(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用い、環境水中の有害物質を検出する方法において、微生物センサの電気的出力の値によって、微生物センサの設定温度を制御することを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、微生物センサの電気的出力値として、センサ出力の減少時しきい値と増加時しきい値との２つのしきい値を設定し、また微生物センサの温度を２つ設定し、微生物センサの電気的出力値が減少時しきい値に達した時に、微生物センサの温度を高温側の設定温度にするように、かつ、微生物センサの電気的出力値が増加時しきい値に達した時には、微生物センサの温度を低温側の設定温度に戻すようにして、微生物センサの設定温度をその相対活性が高い温度範囲外の温度となるように変更する制御を行うことを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水を対象として、水中の化学成分をモニタリングすること目的としたバイオセンサ応用水質計測器を用いた環境水中の有害物質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、検水中の測定対象物質を認識する分子識別素子として、酵素や抗体などの生体機能高分子や、微生物や細胞など生体そのものを利用し、これらの生体材料を多孔性高分子膜に包括または共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器などのトランスデューサとを組み合わせて試料中の化学成分の測定を行うセンサである。
【０００３】
バイオセンサは、検水を上記生体材料の固定化膜に接触させ、これによって生じる化学反応により生成または消費される物質の濃度変化を、検出器で電圧、電流などの電気的な出力（以下にセンサ出力と記載する）の変化に変換して測定する。具体的には、まず、被測定物質の既知濃度の標準液を調合し、この標準液で測定して被測定物質の濃度とセンサ出力との関係を示す検量線を作成する。次に、検水に対する測定で得られたセンサ出力は、この検量線を使って換算し、検水中の目的物質の濃度を算出する。
【０００４】
バイオセンサを使用した測定にあたっては、固定化した生体材料が安定に機能するように温度とｐＨ条件を一定にすることが必要である。そのため、バイオセンサ応用計測器では、温度を一定に保つために検水を一定温度に加温する熱交換器とセンサ温度を一定にする恒温槽が備えられ、また、ｐＨ条件を一定とするために緩衝溶液が用いられている。
【０００５】
最近、本発明者らは、特公平７−８５０７２号公報に示すような水中の有害物検出用バイオセンサを開発し、実用化している。生体材料としては微生物で有毒物質に極めて弱い、言い換えるとセンサとしては高感度な硝化菌を用い、この硝化菌を固定化した膜と、検出器としての溶存酸素電極とを組み合わせてバイオセンサを構成し、水中の有害物質を検出している。
【０００６】
図１は上記公報のバイオセンサを応用した水中有害物質検出装置の構成を示すフロー図であり、図２はこの微生物を用いたバイオセンサの構成を示す模式図である。
図２に示すように、有害物質検出用の微生物を用いたバイオセンサ１の構成は、フローセル１８内にステンレス製の金網２６と、硝化菌の一種であるニトロソモナスユーロピア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ２５９７８）を固定化した固定化微生物膜２５と、溶存酸素電極１９とを、この順に取付け、ナットで固定し、微生物膜２５と溶存酸素電極１９とを密着させている。これを図１に示すように３０℃の温度に設定された恒温槽２に取り付けている。
【０００７】
図１により、バイオセンサを応用した水中有害物質検出装置の測定手順を説明する。
まず、第１の校正は、硝化菌は食料を与えないと活動できず、溶存酸素が消費されないという点を利用して、水中の溶存酸素濃度の測定を行う。即ち、微生物の硝化菌の食料としてのアンモニア性窒素を含まない緩衝溶液Ａ６ａと純水４とを流し、バイオセンサ１の出力安定化後のセンサ出力を装置に記憶する。これは水中の溶存酸素濃度に対応した値である。
【０００８】
次に、第２の校正は、硝化菌に有害物質を含まない既知の量の食料（：基質と呼ぶ）を与えて、硝化菌が正常に活動した場合の溶存酸素濃度の測定を行う。即ち、有害物質のない状態でのセンサ出力として、バルブ７ｄを閉め、バルブ７ｅを開にして、硝化菌の食料としての既知のアンモニア性窒素を含む緩衝溶液Ｂ６ｂと純水４とを流し、センサ１の出力安定化後のセンサ出力を装置に記憶する。これは硝化菌の活動によって消費され、残った溶存酸素濃度に対応した値である。
【０００９】
上記の第１、第２の２つの測定でセンサの自動校正は終了する。この測定で使用する緩衝溶液６Ａ、６Ｂは、硝化菌が安定に機能するｐＨ８〜９付近に緩衝能を持つリン酸緩衝溶液が主成分として含まれている。
