(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体において、この小胞体の外水相面にのみ、機能性物質の官能基と反応する活性化エステル基がスペーサーを介して前記アミノ基と化学結合により結合している反応性小胞体であって、
前記活性化エステル基は、下記式のいずれかで表わされ、
【化１】
0003610602.tif 000018
前記スペーサーはオキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン鎖であることを特徴とする反応性小胞体。
【請求項２】
アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体と、１分子中に２個以上の活性化エステル基を有し、オキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体との反応生成物からなる請求項１記載の反応性小胞体。
【請求項３】
アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体と、１分子中に２個以上の活性化エステル基を有し、オキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、水系溶媒中で反応させることを特徴とする請求項１記載の反応性小胞体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は反応性小胞体およびその製造方法に関する。さらに詳しくは医薬の運搬体、検査薬、診断薬、アジュバント、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームまたは脂肪乳剤等として有用な反応性小胞体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポソームはリン脂質の二分子膜からなる小胞体であり、多分野での応用が試みられている。特に、医薬運搬体、診断・検出用のセンサーなどへの応用が注目されているが、リポソーム外水相面（外水相膜）上または膜中に機能性物質を固定して各種機能をもたせること、およびリポソームの血中濃度を維持することなどが大きな課題となっている。
【０００３】
従来、リポソーム外水相膜上または膜中への機能性物質の固定化に関しては、プルラン誘導体で被覆したリポソームの外水相膜上の多糖上に置換したアミノエチルカルバミルメチル基にγ−マレイミドブチルオキシサクシニミジルを介して抗体フラグメントを結合させる方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ８９８，  ３２３（１９８７））、あるいはあらかじめリポソーム膜形成成分中に糖脂質を加えておき、リポソーム形成後過よう素酸酸化を行い、生じたアルデヒド基と抗体とを反応させて固定化する方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５，  １０５０９（１９８０））などがある。
【０００４】
しかし、これらの従来法では、リポソーム調製後にリポソーム外水相膜上での多段階の化学反応を行う必要があり、このため目的とする機能性物質の導入量が低く制限され、また反応による副生成物や不純物が混入し、リポソーム膜へのダメージが大きいなどの問題点がある。
【０００５】
一方、リポソームを生体内へ投与したとき、その多くは肝臓、脾臓などの網内系器官で捕捉されるため、十分な効果が得られないことが指摘されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４３，  ５３２８（１９８３））。そこで、この網内系器官で捕捉されてしまう問題点や、リポソームに封入した薬剤のもれ防止、あるいはリポソーム自身の崩壊性・凝集性など安定性の低さに関する問題点を改善する方法として、リポソームの外水相膜にポリエチレングリコール鎖（ポリオキシエチレン鎖）を導入することが試みられている（例えば、特開平１−２４９７１７号公報、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２６８，  ２３５（１９９０））。また、ポリオキシエチレンで修飾されたリポソームは、長期間にわたり血液中濃度を維持できることが明らかになっている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０６６，  ２９−３６（１９９１））。
しかし、このような方法により得られるポリオキシエチレン鎖の導入されたリポソームは機能性物質と反応しないので、リポソーム外水相膜上に機能性物質を固定化することはできない。
【０００６】
さらに、特開平４−３４６９１８号公報には、マレイミド基を有するリポソームにまずチオール基を付与したタンパク質（チオール化タンパク質）を反応させ、次いで残存マレイミド基にチオール基を付与したポリアルキレングリコール（チオール化ポリアルキレングリコール）部分を含む化合物を反応させることにより、網内系器官での取込の改善された薬剤含有抗体結合リポソームが得られることが記載されている。
しかし、このリポソームでは、抗体がポリアルキレングリコール層の下部に隠蔽され、標的部位の抗原との反応が妨げられるため、期待される効果が十分には得られないという問題点がある。
【０００７】
さらに、米国特許第４４８３９２９号には、抗体を化学結合により担持した抗体担持リポソームが開示されている。この抗体担持リポソームは、反応活性基としてオキシカルボニルイミダゾール基を有する糖脂質を膜形成成分とする反応性リポソームと抗体とを反応させることにより得られる。
【０００８】
