(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）  上（14）および下（16）表面を有する自己支持型基材（12）を含む母材（11）と、
（b）  基材（12）の上表面（14）に塗布され、水不溶性接着剤と、非阻害性乳化剤と、生育する微生物の栄養素、選択剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの親水性物質とを含む水をベースとする接着剤組成物（18）と、
（c）  水をベースとする接着剤組成物（18）に接着する少なくとも1つのゲル化剤を含む冷水可溶性粉末（20）と、
（d）  基材（12）に取り付けられたカバーシート（22）と、
（e）  開口部（24）を包含し、少なくとも1.3ｍｍの厚みを有することでカバーシート（22）が粉末（20）および接着剤組成物（18）と接触するのを防止する水不溶性スペーサー（23）と、
（f）  スペーサー（23）の開口部（24）内に収まるように適合された膜（26）と
を含む表面コロニー計数薄膜培養平板装置（10）。
【請求項２】
カバーシート（２）が透明である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
（a）  水および親水性物質を含む水性混合物を請求項１記載の部材（a）〜（e)を含む装置の開口部スペースに添加するステップと、
（b）  微生物の存在について評価する液体サンプルを濾過するのに使用した膜を水性サンプル上の開口部スペース内に挿入するステップと、
（c）  装置を一定時間培養するステップと、
（d）  微生物フィルター表面に生育する微生物コロニー数を計数するステップと
を含む表面コロニー計数培養装置を使用して水性試験サンプル中の微生物を検出する方法。
【請求項４】
装置の開口部がカバーシートで少なくとも部分的に覆われる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
親水性物質が少なくとも１種の選択剤である請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の薄膜培養平板装置およびパッケージされた親水性物質を含む微生物生育、検出および／または計数のためのキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、微生物を生育、検出および／または計数するための方法および装置に関する。より正確には本発明は、液体サンプル中に存在する、または微生物フィルターなどの膜表面に存在する微生物を生育、検出および／または計数するための方法、装置およびキットに関する。
背景
現在、異なるタイプのサンプル中の微生物を同定し、計数するために様々な方法および工程が利用できる。これらの方法には、伝統的な寒天平板法、最近開発された様々な免疫化学的方法および周知のPETRIFILM薄膜培養平板装置が含まれる。
PETRIFILM培養平板装置には、米国特許番号第4,565,783号が述べる装置、ならびに米国特許番号第5,137,812号および第5,232,838号が述べるようなこれら装置の変形物が含まれる。これらの装置は便利で比較的安価であり、迅速に使用できる。市販の装置に共通な特徴は、微生物存在を評価する液体サンプルを栄養素含有培地へ接種することである。指示薬は培地中に存在しても良く、あるいは例えばこのような装置のカバーシートから添加されても良い。通例、接種した培地とカバーシートを直接接触させ、微生物を適切な条件下で生育する。しかし目的によっては、生育する微生物がカバーシートに直接接触しないようにして生育させるのが有利な場合もある。
本発明は、接着剤に結合する培地に包含される微生物を生育、検出、計数する試みに存在する困難性と取り組む。
発明の要約
本発明は、微生物フィルターなどの膜表面に微生物が場合に応じて存在するサンプル中で微生物を培養、検出および／または計数する方法、装置およびキットを提供する。一方法は、
（a)  i)  上および下表面を有する自己支持型基材と、基材の上表面にコーティングされ、水不溶性接着剤と、非阻害性乳化剤と、微生物培養ための栄養素、選択剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの親水性物質とを含む接着剤組成物層と、少なくとも１つのゲル化剤とを含む冷水可溶性粉末とを含む母材と、
ii）基材の上表面の開口部スペースに付着し、開口部を包含するスペーサーと
を含む薄膜培養平板装置に水を添加するステップと、
（b)  水性サンプル上の開口部スペースに微生物の存在について評価する膜を挿入するステップと、
（c)  装置を一定時間培養するステップと、
（d)  開口部スペースまたは膜表面のスペース内に生育する微生物コロニー数を計数するステップ
とを含む。
代案として、（b）の後にカバーシートで装置開口部スペースを少なくとも部分的に覆うステップをこの方法にさらに加えることもできる。別の方法では、液体サンプルを開口部スペースに直接添加して、膜を使用しない。
発明の装置は、
（a)  上および下表面を有する自己支持型基材を含む母材と、
（b)  基材の上表面にコーティングされ、水不溶性接着剤と、非阻害性乳化剤と、微生物培養ための栄養素、選択剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つの親水性物質とを含む水をベースとする接着剤組成物の層と、
