(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離されたDNA分子であり、該分子が変異された機能的に活性を有する網膜芽細胞腫蛋白質をコード表現する合成変異Rb遺伝子であり、前記蛋白質がRb蛋白質のP5保存相同領域内の変異されたアミノ酸配列KLLIKPRYDTEGSDEADGSKH又はKPLKKLRFDIEASAEVDASIHを含むことを特徴とする分離されたDNA分子。
【請求項２】
組換え細胞内においてDNAを表現するのに適合したプラスミドであって、該プラスミドは前記細胞内で請求項１のDNA及びこのDNAを表現するのに必要な規制要素を含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項３】
請求項１のDNA分子を用いた非癌性増殖性細胞又は増殖性癌細胞の細胞増殖を抑制するための製薬剤。
【請求項４】
請求項１のDNA分子である遺伝子によってつくりだされる変異された網膜芽細胞腫蛋白質。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には細胞成長および増殖性疾病の規制の分野に関するものである。より具体的には、本発明はRB−１及びp53遺伝子の変異体およびそうした変異体の治療目的のための利用に関するものである。
関連技術の説明
細胞増殖の調節は、複数の相互作用する要素が関連する複雑な要素である。細胞が成長するかどうかは、ネガティブに作用する成長規制遺伝子とポジティブに作用する遺伝子の表現のバランスにかかっている。ネガティブに作用する成長規制遺伝子は、細胞内で表現されるか細胞内に提供された場合、細胞成長の抑制をもたらす。ポジティブに作用する成長規制遺伝子は、細胞内で表現されるか細胞内に提供された場合、その増殖を一層刺激する。
最近、細胞増殖に対してネガティブな効果を及ぼす腫瘍サプレッサー遺伝子と呼ばれるネガティブに作用する成長規制遺伝子が確認されている。これらの遺伝子には、ヒト網膜芽腫、RB−１、およびp53遺伝子などが含まれている。これらのネガティブな成長規制遺伝子の１部の不存在または不活性化は一定のタイプの癌と関連している。
ヒトの網膜芽腫遺伝子、RB−１は、その内部で１つの細胞内で上記遺伝子の両方の対立形質が存在していないか、あるいはその遺伝子またはその遺伝子生成物の表現の抑制が新しい、または異常な細胞増殖をもたらすこの種の腫瘍サプレッサー遺伝子のプロトタイプである。分子レベルで、RB−１の両方の対立形質の喪失あるいは不活性化は網膜芽腫およびそれと臨床的に関連した骨肉腫、繊維肉腫、軟組織肉腫、および黒色腫などの腫瘍の臨床的明示化に関与している。加えて、RB−１の機能のロスは、腫瘍小細胞肺悪性腫瘍、膀胱悪性腫瘍、乳房悪性腫瘍、子宮頚部悪性腫瘍、および前立腺悪性腫瘍など他のタイプの主要癌とも関連している。
腫瘍サプレッサー遺伝子Rbおよびp53は癌性および非癌性細胞の増殖を抑制する
野生タイプのRB−１のcDNAを再導入すると、再導入された遺伝子が多くの異なった腫瘍細胞タイプにおいて成長の停止または遅れを誘発するので、部分的に正常な成長規制が回復されることが分かっている。Rb遺伝子を腫瘍抑制遺伝子として呼ぶのは、Rb遺伝子の１つの対立形質の不活性化が癌の形成をもたらす傾向があるからである。しかしながら、Rb遺伝子の成長抑制効果は、腫瘍細胞にのみ限定されるものではない。２つのコピーを有する正常な細胞も、一定の成長条件の下で、Rb遺伝子の余分のコピーを導入することにより、成長が停止されたり、遅らせられたりすることが分かっている。同様に、野生タイプのp53の非癌性細胞の成長を抑止する能力についてもいろいろな文献で明らかにされている。したがって、Rbおよびp53によってコントロールされるステップは腫瘍形成性表現型には直接影響を及ぼさず、むしろ、腫瘍および正常な細胞の成長を同様に抑制するステップに影響を及ぼしている可能性がある。
正常な細胞の病態的増殖のメカニズム
治療効果をもたらすために新しい方法が必要とされる病態的細胞増殖状態にはいろいろなものがある。こうした病態的状態は異常な細胞増殖を起こし得るほとんどすべての細胞タイプにおいて起き得る。病態的、あるいは異常な成長を示す細胞タイプには、（１）繊維芽細胞、（２）血管内皮細胞、および（３）表皮細胞などがある。上記のことから、個人におけるすべての、あるいはほとんどすべての器官および組織システムにおける局所的あるいは広がった病態状態を処方するための方法が必要であることが分かる。
例えば、眼だけを考えても、新しい方法を用いて、正常な、良性の、あるいは悪性の細胞または組織の異常な増殖による広範な病態的疾患状態を措置することができ、それらの病態的疾患状態には以下のようなものが含まれる。眼の繊維芽増殖性、血管増殖性および／または新たに形成される疾患：思春期網膜症、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、毛細血管腫、コロイド性新血管網、網膜下新血管網、網膜下新血管形成による老年性暗斑変性、角膜新血管形成、表皮薄膜増殖による暗斑しわ、核硬化症による成人性白内障、外傷または手術後の繊維性内成長、光神経網腫、血管腫網膜、新血管性緑内障、洞穴血管腫、皮膚潮紅、鎌細胞増殖性網膜症、目の手術や外傷後の表示下方成長、そこひ後の膜、乳頭腫、サラセミアにおける網膜の新血管形成、弾力繊維性偽黄色腫、および神経線維腫症タイプ１およびタイプ２、網膜芽腫、葡萄膜黒色腫、および眼縁部の偽腫瘍。本発明が有用なその他の良性細胞増殖性疾患には、乾癬、魚鱗癬、乳頭腫、基底細胞悪性腫瘍、鱗状細胞悪性腫瘍、およびスティーブンス−ジョンソン症候群などがある。
なお、正常な細胞の場合、それぞれRb遺伝子とp53遺伝子の２つの正常な対立形質があるが、これら野生タイプの蛋白質は、例えば組織培養成長条件の下で成長因子が与えられた場合、それらの細胞の増殖を防ぐことはできない。他の条件の下では活動を休止している病態状態内部の細胞の制御できない増殖も、それらの細胞の上記病態状態によって誘発された成長因子への接触の結果である（下記参照）。例えば、サラセミアにおける眼の血管の制御できない増殖は、その増殖を止めないと、網膜剥離を起こしてしまう場合がある。Rb遺伝子またはp53遺伝子の過剰なコピーをそうした細胞に導入すると、細胞の成長を抑制するのに十分な場合と、十分でない場合とがある。実際、外因性Rb遺伝子を多くの腫瘍に導入すると細胞の成長を完全に停止させる代わりに、その速度を遅らせるだけだった。Saos−２およびDU145などこれまでに報告されている細胞株はこうした現象の良い事例である。その遺伝子をさらに多く導入することが必要なのかもしれないし、また、導入することが必要な、あるいはそれが可能なコピーの数を制御するのも困難である。他方、成長因子への露出は表現されたRb蛋白質の不活性化をもたらす場合もある。
ホスホリル化によるRb蛋白質の活性の規制
成長サプレッサー因子の不活性化が細胞成長に対する制約を取り除く上で不可欠なステップであるならば、細胞が制御された形で増殖するようにこれら遺伝子生成物の活性を規制するメカニズムが必要である。任意の成長サプレッサー因子の表現が量的または質的に規制される可能性が考えられる。Rb遺伝子の場合、蛋白質の定常状態レベルの細胞の量に対する比率は細胞サイクル全体を通じて一定である。このRb蛋白質濃度の変化がないことは細胞がこの蛋白質の活性を規制するための他のメカニズムが存在しているに違いないことを示唆している。Rb蛋白質（pRb）の活性がそのホスホリル化状態によって規制されていることを示すいくつかの証拠が存在している。種々の成長刺激あるいは抑止因子が、Rb蛋白質など成長サプレッサー遺伝子の生成物のホスホリル化を混乱させることによって、こうした効果をもたらしているのである。Rb蛋白質のホスホリル化の誘発における成長刺激因子の役割に関する証拠は、Rb蛋白質が休止した細胞のホスホリル化形態に存在しているという観察に基づいている。さらに、休止細胞に刺激を与えて血清あるいはEGFなどの成長因子にインシュリンまたはトランスフェリンなどと一緒に露出させて増殖させると、Rb蛋白質の基本的な形態はG1でホスホリル化されたが、それらの細胞がG1/S境界および細胞に入ると、超ホスホリル化される。これらのデータはRb蛋白質が血清または成長因子によって誘発される信号トランスダクション経路の標的であることを示唆している。最後に、成長因子の増殖刺激効果に応答できない老年期ヒト腺維芽細胞もRb蛋白質をホスホリル化できない。
