(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性試料中の被検体の存在または濃度を決定する方法であって、該被検体と結合できる酵素複合体と該試料とを混合する工程、すべての未結合酵素複合体を除去する工程、処理された該試料に、該酵素と接触すると1,2−ジオキセタン類のオキシアニオン、および励起状態の光放射体を形成し、化学発光の放出とともに分解する1,2−ジオキセタン類を加える工程を含み、かつ化学発光の量をモニターして該被検体の存在または濃度を決定する方法において、
該水性試料に、試料の0.005〜50重量／体積％のポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（TBQ）を加える工程を含む改良された方法。
【請求項２】
該方法が、該1,2−ジオキセタン類のオキシアニオンおよびその分解生成物をその中に封鎖できる疎水性領域を該水性試料中に形成する該TBQの能力を改良する、該試料の0.005〜50重量／体積％の増強添加物を該試料に加える工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
１種類より多い該増強添加物を該試料に添加する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該増強添加物が、界面活性剤、溶剤および水溶性重合体からなる群から選ばれる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該ジオキセタン類がAMPPDまたはCSPDである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該増強添加物がZelec DPを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
水性試料中の被検体の存在または濃度を決定する方法であって、該被検体と安定的に結合できる酵素複合体と該試料とを混合する工程、すべての未結合酵素複合体を除去する工程、該試料に、該酵素と接触すると化学発光の放出とともに分解する1,2−ジオキセタン類を加える工程を含み、かつ化学発光の量をモニターして被検体の存在または濃度を決定する方法において、
該試料に、
（ａ）該試料の0.005〜50重量／体積％の量の水溶性重合第四級オニウム塩であって、該試料に添加すると、該1,2−ジオキセタン類の分解により、該水溶性重合第四級オニウム塩の不在下におけるよりも多量の化学発光を生成する該第四級オニウム塩を含む増強剤、および
（ｂ）該1,2−ジオキセタン類およびその化学発光性分解生成物をその中に封鎖できる疎水性領域を該水性試料中に形成する該重合第四級オニウム塩の能力を改良する、該試料の体積を基準にして0.005〜50重量％の増強添加物、ここで、該水溶性重合第四級オニウム塩は、下記一般式：
0003632856.tif 000039
（式中、Ｍは、窒素、リン又は硫黄原子であり、X-は、対イオンであり、R1、R2及びR3は、ブチル基である）
によって示される反復単位を含む、
を加える工程を含む方法。
【請求項８】
該増強剤が、第四級アンモニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ホスホニウム塩、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる単量体から調製される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該増強剤が、重合第四級アンモニウム塩、重合第四級スルホニウム塩、重合第四級ホスホニウム塩、またはそれらの共重合体である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該増強剤が、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）（TBQ）である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該方法が、洗剤である第二の増強添加物を添加する工程を更に含む、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
水性試料中の被検体の存在または濃度を検定する方法であって、
混合すると該試料中の該被検体と安定的に結合する酵素複合体と、該試料とを混合する工程、
該混合後に、該試料中に存在する未結合酵素複合体を除去する工程、
該試料の0.005〜50重量／体積％のTBQを該試料に加える工程、
該酵素複合体の酵素によって、化学発光する分解生成物に分解される1,2−ジオキセタン類を該試料に加える工程、および
得られる化学発光の量を測定する工程を含む方法。
【請求項１３】
該1,2−ジオキセタン類が、式：