（c)  水をベースとする接着剤組成物の層に均一に接着する少なくとも１つのゲル化剤を含む冷水可溶性粉末と、
（d)  基材の上表面に付着し、開口部を包含する水不溶性スペーサーと
を含む表面コロニー計数薄膜培養平板装置を含む。
また発明の装置は、前記開口部を部分的にまたは完全に覆うカバーシートを含んでも良い。また発明の装置は、スペーサー開口部内にはめ込まれた微生物フィルターなどの膜をさらに含んでも良い。
カバーシートが存在する場合、場合に応じて透明である。
本発明は、膜または微生物フィルター表面で微生物を容易に生育、検出および計数できるようにする方法、および薄膜培養平板装置の双方を提供する。さらに本発明は、閉じこめられた微細な気泡の干渉を低下させ、大腸菌型細菌の検出を可能にする。
本発明の方法および装置は、表面コロニー計数に特に適しているが、計数するコロニーとカバーシートとの接触を最小化したい場合に使用することもできる。
また本発明は、微生物の培養、検出、計数のための新しいキットを提供する。これらのキットは、本発明の薄膜培養平板装置と、１つ以上の追加部品とを含有する。追加部品は、微生物フィルターおよび／または親水性物質を含むパッケージである。親水性物質を含むパッケージは、微生物培養ための１つ以上の栄養素、選択剤、および／または担持システムを含むこともできる。
発明を特長づけるこれらおよび様々なその他の利点と特徴は、請求項で特徴と共に指摘する。しかし発明とその利点、およびその使用によって得られる対象物をより良く理解するためには、発明の好ましい実施例が例示され説明される図、および付随の説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
付随する図を参照して発明をさらに詳しく説明する。
図１は、部分的に断面図になっている薄膜培養平板装置実施例の上方斜視図である。
図２は、培養装置の母材上に印刷された格子模様を示す図１の薄膜培養平板装置の上面図である。
図３は、部分的に断面図になっている薄膜培養平板装置の別の実施例の上方斜視図である。
発明の実施例の詳細な説明
定義
本発明の目的のために、
「液体サンプル」とは、水性混合物中で均質化、希釈、または懸濁され、その中に種々の微生物を含有できる食品サンプルなどの水性混合物を意味する。
「粉末」とは、好ましくは直径が約10乃至400ミクロン、より好ましくは直径が約30乃至90ミクロンであり、本発明の薄膜培養平板装置での使用に適した平均直径を有する１つ以上のゲル化剤の粒状物質を意味する。
「冷水可溶性粉末」とは、水性試験サンプルと組み合わせた場合、室温水（例えば約18℃乃至24℃）中でゲル形成する粉末を意味する。
「非阻害性乳化剤」とは、水不溶性接着剤を水性環境中に分散するのに適切であり、生育する微生物の生長を本質的に阻害しない乳化剤、好ましくは非イオン性乳化剤を意味する
「再生培地」とは、水または水性試験サンプルによる冷水可溶性粉末の溶解から形成する溶液またはゲルを意味する。
「空気透過性」とは、その端が本質的に空気に暴露した場合、水平方向に（すなわちその上下表面に平行に）十分に空気透過性であり、再生培地中の好気性微生物の生長を維持するために上に重なる再生培地に適切な通気を提供する物質を意味する。
「水不溶性接着剤」とは、水性環境に本質的に不溶性であり、好ましくは水性乳化重合技術によって形成する疎水性接着剤を意味する。
「水をベースとする接着剤組成物」とは、基材へのコーティングに先立って、非阻害性乳化剤により水性環境中に分散させた水不溶性接着剤の接着剤組成物を意味する。
「微生物および水蒸気に本質的に非透過性」とは、薄膜培養平板装置の輸送、保存および使用中に、下に重なる水をベースとする接着剤組成物と冷水可溶性粉末層の望まれない汚染および水和を防止して、培養期間中、再生培地が微生物の生長を維持するのに適切なように再生培地の乾燥を防ぐカバーシートを意味する。
「選択剤」とは、本発明に従った培養装置上で生育する微生物の生長を阻害し、および／または同定を容易にするように機能するあらゆる元素、化合物または組成物を意味する。
薄膜培養平板装置
図１は、本発明に従った薄膜培養平板装置10を示す。培養平板装置10は、上表面14と下表面16を有する自己支持型基材12を有する母材11を含む。基材12の上表面14は、接着剤組成物層18でコーティングされている。１つ以上のゲル化剤を含む冷水可溶性粉末が薄く比較的均一な層20となって、接着剤組成物18に接着している。水性試験サンプル（図示せず）を接種すると、冷水可溶性粉末層20は迅速に水和して、再生培地（図示せず）を形成し、液体接種物あるいは試験サンプル
微生物フィルターなどの膜表面に存在する微生物を生育することができる（図３参照）。スペーサー23は、基材12および粉末20の表面を部分的にカバーし、開口部24を包含する。さらに薄膜培養平板装置10は、場合に応じてカバーシート22を含み、水性試験サンプル添加後に形成する再生培地をカバーする。
図3に示した代案の実施例では、装置10はスペーサー23の開口部24中に微生物フィルター26を含み、フィルター26の表面に細菌コロニー28が示される。
図１または３に示した薄膜培養平板装置10を使用する際、存在する微生物コロニーの正確な計数が望ましいことが多い。図２に示すように、細菌、酵母またはカビコロニーなどの微生物コロニーの計数は、基材12の上に四角格子模様60を刷り込むことで容易になる。さらにカバーシート22に四角格子模様60を刷り込んで、微生物コロニー計数の一助にできることも理解される。
母材