Rb蛋白質のホスホリル化の下方規制における成長抑制因子の役割に関する証拠も存在している。活発に成長している白血病または神経芽細胞腫をレチノ酸またはビタミンD3、DMSO、その他の差別化誘発剤で措置した場合、Rb蛋白質は初期G1フェーズでの細胞成長休止の開始より前にホスホリル化され、差別化が誘発されることが分かっている。加えて、肺表皮細胞のパラクリン成長抑止性ポリペプチド形質変換成長因子ベータ１（TGFβ１）による措置はRb蛋白質のホスホリル化の下方規制と、それに付随する後期G1での細胞成長の休止をもたらした。これらのことを考え合わせると、これらのデータは、Rb蛋白質のホスホリル化された形態が細胞がG1/S境界を通過するのを積極的に抑制したこと、そして、G1で活性化されたキナーゼ（Ｓ）がRb蛋白質を不活性化して、細胞がＳフェーズに入るようにすることができることを示唆している。
腫瘍細胞内で、消去または突然変異によってRb遺伝子を永続的に除去すると成長が促進されたが、Rb遺伝子の通常の表現を有している正常な細胞における成長への制約を除去は、細胞サイクルに依存したその遺伝子生成物、つまりRb蛋白質（pRb）の翻訳後の修正によって達成される。pRbは種々のホスホリル化形態で存在し、そしてこれは低ホスホリル化形態が活発な形態であることを示唆している。例えば、SV40ラージＴ抗原はRb蛋白質の低ホスホリル化形態に優先的に結合する。Rb蛋白質のホスホリル化は、それをSV40ラージＴ抗原から解放し、pRbの低ホスホリル化形態だけがE2プロモーターに結合して、それからの転写を抑止する。したがって、Rb蛋白質の低ホスホリル化は細胞成長を積極的に抑制する細胞増殖はRb蛋白質の過剰ホスホリル化と関連している。種々の成長刺激または抑止因子がRb蛋白質のホスホリル化を混乱させることによってその効果を発揮している可能性がある。したがって、正常な細胞はRb蛋白質を表現するかもしれないが、病態的な状態を含めて、種々の成長状態で見いだされるような適切な成長因子に露出されると、成長を誘発させることができる。一定の病態的な状態の下では、そうした状態でなければ正常な細胞を望ましくない状態で増殖させることも可能である。糖尿病性網膜症にかかっている眼の、通常は休止状態にある繊維芽細胞の増殖は、細胞成長のそうした望ましくない誘発の事例である。措置しないままで置くと、増殖している繊維芽細胞は最終的には網膜にくっついて、その急速な剥離をもたらす。
p53蛋白質の活性化
Rb遺伝子の場合と同様、p53遺伝子の不活性化あるいは突然変異は腫瘍および非腫瘍細胞株においてしばしば観察されている。野生タイプのp53蛋白質も、それがSV40ラージＴなどのウイルス性抗原に結合した場合に、ネガティブに規制される。p53蛋白質は転写因子として機能し、特定のDNA配列に結合する。野生タイプのp53蛋白質のDNAに結合する能力は、それが適切に機能する上で極めて重要な役割を果たしている。変異体p53においては、その蛋白質の、特定のDNA標的配列に結合したり、転写を活性化させたりする能力が失われ、このことはこれらの活性がその蛋白質の抑制機能にとって重要であることを示唆している。しかしながら、p53蛋白質の配列特異DNA結合活性は奥が深いことが最近報告されている。新たに合成されたp53蛋白質は、その蛋白質が修正されない限り、それがその特定のDNA配列に結合できないという点では不活性である。修正を行う部位の１つはＣ−端末のアミノ酸残基365〜393である。この領域は、RNA分子集団の取り付く部位であると同時に、バクテリア性熱ショック蛋白質dnaKに結合する部位である。抗体Pab421の365〜389アミノ酸残基への結合は、それがその特定のDNA配列に結合するようにするためにその構成を変えることによって蛋白質を活性化させる。
pRbおよびp53の機能モードの差
Rbおよびp53は腫瘍サプレッサー遺伝子とみなされているが、その作用のモードは非常に異なっている。これまでにこれら２つの遺伝子が異なった経路で作用する可能性があることを示す証拠が提供されている。Rb遺伝子が存在しないマウスは胎児の段階で死に至るが、p53の存在しないマウスは、それらが癌を形成しやすい傾向を有しているものの、成長することができる。細胞レベルでは、p53を欠いている癌細胞は外因性p53が不在の場合でも、Rb遺伝子の過剰表現によって成長が休止されたり、遅らされたりすることがあり得る。一方、Rbを欠いている細胞はp53遺伝子による成長抑制効果の影響を受けやすい。分子レベルでは、p53およびRbは異なった蛋白質標的およびDNA配列と（直接および間接的に）相互作用する。
Rbおよびp53遺伝子の治療における活用
これら２つの蛋白質はその作用モードにおいては異なっているが、１つの側面では共通しており、実験的な条件の下でこれら２つの蛋白質の活発な形態を過剰表現すると、細胞の成長の抑止または遅延がもたらされる。細胞成長がpRbおよびp53などのサプレッサー遺伝子の表現によって制御され、そしてそれら蛋白質が機能するためには活発な形状であることが必要であることを考えると、遺伝子治療のためにはこれらの遺伝子がアクティブな形態であることが望ましい。pRbの場合、新たに合成された蛋白質は低ホスホリル化され、アクティブである。それらの細胞が成長因子に露出されると不活性化が起きる場合がある。アクティブな形態にとどまり、そしてホスホリル化による不活性化に対して抵抗性を示す変異体形態を持つことが望ましいであろう。p53の場合、新たに合成される蛋白質は、それが修正されない限りDNAに結合できないという意味では不活性である。遺伝子治療においては、その蛋白質がすでにさらに修正されなくても活性を示すp53遺伝子の変異体形態が更に望ましい。最後に、これら２つの蛋白質は異なった作用モードを有しているので、細胞を１つの成長抑制効果に対して抵抗性を持つようにするその突然変異または成長状態を他方の影響を受けやすくするようにするために、Rbおよびp53遺伝子の両方を組み合わせて用いることが望ましいであろう。
先行技術は、その遺伝子（蛋白質）を永続的に活性状態にして、その細胞が成長因子に露出された場合でも、機能できるようにするために突然変異される腫瘍サプレッサー遺伝子が欠如しているという意味で不十分である。より具体的にいうと、先行技術はp53およびRb遺伝子の有効で機能的な変異形態が欠如しているという意味で不十分である。先行技術は、また、野生タイプおよび／または変異体形態の癌性および非癌性増殖性疾患への同時適用においても不十分である。
発明の要約
１つの側面で、本発明は非癌細胞増殖性疾患および癌細胞増殖疾患において存在しているような不適切な、あるいは病態的な細胞成長の措置に対する一般的なアプローチを可能にする。より具体的には、本発明は突然変異した成長サプレッサー遺伝子および／または遺伝子生成物を投与することによって病態細胞増殖性疾患を措置する方法を提供する。
本発明の１つの実施例において、分離されたDNA分子が提供され、この場合、この分子は突然変異した成長サプレッサー遺伝子の機能的に活性化された形態、あるいは異なった変異体成長サプレッサー遺伝子の組み合わせである。
本発明の別の実施例において、網膜芽細胞腫あるいはp53遺伝子の機能的活性を有する変異体を含む新しいプラスミドが提供される。
本発明の更に別の実施例においては、治療的な目的のために、Rbおよびp53遺伝子の両方の野生タイプおよび／または活性変異体を連続的または同時的投与の方法が提供される。
本発明さらに別の実施例において、非癌性増殖細胞に対して突然変異したRb遺伝子および突然変異されたp53遺伝子を同時並列的あるいは連続的に投与するステップを含む病態的な細胞増殖性疾患を措置するための方法が提供される。
さらに、増殖している癌細胞に同時並行的または順次Rb遺伝子および変異p53遺伝子を投与するステップを含んだ、個人における悪性細胞疾患を措置する方法が提供される。
開示のために以下に提供される本発明の現段階での好ましい実施例を参照することにより、本発明の他の側面、特徴そして利点が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、ポリクローナル抗Rb抗体RB1−Ab＃18および＃20を用いて細胞蛋白質を免疫沈降させることによるpRbとp53との間の相同領域の発見を示している。
図２は、ポリクローナル抗Rb抗体RB1−Ab＃18および＃20を用いての細胞蛋白質の免疫沈降によるpRbおよびp53間の相同領域の確認を示している。
