(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列中に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および／または置換がなされたアミノ酸配列から成ることを特徴とする生物時計の制御に関与するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする生物時計制御遺伝子。
【請求項３】
配列表の配列番号２に示される塩基配列から成ることを特徴とする請求項２記載の生物時計制御遺伝子。
【請求項４】
配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列中に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および／または置換がなされたアミノ酸配列から成ることを特徴とする生物時計の制御に関与するタンパク質。
【請求項５】
請求項４記載の生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする生物時計制御遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号４に示される塩基配列から成ることを特徴とする請求項５記載の生物時計制御遺伝子。
【請求項７】
配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列中に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加および／または置換がなされたアミノ酸配列から成ることを特徴とする生物時計の制御に関与するタンパク質。
【請求項８】
請求項７記載の生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする生物時計制御遺伝子。
【請求項９】
配列表の配列番号６に示される塩基配列から成ることを特徴とする請求項８記載の生物時計制御遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医学、生理学上重要な生物の概日性リズムを司る生物時計制御遺伝子、およびその遺伝子産物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
約２４時間周期の概日性リズムは地球上の生物が環境に適応するための基本的生命現象の一つであり、このリズムを維持するための生物時計（概日性時計、circadian clock）を生物が有していることは広く認識されている。すなわち、生物の生理機能は昼、夜の光や温度の変化に対応して変化し、植物の開花、休眠の他、鳥やミツバチに見られる方向感覚も上記のリズムによって制御されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のごとく、生物の生理機能は生物時計の刻む概日性リズムによって制御されているが、現代社会では、特に、人間は自らの概日性リズムに反する生活を強いられ、不眠症や時差ボケに悩まされることが多い。また、うつ病や神経症などの精神病も概日性時計の異常との関連が深い。生物の持つこの概日性リズムを生じさせる基本振動は生物の細胞の中で発生することは知られている。しかしながら、この基本振動の発生や、それが生物の活動に反映される機構についてはほとんど解明されていない。
本発明の目的は、生物時計による概日性リズム発現の機構を分子生物学的に明らかにし、概日性リズムの異常に起因する疾病に対する治療、対策に貢献すること、およびエネルギー、食糧問題に対する対策などにも役立てることにある。
例えば、今日では社会活動は２４時間休みなく継続されているために、正しく労働−睡眠のリズムが取れないことも多く、ジェット・ラグやシフトワークなどで重大な不適応が生じ、本人の生理的苦痛はもとより、スリーマイル島発電所事故のような重大な災害の原因ともなっている。生物時計の分子メカニズムを解明し、それを外部から適切に操作することにより、このような不適応を緩和、除去することが可能になる。
【０００４】
また、食糧や建築、工芸材料として重要な高等植物は、２４時間周期の地球環境と１年周期の季節変動に適応するために、その成長や花芽形成が生物時計によって制御されている。この時計を人為的に操作することができれば、エネルギーコストを最小に抑えて最大の穀物生産を達成することや、ある特定の環境に適応した植物を人工的に創製することも可能になる。動物、特に、家畜についても同様のことが言える。
このような現代社会のかかえる諸問題を解決するために生物時計を司っている遺伝子を単離し、提供することによって概日性リズムの分子機構解明に糸口を与えることが本発明の目的である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、藍色細菌を材料とし、分子遺伝学的手法を駆使することによって、概日性リズムの乱れを相補する遺伝子、すなわち、生物時計を制御する遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の態様は、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列を有する生物時計の制御に関与するタンパク質またはその機能的同等物、ならびに、それらの生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする生物時計制御遺伝子、とりわけ、配列表の配列番号２に記載した塩基配列を有する生物時計制御遺伝子を提供するものである。さらに、この生物時計制御遺伝子とハイブリダイズし、生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子も提供する。
【０００７】
また、本発明の第２の態様は、配列表の配列番号３に記載したアミノ酸配列を有する生物時計の制御に関与するタンパク質またはその機能的同等物、ならびに、それらの生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする生物時計制御遺伝子、とりわけ、配列表の配列番号４に記載した塩基配列を有する生物時計制御遺伝子を提供するものである。さらに、この生物時計制御遺伝子とハイブリダイズし、生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子も提供する。
【０００８】
また、本発明の第３の態様は、配列表の配列番号５に記載したアミノ酸配列を有する生物時計の制御に関与するタンパク質またはその機能的同等物、ならびに、それらの生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする生物時計制御遺伝子、とりわけ配列表の配列番号６に記載した塩基配列を有する生物時計制御遺伝子を提供するものである。さらに、この生物時計制御遺伝子とハイブリダイズし、生物時計の制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子も提供する。
【０００９】
本明細書で用いる「機能的同等物」とは以下のようなものをいう。
天然に存在するタンパクにはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のタンパクの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパクと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。
このように構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないものを機能的同等物と呼ぶ。人為的にタンパクのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている［サイエンス（Science）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）］。
【００１０】
また、ある種のタンパクは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパクに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型タンパクへの転換に際して除去される。このようなタンパクは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するタンパクであり、「機能的同等物」の範囲内に属するものである。
【００１１】
