(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク断片を取得する方法であって、
a)両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
b)両断片集団にネステッドプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを共有結合させ（前記プライマー結合部位は最も外側のプライマー結合部位、最も内側のプライマー結合部位、およびそれらの間の少なくとも１つの内部プライマー結合部位を含む）、オリゴヌクレオチドで標識した試料および対照の断片集団を生成すること；
c)オリゴヌクレオチドで標識した試料断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も外側のプライマー結合部位に相補的な5’リン酸基を欠く非ターゲッティングプライマーを用いて増幅し、増幅した試料断片集団を得ること；
d)オリゴヌクレオチドで標識した対照断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も内側のプライマー結合部位に相補的な5’リン酸基を含むターゲッティングプライマーを用いて増幅し、増幅した対照断片集団を得ること；
e)前記増幅した試料断片集団を過剰量の前記増幅した対照断片集団と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
f)前記アニーリング混合物を、各鎖中に5’リン酸基を欠く非ターゲッティングプライマーを含む二本鎖断片を除いて全部の断片が分解される条件であって、一本鎖特異的ヌクレアーゼおよび5’リン酸末端基付き核酸に特異的なエキソヌクレアーゼの作用を含む上記条件にさらすこと；および
g)続いて、工程(f)で処理したアニーリング混合物を、前記内部プライマー結合部位の１つに相補的な5’リン酸基を欠く非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかけ、第１の差異産物を生成すること；
を含んでなる方法。
【請求項２】
工程(e)〜(g)を繰り返し、その際、前記増幅した試料断片集団の代わりに差異産物を使用し、前記処理したアニーリング混合物を、先の工程で用いたものと異なるプライマー結合部位に相補的な5’リン酸基を欠く非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかけて追加の差異産物を取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖特異的ヌクレアーゼがMung Bean(ヤエナリ)ヌクレアーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
5'リン酸末端基付き核酸に特異的なエキソヌクレアーゼがλエキソヌクレアーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマー結合部位が異なるアニーリング温度をもつ、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位が、5'末端から3'末端の方向に、順次高くなるアニーリング温度をもつ、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが４つ以上のプライマー結合部位を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記共有結合が酵素的連結反応によるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記断片化が制限エンドヌクレアーゼ消化により成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料および対照ポリヌクレオチド集団がｃＤＮＡを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料および対照ポリヌクレオチド集団がゲノムＤＮＡを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの差異産物のクローニングをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程(b)の前記両集団が、両断片化集団のコンプレキシティーのより低いサブセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在する１以上のポリヌクレオチド断片を単離するためのキットであって、
a)複数のプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチド；
b)核酸増幅用の試薬、酵素、バッファー、前記オリゴヌクレオチドの前記プライマー結合部位にアニーリングすることができる５’リン酸基を欠く非ターゲッティングプライマーおよび５’リン酸基を含むターゲッティングプライマー、ならびにヌクレオチド；
c)一本鎖特異的ヌクレアーゼ；
d)5'リン酸末端基付き末端をもつ核酸に特異的なエキソヌクレアーゼ；
e)アニーリング反応を行うための試薬、塩類およびバッファー；
f)ＤＮＡ連結反応用の試薬および酵素；
g)ｃＤＮＡ合成用の試薬および酵素；
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
関連出願の相互参照
該当せず。
政府後援の研究に基づく発明の権利の言明
該当せず。
技術分野
本発明は、遺伝子分析の分野に該当する。本発明は、差引きハイブリダイゼーション(subtractive hybridization)および選択的増幅の技術を利用して、２つ以上の異なる細胞、細胞集団、または細胞型において、異なって発現された、異なって存在する、または異なって編成された核酸配列を含むポリヌクレオチドを単離する方法に関する。
発明の背景
２つの核酸配列集団の差異を検出する能力は、例えば、新生物、感染性疾患、変性疾患、ウィルス感染、および疾患に対する遺伝的な素質等の種々の病理状態の分子的基礎(molecular basis)を特徴付けるのに重要である。核酸配列の第１の集団には存在するが、第２の集団には存在しない、または異なる濃度で存在する、または異なって編成されている配列を含むポリヌクレオチドを同定するために、差引きハイブリダイゼーションの技術がますます使用されている。
SargentおよびDawid、Science 222:135-139 (1983)は、カエル胚の発生の原腸胚期に優先的に発現するｍＲＮＡ分子を呈示するｃＤＮＡを単離するために差引きハイブリダイゼーションを使用した。原腸胚ｃＤＮＡを、未受精卵由来のＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡをクローン化した。これらのクローン化配列は、カエル原腸胚において異なって発現するｍＲＮＡを呈示した。同様に、Hedrickら、Nature (London) 308:149-153 (1984)は、抗原特異的Ｔ細胞由来のｃＤＮＡをＢ細胞由来のＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかったｃＤＮＡを回収することにより、Ｔ細胞受容体分子をクローン化した。これらの初期の成功にも関わらず、じきに、この方法では、実施上、全ｍＲＮＡ集団の0.01％またはそれ以上を呈示する示差発現ｍＲＮＡの検出に限定されることが明らかになった。さらに、この方法が実施される場合には、(一本鎖材料としての)示差発現するｃＤＮＡの選択がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより達成されるが、これは扱いにくく、有益な材料を損失してしまう。最後に、この技術では、欠失、遺伝子増幅、または再編成等のゲノム構成における差異を検出する方法は得られなかった。
異なるゲノム間の配列の差異を呈示するポリヌクレオチドの同定および単離が可能な、差引きハイブリダイゼーション技術の変法が開発されている。LamarおよびPalmer、Cell 37:171-177 (1984)は、マウスのＹ染色体特異的配列を単離するために選択的クローニング法を使用した。制限酵素で消化した雄ＤＮＡをトレーサとして、および音波処理した雌ＤＮＡをドライバーとして使用し、ハイブリダイゼーションを行った。アニーリング後に得た二重らせんの内、両方の鎖が雄ＤＮＡ由来のものだけがＹ染色体に固有の配列を含んでおり、各末端に制限酵素認識部位を所有している。このような二重らせんを、適合する制限酵素生成末端(restriction enzyme-generated ends)をもつベクターに優先的にクローン化した。
Kunkelら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4778-4782 (1985)およびNussbaumら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6521-6525 (1987)は、制限酵素で消化された、Ｘ染色体について多染色体性である細胞由来のＤＮＡと、１つ以上のＸ染色体欠失を含む細胞由来の過剰量の剪断ＤＮＡとの、再会合速度を高めた条件下でのハイブリダイゼーションによって、ヒトＸ染色体から欠失された配列を含む断片を単離することを記載している。適合する制限酵素生成末端を有するベクターを用いた選択的クローニングを用いて、Ｘ染色体欠失体中に存在しない配列を単離している。
StraussおよびAusubel、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1889-1893 (1990)は、酵母欠失変異体中に存在しないＤＮＡを含むポリヌクレオチドを単離する技術を記載している。この方法では、変性した野生型ＤＮＡを欠失変異体由来のビオチン標識したＤＮＡとアニーリングさせ、ビオチン含有二重らせん(変異体および野生型に共通の配列を含む)を、アビジン被覆ビーズと結合させて溶液から取り出す。このプロセスを、各サイクル後に結合せずに残存する変異型ＤＮＡに新らたなビオチン化野生型ＤＮＡを加えながら、数サイクル繰り返す。最後に、ポリメラーゼ連鎖反応により一本鎖材料を増幅し、欠失変異体に欠けている配列が富化されたプローブを生成する。当然、この方法は、欠失変異体により規定されたゲノム領域を単離することのみにしか使用できず、酵母よりも複雑なゲノムに対してその適用についてはまだ調べられていない。示差発現するｃＤＮＡを単離するためのビオチンに基づく分離を用いた同様の方法が、Lebeauら、Nucleic Acids Research 19:4778 (1991)に記載されている。
Wielandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2720-2724 (1990)は、「ドライバー」(driver)集団には存在せず「テスター」(tester)ＤＮＡ集団に存在する配列を含むポリヌクレオチドを単離する方法を記載している。この方法では、テスターＤＮＡをビオチンで標識化し、次いで過剰量のドライバーＤＮＡと数ラウンドのハイブリダイゼーションを行う。毎ラウンド後に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより一本鎖ＤＮＡを回収する。最終ラウンドの後、ハイブリダイズされなかった少量のビオチン化ＤＮＡ(テスター集団にユニークなＤＮＡ)を、アビジンアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、クローン化して、テスター集団にユニークな配列のプローブを生成する。
最近、一方のＤＮＡ配列集団に存在し、他方のＤＮＡ配列集団には存在しないＤＮＡ断片の単離を可能にする呈示的差異分析(Representational Difference Analysis：ＲＤＡ)として知られる技術が開発されている。Lisitsynら、Science 259:946-951 (1993)；Lisitsynら、Meth. Enzymology 254:291-304 (1995)；米国特許第5,436,142号；米国特許第5,501,964号；Lisitsynら、Nature Genetics 6:57-63 (1994)。この方法により、ＤＮＡ配列の「テスター」集団に存在し、関連する「ドライバー」集団には存在しない断片を検索することが可能になる。このようなユニーク断片を「ターゲット」配列と称する。ＲＤＡの第１の工程では、両集団の「呈示」(representations)を得る。これらの呈示は、元の配列集団のコンプレキシティーのより低いサブセット(lower-complexity subsets)からなる。この技術で最も広範に実施されている実施態様では、呈示を得るにあたって、両集団を別々に制限エンドヌクレアーゼで消化し、このように生成した断片の末端に第１セットのアダプターを連結し、比較的短い断片(２キロ塩基対未満)だけが増幅されるような条件下で、第１のセットのアダプターに相補的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅する。次いで、両集団の増幅断片から制限酵素消化により第１のアダプターを除去し、(第１のセットとは異なる配列を有する)第２のセットのアダプターをテスターＤＮＡ集団のみに由来する増幅断片と連結反応により結合させる。
