(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物におけるホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程を阻害する方法であって、ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程を有する微生物を、該工程を阻害するには有効であるが該微生物の増殖を阻害しない式Ｉ又は式IIのフラノン化合物に暴露することを含む上記方法：
0003620854.tif 000006
0003620854.tif 000007
（式中、
R1は水素、ヒドロキシル、アセトキシ、エステル又はエーテル基であり、
R2はBr又はＨであり、
R3及びR4は水素原子及びハロゲン原子からなる群から独立に選択され、
R5はC1、C3、C5及びC11アルキルからなる群から選択され、
R'1、R'2、R'3、及びR'4は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、メチル、アルキル、エーテル及びエステル基からなる群から各々独立に選択される）。
【請求項２】
前記フラノン化合物は下式の化合物である、請求項１に記載の方法：
0003620854.tif 000008
（式中、
R1＝H,R2＝Br,R3＝Br,R4＝Br,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝Br,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝H,R4＝Br,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝H,R4＝Cl,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝Cl,R4＝Ｈ及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝H,R4＝I,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝I,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝Cl,R4＝Cl,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝I,R4＝I,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝H,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝Br,及びR4＝Br,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝H,及びR4＝Br,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝Cl,及びR4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝H,及びR4＝I,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝I,及びR4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝Cl,及びR4＝Cl,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝I,及びR4＝I,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OH,R2＝Br,R3＝H,及びR4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝Br,R4＝Br,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝H,R4＝Br,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝Br,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝H,R4＝Cl,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝Cl,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝H,及びR4＝I,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝I,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝Cl,R4＝Cl,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝I,R4＝I,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝OAc,R2＝Br,R3＝H,R4＝H,及びR5＝C3アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝H,R4＝Br,及びR5＝C5アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝Br,R4＝H,及びR5＝C5アルキル；又は
