(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式を有する化合物：
【化１】
0003638950.tif 000011
R1、R2およびR3は独立して、
ａ）置換されたかまたは置換されていないC1〜C20の分岐または直鎖状のアルキル、
ｂ）置換されたかまたは置換されていないC3〜C10のシクロアルキル、あるいは
ｃ）置換されたかまたは置換されていないベンジル、ナフチルメチルまたは分岐もしくは直鎖状のフェニルプロピルであり、
ここで、該置換された、アルキル、シクロアルキル、ベンジル、ナフチルメチルおよびフェニルプロピルは、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキル、アリール、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン、ニトロ、C1〜C20の分岐または直鎖状のアルキルカルボニル、アリールカルボニル、C1〜C20の分岐または直鎖状のアルキルスルホニル、アリールスルホニル、C1〜C20の分岐または直鎖状のアルキルスルファミド、アリールスルファミド、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキルカルボンアミド、アリールカルボンアミド、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキルウレアおよびアリールウレアからなる群から選択される置換基で置換されており；ここでｎは、１と20との間である。
【請求項２】
前記分岐または直鎖状の基の各々が１〜20個の炭素原子を有し、そして前記シクロアルキル基が３〜10個の炭素原子を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
R1がシクロヘキシルメチル、R2がエチル、R3がエチルであり、かつ、ｎが２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
認識を増強する必要性のある患者においてその認識を増強するための組成物であって、患者に対する投与のための薬学的に受容可能なキャリア中に請求項１に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項５】
前記薬学的に受容可能なキャリアが、静脈内投与、経口投与、呼吸管を経由した投与、皮下投与、筋肉内投与、直腸投与、および局所投与のためのキャリアよりなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
以下よりなる群から選択される、請求項１に記載の化合物：
【化２】
0003638950.tif 000012
【請求項７】
認識を増強する必要のある被験体においてその認識を増強するための薬学的組成物を製造する方法であって、認識を増強する必要のある被験体の認識を増強するに効果的な量の化合物を、患者に投与するための薬学的に受容可能なキャリア中に配置する工程を包含し、ここで該化合物は、以下の式を有する化合物：
【化３】
0003638950.tif 000013
R1、R2およびR3は独立して、
ａ）置換されたかまたは置換されていないC1〜C20の分岐または直鎖状のアルキル、
ｂ）置換されたかまたは置換されていないC3〜C10のシクロアルキル、あるいは、
ｃ）置換されたかまたは置換されていないベンジル、ナフチルメチルまたは分岐もしくは直鎖状のフェニルプロピルであり、
ここで、該置換された、アルキル、シクロアルキル、ベンジル、ナフチルメチルおよびフェニルプロピルは、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキル、アリール、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン、ニトロ、C1〜C20の分岐または直鎖状のアルキルカルボニル、アリールカルボニル、C1〜C20の分岐または直鎖状のアルキルスルホニル、アリールスルホニル、C1〜C20の分岐または直鎖状のアルキルスルファミド、アリールスルファミド、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキルカルボンアミド、アリールカルボンアミド、C1〜C20の分岐または直鎖状の、アルキルウレアおよびアリールウレアからなる群から選択される置換基で置換されており；ここでｎは、１と20との間である。
【請求項８】
前記分岐または直鎖状の基の各々が１〜20個の炭素原子を有し、そして前記シクロアルキル基が３〜10個の炭素原子を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
R1がシクロヘキシルメチル、R2がエチル、R3がエチルであり、かつ、ｎが２である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬学的に受容可能なキャリアが、静脈内投与、経口投与、呼吸管を経由した投与、皮下投与、筋肉内投与、直腸投与、および局所投与のためのキャリアよりなる群から選択される、請求項７に記載の方法であって、該キャリアについて適切である経路により前記化合物を投与する工程をさらに包含する方法。
【請求項１１】
前記化合物が以下よりなる群から選択される、請求項７に記載の方法：
【化４】
0003638950.tif 000014
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、神経のレセプターの分野に関し、より詳しくはムスカリン様２（muscarinic2）レセプターに対するリガンドの分野に関する。
【０００２】
（ムスカリン様コリン作動性レセプター）
アセチルコリンは２つのクラスの膜レセプター：ニコチン様およびムスカリン様を誘起する。ニコチン様レセプターは、シナプス後部の膜におけるカチオン特異的チャンネルであり、一方ムスカリン様レセプターは、Ｇタンパク質を誘起する７らせんの膜貫通タンパク質である。ムスカリン様コリン作動性レセプターの阻害は記憶能力を損なうのに対し、ムスカリン様レセプター活性の促進は記憶機能を改善する。
【０００３】
分子生物学的研究は、Bonner,T.I.、Trends  Neurosci、12:145−151（1989）によって概説されたように、少なくとも５つのサブタイプのムスカリン様コリン作動性レセプターが存在することを示した。これらのレセプターサブタイプの合成に関連するメッセンジャーRNA（mRNA）は、Buckley,N.J.ら、J.Neurosci、8:4646−4652（1989）によって記載されたように、インサイチュハイブリダイゼーションの技術を用いて位置づけられた。これらのムスカリン様レセプターは中枢神経系（CNS）全体におよぶが、M2レセプターは例外で、Liao,C.−F.ら、J.Biol.Chem.、264:7328−7337（1989）によって報告されたように、それは、かなり特殊化され、２、３の独特の領域にのみ見出されるようである。ムスカリン様コリン作動性レセプターサブタイプの存在は、他のレセプターには影響を及ぼさずに１レセプターのみを標的とする新しい薬物の開発の有望性を有する。今日までに開発されたコリン作動性組成物の多くの副作用は、Colleton,D.、Neurosci、19（１）:1−28（1986）によって概説され、それによってこの方法が非常に望ましい方法であるとされた。唯１つのレセプターサブタイプに作用する、より特異的な薬物が、その効果により焦点を当てることを期待されている。
【０００４】
（ムスカリン様２レセプター）
アセチルコリン（ACh）の放出は、ムスカリン様２（M2）タイプのシナプス前部のレセプターによって調節されているようである。Spencer,D.G.ら、Brain  Res.、380:59−68（1986）によって概説されたように、過去数年間にわたり、M2レセプターは、CNS上のいくつかの部位に位置するシナプス前部にあるという証拠が累積されてきており、そしてMash,D.C.ら、Science、288:1115−1117（1985）およびQuirion,R.ら、TIPS、Dec.Suppl.80−84（1989）による報告によれば、これらの部位はアルツハイマー病において減少する。Pittel,Z.ら、J.Neurochem.、55:665−672（1990）によって報告されたように、コリン作動性ニューロン上のシナプス前部M2レセプターは、コリン作動性ニューロンからのAChの放出を調節する自己レセプターを意味する。これらの部位をブロックする特異的M2リガンドの使用は、シナプスでのAChのレベルを上昇させ、そのことにより、シナプスでの、およびアルツハイマー病に見られるようなコリン作動性ニューロンの損失によってその濃度が減少した領域での神経伝達物質としてのAChの効果を増大させることが期待されている。いくつかの比較的特異的なM2アンタゴニストが開発された。しかし、これらのアンタゴニストは、血液脳関門を通過しない。
【０００５】
（神経障害）
（痴呆）
痴呆は、知的機能、記憶、および学習した知的理解力の漸進的減退である。合衆国の65歳以上の人々の約11％が、軽度なものから重度のものまで精神障害を示し、そして75歳からの痴呆の発生率は、年齢が増加するごとに２％より高い割合で増加する。Goldman,J.およびCote,L.、Principles  of  Neural  Science、第３版、Kandelら編、974−983（Elsevier  New  York  1991）によって報告されたように、現在では、合衆国の100万人以上の人々が、深刻な痴呆症にかかっており、そして毎年その内の推定120,000の人々が深刻な痴呆に関連した原因で死亡している。
【０００６】
痴呆の全ケースの約70％は、アルツハイマー病によるもので、数パーセントのケースが、ハンチントン病またはパーキンソン病のような他の神経変性病（neurodegenerative  disease）に関連している。
【０００７】
（アルツハイマー病）
