(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＬ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡか、あるいは、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個又は数個以内のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表における配列番号６に示す塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含んでなる請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表における配列番号１１に示す塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を含んでなる請求項１に記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明はＬ−アスパラギナーゼをコードする新規なＤＮＡ、詳細には、哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＣ３．５．１．１）は、Ｌ−アスパラギンに作用してＬ−アスパラギン酸とアンモニアを遊離するアミドヒドロラ−ゼの一種である。Ｌ−アスパラギナーゼは動植物及び微生物におけるＬ−アスパラギン代謝の中心的役割を担う酵素であるが、ジェー・ジー・キッズが『ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディスン』、第９８巻、第５６５乃至５８１頁（１９５３年）にリンパ腫に対する阻害作用を報告して以来、抗腫瘍剤としての実用化に向けて精力的な研究が続けられてきた。その結果、今では、大腸菌のＬ−アスパラギナーゼが白血病及びリンパ腫の治療剤として用いられるようになった。
【０００３】
しかし、抗腫瘍作用に優れた大腸菌のＬ−アスパラギナーゼも、人体からみれば、所詮、異種蛋白質であり、これを配合使用する従来の治療剤は、患者に投与すると、アナフィラキシーショック及び蕁麻疹、浮腫、喘鳴、呼吸困難などの過敏反応を始めとする深刻な副作用を頻発させることとなった。斯くして、従来の治療剤は用量及び投与頻度を大幅に制限せざるを得ない状況にあり、そのため、斯かる副作用を軽減乃至解消するための提案が幾つかなされてきた。
【０００４】
その第一は、特開昭５４−１１９０８２号公報に見られるように、２−Ｏ−置換ポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−Ｓ−トリアジンにより大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼにおけるアミノ基の６５％以上を封鎖し、Ｌ−アスパラギナーゼそのものを化学的に修飾しようというものである。第二は、特開平４−３２０６８４号公報に見られるように、ヒトの肺、胃又は胸部から採取した線維芽細胞を培養し、培養物からヒトのＬ−アスパラギナーゼを採取しようというものである。第一の提案には、大量入手容易な大腸菌のＬ−アスパラギナーゼを利用できる利点はあるものの、修飾反応の制御が困難なうえに、副作用を解消するまでには到らないという問題がある。第二の提案によるヒトのＬ−アスパラギナーゼは、大腸菌が産生するものと違って、患者に投与しても抗体を産生し難い利点はあるものの、特開平４−３２０６８４号公報に開示されたヒト細胞はＬ−アスパラギナーゼ産生能が充分高いとは言えず、Ｌ−アスパラギナーゼを量産しようとすると、細胞を大量に培養しなければならない問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていないポリペプチドであっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、そのポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、所望量のポリペプチドが容易に取得できるようになった。
【０００６】
斯かる状況に鑑み、斯界においては、一刻も早く哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードする遺伝子、望ましくは、ヒトのＬ−アスパラギナーゼをコードする遺伝子が単離され、塩基配列の解明されるのが待ち望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記課題を、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を含んでなる哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【０００９】
【作用】
この発明のＤＮＡは、形質転換体とすることにより、特定のアミノ酸配列を含む哺乳類のＬ−アスパラギナーゼの産生を発現する。
【００１０】
以下、実施例等を参照しながらこの発明を説明するに、この発明はモルモットのＬ−アスパラギナーゼをコードする新規なＤＮＡの発見に基づくものである。モルモットの血清中にＬ−アスパラギナーゼの存在することは以前より知られていたものの、その性質・性状はほとんど解明されていなかった。
【００１１】
本発明者は、カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合わせてモルモットの血清からＬ−アスパラギナーゼ活性を有する物質を単離し、その部分アミノ酸配列を決定した。そして、その部分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーを用いて、モルモットの肝細胞から採取したｍＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ反応させたところ、モルモットのＬ−アスパラギナーゼを部分コードするＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片をプローブにして上記ｍＲＮＡから別途作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索したところ、１，６９５塩基対からなる、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、モルモットのＬ−アスパラギナーゼは５６５個のアミノ酸からなり、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００１２】
この知見に基づき、本発明者がヒトの肝細胞から採取したｍＲＮＡを引続き検索したところ、ヒトのＬ−アスパラギナーゼをコードする遺伝子を単離することに成功した。この遺伝子は１，７１９塩基対からなる、配列表における配列番号６に示す塩基配列を含んでなり、解読したところ、５７３個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列をコードしていることが判明した。
【００１３】
配列表における配列番号３乃至６に示すアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作を要約すると、次のようになる。
（１）  クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合わせてモルモットの血清からＬ−アスパラギナーゼを単離し、高度に精製した。
（２）  このＬ−アスパラギナーゼをトリプシン消化し、消化物から３種類のペプチド断片を単離し、アミノ酸配列を決定した。
（３）  モルモットの肝細胞からｍＲＮＡを採取し、これを鋳型に上記アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させてＤＮＡ断片を調製する一方、それらアミノ酸配列に基づき別途化学合成したプローブを用いてそれらＤＮＡ断片を検索したところ、モルモットのＬ−アスパラギナーゼ活性を部分コードするＤＮＡ断片が得られた。