0003632856.tif 000040
（式中、
Ｚは、Ｈ、Cl、その他のハロゲンまたはアルコキシ基；
R1は、C1〜C20アルキル、またはC1〜C12アリールもしくはアラルキルであり；
Ｙは、フェニルまたはナフチルであり；
R2は、ジオキセタンに関してＹにメタ置換されているかまたは共役的に結合していないOX（式中、Ｘは、開裂されるとジオキセタン類のフェノキシまたはナフトキシアニオンを残す、酵素で開裂できる基である）である）
で示される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
水性試料中の被検体の存在または濃度を検定する方法であって、
混合すると該試料中の該被検体と安定的に結合する酵素複合体と、該試料とを混合し、該混合後に、未結合酵素複合体を該試料から除去し、該試料の体積を基準にして0.005〜50重量％の水溶性重合第四級オニウム塩である増強剤と、該1,2−ジオキセタン類およびその分解生成物をその中に封鎖できる疎水性領域を該試料中に形成する該増強剤の能力を改良する、該試料の0.005〜50重量／体積％の増強添加物とを、該増強剤と増強添加物との合計が試料の50重量／体積％を超えないように該試料に加える工程、
該酵素複合体の酵素によって、オキシアニオンを生成し、化学発光する分解生成物に分解される1,2−ジオキセタン類を該試料に加え、そして得られる化学発光の量（ここで、該増強添加物の存在下で観測される化学発光の量は、該増強添加物の不存在下で観測される化学発光の量より多い）を測定する工程、
ここで、該水溶性重合第四級オニウム塩は、下記一般式：
0003632856.tif 000041
（式中、Ｍは、窒素、リン又は硫黄原子であり、X-は、対イオンであり、R1、R2及びR3は、ブチル基である）
によって示される反復単位を含む、
を含む方法。
【請求項１５】
該増強剤が、第四級アンモニウム単量体、第四級ホスホニウム単量体、第四級スルホニウム単量体、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる単量体から調製される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
該増強添加物が、界面活性剤、溶剤および水溶性重合体からなる群から選ばれる、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
該ジオキセタン類が、AMPPD、CSPD、またはそれらの混合物の２ナトリウム塩であり、該増強剤が、TBQ、BDMQ、TMQ、およびそれらの混合物からなる群から選ばれ、そして該増強添加物がZelec DPである、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
水性試料中の被検体の存在または濃度を生物検定するためのキットであって、
試料と混合すると該試料中の該被検体と結合する酵素複合体、
該酵素複合体の酵素と接触すると、化学発光する分解生成物に分解される1,2−ジオキセタン類、および
TBQ
を含むキット。
【請求項１９】
試料中の被検体の存在または濃度を生物検定するためのキットであって、
該試料と混合すると該被検体と結合する酵素複合体、
該酵素複合体の酵素と接触すると、1,2−ジオキセタン類のオキシアニオン、および化学発光する分解生成物に分解される1,2−ジオキセタン類、
重合第四級オニウム塩、および
該1,2−ジオキセタン類のオキシアニオンおよびその分解生成物をその中に封鎖できる疎水性領域を該試料中に形成する該重合第四級オニウム塩の能力を改良する増強添加物、
ここで、該水溶性重合第四級オニウム塩は、下記一般式：
0003632856.tif 000042
（式中、Ｍは、窒素、リン又は硫黄原子であり、X-は、対イオンであり、R1、R2及びR3は、ブチル基である）
によって示される反復単位を含む、
を含むキット。
【請求項２０】
該増強添加物が、界面活性剤、溶剤および水溶性重合体からなる群から選ばれる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
該水溶性重合第四級オニウム塩が、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（TBQ）である、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
該水溶性重合第四級オニウム塩が、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（TBQ）である、請求項19記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本願は、それ自体米国特許第5,112,960号として発行された米国特許出願第07/574,786号の分割出願である、米国特許出願第07/806,928号の部分継続出願である。米国特許第5,112,960号の開示全体は、参照によってここに組み込まれる。本願は、現在係属中の米国特許出願第07/959,531号の部分継続出願でもあり、その開示全体が参照によってここに組み込まれる。
