(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被処理物に遺伝物質を埋め込むための噴出部と前記噴出部の少なくとも噴出部と内部に設置された被処理物を真空雰囲気中に保持するための真空槽と、前記噴出部に高圧ガスを圧送し、かつ前記真空槽を真空雰囲気中に保持するためのコントロール部とを具備した植物組織に遺伝物質を導入する装置において、
前記噴出部が、上部ホルダーの一端開口部と下部ホルダーの一端開口部とを組み合わせてなるカートリッジと、前記カートリッジ内に収納され上面から下面にわたって複数の貫通孔が穿孔されたフィルタ状部材とからなり、前記フィルタ状部材は上面に遺伝物質を載せるための半球状の凹部と、上面から下面方向に縮径されて前記フィルタ状部材の周面に形成される大径部と小径部との段差により前記カートリッジ内に係止される手段とを備えるとともに、前記貫通孔が上面の中心から下面の周縁に向かって斜め方向に形成され、上部ホルダーの他端開口部においてコントロール部のガス圧送経路と連絡する接続手段を介して真空槽内部に取り付けられ、下部ホルダーの他端開口部が噴出口を形成しているものであり、フィルタ状部材の上面に載せられた遺伝物質を高圧ガスに直接に曝すことにより、真空雰囲気中に置かれた被処理物に遺伝物質を導入することを特徴とする直接法遺伝子導入装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パーティクルガン法の原理を応用した直接遺伝子導入装置に関し、更に詳しくは、遺伝物質を坦持した金属微粒子を直接高圧ガスに曝すことにより加速して植物組織に物理的に導入し、外因性遺伝物質の植物生殖系内における形質転換を円滑に行う直接遺伝子導入装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、外因性遺伝物質を植物の細胞組織に注入する手段としては、１９８７年にコーネル大のＳａｎｆｏｒｄらのグループによる報告された火薬銃（ショットガン）方式を初めとして、アーク放電方式、窒素ガス圧方式、圧縮空気圧（エアーガン）方式等が提案されている。
【０００３】
これらの方法は一般にパーティクルガン法と総称されており、ＤＮＡをコーティングした金属微粒子に爆発圧等の物理的エネルギーを間接的に付与することを共通の特徴としている。即ち、前記金属微粒子をシートやプロジェクタイルの被処理物（ターゲット）側の面に付着させのち反対面から圧力を印加し、前記シート等を膨張させることにより推進加速し、直ちに前記シート等をストッパーで停止させることにより、金属微粒子を慣性力によりターゲットに衝突させる方式を採用している。そして、このようにして被処理物となる植物組織の内部に前記金属微粒子を埋め込むことにより細胞膜内にＤＮＡを導入し、形質転換を促すものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記従来技術の場合、複数回の使用を行うとき、前記金属微粒子を加速する行程である銃身の内壁面に前回使用時の飛散したＤＮＡが付着したまま残存することが避けられない。このような場合、新たな使用時におけるＤＮＡが残存するＤＮＡにより汚染され、所望の形質転換が円滑になされないという問題がある。また、シートやプロジェクタイルに間接的に圧力を加えるという方式のため、装置構造が複雑化し、価格も高価となる。
【０００５】
そこで本発明は、ＤＮＡ被覆金属微粒子に直接圧力を加える方式を採用することにより上記問題を解決するとともに、被処理物の形質転換作業をより円滑になすことができる直接法遺伝子導入装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するための手段として、被処理物に遺伝物質を埋め込むための噴出部と前記噴出部の少なくとも噴出部と内部に設置された被処理物を真空雰囲気中に保持するための真空槽と、前記噴出部に高圧ガスを圧送し、かつ前記真空槽を真空雰囲気中に保持するためのコントロール部とを具備した植物組織に遺伝物質を導入する装置において、
