(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜存在受容体タンパク質を有する癌細胞の処置のためのヒストンを基とする癌治療の薬剤であって、該受容体タンパク質が該薬剤と反応するものであり、下記：該薬剤が少なくとも１種のヒト組み換えヒストンH1サブタイプを含有すること、および該受容体タンパク質がコア・ヒストンに属する異なるポリペプチドを含有するか、またはそれらのポリペプチドからなること、
を特徴とする薬剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、癌細胞に対する治療的および予防的薬剤としてのヒストンおよび／またはヒストン様タンパク質（例えば、プロタミン、細菌性ヒストン様タンパク質）に関する。
Reiner Class et al.（in American Journal of Clinical Oncology（CCT）19（５）1996,pp.552−531）によると、癌細胞に対するヒストンの作用は、ヒストンH1により殺される癌細胞が、ヒストンH1に結合し得る細胞膜において、いわゆる受容体タンパク質を発現することに基づいている。この受容体タンパク質は、固定化されたヒストンH1を用いるとアフィニティー・クロマトグラフィーで単離される。ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS−PAGE）での測定では、受容体タンパク質は、分子量約33,000Da（33kDa）±2000Daに相当する電気泳動移動度を示している。
ヒストンH1が膜存在受容体タンパク質と結合すると、膜の統合性が破壊されて、タンパク質やイオンなどの可溶性細胞成分の無調整な流出、および他の物質の流入が生じ、結果として細胞死が起きる。
本発明は、異なる組織に由来する腫瘍細胞（例えば、白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫、黒色腫など）が特殊な個別性を有していること、および該個別性および細胞系特異性のよりよい理解が新しい効果的な治療についての出発点であることに基づいている。受容体タンパク質は、一つのあるいはいくつかの別異の細胞型について特徴的なのではなく、むしろ目的とする治療に到達し得るような個別の、細胞系に特徴的な性質を表しているということができる。
本発明の課業は、受容体タンパク質についてさらに知見を得て、該受容体タンパク質を発現する個別の癌細胞の治療的および予防的処置、すなわち癌細胞の抑制に関する新しい教示に展開することである。
従って、本発明は、該受容体タンパク質を（個別の特性として）発現する癌細胞を認識する診断手段も含む。本発明はまた、該個別癌細胞の治療的処置についての教示（すなわち結果）を予測可能とする。これには、治療薬剤（すなわちヒストンH1）での処置の成功性に準拠した新しい方法で癌細胞を分類し得ることが含まれる。信頼すべきデータでもって該個別性を有する癌細胞を生じるような人についての前徴を予測できるようになるとすぐに、治療法（本発明の対象）が予防領域でも用いることができる。このような人の血液中のヒストンの自然レベルが低すぎることが分かると、治療法は特に適用される。
本発明は、個別癌細胞（特に、白血病、リンパ腫、黒色腫などの造血系の癌細胞）の膜における上記受容体タンパク質がいくつかのヒストンタンパク質またはヒストン様ポリペプチドおよび／またはその部分を占有し、あるいは大部分がこれらのものからなっているとの観察に基づいている。これらのタンパク質は、外部から加えられたヒストンまたはヒストン様タンパク質（例えば、プロタミンおよび細菌性ヒストン様タンパク質）と結合および架橋されて、治療的あるいは診断的な領域で役立ち得る。受容体タンパク質を認識する適当な抗体も、診断手段として用いることができる。
本発明は、請求項１、24、25および26の内容によって特徴付けられる。請求項の特徴および下記の記載から、実施すると、よい結果がもたらされる。
ヒストン様タンパク質とは、プロタミンおよび別異の細菌性タンパク質を本明細書では意味する。細菌を起源とするヒストン様タンパク質のいくつかを、参照文献とともに表１に示す。表示の細菌性ヒストン様タンパク質とヒストンとの類似性は、タンパク質結晶についてのＸ線結晶での構造的観点、DNA結合および転写の検討での機能的観点、およびヒストンH1との配列相同性での生化学的観点から決定された。
