(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えフォンビルブラント因子（ｒｖＷＦ）を、緩衝物質及び場合により塩を含む緩衝溶液中で、４級アミノタイプのアニオン交換体でのアニオン交換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、高純度フォンビルブラント因子の入手方法。
【請求項２】
アニオン交換クロマトグラフィーにより精製されたｒｖＷＦを、更に、緩衝物質及び場合により塩を含む緩衝溶液中で、固定化されたヘパリンでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｒｖＷＦ−濃縮物を形質転換した細胞の無細胞培養上澄みから精製することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
緩衝溶液として、安定剤、アミノ酸及び他の添加物を含有しない緩衝系を使用することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
アニオン交換クロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィーをｐＨ６．０〜８．５の範囲、特にｐＨ値７．４で実施することを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
アニオン交換クロマトグラフィーにおいてアニオン交換体に及びアフィニティークロマトグラフィーにおいて固定化されたヘパリンに結合したｒｖＷＦを、塩濃度を高めることにより溶出させることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
４級アニオン交換体は触手様構造を有するフラクトゲル▲Ｒ▼であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
アニオン交換体はＥＤＭ−ＴＭＡＥ−フラクトゲル▲Ｒ▼であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ｒｖＷＦはアニオン交換体に２７０ｍＭより低い塩濃度で結合させ、２７０ｍＭより高い、特に２８０ｍＭより高い塩濃度で溶出させることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
アフィニティークロマトグラフィーを、ヘパリンを担持した担体で実施し、その際、有利にはＡＦ−ヘパリン−トヨパール▲Ｒ▼（トソハース）、ヘパリンＥＭＤ−フラクトゲル▲Ｒ▼（メルク）又はヘパリン・セファロース・ファスト・フロー▲Ｒ▼（ファルマシア）が同等に適当であることを特徴とする、請求項２から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アニオン交換クロマトグラフィーで予備精製したｒｖＷＦを、固定化したヘパリンに１５０ｍＭより低い塩濃度で結合させ、１５０ｍＭより高い、特に２００〜３００ｍＭ、有利には１６０〜２７０ｍＭの塩濃度で溶出させることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
塩として、一価及び二価の塩を使用することを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
塩として、ＮａＣｌを使用することを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
血漿タンパク質、殊に因子ＶＩＩＩを含まず、病原性ウイルスを含まず、因子ＶＩＩＩに対して高い結合能力を有する、請求項１から１３のいずれか１項記載の方法により得られるｒｖＷＦ。
【請求項１５】
生理学的に活性であることを特徴とする、請求項１４記載のｒｖＷＦ。
【請求項１６】
血友病Ａ又はｖＷＦが不足している血友病Ａを治療するための薬剤組成物を製造するための、ｒｖＷＦの使用。
【請求項１７】
種々異なる型のフォンビルブラント病を治療するための薬剤組成物を製造するための、請求項１４及び／又は１５記載のｒｖＷＦの使用。
【請求項１８】
生理学的に許容される担体中に請求項１４及び／又は１５記載のｒｖＷＦを一つ以上含有することを特徴とする、薬剤組成物。
【請求項１９】
クロマトグラフィー精製法によりｒｖＷＦ含有フラクションから得られる高い構造的完全性を有するマルチマーからなり、マルチマーはタンパク質分解により消化されない、ウイルス安全性の組換えフォンビルブラント因子（ｒｖＷＦ）を含有する安定な薬剤。
【請求項２０】
ｒｖＷＦがフラグメント化されていないタンパク質として含有されていることを特徴とする、請求項１９記載の薬剤。
【請求項２１】
ｒｖＷＦが電気泳動法によりサテライトバンドの不存在下でマルチマーバンドを示すことを特徴とする、請求項１９又は２０記載の薬剤。
【請求項２２】
ｒｖＷＦ含有フラクションが細胞培養から得られることを特徴とする、請求項１９から２１のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項２３】
副作用、例えば血栓形成、血小板活性化又は血小板減少なしに患者に投与するために、薬剤組成物として処方されていることを特徴とする、請求項１９から２２のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項２４】
溶液の形で、室温で少なくとも５０時間安定である、請求項２３記載の薬剤。
【請求項２５】
溶液の形で、貯蔵安定性であることを特徴とする、請求項２３又は２４記載の薬剤。
【請求項２６】
