(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の１種以上の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、（ａ）（ｉ）液体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）所望により中間同系結合対を介して、少なくとも１種の分析物と特異的に結合することが可能である、エレメントの表面の複数の部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含み且つ反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定していない反応表面とを備える導波路デバイスを準備する段階と、（ｂ）所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記１種以上の分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記第１の同系結合対の固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である第２の同系結合対の特異的結合メンバーを準備し、前記１種以上の分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ、試料中の分析物の量に比例して複数の部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、（ｃ）導波路の内部で全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、実質的に全反応表面を同時に照射する段階と、（ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に同時に視覚的に検出可能な散乱光を集光する段階と、（ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部位の光散乱度、又はその両者と比較し、各部位の光散乱を該部位の固定化特異的結合メンバーに特異的な分析物の存在又は量と相関させる段階を含む前記方法。
【請求項２】
チャネル内に反応表面が形成されるような二次元毛管チャネルを形成するように前記第１のエレメントに結合された第２の透明エレメントを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定化した第１の特異的結合メンバーから分析物の解離を開始するように導波路デバイスの反応表面の条件を変更する追加の段階を段階（ｅ）の後に含み、上記変更条件下で段階（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を繰り返す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
液体試料中の少なくとも１種の特異的結合分析物の存在又は近似量を視覚的に検出する方法であって、（ａ）（ｉ）液体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である、エレメントの表面の少なくとも１個の試験部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含み且つ反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定していない反応表面とを備える導波路デバイスを準備する段階と、（ｂ）所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを準備し、前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ、試料中の分析物の量に比例して部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、実質的に全反応表面を同時に照射する段階と、（ｄ）反応表面の光散乱を実質的に同時に視覚的に検査し、検査部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部位の光散乱度、又はその両者と比較し、上記部位の散乱を前記分析物の存在又は量と相関させる段階を含む前記方法。
【請求項５】
チャネル内に反応表面が形成されるような二次元毛管チャネルを形成するように前記第１のエレメントに結合された第２の透明エレメントを更に含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
固定化した第１の特異的結合メンバーから分析物の解離を開始するように導波路デバイスの反応表面の条件を変更する追加の段階を段階（ｄ）の後に含み、上記変更条件下で段階（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す請求項４に記載の方法。
【請求項７】
液体試料中の少なくとも１種の特異的結合分析物の存在又は量を検出するための方法であって、（ａ）（ｉ）液体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である、エレメントの表面の１部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含み且つ反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定していない反応表面とを備える導波路デバイスを準備する段階と、（ｂ）所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを準備し、前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、（ｄ）散乱光が存在する場合には光検出装置を使用して第１の時刻t1で前記表面の部位及び非部位部分から実質的に同時に前記光散乱ラベルにより散乱された光を集光する段階と、（ｅ）段階（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも１回繰り返し、散乱光が存在する場合には第２の時刻t2で前記部位及び非部位部分から散乱光を集光する段階と、（ｆ）時刻t1における前記部位の光散乱度を時刻t2における前記部位の光散乱度と比較し、該部位の光散乱を特異的分析物の存在又は量と相関させ、光散乱の経時的差により、前記部位に存在する分析物の量を表す動的情報を提供する段階を含む前記方法。
【請求項８】
固定化した第１の特異的結合メンバーから分析物の解離を開始するように導波路デバイスの反応表面の条件を変更する追加の段階を段階（ｆ）の後に含み、上記変更条件下で段階（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）を繰り返す請求項７に記載の方法。
【請求項９】
未知核酸のセグメントのヌクレオチド配列を決定するか、又は２種の密接に関連するヌクレオチド配列を区別するための方法であって、（ａ）（ｉ）液体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）未知核酸とハイブリダイズするための種々の配列をもつオリゴヌクレオチドのアレーを構成するようにした、オリゴヌクレオチドを固定した複数の部位を含み且つ前記エレメントの他の非部位部分にはオリゴヌクレオチドを固定していない反応表面とを備える導波路デバイスを準備する段階と、（ｂ）所望により直接又は中間同系結合対を介して、光散乱ラベルで標識されている前記未知核酸を、ハイブリダイゼーション条件下で反応表面と接触させ、オリゴヌクレオチドを有し且つ未知核酸の配列に相補的な反応表面の部位に結合する光散乱ラベル複合体を形成する段階と、（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、（ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に同時に前記光散乱ラベルにより散乱された光を集光する段階と、（ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度又は（ii）別の部位の光散乱度と比較する段階とを含み、（ｆ）更に、導波路デバイスの反応表面でストリンジェンシー条件を増分的に増加し、該部位からの結合核酸の解離を開始させ、各増分毎に段階（ｄ）及び（ｅ）を繰り返す段階を含み、それによって、解離特性の差により、オリゴヌクレオチドと未知の核酸との間の１塩基対の差を完全な一致から区別できるようにする前記方法。
【請求項１０】
液体試料中の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、（ａ）（ｉ）液体試料よりも大きい屈折率をもつ透明TIRエレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である、エレメントの表面の少なくとも１個の部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含み且つ反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定していない反応表面とを備える導波路デバイスを準備する段階と、（ｂ）（ｉ）前記分析物を含む疑いのある試料及び（ii）所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを準備し、第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルと反応表面を接触させて、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成し、並びに（iii）少なくとも15の有効O.D.を与えるに十分な吸光メンバーの溶液と反応表面を接触させる段階と、（ｃ）エレメントの内部で内部全反射を生じるのに有効な光をTIRエレメントの受光縁部に照射し、実質的に全反応表面を同時に照射する段階と、（ｄ）前記光散乱ラベルにより散乱された光を実質的に同時に検出し、部位の光散乱度を非部位部分の光散乱度と比較し、吸光材料に吸収させることによりバックグラウンド散乱を最小限にする段階を含む前記方法。
【請求項１１】
視覚的に検出可能な散乱光からの結果を決定するために、画像装置を使用する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は数種の分野、特に特異的結合パートナー相互作用、エバネッセント導波路（waveguide）及び光散乱に関する。より特定的には、本発明は特異的結合力により導波路のエバネッセント波の侵入深さ内に保持された粒状ラベルにより散乱を生じる光散乱技術により、１種以上の特異的結合分析物（specific binding analytes）、特にDNA又はオリゴヌクレオチドを検出する方法に関する。
発明の背景
内部全反射（total internal reflection:「TIR」）は当該技術分野で公知であり、図１により説明される。TIRは、高密度媒体12（即ち高いほうの屈折率N1をもつ）を通って高密度媒体と低密度媒体16（即ち低いほうの屈折率N2をもつ）の間の界面14にぶつかる光10が式：θＣ＝arcsin（N2/N1）により定義される臨界角θＣよりも大きい角度θＲで界面にぶつかる場合に高密度媒体12の内側で全反射されるという原理に基づいて作用する。これらの条件下では「エバネッセント波」として知られる電磁波形が発生する。図1Bに示すように、高密度媒体内の光に伴う電場は界面に垂直な定常正弦波18を形成する。エバネッセント波は低密度媒体16に侵入するが、そのエネルギーＥは20に示すように界面からの距離Ｚの関数として指数関数的に消散する。「侵入深さ」（図1Aに22で示すdp）として知られるパラメーターは、エバネッセント波エネルギーが界面でのエネルギー値の0.368倍まで低下するような界面からの距離として定義される［Sutherlandら，J.Immunol.Meth.,74:253−265（1984）は、dpをＥ＝（e-1）・E0のときの深さとして定義している］。侵入深さは次のように計算される。
0003608665.tif 000002
侵入深さを増加させる傾向のある因子は、入射角θＲの増加、２つの媒体の屈折率の接近（即ちN2/N1→１）、及び波長λの増加である。例えば石英TIRエレメント（N1＝1.46）を水性媒体（N2＝1.34）に入れると、臨界角θＣは66゜（＝arcsin  0.9178）である。500nmの光がθＲ＝70゜（即ち臨界角よりも大）で界面にぶつかるならば、dpは約270nmである。
侵入深さ内で、低密度媒体（典型的には反応溶液）中のエバネッセント波は試料中に蛍光を励起し得る。この現象は当該技術分野でイムノアッセイに関して利用されている（Harrickら，Anal.Chem.,45:687（1973））。TIR蛍光をイムノアッセイに利用する装置及び方法は、当該技術分野ではHirshfieldの米国特許第4,447,564号、4,577,109号及び4,654,532号、HirschfieldとBlockの米国特許第4,716,121号及び第4,582,809号並びにWO93/20240号として公開された米国特許出願第07/863,553号（Abbott  Labs）に記載されており、これらの全開示内容は参考資料として本明細書の一部とする。免疫特異的物質を該エレメントの表面に付着させ、低密度媒体中で蛍光標識特異的結合パートナーと反応させる。特異的結合の結果、蛍光ラベルは侵入深さ内で結合する。（シフトした波長で）発光した蛍光はTIRエレメントにトンネル効果で戻り（tunnel back）、（異なる波長で）定常正弦波と同一経路に沿ってTIRの内部を伝播し、エレメントの出力で検出される。
