(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含することを特徴とする糖と標的物との相互作用の測定方法。
（ａ）ピリジン、ベンゼン、クマリン、ナフタレン、アントラセンおよびピレンからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物の誘導体であり、かつ少なくとも１つのアミノ基を有する可視光に対して安定な蛍光標識試薬により、天然物中の糖混合物に存在する糖の還元性残基を還元アミノ化反応により蛍光標識する工程、
（ｂ）（ａ）で標識した蛍光を指標に蛍光標識化糖を精製する工程、および
（ｃ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程。
【請求項２】
蛍光標識試薬が、２−アミノピリジン、２−アミノベンズアミド、７−アミノ−４−メチルクマリン、８−アミノ−ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸、５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノメチル））スルホンアミドおよび１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸からなる群から選ばれる蛍光標識試薬である、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
下記工程を少なくとも一度包含することを特徴とする標的物と相互作用を有する糖の検索方法。
（ａ）ピリジン、ベンゼン、クマリン、ナフタレン、アントラセンおよびピレンからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物の誘導体であり、かつ少なくとも１つのアミノ基を有する可視光に対して安定な蛍光標識試薬により、天然物中の糖混合物に存在する糖の還元性残基を還元アミノ化反応により蛍光標識する工程、
（ｂ）（ａ）で標識した蛍光を指標に蛍光標識化糖を精製する工程、
（ｃ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程、および
（ｄ）蛍光標識化糖を構造解析する工程。
【請求項４】
蛍光標識試薬が、２−アミノピリジン、２−アミノベンズアミド、７−アミノ−４−メチルクマリン、８−アミノ−ナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸、５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノメチル））スルホンアミドおよび１−アミノピレン−３，６，８−トリスルホン酸からなる群から選ばれる蛍光標識試薬である、請求項３記載の糖の検索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖と標的物との相互作用の測定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、糖とそれに対する標的物との相互作用を蛍光偏光法により測定する天然物より得られる糖および／または標的物を同定する一連の操作に関する。また、本発明は、本発明の方法に使用するキットにも関する。
本明細書において、「相互作用」とは、分子間に働く、静電力、共有結合、疎水結合、ファンデルワールス力および水素結合のうち、少なくとも１つから生じる分子間力に働く力による作用を意味する。静電力により分子間に働く力には、静電結合の他、電気的反発も包含する。また、共有結合により分子間に働く力には、配位結合の他、電気陰性度が異なる原子が共有結合した場合に生じる双極子間に働く力も包含する。さらに、上記作用の結果生じる、結合反応、合成反応、分解反応なども相互作用に包含する。
【０００２】
具体的な例としては、情報伝達物質のリガンドとレセプターとの間の結合と解離、接着分子とその相手方分子との結合と解離、抗原と抗体との間の結合と解離、酵素と基質との間の結合と解離および酵素と基質との結合と解離の結果生じた基質の分解反応、基質間の転移反応などが挙げられる。また、糖と糖結合タンパク質であるレクチンとの結合と解離、糖と細胞または細胞の断片との結合と解離、糖と高分子との結合と解離、デンプンのアルファー化等のような非共有結合に起因する構造の変化などが挙げられる。
【０００３】
