(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなるヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、ＣＨＯ／Ｌ３９−７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９５３）またはＣＨＯ／ＬＨ−８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９７３）で標示され、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞。
【請求項２】
請求項１記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質が連続的に発現可能な条件下でＣＨＯ細胞を培養することにより製造されることを特徴とする組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分。
【請求項３】
ＣＨＯ細胞が浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞である請求項１または請求項２記載のＣＨＯ細胞。
【請求項４】
請求項１記載のＣＨＯ細胞を培養することを特徴とする組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の製造法。
【請求項５】
ＣＨＯ細胞が浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
請求項２記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分と接触させることを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項２記載のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分を含有することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質またはその部分ペプチド、該ＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分または該組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質もしくはその部分ペプチドを用いるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩、および該化合物を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＨ−ＲＨ（luteinizing hormone-releasing hormone）は、最初ブタ視床下部から単離されたアミノ酸１０個より成るペプチドで〔Matsuo, H. et al.バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.） 43, 1334-1339（1971）〕、下垂体前葉に作用して性腺刺激ホルモン〔ＬＨおよびfollicle stimulating hormone（ＦＳＨ）〕を放出させる活性をもつ〔Clayton, R. N. et al.Endocr. Rev. 2, 186-209（1981）〕。２種の生殖腺刺激ホルモンの内、女性では両者の共存で発情ホルモンの分泌を促し、男性ではＬＨ単独で雄性ホルモンの分泌を促す。このようにＬＨ−ＲＨは生殖腺並びに性ホルモンの制御において根幹に位置するホルモンであり、その作用は多くの生殖器官（例えば、性腺、子宮など）に影響を及ぼす。特に、雄性ホルモンに依存性に増殖する前立腺癌に対しては、ＬＨ−ＲＨの作用を止める薬剤によって進行を止め、治癒せしめることが知られている。また、同様の薬剤が、子宮内膜組織の異所性異常増殖である子宮内膜症に有効なことも知られている。しかし、該薬剤はペプチドであるため、注射による投与が必要で、経口投与が不可能である。
【０００３】
一方、ＬＨ−ＲＨ受容体は、下垂体前葉のＬＨ分泌細胞およびＦＳＨ分泌細胞に存在し、ＬＨ−ＲＨの刺激の伝達に働いている。また、ＬＨ-ＲＨ受容体は、下垂体以外にも胎盤〔Currie, A. J. et al. バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）99,332-338（1981）、ネイチャー（Nature） 282, 90-92（1979）および Clayton, R. N. et al.プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1980）〕、副腎髄質〔Pieper, D. R. et al.  エンドクリノロジー（Endocrinology） 108, 1148-1155（1981）〕、脳〔Jennes, L. et al.  ブレイン・リサーチ（Brain Res.） 452, 156-164（1988）〕、ある種の腫瘍〔Millan, M. A. et al. メソッド・イン・エンザイモロジイ（Methods Enzymol.） 124, 590-606（1986）〕などで発現していることが知られており、ＬＨ−ＲＨの作用を増強あるいは遮断する薬剤の開発は様々な疾病に有効であると考えられる。
【０００４】
例えば、ＬＨ−ＲＨの高活性誘導体（以下、ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物と称する）である酢酸リュープロレリン〔藤野ら、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical  Research Communications）,60巻、406-413頁,1974年、オリバー・アール・ティー・デー（Oliver, R. T. D.）ら、ブリティシュ・ジーナル・オブ・キヤンサー（Br. J. Cancer），59巻、823頁、1989年、戸口ら，ジャーナル・オブ・インターナショナル・メディカル・リサーチ（J．Int．Med．Res．），18巻、35-41頁、1990年〕は、反復投与することにより、下垂体における性腺刺激ホルモンの放出・産生を低下させ、精巣および卵巣における性腺刺激ホルモンに対する反応性の低下を起こし、テストステロンおよびエストロゲンの分泌を抑制する。その結果、こうしたホルモン依存性の癌（例えば、前立腺癌）に対して抗腫瘍活性を示すことが知られており臨床応用されている。また、酢酸リュープロレリンは、子宮内膜症、思春期早発症などの治療剤としても臨床で広く用いられている。酢酸リュープロレリンの高い抗癌活性は、天然型ＬＨ−ＲＨと比較して蛋白分解酵素に対する抵抗性が高いこと、またＬＨ−ＲＨ受容体に対する親和性が高いためにレセプター数の減少によるＬＨ−ＲＨの反応性の低下（desensitization）を起こすことに起因すると推定されている。
しかし、酢酸リュープロレリンは、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する超作動性化合物であるために、初回投与直後に下垂体−性腺刺激作用（急性作用）による血清テストステロン濃度の上昇を伴った一過性の悪化が認められることが知られている。したがって、超作動性作用を有さない化合物、すなわちＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物は、ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物に比べてより優れた前立腺癌、子宮内膜症、思春期早発症などの治療剤として期待できる。
【０００５】
一般に、ある生理活性物質の受容体超作動性化合物や受容体拮抗性化合物を開発する場合、該生理活性物質が特異的に結合する受容体と親和性の高い化合物の探索が行なわれている。ＬＨ−ＲＨ受容体としては現在ウシあるいはラットの下垂体膜画分が用いられているが、動物種が異なるため、その化合物がヒトに効くという保証がない。また、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡは既にクローニングされており、ＣＯＳ−７細胞での発現も報告されている〔Kakar, S. S. et al.  バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）189, 289-295（1992）、ＷＯ９４／００５９０〕。しかし、ＣＯＳ−７細胞は発現量が極めて低く、また一過性の発現であるため、スクリーニングに用いるには不適切と考えられている。また、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質としては、ヒト下垂体を用いることも考えられるが、ヒト由来の組織は入手が極めて困難であるため、スクリーニングに用いるには不適切である。そこで、ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物または拮抗性化合物を効率よくスクリーニングするために、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を高発現できる細胞の開発が望まれていた。
なお、ＬＨ−ＲＨがＬＨ−ＲＨ受容体に結合することによって、ＬＨに限らずＦＳＨも放出されることから、ＬＨ−ＲＨ受容体はＧｎＲＨ受容体とも呼ばれているが、本願明細書では、ＬＨ−ＲＨ受容体と称する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパク質を高発現するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質またはその部分ペプチド、該ＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分または該組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質もしくはその部分ペプチドを用いるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩、および該化合物を含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、ヒトに有効なＬＨ-ＲＨ受容体親和性化合物をスクリーニングする方法につき鋭意研究した結果、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパク質を高発現するＣＨＯ細胞株を製造することに成功した。さらに、本発明者らは、該ＣＨＯ細胞株を用いることにより、効率よく確実にヒトに有効なＬＨ-ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニングを行なうことができることを見いだした。そして、本発明者らは、それらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞、
（２）第（１）項記載のＣＨＯ細胞を、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質が連続的に発現可能な条件下でＣＨＯ細胞を培養することにより製造されることを特徴とする組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分、
（３）ＣＨＯ細胞が浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞である第（１）項または第（２）項記載のＣＨＯ細胞、
（４）第（２）項記載のＣＨＯ細胞から単離されることを特徴とする天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩、
（５）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞を培養することを特徴とする組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の製造法、
（６）ＣＨＯ細胞が浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞である第（５）項記載の製造法、
（７）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分を用いることを特徴とするヒＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（８）第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（９）第（２）項記載のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、または第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩を含有することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１０）第（７）項もしくは第（８）項記載のスクリーニング方法または第（９）項記載のスクリーニング用キットを用いて得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩、
（１１）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物がＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物である第（１０）項記載の化合物またはその塩、
（１２）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物がＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物である第（１０）項記載の化合物またはその塩、
（１３）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物がＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物である第（１０）項記載の化合物またはその塩、
（１４）第（１１）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物またはその塩を含有することを特徴とする動物用の妊娠調節剤または月経周期調節剤、好ましくは動物用の排卵誘発剤または繁殖障害予防・治療剤、
（１５）第（１２）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物またはその塩を含有することを特徴とする前立腺ガン、子宮ガン、乳ガン、下垂体腫瘍、前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮筋腫もしくは思春期早発症の予防・治療剤、妊娠調節剤または月経周期調節剤、および
（１６）第（１３）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物またはその塩を含有することを特徴とする前立腺ガン、子宮ガン、乳ガン、下垂体腫瘍、前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮筋腫もしくは思春期早発症の予防・治療剤、妊娠調節剤（例えば、避妊剤）または月経周期調節剤に関する。
【０００９】
より具体的には、本発明は、
（１７）ＣＨＯ細胞がＣＨＯ／Ｌ３９で標示されるＣＨＯ細胞またはＣＨＯ／Ｌ３９−７で標示されるＣＨＯ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９５３）である第（１）項または第（２）項記載のＣＨＯ細胞、
（１８）浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞がＣＨＯ／ＬＨ−８で標示されるＣＨＯ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９７３）またはＣＨＯ／ＬＳで標示されるＣＨＯ細胞である第（３）項記載のＣＨＯ細胞、
（１９）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡが配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡである第（１）項または第（２）項記載のＣＨＯ細胞、
（２０）組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質が、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１もしくは２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれらのタンパク質のＮ末端のシグナルペプチドが切断されているタンパク質、それらのタンパク質の分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているタンパク質、もしくはそれらのタンパク質に糖鎖などが結合しているタンパク質である第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩。
【００１０】
（２１）（ｉ）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドを接触させた場合と、（ii）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする第（７）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２）（ｉ）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドを接触させた場合と、（ii）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドおよび試験化合物を接触させた場合における、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドの該ＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする第（７）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２３）（ｉ）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に試験化合物を接触させた場合における、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞遊走活性、ホルモンの分泌、グアニン塩基調節蛋白質（Ｇ蛋白質）の活性化、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物もしくはその塩、またはＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物もしくはその塩のスクリーニング方法、
