアデニン（ＢＡ）ｌｐｐｍを添加して、寒天０．７％で固形化した。この培地を「培地ａ」とし、培地ａに植物ホルモンであるベンジルアデニン（ＢＡ）を５ｐｐｍ添加したものを「培地ｂ」とし、さらに、上記培地ａのベンジルアデニン（ＢＡ）を１０ｐｐｍ添加したものを「培地ｃ」として調整した。
【００４６】
各培地ａ〜ｃにそれぞれ除葉処理をした親シュートを置床し、２５℃で２０００ｌｕｘの１６時間照明下で培養し、２ヶ月後に調査を行った。その結果を表２に示した。
【００４７】
【表２】
0003611484.tif 000003
表２に示したように、培地にＢＡの５ｐｐｍ添加区では最も高い６５％の割合で娘シュートの側生が観察された。
【００４８】
［実施例３］    培養時の温度条件の影響
実施例１の除葉処理したシュートを用い、異なる温度条件で培養した際の娘シュートの側生率への影響を調べた。
【００４９】
シュート誘導培地は上記実施例２の結果に従って、Ｂ５培地に蔗糖１％、ココナツウオーター１０％、ベンジルアデニン（ＢＡ）５ｐｐｍを添加して寒天０．７％で固形化したものを調整した。
【００５０】
当該培地に除葉処理をしたシュートを置床し、２５℃、２８℃および３０℃で２０００ｌｕｘの１６時間照明下で培養し、２ヶ月後に調査を行った。その結果を表３に示した。
【００５１】
【表３】
0003611484.tif 000004
表３に示したように、２８℃の高温培養では、最も高い７２％の割合で娘シュートの側生が観察された。一方、この温度より高い３０℃の条件では、葉が枯れるなどの高温障害が現れ、結果として娘シュートの側生率が低下した。
【００５２】
【発明の効果】
以上の通り、本発明によれば、親シュートが潜在的に有する腋芽を側生する能力を効果的に引き出させ、高効率で娘シュートを側生させることが可能となる。従って、本発明の方法は、遺伝的に保存された娘シュートを側生させることができるとともに、この方法により順次娘シュートを側生させることにより、親株の品種を長期に保存することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における未処理の親シュート（Ｉ）、粗処理の親シュート（ＩＩ）、除葉、除根処理された親シュート（ＩＩＩ）を示す図である。
【図１】
0003611484.tif 000005