［技術分野］
本発明は、酵素で標識された標的またはプローブに対する化学発光性基質として1,2−ジオキセタン類を用いることによって、試料中の、一般的には生体試料中の被検体について、化学発光検定する方法の増強に関する。ジオキセタンリポーター分子の化学発光は、水溶性重合第四級塩の添加によって増強される。該水溶性重合体によって形成される疎水性領域内にジオキセタンを封鎖し、それによって、水で誘発される消光反応を抑制または回避できる。そしてその水溶性重合第四級塩の能力を改良する添加物を更に試料に含ませることによって、一層の増強が達成できる。
［背景となる技術］
試料中の、一般的には生体試料中の被検体の存在または濃度を検出するための化学発光検定法は、迅速で、感度が高く、容易に読み取れる生物検定の方法として、近年ますます関心が増大している。そのような検定では、化学発光性化合物をリポーター分子として用いるが、このリポーター分子は、疑わしい被検体の存否に応じて化学発光とする。
リポーター分子として用いうる、非常に多様な化学発光性化合物が知られている。特別な関心を受けている化合物の一群は、1,2−ジオキセタン類である。1,2−ジオキセタン類は、ジオキセタン環の炭素原子のうちの少なくとも１個に安定化基が付加されていることによって安定化することができる。実例となる安定化基は、スピロ結合したアダマンタンである。そのようなジオキセタン類は、他方の炭素の位置にアリール基、好ましくはフェニルまたはナフチルが更に置換しているが、このアリール基に酸素が置換し、更にそれを酵素に不安定な基に結合させる。この不安定な基を開裂できる酵素が接触すると、ジオキセタンのオキシアニオンが形成されてジオキセタンの分解および自発的な化学発光へと導かれる。米国特許第5,112,960号明細書には、非常に多様なそのようなジオキセタン類が開示されている。この特許は、アダマンチルという安定化基に置換基、例えばハロゲン置換基、アルキル基、アルコキシ基等を有するジオキセタン類に的が絞られている。そのようなジオキセタン類は、早くから認識されていたジオキセタン類、例えば３−（４−メトキシスピロ［1,2−ジオキセタン−3,2'−トリシクロ［3.3.1.13,7］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート、および、特にAMPPDとして一般的に特定されているそのナトリウム塩を凌ぐ進歩を示す。塩素で置換された相当物は、アダマンチルという安定化基を、分解反応を進行させる受動的な基から、より速やかなジオキセタンアニオンへの分解、より大きいシグナル対ノイズ比、およびより良好な感度によって増強された化学発光シグナルを発生する能動的な基に転換され、CSPDと呼ばれる。その他のジオキセタン類、例えばフェニルオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（AMPGD）も周知であり、リポーター分子として用いることができる。これらのジオキセタン類、およびそれらの調製は、それ自体はここでは本発明の主題を構成するものではない。
これらのジオキセタン類を用いる検定法は、慣用の検定法、例えばサザン−、ノーザン−およびウエスタン−ブロット検定法、DNA配列決定法、ELISA法はもとより、他の液相および混合相検定法に適用できる。一般に、その検定法は、もし試料中にその標的が存在する場合、その標的を、ジオキセタン類の酵素不安定基を開裂できる酵素を有する複合体と結合させることからなる。DNA検定法では、DNAプローブを用い、共有結合でそれに結合している酵素に標的を結合させ、膜に固定化した試料とプローブとを混合して、ハイブリッド形成させる。その後、過剰な酵素複合体を除去し、ハイブリッド形成させた試料にジオキセタンを加える。ハイブリッド形成が生じているならば、結合された酵素によってそのジオキセタンが影響されて、ジオキセタン類の分解および化学発光へと導くことになる。液相検定法では、標的被検体に応答する抗体と酵素とを結合させるか、または複合させることが多く、未結合複合体を除去し、ジオキセタン類を加え、存在する酵素の量によって影響されるジオキセタンの分解によって、化学発光を生起する。酵素それ自体が標的被検体である場合は、ジオキセタン類を試料に加えることが必要なだけである。非常に多様な検定様式が開発されていて、それは米国特許第5,112,960号明細書はもとより、米国特許第4,978,614号明細書にも開示されているとおりである。
