(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２のアミノ酸配列により特徴づけられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸３１０のアミノ酸配列により特徴づけられる可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３】
配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２のアミノ酸配列により特徴づけられる成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項４】
配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０のアミノ酸配列により特徴づけられる可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項５】
配列番号：３に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項６】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子またはその相補物が緊縮条件下で配列番号：１のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションしうるものである、核酸分子。
【請求項７】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１、２、３、４または６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
(ａ)請求項８または請求項９に記載の宿主細胞を適当な培養培地中で培養し；次いで、
(ｂ)該培養培地から該Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質を精製することを特徴とするＰ-セレクチンリガンド蛋白質の製法。
【請求項１１】
(ａ)請求項４に記載のＤＮＡ、(α１,３/α１,４)フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ、および対形成塩基性アミノ酸変換酵素をコードするＤＮＡで宿主細胞を共形質転換し、ここに各ＤＮＡは発現制御配列に作動可能に連結されており；
(ｂ)該宿主細胞を適当な培養培地中で培養し；次いで、
(ｃ)該培養培地から可溶性の成熟Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質を精製することを特徴とする可溶性の成熟Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の製法。
【請求項１２】
配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列により特徴付けられるＰ-セレクチンリガンド蛋白質であって、他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まないものであるＰ-セレクチンリガンド蛋白質。
【請求項１３】
配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列により特徴付けられるＰ-セレクチンリガンド蛋白質であって、他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まず、成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含まないものであるＰ−セレクチンリガンド蛋白質。
【請求項１４】
(ａ)Ｐ-セレクチン蛋白質と、配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列、および配列番号：３に記載されたアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列によって特徴付けられるＰ-セレクチンリガンド蛋白質とを合わせ、該組合せが第一結合混合物を形成し；
(ｂ)第一結合混合物におけるＰ-セレクチン蛋白質および該Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の間の結合量を測定し；
(ｃ)化合物とＰ-セレクチン蛋白質およびＰ-セレクチンリガンド蛋白質とを合わせて第二の結合混合物を形成させ；
(ｄ)第二の結合混合物における結合量を測定し；次いで、
(ｅ)第一結合混合物の結合量と第二結合混合物の結合量とを比較し；ここに、該化合物は、第二結合混合物の結合量が減少した場合に、Ｐ-セレクチンにより媒介される細胞間接着を阻害できる
ことを特徴とするＰ-セレクチンにより媒介される細胞間接着の阻害剤を同定する方法。
【請求項１５】
請求項１２記載のＰ−セレクチンリガンド蛋白質と特異的に反応する抗体を含む組成物であって、Ｐ−セレクチンに結合でき、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着の阻害剤として作用する薬剤をスクリーニングするために用いられる組成物。
【請求項１６】
請求項１３記載のＰ−セレクチンリガンド蛋白質と特異的に反応する抗体を含む組成物であって、Ｐ−セレクチンに結合でき、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着の阻害剤として作用する薬剤をスクリーニングするために用いられる組成物。
【請求項１７】
（ａ）配列番号：１のアミノ酸４２からアミノ酸５６まで；
（ｂ）位置４６、４８または５１のいずれかまたはすべてにおいて硫酸化されたチロシンを有する、配列番号：１のアミノ酸４３からアミノ酸５６まで；または
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸２３８からアミノ酸２４８まで
から選択されるアミノ酸配列により特徴づけられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１８】
さらに免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項１ないし６または１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
免疫グロブリンがＩｇＧである請求項１８記載の核酸分子。
【請求項２０】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、またはＰ−セレクチンに結合しうる該Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１８または１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質またはその断片であって、該蛋白質が請求項１ないし６または１７ないし１９のいずれか１項に記載の核酸によりコードされており、該Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質またはその断片がＰ−セレクチンに結合しうるものである、単離Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質またはその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血球の内皮細胞への接着を阻害することによって作用する抗炎症性物質の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、「Ｐ−セレクチン」として知られている哺乳動物接着性蛋白質についての新規リガンドに指向される。
【背景技術】
【０００２】
炎症の間、白血球は血管内皮細胞に接着し、内皮細胞下組織に侵入するが、これは、セレクチンまたはＬＥＣ−ＣＡＭクラスの蛋白質が標的細胞上のリガンドへ特異的に結合することによって媒介される相互反応である。また、かかるセレクチン−媒介細胞接着は血栓性障害および寄生虫病でも起こり得るし、また、腫瘍細胞の転移性拡張において関与し得る。
セレクチン蛋白質はＮ−末端レクチン様ドメイン、表皮成長因子様ドメイン、および結合性蛋白質に相補的な相同性の領域によって特徴付けられる。かくして、これまで、３種のヒト・セレクチン蛋白質；Ｅ−セレクチン（以前のＥＬＡＭ−１）、Ｌ−セレクチン（以前のＬＡＭ−１）およびＰ−セレクチン（以前のＰＡＤＧＥＭまたはＧＭＰ−１４０）が同定されている。Ｅ−セレレチンはサイトカインによる活性化の数時間後に内皮細胞によって誘導され、好中球と内皮細胞との間のカルシウム依存相互性作用を媒介する。Ｌ−セレクチンは白血球の帰する受容体であって、Ｐ−セレクチンは活性化されると血小板の細胞表面に迅速に出現し、好中球または単球の血小板に対するカルシウム依存性接着を媒介する。また、Ｐ−セレクチンは内皮細胞のウェイベル−パラダ（Weibel-Palade)体でも見い出されており、これらの小胞からのその放出に際し、Ｐ−セレクチンはヒスタミンまたはトロンビン刺激内皮細胞への好中球の初期結合を媒介する。
【０００３】
セレクチンは標的細胞の表面に存在するリガンドとの特異的相互作用を通じて接着を媒介すると信じられている。一般に、セレクチンのリガンドは少なくとも部分的には炭水化物部位を含む。例えば、Ｅ−セレクチンは末端構造：
【化１】
0003668242.tif 000002
を有する炭水化物に結合し、また、末端構造：
【化２】
0003668242.tif 000003
[式中、Ｒは炭水化物鎖の残部である］
を有する炭水化物にも結合する。これらの炭水化物は公知の血液型抗原であって、各々、通常、シアル化Ｌｅｗｉｓｘ抗原およびシアル化Ｌｅｗｉｓｘという。内皮細胞の表面上にシアル化Ｌｅｗｉｓｘ抗原が単独で存在すると、Ｅ−セレクチン発現細胞への結合を促進するのに十分であろう。また、Ｅ−セレクチンは末端構造；
【化３】
0003668242.tif 000004
を有する炭水化物にも結合する。
Ｅ−セレクチンに関しては、各セレクチンは種々の親和性を持つ一定の範囲の炭水化物に結合するようである。また、セレクチン媒介接着事象の強度（結合親和性）は炭水化物の密度および細胞表面上のセレクチンの密度に依存するであろう。
【０００４】
Ｐ−セレクチンはＬｅｗｉｓｘ血液型抗原の非シアル化形を含有する炭水化物に結合するが、シアル化Ｌｅｗｉｓｘに対してより高い親和性を有する。また、Ｐ−セレクチンは、脂質抽出によって骨髄細胞および腫瘍細胞から単離された、異種３−硫酸化ガラクトシルセラミドであるスルファチドを認識する。しかしながら、Ｐ−セレクチンを担持する細胞の、Ｐ−セレクチンリガンドを担持する細胞への結合は、リガンド担持細胞がプロテアーゼで処理された場合は排除され、これは、Ｐ−セレクチンリガンドが糖蛋白質であり得ることを示す。
Ｐ−セレクチンについての２つの推定糖蛋白質リガンドが最近同定されており、そのうち１つは部分的に精製されている（非特許文献１参照）。しかしながら、これらの糖蛋白質のアミノ酸組成もアミノ酸配列も開示されていない。
