(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）電気泳動分離媒体を含むキャピラリーであって、前記キャピラリーが入り口端部および出口端部を有する、キャピラリー、
（b）前記キャピラリー中に蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を導入する装置、
（c）前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を電気泳動させるに十分な電圧を前記キャピラリーを横切って生成させることができる電源、
（d）複数色の蛍光標識の同時検出を含む前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を検出するためのスペクトル配列検出装置であって、前記検出装置が、レーザー光源および共焦点光学配列を備える、スペクトル配列検出装置、
（e）前記キャピラリーから電気泳動分離媒体を導入し除去する装置であって、前記装置が、前記キャピラリーの前記入り口端部にも、前記出口端部にも接続されずに、前記キャピラリーの前記出口端部と流体連絡している、装置、
を備える、蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の電気泳動分析のための装置。
【請求項２】
複数の軸方向に並んだキャピラリーを備える、請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を前記キャピラリーに導入する装置が動電学的注入装置である、請求項１記載の装置。
【請求項４】
前記キャピラリーの第１の端部と連絡している前記電気泳動分離媒体を含む貯蔵器に正圧をかけて前記電気泳動分離媒体は置換され、置換された前記電気泳動分離媒体を前記キャピラリーの第２の端部を通して除去する、請求項１記載の装置。
【請求項５】
前記キャピラリーの第１の端部と連絡している貯蔵器を真空にして前記電気泳動分離媒体は置換され、置換された前記電気泳動分離媒体を前記キャピラリーの第１の端部を通して除去し、前記キャピラリーの第２の端部は前記電気泳動分離媒体を含む貯蔵器と連絡している、請求項１記載の装置。
【請求項６】
前記キャピラリーが分離媒体を満たす前に洗浄される、請求項１記載の装置。
【請求項７】
前記キャピラリーが水酸化ナトリウムによって洗浄される、請求項６記載の装置。
【請求項８】
分離媒体が約20kDaと約100kDaの間の平均分子量を有する線状ポリアクリルアミドを含む、請求項１記載の装置。
【請求項９】
分離媒体がポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）を含む、請求項１記載の装置。
【請求項１０】
分離媒体がＰＥＧ-35,000-(C6F13)2コポリマーおよびＰＥＧ-35,000-(C8F17)2コポリマーの１：１(w/w)の混合物を含むゲルを含む、請求項１記載の装置。
【請求項１１】
検出装置がスペクトル配列検出装置を含み、その出力が仮想フィルターをもたらすように処理される、請求項１記載の装置。
【請求項１２】
前記仮想フィルターの波長が、540、560、580、および610nmであり、それぞれの幅が10nmである、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
前記仮想フィルターの波長が、530、545、560、580nmであり、それぞれの幅が10nmである、請求項１１記載の装置。
【請求項１４】
光学および電子的検出装置がレーザー光源を含む、請求項１記載の装置。
【請求項１５】
電気泳動中に選択された温度にてキャピラリーを維持する装置を有する、請求項１記載の装置。
【請求項１６】
温度制御装置が熱により制御されたプレートを含み、これに対して変形できる断熱材料によって前記キャピラリーが押圧される、請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
（a）電気泳動分離媒体を含むキャピラリー中に蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を導入する工程であって、前記キャピラリーは、入り口端部および出口端部を有する、工程、
（b）レーザーにより誘導される蛍光による前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の電気泳動を行うために前記キャピラリーを横切って十分な電圧を印加する工程、
（c）レーザー光源および共焦点光学配列を備えるスペクトル配列検出装置によって、複数の蛍光標識の同時検出を含んで前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を検出する工程、
（d）前記キャピラリーの前記入り口端部にも、前記出口端部にも接続されずに、前記キャピラリーの前記入り口端部および前記出口端部と流体連絡される、導入および取り除くための手段を提供することによって、新しい電気泳動分離媒体を導入し前記キャピラリーから古い電気泳動分離媒体を取り除く工程、
を包含する、蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の電気泳動分析方法。
【請求項１８】
軸方向に配列した複数のキャピラリーを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記キャピラリー中に前記蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を導入するための装置が動電学的注入装置である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記キャピラリーの１端に正圧装置によって新しい分離媒体を導入し、他端から古い分離媒体を除去することにより古い分離媒体を前記キャピラリーから除去する、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
