(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）平滑筋細胞シートの形成を可能とする条件下においてインビトロで培養された、継代培養されたヒト平滑筋細胞と、（ii）平滑筋細胞により形成された内因性繊維基質とから構成され、血管作用性アゴニストに応答して収縮する能力を保持する、収縮性平滑筋細胞構築物。
【請求項２】
前記平滑筋細胞構築物が管状の形態である、請求項１に記載の収縮性平滑筋細胞構築物。
【請求項３】
（ａ）継代培養されたヒト平滑筋細胞による繊維基質の合成を促進する培地を使用して、培養容器中で前記平滑筋細胞を培養し、
（ｂ）細胞が培養容器に付着してコンフルエントになって、そして前記細胞および前記基質が細胞シートを形成するまで、前記細胞の培養を維持し、そして
（ｃ）前記細胞のシートを培養容器から自発的に分離させるか、または前記細胞シートを培養容器から分離する、
ことを含む、請求項１に記載の収縮性平滑筋細胞構築物の製造法。
【請求項４】
前記細胞のシートを管状支持体の回りに巻いて、管状生存組織構築物を生成することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地がアスコルビン酸を含有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記管状生存組織構築物を前記支持体から取り出し、そして前記管状生存組織構築物の培養を維持することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ａ）請求項４に記載の管状生存組織構築物を作製し、
ｂ）前記管状生存組織構築物の回りに第二の細胞シートを巻く、
ことを含む、多層管状生存組織構築物の製造法。
【請求項８】
前記第二のシートが線維芽細胞を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記管状生存組織構築物の内側表面上に内皮細胞を接種することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、組織工学の分野に関する。特に、本発明は、生理学的刺激に応答して組織全体が収縮する、平滑筋細胞構築物の三次元インビトロ製造に関する。この平滑筋構築物は、薬理学的試験、研究を目的としてモデル化された器官、および人工血管の開発などに広く応用される。
発明の背景
血管の平滑筋構築物をインビトロ培養するとき、平滑筋構築物は血管作用物質に対する応答を失う。この表現型の変化により、特に高血圧症のような分野において、動物および動物の器官の実験に対する血管の医学的研究が大きく制限されている。いくつかの間接的情報は非収縮性平滑筋細胞培養物から得ることができるが、このような実験の結果は注意して解釈しなくてはならない。さらに、収縮性平滑筋細胞をインビトロで得ることができるが、平滑筋細胞を新しく単離する場合（プリモカルチャー）、この技術は得ることができる細胞および臨床的に入手可能な組織の数により制限される。
平滑筋細胞の培養物の収縮の応答を評価する、現在までに、記載された種々の方法は、次の３つの共通の重大な弱点を有する:1）細胞を非生理学的基質上で培養し、２）収縮力の定量的評価は不可能であり、そして３）収縮の定量的評価は「単細胞の基準」でなされる（多数の細胞を同時に試験することができるが）。したがって、従来の方法は、「組織を基準とした」応答についての情報を必ずしも提供しない。最近、非血管の動物平滑筋細胞のいくつかの二次元の継代培養は、適当な刺激因子に対して限られた収縮の応答を示した。それにもかかわらず、特に血管由来の特定の細胞におけるヒトの継代培養された平滑筋細胞の収縮は、依然として、証明されなくてはならない。
結局、in  vivoにおける平滑筋の応答のインビトロ複製として有用であることができる、平滑筋細胞構築物を開発することが要求されている。
発明の要約
本発明は、（ｉ）平滑筋細胞シートの形成を可能とする条件下においてインビトロで培養された平滑筋細胞と、（ii）平滑筋細胞により形成された内因性繊維基質とから構成され、血管作用性アゴニストに応答して収縮する能力を保持する、収縮性平滑筋細胞構築物を提供する。一つの態様において、平滑筋細胞構築物は管状の形態であることができる。この平滑筋細胞構築物は、血管中膜、血管の収縮要素、の基本的構造の代表であり、そして正常の血管作用性アンタゴニストに対して収縮の応答を示す。したがって、本発明は、生理学的環境においてかつ「組織を基準として」、培養された、または継代培養された、ヒト血管平滑筋細胞の純粋な集団により発生された、等尺性収縮力の定量的研究を可能とする。全体として収縮する、この組織の等価物は、その生理学的相手、すなわち、中膜、に類似する活性的に血管応答性の構造物である。
本発明は、また、収縮性平滑筋細胞構築物の製造法を提供し、この方法は、
（ａ）平滑筋細胞による繊維基質の合成を増強する培地を使用して、培養容器中で平滑筋細胞を培養し、
（ｂ）細胞が培養容器に付着し、コンフルエントとなり、そして細胞シートを形成するまで、前記細胞の培養を維持し、そして
（ｃ）前記細胞シートを培養容器から自発的に分離させるか、または前記細胞シートを培養容器から分離する、
