(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロチノイド化合物を含有するバクテリア菌体を、エントレーナーとしてメタノールまたはイソプロピルアルコールを併用した超臨界流体と接触させることを特徴とするカロチノイド化合物の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はカロチノイド化合物を含有するバクテリア菌体からカロチノイド化合物を抽出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カロチノイド化合物は微生物の菌体、藻類の藻体あるいは植物および動物の組織および器官など天然界に広く分布する赤−黄色色素である。カロチノイド化合物は食品、飲料の着色剤としての食品添加物の分野およびサケあるいはマスなどの魚類の肉あるいは体表、鶏などの家禽類の卵への色付けなどを目的とした飼料添加物などとして近年その用途が拡大している。またカロチノイド化合物は抗酸化作用を持つことが知られており抗酸化剤としての用途も期待される。近年ある種のカロチノイド化合物に発癌阻止効果が見いだされており今後は医薬品としての用途も期待されている。
【０００３】
カロチノイド化合物は分子中に酸素原子を含むものおよび含まないものに大別され、前者をキサントフィル化合物と称することがある。キサントフィル化合物の中では、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチンなどが合成法により工業的に生産されており（Pure and Applied Chemistry, 63 (1), 35-44 (1991)) 、色付けを目的とした飼料添加物として用いられている。
しかしながら近年安全性の問題から合成品を食品および飼料添加物として用いることはできなくなりつつあり、近年の天然物指向ともあいまってこれらの合成品を代替するために天然のカロチノイド化合物を製造する技術の開発が強く望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
天然のカロチノイド化合物を工業的に生産することを考えた場合、安定した供給、生育の早さ、生産性の高さなどを考慮するとバクテリアを培養して菌体にカロチノイド化合物を蓄積させた後菌体を回収し抽出することによる方法が最も有利であると考えられる。
【０００５】
バクテリア菌体からカロチノイド化合物を抽出する方法として、特開平２−１３８９９６、特開平６−１６５６８３、特開平６−１６５６８４などが報告されているが、これらはすべて有機溶媒により抽出を行う方法である。しかしながら抽出されたカロチノイド化合物は食品添加物あるいは試料添加物として使用されるために、有機溶媒を用いた抽出においては使用する溶媒の残留の問題が生じる。そのため安全性を考慮すれば使用できる溶媒は限定される。また、カロチノイド化合物の中の一群であるキサントフィル化合物は特に安全と考えられる溶媒の中に溶解度の高い溶媒がなく溶媒残留の問題が深刻である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、バクテリア菌体に蓄積されるカロチノイド化合物を抽出する方法を研究するうちに、超臨界流体を溶媒として用いることにより安全性に問題のある有機溶媒を用いること無しにカロチノイド化合物を効率よく抽出できることを見いだし本発明を完成させた。
【０００７】
従って本発明は、カロチノイド化合物を含有するバクテリア菌体を超臨界流体と接触せしめることを特徴とするカロチノイド化合物の抽出方法を提供する。
本発明における超臨界流体としては、各種の超臨界流体を用いることができる。超臨界流体は拡散係数は気体の性質をもちながらその比重は液体に近く液体なみの溶解力を持つ流体として作用する。
【０００８】
本願発明において用いる超臨界流体としては、特に超臨界二酸化炭素が好ましい。超臨界二酸化炭素とは、臨界温度（３１．１℃）および臨界圧力（７５．２ kgf／cm2 ）以上の二酸化炭素のことである。
本願発明における抽出方法は特に限定されるものではないが、通常耐圧容器中で超臨界流体単独あるいは超臨界流体にエントレーナーとして他の溶媒を併用したものを被抽出物に接触させることにより行われる。
【０００９】
エントレーナーを併用する場合の使用割合は特に限定されるものではないが、超臨界流体に対し通常、１００重量％以下である。
エントレーナーとして用いる溶媒としては特に制限はないが、通常溶媒が残留した場合の安全性を考慮して水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンなどが好ましく用いられる。
【００１０】
抽出温度は臨界温度以上であれば特に限定されるものではない。超臨界二酸化炭素を用いた場合は、二酸化炭素の臨界温度である３１．１℃以上であり、通常１００℃以下、好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは４５℃以下である。
抽出圧力は臨界圧力以上であれば特に限定されるものではない。超臨界二酸化炭素を用いた場合は、二酸化炭素の臨界圧力である７５．２ kgf／cm2 以上であり、通常５００ kgf／cm2 以下、好ましくは２５０ kgf／cm2 以下である。
【００１１】
抽出時間は特に限定されるものではないが好ましくは１秒以上、好ましくは１分以上、特に好ましくは１０分以上であり、１００時間以下、好ましくは１０時間以下である。
