(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（６）工程を含み、（２）及び（３）の工程、並びに（５）及び（６）の工程を１回以上行うことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
（１）
(a) 一の二本鎖ポリヌクレオチドに由来する、断片間で相互に重なりが全く生じないか又は相互の重なりがわずかであるような二本鎖ポリヌクレオチド断片群と、
(b) 一の二本鎖ポリヌクレオチドと相同な部分を持つ一種類以上の他の二本鎖ポリヌクレオチドに由来する、断片間で相互に重なりが全く生じないか又は相互の重なりがわずかであるような二本鎖ポリヌクレオチド断片群と、
を混合する工程
（２）混合した二本鎖ポリヌクレオチド断片群に含まれる二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させた後、再びアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（３）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせる工程
（４）工程（３）で得られた混合液に一組のプライマーを加える工程
（５）混合液に含まれる二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させた後プライマーとアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（６）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせ、プライマーによって規定される長さのポリヌクレオチドを増幅する工程
【請求項２】
二本鎖ポリヌクレオチドが、DNAであることを特徴とする請求項１記載のハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
【請求項３】
前記二本鎖ポリヌクレオチド断片群が、二本鎖ポリヌクレオチドを制限酵素を用いて切断することにより作製されるものである、請求項２記載のハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
【請求項４】
以下の（１）〜（８）工程を含み、（４）及び（５）の工程、並びに（７）及び（８）の工程を１回以上行うことを特徴とするハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法。
（１） 一の二本鎖ポリヌクレオチドを制限酵素を用いて切断することにより、二本鎖ポリヌクレオチド断片群を作製する工程、
（２） 一の二本鎖ポリヌクレオチドと相同な部分を持つ一種類以上の他の二本鎖ポリヌクレオチドを制限酵素を用いて切断することにより、二本鎖ポリヌクレオチド断片群を作製する工程、
（３） 工程（１）で作製された二本鎖ポリヌクレオチド断片群と、工程（２）で作製された二本鎖ポリヌクレオチド断片群とを混合する工程
（４）混合した二本鎖ポリヌクレオチド断片群に含まれる二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させた後、再びアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（５）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせる工程
（６）工程（５）で得られた混合液に一組のプライマーを加える工程
（７）混合液に含まれる二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させた後プライマーとアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（８）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせ、プライマーによって規定される長さのポリヌクレオチドを増幅する工程
【請求項５】
以下の（１）〜（１１）工程を含み、（４）及び（５）工程、（７）及び（８）工程、並びに（１０）及び（１１）工程を一回以上行うことを特徴とするハイブリッドDNAの作製方法。
（１）一のDNAに複数の制限酵素を別々に作用させ、異なるDNA断片群を複数種類作製する工程
（２）一のDNAと相同な部分を持つ一種類以上の他のDNAに、複数の制限酵素を別々に作用させ、異なるDNA断片群を複数種類作製する工程
（３）一のDNA由来のDNA断片群の一種類と他のDNA由来のDNA断片群の一種類を組み合わせ、複数種類の混合液を作製する工程
（４）複数種類の混合液それぞれについて、混合液中の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させた後再びアニールさせ、heteroduplexを作製する工程
（５）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型としてポリヌクレオチド伸長反応を行わせる工程（一次伸長反応）
