(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群を構成する細菌の同定を行う方法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする結核菌群構成細菌の同定方法。
（１）DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを合成する
（２）（１）で合成したオリゴヌクレオチド、dNTP、DNA ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA を含む溶液を調製する
（３）（２）で調製した溶液をポリメラーゼ連鎖反応が起こり得る条件で繰り返し加熱する
（４）（３）の操作後の溶液について、電気泳動を行い、その電気泳動パターンから細菌の同定を行う
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の結核菌群構成細菌の同定方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の結核菌群構成細菌の同定方法。
【請求項４】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群を構成する細菌の同定を行う方法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とするの結核菌群構成細菌の同定方法。
（１）結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌクレオチドと前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを合成する
（２）（１）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、試料とする細菌のDNA を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（３）（２）で増幅されたDNA 断片を制限酵素で消化する
（４）（３）で消化された断片について電気泳動を行い、その電気泳動パターンから結核菌群構成細菌の同定を行う
【請求項５】
プライマーとして用いる２種類のオリゴヌクレオチドが、配列番号１及び配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドであり、かつ用いる制限酵素がRsa I 及びTaq I であることを特徴とする請求項４記載の結核菌群構成細菌の同定方法。
【請求項６】
DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA 中で、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを有することを特徴とする結核菌群構成細菌用同定キット。
【請求項７】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌクレオチド、前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチド、及び制限酵素を有する結核菌群構成細菌用同定キットであって、前記DNA の一部と同一なオリゴヌクレオチド、前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチド及び制限酵素は前記４菌種の間で電気泳動パターンがそれぞれ異なる断片を生じさせることができることを特徴とする結核菌群構成細菌用同定キット。
【請求項８】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群を構成する細菌の検出を行う方法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする結核菌群構成細菌の検出方法。
（１）DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA 中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを合成する
（２）（１）で合成したオリゴヌクレオチド、dNTP、DNA ポリメラーゼ及び試料とする細菌のDNA を含む溶液を調製する
（３）（２）で調製した溶液をポリメラーゼ連鎖反応が起こり得る条件で繰り返し加熱する
（４）（３）の操作後の溶液について、電気泳動を行い、その電気泳動パターンから細菌の検出を行う
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の結核菌群構成細菌の検出方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の結核菌群構成細菌の検出方法。
【請求項１１】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群を構成する細菌の検出を行う方法が、以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする結核菌群構成細菌の検出方法。
（１）結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌクレオチドと前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを合成する
（２）（１）で合成した２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、試料とする細菌のDNA を鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応を行う
（３）（２）で増幅されたDNA 断片を制限酵素で消化する
（４）（３）で消化された断片について電気泳動を行い、その電気泳動パターンから結核菌群構成細菌の検出を行う
【請求項１２】
プライマーとして用いる２種類のオリゴヌクレオチドが、配列番号１及び配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドであり、かつ用いる制限酵素がRsa I 及びTaq I であることを特徴とする請求項１１記載の結核菌群構成細菌の検出方法。
【請求項１３】
DNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA 中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを有することを特徴とする結核菌群構成細菌用検出キット。
