(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌由来である野生型ニトロ還元酵素遺伝子に変異処理として薬剤を接触作用させる方法を行って得られるフラビン還元酵素遺伝子であり、野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＢ遺伝子またはｎｆｎＢ遺伝子であり、該遺伝子のコードするアミノ酸配列において、１２４位のフェニルアラニンのアミノ酸がセリンのアミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードするフラビン還元酵素遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号１で表される塩基配列を含む、フラビン還元酵素遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のフラビン還元酵素遺伝子がコードするフラビン還元酵素。
【請求項４】
請求項２に記載のフラビン還元酵素遺伝子がコードする配列番号２のフラビン還元酵素。
【請求項５】
塩基配列が配列表の配列番号１で表されるＤＮＡをベクターＤＮＡ に挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換え体ＤＮＡを含み、フラビン還元酵素生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よりフラビン還元酵素を採取することを特徴とするフラビン還元酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は大腸菌のフラビン還元酵素遺伝子、フラビン還元酵素、該遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ、および該組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を使用したフラビン還元酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発光細菌のルシフェラーゼは、還元型フラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮＨ２という）と長鎖脂肪アルデヒドを基質として、酸素の存在下、酸化型フラビンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮという）と長鎖カルボン酸とを生成し、その際に青色に発光する反応を触媒する。
発光細菌ルシフェラーゼは、この発光を指標とする各種の生理活性物質の測定に有用であるが、試験管内等で細菌ルシフェラーゼを利用する場合、基質であるＦＭＮＨ２が即時に自動酸化され、ＦＭＮに変換されるため、その反応系にフラビン還元酵素を共存させる必要がある。
【０００３】
そこで、フラビン還元酵素は細菌ルシフェラーゼの発光を指標とした検出系に欠かせない酵素である。しかし、発光細菌  Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素は、不安定で活性低下を起こしやすい欠点があった。
一方、フラビン還元酵素は、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉにおいては、１種類の酵素が存在することが分かっているに過ぎなかった。「Ｄｕａｎｅ，Ｗ．ａｎｄＨａｓｔｉｎｇｓ，Ｊ．Ｗ．（１９７５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６，５３−６４」
最近、本発明者は発光細菌  Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素が、アミノ酸配列レベルでニトロ還元酵素に類似し、低レベルのニトロ還元酵素活性を有することを見い出した『特願平３−３５１７１７号記載』。また、大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子を単離し、その１次構造を明かにした『特願平５−３４００６１号記載』。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、検査や診断などに利用するため、より安定で高い活性を有するフラビン還元酵素が待ち望まれていた。
すなわち、本発明の目的は安定で高活性を有するフラビン還元酵素を開発することを主たる課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題について鋭意研究の結果、ニトロ還元酵素遺伝子に変異を導入することにより、安定で高活性なフラビン還元酵素をコードするフラビン還元酵素遺伝子の作出に成功し、本発明を完成した。すなわち、本願は以下の発明を提供するものである。
（１）大腸菌由来である野生型ニトロ還元酵素遺伝子に変異処理として薬剤を接触作用させる方法を行って得られるフラビン還元酵素遺伝子であり、野生型ニトロ還元酵素遺伝子がｎｆｓＢ遺伝子またはｎｆｎＢ遺伝子であり、該遺伝子のコードするアミノ酸配列において、１２４位のフェニルアラニンのアミノ酸がセリンのアミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードするフラビン還元酵素遺伝子。
（２）配列表の配列番号１で表される塩基配列を含む、フラビン還元酵素遺伝子。
（３）前記第１項に記載のフラビン還元酵素遺伝子がコードするフラビン還元酵素。
（４）前記第２項に記載のフラビン還元酵素遺伝子がコードする配列番号２のフラビン還元酵素。
（５）塩基配列が配列表の配列番号１で表されるＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
（６）前記第５項に記載の組み換え体ＤＮＡを含み、フラビン還元酵素生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物よりフラビン還元酵素を採取することを特徴とするフラビン還元酵素の製造法。
【０００６】
本発明の構成と効果につき以下に詳述する。
本発明のフラビン還元酵素遺伝子は、ニトロ還元酵素遺伝子を基に改変して得られた遺伝子である。例えば、大腸菌由来である野生型ニトロ還元酵素のアミノ酸配列において、１２４位のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸に変異されているアミノ酸配列をコードする、フラビン還元酵素遺伝子である。この１２４位のアミノ酸がセリンであるアミノ酸配列をコードするフラビン還元酵素遺伝子が好ましく、そのような例として、配列の長さ６５１ヌクレオチド鎖を含み、２１７個のアミノ酸からなる蛋白をコードしている、配列番号１で表わされる塩基配列を含む遺伝子を例で示すことができる。この遺伝子の配列の種類はゲノムDNAである。
