(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノ随伴ウイルスゲノムおよびアデノ随伴rep/capタンパク質をコードするDNA配列を含むDNAベクターであって、ここで該組換えアデノ随伴ウイルスゲノムは、プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に結合した非アデノ随伴ウイルスDNA配列に隣接するアデノ随伴ウイルス逆方向末端反復を含み、そしてrep/capタンパク質をコードする該DNA配列は該ゲノムの外に位置する、DNAベクター。
【請求項２】
前記非アデノ随伴ウイルスDNA配列が、免疫不全ウイルスタンパク質をコードするDNA配列である、請求項１に記載のDNAベクター。
【請求項３】
ベクターpAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap（ATCC 69637）である、請求項２に記載のDNAベクター。
【請求項４】
前記非アデノ随伴ウイルスDNA配列が、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、NT-3、NT-4/5、グリア細胞由来神経栄養因子および線維芽細胞成長因子よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするDNA配列である、請求項１に記載のDNAベクター。
【請求項５】
請求項１または４に記載のDNAベクターにより安定にトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞。
【請求項６】
前記非アデノ随伴ウイルスDNA配列が、免疫不全ウイルスタンパク質をコードするDNA配列である、請求項５に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項７】
HeLa細胞株A64（ATCC CRL 11639）である、請求項６に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項８】
感染性組換えアデノ随伴ウイルスを産生するための方法であって、請求項５に記載の宿主細胞をアデノ随伴ウイルスのヘルパーウイルスで感染させる工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記ヘルパーウイルスが、そのゲノムに挿入されたアデノ随伴ウイルスrep-cap遺伝子を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、同時係属中の米国特許出願第08/254,358号（1994年６月６日出願）の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、大きくはDNAの細胞への送達に有用なアデノ随伴ウイルス（AAV）物質および方法に関する。より具体的には、本発明は、組換えAAV（rAAV）ゲノム、rAAVをパッケージングするための方法、rAAVを産生する安定な細胞株、およびrAAVを利用して目的の遺伝子を細胞に送達する方法に関する。
背景
アデノ随伴ウイルス（AAV）は複製能欠損パルボウイルスであり、その１本鎖DNAゲノムは長さ約4.7kbで、145ヌクレオチドの逆方向末端反復（ITR）を含む。図１を参照されたい。AAV2ゲノムのヌクレオチド配列はSrivastavaら、J．Virol．、45:555-564(1983)に示される。ウイルスDNA複製（ori）、包膜化/パッケージング（pkg）および宿主細胞染色体組み込み（int）を指示するシス作用配列がITR中に含まれる。３つのAAVプロモーター、p5、p19、p40（これらの相対的なマップ上の位置により命名される）は、repタンパク質およびcapタンパク質をコードする２つのAAV内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。１つのAAVイントロンのディファレンシャルなスプライシング（ヌクレオチド2107および2227で）と関連する２つのrepプロモーター（p5およびp9）により、rep遺伝子から４つのrepタンパク質（rep78、rep68、rep52およびrep40）の産生が生じる。repタンパク質は、最終的にウイルスゲノム複製を担う複数の酵素的特性を有する。cap遺伝子はp40プロモーターから発現され、そして３つのキャプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3をコードする。オルタナティブかつ非コンセンサスの翻訳開始部位が３つの関連するキャプシドタンパク質の産生を担う。１つのコンセンサスポリアデニル化部位はAAVゲノムのマップ上の位置95に位置する。AAVの生活環および遺伝学は、Muzyczka、Current Topics in Microbiology and Immunology、158:97-129(1992)に概説される。
AAVがヒト細胞に感染すると、ウイルスゲノムは第19染色体中に組み込まれ、細胞の潜在的感染を生じる。感染性ウイルスの産生は、細胞がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）に感染しない限り起こらない。アデノウイルスの場合、遺伝子E1A、E1B、E2A、E4およびVAがヘルパー機能を提供する。ヘルパーウイルスでの感染の際に、AAVプロウイルスはレスキューされ、そして増幅され、そしてAAVおよびアデノウイルスの両方が産生される。
AAVは独特の特徴を有し、それ故、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとして注目される。培養中の細胞のAAV感染は、非細胞変性であり、そしてヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレント（silent）であり、そして無症候性である。さらに、AAVはほとんどの（全てではないにしても）哺乳動物細胞に感染し、これは、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。Kotinら、EMBO J．、11(13):5071-5078(1992)は、AAVのDNAゲノムは、感染の際に第19染色体上に標的化された組み込みを受けることを報告する。組み込みはウイルスDNAの複製を必要とせず、従ってこのプロセスはヘルパーウイルスを必要としない。AAVプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローン化DNAと同じく感染性である。このことは、組換えゲノムの構築を利用可能にする。さらに、AAV複製、ゲノム包膜化および組み込みを指示するシグナルがAAVゲノムのITR内に含まれているため、ゲノムの内部の約4.3kb（複製タンパク質および構造キャプシドタンパク質、rep-capをコードする）は、従ってプロモーター、目的のDNAおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットのような外来DNAで置換され得る。AAVの別の重要な特徴は、それが極めて安定で頑丈なウイルスであることである。AAVは、アデノウイルスを不活性化するために用いられる条件（56℃〜65℃で数時間）に耐え、これによりrAAVに基づくワクチンの冷却保存はそれ程重要でなくなる。最後に、AAV感染細胞は重複感染に耐性でない。