R1＝H,R2＝H,R3＝Br,R4＝Br,及びR5＝C11アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝Br,及びR4＝Br,及びR5＝C1アルキル；又は
R1＝H,R2＝Br,R3＝H,及びR4＝Br,及びR5＝C1アルキル；又は
R1＝H,R2＝H,R3＝Br,及びR4＝Br,及びR5＝C1アルキル；である）。
【請求項３】
前記ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程が、運動性、スウォーミング、遊泳、細胞外酵素産生、インジゴ形成、発光、粘着性および付着から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
フラノン化合物を10ng/mlを上回る濃度で用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
フラノン化合物を100ng〜1mg/mlの濃度で用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
フラノン化合物を１μｇ〜100μg/mlの濃度で用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程が運動性またはスウォーミングであり、フラノン化合物を微生物培地に10ng/mlを上回る濃度で配合して、微生物の運動性又はスウォーミングを阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
フラノン化合物を培地に１μｇ〜100μg/mlの濃度で配合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
微生物が、植物、甲殻類、魚類、動物またはヒトの病原性微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
微生物がセラチア  リカファシエンス（Serratia liquefaciens）及びエルウィニア  カロトボラ（Erwinia carotovora）から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
微生物がビブリオ  ハーベイイ（Vibrio harveyi）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
微生物がビブリオ  アングイラルム（Vibrio anguillarum）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
微生物がシュードモナス  アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）及びプロテウス  ミラビリス（Proteus mirabilis）から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程が、運動性、スウォーミング、遊泳、細胞外酵素産生、インジゴ形成、発光、粘着性および付着から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
フラノン化合物を10ng/mlを上回る濃度で用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
フラノン化合物を100ng〜1mg/mlの濃度で用いる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
フラノン化合物を１μｇ〜100μg/mlの濃度で用いる、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程が運動性またはスウォーミングであり、フラノン化合物を微生物培地に10ng/mlを上回る濃度で配合して、微生物の運動性又はスウォーミングを阻害する、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
フラノン化合物を培地に１μｇ〜100μg/mlの濃度で配合する、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程が粘着性又は付着であり、フラノン化合物を表面に1ng/cm2を上回る濃度で適用して、該表面への微生物の粘着性又は付着をを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
フラノン化合物を10ng〜10μg/cm2の濃度で表面に適用する、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
微生物が、植物、甲殻類、魚類、動物またはヒトの病原性微生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
微生物がセラチア  リカファシエンス（Serratia liquefaciens）及びエルウィニア  カロトボラ（Erwinia carotovora）から成る群から選択される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
微生物がビブリオ  ハーベイイ（Vibrio harveyi）である、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
