(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の個体の細胞内に遺伝物質を導入する方法であって、
ａ）個体の細胞とポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ；
ｂ）個体の細胞に核酸分子を投与する
の工程を含み、但し核酸分子はレトロウイルス粒子を含まないことおよびポリヌクレオチド機能促進剤がブピバカインであることを特徴とする方法。
【請求項２】
核酸分子が、蛋白質をコードしかつ作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む、請求項第１項記載の方法。
【請求項３】
核酸分子が、それに対する免疫応答が望まれる抗原のエピトープと同一または実質同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は作動可能なように制御配列に連結されている、請求項第１項記載の方法。
【請求項４】
病原体に対してヒト以外の個体を免疫処置する方法であって、
ａ）個体の細胞とポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインとを接触させ；
ｂ）個体の細胞に、病原体抗原のエピトープと同一または実質同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与するが、但しヌクレオチド配列は作動可能なように制御配列に連結されている；
の工程を含み、但し核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、かつヌクレオチド配列は細胞中で発現されうることを特徴とする方法。
【請求項５】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項第４項記載の方法。
【請求項６】
蛋白質が病原体抗原またはその断片である、請求項第４項記載の方法。
【請求項７】
核酸分子が筋肉内に投与される、請求項第４項記載の方法。
【請求項８】
病原体が、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ；ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ；インフルエンザウイルス；Ａ型肝炎ウイルス、ＨＡＶ；Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ；Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ；ヒト乳頭腫ウイルス、ＨＰＶ；単純ヘルペス１ウイルス、ＨＳＶ１；単純ヘルペス２ウイルス、ＨＳＶ２；サイトメガロウイルス、ＣＭＶ；エプスタインバールウイルス、ＥＢＶ；ライノウイルス；およびコロナウイルスからなる群より選択されるウイルスである、請求項第４項記載の方法。
【請求項９】
病原体がＨＩＶであり、核酸分子がＨＩＶ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第４項記載の方法。
【請求項１０】
病原体がＨＩＶであり、核酸分子が２つ以上のＨＩＶ構造蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第４項記載の方法。
【請求項１１】
病原体がＨＩＶであり、核酸分子が２つ以上のＨＩＶ制御蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第４項記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも二つまたはそれ以上の異なる核酸分子が個体の異なる細胞に投与され、異なる核酸分子は各々同じ病原体の一つまたはそれ以上の病原体抗原をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第４項記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド機能促進剤および核酸分子が同時に投与される、請求項第４項記載の方法。
【請求項１４】
病原体が免疫不全ウイルスであり；
核酸分子がＤＮＡであり、ｐｓｉを欠失したＨＩＶ構造蛋白質ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列を含み、但しｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列がラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されている、請求項第４項記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ配列がさらにＨＩＶのｒｅｖ応答要素を含み、そしてＨＩＶインテグラーゼが欠損している、請求項第１４項記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ配列がさらにＨＩＶスプライスアクセプターを含む、請求項第１５項記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ分子がさらにＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されているＨＩＶのｒｅｖをさらに含む配列をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項第１４項記載の方法。
【請求項１８】
ｒｅｖをコードするＤＮＡ配列がさらにＨＩＶのｖｐｕおよびＨＩＶのｅｎｖをコードする、請求項第１７項記載の方法。
【請求項１９】
ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列がさらにＨＩＶのｒｅｖ応答要素を含み、かつＨＩＶインテグラーゼを欠失している、請求項第１７項記載の方法。
【請求項２０】
ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列がさらにＨＩＶスプライスアクセプターを含む、請求項第１９項記載の方法。
【請求項２１】
病原体が免疫不全ウイルスであり；
核酸分子がＤＮＡであり、かつラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されているＨＩＶ構造蛋白質ｒｅｖ，ｖｐｕおよびｅｎｖをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項第４項記載の方法。
【請求項２２】
病原体が免疫不全ウイルスであり；
二つの異なるＤＮＡ分子が個体の異なる細胞に投与され；
核酸分子の一方がＤＮＡであり、ｐｓｉを欠失したＨＩＶ構造蛋白質ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列を含み、但しｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列がラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されており；
核酸分子の他方がＤＮＡであり、かつラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されているＨＩＶ構造蛋白質ｒｅｖ，ｖｐｕおよびｅｎｖをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項第４項記載の方法。
【請求項２３】
疾患に対してヒト以外の個体を免疫処置する方法であって、
ａ）個体の細胞とポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインとを接触させ；
ｂ）個体の細胞に、作動可能なように制御配列に連結され、該疾患を特徴付ける細胞と関連する蛋白質のエピトープと同一または実質同じである少なくとも一つのエピトープを含む標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する；
の工程を含み、但し核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、かつ細胞中で発現されうることを特徴とする方法。
【請求項２４】
疾患が過増殖性細胞により特徴付けられる、請求項第２３項記載の方法。
【請求項２５】
疾患が自己免疫疾患である、請求項第２３項記載の方法。
【請求項２６】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項第２３項記載の方法。
【請求項２７】
核酸分子が筋肉内に投与される、請求項第２３項記載の方法。
【請求項２８】
核酸分子が、癌遺伝子ｍｙｂ，ｍｙｃ，ｆｙｎ，ｒａｓ，ｓａｒｃ，ｎｅｕおよびｔｒｋの蛋白質生成物；転座遺伝子ｂｃｌ／ａｂｌの蛋白質生成物；Ｐ５３；ＥＧＲＦ；Ｂ細胞リンパ腫により作られる抗体の可変領域；およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域からなる群より選択される標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第２３項記載の方法。
【請求項２９】
蛋白質がＢ細胞介在自己免疫疾患に関与する抗体の可変領域；およびＴ細胞介在自己免疫疾患に関与するＴ細胞受容体の可変領域からなる群より選択される、請求項第２３項記載の方法。
【請求項３０】
医薬免疫処置キットであって、
ａ）ｉ）医薬として受容可能な担体または希釈剤；および
ii）作動可能なように制御遺伝子に連結され、少なくとも一つのＨＩＶ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸分子；但し該ヌクレオチド配列はヒト細胞中で発現されることが可能である；
を含む第一の接種物；
ｂ）ｉ）医薬として受容可能な担体または希釈剤；および
ii）作動可能なように制御遺伝子に連結され、少なくとも一つのＨＩＶ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む第二の核酸分子；但し該ヌクレオチド配列はヒト細胞中で発現されることが可能である；
を含む第二の接種物；および
ｃ）ブピバカインを含む第三の接種物
を含み、第一の核酸分子は第二の核酸分子と同一ではないことを特徴とするキット。
【請求項３１】
第一の核酸分子および第二の核酸分子が、合わせてＨＩＶ蛋白質ｇａｇ，ｐｏｌおよびｅｎｖをコードする、請求項第３０項記載の医薬キット。
【請求項３２】
ａ）ｐｓｉを欠失したＨＩＶ構造蛋白質ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、但しｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列はラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されている；および
ｂ）ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン
を含む医薬組成物。
【請求項３３】
ＤＮＡ配列がさらにＨＩＶのｒｅｖ応答要素を含み、ＨＩＶインテグラーゼを欠失している、請求項第３２項記載の医薬組成物。
【請求項３４】
ＤＮＡ配列がさらにＨＩＶスプライスアクセプターを含む請求項第３２項記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ＤＮＡ分子がＳＶ４０プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されているＨＩＶのｒｅｖをさらに含む配列をコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項第３２項記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ｒｅｖをコードするＤＮＡ配列がさらにＨＩＶのｖｐｕおよびＨＩＶのｅｎｖをコードする、請求項第３５項記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列がさらにＨＩＶのｒｅｖ応答要素を含み、ＨＩＶインテグラーゼを欠失している、請求項第３６項記載の医薬組成物。
【請求項３８】
ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列がさらにＨＩＶスプライスアクセプターを含む、請求項第３６項記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ａ）ラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されているＨＩＶ構造蛋白質ｒｅｖ，ｖｐｕおよびｅｎｖをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子；および
ｂ）ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン
を含む医薬組成物。
【請求項４０】
ａ）ｉ）ｐｓｉを欠失したＨＩＶ構造蛋白質ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を含み、但しｇａｇおよびｐｏｌをコードするＤＮＡ配列はラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されている第一の医薬組成物、および
ii）ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン；
を含む第一の接種物；および
ｂ）ｉ）ラウス肉腫ウイルスエンハンサー、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナルおよび随意にＳＶ４０複製開始点に作動可能なように連結されているＨＩＶ蛋白質ｒｅｖ，ｖｐｕおよびｅｎｖをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を含む第二の医薬組成物；および
ii）ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン；
を含む第二の接種物
を含む医薬免疫処置キット。
【請求項４１】
疾患を有すると疑われるヒト以外の個体を処置する方法であって、
ａ）個体の細胞をポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインと接触させ；
ｂ）個体の細胞に、失われたか、機能を果たさないか、または部分的にしか機能しない蛋白質をその存在が補償することになる蛋白質または個体に治療効果を生じさせることになる蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与するが、但し該ヌクレオチド配列は作動可能なように制御配列に連結されている；
の工程を含み、核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、かつ細胞中で発現されることが可能なことを特徴とする方法。
【請求項４２】
核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項第４１項記載の方法。
【請求項４３】
核酸分子が筋肉内に投与される、請求項第４１項記載の方法。
【請求項４４】
核酸分子が、酵素、構造蛋白質、サイトカイン、リンホカインおよび増殖因子からなる群より選択される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項第４１項記載の方法。
【請求項４５】
ｉ）病原体抗原のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質；過増殖性細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じであるエピトープを含む蛋白質；自己免疫疾患を特徴付ける細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同一であるエピトープを含む蛋白質；個体において、失われたか、機能を果たさないか、または部分的にしか機能しない蛋白質をその存在が補償することになる蛋白質；および個体に治療効果を生み出す蛋白質からなる群より選択される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
ii）ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカイン；
を含み、レトロウイルス粒子を含まないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項４６】
ｉ）病原体抗原のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質；過増殖性細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じであるエピトープを含む蛋白質；自己免疫疾患を特徴付ける細胞に関連する蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同一であるエピトープを含む蛋白質；個体において、失われたか、機能を果たさないか、または部分的にしか機能しない蛋白質をその存在が補償することになる蛋白質；および個体に治療効果を生み出す蛋白質からなる群より選択される蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む容器；および
ii）ポリヌクレオチド機能促進剤であるブピバカインを含む容器；
を含み、レトロウイルス粒子を含まないことを特徴とする医薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は個体の細胞内に遺伝物質を導入するための組成物および方法に関する。本発明の組成物および方法は、免疫化および治療のための蛋白質を標的とする蛋白質をコードする遺伝物質を含む予防および／または治療薬の送達に使用することができる。
背景技術
正常な機能的遺伝子の生きている動物への直接的導入は、欠陥を持つ遺伝的情報を置き換える手段として研究されてきた。いくつかの研究において、ウイルス粒子または他の感染ベクターを使用することなく、生きている動物の細胞内へＤＮＡが直接導入された。Ｎａｂｅｌ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８５−１２８８、はマウスの動脈壁内へ直接的に運搬されたベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子のインビボでの部位特異的遺伝子発現を記載している。Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８、はインビボでマウス筋肉内へ直接的に運搬された種々のレポーター遺伝子の発現を記載している。Ａｃｓａｄｉ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：８１５−８１８、はＤＮＡ構築物の筋肉内注入後、マウスでのヒトジストロフィン遺伝子の発現を記載している。Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１（４）：４７４−４８５（ここに引例として包含されている）はインビボでのげっ歯類筋肉内への直接遺伝子運搬を達成する条件を示している。Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．およびＧ．Ｒｈｏｄｅｓ，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：３５１−３５２、はレトロウイルスを用いることなく、精製された遺伝子の薬剤としてのインビボの直接送達を記載している。
代替の抗病原体ワクチン接種法として直接遺伝子運搬の使用が示唆されてきた。一回の注入による直接遺伝子運搬は、ＨＩＶに対する可能なワクチン接種法として示唆されている。ＨＩＶ  ｇｐ１２０をコードするプラスミドＤＮＡの細胞内への導入により、ＨＩＶ  ｇｐ１２０に対する細胞性免疫応答が観察されていることが報告されている。１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１５１５号は単一工程法で個体の細胞内に裸のポリヌクレオチドを直接注入することにより、病原体感染に対して個体を免疫する方法を開示している。リポフェクチン以外のトランスフェクション剤の使用は、開示された方法から特に除外されている。接種された細胞の刺激は開示されていないし、示唆されてもいない。ウイルス蛋白質ｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドの導入からなるＨＩＶワクチンが開示されている。このワクチンの実施可能性は証明されていない。
Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：Ｃ５７８−５８１およびＰＣＴ特許出願第ＷＯ９１／１２３２９号はレトロウイルス介在遺伝子送達プロトコールの一部として、サテライト細胞増殖を誘導するための筋肉細胞へのブピバカインの投与を開示している。
発明の要約
本発明は個体の細胞内に遺伝物質を導入する方法に関する。本方法は、該個体の細胞と、好ましくは細胞によるＤＮＡの取り込みを容易にするかまたは炎症性応答を促進する薬剤であるポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ、そして所望のペプチドまたは蛋白質をコードするかまたは機能性核酸分子の鋳型として働くヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に投与することを含む。核酸分子はレトロウイルス粒子なしで投与される。所望の蛋白質とは個体中で機能するかまたは免疫応答の標的として働く蛋白質であろう。
本発明は病原体に対して個体を免疫する方法に関する。本方法は該個体の細胞と望ましくは細胞によるＤＮＡの取り込みを容易にするかまたは炎症性応答を促進する薬剤であるポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ、そして病原体抗原上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードし、かつ作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に投与することを含む。核酸分子は個体の細胞内で発現されることが可能である。
本発明はＨＩＶに対してヒトを免疫する方法に関する。本方法は、ＨＩＶ蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む少なくとも一つのペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子をヒトに投与する工程を含む。
本発明は、ＨＩＶに対して個体を免疫する方法に関する。本方法は、二つの異なる核酸分子を異なるヒトの細胞に投与する工程を含む。各々の核酸分子はＨＩＶ蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む少なくとも一つのペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む。異なる核酸分子の各々は、各々少なくとも１つの異なるペプチドをコードする異なるヌクレオチド配列を含み、ここで核酸はヒト細胞中で発現されることが可能である。
本発明は過増殖性疾患または自己免疫疾患に対して個体を免疫する方法に関する。本方法は、それぞれ過増殖性疾患関連蛋白質または自己免疫疾患関連蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を個体の細胞に投与する工程を含む；核酸分子は細胞中で発現されることが可能である。
本発明は疾患を持つ個体の処置法に関し、該個体の細胞と、好ましくは細胞によるＤＮＡの取り込みを容易にするかまたは炎症性応答を促進する薬剤であるポリヌクレオチド機能促進剤とを接触させ、そして欠陥のある遺伝子の代わりに機能するか、または個体中で治療的効果を生み出す分子をコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含む核酸分子を個体の細胞に投与する工程を含む。核酸分子は細胞中で発現されることが可能である。
本発明は核酸分子およびポリヌクレオチド機能促進剤を含む医薬組成物に関する。本発明は核酸分子を含む容器およびポリヌクレオチド機能促進剤を含む容器を含む医薬キットに関する。
本発明は医薬として受容可能な担体または希釈剤、および作動可能なように制御配列に連結され、少なくとも一つのＨＩＶ蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む一つまたはそれ以上のペプチドをコードする核酸分子を含む、予防的および治療的ＨＩＶワクチンに関する。ここで核酸分子はヒト細胞中で発現されることが可能である。
本発明は二つの接種物を含む予防的および治療的ＨＩＶワクチンに関する。第一の接種物は、医薬として受容可能な担体または希釈剤および第一の核酸分子を含む。第一の核酸分子は、各々が少なくとも一つのＨＩＶ蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む一つまたはそれ以上のペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含み、ここで核酸分子はヒト細胞中で発現されることが可能である。第二の接種物は、医薬として受容可能な担体または希釈剤および第二の核酸分子を含む。第二の核酸分子は、少なくとも一つのＨＩＶ蛋白質上に示されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む一つまたはそれ以上のペプチドをコードし、作動可能なように制御配列に連結されているヌクレオチド配列を含み、ここで核酸分子はヒト細胞中で発現されることが可能である。第一および第二の核酸分子は異なっており、異なるペプチドをコードする。
【図面の簡単な説明】
図１ＡはプラスミドｐＭ１６０の作製を示しているダイアグラムである。このプラスミドは、ＨＩＶ−ＨＸＢ２糖蛋白質ｇｐ１６０をコードするＰＣＲ発生断片をプラスミドｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）内へ挿入することにより製造された。
図１Ｂは、ｐＭ１６０プラスミドでトランスフェクトされた細胞（３Ｇ７細胞）とベクター単独でトランスフェクトされた細胞（ＴＥ６７１細胞）の全細胞溶解物のウエスタンブロットのオートラジオグラムの写真であり、３Ｇ７細胞においてｇｐ１２０およびｇｐ４１が産生され、ＴＥ６７１細胞では産生されていないことを示している。
図２は125Ｉ−ｇｐ１６０と結合した血清抗体の免疫沈降を示しているオートラジオグラムの写真である。
図３Ａ−３Ｅは、マイクロタイタープレート上に固定された種々の蛋白質への異なる血清の結合のＥＬＩＳＡの結果を示しているグラフである。
図４Ａおよび４Ｂは、連結的に希釈した抗血清と前もってインキュベートされた、ＴＣＩＤ50ＨＩＶ−１／ＩＩＩB細胞フリーウイルスを感染させたＭＴ−２細胞の写真である。
図４Ｃは、対照血清（＋＝ｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅベクター−免疫処置したマウス）および試験血清（○＝ｐＭ１６０−免疫処置したマウス）を用いた結果からの中和値（Ｖｎ／Ｖｏ）対希釈係数を示しているグラフである。
図４Ｄ−４Ｇは、免疫したおよび対照動物からの血清を用いて融合細胞阻害を試験するために実験で使用されたＨ９／ＩＩＩB細胞の写真である。
図５は、ＨＩＶｇｐ１６０−標識および非標識腫瘍細胞により試験された免疫処置および非免疫処置マウスの生存を示している表である。マウスは組換え体ｇｐ１６０蛋白質、ベクターＤＮＡのみまたはｇｐ１６０をコードするＤＮＡを含むベクターで免疫処置された。ＳＰ２／０腫瘍細胞またはＳＰ２／０−ｇｐ１６０（ｇｐ１６０をコードし、ｇｐ１６０を発現するＤＮＡでトランスフェクトされたＳＰ２／０細胞）腫瘍細胞がマウスに導入された。
図６はｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖのプラスミド地図である。
図７はｐＥＮＶのプラスミド地図である。
図８は遺伝子構築物の製造に使用された四つのバックボーンＡ、Ｂ、ＣおよびＤを示している。
図９は遺伝子構築物を製造するためにバックボーン内に挿入される四つの挿入物１、２、３および４を示している。
発明の詳細な説明
本発明は動物の細胞内へ核酸分子を導入する方法に関し、核酸分子の高いレベルの取り込みおよび機能性を提供する。本発明の方法は、個体の細胞に、炎症応答を促進しおよび／または組織における核酸分子の発現を促進させおよび／または細胞による核酸分子の取り込みを容易にする複合剤の投与と共に、ウイルス粒子、特にレトロウイルス粒子が含まれていない核酸分子を投与する工程を含む。本発明の好適な実施態様は、感染性の薬剤を使用せずに個体の細胞に核酸分子を送達する方法を提供する。
本発明に従って細胞へ送達される核酸分子は、１）予防的および／または治療的免疫処置剤として機能する蛋白質のための遺伝子鋳型；２）欠陥のある、失われたまたは機能しない遺伝子の置換コピー；３）治療的蛋白質のための遺伝子鋳型；４）アンチセンス分子のための遺伝子鋳型；または５）リボザイムのための遺伝子鋳型として働くであろう。蛋白質をコードする核酸分子の場合、核酸分子は好適には動物の細胞中での転写および翻訳に必要な制御配列を含む。核酸分子がアンチセンス分子およびリボザイムの鋳型として働く場合、そのような核酸分子は、好適にはそれらにより各々コードされているアンチセンスおよびリボザイム分子の十分なコピーの産生にために必要な制御要素に連結されている。核酸分子はレトロウイルス粒子を含まず、好適にはプラスミドの形のＤＮＡとして提供される。
複合剤はここで”ポリヌクレオチド機能促進剤”または”ＰＦＥ”とも称される。ＰＦＥは炎症応答を促進しおよび／または組織において核酸分子の発現を促進させおよび／または細胞による核酸分子の取り込みを促進し、および好適にはこれらの性質の２つ以上を持つ化合物または組成物である。細胞によるＤＮＡおよびＲＮＡの取り込みを容易にし、かつ細胞分裂および複製を刺激するポリヌクレオチド機能促進剤はまた細胞刺激剤とも称されている。本発明に従った好適な複合剤は安息香酸エステルおよびアニリドからなる群より選択される。好適な実施態様において、ＰＦＥはブピバカインである。
本発明のいくつかの態様に従うと、病原体または異常な疾患関連細胞に対して個体を予防的および／または治療的に免疫する組成物および方法が提供される。遺伝物質は、標的となる病原体または細胞に観察される免疫原性蛋白質と少なくとも一つのエピトープを共有するペプチドまたは蛋白質をコードする。遺伝物質は個体の細胞により発現されて免疫原性標的として働き、それに対して免疫応答が惹起される。得られる免疫応答は広範囲に基ずくものである：体液性免疫応答に加えて細胞性免疫応答の両方が惹起される。本発明の方法は予防的および治療的免疫を与えるのに有用である。従って、免疫処置法には病原体の攻撃または特定の細胞の存在または増殖から個体を保護する方法ならびに病原体感染、過増殖性疾患または自己免疫疾患を持つ個体を処置する両方の方法が含まれる。
本発明は標的蛋白質、すなわち病原体または個体自身の”異常な”細胞に特に関連する蛋白質に対する広い免疫応答を惹起するのに有用である。本発明は、病原体蛋白質に対する免疫応答が病原体に対する保護的免疫性を与えるように、病原体薬剤および微生物に対して個体を免疫するのに有用である。本発明は過増殖性細胞に特に関連する標的蛋白質に対する免疫応答を惹起することにより、癌のような過増殖性の病気および障害を処置するのに有用である。本発明は自己免疫状態に関与する細胞に特に関連する標的蛋白質に対する免疫応答を惹起することにより、自己免疫疾患の病気および障害を処置するのに有用である。
本発明のいくつかの態様は遺伝子治療に関するものである。すなわち、個体中の欠陥のある、失われた、非機能的なまたは部分的にしか機能しない個体の遺伝子に対応するか、または治療的蛋白質（すなわち、個体におけるその存在が個体の不全を除去する、および／またはその存在が個体に治療的効果を提供するであろう）をコードする個々の外因性の遺伝子のコピーを持つ核酸分子を細胞内へ導入するための組成物および方法に関し、それにより蛋白質投与と異なる手段により蛋白質を送達する手段が提供される。