【非特許文献１】ムーア（Moore)ら、ジャーナル・オブ・セリュラー・バイオロジー（J. Cell. Biol.)１１８，４４５−４５６（１９９２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記事情に鑑みると、新規Ｐ−セレクチンリガンドをコードするＤＮＡを得て、それによりコードされる新規Ｐ−セレクチンリガンド蛋白を得ることが本発明の課題である。さらに、新規Ｐ−セレクチンリガンド蛋白およびそれをコードするＤＮＡを含有する、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着に起因する疾病を治療するための医薬組成物を得ること、かかる細胞間接着の阻害剤を同定するためのアッセイを開発すること等も本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１の具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列を含み、該蛋白質は配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載したアミノ酸配列によって特徴付けられる組成物を提供する。また、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列を含み、該蛋白質は配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる組成物が提供される。さらに、本発明は、成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列を含み、該蛋白質は配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる組成物を提供する。もう１つの具体例において、本発明は、可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列を含み、該蛋白質は配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸によって特徴付けられる組成物を提供する。もう１つの具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列を含みり、該蛋白質は配列番号３に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明の単離されたＤＮＡ配列のいずれか１つを含む発現ベクターからなり、該ＤＮＡ配列は発現対照配列に作動可能に連結した組成物；前記ＤＮＡ配列のいずれか１を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞；および
（ａ）本発明のＤＮＡ配列のいずれか１つを含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を適当な培地中で培養し、
（ｂ）該培地からのＰ−セレクチンリガンド蛋白質を精製することを特徴とする、Ｐ−セレクレチンリガンド蛋白質の製法を提供する。
【０００７】
もう１つの具体例において、本発明は、配列番号：１のアミノ酸２１ないしアミノ酸４０２に記載したアミノ酸配列によって特徴付けられる蛋白質からなり、該蛋白質が実質的に他の哺乳動物蛋白質を含まない組成物を提供する。さらに、本発明は、配列番号：１のアミノ酸２１ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を含み、該蛋白質は他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まず、また、もう１つの具体例において、本発明は、配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質を含み、該蛋白質は他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まない。また、本発明は、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を含み、該蛋白質が他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まない組成物を提供する。さらに、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を含み、該蛋白質は他の哺乳動物蛋白質を実質的に含まない組成物が提供される。もう１つの具体例において、本発明は、配列番号３に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる蛋白質を含む組成物を提供する。
【０００８】
なおさらにもう１つの具体例において、本発明は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質について特異的な抗体を含む組成物を提供する。
もう１つの具体例において、本発明は、
（ａ）Ｐ−セレクチン蛋白質を、配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列、および配列番号３に記載されたアミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列によって特徴付けられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質とを組み合せ、ここに、該組合せは第１の結合混合物を形成し、
（ｂ）該第１の結合混合物中のＰ−セレクチン蛋白質とＰ−セレクチンリガンド蛋白質との間の結合の量を測定し、
（ｃ）化合物を、Ｐ−セレクチン蛋白質およびＰ−セレクチンリガンド蛋白質とを組み合わせて第２の結合混合物を形成し、
（ｄ）第２の結合混合物中の結合の量を測定し、次いで、
（ｅ）第１の結合混合物中の結合の量を第２の結合混合物中の結合の量と比較することを特徴とし、
ここに、該化合物は、第２の結合混合物中の結合の量の減少が起こる場合に、Ｐ−セレクチン媒介細胞間接着を阻害できることを特徴とするＰ−セレクチン媒介細胞間接着の阻害剤を同定する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新規Ｐ−セレクチンリガンドをコードするＤＮＡ、およびそれによりコードされる新規Ｐ−セレクチンリガンド蛋白が提供される。さらに、新規Ｐ−セレクチンリガンド蛋白およびそれをコードするＤＮＡを含有する、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着に起因する疾病を治療するための医薬組成物、かかる細胞間接着の阻害剤を同定するためのアッセイ等も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、まず、ヒト内皮細胞および血小板上のＰ−セレクチンについてのリガンドとして作用する蛋白質をコードする新規ＤＮＡを同定し、単離した。Ｐ−セレクチンリダンド蛋白質の完全なアミノ酸配列（すなわち、成熟ペプチド＋リーダー配列）は、配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる。疎水性分析および公知の切断パターンとの比較は、２０ないし２２個のアミノ酸のシグナル配列、すなわち、配列番号１のアミノ酸１ないし２０またはアミノ酸１ないし２２を予測させる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質は配列番号１のアミノ酸３８−４１においてＰＡＣＥ（対となった塩基性アミノ酸変換酵素）切断部位（−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−）を含有する。本発明の成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質は配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態は配列番号１のアミノ酸２１ないし３１０を含有することによって特徴付けられる。成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質のもう１つの可溶性形態は配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態は、さらに、室温にて水性溶液に溶解することによって特徴付けられる。勿論、これらの蛋白質をコードする配列番号１に記載された対応するＤＮＡ配列も本発明に包含される。
【００１１】
本発明のＰ−セレクチンリガンドは、以下の末端炭水化物；
【化４】
0003668242.tif 000005
［式中、Ｒは、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質または該Ｐ−セレクチンリガンド炭水化物に共有結合した脂質部位いずれかに直接共有結合した炭水化物鎖の残部である。さらに、本発明のＰ−セレクチンリガンド糖蛋白質は硫酸化されるか、あるいは翻訳後に修飾されている。ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞で発現されるごとく、全長Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質（配列番号１のアミノ酸１ないし４０２または配列番号１のアミノ酸４２ないし４０２）は、非還元性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されるごとく２２０ｋＤの見掛けの分子量を有するホモダイマー蛋白質である。
配列番号１のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の３つの領域は、細胞外ドメイン（配列番号１の約アミノ酸２１ないし３１０）、膜貫通ドメイン（配列番号１の約アミノ酸３１１ないし３３２）、および細胞内、細胞質ドメイン（配列番号１の約アミノ酸３３３ないし４０２）である。細胞外ドメインは、Ａｓｎ残基６５、１１１および２９２で開始する潜在的Ｎ−連結糖鎖付加の３つのコンセンサストリペプチド部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）を含む。さらに、細胞外ドメインは、残基４６、４８および５１においてチロシン硫酸化の３つの潜在的な部位を含有する。残基５５−２６７からなる領域は、１０のアミノ酸コンセンサス配列Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ／Ｌｅｕ−Ａｌａ／Ｔｈｒ（式中、ＸはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり得る）の１５のデカマー反復のサブドメインを含めた、高パーセントのプロリン、セリンおよびスレオニンを含有する。これらのごとき領域は高度にＯ−グリコシル化された蛋白質が特徴的である。
【００１２】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする遺伝子および（α１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼ（以下、３／４ＦＴという）をコードする遺伝子で共トランスフェクトされたＣＯＳまたはＣＨＯ細胞は、その表面にＰ−セレクチンを発現するＣＨＯ細胞に結合できるが、その表面にＰ−セレクチンを発現していないＣＨＯ細胞に結合することができない。Ｐ−セレクチンに結合するためには、精製された形態またはＣＨＯ細胞の表面で発現されている形態において、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする遺伝子を、３／４ＦＴをコードする遺伝子で共トランスフェクトしなければならない。というのは、他の不存在下におけるいずれかの遺伝子のトランスフェクションはＰ−セレクチン結合活性をなくするか、あるいは実質的に減少させるからである。本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質のＰ−セレクチンへの結合は、ＥＤＴＡによってまたはＰ−セレクチンに特異的な中和モノクローナル抗体によって阻害できる。本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質のＰ−セレクチンへの結合は、Ｐ−セレクチンについて特異的な中和モノクローナル抗体またはイソタイプ対照によっては阻害されない。これらの結果は、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の結合特異性を特徴付ける。
