(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質
【請求項２】
神経発生が初期神経発生である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする神経発生誘導遺伝子。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質
【請求項４】
以下の(c)又は(d)のDNAからなる遺伝子。
(c) 配列番号１で表わされる塩基配列からなるDNA
(d) (c)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項５】
請求項３記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
【請求項６】
神経発生が初期神経発生である請求項３〜５のいずれか１項に記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から神経発生誘導タンパク質を採取することを特徴とする神経発生誘導タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経発生誘導遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脊椎動物の神経発生の初期過程は、外胚葉から、神経板ヘの分化(神経誘導)、神経回路網の形成及び成熟などのいくつかの基本的な過程に分けられる。この過程には神経前駆細胞の出現、神経系のパターン形成及び神経前駆細胞の増殖と分化などが含まれており、これらの過程について種を超えた普遍的原理を解明することが高次脳機能の分子基盤を理解する上で重要である。
【０００３】
ところで、アフリカツメガエルの初期神経発生は、オーガナイザーから分泌されるnoggin、chordinなどにより、骨形成因子BMP４(Bone Morphogenetic Protein 4)のシグナルが遮断されることにより誘導されることが知られている[Sasai, Y. et al.：Nature, 376：333(1995)]。BMP4は、外胚葉を表皮細胞に誘導する因子であり、BMP4が活性化した状態では細胞は表皮へと分化する。
【０００４】
一方、神経誘導（神経発生、分化）の制御に関与する遺伝子（プロニューラル遺伝子という）としては、Neurogenin、NeuroD、XASH-3、XATH-3などのヘリックス・ループ・ヘリックス(bHLH)型転写因子をコードするプロニューラル遺伝子が知られている。
しかし、これらBMP4シグナルの遮断とプロニューラル遺伝子との間をつなぐカスケードを何が調節しているかについては明らかではない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、神経発生誘導タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体、前記タンパク質に対する抗体並びに神経系疾患の治療剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アフリカツメガエルの神経胚cDNAライブラリーから神経発生誘導活性を有する遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質である。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質
【０００７】
さらに、本発明は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする神経発生誘導遺伝子、あるいは、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質
【０００８】
さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDNAからなる遺伝子である。
(c) 配列番号１で表わされる塩基配列からなるDNA
(d) (c)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ神経発生誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
【０００９】
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。
さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から神経発生誘導タンパク質を採取することを特徴とする神経発生誘導タンパク質の製造方法である。
さらに、本発明は、前記タンパク質に対する抗体である。
さらに、本発明は、前記タンパク質を有効成分として含む神経系疾患の治療剤、又は前記遺伝子を含む神経系疾患の遺伝子治療剤である。神経系疾患としては、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、パーキンソン病及び脳虚血症からなる群から選ばれる少なくとも一つが挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子は、神経発生、好ましくは初期神経発生を誘導させる機能を有するものであり、マスター遺伝子とも呼ばれるものである。なお、本発明の遺伝子をZic3ともいう。
本発明の遺伝子は、以下のようにしてクローニングすることができる。
【００１１】
１．Zic3のクローニング
(1) Zic3のcDNAライブラリーの作製及びスクリーニング
mRNAの供給源としては、アフリカツメガエル（Xenopus laevis)の神経胚などの組織が挙げられる。
mRNAの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記組織又は細胞を、グアジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全RNAを得た後、オリゴdT-セルロースやセファロース2Bを担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A+)RNA(mRNA)を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ(A+)RNAをさらに分画してもよい。
【００１２】
このようにして得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。このようにして得られた二本鎖cDNAを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。得られる組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、cDNAのライブラリーを得ることができる。
【００１３】
ここで、大腸菌の形質転換は、Hanahanの方法[Hanahan,D.： J. Mol. Biol. 166：557-580(1983)]、すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等より行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合はテトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有することが必要である。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばλファージ等を用いることもできる。
【００１４】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のDNAを有する株を選択するスクリーニング方法としては、例えば、マウスZic遺伝子ファミリーの亜鉛フィンガーモチーフのアミノ酸配列に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う方法が挙げられる。
【００１５】
ここで用いられる鋳型DNAとしては、前記mRNAから逆転写反応により合成されたcDNAが挙げられる。また、プライマーとしては、例えばセンス鎖についてはGlu Asn Leu Lys Ile His Lys (配列番号3）に基づいて合成した5'-GAGAACCTCAAGATC CACAA-3'(配列番号5)を、アンチセンス鎖についてはHis Met Lys Val His Glu Glu (配列番号4)に基づいて合成した5'-TT(C/T)CCATG(A/G)ACCTTCATGTG-3'(配列番号6)を用いることができる。但し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。
このようにして得られたDNA増幅断片を、32P、35S又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のDNAを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００１６】
(2)塩基配列の決定
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