種々のグループが、疾患状態の処置におけるAAVの可能な使用を研究している。特許協力条約（PCT）国際公開公報第WO91/18088号（1991年11月28日公開）および対応する雑誌の記事であるChatterjeeら、Science、258:1485-1488(1992)は、HIV-1 TARは配列に特異的なアンチセンスRNAおよびポリアデニル化シグナルをコードするrAAVを用いるヒト造血細胞系および非造血細胞系におけるヒト免疫不全ウイルス-1（HIV-1）に対する細胞内耐性の導入を記載する。HIV-1感染の遺伝子治療に関する概説記事であるYuら、Gene Therapy、1:13-26(1994)は、造血幹細胞用の遺伝子治療ベクターの可能性を有するものとしてAAVを挙げている。培養気道上皮細胞における遺伝子（特に、嚢胞性線維症膜貫通調節遺伝子）の安定した組み込みおよび発現のための送達系としてのrAAVの使用が、PCT国際公開公報第WO93/24641号（1993年12月９日公開）および対応する雑誌の記事であるFlotteら、Am．J．Respir．Cell Mol．Biol．、7:349-356(1992)に記載される。異常血色素症および他の造血疾患の処理および細胞特異的多剤耐性の付与におけるrAAVを含む遺伝子治療が、PCT国際公開公報第WO93/09239号（1993年５月13日公開）；Muro-Cachoら、J．Immunol．、11:231-237(1992)；LaFaceら、Virol．、162:483-486(1988)；およびDixitら、Gene、104:253-257(1991)において提唱されている。グリオーム細胞への治療用遺伝子送達が、Tenenbaumら、Gene Therapy、１（補遺１）：S80(1994)で提唱されている。
遺伝子導入の分野における比較的新しい概念は、導入遺伝子の産物による免疫化がもたらされ得るということである。「遺伝子的免疫化（genetic immunization）」におけるいくつかの試みが報告されており、これはインフルエンザＡの核タンパク質配列の直接DNA注入［Ulmerら、Science、259:1475-1749(1993)］、ヒト成長ホルモン配列を用いるバイオリスティックガン（biolistic gun）免疫化［Tangら、Nature:356:152-154(1992)］およびHIV-1 gp160エンベロープタンパク質配列を含むレトロウイルスベクターでの感染［Warnerら、AIDS RESEARCH AND HUMAN RETRO VIRUSES、7(8):645-655(1991)］が含まれる。これらのアプローチは利用可能のようであるが、直接DNA接種は、長く継続する免疫応答を提供し得ず、そしてレトロウイルスベクターの使用に関して、深刻な安全性についての疑念が付きまとう。遺伝学的免疫化のためのAAVの使用は、これらの問題をこうむらない新規なアプローチである。
DNA送達のためのAAVの使用に対する障害は、組換えゲノムの包膜化のための高度に効率的なスキームの欠如である。rAAVゲノムを包膜化して、組換えウイルス粒子を作製するためのいくつかの方法が記載されている。これらの方法は全て、トランスに（in trans）AAV rep-capおよびアデノウイルスヘルパー機能を必要とする。最も単純な方法は、rAAVゲノムを宿主細胞にトランスフェクトし、その後野生型AAVおよびアデノウイルスで同時感染する工程を包含する。例えば、CarterおよびTratschinの米国特許第4,797,368号（1989年１月10日発行）および対応する雑誌の記事であるTratshinら、Mol．Cell．Biol．、5(11):3251-3260(1985)を参照されたい。しかし、この方法は、受容不可能に高レベルの野生型AAVを導く。別の一般的な方策は、rAAVプラスミドと同時トランスフェクトされる第２のプラスミド（rAAVゲノムとは分離している）にAAV機能を補充する工程を包含する。例えば、Hermonatら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、81:6466-6470(1984)およびLebkowskiら、Mol．Cell．Biol．、8(10):3988-3996(1988)を参照されたい。２つのプラスミドの間に配列重複が存在しない場合、Samulskiら、J．Virol．、63(9):3822-3828(1989)に記載のように、野生型AAV産生は回避される。しかし、rAAV粒子を作製するために３つの別々のDNA導入事象（２つのプラスミドの同時トランスフェクションならびにアデノウイルスでの感染）を必要とするため、本来この方策は非効率的である。この方法によるrAAVの大規模な生産は、コストが高く、そしてトランスフェクション効率の変動を受けやすい。
Vincentら、Vaccines、90:353-359(1990)は、rep-cap機能を発現する細胞株を用いてrAAVをパッケージングし得たことを報告している。このような方法は、rAAVゲノムの細胞株へのトランスフェクションをさらに必要とし、そして報告された得られたrAAVの力価は非常い低かった（わずか約103感染性ユニット/ml）。Dutton、Genetic Engineering News、14(1):1および14-15（1994年１月15日）は、Applied Immune ScienceのJane Lebkowski博士が、組換えAAVゲノム、ヒグロマイシン耐性遺伝子ならびにEBV ori ＰフラグメントおよびEBNA遺伝子を含むキメラAAV/エプスタインバールウイルスプラスミドを用いてrAAVを製造することを報告している。プラスミドは細胞にトランスフェクトされて安定な細胞株を生じる。次いで、この安定な細胞株を野生型AAv rep-cap機能物でトランスフェクトし、そしてアデノウイルスに感染させてrAAVを産生する。Vincentの方法と同様に、Lebkowskiのパッケージング方法は、rAAV粒子を生成させるためにトランスフェクション事象と感染事象の両方を必要とする。
従って、rAAVゲノムをパッケージングする効率的な方法および細胞へのDNA送達のためのベクターとして有用な特定のrAAVに対する必要性が当該技術分野に存在する。
発明の要旨