【００１３】
本発明の目的では、蛋白質が、実施例４のＣＨＯ−Ｐ−セレクチン結合アッセイにおけるごとく細胞表面に存在するＰ−セレクチンに、あるいは例えば実施例４のキメラＰ−セレクチン−ＩｇＧγ１蛋白質がペトリ皿に付着するごとく、もう１つの表面に付着するＰ−セレクチンにカルシウム依存的に結合する場合は、「Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質活性」を有するものと定義される。すなわち、本明細書中では、「Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質」、もしくは「Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白質」もしくは単に「Ｐ−セレクチンリガンド」と言い換える。
【００１４】
本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の糖鎖付加状態は、実施例５（Ｃ）に詳細に記載され、ｓＰＳＬ.Ｔ７と命名するＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性キメラ形態を用いて調べた。３／４ＦＴで共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞から生じたｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白質は、実施例６（Ｃ）に詳細に記載するごとく翻訳後グリコシル化によって大いに修飾されている。かくして、そのうち少なくともいくつかがシアル化されているＮ−およびＯ−連結オリゴ糖鎖は共に本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質上に存在すると考えられる。
【００１５】
また、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質はＥ−セレクチンにも結合することができる。ｓＰＳＬ.Ｔ７をコードするＤＮＡおよび３／４ＦＴ〜コードするＤＮＡで共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの条件培地は、プラスチック製マイクロタイタープレートのウェルに被覆した場合、Ｅ−セレクチンを発現するＣＯＳ細胞がプレートへ結合するのを引き起こす。しかしながら、Ｅ−セレクチンを発現していないＣＨＯ細胞はかかるプレートに結合しない。Ｅ−セレクチンを発現するＣＨＯ細胞の、ｓＰＳＬ.Ｔ７をコードするＤＮＡおよび３／４ＦＴをコードするＤＮＡで共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの条件培地で被覆したマイクロタイタープレートへの結合は、ＥＤＴＡまたはＥ−セレクチンにつき特異的な中和抗体に存在化でなくされる。ｓＰＳＬ.Ｔ７ ＤＮＡのみでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの条件培地は、マイクロタイタープレートのウェルに被覆された場合、Ｅ−セレクチンを発現するＣＨＯ細胞の結合を引き起こさない。これらの理由で、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、Ｐ−セレクチン媒介細胞間接着に加え、Ｅ−セレクチン媒介細胞間接着の阻害剤として有用であると考えられる。
【００１６】
Ｐ−セレクチンと相互作用できる、またはＰ−セレクチン媒介細胞間接着を阻害できるＰ−セレクチンリガンド蛋白質の断片も本発明に含まれる。かかる断片は配列番号１のアミノ酸２１ないし５４（低頻度のセリンおよびスレオニン残基を有するＰ−セレクチンリガンド蛋白質の領域）；配列番号１のアミノ酸５５ないし１２７（アスパラギン連結糖付加についての２つのコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に加えて、高頻度のプロリン、セリンおよびスレオニンを有する）；もう１つのより大きい断片である配列番号１のアミノ酸１２８ないし２６７（高頻度のプロリン、セリンおよびスレオニンを有し、かつ以下の１０のアミノ酸コンセンサス配列：Ａｌａ−（Ｔｈｒ／Ｍｅｔ）−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−（Ｐｒｏ／Ａｒｇ／Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｇｌｕ）−（Ｌｅｕ／Ｐｒｏ）−（Ａｌａ／Ｔｈｒ）の１５反復を含む）（この大きな断片内のより小さい断片もまたＰ−セレクチンと相互作用し、またはＰ−セレクチン−媒介細胞間接着の阻害剤として作用する能力を保持し得る）；アスパラギン連結糖鎖付加についてのコンセンサス配列を含有し、配列番号１のアミノ酸２６８ないし３０８を含む領域；配列番号１のアミノ酸３０９ないし３３３によって表される蛋白質の疎水性領域ｌ；およびアミノ酸３３４ないし４０２のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の両親媒性領域を含む。さらなる断片は配列番号１のアミノ酸４３ないしアミノ酸５６を含み、アミノ酸４６、アミノ酸４８および／またはアミノ酸５１において１個またはそれ以上の硫酸化チロシンを持つ。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の断片は線状形態であるか、あるいは、例えばここに引用して本明細書の一部とみなすエイチ・ユー・サラゴビ（H. U. Saragovi)ら、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology)１０、７７３−７７８（１９９２）およびアール・エス・マクドウェル（R. S. McDowell)ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイェティ（J. Amer. Chem. Soc.)１１４、９２４５−９２５３（１９９２）に記載されているごとき公知の方法によって環化することができる。本発明の目的では、「Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質」へのすべての言及はＰ−セレクチンに結合できる断片も含む。
【００１７】
かかる断片は、免疫グロブリンのごときキャリアー分子に融合させて、Ｐ−セレクチンリガンド結合部位の価数を増加させることができる。例えば、配列番号１のアミノ酸４２ないしアミノ酸２９５の断片のごとき、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態は、「リンカー」配列を通じて、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させることができる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の二価形態については、かかる融合は、実施例５（Ｄ）および配列番号６におけるごとく、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対して行うことができる。他の免疫グロブリンのイソタイプを用いてかかる融合を生じさせることもできる。例えば、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質−ＩｇＭ融合は本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質のデカ価形態を生じるであろう。
【００１８】
後記する実施例に詳細に記載するごとく、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、最初、発現クローニングアプローチによって得られた（クラーク（Clark)、米国特許第４,６７５,２８５号）。ｃＤＮＡライブラリーはヒト前骨髄細胞系ＨＬ６０から構築した（エス・ジェイ・コリンズ（S.J.Collins)ら、ネイチャー（Nature)２７０、３４７−３４９（１９７７）、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２４０）。このライブラリーを３／４ＦＴをコードするＤＮＡでＣＯＳ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクト体を、Ｐ−セレクチンの細胞外部分およびヒトＩｇＧγ１モノクローナル抗体のＦｃ部分を含むキメラ分子への結合につきスクリーニングした。キメラＰ−セレクチンに結合した共トランスフェクト体はＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードするｃＤＮＡが豊富であった。このスクリーニングプロセスを数回繰り返して、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードするｃＤＮＡについてのプラスミド集団を豊富とした。第２のクローニング段階では、該豊富化プラスミド集団を３／４ＦＴ遺伝子で再度ＣＯＳ細胞に共トランスフェクトし、細胞表面でＰ−セレクチンを発現する蛍光標識ＣＨＯ細胞系への結合につきスクリーニングした。単一のｃＤＮＡクローンはこのアプローチから得られ、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５と命名した。該ｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミドは１９９２年１０月１６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９０９６が付与された。