図３は、Pab421が不存在な場合の、P1,P3,P5変異体P53蛋白質の特定のDNA配列に結合する能力を示している。
図４は、変異体Rb蛋白質のホスホリル化パターンの２次元マッピング分析を示しており、（Ａ）はインビボでのラベルされた蛋白質、（Ｂ）はインビトロでラベルされた蛋白質を示している。
図５は、網膜芽腫蛋白質のSV40ラージＴ抗原への結合とホスホリル化による錯体の分離を示している。
図６は、２つの異なった形態のホスホリル化網膜芽腫蛋白質（SVラージ40Tに結合されたものと、そうでないもの）の２次元マッピング分析を示している。
図７は、異なった成長条件下での網膜芽腫蛋白質のホスホリル化パターンにおける変化の２次元マッピング分析を示している。
図８は、m89Rb変異体の正常な細胞WS1の成長を抑制する能力を示している。
図９は、m89Rb変異体の膀胱癌細胞株TCCSUPの成長を抑止する能力を示している。
本発明の詳細な説明
定義
“遺伝子の機能的表現”という用語は、遺伝子の転写の抑制、遺伝子転写（プレメッセージRNA）の劣化、スプライシングの抑止、メッセージRNAの破壊、メッセージRNAの翻訳の阻止、蛋白質の翻訳後修正の阻止、蛋白質の破壊、あるいは蛋白質の正常な機能の抑制を含む意味を有している。
“トレンスフェクトされたプラスミド”という用語は、任意の細胞に導入（トランスフェクト）されるべき変異網膜芽細胞腫あるいはp53遺伝子を含むバクテリア性プラスミドを含む意味を有している。
“遺伝子治療”とは、細胞、細胞のグループ、組織、病態病巣、器官、あるいは生物への、遺伝子表現および／またはその遺伝子生成物の機能の調節を目的とする、遺伝子、DNA構成、RNA、あるいは遺伝子生成物の全体その一部の挿入を意味する。
“予防的遺伝子治療”とは、疾患および疾患の広がりを部分的または全体的に抑止あるいは阻止するために用いることができる遺伝子を含むと同時に、細胞、組織、あるいは生殖系における不在、あるいは不良ネガティブ成長を補足あるいは代替するために用いることができる遺伝子を含む意味を有している。
“細胞増殖性疾患”という用語は、良性であるか悪性であるかを問わず、単一または複数の局部的な、細胞、細胞グループ、または組織の異常増殖によって特徴づけられる器官、空洞部、または身体部分のいずれか１部あるいはその組み合わせに影響を及ぼす、ヒトまたは動物の疾患あるいは不全を含む意味を有している。
“予防的”という用語は、本発明の組換え分子を表現するために、DNAで形質転換することができるすべてのバクテリアを含む意味で用いられている。
本発明によるDNA構成のために用いられるDNAは合成、またはいずれかの哺乳動物種から誘導することができる。必要なのは、真核または原核生物内でRbあるいはp53遺伝子のための遺伝子配列が機能的に表現されるということだけである。好ましいのは合成DNAである。
本発明によるDNA構成をコード表現する組換えDNA分子を用い、当業者に公知のいずれかの技術にしたがって、ホストを形質転換することができる。
溶融した、操作的に結合された遺伝子を作成し、それらをバクテリア内で表現させる方法は知られており、例えば、本明細書に引例として取り入れられている米国特許第4,366,246号に示されている。この特許に述べられている遺伝子構成および方法は本発明によるDNA構成の作成と真核または原核宿主へのトランスフェクションに用いることができる。
原核宿主としては、グラム陰性菌の他に、大腸菌、S.チムフイムリウム（tymphimurium）、セラチア  マルセッセンス（Serratia marcescens）およびバチルス  ズブチルス（Bacillus subtillis）などのグラム陽性菌がある。真核宿主にはピチアパストリス（Pichiapastoris）などのイースト菌あるいは哺乳動物の細胞がある。
一般的に、導入されたDNAフラグメントの効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含んだ表現ベクターがその宿主との関連で用いられる。表現ベクターは一般的には複製の出発点、プロモーター、ターミネータ、および形質転換された細胞において表現型の選択を行うことができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質転換された宿主は、当業者が知っている手段で発酵、培養され、最適な細胞成長を達成することができる。
本発明で用いることができるプロモーターの例としては、ヒトβアクチンプロモーター、メタロチオニンプロモーター、複製のSV40オリジン（origin）、MMTV  LTRプロモーター、およびMuLV  LTRプロモーターなどを含んでいる。本発明で用いることができるプラスミドまたはバクテリオファージの１部の例はManiatisら、Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratories,1982に示されており、その他は当業者に公知で、簡単に確認することができる。
遺伝子はその鋳型またはメッセンジャーRNAを通じて、特定のペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコード表現するDNA配列である。cDNAという用語は、そこから干渉性配列が除去された遺伝子を含んでいる。“組換えDNA"（rDNA）という用語は、cDNAまたはゲノム性DNA配列をインビトロでスプライシングすることによって組換えられた分子を意味する。
クローニング伝播体はプラスミドかファージDNA、あるいは、そうしたDNA配列が予め決められた方式で、そのDNAの基本的な機能を損なうことなく切断されるひとつまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位で特徴づけられ、そして形質導入された細胞の識別に用いるのに適しているマーカーを含んでいる宿主細胞において複製できる他のDNA配列である。このマーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性である。“ベクター”という用語はクローニング伝播体のために使われる場合もある。
表現伝播体はクローニング伝播体に類似した伝播体であるが、通常、ある種のコントロール配列のコントロールの下で、宿主において任意の構造遺伝子を表現できる伝播体である。
“個体”という用語は動物、およびヒトを含んでいる。
増殖細胞の成長を“生物学的に抑止する”、あるいはその“抑止”という用語は、成長の部分的、または全体的な抑止を意味し、そしてまた、細胞の成長または増殖の速度の低下を含む意味で使われている。本発明による変異体の生物学的に抑制効果を有する投与量は組織培養内での、標的とされる悪性の、または異常に増殖する細胞の成長、動物における腫瘍成長、および細胞培養、あるいはいずれかその他の当業者に公知の方法で、テスト要素の効果を評価することによって判定される。
ここで用いられる“保存相同領域”という用語は、表Ｉに示されているように、Rbとp53の間で相同のアミノ酸領域を示している。
本発明による蛋白質の投与は局所的でも、眼球内でも、腸外でも、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下注射でも、他のいずれか適した手段を用いてでも差し支えない。眼球疾患の措置のための好ましい投与法は眼球内あるいは眼球周辺注射である。皮膚細胞増殖性疾患の措置のための好ましい投与法は局所投与または皮下注射である。
別の実施例で、本発明のDNA構成物をその増殖性疾患の患部に直接投与しても構わない。眼球増殖性疾患の場合、本発明のDNA構成物をその眼球に直接注射しても構わない。本発明によるDNA構成物は、内部器官の患部、身体空洞部などにその患部に注射針を直接導くために用いられる画像装置を用いて直接与えてもよい。本発明によるDNA構成物は、また、外科手術時に患部に投与することもできる。
投与されるDNAの量は年齢、臨床ステージ、および疾患の程度、または、個体の遺伝的傾向、位置、体重、同時並行的に行われる措置があればその種類、そして、病態的または悪性状態の性質によって決められる。本発明による方法で有用な効果的伝達システムを、経口投与に適したカプセル、錠剤、溶液、懸濁液、あるいはエリキシル剤などの形態、あるいは、溶液、懸濁液、またはエマルジョンなどの無菌液体形態で用いることができる。食塩水、またはリン酸緩衝食塩水、あるいは本発明による方法で用いられる化合物が適切な可溶性を有する担体など、いずれかの不活性担体を用いてもよい。
