(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌（E.coli）用の培地に加え、α−ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物、β−グルコシダーゼ酵素の基質である色原体化合物、およびβ−グルクロニダーゼ酵素の基質である色原体化合物を含有する培地に、検体もしくは該検体由来の接種材料を接種し、腸管出血性大腸菌血清型Ｏ157の存在（存在する場合に）を明らかにすることを特徴とする、検体中の腸管出血性大腸菌血清型Ｏ157を検出する方法。
【請求項２】
α−ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物がインドキシル−α−ガラクトシド誘導体から選ばれ、β−グルコシダーゼ酵素の基質である色原体化合物がインドキシル−β−グルコシド誘導体から選ばれ、β−グルクロニダーゼ酵素の基質である色原体化合物がインドキシル−β−グルクロニド誘導体から選ばれ、ここで発色団が置換もしくは非置換インドキシル基から選ばれることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
α−ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物が下記から選ばれ：
5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α−ガラクトシド、および
6-クロロ-3-インドキシル-α-ガラクトシド、
β−グルコシダーゼ酵素の基質である色原体化合物およびβ−グルクロニダーゼ酵素の基質である色原体化合物の発色団が下記の基から選ばれることを特徴とする、請求項２記載の方法：
5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル、
5-ブロモ-3-インドキシル、および
3-インドキシル。
【請求項４】
各色原体化合物の濃度がそれぞれ0.01〜0.2g/lであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
各色原体化合物の濃度がそれぞれ0.05g/lであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記培地に接種する前に、予め検体の微生物増殖法を用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの項記載の方法。
【請求項７】
前記培地に接種する前に、検体の微生物増殖法に次いで、免疫取り込み増菌法、IMS法を用いることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
大腸菌（E.coli）用の培地に加え、α−ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物、β−グルコシダーゼ酵素の基質である色原体化合物、およびβ−グルクロニダーゼ酵素の基質である色原体化合物を含有することを特徴とする、腸管出血性大腸菌血清型Ｏ157を検出するための培地。
【請求項９】
各色原体化合物の濃度がそれぞれ0.01〜0.2g/lであることを特徴とする、請求項８記載の培地。
【請求項１０】
各色原体の濃度がそれぞれ0.05g/lであることを特徴とする、請求項９記載の培地。
【発明の詳細な説明】
本発明は大腸菌（E.coli）Ｏ157および／または011を分離および同定するための新規な培地、並びにそれらを示す方法に関する。
腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）、特に血清型（セロタイプ）Ｏ157は、米国、カナダおよびヨーロッパにおける食中毒の多くの場合の原因となっている。北アメリカにおいては、牛肉（特に生の牛肉）、牛肉製品および非加工牛乳がこれらの流行病に関与している。
この微生物は血液様の下痢を特徴とする出血性大腸炎を引起し、これらの症状は非常に重篤な腎臓の合併症（溶血性尿毒症）に進むかもしれないため、腸管病原性大腸菌およびベロ毒素産生性（verotoxinogenic）大腸菌の毒性と同様な毒性により、この微生物は主要な公衆衛生の課題となっている。
従って、最近、食品中のEHEC株の迅速な検出を目指す研究が行われており（FDA、８版、1995年、Bolton et al.,1995）、より詳しくは血清型Ｏ157の特異的検出に向けて行われている。
従来技術の分離培地は以下の通りである：
−特に、選択性のあまりない培地、例えばソルビトール・マッコンキー（MacConkey）培地、グラム陰性でソルビトール陰性のすべての細菌の検査、
−抗生物質を場合により添加するが、目的の大腸菌Ｏ157の成長阻害が生じるためあまり成功しない、
−フルオロゲン（fluorogenic）化合物もしくは色原体（chromogenic）化合物を場合により添加し、β-グルクロニダーゼを含有する細菌のコロニー（本質的に典型的な大腸菌）を除去する。
流行病から分離した大腸菌Ｏ157のほとんどの菌株は24時間たってもソルビトールを発酵せず、β-グルクロニダーゼ活性を持たず、45.5℃で生育しない。従って、臨床もしくは食物の検体中のEHEC株のスクリーニングのための多くの方法は、一次分離用培地としてソルビトール・マッコンキー寒天培地（SMAC）を用いる。
ソルビトール陰性の、疑わしいコロニーを、次いで生化学的および血清学的検査により大腸菌Ｏ157と確認する。
ごく普通に用いられるその他の培地には、以下のようなものが挙げられる。
−CT-SMAC：２種類の阻害剤（セフィキシム（cefixime）および亜テルル酸カリウム）を含有する、SMAC由来の培地。これらの阻害剤はソルビトールを発酵しない多くの細菌、例えばプロテウスspp.（Proteus spp.）、モルガネラ・モルガニイ（Morganella morganii）、プロビデンシアspp.（Providencia spp.）、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）等を阻害するので、培地をより選択的なものにする。1993年に行われた研究では、CT-SMAC培地で培養された、約400株のEHEC大腸菌Ｏ157がソルビトール陰性コロニーであることを示した。
−CR-SMAC：ソルビトール陰性、ラムノース陰性コロニーを明らかにするための、セフィキシムとラムノースを含有する、SMAC由来の培地。
−SMAC＋MUG、ソルビトール陰性、β-グルクロニダーゼ陰性のコロニーを明らかにするための（4-メチルウンベリフェリル-β-グルクロニド）。
−SMAC＋BCIG、ソルビトール陰性、β-グルクロニダーゼ陰性のコロニーを明らかにするための（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-D-β-グルクロニド）。
−Fluorocult大腸菌Ｏ157:H7寒天培地：ソルビトール陰性、MUG陰性およびH2S陰性のコロニーを明らかにするための、ソルビトール、MUGおよびチオ硫酸ナトリウム含有培地。