配列番号１に本発明の遺伝子の塩基配列を、配列番号2に本発明のタンパク質のアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク質が神経発生誘導活性、特に初期神経発生誘導活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００１７】
例えば、配列番号2で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００１８】
従って、上記変異が導入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子も、神経発生誘導活性（例えば初期神経発生誘導活性）を有する限り本発明の遺伝子に含まれる。
また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
【００１９】
ここで、初期神経発生において、「初期」とは、外胚葉から神経板が形成されるまで(ツメガエル胚の後期胞胚期から神経胚期まで)を意味し、「神経発生」とは、それ以降の神経系の発生、分化、成熟を含めた全般の過程を意味する。また、「初期神経発生誘導活性」とは、外胚葉から神経板及びこれに関連した組織(例えば、神経堤)を生じさせる活性を意味する。
【００２０】
なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNAないしゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２１】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
(1)組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００２２】
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２３】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
(2)形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２６】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)MI 114、207-21などが挙げられる。
【００２７】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００２８】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-2114 (1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。
【００３０】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182-187 (1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929-1933 (1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163-168 (1983)]等が挙げられる。
【００３１】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
なお、本発明の組換えベクターは、大腸菌DH5に導入され（名称： Escherichia coli pXenopus Zic3）、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平成10年3月26日付でFERM P-16733として寄託されている。
【００３３】
３．Zic3遺伝子の発現時期及び胚内での発現部位の分析
本発明の遺伝子は、神経発生誘導活性を有するものであるため、所定の発生ステージにおける胚を用いて遺伝子の発現を調べることができる。
本発明のZic3遺伝子の胚内での発現時期は、例えば、各発生ステージの胚におけるmRNAの発現又はタンパク質の発現を解析することにより確認することができる。例えば、Zic3 mRNAの発現の確認方法として、RT-PCRやノーザン分析等が挙げられ、ZIC3タンパク質の発現の確認方法として、本タンパク質に対する抗体を用いたウエスタン分析等が挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明のZic3の胚内での発現分布は、例えば、in situハイブリダイゼーションなどによりmRNAを分析することによって、又は、抗体を使用する免疫組織化学的手法などによりタンパク質を分析することによって確認することができる。in situハイブリダイゼーションは、例えば、公知の文献の記載に従い[Chitnis, A . et al.：Nature 375：761-766(1995)]、ジゴキシゲニン又は放射性同位体標識RNAプローブを用いて、胚をそのまま染色することにより行うことができる。
【００３５】
４．本発明のタンパク質の生産
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子Zic3によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつ神経発生誘導活性を有するものである。なお、本発明のタンパク質をZIC3タンパク質ともいう。
本発明のZIC3タンパク質は、前記形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３６】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３７】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
【００３８】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００４０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４１】
培養後、本発明のZIC3タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりZIC3タンパク質を抽出する。また、本発明のZIC3タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のZIC3タンパク質を単離精製することができる。
【００４２】
５．本発明のタンパク質に対する抗体
本発明においては、本発明のZIC3タンパク質に対する抗体を作製することもできる。「抗体」とは、抗原である本発明のペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片(例えば、FabまたはF(ab')2断片)を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばSambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照]。
【００４３】
(1) 本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製
前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のZIC3タンパク質又はその断片を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜10mgであり、アジュバントを用いるときは１〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜10回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜60日後に、好ましくは、酵素免疫測定法(EIA； enzyme immunoassay)、放射性免疫測定法(RIA；radioimmuno assay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４４】
(2) 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体の作製
(ｉ) 抗体産生細胞の採取
前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のタンパク質又はその断片を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1〜10mgであり、アジュバントを用いるときは１〜100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは２〜５週間間隔で、１〜10回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜10日後、好ましくは３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、抹消血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