図１および３でそれぞれ図示した培養装置10では、母材11は自己支持型基材12を含む。好ましくは基材12は、ポリプロピレンおよびポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリエステル、ポリスチレンまたはそれらの混合物などのポリマー物質の比較的堅いフィルムをラミネートなしに含むがこれに限定されない。好ましくは自己支持型基材12は、本質的に防水性であり、本質的に水を吸収したり、あるいは水によるその他の影響を受けない。厚さ約100μ乃至180μのポリエステルフィルム、厚さ約100μ乃至200μのポリプロピレンフィルム、および厚さ約300μ乃至380μのポリスチレンフィルムが、本発明で良好に機能することが分かった。その他の適切な基材としては、例えば「SchoellerタイプMIL」印画紙（ニューヨーク州プラスキのSchoeller, Inc.）などのポリエチレンまたはその他の本質的に防水性のコーティングを有する紙が挙げられる。さらに基材12を通して微生物コロニーの観察と計数をしたいかどうかによって、基材12は透明、半透明、または不透明でも良い。
米国特許番号第5,232,838号が述べるように、本発明の装置において空気透過性膜の層を使用することもできる。
接着剤組成物
好ましくは接着剤組成物は、感圧接着剤である。より好ましくは接着剤は、アルキルアクリレートモノマーおよびアルキルアミドモノマーのコポリマーを含む水不溶性接着剤などの感圧接着剤である。好ましくは、これらコポリマー中のアルキルアミドモノマーに対するアルキルアクリレートモノマーの重量比は、約90:10乃至99:1、より好ましくは94:6乃至98:2である。アルキルアクリレートモノマーとしては、アクリル酸イソオクチル（IOA）、アクリル酸2-エチルヘキシル、アクリル酸ブチル、アクリル酸エチル、アクリル酸イソアミル、およびそれらの混合物などのアクリル酸低級アルキル（C2乃至C10）モノマーが挙げられるがこれに限定されない。アルキルアミドモノマーには、アクリルアミド（ACM）、メタクリルアミド、N-ビニルピロリドン（NVP）、N-ビニルカプロラクタム（NVCL）、N-ビニル-2-ピペリジン、N-（モノまたはジ低級アルキル（C2乃至C5））（メタ）アクリルアミド、N-メチル（メタ）アクリルアミド、N,N-ジメチル（メタ）アクリルアミド、またはそれらの混合物などが含まれるがこれに限定されない。本発明に従った特に好ましい水不溶性接着剤コポリマーとしては、米国特許番号第5,232,838号が述べるようなIOAおよびACMのコポリマー、またはIOAおよびNVPのコポリマーの水性乳化懸濁液が挙げられる。
好ましくは接着剤組成物は、水性乳化重合により形成される水不溶性接着剤である。乳化重合によるこの水不溶性接着剤の調製に際し、上述のアルキルアクリレートおよびアルキルアミドモノマーおよび重合開始剤は、非阻害性乳化剤を含む水性培地中での好ましい重量比に従って組み合わされる。例えば米国特許番号第5,424,122号を参照されたい。
本発明に従った乳化された水をベースとする接着剤組成物を製造する典型的な工程には、最初に非イオン性乳化剤と水の水性溶液を調製することが含まれる。次に、前もって望む重量比で調製したアルキルアクリレートとアルキルアミドモノマーの混合物、および非イオン性親油性重合開始剤を水性溶液中に分散して混合する。水中油型懸濁液を調製するために、均質化条件の下で約１分間混合を行う。
好ましくは、アルキルアクリレートおよびアルキルアミドモノマーは、モノマー、乳化剤、重合開始剤、および水を合わせた全重量の約20乃至60重量%、より好ましくは約30乃至50重量%を占める。さらに反応混合物は、場合に応じて、4-アクリロイロキシベンゾフェノンまたは1,6-ヘキサンジオールジアクリレート（HDDA）などの中性非イオン性架橋剤のようなその他の添加剤を、存在するモノマー全重量を基準にして重量で約0.01%乃至0.5%、好ましくは約0.02%乃至0.1%、最も好ましくは約0.03%乃至0.08%の濃度で含むこともできる。
結果的に得られる水中油型懸濁液を誘導温度に加熱し、窒素下で反応発熱によって示される重合が起きるまで撹拌する。高温（約50℃乃至90℃）で撹拌を約２時間継続し、反応容器を室温に冷却して、次にポリマー生成物を濾過により回収する。結果的に得られる組成物を直接コーティングする場合、栄養素および親水性選択剤などのあらゆる添加剤を撹拌しながら添加する。適切なコーティング粘度に達するまで水を添加または除去し、混合物を適切な基材上にコーティングする。典型的には、接着剤組成物の接着剤粒子直径は、約0.1乃至0.9ミクロンの範囲であり、ブルックフィールド粘度は、約５乃至15cpsである。さらに水をベースとする接着剤組成物が微生物の生長に対し非阻害性であるように、必要に応じて接着剤組成物のpHを適切に調整する。典型的には、水をベースとする接着剤組成物のpHは、約５乃至９、より好ましくは約６乃至８に保たれるべきである。