ある遺伝子に「ハイブリダイズする遺伝子」とは、該遺伝子に類似した塩基配列を有する遺伝子である。ある遺伝子に類似した塩基配列を有する遺伝子は、そこにコードされているタンパク質のアミノ酸配列、さらに該タンパク質が有している機能も類似している可能性が高い。遺伝子の塩基配列の類似性は、両遺伝子またはその一部同士がハイブリッドを形成する（ハイブリダイズする）かどうかによって調べることができ、これを利用してある遺伝子がコードするタンパク質と同様の機能を持つタンパク質をコードする遺伝子を取得することができる。すなわち、本発明で得られた遺伝子、またはその一部をプローブに用いて公知の方法でハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明の遺伝子に類似の塩基配列を有する遺伝子を取得することができる。また、ハイブリダイゼーションにかえて、本発明で得られた遺伝子の塩基配列の一部をプライマーに用いる遺伝子増幅法、例えば、ＰＣＲ法を利用することもできる。こうして得られた遺伝子が目的の機能を有するタンパク質をコードするものであるかとうか、以下のようにして調べることができる。すなわち、本明細書に示すように、概日性リズムの乱れた変異体に、得られた遺伝子を導入して変異の相補を調べることにより、該遺伝子にコードされるタンパク質の機能を確認することができる。適当な変異体が得られていない場合には、得られた遺伝子にその機能が失われるような変異（ナンセンス変異等）を導入した後、相同組み換えによって、野生型生物の染色体上の遺伝子を破壊し、これによって概日性リズムが乱れるがどうかを調べればよい。このように、本発明の遺伝子にハイブリダイズする遺伝子は本明細書の開示によって容易に取得可能であり、本発明の範囲のものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（１）藍色細菌（Synechococcus）において生物時計の刻む概日性リズムに支配されていることがわかっているプロモーター PpsbAIを単離し、その下流に発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を接続して、シネココッカス・スピーシーズ（Synechococcus sp.） PCC 7942株のゲノムＤＮＡ上のニュートラルな部位（NS1部位）に相同的組換えによって挿入した形質転換体 AMC149株を作製することができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第90巻、第5672-5676頁（1993）］。該形質転換体においては、プロモーター PpsbAI依存的にルシフェラーゼが発現されるため、ルシフェラーゼ活性による生物発光を連続的に測定することにより概日性リズムを確認することができる。
ルシフェラーゼ活性に由来する生物発光を連続的に測定できる実験系は、すでに本発明者らによって完成、特許出願されており、特開平６−１５３９９４号公報に記載されている。また、プレート上のSynechococcusのコロニーについて同様の測定を行う方法も J. Bacteriol.、第176巻、第1881-1886頁（1994）に記載されている。これらの方法を用いることにより、上記の AMC149株の生物発光がほぼ２４時間周期の概日性リズムを刻むことが確認されている［Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第90巻、第5672-5676頁（1993）］。
【００１３】
（２）上記の AMC149株を用いて概日性リズムが乱れた変異体を分離する。例えば、該菌株を化学変異原であるエチルメタンスルフォネート（ethylmethanesulfonate、ＥＭＳ）処理した後に上記の方法で概日性リズムの測定を行い、長周期型、短周期型、無周期型、低振幅型等の概日性リズムに異常を生じた変異体を分離することができる。本発明には Science、第266巻、第1233-1236頁（1994）に記載の P30、P38、P48、LP60等の突然変異体を使用することができる。これらの変異体はそれぞれ約３０時間、約３８時間、約４８時間、約６０時間周期の発光リズムを示す。
【００１４】
（３）野生株であるSynechococcus sp. PCC 7942株のゲノムＤＮＡを調製し、適当な制限酵素、例えばＳau３ＡＩで部分消化する。これを適当なクローニングベクターに連結したゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。
ベクターとしては、例えば、プラスミドpNS2KTOAを使用することができる。該プラスミドは、プラスミドpBR322由来のアンピシリン耐性遺伝子、Synechococcusゲノム上のターゲッティングサイト２の両隣の領域（NS2領域; プラスミドpAM717に挿入されたSynechococcusゲノム由来の２．８kb ＢamＨＩ断片［Mol. Gen. Genet.、第232巻、第221-230頁（1992）］）、選択マーカーであるプラスミドpACYC177由来のカナマイシン耐性遺伝子（Km）に連結した大腸菌（E.coli）プラスミドPA15の複製開始点領域（ori PA15）の三つの部分よりなり、Km、ori PA15部分はターゲッティングサイト２に挿入されている。プラスミドpNS2KTOAの制限酵素地図を図１に示す。外来ＤＮＡを挿入するためのＢamＨＩクローニングサイトは、Kmとori PA15の連結部に存在し、その両隣にＥcoＲＩサイトが付加してある。このベクターでSynechococcusを形質転換することにより、任意の外来ＤＮＡをKm、 ori PA15部分と共に、Synechococcus ゲノム上のターゲッティングサイト２に挿入できる。ゲノムに組み込まれたこの領域は、形質転換体のゲノムＤＮＡをＮotＩで切断することによりゲノムから切り出すことができ、さらに得られたＮotＩ断片を環状化して大腸菌に導入することによりプラスミドとして回収できる（プラスミドレスキュー）。
また、回収されたプラスミド中の外来ＤＮＡ断片はベクター部分からＥcoＲＩで切り出して解析することができる。
ＤＮＡの切断、連結、プラスミドの調製などの基本的な操作には公知の方法を使用することができ、当該方法の詳細はコールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社発行、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition、（1989）に記載されている。
【００１５】
（４）上記の SynechococcusゲノムＤＮＡライブラリーを用いて、（２）で得られた概日性リズム変異体を形質転換する。形質転換の方法としては、例えば、 Methods Enzymol.、第153巻、第215-231頁（1987）に記載のように、Synechococcusが本来有する形質転換能力を利用する方法を用いることができる。すなわち、培養した Synechococcus菌体とＤＮＡとを混合し、静置した後にカナマイシン耐性のコロニーを選択して形質転換体を得ることができる。
得られた形質転換体を寒天培地上に生育させ、１２時間の暗期を与えて生物時計を同調させた後に、上記の方法にしたがって形質転換体コロニーの生物発光を連続的に測定し、発光リズムの周期が野生型（２４時間）に戻った相補体コロニーを分離する。
【００１６】
（５）相補体コロニーからゲノムＤＮＡを調製し、上記のＤＮＡライブラリーからゲノムＤＮＡ中に挿入されたＤＮＡ断片を回収する。ＤＮＡライブラリーがプラスミドpNS2KTOAをベクターに用いて作製されたものである場合には上記のプラスミドレスキュー法により目的のＤＮＡ断片を回収することができる。すなわち、相補体コロニーから調製されたゲノムＤＮＡをＮotＩで切断した後、生じた断片をＤＮＡリガーゼで環状化し、大腸菌に導入してカナマイシン耐性の形質転換体を選択する。該形質転換体より目的のＤＮＡ断片を含むプラスミドを回収することができる。
レスキューされたプラスミドに挿入された上記のライブラリー由来のＤＮＡ断片について、その塩基配列を決定する。配列の決定は通常の方法、例えば、ジデオキシ法によって決定することができる。さらに、得られた塩基配列を解析することにより、該塩基配列中のタンパクをコードしうる領域（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）を推定することができる。
【００１７】
（６）上記の塩基配列をもとに、概日性リズムが乱れた変異体のゲノムＤＮＡ上の対応する領域の塩基配列を調べて両者を比較することにより、変異体ゲノムＤＮＡ上に生じている突然変異の位置およびその種類を知ることができる。変異体のゲノムＤＮＡの塩基配列の決定にあたっては、サザンブロッティング解析により目的の領域を含むゲノムＤＮＡ断片を単離する方法や、ＰＣＲを利用したダイレクトシークエンス法が使用できる。
【００１８】
