(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸酸配列を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ；又は
（ii）アスパラギン酸プロテアーゼ活性を維持している上記（ｉ）の断片；
をコードするDNA配列を含んで成る単離されたDNA分子。
【請求項２】
配列番号：１に示されるDNA配列を含んで成る、請求項１に記載のDNA分子。
【請求項３】
請求項１に記載のDNA配列を含んで成るハイブリッドベクター。
【請求項４】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするDNA配列が、適当な宿主細胞におけるアスペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の発現に適当な調節領域と機能的に連結されている、請求項３に記載のハイブリッドベクター。
【請求項５】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするDNA配列が、アスペルギルス株におけるアスペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の発現に適当な調節領域と機能的に連結されている、請求項４に記載のハイブリッドベクター。
【請求項６】
所望のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子と同種性のアスペルギルス（Aspergillus）プロモーターを含んで成る、請求項５に記載のハイブリッドベクター。
【請求項７】
所望のアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子と異種性のアスペルギルス（Aspergillus）プロモーターを含んで成る、請求項４に記載のハイブリッドベクター。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のDNA分子の調製方法であって、前記DNA分子により形質転換された宿主細胞を培養し、そして宿主細胞から前記DNA分子を単離することを含んで成る方法。
【請求項９】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス・ニガー株。
【請求項１０】
配列番号１の配列を有するpepE遺伝子が欠損している、請求項９に記載のアスペルギルス株。
【請求項１１】
請求項９又は10に記載のアスペルギルス株の調製方法であって、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の試験管内突然変異誘発、変異型外因性遺伝子による、対応する内因性染色体アスペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子を有するアスペルギルス宿主の形質転換、および内因性遺伝子が変異型外因性遺伝子により置換されている変異株の単離、を含んで成る方法。
【請求項１２】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の破壊を含んで成る、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号：１の配列を有するＡ．ニガーpepE遺伝子を破壊することを含んで成る、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
所望のポリペプチドの調製方法であって、所望のポリペプチドの発現に適当な発現カセットを担持している発現ベクターにより請求項９又は10に記載のアスペルギルス株を形質転換せしめ、形質転換されたアスペルギルス株を所望のポリペプチドの発現に適当な条件下で培養し、そして所望のポリペプチドを単離する、ことを含んで成る方法。
【請求項１５】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ、又はアスパラギン酸プロテアーゼ活性を維持しているその断片。
【請求項１６】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼの調製方法であって、請求項４〜７のいずれか１項に記載のハイブリッド発現ベクターにより形質転換された適当な宿主を培養することを含んで成る方法。
【請求項１７】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のハイブリッド発現ベクターにより形質転換された宿主。
【請求項１８】
アスペルギルス株である、請求項17に記載の形質転換された宿主。
【請求項１９】
アスペルギルス株におけるアスペルギルス−アスパラギン酸プロテアーゼの発現に適当な調節要素を含んで成るハイブリッド発現ベクターにより形質転換されたアスペルギルス株である、請求項18に記載の形質転換された宿主。
【請求項２０】
所望のアスペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子と相同のプロモーターを含んで成るハイブリッド発現ベクターにより形質転換されたアスペルギルス株である、請求項19に記載の形質転換された宿主。
【請求項２１】
所望のアスペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子と非相同のプロモーターを含んで成るハイブリッド発現ベクターにより形質転換されたアスペルギルス株である、請求項19に記載の形質転換された宿主。
【請求項２２】
請求項17に記載の形質転換された宿主の調製方法であって、適当な宿主を、請求項４に記載のハイブリッド発現ベクターにより形質転換せしめることを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus ）アスパラギン酸プロテアーゼをコードする新規ＤＮＡ配列、アスペルギルスアスパラギン酸プロテアーゼそれ自体、およびそれの調製方法に関する。本発明は更に、非相同タンパク質の発現に有用である、アスパラギン酸プロテアーゼが欠損している新規アスペルギルス変異株、およびそのような変異株の調製方法にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスペルギルス（Aspergillus ）種、特にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）は、食品加工産業に使われる酵素の工業生産に利用されている。Ａ．ニガーは、タンパク質分泌能力が高いためと、系がその分子的遺伝子操作に利用可能であるために、組換えタンパク質の生産用の宿主として利点を有する。しかしながら、培養液、周辺腔または小胞体およびゴルジ装置中のプロテアーゼの存在が、Ａ．ニガーにおける非相同タンパク質の発現にとって有害であることがわかった。
【０００３】
実際、アスペルギルスはプロテアーゼを生産するのに商業的に利用されている。アスペルギルス由来の多数の細胞外プロテアーゼが文献に記載されている。最近、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus  awamori）由来のアスペルギロペプシンＡをコードするpepA遺伝子がクローニングされた。pepA遺伝子産物はＡ．ニガーから分泌される酸性プロテアーゼの大部分を占め、pepA遺伝子を削除した株はＡ．ニガー変種アワモリ（Aspergillus niger var. awamori）における非相同タンパク質の発現を増加させた。
【０００４】
最近アスペルギルスから別のプロテアーゼ遺伝子もクローニングされており、それらとしてはＡ．オリゼ（A.  oryzae）のアルカリ性アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａ．フミガーツス（A. fumigatus）のアルカリ性アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー変種マクロスポルス（Aspergillus niger var. macrosporus）由来の非ペプシン型酸プロテアーゼ、、Ａ．オリゼ（A.  oryzae）由来のメタロプロテアーゼと呼ばれる中性プロテアーゼII、およびＡ．ニガー由来の２種のセリンプロテアーゼが挙げられる。
【０００５】
Ａ．ニガーの単離され変異されたプロテアーゼ遺伝子は、遺伝子破壊実験、即ち、対応する生来の遺伝子が破壊されている変異株の調製に用いることができる。例えば、アスペルギロペプシンＡ欠損株を調製するために、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus  awamori）由来のpepA遺伝子が遺伝子破壊により破壊された。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述したように、アスペルギルスは多数の異なるプロテアーゼを生産するため、他のプロテアーゼを欠損しているタンパク質工業生産用のアスペルギルス株に引き続き要求がある。この目的のため、試験管内突然変異誘発、例えば遺伝子破壊によるプロテアーゼ欠損株の調製に利用することができる他のプロテアーゼ遺伝子も要求される。更に、タンパク質プロセシングに産業上応用することができる組換えプロテアーゼタンパク質も要求される。
【０００７】
Ａ，ニガーにおける分泌型プロテアーゼ活性の別の主成分はアスパラギン酸プロテアーゼである。アスパラギン酸プロテアーゼは多数の真菌においてクローニングされており、例えばＳ．セレビシエ（S.  cerevisiae）の液胞タンパク質pep4（＝pepA）、カンジダ（Candida ）、ムコール（Mucor ）、リゾプス（Rhizopus）、クリホネクトリア（Cryphonectria ）およびペニシリウム（Penicillium ）種の分泌型プロテアーゼ、並びにＡ．ニガーとＡ．オリゼの両方の分泌型主要酸性プロテアーゼが挙げられる。最近、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora  crassa）から液胞タンパク質遺伝子が単離され、酵母pep4との相当な配列相同性を有することが示された。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
アスペルギルスはペプシンと相同であるが既知のアスペルギロペプシンに対してほとんど相同性を示さない別のアスパラギン酸プロテアーゼも生産することを発見した。本発明はこの新規プロテアーゼに焦点を合わせる。
本発明の目的は、アスペルギルスアスパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮＡ分子を提供することである。
【０００９】
更なる目的は組換えアスペルギルスアスパラギン酸プロテアーゼを提供することであり、このために、それの生産用の形質転換されたアスペルギルス株を提供することである。
別の目的は、アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス株を提供することであり、その株は非相同または相同タンパク質の一層効率的な生産に利用することができる。
【００１０】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus ）アスパラギン酸プロテアーゼに関する。そのようなプロテアーゼは、本明細書中、「アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」と呼称される。本発明の「アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」は、(a) アスペルギルス種に由来するものであり、(b) 活性部位における触媒的アスパラギン酸残基のためプロテアーゼ活性を示し、そして(c) アスパラギン酸プロテイナーゼ科に分類されるのに十分な既知アスパラギン酸プロテアーゼとのアミノ酸配列相同性を有するものと解釈される。
【００１１】
しかしながら、本発明において使用するアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼなる用語の意味には、アスパラギン酸プロテアーゼ活性を保持しているそのような酵素の断片も含まれる。しかし、全長の酵素が好ましい態様である。追加のアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質に結合された本発明の「アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」を含む融合タンパク質も、本発明の一部であると解釈される。
【００１２】
好ましい意味では、「アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）に由来するプロテアーゼまたは活性断片を言い、より好ましくは配列番号１のもとに示されたアミノ酸配列または配列の一部分を有するプロテアーゼまたは活性断片を言う。
本発明はまた、本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードする単離されたＤＮＡ配列、およびそのようなＤＮＡ配列のクローニングと増殖のためのハイブリッドベクターに関する。
【００１３】
本発明は更に、適当な宿主細胞におけるアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの発現に適当な調節領域と機能的に連結されたそのようなＤＮＡ配列を含んで成る、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ生産用の発現ハイブリッドベクターに関する。本発明はまた、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現することのできる形質転換された宿主細胞、例えば形質転換後の該遺伝子のコピー数の増加によってアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを過剰発現することのできるアスペルギルス株、にも関する。
【００１４】
本発明は、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス株、および突然変異誘発（例えば遺伝子破壊）によりもはや機能的なタンパク質を発現することができないアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列を使った前記株の製造方法にも関する。
【００１５】
更に、本発明は、本発明のＤＮＡ配列、ハイブリッドベクター、発現ベクターおよびアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの調製方法並びにアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス株およびアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを過剰生産する宿主株の発現方法に関する。
【００１６】
【具体的な説明】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ、クローニング用および発現用のハイブリッドベクター
本発明は、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ分子に関する。該ＤＮＡ配列は、例えば配列番号１に示されるpepE遺伝子のように、ゲノムＤＮＡライブラリーから単離することができるＤＮＡ分子を有するので１または複数のイントロンを含み得る。しかしながら、本発明は該ＤＮＡ配列のイントロン不含有変異体、例えばｃＤＮＡクローニングによりまたは例えばＰＣＲ技術の適用による突然変異誘発後に単離可能であるものにも関する。そのようなイントロン不含有遺伝子は、特に非アスペルギルス宿主、好ましくは原核生物または酵母における発現に有用である。
【００１７】
本発明は、好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＡ．ニガーアスパラギン酸プロテアーゼPEPEまたはアスパラギン酸プロテアーゼ活性を保持しているその断片をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ分子に関する。本発明のＤＮＡ配列は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列に示される成熟PEPEプロテアーゼのコード領域である。しかしながら、本発明は、PEPEをコードする縮重ＤＮＡ配列またはその断片、即ち、コードされるアミノ酸配列を変えずにヌクレオチドが置換されている配列、にも関する。そのようなＤＮＡ配列は、例えば、異なる宿主における好ましいコドン用法の相違のため、または制限酵素用の新規認識部位の存在のために有用である。
