(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する染料組合せを選択する工程と；
（ｂ）前記染料組合せをポリマー微小粒子中に配合する工程であって、該染料組み合わせは互いに共有結合されていない、工程と
を含む方法によって製造される蛍光微小粒子であって、
ここで、該染料は、供与体染料とトランスファー及び／又は受容体染料との間の平均分子内距離が４０Å〜２５Åになるように、ランダムに該ポリマー微粒子に固定化されており、かつ
ここで、該蛍光染料は、以下の式：
【化１】
0003689412.tif 000009
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］
で示されるポリアザインダセン染料ではない、蛍光微小粒子。
【請求項２】
スペクトル重複が、約９０％より大きいエネルギー伝達を可能にする請求項１記載の微小粒子。
【請求項３】
ポリマー微小粒子がポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ニトロセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、又はポリジビニルベンゼンである請求項１記載の微小粒子。
【請求項４】
蛍光染料がクマリン、炭化水素もしくは置換炭化水素染料；オキサゾールもしくはオキサジアゾール；アリール置換もしくはヘテロアリール置換ポリオレフィン（Ｃ２−Ｃ８オレフィン部分）；カルボシアニン；フタロシアニン；オキサジン；カルボスチリル；ポルフィリン染料；又はこれらの組合せである請求項１記載の微小粒子。
【請求項５】
スペクトル重複が、約９５％より大きいエネルギー伝達を可能にする請求項４記載の微小粒子。
【請求項６】
蛍光染料組合せが約６種未満の染料を約０．５重量％〜２重量％の総染料濃度で含む請求項１記載の微小粒子。
【請求項７】
初期供与体対最終受容体の比が約１：５と約１０：１との間である請求項１記載の微小粒子。
【請求項８】
請求項１記載の蛍光微小粒子の製造方法。
【請求項９】
好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する蛍光染料組合せを含み；総染料濃度が約１０重量％未満になり、初期供与体対最終受容体の比が約１：５と約１０：１との間になるように、前記染料組合せがポリマー微小粒子中に配合され、該染料組み合わせが互いに共有結合されていない、蛍光微小粒子であって、
ここで、該染料は、供与体染料とトランスファー及び／又は受容体染料との間の平均分子内距離が４０Å〜２５Åになるように、ランダムに該ポリマー微粒子に固定化されており、かつ
ここで、該蛍光染料は、以下の式：
【化２】
0003689412.tif 000010
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］
で示されるポリアザインダセン染料ではない、蛍光微小粒子。
【請求項１０】
微小粒子がニトロセルロース、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、又はポリジビニルベンゼンであり、直径約１５μｍ未満である請求項９記載の微小粒子。
【請求項１１】
核酸検出方法において、
（ａ）標的核酸を含むと考えられるサンプルを調製する工程と；
（ｂ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する染料組合せを配合し、かつ標的核酸を特異的に認識する核酸配列に結合しているポリマー微小粒子を各プローブが含む、微小粒子標識プローブの懸濁液を調製する工程であって、該染料組み合わせが互いに共有結合されておらず、ここで、該染料は、供与体染料とトランスファー及び／又は受容体染料との間の平均分子内距離が４０Å〜２５Åになるように、ランダムに該ポリマー微粒子に固定化されている、工程と；
（ｃ）微小粒子標識プローブの懸濁液をサンプルと一緒にする工程と；
（ｄ）結合しないプローブを除去する工程と；
（ｅ）微小粒子の初期供与体染料の励起ピークの範囲内で発光する励起源でプローブを照射する工程と；
（ｆ）照射されたプローブから生ずる蛍光を検出する工程と
を含む方法であって、
ここで、該蛍光染料は、以下の式：
【化３】
0003689412.tif 000011
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］
で示されるポリアザインダセン染料ではない、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はストークスシフトの制御された強化を可能にするために多重の蛍光染料を含むポリマー物質に関する。特に詳しくは、本発明は、好ましい有効ストークスシフトを有する蛍光微小粒子を生成するために、重複する励起スペクトルと発光スペクトルとを有する２種以上の蛍光化合物の組合せを含む微小粒子を述べる。この新規な蛍光微小粒子は例えば、非常に高い感度を要する、ＤＮＡとＲＮＡのような生体分子の検出と分析のような用途と、フローサイトメトリー及び顕微鏡検査による分析方法とに有用である。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光染料で標識した微小粒子は広範囲な用途に用いられている。微小粒子は一般に、球状又は不規則な形状であって、直径約５０μｍ未満であると考えられる。微小粒子はスチレン、アタリレート、不飽和塩化物、エステル、アセテート、アミド、及びアルコールを含めた、多様な重合可能なモノマーから、幾つかの実用的な方法によって製造される。微小粒子はさらに、１種以上の第２ポリマーによって被覆して、粒子の表面特性を変えるように改質することができる。
【０００３】
蛍光微小粒子は、検出可能な蛍光を発光し、環境における特定の物質と結合することができる、単分散性で、化学的に不活性な生体適合性粒子の使用から利益を得ることができる用途に、最も一般的に用いられる。例えば、生物学的分子を付着させることができる蛍光粒子はイムノアッセイに（米国特許第４，８０８，５２４号（１９８９））、核酸の検出と塩基配列決定に［ヴェナー（Ｖｅｎｅｒ）等，ＡＮＡＬＹＴ．ＢＩＯＣＨＥＭ．１９８，３０８（１９９１）；クレムスキー（Ｋｒｅｍｓｋｙ）等，ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１５，２８９１（１９８７）；ヴォルフ（Ｗｏｌｌ）等，ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１５，２９１１（１９８７）］、細胞表面抗原の標識として［ＦＬＯＷ  ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ  ＡＮＤ  ＳＯＲＴＩＮＧ，第２０章，第２版（１９９０）］、及び細胞代謝プロセスを調べるためのトレーサーとして［Ｊ．ＬＥＵＣＯＣＹＴＥ  ＢＩＯＬ．４５，２７７（１９８９）］用いられている。微小粒子の大きい表面積は生物学的分子を取り付けるための優れたマトリックスを提供し、これらの粒子の蛍光性は高い感度でのそれらの検出を可能にする。これらの微小粒子は水性懸濁液中で、又は膜に捕捉されたときにそれらの蛍光によって定量されることができる。
【０００４】
蛍光微小粒子は、通常の光学顕微鏡検査または蛍光顕微鏡検査、レーザー走査共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）顕微鏡検査を含めた、多様な結像（ｉｍａｇｉｎｇ）方法によって可視化することができる。共焦点顕微鏡検査における三次元像分解方法は、顕微鏡の点拡大機能（点源の像）の知識を利用して、焦点はずれの光線をその適当な遠近法に釣り合わせる。小さい、均一な蛍光標識ポリスチレン微小粒子はこれらの顕微鏡に点源として用いられている（ＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  １５４頁（１９９０年、改訂版））。
多くの発光化合物が例えばポリスチレン及びポリメチルメタクワレートのような種々のキャスト又は成形プラスチックに鮮やかな、目視的に魅力的な色を与えるために適することが知られている。均一な蛍光ラテックス微小粒子は特許に［米国特許第２，９９４，６９７号（１９６１）；米国特許第３，０９６，３３３号（１９６３）；英国特許第１，４３４，７４３号（１９７６）］及び研究文献に［モルダイ（Ｍｏｌｄａｙ）等，Ｊ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．６４，７５（１９７５）；マーゲル（Ｍａｒｇｅ１）等，Ｊ．ＣＥＬＬ  ＳＣＩ．５６，１５７（１９８２）］述べられている。発明者の最近の特許出願［Ｂｒｉｎｋｌｅｙ等，１９９０年１２月１８日出願の出願第０７／６２９，４６６号］は、蛍光微小粒子の製造に有用な染料として化合物のジピロメテンホウ素ジフルオリド類（ｆａｍｉｌｙ）の誘導体（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの誘導体）を開示する。この染料類は有利なスペクトルデータ、その他の性質を有して、優れた蛍光微小粒子を生成する。
【０００５】
ジピロメテンホウ素ジフルオリド標識物質は高度に蛍光性であり、光化学的に安定であるが、これらの蛍光物質の欠点は、１種類のみを用いた場合の、それらの比較的小さいストークスシフト（ピーク励起波長とピーク発光波長との差）である。励起光の最適波長はピーク発光に近いので、干渉を除去又は減少するために、小さいストークスシフトを有する蛍光粒子には正確な励起及び発光フィルターが必要である。励起フィルターの慣習的な使用が励起発光の部分をブロックする、さもない場合には、この励起発光が蛍光の効率を高め、蛍光シグナルの強度を減ずる。ストークスシアトの大きい、光沢ある蛍光染料を含む蛍光物質は、大きい蛍光シグナルを生ずる、有効な励起発光の最大利用を可能にする。
【０００６】
ストークスシフトの大きい蛍光物質の他の利点は、他の蛍光物質の存在下で容易に検出可能であることである。例えばピリン、フラビン及び薬物のような、多くの内因性蛍光分子を含む体液中で、イムノアッセイが典型的に実施される。干渉蛍光物質の大半は比較的短いストークスシフトを有するので、その励起波長よりもはるかに大きい波長で発光する蛍光標識の使用は、大抵のバックグラウンド蛍光が最小である波長において標識の蛍光シグナルが発光するので、標識をバックグラウンド蛍光から区別することを容易にする。
【０００７】
ストークスシフトの大きい蛍光物質の第３の利点は、単一サンプル中の多重分析物の単一励起波長を用いた検出におけるそれらの有用性である。それぞれが特定波長（例えば、４８８ｎｍアルゴンレーザー主要発光）において励起されることができる、２種類以上の蛍光標識を用いると、種々な標識の発光ピークは異なる波長において検出され、各発光スペクトルは単一分析物の特徴である。これを上首尾に実施するためには、種々な染料の間の補正率が最小になるように、蛍光標識の発光ピークが相互から良好に分離されなければならない。標識の高い光安定性（ｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ）も有利である。ストークスシフトの大きい蛍光物質はストークスシフトの小さい蛍光物質と組合せて用いることができ、この場合に両方の物質は同一波長で励起し、異なる波長で発光し、多重のシグナルを生じ、これらのシグナルは光学フィルター又はモノクロメーターによって分解されることができる。
【０００８】
５０〜１００ｎｍのストークスシフトと、検出可能性のために必要な、高い蛍光効率と５００ｎｍより大きい発光波長とを有する標識試薬として有用な、蛍光化合物は、残念ながら、比較的稀である。［ハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ），顕微鏡検査と結像のためのフルオレセイン代替え物，ＯＰＴＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＦＯＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１４３−５７頁（１９９０）］。蛍光染料におけるストークスシフトの大きさは、強いシグナルを保証するために必要な、高い吸光度に一般に逆比例することが判明している。例えばキサンチン、ジピロメテンホウ素ジフルオリド、ローダミン及びカルボシアニンのような生物学的分子の標識試薬として用いる蛍光染料は一般に、約３０ｎｍ未満のストークスシフトを有する。
【０００９】
大きいストークスシフトを有する適当な蛍光染料が存在しないことが、標識としてのフィコビリ蛋白質として知られた蛋白質ベースド発蛍光団の開発と使用を導いた［例えば、両方ともストリエル（Ｓｔｒｙｅｒ）等の米国特許第４，５２０，１１０号と第４，５４２，１０４号（１９８５）を参照のこと］。他の発蛍光団と同様に、これらはビーズ及びマクロ分子に共有結合されている。例えば、オイ（Ｏｉ）等のＪ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯ．９３，９８１（１９８２）を参照のこと。これらの大きいピリン含有分子は非常に高い吸光係数と言う好ましい特徴を有し、共有結合した、異なる発蛍光団の間の内部エネルギー伝達を利用して、比較的大きいストークスシフトを得る。これらは低い化学的安定性、光漂白に対する不安定性、限定された長波長発光能力、大きい分子サイズ（ＭＷ＞１００，０００ダルトン）及び比較的高い費用と言う欠点を有する。さらに、この種のごく僅かな蛋白質が知られているにすぎないので、それらのスペクトル特性を選択又は適当に調節することができない。フィコビリ蛋白質の蛍光発光効率をそれらの分子サイズを有意に高めずに改良しようと試みて、フィコビリ蛋白質は蛍光染料アズーレ（Ａｚｕｒｅ）Ａに共有結合されている（チャン（Ｃｈａｏ）への米国特許第４，６６６，８６２号（１９８７））。