本発明者らは、Synechococcus sp. AMC149株由来の４種の突然変異体、P30、P38、P48、LP60のそれぞれを、Synechococcus sp. PCC 7942株のゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡライブラリー（Ｇライブラリー）を用いて形質転換し、得られた形質転換体、計約５万コロニーについて上記の方法で生物発光を連続測定した。
この結果、生物発光リズムが正しい２４時間周期に戻った相補体を、各変異体についてそれぞれ１種ずつ得ることができた。これらの相補体はそれぞれP30CG（cured with G library）、P38CG、P48CG、LP60CGと命名されている。これらの相補体のゲノムＤＮＡ上に、ベクターの設計どおりにライブラリー由来のＤＮＡ断片が挿入されていることは、ライブラリーの作製に使用されたベクター由来のＤＮＡ断片をプローブに用いたサザンブロッティング解析によって確認することができる。
【００１９】
各相補体よりプラスミドレスキュー法により回収されたプラスミドは、何れも上記のサザンブロッティング解析の結果から予想されるサイズのＤＮＡ断片を保持している。また、これらのプラスミドを再度突然変異体、P30、P38、P48、LP60に導入し、得られる形質転換体の生物発光リズムを測定することにより、該プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片上に生物時計機能の変異を相補する能力がコードされていることを確認することができる。
また、これらの各プラスミドの挿入ＤＮＡ断片をプローブとし、野生型であるSynechococcus sp. PCC 7942株のゲノムＤＮＡについてサザンブロッティング解析を行うことにより、これらの挿入断片の上記野生株のゲノムＤＮＡ上での関係を調べることができる。これにより、上記の挿入断片は共通のＤＮＡ断片を有していることがわかる。さらに、これらの挿入断片の制限酵素地図や、部分的な塩基配列を決定して比較することにより、それぞれのＤＮＡ断片がカバーするＤＮＡ領域の関係を知ることができる。
【００２０】
以上のようにして各相補体から回収されたプラスミドのうち、突然変異体 P48の相補体であるP48CGより得られたものの一つはプラスミドp48N2と命名されている。また、該プラスミドで形質転換された大腸菌JM109は Escherichia coli JM109／p48N2と命名、表示され、平成８年５月２８日より通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１５６４８として寄託されている。該プラスミドは P30、P38、P48、LP60のどの突然変異体に導入された場合にも生物発光リズムの乱れを相補することができ、これらの変異体に生じたＤＮＡ上の変異のすべてをカバーするＤＮＡ断片を含んでいることがわかる。また、他のプラスミドに挿入されている挿入ＤＮＡ断片との比較から、プラスミドp48N2に挿入されているＤＮＡ断片中の２つのＥcoＲＩサイトにはさまれた約５kbのＤＮＡ断片上に、上記の４種の変異体の生物発光リズムの変異を相補する能力がコードされていることが示される。図２にプラスミドp48N2に挿入されているＤＮＡ断片の制限酵素地図、ならびに上記の約５kbＤＮＡ断片を示す。
【００２１】
上記の約５kbのＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えば、ジデオキシ法によって決定することができる。配列表の配列番号７に決定された塩基配列を示す。さらに、該塩基配列を解析することにより、タンパク質をコードすることのできるＯＲＦを調べることができる。該塩基配列中には Synechococcus属で使用頻度の高いコドンからなる３つのＯＲＦがタンデムに並んでおり、これらは上流に存在するものから順にＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆと命名されている。配列表の配列番号２、４、６にそれぞれＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆの塩基配列を示す。また、配列表の配列番号１、３、５にそれぞれＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆにコードされているタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。これらのＯＲＦは非常に近接して存在しており、ＯＲＦ−ＤとＯＲＦ−Ｅの間は約９０bp、ＯＲＦ−ＥとＯＲＦ−Ｆの間は約５０bpしか離れていない。このことはこれらのＯＲＦが一つのオペロンを構成していることを示していると考えられる。
【００２２】
配列表の配列番号７に示された塩基配列をもとにこの塩基配列中の任意の領域をＰＣＲ法によって増幅するためのプライマーを設計することができる。次に、これらのプライマーを用い、上記の概日性リズムが乱れた４種の突然変異体のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、該領域に対応する突然変異体ゲノム上のＤＮＡ断片を増幅することができる。さらに得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、配列表の配列番号７に示された塩基配列と比較することにより、変異体のゲノムＤＮＡに生じている突然変異を特定し、さらに、そこにコードされている遺伝子産物が該日性リズムの発現に関与するものであることを確認することができる。
【００２３】
この結果、突然変異体 P38、P48、LP60では、ＯＲＦ−Ｆ上にそれぞれ１箇所の塩基置換（および１アミノ酸置換）が、また突然変異体P30では、ＯＲＦ−Ｄ上に１箇所の塩基置換（および１アミノ酸置換）が見い出された。また、これら以外に単離されている変異体について同様の解析を行った結果、ＯＲＦ−Ｅ上にアミノ酸置換を有する変異体においても該日性リズムが変化していることが確かめられた。
こうして、Synechococcus sp. PCC 7942株より該日性リズムの発現に関与する３種の生物時計制御遺伝子、およびそこにコードされるタンパク質が明らかにされた。
【００２４】
本発明で得られた遺伝子の塩基配列を利用して、本発明のタンパク質と同様の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を取得することができる。すなわち、本発明の遺伝子、あるいはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーションのプローブまたはＰＣＲ等の遺伝子増幅法のプライマーに用いることにより、Synechococcus属をはじめとする藍色細菌やその他の生物から本発明のタンパク質に類似の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。
上記の方法では目的の遺伝子の一部のみを含むＤＮＡ断片が得られることがあるが、その際には得られたＤＮＡ断片の塩基配列を調べてそれが目的の遺伝子の一部であることを確かめた上、該ＤＮＡ断片またはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、あるいは該ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的の遺伝子全体を取得することができる。
【００２５】
上記のハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件で行うことができる。すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１×までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄する。
また、こうして得られた新たな遺伝子について、そこにコードされているタンパク質の有する機能を上記同様の方法によって調べることにより、得られた遺伝子が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
【００２６】
本発明によって得られた遺伝子は、例えば、上記のように生物時計機能に異常を有する生物の概日性リズムを正常な状態に回復させるために使用することができる。またその逆に生物時計機能への選択的な変異導入にも利用できる。
本発明において突然変異体の作製に用いられた変異原処理のようなランダムな変異誘起法では、得られた変異体が生物時計機能以外にも何らかの異常を有している可能性がある。例えば、本発明によって得られた生物時計制御遺伝子に任意の変異を導入した後、これを相同組換えによって正常な生物に導入することにより、用いられた生物時計制御遺伝子にのみ変異を有する生物を得ることができる。このような手法を用いることによって、従来にない新規な性質、例えば、開花の時期や期間を人為的に変化させた観賞用植物等を作製することができる。
