(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）除外した場合に微生物株を増殖不能にする該微生物株の増殖に必要とされる栄養補足物の存在なしで該微生物株を増殖させ得、かつグルタミンシンセターゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ、ジヒドロ−ジピコリネートシンターゼ、アセトヒドロキシアシッドシンターゼおよびホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼからなる群より選ばれる必須植物遺伝子産物をコード化する植物遺伝子を微生物株内で発現させ；
ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）除外した場合に微生物株を増殖不能にするが、該必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖は不能にしない増殖培地中に栄養補足物を欠く試験条件、および（２）b)(１)に記載の栄養補足物を含有する逆転条件、の下で維持することにより、（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物である、
植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【請求項２】
ａ）ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼをコード化する植物遺伝子を発現する微生物株を、（１）ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼが欠乏しているか或はアントラニレートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンの生合成経路で作り出される化合物が欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが、トリプトファン、および他の、アントラニレートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り出される化合物を欠く試験条件、および（２）トリプトファンか、或は他の、アントラニレートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り出される化合物、を含んでいる逆転条件、の下で維持することにより、試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害する化合物である、
植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが、アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸を欠く試験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物である、
植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する請求項１記載の方法。
【請求項４】
ａ）植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を、植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼを阻害する化合物である、
３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する請求項１記載の方法。
【請求項５】
ａ）植物グルタミンシンセターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）グルタミンシンセターゼおよびグルタミン両方が欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、グルタミンシンセターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが、グルタミンを欠く試験条件、および（２）グルタミンが含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転条件下の培養物を、グルタミンシンセターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、植物グルタミンシンセターゼを阻害する化合物である、
植物グルタミンシンセターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する請求項１記載の方法。
【請求項６】
ａ）植物ジヒドロジピコリネートシンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）ジヒドロジピコリネートシンターゼおよびジアミノピメリン酸両方が欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、ジヒドロジピコリネートシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが、ジアミノピメリン酸を欠く試験条件、および（２）ジアミノピメリン酸が含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転条件下の培養物を、ジヒドロジピコリネートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物である、
植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する請求項１記載の方法。
【請求項７】
必須植物遺伝子産物を阻害する化合物を同定するために有用な微生物株であって、該必須植物遺伝子産物をコード化する遺伝子が、植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼをコード化し、該必須植物遺伝子産物をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化し、該必須植物遺伝子産物をコード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼをコード化していることを特徴とする、微生物株。
【請求項８】
グルタミンシンセターゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート―７−ホスフェートシンターゼ、ジヒドロ−ジピコリネートシンターゼ、アセトヒドロキシアシッドシンターゼおよびホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼからなる群より選ばれ、かつ、野生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する微生物細胞を同定する方法であって、
ａ）除外した場合に微生物株を増殖不能にするが、該微生物株の増殖に必要とされる栄養補足物の存在なしで、必須植物遺伝子産物の細菌同族体をコード化する遺伝子に変異を有する微生物株の増殖は可能にする必須植物遺伝子産物をコード化する変異植物遺伝子を微生物株内で発現させ；
ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、除外した場合に微生物株を増殖不能にするが、該必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖は不能にしない増殖培地中に栄養補足物を欠く条件下で維持することにより、該微生物株が増殖している培養物を生じさせ；
ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している培養物を、野生型必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖阻害を生じさせるに充分な量の、該野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤と接触させ；そして
ｄ）該野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤存在下の（ｂ）に記述した条件下で増殖する微生物細胞を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記同定した細胞は、その野生型の必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である、ことを特徴とする方法。
【請求項９】
植物の成長に必要なグルタミンシンセターゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ、ジヒドロ−ジピコリネートシンターゼ、アセトヒドロキシアシッドシンターゼおよびホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼからなる群より選ばれる除草剤耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法であって、
ａ）除外した場合に微生物株を増殖不能にするが、該微生物株の増殖に必要とされる栄養補足物の存在なしで、必須植物遺伝子産物の細菌同族体をコード化する遺伝子に変異を有する微生物株の増殖は可能にする除草剤耐性必須植物遺伝子産物をコード化する変異植物遺伝子を微生物株内で発現させ；
ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）除外した場合に微生物株を増殖不能にするが、該除草剤耐性必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖は不能にしない増殖培地中に栄養補足物を欠く試験条件下および（２）工程ｂ）（ａ）（１）に記載の栄養補足物を含む逆転条件下、で維持することにより、（ａ）に記載した微生物株が増殖している試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、植物の成長に必要な除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻害する化合物であることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
ａ）イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する植物遺伝子を発現する微生物株を、（１）イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが、アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸を欠く試験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験条件下の培養物および逆転条件下の培養物を、イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含んでなり、ここで、上記化合物は、イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物であることを特徴とする、
イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【請求項１１】
除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物をコード化する植物遺伝子を発現する能力を有しており、ここで、この発現により、この微生物株の増殖に必要とされる栄養補足物の存在なしでもこの微生物株の増殖が可能になる、請求項７記載の微生物株。
【請求項１２】
