(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで動物細胞内に遺伝子を導入および発現させる方法であって、該方法が、該動物細胞を生きたShigella  spp.で感染させる工程を包含し、該Shigella  spp.が、該遺伝子をコードする真核生物発現カセットを含有する、方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、ワクチン抗原、治療薬、免疫調節剤、アンチセンスRNA、および触媒RNAをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子が、ワクチン抗原をコードし、該ワクチン抗原が、検出可能なレベルで発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞が、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、シカ、ヤギ、ウマ、ロバ、霊長類、および水牛の細胞からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Shigella  spp.が弱毒化される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記動物細胞が、103〜1011個の生存能力のあるShigella  spp.で感染させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記動物細胞が、105〜109個の生存能力のあるShigella  spp.で感染させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物細胞が、0.1から106の範囲の感染多重度で感染させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物細胞が、102から104の範囲の感染多重度で感染させられる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
非ヒト動物における動物細胞内に遺伝子を導入および発現させる方法であって、該方法が、粘膜表面への投与によって該動物を生きたShigella  spp.で感染させる工程を包含し、該Shigella  spp.が、該遺伝子をコードする真核生物発現カセットを含有する、方法。
【請求項１３】
前記粘膜表面への投与が、鼻腔内投与である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子が、ワクチン抗原、治療薬、免疫調節剤、アンチセンスRNA、および触媒RNAをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物が非ヒト哺乳動物である、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ヒト哺乳動物が、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、水牛、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、シカ、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記Shigella  spp.が弱毒化される、請求項12〜16のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記動物が、103〜1011個の生存能力のあるShigella  spp.で感染させられる、請求項12に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物が、105〜109個の生存能力のあるShigella  spp.で感染させられる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト内に遺伝子を導入および発現させるための薬学的組成物であって、該組成物は、生きたShigella  spp.を含み、該Shigella  spp.が、該遺伝子をコードする真核生物発現カセットを含有し、該組成物は、粘膜表面への投与のためのものである、薬学的組成物。
【請求項２１】
前記粘膜表面への投与が、鼻腔内投与である、請求項20に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記遺伝子が、ワクチン抗原、治療薬、免疫調節剤、アンチセンスRNA、および触媒RNAをコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項20に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記Shigella  spp.が弱毒化される、請求項20〜22のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
103〜1011個の生存能力のあるShigella  spp.を含む、請求項20に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
105〜109個の生存能力のあるShigella  spp.を含む、請求項24に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明の開発は、メリーランド州バルチモアのメリーランド大学によって支援された。
発明の分野
本発明は、生きた侵襲性細菌をベクターとして用いて内生または外来遺伝子を動物細胞内に導入する方法に関する。この方法は、内生または外来遺伝子をコードする真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達することができ、そして動物細胞または動物組織内で、例えばワクチン抗原、治療薬、免疫調整剤、アンチセンスRNA、および触媒RNAを発現させるために有用である。
発明の背景
I.生きた細菌ベクターワクチン
組換えDNA技術の進歩により、伝染性、風土性、および汎流行性感染症を制御するワクチンの開発が大いに促進された（Woodrowら編、New Generation Vaccines:The Molecular Approach,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY（1989）;Cryz編、Vaccines and Immunotherapy,Pergamon Press,New York,NY（1991）；およびLevineら、Ped.Ann.,22:719−725（1993））。特に、この技術により、細菌ベクターワクチンと呼ばれる新しいクラスのワクチンの増殖が可能になった（Curtiss編、In:New Generation Vaccines:The Molecular Approach,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY、161〜188頁および269〜288頁（1989）；およびMimsら編、In:Medical Microbiology,Mosby−Year Book Europe Ltd.,London（1993））。これらのワクチンは、経口、経鼻腔、または非経口により宿主に入り得る。一旦宿主に入ると、細菌ベクターワクチンは、その中に含まれる真核生物発現カセットを発現し、このカセットは外来抗原をコードする。外来抗原は、ワクチン特性を有する細菌病原体、ウィルス病原体、または寄生病原体由来のタンパク質（またはタンパク質の一部）もしくはそれらのタンパク質の組み合わせであり得る。（New Generation Vaccines:The Molecular Approach（前出）;Vaccines and Immunotherapy（前出）;Hilleman、Dev.Biol.Stand.,82:3−20（1994）;Formalら、Infect.Immun.34:746−751（1981）;Gonzalezら、J.Infect.Dis.,169:927−931（1994）;Stevensonら、FEMS Lett.,28:317−320（1985）;Aggarwalら、J.Exp.Med.,172:1083−1090（1990）;Honeら、Microbial.Path.,５:407−418（1988）;Flynnら、Mol.Microbiol.,４:2111−2118（1990）;Walkerら、Infect.Immun.,60:4260−4268（1992）;Cardenasら、Vacc.,11126−135（1993）;Curtissら、Dev.Biol.Stand.,82:23−33（1994）;Simonetら、Infect.Immun.,62863−867（1994）;Charbitら、Vacc.,11:1221−1228（1993）;Turnerら、Infect.Immun.,61:5374−5380（1993）;Schodelら、Infect.Immun.,62:1669−1676（1994）;Schodelら、J.Immunol.,145:4317−4321（1990）;Stabelら、Infect.Immun.,59:2941−2947（1991）;Brown、J.Infect.Dis.,155:86−92（1987）;Doggettら、Infect.Immun.,61:1859−1866（1993）;Brettら、Immunol.,80:306−312（1993）;Yangら、J.Immunol.,145:2281−2285（1990）;Gaoら、Infect.Immun.,60:3780−3789（1992）；およびChatfieldら、Bio/Technology,10:888−892（1992））。細菌ベクターワクチンを用いる外来抗原の宿主組織への送達は、外来抗原に対する宿主免疫応答を生じ、これは、外来抗原起源である病原体に対する保護を提供する（Mims、The Pathogenesis of Infectious Disease,Academic Press,London（1987）；およびNew Generation Vaccines:The Molecular Approach（前出））。
細菌ベクターワクチンの中でも、生きた経口Salmorellaベクターワクチンが最も広く研究されている。Salmonellaベクターが細菌抗原、ウィルス抗原、および寄生生物抗原に対する体液および細胞免疫を引き出し得ることを示す例は数多くある（Formalら、Infect.Immun.,34:746−751（1981）;Gonzalezら（前出）;Stevensonら（前出）;Aggarwalら（前出）;Honeら（前出）;Flynnら（前出）;Walkerら（前出）;Cardenasら（前出）;Curtissら（前出）;Simonetら（前出）;Charbitら（前出）;Turnerら（前出）;Schodelら（前出）;Scholdeら（1990）（前出）;Stabelら（前出）;Brown（前出）;Doggettら（前出）;Brettら（前出）;Yangら（前出）;Gaoら（前出）；およびChatfieldら（前出））。これらの体液応答は粘膜コンパートメントで（Stevensonら（前出）;Cardenasら（前出）;Walkerら（前出）および;Simonetら（前出））、ならびに全身コンパートメントで（Gonzalezら（前出）;Stevensonら（前出）;Aggarwalら（前出）;Honeら（前出）;Flynnら（前出）,Walkerら（前出）;Cardenasら（前出）;Curtissら（前出）;Simonetら（前出）;Charbitら（前出）;Turnerら（前出）;Schodelら（前出）;Scholdelら（1990）（前出）;Stabelら（前出）;Brown（前出）;Doggettら（前出）;Brettら（前出）;Yangら（前出）;Gaoら（前出）；およびChatfieldら（前出））で起こる。生きた経口Salmonellaベクターワクチンはまた、外来抗原に対するＴ細胞応答を誘引する（Wickら、Infect.Immun.,62:4542−4548（1994））。これらは、抗原特異的細胞障害性CD8+T細胞応答を含む（Gonzalezら（前出）;Aggarwalら（前出）;Flynnら（前出）;Turnerら（前出）；およびGaoら（前出））。
理想的には、細菌ベクターワクチンは、レシピエント動物またはヒトによって遺伝子的に定義され、弱毒化され、そして良好に寛容され、かつ免疫原性を保持する（Honeら、Vaccine,９:810−816（1991）;Tacketら、Infect.Immun.,60:536−541（1992）;Honeら、J.Clin.Invest.,90:412−420（1992）;Chatfieldら、Vaccine,10:8−11（1992）;Tacketら、Vaccine,10:443−446（1992）；およびMims（前出））。近年、原核生物発現カセットの送達のための潜在的な細菌ベクターワクチンの数が増加している。これらは現時点ではYersinia enterocolitica（van Dammeら、Gastroenterol.,103:520−531（1992））、Shigella spp.（Noriegaら、Infect.Immun.,62:5168−5172（1994））、Vibrio cholerae（Levineら、In:Vibrio cholerae,Molecular to Global Perspectives,Wachsmuthら編、ASM Press,Washington,D.C.、395−414頁（1994））、Mycobacterimu BCG株（Lagranderieら、Vaccine,11:1283−1290（1993）;Flynn、Cell.Molec.Biol.,40（補遺、１）:31−36（1994））、およびListeria monocytogenes（Schaferら、J.Immunol.,149:53−59（1992））ベクターワクチンを含むが、これらに限定されない。
II.真核生物および原核生物発現カセット