（４）  このＤＮＡ断片を同位体標識した後、前記ｍＲＮＡを鋳型に調製したｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取した。
（５）  形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を決定し、解読するとともに、その解読したアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列を比較したところ、モルモットのＬ−アスパラギナーゼは配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、配列表における配列番号５に示す塩基配列によりコードされていることが判明した。
（６）  さらに、ヒトの肝細胞から採取したｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡライブラリーを作製する一方、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡ断片を調製し、同位体標識後、上記ｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取した。
（７）  形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を決定し、解読したところ、ヒトのＬ−アスパラギナーゼは配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を有し、配列表における配列番号６に示す塩基配列によりコードされていることが判明した。
【００１４】
配列表における配列番号３及び４に示すアミノ酸配列を比較すると、両者は、共通して、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有している。すなわち、配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列番号３及び４に示すアミノ酸配列における第１６乃至１９番目の配列に、一方、配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号３及び４に示すアミノ酸配列における第１１４乃至１１８番目の配列に相当する。アミノ酸配列における斯かる共通性に基づき、この発明でいう哺乳類のＬ−アスパラキナーゼは、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を含んでなるものということになる。その代表例としては、例えば、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有するモルモットのＬ−アスパラギナーゼ、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するヒトのＬ−アスパラギナーゼ、さらには、それらアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体が挙げられる。斯かる変異体は、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を保持しつつ、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を実質的に失わない範囲で、配列表における配列番号３又は４に示すアミノ酸配列におけるそれ以外のアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換したもの、さらには、それら配列番号３及び４に示すアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸が１個又は２個以上付加したもの、及びそのＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したものを包含する。
【００１５】
斯くして、この発明のＤＮＡは、上記のごときアミノ酸配列をコードするものということになる。個々のＤＮＡとしては、例えば、配列表における配列番号５乃至６及び１０乃至１１に示す塩基配列及びそれらに相同的な塩基配列並びにそれらに相補的な塩基配列のものを挙げることができる。斯かる塩基配列においては、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、それら塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換してもよい。また、この発明のＤＮＡが、実際に、宿主内で哺乳類のＬ−アスパラギナーゼの産生を発現するために、この発明でいうＬ−アスパラギナーゼ又はその変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは言うまでもない。
【００１６】
この発明のＤＮＡは、それが上述のごとき塩基配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、モルモット及びヒトの肝臓が挙げられ、その細胞からは、例えば、配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列を含むＤＮＡが得られる。一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号３又は４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００１７】
斯くして得られるＤＮＡは、斯界における慣用の方法により形質転換体とすることができる。斯かる形質転換体は、培養すると、細胞乃至菌体内外に哺乳類のＬ−アスパラギナーゼを産生する。哺乳類のＬ−アスパラギナーゼは、従来公知の大腸菌のものと違い、患者に反復投与してもアナフィラキシーショックや過敏反応などの副作用を惹起し難い特徴があるので、単独又は他の薬剤と併用して、急性白血病、急性リンパ性白血病及び悪性リンパ腫を含む哺乳類における悪性腫瘍一般の治療に有利に用いることができる。
【００１８】
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、そこで用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、ティー・マニャティスら『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー発行や、松村正実『ラボマニュアル遺伝子工学』、１９８８年、丸善発行などにも詳述されている。
【００１９】
【実施例１  モルモットのＬ−アスパラギナーゼの精製】
８乃至１０週齢のモルモット１００匹から採血し、血液を常法にしたがって処理して血清３００ｍｌを得た。血清に硫酸アンモニウムを５０％飽和になるように加え、４℃で２時間静置し、約８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈澱部を採取し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、新鮮な同一緩衝液に対して４℃で１８時間透析後、予め新鮮な同一緩衝液により平衡化しておいたファルマシア製ゲル濾過クロマトグラフィー用ゲル『セファクリルＳ−３００』３００ｍｌのカラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液した。
【００２０】