好ましくは、眼球内への伝達、および他の局所的な患部への伝達のためには、本発明による方法で有用な伝達システムを、溶液、懸濁液、またはエマルジョンなどの無菌液体形態で用いてもよい。局所的な使用のためには、油剤、クリームまたは噴霧などの形態で用いてもよい。好ましくは、食塩水、リン酸緩衝食塩水あるいは本発明の方法で用いられる化合物が適切な可溶性を有するいずれかの担体など、不活性な担体の使用が好ましい。
細胞への局所的な投与は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクションなどを含む当業者に公知のいずれかの方法で行ってもよいし、リポソーム、リポフェクチン、あるいは裸のDNAまたはRNAなどの伝播体を用いて行ってもよい。本発明によるDNAはレトロウィルス性ベクター（Gilboa（1982）J.Virology 44:845;Hocke（1986）Nature 320:275;Wilsonら、Proc Natl Acad Sci USA 85:3014）、ワクシニアウィルスシステム（Chakrabartyら、（1985）Mol.Cell Biol.5:3403）または他の効率的なDNA伝達システム（Yatesら、（1985）Nature 313:812）など、当業者に公知の遺伝子伝達システムによって伝達することができる。これらの引例は説明のためにだけここに紹介するものである。異常に増殖し、非−分裂細胞には影響を及ぼさない細胞を特異的に伝達またはトランスフェクトするためには、当業者に公知のレトロウィルス伝達システムを用いるのが好ましい。レトロウィルスDNAが一体化するためには宿主DNAの複製が必要であり、そのレトロウィルスはそのライフサイクルに必要なレトロウィルス遺伝子を欠いているので自己複製することができないので、本発明においては、そうしたレトロウィルス伝達システムを用いて、該自己増殖性要素を異常に増殖する細胞を標的とするが、非−分割性の正常な細胞には何の影響も及ぼさない。
本発明による変異体蛋白質は生物学的に有効な担体に入れて投与することができる。生物学的に有効な担体はレトロウィルス、リポソーム、およびその他のいずれかの、外来蛋白質を細胞のゲノムに導入することができるトランスフェクションメカニズムを含んでいてもよい。そうしたトランスフェクションメカニズムは当業者に公知のものである。担体も、本発明による構成物が溶け込むことができ、投与された量で措置された個体または細胞に対して毒性を示さないいずれかの試薬または溶剤を含んでいてもよい。
措置されるべき病態細胞増殖状態
本発明による方法が治療的な利点をもたらす病態癌性および非癌性細胞増殖状態にはいろいろなものがある。これらの病態状態は異常な細胞増殖を起こし得るほとんどすべての細胞タイプで起こり得る。病態的、または異常な成長を示す細胞タイプには、（１）繊維芽細胞、（２）血管内皮細胞、および（３）表皮細胞がある。上記のことから、本発明による方法が、個体のすべて、あるいはほとんどすべての器官および組織システムにおける局所的あるいは分散病態状態の措置において有用であることが分かる。
例えば、眼だけを考えても、本発明による方法を用いて、正常な、良性の、あるいは悪性の細胞または組織の異常な増殖による広範な病態的疾患状態を措置することができ、それらの病態的疾患状態には以下のようなものが含まれる。眼の繊維芽増殖性、血管増殖性および／または新たに形成される疾患：思春期網膜症、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、毛細血管腫、コロイド性新血管網、網膜下新血管網、網膜下新血管形成による老年性暗斑変性、角膜新血管形成、表皮薄膜増殖による暗斑しわ、核硬化症による成人性白内障、外傷または手術後の繊維性内成長、光神経網腫、血管腫網膜、新血管性緑内障、洞穴血管腫、皮膚潮紅、鎌細胞増殖性網膜症、目の手術や外傷後の表示下方成長、そこひ後の膜、乳頭腫、サラセミアにおける網膜の新血管形成、弾力繊維性偽黄色腫、および神経繊維腫症タイプ１およびタイプ２、網膜芽腫葡萄膜黒色腫、および眼縁部の偽腫瘍。本発明が有用なその他の良性細胞増殖性疾患には、乾癬、魚鱗癬、乳頭腫、基底細胞悪性腫瘍、鱗状細胞悪性腫瘍、およびスティーブンス−ジョンソン症候群などがある。
一般的に、本発明はRb遺伝子および／またはp53遺伝子が骨肉腫、軟組織肉腫、黒色腫、繊維芽肉腫、網膜肉腫、乳房、膀胱、子宮頸部、肺、結腸、腎臓、膵臓および生殖器の悪性腫瘍などを含むあらゆる形態の癌に適用することができる。
pRbおよびp53間に保持されているコンフォーメイション決定領域
本発明は２つの腫瘍サプレッサー遺伝子生成物、Rbおよびp53のコンフォーメイションをコントロールしている保持された相同構造領域を開示しており、それによって、これらの遺伝子の変異体の創造とそれらを利用する方法を可能にしている。したがって、本発明単離されたDNA分子を提供する。この場合上記分子は変異された成長サプレッサー遺伝子である。この本発明による変異体成長サプレッサー遺伝子は細胞の増殖を抑制するものであれば、いずれであってもよい。本発明の１つの好ましい実施例において、この変異体成長サプレッサー遺伝子は変異体Rb遺伝子である。本発明の別の好ましい実施例においては、この変異体成長サプレッサー遺伝子は変異体p53遺伝子である。
pRbとその細胞標的との間の相互作用を理解する試みとして、Rb蛋白質の種々の親水性領域に対する抗体を発生させた。Rb蛋白質の異なった領域は異なった蛋白質と相互作用するので、抗体の１部が、それらの相互作用に干渉することなくRb蛋白質とその標的との間の蛋白質錯体をもたらすように、多くの異なった領域に対する抗体を発生させることが必要であった。種々の親水性領域に対応する配列を有する合成ペプチドに対して発生させられた１群のポリクローナル抗Rb−抗体のうちで、２つ（Rb1−Ab18およびRb1−Ab20）は、一貫して、Rb蛋白質に加えて、分子量が53KDの蛋白質をもたらした（図1A,レーン1,2,8および９）。これら２つの抗体は同じ合成ペプチド、p5に対して発生することが分かった。53kD蛋白質の出現は、p5に対して発生した抗血清に固有のものである。他の領域に対して発生した抗血清、例えば、Rb1−Ab  Ｂ（図１、レーン４〜５）およびRb1−Ab  Ｃ（図１、レーン６〜７）は、Rb蛋白質を識別するものの、上記53kD蛋白質を免疫沈降させなかった。この蛋白質の分子重量とp53のそれとの類似性から、これはp53蛋白質自体であるように思われる。p53に対するモノクローナル抗体であるPab122によるこれらの細胞株の免疫沈降を行った結果、p53が実際に上記53kD蛋白質（レーン10）とまったく同じ分子量を有していることが示された。さらに、p53がPab122によって細胞溶解物から最初の除去されると、Rb1−Ab18あるいはRb1−Ab20のいずれも、Rb蛋白質を免疫沈降させることはできるものの、この53kD蛋白質を免疫沈降させることはできない（レーン11）。さらに、この53kD蛋白質が実際にp53であることを確認するために、内発性p53および／またはRb蛋白質を表現しないいくつかの細胞系で免疫沈降を行った。すべての場合（レーン12〜20）で、この抗体は実際にこれらのp53遺伝子の存在、不存在にしたがって、p53蛋白質を識別することができる、さらに、p53の免疫沈降はRb蛋白質の存在、あるいは不存在とは無関係であり、このことは、錯体が形成されなかったこと、およびp53蛋白質が直接これらの抗体によって識別されなかったことを示唆している。
このp53蛋白質がRb蛋白質との共通の抗原領域には影響を及ぼさないことを明確に示すために、Rb蛋白質のP5領域に対応するp53蛋白質のアミノ酸配列の調査が行われた。これら２つの蛋白質およびP5ペプチドにおける３次元構造状態が入手されれば、p53蛋白質の対応する領域についても明らかになる可能性がある。さらに、この保持された抗原領域を有するペプチドはRB1−Ab18またはRB1−Ab20によって、p53の免疫沈降を阻止するはずである。Rb1−Ab12によるRbおよびp53の免疫沈降（図2A）が、いろいろな量のこれらのペプチドが存在している状態の下で行われた。そうしたp53ペプチドの１つであるF19は、テストされた（図2A、レーン12〜14）最低の濃度（10ug/ml）でRb1−Ab18によるp53の免疫沈降を阻止した。これは沈降を阻止するために用いられたRbペプチドp5と同じ濃度であった（レーン１および２）。対照的に、他のすべてのp53ペプチドは50〜100倍の濃度が用いられても、Rb1−Ab18によるp53の免疫沈降を阻止することはできなかった（レーン３〜11）。