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最初に、個別癌細胞（白血病細胞系IM9、Daudi、およびリンパ腫細胞系OH77）膜の上記の受容体タンパク質に関する特徴が発明者により明らかにされた。
MALDI−MS技法（マトリックス支援レーダー脱離／イオン化質量分析）を用いSDS−PAGEで誘導されたタンパク質バンドを質量分析して、電気泳動的に同一源のバンドが分子量11.2、13.7および15.0kDaの３種のタンパク質を含むことが明らかになった。
詳細には、下記の平均値が得られた。
11,175±40kDa
13,730±40kDaおよび
15,035±80kDa
平均値は、検査したサンプルからの、単一および二重電荷分子イオンシグナルおよび４〜６の総計スペクトルから計算する。
上記の受容体ポリペプチド分子量に比較すると、下記ヒト・ヒストン配列は次の分子量を有する。
H4                                     11,282kDa
H2B                                    13,774kDa
H3                                     15,324kDa
H2                                     14,004kDa
自動Edmanタンパク質減成による配列分析でもって、ヒト・ヒストンH4のアミノ酸残基23〜59に相当し、23位と35位のみが異なるペプチド配列を同定した。これは、健常細胞におけるヒトH4の既知配列に対して97.2％の相同性を示す。
これらの知見から導かれる驚くべき結論は、上記の受容体タンパク質が、ヒストンH4、H2BおよびH3またはこれらに非常に類似したタンパク質に結合し得るタンパク質からなるか、またはこのタンパク質を含むことである。個別の癌細胞膜におけるヒストンタンパク質の存在は、その細胞の腫瘍発生性形質転換が主な原因のようであり、また、核ヒストンに比較して量的な組成および可能な構造の相違にもよるようである。
比較的高濃度で個別癌細胞膜において発現されるヒストンH2A、H2B、H3および／またはH4（いわゆるコア・ヒストン）に属するヒストンタンパク質は、ヒストン、特にヒストンH1、またはその活性成分の外部からの添加によって、架橋される。架橋は、特定の癌細胞における膜統合性を喪失せしめ、最後に細胞死をもたらす。上記ヒストンタンパク質は、天然起源、例えばウシ組織からの抽出でもよく、または組換えタンパク質でもよい。共有統合的に修飾されたヒストンタンパク質またはその部分や機能的または構造的に類似するタンパク質も用いられる。適当な共有結合的修飾には、限定するわけでないが、ポリオキシエチレン鎖での誘導（“pegylation"）がある。機能的または構造的に類似のタンパク質の例としては、プロタミン、または原核生物または古細菌由来のヒストン様タンパク質がある。
H1分子は、いわゆるヌクレオソーム間、コア・ヒストンのよく組織された複合体間のリンカーとして作用し、クロマチンの縮合構造を形成することが知られている。この形成をなすためには、ほとんど無傷のヒストン分子を必要とし、この分子は近接の可動性Ｎ−およびＣ−末ドメインを有する折りたたまれた密な中心部分（すなわち、球状部分）を含有している。
この知見から、ヒストンH1分子の生物的活性（すなわち細胞傷害性）ドメインを的確に指摘する方法を演繹することができる。これは、個別癌細胞膜で発現されるコア・ヒストンとの架橋または結合を保証するドメインである。
このために、組換え的につくられたヒストンH5を細胞毒性実験において部分的に用いた。ヒストンH5は、チキン赤血球から誘導され、ヒストンH1の赤血球特異的変種を発現する。このヒストンタンパク質の断片は、両末テイルを広範に短くしたり、またはＣ末を徐々に短くするのに、部分的に用いた。この断片および遺伝子工学的製法については、Gercham et al.in Protein Expression ＆ Purification,5（1994）,pages242−251に記載されている。