アルツハイマー病（AD）は、中隔海馬回路（septohippocampal  pathway）、および基底核から大脳皮質までの投射路におけるコリン作動系内の細胞損失により特徴付けられる（Colleton,D.、Neurosci.、19（１）:1−28（1986）、およびSmith,G.、Brain  Res.Rev.、13:103−118（1988））。記憶機能とコリン作動性薬物との関係は、詳細に記録されている。例えば、スコポラミンのようなムスカリン様コリン作動性アンタゴニストは、記憶機能を低下させる。ムスカリン様レセプター部位への結合に影響を及ぼすいくつかのコリン作動性アゴニストが開発された。Colleton,D.、Neurosci.、19（１）:1−28（1986）によって報告されたように、コリン作動性アゴニストおよび抗コリンエステラーゼが上手く用いられ、選択された患者の記憶を改善した。しかし、これらの化合物は、Colleton,D.、Neurosci.、19（１）:1−28（1986）によって報告されたように、作用時間が短く、そしてそれらの副作用はすぐに治療を受けている患者に耐えられなくなる。
【０００８】
従って、神経障害の治療に有用な化合物を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
神経障害の治療方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００１０】
血液脳関門を効果的かつ治療的方法で通過し、そして経口的、静脈内、または非経口的のいずれでも投与し得る痴呆治療用化合物を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１１】
現在の神経障害の治療方法に関連した副作用を最少にし、そして長期の治療に適した痴呆治療用化合物を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１２】
（発明の要旨）
神経障害の治療に適し、そして最少の副作用で投与され得るムスカリン様M2レセプターリガンドが記載されている。
【００１３】
本明細書中に記載される化合物は以下の一般的構造を有する：
（第１世代M2リガンド）
【００１４】
【化５】
0003638950.tif 000002
【００１５】
R1、R2およびR3は、独立して、メチル（methyl）、イソプロピル（isopropyl）、またはｔ−ブチル（ｔ−butyl）のようなアルキル（alkyl）；シクロペンチル（cyclopentyl）、シクロヘキシルメチル（cyclohexylmethyl）、またはアダマンチル（adamantyl）のようなシクロアルキル（cycloalkyl）；ベンジル（benzyl）、ナフチルメチル（napthylmethyl）、またはフェニルプロピル（phenylpropyl）のようなアリールアルキル（arylalkyl）；であるが、これらのアルキル基、シクロアルキル基、またはアリールアルキル基には限定されず、そして任意に以下の基と置換される：アルキル、アリール（atyl）、アルコキシ（alkoxy）、アリールオキシ（aryloxy）、アミノ（amino）、アルキルチオ（alkylthio）、アリールチオ（arylthio）、ハロゲン（halogen）、ニトロ（nitro）、アルキルまたはアリールカルボニル（carbonyl）、アルキルまたはアリールスルホニル（sulfonyl）、アルキルまたはアリールスルファミド（sulfamido）、アルキルまたはアリールカルボンアミド（carbonamido）、アルキルまたはアリールウレア（urea）；
ここでｎは、１と20との間である。
【００１６】
（第２世代M2リガンド）
【００１７】
【化６】
0003638950.tif 000003
【００１８】
Ｘ＝−CH、N;
Ｙ＝−CONR1−、−NR1CO−、−CH2NR1−、−NR1CH2−、−NCO（CH2）nNR;
R1は、メチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルのようなアルキル；シクロペンチル、シクロヘキシルメチル、またはアダマンチルのようなシクロアルキル；ベンジル、ナフチルメチル、またはフェニルプロピルのようなアリールアルキル；シクロヘキサンカルボニル（cyclohexane  carbonyl）またはベンゾイル（benzoyl）のようなアルキルまたはアリールカルボニル（carbonyl）；メタンスルホニル（methane  sulfonyl）またはナフタレンスルホニル（napthalenosulfonyl）のようなアルキル−またはアリールスルホニル；シクロヘキシルウレア（cyclohexylurea）またはフェニルウレア（phenylurea）のようなアルキルまたはアリールウレア；であるが、これらのアルキル基、またはアリール基に限定されず、そして任意に以下の基によって置換される：アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、ハロゲン、ニトロ、アルキルまたはアリールカルボニル、アルキルまたはアリールスルホニル、アルキルまたはアリールスルファミド、アルキルまたはアリールカルボンアミド、アルキルまたはアリールウレア；
R2およびR3は、メチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルのようなアルキル；シクロペンチル、シクロヘキシルメチル、またはアダマンチルのようなシクロアルキル；ベンジル、ナフチルメチル、またはフェニルプロピルのようなアリールアルキルであるが、これらのアルキル基、アリールシクロアルキル基、またはアリールアルキル基に限定されず、そして任意に以下の基によって置換される：アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、ハロゲン、ニトロ、アルキルチオまたはアリールチオ、アルキルまたはアリールカルボニル、アルキルまたはアリールスルホニル、アルキルまたはアリールスルファミド、アルキルまたはアリールカルボンアミド、アルキルまたはアリールウレア；
ここで、ｍおよびｎは、１と20との間である。
【００１９】
第１世代M2リガンドは、化合物２（図１）が過剰の第２アミンと反応することにより生成される。第２アミンは、３つの経路により生成される：（１）酸クロライド（acid  chloride）とN,N−ジアルキルジアミノアルカン（N,N−dialkyl  diamino  alkanes）との反応、（２）第１アミンと活性化されたN,N−ジアルキルアルカン酸（N,N−dialkyl  alkanoic  acid）との反応、および（３）第１アミンとクロロアルカノイルクロライド（chloroalkanoyl  chloride）とを反応させて塩化アルキル（alkylchloride）を得、次いでそれを第２アミンと反応させる。
【００２０】
第２世代M2リガンドは、化合物２（図１）が第２シクロアルキルアミン（cycloalkylamine）と反応することにより生成される。第２シクロアルキルアミンは、Ｎ−保護されたイソニペコチン酸（Ｎ−protected  isonipecotic  acid）、Ｎ−ベンジルピペラジン（Ｎ−benzylpiperazine）、またはＮ−ベンジル−４−ピペリドン（Ｎ−benzyl−４−piperidone）と第１世代化合物中に生成した第２アミンとの反応により生成され得る。これらの反応の生成物は、Ｎ−脱保護され、そして化合物２（図１）と反応する。
【００２１】
化合物は、経口的に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、または局所的に、治療上有効な用量で、即ち治療指数が２またはそれより大きく、認識機能の促進を生じ、最も好ましくはそのような促進を必要としている被験者の認識を高めるために体重1kg当たり化合物10mgの用量で１日に１回経口的に投与され得る。治療上有効な用量を用いることによる毒性の副作用は観察されなかった。実施例は標準的な薬理学的インビボテストにおけるいくつかの化合物の効果を示す。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
神経障害の治療に適切であり、そして最少の副作用で投与され得るムスカリン様（Ｍ）２レセプターリガンドが記載される。痴呆治療のためのこれらの化合物の投与、およびこれらの化合物の合成方法もまた記載される。
【００２３】
この化合物は、以下の病状に関連する（ただし、それらに限定されない）痴呆症の治療に適切である：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、老年痴呆、アルコール症、髄膜炎、新生児低酸素症、卒中、または大脳虚血（global  cerebral  ischemia）。
M2レセプターリガンドの合成
本明細書中で用いられる場合には、以下の規定を適用する：
用語「アルキル」は、他に規定がない限り、C1からC20の直鎖状（straight）、または分岐状（branched）アルキル基をいい、具体例としてはメチル、イソプロピルおよびｔ−ブチルが挙げられる。
【００２４】
用語「シクロアルキル」は、他に規定がない限り、３から10個の炭素原子の環状アルキル基をいう；
用語「アルコキシ」は、他に規定がない限り、Ｏ−アルキル構造の部分をいう；
用語「アリール」は、他に規定がない限り、フェニル、またはベンジル、あるいは置換されたフェニルまたは置換されたベンジルであり、ここで置換基は（Ａ）メチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルのようなアルキル；（Ｂ）シクロペンチル、シクロヘキシルメチル、またはアダマンチルのようなシクロアルキル；ベンジル、ナフチルメチル、またはフェニルプロピルのようなアリールアルキル；シクロヘキサンカルボニルまたはベンゾイルのようなアルキルまたはアリールカルボニル；メタンスルホニルまたはナフタレンスルホニルのようなアルキルまたはアリールスルホニル；シクロヘキシルウレアまたはフェニルウレアのようなアルキルまたはアリールウレア；そして（Ｃ）これらは以下の基により任意に置換される：アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、ハロゲン、ニトロ、アルキルまたはアリールカルボニル、アルキルまたはアリールスルホニル、アルキルまたはアリールスルファミド、アルキルまたはアリールカルボンアミド、アルキルまたはアリールウレア。