本発明の１つの新規ＤＮＡを配列番号１に記載する。本発明の該ＤＮＡは種々の形態のＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードできる。例えば、１つの具体例において、本発明のＤＮＡ配列は、配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸４０２に記載したアミノ酸配列を有する完全なＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする。もう１つの具体例において、本発明のＤＮＡ配列は、シグナル配列を欠き、配列番号：１のアミノ酸２１ないしアミノ酸４０２に記載したアミノ酸配列によって特徴付けられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質の形態をコードする。さらにもう１つの具体例において、本発明のＤＮＡ配列は、配列番号：１のアミノ酸４２ないしアミノ酸４０２に記載したアミノ酸配列によって特徴付けられる成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする。本発明のＤＮＡ配列のもう１つの具体例は、配列番号：１のアミノ酸１ないしアミノ酸３１０に記載したアミノ酸配列によって特徴付けられるＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態をコードする。また、本発明のＤＮＡは、成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態をコードする配列に具体化され、該蛋白質はアミノ酸４２ないしアミノ酸３１０の反列番号１に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる。本発明のＤＮＡは、さらに、シグナル配列を欠くＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態をコードするＤＮＡに具体化され、該蛋白質は配列番号：１のアミノ酸２１ないしアミノ酸３１０に記載されたアミノ酸配列によって特徴付けられる。本発明のＤＮＡは他のヒトＤＮＡとの関連はなく、かくして、単離されたＤＮＡとして特徴付けられる。前記にて詳細に記載したごとく、Ｐ−セレクチンと相互作用するＰ−セレクチンリガンド断片をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００１９】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質ｍＲＮＡ転写体の発現は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質ｃＤＮＡプローブを用いるノーザン分析によって、種々のヒト細胞系（ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７）において、およびヒト単球および多形核白血球で観察されている。これらの細胞系のすべてにおいて、２.５ｋｂの主要転写体が観察された。ほぼ４ｋｂの従たる種はＨＬ６０およびＵ９３７細胞系で、および多形核白血球で観察された。対照的に、Ｐ−セレクチンリガンドｍＲＮＡ発現はヒト肝芽細胞腫細胞系ＨｅｐＧ２で検出された。
【００２０】
本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質は単一コピーの遺伝子によってコードされ、サザーンブロット分析によって測定されたごとく、マルチ遺伝子ファミリーの一部ではない。本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質のゲノミック形態は、５’非翻訳領域のヌクレオチド５４に位置する約９ｋｂの大きいイントロンを含有する。多形白血球および単球において、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質は配列番号３に記載されたＤＮＡ配列によってコードされる。この具体例において、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質は１６の反復領域を含有する。本発明の単離されたＤＮＡは、対応して、配列番号３に記載されたＤＮＡ配列に具体化され、プラスミドｐＰＬ８５Ｒ１６に含有され、これは、１９９３年１０月２２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号７５５７７が付されている。
【００２１】
本発明は配列番号：１として記載される単離されたＤＮＡまたは配列番号：３として記載される単離されたＤＮＡの対立遺伝子変種も包含し、すなわち、Ｐ−セレクチンリガンドの活性を有する蛋白質もコードする、配列番号：１または配列番号：３として記載される単離されたＤＮＡの天然に生じた別の形態を含有する。本発明には、緊縮（例えば６５℃にて４×ＳＳＣまたは５０％ホルムアミドおよび４２℃にて４×ＳＳＣ）、または緩和（５０℃にて４×ＳＳＣまたは４２℃にて３０−４０％のホルムアミド）条件下で配列番号：１として記載されるＤＮＡまたは配列番号：３で記載されるＤＮＡにハイブリダイズする単離されたＤＮＡも含有され、これらはＰ−セレクチンリガンド活性を有する。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードするが遺伝暗号の縮重のために配列番号：１で記載されるＤＮＡまたは配列番号：３で記載されるＤＮＡとは異なり、かつＰ−セレクチンリガンド蛋白質活性を有する単離されたＤＮＡ配列も本発明に含有される。Ｐ−セレクチンンリガンド活性、半減期および産生レベルを増大する点突然変異または誘導された修飾により引き起こされた配列番号：１で記載されるＤＮＡまたは配列番号：３で記載されるＤＮＡの変種も本発明に含有される。本発明の目的のために、「配列番号：１のＤＮＡ」に対する本明細書中のすべての言及は、配列番号：１で記載される特異的なＤＮＡ配列に加えて、配列番号：１の成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ配列；Ｐ−セレクチンに結合可能な配列番号：１のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするＤＮＡ配列；配列番号：１のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶な形をコードするＤＮＡ配列；配列番号：１のＤＮＡ配列の対立遺伝子変種；配列番号：１のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ類；遺伝子コードの縮重のために配列番号：１のＤＮＡと異なるＤＮＡ類；および上記で記載される配列番号：１のＤＮＡ配列の変種を含有する。同様に、「配列番号：３」に対する本明細書中のすべての言及は、配列番号：３で記載される特異的なＤＮＡ配列に加えて、配列番号：３の成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ配列;Ｐ−セレクチンに結合可能な配列番号：３のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の断片をコードするＤＮＡ配列；配列番号：３のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶な形をコードするＤＮＡ配列；配列番号：３のＤＮＡ配列の対立遺伝子変種;配列番号：３のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ類；遺伝子コードの縮重のために配列番号：３のＤＮＡと異なるＤＮＡ類;および上記で記載される配列番号：３のＤＮＡ配列の変種を含有する。
【００２２】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶形をコードするＤＮＡは、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の細胞膜内及び細胞質ドメインをコードする領域を欠失させおよび／または停止コドンを細胞外ドメインのカルボキシ末端アミノ酸コドンの３’側に誘導した修飾されたＤＮＡの発現により調製し得る。例えば、疎水性分析により、配列番号：１で記載されるＰ−セレクチンリガンド蛋白質が配列番号：１のアミノ酸３１１から３３２で構成される膜貫通ドメインおよび配列番号：１のアミノ酸３３３から４０２で構成される細胞質ドメインを有することを予言する。上記のように記載された修飾されたＤＮＡは、当該分野で公知の部位特異的変異誘発法または適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応を含む標準的分子生物学的方法により作成される。種々の可溶なＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードする数種のＤＮＡを生産する方法が実施例５に記載されている。
【００２３】
本発明の単離されたＤＮＡはＰ−セレクチンリガンドを遺伝子組換え的に生産するために、カウフマン（Kaufman)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.)１９、４４８５−４４９０（１９９１）に開示されているｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのごとき発現制御配列に作動可能に連結し得る。多くの適当な発現制御配列が当該分野で公知である。遺伝子組み換え蛋白質の発現の一般的方法も公知であってアール・カウフマン（R. Kaufman)のメソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology)１８５、５３７−５６６（１９９０）に例示されている。本明細書中に定義されるように「作動可能に連結する」とは、連結されたＤＮＡ／発現制御配列により形質転換された（トランスフェクトされた）宿主細胞によりＰ−セレクチンリガンド蛋白質が発現されるような方法で本発明の単離されたＤＮＡと発現制御配列の間に酵素的または化学的に共有結合を形成するように結合することを意味する。
【００２４】
対合するアミノ酸配列（例えば、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−  および  −Ａｒｇ−Ａｒｇ−）のカルボキシル側で前駆体ペプチドを切断して成熟蛋白質を得るいくつかの内部蛋白質分解酵素が公知である。このような酵素は一般的に対合した塩基性アミノ酸変換酵素またはＰＡＣＥとして公知であり、成熟ペプチドの遺伝子組換え的生産におけるそれらの使用はＷＯ９２／０９６９８および米国特許第０７／８８５，９７２号に開示されており、引用して本明細書の一部とする。酵素のＰＡＣＥファミリーは組換え宿主細胞中での前駆体ポリペプチドの蛋白質分解的プロセッシングの効率を増加することが公知である。上記で言及したように、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質はこのようなＰＡＣＥ切断部位を有する。
【００２５】
本発明の可溶な成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質は本明細書中に記載されるようないかなる可溶なＰ−セレクチンリガンド蛋白質をもコードするＤＮＡ配列またはＷＯ９２／０９６９８および米国特許第０７／８８５，９７２号に記載され引用して本明細書の一部としているＰＡＣＥをコードするＤＮＡ配列を含有する宿主細胞によってまたは、配列番号：５のＤＮＡ配列を用いて生産され得る。このような宿主細胞は可溶なＰ−セレクチンリガンド蛋白質ＤＮＡ及びＰＡＣＥＤＮＡをそれぞれ含有する別々の発現ベクターの共トランスフォメーションまたは連続したトランスフォーメーションの結果として生じたＤＮＡを含有する。３／４ＦＴをコードする第三のＤＮＡもまたＰ−セレクチンリガンド蛋白質及びＰＡＣＥをそれぞれコードするＤＮＡによって共トランスフォーメーションされる。あるいはまた、宿主細胞は可溶なＰ−セレクチンリガンド蛋白質ＤＮＡおよびＰＡＣＥＤＮＡの双方を含有する単一の発現ベクターのトランスフォーメーションの結果として生じたＤＮＡを含有していてもよい。このような発現ベクターの構築は分子生物学の通常の技術のレベルにある。共トランスフォーメーション及びトランスフォーメーションの方法もまた公知である。
【００２６】