除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物をコード化する植物遺伝子が、イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する、請求項１１記載の微生物株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
近年、除草剤の発見において、栄養的に必須なアミノ酸のための代謝経路が興味の持たれている主要焦点になってきている。このような興味は、上記経路中の酵素を阻害することが見いだされている、高い活性を示すと共に低い動物毒性を示す、いくつかの種類の除草剤が発見されたことが原因となっている。これらの除草剤は、分枝鎖アミノ酸類（イミダゾリドン類、スルホニル尿素類およびトリアゾロピリミジン類による阻害）、芳香族アミノ酸類（グリホセート（glyphosate）による阻害）、グルタミン（ビアラホス（bialaphos）およびホスフィノトリシン（phosphinothricin）による阻害）またはヒスチジン（アミトロール（amitrole）による阻害）のための経路中の酵素を阻害している。
【０００２】
伝統的な除草剤発見では、化学サンプルを全植物の上に噴霧し、そして一定期間、典型的には投与から２から３週間おいた後、その化学品の効果の評価が行われている。その後、このようなアプローチで同定された化合物に関して更に、それの影響を受ける植物のスペクトル、毒性および作用部位の特徴付けを行う必要がある。このような過程は、多量の試験化合物を必要とすると共に、時間を消費し、高価でありそして非効率的である。従って、除草剤の開発では、可能な除草剤をスクリーニングするための迅速で小規模な方法が有利である。
【０００３】
【発明の要約】
本発明は、多くの場合植物に特異的な、予め決めた酵素または代謝標的部位を特異的に阻害する化合物をスクリーニングして迅速同定するための新規なプロトコルに関するものである。本発明は更に、ここに記述するスクリーニング方法で用いるに有効な微生物株にも関する。この新規なスクリーニングで特異的もしくは間接的影響を受ける酵素には、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート（heptulosonate）７−ホスフェートシンターゼ（ＤＡＨＰ）、ジヒドロ−ジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）、アセトヒドロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）およびホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）が含まれる。理想的には、この新規なスクリーニングプロトコルの標的となる酵素経路は、植物、細菌および菌・カビにユニークであり、そしてこれらは低レベルで存在している。ここに記述するスクリーニングはまた、動物の中に存在している酵素、例えばグルタミンシンセターゼなども標的にし得る。これらの酵素の形態、或は化合物の輸送、吸収または分解において植物と動物との間に有意な差が存在していることから、植物酵素の阻害剤が必ずしも動物形態の酵素に活性を示すとは限らない。従って、これらの酵素の阻害は、ヒトまたは動物にほとんどか或は全く毒性を与えるべきでない。これらのスクリーニングは、試験化合物が示す除草剤効力を評価するに有効な迅速方法を提供する。この新規なスクリーニングプロトコルで同定された先頭に立つ化合物は、植物の成長を阻害する除草剤として用いられ得る。
【０００４】
ここに記述する方法では、理想的には必須植物遺伝子産物の細菌同族体を発現する微生物株を用いる。この微生物株は、その細菌同族体をコード化する遺伝子の中に変異を有しており、その結果として、これは、その植物遺伝子産物の発現なしか或は栄養補足物(本明細書では、「栄養的補足物」ともいう。)の添加なしには増殖することができない。本発明の１つの具体例において、この微生物株を下記の２組の条件下に維持する：その植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるがこの植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験条件；およびその必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖に適切な条件である逆転〔リバース(reversed)または復帰〕条件。次に、これらの２つの条件下で増殖させた微生物培養物を、植物の成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させる。この必須植物遺伝子産物を特異的に阻害する化合物を、試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下では増殖を阻害しない化合物として同定する。
【０００５】
本発明の方法では、その必須植物代謝経路全体の酵素全てをその微生物株内で発現させる必要はない。本方法では、この微生物株の栄養的要求を補完するに充分な１種のみの、標的植物経路の酵素の発現を必要としている。
【０００６】
加うるに、本発明の方法では、その微生物株内でその必須植物遺伝子産物全体を発現させる必要はない。本方法では、その微生物株の栄養的要求を補完するに充分な、その植物遺伝子産物の一部のみの発現を必要としている。例えば、この微生物株の栄養的要求を補完するに充分なその植物遺伝子産物の部分は、その植物遺伝子産物のフラグメントか或はホロ酵素のサブユニットであってもよい。
【０００７】
本発明の特別な具体例に従い、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼが、阻害性を示す化合物のためのスクリーニングで標的となる必須植物遺伝子産物である。このスクリーニングで用いられる微生物株は、トリプトファンなしか或は植物遺伝子産物であるホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼなしでは増殖し得ない株である。この具体例に従う試験条件は、トリプトファン、および他の、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ活性が欠乏している微生物株の増殖を可能にする何らかの化合物、が不足している条件である。逆転条件は、トリプトファンか或はホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ活性が欠乏している微生物株の増殖を可能にする他の何らかの化合物が含まれている条件である。
【０００８】
本発明の別の具体例において、アセトヒドロキシアシッドシンターゼがその標的となる必須植物遺伝子産物であり、そして用いられる微生物株は、アセトヒドロキシアシッドシンターゼまたは分枝アミノ酸類（アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している微生物株はこれらを作り出すことができない）なしでは増殖し得ない株である。試験条件は、アセトヒドロキシアシッドシンターゼの存在なしで増殖するに必要とされる分枝鎖アミノ酸を含んでいないが、逆転条件は、その必要とされる分枝鎖アミノ酸を含んでいる。
【０００９】
本発明のさらなる具体例において、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼが、阻害性を示す化合物のためのスクリーニングで標的となる必須植物遺伝子産物である。このスクリーニングで用いられる微生物株は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼなしか或はアミノ酸であるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンなしでは増殖し得ない。試験条件には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれておらず、一方逆転条件には、これらのアミノ酸が含まれている。
【００１０】
本発明のさらなる具体例において、グルタミンシンセターゼがその標的となる必須植物遺伝子産物である。この具体例に従うスクリーニングで用いられる微生物株は、グルタミンシンセターゼの発現なしか或はグルタミンの添加なしには増殖し得ない株である。試験条件にはグルタミンが存在しておらず、一方その逆転条件にはグルタミンが存在している。
【００１１】
本発明の更に別の具体例に従い、植物に特異的な植物成長阻害剤のためのスクリーニングで標的となる植物必須遺伝子産物は、ジヒドロジピコリネートシンターゼである。この具体例に従い、阻害剤のスクリーニングで用いられる微生物株は、ジヒドロジピコリネートシンターゼの発現なしか或はジアミノピメリン酸の添加なしでは増殖し得ない。従って、試験条件にはジアミノピメリン酸が含まれておらず、一方逆転条件にはジアミノピメリン酸が含まれている。
【００１２】
本発明の別の具体例は、変異遺伝子産物に相対する野生型を阻害する化合物に耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を同定する方法に関する。上記変異遺伝子産物を同定するか、或は該変異遺伝子産物を発現する微生物株を同定することが可能なことは、その変異必須遺伝子産物をコード化する変異遺伝子を発現する形質転換植物の生産で有効性を示す。このような植物は、その変異遺伝子を発現しない同様な植物（即ち野生型植物）の成長を阻害する化合物に耐性を示す。この具体例に従い、必須植物遺伝子産物をコード化する変異遺伝子を発現する微生物株は、その野生型必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株を増殖させるに必要な栄養的補足物なしに増殖する。このような条件下、この微生物株は、その微生物株が発現する変異必須植物遺伝子産物が、その株が栄養的補足に必要とされているものを補完し得る場合、増殖する。次に、これらの条件下で増殖する微生物を、野生型遺伝子産物を発現する微生物株の増殖阻害を生じさせるに充分な量の、この野生型必須植物遺伝子産物の公知阻害剤に接触させる。この公知阻害剤が存在している上記条件下で増殖し得る微生物細胞は、その野生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である。
【００１３】
本発明の別の具体例は、新規な植物成長阻害剤を同定する目的で変異植物遺伝子産物を用いることに関する。公知阻害剤に耐性を示すように変化した形態の必須植物酵素をコード化する変異植物遺伝子は、同じ化学種の追加的一員（ここに記述したスクリーニング方法で測定した）に耐性を示す可能性がある。しかしながら、このような変異体は、前に発見した阻害剤とは化学的に異なっている新規な阻害剤に必ずしも耐性を示すとは限らない。従って、ここに記述するスクリーニングは、変異体である、除草剤に耐性を示す必須植物遺伝子産物の、新規な阻害剤を同定する目的で用いられ得る。
【００１４】
【発明の詳細な記述】
ここに記述する方法は、植物、細菌および菌・カビに特異的な、予め決めた酵素または代謝標的部位を特異的に阻害する化合物を迅速同定することを可能にするものである。更に、不活性な代謝産物に対して化合物が示す偶発的な代謝を基にした選択または特別な植物種による化合物の排除を基とした選択ではなく、興味の持たれている作物植物が示す遺伝的修飾を基とした差別的作物選択を可能にする、標的部位の変異体に関する選択を行う目的で、化学的発見で用いたのと同じ生物学剤を用いることができる。
【００１５】