【００１０】
１対の発蛍光団の共有結合が個々の染料のいずれよりも大きいストークスシフトを有する蛍光染料を生ずることは知られている（例えば、ゴレレンコ（Ｇｏｒｅｌｅｎｋｏ）等，溶液及びポリマー中のレーザー染料に基づく二色発色団のフォトニクス，ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＥＬＬＥ  ＴＥＣＨＮＩＫ  ＤＥＲＰＨＹＳＩＫ３７，３４３（１９８９））。このアプローチは、報告ではストークスシフトの増大に効果的であるが、２種の染料を化学的に結合させるために、有効な反応部位の数と位置によって限定される、複雑な合成方法を必要とする。３種、４種又はそれ以上の染料を充分に密接に結合させ、適当な形態で実質的なエネルギー伝達を行わせるために必要な合成操作を実施する方法は、不可能ではないとしても、非常に困難である。さらに、共有結合した分子は典型的に、有意な衝突不活化が生ずるほど充分な運動の自由を有し、蛍光よりもむしろ振動緩和によってエネルギー損失を生ずる。強化された有効ストークスシフトを有する、有用な蛍光標識を得るために複雑な共有結合以外の方法によって染料のスペクトル特性を結合させる手段が必要である。
【００１１】
共有結合した染料対の間のエネルギー伝達の研究では、２種の蛍光染料間のエネルギー伝達の効率が、フェルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）の理論に一致して、２種の相互作用分子の間の距離の６乗に逆比例することが判明している（ストリエル（Ｓｔｒｙｅｒ）とハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ），エネルギー伝達：分光器ルーラー，ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ  ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ５８，７１９（１９６７））。この参考文献は、測定可能なエネルギー伝達％を用いて、１０〜６０Å範囲内の共有結合した発蛍光団を分離して距離を測定することができることを示唆する。その後の論文、ハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ）、イグエラビド（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ）及びストリエル（Ｓｔｒｙｅｒ）、一重項−一重項エネルギー伝達の動力学のスペクトル重複への依存性，ＰＮＡＳ，６３，２３（１９６９）は、分子内一重項エネルギー伝達がスペクトル重複積分値の大きさに依存することを報告している。
【００１２】
マクロ分子に結合した染料の間のエネルギー伝達は、生体分子における［例えば、ジュリエン（Ｊｕｌｌｉｅｎ）と、ガレル（Ｇａｒｅｌ），ＢＩＯＣＨＥＭ．２２，３８２９（１９８３）；ウーレイ（Ｗｏｏｌｅｙ）等の，ＢＩＯＰＨＹＳ．ＣＨＥＭ．２６，３６７（１９８７）］及びポリマー鎖と組織とにおける［例えば、オーミン（Ｏｈｍｉｎｅ）等，ＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  １０，８６２（１９７７）；ドレイク（Ｄｒａｋｅ）等，ＳＣＩＥＮＣＥ２５１，１５７４（１９９１）］分子内距離及び配座の研究に実証されている。結果としての波長シフトを伴うエネルギー伝達はレーザー光線発生（ｌａｓｉｎｇ）溶液中の染料混合物に関して述べられている。例えば、サイトー（Ｓａｉｔｏ）等，ＡＰＰＬ．ＰＨＹＳ．ＬＥＴＴ．５６，８１１（１９９０）。染料と他の組織化分子アセンブリとの単分子層間のエネルギー伝達は実証されている、例えば、クーン（Ｋｕｈｎ），簡単な組織化分子系の製造，ＰＵＲＥ  ＡＰＰＬ．ＣＨＥＭ．１１，３４５（１９６６），ＣＨＥＭ．ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ，６６，６７１（１９６７）に要約；ヤマザキ（Ｙａｍａｚａｋｉ）等，Ｊ．ＰＨＹＳ．ＣＨＥＭ．９４，５１６（１９９０）。供与体と受容体との組合せの間のエネルギー伝達も、エネルギー伝達動力学の研究手段としてポリマーフィイルムにおいて実証されている、例えば、マタガ（Ｍａｔａｇａ）等、Ｊ．ＰＨＹＳ．ＣＨＥＭ．７３，３７０（１９６９）；ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ），Ｊ．ＣＨＥＭ．ＰＨＹＳＩＣＳ．４１，３０３７（１９６４）。フェルスターの理論式への研究結果の適合は広範囲に報告されているが、この理論の実用的な応用は限定されている。上記参考文献は、染料組合せを配合した蛍光微小粒子を有効ストークスシフトが強化された標識試薬として用いることを予想も示唆もしていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
より有用な蛍光標識試薬を形成するために、衝突不活化を最小にし、効果的なエネルギー伝達を可能にし、有効ストークスシフトを増大させながら、多重の染料のスペクトル特性を組合せるための複雑な共有結合よりも簡単な方法を提供することが、本発明の目的である。有効ストークスシフトが増大するのみでなく、スペクトル特性が重複する適当な染料の選択によって、有効ストークスシフトが選択的に制御されうる物質を提供することが、本発明の他の目的である。
【００１４】
本発明によってポリマーマトリックス中にランダムに蛍光染料を固定することは、制御可能な強化有効ストークスシフトを有する、新規な蛍光物質を製造するためのごく簡単な方法を提供することになる。例えばジピロメテンホウ素ジフルオリド染料、クマリン染料及びポリオレフィン染料のような、ある種の蛍光染料はポリマー物質中に導入されたときに高い蛍光効率を有し、広範囲な励起及び発光最大値を有する多数の誘導体として利用可能である。これらの特徴は、微小粒子に配合するために適当なスペクトル重複を有する染料を細心に選択することによって、励起波長と有効ストークスシフト増大の大きさとの容易な制御を可能にする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記工程：（ａ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する染料組合せを選択する工程と；（ｂ）前記染料組合せをポリマー微小粒子中に配合する工程と、を含む方法によって製造される蛍光微小粒子である。
【００１６】
好適な実施形態において、上記スペクトル重複が、約９０％より大きいエネルギー伝達を可能にする。
【００１７】
好適な実施形態において、上記ポリマー微小粒子が、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ニトロセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、又はポリジビニルベンゼンである。
【００１８】
好適な実施形態において、上記蛍光染料は、ポリアザインダセン、クマリン、炭化水素もしくは置換炭化水素染料；オキサゾールもしくはオキサジアゾール；アリール置換もしくはヘテロアリール置換ポリオレフィン（Ｃ２−Ｃ８オレフィン部分）；カルボシアニン；アタロシアニン；オキサジン；カルボスチリル；ポルフィリン染料；又はこれらの組合せである。
【００１９】
好適な実施形態において、少なくとも１種の蛍光染料が式：
【００２０】
【化４】
0003689412.tif 000002
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］
で示されるポリアザインダセン染料である。
【００２１】
好適な実施形態において、上記スペクトル重複が、約９５％より大きいエネルギー伝達を可能にする。
【００２２】
好適な実施形態において、上記蛍光染料組合せが、約６種未満の染料を約０．５重量％〜２重量％の総染料濃度で含む。
【００２３】
好適な実施形態において、初期供与体対最終受容体の比が約１：５と約１０：１との間である。
【００２４】
好適な実施形態において、上記ポリマー微小粒子がポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド又はポリアクロレインであり；蛍光染料の組み合わせが式：
【００２５】
【化５】
0003689412.tif 000003
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］
で示される、種々なポリアザインダセン染料である、約６種未満の染料を含み；総染料濃度が約０．８〜１．２重量％であり；
初期供与体染料と最終受容体染料との比が約４：１と約６：１との間である。
【００２６】
本発明はまた、上記蛍光微小粒子の製造方法である。
【００２７】
本発明はまた、好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する蛍光染料組合せを含み；総染料濃度が約１０重量％未満になり、初期供与体対最終受容体の比が約１：５と約１０：１との間になるように、前記染料組合せがポリマー微小粒子中に配合される蛍光微小粒子である。
【００２８】
好適な実施形態において、上記微小粒子が、ニトロセルロース、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、又はポリジビニルベンゼンであり、直径約１５μｍ未満である。
【００２９】
好適な実施形態において、上記蛍光染料の組合せが式：
【００３０】
【化６】
0003689412.tif 000004
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］で示される、約６種未満のポリアザインダセン染料を含む。
【００３１】
好適な実施形態において、上記微小粒子が、共有結合した又は不動吸着した（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ  ａｄｓｏｒｂｅｄ）生体反応性物質をさらに含む。
【００３２】
好適な実施形態において、上記生体反応性物質が生体分子である、すなわちビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、又は核酸化合物である。
【００３３】
本発明はまた、核酸検出方法であって、以下：
（ａ）標的核酸を含むと考えられるサンプルを調製する工程と；
（ｂ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する染料組合せを配合し、かつ標的核酸を特異的に認識する核酸配列に結合しているポリマー微小粒子を各プローブが含む、微小粒子標識プローブの懸濁液を調製する工程と；
（ｃ）微小粒子標識プローブの懸濁液をサンプルと一緒にする工程と；
（ｄ）結合しないプローブを除去する工程と；
（ｅ）微小粒子の初期供与体染料の励起ピークの範囲内で発光する励起源でプローブを照射する工程と；
（ｆ）照射されたプローブから生ずる蛍光を検出する工程と
を含む方法、である。
【００３４】
【発明の実施の形態】
（発明の概要）
本発明は有効ストークスシフトの制御された強化を可能にする多重蛍光染料を含むポリマー微小粒子に関する。有効ストークスシフトは微小粒子のストークスシフトである、すなわち初期供与体染料のピーク励起波長と、微小粒子に配合した後の最終受容体染料の発光ピークとの差である。特に、本発明は重複した励起スペクトルと発光スペクトルを有する２種以上の蛍光化合物の組合せを含む微小粒子を開示する。組合せ中の最後の染料の発光波長において再発光する、組合せ中の第１染料の励起波長からの効果的なエネルギー伝達が、大きい、容易に制御可能な有効ストークスシフトを生ずる。適当な染料の選択が好ましい励起及び／又は発光波長と、所定の増大した有効ストークスシフトとを有する蛍光プローブを生ずる。
【００３５】
（染料の選択）
微小粒子に配合するための蛍光染料の組合せはそれらの励起及び発光スペクトル特性に基づいて選択される。組合せに含まれる染料は高エネルギー（短波長）から低エネルギー（長波長）へ伝達される励起エネルギーのカスケードを形成し、それらの配合順序又は微小粒子中のそれらのランダムな物理的位置に拘わらず、組合せ中の最終染料からの光学ルミネセンスの強化を生ずる。
【００３６】