テスター集団由来のアダプター含有増幅断片を、次いで、ドライバー集団由来の過剰量の増幅断片(アダプターを欠く)と組み合わせ、この混合物を変性およびアニーリング条件下でインキュベートし、その後、第２のセットのアダプターに相補的なプライマーを用いてもう一回のPCR増幅を行う。アニーリング工程の間、数種類の二重らせんが形成される。ドライバー断片は過剰量で存在するため、テスター集団およびドライバー集団の両方に共通の配列を含む断片の大多数が、(アダプターを含まない)ドライバー-ドライバー二重らせん、または(テスター断片由来の鎖に単一アダプターを含む)テスター-ドライバー二重らせんのいずれかを形成する。テスター集団にユニークな配列を含む断片は、自己アニーリングし、各末端にアダプターをもつ二重らせんを生成することが可能である。結果的に、アニーリング後のPCR工程の間、テスター-テスター二重らせんは指数的に増幅される。一方、単一アダプターのみをもつテスター-ドライバー二重らせんは、直線的に増幅され、従って、増幅配列の集団の小さい画分しか形成しない。アダプターを欠くドライバー：ドライバー二重らせんは、全く増幅されない。つまり、ターゲット配列を含む断片の選択的増幅は、アニーリングに先立ち、テスター集団由来の断片のみがアダプターをもっており、指数的増幅の可能性があるテスター-テスター二重らせんを利用するという事実により達成される。
先の工程から得た富化されたターゲット断片に存在するアダプターを除去する工程と、新たなアダプターを付加する工程と、変性かつアニーリング条件下でドライバー集団由来の過剰量の断片と共にインキュベートする工程と、PCRによる増幅とを、所望の程度の富化が達成されるまで繰り返す。
最近、ｃＤＮＡ-ＲＤＡと称されるＲＤＡの変法が、HubankおよびSchatz、Nucleic Acids Research 22:5640-5648 (1994)に記載された。該文献においては、ｃＤＮＡの２つの集団を、２つの集団の一方に固有のｍＲＮＡまたは２つの集団において異なって発現するｍＲＮＡを呈示するｃＤＮＡ断片の存在について比較する。ｃＤＮＡ-ＲＤＡは、以下の点において元来のＲＤＡプロトコルと異なる。
1)典型的な哺乳動物細胞のｍＲＮＡ集団のコンプレキシティーはゲノムコンプレキシティーの約１〜２％にすぎないため、ｃＤＮＡ-ＲＤＡを実施する上で呈示の生成が必要でない。従って、一回の実験でより完全な差異分析が得られる。2)２つの集団間で異なることがすでに知られている断片の増幅を、このような断片をドライバーに付加することによって最小限にすることができる。3)増幅前に、低存在量(low-abundance)配列の集団を(低C0tとハイブリダイズさせることにより)減損させ、第１の差異産物の生成後のハイブリダイゼーションの間ドライバー対テスターの比率を低くすることにより、(一方の集団に存在しないのではなく)２つの集団に異なるレベルで存在するｍＲＮＡを呈示する断片の増幅が達成される。これにより、アッセイの目的のために、アップレギュレートされた配列がユニーク配列に効果的に変換される。ｃＤＮＡ-ＲＤＡの限界は、点突然変異、小さい欠失、または小さい挿入による差異を、それらが特定の制限酵素認識部位に影響を及ぼさない限り、検出できないということである。ｃＤＮＡ-ＲＤＡは、培養細胞中のトランスフェクトされた遺伝子の転写物を検出し、環境的な刺激に応答して転写がアップレギュレートされた遺伝子を呈示するｃＤＮＡをクローン化するために使用されてきた。
ＲＤＡおよびｃＤＮＡ-ＲＤＡは、特定の核酸配列集団にユニークな配列もしくは特定の核酸配列集団で富化された配列を含むポリヌクレオチドを富化するための選択的増幅に依存する。酵素的分解サブトラクション技術では、ユニーク配列の選択的増幅が、両集団に共通する配列の選択的分解と併用された。Zengら、Nucleic Acids Research 22:4381-4385 (1994)；米国特許第5,525,471号。この方法では、α-ホスホロチオエートで修飾されたヌクレオチドの酵素的付加により、テスター集団を含む増幅ｃＤＮＡ断片の末端をブロックする。次いで、ブロックされたテスター断片と、過剰量のブロックされていないドライバー断片とのハイブリダイゼーションを、アニーリング速度を加速し、比較的低いドライバー濃度の使用が可能な条件下で行う。ハイブリダイゼーションの後、エキソヌクレアーゼIII(3'末端から分解する二本鎖特異的ヌクレアーゼ)およびエキソヌクレアーゼVII(一本鎖特異的ヌクレアーゼ)で処理して、ドライバー-ドライバーおよびテスター-ドライバー二重らせんを破壊する。しかし、ホスホロチオエートでブロックされた、テスター-テスターハイブリッドの末端は、これらの二重らせんを、組み合わされたヌクレアーゼ処理に対して耐性にする。ヌクレアーゼ処理に耐えうるテスター-テスター二重らせんは、２ラウンド目のサブトラクションに供され、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。必要に応じて、追加ラウンドのサブトラクションおよび増幅を行い得る。
最近になり、ＲＤＡの技術がますます広範に実施されるようになってくるにつれて、いくつかの難点が明らかになってきた。主な問題は、この技術で利用する多数の制限消化および連結反応が非効率的であることに起因する。完全な制限消化が行われないと、テスター断片集団からの第１のセットのアダプターの除去が不完全となり、第２のセットアダプターに結合する能力が無くなる。同様に、非効率的な連結反応工程は、第１のセットが除去された部位でさえも、第２のセットのアダプターの不完全な結合をもたらす。増幅プライマーは第２のセットのアダプターに相補的であるため、第２のアダプターセットの不完全な結合により、達成され得るターゲット配列の増幅が低下する。さらに、複数の工程を通して試料を処理し、場合によっては工程間で材料を精製する必要があるため、すでに乏しい実験材料の損失が生じる。非効率的な制限消化および/または連結反応の１つの可能性のある結果は偽陽性の結果であり、この場合は増幅の失敗による特定のドライバー配列の損失が、ターゲット配列としてのテスター中のその相補体の不適切な同定へと至らせる。
よく実施される上でのＲＤＡの別の難点は、増幅工程の間のポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数の多さに起因する。典型的には、呈示を生じるために20サイクルのPCRを使用し、ＲＤＡのハイブリダイゼーション/増幅の各ラウンドの間に25〜30サイクルのPCRを使用する。仮に、通常通りに３ラウンドのハイブリダイゼーション/増幅を行うと、ターゲット核酸が単離される頃には95〜110ラウンドの増幅が行われたことになる。通常、増幅の追加ラウンドを用いて、ＲＤＡで単離した差異産物をクローン化して配列決定する。PCR増幅のサイクル数が多い場合、「プラトー効果」が見られることがすでに知られている。InnisおよびGelfland、“PCR Protocols: A guide to methods and applications”Innisら編集、Academic Press (1990)、pp.3〜12。この効果は、後半のサイクルの間に生じる増幅産物の指数的蓄積速度が減速する点に特徴がある。プラトー効果の可能性のある原因としては1)基質の枯渇、2)酵素活性の消失、3)基質の分解、4)最終産物による阻害、5)非特異的産物による反応物に対する競合、6)高い産物濃度での産物の不完全変性、ならびに7)高い産物濃度での産物の再アニーリング(これにより、プライマーのアニーリングおよび/または伸長がブロックされ得る)が挙げられる。
ポリメラーゼ連鎖反応の後半のサイクルのこれら最後の２つの特徴は、ＲＤＡおよび関連する技術に特に重要である。何故なら、指数的増幅を下回るだけでなく、ＲＤＡ等の多数の断片が増幅される反応において産物の呈示にずれを生じるからである。特に、
0003715657.tif 000002
ら、Nucleic Acids Research 24:2080-2086 (1996)は、後半サイクルにおいては、同じ反応において、存在量の多い産物の増幅速度が、それよりも存在量の少ない産物の速度よりも速く減速したことを示した。これは、存在量の多い産物の優先的な再アニーリングに起因し、これら存在量の多い種のプライマー結合および/または伸長が妨害される。この現象は、アニーリング速度が反応鎖の濃度と比例するという事実と一致する。ｃＤＮＡ-ＲＤＡの実施におけるこの効果の結果は、(２つの集団の一方に固有のｍＲＮＡと対照的に)２つの集団中に異なる濃度で存在するｍＲＮＡを検出する能力が、出発集団中にｃＤＮＡが高い濃度で存在するｍＲＮＡの場合は最小限にされることである。
現行のＲＤＡ法において更に可能性のある人工産物の原因は、第１のハイブリダイゼーション工程の直後に10サイクルのPCRを利用することである。この10サイクルの増幅を行って初めて、材料がヌクレアーゼで処理され、ハイブリダイズされていない材料が分解される。この工程順序は、テスター:テスター二重らせん(即ち、所望の産物)に対して10回の変性工程を施すという潜在的に望ましくない作用を及ぼし、例えば変性状態のままでの構成鎖の分解により、これら二重らせんの一部が再形成しないという危険性を伴う。
最後に、ヌクレアーゼ処理に先立って10サイクルのPCRの間に過剰量のドライバーＤＮＡが存在することは、テスター:テスターハイブリッドの増幅効率の低下を招く。これは、残存するドライバー:ドライバーおよびドライバー:テスター二重らせんが、プライマー、基質、対イオン、および酵素のシンク(sink)として作用しうることに起因する。
本発明の実施おいて、より少ないPCRサイクル数、増幅前のヌクレアーゼ消化、および多数のプライマーと使用するために設計された単一アダプターを使用する方法により、上記難点が克服される。以下に記載するように、本発明は更に利点を提供する。
発明の概要
本発明は、第１の（試料）細胞、細胞型または細胞集団中に存在するが１以上の他の（対照）細胞、細胞型または細胞集団中に存在しない核酸配列を含むポリヌクレオチドを同定および単離するための改良法を提供する。このようなポリヌクレオチドは本発明の方法を用いて「ユニーク断片」、「固有の断片」または「差異産物」として同定される。ユニーク断片は挿入や欠失のような配列含量の差異の結果として、または逆位や転座のような配列構成の差異により得られる。本発明の方法は、制限酵素消化および連結の反復工程に伴う材料の損失、過度の増幅サイクルから生じる呈示のずれ(skewed representations)、大量の不必要な対照配列による増幅工程の妨害といった以前の差引きハイブリダイゼーション法に関連した問題点を抱えていない。
したがって、本発明は、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を得る方法を提供し、この方法は、
次の工程：
(a) ポリヌクレオチド試料集団のコンプレキシティーの低いサブセットを、ポリヌクレオチド対照集団のコンプレキシティーの低いサブセットと一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を生成すること；
(b) 前記アニーリング混合物を、該対照集団のコンプレキシティーの低いサブセットのメンバーが、該試料集団のコンプレキシティーの低いサブセットのメンバーと比べて、優先的に分解されるか、または非増幅性にされる条件にさらすこと；
(c) 続いて、工程(b)で処理したアニーリング混合物を増幅反応にかけて第１の差異産物を得ること；
を行うことにより、該試料集団と該対照集団のコンプレキシティーの低いサブセット間の差異産物を生成することを含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(a)〜(c)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、前記試料集団のコンプレキシティーの低いサブセットの代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用する。
本発明はさらに、次の一連の工程：
a)両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
b)前記試料および対照の断片集団を示差的にマークして、マークした試料断片集団とマークした対照断片集団を生成し、その結果として、マークした対照断片集団が、マークした試料断片集団と比べて、分解に対して選択的に感受性となること；
c)マークした試料および対照の断片集団を増幅度が制限される条件下で増幅して、マークした試料および対照の断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットを得ること；
を行うことにより、ポリヌクレオチドの試料および対照集団のコンプレキシティーの低いサブセットを得る方法を提供する。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)次の一連の工程：