TIRは散乱内部全反射率（Scattered Total Internal Reflectance:「STIR」）と呼ばれる技術でも光散乱検出に関連して使用されている。例えばSchuttらの米国特許第4,979,821号及び5,017,009号並びにWO94/00763号（Akzo  N.V.）参照。この技術によると、光ビームを適切な角度でTIRエレメントの表面を走査すると、光エネルギーはエバネッセント波を除いて完全に反射する。赤血球、コロイド金又はラテックス等の粒子を侵入深さ内に特異的に結合して光を散乱させ、散乱光は光検出手段により検出される。WO94/00763号は、（１）より広いダイナミックレンジに達するために異なる濃度の同一結合メンバー又は（２）多重フォーマットで種々の分析物を試験するために異なる結合メンバーのいずれかである特異的結合メンバーの数箇所に光ビームを走査することも記載している。多重部位に光ビームを走査し、各部位での散乱光を集めるのは非常に時間消費的な方法である。
Carterらの米国特許第4,608,344号では、TIRエレメントとして光導波路を使用している。１態様では、多重結合部位を導波路に特定線又は格子状に配置し、散乱光の回折格子パターンを形成している。この方法は、その後、特定順序の散乱光のみを検出することにより、表面欠陥及び／又は塵粒子等の不純物により生じる散乱を最小限にしている（図14及び17〜19欄参照）。
Carter及びSTIR装置の実用は、溶液中の粒子から散乱する深刻なバックグラウンド散乱により著しく制限される。このバックグラウンドは分析物に関連する結合粒子の検出感度を制限する。性能不良は、高いバックグラウンドレベルにわたって少量の信号を判別できる高度エレクトロニクス及びオプティクス（optics）によって補われた。しかし、エレクトロニクス及びオプティクスが複雑なため、非常に高価なシステムになっている。
最後に、Attridgeらの米国特許第5,192,502号は、試料流体を収容するキャビティを規定する平行なプレートを含む装置を教示している。一方のプレートは導波路として使用され、他方には吸光材料層が被覆してある。
他の興味深い背景技術としては、Drmanacらの米国特許第5,202,231号の開示が挙げられ、同特許にはハイブリダイゼーションによる配列決定（SBH）として知られる新規な核酸配列情報生成法が記載されている。この方法によると、既知配列のオリゴヌクレオチドのアレー（array）が結合した固相を試料からの標識化DNAとハイブリダイズさせる。従って、１回のハイブリダイゼーション実験でDNA分子上の多数の異なる部位を試験することができる。デュシェーヌ筋ジストロフィー又は嚢胞性線維症等の数種のヒト遺伝的症状の診断には、疾患状態に関連する突然変異を正確且つ費用効果的に判定できるような分解能のSBH型システムが必要であると思われる。SBH法のある特定利用例では、高密度二次元アレーに固定化した多数のオリゴヌクレオチドを使用している。このような装置は「DNAチップ」と呼ばれ、エレクトロニクス産業で製造されている高密度回路と似ている。未知DNAの試料をチップに適用し、ハイブリダイゼーションのパターンを決定及び分析し、配列情報を得る。WO92/10588及びWO92/10092（Affymax  Technologies  N.V.）にも同様の開示があり、更にこのようなチップを製造するための写真平版法も開示されている。
ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションに影響するので、ストリンジェンシーを正確に制御できるならば、良好な区別と特異性が得られる。例えば、融解曲線はDNAチップシステムに付加的寸法を与えることができ、SBHテクノロジーの実施に問題となる密接に関連する配列を良好に区別することができよう。温度を変化させてチップハイブリダイゼーションパターンをリアルタイムでモニターできるならば、特にGC含量の変動幅が大きい場合に非常に有用であろう。Livshitsら，J.Biomol.Struct.＆  Dynamics,11:783−795（1994）は、放射性又は蛍光ラベルを使用してゲル固定化DNAのシステムで完全及び不完全ハイブリダイゼーションの判別を可能にしたDNA配列決定法を記載している。ゲルを５℃毎に１分間洗浄し、不完全にハイブリダイズしたDNAに関連するラベルを除去している。著者らは、他の表面よりも固定化能と判別能が高いという理由でゲルが有利であったと主張している。しかし、表面から過剰のラベルを洗浄する必要があり、測定値を得るために全表面を走査するのに比較的長時間を要することが重大な制約となっている。例えば、１個のDNAチップアレー全体を読み取るために１分を要し、温度の増分毎に１分間の洗浄が必要であるならば、30から70℃まで（例えば１℃毎の）高分解能融解曲線を得るには１時間が必要である。チップ上の全スポットが測定されるまで各増分温度に１分間温度を一定に保たなければならない。
参考資料として本明細書の一部とする本願と同一名義の1993年10月21日付け同時係属米国出願第08/140,383号、発明の名称「標的リガンドの検出装置及び方法」の開示も注目される。この出願は、単一固相上の空間的に分離した多重位置に配置した特異的結合標的リガンドを撮像及び検出するために電荷結合デバイス「CCD」カメラ及び画像処理ソフトウェアを使用することを記載している。
発明の要約
Human  Genome  Projectがヒトゲノムの完全な配列決定で直面した１つの問題は、DNA配列データの獲得速度を２桁増加することである。本願は、好適態様として、DNAアレーを含む支持体上の多重捕獲部位で光散乱ラベルのリアルタイム結合又は融解を測定できる二次元光導波路を使用して検出方法に関する。この結果、ビデオ録画が可能な迅速さでハイブリダイゼーションデータを集めることができる。本方法は、エバネッセント波の散乱を利用し、侵入深さ内に閉じ込められたラベルのみが信号を発生するようにしたものである。散乱光の撮像（imaging）により、アレー全体を同時に調べることができる。ハイブリダイゼーション特異性は慣用システム及びオートラジオグラフィーで得られるのと等価である。融解曲線は同一配列組み合わせの液相融解曲線に一致し、１塩基対といった僅少差を容易に区別できる。希釈の制限により約0.4nM程度の低濃度の標的の検出が立証され、これは現在最良の蛍光システムに匹敵する。この方法は配列変動を迅速で費用効果的に検出する強力なツールを提供すると期待される。
即ち、１態様において本発明は流体試料中の１種以上の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法に関し、該方法は、
（ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部（light receiving edge）と、（iii）エレメントの表面の複数の部位に固定された少なくとも１個の同系結合対（cognate binding pair）の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、少なくとも１種の分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と、
（ｂ）前記１種以上の分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同系結合対の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記１種以上の分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記第１の同系結合対の固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である）、試料中の分析物の量に比例して複数の部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、
（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、
（ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、
（ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部位の光散乱度、又はその両者と比較し、各部位の光散乱を該部位の固定化特異的結合メンバーに特異的な分析物の存在又は量と相関させる段階を含む。
上記方法によると、単一導波路に多重部位が存在し、導波路を一度に照射し、同時に全部位からの散乱を光検出器又は視覚により集める。
別の態様において、本発明は流体試料中の少なくとも１種の特異的結合分析物の存在又は近似量を視覚的に検出するための方法に関し、該方法は、
（ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）エレメントの表面の少なくとも１個の試験部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と、
（ｂ）前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である）、試料中の分析物の量に比例して部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、
（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射する段階と、
（ｄ）反応表面の光散乱を視覚的に検査し、試験部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度、もしくは（ii）別の部位の光散乱度、又はその両者と比較し、上記部位の散乱を前記分析物の存在又は量と相関させる段階を含む。
本方法は多重部位に制限されず、視覚検出を必要としない。
同様に多重部位に制限されない別の態様は、速度読取（rate−read）法を使用する散乱の測定である。即ち、本態様では本発明は、
（ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）エレメントの表面の１部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と、
（ｂ）前記分析物を含む疑いのある試料と第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ（ここで、該第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である）、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成する段階と、
（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、
（ｄ）散乱光が存在する場合には光検出装置を使用して第１の時刻t1で前記表面の前記部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、
（ｅ）段階（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも１回繰り返し、散乱光が存在する場合には第２の時刻t2で前記部位及び非部位部分から散乱光を集光する段階と、
（ｆ）時刻t1における前記部位の光散乱度を時刻t2における前記部位の光散乱度と比較し、該部位の光散乱を特異的分析物の存在又は量と相関させ、光散乱の経時的差により、前記部位に存在する分析物の量を表す動的情報を提供する段階を含む。
本態様は単一又は多重部位のどちらにも適用できるが、経時的に微小な信号変動が現れる可能性があるので、視覚検出はできないと思われる。経時読取は連続して行ってもよいし、不連続でもよい。連続読取では、時間進行の初期傾きから初期速度を決定することができる。
本発明の特に有用な適用例はリアルタイムオリゴヌクレオチド融解試験である。従って、別の態様において本発明は未知核酸のセグメントのヌクレオチド配列を決定するか、又は２種の密接に関連するヌクレオチド配列を区別するための方法に関し、該方法は、
（ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明エレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）オリゴヌクレオチドを固定した複数の部位を含む反応表面（前記部位は未知核酸とハイブリダイズするための種々の配列をもつオリゴヌクレオチドのアレーを構成するようにし、前記エレメントの表面の他の非部位部分にはオリゴヌクレオチドを固定しない）とを備える導波路デバイスを準備する段階と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション条件下で反応表面を前記未知核酸（前記未知核酸は、所望により直接又は中間同系結合対を介して、光散乱ラベルで標識されている）と接触させ、未知核酸の配列に相補的な反応表面の部位に結合する光散乱ラベル複合体を形成する段階と、
（ｃ）導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、
（ｄ）散乱光が存在する場合には前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、
（ｅ）各部位の光散乱度を（ｉ）非部位部分の光散乱度又は（ii）別の部位の光散乱度と比較する段階とを含み、
（ｆ）さらに、導波路デバイスの反応表面でストリンジェンシー条件を増分的に（incrementally）増加し、該部位からの結合核酸の解離を開始させ、各増分毎に段階（ｄ）及び（ｅ）を繰り返す段階を含み、それによって、解離特性の差により、オリゴヌクレオチドと未知の核酸との間の１塩基対の差を完全な一致から区別できるようにする。
最後に、二次元導波路又は同時照射にも制限されない態様において、本発明はバックグラウンドを低減した改善された光散乱法にも関する。即ち、本発明は同様に流体試料中の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、該方法は、