ＰＡＣＥをコードする多くのＤＮＡ配列が公知である。例えば、フリンとして公知であるＰＡＣＥの一つの形をコードするＤＮＡがエイ・エム・ダブリュー・ファン・デン・オウウェランド（A. M. W. van den Ouweland)らの、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl. Acids Res.)１８、６６４（１９９０）に開示されており、ここに引用して本明細書の一部とする。ＰＡＣＥＳＯＬとして公知であるＰＡＣＥの可溶な形をコードするｃＤＮＡは、配列番号：５に記載されている。他の形のＰＡＣＥをコードするＤＮＡもまた存在し、このようないかなるＰＡＣＥをコードするＤＮＡも、ＰＡＣＥがＰ−セレクチンリガンド蛋白質を３８−４１のアミノ酸の部分で切断可能な限り、本発明の可溶な成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を生産するのに用いることができる。好ましくは、ＰＡＣＥの可溶な形をコードするＤＮＡは本発明の可溶な成熟Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を生産するのに用いられる。
【００２７】
別々または一緒に、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質およびＰＡＣＥの可溶な形をコードするＤＮＡはＰＡＣＥで切断された可溶なＰ−セレクチンリガンド蛋白質を組み換え的に生産するために、上記で述べたｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターを含有するような発現制御配列に作動可能に連結し得る。付加的な適当な発現制御配列は当該分野で公知である。下記の実施例３(Ｃ)および３（Ｄ)は本発明の可溶な成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質を生産する方法を記載する。
【００２８】
多数の細胞の型がＰ−セレクチンリガンド蛋白質の発現のための適当な宿主細胞として作用する。適当な宿主細胞は機能的なＰ−セレクチンリガンド蛋白質に特徴的な炭水化物側鎖を付けることが可能である。このような能力は天然に生じたか、化学的突然変異により誘導されるか、グリコシル化酵素をコードするＤＮＡ配列を含有する適当な発現プラスミドによる宿主細胞のトランスフェクションによる、宿主細胞中での適当なグリコシル化酵素の存在のおかげで生じ得る。
宿主細胞は、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類の細胞系統、通常の二倍体細胞、一次組織、一次外植体、ヒーラ細胞、マウス・Ｌ細胞、ＢＨＫ、Ｕ９３７、またはＨａＫ細胞のイン・ビトロの培養由来の細胞株を含有する。
【００２９】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質はまた本発明の単離されたＤＮＡおよび、１つまたはそれ以上の、適当なグリコシル化酵素をコードするＤＮＡと、１つまたはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に、作動可能に連結し、昆虫発現システムを働かせることにより生産され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現システムのための材料と方法は、例えば、インビトローゲン（Invitrogen)、サンディエゴ(San Diego)、カリフォルニア（California)、アメリカ合衆国（U. S. A.)からのキット(ザ・マックスバックＲ・キット（the MaxBacＲ kit)として商業的に入手可能であり、このような方法はサマーズ（Summers)とスミス(Smith)の、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメント・スティション・ブラティン（Texas Agricultural Experiment Station Bulletin)１５５５（１９８７）（これを引用して本明細書の一部とする）に記載されているように、当該分野でよく知られている。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶な形はまた適当な単離されたＤＮＡを用いて昆虫細胞中で生産することができる。ＰＡＣＥの形をコードするＤＮＡは、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質のＰＡＣＥで切断された形を生産するために、さらに昆虫宿主細胞中で共発現され得る。
【００３０】
あるいはまた、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を酵母のごとき下等な真核生物において、または細菌のごとき原核生物において生産し得る。潜在的に適当な酵母の株はサッカロマイセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）株、カンディダ(Candida)、またはヘテロロガスな蛋白質を発現可能ないかなる酵母の株も含む。潜在的に適当な細菌の株はエスヒェリキア・コーライ（Escherichia coli）、バシルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium)、またはヘトロロガスな蛋白質を発現可能ないかなる細菌の株をも含む。もしＰ−セレクチンリガンド蛋白質が酵母または細菌で作られれば、グリコシル化されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質を得るために、蛋白質部分の適当な部位に適当な炭水化物を付けることが必要である。このような共有結合の接着は公知の化学的または酵素的方法を用いて成し遂げることができる。
【００３１】
本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、例えば、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有する体細胞または生殖細胞により特徴づけられるトランスジェニック雌ウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳として、トランスジェニック動物の生産物としても発現し得る。
【００３２】
本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質はＰ−セレクチン結合糖蛋白質を発現するのに必要な培養条件下で、形質転換された宿主細胞を培養することにより調製し得る。得られた発現された糖蛋白質を次いで培養培地または細胞抽出液から精製することができる。本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶な形はレンチル・レクチン−セファロース（Lentil lectin-SepharoseＲ）のアフィニティークロマトグラフィーに付して精製することができ、続いて０.５Ｍ  α−メチル−マンノシドで溶出する。溶出した可溶なＰ−セレクチンリガンド蛋白質は次いでさらに精製することができ、０−７０％硫酸アンモニウム沈澱のステップにより濃縮することができる。蛋白質を次いで回収し、再懸濁し、さらにＴＳＫ  Ｇ４０００ＳＷＸＬのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。他の方法として、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の全長形は発現している細胞からの全膜画分を調製し、膜をトリトン  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤で抽出することにより精製し得る。界面活性剤抽出物は次いで固定化されたＰ−セレクチンからなるアフィニティーカラムを通り過ぎ、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質はカラムから０.１％の界面活性剤を含有する緩衝液中の１０ｍＭ  ＥＤＴＡにより溶出することができる。アフィニティーカラムから溶出された物質は次いでＥＤＴＡを除去するために透析され、さらにレンチル・レクチン・セファロースＲ（Lentil lectin-SepharoseＲ）のアフィニティーカラムに付して精製することができ、また０.５Ｍ  α−メチル−マンノシドで溶出する。
【００３３】
他の方法として、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、例えばアミコン（Amicon)またはミリポア・ペリコン（Millipore Pellicon)限外濾過ユニットのような商業的に入手可能な蛋白質濃縮フィルターを用いて濃縮できる。濃縮ステップに続き、濃縮物はゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに付すことができる。他の方法として、アニオン交換樹脂は、例えば、ペンダント・ジエチルアミノエチル（DEAE)基を有するマトリックスまたは基質に用いることができる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは普通に蛋白質精製に用いられる他の形であり得る。他の方法として、カチオン交換ステップを用いることができる。適当なカチオン交換体はスルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性のマトリックスを含む。スルホプロピル基が好ましい（例えば、Ｓ−セファロースＲ（SepharoseＲ)カラム類）。培養上清からのＰ−セレクチンリガンド蛋白質の精製は、コンカナバリン  Ａ−アガロース、ヘパリン−トヨオパールＲまたはシバクロンブルー  ３ＧＡ  セファロースＲのごときアフィニティー樹脂によるもう１つまたはそれ以上のカラムステップを含む
か；またはフェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いた疎水相互作用クロマトグラフィー；または免疫親和性クロマトグラフィーを含む。
【００３４】
最終的に、例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有する疎水性のＲＰ−ＨＰＬＣ媒体を用いる１またはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフイーが、さらにＰ−セレクチンリガンド蛋白質を精製するために用いることができる。前述の精製ステップのいくつかまたは全てが、種々の組み合わせで、実質的に同質の単離された組換え蛋白質を供給するために用いることができる。次いで精製されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は実質的に他の哺乳類の蛋白質を含まず、本発明に関しては、「単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質」として定義される。
【００３５】