（２４）（ｉ）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体アゴニストを接触させた場合と、（ii）第（２）項記載のＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体アゴニストおよび試験化合物を接触させた場合における、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ホルモンの分泌、細胞遊走活性、グアニン塩基調節蛋白質（Ｇ蛋白質）の活性化、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２５）（ｉ）第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドを接触させた場合と、（ii）第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする第（８）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２６）（ｉ）第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドを接触させた場合と、（ii）第（４）項記載の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドおよび試験化合物を接触させた場合における、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドの該組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする第（８）項記載のＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【００１１】
（２７）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とするヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質発現ベクターであって、エシエリキアコリ ＭＶ１１８４／／ｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４５）に含まれるｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲで標示されるヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質発現ベクター、
（２８）ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡが第（２７）項記載の発現ベクターである第（１）項〜第（３）項、第（１７）項〜第（１９）項記載のＣＨＯ細胞。
【００１２】
（２９）
（ｉ）第（１）項記載のＣＨＯ細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化するか、
（ii）第（１）項記載のＣＨＯ細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化した後、無血清培地に馴化するか、
（iii）第（１）項記載のＣＨＯ細胞を浮遊撹拌培養下で血清濃度を徐々に下げて無血清培地に馴化するか、または、
（iv）第（１）項記載のＣＨＯ細胞を静置培養（例えば、プレート培養など）で無血清培地に馴化した後、浮遊撹拌培養に馴化することを特徴とするヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する第（３）項記載の浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞の製造法、
（３０）
（ｉ）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化するか、
（ii）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化した後、無血清培地に馴化するか、
（iii）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を浮遊撹拌培養下で血清濃度を徐々に下げて無血清培地に馴化するか、または、
（iv）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を静置培養（例えば、プレート培養など）で無血清培地に馴化した後、浮遊撹拌培養に馴化することを特徴とする受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する浮遊増殖可能な細胞の製造法、および
（３１）第（３０）項記載の製造法で製造されることを特徴とする受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する浮遊増殖可能な細胞を提供する。
【００１３】
本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞は、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞である。
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが用いられているが、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質またはヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同等のリガンド結合活性を有する部分ペプチドをコードする塩基配列を有するものであれば、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、公知のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質コードするｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどを用いることができるが、合成ＤＮＡなどであってもよい。例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列〔図２〕を有するヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードする配列番号：１で表わされる塩基配列〔図１の塩基配列の第５４番目〜第１０３７番目の塩基配列〕を有するＤＮＡなどが挙げら、具体的には、図１の塩基配列を有するｃＤＮＡなどが挙げられる。これらのＤＮＡは、それ自体公知の遺伝子工学的手法を用いてクローニングすることができるし、あるいはヌクレオチド合成装置を用いて製造することもできる。例えば、後述する参考例２の方法あるいはそれに準ずる方法に従ってクローニングすることもできる。
【００１４】
ヒトＬＨ-ＲＨ受容体をコードするＤＮＡ断片をＣＨＯ細胞に導入し、組換えヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を発現させるためには、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体をコードするＤＮＡ断片を含有する発現ベクターを構築する必要がある。
ベクターとしては、例えば、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩＮｅｏなどが挙げられる。プロモーターとしては、宿主となる細胞で効率よく発現するものであればいかなるプロモーターでもよい。該プロモーターの具体例としては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。
発現ベクターには以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲ又はｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
【００１５】
ヒトＬＨ-ＲＨ受容体をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターとしては、例えば、前記のベクター（例えば、ｐＡ１−１１など）に挿入されたヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡの上流に前記のプロモーター（特に、ＳＲαプロモーターなど）を挿入し、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡの下流にポリＡ付加シグナルを挿入し、さらにその下流に前記のプロモーター（特に、ＳＶ４０プロモーターなど）、ＤＨＦＲ遺伝子または（および）ポリＡ付加シグナルを挿入し、好ましくはさらにその下流にアンピシリン耐性遺伝子を挿入したものなどが挙げられる。
具体的には、ベクターｐＡ１−１１に挿入されたヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡの上流にＳＶ４０ｏｒｉおよびＳＲαプロモーターが挿入され、該ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡの下流にポリＡ付加シグナルが挿入され、さらにその下流にＳＶ４０プロモーター、ＤＨＦＲ遺伝子およびポリＡ付加シグナルの順序で挿入され、さらにその下流にアンピシリン耐性遺伝子が挿入されていることを特徴とするｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲで標示される発現ベクター〔図３〕などが好適である。
【００１６】
宿主細胞となるＣＨＯ細胞〔ジャーナル・オブ・エクスペリメント・オブ・メディソン（Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．）、１０８，９４５（１９５８）〕としては、特にＤＨＦＲ遺伝子が欠損しているＣＨＯ細胞〔Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７７，４２１６−４２２０（１９８０）〕（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞と略称する）、ＣＨＯ Ｋ−１細胞［（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）６０，１２７５（１９６８）］などが好ましく、特にＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞が好適である。
発現ベクターと宿主細胞の組み合わせとしては、適宜好ましい組み合わせを選択することができるが、例えば、ｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲで標示される発現ベクター〔図３〕の宿主細胞としてはＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞が好適である。
なお、宿主としてＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞を用いる場合であっても、発現ベクターにＤＨＦＲ遺伝子が導入されている時は、該発現ベクターを含有するＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞は、結果として、ＤＨＦＲ遺伝子を有していることになる。本願明細書においては、ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターをＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞に含有せしめて得られるＣＨＯ細胞を「ＣＨＯ（ｄｈｆｒ+）細胞」と表記する場合がある。
【００１７】
上記のごとく作製したヒトＬＨ-ＲＨ受容体をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従ってＣＨＯ細胞に導入することができる。該導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology） 52, 456-467（1973）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.） 1, 841-845（1982）〕等が挙げられる。以上のようにしてヒトＬＨ-ＲＨ受容体発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞を得ることができる。
また、ＣＨＯ細胞以外の他の動物細胞も宿主細胞として使用することができる。該動物細胞としては、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体を発現し得る動物細胞であればいかなるものでもよく、具体例としては、例えば、２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞、ミエローマ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ-２／Ｏ細胞などが挙げられる。これらの中でも、２９３細胞などが好ましい。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞は、前述のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、該ＤＮＡを持続的に発現し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞を、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡが連続的に発現可能な条件下でＣＨＯ細胞を培養することにより製造され得るものである。
前述のＣＨＯ細胞を用いて、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパク質を安定に発現させる方法としては、上記の導入発現ベクターが染色体に組込まれたＣＨＯ細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標として形質転換株を選択する。
さらに、このようにして選択マーカーを用いて得られた形質転換株に対して、繰り返しクローン選択を行うことにより、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパク質の高発現能を有する安定な細胞株を得ることができる。また、ＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸの濃度を漸次上げて培養して耐性細胞を選択することにより、導入遺伝子を細胞内で増幅させて、さらに高発現のＣＨＯ細胞株を得ることもできる。
前述のＣＨＯ細胞を培養する際、培地としては約０.５〜２０％のウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などが挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞およびＤＨＦＲ選択マーカー遺伝子を用いる場合、チミジンを含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。ｐＨは約６〜８であるのが望ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００１８】
さらに、このようにして得られたＣＨＯ細胞株を浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞株に馴化することも有効である。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化するか、
（２）本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化した後、無血清培地に馴化するか、
（３）本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞を浮遊撹拌培養下で血清濃度を徐々に下げて無血清培地に馴化するか、または、
（４）本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞を静置培養（例えば、プレート培養など）で無血清培地に馴化した後、浮遊撹拌培養に馴化することを特徴とするヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞の製造法を提供する。
【００１９】
具体的には、本発明のＣＨＯ細胞の浮遊撹拌培養への馴化方法としては、通常、有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化する方法が採られる。また、有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化した後、無血清培地に馴化することも有効である。さらに、浮遊撹拌培養下で血清濃度を徐々に下げて無血清培地に馴化することもできる。逆にプレート培養などの静置培養で先ず無血清培地に馴化した後、浮遊撹拌培養に馴化する方法も有用である。
