(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の塩基配列で構成された、カスパーゼ-3に対するアンチセンスヌクレオチドを有効成分として含む、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進する、組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性増進剤。
【請求項２】
カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させる発現ベクターASCASP3-200(寄託番号:KCTC10038BP)を有効成分として含む、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進する、組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性増進剤。
【請求項３】
配列番号1の塩基配列で構成されたアンチセンスヌクレオチドまたは発現ベクターASCASP3-200(寄託番号:KCTC10038BP)を組換え細胞に導入して、カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させ、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、カスパーゼ-3に対するアンチセンスヌクレオチドまたはその発現ベクターを有効成分として含む、組換えCHO(chinese hamster ovary)細胞の標的蛋白質の生産性増進剤および組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進させる方法に関するものである。より詳細には、配列番号1の塩基配列で構成された、カスパーゼ-3に対するアンチセンスヌクレオチドまたはカスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させる発現ベクターを有効成分として含む、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進する、組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性増進剤及び上記アンチセンスヌクレオチドまたは上記発現ベクターを組換え細胞に導入して、カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させ、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進させる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
CHO(chinese hamster ovary)細胞株は、現在組換え抗体を始めとするヒトインターフェロン-ガンマ(interferon-gamma, Goldman等、1997, Cytotechnology, 23, 103-111)、第 8 因子(factor VIII, Ganne and Mignot, 1991, Cytotechnology, 6, 233-40)トロンボポイエチン(thrombopoietin, Kim等、2000, Biotechnol Prog, 16, 775-781)等の目的蛋白質を生産するのに最も多く利用されている。組換えCHO細胞を使用して目的蛋白質を生産する時には、単位時間当り生きている細胞からどれくらい多くの量の蛋白質が生産されるかを表示する比生産速度が重要であるが、このような比生産速度を増加させるために外来遺伝子の転写速度を増加させることによって蛋白質の生産性を増加させられると知られている酪酸ナトリウム(NaBu, sodium butyrate, Palermo等、1991, J Biotechnol, 19, 35-47)を使用している。
【０００３】
しかし、NaBuは、細胞の転写速度を増加させることによって比生産速度を増加させられるが、同時にそれ自体の細胞毒性によってアポトーシス(apoptosis)を誘導する為に実際的に高い濃度のNaBuを使用するのには問題がある。したがって、このようなNaBuによって誘導されるアポトーシスを抑制する必要性が台頭してきており、既存の方法としては、アポトーシスを効果的に抑制できると知られているBcl-2 蛋白質のような細胞死滅抑制蛋白質を組換えCHO細胞から過発現させることによって細胞死滅を抑制する実験が試みられたことがある(Tey 等, 2000, Biotechnol. Bioeng., 68, 31-43)。
【０００４】
実際に本発明者等は Bcl-2をヒト化された抗体を生産する組換えCHO細胞で過発現させ、細胞死滅を効果的に抑制させることによって最終抗体濃度を増加させることに成功したことがある(Kim and Lee, 2001, Biotechnol. bioeng., 71, 184-193)。
しかし、Bcl-2のような細胞死滅抑制蛋白質は、細胞死滅を抑制することによって細胞から癌を誘発させられる腫瘍誘発(oncogenic)効果があると明らかにされているため実験室水準では、組換え細胞を利用して外来目的蛋白質の発現量を増加させられるとしても、商業的に診断用蛋白質ではなく人体内に注入することになる治療用蛋白質を生産する側面においては、精製過程でBcl-2の完璧な除去が立証されなければならない難しさがある。したがって、Bcl-2のような細胞死滅抑制蛋白質ではない、異なるアポトーシス阻害剤の開発が求められている。