本発明の方法は、植物由来の遺伝子を用いて微生物の欠陥を遺伝的に補完することに頼っている。ここに記述する方法に従い、興味の持たれている酵素に遺伝的な欠陥を有している結果として栄養的補足または遺伝的修飾（例えば補完）なしでは増殖し得ない有機体を生じさせるように、微生物株を選択して構築する。この遺伝的欠陥は、外因的に添加された必須植物産物なしでは栄養素要求性を引き起こすものから選択される。この微生物に対する原栄養性を回復させるように、その欠陥のある微生物遺伝子を補完し得る植物遺伝子をその微生物内で発現させ、それによって、その遺伝子欠陥で引き起こされた欠乏を軽減する。その得られる微生物が最小培地で増殖するか否かは、その植物遺伝子に依存しているか、或はその遺伝子がコード化する酵素の植物産物に依存している。この微生物を用いて、その選択した植物酵素を阻害する化合物に関するスクリーニングを行うことができる。これは、例えば、興味の持たれている酵素の産物を含んでいるか或はその産物が不足している最小栄養寒天プレートの上で特徴的な増殖を評価することによって行われ得る。これらのプレートの上で、特異的に、この酵素の産物または経路を欠乏させて微生物の増殖を阻害するがその産物を存在させて微生物の増殖を阻害しない化合物が同定され得る。経路の最終産物を用いることで、増殖阻害の逆転を試験するようにこのスクリーニングを修飾することができる。従って、本発明の方法を用いることで、微生物の酵素のその場所に１種以上の植物酵素を含んでいる特異的経路を阻害する化合物を同定することができる。
【００１６】
野生型酵素が示す適当な機能を阻害するか或はそれの邪魔をすることでその酵素を含んでいる有機体の成育を防止する除草剤化合物を同定したならば、耐性変異体を単離することができる。例えば、野生型有機体の増殖を阻害するに充分な濃度の阻害剤の存在下で、１つの集団を変異誘発させた後、増殖し得るか或は野生型有機体よりも迅速に増殖する集団から個体を選択することができる。
【００１７】
ここに記述するスクリーニングを用いることで、植物に特異的な代謝過程の新規阻害剤を同定することができると共に、現存している化学品を基として、植物に特異的な産物の類似物の特徴付けを行うことができ、そして植物に特異的な酵素の、天然に存在している阻害剤を検出することができる。効力を示す阻害剤のための給源には、発酵ブロス、部分精製された発酵ブロス、並びに天然および合成的に作られた化合物が含まれ得る。
【００１８】
この一次スクリーニングで陽性であるとして同定された効力を示す阻害剤、例えば有機分子または発酵ブロスを更に、その植物遺伝子でまだ形質転換されていない（即ち発現していない）植物遺伝子が欠乏している微生物株に対してその化合物を試験することによる二次スクリーニングで評価することができる。この試験では、真の植物産物に特異的な阻害剤は増殖阻害を引き起こさない。しかしながら、これらの植物酵素の微生物同族体の阻害剤は、まだ除草剤として有効であり得る。
【００１９】
この一次スクリーニングおよび二次評価で陽性であると評価された先頭に立つ阻害剤を更に植物に関して試験することができる。
【００２０】
以下に示す実施例において、５種の異なる必須植物遺伝子産物を用いて、標的植物酵素の特異的阻害剤のための生物学的スクリーニングを開発する。各標的酵素は、正常な植物代謝に必須な段階（これなしで植物は成育することができない）を表している。このスクリーニングでは、各場合共、その植物遺伝子産物なしか或は栄養的補足物なしでは増殖し得ない微生物株を用いる。これらのアッセイで用いる微生物株は、公知技術を用いて必要以上の実験なしで容易に構築され得る。いくつかの好適な微生物株の例には、細菌株（例えば大腸菌、サルモネラ菌および藍細菌）および酵母菌が含まれる。
【００２１】
変異体である、除草剤耐性を示す植物遺伝子産物の阻害剤のための、機構を基にした生物学的スクリーニングの例もまた記述する。この具体例に従い、標的酵素は、正常な植物代謝に必須な段階を表しているが、この酵素は、この変異酵素の野生型同族体の阻害剤に耐性を示す変異酵素である。本方法に従うスクリーニングでは、植物遺伝子産物なしか或は栄養的補足物なしには増殖し得ない微生物株を用いる。これらの微生物株は、多くの場合、野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤を同定する目的で用いた菌株と同じであるか或は類似しており、そしてこれらは、公知技術に従って必要以上の実験なしで容易に構築され得る。
【００２２】
アセトヒドロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）が、分枝鎖アミノ酸生合成のための生合成経路に特異的な第一酵素である。アセトヒドロキシアシッドシンターゼは、２分子のピルベートを縮合させてアセトラクテートを生じさせるか或は１分子のピルベートと１分子のα−ケトブチレートからアセトヒドロキシ−ブチレートを生じさせる縮合を触媒している。ＡＨＡＳは、これらの基質に加えて、酵素活性および安定性のためのチアミンピロホスフェートおよびフラビンアデニンヌクレオチドを必要としている。植物由来のＡＨＡＳは、イソロイシン、ロイシンおよびバリンによってフィードバック阻害される。これらの細菌の酵素同族体（ＡＨＡＳ ＩおよびＩＩＩ）はバリンでフィードバック阻害されるが、植物の同族体（ＡＨＡＳ ＩＩ）はフィードバック阻害されない。
【００２３】
ＡＨＡＳは、イミダゾリドン類、スルホニル尿素類およびトリアゾロピリミジン類を含むいくつかの公知および無関係な種類の除草剤の標的部位である。これらのイミダゾリドン類およびスルホニル尿素類は、この酵素を利用している本発明のスクリーニングのための正の対照として働く。動物は分枝鎖アミノ酸を合成するための酵素を有しておらずそして植物が成長するためにはこの経路が必要であることから、これらの除草剤は低い動物毒性を示す。加うるに、表Ｉに示す如き分枝鎖アミノ酸の１種以上は数多くの天然に存在している抗代謝産物（トキシン類）の影響を逆転することもまた報告されている（Scannel、 J.P. およびDavis L. Preuss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-224頁）。
【００２４】
0003641490.tif 000002
イミダゾリドン耐性を示す雑草が存在していることは、イミダゾリドン除草剤およびＡＨＡＳを阻害する他の除草剤を用いる時の関心事である。耐性を示す形態のＡＨＡＳを特異的に阻害する新規化合物を同定することにより、例えばイミダゾリドン耐性を示す雑草を特異的に根絶するに有効な化合物を同定することが可能になる。ＡＨＡＳ阻害剤を同定するためのこの機構を基としたスクリーニングは、野生型形態ではなく耐性を示す形態のＡＨＡＳによってその試験有機体の遺伝的欠陥が補完されることを除き、野生型ＡＨＡＳの阻害剤の同定で記述したスクリーニングと同じである。従って、このようなスクリーニングを用いることで、新規なＡＨＡＳ阻害剤を同定することが可能であると共に、現存化学品を基とする類似物の特徴付けを行うことができ、そして天然産物由来の阻害剤を検出することができる。
【００２５】
３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シンターゼは、芳香族アミノ酸生合成のための生合成経路中の第一酵素である。この酵素を用いた、機構を基としたスクリーニングにより、試験サンプルからＤＡＨＰシンターゼ阻害剤を同定することができ、従ってこれらは、除草性を示す可能性がある。
【００２６】
ＤＡＨＰシンターゼが触媒する反応は、ホスホエノールピルベートとエリスロース−４−ホスフェートとを縮合させて３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートを生じさせる縮合である。この経路で得られる最終的な産物は、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンである。しかしながら、植物におけるこの経路は、リグニン、アントシアニン色素、オーキシンおよび抗菌性フィトアレキシン類を含む多様な列の二次代謝産物をもたらす（Weiss, U.およびJ.M. Edwards (1980）「芳香族化合物の生合成」（The Biosynthesis of Aromatic Compounds（Wiley、 New York）；Hahlbrock, K.およびD. Scheel (1989）、Annu. Rev. .Plant Physiol Plant Mol. Biol 40:347-369）。植物のＤＡＨＰシンターゼイソ酵素は、芳香族アミノ酸類によって阻害されない。
【００２７】
現在のところＤＡＨＰシンターゼを阻害すると同定されたただ１つの天然産物は、フェニルアラニン類似物である２，５−ジヒドロフェニルアラニンである（Scannel J.P.およびDavis L. Preuss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-224頁）。しかしながら、この化合物は微生物酵素のフィードバック阻害によって機能する可能性があると共にその植物酵素に対して有効性を示さない可能性があることから、そのスクリーニングでは別の対照が必要であり得る。芳香族アミノ酸類による増殖阻害の逆転を示し得るがその作用部位がＤＡＨＰシンターゼでない他の化合物が同定された。
【００２８】
グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）が、細菌、菌・カビおよび植物細胞におけるアンモニアの同化および再同化で機能する鍵となる酵素である。この酵素は、グルタメートとアンモニアとＡＴＰからのグルタミン生成を触媒し、そして除草剤化合物であるホスフィノトリシンおよびビアラホス（発酵産物）の標的部位であることが見いだされた。ＧＳは、２種の市販除草剤、INCITE（商標）（ホスフィノトリシン）およびBASTA（商標）（ビアラホス）の標的部位である。ビアラホスは、ScannelおよびPreuss（Scannel J.P.およびDavis L. Preuss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-244頁）（表ＩＩ参照）の中に詳述されている如き他のいくつかの抗代謝産物（除草剤化合物）と同様、天然の発酵ブロスから発見された。ホスフィノトリシンおよびビアラホスは、植物遺伝子産物が示す拮抗作用のための正の対照として働き得る。
【００２９】
表ＩＩ  −−  公知のＧＳ阻害剤
アンチカプシン（Anticapsin）
アザセリン（Azaserine）
６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン（ＤＯＮ）
タブトキシン（Tabtoxin）
デュアゾマイシンＢ（Duazomycin B）
ビアラホス（Bialaphos）
メチオニンスルホキシミン（Methionine sulfoximine）
ホサラシン（Phosalacine）
オキセチン（Oxetin）
ジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）は、β−アスパルテートセミアルデヒドとピルベートとを縮合させて２，３−ジヒドロジピコリネートを生じさせる縮合を触媒する。この反応において、ピルベートは、最初にリジン残基と一緒にシッフ塩基を生じることによってその酵素と結合する（Shedlarski, J.G.およびC. Gilvarg (1970）、 J. Biol Chem. 245:1362-1373）。タバコ、小麦およびトウモロコシ由来の酵素は、リジンによってフィードバック阻害され、そして低い度合であるがリジン類似物によってフィードバック阻害される（Ghislain, M.、 Frankard, V.およびM. Jacobs (1990) Planta 180:480-486；Kumpaisal, R.、 Hashimoto, T.およびY. Yamada (1987)、 Plant Physiol. 85:145-151；Frisch, D.A.、 Tommey, A.M.、 Gegenbach, B.G.およびD.A. Somers (1991)、 Mol. Gen. Genet. 228:287-293）。１００ｍＭのリジンはこの酵素活性を９０％阻害する。そのリジン類似物であるＳ−（２−アミノエチル）Ｌ−システインは、タバコ酵素の最も強い阻害剤であり、０．１ｍＭで５０％阻害を示しそして０．５ｍＭで９０％阻害を示した（Ghislain, M.、 Frankard, V.およびM. Jacobs (1990)