ジオキセタン分解をプロトン性溶媒中で、例えば水中で進行させるならば、消光反応が生じることは周知である。問題の被検体を含有するか、含有しないか疑わしい試料は、概して生体試料であるから、これらの検定法は、一般的には、水性環境中で実施される。したがって、消光反応が、ジオキセタン類の分解によって実際に観測される化学発光を実質的に減少させることがある。特定の被検体、例えば核酸、ウイルス抗体およびその他の蛋白質、特に溶液または溶液−固相系中で調製されたそれらの低レベルの検出が必要である検定法では、不可避的なバックグラウンドシグナルと合わせて、観測される減少した化学発光が検定法の感度を低下させるため、極めて低レベルのものを検出できないことがある。この問題を扱う一つの方法は、米国特許第5,145,772号明細書に詳細に開示されているような、天然および合成分子の双方を包含している水溶性高分子の添加である。この特許の開示は、ここに組み込まれ参照される。同様な効果に関し、米国特許第4,978,614号明細書には、試料への各種の水溶性「増強」剤の添加を扱っているが、該特許は、固体状態での検定法における非特異的結合を抑える問題に言及している。米国特許第5,112,960号明細書では、非特異的結合の抑制によって化学発光を増強する水溶性重合第四級アンモニウム塩として、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）（TMQ）、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）（TBQ）およびポリ（ビニルベンジルージメチルベンジルアンモニウムクロリド）（BDMQ）のような好適な水溶性重合第四級アンモニウム塩が開示されている。
これらの検定法が扱う技術の進歩にもかかわらず、より高い感度を有する化学発光検定法を提供して、一般的には生体試料であり、それゆえ水性環境での検定法で、試料中の被検体の存在、濃度またはその両者を決定することは、当業界の目標であり続けている。そのような化学発光検定法のためのリポーター分子として優れた可能性を示す1,2−ジオキセタン化合物が、既に開発されている。しかしながら、極めて低レベルの検出に用いるには、および／または機械可読性に応えるよう信頼性を改良するには、水性試料中に生成される1,2−ジオキセタン類分子の化学発光の増強を一層改良することが必要である。
［発明の開示］
本発明は、上記の目標のため２つの実施態様を扱っている。上記のとおり、水性試料への水溶性重合アンモニウム塩の添加が、1,2−ジオキセタン類の化学発光を改良または増強することは既に知られている。出願人は、この増強が、ジオキセタン類のオキシアニオンをその中に封鎖する疎水性領域を形成することによって、少なくとも部分的には達成されることを発見した。これらの疎水性領域での分解は、水に基づく消光反応が抑制されるので、化学発光が増強する。用いられる公知の第四級水溶性重合体の塩の中でもTBQは、この疎水性領域を形成することによって、予想外に優れた増強を与える。
水溶性重合第四級塩の添加によって達成される化学発光の増強は、水性試料中に、ジオキセタン類のオキシアニオンと、結果的に生じる励起状態の光放射体であるリポーター分子とを疎水性領域内に封鎖するような重合第四級塩の能力を改良する添加物を含ませることによって、更に改良できる。すなわち、重合第四級塩と添加物との併用は、重合第四級塩、または、界面活性剤もしくは水溶性重合体それ自体であるときは限られた程度にしか化学発光を増強し得ない添加物の添加によって、個別に生起されるそれをはるかに超える増強の増大を生じる。重合第四級塩と添加物との相乗的な組合せは、1,2−ジオキセタン類を用いることによって、水性試料中でさえ低レベルの信頼できる検出を可能にする増強効果を与える。添加物と組み合わせた重合第四級塩は、0.005％未満から0.001％までのレベルで、劇的な４ないし５倍の増大を示す程に充分に強力なエンハンサーである。50％またはそれ以上にも達する量の、一層大量の重合第四級塩、添加物、またはその両者の添加によって、増大したシグナル、および改良されたシグナル／ノイズ比が達成される。一般に、重合第四級塩と添加物との双方についてのレベルは、好ましくは0.05〜25重量％、より好ましくは0.1〜15重量％の範囲内であることができる。
［発明の簡単な説明］
本発明の検定法およびキットは、水溶性の化学発光性1,2−ジオキセタン類を用いる。上記のとおり、これらのジオキセタン類は当該技術において充分確立されており、それらの構造および調製は、それ自体は本発明の新規な主題を構成しない。一般に、検定法を実施するのに充分なほど水中で安定性を示し、酵素との相互作用、および該酵素による分解を誘導する酵素不安定基の開裂によって分解され、そして化学発光し得るいかなる化学発光性ジオキセタン類も、本発明に関連して用いることができる。典型的には、本発明で有効な1,2−ジオキセタン類は、一般式：
0003632856.tif 000002
（式中、