【００２５】
この化合物は、ナノモルの範囲で親和性によりM2レセプターに選択的に結合することが予測され、そして毒性が低い（LD50は、腹腔内なら37.5mg/kgより低く、そして経口的なら45mg/kgより低い）。これらの化合物は、300と1500g/molとの間の範囲の分子量を有する。本明細書中で規定するように、患者の治療に有用な化合物は、２以上の治療指数を有する化合物であり、ここで治療指数とは致死用量（LD）50を有効用量（ED）50で除したものである。
【００２６】
この化合物はまた、経口投与を可能にするため酸に安定であることが予測される。
【００２７】
本明細書中に記載される改変された化合物は、以下の一般的構造を有する：
（第１世代M2リガンド）
【００２８】
【化７】
0003638950.tif 000004
【００２９】
R1、R2およびR3は、独立して、メチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルのようなアルキル；シクロペンチル、シクロヘキシルメチル、またはアダマンチルのようなシクロアルキル；ベンジル、ナフチルメチル、またはフェニルプロピルのようなアリールアルキル；であるが、これらのアルキル基、シクロアルキル基、またはアリールアルキル基には限定されず、そして任意に以下の基と置換される：アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルチオ、アリールチオ、ハロゲン、ニトロ、アルキルまたはアリールカルボニル、アルキルまたはアリールスルホニル、アルキルまたはアリールスルファミド、アルキルまたはアリールカルボンアミド、アルキルまたはアリールウレア；ここでｎは、１と20との間である。
【００３０】
（第２世代M2リガンド）
【００３１】
【化８】
0003638950.tif 000005
【００３２】
Ｘ＝−CH、N;
Ｙ＝−CONR1−、−NR1CO−、−CH2NR1−、−NR1CH2−、−NCO（CH2）nNR;
R1は、メチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルのようなアルキル；シクロペンチル、シクロヘキシルメチル、またはアダマンチルのようなシクロアルキル；ベンジル、ナフチルメチル、またはフェニルプロピルのようなアリールアルキル；シクロヘキサンカルボニルまたはベンゾイルのようなアルキルまたはアリールカルボニル；メタンスルホニルまたはナフタレンスルホニルのようなアルキルまたはアリールスルホニル；シクロヘキシルウレアまたはフェニルウレアのようなアルキルまたはアリールウレア；であるが、これらのアルキル基、またはアリール基に限定されず、そして任意に以下の基によって置換される：アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、ハロゲン、ニトロ、アルキルまたはアリールカルボニル、アルキルまたはアリールスルホニル、アルキルまたはアリールスルファミド、アルキルまたはアリールカルボンアミド、アルキルまたはアリールウレア；
R2およびR3は、メチル、イソプロピル、またはｔ−ブチルのようなアルキル；シクロペンチル、シクロヘキシルメチル、またはアダマンチルのようなシクロアルキル；ベンジル、ナフチルメチル、またはフェニルプロピルのようなアリールアルキルであるが、これらのアルキル基、アリールシクロアルキル基、またはアリールアルキル基に限定されず、そして任意に以下の基によって置換される：アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、ハロゲン、ニトロ、アルキルチオまたはアリールチオ、アルキルまたはアリールカルボニル、アルキルまたはアリールスルホニル、アルキルまたはアリールスルファミド、アルキルまたはアリールカルボンアミド、アルキルまたはアリールウレア；
ここで、ｍおよびｎは、１と20との間である。
【００３３】
（第１世代M2リガンドの合成）
第１世代M2リガンドは、化合物２（図１）と過剰の第２アミンとの反応により生成される。この第２アミンは、３つの経路により生成される：（１）酸クロライド（acid  chloride）とN,N−ジアルキルジアミノアルカンとの反応、（２）第１アミンと活性化されたN,N−ジアルキルアルカン酸との反応、および（３）第１アミンとクロロアルカノイルクロライドとを反応させて塩化アルキルを得、次いでそれを第２アミンと反応させる。（図２）。
【００３４】
（第２世代M2リガンドの合成）
第２世代M2リガンドは、化合物２（図１）と第２シクロアルキルアミンとの反応により生成される。第２シクロアルキルアミンは、Ｎ−保護されたイソニペコチン酸、Ｎ−ベンジルピペラジン、またはＮ−ベンジル−４−ピペリドン（Ｎ−benzyl−４−piperidone）と第１世代化合物中に生成した第２アミンとの反応により生成され得る。これらの反応の生成物は、Ｎ−脱保護され、そして化合物２（図１）と反応する。
【００３５】
（薬学的組成物）
本化合物は、適用に依存して、局所的に、局部的に、または全身に投与される。全身に投与される場合、本化合物は、好ましくは、経口または静脈に投与されるが、通常の生理食塩水のような適切な薬学的キャリアで、または錠剤形態で、腹膜内、筋肉内、または局所的に投与され得る。局所の適用について、本化合物は、好ましくは、軟膏またはクリームベースで、あるいは経皮的な絆創膏によって投与される。本化合物はまた、生分解性ポリマーのような、制御された送達デバイスによって、あるいは吸引、吹込み、または鼻噴霧によって投与され得る。適切なキャリアは、薬学的分野の当業者に公知である。
【００３６】
本化合物は、治療上効果的な用量で経口、腹膜内、筋肉内、皮下、または局所内に投与されて、認知を高め、あるいは、神経障害の症状を軽減し得る。最も好ましい実施態様においては、本化合物は、10mg/kgに相当する範囲の用量で、日に一度、経口的に投与される。マウスに対する、経口投与についてのLD50は、45mg/kgであり、そして腹膜内投与についてのLD50は、37.5mg/kgである。２またはそれより大きい治療指数を有するこれらの化合物のみが、患者に投与される。
【００３７】
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、薬物の吸収、失活、および排出速度、ならびに当業者に公知の他の因子に依存する。用量値もまた、治療される被験体の状態で変化することに注意すべきである。あらゆる特定の被験体に対して、特定用量の摂生は、個々の必要性、および組成物の投与をするまたは管理する者の専門的判断により、長期にわたって投与されるべきであり、そして本明細書に示される濃度範囲は、例示的なものでしかなく、請求の範囲の組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことが、さらに理解されるべきである。
【００３８】
経口送達のために、本化合物は、溶液または懸濁で、単独であるいは、デンプンのような基質固定化物質またはイムモディウム（immodium）のような貧吸収性の塩と組合せて、カプセルに包まれ、錠剤に圧縮され、マイクロカプセル化され、リポソームに取り込まれ得る。薬学的に適合性のある結合剤は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤またはカプセルは、例えば、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含み得る：微晶質のセルロース、ガムトラガカント（gum  tragacanth）またはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような媒体、アルギン酸、Primogel（登録商標）、またはコーンスターチのような、崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesのような、滑沢剤；コロイド二酸化ケイ素のような、グリダント（glidant）；スクロースまたはサッカリンのような、甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料のような、香味剤。用量ユニット形態がカプセルである場合、上記のタイプの物質に加えて、液体キャリアも含み得る。加えて、用量ユニット形態は、用量ユニットの物理形態（physical  form）を改変する種々の他の物質（例えば、糖、セラック、他の腸溶性剤のコーティング）を含む得る。
【００３９】
本発明は、以下の限定されることのない実施例と関連してさらに理解される。
【００４０】
（実施例1:M2レセプターリガンドの合成）
ここで記載される化合物は、三環式芳香環系を有する。三環式芳香環系は、アセチル基を介して、アミン含有側鎖に取り付けられる。三環式芳香族5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン（5,11−dihydro−6H−pyrido［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one）、１、およびそのクロロアセチル誘導体5,11−ジヒドロ−11−（クロロアセチル）−6H−ピリドール［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン（5,11−dihydro−11−（chloroacetyl）−6H−pyridol［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one）、２は、標準手順に従って調製され、そしてEngel,W.W.ら、J.Med.Chem.32:1718−1724（1989）；米国特許第3,406,168号（1968）によって報告された値と同一の物理的性質および分光学的性質を有していた。クロロアセチル誘導体２を、全ての合成に用いた。構造については図１を参照。