【従来の技術】
近年、細胞間認識や接着といった現象に糖鎖が関与していることが明らかになってきている。また、糖鎖そのものや、糖鎖の誘導体が生理活性を持つことも数多く報告されている［Varki，A.，Glycobiology，Vol．3，97-130(1993)］。さらに、糖鎖が癌化や細胞分化のマーカーであることが多く［Varki，A.，Glycobiology，Vol．3，97-130(1993)］、糖鎖が癌化や細胞分化に重要な役割を果たしていることは疑いない。
糖が持つこれらの生理機能の発現には、多くの場合、糖（糖リガンド）が高分子の受容体あるいは結合体である、いわゆる糖レセプターと相互作用をすることが必須であり、糖レセプターの探求と機能解析こそが、糖鎖の機能発現の機序の解明、ひいては糖レセプターを刺激または不活化する薬物の創生のための重要なステップであることは間違いない。
また、レセプター側からみれば、実際に生体内で機能している真のリガンドの探索、そして、より強力なリガンドのスクリーニングが最も有効な研究戦略である。上記のような糖機能の探求活動に欠かすことができないのが、糖と糖レセプター等の標的物との相互作用の測定である。
【０００４】
一般に、あるリガンドとレセプターとの相互作用の測定には、ラジオレセプターアッセイが用いられている。糖と標的物との相互作用の測定にも、ラジオレセプターアッセイを用いることは可能であるが、糖の場合、タンパクでのヨウ素ラベルのような、非特異的かつ効率的な放射標識法がなく、化学合成による標識もその構造の複雑さゆえ非常に困難である。したがって、糖と糖レセプターの相互作用の測定にラジオレセプターアッセイが実際に用いられている例は、渋谷らの報告［Shibuya，N.，et al.，FEBS lett．Vol．329，75-78(1993)］等数少ない。
上記の他、リガンドとレセプターとの相互作用の測定法として、蛍光偏光法［Perrin，F.，J．Phys．Rad.，Vol．１，390―401(1926)］が古くから知られている。この方法では、糖を蛍光標識する必要があるが、従来の報告ではせいぜい４糖までの簡単なオリゴ糖の合成品を用いているのみである［Decastel，M.，et al.，Arch．Biochem．Biophys.，Vol．232，640-653(1984)］。
また、近年、表面プラズモン共鳴法を用い、糖鎖とレクチンとの相互作用を測定する方法が報告されている［Hutchinson，A.，Anal．Biochem.，Vol．220，303-307(1994)］が、高価な専用機器を必要とする上、糖鎖かレセプターの一方を固相化する必要があるため、普及にはいたっていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来より用いられてきたこのような方法では、精製されたある特定の糖を標識または固定することになるため、すでに何らかの活性をもっていることが分かっているような特定の精製された糖に対する糖レセプター等の標的物のスクリーニングまたは精製には都合がよい。
しかし、例えば、セレクチンの様に、標的物側のほうが非常に詳細に研究されているにもかかわらず、生体内で機能しているリガンドについては、諸説は出るものの［Lasky，L.，Ann．Rev．Biochem.，Vol．64，113-139(1995)］、未だ特定されていない。これは、標的物の多くがタンパクであり、タンパクの研究は遺伝子工学的手法の導入により糖のそれに比べると格段に早いためである。このような場合、ある特定の標的物に対して相互作用をする糖を生体よりスクリーニングする必要が生じる。
また、複数の分子が候補にあがった場合、糖を介する分子間相互作用は、抗原抗体反応のように必ずしも特異性が高いとは限らず、このような場合、結合定数を調べるなどして、相互作用の程度を数値化し、各分子を比較する必要が生ずる。
しかし、従来の技術では、候補となる糖の各々を標識や固定化しなければならず、多大な労力を要する。また、固定化により、均一な系での測定ができず、天然時の環境とは異なる条件で測定しなければならない。さらに、糖が未知のものである場合には、まず、糖を分離精製し、純品とする必要があり、この点で、従来法では相互作用を測定することは困難を極めた。
そこで、ある標的物に対して相互作用をする糖を生体より選択または精製する方法の開発が従来から望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ある特定の標的物に対して相互作用をする糖を天然物よりスクリーニングし、さらに、その糖の構造解析を行う方法に求められる要件は、
