(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物、該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物から選ばれる生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取することを特徴とするＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法。
【請求項２】
該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物が、グルコース、フラクトース、マルトース、グリセロールおよび乳酸からなる群より選ばれる化合物である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物。
【請求項４】
バチルス属に属する微生物が、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187株(FERM BP-4646)である請求３記載の微生物。
【請求項５】
バチルス属に属する微生物が、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）S16株(FERM BP-4647)である請求項３記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有する生体触媒を用い、ピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する方法に関する。光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は医薬品の合成原料として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
従来の光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法としては、スレオまたはエリスロ−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミノし、Ｌ−またはＤ−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を各々得る方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C.), 238 ,3660(1963) 〕やオキザロ酢酸とグリオキシル酸から合成したＤＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸からＤおよびＬ体を分離する方法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),  17 partB, 253 〕が知られている。また動物や大腸菌に存在するケトヒドロキシグルタル酸アルドラーゼによって、ピルビン酸とグリオキシル酸から酵素的に４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成することができるが、いずれの場合も得られる４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸はＤ体とＬ体の混合物であることが知られている〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),41  partB ,115〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の製造法は、(1) 原料が高価である、(2) ＤＬ体の分離工程を要する、(3) 収率が低い、などの点で、工業的な製法として必ずしも満足できる方法ではなく、工業的に有利に光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する方法の開発が求められている。本発明の目的は工業的に有利に光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成した光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取することを特徴とする光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法を提供することができる。
【０００５】
なお、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸とはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔(R)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕またはＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔(S)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕のことをいう。
さらに詳しくは、ピルビン酸とグリオキシル酸からＤ−またはＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したＤ−またはＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取することを特徴とするＤ−またはＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法を提供することができる。
【０００６】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる生体触媒としては、微生物、該微生物の培養物、菌体またはそれらの処理物があげられる。
微生物としては、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。具体的にはセルビブリオ属、バチルス属、シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物があげられる。
【０００７】
Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチルス属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはセルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物が好ましい。
【０００８】
具体的にはセルビブリオ  ギルバス（Cellvibrio gilvus）ATCC13127 株、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187 株、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）S16 株などがあげられる。ATCC13127 株およびOC187 株は６０〜９０℃、１５分〜２時間の熱処理を施すことにより、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活させることができる。また、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した株は、セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通常の変異処理手段、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による通常の変異処理により変異させ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能が失活した変異株を選択することによっても得ることができる。S16 株はOC187 株より変異誘導され、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した変異株である。
【０００９】
バチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187 株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分離された菌株であって、その菌学的性質を第１−１表〜第１−６表に詳述する。
(A) 形態
【００１０】
【表１】
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【００１１】
(B) 培養学的性質
【００１２】
【表２】
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【００１３】
(C) 生理学的性質
【００１４】
【表３】
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【００１５】
【表４】
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【００１６】
(D) その他の諸性質
【００１７】
【表５】
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【００１８】
(E) 化学分類学的性質
【００１９】
【表６】
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【００２０】
OC187 株は、陰性あるいは陽性のグラム染色性を示す桿菌で、周毛による運動性を示し、楕円状の内性胞子を有する通性嫌気性菌であった。O-F テストでは発酵的に糖を分解して酸を生成し、カタラーゼ活性は陽性を、オキシダーゼ活性は陰性を示し、硝酸塩を還元しなかった。また、10％の塩化ナトリウム耐性で、55℃で生育したが10℃および65℃では生育しなかった。