Ｐｌａｎｔａ  １８０：４８０−４８６）。
【００３０】
菌・カビ、細菌および植物細胞において、酵素であるジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）は、栄養的に必須なアミノ酸であるリジンの合成で機能する。現在利用できる市販除草剤のいずれも、ＤＨＰＳの阻害による作用を示さない。この酵素は動物内に存在していないと共に、リジン生合成のための菌・カビ経路は植物の経路とは異なっていることから、ＤＨＰＳの阻害剤は動物にとって無毒であると共に植物に特異性を示すと期待される。大腸菌の酵素は、そのアミノ酸レベルで、その植物酵素に２２％のみの相同性を示す。ジアミノピメリン酸またはリジンによって逆転させられる、ScannelおよびPreuss（Scannel J.P.およびDavis L. Preuss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-244頁）が言及した化合物の多くは、代替作用機構を有するか或は微生物酵素のフィードバック阻害剤である。以下の表ＩＩＩを参照のこと。
【００３１】
表ＩＩＩ  −−  ジアミノピメリン酸またはリジンによる拮抗作用を受ける（antagonized）抗代謝産物
Ｌ−セレノメチオニン
Ｌ−４−オキサリジン
Ｌ−２−アミノ−４−（２−アミノエトキシ）−トランス−３−酪酸
ホモアルギニン
カナバニン
アザセリン
６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン
酵素であるホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、トリプトファンの生合成経路において、アントラニレートシンターゼの後の反応を触媒する。この酵素は植物および微生物代謝にユニークであることから、ＰＡＴの阻害剤は、最小限の哺乳動物毒性を示す可能な除草剤であると期待される。この酵素が欠如しているアラビドプシス（Arabidopsis）変異体は増殖できず、このことは、この酵素が良好な除草剤標的部位になり得ることを示唆している。
【００３２】
ＰＡＴは、ホスホリボシルピロホスフェートおよびアントラニレートからのＮ−５’−ホスホリボシルアントラニレート生成を触媒している。この酵素が欠如している植物および微生物は、アントラニレート（ｏ−アミノ安息香酸）が蓄積することが原因で青色発光を示す。トリプトファンを補足した栄養寒天上におけるこれらの変異体が示す増殖の初期段階において、これらの植物は、正常な速度で成長し、野生型と同じに見える。しかしながら、発芽後３から４週間で、このＰＡＴ変異体は、その野生型よりも劇的に小さくなり、縮れた葉、小さい葉柄、手間（business）が増大しそして最終的にねん性が大きく減少することを含む、形態学的異常さを示し始める（Last, R.L.およびG.R. Fink (1988）Science 240:305-310）。植物界におけるこの酵素の調節に関して利用できる情報は非常に少ない。
【００３３】
以下に示す非制限的実施例を用いてここに本発明を更に説明する。
【００３４】
【実施例】
実施例１  −  グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）の阻害剤に関する機構を基としたスクリーニング
材料および方法
大腸菌株ＴＨ１６（Reitzer, L.J.およびB. Magasanik、 (1986)、 Cell 45:785-792）は、そのｇｌｎＡ遺伝子の中にＴｎ１０Ｋａｎトランスポゾンが挿入されていることから、ＧＳ活性が欠如している。この挿入変異の結果として、増殖に関してグルタミン要求を生じ、そしてまたカナマイシンに耐性を示す（そのＴｎ１０Ｋａｎトランスポゾンによって与えられる）。
【００３５】
細菌の膜による化合物の排除を低くする目的（即ち膜透過性を増大させる目的）（Sampson, B.A.、 Misra, R.およびS.A. Benson (1989）、 Genetics 122:491-501）で、Ｐ１ ｖｉｒ仲介形質導入（Miller, J.H.、 (1972）著「分子遺伝学における実験」（Experiments in Molecular Genetics)、 CSH Laboratory、 Cold Spring Harbor、 NY）により、そのＴＨ１６からのＧＳ欠陥をｉｍｐ大腸菌株（ＢＡＳ８４９）の中に移動させた。このｉｍｐ変異により膜透過率が上昇する。ＳＣ３と表示するその得られる菌株は、グルタミン栄養素要求性を示すと共にテトラシクリンに耐性を示す（Ｔｎ１０トランスポゾンによって与えられる）。
【００３６】
このＳＣ３が示すＧＳ欠乏は、ＳＣ３をプラスミドｐＧＳ１２で形質転換することによって補完された。このプラスミドは、ベクターｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）を基にしており、これは、プロモーターの下流に沿ってクローン化した遺伝子を高レベルで発現させるためのキメラ細菌プロモーターｔｒｃを有する低コピー数のプラスミドである。このプラスミドはまた、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有している。葉緑体形態のPisum sativum ＧＳ遺伝子（Tingey, S.V.、 Tsai, F.-Y.、 Edwards, J.W.、 Walker, E.L.およびG,N, Coruzzi (1988）J. Biol Chem. 263:9651-9657）をそのｔｒｃプロモーターの背後にクローン化し、その結果として、このプラスミドを有する大腸菌の中で植物ＧＳ蛋白質の産生が行われる。ＧＳが欠乏している大腸菌株を豆のＧＳで補完した菌株を、ＳＣ３（ＧＳ１２）と表示する。
【００３７】
大腸菌菌株ＳＣ３（ＧＳ１２）の培養物をグリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）から出発させるか、或はプレートからの単一コロニーから出発させた後、５０ｍＬのＭ９ＡＴＫ液体培地中３０℃で一晩増殖させる。
【００３８】
以下に示すように、試験プレートは、Ｍ９ＡＴＫ寒天で構成されており、そして逆転プレートは、Ｍ９ＡＴＫＧ寒天で構成されている。
【００３９】
培地：
完成したＭ９ＡＴＫ液体：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
９７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間オートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン
１．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン
完成したＭ９ＡＴＫ寒天：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
４７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
ボトル２：
１５ｇのＤＩＦＣＯ寒天
５００ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン
１．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン
Ｍ９ＡＴＫＧ：
上述した如くＭ９ＡＴＫ培地を製造。
【００４０】
他のものをボトル１に添加すると共に２５ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬグルタミンを加える。
【００４１】
試験プレート：
１．  Ｍ９ＡＴＫボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００４２】
２．  ５０℃に冷却する。
【００４３】
３．  ＳＣ３（ＧＳ１２）一晩培養物（ＯＤ600≒４）を１０ｍＬ加える。
【００４４】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【００４５】
逆転プレート：
１．  Ｍ９ＡＴＫＧボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００４６】
２．  ５０℃に冷却する。
【００４７】
３．  ＳＣ３（ＧＳ１２）一晩培養物（ＯＤ600≒４）を１０ｍＬ加える。
【００４８】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【００４９】
これらのプレート内の培地を固化させた後３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。対照除草剤であるビアラホスを、そのストックの５μＬを用いて、各プレートに塗布する。これらのプレートを３０℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーンを示す。
【００５０】
スクリーニング結果
１００倍希釈した後のＳＣ３（ＧＳ１２）一晩培養物が示す吸収（ＯＤ600）は約１．０±０．１である。３０℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレートは、完全集密したＳＣ３（ＧＳ１２）増殖を示している。正の除草剤対照であるビアラホスが示す阻害ゾーンは８−１２ｍｍである。
【００５１】
１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる２３種の抗菌化合物を用いてＳＣ３（ＧＳ１２）を試験する。表ＩＶを参照のこと。これらの化合物のいずれも、グルタミンによる拮抗作用を受けない。
【００５２】
加うるに、多様な天然産物である抗生物質を代表する化合物の一団を、ＳＣ３（ＧＳ１２）に対して試験する。表Ｖを参照のこと。これらの化合物のいずれもグルタミンによる拮抗作用を受けない。
【００５３】
種々の有機体を培養する目的で用いられている培地の代表的な１組の異なる発酵培地またはブロスもまた試験する。補完を行っていないＳＣ３が示す最小培地内増殖を支持する能力に関して、これらの培地を試験する。ミクロタイタープレートの中でこれらの培地を試験する。
【００５４】
実施例２  −  アセトヒドロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）の阻害剤に関する機構を基としたスクリーニング
材料および方法
ｌｅｕＢ（リンゴ酸イソプロピルデヒドロゲナーゼ）、ｉｌｖＩＨ（ＡＨＡＳＩＩＩの大型および小型サブユニット）およびｉｌｖＢ（ＡＨＡＳ Ｉの大型サブユニット）に関する欠失を含んでおりそしてまたｉｍｐ（上昇した膜透過率）変異を有する大腸菌株を構築した。このｉｍｐ変異を有する細菌株の構築に関しては実施例１に詳述してある。ｉｌｖＧＭ座位（ＡＨＡＳ ＩＩの大型および小型サブユニット）は、全てのＫ−１２大腸菌株において不活性である。従って、このＳＣ２と表示する大腸菌株は、ＡＨＡＳ活性が欠乏しており、最小培地上で増殖するには、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシンおよびバリンを必要としている。これらの細菌の細胞はまた、このＳＣ２株の構築で用いたＴｎ１０およびＴｎ１０Ｋａｎトランスポゾンが存在していることで、テトラシクリンとカナマイシンに耐性を示す。
【００５５】
アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子（これの単離および特徴付けはPlant Physiol. 85:1110-1117 (1987)）の中に記述されている）を、細菌の発現プラスミドｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）にクローン化した。このプラスミドは、ｔｒｃキメラ細菌プロモーターの背後にクローン化したＡＨＡＳ遺伝子を含んでいる低コピー数のプラスミドである。このプラスミドはまた、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有している。ＡＨＡＳ発現ベクターを用いてＳＣ２細胞を形質転換することで菌株ＳＣ２／ＡＣ２０１を生じさせ、その結果として、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子によるＳＣ２ ＡＨＡＳ変異の補完が生じる。補完により、ロイシン（これは、ｌｅｕＢ変異が存在していることから必要である）のみを補った最小培地上におけるその細胞の増殖が可能になる。
【００５６】
大腸菌株ＳＣ２／ＡＣ２０１をグリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）から出発させるか、或はＭ９ＡＴＫＬプレートからの単一コロニー（２週才未満）から出発させた後、５０ｍＬのＭ９ＡＴＫＬ液体培地中３７℃で一晩増殖させる。Ｍ９ＡＴＫＬ寒天で構成されている試験プレート、およびＭ９ＡＴＫＩＬＶ寒天で構成されている逆転プレートを下記の如く調製する。
【００５７】
培地：
完成したＭ９ＡＴＫＬ液体：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
９７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間オートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン
１．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン
２．０ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−ロイシン
完成したＭ９ＡＴＫＬ寒天：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
４７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
ボトル２：
１５ｇのＤＩＦＣＯ寒天
５００ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン
１．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン
２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−ロイシン
完成したＭ９ＡＴＫＩＬＶ寒天：
上述した如くＭ９ＡＴＫＬ培地を製造。
【００５８】
他のものをボトル１に添加すると共に２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリンを加える。
【００５９】
試験プレート：
１．  Ｍ９ＡＴＫＬボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００６０】
２．  ５０℃に冷却する。
【００６１】
３．  ＳＣ２／ＡＣ２０１一晩培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００６２】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【００６３】
逆転プレート：
１．  Ｍ９ＡＴＫＩＬＶボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００６４】
２．  ５０℃に冷却する。
【００６５】
３．  ＳＣ２／ＡＣ２０１一晩培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００６６】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【００６７】
プレート内の培地を固化させた後、約３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。対照であるイマゼタピル（imazethapyr）を、そのストック（４℃の５０％ＤＭＳＯ／水中１０μＭのイマゼタピル）の５μＬを用いて、各プレートに塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物（即ちＡＨＡＳ活性を阻害する化合物）は、その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーンを示す。
【００６８】
スクリーニング結果
１００倍希釈した後のＳＣ２／ＡＣ２０１一晩培養物が示す吸収（ＯＤ600）は約１．０±０．１である。３７℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレートは、完全集密したＳＣ２／ＡＣ２０１増殖を示している。正の除草剤対照であるイマゼタピルが示す増殖阻害ゾーンは約１０ｍｍである。
【００６９】
１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる、実施例１の表ＩＶに挙げる２３種の抗菌化合物（これらのいずれも、ＡＨＡＳ活性を阻害することによる活性を示さない）を対照として用いて、ＳＣ２／ＡＣ２０１の増殖阻害に関する試験を行う。試験したこれらの化合物のいずれも、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用を受けない。言い換えれば、これらの化合物のいずれも、試験プレートを逆転プレートと比較した時、増殖に関して差別的効果を示さない。
【００７０】
上に挙げた抗菌化合物に加えて、多様な天然産物である抗生物質を代表する化合物の一団を、ＳＣ２／ＡＣ２０１に対して試験した。実施例１の表Ｖを参照のこと。この挙げた化合物のいずれも、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用を受けない。
【００７１】
表ＩＶ  −−  試験した抗菌化合物
化合物                                      Ａｍｔ／盤
カナマイシン（Kanamycin）                   ３０μｇ
ニトロフラントイン（Nitrofurantoin）        ３０μｇ
ナリジクス酸（Nalidixic Acid）              ３０μｇ
ゲンタマイシン（Gentamycin）                １０μｇ
セフォキシチン（Cefoxitin）                 ３０μｇ
クリンダマイシン（Clindamycin）               ２μｇ
スルフィソキサゾール（Sulfisoxazole）         ２ｍｇ
トリメトプリム（Trimethoprim）                ５μｇ
クロラムフェニコール（Chloramphenicol）     ３０μｇ
トリプルサルファ（Triple Sulfa）              １ｍｇ
アンピシリン（Ampicillin）                  １０μｇ
リンコマイシン（Lincomycin）                  ２μｇ
ポリミキシンＢ（Polymixin B）             ３００Ｕ
セファマンドール（Cefamandole）             ３０μｇ
ノボビオシン（Novobiocin）                  ３０μｇ
セファロリジン（Cephaloridine）             ３０μｇ
コリスチン（Colistin）                      １０μｇ
エリスロマイシン（Erythromycin）            １５μｇ
アミカシン（Amikacin）                      ３０μｇ
テトラサイクリン（Tetracycline）            ３０μｇ
ペニシリン（Penicillin）                    １０Ｕ
バンコマイシン（Vancomycin）                ３０ｍｇ
表Ｖ  −−  天然産物である抗生物質化合物
フェナジンアルファ−ＣＯＯＨ（Phenazine Alpha-COOH）
テレイックアシッド（Terric Acid）
カルブラリン（Curvularin）
ミトマイシンＡ（Mitomycin A）
カルダリオマイシン（Caldariomycin）
４−デジメチルアミノ−４−メチルアミノ−アンヒドロテトラシクリン
バリノマイシン（Valinomycin）／ミチシド（Miticide）
ブラスチシジン”Ｓ”（Blasticidin "S"）
アクチチアジックアシッド（Actithiazic Acid）／ミコバシジン（Mycobacidin）
フレノリシン（Frenolicin）（ＡＣ８６０アルファ）
グリセオフルビン（Griseofulvin）、−５−ＯＨ
パリタンチン（Palitantin）
アスパルトシン（Aspartocin）、Ｎａ塩
抗生物質Ｚ−１２２０Ａ＃３
クラシンアセテート（Crassin Acetate）
抗生物質ＢＬ５８０アルファ
抗生物質ＢＭ７８２アルファ−１
抗生物質Ｃ２３０２４アルファ
抗生物質Ｃ０８０７８アルファ
アヴィラマイシン（Avilamycin）
抗生物質Ｄ４９１９４アルファ
抗生物質Ｄ４９１９４ベータ−１
抗生物質Ｆ２８２４９オメガ
オーレオチン（Aureothin）
パロモマイシン（Paromomycin）、スルフェート
クラバシン（Clavacin）／パツリン（Patuli）
コプラゲンＩ（Copragen I）
カスガマイシン（Kasugamycin）
クロラムフェニコール（Chloramphenicol）
バシトラシン（Bacitracin）
ポリミキシン（Polymyxin）−Ｂ−ＳＯ４
ビオマイシン（Viomycin）、スルフェート
抗生物質Ｅ１９０８５アルファ
Ｄ４２０６７アルファ
抗生物質Ｆ２８２４９アルファ
抗生物質Ｅ１９０２０アルファ
抗生物質Ｆ４２２４８アルファ
サイクロセリン（Cycloserine）
イソキノシクリン（Isoquinocycline）ＨＣｌ（ＡＡ５７５ガンマ）
モキシデクチン（Moxidectin）
リンコマイシン（Lincomycin）ＨＣｌ
抗生物質Ａ０３４１ベータ、塩酸塩
ストレプトグラミン（Streptogramin）／ベルチマイシン（Vertimycin）
モナゾマイシン（Monazomycin）
抗生物質ＡＣ５４１、スルフェート
抗生物質Ａ１５３１
アングストマイシン（Angustmycin）
エタマイシン（Etamycin）、Ｎａ塩
抗生物質Ｂ０２９６４コンプレックス
モシマイシン（Mocimycin）
抗生物質Ａ７３６３
抗生物質Ａ９５３７
アクチノマイシンクルード（Actinomycin Crude）
レボマイシン（Levomycin）
抗生物質ＡＭ３７４ ＃２２
アンチプロトゾイン（Antiprotozoin）／アンチプロトゾイン（Antiprotozoin）フサリニックアシッド（Fusarinic Acid）
抗生物質Ａ４８２５
抗生物質Ｖ２４１Ｗ
抗生物質Ｖ２１４Ｘ
レロマイシン（Relomycin）、ＬＬ−ＡＭ６８４ベータ
アンフォマイシン（Amphomysin）、Ｃａ
ノボビオシン（Novobiocin）
ヒグロマイシンＡ（Hygromycin A）
プロマイシン アミノヌクレオシド（Puromycin Aminonucleoside）
プロマイシン（Puromycin）ＨＣｌ
ヌクレオシジン（Nucleocidin）
抗生物質ＢＰ１２アルファ
ロイカニシジン（Leucanicidin）
抗生物質ＢＭ１２３アルファ、ＳＯ４
デクロマイシン（Declomycin）ＨＣｌ
ギベレリックアシッド（Gibberellic Acid）