１．糖に精製の際に指標となる標識をおこなうこと、
２．その標識は精製途中において安定であること、
３．糖と標的物との相互作用の測定が簡便に行えること、
４．標識が、標的物との相互作用の測定にも利用できること、
５．精製した糖の構造解析が高感度で簡便に行えること、
である。
【０００７】
上記要件のうち、蛍光偏光法が、要件３を満たしている。
蛍光偏光法の原理を簡単に説明すると、平面偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転などの運動を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報を得ることができる。
蛍光の偏光度（Ｐ）は数１の式で示される。
【０００８】
【数１】
Ｐ＝（Ｉnt‖−Ｉnt⊥）／（Ｉnt‖＋Ｉnt⊥）
【０００９】
式中、Ｉnt‖は、励起光平面に平行な放射光（蛍光）の強度、Ｉnt⊥は、励起光平面に垂直な放射光の強度を示す。
なお、通常、蛍光偏光度は、励起側、蛍光側ともに偏光素子をセットし、蛍光側の偏光素子を回転させ、励起光の偏光面と平行および垂直の偏光面を有する蛍光を測定することによって得られるので、１分以内の短時間で、１回の測定を終了することができる。また、測定時間が短いことより２分子間相互作用の速度論的解析を行うことができる。また、この方法は、固相化の必要がなく、均一な系での測定が可能である。
本発明者らは、残る上記要件を満たす標識方法および標識用色素の検討を行い、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、その第１の態様として、糖と標的物との相互作用を蛍光偏光法により測定する方法において、糖の特定の基と、蛍光標識試薬との反応により得られる蛍光標識化糖を使用することを特徴とする糖と標的物との相互作用の測定方法を提供する。
また、本発明は、第２の態様として、第１の態様の測定方法に使用する、糖と標的物との相互作用測定用キットを、
第３の態様として、
（ａ）蛍光標識試薬により糖の特定の基を蛍光標識し、蛍光標識化糖を調製する工程、および
（ｂ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程
を包含する糖と標的物との相互作用の測定方法を、
第４の態様として、
（ａ）蛍光標識試薬により糖の特定の基を蛍光標識し、蛍光標識化糖を調製する工程、
（ｂ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程、および
（ｃ）蛍光標識化糖を構造解析する工程
を少なくとも一度包含する標的物と相互作用を有する糖の検索方法を、
第５の態様として、
（ａ）蛍光標識試薬により糖の特定の基を蛍光標識し、蛍光標識化糖を調製する工程、
（ｂ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光度測定法で測定する工程、および
（ｃ）標的物を構造解析する工程
を少なくとも一度包含する糖と相互作用を有する標的物の検索方法を提供する。
【００１１】
本発明は、糖と標的物との相互作用の測定に先立ち、糖の特定の基を標識する蛍光標識試薬で標識すること特徴とする。さらに、導入した蛍光色素の蛍光偏光を測定することにより、糖と標的物との相互作用を測定し、その蛍光を糖の構造解析の際の指標とすることを特徴とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の測定方法で使用する蛍光標識化糖は、糖の特定の基を標識する蛍光標識試薬により標識されていれば特に限定するものではないが、蛍光を指標とし、蛍光標識化糖を分離、精製する場合には、糖１分子当たりの蛍光強度がほぼ一定であり、特定の基のみが標識されていることが好ましい。一方、糖分子と標的物との相互作用を測定する際に蛍光標識化糖を用いる場合、蛍光標識化による糖分子の立体構造に影響が少ないことが好ましい。
