(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  先ず、血液凝固防止剤を入れた採血管を用いて所定量の静脈血を採血し、所定時間遠心することによって血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す工程と、
（ｂ）  次に、そのようにして取り出された血球部分に、所定濃度の分離促進剤を加え、さらに所定時間遠心することによって、白血球、血小板等のバフィーコートを除去する工程と、
（ｃ）  次に、該白血球、血小板等のバフィーコートが除去された赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに所定時間遠心することによって洗浄する工程と、
（ｄ）  次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、同食塩水中の赤血球数が４００万／μｌ前後の赤血球浮遊液を作る工程と、
（ｅ）  次に、該赤血球浮遊液を所定時間遠心することによって、その上澄み分（ＰＢＳ）を除去する工程と、
（ｆ）  次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として所定濃度の食塩水を加え、ほぼ人の体温と同じ温度の下で、所定時間インキュベーションすることによって、赤血球細胞内の成分を浸透圧により浮遊液側に滲み出させる工程と、
（ｇ）  次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに所定時間遠心して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出た上澄み成分を採取する工程と、
（ｈ）  次に、該上澄み成分を生化学自動分析装置にかけて、同上澄み成分中のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度を測定する工程と、
（ｉ）  次に、該測定した上記上澄み成分中のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度に基づいて、所定の計算方法により最終的に赤血球内のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度を求める工程と、
からなる血液の検査方法。
【請求項２】
（ａ）  先ず、血液凝固防止剤を入れた採血管を用いて所定量の静脈血を採血し、所定時間遠心することによって血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す工程と、
（ｂ）  次に、そのようにして取り出された血球部分に、所定濃度の分離促進剤を加え、さらに所定時間遠心することによって、白血球、血小板等のバフィーコートを除去する工程と、
（ｃ）  次に、該白血球、血小板等のバフィーコートが除去された赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに所定時間遠心することによって洗浄する工程と、
（ｄ）  次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、ヘマトクリット値が５０％の赤血球浮遊液を作る工程と、
（ｅ）  次に、該赤血球浮遊液を所定時間遠心することによって、その上澄み分（ＰＢＳ）を除去する工程と、
（ｆ）  次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として所定濃度の食塩水を加え、ほぼ人の体温と同じ温度の下で、所定時間インキュベーションすることによって、赤血球細胞内の成分を浸透圧により浮遊液側に滲み出させる工程と、
（ｇ）  次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに所定時間遠心して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出た上澄み成分を採取する工程と、
（ｈ）  次に、該上澄み成分を酸化還元電位計にかけて、同成分中の酸化還元電位を測定する工程と、
（ｉ）  次に、同一被験者から別途採取した血清を用いて検量線を作成し、上記実測した上澄み成分中の酸化還元電位から、最終的に赤血球細胞内の酸化還元電位を求める工程と、
からなる血液の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本願発明は、血液の所定細胞内成分を簡便に取り出し、生化学的に検査することにより、早期に正確な病態把握を行うことができるようにした血液の検査方法に関するものである。
【従来の技術】
【０００３】
従来から、血液の液体部分である血漿中の成分を取り出して生化学的に分析する血液検査は、患者の病態を把握する有効な検体検査方法の一つとして、多くの医療現場で実施されている。
【０００４】
このような血液検査によって把握しようとする病態には種々のものがあるが、例えば糖尿病の場合を例にとると、患者の空腹時および食事後における血液中（血漿中）のブドウ糖の濃度が測定される。そして、同測定されたブドウ糖の濃度、すなわち血糖値が所定値以上に高いと、糖尿病ないし糖尿病が進行している可能性が高いと判定される。また、例えば慢性呼吸器疾患や心不全、腎不全の場合だと、血液中（血漿中）の乳酸濃度が測定され、同測定された乳酸濃度が所定値以上に高いと、慢性呼吸器疾患や心不全、腎不全が進行している可能性が高いと判定される。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
