(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる結合剤を固体支持体上の分離された位置に固定化させる方法であって、各々の結合剤は供された被検体に特異的な結合部位と、尾部とを有し、該方法が、
（ａ）固体支持体上の分離された位置に複数の捕獲剤を固定化するステップであって、各々の捕獲剤が供された結合剤の尾部に結合できることを特徴とするステップと、
（ｂ）前記結合剤を、前記複数の捕獲剤が固定化された固体支持体と接触させて、前記結合剤がその尾部によりその各々の捕獲剤と特異的に結合するに至るようにするステップ、
を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブリッド形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記方法が、前記支持体に前記結合剤を固定化する前に、該結合剤に前記尾部を付着させるステップを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合剤が、被検体に特異的な結合部位を有する抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合剤が核酸被検体とハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
分離された位置がミクロスポットであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法のためのキットであって、該キットが、
（ａ）複数の尾部であって、各々の尾部が結合剤への付着のためであることを特徴とする尾部と、
（ｂ）固体支持体に付着され、尾部に特異的に結合することができる複数の異なる捕獲剤を複数の位置に有する前記固体支持体と、
を含み、前記捕獲剤が、対応する結合剤の前記尾部における相補的配列とハイブリッド形成することができる配列を有するオリゴヌクレオチドであり、前記アッセイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させることにより、前記捕獲剤が付着された前記固体支持体と共に用い得る結合剤を供することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尾部を有する結合剤、特にオリゴヌクレオチド尾部を有する結合剤を用いる結合アッセイに関する。これらの結合アッセイは、液体サンプル中の被検体の濃度を決定するのに有用である。
【０００２】
【先行技術】
固体支持体上に固定化され、被検体に特異的な結合部位を有する結合剤に液体サンプルを接触させ、結合した被検体を有する結合剤を分離し、そして被検体により占有されている結合剤の結合部位のフラクションを表す値を測定することにより、液体サンプル中の薬又はホルモンのような被検体の濃度を測定することが知られている。典型的には、その後、被検体の周知の濃度を含む一連の標準溶液から得られる値に対して、被検体により占有された結合部位のフラクションを表現する値を比較することによって、液体サンプル中の被検体の濃度が決定され得る。
【０００３】
過去においては、いわゆる競合又は非競合法のいずれかを用いる標識された発現試薬での逆適定により占有された結合部位のフラクションの測定が通常行われていた。
【０００４】
競合法においては、結合した被検体を有する結合剤は典型的にはその被検体の標識されたものであるか又はその結合剤の空の結合部位を認識することができる抗イディオタイプ抗体である標識された発現試薬を用いて、同時又は連続的のいずれかで逆適定される。発現剤は、濃度が測定されている被検体と結合剤上の結合部位について競合すると表現され得る。標識された被検体で占有されるに至った結合部位のフラクションは、その後上述のように被検体の濃度に関連し得る。
【０００５】
非競合法においては、結合した被検体を有する結合剤は、結合した被検体に、又は結合剤上の占有された結合部位のいずれかに結合することができる標識された発現剤で逆適定される。被検体により占有された結合部位のフラクションは、その後標識された発現剤の存在を検出することにより測定され得、ちょうど競合アッセイを用いるように、上述のように液体サンプル中の被検体の濃度に関連し得る。
【０００６】
競合及び非競合法の両方において、発現剤は該発現剤が検出され得るようにマーカーで標識される。過去において種々のマーカー、例えば放射性同位体、酵素、化学発光マーカー及び蛍光マーカーが用いられている。
【０００７】