【００１８】
本発明はまた、本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ（好ましくはそれの好ましい形態）をコードするＤＮＡ配列を挿入断片として含んで成るハイブリッドベクターにも関する。そのような本発明のハイブリッドベクターは、本発明のＤＮＡ配列の複製と増殖に有用である。本発明は、本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ（好ましくはそれの好ましい形態）の生産に適当な発現ベクターにも関する。そのような発現ベクターは、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列が所望の宿主細胞におけるそのようなＤＮＡ配列の発現の調節に適当な調節領域と機能的に連結されている「発現カセット」を含んで成る。
【００１９】
本発明のハイブリッドベクター（発現ベクターを包含する）は、遺伝子操作の技術分野において有用な任意のベクター、例えばウイルス、ファージ、コスミド、プラスミドまたは染色体ＤＮＡに由来することができ、例えばSV40の誘導体、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、λファージ（例えばNM 989もしくはEMBL4 ）、M13 ファージ（例えばM13mp8）、細菌プラスミド（例えばpBR322もしくはpUC18 ）、または酵母プラスミド（例えば酵母２μプラスミド）、
【００２０】
あるいは欠損ウイルス、ファージまたはプラスミドの複製を可能にするヘルパーウイルス、ファージまたはプラスミドの存在下の欠損ウイルス、ファージまたはプラスミド（例えばM14K07ヘルパーファージの存在下のM13(+)KSベクター）、更には、例えばアスペルギルス種（例えばＡ．ニガー）のような糸状菌に由来する染色体ＤＮＡ、例えばEP 184 438により提供されたものであることができる。好ましいのは、Ｓ．セレビシェー（S.  cerevisiae）または糸状菌、より好ましくはアスペルギルス種、更に好ましくはＡ．ニガー用のベクターである。
【００２１】
本発明のハイブリッドベクター（発現ベクターを包含する）は、染色体外要素としてまたは宿主染色体中への組み込みにより、適当な宿主における所望のＤＮＡの複製に備える。幾つかの可能なベクター系が本発明のクローン化ＤＮＡの組み込みと発現に利用可能である。理論上は、選択される宿主において複製し且つ適当に維持される全てのベクターが適当である。よって、該ベクターは形質転換をもくろむ宿主細胞に依存して選択される。
【００２２】
一般に、そのような宿主細胞は、原核または真核微生物、例えば細菌、真菌、例えば酵母、好ましくはＳ．セレビシエ（S.  cerevisiae）、または糸状菌、好ましくはアスペルギルス種、より好ましくはＡ．ニガー、または高等真核生物起源の細胞、例えば脊椎動物、例えば哺乳動物細胞であることができる。適当な宿主細胞については下記に詳細に検討する。
【００２３】
染色体外要素として維持される本発明のハイブリッドベクター（発現ベクターを包含する）は、複製開始点（ori ）または自己複製配列（ＡＲＳ）、選択可能マーカー配列、および所望により追加の制限部位を含んで成る。宿主染色体中への組み込みに向けられるベクターは、それが染色体と関連して細胞中で複製されるため、ori またはＡＲＳを含む必要はない。
【００２４】
複製開始点または自己複製配列（染色体外要素に自己複製能力を付与するＤＮＡ要素）は、シミアンウイルス（SV40）もしくは他のウイルス起源に由来する外因性起点を含むベクターの作製により、または宿主細胞の染色体機構により提供される。
【００２５】
本発明のハイブリッドベクター（発現ベクターを包含する）は、形質転換し、選択しそしてクローニングする予定の宿主に依存する選択マーカーを含んでもよい。マーカーの表現型発現により形質転換体の選択を容易にする任意のマーカー遺伝子を使うことができる。適当なマーカーは特に、例えばテトラサイクリンやアンピシリンに対する抗生物質耐性を示すもの、または独立栄養性真菌変異体の場合には、宿主の傷害を補完する遺伝子である。
【００２６】
対応する遺伝子は、例えば、抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を付与するか、または独立栄養性酵母（好ましくはＳ．セレビシエ）変異体における原栄養性に備え、例えばura3, leu2, his3またはtrp1遺伝子である。形質転換させようとする宿主がマーカーにより発現される生成物について独立栄養性であることを規定する自己複製セグメントに関連した構造遺伝子をマーカーとして使用することも可能である。
【００２７】
Ａ．ニガー用のハイブリッドベクター、特に発現ベクターに関して特に重要なのは、Ａ．ニガー宿主の傷害を補完するマーカー遺伝子、例えばＡ．ニガー（A. niger）もしくはＡ．ニデュランス（A.  nidulans）に由来するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードするargB遺伝子（EP 184 438）、またはＮ．クラッサ（N.  crassa）pyr4遺伝子に相同なＡ．ニデュランスＤＮＡ断片である。他の適当なマーカー遺伝子は、本発明の形質転換された宿主の記載と関連して後述される。
【００２８】
Ｅ．コリにおけるアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡの増殖に適当な本発明のハイブリッドベクターは、例えば、添付の実施例中に後述されるプラスミドpPEPE である。
【００２９】
本発明の発現ベクターの文脈中での「発現カセット」なる用語は、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現することができるＤＮＡ配列を意味し、そしてアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼコード領域と作用可能に連結されたプロモーター、並びに所望により、シグナル配列、転写ターミネーター、転写エンハンサー、リボソーム結合部位、効率的なＲＮＡプロセシングのための配列、効率的なタンパク質プロセシングをコードする配列および正しいタンパク質局在化をコードする配列から成る群のうちの１または複数の更なる調節要素を含んで成る。
【００３０】
本発明の発現カセットにおいて、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼコード領域を相同の調節要素、即ち本来それと連結しているもの、または非相同の調節要素、即ち別の遺伝子から誘導されるもの、と組み合わせることができる。
宿主細胞の性質に依存して、広範囲のプロモーター配列を使用することができる。強く且つ同時に良好に調節されるプロモーターが最も有用である。
【００３１】
プロモーターの例は、原核生物のλＰL ，λＰR ，Ｅ．コリlac, trpまたはtac プロモーターである。酵母、好ましくはＳ．セレビシエ中での発現に適当なプロモーターは、TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO5-, GAL10-または解糖系プロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、
【００３２】
ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ遺伝子のプロモーター、またはPH05−GAPDH ハイブリッドプロモーター（欧州特許第EP-A-213 593号）である。他の真核プロモーターの例は、真核性ウイルス由来のプロモーター、例えばSV40、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウルス、パポバウイルス、シトメガロウイルス由来のプロモーター、または哺乳動物細胞由来のプロモーター、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシンもしくはβ−グロビン遺伝子のプロモーターである。真核プロモーターは、酵母、好ましくはＳ．セレビシエのエンハンサー配列、上流活性化配列（ＵＡＳ）またはウイルスもしくは細胞性エンハンサー、例えばシトメガロウイルスＩＥエンハンサー、SV40エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子エンハンサー等と組み合わせることができる。
【００３３】
エンハンサーは、ウイルス、例えばシミアンウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスもしくはモロニー肉腫ウイルス由来の、またはゲノム起源の転写刺激ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、フィサルム・ポリセファルム（Physarum  polycephalum）の染色体外リボソームＤＮＡ（PCT/EP 8500278）に由来することもできる。適当なエンハンサーは更に、例えば、酵母酸性ホスファターゼPH05遺伝子由来の上流活性化部位である。
【００３４】
シグナル配列は、例えば、ポリペプチドの分泌を指令するプレ配列または分泌リーダー等であることができる。シグナル配列は、例えば、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼのシグナルまたはリーダーペプチド、例えば配列番号１に示されるシグナル配列である。更なるシグナル配列は文献から既知であり、例えば、von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) 中に集められたものである。
【００３５】
翻訳の開始および終結並びにmRNAの安定化に必要な配列は、ウイルスまたは真核生物のｃＤＮＡの非コード５′領域および３′領域から、例えば発現宿主から、一般に入手可能である。
本発明の一態様によれば、例えばプラスミドpGALPEPE中のようなGAL10 プロモーターの調節下での、原核生物中、例えばＥ．コリ中、または好ましくは酵母中、より好ましくはＳ．セレビシエ中でのアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの発現のための、配列番号１に示されるコード領域の３つのエキソンから成るイントロン不含有コード領域を含んで成る発現ベクターが提供される。
【００３６】
本発明は、好ましくはアスペルギルス株におけるアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列の発現に適当な発現ベクターに関する。
本発明の発現ベクターの１つの型は、好ましくはＡ．ニガー（A. niger）のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列に生来連結しているプロモーター、即ちそれの相同プロモーターの調節下に、前記ＤＮＡ配列を含んで成る。より好ましいのは、配列番号１に示されるプロモーター領域の調節下に、配列番号１のPEPEをコードするＤＮＡ配列、最も好ましいのは配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターである。
【００３７】
そのような発現ベクターを、元来アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が由来する種の宿主株におけるアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの発現に用いると、組換えアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子と元のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の両方が同一発現条件下で活性であるため、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼが過剰発現される。
本発明の発現ベクターの別の型は、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列に生来連結していない、アスペルギルス中で機能的なプロモーターの調節下に、前記ＤＮＡ配列を含んで成る。
【００３８】
アスペルギルス種、特にＡ．ニガー中でのアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの発現に適当なプロモーターは、例えば、アスペルギルス種のペクチンリアーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ，ニガーの PLI（EP-A-0 278 355参照）, PLA, PLB, PLC, PLEまたはPLF （EP-A-0 353 188参照）遺伝子のプロモーター、アスペルギルス種のポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガー PGIまたはPGII遺伝子（欧州特許出願EP-A-421919 参照）のプロモーター、アスペルギルス種のピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガー pki遺伝子（欧州特許出願EP-A-439997 参照）のプロモーターである。
【００３９】
本発明の好ましい態様では、例えばプラスミドpPKIPEPEにおいて、Ａ．ニガーのピルビン酸キナーゼプロモーターが、相同のシグナル配列に連結されたアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードする配列番号１に示されるコード領域と機能的に連結される。
【００４０】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の調製方法
本発明は、本発明のＤＮＡ分子、即ち本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ分子、好ましくは本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの好ましい形態をコードするＤＮＡ分子の調製方法、またはそのようなＤＮＡ分子を含んで成るハイブリッドベクターの調製方法にも関する。前記方法は、本発明の前記ＤＮＡ分子またはハイブリッドベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することを含んで成る。本発明の別の態様では、ヌクレオチド縮合を通した化学合成により、本発明のＤＮＡ分子を調製することができる。
【００４１】
宿主の培養は、非形質転換体（即ち所望のＤＮＡ分子を欠く宿主）からの形質転換体（即ち選択マーカーと共に所望のＤＮＡ分子を含有する宿主）の陰性または陽性選択を可能にする化学化合物が補足されているかまたは欠如している常用の栄養培地中で実施される。
【００４２】
当該技術において有用な任意の形質転換可能な宿主、例えば、細菌、例えばＥ．コリ（E.  coli）、真菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、高等真核細胞、例えば昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、または特に糸状菌、例えばアスペルギルス、例えばＡ．ニデュランス（A.  nidulans）、Ａ．オリゼ（A.  oryzae）、Ａ．カルボナリウス（A. carbonarius）、Ａ．アワモリ（A. awamori）、Ａ．ジャポニカス（A. japonicus）および特にＡ．ニガー（A. niger）を使用することができる。宿主の形質転換は常法により実施される。
【００４３】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列は、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現することのできるアスペルギルス株のゲノムから得ることができ、または例えば、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主を培養し、そして必要な時、そこから所望のＤＮＡ配列を単離することにより調製することができる。
【００４４】