【００２１】
また、主要キノン型はMK-7で、細胞壁ペプチドグリカンジアミノ酸組成は、meso-A2pm を示し、DNA のGC含量は45.9 mol% であった。
以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイのマニュアル（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology） Vol.2（1986年）の記載と照合した結果、該菌株をバチルス属に属する細菌と同定し、OC187 株をバチルス  エスピー（Bacillus sp.）OC187 と命名した。
【００２２】
バチルス  エスピー OC187株および S16株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に各々FERM BP-4646、FERM BP-4647として寄託されている。
Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくにシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはシュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属し、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物であればよい。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実質的に生成しない微生物であればより好ましい。
【００２３】
具体的にはシュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 795株、シュウドモナス  プチダ（Pseudomonas putida）ATCC 4359 株、シュウドモナス  サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC 9114 株〔＝ATCC 15946株；IAM Catalogue of Strains (1993) 〕、シュウドモナス  ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）ATCC 15452株、シュウドモナス  タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）ATCC 17466株、シュウドモナス  オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）ATCC 8062 株、パラコッカス  デニトリフィカンス（Paracoccus denitrificans）ATCC 19367株、プロビデンシア  ルスチギアニ（Providencia rustigianii）ATCC 13159株、リゾビウム  メリロッティ（Rhizobium meliloti）RCR 2001株（FERM BP-4582）、モルガネラ  モルガニ（Morganella morganii）ATCC 25830株などがあげられる。
【００２４】
リゾビウム  メリロッティ（Rhizobium meliloti）RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成６年２月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4582として寄託されている。
本発明に用いられる微生物の培養は、通常用いられる合成ないし天然培地を用いて行うことができる。培地中の炭素源としては、セルビブリオ属またはビブリオ属細菌を用いてＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する場合にはＤ−ガラクトン酸が使用可能である。その他の微生物を用いてＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する場合には、用いる微生物が資化しうるかぎり、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノールなどのアルコールなどが使用可能である。
【００２５】
窒素源としては、用いる微生物が資化しうるかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や尿素、硝酸塩ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープリカーなどの各種の窒素含有有機物が使用可能である。
無機塩としては、用いる微生物が利用しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどが使用できる。他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、モリブデンなどの塩類を加えてもよい。
【００２６】
また必要に応じてチアミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
ピルビン酸またはピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する方法は、微生物の培養中に基質を添加する方法を用いてもよいし、培養して得られた微生物の培養物、菌体もしくはそれらの処理物を、基質に作用させて光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成させる方法を用いてもよい。
【００２７】
処理物としては菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的磨砕処理物、溶媒処理物などの菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物などがあげられる。
前者の方法を用いる場合には、ピルビン酸またはピルビン酸に転換され得る化合物およびグリオキシル酸は各々１〜２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/l の濃度範囲で培養の初発もしくは途中に添加する。培養時間は用いる微生物によって異なり、１０〜１００時間程度である。
【００２８】
後者の方法を用いる場合には、ピルビン酸またはピルビン酸に転換され得る化合物１〜２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/l 、グリオキシル酸１〜２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/l 、微生物の菌体またはその処理物０. １〜２００g/l 、好ましくは５〜１００g/l （微生物菌体換算）を含む水性媒体中、温度１５〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃、pH３〜１１、好ましくは５〜９の条件で行う。反応時間は３０分〜８０時間程度である。
【００２９】
水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液や生理食塩水などが使用できる。また必要に応じてトリトンＸ−１００（ナカライテスク社製）やナイミーン（日本油脂社製）などの界面活性剤や少量のトルエンやキシレンなどの有機溶媒を0.1 〜20g/l 添加してもよい。
ピルビン酸に転換され得る化合物としては、菌体あるいはその処理物によってピルビン酸に変換され得る化合物であれば如何なる物でも使用できるが、通常グルコース、フラクトース、マルトース等の糖類あるいはグリセロール、乳酸などを使用する。
【００３０】
水性媒体からの光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の採取は、通常水性媒体から有機酸採取に用いられる方法に従って実施することができる。例えば、遠心分離により菌体もしくはそれらの処理物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂あるいは膜処理法などの操作を組み合わせて、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を単離することができる。
【００３１】
本発明で得られる光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は医薬品合成原料として有用であり、たとえば４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸から４−ヒドロキシプロリンを経て、カルバペネム系抗生物質を合成することができる。４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸から４−ヒドロキシプロリンへの変換は、特開平３−２６６９９５に記載の方法に準じておこなうことができる。カルバペネム系抗生物質は４−ヒドロキシプロリンからヘテロサイクルズ（Heterocycles）, 24, p1331 (1986)に記載の方法に準じてＮ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル−３−メルカプトピロリジンを合成し、さらに特開昭５８−３２８７９に記載の方法に準じて得ることができる。
【００３２】
以下に本発明の実施例を示す。
【００３３】
【実施例】
【００３４】
実施例１
セルビブリオ  ギルバスATCC13127 株を3ml のＬ培地（バクトペプトン10g 、酵母エキス5gおよびNaCl 10gを水１リットルに含みpH7.0 に調整した培地）に接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液２ｍｌを下記第２表の組成からなるＧＮＭＳ培地２０ｍｌに接種した。