蛍光染料の組合せのスペクトル特性は、それらが用いられるポリマー物質中で測定すべきである。ある種の４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンと４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ，８−トリアザ−ｓ−インダセン染料は溶液中でのそれらのスペクトル特性に匹敵するスペクトル特性をポリマー物質中で示すことが判明しているが、大抵の染料はそれらを測定する媒質に依存して、有意な、予測不能なストークスシフトを示す。一般に、油溶性染料と中性染料とはポリマー物質と比較的容易に結合する。後述するような好ましい励起及び発光ピークに加え、本発明に有用な染料は一般に、約０．２より大きい、好ましくは約０．５より大きい量子収量と、約２５，０００ｃｍ−１Ｍ−１より大きい、好ましくは約５０，０００ｃｍ−１Ｍ−１より大きい吸光係数とを有する。
【００３７】
候補の染料の励起及び発光ピーク、その他の性質は通常の手段によって容易に測定される。染料の励起ピークは吸収分光光度計で吸収スペクトルを走査することによって、又は直接、走査蛍光分光光度計を用いて蛍光励起スペクトルを走査することによって大体測定することができる。染料の発光ピークを蛍光分光光度計を用いて測定して、走査蛍光計を用いて発光スペクトルを得ることができる。量子収量は典型的に、励起波長において未知染料と既知吸光度を有する基準染料との両方のポリマー中での総蛍光発光を蛍光計によって測定することによって得られる。吸光係数は典型的に、分光光度計を用いて、重量測定によって測定された濃度を有する溶液の吸光度を測定し、ベールーランベルトの法則に基づいて吸光係数を算出することによって得られる。適当な染料のスペクトル特性を測定した後に、好ましいスペクトル特性を有する染料を選択する。
【００３８】
【表１】
0003689412.tif 000005
（ａ）連続操作可能な主要な励起源（ＣＷ）のみを考慮した。パルス化出力を形成する（例えばＮ２レーザー）又はＣＷイオンレーザーによるポンピングを必要とする（例えば染料レーザー，Ｔｉ：サファイアレーザー）他の幾つかのレーザー源も利用可能である。
（ｂ）物質依存性、多重の種類が利用可能である。
【００３９】
蛍光染料の組合せは好ましい励起ピークを有する初期供与体染料を含む。この初期供与体染料は例えばフォトン、Ｘ線、又は放射性物質（例えばβエミッター）の崩壊からのような、外部励起エネルギーを受容する。本発明の１実施態様では、初期供与体染料は、放射性物質の危険を避けるために、白熱励起源又はレーザーベースド励起源から励起エネルギーを受容する。アルゴンイオン、クリプトンイオン、Ｈｅ−Ｃｄ、Ｈｅ−Ｎｅ、エキシマー、ダイオード、金属蒸気、ネオジミウム−ＹＡＧ、窒素等を含むレーザーは、蛍光励起のための充分なエネルギー（ｐｏｗｅｒ）を含む、１〜数本の分離したラインを生ずる。レーザー源は紫外線から赤外線までのスペクトルにわたって多くの励起ラインを形成し、広範囲な蛍光染料を励起させるために利用可能である。
【００４０】
組合せ中の初期供与体染料は好ましい励起源からのエネルギーの発光波長と重複する励起ピークを有する。例えば、最も広範囲に用いられるビーム走査共焦点顕微鏡は現在、空冷Ａｒイオンレーザーを用いており、又はさらに最近では、Ａｒ−Ｋｒガス混合物を用いており、これらは約４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの間で蛍光染料励起を可能にする。好ましくは、励起ピークは励起源からのエネルギーの吸収のために最適である、すなわち励起ピークは励起源の出力と有意に重複する。表１は幾つかの通常の励起源の波長をリストする。
【００４１】
本発明に用いる蛍光染料の組合せは好ましい発光ピークを有する最終受容体染料をも含む。一般に、好ましい発光ピークは所望の有効ストークスシフトの大きさに基づく。バックグラウンド”ノイズ”に比較した蛍光発光の強度（シグナル対ノイズ比）が、感度と像対比の基本である。蛍光データのシグナル対ノイズ性質は問題の発光蛍光とは異なる波長においてバックグラウンドシグナルによってひどく妨害される。バックグラウンドシグナルは光散乱から生ずるか、又は多くの生物学的系に固有に存在する蛍光によるものであるか、又は分析的に有用な第２発光種から発生する。例えば、細胞の自己蛍光を避けること、又は共通の波長によって励起されるが、好ましい有効ストークスシフトを与える染料組合せの選択によって異なる波長で検出されることができる、ある範囲の物質を形成することが可能である。
【００４２】
好ましい大きさの有効ストークスシフトは、中間の供与体染料と受容体染料との両方として作用する付加的又は”トランスファー”染料を蛍光染料の組合せに含めることを必要とするであろう。好ましい励起及び発光ピークを正確に調整するために、比較的狭いストークスシフトを有する個々の染料が、トランスファー染料として好ましい。各トランスファー染料は組合せ中の上記染料からエネルギーを受容し（上記染料に対して受容体染料として作用する）、受容したエネルギーを組合せ中の次の染料に実質的に伝達する（次の染料に対して供与体染料として作用する）。蛍光染料組合せ中の各染料は組合せ中の他の染料とのスペクトル重複を有する、すなわち組合せ中の各供与体又はトランスファー染料の発光ピークは組合せ中の次の受容体又はトランスファー染料の励起ピークと重複する（Ｅｘ．４／図２）。励起ピークと発光ピークとは充分に重複するので、励起時に、各染料から次の染料への励起エネルギーの有意な（すなわち、約５０％を越える）伝達が達成される。エネルギー伝達効率の測定は、供与体染料のみを負荷したポリマーと同程度の染料負荷時に測定される供与体染料の発光ピークの蛍光強度の低下によって評価される（図１）。典型的には、実質的に完全なエネルギー伝達が達せられる（すなわち、約９０％を越える）。好ましくは、約９５％を越えるエネルギー伝達が達せられる。さらに好ましくは、約９８％を越えるエネルギー伝達が達せられる。エネルギー伝達効率が約９０％未満に低下する場合に、トランスファー染料の添加が最も適当である。トランスアァー染料の機能は初期励起供与体染料から励起状態エネルギーを受容して、最終的に検出される受容体染料へのこのエネルギーの伝達を容易にすることである。
【００４３】
典型的に、供与体染料とトランスファー及び／又は受容体染料との間の平均分子内距離が約４０Å〜約２５Åになるように充分な量の染料がポリマー微小粒子に負荷されるときに、好ましいエネルギー伝達が達せられる。約４０Åより大きい染料間の分子内距離は一般にあまり効果的でないエネルギー伝達を生じ、約２５Åより小さい染料間の分子角距離は一般に、染料の蛍光発光を減ずるような、非放射性エネルギー低下を生ずる。
【００４４】
組合せ中の初期染料から組合せ中の最終染料への効果的なエネルギー伝達が生ずるように、充分な数の供与体、受容体及びトランスファー染料が組合せ中に含まれる。染料は等量で含むことができるが、染料総量があまりに多すぎると、非放射性エネルギー低下のために、ポリマーの性質の劣化が生じ、物質の最適に及ばない蛍光が生ずる。総染料濃度が約１０重量％未満であるときに；総染料濃度が好ましくは約０．５〜２重量％未満；より好ましくは、約０．８〜１．２重量％未満であるときに、有意なエネルギー伝達と適合しうる発蛍光団間の平均ランダム距離が一般に生ずる。時には、供与体染料及び受容体染料よりも少ない（少ないモル当量の）トランスファー染料を用いて、好ましいエネルギー伝達を得ることができる。初期供与体染料よりも少ない（少ないモル当量の）最終受容体染料も好ましいエネルギー伝達を達するために効果的である。最終受容体量を初期供与体量に比例して増加させることは一般に、最終蛍光シグナルの改良に殆ど影響を及ぼさないが、初期供与体の割合を高めることは最終受容体染料の有効吸光係数を改良し、発光を増加させる。理論によって縛られることを望む訳ではないが、初期供与体染料が多い程励起時に大きい吸光係数を生じ、これが次により強度な蛍光シグナルを生ずるように、供与体染料は受容体染料にエネルギー出力を集中させるための放射線回収機構として機能するように思われる。初期供与体染料対最終受容体染料の実行可能な比は約１：５と約１０：１との間であり；好ましくは約１：１と約８：１との間であり；より好ましくは約４：１と約６：１との間である。
【００４５】
本発明の１実施態様では、新規な蛍光物質を２種以上のポリアザインダセン染料（すなわち、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン又は４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ，８−トリアザ−ｓ−インダセンの誘導体）から製造する。本発明による蛍光ポリマー微小粒子の製造に適したポリアザインダセン誘導体は式（１）：
【００４６】
【化７】
0003689412.tif 000006
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル−、アシル−、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである）で示される一般構造を有する。
【００４７】
ポリアザインダセン誘導体のアルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アルコキシ及びアルケニル置換基は一般にそれぞれ独立的に炭素数約２０未満、好ましくは炭素数約１０未満である。アルケニルなる用語には、エテニル又は共役ジエニル又はトリエニルを含み、これらはさらに水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、（これらのアルキル部分はそれぞれ炭素数約２０未満である）、シアノ、カルボキシレートエステル、カルボキサミド、アリール又はヘテロアリールによって置換されてもよい。ヘテロアリール基は少なくとも１種のヘテロ原子（環構造を形成する非炭素原子）を含む複素環芳香族基である。ヘテロアリール基は単環構造又は融合した二環もしくは三環構造であることができる。各環は五員環若しくは六員環でありうる。ヘテロアリール基は１個以上のヘテロ原子を含むことができる。ヘテロアリールなる用語は、アルキル−、アリール−、アリールアルキル−又はヘテロアリール−置換誘導体を含む。例えば、ヘテロアリール置換基はピロール、チオフェンもしくはフラン（単環、単ヘテロ原子）、又はオキサゾール、イソオキサゾール、オキサジアゾールもしくはイミダゾール（単環、多重ヘテロ原子）である。或いは、ヘテロアリール基は１種以上のヘテロ原子を含む多環構造であり、例えばヘテロアリール置換基はベンゾキサゾール、ベンゾチアゾールもしくはベンズイミダゾール（多環、多重ヘテロ原子）、又はベンゾフランもしくはインドール（多環、単ヘテロ原子）である。
【００４８】
一般に、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン誘導体染料は適当なピロール先駆体から、技術上公知の方法［例えば、ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）等への米国特許第４，９１６，７１１号（１９９０）とハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ）等への米国特許第４，７７４，３３９号（１９８８）、これらの各々は参考文献として関係する］に従って製造される。典型的には、ほぼ化学量論的割合のピロール前駆体（これらの１種は２−位置にアルデヒド又はケトン官能基を含む）を、例えば臭化水素のような、適当な酸によって仲介される反応において縮合させて、中間体のピロメテン塩を得る。例えばトリメチルアミンのような強塩基と組合せて三フッ化ホウ素を加えることによって、複素環形成の環化が完成する。４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ，８−トリアザ−ｓ−インダセン誘導体は、例えばＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンのような塩基の存在下での三フッ化ホウ素によるアザピロメテンの環化によって合成される。アザピロメテン中間体は２−ニトロソピロール誘導体と、２−位置に水素を有する、適当なピロール先駆体との酸触媒作用縮合によって製造される。
制御された有効ストークスシフトを有する蛍光微小粒子の製造に適したポリアザインダセン染料の代表的なサンプルとそれらのスペクトル特性の要約とを表２に含める。他の有用なジピロメテンホウ素ジフルオリド染料は１９９１年５月２２日出願のカング（Ｋａｎｇ）等への同時係属特許出願第０７／７０４，２８７号と、１９９０年１２月１８日出願のハウグランド（Ｈａｕｇｌａｎｄ）等への出願第０７／６２９，５９６号（これらの各々は参考文献として関係する）とに述べられている。
【００４９】
ポリマー微小粒子中に共に配合する場合に、供与体から受容体への効果的なエネルギー伝達が行われるように充分に重複する、望ましい励起波長と発光波長を有するポリアザインダセン誘導体の適当な選択は、（１）供与体、トランスファー及び／又は受容体染料の励起と発光との波長と；（２）供与体染料発光とトランスファー及び／又は受容体励起との重複；（３）供与体、トランスファー及び／又は受容体染料の相対的濃度；及び（４）染料分子間の平均距離を考慮して、達せられる。
【００５０】
【表２】
0003689412.tif 000007
＊代表的な、非排他的例
†２−ピロリル
【００５１】
【表３】
0003689412.tif 000008
†メタノール中の遊離染料の吸収最大（λＡｂｓｍａｘ）と発光最大（λＥｍｍａｘ）測定値
‡ラテックス水性懸濁液中の染料の吸収最大（λＡｂｓｍａｘ）と発光最大（λＥｍｍａｘ）測定値。光学密度７００ｎｍにおいて０．１に設定。