特に、そのようなＤＮＡは次のものから選択された段階を含んで成る方法により調製することができる：
a)  適当なアスペルギルス細胞からゲノムＤＮＡを単離し、次いで例えばＤＮＡプローブを使ってまたは適当な発現系を使って所望のＤＮＡを選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスクリーニングする；
b)  適当なアスペルギルス細胞からｍＲＮＡを単離し、例えばＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによりまたは適当な発現系中での発現により所望のｍＲＮＡを選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスクリーニングし、該ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを調製し、次いでそれから二本鎖ＤＮＡを調製する；
【００４５】
c)  ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離し、次いで例えばＤＮＡプローブを使ってまたは適当な発現系を使って所望のｃＤＮＡを選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてスクリーニングする；
d)  Ａ．ニガーpepEをコードする遺伝子から設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使って全アスパラギルスＤＮＡのＰＣＲ技術により試験管内において二本鎖ＤＮＡを合成する；または
e)  段階a), b), c)またはd)に従って得られる二本鎖ＤＮＡを適当なベクター中に組み込み、適当な宿主を形質転換せしめ、宿主を増殖させ、そして該ＤＮＡを単離する。
【００４６】
ゲノムＤＮＡを単離し、所望のＤＮＡについてスクリーニングすることができる（段階ａ）。アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現することのできるアスペルギルス株からゲノムＤＮＡを単離する。確立された手順に従った適当な制限エンドヌクレアーゼでの消化と適当なベクター中への組み込みにより、そこからゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。ゲノムＤＮＡライブラリーを後述のようなＤＮＡプローブを用いてスクリーニングするか、または適当な発現系中で発現せしめ、得られたポリペプチドを常法によりスクリーニングする。
【００４７】
ゲノムライブラリーは、例えばＡ．ニガー株、例えばNW756 またはN400のゲノムＤＮＡを、例えばSau3AIまたはMboIで部分消化し、そして高分子量ＤＮＡ断片を適当な宿主ベクター、例えばＥ．コリプラスミドpUN121またはλベクター例えばEMBL4 中でクローニングすることにより、調製することができる。
所望のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを生産する他の真菌株、例えばＡ．ジャポニカス、Ａ．オリゼ、Ａ．ニデュランス、Ａ．ニガーを、ゲノムライブラリーの入手源として用いることができ、そして他の適当なベクター、例えば上述したものを、前記断片の受容体として使用することができる。
【００４８】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列についてゲノムライブラリーを好結果にスクリーニングするために、ハイブリダイズ用ＤＮＡプローブが必要である。これは、所望のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼのアミノ酸配列またはその一部分が既知であるならば合成ＤＮＡプローブであることができ、またはアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子にハイブリダイズする別のアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、例えばニューロスポラ・クラッサ（Neurospora  crassa）由来のもの、もしくはその一部分であることができる。
【００４９】
既知の方法により、適当な細胞からポリアデニル化伝令ＲＮＡを単離する（段階ｂ）。単離方法は、例えば、界面活性剤とリボヌクレアーゼ阻害剤、例えばヘパリン、グアニジウムイソチオシアネートまたはメルカプトエタノールの存在下でホモジナイズし、所望により塩および緩衝液、界面活性剤および／またはカチオンキレート化剤の存在下で、適当なクロロホルム−フェノール混合物を用いてｍＲＮＡを抽出し、そしてエタノール、イソプロパノール等を使って残った水性の塩含有相からｍＲＮＡを沈澱させることを含む。
【００５０】
単離されたｍＲＮＡは、塩化セシウム勾配中での遠心分離に続くエタノール沈澱によりおよび／またはクロマトグラフィー法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、例えばオリゴ（ｄＴ）セルロースもしくはオリゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィーにより、更に精製することができる。好ましくは、そのような精製された全ｍＲＮＡは、例えば直線ショ糖勾配中での勾配遠心により、または適当なサイズ分画カラム上でのクロマトグラフィー、例えばアガロースゲル上でのクロマトグラフィーにより、サイズ分画される。
【００５１】
所望のｍＲＮＡは、ＤＮＡプロープを用いて該ｍＲＮＡを直接スクリーニングすることによるか、または適当な細胞もしくは無細胞系において翻訳しそして得られたポリペプチドをスクリーニングすることにより、選択される。
所望のｍＲＮＡの選択は、好ましくは、後述のようなＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを使って達成され、それによって追加の翻訳段階が回避される。適当なＤＮＡプローブは、既知のヌクレオチド配列のＤＮＡ、例えば合成ＤＮＡ、所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、または例えば天然源もしくは遺伝子操作された微生物から単離される隣接ＤＮＡ配列を含んで成るゲノムＤＮＡ断片である。
【００５２】
分画されたｍＲＮＡは、細胞、例えばカエル卵母細胞、または無細胞系、例えば網状赤血球溶解物もしくは小麦胚芽抽出物において翻訳することができる。得られたポリペプチドは、例えばイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイまたは蛍光マーカーを使ったイムノアッセイにおいて、酵素活性についてまたは生来のポリペプチドに対して惹起せしめた抗体との反応についてスクリーニングされる。そのようなイムノアッセイやポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製は当業界において公知であり、従ってそれらが適用される。
【００５３】
選択されたｍＲＮＡ鋳型からの一本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製は当業界において公知であり、一本鎖ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調製と同様である。ｍＲＮＡ鋳型をデオキシヌクレオシド三リン酸、所望により放射能標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸（反応の結果をスクリーニングできるようにするために）、該ｍＲＮＡのポリ（Ａ）末尾とハイブリダイズするオリゴｄＴ残基のようなプライマー配列、および例えばトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）からの逆転写酵素のような適当な酵素の混合物と共にインキュベートする。
【００５４】
例えばアルカリ加水分解による鋳型ｍＲＮＡの分解後、ｃＤＮＡをデオキシヌクレオシド三リン酸と適当な酵素の混合物と共にインキュベートして二本鎖ＤＮＡを与える。適当な酵素は、例えば、逆転写酵素、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。通常、一本鎖ｃＤＮＡにより自然に形成されるヘアピンループ構造が第二鎖の合成用のプライマーとして作用する。このヘアピン構造はＳ１ヌクレアーゼでの消化により除去される。あるいは、ｍＲＮＡ鋳型の加水分解前に最初にホモポリマーのデオキシヌクレオチド末尾により一本鎖ＤＮＡの３′末端を伸長し、次いで第二ｃＤＮＡ鎖の合成を行う。
【００５５】
別法では、ｃＤＮＡライブラリーから二本鎖ｃＤＮＡを単離し、所望のｃＤＮＡについてスクリーニングする（段階ｃ）。適当な細胞からｍＲＮＡを単離しそして上述したようにそれから一本鎖および二本鎖ｃＤＮＡを調製することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。このｃＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化し、そして確立された手順に従ってλファージ、例えばλcharon 4A またはλgt11中に組み込む。適当な膜、例えばニトロセルロース膜、荷電ナイロン膜、例えばHybondR , Immobilon R またはGeneScreenR 上で複製させたｃＤＮＡライブラリーを、後述のＤＮＡプローブを使ってスクリーニングするか、または適当な発現系中で発現せしめそして得られたポリペプチドを所望の化合物に特異的な抗体との反応についてスクリーニングする。
【００５６】
二本鎖ＤＮＡの調製の別法はＰＣＲ技術である（段階ｄ）。この方法は特に、少なくとも部分的に既知の配列を有する少量のＤＮＡまたはＲＮＡから出発して大量の二本鎖ＤＮＡを調製するのに用いることができる。しかしながら、既知のベクター配列により隣接されている未知の配列を有するＤＮＡ挿入断片を出発物質として使うこともできる。ＰＣＲ技術では、ＤＮＡの酵素的鋳型依存性合成のためのプライマーとしてＤＮＡ分子、例えばオリゴヌクレオチドが使われる。二本鎖ＤＮＡの変性、プライマーとのハイブリダイゼーションおよび酵素的合成を連続的に繰り返すことができるため、多量のＤＮＡを調製することができる。
【００５７】
合成されるＤＮＡ分子の数は、各回に倍加するので指数的に増加する。ＰＣＲ技術は技術の発達状態にあり、慣例的に本発明において適用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、既知のアスパラギン酸プロテアーゼ間での比較に基づいて保存されたアスパラギン酸プロテアーゼタンパク質配列をコードするであろうＤＮＡにハイブリダイズするように設計することができる。ＰＣＲ技術は当業界において公知であり、従来のＰＣＲ技術、例えばM.A. Innisら（編）, PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990)中に記載されたもの、を本発明に適用することができる。
【００５８】
適当なベクター中への二本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの組み込みのための様々な方法が知られている（段階ｅ）。例えば、対応するデオキシヌクレオシド三リン酸とターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのような酵素の存在下でのインキュベーションにより、二本鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡに相補的ホモポリマー領域を付加することができる。次いで、該ベクターと二本鎖ＤＮＡを相補的ホモポリマー末尾間の塩基対合により結合し、そして最後にリガーゼのような特異的連結酵素により連結する。他の可能性は、二本鎖ＤＮＡの末端への合成リンカーの付加、または平滑もしくは粘着末端連結によるベクター中への二本鎖ＤＮＡの組み込みである。適当なベクターについては下記に詳述する。
【００５９】
得られたハイブリッドベクターにより適当な宿主細胞を形質転換せしめるための形質転換法並びに形質転換された宿主細胞の選択および増殖は当業界において公知である。そのような方法の例を下記に与える。
本発明の所望のＤＮＡ、変異体およびその断片の単離は、当業界において既知の方法、例えばフェノールおよび／またはクロロホルムでの抽出により達成される。所望により、該ＤＮＡを変異誘発物質での処理により操作して変異体を得ることができ、または制限酵素での消化により更に操作して断片を得たり、一端もしくは両端を変更してベクター中への組み込みを容易にしたり、介在配列を除去したりなどすることができる。
【００６０】
本発明のＤＮＡのヌクレオチド配列は、それ自体既知の方法により、例えば末端標識ＤＮＡを使ったマキサム−ギルバート法により、またはサンガーのジデオキシチェーンターミネーション法により、決定することができる。
本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子配列も常法に従った試験管内合成により調製することができる。
【００６１】
この試験管内合成は、特にアスパラギン酸プロテアーゼ活性を有するアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの断片をコードするアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の小断片の調製に適用することができる。試験管内合成は、特にプロモーターまたはシグナルペプチドをコードするＤＮＡの合成にも適用可能である。この試験管内合成は、好ましくはＡ．ニガー由来のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子またはその断片、最も好ましくは配列番号１に示されるpepE遺伝子またはそれのプロモーターもしくはシグナル配列に適用される。
【００６２】
本発明を実施する際、ＲＮＡ分画中のアスペルギルス種（例えばＡ．ニガー）のアスパラギン酸プロテイナーゼｍＲＮＡを同定するためまたはゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー中のアスパラギン酸プロテイナーゼＤＮＡを同定するためのプローブとして、別の種（例えばＮ．クラッサ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子またはその断片を使用することができる。Ａ．ニガー遺伝子の一次配列と他のプロテアーゼへの比較から、該プロテアーゼのコード領域を推定し、そして該遺伝子とアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子ファミリーとの関係を確認することができる。得られた遺伝子は、下記に詳述するような組換えプロテアーゼの調製に利用することができる。
【００６３】
合成ＤＮＡプローブは注文することができ、または既知の方法に従って合成することができる。所望のオリゴヌクレオチドの混合物は、Y. Ikeら（Nucleic Acids Research  11, 477, 1983 ）により記載されたように、適当な縮合段階において保護形態の２種、３種もしくは４種のｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよび／またはｄＴの混合物または対応するジヌクレオチドカップリング単位を使用することにより得ることができる。
【００６４】
ハイブリダイゼーションに向けて、ＤＮＡプローブが標識され、例えばキナーゼ反応により放射能標識される。標識を含むＤＮＡプローブとサイズ分画されたｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは既知の手順に従って実施され、即ち、付加物（例えばカルシウムキレート化剤、粘度調節化合物、タンパク質、非相同ＤＮＡ等）を含有する緩衝液および塩溶液中で、選択的ハイブリダイゼーションに好ましい温度、例えば０℃〜80℃、例えば25℃〜50℃または65℃付近、好ましくはハイブリッド二本鎖ＤＮＡ融解温度よりも低い20℃付近で実施される。
【００６５】
形質転換された宿主およびその調製
更に、本発明は、本発明のハイブリッドまたは発現ベクター、好ましくは本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの好ましい形態をコードするベクター、により形質転換された宿主細胞に関する。
【００６６】