通常は、発現カセットは、プロモーター領域、転写開始部位、リボソーム結合部位（RBS）、タンパク質（またはそのフラグメント）をコードするオープンリーディングフレーム（orf）を含み、これらはRNAスプライス部位（真核生物のみ）、翻訳停止コドン、転写ターミネータ、および転写後ポリアデノシンプロセシング部位（真核生物のみ）を有するかまたは有さない（Wormington、Curr.Opin.Cell Biol.,５950−954（1993）;Renznikoffら編、Maximizing Gene Expression,Butterworths,Stoneham,Ma（1986））。真核発現カセットにおけるプロモーター領域、RBS、スプライス部位、転写ターミネータ、および転写後ポリアデノシンプロセシング部位は、原核生物発現カセットのものとは著しく異なる（Wasylyk、In:Maximizing Gene Expression、（前出）、79−99頁;Reznikoffら、In:Maximizing Gene Expression、（前出）、１−34頁；およびLewin、Genes V,Oxford University Press,Oxford（1994））。これらの相違は、真核生物細胞内での原核生物発現カセットの発現を妨げ、そして組成物の逆もまた同様である（Millerら、Mol.Micro.,４:881−893（1990）；およびWilliamsonら、Appl.Env.Micro.,60:771−776（1994））。
原核生物プロモーターは真核生物細胞内では活性化せず、そして真核生物プロモーターは原核生物細胞内では活性化しない（Eickら、Trends in Genetics,10:292−296（1994））。真核生物のプロモーターと原核生物プロモーターとの間に機能的相違があることの根拠に、RNAポリメラーゼ、転写調節因子、およびプロモーターのDNA構造が介在している（Eickら（前出））。
RNAポリメラーゼは、プロモーター領域のDNAの特定の配列を認識するDNA結合タンパク質である。RNAポリメラーゼは、DNAコード配列によって示される特定の順序でヌクレオシド三リン酸を重合することによってRNA分子の合成を触媒する（Libbyら、Mol.Micro.,５:999−1004（1991）;Kerppolaら、FASEB J.,５:2833−2842（1991）;Albertsら編、Molecular Biology of the Cell,Garland Publishing Inc.,New York,NY（1994）;Watsonら編、Molecular Biology of the Gene,第１巻,The Benjamin/Cummings Publishing Comp.Inc.,Menlo Park CA（1987）；およびLewin（前出））。原核生物のRNAポリメラーゼは、代表的には、２つの同一のαサブユニットおよび２つの類似するが同一ではないβおよびβ’サブユニットよりなる（Ishihama、Mol.Micro.,６:3283−3288（1992）;Watsonら（前出）;Albertsら（前出）；およびLewin（前出））。所定のプロモーター領域のための原核生物RNAポリメラーゼの特異性には、プロモーター領域のDNAによってコードされるコア配列を認識する特異的なσファクターにより媒介される（Libbyら（前出）；およびLewin（前出））。
真核生物細胞内には３つのRNAポリメラーゼが存在する。各異なるRNAポリメラーゼは、10〜15個の異なるサブユニットを含み、そして各々が異なる機能を担う（Kerppolaら（前出）;Larsonら、Biochem.Cell.Biol.,69:5−22（1991）;Archambaultら、Microbiol.Rev.,57:703−724（1993）;Watsonら（前出）;Albertsら（前出）；およびLewin（前出））。さらに、真核生物RNAポリメラーゼがプロモーター領域のDNAに結合するために、特定のDNA結合ファクターが必要となり得る（Darnellら、Molecular Cell Biology,Scientific American Books,Inc.,W.H.Freeman and Co.,New York,NY（1990）;Horiら、Curr.Opin.Gen.Devel.,４:236−244（1994）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））。これらの結合ファクターはDNA中の特定の配列を認識し、そしてまた真核生物RNAポリメラーゼと相互作用する。
原核生物プロモーターのDNA一次配列と真核生物プロモーターのDNA一次配列との間には類似性はほとんどない。原核生物プロモーターのDNA構造は比較的単純であり、−10および−35領域ならびに隣接する調節配列よりなる（Darnellら（前出）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））。原核生物のプロモーターは転写開始部位より上流に位置する。これに対して、真核生物プロモーターは、通常は運転開始部位より50bp上流から20bp下流に位置するコアユニット（Darnellら（前出）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））、および転写開始より約100〜200bp上流に位置するが離れた場所にも位置し得るエンハンサー配列（Sonenberg、Curr.Opin.Gen.Devel.,４:310−315（1994）;Geballeら、Trends Bio.Sci.,１:159−164（1994）；およびLewin（前出））よりなる。
RBSは、メッセンジャーRNA（mRNA）分子の5'末端に結合するための、リボソームによって認識される部位である。この結合は、mRNAをリボソームによってタンパク質に翻訳するために必須である。原核生物では、mRNA分子の5'末端中のRBSは、小さなリボソームRNA分子（5S rRNA）の3'末端に相補的な配列である（Chatterjiら、Ind.J.Biochem.Biophys.,29:128−134（1992）；およびDarnellら（前出）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびWatsonら（前出））。RBSの存在は、発生期のmRNA分子の5'末端へのリボソームの結合を促進する。次いで、スキャンしているリボソームが出会う最初のAUGコドンで翻訳が開始される（Darnellら（前出）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））。現時点では、真核生物のmRNA−リボソーム相互作用にはこのような認識パターンは観察されていない（Eickら（前出））。さらに、真核生物mRNAの翻訳の開始前に、メチル化したグアニレートを最初のmRNAヌクレオチド残基に添加することによって、mRNA分子の5'末端に「キャップ」が付けられる（Darnellら（前出）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））。真核生物リボソームによるmRNA内の翻訳開始部位の認識は、このキャップの認識、その後のmRNA上の開始コドンを取り囲む特定の配列への結合を含むということが提案されている。脳心筋炎ウィルス由来の配列（Dukeら、J.Virol.,66:1602−1609（1992））のようなキャップ非依存性翻訳エンハンサー（CITE）配列が、コード領域の前に含まれるかまたはコード領域の間に含まれる場合は、キャップ非依存性翻訳開始を生じるか、および／または、真核生物発現カセット内に複数の真核生物コード配列を配置することが可能である。しかし、開始AUGコドンは必ずしもリボソームが最初に出会うAUGコドンというわけではない（Louisら、Molec.Biol.Rep.,13:103−115（1988）；およびVoormaら、Molec.Biol.Rep.,19:139−145（1994）;Lewin（前出）;Watsonら（前出）；およびAlbertsら（前出））。従って、真核生物におけるRBS結合配列は原核生物RBS結合配列とはかなり異なるので、これら２つは相互変換し得ない。
原核生物での転写の終了にはrho非依存型およびrho依存型のステムループが介在する（Richardson、Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.,28:1−30（1993）;Platt、Molec.Microbiol.,11:983−990（1994）；およびLewin（前出））。これに対して、ターミネータループは、通常は、真核生物発現カセットの下流には見い出されず、そして転写はオープンリーディングフレームの末端を超えて伸長することが多い（Tuiteら、Mol.Biol.Reps.,19:171−181（1994））。しかし、通常は、過剰に伸長したmRNAはエンドヌクレアーゼによって特異的に切断され、そしてmRNAの3'末端はpoly−Ａポリメラーゼによってポリアデニル化される（Proudfoot、Cell,64:671−674（1991）;Wahle、Bioassays,14:113−118（1992）;Lewin（前出）；およびWatsonら（前出））。これらの翻訳後修飾を生じさせるためには、エンドヌクレアーゼおよびpoly−Ａポリメラーゼによって認識される配列がmRNA分子の3'末端に含まれなければならない。mRNA分子の3'末端のポリアデニル化は、真核生物細胞の細胞質にmRNAを輸送し、そしてタンパク質に翻訳する前の必要なステップであると考えられる（Sachsら、J.Biol.Chem.,268:22955−22958（1993）；およびSachs、Cell,74:413−421（1993））。真核生物発現カセットは機能的な遺伝子産生物をコードする必要はない。すなわち、真核生物発現カセットはまた、真核生物酵素（Warneら、Nature,364:352−355（1993）；およびWang、J.Cell Biochem.,45:49−53（1991））、アンチセンスRNA（Magrath、Ann.Oncol.,５（補遺、１）:67−70（1994）;Milliganら、Ann.NY Acad.Sci.,716:228−241（1994）；およびSchreier、Pharma.Acta Helv.,68:145−159（1994））、触媒RNA（Cech、Biochem.Soc.Trans.,21:229−234（1993）;Cech、Gene,135:33−36（1993）;longら、FASE J.,7:25−30;およびRosiら、Pharm.Therap.,50:245−254（1991））、またはRNAに転写され得る他の任意の配列のインヒビターとして作用する部分遺伝子産物をコードし得る。
真核生物細胞の生態学を研究するために真核生物発現カセットが必要であるため、現在では多くの真核生物発現プラスミドが容易に入手可能である。これらは、Invitrogen Corporation（San Diego,CA）、Stratagene（La Jolla,CA）、ClonTech（Palo Alto,CA）、およびPromega Corporation（Madison,WI）ような会社の商品を含むが、これらに限定されない。これらのすべてのプラスミドは、上記に列挙した真核生物発現カセットのエレメントを含み、そして多くはまた、プロモーター配列より下流に位置する遺伝子が、原核生物細胞ならびに真核生物細胞において発現されるような原核生物プロモーター配列を含む。例えば、プラスミドpSVβ−galは、真核生物SV40プロモーターおよび原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおけるβガラクトシダーゼ遺伝子の発現を可能にする原核生物gptプロモーター（Promega Corp.）を含む。
III.真核生物発現カセットの植物細胞への送達
DNAを植物細胞に安定に送達するために、Agrobacterium tumerfacium Tiプラスミドを使用することは、植物生物工学におけるブームの基本的な要素であった。このシステムは、特定のレセプターを介して植物細胞に結合する繊毛状構造体を使用し、そして次いで細菌接合に類似するプロセスを介してTiプラスミドに連結したDNAを植物細胞に送達する点で独特である（Zambryski、Ann.Rev.Genet.,22:1−30（1988）;Lesslら、Cell,77:321−324（1994）；およびWaldenら、Eur.J.Biochem.,192:563−576（1990））。しかし、この植物に対する送達システムの特異性のため、このシステムはDNAの動物細胞への送達にとっては効果的でない（Chilton、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:3119−3120（1993）；およびWaldenら（前出））。
IV.真核生物発現カセットの動物細胞への送達
DNAを、インビトロで培養された動物細胞に導入するいくつかの技術がある。これらは、化学的な方法（Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:7413−7417（1987）;Bothwellら、Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes,編Jones and Bartlett Publishers Inc.,Boston,Ma（1990）;Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York,NY（1992）；およびFarhood、Annal.N.Y.Acad.Sci.,716:23−34（1994））、プロトプラストの使用（Bothwell（前出））、または電気パルス（Vatteroniら、Mutn.Res.,291:163−169（1993）;Sabelnikov、Prog.Biophys.Mol.Biol.,62:119−152（1994）;Brothwellら（前出）；およびAusubelら（前出））、弱毒化ウィルスの使用（Moss、Dev.Biol.Stan.,82:55−63（1994）；およびBrothwellら（前出））、ならびに物理的な方法（Fynanら（前出）;Johnstonら、Meth.Cell Biol.,43（Pt A）:353−365（1994）;Brothwellら（前出）；およびAusubelら（前出））が含まれる。
DNAの、動物組織への首尾良い送達は、カチオン性リポソーム（Watanabeら、Mol.Reprod.Dev.,38:268−274（1994））、裸のDNAの動物筋肉組織への直接注入（Robinsonら、Vacc.,11957−960（1993）;Hoffmanら、Vacc.,12:1529−1533（1994）、Xiangら、Virol.,199:132−140（1994）;Websterら、Vacc.,12:1495−1498（1994）;Davisら、Vacc.,12:1503−1509（1994）；およびDavisら、Hum.Molec.Gen.,２:1847−1851（1993））、および胚（Naitoら、Mol.Reprod.Dev.,39:153−161（1994）；およびBurdonら、Mol.Reprod.Dev.,33:436−442（1992））、または「遺伝子ガン」技術を用いたDNAの皮内注入（Johnstonら（前出））によって達成されている。これらの技術の制限は、これらがDNAの腸管外部位への送達においてのみ効率的であるということである。現時点では、真核生物発現カセットを粘膜組織に効果的に送達することは限られた成功しか治めていない。これは、恐らく、これらの部位へのアクセスが困難であること、送達媒体に毒性があること、または経口送達の場合に送達媒体が不安定であることによる。