【００４１】
（a.第１世代M2リガンド）
生成される第１のM2リガンドは、上記に記載された式に示される一般構造を有する。これらは、アセチルクロライド２と過剰の二級アミンとを反応させることによって、65〜85％の収率で生成された。二級アミンは、図２に示されるように、３つのルートを経て生成され得る。これらは全て、アミドを介して進行し、最終工程で還元されて、二級アミンを生成する。
【００４２】
図2Aに示されるような、第１のルートは、酸クロライドとN,N−ジアルキルジアミノアルカン（N,N−dialkyl  diamino  alkane）とを反応させることを含む。図2Bに示されるような、第２のルートは、一級アミンと活性化N,N−ジアルキルアルカン酸（N,N−dialkyl  alkanoic  acid）との反応を含む。N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド（N,N−dicyclohexylcarbodiimide）または当業者に公知のいくつかの他の試薬を、アミンによる求核付加に対して、酸を活性化するのに用い得る。図2Cに示されるような、第３のルートは、一級アミンと、クロロアルカノイルクロライド（chloroalkanoyl  chloride）とを反応させ、アルキルクロライドを生成させ、次いで、このアルキルクロライド（alkylchloride）を、ジエチルアミン（diethylamine）のような二級アミンと反応させて、所望のアミドを生成させる。
【００４３】
二級アミンの合成に用いられる全ての試薬は、Aldrich  Chemical  Co.,Inc.,Milwaukee、WIから容易に入手できる。
【００４４】
（合成）
PDC  008.004および関連化合物の合成を、図４に示す。
【００４５】
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−シクロヘキサンカルボキサアミド（Ｎ−［２−（diethylamino）ethyl］−cyclohexane  carboxamide）;3:シクロヘキサンカルボニルクロライド（cyclohexane  carbonyl  chloride）（55.9mmol）を、１リットル３つ口丸底フラスコ中の650mLのアセトン（acetone）に撹拌しながら溶解した。無水炭酸カリウム（anhydrous  potassium  carbonate）（55.0mmol）を、一度にフラスコに加えた。コンデンサー、125mLの添加漏斗、およびストッパーを、３つ口の各々に付けた。N,N−ジエチルエチレンジアミン（N,N−diethyl  ethylenediamine）（43.0mmol）を、100mLのアセトンに溶解し、そして添加漏斗に移した。反応混合物を25℃で撹拌しながら、アミン／アセトン溶液を、1.6時間かけて添加した。25℃で19時間後、全てのシクロヘキサンカルボニルクロライドが消費されると、薄層クロマトグラフィーによるRF  0.25（シリカゲルGF、250μｍ、1:9:90  水酸化アンモニウム（ammonium  hydroxide）：メタノール（methanol）：クロロホルム（chloroform）、ヨウ素可視化）に新しいスポットが生成した。固形物を濾過し、そしてアセトンで洗浄し、そしてこのアセトンをロータリーエバポレーターでエバポレートした。この残渣を200mLのクロロホルムに溶解し、そして10％重炭酸ナトリウム（sodium  bicarbonate）水溶液100mLづつで、３回、抽出した。合わせた重炭酸洗浄液を、300mLのクロロホルムで逆抽出し、そして合わせたクロロホルム相を、100mLの蒸留水で洗浄した。クロロホルムをエバポレートし、そして残りの溶媒を温和な加熱と共に減圧下で除去し、オフホワイトの結晶を得た。ヘキサン（hexane）および酢酸エチル（ethyl  acetate）からの再結晶によって、融点105℃〜107℃を有する白色結晶を得た（30.9mmol、収率72％）。分光学的性質は、提示された構造と一致した。
【００４６】
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキサンメチルアミン（Ｎ−［２−（diethylamino）ethyl］cyclohexanemethylamine）、4:化合物３（11.2mmol）を、アルゴン（argon）でパージされた250mLのフラスコ中の150mLのジエチルエーテル（diethyl  ether）に溶解した。水素化アルミニウムリチウム（lithium  aluminum  hydride）（16.8mmol、1.0M  ジエチルエーテル溶液）を、ガスタイトシリンジで一度に加えた。１時間後、化合物３（Rf  0.5）は完全に消費され、Rf  0.4に新しい１つのスポットを生成した（シリカゲルGF、250μｍ、1:9:90  水酸化アンモニウム：メタノール：クロロホルム）。残っている水素化物をクエンチするために、0.65mLの水を撹拌しながら加え、次いで、0.65mLの15％水酸化ナトリウム（sodium  hydroxide）水溶液、次いで1.95mLの水を加えた。白色沈澱物を濾過し、そして100mLのジエチルエーテルで洗浄した。このエーテルを硫酸ナトリウム（sodium  sulfate）で乾燥し、温和な加熱のみでロータリーエバポレーターでエバポレートした。提示された構造と一致する分光学的性質を有する、無色透明の液体を得た（9.05mmol、収率81％）。
【００４７】
PDC  008.004、5:スターラーバーを入れた500mLの丸底フラスコに、4.41mmolの２、7.06mmolの４、7.06mmolの炭酸ナトリウムおよび170mLのアセトニトリル（acetonitrile）を加えた。２の全ては、25℃では溶解しなかった。加熱（90℃）して還流すると、全ての固形物が溶解する。22時間後、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルGF、250μｍ、1:9:90  水酸化アンモニウム：メタノール：クロロホルム）によって、２（Rf  0.5、紫外線およびヨウ素活性）が完全に消費され、Rf  0.2に新しいスポットが生成する（紫外線およびヨウ素活性）ことが示される。いくつかの未反応の４（Rf  0.4、ヨウ素活性）は、まだ存在している。溶液を室温まで冷却すると、白色固体が、アセトニトリルから沈澱する。炭酸ナトリウムを濾過し、そしてアセトニトリルで洗浄する。この溶媒をエバポレートし、そしてアセトニトリルから再結晶して、融点208℃〜209℃を有する白色針状様結晶を得る（3.77mmol、収率86％）。この物質は、提示された構造と一致する分光学的性質を有していた。１−オクタノール（１−octanol）中、285nmでの吸光係数は、8199±616M-1cm-1である。１−オクタノールと0.1M  ホスフェート（phosphate）との分配係数（log  Ｐ）は、0.78±0.18である。11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン塩酸塩（11−［［［２−（diethylamino）ethyl］cyclohexylmethylamino］−acetyl］−5,11−dihydro−6H−pyrido［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one  hydrochloride  salt）、6:化合物５（1.29mmol）を、溶液のpHを２未満になるまで無水塩化水素で飽和させた無水エタノール（約10mL）に、溶解することによって、その塩酸塩に転換した。この塩は、100mLの無水ジエチルエーテルを沸騰エタノール溶液に加えることによって結晶化された。形成された白色粉末固体を、濾過し、そして50mLのエーテルで２回洗浄した。この手順を繰り返し、そして白色微細粉末を得た（1.22mmol、収率94％）。この粉末は、融解するまえに、190℃で分解した。白色固体は、提示された構造と一致する物理的性質および分光学的性質を有していた。0.1Mホスフェート中の281nmでの吸光係数は、9060M-1cm-1である。0.1M  ホスフェートと１−オクタノールとの分配係数（log  Ｐ）は、0.16である。
【００４８】
（b.関連化合物の合成）
11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン（11−［［［２−（Diethylamino）ethyl］amino］−acetyl］−5,11−dihydro−6H−pyrido［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one）、7:N,N−ジエチルエチレンジアミン（N,N−diethylethylenediamine）（10.7mmol）および２（3.52mmol）を、炭酸ナトリウム（5.22mmol）およびスターラーバーを入れた200mLのアセトニトリルに溶解した。混合物を、95℃で18時間還流した。薄層クロマトグラフィー（シリカゲルGF、250μｍ、1:9:90  水酸化アンモニウム：メタノール：クロロホルム）によって、２（Rf  0.55、UVおよびヨウ素活性）がほとんど完全に消費され、いくらかのN,N−ジエチルエチレンジアミン（Rf  0.1、ヨウ素活性）およびRf  0.45に新しい主要スポット（UVおよびヨウ素活性）が存在することが示された。固形物を反応混合物から濾過し、アセトニトリルで洗浄した。この溶媒を、エバポレートし、そして残渣を酢酸エチルおよび10％重炭酸ナトリウム水溶液に溶解した。125mLの酢酸エチル溶液を、10％重炭酸塩水溶液50mLづつで３回洗浄した。重炭酸塩水溶液を、酢酸エチル（75mL）で逆抽出し、有機相を合わせて、そして100mLの蒸留水で洗浄した。この酢酸エチル溶液を、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして溶媒をエバポレートした。得られた残渣を、エタノールおよび水から再結晶して、融点96℃〜97℃を有するオフホワイトの固体を得た（0.206mmol、収率６％）。物理的性質および分光学的性質は、提示された構造と一致した。
