(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させて生成するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ減少量に基づいてＧＰＴを測定するＧＰＴ測定用キットであって、
１）  液状の形態にある第一試薬と第二試薬からなる液状２試薬系キットであり、
２）  第一試薬が、ピリドキサールリン酸、ＬＤＨおよびＮＡＤＨを必須成分として含み、かつｐＨが８．５から９．０であり、
３）  第二試薬が、Ｌ−アラニンおよびα−ケトグルタル酸を必須成分として含み、かつＧＰＴを測定するために第一試薬と混合した時に、ｐＨが７から８となるようなｐＨである、
ＧＰＴ測定用キット。
【請求項２】
第二試薬が、ＧＰＴを測定するために第一試薬と混合した時にｐＨが７．３となるようなｐＨである請求項１のＧＰＴ測定用キット。
【請求項３】
ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させて生成するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ減少量に基づいてＧＰＴを測定するＧＰＴ測定用キットの安定化方法であって、
液状の形態にある第一試薬と第二試薬からなる液状２試薬系キットであって、第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサールリン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ＬＤＨおよびＮＡＤＨを必須成分を含み、一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサール酸が含み、他方の試薬がピリドキサールリン酸を含まずＬ−アラニンを含むように、液状２試薬系キットを調製する、
ことを特徴とするＧＰＴ測定用キットの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下、ＧＰＴと略す）測定用試薬に関する。より詳細には、長期間に亘って安定に保存することが出来るＧＰＴ測定用の改良されたキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＧＰＴは、日常臨床検査で種々の臓器の細胞障害、なかでも心、肝疾患を検出するための鋭敏な検査法として重要な項目となっており、古くから用いられている。
ＧＰＴの測定法としては、分析機器の性能の向上に従い、ＵＶ法といわれる方法が広く使用されている。このＵＶ法は、ＧＰＴの基質であるＬ−アラニンとα−ケトグルタル酸に、ＧＰＴを作用させて生成されるピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略す）の共存下に乳酸脱水素酵素（以下、ＬＤＨと略す）を作用させて乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨの減少量を波長３４０ｎｍ付近で測定することによりＧＰＴを測定する方法である。
【０００３】
この測定法を反応式で表すと以下の通りである。
【化１】
0003674450.tif 000002
【０００４】
広くＧＰＴが測定されるようになると、測定者間で測定値が異なり、その測定値の互換性がないため患者データの比較ができず、診断に支障をきたす恐れがあるといった問題が発生し始めた。そこで各国において、試薬濃度などが規定された勧告法と呼ばれる測定方法が提唱されるようになった。国際的には、国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）が、標準測定法として、ピリドキサールリン酸の存在下にＬ−アラニンとα−ケトグルタル酸にＧＰＴを作用させるＩＦＣＣ勧告法（IFCC Scientific Committee：Expert panel on Enzymes, IFCC method for alanine aminotransferase, Clinica Chemica Acta, 105, 147F-157F (1980)）を提示し、また日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）も1989年に、ピリドキサールリン酸を用いないでＧＰＴを測定するＪＳＣＣ勧告法を公表した（日本臨床化学会：ヒト血清中酵素活性測定の勧告法−アラニンアミノトランスフェラーゼ−（1989−08−30）, 臨床化学, 18(4), 250-262 (1989)）。
【０００５】
以下に、ＩＦＣＣ勧告法とＪＳＣＣ勧告法とを比較して示す。
【０００６】
【表１】
0003674450.tif 000003
【０００７】