（ａ）（ｉ）流体試料よりも大きい屈折率をもつ透明TIRエレメントと、（ii）受光縁部と、（iii）エレメントの表面の少なくとも１個の部位に固定された少なくとも１個の同系結合対の第１の特異的結合メンバーを含む反応表面（反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない）とを備える導波路デバイス（ここで、前記第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、前記分析物と特異的に結合することが可能である）を準備する段階と、
（ｂ）（ｉ）前記分析物を含む疑いのある試料及び（ii）第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベル（ここで、該第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセイの場合には前記分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイの場合には前記固定化した第１の特異的結合メンバーに結合することが可能である）と反応表面を接触させて、試料中の分析物の量に比例して前記部位に結合した光散乱ラベル複合体を形成し、並びに（iii）少なくとも15の有効O.D.を与えるに十分な吸光メンバーの溶液と反応表面と接触させる段階と、
（ｃ）エレメントの内部で内部全反射を生じるのに有効な光をTIRエレメントの受光縁部に照射する段階と、
（ｄ）散乱光を検出し、部位の光散乱度を非部位部分の光散乱度と比較し、吸光材料に吸収させることによりバックグラウンド散乱を最小限にする段階を含む。
上記全態様において、特異的結合分析物はオリゴヌクレオチド又は核酸であり得る。ほとんどの態様で分析物は抗原又は抗体でもよい。全態様は多重部位をもつことが好ましいが、態様によってはその必要はない。「多重」又は「複数の」部位の数は２といった少数でもよいし、数千と多数でもよい。
上記態様の各々において、導波路エレメントはガラスプレート等の平坦な表面を備え得る。各態様において、第２のプレートをエレメントに結合し、プレート間に毛管チャネルを形成してもよい。反応表面は、反応表面全体に試薬を流す反応容器としてチャネルを利用できるようにチャネルに対面すべきである。また、各態様において表面にカゼイン等の準可溶性（metasoluble）タンパク質を被覆することが好ましい。このコーティングは非特異的結合部位をブロックし、表面全体に液体を流し易くするように機能する。
どの場合も光散乱ラベル（LSL）はコロイド金もしくはセレン等のコロイド粒子でもよいし、微小ラテックス粒子でもよい。全態様において反応表面で溶液中に吸光メンバー（LAM）を使用することも可能である。こうすると、その光源の非常に近傍で散乱するバックグラウンドを低減できるという利点がある。LAMは溶液のO.D.を少なくとも15まで増加し、暗いバックグラウンドを提供し、これに対して該部位の散乱は明領域として示される。
【図面の簡単な説明】
図１は当該技術分野で公知の内部全反射（「TIR」）の原理を示し、これについては発明の背景の項に詳細に説明した。図１は、左側に界面における光の反射を示し、右側に界面からの距離Ｚの関数として電界エネルギーＥのプロットを示す。
図2A、2B及び2Cはそれぞれ本発明の１実施態様によるデバイスの斜視図、側面図及び横断面図である。
図３はオリゴヌクレオチドを導波路表面に固定し、エバネッセント波侵入深さ内でコロイドセレン光散乱粒子を結合したビオチン部分を含む相補的オリゴヌクレオチドを捕獲する本発明の１実施態様の概略図である。
図４〜７、8A及び９〜12は実施例に詳述するような導波路の実際のビデオ画像の印刷表示である。ビデオ画像は８ビットフレームグラバー（frame grabber）に供給して情報をディジタル化した。ディジタル化ファイルを製図アプリケーションにインポートし、高解像度プリンターで印刷した。
図8B及び8CはDNA解離又は融解曲線である。各温度毎に実施例５で該当温度について生成した平均強度データをプロットした。
発明の詳細な説明
以下、本発明の種々の態様をより詳細に説明する。
TIRエレメント及び導波路デバイス
内部全反射（「TIR」）とエバネッセント波の物理的原理については発明の背景の項に記載した。本明細書で使用する「TIRエレメント」なる用語は、内部全反射が可能な界面を提供する任意の透明材料を意味する。該エレメントは例えばキュベット、ロッド又はプレートであり得る。TIRエレメントのエバネッセント波は１又は複数の内部全反射点のみに存在し得る。他方、「導波路」とは、光が多重点で内部全反射し、全表面又はほぼ全表面に実質的に均質なエバネッセント波を形成するような二次元TIRエレメントを意味する。二次元導波路の構造は平面状でも曲線状でもよい。簡単にするために、平面導波路を好適実施態様として説明する。
本発明の１好適実施態様において、TIRエレメントは二次元導波路である。図2A〜2Cは、導波路デバイス30が平面導波路エレメント32と平行な平面プレート34を含む好適実施態様を示す。従って、導波路エレメントは平行な表面36及び38と受光縁部40をもつ。同様に、プレート34は平行な表面42及び44をもつ。導波路エレメント32とプレート34は、エレメント表面38とプレート表面42が狭いチャネル46を規定するように相互に離間して平行に固定されている。エレメントとプレートは、エレメントとプレートの縁部に沿って付着した両面テープから構成される接着手段48等の任意の慣用手段により相互に固定することができる。チャネル46は、流体試料を毛管移送できるように狭いほうが好ましい。例えば、高さを約1mm未満、好ましくは約0.1mm未満にすべきである。
エレメント32はガラス、石英、プラスチック（例えばポリカーボネート、アクリル又はポリスチレン）等の光学的に透明な材料から製造すべきである。導波路の屈折率は、内部全反射を生じるために当該技術分野で公知の通り、試料流体の屈折率よりも大きくなければならない。試料が水溶液の場合には、屈折率ｎは約1.33であるので、導波路は典型的には＞1.35、通常は約1.5以上の屈折率をもつ。導波路はプラスチック又はガラスの部品であり得、例えば標準ガラス顕微鏡スライド又はカバースリップを使用することができる。
プレート34も同様の材料から構成することができる。図2A及び2Bに示すように、導波路エレメント32の受光端40は光源54から発生する迷光の影響を最小限にするようにマスク52の狭いスリット50に配置される。迷光の最小化は後述するように吸光材を使用することによっても改善される。
入射光ビームを発生する光源54は可視、紫外及び近IRスペクトルのエネルギーを含むほぼ任意の電磁エネルギー源であり得る。従って、「光」なる用語は非常に広義の意味であり、視覚検出される態様を除いて可視範囲に限定されない。非可視波長は当該技術分野で周知のように特定波長に最適化された検出器により検出される。光は単色光でも多色光でもよく、コリメート光（collimated light）でも非コリメート光でもよく、偏光でも非偏光でもよい。好適光源はレーザー、発光ダイオード、フラッシュランプ、アーク灯、白熱電球及び蛍光放電灯などである。導波路エレメントを照射するために使用される光源は低ワット数ヘリウム−ネオンレーザーであり得る。下記実施例１に記載するような携帯使い捨てデバイスでは、光源はポケットフラッシュライトに使用されるような電池式小型白熱電球であり得る。好ましくは、光源は光源の強度を変化させるための電位差計手段を含む。あるいは、強度を適切なレベルに調節するためにフィルター及び／又はレンズを利用してもよい。
光散乱度を測定するための検出手段については追って詳述するが、要約すると計器と視覚手段がある。本発明の重要な特徴の１つは、導波路全体の全域で起る光散乱現象を観察者の目と脳又はCCDカメラを含む光検出装置によりほぼ同時にモニターできることであり、CCDカメラで形成した画像はコンピューターでディジタル化及び処理する。いずれの場合も、ただ１つの多機能反応表面を使用し、エバネッセント波により同時に照射する。
反応表面
本発明によると、導波路エレメントの片面に少なくとも１個の部位から構成される反応表面が形成される。実施態様によっては試験部位が単一でもよいが、本発明では複数のこのような部位を使用するのが最良であり、ここでは多重部位デバイスについて説明する。多重試験部位は同一又は異なる特異的結合メンバーを含み得る。「部位」（“situs",複数形“sites"）とは、分析物に特異的な結合メンバーが固定される境界領域（delimited area）として定義され、該境界領域の外側には表面の非部位部分も存在すると解される。固定化された特異的結合メンバーを本明細書では「捕獲メンバー」又は「捕獲SBM」と呼ぶ。好ましくは、部位は小さいスポット又は点であり、非部位部分は部位を包囲している。当然のことながら、他の多数の部位寸法及び構造が可能であり、本発明の範囲に含まれる。部位は線又はバーとして構成してもよいし、文字又は数字、円形、矩形又は三角形でもよいし、例えばコンピューターアイコン又はクリップアートコレクションで一般に使用される任意の図形等の他の任意の図形でもよい。
部位の面積（寸法）は標識した分析物と光散乱粒子を捕獲できるように十分な特異的結合メンバーを固定するに十分な大きさであればよい。これは、後述するように部位の密度に多少依存する。例えば、直径150μｍといった小さい部位面積の使用に成功している（実施例７及び図10参照）。反応表面上の多数の部位を配置して高「部位密度」にする場合にはこのような小さい面積が好ましい。寸法の実際の下限は直径約１μｍである。視覚検出では、拡大せずに検出できるように十分広い面積が望ましく、例えば少なくとも約１〜約50mm2であり、1cm2以上でもよい。製造コストと使用者の便利さを考えなければ寸法の上限はなく、任意の所望の部位寸法又は形状を使用できる。
多重部位デバイスは各部位に同一又は異なるSBMを含み得る。同一の場合には、複数の部位は反復情報を提供するように類似の濃度にしてもよいし、標準に対する半定量又は較正を提供するようにSBMの濃度を変化させてもよい。SBMが異なる場合には、数個の分析物を同時に多重検出するためにデバイスを利用することができる。異なるSBMの特殊な場合では、１個以上の部位を正の対照として使用できる。当然のことながら、多数の部位をもつデバイスでは上記の全組み合わせ（例えば多重化半定量的測定）が可能である。
多重部位デバイスでは、部位は任意の好都合なパターン又はアレーに配置できる。部位間の間隔は後述する検出システムの解像度と、部位を形成するために使用する製法に依存する。製造能力に依存して検出解像度が高ければ高いほど、部位を接近できる。固定化捕獲SBMは、これらのメンバーの各々と流体試料中の対応する結合メンバー及び／又は光散乱標識化メンバーとの個々の反応を別の部位の反応から、近傍の固定化結合対メンバー及びその関連光散乱粒子により実質的に干渉されることなく区別できるように相互に十分に分離すべきである。好ましくは、非部位部分が全ての各部位を明白に分離する。非常に単純なアレーはデカルト格子であるが、線、パターン及び他の図形として多重部位を構成してもよい。多重部位反応表面において、多くの場合は１個以上の部位が正の対照、負の対照、一連の較正標準又はこれらの任意の組み合わせを表す。
１好適部位形態は十字形であり、従って、正の結果の場合に「＋」記号となる。この形態の１変形では、十字形の縦線のみが分析物結合部位であり、＋の横線は分析物の存在から独立したラベルに特異的な結合剤を含む。このような形態はBrownらの米国特許第5,008,080号、発明の名称「固相分析装置及び該装置の使用方法」に記載されている。この変形例の形態は分析物の有無に関係なくマイナス「−」記号を発生し、分析物が存在する場合にはプラス「＋」記号を発生することによりアッセイの検証として機能する。「＋／−」検証形態以外に、引用特許に開示されているようにこの変形例の他の形状も可能である。
図2A〜2Cの２面デバイスでは、チャネル48に向き合う導波路エレメント34の表面38に反応表面60を形成するのが好ましい。図2C参照。こうすると、反応表面全域に毛管流を可能にすることにより、試料及び／又は光散乱ラベル試薬と反応表面の部位との接触を助長できる。チャネルの一端に紙等の吸収性又は吸湿性材料を使用することにより流れを強化することができる。しかし、当然のことながら２面デバイスは１実施態様に過ぎない。単一の二次元導波路エレメントも使用することができ、片面を反応表面で覆う。しかし、試料及び光散乱ラベル試薬との接触を助長するために、反応表面を上向きにする必要はない。その場合には、所望によりミラーを使用してエバネッセント波内の光の散乱を下側から観察すればよい。
特異的結合メンバー及び反応表面への固定
本発明の方法では、まず１個以上の捕獲メンバーを光導波路の表面に固定して反応表面を形成する。特異的結合メンバー（「SBM」）は同系結合対（cognate binding pair）の一方のメンバーである。「同系結合対」とは、一般にイオン吸引、水素結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用等の非共有結合相互作用を介して相互に特異的に結合する任意のリガンド−レセプター組み合わせである。同系対及び相互作用の例は当該技術分野で周知であり、非限定的な例としては、抗体又はFabフラグメントとその抗原、ハプテン又はエピトープとの間の免疫相互作用；タンパク質（例えばホルモン又は酵素）とそのレセプター（例えばアビジン又はストレプトアビジンとビオチン）、又は炭水化物とレクチンとの間の生化学的相互作用；金属とキレート剤との間等の化学的相互作用；及び相補的核酸鎖間の核酸塩基対合が挙げられる。最近報告された特異的結合メンバーは、BuchardtらのWO92/20702号及びWO92/20703号と、Flam,Science,262:1647,（1993）に記載されているペプチド核酸類似体即ち「PNA」であり、核酸又は他のPNAと同系結合対を形成する。核酸は2'−デオキシリボ核酸（DNA）及び、安定性が許容できるときには、リボ核酸（RNA）を含むことが理解されよう。
