(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞及び生殖細胞に、ＨＣＶ全長ｃＤＮＡが血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）プロモーター遺伝子の下流側に挿入されているＤＮＡ配列を含むＤＮＡを有し、かつＨＣＶ ＲＮＡを発現することを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２】
当該ＨＣＶ全長ｃＤＮＡがＳＡＰプロモーター遺伝子の下流側に結合されたウサギβグロビンイントロンII領域中に挿入されているＤＮＡ配列を含むＤＮＡを有することを特徴とする請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
当該ＤＮＡ配列を含むＤＮＡが、寄託番号FERM P-15005として寄託されている大腸菌に組み込まれているプラスミドのHindIII−XhoＩ領域であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
当該動物が齧歯動物であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
当該動物がマウスであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）全長ｃＤＮＡ配列を含むプラスミド、そのＤＮＡ配列を含有するＤＮＡを導入した遺伝子導入動物（トランスジェニック動物）に関するものである。
【０００２】
【従来技術及び課題】
ＨＣＶは、輸血後非Ａ非Ｂ肝炎の主な原因物質であり［Saito, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87,6547-6549(1990)］、このウイルスに起因した肝炎は、慢性化しやすく、肝硬変や肝癌に移行する確率が高い。1988年にカイロン社によって、ＨＣＶのｃＤＮＡがクローニングされ［Choo, Q.-L. et al., Science, 244,359-362(1989)］、現在までに全塩基配列並びに全アミノ酸配列が明らかにされた。また、ＨＣＶは、フラビウイルスやペスティウイルスに近縁なプラス鎖ＲＮＡウイルスであることが明らかにされた［Kato, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87,9524-9528(1990)］。
【０００３】
しかしながら、ＨＣＶの宿主はヒトまたはチンパンジーに限られており、また感受性を示す培養細胞がないことより、ウイルスタンパク質の性状やプロセッシング機構の解析などの基礎研究のみならず、疫学的な研究もあまり進歩していない。
【０００４】
近年、発生工学技術の発達により胚性期に外来遺伝子を導入し、導入遺伝子を個体レベルで発現させるトランスジェニックマウス作製技術が確立されている［Gordon, J.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77, 7380-7384(1980)］。この技術を用い、いくつかのウイルス疾患モデルマウスが確立されており、その中には、Ｂ型肝炎の原因物質であるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡが導入されたマウスが作製され、ＨＢＶ疾患モデル動物として利用されている［Chisari, F.V. et al., Science, 230, 1157-1160(1985)］。
しかしながら、ＨＣＶのＤＮＡが導入されたトランスジェニックマウスについては未だ報告は無い。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このような状況において、鋭意研究を行った結果、体細胞及び生殖細胞に、ＨＣＶ全長ｃＤＮＡが血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）プロモーターの下流側に挿入されているＤＮＡ配列を含有するＤＮＡが導入されているトランスジェニック動物を作製することに成功した。
【０００６】
【発明の構成】
本発明において使用されるＨＣＶ遺伝子は、本発明者らが研究に用いているＨＣＶ全長ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドpHCV7由来のものが使用される。好ましくは、プラスミドpHCV7中に挿入されたＨＣＶ全長ｃＤＮＡのEcoRＩ−EcoRＩ領域が使用される（図１）。
【０００７】
本発明の導入遺伝子は、上記ＨＣＶ全長ｃＤＮＡがヒトＳＡＰプロモーターに依存して転写されるように構築される。ここで、ＳＡＰプロモーターは、生後肝臓にて発現が増加するものである。このＳＡＰプロモーターは、プラスミドpSG-1由来のものが使用される。このプラスミドpSG-1は、プラスミドpAT153、ＳＡＰプロモーター及びウサギβグロビンイントロンIIより成り、SV40のlate及びAn領域を含有する（図１）。
【０００８】
ＨＣＶ全長ｃＤＮＡのEcoRＩ−EcoRＩ領域が上記プラスミドpSG-1のウサギβグロビンイントロンIIのEcoRＩクローニングサイトに挿入され、プラスミドpSGHCV7が構築される。当該プラスミドpSGHCV7を組み込んだ大腸菌Escherichia coli 111927は、FERM P-15005として生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【０００９】
本発明のトランスジェニック動物を作製するために使用する導入遺伝子は、上記プラスミドpSGHCV7由来のＨＣＶ全長ｃＤＮＡとＳＡＰプロモーター遺伝子を含有するＤＮＡが使用される。好ましくは、ＳＡＰプロモーター遺伝子の下流に結合されたウサギβグロビンイントロンII中にＨＣＶ全長ｃＤＮＡが挿入されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡが使用される。さらに好ましくは、pSGHCV7をHindIIIとXhoＩで消化して得られる約12kbのフラグメントが使用される（図２）。
【００１０】
得られたフラグメントを用いて、常法［K. Yamamura et al., J. Biochem. (Tokyo), 96, 357-363(1984)］に従い、ＨＣＶ全長ｃＤＮＡを含有するＤＮＡ配列が導入されたトランスジェニック動物が作製される。
使用される動物は、好ましくは齧歯動物、さらに好ましくはマウスである。
【００１１】
【発明の効果】
本発明において、ＨＣＶ全長ｃＤＮＡのマウスへの導入を試みた結果、ＨＣＶ全長ＤＮＡが検出され、さらには、肝臓においてＨＣＶ ＲＮＡの発現が確認された。すなわち、本発明によりＨＣＶ全長遺伝子を有するトランスジェニックマウスが確立されたことが明らかになった。
