(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列をコードすることを特徴とするヒトｃＭＯＡＴ遺伝子のｃＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡがハイブリダイズする６．５ｋｂのｍＲＮＡを発現し、ヒト第１０染色体の長腕の領域２のバンド４に存在することを特徴とするヒトｃＭＯＡＴ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、慢性間欠性黄疸を特徴とする Dubin-Johnson症候群の発症に関与するヒトｃＭＯＡＴ遺伝子とそのｃＤＮＡに関するものである。これらの遺伝子およびｃＤＮＡは、上記疾患の診断および治療に有効であるばかりか、癌細胞の制癌剤耐性能の獲得を予防もしくは阻害して制癌剤の有効性を持続させるための新しい手段を提供する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
制癌剤による化学療法を処方されている癌患者では、しばしば癌細胞が薬剤耐性能を獲得し、制癌剤の効果が減少もしくは消失してしまうという問題が存在する。
従来より、ＡＴＰ結合カセット（ATP-binding cassette: ＡＢＣ）タンパクであるＰｇｐ(P-glycoprotein)およびＭＲＰ(multidrug resistance protein)が癌細胞の薬剤耐性能獲得に関与することが知られている（Annual Rev. of Biochem., 62: 385-427, 1993; Annual Rev. of Biochem., 58: 137-171, 1989）。これら２つのタンパク質は、１次構造のアミノ酸相同性がわずか１５％であるにも係わらず（Science, 258: 1650-1654, 1992 ）、アンスラサイクリン類、ビンカアルカロイド類、ポドフィロトキシン類等の様々な制癌物質に対する耐性獲得に同様に関与している（Annual Rev. of Biochem., 62: 385-427, 1993; Annual Rev. of Biochem., 58: 137-171, 1989）。ところが、ＰｇｐやＭＲＰを過剰発現する癌細胞はアルキル化剤や代謝阻害剤等の白金含有化合物に対して交叉耐性を示さず（Annual Rev. of Biochem., 62: 385-427, 1993; Annual Rev. of Biochem., 58: 137-171, 1989）、またＭＲＰをトランスフェクトした細胞は上記の各制癌物質や重金属アニオンには耐性を示すものの、白金含有化合物には感受性を示す（Cancer Res., 54: 5902-5910, 1994; Cancer Res., 54: 1649-1652, 1994）。しかしながら、ＭＲＰはシステイニルＬＴＣ４や他のグルタチオン結合体を輸送することができるため（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 13033-13037, 1994; Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7690-7694, 1995; J. Biol. Chem., 269: 27807-27810, 1994）、ＭＲＰはＧＳＨ結合体の輸送体であることが示唆されている。
【０００３】
一方、白金含有化合物のうち、シスプラチンは強力な制癌剤として、睾丸腫瘍、頭部および頸部腫瘍、食道癌、肺癌、卵巣腫瘍および膀胱癌等の様々な悪性腫瘍の治療に広く用いられている。ただし、このシスプラチンは長期間使用すると癌細胞に耐性が生じ、その薬効が低減してしまうために臨床使用が制限されている。
【０００４】
従って、この強力な制癌剤であるシスプラチンの臨床的な使用をさらに有効なものとするためには、癌細胞のシスプラチンに対する感受性および耐性獲得をコントロールするメカニズムを理解することが重要である。特に、この発明の発明者等は、様々なシスプラチン耐性癌細胞株ではシスプラチンの蓄積が著しく減少していることを既に見出していることから（J. Urol., 150: 1970-1973, 1993; Cancer Res., 54: 3248-3252, 1994; Jpn. J. Cancer Res., 85: 426-433, 1994）、この薬剤による化学療法の効力を高めるためには、癌細胞におけるシスプラチンの蓄積と排出に係わる分子生物学的な実体を解明することが重要かつ有効であろうと思われる。
【０００５】