イムノアッセイの分野において、競合アッセイは、バーソン及びヤロー（Ｂｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙａｌｏｗ）  により説かれる、即ち“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ”（１９７３）１１１〜１１６  頁における設計原理に従って一般に行われている。バーソン及びヤローは、競合イムノアッセイの実行において、結合剤の量がおおよそ３０〜５０％の低濃度の検出されるべき被検体に結合するのに用いられる時に最大の感度が達成されることを提案した。非競合イムノアッセイにおいて、液体サンプル中の１００  ％に近い被検体に結合するのに十分な結合剤を用いて、最大の感受性が達成されると一般的に考えられる。しかしながら、両方の場合において、これらの広く受け入れられている指針に従って設計されたイムノアッセイは、知られているサンプルの量並びに正確に知られて、もしくは一定であることが知られて用いられる結合剤の量を要求する。
【０００８】
国際特許出願ＷＯ８４／０１０３１  号において、液体サンプル中の被検体の濃度は、被検体に特異的な結合部位を有する少量の結合剤に、液体サンプルを接触させることにより測定され得ることを私は開示した。この「  周囲の被検体（ａｍｂｉｅｎｔ  ａｎａｌｙｔｅ）」  法において、結合剤の量が液体サンプル中の被検体の濃度に不十分な影響しか与えない程度の少量であるなら、被検体により占有される結合剤上の結合部位のフラクションがサンプルの量と効果的に無関係である。
【０００９】
このアプローチは、ＥＰ３０４，２０２  において更に精密化される。これは、ＷＯ８４／０１０１３１におけるアッセイ中の感度及び発現の容易さが、Ｖがサンプルの容量でありＫが被検体に対する結合剤のアフィニティー定数である、固体支持体上の小さな領域（又は「ミクロスポット」）上に位置した０．１  Ｖ／Ｋより少ない量の結合剤を用いることにより改良されることを開示する。両方のこれらの引用において、被検体により占有された結合部位のフラクションは、上述のように競合又は非競合技術のいずれかを用いて測定される。
【００１０】
発明の概要
アッセイをより迅速かつ容易に行うことができる増加された速度を有する結合アッセイを開発することの絶え間ない必要性がある。加えて、アッセイの使用者が異なる群の被検体を検出するのに容易に適合させられ得る結合アッセイを提供することが要求されるであろう。
【００１１】
従って、第１の態様において、本発明は液体サンプル中の被検体の濃度を決定する方法であって、
（ａ）固体支持体上に１以上の捕獲剤を固定化するステップであって、各々の捕獲剤が、供された結合剤に特異的に結合することができることを特徴とするステップと、
（ｂ）１以上の結合剤に前記液体サンプルを接触させるステップであって、各々の結合剤が、結合部位のフラクションが被検体により占有されるに至るように供された前記被検体に特異的な前記結合部位と、対応する捕獲剤に結合するのに適合した尾部と、を有することを特徴とするステップと、
（ｃ）前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に結合するに至るように、ステップ（ｂ）と同時又は連続的のいずれかで、前記固定化された捕獲剤に前記液体サンプルを接触させるステップと、
（ｄ）被検体により占有された結合剤の前記結合部位の前記フラクションを測定して前記サンプル中の前記被検体の濃度を決定するステップと、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
従って、本発明は、被検体の結合が固体基体の表面よりむしろ液相において起こることを特徴とするアッセイを提供する。これは被検体と結合剤との反応の速度を増加させる。
【００１３】
これにより、１つの実施形態において、結合及び捕獲剤に液体サンプルを同時に接触させることにより、例えばただ一つの反応容器を用いて、ただ一つのステップにおいてアッセイを行うことが可能になる。あるいは特に液体が血清又は血液であり、非特異的結合が誤差の重要な原因である場合に、結合剤及び捕獲剤の連続的な接触が好ましい。これらの場合において、結合剤は第１の容器において液体サンプルに最初に接触され得、その後サンプルは、捕獲剤が結合剤に結合して固体支持体に結合するのを許容する第２の容器に移される。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、支持体上に１以上の結合剤を固定化する方法であって、各々の結合剤が、供された被検体に特異的な結合部位及び捕獲剤に結合するのに適合した尾部を有し、