ここで使用される術語”所望の蛋白質”とは、免疫応答の標的蛋白質として働くかまたは遺伝子治療計画における治療的または補償的蛋白質として働く本発明の遺伝子構築物によりコードされているペプチドおよび蛋白質を表している。
本発明に従うと、所望の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが個体の細胞内へ導入され、そこで発現され、所望の蛋白質を産生する。所望の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、個体の細胞内での発現に必要な制御要素に連結されている。ＤＮＡ発現のための制御要素にはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、コザック領域のような他の要素も遺伝子構築物中に含まれていてもよい。
ここで使用する術語”遺伝子構築物”とは、所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味し、それはワクチン接種された個体の細胞内における直接的発現を可能にするプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に作動可能なように連結された開始および停止信号を含む。
ここで使用される術語”発現可能な形”とは、標的蛋白質をコードするコード配列に作動可能なように連結された必要な制御要素を含む遺伝子構築物を意味しており、そのため個体の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されるであろう。
ここで使用する術語”遺伝子ワクチン”とは。標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む医薬製剤を意味しており、治療的免疫応答を期待するのに有用な医薬製剤を含む。
ここで使用する術語”遺伝子治療”とは、治療的または補償的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む医薬製剤を意味している。
ここで使用する術語”標的蛋白質”とは、それに対して免疫応答が惹起される蛋白質を意味している。標的蛋白質は病原体または癌細胞もしくは自己免疫疾患に関与する細胞のような望ましくない細胞型からの蛋白質と少なくとも一つのエピトープを共有し、それに対する免疫化が必要とされる免疫原性蛋白質である。標的蛋白質に対して向けられる免疫応答は、標的蛋白質が関与する特定の感染または疾患に対して個体を保護し、かつ個体を治療するであろう。
ここで使用される術語”エピトープを共有する”とは、別の蛋白質のエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質を意味している。
ここで使用される術語”実質的に同じであるエピトープ”とは一つの蛋白質のエピトープとは同一ではないが、先の蛋白質と交差反応を起こす細胞性または体液性免疫応答を引き起こす構造を持つエピトープを意味している。
ここで使用される術語”治療的蛋白質”とはその存在が個体に治療的便宜を与えるような蛋白質を意味している。
ここで使用される術語”補償的蛋白質”とは、その存在が、不在の、欠損した、非機能的または部分的にしか機能しない内因性遺伝子のために完全に機能する蛋白質が内因的に産生されないことを補償する蛋白質を意味している。
遺伝子構築物は、所望の蛋白質をコードし、遺伝子発現に必要とされる制御要素に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む。従って、生きている細胞内にＤＮＡまたはＲＮＡ分子が取り込まれることにより、所望の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが発現され、所望の蛋白質が生産される。
細胞により取り込まれた場合、制御要素に作動可能に連結された所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、機能的染色体外分子として細胞中に存在するかまたは、細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み込まれて残るであろう。ＤＮＡは細胞内に導入され、そこでプラスミドの形で別の遺伝物質として残るであろう。もしくは、染色体内へ組み込むことができる線状ＤＮＡが細胞内に導入されるであろう。ＤＮＡを細胞内に導入する場合、染色体内へのＤＮＡ組み込みを促進する試薬が加えられるであろう。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列をＤＮＡ分子内に含ませてもよい。もしくはＲＮＡを細胞に投与してもよい。動原体、テロメアおよび複製起点を含む線状ミニクロモソームとして遺伝子構築物を提供することも企図される。
所望の蛋白質をコードする分子は、所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡであろう。これらの分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらのハイブリッドまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子であろう。従って、ここで使用される場合、術語”ＤＮＡ構築物”、”遺伝子構築物”およびヌクレオチド配列”はＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を指すことを意味している。
ＤＮＡ分子の遺伝子発現に必要な制御要素には、プロモーター、開始コドン、停止コドンおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、エンハンサーがしばしば遺伝子発現に必要とされる。所望の蛋白質をコードする配列にこれらの要素が作動可能なように連結されていること、および制御要素はそれらが投与される個体中で作動可能であることが必要である。
開始コドンおよび停止コドンは一般的に所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列の一部と考えられている。しかしながら、これらの要素は遺伝子構築物が投与される個体中で機能的であることが必要である。開始および停止コドンはコード配列の読み枠内に存在しなければならない。
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能的でなければならない。
本発明の実施、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例には、サルウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）のようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインからのプロモーターが含まれるが、それらに制限されるわけではない。
本発明の実施、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、それらに制限されるわけではない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）中のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが使用される。
ＤＮＡ発現に必要とされる制御要素に加え、他の要素がＤＮＡ分子に含まれていてもよい。そのような付加的な要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのようなウイルスエンハンサーから選択されるが、それらに制限されるわけではない。
遺伝子構築物は、細胞中で本構築物を染色体外に保ちかつ本構築物の多数のコピーを産生させるため哺乳類の複製開始点を含んでいてもよい。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）からのプラスミドｐＣＢＰ４およびｐＲＥＰ４はエプスタイン−バールウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、組込まれることなく高いコピーのエピソーム複製を行う。
いくつかの好適な実施態様において、使用されるベクターは実施例４６に記載されるベクターから選択される。遺伝子治療に関連する本発明の態様においては、活性化のために必要な抗原を含む複製開始点を持つ構築物が望ましい。
免疫化応用に関するいくつかの好適な実施態様においては、遺伝子構築物は標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、さらにそのような標的蛋白質に対する免疫応答を促進する蛋白質のための遺伝子を含む。そのような遺伝子の例は、α−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のようなサイトカインおよびリンホカインをコードするものである。
何らかの理由により遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望まれる場合には、細胞破壊のための標的として働く追加の要素を加えてもよい。発現可能な形のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔＫ）遺伝子を遺伝子構築物に含ませることができる。薬剤ガンシクロビルが個体に投与でき、この薬剤はｔＫを産生している細胞を選択的に殺すので、遺伝子構築物を持つ細胞を選択的に破壊する手段を提供することができる。
蛋白質産生を最大にするために、構築物が投与される細胞中における遺伝子発現に良く適した制御配列が選択されるであろう。さらに、細胞中でもっとも効率的に転写されるコドンが選択されるであろう。当業者は細胞中で機能的であるＤＮＡ構築物を製造することができる。
発現を試験するために、投与される細胞と同じ型の細胞の組織培養を用いて、インビトロで遺伝子構築物の発現レベルが試験できるであろう。例えば、遺伝子ワクチンがヒト筋肉細胞内へ投与されるべきものである場合、発現レベルを測定するためのインビトロモデルとして、横紋筋肉腫の充実性筋肉腫瘍細胞のような培養系で増殖する筋肉細胞を使用することができる。
本発明で使用される遺伝子構築物はレトロウイルス粒子中に取り込まれてはいない。本遺伝子構築物は、レトロウイルス粒子に取り込まれているレトロウイルスＲＮＡを持つレトロウイルス粒子が細胞に感染する場合に起こるようなレトロウイルス粒子媒介挿入が生じることなく細胞により取り込まれる。ここで使用される術語”レトロウイルス粒子を含まない”とはレトロウイルス粒子内に取り込まれていない遺伝子構築物を示していることを意味している。ここで使用される術語”感染性仲介物から解離している”とは細胞に感染しうるウイルス、細菌または真核生物ベクター（活性でも、不活性でも、生きていてもまたは死んでいても）の一部ではない遺伝子構築物を示すことを意味している。
いくつかの実施態様において、細胞内に導入された場合に、遺伝子構築物が感染性ウイルス粒子の直接産生に不完全な遺伝的情報しか持たないように、遺伝子構築物は完全な複製可能なウイルスゲノムより少ないものから構成されている。ここで使用される術語”不完全なウイルスゲノム”とは、細胞内への遺伝子構築物の取り込みが感染性ウイルスの産生に十分な遺伝的情報の導入を与えないように完全なゲノムより少ないものを含む遺伝子構築物を示していることを意味している。
いくつかの実施態様において、弱くしたウイルスワクチンがウイルス粒子の産生を可能にする十分な遺伝子物質を含む遺伝子構築物として送達されるであろう。弱くしたワクチンを遺伝子構築物として送達することは、安全かつ純粋な活性免疫化生成物を多量に産生するためのより容易な方法である。
遺伝子構築物はマイクロプロジェクティルを使用して、または使用しないで投与することができる。本発明の遺伝子構築物は、固形粒子なしで個体の細胞へ送達されるのが望ましい。ここで使用する句”固形粒子なし”とは、細胞内への遺伝子構築物の進入の入り口を作り出すために細胞の細胞膜に穴をあけ、パンクさせまたは刺し通す手段として使用される固形マイクロプロジェクティルを含まない液体を示していることを意味している。
本発明はウイルス、原核生物および単細胞病原性微生物および多細胞寄生虫のような病原性真核微生物のすべての病原体に対して個体を免疫化するために使用することができる。本発明は、ウイルスおよびゴノロエア、リステリアおよび赤痢菌等の原核生物のような、細胞に感染しかつカプセル化されない病原体に対して個体を免疫するのに特に有用である。さらに、本発明はまた、細胞内病原体となる生活環の一つの段階を含む原生動物病原体に対して個体を免疫するのにも有用である。ここで使用される場合、術語”細胞内病原体”とは、その複製または生活環の少なくとも一部において宿主細胞内に存在し、その中で病原性蛋白質を産生または産生する原因となるウイルスまたは病原性微生物を示すことを意味している。表１は本発明に従ってそれに対するワクチンを作成しうるいくつかのウイルス群および属をリストしたものである。表にリストされた抗原のような病原性抗原上で示されるエピトープと同一のまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、ワクチンにおいて有用である。さらに、本発明はまた原核および真核原生動物病原体ならびに表２に掲げたような多核性寄生虫を含む他の病原体に対して個体を免疫するのにも有用である。
病原体感染を防御するための遺伝子ワクチンを生産するためには、防御的免疫応答を与える免疫発生蛋白質をコードする遺伝子材料が遺伝子構築物に含まれていなければならない。病原体が細胞内で（これに対し本発明は特に有用である）または細胞外から感染するにしても、すべての病原体抗原が防御応答を惹起することはありそうもない。ＤＮＡおよびＲＮＡは両方とも比較的小さく、比較的容易に製造できるので、本発明は多数の病原体抗原のワクチン化を可能にするさらなる利点を提供する。遺伝子ワクチンに使用される遺伝子構築物は、多くの病原体抗原をコードする遺伝子材料を含むことができる。例えば、単一の構築物にいくつかのウイルス遺伝子を含ませることにより多くの標的が提供される。さらに、個体において異なる細胞に送達できる多数の接種物が調製でき、いくつかの場合において、ワクチンに完全なまたは、より望ましくは完全に近い不完全な遺伝子の組が集合的に含まれている。例えば、ウイルス遺伝子の完全な組は、各々異なる部位に投与されるゲノムの異なる半分を含む二つの構築物を用いて投与することができる。従って、感染性ウイルスが組み立てられる危険性を伴うことなく各々の抗原に対する免疫応答が引き起こされるであろう。このことは２つ以上の抗原標識の導入を可能にし、防御抗原が同定される必要性をなくすことができる。
さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡの扱い易さおよび高価でないことにより、防御抗原のスクリーニングのより効果的な手段が可能になる。遺伝子は選別でき、蛋白質よりもっと容易に系統的に試験できる。防御のためのワクチンが生産される病原性物質および微生物が選択され、免疫原性蛋白質が同定される。表１および２は、その感染から個体を防御するために遺伝子ワクチンを調製しうるいくつかの病原性物質および微生物のリストである。いくつかの好適な実施態様において、病原体に対して個体を免疫する方法は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶまたはＨＢＶに対するものである。
本発明の別の態様は、過増殖性疾患に特徴的な過増殖性細胞に対する広範囲の防御的免疫応答を与える方法、および過増殖性疾患を持つ個体の処置方法を提供する。ここで使用される術語”過増殖性疾患”とは細胞の過増殖性により特徴付けられる疾患および障害を指すことを意味している。過増殖性疾患の例としてはすべての形の癌および乾癬が挙げられる。
免疫原性”過増殖性細胞”関連蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体の細胞内に導入することにより、個体のワクチン接種された細胞内でこれらの蛋白質が産生されることが発見されている。ここで使用される術語”過増殖性関連蛋白質”とは過増殖性疾患に関連する蛋白質を指すことを意味している。過増殖性疾患に対して免疫するため、過増殖性疾患に関連する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が個体に投与される。
過増殖性関連蛋白質が有効な免疫原性標的であるためには、正常細胞と比較して過増殖性細胞中で独占的にまたはより高い水準で産生される蛋白質でなければならない。標的抗原は、そのような蛋白質に見いだされる少なくとも一つのエピトープを含む蛋白質、その断片およびペプチドを含む。ある場合には、過増殖性関連蛋白質は蛋白質をコードする遺伝子の突然変異の生成物である。変異遺伝子は正常蛋白質とほとんど同一の蛋白質をコードするが、ただし、わずかに異なるアミノ酸配列を持っており、その結果正常蛋白質には観察されない異なるエピトープを生じる。そのような標的蛋白質には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのような癌遺伝子およびトランスロケーション遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされる蛋白質が含まれる。標的抗原としての癌遺伝子生成物に加えて、抗癌治療および防護的計画のための標的蛋白質には、Ｂ細胞リンパ腫により作られる抗体の変異領域およびＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の変異領域が含まれ、それらはいくつかの実施態様において自己免疫疾患のための標的抗原としても使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａおよび葉酸結合蛋白質により認識される蛋白質を含む腫瘍細胞において高いレベルで見いだされる蛋白質のような他の腫瘍関連蛋白質を標的蛋白質として使用することができる。
本発明は、一つまたはそれ以上のいくつかの形の癌に対して個体を免疫するのに使用することができるが、一方、本発明は、特定の癌が発生し易い、または過去に癌を持っており、従って再発し易い個体の予防的免疫接種に特に有用である。遺伝学および技術ならびに疫学の発達は、個体における癌発生の確率の決定および危険度評価を可能にする。遺伝子スクリーニングおよび／または家族病歴を用いて、特定の個体がいくつかの型の一つの癌を発生する可能性を予言することができる。
同様に、すでに癌の発生がある、および癌をすでに除去する処置を受けた、または緩解期のヒトは、特に癌が再発および再出現しやすい。処置計画の一部として、再発と戦うために、そのような個体を、その個体が有していたと診断された癌に対して免疫することができる。従って個体が癌の一つの型を有していたことおよびその再発の危険性があることがわかったら、将来の癌の出現と戦うその免疫系を準備するためにその個体を免疫することができる。
本発明は過増殖性疾患を持つ個体の処置法を提供する。そのような方法においては、遺伝子構築物の導入が免疫治療剤として働き、標的蛋白質を産生する過増殖性細胞と戦うために個体の免疫系を指示および促進させる。
本発明は、細胞受容体および”自己”指示抗体を産生する細胞を含む自己免疫性に関連する標的に対する広範囲な防御的免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害を持つ個体を処置する方法を提供する。
Ｔ細胞介在自己免疫疾患には、慢性間接リュウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊髄炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェグナー肉芽肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、外因性抗原に結合し自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始するＴ細胞受容体により特徴付けられる。Ｔ細胞の変異領域に対するワクチン接種は、ＣＴＬを含む免疫応答を惹起し、これらのＴ細胞を除去するであろう。
ＲＡにおいて、この疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいくつかの特異的変異領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲにはＶβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７およびＶα−１７が含まれる。従って、これらの蛋白質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Ｈｅｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０９２１−１０９２５；Ｐａｌｉａｒｄ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２５−３３３；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ．  ａｌ．，１９９２  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：３２６−３３３を参照、これらの各々はここに引例として包含されている。
ＭＳにおいては、この疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特異的変異領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲにはＶβ−７およびＶα−１０が含まれる。従って、これらの蛋白質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１０１６−１０１９；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｒ．，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ ３４５：３４４−３４６；参照、これらの各々はここに引例として包含されている。
強皮症においては、この疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特異的変異領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲにはＶβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２が含まれる。従って、これらの蛋白質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、強皮症に関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。
Ｔ細胞介在自己免疫疾患の患者を処置するためには、特にＴＣＲの変異領域がまだ特徴付けられていない場合には、滑液生検を実施することができる。存在するＴ細胞の試料を採り、これらのＴＣＲの変異領域を常法により同定することができる。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
Ｂ細胞介在自己免疫疾患には、狼そう（ＳＬＥ）、グレーブル病、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発生胆汁性硬化症および悪性貧血が含まれる。これらの疾患の各々は、外因性抗原に結合し自己免疫疾患に関連する炎症性カスケードを開始する抗体により特徴付けられる。抗体の変異領域に対するワクチン接種は、ＣＴＬを含む免疫応答を惹起し、抗体を産生するＢ細胞を除去するであろう。
Ｂ細胞介在自己免疫疾患の患者を処置するためには、自己免疫活性に関与する抗体の変異領域を同定しなければならない。滑液生検が実施でき、炎症部位に存在する抗体の試料が採取できる。これらの抗体の変異領域を常法により同定することができる。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造できる。
ＳＬＣの場合、一つの抗原はＤＮＡであると信じられている。従って、ＳＬＣに対して免疫されるべき患者においては、その血清が抗−ＤＮＡ抗体についてスクリーニングされ、血清中に観察されたそのような抗−ＤＮＡ抗体の変異領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンが調製できる。
ＴＣＲおよび抗体両方の変異領域間の共通の構造的特徴はよく知られている。Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（ここに引例として包含されている）に記載されているようなよく知られた方法に従って、特定のＴＣＲまたは抗体をコードするＤＮＡ配列が一般的に発見できる。さらに、抗体からの機能的変異領域クローニングの一般的方法は、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６（ここに引例として包含されている）を参照できる。
遺伝子治療に関する本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物は補償遺伝子または治療的蛋白質をコードする遺伝子を含む。補償遺伝子の例としては、ジストロフィンまたは機能的断片をコードする遺伝子、嚢胞性繊維症の患者の欠陥のある遺伝子を補償するための遺伝子、インスリン、ＡＤＡの患者の欠陥のある遺伝子を補償するための遺伝子およびファクターVIIIをコードする遺伝子が挙げられる。治療的蛋白質をコードする遺伝子の例としては、エリスロポエチン、インターフェロン、ＬＤＬ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＴＮＦをコードする遺伝子が挙げられる。さらに、毒性物質に特異的に結合する一本鎖抗体成分をコードする遺伝子構築物が投与できる。
いくつかの好適な実施態様において、ジストロフィン遺伝子はミニ−遺伝子の一部として提供され、筋ジストロフィーの患者の処置に使用される。いくつかの好適な実施態様において、一部のジストロフィン蛋白質のコード配列を含むミニ−遺伝子が提供される。ジストロフィン異常は、軽ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）および重度デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の両方の原因である。ＢＭＤにおいては、ジストロフィンは作られるがサイズおよび／または量が異常である。患者は軽度から中程度に虚弱である。ＤＭＤにおいては、この蛋白質が作られず、１３歳で車椅子を必要とし、通常２０歳で死亡する。何人かの患者、特にＢＭＤの患者では、本発明に従って送達されるミニ−遺伝子の発現により産生されるジストロフィン蛋白質の一部により筋機能が改良できる。
いくつかの好適な実施態様において、存在しているかまたは除去された後個体へ再導入された腫瘍細胞に、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロンまたはＴＮＦをコードする遺伝子が送達される。いくつかの実施態様においては、ガンマインターフェロンが多発性硬化症の患者に投与される。
アンチセンス分子およびリボザイムもまた、そのような活性物質のコピーのための鋳型として働く遺伝物質を導入することにより個体の細胞へ送達されるであろう。これらの物質は、その存在が望ましくない蛋白質をコードする遺伝子の発現を不活性化または妨害する。アンチセンス分子をコードする配列を含む構築物は、細胞内での蛋白質の産生を阻害または防止するために使用できる。従って、癌遺伝子生成物のような蛋白質の産生を排除または減少させることができる。同様に、リボザイムは蛋白質に翻訳される前にメッセンジャーＲＮＡを選択的に破壊することにより遺伝子発現を破壊することができる。いくつかの実施態様においては、他の治療薬の投与および方法を含む治療計画の一部としてアンチセンス分子およびリボザイムをコードする構築物を用い、本発明に従って細胞が処理される。アンチセンス分子およびリボザイムをコードする遺伝子構築物は蛋白質産生が望まれる場合に使用されるベクターと同様のベクターを使用するが、ただしコード配列は蛋白質へのＲＮＡの翻訳を始めるための開始コドンを含まない。いくつかの実施態様において、実施例４６に記載されているベクター、特に複製起点および発現可能な形の適当な核抗原を含むものが好適である。
リボザイムは触媒性ＲＮＡであり、自己切断または他のＲＮＡ分子の切断ができる。ハンマーヘッド、ヘアピン、テトラヒメナグループＩイントロン、アックスヘッドおよびＲＮアーゼＰのようなリボザイムのいくつかの異なる型が本分野で知られている。（Ｓ．Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２  １０，２５６−２６２。）ハンマーヘッドリボザイムは、４０未満のヌクレオチドのコアにマッピングされている触媒部位を有する。植物ウイロイドおよびサテライトＲＮＡのリボザイムのいくつかは、共通の二次構造およびある種の保存ヌクレオチドを共有している。これらのリボザイムは、天然にはそれら自身の基質として役だっているが、酵素ドメインは、保存された切断部位に隣接する配列との塩基対形成を通して別のＲＮＡ基質を標的とすることができる。注文設計リボザイムに対するこの能力は、それらを配列特異的ＲＮＡ切断に使用することを可能にしている（Ｇ．Ｐａｏｌｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ １９９２，１９１３−１９１９）。したがって、ハンマーヘッド触媒配列のようなリボザイムの種々の型の異なる触媒配列の使用およびそれらをここに開示した方法で設計することは当業者には容易であろう。リボザイムは病原体ヌクレオチドおよび癌遺伝子配列を含む種々の標的に対して設計できる。本発明のある種の好適な実施態様では切断反応を残しながらａｂｌ−ｂｃｒ融合転写体を特異的に標的とするのに十分な相補性を含む。
本発明のいくつかの実施態様に従うと、細胞による遺伝子構築物の取り込みを容易にする化合物で細胞が処理される。本発明のいくつかの実施態様に従うと、細胞分裂を誘発し、遺伝子構築物の取り込みを容易にする化合物で細胞が処理される。細胞刺激化合物等の、細胞による遺伝子構築物の取り込みを容易にする化合物の投与により、遺伝子構築物によりコードされる標的蛋白質に対するより有効な免疫応答が得られる。
本発明のいくつかの実施態様に従うと、遺伝子構築物は個体に無針注入装置を用いて投与される。本発明のいくつかの実施態様に従うと、遺伝子構築物は個体に無針注入装置を用いて皮内、皮下および筋肉内に同時に投与される。無針注入の装置はよく知られており、広く応用されている。本分野で通常の技術を持つものは本発明の教示に従って、個体の細胞への遺伝物質の送達に無針注入装置を用いる。無針注入装置はすべての組織への遺伝物質の送達に非常に適している。それらは皮膚および筋肉細胞へ遺伝物質を送達するのに特に有用である。いくつかの実施態様において、ＤＮＡ分子を含む液体を個体の皮膚の表面へ発射させるために針なしの注入装置が使用されるであろう。皮膚に対する衝撃により液体が皮膚を透過するのに十分な速度で液体が発射され、液体はその下の皮膚および筋肉組織に浸透する。従って、遺伝子構築物は皮内、皮下および筋肉内に同時に投与される。いくつかの実施態様において、核酸分子を他の器官の細胞に導入するため、その器官の組織への遺伝物質の送達に無針注入装置が使用されるであろう。
本発明に従うと、遺伝子ワクチンは免疫されるべき個体内へ直接投与されるか、または個体から取り出された細胞内へ生体外で投与された後再移植されるであろう。どちらの経路にしても、遺伝物質は個体の体内に存在する細胞内へ導入される。投与方法には、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、点眼および経口、ならびに経皮、吸入または座剤が含まれるが、それらに制限されるわけではない。投与の好適な経路には、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注入が挙げられる。標的蛋白質をコードする遺伝子構築物の送達は、投与の様式により免疫された個体に粘膜免疫を与えることができ、遺伝物質は粘膜を伴う組織内に存在する。従って、いくつかの実施例においては、遺伝子構築物は個体の口内の口腔に投与することにより送達される。