新しい分離媒体を真空装置によって前記キャピラリーの１端に導入し、古い分離媒体を他端から除去することにより古い分離媒体を前記キャピラリーから除去する、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記キャピラリーが新しい分離媒体を満たす前に洗浄される、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
洗浄が水酸化ナトリウムを用いて行われる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
分離媒体が約20kDaと約100kDaの間の平均分子量を有する線状ポリアクリルアミドである、請求項１７記載の方法。
【請求項２５】
分離媒体がポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
分離媒体がＰＥＧ-35,000-(C6F13)2コポリマーおよびＰＥＧ-35,000-(C8F17)2コポリマーの１：１(w/w)の混合物を含むゲルである、請求項１７記載の方法。
【請求項２７】
検出装置がＣＣＤアレイを含み、その出力が仮想フィルターをもたらすように処理される、請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
前記仮想フィルターの波長が、540、560、580、および610nmであり、それぞれの幅が10nmである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記仮想フィルターの波長が、530、545、560、580nmであり、それぞれの幅が10nmである、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
光学および電子的検出装置が光源としてレーザーを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３１】
電気泳動中に選択された温度にてキャピラリーを維持する装置を有する、請求項１７記載の方法。
【請求項３２】
温度制御装置が熱により制御されたプレートを含み、これに対して変形できる断熱材料によって前記キャピラリーが押圧される、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、電気泳動を行うための装置および方法に関するものであり、さらに詳しくは、ポリヌクレオチド分析のための螢光に基づくキャピラリー電気泳動システムに関するものである。
発明の背景
ポリヌクレオチド断片の分析法は、一色あるいは複数色の蛍光検出と組み合わせて、電界の影響下における高分子網状組織の中を通るポリヌクレオチド断片の移動速度（すなわち、それらの電気泳動移動度）にもとづいて、ポリヌクレオチド断片の混合物の特色を記述するために使われている。一般的には、これらの方法はＰＣＲのような方法を用いるポリヌクレオチドの増幅に続いて応用される、例えばムリスの米国特許4,683,202。このような方法の例には次のものが含まれる。ポリヌクレオチドシーケンス、例えばTrainor,Anal.Chem.,62:418-426(1990)や、制限断片長多型（RFLP）分析、例えば、Watkins,Biotechniques,6:310-319(1988)、それに変化する数の直列型繰り返し（VNTR）またはミクロ付随体分析、例えばZiegelら、Genomics,14:1026-1031。これら方法のそれぞれは、試料ドナーについて、貴重な遺伝情報を提供する。
現在のポリヌクレオチド断片分析システムは、幾つかの欠点をもつ特徴を有している：（i）現在のシステムは、低い電界使用に限られていて、長い分析時間の原因となっている；（ii）手作業で用意した電気泳動ゲルを使用しなければならず、またこれらのゲルは、一回の分析にしか使用できない；（iii）現在のシステムでは、手作業で電気泳動ゲルにサンプルを装填しなければならい。これらの欠点は、これらのシステムの応用が、高い効率での処理が可能なもの、例えば、ゲノム配列の分析プロジェクトや、大規模の臨床サンプルのスクリーニングなどのようなもの、に制限されることである。
高い効率での電気泳動システムの開発のための一つのアプローチは、平板状ゲルをキャピラリー電気泳動（ＣＥ）に基づくシステムに変えることである、例えば、Grossmanら監修、Cappillary Electrophoresis:Theory and Practice(Academic Press,San Diego,1992);Drossmanら、Anal.Chem.,62;900-903(1990);Swerdlowら、Polynucleotides Research,18:1415-1419(1990)。キャピラリー電気泳動は、重大な発達の可能性を有する幾つかの利点を、平板ゲルに比べてもっている。：（i）キャピラリーは、表面：体積の比率が大きいので、電気泳動によってもたらされるジュール熱の、より大きな散逸が可能となり、これによって以下(a)、(b)が可能になる。（a）高い電界の使用、これによってより高速な分析とより優れた分離が可能となる。(b)非硬質の流動性篩分けの網状組織を使用して、自動的に補充できる篩分けの網状組織の使用が可能となる。例えば、Sudorら、Electrophoresis 12:1056-1058(1991);（ii）ＣＥは、サンプル装填工程を自動化したものに基づいて分析できる。複数のキャピラリーを平行に並べて実施することによって実施効率の上昇が認められる；すなわち平板ゲル上に複数のレーンを走行させるのと類似しているアプローチである、例えば、Huangら、Anal.Chem.,64:967-972(1922)。