本発明の酵素は、フラビン還元活性を有し、たとえば、ＦＭＮ還元活性を有するものであり、たとえば配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質である。
本発明の組換え体ＤＮＡは、塩基配列が配列番号１で表わされるＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入したものである。
本発明の酵素の製法は、たとえば、塩基配列が配列番号１で表わされるＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡで修飾された微生物を培養し、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む蛋白を製造することである。
【０００７】
本発明における遺伝子の改変による熱安定な高活性なフラビン還元酵素が提供される前提として、野性型のニトロ還元酵素遺伝子およびその組換え体ＤＮＡを調製することが必要である。野性型のニトロ還元酵素遺伝子等の種類は、提供が企図される熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子の種類に応じて用いられる。そして、大腸菌に由来するあらゆる野生型のニトロ還元酵素遺伝子を用いることが可能であり、たとえば、すでにクローン化されているニトロ還元酵素遺伝子を用いることができる。そのような遺伝子として、大腸菌ｎｆｓＢ／ｎｆｎＢニトロ還元酵素遺伝子『特願平５ー３４００６１号』、大腸菌ｎｆｓＡニトロ還元酵素遺伝子『特願平６−２９８９３６号』、などが例示される。これらの遺伝子等は、すでに公知の方法に従って調製される。たとえば、野性型大腸菌遺伝子およびその組換え体ＤＮＡは、特願平５−３４００６１号に記載の方法により調製することができる。
【０００８】
野性型ニトロ還元酵素遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行い得る。すなわち、野性型ニトロ還元酵素遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触作用させる方法、紫外線照射法、遺伝子工学的手法、または蛋白工学的手法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、たとえば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等を挙げることができる。この接触作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じて選択することが可能であり、現実に、野性型ニトロ還元酵素遺伝子において、所望の変異を起こすことができるかぎり特に限定されない。通常、上記薬剤を好ましくは０．５−１２Ｍの濃度において、２０−８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０ー１８０分間接触作用させることで、所望の変異を起こすことができる。
【０００９】
紫外線照射を行う場合においても、「現代科学、ｐｐ２４−３０，  １９８９年６月号」記載の方法に従い変異を起こすことができる。
蛋白工学的手法としては、一般的に、サイトスペシフィックミュータジェネシス（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知られる方法を用いることができる。たとえば、Ｋｒａｍｅｒ法「Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ９４４１−９４５６」，  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法「Ｔａｙｌｏｒ，  Ｊ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３，  ８７４９−８７６４」，  Ｋｕｎｋｅｌ法「Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．  Ａ．  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４８８−４９２」等があげられる。
なお、上記の遺伝子改変法のほかに、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変ニトロ還元酵素遺伝子、すなわち、熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上記の方法により得られる所望のフラビン還元酵素遺伝子の塩基配列の決定確認は、たとえば、ジデオキシ変法『Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．  （１９８６）  アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）  １５２，  ２３２』などにより行いえる。
【００１０】
上述の如くして得られた熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若くは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、それぞれのベクターに対応する宿主を常法により形質転換あるいは形質導入することができる。たとえば、宿主として、大腸菌ＪＭ８３，  大腸菌Ｄ１２１０，  大腸菌ＪＭ１０９，  大腸菌ＨＢ１０１等を選択する場合には、『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』記載の方法等により、形質導入をすることにより、形質導入株を得ることができる。
【００１１】
そして、上記菌株より熱安定な高活性なフラビン還元酵素生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡを含み、熱安定な高活性なフラビン還元酵素生産能を有する大腸菌菌株を得ることができる。このようにして得られた菌株より純化された新規組換え体ＤＮＡを得るには、たとえば、アルカリ法『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』などを用いればよい  。
【００１２】