DNA送達技術を動物細胞に商業的に適用する範囲は広く、そしてワクチン抗原（Fynanら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11478−11482（1993））、免疫治療薬、および遺伝子治療薬（Darrisら、Cancer,74（３補遺）:1021−1025（1994）;Magrath、Ann.Oncol.,５（補遺１）:67−70（1994）;Milliganら、Ann.NY Acad.Sci.,716:228−241（1994）;Schreierら、Pharma.Acta Helv.,68:145−159（1994）;Cech、Biochem.Soc.Trans.,21:229−234（1993）;Cech、Gene,135:33−36（1993）;Longら、FASEB J.,７:25−30（1993）；およびRosiら、Pharm.The rap.,50:245−254（1991））の送達を含む。
遺伝子治療のために内生および外来遺伝子を動物組織に送達することは、実験動物およびボランティアに顕著な兆候を示した（Nabel、Circulation,91:541−548（1995）;Coovertら、Curr.Opin.Neuro.,７:463−470（1994）;Foa、Bill.Clin.Haemat.,７:421−434（1994）;Bowersら、J.Am.Diet.Assoc.,93:53−59（1995）;Peralesら、Eur.J.Biochem.,226:255−266（1994）;Dankoら、Vacc.,12:1499−1502（1994）;Conryら、Canc.Res.,54:1164−1168（1994）；およびSmith、J.Hemat.,１:155−166（1992））。近年、ニワトリ（Robinsonら（前出））およびケナガイタチ（Websterら、Vacc.,12:1495−1498（1994））の両方におけるインフルエンザ；マウスにおけるPlasmodium yoelii（Hoffmanら（前出））；マウスにおける狂犬病（Xiangら（前出））；マウスにおけるヒトガン胎児性抗原（Conryら（前出））；およびマウスにおけるＢ型肝炎（Davisr（前出））に対して首尾良く免疫化するために、裸のDNAワクチンを有する真核生物発現カセットが用いられている。これらの観察により、内生および外来遺伝子の動物組織への送達を、予防および治療への適用に使用し得るさらなる可能性が開く。
従って、ワクチンまたは治療薬である内生または外来遺伝子をコードする真核生物発現カセットを動物細胞または組織に送達する必要性が存在する。特に、真核生物発現カセットを粘膜表面に送達する方法が大いに所望される。これまでに、原核生物発現カセット上にコードされる外来抗原を動物組織の粘膜部位に送達するために、細菌ベクターワクチンが使用されている。
本発明は、侵襲性細菌が真核生物発現カセットを動物細胞および組織に送達し得るという新規のかつ予期されなかった発見について記載する。真核生物発現カセットを送達するために生きた侵襲性細菌を使用することについての１つの重要な局面は、これらがDNAを粘膜部位に送達し得るということである。
これまで、生きた細菌が動物細胞を侵襲して真核生物発現カセットを導入し、次いでこの真核生物発現カセットが感染した細胞およびその子孫によって発現されることについて述べた文献は存在しない。すなわち、本発明は、生きた侵襲性細菌と動物細胞との間の遺伝子交換についての最初の文献を提供する。これまでは、生きた細菌ベクターワクチンによる外来抗原の送達は、単に、原核生物発現カセットの動物細胞または組織への送達、および細菌ワクチンベクターによる外来抗原の動物細胞または組織内での発現を包含するだけであった。これに対して、本発明は、生きた細菌株による真核生物発現カセットのインビトロにおける動物細胞または動物組織内の細胞への送達、および動物細胞または動物組織内の細胞による真核生物発現カセットの発現を包含する。
発明の要旨
本発明の１つの目的は、生きた侵襲性細菌を使用して、１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達することである。
本発明の別の目的は、生きた侵襲性細菌を使用して、ワクチン抗原をコードする１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達することである。
本発明の別の目的は、生きた侵襲性細菌を使用して、治療薬をコードする１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達することである。
本発明のさらに別の目的は、生きた侵襲性細菌を使用して、生物学的に活性なRNA種をコードする１つ以上の真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達することである。
本明細書で後述される本発明の詳細な説明から明らかである本発明のこれらのおよび他の目的は、１つの実施態様において、これらの動物細胞に生きた侵襲性細菌を感染させることを包含する、遺伝子を動物細胞に導入し、そして発現させる方法によって達成される。ここでこの細菌は、この遺伝子をコードする真核生物発現カセットを含む。
別の実施態様では、本発明は、内生遺伝子または外来遺伝子をコードする１つ以上の真核生物発現カセットを含有する生きた侵襲性細菌に関する。
【図面の簡単な説明】
図1Aおよび図1Bは、ｐβ−gal＋SV40発現カセットを含有するか（図1A）、またはｐβ−gal−SV40発現カセットを含有する（図1B）S.flexneri ΔaroAΔvirGの、６時間、24時間、48時間、72時間、および92時間の細菌感染後にHeLa細胞内に生存するウェル当たりのコロニー形成単位を示す。
図２は、ｐβ−gal＋SV40発現カセットを含有するS.flexneri ΔaroAΔvirGでの、６時間、24時間、48時間、72時間、および92時間の細菌感染後に存在するHeLa細胞のウェル当たりの細胞数を示す。
図3Aおよび3Bは、ｐβ−gal＋SV40発現カセットを含有する（図3A）か、またはｐβ−gal−SV40発現カセットを含有する（図3B）S.Flexneri Δasdの、６時間、24時間、48時間、および96時間の細菌感染後にHeLa細胞内に生存するウェル当たりのコロニー形成単位を示す。
図４は、ｐβ−gal＋SV40発現カセットを含有するS.flexneri Δasdでの、６時間、24時間、48時間、および96時間の細菌感染後に存在するHeLa細胞のウェル当たりの細胞数を示す。
発明の詳細な説明
上述のように、１つの実施態様では、本発明は、遺伝子を動物細胞に導入し、そして発現させる方法に関し、この方法は、これらの動物細胞に生きた侵襲性細菌を感染させる工程を包含し、ここでこの細菌は、この遺伝子をコードする真核生物発現カセットを含有する。
動物細胞は、その分類学上の位置が動物界内に存する多細胞生物体由来するか、またはこれら生物体内に存在する核状の葉緑体非含有細胞として定義される。この細胞は、インタクトな動物、一次細胞培養物、外植片培養物、または形質変換細胞株内に存在し得る。細胞の特定の組織源は本発明にとっては重要ではない。
本発明で用いられるレシピエント動物細胞は本発明にとっては重要ではなく、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類の生物体のような動物界内のすべての生物体に存在するかまたはこれら生物体に由来する細胞を含む。
好適な動物細胞は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、バッファロー、イヌ、ヤギ、ウマ、ロバ、シカ、および霊長類の細胞のような哺乳動物の細胞である。最も好ましい動物細胞はヒト細胞である。
ヒト細胞株の例としては、ATCC番号、CCL 62、CCL 159、HTB 151、HTB 22、CCL 2、CRL 1634、CRL 8155、HTB 61、およびHTB 104が挙げられるが、これらに限定されない。
ウシ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL 6021、CRL 1733、CRL 6033、CRL 6023、CCL 44、およびCRL 1390が挙げられる。
ヒツジ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL 6540、CRL 6538、CRL 6548、およびCRL 6546が挙げられる。
ブタ細胞株の例としては、ATCC番号、CL 184、CRL 6492、およびCRL 1746が挙げられる。
ネコ細胞株の例としては、CRL 6077、CRL 6113、CRL 6140、CRL 6164、CCL 94、CCL 150、CRL 6075、およびCRL 6123が挙げられる。
バッファロー細胞株の例としては、CCL 40およびCRL 6072が挙げられる。
イヌ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL 6213、CCL 34、CRL 6202、CRL 6225、CRL 6215、CRL 6203、およびCRL 6575が挙げられる。
ヤギ由来細胞株の例としては、ATCC番号、CCL 73およびATCC番号CRL 6270が挙げられる。
ウマ由来細胞株の例としては、ATCC番号、CCL 57およびCRL 6583が挙げられる。
シカ細胞株の例としては、ATCC番号、CRL 6193〜6196が挙げられる。
霊長類由来の細胞株の例としては、ATCC番号、CRL 6312、CRL 6304、およびCRL 1868のようなチンパンジー由来の細胞株;ATCC番号、CRL 1576、CCL 26、およびCCL 161のようなサル由来の細胞株；オランウータン細胞株ATCC番号、CRL 1850;およびゴリラ細胞株ATCC番号、CRL 1854が挙げられる。
本明細書において、「侵襲性細菌」は、真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織に送達し得る細菌である。「侵襲性細菌」は、動物細胞の細胞質または核内に自然に侵入し得る細菌、および動物細胞または動物組織内の細胞の細胞質または核内に侵入するように遺伝子操作された細菌を含む。
本発明で用いられる特定の天然に存在する侵襲性細菌は本発明にとって重要ではない。このような天然に存在する侵襲性細菌の例としては、Shigella spp.、Listeria spp.、Rickettsia spp.、および腸内侵襲性Escherichia coliが含まれるが、これらに限定されない。
用いられる特定のShigella株は本発明にとって重要ではない。本発明で用いられ得るShigella株の例としては、Shigella flexneri 2a（ATCC番号29903）、Shigella sonnei（ATCC番号29930）、およびShigella disenteriae（ATCC番号13313）が挙げられる。Shigella flexneri 2a 2457T ΔaroAΔvirG変異株CVD 1203（Noriegaら、上記）、Shigella flexneri M90T ΔicsA変異株（Goldbergら、Infect.Immun.,62:5664−5668（1994））、Shigella flexneri Y SFL114 aroD変異株（Karnellら、Vacc.10:167−174（1992））、およびShigella flexneri ΔaroAΔaroD変異株（Vermaら、Vacc.,９:6−９（1991））のような弱毒化Shigella株が、本発明で好適に用いられる。あるいは、弱毒化した変異を単独で、または１つ以上のさらなる弱毒化変異と組み合わせて導入することによって、新規の弱毒化したShigella spp.株が構築され得る。
弱毒化変異は、化学的にＮ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような薬剤を用いるか、または組み換えDNA技術を用いるかのいずれかの非特異的突然変異生成;Tn10変異誘発、P22−媒介形質導入、λファージ媒介クロスオーバー、および結合転移のような伝統的な遺伝子技術；または組み換えDNA技術を用いる部位特異的突然変異を用いて、細菌病原体に導入され得る。組み換えDNA技術が好適である。何故なら、組み換えDNA技術によって構築される株がはるかにより多く定義されているからである。このような弱毒化変異の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉ）aro（Hoisethら、Nature,291:238−239（1981））、gua（McFarlandら、Microbiol.Path.,3:129−141（1987））、nad（Parkら、J.Bact.,170:3725−3730（1988））、thy（Nnalueら、Infect.Immun.,55:955−962（1987））、およびasd（Curtiss、上記）変異のような栄養要求性変異；
（ii）cya（Curtissら、Infect.Immun.,55:3035−3043（1987））、crp（Curtissら（1987）、上記）、phoP/phoQ（Groismanら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:7077−7081（1989）；およびMillerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:5054−5058（1989））、phoPC（Millerら、J.Bact.,172:2485−2490（1990））、またはompR（Dormanら、Infect.Immun.,57:2136−2140（1989））変異のような、包括的調節機能を不活化する変異；
（iii）recA（Buchmeierら、Mol.Micro.,７:933−936（1993））、htrA（Johnsonら、Mol.Micro.,５:401−407（1991））、htpR（Neidhardtら、Biochem.Biophys.Res.Com.,100:894−900（1981））、hsp（Neidhardtら、Ann.Rev.Genet.,18:295−329（1984））、およびgroEL（Buchmeierら、Sci.,248:730−732（1990））変異のような、ストレス応答を改変する変異；