（６）各混合液由来の一次伸長反応産物を混合する工程
（７）工程（６）で得られた混合液中の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させた後再びアニールさせることにより、heteroduplexを得る工程
（８）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型としてポリヌクレオチド伸長反応を行わせる工程（二次伸長反応）
（９）二次伸長反応産物に一組のプライマーを加える工程
（１０）混合液に含まれる二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させた後プライマーとアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（１１）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせ、プライマーによって規定される長さのDNAを増幅する工程
【請求項６】
以下の（１）〜（９）工程を含み、（４）及び（５）工程、並びに（８）及び（９）工程を一回以上行うことを特徴とするハイブリッドDNAの作製方法。
（１）一のDNAに複数の制限酵素を別々に作用させ、異なるDNA断片群を複数種類作製する工程
（２）一のDNAと相同な部分を持つ一種類以上の他のDNAに、複数の制限酵素を別々に作用させ、異なるDNA断片群を複数種類作製する工程
（３）一のDNA由来のDNA断片群の一種類と他のDNA由来のDNA断片群の一種類を組み合わせ、複数種類の混合液を作製する工程
（４）複数種類の混合液それぞれについて、混合液中の二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させた後再びアニールさせ、heteroduplexを作製する工程
（５）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型としてポリヌクレオチド伸長反応を行わせる工程（一次伸長反応）
（６）各混合液由来の一次伸長反応産物を混合する工程
（７）一次伸長反応産物に一組のプライマーを加える工程
（８）混合液に含まれる二本鎖DNAを一本鎖DNAに解離させた後プライマーとアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（９）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせ、プライマーによって規定される長さのDNAを増幅する工程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法に関する。既存のタンパク質を人工的に改良し、機能の向上したタンパク質を獲得しようとする試みが数多くなされている。本発明は、そうしたタンパク質工学の分野に利用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
既存のタンパク質のアミノ酸配列の一部を置換し、そのタンパク質の改良を試みることは古くから数多く行われている。複数のアミノ酸置換を組み合わせることにより、タンパク質の改良を行う試みも近年数多く行われるようになった。さらに、同じタンパク質ファミリーに属する（すなわち、共通の祖先より由来した）２種類以上のタンパク質の間でハイブリッドを作ることにより、タンパク質を改良する試みもなされている。あるタンパク質に複数のアミノ酸置換を導入したり、同じタンパク質ファミリーに属する２種類以上のタンパク質の間でハイブリッドを作製したりするのに適した方法が近年開発された。このsexual PCRとも呼ばれる方法では、目的のタンパク質をコードする遺伝子（親遺伝子）あるいはその変異遺伝子を断片化し、混合した後、PCRを利用して断片を再結合させる。PCRの条件を設定することにより、遺伝子増幅に伴って新たな突然変異を導入することも出来る。この操作によって、PCR増幅産物中に蓄積された変異をランダムに取り込んだ多くの種類の変異遺伝子群を作製できる。また、この方法を同じタンパク質ファミリーに属する複数の親遺伝子に適用することで、複数の親遺伝子配列がランダムに混ぜ合わされた多数のハイブリッド遺伝子を作製することができる（特表平10-500561 号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
既存のsexual PCR法には、DNAの不特定の箇所に適当な数の切断を導入するという、煩雑な工程が存在する。又、sexual PCR法は、遺伝子配列の相同性が高い（例えば95％以上）複数の遺伝子のハイブリッドを作製するには有効な手段であるが、遺伝子配列の相同性が低い遺伝子間のハイブリッドの作製には必ずしも適していない。
【０００４】