しかしながら、現在までのところ、シスプラチンの蓄積や排出に関与する特定のタンパク質や遺伝子については何ら知られてはいない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者等は、癌細胞の薬剤耐性能獲得に重要な役割を及ぼしていることが知られているＡＢＣ遺伝子群に着目し、これらの遺伝子に共通して保存されている配列をプライマーとし、かつ、シスプラチン耐性細胞が発現するＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲでクローニングした結果、シスプラチン耐性細胞において過剰に発現している新規な遺伝子のｃＤＮＡを見出した。そして、このｃＤＮＡが Dubin- Johnson 症候群の発症に関与するｃＭＯＡＴ（canalicular Multispecific Organic Anion Transporter)遺伝子由来であるとともに、癌細胞におけるｃＭＯＡＴ遺伝子の過剰発現がシスプラチンの排出を促し、薬剤耐性を生じさせる原因となっていることを見出した。
【０００７】
この発明は、この発明者等によって見出された以上のとおりの新規な事実に基づいてなされたものである。
すなわち、この発明は、配列番号１の塩基配列および配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするヒトｃＭＯＡＴ遺伝子のｃＤＮＡを提供する。
またこの発明は、配列番号１の塩基配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するｃＤＮＡがハイブリダイズする６．５ｋｂのｍＲＮＡを発現し、ヒト第１０染色体の長腕の領域２のバンド４（１０ｑ２４）に存在することを特徴とするヒトｃＭＯＡＴ遺伝子を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この発明のｃＤＮＡは、以下の実施例に記載の方法によって得るこができ、あるいは、配列番号２のアミノ酸配列に従って公知の方法により合成することもできる。また、この発明のｃＭＯＡＴ遺伝子は、上記ｃＤＮＡをプローブとして、例えば既存のヒトＤＮＡライブラリーから単離することができる。
【０００９】
この発明のｃＤＮＡは、その全配列または一部配列を癌組織に投与することによって、過剰発現しているｃＭＯＡＴｍＲＭＡに対するアンチセンス分子として機能させ、その発現を抑制することができる。これによって、癌細胞におけるシスプラチンの排出が防止され、その制癌効果を持続させることができる。
この発明のｃＭＯＡＴ遺伝子は、その欠損が Dubin-Johnson症候群の原因であることがモデル動物等からの知見およびヒト Dubin-Johnson症候群患者でのｃＭＯＡＴ遺伝子の変異の同定として知られているので、例えば遺伝子治療のための導入遺伝子として利用することができる。
【００１０】
また、これらのｃＤＮＡや遺伝子からは公知の方法によってタンパク質を得ることができ、このｃＭＯＡＴタンパク質は、Dubin-Johnson 症候群の治療薬剤の成分等として利用することができる。
さらに、このようなｃＭＯＡＴタンパク質は、ｃＭＯＡＴ抗体作成のための免疫原として利用することができ、そのような抗体は Dubin-Johnson症候群の正確な診断を可能とする。
【００１１】
以下、実施例を示して、この発明のｃＤＮＡの取得と、その機能についてさらに詳しく説明する。
【００１２】
【実施例】
シスプラチン耐性の癌細胞で過剰発現する遺伝子のｃＤＮＡをクローニングした。
（１）細胞株
シスプラチン耐性細胞株として、ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞由来のＴ２４／ＤＤＰ１０株（Cancer Res., 54: 3248-3252, 1994）、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞由来のＰ／ＣＤＰ５株（J. Urol., 150: 1970-1973, 1993）、ヒト頭部および頸部腫瘍ＫＢ細胞由来のＫＢ／ＫＣＰ４株（Jpn. J. Cancer Res., 85: 426-433, 1994; J. Natl. Cancer Inst., 86: 1781-1784, 1994）を用いた。また、エトポサイド／テニポサイド耐性細胞として、ＫＢ細胞由来のＫＢ／ＶＰ４株（Jpn. J. Cancer Res., 87: 765-772, 1996) を用いた。
【００１３】