（ａ）支持体上に１以上の捕獲剤を固定化するステップであって、各々の捕獲剤が、供された結合剤の尾部に結合することができることを特徴とするステップと、
（ｂ）前記結合剤が該結合剤各々の捕獲剤に該捕獲剤の尾部を通して特異的に結合するに至るように、支持体上に固定化された前記捕獲剤を有する前記支持体に前記結合剤を接触させるステップと、を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１５】
上述の方法は、結合剤を支持体上に固定化された捕獲剤にさらす前に、前記結合剤に前記尾部を付着させるステップを更に含むことができる。
【００１６】
このように異なる群の被検体を測定すること、及び結合剤がその尾部によって個々に結合することができる、支持体上に固定化された捕獲剤を有する一般的な前記支持体と共に適合された結合剤を用いることにおいて、アッセイの使用者が使用のために結合剤を適合させることが可能である。
【００１７】
本発明のこの態様において、結合剤が捕獲剤に結合されるに至った後に、液体サンプルに支持体をさらすことによりアッセイが行われる。
【００１８】
いずれの態様においても、本発明は、結合剤がその尾部を通して基体に固定化された捕獲剤に間接的に結合することを特徴とするアッセイを提供する。
【００１９】
好ましくは、前記捕獲剤は、前記結合剤の尾部を含む相補的配列にハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチド配列である。捕獲剤又は結合剤の尾として作用するオリゴヌクレオチドは、アッセイ中に用いられる厳重な条件下において強くかつ特異的なハイブリッド形成を供するのに十分に長い。典型的には、少なくとも約８又は９ヌクレオチドの長さの相補性オリゴヌクレオチドが用いられる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは好ましくは８〜３０塩基、更に好ましくは１６〜２０塩基の長さである。しかしながら極めて長いポリヌクレオチドを用いることは好ましくない。というのは、これらは異なる捕獲剤に結合する特異性の消滅又は自己ハイブリッド形成を導き、ヘアピンループ（二重鎖領域）を形成し得るからである。しかしながらアッセイ条件のセットに適したオリゴヌクレオチドの長さ及び配列は、当業者により容易に決定され得る。
【００２０】
都合よくは、結合剤は被検体に特異的な結合部位を有する抗体である。従って、支持体上の捕獲剤が液相の結合剤にさらされた時、結合剤は固体支持体に結合するに至る。あるいは、被検体が核酸配列である場合、結合剤はオリゴヌクレオチドであり得る。このように、本実施形態において、結合剤は、被検体とハイブリッド形成することができる第１の配列と尾部として作用する第２の配列とを有する。
【００２１】
好ましくは、液体サンプルの容量を知る必要がないように、ＷＯ８４／０１０３１  号又はＥＰ３０４，２０２  号に開示されるアッセイに従って少量の結合剤が用いられる。このように液体サンプル中の被検体の周囲の濃度に重要な影響を与えないように、結合剤の量は十分に小さくあるべきである。典型的には、５％未満の被検体に結合する量の結合剤を用いることが好ましい。しかしながら、例えば２％又は１％の被検体に結合する、より少量の結合剤を用いることは、更に、被検体の周囲の濃度を乱すことを削減し、被検体濃度を決定することにおいて誤差を最小化することを助ける。
【００２２】
０．１  Ｖ／Ｋモル未満の結合剤を用いてＥＰ３０４，２０２  号に従ってアッセイを行う場合、結合剤に対する被検体の結合のアフィニィー定数（Ｋ）は、標準的な実施に従って測定される。これは、どれだけの量の結合剤が０．１  Ｖ／Ｋモルを構成するかを決定するのに用いられるアフィニティー定数が、アッセイにおいて用いられる条件（例えば反応物、インキュベーションの時間、ｐＨ、温度等）下で得られる値であることを意味する。
【００２３】
好ましくは各々の捕獲剤は、実質的に全ての供された結合剤に結合するために過剰に用いられる。これはアッセイの感度を最大化して、そして用いられる結合剤の量が知られる又は一定であることが知られる必要がある時、アッセイの使用者はアッセイにおいて用いられる実質的に全ての結合剤が支持体上のその捕獲剤に結合するに至ることを確信することができることを確実にする。
【００２４】