（iv）lsyA（Libbyら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:489−493（1994）、pagまたはprg（Millerら（1990）、上記；およびMillerら（1989）、上記）、iscAまたはvirG（d'Hautevilleら、Mol.Micro.,６:833−841（1992））、plcA（Mengaudら、Mol.Microbiol.,５:367−72（1991）;Camilliら、J.Exp.Med.,173:751−754（1991））、およびact（Brundageら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890−11894（1993））変異のような、特異的毒性ファクターの変異；
（ｖ）topA（Galanら、Infect.Immun.,58:1879−1885（1990））変異のような、DNAトポロジーに影響を与える変異；
（vi）rfb、galE（Honeら、J.Infect.Dis.,156:164−167（1987））またはvia（Popoffら、J.Gen.Microbiol.,138:297−304（1992））変異のような、表面多糖類の生物発生をブロックする変異；
（vii）sacB（Recorbetら、App.Environ.Micro.,59:1361−1366（1993）;Quandtら、Gene,127:15−21（1993））、nuc（Ahrenholtzら、App.Environ.Micro.,60:3746−3751（1994））、hok、gef、kil、またはphlA（Molinら、Ann.Rev.Microbiol.,47:139−166（1993））変異のような、自殺システムを改変する変異；
（viii）P22によってコードされるリソゲン（Rennellら、Virol.,143:280−289（1985））、λムレイントランスグリコシラーゼ（Bienkowska−Szewczykら、Mol.Gen.Genet.,184:111−114（1981））、またはＳ遺伝子（Readerら、Virol.,43:623−628（1971））のような自殺システムを導入する変異；および
（ix）minB（de Boerら、Cell,56:641−649（1989））変異のような正しい細胞周期を破壊するかまたは改変する変異。
弱毒化変異は、構成的に発現され得るか、あるいはプロモーターの温度感受性熱ショックファミリー（Neidhardtら、前出）、もしくは嫌気的に誘導されるnirBプロモーター（Harborneら、Mol.Micro.、６:2805−2813（1992））のような誘導性プロモーター、またはuapA（Gorfinkielら、J.Biol.Chem.、268:23376−23381（1993））、もしくはgcv（Staufferら、J.Bact.、176:6159−6164（1994））のような抑制性プロモーターの制御下のいずれにおいても発現され得る。
用いられる特定のListeria株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るListeria株の例には、Listeria monocytogenes（ATCC番号15313）が挙げられる。好ましくは、L.monocytogenes ΔactA変異株（Brundageら、前出）またはL.monocytogenes ΔplcA（Camilliら、J.Exp.Med.、173:751−754（1991））のような弱毒化したListeria株が、本発明において用いられる。あるいは、新規の弱毒化したListeria株は、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のRickettsia株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るRickettsia株の例は、Rickettsia rickettsiae（ATCC番号VR149およびVR891）、Ricketsia prowaseckii（ATCC番号VR233）、Ricketsia tsutsugamuchi（ATCC番号VR312、VR150およびVR609）、Ricketsia mooseri（ATCC番号VR144）、Ricketsia sibirica（ATCC番号VR151）、およびRochalimaea quitana（ATCC番号VR358）が挙げられる。弱毒化したRicketsia株が、好ましくは本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定の腸内侵襲性Escherichia株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得る腸内侵襲性Escherichia株の例には、Escherichia coli株4608−58、1184−68、53638−Ｃ−17、13−80、および６−81（Sansonettiら、Ann.Microbiol.（Inst.Pasteur）、132A:351−355（1982））が挙げられる。好ましくは、弱毒化した腸内侵襲性Escherichia株が、本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
侵襲性になるように遺伝子操作され得る細菌の例には、Yersinia spp.、Esherichia spp.、Klebsiella spp.、Bordetella spp.、Neisseria spp.、Aeromonas spp.、Franciesella spp.、Corynebacterium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Hemophilus spp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio spp.、Bacillus spp.、およびErysipelothrix spp.が挙げられるが、これらには限定されない。これらの生物体は、これらの生物体が動物細胞の細胞質に接近することを可能にする遺伝子を挿入することによって、Shigella spp.、Listeria spp.、Rickettsia spp.、または腸内侵襲性E.coli spp.の侵襲特性を模倣するほうに操作され得る。
このような遺伝子の例には、Shigellaの侵襲性タンパク質、Escherichiaの溶血素もしくは侵襲性プラスミド、またはListeriaのリステリオリシンＯが挙げられる。なぜなら、このような技術によれば、感染された動物細胞の細胞質に入り得る株を結果として得られることが知られているからである（Formalら、Infect.Immun.、46:465（1984）;Bieleckeら、Nature、345:175−176（1990）;Smallら、Microbiology−1986、121〜124頁、Levineら編、American Society for Microbiology、Washington,D.C.（1986）；およびZychlinskyら、Molec.Micro.、11:619−627（1994））。動物細胞の細胞質への侵入を仲介する１つ以上の供給源由来の任意の遺伝子または遺伝子の組み合わせで十分である。従って、このような遺伝子は、細菌性遺伝子に限定されず、そしてエンドソームの溶解を促進するインフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA−２のようなウイルス性遺伝子を含む（Plankら、J.Biol.Chem.、269:12918−12924（1994））。
上記侵襲性遺伝子は、染色体またはプラスミドの移動性（Miller、A Short Course in Bacterial Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY（1992）;Bothwellら、前出；およびAusubelら、前出）、バクテリオファージにより仲介される形質導入（de Boer、前出;Miller、前出；およびAusubelら、前出）、または化学的（Bothwelら、前出;Ausubelら、前出;Felgnerら、前出；およびFarhood、前出）、エレクトロポレーション（Bothwellら、前出;Ausubelら、前出；およびSambrook、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY）、および物理的形質転換技術（Johnstonら、前出；およびBothwell、前出）を用いて、標的株へと導入され得る。これらの遺伝子は、バクテリオファージ（de Boerら、Cell、56:641−649（1989））、プラスミドベクター（Curtissら、前出）上に組み込まれるか、または標的株の染色体（Honeら、前出）内にスプライシングされ得る。
用いられる特定のYersinia株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るYersinia株の例には、Y.enterocolitica（ATCC番号9610）またはY.pestis（ATCC番号19428）が挙げられる。Y.enterocolitica Ye03−R2（al−Hendyら、Infect.Immun.,60:870−875（1992））またはY.enterocolitica aroA（O'Gaoraら、Micro.Path.、９:105−116（1990））のような弱毒化したYerinia株が、好ましくは本発明において用いられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したYersinia株が構築され得る。
用いられる特定のEscherichia株は、本発明には、重要ではない。本発明において用いられ得るEscherichia株の例には、E.coli H10407（Elinghorstら、Infect.Immun.、60:2409−2417（1992））、ならびにE.coli EFC4、CFT325およびCPZ005（Donnenbergら、J.Infect.Dis.、169:831−838（1994））が挙げられる。好ましくは、弱毒化した七面鳥病原体（turkey pathogen）であるE.coli 02 carAB変異株（Kwagaら、Infect.Immun.、62:3766−3772（1994））のような弱毒化したEscherichia株が、本発明において用いられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したEscherichia株が構築され得る。
用いられる特定のKlebsiella株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るKlebsiella株の例には、K.pneuoniae（ATCC番号13884）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したKlebsiella株が、本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のBordetella株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るBordetella株の例には、B.bronchiseptica（ATCC番号19395）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したBordetella株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のNeisseria株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るNeisseria株には、N.meningitidis（ATCC番号13077）およびN.gonorrhoeae（ATCC番号19424）が挙げられる。好ましくは、N.gonorrhoeae MS11 aro変異株（Chamberlainら、Micro.Path.、15:51−63（1993））のような弱毒化したNeisseria株が本発明において用いられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したNeisseria株が構築され得る。
用いられる特定のAeromonas株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るAeromonas株には、A.eucrenophila（ATCC番号23309）が挙げられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したAeromonas株が構築され得る。
