(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるクリュイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）キノンオキシドレダクターゼをコードする単離された遺伝子。
【請求項２】
配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるクリュイベロミセス・マルシアヌス  キノンオキシドレダクターゼ。
【請求項３】
請求項１に記載のクリュイベロミセス・マルシアヌス  キノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含む、組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された、大腸菌（Ｅ．  Ｃｏｌｉ）。
【請求項５】
大腸菌が、受託番号ＫＣＴＣ  １０１１４  ＢＰで韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託された、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２２ｂである、請求項４に記載の大腸菌（Ｅ．  Ｃｏｌｉ）。
【請求項６】
請求項４に記載の大腸菌（Ｅ．  Ｃｏｌｉ）を培養する工程、
培養物にＩＰＴＧを添加することによってキノンオキシドレダクターゼの発現を誘導する工程、及び、
前記発現されたキノンオキシドレダクターゼを回収して精製する工程
を含む、クリュイベロミセス・マルシアヌス  キノンオキシドレダクターゼの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はクリュイベロミセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）に由来するキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及びこれから発現するアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は配列番号２のアミノ酸配列を有するクリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及びこれから発現されたアミノ酸配列を有するクリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼに関する。
【０００３】
【従来の技術】
いくつかの還元酵素によるキノン化合物の還元生成物は、反応性酸素ラジカルを生成することが知られている。反応性酸素ラジカルは、酸化的ストレスを生じ、ＤＮＡと膜を損傷し、そして癌を誘発することが知られている。しかし、キノンオキシドレダクターゼのような還元酵素は、このような自由ラジカルの形成を防ぐ（非特許文献１）。
【０００４】
【非特許文献１】
アニル・ケー・カイスワル等（Anil K. Kaisuwal et a1.）著、バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）、２０００年、第６０巻、第２０７−２１４頁
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、微生物から産生されるキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子の配列を明らかにし、これを宿主細胞内で過発現させることによってキノンオキシドレダクターゼを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、クリュイベロミセス・マルシアヌスからキノンオキシドレダクターゼが発現されるという事実を発見し、クリュイベロミセス・マルシアヌスからキノンオキシドレダクターゼを分離及び精製してその遺伝子配列を分析することにより本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明はクリュイベロミセス・マルシアヌス由来のキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及びこれから発現するアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
【０００８】
更に具体的には、本発明は配列番号２のアミノ酸配列を有するクリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及びこれから発現されたアミノ酸配列を有するクリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼに関する。
【０００９】
このように、本発明はキノンオキシドレダクターゼを得るためのもので、クリュイベロミセス・マルシアヌスからキノンオキシドレダクターゼ遺伝子をクローニングしてその塩基配列を決定した後、これからタンパク質を発現させ、熱安定性に非常に優れたキノンオキシドレダクターゼを得るためのものである。
【００１０】
キノンオキシドレダクターゼを産生する遺伝子を得るための遺伝子クローニングのフローチャートを図１に示した。本発明において用いた菌株は、、大熊製薬（Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, Korea）から入手した。入手した菌株（ＫＣＴＣ７１５５）を培養した後、遠心分離して回収し、得られた細胞を溶解する。得られた細胞抽出物を遠心分離し、得られた上清をクロマトグラフィーで分離する。基質のそれぞれの溶離液の活性を紫外線分光光度計で測定する。溶離液は、活性が単離され、生成されたことを示す。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、タンパク質バンドを同定する。
