(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の混合物中のＨ．ｐｙｌｏｒｉ  ＮＡＰを濃縮するプロセスであって、該プロセスは、他のタンパク質を塩析する工程であって最終塩濃度が少なくとも５０％飽和である、工程を包含する、プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、金属キレートクロマトグラフィーの工程をさらに包含する、プロセス。
【請求項３】
請求項２に記載のプロセスであって、前記金属がニッケルである、プロセス。
【請求項４】
タンパク質混合物からのＨ．ｐｙｌｏｒｉ  ＮＡＰの精製のためのプロセスであって、該プロセスは塩析の工程および金属キレートクロマトグラフィーの工程を包含する、プロセス。
【請求項５】
実質的に他のタンパク質を含まないＨ．ｐｙｌｏｒｉ  ＮＡＰを含む組成物を生産するためのプロセスであって、
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉＮＡＰを生産する工程；および
他のタンパク質を塩析する工程であって、最終の塩濃度は、少なくとも５０％飽和である、工程、
を包含する、プロセス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のプロセスであって、ここで前記ＮＡＰが組換え宿主により産生され、そして該ＮＡＰがＨ．ｐｙｌｏｒｉ中に天然に存在するＮＡＰと同じ配列を有する、プロセス。
【請求項７】
診断用薬剤の調製のためのプロセスであって、該プロセスは、請求項１〜６のいずれかに記載のプロセスに続いて適切な処方の工程を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのＮＡＰタンパク質に関する。
【０００２】
（背景）
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉは、ヒトの胃に感染するグラム陰性のらせん形の細菌である。世界の５０％を超える人口がこの細菌を保有していると考えられている。
【０００３】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの臨床単離株は、上皮細胞における空胞の形成を誘導する空胞形成細胞毒素（ＶａｃＡ）、および免疫的に優勢な細胞毒素関連抗原（ＣａｇＡ）の発現により特徴付けられ得る。Ｉ型株は、潰瘍または癌を有する患者において優勢であり、これらのタンパク質両方を発現するが、ＩＩ型株は、どちらも発現しない。
【０００４】
種々の抗原性タンパク質が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに関して記載されており［例えば、参考文献１および２］、これには、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのウレアーゼ、ＶａｃＡ、鞭毛タンパク質、および付着因子が含まれる。ＮＡＰ（好中球活性化タンパク質［３、４］として公知のタンパク質は、Ｉ型株およびＩＩ型株両方で見出され、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉマウスモデルで試験した場合に防御的であるようである［５］。
【０００５】
ＮＡＰは、１５ｋＤａサブユニットのホモ十量体であり［６］、そしてこの多量体複合体は環状形構造を有しており、この構造は自然に六角形準結晶構造を形成すると提案されている。集合したタンパク質は、ヒト好中球のスフィンゴ糖脂質レセプターと相互作用するようである［７］。
【０００６】
バクテリオフェリチンとの相同性に基づいて、ＮＡＰは鉄緩衝液として作用し得ることが示唆されている［３］。しかし、鉄またはヘムいずれの存在も、現在まで検出されていない。このタンパク質はまた、Ｎａ＋／Ｈ＋対向輸送体であるとも報告されている［８］。
【０００７】
その名前が示唆するように、ＮＡＰは、好中球の活性化および内皮細胞への好中球の付着を促進する。この機能はその細胞内機能に関連していないようであるが、この親付着（ｐｒｏａｄｈｅｓｉｖｅ）活性は、抗血清により中和され得る［６］。好中球の活性化および内皮細胞への付着は炎症機構を構成するので、そしてＨ．ｏｙｌｏｒｉは胃の炎症の原因であるので、ＮＡＰは、おそらく胃潰瘍疾患の初期段階（このとき、胃粘膜表面で好中球の豊富な蓄積が観察される）で、炎症の原因であるＨ．ｐｙｌｏｒｉのまさにその要因、または一因を表すようであると思われる。
【０００８】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉからのＮＡＰ十量体の精製のためのプロトコールが記載されており［６］、そのプロトコールには、アガロースクロマトグラフィー、分子ふるいおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。これにより、７２％の収量が得られる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＮＡＰ生成もまた報告されている［７］。この遺伝子はプラスミドｐＴｒｘＦｕｓにクローニングされて、チオレドキシン融合タンパク質を生成した。次いで、タンパク質が、ネイティブなタンパク質と同じ方法で精製された。そのＮ末端チオレドキシンは、ＮＡＰの生物学的活性に影響しないことが報告された。
【０００９】
しかし、クローニング人工産物、融合ドメインなどが存在しない、純粋なＮＡＰについての需要が存在する。従って、ネイティブなＮＡＰの精製のためのプロセスを提供することが、本発明の１つの目的である。このプロセスが簡単であり、容易に拡張可能でありかつ経済的に実行可能であるべきであることが、さらなる目的である。このプロセスが非常に純粋なタンパク質を提供すべきであることはさらなる目的である。
【００１０】
本発明者らは、ＮＡＰが驚くべきほど高い水溶性を有しており、８０％硫酸アンモニウム飽和においてでさえ可溶性のままであることを、現在見出している。