微生物がビブリオ  アングイラルム（Vibrio anguillarum）である、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
微生物がシュードモナス  アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）及びプロテウス  ミラビリス（Proteus mirabilis）から成る群から選択される、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
前記ホモセリンラクトン及び／又はアシル化ホモセリンラクトンによって制御される工程が粘着性又は付着であり、フラノン化合物を表面に1ng/cm2を上回る濃度で適用して、該表面への微生物の粘着性又は付着を阻害する、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
フラノン化合物を10ng〜10μg/cm2の濃度で表面に適用する、請求項27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、微生物の工程を制御する方法に関する。詳細には、微生物におけるホモセリンラクトン（HSL）および／またはアシル化ホモセリンラクトン（AHL）によって制御される工程を阻害する方法およびフラノンを含む培地。
背景技術
細菌、真菌および藻類のような微生物は、ヒトおよび動物の活性に大きな影響を与える。このような微生物を制御する化合物および方法を見いだすため、かなりの努力が払われてきた。少なくとも部分的には、これらの微生物は速やかに突然変異して、既に開発されている化合物や方法を巧みに免れる適応性を有するため、前記の目的のための新規な化合物および方法を見いだすことが絶えず必要とされている。
ヒト病原菌を包含する細菌に広く用いられている基本的な制御薬の一つの組は、ホモセリンラクトン（HSL）またはアシル化ホモセリンラクトン（AHL）として知られている。細菌のAHL制御系は、環境条件および細胞外シグナル分子に応じて細菌間活性を制御する２成分制御系である。この系は、生物発光海洋細菌のVibrio harveyiおよびV.fischeriで最初に発見されたものであり、生物発光の発現を制御するのに用いられている。原則として、この系は、２種類のタンパク質Lux RおよびLux Iを含んでいる。Lux I酵素はlux I遺伝子によってコードされ、ホモセリンラクトンとして知られている関連した種類のシグナル分子を産生する。これらのシグナル分子はLux Rレギュレーターに結合して、次いでこれを活性化して、生物発光に関与する酵素をコードする構造遺伝子の正のレギュレーターとして、およびlux I遺伝子自身の正のレギュレーターとして使用される。この系全体は、自動誘導の工程によって増幅される。追加分子は、Lux R−Lux I系のレギュレーターとして用いられる。
この制御系は、生物発光細菌について最初に発見されたものであるが、多数の他の微生物に見いだされており、多種多様な細菌活性に関与している（Swift et al.,1994;Fuqua et al.,1994）。これらの活性としては、植物病原菌であるErwinia carotovoraおよび嚢胞性繊維症の起因菌であるPseudomonas aeruginosaにおける細胞外酵素の産生、およびAgrobacterium tumefaciensから植物へのTiプラスミドの導入が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの場合にも、アシル化ホモセリンラクトンまたはホモセリンラクトン様化合物は、制御自動誘導物質である。
これらの制御系は細菌によく見られ、それらは宿主生物の細菌による侵襲へと工程を制御するので、他の生物はこれらの系に対する防御機構を進化させたことと思われる。これまでのところは、何も見いだされていない。本発明者らは、ホモセリンラクトン類の制御化合物の類似物質である化合物を用いて微生物工程を抑制する方法を開発した。
発明の開示
したがって、第一の態様では、本発明は、微生物におけるホモセリンラクトン（HSL）および／またはアシル化ホモセリン（AHL）によって制御される工程を阻害する方法であって、微生物をフラノン化合物に暴露して工程を阻害するようにすることを特徴とする方法から成っている。
好ましい形態では、フラノン化合物は藻類Delisea pulchraまたはその化学的修飾物または誘導体から誘導される。更に好ましくは、フラノン化合物は、式１および式２の化合物から成る群から選択され、更に一層好ましくは、フラノン化合物は図３の化合物から成る群から選択される。
フラノン化合物は、典型的には10ng/mlを上回る濃度で用いられる。フラノン化合物は、100ng〜1mg/mlの濃度で用いるのが好ましく、１μｇ〜100μg/mlの濃度で用いるのが更に好ましい。
本発明によって阻害することができるHSLおよびAHL制御工程としては、運動性、スウォーミング（swarming）、遊泳、細胞外酵素産生、インジゴ形成、着生、吸着、および発光が挙げられる。しかしながら、当業者であれば、他のAHLおよび／またはHSLによって制御される工程も本発明の方法によって阻害することができることを理解されるであろう。