【０００５】
アポトーシスは、特定アミノ酸の配列に特異的に反応するカスパーゼ(caspase)という一種の蛋白質分解酵素の順次的な活性化によって起こるようになる。現在動物細胞から発見された10種類のカスパーゼ中でカスパーゼ-3はカスパーゼ活性化の最後の段階で作用する酵素(effector caspase;以後「エフェクターカスパーゼ」とする)として知られている。アポトーシスを誘導する細胞毒性を持つ物質は、その種類によって多様な経路でアポトーシスを進行させる。このような多様な経路のアポトーシスは、最終的にカスパーゼ-3のようなエフェクターカスパーゼ(effector caspase)の活性化を誘導するため、結果的に多様な形態のアポトーシス信号が一二種類のカスパーゼ酵素の活性化に集められるのである。
【０００６】
またカスパーゼ-3の細胞内基質は、その他のエフェクターカスパーゼより多いと知られている。したがって、カスパーゼ-3に対するアンチセンス(antisense)RNA発現を誘導することによりアポトーシスを抑制できる。アンチセンスRNAはペプチドを暗号化(encoding)することになるセンス(sense)mRNAの塩基配列に特異的に結合してリボソームによってmRNA 情報がペプチドに転換される翻訳段階を抑制したり、アンチセンス-センス(antisense-sense)RNA二重螺旋構造に特異的なRNaseによってmRNAが分解され目的蛋白質の発現を抑制するようになる。したがって、このようなアンチセンスRNA技術を利用したカスパーゼ-3蛋白質の発現抑制は、Bcl-2のような細胞死滅抑制蛋白質の過発現システムで誘発される問題を解決することができ、求める特定遺伝子の発現だけを抑制させられるという長所がある。
【０００７】
それで、本発明者達は、B型肝炎ウイルスのS表面抗原に特異的なヒト化された抗体を生産する組換えCHO細胞に、カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAの転写を誘導できる発現ベクターを導入した場合、NaBuによるアポトーシスが抑制されることを確認することによって本発明を完成した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の必要性によって案出されたものである。アポトーシスに関与するカスパーゼ-3の発現を効果的に抑制させCHO細胞のアポトーシスを効果的に防止できるアンチセンスヌクレオチド、またはこれの発現ベクターを有効成分として含む、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進する、組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性増進剤、及び上記細胞が生産する目的蛋白質の質を向上させられる標的蛋白質の生産性を増進させる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明は配列番号1の塩基配列で構成された、カスパーゼ-3に対するアンチセンスヌクレオチドまたはカスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させる発現ベクターを有効成分として含む、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進する、組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性増進剤及び上記アンチセンスヌクレオチドまたは上記発現ベクターを組換え細胞に導入して、カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させ、NaBuにより誘導されるアポトーシスを抑制することにより組換えCHO細胞の標的蛋白質の生産性を増進させる方法を提供する。
本発明のカスパーゼ-3の発現を抑制するために使用する、配列番号1の塩基配列で構成されたカスパーゼ-3に対するアンチセンスヌクレオチドを含む発現ベクター(ASCASP3-200)は、次の方式によって製造される。cDNAプール(pool)をCHO細胞からRT-PCR技法を利用して得る。カスパーゼ-3のcDNA断片はcDNAプールとカスパーゼ-3遺伝子の開始コドン(start codon)と終止コドン(stop codon)を含む二個のプライマー(casp3L及びcasp3R)を使用してPCR技法によって増幅した。
【００１０】
使用された二個のプライマー塩基配列は、CHO細胞と塩基配列において類似性があるものと推定され公知のヒトジュルケットT-リンパ球(Jurkat T-lymphocyte)のカスパーゼ-3塩基配列を使用した(Fernandes-Alnemri等, 1994, J. Biol. Chem., 269, 30761-30764)。全体長さのカスパーゼ-3のcDNA断片をpBluescriptII SK(-)クローニングベクター(Stratagene)に存在する多重クローニング部位(multicloning site)に挿入した後、カスパーゼ-3の5'側約200bpを含む部分的なcDNA断片は、終止コドンと 5'開始コドンから約200bp離れたカスパーゼ-3 cDNAの内側部位を含む二個のプライマーを使用して増幅した。増幅されたカスパーゼ-3の部分的なcDNA断片をpcDNA3.1-zeo(+)(InVitrogen)に存在する多重クローニング部位の間に逆方向に挿入することによって最終的にASCASP3-200を製造した。