ＩＦＣＣ勧告法に用いられるピリドキサールリン酸は、ビタミンＢ６リン酸エステル化合物の一つであり、熱、光に不安定とされている。生体内では、アミノ酸代謝にあずかる酵素（ＧＰＴなど）のリシンのε−アミノ基とシッフ塩基を形成し結合して、補酵素として働くもっとも重要な化合物である。ＧＰＴは補酵素と結合した状態で酵素として働くが、何らかの原因で補酵素の外れ去ったものをアポ型ＧＰＴという。一方、補酵素の結合しているものはホロ型ＧＰＴという。従って、ピリドキサールリン酸を試薬に添加することにより、アポ型ＧＰＴが活性化されるため、ホロ型ＧＰＴと合わせて測定することができる。したがって、ＩＦＣＣ勧告法ではアポ型、ホロ型ＧＰＴを共に測定することができるが、ＪＳＣＣ勧告法では、ピリドキサールリン酸を添加しないため、ホロ型ＧＰＴを主に測定している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
近年、臨床検査薬を液状化する技術が発展し、長期間安定性を有する液状試薬を提供できるようになってきている。これに対して、ピリドキサールリン酸の存在下で、ＧＰＴを測定する試薬では、ピリドキサールリン酸が不安定であるため、液状化を達成できていない。例えば、ピリドキサールリン酸を錠剤として添付し使用前に試薬で溶解するキットや、凍結乾燥品とした試薬などが現在用いられている。ＩＦＣＣ勧告法では、ピリドキサールリン酸水溶液を２週間ごとに調製することになっている。また、溶液状態ではピリドキサールリン酸特有の黄色に呈色しているが、安定性の劣化と共に無色となってしまう。このように、ＧＰＴ測定系で使用するピリドキサールリン酸は、現状では溶液状態で長期間安定化させるのが困難であり、溶解後数日程度しか安定性を有していない。
本発明者らは、こうした従来の問題点を解消すべく種々鋭意検討した結果、液状試薬としての充分な保存安定性を有するＧＰＴ測定試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＧＰＴ測定用試薬の試薬組成を種々検討した結果、使用する酵素や基質のうち、Ｌ−アラニンとピリドキサールリン酸を共存させておいた場合に、保存中にピリドキサールリン酸特有の黄色の呈色が失われ、測定値も低下するといった安定性の低下が起こることを見出した。特に、２試薬系で構成する場合には、一方の試薬は、Ｌ−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬は、ピリドキサールリン酸を含まず、Ｌ−アラニンを含有する、２試薬系のキットとすることで、安定な液状ＧＰＴ測定試薬を供給することが可能となった。
従って、本発明は、ピリドキサールリン酸の存在下、Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を作用させて生成するピルビン酸を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の共存下で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の作用により乳酸に変換し、このときのＮＡＤＨ減少量に基づいてＧＰＴを測定するＧＰＴ測定用キットであって、
１）第一試薬と第二試薬からなる２試薬系のキットであり；
２）第一試薬と第二試薬のいずれかに、ピリドキサールリン酸、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ＬＤＨ及びＮＡＤＨが必須成分として含有され；
３）一方の試薬が、Ｌ−アラニンを含まずピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬がピリドキサールリン酸を含まずＬ−アラニンを含有する、
ＧＰＴ測定用キットである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のＧＰＴ測定用キットは、一方の試薬は、Ｌ−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有し、他方の試薬は、ピリドキサールリン酸を含まず、Ｌ−アラニンを含有する、２つの試薬から構成される２試薬系の測定用キットである。
本発明のＧＰＴ測定用キットは、凍結乾燥品の形態であってもよいが、液状の形態にした場合であっても、長期間安定であり、ピリドキサールリン酸特有の黄色も長期間維持される。
【００１１】
一般的に、第一試薬として、ピリドキサールリン酸と共に、ＬＤＨ及びＮＡＰＤＨを必須成分として含有する試薬を調製し、第二試薬として、Ｌ−アラニンとα−ケトグルタル酸を必須成分として含有する試薬を調製してキットとするのが好ましい。第一試薬に含有させるＬＤＨとその補酵素であるＮＡＤＨは、ＧＰＴの測定誤差の原因となる検体中のピルビン酸を消去できる利点がある。
【００１２】
Ｌ−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有する第一試薬のｐＨは、ｐＨ７〜１０に調整するのが好ましい。そして、第二試薬のｐＨおよび緩衝液濃度を適当に調節し、第一試薬と混合してＧＰＴの測定の際に、ＧＰＴ反応時のｐＨが７〜８、好ましくは７．３付近となるように設定するのが好ましい。このようにｐＨを調整した第一試薬と第二試薬を調製することにより、各試薬中の構成成分を長期間安定に保存することができる。
【００１３】
