(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としての、式
【化７】
0003704471.tif 000022
（式中、Ｒ１はＣ５−１０−アルキルである）で示されるＲＡＲα拮抗薬、その薬学的に許容し得る塩、又は、ベンジルエステル、低級アルキルエステル及び９−フルオレニルメチルエステルからなる群から選択される薬学的に許容し得るその加水分解性エステルを含み、活性成分を薬学的に許容し得る担体と組み合せて用いる、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）媒介性免疫疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項２】
経口的又は局所的投与のための、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
錠剤、カプセル、ピル、サシェ、軟膏、クリーム、ローション、スプレー、吸入用の、鼻エアゾール、及びエアゾール又は乾燥粉末である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
活性成分５〜２００mgを含む、錠剤、カプセル、ピル又はサシェである、請求項１〜３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
体重１ｋｇ当たりの経口１日用量０．０５mg〜２０mgを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項６】
活性成分を０．０１〜５重量％含有する、軟膏、クリーム、ローション、スプレー、吸入用の、鼻エアゾール、及びエアゾール又は乾燥粉末である、請求項１〜３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
活性成分が、請求項１に記載の式Ｉの化合物、及びそのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、ベンジルエステル、低級アルキルエステル及び９−フルオレニルメチルエステルからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性アレルギー性疾患の処置のための、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性アレルギー性疾患が、アレルギー性気管支喘息である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介性アレルギー性疾患のような２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）媒介性免疫疾患の処置のための薬剤製造のための、選択的レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）拮抗薬活性、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）拮抗薬活性又は混合ＲＡＲ−ＲＸＲ拮抗薬活性を有するレチノイドを含むレチノイド拮抗薬の使用、同じく該疾患の処置のための該活性物質の使用に関する。
【０００２】
レチノイドは、ビタミンＡに構造的に関連する化合物の１種であり、天然及び合成化合物を含む。レチノイドは、皮膚疾患及び腫瘍疾患の処置に臨床的に有用であることが知られている。
【０００３】
レチノイドの活性は、ステロイド、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターのスーパーファミリーに属する核レチノイドレセプターＲＡＲα、β、γ及びＲＸＲα、β、γによって媒介されると考えられている（Pfahl et al., Vitamins and Hormones 49, 327-382 (1994)）。レセプター作用薬活性を有するレチノイドはレセプターに結合し、そしてレセプターを活性化するが、レセプター拮抗薬活性を有するレチノイドはレセプターに結合するがそれらを活性化しない。
【０００４】
レチノイドレセプター作用薬活性を有するレチノイドは、皮膚疾患及び腫瘍疾患の処置のモデル系だけでなく、免疫疾患の処置のモデルでも有効であることが実験的に示されている。レチノイドレセプター作用薬活性を有するレチノイドは、アジュバント関節炎（Brinckerhoff et al., Science 221, 756-758(1983)）及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（Massacesi et al., J. Clin. Invest. 88, 1331-1337(1991); Racke et al., J. Immunol.154, 450-458(1995)）、リウマチ性関節炎及び多発性硬化症のモデル動物のそれぞれの処置で有効である。両疾患は、Ｔｈ１媒介性の細胞媒介性免疫疾患に属すると考えられている。