そして、このようにして得られた組換え体ＤＮＡより熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、たとえば、該組換え体ＤＮＡに制限酵素、たとえばＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを温度３０ー４０℃で１〜２４時間、好ましくは３７℃で２時間作用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』で処理することにより得ることができる。
【００１３】
上記のようにして、得られた熱安定な高活性なフラビン還元酵素遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡを含み、熱安定な高活性なフラビン還元酵素生産能を有する大腸菌菌株を用いて熱安定な高活性なフラビン還元酵素を生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００１４】
また、上記菌株を培養する培地としては、たとえば酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若くは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類に１種以上を添加し、さらに必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１５】
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７ー９に調整するのが適当である。また、培養は３０ー４２℃、好ましくは３７℃で４ー２４時間、より好ましくは３７℃で１２時間通気攪拌培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より熱安定な高活性なフラビン還元酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
【００１６】
たとえば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を排出するか、またはトルエン等の存在下で振とうもしくは放置して、自己消化をおこなわせ本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液をろ過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等により核酸を除去した後、これを硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、粗酵素を得る。
【００１７】
上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、たとえば、セファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲルろ過法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、しょ糖密度勾配遠心法等の沈殿法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またこれらを組合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることができる。
このようにして、所望の熱安定な高活性なフラビン還元酵素を得ることができる。
【００１８】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
（１）ＰＣＲ反応の鋳型として使用する組換え体プラスミドｐＮＲ１ＤＮＡの調製
特願平５ー３４００６１号記載の方法により構築されたニトロ還元酵素遺伝子を発現しうるプラスミドｐＮＲ１を含有する大腸菌ＪＭ８３株を３７℃で一晩培養し、アルカリ法『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』を用いてｐＮＲ１プラスミドＤＮＡを調製した。すなわち、この培養液１．５ｍＬを遠心分離して、菌体を集め、これを０．１ｍＬのリゾチーム溶液（５０ｍＭグルコース・１０ｍＭＥＤＴＡ・２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ８・４ｍｇ／ｍＬリゾチーム液）に懸濁させ、室温で５分間反応させ溶菌液を得た。この溶菌液に０．２ｍＬの０．２Ｎ水酸化ナトリウム・１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を添加し、混合後５分間氷中に置きアルカリ変性させた。さらに、この変性物に０．１５ｍＬの３Ｎ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を加え混合し、５分間氷中で中和した。この中和物を遠心分離し、沈殿物を除いた上澄みに、等量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８・１ｍＭＥＤＴＡ）飽和フェノールを加えて除蛋白操作を行った後、水層を回収し、これに２倍量のエタノールを加え、混合した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。この沈殿物を０．０５ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解し、これに０．００１ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬＲＮＡ分解酵素Ａ溶液を加え、混合後３７℃で３０分間反応させ、ＲＮＡを分解した。この反応液に２０％ポリエチレングリコール・２．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加え、氷中で１時間放置した後、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。これにより生じた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後乾燥させ、０．０５ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解して組換え体ｐＮＲ１プラスミドＤＮＡを調製した。
【００１９】
（２）ＰＣＲによるニトロ還元酵素遺伝子のランダム変異