しかし、この抗体担持リポソームでは、リポソームの内水相膜（内側）にも反応活性を有するオキシカルボニルイミダゾール基が存在することになり、このためこのようなリポソームをドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）用の医薬運搬体などとして用いた場合、生体内でリポソームが崩壊した際内側に存在していたオキシカルボニルイミダゾール基が生体内のタンパク質などと反応し、副作用や毒性を起こすなどの危険性がある。またリポソームに封入した医薬と内側のオキシカルボニルイミダゾール基とが反応し、期待される医薬効果が得られないなどの問題点もある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記問題点を解決するため、アミノ基などの官能基と容易に反応する活性化エステル基が（ポリ）オキシアルキレン鎖を介して小胞体の外水相面（外側）にのみ結合し、内側には活性化エステル基が存在しない反応性小胞体であって、機能性物質を一段階の反応で固定化することができ、しかも固定化した機能性物質の作用を十分に発揮させることができる反応性小胞体およびその製造方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の反応性小胞体およびその製造方法である。
（１）アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体において、この小胞体の外水相面にのみ、機能性物質の官能基と反応する活性化エステル基がスペーサーを介して前記アミノ基と化学結合により結合している反応性小胞体であって、
前記活性化エステル基は、下記式のいずれかで表わされ、
【化２】
0003610602.tif 000002
前記スペーサーはオキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン鎖であることを特徴とする反応性小胞体。
（２）アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体と、１分子中に２個以上の活性化エステル基を有し、オキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体との反応生成物からなる上記（１）記載の反応性小胞体。
（３）アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体と、１分子中に２個以上の活性化エステル基を有し、オキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、水系溶媒中で反応させることを特徴とする上記（１）記載の反応性小胞体の製造方法。
【００１１】
本発明において、「（ポリ）オキシアルキレン」はオキシアルキレンまたはポリオキシアルキレンを意味する。
本発明において小胞体とは、小胞体形成成分の親水基が界面の水相に向って配向した構造を有する粒子を意味する。本発明においては、小胞体はアミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含有しているので、反応性小胞体を製造する前の小胞体には、外水相面にアミノ基が存在している。小胞体の具体的なものとしては、二分子膜からなる閉鎖小胞であるリポソーム、植物油およびリン脂質などの混合物が乳化された脂肪乳剤、またはミセルなどがあげられる。
【００１２】
反応性小胞体の外水相面に結合している活性化エステル基は、一般式〔１〕
【化３】
0003610602.tif 000003
〔式中、Ｙは機能性物質の官能基に対して反応性を有する活性化試薬残基を示す。〕で表わされる基であって、下記式のいずれかで表わされる。
【化４】
0003610602.tif 000004
【００１３】
上記一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基における活性化試薬残基Ｙは、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸イミドカーボネート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウム・メチルサルフェートなどの残基である。
【００１４】
一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基は、オキシアルキレン基を構造単位として含有する（ポリ）オキシアルキレン鎖をスペーサーとして介して、小胞体外水相面にのみ結合している。スペーサーとなる（ポリ）オキシアルキレン鎖中に含有されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、その平均付加モル数は１〜１０００、好ましくは４〜５００、さらに好ましくは１０〜２３０である。
【００１５】
オキシアルキレン基の具体的なものとしては、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
【００１６】
オキシアルキレン基が２以上付加している場合、オキシアルキレン基の種類は同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。スペーサーとなる（ポリ）オキシアルキレン鎖は親水性であるのが好ましく、この場合オキシアルキレン基としてはエチレンオキシドが単独で付加したもの、特にエチレンオキシドが４以上付加したものが好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。（ポリ）オキシアルキレン鎖に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加モル数を多くする。
このような（ポリ）オキシアルキレン鎖は、後述の活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体を構成する一部分である。
【００１７】