用いられる特定のFranciesella株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るFraniesella株の例には、F.tularensis（ATCC番号15482）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したFranciesella株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のCorynebacterium株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るCorynebacterium株には、C.pseudotuberculosis（ATCC番号19410）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したCorynebacterium株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のCitrobacter株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るCitrobacter株の例には、C.freundii（ATCC番号8090）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したCitrobacter株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のChlamydia株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るChlamydia株には、C.pneumoniae（ATCC番号VR1310）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したChlamydia株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のHemophilus株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るHemophilus株には、H.sornnus（ATCC番号43625）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したHemophilus株が、本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のBrucella株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るBrucella株の例には、B.abortus（ATCC番号23448）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したBrucella株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のMycobacterium株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るMycobacterium株の例には、M.intracellulare（ATCC番号13950）およびM.tuberculosis（ATCC番号27294）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したMycobacterium株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のLegionella株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るLegionella株には、L.pneumophila（ATCC番号33156）が挙げられる。好ましくは、L.pneumophila mip変異株（Ott、FEMS Micro.Rev.、14:161−176（1994））のような弱毒化したLegionella株が本発明において用いられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したLegionella株が構築され得る。
用いられる特定のRhodococcus株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るRhodococcus株の例には、R.equi（ATCC番号6939）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したRhodococcus株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のPseudomonas株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るPseudomonas株の例には、P.aeruginosa（ATCC番号23267）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したPseudomonas株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のHelicobacter株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るHelicobacter株の例には、H.mustelae（ATCC番号43772）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したHelicobacter株が本発明において用いられ、そして上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって構築され得る。
用いられる特定のSalmonella株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るSalmonella株の例には、Salmonella typhi（ATCC番号7251）およびS.typhimurium（ATCC番号13311）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したSalmonella株が、本発明において用いられ、そして例としてS.typhi aroAaroD（Honeら、Vacc.、９:810−816（1991））およびS.typhimurium aroA変異株（Mastroeniら、Micro.Pathol.、13:477−491（1992））が挙げられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したSalmonella株が構築され得る。
用いられる特定のVibrio株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るVibrio株の例には、Vibrio cholerae（ATCC番号14035）およびVibrio cincinnatiensis（ATCC番号35912）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したVibrio株が本発明において用いられ、そして例としてV.cholerae RSI病原性変異株（Taylorら、J.Infect.Dis.、170:1518−1523（1994））およびV.cholerae ctxA、ace、zot、cep変異株（Waldorら、J.Infect.Dis.、170:278−283（1994））が挙げられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したVibrio株が構築され得る。
用いられる特定のBacillus株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るBacillus株の例には、Bacillus subtilis（ATCC番号6051）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したBacillus株が本発明において用いられ、そして例としてB.anthracis変異株pX01（Welkosら、Micro.Pathol.、14:381−388（1993））および弱毒化したBCG株（Stoverら、Nat.、351:456−460（1991））が挙げられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したBacillus株が構築され得る。
用いられる特定のErysipelothrix株は、本発明には重要ではない。本発明において用いられ得るErysipelothrix株の例には、Erysipelothrix rhusiopathiae（ATCC番号19414）およびErysipelothrix tonsillarum（ATCC番号43339）が挙げられる。好ましくは、弱毒化したErysipelothrix株が本発明において用いられ、そして例としてE.rhusiopathiae Kg−1aおよびKg−２（Wataraiら、J.Vet.Med.Sci.、55:595−600（1993））ならびにE.rhusiopathiae ORVAC変異株（Markowska−Danielら、Int.J.Med.Microb.Virol.Parisit.Infect.Dis.、277:547−553（1992））が挙げられる。あるいは、上記のShigella spp.について記載のように、１つ以上の弱毒化変異を導入することによって、新規の弱毒化したErysipelothrix株が構築され得る。
上述したように、細菌が真核生物発現カセットを送達するレシピエント動物細胞は、魚類、鳥類、または爬虫類由来の細胞であり得る。
魚類細胞の細胞質に生来接近し得る細菌の例には、Aeromonas salminocida（ATCC番号33658）およびAeromonas schuberii（ATCC番号43700）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、弱毒化した細菌が、本発明において用いられ、そして例としてA.salmonicidia vapA（Gustafsonら、J.Mol.Biol.、237:452−463（1994））またはA.salmonicidia芳香族依存性変異株（Vaughanら、Infect.Immun.、61:2172−2181（1993））が挙げられる。
鳥類細胞の細胞質に生来接近し得る細菌の例には、Salmonella galinarum（ATCC番号9184）、Salmonella enteriditis（ATCC番号4931）およびSalmonella typhimurium（ATCC番号6994）が挙げられるが、これらに限定されない。弱毒化した細菌が、本発明において好ましく、そして例としてS.galinarum cya crp変異株（Curtissら、（1987）、前出）またはS.enteritidis aroA芳香族依存性変異株CVL30（Cooperら、Infect.Immun.,62:4739−4746（1994））のような弱毒化したSalmonella株が挙げられる。
爬虫類細胞の細胞質に生来接近し得る細菌の例には、Salmonella typhimurium（ATCC番号6994）が挙げられるが、これに限定されない。弱毒化した細菌が、本発明において好ましく、そして例としてS.typhimuirum芳香族依存性変異株（Hormaecheら、前出）のような弱毒化した株が挙げられる。
また、侵襲性細菌で感染させた特定の動物細胞は、本発明には重要ではなく、用いられる侵襲性細菌の宿主範囲に依存する。
例えば、Shigella flexneriは、ヒトおよび霊長類の細胞に感染するが、イヌおよびその他の動物に感染することはまれである（Kreigら、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、WilkinsおよびWilliams編、Baltimore、MD（1984））。一方、Aeromonas salminocidaは、サケの細胞に感染する（Austinら、Bacterial Fish Pathogens:Diseases in Farmed and Wild Fishes、Ellis Harwood Ltd.編、London（1987））。
粘膜および全身の免疫システムは、分画される（Mesteky、J.Clin.Immunol.、７:265−270（19780;Newby,Local Immune Response of the Gut、Boca Raton、CRC Press、NewbyおよびStocks編、第143−160頁（1984）；およびPascualら、Immuno.Methods.、５:56−72（1994））。従って、粘膜表面に送達された抗原は、粘膜および全身の応答を誘発するが、親から送達された抗原は、主として全身の応答は誘発するものの、わずかな粘膜応答しか刺激しない（Mesteky、前出）。さらに、ある粘膜部位（例えば、腸）における粘膜刺激により、他の粘膜表面（例えば、生殖器／尿道）における免疫の発生を生じ得る（Mesteky、前出）。この現象は、共通粘膜システム（common mucosal system）と呼ばれ、多くの文献に述べられている（Mesteky、前出；およびPascualら、前出）。
粘膜ワクチンの開発は、このような経路により送達された場合、抗原の貧弱な免疫原性によって妨げられてきた。この文脈において、抗原は、以下の２つの類に分類され得る。すなわち、腸の表面に結合する抗原および結合しない抗原との２つである。ここで、前者は、後者よりも有意に免疫原性が高い（De Aizpuruaら、J.Exp.Med.、176:440−451（1988））。同様に、DNA分子の粘膜表面への送達は、胃の障壁および胃腸管におけるヌクレアーゼならびに気道における厚い粘膜層のようなこれらの表面に見られる生来の宿主防御のために有効ではない。
宿主のこれら生来の障壁機能を回避し、そして粘膜画分への接近を可能にするための１つの方策としては、細菌ベクターの使用がある（Curtiss、New Generation Vaccines:The Molecular Approach、Marcel Dekker,Inc.編、New York、NY、161−188頁および269−288頁（1989）；およびMimsら、Medical Microbiology、Mosby−Year Book Europe Ltd.編、London（1993））。特定の腸および呼吸器官の病原体、例えばE.coli、Shigella、Listeria、BordetellaおよびSalmonellaは、生来このような応用に適応づけられている。なぜなら、これらの生物体は、宿主の粘膜表面に付着し、それを侵襲する能力を有しているからである（Kreigら、前出）。従って、本発明では、真核生物発現カセットを宿主の粘膜画分へと送達するために、生体経口細菌ベクターが操作され得る。
あるいは、上述したように、粘膜組織の屈性および侵襲特性を模倣し、それにより細菌を粘膜組織内へと侵襲させ、そして遺伝子をそれらの部位へと送達するために、任意の細菌が遺伝的に操作され得る。
また、ある遺伝子産物を単独で、または組み合わせにより発現させることにより、侵襲性細菌の組織特異性を変化させ得る。例えば、Plasmodium vivax網状赤血球結合タンパク質−１および−２は、ヒトおよび霊長類における赤血球に特異的に結合し（Galinskiら、Cell、69:1213−1226（1992））;Yersiniaインベーシンは、β１インテグリン受容体を認識し（Isbergら、Trends Microbiol.、２:10−14（1994））；アシアロオロソムコイドは、肝細胞上のアシロジコプロテイン（asialoorosomucoid）に対するリガンドであり（Wuら、J.Biol.Chem.、263:14621−14624（1988））；インシュリン−ポリ−Ｌ−リシンの存在は、インシュリン受容体をもつ細胞へのプラスミド摂取を標的化することが示されており（Rosenkranzら、Expt.Cell Res.、199:323−329（1992））;Listeria monocytogenesのp60は、肝細胞への屈性を可能にし（Hessら、Infect.Immun.、63:2047−2053（1995））そしてTrypanosoma cruziは、ヘパリン、硫酸ヘパリンおよびコラーゲンに結合することによって、哺乳動物の細胞外マトリックスへの特異的結合をもたらす60kDa表面タンパク質を発現する（Ortega−Barriaら、Cell、67:411−421（1991））。