【請求項１４】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、又はマイコバクテリウム・ミクロティからなる結核菌群構成細菌のDNA ジャイレースβサブユニットをコードするDNA の一部と同一なオリゴヌクレオチド、前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチド、及び制限酵素を有する結核菌群構成細菌用検出キットであって、前記DNA の一部と同一なオリゴヌクレオチド、前記DNA の一部と相補的なオリゴヌクレオチド及び制限酵素は前記４菌種の間で電気泳動パターンがそれぞれ異なる断片を生じさせることができることを特徴とする結核菌群構成細菌用検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結核菌群を構成する細菌のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードするＤＮＡ  （以下「ｇｙｒＢ  ＤＮＡ」という）の塩基配列の違いを利用した結核菌群構成細菌の同定・検出法に関するものであり、さまざまな産業分野での利用が可能であるが、とりわけ医学、疫学、獣医学の分野に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
結核は、世界で９千万人が毎年新たに罹患し、３千万人が毎年死亡する最も重要な感染症にも関わらず、その対策は十分ではない。その原因菌である結核菌群には分類上、ヒトに対して起病性のある結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ（型）菌（マイコバクテリウム・ボビス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）及びアフリカ菌（マイコバクテリウム・アフリカヌム、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）とヒトに対する起病性のないネズミ（型）菌（マイコバクテリウム・ミクロティ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ）の４菌種が含まれる。従来、これらの結核菌をはじめとする抗酸菌の検査の主たるものはＺｉｅｈｌ−Ｎｅｅｌｓｅｎ法による塗抹染色、小川培地を用いた分離培養法ならびに薬剤感受性試験であった。その後の技術の発展によりＢＡＣＴＥＣ  ４６０  ＴＢ  システム、Ｓｅｐｔｉ−Ｃｈｅｃｋ  ＡＦＢ、ＭＧＩＴ  （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  Ｔｕｂｅ）  などの新規培養技術が開発された。
【０００３】
他方、分子生物学的手法を取り入れた方法も新たに開発された。ＤＮＡの相同性を利用した菌種の鑑別・同定、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という）法による検出、挿入配列ＩＳ６１１０を用いる結核菌の亜分類といった方法がすでに実用段階に入っている。
なかでもＰＣＲ法を用いる場合、培養を必要とせず迅速な判定を得るのに適している。その際、用いられる遺伝子は多くの場合ｒＲＮＡ遺伝子であるが、近年、ｒＲＮＡ遺伝子より進化速度の速いタンパク質をコードする遺伝子、なかでもｇｙｒＢ  ＤＮＡを用いることによってより詳細で正確な分類・同定ができることが示された。（Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈａｒａｙａｍａ  １９９５  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６１：  １１０４−１１０９．  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈａｒａｙａｍａ  １９９６  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４６：  ５０６−５１１．  Ｈａｒａｙａｍａ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ  １９９６  ｐ２５０−２５８  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｔ．  Ｎａｋａｚａｗａ，  Ｋ．  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｄ．  Ｈａａｓ，  Ｓ．  Ｓｉｌｖｅｒ  （ｅｄｓ）  ＡＳＭ  ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  山本  敏、原山重明、化学と生物  １９９６    第３４巻  第３号  ｐ．  １４９−１５１．，山本  敏、原山重明、農芸化学会誌  １９９７  第７１巻  第９号  ｐ．８９４−８９７．）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
結核菌群の細菌は生育速度が通常の細菌よりも遅く、培養を必要とする同定法を用いて結果を得るには二から三週間の時間を必要とする。そこで、培養を必要としないＰＣＲ法を用いた方法が結核菌群の細菌を同定する場合必要不可欠な方法といえる。しかしながら、従来用いられてきた  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするＰＣＲ法に基く同定法では、結核菌群を構成する４菌種のｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の間で違いがないため結核菌群を構成する４菌種を区別することは不可能であった。
本発明は、このような従来法の問題を解決し、結核菌群構成細菌の迅速な同定・検出方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ｇｙｒＢ  ＤＮＡの塩基配列の一部が結核菌群を構成する各細菌間で異なっていることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、ｇｙｒＢ  ＤＮＡを指標として結核菌群を構成する細菌の同定を行うことを特徴とする結核菌群構成細菌の同定方法である。
また、本発明は、ｇｙｒＢ  ＤＮＡを指標として結核菌群を構成する細菌の検出を行うことを特徴とする結核菌群構成細菌の検出方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の結核菌群構成細菌の同定・検出方法は、ｇｙｒＢ  ＤＮＡを指標とすることを特徴とする。同定・検出の対象とする結核菌群構成細菌としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・アフリカヌム、及びマイコバクテリウム・ミクロティを挙げることができる。ｇｙｒＢ  ＤＮＡを指標とした同定・検出方法としては、以下に述べる二つの方法を例示することができる。
【０００７】
Ａ）ＰＣＲ  を利用する方法
この方法は以下のように行う。
