(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６のアミノ酸配列を有するマウス造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２３のヌクレオチド配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項４】
マウス造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素を発現する、請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
配列番号１６のアミノ酸配列を有するマウス造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物のプロスタグランジンＨ群をプロスタグランジンＤ群に変換する造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下、プロスタグランジンＤ合成酵素をＰＧＤ合成酵素またはＰＧＤＳと称する）をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをコードする発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転換体、及び該形質転換体によって発現される哺乳動物の造血器型ＰＧＤ合成酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的なプロスタグランジンＤであるプロスタグランジンＤ２は、各種の刺激により生体膜から遊離するアラキドン酸から動物組織で合成される生理活性物質であり、プロスタグランジンＨ２（シクロオキシゲナーゼによって生産されるプロスタグランジン類の共通の前駆体）からＰＧＤ合成酵素によって生産される。
【０００３】
ＰＧＤ合成酵素には、グルタチオン依存型の造血器型ＰＧＤ合成酵素（Christ-Hazelhof and Nugteren, Biochim. Biophys. Acta, 572, 43-51 (1979)、Urade et al., J. Biol. Chem., 262, 3820-3825 (1987)）及びグルタチオン非依存型の脳型ＰＧＤ合成酵素（Shimizu et al., J. Biol. Chem., 254, 5222-5228 (1979)、Urade et al., J. Biol. Chem., 260, 12410-12415 (1985)）の二種類が存在することが知られている（Urade et al., J. Lipid Mediators Cell Signalling, 12, 257-273 (1995))。ラットを用いた研究から、前者は、脾臓、骨髄、消化器、胸腺又は皮膚などのほぼ全身の末梢臓器に幅広く存在することが知られており（Ujihara et al., Arch. Biochem. Biophys., 260, 521-531 (1988))（Ujihara et al., J. Invest., Dermatol., 90, 448-451 (1988)）、後者は、脳、副睾丸、脊髄、網膜又は内耳などの主として中枢神経系を中心に分布することが知られている（Urade et al., J. Biol. Chem., 260, 12410-12415 (1985)、Ueno et al., J. Neurochem., 45, 483-489 (1985)、Urade et al., J. Biol. Chem., 262, 3820-3825 (1987))、Goh et al., Biochim. Biophys. Acta, 921, 302-311 (1987)、Tachibana et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7677-7680 (1987))。
【０００４】
本発明者らは、ラット造血器型ＰＧＤ合成酵素に対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色により、造血器型ＰＧＤ合成酵素は組織球、樹状細胞、肥満細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、肝臓クッパー細胞などの免疫・アレルギーの担当細胞に局在することを見いだした（Ujihara et al., J. Invest. Dermatol., 90, 448-451 (1988)、Urade et al., J. Immunol., 143, 2982-2989 (1989)、Urade et al., J. Biol. Chem., 265, 371-375 (1990)、Miwa et al., Anals Otol. Rhinol. Laryngol., 100, 665-667 (1991))。
【０００５】
そのラットにおける組織分布および細胞局在性から、造血器型ＰＧＤ合成酵素は免疫反応あるいはアレルギー反応に関与することが予想される。さらに本発明者らは最近の研究で、マウス骨髄由来肥満細胞をｃ-ｋｉｔ（癌遺伝子のひとつ）リガンド存在下で培養するとプロスタグランジンＤ２の産生亢進と造血器型ＰＧＤ合成酵素の蛋白質レベルの発現誘導が起きることを見いだし（Murakami et al., J. Biol. Chem., 270, 3239-3246 (1995))、プロスタグランジンＤ２および造血器型ＰＧＤ合成酵素が肥満細胞の分化や成熟に関与することを示した。
【０００６】
一方、ヒトの肥満細胞増多症の患者において観察される下痢、貧脈、呼吸困難、昏睡等の症状は、肥満細胞から放出される多量のプロスタグランジンＤ２によって引き起こされることが報告され（Roberts et al., New Engl. J. Med., 303, 1400-1404 (1980))、ヒトの各種疾患においても、プロスタグランジンＤ２が関与する可能性が指摘されている。
【０００７】