R1は、C1〜C20アルキル、またはC1〜C12アリールもしくはアラルキルであり；
Ｙは、フェニルまたはナフチルであり；
R2は、ジオキセタンに関してＹにメタ置換されているか、または共役的に結合していないOX（式中、Ｘは、酵素で開裂されるとジオキセタンのフェノキシまたはナフトキシアニオンを残す基である）であり；
Ｚは、Ｈ、Cl、その他のハロゲンまたはアルコキシ基である）
を有するであろう。
好ましいジオキセタン類は、AMPPD、特にその２ナトリウム塩はもとより、CSPDおよびその２ナトリウム塩も包含する。これらのジオキセタン類を調製する方法は、上記に参照した譲受人を同じくする特許はもとより、例えば、ウエイン州立大学に譲渡された米国特許第4,962,162号明細書に開示されている。ジオキセタン類の調製、精製および単離は、それ自体は、ここに開示かつ請求される本発明の新規な主題を構成しない。
試料中に標的被検体が存在する場合、その被検体と結合するか、または相互作用する酵素複合体を既に混合した試料に、ジオキセタン類を加える。したがって、ジオキセタン類は酵素に対する基質であって、ジオキセタン類の本体から基質の不安定基の酵素触媒による開裂は、不安定なオキシアニオンおよびそれに続くジオキセタン類の分解を招く。標的被検体が酵素自体である場合は、濁度を低下させるための予備的精製の後または分離の際のいずれかにおいて、ジオキセタン類を試料に直接加える。標的被検体が、酵素以外である場合は、試料中に存在するすべての標的被検体と結合するように、その酵素を結合部分、例えばDNAプローブや抗体と複合させる。検出される化学発光の量は、試料中の被検体、および試料中の被検体の量の双方に応答するであろう。
化学発光シグナルを増強し、シグナル／ノイズ比を改良して、バックグラウンドシグナルと標的に応答する肯定的シグナルとの非常に低レベルでの区別を可能にするには、ジオキセタンの導入に先立って、または同時に、水溶性増強剤を試料に加える。
本発明の増強剤は、一般的には、重合オニウム塩、特に、ホスホニウム、スルホニウム、および、好ましくはアンモニウム部分が第四級塩になったものである。それら重合体は、下記に示す一般式（Ｉ）：
0003632856.tif 000003
（式中、R1、R2およびR3は、それぞれ、１〜20個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状非置換アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシル等;1個またはそれ以上のヒドロキシル、アルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ、ベンジルオキシもしくはポリオキシエチルエトキシ）、アリールオキシ（例えばフェノキシ）、アミノもしくは置換アミノ（例えばメチルアミノ）、アミド（例えばアセトアミド）またはウレイド（例えばフェニルウレイド）で置換された１〜20個の炭素原子を有する直鎖状もしくは分岐鎖状アルキル基；あるいはフルオロアルカンまたはフルオロアリール（例えばヘプタフルオロブチル）、３〜12個の環炭素原子を有する非置換モノシクロアルキル基（例えばシクロヘキシルまたはシクロオクチル）、１個以上のアルキル、アルコキシもしくは縮合ベンゾ基で置換された３〜12個の環炭素原子を有する置換モノシクロアルキル基（例えばメトキシシクロヘキシルもしくは1,2,3,4−テトラヒドロナフチル）、それぞれが５〜12個の炭素原子を有する２個以上の縮合環を有する、非置換であるか、または１個以上のアルキル、アルコキシもしくはアリール基で置換されたポリシクロアルキル基（例えば１−アダマンチルまたは３−フェニル−１−アダマンチル）、非置換であるか、または１個以上のアルキル、アリール、フッ素もしくはヒドロキシル基で置換された、少なくとも１個の環および全部で６〜20個の炭素原子を有するアリール、アルカリールまたはアラルキル基（例えばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジルもしくはデヒドロアビエチル）であることができ;R1、R2およびR3のうち少なくとも２個は、それらが結合している第四級原子とともに、飽和または不飽和の、３〜５個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子を有し、かつベンゼン環が縮合していてもよい窒素、リンまたは硫黄を含有する非置換であるか、または置換された環（例えば１−ピリジニウム、１−（３−アルキルもしくはアラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、アルキルモルホリニウム、アルキルピペリジニウム、Ｎ−アシルピペリジニウム、ピペリジノもしくはアシルピペリジノ、ベンゾオキサゾリウム、ベンズチアゾリウムまたはベンズアミダゾリウム）を形成し得る）で示される。