単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質はＰ−セレクチンにより媒介された細胞間接着により特徴づけられる症状の処置において有用であり得る。そのような状態は、制限なしに、心筋梗塞、細菌またはウイルス感染、転移性状態、関節炎のごとき炎症性異常、急性呼吸困難症候群、喘息、気腫、遅れた形の過敏性反応、全身エリマトーデス、やけどまたは凍傷のごとき温度による傷害、自動免疫甲状腺炎、実験性アレルギー脳髄脊髄炎、多数の硬化症、外傷に対する二次的な多数の臓器障害症候群、糖尿病、レナード（Renaud's)症候群、好中球性皮膚病(スウィート(Sweet）症候群)、炎症性の腸の病気、グレーブ(Grave）病、腎糸球体腎炎、歯肉炎、歯周病、溶血性尿毒性症候群、潰瘍性大腸炎、クローン（Crohn)病、壊死性全腸炎、潰瘍性の輸血に関する症候群、サイトカイン誘導の毒性のごときものを含む。単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は臓器移植において、移植のための臓器を調製するためと臓器移植の拒絶を抑えるためにも有用である。単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は血液透析またはロイコフォレシス（leucophoresis)の患者を治療するのに用いることができる。付加的には、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は抗−転移剤として用いることができる。単離したＰ−セレクチンリガンド蛋白質はそれ自体Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着の阻害剤として用いることができるし、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着の阻害剤を設計するのに用いることもできる。本発明は、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質を含む医薬組成物ならびに単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質を用いる治療の治療方法または使用の双方を含有する。
【００３６】
細胞から精製されるかまたは、組換え的に生産された、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、医薬的に許容される担体と組み合わせた場合に医薬組成物として用いることができる。このような組成物には、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質および担体に加え、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、ならびに他の当該分野でよく知られた物質を含ませることができる。「医薬的に許容される」とは、活性成分（類）の生物学的活性の効率に影響しない毒性のない物質を意味する。担体の特質は投与の経路に依存するであろう。本発明の医薬組成物はサイトカイン類、リンホカイン類、またはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞ファクター、およびエリトロポエチンをも含有する。医薬組成物はプラスミノーゲンアクチベーターまたはファクターＶＩＩＩのごとき血栓溶解性または抗−血栓症ファクターを含有させることができる。医薬組成物はさらに他の抗−炎症剤を含有する。このような付加的なファクターおよび／または薬剤は単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質に相乗的効果を生み出すかまたは単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質により引き起こされる副影響を最小限にするために医薬組成物のなかに含有することができる。逆に言えば、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血ファクター、血栓溶解または抗−血栓症ファクター、もしくは抗−炎症剤による副作用を最小限にするための具体的なサイトカイン、リンホカイン、他の造血ファクター、血栓溶解もしくは抗−血栓症ファクター、または抗−炎症剤の処方中に含有することができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は他の医薬上許容される担体に加え、ミセルとして集合して存在する脂肪、不溶性の単分子層、液晶、水溶液中のラメラ層のごとき両親媒性の薬剤と共に、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質が結合しているリポソームの形の中にある。リポソームの処方の調製は、制限なしに、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソロイシン、リン脂質、サポニン、胆汁酸のごときものを含有する。このようなリポソーム処方の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，７３７，３２３号の中において開示されているように当該分野の技術の範囲内であり、これらすべてを引用して本明細書の一部とする。
【００３８】
本明細書で用いられるように、「治療学的有効量」という用語は、例えば、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞接着またはこのような状態の治癒の増加速度によって特徴づけられる有意義な患者の利益を示すのに十分な医薬組成物または方法の、各活性成分の全体量を意味する。一つだけ投与される、個々の活性成分を適用する場合には、この用語はその成分のみに言及する。組み合わせて適用される場合は、この用語は、連続してあるいは同時に投与されても、治療効果に帰する活性成分の組み合わされた量に言及する。
【００３９】
本発明の治療方法または使用を実行するために、Ｐ−セレクチンにより媒介される病気の状態の哺乳類に、単離したＰ−セレクチンリガンド蛋白質の治療学的有効量を投与した。単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は単一または、サイトカイン、リンホカイン、もしくは他の造血ファクターを用いる治療のごとき他の治療と組み合わせて、本発明の方法に従い投与することができる。１つまたはそれ以上のサイトカイン、リンホカイン、または他の造血ファクターと共投与する場合は、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は、サイトカイン（類）、リンホカイン（類）、他の造血ファクター（類）、血栓溶解または抗−血栓ファクターと同時にまたは連続して投与することができる。もし連続して投与されるとすれば、治療している医師はサイトカイン（類）、リンホカイン（類）、他の造血ファクター（類）、血栓溶解または抗−血栓症ファクターと組み合わせた単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の投与の適当な順番を決定するであろう。
【００４０】
医薬組成物においてまたは本発明の方法を実行するための単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の投与は、経口摂取、吸入、または経皮、皮下、もしくは静脈内注射のごとき種々の通常の方法において行うことができる。患者への静脈内投与が好ましい。
単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の治療学的有効量が経口で投与される場合、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は錠剤、カプセル剤、散剤、溶液またはエリキシルであるであろう。錠剤の形で投与される場合、本発明の医薬組成物は付加的にゼラチンのような固体の担体又はアジュバントを含有することができる。錠剤、カプセル剤、および散剤は、約５ないし９５％の単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質を含有するが、好ましくは２５ないし９０％の単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質を含有する。液体の形で投与される場合、水、石油、およびピーナッツ油、ミネラルオイル、大豆油、または胡麻油のごとき動物または植物起源の油、もしくは合成油のような液体の担体が添加されてよい。医薬組成物の液体形はさらに生理的食塩溶液、デキストロースまたは他の糖類の溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコール類を含有する。液体の形で投与する場合、該医薬組成物は単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の重量にして０.５ないし９０％を含有し、好ましくは単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の１ないし５０％を含有する。
【００４１】
単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の治療学上有効量が静脈内、経皮または皮下注射により投与される場合、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質は発熱物質を含まない、非経口で許容される水溶液の形であるであろう。ｐＨ、等張性、安定性のごときものを考慮した、このような非経口で許容される蛋白質溶液の調製は、当該分野の技術の範囲内である。静脈内、経皮、または皮下の注射のための好ましい医薬組成物は、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質に加えて、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸で処理したリンガー注射液のごとき等張ビヒクル、または当該分野で公知の他のビヒクルを含ませるべきである。本発明の医薬組成物は安定剤、保存料、緩衝液、酸化防止剤、もしくは当該分野で公知の他の付加物も含ませることができる。本発明の医薬組成物における単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の量は、治療されるべき状態の性質および重症度に依存し、患者が経験した以前の治療の性質に依存するであろう。突極的には、治療している医師は各患者を治療するための単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の量を決定するであろう。最初に、治療している医師は単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質の低い用量を投与し、患者の反応を観察するであろう。単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質のさらに多くの用量が、患者にとって最適の治療効果が得られるまで投与され、その時点で該用量はそれ以上増加しない。本発明の方法を実行するために用いられる種々の医薬組成物は、単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質を体重１ｋｇ当たり約０.１μｇないし約１００ｍｇ含有するべきであるということが予期されるであろう。
【００４２】