【０００５】
実験的に、レチノイドレセプター拮抗薬活性（レチノイド拮抗薬）を有するレチノイドは、細胞増殖の阻害、細胞分化の誘導、アポトーシスの誘導及び血管形成の阻害のようなレチノイドレセプター作用薬活性（レチノイド作用薬）を有するレチノイドの多くの特性を弱める作用をする（Bollag et al., Int. J. Cancer 70, 470-472(1977)）。レチノイド拮抗薬は、ビタミンＡ過剰症症候群及び奇形発生の兆候や症徴のようなレチノイド作用薬の有毒な副作用をも抑制する（Standeven et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 169-175(1966), Eckhardt and Schmitt, Toxicol. Letters 70, 299-308(1994)）。それゆえ、レチノイド作用薬によって生じる有害事象の防止又は処置で、これらが臨床的に有用であることができる。
【０００６】
レチノイド拮抗薬は、特にビタミンＡ過剰症症候群と呼ばれるレチノイド誘導性の毒性及び副作用の、予防及び治療での臨床的利用が提唱されている。レチノイド拮抗薬は、前新生物又は新生物領域、ガラス体網膜症及び網膜剥離の予防や処置に、レチノイドレセプター作用薬又は他の核レセプター作用薬と組み合わせて利用することも提唱されている。更に、レチノイド拮抗薬は、レチノイドレセプター作用薬に非感受性である特定の新生物の処置のため、それらの抗増殖性効果に基づき、単一薬剤として使用することができる（ＷＯ９７／０９２９７）。
【０００７】
レチノイド拮抗薬が２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）媒介性免疫疾患、例えばイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）媒介アレルギー疾患又はＴｈ２関連サイトカインによって媒介される疾患の処置に有効であることが、今、初めて、全く予想外に、見出された。
【０００８】
本発明の範囲において、用語“レチノイド拮抗薬”とは、レチノイド又はＲＡＲ、ＲＸＲ若しくは混合ＲＡＲ−ＲＸＲ拮抗薬活性に用いる。レセプター中立拮抗薬活性（中立拮抗薬）、レセプター逆作用薬活性（逆作用薬）及び負のホルモン活性（負のホルモン）を含む（Klein et al., J. Biol. Chem. 271, 22692-22696(1966)）。
【０００９】
本発明の範囲において、用語“レチノイド拮抗薬”は、
ａ）下記式
【００１０】
【化１】
0003704471.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ1はＣ5〜10のアルキルであり、そしてＲ2及びＲ3は互いに独立して水素又はフッ素である）
のＲＡＲα拮抗薬（該化合物は、米国特許５３９１７６６及びJ. Med. Chem. 1997, 40, 2445に記載されている）、
ｂ）下記式
【００１２】
【化２】
0003704471.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ4はジアマンチルであり、Ｘは酸素又はＮＨであり、Ｒ5はフェニル又はベンジルであり、そして場合により環Ａ又は環Ｂのいずれかが存在する）
のＲＡＲα、β拮抗薬（該化合物は、Med. Chem. Res. 1991, 1, 220、Biochem. Biophys. Res. Com. 1997, 231, 243、J. Med. Chem. 1994, 37, 1508に記載されている）、
ｃ）下記式
【００１４】
【化３】
0003704471.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立してヒドロキシ、Ｃ1-4のアルコキシ、場合により分岐のＣ1-5のアルキル、又はアダマンチルである）
のＲＡＲβ、γ拮抗薬（該化合物は、J. Med. Chem. 1995, 38, 4993に記載されている）、
ｄ）下記式
【００１６】
【化４】
0003704471.tif 000005
【００１７】
のＲＡＲγ拮抗薬（該化合物は、Cancer Res., 1995, 55, 4446に記載されている）、
ｅ）下記式
【００１８】
【化５】
0003704471.tif 000006
【００１９】
（式中、Ｙは、−ＣＨ2−又はイオウであり、Ｚは、−ＣＨ＝又は窒素であり、そしてＲ8は、水素又はＣ1-4のアルキルである）
のＲＡＲα、β、γ拮抗薬（該化合物は、J. Med. Chem. 1995, 38, 3163及び4764、J. Biol. Chem. 1996, 271, 11897及び22692に記載されている）、
ｆ）下記式
【００２０】
【化６】
0003704471.tif 000007
【００２１】