前記噴出部が、上部ホルダーの一端開口部と下部ホルダーの一端開口部とを組み合わせてなるカートリッジと、前記カートリッジ内に収納され上面から下面にわたって複数の貫通孔が穿孔されたフィルタ状部材とからなり、前記フィルタ状部材は上面に遺伝物質を載せるための半球状の凹部と、上面から下面方向に縮径されて前記フィルタ状部材の周面に形成される大径部と小径部との段差により前記カートリッジ内に係止される手段とを備えるとともに、前記貫通孔が上面の中心から下面の周縁に向かって斜め方向に形成され、上部ホルダーの他端開口部においてコントロール部のガス圧送経路と連絡する接続手段を介して真空槽内部に取り付けられ、下部ホルダーの他端開口部が噴出口を形成しているものであり、フィルタ状部材の上面に載せられた遺伝物質を高圧ガスに直接に曝すことにより、真空雰囲気中に置かれた被処理物に遺伝物質を導入することを特徴とする直接法遺伝子導入装置を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の直接法遺伝子導入装置について説明する。図１は、一部断面図を含む直接法遺伝子導入装置の概略正面図であり；図２は、図１に示す直接法遺伝子導入装置の部分拡大図であり；図３は、略逆円錐台状のフィルタ状部材のカートリッジ内における収納状態を説明するための図であり；図４乃至図７は、略逆円錐台状のフィルタ状部材の一態様を説明するためのもので、順に上面図、下面図、正面図、図５のＡ−Ａ線に沿う部分断面図であり；図８乃至図１１は、略逆円錐台状のフィルタ状部材の他の態様を説明するためのもので、順に上面図、下面図、正面図、図９のＡ−Ａ線に沿う部分断面図であり；図１２乃至図１５は、略逆円錐台状のフィルタ状部材の他の態様を説明するためのもので、順に上面図、下面図、正面図、図１３のＡ−Ａ線に沿う部分断面図であり；図１６乃至図１９は、略円柱状のフィルタ状部材の一態様を説明するためのもので、順に上面図、下面図、正面図、図１７のＡ−Ａ線に沿う部分断面図であり；図２０乃至図２３は、略円柱状のフィルタ状部材の他の態様を説明するためのもので、順に上面図、下面図、正面図、図２１のＡ−Ａ線に沿う部分断面図であり；図２４乃至図２７は、略円柱状のフィルタ状部材の他の態様を説明するためのもので、順に上面図、下面図、正面図、図２５のＡ−Ａ線に沿う部分断面図であり；図２８は、直接法遺伝子導入装置の機能別ブロック構成図であり；図２９は、図２８におけるコントロール部の機能別ブロック構成図である。
【０００８】
図１及び図２に示すように、直接法遺伝子導入装置１は、高圧ガスの噴出により、遺伝物質（ＤＮＡ被覆金属微粒子）を発射するための噴出部１０と、被処理物を真空雰囲気に保持するための真空槽１００と、高圧ガスの噴出条件と真空槽の真空度などを制御するためのコントロール部２００（図２９参照）と電磁弁２３０とからなるものである。本発明においては、これらの構成要素のうちでも特に噴出部に特徴を有するものであるため、まず、噴出部１０について詳細に説明を加え、その後他の構成要素については噴出部１０との関連において説明をするものとする。
【０００９】
噴出部１０は、カートリッジ１１とその内部に収納されたフィルタ状部材５０とからなり、カートリッジ１１は、それぞれの一端側の大径開口部で一体化された上部ホルダー１３と下部ホルダー１４から構成されている。これらの上部ホルダー１３と下部ホルダー１４は螺合等の手段により着脱自在になされている。このようなカートリッジとしては、例えば、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の（ＳＷＩＮＮＥＹ）１３ｍｍＰＬＡＳＴＩＣ ＳＹＲＩＮＧＥ ＦＩＬＴＥＲＨＯＬＤＥＲを用いることができる。
【００１０】
カートリッジ１１は、上部ホルダー１３の他端開口部側において、コントロール部のガス圧送経路に適当な接続手段により連結されている。その接続手段の一例を示すと、真空槽１００の天板１０２の上方から貫入されたフランジ２０と、このフランジ２０に下方から螺合されたコンプレッションユニオン２２と、コンプレッションユニオン２２に下方から螺合されたコンプレッションアジャストメント２４の組み合わせを用いることができる。よって、かかる接続手段を用いた場合には、カートリッジ１１は、上部ホルダー１３の他端開口部側においてコンプレッションアジャストメント２４に連結され、これらの接続手段を介してガス圧送経路に接続されている。なお、ここで上部ホルダー１３の他端側とコンプレッションアジャストメント２４とを螺合又はそれに類した手段により連結することにより、カートリッジ１１を着脱自在にすることができる。カートリッジ１１の下部ホルダー１４の他端側の小径開口部は、ＤＮＡ被覆金属微粒子の噴出口１６となる。
【００１１】