【００５２】
特定用途に適用するために、励起特性と発光特性の両方を用いて、励起源と検出器との特定必要条件を満たすように蛍光物質は容易に調整される。例えば、化合物１はアルゴンレーザーの本質発光に相当する約４８８ｎｍの非常に有用な励起を有する染料として、供与体染料として選択され、表２の他の染料は所望の発光ピークを得るためのトランスアァー染料又は受容体染料として選択される。
【００５３】
化合物１によってのみ標識されたポリスチレン微小粒子は５０４ｎｍにおける最大励起と約５１２ｎｍに集中する黄−緑色蛍光発光とを有する。粒子を化合物３によってのみ標識する場合は、粒子は５５７ｎｍに集中する橙色蛍光発光を有する。化合物１（供与体）と化合物３（受容体）とを適当なモル比で混合して、ポリスチレン微小粒子中に配合する場合には（Ｅｘ．３）、５１２ｎｍにおける化合物１の黄−緑色発光は約９５％より大きい効率で化合物３に伝達されて、５５７ｎｍにおける橙色発光を生ずる。有効ストークスシフトは８ｎｍから５６ｎｍへ増大する（図１）。有効ストークスシフトをさらに高めるために、トランスアァー染料を加えることができる。化合物１（供与体）、化合物３（トランスアァー染料）及び化合物４（受容体）とを適当なモル比で混合して、ラテックス微小粒子中に配合する場合には（Ｅｘ．４）、エネルギー伝達（約９５％より大きい効率による）が６０５ｎｍにおける赤色発光を生ずる。有効ストークスシフトは８ｎｍから１０１ｎｍへ増大する（図２）。化合物１（初期供与体）、化合物３（トランスファー染料）、化合物４（トランスファー染料）及び化合物６（最終受容体）とを混合して、ラテックス微小粒子中に配合する場合には、エネルギー伝達（約９０％より大きい効率による）が６４５ｎｍにおける暗赤色発光を生ずる。有効ストークスシフトは８ｎｍから１４１ｎｍへ増大する。
【００５４】
或いは、化合物３を供与体として用い、化合物４を受容体として用いた場合に、この場合にも共通アルゴンレーザー（第２ライン）を用い、ヒト血清の自己蛍光の大部分を避けるならば、約５３０ｎｍにおいて励起することができ、約６０５ｎｍにおいて発光することができる（有効ストークスシフト約７５ｎｍ）ラテックス粒子を得ることができる。染料の発光ピークと励起ピークとの間にスペクトル重複が生ずる限り、多くの他の染料組合せが可能である。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、蛍光染料はクマリン染料の組合せである。適当な染料には、表３にリストした商業的に入手可能な染料がある。既述したポリアザインダセン染料の場合と同様に、ポリマー微小粒子中に共に配合するときに、供与体から受容体への効果的なエネルギー伝達が達せられるように充分に重複する、好ましい励起波長と発光波長とを有するクマリン誘導体の適当な組合せを選択することができる。例えば、３６０ｎｍにおいて励起し、約４１５ｎｍに集中する発光を示す（ポリスチレンラテックス中）初期供与体クマリン１３８（７−ジメチルアミノシクロペンタ［ｃ］クマリン）を適当なモル比で、４３０ｎｍにおいて吸収し、約４６０ｎｍに集中する発光を示す（ポリスチレンラテックス中）最終受容体クマリン３１４（２，３，５，６−ｌＨ，４Ｈ−テトラヒドロ−９−カルポエトキシキノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン）と混合して、ラテックス微小粒子中に配合する場合には（Ｅｘ．５）、クマリン１３８の青色発光がクマリン３１４に伝達されて、約４６０ｎｍに集中する青−緑色発光が生ずる。有効ストークスシフトは５５ｎｍから１００ｎｍへ増大する。
【００５６】
新規な微小粒子は非常に高い蛍光効率を有し、典型的に、分子間のエネルギー伝達プロセスを通してのシグナル強度の見かけの（ａｐｐａｒｅｎｔ）損失は生じない。例えば、吸光度が０．５８である場合に４９０ｎｍにおいて図１に示した蛍光微小粒子中の供与体染料の励起は、吸光度が同様に０．５８である場合に５４０ｎｍにおける受容体染料の励起に起因する５５７ｎｍにおける対応シグナルに等しいシグナルを５５７ｎｍにおいて生ずる。この極度に高い伝達効率は、図１の蛍光スペクトルにおいて供与体染料からの検出可能な発光シグナルが殆ど存在しないと言う観察に一致する。図１、スペクトルＡの４９０ｎｍ〜５２０ｎｍの発光シグナルの積分面積と図１、スペクトルＢの４９０ｎｍ−５２０ｎｍの発光シグナルの積分面積との比較は、伝達効率が約９９％であることを実証する。
【００５７】
供与体染料の発光ピークとトランスファーおよび／または受容体染料の励起ピークとの間の重複度は完全である必要はない。例えば、１つの実施形態の微小球では、ジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ）の発光ピークと化合物１の励起ピークとの間に完全ではない重複が存在する。それにも拘わらず、この重複はＤＰＨから化合物１への発光の約７５％の伝達をもたらす。
【００５８】
例えば上記ポリアザインダセン又はクマリンのように、染料は典型的に同じ種類から選択される。他の適当な染料の種類には、炭化水素と置換炭化水素染料；シンチレーション染料（通常は、オキサゾールとオキサジアゾール）；アリール−及びヘテロアリール−置換ポリオレフィン（Ｃ２−Ｃ８オレフィン部分）；カルボシアニン；フタロシアニン；オキサジン；カルボスチリル；及びポルフィリン染料がある（表３参照）。しかし、例えばポリオレフィン染料とジピロメテンホウ素ジフルオリド染料（Ｅｘ．６）；クマリン染料とジピロメテンホウ素ジフルオリド染料（Ｅｘ．７）；ポリオレフィン染料とクマリン染料；ジピロメテンホウ素ジフルオリド染料とオキサジン染料１及びその他の多くの組合せのような、構造的に異なる染料の間で効果的なエネルギー伝達を得ることも可能である。表３は商業的に入手可能な、適当な蛍光染料の部分的なリストを含む。
【００５９】
（表３．商業的に入手可能な染料）
５−アミノ−９−ジエチルイミノベンゾ（ａ）フェノキサゾニウムパークロレート
７−アミノ−４−メチルカルボスチリル
７−アミノ−４−メチルクマリン
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン
３−（２’−ベンズイミダゾリル）−７−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノクマリン
３−（２’−ベンゾチアゾリル）−７−ジエチルアミノクマリン
２−（４−ビフェニリル）−５−（４−ｔ−ブチルフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール
２−（４−ビフェニリル）−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾール
２−（４−ビフェニリル）−６−フェニルベンゾキサゾール−１，３，２，５−ビス−（４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール
２，５−ビス−（４−ビフェニリル）−オキサゾール
４，４”’−ビス−（２−ブチルオクチルオキシ）−ｐ−クオーターフェニル−ｐ−ビス（ｏ−メチルスチリル）−ベンゼン
５，９−ジアミノベンゾ（ａ）フェノキサゾニウムパークロレート
４−ジシアノメチレン−２−メチル−６−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピラン
１，１’−ジエチル−２，２’−カルボシアニンヨージド
１，１’−ジエチル−４，４−カルボシアニンヨージド
３，３’−ジエチル−４，４’，５，５’−ジベンゾチアトリカルボシアニンヨージド
１，１’−ジエチル−４，４’−ジカルボシアニンヨージド
１，１’−ジエチル−２，２’−ジカルボシアニンヨージド
３，３’−ジエチル−９，１１−ネオペンチレンチアトリカルボシアニンヨージド
１，３’−ジエチル−４，２’−キノリルオキサカルボシアニンヨージド
１，３’−ジエチル−４，２’−キノリルチアカルボシアニンヨージド
３−ジエチルアミノ−７−ジエチルイミノフェノキサゾニウムパークロレート
７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリン
７−ジエチルアミノ−４−トリフルオロメチルクマリン
７−ジエチルアミノクマリン
３，３’−ジエチルオキサジカルボシアニンヨージド
３，３’−ジエチルチアカルボシアニンヨージド
３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド
３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニンヨージド
４，６−ジメチル−７−エチルアミノクマリン
２，２”’−ジメチル−ｐ−クオーターフェニル
２，２”’−ジメチル−ｐ−ターフェニル
７−ジメチルアミノ−１−メチル−４−メトキシ−８−アザキノロン−２
７−ジメチルアミノ−４−メチルキノロン−２
７−ジメチルアミノ−４−トリフルオロメチルクマリン
２−（４−（４−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル）−３−エチルベンゾチアゾリウムパークロレート
２−（６−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−２，４−ネオペンチレン−１，３，５−ヘキサトリエニル）−３−メチルベンゾチアゾリウムパークロレート
２−（４−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル）−１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドリウムパークロレート
３，３’−ジメチルオキサトリカルボシアニンヨージド
２，５−ジフェニルフラン
２，５−ジフェニルオキサゾール
４，４，−ジフェニルスチルベン
１−エチル−４−（４−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル）−ピリジニウムパークロレート
１−エチル−２−（４−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル）−ピリジニウムパークロレート
１−エチル−４−（４−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル）−キノリウムパークロレート
３−エチルアミノ−７−エチルイミノ−２，８−ジメチルフェノキサジン−５−イウムパークロレート
９−エチルアミノ−５−エチルアミノ−１０−メチル−５Ｈ−ベンゾ（ａ）フェノキサゾニウムパークロレート
７−エチルアミノ−６−メチル−４−トリフルオロメチルクマリン
７−エチルアミノ−４−トリフルオロメチルクマリン
１，１’，３，３，３’，３’−ヘキサメチル−４，４’，５，５’−ジベンゾ−２，２’−インドトリカルボシアニンヨージド
１，１’，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニンヨージド
１，１’，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドトリカルボシアニンヨージド
２−メチル−５−ｔ−ブチル−ｐ−クオーターフェニル
Ｎ−メチル−４−トリフルオロメチルピペリジノ−＜３，２−ｇｈ＞クマリン
３−（２’−Ｎ−メチルベンズイミダゾリル）−７−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノクマリン
２−（１−ナフチル）−５−フェニルオキサゾール
２，２’−ｐ−フェニレン−ビス（５−フェニルオキサゾール）
３，５，３””’，５””’−テトラ−ｔ−ブチル−ｐ−セクシフェニル
３，５，３””，５””−テトラ−ｔ−ブチル−ｐ−キンキフェニル
２，３，５，６−１Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロ−９−アセチルキノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン
２，３，５，６−１Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロ−９−カルボエトキシキノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン
２，３，５，６−１Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロ−８−メチルキノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン
２，３，５，６−１Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロ−９−（３−ピリジル）−キノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン
２，３，５，６−１Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロ−８−トリフルオロメチルキノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン
２，３，５，６−１Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロキノリジノ−＜９，９ａ，１−ｇｈ＞クマリン
３，３’，２”，３”’−テトラメチル−ｐ−クオーターフェニル
２，５，２””，５””−テトラメチル−ｐ−キンキフェニル
ｐ−ターフェニノレ
ｐ−クオーターアェニル
ニル  レッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）
ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）７００
オキサジン（Ｏｘａｚｉｎｅ）７５０
ローダミン８００
１Ｒ  １２５
１Ｒ  ｌ４４
１Ｒ  １４０
１Ｒ  １３２
１Ｒ  ２６
１Ｒ  ５
ジフェエニルヘキサトリエン
ジフェニルブタジエン
テトラフェニルブタジエン
ナフタレン
アントラセン
ピレン
クリセン
ルブレン
コロネン
フェナントレン
フルオレン
アルミニウムフタロシアニン
白金オクタエチルポルフィリン
上述したように、ポリマー物質中の染料のスペクトル特性を測定したならば、それらの特性を用いて、使用すべき励起源と利用可能な検出系とその物質を用いる環境とを考慮して、一定用途のための最適の染料組合せを選択することができる。
【００６０】
（微小粒子中への配合）
好ましいスペクトル特性を有する染料の組合せを選択した後に、染料をポリマー微小粒子中へ配合する。ポリマー微小粒子はスチレン、アタリレート並びに不飽和塩化物、エステル、アセテート、アミド及びアルコールを含めた、多様な重合可能なモノマーから、非限定的にニトロセルロース、ポリスチレン（例えば臭化ポリスチレンのような高密度ポリスチレンラテックスを含む）、ポリメチルメタクリレートその他のポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、及びポリジビニルベンゼンを含めたポリマーから製造することができる。
【００６１】
本発明の１実施態様では、染料を含まない微小粒子から新規な蛍光物質を製造する。この微小粒子は多様な、有用なサイズと形状で製造することができる。これらの形状は球状又は不規則形であり、サイズは約０．０１μｍ〜約５０μｍの範囲である。標識された微小粒子は典型的に直径約１５μｍ未満であり、球状である。より典型的には、微小粒子は直径５μｍ未満の微小球状である。微小粒子は均一なサイズ及び／又は形状、又は不規則である。或いは、例えば商業的に入手可能な、多様な種類の蛍光微小球のような、予め着色した微小粒子に１種以上の染料を、既存染料と追加染料との間にスペクトル重複の必要条件が満たされる限り、加える。
【００６２】
例えばモノマーと染料含有コモノマーとの共重合又はポリマー微小粒子の水性懸濁液への適当な有機溶媒中の適当な染料誘導体の添加のような、技術上公知の方法のいずれかによって、蛍光染料を微小粒子中に配合する。例えば、カルボキシル、アミノ又はヒドロキシルのような共有結合基を含む又は含まない単不飽和（ｍｏｎｏ−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ）モノマーの水性懸濁液と、供与体染料部分、トランスファー染料部分及び／又は受容体染料部分の適当な混合物を含むモノマー、少なくとも１０重量％を含む蛍光モノマー混合物とのフリーラジカル開始嫌気性共重合によって、レンバウム（Ｒｅｍｂａｕｍ）の方法（参考文献として関係する米国特許第４，３２６，００８号（１９８２））に従って、蛍光微小粒子を製造することができる。蛍光微小粒子は、バングス（Ｂａｎｇｓ）（ＵＮＩＦＯＲＭ  ＬＡＴＥＸ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ（１９８４，サラジェン社（Ｓｅｒａｇｅｎ，ｌｎｃ．））が述べているように、微小粒子の撹拌水性懸濁液に適当な溶媒中の適当な蛍光染料の溶液を徐々に加えることによっても製造することができる。
【００６３】
本発明の微小粒子の主な利点は、微小粒子の有効ストークスシフトを増大させて、微小粒子を特定用途に応ずるように調整するために、多重トランスファー染料を初期供与体染料及び最終受容体染料と容易に混合することができることである。このことは例えば染料相互の共有結合のような化学的手段によっては容易に達成することができない。さらに、染料は粒子中に、共有化学結合によって実際に得られるよりも小さい分子間分離を生ずるような濃度で分布されるので、エネルギー伝達の見込みが改良される。さらに、染料はポリマー中に存在するので、このポリマーが染料の自由運動を制限し、染料分子が振動的に相互を不活化することを防止するように思われる。さらに、ポリマー微小粒子への染料の配合は通常、染料の照射に対する安定性を高め、染料を微小粒子を囲む媒質中の成分から保護する。
【００６４】
有機溶媒に易溶であるが、水中には非常に難溶である油溶性蛍光染料は、予め製造されたポリマー微小粒子への染料の溶液型（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｂａｓｅｄ）添加によって容易に導入することができる。このことは操作の細心の最適化とその後の選択した蛍光染料組合せの添加とによって、好ましい性質を有する均一なポリマー微小粒子を製造することができると言う大きな利点を提供する。さらに、溶液型添加プロセスは効果的なエネルギー伝達を達成する上での重要なパラメーターである、染料の相対的濃度の調節に大きな柔軟性を与える。
【００６５】
このようにして、例えばサイズと電荷密度のような、好ましい物理的性質を有する微小粒子の大きいバッチを得ることができる。次に、このバッチの少量部分に種々な蛍光染料を加えて、例えば診断試験の開発のような用途に矛盾のない、再現可能な性能を与える、好ましい有効ストークスシフトを有する蛍光ポリマー微小粒子のサブバッチを得ることができる。予め製造したポリマー微小粒子に染料を溶液型添加することによって製造する蛍光微小粒子の場合には、本発明の蛍光微小粒子の表面特性は対応する、染料を含まない微小粒子の表面特性と実質的に異ならない。微小粒子の蛍光標識は微小粒子を囲む媒質のｐＨの変化によっても影響を受けない。
【００６６】
さらに、本発明の微小粒子に用いる染料は微小粒子の懸濁媒質として一般に用いられる水性溶媒によって微小粒子から有意に除去されない。例えば、化合物４と化合物６（表２）を含む蛍光微小粒子の水性懸濁液を０．２％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下で６０℃の温度にさらす場合に、粒子から検出可能な染料が抽出されない。均一な微小粒子を細心に製造する場合には、蛍光微小粒子が水性懸濁液中に単分散される。例えば、化合物１と化合物３とによって染色した１．０９μｍポリスチレン微小球は目視検査（エピ蛍光顕微鏡検査）によって単分散することが判明している。
【００６７】
（付加的改質（Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ））
大きくかつ制御可能な有効ストークスシフトを有する、本発明の蛍光ポリマー微小粒子の製造に用いられる蛍光化合物は、一般に親油性であり、通常は正味の中性電荷を有するので、例えば、通常、蛍光微小粒子の製造に使用されるフルオレセイン及びローダミン６Ｇのような、他の蛍光染料のようには、ポリマー微小粒子の荷電特性に寄与しない又はこの荷電特性を変化させない。その結果、本発明の蛍光微小粒子は蛍光染料の他に、例えば生体反応性物質のような、他の多くの物質を含むことができる。生体反応性物質は生物学的系に由来する分子と、このような分子が天然に生成するか又は該系の何らかの外部妨害（例えば、疾患、中毒、遺伝的操作）から生ずるかのいずれであっても、反応する又は結合する物質である。説明のために、生体反応性物質は生体分子（すなわち、限定する訳ではなく、例えばペプチド、蛋白質、多糖類、オリゴヌクレオチド、アビジン、ストレプトアビジン、ＤＮＡ及びＲＮＡのようなポリマー生体分子並びに、例えばビオチン及びジゴキシゲニンのような、非ポリマー生体分子を含む生物学的起源の分子）、例えばウイルス及びハプテン（例えばホルモン、ビタミン又は薬物）のような顕微鏡的微生物を含むものとする。蛍光微小粒子の他の実施態様は微小粒子の表面に共有結合又は不動吸着した（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ  ａｄｓｏｒｂｅｄ）生体反応性物質を含むものとする。この付加的な生体反応性物質は一般に技術上公知の方法によって加えられ、蛍光標識微小粒子の表面に共有結合する（例えば、ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．ＲＥＶ．２，２４９（１９７３））又は非共有的に吸着する（例えば、Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．１５４，１５３９（１９８１））。これらの表面結合又は吸着分子は、蛍光染料を配合した後に、微小粒子に加えるのが最もよい。これらの改質は、制御可能な有効ストークスシフトと共に、本発明の微小粒子を広範囲な診断試験に有用にする。
【００６８】
さらに、蛍光微小粒子の製造に用いられる微小粒子は多様な表面特性を有し、非限定的にスルフェート、ホスフェート、ヒドロキシル、カルボキシル、エステル、アミド、アミジン、アミン、スルフヒドリル、及びアルデヒドを含めた官能基を有するものとして、製造又は購入することができる。表面基は微小粒子の表面への付加的物質の共有結合又は非共有結合に用いるために重要である。この表面基は粒子に例えば種々な親水性度のような、好ましい物理的性質を与えるように選択することもできる。
【００６９】
（核酸の検出）
本発明の蛍光微小粒子はハイブリッド形成による核酸（例えばＲＮＡ及びＤＮＡ）の検出のための理想的な試薬である。この微小粒子は、このような検出のために用いられる標準的試薬である放射能に比べて、比較的安全であり、無毒であり、しかもこれらの微小粒子の検出限界は放射能の検出限界に匹敵する。これらの微小粒子は現在用いられている発蛍光団よりも化学的に安定であり、結合した酵素活性又は抗体による二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）検出を必要とする試薬よりも使用し易い。さらに、シグナル強化が必要である場合には、これらは二次検出のために抗体に結合させることができる。最後に、この新規な微小粒子は種々な波長において発光し、幾つかの選択可能な波長のいずれかにおいて有意な強度を有するように調整することができるので、種々な核酸種又は種々な抗原の同時の又は逐次の多色検出を行うために容易に使用することができる。
【００７０】
核酸の検出又は同定に標識微小粒子を用いることは知られているが（上記参考文献を参照のこと）、本発明の微小粒子は今までに述べられた他の微小粒子を凌駕する多くの利点を有する。長い有効ストークスシフトを得ることができるので、本発明の微小粒子をサンプルの固有の自己蛍光（例えば、藻類又はその他の植物細胞中に存在するような）又は顔料の存在（例えば、ヘム又はキサンチン）が通常シグナルを妨害するような用途に用いることができる。さらに、本発明の微小粒子は非特異的結合を減ずるように改質された表面を有して製造されることができる。この特徴はハイブリッド形成方法のためにバックグラウンドに対してシグナルを非常に高めるので、著しく改質した表面を有する膜の使用を必要とする標識微小粒子を用いる、今までに発表されたプロトコールとは対照的に、標準的なハイブリッド形成フィルターの使用を可能にする。さらに、本発明の微小粒子は現在入手可能な微小粒子よりも有意に光沢があるので、他の標識微小粒子によって可能であるよりも一桁低い大きさまでの検出範囲を生ずる。
【００７１】
核酸検出は一般に、核酸プローブと標的核酸との組合せがハイブリッド形成対を形成するように、標的核酸の塩基配列を特異的に識別する核酸塩基配列を含む核酸プローブを用いて、標的核酸を含むと考えられるサンプルを試験することを含む。この核酸プローブは典型的に約４塩基より多くから数万塩基程度までを含むが、全染色体の試験は数百万塩基を含むことになる。
【００７２】
検出シグナルを与えるために、１個以上の本発明の蛍光微小粒子を核酸プローブに付着させて微小粒子標識プローブを形成する。或いは、１個以上の核酸プローブを単一微小粒子に結合させる。核酸プローブの微小粒子への結合は典型的に、相互に特異的に識別し、緊密に結合する分子対を用いて、すなわち特異的に結合する対要素（例えば、アビジンとビオチン又はジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン抗体）を用いて実施される。特異的に結合する対の１要素は直接に（酵素的もしくは化学的合成中の配合によって又は５’もしくは３’末端結合として）又はリンカー分子を介してのいずれかで、核酸プローブに結合する。特異的に結合する対の他方の要素は直接に又はリンカー分子によって蛍光微小粒子に結合する。或いは、特異的結合対要素の介在を用いずに技術上公知の方法によって、核酸プローブを蛍光微小粒子に共有結合させることができる［例えば、クレムスキー（Ｋｒｅｍｓｋｙ）等，ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１５，２８９１（１９８７），参考文献として引用する］。