好ましくは、捕獲剤の分子は、例えばミクロスポットとして、分離した位置において支持体上に固定化される。これは、支持体上の一連の位置における複数の異なる捕獲剤を用いて、複数の異なる被検体が同時に測定されることを許容する。捕獲剤がミクロスポットとして固定化される場合、アッセイの感度は、高密度で捕獲剤を固定化することが改良され得、これによりシグナル対ノズル比が改良される（例えば我々の同時係属出願ＰＣＴ  ／ＧＢ９４／０２８１４  号を参照のこと）  。０．１  〜１．０  ｍｌの次数のサンプル容量を仮定すると、ミクロスポットは好ましくは、１ｍｍ２  未満の領域と１０００〜１０００００分子／μｍ２  の結合剤の最終表面密度とを有する。
【００２５】
あるいは、供された捕獲剤は、被検体の濃度の一連の測定が同時に行われ得るように、複数の位置において支持体上に固定化され得る。
【００２６】
好ましくは、被検体により占有される結合部位のフラクションは、上述のような競合及び／又は非競合法において発現剤を用いて検出される。発現剤は、結合剤の占有された又は未占有の結合部位に、又は結合した被検体に結合することができ、結合した発現剤が検出されることを可能にするために標識される。好ましくは発現剤は標識された抗体である。
【００２７】
マーカーは、放射性同位体、酵素、化学発光マーカー又は蛍光マーカーであり得る。蛍光染料マーカーを用いることが特に好ましい。というのは蛍光染料は検出のための適切な色の範囲（励起及び発光波長）の蛍光を供するように選択され得るからである。蛍光染料は、クマリン、フルオレセイン、ローダミン及びテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を含む。長期の蛍光期間を有する蛍光染料分子が用いられ得、これにより、バックグラウンドの蛍光が減衰した後時間分解蛍光が蛍光シグナルの長さを測定するのに用いられることを許容する。蛍光もしくは他のマーカーを含む、又は表面上にそれらを有するラテックス（Ｌａｔｅｘ）ミクロスフィアーも本文脈において用いられ得る。マーカーからのシグナルは、レーザー走査共焦顕微鏡を用いて測定され得る。
【００２８】
あるいは化学発光標識のような他の高度に特異的な活性標識を用いることもできる。化学発光標識の場合、結合剤又は発現剤をマークするのに用いられる異なる化学発光標識からのシグナルは、例えばチャージカップルド（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ）  装置（ＣＣＤ）を用いて同時に検出され得る。
【００２９】
結合剤（又はその部分）は、例えば発蛍光団を用いて便利に標識され得る。ＥＰ２７１，９７４  号に説かれる方法に従うと、これはアッセイの使用者が結合剤の量を知ること又はそれが一定であることを知ることが必要でないことを意味する。これは、結合剤からのシグナル及び被検体により占有される結合剤の結合部位のフラクションを示すシグナルの比率が、被検体により占有される結合剤の部位のフラクションに依存するが全量の存在する結合剤には依存しないからである。
【００３０】
あるいは、アッセイの使用者がサンプルの容量を知っているなら、アッセイが周囲の被検体条件下で行われないようにより大量の結合剤を用いることができる。これは、被検体の濃度が、発現剤上の１つの標識を用いて、そして結合剤の量が一定であることを知るかもしくはその量が知られているような第２のマーカーで結合剤を標識するかのいずれかで決定されることを許容する。
【００３１】
（我々の同時係属出願ＰＣＴ  ／ＧＢ９４／０２８１３  号に開示される）  このアプローチの変形において、２つの標識された発現剤、即ち結合剤の未占有の結合部位に特異的に結合することができる第１の発現剤、並びに占有された結合部位もしくは結合した被検体に結合することができる第２の発現剤を用いることができる。このように、いずれのマーカーからのシグナルも被検体により占有された結合部位のフラクションを表し、一方シグナルの総計は用いられた結合剤の全量を表す。
【００３２】
この方法は、固定化された結合剤の量における変化が直ちに補正され得るので、結合剤の一定量が用いられることを知る必要性を避けることもできる。これらの環境下において、サンプル容量Ｖは知られているか、又は一定であるかのいずれかでなければならない。これは、２つの標識された発現剤がサンプル中の被検体の濃度にいかに関係するかを示す以下の式から判断され得る。
【００３３】
占有された結合剤結合部位に対して向けられた発現剤をマークする標識により発せられるシグナルをＳｏとし、
【００３４】
未占有の結合剤結合部位に対して向けられた発現剤をマークする標識により発せられるシグナルをＳｕとし、
占有された又は未占有の部位に対する各々のシグナルに関する定数を各々εｏ  及びεｕ  とし、