ポリヌクレオチド断片分析のための最も好ましい検出方式は、同時的複数色の蛍光性検出であろう。しかしながら、分析するバンドが検出範囲から出てしまわないうちに、それぞれの色を観測できるよう十分にすばやく、フィルターホイールに印を付けねばならないので、現在のアプローチ、すなわちフィルターホイールフォトマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）検出器は、理想的ではない。これは、ＣＥにおける断片の電気泳動速度が速いために問題が多い。それ故、全ての色を同時に獲得できる検出計画は、明らかに、より優れたものになるであろう。
上記のことを考慮して、改良された複数色蛍光検出器をもつ、キャピラリーをベースとする電気泳動装置を利用できることによって、この技術のかなりの進歩が達成される。ＣＥの電気泳動速度の速さに適応するために、このような装置の能力は、連続というよりも、同時に全色を検出するようなものが必要であろう。もちろん、350以上の塩基の断片の中から一つの塩基を検出し決定するために十分な感度が必要である。また、自動的にサンプルを装填し、電気泳動の行程間に新しい分離媒体によってキャピラリーを補給することが出来る能力を持っていなければならないだろう。
発明の概要
広い局面では、本発明は、電気泳動、さらに特に、キャピラリーをベースとした電気泳動を使用する、蛍光性ポリヌクレオチド分析器システムに関連するものである。本発明の分析器システムは次のものから組み合わせる、
（a）電気泳動分離媒体を充填するキャピラリー、
（b）蛍光標識されたポリヌクレオチド断片の混合物を、キャピラリーに導入する手段、
（c）蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を電気泳動することができるに十分なボルト数をキャピラリーを縦断して発生させる電源、
（d）複数の蛍光標識の同時検出を含む、蛍光標識されたポリヌクレオチド断片を検出するための検出手段、そして、
（e）キャピラリーから、電気泳動分離媒体を導入し、取り除くための手段。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のキャピラリーをベースとした電気泳動分析システムの特定例の図である。
図２は、図１によって例示的に示された分析システムの検出部位を通り抜ける光の通り道の概略図である。
定義
ここで使われている”キャピラリー”という用語は、電気泳動を実施するための多量の分離媒体を支持することが出来る、チューブや導管、あるいは他の構造物を示す。キャピラリーの外形は広く変えることができ、そして管状、方形、正方形の断面をもったチューブや、導管、溝、プレートや、幅広い技術によって製作される類似物を含んでいる。本発明に用いられるキャピラリーの重要な特徴は、電気泳動分離媒体に接している表面の、表面：体積の比率である。この比率が高いと、電気泳動の実施中に、分離媒体から周囲への熱伝導が、よりうまくいく。好ましくは、約0.2μm-1ないし0.02μm-1が採用される。これらは、約10μmないし約100μmの幅を持った内径の円形断面を持つ管状のキャピラリーの表面：体積の比率に相当する。好ましくは、本発明に使用されるキャピラリーは、シリカ、溶融シリカ、石英、ホウ珪酸ガラスのようなシリカをベースにしたガラス、リン酸塩ガラス、アルミナ含有ガラス、あるいは類似体、あるいは他のシリカ類似物質から作られる。
ここで使われている”ポリヌクレオチド”という用語は、天然あるいは改変のヌクレオシドモノマーからなる線状ポリマーを示し、これには、二本鎖あるいは一本鎖デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形、あるいは類似体を含む。一般に、ヌクレオシド単量体どうしは、ホスホジエステル結合あるいはそれに類似した結合によってつながっていて、数個単位のモノマー、例えば8〜40、から数千個単位のモノマーの幅をもった大きさのポリヌクレオチドを形成している。ポリヌクレオチドが、”ＡＴＧＣＣＴＧ”のように連続した文字で表されるときは常に、ヌクレオチドが５’から３’の方向に左から右へ並んでいて、これ以外を示すことはない場合には、この”Ａ”はデオキシアデノシンを示し、”Ｃ”はデオキシシチジンを示し、”Ｇ”はデオキシグアノシンを示し、”Ｔ”はチミジンを示すと解釈されることになっている。ホスホジエステル結合の類似物には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデート、あるいは類似物を含む。
ここで使われている”ヌクレオシド”は、天然ヌクレオシドを含み、これは2'-デオキシ及び2'-ヒドロキシの形、例えばコーンバーグおよびベーカーのＤＮＡ  Replication、第２版（Freeman,San Francisco,1992）に述べられているようなものを含む。ヌクレオシドに関しての”類似体”は、修飾塩基部分および／または改変糖部分をもつ、合成ヌクレオシドを含み、例えば、Scheit,Nucleotide Analogs(John Willey,New York,1980)において一般的に記述されている。
ここで使われている”ポリマー”という用語は、特有の様式でお互いに共有結合をしている、全体よりは小さめの単量体サブユニットから形成されている、大きな分子のことである。”ホモポリマー”は、一種類の単量体サブユニットのみからできあがっているポリマーである。”コポリマー”は、二種類、あるいはそれ以上の種類の単量体サブユニットからできあがっているポリマーのことである。ここで使われている”ポリマー”という用語は、ホモポリマーとコポリマーを含む。”単分散”ポリマー溶液は、ポリマー分子が溶液中で、実質的に同一の分子量をもつことを意味する。”多分散”ポリマー溶液は、ポリマー分子が溶液中で、分布した分子量を持つことを意味する。