遺伝子構築物は、伝統的シリンジ、無針注入装置または”マイクロプロジェクティルボンバードメント遺伝子銃”を含む手段により投与されるであろうが、それらに制限されるわけではない。もしくは、遺伝子ワクチンは個体から取り出された細胞内へ種々の方法で導入されるであろう。そのような方法には例えば、生体外トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびマイクロプロジェクティルボンバードメントが含まれる。遺伝子構築物が細胞により取り込まれた後、それらは個体内へ再移植される。たとえワクチン接種された細胞が本来は別の個体から取り出されていても、遺伝子構築物が取り込まれた非免疫原細胞を移植できるように企図されている。
本発明に従う遺伝子ワクチンは、約１ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施態様においては、本ワクチンは約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。
本発明に従う遺伝子ワクチンは、使用される投与様式に従って処方される。本分野で普通の技術を持つものは、遺伝子構築物を含む遺伝子ワクチンを容易に処方することができる。投与様式として筋肉内注入が選ばれた場合、等張処方を使用することが望まれる。一般的に、等張性のための添加物には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが含まれる。いくつかの場合にはリン酸緩衝化塩溶液のような等張溶液が好適である。安定化剤としてはゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様においては処方に血管収縮剤が添加される。本発明に従う医薬製剤は無菌で発熱物質を含まない製剤として提供される。
本発明の遺伝子構築物は、ポリヌクレオチド機能促進剤と共に処方または投与される。本発明に従った好適な複合剤は、局所麻酔薬の一群等の、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタンおよびそれらの塩酸塩からなる群より選択される。
ＰＦＥは以下の式の一つを持つ化合物であろう：
Ａｒ−Ｒ1−Ｏ−Ｒ2−Ｒ3
または
Ａｒ−Ｎ−Ｒ1−Ｒ2−Ｒ3
または
Ｒ4−Ｎ−Ｒ5−Ｒ6
または
Ｒ4−Ｏ−Ｒ1−Ｎ−Ｒ7
式中：
Ａｒはベンゼン、ｐ−アミノベンゼン、ｍ−アミノベンゼン、ｏ−アミノベンゼン、置換ベンゼン、置換ｐ−アミノベンゼン、置換ｍ−アミノベンゼン、置換ｏ−アミノベンゼン（ここでアミノベンゼン化合物中のアミノ基はアミノ、Ｃ1−Ｃ5アルキルアミン、Ｃ1−Ｃ5、Ｃ1−Ｃ5ジアルキルアミンであり、置換化合物中の置換基はハロゲン、Ｃ1−Ｃ5アルキルおよびＣ1−Ｃ5アルコキシである）であり；
Ｒ1はＣ＝Ｏであり；
Ｒ2はＣ1−Ｃ10分岐アルキルを含むアルキルであり；
Ｒ3は水素、アミン、Ｃ1−Ｃ5アルキルアミン、Ｃ1−Ｃ5、Ｃ1−Ｃ5ジアルキルアミンであり；
Ｒ2＋Ｒ3は環状アルキル、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換複素環式（Ｃ1−Ｃ10アルキルＮ−置換複素環式を含む）を形成でき；
Ｒ4はＡｒ、Ｒ2またはＣ1−Ｃ5アルコキシ、環状アルキル、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換複素環式およびＣ1−Ｃ10アルコキシ置換複素環式（Ｃ1−Ｃ10アルキルＮ−置換複素環式を含む）であり；
Ｒ5はＣ＝ＮＨであり、
Ｒ6はＡｒ、Ｒ2またはＣ1−Ｃ5アルコキシ、環状アルキル、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換複素環式およびＣ1−Ｃ10アルコキシ置換複素環式（Ｃ1−Ｃ10アルキルＮ−置換複素環式を含む）であり；および
Ｒ7はＡｒ、Ｒ2またはＣ1−Ｃ5アルコキシ、環状アルキル、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状アルキル、環状脂肪族アミン、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換環状脂肪族アミン、複素環式、Ｃ1−Ｃ10アルキル置換複素環式およびＣ1−Ｃ10アルコキシ置換複素環式（Ｃ1−Ｃ10アルキルＮ−置換複素環式を含む）である。
エステルの例としては：ピペロカイン、メプリルカインおよびイソブカインのような安息香酸エステル；プロカイン、テトラカイン、ブテタミン、プロポキシカインおよびクロロプロカインのようなｐ−アミノ安息香酸エステル；メタブタミンおよびプリマカインを含むメタ−アミノ安息香酸エステル；およびパレトキシカインのようなパラ−エトキシ安息香酸エステルが含まれる。アニリドの例にはリドカイン、エチドカイン、メピバカイン、ブピバカイン、ピロカインおよびプリロカインが含まれる。そのような化合物のその他の例にはジブカイン、ベンゾカイン、ジクロナイン、プラモキシン、プロパラカイン、ブタカイン、ベノキシネート、カルボカイン、メチルブピバカイン、ブタシンピクレート、フェナカイン、ジオタン、ルクカイン、イントラカイン、ヌペルカイン、メタブトキシカイン、ピリドカイン、ビフェナミンおよびコカイン、シンナモイルコカイン、トルキシルリンおよびコカエチレンのような植物ー由来二環式化合物および塩酸と複合体を作ったすべてのこのような化合物が含まれる。
好適な実施態様において、ＰＦＥはブピバカインである。ブピバカインとメピバカインとの相違は、メピバカインのＮ−メチル基の代わりにブピバカインはＮ−ブチル基を持っていることである。化合物はそのＮにＣ1−Ｃ10を持っていてもよい。化合物はプロカインおよびクロロプロカインのようにハロゲンで置換されていてもよい。アニリドは好適である。
ブピバカインは遺伝子構築物に先だって、同時にまたは後で投与される。ブピバカインおよび遺伝子構築物は同一の組成物に処方されてもよい。組織に投与された場合のその多くの特質および活性の点において、ブピバカインは細胞刺激剤として特に有用である。ブピバカインは細胞による遺伝物質の取り込みを促進しかつ容易にする。それ自体トランスフェクション剤である。ブピバカインとともに遺伝子構築物を投与すると、細胞内への遺伝子構築物の導入が容易となる。ブピバカインは細胞膜を破壊、またはさもなくばより透過し易くすると信じられている。細胞分裂および複製がブピバカインにより誘発される。従って、ブピバカインは複製試薬として作用する。ブピバカインの投与はまた組織を刺激し損傷を与える。それ自体炎症剤として作用し、投与部位への免疫細胞の移動および走化性を惹起する。投与部位に通常存在する細胞に加えて、炎症剤に応答してその部位に移動する免疫系の細胞が、投与された遺伝子構築物およびブピバカインと接触できる。トランスフェクション剤として作用するブピバカインは、免疫系のそのような細胞による遺伝物質の取り込みの促進にも利用可能である。
ブピバカインは化学的におよび薬学的にアミノアシル局所麻酔薬に関係している。それはメピバカインの同族体であり、リドカインに関係している。ブピバカインは筋肉組織をナトリウム流入に対して電位感受性となし、細胞内のイオン濃度を達成させる。ブピバカインの薬学的活性の完全な記述はＲｉｔｃｈｉｅ，Ｊ．Ｍ．およびＮ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．編、第８版、１５章：３１１１（ここに引例として含まれている）にみることができる。ブピバカインおよびブピバカインと同様な機能を示す化合物が本発明の方法において望ましい。
ブピバカイン−ＨＣｌは化学的には２−ピペリジンカルボキサミド、１−ブチル−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）一塩酸塩、一水和物と称され、Ａｓｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）、Ｓａｎｏｆｉ  Ｗｉｎｔｈｒｏｐ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）およびＥａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を含む多くの発売元から医薬用として広く市販品として入手可能である。ブピバカインはメチルパラベンを含んだおよび含まない形で、およびエピネフリンを含んだおよび含まない形で商業的に処方されている。そのような処方は何れを使用してもかまわない。０．２５％、０．５％および０．７５％の濃度で医薬として使用するためのものが商業的に入手可能であり、本発明に使用されるであろう。別の濃度、特に望ましい効果を惹起する０．０５％−１．０％の間の濃度が必要に応じ調製されるであろう。本発明に従うと、約２５０μｇから約１０ｍｇのブピバカインが投与される。いくつかの実施例では、約２５０μｇから約７．５ｍｇが投与される。いくつかの実施例では、約０．０５ｍｇから約５．０ｍｇが投与される。いくつかの実施例では、約０．５ｍｇから約３．０ｍｇが投与される。いくつかの実施例では、約５から約５０μｇが投与される。例えば、いくつかの実施例では０．５％ブピバカイン−ＨＣｌおよび０．１％メチルパラベンを含む等張医薬担体の約５０μｌから約２ｍｌ、好適には５０μｌから約１５００μｌ、およびより好適には約１ｍｌがワクチンが投与される前、同時にまたは後で同じ部位に投与される。同様に、いくつかの実施例では０．５％ブピバカイン−ＨＣｌを含む等張医薬担体の約５０μｌから約２ｍｌ、好適には５０μｌから約１５００μｌ、およびより好適には約１ｍｌがワクチンが投与される前、同時にまたは後で同じ部位に投与される。ブピバカインおよびその他の同様に作用する化合物（特に、局所麻酔薬の一群に関連するもの）は細胞による遺伝子構築物取り込みの望まれる促進を提供する濃度で投与されるであろう。
本発明のいくつかの実施態様において、個体に遺伝子ワクチン接種に先だって最初にブピバカイン注射が行われる。例えば、ワクチン接種に先立つ約１週間から１０日までに、個体にブピバカインが最初に注射される。いくつかの実施態様では、（ワクチン接種に先立ち）遺伝子構築物投与約１から５日前にブピバカインが個体に注射される。いくつかの実施態様では、（ワクチン接種に先立ち）遺伝子構築物投与約２４時間前にブピバカインが個体に注射される。もしくは、ブピバカインはワクチン接種と同時に、数分前または数分後に注射できる。従って、ブピバカインおよび遺伝子構築物は混合物として混合され同時に注入されるであろう。いくつかの実施態様では、ブピバカインは遺伝子構築物の投与後に投与される。例えば、遺伝子構築物投与後約１週間から１０日後までに、個体へブピバカインが注射される。いくつかの実施態様では、ワクチン接種約２４時間後に個体へブピバカインが注射される。いくつかの実施態様では、ワクチン接種約１から５日後に個体へブピバカインが注射される。いくつかの実施態様では、ワクチン接種約１週間から１０日後に個体へブピバカインが投与される。
トランスフェクト剤、および／または複製剤および／または炎症剤として機能し、ブピバカインおよび同様に作用する化合物と同時に投与されるであろうその他の薬剤にはα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＧＣ−ＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のようなレクチン、増殖因子、サイトカイン類およびリンホカイン類ならびにコラゲナーゼ、繊維芽細胞増殖因子、エストロジェン、デキサメタゾン、サポニン、免疫誘発複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンのようなベシクルが含まれ、スクアレン、ヒアルロン酸およびヒアルロニダーゼもまた遺伝子構築物と合わせて投与に使用されるであろう。いくつかの実施態様において、これらの薬剤の組み合わせがブピバカインおよび遺伝子構築物と合わせて投与される。例えば、ブピバカインおよびヒアルロン酸かまたはヒアルロニダーゼが遺伝子構築物と同時に投与される。
遺伝子構築物はコラーゲンと組み合わせて乳化剤として非経口で送達されてもよい。コラーゲン乳化剤はＤＮＡの徐放性放出のための手段を提供する。５０μｌから２ｍｌのコラーゲンが使用される。この処方を用いる好適な実施態様においては約１００μｇのＤＮＡが１ｍｌのコラーゲンと混ぜられる。他の徐放性放出処方が、Ｒｅｍｉｎｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌ，（本分野で標準的な参考テキストであり、それはここに引例として包含されている）に記載されている。そのような処方には、水懸濁液、油溶液および懸濁液、乳化剤および移植、ならびに貯蔵器および経皮装置が含まれている。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物のための時間放出処方が好適である。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物は６−１４４時間、好適には１２−９６時間、より好適には１８−７３時間の間に時間放出される。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物は無針注入装置で注入される。無針注入装置は筋肉内、皮内および皮下に物質を同時投与するために特に有用である。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物はＳａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．により１９９０年７月３１日に公開された米国特許第４，９４５，０５０号（ここに引例として包含されている）により教えられているようなマイクロプロジェクティル  パーティクル  ボンバードメント法の手段によりＰＦＥとともに投与される。
本発明のいくつかの実施態様において、遺伝子構築物はポリヌクレオチド機能促進剤とのリポソーム複合体の一部として投与される。
本発明のいくつかの実施態様においては、完全で広範囲の免疫応答を生み出すために一回のワクチン接種が行われる。本発明のいくつかの実施態様においては、完全で広範囲の免疫応答を生み出すために一連のワクチン接種が行われる。本発明のいくつかの実施態様に従うと、少なくとも２回の、および好適には４から５回の注入が一定時間にわたり行われる。注入間隔は２４時間から２週間またはそれ以上であるが、好適には１週間離される。もしくは、少なくとも２つ、かつ４つまでの異なる部位で同時に別々の注入が行われる。
本発明のいくつかの実施態様において、完全なワクチン接種は一つまたはそれ以上の標的化されたエピトープをコードする配列を含む遺伝子構築物を持つ単一の接種物の注入を含む。
本発明のいくつかの実施態様において、完全なワクチン接種は異なる部位への２つまたはそれ以上の異なる接種物の注入を含む。例えば本発明に従ったＨＩＶワクチンにおいては、ワクチンは二つの接種物を含み、各々は異なるウイルス蛋白質をコードする遺伝物質を含む。ワクチン接種のこの方法は、感染性ウイルス粒子の組立の危険を犯さずに、個体内へウイルス遺伝子の完全な組と同等のものを導入することを可能にする。従って、ワクチン接種された個体では、ウイルスのほとんどまたはすべてに対する免疫応答を引き起こすことができる。各々の接種物の注入は異なる部位、好適にはいかなる細胞も両方の遺伝子構築物を受け取ることがないことが確実な距離で実施される。さらなる安全のための予防処置として、感染性ウイルス組立の可能性を防止するためいくつかの遺伝子が欠損させられまたは改変されるであろう。ここで使用される術語”医薬キット”とは本発明で使用される複数の接種物を集合的に呼ぶことを意味している。そのようなキットには異なる接種物および／または細胞刺激剤を含む別々の容器が含まれる。これらのキットは免疫法に使用される接種物の組を含むように提供されることが意図されている。
本発明の方法はヒトおよび家畜両方の治療用医薬の分野で有用である。従って、本発明は哺乳類、鳥および魚の遺伝子免疫化に関する。本発明の方法はヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコを含む哺乳類種に対して特に有用であろう。
以下に示した実施例には本発明の態様の代表的実施例が含まれている。これらの実施例は本発明の範囲を制限することを意味しているのではなく、ただ例示の目的を果たしているものである。さらに、本発明の種々の態様が以下の記述に要約できる。しかしながら、この記述は本発明の範囲を制限するものではなく、ただ本発明の種々の態様を強調するものである。当業者は本発明のさらなる態様および実施態様を容易に評価できるであろう。
実施例
実施例１
本発明は直接的遺伝子免疫処置を用いるＨＩＶワクチンを提供する。個体の細胞内へ送達された時に発現されてＨＩＶ蛋白質を産生する遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施態様に従うと、個体の細胞中での全ウイルス構造蛋白質の産生はＨＩＶ感染を防護する防護的免疫応答が惹起される。本発明のＨＩＶワクチンはＨＩＶ感染から非感染個体を免疫するのに用いられるであろうし、またはすでに感染した個体に対しては免疫治療剤として働くであろう。本発明のＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ感染細胞を認識および攻撃し、およびＨＩＶ蛋白質の最も広範囲の付随物を認識するＣＴＬを含む免疫応答を引き起こす。従って、非感染の個体がＨＩＶ感染から防護される。
いくつかの実施例において、本発明は二つの接種物を投与することによりＨＩＶに対して個体を免疫する方法に関している。これらの二つの接種物は少なくとも二つのおよび好適には二つより多くのＨＩＶウイルスの複数または全ての遺伝子を含んでいる。しかしながら、接種物は一緒には送達されない。従って、接種される細胞には完全な遺伝子の補体は投与されないであろう。ワクチン接種された個体は少なくとも二つの異なった、および好適には二つより多くの、より好適には複数または全ての遺伝子を受け取るであろう。ＨＩＶ蛋白質標的の全補体で免疫応答が指示される。
この方法は最も有効な標的蛋白質をコードする遺伝物質がワクチンに含まれるであろう確率を増加させ、ウイルスが突然変異を行った場合に起こる一つまたはそれ以上のウイルス蛋白質の構造変化にもかかわらずに免疫応答による検出からのがれるであろうウイルス粒子を減少させる。従って、多数のおよび好適にはほとんど完全なまたは完全なウイルス蛋白質をコードしている遺伝子の補体で個体をワクチン処理するのが望ましい。
一つの細胞にウイルス遺伝子の完全な補体が提供されると、細胞内で完全な感染性ウイルスを組み立てることが可能である。従って、本発明に従った遺伝子構築物はそのような完全な遺伝子の補体では提供されない。さらに、各々は遺伝子の不完全な組を持ち、合わせるとウイルス遺伝子の完全な補体を持つ二つまたはそれ以上の接種物が異なった細胞に、望ましくはいかなる細胞も不注意に遺伝子の完全な組に曝されないことを確実にするためお互いに離れた部位で投与される。例えば、ＨＩＶのゲノムの一部が第一の構築物に挿入でき、ＨＩＶゲノムの残った部分は第二の構築物に挿入される。第一の構築物は遺伝子ワクチンとして個体の一つの腕の筋肉組織中に投与され、一方第二の構築物は遺伝子ワクチンとして個体の別の腕の筋肉組織中に投与される。個体はウイルス遺伝子の完全な組に曝されるであろう；それ故、本質的には全ウイルスに対してワクチン接種されているが、感染性ウイルス粒子か組み立てられるであろう危険性はない。
さらなる安全のための予防措置として、遺伝物質が二つまたはそれ以上の接種物により個体の体の離れた部位に送達された場合でも、感染性ウイルス粒子が形成されないことを確かにするために一つまたはそれ以上の必須な遺伝子を欠損または故意に改変できる。そのような実施態様において、個体にはウイルス遺伝子の完全で機能的な組は投与されない。
さらなる安全のための予防措置では別々の遺伝子構築物上のウイルスゲノムの非−重複部分が提供され、各々別々の接種物を作り上げる。従って、二つの遺伝子構築物間の組換えが妨げられる。
本発明のいくつかの実施態様において、構造遺伝子の全補体が提供される。ＨＩＶの構造遺伝子はｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖから成っている。これらの三つの遺伝子は二つの異なったＤＮＡまたはＲＮＡ構築物で提供される。従って、一つの好適な実施態様においてはｇａｇおよびｐｏｌが一つのＤＮＡまたはＲＮＡ構築物上にあり、ｅｎｖは別のものに存在する。別の好適な実施態様においては、ｇａｇおよびｅｎｖが一つのＤＮＡまたはＲＮＡ構築物上にあり、ｐｏｌは別のものに存在する。いくつかの好適な実施態様において、ｇａｇを含む構築物はｇａｇ翻訳開始コドンの上流にスプライスドナーを持っている。随意に、これらの組み合わせにおいてＨＩＶ制御遺伝子もまた存在するであろう。ＨＩＶ制御遺伝子は：ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｒｅｖである。
好適な実施態様におけるＤＮＡ構築物はプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルから成っている。プロモーターは：ＨＩＶ  ＬＴＲ、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ＣＭＶ、ＲＳＶ、モロネイ、ＭＭＴＶ、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンおよびＥＢＶからなる群より選択されるであろう。エンハンサーは：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンおよびＥＢＶからなる群より選択されるであろう。ポリアデニル化シグナルは：ＬＴＲポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（特にその中でもＳＶ４０マイナーポリアデニル化シグナル）からなる群より選択されるであろう。
いくつかの実施例において、二つの接種物のワクチンが個体の空間的に分離した組織に（好適には例えば右および左の腕のような異なった付属器官）筋肉内で投与された。本発明の各々の接種物は約０．１から約１０００マイクログラムのＤＮＡを含んでいるであろう。好適には各々の接種物は約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。最も好適には各々の接種物は約１００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。
いくつかの実施例における本接種物は無菌であり、等張担体（好適にはリン酸緩衝化塩溶液または塩溶液）として存在する。
いくつかの実施態様では、ワクチン投与に先立って、ワクチンが与えられる組織に細胞増殖剤（望ましくはブピバカイン）が注入される。ブピバカイン注入はワクチン接種の約２４時間前までに実施されるであろう。ブピバカイン注入はワクチン接種直前に行うことが意図された。約５０μｌから約２ｍｌ（好適であるのは５０μｌから約１５００μｌであり、最も好適には約１ｍｌ）の０．５％ブピバカイン−ＨＣｌおよび０．１％メチルパラベン等張ＮａＣｌ溶液がワクチンが投与されるべき部位に投与される。
他の実施態様において、細胞増殖剤（好適にはブピバカイン）が遺伝子構築物と一緒に処方に含まれている。約５０μｌから約２ｍｌ（好適であるのは５０μｌから約１５００μｌであり、最も好適には約１ｍｌ）の０．５％ブピバカイン−ＨＣｌおよび０．１％メチルパラベン等張ＮａＣｌ溶液がワクチンが投与されるべき部位に投与される。
従って、いくつかの実施態様は二つの接種物のワクチンから成っている：一つの接種物は二つのＨＩＶ構造遺伝子を持つＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を含んでおり、合わされた接種物がＨＩＶ構造遺伝子の全補体を含むように、他の接種物は第三の残りのＨＩＶ構造遺伝子を持つＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を含んでいる。各々のＤＮＡ構築物の構造遺伝子は作動可能なようにプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルに連結されている。同一または異なった制御配列がウイルス遺伝子の発現を制御するであろう。個体にワクチン接種する場合、二つの接種物は異なった部位に（好適には異なった腕に）筋肉内に投与される。本発明のいくつかの実施態様では、ワクチンが接種されるべき部位にブピバカインが最初に投与される。本発明のいくつかの実施態様では、ブピバカインが遺伝子構築物と一緒に処方に含まれている。
いくつかの実施態様では、ワクチン接種は少なくとも一回、好適には二または三回繰り返される。各々のワクチン接種は２４時間から二ヶ月離して実施される。
いくつかの実施態様では、ワクチンは無針注入装置を用いて投与される。いくつかの実施態様では、ワクチンは無針注入装置を用いて皮下注射的に投与されて筋肉内、皮内、皮下での同時投与が行われ、物質は間質に投与される。
好適な遺伝子構築物は以下のものが含まれる。
プラスミドおよびクローニング法：
二つのプラスミドが作製された：一つはＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌを含んでおり、残りはＨＩＶｅｎｖを含んでいる。
ＨＩＶ−１ゲノムクローンｐＮＬ４３はＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＡＲＲＲＰ）、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨ、を通してＭａｌｃｏｌｍ  Ｍａｒｔｉｎ博士から得られ、遺伝子構築物のためのＨＩＶ−１ウイルス遺伝子の出発材料として使用できる。もしくは、感染細胞のＨＩＶ分子クローンが、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて構築に十分なように修飾でき、ＨＸＢ２クローン、ＭＮクローン並びにＳＦまたはＢＡＬ−１クローンが含まれる。ｐＮＬ４３クローンがＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡにｐＵＣ１８内へクローン化された組み込みの部位から３ｋｂの宿主配列が加わったものからなる構築物である。ｐＮＬ−ｐｕｒｏ−ｅｎｖプラスミドの作製：このプラスミドはｇａｇ／ｐｏｌの発現のために作製された。ｐＮＬ４３の非−ＨＩＶ５’隣接ヒトＤＮＡ内のＳｔｕＩ部位がＳｔｕＩによる部分消化により破壊し、続いて大腸菌ポリメラーゼＩで遊離末端を消化した。線状プラスミドを詰め込んで自己結合を起こさせ、ＨＩＶゲノム内へ特異的ＳｔｕＩ部位を残した。このプラスミドｐＮＬＤｓｔｕは次に平滑端生成酵素ＳｔｕＩおよびＢｓａＢＩで切断し、ｇｐ１２０のコード配列の大部分を除去する。ＳＶ４０プロモーターおよびピューロマイシン耐性コード領域（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ））はＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩを用いてｐＢＡＢＥ−ｐｕｒｏ（ＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎおよびＬａｎｄ，１９９０  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１２）：３５８７−３５９６、ここに引例として包含されている、親切にもＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ＦｕｎｄのＨａｒｔｍｕｔ  Ｌａｎｄ博士から提供を受けた）から単離された。この断片を平滑端化し、ＳｔｕＩ／ＢｓａＢＩ切断ｐＮＬＤｓｔｕ内へクローン化された。ＨＩＶの３’ＬＴＲがＰＡＣメッセージのためのポリＡ機能を提供できるように正しい配向のＳＶ４０−ｐｕｒｏ断片でクローンが選択された。このプラスミドはｐＮＬｐｕｒｏと称された。
ＨＩＶｇａｇ ｐｏｌベクターからのｖｐｒ制御遺伝子の欠失のためのクローニング戦略：
特異的Ｐｆ１Ｍ１部位のすぐ上流からｖｉｆ終止コドンのすぐ後ろまでの領域が、ｖｐｒのアミノ酸２２で非保存的アミノ酸変換（ｇｌｕ＞ｖａｌ）を導入するプライマー、アミノ酸２２の直後のｖｐｒ読み枠内の停止コドン、および新規停止コドンにすぐ続いたＥｃｏＲＩ部位を用いるＰＣＲにより増幅された。このＰＣＲ断片はｐＮＬｐｕｒｏまたはｐＮＬ４３のＰｆ１Ｍ１−ＥｃｏＲＩ断片と置換された。この置換によりｖｐｒの転写解読枠の１２２ヌクレオチドが欠失され、点突然変異法では必然的に伴われる復帰の可能性が除去される。得られたプラスミド（ｐＮＬｐｕｒｏΔｖｐｒ）はｖｐｒの最初の２１の天然のアミノ酸に加えてバリン、加えてＨＩＶ−１遺伝子の残りの全ておよびその天然型のスプライスジャンクションをコードしている。そのような欠失戦略はまたｎｅｆ、ｖｉｆおよびｖｐｕに応用可能であり、構造遺伝子発現は可能であるが生きている組換え体ウイルスの発生を防いでいる。
エンベロープ発現のためのプラスミド作製：
ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２のエンベロープ遺伝子をコードするＤＮＡセグメントはＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから得られたラムダクローン化ＤＮＡを利用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術によりクローン化された。５’および３’プライマーは各々、ＸｈｏＩ部位を含んだ5'-AGGCGTCTCGAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3'（配列ＩＤ番号：１）およびＸｂａＩ部位を含んだ5'-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3'（配列ＩＤ番号：２）でありｇｐ１６０、ｔａｔおよびｒｅｖコード領域を取り巻いている。
遺伝子特異的増幅は使用説明書に従って（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施された。ＰＣＲ反応生成物は０．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３０分間３７℃で処理され、続いてフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱が行われた。回収されたＤＮＡはＸｈｏｌおよびＸｂａｌで２時間３７℃で切断され、アガロースゲル電気泳動にかけた。単離され精製されたＸｈｏｌ−ＸｂａｌＰＣＲ断片はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内へクローン化され続いて真核発現ベクターｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）内へサブクローン化された。得られた構築物はｐＭ１６０（図１Ａ）と称された。プラスミドＤＮＡはＣｓＣｌ濃度勾配超遠心分離で精製された。ＤＮＡ構築物ｐＭ１６０はＲＳＶエンハンサー要素およびプロモーターとしてのＭＭＴＶ  ＬＴＲの制御下ＨＩＶ−１／ＨＸＢ２（Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：２６２−２６５）ｇｐ１６０膜結合糖蛋白質をコードしている。
ＨＩＶ  ｅｎｖ−ｒｅｖプラスミドと称されるエンベロープ発現プラスミドの別の構築法：
ｒｅｖおよびｖｐｕの二つのエキソンおよびＨＩＶ−１  ＨＸＢ２のエンベロープ転写解読枠がＰＣＲにより増幅され、発現ベクターｐＣＮＤＡ／ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へクローン化された。このプラスミドはＣＭＶプロモーターを通してエンベロープ産生を誘導する。
製造および精製