適切な非イオン性乳化剤としては、乳化剤のTERGITOL Xシリーズ（コネチカット州ダンベリーのUnion Carbide Co.）のような酸化エチレンおよび酸化プロピレンの直鎖ならびに分枝C2およびC18アルキル、アルキルアリル、およびアルケニルアルコールをベースとするコポリマーを含めた酸化エチレンと酸化プロピレンの縮合物全般などのポリエーテル、PLURONICおよびTETRONIC乳化剤（ニュージャージー州パーシッパニーのBASF Co.）などの酸化エチレンと酸化プロピレンのブロック共重合体、およびソルビタンと脂肪酸エステル類のポリオキシアルキレン誘導体であるTWEENSおよびSPANS非イオン性乳化剤（デラウエア州ウイルミントンのICI, Inc.）が挙げられるがこれに限定されない。非イオン性乳化剤特定の例としては、エトキシ化脂肪族アルコール、エトキシ化アルキルフェノール、エトキシ化脂肪酸、ソルビタン誘導体、ショ糖エステルと誘導体、酸化エチレンと酸化プロピレンのブロック共重合体、フッ素化アルキルポリオキシエチレンエタノール、およびそれらの混合物が挙げられるがこれに限定されない。好ましい非イオン性乳化剤は、オクチルフェノキシポリ（酸化エチレン）エタノールである（例えばニュージャージー州プリンストンのRhone PouleneからのIGEPAL CA-897）。好ましくは非イオン性乳化剤は、モノマー、乳化剤および重合開始剤を合わせた全重量を基準にして重量で約2%乃至10%、より好ましくは約3%乃至5%、そして最も好ましくは約4%の濃度で使用される。
好ましくは水をベースとする接着剤組成物の形成に使用される重合開始剤は、非イオン性油溶性重合開始剤を含む。適切な重合開始剤の制限を意図しない例としては、過酸化ベンゾイルまたは過酸化ラウロイルなどの過酸化物、ならびに2-（カルバモイルアゾ）イソブチロニトリル（例えばテキサス州ダラスのWako ChemicalsからのV-30重合開始剤）またはアゾビスイソブチロニトリル（デラウエア州ウイルミントンのDuPont Co.からのAIBN重合開始剤）などのアゾ重合開始剤が挙げられる。特に好ましい重合開始剤は、モノマー全重量を基準にして重量で約0.02%乃至0.3%、より好ましくは約0.05%乃至0.25%、そして最も好ましくは約0.07%乃至0.2%の濃度で使用される過酸化ラウロイルである。
上述のように、水をベースとする接着剤組成物には、栄養素、選択剤、またはそれらの組み合わせを含んだ１つ以上の親水性物質が通常組み込まれている。水をベースとする接着剤組成物に使用される特定の栄養素および/または選択剤は、培養および／または選択的染色または阻害される特定の生物次第で異なっても良く、技術分野で普通の技術により容易に決められる。親水性物質を組み込んだ後、コーティング前に、水をベースとする接着剤組成物のpHは約6.5乃至7.5、好ましくは約７に正規化され、水のpHが約５乃至９、より好ましくは約６乃至８に保たれるようにする。
水不溶性接着剤の形成に使用される非阻害性乳化剤、および結果的に得られる水をベースとする接着剤組成物は、好ましくは非イオン性乳化剤である。本発明で使用できる典型的な非イオン性乳化剤は、フェノール、アルコール、カルボン酸、アミン、およびアミドなどの活性水素化合物と酸化エチレンの反応によって形成される。これら非イオン性乳化剤はまた、約10乃至20、好ましくは約12乃至18の親水性・親油性バランス（HLB）を典型的に示す。
適切な栄養素の制限を意図しない例としては、肉ペプトン、カゼインペプトン、牛肉抽出物、乳糖、グルコース、ガラクトース、ならびに脂肪、無機質およびビタミンが挙げられる。本発明で使用するのに適した栄養素配合物の特定の例としては、バイオレットレッド胆汁、標準法、およびBaird-Parker栄養素配合物（全てメリーランド州バルチモアのAcumedia, Inc.から市販される）が挙げられるがこれに限定されない。
水をベースとする接着剤組成物に組み込める親水性選択剤は、水性試験サンプルから培養平板装置10に移された微生物を選択的に阻害または同定する手段を提供する。適切な選択剤には、望まない生物を阻害するためにコリスチンメタンスルホン酸ナリジクス酸などの抗生物質を含めることができる。その他の適切な阻害性選択剤としては、例えばグラム陰性微生物を選択的に生育させるための胆汁酸塩などの阻害性塩が挙げられる。
その他の有用な種類の親水性選択剤としては、生育する微生物によって代謝されたり、別の方法で微生物と反応する染料が挙げられ、これらは視覚化および定量化を容易にするために、色または蛍光を有用なコロニーに与える。このような染料の制限を意図しない例としては、塩化トリフェニルテトラゾリウム、p-トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラチルテトラゾリウムブルー、クリスタルバイオレット、ニュートラルレッド、および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸二ナトリウム塩が挙げられる。本発明に従った特に好ましい染料としては、クリスタルバイオレット、ニュートラルレッドおよび5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸二ナトリウム塩が挙げられる。しかし同定する特定生物次第で、その他の適切な染料が使用できることも理解される。
水をベースとする接着剤組成物は形成後、好ましくは接着剤層18に接着する冷水可溶性粉末粒子の直径に満たない厚さに母材11上にコーティング（好ましくはナイフ塗布）される。水をベースとする接着剤組成物のコーティングに際しては、基材12の上表面14への粉末の接着を容易にするために十分な接着剤組成物を塗布することが目的であるが、水をベースとする接着剤組成物層18に粒子が完全に包埋しない程度にとどめる。通例、水をベースとする接着剤組成物のレベルは、約0.20乃至0.001g/cm2、より好ましくは約0.006乃至0.12g/cm2、そして最も好ましくは約0.008乃至0.08g/cm2が適切である。次に冷水可溶性粉末層20をコーティングする前に、望むならば、水をベースとする接着剤組成物層18を乾燥して残留水を除去することもできる。