【００１１】
本発明者達は、上記発現ベクターASCASP3-200を2001年8月13日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号: KCTC 10038BP)。
最後に本発明のアポトーシスの抑制方法をより詳細に説明する。
アポトーシスは、特定アミノ酸の配列に特異的に反応するカスパーゼという一種の蛋白質分解酵素の順次的な活性化によって起こるようになる。現在動物細胞から発見された10余種類のカスパーゼ中でカスパーゼ-3はカスパーゼ活性化の最後の段階で作用する酵素(effector caspase;以後「エフェクターカスパーゼ」とする)として知られている。アポトーシスを誘導する細胞毒性を持つ物質は、その種類によって多様な経路でアポトーシスを進行させるようになる。このような多様な経路のアポトーシスは、最終的にカスパーゼ-3のようなエフェクターカスパーゼの活性化を誘導するために結果的に多様な形態のアポトーシス信号が一二種類のカスパーゼ酵素の活性化に集められるのである。
【００１２】
また、カスパーゼ-3の細胞内基質は、その他のエフェクターカスパーゼより多いと知られているため、本発明では、カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNA発現を誘導した。
本発明で詳述したように製造されたカスパーゼ-3に対する5'側アンチセンスヌクレオチドを含む発現ベクターをCHO細胞に導入して発現させるとカスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAが発現され、カスパーゼ-3を暗号化するセンスRNAの相補的な塩基配列に特異的に結合してリボソームによってmRNA情報がカスパーゼ-3に転換される翻訳段階を抑制したり、アンチセンス-センス RNA二重螺旋構造に特異的なRNaseによってmRNAが分解されカスパーゼ-3の発現を抑制することによって結局はアポトーシスを防止できるようになる。
【００１３】
本発明の好ましい実施例には、B型肝炎ウイルスのS表面抗原に特異的なヒト化された抗体を生産する組換えCHO細胞を使用した。上記細胞にカスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAの転写を誘導できる発現ベクターを導入してNaBuによるCHO細胞のアポトーシスを防止した。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例をもとに説明する。但、以下の実施例は本発明を例示する為だけのものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
<実施例 1> カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現する発現ベクター (ASCASP3-200)の製造
本発明者達は、下記の過程を通してカスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現する発現ベクターのASCASP3-200を製造した。
【００１５】
具体的に、CHO細胞のcDNA プール(pool)は、CHO細胞(DUKX-B11, ATCC CRL-9096)からMarrathonTM cDNA 増幅キット(Clontech)を利用して得た。全体長さのカスパーゼ-3のcDNA断片は cDNAを鋳型(template)にして二個のプライマー、すなわちcasp3L(配列番号2)及びcasp3R(配列番号3)を使用してPCR(Perkin Elmer)で増幅した。
使用した二個のプライマー塩基配列は、CHO細胞と塩基配列において類似性があるものと推定され公知のヒトジュルケットT-リンパ球のカスパーゼ-3 塩基配列を使用した(Fernandes-Alnemri等, 1994, J. Biol. Chem., 269, 30761-30764)。
【００１６】
casp3Lプライマーには、XbaI制限酵素切断部位と5'開始コドンが、casp3R プライマーには、BamHI制限酵素切断部位と3'終止コドンが入っている。
全体長さのカスパーゼ-3のcDNA 断片をpBluescriptII SK(-)クローニングベクター(Stratagene)に存在する多重クローニング部位のXbaIとBamHIの間に挿入した後、自動化されたDNAシークエンサー(ABI prism model 377, Perkin-Elmer)を使用して挿入された全体長さのカスパーゼ-3 cDNA 塩基配列を確認した。
カスパーゼ-3の5'側約200bpを含む部分的なcDNA断片は二個のプライマー、つまりcasp3Lとcasp3R200(配列番号4)を使用してPCRで増幅した。
【００１７】
casp3R200プライマーには、EcoRI制限酵素切断部位と5'開始コドンから約200bp離れたカスパーゼ-3 cDNAの内側部位を含んでいる。
また、本発明者らは、3'側約200bpを含む部分的なcDNA断片を配列番号５で記載されるcasp3L200及びcasp3Rプライマーを使用してPCRで増幅した。
増幅されたカスパーゼ-3の5'側部分的なcDNA断片をpcDNA3.1-zeo(+)  (InVitrogen)に存在する多重クローニング部位のXbaIとEcoRIの間にCMVプロモーターから誘導される転写方向と逆方向に挿入して最終的にASCASP3-200を製造した。
また、3'側部分的なcDNA断片をpcDNA3.1-zeo(+)ベクターに挿入して最終的にASCASP3-200Rを製造した。