周知のように人間の細胞は、ブドウ糖を主たるエネルギー源としており、夜間も脳、神経、血球、筋肉など、全身の細胞が糖を利用している。一方、肝臓は脂肪やアミノ酸から糖を作って放出している。通常は肝臓の糖放出率と全身細胞の糖利用率が一致しているから、血糖値は一定値（１０９ｍｇ／ｄＬ）以下にある。
【０００６】
そして、そのように全身細胞にブドウ糖を取り込ませ、有効に利用させているのがインスリンというホルモンである。食事を摂ると、糖質はブドウ糖となって小腸から急速に吸収され、血液中に入って全身をめぐる。そして、それにより血糖値が上昇すると、膵臓から瞬時に十分な量のインスリンが分泌される。すると、肝臓は糖の放出を停止する。一方、全身の細胞が糖を取り込むようになり、上記食事後上昇した血糖値は速やかに食事前の値に戻る。これを繰り返しているのが、健康な人の血糖値の動きである。
【０００７】
しかし、食事後血糖値が上昇したのに、「インスリンがゆっくりとしか分泌されないし、分泌量も少ない」という体質の人に、さらに運動不足や過食などが加わってインスリンの働きが低下してくると、上記ブドウ糖が細胞内に取り込まれにくくなって、血液中に過剰なブドウ糖がだぶついてくる。そして、食事後相当な時間が経過しても血糖値が低下しなくなる。
【０００８】
このような状況が「高血糖」状態であり、上記従来一般の生化学的な血液検査方法では、該高血糖状態を把握しようとする場合、上述のように空腹時の血糖値（ＦＢＳ）と食事後の血糖値との両方の測定が血液中の血漿成分を検体として行われる。その結果、例えば空腹時の血漿中の血糖値が１４０ｍｇ／ｄＬ以上であったり、食事後の同血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上あると、一般に糖尿病（２型糖尿病）と診断される。そして、そのような高血糖状態が長期間持続すると、網膜症や腎症などの糖尿病に特有の血管障害が発症してくる。そして、同血糖値が高ければ高いほど、またその時間が長ければ長いほど、網膜症や腎症が悪化する。
【０００９】
ところが、最近では、上記のような従来一般の生化学的な血液検査、すなわち血漿成分中の血糖値検査では、未だ糖尿病と診断されるほどには血糖値が高くない患者に、心筋梗塞が発症するケースが多くなっている。すなわち、糖尿病予備軍といわれる早期、軽症の糖尿病患者にも動脈硬化症が発症し、進展することが確認されてきている。
【００１０】
例えば食事前の血糖値は正常域にあり、健常である。しかし、毎食事後に血糖値が異常に高くなるといったケースが見られる（いわゆる軽症２型糖尿病）。このように食事前の血糖値が正常域にあっても、食事後に異常に血糖値が高くなると、インスリンが当該血糖値の上昇に遅れて、しかし高血糖に刺激されて過剰に分泌される。もちろん運動習慣を有する患者の場合には、上記膵臓から分泌されるインスリンによってブドウ糖は筋に取り込まれるが、運動不足の患者の場合には脂肪細胞に取り込まれる。脂肪細胞に取り込まれた糖は脂肪に変わり、肥満が促進され、高脂血症が引き起こされる。そして、高インスリン血症の持続は、高血圧症をもたらす。
【００１１】
この結果、上述のインスリン分泌パターンが遅延型という体質を有する人の場合、「軽い糖尿病（軽症２型）」、「僅かな肥満」、「軽度高脂血症」、「軽い高血圧」といった悪条件が揃うことにより、動脈硬化症が進行しやすいことが頸動脈壁のエコー検査等により証明されている。事実、最近の日本の研究で、糖尿病と診断されたばかりの住民を１０年間観察すると、１０人に１人が心筋梗塞を、もう１人が脳梗塞を発症することも報告されている。したがって、肉親に糖尿病の人がいたら、糖尿病と診断される前に過食や運動不足に留意すべきである、と言われる位、糖尿病に関して事前の認識、早期の病態把握の必要性が要請されている。
【００１２】
しかし、上記血液の血漿成分を検体とする従来の生化学的な検査方法では、血漿中のブドウ糖濃度を先行的に支配する血液細胞である赤血球内の成分状態の変化（ブドウ糖濃度の上昇、代謝状態等）そのものの分析を行うことができず、同成分が血液の細胞である赤血球中から外部に滲み出し血漿中に表象して初めて分析判定されるにすぎないから、どうしても判定が遅くなり、上記のような早期病態把握の要請には、必ずしも有効に応えられていない問題がある。
【００１３】
そのことが、上述のような低血糖診断を受けながらも、高脂血症、心不全等の症例を招いていると考えられる。したがって、本来早期の病態把握を可能とするためには、血液の細胞成分であり、血漿中に取り込まれたブドウ糖を解糖分解する代謝機能を有し、血漿中の血糖値を上流側で先行的に支配する赤血球細胞内のブドウ糖濃度（血糖値状態）を知ることが肝要である。
【００１４】
また、一方上記のような糖尿病その他の病態にある患者の血液中の酸化還元電位（ＯＲＰ）を測定すると、病態時は酸化還元電位が酸化状態にあり、他方健康時には還元状態にあることが見出される。したがって、これらのことも上記早期の病態把握を可能にする有益な判定パラメータになるが、この場合にも当該酸化還元電位の決定に上記赤血球中の乳酸濃度が大きく影響しており、上記の場合と同様に、同赤血球内の酸化還元電位とともに糖質代謝物としてのピルビン酸濃度や乳酸濃度を知ることが肝要である。
【００１５】