本発明により得られたＨＣＶトランスジェニック動物は、ＨＣＶ遺伝子機能の解析、ＨＣＶ感染並びに感染後肝炎の発症のメカニズムの解明、さらには医薬品のスクリーニング等に極めて有用であると期待される。
【００１２】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００１３】
【実施例】
《実施例１．導入遺伝子の調製》
ＨＣＶ遺伝子は  本発明者らが研究に用いているＨＣＶ全長ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドpHCV7由来のものを用いた（図１）。本発明者らは導入遺伝子としてＨＣＶ全長ｃＤＮＡがヒト血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）プロモーターに依存して転写されるコンストラクトを作製した。このプロモーターは生後、肝臓にて発現が増加するもので、プラスミドpSG-1由来のものを用いた。プラスミドpSG-1は、プラスミドpAT153、ＳＡＰプロモーター及びウサギβ−グロビンイントロンIIより成り、SV40のlate及びAn領域を含む。このプラスミドの切断部位はHindIII-XhoIで、クローニングサイトはEcoRIである。
pHCV7からEcoRＩ−EcoRＩで分離したＨＣＶ全長ｃＤＮＡをプラスミドpSG-1中のウサギβグロビンイントロンII中のEcoRＩクローニングサイトに挿入することにより、プラスミドpSGHCV7を得た（図１）。得られたpSGHCV7を、HindIIIとXhoＩで消化し、最終的に12kbのフラグメントを分離し、これを導入遺伝子フラグメントとして受精卵への注入に用いた（図２）。
本発明で導入遺伝子として使用される全ＨＣＶ遺伝子を含有するプラスミドpSGHCV7を組み込んだ大腸菌が、Escherichia coli 111927（生命工学工業技術研究所：FERM P-15005）として、本出願人により寄託されている。
【００１４】
《実施例２．遺伝子の導入》
トランスジェニックマウス作製にはC57BL/6マウスを用いた。常法［K. Yamamura et al., J. Biochem. (Tokyo), 96, 357-363(1984)］に従い、ホルモン処理した雌マウスを用い、交配により受精卵を得、受精卵の雄性前核内に３ng/mlに調製した導入遺伝子フラグメントをマイクロガラスピペットを用いて注入した。得られた遺伝子導入卵のうち、生き残った500個の卵を偽妊娠雌マウスの卵管に移植した（図３）。その結果、91匹のマウスが誕生した。
【００１５】
《実施例３．導入遺伝子の抽出》
遺伝子導入されたマウスより誕生したマウスの尻尾よりＤＮＡを抽出した。マウスの尻尾をプロテイナーゼＫにより溶解し、フェノール／クロロホルム（１：１）で処理し、エタノール沈殿させ、ＴＥ（10mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA）中に再溶解した。
【００１６】
《実施例４．導入遺伝子の解析》
導入遺伝子の解析は、サザンブロット解析によって行った。実施例３で得られたマウス尾ＤＮＡ抽出液（10μg）をEcoRＩで消化後 0.75% アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜（hybond-N+）に0.1Ｍ NaCl／0.1Ｍ NaOHでアルカリトランスファーした。ハイブリダイゼーションは、コア領域またはNS5領域（図２）をディゴキシゲニンで標識（DIG-DNA標識キット／ベーリンガーマンハイム社）したプローブを用いて行い、化学発光（CSPD／ベーリンガーマンハイム社）または発色（NTB/BCIP／ベーリンガーマンハイム社）によって検出を行った。
【００１７】
その結果、16匹のマウスにおいて、図４に示したように、9.5kbp付近に単一バンドが認められた。この結果から、これら16匹のマウスは完全な長さのＨＣＶ遺伝子を保有していることが確認された。これらのマウスをＦ0（創生）マウスと呼ぶ。
得られた各々のトランスジェニックマウスについて導入遺伝子のコピー数の解析を行った結果、１コピーから100コピー以上の導入遺伝子をもつマウスの系統が得られた（表１）。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
《実施例５．ＨＣＶトランスジェニックマウスの系統確立》
得られたＨＣＶトランスジェニックマウス（Ｆ0）の子孫を得るために同系統であるC57BL/6のWild typeと交配を行った。その結果、10系統が確立された（表１）。
【００２０】
《実施例６．ＨＣＶトランスジェニックマウスのＲＮＡ発現解析》
実施例５において系統化された系統４及び70について、子孫１代目（Ｆ1）または２代目（Ｆ2）のマウスを用いてＲＮＡの発現の有無を確認した。解析は、ＲＰＡIIキット（アンビオン社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、リボヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイを行った。サンプルは、マウスの肝臓を摘出し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてトータルＲＮＡを得た。プローブは、ＨＣＶｃＤＮＡをNcoＩ−PvuIIで消化した1429から1714ntの領域を鋳型にし、32Ｐで標識したＲＮＡプローブ（PENS1-300）をin vitro転写によって作製した。プローブは結果として、in vitro転写に用いたプラスミド由来の45bpを持つ。この領域がＨＣＶＲＮＡと非ハイブリダイズ領域となる。サンプルＲＮＡとプローブを２日間ハイブリダイズを行った後、リボヌクレアーゼＡ及びＴ１によって消化し、５％アクリルアミド−８Ｍ尿素ゲルで電気泳動し、乾燥後、オートラジオグラフィーを行った。
その結果、今回解析を実施した２系統、系統４及び70において肝臓でのＨＣＶＲＮＡの発現が確認された（図５）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＣＶ導入遺伝子の構築図を示す。
【図２】  トランスジェニック動物作製に使用されるＨＣＶ導入遺伝子及びプローブ領域を示す。
【図３】  トランスジェニックマウスの作製方法を示す。
【図４】  サザンブロット分析によりＦ0マウスのＨＣＶ遺伝子導入の確認した結果を示す。
【図５】  リボヌクレアーゼプロテクション分析により、ＨＣＶトランスジェニックマウスの肝臓でのＲＮＡの発現を確認した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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