大腸菌（ＤＨ５アルファ）中のプラスミドは以下のように増殖させた：ＬＢ添加アンピシリン寒天プレートで凍結されている所望のプラスミド培養物が画線培養された。プレートは３７℃で一夜（１４−１５時間）インキュベーションされた。プレートから一つのコロニーを採り、ペプトン調製物および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１５ｍｌのＬＢ培地内へ接種された。この培養物は振とうしながら（約１７５ｒｐｍ）３７℃で８−１０時間増殖させた。ＯＤ600の読みは少なくとも１．０でなければならない。ペプトンおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地内へ１．０ＯＤ培養物が接種された。これらの１−２リットル培養物は振とうしながら（１７５ｒｐｍ）３７℃で一夜増殖させた。
大腸菌（ＤＨ５アルファ株）中で増殖させたプラスミドは以下の方法により採取され精製された。細胞の溶解およびプラスミドの精製の一般的方法は”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、に記載されている。細胞は濃縮されグルコース−トリス−ＥＤＴＡｐＨ８．０緩衝液で洗浄された。濃縮された細胞はリソザイム処理および０．２ＮＫＯＨで短時間処理する事により溶解させ、次にｐＨを酢酸カリウム／酢酸緩衝液で５．５に調節する。不溶性物質は遠心分離により除去される。上清液に２−プロパノールを加えてプラスミドを沈澱させる。プラスミドをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁し、さらにフェノール／クロロホルム抽出およびさらなる２−プロパノールによる沈澱により精製する。
エンドトキシンは下記のものを含む種々の方法により随意に除去できる：ポリミキシンのような固定化物質による特異的吸着（Ｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（２−４）：４５７−６２（１９９２）；Ｉｓｓｅｋｕｔｚ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｄｓ  ６１（３）：２７５−８１（１９８３））；８Ａ１およびＨＡ−１ＡTMのような抗−エンドトキシンモノクローナル抗体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ；Ｂｏｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１０）：４４３８−４４４９（１９９３）；Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙｐａｇｅ  ３８６３（１９９３））；正に荷電したデプスフィルター（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４４（４）：２０４−９（Ｊｕｌ−Ａｕｇ  １９９０））；ポリ（ガンマーメチル  Ｌ−グルタメート）、Ｈｉｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）４０（８）：２１０６−９（１９９２））；ヒスチジン（Ｍａｔｓｕｍａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２：（２）：１２９−４０（１９９０））；疎水的相互作用カラムおよび膜（Ａｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２（２）：１９１−５（１９９０）；Ｕｍｅｄａ  ｅｔ  ａｌ：；Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ａｒｔｉｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ  １８（４）：４９１−７（１９９０）；Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０７３（１）：１４９−５４（１９９１）；Ｓａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｙｇ（Ｌｏｎｄｏｎ）９７（１）：１０３−１４（１９８６））；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｐｏｌｙｐｏｒｅ  Ｒｅｓｉｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａ）のような疎水性ポリスチレン／ジビニルベンゼンまたはジビニルベンゼン樹脂を含むエンドトキシンを除去するために有用な特異的疎水性樹脂；ＸＵＳ  ４０３２３．００（Ｄｏｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）；ＨＰ２０，ＣＨＰ２０Ｐ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ｋａｓｅｉ，Ｕ．ｓ．）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１  ＰＲＰ−ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）；Ｊｏｒｄｉ逆相ＤＶＢ，Ｊｏｒｄｉ  Ｇｅｌ  ＤＶＢ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ  ＰＬｇｅｌTM(ａｌｌｔｅｃｈ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；Ｖｙｄａｃ  ＰＬＸTM(ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）；他のエンドトキシンの除去物質および方法にはＤｅｔｏｘｉ−ＧｅｌTMエンドトキシン除去ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ２０６，（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれる。一般的にはＳｈａｒｍａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８：５−２２（１９８６）もまた参照されたい。好適な抗−エンドトキシンモノクローナル抗体はエンドトキシンの保存領域に結合する、好適にはエンドトキシンの最も構造的に保存���れた部分であるリピドＡへの抗体の結合。そのような抗−リピドＡモノクローナル抗体には高親和性マウスＩｇＧモノクローナル抗体８Ａ１およびヒト抗−リピドＡＩｇＭ（Ｋ）モノクローナル抗体ＨＡ−１ＡTMが含まれる。ＨＡ−１ＡTMはヒトＢ大腸菌Ｊ５ワクチンＨＡ−１ＡTMから誘導された。ＨＡ−１ＡTMは種々の細菌エンドトキシン（リポポリサッカライド）と広い交差反応性があることが報告されている。
実施例２
遺伝子ワクチンおよび蛋白質ワクチンにより惹起される免疫原性応答を比較するために計画された実験において、外来性標的蛋白質を特異的に発現する腫瘍細胞を用いて動物モデルが設計された。外来性抗原を発現する三つの免疫応答性マウスモデルが開発された。Ｂａｌｂ／ｃマウス株に由来する三つのクローン化腫瘍細胞株が使用された。細胞株は：１）他の組織に有意に転移しないが８−１２週で動物を殺すような大きな触知できる腫瘍を形成するリンパ腫細胞；２）いくらかの転移能力（主として肺）を持ち、百万の細胞を接種するとマウスに大きな触知できる腫瘍を発生させそれは同様に８−１２週以内に動物を殺すマウスメラノーマ細胞株；および３）多数の組織に転移し動物を１２またはそれ以上の週のうちに殺すマウス肺アデノカルシノーマ細胞株である。非認識形で外来性抗原を示すことができるサブクローンが選択された。トランスフェクトされた腫瘍が親マウス株に移植された場合、大多数の類似の腫瘍株と異なり、動物は示される外来抗原に対して防護的免疫応答を行わずに腫瘍が受け入れられてしまう。これらの腫瘍は本来の非トランスフェクト腫瘍のように、同じ時間枠での同じ表現形で動物を殺す。これらのモデルを用いて、抗原に対する遺伝子ワクチン接種により惹起される免疫応答が測定できる。
マウスの細胞により標的蛋白質の産生を生じる遺伝子構築物を含む遺伝子ワクチンでマウスをワクチン接種した場合、標的蛋白質を示している腫瘍を完全に除去する強い細胞毒性を示したが、示さない腫瘍には何の影響も与えないことが観察された。標的蛋白質それ自身を接種したマウスでは、それらにより惹起された免疫応答はより低かった。腫瘍はその大きさを減少させたが、細胞毒性がないため除去されなかった。対照として、実験にトランスフェクトされていない腫瘍が使用され、遺伝子ワクチン、サブユニットワクチンでワクチン接種されたおよびワクチン接種されていない動物の免疫応答が比較された。これらの実験は、遺伝子ワクチンがより広範囲でより有効な免疫応答を生み出し、ＣＴＬにより完全に腫瘍を除去できたことが明らかに示された。対照的に、無傷の標的蛋白質を用いた免疫接種はより範囲の狭い、より有効でない免疫応答しか生み出さなかった。
実施例３
本発明の別の実施態様では、ＨＩＶに対する遺伝子ワクチンが設計された。ウイルス蛋白質ｇｐ１６０（ｇｐ１２０およびｇｐ４１内へプロセッシングされている）が標的蛋白質であり、それに対して遺伝子ワクチンが製造された。遺伝子ワクチンは作動可能なように制御要素に連結されたｇｐ１６０をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を含んでいる。個体に投与された場合、遺伝子ワクチンのＤＮＡ構築物が個体の細胞内へ取り込まれ、ｇｐ１６０が産生される。この蛋白質により惹起される免疫応答は広範囲のものに基づいており体液性および細胞性免疫応答の両方が含まれる。広範囲な生物学的応答は蛋白質自体が投与された場合に達成されるより優れた防護を提供する。
マウスに実施例１に記載したｐＭ１６０を筋肉内に注入し、続いて抗−ＨＩＶ免疫応答が分析された。このようにして免疫した動物からの抗血清は抗−ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質免疫応答を生み出し、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および免疫沈降アッセイで測定された。抗血清はＨＩＶ−１感染を中和し、ＨＩＶ−１誘導融合細胞形成を阻害した。
観察された中和および抗−融合細胞活性は惹起された抗体のＨＩＶ−１エンベロープ蛋白質の機能的に重要な領域（なかでもｇｐ１２０のＶ３ループ、ＣＤ４結合部位およびｇｐ４１のＮ−末端”免疫優性”領域のような）への反応性の結果であろう。
ここに記載した遺伝子免疫法において、ＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭筋に筋肉細胞再生の刺激および遺伝子構築物の取り込みを容易にするため１００μｌの０．５％ブピバカイン−ＨＣｌおよび０．１％メチルパラベンの等張ＮａＣｌ溶液が２７−ゲージ針を用いて注射された。２４時間後、同一の注射部位に１００μｇのｐＭ１６０または対照プラスミドとして１００μｇのｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅが注射された（図１Ａ）。マウスは同様の方法でしかしブピバカイン−ＨＣｌ前処理なしで２週間の間隔で３回同量のＤＮＡ構築物を注射することにより追加免疫された。
組換え体ｇｐ１６０免疫処置では、ＢＡＬＢ／Ｃマウスは最初に完全フロインドアジュバンド中の１μｇのグリコシル化組換え体（ＨＩＶ−１／ＩＩＩB）ｇｐ１６０（ＭｉｃｒｏＧｎｅｎｅＳｙｓ  Ｉｎｃ．）で免疫され、続いて各々不完全フロインドアジュバンド中の１μｇのｇｐ１６０で２週間間隔で３回追加免疫された。ＨＩＶ−１に対する抗体の産生はマウス血清の免疫沈降ｇｐ１６０への能力を試験して決定された。免疫沈降はＯｓｔｈｅｒ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １０：６７３−６８３（ここに引例として包含されている）により以前に記載されているように１ｘ１０6ｃｐｍの125Ｉ標識ｒｇｐ１６０、マウス血清およびプロテイン−Ｇアガロースビーズ（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｃ．）を用いて実施された。特異的沈降は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。レーン１は125Ｉ−ｇｐ１６０と反応させた１μｌの免疫前マウス血清である。レーン２はｐＭ１６０免疫マウスから免疫した１μｌのマウス血清である。レーン３は陽性対照として、１μｌのＩＤ６モノクローナル抗−ｇｐ１２０抗体の１：１００希釈液（Ｕｆｗｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｇｐ１２０  ｗｈｉｃｈ  Ｅｌｉｃｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）である。矢印は特異的に免疫沈降された125Ｉ−ｇｐ１６０エンベロープ糖蛋白質を示している。
125Ｉ−標識ｇｐ１６０は特異的にｐＭ１６０−免疫化動物並びに陽性対照抗−ｇｐ１２０モノクローナル血清（図２、レーン１）に由来する抗血清（図２、レーン２）と特異的に免疫沈降された。対照的に、免疫前血清（図２、レーン１）は最小の活性しか示さなかった。
ｐＭ１６０構築物で免疫された１０匹の内の８匹はｇｐ１６０に対する反応性が陽性であることがＥＬＩＳＡで決定され、最も高い抗−ｇｐ１６０力価を持つ動物からの免疫応答が詳細に分析された。ベクターで免疫された４匹のマウスはＥＬＩＳＡにおいてすべてｇｐ１６０に対する反応性が類似の陰性を示し、これらの血清の一つが続いての実験の対照として使用された。
ＨＩＶ中和抗体はｇｐ１２０およびｇｐ４１中のいくつかのエピトープを特異的に標的とすることが知られており、それにはｇｐ１２０のＶ３ループ（Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）ＡＩＤＳ  ２：１５７−１６４；およびＰｕｔｎｅｙ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎ  ＨＩＶ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）、ｇｐ１２０のカルボキシ末端近くのＣＤ４結合部位（Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５０：９７５−９８５）ならびにＮ−末端融合領域のすぐ下流のｇｐ４１の免疫優性ループ（Ｓｃｈｒｉｅｒ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２５３１−２５３６）が含まれる。
これらのマウスで惹起されたどの抗−ｇｐ１６０抗体がこれらの重要な領域に対して反応性があるかを決定するため、エンベロープ糖蛋白質、ＢＲＵ／Ｖ３ループのためのペプチド、ＭＮ／Ｖ３ループのためのペプチド、ＨＸＢ２／ＣＤ４Ｎ−末端のためのペプチドまたは、ＨＸＢ２／ＣＤ４結合部位のためのペプチドがマイクロタイタープレートに吸着されマウス抗血清の特異的反応性がＥＬＩＳＡアッセイで決定された。１μｇのｇｐ１６０または１０μｇの各々のペプチドの０．１Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．５）溶液でマイクロタイタープレートを被覆し（４℃、一夜）、２％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液でブロックし、ＨＲＰＯ（Ｆｉｓｈｅｒ）とコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧと３７℃で１時間反応させ、暗所、室温にてＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）と１０−３０分顕色させた。結果は図３に報告されている。抗血清は以下のものである：（−＋−）は免疫前血清であり、（−ｘ−）はｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅで免疫した血清であり、（−○−）はｐＭ１６０で免疫した血清であり、（−△−）はｒｇｐ１６０蛋白質で免疫されたマウスからのものである。図３Ａはｒｇｐ１６０蛋白質で被覆したプレートを使用した結果を示している。図３ＢはＢＲＵ／Ｖ３ループペプチド（CNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK（配列ＩＤ番号：１１））被覆プレートを使用した結果を示している。図３ＣはＭＮ／Ｖループペプチド（YNKRKRIHIQRGPGRAFVTTKNIIC（配列ＩＤ番号：１２））（ＨＩＶ−１／ＩＩＩBからのＱＲ配列はボールド体で示されている）で被覆したプレートを使用した結果を示している。図３ＤはＨＸＢ２／ＣＤ４結合部位ペプチド（CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGIRC（配列ＩＤ番号：１３））被覆プレートを使用した結果を示している。図３ＥはＢＲＵ／ｇｐ４１免疫優性領域ペプチド（RILAVERYIKDQQLLGIWGCSKLIC（配列ＩＤ番号：１４））被覆プレートを使用した結果を示している。
図３はｐＭ１６０構築物免疫処置マウスからの抗血清が組換え体ｇｐ１６０蛋白質（ｒｇｐ１６０）免疫処置血清より、ＢＲＵおよびＭＮ／Ｖ３ループペプチド、ＣＤ４結合部位ペプチドおよび免疫優性ｇｐ４１ペプチドに対して有意により高い反応性を持っていることを示している。ｒｇｐ１６０免疫処置マウスからの抗血清はｐＭ１６０構築物免疫処置マウスよりｒｇｐ１６０に対してより高い力価を持っていたが、試験されたｇｐ１６０の三つの特異的中和エピトープに対してはより低い活性しか持っていなかった。
ＤＮＡ免疫処置により発生した抗血清が抗ウイルス活性を持っているかどうかを決定するため、ＨＩＶ感染を中和する抗血清の能力が試験された。１００のＴＣＩＤ50での細胞フリーＨＩＶ−１／ＩＩＩBウイルスをＭＴ−２標的細胞の感染に用いる前に連続的に希釈した抗血清とインキュベートした（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．，（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２６：２３１−２３５）。
１００のＴＣＩＤ50ＨＩＶ−１／ＩＩＩB細胞フリーウイルスを連続的に希釈した抗血清と３７℃で１時間前もってインキュベートした。インキュベーション後、前処理したウイルスを４ｘ１０４の標的細胞株ＭＴ−２に加え３７℃で１時間トランスフェクションし、続いてＭＴ−２細胞を３回洗浄し３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。３重の実験について、３日後ウェル当たりの融合細胞の数を位相差顕微鏡下で目で計数することにより定量的に融合が評価された。
結果が図４に報告されている。図４Ａはベクター−免疫処置マウス血清を用いて得られた結果を示しており、ｐＭ１６０免疫処置血清を用いた結果を示す図４Ｂと比較されている。中和化値（Ｖn／Ｖo）対希釈因子（Ｎａｒａ，Ｐ．，（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  ＨＩＶ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｅｄｓ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．＆Ｗａｌｋｔｅｒ，Ｂ．Ｄ．，７７−８６  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）は、図４Ｃに示されている。対照血清（−ｘ）はｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅベクター免疫処置マウスからのものであった。試験血清（○）はｐＭ１６０免疫処置マウスからであった。
融合細胞阻害は、Ｏｓｔｈｅｒ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １０：６７３−６８３により記載されているように実施された。Ｈ９／ＩＩＩB細胞株を５０μｌの総容量で９６ウェルプレートに作成された連続希釈（１：１００，１：２００，および１：４００）抗血清と３７℃、５％ＣＯ2にて前もってインキュベートした。３日後、融合はウェル当たりの融合細胞の数を位相差顕微鏡下で計数することにより定量的に評価された。図４Ｄは免疫前血清で処理されたＨＩＶ−１／ＩＩＩB細胞株と同時培養した標的細胞である。図４Ｅは図４Ｄと同じ物であるが、ただし対照ベクターで免疫された血清で処理されている。図４Ｆは図４Ｄと同じ物であるが、ただしｒｇｐ１６０で免疫された血清で処理されている。図４Ｇは図４Ｄと同じ物であるが、ただしｐＭ１６０で免疫された血清で処理されている。図４Ｄから図４Ｇはこれらのアッセイにおいて１：２００の希釈で融合細胞の阻害が明らかであることを示している。ベクター−免疫処置抗血清で前もってインキュベートされている無細胞ＨＩＶ−１／ＩＩＩBでＭＴ−２を感染させると容易に融合細胞をが形成された（図４Ａ）。対して、ｐＭ１６０免疫処置マウス血清との前もってのインキュベーションは融合細胞形成を妨害した（図４Ｂ）。中和化動力学は中和化値（Ｖn／Ｖo）対抗血清の連続的希釈により決定された（Ｎａｒａ，Ｐ．，（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  ＨＩＶ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｅｄｓ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．＆Ｗａｌｋｔｅｒ，Ｂ．Ｄ．，７７−８６，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）（図４Ｃ）。ｐＭ１６０免疫処置マウスからの血清は１：３２０までの希釈で生物学的に活性な中和活性をもっていたが、一方、対照抗血清は類似の活性を示さなかった。
ｐＭ１６０免疫処置マウスからの血清が直接的細胞−細胞融合を通してのエンベロープ仲介ウイルス拡散を阻害できたかどうかを決定するために、融合細胞阻害アッセイが実施された。ｐＭ１６０免疫処置マウスからの血清はＨＩＶ−１誘導融合細胞形成を１：２００の希釈で阻害した（図４Ｇ）。対照的に、免疫前血清（図４Ｄ）、ｒｇｐ１６０免疫処置マウスからの血清（図４Ｆ）および対照ベクター免疫処置血清（図４Ｅ）は同一の希釈で融合細胞の形成を阻害しなかった。
これらの血清の中和（図４Ａ−Ｃ）および融合細胞阻害アッセイ（図４Ｄ−Ｇ）からの観察結果はＥＬＩＳＡ反応性（図３）で観察されたものと相関している。エピトープの中和に高レベルの結合を示したｐＭ１６０免疫処置マウスからの血清は同様に、高レベルの抗ウイルス活性を示した；逆に、これらのエピトープにほとんど結合しない血清は（ｒｇｐ１６０免疫処置マウスからの血清を含んで）低い抗ウイルスしか持っていなかった。
ｐＭ１６０免疫処置マウスからの血清が、ＣＤ４を運ぶＴ細胞へのｇｐ１２０の結合を阻害できるかどうかを試験するために、フルオロサイトメトリーによりモニターされる直接阻害アッセイが用いられた（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２）ＡＩＤＳ ６：５３３−５３９）。ｐＭ１６９免疫処置マウスからの血清がＣＤ４を運ぶＴ細胞へのｇｐ１２０の結合を阻害できることが観察された：１：１５希釈の免疫血清がＣＤ４+ＳｕｐＴ１細胞へのＦＩＴＣ−ｇｐ１２０の結合を２２％±２％阻害したことが（２重の実験）フローサイトメトリーにより計算された。このことは標的細胞へのＨＩＶの侵入のためのこの領域がこの抗血清により機能的に阻害できることを示している。これらの結果はＣＤ４結合部位ペプチドに対する抗血清のＥＬＩＳＡ反応性で観察されたことと一致している（図３ｃ）。
イムノグロブリンのイソタイプ分類研究が市販のマウスモノクローナル抗体イソタイプ分類キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施された。ｐＭ１６０免疫処置で惹起された抗ｇｐ１６０特異的抗体の内、１９％がＩｇＧ１であり、５１％がＩｇＧ２であり、１６％がＩｇＧ３であり、１０％がＩｇＭであり、および５％がＩｇＡであった。ＩｇＧイソタイプが優勢なことは二次の免疫応答が起こったことを示しており、さらにヘルパーＴ細胞が遺伝子免疫処置により惹起できることを示唆している。
ｐＭ１６０およびｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅ  ＤＮＡがマイクロタイタープレート上に被覆されすべての免疫処置された動物の血清を用いてＥＬＩＳＡにより特異的結合が決定された。プラスミドＤＮＡへの有意な結合は観察されなかった。従って、筋肉組織への接種に遺伝物質を用いても抗プラスミドＤＮＡ応答はないようである。
ＤＮＡ構築物をマウス筋肉へ針による注射で導入すると、一致しない結果を生じるであろう；この技術は筋肉細胞によるＤＮＡの取り込みを制御する手段を提供しないからである。ＤＮＡ構築物単独注入（ｎ＝４）およびブピバカイン前処理動物（ｎ＝４）が比較された。二つの群で観察された免疫応答は同じではなかった、各々２５％および７５％の動物がＥＬＩＳＡアッセイで応答した。パーティクルボンバードメントのような直接ＤＮＡ送達システムにより効率の増加が達成されるであろう（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２８６−２９１）。
中和、融合細胞阻害、ＣＤ４−ｇｐ１２０結合阻害およびｇｐ１６０のいくつかの重要な領域への特異的結合の証拠は、生きている動物の筋肉細胞内へのＨＩＶｇｐ１６０膜結合糖蛋白質コードＤＮＡ構築物の直接的導入は特異的体液性応答を惹起でき、生物学的に適切な抗ウイルス抗体を発生することを示している。
ワクチンが防護的免疫応答を惹起できるかどうかを試験するため、上記の動物モデルが使用された。腫瘍細胞をｐ１６０をコードするＤＮＡでトランスフェクトし、蛋白質の発現を確認して動物内へ移植した。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫処置した動物はプラスミドｐｍ１６０でワクチン処置された。対照は非ワクチン処置動物、ベクターＤＮＡのみでワクチン処置した動物およびｇｐ１６０が投与された動物である。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。ｇｐ１６０蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例４
以下は本発明の方法で使用されるであろう構築物のリストである。以下にリストした構築物の多くの製造のための出発材料として使用されたベクターｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏは初めはＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．およびＨ．Ｌａｎｄ，１９９０  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１２）：３５８７−３５９６（ここに引例として包含されている）により構築および報告されている。ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏプラスミドは哺乳類細胞での外因性遺伝子の発現に特に有用である。発現されるべきＤＮＡ配列はモロネイマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）の制御下のクローニング部位へ挿入される。プラスミドはピューロマイシン耐性の選択可能マーカーを含んでいる。
実施例５
プラスミドｐＢａ．Ｖα３はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＥｃｏＲＩ部位内へクローン化されたＬ、ＶおよびＪセグメントを含むＴ細胞受容体Ｖａ３領域をコードしている２．７ｋｂＥｃｏＲＩゲノム断片を含む７．８ｋｂのプラスミドである。Ｔ細胞受容体由来標的蛋白質はＴ細胞仲介自己免疫疾患およびクロノタイプＴ細胞リンパ腫および白血病に対する免疫処置および治療に有用である。
実施例６
プラスミドｐＢａ．ｇａｇｐｏｌ−ｖｐｒはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏ内へクローン化されたＨＩＶ／ＭＮのｇａｇ／ｐｏｌおよびｖｉｆ遺伝子を含む９．８８ｋｂのプラスミドである。ｖｐｒは欠落している。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。ＨＩＶ  ＤＮＡ配列はＲｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．８：１５４９（ここに引例として含まれている）に報告されている。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例７
プラスミドｐＭ１６０はｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅ内にクローン化されたＨＩＶ−１／３Ｂエンベロープ蛋白質およびｒｅｖ／ｔａｔ遺伝子をコードする２．３ｋｂＰＣＲ断片を含む１１．０ｋｂのプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。ＨＩＶ−１／３ＢのＤＮＡ配列はＦｉｓｈｅｒ，Ａ．，１９８５  Ｎａｔｕｒｅ ３１６：２６２（ここに引例として包含されている）により報告されている。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｋ０３４５５として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例８
プラスミドｐＢａ．ＶＬはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位内へクローン化された抗ＤＮＡ抗体のＶＬ領域をコードするＰＣＲ断片を含む５．４ｋｂのプラスミドである。抗体由来標的蛋白質はＢ細胞仲介自己免疫疾患およびクロノタイプＢ細胞リンパ腫および白血病に対する免疫処置および治療に有用である。抗体からの機能的変異領域のクローニングのための一般法はＣｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１０６６（ここに引例として含まれている）に記載されている。
実施例９
プラスミドｐＯｓｐＡ．ＢはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位内へクローン化されたボレリア  ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病の原因となるスピロヘータ）のＯｓｐＡおよびＯｓｐＢ抗原をコードするコード領域を含む６．８４ｋｂのプラスミドである。ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢ断片を発生させるのに使用されたＰＣＲプライマーは5,-GAAGGATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3'（配列ＩＤ番号：３）および5'-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTTAAG-3'（配列ＩＤ番号：４）。Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．１９９２  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（３）：２０７（ここに引例として含まれている）参照。標的蛋白質をコードするこれらの病原体遺伝子を含むプラスミドはライム病に対する免疫処置に有用である。
実施例１０
プラスミドｐＢａ．Ｒｂ−ＧはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩ部位内へクローン化された狂犬病Ｇ蛋白質をコードするＰＣＲ発生断片を含む７．１０ｋｂのプラスミドである。狂犬病Ｇ蛋白質をコードするこの病原体遺伝子含むプラスミドは狂犬病に対する免疫処置に有用である。このＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ３２７５１に記載されている（ここに引例として含まれている）。Ａｎｉｌｉｏｎｉｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８１  Ｎａｔｕｒｅ ２９４：２７５（ここに引例として含まれている）もまた参照されたい。