しかし、これまで臨床的に行われている赤血球の検査には、赤血球数やヘマトクリット値、ヘモグロビン量の測定、網状赤血球、異常ヘモグロビンの検査などがあるだけで、赤血球中の細胞内液成分を取り出して生化学的に簡便に検査する血液の検査方法は、未だ提案されていないのが実情である。
【００１６】
本願発明は、このような事実に着目し、特に血液の赤血球細胞内のブドウ糖濃度や乳酸濃度、ピルビン酸濃度、さらには酸化還元電位等を測定し、それらの各々により又はそれらの各々を総合して適切に病態把握を行うようにすることにより、一般に血液の生化学検査が有効とされている各種の病態について、早期軽症の段階から正確かつ的確な病態把握を行えるようにした血液の検査方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本願各発明は、上記の目的を達成するために、次のような課題解決手段を備えて構成されている。
【００１８】
（１）  請求項１の発明
この発明の血液の検査方法は、次のａ〜ｉの工程により構成されている。
【００１９】
（ａ）  先ず、血液凝固防止剤を入れた採血管を用いて所定量の静脈血を採血し、所定時間遠心することによって血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す。
【００２０】
（ｂ）  次に、そのようにして取り出された血球部分に、所定濃度の分離促進剤を加え、さらに所定時間遠心することによって、白血球、血小板等のバフィーコートを除去する。
【００２１】
（ｃ）  次に、該白血球、血小板等のバフィーコートが除去された赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに所定時間遠心することによって洗浄する。
【００２２】
（ｄ）  次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、同食塩水中の赤血球数が４００万／μｌ前後の赤血球浮遊液を作る。
【００２３】
（ｅ）  次に、該赤血球浮遊液を所定時間遠心することによって、その上澄み分（ＰＢＳ）を除去する。
【００２４】
（ｆ）  次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として所定濃度の食塩水を加え、ほぼ人の体温と同じ温度の下で、所定時間インキュベーションすることによって、赤血球細胞内の成分を浸透圧により浮遊液側に滲み出させる。
【００２５】
（ｇ）  次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに所定時間遠心して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出た上澄み成分を採取する。
【００２６】
（ｈ）  次に、該上澄み成分を生化学自動分析装置にかけて、同上澄み成分中のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度を測定する。
【００２７】
（ｉ）  次に、該測定した上記上澄み成分中のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度に基づいて、所定の計算方法により最終的に赤血球内のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度を求める。
【００２８】
このような構成によれば、従来のような血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、同血漿中の成分状態を先行的に支配する血液の細胞である赤血球内の成分から、血糖値又はピルビン酸値、乳酸値を測定することができるようになり、時間的に先行し未だ血漿側には表われていない赤血球細胞内の血糖値の上昇やピルビン酸値、乳酸値の変化を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００２９】
そのため、該検査方法によれば、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【００３０】
（２）  請求項２の発明
この発明の血液の検査方法は、次のａ〜ｉの工程により構成されている。
【００３１】
（ａ）  先ず、血液凝固防止剤を入れた採血管を用いて所定量の静脈血を採血し、所定時間遠心することによって血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す。
【００３２】
（ｂ）  次に、そのようにして取り出された血球部分に、所定濃度の分離促進剤を加え、さらに所定時間遠心することによって、白血球、血小板等のバフィーコートを除去する。
【００３３】
（ｃ）  次に、該白血球、血小板等のバフィーコートが除去された赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに所定時間遠心することによって洗浄する。
【００３４】
（ｄ）  次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、ヘマトクリット値が５０％の赤血球浮遊液を作る。
【００３５】
（ｅ）  次に、該赤血球浮遊液を所定時間遠心することによって、その上澄み分（ＰＢＳ）を除去する。
【００３６】
（ｆ）  次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として所定濃度の食塩水を加え、ほぼ人の体温と同じ温度の下で、所定時間インキュベーションすることによって、赤血球細胞内の成分を浸透圧により浮遊液側に滲み出させる。