(i) 両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
(ii)前記試料および対照の断片集団を示差的にマークして、マークした試料断片集団とマークした対照断片集団を生成し、その結果として、マークした対照断片集団が、マークした試料断片集団と比べて、分解に対して選択的に感受性となること；
(iii) マークした試料および対照の断片集団を増幅度が制限される条件下で増幅して、マークした試料および対照の断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットを得ること；
を行うことにより両集団のコンプレキシティーの低いサブセットを生成すること；
b)次の一連の工程：
(i) マークした試料断片集団の前記コンプレキシティーの低いサブセットを、マークした対照断片集団の前記コンプレキシティーの低いサブセットの過剰量と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を生成すること；
(ii)前記アニーリング混合物を、マークした対照断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットのメンバーが、マークした試料断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットのメンバーと比べて、優先的に分解されるか、または非増幅性にされる条件にさらすこと；
(iii) 続いて、工程(ii)で処理したアニーリング混合物を増幅反応にかけて第１の差異産物を得ること；
を行うことにより差異産物を生成すること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(b)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、マークした試料断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットの代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用する。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
b)前記試料および対照の断片集団を示差的にマークして、マークした試料断片集団とマークした対照断片集団を生成し、その結果として、マークした対照断片集団が、マークした試料断片集団と比べて、分解に対して選択的に感受性となること；
c)次の一連の工程：
(i) 前記マークした試料断片集団を過剰量の前記マークした対照断片集団と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
(ii)前記アニーリング混合物を、マークした対照断片集団のメンバーが、マークした試料断片集団のメンバーと比べて、優先的に分解されるか、または非増幅性にされる条件にさらすこと；
(iii) 続いて、工程(ii)で処理したアニーリング混合物を増幅反応にかけて第１の差異産物を得ること；
を行うことにより差異産物を生成すること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(c)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、マークした試料断片集団の代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用する。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)次の一連の工程：
(i) 両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
(ii)両断片集団にネステッドプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドを共有結合させ（前記プライマー結合部位は最も外側のプライマー結合部位、最も内側のプライマー結合部位、およびそれらの間の少なくとも１つの内部プライマー結合部位を含む）、マークした試料および対照の断片集団を生成すること；
(iii) マークした試料断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も外側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて、増幅度を制限する条件下で増幅して、試料断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットを得ること；
(iv)マークした対照断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も内側のプライマー結合部位に相補的なターゲッティングプライマーを用いて、増幅度を制限する条件下で増幅して、対照断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットを生成すること；
を行うことにより前記集団のコンプレキシティーの低いサブセットを得ること；および
b)次の一連の工程：
(i) 前記試料断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットを、過剰量の前記対照断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットと一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
(ii)前記アニーリング混合物を、各鎖中に非ターゲッティングプライマーを含む二本鎖断片を除いて、全部の断片が分解される条件にさらすこと；
(iii) 続いて、前記アニーリング混合物を、前記内部プライマー結合部位の１つに相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかけ、第１の差異産物を生成すること；
を行うことにより差異産物を得ること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(b)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、試料断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットの代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用し、処理したアニーリング混合物を、先の工程で用いたものと異なる内部プライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーまたは最も内側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかける。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)両集団のポリヌクレオチドを断片化して試料断片集団および対照断片集団を得ること；
b)前記試料および対照の断片集団を増幅して、増幅した試料断片集団および増幅した対照断片集団を得ること；
c)前記増幅した試料断片集団を過剰量の前記増幅した対照断片集団と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
d)前記アニーリング混合物を、増幅した対照断片集団のメンバーが、増幅した試料断片集団のメンバーと比べて、優先的に分解されるか、または非増幅性にされる条件にさらすこと；
e)続いて、工程(d)で処理したアニーリング混合物を増幅反応にかけて第１の差異産物を得ること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(c)〜(e)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、増幅した試料断片集団の代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用する。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
b)前記試料および対照の断片集団を示差的にマークして、マークした試料断片集団とマークした対照断片集団を生成し、その結果として、マークした対照断片集団が、マークした試料断片集団と比べて、分解に対して選択的に感受性となること；
c)マークした試料および対照断片集団を増幅して、マークし増幅した試料断片集団とマークし増幅した対照断片集団を生成すること；
d)前記マークし増幅した試料断片集団を過剰量の前記マークし増幅した対照断片集団と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
e)前記アニーリング混合物を、マークし増幅した対照断片集団のメンバーが、マークし増幅した試料断片集団のメンバーと比べて、優先的に分解されるか、または非増幅性にされる条件にさらすこと；
f)続いて、工程(e)で処理したアニーリング混合物を増幅反応にかけて第１の差異産物を得ること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(d)〜(f)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、マークし増幅した試料断片集団の代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用する。
本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
b)両断片集団にネステッドプライマー結合部位を含むまたはコードするオリゴヌクレオチドを共有結合させ（前記プライマー結合部位は最も外側のプライマー結合部位、最も内側のプライマー結合部位、およびそれらの間の少なくとも１つの内部プライマー結合部位を含む）、オリゴヌクレオチドで標識した試料および対照の断片集団を生成すること；
c)オリゴヌクレオチドで標識した試料断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も外側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅し、増幅した試料断片集団を得ること；
d)オリゴヌクレオチドで標識した対照断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も内側のプライマー結合部位に相補的なターゲッティングプライマーを用いて増幅し、増幅した対照断片集団を得ること；
e)前記増幅した試料断片集団を過剰量の前記増幅した対照断片集団と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
f)前記アニーリング混合物を、各鎖中に非ターゲッティングプライマーを含む二本鎖断片を除いて、全部の断片が分解される条件にさらすこと；および
g)続いて、工程(f)で処理したアニーリング混合物を、前記内部プライマー結合部位の１つに相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかけ、第１の差異産物を生成すること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(e)〜(g)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、増幅した試料断片集団の代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用し、処理したアニーリング混合物を、先の工程で用いたものと異なる内部プライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーまたは最も内側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかけて追加の差異産物を得る。本発明はさらに、ポリヌクレオチド対照集団中に存在しないがポリヌクレオチド試料集団中に存在するユニーク核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を得る方法を提供し、この方法は、
a)両集団のポリヌクレオチドを同一方法で断片化して試料および対照の断片集団を得ること；
b)両断片集団に、ネステッドプライマー結合部位を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補体を共有結合させ（前記プライマー結合部位は最も外側のプライマー結合部位、最も内側のプライマー結合部位、およびそれらの間の少なくとも１つの内部プライマー結合部位を含む）、マークした試料および対照の断片集団を生成すること；
c)前記マークした試料断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も外側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅し、増幅した試料断片集団を得ること；