有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化する際、用いる培地としては、ＣＨＯ細胞の培養に通常用いられる基礎培地にウシ胎仔血清（FCS）などの適当な血清を約０.１〜１０％添加した培地、好ましくは約０.５〜５％添加した培地が、または血清代替物質として血清由来増殖因子画分（GFS: 塚本ら、第２回次世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予講集、175頁(1984)）を添加した培地が用いられる。
基礎培地としては、例えば、イーグルＭＥＭ培地、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、イスコフ培地（N. Iscove と F. Melchers, ジャーナル  エクスペリメンタル  メソッズ（J. Exp. Med.)，第147巻，923頁(1978)）、ハムＦ12培地（R. G. Ham, プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミー  オブサイエンス（Proc. Nat. Acad. Sci.），第53巻，288頁(1965)）、Ｌ−15培地（A. Leibovitz, アメリカン  ジャーナル  オブ  ハイジーン（Amer. J. Hyg.）,第78巻，173頁(1963)）、RPMI 1640培地（G. E. Moore ら, ザ  ジャーナル  オブザ  アメリカン  メディカル  アソシエイション（J. A. M. A.）, 第199巻, 519頁(1967)）、ASF104培地（味の素）、CHSF培地（ギブコ）、COSMEDIUM−001培地（コスモバイオ）、Ｅ−RDF培地（極東製薬）、UC−103培地（日水製薬）、UC−202培地（日水製薬）、S−Clone SF−02培地（三光純薬）、Ｔ培地（日本製薬、特開昭60−145088号公報）、TL−２培地（Y. Shintani ら, アプライド  ミクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Appl. Microbiol. Biotechnol.），第27巻，第533頁(1988)）およびこれらを適当な比率で混合した培地などが用いられるが、なかでもASF104培地、Ｅ−RDF培地、ＴＥ培地およびこれらの混合培地が好ましく用いられる。
【００２０】
無血清培地に馴化する際、用いる培地としては、培地中の血清および血清代替物を除いて用い、上記の各種基礎培地にアミノ酸、ビタミン、核酸、増殖因子、ホルモン、その他の低分子化合物などを単独または適当な組合せで、かつ適当な濃度で添加した培地が用いられる。具体的には、例えば、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、プロリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを添加した培地が用いられる。また、遺伝子導入時に形質転換に使用した選択マーカーに応じて、選択薬剤であるメソトレキセート（MTX）、ミコフェノール酸またはＧ４１８などの薬剤を添加してもよい。
また、血清濃度を徐々に下げて無血清にまで到らしめる方法としては、例えば、血清濃度を約５％から約１％へ、約１％から約０.１％へ、約０.１％から約０.０３％へ、約０.０３％から０％へと細胞の継代毎に低下させ、生育してきた細胞を取得する方法がとられる。
浮遊撹拌馴化に用いる培養装置としては、撹拌手段を備えた小型の培養器ならいずれでも良く、例えば、各種容量のスピナーフラスコ、テクネ・スピナーフラスコ、エルレンマイヤーフラスコおよびジャーファーメンターなどが用いられる。  浮遊攪拌および無血清培地に細胞を馴化するための培養方法自体は、公知の方法に従えばよい。該方法として例えば約３０〜４０℃、攪拌回転数約２０〜１００ｒｐｍで約３日〜７日毎に継代を繰り返して行い、必要に応じてｐＨ調節や通気を行う。これらの馴化に要する全期間は約１ヵ月〜５ヵ月である。また、この馴化過程で基礎培地を適宜変更してもよく、これにより得られる馴化細胞の基礎培地に対する生育順応性に幅を持たせることが期待できる。このようにして得られる本発明の馴化細胞は本来の接着性および血清依存性を実質的に喪失しており、上記のような通常の撹拌培養条件下では全く接着性を示さずかつ撹拌培養により十分に生育可能である。
上記のようにして得られた馴化細胞株より高産生クローンを選択して用いることも有効である。高産生クローン選択は自体公知の方法に従っておこなうことができる。該クローニングの方法としては、例えば、コロニー分離法、限界希釈法、マイクロウェル法（日本生化学会編・新生化学実験講座18、細胞培養技術第12〜13頁(1990)、東京化学同人) などが挙げられる。また、例えば限界希釈法などを用いる高産生クローンの選択を繰り返す、培地中の選択薬剤(MTXなど）の濃度を徐々に上げながら継代し、選択薬剤耐性にすることにより、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパクの構造遺伝子を増幅させる、あるいはこれらを組み合わせることにより、株レベルでの生産性を向上させることは当然好ましい。
【００２１】
以上のようにして得られたヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパクの高産生ＣＨＯ細胞株を用いて、目的のヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパクを大量に生産するべく大量培養を実施する。この時の培養装置としては、通気手段、攪拌手段、温度調節手段、ｐＨ制御ならびに溶存酸素（ＤＯ）制御手段など培養に必要な部材が必要に応じて具備された公知の浮遊攪拌培養槽（日本生化学会編・新生化学実験講座１、タンパク質VI合成および発現282頁、286頁(1992)、東京化学同人; 日本生化学会編・新生化学実験講座18、細胞培養技術第313〜323頁(1990)、東京化学同人）が用いられる。
また、エアーリフト式培養槽（J. R. Birch ら，トレンズ  イン  バイオテクノロジー（Trends in Biotechnol.）第３巻，162頁(1985)も用いられる。培養法としては、バッチ培養，フィード培養（フェッド・バッチ培養），灌流培養などが挙げられるが、なかでも効率的な培養を行うためには、浮遊灌流培養が有利である。この培養においては、新鮮な培地を連続的にまたは間欠的に供給し、同量の培養上清液を連続的にまたは間欠的に排出することにより、細胞を生存状態で高密度に保ちつつ長期間維持することが可能である。  灌流培養を実施するためには、培養槽に、培養液中の細胞と培養上清液との分離手段、培養上清液の排出手段および新鮮培地の供給手段が施される。培養液中の細胞と培養上清液との分離手段としては、例えば、フィルターによる分離、コーン型細胞沈殿管や重力沈降管など細胞の沈降を利用した分離、遠心分離などの分離手段が挙げらる。例えば、これらの分離手段が培養槽に施された培養システムを用い、連続的に培養上清液を排出して新鮮培地と交換する方法などが好ましく用いられる。培養上清液の排出と新鮮培地の供給すなわち培地交換は、通常対数増殖期から静止期までの期間、通常培養開始後、約２〜１０日目、好ましくは約３〜７日目から行われ、培地の交換速度は細胞密度の増加とともに徐々に増加させることが好ましい。具体的には、培養１日当たり培養液量の約１０％〜１００％なかでも約２０％〜６０％交換するのが好ましい。
【００２２】
本発明の浮遊灌流培養に用いる培地としては、用いる細胞に応じて、ＣＨＯ細胞培養用培地を適宜調製すればよく、通常、血清あるいは血清代替物（血清画分など）、またはこれらに替えて適当な添加剤を添加して用いられている。具体的には、前述の各種基礎培地、好ましくはASF104培地（味の素）、E−RDF培地（極東製薬）、Ｔ培地（日本製薬）、ＴＬ−２培地、ＴＥ培地（イスコフ培地、ハムＦ12培地およびＥ−RDF培地の１：１：２混合物) などに血清あるいは血清代替物（血清画分など）、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、プロリン、ポリエチレングリコールなどを添加した培地が用いられる。また、必要に応じて遺伝子導入細胞の選択薬剤であるＭＴＸ、ミコフェノール酸またはＧ４１８などの薬剤が添加される。具体的には、PEG−86−１培地（Shintani ら, アプライド  ミクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Appl. Microbiol. Biotechnol.），第27巻，533頁(1988)）、PEG−TE培地（ＴＥ培地にインスリン３.５ｍｇ／ｌ、トランスフェリン６.０ｍｇ／ｌ、エタノールアミン２.５×１０-5Ｍ、亜セレン酸２.５×１０-8Ｍ、プロリン３５ｍｇ／ｌ、ＭＴＸ １０μＭ、ＰＥＧ１ｇ／ｌを添加したもの) などが使用される。
浮遊灌流培養時の温度は、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃付近、攪拌回転数は約２０〜１００ｒｐｍ、好ましくは約３０ｒｐｍ付近、ｐＨは約６〜８、好ましくは約７付近、ＤＯは約０.５〜５ｐｐｍ、好ましくは約１.５ｐｐｍ付近にそれぞれ調節される。
以上のようにして、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクターを含有する細胞を用いて組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有する細胞を製造することができる。
【００２３】
本発明において、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを高発現できる細胞としては、具体的には、後述する実施例１で得られるｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲで標示される発現ベクターを含有するＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞などが挙げられる。具体的には、例えば、ＣＨＯ／Ｌ３９、ＣＨＯ／Ｌ３９−７などで標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ+）細胞などが挙げられ、なかでもＣＨＯ／Ｌ３９−７で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ+）細胞などが好適である。
また、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを高発現できるＣＨＯ細胞であって浮遊培養可能なＣＨＯ細胞としては、例えば、ＣＨＯ／ＬＳ、ＣＨＯ／ＬＨ−８などで標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ+）細胞などが挙げられ、なかでもＣＨＯ／ＬＨ−８で標示されるＣＨＯ（ｄｈｆｒ+）細胞などが好適である。
これらのＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞は、例えば、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＯＳ−７細胞に比べて約１０程度の受容体活性（例えば、リガンド結合活性など）を有するものである。また、ＣＯＳ−７細胞での受容体発現が一過性であるのに対して、ＣＨＯ細胞での受容体の発現は持続的である。したがって、本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞は、後述するＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニングのための有用な材料となる。
さらに、前記の浮遊増殖可能なＣＨＯ細胞の製造法は、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体蛋白質に限らず、あらゆる動物またはヒト由来の受容体蛋白質、特にヒト由来の受容体蛋白質に適用することができ、またＣＨＯ細胞に限らず、あらゆる細胞に適用することができる。
【００２４】
すなわち、本発明は、
（１）
（ｉ）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化するか、
（ii）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を有血清培地を用いて浮遊撹拌培養に馴化した後、無血清培地に馴化するか、
（iii）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を浮遊撹拌培養下で血清濃度を徐々に下げて無血清培地に馴化するか、または、
（iv）受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する細胞を静置培養（例えば、プレート培養など）で無血清培地に馴化した後、浮遊撹拌培養に馴化することを特徴とする受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する浮遊増殖可能な細胞の製造法、および
（２）上記（１）の製造法で製造されることを特徴とする受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産し続ける能力を有する浮遊増殖可能な細胞を提供する。
【００２５】
受容体タンパク質としては、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質に限らず、公知のあるいは新規の動物またはヒト由来の受容体タンパク質のいずれであってもよい。例えば、エンドセリン受容体タンパク質、ＴＲＨ受容体タンパク質、ＰＡＣＡＰ受容体タンパク質、ヒスタミン受容体タンパク質、ソマトスタチン受容体タンパク質、ＣＲＦ受容体タンパク質、ニューロテンシン受容体タンパク質、ＩＬ−８受容体タンパク質、ガラニン受容体タンパク質、ＧＨＲＨ受容体タンパク質、プロスタグランジンＥ2受容体タンパク質、プロスタグランジンＩ2受容体タンパク質、ブラジキニン受容体タンパク質、ＭＣＰ−１受容体タンパク質、ＣＮＰ受容体タンパク質、ＣＣケモカイン受容体タンパク質、アンジオテンシンII受容体タンパク質、ボンベシンレセプター蛋白質、カナビノイドレセプター蛋白質、コレシストキニンレセプター蛋白質、グルタミンレセプター蛋白質、セロトニンレセプター蛋白質、メラトニンレセプター蛋白質、ニューロペプチドＹレセプター蛋白質、オピオイドレセプター蛋白質、プリンレセプター蛋白質、バソプレッシンレセプター蛋白質、オキシトシンレセプター蛋白質、ＶＩＰ（バソアクティブ  インテスティナル  アンド  リレイテッド  ペプチド）レセプター蛋白質、ドーパミンレセプター蛋白質、モチリンレセプター蛋白質、アミリンレセプター蛋白質、ブラジキニンレセプター蛋白質、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）レセプター蛋白質、ロイコトリエンレセプター蛋白質、パンクレアスタチンレセプター蛋白質、トロンボキサンレセプター蛋白質、アデノシンレセプター蛋白質、アドレナリンレセプター蛋白質、ＧＲＯαレセプター蛋白質、ＧＲＯβレセプター蛋白質、ＧＲＯγレセプター蛋白質、ＮＡＰ−２レセプター蛋白質、ＥＮＡ−７８レセプター蛋白質、ＰＦ４レセプター蛋白質、ＩＰ１０レセプター蛋白質、ＧＣＰ−２レセプター蛋白質、ＭＣＰ−１レセプター蛋白質、ＨＣ１４レセプター蛋白質、ＭＣＰ−３レセプター蛋白質、Ｉ−３０９レセプター蛋白質、ＭＩＰ１αレセプター蛋白質、ＭＩＰ−１βレセプター蛋白質、ＲＡＮＴＥＳレセプター蛋白質、パンクレアティックポリペプタイドレセプター蛋白質、およびアドレノメジュリンレセプター蛋白質などが挙げられる。
これらの受容体タンパク質をコードするＤＮＡは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従ってクローニングすることができる。また、該ＤＮＡを含有する発現ベクターの構築も自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、具体的には前記のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターの構築方法などに従って行なうことができる。
【００２６】
浮遊増殖可能な細胞としては、ＣＨＯ細胞に限らず、受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有し、天然型の該受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有する組換え型受容体タンパク質を生産することができる細胞であれば、いかなる細胞であってもよい。例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが挙げられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー，９５，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ~，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞），ヒトＦＬ細胞，２９３細胞，Ｌ細胞，ミエローマ細胞，Ｃ１２７細胞，Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞，Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
発現ベクターの上記細胞への導入方法、浮遊増殖可能な細胞の製造法、浮遊増殖可能な細胞の培養方法、製造される組換え型ヒト由来受容体タンパク質の単離方法としては、前記のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の場合と同様の方法などを用いることができる。
【００２７】
