(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース0.5％、Ｌ−ホモセリン0.02％、リン酸一カリウム0.3%、リン酸二ナトリウム0.6%、硫酸マグネシウム0.01%、塩化カルシウム20mg/lおよび寒天2%を含有し、pH7.2の寒天平板培地を用い、33℃で5日間培養したときに、該寒天平板培地上に1mm以上のコロニーを形成でき、かつＬ−イソロイシンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−イソロイシンを採取することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。
【請求項２】
エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
エシェリヒア・コリに属する微生物がエシェリヒア・コリ  Ｈ−９１４６（FERM BP-5055）株およびエシェリヒア・コリ  Ｈ−９１５６（FERM BP-5056）株から選ばれる微生物である請求項２記載の製造法。
【請求項４】
グルコース0.5％、Ｌ−ホモセリン0.02％、リン酸一カリウム0.3%、リン酸二ナトリウム0.6%、硫酸マグネシウム0.01%、塩化カルシウム20mg/lおよび寒天2%を含有し、pH7.2の寒天平板培地を用い、33℃で5日間培養したときに、該寒天平板培地上に1mm以上のコロニーを形成でき、かつＬ−イソロイシンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物。
【請求項５】
エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物である請求項４記載の微生物。
【請求項６】
エシェリヒア・コリに属する微生物がエシェリヒア・コリ  Ｈ−９１４６（FERM BP-5055）株およびエシェリヒア・コリ  Ｈ−９１５６（FERM BP-5056）株から選ばれる微生物である請求項５記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法に関する。Ｌ−イソロイシンはヒトおよび動物にとって栄養上重要な役割を有するアミノ酸であり、医薬品、食品および飼料添加物などに用いられている。
【０００２】
【従来の技術】
イソロイシンには４つの光学異性体が存在するため、化学合成あるいは酵素分割と組み合わせる方法ではＬ体のみを安価に製造するのは困難である。このためＬ−イソロイシンの工業的生産は主に発酵法によって行われている。発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法としては、例えばＤＬ−α−アミノ酪酸、α−ケト酪酸、あるいはスレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を発酵培地や菌体反応系に添加してＬ−イソロイシンに変換する前駆体添加法（特公昭３５−４５３４７、特公昭４３−８７０９、特公昭４６−２９７８９等）が知られている。  しかし、これらの方法は原料が高価で収率が低く工業的生産には有利な方法とは言えない。
【０００３】
一方、糖から直接Ｌ−イソロイシンを生成蓄積させる直接発酵法としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、セラチア属、アースロバクター属などの微生物の野生株から誘導した突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−イソロイシン生産性変異株としては、例えばアミノ酸や核酸の栄養要求性を有した菌株（特公昭３８−７０９１、特公平１−６０２３７）、アミノ酸のアナログやビタミン等の耐性変異を有した菌株（特公昭５１−２１０７７、特開昭５０−１０１５８２、特公平３−６２３９４、特公平３−６２３９５、特開平５−１３０８８２）、栄養要求性変異とアミノ酸のアナログ耐性変異を共有した菌株（特公昭５１−６２３７、特公昭５４−３２０７０）、フルオロピルビン酸感受性変異を有する菌株（特公平１−６０２３６）、Ｌ−アスパラギン酸を唯一の窒素源として利用して生育する能力が増強された菌株（特公平４−５６５９６）、あるいはアミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素に基質親和性が減少した変異を有する菌株（特開平４−３３０２７５）等が知られている。さらにイソロイシンまたはスレオニンの生合成に係わる遺伝子を含む組換え体ＤＮＡで形質転換された菌株（特開昭５８−８９３、特開昭６０−１２９９５、特開昭６０−３０６９３、特開昭６１−１９５６９５、特開平２−４５８、特開平２−４２９８８）も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
近年、Ｌ−イソロイシンの医薬、食品、飼料等への需要の増大によって、益々その製造法の改善が望まれている。従って、本発明の目的は、医薬品、食品および飼料添加物等として有用なＬ−イソロイシンの工業的に効率のよい製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、Ｌ−ホモセリンを唯一の窒素源とする培地で速やかに生育でき、かつＬ−イソロイシンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−イソロイシンを採取することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法を提供することができる。