本発明の反応性小胞体は、一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基が小胞体の外水相面にのみ存在している小胞体であり、内側または内水相面（以下、両者をまとめて内側という）には活性化エステル基は存在しない。活性化エステル基はアミノ基、水酸基またはチオール基などの官能基、特に第１級アミノ基に対して高い反応性を有している反応活性基部分である。このため本発明の反応性小胞体は、小胞体の外水相面において、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に上記官能基を有する機能性物質を、容易に共有結合により結合させることができる。
【００１８】
本発明の反応性小胞体は、アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体に、一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基を１分子中に２個以上有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体（以下、活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体という）を反応させることにより製造することができる。
【００１９】
アミノ基を有するリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルスレオニンなどがあげられ、一種単独で、または二種以上組合せて使用できる。これらのリン脂質としては、２つの脂肪酸エステル部位に炭素数４〜３０、好ましくは８〜１８の飽和または不飽和の脂肪酸残基を有するものが望ましく、天然または合成のいずれのものでもよい。具体的には、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルスレオニン、ジパルミトイルホスファチジルスレオニン、ジステアロイルホスファチジルスレオニンなどがあげられる。
【００２０】
小胞体形成成分としては、アミノ基を有するリン脂質の他にも小胞体を形成しうる他の化合物も使用でき、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン、その他のリン脂質類、コレステロール、イントラリピッド（大塚製薬（株）、商標）、大豆油、サフラワー油など、従来から小胞体の形成成分として用いられているものが使用できる。また小胞体としては上記イントラリピッドのような脂質混合乳化物を使用することもできる。
【００２１】
全小胞体形成成分中に占めるアミノ基を有するリン脂質の割合は特に制限されないが、通常０．０１〜１００モル％とするのが好ましく、アミノ基の有するリン脂質の割合を多くするほど、一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基の導入量を多くすることができる。これにより小胞体の外水相面に存在する活性化エステル基の量を所望の値に調節することができる。
【００２２】
活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体としては、例えば下記一般式〔２〕〜〔４〕で表わされるものがあげられる。
【化３】
0003610602.tif 000005
〔各式中、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数で１〜１０００の正数を示す。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は同一でも異なっていてもよく、またランダムに付加していても、ブロック状に付加していてもよい。Ｘは
【化４】
0003610602.tif 000006
（ここで、ｐは０または１、ｑは０〜４の整数、Ｙは前記と同じものを示す。）を示す。一分子中に存在するＸは同一でも異なっていてもよい。〕
【００２３】
これらの活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体は、１種単独で使用することもできるし、２種以上を組合せて使用することもできる。
活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体は水溶性であることが好ましく、一般式〔２〕〜〔４〕において（ＡＯ）ｎで示されるアルキレンオキシドの付加部分は、すでに説明したように、エチレンオキシドが単独で付加したもの、特にエチレンオキシドが４以上付加したものが好ましい。またこれ以外にも、エチレンオキシドとテトラヒドロフランおよび／またはプロピレンオキシドとがランダムまたはブロック状に付加したものなどであってもよい。この場合オキシアルキレン基の平均付加モル数（ｎ）は好ましくは４〜５００、さらに好ましくは１０〜２３０である。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加している場合、総付加アルキレンオキシド中に占めるエチレンオキシドの割合は２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上であるのが望ましい。
【００２４】
小胞体と活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体、例えば一般式〔２〕〜〔４〕で表わされる活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体との反応は、水系溶媒、例えば蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の種々の緩衝液中で、ｐＨ１〜１２、好ましくはｐＨ３〜１０、反応温度０〜１００℃、好ましくは０〜６０℃で、反応時間３０分間〜２００時間、好ましくは１時間〜２４時間の条件で行うことができる。