記号X-は、単独に、または合わさって、ハロゲンイオン、すなわちフッ素イオン、塩素イオン、臭素イオンまたはヨウ素イオン、硫酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、例えばメチルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオン、例えばｐ−トルエンスルホン酸イオン、置換アリールスルホン酸イオン、例えばアニリノナフチレンスルホン酸イオン（各種の異性体）、ジフェニルアントラセンスルホン酸イオン、過塩素酸イオン、アルカン酸イオン、例えば酢酸イオン、アリールカルボン酸イオン、例えばフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体、ベンゼン複素環式アリールカルボン酸イオン、例えば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボン酸イオンのような部分を包含できる対イオンを表す。ｐ−テレフタル酸イオンなどの有機ジアニオン類もX-によって表されてよい。
記号ｎは、そのようなポリ（ビニルベンジル第四級塩）の分子量が、固有粘度またはLALLS法を用いて測定して約500〜約500,000（平均分子量）、好ましくは約20,000〜約70,000の範囲にわたる数を表す。
Ｍが窒素であるこれらの重合体、関連共重合体および関連出発材料を調製する方法は、G.D.Jonesら:Journal of PolymerScience、第25巻201ページ（1958年）、米国特許第2,780,604号、第3,178,396号、第3,770,439号、4,308,335号、第4,340,522号、第4,424,326号明細書、およびドイツ国公開特許第2,447,611号公報に開示されている。
記号Ｍは、リンまたは硫黄を表してもよく、ここで、対応するスルホニウムまたはホスホニウム重合体は先行技術に記載されている（米国特許第3,236,820号および第3,065,272号明細書）。
本発明のこれら重合体の調製法は、参照された米国特許はもとより、米国特許出願第07/811,620号明細書でも説明されており、それ自体は本発明のいかなる主題も構成しない。
２個以上の異なるオニウム側鎖を有する共重合体も、ここに述べた本発明で利用できる。
0003632856.tif 000004
記号Ｘ、M'、Ｒ1'、Ｒ2'およびＲ3'は、Ｘ、Ｍ、R1〜R3として上記で説明したものと同様である。記号ＹおよびＺは、共重合体を構成する個々の単量体のモル分率を表す。したがって、記号ＹおよびＺは、合計は常に１に等しく、個別的には0.01から0.99まで変動してよい。
好適な部分として、ＭはＮまたはＰであり、R1〜R3は、それぞれ独立して、１〜20個の炭素原子を有する、非置換であるか、またはヒドロキシル、アミノ、アミド、ウレイドで更に置換されたアルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル（例えばアダマンタン）、アラルキルもしくはアリールであるか、あるいは併せて、Ｍ原子とのスピロ結合を介して複素環式の（場合により他のＮ、ＳまたはＯのヘテロ原子を含む芳香族、脂肪族もしくは混合の）オニウム基を形成する。
出願人は、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリドが、単独で、上記のとおり、1,2−ジオキセタン類リポーター分子の使用に基づく化学発光検定法と組合せると、予想外に優れた増強を与えることを発見した。実際に、TBQの単独での添加によって得られる化学発光シグナルの改良は、概して、次善の増強剤であるBDMQの添加から得られる改良の少なくとも２倍のオーダーであった。完璧を目的として、単独でのTBQを、当技術に認められたもう一つの増強剤である臭化セチルトリメチルアンモニウムとも対比して評価した。
増強剤としての単独でのTBQの評価
各種のエンハンサーの評価のためのプロトコール
0.1Mのジエタノールアミン、1mMのMgCl2、pH9.5の緩衝液とした貯蔵溶液からエンハンサー試料を調製した。CSPDまたはAMPPDをエンハンサー液0.5mlに加えた（最終ジオキセタン濃度は0.4mM）。ジオキセタン添加の10分および60分後に、バックグラウンドをBertholdの952Tというルミノメータ中で室温で記録した。次いで、アルカリ性ホスファターゼを加え（最終酵素濃度は9.35×10-14M）、化学発光シグナルを10、30、および60分（全試料は実施せず）に５秒間の積分として測定した。
1mMのMgCl2に含まれる全緩衝剤
＊＊下記のとおり、プラトー（平坦域）までの半値時間を決定した：
所望の緩衝液中で0.4mMのAMPPDを37℃または30℃で前温置し、次いで、アルカリ性ホスファターゼを各試験管に加えた（最終濃度、4.1×10-13M）。その試験管を、Turnerのモデル20−Ｅというルミノメータに挿入し、定常状態の発光までの半値時間を算出した。