【０００６】
エシェリヒア属に属する微生物は、Ｌ−ホモセリンを唯一の窒素源とする培地では生育できないか、極めて生育が不良である。これまで、該培地で速やかに生育できる能力を獲得したエシェリヒア属に属する微生物を用いたＬ−イソロイシンの製造法は知られていない。
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明の微生物として、Ｌ−ホモセリンを唯一の窒素源とする培地で速やかに生育でき、エシェリヒア属に属する微生物であればいずれも用いることができる。
本発明に用いることのできる微生物として、具体的には、最少培地の窒素源をＬ−ホモセリンに変更し、該Ｌ−ホモセリンを０．０１〜０．１％含有した組成を有する、Ｌ−ホモセリンを唯一の窒素源とする培地（以後、Ｌ−ホモセリン最少培地と呼ぶ。）に寒天を添加した寒天平板培地（以後、Ｌ−ホモセリン最少寒天平板培地と呼ぶ。）を用い、３０〜３５℃で３〜７日間培養したときに、該寒天平板培地上に０．６ｍｍ以上のコロニーを形成することのできる、エシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。このような微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ  Ｈ−９１４６およびエシェリヒア・コリ  Ｈ−９１５６をあげることができる。
【０００８】
本発明のＬ−イソロイシン生産菌は、Ｌ−ホモセリン最少寒天平板培地上で親株より速やかに生育する微生物の中から選択することができ、このような性質の微生物は通常の変異処理、あるいは細胞融合法、形質導入法、その他の遺伝子組換え技法によって得ることができる。さらに、該微生物は、Ｌ−イソロイシン生産性を向上させる他の性質（例えば、栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性等）を合わせ持っていても良い。
【０００９】
本発明の微生物によるＬ−イソロイシンの生産は、通常の細菌培養法にて実施可能である。使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸、グリセリン、エタノールなどのアルコールなどが用いられる。
【００１０】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの各種無機塩類、有機酸のアンモニウム塩、アミン類、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物などが用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどが用いられる。
【００１１】
培養は、振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件下にて行われ、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは２８〜３７℃の範囲である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸カルシウム、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、ｐＨ緩衝液などによって行う。通常１〜７日間の培養により、培養液中にＬ−イソロイシンが生成蓄積する。
【００１２】
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養液からＬ−イソロイシンを回収することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
【００１３】
【実施例】
実施例１  Ｌ−ホモセリン最少培地で速やかに生育できるＬ−イソロイシン生産変異株の取得
Ｌ−ホモセリン最少培地で速やかに生育できるＬ−イソロイシン生産変異株を２種類の親株より誘導した。すなわち、親株としてアミノ酸の生産性を向上させる変異を一切施さず、菌体外に検出される程のアミノ酸を生産することのないアミノ酸非生産株エシェリヒア・コリ ＡＴＣＣ１１１０５株[J. Bacteriol., 60, 17(1950)]およびＬ−イソロイシン生産菌株エシェリヒア・コリ Ｈ−８６８３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４０５２）を用いた。
【００１４】
ＡＴＣＣ１１１０５株およびＨ−８６８３株を常法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる変異処理（０．５ｍｇ／ｍｌ、３３℃、３０分間）を施した後、該変異処理を施した株を、グルコース ０．５％、Ｌ−ホモセリン ０．０２％、リン酸一カリウム ０．３％、リン酸二ナトリウム０．６％、硫酸マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ２０ｍｇ／ｌおよび寒天 ２％を含有するＬ−ホモセリン最少寒天平板培地（ｐＨ７．２）に、さらに栄養要求アミノ酸であるＤＬ−メチオニンを２０ｍｇ／ｌ添加した寒天平板培地上に塗布した。３３℃で４〜７日間培養し、生育してくる大きなコロニーを、Ｌ−ホモセリンを唯一の窒素源とした培地で速やかに生育できる能力を獲得した変異株として釣菌分離した。
【００１５】