分子量約１５０，０００ダルトンに相当する画分を採取し、予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化しておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−５ＰＷ』に負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄した後、０Ｍから１Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１３ｍｌ／分の流速で通液した。塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出した画分約１２０ｍｌを採取し、蒸留水に対して４℃で４時間透析した後、予め５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）により平衡化しておいたファルマシア製アフィニティークロマトグラフィー用ゲル『ブルーセファロースＣＬ−６Ｂ』１００ｍｌのカラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液してモルモットのＬ−アスパラギナーゼを溶出させた。
【００２１】
Ｌ−アスパラギナーゼを含む画分を採取し、濃縮後、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化しておいたファルマシア製ゲル濾過クロマトグラフィー用ゲル『ハイロードスーパーデックス２００』のカラムに負荷し、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液した。分子量約１５０，０００ダルトンに相当する画分を採取し、濃縮したところ、比活性約１０単位／ｍｇ蛋白質のモルモットのＬ−アスパラギナーゼがモルモット１匹当たり約４００μｇの収量で得られた。
【００２２】
なお、この明細書を通じて、Ｌ−アスパラギナーゼの活性は、次のようにして測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに被検試料を１６０μｌ／ウェルずつ分注する一方、Ｌ−アスパラギンを濃度１．４ｍｇ／ｍｌになるように５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶液を４０μｌ／ウェルずつマイクロプレートに加える。この状態でマイクロプレートを３７℃で１０乃至３０分間インキュベートした後、反応により遊離したＬ−アスパラギン酸をアミノ酸分析機により測定する。同時に、被検試料に代えて１．０、０．５又は０．２５単位／ｍｌに希釈した大腸菌のＬ−アスパラギナーゼ標品を用いる系を設け、上記と同様に処置した後、遊離したＬ−アスパラギン酸を同様に測定し、その測定値に基づき検量線を作成する。被検試料の系で測定されたＬ−アスパラギン酸の量をこの検量線に内挿し、被検試料の活性値を推定する。Ｌ−アスパラギナーゼの１単位とは、上記条件下で反応させたとき、１分間にＬ−アスパラギンからアンモニアを１μｍｏｌ遊離するＬ−アスパラギナーゼ活性ポリペプチドの量と定義する。
【００２３】
【実施例２  モルモットのＬ−アスパラギナーゼの部分アミノ酸配列】
実施例１で調製した精製Ｌ−アスパラギナーゼを含む水溶液の一部をとり、約５０μｌまで濃縮した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％（ｗ／ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍｇ／ｍｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分間インキュベートした後、１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ２５０及び１０％（ｖ／ｖ）酢酸を含む５０％（ｖ／ｖ）水性メタノールに浸漬して発色させ、７％（ｖ／ｖ）酢酸を含む１２％（ｖ／ｖ）水性メタノールにより繰返し濯いで脱色し、蒸留水に１８時間浸漬して洗浄後、ゲルより染色部分を切出し、凍結乾燥した。
【００２４】
乾燥ゲルをシグマ製トリプシン剤『ＴＰＣＫトリプシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０水溶液からなる混液０．６ｍｌに浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートしてＬ−アスパラギナーゼをトリプシン消化した。消化物を遠心分離して上清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪した後、遠心分離して上清を採取した。新たに生じた沈澱を、先ず、０．００１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む７０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で、次に、０．００１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０及び５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル溶液で、順次、上記と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清をプールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心瀘過した。
【００２５】
斯くして得られたペプチド断片を含む水溶液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液により平衡化しておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＨＰＬＣ  ＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液で洗浄後、溶出液中のポリペプチド濃度を吸光光度計により２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニタしながら、０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約６６分後、約６９分後及び約７２分後に溶出した画分（以下、それぞれ『ペプチド断片Ａ』、『ペプチド断片Ｂ』、『ペプチド断片Ｃ』と言う。）を別々に採取した。このときの溶出パターンを図１に示す。
【００２６】
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがってこれらペプチド断片Ａ、Ｂ及びＣのアミノ酸配列を調べたところ、それぞれ、配列表における配列番号７乃至９に示すアミノ酸配列を有していた。
【００２７】
【実施例３  モルモットのＬ−アスパラギナーゼの全アミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列】
【００２８】
【実施例３−１  全ＲＮＡの調製】
常法にしたがって調製したモルモットの肝細胞を湿重量で３ｇとり、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む６Ｍグアニジンイソチオシアネート水溶液２０ｍｌに浮遊させ、ホモジナイザにより破砕した。３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムと０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の混液２５ｍｌを注入し、その上に細胞破砕物を重層し、２５，０００ｒｐｍ、２０℃で２０時間遠心分離した。遠心管からＲＮＡを含む画分を採取し、１５ｍｌ容遠心管に移し、等容量のクロロホルム／ブタノール混液（混合比４：１）を加え、５分間振盪した後、１０，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、水層部を採取し、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。沈澱部を７５％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、乾燥したところ、全ＲＮＡが約４ｍｇ得られた。