0003632856.tif 000005
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前述の増強分析から理解できるとおり、TBQは、単独でのジオキセタン類、または当技術に認められた他の増強剤と比較して、化学発光増強の鮮明な改良、上昇したS/Nを与える。すなわち、試料へのTBQの添加のみで、得られる化学発光シグナルおよびS/N値の実質的増強をもたらす。実際に、出願人は、その試料の体積を基準にして0.005重量％未満から0.001重量％までという少量のTBQの添加が、いかなるエンハンサーも伴わずにジオキセタン類から得られたシグナルを４〜５倍上回る化学発光シグナルの増強を招くことを発見した。
増強剤および増強添加物の添加
本発明の増強剤を構成する重合第四級塩は、プロトン性の環境下で、オキシアニオンとして酵素から結果的に生じたジオキセタン部分と、続いて形成された励起状態のものとをその中に封鎖する疎水性領域を形成することによって、化学発光を増強する。疎水性領域を与えることによって、消光性の水との反応が低下するか、または全く回避されて、化学発光の全般的改良が得られる。出願人は、本発明の重合第四級塩である増強剤の添加に加えての増強添加物の使用は、観測される化学発光シグナルを増強し、S/N値を改善することを発見した。本発明の増強添加物は、増強剤と併せると、非常に低いレベルで顕著な改良を示す。試料の体積を基準にして0.005重量％もの増強添加物の添加は、増強剤の使用によって得られる化学発光シグナルの強さを一層改良するが、バックグラウンドのレベルは上昇させない。増強剤によるのと同様に、この添加物は、実用上役立つ限り多量に用いることができる。一般に、試料を基準にして50重量％を上回る量は検定の性能を阻害する。したがって、増強剤と増強添加物との双方を、試料の体積を基準にして、それぞれ0.005重量％から、試料の体積を基準にして両者併せて全部で50重量％以下の量で含ませることが、本発明の範囲内である。増強剤および増強添加物の合計は50％を超えるべきではない。
増強添加物の役割は、ジオキセタン類のオキシアニオン、および結果的に得られるその光放射体をその中に封鎖できる疎水性領域を形成する増強剤の能力を改良して、水の不存在下での分解および化学発光を可能にし、そのため、それによって生起される消光反応を低下させることである。増強添加物は、非常に多様な化合物のいずれからも選択できる。概して、増強添加物は、本発明の増強剤程には強くはないにしても、得られる化学発光シグナルを増強するが、必ずしもその必要はない。したがって、慣用の界面活性剤、主として洗剤類の添加は、比較的安定である疎水性領域を形成して増強剤の能力を改良する。これらの界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、両イオン性または中性であってよい。非常に低い濃度でも活性である他の一群の増強添加物は、非常に多様なアルコール類をはじめとする慣用の溶剤である。もう一つの慣用の溶剤であるテルビンも役立つ。
増強添加物の第四の効果的な群は、第四級塩でない水溶性重合体、例えばポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（PolyOx）である。これらの重合体は、それ自体が、バックグラウンドノイズの増大なしに、化学発光シグナルの限定された増強を誘導し得るが、本発明の重合第四級オニウム塩の増強剤と併せて添加されると、観測される化学発光シグナルの鮮明な増強が得られる。
増強剤への増強添加物の添加によって得られる改良を立証するために、緩衝化したジオキセタン類溶液に、TBQとともに、界面活性剤のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）およびオクチル−β−グルコシドを与えた。下記の表３および４に示した結果が、表示のとおり、CSPDおよびエンハンサー組成物を用いて得られた。
表中に用いた略号
TBQ:ポリビニルベンジルトリブチル第四級アンモニウムクロリド
SDBS:ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム
PolyOx:ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、分子量500,000
OcGluc:オクチル−β−グルコシド
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前述の結果に明瞭に反映されたとおり、TBQという増強剤への多様な増強添加物の様々な量での添加は、化学発光シグナルおよびS/Nを実質的に改良する。
２種類以上の添加物を組合せることによって、化学発光シグナルおよびS/Nの一層の改良を得ることができる。