本発明は、目的の非AAV DNAを細胞に送達するに有用な組換えAAV（rAAV）ゲノムを提供する。本発明のrAAVゲノムは，目的の非AAV DNA配列に隣接するAAV ITRを含み、そして機能的rep-capタンパク質をコードするrep-cap配列を含まない。目的のDNAを細胞中でポリペプチドとして発現させることが望ましい場合は、rAAVゲノムはまた、目的のDNAに作動可能に連結する（構成的または調節可能な）プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含んで、遺伝子カセットを形成する。遺伝子カセットはまた、哺乳動物宿主細胞でのRNA転写物のプロセッシングを促進するためのイントロン配列を含んでもよい。本発明の好ましい遺伝子カセットは、以下のDNAセグメントを含む：（１）サイトメガロウイルス（CMV）即時型（immediate early）プロモーター、（２）ウサギβ-グロブリンイントロン、（３）サル免疫不全ウイルス（SIV）またはヒト免疫不全（HIV）のrevおよびエンベロープ（gp160）遺伝子、ならびに（４）ウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナル。本発明のrAAVゲノムは、AAVのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、E1欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染に対して許容性（permissible）である細胞のトランスフェクションに有用なベクター中で組立てられ得る。前記の好ましい遺伝子カセット、ネオマイシン耐性遺伝子、および野生型AAV rep-cap配列を含むrAAVゲノムを含む本発明のベクターは、E．coli DH5細胞中でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）、12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852に1994年６月１日に寄託され、そしてATCC受託番号69637を受けている。
本発明の好ましいrAAVゲノムは、目的の非AAV DNA（１つまたは複数）としてSIV revおよびエンベロープ（gp160）遺伝子、またはHIV revおよびエンベロープ遺伝子を含む。また、神経学的障害を改善し得るタンパク質をコードする配列（例えば、神経成長因子（NGF）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン３および4/5（NT-3および4/5）、グリア細胞神経栄養因子（GDNF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、および酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（aFGFおよびbFGF）をコードする配列）；チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、および芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（AADC）をコードする配列；スーパーオキシドジスムターゼ（SOD1およびSOD2）、カタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼをコードする配列；腫瘍壊死因子（TNF）、CD4特異的抗体およびTNFまたはCD4レセプターのようなインターフェロン、リンホカイン、サイトカインおよびそれらのアンタゴニスト；GABAレセプターイソ型、GABA合成酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）、カルシウム依存性カリウムチャンネルまたはATP感受性カリウムチャンネルをコードする配列；およびチミジンキナーゼをコードする配列を含むrAAVゲノムもまた好ましい。また、グロビン、オンコジーン、ras、およびp53配列を含むrAAVゲノムもまた本発明により意図される。細胞死抑制遺伝子（例えば、bc1-2）のような特定の遺伝子の発現に影響するか、または興奮性アミノ酸レセプター（例えば、グルタミン酸レセプターおよびNMDAレセプター）の発現に影響するアンチセンスヌクレオチドを含む組換えAAVゲノムもまた、神経学的障害の調節のために意図される。
本発明により意図される、目的の他のDNA配列は、HIV-1およびHIV-2（revおよびgp160配列以外の配列）；Ｉ型およびII型ヒトＴ細胞白血病ウイルス；呼吸器多核体ウイルス（respiratory syncytial virus）；１〜４型パラインフルエンザウイルス；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；風疹ウイルス；１型〜３型ポリオウイルス、Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルス；非ヒト（トリ、ウマ、ブタ）インフルエンザウイルス；Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ型肝炎ウイルス；ロタウイルス；ノーウォーク（norwalk virus）；サイトメガロウイルス；エプスタインバールウイルス；１型および２型単純ヘルパスウイルス；水痘帯状疱疹ウイルス；６型ヒトヘルペスウイルス；ハンタウイルス；アデノウイルス；chlamydia pneumoniae；chlamydia trachomatis；mycoplasma pneumoniae；mycobacterium tuberculosis；非定型抗酸菌（atypical mycobacteria）；ネコ白血病ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス；ウシ免疫不全ウイルス；ウマ感染性貧血ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス；およびビスナウイルスを包含する病原体由来の配列を含む。
本発明の細胞株は、本発明の両方のrAAVゲノムならびにAAV repおよびcap遺伝子のコピーで安定にトランスフェクトされる。好ましい細胞株は、哺乳動物細胞株（例えば、HeLa細胞株）である。AAVヘルパーウイルスでの本発明の細胞株の感染により、感染性rAAV粒子としてのrAAVのパッケージングが生じる。本発明の好ましい安定な細胞株は、1994年６月１日ATCCに寄託され、そしてATCC受託番号CRL 11639を受けているA64 HeLa細胞株である。本発明はまた、AAV repおよびcap配列を含むがrAAVゲノムは含まない安定な細胞株を提供する。