【００２９】
【実施例３−２  モルモットのＬ−アスパラギナーゼを部分コードするＤＮＡ断片の調製】
実施例３−１で調製した全ＲＮＡ  １μｇに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム）を２μｌ、１ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤を１μｌ、２．５単位／μｌ逆転写酵素を１μｌ及び２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした。常法により、混合物を０．５ｍｌ容反応管中、２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間インキュベートして逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。
【００３０】
第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μｌと２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム）を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、さらに、センスプライマー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー１及びプライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、混合物を９４℃で１分間、４２℃で２分間、７２℃で３分間のサイクルで４０回繰返し反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型にモルモットのＬ−アスパラギナーゼを部分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマー１及びプライマー２は、配列表の配列番号８又は７におけるＧｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ又はＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ、５´−ＧＧＮＡＴＧＣＡＲＷＳＮＡＡＲ−３´又は５´−ＧＣＮＧＧＤＡＴＮＣＣＮＧＧＲＴＡ−３´で表される塩基配列を有していた。
【００３１】
斯くして得られたＰＣＲ産物の一部をとり、常法にしたがって２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動して分画後、０．４Ｎ水酸化ナトリウムにより加圧ブロットしてＤＮＡをナイロン膜上に転写し、固定した。ナイロン膜を２×ＳＳＣで洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、プローブ１として、配列表の配列番号９におけるＰｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列に基づき５´−ＴＴＹＡＴＧＹＴＮＧＡＲＡＡＹＹＴ−３´で表される塩基配のオリゴヌクレオチドを化学合成し、［γ−32Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより同位体標識した。そして、プローブ１を１ｐｍｏｌ、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む混液にナイロン膜を浸漬し、４２℃で２４時間インキュベートしてハイブリダイズさせ、室温下でナイロン膜を６×ＳＳＣにより洗浄した後、常法にしたがってオートラジオグラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰＣＲ産物に含まれていた。
【００３２】
残りのＰＣＲ産物にノバジェン製プラスミドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』５０ｎｇと適量のＴ４  ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭ  ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入した。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法によりノバジェン製大腸菌『ＮｏＶａ  Ｂｌｕｅ』株に導入して形質転換体とし、これを１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、２．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌバクトアガー、１００ｍｇ／ｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌ  Ｘ−Ｇａｌ及び２３．８ｍｇ／ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含むプレート培地に接種し、３７℃で２４時間培養してコロニーを形成させた。常法にしたがってプレート培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してコロニーを移取った後、ナイロン膜を剥離し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬して溶菌した。その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３分間浸漬し、２×ＳＳＣで洗浄後、０．４Ｍ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣ中で洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、４２℃で２４時間インキュベートした。その後、常法にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイズさせ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジオグラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質転換体をプレート培地から採取した。
【００３３】
この形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養し、培養物から菌体を採取し、通常のアリカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮＡは配列表の配列番号５に示す塩基配列における第６１乃至７４６番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００３４】
【実施例３−３  ｍＲＮＡの調製】
実施例３−１で調製した全ＲＮＡを５００μｇ含む水溶液を０．０５ｍｌとり、これに１ｍＭ二ナトリウム−ＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加えて全量を１ｍｌとした。混合物に日本ロシュ製オリゴ（ｄＴ）30ラテックス『オリゴテックス−ｄＴ３０スーパ−』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱して変性させた後、直ちに氷浴中で３分間冷却した。５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌ加え、３７℃で１０分間インキュベートし、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット状の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加えて懸濁させ、６５℃で５分間インキュベートしてオリゴテックスからｍＲＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮＡは約５μｇであった。