このようにして反応させることにより、小胞体外水相面のアミノ基と活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体の活性化エステル基とが反応してＣＯＮＨ結合が形成され、これにより一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基が（ポリ）オキシアルキレン鎖を介して小胞体外水相面に導入され、反応性小胞体が得られる。
【００２５】
アミノ基を有するリン脂質としてホスファチジルエタノールアミンを用いた場合のリポソームと一般式〔２〕で表わされる活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体とから反応性リポソームを製造する反応式は下式〔５〕で示される。式中、Ｌｉｐはホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームを示す。ＡＯ、ｎ、Ｙ、ｐおよびｑは前記と同じものを示す。
【化５】
0003610602.tif 000007
【００２６】
一般式〔３〕または〔４〕で表わされる活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体を用いた場合も、上記と同様な反応により、下記〔６〕〜〔８〕で表わされる反応性リポソームが得られる。
【化６】
0003610602.tif 000008
【００２７】
このようにして得られた本発明の反応性小胞体は、ゲル濾過、透析、限外濾過などにより容易に単離・精製することができる。
なお条件によっては、小胞体同士が架橋された架橋小胞体が生じる場合もあるが、この場合には必要に応じて、ゲル濾過、または適当なポアサイズを有するメンブランフィルターなどを使用することにより、容易に分別することができる。
【００２８】
このように本発明の製造方法では、調製済みの小胞体に、後から活性化エステル基を導入しているので、小胞体の外水相面にのみ活性化エステル基が存在し、内側には存在しない反応性小胞体が得られる。
【００２９】
一般式〔２〕〜〔４〕で表される活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体は、例えば両末端にカルボキシル基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体と前記活性化試薬とを、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩などの脱水縮合剤の存在下に反応させることにより容易に製造することができる。また別の方法として、両末端にカルボン酸ハライド基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体と前記活性化試薬とを、トリエチルアミンまたはピリジンなどの脱ハロゲン化水素剤としてのアルカリまたは塩基の存在下に脱ハロゲン化水素反応を行うことによっても容易に製造することができる。
【００３０】
これらの反応は無溶媒または酢酸エチル、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ベンゼンなどの有機溶媒中で、反応温度−１００〜＋１５０℃、好ましくは０〜４０℃で、反応時間１０分間〜１６８時間、好ましくは３０分間〜１２時間の条件で容易に行うことができる。
得られた反応混合物は、精製することなくそのままで、あるいは再沈殿、カラム、ゲル濾過、限外濾過、透析などの方法により単離・精製した後、使用される。
【００３１】
次にそれぞれの反応性小胞体について詳しく説明する。
まず代表的な反応性小胞体である反応性リポソームについて説明する。
本発明に係る反応性リポソームは外水相面（膜）、すなわち膜を構成するいちばん外側の膜の外表面にのみ一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基が存在し、それ以外には存在しない反応性リポソームである。
【００３２】
反応性リポソームを構成する膜形成成分（小胞体形成成分）としては、前記アミノ基を有するリン脂質の他に、従来からリポソームの膜形成成分として用いられているものが制限なく使用できる。具体的には、ジホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール、大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール等のリン脂質および脂肪酸部に不飽和基を有する重合性リン脂質；スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ラクトシルジグリセリド等の糖脂質類；コレステロール等の非極性脂質；その他には、非イオン性界面活性剤、ホスファチジルポリエチレングリコール、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０６６，  ２９−３６（１９９０）」に記載されているホスファチジルエタノールアミンとポリエチレングリコールとの反応物、およびこれらの混合物などがあげられる。
【００３３】
全膜形成成分中に占めるアミノ基を有するリン脂質の割合は、通常前記範囲で用いられるが、０．１〜５０モル％とするのが好ましい。０．０１モル％未満の場合、リポソーム外水相膜に存在する一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基の導入量が少なくなり、このためリポソーム外水相膜に共有結合させる機能性物質の量が少なくなるので好ましくない。
【００３４】
活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体と反応させる前のリポソームは、膜形成成分を有機溶媒等の適当な溶媒に溶解し、エクスツルージョン法、ボルテックスミキサー法、超音波法、界面活性剤除去法、逆層蒸発法、エタノール注入法、プレベシクル法、フレンチプレス法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法、アニーリング法、凍結融解法など、種々の公知の方法によりリポソーム化することにより製造することができる。また、これらの製造法を選択することにより、多重層リポソーム、小さな一枚膜リポソーム、大きな一枚膜リポソームなど、種々の大きさや形態を有するリポソームを製造することができる。