注入製剤として存在することを特徴とする、請求項２３から２５のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項２７】
塩、例えば塩化ナトリウム及び塩化カルシウム及びアミノ酸、例えばグリシン及びリシンをｐＨ６〜８の範囲で含有することを特徴とする、請求項２３から２６のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項２８】
ｒｖＷＦ含有フラクションがウイルスの不活性化もしくは欠乏のために処理されていることを特徴とする、請求項２３から２７のいずれか１項記載の薬剤。
【請求項２９】
哺乳動物への投与後に一重構造を有するマルチマーパターンを保持することを特徴とする、ｒｖＷＦを含有する薬剤。
【請求項３０】
因子ＶＩＩＩ、組換え因子ＶＩＩＩ又は因子ＶＩＩＩの機能性欠失変異株を安定化するための、請求項１４又は１５記載のｒｖＷＦの使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、高純度フォルビルブラント因子（ｖＷＦ）の入手方法に関する。更に、本発明は、本発明方法により得られる組換えフォルビルブラント因子（ｒｖＷＦ）並びにｒｖＷＦを含有する薬剤組成物に関する。
血液凝固の際に、液状血液の血塊、膠様塊状物への変換が起こり、これは血塊形成により損傷された血管をふさぐ。その際に、血漿中に存在する溶解性のフィブリノーゲンの、繊維状膠様の凝固物質、フィブリンへの変換が、多工程経路（いわゆる血液凝固カスケード）で起こり、それにはローマ数字で示される少なくとも１５種の種々異なる血液凝固因子が関与していて、その各々は、その因子が活性化されると、そのつど次の不活性工程を活性化する。
凝固因子のうち、カルシウムイオン、フィブリノーゲン及びプロトロンビン（因子ＩＩ）は常に血液中で循環し、他のものは組織損傷又はコラーゲン又は血小板由来のリン脂質との接触によって（因子ＸＩＩ）活性化される。それ以外の凝固因子には、多くのセリンプロテアーゼ、例えばカリクレイン、トロンビン及び活性化因子ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ及びＸＩがある。
血小板は、フォンビルブラント因子（凝固因子ＶＩＩＩの成分）の存在下で、損傷された結合組織のコラーゲンに、粘着により固着する。血小板はその形を変え、突起を形成し、更にその外側の膜は他の血小板の粘着を容易にする。その後、血小板は、種々異なる物質をその顆粒から放出し、そのことによって血管収縮、並びに血漿性血液凝固の他の因子の堆積及び活性化が生じる。
フォルビルブラント因子には、通常進行する血液凝固における直接的及び間接的な使命が与えられている。フォルビルブラント因子は、複合体の形で、因子ＶＩＩＩと結合する。この複合体は、因子ＶＩＩＩの安定化のために使用される。次いで、この安定化された因子ＶＩＩＩは、因子Ｘの活性化の際の主要な補因子機能を有する。更にフォルビルブラント因子は、損傷した血管での血小板凝集を促進することにより、血液凝固に直接的に影響を及ぼす。
血友病（血液疾患）においては、一定の血漿性血液凝固−因子の不足によって血液凝固が妨げられる。血友病Ａにおいて、出血傾向は、因子ＶＩＩＩの不足もしくは凝固因子ＶＩＩＩの主要な成分をなすｖＷＦの不足に帰因する。血友病Ａの治療は、例えば、因子ＶＩＩＩ、ｖＷＦ因子ＶＩＩＩ−複合体又はｖＷＦを静脈内注入することにより、欠乏している凝固因子を血液保存容器からの因子濃縮物で補充することにより行われる。
フォンビルブラント因子の分泌不足又は分泌過剰に起因する多くの病状が存在する。例えばｖＷＦの分泌過剰は血栓傾向の増大をもたらし、これに対してｖＷＦを補給しないと、その結果、出血傾向の増大又は出血時間の延長に至る。
フォンビルブラント症候群は、多くの表現型で現れうる。全ての型は、機能性ｖＷＦの絶対的な欠乏によって理由づけられる出血時間の延長が著しい。ｖＷＦの不足は表現型血友病Ａをも引き起こしうる。それというのも、ｖＷＦは機能性因子ＶＩＩＩの主要な成分であるからである。この場合に、因子ＶＩＩＩの半減期は、血液凝固におけるその特異な機能を達成しえないないほど減少する。
血漿中でｖＷＦは５〜１０ｍｇ／ｌの濃度で、因子ＶＩＩＩとの非共有結合による複合体の形で循環する。ｖＷＦは、人体の種々異なる細胞中で形成され、後に循環へと放出される糖タンパク質である。その際に、約２２００００（ｖＷＦ−モノマー）の分子量を有するポリペプチド鎖から出発する細胞中で、複数の硫黄架橋を形成することにより、約５５００００の分子量を有するｖＷＦ−二量体（１次ｖＷＦ−二量体）が形成される。次いで、このｖＷＦ−二量体から、結合によって、約２０００００００までのより高い分子量を有するｖＷＦのポリマーが更に製造される。このことから、殊に、血液凝固の際の本質的な重要性が高分子ｖＷＦフラクションにあると想像される。
文献中に、ｖＷＦの種々異なる精製法及び濃縮法が記載されているが、それは全てフォンビルブラント因子の源としてヒトの血漿を使用している。
高解像電気泳動法を用いて、ｖＷＦの構造分析を行うことができる。それによって、バイルロッド（Ｂａｉｌｌｏｄ）等、トロンボーシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６６、７４５〜７５５、１９９２により、ｖＷＦ−マルチマーをバンドに分離し、それぞれのマルチマーバンドは１つ以上のサテライトバンドを有していることが分かった。これはｖＷＦ−マルチマーがタンパク質分解により消化されることに起因する。血液試料ヘプロテアーゼインヒビターを単純に添加することでは、この消化を避けることができなかった。