本発明において用いられる特定の真核生物カセットは、本発明には重要ではなく、そして例えば、Invitrogen Corporation（San Diego、CA）から入手可能なpCEP4あるいはpRc/RSV、Stratagene（La Jolla、CA）から入手可能なpXT1、pSG5、pPbacあるいはpMbac、ClonTech（Palo Alto、CA）から入手可能なpPURあるいはpMAM、およびPromega Corporation（Madison、WI）から入手可能なpSVβ−galのような多数の市販されているカセットのいずれかから選択され得、または、デノボに、あるいは公共のもしくは市販の真核生物発現システムを適用することにより合成され得る。
真核生物発現カセット内の個々の因子は、複数の供給源から導き出され得、そして作用部位における特異性を付与するように、あるいはレシピエント細胞におけるカセットの長寿を付与するように選択され得る。真核生物発現カセットのこのような操作は、任意の標準的な分子生物学的アプローチによりなされ得る。
これらカセットは、通常、プラスミドの形態であり、そして例えば、ウイルス由来のSV40、CMV、ならびに、RSVプロモーターあるいは真核生物由来のβ−カゼイン、ウテログロビン、β−アクチンまたはチロシナーゼプロモーターのような動物細胞における遺伝子発現を駆動するのに有用であることが周知のさまざまなプロモーターを含む。特定のプロモーターは、選択的な細胞タイプにおいてのみ発現を得ることが目的である場合を除いて、本発明には重要ではない。この場合、プロモーターは、選択された細胞タイプにおいてのみ活性となるプロモーターが選択される。組織特異的プロモーターの例には、乳房組織に特異的であるαS1−およびβ−カゼインプロモーター（Platenburgら、Trans.Res.、３:99−108（1994）；およびMagaら、Trans.Res.、３:36−42（1994））；肝臓、腎臓、脂肪、空腸および乳房組織において活性であるホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼプロモーター（McGraneら、J.Reprod.Fert.、41:17−23（1990））；肺および脾臓細胞においては活性であるが、睾丸、脳、心臓、肝臓あるいは腎臓においては活性ではないチロシナーゼプロモーター（Vileら、Canc.Res.、54:6228−6234（1994））；鱗状上皮の分化ケラチノサイトにおいてのみ活性であるインボルセリンプロモーター（Carrollら、J.Cell Sci.、103:925−930（1992））；および肺および子宮内膜において活性であるウテログロビンプロモーター（Helftenbeinら、Annal.N.Y.Acad.Sci.、622:69−79（1991））が挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、発現を制御するためには、細胞特異的エンハンサー配列が用いられ得る。例えば、ヒトの神経親和性パポウイルスJCVエンハンサーは、神経膠細胞のみにおいてウイルスの転写を調節する（Remenickら、J.Virol.、65:5641−5646（1991））。組織特異的発現を制御するさらに別の方法は、どの細胞株においてプロモーターが活性になるかを特定するためにホルモン応答因子（HRE）を用いることである。例えば、MMTVプロモーターは、プロゲステロン受容体のようなホルモン受容体を、それが活性化される前に、上流HREへと結合することを必要とする（Beato、FASEB J.、５:2044−2051（1991）；およびTrussら、J.Steriod Biochem.Mol.Biol.、41:241−248（1992））。
レシピエント動物細胞内でのプラスミドのふるまいを改良するために、さらなる遺伝的因子をプラスミドに含有し得る（Hodgson、Bio/Technology、13:222−225（1995））。このような因子は、哺乳動物の人工染色体因子、あるいは、発現カセットの安定な非組み込み保持を可能にする、DiFi結腸直腸癌細胞に見られるような自律複製環状小染色体からの因子（Huxleyら、Bio/Technology、12:586−590（1994）；およびUntawaleら、Canc.Res.、53:1630−1636（1993））レシピエント細胞染色体への発現カセットの組み込みを指向するインターグラーゼ（Bushman、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、91:9233−9237（1994））、レシピエント細胞染色体への非相同組み込みを促進するアデノ関連ウイルスからの反転された反復体（Goodmanら、Blood、84:1492−1500（1994））、相同組換えを促進するrecAまたは制限酵素（PCT国際特許公開第WO9322443号（1993）；およびPCT国際特許公開第WO9323534−Ａ号（1993））または真核生物発現カセットの核標的化を指向する因子（Hodgson、前出；およびLewin、前出）が挙げられるが、これらに限定されない。インターグラーゼ、recAおよび制限酵素のようなこれらの因子のいくつかを、原核生物発現カセット内で、真核生物発現カセットと同じ遺伝的因子上か、あるいは別の遺伝的因子上にコードすることは、有効であり得る。このような有毒または有害な因子を原核生物プロモーターの制御下に置くことによって、細菌細胞が溶解する前の、原核生物翻訳および転写機が機能している間に、これらの因子をただ転写または翻訳することが確実にできる。よって、有限な投与量のコードされた因子が、真核生物レシピエントへと送達される。
本発明においては、生体侵襲性細菌が、遺伝子をコードする真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織内へと送達し得る。この遺伝子は、外来遺伝子であり得るか、あるいは内因性遺伝子であり得る。本明細書中で用いられるように、「外来遺伝子」とは、ワクチン抗原、免疫調節剤、あるいは治療剤のような、レシピエント動物細胞あるいは組織に対して外来である、タンパク質をコードする遺伝子あるいはその断片、またはアンチセンスRNA、または触媒RNAを意味する。「内因性遺伝子」とは、レシピエント動物細胞または組織に生来存在する、タンパク質をコードする遺伝子あるいはその一部、またはアンチセンスRNA、または触媒RNAを意味する。
ワクチン抗原は、ウイルス性病原体、細菌性病原体および寄生病原体からのタンパク質であり得るか、またはその抗原性断片であり得る。あるいは、ワクチン抗原は、組換えDNA法を用いて構築され、ウイルス性病原体、細菌性病原体、寄生病原体からの抗原またはその一部をコードする、合成遺伝子であってもよい。これらの病原体は、ヒト、家畜動物または野生動物の宿主において感染性であり得る。
抗原は、その動物宿主に入り、そこにコロニーを形成するか、または複製する前またはその間に、任意のウイルス性病原体、細菌性病原体または寄生病原体により発現される任意の分子であり得る。
ウイルス性抗原、細菌性抗原、寄生抗原またはウイルス性抗原、細菌性抗原または寄生抗原の全部、一部または任意の組み合わせをコードする合成遺伝子の任意の組み合わせを発現する複数の真核生物発現カセットが、送達され得る。
ウイルス性抗原が誘導されるウイルス性病原体は、インフルエンザウイルスのようなオルトミクソウイルス;RSVおよびSIVのようなレトロウイルス;EBVのようなヘルペスウイルス;CMVまたは単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルスのようなレンチウイルス；狂犬病のようなラブドウイルス；ポリオウイルスのようなピコルノウイルス；痘疹のようなポックスウイルス；ロタウイルス；およびパルボウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルス性病原体の保護抗原の例には、ヒト免疫不全ウイルス抗原Nef、p24、gp120、gp41、Tat、Rev（Polら、Nature、313:277−280（1985））ならびにgp120のＴ細胞およびＢ細胞エピトープ（Palkerら、J.Immunol.、142:3612−3619（1989））;B型肝炎表面抗原（Wuら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、86:4726−4730（1989））;VP4（Mackowら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、87:518−522（1990））およびVP7（Greenら、J.Virol.、62:1819−1823（1988））のようなロタウイルス抗原；赤血球凝集素あるいは核タンパク質のようなインフルエンザウイルス抗原（Robinsonら、前出;Websterら、前出）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Whitleyら、New Generation Vaccines、825−854頁）が挙げられる。
細菌性抗原が誘導される細菌性病原体は、Mycobacterium spp.、Helicobacterpylori、Salmonella spp.、Shigella spp.、E.coli、Rickettsia spp.、Listeria spp.、Legionella pneumoniae、Pseudomonas spp.、Vibrio spp.およびBorellia Burgdorferiが挙げられるが、これらに限定されない。
細菌性病原体の保護抗原の例には、Shigella sonnei1型抗原（Formalら、Infect.Immun.、34:746−750（1981））;V.cholerae Inaba株569BのＯ抗原（Forrestら、J.Infect.Dis.、159:145−146（1989））;CFA/I采状抗原（Yamamotoら、Infect.Immun.、50:925−928（1985））および非耐熱性毒素の非毒性Ｂサブユニット（Clementsら、46:564−569（1984））のような腸毒素産生性E.coliの保護抗原;Bordetella pertussisのパータクチン（Robertsら、Vacc.、10:43−48（1992））;B.pertussisのアデニル酸シクラーゼヘモリシン（Guisoら、Micro.Path.、11:423−431（1991））；およびClostridium tetaniの破傷風毒素の断片Ｃ（Fairweatherら、Infect.Immun.,58:1323−1326（1990））が挙げられる。
寄生抗原が誘導される寄生病原体は、Plasmodium spp.、Trypanosome spp.、Giardia spp.、Boophilus spp.、Babesia spp.、Entamoeba spp.、Eimeria spp.、Leishmania spp.、Schistosome spp.、Brugia spp.、Fascida spp.、Dirofilaria spp.、Wuchereria spp.、およびOnchocerea spp.が挙げられるが、これらに限定されない。
寄生病原体の保護抗原の例には、P.bergeriiの周囲スポロゾイト（circumsporozoite）抗原あるいはP.falciparumの円形スポロゾイト抗原のようなPlasmodium spp.の円形スポロゾイト抗原（Sadoffら、Science、240:336−337（1988））;Plasmodium spp.のメロゾイト表面抗原（Spetzlerら、Int.J.Pept.Prot.Res.、43:351−358（1994））;Entamoeba historyticaのガラクトース特異的レクチン（Mannら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、88:3248−3252（1991））、Leishmania spp.のgp63（Russellら、J.Immunol.、140:1274−1278（1988））、Brugia malayiのパラミオシン（Liら、Mol.Biochem.Parasitol.、49:315−323（1991））、Schistosoma mansoniのトリオースリン酸イソメラーゼ（Shoemakerら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、89:1842−1846（1992））;Trichostrongylus colubriformisの分泌されたグロビン様タンパク質（Frenkelら、Mol.Biochem.Parasitol.50:27−36（1992））;Frasciola hepaticaのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Hillyerら、Exp.Parasitol.、75:176−186（1992））;Schistosoma bovisおよびS.japonicum（Bashirら、Trop.Geog.Med.、46:255−258（1994））；ならびに、Schistosoma bovisおよびS.japonicumのKLH（Bashirら、前出）が挙げられる。
本発明においては、生体侵襲性細菌はまた、治療剤をコードする真核生物発現カセットを動物細胞または動物組織へ送達し得る。例えば、真核生物発現カセットは、腫瘍特異的な、移植型の、あるいは自己免疫性の抗原またはその一部をコードし得る。あるいは、真核生物発現カセットは、腫瘍特異的な、移植型の、あるいは自己免疫性の抗原またはその一部をコードする合成遺伝子をコードし得る。
腫瘍特異的抗原の例には、前立腺特異的抗原（Gattusoら、Human Pathol.、26:123−126（1995））、TAG−72およびCEA（Guadagniら、Int.J.Biol.Markers、９:53−60（1994））、MAGE−１およびイロシナーゼ（Coulieら、J.Immunothera、14:104−109（1993））が挙げられる。最近、腫瘍抗原を発現する非悪性細胞を用いた免疫がワクチン効果を実現し、そして、動物が、同じ抗原を示す悪性腫瘍細胞を除去する免疫応答を強化する助けになることが、マウスにおいて示された（Koeppenら、Anal.N.Y.Acad.Sci.、690:244−255（1993））。