【００４５】
(ii)細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、Sp2/O、NS-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００４６】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、１×109個/mlの抗体産生細胞と１×108個/mlのミエローマ細胞とを等容量混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1,500ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４７】
(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２×105個/ウエル程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００４８】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって行うことができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００４９】
(iv)モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、５％CO2濃度)で２〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００５０】
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００５１】
このようにしてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が得られた後は、これをリガンドとして、固体担体に結合させることによりアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製し、そして該カラムを用い、前記の採取源又は他の採取源から、本発明のペプチドを精製することができる。さらにこれらの抗体は本発明のタンパク質を検出するためにウエスタンブロッティングに用いることもできる。
【００５２】
６．神経系疾患の治療剤及び遺伝子治療剤
本発明のタンパク質及び遺伝子は神経発生誘導活性を有するため、それぞれ神経系疾患の治療剤、神経系疾患の遺伝子治療剤として有用である。従って、本発明の治療剤又は遺伝子治療剤を、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００５３】
本発明のタンパク質又は遺伝子を神経系疾患の治療剤又は遺伝子治療剤として使用する場合は、使用する対象を特に限定するものではない。例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、パーキンソン病、脳虚血症などの神経系疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよく、いずれも本発明のタンパク質又は遺伝子の使用の対象とすることができる。
【００５４】
本発明の治療剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の治療剤を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００５５】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００５６】
本発明の治療剤の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重1kgあたり0.01mg〜1000 mgの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００５７】
本発明の遺伝子を神経系疾患に対する遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと本発明の遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水層や脂質二分子層に本発明の遺伝子を保持させる（リポソーム-遺伝子複合体）。次に、該複合体を細胞とともに培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下の投与方法で投与すればよい。
【００５８】
本発明の遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神経系組織（脳、脊髄）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態をを採用することもできる。
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人1日あたり0.1〜100mg/bodyの範囲が適当である。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕Zic3遺伝子のクローニング
(1) アフリカツメガエル(Xenopus laevis)神経胚のポリ(A+)RNAの調製
アフリカツメガエル(浜松生物教材(静岡県)）の卵をNewportの方法[Newport:Cell 30:675-686(1982)]に従って人工孵化させることにより胚を得た。胚を２％システイン-HCl(pH7.8)に浸漬してゼリーコートを除去し、その胚を0.1×Steinberg溶液(60mM NaCl、0.67mM KCl、0.34mM Ca(NO3)2、0.83mM MgSO4、10mM Hepes、pH7.4)中で培養し、神経胚を回収した。
回収した神経胚から、AGPC法に従い、全RNAを抽出した。次に、Oligotex dT30(Roche社製)を用い、ポリ(A+)RNA を分離・精製した。
【００６０】
(2) cDNAライブラリーの調製
前記(1)により得られたポリ(A+)RNAを用いて、Time SaverTMcDNA合成キット(Pharmacia社製)を用いてcDNAの合成を行った。すなわち、ポリ(A+)RNAを鋳型として、オリゴ(ｄT)12-18プライマー及びクローン化マウス逆転写酵素を用いて１本鎖cDNAを合成し、さらに大腸菌RNase H及び大腸菌DNAポリメラーゼを用いて２本鎖cDNAを合成した。
【００６１】
合成した２本鎖cDNAをクレノー断片(日本ジーン社製)によって平滑化した後、T4 DNA Ligaseを用いて EcoRI切断末端を有する平滑末端−EcoRIアダプターを付加した。続いてEcoRI切断末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、ファージクローニングベクターであるλZAP IIのマルチクローニングサイトのEcoRI部位に市販のキット(ZAP IITMVector Kit；STRATAGENE社製)を用いて、cDNAのパッケージングを行った。そして、E. coli XL-1blueを宿主として形質導入を行い、cDNAライブラリーを作製した。
【００６２】
(3) Zic遺伝子ファミリーの亜鉛フィンガーモチーフのアミノ酸配列に特異的なプライマーの作製
マウス亜鉛フィンガードメインのよく保存されているアミノ酸配列をもとに、プライマーを合成した。すなわち、５'プライマー配列として、Glu Asn Leu Lys Ile His Lys (配列番号3）に基づいて5'-GAGAACCTCAAGATCCACAA-3'(配列番号5)を、３'プライマーとして、His Met Lys Val His Glu Glu (配列番号4)に基づいて5'-TT(C/T)CCATG(A/G)ACCTTCATGTG-3'(配列番号6)を合成した。
なお、合成オリゴヌクレオチドは、全自動DNA合成機(Applied Biosystem社製)を使用して化学合成した。
【００６３】
(4) PCRによるクローン単離用cDNAプローブの調製
前記(2)で得られたcDNAを鋳型とし、前記(3)で得られた５'プライマー及び３'プライマーを用い、PCRを行った。PCRの反応液の組成は以下の通りである。
0003674744.tif 000002
【００６４】
上記反応液をよく混合後、ミネラルオイルを50μl重層した。PCRは、DNAサーマルサイクラーを用い、94℃で１分、55℃で１分、74℃で２分の反応を１サイクルとして、これを30サイクル行った。その結果、208pbの長さを有する断片を得た。この断片をランダムプライマーラベリングキット (TAKARA社製)を用いてα-32P-dCTPで標識し、クローン単離用cDNAプローブとした。
【００６５】
(5) クローンの単離