p5およびF19だけがRbおよびp53蛋白質間の構造的相同性を示す領域ではない。少なくとも２つの他の領域が目視調査およびコンピュータ調査によって確認された。比較のために、Rbおよびp53の相同領域を表Ｉに示した。
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これらの領域は短いように見えるが、pRbとp53間で相同のこれらアミノ酸はp53内で最も進化した形で（evolutionarily）保持されているものである（異なった種でのRbの配列に関するデータは入手できていない）。この２つの成長サプレッサー蛋白質間の相同性の程度が高いことは、これらの領域が重要な機能を有している可能性を示唆している。図2Bに、pRbとp53上でのこれら相同領域の位置について示す。p53において、これら３つの領域すべてがこの蛋白質のＣ−端末に集まっており、pRbにおいては、領域１と３がＮ−端末に半分集まっており、P5領域はＣ−端末に半分集まっている。しかしながら、p53とpRbの両方で、これら３つの領域はすべて、その蛋白質の抑制機能にとって重要であることが分かっている領域の外側に位置している。これらの領域がその抑止対象との物理的な相互作用に関与していないのであれば、それらは相互作用プロセスの調節に関与しているのかもしれない。予想外の細胞成長を抑止するためには活性のあるRbおよびp53を有することが重要であるのと同様、細胞を増殖できるようにするためには、その活性を下方規制する手段を有することが重要である。これら２つの成長サプレッサー遺伝子においては、保持された領域の生成物がその調整された規制機能を実現している可能性がある。実際、以下に示されるように、これら相同領域はこの２つの蛋白質のコンフォーメイションを決定する領域を形成するように思われる。特に、この領域がこれら３つの領域のいずれか１つの保持されているアミノ酸残基（上の表Ｉで下線を付したもの）で突然変異によって切断されると、これら２つの蛋白質にアクティブはコンフォーメイションが導入された。対照的に、これらの領域の保持されないアミノ酸での変異は何の影響も及ぼさなかった。
P1,P3,P5領域はp53のコンフォーメイションとそのDNAに結合する能力をコントロールしている
転写を活発化させるp53の能力はそのDNAに結合する能力を密接に関連している。癌細胞株に見いだされる変異体p53はDNAに結合することができず、転写を活発化させることもできない。p53蛋白質は抗体Pab421の存在下で特定のDNA配列と結合することができる。Pab421のエピトープを詳しく検査したところ、それがP3領域と重なり合っていることが分かった。Pab421によって認識されるエピトープ（図３参照）はP3領域における最後の４つのアミノ酸残基である。このP3領域全体を抗体（Pab421）でブロックすると、この蛋白質のコンフォーメイションがかなり変わり、p53が特定のDNA配列と結合することが可能になるようである。このDNA結合アッセイは、したがって、p53蛋白質のコンフォーメイションのコントロールにおけるP3およびその他の相同領域P1およびP5をテストするための簡便な手段を提供する。図３に示されているように、野生タイプのP53はその特定のDNA配列に結合することはできなかったが（レーン１）、それは抗体Pab421の存在下では結合する（レーン２）。p53のP1（レーン３）、P3（レーン５および７）またはP5（レーン９）領域のいずれかの保持されているアミノ酸が突然変異された場合、その結果できるp53変異体蛋白質はPab421の不存在下でもDNAに結合することができた。その結果できる錯体はPab421に結合するとスーパーシフトされた（P1,P3,P5に関してレーン４、８および10をそれぞれ）。このスーパーシフトは、これらの変異体におけるP3領域がまだそれらの抗体に結合できること、およびPab421の不存在下でのその変異体のDNAに結合する能力はP3領域での突然変異によるものではないことを示している。実際、これらＣ−端末領域外での抗体Pab1801の結合によって、この錯体のスーパーシフトも可能になった。レーン７および８に用いられた変異体はP3領域の最初の４つのアミノ酸残基で突然変異され、そのことはPab421のその蛋白質に対する結合には影響を及ぼさない。レーン５および６で用いられた変異体はP3領域の最後の４つの残基の保存アミノ酸で突然変異され、これによって蛋白質に対するPab421の結合がなくなった。保持されないアミノ酸での変異は何の影響も及ぼさず、蛋白質の挙動は基本的に野生タイプのものと同じであった。したがって、変異体p53蛋白質のコンフォーメイションは、相同領域が突然変異によって破壊されると、活発な形態に変化する。
相同領域で変異されたRb蛋白質のホスホリル化のコントロールにおける変移
pRb蛋白質の活性のあるコンフォーメイションと活性のないコンフォーメイションとを区別するためにはいくつかの方法がある。活性のあるRb蛋白質は低ホスホリル化され、その細胞の成長を抑止することができる。不活性なRb蛋白質はかなりホスホリル化される。相同領域がpRbの活性および不活性コンフォーメイションに影響を及ぼす場合、P1,P3,P5での突然変異はその蛋白質の細胞成長および本発明を抑制する能力に影響を及ぼす。pRbのP1,P3およびP5領域は保存されるアミノ酸残基によって個別に変異して、その細胞成長を抑止する変異体の能力について調べた。すべての変異体はトランスフェクトされた細胞の成長を抑止することができた。P5領域の保存されるアミノ酸残基で変異されたRb変異体m89−０の、正常な細胞および癌細胞の成長を抑止する能力を以下の２つの例で示す。pRbの活性はホスホリル化によって規制されるので、保存される領域が不活性なコンフォーメイションにおけるpRbの維持の役割を果しているならば、P5の突然変異はその蛋白質を活性化するような変異体pRbのホスホリル化に影響を及ぼすはずである。RB−１の両方の対立形質の突然変異の故にpRbの表現を欠いている細胞株があり、これらの細胞株は、それらをトランスフェクトされたRb遺伝子の抑止効果に対して抵抗性を持たせるようにする他の突然変異も起こした。子宮頚部悪性腫瘍細胞株C33AおよびSaos−２のサブポピュレーションはそうした細胞株の２つの事例である。これらの細胞株はしたがって、それら変異体蛋白質を表現させ、それらの細胞が成長しつづけられるようにし、本発明状態の検査のためにその蛋白質を豊富な量で抽出できるようにする。P5領域の保存されるアミノ酸残基で変異されたP5変異体HuβAcPr−１−neo−P5Cは、したがって、これらの細胞にトレンスフェクトされ、１回の細胞精製によって安定した細胞株が得られた。精製された細胞株Saos−２＃89から分離された変異体pRbのホスホリル化パターンを野生タイプのRb−トランスフェクトおよび精製細胞株Saos−２＃84から抽出された野生タイプのpRbのそれと比較した。ＳフェーズSaos−２＃84（野生タイプ）およびSaos−２＃89（変異体）のpRbの免疫沈降は、野生タイプのpRbがかなりホスホリル化されたのに対して、変異体pRbは僅かしかホスホリル化されなかったことを示した。このことは、P5変異体pRbが、それらの細胞がＳフェーズにあってもアクティブはコンフォーメイションの状態にとどまっていることを示唆している。したがって、P5変異体は特定部位でのホスホリル化に対して抵抗できるコンフォーメイションを有していると考えられる。なお、この蛋白質は他の機能的に重要でない部位ではホスホリル化された。