カートリッジ１１内に収納されたフィルタ状部材５０は、ＤＮＡ被覆金属微粒子を載せることができ、かつガス圧を受けて前記金属微粒子を被処理物に発射するための細孔を有しているものである。かかる作用をなすフィルタ状部材としては、図３に示すような硬質円板状のもので、その上面から下面にわたる複数の貫通孔５５を有するものを挙げることができる。ここでいう「硬質」とは、実用時における高圧のガス圧を受けた場合でも変形することがないという意味であり、その意味における硬質であればその材質は特に制限されるものではなく、通常はプラスティック製のフィルタ状部材を用いることができる。また、前記した作用をなすものであれば、フィルタ状部材５０の形状は円板状に限定されるものではなく、平面形状が三角形、四角形、それ以上の多角形等であっても適用することができる。
【００１２】
貫通孔の数は特に制限されるものではなく、ＤＮＡ被覆金属微粒子の１回の使用量に応じて異なる数の貫通孔を有するフィルタ状部材を使い分けることができる。また、貫通孔の径の大きさはＤＮＡ被覆金属微粒子を通過させることができるとともに、発射前の一定時間の間、フィルタ上面にＤＮＡ被覆金属微粒子を載せることができるように調整する。
【００１３】
次に、フィルタ状部材５０の他の複数の変形態様について説明する。図４乃至図７、図８乃至図１１、図１２乃至図１５及び図１６乃至図１９に示すように、フィルタ状部材５０ａ、５０ｂ、５０ｃ及び５０ｄをそれらの正面形状が略逆円錐台状、即ち、逆円錐台に近似した形状にすることができる。なお、これらの略逆円錐台状の各フィルタ状部材はその形状からも明らかであるが、上記の平板状フィルタ状部材と同様に硬質である。
【００１４】
まず、図４乃至図７に示した態様のフィルタ状部材５０ａについて説明する。フィルタ状部材５０ａは、上面５１ａから下面５３ａ方向の所望の位置において段差が形成されるように縮径されていることが好ましい。このように段差をつけることにより、カートリッジ１１内に収納する際、その段差においてフィルタ状部材５０ａを容易に係止することができる（図３参照）。よって、フィルタ状部材５０ａの周面が、大径部の５７ａと小径部の５８ａをなすようにすることが好ましい。フィルタ状部材５０ａの長さ及び径の大きさはカートリッジ１１の大きさとの関連において決定する。
【００１５】
フィルタ状部材５０ａの上面５１ａにはＤＮＡ被覆金属微粒子を載せるための凹部５２ａが形成されている。この凹部５２ａは、通常半球状に形成することができる。
【００１６】
この凹部５２ａと下面５３ａにわたって貫通孔５５ａが形成されている。貫通孔５５ａは１以上であればよく、その数及び径の大きさは図３に示すフィルタ状部材５０と同様に適宜調整することができる。また、この貫通孔５５ａは、ＤＮＡ被覆金属微粒子を放射状に分散発射するため、上面５１ａの中心から下面５３ａの周縁に向かって斜め方向に形成されていることが好ましい。このときの傾斜角度は、前記目的を考慮すれば、中心線（上面５１ａの中心と下面５３ａの中心を結ぶ線。以下において同義で用いる）を基準にすると約１０〜３０度が好ましく、約１５〜２５度が特に好ましい。
【００１７】
周面５６ａには、上面５１ａ周縁部と下面５３ａ周縁部にわたる１以上の溝５９ａが形成されている。その数及び幅の大きさは、貫通孔に準じて適宜調整することができる。また、この溝５９ａは、ＤＮＡ被覆金属微粒子を放射状に分散発射することを補助するため、中心線に対して斜め方向に形成されていることが好ましい。このときの傾斜角度は、前記目的を考慮すれば、中心線を基準にすると約５〜２５度が好ましく、約１０〜２０度が特に好ましい。
【００１８】
貫通孔５５ａと溝５９ａを、いずれか一方が１で他方を２以上形成した場合又はいずれも２以上を形成した場合、良好なＤＮＡ被覆金属微粒子の分散発射をなすという点から、それらの配置関係を均等にすることが好ましい。例えば、図４及び図５に示すように、貫通孔５５ａ及び溝５９ａをいずれも３つ形成した場合、一つの貫通孔５５ａと一つの溝５９ａの計３つの組み合わせのそれぞれが、いずれも上面５１ａ又は下面５３ａの中心点の延長線上に位置するように、即ち、３つの組み合わせの貫通孔５５ａと溝５９ａが１２０度の角度で等間隔になるように配置することが好ましい。
【００１９】
次に、図８乃至図１１に示した態様のフィルタ状部材５０ｂについて説明する。このフィルタ状部材５０ｂの基本的構成はフィルタ状部材５０ａの対応する各要素と同様であるが、フィルタ状部材５０ｂにおいては、３つの貫通孔５５ｂに囲まれた中央部分に一つの貫通孔６０ｂが形成されている。この貫通孔６０ｂの径は、貫通孔５５ｂより小さくなるように設定されており、鉛直方向に形成されている。