上記のパッケージングプロセスにより生成された組換えAAVは、目的のDNAを細胞へ送達するに有用である。rAAVは、インビボでアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターまたはワクチン（すなわち、遺伝子的免疫化）ベクターとして使用され得る。例えば、AIDS；ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および多発性硬化症、外傷、鬱病、片頭痛、疼痛または発作性疾患のような自己免疫疾患を包含する神経学的障害；成人Ｔ細胞白血病；熱帯性痙攣性不全対麻痺（tropical spastic paraparesis）；上部および下部呼吸器官感染；麻疹；おたふくかぜ；風疹；灰白髄炎；インフルエンザ；肝炎；下痢；全身性サイトメガロウイルス感染；単核細胞症様病；全身性エプスタインバールウイルス感染；典型的な感染性単核細胞症；全身性１型および２型単純ヘルペス感染；性器単純ヘルペス感染；水痘；バラ疹；６型ヒトヘルペスウイルスによる熱病；肺炎および成人呼吸困難症候群；感染；結膜炎；生殖管感染；肺および肺外結核；非定型抗酸菌による全身性感染；ネコ白血病；ネコAIDS；ウシAIDS；ウマ感染性貧血；ヤギの関節炎および脳炎；ならびにヒツジの肺炎および脳炎を包含する疾患状態の処置が本発明により意図される。ワクチンベクターとして、rAAVは目的の遺伝子を細胞に送達し、そしてこの遺伝子は細胞中で発現される。ワクチンベクターを用いて、遺伝子産物が細胞質性である場合（例えば、遺伝子産物がウイルスの組み込みまたは複製をさまたげる場合）、細胞内免疫性を生じさせ得る。あるいは、遺伝子産物が細胞表面で発現されるか分泌される場合、細胞外/全身性免疫性を生じさせ得る。
宿主（特にヒト宿主）は、免疫性誘導量（immunity-inducing amount）の疾患の原因となる生物のポリペプチドをコードする本発明のrAAを宿主に投与することにより、このペプチドに対して免疫され得る。本発明のrAAVを用いるヒト宿主の免疫化は、非経口経路により（例えば、静脈内注射、筋肉内注射または皮下注射により）、表面乱刺によりまたは身体腔内への接種により免疫性誘導用量のウイルスを接種することにより投与する工程を包含する。代表的には、感受性ヒト細胞株または非ヒト霊長類細胞株において測定したところ、それぞれ約1000感染単位と約10,000,000感染単位との間の１回または数回の接種が、ヒト宿主の免疫化をもたらすのに十分である。ワクチンとして使用されるべきウイルスは、液体形態または凍結乾燥形態で（１つ以上の適切な保存剤および/または凍結乾燥プロセスの間ウイルスを保護するための保護（protective）剤と組み合わせて）利用され得る。（例えば、特定の遺伝子産物により改善され得る神経学的障害の）遺伝子治療については、ポリペプチドをコードする治療有効用量の本発明のrAAVがこのような治療を必要とする宿主に投与される。宿主中で免疫性を誘導するかまたは宿主に遺伝子治療を提供するための薬剤の製造における本発明のrAAVの使用が意図される。
【図面の簡単な説明】
本発明の多くの他の局面および利点は、以下の詳細な説明および図面についてなされた参照を考慮すれば明らかである。ここで：
図１は、AAVゲノムの模式図であり；
図２は、実施例で利用されるAAV2配列の供給源であったプラスミドpsub201の模式図であり；
図３A〜図３Bは、ベクターpAAV/CMV/SIVrep-gp160における本発明のrAAVゲノムの構築の流れ図であり；
図４は、本発明のrAAVを産生する安定な細胞株を生成させるために有用なベクターpAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-capの構築の流れ図であり；そして
図５は、本発明の安定な宿主細胞株を利用するrAAVのパッケージングのための方法の模式図である。
図面の詳細な説明
本発明は、本発明のrAAVの産生および使用に関する以下の実施例により説明される。実施例１は、SIV revおよびエンベロープ（gp160）遺伝子を含むrAAVゲノムを含むベクターの構築を記載し、一方実施例２は、AAV rep-cap遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターの構築を記載する。実施例３は、実施例１および２で記載されるベクターからの、rAAVを産生する安定な細胞株を生成させるために使用されるベクターの構築を記載する。SIV revおよびgp160タンパク質をコードするrAAVを産生する安定な細胞株の生成が実施例４に詳細に記載される。実施例５は、本発明の安定な細胞株からrAAVを精製するための好ましい手順を記載する。実施例６は、AAV rep-cap遺伝子を発現する安定な細胞株の生成を記載する。実施例７は、実施例４で記載されるrAAVでの種々の哺乳動物細胞および細胞株の感染の結果を表し、これは感染細胞においてgp160タンパク質が発現されることを示す。実施例８は、目的のDNAとしてβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、そして標的細胞または組織における目的のDNAの発現についてのポジティブコントロールウイルスとして有用であるrAAVを産生する安定な細胞株の生成を記載する。実施例９は、本発明のrAAVを用いてインビボで目的のDNAを発現させた実験の結果を表す。実施例10は、安定な細胞株により産生されるrAAVの力価を増加させるために本発明により意図される方法を記載する。
実施例１
SIV revおよびエンベロープ（gp160）遺伝子カセットを含むrAAVゲノムを含むベクターを、psub201［Samulskiら、前出］と呼ばれる既存のプラスミドから構築した。図２はプラスミドpsub201の図解である。ここで、制限エンドヌクレアーゼ部位を示し、そして以下のように略記する：Ｐ、PvuII；Ｘ、ＸbaI；Ｂ、BamHI；Ｈ、HindIII；およびＮ、NaeI。このプラスミドは、PvuII制限部位の間にクローン化された改変野生型AAV2ゲノムを含む。野生型AAV2ゲノムのDNA配列を配列番号１に記載する。AAV2配列を便利な制限部位を含むように改変した。具体的には、２つのXbaI制限部位を、配列位置190および4484でのリンカー付加を介して付加した。これらの部位は、AAVゲノムの145bpの逆方向末端反復（ITR）を含んだ191bpのITRの内部にある。これらの部位の挿入により、プラスミドのXbaI消化で、AAVrep-cap遺伝子を含む内部の4.3kbのフラグメントの完全な取り出しが可能になる。図２において、191bpのITRを逆方向の矢印で示す。
本発明のrAAVゲノムベクター（pAAV/CMV/SIVrev-gp160）をいくつかの工程で作製した。
第１に、プラスミドpsub201をXbaIで消化し、そしてAAV ITRを含む約4kbのベクターフラグメントを単離した。次いで、CMV遺伝子発現カセットをAAV ITRの間に平滑末端ライゲーションにより挿入した。このCMV発現カセットは、1.8kbのXbaI-AflIII DNAフラグメントとして、Karasuyamaら、J．Exp．Med．，169:13-25(1989)に記載のベクターpCMV-NEO-BAMに由来した。ライゲーションの前に、分子末端をDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを使用してフィルインした。CMV発現カセットは、CMV即時型プロモーターの750bp部分、およびそれに続くウサギβグロビン遺伝子に由来する640bpのイントロンおよび360bpのポリアデニン化シグナル配列を含んだ。イントロンおよびポリＡ配列の間に２つのクローニング部位が存在した：唯一のBamHI部位および２つの隣接するEcoRI制限部位。生じたベクターをpAAV/CMVと命名した。図３Ａを参照のこと。ここで、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示し、そして以下のように略記する：Ｂ、BamHI；Ｅ、EcoRI；Ｎ、NaeI；およびＰ、PvuII。
