(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号９または１０で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４に記載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項１または２に記載されたポリペプチドを発現させるための条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はプロスタグランジンＩ2（以下、ＰＧＩ2と略記する。）受容体に関する。さらに詳しく言えば、本発明はヒトおよびラットのＰＧＩ2受容体ポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体、そのポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物、およびそのポリペプチドまたは宿主細胞を用いたＰＧＩ2アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
背景技術
プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴ）のようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（The Pharmacological Basis of Therapeutics（Gilman，A．G.，Goodman，L．S.，Rall，T．W.，and Murad，F.，eds）7th Ed.，pp 660，Macmillan Publishing Co.，New York（1985）参照のこと）。
それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体によって制御されている（Annu．Rev．Pharm．Tox.，10，213（1989）およびProstanoids and their Receptors．In Comprehensive Medicinal Chemistry.，pp 643（1990），Pergamon Press，Oxford参照のこと）。
プロスタノイドの一員であるプロスタサイクリン（ＰＧＩ2）は、非常に不安定な化合物であり、大部分血管壁の内皮細胞によって生成される。ＰＧＩ2は、アデニールサイクラーゼを活性化させｃＡＭＰを生成することによって、血小板の凝集を抑制し、血管拡張作用を引き起こす。これらの作用は、もうひとつの不安定なプロスタノイドであるＴＸＡ2の強力な血小板凝集作用や血管収縮作用に拮抗することができる。そして循環系のホメオスタシスを維持するために貢献している（Br．J．Pharmacol.,76，3（1982）参照のこと）。ＰＧＩ2のこれらの活性は脳血栓や心筋梗塞のような疾患の予防および／または治療に有用であると考えられる。そして多数の安定なＰＧＩ2類似体が実用化に向けて合成された。
ＰＧＩ2のみならずこれらの安定な類似体を用いて、血小板、平滑筋、および他の組織、さらには種々の細胞におけるＰＧＩ2の作用が熱心に研究されてきた（Prostanoids and their Receptors．In Comprehensive Medicinal Chemistry，pp 643（1990），Pergamon Press，Oxford参照のこと）。これらの研究から、ＰＧＩ2およびその類似体に対する反応は異なった種の組織および細胞間でわずかながら異なっていることが明らかになった。
このことは受容体にサブクラスが存在していることあるいは２種以上のＧ蛋白にＰＧＩ2受容体がカップリングしていることを示唆している。更には、ＰＧＩ2およびその類似体がプロスタノイド受容体の他のタイプに交差反応していることを示唆している（Br．J．Pharmacol.,76，149（1982）およびibid.,97，657（1989）参照のこと）。これらの点を明確にするためには、ＰＧＩ2受容体の構造、シグナリングおよび分布を解析することが必須であると考えられる。
発明の開示
最近、本発明者らはヒトとマウスのＴＸＡ2受容体、さらにはマウスＰＧＥ受容体の３つのサブタイプ、すなわち、ＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ３のｃＤＮＡクローニングに成功した（Nature，349，617（1991），Biochem．Biophys．Res．Commun.，184，1197（1992），J．Biol．Chem.，268，20175（1993），J．Biol．Chem.，268，7759（1993）およびJ．Biol．Chem.，267，6463（1992）参照のこと）。さらに、マウスのＰＧＩ2受容体のｃＤＮＡクローニングにも成功している（1993年１２月６日〜７日開催のInternational Symposium on Molecular Biology of the Arachidonate Cascadeで発表。）。
本発明者らは、マウスのＰＧＩ2受容体をコードするｃＤＮＡまたはその断片を鋳型として用いて、ヒトおよびラットのｃＤＮＡライブラリーをホモロジー検索した。単離されたクローンのシークエンスを解析し、また発現させて分析した結果、それらがヒトおよびラットのＰＧＩ2受容体をコードしていることを明らかにして、本発明を完成した。
なお、スイスプロット（Swiss Prot Release 20）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが確認された。
すなわち、本発明は、
１．配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
２．配列番号８で示されるアミノ酸配列からなる前記１に記載のポリペプチド。
３．前記１または２に記載されたポリペプチドをコードするＤＮＡ。
４．配列番号９または１０で示される塩基配列を含むＤＮＡ。
５．前記３または４に記載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
６．前記５に記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
７．前記１または２に記載されたポリペプチドを発現させるための条件下で前記６に記載の宿主細胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、［3Ｈ］iloprostの、ＭＫ７１をトランスフェクトした細胞膜への結合に対する種々のリガンドの阻害活性を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、実質的に純粋な形であるヒトおよびラットのＰＧＩ2受容体に関する。具体的には、ヒトのＰＧＩ2受容体としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２、３、５または６で示される塩基配列を有するＤＮＡおよび配列番号２、３、５または６で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。また、マウスのＰＧＩ2受容体としては、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグ、およびそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡ、より具体的には、配列番号９または１０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号９または１０で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
