(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害するｇｐ１３０に対する抗体を有効成分とする、骨粗鬆症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は骨粗鬆症の治療方法及び骨粗鬆症の治療薬に関するものであり、詳しくは、ヒトインタ−ロイキン−６（以下ＩＬ−６と略す）等の種々のサイトカイン類のシグナル伝達に関与する蛋白質であるｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害することによる方法及び該シグナル伝達作用を阻害する物質を有効成分とする治療薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は、骨の量が減少することにより、骨折しやすくなる病気である。骨の代謝においては、骨吸収と呼ばれる骨が壊される過程と、骨形成と呼ばれる骨が作られる過程の間に一定のバランスが保たれているが、骨粗鬆症ではこのバランスがくずれ、骨吸収が異常に高まる結果生じるものである。
【０００３】
骨吸収を主に担う細胞は破骨細胞と呼ばれており、血液幹細胞由来の単球系の細胞であることが知られている。最近、ヒト血球を培養して破骨細胞を調製する方法（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４４，  ｐ４２２６，  １９９０  年参照）、ウサギの骨から破骨細胞を調製する方法（Ｔｅｚｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １８６，  ｐ９１１，  １９９２  年参照）、更には破骨細胞の骨吸収活性を測定する方法（Ｔａｋｅｄａら、Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ，  １７，  ｐ３４７，  １９９３年参照）が報告され、破骨細胞の形成や骨吸収作用に対する種々の薬剤の直接的な効果が比較検討できるようになった
ｇｐ１３０は、代表的な多機能性サイトカインであるＩＬ−６のシグナル伝達に関与する、細胞膜上に存在する分子量１３万の糖蛋白として発見され（Ｔａｇａら、Ｃｅｌｌ，  １９８９年参照）  、その後、ＩＬ−６だけでなく、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、白血病阻害因子）  、オンコスタチンＭ更にはＣＮＴＦ（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ）のシグナル伝達にも関与することが報告されている（Ｔａｇａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９９２年参照）。
【０００４】
一方Ｋｕｒｉｈａｒａらは、ＩＬ−６存在下でヒト骨髄細胞を長期間培養すると破骨細胞様の多核細胞が形成されることを（ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４４，  ｐ４２２６，  １９９０  年参照）、Ｊｉｌｋａ  らは子宮を切除したマウスの血清中のＩＬ−６の濃度上昇と破骨細胞数増加の相関性を報告した（Ｊｉｌｋａ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５７，  ｐ８８，  １９９２  年参照）。ＩＬ−６が骨粗鬆症の発症に何らかの役割を果たしていることが示唆される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前述の報告はＩＬ−６が骨粗鬆症の発症に何らかの役割を果たしていることを示唆するものの、具体的な骨粗鬆症の治療方法や治療薬については何等報告していない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＩＬ−６の作用を阻害することで骨粗鬆症を治療し得るか否かについて鋭意研究を行った結果、ＩＬ−６のシグナル伝達に重要な役割を果たすｇｐ１３０の該シグナル伝達作用を阻害することで骨粗鬆症を治療し得ることを見出だし、本発明を完成した。即ち本発明は、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害することによる、骨粗鬆症治療方法である。また本発明は、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害する物質を有効成分とする、骨粗鬆症治療薬である。以下本発明を更に詳細に説明する。
【０００７】
１．ｇｐ１３０のシグナル伝達作用の阻害剤
本発明中のｇｐ１３０とは、ＩＬ−６のシグナルを伝達する蛋白質として発見されたものであり、（１）ＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−との複合体と結合するが、ＩＬ−６の非存在下ではＩＬ−６レセプタ−と結合せず、（２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動において１３０ｋＤａの見かけ上の分子量を示す、糖蛋白である。ｇｐ１３０をコ−ドする遺伝子はヒト及びマウスから単離され、その一次構造は決定されている（Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ，  ６３，  ｐ１１４９，  １９９０  年参照、Ｓａｉｔｏ  ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８，  ｐ４０６６，  １９９２  年参照）。