【００４９】
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホンアミド（Ｎ−［２−（diethylamino）ethyl］−５−dimethylamino−１−naphthalene  sulfonamide）、8:5−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニルクロライド（５−dimethylamino−１−napthalenesulfonylchloride）（DANSYLクロライド）（0.56mmol）を、25℃で撹拌しながら5mLのアセトンに溶解した。無水炭酸カリウム（0.56mmol）を一度に加え、そしてN,N−ジエチルエチレンジアミン（0.43mmol）の3mLアセトン溶液を、添加漏斗から５分間かけて添加した。26℃で18時間の後、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルGF、250μｍ、1:9:90  水酸化アンモニウム：メタノール：クロロホルム）は、いくらかのN,N−ジエチルエチレンジアミン（Rf  0.25、ヨウ素活性）、およびいくらかのDANSYLクロライド（Rf  0.0、UV活性）、およびRf  0.65に主要な新しい蛍光黄色スポット（ヨウ素活性およびUV）を示した。固形物を濾過し、アセトンで洗浄し、そしてこのアセトンをエバポレートした。Rf  0.65での蛍光スポットを、分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧ、1000μｍ、1:9:90  水酸化アンモニウム：メタノール：クロロホルム）によって単離した。Rf  0.45〜0.65の最大のバンドを、250mLの酢酸エチルでシリカから取り出した。この酢酸エチルを、100mLの水で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒をエバポレートして、黄緑フィルムを得た（0.210mmol、収率49％）。このフィルムは、提示された構造と一致するプロトンNMRスペクトルを有していた。
【００５０】
（c.第２世代M2リガンド）
第２世代M2リガンドは、上記に記載された一般構造を有する。第１世代リガンドのように、これらは、アセチル基を介して、アミン含有側鎖に結合される三環式芳香環系を有する。しかし、小さい脂肪族環が、末端アミンと芳香族１との間の側鎖に取り込まれている。リンカーのアミドおよびアミン官能性は、鎖の長さならびに物理的性質および化学的性質が異なる広範な種々のリンカーを、容易に合成し得るように選択された。所望ならば、末端アミンの性質もまた、変えられ得る。
【００５１】
側鎖の合成は、表１に示される容易に入手できる開始物質（Aldrich  Chemical  Co.、Inc.、Milwaukee、WI）から、数工程で達成され得る。これらの前駆体は、合成において使用可能な、広範な種々の選択を示しているだけであって、これらは、完全なリストとして受け取られるべきではない。側鎖の種々の構成物を互いにカップリングする方法は、当業者に公知である。
【００５２】
【表１】
0003638950.tif 000006
【００５３】
環系は、保護または非保護形態の置換ピペリジン（piperidine）またはピペラジン（piperazine）に由来し得る。リンカーは、例えば、種々の長さのジエチルアミノアルカン酸（diethyl  amino  alkanoic  acid）、N,N−ジアルキルジアミン（N,N−dialkyl  diamine）またはN,N−ジアルキルアルキルクロライド（N,N−dialkyl  alkylchloride）から使用可能である。上記の場合には、これらはまた末端アミンを組み入れ、そしてこれらは、R1の限定的な選択（例えばエチル、メチルなど）において使用可能である。さらなるフレキシビリティーのために、クロロアルキル酸クロライド（chloroalkyl  acid  chloride）によって鎖長を変化させる手段が提供され、所望の二級アミンが他の工程で付加される。広範囲な二級アミンが入手可能なので、このルートは興味深い。多様なアルキル基およびアリール基が、酸クロライド（acid  chloride）、スルホニルクロライド（sulfonyl  chloride）、アルキルハライド（alkyl  halide）、イソシアネート（isocyanate）、およびイソチオシアネート（isothiocyanate）として容易に入手可能であり、これらは容易に付加し、そしてリガンドの特性を変化させ得る。このような活性基の付加によって達成され得る所望の特性を以下に例示するが、これらに限定されない：蛍光を発する能力、放射活性同位体の存在、極性の変化、不可逆的リガンド結合のための活性基（光親和性ラベル化）、およびNMRイメージングのためのフッ素含有置換基。
【００５４】
（合成）
図３は、イソニペコチン酸（isonipecotic  acid）９（Aldrich  Chemical  Co.,Inc.,Milwaukee,WI）から出発する第２世代M2リガンドの合成を示す。アミノ官能基を保護し、酸を求核付加のために活性化し、第１世代化合物のために生成された二級アミン（例えば４）と反応させ、脱保護し、そして三環式芳香族の塩化アセチル（acetyl  chloride）誘導体２と反応させて、所望の化合物を得る。
【００５５】
１−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジンカルボン酸（１−benzyloxycarbonyl−４−piperidinecarboxylic  acid）、10:化合物10は、Chemistry  of  the  Amino  Acids,第２巻,John  Wiley  and  Sons,Inc.,891−895頁（New  York  1961）の手順を用いて、イソニペコチン酸９から調製された。イソニペコチン酸（7.74mmol）を10％重炭酸ナトリウム水溶液16mL（19.3mmol）中に、撹拌しながら溶解した。ベンジルクロロホルメート（benzylchloroformate）（8.52mmol）を５回に分けて30分間かけて添加した。ベンジルクロロホルメートと水溶液とを効果的に混合するために、反応混合物を激しく撹拌した。混合物を25℃で18時間撹拌し、この時点で、雲状の白色固体を溶解するために水10mLを加えた。この水溶液をジエチルエーテル（diethyl  ether）50mLで洗い、5Nの塩酸でpH3に中和し、そして酢酸エチル（ethyl  acetate）30mLづつで２回洗った。酢酸エチルを硫酸ナトリウム（sodium  sulfate）で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして、透明な無色の粘稠なオイルを得た（7.6mmol、収率98％）。薄層クロマトグラフィー（シリカゲルGF、250μｍ、１−ブタノール（１−buranol）：酢酸（acetic  acid）：水（4:1:1））によって、出発物質（Rf  0.25、UV活性）は存在しないことが示され、そしてRf  0.85にUV活性でかつヨウ素活性のスポット１つのみが示された。このオイルの物理的性質および分光学的性質は提示された構造と一致する。
【００５６】
４−ニトロフェニル−１−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジンカルボキシレート（４−nitrophenyl−１−benzyloxycarbonyl−４−piperidinecarboxylate）、11:化合物11は、Sakahibara,S.およびInnhai,N.,Bull,Chim,Soc.Jpn.,37:1231−1232（1964）に記載の、４−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（４−nitrophenyl  trifluoroacetate）を用いる手順を用いて10から生成された。化合物10（5.7mmol）を、ピリジン4mLに撹拌しながら溶解した。４−ニトロフェニルトリフルオロアセテート（5.7mmol）を加えると、黄色に発色した。反応混合物を25℃で20時間撹拌し、この時点で、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルGF、250μｍ、水酸化アンモニウム（ammonium  hydroxide）：メタノール：水（1:9:90））によって、出発物質10（Rf  0.1、UV活性かつヨウ素活性）はほぼ完全に消費され、Rf  0.9にUV活性かつヨウ素活性の新しい主要スポットを生じたことが示された。この反応混合物をジエチルエーテル150mLに溶解し、そして10％硫酸銅（copper  sulfate）水溶液150mLづつで２回洗ってピリジンを除去し、10％重炭酸ナトリウム水溶液100mLづつで８回洗って４−ニトロフェノールを除去し、そして水100mLづつで２回洗った。ジエチルエーテルをエバポレートすると、透明な無色のオイルが残り、これは−20℃の冷凍庫で冷却するとオフホワイトの固体を形成した。この試料をヘキサンおよび酢酸エチルから再結晶した。この物理的性質および分光学的性質は同定された構造と一致した。
【００５７】