ここで使われている”電気泳動分離媒体（electrophoretic separation medium）”という用語は、その中を通って、ポリヌクレオチドが電気泳動され、かつポリヌクレオチドに対して、大きさに依存する電気泳動速度を与える物質のことを示す。代表的には、このような物質は、直鎖あるいは有枝鎖ポリマー分子からなる多孔性の網状組織、あるいは類似物である。
ここで使われている”線状ポリアクリルアミド”あるいは”線状ポリアクリルアミドポリマー”という用語は、架橋剤の不存在でアクリルアミドモノマーから形成されたポリマーのことを示し、ここでは、”アクリルアミドモノマー”は、ＮＨ2Ｃ（＝Ｏ）ＣＲ1＝ＣＲ2Ｒ3（式中Ｒ1が水素、そしてＲ2およびＲ3は水素あるいはメチル基であることができる）を有する構造を示す。
本出願に使われている平均分子量という用語は、様々な分子量をもつポリマー種からなるサンプル母集団の数平均分子量（Ｍn）のことを示す。この量は、次の等式によって定義される。Ｍn＝（Σｎi＊ＭＷi）／Σｎi、ここでｎiはｉという種類の分子の数字を示し、ＭＷiはｉという種類の分子量を示す。
発明の詳細な説明
図１は、本発明の分析器の概略図である。ポリヌクレオチド断片は、融解石英キャピラリーチューブ（34）、例えば、内径の直径（i.d.）が50μmで外径の直径が363μm、あるいはそれと類似したものの中で、電気泳動で分離される。典型的には、キャピラリーの外側は十分な耐久性を保証するために、ポリマーによってコーティングされている。
電気泳動中のキャピラリーの温度は、試料の変性の度合いおよび断片の電気泳動速度の両方に影響を与える重要なパラメーターとなる。加えて、上昇した温度は、キャピラリーに導入されるときに分離媒体の粘性を低下させて、それによって注入時間を短縮することができる。本発明の分析器においては、温度調節手段（30）は、選択された温度にキャピラリーを温度維持するために使用される。分離の程度と実施時間は、一部分はキャピラリーの長さによって決定されるので、温度調節手段はキャピラリーの長さ30cmから55cmの範囲に適応しなければならない。好ましくは、キャピラリーの温度は、絶縁された圧プレートを使用して温度調節した表面をキャピラリーに接触させることによってコントロールされる。
試料は、流体力学あるいは動電学的な注入手段、あるいは類似したものによって、電気泳動分離媒体で満たされているキャピラリー（34）に導入される。典型的には、流体力学的な注入において、試料はキャピラリーの入り口末端、すなわち高圧側が試料に浸漬されている間、ポンプ手段を使用してキャピラリーを横切ってかけられる圧力差を利用して、キャピラリー中に導入される。このようなポンプ手段には、容量形シリンジポンプ、遠心ポンプ、真空ポンプ、あるいは他の類似ポンプ手段を含むことができる。典型的には、動電学的注入においては、一番目の電極とキャピラリーの入り口末端が試料溶液中に浸漬されている間、電力供給器および連結回路を使用してキャピラリーを横切る電圧を印加して試料はキャピラリーに導入される。好ましくは、本発明の分析器においては、動電学的注入が使用される。本発明においては、動電学的注入は、次のようにして完成される。初めにキャピラリー（34）の入り口端部（42）および陰極（50）が、オートサンプラー（66）中に設置された試料貯蔵器（26）に入っている試料（58）に差し込まれ、同時にキャピラリー（34）の出口端部（38）および陽極（46）が、電極貯蔵器（18）中に含まれる電気泳動を実施するための緩衝液（54）に差し込まれる。次に、陽極（46）および陰極（50）に接続された電力供給手段（22）によって、選択された注入時間の間、例えば30秒間、注入ボルト数がキャピラリーを横切って印加される。注入時間と注入ボルト数はコンピューター（74）によって制御される。動電学的注入および次の電気泳動を行うために使われる電力供給は一般の設計による。好ましくは、電力供給は、ＤＣ電圧が少なくとも10,000ボルトの発生能力があることである。電極は、化学的不活性かつ電気伝導性の物質、例えばプラチナあるいは類似したものから作られるべきである。
試料の注入に続いて、電気泳動分離が実施される。電気泳動分離は、電源および次の電気回路を使用して、ポリヌクレオチドがキャピラリーに浸透するに十分な実施時間中、電気泳動分離媒体を充填したキャピラリーを横切ってかけられる電気泳動電圧を発生させることによって達成される。好ましくは、オートサンプラー（66）は、キャピラリー（34）の入り口端部（42）および陰極（50）の位置を、試料が入っているチューブ（58）から電気泳動を実施するための緩衝液が入っているチューブ（70）に変える。陽極（46）および陰極（50）に接続された電源（22）によってキャピラリー（34）を横切って電圧が印加され、その結果、試料の構成成分は、大きさによってキャピラリーを移動し、電気泳動が行われる。電気泳動分離媒体のサイホンから流れ出る現象によってもたらされる断片の異常な移動を避けるために、分離中、チューブ（70）およびチューブ（18）の中の緩衝液の流動レベルが同一であるように確保することが重要である。
ポリヌクレオチド断片が分離された後には、これらは検出装置（62）によって検出される。本発明のポリヌクレオチド分析器の重要な特徴は、”スペクトル配列蛍光分析器”である。ここで使われている”スペクトル配列蛍光検出器”という用語は、（i）回折格子やプリズム、あるいはそれに類似したもののような、放射された光をスペクトル分解する手段、（ii）ダイオードアレイや電荷結合素子（ＣＣＤ）システム、光電子倍増管のアレイ、あるいはそれに類似したもののような、光の放射に感度の高い検出素子のアレイ、（iii）白熱電球や、アークランプ、レーザー、レーザーダイオード、あるいはそれに類似したもののような、励起光源、および（iv）励起光と放射光の両方の方向と条件をつける連結光学器械を利用する検出器のことを示す。スペクトル配列検出器の出力は、配列位置としての役割をもった光の強さで、ここでは、配列位置は直接に光の波長と関連づけられる。このような検出器の一つの例は、Kargerら、Nucleic Acids Research 19:4955-4962(1991)によって与えられている。
