(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特定配列を有する合成ペプチド。
0003644035.tif 000027
（Xaaは存在しないか又はCys若しくはSerを表し、XbbはHis又はAsnを表し、XccはLeu又はIleを表し、Ｗは12〜20個のLeu及び／又はNleにより構成される疎水性ペプチド部分を表す。）
【請求項２】
請求項１記載の合成ペプチドの疎水性部分を構成する疎水性アミノ酸12〜20個中に、Ile、Val、Nva及び／又はTrpを１〜５個含有する合成ペプチド。
【請求項３】
特定配列を含有する合成ペプチドが配列番号５〜19に記載のいずれか又は配列番号８のペプチドのＳ−アセトアミドメチル体若しくは配列番号９のペプチドのＳ−パルミトイル体である請求項１又は２記載の合成ペプチド。
【請求項４】
下記特定配列で表される親水性ペプチド部分中のＮ末端及び官能性側鎖が保護された合成用ペプチド。
0003644035.tif 000028
（Xaaは存在しないか又はCys若しくはSerを表し、XbbはHis又はAsnを表し、XccはLeu又はIleを表す。）
【請求項５】
合成用ペプチドがFmoc−Pro−Val−His（Trt）−Leu−Lys（Boc）−Arg（Mtr）、Fmoc−Pro−Val−Asn−Leu−Lvs（Boc）−Arg（Mtr）
又はFmoc−Pro−Val−Asn−Ile−Lys（Boc）−Arg（Mtr）である請求項４記載の合成用ペプチド。
【請求項６】
請求項１又は２記載の合成ペプチドの疎水性ペプチド部分と請求項４又は５記載の合成用ペプチドとを縮合させることを特徴とする請求項１又は２記載の合成ペプチドの製造法。
【請求項７】
請求項１、２又は３記載の合成ペプチド、コリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類からなる肺サーファクタント。
【請求項８】
請求項１、２又は３記載の合成ペプチド、コリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類を含有する肺サーファクタントを有効成分として含む呼吸窮迫症候群治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規な合成ペプチドに関する。詳しくは、脂質混合物と配合することにより強力な表面活性作用を有する合成ペプチド、該合成ペプチドの製造中間体、該合成ペプチドの製造方法、該合成ペプチドと脂質混合物からなる肺サーファクタント及び該肺サーファクタントを有効成分として含有する呼吸窮迫症候群治療剤に関する。
背景技術
呼吸窮迫症候群は、肺サーファクタントの欠乏により肺胞表面の表面活性が低下し、肺胞が虚脱する結果、重篤な呼吸障害をきたす疾病であり、未熟な新生児に多症し死亡率が高い。新生児の呼吸窮迫症候群に対しては、肺サーファクタント製剤が卓効を示すことが知られている。
また、成人においても種々の原因で低酸素血症となり、レスピレーターなどによる呼吸管理にもかかわらず、胸部Ｘ線写真上、両肺に瀰慢性のスリガラス様陰影をきたし、呼吸不全におちいる例が多々見られる。上田らは成人の肺炎２例（▲１▼硝酸ガス誤吸入性肺炎及び▲２▼脳腫瘍由来の反復性嚥下性肺炎において、低酸素血症から全身性状態が悪化し呼吸不全をきたした症例）に対して肺サーファクタントを気道内に注入することにより著明な改善を得、救命したことを報告している〔安田寛基ら「バイオサーファクタント、第３章サーファクタントの臨床、第１節サーファクタントの臨床応用、Ｖ誤引性肺炎とサーファクタント」第184頁、1990年、株式会社サイエンスフォーラム）〕。更に、心臓手術時には呼吸を止めるため、術後呼吸不全を起こす例がみられるが、その呼吸不全に対して肺サーファクタントが効果を示すという報告もある（野坂修一ら、日本界面医学会雑誌第22巻第66頁、1991年）。
このように、外部から経気道的に肺サーファクタントを投与する補充療法は、呼吸窮迫症候群に対し顕著な治療効果が認められる。
近年、哺乳動物の肺サーファクタントに特異的なアポ蛋白質として親水性のサーファクタントアポ蛋白質Ａ及びサーファクタントアポ蛋白質Ｄ、並びに疎水性のサーファクタントアポ蛋白質Ｂ（以下「SP−Ｂ」という。）及びサーファクタントアポ蛋白質Ｃ（以下「SP−Ｃ」という。）の４種が確認された〔アポ蛋白質の構造と機能についての総説（秋野豊明、黒木由夫著、呼吸と循環、第38巻第18号第722頁、1990年；安田寛基ら、バイオサーファクタント、第２章サーファクタントの生化学−サーファクタントとアポ蛋白質、第131頁、1990年、株式会社サイエンスフォーラム）〕。
ヒト肺由来のSP−Ｃ〔配列番号１〕は、アミノ酸35個からなり、Ｎ末端アミノ酸がフェニルアラニンでバリンに富み疎水性が極めて強いアポ蛋白質である。またウシ〔配列番号２〕、ブタ〔配列番号３〕、ラット等の肺から単離されたSP−Ｃも、アミノ酸34〜35個からなり、Ｎ末端側のアミノ酸配列が動物種により異なっているがヒトとの相同性が極めて高い。
また、特表平３−502095号公報には、下記の配列で示されるSP−Ｃの部分構造をもつアミノ酸32個の合成ペプチド〔配列番号４〕が高い表面活性を示す最小単位であり、このペプチドと脂質との混合物が、呼吸窮迫症候群治療に効果的であること、この最小単位のペプチドとこれより短いアミノ酸配列を有する合成ペプチドとの表面活性の比較から、表面活性の喪失は、特定のアミノ酸の喪失に起因するのではなく、ペプチドの鎖長の長さの減少によることが記載されている。
先に本発明者の一部は、SP−Ｃの部分構造をもつ合成ペプチド（以下「TP−Ｃ」という。）と脂質との混合物が、呼吸窮迫症候群治療に効果的であることを知り、特許出願した（特願平５−518188号）。
一般的に合成ペプチドの製造には、そのアミノ酸配列が長くなるにつれて製造時の未成熟なペプチドの生成頻度が高くなり、単離・精製が困難となること、製造に長時間を要すること及び大量製造が困難なこと等の欠点があるといわれている。
また、肺サーファクタント製剤は、品質保全の点から、用時に生理食塩水懸濁液として投与する乾燥粉末製剤として提供されることが多い。肺サーファクタント製剤の懸濁性の改善法として、マンニトール等の懸濁化剤を添加する方法（特公平１−60451号公報）及び凍結乾燥時に一次凍結温度を−１〜−10℃で行う凍結法（特公平４−76965号公報）が提案されているが、操作が煩雑であり、より簡便な製剤の製造法の開発が望まれていた。
SP−Ｃをコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類からなる脂質混合物に配合した肺サーファクタント（以下「Ｓ−35」という。）製剤は、ペプチド中に存在するシステイン残基がジスルフィド結合を形成するためペプチドの凝集性が高いこと、肺サーファクタント自体の疎水性が強いこと等の要因から、生理食塩水に対する分散性が極めて悪く、製剤として使用できる程度に均一な懸濁液とすることが困難であった。
TP−Ｃは一般溶媒に対する溶解性が低いため、肺サーファクタント製剤の調製の際トリフルオロ酢酸（TFA）を使用する必要があった。従って、TFAを極力除去するため濃縮・乾燥時間に長時間を要し、肺サーファクタント製剤中に残留するTFAにより肺サーファクタント懸濁液が酸性化する、という欠点を有していた。
発明の開示
本発明者らは、上記知見に鑑み、合成ペプチドにつき、鋭意研究したところ、Ｎ末端側に特定配列の親水性ペプチド部分を、Ｃ末端側に主としてLeu及び／又はNleから構成される疎水性ペプチド部分を有する下記アミノ酸配列を含有する新規な合成ペプチド（以下「本発明合成ペプチド」という。）が、単離・精製が容易であること、大量製造が可能であること、ギ酸、TFA、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、クロロホルム、クロロホルム／メタノール混合液、メタノール、エチレンクロロヒドリン又はテトラヒドロフランに良く溶解し、特にメタノールに対する溶解度が合成SP−Ｃ及びTP−Ｃに比べ著しく高いこと、本発明合成ペプチドと脂質混合物から調製される肺サーファクタントが、懸濁化剤無添加、−20℃以下で行う通常の凍結乾燥法により製造した場合でも、Ｓ−35又はコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類からなる脂質混合物のみからなる合成肺サーファクタント（以下「SF−３」という。：特公平２−87685号公報）又は哺乳動物の肺臓組織に存在するリン脂質、中性脂質、総コレステロール及び炭水化物並びに微量の蛋白質からなる物質のほかに脂肪酸を含有する物質（以下「Ｓ−TA」という。：特公昭61−9924号公報）に比べ、均一懸濁性が良好で、しかもTP−Ｃと脂質混合物からなる肺サーファクタント、Ｓ−35又はＳ−TAと同等の強力な表面活性作用を有することを知り、本発明を完成させた。