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−Ｎ−シクロヘキサンメチル１−ベンジルオキシカルボニル−４−ピペリジンカルボキサミド（Ｎ−［２−（diethylamino）ethyl］−Ｎ−cyclohexanemethyl  １−benzyloxycarbonyl−４−piperidinecarboxamide）、12:化合物12は、Glass,J.G.およびPelzig,M.Int.J.Peptide  Protein  Res.,12:75−80（1978）に記載のように、４を、活性化したエステル11と、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−hydroxybenzotriazole）の存在下で、反応させることによって調製された。化合物４（1mmol）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾン（１−hydroxybenzotriazone）（1mmol）との1mLジメチルホルムアミド（dimethylformamide）溶液に、ニトロフェニルエステル11（1mmol）を加えた。25℃、１時間の後、この反応をジエチルエーテル10mLで希釈した。形成した沈澱をジエチルエーテル、冷水で洗い、そして熱水に溶解した。室温で放置し、冷却すると、オフホワイトの固体が形成された。物理的性質および分光学的性質は提示された構造と一致した。
【００５８】
Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−Ｎ−シクロヘキサンメチル４−ピペリジンカルボキサミド（Ｎ−［２−（diethylamino）ethyl］−Ｎ−cyclohexanemethyl  ４−piperidine  carboxamide）、13:ピペリジンを保護するベンジルオキシカルボニルの脱保護を、トリメチルシリルヨウ素（trimethylsilyl  iodine）（TMSI）を使用し、Lott,R.S.,ら,J.C.S.Chem.Commun.,495−496（1979）の方法を用いて行った。12（0.1mmol）の1mLクロロホルム溶液に、乾燥したガスタイトシリンジを用いてTMSI（0.12mmol）を加えた。この溶液を50℃まで10分間加熱し、この時点で、シリンジを用いてメタノール（0.4mmol）を加え、反応をクエンチした。反応混合物を室温まで冷却し、溶媒をエバポレートし、そして残渣を酢酸エチルおよびヘキサンから再結晶するとオフホワイトの固体を得た。物理的性質および分光学的性質は、提示された構造と一致した。
【００５９】
11−［［Ｎ−（ジエチルアミノ）エチル］−Ｎ−シクロヘキサンメチル１−ピペリジン−４−カルボキサミド］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン（11−［［Ｎ−（diethylamino）ethyl］−Ｎ−cyclohexanemethyl  １−piperidine−４−carboxamido］−acetyl］−5,11−dihydro−6H−pyrido［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one）、14:13（1.6mmol）の40mLアセトニトリル（acetonitrile）溶液に、２（1.0mmol）および炭酸ナトリウム（sodium  carbonate）（1.6mmol）を加えた。溶液を18時間、加熱して、還流させた。溶液を室温に冷却し、固体を濾過し、そしてアセトニトリルで洗浄し、溶媒をエバポレートした。オフホワイトの固体をアセトニトリルから再結晶した。得られた白色の薄片状固体の物理的性質および分光学的性質は提示された構造と一致した。
【００６０】
以下の化合物を、上記の方法と同様にして合成した。
【００６１】
【化９】
0003638950.tif 000007
【００６２】
（実施例2:11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン（11−［［［２−（diethylamino）ethyl］cyclohexylmethylamino］−acetyl］−5,11−dihydro−6H−pyrido［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one）（PDC008.004）の多段バッチの物理的および化学的特徴付け）
合成バッチのスケールアップにおける純度を測定するために、最初の測定として薄層クロマトグラフィーおよび融点を用いる。次に、構造および純度を確認するためにプロトンNMRおよびHPLCを用いる。
【００６３】
1.PDC008.004、バッチPDC020.031の核磁気共鳴スペクトル
【００６４】
【化１０】
（1H NMR,CDCl3,ppm）:8.35（1H）,7.95（d,1H）,7.60（m,4H）,7.45（t,1H）,7.3（dd,1H）,3.5（m,2H）,2.60（t,2H）,2.50（q,4H）,2.40（m,2H）,2.30（d,2H）,1.60（dd,4H）,1.25（m,1H）,1.10（m,4H）,0.95（t,6H）0.70（m,2H）
【００６５】
バッチPDC008.004、PDC015.091、PDC020.005、およびPDC020.011からのスペクトルは同一である。
【００６６】
2.PDC008.004、バッチPDC020.031の質量スペクトル法：この化合物は揮発性が低いので、化学イオン化および電子衝撃質量スペクトルを得るために、プローブの直接導入を用いた。陽イオンによる化学イオン化の検出により464.43m/z比（MH＋）に強いピークが示され、377.32m/z比および212.17m/z比にフラグメントが示された。電子衝撃により、分子イオンが463m/z比に示され、フラグメントが377.211m/z比に示され、そしてベースピークが86m/z比に示された。PDC008.004の分子量計算値は463.63g/モルである。
【００６７】
3.PDC008.004の紫外線吸収スペクトル：この化合物は、１−オクタノール（１−octanol）中、190nmから250nmに強い吸収を有し、285nmにショルダーを有する。１−オクタノール中での、285nmにおける吸光係数は8199±616M-1cm-1である（バッチPDC008.034、PDC008.055、およびPDC020.023の平均）。
【００６８】
4.PDC008.004のいくつかの合成バッチの融点：アセトニトリルまたはエタノールおよび水からの再結晶により白色の薄片を得る。各々の融点は206〜207℃（１つのバッチ）、および208〜209℃（４つのバッチ）の範囲であった。
【００６９】
5.PDC008.004の薄層クロマトグラフィー：シリカゲルGF（蛍光）（250マイクロメートル）上で、溶離に水酸化アンモニウム／メタノール／クロロホルム（1:9:90）を使用し、UVまたはヨウ素で可視化したPDC008.004の保持係数は0.2である。
【００７０】
6.PDC008.004の高速液体クロマトグラフィー:PDC008.004は8.4分で溶出し、285nmで可視化される。標準的な条件は、水中のメタノール50％から100％（テトラヒドロフラン１％およびトリエチルアミン１％含む）までのグラジエント溶離であり、流速2mL/分の直線グラジエントで、10cmのC18カラムを用いる。
【００７１】
7.PDC008.004の分配係数:log  Ｐは0.78±0.18と測定された。平衡化を、23℃でPDC008.004を１−オクタノール中に溶解（0.01〜0.1mM）し、そして等容量の0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.4）と共に、１時間と24時間との間で、撹拌することによって行った。分配係数は、濃度または平衡化時間とは無関係である。
【００７２】
（実施例3:11−［［［２（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン（PDC008.004）の生化学的薬理学）
PDC008.004による、ラットの脳におけるM2レセプターへの［3H］AF−DX−384の結合の阻害を研究した結果、図５に示すようにKiは422nmであった。これらの結果は、この化合物がnMの範囲でM2レセプターへの親和性を有することを示している。このように、nMの範囲で親和性を有する化合物が、最も治療効果を有しているようである。
【００７３】
脳中での濃度を測定するために高速液体クロマトグラフィーを用い、そしてPDC008.004が実際に存在していることを確認するために質量スペクトルを用いた。
【００７４】
脳の抽出手順:10mg/kgと30mg/kgとの間のPDC008.004を、I.P.およびP.O.ルートの投与でラットに注入し、60分後に屠殺した。脳を取り出し、そして1mLのPBS中でホモジナイズした後、4mLの塩化メチレン（methylene  chloride）で抽出した。アルゴン気流下で、有機層をエバポレートし、そして試料を200マイクロリットルのメタノール中で再構成した。試料を、使用するまで−20℃で凍結した。
【００７５】
高速液体クロマトグラフィーを用いて、濃度既知のスパイクした脳組織試料と比較すると、脳中の濃度は約２μＭである。使用したHPLCの条件は上記と同様であった。
【００７６】
化学イオン化質量スペクトル法による質量464（MH＋）の選択されたイオンのモニタリングによって、PDC008.004が実際に脳組織試料中に１μＭと10μＭとの間の濃度で存在することが示された。
【００７７】
（実施例4:11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オンの特異性および選択性の研究：種々の組織中における放射性リガンドの結合の阻害）
前記のように組織を調製し、そして結合アッセイを行った。表２に示す放射性リガンドの存在下、PDC008.004の濃度を変化させて、膜をアッセイした。値（特異的結合％の平均）は、式Ki＝IC50/1＋［Ｌ］/KDを用いて算出した。山の傾きは1.0に近く、このことは一様性を示し、そして結合が１つの母集団の部位に対して生じることを示している。PDC008.004による放射性リガンドの結合の阻害についてKi値を確立し得ず、従って、Kiは示された濃度よりも高かった。PDC008.004による［3H］ピレンゼピン（pirenzepine）のM1部位への結合の阻害についてのKiは、溶媒コントロールによって測定されたように、部分的に溶媒の相互作用に依存することが観察された。［3H］QNB結合を、10μＭのAF−DX384（添加）の存在下で行った。データの解析はGraphPad（ISS  Software）を用いて行った。これらのデータは明らかに、M2レセプターサブタイプについての特異性および選択性を示している。
