(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(1)：
ＮＣＣＨ2ＣＯＯＲ (1)
（式中、Ｒは、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、又は炭素数１〜20のアルキル基を示す。）で表されるシアノ酢酸エステルを、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属又はゴルドナ(Gordona) 属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物で処理して加水分解することを特徴とする、一般式(2)：
ＨＯＯＣＣＨ2ＣＯＯＲ (2)
（式中、Ｒは、前記のとおりである。）で表されるマロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項２】
加水分解反応中、反応液のシアノ酢酸エステルの濃度を0.01〜10重量％の範囲に維持しながら該エステルを連続添加することを特徴とする、請求項１に記載のマロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項３】
ニトリラーゼ活性を有する微生物がコリネバクテリウム ニトリロフィラス(Corynebacterium nitrilophilus)又はゴルドナ テラエ(Gordona terrae)である請求項１又は２に記載のマロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項４】
ニトリラーゼ活性を有する微生物がコリネバクテリウム ニトリロフィラス(Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419又はゴルドナ テラエ(Gordona terrae) MA-1 (FERM BP-4535)である請求項１又は２に記載のマロン酸モノエステルの製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法で得られた反応溶液を溶剤で抽出して未反応の前記式(1)で表されるシアノ酢酸エステルを除去した後、抽出残液に酸を加えてｐＨ１〜２とし、次いで、溶剤で抽出することにより、前記式(2)で表されるマロン酸モノエステルを得ることを特徴とするマロン酸モノエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の化成品、医薬、農薬等の合成中間体として有用なマロン酸モノエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マロン酸モノエステルの製造方法としてはマロン酸ジエステルを化学的に加水分解する方法が一般的である。しかしながらこの方法では、反応終了後、生成物であるマロン酸モノエステルを、未反応のマロン酸ジエステルおよび副生成物であるマロン酸から単離するのが困難であり、高純度のマロン酸モノエステルを得ることができない。
【０００３】
高純度のマロン酸モノエステルを得る方法として、Meldrum's 酸を原料とする方法が知られている（例えば、Matoba Katsuhide et al., Chem. Pharm. Bull., 31(8), 2955(1983)、又はRigo B. et al., Tetrahedron Lett., 30(23), 3073(1989) 参照）。しかしながら、この方法は、高価なMeldrum's 酸を使用するため実用的な方法とは言い難く、工業的生産には適していない。
【０００４】
また、高純度のマロン酸モノエステルを得る方法として、マロン酸ジエステルにエステル結合を加水分解する能力を有する酵素又は微生物を作用させる方法が公知である（特開平8-173174号公報）。しかしながら、原料となるマロン酸ジエステルはコスト的に不利である。
したがって、生産性に優れた高純度のマロン酸モノエステルの製造方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、種々の化成品、医薬、農薬等の合成中間体として有用なマロン酸モノエステルの生産性に優れた製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、シアノ酢酸エステルに、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属又はゴルドナ(Gordona) 属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物を作用させると、マロン酸モノエステルが選択的に生成され、エステル結合の加水分解等の副反応もなく、高純度のマロン酸モノエステルを製造することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、一般式(1) ：
ＮＣＣＨ2ＣＯＯＲ    (1)
（式中、Ｒは、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、又は炭素数１〜20のアルキル基を示す。）
で表されるシアノ酢酸エステルを、コリネバクテリウム属又はゴルドナ属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物の培養物、菌体又は菌体処理物で処理して加水分解することを特徴とする、一般式(2) ：
ＨＯＯＣＣＨ2ＣＯＯＲ    (2)
（式中、Ｒは、前記のとおりである。）
で表されるマロン酸モノエステルの製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