0003644035.tif 000002
（Xaaは存在しないか又はCys若しくはSerを表し、XbbはHis又はAsnを表し、XccはLeu又はIleを表し、Ｗは疎水性ペプチド部分を表す。）
本発明合成ペプチドは、Ｎ末端側に下記特定配列で表される親水性ペプチド部分を、Ｃ末端側に主としてLeu及び／又はNleから構成される疎水性ペプチド部分を有するペプチド部分を含有し、脂質混合物と配合することにより強力な表面活性作用を示す合成ペプチドである。
0003644035.tif 000003
（Xaは存在しないか又はCys若しくはSerを表し、XbbはHis又はAsnを表し、XccはLeu又はIleを表す。）
疎水性ペプチド部分は、Leu、Nle、Ile、Val、Phe、Nva及びTrp等の疎水性アミノ酸により構成されるが、主としてLeu及び／又はNleが12個以上、好ましくは12〜20個により構成される。この疎水性ペプチド部分は、合成の容易さ等のため単一の疎水性アミノ酸により構成されていることが好ましいが、Leu及びNleが任意に配列されていても良く、また配列中に１〜５個のIle、Val、Nva、Trp等の疎水性アミノ酸が含まれていても良い。
また、本発明合成ペプチドには、上記合成ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸又はペプチドが付加された合成ペプチドも包含される。Ｎ末端に付加するアミノ酸としてはCys又はSerが挙げられ、更に、Ｎ末端に配列Phe−Gly−Ile−Pro又はPhe−Gly−Ile−Proのペプチドを付加することもできる。上記の合成ペプチド中に存在するチオール基又は水酸基は、炭素数14〜18の脂肪酸、好ましくパルミチン酸でアシル化されていても良く、又はアセトアミドメチル化されていても良い。Ｃ末端に付加するペプチドとしては、配列Gly−Ala−Leu−Leu又はGly−Ala−Leu−Leu−Met−Gly−Leuが挙げられる。
更に、本発明合成ペプチドには、構成アミノ酸の１又は複数個が付加、欠失及び／又は置換されていても良い親水性ペプチド部分を含有する合成ペプチド（ただし、天然SP−Ｃの部分構造を有するペプチドを除く。）であって、脂質混合物と配合することにより強力な表面活性作用を示す合成ペプチドが包含される。
本発明合成ペプチドは、化学的又は遺伝子光学的手法により製造することができるが、単離・精製の点から化学的製造法が好ましい。
本発明合成ペプチドの化学製造方法としては、逐次延長法（stepwise elongation）又は断片縮合法（fragment condensation）によるアジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、DCC法、活性化エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ｐ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、カルボイミダゾール法等）、酸化還元法若しくはDCC−活性化法等の液相合成法又は固相合成法が挙げられる。
本発明は、Ｎ末端及び官能性側鎖を保護した親水性ペプチド部分を製造中間体とする本発明合成ペプチドの断片縮合法による製造法をも提供する。
断片縮合法は逐次延長法に比べ、目的物の精製が容易で大量合成に適した製造法であり、不慮の失敗による損失を防止できるという特徴を有している。予め調製したＮ末端及び官能性側鎖を保護した親水性ペプチド部分と疎水性ペプチド部分とを液相合成法又は固相合成法により縮合させることにより、本発明合成ペプチドを製造することができる。Ｎ末端及び官能性側鎖の保護基としては、通常のペプチド合成において使用される保護基であれば特に制限されることはないが、末端アミノ基の保護基としては９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−CLZ）又はｔ−ブチルオキシカルボニル（Boc）基が、Lysの保護基としてはFmoc、Boc、カルボベンゾキシ（Ｚ）又はトシル（Tos）基が、Hisの保護基としてはTrt、Fmoc、Boc、Dnp、Bom、Bzl又はTos基が、Argの保護基としてはMtr、Pmc、Mts又はTos基が挙げられる。すなわち、本発明合成ペプチドの製造中間体として使用できるペプチドとして、Fmoc−Pro−Val−His（Trt）−Leu−Lys（Boc）−Arg（Mtr）、Fmoc−Pro−Val−Asn−Leu−Lys（Boc）−Arg（Mtr）又はFmoc−Pro−Val−Asn−Ileu−Lys（Boc）−Arg（Mtr）が挙げられる。
本発明合成ペプチドに脂質混合物としてコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類を配合することにより肺サーファクタント（以下「本発明サーファクタント」という。）を製造することができる。
配合比は最終生成物の乾燥総重量に対するこれらの成分の重量比率が、合成ペプチドは0.1〜5.0％（W/W）、コリンホスホグリセリドは50.6〜85.0％（W/W）、酸性リン脂質は4.5〜37.6％（W/W）、脂肪酸類は4.6〜24.6％（W/W）となるように設定するのが適当である。
本発明サーファクタントにおいて使用できるコリンホスホグリセリドとしては、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（別名ジパルミトイルホスファチジルコリン）、1,2−ジステアロイルグリセロ−（３）−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルグリセロ−（３）−ホスホコリン若しくは１−ステアロイル−２−パルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン等の1,2−ジアシルグリセロ−（３）−ホスホコリン、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン若しくは１−オクタデシル−２−パルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン等の１−アルキル−２−アシルグリセロ−（３）−ホスホコリン又は1,2−ジヘキサデシルグリセロ−（３）−ホスホコリン等の1,2−ジアルキルグリセロ−（３）−ホスホコリンが適当である。これらの化合物についてはグリセロール残基の２位の炭素に基づく光学異性体が存在するが、本発明サーファクタントにおいてはＤ体、Ｌ体又はDL体のいずれを問わず使用することができる。このほかにコリンホスホグリセリドとしては、上述の単品からなるコリンホスホグリセリド以外に、炭素数が12〜24個のアシル基、好ましくは、飽和アシル基を２個有する1,2−ジアシルグリセロ−（３）−ホスホコリンの２種以上からなる混合物、更には当該混合物と上述の単品との混合物も使用することができる。
酸性リン脂質としては、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−リン酸（別名Ｌ−α−ホスファチジン酸）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−Ｌ−セリン（別名ホスファチジルセリン）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（別名ホスファチジルグリセロール）又は1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−（１）−Ｌ−myo−イノシトール（別名ホスファチジルイソシトール）が適当である。これらの化合物において、１位及び２位は同一種類又は異なる種類のアシル基でそれぞれ置換されていてもよい。ここで、アシル基の炭素数は12〜24個が好ましい。
脂肪酸類としては、遊離脂肪酸、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸グリセリンエステル若しくは脂肪酸アミド又はこれらの２種以上からなる混合物、更には脂肪アルコール又は脂肪族アミンが適当である。
本明細書において「脂肪酸類」とは、ここでいう脂肪アルコール及び脂肪族アミンも包含する意味である。