最初は選択性の低い培地であるSMAC培地に、関連する菌叢を除去することにより大腸菌Ｏ157の分離感度を上げるのに役立つ各種阻害剤を添加してSMAC培地の修飾培地を製造した。
しかし、現在の検出技術には感度および特異性に関して重大な欠点がある。というのは大腸菌Ｏ157は、食物検体中に存在する他の微生物に比べ、また現在の培地では同じ表現型を有するエシェリキア・ハーマニイ（E. hermanii）などの他の種に比べ、食物検体中に少量しか存在しないためである。
本発明は、従来の培地に比べ特異性および選択性が良好であり、α-ガラクトシダーゼ酵素を検出する色原体を無色培地に添加すると、血清群（serogroup）Ｏ157株、およびしばしば血清群Ｏ11株を迅速にかつ容易に検出することができるため、この問題の解決を提供する。選択した色原体の発色団部分に依存する色の、非常に濃い着色が得られ、これらの着色はコロニーに局在し、容易に示される。
従って、本発明は、腸管出血性大腸菌、特に血清型Ｏ157および／またはＯ11を示すための新規な培地に関し、この培地は、大腸菌のための培地に加え、α-ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物を含む。
選択性を上げるために、β-グルコシダーゼの基質である色原体化合物を添加することができ、これは特に多数の大腸菌群を除去する。
選択性を上げるために、β-グルクロニダーゼの基質である色原体化合物を添加することができ、これは特に、Ｏ157およびＯ11以外の血清群の大腸菌(E.coli)のほとんどを除去する。
α-ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物はインドキシル-α-ガラクトシド誘導体から選択され、ここで発色団は置換もしくは非置換インドキシル基から選択されるのが有利である。
好ましくは、β-グルコシダーゼの基質である色原体化合物はインドキシル-β-グルコシド誘導体から選択され、ここで発色団は置換もしくは非置換インドキシル基から選択される。
β-グルクロニダーゼの基質である色原体化合物は、好ましくはインドキシル-β-グルクロニド誘導体から選択され、ここで発色団は置換もしくは非置換インドキシル基から選択される。
「置換もしくは非置換インドキシル」とは、インドキシル基および、１もしくは２以上のアルキルもしくはハロゲン基で置換されたインドキシル基をいう。それらはより詳しくは、アルキル、ハロ、ジハロもしくはトリハロインドキシル基であり、好ましくはブロモインドキシル、クロロインドキシル、ジクロロインドキシル、クロロブロモインドキシル、トリクロロインドキシルおよびメチルインドキシル基から選択される。
インドキシル発色団化合物は、3-インドキシル、6-クロロインドキシル、5-ブロモインドキシル、3-ブロモインドキシル、4,6-ジクロロインドキシル、6,7-ジクロロインドキシル、5-ブロモ-4-クロロインドキシル、5-ブロモ-6-クロロインドキシルおよび4,6,7-トリクロロインドキシル基であるのが有利である。
好ましくは、α-ガラクトシダーゼ酵素の基質である色原体化合物は以下の化合物から選択される：
5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α-ガラクトシド、および
6-クロロ-3-インドキシル-α-ガラクトシド。
β-グルコシダーゼおよび／またはβ-グルクロニダーゼ酵素の基質である色原体化合物としては、発色団が以下の基から選択されるのが好ましい：
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル、
5-ブロモ-3-インドキシル、および
3-インドキシル。
本発明の培地は、α-ガラクトシダーゼの基質である色原体を0.01〜0.2g/l、好ましくは約0.05g/l含有するのが有利である。
必要な場合、β-グルコシダーゼおよび／またはβ-グルクロニダーゼの基質である色原体化合物の濃度も0.01〜0.2g/l、好ましくは約0.05g/lである。
本発明培地のその他の特徴は以下の実施例により明らかとなろう。
実施例１
CHROMagar Ｏ157の組成                                     g/l
寒天                                                    15
ペプトン                                                 5
酵母エキス                                               2
肉エキス                                                 1
NaCl                                                     5
5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル-α-ガラクトシド         0.05
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-グルコシド           0.05
5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-β-グルクロニド         0.05
デオキシコール酸塩                                       0.5
実施例２：各種菌株により得られた色
培地に各種菌株を接種し、次いで24時間培養した。
0003711563.tif 000002
ソルビトール陽性でSLT+（シゲラ毒素様毒素（Shigella Like Toxin）陽性）であり、本発明の培地により示される大腸菌Ｏ157の菌株も見出されるが、一方それらはソルビトール・マッコンキー培地上では赤色の偽の陰性であるため見逃される。従って、本発明の培地は、特異性の利点（偽の陽性の除去）だけでなく、感度の利点（ソルビトール・マッコンキー培地上で偽の陰性の菌株の検出）も提供し、これは非常に重要である。
さらに、グラム陽性の細菌を阻害するための選択的方法を除いて、本発明の培地は主に選択的増殖の原理には基づいていないので、良好な増殖率が得られる。
また、本発明は検体中の腸管出血性大腸菌を示す方法にも関し、この方法では、本発明の培地に検体もしくはこの検体の接種材料を接種し、その後、腸管出血性大腸菌の存在（存在する場合には）が明らかになる。
食物微生物学の分野において、例えば、食物中に大腸菌Ｏ157：Ｈ７の菌体が10個未満であることを示すことが望ましい。培地に広げる前に、微生物増殖方法を用い、次いで場合により、ビーズに固定した抗体を用いた、免疫取り込みによる増菌法、IMS法を行ってもよい。しかし、この増菌法では従来の培地上で偽の陽性結果を与える数種類の細菌を除去できない。従って、本発明の培地を用いることにより、この免疫取り込み増菌法、IMS法を用いる場合でも大きな利点を提供する。