特に、本発明は、
（１）配列番号１または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２、５または９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および
（４）配列番号３、６または１０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
配列番号１または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１または８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドだけでなく、該ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１または８で示されるアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
実質的に純粋な形である配列番号１または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が配列番号１または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
配列番号１または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、例えば２００、２５０または３００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明ポリペプチドとして記載される。
さらに、配列番号１または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
配列番号２、３、５、６、９または１０で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも１００個、好ましくは、少なくとも１５０個、例えば、２００、２５０または３００個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
配列番号２、３、５、６、９または１０で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明のＤＮＡは、遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
さらに、本発明には、配列番号２、３、５、６、９または１０で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１または８で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列番号１または８で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
配列番号３、６または１０で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
（i）本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
（ii）該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、
（iii）該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
（iv）得られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
（v）得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
（vi）目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
より詳細に説明すると、工程（i）は、ヒトまたはラットの組織中、ＰＧＩ2受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは、肺、血管、白血球、血小板等の組織細胞または細胞株より、オカヤマ（Okayama，H）等の方法［Method in Enzymology，154，3（1987）に記載］、Chirgwin，J．M．等の方法［Biochem.，18，5294（1979）に記載］等の方法に従って行なわれる。
（ii）、（iii）および（iv）の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法［Gene，25，263（1983）に記載］に準じて行なわれる。
（iii）の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するλ-ZAPIIが用いられる。
（iv）の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル［Gene，96，23（1990）記載の方法により調製される。］である。
工程（v）は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法［Gene，10，６３（1980）に記載］等によって行なわれる。また、適当なプローブとしては、異種動物のＰＧＩ2受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。
工程（vi）はそれ自体公知であり、例えばジデオキシ・ターミネーター（dideoxy terminator）法やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert）法により行なわれる。
配列番号２、３、５、６、９または１０で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
本発明のポリペプチド（配列番号１または８）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ポリペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２、５または９で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.coliＤＨ１、E.coliＪＭ１０９、E.coliＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３、６または１０で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
本発明のポリペプチドを出血性の疾患の治療等のために投与する際には通常、全身的又は局所的に、一般的には経口または非経口の形で行なわれる。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投与である。
投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。
もちろん前記したように、投与量は、種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