【００２０】
次に、図１２乃至図１５に示した態様のフィルタ状部材５０ｃについて説明する。このフィルタ状部材５０ｃの基本的構成はフィルタ状部材５０ａの対応する各要素と同様であるが、フィルタ状部材５０ｃにおいては、３つの貫通孔５５ｃと３つの溝５９ｃの配置関係がフィルタ状部材５０ａと異なる。３つの貫通孔５５ｃは１２０度の間隔で等間隔に配置されており、３つの溝５９ｃも同様にして等間隔に配置されている。しかし、３つの貫通孔５５ｃと３つの溝５９ｃは、上面５１ｃ又は下面５３ｃの中心点を基準として、６０度ずつずれるようにして配置されている。
【００２１】
次に、図１６乃至図１９に示した態様のフィルタ状部材５０ｄについて説明する。このフィルタ状部材５０ｄの基本的構成はフィルタ状部材５０ａの対応する各要素と同様であるが、フィルタ状部材５０ｄにおいては溝５９ｄが６つ形成されている点が異なる。そして、３つの貫通孔５５ｄと３つの溝５９ｄは上面５１ｄ又は下面５３ｄの中心点を基準として１２０度の等間隔になるように配置されており、残りの３つの溝５９ｄは３つの貫通孔５５ｄと６０度ずつずれるようにして配置されている。
【００２２】
次に、フィルタ状部材５０の更に別の態様について説明する。図２０乃至図２３及び図２４乃至図２７に示すように、フィルタ状部材５０ｅ及び５０ｆをそれらの正面形状が略円柱状、即ち、円柱に近似した形状にすることができる。なお、これらの略円柱状の各フィルタはその形状からも明らかであるが、上記の平板状フィルタと同様に硬質である。
【００２３】
まず、図２０乃至図２３に示した態様のフィルタ状部材５０ｅについて説明する。フィルタ状部材５０ｅは、上面５１ｅから下面５３ｅ方向の所望の位置において段差が形成されるように縮径されていることが好ましい。このように段差をつけることにより、カートリッジ１１内に収納する際、その段差においてフィルタ状部材５０ｅを容易に係止することができる。よって、フィルタ状部材５０ｅの周面が、大径部の５７ｅと小径部の５８ｅをなすようにすることが好ましい。フィルタ状部材５０ｅの長さ及び径の大きさはカートリッジ１１の大きさとの関連において決定する。
【００２４】
フィルタ状部材５０ｅの上面５１ｅにはＤＮＡ被覆金属微粒子を設置するための凹部５２ｅが形成されている。この凹部５２ｅは、通常半球状に形成することができる。
【００２５】
この凹部５２ｅと下面５３ｅにわたって貫通孔５５ｅが形成されている。貫通孔５５ｅは１以上であればよく、その数及び径の大きさは図３に示すフィルタ状部材５０と同様に適宜調整することができる。
【００２６】
周面５６ｅには、上面５１ｅ周縁部と下面５３ｅ周縁部にわたる１以上の溝５９ｅが形成されている。その数及び径の大きさは、貫通孔に準じて適宜調整することができる。また、この溝５９ｅは、ＤＮＡ被覆金属微粒子を放射状に分散発射することを補助するため、中心線に対して斜め方向に形成されていることが好ましい。このときの傾斜角度は、前記目的を考慮すれば、中心線を基準にすると約５〜２５度が好ましく、約１０〜２０度が特に好ましい。
【００２７】
貫通孔５５ｅと溝５９ｅを、いずれか一方が１で他方を２以上形成した場合又はいずれも２以上を形成した場合、良好なＤＮＡ被覆金属微粒子の分散発射をなすという点から、それらの配置関係を均等にすることが好ましい。例えば、図２０及び図２１に示すように、貫通孔５５ｅを１つ、溝５９ｅを２つ形成した場合、それらが同一線上に位置するように配置することが好ましい。
【００２８】
次に、図２４乃至図２７に示した態様のフィルタ状部材５０ｆについて説明する。このフィルタ状部材５０ｆの基本的構成はフィルタ状部材５０ｆの対応する各要素と同様であるが、フィルタ状部材５０ｆにおいては溝５９ｆが３つ形成されている点が異なる。そして、３つの溝５９ｆは上面５１ｆ又は下面５３ｆの中心点を基準として１２０度の等間隔になるように配置されている。
【００２９】
このような構成の噴出部１０は、少なくとも前記噴出部におけるカートリッジ１１の噴出口１６が、真空雰囲気に保持されるように設置されていることが必要であり、好ましくはカートリッジ１１の全体、場合により接続手段を含む部分が真空雰囲気に保持されるように設置されているが、そのような手段として真空槽１００が設けられている。
【００３０】