上記一般式(1) 又は(2) において、Ｒで表されるアルキル基は、直鎖又は分岐状のいずれの構造でもよい。このアルキル基の炭素数は１〜20であり、好ましくは１〜10であり、より好ましくは２〜６である。具体的には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert- ブチル、イソブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、オクチル、2-エチルヘキシル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシルなどが例示される。
【０００９】
Ｒで表されるアルケニル基は、直鎖又は分岐状のいずれの構造でもよく、好ましくは炭素数２〜６である。具体的には、ビニル基、アリル基などが例示される。
Ｒで表されるアリール基としては、フェニル基などが例示される。
【００１０】
Ｒで表されるアラルキル基としては、ベンジル基などが例示される。
一般式(1) で表されるシアノ酢酸エステルの中で、代表的な化合物としては、例えば、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、シアノ酢酸n-プロピル、シアノ酢酸イソプロピル、シアノ酢酸ベンジル等が挙げられる。
【００１１】
本発明に使用される微生物は、コリネバクテリウム属又はゴルドナ属に属し、ニトリラーゼ活性を有していれば、特に制限されない。具体的には、コリネバクテリウム  ニトリロフィラス(Corynebacterium nitrilophilus) ATCC 21419、ゴルドナ  テラエ(Gordona terrae) MA-1 (FERM BP-4535)等が例示される。
【００１２】
これらの微生物のなかで、ゴルドナ  テラエMA-1は、上記寄託番号にて工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、コリネバクテリウム  ニトリロフィラスは、アメリカン  タイプカルチャーコレクション（ATCC）などから入手可能である。
【００１３】
微生物の培養は、液体培地でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。微生物の加水分解能を向上させるため、培地にニトリル化合物を少量添加することも可能である。培養は、微生物が生育可能である温度、pHで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行うのが好ましい。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行ってもよい。
【００１４】
本発明においては、上記のようなコリネバクテリウム属又はゴルドナ属に属し、ニトリラーゼ活性を有する微生物を培地中で培養して得られる培養物をそのままか、又は該培養物から遠心分離などの集菌操作によって得られる菌体、若しくは菌体処理物を用いることができる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、菌体の破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、菌体から分離した粗酵素又は精製酵素などが挙げられる。菌体又は菌体処理物は、架橋したアクリルアミドゲルなどに包括固定したり、イオン交換樹脂、ケーソー土などの固体担体に物理的、化学的に固定化して用いることにより、反応を行った後に回収再利用することも可能である。
【００１５】
本発明において、マロン酸モノエステルは以下の方法で製造することができる。反応媒体に基質であるシアノ酢酸エステルを添加して溶解もしくは懸濁する。また、基質を反応媒体に添加する前に又は添加した後に触媒となる微生物の培養物等を加える。そして、反応温度、必要により反応液のpHを制御しながら加水分解反応を行う。反応媒体としては、例えば、イオン交換水、緩衝液等が用いられる。反応温度は通常０〜70℃、好ましくは10〜35℃であるが、菌体等のニトリラーゼ活性が高くなる温度で行えばよい。反応液のpHは用いる微生物酵素の至適pHに依存するが、一般的にはpH６〜９の範囲内で実施すると化学的加水分解反応による副反応を抑えることができるので好ましい。反応液中の菌体又は菌体処理物の濃度は、乾燥重量として通常0.01〜５重量％相当量である。また、反応液の基質濃度は0.01〜70重量％の間で特に制限はないが、 0.1から15重量％の範囲内で行うことが好ましい。
【００１６】
さらに、加水分解反応中、シアノ酢酸エステルを連続添加することによりマロン酸モノエステルを高濃度に蓄積させることができる。その際、基質による酵素の失活を最小限に抑えるため、反応液の基質濃度を0.01〜10重量％、好ましくは 0.1〜５重量％の範囲に維持しながら基質を添加する。
【００１７】
反応終了後、触媒として使用した微生物の菌体を遠心分離、濾過などの操作により除去してから、ヘキサン、酢酸エチルなどの溶剤で抽出することにより未反応のシアノ酢酸エステルを回収可能である。抽出残液を硫酸、塩酸などの酸でpH１〜２とした後に、ヘキサン、酢酸エチルなどの溶剤で抽出することにより、生成物であるマロン酸モノエステルを得ることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