【００３５】
【実施例３−４  ｃＤＮＡライブラリーの作製】
アマシャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成システム・プラス』を使用し、実施例３−３で調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランド合成用溶液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター１μｌ、デオキシヌクレオチド三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄＴプライマー１μｌを順次加え、実施例３−３で調製したｍＲＮＡを５μｇ加えた後、滅菌蒸留水で１９μｌとした。混合物に逆転写酵素２０単位を含む溶液１μｌを加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００３６】
反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶液３７．５μｌ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを０．８単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序で加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６０分間、２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを２単位を加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む溶液を得た。反応物に０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させてｃＤＮＡを採取した。
【００３７】
このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝液を２μｌ、さらにＥｃｏ  ＲＩアダプターを２５０ｐｍｏｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時間インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏ  ＲＩアダプターを連結した。反応物に０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を２μｌ加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグラフィーにより未反応のＥｃｏ  ＲＩアダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏ  ＲＩアダプターの５´末端を燐酸化した後、反応物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱してＤＮＡを採取した。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液を１．５μｌとＴ４  ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で全量を１５μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートした後、通常の生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。
【００３８】
【実施例３−５  組換えＤＮＡのクローニング】
アマシャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実施例３−４で調製したファージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天倍地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１０時間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移取り、剥離した後、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３分間浸漬する操作を繰返した。ナイロン膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣでさらに濯ぎ、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、実施例３−２で調製したＤＮＡ断片をアマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システム』により32Ｐ標識してプローブ２とし、その適量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液中、６５℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。ナイロン膜を２×ＳＳＣ中、６５℃で２０分間、０．２×ＳＳＣ中、６５℃で２０分間濯いだ後、オートラジオグラフィーして、プローブ２に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取した。
【００３９】
常法にしたがってこのクローンを大腸菌中で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入し、形質転換体を得た。
【００４０】
【実施例３−６  ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸配列の決定】
実施例３−５で調製した形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列番号１０に示す塩基配列を含んでなり、解読したところ、同じく配列番号１０に示すアミノ酸配列をコードしていることが示唆された。このアミノ酸配列においては、その第１０乃至２５番目又は第２４３乃至２５３番目に配列表における配列番号８及び７に示す部分アミノ酸配列が含まれており、このことは、配列番号３のアミノ酸配列を有するモルモットのＬ−アスパラギナーゼが配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００４１】
次の実施例４では、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡ断片をプローブに使用し、ヒトの肝臓から採取したｍＲＮＡからヒトのＬ−アスパラギナーゼをコードするｃＤＮＡを採取する。そして、そのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、解読して、ヒトのＬ−アスパラギナーゼの全アミノ酸配列を決定する。
【００４２】
【実施例４  ヒトのＬ−アスパラギナーゼの全アミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列】
【００４３】
【実施例４−１  ｃＤＮＡライブラリーの作製】