（１）ｇｙｒＢ  ＤＮＡ中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを合成する。各細菌のｇｙｒＢ  ＤＮＡの塩基配列は、図１及び図２に示すように既に決定されているので、上記オリゴヌクレオチドは、この図に基づき合成することができる。好ましいオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、又は配列番号１８記載のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ましいオリゴヌクレオチドとしては配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【０００８】
（２）上記で合成したオリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ  ポリメラーゼ及び試料とする細菌のＤＮＡ  を含む溶液を調製する。溶液中に含まれる各成分の濃度は、通常のＰＣＲ  に使用する反応溶液と同様でよい。試料とする細菌のＤＮＡ  は精製されたものである必要はなく、例えば、菌体の破砕物をそのまま使用してもよい。
【０００９】
（３）上記で調製した溶液をＰＣＲ  が起こり得る条件で繰り返し加熱する。加熱の温度、サイクル等はＰＣＲ  が起こり得る範囲内であれば特に限定されないが、図１及び図２に示すように結核菌群を構成する細菌間のｇｙｒＢ  ＤＮＡの相同性が高いので、アニーリング時の温度はかなり高く設定することが望ましい。具体的には、６８℃以上に設定することが望ましい。合成したオリゴヌクレオチドと試料として添加した細菌のＤＮＡ  が、ハイブリダイズすることができれば、加熱の繰り返しによりＰＣＲ  が起こり、増幅産物が生成する。一方、合成したオリゴヌクレオチドと試料として添加した細菌のＤＮＡ  が、ハイブリダイズすることができれなければ、ＰＣＲ  は起こらず、増幅産物は生成しない。
（４）上記操作後の溶液について電気泳動を行う。溶液中に増幅産物が含まれていれば、それに対応したバンドが泳動ゲル上に現れる。従って、その電気泳動パターンから細菌の同定、検出を行うことができる。
【００１０】
Ｂ）制限酵素断片を利用する方法
この方法は、以下のように行う。
（１）結核菌群構成細菌のｇｙｒＢ  ＤＮＡの一部と同一なオリゴヌクレオチドと前記ＤＮＡ  の一部と相補的なオリゴヌクレオチドを合成する。各細菌のｇｙｒＢ  ＤＮＡの塩基配列は、図１及び図２に示すように既に決定されているので、前記オリゴヌクレオチドは、この図に基づき合成することができる。好ましいオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドと配列番号４記載のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを挙げることができ、特に好ましいオリゴヌクレオチドとしては配列番号１で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００１１】
（２）上記で合成した２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、試料とする細菌のＤＮＡ  を鋳型として、ＰＣＲ  を行う。試料とする細菌のＤＮＡ  は精製されたものである必要はなく、例えば、菌体の破砕物をそのまま使用してもよい。ＰＣＲ  は通常の方法で行うことができる。
（３）上記で増幅されたＤＮＡ  断片を制限酵素で消化する。使用する制限酵素は結核菌群を構成する細菌間で異なる断片を生じさせるようなものであれば特に限定されない。このような制限酵素としては、例えば、Ｒｓａ  Ｉ  及びＴａｑ  Ｉ  を挙げることができる。
【００１２】
（４）上記で消化された断片について電気泳動を行う。消化されたＤＮＡ  断片はその長さに応じた位置に現れる。従って、その電気泳動パターンから細菌の同定、検出を行うことができる。
本発明の同定・検出方法としては、上記の二つの方法を代表例として挙げることができるが、これらの方法以外でも、ｇｙｒＢ  ＤＮＡを指標とする限り、本発明の同定・検出方法に含まれる。上記の方法以外の同定・検出方法としては、例えば、ｇｙｒＢ  ＤＮＡをＰＣＲ  により増幅し、その増幅断片の塩基配列を決定し、細菌の同定・検出を行う方法や、ｇｙｒＢ  ＤＮＡ中の結核菌群構成細菌間で塩基配列の異なる領域を含むオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてサザンブロッティングを行い、細菌の同定・検出を行う方法などを挙げることができる。
【００１３】
【実施例】
〔実施例１〕
結核菌群構成細菌４種と他のマイコバクテリウム属に属する細菌５種の合計９種の細菌から純化ＤＮＡ  を１０ｎｇ調製した。これらのＤＮＡ  を鋳型とし、配列番号１及び配列番号３記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ  を行った。ＰＣＲ  による増幅条件は以下の通りである。
【００１４】
0003634960.tif 000002
Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＧＯＬＤＴＭ及び添付のＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｉを使用（米国Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）
【００１５】
ＰＣＲ  による増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって解析した。この結果を図３に示す。なお、レーンと菌種の関係は以下の通りである。
レーン１：マイコバクテリウム・ツベルクローシス
レーン２：マイコバクテリウム・ボビス
レーン３：マイコバクテリウム・アフリカヌム
レーン４：マイコバクテリウム・ミクロティ
レーン５：マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）
レーン６：マイコバクテリウム・ガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ）
レーン７：マイコバクテリウム・アブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）
レーン８：マイコバクテリウム・ケローネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ）
レーン９：マイコバクテリウム・トリビアーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒｖｉａｌｅ）
【００１６】
〔実施例２〕
４種の結核菌群構成細菌から純化ＤＮＡ  を１０ｎｇ調製した。これらのＤＮＡ  を鋳型とし、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ  を行った。ＰＣＲ  による増幅条件は実施例１と同じである。