【００１１】
（発明の説明）
本発明に従って、タンパク質の混合物中でＨ．ｐｙｌｏｒｉ  ＮＡＰの存在を濃縮するためのプロセスが存在し、このプロセスは他のタンパク質を塩析する工程を包含する。
【００１２】
この塩析工程は、大部分のＮＡＰを可溶形態のままにする。任意の適切な塩が使用され得るが、硫酸アンモニウムを使用するのが好ましい。最終塩濃度は、好ましくは５０％飽和以上（例えば、６０％、７０％、８０％以上）である。この塩析工程は、好ましくは、その混合物中に存在するタンパク質の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％以上）を沈殿させる。
【００１３】
ＮＡＰのこの驚くべきほどの高い溶解性が原因で、この塩析工程のみによって、大多数のタンパク質が除去され、ＮＡＰの存在がかなり濃縮される。
【００１４】
得られた可溶性タンパク質の混合物は、ＮＡＰについて濃縮されており、次いで、さらなる濃縮に供され得る。しかし、この塩析工程で沈殿された物質を除去するために、まずこの混合物を清澄化することが好ましい。これは、代表的には、濾過によって、または好ましくは遠心分離によって達成される。
【００１５】
さらなる濃縮のための適切な工程は、金属キレートクロマトグラフィー［９］を利用する。任意の適切な固定化金属イオン（例えば、亜鉛、コバルト、銅）が使用され得るが、ニッケルが好ましい。
【００１６】
従って、好ましい実施態様において、本発明は、タンパク質混合物からのＨ．ｐｙｌｏｒｉ  ＮＡＰの精製のためのプロセスを提供し、このプロセスは塩析工程および金属キレートクロマトグラフィー工程を包含する。これは、ＮＡＰに関する単純な２工程精製計画を提供する。
【００１７】
「精製」によって、ＮＡＰが、生じる混合物の少なくとも７５％（重量で）（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）を形成することが意味される。
【００１８】
このタンパク質混合物は、ＮＡＰタンパク質の任意の適切な供給源であり得る。例としては、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌自体、またはＨ．ｐｙｌｏｒｉ  ＮＡＰをコードする遺伝子を発現する他の宿主（例えば、形質転換された細菌）が挙げられる。これらは、それらの細胞質成分を利用することを可能にするために、ＮＡＰ濃縮／精製の前に、好ましくは溶解または破壊される（例えば、超音波処理、フレンチプレス、ヒューズプレス、酵素的溶解、すりつぶし、凍結／解凍など）。
【００１９】
本発明のプロセスを実行するための好ましい条件及び試薬は、以下の実施例に述べるものである（例えば、細菌株、ベクター、制限酵素、培養培地、温度、緩衝液、分析方法など）。例えば、低分子量成分を除去するために、少なくとも１つの透析工程を濃縮／精製プロセスの間に含めることが好ましい。
【００２０】
本発明に従って、組換え宿主からのＮＡＰの濃縮または精製のためのプロセスもまた提供される。ここで、このＮＡＰは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに天然に存在するＮＡＰと同じ配列を有する。精製されたタンパク質または濃縮されたタンパク質は、組換えプロセスの間または組換え発現プロセスの間に代表的に導入されるアミノ酸配列を有さない（例えば、ポリヒスチジンタグ、チオレドキシン融合物、ＧＳＴ融合物、インテイン末端配列など）。
【００２１】
本発明に従って、診断用薬剤または治療用薬剤（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）の調製のためのプロセスがさらに提供される。このプロセスには、上記のＮＡＰの濃縮／精製に続いて、適切な処方が含まれる。例えば、薬剤が動物に投与されるために、このプロセスは生理学的に受容可能な緩衝液中にＮＡＰを処方する工程を包含し得る。免疫原性組成物またはワクチンのために、このプロセスは、例えば，アジュバントの添加を含み得る。診断用薬剤のために、このプロセスは、ＮＡＰへの検出可能な標識の添加を含み得る（例えば、放射活性標識または蛍光標識）。これらの処方工程は、十分に当業者の能力内にある。
【００２２】
本発明のさらなる局面に従って、上記のプロセスのいずれかに従って入手可能なＮＡＰが提供される。
【００２３】
図３で配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＮＡＰもまた提供される。
【００２４】
さらに、本発明は、本発明に従うＮＡＰのフラグメントを提供し、このフラグメントは、以下の機能のうちの１つ以上を保持する：（ａ）好中球を活性化する能力；（ｂ）ＮＡＰ特異的抗体に結合する能力（例えば、完全長ＮＡＰの１つ以上のエピトープを保持するフラグメント）。
【００２５】
さらに、本発明は、上記ＮＡＰまたは上記ＮＡＰのフラグメントをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を提供する。
【００２６】
本発明に従うＮＡＰ（またはＮＡＰのフラグメント）を含む治療用薬剤または診断用薬剤もまた提供される。この薬剤は、好ましくは、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
【００２７】
好ましい実施態様において、本発明の診断用薬剤または治療用薬剤は、さらなるＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質または抗原を含む。例えば、これらの組成物は、ＮＡＰに加えて、ＶａｃＡ（空胞形成細胞毒素）タンパク質および／またはＣａｇＡ（細胞毒素関連抗原）タンパク質および／またはウレアーゼタンパク質を含み得る。
【００２８】
本発明に従うワクチンは、予防用（すなわち、感染を防ぐため）または治療用（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【００２９】