これらの細胞は、１０％牛胎児血清、バクトペプトン（1mg/ml）、グルタミン（0.292mg/ml）、カナマイシン（100mg/ml）およびペニシリン (100U/ml)含有のイーグル最小必須培地（日水製薬社製）で、５％ＣＯ2 の大気下、３７℃で培養した。
（２）ｃＤＮＡクローニング
ＫＢ／ＫＣＰ４細胞株から単離した全ＲＮＡの１〜２μg から、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーとしては、ＡＢＣ遺伝子群に属するＭＤＲ１、ＭＲＰおよびＣＦＴＲのＡＴＰ結合領域に共通して保存されている配列を４種類（図１）用い、図２示したようにＣ１断片（5'-1／3'-1）からＣ２、Ｃ３断片へと順次に増幅し、最終的に両端にプライマー配列（5'-2）および（3'-2）を有するＣ４断片を得た。図３は、各ＰＣＲ産物の電気泳動パターンであり、矢印は２０７ｂｐのＣ４断片を示す。なお、各ＰＣＲ（３５サイクル）の温度、時間条件は、変性：９４℃／３０秒間、アニーリング：５０℃／３０秒間、合成：７２℃／３０秒間とした。
【００１４】
得られたＰＣＲ産物（Ｃ４断片）は、ｐＭＯＳＢｌｕｅベクター（Amersham社製）にサブクローニングし、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製）を用いてＤＮＡ配列を決定した。データは、既存のジーンバンクのデータベース（GeneWorks software：Intelli-Genetics社製）により分析した。その結果、サブクローニングした４３クローンのうち、１０クローンが両端に正しいプライマー配列（5'-2)(3'-2) を有していた。これらのうち、５クローンの配列は既知のＭＲＰと同一であり、４クローンはデータベースのいずれの配列とも相同性を示さず、特定不能であった。唯一、クローンｐＡＴＰ２−２８は、ＭＲＰと相同性を示し、しかもより重要なことに、ラットのｃＭＯＡＴ（Science, 271: 1126-1128, 1996)と高い相同性を示した。このことから、このクローンｐＡＴＰ２−２８をヒトｃＭＯＡＴ遺伝子ｃＤＮＡの一部と見なした。
【００１５】
次いで、クローンｐＡＴＰ２−２８の２０７ｂｐｃＤＮＡをプローブとして、λgt11 ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴヒト腎細胞ｃＤＮＡライブラリー（GIBCO BRL 社製）およびλzapIIヒト肝細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、図４に示したような重複クローンを得た。これらの重複クローンをさらにｐＵＣ１８プラスミッドにサブクローニングしたのち、各クローンの配列を決定し、ヒトｃＭＯＡＴ遺伝子のｃＤＮＡのコード領域を特定した。その結果、このコード領域は、配列番号１に示した塩基配列および配列番号２に示したアミノ酸配列を有することが確認された。図５は、このｃＤＮＡと、ラットｃＭＯＡＴおよびヒトＭＲＰの各ｃＤＮＡのアミノ酸配列を示したものであり、３者が高い相同性を有することが確認された。
（３）ＦＩＳＨ分析
ＥＭＢＬ３ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを上記と同様の方法でスクリーニングし、クローンｐＡＴＰ２−２８とハイブリダイズするクローンを得た。公知の方法（Gemone Res., 5: 245-258, 1996）に従い、健常者の血液リンパ球から単離したゲノムＤＮＡ断片に対して上記クローンのin situ ハイブリダイゼーションを行った。
【００１６】
その結果、ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、ヒト第１０染色体の長腕の領域２のバンド４（１０ｑ２４）にハイブリダイズすることが観察されたことから（図６）、ヒトｃＭＯＡＴ遺伝子がこの１０ｑ２４に存在することが判明した。ＡＢＣ遺伝子群に属するＭＤＲ１、ＣＦＴＲおよびＭＲＰの各遺伝子は、それぞれ７ｑ２１．１、７ｑ３１および１６ｑ１３．１２−１３に存在することが知られているので（Science, 258: 1650-1654, 1992; Nature, 318: 382-384, 1985; Somatic Cell Mol. Genet., 12: 415-420, 1986）、このヒトｃＭＯＡＴ遺伝子はそれらの既知遺伝子とは異なる新規な遺伝子であることが確認された。
【００１７】
また、ヒトｃＭＯＡＴ遺伝子が肝臓でのみ発現することから、この遺伝子は、様々な有機アニオンの肝臓における肝細胞から胆管への輸送を媒介しており、その変異が高ビリルビン血症を生じさせ、Dubin-Johnson 症候群の原因となることが示唆された。