【００１８】
本発明者達は、上記発現ベクターASCASP3-200を2001年8月13日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した(寄託番号: KCTC 10038BP)。
<実験例 1> アポトーシスの抑制
<1-1> カスパーゼ-3の発現が抑制されたCHO細胞の選別
本発明者達は、ジヒドロホレイト リダクターゼ(dhfr, dihydrofolate reductase)陰性のCHO細胞(DUKX-B11, ATCC CRL 9096)を1%ヒポキサンチン/チミジン(hypoxanthine/thymidine, Gibco)と10%(V/V) FBS(fetal bovine serum, Gibco)が含まれた5mlのDMEM/F12 培地(Gibco)を入れた60ｍｍ培養皿で1x105 細胞/mlの濃度で24時間の間培養した後、ヒト化抗体発現ベクター(pKC-dhfr-HC-huS, 図1)をリポソーム(liposome)を利用して導入した。
【００１９】
ベクターを導入した後、正確に48時間経過後、550μg/mlのG418 抗生剤(Gibco)と10%(V/V)の透析されたFBS(dFBS)を含んだMEM-アルファ培地で抗生剤に抵抗性を持った細胞を2〜3週掛けて選別した。
選別された細胞にMTX(Sigma)を20、80及び320nMの濃度で処理して比抗体生産性の増加を誘導した後、320nM処理群で最も高い値の比抗体生産性を持った細胞株を確保して「SH2-0.32」と命名した。
SH2-0.32細胞にCHO細胞のカスパーゼ-3酵素に対する5'側アンチセンスRNAを転写する発現ベクター(ASCASP3-200, 図2)をリポソームを使用して導入した。
【００２０】
500μg/mlのゼオシン(zeocin, InVitrogen)抗生剤が入っている培養培地に抗生剤に抵抗性を持った細胞を選別してウエスタンブロットを通してカスパーゼ-3の発現が抑制された組換えCHO細胞を選別した。
その結果、カスパーゼ-3の発現が顕著に抑制された細胞株を選別してこれをASCASP3-200 B3(以下「B3」とする)と命名した。上記のB3細胞株を下記の実験に使用した(図3)。この時、アンチセンスRNAを転写するためのアンチセンスヌクレオチドが挿入されていない種々のベクターpcDNA3.1-zeo(+)をSH2-0.32に導入した細胞を対照群細胞に使用した。
【００２１】
また、3'側アンチセンスRNAが挿入されたベクターASCASP3-200RをSH2-0.32に導入した細胞を比較群に使用した。
<1-2> カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNA発現を通したアポトーシスの抑制本発明者達は、カスパーゼ-3に対するアンチセンスRNAを発現させることによってNaBuによって誘導されたアポトーシスが抑制されるかを確認した。
具体的に、上記<1-1>で収得した対照群細胞とB3細胞を320nMのMTXと5%dFBSが添加された5mlのMEM-アルファ培地が入っている6ウェル培養皿に4x104細胞/mlの濃度で72時間の間培養した後、最終濃度が0〜5mMのNaBuが添加された新しい培養培地に交換した。
【００２２】
一定の時間間隔を置いて、培養培地と培養皿に存在する細胞を取った後、トリパンブルー(trypan blue, Sigma)を使用して生きている細胞と死んだ細胞を区別して細胞生存率を求めELISA方法を利用して培養培地内の抗体濃度を決定した。
その結果、NaBuの濃度に比例して細胞成長が抑制されることを確認した。特に、アポトーシスを誘導する細胞毒性は、5mMの濃度で観察できた(図4のA及び図5のA)。
対照群の場合、5mMのNaBuを添加した後、24時間以後から急激に細胞生存率が低下し、約3日経過後には細胞生存率が50%以下に減少した(図4のB)。
【００２３】
B3細胞の場合は、NaBuによって細胞成長が鈍化される様子は対照群細胞におけるのと同様に現れたが、5mMのNaBuを添加した場合には、大きな差を示した。つまり、対照群の場合、5mMのNaBuを添加した場合、細胞生存率が24時間以後から急激に減少したけれど、B3細胞の場合には、そのような急激な細胞生存率の減少は観察されなかった(図5のB)。
また、比較群の場合にも、5mMのNaBuを添加した場合、細胞生存率が24時間以後から減少した (図６のB)。
このような結果は、カスパーゼ-3に対する5'側アンチセンスRNAによってカスパーゼ-3の発現が抑制されカスパーゼ-3の活性程度が対照群または、比較群より低いためである。
【００２４】
しかし、細胞生存率の増加によって生きている細胞数が増加したのに対照群または、比較群と比較して抗体生産性には大きな差がなかった(図4のC、図5のC及び図6のC)。
細胞生存率の増加にもかかわらず抗体生産性が増加しない理由は、NaBuによってミトコンドリア膜が破れてミトコンドリアの脱分極によって細胞の蛋白質生産代謝に必要なエネルギー(ATP)の合成が阻害されたためであると考えられる。
<実験例 2> 培養培地でのLDH活性度分析
目的蛋白質、特に人体内に注入される治療用蛋白質を生産する場合において、生産性に劣らず重要な要素は蛋白質の無欠性(integrity)問題である。
【００２５】
バッチ培養時蛋白質の無欠性に最も多くの影響を与える要因は、死んでいく細胞である。つまり細胞膜が壊れることによって細胞内に存在する多様な形態の加水分解酵素である。リソソームや小胞体、ゴルジ体に存在していた蛋白質分解酵素等や糖鎖化の構造を変化させられるグリコシダーゼ(glycosidase)等が培養培地に流れ出ることによって生成された蛋白質の構造を変化させ蛋白質の質を落とすようになる。