【００３７】
（ｇ）  次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに所定時間遠心して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出た上澄み成分を採取する。
【００３８】
（ｈ）  次に、該上澄み成分を酸化還元電位計にかけて、同成分中の酸化還元電位を測定する。
【００３９】
（ｉ）  次に、同一被験者から別途採取した血清を用いて検量線を作成し、上記実測した上澄み成分中の酸化還元電位から、最終的に赤血球細胞内の酸化還元電位を求める。
【００４０】
このような構成によれば、従来のような血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、同血漿中の酸化還元状態を先行的に支配する血液の細胞である赤血球内の成分から、酸化還元電位を測定することができるようになり、未だ血漿側には表われていない赤血球細胞内の酸化還元電位を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００４１】
そのため、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種の病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【発明の効果】
【００４２】
以上の結果、本願発明の血液検査方法によると、血液の細胞外成分である血漿から血糖値、ピルビン酸値、乳酸値等を測定して糖尿病等の病態を判定する従来の血液検査方法では正確な病態判定ができなかった正常血糖値状態や、正常ピルビン酸値又は低ピルビン酸値状態、正常乳酸値又は低乳酸値状態の患者の真の病態をも正確に判定することが可能になり、より的確な早期診断、早期治療が可能となる。
【発明の実施の形態】
【００４３】
（実施の形態１）
先ず本願発明の実施の形態１に係る血液の検査方法の詳細について説明する。
【００４４】
この実施の形態では、血球細胞の一つである赤血球内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）および乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）を測定するようにしたことを特徴としている。
【００４５】
すなわち、この実施の形態の血液の検査方法は、次の（ａ）〜（ｉ）の工程により構成されている。
【００４６】
（ａ）  先ず、赤血球の凝固を防止するための血液凝固防止剤として例えばヘパリン（又はＥＤＴＡ）を所定量入れた採血管を用いて、被検者から、例えば静脈血２ｍｌを採血し、例えば５分間遠心（例えば遠心力１５０ｇ程度）することにより、その内の血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分（赤血球、白血球、血小板）のみを取り出す。
【００４７】
すなわち、上記ヘパリン（又はＥＤＴＡ）により赤血球が固まらないようにしておいて、上記採決した２ｍｌの血液を、１５０ｇ程度の遠心力で、５分間ほど遠心分離すると、その内の血漿成分が除かれて、赤血球、白血球、血小板等の血球成分のみになる。
【００４８】
（ｂ）  次に、そのようにして取り出された血球成分に、赤血球とそれ以外の血球成分、すなわち白血球、血小板等のバフィーコートを分離させやすくするための分離促進剤として、例えば濃度２５％前後のメトリザマイト０．２ｍｌ程度を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１０００ｇ）することによって、白血球、血小板等のバフィーコートをできるだけ確実に除去する。
【００４９】
すなわち、赤血球、白血球、血小板よりなる血球成分を上記のようにメトリザマイトを加えて１０００ｇ程度の大きな遠心力で遠心分離すると、赤血球のほうが当該血球中の他の成分よりも重いので、下方へ沈む。この沈んだ赤い層が赤血球となる。
【００５０】
このようにして、血球成分中から白血球、血小板等のバフィーコートを確実に除去するようにすると、赤血球のみを効率良く取り出すことができ、以後の工程において、より高精度に赤血球中の成分が取り出し易くなり、より正確な赤血球内ブドウ糖、乳酸濃度の測定が可能となる。
【００５１】
（ｃ）  次に、該白血球、血小板等のバフィーコートを除去した赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって洗浄する。
【００５２】
これにより、さらに赤血球の表面に付着している血漿成分や白血球、血小板が確実に除かれる。
【００５３】
（ｄ）  次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、同生理食塩水中の赤血球数が例えば４００万／μｌ前後の赤血球浮遊液２ｍｌを作る。
【００５４】
このようにして、後述するブドウ糖濃度および乳酸濃度の測定に必要な赤血球を壊されにくく、かつ細胞内成分を取り出しやすい安定した状態に保存する。
【００５５】
（ｅ）  次に、該赤血球浮遊液を、例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって、そのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の上澄み分を除去する。