例えば、水酸基に反応する蛍光標識試薬を用いた場合、グルコースでさえ水酸基を５個有しており、非特異的に標識試薬が反応すると、得られる蛍光標識化グルコースは、計算上３２種類生じる。したがって、１つの糖から、複数の誘導体が得られる蛍光標識方法を用いることは、例えば、糖の構造解析時に支障をきたす。また、非特異的な標識は、標的物との相互作用に関する中心部位に蛍光色素が導入される場合も当然考えられ、標的物との相互作用の解析に影響を及ぼす場合も生じる。また、天然物中に存在する糖を対象とする場合には混在する、タンパクや核酸等の糖以外の成分への標識の導入の可能性もある。
【００１３】
単糖や構造が簡単なオリゴ糖の場合は、有機合成の手法により、蛍光色素で糖分子の特定の基のみを選択的に標識することも可能であるが、天然物中に存在する構造不明の糖分子の場合、特定の基のみを選択的に標識することは、極めて困難である。
したがって、本明細書における「糖の特定の基と、蛍光標識試薬との反応」工程は、例えば、糖の基を保護する工程等が不要であることが好ましい。
糖の基を保護する工程を含む糖の蛍光標識方法には、例えば、蛍光色素を導入しない基を保護し、目的の基に蛍光色素を導入した後、保護基を外す方法の他、蛍光色素を導入する基を保護し、他の基を不活化した後、目的の基に蛍光色素を導入する方法が挙げられる。
糖の基を保護しない標識方法としては、特に限定するものではないが、生体中の他の成分、例えば、タンパクなどには反応せず、糖特異的に反応する方法が適しており、例えば、糖の還元性残基を標識する方法がある。
かかる還元性残基としては、例えば、糖鎖末端に存在するカルボニル基、遊離のアルデヒド基が挙げられる。糖鎖末端の反応は、標識化による糖の立体構造への影響がほとんどなく、本発明には特に好適である。糖の還元性残基に反応させる方法には還元アミノ化反応やヒドラジド化反応がある。
【００１４】
還元アミノ化による標識の対象となる糖は、還元末端を持つか、アミノ基と特異的に反応できるアルデヒド基を有するものであれば、特に限定するものではなく、糖１分子あたり２分子以上のアミノ基が反応してもよい。また、糖は生体より分離したものでも、人為的に化学合成したものでもよく、さらに、蛍光標識する糖は、均一でも混合物でもよく、また、タンパクまたは脂肪の塩類等の、糖以外の物質が共存していてもよい。還元アミノ化による標識は、糖と蛍光物質が縮合し、シッフ塩基を形成する反応と、シッフ塩基を還元して安定な蛍光標識糖鎖を形成する反応を同時または別々に行うことができればよく、溶媒、対イオン、温度、時間など反応条件は問わない。好ましくは、シアル酸の脱離がなく、かつ反応収率のよい条件がよい。
用いる蛍光標識試薬は、少なくとも１つのアミノ基を有する蛍光標識試薬であれば、特に限定するものではない。
【００１５】
一方、天然物に含有される糖を精製、分離し、標的物との相互作用の測定、さらに該糖分子の構造解析を行う場合、糖の構造の複雑さゆえ、長時間を要する。したがって、蛍光標識化糖は、安定なことが好ましい。本明細書における「実質的に安定な蛍光標識化糖」とは、上記の一連の操作中、安定な蛍光強度を有することを意味する。「実質的に安定な」とは、例えば、水溶液中での分解安定性の他、可視光に対する安定性が挙げられる。一般に、実験操作は屋内で行うため、標識化糖が光に曝される。したがって、「実質的に安定な」蛍光標識化糖には、例えば、ピリジル基を蛍光色素として有する蛍光標識化糖が挙げられる。ピリジル基は、蛍光灯の４０００ルクスの光を１６時間照射しても、照射開始前のほぼ１００％の蛍光強度を有するが、蛍光色素として汎用されるフルオレセイン基は、同一条件下で放置すると、約２０％に蛍光強度が減衰する。フルオレセイン基を標識蛍光色素に用いた場合、操作中、遮光措置を講ずる必要があるが、物質の蛍光の測定には光の照射が必要であるところから、このことは、蛍光を指標として物質を精製することと矛盾を生じる。
したがって、本明細書において、「実質的に安定な」蛍光標識化糖とは、蛍光灯の４０００ルクスの光を１６時間照射しても、２０％以上の蛍光強度を有する蛍光色素で標識された糖に相当する。
【００１６】
上記条件を満たす蛍光標識化糖としては、ピリジン、ベンゼン、ベンゼン、ナフタレン、クマリン、アントラセンおよびピレンからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物の誘導体である蛍光色素を有する糖が挙げられる。かかる蛍光標識化糖としては、例えば、２−アミノピリジン、２−アミノベンズアミド、 ７−アミノ−４−メチルクマリン、８−アミノ−ナフタレン−１,３,６−トリスルホン酸、５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノメチル））スルホンアミド、１−アミノピレン−３,６,８−トリスルホン酸のいずれが１つを糖に反応させることにより得られるものが挙げられる。