特に本発明の組換えＤＮＡ分子の増殖用の適当な宿主の例は、制限酵素または修飾酵素が欠けているかまたは乏しい微生物、例えば細菌、特にエシェリキア・コリ（Escherichia coli）の株、例えばＥ．コリ X1776、Ｅ．コリ Y1090、Ｅ．コリ W3110、Ｅ．コリ HB101/LM1035 、Ｅ．コリ JA221、Ｅ．コリ DH5α、または好ましくはＥ．コリ DH5αF', JM109, MH1もしくはHB101 、またはＥ．コリ K12株である。適当な宿主は更に別の原核細胞、例えばバシラス・サブチリス（Bacillus  subtilis）、
【００６７】
バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus  stearothermophilus）、シュードモナス（Pseudomonas ）、ヘモフィルス（Haemophilus ）、ストレプトコッカス（Streptococcus ）等、および酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、例えばＳ．セレビシエ GRF18である。他の適当な宿主細胞は、高等生物の細胞、特に確立された連続ヒトまたは動物細胞系、例えばヒト胎児肺繊維芽細胞 L132 、ヒト悪性黒色腫Bowes 細胞、HeLa細胞、SV40ウイルスにより形質転換されたアフリカミドリザルの腎細胞 COS-7またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞である。
【００６８】
本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現用の適当な細胞の例は、適当な発現ベクターにより形質転換された上述の細胞、更には適当なバキュロウイルス発現ベクターにより形質転換された昆虫細胞、および特に、適当な発現ベクターにより形質転換された糸状菌、例えばペニシリウム属、セファロスポリウム属または好ましくはアスペルギルス種、例えばＡ．カルボナリウス（A. carbonarius）、Ａ．アワモリ（A. awamori）、Ａ．ニデュランス（A.  nidulans）、Ａ．オリゼ（A.  oryzae）またはより好ましくはＡ．ニガー（A. niger）である。
【００６９】
本発明はそのような形質転換体の調製方法にも関し、該方法は、所望により適当なマーカー遺伝子と一緒に本発明のＤＮＡ分子またはハイブリッドベクターを使って形質転換条件下で適当な宿主細胞を処理し、そして所望により該形質転換体を選択することを含んで成る。アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子は、特に宿主として真核細胞、例えばアスペルギルス種が使われる場合、形質転換後に宿主ゲノム中に組み込まれた状態になってもよい。
【００７０】
微生物の形質転換は、例えばＳ．セレビシエについて（A. Hinnen ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978）、Ｂ．サブチリスについて（Anagnostopoulos ら、J. Bacteriol. 81, 741, 1961 ）、Ｅ．コリについて（M. Mandel ら、J. Mol. Biol. 53, 159, 1970 ）、およびアスペルギルスについて〔F. Buxton ら、Gene  37:207-14 (1985), D.J. Balanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-9 (1983) 〕、文献中に記載されたような常法に従って実施される。
【００７１】
従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換法は、例えば、ＤＮＡ取り込みを可能にするための細胞のCa2+前処理、およびハイブリッドベクターとのインキュベーションを含んで成る。その後の形質転換された細胞の選択は、例えば、ベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存して親細胞からの形質転換細胞の分別を可能にする選択増殖培地に細胞を移すことにより達成される。好ましくは、ハイブリッドベクターを含まない細胞の増殖を許容しない増殖培地が使われる。
【００７２】
酵母またはアスペルギルス種といった真菌の形質転換は、例えば、グルコシダーゼを使った細胞壁の酵素的除去の段階、ポリエチレングリコールとCa2+イオンの存在下でのハイブリッドベクターによる得られたスフェロプラストの処理の段階、および該スフェロプラストを寒天中に包埋することによる細胞壁の再生の段階を含んで成る。好ましくは再生用寒天は、上述の形質転換された細胞の再生と選択を同時に可能にするような方法で調製される。
【００７３】
高等真核生物起源の細胞、例えば哺乳動物細胞系の形質転換は、好ましくはトランスフェクションにより達成される。トランスフェクションは、常用技術により、例えばリン酸カルシウム沈澱、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、即ち一時的に細胞膜の透過性を増加させる短い電気パルスによるＤＮＡの導入、またはヘルパー化合物、例えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロールもしくはポリエチレングリコールの存在下でのＤＮＡの導入等により実施される。トランスフェクション操作の後、トランスフェクトされた細胞は、選択マーカーの性質に依存して選ばれた選択培地、例えば対応する抗生物質を含有する標準培地、例えばダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、最少必須培地、RPMI 1640 培地等の中での培養により同定され選択される。
【００７４】
形質転換された宿主細胞は、同化できる炭素源、例えば炭化水素、例えばグルコースやラクトース、窒素源、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解生成物、例えばペプトン、アンモニウム塩等、並びに無機塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩を含有する液体培地中で、当業界において既知の方法により培養される。培地は更に例えば増殖促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等も含有する。
【００７５】
培地は、好ましくは、選択圧力を発揮し且つ形質転換されていないかまたはハイブリッドベクターを失ってしまった細胞の増殖を防ぐように選択される。例えば、ハイブリッドベクターがマーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含む場合、培地に抗生物質が添加される。例えば必須アミノ酸中で独立栄養性である宿主細胞を使用し、そしてハイブリッドベクターが宿主の欠損を補完する酵素をコードする遺伝子を含む場合、形質転換された細胞を培養するのに前記アミノ酸を欠く最少培地が使われる。
【００７６】
哺乳動物細胞のような高等真核生物起源の細胞は、所望により増殖促進物質および／または哺乳類血清が補足された、市販の培地、例えば上述したようなダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、最少必須培地、RPMI 1640 培地等を使って、組織培養条件下で増殖される。組織培養条件下での細胞培養技術は当業界において周知であり、それらの技術としては、例えばエアーリフト反応器中または連続攪拌反応器中での均一懸濁培養、あるいは例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガロース微小ビーズ上、多孔質ガラスビーズ上、セラミックカートリッジ上もしくは他の微小担体上での固定化または封入細胞培養が挙げられる。
【００７７】
培養は当業界において既知である方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpHおよび醗酵時間は、本発明のポリペプチドまたは誘導体の最大力価が得られるように選択される。例えば、Ｅ．コリまたは酵母株は、約20℃〜40℃、好ましくは約30℃、および４〜８のpH値、好ましくは約７のpH値において、約４〜30時間、好ましくは本発明のポリペプチドまたは誘導体の最大収量に達するまで、振盪または攪拌しながら深部培養により好気性条件下で培養される。
【００７８】
非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択を可能にするために、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカーを担持しているか、あるいはまた、そのようなマーカーを含有する第二のベクターにより細胞が同時形質転換される。他の系の中でそのような選択マーカーは発現可能な構造遺伝子であるので、それから発現されるポリペプチド（酵素）は受容体生物に毒性の化合物に対する耐性を付与するかまたはそのような必須ポリペプチドを欠いている変異体の酵素系を補完する。形質転換された糸状菌細胞の選択に適するそのようなマーカー遺伝子は、例えば、既知のqa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdSまたはargB遺伝子である。
【００７９】
EP-A-0 278 355に記載されたように、Ａ．ニガーのゲノムライブラリーからpyrAと命名されたマーカー遺伝子が単離された。これはＡ．ニデュランスのpyrGおよびＮ．クラッサのpyr4に関連があり且つ同様な機能を有し、即ち、オロチジン５′−リン酸デカルボキシラーゼ酵素を産生する。この酵素は、オロチジン５′−リン酸からウリジル酸（ウリジン５′−リン酸）への脱炭酸と、フルオロオロト酸から毒性フルオロウリジンへの脱炭酸を触媒する。
【００８０】
しかしながら、オロチジン５′−リン酸デカルボキシラーゼをコードする他の任意のpyr 遺伝子のＤＮＡを使ってもよい。Ｅ．コリ BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968)と命名された陽性クローンから、pyrA遺伝子を含んで成るプラスミド pCG59D7を単離し、Ａ．ニガーpyrA- 変異体の同時形質転換に使用した。そのようなpyrA- 変異体はオロチジン５′−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が欠損しており、従って対応する酵素を生産することができない。そのような変異体は、Ａ．ニガー N756 の分生子柄を変異誘発ＵＶ照射下で処理し、そしてフルオロオロト酸の存在下で生き残ったコロニーを選択することにより調製した。
【００８１】
フルオロオロト酸の存在下で且つウリジンの非存在下で生き残ったコロニーは排除される。残ったウリジン要求変異体は、形質転換され得るそれらの能力に従って、それぞれＡ．ニガー変異体An8 およびAn10により表される２つの相補群pyrAおよびpyrBに属する。それらをそのプロトプラストの形において形質転換条件下でpyrA含有プラスミドpCG59D7 (DSM 3968)により処理する。Ａ．ニガーAn8 (DSM 3917)コロニーのみが形質転換され、消化されたそれのＤＮＡがpUN 121 のＤＮＡとハイブリダイズする能力により立証されるようにpyrA遺伝子を含むことがわかった。
【００８２】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの調製方法
本発明はまた、本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ、好ましくはそれの好ましい形態の調製方法であって、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現に適当な条件下で本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主を培養することを含んで成る方法にも関する。必要ならば、該ポリペプチドは常法により単離される。発現ベクターの作製方法に依存して、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼは生産されるか、またはシグナル配列が存在する場合には生産されそして細胞質から培地中もしくは別の細胞区画中に分泌される。
【００８３】
選択される宿主が発現に適するか否かは、発現ベクターを作製するのに選ばれる調節配列、特にプロモーターに主として依存する。
例えば、本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現にアスペルギルス種、好ましくはＡ．ニガー遺伝子由来のプロモーターが使われる場合、アスペルギルス種、好ましくはＡ．ニガーが適当な宿主である。しかしながら、本発明の発現ベクターの作製にアスペルギルス遺伝子に由来しないプロモーターが使われる場合、他の宿主、例えば細菌、例えばＥ．コリ、または酵母、例えばＳ．セレビシエが発現に適する。本発明のポリペプチドの調製に適する宿主とプロモーターは、前に与えた形質転換に適するものでもよい。
【００８４】
特に、本発明は、内因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が活性である条件下で形質転換されたアスペルギルス宿主が外因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を発現しており、よって遺伝子量の増加のために本来の量よりも多量のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現している方法に関する。このために、アスペルギルス宿主、特にＡ．ニガーは、相同の（即ち本来連結している）発現調節配列、特にプロモーターおよびシグナル配列の調節下にアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を含んで成る発現ベクターにより形質転換される。
【００８５】
特に、本発明は、内因性遺伝子が異なるプロモーターに融合されているために、形質転換されたアスペルギルス宿主が内因性遺伝子よりも高レベルにまたは内因性遺伝子とは異なる条件下で外因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を発現している方法にも関する。
【００８６】
１または複数の外因性遺伝子の最大発現のための条件は、選択される発現系に依存する。例えば、Ａ．ニガーのペクチンリアーゼ（ＰＬ）またはポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）遺伝子のプロモーターが使われる場合、それに連結されたアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現は、Ａ．ニガー細胞において培地中へのペクチンまたはペクチン分解生成物の添加により誘導可能である。
【００８７】
しかしながら、Ａ．ニガー株、例えばAn8 (DSM 3917)を宿主として使用する場合、十分なグルコースの存在下では該プロモーターは誘導できない。これは、Ａ．ニガーのＰＬまたはＰＧプロモーターの調節下のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子がＡ．ニガーにおいて「代謝産物抑制」されることを意味する。しかし、別のアスペルギルス株、好ましくはＡ．オリゼまたは最も好ましくはＡ．ニデュランスを使うと、Ａ．ニガーＰＬまたはＰＧプロモーターの調節下のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子は常に発現され、即ち、ペクチンの非存在下および／またはグルコースの存在下でも発現される。
【００８８】
従って、Ａ．ニガー以外のアスペルギルス宿主、好ましくはＡ．オリゼ、最も好ましくはＡ．ニデュランスにおいてＡ．ニガーのＰＬまたはＰＧプロモーターの調節下のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を発現させることが有利であろう。何故なら、該遺伝子の発現の間のエネルギー源および炭素源としてペクチンに代わりグルコースを栄養培地に添加することができるからである。
【００８９】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現にアスペルギルス、好ましくはＡ．ニガーのピルビン酸キナーゼプロモーターが使われる場合、該遺伝子は炭素源およびエネルギー源としてグルコースを有する最少培地を使用すれば発現される。
【００９０】