第一試薬の緩衝液は、ｐＨを前記の範囲内にすることができれば、従来公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、ＩＦＣＣ及びＪＳＣＣ勧告法に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンやｐＨ７〜１０に緩衝能を持つ緩衝液であれば何ら問題なく使用することができる。また、複数の緩衝液を組み合わせて第一試薬のｐＨをｐＨ７〜１０に設定することもできる。第一試薬のｐＨは、前記したようにｐＨ７〜１０、ＮＡＤＨの安定性を鑑み、ｐＨ８．５〜９．０が特に好ましい。
【００１４】
第二試薬の緩衝液は、ＧＰＴ反応時のｐＨを前記範囲内にすることができる公知の緩衝液を適宜選択して使用することができる。具体的には、第一試薬と同様にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどが使用できる。また、緩衝液のｐＨは特に規定されないが、第一試薬と混合した際にｐＨ７〜８付近となるようにｐＨおよび緩衝液濃度を設定するのが好ましい。
【００１５】
第一試薬中のピリドキサールリン酸の添加量は、通常０．０１〜１ｍＭ、好ましくは０．１〜０．３ｍＭである。また、ＮＡＤＨは通常０．０５〜５ｍＭ、好ましくは、０．１〜１ｍＭである。本発明に用いられるＬＤＨとしては、その由来は特に限定されない。ＬＤＨの添加量としては、通常１０００Ｕ以上を適宜選択して使用すればよい。
第二試薬に用いるＬ−アラニンの添加量は、通常１０〜２０００ｍＭ、好ましくは、５００〜１５００ｍＭである。また、α−ケトグルタル酸の添加濃度は、通常１〜２００ｍＭ、好ましくは、１０〜５０ｍＭである。
これらの試薬の添加量は、第一試薬と第二試薬の混合比によって変動するため、上記範囲外であってもよい。
【００１６】
第一試薬および第二試薬には、上記の成分の他に、必要により、一般的に添加される成分である、ＥＤＴＡ等のキレート化剤やアジ化ナトリウムなどの防腐剤、各種界面活性化剤等を適宜添加することができる。
【００１７】
このように構成されたＧＰＴ測定用キットを用いて検体中のＧＰＴを測定することによって、検体中のＧＰＴはピリドキサールリン酸の作用でアポ型ＧＰＴがホロ型ＧＰＴへと活性化される。そして、検体中に存在しているホロ型ＧＰＴに、ＧＰＴの基質であるＬ−アラニンとα−ケトグルタル酸を作用させると、グルタミン酸とピルビン酸が生成される。ピルビン酸は、共役酵素であるＬＤＨにより、ＮＡＤＨを酸化して乳酸とＮＡＤになる。この反応で酸化されるＮＡＤＨの減少量を波長３４０ｎｍ付近の吸光度で測定することで、ＧＰＴ活性を求めることができる。
【００１８】
【実施例】
以下に、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ピリドキサールリン酸のＬ−アラニンに対する安定性
ピリドキサールリン酸のＬ−アラニンに対する安定性を検証した。
３６．６ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．７０）にピリドキサールリン酸を０．１２５ｍＭ添加し、さらにＬＤＨ、β−ＮＡＤＨ、界面活性剤を添加した試薬に、Ｌ−アラニンを２００ｍＭ又は４００ｍＭ添加後、ｐＨを４Ｎ−ＮａＯＨにてｐＨ８．７０に再調整した第一試薬と、対照としてＬ−アラニンを添加しない第一試薬を調製した。
第二試薬は、３６６ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ４．００）に、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸及び界面活性剤を添加し、２Ｎ−ＨＣｌにてｐＨを調整した。試薬組成は下記に記した。
【００１９】
第一試薬組成
トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン      ３６．６ｍＭ  ｐＨ８．７０
β−ＮＡＤＨ                                  ０．０２ｍＭ
ＬＤＨ                                        ２５６７Ｕ／Ｌ
界面活性剤                                    ０．０１％
ピリドキサールリン酸                          ０．１２５ｍＭ
Ｌ−アラニン                                  ０、２００又は４００ｍＭ
【００２０】
第二試薬組成
トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン      ３６６ｍＭ  ｐＨ４．００
α−ケトグルタル酸                            ７７ｍＭ
Ｌ−アラニン                                  １０００ｍＭ
界面活性剤                                    ０．０１％
【００２１】
ＧＰＴの活性は日立７１５０型自動分析装置を用い、試料として血清または生理食塩水１０μＬに対し第一試薬３００μＬ、第二試薬７５μＬを反応させ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析装置の機能で３０〜５０測光ポイント間（R2添加後１分後から５分後に相当）において吸光度変化率を追跡した。試料中のＧＰＴの活性値は下記式より算出した。