スペクトル配列検出器の出力を扱う一つの好ましい方法は、”仮想フィルター”を作ることである。ここで使われている”仮想フィルター”という用語は、複数の分離した波長領域が試されているスペクトル配列検出器から得られたデータを操作する方法を示し、ここでは、それぞれの波長領域の位置と領域幅は、ソフトウェアを使って動的に変えられる。仮想フィルターは、物理学上の干渉あるいは吸収フィルターを模することができ、さらに幾つかの重要な利点を持つ。第１に、仮想フィルターは、放射光を複数の光束に分裂させる必要なく、多数の放射線長を同時に応答指令信号を送るようにプログラムすることが可能であり、それによって、それぞれの検出器に入射する光線の強度を引き下げることができ、それによって、放射光源のスペクトルの性質に検出器をよりマッチさせることが可能になり、特定の蛍光染料を使うことが可能になる。加えて、移動の速い分析物の十分な多色分析を同時に検出でき、多数のフィルターを素早く指し示す必要はない。第２に、仮想フィルターは放射領域帯の幅を検出するようにプログラムすることができる。どんな応用においても感度および色の識別の最適な組み合わせが存在するので、これは重要なことである：検出バンド幅が広くなるので、検出器がさらに光を収集し、それによって感度をあげるが、しかしながら、それと同時に、より広いバンド幅は、ごく近い関係の色と色を識別する能力を減らす。第３に、仮想フィルターは本質的に完璧な送波カーブを描くことができる、すなわち、フィルターは、ごく近い関係の色と色を識別することができる。第４に、仮想フィルターの選択された波長領域は、ソフトウェアを使って、多様な放射光源および染料の組み合わせの特徴に適合するように、簡単に調節することができる。それ故、染料物質を変えることは、ソフトウェアを使って仮想フィルターを変えるという単純なことであり、一方、有形のフィルターが使用される場合は、システムを機械的操作することが必要になる。さらに、仮想フィルターの選択された波長領域およびバンド幅は、動的、すなわち、走行の過程で変えることができ、進行中におこる染料標識のどんなスペクトル変化も補償することができる。
図２は本発明のスペクトル配列検出システムでの光路の概略図である。検出器に到達する散乱された放射光の量を減らすために、焦点を共有する光学配列を使用する。好ましくは、本発明の分析システムは、10ｍＷ、直径0.67mm、波長488nmおよび514nmに最大強度をもつ、偏光された光線ビームを放射するアルゴンイオンレーザーのような、蛍光励起波長源としてレーザーを使用する。レーザー（100）からの光は、フィルター（104）を通ってレーザーチューブの陰極のグローを取り除く。フィルター（104）はわずかに、例えば１〜２度、傾いていて、フィルター表面からの反射が軸からはずれて、レーザーチューブの中へ戻らないようになっている。次に、凹レンズ（108）が、光線を発散して、顕微鏡の対物レンズ（112）に過剰な集束をしないようにする。（レーザーが、キャピラリーの内径を越えて集束した場合、過剰な蛍光漂白が起こり、これにより、最終の蛍光シグナルの減少が起こる）。レーザー光は次に、偏光したレーザー光を全部を事実上通す二色性の鏡（116）の中を通過し、次に顕微鏡の対物レンズ（112）中を通って、キャピラリーの検出領域（117）に達する。
キャピラリー内径（117）に入射するレーザー光は、検出領域中に位置する蛍光標識を励起し、その結果、光が放射されて顕微鏡対物レンズが放射光を収集する。ランダムに偏光した放射光は、次に二色性の鏡（116）で反射されて、分光器（120）に向かう。分光器（120）に達する散乱したレーザー光の量を減らすために、放射光は長路フィルター（124）を通り、再映像レンズ（132）によって分光器（120）のスリット（128）に焦点を合わせる。好ましくは、分光器（120）は、17nm/mmの分散度をもつ405g/mm、450nmの回折格子を使用する。分光器を通ったあとは、光は次にＣＣＤ（64）に入る。ＣＣＤ（64）からの出力信号は、次に行われるデータ分析および表示のために、コンピュータ（140）に転送される。
次に続く試料を処理するための分析器の準備のために、キャピラリーは再び新しい電気泳動分離媒体によって再充填される必要がある。キャピラリーは、新しい電気泳動分離媒体がキャピラリーの高圧側端部に注入される間に、ポンプ装置によって加えられるキャピラリー中を横切る圧力差を利用することによって、新しい電気泳動分離媒体を再充填することができる。一つの好ましい具体化においては、ポンプ（4）からの正の圧力が、新しい電気泳動分離媒体が入っている貯蔵器（8）に加えられ、それによって電気泳動分離媒体を貯蔵器（8）から出てＴ字管（11）に押し出し、これは媒体をキャピラリー（34）中に導く。バルブ（12）はこの操作段階の間は閉じているので、電気泳動分離媒体は、入り口端部（42）の方向へ最初に流れていく。好ましくは、ポンプ（4）は容量形シリンジポンプ、遠心ポンプ、あるいは他のポンプ類似手段のようなものを含むことができる。さらに好ましくは、ポンプ（4）は正および負の圧力操作が可能な気密シリンジポンプである。好ましくは、バルブ（12）は貯蔵器（18）の水面より下側に位置することで、捕捉された気体の泡をシステムから取り除くことを促進することができる。一旦キャピラリーのＴ字管（11）と入り口端部（42）の間が満たされると、バルブ（12）は開き、そのため新しい電気泳動分離媒体が貯蔵器（8）から緩衝液貯蔵器（18）の方へ流出し、それ故、キャピラリーの入り口端部（42）と出口端部（38）の間が完全に満たされることになる。Ｔ字管（11）と出口端部（38）との間のキャピラリーの長さは、Ｔ字管（11）と入り口端部（42）との間のキャピラリーの長さに比べて短いので、バルブ（12）が開いて貯蔵器（8）に圧力がかけられると、物質はまず出口端部（38）方向へ流出する。キャピラリー（34）の入り口端部（42）と出口端部（38）が満たされた後に、バルブ（12）は入り口端部（42）と出口端部（38）がつながるように開いて、そのため、電極（46）と電極（50）の間に、遮るもののない電流路が作り出される。