本発明者らは、ともにカテコール2,3-酸素添加酵素をコードするxylE遺伝子とnahH遺伝子（両遺伝子の塩基配列の相同性は80％程度）とのハイブリッド遺伝子をsexual PCR法によって作製することを試みた。しかし、この方法によって得られた遺伝子の大部分は、もとの親遺伝子と同じ配列を持ち、ハイブリッド遺伝子は全体の１％以下に過ぎなかった。同じ遺伝子より由来した断片同士のアニーリングの確率が、異なる遺伝子より由来した断片同士のアニーリングの確率よりも高いことが、ハイブリッド遺伝子の出現頻度が低かった原因であろうと推定された。すなわち、あるxylEの遺伝子断片が、それと相同性を持つnahHの遺伝子断片とアニーリングしヘテロな分子種を作る可能性よりも、そのxylE遺伝子断片が他のxylEの遺伝子断片とアニーリングしホモの分子種を作る可能性のほうが高いためと推測された。このように、sexual PCRは、遺伝子配列の相同性があまり高くない遺伝子間でのハイブリッド作製には適していないと考えられる。
煩雑な遺伝子断片化の作業を必要とせず、又、比較的相同性が低い遺伝子間でもハイブリッドを形成できる遺伝子組換え法の開発は急務である。本発明の目的は、このような要求を満たす試験管内遺伝子組換えの手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ベンゼン環のメタ開裂を行う酸素添加酵素は数多くの生物から見いだされ、スーパーファミリーを構成している。カテコール2,3-酸素添加酵素は、そのスーパーファミリーに属する酵素の一つである。トルエンおよびキシレンを分解する酵素の遺伝子群を運ぶTOLプラスミドpWW0上のxylE遺伝子、ナフタレンの分解酵素遺伝子群を持つNAH7プラスミド上のnahH遺伝子はともにカテコール2,3-酸素添加酵素をコードする。約900 bpの長さを持つ両遺伝子は、塩基配列において約80％の相同性を有する。既存のsexual PCR法に従い、この２種類の遺伝子をDNase Iでランダムに断片化し、得られたxylE遺伝子断片及びnahH遺伝子断片を混合、熱変性により一本鎖に解離させた後再びアニールさせ、更にPCR反応を行った。しかし、この方法を用いた時、xylEとnahHのハイブリッドは低い頻度でしか得られなかった。xylE遺伝子断片同士、nahH遺伝子断片同士の同種間のアニーリングが優先的に進行し、xylE遺伝子断片とnahH遺伝子断片との間の異種間のアニーリングが起こりにくかったためと予想される。同種の遺伝子断片同士のアニーリングと、それに付随して起こるDNA伸長反応の頻度を減少させるためには、同種の遺伝子に由来する遺伝子断片の重なりを無くするあるいは少なくすればよい。そこで、制限酵素による遺伝子断片化について検討した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のハイブリッドポリヌクレオチドの作製方法は、以下の工程を含み、（４）及び（５）の工程、並びに（７）及び（８）の工程を１回以上行うことを特徴とする。
【０００７】
（１）一のポリヌクレオチドから相互にアニーリングしにくいようなポリヌクレオチド断片群を作製する工程
（２）一のポリヌクレオチドと相同な部分を持つ一種類以上の他のポリヌクレオチドから上記と同様の断片群を作製する工程
（３）一のポリヌクレオチドから得られた断片群と他のポリヌクレオチドから得られた断片群を混合する工程
（４）混合したポリヌクレオチド断片群に含まれる二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させた後再びアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
【０００８】
（５）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせる工程
（６）工程（５）で得られた混合液に一組のプライマーを加える工程
（７）混合液に含まれる二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに解離させた後プライマーとアニールさせることによりheteroduplexを得る工程
（８）heteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせ、プライマーによって規定される長さのポリヌクレオチドを増幅する工程
ここで、「一のポリヌクレオチド」とは、任意のポリヌクレオチドを意味し、「他のポリヌクレオチド」とは、「一のポリヌクレオチド」とは異なる任意のポリヌクレオチドを意味する。「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは、一のポリヌクレオチドの一部が、他のポリヌクレオチドの一部と置換されているポリヌクレオチドをいう。
【０００９】
一のポリヌクレオチド及び他のポリヌクレオチドは、タンパク質をコードするDNA であることが好ましく、また、同じタンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードするDNA であることが更に好ましいが、これに限定されるわけではない。
一のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドの間の相同性の度合いは問わず、少しでも相同な部分があればよい。例えば、10％の相同性でも90％以上の相同性でもよい。なお、他のポリヌクレオチドは１種類に限らず、複数であってもかまわない。