Ｋ＝被検体と結合剤との間の反応を支配する有効平衡定数とする。
そして、サンプル中の被検体濃度をＹとすると、
Ｙ＝（Ｓ０／εｏ  ）  〔εｕ  ／（ＫＳｕ）  ＋１／Ｖ〕
Ｖが知られていると仮定すると、この等式は２つの未知の定数、Ｓｏ及びεｕ  ／Ｋを含む。一連の周知の被検体濃度についてシグナルＳｏ及びＳｕを決定することにより、これらの定数は決定され得、未知の被検体濃度は、対応するＳｏ及びＳｕの決定から見積もられる。このようにこのアッセイは周知の被検体条件下で作業を行う必要がない。
周囲の被検体条件下において、１／Ｖ項は無視することができ、Ｓｏ／Ｓｕは周囲の被検体濃度に比例する。
【００３５】
第１のキットの態様において、本発明は、上述のような方法において、液体サンプル中の１以上の被検体の濃度を決定するためのキットであって、該キットが、
（ａ）固体基材に付着し、結合剤に特異的に結合することができる捕獲剤を複数の位置に有する前記固体基材と、
（ｂ）１以上の結合剤であって、各々の結合剤が被検体に特異的な結合部位と、１以上の捕獲剤に結合するのに適合した尾部と、を有することを特徴とする結合剤と、
（ｃ）占有された結合剤結合部位もしくは結合剤に結合した被検体又は未占有の結合剤結合部位に結合することができるマーカーを有する１以上の発現剤と、を含むことを特徴とするキットを提供する。
【００３６】
第２のキットの態様において、本発明は、１以上の被検体の濃度を決定するためのアッセイを適合させるためのキットであって、
（ａ）各々が結合剤への付着のためである１以上の尾部と、
（ｂ）固体基材に付着され、尾部に特異的に結合することができる１以上の捕獲剤を複数の位置に有する固体基材と、
を含み、アッセイの使用者が前記尾部を前記結合剤に付着させることにより、前記捕獲剤が上述のような方法において付着された固体基材と共に用いられ得る結合剤を供することを特徴とするキットを提供する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態は、添付された概略図を参照することにより記載される。
【００３８】
図１〜３は、異なる被検体６、８に特異的な結合部位を有する２種類の結合剤２、４が用いられる結合アッセイを示す。各々の結合剤２、４はオリゴヌクレオチド尾部１２、１６が供された抗体１０、１４を含む。オリゴヌクレオチド尾部は異なるヌクレオチド配列を有し、その配列は、ミクロスポットの形態で固体支持体２２上に固定化された捕獲剤１８、２０の配列の１つに相補的である。この例において、オリゴヌクレオチドは８ヌクレオチド長である。
【００３９】
このアッセイにおいて、サンプル中の２つの被検体６、８は、該被検体６、８のフラクションが抗体１０、１４に結合するに至るように結合剤２、４にさらされる。この反応は液相中でおこるので抗体１０、１４と被検体（抗原）６、８の間の反応の速度は最適化される。
【００４０】
最初の抗体／被検体反応と同時又は連続的に、液体サンプル及び結合剤は、固体支持体２２上に固定化された捕獲剤１８、２０を有する前記固体支持体２２にさらされる。これは結合剤２、４のヌクレオチド配列１２、１６が支持体２２上に固定化された捕獲剤１８、２０の相補性配列に結合することを許容する。これを図２に示す。しかしながら、捕獲剤１６、１８は実質的に全ての結合剤１０、１４が支持体２２に結合することを確実にするため、一般的に過剰に用いられる。このように、図２及び３において、捕獲剤２８の１分子が未占有のものとして残る。
【００４１】
結合剤２、４の結合部位のフラクションは、その後慣用の逆適定技術を用いて決定され得る。このように図３において標識された抗体２４、２６は、各々占有された結合剤２、４の存在をマークするために、非競合技術において用いられる。抗体２４、２６は、マーカー（非表示）で標識されるので、結合剤２、４の結合部位のフラクションが、その後決定され得る。次にこれは、例えば一連の周知の被検体濃度の溶液を用いて得られた結果を参照することにより、液体サンプル中の被検体の濃度が見い出されることを許容する。
【００４２】
図１〜３に示されるアッセイは、固体支持体２２上に固定化された捕獲剤１８、２０を有する同様の前記固体支持体２２を用いて、被検体のいずれの対の濃度を測定するのに適合され得る。これは、結合剤がミクロスフィアー１８、２０の１つに特異的に結合するであろうように、被検体をオリゴヌクレオチド尾部１２、１６に結合させるのに適した結合剤を提供することにより行われ得る。このように、アッセイの使用者は、ミクロスポットの全部の配置と共に、用いるための結合剤を適合させることができるであろうことが考えられる。
【００４３】
実施例
試薬：