抗体SBMの製造は旧来から周知の技術であるので、詳述には及ばない。要約すると、免疫計画に従って動物を所望のハプテンで免疫又は攻撃する。多くの場合には、BSA等の担体分子にハプテンを結合して認識を助長する。適切な時間後、動物から採血して抗体を抽出する。あるいは、腹水液から抗体を採取してもよい。所望により今日の慣用法であるKohlerとMilstein,Nature,256,495（1975）の方法を使用すると、高度に特異的なモノクローナル抗体を製造することができる。抗体は結合反応に使用され得る多数のアミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基をもつ。
オリゴヌクレオチドSBMの合成も常套方法であり、ABI480等の自動合成器を使用する。これらの装置は約75〜100塩基までの長さのほぼ任意の所望の配列のオリゴヌクレオチドを製造できる。所望により、公知クローニング技術又は短いセグメントを合成してアセンブリすることにより、もっと長いポリヌクレオチドも製造できる。所望により、結合に備えて末端アミン又は他の反応基でオリゴヌクレオチドを修飾してもよい。Goodchild,Bioconjugate  Chemistry,1（３）:165−187（1990）には、多少古くなったが依然として有用な結合化学の報告が記載されている。
SBMは当該技術分野で公知の化学結合手段を介して導波路に共有結合することができる。添加した（applied）SBMと後で所定の条件下で安定な共有結合を形成する種々の化学的反応基で反応表面を直接誘導体化してもよい。あるいは、添加したSBMと後で共有結合を形成する、デキストラン又はPEG等の化学的誘導体化ポリマーで反応表面をまず被覆してもよい。ある種の洗剤を反応表面に被覆し、インシトゥで誘導体化してSBMと反応させてもよい。例えば、ガラス及び石英導波路は、リンカーを介して特異的結合メンバーと結合することができる反応性ヒドロキシル及びシロキシ基に活性化可能な基を含む。このようなリンカーとしては例えば公知ホモ及びヘテロ二官能価リンカーが挙げられる。
当然のことながら、結合メンバーの特異的結合性を失わないようにSBMを反応表面に結合することが好ましい。例えば、米国特許第5,191,066号（Bieniarzら）に教示されているように抗体はそのFc部分を介して結合することができ、オリゴヌクレオチドは末端アミン又は他の官能基を介して結合することができる。Ruthの米国特許第4,948,882号により教示さているようなリンカーアームを塩基部分の「立体耐性」部分に配置すると、ハイブリダイゼーション能を失わずに固相との結合を助長することができる。更に別の方法では、物理的吸着により反応表面をストレプトアビジンで被覆した後、ビオチン標識化結合対メンバーと反応させ、十分な特徴をもつ生物学的反応表面を形成することもできる。
より最近では、WO92/10092号（Affymax  Technologies,N.V.;Fodorら）に写真平版法を使用して固体支持体上でオリゴヌクレオチドを直接合成する方法が記載されている。
出願人らが驚いたことには、捕獲SBMは反応表面に共有結合する必要がない。SBMはタンパク質コーティング層を使用して表面に吸着又は結合することができる。捕獲SBM（例えばDNA）及びラベルSBM（例えば抗体）を適切に固定する種々の非共有結合力がDNAハイブリダイゼーション力よりも安定であるという知見は多少予想外であった。しかし、これは条件の偶然の選択も一因であり、即ちDNAの融点を比較的低くできるイオン強度を選択したためである（実施例参照）。（イオン強度を増加することにより）DNAデュプレクスが鎖内でもはや弱い結合でなくなるような点まで融点を上昇させることも可能である。
反応表面上の捕獲SBMの密度（単位面積当たりの量）はシステムの感度と正の相関がある。オリゴヌクレオチドSBMを使用すると、本明細書に記載するスポット法により１μm2当たり約5000個のDNA分子に達することができる。他のチップ製造法、例えば上記写真平版法では他の密度が得られる。核酸SBMの推定理論最大密度は約250,000分子／μm2である。しかし、この密度のチップに達せられると考えられず、達したとしても立体的制約により最適性能は得られないと思われる。最良の感度に対する最適な密度に達するには、拡散動的要件と立体要件を考慮しながら、単位面積当たりの結合部位の数の最大化とこのような部位への接近の最大化の兼ね合いが必要である。
捕獲SBMを反応表面に加えるには任意の慣用手段により実施できる。例えば、マイクロピペットマイクロ毛管をマニュアルで使用して反応表面に捕獲メンバーをスポットしてもよい。しかし、簡便性、再現性及び費用節約のためにはこの方法を自動化することが好ましい。常套スクリーニング適用等の大規模試験でアッセイを使用する場合には特に機械化添加（mechanized application）が望ましい。自動添加法としては例えば容量形ポンプ、Ｘ−Ｙポジショニングテーブル、及び／又はインクジェット噴霧もしくは印刷システム等が挙げられる。
適宜、SBMを最初に溶液に加えて試料を反応表面に付着し易くしてもよい。この目的に適した溶液は、乾燥後にSBMが実質的にその特異性（即ち特異的結合性）を維持し、エレメントの屈折性を有意に妨げないという一般要件だけを満たせばよい。溶液の付着量は溶液中のSBMの濃度に依存する。理想的には、小液滴（約２μｌ）が所望量のSBMを含むように、約0.5〜500μＭの濃度範囲の溶液を調製する。典型的には、低濃度のSBMを繰り返し添加し、SBMを浪費しないようにすることが好ましい。近傍部位に重複して添加しないように注意しながら十分なSBMが得られるまでこれを繰り返す。所望により、特異的結合性を妨げないものという条件で架橋剤を加えて捕獲部位のSBMの量を増加してもよい。
SBMを反応表面の１個以上の部位に堆積した後、メンバーを乾燥させて反応表面に固定させる。好適乾燥方法は蒸発であり、室温（約25℃）で実施することができる。所望により、捕獲メンバーが対応する結合対メンバーと特異的に相互作用する能力を有意に妨げないという条件で、高温で蒸発させてもよい。例えば、固定化捕獲SBMがタンパク質である場合には、非変性温度を使用すべきである。
捕獲SBMを反応表面に固定するのに加え、試験しようとする流体試料中の分析物結合メンバーと反応表面の非特異的相互作用を阻止するように反応表面を処理するのが好ましい。反応表面にタンパク質SBM（例えば抗原、抗体又はPNA）を固定する場合には、ブロッキング剤はSBMの固定後に添加すべきである。適切なタンパク質ブロッキング剤はカゼイン、ゼイン及びウシ血清アルブミン（BSA）である。他のブロッキング剤としては洗剤や長鎖水溶性ポリマーも利用できる。ブロッキング剤は水溶液又は緩衝水溶液として反応表面に添加すると好都合である。ブロッキング溶液は第１の捕獲SBMの固定後の任意の時間に反応表面に添加することができる。核酸SBMの場合には、ブロッキング剤はSBMの固定前に添加してもよいし、固定後に添加してもよい。適切なブロッキング剤としては、上述のものや、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）及び１〜５倍Denhardt溶液（１倍Denhardt溶液は0.02％Ficoll、0.02％ポリビニルピロリドン及び0.2mg/mlBSAからなる）が挙げられる。
カゼインはDNAと抗体SBMの両者に好適なブロッキング剤であることがわかっており、Sigma  Chemical,St.Louis,MO（カタログ番号Ｃ−3400）から市販されている。カゼインは「準可溶性（mela−soluble）」タンパク質（例えば参考資料として本明細書の一部とするChingらの米国特許第5,120,643号参照）として知られる類のタンパク質に属し、可溶性を高めるためには化学的処理が必要である。このような処理は酸又はアルカリ処理を含み、無傷のタンパク質の分解及び／又は部分的加水分解を生じると考えられる。他の準可溶性タンパク質としては、ゼイン（Sigmaカタログ番号Ｚ−3625）と非アルブミン卵白タンパク質（Sigmaカタログ番号Ａ−5253）が挙げられる。カゼインは約23,600（ウシβカゼイン）の分子量をもつ乳タンパク質であるが、本明細書で「カゼイン」又は「アルカリ処理」カゼインという場合には、いずれも米国特許第5,120,643号の実施例１に記載されているアルカリ処理により得られる部分加水分解混合物を意味する。こうして処理したカゼインの電気泳動ゲル（20％ポリアクリルアミドTBE）は、このマーカーよりも下の拡散バンドを示し、主に15,000未満の分子量をもつフラグメントの混合物であることを示す。
ブロッキング剤、特にカゼインは実施例に記載する「シーティング（sheeting）」作用を助長する疎水性を表面に与えると予想される。「シーティング」は表面に加えた水が多数の小液滴よりもむしろ１つの凝集液滴としてエレメントに与えられるときに生じる。しかし、コーティングの均質性はその疎水性よりも重要であると考えられる。実施例１のようにチャネルデバイスに形成したエレメントは好ましいことにこのようなシーティング作用を示す。これはチャネル内の流動及び拡散を助長すると考えられる。
第１の特異的結合メンバーは所望により付加的な同系対を介して分析物に特異的であり得ると理解すべきである。例えば、オリゴヌクレオチドSBMをビオチン化し、ビオチン−アビジン同系結合対を介して反応表面に結合することができる。このような結合はHansenによりEP  ０  139  489号（Ortho）に記載されている。同様に、Stabinskyにより米国特許第4,751,177号（Amgen）に開示されているようにメディエータープローブを介してオリゴヌクレオチドを反応表面に結合することもできる。中間同系結合対を使用する場合には、（反応表面の）界面から光散乱ラベルまでの合計距離が侵入深さをさほど上回らないように注意しなければならない。この点で、免疫グロブリン抗体の直径は約5nmであり、DNA20量体（βヘリックス形）の長さは約6.8nmであると推定されている。従って、典型的な200〜300nmの侵入深内に多重同系対の為の余地が残される（発生の背景の項参照）。同系結合相互作用は、用途によっては高温も含み得る後続反応条件に耐えなければならないことも理解すべきである。オリゴヌクレオチドが長いほど又はGC含量が高いほど安定であり、この場合には好ましい。
光散乱ラベル
本発明の別の重要な要素は光散乱ラベル又は粒子（「LSL」）である。LSLは入射光を弾性的に散乱、即ち光エネルギーを実質的に吸収せずに散乱させる分子又は材料であり、多くの場合には粒子である。LSLの例としてはコロイド金属及び非金属ラベル（例えばコロイド金又はセレン）、赤血球、並びにラテックス、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート又は類似の材料から製造された染色プラスチック粒子が挙げられる。このような粒状ラベルの寸法は10nm〜10μｍ、典型的には50〜500nm、好ましくは70〜200nmである。粒子が大きいほど光散乱効果は大きいが、これは結合及びバルク溶液粒子の両者について言えることであるので、バックグラウンドも粒度と共に増加する。適切な粒子LSLはBangs  Laboratories,Inc.,Carmel,IN,米国から市販されている。
本発明では、LSLを第２の同系結合対の第１の特異的結合メンバーに結合する。第２の特異的結合対メンバーを「ラベルSBM」と呼び、LSLとラベルSBMの複合体を「ラベル結合体」又は単に「結合体」と呼ぶ。ラベルSBMの性質及び特異性はアッセイのフォーマットに依存する。競合アッセイフォーマットでは、ラベルSBMは分析物の類似体であり、分析物と競合して捕獲SBMに特異的に結合する。直接サンドイッチアッセイフォーマットでは、ラベルSBMは分析物上の第２のエピトープに特異的である。このため、分析物を捕獲SBMとラベルSBMの間に「サンドイッチ」することができる。間接サンドイッチアッセイフォーマットでは、ラベルSBMは分析物に結合した部位又はリポーター基に特異的である。例えば、抗原分析物が捕獲されたら、ビオチン化抗体を使用して分析物を「サンドイッチ」し、ビオチン特異的ラベルSBMを使用する。この間接サンドイッチフォーマットは核酸にも有用である。この場合には、捕獲SBMは標的に相補的なオリゴヌクレオチドであり、標的は特異的結合リポーター分子（例えば、典型的にはLCR又はPCR等の増幅法により取り込まれたビオチン又はハプテン）を含み、ラベルSBMはリポーター基に特異的となるように選択される。
当然のことながら、ラベルSBMは捕獲SBMの場合と同様の中間同系対を介してそのそれぞれのパートナー（フォーマットに依存して分析物又は第１のSBM）に特異的であり得る。例えば、分析物がハプテンリポーター基をもつ増幅産物等のオリゴヌクレオチドである場合には、サンドイッチアッセイフォーマットは抗ハプテン抗体に結合したLSLを含む。従って、ラベルSBMはハプテン−抗ハプテン同系結合対を介して分析物に特異的である。核酸中間同系対の１例はSchneiderら，米国特許第4,882,269号（プリンストン大学）に記載されている。ラベルSBMでも捕獲SBMと同様に界面からの距離と同系対の安定性を考慮すべきである。
アッセイフォーマットに関係なく、ラベルSBMは光散乱ラベルに結合して結合体を形成しなければならない。捕獲SBMと同様に、ラベルSBMもLSLに共有結合していてもよいが、必ずしもその必要はない。粒状LSLにラベルSBMを物理的に吸着させてもよい。この場合には、例えば洗浄段階又は他の流体流動によりLSLを実質的に損失せずに後続反応条件に耐えるに十分な強さに結合すればよい。