このように本発明により得られた生物時計制御遺伝子は、生物の有する概日性リズムを研究するうえでの情報、あるいは材料としてばかりでなく、新規な性質を有する生物を作成するための手段としても極めて重要なものである。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例の内容のみに限定されるものではない。
実施例１
Synechococcus細胞株とその培養
材料として野生型の藍色細菌Synechococcus sp. PCC 7942、該細菌のゲノム上の特定部位（NS1; ターゲッティングサイト１；ここに外来DNA断片を挿入しても細胞の生育には全く害が認められない）にスペクチノマイシン耐性遺伝子と連結したPpsbAI::luxAB融合遺伝子がレポーターとして組み込まれているAMC149株［Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第90巻、第5672-5676頁（1993）］、およびエチルメタンスルフォネート処理によって AMC149株から分離された生物発光リズムの周期に乱れを生じた突然変異体P30、P38、P48、LP60［Science、第266巻、第1233-1236頁（1994）］を用いた。AMC149株、およびその突然変異体の概日性リズムは、特開平６−１５３９９４号公報、および J. Bacteriol.、第176巻、第1881-1886頁（1994）に記載の方法により、n-デカナール (n-decanal) 存在下での生物発光として測定することができる。
Synechococcusを液体培養する場合には改変BG-11培地［J. Bacteriol.、第173巻、第7525-7533頁（1991）］中、対数増殖期の中ごろ（ＯＤ750＝０．６５）まで３０℃の恒明条件下で通気培養した。スペクチノマイシン耐性を有する株を培養する場合には培地に終濃度４０μg／mlのスペクチノマイシンを添加した。また、コロニーを形成させる場合には改変BG-11寒天培地を使用した。
【００２８】
実施例２
Ｇライブラリーの作製
（１）ライブラリーベクターpNS2KTOA
ライブラリーベクターpNS2KTOA（７．４３kb）は、プラスミドpBR322由来のアンピシリン耐性遺伝子（bla）、Synechococcusゲノム上のターゲッティングサイト２の両隣の領域（NS2; プラスミドpAM717由来の２．８kb ＢamＨＩ断片［Mol. Gen. Genet.、第232巻、第221-230頁（1992）］）、選択マーカーであるプラスミドpACYC177由来のカナマイシン耐性遺伝子（Km）に連結した大腸菌プラスミドPA15の複製開始点領域（ori PA15）の三つの部分よりなり、Km、ori PA15部分はNS2領域中に挿入されている。外来ＤＮＡを挿入するためのＢamＨＩクローニングサイトは、Kmとori PA15の連結部に存在し、その両隣にＥcoＲＩサイトが付加してある。プラスミドベクターpNS2KTOAの制限酵素地図を図１に示す。
ライブラリーベクターpNS2KTOA ５μgを ５０μlの反応液（ＢamＨＩ緩衝液、ＮＥＢ社製）中で８０ユニットの制限酵素ＢamＨＩ（ＮＥＢ社製）を用いて３７℃で３．５時間処理して線状化し、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。次にベクターの自己環状化を防ぐために、５０μlの反応液中（脱リン酸化緩衝液、ベーリンガーマンハイム社製）、２ユニットのアルカリホスファターゼ（Calf intestinal phosphatase、ベーリンガーマンハイム社製）で３７℃で１時間処理した後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。線状化ＤＮＡを未分解の環状ＤＮＡと分離するために、０．８％アガロースゲル電気泳動で分画し、線状化ＤＮＡを含むアガロースゲルをカミソリの刃で切り出し、ガラスビーズ法（QIAX、Qiagen社製）でＤＮＡをアガロースから抽出・精製した。
【００２９】
（２）Synechococcus のゲノムＤＮＡ断片の調製
Synechococcus sp. PCC 7942のゲノムＤＮＡはPorterの方法［Methods Enzymol.、第167巻、第703-712頁（1988）］で調製した。なお、培養には改変BG-11培地［J. Bacteriol.、第173巻、第7525-7533頁（1991）］を使用し、培養温度は３０℃とした。得られたゲノムＤＮＡ１００μgを３．３mlの反応液中（Ｈ緩衝液、宝酒造社製）で２６ユニットの制限酵素Ｓau３ＡＩ（宝酒造社製）で３７℃で１時間処理し、ＤＮＡの平均長が約６kbになるように部分分解した。エタノール沈殿によって反応液からＤＮＡ断片を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分画して５〜７kbのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出した。このゲル中のＤＮＡをガラスビーズ法（QIAX、Qiagen社製）によって精製した。
【００３０】
（３）ライブラリーベクターとゲノムＤＮＡ断片の連結
上記のゲノムＤＮＡ断片（４１ng）と線状化したライブラリーベクターＤＮＡ（５０ng）を１０μlの反応液（Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ緩衝液、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社発行、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition、（1989））中、２００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）で１６℃で１５時間処理して連結した。エタノール沈殿で反応液からＤＮＡを回収し、１５μlの１／２ＴＥ緩衝液（５mM Ｔris−ＨＣｌ、０．５mM ＥＤＴＡ）に溶かした（以後、このＤＮＡ溶液をライゲーション反応産物とよぶ）。１μlのライゲーション反応産物を電気パルス発生装置（Cellject Basic、Cellject社製）を用いた電気穿孔法によって大腸菌 DH10Bエレクトロコンピテントセル（ＢＲＬ社製）に導入し、これをＬＢ寒天培地（５０μg／ml アンピシリン、２５μg／ml クロラムフェニコール入り）にまき、３０℃で約２１時間培養して形質転換体コロニーを形成させた。現れたコロニーより無作為に１２コロニーを選び、そのそれぞれからボイリング法によってプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡの制限酵素解析（制限酵素ＮotＩ、ＥcoＲＩなどで切断し、アガロース電気泳動でＤＮＡ断片の長さを調べた）を行い、１２クローンのうち９クローンのプラスミドにＧライブラリー由来のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した（平均クローニング効率は７５％）。また、挿入ＤＮＡ断片の平均長は５．９kbであった。
【００３１】
（４）ＧライブラリープラスミドＤＮＡの調製
ライゲーション反応産物を電気穿孔法により、再度大腸菌 DH10Bエレクトロコンピテントセルに導入し、上記同様に形質転換体コロニーを形成させ、約38,000個のコロニーを得た。スプレッダーを用いて、寒天培地上のコロニーを３２mlのＬＢ液体培地中に回収し、よく撹拌して均一化した後、３１mlはグリセロール（最終濃度１５％［v/v］）と混ぜて液体窒素で凍結させ−８０℃で保存した。残りの１mlを使ってライブラリープラスミドＤＮＡを調製した。すなわち、この１mlの大腸菌けん濁液を５００mlのＬＢ液体培地（５０μg／ml アンピシリン、２５μg／ml クロラムフェニコール入り）を含む３リットル容の三角フラスコに接種し、３０℃で約９時間振とう培養（１８０rpm）して大腸菌を増殖させた。菌体を集めた後、Qiagen Plasmid Midi Kit（Qiagen社製）を用いたアルカリリシス法でライブラリープラスミドＤＮＡを調製した。このライブラリーをＧライブラリーと命名し、以下の操作に用いた。
【００３２】
実施例３
生物時計制御遺伝子を含むクローンのスクリーニング
（１）Synechococcus突然変異体の形質転換
Synechococcusが本来持つ形質転換能力を利用したトランスフォーメーション ［Methods Enzymol.、第153巻、第215-231頁（1987）］により、ＧライブラリープラスミドをAMC149株由来の生物時計突然変異体P30、P38、P48、LP60のそれぞれにに導入した。