冷水可溶性粉末
冷水可溶性粉末に含めるのに適切なゲル化剤としては、室温で水溶液になる天然および合成双方のゲル化剤が挙げられる。標準ゲル化剤としては、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、イナゴ豆ガム、グアーガム、キサンタンガムおよびアルギンなど、高吸収性物質としては、UCARGEL高吸収性剤（ニュージャージー州バウンドブルックのUnion Carbide）などのグリコール改質多糖類、およびWATER LOCK高吸収性物質（アイオワ州マスカティーンのGrain Processing Corp.）などのデンプングラフトポリ（アクリル酸ナトリウム-コ-アクリルアミド）が挙げられる。特に好ましい実施例では、グアーガムおよびキサンタンガムが1:2の重量比で混合される。
好ましくは冷水可溶性粉末は、水吸収性が約50ml/g乃至200ml/g、より好ましくは約100ml/g乃至180ml/gの高吸収性物質と、水吸収性が約１ml/g乃至20ml/g、より好ましくは約５ml/g乃至10ml/gの標準ゲル化剤との混合物である。冷水可溶性粉末中で高吸収性物質と標準ゲル化剤との混合物を使用することにより、比較的少量の冷水可溶性粉末を使用しながら（例えば一層の粉末のみ）迅速に水和して、取り扱いおよび保管が容易な大きさ（例えば約75cm2）の基材表面上に比較的大きなサンプル容積（例えば少なくとも約５ml）を包含する粉末コーティングが提供される。
冷水可溶性粉末には、十分な量のゲル化剤が含まれるので、母材11の端から水性試験サンプルが流れ落ちることなく、母材11上に所定量の水性試験サンプルを塗布して保持できる。好ましくは十分なゲル化剤が提供され、粉末被覆母材11上にのせられた約１ml乃至５mlの水性試験サンプルは、半固形再生培地を形成する。冷水可溶性粉末と水性試験サンプルの組み合わせにより、混合物の約5%乃至15%溶液、より好ましくは約7%乃至12%溶液が形成することが特に好ましい。これらのようなゲルは、取り扱いおよび積み重ねに便利であり、明確なコロニー同定を提供する。
ほとんどの場合、表面積１cm2上で約2.5mg乃至５mgの冷水可溶性粉末を１ml乃至５mlの水性試験サンプルで水和すると、十分に粘着性のゲルが提供される。ゲル化再生培地を得るために、混合あるいは培地の加熱その他の処理は必用ない。冷水可溶性粉末粒子の大きさを利用して、単位面積当たりコーティング重量をコントロールできる。例えば約100メッシュ粉末は、直径5cmのディスクに重量約50mgのコーティングを、400メッシュ粉末は、直径５cmのディスクに重量約25mgのコーティングを与える。
実施例によっては、栄養素をゲル化剤と共に冷水可溶性粉末に組み込むことが望ましいこともある。栄養素の包含は、水性試験サンプルを通じて培養装置10に移された微生物の初期生長促進を助けるために特に有用である。さらに冷水可溶性粉末に染料またはその他の試薬を含めて、微生物コロニーの視覚化をさらに向上させることもできる。
開口部スペーサー部材
比較的厚いスペーサー部材が、発明の装置および方法の特徴である。スペーサー部材は、例えば米国特許番号第5,364,766号で報告されたようなPETRIFILMタイプ装置でかつて使用されたフォームスペーサー部材よりもはるかに厚い。以前報告されたフォームスペーサーの目的は、装置に入れられた水性溶液のために保持ウェルを提供することだった。本発明のより厚い開口部付きスペーサー部材の一目的は、スペーサー部材の開口部内に入れた膜を定位置に保ち保護することである。より厚いスペーサー部材の別の目的は、微生物の生育コロニーとカバーシートとの接触を低下させあるいは防止することである。
スペーサー部材として適切な物質は、シート形態で容易に入手できるあらゆる固形の非阻害性天然または合成物質であるが、微生物生長部位ではない。ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートおよびポリスチレンは、適切な合成物質のいくつかの例である。特に、比較的安価な市販のポリスチレンフォームおよびポリエチレンフォームが好ましく、ポリスチレンフォームが現在最も好ましい。セルロースシート、例えばフォイルシートなどの金属、木、その他の天然物質は、あまり好ましくない代用品である。
スペーサー部材の厚さは、膜を囲んでカバーシートと微生物フィルターとの接触を避ける、あるいは少なくとも最小化するのに十分でなくてはならない。膜の厚さによって、スペーサーは少なくとも厚さ約1.3mm、好ましくは少なくとも厚さ1.5mm、そして一般には厚さ約２mmでなくてはならない。余分な厚さは材料の無駄になり不必要な重量と嵩を加えるため、２または３mmを超えるスペーサーの厚さは、通常必用でなくまた望ましくもない。
カバーシート
好ましい実施例では、カバーシート22は母材11の一端に添付されている。カバーシート22は、好ましくは透明で微生物コロニーの計数を容易にし、微生物および水蒸気の双方に本質的に非透過性である。通例、カバーシート22は、透明度および好ましい不透水性などについて基材12と同一の特性を有する。さらにカバーシート22は、微生物コロニー計数の一助となり、水性試験サンプルをのせる標的を提供し、および／または美的外観のために、上に押された四角格子模様60または面形模式端（図示せず）などのパターンを有することができる。