【００１０】
本発明は、相互にアニーリングしにくいようなポリヌクレオチド断片群を作製する工程を含む。ここで、「相互にアニーリングしにくいようなポリヌクレオチド断片群」とは、制限酵素で切断した結果得られる断片群のように各断片が全く重なりが生じないか、あるいは相互の重なりがわずかであるような断片群を意味する。このような断片群を作製する方法としては、適当なポリヌクレオチドを鋳型とした、試験管内でのポリヌクレオチド伸長反応（たとえばPCR）や化学合成による方法などを例示できるが、ポリヌクレオチドとしてDNAを対象とする場合であれば、制限酵素を使用して作製するのが好ましい。この時使用する制限酵素は、対象とするDNAに切断部位を有するものであれば特に限定されない。使用する制限酵素は１種に限られず、２種以上同時に用いても構わない。
【００１１】
本発明は、DNase I処理等によるDNAの断片化といった煩雑な作業を行うことなく、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製できる手段を提供する。又、sexual PCR法では、同一ポリヌクレオチド由来の断片（同種断片）同士がアニーリングし、アニーリングした分子上でポリヌクレオチド伸長反応が起こることを避けることは出来ないが、本発明の方法の一つによって、同種断片のアニーリングに伴うポリヌクレオチド伸長反応を最小限に押さえることも出来る。この点については、以下、図１を用いてこれを説明する。
【００１２】
２種類のポリヌクレオチドをランダムに断片化し（図１Ａ）、アニーリングさせると、両ポリヌクレチドの相同性があまり高くない場合には同種断片間のアニーリング（図１Ｂ）が優先的に起こり、異なるポリヌクレオチド由来の断片（異種断片）間のアニーリング（図１Ｃ）は起こりにくい。一方、２種類のポリヌクレオチドのそれぞれを、同じポリヌクレオチドの間で相互に重なりが生じないか、あるいは相互の重なりが僅かであるように断片化し（図１Ｄ）、アニーリングさせると、同種断片間では、ポリヌクレオチド伸長反応が起こるような形でアニーリングした分子を形成することができず（図１E）、異種断片間同士のアニーリングに伴ったポリヌクレオチド伸長反応のみが起こる（図１F）。
【００１３】
一のDNAと他のDNAとの間に相同でない部分がかなり広い領域にわたって存在する場合、両DNA由来の断片群を混合し、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせても途中で伸長が停止してしまい、完全長のハイブリッドDNAが得られない場合がある。これは、切断部位の位置によっては相手の断片と相同な部分を持たない断片（即ち、heteroduplexを形成できない断片）が生じ、その部分で伸長反応が停止してしまうからである。このような伸長反応の停止は、一つのDNAを複数の制限酵素で別々に切断し、複数の断片群を作製することによって回避できる。複数の断片群を作製することは、より多様なハイブリッドDNAを作製できるという点でも好ましい。但し、これら複数の断片群を同時に混合しアニーリングさせると、同種断片間のアニーリングによるポリヌクレオチド伸長反応が起こるので、次に述べるような三段階でのポリヌクレオチド伸長反応（一次伸長反応、二次伸長反応、最終伸長反応）を行わせることが望ましい。先ず、一のDNA に複数の制限酵素を別々に作用させ、異なるDNA断片群を複数種類作製する。又、一のDNAと相同な部分を持つ一種類以上の他のDNAから、上記と同様の方法で、異なるDNA断片群を複数種類作製する。次に、一のDNA由来のDNA断片群の一種類と他のDNA由来のDNA断片群の一種類を混合する。このようにして一のDNA由来のDNA断片群と他のDNA由来のDNA断片群との混合液を複数の組み合わせで作製する。複数の混合液のそれぞれについて、混合液に含まれる二本鎖DNAを熱処理あるいは他の適当な方法により一本鎖DNAに解離させた後再びアニールさせることにより、heteroduplex（一本鎖ポリヌクレオチド同士が部分的に二本鎖へと結合した分子）が得られる。このheteroduplexの一本鎖部分を鋳型として、ポリヌクレオチド伸長反応を行わせ、一のDNAと他のDNAとが共有結合したハイブリッドポリヌクレオチドを作製する（一次伸長反応）。必要に応じて一本鎖DNA への解離、アニーリング、ポリヌクレオチド伸長反応の工程を複数回行ってもよい。次に、すべての各混合液由来の一次伸長反応産物を一つの反応液に混合する。この混合液に含まれる二本鎖DNAを熱処理あるいは他の適当な方法により一本鎖DNAに解離させた後再びアニールさせることにより、heteroduplexを得ることが出来る。このheteroduplexの一本鎖部分を鋳型としてポリヌクレオチド伸長反応を行わせる（二次伸長反応）。必要に応じて一本鎖DNA への解離、アニーリング、ポリヌクレオチド伸長反応の工程を複数回行ってもよい。二次伸長反応産物に適当なプライマーを加え、混合液に含まれる二本鎖DNAを熱処理あるいは他の適当な方法により一本鎖DNAに解離させた後プライマーとアニールさせることにより、heteroduplexを得ることが出来る。このheteroduplexの一本鎖部分を鋳型としてポリヌクレオチド伸長反応を行わせプライマーによって規定される長さのポリヌクレオチドを増幅することが出来る（最終伸長反応）。必要に応じて一本鎖DNA への解離、アニーリング、ポリヌクレオチド伸長反応の工程を複数回行ってもよい。ここで使用するプライマーは、目的のハイブリッドDNAを増幅することができるものであれば特に限定されないが、一のDNAと他のDNA間で保存性の高い領域であって、５’末端及び３’末端の近傍に位置する領域に対応するものが好ましい。又、二次伸長反��を行わず、一次伸長反応産物を混合した後、適当なプライマーを加えた最終伸長反応を行っても良い。