タイプＩＩＡの異常ｖＷＦは、異なった電気泳動パターンを示す。マルチマー分析の結果として、タイプＩＩＡのフォンビルブラント病を有する患者において、マルチマーはそれぞれ単独バンド（一重線）として生じ、サテライトバンドに分かれないことが分かった。このことは、Ｔｙｒ−８４２とＭｅｔ−８４３との間のプロテアーゼ感受性結合がタイプＩＩＡ患者においておそらく切断されないという事実に起因する。この患者は、出血傾向と関連した種々異なる病状を示す。
マルチマーバンドの類似のパターンが、組換えｖＷＦに関するフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）等、ＦＥＢＳ  レターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）３５１（１９９４）３４５〜３４８に記載されている。このｒｖＷＦを、ＣＨＯ細胞により発現し、マルチマー分析を行う。血漿ｖＷＦとは対照的に、三重構造は認められなかった。従って、このｒｖＷＦは、タンパク質分解により消化されていない完全に無損傷のタンパク質として存在する。
しかしながら、このｒｖＷＦには、例えば精製、ウイルス不活性化並びにウイルス減少のような処理法がなされなかった。それゆえに、製剤も存在しなかった。
従来公知のｖＷＦ−製剤は、ｖＷＦを、タンパク質分解で消化された形で含有する。このことによって、この製剤の安定化は制限される。血液試料の検査による、適当なインヒビターを用いてタンパク質分解を回避するための実験も、無損傷構造を有するｖＷＦをもたらさなかった。
欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０５０３９９１号明細書は、次の３つの連続するクロマトグラフィー工程によりヒト低温沈殿物からｖＷＦを精製することを記載している；１．ＤＥＡＥ（ＤＥＡＥ−セルロース、ジエチルアミノエチル−セルロース）−フラクトゲルでのイオン交換クロマトグラフィー及び０．１５ＭのＮａＣｌによるｖＷＦの溶出；２．ＤＥＡＥ−フラクトゲルでの再度のイオン交換クロマトグラフィー及び０．１７ＭのＮａＣｌによるｖＷＦの溶出；３．ゼラチン−セファロース▲Ｒ▼（Ｇｅｌａｔｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）でのアフィニティークロマトグラフィー。緩衝系として、アミノ酸及びカルシウムイオンを含有する緩衝液が使用されている。
Ｍ．ブルノウフ・ラドセヴィッチ（Ｂｕｒｎｏｕｆ−Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ）及びＴ．ブルノウフ（Ｂｕｒｎｏｕｆ）、フォックス・ザング（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ）６２（１９９２）１〜１１は、ＤＥＡＥ−フラクトゲルでのイオン交換クロマトグラフィーと、アミノ酸及びカルシウムイオンを含有する緩衝系中でのゼラチン−セファロース▲Ｒ▼−濾過との組み合わせによる、血漿−ｒＷＦの類似のクロマトグラフィー精製を記載している。
国際特許出願公開（ＷＯ−Ａ）第８９１２０６５号明細書は、ＤＥＡＥ−フラクトゲルへのタンパク質の結合、及びＮａＣｌを徐々に添加することによる段階的溶出による、血漿−低温沈殿物からの血漿−タンパク質の分離を記載している。この方法は、殊に、血友病Ａを治療するための高い純度の因子ＶＩＩＩ濃縮物を得るために、並びにフィブリノーゲン、ｖＷＦ及びフィブロネクチンの濃縮物を得るために適当である。ｖＷＦ含有フラクションを、有利には、アミノ酸及びカルシウムイオンを含有する緩衝液を使用して、同様のアニオン交換体での第二のクロマトグラフィーにかける。
欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０４１６９８３号明細書は、塩化バリウム及び水酸化アルミニウムからなる組み合わせ物を用いる沈殿及び引き続くＤＥＡＥ−フラクトゲルでのアニオン交換クロマトグラフィーによる、ヒト血漿からのｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ−複合体の入手を記載している。
ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）等、トロンボーシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）Ｒｅｓ．５０（１９８８）２９５〜３０４によれば、ｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ−複合体を、デキストランスルフェート−アガロースでのクロマトグラフィーにより精製する。この方法によるｖＷＦ−因子ＶＩＩＩ−複合体の精製の際に確かに因子ＶＩＩＩ：Ｃが高い純度で得られる。
従って、血友病Ａの治療のために、ｖＷＦを全く含有しないか又は痕跡量しか含有しないより良好に精製された因子ＶＩＩＩ：Ｃ濃縮物も使用される。従って、このような製剤は、ｖＷＦ欠乏を処置するのに適さない。すなち純粋なフォルビルブラント因子濃縮物の需要は非常に多い。
欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第０４６９９８５号明細書及び米国特許（ＵＳ−Ａ）第５２５２７１０号明細書は、ｖＷＦがアニオン交換カラムにではなく因子ＶＩＩＩに結合するので、第一の精製工程でｖＷＦから因子ＶＩＩＩを分離する、因子ＶＩＩＩを殆んど含まない血漿−低温沈殿物からのｖＷＦの製法を記載している。次いで第二工程で、アニオン交換体に結合していない材料の塩濃度を本質的に低下させ、ｖＷＦを第二のアニオン交換体に結合させ、次いで高いイオン濃度の溶液を用いて再び溶出させる。