アラゾペプチン（Alazopeptin）
ニスタチン（Nystatin）
カルボマイシン（Carbomycin）
ノシヘプチド（Nosiheptide）
ネトロプシン（Netropsin）、ＨＣｌ
アボパルシン（Avoparcin）、スルフェート
ミコルホジン（Mycorhodin）
抗生物質Ｃ１９００４アルファ
ボトロマイシン（Bottromycin）
抗生物質ＡＦ２８３アルファ
抗生物質ＡＦ２８３ベータ
レモノマイシン（Lemonomycin）
抗生物質ＢＯ４０６８
センフォロマイシン（Senfolomycin）（ＲＡ６９５０ベータ−Ａ）
抗生物質ＲＡ６９５０ベータ−Ｂ
抗生物質１５Ｅ０３８アルファ
ノナクチン（Nonactin）（ＡＥ４０９ガンマ）
抗生物質ＡＭ３１ベータ＆ガンマ
ロイコマイシン（Leucomycin）
ウスニックアシッド（Usnic Acid）
ニュートラムシン（Neutramcin）
シトリニン（Citrinin）
ゲルダマイシン（Geldamycin）
抗生物質ＢＭ１２３ガンマ、ＨＣｌ
実施例３  −  イミダゾリドン耐性を示す形態のアセトヒドロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）の阻害剤に関する機構を基としたスクリーニング
材料および方法
イミダゾリドン耐性を示す形態の植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼの阻害剤のためのスクリーニングで用いるには、実施例２に記述した大腸菌株ＳＣ２が適当な株である。この株は、ｌｅｕＢ、ｉｌｖＩＨおよびｉｌｖＢに関する欠失を含んでいると共に、不活性なｉｌｖＧＭ座位を含んでいる。加うるに、この菌株は、上昇した透過率変異、即ちｉｍｐを有している。この株のより詳細な記述に関しては実施例２を参照のこと。
【００７２】
イミダゾリドン耐性を示すＡＨＡＳ遺伝子によるＳＣ２のＡＨＡＳ欠乏の補完により、ロイシン（ｌｅｕＢ変異で必要とされている）のみを補った最小培地上でその菌株が増殖することが可能になる。ＳＣ２内のＡＨＡＳ欠乏を補完する目的で用いた変異ＡＨＡＳ遺伝子を、例えば容易に利用できる細菌発現プラスミド内でクローン化するか或はサブクローン化する。
【００７３】
このスクリーニングにおける試験および逆転プレートで用いた培地は、植物ＡＨＡＳの阻害剤に関するスクリーニングで記述した実施例２に記述したのと同じである。その方法もまた実施例２に記述したのと同じであるが、但し、ＡＨＡＳ活性は欠乏しているがイミダゾリドン耐性植物ＡＨＡＳ遺伝子によってその変異が補完される変異細菌株（例えば菌株ＳＣ２／ＡＣ１５２）の一晩培養物をその試験および逆転プレートに接種する。
【００７４】
スクリーニング結果
１００倍希釈した後のＳＣ２／ＡＣ１５２一晩培養物が示す吸収（ＯＤ600）は約０．９５０±０．０７である。３７℃で一晩増殖させた後、実施例２および上に記述した如く調製したプレートは、完全集密したＳＣ２／ＡＣ１５２増殖を示している。
【００７５】
ＢＢＬから得られる２３種の抗菌化合物（実施例１の表ＩＶに挙げる）（これらのいずれも、野生型植物のＡＨＡＳ活性を阻害することによる活性を示さない）を用いて、ＳＣ２／ＡＣ１５２を試験する。これらの化合物のいずれも、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用を受けない。表ＩＶに挙げた抗菌化合物に加えて、多様な天然産物である抗生物質を代表する化合物の一団を、ＳＣ２／ＡＣ１５２に対して試験した。実施例１の表Ｖを参照のこと。この挙げた化合物のいずれも、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用を受けない。
【００７６】
実施例４  −  ３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シンターゼの阻害剤に関する機構を基としたスクリーニング
材料および方法
大腸菌株ＨＥ６２８は、ａｒｏＦ（チロシン抑制性ＤＡＨＰシンターゼ）、ａｒｏＧ（フェニルアラニン抑制性ＤＡＨＰシンターゼ）およびｔｙｒＡ（コリスメートムターゼ（chorismate mutase）／プレフェネート（prephenate）デヒドロゲナーゼ）に関する欠失を含んでいる（Garner, C.C.およびK.M. Herrmann (1985) J. Biol. Chem. 260:3820-3825）。これらの細胞は、増殖に関してチロシンを要求するが、トリプトファンによるａｒｏＨ（トリプトファン抑制性を示すＤＡＨＰシンターゼ）のフィードバック阻害のため、チロシンとトリプトファンを４０μｇ／ｍＬ補った最小培地上で増殖することはできない。これらの細胞を、実施例１に記述した如きｉｍｐ表現型を有するようにした。植物ＤＡＨＰシンターゼでＨＥ６２８を補完して菌株ＨＥ８２８／ｐＬＷ３−２１０を生じさせると、これらの細胞はトリプトファンおよびチロシン上で増殖することが可能になる。細菌の発現プラスミドｐＫＫ２３３−２にクローン化した大腸菌株およびジャガイモＤＡＨＰシンターゼの供給を、Purdue UniversityのDr. Klaus Herrmannから受けた。この発現プラスミドはｔｒｃキメラ細菌プロモーターの制御下にあるジャガイモＤＡＨＰシンターゼを含んでいる低コピー数のプラスミドである。このプラスミドはまた、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有している。
【００７７】
グリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）から出発させるか或はＭ９ＡＴＴプレートからの単一コロニーから出発させた５０ｍＬのＭ９ＡＴＴ液体培地中３７℃で、振とうしながら、大腸菌細胞（ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０）の一晩培養物を増殖させる。Ｍ９ＡＴＴ寒天で構成されている試験プレート、およびＭ９ＡＴＴＦ寒天で構成されている逆転プレートを下記の如く調製する。
【００７８】
培地：
完成したＭ９ＡＴＴ液体：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
９７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間オートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
１．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−トリプトファンおよびＬ−チロシン
完成したＭ９ＡＴＴ寒天：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
４７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
ボトル２：
１５ｇのＤＩＦＣＯ寒天
５００ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
１．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−トリプトファンおよびＬ−チロシン
完成したＭ９ＡＴＴＦ寒天：
上述した如くＭ９ＡＴＴ培地を製造。
【００７９】
他のものをボトル１に添加すると共に１．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−フェニルアラニンを加える。
【００８０】
試験プレート：
１．  Ｍ９ＡＴＴボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００８１】
２．  ５０℃に冷却する。
【００８２】
３．  ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０一晩培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００８３】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【００８４】
逆転プレート：
１．  Ｍ９ＡＴＴＦボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００８５】
２．  ５０℃に冷却する。
【００８６】
３．  ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０一晩培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００８７】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【００８８】
これらのプレート内の培地を固化させた後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培養した後、これらの対抗する試験および逆転プレート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーンを示す。
【００８９】
スクリーニング結果
１００倍希釈した後のＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０一晩培養物が示す吸収（ＯＤ600）は約１．２１±０．０４である。３７℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレートは、完全集密したＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０増殖を示している。
【００９０】
１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる、２３種の抗菌化合物（ＤＡＨＰシンターゼの阻害を含まない公知様式の作用を示す）を対照として用いて、ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０を試験する。実施例１の表ＩＶを参照のこと。試験したこれらの化合物のいずれも、フェニルアラニンによる拮抗作用を受けない。
【００９１】
加うるに、多様な天然産物である抗生物質および種々の化学的構造を代表する化合物の一団を、ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０に対して試験した。実施例１の表Ｖを参照のこと。これらの化合物が示す効果のいずれも、フェニルアラニンによる拮抗作用を受けなかった。
【００９２】
実施例５  −  ジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）の阻害剤に関する機構を基としたスクリーニング
材料および方法
大腸菌株ＡＴ９９７（Yeh, P.、 Sicard, A.M.およびA.J. Sinskey (1988)、 Mol. Gen. Genet. 212:105ー111）は、ｄａｐＡ遺伝子内の変異が原因でＤＨＰＳ活性が欠如している。その結果として、この菌株の増殖にはジアミノピメリン酸が必要である。この欠乏は、細胞壁の生合成でもジアミノピメレートが必要とされていることから、リジンでは補完されない。従って、このスクリーニングは、最小培地ではなく豊富なブロス上で行われ得る。この菌株はまた、ｉｍｐ変異を有しており、その結果として増大した膜透過性を示す。ｉｍｐ株の構築に関しては実施例１に記述してある。この菌株におけるｄａｐＡ遺伝子内の遺伝的欠陥を、プラスミドｐＺＭＤＨＰＳ５（Frisch, D.A.、 Tommey, A.M.、 Gegenbach, B.G.およびD.A. Somers (1991)、 Mol. Gen. Genet. 228:287-293）、即ちｌａｃプロモーター制御下のＤＨＰＳのためのトウモロコシｃＤＮＡを含んでいるｐＵＣ１９ベクターでこの菌株を形質転換することによって補完した。ｐＺＭＤＨＰＳ５はまた、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子も有している。このｐＺＭＤＨＰＳ５プラスミドを有する変異大腸菌株をＤＨＰＳ／ＡＴ９９７と表示した。