様々な方法を適用できることにより、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを過剰発現させることが可能になった。全くアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現することができないかまたは少量のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現するかまたは外因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現に使われる誘導条件下でアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現しない適当な宿主を、好ましくはＡ．ニガー由来のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ、最も好ましくは配列番号１に示されるPEPE、
【００９１】
またはアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼのアスパラギン酸プロテアーゼ活性を有する断片をコードする構造遺伝子を含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換せしめ、そして前記構造遺伝子を発現せしめるという方法により、精製された単一のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを調製することができる。他のアスパラギン酸プロテイナーゼを発現することができない宿主を使用すると、それぞれの単一のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを精製された形で（これは、他のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼにより汚染されていないことを意味する）得ることができる。
【００９２】
全くアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現することができない宿主は、対応する遺伝子を持たない微生物であるか、または内因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現が適当に条件付けられた増殖培地中で抑制されている一方で、所望のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ構造遺伝子と作用可能に連結された外因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼプロモーター（例えばＡ．ニガー由来のプロモーター）がそれらの条件下で活性であるアスペルギルス株、もしくは該アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が別のプロモーターに融合されているアスペルギルス株である。
【００９３】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの調製に適する他のプロモーターおよび株は、上記の本発明の発現ベクターの説明のところで与えたものである。
【００９４】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼおよびそれの利用
本発明は、本明細書中「アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」と命名された純粋なアスペルギルスアスパラギン酸プロテアーゼそれ自体にも関する。そのようなプロテアーゼは、(a) アスペルギルス種に由来し、(b) 活性部位における触媒的アスパラギン酸残基のためプロテアーゼ活性を示し、そして(c) アスパラギン酸プロテイナーゼ科に分類するのに十分な既知のアスパラギン酸プロテアーゼとのアミノ酸配列相同性を示すと解釈される。アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼという用語には、アスパラギン酸プロテアーゼ活性を保持しているそのような酵素の断片も包含される。
【００９５】
本発明は、優先的にはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）の純粋なアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ、好ましくは配列表中の配列番号１のもとに示されるアミノ酸配列を有するアスパラギン酸プロテアーゼPEPE、並びにアスパラギン酸プロテアーゼ活性を保持しているそれの断片および変異体に関する。
【００９６】
本発明は更に、所望によりアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ活性以外の活性を有する１または複数の適当な酵素との予め決められた組合せにおいて、１もしくは複数のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼおよび／またはアスパラギン酸プロテアーゼ活性を有するそれの誘導体および／または生物学的に許容されるそれの塩を含んで成る酵素組成物に関する。
【００９７】
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼが欠損しているアスペルギルス株
本発明は、内因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が欠損している変異型アスペルギルス株、好ましくは変異型Ａ．ニガー株にも関する。好ましいのは、配列番号１に示されるpepE遺伝子が欠損しているＡ．ニガー株である。pepE遺伝子が欠損しており且つ他のプロテアーゼ遺伝子例えばpepA, pepB, pepCまたはpepDが欠損しているＡ．ニガー株も好ましい。
【００９８】
欠損アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を有する本発明の変異型アスペルギルス株は、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子破壊により、即ち、破壊しようと望む内因性アスペルギルス遺伝子に対応するＤＮＡ配列を試験管内で欠損遺伝子に変異せしめそしてアスペルギルス宿主細胞中に形質転換せしめることにより、調製することができる。細胞内での相同組換え現象により、完全な内因性遺伝子が外因性欠損遺伝子により置き換えられる。
【００９９】
通常、コード領域中にマーカー遺伝子を挿入することにより内因性遺伝子が破壊される。これは、容易にモニタリングすることができ且つ対応する内因性遺伝子が破壊されている形質転換体を選択するのに使うことができる欠損遺伝子をもたらす。しかしながら、機能的なアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを全く発現できないような方法で内因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が変異されている変異型アスペルギルス株、好ましくは変異型Ａ．ニガー株の調製に他の突然変異誘発法を使ってもよい。
【０１００】
本発明の最も好ましい態様では、配列番号１に示されるpepE遺伝子の欠損変異体、例えば選択マーカー遺伝子が挿入されている破壊されたpepE遺伝子、例えば後述の実施例に記載されるプラスミドpPEPEPYRA 中に含まれるような破壊されたpepE遺伝子、を含んで成るハイブリッドベクターを用いてＡ．ニガー株が形質転換され、そして形質転換体が選択される。
欠損アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を有する本発明の変異型アスペルギルス株は、細胞内または細胞外のいずれかにおける非相同または相同タンパク質の改良生産の発現に有用である。
【０１０１】
アスペルギルス種における異種性（heterologous）または同種性（homologous）タンパク質の発現は常法に従って達成することができる。通常、アスペルギルス中で機能的な相同または非相同プロモーターおよび所望によりアスペルギルス中で機能的な他の発現調節配列（例えば上述したもの）と作用可能に連結された相同または非相同遺伝子を含んで成る発現ベクターを作製する。必要ならば、常法によりポリペプチドを単離する。発現ベクターの構成に依存して、生成物は宿主細胞中で生産され、またはシグナル配列が存在する場合には、宿主細胞中で生産されそして分泌される。
【０１０２】
本明細書中の構造遺伝子は、例えば、ウイルス、原核細胞または真核細胞に由来し、そしてゲノムＤＮＡからまたはｍＲＮＡを経由して調製されたｃＤＮＡから誘導することができまたは化学的に合成することができる構造遺伝子であり、特に高等真核生物、特に哺乳類、例えば動物または特にヒト起源の多種多様の有用なポリペプチド（グリコシル化ポリペプチドを含む）、例えば栄養素の生産におよび化学において酵素反応を実施するのに利用することができる酵素、またはヒトや動物の病気の治療やその予防に有用であり且つ有効であるポリペプチド、例えばホルモン、免疫調節性、抗ウイルス性および抗腫瘍性を有するポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、凝固因子、食品等をコードする構造遺伝子である。
【０１０３】
そのような構造遺伝子の例は、例えば、アスペルギルスポリガラクツロナーゼ、例えばPGI およびPGII、またはアスペルギルスペクチンリアーゼ、例えばPLI, PLA, PLB, PLC, PLE およびPLF 、またはホルモン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレノコルチコトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−リポトロピン、ウロガストロンもしくはインスリン、増殖因子、例えば表皮増殖因子、インスリン様増殖因子(IGF) 、例えばIGF-I およびIGF-II、マスト細胞増殖因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞増殖因子、または形質転換増殖因子(TGF) 、例えば TGFβ、成長ホルモン、例えばヒトもしくはウシ成長ホルモン、
【０１０４】
インターロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子(MIF) 、インターフェロン、例えばヒトα−インターフェロン、例えばインターフェロン−αＡ，αＢ，αＤもしくはβ−インターフェロン、γ−インターフェロンまたはハイブリッドインターフェロン、例えばαＡ−αＤ−もしくはαＢ−αＤ−ハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインターフェロンBDBB、プロテイナーゼ阻害因子、例えばα1 −抗トリプシン、SLPI等、肝炎ウイルス抗原、例えばＢ型肝炎ウイルス表面もしくはコア抗原、
【０１０５】
Ａ型肝炎ウイルス抗原、または非Ａ非Ｂ型肝炎抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子もしくはウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドルフィン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＤ，ＥもしくはＧの軽鎖および／または重鎖、またはヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子、例えば第IXもしくはVIIIc 因子、エリトロポイエチン、エグリン、例えばエグリンＣ、
【０１０６】
ヒルジン、デスルフェートヒルジン、例えばデスルフェートヒルジン変異体HV1, HV2もしくはPA、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼをコードするものである。好ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロンまたはハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインターフェロンBDBB、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBVsAg）、インスリン様増殖因子ＩおよびII、エグリンＣ、並びにデスルフェートヒルジン、例えば変異体HV1 をコードするものである。
【０１０７】
【実施例】
最も好ましい態様を実施例において記載する。
次の実施例は本発明を説明するためものものであり、それを制限するためのものではない。
【０１０８】
使用する略語は次の意味を有する：
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＤＴＴ：１，４−ジチオトレイトール
EDTA：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩
IPTG：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
kbp ：キロ塩基対
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
X-gal ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド
【０１０９】
緩衝液、培地、試薬
ＳＭ：100mM NaCl, 8.1mM MgSO4, 50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01 ％ゼラチン
ＬＢ：１％トリプティカーゼペプトン(BBL) 、0.5 ％酵母エキス(BBL) 、１％NaClおよび0.05mM Tris-HCl pH 7.5
ＬＭ：１％トリプティカーゼペプトン(BBL) 、0.5 ％酵母エキス(BBL) 、10mM NaCl および10mM MgCl2
ＳＳＣ：0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム
ＰＳＢ：10mM Tris-HCl pH 7.6, 100mM NaCl, 10mM MgCl2
ＴＥ：10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA pH 8.0
【０１１０】
最少培地：１リットルが 1.5 g KH2PO4, 0.5 g KCl, 0.5 g  MgSO4・7H2O, 0.9 mg ZnSO4・7H2O, 0.2 mg MnCl2・4H2O, 0.06 mg  CoCl2・6H2O, 0.06 mg  CuSO4・5H2O, 0.29 mg  CaCl2・62H2O, 0.2 mg  FeSO4・7H2O, 明細書中に明記したような炭素源および窒素源またはそれらの源が明白に言及されない場合１リットルあたり6 g のNaNO3 と10 gのグルコースを含有し、NaOHでpH 6.0に調整したもの
【０１１１】
完全培地：１リットルあたり6 g のNaNO3 と10 gのグルコース、並びに１リットルあたり2 g のトリプティカーゼペプトン(BBL) 、1 g のカザミノ酸(Difco) 、1 g の酵母エキス(BBL) 、0.5 g の酵母由来リボ核酸ナトリウム塩(ICN, Cleveland, USA), 2 ml のビタミン溶液を含有し、NaOHでpH 6.0に調整したもの
ビタミン溶液：100 mlあたり10 mg のチアミン、100 mgのリボフラビン、10 mg のパントテン酸、2 mgのビオチン、10 mg のｐ−アミノ安息香酸、100 mgのニコチンアミド、50 mg のピリドキシン−HCl
【０１１２】
ＴＢＥ：１リットルが4 mlの0.5M EDTA pH 8.0溶液、10.8 gのTrisおよび5.5 g のH3BO3 を含有する
フェノール：Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982（438 頁）により記載されたように処理したフェノール
試料緩衝液：10％(v/v) グリセロール、100mM EDTA pH 8.0 および0.01％ブロモフェノールブルー
ＲＮアーゼＡ：Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982（451 頁）により記載されたように処理したＲＮアーゼＡ
【０１１３】
使用する菌株およびベクター
Ａ．ニガー N400 ：野生型。