アマシャム社製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成システム・プラス』を使用し、クローンテック製ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランド合成用溶液１０μｌ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液２．５μｌ、１μｇ／μｌヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター２．５μｌ、１μｇ／μｌデオキシヌクレオチド三燐酸混合液５μｌ及び１μｇ／μｌオリゴｄＴプライマーを２．５μｌとり、ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡを５μｇ加え、滅菌蒸留水で４５μｌとした後、逆転写酵素１００単位を含む溶液を５μｌ加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００４４】
反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶液９３．５μｌ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを４単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを１１５単位加え、滅菌蒸留水で２５０μｌとし、１２℃で６０分間、２２℃で６０分間、７０℃で１０分間この順序でインキュベートした後、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを１０単位加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１０μｌ加えて反応を停止させた後、反応物を常法にしたがってフェノール／クロロホルム抽出し、抽出物をエタノール沈澱させて第二ストランドｃＤＮＡを得た。
【００４５】
このようにして得た第二ストランドｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を２μｌ、Ｅｃｏ  ＲＩアダプターを２５０ｐｍｏｌ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを２．５単加え、滅菌蒸留水で２０μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートしてｃＤＮＡの両端にＥｃｏ  ＲＩアダプターを連結した後、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を２μｌを加えて反応を停止させた。分子篩クロマトグラフィーにより反応物から未反応のＥｃｏ  ＲＩアダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液  （ｐＨ８．０）を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏ  ＲＩアダプターの５´末端を燐酸化した後、フェノール／クロロホルム抽出し、抽出物をエタノール沈澱してｃＤＮＡを採取した。その後、ｃＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を１．５μｌとＴ４  ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で１５μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートした後、通常の生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。
【００４６】
【実施例４−２  組換えＤＮＡのクローニング】
常法により、大腸菌ＮＭ５１４株に実施例４−１で調製したファージを感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天倍地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１０時間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移取り、剥離した後、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３分間浸漬する操作を繰返した。ナイロン膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣでさらに濯ぎ、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。
【００４７】
組換えＤＮＡをクローニングすべく、別途、アマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システム』を使用し、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡ断片を同位体標識してプローブ３を調製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に実施例３−５の方法により得たＤＮＡ断片を２５ｎｇとり、滅菌蒸留水で４５μｌとし、９５℃で３分間加熱した後、反応管にとり、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ溶液を５μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートして同位体標識した。その後、同位体標識したＤＮＡ断片を含む反応物に通常の分子篩クロマトグラフィーを適用し、未反応の［α−32Ｐ］ｄＣＴＰを除去してプローブ３を得た。
【００４８】
次に、前記ナイロン膜をプローブ３の適量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液中、５０℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせた後、６×ＳＳＣ中、室温下で２０分間、２×ＳＳＣ中、室温下でさらに２０分間インキュベートし、洗浄し、オートラジオグラフィーして、プローブ３に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取した。常法によりこのクローンを大腸菌中で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入し、形質転換体を得た。
【００４９】
【実施例４−３  ヒトのＬ−アスパラギナーゼをコードするＤＮＡの塩基配列と全アミノ酸配列の決定】
実施例４−２で調製した形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列番号１１に示す塩基配列を含んでいた。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号１１に併記したとおりであり、このことは、配列表における配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトのＬ−アスパラギナーゼが配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示唆している。また、配列表における配列番号３及び４に示すアミノ酸配列を比較すると、約７０％の相同性のあることが判明した。
【００５０】
【発明の効果】
叙上のとおり、この発明は、哺乳類のＬ−アスパラギナーゼをコードする新規なＤＮＡの発見に基づくものである。この発明のＤＮＡに組換えＤＮＡ技術を適用することにより、従来、入手困難であったヒトを含む哺乳類のＬ−アスパラギナーゼの所望量を容易に入手できることとなる。
【００５１】
斯くも顕著な作用効果を発揮するこの発明は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明と言える。
【００５２】
【配列表】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】モルモットのＬ−アスパラギナーゼのペプチドマップを示す図である。
【図１】
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