【００１７】
本発明における、糖とは、単糖、オリゴ糖、多糖あるいは単糖、オリゴ糖および／または多糖含有物から選ばれる糖であればいずれでもよい。例えば、糖脂質、糖ホルモンまたは糖ペプチドであってもよい。
また、糖と相互作用する標的物は、タンパク、脂質、糖質、核酸またはそれらのうち少なくとも一つからなる複合体のいずれでもよく、例えば、細胞あるいは細胞の断片などであってもよい。また、人工物質でもよく、さらには、複数の物質を人為的に結合させたものでもよい。また、均一でも混合物でもよく、タンパク、核酸、糖、脂質およびこれらの少なくとも１つからなる複合体であればいずれでもよい。
【００１８】
本発明の方法の実施においては、蛍光標識の後、余剰の試薬等の標識糖以外の物質を除去する方がよく、さらに、好ましくはクロマトグラフィーや、電気泳動等により分離するのがよい。
蛍光偏光度測定装置は、蛍光色素を励起させるための励起光源、励起偏光および蛍光偏光を得るための偏光素子、光電管や光電子倍増管等の蛍光量を電気量に変換する検出器および検出器で変換された電気量を読み取るメーターまたは記録計等が備えられていれば、特に限定するものではなく、蛍光測定の条件も特に限定するものではない。
【００１９】
本発明の第２の態様は、上記に示した蛍光偏光法に使用する、糖と標的物の相互作用測定用のキットである。
該キットは、上記したような蛍光標識化糖を形成させるための蛍光標識試薬、例えば、２−アミノピリジン等の蛍光標識試薬を構成の必須要素としてなる。要すれば、例えば、天然物より糖を得る場合は、糖とタンパクなどを遊離させる試薬、糖を単離するためのクロマト担体等を構成要素として含めることができる。また、第２の態様の別の例においては、上記したような蛍光標識化糖をキットの構成の必須要素とすることができる。
これらの構成要素は、自体公知の方法で、液体ないし固体の形状にしたものとすることができる。
【００２０】
本発明の測定方法の好ましい態様として、糖と標的物質との相互作用の程度の測定が挙げられる。具体的な測定方法としては、次のような工程を含む態様が例示できる。すなわち、
（ａ）糖を蛍光標識し、実質的に安定な蛍光標識化糖を調製する工程、および（ｂ）単離された蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程、
である。
工程（ａ）は、蛍光標識化糖を調製する工程である。本工程に用いられる糖としては、特に限定するものではなく、合成された糖でも、天然物中に存在する糖でもよい。天然物由来の糖の蛍光標識化には、天然物より、糖を精製後、蛍光標識することができる。なお、本発明では、実質的に安定な蛍光標識物を用いており、天然物中に存在する糖混合物を、予め蛍光標識し、その蛍光を指標にカラムクロマトグラフィー等により精製した蛍光標識化糖を用いることもできる。
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた蛍光化標識化糖と標的物との相互作用を蛍光偏光法を用いて測定する工程である。測定機器は、蛍光標識化糖の蛍光偏光の測定に適している装置であれば、特に限定するものではない。
【００２１】
測定する糖分子と標的分子との相互作用は、必ずしも抗原抗体反応ほど特異性が高くなく、最適の組み合わせを見つけるには、相互作用の程度を数値化する必要が生じる。相互作用の程度を示す指標としては、例えば、一定濃度の蛍光標識化糖に対し、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の１／２の値を示すＥＣ50を用いることができる。
【００２２】
本発明の他の好ましい態様として、標的物との相互作用を測定する糖分子のスクリーニング方法が挙げられる。 具体的な方法としては、次のような工程を含む態様が例示できる。すなわち、
（ａ）糖を蛍光標識し、実質的に安定な蛍光標識化糖を調製する工程、
（ｂ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程、および
（ｃ）蛍光標識化糖を構造解析する工程、
である。
【００２３】
工程（ａ）は、蛍光標識化糖を調製する工程である。本発明に用いられる糖試料としては、特に限定すものではなく、合成された糖でも、天然物中に存在する糖でもよい。