【００７３】
全てのプローブが初期供与体染料の同一励起ピークを有するが、各プローブが他のプローブの発光ピークとは検出可能に識別される、異なる発光ピークを有する、数種の微小粒子標識プローブを製造できることが、本発明の微小粒子の特別な利点である。この結果、これらの微小粒子は多重の核酸種の同時検出に特に適する。放射性方法、化学発光標識又は直接発蛍光団結合体とは異なり、本発明の微小粒子は例えば、手で支えるＵＶ灯のような、安価で、容易に入手可能な装置によって同時に励起可能であり、スペクトル的に識別可能な、広範囲な色で製造することができ、その発光は眼によって容易に検出され、識別されることができる。
【００７４】
蛍光シグナルの単離のために機器手段を加えると、検出可能に異なる標識の可能な数は膨大に増加する。本発明の方法を用いると、例えばアィルター、モノクロメーター、又はフォトダイオードアレイ、又は例えばパルスもしくは位相変調手段によるような蛍光シグナルの他の識別方法のような、波長選択要素の適当な選択によって分解可能である限り多くの、異なる標識を作成することができ、各異なる標識が異なる分析物の検出を可能にする。このように、検出可能な”Ｘ”種の染料を含むことはＸ種の核酸プローブを異なる染料によって独立的に標識し、単一核酸標的混合物にハイブリッド形成させて、その混合物中のＸ種の独立的な標的種を検出することを可能にする。例えば、細胞質中のマイコプラズマ、ウイルス又はプラスミドの存在を単細胞の核中（又は発生する胚の部分中）の染色体もしくはプラスミドに含まれる遺伝子から、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いて、目視的に識別することができる；又はＸ種と同程度の異なる遺伝子に相当するＲＮＡもしくはＤＮＡ分子をノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）もしくはスポットプロットにおいて又は溶液ハイブリッド形成によって、同時に分析することができる；又はＸ種と同程度の異なる遺伝子の位置を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いて、染色体スカッシュ（ｓｑｕａｓｈ）もしくはスプレッド（ｓｐｒｅａｄ）上の真核細胞染色体上で相互に関して測定することができる。
【００７５】
このような多色検出のための微小粒子標識プローブは種々な形式で仲介されることができる。これらには（ａ）直接の核酸−微小粒子結合体（リンカー分子を含む又は含まない）、（ｂ）ビオチニル化核酸とアビジン標識微小粒子との使用、又はビオチニル化核酸とストレプトアビジンとビオチニル化微小粒子との使用による結合、（ｃ）ジゴキシゲニン標識核酸と、微小粒子に結合したジゴキシゲニンに対する抗体、（ｄ）微小粒子に結合した抗体によって検出される、フルオレセインもしくはジニトロフェニル基のような、他の抗原物質によって標識された核酸、又は（ｅ）抗原物質による標識後に、適当な抗体との反応、その後にプロティンＡ結合微小粒子によって検出される核酸がある。これらの種々な検出方法を組合せて、多重に仲介される多色検出を行うこともできる。
【００７６】
微小粒子標識プローブは、単色検出系用又は多色検出系用のいずれであっても、標的核酸を含むと考えられるサンプルと組合せる。典型的に、このサンプルを微小粒子標識プローブの水性懸濁液と共にインキュベートする。単色系を用いる場合には、この水性懸濁液は実質的に同一微小粒子標識プローブを含むことができる。多色系を用いる場合には、この水性懸濁液は数種類の検出可能な微小粒子標識プローブを含むことができる。各場合に、微小粒子標識プローブは特定の核酸標識又は核酸標的の組合せに対して特異的である。
【００７７】
微小粒子標識プローブと組合せる前に、サンプル中の核酸をプローブに接近可能にする方法でサンプルを調製する。サンプルは混合物として又は個別の核酸種として精製核酸を含むことができる；サンプルは溶解した細胞中の核酸を他の細胞成分と共に含むことができる；又はサンプルは透過性細胞全体として核酸を含むことができる。サンプルの調製はサンプル中の核酸を利用可能にする方法に依存する。
【００７８】
サンプルが精製核酸を含む場合に、精製核酸は種々な核酸の混合物であることができる。或いは、この精製核酸をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、個別の核酸種にすることもできる。精製核酸を含むサンプルの調製は変性と中和を含む。塩基（例えば水酸化ナトリウム）とのインキュベーション又は熱によって、ＤＮＡを変性させることができる。ＲＮＡも加熱（スポットブロットのために）又は、塩基への暴露によってではなく、例えば尿素、グリオキサルもしくはホルムアルデヒドのような変性剤の存在下での電気泳動（ノザンブロットのために）によって変性させることができる。次に、任意に、酸（例えば、塩酸）の添加、急冷、又は緩衝液（例えば、トリス、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）の添加によって、核酸を中和する。
【００７９】
精製核酸を含むサンプルの調製は典型的にさらに、固体担体への核酸の固定を含む。精製酸を一般に、例えばニトロセルロースフィルター又はナイロン膜のようなフィルター膜上に、ＤＮＡスポットブロットのためには適当な塩（例えば塩化ナトリウム又は酢酸アンモニウム）の存在下でスポットする。或いは、適当な緩衝剤条件下での毛管ブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）又はエレクトロブロッィング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）（サザンプロットのために）によって、精製核酸をニトロセルロースフィルターに移す。核酸をフィルター膜に永久的に結合させるために、標準架橋方法を用いる（例えば、ニトロセルロースフィルターを真空中で８０℃において焼成する；ナイロン膜を３６０ｎｍ光線によって照射する）。次に、フィルター膜を核酸プローブの非特異的結合を阻止するように設計された溶液（例えば、ＢＳＡ、カゼイン加水分解物、プローブに関係しない種からの一重鎖核酸等）と共にインキュベートし、同じ溶液内でプローブとハイブリッド形成させる。非特異的結合プローブをフィルターから、例えばクエン酸塩生理食塩水又はリン酸塩緩衝剤のような溶液によってフィルターから、非特異的結合プローブを洗い流す。微小粒子（例えば洗剤）の非特異的付着を阻止するために、フィルターをブロックする。最後に、サンプルを標識微小粒子によってプロービングし、さらにブロッキング緩衝剤による洗浄によって非特異的結合した微小粒子を除去する。サンプルが細胞核酸（例えば、細胞、ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルス又はマイコプラズマ感染細胞内の染色体又はプラスミドに含まれる遺伝子、又は細胞内ＲＮＡ）を含む場合には、サンプルの調製は既述した変性と中和の他に、細胞の溶解又は透過性化を含む。細胞を例えば洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙ１）又はトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ））、リゾチーム、塩基（例えば、ナトリウム、リチウム又はカリウムの水酸化物）、クロロホルム、又は熱のような作用剤への暴露によって溶解する。細胞を例えば緩衝剤中のホルムアルデヒドによるような、通常の方法によって透過性化する。
【００８０】
精製核酸を含むサンプルの場合と同様に、細胞核酸を含むサンプルの調製は典型的にさらに固体担体上の核酸の固定を含む。溶解した細胞では、懸濁液中の細胞をニトロセルロースもしくはナイロン膜上にスポットする、又はニトロセルロースもしくはナイロン膜を通して濾過する、或いは細胞コロニーを適当な増殖培地と接触する膜上で直接増殖させて、核酸を上述のようにフィルターに永久的に固定する。透過性化細胞は典型的に顕微鏡スライド上に、染色体”スカッシュ”又は”スプレッド”へのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成及びハイブリッド形成のために用いられる公知の方法（例えば、緩衝化溶液中のホルムアルデヒドのような試薬による）によって固定される。次に、スライドを溶液（例えば、トリエタノールアミンと無水酢酸）によって処理して、微小粒子の非特異的結合を阻止し、緩衝溶液（例えば、トリス／グリシン、リン酸塩緩衝化した生理的食塩水又はクエン酸塩生理食塩水）によって処理する。最後に、顕微鏡検査のためのサンプルを調製するために、サンプルを脱水して（例えば、エタノールの段階的希釈物シリーズのような試薬による）、乾燥させる。予備ハイブリッド形成及びハイブリッド形成溶液、ブロッギング、ブロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）、固体担体上での洗浄は本質的に上述した通りである。
【００８１】
微小粒子標識プローブによるサンプルのブロービング後に、非結合プローブを例えば洗浄のような通常の方法によってサンプルから除去する。次に、微小粒子標識プローブの初期供与体染料の励起ピークの範囲内の励起エネルギー放出源によって、サンプルを照射し、その後に照射されたプローブに由来する蛍光を検出する。
【００８２】
下記説明によって、本発明の実施を述べるが、この説明は例示のためであり、限定のためではない。
【００８３】
【実施例】
（実施例１：４，４−ジフノレオロ−５，７−ジフェニル−３−（ピロール−２−イル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（化合物６）の調製）
ジクロロメタン  １５ｍｌ中の３，５−ジフェニルピロール−２−カルボキサアルデヒド９０ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）と２，２’−ビピロール５０ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）との溶液に、オキシ塩化リン４０μｌ（０．４５ｍｍｏｌ）を加える。この反応混合物を室温において１２時間撹拌し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン２２５μ１（１．６２ｍｍｏｌ）を加え、次に三フッ化ホウ素エーテレート２００μｌ（１．６２ｍｍｏｌ）を加える。全混合物を室温において２時間撹拌した後に、水２０ｍｌずつで２回洗浄する。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、暗青紫色固体を得る。粗生成物を溶離剤としてヘキサン中３０％クロロホルムを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製して、暗青紫色固体４９ｍｇ（３３％）を得る。
【００８４】
Ｈ．ラパポルト（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ）等，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．８４，２１７８（１９６２）に述べられているように、２，２’−ビピロールを製造する。Ｒ．Ｍ．シルバースタイン（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ）等，ＯＲＧ．ＳＹＮＴＨ．ＣＯＬＬ．ＩＶ巻，８３１頁に従って、ビルスマイヤー  ハーク（Ｖｉｌｓｍｅｙｅｒ  Ｈａａｋ）ホルミル化によって、３，５−ジフェニル−２−ピロールカルボキサアルデヒドを２，４−ジフェニルピロールから製造する。
【００８５】
化合物１と２を、実施例１に述べたように、ピロール−２−カルボキサアルデヒドと３，５−ジメチルピロール−２−カルボキサアルデヒドのそれぞれ２，４−ジメチルピロールとの反応によって製造する。化合物３と４を、実施例１に述べたように、２，４−ジメチルピロールと２，４−ジフェニルピロールのそれぞれ３，５−ジフェニルピロール−２−カルボキサアルデヒドとの反応によって製造する。
【００８６】
（実施例２；４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−８−トリアザ−ｓ−インダセン（化合物５）の調製）
氷酢酸５ｍｌ中の２，４−ジフェニルピロール８５ｍｇ（０．４０ｍｍｏｌ）と２−ニトロソ−３，５−ジフェニルピロール１００ｍｇ（０．４０ｍｍｏｌ）との混合物を３時間還流加熱する。反応混合物が室温に冷却した後に、これをエーテル２０ｍｌ中に注入する。生ずる混合物を濾過によって回収し、エーテルによって洗浄し、乾燥させて、青色固体８９ｍｇを得る。この固体をジクロメタン１０ｍｌ中に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１００μｌ（０．５７ｍｍｏｌ）と、三フッ化ホウ素エーテレート７０μｌ（０．５１ｍｍｏｌ）とを加える。反応混合物を室温において２時間撹拌した後に、反応混合物を実施例１に述べたように処理し、精製して、暗青色固体として化合物８０ｍｇ（４０％）を得る。
【００８７】
（実施例３：２種のポリアザインダセン染料を用いた新規な微小粒子の製造）