【００１１】
同定されたタンパク質をＰＶＤＦ（Polyvinylidene Fluoride）メンブレンに移し、アミノ末端の配列を決定し、そのアミノ酸配列からｃＤＮＡ合成のための５′プライマーを合成する。
【００１２】
次に、クリュイベロミセス・マルシアヌス菌株を培養して遠心分離により回収し、全ＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡの合成を容易にするために、全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した後、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために前記合成した５′プライマーを用いて逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施する。合成されたｃＤＮＡに対してポリメラーゼ酵素連鎖反応を実施し、得られた合成物をクローニングベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列を決定する。クローンの遺伝子配列をチェインターミネーター法により決定した後、ＢＬＡＳＴ （Basic Local Aligment Search Tool）プログラムを利用して分析することにより、従来の還元酵素と配列類似性を表すキノンオキシドレダクターゼを確認する〔Foster, C.E., Bianchet, M.A., Talalay, P., Zhao, Q., and Amzel, M.L., Biochemistry, 38(1999), 9881-9886〕。
【００１３】
キノンオキシドレダクターゼを生産する遺伝子を得るため、クリュイベロミセス・マルシアヌス菌株からプラスミドライブラリーを次の通り調製する。
クリュイベロミセス・マルシアヌスのゲノムＤＮＡを精製し、異なる制限酵素で切断してサザンブロットハイブリダイゼーションに付し、大略的な制限酵素地図を作成する。これを基礎に、ゲノムＤＮＡを適当なサイズに切断する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）を用いてプラスミドライブラリーを調製する。
調製したライブラリーを同位元素（32Ｐ）で処理されたプローブ（ＱＯＲｐ）（配列番号８）を用いてコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングを実施する。陽性シグナルを示すクローンについてジデオキシヌクレオチドチェインターミネーター法を用いて遺伝子の塩基配列を決定する。
【００１４】
キノンオキシドレダクターゼタンパク質を得るため、キノンオキシドレダクターゼ遺伝子を含有するクローンを２個の合成オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応に付す。この産物を、アガロースゲル上で分離し、１，１４３個の塩基の遺伝子断片を得、この断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理した後、同じ制限酵素で処理されたｐＥＴ２２ｂ（Novagen Inc., Madison, Wisconsin, USA）に結合させてプラスミドｐＱＯＲ２２ｂを調製する。
【００１５】
前記使用された合成オリゴヌクレオチドは、前記使用した制限酵素の切断部位を含み、タンパク質翻訳開始部位に正確に結合されるように設計され、その配列は次の通りである。
kmQOR-F:5′-TCATTGTACATATGTCATCATTCCTATCAAAG-3′ （配列番号 3）
kmQOR-R:5′-GGTCTCGAGCCATTTCAACACAACCATATT-3′   （配列番号 4）
【００１６】
前記プラスミドｐＱＯＲ２２ｂを発現宿主細胞であるＥ. Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３） 〔hsdＳ  gal（λｃＩts８５７ind1  sam7  nin5  lacUV5-T7  genel）〕（Novagen Inc., Madison, Wisconsin,USA）から市販されている）を形質転換した後、培地に接種して成長させる。その後、ＩＰＴＧ（β−Ｄ−イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加してキノンオキシドレダクターゼタンパク質の発現を誘導する。振盪培養した後、細胞を遠心分離して溶解させる。得られた細胞抽出物をクロマトグラフィー等で分離し、電気泳動に付しタンパク質バンドを確認する。
【００１７】
ｐＱＯＲ２２ｂを含むＥ．  Ｃｏｌｉ菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）／ｐＥＴ  ２２ｂ）は、２００１年１１月１２日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行（Korean Co1lection for Type Cultures）に寄託され、寄託機関により付与された受託番号はＫＣＴＣ  １０１１４  ＢＰであった。
【００１８】