【００７８】
【表２】
0003638950.tif 000008
【００７９】
（実施例5:11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オンのm2−CHO細胞におけるカルバコール媒介cAMP減少に対する効果。）
m2−ムスカリン様のレセプター（m2−Muscarinic  receptor）は、アデニラートシクラーゼ（Adenylate  cyclase）と負に結合することは周知であるので、このレセプターを刺激すると、この酵素を阻害することになる。この効果は、アトロピン（atropine）等の古典的なムスカリン様アンタゴニストで阻止され得る。アデニラートシクラーゼは細胞内ATPをcAMPに変換する。アデニラートシクラーゼのムスカリン様のレセプター媒介阻害の測定の１つの方法は、細胞内cAMPレベルの減少結果を測定することである。しかし、最初それらのレベルは低いので、cAMPレベルを上昇させ得る、例えば、フォルスコリン（forskolin）でアデニラートシクラーゼを先ず刺激し、それからcAMPレベルのその後の減少を観察する方が簡単である。
【００８０】
次の実験は、PDC008.004が、m2でトランスフェクトされたCHO細胞におけるcAMPのレベルのカルバコール媒介阻害を阻止することにおいて、ムスカリン様アンタゴニストのように作用するかどうかを決定するように設計された。
【００８１】
（方法）
m2ムスカリン様のレセプターでトランスフェクトされたCHO細胞は、Dr.Mark  Brann（バーモント大学）から得、24−ウェルプレートにおいて90％の集密度まで成長させた。細胞内cAMPは代謝されるので、細胞は、DMEM−HEPES  pH7.2において1mM  IBMX（ホスホジエステラーゼインヒビター）で予め処理された。それから、アンタゴニスト（AQ−RA  741またはPDC008.004のどちらか）およびアゴニスト（５μＭカルバコール）が添加され、10分間プレインキュベートされ、次いで、アデニラートシンクラーゼを、１μＭフォルスコリンで活性化した。37℃で10分後、反応を停止し、そして環状ヌクレオチドを抽出し、RIAによってcAMPをアッセイした。
【００８２】
（結果）
m2でトランスフェクトされたCHO細胞をカルバコール刺激すると、細胞内cAMPレベルが約50％阻害された。基準cAMP値はcAMPの5.4±0.1pmolであった。この阻害は、アトロピン（atropine）（１μＭ）およびAQ−RA  741（１μＭ）によって完全に阻止された。AQ−RA  741およびPDC008.004の用量応答曲線における、IC50値はそれぞれ0.17μＭおよび5.2μＭであった。PDC008.004のIC50値は、３つの別個の実験において、平均3.7±1.0μＭであった。カルバコールがなく、10μＭのPDC008.004で処理された細胞は、未処理の細胞と区別不可能なcAMPレベル（4.9±0.5pmol）を有し、従って、PDC008.004は、アゴニスト活性を有していなかったことを示す。
【００８３】
（結論）
PDC008.004は、m2でトランスフェクトされたCHO細胞におけるカルバコール媒介cAMP減少の阻害に対して3.7±1.0μＭのIC50を有するm2−ムスカリン様アンタゴニストである。同アッセイにおいて、ムスカリン様アンタゴニストAQ−RA  741は、0.17μＭのIC50を有する。PDC008.004は、検出可能なムスカリン様アゴニスト活性を有していない。
【００８４】
（実施例6:11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オンの、ラットの脳におけるアセチルコリン（acetylcholine）放出の調節物質としての効果）
脳におけるインビトロおよびインビボ研究は、アセチルコリン（ACh）の放出を制御している負のムスカリン様の自己レセプターが、優勢的に、薬理学的M2サブタイプ（分子的に定義されたm2およびM4サブタイプを含む）であるということを示唆してきた。証拠は主に、例えば、Lapchakら、1989、［3H］AF−DX  116の結合部位およびラットの脳スライスからの内生的なアセチルコリン（「ACh」）放出に対するAF−DX  116の効果、Brain  Res.、496、285−294;およびQuirionら、1993、自由に動いている成熟ラットにおけるインビボ顕微透析によりモニターされる皮質性アセチルコリン放出のムスカリン様およびニコチン様調節、Synapseに記載のように、AF−DXシリーズの選択的M2レセプターアンタゴニスト対M1ブロッカーを用いる実験から得られる。このように、ムスカリン様アゴニストはACh放出を阻害し、一方でM2アンタゴニストはそれを促進する。
【００８５】
この研究の目的は、ラットの海馬の脳スライスにおけるインビトロACh放出に対するPDC008.004の効果を調べることであった。得られたデータを、典型的M2ブロッカーであるAF−DX  116（Lapchak）のデータと比較した。
【００８６】
（材料および方法）
成熟ラットの海馬スライスからのインビトロACh放出を、Hanishら、1993、海馬のアセチルコリン放出の調節：インターロイキン２（interleukin−２）の強力な中枢作用、J.Neurosci、13、3368−3374に記載されているように調べた。要するに、成熟ラット海馬スライス（0.4mm）を調製し、ブランデル（Brandel）過融解装置を用いて、通常クレブス（pH7.4）中で１時間過融解し、続いて、さらに１時間、PDC008.004（10-9M〜10-4M）を含む、または含まない25mM  K+クレブス緩衝液（pH7.4）中で過融解した。次いで、過融解物を集め、抽出し、それから、放射酵素法を用いてアセチルコリンを分析した。データを、スプレッドシートソフトウェア（Spreadsheet  Software）Lotus1−２−３を用いて分析した。
【００８７】
（結果）
PDC008.004は、図６に示すように、μＭ濃度においてACh放出を有意に刺激したが、より低濃度では統計的に有意な効果を示さなかった。ACh放出に対する最大の効果は、10-5Mで観察され、10-4Mにおいて、いくらか低い効力が見られた。同じく図６に示すように、AF−DX  116を用いても同様の結果が得られた。PDC008.004の最大の効果は、AF−DX  116の効果よりわずかに大きかった（コントロールに対して189対152％）。
【００８８】
データを、６分間にわたる時間の関数として表す場合、PDC008.004は、一過的に（最初の20分間）、nM濃度でACh放出を阻害したことが見られ得る（表３）。この効果は、60分間の間に消滅した。
【００８９】
（議論）
これらのデータから、PDC008.004が、ラットの脳のおいて、負のM2自己レセプターの強力なアンタゴニストとして作用することが明らかである。実際、この分子は、典型的M2ブロッカーであるAF−DX  116よりも、ACh放出を促進することにおいて、わずかに強力である。従って、PDC008.004は、このモデルにおいてこれまで試験された分子の中で最も強力なものの１つである。nM濃度において検出された一過的な阻害作用の意義は、現時点においては不明である。それは、m2レセプター対m4レセプターに対するPDC008.004の異なる親和性に関連し得る。両者とも、自己レセプターとして作用するが、ACh放出に対して反対の効果を有する。
【００９０】
【表３】
0003638950.tif 000009
【００９１】
（実施例7:11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オンの毒性研究）
PDC008.004の様々な用量の、PDC008.004を累積的な用量（0.1〜31.1mg/kg）を与えられた雄のSprague−Dawleyラットの心拍数に与える効果を、心拍数を各投与後約15分のEKGにより評価することによって測定した。コントロール動物は、同容積の媒体（Emulphor:生理食塩水:DMSO、18:72:10％）、または二酒石酸（−）ノルエピネフリン（ラット当たり1mg）が与えられた。
【００９２】
結果を図７に示す。これらのデータは、PDC008.004が、媒体コントロールに比べて、心拍数を大きく変えなかったことを示している。二酒石酸（−）ノルエピネフリンの投与は媒体コントロールより心拍数を43％有意に増加させた。
【００９３】
（実施例8:水迷路行動研究における11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オンの評価）
以下の手順は、当業者によって日常的に用いられている標準技術（Morris,R.G.M.、1981）である。
【００９４】
（材料）
1.動物
雄C57BL/6マウス、体重30g。最低数50匹。The  Jackson  Laboratories、Bar  Harbor、Rt.3、Maine  04609より入手可能。CL−１マウスも用いられ、同様の結果を得た。
【００９５】
動物は、実験前にコロニーに対する順化に少なくとも１週間を必要とする。ハウジング：標準環境、しかしできるだけ静かな環境。
2.装置
2A.水槽および付属物；
頑丈な（最低10mm厚）黒色（または非常に暗く、不透明）のルーサイトまたは、他のプラスチックからなる円形水槽。水槽の直径:1メートル；壁高:509cm。水槽は、大きな直径（最低内径1.5cm）の水充填／排水ゴムホース（最低長さ10フィート）に接続されているバルブを有する必要がある。
2B.ターゲット：
水槽と同じプラスチックからなるもの（「黒ターゲット」）、および半透明の種類からなるものの、２つのターゲット。一辺10インチの正方形として成形された重いルーサイト（１インチ厚）からなるベース。ベースの上面とターゲット台の下面との間の高さ:20cm。ターゲット台支柱：高さ20cm、環状ロッド（直径１インチ）。円形ターゲット台、直径8cm、0.5cm厚のプラスチックからなり、（ターゲットによって）黒または白のどちらかの色を塗ったノンスキッド材料（外科用テープを使用し得る）で覆われている。