１）Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ  （ＳＡＰＵ）からのマウスＩｇＧ（モノクローナル抗ＴＳＨ）。
２）Ｓｉｇｍａ  からのウサギＩｇＧ  、ヤギ抗マウスＩｇＧ（全体の分子）  及びヤギ抗ウサギＩｇＧ（全体の分子）  抗体。
３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからの０．１  μｍ径で黄色／緑色蛍光（ｅｘ  ４９０：ｅｍ  ５１５ｎｍ）  のスルフェートフルオスフィアー（Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓ）及び０．１  μｍ径で赤色蛍光（ｅｘ  ５８０：ｅｍ  ６０５ｎｍ）  のスルフェートフルオスフィアー（Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓ）。
４）Ｏｓｗｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｒｖｉｃｅからのオリゴヌクレオチド：
ａ）５′−ビオチン修飾を有するＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ（ポリ−ＣＡ）（配列番号１）
ｂ）５′ホスホロチオエート修飾を有するＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴ（ポリ−ＧＴ）（配列番号２）
ｃ）５′−ビオチン修飾を有するＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（ポリ−ＧＡ）（配列番号３）
ｄ）５′−ホスホロチオエート修飾を有するＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ（ポリ−ＣＴ）（配列番号４）
５）Ｐｉｅｒｃｅからのスルホ−  ＬＣ  −ＳＰＤＰ｛スルホスクシニミジル６−〔３′−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド〕ヘキサノエート｝。
６）Ｐｈａｒｍａｃｉａ  からのＰＤ１０カラム及びセフアデックスＧ２００  （Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２００）  。
７）Ｓｉｇｍａ  からのＲＩＡ  グレードウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  、Ｔｗｅｅｎ２０  、アジ化ナトリウム、無水オルトリン酸水素二ナトリウム、オルトリン酸二水素ナトリウム、ＥＤＴＡ及びＴｒｉｚｍａ。
８）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  からのアビジンＤＸ（Ａｖｉｄｉｎ  ＤＸ）。
９）Ａｍｉｃｏｎからのセントリコン−３０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０）  及びセントリプレップ−３０  （Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０）  濃縮器。
１０）  ＮＩＨ  ＵＳＡ  からの甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）  。
【００４４】
スルフェートフルオスフィアーへの抗マウスＩｇＧ  及び抗ウサギＩｇＧ  抗体の吸着１）２％（１０ｍｇ）の０．１  μｍ黄色／緑色フルオスフィアーの０．５ｍｌ  分割量を、０．５ｍｌ  の０．１  Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４  中に溶解された２ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧ  抗体に添加した。２％（１０ｍｇ）の０．１  μｍ赤色フルオスフィアーの０．５ｍｌ  分割量を０．５ｍｌ  の０．１  Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４  中に溶解された２ｍｇのヤギ抗ウサギＩｇＧ  抗体に添加した。両方の標品を室温で一晩振とうした。
２）この２つの標品を、ＭＳＥ  高回転２１超遠心機（ＭＳＥ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｉｎ２１  Ｕｌｔｒａ−ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）において、８℃で１０分間遠心した。