【００１４】
【実施例】
〔実施例１〕
プラスミドpZErO-nahH及びpZErO-xylEを制限酵素KpnI、ApaIで切断し、nahH遺伝子DNA及びxylE遺伝子DNAを得た。nahH遺伝子DNA 1μgを制限酵素AvaI及びDdeIで、xylE遺伝子DNA 1μgを制限酵素NciIで切断した。その結果nahH遺伝子DNA、xylE遺伝子DNAはそれぞれ５個の断片に分かれた。各々の遺伝子由来の断片を混ぜ合わせ、耐熱性ポリメラーゼPfu polymeraseを用いてPCRを行った。この時プライマーは無添加である。反応は、96℃で 2分処理した後、94℃ 1分、56℃ 1分、72℃ 1分＋5秒／サイクルを40サイクル繰り返した。この反応において、nahH及びxylE各断片の相同領域でアニーリングが起こり、結果的にはnahH及びxylEの間での相同組換えが起こる。次いで、一次PCR産物を鋳型とし、一組のプライマー（配列番号１及び配列番号２）を用いてPCRを行った。PCRは、96℃2分の後、94℃30秒、58℃30秒、72℃45秒＋20秒／サイクルを25サイクル行い、その後72度で7分処理した。
【００１５】
プライマーによって全長へと増幅された断片をベクタープラスミドpZErO‐2のXbaI、SpeI切断部位にクローン化し、大腸菌TOP10F'を形質転換した。寒天培地上で生育したコロニーにカテコールを噴霧し、黄色を呈し活性を示したものの中から無作為に10個を選んでプラスミドを抽出し組換え遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、図２に示されるように10個の組換え遺伝子は全てnahH遺伝子とxylE遺伝子のハイブリッドになっており、組換え部位は遺伝子の全領域に分布していた（図中の黒く塗りつぶした部分はNahH由来、灰色の部分はXylE由来の配列を示す。）。
【００１６】
〔実施例２〕
組換えの位置を多様にするため、断片化に用いる制限酵素を両遺伝子について２種類に増やした。まず、nahH遺伝子DNA 1μgを２等分し、それぞれを制限酵素HhaI、BstNIで切断し、７個と８個の断片を得た。また、xylE遺伝子DNA 1μgを２等分し、それぞれを制限酵素NciI、Sau3Aで切断し、５個と６個の断片を得た。ここで全ての断片を混ぜ合わせアニーリングを行うと、両遺伝子間に20％の非相同領域があることからxylE断片同士、nahH断片同士でのアニーリングが高い確率で起こり、組換え産物の出現頻度が低くなることが予想される。これを防ぐため、まず、各々１種類ずつの酵素で切断した遺伝子断片を、nahH/HhaI＋xylE/NciI、nahH/BstNI＋xylE/Sau3AI、 nahH/HhaI＋xylE/Sau3AI、nahH/BstNI＋xylE/NciI、という４種類の組み合わせで混合し、それぞれをプライマー無添加でPCRを行った（一次PCR）。反応は、96℃で 2分処理した後、94℃ 1分、56℃ 1分、72℃ 1分＋5秒／サイクルを15サイクル繰り返した。この一次PCRによって、nahH遺伝子とxylE遺伝子の組換え小断片を作製した。次に、別々に反応させた４サンプルを1つにまとめて二次PCRを同条件で25サイクル続けた。最後に、二次PCR産物を鋳型とし、一組のプライマー（配列番号１及び配列番号２）を用いてPCRを行った。PCRは96℃2分の後、94℃30秒、58℃30秒、72℃45秒＋20秒／サイクルを25サイクル行い、その後72度で7分処理した。
【００１７】
プライマーによって全長へと増幅された断片をベクタープラスミドpZErO‐2のXbaI、SpeI部位にクローン化し、大腸菌TOP10F'を形質転換した。生育したコロニーにカテコールを噴霧し、黄色を呈し活性を示したものの中から無作為に10個を選んでプラスミドを抽出し組換え遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、図３に示されるように10個の組換え遺伝子は全て異なるnahH遺伝子とxylE遺伝子のハイブリッドになっており、組換え部位は遺伝子の全領域に分布していた（図中の黒く塗りつぶした部分はNahH由来、灰色の部分はXylE由来の配列を示す。）。
【００１８】
〔実施例３〕