真空槽１００は、真空雰囲気を維持することができる密閉可能な筐体１０２と、被処理物の設置手段としての棚板１１０とからなるものである。筐体１０２には、その一部側壁において、被処理物を設置するための開閉自在の扉が取り付けられている（図示せず）。この筐体１０２は、作業状態を確認できるようにするため、透明部材、例えばアクリル樹脂板等で形成することが好ましい。棚板１１０は、筐体１０２の側壁に固定して取り付けることもできるが、噴出部１０のフィルタ状部材５０と被処理物との距離を可変自在にするため、上下動できるようにすることが好ましい。よって、その手段の一つとして、筐体１０２の対向する二つの側壁（扉がない対向側壁）のそれぞれに平行な複数段のスリット１０４を幅方向に形成し、任意の段のスリット１０４に棚板１１０をかけ渡すようにすることができる。被処理物１２０は棚板１１０上に直接置くことができ、必要に応じてシャーレ等の容器１１２を用いることもできる。なお、棚板１１０を取り除き、筐体１０２の底面を設置手段とすることもできる。
【００３１】
コントロール部２００の構成は高圧ガスを噴出部１０に圧送でき、かつ真空槽１００を真空雰囲気に保持できるものであれば特に制限されるものではない。次に、その一例を図２８及び図２９に基づいて説明する。コントロール部２００は、真空槽１００の真空度を調節するための真空調整部２１０、圧縮ガス（ヘリウムガス）の噴出圧力を調節するための圧力調整部２２０、電磁弁２３０の開閉時間を設定する計時回路２４０、電磁弁起動部２５０、真空排気ポンプ２６０及び電源供給部２７０を備えている。真空調整部２１０は、真空計２１１、真空調整バルブ（手動）２１２及びチャンバー排気／リーク切替バルブ（手動）２１３からなり、圧力調整部２２０は、ガス圧力計２２１及びガス圧力調整バルブ（手動）２２２を備えており、電磁弁起動部２５０は、タイムラグ回路２５１及び噴出起動回路２５２を備えており、真空排気ポンプ２６０は、排気ポンプ起動回路２６１、排気ポンプ２６２及び排気ポンプリーク弁（自動）２６３を備えている。なお、各図中、１点鎖線はヘリウムガス経路（樹脂製耐圧チューブ等）を示し、２点鎖線は電気系経路を示し、点線は真空経路（ステンレス管等）を示す。
【００３２】
また、真空槽１００の内部には、真空調整部２１０のエアリーク用空気導入口２１４に真空槽リーク用フィルタ２１５を取り付け、圧力調整部２２０の高圧ガス導入口２２３にヘリウムガス用滅菌フィルタ２２４を取り付けることができる。
【００３３】
次に、本発明の直接法遺伝子導入装置の動作を図面に基づいて説明する。なお、まずフィルタとして図３に示すような円板状フィルタを備えた装置について説明する。
【００３４】
直接法遺伝子導入装置１の起動前に、まず、導入物質となるＤＮＡ被覆金属微粒子と被処理物（ターゲット）となる植物組織を用意する。ＤＮＡ被覆金属微粒子は、例えば、次の方法により調整することができる。滅菌洗浄した金、タングステン等の金属微粒子（粒径１．５〜３．０μｍ）をエッペンドルフチューブにとり、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を１ｍｇ当たり２０μｌ加える。次に、ｍｉｃｒｏｔｉｐプローブに漬け、数十秒間懸濁する。その後、ボルテックスでよく懸濁し、２０μｌを２μｇのＤＮＡ溶液を含むエッペンドルフチューブに加え、更にＴＥを加えて５０μｌにする。次に、５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加え、混合する。その後、１１０μｌの１００％エタノールを加え、よく混合する。次に、−２０℃で１０分間静置し、スピンダウンしたのち、上清を捨てる。その後、７０％エタノールでリンスし、１００％エタノールを１６０μｌ加え、ソニケーター（ｏｕｔｐｕｔ８）のホーン壁にチューブを一瞬押し付け、パーティクルを懸濁させる。この懸濁液から５０μｌとり、１００％エタノールを１５０μｌ加える。
【００３５】
続いて、装置の起動操作に入る。まず、ガスボンベ３００からガスレギュレーター３０１の操作により圧縮ヘリウムガスをコントロール部２００のガス圧力調整部２２０の入力に与える。次に、コントロール部２００の電源起動後、真空排気ポンプ２６０を作動する。なお、この時点では真空排気ポンプ２６０は真空槽１００から分離されている。その後、ガス圧力調整部２２０のガス圧力計２２１により圧力範囲の設定を行う。これは圧縮ヘリウムガスの圧力範囲が任意限定下でのみ、電磁弁起動部２５０の出力を開放させるためである。次に、真空調整部２１０の真空計２１１により、真空範囲の設定を行う。これは真空槽１００の真空範囲が任意限定下でのみ、電磁弁起動部２５０の出力を開放させるためである。その後、計時回路２４０により、噴出時間の設定を行う。次に、ガス圧力調整部２２０のガス圧力調整バルブ２２２により、噴出圧の調整を行う。これにより希望する圧力の圧縮ヘリウムガスが電磁弁２３０の入力に与えられる。