３）各々のペレットを１％ＢＳＡ  を含むリン酸緩衝液２ｍｌ中に分散させ、室温で１時間振とうし、上述のように遠心した。
４）各々のペレットを０．５  ％のＴｗｅｅｎ２０（商標）を含むリン酸緩衝液２ｍｌ中に分散させ、室温で３０分間振とうし、上述のように遠心した。
５）各々のペレットを２ｍｌのリン酸緩衝液中に分散させ、上述のように遠心した。
６）各々のペレットを２ｍｌのリン酸緩衝液中に分散させ、上述のように遠心した。
７）各々のペレットを０．１  ％アジ化ナトリウムを含む１％ＢＳＡ  の２ｍｌ中に分散させ、４℃で保存した。
【００４５】
オリゴヌクレオチドへのマウスモノクローナルＩｇＧ  及びウサギＩｇＧ  の接合
１）３ｍｇのスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを１ｍｌのＰＢＳ  ／ＥＤＴＡ中に溶解された４．６ｍｇ  のマウス抗ＴＳＨ  モノクローナル又はウサギＩｇＧ  に添加して室温で３０分間振とうした。
２）この活性化された抗体をＰＤ１０カラムで未処理のＳＰＤＰから分離した。このサンプルをＰＢＳ  ／ＥＤＴＡで溶出して０．５ｍｌ  フラクションを収集した。
３）この活性化された抗体を含む第１のピークからのフラクションをプールして、セントリコン−３０濃縮器を用いておおよそ１０μｌまで濃縮した。
４）５′−ホスホロチオエート修飾されたポリ−ＧＴオリゴヌクレオチド１００ｎＭ  を活性化されたマウスモノクローナルＩｇＧ  １４．８ｎＭに添加した。５′−ホスホロチオネート修飾されたポリ−ＣＴオリゴヌクレオチド５８．３ｎＭを活性化されたウサギＩｇＧ  ８．７ｎＭ  に添加した。両方の標品をＰＢＳ  ／ＥＤＴＡで１ｍｌにして、室温で一晩振とうした。
５）オリゴヌクレオチド接合マウスおよびウサギＩｇＧ  標品をセファデックスＧ２００カラム（１．５×４５ｃｍ）で未反応のオリゴヌクレオチドから分離した。このサンプルをＰＢＳ  ／ＥＤＴＡで溶出して２ｍｌフラクションを収集した。
６）オリゴヌクレオチド接合抗体を含む第１のピークからのフラクションをプールして、セントリプレップ−３０濃縮器を用いておおよそ５００  μｌに濃縮して４℃で保存した。
【００４６】
オリゴヌクレオチド接合抗体が、ミクロスポットとして固相上に配された相補的オリゴヌクレオチドのみとハイブリッド形成するであろうことの論証
１）ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイターウエル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ｂｌａｃｋ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ  ｗｅｌｌｓ）  を０．１  Ｍ重炭酸緩衝液ｐＨ８．５  中のアビジンＤＸ  ５０  μｌで５μｇ／ｍｌの濃度で室温で５分間コートした。
２）０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコートされたマイクロタイターウェルを室温で１時間、２００  μｌの１％ＢＳＡ  でブロックして、同じ緩衝液で再び洗浄して乾燥させた。
３）０．１  ％ＢＳＡ  中で０．０２５ｎＭ  ／ｍｌの濃度の２つの５′−ビオチン修飾されたポリ−ＣＡ及びポリ−ＧＡオリゴヌクレオチドの各々の０．２５μｌドロップレットを、アビジンコートされたマイクロタイターウェルの反対側に配し、湿った雰囲気下で３０分間、反応させた。その後、ドロップレットを吸収して、このマイクロタイターウェルをリン酸緩衝液で洗浄した。
４）ポリ−ＧＴ接合マウスモノクローナルＩｇＧ  及びポリ−ＣＴ接合ウサギＩｇＧ  の各々０．２５μｇ／ｍｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  アッセイ緩衝液の５０μｌ分割量を対照マイクロタイターウェル（かわりに未接合のマウス及びウサギＩｇＧ  を含むアッセイ緩衝液５０μｌを対照ウェルに添加した）  以外全てに添加し、湿った雰囲気下で１時間、振とうして、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商標）を含むリン酸緩衝液で洗浄した。