本発明化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれる。
このような固体組成物においては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコース、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アスパラギン酸等）を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで皮膜してもよいし、また２以上の層で皮膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第2,868,691号および同第3,095,355号明細書に詳しく記載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤としては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）等が挙げられる。
このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいてもよい。
これらはバクテリア保留フィルターを通すろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結乾燥法等により）、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することもできる。
非経口投与のためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のための坐剤およびペッサリー等が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下に、参考例および実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
参考例１：マウスＰＧＩ2受容体のｃＤＮＡクローニング
マウスのマストサイトーマ（mastocytoma）細胞（ｐ−８１５）の総ＲＮＡをアシッド・グアニジウム・チオシアネート−フェノール−クロロホルム（acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform）法（Anal．Biochem.，162，156（1987）に記載）に従って分離した。一本鎖ｃＤＮＡを、ランダムプライマー（東洋紡社製）とモロニームラインロイケミアウイルス（Molony Murine Leukemia Virus）の逆転写酵素（Bethesda Research Laboratories社製）を用いて合成した。ＰＣＲのプライマーとして、ヒトとマウスのＴＸＡ2受容体およびマウスの３種のＰＧＥ受容体サブタイプのｃＤＮＡのうち、２番目の細胞外ループ領域および７番目の膜貫通領域をコードすると想定される部分を用いた。すなわち、ＰＣＲプライマーとして、それぞれアミノ酸配列ＬｅｕＡｌａＶａｌＴｈｒＡｓｐＬｅｕおよびＡｓｐＰｒｏＴｒｐＩｌｅＴｙｒＩｌｅに相当する以下に示す合成ヌクレオチド（ａ）及び（ｂ）を用いた。
５′−CTG/CGCA/TGTG/CACNGAT/CT/CT−３′    （ａ）
５′−AT/GA/GTANACCCANGGA/GTC−３′        （ｂ）
増幅は、鋳型として上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを用いて、最初の２回は、９４℃で１分間変性、４０℃で0.5分間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションを行ない、次の３回は、９４℃で１分間変性、４６℃で0.5分間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションを行ない、そして最後に２７回、９４℃で１分間変性、５５℃で0.5分間アニーリング、７２℃で１分間イクステンションを行なった。増幅されたｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑化し、アガロースゲル電気泳動にかけて分離した後、pBluescript SK（+）（Stratagene社製）ベクターのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングした。ランダムにピックアップしたクローンについてシークエンシングした結果、７０６ｂｐを有するクローン（このクローンをＣＹと命名した。）は、公知のプロスタノイド受容体のｃＤＮＡ塩基配列と比較的相同性を示したので、以下のハイブリダイゼーションの鋳型として用いることにした。
Ｐ−８１５細胞よりｐｏｌｙ（Ａ）の付加されたＲＮＡを分離した。オリゴ（ｄＴ）プライミング法により、ｃＤＮＡ合成キット（Pharmacia社製）を用いて調製されたｃＤＮＡより、1.5キロベース（Ｋｂ）以上のものを選択し、ＥｃｏＲＩアダプター（New England Biolabs社）を付け、λ-ZAPIIＤＮＡ（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製した。得られたｃＤＮＡライブラリー中の3.5×１０5個のクローンを、ナイロンメンブラン（商品名：ハイボンド−エヌプラス（Hybond-N plus）,Amersham社製）に移し、上記で得られたクローンＣＹのｃＤＮＡインサートを用いたクロスハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５×Denhardt's（0.1％Ficoll，0.1％ポリビニルピロリドンおよび0.1％ウシ血清アルブミン）、0.5％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）、２００μｇ／ｍｌの熱変性させたサケ精子ＤＮＡおよび32Ｐで標識したクローンＣＹのｃＤＮＡインサートを含有する６×ＳＳＣ（９００ｍＭ  ＮａＣｌ，９０ｍＭクエン酸ナトリウム）中、６５℃で１５時間行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６５℃で３０分間、１％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣで２回洗浄した。
９個のポジティブクローンを単離し、インビボ・エクジション（in vivo excision）法によってプラスミドに変換した。核酸の塩基配列は、ブカベスト（Bca Best）ＤＮＡシークエンシングキット（宝酒造社製）を用いて、二本鎖について実施した。その結果、代表的クローンのひとつ、ＣＰ３０２を得た。
実施例１：ヒトＰＧＩ2受容体のｃＤＮＡクローニング（ヒト血小板由来）