【００９３】
ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７大腸菌細胞の一晩培養物を単一コロニーからか或はグリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）から出発させた後、３７℃の５０ｍＬＬＢＡ（Luria Broth Base）中で振とうしながら増殖させる。
【００９４】
ＬＢＡ寒天から成る試験プレート、およびＬＢＡＤａｐ寒天から成る逆転プレートを下記の如く調製した。
【００９５】
培地：
ＬＢＡ：
２５ｇのGIBCO／ＢＲＬ Luria Broth Base粉末
１Ｌの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中の５００ｍＬをオートクレーブ
冷却した時点で、各ボトルに０．５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックを加える。
【００９６】
ＬＢＡ寒天：
２５ｇのGIBCO／ＢＲＬ Luria Broth Base粉末
１５ｇのBacto寒天
１Ｌの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中の５００ｍＬをオートクレーブ
プレートに注ぐに先立って、各ボトルに０．５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックを加える。
【００９７】
ＬＢＡａｐ寒天：
２５ｇのGIBCO／ＢＲＬ Luria Broth Base粉末
１５ｇのBacto寒天
１Ｌの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中の５００ｍＬをオートクレーブ
プレートに注ぐに先立って、各ボトルに０．５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックと２５ｍｇのＤ，Ｌ−α，ε−ジアミノピメリン酸（Sigma）を加える。
【００９８】
試験プレート：
１．  ５００ｍＬのＬＢＡ寒天、溶融。
【００９９】
２．  ５０℃に冷却する。
【０１００】
３．  各ボトルにＤＨＰＳ／ＡＴ９９７一晩培養物（ＯＤ600＝１）を５ｍＬ加える。
【０１０１】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１０２】
逆転プレート：
１．  ５００ｍＬのＬＢＡａｐ寒天、溶融。
【０１０３】
２．  ５０℃に冷却する。
【０１０４】
３．  各ボトルにＤＨＰＳ／ＡＴ９９７一晩培養物（ＯＤ600＝１）を５ｍＬ加える。
【０１０５】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１０６】
これらのプレート上の培地を固化させた後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個のウエル／プレート、１２ｘ１２列、直径５ｃｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーンを示す。
【０１０７】
スクリーニング結果
上述した如く培養したＬＢＡ中のＤＨＰＳ／ＡＴ９９７一晩培養物が示す６００ｎｍにおける吸収は約１．０±０．１１である。３７℃で一晩培養した後、記述した如く調製したプレートは、集密したＤＨＰＳ／ＡＴ９９７増殖を示している。
【０１０８】
１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる１組の標準抗菌化合物を、ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７に対して試験する。実施例１の表ＩＶを参照のこと。これらの化合物のいずれも、ジアミノピメリン酸による拮抗作用を受けない。加うるに、多様な抗生物質および化学品を代表する天然産物化合物の一団を、ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７に対して試験する。実施例１の表Ｖを参照のこと。これらの化合物のいずれも、ジアミノピメリン酸による拮抗作用を受けない。
【０１０９】
実施例６  −  ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の阻害剤に関する機構を基としたスクリーニング
材料および方法
E. coli Genetics Stock Center、 Yale Universityから入手した大腸菌株ｔｒｐＤ９９２３は、ｔｒｐＤ遺伝子内に変異を有することから、ＰＡＴ活性が欠乏している。この菌株は増殖に関してトリプトファンを要求する。この遺伝的欠乏は、Dr. Rob Last（Boyce Tompson Institute）から入手したプラスミドｐＡＣＴ１３でこのｔｒｐＤ大腸菌株を形質転換することによって補完された。ｐＡＣＴ１３は、ｌａｃプロモーター制御下のＰＡＴのためのアラビドプシスｃＤＮＡを含んでいるλＹＥＳベクターである（Rose, A.B.他、 Plant Physiol. 100:582-592 (1992)）。このＰＡＴ遺伝子を有する変異大腸菌株はまた、膜透過性を増大させるためのｉｍｐ変異を包含するように修飾されている（実施例１により詳しく記述してある）。ｐＡＣＴ１３はまた、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を含んでいる。このｐＡＣＴ１３プラスミドを有する変異大腸菌株をＰＡＴ／ｔｒｐＤと表示した。
【０１１０】
単一のコロニーからか或はグリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）からＰＡＴ／ｔｒｐＤ大腸菌細胞の一晩培養物を開始させた後、５０ｍＬのＭ９Ａ中３７℃で振とうしながら増殖させる。Ｍ９Ａ寒天から成る試験プレート、およびＭ９ＡＷ寒天から成る逆転プレートを下記の如く調製する。
【０１１１】
培地：
完成したＭ９Ａ液体：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
９７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間オートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン
完成したＭ９Ａ寒天：
ボトル１：
１０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO）
４７０ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
ボトル２：
１５ｇのＤＩＦＣＯ寒天
５００ｍＬの蒸留水
２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレーブ
使用前のボトル１に下記を添加：
１０ｍＬの２０％グルコース
１０ｍＬの５％ＮａＣｌ
１０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2
１ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4
２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン
０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン
２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン
完成したＭ９ＡＷ寒天：
上述した如くＭ９Ａ培地を製造。
【０１１２】
他のものをボトル１に添加すると共に１．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬトリプトファンを加える。
【０１１３】
試験プレート：
１．  Ｍ９Ａボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【０１１４】
２．  ５０℃に冷却する。
【０１１５】
３．  各ボトルにＰＡＴ／ｔｒｐＤ一晩培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【０１１６】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１１７】
逆転プレート：
１．  Ｍ９ＡＷボトル１と２（溶融）を一緒にすることで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【０１１８】
２．  ５０℃に冷却する。
【０１１９】
３．  各ボトルにＰＡＴ／ｔｒｐＤ一晩培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【０１２０】
４．  ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオトレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１２１】
これらのプレート上の培地を固化させた後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個のウエル／プレート、１２ｘ１２列、直径５ｃｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーンを示す。
【０１２２】
スクリーニング結果
上述した如く培養したＭ９Ａ中のＰＡＴ／ｔｒｐＤ一晩培養物が示す６００ｎｍにおける吸収は約１．０±０．１４である。３７℃で一晩培養した後、記述した如く調製したプレートは、集密したＰＡＴ／ｔｒｐＤ増殖を示している。
【０１２３】
１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる１組の標準抗菌化合物（実施例１の表ＩＶ参照）を、ＰＡＴ／ｔｒｐＤに対して試験する。これらの化合物のいずれも、トリプトファンによる拮抗作用を受けない。加うるに、多様な抗生物質および化学品を代表する天然に存在している化合物の一団を、ＰＡＴ／ｔｒｐＤ（実施例１の表Ｖを参照）に対して試験する。これらの化合物のいずれも、トリプトファンによる拮抗作用を受けない。
【０１２４】
更に、多様な発酵培地の集団も試験する。これらの培地のいずれも、形質転換していないｔｒｐＤ大腸菌株の増殖を支持せず、またこれらは、ｔｒｐＤまたはＰＡＴ／ｔｒｐＤ株の増殖も阻害しない。
【０１２５】
最後に、標準的除草剤団を代表する種々の化合物のスクリーニングを行う。（以下の表ＶＩを参照）。ここに挙げた化合物のいずれも、このスクリーニングでは、活性を示す阻害剤ではない。
【０１２６】
表ＶＩ  −−  除草剤
化合物
Ｆ３８１４−５２５パーフルイドン（Perfluidone）
２−０１４−１オキサジアゾン（Oxadiazon）
シマジン（Simazine）（ＣＬ１５３９５）
ノレア（Norea）（ＣＬ２６０８）
モヌロン（Monuron）
フェヌロン（Fenuron）
プラナビン（Planavin）
メフルイジド（Mefluidide）
ＣＭＵ（ＣＬ１４２５５）
パラクアット（Paraquat）
ネブロン（Neburon）
マレイン酸ヒドラジド（ＣＬ６３７４）
シルベックスアシッド（Silvex Acid）（ＣＬ３５８６１）
ジフェナミド（Diphenamid）（ＣＬ８７４１７）
テブツイロン（Tebuthuiron）
ノルフルラゾン（Norflurazon）
シプロミド（Cypromid）
ＣＩＰＣ
シデュロン（Siduron）
ノルフルラゾン（Norflurazon）
ＩＰＣ