ことを含んでなる。細胞シートは、種々の手段、例えば、酵素分離または機械的分離を使用して分離することができる。
この方法は、また、前記細胞シートを管状支持体の回りに巻いて、管状細胞構築物を生成する、追加の工程（ｄ）を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
第1A図〜第1J図は、本発明の方法によって得られた管状生存組織構築物の製造を示す略線図である。
第2A図は、セロトニンの濃度を変化させた場合の生存組織構築物の収縮を示す投与量応答曲線である。
第2B図は、ヒスタミンの濃度を変化させた場合の生存組織構築物の収縮を示す投与量応答曲線である。
発明の具体的説明
間充織起源の細胞（例えば、平滑筋細胞および繊維芽細胞）は、細胞それら自体により合成された細胞外基質（例えば、コラーゲン）中で絡み合った細胞の多層として成長するであろうことが決定された。これらの細胞をアスコルビン酸の存在において培養するとき、細胞はより速くコンフルエンスに到達し、そして前述の培養物のコラーゲン成分の比率は著しく増加する。これらの細胞をコンフルエンス後数日間培養において維持する場合、細胞および基質は培養の下層から全体として分離し、こうして内因性起源のコラーゲン基質中で生きている細胞のシートを作製する。
このような生存シートの自発的分離は、細胞培養におけるコラーゲン（または他の基質タンパク質）の合成または集合の増強により達成される。また、分離は、下層の接合部に対する細胞の強さを低下することにより、例えば、下層の付着を低下することによって、タンパク質分解酵素を使用することによって、または機械的力を使用することによって、誘発することができる。
いったん生きている組織のシートが得られると、それを直径を変化させた管状支持体の外側表面上に巻取って、それを管の形態にすることができる。適当な細胞培養条件において数時間巻取られた状態にある間、シートを所定位置に保持する場合、シートはそれ自体に比較的しっかり付着し、そしてその管状支持体の回りに、管の形態で止まるであろう。こうしてつくられた管状組織を培養条件において延長した時間の間保持し、種々の培養条件に暴露して、その進行する成長に影響を及ぼすことができる（アスコルビン酸、血清、有糸分裂誘発因子など）。
成熟期間の終わりにおいて、管状組織を管状支持体から滑らせて取り出して、いっそう複雑な組織培養系の構築のための基本的骨組みを得ることができる。例えば、内皮細胞を平滑筋細胞から作製された管状組織の内側表面上に接種し、これにより基本的血管構築物または人工血管を生成することができる。このような人工管状組織は、移植レシピエントの細胞から作られ、こうして人工器官の免疫学的拒絶反応を回避できるので、組織の移植において有用である。さらに、管状組織は同様に生成されたシート中に巻取って、二層の管状ライニング組織構築物を得ることができる。第二層を形成する細胞は、第一層の細胞と特質を同一にして、より厚い組織を得るか、または異なる由来の細胞であって（例えば、繊維芽細胞）、例えば、細胞−細胞の相互作用を研究するために、２つの細胞型の生きている器官の同等物をつくることができる。
平滑筋細胞の構築を研究するために、平滑筋細胞から作製された管状組織をその支持体から滑らせて取り出し、所望の幅の環状切片に切断する。また、管状組織を支持体から滑らせて取り出す前に、環状切片を切断することができる。器官培養浴の中に入れている間、このような環状切片を等尺力トランスデューサーに取付け、基礎張力に暴露する。血管作用物質を浴の中に注入し、トランスデューサーの出力を通して収縮応答を記録することによって、刺激を実施することができる。この技術はよく確立されており、そして本発明は収縮性組織として通常使用される動物血管についての代替物であることができる。
実施例１ 収縮性平滑筋細胞のシートの製造
下記の実施例において、本発明により平滑筋細胞から作製された収縮性管状組織を調製する一つの方法を説明する。下記実施例は本発明の範囲を一つの特定の形状、細胞の由来または年令、時間フレーム、成分の濃度または培養条件に限定するものではない。当業者であれば本発明の範囲および精神から逸脱せず種々の変更をこの方法に対して行うことが可能であることを、容易に理解するであろう。
典型的には、750,000の生存能力を有する継代培養されたヒト平滑筋細胞（継代３〜７）を、標準的75cm2培養皿の中に、104細胞/cm2の最終の接種密度に接種する。細胞に20mlの培地（ダルベッコ改変イーグル培地と、ハムF12改変培地、10％胎児クローンII（Hycloneから）、100U/mlのペニシリンＧおよび25μg/mlのゲンタマイシンとの3:1混合物）を与える。培地を毎日交換する。新しく調製したアスコルビン酸溶液を、毎日培地に100μg/mlの最終濃度で添加する。細胞を加湿した雰囲気（92％空気および８％CO2）中に保持する。