プロスタグランジンＤ２はさらに酵素的あるいは非酵素的反応により、９α,１１β−プロスタグランジンＦ２やプロスタグランジンＪ２に変化する。これらのプロスタグランジンは、他のプロスタグランジンとは異なった生理作用を示す。特に、プロスタグランジンＪ２およびその類似体は癌細胞の増殖阻害活性を示したり、肥満の原因である脂肪細胞の分化の指標として研究されている、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor（ペルオキシゾーム増殖剤活性化レセプター）γの内因性リガンドとして同定され（Kliewer et al., Cell 83, 813-819 (1985))、（Barry et al., Cell 83, 803-812 (1985)）注目をあびている。
【０００８】
しかし、免疫、アレルギー、肥満などの生体反応において、プロスタグランジンＤ２およびその代謝産物である９α,１１β−プロスタグランジンＦ２、プロスタグランジンＪ２さらに、△１２プロスタグランジンＪ２、などのＪ２類似体がいかなる役割をもつのか、これらのプロスタグランジン類の生合成を決定する造血器型ＰＧＤ合成酵素がいかなる役割をもつのか、また一般に、生成量や反応性の動物種差の大きいことが知られているプロスタグランジンの中で、プロスタグランジンＤ２の合成酵素の組織分布および細胞局在がどの程度の動物種差を示すのか、あるいはその遺伝子発現調節がどのように行われるかなどの問題に関する答えは得られていない
【非特許文献１】Urade et al., J. Biol. Chem., 262, 3820-3825 (1987)
【非特許文献２】Urade et al., J. Immunol., 143, 2982-2989 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ラットの造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのクローニングに成功し、そのヌクレオチド配列を決定し、該酵素のアミノ酸配列を決定した。さらに本発明者らはラットのヌクレオチド配列に基づいて、マウスおよびヒトの造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、該酵素のアミノ酸配列を決定した。
【００１０】
即ち、本発明者らは、ヒト、ラット、マウス全ての造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのクローニングに成功し、そのヌクレオチド配列を決定し、該酵素のアミノ酸配列を決定した。これにより造血器型ＰＧＤ合成酵素を特異的に認識する抗体の作成、および該酵素を用い、その阻害剤をスクリーニングする道が開けた。また、造血器型ＰＧＤ合成酵素の遺伝子発現機構を調べることにより、末梢でのプロスタグランジンＤ２の役割を理解する研究が可能となった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは種々のヒト組織を造血器型ＰＧＤ合成酵素の発現に関してスクリーニングして、ヒト胎盤が他の組織の約５０倍の造血器型ＰＧＤ合成酵素を発現することを見い出した。次いで、ヒト胎盤のＲＮＡを用い、造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡの単離とクローニングに成功した。
得られた１つのｃＤＮＡクローン（ｐｈＨＰＧＤＳ１）のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を図１に示す。
【００１２】
上記のｃＤＮＡは１９９アミノ酸からなるタンパク質をコードすることができるオープンリーデイングフレームを有する。推定のアミノ酸配列から、造血器型ＰＧＤ合成酵素は１９９アミノ酸からなるタンパク質であり、その配列は同時にクローニングされたマウスおよびラットの造血器型ＰＧＤ合成酵素の配列と高い相同性を示す。後述するように、造血器型ＰＧＤ合成酵素のアミノ酸配列を他のタンパク質のアミノ酸配列と比較し、該タンパク質はグルタチオン転移酵素ファミリーに属することが確認された。
【００１３】
本発明のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡをＴ７ポリメラーゼ遺伝子のプロモーターのコントロール下に含有する発現プラスミド（ｐＴ７−７ｈＨＰＧＤＳ）を構築し、該プラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換体をＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）存在下に培養した結果、その菌体内に多量のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を発現することが示された。
【００１４】
すなわち、本発明はヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを担持する発現ベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、およびかかる形質転換体によって生産されるヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を提供するものである。
【００１５】
発現プラスミドｐＴ７−７ｈＨＰＧＤＳで形質転換された大腸菌ｐＹＫ１は受託番号、ＦＥＲＭ ＢＰ−５４８９の下、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。（受託日：平成８年３月２７日)。
【００１６】
本発明のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡのクローニングは以下に述べる方法により行った。
成熟ラット脾臓の細胞質画分により造血器型ＰＧＤ合成酵素を精製し（Urade et al., (1987) 前掲）、精製酵素をリジルエンドペプチダーゼによって分解して得たペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。
【００１７】