ドイツ国特許出願公開（ＤＥ−Ａ）第３９０４３５４号明細書は、因子ＶＩＩＩからｖＷＦを分離することによる血漿−低温沈殿物からのｖＷＦ−濃縮物の製造を記載しており、その際、因子ＶＩＩＩはイオン交換体に結合するがｖＷＦは結合しない。
米国特許（ＵＳ−Ａ）第５２５２７０９号明細書は、ヒト血漿からの因子ＶＩＩＩ、ｖＷＦ、フィブロネクチン及びフィブリノーゲンの分離法を記載しており、その際、先ず、因子ＶＩＩＩ、ｖＷＦ及びフィブロネクチンをＤＥＡＥタイプのイオン交換体に結合させ、引き続き塩濃度を高めることによりイオン交換体から分離して溶出させる。
この方法は、因子ＶＩＩＩの分離を伴うｖＷＦの精製を記載しているにもかかわらず、因子ＶＩＩＩもしくは他の血漿タンパク質での僅かな汚染は回避されない。
更に、ヒト血漿からのタンパク質の精製により得られるか又は哺乳動物からの生物学的材料との接触で生じる全てのｖＷＦ濃縮物は、血漿給血者からの病原性分子、例えばウイルスを含有するというリスクを潜在的に有している。
本発明の課題は、本質的に他の血漿タンパク質を含まず、殊に因子ＶＩＩＩを含まない高純度フォンビルブラント因子を効率よく簡単に安全に製造する方法を提供することにある。
本発明の更なる課題は、その安定性が従来公知の製剤に対して改善されているｖＷＦを含有する薬剤を提供することにある。
これらの課題は、本発明の主題を用いて解決される。
本発明の主題は、組換えフォルビルブラント因子（ｒｖＷＦ）を４級アミノタイプのアニオン交換体でのアニオン交換クロマトグラフィーによりクロマトグラフィー精製する、高純度フォンビルブラント因子の入手方法である。
有利には、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製されたｒｖＷＦを、緩衝物質及び場合により塩を含む緩衝溶液中で、固定化されたヘパリンでのアフィニティークロマトグラフィーにより更にクロマトグラフィー精製する。
組換えフォンビルブラント因子は、形質転換したウイルスを含まない動物細胞の無細胞培養濾液から、細胞培養技術を用いて得られる。
この方法の有利な実施態様は、請求項２から１３項に記載されている。
本発明の更なる主題は、血漿タンパク質を含有しない、殊に因子ＶＩＩＩを含有しない、本発明方法により得られる組換えフォンビルブラント因子である。この組換えフォンビルブラント因子は生理学的に活性である。
本発明の主題は、更に、血友病Ａ及び種々異なる型のフォンビルブラント病を治療するために、本発明方法により得られるｒｖＷＦを使用することである。更なる主題は、この組換えフォンビルブラント因子を、血友病Ａ及び種々異なる型のフォンビルブラント病を治療するための薬剤組成物を製造するために使用することでもある。
本発明の主題は、更に、本発明方法により得られるｒｖＷＦを生理学的に許容される担体中に含有することを特徴とする、請求項１８記載の薬剤組成物である。
本発明のもう一つの主題は、高い構造的完全性(structural integrity)を有するマルチマーからなるウイルス安全性のｒｖＷＦを含有する製剤である。
組換えｖＷＦ因子（ｒｖＷＦ）を、動物細胞の発酵後の無細胞培養基から単離し、精製する。発酵のために使用された培養基は、このような目的のために慣用されている、動物細胞が生きるために必要な全ての物質、例えば、ビタミン、糖、塩、ホルモン、抗生物質及び緩衝物質の複合合成混合物であり、従って、全ての基本的特性において、ヒト血漿又は血漿−低温沈殿物の組成とは本質的に異なる。従って、本発明方法が、高純度フォンビルブラント因子を製造するために特に適していることは予測されえなかった。本発明方法では、特に、形質転換した細胞の無細胞培養上澄み由来の組換えフォンビルブラント因子を使用する。
本発明方法において、緩衝系として、特に安定剤、アミノ酸及び他の添加物を含まず、緩衝物質及び場合により塩、特に塩化ナトリウムを含む緩衝溶液を使用する。安定剤、アミノ酸及び他の添加物が、フォンビルブラント因子を安定化するために、因子ＶＩＩＩ−フォンビルブラント複合体を不安定にし、他のタンパク質の分離を容易にするために必要であることが従来から知られている。本発明方法においては、緩衝液中のこのような成分を完全に省くことができ、それにもかかわらず生理学的に活性の組換えフォンビルブラント因子が得られる。
緩衝系として、特に、安定剤、アミノ酸及び他の添加物を含まない緩衝系、例えばトリス−ＨＣｌ／ＮａＣｌ−緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液を使用する。
アニオン交換クロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィーは、特にｐＨ範囲６．０〜８．５、殊に有利にはｐＨ７．４で実施される。
アニオン交換クロマトグラフィーでのアニオン交換体及びアフィニティークロマトグラフィーでの固定化されたヘパリンに結合したｒｖＷＦの溶出を、特に塩濃度を高めることにより行う。
４級アミノタイプのアニオン交換体として、特に、触手構造（Ｔｅｎｔａｋｅｌｓｔｒｕｋｔｕｒ）を有するフラクトゲル及び殊にＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクトゲルを使用する。
特に、ｒｖＷＦを、＜２７０ｍＭの塩濃度でアニオン交換体に結合し、＞２７０ｍＭ及び特に＞２８０ｍＭの塩濃度で溶出させる。塩として、可溶性の一価及び二価の塩が使用可能であり、ＮａＣｌが有利である。