下記の図は、用いたH5断片およびその構造的組成を示す。全ヒストンH5分子（H5）、うち球状ドメインのみ（GH5）、Ｎ末ドメインを有する球状ドメイン（NGH5）、Ｎ末ドメインとＣ末アミノ酸98−131を有する球状ドメイン（NGC1H5）、Ｎ末とＣ末アミノ酸98−151を有する球状ドメインである。用いたすべてのタンパク質および培養基はエンドトキシン陰性であった。
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コウシ胸腺由来ヒストンH1の形質転換癌細胞に対する作用について可能な構造−機能の関係を調べるために、一連の実験を行って、ヒストンH1を上記のヒストンH5の組換えポリペプチド断片と比較した。次の細胞／細胞系を試験した。急性骨髄白血病（AML）の女性患者の末梢血からの初生の細胞系、白血病細胞系IM9の細胞、およびリンパ腫細胞系OH77の細胞である。すべての実験において、ヒストンH1は濃度250μg/mlで細胞毒性が認められた。長い組換えH5誘導ポリペプチド、NGC1H5およびNGC2H5のAML細胞およびリンパ腫細胞系に対する細胞毒性作用は、細胞系IM9について強い細胞毒性作用が認められるヒストンH1に匹敵した。最も小さい生長阻害作用は、すべての細胞型において球状ドメインGH5および断片NGH5によって誘発された。組換え断片は250μg/mlのヒストンH1に等モルの濃度で用いた。結果は下記の実施例１−５に要約される。
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上図は、ヒストンH1および組換えヒストン断片の、AML（急性骨髄性白血病）の女性患者の白血病細胞に対する細胞毒性を示す。
例１−５において、１×106細胞/mlを次の標準的条件で48時間インキュベートした。
H1:ヒストンH1、ヒストンH5の組換え断片;GH5:断片GH5;NGH5:断片NGH5;C1:断片NGC1H5;C2:断片NGC2H5。ヒストンH1および組換え断片は12μＭで用いた。細胞の生存能の測定はMTT法を用いた。４平行実験の平均値で示した。
下記の例６−10において、ヒストンH1および組換えヒストン断片の細胞毒性を骨髄性白血病細胞系IM9の細胞について示す。
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さらに下記の例11−15において、ヒストンH1および組換えヒストン断片の細胞毒性を骨髄性白血病細胞系OH77の細胞について示す。
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例６−15において、５×104細胞/mlを次の標準的条件で48時間インキュベートした。
H1:ヒストンH1、ヒストンH5の組換え断片;GH5:断片GH5;NGH5:断片NGH5;C1:断片NGC1H5;C2:断片NGC2H5。ヒストンH1および組換え断片は12μＭで用いた。細胞の生存能の測定はMTT法を用いた。４平行実験の平均値で示した。
実施例から、ヒストンH1（またはH5）分子GH5の球状ドメインが低い細胞毒性を有するか、またはまったく細胞毒性を有していないこと（細胞毒性指数20以下で表す）が分かる。Ｃ末ドメインをほとんど完全に欠失している断片NGH5についても同様である。少なくとも残基108−131が存在し、かつＮ末ドメインが無傷であると（NGC1H5）、断片の細胞毒性は無傷のヒストン分子と同じかまたはそれ以上である（例４および９）。同じことがＣ末ドメインの38アミノ酸のみを欠失しているNGC2H5についても当てはまる。
同様の関係が短いＮ末ドメインおよび無傷のＣ末ドメインを有するヒストン断片について夫々成立する。
本発明によって、ヒストンH5の代わりにヒトヒストンH1サブタイプ、特にサブタイプH1.1、H1.2、H1.3、H1.4およびH1.0またはその部分を用いることが示唆される。
例16−18
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例16−17は、組換えヒト（rh）ヒストンH1のサブタイプH1.0およびH1.2の、バーキットリンパ腫細胞系Daudiの細胞に対する細胞毒性を示す。コウシ胸腺由来（ウシ）ヒストンH1と比較する（例18）。