前記(2)で得られたcDNAライブラリーをNZYプレート(ファルコン社製)上に、１プレート当たり約150,000個のプラークが形成されるように計12枚のプレート播き、このプレート上にナイロンフィルターであるColony/Plaque Screen(Dupont NEN社製)をのせ、0.5N NaOH水溶液を用いて固定後、前記(4)で調製した標識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液(50％ホルムアミド、1M NaCl、10％硫酸デキストラン、１％ドデシル硫酸ナトリウム、100μg/ml変性サケ精子DNA)中で、42℃、18時間ハイブリダイゼーションを行った。
このスクリ−ニングにより、１個のクローンを得た。得られたクローンをXL1-Blue、ヘルパーファージR408(STRATAGENE社製)と共に感染させ、λZAP IIからpBluescriptSK(-)への切り出し、XL1-Blueへの形質転換を行った。その結果、約2.4kbのインサートを持つものが１個得られた。
【００６６】
(6) cDNA塩基配列の決定
前記(5)で得られたクローンの塩基配列を、ABI PRISMTM Dye Cycle Ready Reaction Kit(PERKIN-ELMER社製)を用い、蛍光自動DNAシーケンサー(Applied Biosystems社製)により解析した。その結果、2364bの長さを有するZic3遺伝子の塩基配列が得られた（配列番号１）。このcDNAは、441個の推定アミノ酸配列を有していた（配列番号２）。
【００６７】
ホモロジーの検索を、GenBank／EMBL核酸データベースに対してFESTAホモロジー検索プログラム[Pearson et al.：Proc.Natl. Acad. Sci.USA 85：2444-2448(1988)]を用いて行った。その結果、本発明の遺伝子の塩基配列は、マウスZic3遺伝子[Aruga, J. et al.：  Ｊ.Biol. Chem. 271：1043-1047(1996)]と76％のホモロジーを示し、また、そのアミノ酸配列は、他のZic[Aruga, J. et al.：  Ｊ.Biol. Chem. 271：1043-1047(1996)]及びOpa[Benedyk et al.：Genes Dev.8：105-117(1994)]に対して、それぞれ66％、35％のホモロジーを示した。そこで本発明の遺伝子をXenopus Zic3(「Zic3遺伝子」又は「Zic3」ともいう)と命名した。
【００６８】
〔実施例2〕本発明のZic3遺伝子の機能
(1) ツメガエル胚におけるZic3遺伝子の発現パターンの分析
本発明のZic3遺伝子のツメガエル胚における発現パターンを明らかにするため、ホールマウントin situハイブリダイゼーション（whole mount in situ hybridization）を行った[Daniel, H.S. et al.：J. Biochem. Biophys. Methods 31：185-188(1996)]。
【００６９】
ハイブリダイゼーション用のジゴキシゲニン(DIG)標識RNAプローブは、Harlandの方法[Harland, R.M.：Methods in Cell Biology 36：685-694(1991)]に従って合成した。すなわち、実施例１で得られたZic3遺伝子を含むcDNAクローン2.5μgから、RNAポリメラーゼによりRNAを合成し、DIG標識した。得られたDIG標識RNAプローブをDNase処理後、最終濃度0.5Mになるように酢酸ナトリウム溶液を添加し、３倍容のエタノールによりエタノール沈殿させた。５分間、12,000rpmで微量遠心機にかけ、プローブを沈降後、20μlの80％ホルムアミドに再懸濁し、−20℃に保存した。
【００７０】
一方、実施例１(1)の記載に従い、各ステージまで培養したツメガエル胚を、ホルマリン系固定液で処理後、メタノール中に−20℃で保存した。in situハイブリダイゼーション用に、胚を５ml容のスクリューバイアルに小分けした。バイアルは、室温でNutator(Becton-Dickinson社製)上で振盪させた。
【００７１】
胚を、50％メタノール／50％0.1Mトリエタノールアミン(TEA、pH7.5)中に５分間浸漬させ、次いで５分間TEAで洗浄した。TFA１mlに対して、無水酢酸を５μlの割合で加え10分間インキュベートした。次いで、胚を3.7％ホルムアルデヒドを含むTEA中に浸漬させて固定した。プレハイブリダイゼーション溶液(50％ホルムアミド、５×SSPE、５％SDS、１mg/ml Torula RNA)を加え60℃で１時間10分放置することにより、プレハイブリダイゼーションを行った。次いでプレハイブリダイゼーション溶液を、十分量のハイブリダイゼーション溶液(前記プレハイブリダイゼーション溶液に、前記のDIG標識RNAプローブを１μg/mlになるように加えたもの)で置換し、60℃で１晩インキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行った。
【００７２】
ハイブリダイゼーション後、50％ホルムアミドを含む２×SSCを用いて、60℃で30分間、胚の洗浄を２回行った。次いでこの胚を、マレイン酸緩衝液(MAB；100mMマレイン酸、150mM NaCl、pH7.5)で５分間すすぎ、２％BMB(Boehringer-Mannheim Blocking Reagent)を含むMABで１時間ブロックした。さらに２％BMB、20％熱処理したヒツジ血清を含むMAB中で１時間インキュベートした。そして抗ジオキシゲニン抗体の結合したアルカリホスファターゼ(Boehringer-Mannheim社製)を0.5μl/mlの割合で加え、室温で４時間インキュベートした。MABでの１時間の洗浄を少なくとも５回行った後、胚をアルカリホスファターゼ緩衝液(100mM Tris、50mM MgCl2、100mM NaCl、pH 9.5)中に、室温で10分間浸漬することにより平衡化させた。
【００７３】
この緩衝液１ml当たり4.5μlのニトロブルーテトラゾリウム溶液(NTB；70％ジメチルホルムアミド１ml当たり75mgを含む)及び3.5μlの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP；ジメチルホルムアミド１ml当たり50mgを含む)を加え、室温でインキュベートすることにより発色反応させた。発色の停止はTE(10mM Tris-HC、1mM EDTA、pH8.0)を加えることにより行った。また、再固定及びマウンティングはHarlandの方法[Harland, R.M.：Methods in Cell Biology 36：685-694(1991)]に従った。
その結果、Zic3遺伝子は、原口背唇部の初期原腸及び将来の神経板部において検出された（図１A（ステージ10.25）及びB（ステージ10.5））。図１において、原腸については矢印で、神経板についてはくさび型矢印で示す。
【００７４】
原腸形成が進むと、本発明のZic3遺伝子の発現は原口背唇部では減少し、神経板部では増加することがわかった（図１B及びC(ステージ10.5）)。なお、Cは、Bの胚の切片を作成して観察したものである。
後期原腸においては、Zic3の発現は中央の領域で徐々に消失した（図１D,ステージ12）。神経板ステージ(図１E,ステージ14）では、Zic3は将来の中脳及び前方菱脳部領域において強く発現した。その後、Zic3発現は前方神経ヒダで強く発現するようになったが、神経幹における神経ヒダでは発現は弱いものであった(図１F,ステージ16)。
【００７５】
初期尾部突起ステージ(図１G及びH,ステージ20)では、Zic3の発現は前脳(終脳及び間脳)の背側領域、中脳及び後脳に徐々に限定され、神経幹の背側領域では発現が弱いものであった。
中期尾芽胚ステージ後では、Zic3発現は間脳において消失したが、尾芽領域の外側中胚葉において発現を明確に確認することができた(図１I、ステージ30)。ステージ30での頭部の切片においては、Zic3発現は神経管の背側部に限定された(図１J）。なお、図１J中、ntは神経管、eは目、fgは前方消化管である。
以上のことから、Zic3は初期神経発生に密接に関係した領域で発現していることが分かった。
【００７６】
(2) RT-PCRによるZic3遺伝子及び各種神経マーカー遺伝子発現の経時的変化の分析
Zic3は原腸形成の間将来の神経板領域に発現するので、本発明者はZic3の発現が時間経過によりどのように変化するかについて、他の神経マーカー遺伝子と比較した。
【００７７】
使用したマーカー遺伝子は、NCAM及び N-tubulin並びに転写因子であるXASH-3、 XATH-3、 XlPOU2及びNeuroDをコードする各遺伝子である[Lee,J.E.et al.：Science 268： 836-844(1995); Ferreiro,B. et al.：Development 120：3649-3655(1994); Turner,D.L. et al.：Genes Dev. 8：1434-1447(1994); Takebayashi, K. et al.：EMBO J. 16：384-395(1997); Witta,S.E. et al.： Development 121：721-730(1995); Chitnis,A. et al.：Nature 375：761-766(1995); Kintner,C.R. et al.： Development 99：321-325(1987); Zimmerman,K. et al.： Development 119： 221-231(1993); Oschwald,R. et al.：Int. J. Dev. Biol. 35：399-405(1991)]。これらの遺伝子は、上記文献に記載の遺伝子の塩基配列からプライマーを合成し、アフリカツメガエルのゲノムDNA等を鋳型として、当業者に公知のPCR技術を用い、各遺伝子を増幅することにより入手することができる。