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列（Urade et al., (1989) 前掲）、及び得られたペプチド断片のアミノ酸配列より推測されるＤＮＡプライマーを合成し、ラット脾臓ｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲを行った結果、１３４ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅され、そのヌクレオチド配列はラット脾臓より精製した造血器型ＰＧＤ合成酵素の部分アミノ酸配列をコードしていた。１３４ｂｐのｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列とそれがコードするアミノ酸配列を図２に示す。増幅されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基き遺伝子特異的プライマーを合成し、５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法、３’−ＲＡＣＥ法により完全長（１ｋｂ）のラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図３に示す。
【００１８】
ラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡは１９９アミノ酸をコードし得る５９７ヌクレオチドのオープンリーデイングフレームを有する。推定のアミノ酸配列は、上記の方法で決定したラット脾臓より回収した精製酵素の部分アミノ酸配列のすべてを含んでいた。そのアミノ酸配列を他のタンパク質のアミノ酸配列と比較すると、グルタチオン転移酵素のアミノ酸配列と２０〜４０％の相同性を示し、該タンパク質はグルタチオン転移酵素遺伝子ファミリーに属することが判明した（図８)。また、その遺伝子系統樹から、該タンパク質はこの遺伝子ファミリーの全く新たな構成員であることが確認された（図９)。
【００１９】
ヒトの各種臓器から調製した全ＲＮＡを用いて、ラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡをプローブとするノーザンハイブリダイゼーションを行い、ヒト胎盤が他の組織の約５０倍の造血器型ＰＧＤ合成酵素ｍＲＮＡを発現することを見い出した。同時に、ヒト染色体遺伝子ライブラリーをラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングし、ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の染色体遺伝子断片を含むクローンを単離し、そのヌクレオチド配列を決定してエクソン部分の配列から遺伝子特異的プライマーを合成した。さらに、ヒト胎盤から全ＲＮＡを調製し、遺伝子特異的プライマーを用いた５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法を行い、完全長（１ｋｂ）のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡを単離した（図１)。
【００２０】
その配列は同時にクローニングされたマウスおよびラットの造血器型ＰＧＤ合成酵素の配列と高い相同性を示した（図７)。
【００２１】
得られたヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡをＴ７ポリメラーゼ遺伝子のプロモーターのコントロール下に含有する発現プラスミド（ｐＴ７−７ｈＨＰＧＤＳ）を構築し、該プラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換体をＩＰＴＧの存在下に培養した結果、その菌体内に多量のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素が発現された。その発現蛋白質は試験管内でＰＧＤ合成酵素活性を示し、その酵素学的性質は本発明者らが示したラット脾臓の細胞質画分より精製した造血器型ＰＧＤ合成酵素の性質（Urade et al., (1987) 前掲）とよく一致した。
【００２２】
本発明によりにヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、そのヌクレオチド配列が明らかになったので、適当な宿主系内で組換えヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を発現する発現ベクターを構築することができる。得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体をヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、組換えヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を製造することができる。このようにして得られた組換えヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素は、造血器型ＰＧＤ合成酵素に特異的に結合する抗体の調製、あるいは、その阻害剤のスクリーニングに用いられ、プロスタグランジンＤ２の生理作用関係の究明等の研究および臨床面で有用である。
【００２３】
本発明のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は図１に記載されているが、当業者ならば、該ＤＮＡから、ヌクレオチドの挿入、置換、または欠失により、天然のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素と同様の機能を有する誘導体を導くことができるということを理解するであろう。従って、そのようにして導かれるＤＮＡ誘導体およびそれによってコードされるヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素誘導体も本発明の範囲に包含されるものである。
【００２４】
本発明のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築することができる。ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ＤＮＡの発現に適したベクターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウィルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因子ＥＦ−１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウィルスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターやベーターガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌、大腸菌での発現に用いることができる。ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ＤＮＡの挿入部位下流には転写終結シグナルがあることが望ましい。
