(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシ白血病発症の可能性を判定する方法であって、ウシ個体のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメイン：
0003613570.tif 000009
のアミノ酸番号75から78で特定されるアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyrであるウシ個体を白血病の発症可能性ありと判定する方法。
【請求項２】
両方の対立遺伝子ともウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78で特定されるアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyrであるウシ個体を発症危険性ありと判定する請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性を判定する方法であって、下記の工程：（１）ウシ個体から分離したゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅してウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコードするDNAを含むPCR産物を調製する工程：及び（２）上記PCR産物に含まれるDNAによりコードされるアミノ酸配列において、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78に相当するアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyrであるウシ個体を白血病の発症可能性ありと判定する工程；
を含む方法。
【請求項４】
PCR産物をPst Iで消化する工程を含む請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、ウシ個体のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する方法。
【請求項６】
少なくとも一方の対立遺伝子においてウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであるウシ個体を発症抵抗性ありと判定する請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
両方の対立遺伝子ともウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであるウシ個体を発症抵抗性が高いと判定する請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項８】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、下記の抵抗：（１）ウシ個体から分離したゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅してウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコードするDNAを含むPCR産物を調製する工程：及び（２）上記PCR産物に含まれるDNAによりコードされるアミノ酸配列において、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78に相当するアミノ酸がValであるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工程；
を含む方法。
【請求項９】
PCR産物をPst Iで消化する工程を含む請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性又は抵抗性を判定するために用いるプライマー・セットであって、
0003613570.tif 000010
を含むセット。
【請求項１１】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性又は抵抗性を判定するために用いるプライマー・セットであって、
0003613570.tif 000011
を含むセット。
【請求項１２】
ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性又は抵抗性を判定するために用いるプライマー・セットであって、
0003613570.tif 000012
からなる群から選ばれるプライマー、並びに
0003613570.tif 000013
を含むセット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病の発症可能性及び白血病発症の抵抗性を評価する方法に関する。
背景技術
主要組織適合抗原（MHC）は、生体の感染防御機構において自己−非自己の識別に関与する分子であり、α鎖及びβ2MからなるクラスＩとα鎖及びβ鎖からなるクラスIIとからなり、それぞれのα１とα２ドメイン及びα１とβ１ドメインには抗原ペプチドを噛み込む溝が存在している。そして、この溝に収容された断片化ペプチドのみがＴ細胞レセプターによって認識されるという特徴を有しており、クラスＩを認識したCD8＋細胞によって細胞死（細胞性免疫）が達成され、クラスIIを認識したCD4＋細胞によって主として抗体産生（液性免疫）が誘導される。