アフィニティークロマトグラフィーのために、ヘパリンに結合されうる担体はいずれも使用することができる。例えばＡＦ−ヘパリン−トヨパール▲Ｒ▼（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）（メタクリレートを主成分とする合成の孔の大きい親水性ポリマー；Ｔｏｓｏｈａａｓ）、ヘパリンＥＭＤ−フラクトゲル▲Ｒ▼（エチレングリコール、メタクリレート及びジメタクリレートを主成分とする合成の親水性ポリマー；Ｍｅｒｃｋ）又はヘパリン・セファロース・ファスト・フロー▲Ｒ▼（天然デキストラン−もしくはアガロース誘導体を含有；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が非常に適当なものであることが判明した。
アニオン交換クロマトグラフィーの工程により予備精製されたｒｖＷＦを、固定化したヘパリンに＜１５０ｍＭの塩濃度で結合させ、＞１５０ｍＭ、特に２００〜３００ｍＭ、有利には１６０〜２７０ｍＭの塩濃度で溶出させる。塩として、溶解性の一価又は二価の塩が使用可能であり、その際ＮａＣｌが有利である。
ｒｖＷＦの分子量に基づいて（５０００００〜数百万の分子量）、本発明方法では、アニオン交換クロマトグラフィーにおいてもアフィニティークロマトグラフィーにおいても、特に、例えば、担体構造へのｒｖＷＦ分子の拡散及び分配を妨げない担体材料、例えば、触手構造を有するゲルを使用する。
本発明方法の有利な実施態様において、無細胞培養基を先ず強いアニオン交換体で濾別し、その際にｒｖＷＦが交換体に結合される。アニオン交換体として、特に、触手構造を有し、強く結合するイオン交換基を有する、４級アミノタイプの孔の大きいゲル、例えばＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクトゲルを使用する。塩含有、特にＮａＣｌ含有緩衝液を用いて付随するタンパク質及び汚れを除去した後に、次いでｒｖＷＦを、イオン交換体から、濃縮した形で溶出させる。アフィニティークロマトグラフィーの第二の精製工程において、ｒｖＷＦを含有する溶出液を、共有結合したヘパリンを有するアフィニティー担体と接触させ、これによってｒｖＷＦがこの担体に結合する。適当な溶離剤（例えば緩衝物質）による異種物質及び異種タンパク質の除去後に、ｒｖＷＦを、特にＮａＣｌ含有緩衝系を用いて、アフィニティー担体から溶出させる。
高純度フォンビルブラント因子を入手するための本発明方法により、効率よい簡単な方法で、抗体を含まず、血漿タンパク質、殊に因子ＶＩＩＩを含まず、生理学的に活性であり、病原性ウイルスも含まない高純度ｒｖＷＦを得ることができる。
この高純度ｒｖＷＦは、更に、ｖＷＦタンパク質の割合が全タンパク質に対して少なくとも８０％、殊に少なくとも８６％であることを特徴とする。
本発明方法により得られる高純度ｒｖＷＦは、これが抗体を含まず、血漿タンパク質を含まず、病原性ウイルスを含まず、因子ＶＩＩＩを含まないという特性により、血友病Ａの治療において的確に使用することができる。
更に、本発明方法により得られる高純度ｒｖＷＦは、種々異なる型のフォンビルブラント病を治療するために使用できる。
更に、本発明により、高い構造的完全性を有するマルチマーからなるｒｖＷＦを含有する安定な薬剤が提供される。このｒｖＷＦは、これをウイルス安全性の製剤として提供できる程度に安定性である。ウイルス安全性は、ウイルスの不活性化もしくはウイルスの欠乏のための、ｒｖＷＦを処理するための方法工程により保証される。
ウイルスの不活性化のために、脂質で被覆されたウイルスも脂質で被覆されていないウイルスも確実に不活性化することができる、溶液もしくは固体状態での加熱処理は殊に適当である。例えば、本発明による製剤を、欧州特許（ＥＰ）第０１５９３１１号明細書により、固形の湿潤状態で加熱処理する。ウイルス−不活性化のための他の方法は、例えば欧州特許（ＥＰ）第０５１９９０１号明細書、国際特許（ＷＯ）第９４／１３３２９号明細書、ドイツ国特許（ＤＥ）第４４３４５３８号明細書、欧州特許第０１３１７４０号明細書及び国際特許（ＷＯ）第９０／１５６１３号明細書による洗浄剤又はカオトロピック物質での処理も包含する。
ｒｖＷＦは、本発明による製剤中に、クロマトグラフィー精製法により得られる特に高純度タンパク質として含有される。クロマトグラフィー精製は、殊にイオン交換クロマトグラフィー及び／又はアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。このために、とりわけ、アニオン交換のための材料（これに関しては、リガンド、例えばＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、ＱＡＥ、Ｑ又はアミノアルキル基を有する炭水化物を主成分とする合成の担体材料又は担体が挙げられる）もしくはｖＷＦに対して特異的なアフィニティーを有する固定化した物質を有する担体を含有していてよい。適当なアフィニティー材料は、例えばヘパリンを含有する。この精製法は、特に、ｒｖＷＦの大規模な入手のために適当である。
その上、意外にも、本発明による製剤中のｒｖＷＦが、タンパク質分解による消化に対して、慣用の安定剤の添加を省くことができる程度に十分な耐性を有することが分かった。しかしながら、例外的に、無損傷の構造を得るために、製造方法の間に、適当なプロテアーゼインヒビターを添加することもできる。ｖＷＦの安定性を更に助けるために、製剤は、ｒｖＷＦを沈殿させず、生理学的に許容されポリアルキレングリコール、例えばＰＥＧ又はポリプロピレングリコール、又はグリセリンを濃縮して含有していてよい。
本発明により、製剤中のｒｖＷＦは、電気泳動法により、サテライトバンドの不存在下でマルチマーバンドを示す。このことは、フラグメント化されていない、すなわち無損傷のタンパク質としてのｒＷＦの構造に相当する。特に、製剤中のｒｖＷＦは、マルチマーの全スペクトルを、殊に、天然のマルチマー分布に類似する高い分子量を有するｖＷＦを示す。