遊離脂肪酸としてはミリスチン酸、パルミチン酸又はステアリン酸が適当であるが、パルミチン酸が好ましい。
脂肪酸のアルカリ金属塩としては上記遊離脂肪酸のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩又はカルシウム塩が適当であるが、好ましくはパルミチン酸ナトリウムである。脂肪酸アルキルエステルとしては炭素数１〜４の低級アルキルエステルが適当であるが、好ましくはパルミチン酸エチルエステルである。脂肪酸グリセリンエステルとしてはモノグリセリンエステルが適当であるが、好ましくはモノパルミチンである。脂肪酸アミドとしてはパルミチン酸アミドが好ましい。
脂肪アルコールとしては炭素数14〜18のアルコールが適当であるが、好ましくはヘキサデシルアルコールである。脂肪族アミンとしては炭素数14〜18のアミンが適当であるが、好ましくはヘキサデシルアミンである。
上述のコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類は動植物から分離された製品、半合成品又は化学合成品のいずれでもよく、それらの市販品を使用することができる。
本発明サーファクタントは、本発明合成ペプチド溶液と上記脂質混合物溶液との混合溶液を減圧乾固し、得られた残留物を適当な懸濁溶媒を用いて懸濁し、次いで凍結乾燥する方法により製造することができる。
本発明合成ペプチド溶液の調製に使用される溶媒としては、例えば、ギ酸、TFA、トリフルオロエタノール、DMSO、クロロホルム／メタノール、クロロホルム、メタノール、エチレンクロロヒドリン又はテトラヒドロフラン等が挙げられる。
脂質混合物溶液の調製に使用される溶媒としては、例えば、クロロホルム、クロロホルム／メタノール〔1:2〜5:1（V/V）〕が挙げられる。
懸濁溶媒としては水又は水−エタノール混合液〔4:1〜20:1（V/V）〕が挙げられるが、水−エタノール混合液が好ましい。懸濁は30〜60℃、好ましくは40〜50℃で、５〜60分間、好ましくは15〜30分間かけて行う。
本発明サーファクタントには製法上、微量の水分の残存は避けられないが、その残存重量比率が総重量に対して5.0％（W/W）以下になるまで乾燥することが望ましい。かかる程度まで乾燥すれば、水−エタノール混合液を用いる場合、エタノールの残存は検出不能となる。
また、本発明サーファクタント乾燥粉末製剤は、シェイクハンド、可変速度式ミクスチャー又は超音波発生装置により、適切な生理的な濃度の１価又は２価金属塩、例えば0.9％塩化ナトリウム若しくは1.5mM塩化カルシウム又はそれらを含有する生理的な緩衝液を用いて均一に懸濁分散させて使用することができる。
次に、このようにして製造された本発明サーファクタントの表面活性、懸濁性及び薬理学的性質について詳述する。
（１）表面活性
▲１▼表面張力低下作用；
表面張力低下作用の測定を田中らの方法（日本界面医学会雑誌、第13巻第２号第87頁、1982年）に準じて行った。
本発明サーファクタント懸濁液を生理食塩水（表面積;54.0cm2）上に、1cm2あたり本発明サーファクタントが1.0〜2.0μｇとなるように滴下し、該表面積を54.0〜21.6cm2の範囲内で２〜５分かけて圧縮・拡張した際の表面張力をウィルヘルミー表面張力測定装置（協和界面科学株式会社製）により、37℃で連続的に測定した。本発明サーファクタントの表面張力低下作用は、最大表面張力が24.7〜34.1dyne/cm、最小表面張力が0.2〜8.7dyne/cmであり、生理食塩水の表面張力を低下させることが認められた。
同様にして測定したSF−３の表面張力低下作用は、最大表面張力が26.8〜50.3dyne/cm、最小表面張力が1.0〜13.5dyne/cmであった。
なお37℃における生理食塩水の当初の表面張力は70.5dyne/cmであった。
▲２▼気液界面拡散作用；
生理食塩水の液面に、表面積1cm2あたり0.8〜1.5μｇの本発明サーファクタント懸濁液を滴下し、滴下直後からの表面張力を垂直板法により経時的に測定した。測定温度は37℃であった。
なお、到達時間とは、試料の滴下直後から表面張力が一定値にまでに要する時間をいい、平衡表面張力とはその時の値をいう。
本発明サーファクタントは30〜60秒という短時間で気液界面に膜を形成し、表面張力を26.7〜34.3dyne/cmにまで低下させた。
同様にして測定したSF−Ｓの気液界面拡散作用は、120秒経過後の表面張力が38.1〜52.9dyne/cmであった。
このことは本発明サーファクタントが気液界面に素早く拡散し、急速に表面張力を低下させる作用を有していることを示している。
▲３▼気液界面吸着作用；
1mlあたり0.2〜1.0mgの本発明サーファクタントを含有する37℃の生理食塩水懸濁液を調製し、懸濁された本発明サーファクタントの生理食塩水気液界面への吸着速度を測定した。
吸着速度の測定はキングらの方法（American Journal of Physiology,第223巻第715頁、1972年）に従った。
すなわち、懸濁液を生理食塩水の入っている直径5cmのテフロン水槽の底に注入後、マグネティックスターラーでゆっくり攪拌し、攪拌を停止した後の表面張力の変動値より吸着速度を求めた。
本発明サーファクタントは、攪拌を停止してから30〜100秒経過後に、表面張力を28.3〜36.8dyne/cmの範囲に低下させ、その後、一定値を示した。
これは懸濁状態にある本発明サーファクタントが30〜100秒で気液界面に浮上吸着し、強い表面活性をもつ膜を形成したことを示している。
同様にして測定したSF−３は、表面張力が42.2〜58.3dyne/cmの範囲で一定値を示し、その所要時間は150秒以上であった。
このことはSF−３の気液界面吸着作用が本発明サーファクタントよりも弱いことを示し、本発明サーファクタントが強力な表面吸着促進力をもつことを示している。
（２）懸濁性
肺サーファクタントの懸濁性試験を、特公平４−76965号公報記載の方法に準じて行った。
すなわち、懸濁開始後所定時間ごとの分散率及び懸濁開始後２分経過時の最大分散粒子径により、懸濁性を判定した。
分散率の試験は、20ml容バイアルに肺サーファクタント60mgを分取し、生理食塩水2mlを注入し、当該バイアルをイワキKMシェーカーＶ−Ｓ型振盪器（イワキ株式会社製）に装着して270ストローク／分で振盪し、振盪開始後２分まで30秒ごと、２分以降４分まで１分ごとに、更に４分以降10分までは２分ごとに各試料の分散状態を容器の外からルーペを通して肉眼で観察することにより行った。
懸濁状態の判定は、各時間ごとに各試料10本ずつ２人で行い、懸濁したか否かの判断は容器内に小塊を全く認めず、製剤が生理食塩水中に均一に分散して白色のやや粘稠性の懸濁液が形成されたか否かで行った。
分散率は各人が各時間ごとに懸濁が完了した試料の全本数（10本）に対する百分率を求め、これの２人による平均値で表示した。
最大分散粒子径は各試料を20ml容バイアルに肺サーファクタント60mgを分取し、生理食塩水2mlを注入し、上述と同一の振盪条件で２分間連続して振盪し、懸濁液中の最大粒子を顕微鏡を用いて探し出し、その直径をノギスで測定することにより求めた。本発明サーファクタントは、いずれも大部分が２分以内に懸濁し、しかもその最大粒子径は0.8mm以下であり、懸濁性が良好であった。
（３）薬理学的性質
▲１▼急性毒性；
５週令の雄性ICR系マウス及びウィスター系ラットを用いて本発明サーファクタントの急性毒性を試験した。マウスでの経口LD50及び腹腔内LD50は、2.4〜10.0g/kg及び1.0〜5.0g/kgであり、ラットでのそれらは1.5〜5.0g/kg及び1.5〜2.5g/kgであった。
▲２▼亜急性毒性；
毎日300〜600mg/kgずつ１月間、本発明サーファクタントをウィスター系成熟ラットに腹腔内投与したが、体重の変化及び主要臓器の肉眼的、組織学的観察における異常は認められなかった。
▲３▼肺胞腔容量維持作用；
在胎期間27日の兎未熟胎仔は肺サーファクタントを殆ど産生せず、肺サーファクタント欠乏状態にあることから、新生児呼吸窮迫症候群のモデル動物とされている。
この在胎期間27日の兎胎仔５匹を用いて、気道内圧の増減下における肺胞腔容量（以下、肺容量という。）を37℃で測定した。
測定は胎仔の頸部を切開し、気管に接続させた水マノメーターを用いて、本発明サーファクタントを経気道的に投与した５分後から連続的に行われた。気道内圧を、気管に接続させた２チャンネル独立駆動シリンジポンプNo.940（米国ハーバード社製）を用いて30cm水圧まで加圧し、肺胞を拡張した。次いで、気道内圧を0cm水圧まで減圧し肺胞を収縮させ、各水圧における肺容量を測定した。肺容量は体重1kgあたりのミリリットル（ml/kg）で表示した。
