(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）又は式（II）：
【化１】
0003634891.tif 000006
【化２】
0003634891.tif 000007
（ここで、Ｒ1は水素、メチル基、イソプロピル基を示し、Ｒ2及びＲ3は水素又は水酸基を示す）
で表されるジケトピペラジン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするキチナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アルギニンを含む２つのα−アミノ酸からなる環状ジペプチドを有効成分として含有するキチナーゼ阻害剤に関するものである。このキチナーゼ阻害剤は、抗真菌剤、農薬などに利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
キチンは、甲殻類、昆虫類、カビ、酵母等に幅広く分布している。甲殻類、昆虫類においては、クチクラの主成分がキチンであり、脱皮、成長の過程で、キチンの合成と分解が巧みに制御されていることが知られている。また、カビ、酵母等の真菌類は、分裂及び増殖の過程でキチンの合成と分解が制御されている。キチナーゼは、キチンをＮ−アセチルキトビオースにまで分解する酵素であり、この酵素が阻害剤によって阻害されれば、甲殻類、昆虫類の脱皮、成長また、カビ、酵母等の分裂、増殖に影響を与えることになる。すなわち、キチナーゼは、この代謝系に関わる重要な酵素であり、キチナーゼに対する阻害剤は、新しいタイプの抗真菌剤あるいは昆虫の成長制御剤になることが期待される。
【０００３】
これまでに、キチナーゼ阻害剤としては、アロサミジン及びその誘導体（バイオサイエンスとインダストリー，作田庄平    ５１巻，１８−２３  １９９３年）  知られていた。また、本発明者らは、新規キチナーゼ阻害物質としてシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンを報告している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗真菌剤、農薬等に有用な新規なキチナーゼ阻害剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、種々の化学物質のキチナーゼ阻害活性を測定した結果、アルギニン残基を含む環状ジペプチドが高いキチナーゼ阻害活性を有することを見出し、それらの有効な使用方法を明らかにすることによって、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、アルギニン残基を含む環状ジペプチドを有効成分として含有することを特徴とするキチナーゼ阻害剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。
環状ジペプチドを構成する２つのアミノ酸の一方のアミノ酸は、アルギニンである必要があるが、アルギニンはＬ体でもＤ体でもかまわない。もう一方のα−アミノ酸は、公知のα−アミノ酸のいずれでもよく、Ｌ体、Ｄ体の別は問わない。このようなアミノ酸を具体的に例示すると、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、セリン、ヒドロキシプロリン、オルニチンなどがあげられる。これらの環状ジペプチドのうち、Ｌ−アルギニンとＤ−プロリンの縮合反応したもの、即ち、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンは物質自体としても新規である。
【０００７】
本発明の環状ジペプチドは、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）にあるようなジケトピペラジン誘導体として表すことができる。
【０００８】
【化１】
0003634891.tif 000002
【０００９】
【化２】
0003634891.tif 000003
【００１０】
ここで、Ｒ１  はグリシンにおける水素、アラニンにおけるメチル基、バリンにおけるイソプロピル基などのアミノ酸由来の側鎖を示し、Ｒ２  及びＲ３  は水素又は水酸基を示す。
これら、２つのアミノ酸が、縮合反応によって、環状ジペプチドを形成した化合物にキチナーゼ阻害活性が認められる。キチナーゼに対する阻害剤は、新しいタイプの抗真菌剤あるいは昆虫の成長制御剤になることが期待される。
【００１１】
本発明の環状ジペプチドは、合成法によって簡単に製造することができる。すなわち、保護基を有するアルギニンとそれぞれのアミノ酸をＮ，Ｎ−ジクロロヘキシルカルボジイミド法等によって縮合し、脱保護、環化反応を行うことで簡単に製造することができる（Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｓｃｈｅｅｈａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｖｏｌ．７７，  ｐ１０６７−１０６９（１９５５））。なお、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンについては、シュードモナスｓｐ．ＩＺ２０８株（ＦＥＲＭＰ−１４７３８  ）をはじめとしたシュードモナス属微生物を培養し、その培養物を採取することによっても製造できる。
【００１２】