このようなワクチンは、１つの抗原または複数の抗原を、通常は「薬学的に受容可能なキャリア」と組合せて含み、このようなキャリアは、この組成物を受ける個体に有害な抗体の抗体の生成をそれ自体は誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原は、細菌性トキソイドに結合体化され得る。
【００３０】
この組成物の有効性を増強する好ましいアジュバントは、以下を含むが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルジョン処方物（ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激薬剤を含むか、あるいは含まない）であって、例えば、以下のようなもの：（ａ）ＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ  ９０／１４８３７）（これは５％スクアレン、０．５％  ＴｗｅｅｎＴＭ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含むが、欠かせないわけではない）、マイクロフリューダイザーを使用してミクロン以下の粒子へと処方されている）（ｂ）ＳＡＦ（これは１０％スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および５％  プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、微小流体化されてミクロン以下のエマルジョンにされているか、またはボルテックスされてより大きなサイズのエマルジョンを生成している）、ならびに（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（これは、２％スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびに以下：モノリン脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含み、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）である）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭが使用され得る）またはそれらから生成された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）：（４）フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント（ＣＦＡおよびＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮγ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；ならびに（６）この組成物の効力を増強する免疫刺激性薬剤として作用する他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【００３１】
上記のように、ムラミルペプチドは以下を含むが、これらに限定されない：Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【００３２】
免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、など）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）が、このようなビヒクル中に存在し得る。
【００３３】
代表的には、これらの免疫原性組成物は、注射可能なものとして（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液のために適切な固体形態または懸濁液のために適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、上述のように、アジュバント（ａｄｊｙｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）効果の増強のために、リポソーム中で乳化またはカプセル化され得る。
【００３４】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量のこれらの抗原性ポリペプチド、ならびに必要とされる場合は、任意の他の上述の成分を含む。「免疫学的に有効な量」によって、個体へのこの量の投与が、単回用量でまたは一続きのうちの一部としてのいずれであっても、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康および身体的条件、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、これらの個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、処置する医者による医学的状況の評価、ならびに他の関連の要素に依存して変化する。この量は、慣用的試行を通じて決定され得る、比較的広い範囲にあることが予期される。
【００３５】
これらの免疫原性組成物は、従来のように非経口的に（例えば、皮下または筋肉内いずれかの注射により）投与される。これらはまた、粘膜表面に（例えば、経口的にまたは経鼻的に）あるいは肺用処方物、坐剤または経皮適用の形態で投与され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールであってもよいし、または複数回用量スケジュールであってもよい。このワクチンは、他の免疫調節薬剤と組合せて投与され得る。
【００３６】