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有する細胞（好ましくは、ＣＨＯ細胞など）の細胞膜画分とは、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有する細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜を多く含む画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、ホモジェナイザーで細胞を押潰す方法、ポリトロンや超音波による破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（１〜１０分）遠心し、次に、上清を高速（１５０００〜４００００ｒｐｍ）で３０〜１２０分間遠心して、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、ヒトＬＨ-ＲＨ受容体タンパクおよび細胞由来のリン脂質や膜タンパクなどの膜成分が多く含まれる。
このようにして得られた細胞またはその細胞膜画分は、ＬＨ-ＲＨ受容体に親和性の化合物のスクリーニングに用いることができる。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有する細胞やその細胞膜画分中のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の量は、膜蛋白質１ｍｇ当たり約０．０１〜１００ｐｍｏｌであるのが好ましく、約０．１〜１０ｐｍｏｌでるのが好適である。あるいは、１細胞当たり約１０3〜１０8分子であるのが好ましく、約１０4〜１０6分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど細胞膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００２８】
本発明のＣＨＯ細胞から単離される組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡから製造される配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質などが挙げられる。さらに、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、または配列番号：２で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられる。さらに、これら組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質は、Ｎ末端のシグナルペプチドが切断されていてもよいし、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されていてもよいし、あるいは糖鎖などが結合していてもよい。
また、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質は、天然のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質や、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを含有するＣＯＳ−７細胞を培養して製造される組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質などの公知のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と比べて、糖鎖の種類、大きさ、数などが異なっていてもよい。すなわち、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の分子量などは、公知のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の分子量と異なっていてもよい。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２９】
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質は、例えば本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞を、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡから組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の発現が可能な条件下で培養することにより組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を製造することができる。得られた組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有する細胞から組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を単離するには、それ自体公知あるいはそれに準じる方法を用いることができるが、例えば下記の方法により行なうことができる。
組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を細胞から抽出するのに際しては、培養後、公知の方法で細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、ホモジナイザーまたは凍結融解などによって細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中にＰＭＳＦ、ペプスタチン、ロイペプチンなどの蛋白分解酵素阻害剤や、ＣＨＡＰＳ、ジギトニン、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
得られた抽出液中に含まれる組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【００３０】
以上のごとく、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするＤＮＡを保持する発現ベクターを含有する細胞を、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の発現が可能な条件下で培養することにより製造され得る組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質は、天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質、ムテインもしくは部分ペプチドをいう。
実質的に同質の活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性などのようなシグナル情報伝達や、リガンド結合活性などが挙げられる。リガンド結合活性としては、例えば、ＬＨ−ＲＨ受容体アゴニスト（例えば、ＬＨ−ＲＨなど）、ＬＨ−ＲＨ受容体スーパーアゴニスト（例えば、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）またはＬＨ−ＲＨ受容体アンタゴニストなどとの結合活性が挙げられる。好ましくは、この組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質は上記の活性の少なくとも２つ、更に好ましくは３つを有する。更に、この組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質は天然型のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％の活性を有するものである。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、受容体タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００３１】
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の分子のうち、細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。具体的には、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分ペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。さらに、個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分ペプチドでもよい。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
▲２▼SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、または本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩は、ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物（好ましくは、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物）またはその塩のスクリーニングに有用である。
【００３２】
該ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物には、次の３種類の化合物が含まれる。
（Ｉ）ＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物：
ＬＨ−ＲＨ受容体に結合して、ＬＨまたは（および）ＦＳＨの放出を促す作用を有する化合物であり、ＬＨ−ＲＨ受容体アゴニストと称する場合がある。
（II）ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物：
ＬＨ−ＲＨ受容体に結合して、過剰のＬＨまたは（および）ＦＳＨの放出を促す作用を有する化合物であり、ＬＨ−ＲＨ受容体スーパーアゴニストと称する場合がある。
（III）ＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物：
ＬＨ−ＲＨ受容体に結合するが、ＬＨまたは（および）ＦＳＨの放出を促す作用を有さない化合物であり、ＬＨ−ＲＨ受容体アンタゴニストと称する場合がある。
【００３３】
具体的には、本発明は、
（１）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドを接触させた場合と、（ii）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（２）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドを接触させた場合と、（ii）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば該組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩、または組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に対するＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドの結合量や、リガンドによる細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とするものである。
【００３４】
すなわち、本発明は、
（１ａ）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に  ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドを接触させた場合と、（ii）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドおよび試験化合物を接触させた場合における、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドの該受容体タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ａ）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドを接触させた場合と、（ii）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドおよび試験化合物を接触させた場合における、ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドの該ＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２ｂ）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に試験化合物を接触させた場合における、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするヒトＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物もしくはその塩、またはＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物もしくはその塩のスクリーニング方法、および
（２ｃ）（ｉ）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体アゴニストを接触させた場合と、（ii）本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分に、ＬＨ−ＲＨ受容体アゴニストおよび試験化合物を接触させた場合における、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【００３５】
上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法において、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは本発明のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分に結合して、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドと組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは本発明のＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分との結合を阻害する化合物をＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩の候補化合物として選択することができる。
また、上記（２ｂ）のスクリーニング方法において、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体に結合し、該受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、ホルモンの分泌、Ｇ蛋白質の活性化、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物をヒトＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物として選択することができ、それらの化合物の中でも極めて強い受容体作動性作用（例えば、過剰のＬＨ、ＦＳＨ放出作用などの超作動性作用）を有する化合物をＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物として選択できる。
さらに、上記（２ｃ）のスクリーニング方法において、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するアゴニストと本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分との結合を阻害するが、前記の細胞刺激活性を有さない化合物をＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物として選択することができる。
本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞が得られる以前は、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を持続的に高発現できる動物細胞がなかったため、ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物（特に、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物）またはその塩を効率良くスクリーニングすることができなかった。しかしながら、本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡを含有するＣＨＯ細胞は、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を大量に発現できるので、ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。特に、本発明の浮遊培養可能なＣＨＯ細胞は、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の大量培養に適している。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明のスクリーニング方法において、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を用いる場合は、該ＣＨＯ細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化することができる。固定化方法は、それ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法において使用されるＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドとしては、例えば、公知のＬＨ−ＲＨ受容体アゴニスト（例えば、ＬＨ−ＲＨなど）、ＬＨ−ＲＨ受容体スーパーアゴニスト（例えば、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）、ＬＨ−ＲＨ受容体アンタゴニストなどが挙げられる。
ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンドとしては、例えば、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識した前記のリガンドなどを用いることができる。具体的には、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなどを用いることができる。
これらの標識体は自体公知の方法に従って製造することができるが、例えば、〔125Ｉ〕または〔3Ｈ〕で標識されたＬＨ−ＲＨが市販されている（アマシャムおよびデュポン）ので、それらを利用できる。また、〔125Ｉ〕で標識されたリュープロレリンは、後述する実施例３などに従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法で使用される試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの試験化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００３７】
具体的には、上記の（１ａ）または（２ａ）のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、または組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質またはその部分ペプチドを、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁することにより受容体標品を調製する。緩衝液としては、ＬＨ-ＲＨと受容体の結合を阻害しないものであれば何でもよく、例えば、ｐＨ約６〜８のリン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝液などが用いられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、チャップスやトゥイーン８０、ジギトニンなどの界面活性剤を加えることもできる。さらに、プロテネースによるリガンドや該受容体の分解を抑えるために、ＰＭＳＦ、ペプスタチン、ロイペプチンなどのプロテネース阻害剤を添加することもできる。一方、受容体発現ＣＨＯ細胞が接着細胞の場合、培養器に接着させたまま、つまり細胞を生育させた状態でＬＨ-ＲＨとＬＨ−ＲＨ受容体とを結合させることができる。
この場合、該緩衝液はハンクス液などが用いられる。約０.０１〜１０mlの該受容体発現細胞または該受容体標品に、一定量（約５，０００〜１，０００，０００ｃｐｍ）の標識体を添加し、同時に約１０-4〜１０-10Ｍの検体化合物や発酵生産物などを共存させる。非特異的結合を知るために、大過剰の非標識体を共存させたものも用意する。反応は約０〜５０℃（望ましくは、約４〜３７℃）で、約０.５〜２４時間（望ましくは、約０.５〜３時間）行なう。反応後、ガラス繊維濾紙などで濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維に残存する放射線の量をガンマカウンターまたは液体シンチレーションカウンターで測定する。共存物質のない状態の結合量（総結合量）から非特異的結合量を差し引いた値（特異的結合量）を１００％とした時、例えば、これを５０％以下に抑える試験化合物をＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩の候補化合物として選択することができる。
【００３８】
また、上記（２ｂ）および（２ｃ）のスクリーニング方法を実施するためには、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+濃度の変動、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下、細胞の遊走活性、Ｇ蛋白質の活性化、ホルモンの分泌、細胞成長などを促進する活性または抑制する活性など）および細胞成長を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００３９】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、または本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質、その部分ペプチドもしくはその塩を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
（Ｉ）組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞を含有する、スクリーニング用キット
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液Ａ
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.２％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）および適当なプロテイネース阻害剤（例えば０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、１００μｇ／ｍｌホスホルアミドン）を加えたもの。
孔径０.２μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質標品
組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０4個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンド
ＬＨ−ＲＨ受容体に対する市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したリガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）
溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃〜−８０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて２５ｎＭに希釈する。
▲４▼ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドの標準液
ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４０】
〔測定法〕
▲１▼２４穴組織培養用プレートにて培養した組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液Ａ３００μｌで１回洗浄した後、２９４μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０-3〜１０-12Ｍの試験化合物溶液を３μｌ加えた後、２５ｎＭ標識リガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）を３μｌ加えて、室温（約１〜３０℃）にて９０分反応させて結合反応をスタートさせる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０-4Ｍの非標識リガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）を３μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、３００μｌの洗浄用緩衝液Ａで３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０．５ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨで回収した。
▲４▼〔125Ｉ〕で標識されている場合は、液体シンチレーターと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定できる。
他の場合この回収溶液は適当量の液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent of Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕    ＰＭＢ＝（Ｂ−ＮＳＢ）／（ＴＢ−ＮＳＢ）×１００（％）
ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding
Ｂ    ：検体を加えた時の放射活性
ＮＳＢ：過剰量（約１０~6Ｍ）の冷リガンドが加えられたときの放射活性（非特異的結合量）
ＴＢ   ：検体が加えられなかった時の放射活性（総結合量）。
【００４１】
（II）組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を含有するＣＨＯ細胞膜分画を含有するスクリーニング用キット
〔スクリーニング用試薬〕
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液Ｂ
１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）および適当なプロテイネース阻害剤（例えば０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、１００μｇ／ｍｌホスホルアミドン）を加えたもの。
この溶液を４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質標品
組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の膜分画である。この標品は上記ＣＨＯ細胞から調製し、使用前は−８０℃で保存することができる。
▲３▼ＬＨ−ＲＨ受容体に対する標識したリガンド
ＬＨ−ＲＨ受容体に対する市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したリガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）
溶液の状態のものを−２０℃〜−８０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて３．６ｎＭに希釈する。
▲４▼ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンドの標準液
ＬＨ−ＲＨ受容体に対するリガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで０.１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃〜−８０℃で保存する。
【００４２】
〔測定法〕
▲１▼組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の膜分画を適当な濃度にまで希釈し（約０．１〜５０００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５００μｇ／ｍｌ）、次いで反応のため１８８μｌづつに分ける。
▲２▼１０-3〜１０-12Ｍの試験化合物溶液を２μｌ加えた後、３．６Ｍ標識リガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）を１０μｌ加えて、室温（約１〜３０℃）にて１時間反応させて結合反応をスタートさせる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０-4Ｍの非標識リガンド（例えば、ＬＨ−ＲＨ、リュープロレリン、酢酸リュープロレリンなど）を２μｌ加えておく。
▲３▼反応液をグラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｆ）でろ過し、１〜５ｍｌの測定用緩衝液Ｂで２回洗浄する。
▲４▼放射活性リガンドが〔125Ｉ〕で標識されている場合は、該フィルター上に残っている標識リガンドを液体シンチレーターと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定できる。
他の場合このフィルターに適当量の液体シンチレーターＡ（和光純薬製）を加え、次いで液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定する。Percent of Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕    ＰＭＢ＝（Ｂ−ＮＳＢ）／（ＴＢ−ＮＳＢ）×１００（％）
ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding
Ｂ    ：検体を加えた時の放射活性
ＮＳＢ：過剰量（約１０~6Ｍ）の冷リガンドが加えられたときの放射活性（非特異的結合量）
ＴＢ   ：検体が加えられなかった時の放射活性（総結合量）。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩は、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて、試験化合物（例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの試験化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。）の中から選択される化合物またはその塩であり、ＬＨ−ＲＨと本発明の組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質との結合を阻害する化合物である。該化合物には、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、ＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物）、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を介して過剰の細胞刺激活性を有する化合物（いわゆる、ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物）またはその塩、あるいは該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、ＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物）またはその塩が含まれている。さらに、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られた該ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物の構造式を化学修飾あるいは置換したもの、また、該化合物の構造式を基にデザイン化した化合物なども、本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られたＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物に含まれる。
該ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物の塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩の中でも、ＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物またはその塩は、安全で毒性のない化合物であり、動物（例えば、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど、特にウシ）用の妊娠調節剤、月経周期調節剤などとして有用である。具体的には、動物用の排卵誘発剤または繁殖障害予防・治療剤などとして有用である。
ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物もしくはその塩またはＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物もしくはその塩は、安全で毒性のない化合物であり、性ホルモン依存性疾病の予防・治療剤などとして有用である。具体的には、例えば、前立腺ガン，子宮ガン，乳ガン，下垂体腫瘍，前立腺肥大症，子宮内膜症，子宮筋腫，思春期早発症などの予防・治療剤、妊娠調節剤（例えば、避妊剤など）、月経周期調節剤などとして有用である。
また、本発明のスクリーニング方法によって得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩は、ＬＨ−ＲＨ受容体に結合することができるので、受容体発現細胞や生体内におけるＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の検出または定量用の試薬としても有用である。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩を上述の動物またはヒトなどの医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、温血哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジー、ヒトなど、特にヒト）に対して投与することができる。
【００４５】
該ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（約６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