（式中、付点の結合は任意であり；付点の結合が存在する場合には、Ｒ９はメチルであり、そしてＲ１０は水素であり、付点の結合が存在しない場合には、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってメチレンであり、シス置換されたシクロプロピル環を形成し、そしてＲ１１はＣ１−４のアルコキシである）
のＲＸＲ拮抗薬（該化合物は、欧州特許出願第９７１０７８４３．１、J. Med. Chem. 1996, 39, 3229及びNature, 1996, 383, 450に記載されている）、
を包含する。
【００２２】
本発明によれば、レチノイド拮抗薬、薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得るその加水分解性のエステルの投与が、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）媒介疾患の患者の処置に有効であることが見出されている。レチノイド拮抗薬の投与が、インターロイキン４（ＩＬ−４）及びＩＬ−５のようなＴｈ２関連サイトカインによって媒介される疾患の患者の処置に有効であることも見出されている。
【００２３】
それゆえ、本発明の１つの特徴は、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）媒介性免疫疾患処置の薬剤製造の、レチノイド拮抗薬、薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得るその加水分解性エステルの利用に関する。もう一つの発明の特徴としては、ＩＬ−４及びＩＬ−５のようなＴｈ２関連サイトカイン媒介性疾患処置の薬剤製造の、レチノイド拮抗薬、それらの薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得るそのエステルの利用に関する。
【００２４】
本発明は、レチノイド拮抗薬、薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得るそれらの加水分解性エステルの群から選択された化合物を該ヒト患者へ投与し、該化合物を該疾患の処置に有効量で投与することを特徴とする、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）媒介性免疫疾患を有する患者の処置方法にも関する。用語「処理」又は「処置すること」は、予防的処置及び／又は治療的処置を含む。
【００２５】
ここで用いる用語“２型ヘルパーＴ細胞媒介性免疫疾患”は、アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞の、発生及び活性化によるイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）及びマスト細胞に関わる疾患に関し、またアレルギー疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、他のアトピーに関連する皮膚疾患、アレルギー性鼻炎又は枯草熱、急性又は慢性気管支炎を伴う又は伴わない、軽症又は重症の、急性又は慢性アレルギー性気管支喘息を包含する。イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）の高い血清中濃度及び好酸球過多症をこれらの疾患に加えることができる。レチノイド拮抗薬は、Ｔｈ２細胞活性の増加及びＩＬ−４やＩＬ−５のような関連サイトカインの増加した分泌に関連する全てのこれらの免疫疾患に有効である。レチノイド拮抗薬の治療的効果は、Ｔｈ２細胞活性の低下、ＩＬ−４及びＩＬ−５のような関連サイトカイン分泌の減少、及び／又は活性化骨髄単球細胞によるＩＬ−１２産生亢進によるＴｈ１細胞活性の増大の結果である（S. Romagnani, Ann. Rev. Immunol. 12, 227-257(1994)、Romagnani, ed., Th1 and Th2 Cells in Health and Disease. Chem. Immunol.,Karger, Basel, 63, pp.187-203(1996)、Abbas et al., Nature 383, 787-793(1996)）。
【００２６】
本発明に記載のレチノイド拮抗薬の有効性は、Ｔｈ１細胞活性の上方制御又はＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＴＮＦのようなサイトカインの産生の誘導／刺激、及び／又はＴｈ２細胞活性の下方制御又はＩＬ−４及びＩＬ−５のようなサイトカインの産生の阻害によって示すことができる。
【００２７】