【００９６】
ターゲットキュー（cue）：水槽壁の縁の上にまたは水槽壁の縁から吊るされ、簡単に認識可能な模様が描かれている白いシート。
【００９７】
水槽の水を曇らせるための脱脂粉乳の供給。水槽清掃用品（アルコノックス（Alconox）、スポンジ等）。
2B.データ収集装置
移動可能な台に載ったハードディスクおよび3.5インチフロッピードライブを有する標準パーソナルコンピュータ、モニターおよびキーボード。コンピュータは、この期間中当該研究専用であるべきである。
【００９８】
WATERMAZcデータ収集プログラムInfallible  Software,Inc.、Durham、N.C.）。
【００９９】
統計ソフトウエア。
3.環境
水槽を、流しならびに温水および冷水の両方の蛇口の近くの場所に置いた。水槽は、両方面から近づくことができた。この場所は、施錠可能なドア、および明かるすぎない蛍光性天井照明を有する静閑な孤立した部屋に備えられた。部屋は、約22℃の一定の温度を有した。
4.方法
4A.試験方法（Regimen）：
試験方法［Ａ］は、薬または生理食塩水のいずれかの注入および水泳の同時発生からなる。注入−24時間−水泳−２時間−注入−24時間−水泳−２時間−注入・・・等の順序で、コントロールにおいて安定した「ターゲットへの時間」がプラトーに達するまで注入投与した。所望であれば、この試験方法を、さらに５〜７日間延長し、処理された群のデータがコントロールに関して最終的に変わるかどうか観察し得る。
【０１００】
試験方法［Ｂ］は、生理食塩水または薬を注入した動物からなり、水泳の前に７日間試薬を投与し、次いで１日注入を中断し（洗浄期間）、そして安定的なコントロールプラトーに達するまでターゲットへの訓練を行う。
【０１０１】
マウスは、割合すぐに疲れる。従って、絶対に必要でなければ、「大量試験」（すなわち、１日に１回以上の試験）は、身体的ストレス要因を偶然引き起こし得るので、勧めない。１日１回の試験は問題ない。
【０１０２】
１群当たり10匹の動物が、十分高い統計的信頼性を提供する。しかし、１日当たり40匹の動物（すなわち、４群）より多くの訓練は、水槽に新鮮な水を入れるために必要な中断、注入順序の問題、および結果的に統計分析の効率を低下させる大量の生成データ（プログラムのなかには、そのような大量のデータエントリーを受容し得ないものもある）のために、実用的ではない。
実験のコースおよび収集データ：
実験を、次の順序で行った。水中のターゲットへの時間（７日）−自由水泳［ターゲット除去（１日）］−水中ターゲットへの時間（７日）−自由水泳（１日）・・・等（プラトーまで）−裏向きターゲット［新たな位置のターゲット（プラトーになるまで、代表的には３〜５日］−可視（黒ターゲット、プラトーになるまで）。ターゲットへの許容最長時間:120秒。
自由水泳中、水槽での最長時間:60秒。
データ：ターゲットまでの時間
四分円選択（時間／四分円）
非移動性
中心通過の数
運動のパターン
（結果）
結果を図８および図９に示す。結果は、10mg/kgの媒体で腹腔内に処理した10匹のコントロール動物、および10mg/kgのPDC008.004で腹腔内に処理した10匹の動物に対するものである。図９は、薬物（11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン）で処理したマウスにおける、サイグモタクティック（壁にしがみつくこと）から中心通過へのすばやい移動および中心通過ゴール指向行動からなる、実質的および有意な（ｐ＜0.01）移動パターンを示す。この行動は、薬物を（10mg/kg、腹腔内に）１回注入し、24時間おいて行動試験を行った時見られた増加した運動活動と一致している。コントロール群において、サイグモタキシーからサイグモタキシー／中心通過までのゆっくりした移動は明らかであるが、壁へのしがみつきが優勢的である。コントロール動物の行動は、幾つかの先行の研究で観察された生理食塩水注入動物の行動と一致している。Morris,R.G.M.、Learning  and  Motivation、1981。
【０１０３】
図10は、PDC008.004を（10mg/kg、腹腔内に）毎日注入処理したマウスを用いて４回目の試験の後、隠したターゲットを見つけるのに必要な時間における、実質的な統計的に有意な（ｐ＜0.05）減少を示す。
【０１０４】
これらの結果は、観察された効果が、投与した試薬であるPDC008.004（10mg/kg、腹腔内に、毎日）によるM2レセプターの中枢効果に直接関係することを示している。さらに、100mg/kgの薬物を腹腔内に注入した動物で観察された運動異常症、運動失調症の存在、および弛緩麻痺の不在が、この結論を裏付けている。行動の前兆（運動異常症および中枢コリン作動性媒介事象）の非常に速い発現（最大２分）が、大脳内の空間へのすばやい浸透を示している。
【０１０５】
さらに研究が行われ、２つの異なった系統のマウス、C57BL/6、およびCL−１において同様の結果が得られたことを示す。これらの結果を表４に示す。
【０１０６】
【表４】
0003638950.tif 000010
【０１０７】
Morris水迷路行動モデルを用いた終了した予備結果は、約５〜10mg/kg（I.P.およびP.O.）の有効な用量を示した。これらのデータに基づくと、TI（治療指数）は、I.P.およびP.O.投与が、それぞれ、7.5と10との間である。他の研究は、PDC008.004の有効用量が、5mg/kg未満であり得、相応じてよりよりTIを有することを示す。
【０１０８】
結論として、４回の行動試験の間に得られた結果は、認識プロセスがひどく冒されるような急性および慢性疾患において、試薬、PDC008.004およびその関連化合物の潜在的治療応用を示す。このような疾患の例には、卒中、（心停止後の）大脳虚血、アルツハイマーおよび高齢による関連疾患（すなわち、老年痴呆）、パーキンソン病、ハンチントン病、慢性中毒障害（すなわち、アルコール症）、ならびに、脳の炎症性疾患（すなわち、髄膜炎）等がある。新生児低酸素症および関連の認識欠損（cognitive  deficits）もまた、このような治療に敏感に反応し得る。
【０１０９】
本発明の改変および変更は、上記の詳細な記述から当業者にとって自明である。このような改変および変更は、添付の請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ムスカリン様２アンタゴニスト化合物に対する３環式（tricyclic）芳香族前駆体である。
【図２】図2A、2B、および2Cは、ムスカリン様２アンタゴニスト化合物の合成に用いられる第２アミンの合成のための３つの経路の略図である。図2Aは、酸クロライド＋ジアミンを用い、その後還元する。図2Bは、アミン＋ジアルキルアミノ酸（dialkylamino  acid）を用い、その後還元する。図2Cは、アミン＋クロロアルキル酸クロライド（chloroalkylacid  chloride）、次いで第２アミンを用い、その後還元する。
【図３】図３は、第２世代ムスカリン様２化合物の合成の略図である。
【図４】図４は、11−［［［２−（ジエチルアミノ）エチル］シクロヘキシルメチルアミノ］−アセチル］−5,11−ジヒドロ−6H−ピリド−［2,3−ｂ］［1,4］−ベンゾジアゼピン−６−オン）（11−［［［２−（diethylamino）ethyl］cyclohexylmethylamino］−acetyl］−5,11−dihydro−6H−pyrido［2,3−ｂ］［1,4］−benzodiazepin−６−one）（本明細書中では「PDC008.004」という）の合成の１つの実施態様を示すものである。
【図５】図５は、ラットの脳における［3H］AF−DX−384のM2レセプターへの結合のPDC008.004による阻害を、nMでの［PDC008.004］の対数に対する特異的［3H］AFDX384結合％で測定したグラフである。
【図６】図６は、誘発された海馬アセチルコリン放出に対するPDC008.004の用量応答性を、PDC008.004（白い四角）およびAF−DX  116（黒い四角）の濃度（Ｍ）に対するアセチルコリンの放出（コントロールに対するパーセント）で示したグラフである。
【図７】図７は、種々の用量のPDC008.004が、PDC008.004の累積用量（0.1〜31.1mg/kg）を与えられたオスのSprague−Dawleyラットの心拍数に与える影響を、各投薬の約15分後にEKGによって心拍数を評価したグラフである（網かけ棒）。コントロール動物には等量の媒体（Emulphor:生理食塩水:DMSO、18:72:10:％）（黒い棒）、または二酒石酸（−）ノルエピネフリン（（−）norepinephrine  bitartrate）（1mg/ラット）（白い棒）が与えられた。
【図８】図８は、PDC008.004で処理されたマウスと処理されていないマウス（コントロール）の水迷路（watermaze）中の平均運動パターンの変化を示すグラフである。運動のタイプ:1、壁にしがみつく（wall  hug）;2、壁にしがみつく／乗り越える（wall/cross）;3、乗り越える（cross）;4、乗り越える／ゴールする（cross/goal）；および５、ゴールする（goal）。
【図９】図９は、PDC008.004処理されたマウス（網かけ棒）および未処理のマウス（コントロール）（白い棒）の第４回目のトライアル後において、水迷路中のターゲットへの到達時間（秒）を示すグラフである。
【図１０】図10は、コントロール（白丸）およびPDC008.004処理動物（黒丸）について時間（日数）に対するターゲットまでの時間（秒）を示すグラフである。
【図１】
0003638950.tif 000015
【図２】
0003638950.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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