MHCは最も多型に富んだ遺伝子群であり、そのハプロタイプによってペプチド収容溝のポケットの位置、形、大きさ、及び性状が異なり、それに伴って噛み込まれる断片化ペプチドの結合状態が変化し、個体ごとの免疫応答及び疾患感受性を決定しているものと考えられている。MHCハプロタイプと疾患抵抗性（抗病性）又は発症可能性（易病性）との相関については、例えば、ヒト免疫不全ウイウス（HIV）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV）、及びマラリヤに関する報告がある。
一方、ウシMHC（BoLA）クラスII遺伝子については、これまでにDQA,DQB,DRA,DRB,DNA,DOB,DYA,及びDYB遺伝子の存在が推測されている。なかでも、DRB遺伝子座において同定されている３つの遺伝子（DRB1〜B3）のうち、DRB3については機能的な蛋白質をコードすることが知られており、現在までに73種類の対立遺伝子の存在が明らかにされている。しかしながら、ウシの感染性疾患とウシMHC（BoLA）ハプロタイプとの相関については従来ほとんど報告がない。
特に、ヒト免疫不全ウイウス（HIV）と同様にウイルス増殖を調節する遺伝子PXを有しており、HTLV−Ｉに最も近縁のレトロウイルスであるウシ白血病ウイルス（BLV）については、ウシMHC（BoLA）ハプロタイプとの相関に関して米国のグループが抗病性を中心に報告しているが、白血病発症可能性との関連性の報告は全くない。このウイルスに感染したウシの割合（日本における感染率）は10〜20％であり、そのうちの１〜２％は10〜15年程度という長期の潜伏期管の間に極めて悪性の地方病性ウシ白血病を発症して死に至るので、このウイルスが引き起こす畜産農家への経済的損失は非常に深刻である。ウシMHC（BoLA）ハプロタイプの解析によってBLV感染後のウシの発症可能性を簡単に判定できるようになれば、発症抵抗性のウシを予め選択して飼育することが可能になり、極めて安全にウシの飼育を継続することが可能になるものと期待される。
従って、本発明の課題は、ウシ白血病ウイルス（BLV）とウシMHC（BoLA）ハプロタイプとの相関を解明し、ウシ個体のウシ白血病ウイルス（BLV）に対する白血病発症の可能性及び白血病に対する発症抵抗性を遺伝子工学的な手法で簡便に判定する方法を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記の判定方法に有用なプライマー・セットを提供することにある。
発明の開示
本発明者は、先に、ウシMHC（BoLA）クラスII遺伝子のうち、DRB遺伝子座の構造を解析して、DRB3遺伝子（BoLA−DRB3）及びその遺伝子産物の構造を明らかにした（Biochem.Biophys.Res.Commun.,209,pp.981−988,1995）。本発明者はさらにこの遺伝子の機能を研究するうち、白血病発症牛と未発症牛とでは、BoLA−DRB3の中で特に多型が認められる第二エクソン（β１ドメイン）からの遺伝子産物において、明らかにアミノ酸配列の異なる部分が存在することを見いだした。また、このアミノ酸置換が、BLVに対する発症可能性及び発症抵抗性に直接関与していることを見いだした。本発明はこれらの知見を基にして乾性されたものである。
すなわち本発明は、ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性を判定する方法であって、ウシ個体のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78で特定されるアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyrであるウシ個体を白血病の発症可能性ありと判定する方法を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、ウシ白血病ウイルスBLVに感染したウシに対して行う上記方法；並びに、両方の対立遺伝子ともウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78で特定されるアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyrであるウシ個体発症危険性ありと判定する上記方法が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性を判定する方法であって、下記の工程：
（１）ウシ個体から分離したゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅してウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコードするDNAを含むPCR産物を調製する工程：及び
（２）上記PCR産物に含まれるDNAによりコードされるアミノ酸配列において、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78に相当するアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyrであるウシ個体を白血病の発症可能性ありと判定する工程；
を含む方法が提供される。この方法の好ましい態様では、PCR産物をPst Iで消化する工程を含んでいる。