イン・ビトロで培養するときに微生物の運動性またはスウォーミングを阻害するため、本発明に用いられるフラノンを培地に加えて、運動性微生物がその培地中または上で生育するときにその運動性またはスウォーミング工程を阻害するようにすることができる。これは、半固形培養基で微生物の混合培養物を培養において、１種類の運動性微生物が培養基上をスウォーミングし、混合物中に含まれる他の非運動性微生物の単離または選別を妨害する問題がある場合に、特に有用である。１種類以上のフラノンを培地に配合すると、その上で培養されているあらゆる微生物のHSLおよび／またはAHLによって制御される運動性またはスウォーミング工程が阻害される。
本発明の方法は、イン・ビボでの植物、動物およびヒトの微生物病原体における工程を阻害する目的で適用することができる。典型的な植物病原体としては、Serratia liquiaciensおよびErwinia carotovoraが挙げられ、動物病原体としては、Vibrio harveryiおよびVibrio anguillarumが挙げられ、ヒト病原体としては、Pseudomonas aeruginosaおよびProteus mirabilisが挙げられる。
本発明の方法は、微生物を直接フラノンで処理することによって、並びに間接的には例えば植物、動物またはヒトにフラノンを投与または適用して、植物、動物またはヒト中または上の目的とする微生物のHSLおよび／またはAHLによって制御される工程を阻害することによって微生物に対して行うことができることが理解されるであろう。フラノンの効果は、HSLおよび／またはAHLの経路自身に対する特定の作用とは無関係に目的とする制御される工程の減少または抑制である。
第二の態様では、本発明は、微生物のホモセリンラクトン（HSL）および／またはアシル化ホモセリンラクトン（AHL）によって制御される工程を阻害するための微生物培地であって、生育および／または維持成分、およびフラノン化合物を含んでなる培地から成っている。
好ましい形態では、フラノン化合物は藻類Delisea pulchraまたはその化学的修飾物まはた誘導体から誘導される。更に好ましくは、フラノン化合物は、式１および式２の化合物から成る群から選択され、更に一層好ましくは、フラノン化合物は図３の化合物から成る群から選択される。
フラノン化合物は、典型的には10ng/mlを上回る使用時の最終濃度を生じるように培地に加えられる。フラノン化合物の最終濃度は、100ng〜1mg/mlが好ましく、フラノン化合物の最終濃度は１μｇ〜100μg/mlが更に好ましい。
本明細書で用いられる「式１の化合物」という用語は、図１に示される構造のフラノンである化合物であって、R1が水素原子であるか、ヒドロキシル、エステルまたはエーテル基であり、R2およびR3がそれぞれ水素原子またはハロゲン原子であるものを意味する。
本明細書で用いられる「式２の化合物」という用語は、図２に示される構造のフラノンである化合物であって、R1、R2、R3およびR4がそれぞれ水素、ハロゲン、メチル、アルキル、ヒドロキシル、エーテルまたはエステル基であるか、またはこれらの基の組み合わせであるものを意味する。
本発明で用いられる化合物は、一連の構造的に関連した化合物から成っている。これらの化合物の幾つか（図１）は、以前に文献に部分的には本発明者らによって記載されており（Kazlauskas et al.,1977;de Nys et al.,1993）、その分子構造は核磁気共鳴分光分析法、マススペクトル分析装置、紫外および赤外分光分析法、および旋光度（∝Ｄ）によって解明され、特性決定されている。これらの化合物は総て、フラノン残基から成る基本炭素骨格であって、この基本構造の３位にアルキル側鎖を有するものを有している。R1位が水素、ヒドロキシおよびアセトキシ基で置換され、R2、R3位が水素、臭素、塩素およびヨウ素で置換されたものが好ましく、大きな一連の構造的に関連した代謝物を生じる（図１）。これらの位置での最も可能性のある置換の組み合わせでは、30種類の可能な構造が得られ、そのうちの13種類が特性決定されている。更に、本発明者らは、これらの化合物の幾つかの合成類似体であって、基本フラノン骨格を有するが、アルキル側鎖の長さが異なるものを試験した。本発明は、取り分け図１の30種類の化合物、並びに図２および３に示されるこれらの構造の拡張の総ての使用を包含するものである。
フラノン化合物はAHL類のレギュレーターと構造的に近接した類似体であり（ホモセリンラクトンおよび関連した制御分子の構造は、Swift et al.,1994およびFuqua et al.,1994に記載されている）、これらの化合物は実際にはホモセリンラクトン類の制御化合物の類似化合物であると思われる。したがって、フラノンは、多種多様な応用においてこれらの制御系の競合的阻害薬として広く用いられるものと思われる。
本発明を一層明確に理解できるようにするため、その例を下記の図面に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、Delisea pulchra由来のフラノンの構造、式１を示し、
図２は、Delisea pulchra由来のフラノンの構造、式２を示し、
図３は、試験を行うフラノンの構造を示し（化合物１〜５、８、10および12〜16を分析）、
図４は、フラノンによるSerratia liquifaciensでのAHLによって制御されたスウォーミングの阻害を示し、
図５は、（ａ）1.5％寒天を含むLB10でのスウォーミング、（ｂ）0.3％寒天を含むLB10での遊泳、および37℃でのProteus mirabilusの生育に対するフラノン化合物の効果を示し、