５）０．３  μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ  抗体接合黄色／緑色フルオスフィアー及び０．６  μｇ／ｍｌヤギ抗ウサギＩｇＧ  抗体接合赤色フルオスフィアーを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  アッセイ緩衝液の２００  μｌ分割量を全マイクロタイターウェルに添加し、室温で１時間振とうし、リン酸−Ｔｗｅｅｎ２０  緩衝液で洗浄して、アルゴン／クリプトン（Ａｒｇｏｎ  ／Ｋｒｙｐｔｏｎ）レーザーを備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査した。
【００４７】
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【００４８】
結論
（１）ポリ−ＧＴオリゴヌクレオチドで標識されたマウスＩｇＧ  は、相補的ビオチン化ポリ−ＣＡとのみハイブリッド形成し、同じマイクロタイターウェル上に配された非相補的ビオチン化ポリ−ＧＡオリゴヌクレオチドミクロスポットとはハイブリッド形成しなかった。
（２）ポリ−ＣＴオリゴヌクレオチドで標識されたウサギＩｇＧ  は、相補的ビオチン化ポリ−ＧＡとのみハイブリッド形成し、同じマイクロタイターウェル上に配された非相補的ビオチン化ポリ−ＣＡオリゴヌクレオチドミクロスポットとはハイブリッド形成しなかった。
【００４９】
オリゴヌクレオチド標識された抗体ミクロスポットの抗原結合の論証
１）ダイナテックブラックミクロフローマイクロタイターウェルを０．１  Ｍ重炭酸緩衝液ｐＨ８．５  中のアビジンＤＸ  ５０  μｌで５μｇ／ｍｌの濃度で室温で５分間、コートした。
２）０．０１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した後、アビジンコートされたマイクロタイターウェルを室温で１時間、２００  μｌの１％ＢＳＡ  でブロックして、同じ緩衝液で再び洗浄して乾燥させた。
３）０．１  ％ＢＳＡ  中で０．０２５ｎＭ  ／ｍｌの濃度の５′−ビオチン修飾されたポリ−ＣＡオリゴヌクレオチドの０．２５ドロップレットをアビジンコートされた各々のマイクロタイターウェル上に配し、湿った雰囲気下で３０分間反応させた。その後、ドロップレットを吸引して、このマイクロタイターウェルをリン酸緩衝液で洗浄した。
４）ポリ−ＧＴ接合抗ＴＳＨ  マウスモノクローナルＩｇＧ  ０．２５μｇ／ｍｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  アッセイ緩衝液の５０μｌ分割量をこのマイクロタイターウェルに添加し、湿った雰囲気下で１時間、振とうして、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（商標）を含むリン酸緩衝液で洗浄した。
５）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  アッセイ緩衝液中のＴＳＨ  標準の２００  μｌ分割量（０、０．１、０．３及び１．０  μＵ／ｍｌ）を３回重複でウェルに添加し、室温で１時間インキュベートしてリン酸−Ｔｗｅｅｎ２０（商標）緩衝液で洗浄した。
６）５０μｇ／ｍｌ抗ＴＳＨ  発現抗体接合黄色／緑色スルフェートフルオスフィアーの２００  μｌ分割量を全マイクロタイターウェルに添加し、室温で１時間振とうし、リン酸−Ｔｗｅｅｎ２０（商標）緩衝液で洗浄して、アルゴン／クリプトンレーザーを備えた共焦レーザー走査顕微鏡で走査した。
【００５０】
結果及び結論
ポリ−ＧＴオリゴヌクレオチド標識された抗ＴＳＨ  マウスモノクローナルＩｇＧ  は、それを、アビジンコートされたマイクロタイターウェルに結合したビオチン化された相補的ポリーＣＡオリゴヌクレオチドを通して固相に配された結合抗体として用いた時、標準曲線の作成が成功したことにより証明されるように十分に機能することができた（図４を参照のこと）。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、捕獲剤が２つのミクロスポットにおいて固定化されている、２種類の前記捕獲剤及び２種類の結合剤を用いて液体サンプル中の２つの被検体を検出するためのアッセイを示す。
【図２】図２は、捕獲剤が結合剤に結合するに至っている図１のアッセイを示す。
【図３】図３は、第２の標識された抗体を用いて結合剤の占有率を決定する非競合法を示す。
【図４】図４は、前述の実験的な例からのＴＳＨ  濃度に対してプロットされたシグナルのグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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