レチノイド拮抗薬は、アレルギー性気管支喘息の処置に有効である。喘息疾患に関連する炎症の特徴は、活性化好酸球の存在、気道の感受性増加（応答性亢進）、浮腫、粘液過分泌及び咳である。この炎症の進行は、Ｔｈ２タイプ細胞の、発生及び活性化によって媒介される。Ｔｈ１タイプの応答を促進し、その結果Ｔｈ２タイプの応答を抑制するレチノイド拮抗薬の能力は、アレルギー性の肺炎又は喘息でのこれらの化合物の有効性の基礎をなす機序であると考えられている。レチノイド拮抗薬は、アレルギー性の肺炎又は喘息の、徴候及び症候の抑制でＴｈ１タイプ細胞に作用している（Gavett et al., J. Exp. Med. 182, 1527-1536(1995)、Kips et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 153, 535-539(1996)）。これらは、抗原又はアレルゲン（例えば、卵白アルブミン）で刺激した、及びチャレンジした動物で活動的である。エアゾールによって全身又は局所のいずれかで投与されたレチノイド拮抗薬は、気管支収縮、気道浮腫及び粘液過分泌、気道炎症、気管支肺胞組織洗浄及び気管支肺胞洗浄それぞれの、好酸球と好中球の蓄積の軽減、抑制又は逆進、同じく非特異的刺激に対する気道応答性亢進に効果的である。
【００２８】
処置のために、活性化合物、例えば、レチノイド拮抗薬、薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得るその加水分解性エステルを、全身又は局所に投与することができる。好ましくは、該化合物を、該活性化合物及び、薬学的に許容し得る担体又は該化合物に適合性の希釈剤を含有する組成物として投与する。該組成物の製造においては、いかなる従来の薬学的に許容し得る担体も利用することができる。薬剤を経口的に投与する場合は、通常一定の間隔で、好都合には、食事時間又は一日一回投与する。本化合物を、経口的に投与した場合又は局所的に投与した場合には、副作用を示さない用量又は軽度の副作用を示す用量で効果的なことが証明されている。それゆえ、活性化合物の経口投与又は局所投与が、通常は好ましい。皮膚、口、鼻、咽頭、気管支等の疾患処置のため、局所投与と組み合わせた経口投与もまた有利に用いることができる。
【００２９】
２型ヘルパーＴ細胞媒介性免疫疾患の処置において、経口的に投与した場合のレチノイド拮抗薬は、ビタミンＡ過剰症の毒性症候群、例えば、粘膜皮膚症状、筋骨格症状、神経性症状及び、トランスアミナーゼ、中性脂肪やコレステロールの上昇のような有害事象を誘発しない。更に、レチノイド拮抗薬は、皮膚疾患及び腫瘍疾患の処置に臨床的に有用なレセプター作用薬レチノイド、例えば、全トランスレチノイン酸（トレチノイン）、１３−シスレチノイン酸（イソトレチノイン）、エトレチナート及びアシトレチンとは対照的に、催奇形性を示さないか、又はより低い催奇形性を示す。
【００３０】
２型ヘルパーＴ細胞媒介性疾患の処置において、レチノイド拮抗薬、薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得るその加水分解性エステルを、単独又は他の処置、例えば、局所性又は全身性の副腎皮質ステイロイド剤、抗ヒスタミン剤及び気管支拡張剤他のような薬学的に活性な物質と組み合わせて用いることができる。他の物質と組み合わせて用いる場合は、レチノイド拮抗薬及び該他の物質を別々に投与するか、又は一つの薬学的組成物中へ有効量を組み込んで投与することができる。
【００３１】
本発明の範囲内で、“薬学的に許容し得る塩”は、レチノイド拮抗薬の技術分野で化学的に許容し得るいかなる塩及び薬学的に許容し得る製法でヒト患者に適用し得るいかなる塩をも包含する。いかなる上記のレチノイド拮抗薬の従来の薬学的に許容し得る塩も利用することができる。利用することができる従来の塩には、塩基塩、例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩又はマグネシウム塩のようなアルカリ金属塩及びアンモニウム又はアルカリアンモニウム塩が含まれる。
【００３２】
本発明によれば、レチノイド拮抗薬は、その薬学的に許容し得る加水分解性エステルの形態で投与することもできる。いかなる薬学的に許容し得る加水分解性エステルも、組成物及び本発明の方法で用いることができる。例えば、好ましいエステルは、芳香族エステル、例えば、ベンジル部分が低級アルキル、ハロ、ニトロ、チオで置換された若しくは置換されていない、又はチオで置換されたベンジルエステル、あるいは低級アルキルエステル、例えばエチル、t−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチルエステル、又は９−フルオレニルメチルエステルである。
【００３３】
本発明の範囲内で、用語“アルキル”とは直鎖、特にそれらが１〜１２個の炭素原子、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、t−ブチル、デシル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含有している、分岐又は環状アルキル残基を意味する。用語“低級アルキル”とは、１〜７個の炭素原子を含有しているアルキル基を意味する。