本発明サーファクタント（60mg/kg）の投与はその濃度が1.0〜6.0％（W/V）になるように調整した生理食塩水懸濁液0.05〜0.5mlを気道内に直接注入する方法で行った。
機能的残気量を示す減圧時の5cm水圧の肺容量が大きいほど肺サーファクタント活性が高いことを意味する。
対照として、本発明サーファクタント懸濁液に代えて生理食塩水を投与した。対照群では、在胎期間27日の兎未熟胎仔の肺容量（5cm水圧）は１〜5ml/kgで、肺胞が殆ど拡張していなかった。
また、正常レベルの肺サーファクタントを有する在胎30日の満期胎仔は、肺容量（5cm水圧）が35〜53ml/kgであり、肺胞が十分に拡張しており、正常な呼吸を営むことが可能であることを示す。
SF−３を投与した場合には、未熟胎仔の肺容量（5cm水圧）が15〜25ml/kgと肺胞の拡張が不十分であった。
本発明サーファクタントと投与した未熟胎仔の肺容量（5cm水圧）は39〜55ml/kgを示し、本発明サーファクタントが未熟胎仔の肺容量を正常レベルまで改善することが認められた。
以上のように、本発明合成ペプチドは、脂質混合物の表面活性を強力に賦活する作用を有する。従って、本発明合成ペプチドと脂質混合物からなる本発明サーファクタントからは、表面活性、懸濁性及び薬理学的性質から有効な呼吸窮迫症候群治療剤を調製することができる。
本発明サーファクタントを有効成分とする製剤は、肺サーファクタントが治療効果を示す疾病、例えば、術後呼吸不全、喘息、気管支炎、新生児壊死性腸炎、胃・十二指腸潰瘍、ウイルスによる呼吸器疾患、耳管閉塞症等の治療、卵管癒着及び術後の臓器癒着の防止並びに去痰剤として使用することができる。
本発明により提供される呼吸窮迫症候群治療剤は１回投与量として、小児用には、50〜1000mg、成人用には500〜5000mgの本発明サーファクタントを含有する。この用量を水、生理食塩液又は生理的に許容される緩衝液等に懸濁し、濃度が1.0〜10.0％（W/V）になるように調整し、これを呼吸障害発現直後から72時間以内に気道内に１〜10回注入又は噴霧することにより使用する。そのほか、懸濁させることなく、そのまま粉末剤として直接、吸入させることもできる。用量、使用法及び回数は患者の症状及び併用療法に応じて適宜変更しても良い。
本発明治療剤には必要に応じて安定剤、保存剤、等張化剤、緩衝剤、懸濁化剤、抗酸化剤及び界面活性剤等の医薬品添加物又は気管支拡張剤、抗アレルギー剤、制癌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗真菌剤等の医薬品を含有させることができる。
剤型は液剤又は用時に懸濁して用いる粉末剤が適当である。本発明治療剤はバイアル瓶又はアンプル瓶等の密封容器内に充填され、無菌製剤として保存される。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。
（１）ペプチドの製造
以下の実施例において、合成したペプチドの分子量を高速原子衝撃法（FABMS）により測定した。質量分析計には、JMS−S102A型（日本電子株式会社製）を使用し、イオン源はセシウムガン（10KeV）を用いた。
〔実施例１〕
〔配列番号５〕記載のペプチド（ペプチドＡ）を「ザ・ペプチド（The Peptides）」〔グロス（Gross,E.）及びマイネンホーフ（Meinenhofe,J.）編、バラニー（Barany,G.）及びメリフィールド（Merrifield,R.）著、第２巻第１〜284頁、アカデミックプレス、ニューヨーク、1980年）〕に記載の方法に従い、固相合成法によりフェニルアセトアミドメチル（PAM）樹脂上で合成した。
Ｃ末端アミノ酸残基のロイシンをｔ−ブチルオキシカルボニル−ロイシン（Boc−Leu）とし、オキシメチルフェニルアセトアミド結合を介してPAM樹脂に結合させた。Ｃ末端結合後Boc−Leu−PAM樹脂（0.70mol/g、0.35g）をペプチド合成装置（モデル990E、ベックマン社製）の反応容器に移した。保護処理を施したアミノ酸を予め形成した対称無水物法により樹脂上でＮ末端方向に延長し、完全に保護したペプチド−Ｏ−樹脂を合成した。但し、アルギニンの縮合に際しては、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾール［コニー等、Chem.Ber.,103,788−789（1970）］を用いてダブルカップリングした。
なお、全てのアミノ酸のＮ末端のアミノ基は、Boc基で保護し、官能性側鎖を以下の基により保護し、反応に使用した。
Arg−Tos;（トシル）．
Lys−2CLZ;（２−クロロベンジルオキシカルボニル）．
Cys−4MeBzl;（４−メチルベンジル）．
His−Tos;（トシル）．
この縮合反応の確認はニンヒドリン法によるカイザーテストで行った。
完全に保護したペプチド−Ｏ−樹脂（155mg）を塩化メチレン中で５分間膨潤させた。Ｎ−α−Boc保護基を１％（v/v）インドールおよび0.1％（v/v）エタンジチオールを含有するTFAを用いて脱保護した。次いで、この脱保護したペプチド−Ｏ−樹脂を、ｐ−クレゾール（1ml）、ｐ−チオクレゾール（0.2g）及びDMSO（1ml）を添加した無水フッ化水素（HF）（11ml）で、０℃にて60分間処理し、ペプチドを樹脂から切り出した。
HF及びDMSOを真空下、０℃にて留去した。この切り出したペプチド及び樹脂を冷ジエチルエーテル（15ml）で３回洗浄し、次いで切り出したペプチドを冷TFA（5ml）で４回洗浄することにより抽出した。この抽出液を直ちに濾過し、氷冷水（150ml）に加えて粗製のペプチドを沈澱させた。次いで、この粗製のペプチドを、1000×g,0℃にて30分間遠心分離し沈澱物として回収した。この沈殿物をジエチルエーテル（15ml）で洗浄した。この洗浄工程を、更にジエチルエーテル、酢酸エチル、蒸留水を用いて繰り返し行いペプチドＡを84mg得た。
この粗製のペプチドを50％DMSO水溶液に溶解し、μ−ボンダスフェアー、C8−300カラムによる逆相系高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製し、純粋なペプチドＡを採取した。
溶離液としては、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を用い５分間溶出した。次いで、同溶離液と0.1％TFAを含む80％アセトニトリル水溶液による直線的な濃度勾配により30分間溶出した。
溶出液中のペプチドの存在は、245nm（分光光度計；日本分光株式会社モデル870−UV）および示差屈折計（島津製作所株式会社モデルRID−6A）でモニターした。
FABMS（Ｍ＋H+）;3837.1（分子量の計算値;3835.9）
〔実施例２〕
〔配列番号６〕のペプチド（ペプチドＢ）をアセルトン（E.Atherton）及びシェパード（R.C.Sheppard）著「ソリッドフェィズペプチドシンテイシス（Solid  phase  peptide  synthesis−ａ  practical  approach,p.25−189,1989,Oxford  University  Press,Oxford）」及びKenich,Akagi  et  al.,Chem.Pharm.Bull.,37（10）,p2661−2664（1989）に記載の方法を参考に、マルチペプチド固相合成システム「コックさん」（商品名；国産化学株式会社製）により固相合成した。
初発の樹脂として、Ｎ−α−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−ロイシン（Fmoc−Leu）を４−（ヒドロオキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン１％ジビニルベンゼン）樹脂に結合させたＮ−α−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−ロイシン−Ｏ−樹脂（Fmoc−Leu−Ｏ−樹脂）（0.20mmol/0.5g）を使用した。その樹脂をN,N−ジメチルホルムアミド（DMF）で20分間膨潤させた後、DMFで４回樹脂を洗浄した。20％ピペリジン−DMF溶液を加え振盪し脱保護を行った。この脱保護を完全に行うためにこの操作を３回繰り返した。次いで、樹脂中の過剰のピペリジンを除去するためDMFで３回、Ｎ−メチル−２−ピロリドンで３回、更に、DMFで３回洗浄した。この際、ピペリジンの有無の確認をpH試験紙で行った。