本発明に従うＮＡＰはまた、免疫アッセイにおいて使用されて抗体レベルを検出し得る（あるいは、反対に、抗ＮＡＰ抗体が使用されて抗原レベルを検出し得る）。十分に規定された組換え抗原に基づく免疫アッセイが開発されて、侵襲性の診断方法に取って代わり得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）中のＮＡＰに対する抗体が検出され得る。これらの免疫アッセイの設計は、多くのバリエーションに供され、そして種々のこれらのものが、当該分野で公知である。この免疫アッセイに関するプロトコルは、例えば、競合、または直接検出、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコールはまた、例えば、固体支持体を使用し得るし、あるいは免疫沈降によってであり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体または標識されたポリペプチドの使用を伴い；これらの標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であり；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である。
【００３７】
本発明はまた、免疫診断に適切なキットも提供する。これらのキットは、標識された適切な試薬を含み、そして適切な物質（本発明の組成物を含む）を適切な容器の中に、このアッセイの実施に必要な残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）、ならびにアッセイの指示書の適切なセットとともにパッケージングすることにより構築される。
【００３８】
本発明に従って、生物学的サンプル中のＮＡＰに対する抗体を検出するためのプロセスもまた提供され、このプロセスは、本発明に従うＮＡＰを上記の生物学的サンプルと接触させる工程を包含する。
【００３９】
本発明に従って、動物を免疫する方法がさらに提供され、この方法は、本発明に従うＮＡＰの投与を包含する。このＮＡＰは、好ましくはワクチン組成物の形態である。
【００４０】
タンパク質に基づくワクチンの代替として、ＤＮＡワクチン接種が使用され得る［例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１〜２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７〜６４８］。従って、ＮＡＰを含むよりもむしろ、本発明のワクチンは、ＮＡＰをコードする核酸を含み得る。
【００４１】
本発明は、配列番号２として図３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をさらに提供する。このタンパク質は、本発明に従うＮＡＰと同じ方法で使用され得る。
【００４２】
（実施例）
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような技術は、例えば、以下のような文献に完全に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編  １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ、１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）特に第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編  １９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、１９８７）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｃｏｐｅｓ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６）。
【００４３】
（ＮＡＰをコードする遺伝子のクローニング）
図１に示す遺伝子を、以下のＰＣＲプライマーを使用して、ＣＣＵＧの染色体から増幅した。これには、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限部位も導入した：
【００４４】
【化１】
0003626684.tif 000002
この増幅産物を、ＳｃａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、そして同じ２つの酵素を用いて消化しておいたプラスミドｐＳＭ２１４Ｇ［１０］中に連結した。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉとＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとの間のシャトル発現ベクターである。図１から理解され得るように、この組換え遺伝子は、構成的プロモーターおよびリボソーム結合部位（これらはＥ．ｃｏｌｉとＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方で機能する）の制御下で発現される。
【００４５】
連結したプラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてポジティブクローンをクロラムフェニコールプレート上で選択した。１つのポジティブクローンからのプラスミド（「ｐＳＭ２１４−ＮＡＰ」）を単離し、そして特徴付けた。このクローンのグリセロールバッチを−８０℃で保存した。
【００４６】
さらに、このプラスミドを使用してＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換し、これもまたグリセロールバッチとして−８０℃で保存した。
【００４７】
（予備発現分析）
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の単一コロニーを、４ｍｌのＬＢ−ＣＡＰ培地（すなわち、ＬＢ培地＋２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）中に接種し、そして３７℃で１４時間培養した。ＮＡＰインサートを含まない形質転換ベクターを含むコントロール株を増殖させた。