【００３６】
その後、先に調製したＤＮＡ被覆金属微粒子のエタノール懸濁液７０を円板状フィルタ状部材５０の上面（反ターゲット側の面）に載せ、それをカートリッジ１１内に収納したのち、真空槽１００の扉を開け、カートリッジ１１を接続手段であるコンプレッションアジャストメント２４の下部内径に螺合して連結する。次に、棚板１１０の上面に、ターゲットとなる植物組織を入れたシャーレ等の容器１１２を置き、扉を閉め、真空槽１００内を外部雰囲気から遮断する。その後、真空調整部２１０のチャンバー排気／リーク切替バルブ２１３により、真空槽１００と真空排気ポンプ２６０とを接続し、真空槽１００の排気を行う。次に、真空調整部２１０の真空調整バルブ２１２により、真空槽１００の真空度を希望するレベルに設定する。
【００３７】
その後、電磁弁起動部２５０の噴出起動回路２５２により電磁弁２３０を開放する。この電磁弁２３０の開放により、フランジ２０、コンプレッションユニオン２２及びコンプレッションアジャストメント２４を経て圧送された高圧ガスは、カートリッジ１１内に収納されたフィルタ状部材５０の上面に載せられているＤＮＡ被覆金属微粒子に直接衝突する。その結果、ＤＮＡ被覆金属微粒子はフィルタ状部材５０の細孔５５を通過し、噴出口１６から発射され、ターゲット１２０に埋め込まれる。
【００３８】
終了後、真空調整部２１０のチャンバー排気／リーク切替バルブ２１３により真空槽１００内を常圧に戻したのち、ターゲット１２０を取り出す。繰り返し使用する場合にはカートリッジ１１ごと交換するので、前回使用時のＤＮＡ汚染の問題は生じない。この一連の操作においてより好適な処理をなすためには、噴出ガス圧力、真空度、噴出時間及びフィルタ状部材５０（＝ＤＮＡ被覆金属微粒子）とターゲット１２０との距離等を相互に関連づけて設定することが重要となる。これらの数値はターゲットの種類等の要素により変更されるものであるが、その一例としては、噴出ガス圧力が約２〜７ｋｇ／ｃｍ2 、真空度が約４００〜７００ｍｍＨｇ、噴出時間が数十ｍｓ及び前記距離が約３〜８ｃｍの範囲を挙げることができる。これらの要素のうち、フィルタ状部材５０とターゲット１２０との距離は、棚板１１２を上下動させることにより調整することができ、そのほかにもコンプレッションユニオン２２とコンプレッションアジャストメント２４のねじ込み具合によっても調整することができる。
【００３９】
次に、フィルタとして、フィルタ状部材５０ａ、５０ｂ、５０ｃ及び５０ｄを用いた場合の動作について説明する。これらのフィルタを用いた場合でも基本的動作はフィルタ状部材５０を用いた場合と同様であるが、ＤＮＡ被覆金属微粒子の発射状態に相違がある。
【００４０】
フィルタ状部材５０ａを例にとると、上面５１ａの凹部５２ａに載せられた（凹部５２ａの外にはみ出して載せることを妨げない）ＤＮＡ被覆金属微粒子は、高圧ガスに直接曝されて貫通孔５５ａを通過して発射される。このとき、貫通孔５５ａは外側に広がる方向に穿孔されているため、そこを通過したＤＮＡ被覆金属微粒子は放射状に広がって発射される。また、斜めに方向に形成された３つの溝５９ａは、一部のガスを逃がすことによりガス圧を分散させ、過度の圧力がＤＮＡ被覆金属微粒子に加えられることを抑制するとともに、それらを通過したガスを渦巻くように散らす作用（ガスの乱流を生じさせる作用）もする。この作用はＤＮＡ被覆金属微粒子を放射状に分散させ、発射することを補助する。また、３つの溝５９ａが均等に配置されているため、前記作用も偏ることなく均等に発揮される。
【００４１】
フィルタ状部材５０ｂ、５０ｃ及び５０ｄを用いた場合にも、ほぼ同様にしてＤＮＡ被覆金属微粒子が発射される。フィルタ状部材５０ｃを用いた場合には、貫通孔５５ｃと溝５９ｃの配置がずらされているので、貫通孔５５ｃと溝５９ｃを通過したガス流が衝突し、より大きな乱流を生じさせることができる。また、フィルタ状部材５０ｄを用いた場合には、フィルタ状部材５０ａとフィルタ状部材５０ｃの両方の作用を兼ね備えたものとなる。但し、６つの溝５９ｃによるガス流の分散が大きいため、貫通孔５５ａに付与されるガス圧はフィルタ状部材５０ａ，５０ｂ及び５０ｃと比較すると、低減される。
【００４２】
このようにフィルタ状部材５０ａ、５０ｂ、５０ｃ及び５０ｄを備えた直接法遺伝子導入装置は、より広い範囲にＤＮＡ被覆金属微粒子を分散発射することができるので、装置としての精度信頼性が一層向上される。