検水の連続監視測定は、バルブ７ｂを閉め、バルブ７ａを開にして、検水３の測定を開始する。もし検水の中に有害物質が含まれていると、正常活動の場合に比べて硝化菌の活性度が落ちるために溶存酸素の消費量が減り、センサ出力は上記第１、第２の２つの校正時の値の中間になる。
本装置は１日１回程度、前記のようにセンサの自動校正を行いながら連続的に検水のモニタリングを行う。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
通常、上記のような微生物を使用するバイオセンサ応用計測機器では、センサ部に使用する微生物の数や活性をできるだけ長い期間安定に維持するために、測定条件として使用する微生物の至適温度条件（３０℃）の下で、至適ｐＨ条件（９．０）を維持し、生育に必要な微量栄養成分（鉄やマグネシウム）を含む緩衝溶液を用いて測定を行っている。
【００１１】
通常の水道水源となる上流域の河川では、測定する検水が比較的清浄で微生物にとっては貧栄養の水であるため、このような条件下でも微生物は固定化微生物膜内で徐々に死滅し、この結果、センサの使用寿命はそう長くなく、約１ヶ月程度で微生物膜の交換を行う必要がある。
しかしながら、監視を必要とする検水が、河川の下流域であるような大都市の河川水や下排水である場合には、検水中に様々な種類と様々な濃度の栄養成分が含まれているために、固定化微生物膜内の微生物が過剰に増殖あるいは呼吸活性が増大してしまい、この結果、下記に述べるようにセンサとしては有害化学物質に対する感度が低下するという問題点がある。
【００１２】
本発明はこの課題を解決するためになされたものであり、どのような検水に対しても有害物質に対する感度を低下させることのない、微生物を使用するバイオセンサ応用水質計による有害物質の検出方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
このバイオセンサの有害物質に対する感度低下のメカニズムについて、種々の検討を行った結果、この原因が固定化微生物膜内の微生物数や活性の増加にあることをつきとめた。以下に図３の有害物質添加時のセンサ出力から感度低下を示す図により、シアン溶液での応答例によってこのメカニズムを説明する。
【００１４】
この図において、（１）の曲線は、微生物膜を溶存酸素電極に装着当初のセンサ出力の例、（２）の曲線は、大都市の汚濁河川水を約１週間程度連続測定した後のセンサ出力の例である。
（１）の曲線に示すように、微生物膜を溶存酸素電極に装着した当初は、通常、センサ出力電圧は第１のセンサ校正▲１▼で５ｍＶ程度、第２のセンサ校正▲２▼で０ｍＶ付近であり、その後に、検水の連続監視測定▲３▼に移る。
【００１５】
この時、溶存酸素電極のセンサ出力電圧は０ｍＶに近い状態で推移する。
次に、▲４▼ａおよび▲４▼ｂの時点で、人や生物に呼吸阻害作用を示す有害物質であるシアン溶液が試料水中に混入すると、硝化菌の呼吸阻害作用により、溶存酸素の消費量が減り、シアン溶液の濃度（▲４▼ａでは０．０５ｍｇ／Ｌ、▲４▼ｂでは０．２ｍｇ／Ｌ）が増加すると、センサ出力電圧値（▲４▼ａより▲４▼ｂが大きい）も増加する。この結果、有害物質が混入したこととその度合いが検出できる。
【００１６】
（２）の曲線に示すように、汚濁河川水を約１週間程度の連続測定後は、▲３▼のセンサ出力は完全に０ｍＶとなり、また、有害物質の混入については、▲４▼ａのシアン溶液の濃度０．０５ｍｇ／Ｌでは検出できず、また濃度が高い▲４▼ｂの濃度０．２ｍｇ／Ｌでも感度が低下する。これは、図中破線で示すように固定化微生物膜内では酸素が不足状態になっており、不足の状態でも酸素電極出力は０ｍＶ以下の負の値とはならないため、見かけ上０ｍＶとなるためである。酸素電極出力が負の値がとれるとすると、有害物質に対する応答は、図３の破線で示すような応答となると考えられる。
【００１７】
これを、有害物質濃度に対する微生物センサの酸素消費率、即ち、作用応答曲線で表現すると図４に示すようになる。ここで、センサの検出可能濃度を、酸素消費率が２０分間で１０％低下するレベルとすると、微生物膜装着当初（図３の（１）の曲線）はシアンに対する検出感度が０．０５ｍｇ／Ｌであったのが、汚濁河川水を約１週間程度の連続測定後（図３の（２）の曲線）は、０．２ｍｇ／Ｌに感度が劣化したことになる。
【００１８】
次に、この問題を解決するために、測定状態での固定化微生物膜内の微生物の相対活性の温度特性を測定した。図５にその測定例を示す。
この図において、微生物の相対活性の高い温度範囲は２８〜３４℃で、この範囲を外れると活性が低下するが、特にこの温度範囲の高温側は、活性の低下が著しいことが判明した。２８〜３４℃の温度範囲では、微生物膜内の菌の数や活性を減少させることができず、微生物が増殖した場合には、水中の溶存酸素を使いつくし、その結果として有害物質に対する感度保持は難しいことになる。そこで、微生物の相対活性が高い２８〜３４℃の温度範囲を外すことによって、微生物を減少または活性を低下させて、水中の溶存酸素を残し、有害物質に対する感度を保持するという制御が必要である。
【００１９】