環状ジペプチドを医薬として製剤するには周知の方法を用いることができ、有効成分である環状ジペプチドに賦形剤を加えて製剤するのが好ましい。例えば、固体組成物を調製する場合タルク、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、スターチ、ラクトース、メチルセルロース等の賦形剤または担体と混合する。流体組成物を調製するには、砂糖、芳香フレーバー剤及び保存剤とともに水性ビヒクルに溶解してシロップとする。また剤形及び投与形態としては、周知である個々の適用形態を用いて行うことができ、例えば、環状ジペプチドの適量を含有する錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、点眼剤、座薬、エアロゾル、エマルジョン、液剤、懸濁剤等のごとき適用形態に処方できる。製剤全体における環状ジペプチドの含有量は、特に限定されず広範囲に選択できるが、通常０．１から７０重量％にするのが望ましい。投与方法は、限定されるものではなく例えば、経口投与、非経口投与、局所投与、経直腸投与、吸入投与等の方法を用いることができる。臨床投与量は用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により便宜選択されるが通常環状ジペプチドの量は、一日あたり体重１ｋｇ当たり０．１〜２００ｍｇ  の範囲であり、通常１日１〜５回投与するのが好ましい。
【００１３】
キチナーゼの阻害活性は、シャーレ変法等の既知の方法（キチン、キトサン実験マニュアル，キチン，キトサン研究会編，ｐ１０９−１２０）  又は、キチナーゼ阻害物質の検定法（特願平６−２３７６５０号明細書）  により測定することができる。
本発明の環状ジペプチドは、例えば、カンジタ症の治療剤として利用できる。カンジダ    アルビカンスは、酵母型と糸条型の二つの形態を取り、酵母型は病原性がないのに対し、糸条型は病原性があることから、糸条型への形態の変化を阻害すればカンジダ症治療剤としての効果が期待できる。本発明化合物へのカンジダ    アルビカンスへの影響は、カンジダ    アルビカンスを本発明化合物を含む培地中で培養し、その形態変化を顕微鏡で観察することで判定できる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
塩化メチレン溶液４ｍｌ中にＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン４８７ｍｇ  を溶解後、Ｄ−プロリンベンジルエステル塩酸塩２４２ｍｇ  とトリエチルアミン０．１７ｍｌを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロロヘキシルカルボジイミド２２７ｍｇ  を加え室温で２時間攪拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル０．１ｍｌを加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エーテル−石油エーテル２ｍｌから結晶化することで、Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステルを５７２  ｍｇを得た。
【００１５】
Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステル４０４  ｍｇをトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶液１ｍｌに加え５０℃で９０分攪拌した。反応液を減圧濃縮後、生じた油状成分に水３ｍｌを加え、トリエチルアミンでｐＨ６．０に調整後８０℃で１６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン１１５ｍｇ（収率７６％）  を得た。
［実施例２］
塩化メチレン溶液４ｍｌ中にＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン４８７ｍｇ  を溶解後、Ｌ−プロリンベンジルエステル塩酸塩２４２ｍｇ  とトリエチルアミン０．１７ｍｌを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロロヘキシルカルボジイミド２２７ｍｇ  を加え室温で２時間攪拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル０．１ｍｌを加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エーテル−石油エーテル２ｍｌから結晶化することで、Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリンベンジルエステルを５６３  ｍｇを得た。
【００１６】
Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリンベンジルエステル４０４  ｍｇをトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶液１ｍｌに加え５０℃で９０分攪拌した。反応液を減圧濃縮後、生じた油状成分に水３ｍｌを加え、トリエチルアミンでｐＨ６．０に調整後８０℃で１６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリン１１２ｍｇ（収率７４％）  を得た。
［実施例３］