その後、DMF（6ml）、Fmoc−Leu（0.5mmol）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.5mmol）及びN,N'−ジイソプロピルカルボジイミド（0.5mmol）を加え90分間振盪し縮合反応を行った。次いで、DMFで４回樹脂を洗浄し、過剰の試薬を除去した。この縮合反応の確認は、ニンヒドリン法によるカイザーテストで行った。
このようにして合成計画に従い、順次アミノ酸を樹脂上でＮ末端方向に延長し、Ｎ末端及び官能基を完全に保護したペプチド−Ｏ−樹脂を合成した。
なお、Arg、Lys、His、Pro、Cysの導入時の縮合反応は、120分、２回行った。
その後、保護したペプチド−Ｏ−樹脂に20％ピペリジン−DMF溶液を加えＮ末端のFmoc保護基の脱保護を行い、このペプチド−Ｏ−樹脂をDMFで６回、メタノールで６回洗浄し、減圧乾燥した。その乾燥したペプチド−Ｏ−樹脂（100mg）に氷冷下で攪拌しながら、ｍ−クレゾール（0.2ml）、1,2−エタンジチオール（0.5ml）、チオアニソール（1.2ml）、TFA（7.5ml）及びトリメチルシリルブロマイド（1.4ml）を加えた後、120分間氷冷下で攪拌し、官能性側鎖の脱保護とともにペプチドを樹脂から切り出し、グラスフィルター（G3）で濾過した。この濾過液をエバポレイターにより約5mlにまで減圧濃縮し、ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させた。このペプチド沈殿物をグラスフィルター（G3）で濾取し、ジエチルエーテルで５回洗浄した後、減圧乾燥してペプチドＢを60mg取得した。
なお、全てのアミノ酸のＮ末端のアミノ基は、Fmoc基で保護し、官能性側鎖を以下の基により保護し、反応に使用した。
Arg−Mtr;（４−メトキシ−２、３、６−トリメチルベンゼンスルホニル）．
Lys−Boc;（ｔ−ブチルオキシカルボニル）．
Cys−Trt;（トリチル）．
His−Trt;（トリチル）．
この粗製のペプチド約100mgをTFA（1ml）で溶解し、４倍量の移動相溶媒即ち10mMβ−メチルカプトエタノール含有TFA−ジクロロメタン（5:95,V/V）溶液を添加し20mg/mlの試料溶液を調製し、アサヒパック（Asahipak）GS−510（φ7.5×500mm）カラム（商標、旭化成社製）によるHPLCで精製し、純粋なペプチドＢを採取した。
溶離液としては、10mMβ−メルカプトエタノール含有TFA−ジクロロメタン（5:95,V/V）溶液を用い、0.8ml/minの流速で80分間溶出した。溶出液中のペプチドの存在は、245nm（分光光度計；日本分光株式会社モデル870−UV）および示差屈折計（島津製作所株式会社モデルRID−6A）でモニターした。
FABMS（Ｍ＋H+）;3017.9（分子量の計算値;3016.9）
〔実施例３〕
〔配列番号７〕のペプチド（ペプチドＣ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;3116.0（分子量の計算値;3115.1）
〔実施例４〕
〔配列番号８〕のペプチド（ペプチドＤ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2663.7（分子量の計算値;2662.5）
〔実施例５〕
〔配列番号９〕のペプチド（ペプチドＥ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2211.2（分子量の計算値;2209.9）
〔実施例６〕
〔配列番号10〕のペプチド（ペプチドＦ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2647.5（分子量の計算値;2646.4）
〔実施例７〕
〔配列番号11〕のペプチド（ペプチドＧ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;3018.1（分子量の計算値;3016.9）
〔実施例８〕
〔配列番号12〕のペプチド（ペプチドＨ）を実施例２に準じてマルチペプチド固相合成システムにより固相合成した。
初発の樹脂として、Ｎ−α−フルオニルメチルオキシカルボニル−ノルロイシン−Ｏ−樹脂（Fmoc−Nle−Ｏ−樹脂）（0.20mmol/0.5g）を使用した。その樹脂をDMFで20分間膨潤させた後、DMFで４回樹脂を洗浄した。20％ピペリジン−DMF溶液を加え振盪し脱保護を行った。この脱保護を完全に行うためにこの操作を３回繰り返した。次いで、樹脂中の過剰のピペリジンを除去するためDMFで９回洗浄した。この際、ピペリジンの残留をpH試験紙で確認した。
その後、DMF（6ml）、Fmoc−Nle（0.5mmol）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.5mmol）及びN,N'−ジイソプロピルカルボジイミド（0.5mmol）を加え90分間振盪し縮合反応を行った。次いで、DMFで４回樹脂を洗浄し、過剰の試薬を除去した。この縮合反応の確認は、ニンヒドリン法によるカイザーテストで行った。
このようにして合成計画に従い、順次アミノ酸を樹脂上でＮ末端方向に延長し、Ｎ末端及び官能基を完全に保護したペプチド−Ｏ−樹脂を合成した。
なお、Arg、Lys、His、Proの導入時の縮合反応は、120分、２回行った。
その後、保護したペプチド−Ｏ−樹脂に20％ピペリジン−DMF溶液を加えＮ末端のFmoc保護基の脱保護を行い、このペプチド−Ｏ−樹脂をDMFで６回、メタノールで６回洗浄し、減圧乾燥した。その乾燥したペプチド−Ｏ−樹脂（100mg）に氷冷下で攪拌しながら、ｍ−クレゾール（0.2ml）、1,2−エタンジチオール（0.5ml）、チオアニソール（1.2ml）、TFA（7.5ml）及びトリメチルシリルブロマイド（1.4ml）を加えた後、120分間氷冷下で攪拌し、官能性側鎖の脱保護とともにペプチドを樹脂から切り出し、グラスフィルター（G3）で濾過した。この濾過液をエバポレイターにより約5mlにまで減圧濃縮し、ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させた。このペプチド沈殿物をグラスフィルター（G3）で濾取し、ジエチルエーテルで５回洗浄した後、減圧乾燥してペプチドＨを65mg取得した。
なお、全てのアミノ酸のＮ末端のアミノ基は、Fmoc基で保護し、官能性側鎖を以下の基により保護し、反応に使用した。
Arg−Mtr;（４−メトキシ−２、３、６−トリメチルベンゼンスルホニル）
.Lys−Boc;（ｔ−ブチルオキシカルボニル）．
Cys−Trt;（トリチル）．
His−Boc;（ｔ−ブチルオキシカルボニル）．
このペプチド約10mgを3.0mlのクロロホルム−メタノール（C/M）2:1,（V/V）混合溶媒に溶解した。同試料をC/M混合溶媒2:1,（V/V）で平衡化したセファデクスLH−60カラム（φ2.5cm×90cm）により精製し、純粋なペプチドＨを採取した。
溶出液中のペプチドの存在は、245nm（分光光度計；日本分光株式会社モデル870−UV）及び示差屈折計（島津製作所株式会社；モデルRID−6A）でモニターした。
FABMS（Ｍ＋H+）;2663.6（分子量の計算値;2662.5）
〔実施例９〕
〔配列番号13〕のペプチド（ペプチドＩ）を実施例８と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2560.4（分子量の計算値;2559.3）
〔実施例10〕
〔配列番号14〕のペプチド（ペプチドＪ）を実施例８と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2663.8（分子量の計算値;2662.5）
〔実施例11〕
〔配列番号15〕のペプチド（ペプチドＫ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2663.5（分子量の計算値;2662.5）
〔実施例12〕
〔配列番号16〕のペプチド（ペプチドＬ）を実施例２の方法に準じて調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2503.6（分子量の計算値;2502.4）
〔実施例13〕
〔配列番号17〕のペプチド（ペプチドＭ）を実施例２の方法に準じて調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2736.7（分子量の計算値;2735.5）
〔実施例14〕