d)前記マークした対照断片集団を、前記オリゴヌクレオチドの最も内側のプライマー結合部位に相補的なターゲッティングプライマーを用いて増幅し、増幅した対照断片集団を得ること；
e)次の一連の工程：
(i) 前記増幅した試料断片集団を過剰量の前記増幅した対照断片集団と一緒にし、変性し、アニーリング条件下でインキュベートしてアニーリング混合物を得ること；
(ii)前記アニーリング混合物を、各鎖中に非ターゲッティングプライマーを含む二本鎖断片を除いて、全部の断片が分解される条件にさらすこと；
(iii) 続いて、前記アニーリング混合物を、前記内部プライマー結合部位の１つに相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかけ、第１の差異産物を生成すること；
を行うことにより差異産物を生成すること；
を含んでなる。
本発明はまた、前述の一連の工程(e)を繰り返すことにより追加の差異産物を得る方法を提供し、この方法では、増幅した試料断片集団の代わりに第１の差異産物（または後続の差異産物）を使用し、処理したアニーリング混合物を、先の工程で用いたものと異なる内部プライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーまたは最も内側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを用いて増幅反応にかける。
好ましい実施態様では、２以上の異なる細胞、細胞型または細胞集団のｍＲＮＡ集団の差異を呈示するユニークｃＤＮＡ断片を取得するる方法を提供する。
別の実施態様では、２つのポリヌクレオチド集団間で異なる１以上のポリヌクレオチド断片を含む差異産物を取得するる方法を提供する。
他の実施態様では、２つのゲノム間の配列差異を呈示する断片を取得するる方法を提供する。
他の実施態様では、特定のポリヌクレオチド集団に固有の（ユニークな）ＲＮＡ分子を呈示するｃＤＮＡを取得するる方法を提供する。
他の実施態様では、特定のポリヌクレオチド集団において優先的に発現されるＲＮＡ分子を呈示するｃＤＮＡを取得するる方法を提供する。
他の実施態様では、制限酵素消化および連結反応の多工程を回避する、呈示的差異分析(representational difference analysis)の改良法を提供する。
他の実施態様では、選択的分解のためのポリヌクレオチドの集団をターゲッティングする方法を提供する。
他の実施態様では、ポリヌクレオチド集団の選択的増幅を行う方法を提供する。
他の実施態様では、本発明の方法および関連方法で使用するための、複数のプライマー結合部位を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
他の実施態様では、本発明の方法および関連方法で使用するための、5'末端から３'末端へと次第に上昇するアニーリング温度を有する複数のプライマー結合部位を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の方法の好ましい実施態様のフローチャートを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、特定のポリヌクレオチド試料集団にユニークなポリヌクレオチド断片を同定するための改良された差引きハイブリダイゼーション方法を提供する。本方法は、とりわけ、特殊な病的状態または発達状態に特徴的なｃＤＮＡ等のポリヌクレオチド断片を単離するために使用できる。本方法は既存の方法よりも迅速であり、従来の方法よりも真正の産物が高収率で得られ、かつユニーク断片のより呈示的なコレクションが生成する。
他に示さない限り、本発明の実施には当該分野の技術範囲である分子生物学、生化学、微生物学、組み換えＤＮＡ、核酸ハイブリダイゼーション、遺伝学、免疫学、発生学および腫瘍学の伝統的な技術を使用する。このような技術は文献に十分説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch&Sambrook，分子クローニング：実験マニュアル（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL），Cold Spring Harbor Laboratory Press(1982); Sambrook, Fritsch&Maniatis,分子クローニング：実験マニュアル（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL），第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Ausubelら，分子生物学の現在のプロトコル（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY），John Wiley&Sons(1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Glover,ＤＮＡクローニング：実用的なアプローチ（DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH），第I巻および第II巻，IRL Press(1985),第III巻，IRL Press(1987); Perbal,分子クローニングへの実用的手引き（A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING），John Wiley&Sons(1984); Rigby(編),遺伝子工学シリーズ（The series GENETIC ENGINEERING）(Academic Press); Setlow&Hollaender(編),遺伝子工学シリーズ：原理と方法（The series GENETIC ENGINEERING:PRINCIPLES AND METHODS），Plenum Press;酵素学における方法シリーズ（The series METHODS IN ENZYMOLOGY）(Academic Press); Silhavy, Berman&Enquist,遺伝子融合を用いた実験（EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS），Cold Spring Harbor Laboratory Press(1984); Gait(編),オリゴヌクレオチド合成：実用的なアプローチ（OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1984, 1985); Eckstein(編)オリゴヌクレオチドと類縁体：実用的なアプローチ（OLIGONUCLEOTIDE AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1991); Hames&Higgins,核酸のハイブリダイゼーション：実用的なアプローチ（NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1985); Hames&Higgins，転写と翻訳：実用的なアプローチ（TRANSCRIPTION AND TRANSLATION: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1984); Freshney,動物細胞培養：実用的なアプローチ（ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1986); Mahy,ウイルス学：実用的なアプローチ（VIROLOGY: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1985); Woodward,固定化細胞と固定化酵素：実用的なアプローチ（IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES: A PRACTICAL APPROACH）, IRL Press(1985); Miller&Calos(編),哺乳動物細胞のための遺伝子転移ベクター（GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS）, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987); Erlich(編)ＰＣＲの技術（PCR TECHNOLOGY）, Stockton Press(1989); Innis,ＰＣＲのプロトコル（PCR PROTOCOLS）, Academic Press(1990)を参照すること。ここ、上記および下記に記載の全ての特許および文献は、全て参考としてここに組み込むものとする。
本発明を説明するにあたり、以下に定義する次の用語を使用する。
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーであり、この語はより大きなポリヌクレオチドの断片化によって生成するより小さなポリヌクレオチド（断片）を含むものとする。
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含み、また一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドおよび核酸の双方を含む。ポリヌクレオチドはまた、修飾されたポリヌクレオチドおよび核酸を含み、その修飾は当該分野で公知の塩基、糖またはリン酸基の修飾を含む。
ポリヌクレオチドの「集団」とは、異なるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドのコレクションである。ポリヌクレオチド集団の例としては、正常細胞のゲノム、感染細胞のゲノム、新生物細胞のゲノム、病的状態にある細胞のゲノム、特殊な細胞、多細胞構造、器官、分化の状態、病的または非病的状態に特徴的なＤＮＡ、細胞の全ＲＮＡ集団、細胞のポリアデニル化ＲＮＡ集団、または特殊な細胞、多細胞構造、器官、分化の状態、病的または非病的状態のｍＲＮＡ集団の代わりのｃＤＮＡ集団が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法を使用して、ポリヌクレオチドの「対照集団」と比較してユニークな１以上のポリヌクレオチド配列を有する断片をポリヌクレオチドの「試料集団」で探索し得る。「試料集団」は、例えば特定の発達状態または疾患の進行状態における特定の細胞、細胞型、感染細胞または病的細胞から得られ、本発明の方法に従って「対照集団」と比較して１以上のユニークな断片の存在を調べられる。例として、ウイルス感染細胞から試料集団を得た場合、対照集団は同じ型の非感染細胞から得る。特定の病的状態で欠損している配列の同定のようなある状況下では、正常な（非病的）細胞を試料集団として使用しても良い。
「配列コンプレキシティー」または「コンプレキシティー」は、ポリヌクレオチドの集団に存在する繰り返しのないヌクレオチド配列の長さとして定義される。
ポリヌクレオチドまたは断片の集団の「コンプレキシティーの低いサブセット」は、もとの集団に存在する配列または断片の全てではないが一部を含むコレクションである。
核酸の「断片」は、核酸の小片である。「断片化」は断片を得る方法である。断片化は、与えられたポリヌクレオチド集団において同じセットの断片を再生産的に生成する方法である限り、当該分野で公知のいずれの方法、例えば酵素的、化学的、機械的方法等によって得ることができる。ポリヌクレオチド集団の断片化の一つの一般的な方法は、集団を制限的エンドヌクレアーゼの作用にかけることである。
「断片集団」は、核酸またはポリヌクレオチド集団を断片化にかけた時に得られる。
ここで使用する場合の「マークする」(marking)はポリヌクレオチドまたは核酸断片に更なる配列を添加する方法を言う。ポリヌクレオチド断片の「マークした集団」は、例えばポリヌクレオチド断片集団にオリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターを結合させることによって作成できる。「示差的にマークする」は２種以上のポリヌクレオチド集団またはポリヌクレオチド断片を互いに区別するために更なる配列を存在させた状態を言う。
「変性」は二本鎖核酸がその構成一本鎖に変換される過程を言う。例えば高温の使用、低イオン強度、酸性またはアルカリ性のｐＨ、および／またはある種の有機溶媒によって変性が起こり得る。核酸を変性させる方法は当該分野で良く知られている。
「アニーリング」（時にハイブリダイゼーションと呼ばれる）は、相補的な一本鎖核酸が、二本の鎖の相補的塩基間の水素結合によって仲介される二本鎖構造、または「二重らせん」を形成する過程を言う。
「アニーリング条件」とは、アニーリングが生じることを可能とする、例えば温度、イオン強度、ｐＨおよび溶媒等の値を言う。上記の変数の多くの異なる組み合わせがアニーリングにつながる。アニーリングのために適当な条件は当該分野で良く知られており、一般に、中性または中性に近いｐＨでイオン強度が５０ｍＭまたはそれ以上の１価および／または２価のカチオンを含む。