なお、ＬＨ−ＲＨ受容体親和性化合物がＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物である場合、超作動性作用（例えば、過剰のＬＨまたはＦＳＨの放出作用など）を示す濃度の約１０００〜１００００倍の濃度に希釈することによって、ＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物として使用することもできる。
【００４６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＥＩＡ          ：エンザイムイムノアッセイ
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニールアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ＢＳＡ          ：ウシ血清アルブミン
後述の実施例１で得られたプラスミド ｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲを保持する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli) ＭＶ１１８４／／ｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲは、平成６年４月１８日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６４５として寄託されている。またこのものは平成７年３月２９日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５８１２として寄託されている。
後述の実施例２で得られたＣＨＯ／Ｌ３９−７は、平成６年１２月２２日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４９５３として寄託されており、また平成７年２月８日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ  ５０４５１として寄託されている。
後述の実施例６で得られたＣＨＯ／ＬＨ−８は、平成７年１月１９日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９７３として寄託されており、また平成７年２月８日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ  ５０４５２として寄託されている。
【００４７】
本願明細書の配列表における各配列番号について以下に説明する。
〔配列番号：１〕
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を表わす。
〔配列番号：２〕
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質のアミノ酸配列を表わす。
〔配列番号：３〕
ラットＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングに用いたＰＣＲ用ＤＮＡオリゴマーの塩基配列を表わす。マウスＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分塩基配列である。
〔配列番号：４〕
ラットＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングに用いたＰＣＲ用ＤＮＡオリゴマーの塩基配列を表わす。マウスＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分塩基配列である。
〔配列番号：５〕
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターの構築に使用したＰＣＲ用ＤＮＡオリゴマーの塩基配列を表わす。ラットＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分塩基配列を含有する。
〔配列番号：６〕
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターの構築に使用したＰＣＲ用ＤＮＡオリゴマーの塩基配列を表わす。ラットＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分塩基配列を含有する。
【００４８】
【実施例】
以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明がそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング〔Molecular cloning〕Cold Spring Harbor Press, New York,1989 に記載されている方法に従った。
1Ｈ-ＮＭＲスペクトルは内部基準としてテトラメチルシランを用いてバリアンGEMINI 200（２００ＭＨｚ）型スペクトルメーターで測定し、全δ値をppmで示した。
また、本明細書中で用いる記号は次のような意味を有する。
s：シングレット，d：ダブレット，t：トリプレット，dt：ダブルトリプレット，m：マルチプレット，br：幅広い
【００４９】
【参考例１】
ラットＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡのクローニング
既知のマウスＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ〔Reinhort, J. et al. ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.） 267, 21281-21284（1992）および Tsutsumi, M. et al. モレキュラー・エンドクリノロジイ（Mol. Endocrinol.） 6, 1163-1169（1992）〕の塩基配列に基づき、ＤＮＡオリゴマー▲１▼および▲２▼を合成した。▲１▼は５’−ＴＧＡＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣ−３’（配列表の配列番号：３）であり、−２２〜＋５（翻訳開始部位を＋１とする）のセンス配列を含むオリゴマーである。また▲２▼は５’−ＡＡＡＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＡ−３’（配列表の配列番号：４）であり、＋６１０〜＋６３６のアンチセンス配列を含むオリゴマーである。
ラット精巣からＲＮＡを調製し、これを精製してポリＡ+ＲＮＡを得た（ファルマシア  mRNA purification kit）。このポリＡ+ＲＮＡ５μｇから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ合成を行なった。ＲＮＡを分解後、引き続いて上記ＤＮＡオリゴマー▲１▼、▲２▼とＴａｑポリメレースを用いてポリメレース・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を行なった。反応条件は、最初９４℃で５分間置いた後、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１５分間反応させた。反応後、特異的に増幅されたＤＮＡ断片を切り出し、Ｔ４ポリメレースで平滑末端化し、ｐＵＣ１１９ベクター（宝酒造）のＨｉｎｃII部位に挿入して、プラスミドｐＴＳ８４６を得た。挿入されたラットＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡの塩基配列を、〔α-32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム社）を用いた通常の方法で確認したところ、報告されているラットＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡの塩基配列〔Kaiser, U. B. et al. バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）189, 1645-1652（1992）〕と完全に一致した。以上のように、ラットＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを得た。
【００５０】
【参考例２】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡのクローニング
ヒト下垂体より作製されたｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１１；クロンテック）のλファージを大腸菌Ｙ１０９０に感染させた後、軟寒天プレート上に約１×１０4クローンずつ撒いた。プラークをニトロセルロースフィルター上に移した後、変性溶液〔０.５Ｍ  ＮａＯＨ、１.５Ｍ  ＮａＣｌ〕、中和溶液〔０.５ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.０）、１.５Ｍ  ＮａＣｌ〕、３×ＳＳＣ〔２０×ＳＳＣ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０.３Ｍ クエン酸ナトリウム〕で順次処理し、風乾後、８０℃で２時間処理してＤＮＡをフィルターに固定した。一方、参考例１で得たラットＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで切り出し、〔α-32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム社）で標識した（アマーシャムＤＮＡラベリングキット）ものをプローブとした。ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液〔５×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ、０.２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７.４）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、１０×デンハート溶液、５０％フォルムアミド〕中４２℃でハイブリダイゼーションした。フィルターは０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで洗浄後、オートラジオグラムを取ってプローブとハイブリダイズするクローンを検索した。この方法により得られたクローンλＬＲＲ２９よりファージＤＮＡを抽出し、これをＥｃｏＲＩで切断してｃＤＮＡ断片を切り出し、ｐＵＣ１１８ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入してプラスミドｐＬＲＲ２９を得た。挿入された部分の塩基配列を上記と同様の方法で確認したところ、既に報告されているヒトＬＨ−ＲＨ受容体のｃＤＮＡの塩基配列〔Kakar, S. S. et al.  バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）189, 289-295（1992）〕と完全に一致した。以上のようにしてヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡを含むプラスミドを得た。
【００５１】
【参考例３】
２−アミノ−５−フェニルチオフェン−３−カルボン酸エチルエステルの合成
シアノ酢酸エチル（６.１ｇ，５０ｍｍｏｌ）、硫黄（１.６１ｇ，５０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（３.５ｍｌ，２５ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）の混合物に、４５℃で撹拌しながら、フェニルアセトアルデヒド（５０％ジエチルフタレート溶液；１２.０５ｇ，５０ｍｍｏｌ）を２０分間で滴下した。４５℃で９時間撹拌した後、反応液を濃縮して得られる残さを酢酸エチルで抽出した。抽出液を食塩水で洗浄し乾燥(ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下に留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、エーテル-へキサンから結晶化させて微黄色板状晶（５.５５ｇ，４５％）を得た。
mp 124.5-125.5℃ (文献値; 123-124℃).
元素分析値  C13H13NO2Sとして
0003694057.tif 000002
1H-NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.37 (3H, t, J=7.1Hz), 4.30 (2H, d, J=7.1Hz), 5.97 (2H, br), 7.17-7.46 (6H, m).
IR (KBr): 3448, 3320, 1667, 1590, 1549 cm-1。
【００５２】
【参考例４】
２−アミノ−４−メチル−５−(４−メトキシフェニル)チオフェン−３−カルボン酸エチルエステルの合成
4-メトキシフェニルアセトン（１６.５ｇ，０.１０ｍｏｌ）、シアノ酢酸エチル（１２.２ｇ，０.１０ｍｏｌ）、酢酸アンモニウム（１.５５ｇ，２０ｍｍｏｌ）、酢酸（４.６ｍｌ，８０ｍｍｏｌ）およびベンゼン（２０ｍｌ）の混合物を、ディーンスターク装置で生成する水を除きながら、２４時間加熱還流した。冷後、反応液を減圧下濃縮し、残さをジクロルメタンと重曹水で分配した。有機層を食塩水で洗浄し乾燥（ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下に留去した。得られた残さのエタノール（３０ｍｌ）溶液に、硫黄（３.２１ｇ，０.１０ｍｏｌ）とジエチルアミン（１０.４ｍｌ，０.１０ｍｏｌ）を加え、５０〜６０℃で２時間撹拌した後、反応液を濃縮して得られる残さを酢酸エチルで抽出した。抽出液を食塩水で洗浄し乾燥（ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下に留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、エーテル-へキサンから結晶化させて、淡黄色板状晶（１１.５ｇ，４０％）を得た。
mp 79-80℃.
元素分析値  C15H17NO3Sとして
0003694057.tif 000003
1H-NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.37 (3H, t, J=7.1Hz), 2.28(3H, s), 3.83 (3H, s),  4.31 (2H, q, J=7.1Hz), 6.05 (2H, brs), 6.91 (2H, d, J=8.8Hz), 7.27 (2H, d, J=8.8Hz).
IR (KBr): 3426, 3328, 1651, 1586, 1550, 1505, 1485 cm-1.
FAB-MS m/z: 291 (M+)。
【００５３】
【参考例５】
２−アミノ−４−メチル−５−フェニルチオフェン−３−カルボン酸エチルエステルの合成
参考例４に記載した方法と同様にして、4-メトキシフェニルアセトンの代わりにフェニルアセトン（１１.６ｇ，８６.５ｍｍｏｌ）を用い、シアノ酢酸エチル（１０.５ｇ，８６.５ｍｍｏｌ）、酢酸アンモニウム（１.３４ｇ，１７.４ｍｍｏｌ）、酢酸（３.９６ｍｌ，６９.２ｍｍｏｌ）、硫黄（２.７８ｇ，８６.５ｍｍｏｌ）およびジエチルアミン（８.９５ｍｌ，８６.５ｍｍｏｌ）から、無色針状晶（９.０５ｇ，４０％）を得た。
mp 64-65℃ (エーテル-ヘキサンより再結晶, 文献値; 95℃).
元素分析値  C14H15NO2Sとして
0003694057.tif 000004
1H-NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.37 (3H, t, J=7.1Hz), 2.33 (3H, s), 4.32 (2H, q, J=7.1Hz), 6.09 (2H, br), 7.24-7.42 (5H, m).
IR (KBr): 3388, 3278, 1665, 1584, 1549, 1481 cm-1.
【００５４】
【参考例６】
｛３−エトキシカルボニル−５−（４−メトキシフェニル）−４−メチルチオフェン−２−イル｝アミノメチレンマロン酸ジエチルエステルの合成参考例４で得られた化合物（１０ｇ，３４.３ｍｍｏｌ）にエトキシメチレンマロン酸ジエチルエステル（７.４５ｇ，３４.５ｍｍｏｌ）を加え、１２０℃で２時間撹拌した。冷後、反応液から析出した結晶にエーテルを加えてろ取し、再度エーテルで洗い、五酸化リン上で減圧下に乾燥し黄色結晶（１４.２ｇ，９０％）を得た。
mp 122-123℃.
1H-NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.32 (3H, t, J=7.1Hz), 1.38 (3H, t, J=7.2Hz), 1.41 (3H, t, J=7.2Hz), 2.34 (3H, s), 3.85 (3H, s), 4.25 (2H, q, J=7.1Hz), 4.38 (2H, q, J=7.2Hz), 4.45 (2H, q, J=7.2Hz), 6.95 (2H, d, J=8.8Hz), 7.31 (2H, d, J=8.8Hz), 8.22 (1H, d, J=13.4Hz), 12.74 (1H, d, J=13.1Hz).
IR (KBr): 2984, 1720, 1707, 1688, 1653, 1599, 1518, 1499 cm-1。
【００５５】
【参考例７】
｛３−カルボキシ−５−（４−メトキシフェニル）−４−メチルチオフェン−２−イル｝アミノメチレンマロン酸ジエチルエステルの合成
参考例６で得られた化合物（７.０ｇ，１５.２ｍｍｏｌ）のジオキサン（２０ｍｌ）溶液に、６０〜７０℃に加熱撹拌下、水酸化カリウム（５.０ｇ，７５.７ｍｍｏｌ）のエタノール（３０ｍｌ）溶液を加えた。同温で１時間撹拌した後、室温で１時間放置した。反応液に氷冷下、２Ｎ塩酸（４０ｍｌ，８０ｍｍｏｌ）を加え、反応液を減圧下濃縮した。黄色析出物をろ取し、冷却した水−エタノールで洗浄し、五酸化リン上で減圧下に乾燥し黄色粉末（６.１ｇ，９３％）を得た。
mp 184-187℃.