【００２２】
【式１】
ＧＰＴ活性値（ＩＵ／Ｌ）＝（ΔＥ／ｍｉｎ）／ε×（Ｖ／ｖ）×１０6
ΔＥ／ｍｉｎ：１分間あたりの吸光度変化率
ε：モル分子吸光係数（ＮＡＤＨの場合、６．２２×１０3Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）
Ｖ：全反応液量（試料＋第一試薬＋第二試薬）
ｖ：試料液量
【００２３】
ピリドキサールリン酸の安定性は、調製当日のコントロール血清の測定値を１００％として、第一試薬を４℃および３７℃保存し、測定値の変化率を算出した。結果を表２に示す。ピリドキサールリン酸の呈色の変化としても確認した。結果を表３に示す。
【００２４】
【表２】
0003674450.tif 000004
【００２５】
表２は、コントロール血清の測定値を調製当日と比較した相対活性として示した表である。表２に示されるように、３７℃保存では、Ｌ−アラニンを第一試薬に添加し、ピリドキサールリン酸と共存させておいた場合、コントロール血清の測定値が測定日ごとに低下していき、試薬の安定性が失われていることが分かる。しかし、Ｌ−アラニン無添加の試薬では３７℃保存においても、ほとんど測定値に変化は見られず試薬が安定性を保っていることがわかる。
【００２６】
【表３】
0003674450.tif 000005
【００２７】
表中の記号「＋＋」は黄色の呈色を示し、「＋」は淡黄色、「−」は無色を表す。表３からも同様に、濃度に関わらずＬ−アラニンが試薬中に存在する場合には、呈色が失われ無色となってしまい、ピリドキサールリン酸が変化してしまったものと推測できる。しかしながら、Ｌ−アラニンを含まない試薬では、呈色も維持し続けた。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、Ｌ−アラニンによって失われることは明らかであり、Ｌ−アラニンを含まず、ピリドキサールリン酸を含有する試薬が安定性において優れていることがわかる。
【００２８】
実施例２
ピリドキサールリン酸のｐＨに対する安定性
ピリドキサールリン酸のｐＨによる安定性の変化を検証した。
１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液にピリドキサールリン酸を０．２０５ｍＭ添加し、さらにＬＤＨ、β−ＮＡＤＨ、塩化ナトリウム、界面活性剤を添加した試薬のｐＨを４Ｎ−ＮａＯＨおよび２Ｎ−ＨＣｌにてｐＨ７〜１０に調整した第一試薬と、１０５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ４．２０）にＬ−アラニンおよびα−ケトグルタル酸、界面活性剤を添加し、２Ｎ−ＨＣｌにてｐＨを調整した第二試薬を調製した。試薬組成は下記に記した。
【００２９】
0003674450.tif 000006
【００３０】
第二試薬組成
トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタン      １０５ｍＭ  ｐＨ４．２
α−ケトグルタル酸                            ３０．７５ｍＭ
Ｌ−アラニン                                  １０２５ｍＭ
界面活性剤                                    ０．０１％
【００３１】
ＧＰＴの活性は日立７１５０型自動分析装置を用い、試料として血清または生理食塩水１０μＬに対し第一試薬２００μＬ、第二試薬２００μＬを反応させ、主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍとし、該分析装置の機能で３０〜５０測光ポイント間（R2添加後１分後から５分後に相当）において吸光度変化率を追跡した。ＧＰＴ活性値は、実施例１と同様に求めた。
【００３２】
実施例１と同様に、ピリドキサールリン酸の安定性は、保存当日のコントロール血清の測定値を１００％として、第一試薬を３７℃保存し、測定値の変化率を算出した。結果を表４に示す。また、ピリドキサールリン酸の呈色の変化としても確認した。結果を表５に示す。
【００３３】
【表４】
0003674450.tif 000007
【００３４】
表４は、コントロール血清の測定値を調製当日と比較した相対活性として示した表である。表４に示されるように、ｐＨ７〜１０、特にｐＨ７〜９ではコントロール血清の測定値も変わらず、安定であることが示される。
【００３５】
【表５】
0003674450.tif 000008
【００３６】
表中の記号「＋＋」は黄色の呈色を示し、「＋」は淡黄色、「−」は無色を表す。ｐＨ７〜１０、特にｐＨ７〜９とした第一試薬では、呈色は維持し続けた。即ち、ピリドキサールリン酸の安定性が、特にｐＨ７〜９において保持されることがわかる。
【００３７】
【発明の効果】
以上の実施例にも示した通り、本発明の試薬は自動分析装置への適用に即し、しかも液状試薬として供することが可能となり、操作性および安定性が格段に向上したものである。すなわち、本発明の方法により、従来不可能であった液状でのピリドキサールリン酸の安定性を図ることが可能となり、長期間にわたって使用可能な試薬を供給できるようになった。