【００７８】
経時的変化の比較はRT-PCRによって行った。すなわち、卵、８細胞、桑実胚、胞胚、原腸胚、神経胚、尾芽の各ステージの胚から、全RNAを抽出し、RT-PCRを行った。RNA回収率の指標として、ヒストンH4を用いた[Turner et al.：Nucleic Acids Res.10:3769-3780(1982)]。陽性対照としては、姉妹胚の対照胚を用いた。また、DNAの混入用の対照としては、逆転写を行わずにPCRを行った。
【００７９】
具体的には、まず1.5mlのマイクロチューブ中で、各ステージの胚を100μlの変性溶液(4M グアニジンチオシアネート、25mMクエン酸ナトリウム、0.1M 2-メルカプトエタノール、0.5％N-ラウロイルサルコシンナトリウム)に懸濁し、激しく振盪した。これに、2M酢酸ナトリウム(pH4.0)を10μl加え内容物を完全に混合した。次いで水飽和フェノール100μlを加え混合後、CIA(クロロホルム:イソアミルアルコール=49:1容量)30μl及びエタチンメート(ニッポンジーン社製)１μlを加え、激しく振盪した。次いで氷上に15分間静置した。４℃、15,000rpmで20分間遠心後、上層を新しいチューブに回収した。そこにエタノール250μlを加え、４℃、15,000rpmで10分間遠心しRNAをペレット化した。上清を除去し、チューブを風乾後、滅菌水88μl、10×DNase緩衝液(BRL社製)10μl、RNasin(Promega社製)１μl、DnaseI(TAKARA社製)１μlを加え、37℃で１時間反応させることにより、混入しているDNAを分解した。次いで、エタノール100μlを加え、４℃、15,000rpmで10分間遠心しRNAをペレット化した。
【００８０】
上清を除去し、チューブを風乾後、溶液Ｋ(0.01M Tris、0.005M EDTA、0.5%SDS、pH7.8)100μl及び20mg/mlプロティナーゼＫ溶液１μlを加え、37℃で１時間反応させることにより混在するタンパク質を分解した。次いでフェノール／CIA  100μlを加え混合後、４℃、15,000rpmで10分間遠心した。その後さらにCIA 100μlを加え混合し、４℃、15,000rpmで10分間遠心した。上層を新しいチューブに回収し、そこにエタノール250μlを加え、４℃、15,000rpmで10分間遠心しRNAをペレット化した。上清を除去し、チューブを風乾後、室温で放置した。
【００８１】
得られたRNAサンプルを、DPEC処理水(蒸留水100ml当たりジエチルピロカーボネート0.2mlを加え激しく振盪し、オートクレーブしたもの)10μlに溶解し、そのうち３μlをマイクロチューブに取り、100pmol/μlランダムヘキサマー(TAKARA社製)１μl及び滅菌水７μlを加えてよく混合後、72℃で２分間及び37℃で５分間インキュベートした。次いで、５×RT緩衝液４μl、0.1M DTT、５mM dNTPミックス２μl、マウス白血病ウイルス(MMLV)由来逆転写酵素(BRL社製)0.5μｌを加えよく混合後、37℃で１時間逆転写反応を行った。次いで、98℃で10分間維持して、反応を停止させ、第１鎖cDNA溶液を得、第２鎖のPCR合成に供するまで−20℃に保存した。
前記のようにして得られた第１鎖cDNA溶液を鋳型とし、PCRを行った。PCRの反応液の組成は以下の通りである。
【００８２】
0003674744.tif 000003
【００８３】
上記反応液をよく混合した後、ミネラルオイルを50μl重層した。PCRは、94℃で0.5分間の熱変性、55℃で0.5分間のアニーリング、72℃で１分間の伸長反応の条件を１サイクルとして、25〜36サイクル行った。反応終了後、PCR反応液４μlをアガロース電気泳動に供し、増幅産物を調べることにより各遺伝子の発現を調べた。
【００８４】
Zic3      (センス)   5'-TTCTCAGGATCTGAACACAT-3'    (配列番号：７)
(アンチセンス)   5'-CCCTATAAGACAAGGAATAC-3'    (配列番号：８)
XASH-3    (センス)   5'-GGACTCTCGCCTTGTGGC-3'      (配列番号：９)
(アンチセンス)   5'-GATATGTTCTTGTAATAGTCAGT-3' (配列番号：10)
XATH-3    (センス)   5'-TGGACCTCAGGCCATGTTC-3'     (配列番号：11)
(アンチセンス)   5'-GATGCTGAGTGGAGGTGTTA-3'    (配列番号：12)
XlPOU 2   (センス)   5'-ACCCAACGACCACGTGGACCTG-3'  (配列番号：13)
(アンチセンス)   5'-AGCTCATTGCAGGAGGTGTCTG-3'  (配列番号：14)
NeuroD    (センス)   5'-GTGAAATCCCAATAGACACC-3'    (配列番号：15)
(アンチセンス)   5'-TTCCCCATATCTAAAGGCAG-3'    (配列番号：16)
NCAM      (センス)   5'-CACAGTTCCACCAAATGC-3'      (配列番号：17)
(アンチセンス)   5'-GGAATCAAGCGGTACAGA-3'      (配列番号：18)
N-tubulin (センス)   5'-ACACGGCATTGATCCTACAG-3'    (配列番号：19)
(アンチセンス)   5'-AGCTCCTTCGGTGTAATGAC-3'    (配列番号：20)
Histone H4(センス)   5'-CGGGATAACATTCAGGGTATCACT-3' (配列番号：21)
(アンチセンス)   5'-ATCCATGGCGGTAACTGTCTTCCT-3' (配列番号：22)
【００８５】
結果を図２に示す。図２から明らかなように、Zic3の発現は初期原腸（ステージ10)において検出された。一方、他の神経マーカー遺伝子の発現に関しては、XATH-3及び NCAMについては中期原腸ステージにおいて検出され、NeuroD及び N-tubulinについては後期原腸ステージにおいて検出された。XASH-3及びXlPOU 2は初期原腸ステージにおいても発現が検出されたが、Zic3と比較した場合、その発現は極めて弱いものであった。
【００８６】
Zic3は、神経誘導直後に神経板の予定域で最初に検出されたので（図１A)、本発明者は、Zic3と神経発生の初期に発現されることが知られている神経誘導因子chordin[Sasai, Y. et al.：Cell, 79：779-790(1994)]との間で発現の開始時期がどのように異なるかを正確に調べた。その手法は以下の通りである。
【００８７】
培養皿内で、ツメガエル卵と精子とを人工授精させ、いっせいに同調して発生を進ませた。人工授精後、23℃に維持して６時間から10.5時間培養した後、胚を採取し、直ちに凍結した。そして、実施例１(1)に記載の手法と同様の手順で、これらの試料からZic3のRNA抽出し、RT-PCRを行った。また、chordinについては、以下のプライマーを用いてRT-PCR法を行った。
Cordin(センス) 5'-AACTGCCAGGACTGGATGGT-3' (配列番号：23)
(アンチセンス) 3'-GGCAGGATTTAGAGTTGCTTC-3'(配列番号：24)
【００８８】
その結果、Zic3遺伝子の発現開始時期は受精後7.5時間目であるのに対し、chordinの発現開始時期は受精後7時間目であった(図3)。なお、各レーンの数字は人工授精後の培養時間を表す。Zic3遺伝子の発現はchordinと比較してわずか30分遅れたにすぎなかったことから、Zic3遺伝子はchordinと同様、神経誘導の最初のステップを誘導するものであることが分かった。
【００８９】
(3) Zic3の発現誘導機構
アフリカツメガエル（Xenopus laevis)の卵細胞の外胚葉（動物極）は、長期分散培養によって神経化させることができる[Gruntz,H. et al.： Cell Differ. Dev. 28： 211-218(1989); Godsave,S.F. et al.： Dev. Biol. 134：486-490(1989)]。
これは、細胞を分散させることにより、外胚葉細胞が神経化抑制因子から解放されるためである。
そこで、動物極の組織片においてZic3が誘導されるか否かを調べた。
すなわち、動物極の組織片をCa2+、Mg2+イオンを含まない緩衝液中に浸漬し、軽くピペッティングすることにより分散された細胞を得た。この状態で、Ca2+、Mg2+イオンを含まない培地中、23℃で４時間培養後、再び細胞塊を作らせ神経胚相当の時間まで培養を続けた。
【００９０】