【００５６】
（ｆ）  次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として例えば濃度５％程度の食塩水（ＮａＣｌ）を、上記除去した上澄み分に代替させる形で加えることによって全量を２ｍｌとし、ほぼ人の体温と同じ程度の保温温度３７℃の下で、例えば１０分間程度インキュベーションする。
【００５７】
この結果、赤血球細胞内と赤血球浮遊液との間に作用する浸透圧により、同食塩水を含む浮遊液内の赤血球中からブドウ糖や乳酸成分を含む内液成分が水分とともに、同食塩水を含む浮遊液側に滲み出して行く。
【００５８】
（ｇ）  次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに例えば１０分間程度遠心（例えば遠心力１７５０ｇ）して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出した上澄み成分を採取する。
【００５９】
（ｈ）  次に、該上澄み成分を生化学自動分析装置にかけて、同上澄み成分中の、ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）Ａ、乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）Ｂを各々測定する。
【００６０】
（ｉ）  次に、該測定した上澄み成分中のブドウ糖濃度Ａおよび乳酸濃度Ｂに基づいて、次に述べる所定の計算方法により、最終的に赤血球内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）、乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）を求め、対応する糖尿病、慢性呼吸器疾患等の病態の判定を行う。
【００６１】
同最終的な赤血球細胞内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）および乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）は、例えば次のようにして求められる。
【００６２】
ブドウ糖濃度又は乳酸濃度＝測定値A又はB×(赤血球浮遊液全量[ml]／全赤血
球容積[ml])
＝測定値A又はB×{赤血球浮遊液全量[2ml]／2(赤血
球浮遊液濃度[万/μl]×103×平均赤血球容積[fl]
×10-15×103)｝
このような構成によれば、従来のような血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、血液中に取り込まれたブドウ糖の代謝解糖機能を有し、同血漿中の血糖値等成分状態を先行的に支配する血液細胞である赤血球内の成分から、血糖値、乳酸値を正確に測定することができるようになり、未だ血漿側には表われていない血糖値の上昇や乳酸値の変化を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００６３】
そのため、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【００６４】
−実施例−
例えばインスリン非依存性糖尿病患者（ＮＩＤＤＭ患者）３７名と健常成人５２名の任意の時刻における赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）を上記の方法で、また同血液の血漿中の血糖値を従来と同様の方法で各々測定した。
【００６５】
その結果、インスリン非依存性糖尿病患者の場合、血漿中の血糖値が高いと赤血球細胞内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）も高く、血糖値が３５０ｍｇ／ｄｌ位で赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）は５０ｍｇ／ｄｌにも達した。すなわち、両者の間には正の相関が認められた。
【００６６】
一方、健常成人の場合には、血糖値１５０ｍｇ／ｄｌ位までで、赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）は最大１０ｍｇ／ｄｌであり、やはり正の相関が認められた。
【００６７】
これらインスリン非依存性患者と健常成人のすべてのデータから見ても、血漿中の血糖値と赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）との間には、明らかに正の相関が認められる。
【００６８】
したがって、この実施例からも、上記本実施の形態に係る血液検査方法の検査精度、早期病態把握の有効性が確認される。
【００６９】
（実施の形態２）
次に本願発明の実施の形態２に係る血液の検査方法の詳細について説明する。
【００７０】
この実施の形態では、血球内細胞の一つである赤血球内液の酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）を測定するようにしたことを特徴としている。
【００７１】
この実施の形態の血液の検査方法は、次の（ａ）〜（ｉ）の工程により構成されている。
【００７２】