ゴルドナ  テラエ MA-1 (FERM BP-4535)を滅菌したＬＢ培地（１％ポリペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％ NaCl ）３mlに植菌し、30℃で24時間振盪培養した。得られた菌体培養液１mlを滅菌した下記培地Ａ 100mlに植菌し、30℃で48時間培養した。
【００１９】
培地Ａ（pH 7.2）
グリセロール             1.0  ％
イソバレロニトリル       0.2  ％
酵母エキス               0.02 ％
ＫＨ2ＰＯ4               0.2  ％
ＮａＣｌ                 0.1  ％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ       0.02 ％
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ       10   ppm
ＣｏＣｌ2・４Ｈ2Ｏ       10   ppm
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ        1   ppm
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ        7   ppm
【００２０】
培養終了後、培養液を遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水で洗浄したのち、50mMリン酸緩衝液（pH7.0) 100mlに懸濁した。この菌体懸濁液の濁度は、ＯＤ630 ＝5.5 であった。この菌体懸濁液に基質としてシアノ酢酸エチル1.00ｇを添加し、30℃で１時間反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：TSKgel ODS-120A （東ソー株式会社製）、 4.6mm I.D. × 25 cm、移動相：５％アセトニトリル，95％水， 0.1％リン酸、流速： 0.5ml/min、検出：ＵＶ 220nm）で分析したところ、全ての基質がマロン酸モノエチルに変換されていた。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、２Ｎ塩酸を添加し、pHを 2.0に調整し、反応生成物であるマロン酸モノエチルを酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去して、1.05ｇのマロン酸モノエチルを得た（収率89.9％）。
【００２１】
〔実施例２〕
微生物としてコリネバクテリウム  ニトリロフィラス ATCC 21419 を用いた以外は全て実施例１と同様にして1.07ｇのマロン酸モノエチルを得た（収率91.6％）。
【００２２】
〔実施例３〕
基質としてシアノ酢酸メチルを用いた以外は全て実施例１と同様にして0.97ｇのマロン酸モノメチルを得た（収率81.4％）。
【００２３】
〔実施例４〕
基質としてシアノ酢酸n-プロピルを用いた以外は全て実施例１と同様にして1.05ｇのマロン酸モノn-プロピルを得た（収率91.3％）。
【００２４】
〔実施例５〕
基質としてシアノ酢酸イソプロピルを用いた以外は全て実施例１と同様にして1.02ｇのマロン酸モノイソプロピルを得た（収率88.7％）。
【００２５】
〔実施例６〕
基質としてシアノ酢酸n-ブチルを用いた以外は全て実施例１と同様にして1.06ｇのマロン酸モノn-ブチルを得た（収率93.4％）。なお、ＨＰＬＣ分析の移動相として、40％アセトニトリル，60％水，0.1 ％リン酸を用いた。
【００２６】
〔実施例７〕
基質としてシアノ酢酸t-ブチルを用いた以外は全て実施例６と同様にして1.05ｇのマロン酸モノt-ブチルを得た（収率92.5％）。
【００２７】
〔実施例８〕
基質としてシアノ酢酸アリルを用いた以外は全て実施例６と同様にして1.02ｇのマロン酸モノアリルを得た（収率87.2％）。
【００２８】
〔実施例９〕
基質としてシアノ酢酸2-エチルヘキシルを用いた以外は全て実施例６と同様にして1.01ｇのマロン酸モノ2-ヘチルヘキシルを得た（収率91.8％）。
【００２９】
〔実施例10〕
基質としてシアノ酢酸ベンジルを用いた以外は全て実施例６と同様にして反応を行った。酵素反応終了後、10％のシアノ酢酸ベンジルが未反応であった。未反応のシアノ酢酸ベンジルを酢酸エチルで抽出除去した。その抽出後、水層に２Ｎ塩酸を添加してpHを 2.0に調整し、次いで反応生成物であるマロン酸モノベンジルを酢酸エチルで抽出した。有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去し、0.89ｇのマロン酸モノベンジルを得た（収率80.3％）。
【００３０】
〔実施例11〜19〕
実施例１と同様にして得られた菌体懸濁液に、シアノ酢酸エチルを５〜50重量％濃度となるように添加し、25℃で20時間反応させた。反応終了後の反応収率を液体クロマトグラフィーで測定した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
0003718572.tif 000002
【００３２】
〔実施例20〕
実施例１と同様にして得られた菌体懸濁液 100mlに、シアノ酢酸エチルを５ｇ添加し、25℃で反応させた。以後、反応液中の基質濃度が５重量％を超えないように、基質濃度を測定しながら合計30ｇのシアノ酢酸エチルを分割して添加した。30時間後、反応収率は 100％であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、種々の化成品、医薬、農薬等の合成中間体として有用な、マロン酸モノエステルを生産性よく製造することができる。