LSLとラベルSBMを結合するのに適した共有結合法は多数のものが文献に記載されている。例えば、標準合成化学によりアミノ基をラベルSBMに導入することができる（例えばGenosys  Biotechnologies,Inc.,The  Woodlands,TX,米国の市販品）。アミン修飾SBMに共有結合するためにLSLを活性化する化学物質の非限定的な例は臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はカルボジイミドである。W.H.Scouten著AFFINITY  CHROMATOGRAPHY,1981,John  Wiley  ＆  Sons及びW.H.Scouten著SOLID  PHASE  BIOCHEMISTRY,ANALYTICAL  AND  SYNTHETIC  ASPECTs,1983,John  Wiley  ＆  Sonsにはこのような活性化技術が記載されている。場合により、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミドを用いる場合にはLSLは表面カルボキシル基を含まなければならず、臭化シアンで活性化する場合にはLSLは表面ヒドロキシル基を含まなければならない。周知のヘテロ及びホモ二官能価リンカーもこのような共有結合に利用することができる。LSLとして使用するのに適した化学基及び直径をもつLSL粒子は数種の商業源から得られる（例えばBangs  Laboratories,Inc.,Carmel,IN,米国）。結合特異性を改善するためにストリンジェントな条件が必要なシステムではラベルSBMのLSLへの非共有結合吸着が妨げられる恐れがあるので、このようなシステムではLSLをラベルSBMに共有結合すると有利であると思われる。
吸光材料
本発明の１好適態様では、試料とラベル結合体の混合物に吸光材料（「LAM」）を加える。LAMは迷光が光散乱反応に干渉しないようにすることを目的とする。迷光は主に反射界面の微視的欠陥と、侵入深さに移動し且つ結合していない粒子によるエバネッセント波の散乱によって生じる。LAMはバルク溶液に分散すると、（従来技術のように）不透明層を形成するために同一材料を表面に被覆する場合よりもこのような迷光の効果を良好に吸収及び最小化する。LAMは少なくとも15、好ましくは＞100、最も好ましくは300以上の最終有効光学密度（「O.D.」）を提供すべきである。「有効」O.D.は入射光の波長を考慮し、単色光の波長のO.D.と多色光の最も主要な波長のO.D.である。
適切なLAMとしては結合体自体と多数の吸光染料が挙げられる。吸光染料は、理想的には光源の波長に対応する波長で電磁スペクトルからエネルギーを吸収する任意の化合物である。当該技術分野で公知の通り、染料は一般に、例えばアゾ染料、ジアゾ染料、トリアジン染料、食品着色剤又は生物染料等の分類の染料のように共役複素環構造から構成される。特定染料としては、クーマシーブリリアントブルーＲ−250染料（Biorad  Labs,Richmond,CA）、リアクティブレッド２（Sigma  Chemical  Company,St.Louis,MO）、ブロモフェノールブルー（Sigma）、キシレンシアノール（Sigma）及びフェノールフタレイン（Sigma）が挙げられる。Floyd  J.Green著Sigma−Aldrich  Handbook  of  Stains,Dyes  and  Indicators,Aldrich  Chemical  Company,Inc.（Milwaukee,WI）刊には、他の染料の多くのデータが記載されている。これらのデータに基づき、光源により発生される波長に一致するように適当な吸光性をもつ染料を選択することができる。
これらのLAMはLSLへのラベルSBMの吸収を妨げず、又は固定化ラベルSBMの特異性を妨げないものが好ましい。例えば、ラベルSBMがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である場合には、LAMはペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を変性しないことが好ましい。同様に、ラベルSBMがヌクレオチド配列である場合には、LAMはヌクレオチド配列を変性しないことが好ましい。吸光性に基づいて選択した染料を実験により評価し、染料が導波路アッセイの実施に必要な特異的結合事象を妨げないようにすることができる。
驚くべきことに、結合体自体もLAMとして機能し得る。必要濃度を上回るラベル結合体、例えば少なくとも15、好ましくは＞300、最も好ましくは＞500の有効O.D.を提供するような濃度を使用しても検出を改善できることが判明した。結合体の濃縮方法としては、実施例２及び３に記載するようなアフィニティー精製又は遠心分離が挙げられる。染料を濃縮結合体と併用してもよいが、高濃度の結合体は通常は単独で十分であることが判明した。ラベルの添加量を増して信号対雑音レベルを改善するこの現象は、診断アッセイでは実質的に前代未聞であり、一般の考えに全く反するものである。
LAMは本発明の選択的態様であるが、その使用により、より高濃度のラベル結合体、より高強度の光及びより大きいラベル粒子を使用できるようになり、これらはいずれも吸光材料を含まないシステムよりも性能を著しく改善する。LAMを使用する効果の増大は、公知の従来技術の方法よりも迷光の光源に著しく近い点で迷光を除去するためであると推測される。反応表面に対向する導波路表面にコーティングしても、この表面に到達する迷光しか吸収することができない。溶液中の迷光は依然として望ましくない散乱を生じ得る。
使用方法
本発明によるアッセイ方法は上記のようなTIRエレメント又は導波路を利用し、競合アッセイフォーマット及び直接又は間接サンドイッチアッセイフォーマットを含む。図３は間接サンドイッチフォーマットを示す。
まず最初に、少なくとも１個の捕獲SBMを界面64で反応表面の１個以上の部位に固定したTIRエレメント又は導波路62を上述のように作成する。捕獲SBMは分析物に特異的である。図３ではSBMは捕獲オリゴヌクレオチド（66に示す）であり、配列5'−AGTGGAGGTCAACGA（配列番号３）をもち、界面64に固定されている。非部位部分により空間的に分離された別個の部位に多数のSBMを固定すると好ましい。
サンドイッチフォーマットでは、次に分析物の存在又は量を試験しようとする流体試料を反応表面上の捕獲SBMと接触させる。この方法段階の唯一の一般要件は、空間的に分離して固定したSBMに試料を直接接触させて分析物と捕獲SBMを結合させることである。本発明の方法では、反応表面と接触させた後に流体試料を温和に混合することも好ましいが、必ずしもその必要はない。このような混合は流体試料と固定化SBMの緊密な接触を確保するのに役立つ。混合する代わりに、反応表面に試料流体の毛管流を流しても分析物と捕獲SBMとの良好な接触及び結合を助長できる。
次に、結合条件下でラベル結合体も反応表面と接触させる。ラベル結合体は分析物（又は分析物に結合したリポーター基）と結合して反応表面又はその近傍に光散乱特異的結合複合体を形成する。サンドイッチフォーマットでは、場合により反応表面を試料又は結合体のいずれかと接触させる前に試料と結合体を混合してもよいし、上記２段階法を使用してもよい。所望により、LAMを使用して結合体又は試料−結合体混合物に加えることにより方法を実施してもよい。
図３によるとラベル結合体は抗ビオチン抗体70を固定した光散乱コロイドセレン粒子68から構成される。分析物は72に示すオリゴヌクレオチド5'−TCGTTGACCTCCACT（配列番号12）であり、ビオチン（「Bi」）リポーター基74で標識されている。オリゴヌクレオチドの相補性とビオチンに対する抗体特異性により、LSLは導波路の侵入深さ76内に保持される。
このようなリポーター基を試料核酸に組込む方法は多くのものが知られている。例えば、PCRやLCR等の方法を使用し、プライマーにリポーターを担持させて試料を増幅してもよい。あるいは、リポーターを個々のヌクレオチドトリホスファートに結合した後、試料から作成したエクステンション産物に組込んでもよい。この組込み法はPCRでもGap  LCRとして知られるLCR変法でも実施される。
次に、内部全反射を生じるようにエレメントを照射する。TIRの光源及び物理的原理については既に述べた通りである。図３ではエバネッセント波の散乱を78に示す。迷光を少なくするためにスリットを使用すると好ましい。光散乱特異的結合複合体が形成された部位では、光の散乱は非部位部分の暗いバックグラウンドに対して明るい領域として観察される（例えば図４〜8A及び９〜12参照）。部位が明るければ明るいほどその部位には多量のLSLが結合しており、多量の分析物が存在する。この方法を使用し、グレートーン（gray tones）をコンピューターに読み込ませ、カリブレーターを使用して各部位に存在する分析物の量を推定することにより定量又は半定量することができる。競合フォーマットでは、TIRデバイスと反応表面は上記と同様である。他方、LSLは捕獲SBMに関して試料分析物と競合する分析物類似体である。従って、スポットの明度は分析物の量に反比例する。このフォーマットでは、試料と結合体のいずれか一方を反応表面と接触させる前に相互に混合しなければならない。サンドイッチフォーマットと全く同様に競合フォーマットでもLAMが有用である。
「前縁（leading edge）」又は「シャドウイング」などと種々の呼称で知られている現象は本発明では問題とならないことを指摘すべきである。この現象は下流部位のラベルの結合が上流部位の結合よりも弱いクロマトグラフィー流装置で見られる。実施態様によっては流路を使用することもあるが、LSLの結合を制御する要素が主に拡散であってクロマトグラフィーではないことがこの現象が回避される主因である。
従来技術のように光ビームを個々の部位に逐次当ててエバネッセント波の小さい発生地点を形成することにより本発明のデバイスを使用することも可能であるが、導波路全体を一度に照射し、反応表面全体の全域にエバネッセント波エネルギーを形成するほうが断然好ましい。このように反応表面全体を同時に照射すると、全部位を同時に試験及び比較することができ、従って、従来可能であったよりも著しく迅速に検出することができる。本発明のシステムの主要な利点の１つは、リアルタイム結合及び／又は解離の動的変化を観察することができ、約数秒、好適実施態様では例えば１〜20秒以内に可視信号を発生できることである。導波路反応表面全体を一度に観察（及び／又は検出）でき、全体を同時に照射することができるので、入射光を照射するため又は散乱光を検出するために各部位を走査する必要がなく、部位のLSLの蓄積をリアルタイムで観察することができる。
TIRに関する従来の教示に対してこの知見は多少予想外である。典型的には、TIRエレメントの検出器は光がエレメントから出てくるにつれて集光できるようにエレメントの出口に配置される。エレメントから出る光は結合事象により変化したと常に考えられていた。実際に、結合事象による光のこのような変化なしに出口光を用いる検出は不可能であった。従って、光は結合事象により何らかの方法で変化すると予想される。このため、光が第２の結合部位にあたったときに同様に挙動すると保証することができず、従って、このような教示の下では多重部位エレメントを共通光源により同時に照射することはできないと考えられていた。本発明は、（光源に関して）下流部位の内部全反射光が上流部位の結合現象によって干渉されないことを意外にも見出した。
更に、種々の条件が変化するにつれて結合の程度又は範囲をリアルタイムでモニターすることができる。例えば、SBMが鎖対合を形成できるようにしたオリゴヌクレオチドであり、変化する条件がストリンジェンシーである場合には、核酸の鎖の解離（その結果、LSLが遊離してバルク溶液に移動し、エバネッセント波エネルギーを散乱できなくなる）は部位の明点の損失として実際に観察することができる。当該技術分野で公知の通り、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは温度やイオン強度等のパラメーターを変化させることにより制御することができる。温度が増加するとストリンジェンシーは増加し、デュプレクスは不安定になる。この方法には慣用加熱ブロックを使用することができ、上記好適２プレートデバイスを加熱ブロックに載せるだけでよい。溶液相の融点と良好な対応を示すオリゴヌクレオチドの融解温度（Tm）が得られる。水で希釈するなどして有効カチオン濃度を低下させてもストリンジェンシーは増加する。従って、本発明の導波路及び方法は、オリゴヌクレオチド融解温度のリアルタイムモニターメカニズムを提供する。こうしてストリンジェンシーを制御することにより、たった１塩基でもミスマッチを含む鎖から完全に相補的な鎖を区別することができる。このようなシステムは遺伝子配列決定及び診断に極めて有用である。
オリゴヌクレオチド対の代わりに抗体とハプテンを使用することにより、抗体−ハプテン相互作用に影響する条件変化も同様に評価することができる。例えば、温度が増加するとタンパク質結合因子（例えば抗体）が変性し、その結果、結合能が失われる。本発明を使用すると、タンパク質のこの変性をリアルタイムでモニターすることができる。留意すべき点として、分析物と捕獲SBMとの結合がモニターされる解離事象であるように、SBMを導波路表面に保持するか又はLSLをラベルSBMに結合するのに使用する全ての同系結合対はこのような条件の変化に耐えられることが好ましい。
着目すべき点として、本発明の別の利点は、検出を可能にするために捕獲部位から試薬及び試料（例えば結合体−試料溶液）を洗い流す必要がないことである。蛍光及び放射性ラベルを用いる場合には、望ましくない信号を防ぐために未結合ラベルを表面から除去しなければならない。しかし、本発明の未結合LSLは一般に侵入深さから拡散し、物理的に除去しなくても信号を発生しなくなる。表面から未結合成分を洗浄する必要がないため、アッセイを実施可能な速度が著しく増す。