〔配列番号18〕のペプチド（ペプチドＮ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2640.4（分子量の計算値;2639.4）
〔実施例15〕
〔配列番号19〕のペプチド（ペプチドＯ）を実施例８と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2640.3（分子量の計算値;2639.4）
〔実施例16〕  Fmoc−Pro−Val−His（Trt）−Leu−Lys（Boc）−Arg（Mtr）
標題のペプチド（ペプチドＰ）をペプチドシンセサイザーシステム9050型（ミリポア社製）により固相合成した。
初発の樹脂としてＮ−α−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ−ω−４−メトキシ−2,3,6,−トリメチルベンゼンスルホニル−アルギニン（Fmoc−Arg（Mtr））を２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール−樹脂（サスリン（Sasrin）樹脂、バッケイム（Bachem）社、商標）に結合させたＮ−α−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ−ω−４−メトキシ−2,3,6,−トリメチルベンゼンスルホニル−アルギニン−Ｏ−樹脂（Fmoc−Arg（Mtr）−Ｏ−樹脂）（0.20mmol）を使用し、ペプチドシンセサイザーシステム9050型の合成プロトコールに従い、モニターしながら順次アミノ酸を樹脂上でＮ末端方向に延長し、Ｎ末端及び官能基を完全に保護したペプチド−Ｏ−樹脂を合成した。
その後、完全に保護したペプチド−Ｏ−樹脂をメタノールで５回洗浄し、減圧乾燥した。その乾燥したペプチド−Ｏ−樹脂（330mg）に氷冷下で攪拌しながら、TFA−ジクロロメタン（1:99,V/V）溶液を加えた後、30分間氷冷下で攪拌し、次いで、90分間室温で攪拌し、保護基をつけたままペプチドを樹脂から切り出し、グラスフィルター（G3）で濾過した。この濾過液をエバポレーターにより約5mlにまで減圧濃縮し、ジエチルエーテルを加えてペプチドを沈殿させた。このペプチド沈殿物をグラスフィルター（G3）で濾取し、ジエチルエーテルで５回洗浄した後、減圧乾燥してペプチドＰを180mg取得した。
なお、全てのアミノ酸のＮ末端のアミノ酸は、Fmocで保護し、官能性側鎖を以下の基により保護し、反応に使用した。
Arg−Mtr;（４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル）
Lys−Boc;（ｔ−ブチルオキシカルボニル）
His−Trt;（トリチル）
この粗製のペプチドＰにTFA−ジクロロメタン（1:99,V/V）溶液を添加し10mg/mlの試料溶液を調製し、アサヒパック（Asahipak）GS−510（φ21.5×500mm）カラム（商標、旭化成社製）によるHPLCで精製し、純粋なペプチドＰを採取した。
溶離液としては、TFA−ジクロロメタン（1:99,V/V）溶液を用い、8.1ml/minの流速で120分間溶出した。溶出液中のペプチドの存在は、245nm（分光光度計；日本分光株式会社モデル870−UV）及び示差屈折計（島津製作所株式会社モデルRID−6A）でモニターした。
FABMS（Ｍ＋H+）;1405.0（分子量の計算値;1403.8）。
〔実施例17〕
実施例８に準じてＨ−Nle−（Nle）14−Nle−Ｏ−樹脂をマルチペプチド固相合成システムにより合成した。
次いで、合成したＨ−Nle−（Nle）14−Nle−Ｏ−樹脂にDMFを添加後、Fmoc−Arg（Mtr）の代わりにペプチドＰをＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びN,N'−ジイソプロピルカルボジイミドを加え８時間振盪し縮合反応を２回行った。なお、この縮合反応の確認は、ニンヒドリン法によるカイザーテストで行った。
その後、実施例８の方法に従って、官能性側鎖の脱保護とともにペプチドを樹脂から切り出し、HPLCによる精製を行い、〔配列番号13〕のペプチド（ペプチドＩ）を調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2560.2（分子量の計算値;2559.3）
〔実施例18〕
ペプチドＤのチオール基のアセトアミドメチル（ACM）体（ペプチドＱ）を実施例４におけるFmoc−Cys−TrtをFmoc−Cys−ACMに代えた以外は同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2734.7（分子量の計算値;2733.6）
〔実施例19〕
Sarin,Virender  Kumarら方法（EP  ０  458  167A1）に準じて、ペプチドＥのチオール基をパルミチン酸エステル化し、ペプチドＲを調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2448.5（分子量の計算値;2448.3）
〔参考例１〕
〔配列番号20〕のペプチド（ペプチドＳ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;2793.8（分子量の計算値;2792.6）
〔参考例２〕
〔配列番号21〕のペプチド（ペプチドＴ）を実施例２と同様の方法で調製した。
FABMS（Ｍ＋H+）;3018.3（分子量の計算値;3016.9）
〔本発明合成ペプチドのアミノ酸組成分析〕
本発明合成ペプチドを５％（v/v）フェノールを含む12規定塩酸−TFA〔2:1（V/V）〕で、真空下、150℃にて１、２、４、６、12、24、48及び72時間酸加水分解し、酸を除いた後に、加水分解生成物を島津アミノ酸自動分析システム（LC−9A）により分析した。なお、ペプチドＭのTrpについては、4.2規定水酸化ナトリウム水溶液で16、24、32時間アルカリ加水分解後、塩酸で中和し、アミノ酸自動分析システムにより分析した。１〜72時間加水分解において、より高い回収を示したアミノ酸値を採用し、アミノ酸組成値を算出したところ、計算値とほぼ一致する値を示した。
結果を表１に示す。
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（２）本発明サーファクタントの製造
本発明サーファクタントを、本発明合成ペプチドと脂質成分としてコリンホスホグリセリド、酸性リン脂質及び脂肪酸類の３成分とを、混合して調製した。
〔実施例20〕
無菌処理した1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（1350mg）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）（450mg）及びミリスチン酸（200mg）を常温でクロロホルム−メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（1000ml）に溶解し、ペプチドＡの25mgをTFA（1.0ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を40℃で15分間かけて水−エタノール混合液〔9:1（V/V）〕（100ml）に懸濁した。この懸濁液を−50℃で凍結させて真空度85〜100μHgで36時間乾燥し、サーファクタント（2070mg）を白色粉末として得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは65.2％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは21.7％（W/W）、及びミリスチン酸は9.7％（W/W）、ペプチドＡは1.2％（W/W）及び水2.2％（W/W）であった。
〔実施例21〕
1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（300.0mg）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）（100.0mg）及びパルミチン酸（40.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（300ml）に溶解し、ペプチドＢの10.0mgをクロロホルム・メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（2.0ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を45℃で20分間かけて水−エタノール混合液〔9:1（V/V）〕（100ml）に懸濁した。この懸濁液を−60℃で凍結させて真空度60〜110μHgで40時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを459.1mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは65.3％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは21.8％（W/W）、及びパルミチン酸は8.7％（W/W）、ペプチドＢは2.2％（W/W）及び水2.0％（W/W）であった。