１×１０9個の細胞を含む上記の変異体の培養液（ＯＤ730で培養液の濁度を測定し、吸光度が０．２５を示したとき、その培養液１ml中に１×１０8個の細胞が含まれている）を室温で遠心分離（４５００rpm、１０分間）し、菌体を集めた。得られた菌体を２mlの１０mM ＮａＣｌ溶液に懸濁した後、再び遠心して上清を除き、菌体を洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返した。洗浄した菌体を１mlのBG-11培地に懸濁して５０mlポリプロピレン遠心チューブに移し、２μlのＴＥ緩衝液（１０mM Ｔris−ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ）に溶かした１μgのＧライブラリープラスミドＤＮＡを加えた。遠心チューブをアルミホイルで遮光して、３０℃で１２時間振とうした。次に、それを、BG-11寒天培地に ２５、５０、１００、２００μlずつ塗布し、カナマイシン耐性遺伝子を形質転換体で充分発現させるために恒明条件下、３０℃で一晩培養した。その後、形質転換体を選択するために、最終濃度が２０μg／mlになるように寒天培地の底に３００μlの硫酸カナマイシン溶液（２mg／ml）を添加して４〜５日恒明条件下で静置し、形質転換体コロニーの直径が１〜２mmになるまで生育させた。
【００３３】
（２）生物発光の経時測定による相補体コロニーのスクリーニング
上記の形質転換体プレートの中からおよそ１０００個のコロニーが出現したものを選び、概日性リズムの変異が野生型に戻ったクローン（相補体クローン）のスクリーニングを行った。形質転換体コロニーに１２時間の暗期を与えて生物時計を同調させた後に、特開平６−１５３９９４号公報記載の方法にしたがって形質転換体コロニーの生物発光リズムを調べた。すなわち、生物発光の基質であるn-デカナール （シグマ社製）を最終濃度３％（V/V）になるように真空ポンプオイルと混合し、この混合液３００μlをエッペンドルフチューブの蓋に入れ、暗期の終わりに寒天培地上におき、気相を介して投与した。生物発光リズムは、生物発光自動測定装置で測定し、リズムの周期が野生型（２４時間）に戻った相補体コロニーを探した。
この結果、用いた４つの突然変異体について、それぞれ１つづつの野生型のリズムを示す（あるいは野生型のリズムに近づいた）コロニーが得られた。P30、P38、P48、LP60の各変異体から得られた相補体クローンは、それぞれP30CG、P38CG、P48CG、LP60CGと命名した。
【００３４】
（３）サザンブロッテイング解析
上記の相補体クローンのゲノムＤＮＡ上にＧライブラリー由来のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認するため、サザンブロッティング解析を行った。すなわち、各相補体クローンより調製したゲノムＤＮＡをＮotＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲル上のＤＮＡをキャピラリートランスファー法［コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社発行、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition.、（1989）］で正電荷を帯びたナイロンメンブレン（ハイボンド−Ｎ＋、アマシャム社製）に転写した後、ＤＩＧ（ベーリンガーマンハイム社製）で標識したプラスミドpBR322（ゲノムに組み込まれるはずのないアンピシリン耐性遺伝子（bla）を含むベクター）、あるいはプラスミドpACYC177由来のカナマイシン耐性遺伝子（Km；野生型ゲノムＤＮＡインサートと共にターゲッティングサイト２に組み込まれる）をプロ−ブとしてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のシグナルの検出はＤＩＧ Luminescent Detection Kit for Nucleic Acids（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてハイブリダイゼーションシグナルを光に変え、Ｘ線フィルムに露光させることによって行った。
上記の４種の相補体クローンすべてにおいて、Kmプローブの場合には、それぞれ単一のシグナルバンドが検出されたが、pBR322プローブの場合には、バンドは全く検出されなかった。このことは、Ｇライブラリー由来のＤＮＡ断片が、ライブラリーベクターのKm、ori PA15部分とともに相補体クローンのゲノムＤＮＡ中に挿入されていることを示している。また、KmプローブとハイブリダイズしているＮotＩ断片のサイズより、P30CG、P38CG、P48CG、LP60CGの各相補体クローンのゲノムＤＮＡ中に挿入されているＧライブラリー由来のＤＮＡ断片が、それぞれ約１１kb、約１０kb、約９．４kb、約１２kbであることも確認された。
【００３５】
（４）相補体クローンからのＧライブラリー由来ＤＮＡ断片の回収
上記の各相補体クローンより調製したゲノムＤＮＡ、２．５μgずつをそれぞれ２０μlの反応液（ＮＥＢ緩衝液３、ＮＥＢ社製）中で２５ユニットのＮotＩ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて３７℃で２時間処理し、完全に切断した。その反応液１０μlを３９０μlのライゲーション反応液（ＮＥＢ社製）中で２００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼで処理し、ＤＮＡを環状化した。該反応液よりＤＮＡをエタノール沈殿法で回収し、１０μlのＴＥ緩衝液に溶かした。そのうちの１μlを使用して電気穿孔法による大腸菌 DH10Bの形質転換を行い、形質転換後の大腸菌を１００μg／mlの硫酸カナマイシンを含むＬＢ寒天培地にまいて３０℃で一晩培養した。相補体クローンP30CG、P38CG、P48CG、LP60CGのそれぞれから得られたカナマイシン耐性コロニ−を２０個ずつ選び、このそれぞれからボイリング法によってプラスミドＤＮＡを調製した。ＮotＩを用いた制限酵素解析の結果、各プラスミドに含まれるＧライブラリー由来ＤＮＡ断片の長さはそれぞれ上記のサザンブロッティング解析から推定される長さと一致した。各相補体クローン由来のプラスミドを２つずつ選び、それぞれプラスミドp30N1、p30N2、p38N1、p38N2、p48N1、p48N2、p60N1、p60N2と命名した。
これらのプラスミドに相補活性があることを確認するために、それぞれを対応する突然変異体P30、P38、P48、P60に再導入し、得られたカナマイシン耐性形質転換体の生物発光リズムの周期を調べた。その結果、すべてのプラスミドが対応する変異体の生物発光リズムの周期をほぼ２４時間の野生型に戻した。また、プラスミドp48N2はこれら４種の突然変異体のすべてを相補する能力を有することも示された。
プラスミドp48N2に含まれるＧライブラリー由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図２に示す。
【００３６】
実施例４
生物時計制御遺伝子の解析
（１）変異相補活性を有するＤＮＡ断片のマッピング
上記の４種のプラスミド（プラスミドp30N2、p38N2、p48N2、p60N2）に含まれるＧライブラリー由来ＤＮＡ断片の Synechococcusのゲノム上での関係を調べるために、これら４種のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片をプロ−ブとして、SynechococcusゲノムＤＮＡのサザンブロッティング解析を行った。その結果、これら４種の挿入ＤＮＡ断片は互いに共通の領域を持っていることが示された。
そこで、これらの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を部分的に決定して比較した。すなわち、プラスミドp30N2、p38N2、p48N2、p60N2を制限酵素ＥcoＲＩで切断することによりベクタ−から切り出された種々のＤＮＡ断片について、ＥcoＲＩサイト近傍の塩基配列を決定し、そのそれぞれを比較した。
以上の結果より、上記の４種の突然変異体の概日性リズムの変異を相補する能力は、プラスミドp48N2に含まれるＧライブラリー由来ＤＮＡ断片のうち、図２に示された２つのＥcoＲＩサイトにはさまれた約５kbのＤＮＡ断片上にコードされていることが示された。
【００３７】
（２）塩基配列の決定と蛋白質コード領域の推定
上記のプラスミドp48N2由来の約５kbのＥcoＲＩ断片の塩基配列を以下のようにして決定した。