次に、Zic3及び他の遺伝子（表皮ケラチン、NCAM、Xtwi、Xslu、ヒストンH4）の発現をRT-PCRによって調べた。すなわち、分散させていない動物極組織片及び分散させた組織片よりRNAを抽出し、各遺伝子に対するプライマーとして、前記及び以下に記載のものを用い、本実施例の(1)に記載の条件と同じ条件でRT-PCRを行った(動物極アッセイ)。
【００９１】
表皮ケラチン(センス) 5'-CACCAGAACACAGAGTAC-3'      (配列番号：25)
(アンチセンス) 5'-CAACCTTCCCATCAACCA-3'      (配列番号：26)
Xtwi        (センス) 5'-AGTCCGATCTCAGTGAAGGGCA-3'  (配列番号：27)
(アンチセンス) 5'-TGTGTGTGGCCTGAGCTGTAG-3'   (配列番号：28)
Xslu        (センス) 5'-GCCCTATTTCCTTGTTGC-3'      (配列番号：29)
(アンチセンス) 5'-AACCCTTCTTGGTTGCAC-3'      (配列番号：30)
【００９２】
その結果を図4Aに示す。各レーンにおいて、Intactは動物極組織片(分散させなかった細胞)、Dispersedは動物極を分散培養したもの、Embryoは胚、RT-は逆転写酵素なしの結果を表す。動物極組織片では、表皮マーカー遺伝子である表皮ケラチン遺伝子の発現が認められたが、Zic3の発現は認められなかった。一方、分散させた細胞では、Zic3及びは神経マーカー遺伝子であるNCAMの発現が認められたが、表皮ケラチン遺伝子の発現は認められなかった。
【００９３】
動物極由来の分散細胞において神経化が生じるのは、外胚葉細胞を表皮細胞に誘導するBMP4媒介シグナル[Wilson,P.A. et al.：Nature 376： 331-333(1995)]が弱まるためであると考えられる。従って、本発明者らは、BMP4媒介シグナルを遮断することにより、in vivoにおいて実際にZic3の発現を誘導することができるものと仮定し、以下の実験を行った。
すなわち、ドミナントネガティブ型BMPレセプター(dnBMPR)mRNA[Suzuki,A. et al.：Devlop. Growth. Differ. 37：581-588(1995)]を胚に注入することにより、dnBMPRを胚で過発現させ、初期原腸ステージの胚について、Zic3の発現を、前記と同様の手順でin situ ハイブリダイゼーションを行った。
【００９４】
具体的には、Zic3及びdnBMPR mRNAをin vitro転写により合成した。Zic3 mRNA (100pg)を、ガラス微小針により２細胞ステージの胚に注入した。対照としては、LacZ mRNAを注入した初期原腸胚を用いた。dnBMPR mRNA(500pg)を２細胞期胚の腹領域に注入した。注入した胚を、５％Ficollを含む１×Steinberg溶液中でステージ10.25の初期原腸胚まで発生させ、これを前記と同様の手順で、ホールマウント in situハイブリダイゼーションを行いZic3の発現を調べた。
【００９５】
その結果、dnBMPR mRNAを注入した胚、注入しない胚のいずれの場合とも本来の位置にZic3の発現が観察されたが(図4B、くさび型矢印)、 dnBMPR mRNAを注入した胚においては原腸の腹部縁の領域においても、異所性のZic3 mRNA発現が誘導された（図4B矢印)。dnBMPR mRNAの注入により、細胞内で過剰量のdnBMPRが発現し、BMP4シグナルが阻害され、神経外胚葉を誘導することが示されている[Zimmerman, L.B.,et al.： Cell 86：599-606(1996)]。従って、Zic3の発現は、in vivoにおいてBMP4シグナルを遮断することにより誘導されることが分かった。
【００９６】
(4) 初期胚におけるZic3の過発現試験
アフリカツメガエルのZic3の発現パターン及び神経誘導を調節する活性は、Zic3が神経発生の初期過程において何らかの役割を有することを示唆する。そこで、胚の過発現実験によりZic3の機能を試験した。
まず、2細胞ステージ胚の分割細胞の一つにZic3 mRNAを注入し、胚の左側のみあるいは右側のみにおけるZic3の過発現を行った。
【００９７】
すなわち、前記と同様の手順により、Zic3、LacZ、dnBMPR mRNAを、in vitro転写により合成した。各Zic3 mRNAを、LacZ mRNAと共に、または単独で、２細胞ステージ胚の１割球又は８細胞ステージ胚の２割球に注入した。また、dnBMPR mRNA(500pg)は２細胞ステージ胚の腹領域に注入した。動物極アッセイ用に、Zic3 mRNAを２細胞ステージ胚の２割球の動物側に注入した。対照として、LacZ mRNAのみの注入、H2Oのみの注入、又は注入しないものについても実験を行った。注入処理された胚を５％Ficollを含む１×Steinberg溶液中で培養し、中期胞胚ステージとなったところで、これらの胚を0.1×Steinberg溶液に移し、ステージ９のときに動物極アッセイに供し、あるいは種々のステージのときに前記と同様の手順で、in situハイブリダイゼーションに供した。
【００９８】
結果を図5に示す。図5において、AはZic3 mRNAを注入しなかった側の対照の胚であり(ステージ27）、BはZic3 mRNAを注入した側の胚である(ステージ27）。CはZic3 mRNAを注入した胚(ステージ36)の前方背面領域を示した写真である。D〜Fは、Cで示される胚の横断切片の顕微鏡写真である。G〜Jは、100pgのZic3 mRNA、又は対照としてLacZ mRNAを、８細胞ステージの細胞のうち２つの卵割球にそれぞれ注入したときのZic3の過発現を示したものである。G(ステージ36)は背側の動物極に、H〜J(H及びIはステージ25、Jはステージ20）は腹側の動物極にmRNAを注入したものである。G及びHの上の図は対照であるLacZ mRNAを注入した胚の側面を表し、下の図はZic3 mRNAを注入した胚の側面を表す。IはHのクラスター部を拡大したものである。Jは、8細胞ステージの胚における腹側動物極の2個の割球にLacZ mRNA又はZic3 mRNAを注入したときのXtwi発現を示す。
【００９９】
Zic3 mRNAを注入した胚は、ほとんど全てにおいて頭側が粗大化したに止まり、目の形成はほとんど認められなかった(図5B,C)。一方、Zic3 mRNAを注入しなかった胚は正常に目が形成された(図5A,C)。
【０１００】
胚の頭部領域組織切片を観察すると、Zic3 mRNAを注入した側において神経壁がかなり厚くなった(図5D-F)。また、Zic3 mRNAを注入した場合は、神経壁が肥大したことに加え、頭部領域の神経堤由来である推定の間葉組織が顕著な過形成を示した。しかし、ほとんどの場合に神経網膜はかなり歪んでおり、過形成は少なかった(図5D)。しかも、網膜の色素細胞は減少し、特にレンズは全く誘導されなかった(図5C、D）。さらに、背側割球にZic3 mRNAを注入した胚では目の異常が観察された（図4G下)。また、腹側割球にZic3 mRNAを注入した胚では異所性の色素細胞のクラスターが顕著に表れた(図5H下)。これに対し、Zic3 mRNAを注入しなかった胚では、このような異常は全く観察されなかった。
【０１０１】
一方、Xtwiの発現を観察すると、対照胚では頭部神経堤において発現が観察された(図5J上,くさび型矢印)。
これに対し、Zic3 mRNAを注入したものは、胚の腹側において色素細胞の異所性クラスターの近くに異所性Xtwi発現が誘導された(図5Jの下,白のくさび型矢印)。なお、頭部神経堤を発現するXtwiの広がり(図5Jの下、黒のくさび型矢印)は、8細胞ステージの胚において観察され、色素含有細胞の異所性クラスターは頭部領域に観察された(図5B)。
【０１０２】
次に、本発明者は、8細胞ステージ胚の背側動物極又は腹側動物極の2個の割球にZic3 mRNAを注入し、背側又は腹側に局所的にZic3を発現させた(図4G-J)。この発現実験は前記と同様にして、80個の胚について行った。
その結果、Zic3 mRNAを背側動物極の割球に注入すると、胚の頭部は大きくなり、そして目の変化は網膜神経上皮の異常、網膜色素上皮細胞の減少、水晶体の欠損であり、２細胞ステージ段階で注入した胚において観察されたものと同様であった(試験した80個の胚のうち58個)(図5G)。また、前方領域では神経管形成の終止が遅延し、色素細胞は背側頭部において観察された(試験した80個の胚のうち58個)。
【０１０３】
これに対し、Zic3 mRNAを腹側動物極の割球に注入すると、異所性の色素細胞は腹側表皮に表れた(試験した111個の胚のうち90個)。そして、腹側色素細胞のクラスターは、腹側を横断する過形成組織の隆起上に整列した。これらの色素細胞は神経堤由来のメラニン細胞であると考えられた。そこで、神経堤細胞マーカーであるXtwiをプローブとして用いて、Zic3 mRNAを注入した胚についてのin situハイブリダイゼーションを行った。in situハイブリダイゼーションの手法は前記(1)と同様である。
その結果、異所性のXtwi発現は、頭部神経堤のXtwi発現領域の広がりに加えて、色素細胞の異所性であることが明らかなクラスターの近くに観察された。
【０１０４】