ヒト巨核球白血病細胞株（ＣＭＫ細胞、Brit．J．Haematol.，72，184（１９８９）記載の方法により調製した。）より、オリゴ（ｄＴ）プライミング法により調製されたｃＤＮＡより、1.5キロベース以上のものを選択し、ＥｃｏＲＩアダプター（New England Biolabs社）を付け、λ-ZAPIIＤＮＡ（Stratagene社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｃＤＮＡライブラリーを調製した。得られたｃＤＮＡライブラリー中の3.0×１０5個のクローンを、ナイロンメンブラン（商品名：ハイボンド−エヌプラス（Hybond−N plus），Amersham社製）に移し、参考例１で得られたクローンＣＹのｃＤＮＡをインサートを用いたクロスハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５×Denhardt′s溶液、0.5％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの熱変性させたサケ精子ＤＮＡおよび32Ｐで標識したクローンＣＹのｃＤＮＡインサートを含有する６×ＳＳＣ（９００ｍＭ  ＮａＣｌ，９０ｍＭクエン酸ナトリウム）中、６５℃で１５時間行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６５℃で３０分間、１％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣで２回洗浄した。多数のポジティブクローンを単離し、シークエンス解析に供した。
核酸の塩基配列は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain ter-mination method）により、二本鎖について実施した。その結果、代表的クローンのひとつ、ＭＫ７１は、1158bpの転写解読枠（配列番号２に示す。）を持つ完全長ｃＤＮＡクローンであった。全長の塩基配列を配列番号３に示し、転写解読枠より推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、配列番号３で示されるＭＫ７１とそれによってコードされる推定アミノ酸を併せて配列番号４に示す。
実施例２：ヒトＰＧＩ2受容体のｃＤＮＡクローニング（ヒト肺由来）
ヒト肺由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontechコード番号：CHAL1033a）と、参考例１で得られたＣＰ３０２をＥｃｏＲＶで切り出したフラグメント（約1.5Ｋｂ）を用いて、下記の条件で、実施例１と同様に操作して、クロスハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、２５％ホルムアミド、１×Ｄｅｎｈａｒｄ's溶液、0.1％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの熱変性させたサケ精子ＤＮＡおよび32Ｐで標識した鋳型（参考例１で得られたＣＰ３０２をＥｃｏＲＶで切り出したフラグメント）を含有する５×ＳＳＰＥ（0.75Ｍ  ＮａＣｌ，0.05Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ，0.005Ｍ  ＥＤＴＡ）中、３７℃で２０時間行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターは、室温で１０分間、２×ＳＳＣで２回、続いて、３７℃で１０分間、２×ＳＳＣで２回、さらに４２℃で１０分間、２×ＳＳＣで１回洗浄した。多数のポジティブクローンを単離し、pBluescript KS（-）（Invitrogen社製）にサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
核酸の塩基配列は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain ter-mination method）により、二本鎖について実施した。その結果、代表的クローンのひとつ、ｐｈＩＰＲ１は、1158ｂｐの転写解読枠（配列番号５に示す。）を持つ完全長ｃＤＮＡクローンであった。全長の塩基配列は、配列番号６に示し、転写解読枠より推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、配列番号６で示されるｐｈＩＰＲ１とそれによってコードされる推定アミノ酸を併せて配列番号７に示す。
ここで、配列番号２と配列番号５を比べてみると、配列番号２の１５９番目の塩基であるグアニン「Ｇ」は、配列番号５ではシトシン「Ｃ」となっており、さらに、配列番号２の９８４番目の塩基であるアデニン「Ａ」は、配列番号５ではシトシン「Ｃ」となっていることがわかる。同様のことは、配列番号３と配列番号６、および配列番号４と配列番号７の相当する場所にも存在する。これらの相違は、ｃＤＮＡライブラリーの作成のために用いた細胞の違いによるものと考えられる。
実施例３：ラットＰＧＩ2受容体のｃＤＮＡクローニング（ラット肺由来）
ラット肺由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontechコード番号：CLRL1008a）と、参考例１で得られたＣＰ３０２をＥｃｏＲＶで切り出したフラグメント（約1.5Ｋｂ）を用いて、実施例２と同様の条件で操作して、クロスハイブリダイゼーションを行った。多数のポジディブクローンを単離し、pBluescript KS（-）（Invitrogen社製）にサブクローンした後、シークエンス解析に供した。
核酸の塩基配列は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain ter-mination method）により、二本鎖について実施した。その結果、代表的クローンのひとつ、ｐｒＩＰＲ１は、1248ｂｐの転写解読枠（配列番号９に示す。）を持つ完全長ｃＤＮＡクローンであった。全長の塩基配列は、配列番号１０に示し、転写解読枠より推定されるアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、配列番号１０で示されるｐｒIＰＲ１とそれによってコードされる推定アミノ酸を併せて配列番号１１に示す。
実施例４：ＣＨＯ細胞による発現とリガンドとのバインディングアッセイ
ＭＫ７１のｃＤＮＡのＥｃｏＲＩインサートを、セレクションマーカーとしてマウスの遺伝子を含む真核細胞発現ベクターであるｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒにサブクローンし、得られたプラスミドＤＮＡをリポフェクション（lipofection）法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，7413（1987）に記載。）によって、ジヒドロ葉酸還元酵素活性の欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−）に形質転換した。ジヒドロ葉酸還元酵素を発現する細胞群は、ペニシリン（１００units／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）および１０％透析ウシ胎児血清を含有するα−改変イーグル培地（Cell Culture Laboratories社製）中で培養し、選択した。これらの細胞群からシングルセルクローニングによって細胞株を単離した。ｃＤＮＡの発現はＲＮＡブロッティング法によってアッセイした。コントロールとして用いた、ＣＨＯ細胞にｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒをトランスフェクションして得た細胞株は、ＲＮＡブロッティングにおいて、何らシグナルを示さなかった。