本発明の別の観点によれば、ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、ウシ個体のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する方法を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、ウシ白血病ウイルスBLVに感染したウシに対して行う上記方法；少なくとも一方の対立遺伝子においてウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであるウシ個体を発症抵抗性ありと判定する上記方法；並びに、両方の対立遺伝子ともウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであるウシ個体を発症抵抗性が高いと判定する上記方法が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の抵抗性を判定する方法であって、下記の工程：
（１）ウシ個体から分離したゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅してウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコードするDNAを含むPCR産物を調製する工程：及び
（２）上記PCR産物に含まれるDNAによりコードされるアミノ酸配列において、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78に相当するアミノ酸がValであるウシ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工程；
を含む方法が提供される。この方法の好ましい態様では、PCR産物をPst Iで消化する工程を含んでいる。
これらの発明の好ましい態様によれば、下記のプライマー・セットとそれらを用いる上記方法、好ましくはそれぞれウシ白血病ウイルスBLVに感染したウシに対して行う上記方法が提供される。さらに本発明により、ウシ白血病ウイルスBLVに対するウシの白血病発症の可能性を判定するために用いるプライマー・セットであって、下記のＡプライマー及びＢプライマーを含むプライマー・セット（１）ないし（３）が提供される。
0003613570.tif 000002
【図面の簡単な説明】
第１図はウシMHC Class II DRβ鎖の構造を示す図である。図中、（Ａ）はウシMHC Class II DRβ鎖mRNAの構造を示し、（Ｂ）はウシMHC Class II DRβ鎖をコードするcDNAの全長及びその遺伝子産物のアミノ酸配列を示し、β１ドメインはアミノ酸番号１からアミノ酸番号94までのアミノ酸配列により特定される部分である。
第２図（Ａ）〜（Ｃ）はウシ白血病ウイルスBLV感染未発症牛（（Ａ）リンパ球増多症牛７頭、（Ｂ）及び（Ｃ）抗体陽性健康未発症牛24頭）由来のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸（アミノ酸番号９〜86で特定されるアミノ酸配列）を比較した結果を示す図である。左側の数字はウシ個体の識別番号であり、図中、アミノ酸は一文字表記で示した。
第３図（Ａ）及び（Ｂ）は白血病発症牛（24頭）由来のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸（アミノ酸番号９〜86で特定されるアミノ酸配列）を比較した結果を示す図である。左側の数字はウシ個体の識別番号であり、図中、アミノ酸は一文字表記で示した。
発明の実施するための最良の形態
本発明の方法は、ウシ白血病ウイルスBLVに感染したウシ、又はウシ白血病ウイルスBLVに未感染のウシについて、その個体の白血病発症の可能性を判定する方法である。また、本発明の別な方法は、ウシ白血病ウイルスBLVに感染したウシ、又はウシ白血病ウイルスBLVに未感染のウシについて、その個体の白血病発症の抵抗性を判定する方法である。
本発明の好ましい態様では、ウシ個体からゲノムDNAを分離した後、PCR法によってウシMHC Class IIのDRβ鎖のβ１ドメイン（DRB3遺伝子の第二エクソン）の一部又は全部をコードする遺伝子を特異的に増幅し、得られたPCR産物のシークエンシングを行ってβ１ドメインのアミノ酸番号75から78で特定されるアミノ酸配列を推定する。このアミノ酸配列（アミノ酸番号75−78）がVal−Asp−Thr−Tyr（一文字表記ではVDTYで表される）であるウシ個体がすでにウシ白血病ウイルスBLVに感染している場合、又はウシ白血病ウイルスBLVに感染した場合には、そのウシ個体は白血病の発症可能性がある。ウシ個体がウシ白血病ウイルスBLVに感染しているか否かは、抗ウシ白血病ウイルスBLV抗体を用いた試験により容易に確認することが可能である。
上記の判定をより正確に行うためには、対立遺伝子（ハプロタイプ）における上記アミノ酸配列を比較することが好ましい。両方の対立遺伝子のアミノ酸配列（アミノ酸番号75−78）がVal−Asp−Thr−Tyrである場合（すなわちVDTYホモ）には、そのウシ個体がすでにウシ白血病ウイルスBLVに感染している場合、又はウシ白血病ウイルスBLVに感染した場合には、その個体は白血病発症の危険性が高い。一方、対立遺伝子におけるアミノ酸配列がVal−Asp−Thr−Tyr（VDTY）とVal−Asp−Thr−Val（VDTV）とのヘテロ;Val−Asp−Thr−Tyr（VDTY）とVal−Asp−Arg−Val（VDRV）とのヘテロ;Val−Asp−Thr−Val（VDTV）ホモ;Val−Asp−Arg−Val（VDRV）ホモ：又は、Val−Asp−Arg−Val（VDRV）とVal−Asp−Thr−Val（VDTV）ヘテロである場合などは、そのウシ個体がすでにウシ白血病ウイルスBLVに感染しているか、ウシ白血病ウイルスBLVに感染した場合であっても、白血病を発症する可能性は非常に低い。