もう一つのキャピラリー充填プロトコールにおいては、キャピラリーの入り口端部（42）はチューブ（70）に、出口端部（38）は緩衝液貯蔵器（18）に差し込まれ、その両方は新しい電気泳動分離媒体が入っており、その間、ポンプ（4）は、貯蔵器（8）とＴ字管（11）を経てキャピラリー（34）を真空にする。入り口端部（42）およびＴ字管（11）の間のキャピラリー（34）を満たすために、バルブ（12）は閉じた位置に保持される。一旦、キャピラリーのＴ字管（11）および入り口末端（42）が満たされると、バルブ（12）は媒体が緩衝液貯蔵器（18）からＴ字管（11）の方向へ、そして貯蔵器（8）の中へ流れるように開かれて、その結果、キャピラリー（34）の入り口端部（42）と出口端部（38）の間は、新しい電気泳動分離媒体によって完全に満たされる。キャピラリー（34）の入り口端部（42）と出口端部（38）の間が満たされた後に、バルブ（12）は入り口端部（42）と出口端部（38）がつながるように開けられて、その結果、電極（46）および電極（50）の間に、遮るもののない電流路が作り出される。
本発明の分析器の他の重要な面は、ポリヌクレオチド断片の大きに基づいた分離を行うように使われる分離媒体に関する。フリー溶液の中では、異なる大きさのポリヌクレオチドも同一の電荷対摩擦抵抗比を持つので、電気泳動分離には、ポリヌクレオチドを大きさに依存する方法で篩分けすることができる分離媒体の存在が必要となる。好ましくは、システムの自動化を促進するために、分離媒体として流動性ポリマー溶液を採用することによって、このような篩分けは達成される。特に好ましいポリマー溶液には、メンチェンらによって国際出願No.PCT/US93/09115中に記述されているような分枝共重合体、および（i）約20℃から約50℃の間の温度領域に水溶性で、（ii）約0.001％から約20％（重量／容量）の領域で分離媒体中で濃縮、そして（iii）約5×103から約1×106ダルトン（Da）の領域の分子量を特徴とする線状のホモポリマーを含む。さらに、ポリマー溶液の粘性は、例えば30,000cp以下であり、キャピラリーに容易にポンプで注入、排出することができるようなものでなければならない。
特に好ましい線状ホモポリマーには、約20kDaから約100kDaの間の平均分子量を持つ線状ポリアクリルアミドを含む。ポリマー溶液は、例えば尿素のような変性剤と、ｐＨおよび溶液の電気伝導性の調整のための選択された緩衝液と共に、約2から約20重量％の間の濃度の線状ポリアクリルアミドを含む。この分離媒体を使用するには、実施例２に記述するようなコーティングされたキャピラリーが使用されなければならない。
本発明の他の具体化においては、ポリマーが、Ｎ，Ｎ−ジ置換ポリアクリルアミドおよびＮ−置換ポリアクリルアミドからなるグループから選択される。さらに好ましくは、本発明のこのようなポリマーはポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である。ポリマー溶液は、例えば尿素のような変性剤と共に約2から約20重量％の間の濃度でのポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、そして溶液のｐＨおよび電気伝導性を調整するための選択された緩衝液を含む。この分離媒体の使用には、コーティングされていないキャピラリーを使用しても良い。
本発明の他の具体化には、水性の媒質中に凝集したコポリマーのマトリックスからなる電気泳動分離媒体が含まれる。コポリマーは選択されたほぼ均質なセグメントの長さをもつ親水性ポリマーセグメント、および親水性ポリマーセグメントにつながりこれによって互いに間隔をあけた複数の疎水性ポリマーセグメントから構成されている。コポリマーが水性の媒質中に分散するとき、主として、それぞれのコポリマー分子の疎水性部分どうしの結合によって、高分子の集合を形成する。本発明のひとつの具体化では、親水性ポリマーセグメントが、ポリエーテル、ポリエステル、多糖類、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホアミド、およびポリスルホキシドからなる群から選ばれ、また、疎水性ポリマーセグメントが、フッ素化炭化水素鎖からなる群から選ばれる。好ましくは、親水性ポリマーセグメントは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選ばれ、疎水性ポリマーセグメントがフッ素化炭化水素鎖からなる群から選ばれる。このようなコポリマーは、通常の方法によって合成される、例えば、Menchenら（すでに引用）；Odian,Principles of Polymerization,第３版（John Wiley,New York,1991）等がある。
典型的には、ｐＨおよび導電性をコントロールする緩衝液システムは、分離媒体の電荷運搬成分として採用される。典型的な緩衝液には、クエン酸、酢酸、ギ酸のような有機酸；ＴＥＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ＡＣＥＳ（２−［２−アミノ−２−オキソエチル）−アミノ］エタンスルホン酸）、またはグリシルグリシンのような両性イオン；リン酸のような無機酸；例えばシグマ社から入手できるトリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）緩衝液のような有機塩基を含む。例えば約１mMから１Ｍの間で緩衝液の濃度を広く変えることができるが、典型的には約20ｍＭである。通常の電気泳動に適用する典型的な緩衝溶液には、次のものが含まれる：（i）一本鎖ポリヌクレオチド分離のためにｐＨ7.6にした0.1Ｍトリス、0.25Ｍホウ酸、7Ｍ尿素；あるいは（ii）二本鎖ポリヌクレオチド分離のための、0.089Ｍトリス、0.089Ｍホウ酸、0.005ＭのＥＤＴＡ。