メフルイジド（Mefluidide）（ＣＬ１１７２０４）、ＥＭＢＡＲＫ
ベネフィン（Benefin）
２，３，５−トリクロロ安息香酸
ＤＡＣＴＨＡＬ
デスメジファム（Desmedipham）
トリフルラリン（Trifluralin）
ＤＤＴ（ＣＬ２０１３）
アトラトン（Atratone）
コンセプＩＩ（Concep II）
プロパジン（Propazine）
トリアレート（Triallate）
フェンメジファム（Phenmedipham）
ビフェノックス（Bifenox）
ＰＰＧ８４４
ＣＤＥＣ（Vegedex）
ビアラホス（Bialaphos）
チオベンカルブ（Thiobencarb）（Bolero tech）
イソプロパリン（Isopropalin）
プレファー（Prefar）
ジアレート（Diallate）（Avadex tech）
チラム（Tillam）
ＣＤＥＡ（ＣＬ２５２２４）
本分野の技術者は、常規のみの実験を用いることで、ここに記述した特定具体例に対する数多くの相当物を認識するか或は確かめることができるであろう。上記相当物を請求の範囲に包含させることを意図している。  本発明の特徴および態様は以下のとうりである。
【０１２７】
１．  ａ）微生物株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖させ得る必須植物産物をコード化する植物遺伝子を微生物株内で発現させ；
ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるがこの必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）その必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆転培養物を生じさせ；
ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物である、
植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１２８】
２．  該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物グルタミンシンセターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物ジヒドロジピコリネートシンターゼの全てまたは一部をコード化する、第１項記載の方法。
【０１２９】
３．  ａ）ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼをコード化する植物遺伝子を発現する微生物株を、（１）ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼが欠乏しているか或はアントラニレートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り出される化合物が欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが、トリプトファン、および他の、アントラニレートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り出される化合物、が不足している試験条件、および（２）トリプトファンか、或は他の、アントラニレートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り出される化合物、を含んでいる逆転条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害する化合物である、
植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３０】
４．  ａ）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している試験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物である、
植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３１】
５．  ａ）植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼを阻害する化合物である、
３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３２】
６．  ａ）植物グルタミンシンセターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）グルタミンシンセターゼおよびグルタミン両方が欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、グルタミンシンセターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切である、グルタミンが不足している試験条件、および（２）グルタミンが含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、グルタミンシンセターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、植物グルタミンシンセターゼを阻害する化合物である、
植物グルタミンシンセターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３３】
７．  ａ）植物ジヒドロジピコリネートシンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）ジヒドロジピコリネートシンターゼおよびジアミノピメリン酸両方が欠乏している状態の微生物株は増殖できないところの、ジヒドロジピコリネートシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切である、ジアミノピメリン酸が不足している試験条件、および（２）ジアミノピメリン酸が含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ジヒドロジピコリネートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物である、
植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３４】
８．  必須植物産物をコード化する植物遺伝子の全てまたは一部を発現する能力を有しており、ここで、この発現により、この微生物株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在なしでもこの微生物株の増殖が可能になるところの、必須植物遺伝子産物を阻害する化合物の同定で有効な微生物株。
【０１３５】
９．  該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物グルタミンシンセターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する遺伝子が植物ジヒドロジピコリネートシンターゼの全てまたは一部をコード化する、第８項記載の微生物株。
【０１３６】
１０．  ａ）微生物株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖させ得る必須植物産物をコード化する変異植物遺伝子を微生物株内で発現させ；
ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、その必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるがこの必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験条件下で維持することにより、その微生物株が増殖している培養物を生じさせ；
ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している培養物を、野生型必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖阻害を生じさせるに充分な量の、その野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤と接触させ；そして
ｄ）その野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤存在下の（ｂ）に記述した条件下で増殖する微生物細胞を同定する；
ことを含み、ここで、上記同定した細胞は、その野生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である、
野生型植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する微生物細胞を同定する方法。
【０１３７】
１１．  ａ）微生物株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖させ得る除草剤耐性を示す必須植物産物をコード化する変異植物遺伝子を微生物株内で発現させ；
ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるがこの除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）その除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆転培養物を生じさせ；
ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の成長に必要な除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻害する化合物である、
植物の成長に必要な除草剤耐性を示す変異必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３８】
１２．  ａ）イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する植物遺伝子を発現する微生物株を、（１）イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している試験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ；
ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして
ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を同定する；
ことを含み、ここで、上記化合物は、イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物である、
イミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３９】
１３．  除草剤耐性を示す必須植物産物の全てまたは一部をコード化する植物遺伝子を発現する能力を有しており、ここで、この発現により、この微生物株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在なしでもこの微生物株の増殖が可能になるところの、除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻害する化合物の同定で有効な微生物株。
【０１４０】
１４．  該除草剤耐性を示す必須植物産物の全てまたは一部をコード化する遺伝子がイミダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼの全てまたは一部をコード化する第１３項記載の微生物株。