このような方法により、リポソームの外水相膜および内側にアミノ基が存在するリポソームが得られる。
【００３５】
リポソームの内部には、一般のリポソームと同様に種々の物質を公知の方法により封入することが可能である。被封入物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物、電極感応性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬；ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等の水溶性高分子類；ホスファチジルセリン等のリン脂質；これらの混合物などがあげられる。
【００３６】
上記のようなリポソームと活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを前記のようにして反応させることにより、反応性リポソームが得られる。この場合、全反応溶液中のリポソームの膜構成成分の濃度は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍｌとするのが望ましく、また活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体の濃度は特に限定されないが、０．００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／ｍｌとするのが望ましい。活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体の使用量が上記下限値より少ない場合、得られた反応性リポソームは外水相膜に共有結合させる機能性物質の量が少なくなるので好ましくない。一方、上限値を超えると反応溶液の粘度が高くなり、リポソームの安定性が低下するため好ましくない。
【００３７】
なお、リポソーム外水相膜のアミノ基の全量に活性化エステル基を導入する必要がない場合には、アミノ基ブロック化剤、例えばアミノ基に対する反応性基を１分子中に１個だけ有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体、具体的にはα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン、α−Ｎ−オキシカルボニルイミダゾール−ω−メチル−ポリオキシエチレン、または活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体を製造した際に副生した１分子中に１個だけ活性化エステル基を有する（ポリ）オキシアルキレン誘導体などを、リポソーム外水相膜のアミノ基と反応させて、アミノ基をブロックすることができる。このようなアミノ基のブロック化は、反応性リポソームを製造する際の反応溶液中にアミノ基ブロック化剤を添加して行うこともできるし、活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体と反応させる前に行うこともできるし、または活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体と反応させた後に行うこともできる。このようにリポソーム外水相膜のアミノ基をブロックすることにより、リポソーム外水相膜に導入される一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基の量を所望の値に調節することができる。
【００３８】
このようにして得られた反応性リポソームは、リポソームの外水相膜に（ポリ）オキシアルキレン鎖からなるスペーサーを介して活性化エステル基が結合しているので、アミノ基、水酸基、チオール基などの官能基、特に第１級アミノ基を有する機能性物質を効率よくかつ簡単に、リポソームの二分子膜の外水相膜上に（ポリ）オキシアルキレン鎖からなるスペーサーを介して、化学結合により化学的に固定化することができる。
【００３９】
反応性リポソームに固定化できる機能性物質としては、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標識物質；光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物等の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、その他のタンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモン等の生理活性物質；医薬；ホスファチジルセリン等のリン脂質；これらの混合物などがあげられる。
【００４０】
反応性リポソーム外水相膜への機能性物質の固定化反応は、水系溶媒、例えば蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液などの種々の緩衝液；これらの水系溶媒とアセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルスルホキシド、ピロリドン等の有機溶媒との混合溶媒中で、反応性リポソームと機能性物質とをｐＨ１〜１２、好ましくはｐＨ３〜１０、反応温度−１０〜＋１２０℃、アミノ基との反応の場合は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは０〜４０℃、水酸基またはチオール基との反応の場合は好ましくは０〜１２０℃で、反応時間５分間〜１０００時間、好ましくは３０分間〜７２時間の条件で、攪拌下に反応させる方法などにより、一段階で容易に行うことができる。この場合、反応条件は温和であり、しかも一段階で行うことができるので、得られる機能性物質固定化リポソームの安定性は高い。なお上記条件外では、リポソームの安定性が悪くなるため好ましくない。