キノンオキシドレダクターゼの活性を紫外線分光光度計（ＵＶ−１６０１ＰＣ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を利用して測定する。活性測定は、１，４−ベンゾキノンの濃度を変化させながら３４０nmの波長でのＮＡＤＰＨ（ε340nm＝６．２３mM-1）の酸化による吸光度の変化を測定することにより行う。正確な結果を得るため、実験を複数回実施した後、その平均値を計算して反応速度定数を求めることができる。下記実施例に詳細に記載されている通り、本発明のキノンオキシドレダクターゼは非常に高いキノン化合物還元活性を有することが分かる。
本発明を下記の実施例でさらに説明するが，これは、本発明を制限するために解釈すべきではない。
【００１９】
【実施例】
＜実施例１＞クリュイベロミセス・マルシアヌスからキノンオキシドレダクターゼの単離精製
大熊製薬でスクリーニングしたクリュイベロミセス・マルシアヌス菌株（ＫＣＴＣ７１５５）を３０℃で７２時間、８ＬのＹＭ培地でＯ.Ｄ．600が７.０になるまで培養した。培養した細胞を３，０００ｇで１０分間遠心分離して回収した。得られた細胞を希釈液（５０mM  リン酸ナトリウム、  pH６．５，  １mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、ＰＭＳＦ）２００mlに溶解させた。その後、フレンチプレスセルを圧力１１，０００バールで作動させて細胞を破砕させた後、超音波発生機（Branson sonifier, Model 450）を５分ずつ５回作動させて更に細胞を破砕した。得られた細胞抽出物を２５,０００ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清をカチオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−セファロース,Pharmacia）により分離した。次いで、それぞれの溶離液について紫外線分光光度計（ＵＶ−１６０１ＰＣ、  シマズ）を用いて基質に対する活性を測定した（図３）。
【００２０】
活性を示した溶液を集めて硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の濃度が１．２Mになるように硫酸アンモニウムを添加した後、フェニルセファロースにより分離した。活性を表した溶離液をアフィニティカラムであるハイトラップ−ブルー（HiTrap-Blue）セファロースクロマトグラフィーに付して分離し、ゲル濾過クロマトグラフィー（スーパーデッキス−７５、Pharmacia）を利用して最終的に分離した。精製されたタンパク質を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動に付し、４２kDaのサイズを有するタンパク質が認められた（図４）。
【００２１】
図４において、レーン１は、細胞破砕上清、レーン２は、Ｓセファロースクロマトグラフィー分離物、レーン３は、フェニルセファロースクロマトグラフィー分離物、レーン４は、ハイトラップブルークロマトグラフィー分離物、レーン５は、スーパーデッキス７５クロマトグラフィー分離物、Ｍは、標準分子量マーカーを表す。
【００２２】
前記認められたタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに移し、アミノ酸配列の末端を同定し、そのアミノ酸配列からｃＤＮＡ合成のための５′プライマーを合成した。
プライマー１：５′−ATGTCYTCNTTNCTNTCNAANAG−３′（配列番号５）
プライマー２：５′−ATGTCYTCYTTDCTDTCYAAYAG−３′（配列番号６）
【００２３】
＜実施例２＞クリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼのｃＤＮＡ合成及びＤＮＡ配列決定
クリュイベロミセス・マルシアヌス菌株を３０℃で７２時間１００mlのＹＭ培地で培養した。培養した菌株を３，０００ｇで遠心分離して回収した。トリゾール（TRIZOL GIBCO BRL, Life Techno1ogies）溶液を用いて菌株から全ＲＮＡを抽出した（図５ａ）。図５ａは、クリュイベロミセス・マルシアヌスから抽出した全ＲＮＡを１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した結果を表した写真であり、レーン１と２は、クリュイベロミセス・マルシアヌスの全ＲＮＡを表す。
【００２４】
ｃＤＮＡの合成を容易にするために、全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために実施例ｌで合成したプライマーを使用して逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ，３０℃１０分，４２℃３０分，９６℃５分，１サイクル）を実施した。合成されたｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（プライマー１，２，Ｍ１３プライマーＭ４（５′−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３′（配列７））、９４℃３０秒，４８℃３０秒、７２℃３０秒、５サイクル、９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０秒、３０サイクル）に付した（図５ｂ）。図５ｂにおいて、レーン１（Ｍ）は、ＨａｅIIIマーカー、レーン２は、プライマー１とＭ１３プライマーＭ４の反応生成物を表す。