第２に、pAAV/CMV発現ベクターをBamHI部位で線状化し、そして付着末端をクレノウを用いて平滑化した。PCRで生成させた、revおよびエンベロープ（gp160）配列［配列番号２、Hirschら、Nature，339:389-392(1989)］を含む2.7kbのSIVサブゲノムフラグメントを、平滑末端化したBamHI部位にクローン化した。生じた組換えAAVゲノムベクター、pAAV/CMV/SIVrev-gp160は、8.53kbの長さである。図３Ｂを参照のこと。ここで、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を示し、そして以下のように略記する：Ｎ、NaeI；およびＰ、PvuII。このベクターは、以下のDANセグメントを配列中に含む：（１）AAV ITR、（２）CMVプロモーター、（３）ウサギβグロビンイントロン、（４）SIV revおよびエンベロープ配列、（５）ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル、および（６）AAV ITR。ヒト293細胞の一過性トランスフェクションアッセイにおいて、このベクターはSIV gp160タンパク質の高レベルの発現を生じた。これは、SIVで感染されたサル由来のポリクローナルな血清を用いる放射性免疫沈降アッセイにより測定した。
本発明は、前記のベクター中のSIV rev/エンベロープ配列を、以下の配列で、標準的な組換えDNA技術により置換することを特に意図する：HIV-1 rev/エンベロープ配列（HIV-1MN rev/エンベロープ配列を配列番号３に記載する）；神経成長因子［Levi-Montalcini，Science，237:1154-1162(1987)］；毛様体神経栄養因子［Manthorpeら、Nerve Growth Factors，Wiley and Sons(1989)、135頁から］；グリア細胞由来神経栄養因子［Linら、Science，260:1130-1132(1993)］；トランスフォーミング成長因子［Puolakkainenら、Neurotrophic Factors，Academic Press(1993)、359頁から］；酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子［Unsickerら、Neurotrophic Factors，Academic Press(1993)、313頁から］；ニューロトロフィン３［Maisonpierreら、Genomics，10:558-568(1991)］；脳由来神経栄養因子［Maisonpierre，前出］；ニューロトロフィン4/5［Berkemeierら、Neuron，7:857-866(1991)］；チロシンヒドロキシラーゼ［Grimaら、Nature，326:707-711(1987)］；および芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ［Sumiら、J．Neurochemistry，55:1075-1078(1990)］。
実施例２
AAV rep-cap遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を含むpSV40/neo/rep-capと呼ばれるプラスミドを、実施例１に記載のrAAVゲノムベクターと共に使用してrAAVを産生する安定な細胞株を生じさせるために、構築した。
pAAV/SVneoと呼ばれるプラスミド（Samulskiら、前出）を、EcoRIおよびBamHIで消化して、SV40初期プロモーターの421bp部分、1.4kbのネオマイシン耐性遺伝子、ならびにSV40tスプライス部位およびポリアデニル化シグナルを含む852bpにDNAフラグメントを含む2.7kbの挿入物を放出させた。この放出された挿入物をpBLUESCRIPT KS+（Stratagene，La Jolla，CA）のEcoRIおよびBamHI部位にクローン化して、5.66kbのプラスミドpSV40/neoを作製した。次に、AAV rep-cap遺伝子を含む約4.3kbのDNAフラグメント（実施例１に記載のようにpsub201のXbaIでの消化に由来する）を、pSV40/neoのXbaI制限部位に連結して、プラスミドpSV40/neo/rep-cap（約10kb）を作製した。このプラスミドの構築を、図４の前半において詳述する。ここで、制限エンドヌクレアーゼ部位を示し、そして以下のように略記する：Ｂ、BamHI；Ｅ、EcoRI；Ｐ、PvuII Ｎ；NotI；RV、EcoRV；およびＸ、XbaI。このプラスミドは、repおよびcap活性についての一過性アッセイにおいて機能性であり、そしてそれ自体を最終的に用いて安定な細胞株を誘導した（以下の実施例５を参照のこと）。
実施例３
rAAVを産生する安定な細胞株を生成させるために使用するべき最終的なベクターを、ベクターpAAV/CMV/SIVrev-gp160（実施例１）およびプラスミドpSV40/neo/rep-cap（実施例２）から生成させた。
構築は、pSV40/neo/rep-capからのneo-rep-cap遺伝子カセットの取り出し、およびこのカセットのpAAV/CMV/SIVrev-gp160中の唯一のNaeI部位への挿入を必要とした（図３Ｂを参照のこと）。具体的には、ベクターpAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep/capを、pSV40/neo/rep-cap由来のSV/neoおよびrep-cap発現ドメインを含む7.0kbのEcoRV-NotI DANフラグメントをアガロースゲルバンド単離することによって作製した。フラグメントの付着末端をクレノウを用いて平滑化し、そしてこのフラグメントをpAAV/CMV/SIVrev-gp160の平滑末端化したNaeI部位に連結した。図４を参照のこと。ベクターpAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap（ATCC 69637）は、以下の要素を含む：（１）rAAVゲノム；（２）AAV rep-cap遺伝子；および（３）ネオマイシン耐性遺伝子。
実施例４
ベクターpAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep/capを用いて、本発明のrAAVゲノムおよびAAV rep-cap遺伝子の両方を含む安定な細胞株を生成させた。