固定化反応の終了後は、必要によりゲル濾過、限外濾過、透析、遠心分離、静置沈降分離等の方法により精製を行うことができる。
【００４１】
リポソーム外水相膜上でのアミノ基を有する機能性物質の固定化反応を模式的に示すと下式〔９〕のようになる。式中、波線は（ポリ）オキシアルキレン鎖、Ｆは機能性物質、Ｙは前記と同じものを示す。
【化７】
0003610602.tif 000009
【００４２】
機能性物質を固定化したリポソームは、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に機能性物質が固定されているので（ポリ）オキシアルキレン鎖の長さを調節することにより機能性物質の作用を十分に発揮させることができる。また、（ポリ）オキシアルキレン鎖が導入されているので、従来からの（ポリ）オキシアルキレン鎖導入の効果、例えば長期間にわたる血液中濃度の維持、非免疫原生、リポソーム内部に封入した物質の漏れ防止などの効果も期待できる。さらにリポソームの内側（内水相膜）には反応活性の高い基は存在しないので、ＤＤＳ用の医薬運搬体、診断薬、アジュバントなど、生体内に投与する機能性リポソームとして用いても生体内の官能基とは反応せず、副作用や毒性を示す危険性がないほか、封入した機能性物質とも反応しない。このほか、不必要な活性化エステル基が残存したとしても、酸・アルカリで加水分解したり、またはグリシン等のアミノ酸やアミノエチルアルコールなど、アミノ基を有する化合物を作用させてキャッピングを行う方法などにより、その全てを容易に失活させることができる。
【００４３】
このため反応性リポソームは、医薬の運搬体、検査薬、診断薬、アジュバント、センサー、固定化触媒、バイオリアクター、バイオエレクトロニクス素子、マイクロカプセル代替品など、種々の機能性リポソームとして利用できる。これらの中でも、医薬の運搬体、診断薬、アジュバントなどの生体内に投与する機能性リポソームとして好適に利用できる。
【００４４】
なお、リポソームを製造する際、膜形成成分として重合性リン脂質を配合することにより、重合性の反応性リポソームとすることができる。重合性のリン脂質としては、公知の重合性リン脂質を使用することができるが、例えば１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンの他、野島庄七、砂本順三、井上圭三編集、１９８８年南雲堂発行の「リポソーム」ｐ３１３〜３１５に記載のものなどがあげられる。これらの中では、１，２−ジ（２，４−オクタデカジエノイル）−３−ホスファチジルコリンが好ましい。
【００４５】
重合性リポソームは、リポソーム調製後に、光重合開始剤の存在下または非存在下でＵＶ、γ線、電子線などの光照射を行うことにより、あるいはレドックス開始剤系により、あるいはアゾ系開始剤または有機過酸化物などの存在下で加熱を行うことにより、容易に重合を行うことができる。
このようにして得られた重合後のリポソームは、優れた安定性を有しているので、水溶液に分散させたままで、あるいは凍結乾燥等により粉末状に調製し、安定して使用することができる。
【００４６】
他の反応性小胞体としての反応性脂肪乳剤は、アミノ基を有するリン脂質と、大豆油、サフラワー油等の植物油と、必要により添加される他の添加剤、例えば大豆レシチン、卵黄レシチン等のリン脂質、イントラリピッド（大塚製薬（株）製、商標）、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、脂溶性医薬、脂溶性生理活性物質などを含む油脂混合物が、外水相面にのみ一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基が（ポリ）オキシアルキレン鎖を介して存在する状態で乳化されたものである。
【００４７】
活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体と反応させる前の脂肪乳剤は、公知の方法により製造することができる。例えば、アミノ基を有するリン脂質、植物油、および必要により配合する添加剤を混合、加熱し、水を加えてホモミキサー等で粗乳化し、次にマントン−ガウリン型の加圧噴射式ホモジナイザー等で均質化する方法などにより製造することできる。また脂肪乳剤としては、上記イントラリピッドのような脂質混合乳化物を使用することもできる。
【００４８】
このようにして得られた活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体との反応前の脂肪乳剤と、活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体とを、反応性リポソームの場合と同様にして反応させることにより、本発明に係る反応性脂肪乳剤が得られる。反応性脂肪乳剤は反応性リポソームと同様にして、同様の機能性物質を容易に固定化することができる。
このため反応性脂肪乳剤は、医薬の運搬体、検査薬、診断薬、センサー、固定化触媒などとして利用できる。
【００４９】
上記以外の反応性小胞体である反応性ミセルは、アミノ基を有するリン脂質が単独で、または他の成分、例えばホスファチジルコリン、その他のリン脂質類、コレステロールなどが、外水相面にのみ一般式〔１〕で表わされる活性化エステル基が（ポリ）オキシアルキレン鎖を介して存在する状態でミセル化したものである。反応性ミセルも反応性脂肪乳剤と同様にして機能性物質を固定化することができ、また同様の用途に利用できる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の反応性小胞体は、活性化エステル基が小胞体の外水相面にのみ存在し、内側には存在していないので、機能性物質を固定化した小胞体中には反応活性基が残存せず、このため生体内に投与しても生体内の官能基とは反応が起らず、副作用や毒性を起す危険性がない。また機能性物質の固定化は簡単にかつ効率よく行うことができ、しかも小胞体の安定性は低下しない。さらに（ポリ）オキシアルキレン鎖の長さを調節することにより、固定化した機能性物質の作用を十分に発揮させることができる。