Nested Deletion Kit（ファルマシア社製）を用いて、上記の約５kbＤＮＡ断片をおよそ２５０bpづつ欠失させたＤＮＡ断片を含む一連のプラスミドを作製し、蛍光式自動塩基配列決定装置（３７３Ａ ＤＮＡ Sequencing System、ＡＢＩ社製）を使用して該ＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号７に示す。該配列をもとにGene Works遺伝子情報解析ソフトウエア（IntelliGenetics社製）を用いて制限酵素認識部位やオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を解析した。この結果、Synechococcusで使用頻度の高いコドンからなる３つのＯＲＦがタンデムに並んでいることが見い出された。これらのＯＲＦを上流に存在するものから順にＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆと命名した。配列表の配列番号２、４、６にそれぞれＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆの塩基配列を示す。また、配列表の配列番号１、３、５にそれぞれＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆにコードされているタンパク質の推定アミノ酸配列を示す。
【００３８】
（３）生物時計制御機能の確認
上記の概日性リズムの変異を有する４種の突然変異体は、ＯＲＦ−Ｄ、ＯＲＦ−Ｅ、ＯＲＦ−Ｆのいずれかに変異を有していることが予想される。そこで、各突然変異体ゲノムＤＮＡ上のＯＲＦ−Ｄ開始コドンのおよそ４００bp上流から、ＯＲＦ−Ｆの下流約５０bpの領域の塩基配列をＰＣＲによるダイレクトシークエンス法によって決定し、配列表の配列番号７に示される野性型の塩基配列と比較した。突然変異体 P38、P48、LP60では、ＯＲＦ−Ｆ上にそれぞれ１箇所の塩基置換（および１アミノ酸置換）が起きていること、突然変異体P30では、ＯＲＦ−Ｄ上に１箇所の塩基置換（および１アミノ酸置換）が起きていることが確認された。また、これまでに多様な変異（短周期型、長周期型、無周期型）を示す約３０種類の突然変異体について、このＯＲＦ−Ｄ、Ｅ、Ｆを含むゲノム領域の塩基配列を決定し、ほとんどの変異がこれら三つのＯＲＦのどれかに存在することが明らかになった。ＯＲＦ−Ｅ上にアミノ酸置換を有する変異体もすでに２種類が確認されている。こうしてＯＲＦ−Ｄ、Ｅ、Ｆそれぞれに生じたアミノ酸置換突然変異が生物時計に異常を引き起こすことが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、生物の概日性リズムの発現に関与するタンパク質およびそれをコードする遺伝子が明らかにされた。本タンパク質およびその遺伝子は、生物時計による概日性リズム発現の機構を解明するうえで重要である。さらに、本発明の遺伝子を利用することにより、生物の概日性リズムを人為的に調節することも可能となる。
【００４０】
【配列表】
【００４１】
配列番号：1
配列の長さ：284
配列の型：アミノ酸
鎖の数：1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003691164.tif 000002
0003691164.tif 000003
【００４２】
配列番号：2
配列の長さ：855
配列の型：核酸
鎖の数：2
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
GTGCTCTCGC AAATTGCAAT CTGCATTTGG GTGGAATCGA CGGCAATTTT GCAGGATTGC    60
CAGCGGGCGC TGTCGGCCGA TCGCTATCAA CTCCAAGTCT GTGAGTCTGG CGAAATGCTC   120
TTGGAGTATG CCCAAACCCA TCGTGACCAA ATCGACTGCC TGATTTTAGT GGCAGCCAAT   180
CCCAGCTTCA GGGCAGTTGT TCAGCAGCTC TGCTTTGAGG GAGTGGTGGT ACCAGCGATT   240
GTCGTAGGCG ATCGCGACAG TGAGGATCCC GATGAACCAG CCAAAGAACA GCTCTATCAC   300
AGCGCTGAAC TGCACCTCGG TATCCATCAG CTCGAGCAAT TGCCCTACCA AGTTGATGCT   360
GCACTGGCTG AATTTCTGCG CTTAGCCCCG GTCGAGACCA TGGCCGACCA CATCATGCTG   420
ATGGGGGCCA ACCACGATCC CGAGCTATCG AGCCAGCAGC GGGACCTCGC TCAGCGACTA   480
CAAGAGCGCC TAGGCTATCT CGGGGTCTAC TACAAGCGTG ATCCCGATCG CTTTCTGCGC   540
AACCTACCCG CCTACGAAAG CCAAAAGCTG CACCAAGCGA TGCAGACTAG CTATCGTGAA   600
ATCGTTTTGA GCTATTTTTC GCCGAATAGC AACCTCAACC AGAGCATTGA CAACTTCGTC   660
AACATGGCTT TCTTTGCCGA TGTTCCAGTC ACCAAAGTGG TAGAAATTCA CATGGAGCTG   720
ATGGACGAGT TTGCCAAGAA GCTCCGCGTA GAGGGACGTT CAGAGGACAT TTTGCTGGAT   780
TATCGGCTGA CTTTAATTGA TGTAATTGCA CATCTTTGTG AGATGTATCG ACGGTCTATC   840
CCACGAGAAA CCTGA                                                    855
【００４３】
配列番号：3
配列の長さ：102
配列の型：アミノ酸
鎖の数：1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003691164.tif 000004
【００４４】
配列番号：4
配列の長さ：309
配列の型：核酸
鎖の数：2
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGAGCCCTC GTAAAACCTA CATTCTCAAG CTCTACGTCG CCGGCAATAC TCCAAACTCA    60
GTCCGTGCCC TCAAAACGCT CAAGAACATT CTCGAAGTTG AATTTCAAGG TGTTTATGCT   120
CTAAAGGTGA TCGATGTTCT CAAAAATCCT CAGTTGGCAG AAGAGGATAA AATCCTAGCG   180
ACGCCAACCC TCGCCAAGGT TCTACCACTG CCTGTCCGAC GGATTATTGG TGATTTATCC   240
GACCGTGAGA AAGTTTTGAT TGGCCTTGAT TTACTCTACG GCGAACTTCA AGATTCCGAC   300
GACTTCTAA                                                           309
【００４５】
配列番号：5
配列の長さ：519
配列の型：アミノ酸
鎖の数：1
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
0003691164.tif 000005
0003691164.tif 000006
0003691164.tif 000007
【００４６】
配列番号：6
配列の長さ：1560
配列の型：核酸
鎖の数：2
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
ATGACTTCCG CTGAGATGAC TAGCCCTAAT AATAATTCTG AGCACCAAGC CATCGCTAAG    60
ATGCGCACGA TGATTGAAGG CTTTGATGAT ATTAGTCATG GCGGTCTTCC AATCGGGCGA   120
TCGACCCTCG TTAGTGGTAC TTCAGGAACC GGCAAGACCC TTTTTTCTAT TCAATTTCTC   180
TATAACGGTA TTATCGAGTT TGATGAGCCT GGGGTTTTCG TTACTTTCGA AGAAACCCCG   240
CAAGATATCA TTAAAAACGC CCGTAGTTTT GGCTGGGATT TAGCCAAGCT GGTCGATGAG   300