図６は、Deliseaの粗製抽出物のプラスチックにコーティングしたときの（ａ）実験室での６種類の菌株、および（ｂ）屋外での細菌の吸着に対する効果の結果を示す。
発明を実施するための態様
方法
下記に記載する試験のために、Delisea pulchra代謝物（フラノン化合物）を下記のようにして抽出した。藻類をケープ・バンクス、NSW、オーストラリアから収集し、収集時に凍結した。次に、組織を凍結乾燥し、ジクロロメタンで抽出し、粗製抽出物を真空で濃縮した。精製した代謝物を、真空液体クロマトグラフィに続いて高性能液体クロマトグラフィによって単離した（de Nys et al.,1993）。精製した代謝物の構造決定は、核磁気共鳴分光分析法およびマススペクトル分析法の組み合わせを用いて行った。以前に特定決定したDelisea代謝物および図３に示した合成類似体を生物学的試験に用いた。
フラノン化合物およびその類似体を、下記の示すように微生物に対して試験した。総ての試験（バイオアッセイ）は、制御条件下で実験室内で行った。
細菌におけるホモセリンラクトンによって媒介される系の阻害：スウォーミング、細胞外酵素、インジゴ産生および生物発光
総ての細菌は、液体LB培地中またはLBプレート上で室温にて前培養した。Serratia liquifaciens（スウォーミングおよび細胞外プロテアーゼ）アッセイ  Serratia liquifaciensは、液体LB培地中で室温にて450nmで0.3の光学濃度まで生育し、LB寒天（0.7％寒天）プレートに安定に接種した。プレートを30℃でインキュベーションし、スウォーミング行動について定期的に観察した。フラノン化合物のスウォーミングに対する効果を、（寒天を滅菌および冷却した後）化合物１〜13（図３）を５〜100μg/mlの濃度でプレートに加えることによって試験した。
Serratia liquifaciensによる細胞外プロテアーゼの産生のアッセイのため、細菌を上記と同様に培養して、液体LB培地に接種した。フラノン化合物の効果を、化合物３および４（図３）を100μg/mlで加えることによって試験した。少量を培養物から採取して、遠心分離し、滅菌濾過した。上清６μｌを脱脂粉乳寒天プレート（1.5％脱脂粉乳/M9培地）中のウェルに加えた。プレートを室温にてインキュベーションし、ウェルの周囲の透明になるゾーンを観察した。
フラノン化合物のSerratia liquifaciensの生育に対する効果も、体液LB培地中で、化合物を添加していない培養物の生育対フラノン化合物を添加した培養物の生育（別々の培養物中100μg/mlの化合物１〜13（図３））を比較することによって測定した。生育は450nmでの光学濃度として測定し、48時間に亙って継続した。
Chromobacterium violencia（インジゴ）アッセイ
HSLオートインデューサー（HSL auto inducer）に陰性のChromobacterium violenciaの突然変異株を、アッセイに用いた。この菌株を高濃度でLB培地に播種し、培地が凝固した後、打ち抜いた。様々なHSL産生株からの滅菌して濾過した上清を、ウェルに添加した。プレートを30℃でインキュベーションし、ウェルの周囲の紫色のゾーン（インジゴの産生による）の形成を観察した。フラノン化合物１および２の効果（図３）を、フラノン化合物を100μg/mlの濃度で含むLB培地のプレート上でこのアッセイを行うことによって評価した。化合物のChromobacteriumの生育に対する効果を、上記と同様にして評価した。
Pseudomonas aeruginosa（エラスターゼ）アッセイ
前培養物からの接種物を、0.3％エラスチンを含むペプトン−トリプシン大豆ブロス（Peptone−Tryptic Soy Broth）にすじ状に接種した。プレートを37℃でインキュベーションして、エラスチンの加水分解を観察した。フラノン化合物の効果を、プレートに化合物１〜４（100μg/ml）を添加し、化合物を添加したおよび添加していないプレートでの加水分解のゾーンを比較することによって評価した。
Erwinia carotovora（細胞外酵素）アッセイ
前培養したE.carotovoraからの接種物を、ジャガイモのスライスに加えた。ジャガイモの分解（軟化および褐変）を、フラノン化合物（３および４）を添加したおよび添加していないスライスで比較した。
Vibrio fisheriおよびV.harveyi（生物発光）アッセイ
Vibrioの両菌株についての初期分析物を、５〜100μg/mlのフラノン化合物を添加したおよび添加していないLB寒天プレート（２％をNaClを含む）にすじ状に接種した。室温で24時間インキュベーションした後、プレートの生物発光を目視により評価した。次のアッセイでは、両菌株をフラノンの存在下にて液体培養で生育させた。生物発光をルミノメーター（luminometer）によって測定した。両金貨物の生育に対するフラノンの効果を、上記と同様にして評価した。
表面運動性および粘着性の阻害
フラノンは、詳細に定義されたAHLによって媒介される細菌の特性に特異的に影響を与えると同時に、他の細菌の特性、特に表面運動性および粘着性も阻害する。フラノンは、他のAHL系を妨害するのと同様に、表面運動性およびスウォーミングを妨害しまたは阻害するが、一般的生育阻害または殺微生物効果は必ずしも持たない。これらの試験では、Proteus mirabilisおよび数種類の特性決定された（しかし、分類学的には同定されていない）海洋性単離物を用いた。
Proteus mirabilisおよび海洋性単離物（スウォーミングアッセイ）