【００５１】
本発明の反応性小胞体の製造方法では、アミノ基を有するリン脂質を小胞体形成成分として含む小胞体に、活性化（ポリ）オキシアルキレン誘導体を反応させるだけで、簡単に効率よく、しかも小胞体の安定性を低下させることなく前記のような反応性小胞体を製造することができる。
【実施例】
【００５２】
以下実施例によりさらに詳細な説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。
合成例１
酢酸エチル１０ｍｌ中に、両末端にカルボキシル基を有するポリオキシエチレン誘導体（分子量３０００）１ｇ（０．３３ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド１６５ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。さらに、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド９２ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を加え、４℃で１２時間攪拌した。反応終了後、析出物を濾過除去し、濾液をエーテル１００ｍｌ中に再沈殿させ、白色粉末状の目的の下式〔１０〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体を得た（収率９２％）。生成物の確認は、ＩＲにおいて、ポリオキシエチレン誘導体末端のカルボキシル基（１７００ｃｍ−１）の消失および、エステル結合（１７３０ｃｍ−１）の生成によって確認した。
【化８】
0003610602.tif 000010
【００５３】
実施例１−１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン２．８ｍｇ（４μｍｏｌ）をナス型フラスコに入れ、２ｍｌのベンゼンで溶解させた後、凍結乾燥を行った。これに生理的食塩水１ｍｌを加え、バス型超音波照射およびボルテックスミキサーにより、多重層リポソームを得た。さらにエクスツルーダーにより３．０→１．０→０．２μｍのポリカーボネートメンブランを順次通過させることにより、大きな一枚膜リポソームを得た。
【００５４】
次に、得られたリポソーム懸濁液の５００μｌに、合成例１で得られた反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを加え、室温で６時間反応させた。反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取し、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソーム外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た。得られた反応性リポソームの粒径をレーザー散乱粒度分布計（ＮＩＣＯＭＰ社製、ＮＩＣＯＭＰ３７０ＨＰＬ、商標）を用い測定したところ、平均粒径２２５ｎｍ（ＣＶ値１７％）であった。
【００５５】
実施例１−２
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、合成例１で得られた反応性ポリオキシアルキレン誘導体５ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量１５００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソーム外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２５２ｎｍ、ＣＶ値２１％）。
【００５６】
実施例１−３
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１１〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（ブロック共重合体：分子量約２０００）５ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量２０００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２４２ｎｍ、ＣＶ値２２％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２５１ｎｍ（ＣＶ値２４％）であり、安定性に優れていた。
【化９】
0003610602.tif 000011
【００５７】
実施例１−４
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１２〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（ランダム共重合体：分子量約２１００）５ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量２０００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２４２ｎｍ、ＣＶ値２２％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２５４ｎｍ（ＣＶ値２５％）であり、安定性に優れていた。
【化１０】
0003610602.tif 000012
【００５８】
実施例１−５