【００２５】
ベクター中にはたとえば薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在することが望ましい。あるいは、ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換してもよい。
【００２６】
発現ベクターを構築するには本発明のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入する。適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。本発明のｃＤＮＡを挿入し、培養細胞に導入してこのｃＤＮＡを発現する目的に用いることができるＤＮＡベクターとして、例えば動物細胞での発現においてはｐＫＣＲ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ等を挙げることができる。
【００２７】
本発明のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の発現に用い得る細胞は複製可能で図１記載のＤＮＡを発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ．セレビジエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内から本発明の造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、末梢組織におけるプロスタグランジンＤ２産生に関わるヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の遺伝子が単離され、今後遺伝子レベルで免疫アレルギー反応でのプロスタグランジンＤ２産生の調節機構が解析できるようになった。
【００２９】
プロスタグランジンＤ２は血管拡張、気管支収縮、睡眠誘発などの作用をもつ生理活性物質であり、抹消組織でのプロスタグランジンＤ２産生は造血器型ＰＧＤ合成酵素によって行われる。気管支喘息などのアレルギー疾患や肥満細胞増多症における種々の症状はプロスタグランジンＤ２が大きく関わっており、その治療法のひとつとして造血器型ＰＧＤ合成酵素の阻害剤はそれらの治療薬となる。本発明によりプロスタグランジンＤ２およびその代謝産物の関与する疾患の治療薬が開発できる。さらに本発明により造血器型ＰＧＤ合成酵素を特異的に認識する抗体を作成することができるので、骨髄液中の造血器型ＰＧＤ合成酵素を定量または染色し、肥満細胞腫ほか種々の白血病の診断キットおよび治療効果の判定キットが作製できる。白血病の診断および治療効果の判定には高感度の検出方法が要求される。本発明によって造血器型ＰＧＤ合成酵素のヌクレオチド配列が決定されたので、ＰＣＲ法による造血器型ＰＧＤ合成酵素遺伝子転写物の定性および定量的解析キットが作製できる。また、プロスタグランジンＤ２の代謝産物１５−デオキシ−△１２,１４−プロスタグランジンＪ２は脂肪細胞の分化に関与するので造血器型ＰＧＤ合成酵素の阻害剤は、成人病のリスクファクターである肥満の予防薬および治療薬となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３１】
実施例１  ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素をコードするｃＤＮＡのクローニング
(1) ラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのクローニング
既述の方法（Urade et al., (1987) 前掲）によりラット脾臓の細胞質画分により造血器型ＰＧＤ合成酵素を精製した。３００μｇの精製酵素を３μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬）によって分解（0.1M Tris-HCl(pH 9）中、３７℃、終夜）し、得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣ（Toso社製, TSKgel ODS-80Ts カラム、4.6x250mm）で分離（0.05% TFA（トリフルオロ酢酸）の存在下、アセトニトリルグラジエントにて溶出）してそのアミノ酸配列を決定（model 477A, Applied Biosystems社）した。このアミノ酸配列（配列番号３）を以下に記す。
Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
【００３２】
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列（Urade et al., (1989) 前掲）、及び得られたペプチド断片のアミノ酸配列より推測されるＤＮＡプライマーを合成した（Beckman社製、Oligo1000使用)。このＰＣＲ用の２個のプライマーのヌクレオチド配列（配列番号４および５）を以下に記す。
５’−ＣＴＩＣＴＩＴＡＣＴＴＣＡＡＹＡＴＧＭＧＩＧＧＩＡＧＩＧＣＩＧＡＡＡＴ−３’
（ＹはＣあるいはＴを示す。ＭはＡあるいはＣを示す。）
５’−ＴＴＩＣＣＲＡＡＩＧＧＩＡＲＩＧＴＩＧＧＴＴＴ−３’
（ＲはＡあるいはＧを示す。）
【００３３】
グアニジンチオシアネート／酸フェノール法（Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)）により、ラット脾臓より全ＲＮＡを調製し、oligo(dT)−セルロースカラムクロマトグラフィーを用いてｐｏｌｙ（Ａ）−ＲＮＡを選択した。上記プライマーを用いてラット脾臓ｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ（逆転写）−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは、ＡＭＶ逆転写酵素（Takara社製）とＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用い、ＰＣＲ条件 ９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った（Perkin-Elmer社製、Gene Amp PCR System 2400を使用)。