またｇｐ１３０は細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞内領域から構成され、ＩＬ−６だけでなく、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、白血病阻害因子）  、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ）のシグナル伝達にも関与することが知られている（Ｔａｇａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８９，  ｐ１０９９８，  １９９２年参照）。
【０００８】
本発明中のｇｐ１３０のシグナル伝達作用というのは、細胞膜上のｇｐ１３０が、ＩＬ−６、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦの刺激にそれぞれ反応し、該細胞に何らかのシグナルを伝え、その結果として該細胞が増殖や分化をおこしたり、何らかの生理活性物質を放出したり、何らかのレセプタ−分子を細胞表面に発現したりすることを意味する。このようなシグナル伝達作用としては、例えばＩＬ−６で抗原刺激を受けたＢ細胞を刺激したとき、Ｂ細胞膜上のｇｐ１３０が細胞内にシグナルを伝達し、その結果としてＢ細胞の抗体産生が増加することや、ＬＩＦで白血病細胞株Ｍ１を刺激したとき、Ｍ１細胞膜上のｇｐ１３０がシグナルを細胞内に伝達し、その結果としてマクロファ−ジに分化することや、ＩＬ−６で肝細胞を刺激したとき、肝細胞膜上のｇｐ１３０が細胞内にシグナルを伝達し、その結果として急性期タンパク質を発現すること等が挙げられる。
【０００９】
従って、本発明中のｇｐ１３０のシグナル伝達作用阻害剤は、上述のｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害するもの全てを意味する。ｇｐ１３０はその細胞外領域でリガンド分子あるいはリガンド分子とレセプタ−分子の複合体を認識し、細胞内領域でシグナルを細胞内に伝達するから、該阻害剤は、細胞外領域の作用と細胞内領域の作用のどちらを阻害するものでも良い。
【００１０】
細胞外領域の作用を阻害するものとして、例えば抗ｇｐ１３０抗体を例示できる。また、ＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−との複合体がｇｐ１３０と結合するという性質からは、ＩＬ−６とは結合できるが生じた複合体がｇｐ１３０と結合できないような変異型ＩＬ−６レセプタ−も例示できる。中でも調製が容易で、かつｇｐ１３０を特異的に認識し得る抗ｇｐ１３０抗体を阻害剤として使用することが好ましい。
【００１１】
より具体的に、ｇｐ１３０に対する抗体は、ＩＬ−６とＩＬ−６レセプタ−との複合体とｇｐ１３０が結合するのを立体的に妨害し得る様なものであれば良いが、前記複合体とｇｐ１３０が結合する部分と結合することが望ましい。阻害効果の程度については、一定量を添加あるいは投与したときに、より強い阻害効果を有する抗体、あるいは同程度の阻害効果を達成するために、より少量の添加あるいは投与で足りる抗体ほど、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用に対する阻害効果の強い抗体であり好ましい。このような抗体として例えば、ＧＰＸ７、ＧＰＸ
２２又はＧＰＺ３５（Ｔａｇａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８９，  ｐ１０９９８，  １９９２年参照）等のモノクロ−ナル抗体が特に好ましい。
【００１２】
以上の抗体を調製するために免疫原として用いるｇｐ１３０は、細胞膜から精製した天然型ｇｐ１３０、培養上清、血清あるいは尿から精製した天然型ｇｐ１３０、更には遺伝子工学的に作製したｇｐ１３０のどれでも良いが、遺伝子工学的手法によれば大量のｇｐ１３０を調製することが可能である。ｇｐ１３０の調製法としては、１９９１年度日本免疫学会総会・学術集会記録２１巻ｐ１０８に斎藤らによる報告がある。なお、調製された抗ｇｐ１３０抗体は、本発明の治療方法又は治療薬として使用する前に、骨粗鬆症患者で見出だされるｇｐ１３０を認識し得ることを確認すること良い。
【００１３】
本発明でｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害する物質として好ましく使用される抗体の中でも、特にｇｐ１３０に対するモノクロ−ナル抗体が良い。このようなモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マは、常法に従って調製することができる。例えば前記の免疫原のいずれかによりマウス等の哺乳類を免疫し、この動物から脾臓細胞を得、これを樹立されたミエロ−マ細胞と融合せしめ、次に目的とする反応性、すなわちＩＬ−６作用を阻害する抗ｇｐ１３０抗体を産生しているクロ−ンを選択する等である。ＩＬ−６作用の阻害の程度については、本発明で提供される抗ｇｐ１３０抗体等と比較すればよい。また、多数のクロ−ンから目的とするクロ−ンを得るため、まずｇｐ１３０との結合性を確認し、一定数のクロ−ンを選択してから、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用に対する阻害効果を比較しても良い。このようにして調製されたハイブリド−マを培養すれば、培養上清からモノクロ−ナル抗体を採取できる。あるいは前記ハイブリド−マを動物の腹くう内に接種し、腹水を得、これからモノクロ−ナル抗体を単離することもできる。ハイブリド−マ細胞培養上清中の抗体または腹水中の抗体は、常法に従って、例えば硫酸アンモニウム塩析により濃縮することができ、さらにアフィニティ−クロマトグラフィ−により精製することができる。