SDS−PAGEによる１次元分析は、その蛋白質が低ホスホリル化されることだけを示し、そのホスホリル化の性質は明らかにしないので、２つのことなったプロテアーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンを用いた32PでラベルしたpRbの２次元ホスホペプチド分析を行った。２−Ｄマップを比較したところ、この変異体には野生タイプとは対照的に、一貫してホスホリル化されない部位S10aおよびS10bが存在することが分かった（図4A参照）。ホスホリル化による相違がインビボでの酵素活性の差ではなくそれら蛋白質のコンフォーメイションの内在的な差によるものであることを示すために、それら蛋白質のインビトロでのホスホリル化パターンを比較した。野生タイプおよび変異体pRbはサイクリンと結合したキナーゼを含むキナーゼ製剤を用いてホスホリル化された。このキナーゼに対する抗体はホスホリル化を阻止するので、インビトロでのラベリングはサイクリン結合キナーゼに基づいて行われた。インビトロでホスホリル化されたpRbを二次元ペプチドマッピングを用いて分析した結果、図4Bに示すように、この変異体では同じホスホリル化部位は用いられなかった。したがって、豊富な量の酵素を供給し、野生タイプのrPbが完全にホスホリル化される最適のホスホリル化条件を用いても、変異体pRbは本発明部位S10aおよびS10bに対して完全に抵抗性を示した。したがって、S10aおよびS10bのホスホリル化における偏差はインビボでの酵素の特異性の偏差によるものではなく、野生タイプおよび変異体蛋白質におけるコンフォーメイションの内在的な偏差によるものである。
相同領域で突然変異したRb蛋白質は活性形態であることの実証
（Ａ）S10aおよびS10bでのホスホリル化とpRbの活性との間の相関性
以下に示すデータは、S10aおよびS10bにおける偏差が、pRbのSV40ラージＴ抗原の能力と相関性があることを示している。インビトロでのホスホリル化を調べるために、その内部でポリヘドリン遺伝子がRb遺伝子と部分的に取り替えられている組換えRb−バクロウィルスで感染されたSF9細胞から分離された。高感染タイター条件の下で、抽出されたRb蛋白質の大部分はホスホリル化によってSV40ラージＴによって結合することができなくなったが、Rb蛋白質の小部分は依然としてラージＴに結合できた。この結合を図５に示す。Rb蛋白質およびSV40ラージＴはインビトロで対応するバックロウィルスおよびキナーゼによって感染されたS35でラベルされたSF9細胞から得られた。レーン１は抽出されたRb蛋白質が低ホスホリル化された形態と高ホスホリル化された形態で構成されており、１部の蛋白質はラージＴに結合していることを示している。ラージＴはRB蛋白質の低ホスホリル化形態にだけ結合することができた（レーン２およびレーン３）。種々の量のRbキナーゼによるラージT:Rb錯体のホスホリル化（レーン３−６）によって、Rb蛋白質の大部分がラージＴから解放された。この形態のRB蛋白質はRB−Ｅ（Ｅ＝露出された重要な部位）と呼ぶことができる。しかしながら、Rb蛋白質の20〜30％（RB−Ｈと呼ばれる部分）（Ｈ＝隠れた重要部位）はラージＴに固く結合したままで、錯体全体を抗ラージＴ抗体にすることができた。最も重要なことは、Rbキナーゼを増やすとRb蛋白質をその最も遅い速度でミグレートする形態にホスホリル化することができたが（レーン４〜６とレーン８〜10を比較）、高ホスホリル化されたRb蛋白質はラージＴに結合したままだった。これらのRb蛋白質の免疫沈降は蛋白質Ａへの非特異性吸着によるものではないということは、レーン６をレーン２と比較すれば分かる。Rb蛋白質の70％程度はラージＴから放出された。この放出されたRb蛋白質がその蛋白質の非特異性変性によるものでないことは、その反応が抗−Rb抗体によって行われるのであれば、すべてのRb蛋白質を（レーン8,9および10に示されているように）考慮に入れねばならないという事実によって示されている。種々の形態のRb蛋白質のラージＴに結合する能力もレーン8,9および10に示されており、Rb蛋白質によって少量のラージＴによってもたらされている。
これらの結果はRb蛋白質に２つのタイプのホスホリル化部位が存在しており、その一方が、それがラージＴに結合できなくなるようにRb蛋白質を不活性化する上で極めて重要であり、一方、他方はその結合に影響を及ぼすことなくホスホリル化できるという事実と一貫している。Rbキナーゼ錯体の場合、ホスホリル化が可能な部位（S/TPXX）が17か所ある。これらホスホリル化部位がRb蛋白質の不活性化によって重要な役割を果していることを示すために、SV40ラージＴに結合したままのRb蛋白質（RB−Ｈ）とホスホリル化後SV40ラージＴを含んでいないもの（RB−Ｅ）に関して２−Ｄマッピング分析を行った。ラージＴからのRbの切り離しがホスホリル化の結果であるならば、これら２つのRb蛋白質の形態の間で、ホスホリル化部位に違いがあるはずである。図６に示されているように、S10aおよびS10bはラージＴ蛋白質に結合したままのpRbではホスホリル化されないことが分かった。
P5領域の保存されるアミノ酸での突然変異はその蛋白質を活性を有するコンフォーメイションにする。S10aおよびS10bでのホスホリル化は細胞サイクルに伴うものであり、その細胞の増殖能力と相関性を有している。
（Ｂ）pRbのS10aおよびs10bでのホスホリル化と細胞成長条件との間の相関性
以下に示すデータは、S10aおよびS10bでのホスホリル化における偏差が細胞サイクルに依存した形で行われることを示している。
正常であれ、癌性のものであれ、細胞をTGFβに露出すると、成長の休止にむすびつくことが多かった。細胞成長の抑制におけるpRbの役割は、上にも述べた。pRbのホスホリル化におけるTGFβの役割を理解するために、TGFβによる措置で成長を休止させることができる乳房悪性腫瘍細胞株MDAMB231を用いた。これら細胞の増殖状態をトリチウム含有チミジン摂取でモニターし、32PでラベルしたpRbのホスホリル化パターンを２−Ｄマッピングで分析した。重要なことであるが、TGFβによって成長休止された細胞のpRbはS10aおよびS10bでホスホリル化されなかった（図７参照）。しかしながら、それらの細胞がTGFβから放出されると、S10aおよびS10bは再びホスホリル化された。したがって、成長休止細胞でアクティブなpRb蛋白質はS10aおよびS10bでホスホリル化されなかった。この可逆性ホスホリル化がTGFβの成長抑止効果だけに特異的に示されるものではないということは、S10aおよびS10の同様のホスホリル化パターンが血清を奪うことで成長休止された細胞から分離されたpRbでも観察されたという事実によって示されている。血清かあるいは成長因子を再び提供すると、S10aおよびS10bが再びホスホリル化された。加えて、レチノ酸で成長休止された細胞から分離されたpRbではS10aおよびS10bはホスホリル化されなかった。したがって、pRb蛋白質で機能的に重要な役割を果しているS10aおよびS10bは異なった成長条件の下で可逆性ホスホリル化を受けることができるのである。
Rb遺伝子およびp53遺伝子の変異体
このように、pRbとp53の両方の場合に、相同領域の突然変異はそれらをアクティブにするコンフォーメイションを持つと考えられる蛋白質をもたらした。コンフォーメイション的に活性を有するRbおよびp53の変異体の事例、および細胞成長の抑止におけるその使用を以下に示す。Rb蛋白質に関しては、２つのタイプの変異体について述べる。（１）規制または相同領域における変異体、および（２）ホスホリル化部位における変異体。p53蛋白質に関しては、相同領域の変異体について述べる。
Rb遺伝子の変異体
ホスホリル化されたRb蛋白質のホスホアミド酸分析の結果、アミノ酸セリンおよびスレオニンはホスホリル化されることが分かった。Rb蛋白質には79セリンおよび55スレオニン残基が存在する。これらのうち、17はcdc2キナーゼに対してホスホリル化の可能性を有する部位であるモチーフ（S/TPXX）に見出される。cdc2キナーゼ、および関連するキナーゼはRb蛋白質をホスホリル化できることが分かっている。
Rb蛋白質には２つの種類のホスホリル化部位があって、それがラージＴに結合しないようにRb蛋白質の不活性化に重要な役割を果し、他方がその結合に影響を及ぼすことなくホスホリル化されるようである。Rbキナーゼ錯体に関しては少なくとも17のホスホリル化が可能な部位（S/TPXX）が存在しているので、そのいくつかはRb蛋白質の不活性化に重要な役割を果している可能性がある。これら17のホスホリル化部位はT005,S230,S249,T252,T356,T373,S567,S608,S612,T773,S780,S788,S795,S807,S811,T821,T826で、ここでＴおよびＳはそれぞれスレオニンとセリンとを意味しており、その後に続く数字はRb領域内のアミノ酸の残基番号を示している。