【００３４】
その結果１３４ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅され、そのヌクレオチド配列はラット脾臓より精製した造血器型ＰＧＤ合成酵素の部分アミノ酸配列をコードしていた。そのヌクレオチド配列（配列番号６）および予想アミノ酸配列（配列番号７）を図２に記す。
【００３５】
増幅されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基き遺伝子特異的プライマーを合成し、５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法、３’−ＲＡＣＥ法により完全長（１ｋｂ）のラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡを単離した（Clontech社製、Marathon cDNA Amplification Kitを使用)。遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列（配列番号８および９）を以下に記す。
５’−ＲＡＣＥ用プライマー
５’−ＴＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＡＴ−３’
３’−ＲＡＣＥ用プライマー
５’−ＡＴＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＣＴＡ−３’
得られた完全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０）およびその予想アミノ酸配列（配列番号１１）を図３に記す。
【００３６】
同様にしてマウス卵管ｍＲＮＡを鋳型として遺伝子特異的プライマー（配列番号８および９）を用いた、５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法、３’−ＲＡＣＥ法により完全長（１ｋｂ）のマウス造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡを単離した（Clontech社製、Marathon cDNA Amplification Kitを使用)。
得られたマウス完全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２３）およびその予想アミノ酸配列（配列番号１６）を図１１に示す。
【００３７】
(２) ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素染色体遺伝子のクローニング
ヒト肝臓由来染色体遺伝子ライブラリー（Clontech社）を（１）で製造したラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニング（プラークハイブリダイゼーション法）し、ヒト染色体遺伝子断片を含むクローンを単離した。得られたクローンのヌクレオチド配列を決定してラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と比較し、エクソン部分を含む配列を同定した。
【００３８】
ラット造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素染色体遺伝子のエクソンを含む部分のヌクレオチド配列（配列番号１２および１３）の比較図を図４に記す。
【００３９】
(３) ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのクローニング
ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素遺伝子のエクソン部分から以下に示す２つの遺伝子特異的プライマーを合成した。両プライマーおよびヒトの胎盤から調製した全ＲＮＡを用いて５’−ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法、３’−ＲＡＣＥ法により完全長（１ｋｂ）のヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡを単離した（Clontech社製、Marathon cDNA Amplification Kitを使用)。遺伝子特異的プライマーのヌクレオチド配列（配列番号１４および１５）を以下に記す。
５’−ＲＡＣＥ用プライマー
５’−ＧＡＡＴＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴ−３’
３’−ＲＡＣＥ用プライマー
５’−ＡＧＴＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣ−３’
得られた完全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）およびその予想アミノ酸配列（配列番号２）を図１に記す。
ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示した図１において、ヌクレオチド番号は上、アミノ酸番号は下に記されている。
【００４０】
このｃＤＮＡの解析により、以下の点が明らかになった。
１）ｃＤＮＡは１ｋｂからなり３’末端にポリ（Ａ）付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を有する。
２）長いオープンリーディングフレーム（５９７ヌクレオチド）が存在する。このオープンリーディングフレームはヌクレオチド位置１１〜１３の開始コドンから始まり６０８〜６１０位のＴＡＧ終止コドンに至り、１９９アミノ酸からなるタンパク質をコードすることができる。
３）この蛋白Ｎ末側にタイロシンキナーゼ（チロシンキナーゼ）によるリン酸化を受けるコンセンサス配列（図１下線）を有している。
【００４１】
実施例２  ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を発現する形質転換体の調製
(１) ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の大腸菌での発現