融解温度測定の独自の反転では、本発明のデバイス及び方法を校正温度計として使用して導波路の正確な温度をモニターするか、又は製造品質管理として使用して熱伝達の均質性をモニターすることができる。温度計としては、既知増分で増加する融解温度をもつ一連のオリゴヌクレオチド対を反応表面上の一連の部位に配置する。温度が増加するにつれ、まず最低融解温度の対が解離し、次いで融解温度の順に後続対が解離する。反応表面の温度は、これらの校正オリゴヌクレオチドの融解温度を知ることにより測定することができる。オリゴヌクレオチド対を既知融解温度の順に直線アレーに配置するならば、「段階様（ladder−like）」効果が得られる。
更に、導波路全体を同一融解温度のオリゴヌクレオチドで被覆するならば、品質管理環境で熱伝達の均質性を評価することができる。加熱が均質であるならば全部位で同時に解離が生じる筈である。このようなチップを使用して加熱ブロックが「熱点」又は「冷点」を生じる変化を示すか否かを判定することができる。
散乱光の検出
上記に言及したように、散乱光は視覚的又は光電手段により検出することができる。視覚検出の場合には、観察者の目と脳が特定部位の散乱の有無を決定する画像処理段階を実施する。部位が周囲のバックグラウンドよりも明るい場合に散乱が観察される（例えば実施例に関連する図参照）。部位の数が少ない場合、恐らく12以下の場合には、処理段階はほぼ同時に実施することができる。部位数が多い（数百以上）場合には、光電検出システムが望ましい。
光電検出システムは、部位の光強度により変調される電気信号を使用する任意のシステムを含む。例えば、フォトダイオード、電荷結合デバイス、フォトトランジスター、フォトレジスター及び光電子増倍管が適切な光電検出デバイスである。反応表面上の部位のアレーに対応するようなアレー状に検出器を配置し、一部の検出器は非部位部分に対応するように配置すると好ましい。しかし、電荷結合デバイス（CCD）カメラを市販フレームグラビング（frame grabbing）及び画像処理ソフトウェアと組み合わせるなどして反応表面をディジタル表示すると一層好ましい。
CCDカメラ、フレームグラバーカード（frame grabber cards）、コンピューター及び画像処理ソフトウェアのいくつかの使用例は、参考資料として本明細書の一部とする本願と同一名義の1993年10月21日付け同時係属米国出願第08/140,838号に記載されている。要約すると、CCDカメラ又はビデオカメラは全部位及び非部位部分を含む反応表面全体の画像を形成し、この画像をコンピューターのフレームグラバーカードに供給する。画像は、数値を各画素に割り当てることによってフレームグラバーによりディジタル情報に変換される。ディジタルシステムはバイナリー（例えば明＝１及び暗＝０）でもよいが、８ビットグレースケール（gray scale）のほうが好ましく、ゼロ（０）が黒画像を表し、255が白画像を表し、中間の値が各画素の種々のグレーの色相を表すように数値を各画素に割り当てる。
ディジタル情報はモニターに表示してもよいし、その後の操作に備えてRAM又は任意の記憶装置に記憶してもよい。２種の操作について述べる。まず第１に、ディジタル化データファイルをソフトウェア製図アプリケーションに変換及びインポートすることができる。こうすると、図４〜７、8A及び９〜12を作成するために実施例で生成したビデオ画像で行ったように、記録の（archival）目的で画像を印刷することができる。適切な製図アプリケーションはPublishers  PaintBrushソフトウェア（ZSoft  Corp.,Atlanta,Georgia）であり、この他にも多くのソフトウェアパッケージが「生」、TIFF、GIF、PCX、BMP、RLE及び他の多くを含む多種のファイルフォーマットでファイルインポートを受理又は変換する。印刷及び記録の操作では、画像の正しく忠実な表示が得られるように変換及びインポーテーションはデータの内容を変えるべきでない。
第２に、画像処理ソフトウェアを使用してディジタル情報を分析し、各部位の境界又は輪郭と各部位の強度の平均又は代表値を決定することができる。強度は部位に存在するLSLの量と正の相関があり、LSLの存在量はこのような部位における分析物結合メンバーの量と（アッセイフォーマットに依存して負又は正の）相関がある。このようなデータ操作は実施例２及び５に実証し、図8B及び8Cが得られた。
同一部位の多重画像を蓄積し、経時的に分析することもできる。反復画像については導波路又はTIRエレメントを多重回数照射するか、又はより一般には画像が各所望時刻に形成されるまで単に照明を維持する。第１の時刻t1の光散乱を第２の時刻t2の散乱に比較することにより、動的情報が得られる。光散乱量の増減の時間依存性（即ち速度）は任意の所要の反応時点の反応による合計散乱量よりも流体試料中に存在する結合対メンバーのレベルを正確に表すことができるので、この動的情報はアッセイが定量を目的とする場合に特に有用である。更に、多重画像を使用すると、検出された散乱光の増加が時間に関する既知関数となるようなデータセットが得られる。反応表面の所与の領域からの散乱光の強度の経時的変化率を測定することにより、反応速度が得られる。反応動力学を使用することにより、速度を試料溶液中の分析物濃度の定量値に相関させる。当然のことながら、３回以上データを集めてもよく、一般には多くのデータ点を獲得するほど動的即ち速度情報の信頼性は増す。
反応動力学の代わりに別の方法も使用できる。この方法では、散乱光強度を時間に対して積分する。この積分により得られた面積は溶液中の分析物の濃度に相関する。
以下、詳細な実施例により本発明の種々の態様を示す。実施例は例示の目的に過ぎず、発明を制限するものではない。
実施例
実施例1.染料LAMを使用したhCGイムノアッセイ
A.導波路への捕獲SBMの結合
本実施例で使用した導波路はCorningから市販されている抗体被覆標準ガラスカバースリップ（Corning,N.Y.;カタログ＃2,22mm平方）であった。少量（約２μｌ）の抗体溶液（例えばアフィニティー精製ヤギポリクローナル抗−βhCG,10mMリン酸塩,pH7.4,120mM  NaCl）をほぼ円形の規定領域に付着させることにより、ガラス導波路に反応表面を形成した。ストック抗体濃度は3.3mg/mlであり、直接使用するか、又は塗布前に抗体を１％スクロース（水に溶解した１％重量／容量［w/v］スクロース）に1:10に希釈した。いずれの場合も、導波路の表面に保持できるタンパク質の量よりも過剰の抗体を付着させ、この過剰の抗体を水洗して乾燥した。
抗体を導波路に固定後、ガラス表面を0.05％アルカリ処理カゼイン水溶液で処理し、ガラス表面と流体試料中の物質との非特異的相互作用を阻止した。表面を覆うに十分な容量の0.05％カゼイン溶液を室温で１〜５分間インキュベートした後、洗壜を使用してガラスを水洗した。カゼインは物理的吸着によって表面を被覆し、その結果、「シーティング作用（sheeting action）」を示す表面が形成された。即ち水流を慎重に当てることによりチップ表面の全水が重力流により除去された。
B.デバイスの組み立て
アッセイ試薬を収容するデバイスは、図2A〜2Cに示すような２枚のガラスカバースリップから構成した。一方のカバースリップ（導波路）には結合捕獲SBMを収容し、別のガラスカバースリップは試料−結合体溶液を保持するチャネルを形成するようにした。２枚のカバースリップをずらして両面テープ（Arcare  7710B,Adhesives  Research  Inc.,Glen  Rock,Penn）で張り合わせ、幅16mm及び厚さ約75μｍ（両面テープの厚さ）のチャネルを形成した。形成されたチャネルは容量約25μｌを保持する。
C.導波路の照射
次に約2mmのスリット開口部（aperture）を備える150ワット白熱電球からなる光源で導波路を照射した。導波路を光源スリットに挿入し、導波路の厚さ2mmの受光縁部に光が当たるようにした（図2A参照）。導波路はマスクに対して約45゜となるようにスリットに挿入したが、入射光の角度を最適化したり、臨界角未満でエレメントに当たる光を除去するようにはしなかった。
D.試料、光散乱結合体、吸光染料の添加
次に、試料、光散乱結合体及び吸光染料を含む溶液を反応表面に加えて捕獲部位を覆った。結合体は、コロイドセレン粒子（Yostらの米国特許第4,954,452号）を使用して次のように調製した。セレンコロイド（546nmの吸収最大波長で32O.D.濃度）1mlをモノクローナル抗αhCG抗体（PBS中1mg/ml）2.5μｌ及び20％BSA（20g/100ml水溶液）30μｌと10秒間混合した。次にセレン結合体10μｌをhCGカリブレーター（Abbott  Laboratoriesの製品hCG−Urine  Controls（Abbott  Park,IL;カタログ＃3A28−02））40μｌに加えた。最後に青色McCormick食品着色染料（McCormick,Hunt  Valley,MD）２〜３μｌをこの混合物に加え、630nmで140〜200の最終O.D.とした。
E.光散乱信号の検出
エバネッセント光波と光散乱ラベルとの相互作用により誘導される散乱光は視覚的又は標準ビデオ分析システムにより検出することができる。視覚検出の場合には、信号は約１分以内に観察され、５分以内に非常によく見えるようになる。この視覚信号を標準８ビットCCD（電荷結合デバイス）カメラ（Cohuモデル4815  Cohu,Inc.,San  Diego,CA）で記録した。Compac  DeskPro  386/20e（Compaq  Computer  Corporation,Houston,TX）でフレームグラバー（Imaging  Technology  Incorporated,PC  VISION  plsu  Frame  Grabber  Board;Woburn,Mass）を使用して画像のディジタル表示を生成した。ディジタル化画像データファイルをPublishers  PaintBrushソフトウェア（ZSoft  Corp.,Atlanta,Georgia）に変換及びインポートし、300dpi解像度プリンターで画像を印刷した。印刷画像を図４に示す。
実施例2.改善hCG導波路アッセイ
A.アッセイ構成
セレン結合体を次のように30倍に濃縮した以外は実施例１に記載した通りにアッセイを実施した。546nM光で32O.D.のセレンコロイド10mlを抗hCG（1mg/ml、実施例１に記載）25μｌ及び20％BSA（実施例１参照）300μｌと混合した。得られた溶液を２本の6ml容量遠心管に入れ、遠心機モデルCentra−4B（International  Equipment  Company,Needham  Heights,MA）を使用して5,000R.P.M.で10分間遠心分離し、セレン結合体をペレット化した。淡黄色の上清約9.66mlを除去すると、撹乱されずに濃赤色のセレンペレットが残った。セレン結合体ペレットを残りの上清0.33mlに再懸濁して合わせた。hCG「試料」は、それぞれ250、50及び0mIU/mlのhCGを含有するAbbott  Laboratoriesから入手したhCG−Urine高陽性、低陽性及びゼロ対照（Abbott  Park,IL;カタログ＃3A28−02）であった。更に、非特異的結合を阻止するブロッキング剤として10％カゼイン（100mM  Tris,pH7.4,150mM  NaCl,10％w/vカゼイン）0.5mlを最終カゼイン濃度0.9％となるように対照の各々に加えた。導波路は、部位が手書き「＋」記号となるようにポリクローナル抗hCG抗体をガラス毛管でガラス表面に添加した以外は、実施例１に記載したように構成した。
等量の30倍濃縮セレン結合体（上記）と試料を混合し、すぐに導波路に適用した。この場合は、結合体−試料混合物の光学密度（約465O.D.）が非常に高いので、バックグラウンド散乱を阻止するために食品着色染料を加える必要がなかった。更に高濃度結合体は、驚くべきことにバックグラウンド散乱を増加することなく導波路信号発生の感度と速度を増加した。0mIU/ml試料では容易に感知可能な信号は得られず、25mIU/ml試料（最終濃度）では約30秒で可視信号が得られ、125mIU/ml試料（最終濃度）では５秒以内に信号が得られた。図５は実施例１−Ｄに記載するように撮像、ディジタル化及び印刷したものであり、高陽性hCG試料（125mIU/ml）では１秒で微かな「プラス」信号が認められる。時刻＝０は導波路チャネルの結合体溶液充填を示し、時刻＝１秒はほぼ瞬時の可視プラス信号の初期形成を示し、時刻＝５及び20秒は明白な可視プラス信号を示す。
B.感度測定
抗体溶液（実施例１参照、ポリクローナル抗hCG抗体1mg/ml）の単一スポットを導波路に加えて反応表面に単一部位を形成した以外は上記と同様に導波路チップを作成した。このシステムの感度を推定するために、0mIU/mlの試料６個と31mIU/mlの試料５個を用いて実験を繰り返した（公称hCG濃度であり、実測は行わなかった）。試料と結合体を１分間混合し、導波路チャネルに加え、信号生成から１分後にフレームグラバーとCCDビデオカメラを使用してディジタルビデオ画像を獲得した。ディジタル画像は０（暗）〜255（白）の一連の８ビットグレースケール値から構成される。従って、ディジタルファイルは一連のこのような数値から構成され、各数値は画像の特定の単一画素位置に対応する。
得られたディジタル化データをImage  Pro  Plusソフトウェア（Media  Cybernetics,Silver  Spring,MD）で分析し、ほぼ信号スポットの寸法の円形領域を使用して画像データの数値グレースケール値を測定した。円形測定領域内のディジタル値を平均した。即ち円内の各値を加算し、得られた和をこのような値の個数で割った。捕獲部位と信号部位に隣接する代表的なバックグラウンド非部位部分についてこのような値を得た。信号からバックグラウンドを引いた差を測定値とした。この実験で得られたデータを表2.1に示す。
0003608665.tif 000003
0mIU/ml実験の平均純（net）信号は6.6±0.7mIU/mlであり、31mIU/ml実験では29.2±7.8mIU/mlである。従って、線形補間（interpolation）によると、１グレーレベル＝1.4mIU/mlであり、0mIU/ml純信号を２標準偏差上回る純信号値、即ち1.4、は約2mIU/mlの感度推定値をもたらす。