「アニーリング混合物」とは、相補的配列の領域を有する分子間でアニーリングが生じることを可能とする適当な温度、ｐＨおよびイオン強度で一本鎖核酸を含有する組成物である。
「二重らせん」とは二本鎖ポリヌクレオチドを言う。
「増幅」とは、核酸配列の更なるコピーまたは核酸配列のコレクションが生成する過程を言う。増幅は一般にＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用して酵素的に行う。今日の技術では、一般にポリメラーゼ連鎖反応として知られる変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼ伸長段階の反復適用（reiterative application）を通して、一対のオリゴヌクレオチドプライマーのための結合部位に隣接する（flanked）配列の指数関数的な増幅が可能である（米国特許4,683,202号、Saikiら，Science 239:487-491(1988)，Innisら，上記，Erlich，上記）ポリメラーゼ連鎖反応で最も広く実施されている条件では、ポリマー形成の速度は１分間当たりおよそ1,000-2,000ヌクレオチドである。従って、増幅可能な配列の最大長は反応条件（例えば伸長段階の時間）によって制限されるだろう。ポリメラーゼ連鎖反応において伸長の度合いを調節する能力は、コンプレキシティーの高い初期断片コレクションから増幅断片のコンプレキシティーのより低いサブセットを有利に生成するために使用できる。
「分解」とは、ポリヌクレオチドの脱ポリマー化を言う。ポリヌクレオチドの分解は一般にヌクレオチド内のホスホジエステル結合の加水分解によって起こり、短いオリゴヌクレオチドおよび／またはモノヌクレオチドを放出する。分解は化学的に、または酵素的に行うことができる。本発明の好ましい態様において、ポリヌクレオチド断片の対照集団の断片はポリヌクレオチド断片の試料集団と比較して異なってマークされているために優先的にエキソヌクレアーゼによる分解を受ける。
「差異産物」とは、本発明の実施の結果として得られるポリヌクレオチドである。これは試料集団のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片に存在し、対照集団のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片に存在しない１以上のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片を含有する。
「ユニーク断片」とは、試料集団のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片に存在し、対照集団のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片に存在しない断片である。
「プライマー」とは、ポリヌクレオチドと塩基対を形成することができ、ポリマー形成が始まり得る部位として機能するオリゴヌクレオチドである。その伸長産物が分解に対して感受性があるような性質を有するプライマーは「ターゲッティングプライマー」として知られている。その伸長産物が分解から保護されているような性質を有するプライマーは「非ターゲッティングプライマー」として知られている。より一般的には、ポリヌクレオチドの「標的」集団は、ポリヌクレオチドの「非標的」集団とは共有しない独特の性質または成分によって優先的に分解にかけられるものである。
「プライマー結合部位」とは、プライマーと塩基対を形成できる、またはプライマーと塩基対を形成できる配列をコードする、アダプターのような、またはアダプターによってコードされる配列のようなポリヌクレオチドの領域を言う。例として、本発明のアダプターは多重プライマー結合部位をその配列内に有するか、これらをコードしても良い。多重プライマー結合部位の場合には、「最も外側のプライマー結合部位」はそれが存在する核酸鎖の３'末端に最も近く位置するプライマー結合部位である。「最も内側のプライマー結合部位」は、それが存在する核酸鎖の３'末端から最も離れて位置している。最も外側のプライマー結合部位と最も内側のプライマー結合部位間には１以上の「内部プライマー結合部位」が存在しても良い。ポリマー形成は５'から３'方向に進行し、プライマー結合部位はポリマー形成が開始するプライマーに相補的であることから、最も外側のプライマー結合部位が、内部または最も内側のプライマー結合部位と比較して、ポリマー形成の産物の５'末端に最も近い配列をコードすることに留意すべきである。
「オリゴヌクレオチド」は、短い核酸、一般にＤＮＡであり、一般に一本鎖である。一般に、オリゴヌクレオチドは２００ヌクレオチドより短く、より好ましくは１００ヌクレオチドより短く、最も好ましくは５０ヌクレオチド以下である。
「ヌクレアーゼ」は、核酸を分解し得る酵素である。「エキソヌクレアーゼ」は核酸分子の末端から分解する。５'特異的エキソヌクレアーゼは核酸分子の５'末端で分解を始め、３'特異的エキソヌクレアーゼは核酸分子の３'末端で分解を始める。５'特異的エキソヌクレアーゼは更に５'リン酸または５'水酸基末端のいずれに対しても特異的なものであって良い。同様に、３'特異的エキソヌクレアーゼは３'リン酸または３'水酸基末端のいずれに対しても特異的なものであって良い。「エンドヌクレアーゼ」は核酸分子を内部で分解する。「一本鎖特異的ヌクレアーゼ」は、一本鎖核酸をエキソヌクレアーゼ的にも、またエンドヌクレアーゼ的にも分解することができるが、二本鎖核酸を分解することはできない。
「ゲノムＤＮＡ」は細胞から得られるＤＮＡであって、その細胞のゲノムの全てまたは一部を表す。
「ｃＤＮＡ」または“相補的ＤＮＡ”は逆転写によってＲＮＡをコピーすることで得られるＤＮＡである。これは、特定の細胞、細胞型、発達状態または病的状態で見られるｍＲＮＡ分子の集団を最も良く呈示する。
発明の方法
Ａ．出発物質
本発明の方法の実施のための出発物質は、少なくとも２種のポリヌクレオチド集団である。ポリヌクレオチド集団は細胞または細胞群のゲノムを含んでいても良く、また例えば、細胞の破壊、場合によってはその後に核の単離を行う当該分野で公知の技術によって得ても良い。破壊した細胞または核の調製物は、更に蛋白分解酵素の作用および有機溶媒による抽出にかけても良く、核酸は、クロマトグラフィーおよび選択沈殿等の、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれによって精製しても良い。
あるいはまた、ｃＤＮＡの集団は本発明の方法の実施のための出発物質として使用しても良い。この場合、まずＲＮＡを目的の細胞、細胞型または細胞集団から、当該分野で公知の通りＲＮＡの分解を最小限にするために適当な注意を払いながら精製する。ポリアデニル化ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、全細胞ＲＮＡまたは他の選択されたＲＮＡの集団を使用できる。該ＲＮＡを、例えば当該技術分野で周知の方法（例えばManiatisら、Sambrookら、Ausubelら(上記)を参照すること）により、第一の鎖を生成する逆転写酵素、および第一の鎖を二重らせんに変換するＤＮＡポリメラーゼの連続的な作用でｃＤＮＡ（“相補的ＤＮＡ”）に変換する。
他の型の核酸またはポリヌクレオチドも出発物質として使用できる。
Ｂ．断片化およびコンプレキシティーの低いサブセットの任意の選択
増幅過程を容易にするために、ポリヌクレオチド集団に断片化操作を行った。断片化は、例えば制限エンドヌクレアーゼで核酸を分解することで達成できる。断片化の他の方法には、生理的温度と、断片化するポリヌクレオチドの融点との中間の温度での、Mung BeanヌクレアーゼまたはS1ヌクレアーゼのような一本鎖特異的ヌクレアーゼでの分解が挙げられる。ある種の条件下では、機械的剪断による断片化も適当であり得る。
コンプレキシティーの高いポリヌクレオチド集団、例えばヒトの細胞のゲノムにおいては、場合により、該ポリヌクレオチド集団のコンプレキシティーを低減させる方法を使用しても良い。例えば、同じセットの断片を再現可能に生成する方法を使用したポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド集団の断片化をポリヌクレオチドの出発集団のコンプレキシティーのより低いサブセットを得るための第一の段階として使用できる。断片化に続き、生成した断片のサブセットの選択によって、必要な場合には、出発物質のものよりもより低いコンプレキシティーを有する、もとのポリヌクレオチド集団のサブセットが得られる。例えば大きさ（サイズ）による選択を行うことができる。大きさの選択は、例えばゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィー等の当該技術分野で知られる多くの方法によって達成できる。大きさの選択を達成するための好ましい方法は、ポリヌクレオチドの集団を制限酵素で消化することである。ポリヌクレオチド集団がゲノムＤＮＡに由来するものである場合、６−ヌクレオチド認識配列を有する制限酵素がしばしば使用される。制限酵素消化で生成する断片の集団を、次いで増幅産物の大きさがおよそ２キロベース以下に限定される条件下で、例えばＰＣＲのような増幅にかける。このような条件は当該分野で公知である（Innisら、上記）。６−ヌクレオチド認識配列を有する制限酵素による消化で生成する断片の一部はおよそ２キロベースより大きいことから、これらは増幅されない。従って、増幅された集団は出発断片集団のサブセットを含有する。
選択は大きさに加えて他の当該分野で知られる方法で達成し得る。例えば、浮遊密度、配列組成および特定のリガンドに対する親和性は更なる選択技術の非限定的な例である。
細胞のｍＲＮＡ集団に相当するもののような、ある種の核酸集団は、コンプレキシティーの低いサブセットの生成が必要でない程十分に低いコンプレキシティーのものであり得る。この場合、４−ヌクレオチド認識配列を有する制限酵素による消化によって、（４−ヌクレオチド認識配列を有する制限酵素での切断によって生成する断片の大多数は２キロベースより短いため、）アニーリング段階で使用する増幅された断片集団を得るための後続のアダプターの結合が容易になり、実質的に全ての断片の増幅につながる。
Ｃ．アダプターオリゴヌクレオチド
本発明は、制限酵素消化および連結反応によるアダプターの反復置換の必要性を除くことによって、その使用がより高い効率、および真正の差異産物のより高い収量につながる新規なアダプターオリゴヌクレオチドを提供する。これらの新規なアダプターオリゴヌクレオチドは、断片増幅に使用し、必要に応じて選択的分解のためにある種の増幅された断片を標的とすることができる数種の個々のプライマーに対する結合部位を含有するか、またはコードする。新規なオリゴヌクレオチドはある種の数個のプライマー結合部位を有する程度の十分な長さのものであるが、ハイブリダイゼーションの特異性を妨害する（すなわち、自己−相補性の領域を有することによって）ほどには長くない。アダプター内に含有される、またはこれによってコードされる多重プライマー結合部位はネステッド（nested）プライマー結合部位を生成するために互いに重複しても良く、またプライマー結合部位は不連続であっても良い。
好ましい態様において、アダプターの５'末端から３'末端へと進行する、プライマー結合部位をコードするそれぞれの配列は、段階的により高いアニーリング温度を有する。隣接する部位間のアニーリング温度の差はおよそ１０℃、より好ましくは５℃、そして最も好ましくは３℃である。従って、アダプターの５'末端から３'末端へ進行するにつれて、それぞれのプライマー結合部位のグアニン＋シトシン含量および／または長さも増加する。かくして、一般に、最も５'側、すんわち最も外側のプライマー結合部位はより短く、より低いグアニン＋シトシン含量、より低いアニーリング温度を有し、一方最も３'側、すなわち最も内側のプライマー結合部位はより長く、より高いグアニン＋シトシン含量、より高いアニーリング温度を有する。アダプターの個々のプライマー結合部位のアニーリング温度の範囲は、下限は特異的なハイブリダイゼーションが可能な程度に十分高く、上限は増幅に使用するＤＮＡポリメラーゼに対して阻害的でないものである。この範囲は約２０℃から約９０℃、より好ましくは約３５℃から約８５℃、更に好ましくは約４５℃から約８０℃、最も好ましくは約５５℃から約７５℃である。好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドアダプターは４個のプライマー結合部位を有する。しかしながら、４個を越える、または４個未満のプライマー結合部位（を有するアダプター）も本発明に包含されること、およびプライマー結合部位のアニーリング温度間に特定の関係が必ずしも必要でないことは明らかである。