GGCAAACTAT TTATTCTTGA TGCTTCACCC GATCCAGAAG GTCAAGAGGT TGTTGGCGGC   360
TTCGATCTCT CTGCTCTGAT TGAGCGGATT AATTATGCAA TTCAAAAGTA TCGAGCGCGG   420
CGGGTTTCAA TTGACTCGGT CACGTCCGTT TTCCAGCAAT ATGATGCCTC TTCTGTGGTT   480
CGCCGCGAAC TCTTTCGGTT GGTAGCTCGC CTAAAACAAA TTGGGGCAAC TACGGTCATG   540
ACCACCGAGC GTATCGAGGA ATATGGCCCG ATCGCTCGTT ACGGTGTTGA GGAATTTGTC   600
TCCGATAACG TCGTGATTCT CCGCAACGTT TTGGAAGGGG AGCGCCGTCG CCGCACCCTC   660
GAAATCCTCA AGCTACGTGG CACCAGCCAC ATGAAAGGGG AATATCCGTT CACGATTACG   720
GATCATGGCA TCAATATCTT CCCGCTCGGG GCAATGCGCC TTACGCAGCG ATCGTCGAAC   780
GTGCGTGTTT CATCTGGTGT CGTCCGACTC GATGAAATGT GTGGTGGGGG CTTCTTTAAG   840
GACTCAATCA TTCTGGCAAC TGGCGCTACA GGCACTGGTA AAACTCTGTT AGTTAGCCGT   900
TTCGTTGAGA ATGCTTGTGC TAACAAAGAG CGGGCGATTC TGTTCGCTTA TGAAGAGTCA   960
CGAGCTCAGC TGCTCCGCAA TGCCTATTCA TGGGGAATGG ACTTTGAGGA GATGGAGCGC  1020
CAAAACCTCC TCAAAATTGT TTGCGCCTAT CCTGAATCTG CAGGTCTTGA AGACCATTTG  1080
CAGATTATTA AGTCGGAGAT CAATGACTTT AAGCCAGCTC GTATTGCAAT CGACTCCCTC  1140
TCTGCTTTGG CGCGGGGCGT TAGCAACAAT GCCTTCCGCC AATTTGTAAT TGGTGTCACT  1200
GGCTACGCGA AACAAGAAGA AATCACGGGA CTATTCACAA ATACCAGTGA TCAATTTATG  1260
GGAGCGCATT CGATTACTGA CTCCCATATC TCAACAATTA CGGATACGAT TATCTTGCTC  1320
CAATACGTCG AGATTCGTGG CGAAATGTCC CGCGCCATTA ACGTCTTCAA GATGCGCGGA  1380
TCTTGGCATG ACAAAGCAAT CCGCGAATTC ATGATCAGCG ACAAAGGGCC GGACATCAAG  1440
GATTCTTTCC GGAACTTTGA GCGGATTATT TCAGGTTCGC CAACACGGAT TACCGTCGAT  1500
GAGAAAAGCG AACTCTCGCG AATTGTGCGC GGCGTTCAAG AAAAAGGGCC GGAGAGCTAG  1560
【００４７】
配列番号：7
配列の長さ：4943
配列の型：核酸
鎖の数：2
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：
GAATTCGAAT TGACTGAATT TCTACGGTGC GCCAAGGGAG CTCCGTGGGG GCTTCCCCGC    60
GCCGAGCAAG CTGATAGAGT CGCTGCCCTT GCACTTGTAC GGCACTAACC TGGGGCGGTT   120
GCTGCTGAAT GTGGCCGAGG AATTGGGGTA GCGCCGCCTC GATTGCCTCT CGCGACAAGT   180
GGCTGGTATC GGCTTCTGCC AGGCGATCGC CCGTCAGATC GTCCGTACTG GTCTGCAACC   240
CGAAGCGAAT GGTGCCGACG TAGGTTTTGC CACTGGGAAG ATAGGGTAGG AGCCGCGTGG   300
CTCGTCCCAC CGCGATCGGC AGAACACCTG TGACTGCCGG ATCAAGCGTG CCACCATGGC   360
CGATACGCCG CTCCCGTAAC AGACGCCGTA ACTTGGCGAC ACAGTCATGG GAAGTCCAGC   420
CCGCTGGCTT ATCGAGGTTG ACAAACCCTT CCGATGACAT AGCAAGACCT CTGTCTTAAG   480
ACGGTAGACT GCATCACAGC CACAAGCGAT CGTCGATAGT AGAATTGGCT CTTCTGAGTT   540
ACGGTTGCGC AGATGGCCAA TATCCTCGTT GTTGATGACA GCAGTCTCTA CCTAGAACTT   600
GCCCGTCAAG CCTTAGTTGA TCATGGCCAC CAGGTTGAAC TTGCCAACAA CGGTCAAGAA   660
GCCTTGCAAT CCGTCGCCAA CAAGAAGCCT GACTTGATTC TGCTCGATAT CGTTATGCCA   720
GAAATGAATG GCTACGACGT ACTGCGATCG CTCAAGAAAT CAGCTGAAAA CGCTACGATT   780
CCTGTCATTC TTTGCTCGAC CAAAGGCGAG GATTTTGACA AGTATTGGGG GCTCAAACAG   840
GGAGCCAATG CCTACTTGAC TAAGCCCTAT GAACCAACCG AACTATTGCT ATTGGTGCAG   900
GAACAACTGA CTGCAGCCCG CAATTCTTGA AATTTGGCGG GGCGATCGTG ACCTCTGACC   960
TGACAAAATC AATTGATCAG ACGCGATCGC AGACAAAGTG AAGGGGATCA GGACAATAAT  1020
GTCCGATCCC CTTTGTTCTA GTTCGCTGGA ATTAAGCAGC TTCGCCAGCA GGGTAAACGC  1080
TGACTTTCTT GCCGCCTTTG CCTTTGCGCT CAAAGGTGAC GACGCCGTCG ATCAGTGCAA  1140
ACAGGGTGTC GTCACCGCCG CGACCAACAT TGACACCCGG ATGGAACTTA GTACCCCGTT  1200
GACGAACGAT GATGCTGCCC GAGCGCACCA CTTCGCCACC GAATTTTTTG ACGCCGAGGC  1260
GCTGAGCGTT AGAGTCACGC CCGTTACGAG TACTACCCGT ACCTTTCTTA TGAGCCATGG  1320
TCTTGGAATC CTCTGGTTAG AACGACGAAA AACTAGCCAG CAGCGTCAAT GTCCGCTTCT  1380
GATTTCGGTA AGTCAGCCGC GTTAGCCGTC AAGACTTTAC CGCCTACAGT AATCGACTCC  1440
ACCAAAACCC GGGTCAAATC TTGGCGATGG CCTTGTTTCT TACGGGTTTT TTTCTTGGGC  1500
TTCATCTTGT AGACAGTGAC TTTGCGACCC CGAGGGTGAC TCAGAACCGT CACTTGCACT  1560
GTGGCACCGG CCACGTAGGG CTGTCCAATC TGCGGTGCGC CTTCGTCTTG AACGAGCAGG  1620
ACTTTGTCGA GGGTGAGCGA CTGATCCAAG TCTGCGTCGA GGCGATCGAG ATCGTAGAAC  1680
CGACCGGGTT CAACCCAGAG TTGCTTACCG CTTGCTTCGA TGATTGCGTA AGCCATGCAT  1740
TTTCAGCCGT AGAGGTGGCT ACACCTGCCG AGGGCAGAGA GAGCACTTGA AGAAACCTGT  1800
TCCGAGCCGC CTTTTAAACA ACAGCCCTCT ATCATCTCAG AAACTTTTGA GAACTGTCAA  1860