（ａ）  先ず、赤血球の凝固を防止するための血液凝固防止剤としてヘパリン（又はＥＤＴＡ）を所定量入れた採血管を用いて、被検者から、例えば静脈血２ｍｌを採血し、例えば５分間遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することにより、血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す。
【００７３】
すなわち、ヘパリン（又はＥＤＴＡ）により赤血球が固まらないようにしておいて、採決した２ｍｌの血液を、１５０ｇ程度の遠心力で、５分間ほど遠心分離すると、その内の血漿成分が除かれて、赤血球、白血球、血小板等の血球成分のみになる。
【００７４】
（ａ′）  血液凝固促進剤および血清分離剤を所定量入れた採血管を用いて、被検者から、例えば静脈血４ｍｌを採血し、例えば３０００ｒｐｍで１０分間ほど遠心して血清を採取する。
【００７５】
なお、この（ａ′）の静脈血４ｍｌの採血と上記（ａ）の静脈血２ｍｌの採血とは、必ずしも別々に行う必要はなく、例えば６ｍｌの採血を２ｍｌと４ｍｌに分けて使用するようにしても良いことは言うまでもない。
【００７６】
（ｂ）  次に、上記（ａ）のようにして取り出された血球成分に、赤血球とそれ以外の血球成分、すなわち白血球、血小板等のバフィーコートを分離させやすくする分離促進剤として、例えば濃度２５％前後のメトリザマイト０．２ｍｌ程度を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１０００ｇ）することによって、上記白血球、血小板等のバフィーコートをできるだけ確実に除去する。
【００７７】
すなわち、赤血球、白血球、血小板よりなる血球成分に上記のようにメトリザマイトを加えて上記１０００ｇ程度の大きな遠心力で遠心分離すると、赤血球のほうが当該血球中の他の成分よりも重いので、下方へ沈む。この沈んだ赤い層が赤血球となる。
【００７８】
このようにして、白血球、血小板等のバフィーコートを確実に除去するようにすると、赤血球のみを効率良く取り出すことができ、以後の工程において、より高精度に赤血球中の成分が取り出し易くなる。
【００７９】
（ｃ）  次に、該白血球、血小板等のバフィーコートを除去した赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって洗浄する。
【００８０】
これにより、さらに赤血球の表面に付着している血漿成分や白血球、血小板が確実に除かれる。
【００８１】
（ｄ）  次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、ヘマトクリット値が５０％の赤血球浮遊液２ｍｌを作る。
【００８２】
このようにして、後述する酸化還元電位の測定に必要な赤血球を壊されにくく、かつ細胞内成分を取り出しやすい安定した状態に保存する。
【００８３】
（ｅ）  次に、該赤血球浮遊液を、例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって、上記リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の上澄み分を除去する。
【００８４】
（ｆ）  次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として例えば濃度５％程度の食塩水（ＮａＣｌ）を上記除去したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）分だけ加えることによって全量を同じ２ｍｌとし、ほぼ人の体温と同じ程度の保温温度３７℃の下で、例えば１０分間程度インキュベーションする。
【００８５】
この結果、赤血球細胞内と赤血球浮遊液との間に作用する浸透圧により、同食塩水を含む浮遊液内の赤血球中からブドウ糖や乳酸成分を含む内液成分が水分とともに、同食塩水を含む浮遊液側に滲み出して行く。
【００８６】
（ｇ）  次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに例えば１０分間程度遠心（例えば遠心力１７５０ｇ）して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出した上澄み成分を採取する。
【００８７】
（ｈ）  次に、該上澄み成分を酸化還元電位計（ＯＲＰ計）にかけて、同成分中の酸化還元電位（ＯＲＰ）を測定する。
【００８８】
（ｉ）  次に、例えば図２に示すように、同一被検者から採取した上記（ａ′）の血清を用いて、例えば図１に示すような検量線を作成し、上記酸化還元電位計による実測の酸化還元電位（ＯＲＰ）から、最終的な赤血球細胞内の酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）を求める。
【００８９】
ここで図１のような検量線を作成するのは、次のような理由によっている。
【００９０】
すなわち、本来は、直接赤血球の細胞内液の酸化還元電位を測定したいところである。しかし、赤血球細胞内に刺入して測定できる、針電極はない。そこで、上記赤血球の細胞内液を細胞の外へ漏出させ、それを測定することが考えられる。しかし、機械的に赤血球を圧縮したのでは、赤血球膜や赤血球内のヘモグロビン等が壊され、細胞内液に混じってしまう。それでは細胞内液の純粋な酸化還元電位を測定したことにはならない。
【００９１】
そこで、細胞内液のみが純粋に抽出されるようにするために、赤血球を浮遊させている溶液を細胞内液よりも高張液にすると、細胞内液は浸透圧により高張液側へ移動することになる。
【００９２】