Ａ．ニガー An8  ：EP-A-0 278 355に開示されておりDSM 3917として寄託されたペクチナーゼ複合体高度産生株のウリジン独立栄養性変異体。
Ｅ．コリ LE392： F- , hsdR514(rk- , mk+ ), supE44, supF58, lacY1または(lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55,  λ- 。
Ｅ．コリ DH5αF'： F' , endA1, hsdR17(rk - , mk + ), supE44, thi-1, recA1, gyrA, relA1, 80φlacZ M15, Δ(lacZYA-argF)U169,  λ- 。
【０１１４】
EMBL4 ：EMBL4 は、9 〜23 kbpのクローニング容量を有するλ置換ベクターである（Frischauf ら、J. Mol. Biol. 170:827-842, 1983 ）。それはλアームと非必須詰め物領域の間に多重クローニング領域を含む。これは着目の外来ＤＮＡが挿入される時ベクターへの詰め物への再連結が除去されるような方法での複数の制限酵素消化を実施可能にする。該ベクターはまた、組換え体についての直接選択を提供するのにSpi 表現型を利用する（Zissler ら、A.D. Hershey編、The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, 1971 ）。
【０１１５】
実施例中、ＰＣＲ技術において一連のオリゴヌクレオチドが使われる。次のものはオリゴ体の簡単な特徴づけである。配列は配列表の中に示される。
オリゴヌクレオチド１：pki プロモーター中のBamHI 部位の直前でプライムするように設計される。
オリゴヌクレオチド２：ピルビン酸キナーゼのＡＴＧの直前にPstI部位を挿入するように設計される。
オリゴヌクレオチド３：pepEのＡＴＧの直前にPstI部位を挿入するように設計される。
オリゴヌクレオチド４：pepEの終結コドンの直後にXhoI部位を挿入するように設計される。
【０１１６】
オリゴヌクレオチド５：ピルビン酸キナーゼの終結コドンの直後にSalI部位を挿入するように設計される。
オリゴヌクレオチド６：ピルビン酸キナーゼターミネーターの終わりにBamHI 部位を置くように設計される。
オリゴヌクレオチド７：pepE中の第一イントロンをループアウトするように設計される。
オリゴヌクレオチド８：pepE中の第二イントロンをループアウトするように設計される。
オリゴヌクレオチド９：pepE中の第三イントロンをループアウトするように設計される。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドＡ：pepE  ＲＮＡからの印刷（runoff）転写物をプライムするように設計される。
オリゴヌクレオチドＢ：pepEの第一および第三エキソンの一部並びに第二エキソンの全部を増幅させるためのＰＣＲプライマーとして設計される。
オリゴヌクレオチドＣ：pepE  ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を開始させそしてpepEの第一および第三エキソンの一部並びに第二エキソンの全部を増幅させるように設計される。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドＤ：pepEの第三および第四エキソンの一部を増幅させるためのＰＣＲプライマーとして設計される。
オリゴヌクレオチドＥ：pepE  ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を開始させそしてpepEの第三および第四エキソンの一部を増幅させるように設計される。
【０１１９】
実施例１：アスペルギルス・ニガーのゲノムライブラリーの作製
実施例 1.1：Ａ．ニガー N400 からの高分子量ＤＮＡの単離
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）の分生子柄を200 mlの最少培地中に106 胞子／mlの最終胞子密度に接種し、11個のアーレンマイヤフラスコ中で28℃にて300 rpm で24時間振盪する。ブフナー漏斗上でのミラクロス(Myracloth) を通した濾過により菌糸を収集し、冷却した無菌塩溶液で洗浄し、液体窒素中で凍結させ、−60℃で貯蔵するかまたはそのまま使用する。ゲノムライブラリーを作製するためのＤＮＡの単離に使用する方法は、Yeltonら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474 (1984)〕により記載された手順に基づく。
【０１２０】
ライブラリー作製のため、10 gの菌糸を1 g ずつ液体窒素中でBraun 小型膜除去器中で粉砕する。粉砕した菌糸を、200 mlの抽出緩衝液（50mM EDTA pH 8.5, 0.2% SDS）と200 μl のジエチルピロカーボネートの入った11本の無菌アーレンマイヤーに移す。この混合物をゆっくり室温まで温め、次いで時折振盪させながら68℃に20分間加熱する。懸濁液を室温に冷やし、12,000×g で15分間遠心する。上清に１／16容の８Ｍ酢酸カリウム溶液 pH 4.2 を加え、該混合物を氷上に１時間置いておく。
【０１２１】
遠心（20分；16,000×g ；４℃）により沈澱を除去する。氷上で15分間の0.6 容のイソプロパノールとのインキュベーションにより、上清から核酸を沈澱させる。沈澱した核酸を遠心（10分；6,000 ×g ；４℃）により収集し、70％エタノールで洗浄し、手短に乾燥する。ペレットを20μg/mlのＲＮアーゼＡ（Boehringer, Mannheim）を含む10 ml のＴＥ中に懸濁させ、そして37℃で15分間インキュベートする。該ＤＮＡをヌクレアーゼ不含有プロナーゼ（最終濃度１mg/ml ）（Kochlight, Coinbrook）により37℃にて１時間処理する。
【０１２２】
得られたＤＮＡ溶液 9 ml に8.5 g のCsClを溶かし、0.2 mlの10 mg/ml臭化エチジウムを添加し、この溶液をBeckman SW41ローター中で33,000 rpmで60時間遠心するか、またはBeckman 50 Ti ローター中で45,000 rpmで40時間遠心する。ＤＮＡバンドを集め、NaCl飽和水溶液で平衡化されたイソプロパノールでの繰り返し抽出により臭化エチジウムを除去する。
【０１２３】
５容のＴＥを添加し、ＴＥで飽和したフェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール 25:24:1、およびクロロホルム／イソアミルアルコール 24:1 により該ＤＮＡ溶液を順次処理する。0.1 容の３Ｍ酢酸ナトリウム pH 5.2 、2.5 容のエタノールの添加と−20℃での一晩のインキュベーションによりＤＮＡを沈澱させる。沈澱物を遠心（１時間；30,000×g ；４℃）により収集し、70％エタノールで洗浄し、乾燥し、そして400 μl のＴＥに溶かす。
【０１２４】
実施例 1.2：MboIによるＡ．ニガー N400 ＤＮＡの部分消化および断片の単離
13.6〜23 kbpに最大量のＤＮＡ断片を与えるMboI濃度を試験するために、１μg 部分のＡ．ニガー N400 ＤＮＡを、製造業者が推奨する適当な緩衝液中で減少する量のMboI（0.5 〜0.001 Ｕ）を使って10μl の容量で37℃にて１時間消化する。１μl の0.25M EDTAの添加により反応を停止させ、そして１μg/mlの臭化エチジウムを含むＴＢＥ緩衝液中 0.6％アガロースゲルの上に試料を負荷した。所望の13.6〜23 kbp断片の高収量を与えるのに必要なMboI濃度は約0.02Ｕ／μg ＤＮＡである。
【０１２５】
従って、総容量２mlにおいて200 μg のＤＮＡを消化する。37℃で１時間後、25mMの最終濃度にEDTAを添加し、65℃で10分間酵素を不活性化し、ＤＮＡを沈澱させ、洗浄し、乾燥し、そして400 μl のＴＥに溶かす。断片化されたＤＮＡを４℃，40Ｖ（３Ｖ／cm）にて 0.4％調製用アガロースゲル上で分離する。正しいサイズの断片をゲルから切り取り、２mlのＴＢＥを含む無菌の透析チューブの中で100 Ｖで２〜３時間ゲルからＤＮＡを電気溶出させる。電流を30秒間逆流させ、該ＤＮＡを含む緩衝液を回収する。次いでエタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を濃縮し、100 μl のＴＥに溶かす。
【０１２６】
実施例 1.3：ベクターＤＮＡの調製
λベクターEMBL4 中にＡ．ニガーN400株のゲノムライブラリーを作製する。9 〜23 kbpのクローニング容量を有するこのベクターは、Frischauf ら〔J. Mol. Biol. 170:827-842 (1983)〕とKarnら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5172-76 (1980)〕により記載されており、Promega Biotechnology Inc.から購入することができる。該ゲノムの異なる部分から生じた２つの挿入断片が１つのファージの中にクローニングされるのを避けるために、最小の断片の長さ 13.6 kbp をクローニングに使用する。
【０１２７】
10μg のλEMBL4 ＤＮＡを製造業者が推奨する適当な緩衝液中で100 μl の容量において50単位のBamHI により37℃にて２時間完全消化する。65℃で10分間酵素を不活性化する。NaCl濃度を150mM に高め、50単位のSalIを加え、そして更に２時間37℃でのインキュベーションを続ける。25mMへのEDTAの添加後、65℃で10分間加熱することにより酵素を不活性化する。
【０１２８】
同容量のフェノール（ＴＥ飽和）、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1) 、およびクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)により溶液を抽出する。小さいBamHI/SalIポリリンカー断片を除去するために、0.1 容の３Ｍ酢酸ナトリウム pH 5.2 の添加後に0.6 容のイソプロパノールでＤＮＡを沈澱させる。氷上に15分置きそして12,000×g で４℃にて15分間遠心した後、沈澱物を70％エタノールで徹底的に洗浄し、乾燥し、40μl のＴＥに溶かす。
【０１２９】
実施例 1.4：Ａ．ニガー N400 ＤＮＡゲノム断片の連結および試験管内パッケージング
連結反応前に実施例 2.3に従って調製したベクターのcos 部位がアニールされることが不可欠である。100mM Tris-HCl pH 7.5 および10mM MgCl2の中のベクターを65℃で10分間加熱し、次いで42℃で１時間アニーリングする。試験連結から約１：１（重量で）のベクター対断片の比が最大量の組換え体を与えることがわかった。
【０１３０】
50mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTTおよび1mM ATP 中で総容量100 μl において9.5 g のベクターと10μg のＤＮＡ断片を使って連結を行う。ＤＮＡリガーゼ(BRL) を0.5 Ｕ／μg ＤＮＡの濃度に添加し、そして連結混合物を14℃で一晩インキュベートする。連結について試験するために、連結したＤＮＡの試料をアガロースゲル上に負荷する。また、対照として、断片の添加を伴わずに0.5 μg のベクターを５μl の容量において連結せしめる。
【０１３１】
連結混合物をエタノール沈澱により濃縮し、試験管内パッケージング前に20μl のＴＥに溶かす。試験管内パッケージングは、Promega Packagene 抽出物を使って製造業者の教示に従って10μl 部分を使って１μg のＤＮＡをパッケージングする。該抽出物を与えた１μg の高分子量対照ファージλcI857 Sam7を対照として別にパッケージングする。パッケージング後、500 μl のファージ溶液緩衝液（ＰＳＢ）と５μl のクロロホルムを加える。組換えファージ原液を４℃で保存することができる。
【０１３２】
実施例 1.5：Ａ．ニガー株 N400 ゲノムライブラリーの滴定および増幅
Ｅ．コリ NM539の細胞を、0.2 ％マルトース、10mM MgSO4および1mM CaCl2 を含むＬＢ培地上で1.0 の光学濃度（600 nm）まで増殖させる。この培養物の0.2 mlアリコートをＰＳＢ中の適当なファージ希釈液 0.1 ml に添加する。該ファージを37℃で20分間吸着させた後、45℃の0.6 ％ＬＢ−トップアガー3 mlを加え、混合物をＬＢ寒天プレート上に塗抹し、それらを37℃で一晩インキュベートする。
【０１３３】
ファージ懸濁液１mlあたりのプラーク形成単位(pfu) は、実施例 1.4に従って調製した２つのファージ原液についてそれぞれ12×105 と 4.2×105 pfu/mlである。断片なしでの対照連結から算出されたバックグラウンド（それぞれ17％と40％）を差し引いた後の組換え体の絶対数は 6×105 である。組換え体中に含まれるＤＮＡはアスペルギルス・ニガーのゲノム数 200以上に等しい。
【０１３４】
該ライブラリーを増幅させるために、両ファージ原液80μl アリコートを使ってＥ．コリNM539 細胞を感染させ、これをＬＢ寒天プレート上のＬＢトップ−アガロース中に塗抹し、次いで37℃で一晩インキュベートする。該プレートをプレートあたり5 mlのＰＳＢと共に室温で１時間穏やかに振盪することにより、アガロースからファージを溶出させる。ＰＳＢを収集し、遠心（6000×g で10分）して細菌を除去し、クロロホルムを加える（最終濃度0.5 ％）。ほぼ同じ程度に増幅された両ファージ原液を混合し（40μl 原液）、滴定し（８×109 pfu/ml）、そして４℃で保存する。
【０１３５】
実施例２：Ｎ．クラッサpep4プローブの調製
実施例 2.1：Ｎ．クラッサプローブの調製
プラスミドpNCPEP4 は、Ｎ．クラッサ（N.  crassa）pep4遺伝子をコードするＮ．クラッサＤＮＡの3.8 kb断片を含有する。このコード領域の一部はSalIにより簡単に切り出すことができる。従ってプラスミドpNCPEP4 をSalIで消化し、1.2 ％アガロース上で断片を分離する。0.6 kb断片を切り取り、ＤＮＡを電気溶出させる。この断片 100 ng を、標識ヌクレオチドとして32P-ATP を使ってニックトランスレーションし、すぐにサザンまたはプラークリフトプロービングのいずれかに使用する。
【０１３６】
実施例 2.2：Ａ．ニガーＤＮＡのサザンブロット
上述の通りに調製したＡ．ニガーＤＮＡの２μg アリコートをBamHI かHindIII のいずれかで消化し、0.8 ％アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色したゲルを撮影した後、毛管ブロッティングによりニトロセルロース膜にＤＮＡを移行させ〔Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975) 〕、そして実施例３に記載したように標識酵母ＰＲＢプローブとハイブリダイズせしめる。両方の消化物を含むニトロセルロースの各切片を様々な洗浄法にかけ、最強のシグナル対ノイズ比を与える条件を決定する。２×ＳＳＣ中室温にて30分間の１回の洗浄に続き２×ＳＳＣ中56℃にて30分間の２回の洗浄が最良の結果を与えることがわかった。
【０１３７】
実施例３：Ｎ．クラッサpep4プローブを用いたＡ．ニガーN400ライブラリーのスクリーニング
上述のアスペルギルス・ニガーN400株のゲノムライブラリー（実施例１）の一部をＳＭ中に希釈し、各々が約2000 pfuを含む0.1 ml部分を平板培養する。0.2 ％マルトースが補足されたＬＢ培地 50 mlをＬＢ培地中のＥ．コリ NM539の一晩培養物 0.5 ml に接種し、37℃において250 rpm で４時間振盪し、次いで0.5 mlの1M MgSO4と0.5 mlの0.5M CaCl2を加えることにより、宿主細胞を調製する。それらの細胞の0.2 mlアリコートをそれぞれファージ懸濁液の0.1 ml部分と混合し、室温で30分間インキュベートする。次いで、47℃のＬＭ培地中0.7 ％アガロース 3 ml を添加し、手短に渦動攪拌し、即座にＬＭ寒天プレート上に塗抹する。該プレートを37℃で一晩インキュベートし、そして４℃で２時間冷蔵する。
【０１３８】