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた蛍光化標識化糖分子と標的分子との相互作用を蛍光偏光法を用いて測定する工程である。測定機器は、蛍光標識化糖の蛍光偏光度の測定に適した装置であれば、特に限定するものではない。本工程では、多種類の試料の蛍光偏光測定を行う必要があり、１回の測定が、短時間で終了することが好ましい。この点で、１回の測定時間が、１分と短時間で終了するBEACONTM（パンベラ社製）の光源、偏光素子等を使用する蛍光標識化糖の測定条件に応じ変更することにより、良好な結果を得ることができる。
【００２４】
工程（ｃ）は、標的物と相互作用する糖分子の構造解析を行う工程である。天然物から糖分子を得る場合、クロマトグラフィー等による分離、精製操作も本工程に含まれる。
一般に、未標識の糖、特に糖鎖を精製することは、適当な発色試薬が無い等の検出の面や、天然の通常の糖鎖は電荷を持たないなど、精製手段が限定される面で困難である。したがって、標識の際には、精製手段の選択肢が広がる標識方法でが好ましく、また、糖鎖構造研究を行う反応条件、例えば、メチル化、酸やアルカリ水解、過ヨウ素酸酸化、ヒドラジン分解等に対し、安定であり、糖に、例えば、適当な電荷や疎水性を与えることができる標識が好ましい。蛍光色素の中でもピリジル基が特にこれらの条件を満たしており、本工程に適している。
【００２５】
また、分離、精製された蛍光標識化糖分子を同定するには、メチル化分析や核磁気共鳴分析、質量分析などの物理化学的手法により構造解析できるほか、既存の蛍光標識化糖分子の標準品と物性を比較し同定することにより実施することができる。したがって、糖鎖構造研究を行う反応条件下で比較的安定であり、蛍光標識化により糖鎖に電荷と適度な疎水性を与えることにより精製手段の選択肢を増やすことができ、さらに、既存標準品が多数揃っている、ピリジルアミノ標識化糖の使用が、本工程では好適である。
【００２６】
本発明のもう１つ別の好ましい態様として、糖分子と相互作用する未知の標的物の検索が挙げられる。具体的な測定方法としては、下記工程を少なくとも一度包含する態様が例示できる。すなわち、
（ａ）糖を蛍光標識し、実質的に安定な蛍光標識化糖を調製する工程、
（ｂ）蛍光標識化糖と標的物の相互作用を蛍光偏光法で測定する工程、および
（ｃ）標的物を構造解析する工程、
である。
工程（ａ）は、蛍光標識化糖分子を調製する工程である。本発明に用いる糖分子試料としては、特に限定するものではなく、合成された糖分子でも、天然物中に存在する糖分子でもよい。天然物中からの糖分子の蛍光標識化には、天然物より糖分子を精製後、蛍光標識することができる。なお、本発明では、実質的に安定な蛍光標識試薬を用いており、天然物中に存在する糖分子を、予め蛍光標識し、その蛍光を指標にカラムクロマトグラフィーを用い精製した蛍光標識化糖分子を用いることもできる。
【００２７】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた蛍光標識化糖分子と標的物との相互作用を蛍光偏光法を用いて測定する工程である。測定機器は、蛍光標識化糖の蛍光偏光の測定に適した装置であれば、特に限定するものではない。本工程では、多種類の試料の蛍光偏光度測定を行う必要があり、この点で、上記のBEACONTM改良機が好適に使用できる。
工程（ｃ）は標的物を同定する工程である。本工程では、天然物より標的物を得る場合、それに伴う分離、精製操作も本工程に含まれる。分離操作は、標的物の物性により、遠心分離、沈殿操作、クロマトグラフィー等の既存の精製手段を用いることができる。さらに、標的物が、例えば、タンパクの場合、エドマン分解［Edman，P.，Arch．Biodhem．Biophys.，Vol.22，475(1949)］等を利用したアミノ酸配列のシークエンス、ＤＮＡの場合は、ジデオキシターミナルチェーンリアクション法［Sanger，F.，Nicklen，S.，およびColuson，A．R.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．Vol．74，5463(1977)］等を用いることにより構造解析を行うことができる。
【００２８】
【実施例】
つぎに、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
蛍光標識物質の安定性