しかし、それによって得られた溶液は、細胞内液と高張液との混合液である。そのため、その酸化還元電位は細胞内液のみの酸化還元電位ではなく、高張液との混合液の酸化還元電位になる。そこで、通常の状態では細胞内液と細胞外液（血清）とは細胞膜を介して互いに出入りしていると考えられるので、同一被検者ならば細胞内液と血清の基本的性質は同じと考えられる。無論、細胞内でより多くの活性酸素が発生したり乳酸やピルビン酸等の酸性物質が産生されたりするので、酸性酸化状態は、細胞内液において圧倒的に強いわけであるが、体液としては、同一被検者における細胞内液も細胞外液も同じ性質と考えられる。したがって、細胞外液である血清の酸化還元電位の正又は負の方向の延長線上に、細胞内液の酸化還元電位があると考えられる。
【００９３】
上述のように赤血球を５％食塩水に浸すことによって、細胞内液が高張液側に全部漏出されてきたとすれば、その混合液、すなわち遠心分離後の上澄み分のうち、細胞内液が５０％、高張液が５０％ということになる。
【００９４】
もちろん、このことは上記実験行程の中で５％食塩水を用いてヘマトクリット値５０％の赤血球浮遊液を作成したことに起因している。そこで、血清の酸化還元電位と５％食塩水で２倍に希釈したその血清の酸化還元電位とをそれぞれ求め、これらにより決まる点を図示Ａ点とする。次に、もとの血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍に希釈した血清の酸化還元電位と、同リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍に希釈した血清をさらに５％食塩水で２倍に希釈した血清の酸化還元電位とによって得られたのが図示Ｂ点である。なぜ血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈できるかについては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、リン酸緩衝生理食塩水自体の性質として、その血清の基本的な性質は変えないのでこれを用いたわけである。同様にＣ点はもとの血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４倍に希釈したものの酸化還元電位と、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４倍に希釈した血清を５％食塩水で２倍に希釈したものの酸化還元電位とによって求められた点である。これらＡ，Ｂ，Ｃの各点を結んで正又は負の方向へ延長線を引き、これを検量線とする。そして、細胞内液と上記５％食塩水の混合液における酸化還元電位の実測値を、先程の検量線のＹ軸（血清を５％食塩水で希釈して求めた酸化還元電位の目盛りの軸）に当てはめ、Ｘ軸の目盛りから推測される細胞内液の酸化還元電位を読み取る。すなわち、血清酸化還元電位の正又は負の延長線上に細胞内液の酸化還元電位があると考えるわけである。
【００９５】
（ｊ）  最後に、該赤血球細胞内の酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）に基いて所定の処理を行ない対応する病態の判定を行う。
【００９６】
なお、以上の工程（ｈ）において、上記酸化還元電位計（ＯＲＰ計）で、酸化還元電位（ＯＲＰ）を求めるには、測定値に対して比較電極の電位を加える。この比較電極の電位は、その時の上澄み成分の温度に応じて決定され、例えば同温度が０〜６０℃の間では、図３の表のようになっている。
【００９７】
このような構成によれば、従来の血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、血液中に取り込まれたブドウ糖の代謝解糖機能を有し、同血漿中の成分状態を先行的に支配する血球中の細胞である赤血球の内液成分から、酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）を測定することができるようになり、未だ血漿側には表われていない酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）の変化を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００９８】
そのため、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【００９９】
（実施の形態３）
上記実施の形態１に関する実施例においても示されるように、例えばインスリン非依存性患者（ＮＩＤＤＭ患者）の場合、血漿中の血糖値が高いほど赤血球細胞内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）も高いが、これは何らかの理由で赤血球細胞内でのブドウ糖代謝機能が抑制されているからであると考えられる。
【０１００】
一方、本件発明者の知見によると、同患者に対して、例えば所定量のマイナスイオンを照射した後、血漿中の血糖値および赤血球細胞内のブドウ糖濃度を測定すると、血漿中の血糖値の減少とともに赤血球細胞内のブドウ糖濃度が減少し、反対に赤血球細胞内及び血液中のピルビン酸濃度や乳酸濃度が増加した。
【０１０１】