各プレートから、BentonおよびDavis のプラークハイブリダイゼーション法〔Benton, W.D.およびDavis, R.W., Science 196:180-182 (1977) 〕に従って２枚の複製物を作製する。該プレートの上に第一のフィルター（Schleicher and Schuell BA85 ）を１分間置き、そして第二の複製物を２分間置き、それらの複製物の位置をIndia インクで印す。フィルターを取り外した後、それらを100 mlの変性溶液（1M NaCl, 0.5M NaOH）の入った皿の中に0.5 分間置き、次いで100 mlの中和溶液（0.5M Tris-HCl pH 7.5, 1.5M NaCl ）中に１分間置く。それらのフィルターを３×ＳＳＣの入った皿に移し、手袋をして穏やかに表面をこすって細菌砕片を除去し、そして３×ＳＳＣですすぐ。それらのフィルターをブロッティングし、室温で10分間乾燥し、Whatman 3MM 紙の上にのせて80℃のオーブン中で２時間焼く。
【０１３９】
焼いたフィルターを３×ＳＳＣ中で湿らせ、この溶液中で室温で１時間洗浄し、次いで250 mlの予熱した（56℃）予備ハイブリダイゼーション混合物〔６×ＳＳＣ、10×デンハーツ溶液（0.2 ％ＢＳＡ，Boehringer第Ｖ分画；0.2 ％フィコール 400, Pharmacia ；0.2 ％ポリビニルピロリドン−10, Sigma ）、0.1 ％ＳＤＳおよび0.1 mg/ml の尖断され新たに変性されたニシン精子ＤＮＡ〕を含む皿に移す。振盪湯浴中で56℃で１時間予備ハイブリダイゼーションした後、250 mlの予熱した（56℃）ハイブリダイゼーション混合物（ニシン精子ＤＮＡを欠くこと以外は予備ハイブリダイゼーション混合物と同じである）中でフィルターを30分間洗浄する。次いで、予め標識されたプローブが新たに加えられた150 mlの予熱した（56℃）ハイブリダイゼーション混合物を含む皿にフィルターを移す。
【０１４０】
65℃で14時間のハイブリダイゼーション後、250 mlの２×ＳＳＣ中で、室温に次いで56℃でそれぞれ30分間１回ずつフィルターを洗浄する。フィルターを乾燥し、そして映像強化膜を使って−70℃にて１〜３日間Kodak XAR5フィルムに露出させる。
【０１４１】
こうして、スクリーニングした３枚のプレートから３つの陽性シグナルが得られる。インクマーカーを利用してプレートをオートラジオグラムの上に注意深く位置合わせすることにより、無菌のパスツールピペットを使って陽性プラークを切り抜く。陽性プラークを含む寒天片を１mlのＳＭに添加し、それに 2.5μl のクロロホルムを加える。時折渦動攪拌しながら室温で１時間寒天から外にファージを拡散させ、次いで４℃で一晩インキュベートする。５分間の遠心により寒天と細胞砕片を除去し、2.5 μl のクロロホルムを加え、ファージ原液を４℃で保存する。
【０１４２】
陽性クローンをλ１，λ２，λ４と命名する。ファージを高密度で塗抹したので、それらを低密度で塗抹しそして複製平板分離、ハイブリダイゼーションおよび陽性プラークの選択の全手順を繰り返すことにより、陽性プラークを３回精製する。
【０１４３】
実施例４：λクローンの特徴づけ
実施例 4.1：λＤＮＡの単離
組換え体クローンからＤＮＡを単離するために、まずファージを増幅させる。このために、Ｅ．コリ LE392宿主細胞を、10mM MgSO4と0.2 ％マルトースが補足されたＬＢ培地中で1.0 の光学濃度（600 nm）まで増殖させる。次いで精製したファージ原液50μl を別々に上述したように塗抹する。37℃で一晩のインキュベーション後、該プレートの上に5 mlのＳＭを拡散しそして穏やかに振盪しながら２時間インキュベートすることにより、非集密的プレートからファージを溶出させる。溶出したファージを収集し、0.1 mlのクロロホルムを加える。この混合物を手短に渦動攪拌し、遠心分離により細胞砕片を除去する。上清を回収し、クロロホルムを0.3 ％に加え、得られたプレート溶解物を４℃で保存する。
【０１４４】
ファージＤＮＡの単離のための出発物質としてほぼ集密的プレートを得るために、プレート溶解物の10 ml 部分をＥ．コリ LE392宿主細胞に塗布する。37℃で一晩のインキュベーション後、３つのほぼ周密的プレートからアガロース上層を掻き取る。それらの層を合わせ、20 ml のＳＭと0.4 mlのクロロホルムを加え、得られた混合物を37℃で30分間振盪する。遠心により細胞砕片とアガロースを除去し、上清を回収し、その容量をＳＭで18 ml に調整する。同容量の2M NaCl, 20% PEG6000 (BDH, Poole, GB) ／ＳＭを加え、該溶液を混合し、氷上に置く。
【０１４５】
75分後、４℃にて1200×g での20分間の遠心によりファージをペレット化する。上清をデカンテーションし、残った液体をKleenex ティッシュで取り除く。ペレットを3 mlのＳＭ中に再懸濁し、次いで3 mlのクロロホルムで抽出する。水相をＲＮアーゼＡ（67μg/ml）とＤＮアーゼＩ（33μg/ml）で37℃にて20分間処理する。次いで2 mlのフェノールを加え、渦動攪拌し、1 mlのクロロホルムを加え、再度渦動攪拌し、そして遠心により二相を分離することにより、この混合物を抽出する。
【０１４６】
水相を3 mlのフェノール／クロロホルム（１：１）と3 mlのクロロホルムにより、それぞれ更に２回抽出する。次いで0.3 mlの３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）と6 mlのエタノールを順次添加することにより、水相からＤＮＡを沈澱させる。この混合物を４℃で16時間放置しておき、次いで遠心（10分、12000 ×g 、４℃）によりＤＮＡを回収する。ペレットを0.4 mlのＴＥ緩衝液に溶かし、それにＲＮアーゼＡを200 μg/mlに添加し、そして37℃で１時間インキュベートする。38μl の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）と0.8 mlのエタノールを添加することにより４℃にて１時間ＤＮＡを沈澱させる。遠心により該ＤＮＡを回収し、次いで100 μl のＴＥに溶かす。
【０１４７】
実施例 4.2：Ａ．ニガー N400 pepEクローンの制限分析
制限分析により３つのファージ全てがＡ．ニガーゲノムの同一領域に由来する挿入断片を含むことが確立され、λ１の部分制限地図が作製される。
【０１４８】
２μg のファージＤＮＡを、製造業者(BRL) が推奨する緩衝液中で20μl の容量において20単位のBamHI により37℃で１時間消化し、次いで65℃で10分間加熱する。試料を 0.7％アガロースゲルにかけた後、写真撮影する。ＤＮＡをニトロセルロース膜に移行せしめ、標識したＮ．クラッサpep4プローブとハイブリダイズせしめる。それらの消化物から３つのファージ全てが同じであり、且つ5.8 kb断片がpep4プローブとハイブリダイズする唯一の断片であり、よって対応するＡ．ニガー遺伝子の全部でないにしても大部分を含むことが明らかである。３つの同一ファージのうちの１つをλ１と命名し、次の実験に使用する。
【０１４９】
実施例５：プラスミド中へのPEPEのクローニングおよびそれの配列決定と特徴づけ
実施例 5.1：pPEPE の作製
本質的には上述した通りにλ１ＤＮＡを制限酵素BamHI と共にインキュベートする。クロロホルムでの抽出後、該ＤＮＡを沈澱させ、遠心によりペレット化し、試料緩衝液中に溶かし、１×ＴＢＥ緩衝液中において0.6 ％アガロースゲル上での電気泳動にかける。5.8 kbp のBamHI 断片を含むゲル切片を回収し、ＤＮＡを電気溶出させる。次いでこれを100 μl のクロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させ、40 ml のＴＥ緩衝液に再溶解する。アガロースゲル電気泳動に続きＵＶ光下でのバンドの視覚化により、ＤＮＡ濃度を評価する。
【０１５０】
製造業者(BRL) により推奨される条件下でのBamHI での消化により、pTZ18Rベクターを調製する。該ＤＮＡをフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）およびクロロホルムにより抽出し、エタノール沈澱させる。
上記断片の各々 100 ng を、BRL により推奨される緩衝液とＡＴＰ（1 mM）、1.5 ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ(BRL) を含む25μl の反応容量において一緒に連結せしめる。この反応混合物を16℃にて16時間インキュベートし、次いでＥ．コリDH5aF'を形質転換させるのに使う。25μg/mlのアンピシリン、0.005 ％のXgal、0.05mMのIPTGを含むＬＢ寒天プレート上に該細胞を塗布し、37℃で一晩インキュベートする。
【０１５１】
幾つかの単一白色コロニーを使って、0.1 ％グルコースと25 mg/mlのアンピシリンが補足されたＬＢ培地中で一晩培養物を調製する。それらの培養物を使ってHolmesおよびQuigley のミニプレプ法〔Holmes, D.S.およびQuigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)〕を利用してプラスミドを単離する。製造業者(BRL) の教示に従ってそしてＲＮアーゼＡ（0.5 mg/ml ）の存在下で、プラスミドを幾つかの制限酵素で消化し、そして生成物をアガロースゲル上で分析する。期待されるサイズのBamHI 断片を生じるプラスミドを選択し、それらを含有するＥ．コリ細胞をグリセロール上で−20℃に維持する。このプラスミドをpPEPE と命名する（ＤＳＭに寄託される）。
【０１５２】
実施例 5.2：pepEのヌクレオチド配列
pepEサブクローンであるpTZ18Rベクター中の5.8 kbp BamHI 断片を、合成オリゴヌクレオチドプライマーとシークエナーゼ（United States Biochemical Corp. ）を使って、ジデオキシ−チェーンターミネーション法〔Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67 (1977)〕により部分的に配列決定する。
完全ヌクレオチド配列を配列表に与える。他の既知のアスパラギン酸プロテアーゼとの比較により転写解読枠を同定し、これを転写マッピングにより確認する。
【０１５３】
実施例 5.3：PEPEのＲＮＡマッピング
Frederick およびKinseyの方法〔Curr. Genet. 18:53-58 (1990)〕の方法により、炭素原としてグルコースを含みそして窒素原としてアンモニアを含む最少培地上で増殖させ凍結乾燥した菌糸の粉砕物から全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡを32Ｐで末端標識したオリゴヌクレオチドＡ（配列番号12）とハイブリダイズせしめ、そして同じオリゴヌクレオチドを使ったジデオキシ配列決定法（Maniatisら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982 ）により行われる配列決定反応と比較することによって配列決定用ゲル上で逆転写酵素により生産された印刷転写物のサイズを決定することにより、伝令ＲＮＡの５′末端を同定する。
【０１５４】
pepE情報の部分的ｃＤＮＡコピーをクローニングし配列決定することにより、イントロンの正確なスプライス部位を同定する。第一鎖合成は、プライマー用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドＣ（配列番号14）かオリゴヌクレオチドＥ（配列番号16）のいずれかであること以外は、標準法（Maniatisら、前掲）により実施する。それらのｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドＢ（配列番号13）とＣまたはオリゴヌクレオチドＤ（配列番号15）とＥを使ったＰＣＲにかけ、pTZ18R中にクローニングする。
【０１５５】
各々の２つの独立したクローンの両鎖を完全に配列決定する。プローブとして2.8 kb BamHI−BglII 断片を使ったノーザン分析（Maniatisら、前掲）により、pepE遺伝子から生産されるｍＲＮＡの全長を決定すると、1.3 〜1.5 kbであると決定された。これは、転写解読枠のサイズと転写開始部位の位置から期待されるものに一致する。
【０１５６】
実施例６：PEPEのゲノム破壊
実施例 6.1：pTZ18REEの作製
pTZ18RをユニークHindIII 部位のところで切断し、これをＴ４ポリメラーゼでフィルインし、そして配列 5′GGAATTCCを有する過剰量の未リン酸化 EcoRIリンカーの存在下で連結せしめる。Ｅ．コリ中への形質転換により、２つのEcoRI 部位（ポリリンカー配列の各端に１つずつ）を有するプラスミドpTZ18REEが生じる。配列決定により正しいプラスミドを同定する。
【０１５７】
実施例 6.2：pPEPEPYRA の作製
pAXIからpyrA遺伝子を含む4 kb XbaI 断片を切り取り、ベクター配列から精製する。該断片をＴ４ポリメラーゼで処理して粘着末端をフィルインし、フェノール抽出し、そしてエタノール沈澱させる。
pPEPE をEcoRI で切断し、細菌アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸し、Ｔ４ポリメラーゼで処理して５′突出末端をフィルインし、次いでBamHI で切断する。アガロースゲル上で断片を分離し、3.4 kb EcoRI（平滑）−BamHI 断片を精製する。
【０１５８】
pPEPE をHindIII で切断し、細菌アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸し、Ｔ４ポリメラーゼで処理して５′突出末端をフィルインし、次いでBamHI で切断する。アガロースゲル上で断片を分離し、1.4 kb HindIII（平滑）−BamHI 断片を精製する。
pTZ18RをBamHI で切断し、細菌アリカリ性ホスファターゼにより脱リン酸する。
上記４つの断片を一緒に連結せしめる。Ｅ．コリの形質転換後、正しいプラスミドを含むコロニーを、ミニプラスミド調製物の制限酵素消化により同定する。
【０１５９】
pPEPEPYRA は、PEPE遺伝子を有するEcoRI 断片を含有するpTZ18Rベクターから成り、オロチジン一リン酸デカルボキシラーゼをコードするXbaIＤＮＡ断片により置換された、成熟プロテアーゼ転写解読枠のほどんどを含む中心の EcoRI−HindIII 断片と EcoRI−EcoRI 断片を有する。
【０１６０】
実施例 6.4：Ａ．ニガーの形質転換
10μg のプラスミドpPEPEPYRA をEcoRI により完全消化する。アリコートをゲル上に負荷することにより消化の完了を確認し、残りのＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈澱させ、そして20μl の無菌蒸留水に再懸濁する。
独立栄養性Ａ．ニガー An8（DSM 3917）の分生胞子を、完全培地上で十分に胞子形成するまで28℃にて４日間増殖させる。２×108 分生子柄を使って、１g/l のアルギニンとウリジンが補足された最少培地 200 ml に接種する。
【０１６１】
180 rpm で28℃で20時間増殖した後、Miracloth を通した濾過により菌糸を収集し、10 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄し、そして20 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2, 0.5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) 中に再懸濁する。この混合物を、十分なプロトプラストが放出されるまで振盪湯浴（30℃、50 rpm）中でインキュベートする（90〜120 分後に顕微鏡で検出される）。
【０１６２】
プロトプラスト懸濁液を漏斗に付けたガラスウール栓を通して濾過し、菌糸砕片を除去する。室温での軽い遠心（10分、2000 rpm）によりプロトプラストをペレット化し、10 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄する。該プロトプラストを最後に200 〜500 μl の0.8M KCl, 50mM CaCl2中に再懸濁して１×108 スフェロプラスト／mlの濃度を与える。
【０１６３】