抽出に用いられる超臨界流体の使用量は特に限定されるものではなく、通常バクテリア菌体１mgに対し、１mg以上、好ましくは１０mg以上であり、１０ｇ以下、好ましくは５ｇ以下である。
【００１２】
本願発明の被抽出物は、カロチノイド化合物を含んだバクテリア菌体であれば特に限定されるものではない。このようなバクテリア菌体の具体例としては、Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）などのアスタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロチン、エキネノン、カンタキサンチン及びゼアキサンチンから成るカロチノイド化合物のうち少なくとも１種を生産する能力を有するバクテリアを、生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩および必要であれば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基等）を含む培地で培養した後に遠心分離、濾過等により分離して得た菌体、あるいはカンタキサンチン生産能を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＳＱＨ３４８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８４）などのコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するバクテリアを、生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩および必要であれば特殊な要求物質（例えば、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基等）を含む培地で培養した後に遠心分離、濾過等により分離して得た菌体が挙げられる。当然のことながら本発明はこれらの具体例により限定されるものではない。
【００１３】
抽出される菌体はいかなる状態で用いても差し支えない。好ましくは、湿潤状態、乾燥状態あるいは菌体を何らかの溶媒にけんだくした状態で用いる。
抽出されるカロチノイド化合物は特に限定されるものではない。特に本発明の方法によれば、通常の方法では抽出されにくいキサントフィル化合物に対しても非常に有効である。
【００１４】
本発明の方法により抽出されるカロチノイド化合物としては、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、クリプトキサンチン、アドニルビン、アステロイデノン、ロドキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アスタキサンチンエステル、β−カロチン、α−カロチン、γ−カロチン、リコペン、カプサンチン、β−ゼアカロテン、トルレン、フラボキサンチン、α−ドラカロテン、フコキサンチン、フォニコキサンチンなどが挙げられる。
【００１５】
本発明においては、これらのカロチノイド化合物の少なくとも１種を含むバクテリア菌体が用いられる。特にアスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、クリプトキサンチン、アドニルビンおよびアステロイデノンから選ばれる少なくとも１種のカロチノイド化合物を含有するものが好ましく用いられる。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
調製例１．
アスタキサンチンおよびアドニキサンチンの生産バクテリアであるＥ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）を酵母エキス２０ｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸２ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水物０．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄（II）７水物０．０１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．０１ｇ／Ｌを含み、炭酸ナトリウムを用いてpH７．０に調製した３０Ｌの培地で５日間培養した後遠心分離により９００ｇの湿菌体を得た。この湿菌体のカロチノイド化合物濃度は１．０mg／ｇであった。
得られた菌体３００ｇを凍結乾燥することにより凍結乾燥菌体５７ｇを得た。
【００１７】
実施例１〜２０．
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）乾燥菌体５０mgを２．５mL容のＨＰＬＣ用空カラムに充填し、超臨界クロマトグラフィー装置（日本電子（株）製）に接続した。ここに超臨界状態の二酸化炭素を９２mg／min の速度で通じることにより抽出を行った。エントレーナーとして別の溶媒を同時に流す場合は超臨界状態の二酸化炭素の流速を９２mg／min 、エントレーナーの流速を２０μＬ／min に設定して抽出を行った。
【００１８】
抽出温度、抽出圧力、エントレーナー条件を変えて抽出を行った結果を表１に示した。抽出効率は、抽出されたカロテノイド量と菌体に含まれているカロテノイド量の比として表した。
【００１９】
実施例２１〜４０．