アダプターは当該分野で良く知られた技術によって断片に結合させる。アダプターは、化学的に、またはＤＮＡあるいはＲＮＡリガーゼの作用を介して（例えばManiatisら、Sambrookら、Ausubelら、上記）酵素的に結合させても良い。好ましいアダプターの結合方法において、ＤＮＡ集団の断片化を５'突出（protruding）末端を残す制限酵素での処理によって行う。短いオリゴヌクレオチドで、その一部がこの５'突出部分に相補的であり、かつその一部がアダプターの３'末端における配列に相補的であるものを、制限酵素で生成する末端の５'末端にアダプターの３'末端を結合させるためにアダプターを整列させるために使用する。アダプターの結合後、変性によって短いオリゴヌクレオチドを除去し、アダプターの相補体（complement）を、もとの断片の３'末端をプライマーとして使用して、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって合成する。
対照および試料ポリヌクレオチド集団のコンプレキシティーの低いサブセットが小断片の選択的増幅によって生成するものであれば、アダプターはこの段階に先立ち、集団のメンバーに結合される。そして試料断片集団は最も外側のプライマー結合部位に相補的な非リン酸化プライマーを使用して増幅し、一方対照断片集団は最も内側のプライマー結合部位に相補的なリン酸化プライマーを使用して増幅するのが好ましい。
Ｄ．示差的にマークした対照および試料断片集団の生成
アダプターの結合後、対照および試料断片集団を、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応によって別々に初期増幅段階にかける。アダプター配列の相補体の生成は、先に記載したように、プライマーの非存在下での初期伸長の実施によって初期増幅に先立って達成することができる。
この初期増幅段階過程を通して、試料および対照断片集団の増幅産物は異なってマークされることになる。この示差的マーキングによって、対照集団の増幅された断片は選択的分解の標的とされ、試料集団の増幅された断片からの（次のアニーリング段階で生じる）非標的二重らせんが分解に耐えるものとする。示差的マーキングはこれから記載するように、対照断片集団および試料断片集団の増幅に異なる型のプライマーを使用することで達成する。
オリゴヌクレオチドアダプターのプライマー結合部位にアニーリングすることができるプライマーは、５'末端がリン酸化されていてもリン酸化されていなくても良い。自動化された合成によっていずれの型のプライマーを調製することも当該分野の技術範囲内である（例えばApplied Biosystems Model 380D DNA合成器  ユーザーズマニュアルおよび関連技術報告、Gait、上記、およびEckstein、上記、（参考のためにその開示をここに組み入れる）を参照すること）。リン酸化オリゴヌクレオチドは、最終カップリングサイクルでリン酸化されたモノマーを使用することによって自動化装置上で合成する。自動化合成で使用するためのこうしたリン酸化モノマーは市販のものが得られ、例えばClontech Laboratories, Palo Alto, CAまたはApplied Biosystems, Foster City, CAまたはGlen Research, Sterling, VAまたは他の市販品販売者から得られる。あるいはまた、リン酸化オリゴヌクレオチドは、５'水酸基末端オリゴヌクレオチドを自動化合成し、続いて当該分野で良く知られている方法を使用して酵素的にリン酸化して調製しても良い（例えばManiatisら，Sambrookら，Ausubelら，上記）。
本発明の好ましい具体例において、リン酸化プライマーおよびリン酸化されていないプライマーを、以下のように２種のポリヌクレオチド断片の集団の示差的マーキングに使用する。対照断片集団の初期増幅において、５'リン酸化プライマーを増幅に使用する。試料集団の初期増幅においては、５'非リン酸化プライマーを増幅に使用する。増幅された対照断片集団を構成する断片上の５'リン酸基の存在によって、これらの断片はλエキソヌクレアーゼのような５'リン酸末端でエキソヌクレアーゼ分解を開始するヌクレアーゼの作用を受け得るようになる。これに対して、試料断片集団を構成する断片上の５'リン酸基の欠乏によって、これらの断片はλエキソヌクレアーゼのような５'リン酸特異的ヌクレアーゼの作用から保護される。伸長産物が分解を受け得るプライマーはターゲッティングプライマーとして知られ、その伸長産物は標的とされていると言う。一方、伸長産物が分解から保護されているプライマーは非ターゲッティングプライマーとして知られ、その伸長産物は標的とされていないと言う。他の型の非−ターゲッティングプライマーには、５'末端の近くに１以上のα−ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート・ヌクレオチド間結合を有するもの、または５'末端がアミンまたはチオール基で遮断されているプライマーが挙げられ、これらは全てλエキソヌクレアーゼによる分解に耐える伸長産物を産する。５'特異的エキソヌクレアーゼに耐性のオリゴ−またはポリヌクレオチドになる他の型の５'末端修飾［すなわち、例えばビシクロＤＮＡ、Bolliら，（1996）Nucleic acids Res. 24:4660-4667のような修飾核酸構造、およびペプチド核酸、Nielsenら，（1991）Science 254: 1497-1500］も、本発明に使用できる。更に、標的核酸鎖の分解のために他の型のヌクレアーゼを使用できる。例えば、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼは５'から３'方向に加水分解する二本鎖特異的エキソヌクレアーゼである（KerrおよびSadowski(1989) J. Biol. Chem. 247:311-318）。しかしながら、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼによる消化は二本鎖ＤＮＡ分子の５'末端で４個以上のホスホロチオエート結合の存在によって阻止され得る（Nikiforovら、（1994）PCR Meth.&App. 3:285-291）。自動化オリゴヌクレオチド合成中のアミノ−またはチオ−修飾ヌクレオチドの組み込みに有用なモノマーおよび試薬は種々の市販の供給者、例えばClontech Laboratories, Palo Alto, CAまたはApplied Biosystems, Foster City, CAまたはGlen Research, Sterling, VA,または他の供給者から入手できる。
非標的増幅産物の作成のために、標的断片集団の増幅のために使用されるものと異なるプライマー結合部位に相補的な５'水酸基末端プライマーで増幅を開始する。一般に、増幅された対照断片集団は標的とされ、増幅された試料断片集団は非標的とされる。
対照断片集団のコンプレキシティーの低いサブセットを標的とするもう１つの方法は、チミンの代わりにウラシルがＤＮＡ中に組み込まれる条件下で対照集団が得られる細胞を成長させること（またはチミジン三リン酸の代わりにデオキシウリジン三リン酸を使用して対照断片集団の初期増幅を行うこと）である。これにより、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ酵素の分解作用を受け得るウラシル−置換ＤＮＡが得られる。
本発明の初期増幅段階の最も好ましい具体例として、対照断片集団はアダプターの最も内側のプライマー結合部位に相補的な配列を有するリン酸化プライマーを使用して増幅し、試料断片集団はアダプターの最も外側のプライマー結合部位に相補的な配列を有する非リン酸化プライマーを使用して増幅する。
Ｅ．アニーリング
初期増幅反応で生成する、示差的にマークされた対照および試料断片集団を互いに組み合わせ、変性条件にかけ、次いで過剰量の対照集団由来の断片と共にアニーリング条件下でインキュベートする。この（ヌクレオチドのモル数と比較した）過剰の度合いは、実験の必要条件に応じて２：１から100,000：１の範囲で良く、好ましくは１００：１である。対照断片の試料断片に対する過剰度は異なるハイブリダイゼーション／増幅サイクルで異なっていても良い。
高温および／または低イオン強度および／または中程度から高濃度の有機溶媒等の変性を促進する条件は当該分野で良く知られている。同様に、高イオン強度および／またはより低い温度等の再アニーリングまたは再変性を促進する条件、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整するためのこれらの条件の変動は当該分野で良く知られている（例えばManiatisら，Sambrookら，Ausubelら，上記）。アニーリング時間は反応における配列のコンプレキシティーおよび必要とされる変性の度合いに応じて変えることができ、一般に次の式を使用して決定される。
C0t1/2＝1/k.
［式中、Ｃ0は一本鎖ＤＮＡの初期濃度を示し、ｔ1/2は最初の一本鎖ＤＮＡの半分が二重らせんを形成した時間であり、ｋはＤＮＡ集団のコンプレキシティーに依存する再会合（reassociation）の速度定数である。］アニーリング混合物は一般にｐＨを中性付近に緩衝化されており、ＥＤＴＡ等のキレート剤を含有しても良い。例えばSambrookら,上記，Ausubelら,上記，およびHames&Higgins(1985)上記を参照すること。
アニーリング混合物のイオン強度は伝統的にＮａ+カチオンを使用して調整される。しかしながら、いくつかの理由でＭｇ2+カチオンが好ましい。第一に、与えられるＭｇ2+濃度で、同濃度のＮａ+またはＫ+のような１価のカチオンと比較してより高いイオン強度が得られる。第二に、アニーリング反応において使用される高濃度のＮａ+（典型的にはおよそ１Ｍ）は増幅に使用されるＤＮＡポリメラーゼ酵素に阻害的であり、増幅に先立つアニーリング産物の沈殿または精製を必要とする合理的な反応容量を維持しながら増幅反応中にアニーリング混合物を希釈可能とするには高濃度すぎる。従来、アニーリング反応におけるＭｇ2+の使用は、ＤＮＡおよびＲＮＡ調製物をしばしば汚染したＭｇ2+依存性ヌクレアーゼの存在のために除外されていた。本発明において、増幅すべき核酸は、核酸の汚染が無視し得る程の、一般に十分な数の精製段階（例えばアダプターの連結の前後）にかけられた。あるいはまた、核酸調製物を、ヌクレアーゼフリーの調製物を得るために、QiaexII(Qiagen)またはGene Clean(Bio 101)等の特異的に設計されたマトリックス上のクロマトグラフィーで精製できる。従って本発明は、イオン強度の点で１Ｍ  NaClに等価な62.5ｍＭの濃度での、アニーリング反応におけるＭｇ2+の使用を意図している。「ＰＣＲ戦略」Innisら編、Academic Press(1995)のpp.69-83 WetmurおよびSninsky参照。アニーリング反応完了後、一般に約1.5ｍＭである、増幅に使用するＤＮＡポリメラーゼの至適Ｍｇ2+に応じて、Ｍｇ2+濃度が１−５ｍＭになるように、反応混合物を増幅反応の成分中に単に希釈しても良い。
Ｆ．ヌクレアーゼ消化
アニーリングの後、アニーリング混合物を、標的断片は分解され、非標的断片は分解から保護され、かつ優先的に増幅されるように処理する。用語「標的」および「非標的」の意味、および標的断片の選択的分解および非標的断片の選択的増幅を行う方法は上記で記載した。
従って、アニーリング段階の後、標的ポリヌクレオチドが分解を受け得る１以上のヌクレアーゼ分解段階を行う。好ましい態様において、ターゲッティングプライマーは５'リン酸基を含有し、非ターゲッティングプライマーは５'末端がリン酸化されていない。そして消化にはMung Beanヌクレアーゼとλエキソヌクレアーゼの組み合わせを使用する。これらの条件により、Mung Beanヌクレアーゼによる一本鎖物質の消化、５'リン酸基で終わるいずれかの鎖の（λエキソヌクレアーゼによる）エキソヌクレオリティックな分解が生じる。従って、対照断片集団由来の双方の鎖を含有する二重らせんが分解される。一本の（対照断片集団由来の）５'リン酸化鎖および（同じ断片集団由来の）５'末端がリン酸化されていない一本の鎖を有する二重らせんはλエキソヌクレアーゼによって５'リン酸化鎖の分解が起こり、その後に残部の鎖がMung Beanヌクレアーゼの作用を受けられるようになる。増幅された試料断片集団からの２本の鎖を有する二重らせんは２個の５'ヒドロキシ末端を有し、従って分解に対して抵抗性がある。このような二重らせんはまた、下記のように増幅可能である。これらの酵素による分解はどういう順で行っても良い。好ましい態様において、λエキソヌクレアーゼで最初に分解し、次いでMung Beanヌクレアーゼで処理する。Mung Beanヌクレアーゼおよびλエキソヌクレアーゼと同じ特異性を有する酵素および化学処理も本発明に使用できる。
Ｇ．増幅
ヌクレアーゼ処理の後、分解されずに残ったポリヌクレオチドを、内部プライマー結合部位の一つ、好ましくは最も外側のプライマー結合部位に隣接する第一の内部プライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを使用して増幅する。上記のように、試料集団にユニークな配列を含有する二重らせんは、そのリン酸化されていない５'末端のためにヌクレアーゼ分解を受けずに残る。従ってこれらは指数関数的増幅を受け得る。他の種の二重らせんまたは一本鎖ポリヌクレオチドは全て先のヌクレアーゼ処理によって分解されているだろう。従って、増幅産物は試料集団にユニークな断片に非常に富むものとなる。
Ｈ．更なる差異産物を得るためのサイクルの繰り返し