70%コンフルエントのHeLa細胞を、100mmディッシュ中で、10μgのpAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-capプラスミドDNAでトランスフェクトした。細胞を、製造者のプロトコル（Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN）によって指示されるように、血清マイナス培地中でのDOTAP/DNA複合体の形成後６時間トランスフェクトした。トランスフェクション培地の除去の後、10%ウシ胎児血清を含有するDMEM培地を細胞に加えた。３日後、700μg/mlのGeneticin（Gibco-BRL，Gaithersburg，MD）を補充した培地を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を安定に発現した細胞を選択した。新鮮なGeneticin含有DMEM培地を、４日毎に添加した。Geneticinn耐性クローンを選択培地を添加した10〜14日後に選択した。全部で55コロニーを選択して24ウェルプレートに移し、そしてさらなる分析のために拡大した。
55個のネオマイシン耐性HeLa細胞株を、最初に機能性のrep遺伝子活性についてスクリーニングした；21個がポジティブと評価された。rep遺伝子活性は、細胞株を５型アデノウイルス（Ad5）で感染させることによりアッセイした。アデノウイルスによる感染は、repおよびcap遺伝子をトランスアクチベートする。この結果、rAAVゲノムの複製およびその後のこれらの配列の感染性AAV粒子への包膜化が生じる。rAAV産生の模式図を図５に示す。最大のAd5誘導性細胞変性効果（CPE；細胞が丸くなることおよび培養フラスコからの90%脱離）の後、細胞溶解物を調製し、そしてHirt DNA（低分子量DNA）を単離した［Hirt，J．Mol．Biol．，26:365-369(1967)］。サザンブロット分析を用いて、組換えAAV（rAAV）の複製型分子（１本鎖、単量体、および２量体形態）の合成を可視化した。Ad5を受けていないコントロールウェルは、常にネガティブであった。高い相対的レベルのrep遺伝子活性を有する細胞株を、さらなる研究のために選択した。
cap遺伝子の機能性をアッセイするために、細胞株をAd5で感染させ、そして明澄化した溶解物を最大のCPEの発生の後に調製した。細胞溶解物、Ad5、および野生型AAVを用いてHeLa細胞を感染させた。Ad5誘導性CPEの発生の後（72時間）、Hirt DNAを単離し、そしてサザンブロット分析を実施した。gp160ハイブリダイズ可能rAAV（SIV gp160）複製配列を生じた細胞株溶解物は、キャプシド産生についてポジティブであると評価された。
各々の細胞株により産生されるrAAVの感染単位/ml（IU/ml）力価を、Ad5および試験されるべき明澄化細胞株溶解物の連続10倍希釈物でC12細胞（安定なrepおよびcap遺伝子発現を示す）を同時感染させることにより得た。最大のAd5誘導性CPEの後、Hirt DNAを単離し、そしてrAAV複製型分子の存在を検出するためにサザンブロット分析を行った。可視単量体および２量体複製中間体を生成した終点希釈物を、力価とした。力価の見積は、２回から４回の繰り返し実験に基づいた。
55個の細胞株のうち８個の特徴付けの結果を、以下の表１に示す。ここで、「ND」は値が測定されなかったことを示す。
0003720845.tif 000002
細胞株A64（ATCC CRL 11639）は、高力価のrAAV（106 iu/ml）を明澄化溶解物中に産生した。この力価は、Vincentら、前出により報告されたrAAVの力価よりも約1000倍高い。
種々の細胞株により産生されたrAAVを、組換えウイルスで感染させたHeLa細胞におけるSIV gp160を発現するその能力についても試験した。表１に列挙した８つの安定な細胞株により産生されるrAAVの濃縮ストックを得た。rAAV粒子を含む細胞溶解物を、段階密度勾配（CsCl）精製に供した。脱塩透析およびAd5の加熱失活の後、rAAV粒子を用いて培養物中のHeLa細胞を感染させた（形質導入した）。２系列の調査を遂行した。第１に、形質導入した細胞を、形質導入後72時間で採取した全RNAについてのRT-PCRを行うことによって、SIV gp160特異的mRNAの存在について試験した。SIV gp160に特異的なプライマーにより、逆転写酵素およびTaqポリメラーゼの存在下でのみ予想された300bpのフラグメントが増幅された；逆転写酵素なしで行ったサンプルは、一様にネガティブであった。第２に、HeLa細胞を上記のように種々の希釈度の同一なrAAV/SIVストックで形質導入し、そして形質導入後72時間に間接免疫蛍光を感染細胞に対して行った。試験したすべての希釈度で（端（out）〜１：200）、SIV gp160タンパク質についてポジティブである細胞が検出された；より低い希釈度が明らかにより多くのポジティブ細胞を有した。
A64細胞株を、標準的な方法により、野生型AAVの産生について試験した。細胞株をアデノウイルスで感染させてrAAVを溶解物として産生させた。次いで、この溶解物を用いて正常HeLa細胞を以下のいずれかで感染させた：（ｉ）単独；（ii）アデノウイルスとともに；または（iii）アデノウイルスおよび野生型AAVとともに。コントロールとして、HeLa細胞をrAAVなしでアデノウイルスおよび野生型AAVで感染させた。Hirt DNAを調製し、そしてrAAVまたは野生型AAVのいずれかの複製型分子についてのサザンブロッティング（２つの異なるブロット）により分析した。野生型AAVに曝露していないA64細胞中には、野生型AAVは検出されなかった。
本発明はAAV repおよびcap遺伝子のコピーのみならず、rAAVゲノム（目的のITRに隣接するDNAを有する）も含む安定な細胞株の樹立を包含するので、単に細胞株をアデノウイルスで感染させることによりrAAVが産生される。外因性DNAのトランスフェクションは必要でない。その結果、以前に記載された方法に比較してrAAV産生の効率が増加する。本発明のその他の重要な特徴は、野生型AAVが産生されないこと、およびrAAVの産生の規模拡大が容易であり、かつ培養における細胞増殖の通常の抑制によってのみ制限されることである。
実施例５
安定な（産生（producer））細胞株からrAAVを単離および精製するための方法を開発した。
産生細胞（例えば、実施例４のA64細胞）を、増殖培地中、175cm2表面積当たり３×106産生細胞の細胞密度で播種した。細胞は16〜18時間後に約８×106細胞の密度に達し、次いでこの細胞を、アデノウイルス（Ad5）で、感染多重度（moi）５で、１〜２時間、増殖培地中で感染させた。15mlの感染容積を使用し、そして、１〜２時間の感染後、10mlの増殖培地を各々のフラスコに添加して最終容量を25mlとした。［あるいは、Ad5を以下のようにすることにより直接に添加し得る；ほとんど15mlの増殖培地を取り出し、そして10mlの容量でAd5を添加して（HBSS中で希釈する）最終容量を25mlとする。］