０．０９３μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく撹絆した懸濁液［インターフェイシャル  ダイナミックス社（Ｉｏｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．），オレゴン州，ポートランド；５０％ｖ／ｖ蒸留水／メタノール中の３．０５％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン９ｍｌと無水エタノール１６ｍｌとの均質な混合物中に溶解した化合物１  ５０ｍｇと化合物３  １７ｍｇとの溶液を加える。染料の添加はテフロン（登録商標）分配管（内径０．０３８インチ）を装備した注射器ポンプによって実施し、染料溶液を６ｍｌ／時の流量で供給する。添加が終了した後に、ゆるやかに充填したガラスウールに通して、この懸濁液を濾過して、デブリ（ｄｅｂｒｉ）を除去し、回転蒸発器上で室温において部分的に蒸発させて、ジクロロメタンとアルコールとを除去する。次に、染色したラテックスの水性懸濁液を再びガラスウールに通して付加的デブリを除去し、透析して（２５ｍｍ管、ＭＷカットオフ１２，０００〜１４，０００）、残留染料を除去する。透析物の蛍光測定分析による検出時に遊離染料が粒子からもはや除去されなくなるまで、透析を実施する。透析から蛍光ラテックス懸濁液を取り出し、再びガラスウールに通して濾過して、残留凝集物とその他のデブリを除去する。次に、この懸濁液を浴音波処理装置中で１０分間音波処理して、単分散を確実にする。標準ローダミンフィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。４８０ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、５５７ｎｍに集中する単一発光ピークを示す。
【００８８】
（実施例４：３種のポリアザインダセン染料を用いた新規な微小粒子の製造）
０．０３０μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく撹拝した懸濁液［インターフェイシャル  ダイナミックス社，オレゴン州，ポートランド；５０％ｖ／ｖ蒸留水／メタノール中の３．６７％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン７．５ｍｌと無水エタノール１７．５ｍｌとの均質な混合物中に溶解した化合物１５０ｍｇと、化合物３  １７ｍｇと、化合物４  ２２ｍｇとの溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。標準テキサスレッド  コンパーチブル  フィルター（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｃｏｍｐａｒｔｉｂｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。４８０ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、６０５ｎｍに集中する単一発光ピークを示す。
【００８９】
（実施例５：２種のクマリン染料を用いた新規な微小粒子の製造）
０．２８２μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく撹拌した懸濁液［インターフェイシャル  ダイナミックス社，オレゴン州，ポートランド；５０％ｖ／ｖ蒸留水／メタノール中の２．７５％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン７．５ｍｌと無水エタノール１７．５ｍｌとの均質な混合物中に溶解したクマリン１３８［イーストマン  コダック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ），ニューヨーク州，ロチェスター］３０ｍｇと、クマリン３１４（イーストマンコダツク）３０ｍｇとの溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。標準ＡＭＣＡ励起及び発光フィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。３６０ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、４１０ｎｍに集中する発光ピークと４６０ｎｍに集中する発光ピークとを示す。４６０ｎｍピーク（クマリン３１４から）対４１０ｎｍピーク（クマリン１３８）の積分比は９２：８であり、このことはクマリン１３８からクマリン３１４への発光エネルギーの効果的な伝達を実証する。
【００９０】
（実施例６：１種のポリオレフィン染料と１種のポリアザインダセン染料とを用いた新規な微小粒子の製造）
０．９７７μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく撹拝した懸濁液［インターフェイシャル  ダイナミックス社，オレゴン州，ポートランド；５０％ｖ／ｖ蒸留水／メタノール中の２．１０％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン９ｍｌと無水エタノール１６ｍｌとの均質な混合物中に溶解したジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ）５０ｍｇと、化合物１  １０ｍｇとの溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。標準フルオレセインフィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。３６５ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、４３０ｎｍに集中する発光ピークと５１２ｎｍに集中する第２発光ピークとを示す。４３０ｎｍピーク（ＤＰＨから）対５１２ｎｍピーク（化合物１から）の積分比は７４：２６であり、このことはＤＰＨから化合物１への発光エネルギーの効果的な伝達を実証する。エネルギー伝達の効果の他の確証として、化合物１のみによって上述のように０．０９３ミクロンラテックス粒子を製造する。これらのラテックス粒子をＤＰＨと化合物１との両方を含む粒子と同じ条件下で３６５ｎｍにおいて励起させる場合に、５１２ｎｍピークの積分面積は２種染料系で得られる積分面積の１０％未満である。
【００９１】
（実施例７：１種のクマリン染料と１種のポリアザインダセン染料とを用いた新規な微小粒子の製造）
０．２８２μｍカルボキシレート改質ラテックスの激しく撹拌した懸濁液［インターフェイシャル  ダイナミックス社，オレゴン州，ポートランド；５０％ｖ／ｖ蒸留水／メタノール中の２．１０％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン９ｍｌと無水エタノール１６ｍｌとの均質な混合物中に溶解したクマリン６  ５０ｍｇと、化合物１  ５０ｍｇとの溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。標準フルオレセイン励起及び発光フィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。４３０ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、５１２ｎｍに集中する主要発光ピークを示す。クマリン６からの５２０ｎｍに集中する小発光ピークが存在し、このことは実質的ではあるが、完全ではないエネルギー伝達を実証する。
【００９２】
（実施例８：２種のポリアザインダセン染料を用いた新規なアビジン標識微小粒子の製造）
１５ｍｌガラス遠心管に、１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍｌと、アビジン（完全溶解可能）４ｍｇと、実施例６で製造したラテックス微小粒子の２％水性懸濁液５ｍｌとを加える。この混合物を撹拌し、室温において１５分間インキュベートする。次に、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）４０ｍｇを加え、管を揺り動かして、内容物を混合する。ｐＨを希ＮａＯＨによって６．５±０．２に調節し、反応混合物をロケット又は軌道シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）上で室温において２時間穏やかに撹拝しながらインキュベートする。アビジン標識ラテックス微小粒子を非結合アビジンから２，０００ＲＰＭにおける２０分間の遠心によって分離する。上澄み液をデカンテーションし、アビジン標識ラテックスペレットを１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、遠心／デカンテーションによって３回洗浄する。アビジン標識ラテックスを１００ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍｌの最終量中に懸濁させる。
【００９３】
アビジンの代わりに６−（（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサン酸に結合したＢＳＡを用いて、実施例８の方法に従って、ビオチニル化ラテックス微小粒子を製造する。
【００９４】
（実施例９：ニトロセルロースフィルター上にスポットしたＭ１３ＤＮＡの、新規な微小粒子を用いた検出）
ニトロセルロースフィルター［ＢＡ８５，０．４５ミクロン孔，シュライヘルアンド  シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ），ニューハンプシャー州，キーン］を水とのインキュベーション、次に２０ＸＳＳＣ（１リットルにつきＮａＣｌ  １７５ｇ，クエン酸ナトリウム８８ｇ，ｐＨ７．０）とのインキュベーションによって前処理し、風乾させる。Ｍｌ３一重鎖ＤＮＡをミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管中でＴ．Ｅ．（１０ｍＭ  トリス−Ｃｌ，ｐＨ７．８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）によって連続的に希釈して、これらのフィルター上にスポットする。フィルターを風乾させ、真空オーブン中で８０℃において１時間焼成する。６ＸＳＳＣ（１リットルにつきＮａＣｌ  ５２．５ｇ，クエン酸ナトリウム２６．４ｇ、ｐＨ７．０）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５Ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）（０．１％フィコール（Ｆｉｃｏ１１）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））及び一重鎖ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌ中での６０℃における１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド形成を実施する。Ｍ１３ビオチニル化オリゴヌクオチドプローブ３０ｎｇ／ｍｌを添加した同じ溶液中で同じ温度において３時間、ハイブリッド形成を実施する。このフィルターを６ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での室温における２０分間のインキュベーション、次に６０℃における５分間のインキュベーションによって洗浄する。次に、フィルターを１００ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８、０．０５％乾燥脱脂乳、０．５％ツイーン−２０中での１時間のインキュベーションによってブロックする。アビジン結合され、蛍光標識された、実施例８で製造された微小粒子の１：１０００希釈物（２％固体）を含む、同じ溶液中での室温における１時間のインキュベーションによって標識付けを実施する。最後に、乾燥脱脂乳を含まない同じ溶液中で室温において１０分間、フィルターを洗浄することによって、非特異的に吸着した微小粒子を除去する。３６０ｎｍ光線による照射によってスポットを可視化する。
【００９５】
（実施例１０：溶解した組織培養物細胞中のＬａｃＺ遺伝子特異的ｍＲＮＡの、新規な微小粒子を用いた検出）