【００４８】
Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングサンプル緩衝液中に再懸濁した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ培養物を収集し、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチームを用いて処理（３７℃、３０分間）し、次いで、３×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングサンプル緩衝液を添加した。これらのサンプルを９５℃で５分間インキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後、これらのタンパク質をクマシーブルー染色およびウェスタンブロットにより分析した。このブロットを、ＮＡＰ−チオレドキシン融合物を用いてウサギを免疫することによって入手した抗血清で可視化した（図４）。
【００４９】
形質転換された細菌は、ウサギ抗血清により示されるように、非形質転換株に存在しない１５ｋＤａタンパク質を明らかに発現している。
【００５０】
（細胞培養および溶菌）
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの単一コロニーを、５ｍｌのＬＢ−ＣＡＰに接種し、そして３７℃で１０時間インキュベートした。次いで、５ｍｌ培養物を使用して、５００ｍｌ  ＬＢ−ＣＡＰを含む２リットルフラスコに接種した。３７℃で１４時間の回転振盪器（２５０サイクル／分）上でのインキュベーション後、これらの細胞を、４℃で６０００ｇ、２０分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理またはフレンチプレスのいずれかを使用して破砕した。
【００５１】
超音波処理について、ペレットを、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチームを補充した８ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８）に再懸濁した。氷上（１０分間）に次いで３７℃で（７分間）のインキュベーション後、２ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−４２６３）３５μｌを添加した。これらのサンプルを氷上に置き、そして粘性が消失するまで完全に超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０、中チップ、衝撃係数５０、出力制御５、２分間サイクル（超音波処理１分間／氷上１分間）約２５回）。この溶解物を、緩衝液Ａで１４ｍｌにし、そして４℃で２００００ｇ、２０分間遠心分離した。上清（可溶性総抽出物）およびペレット（不溶性総抽出物）を分離し、そしてすぐに使用するか、または−２０℃で保存するかのいずれかを行った。
【００５２】
フレンチプレス破砕について、細胞を１５ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁し、そしてこのプレス中の３つの通路により溶解した。可溶性タンパク質を、４℃で１２０００ｇ、３０分間の遠心分離により収集し、そしてその上清を緩衝液Ａで２８ｍｌにした。
【００５３】
可溶性総抽出物および不溶性総抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図５および６）は、ＮＡＰに対して惹起された血清が可溶性画分とのみ反応することを示し、このことはＮＡＰが完全に緩衝液Ａに可溶性であることを示す。
【００５４】
（タンパク質の精製）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ総可溶性タンパク質を、緩衝液Ａで希釈し、総タンパク質濃度８ｍｇ／ｍｌ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）にした。硫酸アンモニウムを最終濃度６０％飽和まで添加し、そして塩析プロセスを穏やかに撹拌しながら４℃で一晩放置した。沈殿したタンパク質を、４℃で１２０００ｇ、３０分間の遠心分離により除去し、そして上清を緩衝液Ａに対して一晩透析した。
【００５５】
透析された溶液を、緩衝液Ａで平衡化されたニッケル活性化キレート化セファロースＦＦカラム（１×８ｃｍ）上にローディングした。このカラムを、緩衝液Ａ＋２００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。タンパク質溶出を、０〜４０ｍＭイミダゾールの４６ｍｌ直線勾配、続いて４０〜１００ｍＭイミダゾールの第２の１０ｍｌ勾配（流速０．５ｍｌ／分）で実行した。次いで、２５ｍｌの１００ｍＭイミダゾールで溶出を続けた。
【００５６】
画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてＮＡＰを含む画分をプールし、そしてＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７〜７．５）に対して透析した。
【００５７】
塩析手順に８０％飽和を使用したことを除いて、同じ方法でＥ．ｃｏｌｉからＮＡＰを精製した。
【００５８】
（純度）
１リットルの培養物からの、精製の結果は以下である：
【００５９】
【表１】
0003626684.tif 000003
純度の表示は、クマシーブルー染色によって、図８に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の物質の方が、わずかにより純粋であるようである。デンシトメトリー分析により、収量８０％と評価した。
【００６０】
（塩析）
ＮＡＰは、非常に高濃度の硫酸アンモニウムにおいてでさえ可溶性であるようである。図７に示すように、ＮＡＰは、８０％飽和においてでさえ可溶性のままである。このゲルのレーン４は、塩析のみで高い程度の精製が得られることを示す。