調製したｐＮＲ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、開始コドンＡＴＧを含んだ上流側の合成オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ−Ｎと終止コドンＴＡＡを含んだ下流側の合成プライマーＮＲ−Ｃ（図１に示す）を用いて、ランダムに変異が導入できるＰＣＲ法『Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，  Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，  Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．  （１９９０）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ』により、ニトロ還元酵素遺伝子のコーディング領域を増幅反応した。すなわち、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの基質であるｄＮＴＰの濃度を、ｄＴＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＧＴＰについては、それぞれ１  ｍＭ，  ｄＡＴＰは０．２  ｍＭとし、０．５  ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む６．１  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、そして１  ｎｇの標的プラスミドに対して２５サイクルのＰＣＲ反応をおこなった。アガロース電気泳動『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』で、標的ＤＮＡの増幅の確認を行った後、このＰＣＲ反応液を上記（１）項に記載のように、フェノールで除蛋白処理した後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２及び２．５倍量のエタノールを加え、温度−７０℃で１５分間放置した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物を得た。この沈殿物を乾燥した後、０．０５ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解し、変異ニトロ還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片溶液を作製した。
【００２０】
（３）変異ニトロ還元酵素遺伝子を発現しうるプラスミドを有する大腸菌の作製
得られた変異ニトロ還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片の溶液０．０５ｍＬを、０．００６ｍＬのＭｅｄ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５・１０ｍＭ塩化マグネシウム・１ｍＭジチオスレイトール・５０ｍＭ塩化ナトリウム）と１０ユニットの制限酵素ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを加え、温度３７  ℃で１時間反応させて切断した。この切断物を７０  ℃で処理し、制限酵素を失活した。この処理物を上記（１）項に記載の方法と同様にフェノール抽出し、その後、上記（２）に記載の方法と同様にエタノール沈殿し、沈殿物を得た。この沈殿物を乾燥後、０．０１ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解した。この溶液の０．００５ｍＬに、０．００１ｍＬのＸ１０ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ塩化マグネシウム・６６０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．６・１０ｍＭＡＴＰ・１５０ｍＭジチオスレイトール）、１ユニットのＴ４ＤＮＡライゲース及び変異ニトロ還元酵素遺伝子のＤＮＡ断片と同様にして制限酵素ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩにより切断処理されたｐＵＣ１１８プラスミド『Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．  （１９８７）  メソッズインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）  １５３，  ３』の０．００１ｍｇを加え、さらに、水を加えて全量０．０１ｍＬとして、温度１６℃にて１６時間反応を行った。得られた反応液を用い、『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』に記載の形質転換法により、大腸菌ＪＭ８３株『Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．（１９８２）  ジーン（Ｇｅｎｅ），  １９，  ２６９』を形質転換し、アンピシリン耐性及びベーターガラクトシダーゼ活性を検討し、形質転換株を得た。図２に変異ニトロ還元酵素遺伝子を発現しうるプラスミドの構築工程を示す。
【００２１】
（４）フラビン還元酵素遺伝子を発現するプラスミドを含有する大腸菌の選択
得られた形質転換株の９０株について、コロニーを０．０５ｍｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地（１Ｌ当り、トリプトン１０ｇ・イーストエクストラクト５ｇ・塩化ナトリウム１０ｇを含有し、水酸化ナトリウムで中和してある）『Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ』の１０ｍＬに植菌し、３７  ℃で５時間培養した。その菌体に対して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳーＰＡＧＥと略す）による分析『Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．  （１９７０）  ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），  ２７７，  ６８０』を行い、プラスミドを有していない大腸菌の発現蛋白のパターンと比較して、形質転換株のプラスミドから発現する変異ニトロ還元酵素の量とサイズを見積もったところ、その発現量はまちまちで、そのサイズは分子量２７，０００を示した。
【００２２】