移植型抗原の例には、Ｔ細胞のCD3受容体が挙げられる（Alegreら、Digest.Dis.Sci.、40:58−64（1995））。CD3受容体に対する抗体を用いた処理は、循環するＴ細胞を迅速に除去し、拒絶エピソードの大半を逆にすることが示されている（Alegreら、前出）。
自己免疫抗原の例としては、IASβ鎖（Tophamら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:8005−8009（1994））が挙げられる。IASβ鎖からの18個のアミノ酸ペプチドをマウスに予防接種すると、実験的に自己免疫脳脊髄炎を有するマウスに対して予防および処置を提供することが示された（Tophamら、上述）。
あるいは、本発明において、生きた侵襲性細菌は、免疫調節分子をコードする真核生物発現カセットを送達し得る。これらの免疫調節分子は、Ｍ−CSF、GM−CFSのような増殖因子；ならびにIL−２、IL−４、IL−５、IL−６、IL−10、IL−12またはIFN−γのようなサイトカインを含むが、これらに限定されない。近年、サイトカイン発現カセットの腫瘍組織への送達が、全身性のサイトカイン毒性を生じることなく、強力な全身性免疫および増大した腫瘍抗原の提示を刺激することが示された（Golumbekら、Canc.Res.、53:5841−5844（1993）;Golumbekら、Immun.Res.、12:183−192（1993）;Pardoll、Curr.Opin.Oncol.４:1124−1129（1992）；およびPardoll、Curr.Opin.Immunol.、４:619−623（1992））。
動物細胞に送達されるアンチセンスRNAおよび触媒RNA種は、受容細胞内に存在するかまたは受容細胞内に存在し得る任意の分子に対して標的づけられ得る。これらは、インターロイキン−６のような細胞調節分子をコードするRNA種（Mahieuら、Blood、84:3758−3765（1994））、rasのような腫瘍遺伝子（Kashani−Sabetら、Antisen.Res.Devel.,２:3−15（1992））、ヒトパピローマウイルスのような癌の原因因子（Steeleら、Canc.Res.、52:4706−4711（1992））、酵素、HIV−１のようなウイルスRNAおよび病原体由来のRNA（Meyerら、Gene、129:263−268（1993）;Chatterjeeら、Sci.、258:1485−1488（1992）；およびYamadaら、Virol.、205:121−126（1994））を含むが、これらに限定されない。RNAはまた、プロモーターまたはエンハンサー領域などの非転写DNA配列において標的とされ得るか、または限定はされないがDNA合成もしくはtRNA分子に関与する酵素のような受容細胞に存在する他の任意の分子を標的とし得る（Scanlonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:10591−10595（1991）；およびBaierら、Mol.Immunol.、31:923−932（1994））。
本発明において、生きた侵襲性細菌はまた、タンパク質をコードする真核生物発現カセットを動物組織に送達し得、後にこの動物組織からカセットを収穫または精製し得る。一例としては、α１−アンチトリプシンをコードするマウス乳腫瘍ウイルス（ATCC番号VR731）由来のような乳房特異的ウイルスプロモーターの制御下での真核生物発現カセットのヤギまたはヒツジの乳房組織への送達が挙げられる。
あるいは、真核生物発現カセットを保有する侵襲性細菌は、組織部位から広がらないように組織部位に導入され得る。これは、任意のいくつかの方法により他姓され得る。これらの方法は、非常に制限された投与量の送達、迅速に不活性化されるかまたは死滅する、asd変異体のような高度に弱毒化された栄養要求性株（cyrtissら、上述）の送達、またはanerobic nirBプロモーター（Harborneら、上述）（これは、受容宿主組織内でスイッチオンされる）のような、強力なプロモーターの制御下での自殺系（Rennellら、上述；およびReaderら、上述）のような弱毒化領域を含有する細菌性の送達を含む。さらに、異なる種および／または侵襲性細菌の血清型の多数投与量を用いることによって、目的の真核生物発現カセットは、動物に与えられ、発現レベルまたは生産型を操作し得る。このアプローチは、現在の場合のように、組織特異的プロモーターを含み、そして発現の厳格な制御を有する特別に飼養されたトランスジェニック動物を不必要にする（Janneら、Int.J.Biochem.、26:859−870（1994）;Mullinsら、Hyperten.、22:630−633（1993）；およびPersuyら、Eur.J.Bichem.、205:887−893（1992））。
さらなる代替として、腫瘍特異的抗原、移植恋おう原、および／または自己免疫抗原をコードする１つのまたは複数の真核生物発現カセットは、免疫調節分子または他のタンパク質をコードする真核生物発現カセットとの１つのまたは複数の任意の組合せで送達され得る。
なおさらに別のアプローチは、真核生物発現カセットと組合せて原核生物発現カセットを送達することである。
真核生物発現カセットを含む侵襲性細菌は、インビトロで培養される動物細胞を感染するために用いられ得る。この動物細胞は、インビトロでさらに培養され得、所望の遺伝的特徴を有する細胞は、細菌感染（bactofection）時に受容細胞に導入される任意の選択マーカーに対する選択によって富化され得る。このようなマーカーには、例えば、ハイグロマイシン、もしくはネオマイシンなどの抗生物質耐性遺伝子、選択細胞表面マーカー、または細菌感染によって導入または改変される他の任意の表現型もしくは遺伝子型エレメントが含まれ得る。次いで、これらのインビトロで感染された細胞またはインビトロで富化された細胞は、静脈注射、筋肉注射、皮内注射、もしくは腹腔内注射、または細胞を宿主組織に侵入させることが可能な任意の接種経路によって、動物に導入され得る。
あるいは、真核生物発現カセットを含む侵襲性細菌は、静脈、筋肉、皮内、腹腔内、経口、鼻腔内、眼内、直腸内、膣内、経口挿入および尿道内接種の経路によって導入されて動物を感染し得る。
投与される本発明の生きた侵襲性細菌の量は、被験体の種、および処置されている疾病または健康状態に応じて変化する。一般に、使用される投与量は、約103〜1011の生存能力のある生物体、好ましくは約105〜109の生存能力のある生物体である。あるいは、個々の細胞を細菌感染する場合、投与される生存能力のある生物体の投与量は、約0.1から106、好ましくは約102から104の範囲の感染多重度である。
本発明の侵襲性細菌は、一般に、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液と共に投与される。
用いられる特定の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈液は、本発明には重要ではない。希釈液の例としては、リン酸緩衝化生理食塩水、スクロースを含有するクエン酸緩衝液（pH7.0）のような胃中の胃酸に対して緩衝する緩衝液、重炭酸緩衝液（pH7.0）単独（Levineら、J.Clin.Invest.、79:888−902（1987）；およびBlackら、J.Infect.Dis.、155:1260−1265（1987））、またはアスコルビン酸、ラクトース、および必要に応じてアスパルテームを含有する重炭酸緩衝液（pH7.0）（Levineら、Lancet、II:467−470（1988））が挙げられる。キャリアの例としては、タンパク質（例えば、スキムミルク中に見出される）、糖（例えば、スクロース）、またはポリビニルピロリドンが挙げられる。代表的には、これらのキャリアは、約0.1〜90％（w/v）の濃度で用いられるが、好ましくは１〜10％（w/v）の範囲の濃度で用いられる。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
真核生物発現カセットを必要とする細菌感染
侵襲性細菌での感染は、動物細胞中に外来遺伝子を導入し得、次いでこれが動物細胞によって発現されること（以下「細菌感染」と呼ぶ）を示すために、以下の実験を行った。
A.真核生物発現カセット
Promega Corp.（TB094、Promega Corp.）によって記載されるように、ΔaroA弱毒化障害およびΔvirG弱毒化障害のを両方を含有する弱毒化Shigella flexneri株（Noriegaら、上述）を、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ（β−gal）を含有するpSVβ−gal（Promega Corporation、Madison、WI）（以後、「ｐβ−gal＋SV」と呼ぶ）またはウイルス由来のSV40真核生物プロモーター領域を欠失するその誘導体（以後、「ｐβ−gal−SV」と呼ぶ）のいずれかで形質転換した。両構築物はまた、S.flexneriによってβ−galの発現を可能にする原核生物Escherichia coli gptプロモーターを含有する。
ｐβ−gal−SVを、SV40プロモーターを、Hind IIIおよびNco I制限エンドヌクレアーゼ消化によってｐβ−gal＋SVから除去し、DNAオーバーハングを挿入し、次いで、標準的な分子生物学技術（Sambrookら、上述）を用いて再連結を行うことによって得た。SV40プロモーター領域の欠失を、制限消化分析によって確認した。
従って、ｐβ−gal＋SVは、機能的な
真核生物発現カセットを含有し、一方ｐβ−gal−SVは、機能的な原核生物プロモーターのみを含有する。
得られた形質転換細菌を、−70℃に維持した30％（w/v）グリセロールストックから100μg/mlのアンピシリン含有固形培地（Tryptic Soy Agar、DIFCO、Madison、WI）に蒔いてプラスミドを含有する細菌を選択し、37℃で一晩増殖した。
B.
真核生物細胞
HeLa細胞（ATCC番号CCL−２）を、10％（v/v）のウシ胎児血清、2.0mMのＬ−グルタミン、1.0mMのＬ−ピルピン酸、50U/mlのペニシリン、および50μg/mlのストレプトマイシンを補給したRPMI培地（以後、「RPMI/FBS」と呼ぶ）中で５％（v/v）CO2中37℃でプラスチック組織培養プレート上で増殖させた。細菌感染の24〜48時間前に、HeLa細胞を1.0mMのEDTAを含有する0.25％（w/v）トリプシンでトリプシン処理し、細胞が実験時に40〜60％コンフルエントとなるように希釈を制限することによって分離した。
細菌感染の前に、存在するHeLa細胞の数を血球計でカウントすることによって確認した（Celis、Cell Biology:A Laboratory Manual、Ed.Academic Press、San Diego、CA（1994））。
C.真核生物細胞の細菌感染
５×104のHeLa細胞を、ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシン欠失RPMI培地（以後、「SFM」と呼ぶ）で一度洗浄し、次いでSFM中で細菌懸濁液を重層し、そして５％のCO2中37℃でインキューベートした。細菌懸濁液は、一晩の寒天プレート、または新鮮なブロース培養物由来であり、そして１個のHeLa細胞に対して約101〜103の生存能力のある形質転換細菌の感染比を与えるように調製した。
３時間後、細胞外細菌を含有するSFMを除去し、HeLa細胞をRPMI/FBSで一度リンスし、次いで100μg/mlのゲンタマイシンを含有する新鮮なRPMI/FBSを加えた。５％のCO2中で37℃でのさらなる一時間のインキュベートに続いて、ゲンタマイシン溶液を除去し、HeLa細胞をRPMI/FBSで一度リンスし、新鮮なRPMI/FBSを加え、そして細胞を５％のCO2中37℃に戻した。
細菌感染の６時間、24時間、48時間、72時間および92時間後に、HeLa細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（以後、「PBS」と呼ぶ）で２度洗浄し、Hawley−Nelsonら、Focus、15:73−79（1993）によって記載されるようにβ−gal活性について染色し、そして次いで写真を撮った。分析前のインキュベーション時間が48時間よりも長い場合には、RPMI/FBSを48時間で交換した。
細胞質が均一に青色に染色されている細胞は、ｐβ−gal＋SVを含有するS.flexneriで細菌感染したHeLa細胞についてのみ観察され、そしてｐβ−gal−SVを含有するS.flexneriで細菌感染したHeLa細胞については観察されなかった。コンフルエントな染色の平均的な程度は、細菌感染と写真撮影との間の期間が長いほど大きかった。これは、発現が細菌感染前にShigellaによって合成されたβ−galのみに起因したのではなく、HeLa細胞内で新たに合成されたβ−galの結果であったことを示している。このことは、時間に関連して染色の程度が増加しなかったｐβ−gal−SV細菌感染細胞によって確認された。
青色に染色されたサイトソル内細菌（E.coligptプロモーターのβ−galがオフのS.flexneri発現の結果）および／または25％以下の青色に染色された細胞質を有する細胞として定義されるような、形質転換はされていないが細菌に関連するHeLa細胞（以後、「トランスフェクトされていない」と呼ぶ）に対する、25％より多くの細胞形質が青色に染色された細胞として定義される、陽性β−gal染色細菌感染形質転換HeLa細胞（以後、「トランスフェクトされた」と呼ぶ」の比を、各３ウェルにおいて500個の細胞をカウントすることによって決定した。両セットの細菌感染細胞において、少数（ウェル当たり５以下）のHeLa細胞をS.flexneriに過剰感染させた。これらの過剰感染細胞は、顕微鏡によって見られる個々の青色に染色された細菌のために、その「不調和（patchy）」な外観および不均一な着色によって識別可能であった。これらの過剰感染細胞は、25％より多いの青色染色を有するものとしてはカウントされなかった。この結果を以下の表１に示す。
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上記の表１に示されるように、β−gal構築物（ｐβ−gal＋SV）を含有する真核生物SV40プロモーターで細菌感染したHeLa細胞のみが、形質転換表現型であった。これは、青色のβ−gal表現型が原核生物的に発現したβ−galによるものではなく、むしろ細菌感染したHeLa細胞による発生期の合成によるものであったことを示している。