【００１４】
本発明に従って骨粗鬆症を治療するには、前記したように、例えば抗ｇｐ１３０抗体等を患者に投与すれば良い。
【００１５】
【実施例】
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１．破骨細胞の形成に対する抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体の効果
Ｋｕｒｉｈａｒａら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４  巻、ｐ４２２６  、１９９０年）に示された方法によりヒト血液から破骨細胞を形成させ、それに対する抗ｇｐ１３０抗体の阻害効果を調べた。
【００１７】
ヒト血液から、フィコ−ルを用いる通常の方法で単核細胞を集め、α−ＭＥＭ培地、１０％牛血清中で培養した。まず、培養容器に付着する細胞を除き、抗ＣＤ３４抗体を培養容器に付着させ、培養容器に付着する細胞を集めた。このようにして得た細胞をメチルセルロ−ス寒天中で、１００  ｐｇ／ｍｌ  のＧＭ−ＣＳＦ存在下で７日間培養した。次に、リコンビナントヒトＩＬ−６を１００  μｇ／ｍｌ存在下で、抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体ＧＰＸ７、ＧＰＺ３５をそれぞれ添加し、１４日間培養した。生じた破骨細胞のコロニ−数は抗ビトロネクチンレセプタ−α鎖モノクロ−ナル抗体２３Ｃ６を用いて測定した。結果を表１に示す
【００１８】
【表１】
0003622208.tif 000002
【００１９】
表１より明らかなように、ＩＬ−６による破骨細胞の形成数の増加は、ＧＰＸ７、ＧＰＺ３５により濃度依存的に阻害され、約１μｇ／ｍｌの添加ではほぼ基定レベルにまで低下した。ＩＬ−６によるＢ細胞株への抗体産生誘導作用やミエロ−マ細胞増殖作用に対するＧＰＸ７、ＧＰＺ３５の阻害効果（特願平４−１３４３２９）では、基定レベルにまで低下させるのに必要な抗体の添加量は１０〜５０μｇ／ｍｌである。従って、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用の阻害による破骨細胞の形成阻害は顕著であることが示された。
【００２０】
実施例２．破骨細胞の骨吸収作用形成に対する抗ｇｐ１３０モノクロ−ナル抗体の効果
Ｔｅｚｕｋａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６巻、ｐ９１１、１９９２年）に示された方法により、ウサギから破骨細胞を調製した。生後１０日目のウサギ（体重１１０  ｇ）から長骨を取り出し、はさみで切り刻んだ後、３  ｍｌ  のα−ＭＥＭ培地、５％牛血清中に浸した。次に、２０  ｍｌ  の同培地中で、ボルテックスによる３０秒間の緩やかなに攪拌を２回行った後、遠心して上清を集めた。こうして、約２  ×１０７  個の骨細胞を得た。それを直径９０  ｍｍ  のデッシュで２日間培養し、破骨細胞を得た。
【００２１】
次に、Ｔａｋｅｄａら（Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ、１７巻、ｐ３４７、１９９３年）に示された方法により、象牙の切片上での破骨細胞の骨吸収作用における抗ｇｐ１３０抗体の阻害効果を調べた。６×  ０．１５  ｍｍ    の象牙のスライスを一晩プレスした後、７０％エタノ−ル中で超音波処理を行った。次に、９６穴ウエル中で、上述のウサギ由来破骨細胞と象牙を混合し、２５０  μｌ  のα−ＭＥＭ培地、５％牛血清中で２時間培養した。次にモルモット由来抗ヒトｇｐ１３０ポリクロ−ナル抗体を種々の濃度で加え、２日間培養した。コントロ−ルとしては１０−７Ｍのカルシトニンを用いた。２日間の培養の後、生じたピット数を計測した。同様の操作を２度行った結果を（操作１及び操作２）を表２に示す。
【００２２】
【表２】
0003622208.tif 000003
【００２３】
表２より明らかなように、モルモット由来抗ヒトｇｐ１３０ポリクロ−ナル抗体は濃度依存的にピットの形成を阻害した。これはウサギ破骨細胞の細胞膜上の抗ｇｐ１３０に、抗ヒトｇｐ１３０抗体が結合し、その結果、ウサギ破骨細胞の骨吸収作用が阻害された結果である。コントロ−ルのカルシトニンの効果と比較して、ｇｐ１３０のシグナル伝達作用の阻害による破骨細胞の骨吸収作用阻害効果は顕著であることが示された。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のｇｐ１３０のシグナル伝達作用を阻害することを特徴とする骨粗鬆症治療薬により、従来には存在しなかった新しいタイプの骨粗鬆症治療薬の開発が可能になる。また抗ｇｐ１３０抗体を用いた基礎研究により、ｇｐ１３０を介してシグナルが伝達されるＩＬ−６等の生理活性物質の骨粗鬆症での種々の役割を同定することが可能となり、このことは、骨粗鬆症の研究、さらにはそれらの成果に基づく新しい治療薬診断薬等の開発等に大きな意義を有するものである。