そこで、測定状態での固定化微生物膜内の微生物数あるいは活性を抑制する方法として、バイオセンサの測定温度条件を制御してこの課題を解決することとする。即ち、センサ出力電圧の値によって、バイオセンサの測定温度条件を制御し、▲３▼のセンサ出力が完全に０ｍＶとなるような微生物の増殖数や活性の増加の速度が大きい場合には、センサ出力値に減少側と増加側に２つのしきい値を設定し、このしきい値の範囲になった場合には、バイオセンサがある恒温槽の設定温度を至適温度条件（３０℃）よりも＋５〜１０℃程度高温側の温度条件とすることとする。
【００２０】
微生物の増殖を抑制するこの手段の採用により、固定化微生物膜内の微生物の数または呼吸活性を、酸素不足にならない酸素電極出力を０ｍＶに近い状態に維持することができ、有害物質に対する検出感度の保持が可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に、実施例として設定温度とセンサ出力との時間経過を示す図６に基づいて説明する。
この例では、センサ出力値の２つのしきい値を、減少の場合は０．４ｍＶ、増加の場合は０．０３ｍＶに設定している。
【００２２】
上記の汚濁河川水などの検水を連続的に測定する場合、検水をセンサに導入すると、センサ出力電圧は減少しはじめ０ｍＶに近づいていく。センサ出力が０．４ｍＶになったとき、恒温槽の設定温度を至適温度３０℃から３７℃に昇温する。この状態では高温のために微生物の増殖や活性の増加が抑制されるので、センサ出力は０ｍＶの近くまでに減少するものの、０ｍＶを長時間維持することはなく、やがて増加に転ずる。センサ出力が０．０３ｍＶになった時に、恒温槽の設定温度を３７℃より至適温度３０℃に戻す。このように、センサ出力の増減によりこの設定温度コントロールを繰り返すことにより、有害物質に対する検出感度の保持が可能となる。
【００２３】
図７には、センサ出力値の２つのしきい値を設定し、制御を行ったときの有害物質シアンに対する呼吸阻害率Ａの経時変化を示す。ここで呼吸阻害率Ａは次式で計算される。
0003678093.tif 000002
ここで  Ｖ1 ：▲１▼の校正のセンサ出力、Ｖ2 ：▲２▼の校正のセンサ出力、
ＶM ：検水のセンサ出力  である。
この図から、大都市の河川水を使用しても、シアン０．０５ｍｇ／Ｌおよびシアン０．２ｍｇ／Ｌに対する検出感度は、１ヶ月以上初期値と同レベルに保持できていることがわかる。
【００２４】
【発明の効果】
微生物を使用したバイオセンサ出力値の出力減少側と増加側とに２つのしきい値を設定し、バイオセンサ出力値がこのしきい値の範囲に入った場合には、バイオセンサの設置してある恒温槽の設定温度を高温側にするという本発明により、検水の水質によらずバイオセンサの有害物質に対する検出感度を高感度に維持することができることがわかった。これにより、安定に水質を連続監視でき、より実用性の高いバイオセンサ応用水質計を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バイオセンサを応用した水中有害物質検出装置の構成を示すフロー図
【図２】微生物を用いたバイオセンサの構成を示す模式図
【図３】有害物質添加時のセンサ出力から感度低下を示す図
【図４】有害物質濃度に対する微生物センサの酸素消費率の関係を示す図
【図５】微生物の相対活性の温度特性の測定例を示す図
【図６】本発明の実施例として設定温度とセンサ出力との時間経過を示す図
【図７】本発明の実施例としてシアンに対する呼吸阻害率の経時変化を示す図
【符号の説明】
１：      バイオセンサ
２：      恒温槽
３：      検水
４：      純水
５：      酸洗浄水
６ａ：      緩衝液Ａ
６ｂ：      緩衝液Ｂ
７ａ〜７ｇ：      電磁弁
８ａ〜８ｂ：      送液ポンプ
９：      熱交換器
１０：      エアポンプ
１１：      圧力センサ
１２：      ローラークランプ
１３：      二方切換三方弁
１４：      表示部
１５：      制御部
１６：      記録計
１７：      測定部
１８：      フローセル
１９：      溶存酸素電極
２０：      試料流路
２１：      正極
２２：      負極
２３：      電極液
２４：      隔膜
２５：      固定化微生物膜
２６：      ステンレス製金網
２７ａ〜２７ｃ：      Ｏリング
２８ａ〜２８ｂ：      リード線
２９：      ワッシャー
【図１】
0003678093.tif 000003
【図２】
0003678093.tif 000004
【図３】
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【図４】
0003678093.tif 000006
【図５】
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【図６】
0003678093.tif 000008
【図７】
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