形質転換したＣＨＯ細胞を培養し、回収した後、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ7.5）、0.25Ｍショ糖、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび0.1ｍＭフェニールメチルスルホニルフルオライドからなる溶液中、ポーター−エルベジェム（Potter-Elvehjem）ホモジナイザーを用いて、ホモジネートした。ホモジネート液は、８００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を取り置き、ペレットを２５ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ7．5）、0.25Ｍショ糖、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび0.1ｍＭフェニールメチルスルホニルフルオライドからなる溶液中に懸濁させ後、ホモジネートし、再度、遠心分離した。今回得られた上清を、先に得られた上清と合わせ、100,000×ｇで１時間遠心分離した。得られたペレットを２０ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物、ｐＨ6.0）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（以下、懸濁バッファーという。）中に懸濁させてクルードな膜組織として用いた。
［3Ｈ］iloprostとのバインディングアッセイは、以下のようにして行なった。すなわち、クルードな膜組織、４０μｇ蛋白と種々の濃度の［3Ｈ］iloprost（Scatchard分析用）または２０ｎＭの［3Ｈ］iloprost（置き換え実験用）を全ボリューム１００μｌとなるように懸濁バッファー中に懸濁させて、３０℃で１時間培養した。培養は、氷冷した懸濁バッファー２ｍｌを加えることにより終結させた。混合物をすばやくワットマン（Whatman）ＧＦ／Ｃフィルターでろ過した。フィルターは、氷冷した懸濁バッファー２ｍｌで４回洗浄した後、フィルター上の放射活性を常法により測定した。結果を図１に示す。
このアッセイの結果、ＰＧＩ2受容体に対する特異的リガンドである［3Ｈ］iloprostはＭＫ７１を発現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することがわかった。この結合のScatchard分析の結果、解離常数は3.3ｎＭ、最大結合は3.2pmol／ｍｇ蛋白であった。さらに、［3Ｈ］iloprostの特異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性を図１に示す。種々のプロスタノイドによる結合阻害は、iloprost＝cicaprost＞＞carbacyclin（これらはいずれも安定なＰＧＩ2のアゴニスト）＞ＰＧＥ1＞ＳＴＡ2（安定なＴＸＡ2アゴニスト）＞＞ＰＧＥ2＝ＰＧＤ2＝ＰＧＦ２αの順序で認められた。
発明の効果
本発明のポリペプチドは、それ自体、ＰＧＩ2と特異的に結合するのでＰＧＩ2の過剰産生によって生ずる疾患、例えば、出血性の疾患等の予防あるいは治療剤として用いることができる。また、ＰＧＩ2のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
本発明のＤＮＡは、上記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このようなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御することに用いることもできる。
本発明には、本発明のポリペプチド、その抗体と薬学的に許容される賦形剤及び／または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
さらに、本発明のポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３８６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0003692536.tif 000002
0003692536.tif 000003
配列番号：２
配列の長さ：１１５８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
0003692536.tif 000004
配列番号：３
配列の長さ：１９７９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
0003692536.tif 000005
0003692536.tif 000006
配列番号：４
配列の長さ：１９７９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：homo sapiens
細胞の種類：巨核球白血病細胞
セルライン：CMK
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：92..1249
特徴を決定した方法：Ｐ
配列
0003692536.tif 000007
0003692536.tif 000008
0003692536.tif 000009
0003692536.tif 000010
配列番号：５
配列の長さ：１１５８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
0003692536.tif 000011
配列番号：６
配列の長さ：１３２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
0003692536.tif 000012
配列番号：７
配列の長さ：１３２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：homo sapiens
組織の種類：肺
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：67..1224
特徴を決定した方法：Ｐ
配列
0003692536.tif 000013
0003692536.tif 000014
0003692536.tif 000015
0003692536.tif 000016
配列番号：８
配列の長さ：４１６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0003692536.tif 000017
0003692536.tif 000018
0003692536.tif 000019
配列番号：９
配列の長さ：１２４８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
0003692536.tif 000020
配列番号：１０
配列の長さ：１３８７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列
0003692536.tif 000021
配列番号：１１
配列の長さ：１３８７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：rat
組織の種類：肺
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＳ
存在位置：107..1354
特徴を決定した方法：Ｐ
配列
0003692536.tif 000022
0003692536.tif 000023
0003692536.tif 000024
0003692536.tif 000025
【図１】
0003692536.tif 000026