【００３５】
【表７】
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【００３６】
これを１０mlづつ２本の試験管に分注し２０時間培養した。培養終了後、１本の試験管には80℃で１時間加温する熱処理を施し、もう一本は３０℃に保った。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、滅菌した１mlの反応液(a) 〔KH2PO4 3g 、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol およびグリオキシル酸100mmol を純水１リットルに含みNaOHでpH７. ０に調整した反応液〕に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中で３７℃で振とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量した。測定結果を第３表に示す。なお、ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の標準化合物は各々、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C.), 237,476(1962) および同, 238, 3660(1963) に記載の方法によって調製した。
【００３７】
【表８】
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【００３８】
実施例２
Ｌ培地３ｍｌを試験管に分注し、滅菌後、第５表に示した微生物を各々接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液１ｍｌを下記第４表の組成からなるＧＭＳ培地１０ｍｌに接種し試験管で２０時間培養した。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
培養終了後、遠心分離操作で各々菌体を集め、滅菌した１mlの反応液(b) 〔KH2PO4 3g 、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、MgSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol 、グリオキシル酸100mmol および亜ひ酸10mmolを純水１リットルに含みNaOHでpH７. ０に調整した反応液〕に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中で３０℃で振とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量した。結果を第５表に示す。
【００４１】
【表１０】
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【００４２】
実施例３
実施例１で用いた反応液(a) 中のピルビン酸ナトリウム100mmol の代わりにグルコース20g 、グリセロール20g または乳酸アンモニウム20g を含む反応液を各々調製した。この反応液にシュウドモナス  プチダ ATCC795株を実施例２と同様に培養して得た菌体を懸濁し、実施例２と同様に３０℃で振とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量した。結果を第６表に示す。
【００４３】
【表１１】
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【００４４】
実施例４
セルビブリオ  ギルバスATCC13127 株をＬ培地９ｍｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全量を300ml のＧＮＭＳ培地に接種し２リットル容の三角フラスコで３０℃で２０時間振とう培養した。この培養液を８０℃で１時間加熱処理した後、遠心分離によって菌体を分離し、反応液(a) 60mlに懸濁し、300ml 容ビーカー中で撹拌しつつ１規定硫酸でpHを6.5 に保って反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２Ｍ溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液3ml を添加した。反応開始後２４時間目で遠心分離によって反応液から菌体を除き、遠心上清中の４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をＨＰＬＣによって定量した。Ｌ−体は検出されず、125mM のＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が検出された。
【００４５】
ダイヤイオンPA416 （三菱化成社製）を充填したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、０〜６Ｍ蟻酸の指数的グラジエントによって溶出した。６〜８カラム容量に溶出される４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶液を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加し、Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩を晶出させた。このようにしてＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.5gを得た。
【００４６】
実施例５
シュウドモナス  プチダATCC795 株をＬ培地９ｍｌに接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全量を300ml のＧＭＳ培地に接種し２リットル容の三角フラスコで３０℃で２０時間振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離し、反応液(b)60ml に懸濁し、300ml 容ビーカー中で撹拌しつつ１規定硫酸でpHを6.5 に保って反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２Ｍ溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液3ml を添加した。反応開始後２４時間目で遠心分離によって反応液から菌体を除き、遠心上清中の４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をＨＰＬＣによって定量した。Ｄ−体は検出されず、150mM のＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸が検出された。
【００４７】
ダイヤイオンPA416 （三菱化成社製）充填したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、０〜６Ｍ蟻酸の指数的グラジエントによって溶出した。６〜８カラム容量に溶出される４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶液を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加し、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩を晶出させた。このようにしてＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.7gを得た。
【００４８】
実施例６
セルビブリオ  ギルバス ATCC13127株のかわりにバチルス  エスピー OC187株を用い、実施例１と同様に培養し、同様に反応を行った。結果を第８表（実施例７参照）に示す。
【００４９】
実施例７
バチルス  エスピー OC187株をＬ培地で30℃、6 時間培養した菌体を集め、0.05M トリス−マレイン酸緩衝液（pH6.0 ）で洗浄後、菌体濃度が約109 細胞/ml になるように同緩衝液に懸濁し、これにNTG を終濃度が600mg/l になるように加え、30℃、20分間保持して変異処理を行った。この変異処理菌体を第７表の組成からなるＭＧ寒天培地に塗布した。
【００５０】
【表１２】
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【００５１】
生じたコロニーをＬ寒天培地（Ｌ培地に寒天２％を加えたもの）に拾い、Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生産性を調べた。即ち、各株を実施例１と同様に培養し、同様に反応を行った。ただしいずれの株に対しても熱処理は行わなかった。反応終了後の遠心上清中の４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実施例１と同様に分析した結果、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成せず、Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成する変異株S16 株を得た。S16 株の反応上清の分析結果を第８表に示す。
【００５２】
【表１３】
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【００５３】
【発明の効果】
医薬品の合成原料として有用な光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を工業的に有利に得ることができる。