【００３４】
上記のレチノイド拮抗薬、塩及びそのエステルは、薬学的に許容し得る経口的又は局所的形態で特に有用である。これらの薬学的組成物は、適合する薬学的に許容し得る担体材料と一緒に該活性化合物を含有する。いかなる従来の担体材料も利用することができる。担体材料は、経口投与に適した有機的に不活性又は無機的に不活性な担体材料であることができる。適切な担体は、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリン等を包含する。更に、薬学的に活性な製剤は、他の薬学的に活性な薬剤を含有することができる。更に、香料、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等を、許容された薬学的配合実務にしたがって添加することができる。
【００３５】
薬学的製剤は、特に（ａ）錠剤、カプセル（例えば、ハード又はソフトゼラチンカプセル）、ピル、サシェ、粉末、顆粒等のような経口投与のための固体形態、（ｂ）溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、微粉末、スプレー、エアゾール等の局所投与のための製剤を含むいかなる従来の形態でも構成することができる。
【００３６】
皮膚又は粘膜への局所投与のため、上記誘導薬は、好ましくは軟膏、チンキ、クリーム、ゲル、溶液、ローション、吸入用のスプレー、エアゾール及び乾燥粉末、懸濁液、シャンプー、毛髪用石鹸、香水等として製造する。実際、いかなる従来の組成物も本発明で利用することができる。本発明の薬剤を含む組成物に適用する好ましい方法には、例えば軟膏、ゲル、クリーム、ローション、吸入用のスプレー、エアゾール又は乾燥粉末がある。皮膚への局所投与用の薬学的製剤は、上記活性成分に、無毒の、治療的に不活性な、該製剤に従来用いられる固体又は液体の担体を混合することによって製造することができる。これらの製剤は、従来、組成物の全重量を基準として、重量で０．０１〜５．０％、好ましくは重量で０．１〜１．０％の活性成分を含んでいる。
【００３７】
上記の局所性製剤の製造において、局所性製剤の薬学的調剤の従来技術である、保存剤、増粘剤、香水等の添加剤を用いることができる。更に、従来の抗酸化剤又は従来の抗酸化剤の混合物を、上記活性剤を含む局所性製剤に組み入れることができる。これらの製剤で利用することができる従来の抗酸化剤の中には、Ｎ−メチル−α−トコフェロールアミン、トコフェロール、ブチル化ヒドロキアニソール、ブチル化ヒドロキトルエン、エトキシキン等が含まれる。本発明によって用いられる活性薬剤を含むクリームベースの薬学的剤形は、脂肪酸アルコール、半固形石油炭化水素、エチレングリコール及び乳化剤を含む水性乳濁液を構成する。
【００３８】
本発明に従った活性剤を含む軟膏剤形は、活性物質の溶媒分散と半固形石油炭化水素の混合物を含む。本発明で用いる活性成分を含むクリーム組成物は、好ましくは、湿潤剤、粘性安定剤及び水の水相、脂肪酸アルコール、半固形石油炭化水素及び乳化剤の油相、及び水性安定剤−緩衝液中に分散させた活性剤を含む相から形成された乳濁液を含む。安定剤は局所性製剤に加えることができる。油相では、脂肪酸アルコール成分が安定剤として機能する。これらの脂肪酸アルコール成分は、少なくとも１４個の炭素原子を含む長鎖飽和脂肪酸の還元によって得られる。また、毛髪用局所性製剤に一般に利用される従来の香水及びローションを、本発明にしたがって利用することができる。更に、所望ならば、従来の乳化剤を本発明の局所性製剤に利用することができる。
【００３９】
アレルギー性鼻炎及びアレルギー性気管支喘息の局所的処置のため、経鼻および吸入エアゾールを用いる。該エアゾールの剤形は、Drugs and Pharmaceutical Sciences, Marcel Dekker, New York, 1996, Vol. 72, pp. 547-574に記載されている。更に、活性化合物を乾燥粉末吸入によって送達することができる。該剤形及び手段はPharmaceutical Technology, June 1997, pp.117-125に記載されている。
【００４０】
好ましい経口投与剤形は、錠剤、ピル、サシェ、又はハード若しくはソフトのゼラチン、メチルセルロース若しくは消化管で容易に溶解する他の適切な材料のカプセルを含む。各錠剤、ピル、サシェ又はカプセルは、好ましくは約５〜約２００mg、より好ましくは約２０〜１００mgの活性成分を含むことができる。本発明にしたがって意図される経口用量は、医師の処方によって決められるので、個々の患者の要件によって異なる。しかし、一般に、患者の体重１kg当たり０．０５〜２０mg、好ましくは０．１〜７mg、最も好ましくは約０．３〜１．５mgの一日用量が用いられる。この投与量を、患者の要件に従い医師によって決められる、いかなる投与計画によっても投与することもできる。