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１３〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（分子量約１５００）５ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量２０００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２４２ｎｍ、ＣＶ値２２％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２５０ｎｍ（ＣＶ値２５％）であり、安定性に優れていた。
【化１１】
0003610602.tif 000013
【００５９】
実施例１−６
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１４〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（分子量約２０００）５ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量２０００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２１６ｎｍ、ＣＶ値１９％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２２３ｎｍ（ＣＶ値２３％）であり、安定性に優れていた。
【化１２】
0003610602.tif 000014
【００６０】
実施例１−７
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１５〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（分子量約２０００）５ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量２０００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２１６ｎｍ、ＣＶ値１９％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２３５ｎｍ（ＣＶ値２４％）であり、安定性に優れていた。
【化１３】
0003610602.tif 000015
【００６１】
実施例１−８
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１６〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（分子量約２０００）１ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量３０００）１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２１６ｎｍ、ＣＶ値２８％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２５５ｎｍ（ＣＶ値３０％）であり、安定性に優れていた。
【化１４】
0003610602.tif 000016
【００６２】
実施例１−９
実施例１−１と同様にして、ただし反応性ポリオキシアルキレン誘導体の１０ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌに代えて、下式〔１７〕で表わされる反応性ポリオキシアルキレン誘導体（分子量約２０００）１ｗｔ％およびα−Ｎ−オキシコハク酸イミド−ω−メチル−ポリオキシエチレン（分子量４５００）５ｗｔ％を含む生理的食塩水１ｍｌを用いることにより、活性化エステル基がポリオキシアルキレン鎖を介してリポソームの外水相膜にのみ結合した反応性リポソームを得た（平均粒径２３０ｎｍ、ＣＶ値２８％）。また、５℃で３週間保存した後の平均粒径は２６１ｎｍ（ＣＶ値３１％）であり、安定性に優れていた。
【化１５】
0003610602.tif 000017
【００６３】
実施例２
実施例１−１で得られた反応性リポソームの懸濁液５００μｌに、西洋山葵ペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）１ｍｇを溶解させた０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌを加え、４０℃で６時間攪拌し、ＨＲＰをリポソームの外水相膜に固定化した。反応終了後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を用いてゲル濾過を行い、含リポソーム分画を分取した。これにＨＲＰの基質である１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見られた。
この結果から、実施例１−１で得られた反応性リポソームは、ＨＲＰと攪拌するだけでＨＲＰを外水相膜に固定できることがわかる。
【００６４】
比較例１
卵黄ホスファチジルコリン２０ｍｇ（２６μｍｏｌ）、コレステロール３．９ｍｇ（１０μｍｏｌ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン２．８ｍｇ（４μｍｏｌ）のみを用いて、実施例１−１と同様の操作により、固形分量約０．２５％の大きな一枚膜リポソームを得た。このリポソームに実施例２と同様にしてＨＲＰを作用させ、ゲル濾過により精製した。次に１，２−フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）０．１ｍｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたが、発色は見られなかった。
この結果から、活性基エステル基を持たないリポソームではＨＲＰは固定できないことがわかる。