【００４３】
次に、フィルタとして、フィルタ状部材５０ｅ及び５０ｆを用いた場合の動作について説明する。これらのフィルタを用いた場合でも基本的動作はフィルタ状部材５０を用いた場合と同様であるが、ＤＮＡ被覆金属微粒子の発射状態に相違がある。フィルタ状部材５０ｅ及び５０ｆの場合には、どちらも溝５９ｅ、５９ｆが斜め方向に形成されているため、５０ａ等と同様にガスの乱流を生じさせ、ＤＮＡ被覆金属微粒子を分散発射に寄与する。ただし、貫通孔５５ｅ、５５ｆは鉛直方向に形成されているため、フィルタ状部材５０ａ等と比べるとＤＮＡ被覆金属微粒子の分散度合いは小さくなるが、フィルタ状部材５０と比べるとＤＮＡ被覆金属微粒子の分散度合いは大きくなる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４５】
実施例１下記条件により、植物組織にＤＮＡ被覆金属微粒子を導入した。結果を表１に示す。なお、表１中において、リーフディスク及び葉の数値は発現細胞を計数したものであり、胚軸の＋は発現細胞の計数が不可能なため、目視による良否状態（＋が多い方が良好）を示す。
（１）試料植物組織：大豆リーフディスク（大豆葉を１５ｍｍφに切断したもの）
：大豆の胚軸 ：大豆の葉ＤＮＡ種：ＧＵＳ遺伝子 金属微粒子：粒径が１．５〜３．０μｍの金微粒子（２）実施条件真空度：６００ｍｍＨｇヘリウムガス圧力：４．０ｋｇ／ｃｍ2噴出時間：５０ｍｓ距離：大豆リーフディスク、大豆の胚軸は４．０ｃｍ大豆の葉は６．０ｃｍフィルタの種類：フィルタ状部材５０、５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ、５０ｅ及び５０ｆを、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の（ＳＷＩＮＮＥＹ）１３ｍｍＰＬＡＳＴＩＣ ＳＹＲＩＮＧＥ ＦＩＬＴＥＲ ＨＯＬＤＥＲに収納されるように大きさを設定したもの。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
実施例２下記条件により、植物組織にＤＮＡ被覆金属微粒子を導入した。結果を表２に示す。なお、表２中において、各数値は発現細胞を計数したものである。
（１）試料植物組織：大豆の葉 ：大豆リーフディスク（大豆葉を１５ｍｍφに切断したもの）
：タバコリーフディスク（タバコ葉を１５ｍｍφに切断したもの）
ＤＮＡ種：ＧＵＳ遺伝子 金属微粒子：粒径が１．５〜３．０μｍの金微粒子（２）実施条件真空度：６００ｍｍＨｇヘリウムガス圧力：４．０ｋｇ／ｃｍ2噴出時間：５０ｍｓ距離：各リーフディスクは５．０ｃｍ大豆の葉は４．０ｃｍフィルタの種類：フィルタ状部材５０、５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ、５０ｅ及び５０ｆを、Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の（ＳＷＩＮＮＥＹ）１３ｍｍＰＬＡＳＴＩＣ ＳＹＲＩＮＧＥ ＦＩＬＴＥＲ ＨＯＬＤＥＲに収納されるように大きさを設定したもの。
【００４８】
【表２】
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フィルタ状部材５０ａ乃至５０ｄを用いた場合の結果において、リーフディスクの発現数が他と比較してやや少ない場合があるのは、噴出範囲がリーフディスクの大きさよりも広がったためと考えられる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の直接法遺伝子導入装置は、ＤＮＡ被覆金属微粒子を直接に高圧のヘリウムガスに曝すという方式を採用した点において、構造の簡略化も含めて従来とはまったく異なる新規なものである。
本発明の直接法遺伝子導入装置においては、使用時に飛散したＤＮＡはカートリッジ内に溜まり、更には、フィルタ状部材は上面から下面方向に縮径されて形成される大径部と小径部との段差により前記カートリッジ内に係止される手段を備えているため、フィルタ状部材を容易にカートリッジ内に係止することができ、カートリッジの交換により次回以降の使用時におけるＤＮＡ汚染を防止できる。