〔実施例22〕
1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（280.0mg）、1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（120.0mg）及びパルミチン酸（27.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（150ml）に溶解し、ペプチドＣの2.8mgをクロロホルム・メタノール混合液〔1:2（V/V）〕（0.5ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を40℃で45分間かけて水−エタノール混合液〔8:2（V/V）〕（100ml）に懸濁した。この懸濁液を−65℃で凍結させて真空度50〜80μHgで36時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを437.6mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは64.0％（W/W）、1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは27.4％（W/W）、及びパルミチン酸は6.2％（W/W）、ペプチドＣは0.6％（W/W）及び水1.8％（W/W）であった。
〔実施例23〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＤを用い、又、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）の代わりに１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールを用いた以外は〔実施例21〕と同様な操作を行い、白色のサーファクタント粉末を451.9mg製造した。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは66.4％（W/W）、１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは22.1％（W/W）、及びパルミチン酸は8.9％（W/W）、ペプチドＤは2.2％（W/W）及び水0.4％（W/W）であった。
〔実施例24〕
1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（320.0mg）、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（80.0mg）及びパルミチン酸（60.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔1:1（V/V）〕（200ml）に溶解し、ペプチドＥ（14.0mg）をTFA（0.3ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を45℃で60分間かけて水−エタノール混合液〔10:1（V/V）〕（50ml）に懸濁した。この懸濁液を−45℃で凍結させて真空度50〜110μHgで24時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを479.2mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは66.8％（W/W）、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは16.7％（W/W）、及びパルミチン酸は12.5％（W/W）、ペプチドＥは2.9％（W/W）及び水1.1％（W/W）であった。
〔実施例25〕
ペプチドＢ（10.0mg）の代わりにペプチドＦ（22.0mg）を用い、また、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）の代わりに1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールを用いた以外は〔実施例21〕と同様な操作を行い、白色のサーファクタント粉末を463.9mg製造した。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは64.7％（W/W）、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは21.6％（W/W）、及びパルミチン酸は8.6％（W/W）、ペプチドＦは4.7％（W/W）及び水0.4％（W/W）であった。
〔実施例26〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＧを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を454.1mg製造した。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは66.1％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）は22.0％（W/W）、及びパルミチン酸は8.8％（W/W）、ペプチドＧは2.2％（W/W）及び水0.9％（W/W）であった。
〔実施例27〕
1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（210mg）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）（90.0mg）及びステアリン酸（33.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔3:1（V/V）〕（100ml）に溶解し、ペプチドＨ（1.9mg）をメタノール（0.5ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を50℃で15分間かけて水−エタノール混合液〔9:1（V/V）〕（90ml）に懸濁した。この懸濁液を−55℃で凍結させて真空度100〜120μHgで28時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを340.2mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは61.7％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは26.5％（W/W）、及びステアリン酸は9.7％（W/W）、ペプチドＨは0.5％（W/W）及び水1.6％（W/W）であった。
〔実施例28〕
1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（210mg）、１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−Ｌ−セリン（90.0mg）及びパルミチン酸（33.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔4:1（V/V）〕（100ml）に溶解し、ペプチドＩ（11.0mg）をTFA（0.5ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を45℃で25分間かけて水−エタノール混合液〔9:1（V/V）〕（110ml）に懸濁した。この懸濁液を−55℃で凍結させて真空度100〜120μHgで28時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを348.7mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは60.2％（W/W）、１−パルミトイル−２−オレオイル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−Ｌ−セリンは25.8％（W/W）、及びパルミチン酸は9.5％（W/W）、ペプチドＩは3.2％（W/W）及び水1.3％（W/W）であった。