さらに、白血病の発症抵抗性の観点からは、β１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸を推定する。このアミノ酸（アミノ酸番号78）がVal（一文字表記ではＶで表される）であるウシ個体がすでにウシ白血病ウイルスBLVに感染している場合、又はウシ白血病ウイルスBLVに感染した場合には、そのウシ個体は白血病の発症に対して抵抗性を有している。抵抗性の判定においても、対立遺伝子（ハプロタイプ）における上記アミノ酸を比較することが好ましいが、対立遺伝子の少なくとも一方においてβ１ドメインのアミノ酸番号78で特定されるアミノ酸がValであれば、そのウシ個体は白血病の発症抵抗性を有しており、両方の対立遺伝子の上記アミノ酸がValであれば、その個体は白血病の発症に対して高い抵抗性を有している。
ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸配列については、間ら（Aida,Y.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,209,pp.981−988,1995）による報告がある。図１にウシMHC Class II DRβ鎖のmRNAの構造（Ａ）及びcDNAの全長と遺伝子産物のアミノ酸配列（Ｂ）を示した。図中、β１ドメインはアミノ酸番号１からアミノ酸番号94までのアミノ酸配列により特定される部分であり、このヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、アミノ酸番号75から78までのペプチド配列が"Val−Asp−Thr−Tyr（VDTY）”である場合について図示してある。
本発明の判定方法の対象となるウシは特に限定されず、ウシ白血病ウイルスBLVに感染する可能性があり、感染により白血病を発症する可能性があるものであれば、乳用種、乳肉兼用種、肉用種、役用種、及び役肉兼用種などのいかなるウシを対象としてもよい。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角などの和牛、ホルスタイン、ジャジー、ヘレフォード、アバディーンアンガス、フリーシャン等の品種を挙げることができるが、これらの品種に限定されることはない。
ウシ個体からゲノムDNAを調製するための試料としては、末梢血や臓器などを利用することができる。臓器としては、例えば、リンパ節などの組織片を用いることができる。上記の試料からゲノムDNAを調製する方法としては、当業者に利用可能なものであればいかなるものを利用してもよい。試料として末梢血白血球、又は末梢血リンパ球を用いる場合には、例えば、Hughesらの方法（Hughes,S.H.et al.,Cell,15,pp.1397−1410,1978）を用いることができる。臓器を用いる場合には、例えば、凍結した組織片をハサミで薄切した後、ドデシル硫酸ナトリウム、フェノール−クロロホルム法（Mcknight,G.S.,Cell,14,pp.403−413,1978）により調製することができる。また、細胞からのゲノムDNAの簡便抽出法を用いてもよいが、その詳細は実施例に記載した。
調製したゲノムDNAをPCR法により増幅するにあたり使用するプライマーとしては、ウシMHC Class IIのDRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78までの部分アミノ酸配列又はβ１ドメインの全長をコードする遺伝子を含むDNAを増幅できるものであれば、いかなるものを用いてもよい。
本発明の方法に特に好適に使用可能なプライマーのセットとして、サイクルシークエンシング及びダイナビーズDNA直接シークエンス等の直接シークセンス法が可能な下記のプライマーセット（１）:Aプライマー:5′−TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′；及びＢプライマー:5′−CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC−３′を挙げることができる。また、制限酵素サイトを付加したプライマーセットとして、プライマー・セット（２）Ａプライマー:5′−GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′；及びＢプライマー:5′−AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC−３′、又はプライマー・セット（３）Ａプライマー:5′−GAGTGTCATTTCTTCAACGGGAC−３′、５′−GGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGA−３′、及び５′−GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′からなる群から選ばれるプライマー;Bプライマー:5′−AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC−３′を利用することができる。特に、プライマー・セット（３）を用いて増幅したPCRアリルをPst Iで消化した後、切断パターンの違いを判定することにより、そのウシ個体が白血病抵抗性であるか、または白血病発症の可能性があるかを簡便に判定できる。もっとも、本発明の方法に利用可能なプライマー及びプライマー・セットはこれらに限定されることはない。