(5) 初期胚発生過程におけるZic3遺伝子の役割
Zic3の過発現が、初期胚においてどのような細胞運命付けの変化をもたらすかを調べるため、初期神経胚においてNCAM、Xtwi、Xslu、及び表皮性抗原であるEpA[Jones,E.A & Woodland,H.R.：Cell 44：345-355(1986)]の各遺伝子の発現を試験した。
【０１０５】
すなわち、２細胞ステージ胚の割球に全量100pgのZic3 mRNAを注入し、NCAM及びXsluプローブを用いたin situハイブリダイゼーション、並びにEpAモノクローナル抗体(Univ. of Warwick, UKのE. Jones氏から入手)を用いた免疫組織化学染色を行い、上記各遺伝子のステージ14での発現パターンを試験した。
結果を図6に示す。図6A〜Dのいずれもステージ14胚の背側を表す。また、AはNCAMを、BはXtwiを、CはXsluをプローブとして用いたときの結果であり、DはEpAモノクローナル抗体を用いたときの結果である。
【０１０６】
試験した45個の胚のうち31個の胚において、Zic3 mRNAを注入した側の前方神経板領域でNCAMの発現が顕著に増加した (図6A)。神経堤細胞でのXtwi(45個の胚のうち43個)及びXslu(12個の胚のうち12個)の発現も、Zic3 mRNAを注入することにより増加した(図6B及びC)。しかし、表皮のZic3 mRNA注入部位では、EpA染色の染色量は減少した(図6D)。
ここで、Zic3 mRNAの注入により、表皮への運命付けが神経及び神経堤への運命付けへと変化すると仮定すると、表皮はZic3 mRNAを注入した部位において縮小するはずである。この可能性を確認するため、次にZic3 mRNAを注入した胚中のEpAの発現を測定した。
【０１０７】
発現の測定は以下の通り行った。すなわち、胚をDent's固定液(20％ジメチルスルホキシド、80％メタノール)中に浸漬し、数回緩やかに振盪した。そして−20℃に一晩放置し固定した。次いで固定液を除去後、漂白溶液(10％H2O2、47％メタノール、20％DMSO)を加え、１〜２日静置し漂白した。漂白液を除去後、100%メタノールを加え、−20℃に保存した。その後、TBS(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、150mM NaCl、0.05％Tween20)での20分間の洗浄を２回行い、EpAモノクローナル抗体を20％正常ヤギ血清を含むTBSで100〜1000倍に希釈し、これを用いて、４℃で一晩、一次染色した。次いで、TBSでの１時間の洗浄を５回行った後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を20％正常ヤギ血清を含むTBSで約200倍に希釈し、これを用いて、４℃で一晩、二次染色した。TBSでの１時間の染色を５回行った後、発色液(0.5mg/mlジアミノベンジジン、0.02％H2O2を含むTBS)で二次染色した。適当な濃さになるまで発色させた後、100％メタノールでの10分間の洗浄を２回行った。次いで胚を透明化させるため、BABB溶液(ベンジルアルコール：ベンジルベンゾエート＝１：２)に浸漬した。この後、100％メタノール中で保存した。
【０１０８】
その結果、Zic3を注入した部位では、EpAの発現は有意に減少した(図6D)。この事実は、Zic3が、表皮細胞への運命付けを神経及び神経堤細胞への運命付けへと変化させることを意味するものである。
【０１０９】
(6) Zic3遺伝子の機能発現試験
前記実験は、初期神経及び神経堤の発生過程においてZic3が重要な役割を果たすことを示唆するものである。この過程においてZic3がどのように作用するのかを調べるため、Zic3 mRNAが注入された動物極の移植片においてRT-PCRによるいくつかのマーカー遺伝子の発現実験を行った。
2細胞ステージの胚に100pgのZic3又は対照のLacZ mRNAを注入した。ステージ９で動物極を外移植し、培養した。
【０１１０】
姉妹胚がステージ20に達したときに、神経マーカー(NCAM, Neurogenin, NeuroD, XASH-3, XATH-3, XlPOU 2)及び神経堤マーカー(Xtwi, Xslu)の発現をRT-PCRによって試験した。また、初期中胚葉マーカーであるXbra (Xenopus brachyury)及び背側中胚葉マーカーであるM.actin (muscle actin)の発現を、姉妹胚がそれぞれステージ10.5及びステージ20に達したときに前記と同様の手順でRT-PCRによって試験した。また、Neurogenin、Xbra、M.actinについては、以下のプライマーを用いてRT-PCR法を行った。
【０１１１】
Neurogenin (センス) 5'-CAAGAGCGGAGAAACTGTGT-3'  (配列番号：31)
(アンチセンス) 5'-GAAGGAGCAACAAGAGGAAG-3'  (配列番号：32)
Xbra       (センス) 5'-GTCCGTACACTCACAGAAAC-3'  (配列番号：33)
(アンチセンス) 5'-GAGGTGTAGAGCCAAGTAAG-3'  (配列番号：34)
M.actin    (センス) 5'-GCTGACAGAATGCAGAAG-3'    (配列番号：35)
(アンチセンス) 5'-TTGCTTGGAGGAGTGTGT-3'    (配列番号：36)
【０１１２】
その結果を図7に示す。Zic3は試験した全ての神経及び神経堤マーカー遺伝子を誘導した。注入しなかった胚の動物極(Uninj.)又はLacZを注入した胚の動物極(LacZ)は、上記いずれのマーカーも発現しなかったが、Zic3 mRNAを注入した動物極(Zic3)は、試験した全ての神経マーカー及び神経堤マーカーを発現した(図7A)。しかし、Zic3は中胚葉マーカーを誘導しなかった(図7B)。
【０１１３】
これらの結果は、Zic3が中胚葉を除く神経組織誘導を指揮することができ、Zic3が表皮への運命付けを神経及び神経堤への運命付けに直接変換することができることを示す。
さらに、前方神経板で発現する分子マーカーEn-2[Hemmati-Brivanlou, A. et al. ：Development 111：715-724(1991)]及び後方マーカーXlHbox6 [Wright, C.V.E. et al.：Development 109：225-234(1990)]の発現を、前記と同様の手順でRT-PCRによって試験した。なお、En-2、XlHbox6については以下のプライマーを用いてRT-PCR法を行った。
【０１１４】
En-2       (センス) 5'-CACAAGGGGTTAAAGGCAAG-3' (配列番号：37)
(アンチセンス) 5'-CCCAGTGTCTCTCTCAGTAT-3' (配列番号：38)
XlHbox6    (センス) 5'-TACTTACGGGCTTGGCTGGA-3' (配列番号：39)
(アンチセンス) 5'-AGCGTGTAACCAGTTGGCTG-3' (配列番号：40)
【０１１５】
その結果、前方神経マーカーEn-2は誘導されたが、後方マーカーXlHbox6は誘導されなかった(図7C)。この結果は、BMP4シグナルが遮断されることによって生じる神経組織は前方神経外胚葉であるとする先の知見と一致する[Hemmati-Brivanlou,A. et al.： Cell 77：283-295(1994); Sasai, Y. et al.： Nature 376：333-336(1995); Lamb,T.M. et al.：Science 262：713-718(1993)]。従って、Zic3は前方の性質をもった神経外胚葉を誘導する活性をもつことが明らかとなった。
【０１１６】
Zic3の過発現によって外移植物において神経マーカー(NCAM)が誘導され、神経堤マーカー(Xtwi及びXslu)も誘導された(図7A)。このことは、分散させた動物極細胞においてZic3は発現したがXtwi及びXsluは発現しなかった結果（図4)と対照的である。
以上のことから、Zic3はいわゆるプロニューラル遺伝子(proneural gene)を誘導し、これまでに知られているプロニューラル遺伝子の上流に作用することが示された。従って、Zic3遺伝子は、神経発生誘導活性、特に初期神経発生誘導活性を有しており、神経誘導のマスター遺伝子と呼ぶことができる。
【０１１７】
【発明の効果】
本発明により、神経発生誘導タンパク質、該タンパク質をコードする神経発生誘導遺伝子Zic3、該遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体、前記タンパク質に対する抗体並びに神経系疾患の治療剤が提供される。本発明のZic3遺伝子は、神経疾患の診断薬、アルツハイマー病等の治療薬、神経疾患を検出するためのプローブとして有用である。
【０１１８】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：2364
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：ゼノパス・ラエビス(Xenopus laevis)
株名：
配列の特徴
特徴を表わす記号：CDS