細胞を、大部分の細胞が激しい振盪の後フラスコから放出された、感染後約48〜60時間後に回収した。次いで、細胞を生存細胞の割合を測定するためにトリパンブルーで染色した。80%より多くが生存していることが望ましい。次いで、細胞を250mlディスポーザブル円錐ボトル（Corning）に移し、そして1000×g、15分間、４℃でペレット化した。生じた上清をアリコートを保存して除去し、そして細胞をTM緩衝液（50mM Tris（pH8.0）および1mM MgCl2）中に５×106細胞/mlの密度で懸濁した。この細胞を、３サイクルのドライアイス上での凍結/融解に供し、各々の融解の間に２分間ボルテックスした。次いで、溶解した細胞を、最後の融解の間に、30分間から１時間56℃に加熱して、7.5分毎にボルテックスした。10%のデオキシコレートを最終濃度１%になるように溶解物に添加し、そしてこの混合物を、完全な溶解を達成するために断続的にボルテックスしながら、37℃で30分間インキュベートした。完全な溶解が必要な場合は、混合物を毎回２分間最大設定で３回超音波処理した。血球計を用いて完全な細胞溶解を確認した。細胞片を2000×g、15分間、４℃でペレット化した。rAAV含有上清を保存した。
rAAVを、1.31g/mlのCsClクッションを用いて単離した。21mlの溶解物上清をSW-28チューブ中の14mlのCsClクッション上に重層し、そして16,000rpm、10℃、16時間スピンした。生じた上清を吸引し、そしてrAAVペレットをHBSSで洗浄して残渣のCsClを除去した。rAAVペレットを、扱い得る最小の容量（約500μl/ペレット）で20mM Tris（pH８）、150mM NaCl、１mM MgCl2（TMN緩衝液）中に再溶解し、そして一晩水和させた。次いで、これを５分毎にボルテックスしながら30分間56℃に加熱した。この終点で、ウイルスをさらに精製しない場合は、ウイルスをTMN緩衝液に対して透析してすべての微量のセシウムを除去した。
rAAVを等密度バンド化法（isopycnic banding）によりさらに精製し得る。これは、ウイルスをインビボで投与する条件下において適切である。水和したrAAVを密度1.41g/mlのCsClに移し、次いでSW-41チューブ中で30K、48時間、10℃でスピンした。アデノウイルスを含有する勾配上部（密度1.34〜1.36g/ml）を捨て、CsCl勾配の残りの部分を1.1g/ml未満の浮遊密度までTMNで希釈した。次いで、rAAVを一晩＞60,000×ｇでスピンすることによりペレット化した。rAAVを最小量の１%セラチンを補充したTMN緩衝液に再懸濁した。効率的な水和のために、ペレットを一晩４℃に置いた。次いで、rAAVをアリコートにして-20℃で保存した。
実施例６
実施例４に記載の安定な細胞の生成と同時に、rep-cap遺伝子を含むがrAAVゲノムを含まない安定なHeLa細胞株を、ピラスミドpSV/neo/rep-cap（実施例２）を使用して類似の方法により樹立した。全部で52個のネオマイシン耐性HeLa細胞株を単離し、そして特徴付けした。
rep遺伝子機能について試験するために、各々の細胞株をAd5で感染させ、そして次にpAAV/CMV/SIVrev-gp160を用いてトランスフェクトした。Ad5誘導性CPEの後（72時間）、Hirt DNAを単離し、そしてサザンブロット分析を実施した。rep遺伝子機能を、単量体および２量体rAAV gp160配列を生じた細胞株についてポジティブであると評価した。オートラジオグラフのシグナルの強度を、rep遺伝子発現の相対的な尺度として用いた（１〜５＋）。Ad5マイナスのコントロールサンプルは、rAAV複製型分子を決して生じなかった。Cap遺伝子向上を、明澄化細胞溶解物を最大のCPEの発生の後に調製した以外は、同様な方法（Ad5感染およびpAAV/CMV/SIVrev-gp160トランスフェクション）でアッセイした。次いで、HeLa細胞を明澄化した細胞溶解物の一部、Ad5、および野生型AAVで同時感染した。Hirt DNAを72時間後に単離し、そしてハイブリダイゼーション分析を用いてrAAV/gp160複製型分子（単量体および２量体）の存在を可視化した。記載したアッセイにおいて、C12細胞株がrAAV/gp160/120配列の最高の相対的割合を生じた。
８つの細胞株についての特徴付けアッセイの結果を表２に示す。ここで、略号「ND」は値が測定されなかったことを示す。
0003720845.tif 000003
rep-cap配列を発現する安定な細胞株の２つの主要な使用方法が存在する：（１）細胞株をrAAVゲノムでトランスフェクトし、そしてヘルパーウイルスで感染させる場合、rAAV粒子を生成すること；および（２）rAAV感染力価を決定すること、である。rAAV感染力価を算定するために、これらの細胞株をアデノウイルスとrAAVストックの連続希釈物とで同時トランスフェクトする。最大CPEの後、Hirt DNAを単離し、そして複製型rAAVをサザンブロット分析により視覚化する。次いで、終点力価（ポジティブハイブリダイゼーションシグナルを与えるための最後のrAAVストック希釈）を用いて感染力価を測定する。
実施例７
HeLa細胞株A64により産生されるrAAVの、HeLa細胞（実施例４を参照のこと）に加えて種々の哺乳動物の細胞型において感染（形質転換導入）し、そしてSIV gp160タンパク質を産生する能力を分析した。rAAV（約１の感染多重度）を用いて、細胞型に応じて単層または浮遊のどちらかの細胞を感染させた。rAAV感染の３日後、細胞をアセトン/メタノール中で固定し、そしてSIV感染サル由来のポリクローナル抗血清を用いる間接免疫蛍光法によりgp160の産生を評価した。以下の細胞または細胞株を感染させ、そしてそれらがgp160を産生することを示した；ラット胎児脳細胞（ニューロンおよびグリア細胞）、マウス3T3線維芽細胞、マウス膣細胞、ヒト膣細胞、ヒト結腸細胞、ヒトおよびサルリンパ球ならびに293細胞。非許容性細胞型は同定されなかった。これらの結果は、A64細胞株により産生されるrAAVは、広範な哺乳動物の細胞型に感染し、そして形質導入細胞において、SIVエンベロープ遺伝子産物であるgp160の細胞表面発現を誘導することを示す。
実施例８
目的の遺伝子としてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を有するrAAVを産生する安定な細胞株を生成した。これらのrAAVは標的細胞または組織における目的のDNAの発現の試験に対するポジティブコントロールとして有用である。
ヒトCMVプロモーター、E．coli β-ガラクトシダーゼ遺伝子、およびSV-40スプライス/ポリアデニル化配列を含むβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現カセット（Clontech、Palo Alto、CA）を、ウサギβ-グロビンイントロン、SIV revおよびエンベロープ配列ならびにウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルの代わりにAAV ITRの間に含むpAAV/CMV/SIVrep-gp160/neo/rep-capのようなベクターを構築した。このβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現カセットを、標準的な組換え法によりAAV ITRの間にクローン化した。