カバーシート22は、生育を望む微生物タイプが必用とする酸素透過量を提供するために選択できる。例えば低い酸素透過性（厚さ25μ当たり0.78g/100cm2/24時間未満）を有するポリエステルフィルムは、嫌気性細菌の培養に適している。他方ポリエチレンのいくつかの形態は、比較的高い酸素透過性(厚さ25μ当たり約78g/100cm2/24時間）を有し、空気透過性膜使用の有無に関わらず好気性生物の生長に適している。カバーシート22のために好ましい１つの物質は、1.6ミルの二軸延伸ポリプロピレンフィルムである。カバーシートとして好ましい別の物質は、くもり防止剤で処理した市販のポリエチレンテレフタレートである（ニュージャージー州ホワイトハウスのFilm Specialties Inc.から市販されるFSI-47）。別の好ましい物質は、ゾルゲル処理ポリエチレンテレフタレートである（ミネソタ州セントポールの3Mから市販されるSCOTCHPARブランドフィルムNo. FE 40492）。代案としてカバーシート22を母材11に添付できることも理解される。カバーシートは、ヒートシール、接着剤、両面粘着テープなどの従来の方法で添付できる。
図１および３に示した双方の実施例は、培養装置10に付着したカバーシート22を有するが、保存および培養中、培養装置10のカバーを取って単に滅菌環境に置くことも発明の範囲内で考察された。
差込部材
試験サンプルは、接種物あるいは微生物フィルターなどの膜のどちでも良い。発明の方法および装置によって生育、検出および／または計数する微生物の表面コロニーを提供するために、様々な膜やフィルムが使用できる。特に適切なのは、大量の液体サンプルから細菌などわずかな個体数の微生物を分離するために一般に使用される既知の微孔性フィルターである。以前、このようなフィルターは、濾過した微生物を計数および評価するために、寒天培地表面にのせて培養された。このようなフィルターは、マサチューセッツ州マールボロのMillipore Corp.およびミシガン州アンアーバーのGelman Corp.などの会社から入手できる。Milliporeは、HAWGシリーズ、例えばHAWG 04750タイプHAなどの適切なフィルターを提供する。Gelmanは、Metricelタイプ、例えばGN-6 Metricel膜などの適切なフィルターを提供する。その他の適切な膜には、種々のポリマー上にビニルアルコールのホモまたはコポリマーを含むコーティングを提供することで調製される親水性膜が含まれる。この技術については、国際出願WO 92/07899で述べられている。国際出願の実施例５で述べられた方法で調製されたビニルアルコール被覆微孔性ポリプロピレンは、本発明における好ましい微生物フィルターである。
上述の微生物フィルターのフィルムは、通例、比較的薄く、厚さ約0.01乃至２mm、好ましくは厚さ0.05乃至1.0mmであり、例えば長方形や部分的円板を含む円板などのあらゆる希望する二次元形状で提供できる。
微生物は、このようなフィルターにより膜の孔の大きさ次第で様々に異なる効率で分離される。細菌はこのようなフィルターによって容易に分離され、酵母とカビもまた分離される。濾過は、従来の方法により、漏斗および適切な大きさのディスクを用いて行われる。ディスクは、好ましくは無菌的にピンセットで取り扱われる。ディスクは、市販の物質からユーザーが作成することもでき、または発明のキットと別に、もしくはその一部として無菌パッケージで提供される。
発明のキット
発明が提供するキットは、２つ以上の部分を含む。１つの部分は、好ましくは培養平板装置の開口部全体を覆うカバーシートを場合に応じて包含する発明の薄膜培養平板装置を含む。
各キットの第２の部分は、キットの培養平板装置のスペーサー部材の開口部に収めるのに適した形状および大きさの１つ以上の微生物フィルターでも良い。異なる種類のフィルターがキットと共に提供でき、または複数キットに種々のフィルターを含めることもできる。フィルターは場合に応じて、そして好ましくは、γ照射、酸化エチレンまたはその他の滅菌法で滅菌したポリエチレン被覆紙パッケージなどの無菌条件で提供される。代案としてフィルターは、ユーザーが滅菌することを前提にした非滅菌のユニットでも良い。
キットに１つ以上の微生物フィルターが含まれない場合、親水性物質のパッケージが含まれる。好ましくは、フィルターおよび親水性物質パッケージの双方が各キットで提供される。親水性物質は好ましくは、例えばフォイルパッケージなど製薬業界で慣習的に用いられるような滅菌パッケージ内に封入される。このようなパッケージの例は、NITRO-BID軟膏(ミズーリ州カンサスシティのMarion Laboratories, Inc.)で使用される。
パッケージに含まれる栄養素および／または選択剤は、上で述べたものと同一であり、接着剤組成物に組み込むこともできる。パッケージ中で有用かつ必用な親水性物質の選択は、評価する微生物に依存する。パッケージ部材の選択のその他の基準は、親水性物質の短期および長期の化学適合性である。
接種法
発明の装置の接種は、いくつかの方法の内の１つによって行われる。
微生物フィルターを使用しない場合、親水性物質を粉末上の接着剤組成物に接着した冷水可溶性粉末中に含め、評価する微生物の水性サンプルを開口部を通じて装置に入れて接種を行う。代案としては、膜に含まれるサンプルを装置に接種する前に、ユーザーから提供される、あるいは例えば発明のキットに関して述べたような滅菌パッケージから提供される緩衝液、栄養素および／または選択剤を加える。