前述の培養条件下に、細胞は培養表面に付着し、培養表面全体が細胞で覆われる（コンフルエンス）まで、増殖する。培養条件が維持される場合、細胞は細胞の多層および内因性繊維物質として成長するであろう。培養をさらに数日間延長する場合、この繊維組織は培養下層から分離する徴候を示し、そして、全体として、下層から自発的に完全にそれ自体分離するであろう。アスコルビン酸を省略すると、分離前の培養期間はより長くなり、凝着した単一のシートは生成せず、むしろ凝集した細胞の多数の不規則の塊が生成するであろう。自発的組織の分離の完全なプロセスは、速く経過する、急激なプロセスであり、15分程度に短い時間で完結することができる。生きている組織から得られた自由浮遊シートは、製作の次の段階まで、広げられた状態で保持されなくてはならない。なぜなら、シートは容易にかつ不可逆的に膠着するからである。また、例えば、分離の時間をコントロールするために、形成するシートの分離を誘発することが可能である。一つの可能性は、分離の徴候が明らかとなったとき、ゴムのポリスマンを使用してシートを培養表面から分離することである。しかしながら、この方法はシートの中に孔を発生することがあるので、非常に注意して実施しなくてはならない。
このシートはその平らな形態で多数の応用において使用できるが、管状の形態はいくつかの他の応用を促進するであろう。特に、管状の形態は血管の生理学および薬理学に関する実験に価値がある。組織のシートを円筒形するために、発明者らは第1A図〜第Ｊ図に略図的に示す管状支持体を設計した。第1A図を参照すると、管状支持体（２）は管状支持体の外表面に縦方向にセットすることができる糸（４）を有する。糸が管状支持体の表面に対して密接に横たえられることを保証するために、管状支持体の両端に外側に位置する二つの弾性リング（３）により、張力が与えられる。典型的には、ポリプロピレンの糸をシリコーンエラストマーのリングの下にストップノッチ（５）により固定するが、糸の他方の端を管の他方の端におけるシリコーンリング（３）の下に滑り込ませる。
生きているシートを巻取るために、シート（１）の一つのへりを管状支持体と糸との間に配置する。次いで糸（４）を矢印（６）に沿って引いて、第1A図に示すように、糸と管状支持体の外表面との間においてシートの一つのへりを絞る（７）。第1C図に示すようにすべてのへりを固定することが重要であるが、最小量のシートが糸を越えて横切るようにすべきである。生きているシートを巻取る間、第1E図に示すようにシートを種々の程度に伸長させるために、限らされた力をシートのもっと遠いへりに加えることができる。シートを機械的に分離する場合、シートの端の一つを培養表面に取り付けたまま残して、生きているシートを巻取るとき、このような伸長力を提供することは有効である。シートが完全に巻取られたとき、第1G図に示すように、糸を矢印の方向に引くことによって滑らせて取り出す。次いで、第1I図に示すように、シートを糸で再固定して、巻出し防止する。次いで、管状の生きている組織を数週間アスコルビン酸とともに培養して、組織をさらに成熟させることができる。糸を１〜２日後に除去することができる。
管状支持体は種々の材料から作ることができる。管状支持体を、通常、スチレンのような不活性材料から作って、成熟期間の終わりにおける組織の取り出しを促進する。しかしながら、管状支持体は、また、ステンレス鋼、コラーゲン、ポリテトラフルオロエチレンまたは生物学的に活性なまたは生物分解性の材料から作ることができる。容易にクリーニングおよび滅菌することができる材料から作られた管を使用することは好ましい。管の外径は生成された管状の生きている組織の管腔の最終直径（２〜8mm）を確立するであろう。糸は各使用後容易に置換することができる。プラスチック型の糸は、それを各使用後クリーニングする場合、使用することができる。
前述の培養条件において３〜４週後、血管中膜と同等である管状組織をその管状支持体から滑らせて取り出し、２〜5mmの環状切片に切断する。これらの環状切片は、平滑筋の収縮をインビトロで試験するために使用することができる。本発明に従い調製された環状切片を、２つの生理学的血管作用物質、すなわち、セロトニンおよびヒスタミンを使用して試験した。第2A図および第2B図は、セロトニン（第2A図）およびヒスタミン（第2B図）の濃度を変化させて刺激したときにおける、環状切片の収縮の応答を示す。第2A図において、点（１）、（２）、（３）、および（４）は、それぞれ、30ng/ml、100ng/ml、300ng/mlおよび1000ng/mlのセロトニンを使用する刺激を表す。第2B図において、点（１）、（２）、および（３）は、それぞれ、10-5M、３×10-5M、および10-4Mのヒスタミンを使用する刺激を表す。これらの結果はヒトまたは動物の血管を使用して得られた結果に匹敵し、したがって、本発明に従い調製された組織同等物は生きている組織の有用なモデルであることが証明される。
組織および細胞の培養分野における当業者は、特定の成分または技術の代わりに、同一の一般的効果を生成する同様な成分または技術を使用することによって、具体的応用のために使用することができる、等価の構造物を、細胞培養の実験室において入手可能な材料のみを使用して、構築することができるであろう。このような等価物は、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
0003625836.tif 000011
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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