次に、変異ニトロ還元酵素の発現が確認できた形質転換株に対して、上記の培養液１．５ｍｌを１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除いた。菌体を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍｌに懸濁し、ブランソン社製のソニファイヤー２５０を用いて、超音波破砕した。この破砕物を１２，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、この上清を粗酵素抽出液とした。この抽出液に対して、フラビン還元酵素活性とニトロ還元酵素活性を測定した。フラビン還元酵素活性の測定は、電子供与体としてＮＡＤＨを用い、電子受容体としてＦＭＮを用いて、善野らの方法『Ｚｅｎｎｏ，Ｓ．，  Ｓａｉｇｏ，Ｋ．，  Ｋａｎｏｈ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．  （１９９４）  ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），  １７６，  ３５３６』で行った。一方、ニトロ還元酵素活性の測定は、電子供与体としてＮＡＤＨを用い、電子受容体としてニトロフラゾンを用いて、Ｐｅｔｅｒｓｏｎらの方法『Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｆ．Ｊ．，  Ｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．，  Ｈｏｖｓｅｐｉａｎ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｊ．Ｌ．  （１９７９）  ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．），  ２５４，  ４００９』で行った。さらに、蛋白濃度の測定はバイオラッド社製のプロテインアッセイキットを用いて、標準蛋白を牛血漿グロブリンとして、色素結合法『Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．  （１９７６）  アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）  ７２，  ２４８』により決定した。
以上の結果、ニトロ還元酵素活性よりフラビン還元酵素活性の方が明らかに高い形質転換株を１株得た。この株の含有するプラスミドをｐＮＲ２４７と名付けた。すなわち、プラスミドｐＮＲ２４７にコードされる変異ニトロ還元酵素は、フラビン還元酵素であった。
【００２３】
（５）プラスミドｐＮＲ２４７にコードされるフラビン還元酵素の精製
上記（４）に準拠して、ｐＮＲ２４７を含有するＪＭ８３株を培養し、この培養液から粗酵素抽出液を得た。この抽出液を出発物として、以下のように、フラビン還元酵素を４  ℃にて精製した。粗酵素抽出液を、１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に対して透析した。この透析物を  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ社製）陰イオン交換カラム（２．６  ｘ  １０  ｃｍ）にかけた。５０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、５０−５００  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて溶出した。本クロマトグラフィーは流速２．０  ｍｌ／ｍｉｎで行った。それぞれの画分に対して、フラビン還元酵素活性を測定した。次に、酵素活性のピーク画分を１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に対して透析した後、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ社製）カラム（１．０  ｘ  １０  ｃｍ）にかけた。２０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、１  ｍＭ  ＮＡＤＨ・２０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて溶出した。流速１．０  ｍｌ／ｍｉｎで行った。さらに、酵素活性のピーク画分に硫酸アンモニウムを２０  ％になるように加え、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ社製）カラム（１．０  ｘ  １５  ｃｍ）にかけた。２０  ％硫酸アンモニウム／５０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄後、２０−４  ％硫酸アンモニウム／５０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて溶出した。流速１．０  ｍｌ／ｍｉｎで行った。最後に、酵素活性のピーク画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０（Ａｍｉｃｏｎ社製）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ社製）ゲルろ過カラム（１  ｘ  ３０  ｃｍ）にかけた。本クロマトグラフィーは１００  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて、流速０．２  ｍｌ／ｍｉｎで行った。この酵素活性画分を精製フラビン還元酵素とした。本標品を上記（４）に記載のＳＤＳーＰＡＧＥによる分析で評価したところ、単一バンドの蛋白として検出された。
【００２４】
また、本酵素のニトロ還元酵素活性とフラビン還元酵素活性を測定したところ、それぞれ９．５５  ｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白および１３８０ｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白であった。それに対して、同様にして精製した変異を導入していない正常なニトロ還元酵素の、ニトロ還元酵素活性とフラビン還元酵素活性は、それぞれ９．７４  ｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白および０．６４７ｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白であった。よって、ｐＮＲ２４７にコードされる酵素はフラビン還元酵素であり、変異を導入することにより、ニトロ還元酵素をフラビン還元酵素に変換できた。