存在位置：138..1463
配列
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0003674744.tif 000005
0003674744.tif 000006
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【０１１９】
配列番号：２
配列の長さ：441
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
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0003674744.tif 000009
【０１２０】
配列番号：3
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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【０１２１】
配列番号：4
配列の長さ：7
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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【０１２２】
配列番号：5
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２３】
配列番号：6
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２４】
配列番号：７
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２５】
配列番号：8
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２６】
配列番号：9
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２７】
配列番号：10
配列の長さ：23
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２８】
配列番号：11
配列の長さ：19
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１２９】
配列番号：12
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３０】
配列番号：13
配列の長さ： 22
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３１】
配列番号：14
配列の長さ： 22
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３２】
配列番号：15
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３３】
配列番号：16
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３４】
配列番号：17
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３５】
配列番号：18
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３６】
配列番号：19
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３７】
配列番号：20
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３８】
配列番号：21
配列の長さ：24
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１３９】
配列番号：22
配列の長さ：24
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４０】
配列番号：23
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４１】
配列番号：24
配列の長さ：21
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４２】
配列番号：25
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４３】
配列番号：26
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４４】
配列番号：27
配列の長さ：22
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４５】
配列番号：28
配列の長さ：21
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４６】
配列番号：29
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４７】
配列番号：30
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４８】
配列番号：31
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１４９】
配列番号：32
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１５０】
配列番号：33
配列の長さ：
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１５１】
配列番号：34
配列の長さ：
配列の型: 核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１５２】
配列番号：35
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
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配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１５３】
配列番号：36
配列の長さ：18
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003674744.tif 000043
【０１５４】
配列番号：37
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003674744.tif 000044
【０１５５】
配列番号：38
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
0003674744.tif 000045
【０１５６】
配列番号：39
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【０１５７】
配列番号：40
配列の長さ：20
配列の型: 核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列
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【図面の簡単な説明】
【図１】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す写真である（生物の形態）。
【図２】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す電気泳動写真である。
【図３】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す電気泳動写真である。
【図４】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す電気泳動写真及び生物の形態の写真である。
【図５】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す写真である（生物の形態) 。
【図６】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す写真である（生物の形態) 。
【図７】  Zic3遺伝子の発現試験結果を示す電気泳動写真である。
【図１】
0003674744.tif 000048
【図２】
0003674744.tif 000049
【図３】
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【図４】
0003674744.tif 000051
【図５】
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【図６】
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【図７】
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