【００２５】
ＤＮＡ配列決定のため、得られた産物をＴＡクローニングベクターにクローニングした。約１８個のクローンの遺伝子配列をチェーンターミネーター法により決定した後、ＢＬＡＳＴプログラム（Basic Local Alignment Search Tool Program）を利用して分析した。その結果、従来のレダクターゼと配列類似性を示すキノンオキシドレダクターゼが同定された。
【００２６】
キノンオキシドレダクターゼと類似性を示すクローンは、約６３９bpのサイズであり（配列番号８）、全体遺伝子配列を探すためのプローブ（ＱＯＲｐ）として用いられた。
【００２７】
＜実施例３＞キノンオキシドレダクターゼ遺伝子のクローニング
キノンオキシドレダクターゼを産生する遺伝子を得るために図１に示されているような遺伝子クローニングフローチャートを設計した。まず、クリュイベロミセス・マルシアヌス菌株からプラスミドライブラリーを次のように調製した。
【００２８】
クリュイベロミセス・マルシアヌスのゲノムＤＮＡを精製し、１０種類の制限酵素で切断した後、サザンブロッティングハイブリダイゼーションによって同定し、大略的な制限酵素地図を調製した。これに基づき、ゲノムＤＮＡを適当なサイズに切断する制限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）を用いてプラスミドライブラリーを調製した。
【００２９】
調製したライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。スクリーニングを同位元素（32Ｐ）で処理されたプローブ（ＱＯＲｐ）を用いて実施した。１次スクリーニングでは、４個の陽性シグナルを得、２次では、２０余個の強い陽性シグナルを得た。陽性シグナルを表すクローン２０個中、１０個を選びサザンブロッティングを実施した結果、目的遺伝子が存在することを再び確認することができた。このうち１個のクローンを、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーションを利用して遺伝子の塩基配列を決定した（図２参照）。
【００３０】
＜実施例４＞キノンオキシドレダクターゼ（ｋｍＱＯＲ）の発現及び分離精製制限酵素地図及び塩基配列を検討した後、現在タンパク質発現装置として最もよく確立されているＥ．  Ｃｏｌｉで発現させ、キノンオキシドレダクターゼタンパク質を得た。先ず、Ｃ末端に６個のヒスチジン残基を付けることができる発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂ（Novagen, Inc.）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断して線形化させた。キノンオキシドレダクターゼ遺伝子を含有するクローンを２個の合成オリゴヌクレオチドを使用してポリメラーゼ連鎖反応させた後、アガロースゲル上で分離し、１，１４３個の塩基の遺伝子断片を得た。この断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理した後、同じ制限酵素で処理されたｐＥＴ２２ｂに結合させてプラスミドｐＱＯＲ２２ｂを調製した。
【００３１】
前記使用された合成オリゴヌクレオチドは、前記使用した制限酵素の切断部位を含み、タンパク質翻訳開始部位に正確に結合できるように設計され、その合成オリゴヌクレオチド配列は次の通りである。
kmQOR-F:5′-TCATTGTACATATGTCATCATTCCTATCAAAG-3′（配列番号３）
kmQOR-R:5′-GGTCTCGAGCCATTTCAACACAACCATATT-3′  （配列番号４）
【００３２】
前記プラスミドｐＱＯＲ２２ｂを発現宿主細胞であるＥ. ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）〔hsdS  gal（λ  ｃＩts857  ind1  sam7  nin5  lacUV5-T7  genel）〕（Novagen Inc., Madison, Wisconsin, USA）内に形質転換させた（図６）。
【００３３】
前記キノンオキシドレダクターゼ遺伝子に形質転換されたＥ．  ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン（１００mg/ml）が添加された１リットルのＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ600が０．６になるように増殖させた後、ＩＰＴＧ（β−Ｄ−イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度５００mMになるように添加してキノンオキシドレダクターゼタンパク質の発現を誘導した。以後４時間振盪培養した後、細胞を３，０００ｇで１０分間遠心分離して回収した。得られた細胞を希釈溶液（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH７．９，  ５００mM  ＮａＣｌ，５mM  イミダゾール，１mM  ＰＭＳＦ）２５mlに溶かした後、超音波発生機を５分ずつ３回作動させて破砕させた。この時、得られた細胞抽出物を２５,０００ｇで３０分間遠心分離し、得られた上清をハイトラップキレーティング（HiTrap Chelati1lg）カラム（Pharmacia）を利用して分離した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（スーパーデッキス−７５，Phamacia）を利用して最終分離した。精製されたタンパク質を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、その結果、約４２kDaの分子量を有するタンパク質のバンドが同定された（図７ａ及び７ｂ）。