本発明者達は、このように細胞膜が壊れる現象の程度を調べるために間接的な方法として細胞内酵素であるLDHの培養培地内活性度を分析した。
【００２６】
その結果、B3細胞の場合、NaBuによるLDHの増加が対照群または、比較群と比較して確然に低下していることを確認した(図７)。したがって、5'側アンチセンスRNAを利用したカスパーゼ-3活性の抑制は、蛋白質生産性の増加よりも蛋白質の質を向上させるのにその効用性がある。
このような技術は、特に蛋白質分解酵素に相当に敏感に反応する目的蛋白質、例をあげるとヒトインターフェロン-ガンマ(interferon-gamma)、第8因子(factor VIII)、トロンボポイエチン(thrombopoietin)、エリスロポイエチン(erythropoietin)のような蛋白質を生産するのにとても有用に使用できる。
【００２７】
【発明の効果】
詳述したように本発明によると、アポトーシスに関与するカスパーゼ-3の活性を効果的に抑制させアポトーシスを防止でき、またアポトーシスを防止することによって上記細胞が生産する目的蛋白質の質(integrity)を向上させられる効果がある。
【００２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  B型肝炎ウイルスのS表面抗原に対するヒト化された抗体の軽鎖(light chain)と重鎖(heavy chain)をCHO(chinese hamster ovary)細胞内で同時に発現できるように考案された発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図２】  B型肝炎ウイルスのS表面抗原に対するヒト化された抗体を生産する組換えCHO細胞内でCHO細胞のカスパーゼ-3酵素に対するアンチセンスRNAを発現させられるように考案された発現ベクター ASCASP3-200の構造を示した模式図である。
【図３】Aは、対照群(control)細胞と発現ベクターASCASP3-200を導入して抗生剤に抵抗性を持った細胞を選別してウエスタンブロット(Western blotting)を行なってカスパーゼ-3の発現が抑制されたASCASP3-200 B3(以下「B3」と略称する)細胞を得る過程を示した電気泳動写真である。
B3: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されカスパーゼ-3の発現が抑制された細胞株である。
C1: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が見られない細胞株である。
E1: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が見られない細胞株である。
F5: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が弱い細胞株である。
H3: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が弱い細胞株である。
Bは、対照群(control)細胞と発現ベクターASCASP3-200を導入して抗生剤に抵抗性を持つ細胞を選別してウエスタンブロット(Western blotting)を行なってそのバンドの密度(intensity)を数値化することによってカスパーゼ-3の発現が抑制されたASCASP3-200 B3(以下「B3」と略称する)細胞を得る過程を示したグラフである。
B3: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されカスパーゼ-3の発現が抑制された細胞株である。
C1: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が見られない細胞株である。
E1: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が見られない細胞株である。
F5: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が弱い細胞株である。
H3: 発現ベクターASCASP3-200が挿入されたが、カスパーゼ-3の発現抑制が弱い細胞株である。
【図４】  対照群細胞に色々な濃度の酪酸ナトリウム(NaBu, sodium butyrate)を添加した状態でバッチ培養した時に現れる細胞成長、細胞生存率及び抗体の発現程度を示したグラフである。
【図５】  B3細胞に色々な濃度のNaBuを添加した状態でバッチ培養した時に現れる細胞成長、細胞生存率及び抗体の発現程度を示したグラフである。
【図６】  比較群細胞に色々な濃度のNaBuを添加した状態でバッチ培養した時に現れる細胞成長、細胞生存率及び抗体の発現程度を示したグラフである。
【図７】  対照群細胞とB3細胞を5mMのNaBuを添加した状態でバッチ培養した時に死んだ細胞の細胞膜が破れて細胞培養培地に流れ出たラクタートデヒドロゲナーゼ(LDH, lactate dehydrogenase)の酵素活性度の変化量を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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