【００４１】
処置の用量は、一般的には投与経路、年齢、体重及び個々の疾患状態によって決められる。適切な剤形は、既知技術又はそれ自体既知の方法で容易に得ることができる。本発明の範囲内で特に適切であるか、又は上記教示にしたがって容易に適合させることができるローション、ゲル、クリーム、吸入のためのスプレー、エアゾール及び乾燥粉末、ハード又はソフトゼラチンカプセル、錠剤及びサシェは、従来技術である。
【００４２】
実験方法
Ｉ．レチノイド拮抗薬によるＩＬ−１２誘導の生体外（in vitro）検定
ＴＨＰ−１細胞をAmerican Tissue Culture Collectionより入手し、完全培地中で培養した。ＩＬ−１２産生の検定のため、１．２５×１０6細胞／mLのＴＨＰ−１細胞を、S. aureus Cowan株（ＳＡＣ）（１／１０００）及びヒト組換えインターフェロンγ（ｈｕＩＦＮγ）（１０００Ｕ／mL）（Ma et al., J. Exp. Med. 183, 147-157(1996)）で刺激した。別の方法として、０．５×１０6個のヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（培養液１mL、４８ウェルプレート）を、ｈｕＩＦＮγ（１０００Ｕ／mL）で３７℃において１６時間初回刺激し、次いでＳＡＣ（１／１０００）で刺激した。４８時間後に上清を回収し、そして試験まで−２０℃で凍結した（Panina-Bordignon et al., J. Clin.. Invest. 100, 1513-1519(1997)）。
【００４３】
ＩＬ−１２産生を、Zhang et al., J. Clin. Invest. 93, 1733-1739(1994)に記載されているように、コーティングバッファー中の２０Ｃ２抗体（ラット抗ヒトＩＬ−１２ヘテロ２量体ｐ４０−ｐ３５）２．５μg／mL及びアッセイバッファー中の２５０ng／mLペルオキシダーゼ結合４Ｄ６抗体（ラット抗ヒトＩＬ−１２）を用いる特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。アッセイバッファーで希釈した標準物質（組換えヒトＩＬ−１２、８００pg／mL〜６pg／mL）及び検体（１００μL）をそれぞれ２つずつのウェルに加えた。吸光度を４５０〜６５０nmで測定した。検体の未知のＩＬ−１２濃度を、対応する標準曲線から読み取り、対応する希釈計数を乗じた。最大ＩＬ−１２産生は、２００と４００pg／mLの間で変化した。
【００４４】
凍結乾燥レチノイド拮抗薬を、氷上、黄色灯下、ＤＭＳＯで２mMの濃度に希釈した。完全ＲＰＭＩ培地で一連の希釈液（１μM〜１pM）を調製した。各希釈液の１０μLを培養１mLに加えた。
【００４５】
実験結果は、試験したレチノイド拮抗薬がＩＬ−１２産生に影響することを示した。特に、試験したレチノイド拮抗薬は、活性化ヒト単球によるＩＬ−１２産生を刺激した、表１及び表２を参照せよ。
【００４６】
【表１】
0003704471.tif 000008
【００４７】
【表２】
0003704471.tif 000009
【００４８】
化合物Ａ：ｐ−〔（Ｅ）−２−〔３′，４′−ジヒドロ−４′，４′−ジメチル−７′−（ヘプチルオキシ）−２′Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６′−イル〕プロペニル〕安息香酸１′，１′−ジオキシド
化合物Ｂ：４−（７，７，１０，１０−テトラメチル−１−ピリジン−３−イルメチル−４，５，７，８，９，１０−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフト〔２，３−ｇ〕インドール−３−イル）安息香酸
化合物Ｃ：（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−〔２−ブトキシ−３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）フェニル〕−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸
【００４９】
II．レチノイド拮抗薬によるヒト未分化Ｔ細胞の２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）への分化の阻害の試験管内（in vitro）検定