HeLa細胞内部の弱毒化S.flexneriの生存を、標準的な方法により細菌感染後の６時間、24時間、48時間、72時間および92時間で各３ウェル中に存在する生存能力のある細菌をカウントすることによって決定した（Celis、Cell Biology:A Laboratory Manual、Ed.Academic Press、San Diego CA（1994））。すなわち、細菌感染後のHeLa細胞を、1.0％（w/v）のデオキシコール酸で溶解し、生存能力のある細菌を固形培地上で数えた。S.flexneri::pβ−gal＋SVに細菌感染したHeLa細胞に関する結果を図1Aに、そしてS.flexneri::pβ−gal−SVに細菌感染したHeLa細胞に関する結果を図1Bに示す。
図1Aおよび1Bに示すように、S.flexneriは、HeLa細胞内部で迅速に不活性化された。このことは、β−gal表現型の増加が新しい酵素合成によるものであることをさらに示している。すなわち、本実施例で用いられるプラスミドは、pSVβ−gal由来のものであり、そして真核生物オリジンの複製を欠失する。それゆえ、これらのプラスミドは、受容HeLa細胞内では複製していない。従って、プラスミドの隔絶は調節されず、そして新しい娘細胞は、永久的に形質転換された表現型を発展させるのに十分なプラスミドを含まない。
細菌感染がHeLa細胞を殺傷していなかったことを確認するために、細菌感染したコントロールHeLa細胞（S.flexneri::pβ−gal＋SVを使用）を、Celis（上述）によって記載されるトリプシン処理後の血球計による規則的な間隔での方法でカウントした。その結果（各時間ごとの２ウェルの平均）を図２に示す。
図２に示すように、HeLa細胞の数は実験を通じて増加し続け、細菌感染のプロセスが宿主細胞に対する重篤な細胞毒性なしに成し遂げられ得ることを示した。
実施例２
種々の細胞型の細菌感染
上皮様ヒト子宮頸HeLa細胞以外の細胞株を形質転換する細菌感染の能力を確かめるために、さらに２つの上皮様細胞株および１つの腎臓細胞株を細菌感染に供した。
さらに詳細には、Int 407（ATCC番号CCL−６）、ヒト胎児回腸／空腸細胞株;CaCo−２（ATCC番号HTB−37）、ヒト結腸細胞株；およびMDCK（ATCC番号CCL−34）、イヌ腎臓細胞株を培養し、そしてｐβ−gal＋SVまたはｐβ−gal−SVのいずれかを含有するS.flexneriで感染し、HeLa細胞に関して上記の実施例１で記載したように、細菌感染後24時間のβ−gal活性を評価した。
ｐβ−gal＋SVを用いて、形質転換されたβ−gal陽性染色細胞を、Int 407およびCaCo−２細胞について得たが、予想通りMDCK細胞については得られなかった。すなわち、細菌感染は、野生型のShigella種により見出される天然の侵襲特性を反映しているようであり、このようなShigellaがイヌに感染するのは非常にまれで、そして通常は、上皮細胞においてのみ見いだされるからである（Kreigら、上述）。
従って、本発明の方法が、１つの動物細胞型に限定されず、しかし種々の組織から得られる動物細胞に適用可能であることは明白である。
実施例３
種々の外来抗原の細菌感染媒介性発現
細菌感染が、HeLa細胞、およびヒト抹消血由来単核細胞において種々の外来抗原の発現を媒介し得ることを示すために、以下の実験を行った。
A.真核生物発現カセット
S.flexneriΔaroΔvirG株を、市販の真核生物レポータープラスミドpGFP−C1（Stratagene、La Jolla、CA）で形質転換した。このプラスミドは、Aequorea victoriaクラゲ緑色蛍光タンパク質（GFP）（Wangら、Nature、369:400−403（1994））をコードする遺伝子の発現を駆動するウイルス由来のCMV真核生物プロモーターを含む。プラスミドpGFP−C1は、原核生物宿主においてGFPを発現する正しい位置では原核生物プロモーターを含まない。すなわち、GFP遺伝子は、機能的な原核生物発現カセット内には位置しない。プラスミドが真核生物細胞に送達されるのは、GFPが真核生物発現カセットから生成されるときのみである。
さらに、安定なエピソーム真核生物プラスミドpCEP4（Invitrogen Corporation、San Diego、CA）上にHIV−１のgp160領域を含む真核生物発現カセットを構築した。プラスミドを、HIV−１分子クローンpBH10から増幅したtatのエクソン１からrevの最後のエクソンにわたる3.5kbのPCR増幅Xba I::Not Iフラグメントをクローニングすることによって作製した（Ratnerら、上述）。このプラスミドをプラスミドpCEP4::gp160と称した。宿主プラスミドpCEP4の設計のために、クローニングされたgp160配列は、真核生物細胞内でのみ発現される。すなわち、この配列は、原核生物発現カセットではなく、真核生物発現カセット内に存在する。
B.真核生物細胞
細菌感染前に24時間カバーガラス上で増殖させたこと以外は上記の実施例１に記載するように、HeLa細胞を得、そして調製した。
単核細胞を、カバーガラスに付着する前に５日間、テフロンビーカー中で10％（v/v）のヒト血清を補給したRPMI培地で培養することによって、細菌感染前に24時間マクロファージを富化した。
C.真核生物細胞の細菌感染
上記の実施例１に記載するように、HeLa細胞およびマクロファージの両方を、pGFP−C1で形質転換したS.flexneri ΔaroΔvirG株に細菌感染させた。48時間の細菌感染後、細菌感染した形質転換動物細胞によって合成されたGFPの存在を、蛍光顕微鏡によって緑色蛍光で可視化した。その結果、HeLa細胞およびマクロファージは両方とも、細菌感染し、そのために、発現されたGFPによる蛍光性を有する細胞と、細菌感染せず、そのために、蛍光性を有さない細胞との２つの群に分かれた。細菌感染していないHeLa細胞に対する細菌感染したHeLa細胞の比は、ｐβ−gal＋SVに関して見られるのと明らかに同様であったが、細菌感染したマクロファージは少なかったようであった。
さらに、pCEP4::gp160またはpCEP4のいずれかで形質転換したShigella ΔaroΔvirGを用いて、上記の実施例１に記載するように、カバーガラス上で増殖したHeLa細胞を細菌感染させた。細菌感染の48時間および72時間後に、カバーガラスをRPMI/FBSから取り出し、PBSで２度リンスし、次いで、−20℃のメタノール中で２時間より長く固定した。固定後、Harlowら、Antibodies、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY（1988）によって記載されるように、抗gp160モノクローナル抗体反応混液（Abaciogluら、AIDS Res.およびHuman Retroviruses、10（４）:371−381（1994））、およびFITC標識検出抗体を用いて、gp160タンパク質を免疫蛍光によって検出した。蛍光顕微鏡で明視化すると、２つの細胞群、即ち、陽性の染色細菌感染し形質転換された、gp160を発現する細胞と、非形質転換細胞との両方が可視化された。細菌感染していないHeLa細胞に対する細菌感染したHeLa細胞の比は、ｐβ−gal＋SVに関して見られたのと明らかに同様であった。しかし、gp160の過剰発現のために、形質転換された細胞は、変形しているようであり、長期間は本質的に不安定であった。
実施例４
他の弱毒化した病斑での細菌感染
実施例１で用いられるS.flexneri株におけるΔaroΔvirG弱毒化が細菌感染に必要でないことを示すために、Δasd弱毒化を有する第２のS.flexneri株を、ｐβ−gal＋SVおよびｐβ−gal−SVプラスミドで形質転換し、実施例１に記載するように種々の細胞型の細菌感染実験に用いた。
Δasd弱毒化（EC 1.2.1.11）は、原核生物における細胞壁の合成に必要なペプチドグリカンの製造を停止させる（Cohenら、Escherichia coliおよびSalmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology、１巻、429〜444頁、Ingrahamら編、American Society of Microbiology、Washington、D.C.（1987））。増殖培地に外部から添加されたDL−α、ε−ジアミノピメリン酸（本明細書中以後、「DAP」と呼ぶ）が存在しないと、Δasdが弱毒化された原核細胞は溶解する。この化合物は、真核生物細胞内には存在しない。
Δasd弱毒化が存在すると、ΔaroΔvirG菌株と比較して、HeLa、Int−407、およびCaCo−２細胞に侵襲する能力がわずかに低下する。この弱毒化菌株はまた、MDCK細胞にも侵襲できないことが見いだされた。３時間の侵襲インキュベーション中にDAP（50μl/ml）を細菌細胞懸濁液に添加すると、侵襲レベルは、ΔaroΔvirGが弱毒化された株に関して見られるレベルまで回復した（以下の表２を参照のこと）。
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上記の表２は、DAPを添加したまたは添加しないS.flexneri Δasd形質転換体による細菌感染の48時間後に形質転換された表現型を示すHeLa細胞の数を示す。細胞をβ−gal活性について一晩染色し、次いで、各３ウェルにおいて500個の細胞を計数した。平均±標準エラーを示す。ｐβ−gal＋SVを含有するS.flexneri Δasdで細菌感染させたHeLa細胞のみが、青色のβ−gal陽性表現型となった。
このように、弱毒化の性質は、細菌感染が起こるためには重要ではないが、形質転換のレベルに影響を与え得る。
HeLa細胞内の弱毒化されたS.flexneri Δasd（＋DAP）の生存は、実施例１で記載したように細菌感染の６時間、24時間、48時間、および96時間後に３ウェルのそれぞれに存在する生存能力のある細菌を計数することによって決定した。S.flexneri::pβ−gal＋SVで細菌感染させたHeLa細胞についての結果を図3Aに、そしてS.flexneri::pβ−gal−SVで細菌感染させたHeLa細胞についての結果を図3Bに示す。図3Aおよび3Bに示すように、S.flexneriは、HeLa細胞内では複製していなかった。従って、β−gal表現型の増加は、新規の酵素合成によるはずである。
細菌感染がHeLa細胞を殺さないことを確認するために、細菌感染したコントロールHeLa細胞（S.flexneri::pβ−gal＋SVを用いる）を実施例１に記載するように計数した。その結果（即ち、各時点ごとの２ウェルの平均）を図４に示す。
図４に示すように、HeLa細胞の数は、実験を通じて増加し続け、これは、細菌感染のプロセスが細胞傷害性でなかったことを示す。
実施例５
インビボでのレポーター遺伝子の動物組織への送達
細菌感染がインビボで起こり得ることを示すために、抑制マウス（Balb/c）に、10μｌのPBSの容量でｐβ−gal＋SVまたはｐβ−gal−SVのいずれかを含有する５×106個の生存能力のあるS.flexneri ΔaroΔvirGを鼻腔内接種した。接種の48時間後、マウスを屠殺し、肺組織を採取し、そして−70℃に凍結した。凍結切片（5.0μＭ）を調製し、固定し、次いで上記（Hawley−Nelsonら、上述）のようにβ−gal活性について一晩染色した。染色後、切片をPBSで２度リンスし、次いでカバーガラス下に密封した。
青色に染色したβ−gal−陽性細胞は、ｐβ−gal＋SVで感染させた肺部分ごとに見ることができたが、ｐβ−gal−SVで感染させた肺部分には見られなかった。
このように、細菌感染は、インビトロにおける適用に限定される現象ではなく、インビボの使用にもまた適切である。
実施例６
細菌感染は、生存能力および侵襲表現型の両方を必要とする
細菌感染が起こるために生存能力または活発な侵襲表現型のいずれかが必要であるかどうかを決定するために、非侵襲性（コンゴレッド陰性）S.flexneri ΔaroΔvirG::pβ−gal＋SVおよび紫外線致死性侵襲性（コンゴレッド陽性）S.flexneri ΔaroΔvirG::pβ−gal＋SVを用いて、実施例１に記載するようにHeLa細胞を細菌感染させた。侵襲性（コンゴレッド陽性）S.flexneri ΔaroΔvirG::pβ−gal＋SVの、紫外線非致死性複製培養物をコントロールとして用いた。
コンゴレッド陰性も紫外線致死性細菌も、HeLa細胞に付着も侵襲もできなかった。両方の場合において、陽性のβ−gal染色形質転換HeLa細胞は検出されなかった（以下の表３を参照）。生存能力のあるコンゴレッド陽性S.flexneri Δasd::pβ−gal＋SV細胞（＋DAP）または紫外線致死性細胞（＋DAP）のいずれかを用いたさらなる実験は、同様の結果を示した（以下の表３を参照のこと）。
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上記の表３は、レポータープラスミドｐβ−gal＋SVを含有するS.flexneri株による細菌感染の48時間後に形質転換された表現型を示すHeLa細胞の数を示す。細胞をβ−gal活性について一晩染色し、次いで、３ウェルのそれぞれにおける500個の細胞を計数した。平均±標準エラーを示す。侵襲性の、生存能力のあるS.flexneriで細菌感染させたHeLa細胞のみが、青色のβ−gal陽性表現型となった。
従って、細菌感染で用いられる原核生物細胞の真核生物標的細胞に侵襲するための生存能力および能力は、細菌感染による動物細胞の形質転換のためには必要なようである。
実施例７
インビボで送達された遺伝子に対する免疫応答の発達
細菌感染のインビボでの使用の他の例を示すために、５×107個のpCEP4::gp160プラスミド構築物を含有するS.flexneri ΔaroΔvirGを抑制Balb/cマウスに鼻腔内投与した。細菌感染の14日後、マウスを屠殺し、そして脾臓を採取した。
適合抗原としてgp120（Intracel、Cambridge、MA）を、そしてコントロール抗原としてオボアルブミン（Sigma Chemical Co.、St Louis、MO）を用いて、標準方法（Kruisbeckら、Current Protocols in Immunolory、3.12.1〜3.12.4頁、Current Protocols、New York、NY（1991））によって脾臓細胞の増殖アッセイを行った。
HIV−1 gp160の遺伝子を含むプラスミドpCEP4::gp160で細菌感染させたマウスから単離した脾臓細胞は、７倍の刺激を示し、一方、コントロールの、細菌感染させた（pCEP4）マウスからの脾臓細胞は応答を示さなかった。
従って、細菌感染は、免疫応答が高まってきた抗原をコードする遺伝子の送達に適したシステムである。
本発明は、詳細に、かつその具体的な実施態様を参照しながら記載したが、当業者には明らかなように、種々の変更および改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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