ＰＣＲ  による増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって解析した。この結果を図４に示す。なお、レーンと菌種の関係は以下の通りである。
【００１７】
レーン１：マイコバクテリウム・ツベルクローシス
レーン２：マイコバクテリウム・ボビス
レーン３：マイコバクテリウム・アフリカヌム
レーン４：マイコバクテリウム・ミクロティ
図４に示すように、配列番号５及び配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスでのみ増幅産物が観察され、配列番号９及び配列番号１１で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウム・ボビスでのみ増幅産物が観察され、配列番号５及び配列番号１３で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウム・アフリカヌム及びマイコバクテリウム・ミクロティで増幅産物が観察され、配列番号１５及び配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとした場合はマイコバクテリウム・ミクロティでのみ増幅産物が観察された。
以上の結果から、プライマーと菌種との関係をまとめると以下のようになる。
【００１８】
【表１】
0003634960.tif 000003
【００１９】
〔実施例３〕
４種の結核菌群構成細菌から純化ＤＮＡ  を１０ｎｇ調製した。これらのＤＮＡ  を鋳型とし、配列番号１及び配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ  を行った。ＰＣＲ  による増幅条件は実施例１と同じである。ＰＣＲ  による増幅産物を制限酵素ＲｓａＩ及びＴａｑＩで消化し、それによって生ずるＤＮＡ  断片をアガロースゲル電気泳動法によって解析した。この結果を図５に示す。なお、レーンと菌種の関係は以下の通りである。
【００２０】
レーン１：マイコバクテリウム・ツベルクローシス
レーン２：マイコバクテリウム・ボビス
レーン３：マイコバクテリウム・アフリカヌム
レーン４：マイコバクテリウム・ミクロティ
【００２１】
〔実施例４〕
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核臨床患者より単離された株  ＫＰＭ  ＫＹ６３１の菌体破砕液を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ  による増幅産物をアガロースゲル電気泳動法によって解析したところ、配列番号１と配列番号３、及び配列番号５と配列番号７に示した組み合わせでのみ増幅産物が観察されたので、  ＫＰＭ  ＫＹ６３１は結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスと同定された（表１及び図４）。
【００２２】
〔実施例５〕
配列番号１と配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核臨床患者より単離された株  ＫＰＭ  ＫＹ５９０の菌体破砕液を用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ  断片の塩基配列を決定したところ、得られた塩基配列が結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスの塩基配列と一致したので、ＫＰＭ  ＫＹ５９０は結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスと同定された（図１及び図２）。
【００２３】
〔実施例６〕
配列番号１と配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、結核に罹患したウシより単離された株の菌体破砕液を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ  による増幅産物を制限酵素ＲｓａＩ及びＴａｑＩでそれぞれ消化し、それによって生ずるＤＮＡ  断片をアガロースゲル電気泳動法によって解析したところ、マイコバクテリウム・ボビスから得られるパターンと一致したので、この菌株はマイコバクテリウム・ボビスと同定された（図５）。
【００２４】
【発明の効果】
本発明は、従来の方法では迅速に同定及び検出することが困難であった結核菌群を構成する４菌種について迅速な同定及び検出を可能にし、医学、疫学、獣医学の現場でのこれらの菌種の分類を可能にする。
【００２５】
【配列表】
0003634960.tif 000004
【００２６】
0003634960.tif 000005
【００２７】
0003634960.tif 000006
【００２８】
0003634960.tif 000007
【００２９】
0003634960.tif 000008
【００３０】
0003634960.tif 000009
【００３１】
0003634960.tif 000010
【００３２】
0003634960.tif 000011
【００３３】
0003634960.tif 000012
【００３４】
0003634960.tif 000013
【００３５】
0003634960.tif 000014
【００３６】
0003634960.tif 000015
【００３７】
0003634960.tif 000016
【００３８】
0003634960.tif 000017
【００３９】
0003634960.tif 000018
【００４０】
0003634960.tif 000019
【００４１】
0003634960.tif 000020
【００４２】
0003634960.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】結核菌群を構成する４細菌のｇｙｒＢ  ＤＮＡの塩基配列を示す図である（前半部分）。
【図２】結核菌群を構成する４細菌のｇｙｒＢ  ＤＮＡの塩基配列を示す図である（後半部分）。
【図３】結核菌群を構成する細菌に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ  による増幅産物の電気泳動写真である。
【図４】結核菌群を構成する各細菌に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ  による増幅産物の電気泳動写真である。
【図５】ＰＣＲ  産物を制限酵素により消化した断片の電気泳動写真である。
【図１】
0003634960.tif 000022
【図２】
0003634960.tif 000023
【図３】
0003634960.tif 000024
【図４】
0003634960.tif 000025
【図５】
0003634960.tif 000026