臍帯血からの未分化Ｔ細胞を単離し、Panina-Bordignon et al. J. Clin. Invest. 100. 1513-1519 (1997)に記載されているように処理した。簡単にいえば、臍帯血由来単核球を、抗ＣＤ４５ＲＡ及び抗ＣＤ４モノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。２０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇをコートした磁気ビーズと一緒にインキュベートした。陽性細胞を分離し、１mMのｐ−〔（Ｅ）−２−〔３′，４′−ジヒドロ−４′，４′−ジメチル−７′−（ヘプチルオキシ）−２′Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６′−イル〕プロペニル〕安息香酸１′，１′−ジオキシド（化合物Ａ）又は（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−〔２−ブトキシ−３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）フェニル〕−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸（化合物Ｃ）の、存在下又は不在化で、自家性の付着細胞、ＰＨＡ及びＩＬ−４と一緒に２４ウェルプレートに１×１０6細胞／mLの密度で播種し、５日間培養した。それから、細胞を洗浄し、ＩＬ−２（１００Ｕ／mL）存在下の培養液に戻した。１０日後、細胞を回収し、ＰＭＡ（５０ng／mL）及びイオノマイシン（１μg／mL）で４時間、再び刺激した。最後の２時間、ブレフェルジン（Brefeldin）Ａ（１０μg/mL）を加えた。それから、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、サポニンで透過させた。固定した細胞を、ＦＩＴＣ抗ＩＦＮγ及びＰＥ抗ＩＬ−４ｍＡｂｓで染色し、サイトフローメトリー解析に付した。
【００５０】
実験結果は、試験したレチノイド拮抗薬が、未分化Ｔ細胞のＩＬ−４分泌Ｔｈ２細胞への分化を減退させたことを示した（表３）。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
III．アレルゲン誘導性の、炎症及び応答亢進のモデルマウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８−９週齢）を、０日目に、卵白アルブミン（ＯＡ）に感作させ、次いで１４日目に、滅菌生理食塩液０．２mL中のＯＡ１０μg＋Ａｌ（ＯＨ)3（ゲルサスペンション）１mgの腹腔内注射によって感作させた。２１日目に、マウスを５．０％ＯＡエアゾールで１８分間チャレンジさせた。エアゾールは、排気口を動物を収容する小さなプレキシグラスチャンバーと接続してある、De Vilbiss Ultra-Neb 90 超音波噴霧器で発生させた。このマウスに、ＲＸＲ拮抗薬化合物Ｃ（１０及び３０mg/kg、腹腔内投与）を３日間毎日、４８時間、２４時間及びＯＡチャレンジ直前に投与した。動物は２１日目で用いた。
【００５３】
気道炎症細胞の蓄積
２４日目、ＯＡエアゾールでのチャレンジ３日後に、動物をウレタン（２．４g／kg）で麻酔し、２３ゲージのカテーテルで気管切開した。肺を一定量のＣａ++及びＭｇ++含まない滅菌ハンクス平衡塩溶液（２×１mL）で洗浄した。３０秒後、洗浄液を緩やかな吸引によって回収し、各動物毎にプールした。検体を、５℃で１５分間、２０００rpmで遠心した。赤血球を、得られたペレットから蒸留水０．５mLで溶解し、ペレットに残っている細胞を、ＨＢＳＳ５mLに戻した。検体を、５℃で１５分間、２０００rpmで２度目の遠心をした。得られたペレットをＨＢＳＳ１mLに懸濁した。全細胞数を、一定量の細胞懸濁液から血球計算板を用いて測定した。細胞標品のため、細胞を細胞遠心した（cytocentrifuged）スライド上に固定し、改変ライト染色液で染色した。細胞分類のため標準的な形態判定基準を用いて、少なくとも３００細胞について鑑別計算を実施した。
【００５４】
実験の結果は、試験したレチノイド拮抗薬が、気道炎症細胞のアレルゲン誘導性蓄積を阻害することを示した（表４）。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
気道応答亢進
ＯＡエアゾールでのチャレンジ３日後（２４日目）、動物をペントバルビタールナトリウム（１００mg／kg、腹腔内投与）で麻酔し、気管切開した（ＰＥ−１９０）。頚静脈に、静脈内薬物送達のためのシラスチックチュービングを挿管した。動物を呼吸流量計と一体型の全身体積記録計内に置き、臭化バンクロニウム（０．１mg／kg、静注）処置に続いて直ちに機械的に呼吸させた（Ｖf＝１５０／min.、Ｖt＝０．３mL、Model 683, Harvard Apparatus, S. Natic, MA）。１回呼吸量を、圧力差変換器（Validyne DP 103-08, Northridge, CA）を用いる呼吸流量信号の集積から得た。肺圧差を、気管内圧と胸膜内圧（肋間腔内へ挿入したカニューレから得られた）との間の差として圧力差変換機（Validine DP 45-30, Northridge, CA）を用いて測定した。メタコリンの増量（３０、１００、３００、１０００μg／kg、静注）に対する肺抵抗力（ｃｍＨ2Ｏ／ml／ｓ）の変化を、Modular Instrument Signal Processing System（Malvern, PA）を用いる肺圧差、一回呼吸量及び呼吸流量の測定値から算出した。