実施例3.甲状腺刺激ホルモン（TSH）イムノアッセイ
A.固相への捕獲試薬の結合
濃度0.25〜0.5mg/mlのアフィニティー精製ポリクローナル抗αTSH抗体から構成される少量（約２μｌ）の抗体溶液を加えることにより導波路のガラス表面に抗体捕獲部位を形成した以外は、実施例１に記載した通りに導波路を作成した。抗体溶液は１％スクロースを含有する。抗体を乾燥させて固定させ、ガラス表面に吸着させ、HPLC水で濯ぎ、強制空気風乾した。固定後、ガラス表面を≦１分間0.05％アルカリ処理カゼイン（100mM  Tris,pH7.8,150mM  NaCl）で処理し、反応表面と流体試料中の物質との非特異的相互作用を阻止し、チャネル内の流れを助長した。過剰のカゼインを「シーティング作用」でHPLC水でスライドから濯ぎ流した。残留液体を強制風乾した。
実施例１に記載したように使い捨てデバイスを組み立て、実施例１に記載したように光源のスリット開口部に挿入した。
B.試料及び濃縮光散乱結合体の添加
次に、試料と光散乱結合体を含む溶液を反応表面に加えて捕獲部位を覆った。光散乱結合体は第２の抗体（モノクローナル抗βTSH;10μg/ml）を16O.D.（546の吸収最大波長）まで希釈した実施例１のセレンコロイドで標識することにより調製した。10秒間混合後、0.6％BSAを加えて結合を阻止し、8000rpmで３〜５分間遠心して濃縮した。結合体を元の容量の1/20に再懸濁した。次に、最終カゼイン濃度2.5％となるように10％アルカリ処理カゼイン（100mM  Tris,pH7.8,150mM  NaCl）7.5μｌと混合したセレン結合体7.5μｌから構成した試料緩衝液15μｌをTSH試料15μｌと混合した。TSH試料はAbbott  Laboratoriesの市販品（カタログ＃A3A62−01）であり、Ａ＝０、Ｂ＝0.5、Ｃ＝２、Ｄ＝10、Ｅ＝40及びＦ＝100μIU/mlのTSHレベルをもつIMx（登録商標）Ultrasensitive  hTSHアッセイカリブレーターＡ−Ｆであった。これらのカリブレーターを試料緩衝液で1:1に希釈して使用し、カリブレーターの濃度として記載した濃度の２分の１の最終濃度とした。
C.光散乱信号の検出
エバネッセント光波と光散乱ラベルとの相互作用により誘導される散乱光を視覚的及び標準ビデオ分析システムにより検出した（例えば実施例１参照）。視覚検出の場合には、約１分で信号が観察された。図６は実施例１−Ｄに記載したように撮像、ディジタル化及び印刷した。図６に示すように、１分でバックグラウンドを上回る信号が明白に観察される。視覚検出によるシステムの推定感度は0.25μIU/ml  TSHである。0.125μIU/ml  TSHの信号は目視ではゼロよりも高いことがかろうじて識別できる。
実施例4.DNAハイブリダイゼーションアッセイ
A.  DNA導波路作成
1cm平方のガラス基板から嚢胞性線維症を生じるヒト遺伝子突然変異の検出用DNA導波路を作成した。反応表面に多重捕獲部位を提供するようにオリゴヌクレオチドをガラスに固定した。特に、９個の異なるオリゴヌクレオチドCAT01〜CAT09（配列番号１〜９）を導波路のガラス表面に加え、CAT＃が標準プッシュホン電話機と同一番号により占められる位置に対応するように３×３アレーパターンを形成した。DNAスポットは直径約2mmで約2mmの間隔とした。CAT01〜CAT09（配列番号１〜９）の配列及び突然変異部位を表4.1に示す。
0003608665.tif 000004
ヒト遺伝子突然変異は標準表記法により示す。例えば、Δ508は嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターポリペプチド（J.Zielenskiら，Genomics  10:214−228,1991）の508位における３塩基対の欠失を示す。「WT」はこの位置が野生型又は正常配列であることを示す。オリゴヌクレオチドの3'末端にアミノ基が存在すると導波路の表面にDNAを固定し易くなるが、そのメカニズムは現在分かっていない。DNA溶液はSynthecell（Columbia,MD）により調製し、PBS（リン酸緩衝塩類,pH7.4）緩衝液で1:20に希釈し、直径約1mmのドリルビット（drill bit）の鈍端を使用して導波路のガラス表面に添加した。DNAを清浄なガラス表面又は予め0.05％カゼインを被覆しておいた表面に固定したが、ハイブリダイゼーション結果は区別できなかった。導波路のガラス表面に加えたDNAの最終濃度は高いほうではCAT02の14μＭから低いほうのCAT08の0.9μＭまでであり、Synthecellから入手した出発材料の濃度と比較することにより決定した。塗布後、DNA溶液を室温でチップ上で乾燥させるか、又は約35％〜80％の相対湿度の湿潤な日に50〜70℃に設定したインキュベーターに入れて乾燥するまで（約10分間）放置した。この手順により、上記３×３アレーに９個の「スポット」又はハイブリダイゼーション捕獲部位が形成された。
B.  ハイブリダイゼーション
DNA導波路性能を評価するために、3'末端にビオチンラベルを使用してSynthecellにより９個の追加のオリゴヌクレオチドCAT21B〜CAT29B（配列番号10〜18）を合成した。試験DNAオリゴヌクレオチドの配列を表4.2に示す。
0003608665.tif 000005
オリゴヌクレオチドはCAT21B（配列番号10）がCAT01（配列番号１）に相補的であり、CAT22B（配列番号11）がCAT02（配列番号２）に相補的であり、以下同様にCAT09（配列番号９）に相補的なCAT29B（配列番号18）まで設計及び命名した。濃度は高いほうのCAT25B（配列番号14）の473mMから低いほうのCAT27B（配列番号16）の151mMまでとした。９個のDNA試料の各々をハイブリダイゼーション緩衝液（１％カゼイン、10mM  Tris  pH7.4,15mM  NaCl）1mlに１μｌの割合で希釈し、９個の異なるDNA導波路の各々に１個ずつ加え、室温（約23℃）で５分間インキュベートした。洗壜を使用してDNA導波路の表面をPBSで洗浄した後、ハイブリダイゼーションの検出までPBS下に保存した。
C.  ハイブリダイゼーションの検出
９個の異なるビオチン標識DNAのハイブリダイゼーションをセレン抗ビオチン結合体から散乱した光により導波路内で検出した。セレン結合体は抗ビオチン（ポリクローナルウサギ抗ビオチン抗体、PBS中1.13mg/ml,pH7.4、米国特許出願第08/196,885号に対応するMushahwarらのEP0  160  900  B1号参照）2.5μｌを実施例１からのセレンコロイド（32O.D.濃度）1Mlに加えた後、ウシ血清アルブミン（20％W/V溶液となるように水に溶解した粉末BSA）30μｌを加えることにより調製した。結合体溶液50μｌをDNA導波路の表面に加え、導波路の側面に光を当ててセレンと種々のDNA捕獲部位との結合を観察した。１分以内に多数の部位でポジティブハイブリダイゼーションが見えた。DNA導波路をPBSで洗浄して過剰のセレン結合体を除去し、導波路励起光散乱を生じるように照射し、Cohuモデル4815CCDカメラを使用して撮像した。画像を実施例１−Ｄに記載したようにディジタル化及び印刷し、図７に示す。導波路を使用すると１回の画像測定でDNAハイブリダイゼーションの完全なパターンが検出され、導波路に加えたオリゴヌクレオチドのDNA配列を決定することができた。CAT21B（配列番号10）及びCAT22B（配列番号11）（図７の最初から２こま）の場合には、これらのオリゴヌクレオチドとそれぞれCAT01（配列番号１）及びCAT02（配列番号２）以外のDNA捕獲部位との配列相同が僅かであったため、ハイブリダイゼーションパターンは比較的単純であった。他方、CAT23B〜CAT29B（配列番号12〜18）の場合には、有意な配列相同の結果、結合パターンは複雑になった。
実施例5.リアルタイムDNA融解
A.  DNA導波路作成
CAT03（配列番号３）及びCAT04（配列番号4,PBSに1:20に希釈）を含有するオリゴヌクレオチド溶液１μｌを導波路カバースリップ（実施例１と同様に0.05％カゼインで被覆）に加えた後、室温で乾燥することにより、２個のDNA捕獲スポットを含む導波路を作成した。２個のスポットから過剰のDNAを水で濯いだ後、チップを室温で乾燥した。２個のスポットを含むDNA導波路を別のガラスカバースリップと結合し、実施例１に記載したようなアッセイ試薬を収容するための使い捨てデバイスを形成した。
B.  ハイブリダイゼーション及び検出
１％カゼイン、10mM  Tris,pH7.4、15mM  NaClの1ml中に１μｌを希釈することにより、CAT23B（配列番号12）又はCAT24B（配列番号13）の溶液を調製した。溶液を毛管流により使い捨て導波路のチャネルに導入し、室温で５分間ハイブリダイズさせた。セレン結合体（実施例４）を導入することによりDNA溶液をチャネルから排出させ、導波路を光源において検出を行った。数秒以内にDNA捕獲部位に２個の明スポットが現れ、ハイブリダイゼーションが生じたことを示した。CAT23B（配列番号12）とCAT04（配列番号４）の間の差は１塩基対しかなかったので、CAT23B（配列番号12）とCAT03（配列番号３）の間のハイブリダイゼーションもCAT23B（配列番号12）とCAT04（配列番号４）の間のハイブリダイゼーションと同様に予想された。低温（即ち室温）及び高塩（15mM  NaCl）条件では、ハイブリダイゼーション法で１塩基ミスマッチを区別するのに十分な識別力がなかった。
C.  リアルタイム融解
室温ハイブリダイゼーションパターンの観察後、加熱ブロックをチャネルの非導波路側（即ち使い捨てデバイスのチャネルを形成するために使用した第２のガラスカバースリップ）に配置することにより、DNA導波路の温度を増加した。導波路表面にCCDカメラとビデオカセットレコーダー（VCR）の焦点を合わせてハイブリダイゼーションパターンに及ぼす熱の効果をリアルタイムで記録した。導波路の下の（即ち使い捨てデバイスのチャネルを形成するために使用した第２のガラスカバースリップと接触している）加熱ブロックの温度を熱電対で測定した。ディジタル温度読出し（Watlowシリーズ965温度制御器、Watlow  Controls,Winona,MN）をCCDカメラで撮像することにより記録した。温度が増加するにつれてDNA部位の強度はDNA融解から予想されるように低下した。更に、ミスマッチでハイブリダイズしたDNAを含むDNA部位のほうが正確なマッチしたDNAを含む部位よりも低温で融解する。その結果、正確なマッチしたハイブリダイゼーションと１塩基ミスマッチハイブリダイゼーションを区別することができ、従って１塩基突然変異を検出することができた。ビデオ画像形態のデータを１℃増分毎に集め、上記と同様にフレームグラバーを使用してディジタル化した。図8Aは５℃間隔のデータの印刷表示であり、約50℃までにミスマッチスポットは消え始めるが完全にマッチした対は約60℃まで見えていることを示す。捕獲部位の強度を実施例２と同様に測定し、各温度の平均スポット強度を計算した。図8BはCAT23B（配列番号12）の融解曲線プロットであり、図8CはCAT24B（配列番号13）の融解曲線プロットである。融解温度は最上部プラトーと最下部プラトーの中間点として推定される。
実施例6.DNAハイブリダイゼーションアッセイ感度
導波路に加えるDNAの濃度の低下に伴って散乱信号強度を観察することにより、導波路DNAハイブリダイゼーションアッセイの感度を推定した。各々PBSで1:20に希釈したCAT01（配列番号１）及びCAT03（配列番号３）0.5μｌを加えることにより、４個の同一のDNA導波路を作成した。この手順を２回繰り返し、（向かって）左上及び右下角にCAT01（配列番号１）を配置し、（向かって）右上及び左下角にCAT03（配列番号３）を配置した22アレーを形成した。DNAスポットを70℃のオーブンで15分間乾燥し、過剰のDNAを洗い流さずに第２のカバースリップを固定し、実施例１と同様にチャネルを形成した。CAT23B  DNA（配列番号12）をハイブリダイゼーション緩衝液（１％カゼイン、10mM  Tris,pH7.4,15mM  NaCl）で39.6nM、4nM及び0.4nMの濃度に希釈した。第４のDNA濃度（0nM）としてハイブリダイゼーション緩衝液単独を使用した。各DNA溶液30μｌを４個の導波路デバイスの１個に導入した。DNA溶液を使い捨て導波路の一端の開口部（open gap）に加え、次いで毛管作用によりチャネルに充填させた。溶液を室温で10分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを生じさせた。次に、セレン抗ビオチン結合体（実施例４）30μｌをチャネルの一端に加え、チャネルの他端にペーパータオルを当ててDNA溶液を除去し、その代わりにチャネルに結合体溶液を充填した。チャネルに結合体溶液を充填しながらDNA導波路を照射することによりハイブリダイゼーションを検出した。セレン結合体の結合から１分後に、30フレーム／秒でCohu  CCDカメラを使用して導波路信号のディジタル画像を獲得した。４個のチップを各々のインポート及び印刷画像を図９に示す。CAT03（配列番号３）部位のみに信号が存在することにより特異的ハイブリダイゼーションが判明した。0nM試料のチップにはどの部位にも信号は観察されず、CAT01（配列番号１）部位からはどの濃度でも信号は観察されなかった。実験で使用したDNAの最低濃度である0.4nM  CAT03はこれらの条件下で導波路により検出され、感度の近似測定値に相当する。典型的比較として、Peaseら，Proc.Natl.Acad.Sci.,91:5022−5026,1994は1/30秒でなく数分の読取り時間でレーザー走査システムを用いた10nM濃度の蛍光標識DNAの検出を報告している。
実施例7.高部位密度DNA導波路の検出