PCR法に用いるDNA量は適宜選択可能であるが、例えば、末梢血白血球又は末梢血リンパ球を用いる場合には0.1〜0.5μｇ程度である。また、上記のようにして増幅されたDNA（PCR産物）のシークエンス決定法としては、当業者に利用可能なものであればいかなるものを利用してもよいが、例えば、直接シークエンス法などを用いることが好ましい。その具体例は実施例に詳細に記載されている。なお、多くのウシはヘテロ接合体（heterozygote）であり、父親又は母親由来の対立遺伝子の塩基配列が異なると、直接シークエンス法ではどちらの対立遺伝子なのかを決定することができないことがある。このような場合、上記のプライマーセット（２）を用いて増幅されたPCR産物を制限酵素EcoR IおよびSal Iで消化後ベクターにサブクローニングして、片方の対立遺伝子のみの塩基配列を決定して比較することにより、もう一方の対立遺伝子の塩基配列を確実に決定することが可能になる。より正確に遺伝子情報を得るためには、PCR産物から両方の対立遺伝子をサブクローニングしてそれぞれの塩基配列を決定することが好ましい。その具体的方法及び利用可能なプライマーは下記の実施例に詳細に記載されている。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1:白血病の発症可能性の検討
試料としてウシ個体から末梢血を抗凝固剤入りの注射筒で採取し、４℃、3,000rpmの条件下で20分間遠心して白血球層を得た後、分離した白血球層をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、遠心によりペレットを得て末梢血白血球の試料とした。また、上記と同様にして採取した末梢血から、宮坂らの方法（Miyasaka,M.and Trnka,Z.,Immunological Methods,Vol.3,pp.403−423,1985,Academic Press,NY）により末梢血リンパ球を得て、上記と同様のペレットを得ることにより末梢血リンパ球の試料を調製した。また、BLV感染浮遊細胞液を４℃、1,100rpmの条件下で５分間遠心して培養液を除去し、細胞をPBSで洗浄した後に遠心してペレット状の試料を調製した。さらに、BLV感染リンパ肉腫を発症したウシのリンパ節及び腫瘍組織から組織片を分離し、無固定のまま液体窒素により急速凍結して−80℃で保存したものを組織片の試料とした。
1.5mlのミクロ遠心チューブの中で上記の各試料細胞をPBSで２回洗浄し、沈殿した細胞を再度PBSにボルテックスミキサーを用いて懸濁した。１×106個の細胞に対して200μｌの１×PCR緩衝液［10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,2.5mM MgCl2,0.5％ Tween−20］と１μｌのプロテナーゼＫ（20mg/ml）を加えてボルテックスミキサーで再懸濁し、56℃で45〜60分間インキュベーションした。さらに、95℃で10分間処理した後、５分間以上氷冷して、約５〜10μｌをPCR法での増幅に用いた。
200μＭの各dNTP、0.2〜0.4μＭのプライマー、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（Gene Amp Kit;Perkin−Elmer Cetus）を含む50μｌの１×PCR緩衝液［10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.001％（w/v）ゼラチン］にゲノムDNAを溶解し、94℃で１分;61℃で１分；及び72℃で１分の処理を１サイクルとして25サイクルの増幅を用い、さらに72℃で５分間処理を行った。プライマーとしては、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメイン（BoLA−DRβのβ１ドメイン:DRB3遺伝子の第二エクソン）をPCR法により特異的に増幅できる以下のプライマーを用い、Ｂプライマーの５′末端には特異的なビオチン化を導入した。なお、このプライマーは、サイクル・シークエンシングに好適に使用できるものである。
0003613570.tif 000003
20μｌのDYNAEADS M−280 Streptoavidin（Dynal A.S,N−0212,Oslo,Nolway）を100μｌの２×結合−洗浄用緩衝液（Ｂ＆Ｗ緩衝液:10mM Tris−HCl（pH7.5）,1.0mM EDTA,2M NaCl,0.1％ Tween−20）で洗浄し、ビーズを80μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液中に再懸濁した。このビーズ懸濁液に上記のPCR産物（50μｌ）を加えて穏やかにピペッティングした後、ホイルローテーターでゆっくり回転しながら室温で15分間インキュベートした。固定化されたPCR産物を含むチューブを磁石（Dynal MPC）上に置き、上清をピペットで除去した後、100μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液を加えてビーズを洗浄した。磁石を用いて再度上清を除去した後、用時調製した0.1M NaOH 50μｌに再懸濁した。
ビオチン化鎖が固定化されたビーズを磁石を用いてチューブ壁に集めて上清を除き、ビーズを50μｌの0.1M NaOHで１回、100μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で３回、50μｌのTE緩衝液で１回洗浄した。全ての操作において、スムースなストロークで再懸濁を行った。さらに100μｌの蒸留水で洗浄した後に上清を除去し、蒸留水を加えて容量を調整してシークエンシングに用いた。シークエンシングはBcaBESTジデオキシ・シークエンシング・キット（タカラ・バイオメディカルズ製）を用いて、添付の説明書に記載された条件に従って行った。なお、シークエンスプライマーとして以下のプライマーを用いた。