〔実施例29〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＪを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を459.3mg製造した。
〔実施例30〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＫを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を452.5mg製造した。
〔実施例31〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＬを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を456.6mg製造した。
〔実施例32〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＭを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を453.9mg製造した。
〔実施例33〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＮを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を452.5mg製造した。
〔実施例34〕
ペプチドＢの代わりにペプチドＯを用いた以外は〔実施例21〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を458.1mg製造した。
〔実施例35〕
1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリン（30.0mg）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）（10.0mg）及びパルミチン酸（4.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（30ml）に溶解し、ペプチドＱの1.0mgをクロロホルム・メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（2.0ml）に溶解した。これらの溶液を混合し、減圧乾固した。得られた残留物を45℃で20分間かけて水−エタノール混合液〔9:1（V/V）〕（10ml）に懸濁した。この懸濁液を−60℃で凍結させて真空度60〜120μHgで36時間乾燥し、白色粉末のサーファクタントを45.4mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは66.1％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロールは22.0％（W/W）、及びパルミチン酸は8.8％（W/W）、ペプチドＱは2.2％（W/W）及び水0.9％（W/W）であった。
〔実施例36〕
ペプチドＱの代わりにペプチドＲを用いた以外は〔実施例35〕と同様にして白色のサーファクタント粉末を45.7mg製造した。
〔参考例３〕
ペプチドＢ（10.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（2.0ml）に溶解した溶液の代わりに、ペプチドＳ（10.0mg）をTFA（0.3ml）に溶解した溶液を用いた以外は〔実施例21〕と同様にして、サーファクタントを455.2mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは65.9％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）は22.0％（W/W）、及びパルミチン酸は8.8％（W/W）、ペプチドＳは2.2％（W/W）及び水1.1％（W/W）であった。
〔参考例４〕
ペプチドＢ（10.0mg）をクロロホルム−メタノール混合液〔2:1（V/V）〕（2.0ml）に溶解した溶液の代わりに，ペプチドＴ（10.0mg）をTFA（0.3ml）に溶解した溶液を用いた以外は〔実施例21〕と同様にして、サーファクタントを456.0mg得た。
この粉末中にはエタノールの残存は認められず、サーファクタントの総重量に対する各成分の含量は、1,2−ジパルミトイルグリセロ−（３）−ホスホコリンは65.8％（W/W）、1,2−ジアシル−sn−グリセロ−（３）−ホスホ−sn−グリセロール（アシル基の炭素数14〜24個：シグマ社製）は21.9％（W/W）、及びパルミチン酸は8.8％（W/W）、ペプチドＴは2.2％（W/W）及び水1.3％（W/W）であった。
本発明サーファクタントの表面活性及び肺胞腔容量維持作用の結果を表２に示す。
産業上の利用可能性
上述のように本発明である新規な合成ポリペプチドは、単離・精製が容易でありかつ大量製造が可能な方法で作られ、一般溶媒に対する溶解性が高く、従来の製剤に比べ、良好な均一懸濁性及び同等の強力な表面活性を示した。
従って、重篤な呼吸障害をきたす疾病である呼吸窮迫症候群の治療剤として利用することができる。
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配列表
配列番号:1
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:2
配列の長さ:34
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:3
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:4
配列の長さ:32
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:5
配列の長さ:35
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:6
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:7
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:8
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:9
配列の長さ:19
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:10
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:11
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:12
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:13
配列の長さ:22
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:14
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:15
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:16
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:17
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:18
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:19
配列の長さ:23
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:20
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号:21
配列の長さ:27
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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