【００３４】
図７ａにおいて、レーン１は、ＩＰＴＧ添加前、レーン２は、ＩＰＴＧ添加後４時間培養時、レーン３は、ＩＰＴＧ添加後４時間培養した細胞破砕上清、レーン４は、ＩＰＴＧ添加後４時間培養した細胞破砕沈殿物、Ｍは、標準分子量マーカーを表す。
【００３５】
図７ｂにおいて、Ｍは、標準分子量マーカー、レーン１は、細胞破砕上清、２は、ハイトラップキレーティングセファロースで分離された画分、３は、スーパーデッキス７５クロマトグラフィーで分離された分画を表す。
【００３６】
＜実施例５＞キノンオキシドレダクターゼの活性測定
キノンオキシドレダクターゼの活性測定は、紫外線分光光度計（ＵＶ−１６０１ＰＣ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を利用して測定した。活性測定は、２mMキノンオキシドレダクターゼ、５０mM  リン酸ナトリウム緩衝溶液、pH６．５及び１，４−ベンゾキノンを含む１mlの反応混合液中で行った。還元反応は、２５℃で溶液に２００mM  ＮＡＤＰＨを加えた後すぐに開始した。活性測定は、１，４−ベンゾキノンの濃度を１０mMから２００mMまで変化させながら３４０nmの波長でＮＡＤＰＨ（ε340nm＝６．２３mM-1）の酸化による吸光度の変化を測定することによって行った。より正確な結果を得るため、実験を３回ずつ実施し、その平均値を計算して反応速度常数を求めた。１，４−ベンゾキノンに対するキノンオキシドレダクターゼの反応速度定数はＫｍ＝１．８mM、ｋｃａｔ＝９．５×１０5ｍ-1であり、ｋｃａｔ／Ｋｍは５．３×１０7Ｍ-1ｍ-1であった（図８）。
【００３７】
他のキノンオキシドレダクターゼの反応に対する例を挙げれば次の通りである。ファネロキーテクリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）のキノンオキシドレダクターゼの場合、１，４−ベンゾキノンに対する還元反応は１７．１nmol・m-1である〔Brock, B. J., and Gold, M. H., Arch. Biochem. Biophys. 331（1996）, 31-40〕。ヒトのキノンオキシドレダクターゼの場合、α-トコフェロールキノンに対する反応速度定数Ｋｃａｔ／Ｋｍは、１．５×１０7M-1m-1である〔Siegel, D., Bolton, E.M., Burr, J. A. Leibler, D. C., and Ross, D. Mol. Pharmacol. 37(1997)300-305〕。また、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）の場合、基質であるジュロキノン（duroquinone）に対する反応速度定数は、３．２×１０7M-1m-1である〔Sparla, F., Tedeschi, G., Pupil1o, P., Trost, P. FEBS Letters 463 （1999） 382-386〕。
【００３８】
上記のように、本発明のクリュイベロミセス・マルシアヌスのキノンオキシドレダクターゼは、優れたキノン化合物還元能力を有し、ゆえに、キノン化合物の還元反応及び生物学的活性化合物の中間体の合成に好都合に用いることができる。
【００３９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において使用した遺伝子クローニングのためのフローチャートである。
【図２】クリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼ（ｋｍＱＯＲ）の遺伝子及びアミノ酸配列である。
【図３】紫外線分光光度計を利用して活性を測定したスペクトロームである。
【図４】還元酵素の精製を確認するためのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％）電気泳動結果を表す写真である。
【図５ａ】クリュイベロミセス・マルシアヌスから精製した全ＲＮＡを表す写真である。
【図５ｂ】ｃＤＮＡを重合酵素連鎖反応させて得た結果を表す写真である。
【図６】クリュイベロミセス・マルシアヌスに由来するキノンオキシドレダクターゼの大量発現のためのｐＱＯＲ２２ｂの製造フローチャートである。
【図７ａ】Ｅ．  Ｃｏｌｉからキノンオキシドレダクターゼが大量発現するかを確認するためのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％）電気泳動結果の写真である。
【図７ｂ】Ｅ．  Ｃｏｌｉから大量発現されたキノンオキシドレダクターゼを精製したことを確認するためのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２％）電気泳動結果の写真である。
【図８ａ】精製したキノンオキシドレダクターゼの活性の測定結果を表すグラフである。
【図８ｂ】精製したキノンオキシドレダクターゼの活性の測定結果を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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