変異された網膜芽細胞腫遺伝子は、好ましくはいずれもホスホリル化される蛋白質の能力に影響を及ぼす２つの異なった方法の１つで変異される。第１の方法として、遺伝子はRb遺伝子の保存される相同領域のアミノ酸を変化させることによって変異される。好ましくは、Rb遺伝子の保存される相同領域は、これまでに述べられるように、P1,P3およびP5で構成されるグループから選択される。変異されたRb蛋白質に関するコード表現をする変異されたRb遺伝子の代表的な例は、配列ID番号No.1および２に示してある。蛋白質のホスホリル化にとっての保存される相同領域の知識を有する当業者なら、他の望ましい変異されたRb蛋白質に関するコード表現を行う他の変異されたRb遺伝子を簡単に構成することができるであろう。
ホスホリル化と、したがってRb蛋白質の不活性化を防ぐための第２の方法は、ホスホリル化部位におけるアミノ酸を変化させることによって変異される。好ましくは、ホスホリル化部位はT005,S230,S249,T252,T373,S567,S608,S612,T773,S780,S788,S795,S807,S811,T821,T826で構成されるグループから選択される。上記のホスホリル化部位に関する略号で、Ｓはセリン、Ｔはスレオニンを意味し、数字はRb蛋白質の配列におけるアミノ酸の場所を示している。ここで開示されているホスホリル化変異体に関しては、スレイニンまたはセリン残基のそれぞれが個々のプラスミド内でアラニンに変異された。前にも述べたように、少なくとも２つの種類のホスホリル化部位があり、その１つはpRbの不活性化にとって機能的に重要な意味を持っている。したがって、上に述べたようにつくられた１つまたは複数の変異体は変異体pRbのホスホリル化を不能にして、その不活性化を阻止する筈である。
本発明の他の実施例で、変異されたRb蛋白質をコード表現するDNAで構成されるプラスミドが提供される。加えて、配列ID番号No.1の変異されたRb蛋白質に関するコード表現を行うDNAとその細胞におけるcDNAの表現のために必要な規制要素で構成された組換え細胞における表現に適したプラスミドと、配列ID番号No.2の変異されたRb蛋白質に関するコード表現を行うDNAと、その細胞におけるcDNAの表現のために必要な規制要素とで構成されたプラスミドが提供される。
p53遺伝子の変異体
本発明の別の実施例で、変異された成長サプレッサー因子は変異されたp53遺伝子である。好ましくは、p53遺伝子はp53遺伝子の保存される相同領域内のアミノ酸（表１で下線を付したもの）を変化させることによって変異される。同様に、p53遺伝子の保存される相同領域はP1,P3およびP5で構成されるグループから選択される。変異体はP1,P3またはP5のいずれか１つ、またはいずれかの組み合わせ（これら３つの領域すべての組み合わせを含む）突然変異で構成することができる。加えて、Ｃ−端末アミノ酸残基295〜393が消去された変異体は、特定のDNA配列への結合では依然として活性を示した。
細胞成長の抑止のためのpRbおよびp53変異体の利用
本発明はまた、変異されたRb蛋白質をコード表現する請求項１の分離されたDNA分子で構成されるトランスフェクトされた細胞など、新しいトランスフェクトされた細胞も開示している。また、本発明によって、変異されたRb蛋白質に関するコード表現を行う変異されたRb蛋白質を表現する安定的にトランスフェクトされた細胞も提供される。好ましくは、本発明によるトランスフェクトされた細胞は配列ID番号No.1または配列ID番号No.2に示されている変異されたRb蛋白質に関するコード表現を行う核酸配列で構成される変異されたRb遺伝子を含んでいる。加えて、本発明はまた、変異されたp53蛋白質をコード表現する変異されたp53遺伝子を表現する安定的にトランスフェクトされた細胞を提供する。
本発明はまた、非癌性増殖細胞への変異された成長サプレッサー遺伝子のDNA分子の投与ステップを含む病態的細胞増殖性疾患の措置のための方法を提供する。１つの実施例で、投与される分子は、変異されたRbまたはp53遺伝子である。この遺伝子はRb遺伝子の保存される相同領域内のアミノ酸を変化させることによって変異されるか、あるいはその遺伝子はホスホリル化部位内のアミノ酸を変化させることによって変異される。保存される相同領域およびホスホリル化部位は上に述べたのと同様である。
一般的に、この方法はどんな細胞増殖性疾患を措置するためにも用いることができる。非癌性細胞増殖性疾患の代表的な事例としては乾癬、良性増殖性皮膚疾患、魚鱗癬、乳房腫、基底細胞悪性腫瘍、鱗状細胞悪性腫瘍、繊維増殖性疾患、血管増殖性疾患、および皮膚増殖性疾患などがある。
本発明はまた、増殖中の癌細胞への変異されたRbまたはp53遺伝子のDNA分子への投与ステップを含む、個体における悪性細胞疾患を措置する方法を提供する。これらの変異された遺伝子は上に述べたように構成される。
一般的に、悪性細胞疾患を阻止するための上記方法は、非−癌性細胞増殖性疾患の措置と類似している。増殖する癌細胞によって引き起こされる疾患の代表的な事例としては、骨肉腫、繊維芽細胞腫、乳房の悪性腫瘍、膀胱、子宮頸部、肺、結腸、卵巣、腎臓、膵臓、および生殖器の疾患などを含む。
本発明による方法によれば、広範な種類の細胞増殖性疾患における、異常な＊p1319X増殖を阻止、または抑止するために、変異体Rbまたはp53蛋白質を導入することによって細胞性増殖性プロセスを操作することができる。増殖プロセスの操作は標的の増殖中の細胞に変異体Rbまたはp53蛋白質要素をコード表現するDNA構成を導入することによって達成される。
本発明はまた、増殖中の細胞に変異されたRbまたはp53遺伝子を投入するステップを含む局所細胞増殖性疾患を措置するための方法を提供する。一般的に、増殖中の細胞は眼における繊維増殖性、血管増殖性、および新形成性疾患などの代表的な疾患の原因となる必要がある。
別の実施例においては、Rb遺伝子のホスホリル化部位は細胞に導入される前に変異化される。Rb蛋白質には17のホスホリル化部位が存在する。Rb  cDNA内のセリンまたはスレオニンコード表現配列のアラニンまたはバリンその他への変異は、したがって、ホスホリル化によって不活性化されない永続的に活性を有するRb蛋白質の生産をもたらす。つまり、宿主細胞はホスホリル化によってRb蛋白質を不活性化することができなくなる。そうした変異されたRb遺伝子を細胞に導入すると、成長休止がもたらされる。これらすべての変異体はヒトβ−アクチンプロモーターベクターにサブクローンされている。Rb  cDNAをサブクローンするためには、全体的にオープンな（entire open）リーディングフレームが５′端にBamH1部位CGGATCCGCGTCを含む合成リンカーおよび３′端にAATAAAおよびBamH1を含む合成リンカーに結合された。その結果できるBamH1フラグメントはベクターのBamH1部位にサブクローンされ正しい方向性を有するクローンが選択された。
実施例１
p5変異体m89−０およびm88−０の調製
m89−０変異体をつくるために、変異される領域′P5′を含むDNAオリゴヌクレオチドプライマーの対（Pm1とQM1）と、領域′５′の両側に隣接するオリゴヌクレオチド（P3およびQ3）の対を、メーカーの指示にしたがってAB1  PCR−メイトオリゴヌクレオチドシンセザイザーを用いて合成された。野生タイプのRb  cDNAをテンプレートとして用い、プライマーP3およびQm1を用いて、ポリメラーゼチェーン反応（PCR）を40サイクル行った。第２のチューブでは、プライマーPm1とQ3を用いてポリメラーゼチェーン反応が40サイクル行われた。反応の完了後、少量の反応生成物を第１のチューブから取り出して、過剰なP3プライマーの存在下で、PCRを80サイクル行った。同様に、過剰なQ3プライマーの存在下で、第２のチューブでPCRを80サイクル行った。これら２つのチューブからの基本的に優勢な単一鎖反応生成物を組み合わせ、プライマーが20サイクル延長するようにされた。その結果できる、変異されたP5領域を含んだ二重鎖生成物をMlu  １およびHind  ３部位でRb表現プラスミドHuBAcpr−１−neo−PQ（m89−０）にサブクローンした。その結果できるプラスミドは以下に示す変異されたP5領域を有している。ここで、変異されたアミノ酸には下線を付してある。K870およびH890はそれぞれRb蛋白質の位置870および890に存在するリシンおよびヒスチジンアミノ酸残基を意味している。m88−０も同様につくられた。