【００５７】
実験の結果は、レチノイド拮抗薬がアレルギー性気管炎症、及びアレルギー性気管支喘息のようなアレルギー性気管疾患に特有の抗原誘発気管支収縮を抑制又は逆転することができることを示した。
【００５８】
剤形の例：カプセル、錠剤、サシェ、ローション、ゲル、クリーム、エアゾール及び吸入用乾燥粉末。下記の実施例での活性組成物は、
ｐ−〔（Ｅ）−２−〔３′，４′−ジヒドロ−４′，４′−ジメチル−７′（ヘプチルオキシ）−２′Ｈ−１−ベンゾチオ−ピラン−６′−イル〕プロペニル〕安息香酸１，１′−ジオキシド、又は
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−〔２−ブトキシ−３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）フェニル〕−３−メチル−２，４，６−オクタトリエン酸
である。
【００５９】
【実施例】
実施例１
【００６０】
【表５】
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【００６１】
*  又は他の界面活性剤
**  又は他の錯化剤、例えばＥＤＴＡ
***  又は他のアルコール、例えばエタノール
【００６２】
実施例２
【００６３】
【表６】
0003704471.tif 000013
【００６４】
*  又は他の界面活性剤
**  又は他の錯化剤、例えばＥＤＴＡ
***  又は他のアルコール、例えばエタノール
****  ヒドロキシプロピルメチルセルロース又は他のポリマー、例えば、中和されたカルボマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム
*****  保存剤、例えば、パラベンエステル（メチル、エチル、プロピル、ブチル）、ソルビン酸、安息香酸
【００６５】
実施例３
【００６６】
【表７】
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【００６７】
*  例えば、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、カプリル酸／カプリン酸／リノール酸トリグリセリド、天然グリセリド、同じく、例えば、プロピレングリコール、ジカプリラート／ジカプラート及びステアリル、ステアラート、オレイル、オレアート、イソプロピルミリスタートのようなワックス
**  Ceteareth 5-30、又は他のPolysorbase20-80、脂肪酸のソルビタンエステル、ＰＥＧの脂肪酸エステルのような乳化剤
***  保存剤、例えば、（メチル、エチル、プロピル、ブチル）パラベンエステル、ソルビン酸、安息香酸
【００６８】
実施例４
【００６９】
【表８】
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【００７０】
*  天然植物油、例えば、大豆油、ピーナツ油、及び人工グリセリド
**  天然、及び人工ワックス又は部分的水和脂肪の組成物
【００７１】
【表９】
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【００７２】
実施例５
【００７３】
【表１０】
0003704471.tif 000017
【００７４】
製法
活性化合物を、ゼラチン、マルトデキストリン、ｄｌ−α−トコフェロール及びアスコルビン酸ナトリウム溶液中で湿式粉砕した。
湿式粉砕した懸濁液をスプレードライした。
スプレードライした粉末を微結晶セルロース及びステアリン酸マグネシウムと混合した。
この混合物の２６０mg毎を適切なサイズ及び色のハードゼラチンカプセルに充填した。
【００７５】
実施例６
【００７６】
【表１１】
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【００７７】
製法：
本化合物を無水ラクトース及び微結晶セルロースと混合した。
混合物を、ポリビニルピロリドン、ｄｌ−α−トコフェロール及びアスコルビン酸ナトリウムの溶液／分散液と水中で顆粒化した。
顆粒材料をマグネシウムスレアラートと混合し、後に重量２５０mgを核としてプレスした。
核を上記組成物の溶液／懸濁液でフィルムコートした。
【００７８】
実施例７
【００７９】
【表１２】
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【００８０】
実施例８
【００８１】
【表１３】
0003704471.tif 000020
【００８２】
実施例９
【００８３】
【表１４】
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