１×１０４ＣＲＥＢＡＧ細胞（１ａｃＺ遺伝子に関して陽性）又はＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｌａｃＺ遺伝子に関して陰性）の懸濁液をニトロセルロースフィルター（ＢＡ８５，０．４５ミクロン孔，シュライヘル  アンド  シュエル，ニューハンプシャー州，キーン）上にスポットする。１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．８、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とのインキュベーションによって、細胞を溶解する。ＤＮＡを１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨとの５分間のインキュベーションによって変性させ、次に１００ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌとの５分間のインキュベーションによって中和する。フィルターを真空オーブン中で８０℃において１時間焼成する。次に、フィルターを６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハート、０．５％ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌとの６０℃における１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド形成させる。Ｍｌ３ビオチニル化オリゴヌクオチドプローブ（１ａｃＺ遺伝子とハイブリッド形成）３０ｎｇ／ｍｌを添加した同じ溶液中で、ハイブリッド形成を実施し、６０℃において１時間インキュベーションする。０．１％ＳＤＳを含む６ＸＳＳＣ中でフィルターを室温において２０分間洗浄し、次に同じ溶液中で６０℃において５分間洗浄する。次に、フィルターを１００ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ツイーン−２０及び３％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にの室温における１時間のインキュベーションによってブロックする。このブロックした緩衝液に、実施例８で製造した微小粒子（ビオチニル化し、蛍光標識した微小粒子、２％固体）を最終希釈度１：１０００で加え、フィルターと共に室温において３０分間インキュベートする。次に、フィルターを１００ｍＭトリス、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌによって室温において３０分間洗浄し、シグナルを約３６０ｎｍに集中する広帯域フィルター付きの手で支えるＵＶ灯［ＵＶＰ社（ＵＶＰ，Ｉｎｃ．），カルフォルニア州，サンガブリエル］による照射によって可視化する。ＣＲＥＢＡＧ細胞は明確に見える黄緑色蛍光を示すが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は示さない。
【００９６】
（実施例１１：新規な微小粒子を用いるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によるＬａｃＺ遺伝子特異的ｍＲＮＡの検出）
顕微鏡スライド上で増殖するＣＲＥＢＡＧ（１ａｃＺ陽性）とＮＩＨ３Ｔ３（ｌａｃＺ陰性）細胞をＰＢＳ（１リットルにつき塩化ナトリウム８ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２４ｇ、ｐＨ７．４）中の３．７％ホルムアルデヒド中での１５分間のインキュベーションによって、透過性化し、固定する。スライドを２ＸＳＳＣ（１リットルにつき塩化ナトリウム１７．５ｇ、クエン酸ナトリウム８．８ｇ、ｐＨ７．０）中で１分間２回すすぎ洗いし、次に０．ｌＭトリエタノールアミン／０．２５％無水酢酸中で１０分間インキュベートする。次に、細胞を２ＸＳＳＣ中で１分間、ＰＢＳ中で１分間、０．１Ｍトリス／グリシン緩衝剤（ｐＨ７．０）中で３０分間平衡させる。スライドを２ＸＳＳＣ中で２回すすぎ洗いし、次に７０％と９５％エタノール中で脱水してから、風乾させる。次に、５０％ホルムアミド、５Ｘデンハート（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、６ＸＳＳＰＥ（１．０８Ｍ  塩化ナトリウム、６０Ｍ  ＮａＨ２ＳＯ４、ｐＨ７．４、６ｍＭ  ＥＤＴＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ  ２５０μｇ／ｍｌ、ウシ胸腺ＤＮＡ  ５００μｇ／ｍｌを含む溶液３００ｍｌと共にの室温における１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド形成を実施する。ビオチニル化オリゴヌクオチドプローブ２μｇ／ｍｌを添加した同じ溶液の同量を用いて、ハイブリッド形成を実施し、４２℃において一晩インキュベーションする。次に、フィルターを２ＸＳＳＣによって数回洗浄し、３％ＢＳＡと０．１％ツイーン２０とを含むＰＢＳとのインキュベーションによってブロックして、上記実施例８で製造した微小粒子（アビジン標識蛍光微小粒子、２％固体）の１：１０００希釈物と共に室温において３０分間インキュベートする。スライドをＰＢＳによって簡単に洗浄して、可視化する。ＵＶ光源によって顕微鏡を照明すると、ＣＲＥＢＡＧ細胞は容易に検出可能な黄緑色蛍光を示すが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は示さない。
【００９７】
（実施例１２：新規な微小粒子を用いるノーザンブロッティングによるゼブラフィッシュ（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）胚における発生的に重要なｍＲＮＡ分子の検出）
ゼブラフィッシュのエングレイルド（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）遺伝子、インバーデッド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）遺伝子とＨＯＸ（ホメオボックス（ｈｏｍｅｏｂｏｘ）遺伝子並びにＣＡＴ（クロラムフェニカルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプローブに、文献に述べられた方法のいずれかを用いて、微小粒子を直接結合させる。オリゴヌクレオチドプローブは、異なって標識された０．１ミクロン微小粒子にそれぞれ結合させる：
エングレイルドは黄緑色（発光５１２ｎｍ、化合物１含有ラテックス）へ、インバーデッドは橙色（発光５５７ｎｍ、実施例３におけるような、化合物１と３とを含むラテックス）へ、ＨＯＸは赤色（発光６０５ｎｍ、実施例４におけるような、化合物１，３，及び４を含むラテックス）へ、ＣＡＴは深紅色（発光６５０ｎｍ、化合物１，３，４及び６を含むラテックス）へ結合させる。総細胞ＲＮＡは幾つかの異なる発生期におけるゼブラフィッシュ胚から調製する。ＲＮＡは細胞破壊から調製し（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びプロテイナーゼＫ  ２００μｇ／ｍｌから成る均質化緩衝液の存在下で、ベークドガラス（ｂａｋｅｄ  ｇｌａｓｓ）ホモジェナイザーを使用）、３７℃において１時間インキュベートして、蛋白質を消化させる。ホモジェネートを等量のフェノール：クロロホルム１：１によって抽出し、水相を同じ溶液によってさらに２回抽出する。０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と２．５倍量の氷冷エタノールとを加え、氷上で２時間インキュベートすることによって、核酸を沈殿させる。核酸を４℃における１５分間の５０００ｇでの遠心分離によってペレット化させ、上澄み液を捨て、ペレットを風乾させる。全核酸（主としてＲＮＡから成る）を無菌水中に溶解する。１レーンにつきＲＮＡ  １０μｇを標準方法を用いてグリオキシル化し、アガロースゲル（０．０１Ｍリン酸ナトリウム中１％アガロース、ｐＨ７，９）上で電気泳動する。ＲＮＡを２０ＸＳＳＰＥ（１リットルにつきＮａＣｌ  １７４ｇ、ＮａＨ２ＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ２７．６ｇ及びＥＤＴＡ  ７．４ｇ、ｐＨ７．４）に含めて、２ＸＳＳＣ（１リットルにつきＮａＣｌ  ｌ７．５ｇ、クエン酸ナトリウム８．８、ｐＨ７．０）中で予備平衡化させたニトロセルロースフィルター膜（ＢＡ８５，０．４５ミクロン孔，シュライヘル  アンド  シュエル，ニューハンプシャー州，キーン）上に毛管転移させる。このニトロセルロースフィルター膜を真空オーブン中で８０℃において１時間焼成して、核酸を永久的に結合させる。次に、プロットを６ＸＳＳＣ（１リットルにつきＮａＣｌ  ５２．５ｇ、クエン酸ナトリウム２６．４ｇ、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、０．０５％乾燥脱脂乳、０．５％ツイーン−２０及び一重鎖標準ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌと共にの６０℃における１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド形成させる。次に、フィルターを各微小粒子結合オリゴヌクレオチドプローブ３０ｎｇ／ｍｌを添加した同じ溶液中で、同温度において３時間、ハイブリッド形成させる。次に、フィルターを６ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによって室温において２０分間洗浄し、次に６０℃において５分間洗浄して、非特異的に吸着したプローブを除去する。個々のＲＮＡ種に相当する帯を、約３６０ｎｍに集中する広帯域アィルター付きの手で支えるＵＶ光源（ＵＶＰ社、カルフォルニア州，サンガブリエル）による照射によって可視化する。各ＲＮＡ種は明確な色を有し、ＣＡＴ遺伝子に対応す��ＲＮＡは発生中の全ての段階において製造されるが、エングレイルド遺伝子、ＨＯＸ及びインバーデッド遺伝子に対応するＲＮＡは発生中の限定された期間にのみ存在することを示す。
【００９８】
上記発明を例証及び実施例として詳述したが、好ましい又は特定の実施態様のみを明らかにしたにすぎず、多くの変更、置換及び変化が下記請求の範囲に述べる本発明の要旨又は範囲から逸脱せずに全て可能であることを理解すべきである。
【００９９】
本発明は、組合せ中の第１染料の励起波長からの効果的なエネルギー伝達、組合せ中の染料を介しての伝達及び組合せ中の最後の染料の発光波長における光学シグナルとしての再発光を可能にする、励起と発光とのスペクトル重複を有し、適当な染料の選択によって制御される望ましい有効ストークスシフトを生ずる、２種以上の蛍光染料の組合せを含む微小粒子に関する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ジピロメテンホウ素ジフルオリド染料の種々な組合せを含む、０．０９３μｍポリスチレンラテックス粒子の発光スペクトルのグラフである。スペクトルＡは４９０ｎｍ（好ましい励起波長）において励起した、１６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物１（下記表２参照）を示し、スペクトルＢはこの場合も４９０ｎｍにおいて励起した、１６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物１（供与体）と９．６μｍｏｌ／ｇの化合物２（受容体）との混合物を含む粒子によるものであり、スペクトルＣは５４０ｎｍにおいて励起した、９．６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物２を含む粒子の発光である。
【図２】図２は、３種のジピロメテンホウ素ジフルオリド染料：化合物１（供与体染料）、化合物２（トランスアァー染料）及び化合物３（受容体染料）を含む０．０９−３μｍポリスチレンラテックス粒子の発光スペクトルを示す。
【図３Ａ】図３は、０．０９３μｍラテックス微小粒子における約１０ｎｍから７０ｎｍまでのストークスシフトの増大によって得られる蛍光シグナルの増強をグラ７形で示す。スペクトルＡ（図３Ａ）の微小粒子は１６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物１を含み、スペクトルＢ（図３Ｂ）の微小粒子は１６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物１（供与体）と９．６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物３（受容体）とを含む。対比的に陰影をつけた領域はこれらの微小粒子製剤の各々に用いることができる最適フィルター帯幅を示し、供与体−受容体染料対を含む微小粒子から得られるシグナル増強を実証する。
【図３Ｂ】図３は、０．０９３μｍラテックス微小粒子における約１０ｎｍから７０ｎｍまでのストークスシフトの増大によって得られる蛍光シグナルの増強をグラ７形で示す。スペクトルＡ（図３Ａ）の微小粒子は１６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物１を含み、スペクトルＢ（図３Ｂ）の微小粒子は１６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物１（供与体）と９．６μｍｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物３（受容体）とを含む。対比的に陰影をつけた領域はこれらの微小粒子製剤の各々に用いることができる最適フィルター帯幅を示し、供与体−受容体染料対を含む微小粒子から得られるシグナル増強を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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