実施例１
アゾビスイソブチロニトリルを使用してのジオキサン中でのポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の合成
ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）（ｐＤＭＡ）は既知の技術で合成さる。例えば、Trossarelliら、J.Polymer Sci.,57:445-452(1962)。既知の量のジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、ジオキサン、およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）をエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、アルゴンガスを室温で10分間、溶液中に吹き込む。温度を55℃に上昇させて、重合を開始する。重合時間はモノマーの濃度に依存して10分間から25分間の範囲である。重合の後に、生成したポリマーは３回繰り返してヘキサン中に沈殿させCH2Cl2中に溶解し精製する。最後に、ヘキサン沈澱物を真空乾燥器中で一晩乾燥させて、次に凍結乾燥させる。下表は幾つかの実験のための反応条件を要約したものである。
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実施例２
アゾビスイソブチロニトリルを使用してのｔ−ブチルアルコール中のポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）の合成
以下のプロトコルを使用して、ｔ−ブチルアルコール（t-BuOH）の存在下に、さらに重合を行った：既知量のＤＭＡモノマー、ｔ−ブチルアルコール、ＡＩＢＭを合わせて、アルゴンガスを20分間溶液中に吹き込んだ。混合物を55℃に上げて15分間の重合した。生成したポリマーは、実施例１に記載したように単離した。下表は、幾つかの実験のための反応条件を要約したものである。
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実施例３
線状ポリアクリルアミドおよびコーティングされたキャピラリーの準備
次の手順のために、ＴＭＥＤ（N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン、水に対して10％ ｖ：ｖ）およびＡＰＳ（アンモニウム過硫酸塩、水に対して10％ ｗ：ｖ）の貯蔵溶液を準備した。
水浴中で35℃に維持した500mlのエルレンマイヤーフラスコに、222mlの水と6.55mlのイソプロパノールを添加した。溶液は、ヘリウムを溶液中に吹き込みながら約10分間攪拌した。次にアクリルアミド（25g）を加えた（最終的に-1.5Ｍ濃度）。アクリルアミドが完全に溶解した時、1.25mlずつのＴＭＥＤおよびＡＰＳの上記貯蔵液を加え、そして90分間激しく撹拌を続けて重合させ、蜂蜜のような軟度をもつ溶液を得た。
ポリマー溶液は、12〜14kDaカットオフ透析膜（Spectra/por ♯2,Spectrum Medical Industries,Los Angeles,CA）を使用して、4℃で3日間かけて、5回水を換えて（それぞれ3.5リットル）透析した。透析に続いて、ポリマー溶液を凍結乾燥し、9.58gの乾燥ポリマーを得た。
以下の寸法をもつ溶融シリカキャピラリー管状材料（ＴＳＰ 050375,Part ♯2000017）は、Polymicro Technologies,Tucson,AZから得られる：長さ＝20m、内径＝50μm、外径＝361μm、外側のポリイミド層の厚み＝16μｍ。この管状材料から、5ｍの部分を取り出し、ポリイミドコーティングを熱線によって焼き取り、管状材料中に、等間隔に離れた8個の連続した2mmの窓を形成した。窓は、約55cm間隔で離れており、それぞれが入り口から40cm、出口から15cmのところに窓を持つ、８あるいは９本のキャピラリーチューブを、5ｍの部分から用意することができた。
下記のコーティング手順に先立って、管状材料はシリンジを使い手動で、1.0Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗い流し、シリンジポンプ（Model 351,Orion Research,Cambridge,MA）を使用して、水で自動的に洗い流した。
キャピラリーチューブの内壁は、Cobbら、Anal.Chem.,62:2478(1990)の操作を改良して３段階で、化学的にコーティングした。
１段階目では、内壁表面のシリカ壁を塩化チオニル（SOCl2）を使用して活性化した。塩素処理に先だって、チューブを4時間以上、乾燥した蒸留テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で上記シリンジポンプを使用して洗い流し、内壁表面を乾燥させた。流出割合を”0.4”にセットし、サイズを”５”にセットした2mlの気密シリンジを使用した。チューブを通過したＴＨＦの総量は、約800μl（約〜80カラム体積）であった。次に残りのＴＨＦをヘリウム流を使ってチューブから手動で放出し、そして、上記のＴＨＦ（〜4時間、〜800μl）のように、SOCl2（2ml）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、10μl）の混合物をシリンジポンプによってチューブに通した。次にチューブの末端を隙間のないプラスチックスリーブと連結し、チューブをオーブン中で一晩、55℃でインキュベートした。