還元アミノ化蛍光標識試薬の場合、糖と反応後の励起波長、蛍光波長および蛍光強度が極端に変化しないため、光安定性の測定には蛍光標識化試薬を代替として用いた。蛍光標識試薬として、以下の６種類を選択した。
１．２−アミノピリジン（AP）                 (ナカライテスク社製)
２．７−アミノ−４−メチルクマリン（AC）             (シグマ社製)
３．８−アミノ−２−ナフトール（AN）           (アルドリッチ社製)
４．５−（（５−アミノペンチル）チオウレイジル）フルオレセイン（AF）（モリキュラプローブス社製）
５．５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノエチル））スルホン                           (モリキュラプローブス社製)
６．２−アミノベンズアミド（AB） (オックスフォードグライコシステム社製)
７．８−アミノ−ナフタレン−１,３,６−トリスルホン酸（ANTS） (モリキュラプローブス社製)
上記試薬を１０mＭ トリス−塩酸緩衝液(pＨ ７.５)にて１μＭとなるように溶解し、それぞれ１mlずつを硬質ガラス製試験管（サイズ：直径１２ mm、長さ１２０mm）に入れ、白色蛍光灯下、２５℃にて放置した。なお、この時の溶液近辺の照度を照度計にて測定したところ、約４０００ルクスであった。コントロールには、アルミホイルで遮光し、同一条件で保存した上記試験管を用意した。１６時間後それぞれの溶液の蛍光を、ＲＦ−５４０分光蛍光光度計（島津製作所社製）にて測定した。表１にそれぞれの蛍光物質溶液の蛍光測定の際の励起波長、測定波長および残存蛍光（遮光した溶液の相対蛍光度に対する露光した溶液の相対蛍光度の比）を示した。
【００２９】
【表１】
0003720520.tif 000002
【００３０】
実施例２
インゲン豆に含有されるコンカナバリンＡと相互作用を有する糖の検出
１．インゲン豆含有糖分子の蛍光標識化
脱脂インゲン豆粉末をアクチナーゼＥ（科研製薬社製）で十分に消化して得られた糖ペプチド１mgを、高崎らの方法［Takasaki，S.，et al.，Meth．in Enzymol.，Vol．83，263-268(1982)］にしたがってヒドラジン分解し、遊離糖混合物を得た。得られた混合物を凍結乾燥した後、近藤らの方法［Kondo，A.，et al.，Agric．Biol．Chem.，Vol．54，2169-2170(1990)］に従って２−アミノピリジン（ナカライテスク社製）による蛍光標識を行った。余剰の試薬をセファデックスＧ−１５（Pharmacia社製）による分子篩いクロマトグラフィーにより除去し、蛍光標識化糖混合物を得た。蛍光標識化糖混合物を濃縮乾固し、得られた残渣を４０マイクロリッターの蒸留水に溶解した。そのうちの２０マイクロリッターを下記条件の高速液体クロマトグラフィーに供し、ＡからＧの７つの画分を分取した。分離結果を図１に示す。
図１において、縦軸は相対蛍光強度を、横軸は保持時間（分）を示す。各画分の収量は、Ａ：１.６nmol、Ｂ：２.６nmol、Ｃ：２.２nmol、Ｄ：２.９nmol、Ｅ：６.９nmol、Ｆ：４.６nmol、Ｇ：６.９nmolであった。
【００３１】
条件
カラム：アサヒパックＮＨ2Ｐ−５０（昭和電工社製）
溶離液Ａ：アセトニトリル７５容、蒸留水１５容、５００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン水溶液（ｐＨ７．３）１０容の混合液
溶離液Ｂ：アセトニトリル５０容、蒸留水４０容、５００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン水溶液（ｐＨ７．３）１０容の混合液
流速：１ml／分
カラム温度：４０℃
溶出条件：溶離液Ａで平衡化したカラムにサンプルを導入後、５０分間に溶離液Ｂの割合を０％から５０％に経時的に増加させる。
検出：蛍光検出（励起波長３１０nm、蛍光波長３８０nm）
装置
ポンプ：ＬＣ−６Ａ（島津製作所製）
蛍光検出器：ＲＦ−５３５（島津製作所製）
カラムオーブン：ＣＴＯ−６Ａ（島津製作所製）
【００３２】
２．蛍光偏光度測定装置の作製
BEACONTM2000（パンベラ社製）をピリジルアミノ標識化物の検出に対応するように改良した。すなわち、光源を紫外領域の励起波長光を得られる水銀灯に、偏光素子を Glan-Taylor 型に交換した。