形質転換のため、前記プロトプラスト懸濁液の200 μl アリコートを、50μl のＰＣＴ（10mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG 6000）中の EcoRI消化されたpPEPEPYRA ５μg と共にインキュベートする。このインキュベーション混合物を氷上に20分間維持し、更に2 mlのＰＣＴを加え、室温で更に５分間インキュベートする。次いで4 mlの0.8M KCl, 50mM CaCl2を加え、最終形質転換溶液の1 mlアリコートを、0.8M KClで安定化された液体最少寒天培地〔最少培地＋1 g/l アルギニン＋10 g/l Bacto-Agar(Difco)〕と混合する。この混合物をすぐに同培地の寒天プレート上に注ぎ、そして30℃でインキュベートする。
【０１６４】
28℃で２〜３日間増殖した後、何百という小さな恐らく不全の形質転換体のバックグラウンド増殖の上に、活発に増殖しそして胞子形成しているコロニーとして、安定な形質転換体が出現する。
【０１６５】
実施例 6.5：遺伝子破壊の同定
安定なコロニーから、個々の胞子懸濁液を作り、新鮮な最少＋アルギニンプレート上で画線培養する。単一コロニーを選択し、再度画線培養して純粋培養物を与える。それらを使って1 g/l のアルギニンが補足された液体最少培地200 mlに接種する。180 rpm で振盪しながら30℃で24時間後、濾紙の上に菌糸を収集し、そのパッドを凍結乾燥する。乾燥後、乳鉢と乳棒を使って該パッドを細粉に粉砕することにより、個々のパッドからＤＮＡを調製する。
【０１６６】
この粉末60 mg を渦動攪拌により3 mlの１％ドデシル硫酸ナトリウム、0.1 ％Tween 80、１Ｍ酢酸アンモニウム中に再懸濁する。これを時折混合しながら65℃に20分間加熱する。15,000×g で５分間の遠心により、このＤＮＡ溶液から細胞砕片を分離する。上清をフェノールで２回、クロロホルムで２回それぞれ抽出し、次いでエタノール沈澱せしめる。ＤＮＡペレットを100 μl の無菌ＴＥに再溶解する。
【０１６７】
各ＤＮＡ20μl を１μg のＲＮアーゼＡの存在下でEcoRI で１時間消化する。これをアガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移行させ、焼く。PEPE遺伝子を含有するpPEPE からの BglII−HindIII 断片を精製し、ニックトランスレーションにより標識し、前記ニトロセルロース膜を探査するのに使用する。pepE遺伝子の破壊を有する株は、0.5 kb EcoRIハイブリダイズ断片を欠き且つ他の２つの隣接断片の移動度が異なることから、容易に認識される。
【０１６８】
それらの株のうちの１つを、ウリジンと５−フルオロオロト酸を含む培地上に塗布する。この培地上でより強力に増殖することによりピリミジン独立栄養株への変異体を同定し、それを抜き取り、単一コロニーに画線培養することにより精製する。
【０１６９】
実施例 6.6：pepE- Ａ．ニガー株におけるインターフェロンの生産
実施例 6.5で単離したpepE- Ａ．ニガー An8株のうちの１つを、pyrA+ 含有プラスミドおよび非相同インターフェロン遺伝子を含む発現カセットによるその後の形質転換のための宿主として使用する。
Ａ．ニガー An8のウリジン独立栄養性pepE- 変異体の分生胞子を、十分に胞子形成するまで完全培地中で28℃で４日間増殖させる。２×108 分生子柄を使って、１g/l のアルギニンとウリジンが補足された最少培地 200 ml に接種する。
【０１７０】
180 rpm で28℃で20時間増殖した後、Miracloth を通した濾過により菌糸を収集し、10 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄し、そして20 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2, 0.5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) 中に再懸濁する。この混合物を、十分なプロトプラストが放出されるまで振盪湯浴（30℃、50 rpm）中でインキュベートする（90〜120 分後に顕微鏡で検出される）。プロトプラスト懸濁液を漏斗に付けたガラスウール栓を通して濾過し、菌糸砕片を除去する。室温での軽い遠心（10分、2000 rpm）によりプロトプラストをペレット化し、10 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄する。該プロトプラストを最後に200 〜500 μl の0.8M KCl, 50mM CaCl2中に再懸濁して１×108 ／mlの濃度を与える。
【０１７１】
形質転換のため、前記プロトプラスト懸濁液の200 μl アリコートを、５μg のpAXI (DSM 7017) と50μg のpGIIss-IFN AM119またはpGII-IFN AM119  ＤＮＡ（両プラスミドとも欧州特許出願第0 421 919 号の中に完全に開示されている）、50μl のＰＣＴ（10mM Tris-HCl pH 7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG 6000）と共にインキュベートする。このインキュベーション混合物を氷上に20分間維持し、更に2 mlのＰＣＴを加え、室温で更に５分間インキュベートする。次いで4 mlの0.8M KCl, 50mM CaCl2を加え、最終形質転換溶液の1 mlアリコートを、0.8M KClで安定化された液体最少寒天培地〔最少培地＋1 g/l アルギニン＋10 g/l Bacto-Agar(Difco)〕と混合する。この混合物をすぐに同培地の寒天プレート上に注ぎ、そして30℃でインキュベートする。
【０１７２】
28℃で２〜３日間増殖した後、何百という小さな恐らく不全の形質転換体のバックグラウンド増殖の上に、活発に増殖しそして胞子形成しているコロニーとして、安定な形質転換体が出現する。
形質転換体を取り、インターフェロン発現について分析する。インターフェロン活性は、攻撃ウイルスとしての水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）とヒトCCL-23細胞を使って、Armstrong の方法〔J.A. Armstrong, Appl. Microbiol.  21, 732 (1971)〕に従って測定する。
【０１７３】
形質転換体からの分生胞子を個別に50 ml の予備培養培地〔ペクチン Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l、NH4Cl 2 g/l 、KH2PO4 0.5 g/l、NaCl 0.5 g/l、 MgSO4・7H2O 0.5 g/l、 CaSO4・2H2O 0.5 g/l、pH 7.0、１％アルギニン〕中で予備培養する。この予備培養物を28℃にて250 rpm で72時間インキュベートする。予備培養物の10％を50 ml の本培養培地（大豆粉末 20 g/l 、ペクチン Slow Set 5 g/l 、１％アルギニン）に接種する。該培養物を250 rpm と28℃で72〜96時間増殖させる。
【０１７４】
様々な時点で（20時間毎に）試料を採取し、遠心により細胞をペレット化し、そして凍結乾燥と乾燥粉砕により破壊する。上清と細胞抽出物の両方を上述如くインターフェロン活性について試験する（前掲）。インターフェロン活性の大部分は、pGIIss-IFN AM119を担持する形質転換体では培地中に分泌された状態で認められるが、一方pGII-IFN AM119を担持する形質転換体では主として細胞抽出物中に認められる。
【０１７５】
実施例７：Ａ．ニガーにおけるpepEの過剰発現
実施例 7.1：多重コピーの過剰発現
１μg のpAXIと10μg のpPEPE を用いてＡ．ニガー An8を形質転換せしめてウリジン原栄養体を得る。上述した通りにコロニーを精製してＤＮＡを調製する。pPEPE の BglII−HindIII 断片を使ったサザンブロットは、それらのゲノム中に組み込まれたpPEPE の単一コピーを有している形質転換体と、それらのゲノム中に10近くまたはそれ以上の余分なコピーを有している形質転換体があることを示した。従ってそれらの株はより高いタンパク質分解活性を有し、分裂上安定である。
【０１７６】
実施例 7.2：遺伝子融合体からのpepEの過剰発現
オリゴヌクレオチド１（配列番号３）とオリゴヌクレオチド２（配列番号４）を使ってＰＣＲ技術によりpGW1100 (DSM 5747)からＡ．ニガーのピルビン酸キナーゼプロモーターを増幅せしめる。該プロモーター断片をBamHI とPstIで切断し、アガロースゲルから精製する。
【０１７７】
オリゴヌクレオチド３（配列番号５）とオリゴヌクレオチド４（配列番号６）を使ってＰＣＲ技術によりpPEPE からアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼコード領域を増幅せしめる。該コード領域断片をPstIとXhoIで切断し、アガロースゲルから精製する。
【０１７８】
オリゴヌクレオチド５（配列番号７）とオリゴヌクレオチド６（配列番号８）を使ってＰＣＲ技術によりpGW1100 (DSM 5747)からＡ．ニガーのピルビン酸キナーゼターミネーターを増幅せしめる。該ターミネーター断片をBamHI とPstIで切断し、アガロースゲルから精製する。
pTZ18RをBamHI で切断し、細菌アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸する。
【０１７９】
上記４断片の連結とＥ．コリ中への形質転換により、プラスミドpPKIPEPEが形成する。該プラスミドの正しい構造を制限消化と配列決定により確認する。pPKIPEPEはpTZ18R中に挿入されたBamHI 断片を含み、このBamHI 断片は、Ａ．ニガーのpepE遺伝子のＡＴＧ開始コドンに融合されたＡ．ニガーのピルビン酸キナーゼプロモーターから成り、ピルビン酸キナーゼターミネーターにより終結する。pPKIPEPEをpAXIと一緒に使用して、Ａ．ニガー An8をウリジン原栄養体に同時形質転換させる。
【０１８０】
pki-pepE融合体の存在は、個々の精製形質転換体からＤＮＡを調製し、そしてそれを pkiとpepE由来のプローブを用いるサザン分析に使うことによって確認される。ゲノム中に組み込まれたこの遺伝子融合体の１または複数のコピーを有する株は、Ｃ源としてグルコース上で該細胞を増殖させた時により大きなタンパク質分解活性を生産することが証明される。
【０１８１】
実施例８：他の生物体におけるpepEの発現：酵母中での発現
配列表にそれぞれ配列番号９，10および11のもとに示されたオリゴヌクレオチド７，８および９の３つの合成オリゴヌクレオチドを用いてプラスミドpPEPE を試験管内突然誘発せしめる（３つのイントロンの全てをループアウトする）。これによってプラスミドpPEPEIが生成し、その配列を転写解読枠の全配列決定により確認する。
【０１８２】
pFBY129 （DSM 7016として寄託）をEcoRI で切断し、次いでＳ１ヌクレアーゼで処理して粘着末端を除去する。この平滑末端化した分子を配列 5'CCTGCAGG の過剰の非リン酸化リンカーと再連結し、そしてＥ．コリ中に形質転換せしめる。EcoRI 部位がPstI部位に置換した正しいプラスミドを配列決定により同定し、pFBY129Pと命名する。
【０１８３】
pFBY25（DSM 7020）をSnaBI で切断し、次いでＴ４ポリメラーゼで処理して末端をフィルインする。この平滑末端化した分子を配列 5'GAGATCTC の過剰の非リン酸化リンカーと再連結し、そしてＥ．コリ中に形質転換せしめる。SnaBI 部位がBglII 部位に置換した正しいプラスミドをプラスミドの微量調製物の制限分析により同定し、配列決定により確認する。このプラスミドをpFBY25Bgと命名する。pFBY25BgをBglII で消化し、そして細菌アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸する。
【０１８４】
オリゴヌクレオチド３と４を使ってＰＣＲによりpPEPEIから断片を増幅させる。イントロンを持たない全pepE転写解読枠を含むこの断片をPstIとXhoIで切断し、アガロースゲルから精製する。
オリゴヌクレオチド５と６を使ってＰＣＲによりpGW1100 (DSM 5747)からＡ．ニガーピルビン酸キナーゼ遺伝子のターミネーターを増幅させる。この断片をSalIとBamHI で切断し、アガロースゲルから精製する。
【０１８５】
BamHI とPstIを使ってpFBY129PからGal10 酵母プロモーターを切り取り、該断片をアガロースゲルから精製する。
上記で得られた３つの断片を BglIIで消化され脱リン酸されたpFBY25Bgと一緒に連結せしめ、プラスミドpGALPEPEを作製する。制限分析により正しい構造を確認する。プラスミドpGALPEPEを酵母中に形質転換せしめると、この形質転換体はグルコースによる組換え遺伝子の発現の誘導後にPEPEタンパク質を生産することが証明された。
【０１８６】
微生物の寄託
次の微生物は、ブダペスト条約のもとにDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig に寄託されている：
微生物／プラスミド                寄託日              寄託番号
Ｅ．コリ DH5αF'／pGW1100         1990年１月18日      DSM 5747
Ａ．ニガー An8                    1986年12月11日      DSM 3917
Ｅ．コリ DH5αF'／pFBY129         1992年３月30日      DSM 7016
Ｅ．コリ DH5αF'／pAXI            1992年３月30日      DSM 7017
Ｅ．コリ DH5αF'／pFBY25          1992年３月30日      DSM 7020
Ｅ．コリ DH5αF'／pPEPE           1993年10月７日      DSM 8613
Ｅ．コリ BB4／pNCPEP4             1993年10月７日      DSM 8612
【０１８７】
【配列表】
0003727678.tif 000002
【０１８８】
0003727678.tif 000003
0003727678.tif 000004
【０１８９】
0003727678.tif 000005
【０１９０】
0003727678.tif 000006
0003727678.tif 000007
【０１９１】
0003727678.tif 000008
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【０１９２】
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【０１９３】
0003727678.tif 000011
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
0003727678.tif 000015
【０１９７】
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【０１９８】
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【０１９９】
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【０２００】
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【０２０１】
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【０２０２】
0003727678.tif 000021
【０２０３】
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【０２０４】
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【０２０５】
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【０２０６】
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【０２０７】
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【０２０８】
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【０２０９】
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