0003613570.tif 000004
結果を図２及び図３に示す（図中、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号９から86を示し、左側の数字はウシ個体の識別番号である）。ウシ白血病ウイルスBLVに感染しているものの白血病を発症していないウシ［リンパ球増多症牛（前癌状態）７頭、及び未発症牛（抗体陽性健康未発症牛）24頭：それぞれ図２の上段及び下段］、及び白血病発症牛（24頭；図３）由来のウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸を比較したところ、白血病発症牛では両方の対立遺伝子においてアミノ酸番号75から78の配列がVal−Asp−Thr−Tyr（VDTY）モチーフを有しているという極めて特徴的な結果が得られた。アミノ酸番号75から78番目に相当する部位はβ１ドメインのαヘリックス上に相当しており、Ｔ細胞認識部位として機能している可能性がある。また、コンピューター解析の結果、このモチーフはウシ白血病ウイルスBLVの中でpol蛋白質にのみ存在していることが明らかになった。
以上の結果を表１に示す。表中の遺伝子型VDTY/VDTYなどの表記は、両対立遺伝子のアミノ酸配列（ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78まで）を一文字表記で記載したものである。なお、BLV感染牛の感染状態は、レヴィーら（Levy,D.,et al.,Int.J.Cancer,19,pp.822−827,1977）及び間ら（Aida,Y.,et al.,Cancer Res.,52,pp.6463−6470,1992）の基準に基づいて分類した。
0003613570.tif 000005
例2:白血病の発症抵抗性の検討
例１と同様にして、白血病発症牛（24頭）、白血病未発症牛（リンパ球増多症及び健康牛，計31頭）について、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78のアミノ酸の種類を調べた結果を以下の表２に示す。また、71番目及び74番目のアミノ酸の種類も同様に調べた（表中、アミノ酸は一文字表記で示した。Y:Tyr;V:Val;R:Arg;E:Glu;K:Lys;N:Asn）。この結果、78番目のアミノ酸がバリンとチロシンのヘテロ接合である個体と、78番目のアミノ酸がバリンのホモ接合である個体は白血病発症に対して抵抗性であり、特に、78番目のアミノ酸がバリンのホモ接合である個体は、白血病発症に対して高い抵抗性を有していることが明らかとなった。また、白血病未発症のウシの74番目のアミノ酸はいずれもGln又はAsnであり、71番目のアミノ酸残基はLys又はArgであったことから、71番目のアミノ酸がリジン又はアルギニンであり、74番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンであり、かつ、78番目のアミノ酸がバリンであるアリルを有する個体は、白血病発症に対して高い抵抗性を有していることが示唆された。
0003613570.tif 000006
例3:発症可能性と抵抗性の迅速な判定方法
上記のように、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号78のアミノ酸がValである遺伝子を有する個体はウシ白血病ウイルスによる白血病に対して抵抗性であり、一方、両方の対立遺伝子の78番目のアミノ酸がTyrである個体は白血病の発症可能性がある。そこで、78番目のアリルがValである遺伝子には存在しており、78番目のアリルがTyrであるアリルには存在しない制限酵素Pst I切断部位を利用して、増幅したPCRアリルをPst Iで消化した後、切断パターンの違いによりそのウシ個体が白血病抵抗性であるか、または白血病発症の可能性があるかを簡便に判定できる。
PCRプライマーとして以下のプライマーを用いた。
0003613570.tif 000007
PCRの条件は例１の条件に準じて行った。具体的には、プライマーの組み合わせにより、以下のサイクルを１サイクルとして35サイクルの増幅を行い、さらに72℃で10分間処理を行った。ゲノムDNAはPCR 100μｌの系に対して100ngを用いた。
DRB40/SRB3:94℃で１分、63℃で２分、72℃で２分
DRB100/SRB3:94℃で１分、66℃で２分、72℃で２分
ERB3/SRB3:94℃で１分、61℃で２分、72℃で２分
上記のPCR産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した後、制限酵素Pst Iで切断した（12μ中、10×制限酵素用バッファー1.2μl,増幅後DNA 6−７μl,制限酵素Pst I 2 units,及びH2O）。制限酵素による反応終了後、各検体を３％アガロースゲル電気泳動に付して判定を行った。結果を表３に示す。
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産業上の利用可能性
本発明の判定方法によれば、ウシ個体のウシ白血病ウイルス（BLV）に対する白血病発症の可能性及び抵抗性を確実に予知することができるので、安全なウシの飼育が可能になり、畜産農家の経済的損失を防ぐことができる。
【図１】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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