本発明の単離されたＰ−セレクチンリガンド蛋白質はＰ−セレクチンリガンド蛋白質と特異的に反応するまたはＰ−セレクチンに媒介される細胞接着を阻害するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を得るために動物を免疫するためにも用いることができる。このような抗体は全Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質を免疫原として用いるか、可溶性の成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質のようなＰ−セレクチンリガンド蛋白質の断片を用いることにより得られる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質のより小さい断片は、以下に記載される断片のように、動物を免疫するために用いることもできる：配列番号：１のアミノ酸４２ないし５６、または配列番号：１のアミノ酸１２７ないしアミノ酸１３８。付加的なペプチド免疫原は、アラニン残基をペプチドのアミノ末端に添加した配列番号：１のアミノ酸２３８ないしアミノ酸２４８からなる。もう一つのペプチド免疫原は硫酸化されたチロシンを４６、４８または５１のいずれかまたは全ての位置に有する配列番号：１のアミノ酸４３ないしアミノ酸５６からなる。ペプチド免疫原は付加的にはカルボキシル末端にシステイン残基を有し、鍵穴カサガイ・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のごとき部分抗原に結合する。付加的なペプチド免疫原はチロシン残基を硫酸化されたチロシン残基と置換することにより生じる。このようなペプチドを合成する方法は、例えば、アール・ピー・メリフィールド（R. P. Merrifield)の、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J. Amer. Chem. Soc.)、８５、２１４９−２１５４（１９６３）；ジェイ・エル・クルステナンスキー（J. L. Krstenansky)ら、ＦＥＢＳ・レターズ（Lett.)２１１、１０（１９８７）にあるように、当該分野で公知である。
【００４３】
Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白質またはＰ−セレクチンリガンド糖蛋白質に特徴的な複雑な炭水化物基に結合するモノクローナル抗体は炎症の病気および数種の癌の免疫検出のための診断薬剤として使用することができる。小さい細胞の肺がん腫のごときいくつかの癌細胞は、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の検出可能なレベルを発現することができる。癌細胞によるＰ−セレクチンリガンド蛋白質のこの異常な発現はこれらの細胞の転移において役割を演ずる。
Ｐ−セレクチンリガンド糖蛋白質、あるいはＰ−セレクチンリガンド糖蛋白質に対し特徴的な複雑な炭水化物に結合するモノクローナル抗体を中和することは双方の炎症の病気に対し有用な治療でもあり、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の異常な発現が含まれている癌のいくつかの形の治療においてもまた有用な治療である。これらの中和しているモノクローナル抗体はＰ−セレクチンリガンド蛋白質のセレクチンに媒介される細胞間接着機構を阻害することができる。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質の結合を阻害することにより、白血球の不適当な炎症の部位への接着はなくなるか顕著に減少する。癌細胞または白血病細胞の例のように、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質に対するモノクローナル抗体を中和することは、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質により媒介される癌細胞の転移の広がりを検出しまたは予防する際に有用である。加えて、これらの細胞に結合するモノクローナル抗体は、抗体に依存する細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を目的とし、次いで癌細胞を除去するのを助ける。Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質と反応するヒト・抗体はその生殖細胞系統中の遺伝子をコードするヒト・免疫グロブリンを含有するトランスジェニツク動物中で生産し得る。下記の実施例７はＰ−セレクチンリガンド蛋白質断片に特異的なウサギポリクローナル抗体の生産を記載する。
【００４４】
本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質はＰ−セレクチンリガンド蛋白質に結合可能であって、次いでＰ−セレクチンにより媒介される細胞間接着の阻害剤として作用する薬剤を探索するために用いることもできる。固定化されているかいないかにかかわらず、望む結合蛋白質を用いた結合アッセイは当該分野でよく知られており、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質を用いたこの目的のために使用することができる。適当な探索アッセイは、下記の実施例３に示されるように細胞に基づいていてよい。他の方法として、精製した蛋白質に基づく探索アッセイはこのような薬剤を同定するために用いることができる。例えば、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質は精製された形で担体上に固定化され、精製したＰ−セレクチンへの結合を潜在的阻害薬剤の存在下または非存在下で測定することができる。適当な結合アッセイは他の方法として、本発明のＰ−セレクチンリガンド蛋白質の可溶な形と共に担体上に固定化された精製されたＰ−セレクチンを用いることができる。
【００４５】
いかなるＰ−セレクチンリガンド蛋白質も上述の探索アッセイにおいて用いることができる。例えば、配列番号：１のアミノ酸１からアミノ酸４０２で記載される全長のＰ−セレクチンリガンド蛋白質を、阻害剤を探索するために用いることができ；あるいは配列番号：１のアミノ酸４２からアミノ酸４０２で記載される成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質は阻害剤を探索するために用いることかでき、または配列番号：１のアミノ酸４２からアミノ酸３１０で記載される可溶性の成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質は阻害剤を探索するために用いることができる。他の方法として、配列番号：３のアミノ酸１からアミノ酸４１２で記載されるＰ−セレクチンリガンド蛋白質、あるいは配列番号：３のアミノ酸４２からアミノ酸４１２で記載されるＰ−セレクチンリガンド蛋白質の成熟した形、または配列番号：３のアミノ酸４２からアミノ酸３２０で記載される可溶性の成熟したＰ−セレクチンリガンド蛋白質は本発明に関する細胞間接着の阻害剤を探索するために用いることができる。
【００４６】
このような探索アッセイにおいて、第一の結合混合物を、Ｐ−セレクチンおよびＰ−セレクチンリガンド蛋白質を結合させることにより形成し、第一の結合混合物の結合の量（Ｂ０）を測定する。第二の結合混合物はＰ−セレクチン、Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質、および探索されるべき薬剤の化合物を組み合わせることによりまた形成し、第二の結合混合物の結合の量（Ｂ）を測定する。第一および第二の結合混合物の結合量を、例えば、Ｂ／Ｂ０の計算を行うことにより比較する。
化合物または薬剤が、第一の結合混合物と比較して、第二の結合混合物の結合における減少が観察されるかどうかによって、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着を阻害できることが考慮される。結合混合物の処方と最適化は当該技術のレベルの範囲内であり、このような結合混合物は結合を増大するかまたは最適化するのに必要な緩衝液または塩も含有し、付加的な制御アッセイは本発明の探索方法内に含めることができる。
【００４７】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質のＰ−セレクチンへの結合活性を少なくとも約１０％、好ましくは５０％またはそれ以上減少させることが見いだされた化合物はこのように同定され、次いで、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンへの結合活性のアッセイ、およびイン・ビボアッセイを含めた他のセレクチン結合アッセイによって二次的に探索された。これらの手段によって、抗−炎症薬剤として適当で有り得るセレクチンにより媒介される細胞間接着に対する阻害活性を有する化合物を同定することができる。
【実施例１】
【００４８】
Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質遺伝子のクローニング
Ａ．ＨＬ６０  ｃＤＮＡライブラリーの構築
Ｐ−セレクチンリガンドの発現クローニングのためにＨＬ６０  ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ポリＡ＋  ＲＮＡを、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット（Fast Track mRNA Isolation Kit)（インビトローゲン（Invitrogen); San Diego(サンディエゴ), CA(カリフォルニア))を用い、ヒト・前骨髄細胞系統ＨＬ６０の全体のＲＮＡから単離した（エス・ジェイ・コリンズ（S. J. Collins))ら、上記）。二本鎖ｃＤＮＡをポリＡ＋  ＲＮＡ画分から合成しＥｃｏＲＩアダプター（５’−ＡＡＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧ−３’，５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧ−３’）により平滑末端で結合した。ｃＤＮＡを発現ベクターｐＭＴ２１（アール・カウフマン（R. Kaufman)ら、J. Mol. Cell. Biol.９、９４６−９５８（１９８９））に連結し、これをＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼと子ウシ胸腺アルカリホスファターゼと共に連続してインキュベートしゲルにより精製した。結合により生じた生成物を２μｌのアリコートでコンピテントなイー・コリ（E. coli)ＤＨ５α細胞に電気穿孔し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および２％グリセロールを追加した１ｍｌのＳＯＢ培地[ジェイ・サムブルック（J. Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning):ア・ラボラトーリー・マニュアル（A Laboratory Manual)、ニューヨーク(New York）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトーリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ｐ１．９０（１９８９）]中で３７℃において１時間成育させた。ライブラリーをより小さなサブセットに分けるために、細菌懸濁液の各１ｍｌずつからのアリコートをアンピシリンの存在下アガープレートにプレートし、１ｍｌ当たりのコロニー数を計算した。各コロニーが１つのｃＤＮＡを表しているとすると、６００,０００クローンが生じ、プール当たり約１６,０００クローンのサブセットに分けられた。３８プールの各々をアンピシリンの存在下Ｌ培地中で一晩成育させ、プラスミドをＣｓＣｌ勾配により精製した。
【００４９】
Ｂ．Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質遺伝子の探索