（４）ノーザンブロット分析
ヒトの複数組織のノーザンブロット（Clontech社製）と、対数増殖期のヒト耐性株細胞より抽出した全ＲＮＡを用いて作成したナノーザンブロットを用い、
32Ｐで標識したｃＤＮＡプローブをハイブリダイズした。ヒトｃＭＯＡＴのｍＲＮＡ量は、イメージアナライザー（Fujix BAS 2000: 富士写真フィルム社製）で定量した。
【００１８】
結果は、図７に示したとおりであり、ヒトｃＭＯＡＴ遺伝子のｍＲＮＡは、肝臓でのみ特異的に発現することが判明した。これは、ラットにおけるｃＭＯＡＴ発現と同様であった。また、図８に示したように、全てのシスプラチン耐性細胞株は、その親株である感受性細胞に比べ、ヒトｃＭＯＡＴのｍＲＮＡを４〜６倍も多量に発現していた。一方、ＭＲＰ遺伝子を過剰発現するＫＢ／ＶＰ４細胞では、ヒトｃＭＯＡＴ遺伝子の発現は増大していなかった（図９および図１０）。
【００１９】
さらに、ヒトｃＭＯＡＴｍＲＮＡの分子量は、ＭＲＰｍＲＮＡ（図１０）と同様の約６．５ｋｂと見積もられた（図８）。
以上の結果は、癌細胞におけるヒトｃＭＯＡＴ遺伝子の過剰発現がシスプラチンの排出を促し、結果的に癌細胞がシスプラチン耐性能を獲得する原因となることを示唆する。
【００２０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、ヒトｃＭＯＡＴ遺伝子とそのｃＤＮＡが提供される。これによって、Dubin-Johnson 症候群診断および治療に新たな手段が可能となり、また強力な制癌剤であるシスプラチンのさらに有効に臨床使用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例のｃＤＮＡクローニングに用いたＰＣＲプライマーを示した塩基配列である。
【図２】図１に示したプライマーを用いたｃＤＮＡクローニングにおけるＰＣＲの増幅ステップを示した模式図である。
【図３】図２に示した各増幅ステップにおけるＰＣＲ産物のゲル電気泳動図である。
【図４】図３に示したＰＣＲ産物（Ｃ４）をプローブとするｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング結果を示した模式図である。
【図５】この発明のｃＤＮＡと、ラットｃＭＯＡＴおよびヒトＭＲＰの各ｃＤＮＡのアミノ酸配列の比較図である。
【図６】この発明のｃＤＮＡと、ヒト染色体断片との in situハイブリダイゼーションの結果を示した写真図である。
【図７】この発明のｃＤＮＡをプローブとしたヒト組織のノーザンブロット図である。
【図８】この発明のｃＤＮＡをプローブとした癌細胞株のノーザンブロット図である。
【図９】この発明のｃＤＮＡをプローブとした癌細胞株の別のノーザンブロット図である。
【図１０】ＭＲＰをプローブとした癌細胞株のノーザンブロット図である。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：4868
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源：
生物名：ホモ  サピエンス
染色体上の位置：10q24
配列：
0003695858.tif 000002
0003695858.tif 000003
0003695858.tif 000004
配列番号：２
配列の長さ：1545
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列の種類：配列番号１の配列にコードされたアミノ酸配列
配列：
0003695858.tif 000005
0003695858.tif 000006
0003695858.tif 000007
0003695858.tif 000008
0003695858.tif 000009
0003695858.tif 000010
0003695858.tif 000011
0003695858.tif 000012
【図１】
0003695858.tif 000013
【図２】
0003695858.tif 000014
【図３】
0003695858.tif 000015
【図４】
0003695858.tif 000016
【図５】
0003695858.tif 000017
【図６】
0003695858.tif 000018
【図７】
0003695858.tif 000019
【図８】
0003695858.tif 000020
【図９】
0003695858.tif 000021
【図１０】
0003695858.tif 000022