本発明による製剤の安定性は、とりわけ、液体製剤にとって必要である。本発明による製剤の溶液は、例えば室温で少なくとも４８時間、特に７２時間安定性であり、４℃で２年以上貯蔵可能である。安定性は、５０％より少ない、特に２０％より少ない、大抵、有利には１０％より少ないほんの僅かな活性損失によって明らかになる。それによって、本発明の製剤は、製剤が変化する危険性及び用量計画の変更の必要性なしに、長時間にわたって患者に注入することもできる注入製剤として適当である。起こりうる副作用反応の回避に関して、無損傷及び安定性の構造を有するタンパク質を投与することは同様に有利である。
本発明による製剤が副作用反応、例えば血栓形成、血小板活性化又は血小板減少なしに患者に投与することができることが明らかになった。このことは、本発明による製剤中のｒｖＷＦが、タイプＩＩＡ−フォンビルブラント病の原因となっている形と類似のマルチマーパターンを有するので、とりわけ意外であった。
本発明による製剤の処方は、自体公知の慣用の方法で、例えば塩及び場合によりアミノ酸を用いて、更に界面活性剤の存在下で行うことができる。特に、塩、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムが有利に使用され、６〜８の範囲のｐＨが選択される。アミノ酸として、グリシン又はリシンは有利である。同様に、薬学的に許容される緩衝液を選択することができる。ｒｖＷＦの高い安定性に基づいて、通常、処方物において安定剤、例えば担体タンパク質又はインヒビターの使用を省くことができる。
直ちに投与できる溶液中のｒｖＷＦの有利な濃度は、１〜１００単位／ｍｌの範囲である。製剤の高い純度によって、これを１０００Ｕ／ｍｌまでの濃度で処方することもできる。活性は、リストセチン媒介血小板凝集によって特徴付けられ、リストセチン−補因子活性（ＲＣｏＦ）として示される（これに関して、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ５２，２７０８〜２７１６，１９７３参照）。ｖＷＦの一般的用量は、６〜４８時間の間隔で４０〜８０ＲＣｏＦ−単位／ｋｇの範囲である。開始用量として、２００ＲＣｏＦまでの高い用量を選択することもできる。
本発明による製剤の投与後のｒｖＷＦの半減期は、意外にも、２０時間より長い生物学的半減期で、従来の製剤よりも明らかに長い。
有利な実施態様によれば、ｒｖＷＦは、哺乳動物への投与後に一重構造を有するマルチマーパターンを保持する。従って、サテライトバンドでの、一重バンドのタンパク質分解的分解は生じない。
特に、本発明による製剤は、ｒｖＷＦを唯一の主要な成分として含有する。従って、この製剤は、本質的に、よく精製されたｒｖＷＦからなりうる。
本発明方法により得られるｒｖＷＦは、因子ＶＩＩＩ、組換えにより製造された因子ＶＩＩＩ又は因子ＶＩＩＩの機能欠失変異株を安定化するためにも使用され、その際、安定化をｉｎｖｉｔｒｏで立証することができる。
こうして安定化された因子ＶＩＩＩ製剤は、血漿製品のように病原性ウイルスで汚染されうるという危険性がない。
意外にも、ｒｖＷＦが因子ＶＩＩＩへの高い結合能力を潜在的に有し、それによって因子ＶＩＩＩが血漿性ｖＷＦより効率よく結合することが分かった。
従って、本発明の主題は、因子ＶＩＩＩに関する高い結合能力を有することを特徴とする本発明方法により得られるｒｖＷＦでもある。
この製剤を製造するために、特に、高純度組換えフォンビルブラント因子を含有するフラクションを濃縮し、濃縮物を更に処理する。
この薬剤組成物は、血友病Ａ及び種々異なる型のフォンビルブラント病の治療のために慣用の及び慣用の服用形で存在していてよく、特にこの薬剤組成物は、注入に適した製剤の形で存在する。
以下の例で、本発明を詳述するが、本発明はそれに限定されない。
例１には、形質転換された動物細胞の発酵による無細胞培養基から得られたｒｖＷＦを、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製することが記載されている。アフィニティークロマトグラフィーの処理工程後の精製が、例２に記載されている。
図１は、ｒｖＷＦの８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す。レーンＡ：培養基；レーンＢ：フラクトゲルによる２８０ｍＭのＮａＣｌフラクション；レーンＣ：ヘパリン−アフィニティークロマトグラフィーによる２７０ｍＭのＮａＣｌフラクション；レーンＤ：分子量マーカー。
例１
アニオン交換クロマトグラフィーによる、培養上澄みからのｒｖＷＦの精製：
組換えｖＷＦを、細胞培養技術でワクシニアウイルスをベロ細胞（サル−腎臓細胞）に感染させた後慣用の方法により得た。ベロ／ワクシニア発現系及び細胞培養条件は、Ｆ．Ｇ．フォークナー（Ｆａｌｋｎｅｒ）等、トロンボーシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）６８（１９９２）１１９〜１２４、Ｎ．バレット（Ｂａｒｒｅｔ）等、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．５（１９８９）１５９〜１７１及びＦ．ドーナー（Ｄｏｒｎｅｒ）等、ＡＩＤＳワクチン・リサーチ・アンド・クリニカル・トライアルス（ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ）、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ），Ｉｎｃ、ニューヨーク（１９９０）中に詳しく記載されている。ｒｖＷＦの発現は、合成ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）標準媒体中で行なった。