実施例１１
プラスミドｐｂａ．ＨＰＶ−Ｌ１はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位内へクローン化されたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）株１６、１８、３１および３３を含むＨＰＶのＬ１カプシド蛋白質をコードするＰＣＲ発生断片を含む６．８０ｋｂのプラスミドである。本プラスミドはＨＩＶ感染およびそれにより起こされる癌に対する免疫処置に有用である。このＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１５７８１に記載されている（ここに引例として含まれている）。Ｈｏｗｌｅｙ，ｐ．，１９９０  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｅｄｓ．：Ｃｈａｎｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ５８：１６２５；ａｎｄ  Ｓｈａｈ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐ．Ｈｏｗｌｅ，１９９０  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｅｄｓ．：Ｃｈａｎｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ５９（ここに引例として含まれている）もまた参照されたい。
実施例１２
プラスミドｐＢａ．ＨＰＶ−Ｌ２はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位内へクローン化されたヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）株１６、１８、３１および３３を含むＨＰＶのＬ２カプシド蛋白質をコードするＰＣＲ発生断片を含む６．８０ｋｂのプラスミドである。本プラスミドはＨＩＶ感染およびそれにより起こされる癌に対する免疫処置に有用である。このＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１５７８１に記載されている（ここに引例として含まれている）。Ｈｏｗｌｅｙ，ｐ．，１９９０  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｅｄｓ．：Ｃｈａｎｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ５８：１６２５；ａｎｄ  Ｓｈａｈ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐ．Ｈｏｗｌｅ，１９９０  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｅｄｓ．：Ｃｈａｎｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ５９（ここに引例として含まれている）もまた参照されたい。
実施例１３
プラスミドｐＢａ．ＭＮｐはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩにクローン化されたＨＩＶ  ＭＮ  ｇａｇ（コア蛋白質）配列を含むｐ７コード領域をコードしているＰＣＲ発生断片を含む５．２４ｋｂプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。Ｒｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．  ８：１５４９（ここに引例として含まれている）。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例１４
プラスミドｐＧＡ７３３−３はｐＣＤＭ８ベクターのＢｓｔＸＩ部位内に結腸直腸癌細胞株ＳＷ９４８からクローン化されたＧＡ７３３−２腫瘍表面抗原を含む６．３ｋｂのプラスミドである。（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ａｎｄ  Ａ．Ａｒｕｆｆｏ，１９８７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡＣａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３３６５、ここに引例として含まれている）。腫瘍付随標的蛋白質は癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用な標的蛋白質の例である。ＧＡ７３３−２抗原は結腸癌に対する有用な標的抗原である。ＧＡ７３３抗原はＳｚａｌａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３５４２−３５４６（ここに引例として含まれている）に報告されている。
実施例１５
プラスミドｐＴ４−ｐＭＶ７はｐＭＶ７ベクターのＥｃｏＲＩ部位内にクローン化されたヒトＣＤ４受容体をコードしているｃＤＮＡを含む１１．１５ｋｂのプラスミドである。ＣＤ４標的蛋白質はＴ細胞リンパ腫に対する免疫処置および治療に有用である。プラスミドｐＴ４−ｐＭＶ７はＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから入手可能である（カタログ番号１５８）。
実施例１６
プラスミドｐＤＪＧＡ７３３はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩにクローン化されたＧＡ７３３腫瘍表面抗原を含む５．１ｋｂのプラスミドである。腫瘍付随標的蛋白質は癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用な標的蛋白質の例である。ＧＡ７３３−２抗原は結腸癌に対する有用な標的抗原である。
実施例１７
プラスミドｐＢａ．ＲＡＳは最初にｐＺＩＰｎｅｏＲＡＳからサブクローン化され、ｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩ部位にクローン化されたｒａｓコード領域を含む６．８ｋｂのプラスミドである。ｒａｓ標的蛋白質は細胞質シグナル発生分子の例である。ｒａｓクローニングの方法はＷｅｉｎｂｅｒｇ  １９８４  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４：１５７７（ここに引例として含まれている）に報告されている。ｒａｓをコードしているプラスミドは癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用である；特に、膀胱、筋肉、肺、脳および骨のようなｒａｓ関連の癌。
実施例１８
プラスミドｐＢａ．ＭＮｐ５５はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩ部位内にクローン化されたＨＩＶ  ＭＮ  ｇａｇ前駆体（コア蛋白質）配列を含むｐ５５コード領域をコードするＰＣＲ発生断片を含む６．３８ｋｂのプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。Ｒｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．８：１５４９（ここに引例として含まれている）。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例１９
プラスミドｐＢａ．ＭＮｐ２４はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内にクローン化されたＨＩＶ  ＭＮ  ｇａｇ前駆体（コア蛋白質）配列を含むｐ２４コード領域をコードするＰＣＲ発生断片を含む５．７８ｋｂのプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。Ｒｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．８：１５４９（ここに引例として含まれている）。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例２０
プラスミドｐＢａ．ＭＮｐ１７はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内にクローン化されたＨＩＶ  ＭＮ  ｇａｇ前駆体（コア蛋白質）配列を含むｐ１７コード領域をコードするＰＣＲ発生断片を含む５．７８ｋｂのプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。Ｒｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．８：１５４９（ここに引例として含まれている）。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例２１
プラスミドｐＢａ．ＳＩＶｅｎｖはｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内にクローン化されたｐＢＲ３２２のＳＩＶ２３９を含む構築物から増幅された２．７１  ＰＣＲ発生断片を含む７．８ｋｂのプラスミドである。使用されたプライマーは5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3'（配列ＩＤ番号：５）および5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3'（配列ＩＤ番号：６）である。プラスミドはＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから入手可能である（カタログ番号２１０）。
実施例２２
プラスミドｐｃＴＳＰ／ＡＴＫ．ｅｎｖはｐｃＤＮＡ１／ｎｅｏベクター内へサブクローン化されたＨＴＬＶ−１／ＴＳＰおよび／ＡＴＪＫ単離物からの完全ＨＴＬＶエンベロープコード領域を含む８．２９ｋｂプラスミドである。使用されたプライマーは5'-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3'（配列ＩＤ番号：７）および5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3'（配列ＩＤ番号：８）である。プラスミドｐｃＴＳＰ／ＡＴＫ．ｅｎｖは１９８８年にＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３５９９（ここに引例として含まれている）に報告されている。ＨＴＬＶ  ｅｎｖ標的蛋白質はＨＴＬＶおよびＴ細胞リンパ腫に対する免疫処置および治療に有用である。
実施例２３
プラスミドｐＢａ．ＭＮｇｐ１６０はｐＢａｂｅ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内にクローン化されたｐｓＰ７２のＭＮｅｎｖを含む構築物から増幅された２．８ｋｂ  ＰＣＲ発生断片を含む７．９ｋｂのプラスミドである。使用されたプライマーは5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3'（配列ＩＤ番号：９）および5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3'（配列ＩＤ番号：１０）である。Ｒｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．８：１５４９，（ここに引例として含まれている）。この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。
実施例２４
プラスミドｐｃ．ＭＮｐ５５はｐＣＥＰベクター内にクローン化され、ＭＮ単離物のｇａｇ領域から増幅された１．４ｋｂＰＣＲ発生断片を含む１１．８ｋｂのプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。Ｒｅｉｚ，Ｍ．Ｓ．，１９９２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏ．８：１５４９（ここに引例として含まれている）。
この配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ１７４４９として入手可能である（ここに引例として含まれている）。
実施例２５
プラスミドｐＣ．ＮｅｕはＬＴＲ−２／ｅｒｂ２構築物から切断されｐＣＥＰ４ベクター内へサブクローンされたヒトｎｅｕ癌遺伝子コード領域を含む３．８ｋｂＤＮＡ断片を含む１４．２ｋｂのプラスミドである。ｐＣ．ＮｅｕプラスミドはＤｉＦｉｏｒｅ  １９８７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１７８（ここに引例として含まれている）に報告されている。ｎｅｕ癌遺伝子標的蛋白質は癌（特に、結腸、乳、肺および脳の癌）のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用である増殖因子受容体の例である。
実施例２６
プラスミドｐｃ．ＲＡＳは最初にｐＺＩＰｎｅｏＲＡＳからサブクローンされ、ｐＣＥＰ４のＢＡｍＨＩ部位内へサブクローン化されたｒａｓ癌遺伝子コード領域を含む１．４ｋｂＤＮＡ断片を含む１１．７ｋｂのプラスミドである。ｐｃ．ＲＡＳプラスミドはＷｅｉｎｂｅｒｇ  １９８４Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４：１５７７（ここに引例として含まれている）に報告されている。ｒａｓ標的蛋白質は細胞質シグナル発生分子の例である。ｒａｓをコードしているプラスミドは癌のような過増殖性疾患に対する免疫処置および治療に有用である；特に、膀胱、筋肉、肺、脳および骨のようなｒａｓ関連の癌。
実施例２７
プラスミドｐＮＬｐｕｒｏはＨＩＶ  ｇａｐ／ｐｏｌおよびＳＶ４０−ｐｕｒｏ挿入物を含む１５ｋｂのプラスミドである。ＨＩＶ標的蛋白質をコードするこれらのＨＩＶウイルス遺伝子を含むプラスミドはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに対する免疫処置および治療に有用である。
実施例２８
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのヒトＣＤ４に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験はＴリンパ腫抗原に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。従って、このモデルはＴリンパ腫防護に対する遺伝子ワクチンの能力を示している。さらに、これらの実験では分子の多数のイムノグロブリンスーパーファミリーに対する有効性を試験された。ＣＤ４はヒトおよびマウス種間で非常によく保存されている。
使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はＣＤ４をコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。動物は免疫受容性であるが、非ワクチン処置動物の移植ＣＤ４標識腫瘍に対して免疫応答は起こらなかった。
遺伝子で免疫された動物は実施例１５に記載されているプラスミドｐＴ４−ｐＭＶ７でワクチン接種された。対照は非ワクチン接種動物およびＣＤ４投与動物である。
ここに記載した遺伝子免疫法において、ＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭筋に筋肉細胞再生の刺激および遺伝子構築物の取り込みを容易にするため１００μｌの０．５％ブピバカイン−ＨＣｌおよび０．１％メチルパラベンの等張ＮａＣｌ溶液が２７−ゲージ針を用いて注射された。２４時間後、同一の注射部位に１００μｇのｐＴ４−ｐＭＶ７または対照プラスミドとして１００μｇのｐＭＶ７が注射された。マウスは同様の方法でしかしブピバカイン−ＨＣｌ前処理なしで２週間の間隔で３回同量のＤＮＡ構築物を注射することにより追加免疫された。
動物は１，０００，０００のＣＤ−４標識腫瘍細胞を受け取っている。非ワクチン処置動物においては大きな腫瘍が形成され、約７−１０週間後に死亡した。ワクチン処置動物においては類似の致死性腫瘍は形成されなかった。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。ＣＤ４蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例２９
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのヒトＧＡ７３３に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験は結腸癌のようなＧＡ７３３に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はＧＡ７３３をコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例１４に記載されているプラスミドｐＧＡ７３３−２でワクチン接種された。対照は非ワクチン接種動物およびＧＡ７３３投与動物である。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。ＧＡ７３３蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例３０
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのヒトｐ１８５ｎｅｕに対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験は乳、肺および脳癌のようなｐ１８５ｎｅｕ付随癌に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はｎｅｕをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したような方法に従って、ＬＴＲ−２のＸｈｏＩ部位内へクローン化されたヒトｎｅｕ癌遺伝子コード領域を含む１４．３ｋｂのプラスミドｐＬＴＲ−２／ｅｒｂＢ−２でワクチン接種された。５’−ＬＴＲおよび３’−ＬＴＲはＭｏｌｅｎｅｙ−ＭｕＬＶ  ＬＴＲからのものである。対照は非ワクチン接種動物およびｐ１８５ｎｅｕ投与動物である。
結果は、遺伝子でワクチン処置されたマウスの免疫応答はトランスフェクトされた腫瘍を完全に除去する一方、非トランスフェクト腫瘍には何の影響も与えないことを示した。ｐ１８５蛋白質ワクチン処置では、非トランスフェクト腫瘍と比較してトランスフェクトされた腫瘍で腫瘍の大きさがいくらか減少したが死亡率には何の影響も与えなかった。非ワクチン処置動物ではトランスフェクトされたおよび非トランスフェクト腫瘍の両方で同じ死亡率であった。
実施例３１
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのヒトＲａｓに対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験は膀胱、筋肉、肺、脳および骨癌のようなＲａｓ付随癌に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はＲａｓをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例１７に記載されているプラスミドｐＢａ．Ｒａｓでワクチン接種された。Ｒａｓ標的蛋白質は細胞質シグナル発生分子の例である。ｒａｓのクローニング法はＷｅｉｎｂｅｒｇ  １９８４  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５７７（ここに引例として含まれている）に報告されている。対照は非ワクチン接種動物およびＲａｓ蛋白質投与動物である。
実施例３２
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのヒト狂犬病Ｇ蛋白質抗原に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞は狂犬病Ｇ蛋白質をコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例１０に記載されているプラスミドｐＢａ．Ｒｂ−Ｇでワクチン接種された。狂犬病Ｇ蛋白質標的蛋白質は病原体抗原の例である。このＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ番号：Ｍ３２７５１に記載されている（ここに引例として含まれている）。対照は非ワクチン接種動物およびＧ蛋白質投与動物である。
実施例３３
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのライム病抗原に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はＯｓｐＡおよびＯｓｐＢをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例９に記載されているプラスミドｐＯｓｐＡ．Ｂでワクチン接種された。対照は非ワクチン接種動物およびＯｓｐＡおよびＯｓｐＢ蛋白質投与動物である。
実施例３４
ＤＮＡ構築物がマウスにおいてのヒトＴ細胞受容体変異領域に対する遺伝子ワクチンの有効性を試験するために設計された。これらの実験はＴ細胞リンパ腫およびＴ細胞仲介自己免疫疾患のようなＴ細胞由来蛋白質付随癌に対する防御のワクチンの能力を試験するように設計された。使用された動物モデルは前に説明されている。腫瘍細胞はＲａｓをコードするＤＮＡでトランスフェクトされ、蛋白質の発現を確認して動物に移植された。対照は非トランスフェクト腫瘍株である。
遺伝子で免疫された動物は前に説明したように実施例５に記載されているプラスミドｐＢａ．Ｖα３でワクチン接種された。
実施例３５
プラスミドｐＭ１６０はＨＩＶのｅｎｖ部分からの一つまたはそれ以上の遺伝子の発現に有用ないくつかのプラスミドの出発材料として使用できる。ｐＭ１６０の構築は前に説明されている。プラスミドはｇｐ１６０、ｔａｔおよびｒｅｖコード領域を包含している。ｎｅｆ遺伝子は欠落している。
プロモーター制御ｇｐ１６０／ｔａｔ／ｒｅｖ遺伝子発現はＭＭＴＶ  ＬＴＲである。プロモーターは欠損させられ、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター，ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターおよびＣＭＶプロモーターで置き換えられている。
アンピシリン耐性を与える遺伝子は欠損されているか、さもなくば不活性化されている。ネオマイシン耐性を与える遺伝子は細菌プロモーターの制御下に置かれている。
ラウス肉腫ウイルスエンハンサーはプラスミドから欠落されているであろう。ＲＳＶエンハンサーは筋肉クレアチンエンハンサーと置き換えられているであろう。
ｇｐ１６０／ｔａｔ／ｒｅｖ遺伝子は異なった読み枠の同一のヌクレオチド配列に重複しおよび共有している。ｒｅｖ遺伝子はその開始コドンを異なったコドンに変化させることにより欠落されているであろう。同様に、ｔａｔ遺伝子も同じ手段により除去されているであろう。ｇｐ１６０／ｔａｔ／ｒｅｖ制御にＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターを使用しているものを除いて各々のプラスミドにおいてｒｅｔかまたはｔａｔまたはｒｅｔおよびｔａｔの両方が除去されているであろう。ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターを使用しているプラスミドにおいては、ｔａｔは存在していなければならない。
下記の表はｐＭ１６０修飾プラスミドを掲げている。各々のプラスミドは不活性化アンピシリン遺伝子を持っている。いくつかはエンハンサーを持っていず（ナシ）；いくつかは筋肉クレアチンエンハンサー（ＣＭＥ）を持っている。いくつかはＨＩＶｒｅｖ遺伝子を持っているが（アリ）、他のものでは欠落している（ナシ）。いくつかはＨＩＶｔａｔ遺伝子を持っているが（アリ）、他のものでは欠落している（ナシ）。
0003701966.tif 000002
ＲＡ−２９からＲＡ−５６の構築物はＲＡ−１からＲＡ−３２と各々同じであるが、ただし各々の場合においてネオマイシン遺伝子を制御しているプロモーターは細菌プロモーターである。
実施例３６
プラスミドｐＮＬｐｕｒｏはＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するいくつかの異なったプラスミド製造の出発材料に使用されるであろう。前に説明したように、ｐＮＬｐｕｒｏはｇａｇ ｐｏｌ発現のために構築される。プラスミドｐＮＬｐｕｒｏΔｖｐｒ（前に記載されている）はワクチン接種により導入されるべき遺伝子の組から必須の制御蛋白質を除去するためにＨＩＶｇａｇ ｐｏｌベクターからｖｐｒ制御遺伝子が欠落するように設計されている。ｖｐｒに加えて、標準的分子生物学技術および広く入手可能な出発材料を用いて、当業者はプラスミドｐＮＬ４３ｐｕｒｏに他の変化を与えるであろう。
ＨＩＶ配列のヒト隣接配列５’および３’はいくつかの方法で除去できる。例えば、ＰＣＲを用いてＨＩＶ、ＳＶ４０−ｐｕｒｏおよびｐＵＣ１８配列が増幅され再構築できる。
ウイルスのパッケージングに重要であるＨＩＶのｐｓｉ領域がｐＮＬ４３ｐｕｒｏに基づくプラスミドから欠損できる。ｐｓｉ領域を欠損させるためには、ｐＮＬ４３ｐｕｒｏをＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断する。この消化はｐｓｉ領域ならずｐｓｉの下流にあるｇａｇ／ｐｏｌの上流にあり、その一部である５’ＬＴＲも除去する。欠損した非ｐｓｉ配列を再挿入するため、ＰＣＲ増幅が実施されこれらの配列を再生する。プライマーはｐｓｉを再生する事なくＨＩＶ配列５’および３’からｐｓｉの部分を再生するように設計されている。プライマーは５’ＬＴＲのプラスミド５’の部分にＳａｃＩ部位を再形成させる。ＳａｃＩ部位の上流の部位から５’末端のすぐ３’部位へ下がるプライマーは３’末端にＡａｔＩ部位を発生させている。
ｐｓｉ領域のちょうど５’から出発するプライマーもまたＡａｔＩ部位を発生させ、およびＳｐｅＩの３’から出発してもその部位を再生する。ＰＣＲ発生断片をＳａｃＩ、ＡａｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、ＳａｃＩ／ＳｐｅＩ消化ｐＮＬｐｕｒｏ−ｐｓｉと一緒に連結した。ＨＩＶ  ５’ＬＴＲプロモーターを欠落でき、Ｍｏｌｏｎｅｙウイルスプロモーター、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーターおよびＣＭＶプロモータで置換できる。
ＨＩＶ  ３’アデニル化部位を欠落でき、ＳＶ４０アデニル化部位で置換できる。
アンピシリン耐性を与える遺伝子は欠落させるか、さもなくば不活性化される。
以下のものはＨＩＶｐｓｉおよびｖｐｒ領域が欠落されており、およびＨＩＶ配列のヒト隣接領域５’および３’が欠落されている。
0003701966.tif 000003
構築物ＬＡ−１７からＬＡ−３２はＬＡ−１からＬＡ−１６と同一であるが、ただし各々には少なくとも一つのヒト隣接配列が残っている。
実施例３７
ｅｎｖ遺伝子を発現するための別の構築物において、ＨＩＶのその領域は商業的に入手可能なプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ導入されるであろう。ｐＣＥＰ４はエプスタイン  バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいるので特に有用である。ｐＣＥＰ４はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。ＨＩＶｅｎｖコード領域はＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。ＨＩＶｅｎｖコード領域はＨＩＶ／３Ｂから２．３ｋｂＰＣＲ断片として得られた（Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列Ｋ０３４５５）。得られたｐＣＥＰ４に基づいたプラスミド、ｐＲＡ−１００、は染色体外に維持され、ｇｐ１６０蛋白質を産生する。
実施例３８
ｅｎｖ遺伝子を発現するための別の構築物において、ＨＩＶのその領域は商業的に入手可能なプラスミドｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ導入されるであろう。ｐＣＥＰ４はエプスタイン  バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいるので特に有用である。ｐＲＥＰ４はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。ＨＩＶｅｎｖコード領域はＲＳＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。ＨＩＶｅｎｖコード領域はＨＩＶ／３Ｂから２．３ｋｂＰＣＲ断片として得られた（Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列Ｋ０３４５５）。得られたｐＣＥＰ４に基づいたプラスミド、ｐＲＡ−１０１、は染色体外に維持され、ｇｐ１６０蛋白質を産生する。
実施例３９
ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するための別の構築物において、ＨＩＶのその領域は商業的に入手可能なプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ導入されるであろう。ｐＣＥＰ４はエプスタイン  バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいるので特に有用である。ｐＣＥＰ４はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。ＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード領域はＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。ＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード領域はＨＩＶ  ＭＮから得られ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列ＫＩ７４４９）、ｖｉｆ遺伝子を含んでいる。ｖｐｒ遺伝子は含まれていない。得られたｐＣＥＰ４に基づいたプラスミド、ｐＬＡ−１００、は染色体外に維持され、ＧＡＧ５５、逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼ蛋白質を産生する。
実施例４０
ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現するための別の構築物において、ＨＩＶのその領域は商業的に入手可能なプラスミドｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へ導入されるであろう。ｐＲＥＰ４はエプスタイン  バールウイルス複製起点および組込みなしに高いコピー数のエピソーム複製を与える核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいるので特に有用である。ｐＲＥＰ４はチミジンキナーゼプロモーター制御下のヒグロマイシンマーカーおよびポリアデニル化部位も含んでいる。ＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード領域はＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位の制御下に置かれている。ＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード領域はＨＩＶ  ＭＮから得られ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列ＫＩ７４４９）、ｖｉｆ遺伝子を含んでいる。ｖｐｒ遺伝子は含まれていない。得られたｐＲＥＰ４に基づいたプラスミド、ｐＬＡ−１０１、は染色体外に維持され、ＧＡＧ５５、逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼ蛋白質を産生する。