以下の様にして、実施例１で得られたヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡをＴ７ポリメラーゼ遺伝子のプロモーター（Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074-1078 (1985)）のコントロール下に含有する発現プラスミド（ｐＴ７−７ｈＨＰＧＤＳ）を構築した。
【００４２】
塩基配列から推定されるアミノ酸配列のみ発現されるように制限酵素部位 ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを、実施例１で得たヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのそれぞれ５’末端側および３’末端側に導入した。導入はプラスミド（ｐｈＨＰＧＤＳ）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲ法にて行った。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社）を用い、ＰＣＲ条件 は９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとしてこれを２０サイクル行った（Perkin-Elmer社製、Gene Amp PCR System 2400を使用)。
用いたプライマーの塩基配列を以下に記す（配列番号２１、２２)。
５’−ＮｄｅＩプライマー
５’−ＴＧＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡ−３’
３’−ＥｃｏＲＩプライマー
５’−ＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＴＴＴＧ−３’
【００４３】
ｐＴＨＣ８（American Type Culture Collection 45127）を制限酵素ＢamＨＩで消化した（３７℃、６０分）後、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ（Takara社）にて平滑末端とした（１６℃、６０分)。これに、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（Takara社）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Takara社）にて結合させたものを、制限酵素ＮｄｅＩで消化し、アガロース電気泳動にて分離し、約２.５キロベースのＤＮＡ断片を回収した。この様にして得たベクターをｐＴ７−７と命名した。
【００４４】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Takara）にて、上で得たｐＴ７−７ベクターに結合させた（１６℃、３０分)。以上の過程を図５に示す。
【００４５】
上で得た反応液を用い、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を改変塩化カルシウム法（Inoue et al., Gene 96, 23-28 (1990)）により形質転換し、形質転換体、Ｅ. coli ｐＹＫ１をＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にて８〜１６時間培養した後、ＩＰＴＧ（終濃度０.４ｍＭ）を添加してさらに６時間培養した。発現の確認は菌体の可溶性蛋白質（培養後の菌体を遠心にて回収し、ＰＢＳに懸濁後、超音波破砕した(Output level 5, 60 sec, W-385, Heat Systems-Ultrasonics, Inc.)。）を１４％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動し、クマシーブルー染色を行った。その結果、菌体内にヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素が可溶性蛋白質として大量に発現された。ＰＧＤ合成酵素活性の測定は、以下の様にして行った。
【００４６】
ＰＧＤ合成酵素活性の測定
０.１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、１ｍＭグルタチオンの条件下で、４０μＭ［１４Ｃ］−プロスタグランジンＨ２（第一化学）と発現産物を含む試料を２５℃、１分間インキュベートした。反応停止液（ジエチルエーテル：メタノール：１Ｍクエン酸＝３０：４：１）を加えて、基質および酵素反応産物のプロスタグランジンＤ２を有機溶媒層（エーテル層）に抽出し、薄層クロマトグラフィーにより展開（展開溶媒はジエチルエーテル：メタノール：酢酸＝９０：２：１）し、オートラジオグラフィーにかけた（ＢＡＳ２０００，Ｆｕｊｉ)。結果を表１に示す。酵素反応によって生じたプロスタグランジンＤ２の放射能活性と全放射能活性からＰＧＤ合成酵素の活性を求めた。試料中の蛋白質濃度をLowry法（Lowry et al., J. Biol. Chem.193,265-275 (1951)）により測定し、ＰＧＤ合成酵素の比活性を計算した。
【００４７】
【表１】
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表１から明らかな様に、容量依存的なプロスタグランジンＨ２からプロスタグランジンＤ２への変換が認められた。
【００４８】
(２)遺伝子組換え 型ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の精製
ＩＰＴＧ存在下に培養した形質転換体の可溶性画分（培養後の菌体を遠心にて回収し、ＰＢＳに懸濁後、超音波破砕した（Output level 5, 60 sec, W-385, Heat Systems-Ultrasonics, Inc.)。）に含まれる遺伝子組換え 型酵素を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で平衡化したグルタチオンセファロース（ファルマシア社）に結合させ、同じ緩衝液で洗浄した後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）で溶出して回収した。最終的に１００ｍｌの培養から約２ｍｇの遺伝子組換え 型ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を得た。