組換えｖＷＦを、ＣＨＯ細胞の形質転換によって得ることもできる。
形質転換した細胞の発酵後に培養基を分離し、細胞及び細胞断片を遠心分離により除去した。他の僅かな成分、例えば膜断片又は細菌を、０．４μｍの孔径を有するフィルターによる濾過により除去した。
無細胞培養上澄み７７０ｍｌを、流速２ｍｌ／ｃｍ2／ｍｉｎで、カラム（１．６ｃｍ×５ｃｍ、アニオン交換体ＥＭＤ−ＴＭＡＥ−フラクトゲル（Ｍｅｒｃｋ））１０ｍｌを充填）を用いて濾過した。ゲルを先ず２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて平衡させた。引き続き、カラムを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。
異種物質を、２００ｍＭのＮａＣｌ含有緩衝液でカラムを洗浄して除去した。次いでｒｖＷＦを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中の２８０ｍＭのＮａＣｌを用いて、担体から溶出させた。最後に、１ＭのＮａＣｌを用いて、場合によって存在する残留物質をカラムから溶出した。クロマトグラフィーの間に、タンパク質吸収を慣用の方法で２８０ｎｍで観察した。クロマトグラフィー後に、タンパク質濃度を、ブラッドホルド法（Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１９７６）２４８〜２５４）により測定した。ｒｖＷＦの含量を、市販のＥＬＩＳＡ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて測定した。
ほとんど全てのｒｖＷＦが担体に結合したことが分かった。ｒｖＷＦを０．２８ＭのＮａＣｌにより、アニオン交換体から溶出させた。アニオン交換体でのｒｖＷＦの精製の結果を第１表中にまとめる。
この例に記載した精製により、ｒｖＷＦは約６倍に濃縮された。
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例２
アフィニティークロマトグラフィーによるｒｖＷＦの精製
例１により得られたｒｖＷＦを、塩濃度（１６０ｍＭのＮａＣｌ）を減少させるために２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。引き続き、溶液をカラム（１．６ｃｍ×５ｃｍ、ＡＦ  ヘパリン  トヨパール６５０（Ｔｏｓｏｈａａｓ）１０ｍｌを充填）により、流速１ｍｌ／ｃｍ2／ｍｉｎで濾過した。カラムを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で予め平衡させた。非特異的に結合したタンパク質を、先ず、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いる洗浄により除去した。ｒｖＷＦを、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中の２７０ｍＭのＮａＣｌによって担体から溶出された。最後に、１ＭのＮａＣｌを用いて、残留物質をカラムから溶出した。クロマトグラフィーの間に、タンパク質吸収を慣用の方法で２８０ｎｍで観察した。クロマトグラフィー後に、タンパク質濃度を、ブラッドホルド法（Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１．ｃ．）により測定した。ｒｖＷＦの含量を、市販のＥＬＩＳＡ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて測定した。
ほとんど全てのｒｖＷＦが担体に結合したことが分かった。２７０ｍＭのＮａＣｌでの溶出の際に、ｒｖＷＦの大部分がカラムから溶出する一方、１ＭのＮａＣｌでの洗浄は痕跡量のｒｖＷＦを含んでいた。この精製工程の結果を第２表にまとめる。この精製工程により、ｒｖＷＦタンパク質の割合は８６％より上まで高められた。
変性ＳＤＳ−タンパク質ゲル電気泳動（Ｕ．Ｋ．Ｌａｒｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０）６８０−６８５）及び引き続くウエスタンブロット法を用いて、２７０ｍＭのＮａＣｌのフラクションを正確に試験した。
図１に示したように、変性電気泳動分析により、例１及び例２中に記載した精製によってｒｖＷＦが高い純度で得られたことが明らかになった。こうして得られた生成物中で、他の凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩは検出されなかった。
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精製したｒｖＷＦは、血小板凝集に関してｒｖＷＦ：Ａｇ４．３２Ｕ／ｍｇの活性を有する。
例３
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって、血漿ｒＷＦ（ｐ−ｖＷＦ）、低温沈殿物からのｖＷＦ（ｋ−ｖＷＦ）および組換えｖＷＦ（ｒ−ｖＷＦ）を精製した。種々異なるｖＷＦ−製剤を因子ＶＩＩＩへの結合に関して試験した。
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第３表は、ｖＷＦ：因子ＶＩＩＩの化学量論量のデータを示す。このデータは、ｒ−ｖＷＦの、因子ＶＩＩＩに対する結合能力がｐ−ｖＷＦよりも本質的に高いことを示している。
例４
溶液の形での組換えフォンビルブラント因子の安定性