また、善野らの方法『Ｚｅｎｎｏ，Ｓ．，  Ｓａｉｇｏ，Ｋ．，  Ｋａｎｏｈ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．  （１９９４）  ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），  １７６，  ３５３６』で精製したＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素は、ニトロ還元酵素活性とフラビン還元酵素活性が、それぞれ１４．１  ｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白および３５．２  ｍｍｏｌ／ｍｇ蛋白であった。このことから、今回得たニトロ還元酵素を改変して得られたフラビン還元酵素が、大腸菌のニトロ還元酵素とＶ．  ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素より、高いフラビン還元酵素活性を有していた。
【００２５】
（６）プラスミドｐＮＲ２４７にコードされるフラビン還元酵素遺伝子の塩基配列の決定
フラビン還元酵素遺伝子を有するｐＮＲ２４７プラスミドＤＮＡを、上記（１）項に記載のアルカリ法を用いて調製した。ｐＮＲ２４７プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ変法『Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．  （１９８６）  アナリティカルバイオケミストリー（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）  １５２，  ２３２』  にて決定した。その塩基配列は、配列番号１に示す。また、その塩基配列から予測されるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。図３に示すように、正常なニトロ還元酵素のアミノ酸配列と得られた塩基配列から予測されるアミノ酸配列を比較したところ、アミノ酸配列の１２４番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がセリン（Ｓｅｒ）に置換していた。
【００２６】
（７）プラスミドｐＮＲ２４７にコードされるフラビン還元酵素の熱安定性試験
上記（５）で得られたフラビン還元酵素を１ｍｇ／ｍｌの濃度で、０．１ｍＬづつ１．５ｍＬチューブに入れ密栓し、１時間で４〜６０℃に加温して処理した後、上記（４）に記載の方法でフラビン還元酵素活性を測定した。比較として、善野らの方法『Ｚｅｎｎｏ，Ｓ．，  Ｓａｉｇｏ，Ｋ．，  Ｋａｎｏｈ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．  （１９９４）  ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），  １７６，  ３５３６』で精製した発光細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素に関しても、同様に、熱安定性を試験した。これらの結果を図４に示す。本発明のフラビン還元酵素は４０℃まで安定なのに対して、発光細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素は３０℃までしか安定でなかった。本発明のフラビン還元酵素の方が、発光細菌Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素より安定な酵素であることが解った。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、大腸菌のニトロ還元酵素遺伝子に変異を導入することにより、大腸菌のニトロ還元酵素および発光細菌Ｖ．  ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素より、高いフラビン還元活性を有し、Ｖ．  ｆｉｓｃｈｅｒｉのフラビン還元酵素より、安定な新規なフラビン還元酵素を提供することができた。そして、本発明の方法により、高いフラビン還元活性を有する、安定なフラビン還元酵素を効率よく生産することができるので、本発明は産業上極めて有用である。
【００２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ニトロ還元酵素遺伝子の変異導入に用いられたＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマー（ＮＲ−ＮおよびＮＲ−Ｃ）。制限酵素切断部位は下線で示した。
【図２】本発明に係わる大腸菌の変異ニトロ還元酵素遺伝子を含有する本発明の組換えプラスミド構築工程を示す。
ｐＵＣプラスミドベクターに由来する部分は白色で、変異ニトロ還元酵素遺伝子の部分は斜め線で示した。
【図３】正常なニトロ還元酵素遺伝子とフラビン還元酵素遺伝子の塩基配列の相違部分とその周辺の構造を示す。
番号は正常なニトロ還元酵素およびフラビン還元酵素のアミノ酸配列の位置を示す。正常なニトロ還元酵素遺伝子とフラビン還元酵素活性遺伝子の塩基配列の相違部分は矢印で示した。
【図４】フラビン還元酵素の熱安定性試験の結果を示す。
酵素活性は４℃での活性を１００％として、各温度における活性を相対活性として％で表した。○は本発明のフラビン還元酵素で、□は発光細菌のフラビン還元酵素である。
【符号の説明】
ｌａｃＰ        ラクトースオペロンのプロモーター
Ａｍｐｒ          アンピシリン耐性遺伝子
ｐＵＣ１１８    プラスミドベクター
ｐＮＲ１        正常なニトロ還元酵素遺伝子発現プラスミド
ｐＮＲ２４７    フラビン還元酵素遺伝子発現プラスミド
ＮｒｕＩ        制限酵素切断部位（ＴＣＧＣＧＡ）
ＰｓｔＩ        制限酵素切断部位（ＣＴＧＣＡＧ）
ＥｃｏＲＩ      制限酵素切断部位（ＧＡＡＴＴＣ）
ＸｂａＩ        制限酵素切断部位（ＴＣＴＡＧＡ）
ＨｉｎｃＩＩ      制限酵素切断部位（ＧＴＰｙＰｕＡＣ：Ｐｙはピリミジン、Ｐｕはプリンを表す）
ｎｒ            正常なニトロ還元酵素遺伝子の塩基配列
ｆｒ            フラビン還元酵素遺伝子の塩基配列
ＮＲ            正常なニトロ還元酵素のアミノ酸配列
ＦＲ            フラビン還元酵素のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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