Serratia liquifaciensについて記載した方法を用いた。フラノンによるこれらの細菌の生育の阻害を、上記と同様にして測定した。
海洋性単離物（粘着力アッセイ）
シドニー付近の海岸の水中に沈んだ表面からの６種類の海洋性細菌株を単離して、上記と同様にしてLB培地（２％NaClを含む）中で培養した。粘着性アッセイは、２つの方法で行った。第一に、フラノンを、数段階の濃度でプラスチック皿にコーティングして、皿をフレームに付着させた。それぞれのフレームを、６種類の細菌単離物の一つを107/ml含む培地に入れた。２時間後、フレームを取り出し、十分洗浄して、DAPIで染色し、それぞれの皿に付着した細菌の数をエピフルオレッセンス顕微鏡分析法（epifluorescence microscopy）によって計数した。
第二に、付着の阻害を、菌株をフラノンと共に前インキュベーションして、細胞が化合物を吸収することができるようにして試験した。1/2、３および10時間の３段階の前インキュベーション時間を用いた。前インキュベーション時間が終了したならば、細胞を洗浄して、107/mlを実験容器に入れ、プラスチック皿（未コーティング）を容器に入れた。２時間後に、フレームを皿と共に取り出して、洗浄し、付着した細胞の数を上記と同様にして計数した。
式２の化合物による細菌および真菌の生育の阻害
上記の試験に加えて、一般式２の選択された化合物の細菌、１種類の酵母（Candida albicans）および１種類の真菌（Helminthosporium sp.）の生育に対する効果を評価した。細菌を様々な濃度のフラノンの存在下にて液体培地中で生育させ、生育を光学濃度（OD）の変化によって測定した。真菌は、寒天プレートに胞子を接種することによって分析した。これらのプレートは、プレート内のウェルに様々な濃度のフラノン化合物を含んでいた。これらのウェルの周囲の阻止のゾーンを、48時間後に測定した。
バイオアッセイの効果
AHLによって媒介される工程に対する効果
いくつかの細菌種のAHLアッセイ用菌株について、AHL依存性の表現型および生育に対するフラノンの効果を表１に示す。いずれの場合にも、フラノンの幾つかは、生育を阻害しない濃度でAHL依存性の表現型に影響を与えた。最も完全な結果の組は、条件的植物病原体であるSerratia liquifaciensについて得られた。試験したフラノンは、いずれもこの生物の生育または遊泳行動を阻害しなかった。しかしながら、試験した総ての化合物は、AHL依存行動であるスウォーミングを様々な程度まで阻害した（図4a、4bおよび表１）。これは、細菌の細胞同士の連絡を妨害することにより、細菌の生育または生存に影響を与えることなく細菌の表面コロニー形成を制限する機構の存在を示している。同様にして、化合物３および４は、生育が影響を受けない濃度でSerratia exoproteasesにより細胞外プロテアーゼの産生を阻害する（試験した化合物は、いずれも100μg/mlではSerratia liquifaciensの生育を阻害しなかった）。
HSLによって制御される系であるChromobacterium violenciaにおけるインジゴの形成は、化合物１および２によって阻害される（表２）。これらの２種類の化合物は、この細菌の生育に影響しない。インジゴ陰性のChromobacterium violentia突然変異株は、化合物１および２の添加に応答して色素を産生しなかった（例えば、これらの化合物はインジゴ産生を刺激しない）。Serratiaについては、これらの化合物は、この生物に対して総体的効果を有するよりはむしろAHLによって媒介される工程を特異的に妨害すると思われる。いずれの場合にも、これらの結果は、本発明の化合物によるHSLの競合阻害を示唆している。Chromobacteriumの生育は、化合物４の100μg/mlによって阻害されたが、同じ濃度の化合物では影響を受けなかった。
これらの化合物は、２種類の重要な病原体であるヒト病原体のPseudomonas aeruginosa（嚢胞性線維症）および植物病原体のErwinia carotovora（軟腐病）においてAHLによって媒介される工程にも影響を与える。P.aeruginosaのAHLによって媒介される毒性因子であるエラスターゼの産生は、化合物１および２によって刺激されるが、化合物３および４によって阻害される。成育については化合物２および４は検出可能な効果は見られない。構造的に極めて類似した化合物（１および２対３および４）がエラスターゼ産生に対して反対の効果を有することがあるという観察は、このHSLによって媒介される系に対するこれらの化合物の極めて特異的な効果をも示している。
Erwinia carotovoraについては、化合物４は、細胞外酵素の産生を減少するが、生育は阻害しない。化合物３では、生育および細胞外酵素の形成のいずれに対しても効果は見られず、これらの代謝物の特異的効果を支持している。
フラノンはVibrio fischeriおよびV.harveyiにおいてAHLによって制御される生物発光を阻害するが、いずれの菌株の生育も阻害しない（表２）。
0003620854.tif 000002
0003620854.tif 000003
0003620854.tif 000004
表面運動性および粘着性の阻害
Deliseaの粗製抽出物および化合物４はいずれも、日和見ヒト病原体Proteus mirabilisによるスウォーミングを阻害した。化合物４は、スウォーミングを阻害する濃度では生育または遊泳に影響を与えなかった（図５）。６種類総ての海洋性菌株のスウォーミングも、生育を阻害しない濃度のフラノンで阻害された（表２）。