単一オリゴヌクレオチドCAT01（配列番号１）を複数回加えることにより、高部位密度（部位当たりのDNAの量とは区別し、部位数／チップとして定義される）DNA導波路を作成した。Asymtek  Automove  102  XYZ  Table（Asymtek,Carlsbad,CA）をプログラムし、直径150μｍのピンをCAT01  DNAの溶液（CAT01を1:20にPBSで希釈）に浸漬させた後、ピンをカゼイン被覆した1cm平方のガラス導波路の表面に接触させた。このプロセスを323回繰り返し、直径150μｍで300μｍ間隔のDNAスポットの18×18アレーを形成した（18×18アレーは324スポットをもつはずであるが、プログラミングエラーにより１個のスポットの場所がなくなり、アレーの（向かって）右上部分が「ホール」になったため、323スポットとなった）。アレー全体は1cm平方導波路の中心に各辺約5.1mmの正方形（26mm2）を占有した。
得られた導波路を乾燥し、水洗し、ハイブリダイゼーションに備えて再び乾燥した。１％カゼイン、10mM  Tris,pH7.4,15mM  NaClで1:1000に希釈したCAT21B（配列番号10）の溶液を導波路の表面に加え、アレー全体を室温で５分間覆うことによりハイブリダイゼーションを行った。PBSを用いてDNA溶液を導波路の表面から濯ぎ落とした後、導波路の表面をセレン抗ビオチン結合体（実施例４）で覆って導波路を照射することによりハイブリダイゼーションを検出した。CAT21B  DNA（配列番号10）とDNAアレーのハイブリダイゼーションは約30〜60秒で視覚的に観察できた。チップをPBS皿に入れて過剰の結合体溶液を洗い流した。上記と同様にフレームグラバーを使用してビデオ画像をディジタル化することによりハイブリダイゼーションパターンを記録した。画像データの印刷表示を図10に示す。図から明らかなように、導波路検出は全323個のハイブリダイゼーション部位を同時に測定及び区別することができた。
実施例8.ハイブリダイズしたDNAの低イオン強度による解離
導波路検出の別の利点は再利用性である。この場合には、表面に固定したDNAを傷つけずに導波路の表面にハイブリダイズした試料DNAチップから剥離しなければならない。本実施例は、再生プロセスをモニターするために導波路を利用できることを立証する。
22mm平方＃２ガラスカバースリップを使用して実施例４に記載したようにオリゴヌクレオチドCAT01〜CAT09（配列番号１〜９）を３×３アレー状に配置した嚢胞性線維症DNA導波路を作成した。シリコーン接着剤（Dow  Corning,Midland,MI）を使用して第２のカバースリップを導波路に固定することにより流路を形成し、対向する対角線の角に２個の管部品を取り付けて入口及び出口とした。カバースリップは実施例１に記載したようにずらせ、導波路として機能する上部カバースリップに光が入射できるようにした。CAT03（配列番号３）に完全に相補的なCAT23B（配列番号12）をハイブリダイゼーション緩衝液（10mM  Tris,pH7.4,12mM  NaCl中１％カゼイン）に溶解した溶液を注射器で流路に手作業で注入し、流れを止めて１分間ハイブリダイゼーションを行った。次に、セレン抗ビオチン結合体（実施例４）をチャネルに注入してDNA溶液に置換し、流れを止め、（上述のように）結合体の存在下で導波路照射によりハイブリダイゼーションを検出した。次いでPBSを注入してチャネルを洗浄し、結合体溶液に置換した。最後に、チャネルに純水を注入することにより、ハイブリダイズしたDNA−セレン抗ビオチン結合体複合体を導波路の表面から解離させた。水は、NaClを希釈してイオン強度を低下させることによりストリンジェンシー条件を増す。捕獲部位からのDNAとセレンの解離はリアルタイムで観察され、ビデオカメラ及びVCRを使用して記録した。解離プロセスの種々の時点でビデオ画像をフレームグラバーにより捕獲し、上述のようにディジタル化及び印刷し、結果を図11に示す。流路内の過剰の気泡により、右上の２×２アレーのみを示し、例えば４部位は番号２（CAT02、配列番号２）、３（CAT03、配列番号３）、５（CAT05、配列番号５）及び６（CAT06、配列番号６）に対応する。図から明らかなように、解離プロセスは低イオン強度媒体の初期導入から、実質的に全導波路信号がDNAチップから最終的に取り出されるまで追跡された。従って、導波路はオペレーターに再利用のためにDNA導波路の再生プロセスをモニターさせることができた。特に、再生に関するリアルタイム情報を使用して再生時間を制御し、診断用途における処理時間を改善することができる。
実施例9.DNAの多重抗体試験
共通のビオチンSBMと、３個のオリゴヌクレオチド産物の各々に固有の異なる「捕獲」SBMを使用して、ビハプテン化（bi−haptenated）DNA産物の多重抗体試験を行った。このようなビハプテン化オリゴヌクレオチドはWO93/20227号（Abbott  Labs）として公開された1992年３月31日付け米国特許出願第07/860,702号に開示されているように多重リガーゼ鎖反応により得られる生成物を表す。抗フルオレセイン、抗アダマンタン及び抗キノリンモノクローナル抗体をCorning  ＃２ガラス顕微鏡カバースリップに固定することにより導波路を作成した。抗アダマンタン抗体は1991年12月17日付け米国特許出願第808,508号及びPCT/US93/05534号に開示されている。抗キノリン抗体は1992年３月27日付け米国特許出願第07/858,820号及びWO93/20094号に開示されている。これらの全文献は参考資料として本明細書の一部とする。
抗体は水で1:10に希釈し、約0.5μｌを導波路に加え、図12aに示すように、右上頂点に抗フルオレセイン（スポット＃１）、左に抗アダマンタン（スポット＃２）及び右下に抗キノリン（スポット＃３）を配置した３個の空間的に分離したスポットを形成した。第２のガラススライドを導波路に固定して（実施例１と同様に）チャネルを形成した。3'末端にビオチンを含み、5'末端にフルオレセイン、アダマンタン又はキノリンのいずれかを含む合成１本鎖DNAを１％カゼイン、10mM  Tris,pH7.4,15mM  NaClの50μｌに３μｌの割合で希釈した。最終DNA濃度は約100nMであった。DNA配列を表9.1に示す。
0003608665.tif 000006
得られた溶液を等容量の抗ビオチンセレン結合体（実施例４）と混合し、毛管作用により導波路チャネルに導入した。図12b〜12dは単一標識化種を含むDNA溶液を使用した結果を示す。図12bでは配列番号21を使用し、図12cでは配列番号19を使用し、図12dでは配列番号20を使用した。図12eではキノリン−ビオチンDNAとフルオレセイン−ビオチンDNAの混合物を使用した結果、２個の適当な捕獲部位（スポット１及び３）に検出可能な信号が得られた。従って、導波路システムは混合物中の複数の分析物を同時に検出することができた。
以上、実施例により本発明の数種の特定実施態様を説明したが、本発明はこれらの特定実施例に制限されるものではない。発明の保護範囲は請求の範囲により定義される。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:2
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:3
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:4
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:5
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:6
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:7
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
存在位置:15
配列
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配列番号:8
配列の長さ:15
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
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配列
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配列番号:9
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′amine
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配列
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配列番号:10
配列の長さ:15
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
存在位置:15
配列
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配列番号:11
配列の長さ:15
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
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配列
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配列番号:12
配列の長さ:15
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
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配列
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配列番号:13
配列の長さ:15
配列の型：核酸
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トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
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配列
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配列番号:14
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
存在位置:15
配列
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配列番号:15
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
存在位置:15
配列
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配列番号:16
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
存在位置:15
配列
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配列番号:17
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
存在位置:15
配列
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配列番号:18
配列の長さ:15
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:3′biotin
存在位置:15
配列
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配列番号:19
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:5′biotin
存在位置:1
特徴を表す記号:3′fluorescein hapten
存在位置:24
配列
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配列番号:20
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:5′biotin
存在位置:1
特徴を表す記号:3′quinoline hapten
存在位置:24
配列
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配列番号:21
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号:5′biotin
存在位置:1
特徴を表す記号:3′adamantane hapten
存在位置:24
配列
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【図２Ａ】
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【図１】
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【図２Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図３】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図１１Ｄ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１０】
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