２段階目では、塩素活性化チューブの内壁を、ビニルマグネシウムプロマイド（”グリニャール試薬”）によって反応させた。塩素活性化チューブは、まず、乾燥蒸留ＴＨＦ（１時間、〜300μl）をシリンジポンプを使って洗い流し、SOCl2溶液を除去し、そして次にＴＨＦ中の1Ｍグリニャール試薬溶液で洗い流した（シリンジポンプ、2mlシリンジ、〜1ml、5時間以上）。チューブは反応を促進するために、熱線銃で断続的に加熱した。5時間洗浄後、チューブの末端に再び隙間のないプラスチックスリーブをはめ、まだグリニャール試薬を含んでいるキャピラリーチューブは、70℃で一晩インキュベートした。
３段階目では、ビニルコーティングした内壁をアクリルアミドと反応させて、アクリルアミドコーティングをした。先ずキャピラリーはシリンジポンプを使ってＴＨＦで洗い流し、グリニャール溶液を取り除き（1mlシリンジ、〜200μl、20分間以上）、次にメタノール（〜150μl）、そして次に水（〜200μl）で洗い流した。次にチューブを30分間以上、新しく用意した300μlの10％ w:v水中のアクリルアミドを含んだ重合溶液（1ml）、700μlの水、1μlのＴＭＥＤ、および10μlの10％（w:v）ＡＰＳ水溶液を流す。チューブには次に水（100μl）を流し、1.5時間ヘリウムを流して乾燥させ、使用するまで−20℃の冷凍庫に保存した。
実施例４
親水性−疎水性コポリマーマトリックスの合成と調製
ＰＥＧ-35,000-(C6F13)2コポリマー：トリデカフルオロ−１−オクタノール（C6F13CH2CH2OH、6.2g、♯17112-4、PCR Incorporated,Gainesville,Florida）を、あらかじめ重さを量ってあるテフロン攪拌棒を備えた200mlの丸底フラスコに入れた。あらかじめ重さを量ったフラスコは、ドライアイス・アセトン浴中に入れ、真空蒸留装置のための受け器として使った。約10mlのイソホロンジイソシアネートの全量を0.01mm／85〜90℃でアルコール上に留出させた。得られた溶液はアルゴンによって不純物質を取り除き、活栓／真空除去で密封し、80〜90℃の油浴中で一晩撹拌した。次に活栓を、短路蒸溜組立（連結アダプタ、真空アダプタ、および受器）と取り替えて、システムを高真空下（0.01mm）におき、油浴温度を100℃まで上げて、この間に、過剰なジイソシアネートのほとんどを集めた。油状残余物は、60mlの乾燥（CaH2で）ヘキサンで完全に溶解するまで還流し、その後にフラスコをゴムの隔膜で密封して、−15℃で１〜２時間冷却した。次に、上清を素早く（冷たいフラスコ中で、水が凝集しないように）油状の残余物からデカントし、そしてこの抽出操作（60mlヘキサン中で還流し、次に冷たい上清をデカントする）をさらに２回繰り返した。生成した粘着性の残留物は、数時間かけて排気し、2.24gの活性アルコールを透明な液体として生成した。
上記からの活性アルコール上に乾燥エチレングリコールジメチルエーテル（直接LiAlH4から）100mlをアルゴン下に留出させた。100℃の油浴中で、0.01mmで４時間乾燥した20.0gの35,000ＭＷ ＰＥＧ（Fluka Chemical Co.,Ronkonkoma,NY）が入っているフラスコに、生成した溶液を注入した。得られた混合物は、温めながらアルゴンの存在下に均質化し、続いて、乾燥した（CaH2で）ヘキサン２ml中0.5gのジブチルチンジラウレートの溶液、50μlを加えた。混合物はアルゴン下に２時間還流し、次いで冷却した。上清をデカントした後、白いゴム状の生成物は、200mlずつの還流メチルｔ−ブチルエーテルで３回、200mlずつの還流ヘキサンで２回粉砕した。終夜排気して、18.2gの靱性の白い固体の生成物を得た。
ＰＥＧ-35,000-(C8F17)2コポリマー：ヘプタデカフルオロ−１−デカノール（C8F17CH2CH2OH、11.05g、♯17113-2、PCR Inc.）およびイソホロンジイソシアネート（約30ml）を上記方法を用いて反応させ、12.6gの活性アルコールを濃厚油として生成した。次に活性アルコールを99.0gの乾燥（CaH2で）トルエンに溶かし、トルエン溶液１gにつき0.113gの活性化アルコールの貯蔵溶液を得た。
35,000ＭＷのＰＥＧ（30g）が、100℃の油浴中で0.01mmで４時間乾燥した。乾燥ＰＥＧに、15gの活性アルコール貯蔵溶液および50mlの乾燥（CaH2で）トルエンを加えた。得られた混合物は、温めながらアルゴンの下に均質化され、続いて乾燥（CaH2で）ヘキサン2ml中の0.5gジブチルチンジラウレートの溶液50μlを加えた。混合物は、アルゴン下に３時間還流し、続いて実施例１６に記述されているように処理して約30gの白いゴム状固体を得た。
上記からのＰＥＧ-35,000-(C6F13)2コポリマーおよび上記からのＰＥＧ-35,000-(C8F17)2コポリマーの１：１（w/w）混合物を含んでいる電気泳動ゲルは、全体で6％（w/v）濃度である（3％ずつが、それぞれのコポリマー）。
本発明は、前述の記載によって説明されるが、そこで採用されている素材に限定されると解釈されるものではなく、むしろ本発明は、上に明らかにされたところの包括的な範囲に向けられている。その様々な改良および具体化をそれらの意図あるいは範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
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【図２】
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