Deliseaの粗製の無極性抽出物を実験室でのアッセイにおいて人工的表面にコーティングすると、これは試験を行った６種類総ての海洋性単離物による粘着性を阻害した。幾つかの菌株の阻害は10ng/cm2程度の低濃度で起こり、６種類の菌株の５個は、１μg/cm2で阻害された（図6A）。細菌の粘着性の屋外試験の結果は、これらの結果と一致していた。１μg/cm2の濃度で表面にコーティングした粗製のDelisea抽出物は、屋外では細菌の付着を＞90％まで減少させた（図6B）。
細菌をDeliseaの粗製の無極性抽出物と共に前インキュベーションした後、細胞を洗浄しても、その後に（コーティングしていない）死表面への細菌の付着をかなり阻害した。この結果は、特に上記のAHL制御系の阻害についての結果に関して影響を与えている。これは、フラノンが単に表面特性を変化させることによって付着を阻害するのではないことを前インキュベーション実験が示しているからである。実際には、それらは細胞によって摂取され、その結果、粘着が阻害され、制御系が影響を受けて、（複数の）付着素の産生が喪失されることを示している。影響を受ける制御系は制御されるAHLであるというもう一つの証拠は、細胞をAHLと共に前インキュベーションすると付着が増加するという観察（データーは示していない）から得られる。多くの粘着性分析はDeliseaの粗製抽出物で行ったが、当業者であれば、これらの効果は、抽出物に含まれるフラノンによるものであることを理解されるであろう。
式２の化合物による真菌の生育の阻害
総ての化合物は、試験した濃度の少なくとも１つについてCandida albicansまたはHelminthosporiumを阻害した（表３）。これらの化合物はHelminthosporiumに対して最も有効であり、活性は幾つかの場合には市販の殺真菌薬アンホテリシンＢの活性に匹敵した。試験を行った最高濃度では、Helminthosporiumの生育はフラノンの４種類によって完全に阻害され、アンホテリシンＢの効果とは異なっていた。また、これらの化合物の寒天中への拡散は水溶性のアンホテリシンＢより遥かに少ないので、これらのアッセイではこれらの化合物の効果を市販品と比較して少なく見積っていることも強調される。
これらの結果は、天然フラノンおよび合成類似体が、
（ｉ）ホモセリンラクトンまたはアシル化ホモセリンラクトン制御系によって制御される細菌の特性を特異的に妨害する。本発明で影響を受けることが示されているAHLによって制御されることが知られている特性としては、スウォーミング、細胞外酵素産生、生物発光、および色素産生が挙げられる。AHLの添加によって刺激され、AHLによって制御されるとも考えられる粘着性も、試験したフラノンによって阻害された。同様に、Proteus mirabilisおよび多数の海洋性単離物のスウォーミングも、フラノンによって阻害された。本明細書では試験を行っていない他の工程または特性、例えばAHLによって制御される魚類病原体であるVibrio anguillarumの毒性、Agrobacterium tumefaciensにおけるプラスミド・トランスファーもフラノンによって阻害されると思われることに留意すべきである。
（ii）また、試験を行った化合物（式２）の幾つかは、細菌および真菌の生育の生育を阻害しおよび／または殺した。
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したがって、これらの化合物は、全体としてみれば、微生物のAHLによって制御される系を妨害し、幾つかの菌株の生育を阻害する。これらの効果は極めて特異的であり、フラノン化合物の濃度、試験を行った菌株およびフラノンの構造、および所定のAHLによって媒介される系によって変化する。フラノンは、生育を疎外すること無くHSL系を特異的に阻害するのに用いることができ、また生育を阻害するのに用いることもできる。細菌におけるHSLによって媒介される機能は広汎に存在しているため、これに関してフラノンを生物医学的、農業、および防腐（antifouling）の用途など、これらに限定されないが、多くの用途に用いることができる。
殺生物薬としてのこれらの化合物の幾つかの活性に関する幾つかの以前の研究、特にReicheltとBorowitzka（1984）によって報告された結果が行われている点が注目される。これらの結果は、式１のフラノンの幾つかは細菌の生育を阻害することを示しているが、フラノンが特異的な制御系を生じることができることは示唆も教示もされていない。本発明者らは、フラノンがこれらの細菌の特異的性質（細胞外酵素産生、スウォーミングなど）を強く阻害し、これらの化合物を様々なイン・ビトロおよびイン・ビボ系に用いてこのような特性を生じることができることを見いだした。
多数の変更および／または改質を、特定の具体的態様に示されるように、広汎に記載されている発明の精神または範囲から離反することなく本発明に行うことができることは、当業者であれば理解されるであろう。したがって、本発明の態様は、あらゆる側面において例示のためのものであり、制限のためのものではないと考えるべきである。
参考文献
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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