ACTGTGGACA AAGCGATCGC GGCCTCATGA GCTGCAGTGC TAGGCTAAAT TAAATTTTTC  1920
CTTTGTCCAG AGATTAATCT GTCTGCAGAC TCAGTCCTGA CAGGAGCGAC TGCGTGCTCT  1980
CGCAAATTGC AATCTGCATT TGGGTGGAAT CGACGGCAAT TTTGCAGGAT TGCCAGCGGG  2040
CGCTGTCGGC CGATCGCTAT CAACTCCAAG TCTGTGAGTC TGGCGAAATG CTCTTGGAGT  2100
ATGCCCAAAC CCATCGTGAC CAAATCGACT GCCTGATTTT AGTGGCAGCC AATCCCAGCT  2160
TCAGGGCAGT TGTTCAGCAG CTCTGCTTTG AGGGAGTGGT GGTACCAGCG ATTGTCGTAG  2220
GCGATCGCGA CAGTGAGGAT CCCGATGAAC CAGCCAAAGA ACAGCTCTAT CACAGCGCTG  2280
AACTGCACCT CGGTATCCAT CAGCTCGAGC AATTGCCCTA CCAAGTTGAT GCTGCACTGG  2340
CTGAATTTCT GCGCTTAGCC CCGGTCGAGA CCATGGCCGA CCACATCATG CTGATGGGGG  2400
CCAACCACGA TCCCGAGCTA TCGAGCCAGC AGCGGGACCT CGCTCAGCGA CTACAAGAGC  2460
GCCTAGGCTA TCTCGGGGTC TACTACAAGC GTGATCCCGA TCGCTTTCTG CGCAACCTAC  2520
CCGCCTACGA AAGCCAAAAG CTGCACCAAG CGATGCAGAC TAGCTATCGT GAAATCGTTT  2580
TGAGCTATTT TTCGCCGAAT AGCAACCTCA ACCAGAGCAT TGACAACTTC GTCAACATGG  2640
CTTTCTTTGC CGATGTTCCA GTCACCAAAG TGGTAGAAAT TCACATGGAG CTGATGGACG  2700
AGTTTGCCAA GAAGCTCCGC GTAGAGGGAC GTTCAGAGGA CATTTTGCTG GATTATCGGC  2760
TGACTTTAAT TGATGTAATT GCACATCTTT GTGAGATGTA TCGACGGTCT ATCCCACGAG  2820
AAACCTGAAA AGGTAAAGGA GGTCTTAAGC TCGGCTCAAT TTCTCTCTTT ATCCTGTTAG  2880
ATGGTTTGAT TGCTGTTGCT ACCCCGTTGA TCTGCGTATG AGCCCTCGTA AAACCTACAT  2940
TCTCAAGCTC TACGTCGCCG GCAATACTCC AAACTCAGTC CGTGCCCTCA AAACGCTCAA  3000
GAACATTCTC GAAGTTGAAT TTCAAGGTGT TTATGCTCTA AAGGTGATCG ATGTTCTCAA  3060
AAATCCTCAG TTGGCAGAAG AGGATAAAAT CCTAGCGACG CCAACCCTCG CCAAGGTTCT  3120
ACCACTGCCT GTCCGACGGA TTATTGGTGA TTTATCCGAC CGTGAGAAAG TTTTGATTGG  3180
CCTTGATTTA CTCTACGGCG AACTTCAAGA TTCCGACGAC TTCTAACTGT CGTTAACTGC  3240
TTTGTTGGTA CTACCTGACT TCACCCTCTT TTAAGATGAC TTCCGCTGAG ATGACTAGCC  3300
CTAATAATAA TTCTGAGCAC CAAGCCATCG CTAAGATGCG CACGATGATT GAAGGCTTTG  3360
ATGATATTAG TCATGGCGGT CTTCCAATCG GGCGATCGAC CCTCGTTAGT GGTACTTCAG  3420
GAACCGGCAA GACCCTTTTT TCTATTCAAT TTCTCTATAA CGGTATTATC GAGTTTGATG  3480
AGCCTGGGGT TTTCGTTACT TTCGAAGAAA CCCCGCAAGA TATCATTAAA AACGCCCGTA  3540
GTTTTGGCTG GGATTTAGCC AAGCTGGTCG ATGAGGGCAA ACTATTTATT CTTGATGCTT  3600
CACCCGATCC AGAAGGTCAA GAGGTTGTTG GCGGCTTCGA TCTCTCTGCT CTGATTGAGC  3660
GGATTAATTA TGCAATTCAA AAGTATCGAG CGCGGCGGGT TTCAATTGAC TCGGTCACGT  3720
CCGTTTTCCA GCAATATGAT GCCTCTTCTG TGGTTCGCCG CGAACTCTTT CGGTTGGTAG  3780
CTCGCCTAAA ACAAATTGGG GCAACTACGG TCATGACCAC CGAGCGTATC GAGGAATATG  3840
GCCCGATCGC TCGTTACGGT GTTGAGGAAT TTGTCTCCGA TAACGTCGTG ATTCTCCGCA  3900
ACGTTTTGGA AGGGGAGCGC CGTCGCCGCA CCCTCGAAAT CCTCAAGCTA CGTGGCACCA  3960
GCCACATGAA AGGGGAATAT CCGTTCACGA TTACGGATCA TGGCATCAAT ATCTTCCCGC  4020
TCGGGGCAAT GCGCCTTACG CAGCGATCGT CGAACGTGCG TGTTTCATCT GGTGTCGTCC  4080
GACTCGATGA AATGTGTGGT GGGGGCTTCT TTAAGGACTC AATCATTCTG GCAACTGGCG  4140
CTACAGGCAC TGGTAAAACT CTGTTAGTTA GCCGTTTCGT TGAGAATGCT TGTGCTAACA  4200
AAGAGCGGGC GATTCTGTTC GCTTATGAAG AGTCACGAGC TCAGCTGCTC CGCAATGCCT  4260
ATTCATGGGG AATGGACTTT GAGGAGATGG AGCGCCAAAA CCTCCTCAAA ATTGTTTGCG  4320
CCTATCCTGA ATCTGCAGGT CTTGAAGACC ATTTGCAGAT TATTAAGTCG GAGATCAATG  4380
ACTTTAAGCC AGCTCGTATT GCAATCGACT CCCTCTCTGC TTTGGCGCGG GGCGTTAGCA  4440
ACAATGCCTT CCGCCAATTT GTAATTGGTG TCACTGGCTA CGCGAAACAA GAAGAAATCA  4500
CGGGACTATT CACAAATACC AGTGATCAAT TTATGGGAGC GCATTCGATT ACTGACTCCC  4560
ATATCTCAAC AATTACGGAT ACGATTATCT TGCTCCAATA CGTCGAGATT CGTGGCGAAA  4620
TGTCCCGCGC CATTAACGTC TTCAAGATGC GCGGATCTTG GCATGACAAA GCAATCCGCG  4680
AATTCATGAT CAGCGACAAA GGGCCGGACA TCAAGGATTC TTTCCGGAAC TTTGAGCGGA  4740
TTATTTCAGG TTCGCCAACA CGGATTACCG TCGATGAGAA AAGCGAACTC TCGCGAATTG  4800
TGCGCGGCGT TCAAGAAAAA GGGCCGGAGA GCTAGCCAGC GATCGCGCTT AGGTATTCTT  4860
GTCTCAGCTC AGTCGTCAAC CCGAGCACCG AGAAAGCTAA GGCCTCGCGA TAAAGCCGTT  4920
GTGCTGGATT CTGTAGCGAA TTC                                          4943
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスミドpNS2KTOAの制限酵素地図である。
【図２】  プラスミドp48N2に含まれる挿入DNA断片の制限酵素地図である。
【図１】
0003691164.tif 000008
【図２】
0003691164.tif 000009