【００４９】
上記酵素はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果、単一バンドを示し、その分子量は２６,０００であり、等電点は４.５であった（アミノ酸分析は行っていない)。
形質転換体の可溶性画分と上記酵素のＳＤＳ電気泳動の結果を図６に示す。
【００５０】
(３) 遺伝子組換え 型ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の酵素学的解析
上で得た発現蛋白質は試験管内でＰＧＤ合成酵素活性を示した（表１)。
遺伝子組換え 型ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の精製標品の比活性（30.0 μmol/min/mg 蛋白質）はラット脾臓より精製した酵素の比活性（32.5 μmol/min/mg 蛋白質）と同等であった。
【００５１】
遺伝子組換え 型酵素はグルタチオン要求性があり、ジチオスレイトールやメルカプトエタノール等の他のＳＨ剤の存在下では活性はみられなかった。その酵素反応の至適ｐＨは８であり、ＰＧＤ合成反応の際に反応不活化を示した。遺伝子組換え型酵素はグルタチオン転移酵素活性も有するが、その比活性はこれまで同定されているグルタチオン転移酵素の１０分の１以下である。
【００５２】
これらの酵素学的性質は本発明者らが示したラット脾臓の細胞質画分より精製した造血器型ＰＧＤ合成酵素の性質（Urade et al., (1987）前掲）とよく一致する。
【００５３】
(４) 造血器型ＰＧＤ合成酵素の系統関係と進化学的解析
ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は同時にクローニングされたマウスおよびラットの造血器型ＰＧＤ合成酵素の配列と高い相同性を示す。そのアミノ酸配列（配列番号２、１１、１６）の比較を図７に記す。
【００５４】
造血器型ＰＧＤ合成酵素のアミノ酸配列を他のタンパク質のアミノ酸配列と比較した結果、該タンパク質はグルタチオン転移酵素ファミリーに属することが確認された。ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素と他のグルタチオン転移酵素遺伝子ファミリーのメンバーのアミノ酸配列（配列番号２、１１、１６、１７、１８、１９、２０）の比較を図８に記す。
【００５５】
ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素のアミノ酸配列と他のグルタチオン転移酵素遺伝子ファミリーのメンバーの配列との比較。相同性が多くなるようにギャップ（−）を導入した。
【００５６】
造血器型ＰＧＤ合成酵素は、現在までに知られている哺乳動物のグルタチオン転移酵素とは約２０〜３０％の相同性を有したが、イエバエより見出されたグルタチオン転移酵素と４０％と最も高い相同性を示し、他に、線虫、回虫、イカのグルタチオン転移酵素とも高い相同性を有した。
【００５７】
アミノ酸配列のアライメントをもとにしてグルタチオン転移酵素遺伝子ファミリーの進化系統樹を作成した。その進化系統樹を図９に記す。
【００５８】
造血器型ＰＧＤ合成酵素は、哺乳動物で今まで知られているグルタチオン転移酵素のクラスターとは離れた位置に存在し、むしろハエ、線虫、回虫、イカ、タコのグルタチオン転移酵素に近い、この遺伝子ファミリーの全く新たな構成員であることが確認された。
【００５９】
(５) ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｍＲＮＡの臓器分布
ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡをプローブとしてヒトの臓器別遺伝子発現をノーザンブロット分析にて調べた。その結果を図１０に記す。
【００６０】
ラット造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素ｍＲＮＡが脾臓、胸腺、骨髄、パイエル板、小腸と卵管に強く発現しているのに対し、ヒトでは胎盤、肺、心臓、胎児肝臓、リンパ節、脾臓、胸腺、骨髄、及び盲腸に強い発現が認められた。
【００６１】
末梢組織におけるプロスタグランジンＤ２産生に関わる本酵素の遺伝子が単離されたことで今後遺伝子レベルで免疫アレルギー反応でのプロスタグランジンＤ２産生の調節機構が解析できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の模式図。
【図２】ＰＣＲ後（１３４ｂｐ）のｃＤＮＡ断片のヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列の模式図。
【図３】ラットＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列の模式図。
【図４】ヒトＰＧＤ合成酵素染色体遺伝子のエクソン部分とラットＰＧＤ合成酵素ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較図表。
【図５】ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の大腸菌内発現プラスミドの構築過程を示す模式図。
【図６】ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素の発現形質転換体の可溶性画分と精製酵素のＳＤＳ電気泳動写真。
【図７】ヒト、マウスおよびラットの造血器型ＰＧＤ合成酵素のアミノ酸配列比較図表。
【図８】ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素と他のグルタチオン転移酵素の配列比較図表。
【図９】グルタチオン転移酵素遺伝子ファミリーの進化系統樹を示す図表。
【図１０】ヒトの臓器の造血器型プロスタグランジンＤ合成酵素ｃＤＮＡを用いたノーザンブロットの電気泳動写真。
【図１１】マウスのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびその予想アミノ酸配列の模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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