ＡＴＣＣ１１１０５株から誘導した変異株について、Ｌ−イソロイシンの生産試験を以下に記載のバイオアッセイ法により行なった。該変異株１００株の内７株において、Ｌ−イソロイシンの生産を示す，ＣＧＳＣ３５１６株の生育により形成された円形の生育ゾーン（ハロー）が観察された。このようなハロー形成株の中から最も大きなハローを形成した菌株をエシェリヒア・コリＨ−９１４６株と命名した。
【００１６】
〔バイオアッセイ法によるＬ−イソロイシン生産試験〕
天然培地（トリプトン １％、酵母エキス ０．５％、NaCl １％、ｐＨ７．２）で２４時間培養したＬ−イソロイシン要求株エシェリヒア・コリ ＣＧＳＣ３５１６(ilvE316, trp-3, his-4, thi-1)[J. Bacteriol., 98, 1179 (1969)] を生理食塩水で２回遠心洗浄後、生産試験用寒天培地（グルコース ０．５％、塩化アンモニウム ０．２％、リン酸一カリウム ０．３％、リン酸二ナトリウム ０．６％、硫酸マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ２０mg／ｌ、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、ＤＬ−メチオニンを各２０mg／ｌ、サイアミン塩酸塩 １mg／ｌ、寒天 ２％、ｐＨ７．２）に混合して、ＣＧＳＣ３５１６株を最終菌濃度が約１０6／mlになるように含む平板培地を作製する。この平板培地に、Ｌ−イソロイシン生産を試験したい菌株をレプリカし、３３℃で１日培養する。培養後、該試験菌の周囲に形成された、ＣＧＳＣ３５１６株の生育を示す円形の生育ゾーンの大きさよりＬ−イソロイシン生産性を判断する。
【００１７】
一方、Ｌ−イソロイシン生産菌Ｈ−８６８３株から誘導した変異株については、１００株について太型試験管を用いたＬ−イソロイシンの生産試験を後述の実施例３と同様な方法により行った結果、約８％の頻度で親株よりＬ−イソロイシン生産性の向上した株が得られた。このような変異株の中から最もＬ−イソロイシン生産量の多い菌株をエシェリヒア・コリ Ｈ−９１５６株と命名した。
【００１８】
エシェリヒア・コリ Ｈ−９１４６株およびエシェリヒア・コリ Ｈ−９１５６株はブダペスト条約に基づいて平成７年３月２８日付けで、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−５０５５、ＦＥＲＭ ＢＰ−５０５６として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１９】
実施例２  Ｌ−ホモセリン最少寒天平板培地での生育比較試験
実施例１で取得された変異株Ｈ−９１４６株およびＨ−９１５６株について、Ｌ−ホモセリンを唯一の窒素源とする実施例１記載のメチオニンを２０ｍｇ／ｌ含有するＬ−ホモセリン最少寒天平板培地上での生育度をそれぞれの親株ＡＴＣＣ１１１０５株およびＨ−８６８３株と比較した。天然培地で２４時間培養した各菌体を生理食塩水に懸濁して１〜１０cells／cm2になるように塗布し、３３℃、５日間培養した。培養後、出現したコロニーの大きさに基づいて各菌株の生育度を比較した。結果を第１表に示した。
【００２０】
親株ＡＴＣＣ１１１０５株およびＨ−８６８３株はＬ−ホモセリンを唯一の窒素源として含む上述のＬ−ホモセリン最少寒天平板培地上では生育が極めて不良で、０．５ｍｍ以下の微小コロニーしか形成できないが、Ｈ−９１４６株およびＨ−９１５６株は同寒天平板培地上で１ｍｍ以上の明確なコロニーを形成することができ、Ｈ−９１４６株およびＨ−９１５６株はＬ−ホモセリンを唯一の窒素源として利用して速やかに生育できる能力を獲得した株であることが確認された。
【００２１】
【表１】
0003717970.tif 000002
【００２２】
実施例３  Ｌ−イソロイシンの生産試験
実施例１で取得した変異株Ｈ−９１４６およびＨ−９１５６と、それらの親株ＡＴＣＣ１１１０５およびＨ−８６８３について、Ｌ−イソロイシンの生産試験を以下のように行った。
これら４株をそれぞれ６ｍｌの種培地（グルコース ２％、ペプトン １％、酵母エキス １％、ＮａＣｌ ０．２５％、ＤＬ−メチオニン １３０ｍｇ／ｌ、炭酸カルシウム １％、ｐＨ７．０）を含む太型試験管に接種して、３０℃、１６時間振盪培養した。得られた種培養液０．１ｍｌを、それぞれ５ｍｌの生産培地（グルコース ６％、コーンスチープリカー ０．２％、硫酸アンモニウム １．６％、リン酸一カリウム ０．１％、DL−メチオニン １００ｍｇ／ｌ、リン酸マグネシウム ４％、炭酸カルシウム １％、ｐＨ７．０）を含む太型試験管に接種して、３０℃、４８時間振盪培養した。培養後、培養液中のＬ−イソロイシンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィー法により定量した。
【００２３】
結果を第２表に示した。アミノ酸非生産性菌株ＡＴＣＣ１１１０５から誘導されたＨ−９１４６株は菌体外に充分検出可能な程のＬ−イソロイシンの生産能を獲得しており、Ｌ−イソロイシン生産性菌株Ｈ−８６８３から誘導したＨ−９１５６株もＬ−イソロイシン生産能が更に向上し、親株よりも約１３％、Ｌ−イソロイシン蓄積量の向上が認められた。
【００２４】
以上のことより、実施例１に示した方法を用いることにより、Ｌ−イソロイシン生産株はもちろんのこと、アミノ酸の生産性を向上させる変異が一切施されていないアミノ酸非生産株においてもＬ−イソロイシン生産能の向上した変異株を取得することが可能であることがわかった。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−イソロイシンを工業的に効率よく製造できる。