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）湿菌体１００mgを短冊状に切断したメッシュに擦り付け２．５mL容のＨＰＬＣ空カラムに充填し、超臨界クロマトグラフィー装置に接続した。抽出は乾燥菌体の場合と同一の条件で行った。
抽出温度、抽出圧力、エントレーナー条件を変えて抽出を行った結果を表２に示した。抽出効率は、抽出されたカロテノイド量と菌体に含まれているカロテノイド量の比として表した。
【００２０】
【表１】
0003727077.tif 000002
【００２１】
【表２】
0003727077.tif 000003
【００２２】
実施例４１．
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）乾燥菌体１０ｇを１００mL容の高圧容器に収容し、該容器に温度３５℃、圧力１５０ kgf／cm2 の超臨界二酸化炭素を１０ｇ／min の速度で２時間流すことによりカロチノイド化合物の抽出を行った。その結果、カロチノイド化合物の抽出効率は７５％であった。
【００２３】
実施例４２．
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）乾燥菌体１０ｇを２０mLのイソプロピルアルコールと混合して１００mL容の高圧容器に収容し、該容器に温度３５℃、圧力１５０ kgf／cm2 の超臨界二酸化炭素を１０ｇ／min の速度で２時間流すことによりカロチノイド化合物の抽出を行った。その結果、カロチノイド化合物の抽出効率は９７％であった。
【００２４】
実施例４３．
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）湿菌体２０ｇを１００mL容の高圧容器に収容し、該容器に温度３５℃、圧力１５０ kgf／cm2 の超臨界二酸化炭素を１０ｇ／min の速度で２時間流すことによりカロチノイド化合物の抽出を行った。その結果、カロチノイド化合物の抽出効率は６４％であった。
【００２５】
実施例４４．
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）湿菌体２０ｇを２０mLのイソプロピルアルコールと混合して１００mL容の高圧容器に収容し、該容器に温度３５℃、圧力１５０ kgf／cm2 の超臨界二酸化炭素を１０ｇ／min の速度で２時間流すことによりカロチノイド化合物の抽出を行った。その結果、カロチノイド化合物の抽出効率は９５％であった。
【００２６】
調製例２．
カンタキサンチン生産菌体であるコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．ＳＱＨ３４８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８４）を酵母エキス３０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、大豆油５mL／Ｌ、硝酸アンモニウム２．５ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸２ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水物０．５ｇ／Ｌ、硫酸鉄（II）７水物０．０１ｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．０１ｇ／Ｌを含み、炭酸カルシウムでpH８．０に調製した３Ｌの培地で７日間培養を行い、遠心分離により湿菌体７５ｇを得た。湿菌体のカロチノイド化合物含量は０．６１mg／ｇであった。湿菌体４０ｇを凍結乾燥することにより凍結乾燥菌体８．６ｇを得た。
【００２７】
実施例４５〜４９．
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＱＨ３４８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８４）乾燥菌体５０mgを２．５mL容のＨＰＬＣ用空カラムに充填し、超臨界クロマトグラフィー装置（日本電子（株）製）に接続した。ここに超臨界状態の二酸化炭素を９２mg／min の速度で通じることにより抽出を行った。エントレーナーとして別の溶媒を同時に流す場合は超臨界状態の二酸化炭素の流速を９２mg／min 、エントレーナーの流速を２０μＬ／min に設定して抽出を行った。その結果を表３に示した。
【００２８】
実施例５０〜５４．
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＳＱＨ３４８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８４）湿菌体１００mgを短冊状に切断したメッシュに擦り付け２．５mL容のＨＰＬＣ空カラムに充填し、超臨界クロマトグラフィー装置に接続した。抽出は乾燥菌体の場合と同一の条件で行った。その結果を表３に併記した。
【００２９】
【表３】
0003727077.tif 000004
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば超臨界流体を用いることによりバクテリア菌体から効率よくカロチノイド化合物、特にキサントフィル化合物を抽出することができる。また本発明の方法により製造されるカロチノイド化合物は飼料添加物あるいは食品添加物として安全に使用することができる。