前述の結果（表４）に反映されたとおり、PolyOxは、TBQと併用する増強添加物として、増強されるシグナルはごくわずかではあるが、改良された結果が得られた。これらの結果は、ジオキセタン類としてAMPPDを用い、TBQの評価に関して上記に述べたプロトコールに従って得られたことに注目すべきである。
増強の改良は、ジオキセタン類が上記のような用途に適した化学発光性種であることを条件として、ジオキセタン類の構造とは無関係に、TBQを単独で、または特に増強添加物とともに加えることによって得られる。したがって、TBQは、CSPDとAMPPDとの双方と共に、所望の効果をあげるように用いられる。更に、認識されたように、増強添加物をTBQと共に用いて、シグナルの強さとS/N値との双方を一層改良できる。TBQとCSPDを併用して優れた結果を与える一つの特定の増強添加物は、登録商標「Zlec］として帯電防止剤として販売されており、DuPont社から入手できる。Zelecの組成は、企業秘密として保守されているものと思われるが、テレビン、Ｎ−オクチルアルコール、水、イソプロピルアルコール、酢酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム、およびニュージャージー州企業秘密登録番号（NJ Trade Secret Registry Number）第00850201001−5400P号として特定されるTSという化合物または化合物類を含有する。Zelecという帯電防止剤に関する材料安全データシートは、第5909PP号によって特定される。ここで下記に説明のとおり、ZelecとTBQ、またはTBQの共重合体との組合せは、実質的な改良および結果を与える。単独でのAMPPDおよびCSPDはもとより、増強剤としてのBDMQと併用し、それらまたはそれに代えて、増強剤を添加しないZelecも、比較を目的として包含した。
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増強剤と増強添加物との併用
前述のとおり、TBQは単独で、観測される化学発光に印象的な改良を与える。化学発光性のジオキセタン種をその中に封鎖する疎水性領域を形成するTBQの能力を改良する増強添加物と併用したTBQは、化学発光シグナルの増強とS/N比との双方を一層改良する。言うまでもなく、ノイズもともに増大するならば、シグナルの強さを改良することは、より望ましくないことであろう。前述のデータは、米国マサチューセッツ州BedfordのTropix社から入手できる商業的に入手できるジオキセタン類を用いると、ノイズは低レベルに維持されることを明瞭に証明している。この改良は、TBQのみの添加、または増強添加物のみの添加を理由として予測できるであろうそれをはるかに超えるが、その添加物は、本発明の重合第四級オニウム塩の増強剤の不存在下では、ときには多少の、しかし一般的にはわずかな増強効果を有する。
本発明の重合第四級オニウム塩による増強剤を、化学発光性の種をその中に封鎖する疎水性領域を形成する増強剤の能力を改良できる増強添加物と併用することによって、得られる改良を更に立証するため、増強剤と１種以上の増強添加物との非常に多様な組合せを調製し、化学発光について評価した。これらの増強剤は、界面活性剤、慣用の溶剤、および水溶性重合体を包含する非常に多様な化合物群から選択されるものである。結果は以下のページに反映される。
様々なエンハンサー系を評価するために、下記の方法を用いた。おのおののエンハンサー配合物試料（0.5ml）は、濃縮した貯蔵溶液から調製した。用いた緩衝液は、0.1Mのジエタノールアミン、1mMのMgCl2、pH9.5であった。エンハンサー配合物を調製した後、CSPDを加えた（最終ジオキセタン濃度、0.04mM）。次いで、基質の添加の約10分後および１時間後にBertholdの952Tルミノメータ中で、バックグラウンドを室温で測定した。次に、アルカリ性ホスファターゼを加え（最終濃度、9.35×10-14M）、10、30および60分（時折り）に、化学発光シグナル（５秒間、RLU）を測定した。
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出願人は、可能な組合せの広範な実施態様によって、その発明を例示するために努力した。にもかかわらず、可能な組合せは無限であり、網羅的には具体化できないことが認識される。上記の教示を前提として、当業者は、前述の出願中に特定して例示されてはいない増強剤および増強添加物に到達するものと思われる。実施例は、限定的であるとは解釈されず、その他の組合せの特定は、前述の開示を前提として、適当な実験を伴うことなく本技術を実施する者の技量の充分な範囲内にある。そのような組合せは、以下に述べる請求項によって明白に限定または排除されるようなものを除いて、本発明の範囲内にあると解釈される。