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実施例２
ヒト腺維芽細胞系におけるトランスフェクトされたプラスミドの効果
変異体m89−０を正常なヒト繊維芽細胞系WS1にトランスフェクトされた場合の、細胞成長に対するRBcDNAの効果を観察した。SV40ラージＴ抗原に関する遺伝子をトランスフェクションのコントロールとして用いた。次に、トランスフェクションの影響をモニターするために、SV40ラージＴ抗原およびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドpPVUO−Neoをトランスフェクトした。加えて、不活性変異体形態のRb遺伝子、“HuβAcpr−１−neo−P16"をコントロールとして用いた。トランスフェクションを行うために、エレクトロポレーションチェンバー装置Cell−PoratorTM内で、最終体積が0.8mlのRPM1  1640媒体（Gibco）＋10％FCSとなるように、プラスミドDNAのそれぞれを100ugずつWS1細胞と混合した。エレクトロポレーションが200ボルトおよび1180uFで行われた。エレクトロポレートされた細胞は室温で10分間回収され、その後、RPM1  1640＋10％仔ウシ胎児血清（FCS）内で希釈され、60mm皿内に、２×104細胞/cm2の細胞密度で入れられた。これらの細胞は２日間、同じ培養液内で付着、成長されるようにされた。その後、培養液はRPM1  1640＋10％FCS＋15ug/ml  G418（GIBCO）に変えられた。３日に１度ずつ、ウサギポリクローナル抗Rb蛋白質抗体RB1−ABA1（図8A）か、あるいはマウスモノクローナル抗SV40ラージＴ抗原抗体Pab101（図8B）のいずれかを用いた組織免疫化学染色を行うために複製皿を取り出した。図8Aから分かるように、G418培養液内でのトランスフェクションおよび選択から13日後に、トランスフェクトされたRb  cDNAプラスミドm89−０を表現しているWS1細胞は、抗Rb蛋白質抗体で強度に染色された。しかしながら、Rb蛋白質を表現した細胞は単一細胞のままにとどまり、分裂しなかった。対照的に、トランスフェクトされたSV40ラージＴ抗原（SVLT）は図8Bのマウス抗SVLT抗体でポジティブの染色された細胞のグループと同様、コロニーに分裂し続けた。したがって、細胞でm89−０  Rb cDNAが高表現されると、正常な細胞WS1の細胞成長は完全に休止した。不活性な形態のRb  HuβAcpr−１−neo−P16でトランスフェクトされた細胞は抑制されず、コロニーに分裂した。
実施例３
ヒト膀胱悪性腫瘍細胞株TCCSUPに対するトランスフェクトされたプラミドの影響
変異体m89−０およびHuβAcpr−１−neo−P16プラスミドも、上に述べた手順で、内発性Rb蛋白質を持っていないヒト膀胱悪性腫瘍細胞にトランスフェクトされた。用いられたプラスミド、トランスフェクションおよび免疫染色の方法は上に述べたのと同様である。
図9Aに示されているように、トランスフェクトされたm89−０  cDNAを表現する細胞は分裂できなった。対照的に、トランスフェクトされたHuB Acpr−１−neo−P16を表現する細胞は分裂してコロニーを形成した（図9B）。m89−０  Rb  cDNAの過剰表現はインビトロでの腫瘍細胞の成長をかなり遅らせた。
実施例４
Rbとp53間で相同領域での変異体に加えて、p53蛋白質における変異。表IIは野生タイプp53の部分的なアミノ酸配列と、作成された保存されるアミノ酸変異体を示している。さらに、表IIは上記変異体アミノ酸配列に対応するDNA配列を示している。変異体を作成するために、２つのプライマーを合成して、同時にアニールした。上に述べたようにPCRを実行した。上に示す通り、変性P1,P3およびP5領域はp53蛋白質のコンフォーメイションを変化させ、その標的DNA配列に直接結合できるようにさせた。
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実施例５
変異体Rb遺伝子を含んだ組換えレトロウィルスの発生
変異体Rb＃89のコーディング領域全体を含んでいるHind  III/Bam  H IフラグメントをレトロウィルスベクターのHind  III/Bg III部位にサブクローンする。その結果作成されるプラスミドは細胞株Psi−２にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞を培養するために用いられる媒体は別の細胞株PA317に感染される。組換えウィルスをつくりだす細胞がG418で選択され、培養液から集められたレトロウィルスが濃縮され、蔗糖勾配を通じて精製される。p53遺伝子の変異体も同様の方法でテストされる。
実施例６
眼における細胞増殖へのG1NaSvRb89の影響
ウサギにおける実験的な増殖性硝子体網膜症（PVR）をウサギ線維芽細胞の注射と極部的に傷をつけることで誘発する。この手順は、縁に傷をつけて、２×105ウサギ繊維芽細胞を一般的な麻酔状態の下で硝子体に注射するステップを含んでいる。手術後、ウサギに局所軟膏を含む抗生物質が投与される。
変異体Rbまたはp53遺伝子を含んだ組換えレトロウィルスを一般的な麻酔状態の動物の硝子体に注射する（２×105細胞／ウサギ）。最初に、ウィルスの最大投与量（用いられるウィルスの濃度、およびウィルスの注射量）を評価することによって、ウィルスの局所的許容量についてのテストを行う。レトロウイルスをマウスの網膜下に注射しても副作用が起きないことについては、すでに報告されている（TurnerおよびCepko,Nature 328:132,1987）。副作用を起こさない最大投与量をその後のすべての措置において用いる。
インビボでの細胞の成長を写真で観察する。網膜剥離の程度を１−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んだレトロウィルスだけが注射されたコントロールと比較する。さらに、インビボでの細胞の成長をブロモデオキシウリジンでガラス内にラベルすることによって観察する。安楽死させる１時間前に、増殖細胞にラベルするためにウサギに50mg/kg BrdUを注射する。安楽死後、BrdUへの抗体による免疫染色によってそのDNAにBrdUが組み込まれているかどうかについて分析する。同時に、Rbまたはp53蛋白質あるいは１−ガラクトシダーゼ蛋白質に対する抗体によるそれら細胞の免疫染色を行って、感染の効果についての評価を行う。
レトロウィルスが注射された細胞の成長を抑止するための最適時間について、PVRの誘発後の種々の時間にウィルスを注射することによって評価する。ウサギ繊維芽細胞腫における感染効率への硝子体の影響についても判定する。ウサギの繊維芽細胞腫へこれらウィルスを付加するための時間的な遅れについての判定も行う。成長速度を速めるために繊維芽細胞腫成長因子で刺激を与えたウサギ繊維芽細胞腫へこれらのウィルスを付加するための時間的遅れについての判定も行われる。
本明細書に述べられているすべての特許および公開資料は本発明が関連する分野の当業者には理解できるレベルのものである。すべての特許および公開資料は、各個別資料と同程度に、本明細書中に引例として組み込まれるものである。
本発明がここに述べられている目的を実行し、課題、利益を達成すると同時に、それらに本質的に付随した目的、課題、利益の達成によく適合していることは、当業者なら容易に分かるであろう。本実施例は、ここに述べられている方法、手順、措置、分子、および具体的な化合物と同様、現在の段階で好ましい実施例であり、説明のために例示されているものであって、本発明の範囲の限定を意味するものではない。その変更、他の利用法などは、特許請求の範囲に定義されている本発明の精神の範囲に含まれる技術に通じている人には容易に想起されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図５】
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【図４Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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