実施例４１
構築に続いて、ここでｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖと称されるものがＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌの発現に有用である。
本プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子およびＤＮＡ複製のｐＢＲ３２２起点を含んでいる。転写制御に提供された配列は：サイトメガロウイルス、プロモーター；ラウス肉腫ウイルスエンハンサー；およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含んでいる。ｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖ内のＨＩＶ−１配列はｇａｇ転写解読枠のｐ１７、ｐ２４およびｐ１５をコードしている配列；プロテアーゼをコードしている配列；ちいさな欠損を持つ逆転写酵素をコードしている配列およびｐｏｌ転写解読枠のインテグラーゼの不活性アミノ末端をコードしている配列；およびｒｅｖをコードしている配列を含んでいる。ＨＩＶ配列の各々はＨＩＶ−１株ＨＸＢ２から誘導される。
ｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖにいくつかの安全措置が含まれている。これらにはＣＭＶプロモーターおよび非レトロウイルスポリ（Ａ）部位の使用が含まれる。さらに、φ配列の欠損はウイルスＲＮＡパッケージの能力を制限する。さらに、逆転写酵素の多数の突然変異は酵素的に不活性な生成物を産生させる。さらに、インテグラーゼの大きな欠落により不活性な生成物を与え、カナマイシン耐性マーカーは細菌形質転換体の安定化に使用される。
プラスミドｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖは以下のように構築される。
工程１．  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内へクローン化されているＨＩＶ−１ゲノムの一部のサブクローン（ＨＸＢ２）が使用された。ＨＩＶ−１のサブクローンは完全５’ＬＴＲおよびヌクレオチド５７９５（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号付け）までのＨＩＶ−１ゲノムの一部を含んでいる。ＨＩＶ−１配列はＨＸＢ２Ｄプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から得られた。
工程２．  ＨＸＢ２Ｄプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）転写解読枠からのｇａｇのＰＣＲ部分。ＰＣＲ断片をＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで切断し、ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩで制限分解した前記のＨＩＶ−１サブクローンに連結する。
工程３．  プライマー配列ＩＤ番号：１５および配列ＩＤ番号：１６でＰＣＲｇａｇ／ｐｏｌおよびＨＸＢ２Ｄプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）からのｐｏｌコード配列の一部を結合。ＰＣＲ生成物をＣｌａＩで切断し一緒に連結。連結した断片をＢｃｌＩおよびＳａｌＩで切断し、ＢｃｌＩおよびＳａｌＩで消化された工程２からのプラスミドと連結。
工程４．  工程３からのプラスミドをＢｓｐＭＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アニーリングリンカー配列ＩＤ番号：１７および配列ＩＤ番号：１８から形成されたアダプターと再連結。
工程５．  工程４からのプラスミドをＮｏｔＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＥＮＶ（下記）にために書かれた記述の４ａかまたは４ｂからのプラスミドと連結。ＮｏｔＩおよびＳａｌＩでまた切断。
工程６．  工程５からのプラスミドをＳａｌＩおよびＭｌｕＩで制限分解し、プライマー配列ＩＤ番号：１９および配列ＩＤ番号：２０でｒｅｖのＰＣＲにより得られたＰＣＲ生成物と連結。
工程７．  工程６からのプラスミドをＮｏｔＩで切断し、プライマー配列ＩＤ番号：２１および配列ＩＤ番号：２２でＨＸＢ２Ｄプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）のｒｅｖ応答性要素のＰＣＲで得られた生成物と連結。
工程６および７は随意である。
実施例４２
構築に続いて、ここでｐＥＮＶと称されるものがＨＩＶｅｎｖの発現に有用である。
本プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子およびＤＮＡ複製のｐＢＲ３２２起点を含んでいる。転写制御に提供された配列は：サイトメガロウイルス  プロモーター；ラウス肉腫ウイルスエンハンサー；およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含んでいる。ｐＥＮＶ内のＨＩＶ−１配列はｖｐｕをコードしている配列；ｒｅｖをコードしている配列；ｇｐ１６０をコードしている配列；ｎｅｆの５９％をコードしている配列；ｖｉｆをコードしている配列；および１３のアミノ酸カルボキシ末端が欠落したｖｐｒをコードしている配列を含んでいる。ｖｐｕ、ｒｅｖ、ｇｐ１６０およびｎｅｆ配列はＨＩＶ−１株ＭＮから誘導される。ｖｉｆおよびｖｐｒ配列はＨＩＶ−１株ＨＸＢ２から誘導される。
ｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖにいくつかの安全措置が含まれている。これらにはＣＭＶプロモーターおよび非レトロウイルスポリ（Ａ）部位の使用が含まれる。さらに、ｔａｔは欠落しており，ｎｅｆの５０％欠落は”不活性”ｎｅｆ生成物が産生される。さらに、ｖｉｆおよびｖｐｒは正常配列外に置かれており、ｖｐｒの部分的欠落は不活性ｖｐｒ生成物をさらに確かにしている。
プラスミドｐＥＮＶは以下のように構築された。
工程１．  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１８から出発。ＣｏｌＥ１複製起点を含む得られた断片は我々の肉腫ウイルスエンハンサーを含むｐＭＡＭｎｅｏＢｌｕｅからのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結されなければならない。得られたプラスミドまたはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのｐＭＡＭｎｅｏ−ＢｌｕｅはＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩで消化できる。常法を用いてｇｅｎｅｂｌｏｋプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＰＣＲにより得られたｋａｎ遺伝子を含む断片と連結。
工程２．  もし、ｐＭＡＭｎｅｏ−Ｂｌｕｅを出発プラスミドとして使用した場合、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ポリメラーゼＩのクレノー断片で末端を充填し、再連結。
工程３．  ｐＭＡＭｎｅｏ−ＢｌｕｅまたはｐＵＣ１８由来プラスミドを持つそれらをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プライマー配列ＩＤ番号：２３および配列ＩＤ番号：２４でＳＶ４０ポリＡ部位およびｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のＰＣＲにより得られた初期スプライシング領域を連結。
工程４ａ．  ＢａｍＨＩで消化し、プライマー配列ＩＤ番号：２５および配列ＩＤ番号：２６でｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のＰＣＲにより得られたＣＭＶプロモーターと連結。
工程４ｂ．  ＢａｍＨＩで消化し、プライマー配列ＩＤ番号：２７および配列ＩＤ番号：２８でＰＣＲにより得られたＭｏＭＬＶ  ＬＴＲと連結。
工程５．  ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩで消化し、プライマー配列ＩＤ番号：２９および配列ＩＤ番号：３０でｐＭＮ−ＳＴ１のＰＣＲにより得られたｇｐ１６０コード領域と連結。
工程６．  ＭｌｕＩで消化し、プライマー配列ＩＤ番号：３１および配列ＩＤ番号：３２でｖｉｆ（完全な形で）およびＨＸＢ２Ｄプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）のＣＰＲにより１３ａａカルボキシ末端が欠落したｖｐｒをコードする配列と連結。
実施例４３
以下のものからなる免疫処置システムが提供される：
等張で、医薬として受容可能な溶液に溶解された約１００μｇのｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖを含む医薬組成物；および
等張で、医薬として受容可能な溶液に溶解された約１００μｇのｐＥＮＶを含む医薬組成物。
さらに、免疫処置システムは好適には等張医薬担体中に約１ｍｌの０．５％ブピバカイン−ＨＣｌおよび０．１％のメチルパラベンを含む医薬組成物を含んでいる。
そのような好適な免疫処置システムにおいて、投与の最初の組が実施され、それではブピバカインおよび二つの医薬組成物の一つが個体に投与される（好適には腕または尻の筋肉内に）。ブピバカインおよび二つの医薬組成物の他のものは個体の異なった部位に投与される（好適には先の医薬組成物の投与部位から離れた部位に、好適には腕または尻の筋肉内に）。続いての組の投与は時間をおいて実施されるであろう（好適には４８時間から２週間またはそれより後に）。
免疫治療で個体をＨＩＶ感染から防護するために、またはＨＩＶ感染個体の治療のため、個体のワクチン接種に本免疫処置システムが使用される。
実施例４４
いくつかの実施態様において、本発明は単一接種物投与によりＨＩＶに対して個体を免疫処置する方法に関している。この接種物は少なくとも一つの、好適には二つの、より好適には二つより多くのまたは多数のＨＩＶウイルスの遺伝子またはすべての構造遺伝子を含む遺伝子構築物を含んでいる。しかしながら、接種物はすべてのＨＩＶ遺伝子の完全補体を含んではいない。もし一つの細胞にウイルス遺伝子の完全な補体が提供されたら、細胞内で完全な感染性ウイルスを組み立てる事が可能である。したがって、本発明に従った遺伝子構築物はそのような遺伝子の全補体を提供しない。安全措置として、一つまたはそれ以上の必須遺伝子を欠損でき、または感染性ウイルス粒子が形成されないことをさらに確かにするため意図的に変換されている。
本発明のいくつかの実施態様において、一つ、二つまたはすべてのＨＩＶ構造遺伝子の少なくとも一部が提供される。ＨＩＶ構造遺伝子はｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖからなっている。これらの三つの遺伝子の少なくとも一つの一部が遺伝子構築物上に提供される。従って、いくつかの実施態様において、ｇａｇおよびｐｏｌの各々の少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され；いくつかの実施態様において、ｅｎｖの少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され；いくつかの実施態様において、ｇａｇの少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され；いくつかの実施態様において、ｐｏｌおよびｅｎｖの各々の少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され；いくつかの実施態様において、ｇａｇおよびｅｎｖの各々の少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供され；いくつかの実施態様において、ｐｏｌの少なくとも一部が遺伝子構築物上に提供される。随意に、全遺伝子が提供される。随意に、これらの遺伝子構築物において、ＨＩＶ制御遺伝子もまた存在するであろう。ＨＩＶ制御遺伝子はｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｒｅｖである。
実施例４５
ここで使用される術語”発現ユニット”とは作動可能なようにポリアデニル化シグナルに連結され、作動可能なようにコード配列に連結されたプロモーターを含む核酸配列を示す事を意味している。コード配列は一つまたはそれ以上の蛋白質またはその断片をコードしているであろう。好適な実施態様において、発現ユニットはプラスミド内に存在する。ここで使用される術語”ＨＩＶ発現ユニット”とは作動可能なようにポリアデニル化シグナルに連結され、作動可能なようにコード配列に連結されたプロモーターを含む核酸配列を示す事を意味しており、ここでコード配列はＨＩＶ蛋白質上に観察されるエピトープと同一であるかまたは実質的に同じであるエピトープを含む配列をコードしている。”実質的に同じであるエピトープ”とはＨＩＶ蛋白質のエピトープと同一でない構造を持ってはいるが、それでもなおＨＩＶ蛋白質と交差反応を起こす細胞性または体液性免疫応答を引き起こすものである。好適な実施態様において、ＨＩＶ発現ユニットは一つまたはそれ以上のＨＩＶ蛋白質またはその断片をコードしているコード配列を含んでいる。好適な実施態様において、ＨＩＶ発現ユニットはプラスミド内に存在する。
本発明のいくつかの実施態様において、一つまたはそれ以上のＨＩＶ蛋白質またはその断片をコードしているＤＮＡ配列を含む単一ＨＩＶ発現ユニットを持つ単一遺伝子構築物が提供される。ここで使用される術語”単一ＨＩＶ発現ユニット構築物”とは、単一ＨＩＶ発現ユニットを含む単一遺伝子構築物を示す事を意味している。好適な実施態様において、単一ＨＩＶ発現ユニットはプラスミド内に存在する。
本発明のいくつかの実施態様において、単一遺伝子構築物は一つより多くのＨＩＶ発現ユニットを持つものとして提供され、ここで各々が一つまたはそれ以上のＨＩＶ蛋白質またはその断片をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる。ここで使用される術語”多ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物”とは、一つまたはそれ以上のＨＩＶ発現ユニットを含む単一プラスミドを示す事を意味している。好適な実施態様において、多ＨＩＶ発現ユニット構築物はプラスミドの形である。
本発明のいくつかの実施態様において、二遺伝子構築物は二つのＨＩＶ発現ユニットを持つものとして提供され、ここで各々が一つまたはそれ以上のＨＩＶ蛋白質またはその断片をコードしているＤＮＡ配列を含んでいる。ここで使用される術語”二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物”とは、二つのＨＩＶ発現ユニットを含む単一プラスミドを示す事を意味している；すなわち、二つのＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物を含む多ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物。二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物において、一つのＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物が他のＨＩＶ発現ユニットの反対の方向に働くものが好適である。好適な実施態様において、二ＨＩＶ発現ユニット構築物はプラスミドの形である。
本発明のいくつかの実施態様において、ＨＩＶ遺伝子ワクチンは単一遺伝子構築物を含むものとして提供される。単一遺伝子構築物は単一ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物、二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物または二つより多くのＨＩＶ発現ユニットを含む多ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物であろう。
本発明のいくつかの実施態様において、一つより多くの接種物中、一つより多くの遺伝子構築物を含んだＨＩＶ遺伝子ワクチンが提供される。ここで使用される術語”多接種物”とは、一つより多くの遺伝子構築物を含む遺伝子ワクチンを示す事を意味しており、その各々は別々に投与される。
本発明のいくつかの実施態様において、二つの遺伝子構築物を含んだＨＩＶ遺伝子ワクチンが提供される。各々の遺伝子構築物は独立して、単一ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物、二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物または二つより多くのＨＩＶ発現ユニットを含む多ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物であろう。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子構築物は単一ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物である。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子構築物は二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物である。いくつかの実施態様において、両方の遺伝子構築物は多ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物である。いくつかの実施態様において、一つの遺伝子構築物は単一ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物であり、他方は二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物である。当業者は遺伝子ワクチンに使用された遺伝子構築物の数および各々の遺伝子構築物に存在するであろうＨＩＶ発現ユニットの数に依存して多くの変法を認識および評価するであろう。
本発明の遺伝子構築物はある種のＨＩＶ配列（特にそれが導入された細胞の染色体物質内へのＨＩＶゲノムの取り込みに役割を果たすような）を含まないことが望まれる。本発明の遺伝子構築物はＨＩＶからのＬＴＲを含まないことが望まれる。同様に、本発明の遺伝子構築物はＨＩＶからのｐｓｉ部位を含まないことが望まれる。さらに、逆転写酵素遺伝子が欠失されており、インテグラーゼ遺伝子が欠失されていることが望まれる。遺伝子を本質的に欠失させるため、コドンのいくつかのみの欠失またはコドンのいくつかを置換することが欠失に含まれる。例えば、ヌクレオチド配列を不完全および非機能的なものにするため開始コドンを欠失させるか、変化させるかまたは読み枠外に移行させる。
また本発明の遺伝子構築物はＨＩＶからの転写可能ｔａｔ遺伝子を含まないことも望まれる。ｔａｔ遺伝子（ｒｅｖ遺伝子と重複している）はｒｅｖをコードしているコドンを他のコドン（ｒｅｖのために同一のアミノ酸をコードしているが、ｔａｔがコードされている読み枠内に必要とされるｔａｔアミノ酸をコードしていない）に置換することにより完全に欠失される。もしくは、ｔａｔの開始コドンを変化させ（すなわち、本質的な欠失）および／または不完全および非機能的ｔａｔをコードするヌクレオチド配列を生じるような十分な変化（すなわち、本質的な欠失）をさせるため、いくつかのコドンが転換される。
遺伝子構築物は、ＨＩＶｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖまたはｒｅｖ蛋白質からのエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含むことが望まれる。遺伝子構築物は、ＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖまたはｒｅｖ蛋白質またはその断片の少なくとも一つをコードするコード配列を含むことがより望まれる。遺伝子構築物はＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖまたはｒｅｖ蛋白質からのエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである一つより多いエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含むことが望まれる。遺伝子構築物はＨＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖまたはｒｅｖ蛋白質またはその断片を一つより多くコードするコード配列を含むことがより望まれる。
いくつかの実施態様において、遺伝子構築物はＨＩＶ  ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕまたはｎｅｆ蛋白質からのエピトープと同一であるかまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含んでいる。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物はＨＩＶ  ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕまたはｎｅｆ蛋白質またはその断片の少なくとも一つをコードするコード配列を含んでいる。
単一ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物は、ＨＩＶ蛋白質またはその断片の少なくとも一つを共有する一つまたはそれ以上のペプチドのためのコード領域を、単一のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルの制御下に単一の発現ユニットに含んでいるであろう。遺伝子構築物が一つより多いＨＩＶ蛋白質またはその断片をコードしていることが望ましい。プロモーターはヒト細胞中で機能的であるプロモーターである。プロモーターはＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーター（好適にはＣＭＶ前初期プロモーター）であるのが望ましい。ポリアデニル化シグナルはヒト細胞中で機能的であるポリアデニル化シグナルであろう。ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（好適にはＳＶ４０副ポリアデニル化シグナル）が望ましい。一つより多くのコード領域が単一発現ユニットに提供された場合、それらはお互いにすぐ隣接してしているか、または非コード領域で分離されているであろう。適切に発現されるために、コード領域は開始コドンおよび停止コドンを持たなければならない。
二ＨＩＶ発現ユニット遺伝子構築物は、二つの各々の発現ユニット上、ＨＩＶ蛋白質またはその断片と少なくとも一つのエピトープを共有する一つまたはそれ以上のペプチドのためのコード領域を含んでいる。各々の発現ユニットは単一のプロモーターおよびポリアデニル化シグナルの制御下にある。いくつかの実施態様において、遺伝子構築物は一つより多いＨＩＶ蛋白質またはその断片をコードしていることが好適である。いくつかの実施態様において、ｇａｇおよびｐｏｌをコードしているヌクレオチド配列が一つの発現ユニットに存在し、ｅｎｖおよびｒｅｖをコードしているヌクレオチド配列が別の発現ユニットに存在することが好適である。プロモーターはＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーター（好適にはＣＭＶ前初期プロモーター）であるのが望ましい。ポリアデニル化シグナルはヒト細胞中で機能的であるポリアデニル化シグナルであろう。ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（好適にはＳＶ４０副ポリアデニル化シグナル）が望ましい。一つより多くのコード領域が単一発現ユニットに提供された場合、それらはお互いにすぐ隣接してしているか、または非コード領域で分離されているであろう。適切に発現されるために、コード領域は開始コドンおよび停止コドンを持たなければならない。
本発明のいくつかの実施態様に従うと、ｅｎｖのＭＨＣクラスＩＩ交差反応性エピトープが欠失されておりＨＩＶＩＩからの類似の領域に置き換えられている。
遺伝子構築物がｇａｇおよび／またはｐｏｌを含む場合、一般的にｒｅｖもまた存在することが重要である。ｒｅｖに加えて、これらの遺伝子の発現を増加させるためにｒｅｖ応答要素がｇａｇおよびｐｏｌと共に提供されるであろう。
遺伝子構築物が製造される場合、プラスミド１に使用されるｅｎｖ遺伝子はＭＮ、またはＭＮに似ている臨床単離物を含むＭＮ様単離物から誘導されるのが好適である（好適には融合細胞を誘導しない臨床単離物、マクロファージ熱帯型初期段階臨床単離物であるもの）。
単一発現ユニットから変質スプライシングにより多数の蛋白質が産生されるであろう。スプライシングシグナルが提供され、ｔｐが変質スプライシングを可能にし、異なった蛋白質をコードしている異なったメッセージが産生される。
実施例４６
図８は四つのバックボーンＡ、Ｂ、ＣおよびＤを示している。図９は四つの挿入物１、２、３および４を示している。挿入物１はｇａｇおよびｐｏｌの発現をささえ；ｒｅｖ応答要素はＨＩＶスプライスアクセプターを保存する様式でクローン化された。挿入物２はｇａｇおよびｐｏｌの発現をささえるのは挿入物１と同じであるが、ＨＩＶスプライスアクセプターを保存することなくｒｅｖ応答要素がクローン化された。挿入物３はｇａｇおよびｐｏｌの発現をささえ、インテグラーゼ遺伝子の欠失を含んでいるがシス作用性ｒｅｖ応答要素が存在しない。挿入物４はｒｅｖ、ｖｐｕおよびｅｎｖの発現をささえる。ｅｎｖは交差反応性を除去するように改造されたＭＨＣクラスいい交差反応性エピトープを持っているであろうし、融合細胞形成の可能性を除去するためＶ３ループが改造されているであろう。
いくつかの実施態様において、バックボーンＡは挿入物１と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＡｌｏｒｉ＋は挿入物１およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＡである。プラスミドｐＡｌｏｒｉ−は挿入物１を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＡである。さらに、ｐＡ１ｏｒｉ＋またはｐＡ１ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＡ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＡ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＡ１ｏｒｉ＋、ｐＡ１ｏｒｉ−、ｐＡ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＡ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＡ１ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＡ１ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＡ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＡ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＡは挿入物２と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＡ２ｏｒｉ＋は挿入物２およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＡである。プラスミドｐＡ２ｏｒｉ−は挿入物２を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＡである。さらに、ｐＡ２ｏｒｉ＋またはｐＡ２ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＡ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＡ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＡ２ｏｒｉ＋、ｐＡ２ｏｒｉ−、ｐＡ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＡ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＡ２ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＡ２ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＡ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＡ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＢは挿入物１と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＢｌｏｒｉ＋は挿入物１およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＢである。プラスミドｐＢｌｏｒｉ−は挿入物１を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＢである。さらに、ｐＢ１ｏｒｉ＋またはｐＢ１ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＢ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＢ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＢ１ｏｒｉ＋、ｐＢ１ｏｒｉ−、ｐＢ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＢ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＢ１ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＢ１ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＢ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＢ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＢは挿入物２と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＢ２ｏｒｉ＋は挿入物２およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＢである。プラスミドｐＢ２ｏｒｉ−は挿入物２を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＢである。さらに、ｐＢ２ｏｒｉ＋またはｐＢ２ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＢ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＢ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＢ２ｏｒｉ＋、ｐＢ２ｏｒｉ−、ｐＢ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＢ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＢ２ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＢ２ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＢ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＢ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、ｒｅｖを除いたバックボーンＡが挿入物３と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋は挿入物３およびＳＶ４０複製起点を含むｒｅｖを除いたバックボーンＡである。プラスミドｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ−は挿入物３を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないｒｅｖを除いたバックボーンＡである。さらに、ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋またはｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋、ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ−、ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＡ／ｒ−３１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＡ／ｒ−３ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＣは挿入物１と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＣｌｏｒｉ＋は挿入物１およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＣである。プラスミドｐＣｌｏｒｉ−は挿入物１を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＣである。さらに、ｐＣ１ｏｒｉ＋またはｐＣ１ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＣ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＣ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＣ１ｏｒｉ＋、ｐＣ１ｏｒｉ−、ｐＣ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＣ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＣ１ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＣ１ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＣ１ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＣ１ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＣは挿入物２と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＣ２ｏｒｉ＋は挿入物２およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＣである。プラスミドｐＣ２ｏｒｉ−は挿入物２を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＣである。さらに、ｐＣ２ｏｒｉ＋またはｐＣ２ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＣ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＣ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＣ２ｏｒｉ＋、ｐＣ２ｏｒｉ−、ｐＣ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＣ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＣ２ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＣ２ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＣ２ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＣ２ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＣは挿入物３と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＣ３ｏｒｉ＋は挿入物３およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＣである。プラスミドｐＣ３ｏｒｉ−は挿入物３を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＣである。さらに、ｐＣ３ｏｒｉ＋またはｐＣ３ｏｒｉ−のどちらもインテグラーゼを含んでもよく、各々ｐＣ３ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＣ３ｏｒｉ−ｉｎｔ＋が得られる。プラスミドｐＣ３ｏｒｉ＋、ｐＣ３ｏｒｉ−、ｐＣ３ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋およびｐＣ３ｏｒｉ−ｉｎｔ＋は逆転写酵素（ＲＴ）遺伝子を機能的に欠失させることによりさらに修飾してもよく各々ｐＣ３ｏｒｉ＋ＲＴ−、ｐＣ３ｏｒｉ−ＲＴ−、ｐＣ３ｏｒｉ＋ｉｎｔ＋ＲＴ−およびｐＣ３ｏｒｉ−ｉｎｔ＋ＲＴ−を得る。
いくつかの実施態様において、バックボーンＤは挿入物４と使用される。そのような構築物は随意に、ＳＶ４０複製起点を含んでいる。プラスミドｐＤ４ｏｒｉ＋は挿入物４およびＳＶ４０複製起点を含むバックボーンＤである。プラスミドｐＤ４ｏｒｉ−は挿入物４を含むがＳＶ４０複製起点は含まれていないバックボーンＤである。
実施例４７
いくつかの実施態様において、ＨＩＶタンパク質のエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列を含有する遺伝子構築物より構築される単一発現ユニット／単一接種体遺伝子ワクチンが提供される。コード配列はＣＭＶ即時初期プロモーターとＳＶ４０マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。
いくつかの実施態様において、少なくとも一つのＨＩＶタンパク質またはその断片をコードするコード配列を含有する遺伝子構築物より成る単一発現ユニット／単一接種遺伝子ワクチンが提供される。コード配列はＣＭＶ即時早期プロモーターとＳＶ４０マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。ＨＩＶタンパク質はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖとｒｅｖより構築されたグループから選択される。いくつかの実施態様においてｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも二つのＨＩＶタンパク質またはそれらの断片をコードする配列を含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンを提供するのが望ましい。いくつかの実施態様においてｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも三つのＨＩＶタンパク質またはそれらの断片をコードする配列を含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンを提供するのが望ましい。いくつかの実施態様においてｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片をコードするコード配列を含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンを提供するのが望ましい。
いくつかの実施態様において、それぞれがＨＩＶタンパク質のエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを持つペプチドをコードするコード配列より成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物を構成する二つの発現ユニット／単一接種体遺伝子ワクチンが提供される。コード配列はＣＭＶ即時初期プロモーターとＳＶ４０マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。二つの発現ユニットはそれぞれ他と反対方向にコードされる。
いくつかの実施態様において、それぞれが少なくとも一つのＨＩＶタンパク質またはその断片をコードするコード配列より成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物より成る二つの発現ユニット／単一の接種遺伝子ワクチンが提供される。それぞれの発現ユニットはＣＭＶ即時早期プロモーターとＳＶ４０マイナーポリアデニル化信号の調節制御の下にある。ＨＩＶタンパク質はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖとｒｅｖより構築されたグループから選択される。いくつかの実施態様においてｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも二つのＨＩＶタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る、そして他はｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも一つのＨＩＶタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンが提供せれることが望ましい。いくつかの実施態様においてｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも三つのＨＩＶタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る、そして他はｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片より構築されたグループから選択される少なくとも一つのＨＩＶタンパク質またはそれらの断片をコードするコードより成る二つの発現ユニットを含有する遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンが提供せれることが望ましい。いくつかの実施態様においてｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖとｒｅｖまたはそれらの断片をコードしたコード配列を含有し、二つの発現ユニットより成る遺伝子構築物より成る遺伝子ワクチンが望ましい。
実施例４８
遺伝子構築物、プラスミドｐＣＭＮ１６０Δ１６は抗−ＨＩＶ医薬キットまたは医薬組成物として使用するために作製される。ｐＣＭＮ１６０
１６は下記のように構築される：
工程１：プライマー配列ＩＤ番号：３５と配列ＩＤ番号：３４はＨＩＶ／ＭＮゲノムＤＮＡからのＰＣＲ断片を用いる。
工程２：プライマー配列ＩＤ番号：３３と配列ＩＤ番号：３６はＨＩＶ／ＭＮゲノムＤＮＡからのＰＣＲ断片を用いる。
工程３：プライマー配列ＩＤ番号：３５と配列ＩＤ番号：３６は工程１と工程２からの２μｌの反応物を組み合わせる。
工程４：工程３からの反応産物はＮｏｔ１とＭｌｕ１で切断し、Ｎｏｔ１とＭｌｕ１で切断した実施例４６に記述したバックボーンＡに挿入する。
プラスミドｐＣＭＮ１６０Δ１６はこのようにバックボーンＡに挿入された、ｒｅｖ領域とＨＩＶ−２に変化したＨＬＡ−ＤＢ領域を含有するｎｅｆの半分を持つＭＮ株ＥＮＶタンパク質をコードするコード領域を含有して生成される。
実施例４９
プラスミドｐＧＡＧＰＯＬ．ｒｅｖ２は下記のように作製される。最初にバックボーンが作製される。次にＨＩＶ  ｇａｇとｐｏｌを持つ挿入体を生成しバックボーンに挿入する。
バックボーンは下記のように調製される。
工程１。ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）をＢｇｌ１で切断する。ポリメラーゼＩのクレノー断片により充填する。ＨｉｎｄＩＩＩにより切断する。１７６３ｂｐ断片をゲルで精製する。
工程２。ＫａｎR遺伝子をオリゴ配列ＩＤ番号：３７と配列ＩＤ番号：３８とともに、プラスミドｐＪ４Ωｋａｎ+（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．から得られたカナマイシン耐性遺伝子が、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄ  ＵＫより贈与されて得られたｐＪ４Ωにクローニングされたもの、すなわちｐＪ４ΩはもともとＭｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎとＬａｎｄによって構築、報告された。Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄＨ．Ｌａｎｄ，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（４）：１０６８、ここに引例として包含されている）から増幅する。ＰＣＲ産物を平滑末端化する。ＨｉｎｄＩＩＩにより切断する。ＰＣＲ断片をゲル精製する。
工程３。工程１に記述されたｐＭＡＭｎｅｏから作製したベクターバックボーンと工程２に記述されたＫａｎR遺伝子をコードしているＰＣＲ産物とを連結する。ＫａｎR遺伝子と細菌の複製開始点とを含んだプラスミドを単離する。
工程４。得られたプラスミドをＭｌｕＩにて消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で充填する。ＳａｃＩＩのリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と連結する。
工程５。工程４で得たプラスミドをＡｓｅＩとＳｓｐＩとで消化する。
工程６。工程３に記述されたプラスミドからのＫａｎR遺伝子の部分とプライマー配列ＩＤ番号：３９および配列ＩＤ番号：４０とを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物をＳｓｐＩとＡｓｅＩとで切断する。
工程７。工程５で得られた最大の断片と、工程６で得られたＰＣＲ産物とを連結する。
工程８。工程７で得られた連結産物／プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断する。ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で平滑末端かする。
工程９。ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＳａｌＩで切断して、ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、そしてＳＶ４０ポリＡ部位を含むＤＮＡ断片を取り出す。この断片を精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で平滑末端化する。
工程１０。工程８で得られたプラスミドと工程９で得られた断片を連結する。細菌の複製開始点、ＫａｎR遺伝子、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、そしてＳＶ４０ポリＡ部位を含んだプラスミドを単離する。
工程１１。工程１０で得られたプラスミドをＢａｍＨＩとＮｈｅＩとで切断する。
工程１２。オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：４１と配列ＩＤ番号：４２とをアニーリングさせる。
工程１３。工程１０で得られたプラスミドと工程１２で得られたアニーリングされたオリゴヌクレオチドとを連結する。工程１２で含まれたアダプターを包含するプラスミドを単離する。
工程１４。工程１３で得られたプラスミドをＳａｌＩとＭｌｕＩとで消化する。
工程１５．ｒｅｖ  転写解読枠を、ＢＢＧ３５（ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；ｐＵＣ１９におけるＨＩＶ株であるＨＸ３Ｂからのｒｅｖのコード領域を含む）を鋳型として用いて、プライマー配列ＩＤ番号：４３と配列ＩＤ番号：４４とともにＰＣＲ増幅する。
工程１６：工程１４で得られたプラスミドと工程１５で産生されたＰＣＲ産物とを連結する。ｒｅｖコード領域を含んだプラスミドを単離する。ｇａｇ／ｐｏｌ挿入物を準備する。
工程１。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中にクローニングされたＨＩＶ−Ｉ（ＨＸＢ２）ゲノムの部分のサブクローン。完全な５’ＬＴＲとＨＩＶ−１ゲノムの残りの部分からヌクレオチド５７９５（ジーンバンク番号）までを含むＨＩＶ−１のサブクローンを、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｂａＩとＳａｌＩ制限酵素切断部位にクローニングする。ＨＩＶ−１の配列はＨＸＢ２Ｄプラスミド（ＡＩＤＳ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から得られた。
工程２。工程１において記述された、プラスミドの転写解読枠からｇａｇコード領域の部分（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＨＩＶ−１  ＨＸＢ２の部分のサブクローン）ををプライマー配列ＩＤ番号：４５とＩＤ番号：４６を用いてＰＣＲ増幅する。
工程３。工程１で記述されたプラスミド（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたＨＩＶ−１  ＨＸＢ２の部分のバックボーン）をＥｃｏＲＩで消化する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーン，５’ＨＩＶ−１  ＬＴＲ、ｇａｇコード領域，そしてｐｏｌコード領域の部分を含んだプラスミドを消化し、再結合する。
工程４。工程３で得られたプラスミドをＮｏｔＩとＳｐｅＩで切断し、Ｎｏｔ１とＳｐｅＩで消化された工程２に記述されたＰＣＲ断片に連結する。もともとは５’ＨＩＶ−１  ＬＴＲを含んでいたＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ断片の代わりに、ＰＣＲ断片を含有したプラスミドを単離する。
工程５。工程４で得られたプラスミドをＥｃｏＲ１とＳａｌＩとで消化する。工程６。オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：４７と配列ＩＤ番号：４８とをアニールする。
工程７。工程５で得られたプラスミドを工程６で得られたアダプターを用いて連結する。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ制限酵素部位へクローニングされたアダプターを含んだプラスミドを単離する。
工程８。工程７で得られたプラスミドをＮｄｅＩとＥｃｏＲＩとで消化する。
工程９。プライマー配列ＩＤ番号：４９と配列ＩＤ番号：５０を用いて、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ２からのＲＲＥ配列を含んだプラスミドから、配列決定Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）をＰＣＲ増幅する。
工程１０。工程８で得られたプラスミドと工程９で得られたＰＣＲ産物を連結させる。ＲＲＥ配列を含む挿入物を含有したプラスミドを単離する。
工程１１。工程１０で得られたプラスミドをＮｏｔＩとＳａｌＩとで消化し、ｇａｇコード領域、修飾ｐｏｌコード領域、そしてＲＲＥ配列を含んだ断片を単離する。
工程１２。ＮｏｔＩとＳａｌＩで、上記のバックボーン調製のための方法の工程１６で得られたプラスミドを消化する。
工程１３。工程１２で得られたプラスミドと工程１１で得られた挿入物とを連結する。ｇａｇコード領域、修飾ｐｏｌコード領域、ＲＲＥ配列を持つ挿入物を含んだプラスミドを単離する。
工程１４。工程１３で得られたプラスミドをＸｂａＩとＮｈｅＩとで消化し、平滑末端化し、再連結させる。工程１３で得られたプラスミドにおいて、ＸｂａＩとＮｈｅＩとの間に存在するＫｐｎＩ切断部位を欠いたプラスミドを単離する。
工程１５。工程１４で得られたプラスミドをＫｐｎＩで消化し、最大の断片を単離する。
工程１６。オリゴヌクレオチド配列ＩＤ番号：５１と配列ＩＤ番号：５２とをアニーリングさせる。
工程１７。工程１５で得られた精製されたプラスミド断片と工程１６で得られたアダプターとを連結する。工程１５で得られたプラスミドのＫｐｎＩ切断部位に挿入されたアダプターを含んでいるプラスミドを単離する。
実施例５０  調節タンパク質に対する遺伝子での遺伝子免疫処置
ＨＩＶを攻撃する上での困難さはウイルスの異常な可変性であり、そして新しい形に素早く変異する能力によるものである。概して人間の集団において発見されたＨＩＶ単離体間でかなりのタンパク質配列の変異があるだけではなく、ウイルスはあまりに素早く変異するため全てのＨＩＶ感染者が実際に多くの関連したＨＩＶの小変異体を保持する。そのようなＨＩＶ単離体は複製効率や趨勢、無毒化に対する感受性、薬物耐性に差異を示す。薬物耐性変異体が出現すると薬物療法の有効性が色あせてしまう。ＡＺＴでは薬物耐性は一年の治療期間内に特徴的に増大する。この逃避変異体が絶えず生成されることはウイルスが制御されているように見える長い期間の後宿主の防御をついには乗り越えるＨＩＶの能力の原因であろう。
この変異の動きはもっとも重要な中性領域であるＶ３ループを含むｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の種々の領域、及びＨＩＶのコアタンパク質において報告されている。ＨＩＶ調節タンパク質は構造タンパク質よりもより保存性が高く長く変異の動きが鈍い。そのため調節タンパク質は抗ウイルス攻撃の魅力的な標的である。
ＨＩＶは調節タンパク質と構造タンパク質の発現の顕著な時間的調節を受けていることが示されている。ウイルスの複製の早期においてはＴａｔおよびＲｅｖ，ＮｅｆをコードするｍＲＮＡが優勢を占めているが、後期においてはＧａｇやＰｏｌ，Ｅｎｖ前駆体、多くのアクセサリータンパク質を含む構造タンパク質をコードするｍＲＮＡの大きな発現が起こる。この早期から後期へのシフトはＲｅｖタンパク質があるレベルに達すると起こる。ウイルスの複製サイクルの早期でのＴａｔおよびＲｅｖ、Ｎｅｆの優勢はこれらのタンパク質を抗ウイルス攻撃の好ましい標的とする。このことは特にｔａｔとｒｅｖで顕著であり、それらはＨＩＶ遺伝子発現の転写と翻訳後調節において絶対的に必須な役割を演じ、ウイルスの複製サイクルの早期、ウイルスの構造タンパク質の転写と感染ウイルス粒子生成の前に優勢を占める。
ＨＩＶ複製に必須の役割を明確に演じるｔａｔやｒｅｖと対照的に、ｎｅｆやｖｐｒ，ｖｉｆ，ｖｐｕのような調節タンパク質はときどき”アクセサリー”タンパク質として言及される。これらの機能はあまりよくは理解されておらず、特別の機能の消失により減少するウイルス複製の程度は著しく変動し、感染した宿主細胞に依存する。にもかかわらず、他の霊長類の免疫不全症ウイルスと同様に、種々の異なったＨＩＶ単離体の間でもそのような機能が強く保存されていることは自然の感染過程においてこれらの”アクセサリー”機能の重要性を示唆している。（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ，Ｅ．Ｆ．（１９９２）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ ２：３−２７、Ｗ．Ｃ．Ｋｏｆｆ，Ｆ．Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ、ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）．実際，ｖｐｒまたはｎｅｆ、ｖｉｆを欠除した霊長類の組み換えウイルスがインビボで非感染性であることはウイルスの生活環におけるこれらのアクセサリー遺伝子の重要性を開示する。
ＨＩＶ遺伝子全体よりも、いくつかの調節タンパク質および／または酵素タンパク質を選択的に存在させることによりＨＩＶに対するより高いレベルで、より防御的な免疫応答が達成される証拠がある。したがって、ｔａｔやｒｅｖ，ｖｐｒ，ｎｅｆ，ｖｐｕ，ｖｉｆを含む一つまたはそれ以上の調節、非構造ＨＩＶタンパク質のコード配列を用いて遺伝子免疫処置を含む焦点を捉えた免疫処置戦略が望ましい。ｖｐｒのみがウイルス粒子に付着していることが見いだされており、他のｔａｔやｒｅｖ，ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕを含む調節タンパク質はウイルス粒子付着ではない。
いくつかの調節遺伝子を用いたＨＩＶに対する遺伝子免疫処置の実施例において、ｔａｔやｒｅｖ，ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ遺伝子のうち一つまたはそれ以上は実施例４６に記述したバックボーンＡに挿入される。ｔａｔおよび／またはｒｅｖを用いるのが望ましい。いくつかの実施例においては、ｔａｔまたはｒｅｖが実施例４６に記述したバックボーンＡに挿入される。いくつかの実施例においては、望ましさは劣るが標的としてｎｅｆ，ｖｐｒ、ｖｉｆ，ｖｐｕを用いる。ｔａｔとｒｅｖ；ｔａｔとｒｅｖ、ｎｅｆ；ｔａｔとｒｅｖ，ｎｅｆ、ｖｐｒ；ｔａｔとｒｅｖ，ｎｅｆ、ｖｐｒ，ｖｉｆ；ｔａｔとｒｅｖ、ｎｅｆ，ｖｐｒ，ｖｉｆ，ｖｐｕ；および、ｔｅｖのような他の調節遺伝子も含め、それらの組み合わせを含む一つ以上の調節遺伝子を用いることが望ましい。
Ｔａｔタンパク質はＬＴＲ方向の遺伝子発現のトランスアクチベーターである。それはＨＩＶ複製にとって絶対的に必須である。Ｔａｔはウイルスの複製の初期に生成され、機能を持つＴａｔはＧａｇやＰｏｌ，Ｅｎｖ，Ｖｐｒの発現に必要である。Ｔａｔの主な形体は二つのエクソンｍＲＮＡ由来の８６アミノ酸タンパク質である。アミノ末端５８アミノ酸はトランスアクチベーションに十分であるが、活性は低下する。Ｔａｔはｔａｒと言及されるｃｉｓに働く配列に働きＬＴＲ起動の遺伝子発現の劇的な増大を生じる．Ｔａｔは一部ではＲＮＡ合成を通して働き、また一部ではＲＮＡ転写物あたりに合成されるタンパク質の量の増大によって働く。最近まで、ＴａｔはＨＩＶ−１  ＬＴＲ上でのみ働くと考えられていた。しかし、ＪＣウイルス後期プロモーターからのＴａｔ活性化発現も報告されてきた。Ｔａｔは外来因子として細胞増殖を促進し、ＨＩｖ感染患者のＫａｐｏｓｉ肉腫の増殖を促進する上で重要な役割を演じているかもしれない。ＨＩＶ感染および非感染者にそのような潜在的に有害な作用のため遺伝子免疫処置に用いるｔａｔ構築物は非機能的なＴａｔを発現するよう修飾することが望ましい。ＴａｔまたはＲｅｖを不活性化する変異はトランスドミナントの変異として働きそれによってＨＩＶ感染者で生成されるすべての機能的なＴａｔを潜在的に不活性化する。
Ｒｅｖはういるすの複製に必須な第二のＨＩＶの調節タンパク質である。それは種々の多数スプライスされたｍＲＮＡに見られる二つのコードエクソンより発現される１９ｋＤ（１１６アミノ酸）である。転写物を含むＲＲＥ（Ｒｅｖ応答要素）に結合する塩基性領域と、結合体のような転写物の核移行を誘発する活性ドメインの二つの異なるドメインが同定されている。自然のウイルス感染ではＲｅｖはＶｐｒとともにＨＩＶ構造タンパク質ＧａｇおよびＰｏｌ，Ｅｎｖの発現に必要である。
Ｖｐｒは、多くのウイルス株で細胞培養での度重なる継代によって著しく転写解読枠が切り詰められるが、多くのＨＩＶ−１株で１５ｋＤ（９６アミノ酸）のタンパク質である。ｖｐｒの転写解読枠はＨＩＶ−２や多くのＳＩＶ単離体においても存在する。ＶｐｒはＨＩＶウイルス粒子に付着して見いだされた初めてのレトロウイルス調節タンパク質である。そのＨＩＶウイルス粒子での存在はウイルスの複製サイクルの初期の点で機能を果たしていることを示唆する。ＶｐｒはＨＩＶの複製を、特に感染の初期に促進する。ＶｐｒはＨＩＶ  ＬＴＲへ連関したレポーター遺伝子の発現を約３倍増大させた。さらに、ＶｐｒとＴａｔはＬＴＲ連関遺伝子に関して相乗的に働くようである。ＶｐｒはＨＩＶ感染者の血清から単離でき、ウイルスの新しい細胞に感染する能力を増大させるようである。Ｖｐｒは細胞増殖を阻害し細胞分化を誘発することが見いだされている（Ｌｅｖｙ，Ｄ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：１−２０）、そして初代培養の単球／マクロファージは分化が進行しているときのみインビトロで感染できるという報告は重要な発見かも知れない（Ｓｃｈｉｔｅｍａｋｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１１５４−１１６０）。ＨＩＶ複製を支持できない細胞でもＶｐｒの影響で脱調節される。ＶｐｒはＡＩＤＳ患者に頻繁に見られる筋肉の消耗に関与しているかも知れない。Ｖｐｒの潜在的に有害な活性から遺伝子免疫処置は好ましくは非機能的Ｖｐｒタンパク質を発現する修飾されたｖｐｒ構築物で遂行するべきである。
Ｎｅｆ（古い文献では３’ｏｒｆと呼ばれていた）は２５−２７ｋＤのタンパク質である。ＮｅｆはＣＤ４＋Ｔリンパ球のダウンレギュレーションに関与することが示唆されている。加えて、Ｎｅｆは細胞の信号伝達に役割を演じているようだ。ＮｅｆはインビボでのＨＩＶ感染の成立に重要である。Ｎｅｆに特異的なＣＴＬはインビボでのＨＩＶ感染を制御する上で重要であると信じられている。
Ｖｉｆはウイルス感染性因子と呼ばれている２３ｋＤの細胞質タンパク質である。Ｖｉｆ欠除変異ウイルスは細胞−細胞の移行に関して緩和されるわけではないが、多くのＣＤ４＋細胞株の感染を顕著に減少させることが開示されている。Ｖｉｆなしではウイルスの発芽と感染性が減少する。霊長類の研究によれば、Ｖｉｆの欠除変異体はインビボでの感染の成立の能力が顕著に減少することが示される。これらの研究は宿主におけるウイルス複製におけるＶｉｆの臨床上の役割を支持する。
Ｖｐｕは１５−２０ｋＤ（８１アミノ酸）のタンパク質である。Ｖｐｕ（＋）とＶｐｕ（−）ウイルスは同量のウイルスタンパク質を生成するが、こうしゃは細胞内でのウイルスタンパク質の蓄積と細胞外のウイルスの減少を示す。これはＶｐｕがウイルスの粒子の組立および／または遊離に関与することを示唆する。
ネズミおよびトリウイルスのような単純なレトロウイルスはＨＩＶ−１やＨＩＶ−２、ＳＩＶ調節タンパク質に類似のタンパク質を欠いている。そのような動物ではレトロウイルスの感染はウイルスの除去と病原性の低下に伴い自己限定的になる傾向がある。同様にＴａｘ（Ｔａｔのように働きＶｐｒ様の活性を示す）およびＲｅｘ（Ｒｅｖのように働く）を含むＨＴＬＶ−１は多くの個体で除去される。調節遺伝子による遺伝子免疫処置はＨＩＶに対してだけではなくＨＢＶ（Ｘ遺伝子産物）とＨＣＶ、ＨＴＬＶ−１（Ｔａｘ）と（Ｒｅｘ）のようなウイルスに対しても重要であると考えられる。これらのすべてのウイルスにおいて調節遺伝子はウイルスの生活環と感染の成立に重要な役割を演じていると信じられる。