β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むrAAV（rAAV/β-gal）を産生する安定なHeLa細胞株を、実施例４に記載されるように上記ベクターを用いて生成した。
実施例９
実施例８のrAAV/β-galを用いて、生存マウスの脳への遺伝子導入のための本発明のrAAVの使用方法を示した。rAAV/β-galをマウスの脳に直接注射し、次いで脳をβ-ガラクトシダーゼ活性の証拠について検査した。
Balb/cマウス（n＝３；雄；９ヶ月齢）を麻酔し、そしてマウス固定プラットフォーム上に固定した。滅菌技法を用いて、rAAV/β-gal（１μl、３×106感染単位を含有する）を右海馬に注射した。さらなるマウス（n＝３）はコントロールとして希釈物の注射を受けた。注射の１週間後、マウスを心臓放血により屠殺し、続いて50mlのヘパリン化リン酸緩衝化生理食塩水、次いで50mlの0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.3）中のパラホルムアルデヒド（0.5％）およびグルタルアルデヒド（2.5％）の混合物を連続して注入した。脳を全部取り出し、同一の固定混合液中で後固定（post-fix）し（２時間）、そしてO.C.T中で凍結させた。クリオスタット切片（10μm）をポリ-L-リジンでコートした顕微鏡スライド上に配置し、そして-20℃で保存した。スライドを室温で解凍し、再び固定し（４℃で５分間）、PBS中で２回洗浄し、そしてX-gal染色（β-ガラクトシダーゼの酵素活性の基質）に移した。37℃で一晩インキュベートした後、スライドをPBS中で２回洗浄し、ヌクレア-ファストレッドで対比染色し、そして青に染色された細胞（β-ガラクトシダーゼが発現されている細胞）について顕微鏡で検査した。
rAAV/β-galを注射したマウスの脳において、海馬中で青に染色された細胞は、顕微鏡検査で容易に検出された。希釈液（コントロール）を注射したマウスの脳においては、青に染色された細胞は見出されなかった。
実施例10
安定な細胞株から生成されるrAAVの力価を上昇させる種々の方法が本発明により意図される。この方法は、さらなるAAV repおよびcap遺伝子を細胞株に供給する工程を包含する。
さらなるrepおよびcap遺伝子を提供することの有用性を示す第１の方法において、産生細胞株をアデノウイルス感染の前に、AAV repおよびcap遺伝子を有するヘルパープラスミドでトランスフェクトされる。rAAV/β-gal産生細胞株（H44）をこのようにトランスフェクトした実験の結果を下の表３に示す。
0003720845.tif 000004
第２の方法において、AAV repおよびcap遺伝子を、EBVまたはBPVのDNA複製起点および薬剤耐性マーカー（ヒグロマイシン）を含む別々のプラスミドに配置した。このプラスミドを産生細胞株にトランスフェクトし、次いで新たな細胞株をネオマイシンおよびヒグロマイシン上で選択する。この選択圧により、rAAVゲノムとAAV repおよびcap遺伝子の複数のコピーとの両方を含む安定な細胞株を得る。
第３の方法において、テトラサイクリンオペレーターの制御下でアデノウイルスのE3位置に、AAV repおよびcap遺伝子をクローン化する。
本発明を好適な実施態様に関して記載したが、当業者には変更および改善が可能であることはいうまでもない。従って、請求の範囲の限定のみが本発明に適用される。
配列表
(1)一般情報：
(i)出願人：ジョンソン，フィリップ アール．
(ii)発明の名称：アデノ随伴ウイルス物質および方法
(iii)配列数：３
(iv)連絡住所：
(A)名称：マーシャル，オットール，ガースティン，マレー アンド ボーラン
(B)番地：6300シアーズ タワー，233エス．ワッカー ドライブ
(C)市：シカゴ
(D)州：イリノイ
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：60606
(v)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピー ディスク
(B)コンピューター：IBM PC互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース#1.0，バージョン#1.25
(vi)現在の出願データ：
(A)出願番号：US
(B)出願日：
(C)分類：
(viii)代理人/事務所情報：
(A)氏名：ノランド，グレタ イー．
(B)登録番号：35,302
(C)照会/記録番号：31975
(ix)電話回線情報：
(A)電話：(312)474-6300
(B)テレファックス：(312)474-0448
(C)テレックス：25-3856
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：4680塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポリジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA（genomic）
(xi)配列：配列番号１：
0003720845.tif 000005
0003720845.tif 000006
0003720845.tif 000007
0003720845.tif 000008
0003720845.tif 000009
0003720845.tif 000010
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：2658塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA（genomic）
(xi)配列：配列番号２：
0003720845.tif 000011
0003720845.tif 000012
0003720845.tif 000013
0003720845.tif 000014
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：2571塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA（genomic）
(xi)配列：配列番号３：
0003720845.tif 000015
0003720845.tif 000016
0003720845.tif 000017
0003720845.tif 000018
【図１】
0003720845.tif 000019
【図２】
0003720845.tif 000020
【図３】
0003720845.tif 000021
【図４】
0003720845.tif 000022
【図５】
0003720845.tif 000023