また、カートリッジに収納するフィルタ状部材の上面にＤＮＡ被覆金属微粒子を載せて貫通孔から発射することができ、発射状態の異なる種々の態様のものと適宜交換することにより、小さなターゲットから大きなターゲットまで幅広く、確実にＤＮＡ被覆金属微粒子を埋め込むことができ、特に、貫通孔が上面の中心から下面の周縁に向かって斜め方向に形成されているので、ＤＮＡ被覆金属微粒子を放射状に分散発射することができ、ＤＮＡ被覆金属微粒子の分散度合いは大きくなる。
更に、高圧ガス源として分子量の小さなヘリウムガスを使用し、電磁弁の開閉時間を計時回路により制御してガスの噴出量を抑えることにより、ターゲットへのダメージを最小限にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、一部断面図を含む直接法遺伝子導入装置の概略正面図である。
【図２】図２は、図１に示す直接法遺伝子導入装置の部分拡大図である。
【図３】図３は、略逆円錐台状のフィルタ状部材のカートリッジ内における収納状態を説明するための図である。
【図４】略逆円錐台状のフィルタ状部材の一態様の上面図である。
【図５】略逆円錐台状のフィルタ状部材の一態様の下面図である。
【図６】略逆円錐台状のフィルタ状部材の一態様の正面図である。
【図７】図５におけるＡ−Ａ線に沿う部分断面図である。
【図８】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の上面図である。
【図９】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の下面図である。
【図１０】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の正面図である。
【図１１】図９におけるＡ−Ａ線に沿う部分断面図である。
【図１２】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の上面図である。
【図１３】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の下面図である。
【図１４】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の正面図である。
【図１５】図１３におけるＡ−Ａ線に沿う部分断面図である。
【図１６】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の上面図である。
【図１７】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の下面図である。
【図１８】略逆円錐台状のフィルタ状部材の別態様の正面図である。
【図１９】図１７におけるＡ−Ａ線に沿う部分断面図である。
【図２０】略円柱状のフィルタ状部材の一態様の上面図である。
【図２１】略円柱状のフィルタ状部材の一態様の下面図である。
【図２２】略円柱状のフィルタ状部材の一態様の正面図である。
【図２３】図２１におけるＡ−Ａ線に沿う部分断面図である。
【図２４】略円柱状のフィルタ状部材の別態様の上面図である。
【図２５】略円柱状のフィルタ状部材の別態様の下面図である。
【図２６】略円柱状のフィルタ状部材の別態様の正面図である。
【図２７】図２５におけるＡ−Ａ線に沿う部分断面図である。
【図２８】図２８は、直接法遺伝子導入装置の機能別ブロック構成図である。
【図２９】図２９は、図２８におけるコントロール部の機能別ブロック構成図である。
【符号の説明】
１    直接法遺伝子導入装置
１０    噴出部
１１    カートリッジ
１３    上部ホルダー
１４    下部ホルダー
１６    噴出口
２０    フランジ
２２    コンプレッションユニオン
２４    コンプレッションアジャストメント
５０    フィルタ状部材
５０ａ    フィルタ状部材
５０ｂ    フィルタ状部材
５０ｃ    フィルタ状部材
５０ｄ    フィルタ状部材
５０ｅ    フィルタ状部材
５０ｆ    フィルタ状部材
５５      貫通孔
５５ａ    貫通孔
５５ｂ    貫通孔
５５ｃ    貫通孔
５５ｄ    貫通孔
５５ｅ    貫通孔
５５ｆ    貫通孔
１００    真空槽
１０４    棚板
１２０    被処理物（ターゲット）
２００    コントロール部
２３０    電磁弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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