これまでの段階で得られる増幅された物質を過剰量（２倍から100,000倍、好ましくは１００倍）の対照集団からの増幅された断片と合わせ、アニーリング、ヌクレアーゼ分解および増幅のサイクルを１種以上の目的とする差異産物が得られるまで繰り返しても良い。それぞれのサイクルにおいて、異なる非ターゲッティングプライマーを増幅段階に使用する。好ましい具体例において、いずれのサイクルにおいても増幅プライマーは先のサイクルで使用したものの内側の次のプライマー結合部位に対応する。必要であれば、最も内側のプライマー結合部位に相補的な非ターゲッティングプライマーを使用しても良い。
対照断片：試料断片の比率は１００：１に維持する。差引きのラウンドが進行するにつれて、増幅された試料断片集団中でまれな差異産物の比率が増加する。この増加によってまれな差異産物がハイブリダイゼーションの間（秒のオーダーの動的反応）により速やかに同一の対（match）を見つけられるようになる。これにより、まれなメッセージを見いだすために必要な差引きハイブリダイゼーションのラウンドの数を減らし、後の方のラウンドでは長いハイブリダイゼーション時間（２０時間）を６〜８時間程度に短くすることができ、かつ／また、差異産物を増幅するために必要なサイクルの数を減少させることができる。
差異産物において「既知の」望ましくない配列を得ることを避けるために、増幅された対照断片集団に「既知の」配列を加えることができ、または増幅された試料断片集団を望ましくない「既知の」配列を含有する枯渇（depletion）ライブラリーとハイブリダイズさせることができる。これらの方法のいずれも、第二の（またはそれ以降の）差異産物の生成に最も効果的に働く。
まれなメッセージを増やすことは、第二の（またはそれ以降の）差異産物の生成において枯渇させた対照断片集団を使用して増大させることができる。枯渇させた対照断片集団は、限られた量の対照断片集団を使用し、過剰量の試料断片集団でこれを消去することで生成させる。枯渇させた対照断片集団は差引きハイブリダイゼーションの最終ラウンドで使用すべきである。
本発明の実施によって得られる差異産物はプローブとして直接使用しても良く、また配列決定のため、プローブとしての使用のため等でクローニングし、増やしても良い。
実施例
本発明の非限定的な実施例において、２種のｃＤＮＡ集団間の差異分析のための以下のプロトコルを提供する。TE（または１Ｘ TE）は１０mM Tris−Cl（２０℃でpH8.0）／0.1mMエチレンジアミン四酢酸である。３Ｘ EE緩衝液は３０mM EPPS（シグマケミカル社）、pH8.0（２０℃で）／３mMエチレンジアミン四酢酸である。
チップの取り替えに起因するペレットの損失を減少させるために、Beveledゲルローディングチップをペレットからの上清の除去に使用する。沈殿の収量を上げるために、Hi-Yield（トレードマーク）チューブ（Robbins Scientific Corporation, Sunnyvale, CA）を使用する。増幅段階では薄壁ＰＣＲチューブ（MicroAmp(トレードマーク)反応チューブ、Perkin Elmer, Norwalk, CT）を使用する。
サーモサイクラー間のサイクリング条件の差異、およびウェル間の不一致は増幅段階のためのタッチダウンＰＣＲプログラムを使用して回避することができる。（Don, R.H.ら、(1991)遺伝子増幅中の偽のプライミングを避けるための‘タッチダウン’ＰＣＲ、Nucleic Acids Research 19:4008）参考の為にその開示をここに組み入れておく。
Ａ．オリゴヌクレオチド
Applied Biosystems 380D DNA合成機を使用した自動化学合成によって以下のオリゴヌクレオチドを調製する。
0003715657.tif 000003
Ｂ．ｃＤＮＡの調製
好ましくは細胞質ｍＲＮＡを生成する部分溶解を使用して、真核細胞または組織からポリＡ+ｍＲＮＡを調製する。原核細胞がＲＮＡ源の場合は、総ＲＮＡ調製物を使用しても良い。大きな全長転写物を保持するために（例えば無菌のリボヌクレアーゼフリーの試薬およびピペッターを使用して）注意を払い、試料が等しく処理され、成長の同じ段階にあるようにする。
オリゴ５'−Ｔ30ＭＮ−３'プライマー（Ｍ＝Ａ，ＧまたはＣかつＮ＝Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ）を使用し、Gibco BRL(Gaithersburg, MD)SuperscriptTMII RT酵素に添付されている二本鎖ｃＤＮＡ製造プロトコルに従って二本鎖ｃＤＮＡを調製する。試料および対照ＲＮＡ集団の双方から、別々の反応容器で同一の条件下でｃＤＮＡの調製を行う。
Ｃ．ｃＤＮＡの制限酵素消化
試料および対照ｃＤＮＡ集団に対して以下の段階を同様に、しかし別々の反応容器で実施する。ｃＤＮＡ２μｇをDpnII（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）１００μｌ、３７℃、２から４時間、供給者の勧める条件下で、無菌緩衝液およびピペット装置を使用して分解する。消化の進行を消化反応液のアリコートのアガロースゲル電気泳動で監視し得る。消化完了後、消化混合物からフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出する。水層にグリコゲン担体２μｇ、１０Ｍ  NH4OAc５０μｌ、および１００％エタノール６５０μｌを添加する。混合液を氷上に２０分間置き、その後４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離にかける。ペレットを８５％エタノールで洗浄し、乾燥してTE２０μｌに再懸濁する。
Ｄ．アダプターの連結
試料および対照ｃＤＮＡ集団に対して以下の段階を同様に、しかし別々の反応容器で実施する。以下の成分を（無菌の緩衝液および水を用いて）混合する：
制限消化したｃＤＮＡ（試料断片集団または対照断片集団）１２μｌ（およそ1.2μｇ）
脱塩した４５merのオリゴＡＯ（２mg/ml）［配列番号１］7.5μｌ
脱塩したリンカーアダプター１３merオリゴＬＡ（１mg/ml）［配列番号２］4.3μｌ
１０Ｘリガーゼ緩衝液（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）６μｌ
水27.2μｌ
アニーリングさせるために、混合液をHot Bonnetを有するPTC100TMサーモサイクラー（MJ Research, Watertown, MA）で５０℃で１分間インキュベートし、次いで１時間かけて１０℃まで冷却する。連結のためにT4 ＤＮＡリガーゼ（４００Units/μｌ, New England Biolabs, Beverly, MA）３μｌを添加し、１２−１６℃で一晩インキュベーションを続ける。連結混合液をTE１４０μｌの添加で希釈する。
Ｅ．初期増幅
試料および／または対照断片集団のコンプレキシティーのより低いサブセットを生成するために初期増幅反応を使用できる。これは、集団中のより大きな断片が増幅できないように、制限消化（段階Ｃ，上記）のための制限酵素および増幅条件の適当な組み合わせを選択することによって達成できる。あるいはまた、増幅集団は単に次の段階に利用できる物質の量を増大させるために使用する初期増幅と共に、出発物質のコンプレキシティーを保持しても良い。増幅されるそれぞれの集団に対して増幅物質０．５−１ｍｇを提供するように以下の条件を設計する。
１．試料断片集団（非標的）
反応液２００μｌを０．５ｍｌのミクロ遠心用チューブに集め、２０−３０個の反応液を調製する。試料断片集団として、それぞれの反応液は、示した順に添加される以下の成分を含有する。
無菌の水169.2μｌ
１０Ｘ  Vent（登録商標）ＰＣＲ緩衝液（New England Biolabs, Beverly, MA）20μｌ
ＰＣＲヌクレオチドミックス（それぞれ１０ｍＭのdATP，dCTP，dGTP，dTTP;Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）6.8μｌ
プライマーＰ１（１mg/ml）［配列番号３］２μｌ
上記Ｄと同様に希釈したアダプター連結試料断片集団２μｌ
反応液をHot Bonnetを有するPTC100TMサーモサイクラー（MJ Research, Watertown, MA）中に置き、（段階Ｄからのリンカーアダプター１３merを解離するために）７２℃で３分間インキュベートする。１μｌ（５ユニット）のVent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を添加して７２℃でのインキュベートを５分間続ける。これによって段階Ｄで断片に連結した４５merのアダプターオリゴヌクレオチドに相補的な末端が満たされ、１組のプライマー結合部位が生成する。次に、反応混合液を９５℃で１分間、58.4℃で３０秒間、７２℃で３分間の２０回のサイクルにかける。最後に７２℃を１０分間に延長し、次いで反応液を４℃に冷却する。より小さい増幅産物が生じて、これが次の差引き過程を偏ったものとするため、サイクル数が２０を越えないようにすることは重要である。より多量の生成物が必要な場合には、反応液の数を増すべきである。
増幅産物の精製のために、４個の反応液を1.5ｍｌのエッペンドルフチューブに合わせる。それぞれの混合液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール７００μｌで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出する。次いで３Ｍ NaOAc（ｐＨ5.3）７５μｌおよびイソプロパノール800μｌを添加、混合し、チューブを氷上に２０分間置く。次いでチューブを４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離にかける。ペレットを８５％EtOHで洗浄、乾燥し、再懸濁して核酸濃度0.5mg/ml（４個の反応チューブ当たりおよそ１００−１５０μｌ）とする。
２．対照断片集団（標的）
対照断片集団のために、反応液２００μｌを0.5ｍｌのミクロ遠心用チューブに集め、２０−３０個の反応液を調製する。それぞれの反応液は、示した順に添加される以下の成分を含有する：
無菌の水169.2μｌ
１０Ｘ  Vent（登録商標）ＰＣＲ緩衝液（New England Biolabs, Beverly, MA）20μｌ
ＰＣＲヌクレオチドミックス（それぞれ１０ｍＭのdATP，dCTP，dGTP，dTTP;Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）6.8μｌ
プライマーＰＰ４（１mg/ml）［配列番号７］２μｌ
上記Ｄと同様に希釈したアダプター連結試料断片集団２μｌ
反応液をHot Bonnetを有するPTC100TMサーモサイクラー（MJ Research, Watertown, MA）中に置き、（段階Ｄからのリンカーアダプター１３merを解離するために）８０℃で３分間インキュベートする。１μｌ（５ユニット）のVent（登録商標）（エキソ-）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を添加して８０℃でのインキュベートを５分間続ける。これによって段階Ｄで断片に連結した４５merのアダプターオリゴヌクレオチドに相補的な末端が満たされ、１組のプライマー結合部位が生成する。次に、反応混合液を９５℃で１分間、および74.9℃で３分間の２０回のサイクルにかける。最後に７５℃を１０分間に延長し、次いで反応液を４℃に冷却する。より小さい増幅産物へのゆがみが生じて、これが次の差引き過程を偏ったものとするため、サイクル数が２０を越えないようにすることは重要である。より多量の生成物が必要な場合には、反応液の数を増すべきである。
増幅産物の精製のために、４個の反応液を1.5ｍｌのエッペンドルフチューブに合わせる。それぞれの混合液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール７００μｌで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出する。次いで３Ｍ NaOAc（ｐＨ5.3）７５μｌおよびイソプロパノール８００μｌを添加、混合し、チューブを氷上に２０分間置く。次いでチューブを４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離にかける。ペレットを８５％EtOHで洗浄、乾燥し、再懸濁して核酸濃度0.5mg/ml（４個の反応チューブ当たりおよそ１００−１５０μｌ）とする。
Ｆ．差引きハイブリダイゼーション
アニーリング混合物を調製するために、上記段階Ｅからの増幅された、アダプター連結対照断片集団（４０μｇ）８０μｌを、上記段階Ｅからの増幅された、アダプター連結試料断片集団（0.4μｇ）の５０倍希釈４０μｌと0.5ｍｌエッペンドルフミクロ遠心用チューブ中で混合する。混合液をフェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出する。１０Ｍ  NH4OAc３０μｌ、１００％EtOH３８０μｌの添加、および−７０℃で１０分間のインキュベーションによって核酸を沈殿させる。（塩の沈殿を最小限にするために）混合液を３７℃で１から２分間加温し、次いで４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離にかける。ペレットを８５％EtOHで２回、それぞれ軽く遠心分離を行って洗浄し、真空下で３分間乾燥させる。