【００６１】
（多量体アセンブリー）
精製されたＮＡＰが多量体形態へとアセンブルする能力を、サイズ排除クロマトグラフィー（非還元、非変性）を使用して調べた。ＮＡＰを、緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３０カラムにローディングし、そして０．５ｍｌ／分で溶出した。そのＮＡＰの供給源に関わらず、そのタンパク質は、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ（分子量１５０ｋＤａ）と同じ保持時間を有する単一ピークで溶出した。このことは、十量体構造［６］を示す。
【００６２】
（Ｎ末端配列決定）
精製されたＮＡＰのＮ末端配列決定を、オンライン接続されたＰＴＨアミノ酸のＲＰ−ＨＰＬＣ分析装置を備えたＢｅｃｋｍａｎｎ  ＬＦ  ３０００タンパク質シークエンサーを使用して実行した。配列決定した１０アミノ酸は、図１に示す遺伝子配列から推定した１０アミノ酸と同一であった。
【００６３】
（天然タンパク質との比較）
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ＣＣＵＧ細胞を、血液寒天プレートの表面から収集し、氷冷したＰＢＳで洗浄し、そして溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ７．８）に再懸濁した。この細胞懸濁液を、３７℃で２０分間インキュベートし、超音波処理し、そして２００００ｇで４０分間遠心分離した。その上清（可溶性タンパク質）を、使用するまで−２０℃で保存した。
【００６４】
Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＮＡＰまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから精製されたＮＡＰについての、ゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ可溶性タンパク質抽出物でのゲル濾過クロマトグラフィーでの保持時間と同一であった。
【００６５】
本発明は、上記に例示のみのために記載されており、そして本発明の範囲および精神内にとどまりながら、改変がなされ得ることが理解される。
【００６６】
（参考文献）
【００６７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＣＵＧ株のＮＡＰをコードする遺伝子の完全配列を示す。これは、プラスミドｐＳＭ２１４Ｇ中にクローニングされてｐＳＭ２１４−ＮＡＰを生じた。この図はまた、この遺伝子の５’末端に隣接するプラスミドベクター中の配列（小文字）および推定アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、参考文献６および８中のヌクレオチド配列とのクローン化されたＮＡＰのヌクレオチド配列の比較を示す。アミノ酸の差異（図３）をもたらす差異が、残基８、５８、および８０（参考文献６との比較）ならびに残基８、７３、９７、１０１および１４０（参考文献８との比較。全ゲノム配列から推定）にて観察され得る。
【図３】図３は、参考文献６および８中のアミノ酸配列とのクローン化されたＮＡＰのアミノ酸配列の比較を示す。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の総細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）を示す。レーン１：形質転換された細胞からの総抽出物；レーン２：ネガティブコントロール；レーン３：低分子量マーカー。
【図５】図５は、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉのＰｏｉｎｃｅａｕ染色（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）を示す。レーン１：可溶性抽出物；レーン２：不溶性抽出物；レーン３：低分子量マーカー。
【図６】図６は、形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰｏｉｎｃｅａｕ染色（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）を示す。レーン１および２：それぞれＳＭＳ１１８株の可溶性抽出物および不溶性抽出物；レーン３および４：それぞれＳＭＳ３００株の可溶性抽出物および不溶性抽出物；レーン５：ネガティブコントロール（ＮＡＰインサートを含まないｐＳＭ２１４で形質転換されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。
【図７】図７は、硫酸アンモニウムによる塩析の効果を示す。レーン１および２：それぞれ６０％飽和でのペレットおよび上清（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）；レーン３および４：６０％から８０％に増加された飽和度（それぞれ、ペレットおよび上清）；レーン５：精製されたＮＡＰ；レーン６：マーカー。
【図８】図８は、最終ＮＡＰ生成物の純度を示す。レーン１〜３は、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された物質を含む；レーン５〜７はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＳＭＳ１１８）から精製された物質を含む。左から右に、これらのレーンは、それぞれ１μｇ、２μｇおよび３μｇのタンパク質を含む。レーン４および８はマーカーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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