微生物フィルターを使用する場合、緩衝液、栄養素および／または選択剤は、通例、開口部を通じてフィルターの前に装置に加えられるが、この順序は逆でも良い。緩衝液、栄養素および／または選択剤は、ユーザーから提供され、あるいは発明のキットに関して述べたような滅菌パッケージから提供される。
発明を以下の制限を意図しない例を参照してさらに詳しく説明する。あらゆる部および百分率は、特に断りのない限り重量部である。
実施例
実施例１
厚さ0.13mmのポリエチレン被覆紙（ニューヨーク州プラスキのSchoeller Paper Inc.）の片面を重量比96:4（IOA:ACM）のアクリル酸イソオクチル（IOA）とアクリルアミド（ACM）の非阻害性接着剤コポリマーのヘプタン/酢酸エチル（1:1）中約20%固形分溶液によって約0.9mg/cm2（乾燥時測定）のレベルにコーティングし、乾燥した。
次に１重量部のグアーガム（スイス国クルーズリンゲンのMeyhall Chemical AG）および２重量部のキサンタンガム（カリフォルニア州サンディエゴのKelco, Inc.）の混合物である粉末を接着剤に均一にまぶした。この粉末被覆紙を酸化エチレンに暴露して殺菌した。
0.08インチ（0.20cm）厚さのポリスチレンフォームの長方形（８cm x 11cm）シートから円形開口部（直径５cm）が中心に切り抜かれたスペーサーを作成し、上述の粉末被覆紙の長方形シートにハンドローラー圧をかけて付着した。
厚さ４ミル（0.10mm）のゾルゲル処理透明ポリエステル（ミネソタ州セントポールの3MからのSCOTCHPARポリエチレンテレフタレートフィルムNo. FE 40492）の堅いが曲げやすい長方形形状（８cm x 11cm）シートからカバーシートを作成した。カバーシートの0.7cmの部分で両面粘着テープによって、装置の幅８cmのフォーム端にカバーシートを付着した。
使用に際しては、装置を平らな表面に置いて上記カバーシートを折り返し、フォームスペーサーとその中の開口部を露出した。開口部の中に、選択剤を含有する緩衝液添加栄養素溶液（表参照）1.0mlを加えた。サンプル液体100mlを濾過して既知の微生物サンプルを除去するために使用したポリビニルアルコール処理親水性ポリプロピレンの直径4.6cmのディスク（出版済特許出願WO 92/07899に述べるようにして調製）を開口部中の溶液上にのせた。次にカバーシートを元に戻して、ディスク表面に接触させずに開口部を覆った。次に装置を35℃で24時間培養し、市販の選択剤によって検出できる細菌が存在するかどうか検査した（存在する場合はコロニーを数えた。）
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栄養素は、ミシガン州デトロイトのDifco, Inc.から入手できる。
これらの試験結果は、従来の（そして扱いにくい）寒天平板方法で検出できる微生物が、本発明の装置および方法で容易に検出できることを示す。
実施例２
厚さ0.18mmのポリエチレンテレフタレートフィルムの片面を米国特許番号第5,232,838号で報告されたアクリル酸イソオクチルとN-ビニルピロリドンのラテックス接着剤コポリマーでコーティングした。この接着剤組成物を6.2mg/cm2のレベル（乾燥時測定）でフィルムにナイフ塗布し、93℃の空気炉中で乾燥し、基材表面に水をベースとする接着剤組成物の粘着性の層を作った。水をベースとする接着剤組成物は、240gのEndo栄養素配合物（メリーランド州バルチモアのBBL Inc.）、10gの寒天ガム（ケンタッキー州ルイスビルのHi-Tek Polymers Inc.）および１gの寒天（ミシガン州デトロイトのDifco, Inc.）をアクリル酸イソオクチル（IOA）とN-ビニルピロリドン（NVP）の重量比98:2（IOA:NVP）の水不溶性接着剤コポリマーの水性乳化懸濁液1Lに撹拌しながら溶解して形成した。水をベースとする接着剤コポリマーの成分には、1568gのIOA（38.5重量部）、32gのNVP（0.8部）、2400gの脱イオン水（59部）、68.8gのIGEPAL CA89997非イオン性界面活性剤（1.7部）、および24gの過酸化ラウロイル（0.06重量部）が含まれた。
等重量比のキサンタンガム（KELTROL、カリフォルニア州サンディエゴのKelco Inc.）とグアーガム（スイス国クルーズリンゲンのMeyhall Chemical AG）から形成された冷水可溶性粉末の混合物を水をベースとする接着剤層の表面にまぶした。過剰な粉末は、はたき落とした。この接着剤被覆および粉末被覆紙を使用して、薄膜培養平板装置の底の部分を形成した。
実施例１のような開口部のあるポリスチレンフォームのシートを粉末コーティングの上にしっかりのせた。くもり止め処理を施したポリエチレンテレフタレートのカバーシートフィルム（FSI-47、ニュージャージー州ホワイトハウスのFilm Specialties Inc.）をポリスチレンフォームに取り付けた。
この薄膜培養平板装置の開口スペースに２mlの標準0.1% Mペプトン緩衝液を接種した。100mlの液体サンプルを濾過するのに使用した4.5cmの微生物フィルターディスク（HAWG 0450タイプHA、マサチューセッツ州マールボロのMillipore Corp.）を希釈液の上にのせた。フィルターディスクにより緩衝液は押し広げられた。装置を37℃で24時間培養し、次にフィルター表面の細菌コロニーについて検査して、標準Endo寒天ペトリ皿培養平板と比較した。結果は表２に示した。