実施例２と同様の制限酵素処理を行った後、４種類の断片化DNA、すなわち、nahH/HhaI、nahH/BstNI、xylE/NciI、xylE/Sau3AIを全て混ぜ合わせ、40サイクルの一次PCRを行った。PCRの条件は実施例２と同様である。その後プライマー（配列番号１及び配列番号２）を添加し実施例２と同様のPCRを行い、増幅断片をクローン化し、大腸菌を形質転換した。生育したコロニーにカテコールを噴霧し、活性を示したものの中から無作為に選んだ10個の組換え遺伝子の配列を調べた結果、10個の組換え遺伝子は全てnahH遺伝子とxylE遺伝子のハイブリッドであったが、そのうちの３つの組換え遺伝子の塩基配列は同一であった。
【００１９】
〔実施例４〕
nahH遺伝子DNA 1μgを３等分し、それぞれを制限酵素DpnI、Fnu4HI、ScrFIで切断し、９個、８個、10個の断片を得た。また、xylE遺伝子DNA  1μgを３等分し、それぞれを制限酵素BslI、MnlI、TaqIで切断し、７個、９個、９個の断片を得た。１種類の断片化nahH遺伝子DNA及び１種類の断片化xylE遺伝子DNAを混合し、合計９種類の組み合わせを作製した後、別々にプライマー無添加でPCRを行った。反応は、96℃で 2分処理した後、94℃ 1分、56℃ 1分、72℃ 1分＋5秒／サイクルを15サイクル繰り返した。この一次PCRによって、nahH遺伝子とxylE遺伝子の組換え小断片を作製した。次に、別々に反応させて得られた９個の一次PCR産物を1つにまとめて二次PCRを同条件にて25サイクル続けた。最後に、二次PCR産物を鋳型とし、両遺伝子に共通な5'末端及び3'末端に対応するプライマー（配列番号１及び配列番号２）を用いてPCRを行った。PCRは96℃2分の後、94℃30秒、58℃30秒、72℃45秒＋20秒／サイクルを25サイクル行い、その後72度で7分処理した。
【００２０】
増幅断片をベクタープラスミドpZErO‐2のXbaI、SpeI部位にクローン化し、大腸菌TOP10F'を形質転換した。生育したコロニーにカテコールを噴霧し、黄色を呈して活性を示したクローンの中から無作為に10個を選んでプラスミドを抽出し組換え遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、図４に示されるように10個の組換え遺伝子は全て異なるnahH遺伝子とxylE遺伝子のハイブリッドになっており、組換え部位は遺伝子の全領域に分布していた（図中の黒く塗りつぶした部分はNahH由来、灰色の部分はXylE由来の配列を示す。）。
【００２１】
〔実施例５〕
実施例４と同様の制限酵素でnahH遺伝子DNA、xylE遺伝子DNAを切断し、nahH/DpnI、nahH/Fnu4HI、nahH/ScrFI、xylE/BslI、xylE/MnlI、xylE/TaqIの計6種類の断片化遺伝子DNAを得た。これら６種類全てを混合し、40サイクルの一次PCRを行った。PCRの条件は実施例４と同様である。その後プライマー（配列番号１及び配列番号２）を添加し実施例４と同様のPCRを行い、増幅断片をクローン化し、大腸菌を形質転換した。生育したコロニーにカテコールを噴霧し、活性を示したものの中から無作為に選んだ10個の組換え遺伝子の配列を調べた。その結果、半数が元となったxylE遺伝子と同じ配列であった。
【００２２】
〔実施例６〕
実施例４と同様の方法によって得られた組換え体コロニーをレプリカした後、50℃、60℃の高温に暴露した後の残存活性を測定したところ、15％は元となった野生型酵素NahH、XylEよりも高い耐熱性を示した。最も耐熱化したと予想されるハイブリッドカテコール2,3-酸素添加酵素を精製し、元となったカテコール2,3-酸素添加酵素のうち、より耐熱性の高いXylEと比較した。図５に示すように、組換え酵素は60℃における半減期が26.8分であり、XylEカテコール2,3-酸素添加酵素の4.2分と比較して約6.4倍長かった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、DNaseI処理等のランダムなDNA断片化の工程を行うことなく、効率よくハイブリッドを作製することができるようになる。本発明は、比較的相同性の低い遺伝子の間でハイブリッド遺伝子を作る時に有効である。本発明は、耐熱性に優れた酵素や基質特異性の変化した酵素など既存のタンパク質に比べて高機能を持ったり、また全く新しい機能を持ったタンパク質の創出に有効である。
【００２４】
【配列表】
0003641560.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】本方法の概要を示す図である。
【図２】実施例１で得られたxylEとnahHのハイブリッド遺伝子の構造を示す図である。
【図３】実施例２で得られたxylEとnahHのハイブリッド遺伝子の構造を示す図である。
【図４】実施例４で得られたxylEとnahHのハイブリッド遺伝子の構造を示す図である。
【図５】  XylEタンパク質とXylE及びNahHのハイブリッドタンパク質についての耐熱性試験結果を示す図である。
【図１】
0003641560.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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