フォンビルブラント因子製剤を、例２に記載したようにして製造し、Ｎａ3クエン酸塩．２Ｈ2Ｏ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２ｇ／ｌ、グリシン５ｇ／ｌ、Ｌ−リシン・ＨＣｌ５ｇ／ｌ及びＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ０．６２ｇ／ｌを含有する緩衝液、ｐＨ７．０中で、リストセチン媒介血小板凝集を用いて測定されたフォンビルブラント因子濃度が１０Ｕ／ｍｌであるように処方した。このような溶液を、４℃、２５℃、３７℃及び５０℃で７０時間まで保持した。種々異なる時間に試料を採取し、リストセチン媒介血小板凝集を用いてそのフォンビルブラント因子活性に関して測定した。
４℃及び２５０℃では観察時間内に活性の変化は生じず、３７℃で活性は２４時間にわたって８０％より高いままであり、５０℃ですら８時間にわたって生物学的活性の変化は認められなかった。同時に、抗原含量をＥＬＩＳＡを用いて測定した。抗原含量は、全ての貯蔵温度で全ての測定時間にわたって同様に出発値のままだった。安定性試験を、慣用のタンパク質安定剤、例えば担体タンパク質又は糖なしに実施した。
例５
組換えフォンビルブラント因子の凍結乾燥法
組換えフォンビルブラント因子を、例４に記載したようにして処方し、１０Ｕ／ｍｌの活性に調節した。慣用の安定化剤を更に添加せずに凍結乾燥させ、引き続き、水を用いて当初容量に再構成した。その後に新たにリストセチン−補因子−活性を測定した。ｒｖＷＦは、８０％の収率で再構成することができた。比較試験として、０．１％ヒト血清アルブミンの存在下で凍結乾燥させたときには、当初活性の９８％が再構成後に得られた。
例６
ブタにおける組換えフォンビルブラント因子のマルチマーの薬物動態学
試験のために、フォンビルブラント欠乏動物、例えばロウシ（Ｒｏｕｓｓｉ）等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９０：６６１〜６６８  １９９５に記載されている同型接合体フォンビルブラント欠乏ブタを使用することができる。この試験で生後４カ月の体重３７ｋｇのメスの同型接合体フォンビルブラント欠乏ブタを使用した。これは、サママ（Ｓａｍａｍａ）等、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．７１：６６３〜６６９、１９９４の耳たぶ出血法により測定して３０分より長い出血時間により特徴づけられ、検出限界より低いフォンビルブラント因子−血漿濃度が、抗原−ＥＬＩＳＡ及びリストセチン補因子活性で測定された。因子ＶＩＩＩ活性は、１−工程−凝固試験、２−工程−凝固試験又は色素原因子ＶＩＩＩ試験（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ、Ｉｍｍｕｎｏ）でヒト因子ＶＩＩＩとして計算して、約１Ｕ／ｍｌであった。
麻酔下で、ブタに、例２に記載したようにして得られた本発明による製剤を、３４ＲＣｏＦ  Ｅ／ｋｇ体重の用量で注入した。注入の直前並びに注入の３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間、３２時間及び４８時間後に、血液試料を採取し、それからクエン酸血漿を製造した。
血漿試料から、フォンビルブラント因子マルチマーの構造を、ルゲリ（Ｒｕｇｇｅｒｉ）等、Ｂｌｏｏｄ  ５７：１１４０〜１１４３による方法によって、２％アガロースゲル中でのＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動により確定した。その際に、フォンビルブラント因子マルチマーを、アイハラ等、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．５５：２６３〜２６７、１９８６による免疫酵素染色により目に見えるようにした。第一の抗体として、ウサギ−抗フォンビルブラント因子−抗血清（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を１：５０００の希釈度で使用した。第二の抗体として、アルカリ性ホスファターゼ−抱合アフィニティーで精製したヤギ−抗ウサギ−ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ抗体（Ａｘｅｌｌ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク）を１：１０００の希釈度で使用した。タンパク質バンドの染色を、ニトロブルーテトラゾリウム−クロリドブロム−インドリル−ホスフェート基質系を用いて行った。
本発明による製剤で処理する前には、フォンビルブラント因子はブタにおいて認められなかった。製剤を与えた後に、天然状態とは異なる、一重線からなるマルチマーパターンを示したが、これは、タンパク質分解で消化されないフォンビルブラント因子に起因している。この構造特性は、全ての観察時間にわたって変化しないままであり、すなわち製剤のタンパク質分解による消化は起きなかった。製剤は、確かに薬物動態学に比例して循環から逐次に排出された。最も低い分子量のマルチマーは、製剤の注入の４８時間後まで検出されなかった。
注入実験から、約３０時間の本発明によるフォンビルブラント因子の半減期を計算することができた。欠乏動物において妨げられた凝固系の規格化のための肉眼によるパラメータとして、出血時間（フォンビルブラント因子の注入の３０分以上前から注入の約１３分後までこれを修正することができた）を測定し、この効果は、注入の３２時間後にも検出可能であった。
【図１】
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