1H-NMR (200MHz, DMSO-d6) δ: 1.24 (3H, t, J=7.1Hz), 1.28 (3H, t, J=7.2Hz), 2.30 (3H, s), 3.80 (3H, s), 4.15 (2H, q, J=7.1Hz), 4.24 (2H, q, J=7.2Hz), 7.03 (2H, d, J=8.7Hz), 7.37 (2H, d, J=8.7Hz), 8.08 (1H, d, J=13.6Hz), 12.41 (1H, d, J=13.6Hz).
IR (KBr): 3422, 2980, 1719, 1653, 1607, 1551, 1512 cm-1.
【００５６】
【参考例８】
４−ヒドロキシ−２−(４−メトキシフェニル)−３−メチルチエノ〔２，３−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
１２０℃に加熱撹拌下、ポリリン酸エステル（ＰＰＥ）（９０ｍｌ）に参考例７で得られた化合物（６.０ｇ，１３．８ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。同温で３０分間撹拌後、反応液を氷水にあけ、酢酸エチルで抽出した。抽出液をあわせて食塩水で洗浄し乾燥（ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下に留去した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して黄色粉末（３.６５ｇ，７７％）を得た。元素分析用のサンプルとして、得られた粉末をエタノールから再結晶して黄色結晶を得た。
mp 162-163℃.
元素分析値  C18H17NO4Sとして
0003694057.tif 000005
1H-NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.47 (3H, t, J=7.1Hz), 2.63 (3H, s), 4.87 (3H, s), 4.49 (2H, q, J=7.1Hz), 6.99 (2H, d, J=8.8Hz), 7.44 (2H, d, J=8.8Hz), 8.84 (1H,s), 12.11 (1H, s).
IR (KBr): 3434, 2992, 1692, 1601, 1582, 1535, 1504 cm-1.FAB-MS m/z: 344 (MH+)。
【００５７】
【参考例９】
４，７−ジヒドロ−７−（２−メトキシベンジル）−２−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−４−オキソチエノ〔２，３−ｂ〕ピリジン−５−カルボン酸エチルエステルの合成
水素化ナトリウム（６０％油状物；１２３ｍｇ，３.０８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３ｍｌ）懸濁液に氷冷窒素気流下、参考例６で得られた化合物（１.０ｇ，２．９１ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）溶液を滴下した。同温で３０分間撹拌した後、２-メトキシベンジルクロリド（０.９２ｇ，５.８７ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液を滴下した。反応液を室温で２３時間、７０℃で２時間撹拌後、反応液を濃縮して得られる残さを酢酸エチルと塩化アンモニウム水溶液で分配した。水層を酢酸エチルで抽出し、抽出液をあわせて食塩水で洗浄し乾燥（ＭｇＳＯ4）後、溶媒を減圧下に留去した。得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して淡黄色アモルファス（０.９５ｇ，７０％）を得た。元素分析用のサンプルとして、得られた粉末をジクロルメタン−エーテルから再結晶して黄色柱状晶を得た。
mp 165-167℃.
元素分析値  C26H25NO5S・0.5H2Oとして
0003694057.tif 000006
1H-NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.41 (3H, t, J=7.1Hz), 2.65 (3H, s), 3.85 (3H, s), 3.86 (3H, s),  4.39 (2H, q, J=7.1Hz),  5.16 (2H, s),  6.92-7.00 (4H, m), 7.21-7.41 (4H, m), 8.41 (1H, s).
IR (KBr): 2980, 1727, 1684, 1609, 1590, 1497, 1464 cm-1。
【００５８】
【実施例１】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ発現ベクターの構築
ＣＨＯ細胞での発現プラスミドとしては、ｐＡ１−１１を用いた。ｐＡ１−１１は次のようにして構築した。特開平５−０７６３８５公報に記載のｐＴＢ１４１７からＨｉｎｄIIIおよびＣｌａＩ処理によってＳＲαプロモーターおよびｐｏｌｙＡ付加シグナルを含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、ｐＴＢ３４８〔Naruo, K. et al. バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）128巻, 256-264頁(1985)〕からＣｌａＩおよびＳａｌＩ処理によりジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む４．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これらのＤＮＡ断片をＴ４ポリメラーゼ処理により末端を平滑末端にした後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ｐＡ１−１１（ｐＡＫＫＯ−１１１）を構築した。次に、参考例２で得たヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡの塩基配列に基づき、ＤＮＡオリゴマー▲３▼および▲４▼を合成した。
▲３▼は５’−ＧＡＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣ−３’（配列表の配列番号：５）であり、制限酵素認識部位を含むアンカー配列を５’端に持つ−１〜＋２０（翻訳開始部位を＋１とする）のセンス配列を含むオリゴマーである。▲４▼は５’−ＧＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＡＴＡＧ−３’（配列表の配列番号：６）であり、制限酵素認識部位を含むアンカー配列を５’端に持つ＋９６６〜＋９８７のアンチセンス配列を含むオリゴマーである。上記ｐＬＲＲ２９プラスミド１ｎｇを鋳型として、上記オリゴマー▲３▼、▲４▼およびＴａｑポリメレースを用いてＰＣＲを行なった。反応条件は参考例１と同じである。反応後、特異的に増幅されたＤＮＡ断片をＴ４ポリメレースを用いて平滑末端化し、ｐＵＣ１１９ベクターのＨｉｎｃII部位に挿入してプラスミドｐＬＲＲ／ＰＣＲを得た。挿入断片の塩基配列を上記と同様の方法で確認した後、ＳａｌＩで挿入断片を切り出して、上記の発現プラスミドｐＡ１−１１のＳａｌＩ部位に挿入して、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ発現プラスミドｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲを得た〔図３〕。この発現プラスミドｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲを大腸菌ＭＶ１１８４に導入して、形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＭＶ１１８４／／ｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲを得た。
【００５９】
【実施例２】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡのＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞での発現
ＣＨＯ（ｄｈｆｒ~）細胞１×１０6細胞を、直径１０cmのシャーレを用いて、１０％ウシ胎児血清を含むハムＦ１２培地で２４時間培養し、この細胞に、実施例１で得たヒトＬＨ−ＲＨ受容体ｃＤＮＡ発現プラスミドｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲ０.５〜１μｇをリン酸カルシウム法で導入した。導入２４時間後、培地を１０％透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に換えて、プラスミドを染色体に組込んだ細胞を選択した。さらに、選択された細胞を限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパクを安定に高発現する細胞株ＣＨＯ／Ｌ３９を得た。この細胞株を用いてクローニングを繰り返すことにより、該受容体をさらに高発現する細胞株ＣＨＯ／Ｌ３９−７を得た。この際、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸを含む培地を用いることにより、導入遺伝子が増幅した高発現細胞株を得ることが可能である。
【００６０】
【実施例３】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体活性の測定
ＣＨＯ細胞またはその細胞膜画分のＬＨ−ＲＨ受容体活性の測定は以下の方法で行なった。
（１）〔125Ｉ〕リュープロレリンの調製
１０μｌの０.３ｍＭ リュープロレリン、１０μlの０.０１ｍｇ／ｍｌ ラクトパーオキシデース、１０μｌのヨード１２５（３７ＭＢｑ；アマーシャム、ＩＭＳ３０）、１０μｌの０.００１％Ｈ2Ｏ2を混合して室温で２０分間反応させた。７００μｌの０.０５％ ＴＦＡを加えて反応を停止し、ＨＰＬＣで分離した。カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ-８０TMＣＴＲで、溶出条件は〔表１〕に示した通りである。また、溶出温度は室温で、溶出速度は１ｍｌ／分である。〔125Ｉ〕リュープロレリンのピーク部分（２６〜２７分）を分取し、ガンマカウンターで比活性を測定した。
【００６１】
【表１】
0003694057.tif 000007
【００６２】
（２）細胞のＬＨ−ＲＨ受容体活性の測定
まずヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現細胞を２４穴プレートに培養した。１回洗浄後、結合反応はリガンドとして２５０ｐＭ〔125I〕リュープロレリンを含む３００μｌの測定用緩衝液Ａ（０.２％  ＢＳＡ、０.２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、２０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１００μｇ／ｍｌ  フォスフォラミドンを含むハンクス液）中で９０分間行なった。反応終了後上清を除き、３００μlの測定用緩衝液で３回洗浄した。残った〔125Ｉ〕の量は１Ｎ  ＮａＯＨで細胞を剥がした後ガンマカウンターで測定し、これを総結合量とした。また、結合反応に１μＭの非標識リュープロレリンを加えて同様の操作を行ない、得られた〔125Ｉ〕の量を非特異的結合量とした。総結合量から非特異的結合量を差し引いたものを特異的結合量とした。その結果を〔表２〕に示す。
【００６３】
【表２】
0003694057.tif 000008
【００６４】
【実施例４】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体を含有するＣＨＯ細胞膜画分の調製
実施例２で得たヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞（１０9個）を５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）に浮遊させ、１００×ｇで５分間遠心した。細胞のペレットに細胞用ホモジネートバッファー（１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を１０ｍｌ加え、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジネートした。４００×ｇで１５分遠心し、上清を超遠心管に取り１００，０００×ｇで１時間遠心し、膜画分の沈澱物を得た。この沈澱物を２ｍｌのアッセイバッファーに懸濁し、１００，０００×ｇで１時間遠心した。沈澱物として回収された膜画分を再び２０ｍｌのアッセイバッファーに懸濁し、分注して、−８０℃で保存し、使用の都度解凍して用いた。