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実施例３
この実施例では、河川水サンプルを細菌の存在について評価した。河川水サンプルの評価に使用した装置は、標準的な市販の好気性菌計数PETRIFILM培養平板装置、標準R2A（マサチューセッツ州バルチモアのAcumedia）寒天ペトリ皿培養平板および発明の装置である。実施例１で述べた処理ポリプロピレンフィルターを通して３mlの河川水を濾過した。好気性菌計数PETRIFILM培養平板装置に１mlのR2A肉汁を接種し、フィルターを入れた。この濾過工程を繰り返し、フィルターをR2A寒天にのせた。第３のフィルターは、発明の装置の上に接種した。結果は表３に示した。
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これらの結果からは、発明の装置がより便利、かつ、より安価に標準寒天評価の複製に成功したことが示される。
実施例４
この実施例で使用される培養平板装置は、米国特許番号第5,089,413号の実施例１が述べる母材を用いて作成された。簡単に述べると、幅20.3cm、長さ30.5cm、厚さ50μmの微孔性ポリエチレン膜（ミネソタ州セントポールの3MからADVENTフィルム製品番号70-0000-4011-6として入手できる多孔質ポリエチレン）の１片を幅19.7cm、長さ30.5cm、厚さ100μmのポリエチレン裏打ち感圧テープ(「クレープ」テープ製品番号43-9100-5976-5、ミネソタ州セントポールの3M）１片の粘着面に手でラミネートして基材を提供した。
基材に培地を固定する接着剤溶液を以下のようにして製造した。
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸二ナトリウム塩（0.2g）、クロラムフェニコール（0.03g）、およびクロロテトラサイクリン（0.03g）の３成分をメタノール（40ml）に溶解した。結果的に得られた溶液をモル比90/10の2-メチルブチルアクリレートとアクリル酸のコポリマー（ミネソタ州セントポールの3M, Specialty Chemicals Division）のヘプタンおよびアセトン（65/33（v/v））中48重量%溶液100mlに加えた。溶液が均質に見えるまで撹拌した。
次にを試験室ナイフコーターを使用して、約24.5mg/100cm2の最終乾燥コーティング重量に接着剤溶液を基材表面にコーティングした。コーティングした基材を空気中で乾燥させた。
粉末栄養素と粉末ゲル化剤の重量比1:4の混合物を調製した。栄養素は、メリーランド州バルチモアのAcumedia Corp.から入手できる粉末栄養素であり、その0.455kg中に200gのブレインハートインフュージョン、200gのグルコース、54gのネオペプトン、1.0gの塩化カルシウム、および0.2gの水が含まれた。ゲル化剤はキサンタンガム（カリフォルニア州サンディエゴのKelco Co.）とイナゴ豆ガム（ケンタッキー州ルイスビルのHi-Tech Polymers, Inc.）の混合物（重量で1:1）であった。栄養素およびゲル化剤粉末混合物を酸化エチレンで滅菌し、完全に曝気して残留滅菌剤を完全に除去し、90%が100メッシュスクリーンを通過する大きさにふるい分けた。接着剤コーティング上に粉末混合物を粉末コーターで約40mg/100cm2の重量に固定した。この粉末被覆製品が装置の母材となった。
中心に円形開口部（直径５cm）を切断した厚さ0.08インチ（0.20cm）のポリスチレンフォームの長方形（８cm x 11cm）シートからスペーサーを作成し、上記の粉末被覆母材の長方形シートにハンドローラー圧で付着した。
実施例２で使用したタイプのカバー装置は、Film specialties, Inc.からのFSI-47により提供された。それは図１に示すように装置の上部全体を覆い、両面粘着テープ（ミネソタ州セントポールの3MからのNo. 1522両面粘着テープ）の１片を母材の粉末被覆表面の中心に沿ってのせて、これにカバー装置を粉末側を下にして注意深くのせ、両面粘着テープ片に沿って２枚のシートを共に手で押しつけて組み立てられた。このようにして得られた製品の両面粘着テープ片の中心をはさみで切った。7.6cm×10.2cm大の装置８個を得るために、結果的に得られた２枚の各断片をはさみで7.6cm間隔に切った。
結果的に得られた装置を使用前にγ線（３メガラド）で滅菌した。
２つの評価を実施した。サンプル１については、カビのサンプル1.0mlを開口部を通して粉末に直接入れた。サンプル２については、1%ペプトン緩衝液1.0mlを開口部を通して粉末に入れ、次に（実施例１で述べたように）ポリビニルアルコール処理ポリプロピレンの直径4.6cmのディスクを通して、カビのサンプル1.0mlの複製サンプルを濾過した。次にフィルターディスクを装置開口部中のペプトン緩衝液上に入れた。
装置を通常の滅菌手順で処理した。カバーシートを折り返して開口部を完全に覆った。装置を５日間25℃で培養した。結果は表４に示した。
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これらの結果からは、どちらの手順もカビ計数に対し同程度の値を提供することが実証される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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