このことは赤血球細胞がＴＣＡ回路を持たず、嫌気的解糖系のみであることを考えれば、マイナスイオンによってブドウ糖代謝が促進したためと推測される。その作用機序は、マイナスイオンの本質が電子（ｅ-）であり、血液ｐＨを上昇（Ｈ+＋ｅ-→Ｈ）させたことが結果的に赤血球細胞内ｐＨの上昇につながり、それが嫌気的解糖系でのグルコース代謝に関わる酵素、例えばホスホフルクトキナーゼなどの活性を高め、ブドウ糖代謝が促進したものと考えられる。
【０１０２】
このようなマイナスイオンの作用は、細胞内へのブドウ糖の取り込みにインスリンを必要とする骨格筋や脂肪細胞においても同じであると考えられる。
【０１０３】
先ず、インスリン受容体にインスリンが結合すると、細胞膜のＮａ+／Ｈ+チャンネルが活性化され、細胞外のＮａ+が細胞内へ、細胞内のＨ+が細胞外へくみ出される。しかし、細胞間質液ｐＨが低下していると、例えばインスリンが存在していてもＮａ+／Ｈ+エクスチェンジャーが十分活性化されない。
【０１０４】
すでに、上記マイナスイオンは、細胞間質液ｐＨを上昇させることが判明しており、結果としてマイナスイオンがインスリンのＮａ+／Ｈ+チャンネルの活性化を促し、細胞内ｐＨを上昇させることからブドウ糖代謝酵素の活性が高まり、ブドウ糖代謝が亢進すると推測される。
【０１０５】
上記インスリン非依存性（ＮＩＤＤＭ患者）で赤血球細胞内のブドウ糖代謝が低下している理由は、不明である。しかし、糖尿病における酸性体質が細胞間質液ｐＨの低下と細胞内ｐＨの低下とを招いており、これが赤血球細胞内でのブドウ糖代謝酵素の活性を低下させ、解糖を阻害していると指摘する研究者もいる。同研究者によると、ストレプトゾトシン投与で糖尿病にしたラットにマイナスイオンを照射すると、細胞間質液ｐＨが上昇することを証明し、これが糖尿病状態の改善につながるとしている。
【０１０６】
そこで、これを確認するために、例えば上記インスリン非依存性患者（ＮＩＤＤＭ患者）にマイナスイオンを照射して、その血液ｐＨと赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）の変化を調べ、同時にＴＣＡ回路をもたず嫌気的解糖系のみを有する赤血球細胞の場合、ブドウ糖代謝の終末産物であるピルビン酸や乳酸値が同赤血球細胞内で実際に変化するか否かを判定することが考えられるが、そのための同ピルビン酸濃度の測定に際しても、上記実施の形態１の（ａ）〜（ｉ）の濃度測定方法を全く同様に適用して、同様に測定することができる。
【０１０７】
ピルビン酸は赤血球以外の細胞、すなわちＴＣＡ回路（クレブス回路又はクエン酸回路）をもつ細胞では、アセチルＣｏＡを介してＴＣＡサイクルに入り、酸化過程を経て最終的にＡＴＰエネルギーが産生される。
【０１０８】
しかし、赤血球細胞内ではＴＣＡサイクルをもたないため、乳酸デヒトロキナーゼ（乳酸脱水素酵素）のもとで乳酸に変化する。しかし、同時にピルビン酸の乳酸への変化は化学的にはピルビン酸の還元が行われたことになり、その還元作用をもつのが解糖系の中間段階で作られるＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）である。
【０１０９】
ところが赤血球細胞の中には、酸素を運ぶためのヘモグロビンが存在し、このヘモグロビンが、しばしば酸素あるいは活性酸素によって酸化され、メトヘモグロビンになる。メトヘモグロビンは酸素を結合することができないので、抹消組織での酸素欠乏状態が生じることになる。
【０１１０】
そこで、ヘモグロビンが酸化されないために、上述の解糖の中間段階で生じるＮＡＤＨが用いられる。しかしそうなった場合には、上記ピルビン酸が乳酸に変わることができなくなるために、細胞内のピルビン酸濃度が上昇する。しかし、ピルビン酸は乳酸と並んで酸性物質であり、細胞内ｐＨが低下しやすくなる。細胞内ｐＨが低下すると解糖系に必要な酵素活性が失活し、ブドウ糖代謝（グルコース代謝）が阻害される。すなわち、細胞内のブドウ糖濃度が上昇しやすくなる。この時、細胞内酸化還元電位は酸素又は活性酸素が多いと上昇しやすくなるが、細胞内の還元性を有する物質すなわちＮＡＤＨ、還元型グルタチオン、還元型アスコルビン酸等の総和量が多いと酸化還元電位は低く保たれる。
【０１１１】
したがって、メトヘモグロビンの発生量と細胞内酸化還元電位との明らかな相関はない。
【０１１２】
しかし、細胞内酸化還元電位が高いとヘモグロビンが酸化されやすいことは容易に想像されるし、もし乳酸脱水素酵素欠損症という病気がないならば、ピルビン酸濃度上昇の原因は、上記ＮＡＤＨがメトヘモグロビンの還元に利用されているためであると推測することができる。
【０１１３】
一方、細胞内酸化還元電位の上昇は、赤血球細胞膜の過酸化を促進し、そのため細胞膜を介して物質の移動ができなくなると考えられる。これらのことが糖尿病をはじめさまざまな病気を引き起こすと考えられる。
【０１１４】
したがって、このような理由から、臨床的にも病態把握上ピルビン酸濃度の測定を行う意義がある。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】  図１は、本願発明の実施の形態２に係る血液の検査方法において作成される検量線を示す図である。
【図２】  図２は、同図１の検量線を作成するための測定ファクターをＸ−Ｙ各軸のパラメータで示した図表である。
【図３】  図３は、同検査方法における酸化還元電位計を用いた酸化還元電位の算出に使用される外気温度に応じた比較電極の電位加算表である。
【図１】
0003714921.tif 000002
【図２】
0003714921.tif 000003
【図３】
0003714921.tif 000004