３．精製蛍光標識化糖とコンカナバリンＡとの相互作用の測定
上記１で調製した７種の蛍光標識化糖画分を凍結乾燥し、溶離液由来の塩類を除去し以後の相互作用の測定に用いた。蛍光偏光度測定は以下のように実施した。
まず、コンカナバリンＡ（ホーネンコーポレーション社製）を、終濃度２０μＭとなるようBinding buffer（１mＭ塩化カルシウムおよび１mＭ塩化マンガン含有１００mＭトリス−塩酸緩衝液（pＨ７.９））に溶解した。ついで、この溶液をBinding bufferで２倍希釈し、得られた希釈液を、さらにBinding bufferで２倍希釈する操作を７回繰り返し、２０μＭ〜１５６nＭの８段階のコンカナバリンＡ溶液希釈系列を作製した。
得られた８種類のコンカナバリンＡ各種濃度溶液に蛍光標識化糖画分を各々１μＭとなるように溶解した。溶解後３０分間室温にて放置後、得られた各反応液１００μｌを用い、上記２記載のBEACON改良機にて、波長３１０ｎｍの励起光を使用し、波長３９０ｎｍの蛍光の偏光度を測定した。
【００３３】
図２に各蛍光標識化糖画分とコンカナバリンＡとの相互作用よる蛍光偏光度の変化を示した。縦軸は蛍光偏光度（mＰ）、横軸は反応液中のコンカナバリンＡの濃度（μＭ）を表す。図中、黒四角は蛍光標識化糖画分Ａを、白倒立三角は蛍光標識化糖画分Ｂを、黒三角は蛍光標識化糖画分Ｃを、黒倒立三角は蛍光標識化糖画分Ｄを、黒菱形は蛍光標識化糖画分Ｅを、黒丸は蛍光標識化糖画分Ｆを、白四角は蛍光標識化糖画分Ｇを用いた結果を示す。また、Ａ〜Ｇ７種の蛍光標識化糖画分１μＭにおけるコンカナバリンＡの結合定数を表２に示す。このうちＡ、ＢおよびＣは、測定に用いたコンカナバリンＡ濃度範囲では極大蛍光偏光度を示さず、したがって、ＥＣ50を算出することができなかった。
【００３４】
【表２】
0003720520.tif 000003
【００３５】
＊：−はＥＣ50算出不能を示す。
表２から明らかなように、ＥＣ50が算出できた４種の画分のうち、Ｇが最も低い値を示し、この結果インゲン豆由来の７種の蛍光標識化糖画分のうち、Ｇが最もコンカナバリンＡと結合しやすいことが明らかとなった。
なお、対照実験として蛍光標識化糖画分の代わりに蛍光標識試薬のみ、すなわち２−アミノピリジンを用い、同様の測定をおこなったが、蛍光標識画分Ａ、Ｂ、Ｃ同様、コンカナバリンＡの濃度を上げても、極大蛍光偏光度を示さなかった。
【００３６】
４．蛍光標識化糖の構造解析
蛍光偏光度測定法による測定の結果、コンカナバリンＡとの結合性を有する蛍光標識化糖Ｇは、富谷らによる高速液体クロマトグラフィーを用いた２次元マッピング法［Tomiya，N.，et al.，Anal．Biochem.，Vol．171，73-90(1988)］によって、式：
【００３７】
【化１】
0003720520.tif 000004
【００３８】
［式中：Ｍはマンノースを、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミンを、ＧＮ−ＰＡはピリジルアミノ化Ｎ−アセチルグルコサミンを意味する。また、α1-2、α1-3、α1-6、β1-4は単糖間の結合様式を表す。］
で示される構造のものであることが明らかとなった。
ピリジルアミノ化Ｎ−アセチルグルコサミンは、式：
【００３９】
【化２】
0003720520.tif 000005
【００４０】
で示される構造を有する。
以上のように、インゲン豆由来の糖鎖混合物のなかから、コンカナバリンＡと結合性を有する糖鎖を蛍光偏光法によって検出し、しかもその構造を容易に決定することができた。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、標的物に対し相互作用を有する、特に、天然物由来の糖のスクリーニングおよびその構造解析を簡便に行うことが可能となる。また、逆に、特定の糖分子に対し、相互作用を有する標的物のスクリーニングも、糖分子の固定化などの操作を行うことなく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  インゲン豆を原材料として得られた蛍光標識化糖混合物を、高速液体クロマトグラフィーで分離した状態を示す図である。
【図２】  一定量の蛍光標識化糖画分に対する、コンカナバリンＡ濃度と蛍光偏光度の関係を示す図である。
【図１】
0003720520.tif 000006
【図２】
0003720520.tif 000007