【００６５】
【実施例５】
〔125Ｉ〕−リュープロレリン結合阻害率の測定
実施例４で調製したＣＨＯ細胞膜画分をアッセイバッファーＢ〔１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＢＳＡ，０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１００μｇ／ｍｌホスホルアミドンを含有する２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌバッファー〕で希釈して、２００μｇ／ｍｌとし、チューブに１８８μｌずつ分注した。６０％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した２ｍＭの化合物(参考例９で製造した化合物、以下同じ)２μｌと、３．６ｎＭの〔125Ｉ〕−リュープロレリン１０μｌとを同時に添加した。最大結合量を測定するために、６０％のＤＭＳＯ２μｌと、３．６ｎＭの〔125Ｉ〕−リュープロレリン１０μｌとを添加した反応液を調製した。また、非特異的結合量を測定するために、６０％のＤＭＳＯに溶解した１００μＭのリュープロレリン２μｌと、３．６ｎＭの〔125Ｉ〕−リュープロレリン１０μｌとを添加した反応液も同時に調製した。
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞膜画分を使用して２５℃で６０分反応させた。反応後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ−カウンターを用いてろ紙上に残った〔125Ｉ〕−リュープロレリンの放射活性を測定した。
（ＴＢ−ＳＢ）／（ＴＢ−ＮＳＢ）×１００（ＳＢ：化合物を加えたときの放射活性、ＴＢ：最大結合放射活性、ＮＳＢ：非特異結合放射活性）を計算して、各被検物質の結合阻害率を求めた。その結果、参考例９で製造した化合物は、６７％の結合阻害活性示し、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物として有用であることが判明した。
【００６６】
【実施例６】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞の浮遊大量培養
実施例２で得たヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパクを高発現する細胞株ＣＨＯ/Ｌ３９−７(２×１０7細胞)を、１２５ｍｌ容のテクネ・スピナーフラスコを用いて、１％透析ウシ胎児血清を含むＴＥ培地〔インシュリン（５ｍｇ／ｌ），トランスフェリン（１０ｍｇ／ｌ），エタノールアミン（１.５３ｍｇ／ｌ），亜セレン酸ナトリウム（０.００４３ｍｇ／ｌ）を含むダイゴＴ培地(日本製薬社製)とＥ−ＲＤＦ培地(極東製薬社製)との１：１(V/V)混合培地，１００ｍｌ〕で５０ｒｐｍの速さで撹拌しながら培養を４回繰り返すことにより、浮遊馴化した細胞株ＣＨＯ／ＬＳを得た。得られた細胞株ＣＨＯ／ＬＳ(５×１０7細胞)を上記培地(５００ｍｌ)に懸濁して５００ｍｌ容テクネ・スピナーフラスコに入れ５０ｒｐｍの速さで撹拌しながら、３７℃，４日間培養した。増殖してきた細胞を遠心分離して集め、上記培地(３リットル)に移し、３リットル容テクネ・スピナーフラスコに入れ、対数増殖期後期まで培養した。その細胞を上記培地(２５リットル)を入れた５０リットル容撹拌培養槽に７×１０4細胞／ｍｌの播種密度で移植し、３０ｒｐｍの速さで撹拌しながら、３７℃で３日間培養し、ＣＨＯ／ＬＳを７×１０9細胞得た。この細胞(５×１０8細胞)より実施例４と同様にして膜画分(６９ｍｇ)を製造した。該膜画分８０μｇ当たりのヒトＬＨ−ＲＨ受容体活性の測定を実施例３と同様にして行なった。その結果を〔表３〕に示す。
【００６７】
【表３】
0003694057.tif 000009
【００６８】
【実施例７】
ヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞の細胞内セカンドメッセンジャーの測定
細胞内カルシウム濃度の変化は、特異的蛍光物質（ｆｕｒａ−２）を用いて行なった。ヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞を、カバーガラスを敷き詰めた６ｃｍシャーレで３日間培養した。カルシウム測定用緩衝液（０.１％ ＢＳＡを含むハンクス液）で３回洗浄し、４μＭ ｆｕｒａ−２を含む２.５ｍｌの同緩衝液を加えて室温で９０分間置いた。同緩衝液で３回洗浄後、カバーガラスをキュベットに移して分光蛍光測定装置で測定した〔図４〕。
イノシトールリン酸（ＩＰｎ、ｎ＝１〜３の整数）濃度の測定は、〔3Ｈ〕イノシトールで細胞をラベルして行なった。ヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞をウェル当たり４×１０4で２４穴プレートに４８時間培養し、ｍｙｏ〔２−3Ｈ〕イノシトール（アマーシャム）をウェル当たり２.５μＣｉ加えて、さらに２４時間培養した。細胞をＩＰｎ測定用緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１.２５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＬｉＣｌ、１０ｍＭ ブドウ糖、０.１％ ＢＳＡ）で洗浄後、同緩衝液を加えて３７℃で３０分間置いた。５００μｌの同緩衝液で置換し、ＬＨ−ＲＨを加えて３７℃で１０分間反応させた。１００μｌの１０％過塩素酸を加え、０℃で３０分間置いた後、１５０μｌの１.５３Ｍ ＫＯＨ、７５ｍＭ ＨＥＰＥＳを加えて中和した。さらに、０℃で３０分間置いた後、遠心して上清を陰イオン交換カラム（ＡＧ１−Ｘ８）で精製した。カラムはＨ2Ｏおよび洗浄液（５ｍＭ 四ホウ酸ナトリウム、６０ｍＭ 蟻酸アンモニウム）で洗浄後、１Ｍ 蟻酸、０.１Ｍ 蟻酸アンモニウムで溶出し、溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）で測定した〔図５〕。
アラキドン酸濃度の測定は、〔3Ｈ〕アラキドン酸で細胞を標識して行なった。細胞をウェル当たり４×１０4で２４穴プレートに４８時間培養し、〔５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−3Ｈ〕アラキドン酸（アマーシャム社）をウェル当たり０.２５μＣｉ加えて、さらに２４時間培養した。アラキドン酸測定用培地（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.４）、０.２％ ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地）で洗浄後、同培地を加えて３７℃で３０分間置いた。５００μｌの同培地で置換し、ＬＨ−ＲＨを加えて３７℃で１５分間置いた後、培養上清中の放射活性をＬＳＣで測定した〔図６〕。
〔図４〕、〔図５〕および〔図６〕から明らかなように、本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体発現ＣＨＯ細胞であるＣＨＯ／Ｌ３９−７細胞では、ＬＨ−ＲＨ刺激によってＩＰｎの産生とそれに続く細胞内Ｃａ2+の上昇、さらにアラキドン酸の遊離が見られた。したがって、下垂体細胞におけるＬＨ放出に伴って起こるとされている細胞内シグナルはすべて観察できることが分かった。このことから、本発明のＣＨＯ／Ｌ３９−７細胞株は、ＬＨ−ＲＨ受容体に対するアゴニスト／アンタゴニストの判定およびアンタゴニスト活性の測定などのスクリーニングの２次評価系として優れていることが分かった。
【００６９】
【発明の効果】
本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞は、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を高発現できるＣＨＯ細胞である。特に、浮遊培養可能なＣＨＯ細胞株に馴化された細胞は、ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質の大量培養に適している。
また、本発明のヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質を生産し続ける能力を有するＣＨＯ細胞もしくはその細胞膜画分、または組換え型ヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質もしくはその部分ペプチドを用いて、ＬＨ−ＲＨ受容体作動性化合物、ＬＨ−ＲＨ受容体超作動性化合物またはＬＨ−ＲＨ受容体拮抗性化合物のスクリーニングを行なうことにより、該化合物を有利に選択することができる。したがって、例えば、前立腺ガン、子宮ガン、乳ガン、下垂体腫瘍、前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮筋腫、思春期早発症などの予防・治療剤、妊娠調節剤（例えば、避妊剤、排卵抑制剤、排卵誘発剤）、月経周期調節剤などを早期に提供することができる。
【００７０】
【配列表】
〔配列番号：１〕
配列の長さ：９８４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：mature protein
配列
0003694057.tif 000010
【００７１】
【配列番号：２】
配列の長さ：３２８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク
配列
0003694057.tif 000011
0003694057.tif 000012
【００７２】
【配列番号：３】
配列の長さ：２７
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0003694057.tif 000013
【００７３】
【配列番号：４】
配列の長さ：２７
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0003694057.tif 000014
【００７４】
【配列番号：５】
配列の長さ：３７
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0003694057.tif 000015
【００７５】
【配列番号：６】
配列の長さ：３０
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
0003694057.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例２で調製したヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【図２】参考例２で調製したヒトＬＨ−ＲＨ受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図３】ｐＡ１−１１／ｈＬＨ−ＲＨＲで標示されるヒトＬＨ−ＲＨ受容体蛋白質発現ベクターの構築図を示す。ｈＬＨ−ＲＨＲｃＤＮＡはヒトＬＨ−ＲＨ受容体蛋白質ｃＤＮＡを示す。Ａｍｐrはアンピシリン耐性遺伝子を示す。ＤＨＦＲはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を示す。ＳＶ４０ｏｒｉはＳＶ４０複製オリジンを示す。
【図４】ＣＨＯ／Ｌ３９−７細胞をＬＨ−ＲＨで刺激した時の細胞内カルシウム濃度の変化を示す。縦軸は３４０ｎｍと３８０ｎｍの蛍光強度の比を示し、細胞内カルシウム濃度を表わす。横軸は溶出時間（秒）を示す。
【図５】ＣＨＯ／Ｌ３９−７細胞をＬＨ−ＲＨで刺激した時の細胞内イノシトールリン酸濃度の変化を示す。縦軸は各濃度のＬＨ−ＲＨで刺激した時の細胞内イノシトールリン酸濃度（ｃｐｍ）を示す。横軸はＬＨ−ＲＨ濃度（ｌｏｇ〔ＬＨ−ＲＨ〕）を示す。
【図６】ＣＨＯ／Ｌ３９−７細胞をＬＨ−ＲＨで刺激した時の細胞内アラキドン酸濃度の変化を示す。縦軸は１０-7Ｍ ＬＨ−ＲＨで刺激した時の細胞内アラキドン酸濃度（ｃｐｍ）を１００％とした時の、各濃度のＬＨ−ＲＨで刺激した時の細胞内アラキドン酸濃度を相対値（％）を示す。横軸はＬＨ−ＲＨ濃度（モル）を示す。
【図１】
0003694057.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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