次の表２は、上記の、Ｎ−およびＣ−末ドメインを夫々有するヒトヒストンH1サブタイプを表示する。Ｎ−末ドメインとＣ−末ドメインとの間の対応球状ドメインは表示していない。チキン由来のヒストンH5での結果に類似することから、これらのサブタイプが膜存在コア・ヒストン受容体を含有する癌細胞に対して同様の細胞毒性を発揮すると考えるのが合理的である。
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上表の段階的変化において、Ｃ−およびＮ−末ドメインは、配列中にアミノ酸プロリン（Ｐ）を含有する領域を意味する。プロリンがポリペプチド鎖の伸長を起して、らせんの形成を阻害するからである。
文献によると、ドメイン境界は違うように定義されている。チキンヒストンH5の場合、何人かの著者が、Ｎ末をアミノ酸１−18に、そして球状ドメインをアミノ酸19−108と定義する。Gerchmanら（上掲参照）は、球状ドメインをアミノ酸24−96と定義する。
要約すると、癌細胞の個別受容体のタンパク質は、現存の知識を基にして、コア・ヒストンH2A、H2B、H3および／またはH4の集合体を表すこと、およびこの集合体が該ヒストンまたはコア・ヒストン様タンパク質を含有することを結論し得る。DNAが膜表面に存在するかどうかは結論的に決定できない。しかし、そうでないとも云えない。
さらに、細胞が腫瘍へ形質転換をした結果として、プロタミンが癌細胞中に合成され得ることを忘れてはならない。このようなプロタミンは、コア・ヒストンの代わりに、あるいはコア・ヒストンとともに細胞膜中に局在し、ヒストンまたはヒストン様タンパク質と複合体を形成したり、結合したりすることがある。
ヌクレオソームに属するヒストン（すなわち、コア・ヒストン）は非共有結合力で互いに強く連結し、大きい分子量を有するようにみえる。ヒストンはまた、細胞膜中で互いに結合して、形質転換依存性の制御異常によって消滅する。
本発明の対象である治療的薬剤の作用機序は、（ａ）架橋され得るヒストンタンパク質、特にヒストンH1およびその部分の外部からの投与、（ｂ）生物的に活性の、共有結合的に修飾されたヒストン、または（ｃ）機能的および／または構造的にヒストン様のタンパク質、による膜存在ヒストンタンパク質の架橋に基づいている。この架橋すなわち結合の結果として、大きい集合体が細胞膜中に形成される。この集合体は、細孔様の性質を有し、細孔の形成を促進する。すなわち、細胞骨格の構造成分に直接関連する細胞膜成分の機械的な分解をもたらす。これらの事象は細胞膜の統合性を破壊し、最後に細胞死に至らしめる。シグナル形質導入機序およびアポトーシスが関与している可能性があるが、細胞死に導く決定的な過程ではない。
本発明の対象である治療的薬剤の生物活性は、次の写真Ａ−Ｄにおいて明らかである。
写真Ａは、リンパ腫細胞系OH77の未処置細胞を示す（倍率、2,000倍）。写真Ｂは、写真Ａの拡大図で、倍率が20,000倍である。この写真によって、無傷のリンパ腫瘍細胞の典型的な表面構造がよく分かる。写真Ｄは、200μg/mlのヒストンH1で12時間インキュベーションした後、腫瘍細胞が劇的に変化したことを表す。明らかなように、細胞は球状形に縮まり、ヒストンH1との24時間インキュベーション後に、完全にバラバラになる（写真Ｃ）。
純ヒストンH1の調製物は、上記の濃度で用い、上記の参照文献に記載の細胞培養に用いられる通常の培地に再懸濁した。
本発明はまた、細胞膜で受容体タンパク質を発現する個別の癌細胞の診断についての方法を含む。本発明により、ヒストン−特にヒストンH1またはその活性部分あるいは適当な抗体−は、癌細胞上の受容体タンパク質に結合して、診断に用いられる。特定の受容体タンパク質を含有する個別の癌細胞を分類することが初めて可能となる。これに必要とする診断技法は、広く知られており、既知の技術である。適当な抗体を見つけ出す技法についても同じことが伝える。この抗体は、癌細胞膜における受容体タンパク質自体または集合によって形成された関連構造を認識するものである。
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