ペレットを３Ｘ  EE緩衝液［３０ｍＭ  EPPS（Sigma Chemical Co.）、pH8.0（２０℃）／３ｍＭ  EDTA］中で少なくとも２分間ピペッティングして完全に再懸濁し、次いで３７℃で５分間加温する。内容物を撹拌して混合し、軽く遠心分離して液体をチューブの底に集め、次いで予め３７℃に加温した鉱油３５μｌを上に載せる。
次いで混合液を９８℃で５分間、サーモサイクラー中でインキュベートして核酸を変性させる。６７℃に冷却し、５Ｍ  NaCl（予め６７℃に加温したもの）１μｌを速やかに差引きハイブリダイゼーション混合液中に直接添加する。６７℃でのインキュベーションを２０時間継続する。
Ｇ．第一の差異産物（ＤＰ１）
１．差引きハイブリダイゼーション混合液の希釈
差引きハイブリダイゼーション混合液を鉱油の下からとり、温度変化によって引き起こされる望ましくないハイブリダイゼーションを最小限にするために予め加熱した溶液を使用して段階希釈を行う。まず、６７℃で２０時間インキュベートした上記段階Ｆからの差引きハイブリダイゼーション混合液を、６７℃に予め加温したTE１５μｌに添加する。サーモサイクラーにチューブを保持しながら、混合液を激しくピペッティングする。（６７℃に予め加温した）TE６５μｌを更に添加し、混合液をもう１度激しくピペッティングする。最後に、（６７℃に予め加温した）無菌水３１５μｌを添加し、混合液を完全に撹拌する。差引きハイブリダイゼーションミックスは今や0.2Ｘ  TEであり、λエキソヌクレアーゼ分解またはMung Beanヌクレアーゼ分解のいずれにも使用できる。これを氷上で、または長期保存のために−７０℃で保存できる。
２．λエキソヌクレアーゼによる分解
上記段階Ｇ．１からの希釈した差引きハイブリダイゼーション混合液２００μｌに、１０Ｘ  λエキソヌクレアーゼ緩衝液（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）３０μｌ、水６０μｌおよびλエキソヌクレアーゼ（１０Units／μｌ、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）１０μｌを添加する。反応混合液を３７℃で３０分間インキュベートする。反応混合液を７５℃で１０分間インキュベーションし、次いで５分間室温まで冷却して分解を止める。反応チューブを軽く遠心分離して縮合物を回収し、水１００μｌを添加、混合する。反応混合液を等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:1、v/v/v）で２回、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1、v/v）で１回抽出する。水層を分け（２本の1.5ｍｌミクロ遠心チューブにそれぞれ２００μｌ）、それぞれのチューブにグリコゲン担体４μｇ、１０Ｍ酢酸アンモニウム0.1ｍｌ、および無水エタノール1.3ｍｌを添加する。混合し、ドライアイス上で２０分間インキュベートした後、沈殿した核酸を４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離によって回収する。ペレットを８５％エタノールで洗浄し、３分間真空乾燥し、ペレット当たり５０μｌの無菌水に再懸濁する。再懸濁したペレットを２本のチューブの一方に合わせ、他方を無菌水５０μｌで２回洗浄し、洗浄液を再懸濁したペレットと合わせる。
エキソヌクレアーゼ分解のポジティブ対照として、一組の市販の５'−リン酸化分子量マーカーを使用することができる。ネガティブ対照として、同じマーカーを（例えば細菌または仔牛腸アルカリ性ホスファターゼの処理によって）脱リン酸化できる。分解産物の存在または非存在はサザンブロット分析によって検出できる。
３．Mung Beanヌクレアーゼ消化
上記段階Ｇ．２からのλエキソヌクレアーゼ消化混合液２００μｌに、以下の成分を添加する：
１０Ｘ  Mung Beanヌクレアーゼ緩衝液（New Eng. Biolabs, Beverly. MA）４０μｌ
ZnSO4４μｌ
無菌水１３６μｌ
Mung Beanヌクレアーゼ（１０Units／μｌ、New Eng. Biolabs, Beverly. MA）２０μｌ
消化混合液を３０℃で３５分間インキュベートする。これを次いでフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、２本の1.5ｍｌミクロ遠心チューブにそれぞれ２００μｌ含有するように分ける。グリコゲン担体４μｇ、１０Ｍ  NH4OAc１００μｌ、および１００％EtOH1300μｌの添加後、混合液をドライアイス上に２０分間置く。４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離で核酸を回収する。ペレットを８５％EtOHで洗浄し、３分間真空乾燥してそれぞれを５０μｌの無菌水に再懸濁する。Pharmacia MicrospinTMカラムS-200（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を使用し、製造者から提供されたプロトコルに従ってMung Beanヌクレアーゼ反応液から核酸を精製しても良い。カラムからの溶出液を合わせる。
４．増幅
段階Ｇ．３からのMung Beanヌクレアーゼ／λエキソヌクレアーゼ消化物質２０μｌを、それぞれ氷上で予め混合した以下の成分を含有する、４本のチューブのそれぞれに氷上で添加する：
無菌水169.2μｌ
１０Ｘ Vent（登録商標）緩衝液（New England Biolabs, Beverly. MA）２０μｌ
ＰＣＲヌクレオチドミックス（それぞれ１０ｍＭのdATP、dCTP、dGTP、dTTP；Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）6.8μｌ
Ｐ２プライマー（１mg/ml）２μｌ［配列番号４］
混合液をサーモサイクラー中で９５℃で１分間インキュベートし、次いで８０℃まで冷却し、その後Vent（登録商標）（エキソ-）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）１μｌ（5ユニット）を添加する。次いで以下のプロトコルに従って増幅サイクルを２２回実施する：９５℃で１分間、61.9℃で３０秒間、そして７２℃で３分間。最後に７２℃を５分間に延長して行い、反応液を４℃に冷却する。
次いで４個の増幅反応液を１個の1.5ｍｌのエッペンドルフチューブに合わせ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回、クロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出する。３Ｍ  NaOAc（ｐＨ5.3）７５μｌ、イソプロパノール８００μｌの添加で核酸を沈殿させ、次に氷上で２０分間インキュベーションする。４℃で14,000rpm、１４分間の遠心分離で沈殿を回収する。ペレットを８５％EtOHで洗浄し、３分間真空乾燥してTE１００μｌに再懸濁し、およそ0.5μｇ／μｌの核酸濃度を得る。これが差異産物１（ＤＰ１）である。
Ｈ．第二の差異産物（ＤＰ２）の生成
ＤＰ−１をTEで１０ｎｇ／μｌに希釈する。差引きハイブリダイゼーション（Ｆ）、希釈（Ｇ．１）、Mung Beanヌクレアーゼ分解（Ｇ．２）、λエキソヌクレアーゼ分解（Ｇ．３）および増幅（Ｇ．４）の各段階を、以下の変更を加えて上記の方法に従って繰り返す。段階Ｆ中、増幅された、アダプター連結試料断片集団の代わりにＤＰ−１とする。段階Ｇ．４中、Ｐ２プライマー［配列番号４］の代わりにＰ３プライマー［配列番号５］とする。そしてＰ３プライマーを使用した増幅のために以下のサイクルプログラムを使用する。９５℃で１分間および72.1℃で３分間。
Ｉ．第三の差異産物（ＤＰ３）の生成
ＤＰ−２をTEで１０ｎｇ／μｌに希釈する。差引きハイブリダイゼーション（Ｆ）、希釈（Ｇ．１）、Mung Beanヌクレアーゼ分解（Ｇ．２）、λエキソヌクレアーゼ分解（Ｇ．３）および増幅（Ｇ．４）の各段階を、以下の変更を加えて上記の方法に従って繰り返す。段階Ｆ中、増幅された、アダプター連結試料断片集団の代わりにＤＰ−２とする。段階Ｇ．４中、Ｐ２プライマー［配列番号４］の代わりにＰ４プライマー［配列番号６］とする。そしてＰ４プライマーを使用した増幅のために以下のサイクルプログラムを使用する。９５℃で１分間および74.9℃で３分間。
Ｊ．差異産物の分析
必要であれば、いずれの差異産物を、以下のように制限消化、ゲル電気泳動で分析しても良い。差異産物のＤＮＡ濃度を（例えば紫外線吸収で）測定し、以下のプロトコルに従ってＤＮＡを消化する。以下を組み合わせる：
ＤＮＡ（ＤＰ１，ＤＰ２またはＤＰ３）1.0μｌ（500ng）
１０Ｘ Dpn II緩衝液（New England Biolabs, Beverly, MA）1.0μｌ
Dpn II（５０Ｕ／μｌ、New England Biolabs, Veberly, MA）0.5μｌ
無菌水7.5μｌ
消化混合液を３７℃で２から４時間インキュベートする。消化産物（５００ｎｇ）、および未消化の差異産物の５００ｎｇアリコート；増幅された、アダプター連結対照断片集団；および増幅された、アダプター連結試料断片集団を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ  Tris−酢酸／１０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、２３℃でのｐＨ8.3）中で実施する2.0％Seakem（登録商標）GTG（登録商標）（FMC BioProducts, Rockland, ME）アガロースミニ−ゲルで分析した。マーカー列はそれぞれ１μｇのマーカーIXおよびIII（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含む。
増幅産物は大きさが200-1300塩基対の範囲であるべきである。差引きハイブリダイゼーション／選択的増幅のラウンド数が増すにつれて、個々の不連続なバンドの存在は強度を増すべきである。もしバンドが汚れていれば、希釈した試料集団で再増幅させ、および／または増幅サイクルの数を減らすことである。最後に、常にＰＣＲをホットスタート(Hotstart)フォーマットで使用することが好ましい。
本発明をある特定の実施例および態様によって上記のように記載したが、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
配列表
(2) 配列番号１の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：45塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号１
0003715657.tif 000004
(2) 配列番号２の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：13塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号２
0003715657.tif 000005
(2) 配列番号３の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：22塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号３
0003715657.tif 000006
(2) 配列番号４の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：24塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号４
0003715657.tif 000007
(2) 配列番号５の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：24塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号５
0003715657.tif 000008
(2) 配列番号６の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：26塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号６
0003715657.tif 000009
(2) 配列番号７の情報
(i) 配列の特色
(A) 配列の長さ：26塩基対
(B) 配列の型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi)配列の記載：配列番号７
0003715657.tif 000010
【図１】
0003715657.tif 000011