塩化メチレン溶液４ｍｌ中にＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン４８７ｍｇ  を溶解後、グリシンメチルエステル塩酸塩１２５．５ｍｇ  とトリエチルアミン０．１７ｍｌを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロロヘキシルカルボジイミド２２７ｍｇ  を加え室温で２時間攪拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル０．１ｍｌを加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エーテル−石油エーテル２ｍｌから結晶化することで、Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−グリシンメチルエステルを４５８ｍｇ  を得た。    Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−グリシンメチルエステル３３４ｍｇ  をトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶液１ｍｌに加え５０℃で９０分攪拌した。反応液を減圧濃縮後、生じた油状成分に水３ｍｌを加え、トリエチルアミンでｐＨ６．０に調整後８０℃で１６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−グリシン７０．３ｍｇ（収率７５％）  を得た。
［実施例４］
塩化メチレン溶液４ｍｌ中にＮ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニン４８７ｍｇ  を溶解後、Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルトシル塩４２７ｍｇ  とトリエチルアミン０．１７ｍｌを加え攪拌後、Ｎ，Ｎジクロロヘキシルカルボジイミド２２７ｍｇ  を加え室温で２時間攪拌した。反応液は減圧濃縮し、残渣に酢酸エチル０．１ｍｌを加え、固形物をろ過により除去後、減圧濃縮し、エーテル−石油エーテル２ｍｌから結晶化することで、Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステルを６０８ｍｇ  を得た。
【００１７】
Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−ω−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−フェニルアラニンベンジルエステル４３４ｍｇ  をトリフルオロ酢酸とアニソールの９対１混合溶液１ｍｌに加え５０℃で９０分攪拌した。反応液を減圧濃縮後、生じた油状成分に水３ｍｌを加え、トリエチルアミンでｐＨ６．０に調整後８０℃で１６時間攪拌した。反応液を減圧濃縮後、イソプロパノールと水の３対１溶液から結晶化することで、シクロ−Ｌ−アルギニル−Ｌ−フェニルアラニン１４２．５  ｍｇ（収率７０％）  を得た。
〔実施例５〕
ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、りん酸第二鉄０．０１ｇ／Ｌ、天然海水１０００ｍｌの組成を有する培養培地（殺菌前ｐＨ７．５）  １５０ｍｌを５００ｍｌ  フラスコに加え、これにシュードモナスｓｐ．ＩＺ  ２０８  株を種菌として植菌し、２５℃，  ７２時間振盪培養した。
【００１８】
得られた培養液１０Ｌを１００００ｒｐｍで遠心分離し、培養上清を得た。上清を酢酸エチル（１０００ｍｌ）  で二層分配し、酢酸エチル層と水層を得た。水層を活性炭（和光純薬製）を充填したカラムに付し、水洗後、２Ｎ酢酸を用いて溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮して１０ｍｌとし、ＨＰ−２０  カラム（三菱化成社製）に付し、分画を行った。活性画分を減圧濃縮して１０ｍｌとし、ＨＷ−４０（東ソー製）  カラムに付し、分画を行った。活性画分を２ｍｌに減圧濃縮し、ＯＤＳカラム（ナカライテスク社製）  を用いたＨＰＬＣで、水（０．１％ＴＦＡ含有）から１０％アセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ含有）のグラジェント溶出（３０分間）によって展開した結果、２８分に活性画分が認められ分取した。分取画分を減圧濃縮してシクロ−Ｌ−アルギニル−Ｄ−プロリン５ｍｇを得た。
［実施例６］
キチナーゼ阻害活性試験は、イカキチン寒天ディスク法（特願平６−２３７６５０号明細書）  に従って行った。イカ由来のキチンを含んだ寒天培地に、キチナーゼ産生菌Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ９９０  の菌液を塗布し、その寒天培地上に本発明の環状ジペプチドを含むペーパーディスクをのせ、２４℃４８時間静置した。その後、ペーパーディスクのまわりに残存するキチンハロの直径を測定し、活性を測定した。結果を下表に示す。
【００１９】
0003634891.tif 000004
［実施例７］
カンジダ    アルビカンスＩＦＯ  １０６０をＹＭＢｒｏｔｈ  （Ｄｉｆｃｏ社製）  を用いて培養を行い、シクロ−Ｌ−アルギニル−グリシンを加えた場合と加えない場合との形態の観察を行った。その結果、シクロ−Ｌ−アルギニル−グリシンを加えない場合は、培養２４時間後に酵母型から菌糸型への形態変化を起こしたが、シクロ−Ｌ−アルギニル−グリシンを６μｇ／Ｌ  以上の濃度にして培養すると、カンジダ    アルビカンスＩＦＯ  １０６０は、酵母型から、菌糸型への形態変化を起こさなかった。
［実施例８］
以下の処方により、シクロ−Ｌ−アルギニル−グリシンを有効成分とする錠剤を調製した。
0003634891.tif 000005
【００２０】
【発明の効果】
本発明は、新規なキチナーゼ阻害剤を提供する。キチナーゼ阻害剤は、抗真菌剤、農薬などに利用できる。