実施例５１  ＨＩＶ−１調節プラスミド、ｐＲＥＧの構築
ｐＰＲＥＧプラスミドは段階的に構築され、それぞれの中間体は構築を続行する前にタンパク質発現の試験を行うことができる。ｔａｔとｒｅｖの発現を支持する発現ベクターは二つの工程を通して構築される。最初は５’ＮｈｅＩ部位とＨＩＶ−１主要スプライス受容部位、ｔａｔコード領域の大部分、ｒｅｖタンパク質アミノ末端領域をコードする領域、ＡｖａＩＩ部位を含む増幅産物を合成鋳型より増幅する。この合成鋳型はＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅより得たひＶ−１のＨＸＢ２の発表された配列を用い、ｔａｔタンパク質の２２と３０位のシステイン残基を変異させて作製された。これらの変異でｔａｔは非機能的となる（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７（９）：３５５１−３５６１）。
ＰＣＲ産物はＮｈｅＩとＡｖａＩＩで消化され、カナマイシン耐性遺伝子とｐＢＲ３２２の複製開始点を含有するベクターに連結させる。加えて、このプラスミドはサイトメガロウイルスプロモーターとラウス肉腫ウイルスエンハンサー、ｒｅｖコード領域、ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含有する。プラスミドに存在するｒｅｖ配列はＨＩＶ−１  ＩＩＩBのプロウイルスのクローンから由来した。これは完全な、しかし変異したｔａｔコード領域と完全なｒｅｖコード領域を含有する発現ベクターを生成する。
続く工程は５’末端にＡｖａＩＩ部位をそして、ｒｅｖの８１番目のアミノ酸に変異を、ｒｅｖの約３０％のコード領域、ｎｅｆの約３０％のコード領域、３’末端にＭｌｕＩ部位を含有するＰＣＲ産物の生成のために遂行される。８１番目のアミノ酸変化はｒｅｖの機能を消失することが示されており、そのため、得られるプラスミドは非機能性ｒｅｖタンパク質の生成するようになる（Ｂｏｇａｒｄ，Ｈ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，Ｗ．Ｃ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（５）：２４９６−２５０２）。ｎｅｆコード領域の大きな欠除は非機能的ｎｅｆタンパク質の生成を起こすであろう。５’ＡｖａＩＩ部位とｒｅｖタンパク質の８１番アミノ酸の変異はＡｖａＩＩ部位と８１アミノ酸をコードするヌクレオチドの両者を含むｒｅｖのコード領域に相補的な５’プライマー上に導入される。Ｎｅｆの終了を起こす６３番アミノ酸の終止コドンと３’コード  クローン部位３’ＰＣＲプライマーによって導入される。このＰＣＲ増幅のための鋳型はＨＩＶ−１のＭＮ株からのｒｅｖとｎｅｆのコード領域を含有するプラスミドまたは合成鋳型である。得られたＰＣＲ産物はＡｖａＩＩとＭｌｕＩで消化し、前パラグラフに記述されたｔａｔ−ｒｅｖプラスミドをＡｖａＩＩとＭｌｕＩで消化した後に生成される小さなＡｖａＩＩ−ＭｌｕＩ断片と交換する。
ｖｐｒを随意、プラスミドの二つの部位の一つに加えることもできる。一つの方法としてはｖｐｒ翻訳開始コドンに至る配列の上流のＭｌｕＩ部位を含む５’ＰＣＲプライマーとｖｐｒ終了コドンとやはりＭｌｕ１クローニング部位を含み、それと接する配列に相補的な３’ＰＣＲプライマーを用いてｖｐｒを増幅することができる。開始コドンの上流配列はスプライス受容体を含む。ＰＣＲ産物はＭｌｕＩで消化し、上述したようにＭｌｕＩで消化したｔａｔ ｒｅｖ ｎｅｆプラスミドに挿入することができる。
あるいはまた、ｖｐｒの増幅を他の類似した方法で行うこともでき、ＰＣＲプライマーは他のベクターへのクローニングに適した制限酵素部位を含有させ、それによって、第二の有核細胞のプロモーターの制御の下に発現される。第二のプロモーター、続いてｖｐｒコード領域そしてポリＡ配列を含有する、このプラスミドより由来するカセットはカセットに接する制限酵素で消化することにより遊離することができるが、その中では切断しない。得られたＤＮＡ断片はｔａｔ  ｒｅｖ  ｖｐｒの発現のために必要な領域の外側に存在する、ｔａｔ，ｒｅｖ、ｖｐｒプラスミドの独自の部位にクローニングする。このようにして二つの発現ユニットを持つプラスミドが作製される。
実施例５２  ＨＣＶとＨＴＬＶ−１プラスミドの構築
同様な方法はウイルスの生活環および／またはこれらのウイルスの調節タンパク質に必要な酵素機能を持つＨＴＬＶ−１またはＨＣＶを発現するプラスミドを生成するために用いることができる。ＨＴＬＶ−１のために調節タンパク質，Ｔａｘをコードするプラスミドはプラスミドバックボーンと上述したものと同様なクローニング戦略を用いて生成される。そのような酵素タンパク質をコードしたＨＣＶ遺伝子はＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼやヘリカーゼ／プロテアーゼ機能を持つタンパク質を含有する。必要な配列は公表され，ＧｅｎＢａｎｋを通して得られる。ＨＴＬＶ−１とＨＣＶのウイルスの構成はそれぞれＣａｎｎ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈｅｎ、Ｉ．Ｓ．Ｙ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ｎ．Ｆｉｄｄｅｒ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０  ａｎｄＢｒａｄｌｅｙ，Ｄ．Ｗ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１（２）：９３−１０２、１９９２に包含される。
実施例５３  酵素遺伝子での遺伝子免疫処置
ＨＩＶ  ｐｏｌ遺伝子のような酵素機能を持つタンパク質をコードする遺伝子での遺伝子免疫処置は、ｐｏｌのような酵素が生ウイルスの生成に必要であることから、重要な抗ウイルス戦略となる。ポリメラーゼまたはその組成が欠除すればＨＩＶは非病原性で非感染性である。同様にＨＢＶポリメラーゼのような他のういるすの酵素
遺伝子も遺伝子免疫処置の魅力的な標的である。Ｒａｄｚｉｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ：ドメイン構造とＲｎａｓｅ  Ｈ活性、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（２）：６１３−６２０（１９９０）参照。
免疫標的としてのウイルス酵素が魅力ある一つの理由は、そのような酵素はそれらのアミノ酸配列を変異させて、しかも酵素機能を保持するには限界があるということである。例えば、ＰｏｌはＨＩＶ−１ではＡＺＴのようなヌクレオチドアナログへの抵抗性に付随した”回避”変異は少ないことが示されている。しかし、薬物回避変異体においてもタンパク質内に極めて多くの免疫の標的が保持されている。
実施例５４  ＨＢＶポリメラーゼプラスミドの構築
本明細書に報告した実験はＨＢＶポリメラーゼ発現がｍＲＮＡ分子にコアとポリメラーゼの両者の転写解読枠が存在するときに組織培養細胞にて達成される。この条件においてコアＡＴＧの変異はポリメラーゼ発現へ影響しないことが示されている。
ＨＢＶゲノムはＡＤＷ  ＨＢＶ株の頭部−尾部二量体を含有するペプチドから増幅される。コアではなくポリメラーゼのみの発現が望ましいことから、５’ＰＣＲプライマーはプレコアとコアの翻訳開始コドンが変異するようにデザインされた。さらに、このプライマーは複製−競合ＨＢＶゲノムＲＮＡの生成の可能性を除去するために変異ＤＲＩ配列も導入された。このＰＣＲ産物はカナマイシン耐性遺伝子とｐＢＲ３２２の複製開始点を含有するプラスミドに挿入された。さらに、このプラスミドはサイトメガロウイルスプロモーターおよびラウス肉腫ウイルスエンハンサー、ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含有する。表面抗原とＸコード領域産物に対する翻訳開始コドンはＨＢＳとＸ遺伝子産物の発現を阻止するために変異されている。
ＨＢＶポリメラーゼの発現を達成するための他の方法によれば、ポリメラーゼ全コード領域をコードするＰＣＲ産物はカナマイシン耐性遺伝子とｐＢＲ３２２の複製開始点を含有するベクターにクローンされ増幅される。さらに、このプラスミドはサイトメガロウイルスおよびラウス肉腫ウイルスエンハンサー、ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含有する。この増幅物に対する５’ＰＣＲプライマーはクローニング部位を含有し、ポリメラーゼ遺伝子の翻訳開始コドンに渡る。３’ＰＣＲ産物は発現ベクターへ挿入物のクローニングのための制限酵素部位を含有し、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子の典型的な終止コドンとこの終止コドンに接する配列に相補正がある。このＰＣＲさんぶつをカナマイシン耐性遺伝子とｐＢＲ３２２の複製開始点、サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー、ＳＶ４０ポリアデニル化信号を含有するプラスミドに連結させた後、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ表面抗原とＸ遺伝子の翻訳開始コドンはこれらの遺伝子産物の発現を抑制させるために変異させている。しかし、上記の戦略と同様の他のものも使用されるが、本実施例での３’プライマーはＨＢＶポリＡ信号と、この信号に接する配列を含有する。この３’プライマーはＨＢＶポリＡ信号を含有および／または、囲んだ配列が発現のために重要である場合に用いられる。変異の解析から、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子産物の機能は特定のヌクレオチドの変化により除去されることが示されている（Ｒａｄｚｉｗｅｌｌ、Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（２）：６１３−６２０）。上記のように構築されたプラスミドを使用する前に、これらの変異のうちの一つまたは類似の変異を導入することにより発現するポリメラーゼを変異することができる。
実施例５５
顆粒球−マクロファージ  コロニー促進因子（ＭＧ−ＣＳＦ）は好中球、単球／マクロファージ、エオジン好性細胞を含む種々の細胞系譜への促進効果を示す。ＧＭ−ＣＳＦの効果は魅力的な治療モデルを与える。ＧＣ−ＣＳＦはＦＤＡにより自家骨髄移植での使用を認可されており、種々のニュウトロペニアの処置における効力試験が開始されている。現在、ＧＭ−ＣＳＦは通常されている多回服用により投薬される必要があるタンパク質として投薬される。タンパク質では生産し、そして生成しなければならない。
他のＧＭ−ＣＳＦタンパク質の使用法としてはｂｕｐｉワクチンの投与の助けを借りてＧＭ−ＣＳＦをコードした遺伝子を含む遺伝子構築物の直接投与によるものである。遺伝子構築物はシグナル配列を含むＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のＰＣＲにより構築される。遺伝子構築物はカナマイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子）および、細菌の複製開始点、実施例４６におけるバックボーンとして記述されたベクターに導入されるプラスミドが細胞の中でＧＭ−ＣＳＦのコード領域の発現が支持される配列を含有することが望ましい。プラスミドはｂｕｐｉワクチンに付随して細胞の複製により誘導される哺乳類の複製開始点を含有することが望ましい。もしＥＢＶ複製開始点を用いた場合、核抗原ＥＢＮＡ−１をコードする配列が適切な調節配列とともに含有される。挿入物のＰＣＲ増幅のためのプライマーは発現ベクターにクローニングができるように制限酵素部位を含有し、ＧＭ−ＣＳＦのコード配列の５’と３’末端に相補的である。ＰＣＲ反応はＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８２：４３６０−４３６４に記述されているようにｃＤＮＡクローンを用いて遂行する。
実施例５６
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）はＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体；染色体９と２２間の転座に起因する染色体異常に付随した血液幹細胞のクローン骨髄増殖異常である。染色体２２の切断点は切断点クラスター領域（ＢＣＲ）と呼ばれる６ｋｂに集まっている。一方、染色体９の切断点はｃ−ａｂｌ  エクソン２の上流９０ｋｂに渡って散在する。種々の９：２２転座はＫ２８転座とＬ６転座の二つに分類することができる。ｂｃｒ−ａｂｌ転座を通しての転写は融合ｍＲＮＡの生成を生じる。ｂｃｒ−ａｂｌ結合点のｍＲＮＡへ標的となるアンチセンスはＣＭＬ患者から得られた血液細胞のコロニー形成を阻害することが示されている。
アンチセンスをコードした遺伝子構築物はＣＭＬ患者の細胞にエクスビボにｂｕｐｉワクチンとともに投与する。処置した細胞は患者に再び導入される。
実施例５７
ＨＢＶに対する医薬キットとワクチンの構成物に有効な遺伝子構築物は実施例４６におけるバックボーンとして記述されたベクターで構築される。プラスミドはＨＢＶ構造遺伝子、特にＨＢＶの表面抗原および／またはＨＢＶのコア抗原および／またはＨＢＶ前コア抗原をコードする遺伝子を含有する。
実施例５８
ＨＣＶに対する医薬キットとワクチンの構成物に有効な遺伝子構築物は実施例４６におけるバックボーンとして記述されたベクターで構築される。プラスミドはＨＣＶ構造遺伝子、特にＨＣＶのコア抗原および／またはＨＣＶエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含有する。
実施例５９
遺伝子構築物ｐＲＥＶは唯一の標的タンパク質としてＨＩＶ  ｒｅｖをコードしたヌクレオチド配列を含有するように作製された。ｒｅｖのコード配列はｐＵＣ１９においてＨＩＶのＨＸ３Ｂ株からのｒｅｖのコード領域を含むＢＢＧ３５から実施例４６に記述したバックボーンにクローニングされる。
ｇａｇＫａｎR
0003701966.tif 000004
0003701966.tif 000005
0003701966.tif 000006
0003701966.tif 000007
0003701966.tif 000008
0003701966.tif 000009
【配列表】
配列番号1:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:32塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:1:
0003701966.tif 000010
配列番号2:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:30塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:2:
0003701966.tif 000011
配列番号3:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:29塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:3:
0003701966.tif 000012
配列番号4:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:30塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:4:
0003701966.tif 000013
配列番号5:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:30塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:5:
0003701966.tif 000014
配列番号6:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:27塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:6:
0003701966.tif 000015
配列番号7:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:24塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:7:
0003701966.tif 000016
配列番号8:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:8:
0003701966.tif 000017
配列番号9:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:27塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:9:
0003701966.tif 000018
配列番号10:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:24塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:10:
0003701966.tif 000019
配列番号11:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:22アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:11:
0003701966.tif 000020
配列番号12:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:12:
0003701966.tif 000021
配列番号13:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:27アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:13:
0003701966.tif 000022
配列番号14:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25アミノ酸
（B）型:アミノ酸
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:ペプチド
（xi）配列:SEQ ID NO:14:
0003701966.tif 000023
配列番号15:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:27塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:15:
0003701966.tif 000024
配列番号16:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:21塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:16:
0003701966.tif 000025
配列番号17:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:17:
0003701966.tif 000026
配列番号18:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:25塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:18:
0003701966.tif 000027
配列番号19:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:40塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:19:
0003701966.tif 000028
配列番号20:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:29塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:20:
0003701966.tif 000029
配列番号21:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:24塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:21:
0003701966.tif 000030
配列番号22:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:22:
0003701966.tif 000031
配列番号23:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:78塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:23:
0003701966.tif 000032
配列番号24:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:29塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:24:
0003701966.tif 000033
配列番号25:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:22塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:25:
0003701966.tif 000034
配列番号26:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:24塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:26:
0003701966.tif 000035
配列番号27:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:31塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:27:
0003701966.tif 000036
配列番号28:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:31塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:28:
0003701966.tif 000037
配列番号29:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:30塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:29:
0003701966.tif 000038
配列番号30:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:34塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:30:
0003701966.tif 000039
配列番号31:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:40塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:31:
0003701966.tif 000040
配列番号32:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:32塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:32:
0003701966.tif 000041
配列番号33:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:38塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:33:
0003701966.tif 000042
配列番号34:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:39塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:34:
0003701966.tif 000043
配列番号35:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:39塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:35:
0003701966.tif 000044
配列番号36:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:39塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:36:
0003701966.tif 000045
配列番号37:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:31塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:37:
0003701966.tif 000046
配列番号38:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:36塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:38:
0003701966.tif 000047
配列番号39:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:33塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:39:
0003701966.tif 000048
配列番号40:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:111塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:40:
0003701966.tif 000049
配列番号41:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:55塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:41:
0003701966.tif 000050
配列番号42:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:55塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:42:
0003701966.tif 000051
配列番号43:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:48塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:43:
0003701966.tif 000052
配列番号44:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:35塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:44:
0003701966.tif 000053
配列番号45:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:35塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:45:
0003701966.tif 000054
配列番号46:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:21塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:46:
0003701966.tif 000055
配列番号47:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:80塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:47:
0003701966.tif 000056
配列番号48:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:80塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:48:
0003701966.tif 000057
配列番号49:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:41塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:49:
0003701966.tif 000058
配列番号50:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:70塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:50:
0003701966.tif 000059
配列番号51:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:29塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:51:
0003701966.tif 000060
配列番号52:
（i）配列の特性:
（A）配列の長さ:29塩基対
（B）型:核酸
（C）鎖の数:一本鎖
（D）トポロジー:直線状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列:SEQ ID NO:52:
0003701966.tif 000061
【図１Ａ】
0003701966.tif 000062
【図１Ｂ】
0003701966.tif 000063
【図２】
0003701966.tif 000064
【図３Ａ】
0003701966.tif 000065
【図３Ｂ】
0003701966.tif 000066
【図３Ｃ】
0003701966.tif 000067
【図３Ｄ】
0003701966.tif 000068
【図３Ｅ】
0003701966.tif 000069
【図４Ａ】
0003701966.tif 000070
【図４Ｂ】
0003701966.tif 000071
【図４Ｃ】
0003701966.tif 000072
【図４Ｄ】
0003701966.tif 000073
【図４Ｅ】
0003701966.tif 000074
【図４Ｆ】
0003701966.tif 000075
【図４Ｇ】
0003701966.tif 000076
【図５】
0003701966.tif 000077
【図６】
0003701966.tif 000078
【図７】
0003701966.tif 000079
【図８Ａ】
0003701966.tif 000080
【図８Ｂ】
0003701966.tif 000081
【図８Ｃ】
0003701966.tif 000082
【図８Ｄ】
0003701966.tif 000083
【図９】
0003701966.tif 000084