第一段階として、実施例４（Ａ）のＬＥＣ−γ１結合アッセイを、ＨＬ６０  ｃＤＮＡライブラリーをより分けそれにより興味のあるプラスミドを富ませるために使用した。各ＨＬ６０  ｃＤＮＡライブラリープールの６μｇを、２μｇのα  ３／４ＦＴ遺伝子と共にＣＯＳ細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクション後約４５時間で、ＣＯＳ細胞を３７℃で１５分間１ｍＭ  ＥＧＴＡ中でインキュベートし、続いて細胞リフターで削り取ることによりプレートから持ち上げた。細胞を１ｍＭ  カルシウムを含有するハンクス（Hanks）緩衝食塩溶液（ＨＢＳＳ）中で二回洗浄した。細胞は４ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁された。再懸濁されトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は実施例４（Ａ）に記載されるＬＥＣ−γ１結合アッセイを用いて探索された。
粘着したＣＯＳ細胞からのプラスミドはハーツ（Hirts）抽出物［ビィ・ハーツ（B. Hirts)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）２６、３６５−３６９（１９６７)]から得られ、次いで増幅のためにイー・コリ（E. coli)ＤＨ５α細胞中に電気穿孔した。プラスミドの富まされた集団はＣｓＣｌ勾配で精製され３／４ＦＴ遺伝子（実施例２）と共にＣＯＳ細胞中に再トランスフェクトされた。トランスフェクション、探索、およびプラスミド増幅の工程を、ＬＥＣ−γ１で覆われたプレートに結合したプールが視覚的に検出できるまで全部で３回繰り返した。陽性のプラスミドプールは続いてサブセットにこわされた。これは陽性プールからのハーツ抽出物をイー・コリＤＨ５α細胞に電気穿孔し、上記のごとくｍｌ当たりのコロニー数を定量することを含んだ。種々のプールの大きさが、アンピシリンの存在下アガープレート上のコロニーの前もって決定した数を数えることにより作られた。二連のプレートを、ニトロセルロースリフトを行い新しいアガープレート上でフィルターを保存することにより調製した。二連のプレートを陽性だと決定されるあらゆるプールからの個々または群のコロニーかを選択するための対照プレートとして使用した。
クローニングの第二段階において、ＣＯＳ細胞をサブライブラリープールおよび３／４ＦＴ遺伝で、探索の第一段階で用いたのと同じ方法により共トランスフェクトした。トランスフェクト後４８時間で、トランスフェクトされた細胞を実施例４（Ｂ）の蛍光ＣＨＯ：Ｐ−セレクチンアッセイを用いて探索した。上記のように陽性のプールは最終的に個々のコロニーが探索され陽性のコロニーが同定されるまで更に小分けされた。この方法を用い、一つの陽性のクローンであるｐＭＴ２１：ＰＬ８５がＰ−セレクチンリガンド蛋白質をコードすることが見いだされた。ｐＭＴ２１：ＰＬ８５に含まれるＰ−セレクチンリガンドのＤＮＡ配列は配列ＩＤ番号：１に記載されており、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５にコードされるＰ−セレクチンリガンド蛋白質の結合特性は以下の実施例４（Ｃ）に記載されている。
【実施例２】
【００５０】
１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
α１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（３／４ＦＴ）をＰＣＲにより全体のヒト染色体ＤＮＡ（クロンテック・ラボラトーリーズ（Clontech Laboratories））からクローンした。センスオリゴヌクレオチドプライマーはＸｂａＩ部位および遺伝子の５’末端を含み（５’−ＴＡＧＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡ−３’）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーはＥｃｏＲＩ部位と遺伝子の３’末端を含んでいた（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＧＣＣＧＣ−３’）。ＰＣＲ産物を続いてＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化し、標準的なゲル精製法により精製した。この遺伝子はベクターｐＭＴ３Ｓｖ２ＡＤＡ（アール・カウフマン（R. Kaufmann))、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、上記)に連結され、これも連続してＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化し、標準的なゲル精製法により精製した。コンピテントなＨＢ１０１細胞（Biorad)はこの連結産物により形質転換されアンピシリンの存在下アガープレートにプレートした。アンピシリン耐性のトランスフォーマントのニトロセルロースフィルターリフトは遺伝子中央のヌクレオチド領域５０６−５３０に相補的な放射能標識されたオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴ−３’）でプローブされた。
プラスミドＤＮＡのミニプレップを１２の陽性クローンから調製した。精製したＤＮＡを次いでＥｃｏＲＩとＸｂａＩで適当な大きさのインサートを含む正しいクローンを同定するために消化した。このクローン（ｐＥＡ．３／４ＦＴ）を次いで大きいスケールで成育させＣｓＣｌ密度勾配のバンドにより単離した（ジェイ・サムブルック（J. Sambrook)ら、上記）。ＤＮＡ配列決定は３／４遺伝子の同一性を確実にした。遺伝子の機能性は以下の細胞−細胞結合アッセイにより評価された。ＣＯＳ−１  サル細胞［（クローン  Ｍ６；エム・ホロビッツ（M. Horwitz)ら、モル・アプル・ゼネット（Mol. Appl. Genet.)、２:１４７−１４９、（１９８３）］を、ＤＥＡＥデキストランを用い３／４ＦＴでトランスフェクトし、続いてＤＭＳＯショック処理およびクロロキンインキュベーションをした［エル・ソムペイラック（L. Sompeyrac)およびケイ・ダナ（K. Dana)ら、プロシーディングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci.)、７８：７５７５−７５７８（１９８１)；エム・ロパタ（M, Lopata)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.)、１２：５７０７−５７１７、（１９８４）；エイチ・ルースマン（H. Luthman)およびジー・マグヌソン（G. Magnuson）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.)、１１：１２９５−１３０８、（１９８３）]。トランスフェクトされたＣＯＳ細胞を懸濁しＥ−セレクチンを発現しているＣＨＯラインへの結合を定量した[ジー・ラルセン（G. Larsen)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６７：１１１０４−１１１１０、（１９９２）］。このアッセイにより３／４ＦＴ細胞でトランスフェクトされた細胞は細胞表面にシアル酸化されたＬｅｗｉｓｘエピトープを発現し得ることが確認された。
【実施例３】
【００５１】
ＬＥＣ１１細胞中でのＰ−リガンドの発現
Ａ．ＬＥＣ１１細胞中でのＰ−セレクチンリガンドの発現
機能性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質がＳＬｅｘが陽性のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統ＬＥＣ１１（キャンベル・シー（Campbell, C.)およびスタンレー・ピー(Stanley, P.)の、セル(Cell）３５：３０３−３０９（１９８３）参照）において以下のように発現された；Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質遺伝子を含有するプラスミド（ｐＭＴ２１：ＰＬ８５、実施例１）の約８μｇを、ＬＥＣ１１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクト後６８時間で、細胞を２.５ｍＭ  酪酸ナトリウムで４時間処理した。細胞は６−ＣＦＤでラベルしたＣＨＯ：Ｐ−セレクチン細胞結合アッセイ（実施例４、セクションＢ）を用いて決定されたように、細胞はＰ−セレクチンの接着を観察された。対照的に、ＬＥＣ１１細胞のみでも、対照のプラスミドでトランスフェクトしたＬＥＣ１１細胞でもどちらもＰ−セレクチンによる接着を引き起こした。
【００５２】
Ｂ．ＣＯＳ細胞中の可溶性Ｐ−セレクチンリガンドの発現
ＣＯＳ細胞を８μｇのｐＥＤ．ｓＰＳＬ．Ｔ７（実施例５Ｃ参照）および４μｇの、実施例２のｐＥＡ．３／４  ＦＴプラスミド、８μｇのｐＥＤ．ｓＰＳＬ．Ｔ７のみ、もしくは８μｇのプラスミドベクターｐＭＴ２１）および４μｇのｐＥＡ．３／４  ＦＴ遺伝子でトランスフェクトした。トランスフェクト後４５時間で、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加した、血清を含まないＤＨＥＭ・マイナス・フェノール・レッド（ＪＲＨ（バイオサイエンシズ（Biosciences))中で３７℃で一晩インキュベートした。フッ化フェニルメチルスルホニル、アプロチニンおよびＮａＮ３をそれぞれ終濃度１ｍＭ、２μｇ／ｍｌおよび０.０２％になるように添加し、調節された培地を遠心して全てのデブリを除去した。
免疫沈澱の実験のために、ラベルした可溶性Ｐ−セレクチンリガンド蛋白質はＣＯＳ細胞をｐＥＤ．ｓＰＳＬ．Ｔ７およびｐＥＡ．３／４  ＦＴで共トランスフェクトすることにより生産した。トランスフェクト後４５時間で、ＣＯＳ細胞を５時間２５０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニン（ＮＥＮ）でラベルし培地を回収した。ｓＰＳＬ．Ｔ７蛋白質の発現は抗−Ｔ７抗体による免疫沈降により確認された。
【００５３】
Ｃ．ＣＯＳ細胞におけるＰＡＣＥ-切断Ｐ-セレクチンリガンドの発現
実施例５(Ｃ)のｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７プラスミド、実施例２の
ｐＥＡ.３/４ＦＴ ｃＤＮＡ、および配列番号５に記載のＰＡＣＥ ｃＤＮＡを含有するプラスミドでＣＯＳ細胞を共トランスフェクトした。ｐＥＤ.sＰＳＬ.Ｔ７プラスミドおよびｐＥＡ.３/４ＦＴプラスミドのみを用いて、平行して対照を共トランスフェクトした。４５時間後に、これらのトランスフェクトしたＣＯＳ細胞からの条件培地をプラスチィク皿上に被覆し、ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞(実施例４)への結合を測定した。ＰＡＣＥで共発現させたＰ-セレクチンリガンドを含有する培地で被覆した皿では、ＰＡＣＥで共発現させなかったＰ-セレクチンリガンドを含有する培地に比して、結合したＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞の約２倍の上昇が観察された。ＰＡＣＥで同時トランスフェクションからの精製ｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白質のＮ-末端アミノ酸配列決定により、全てのリガンドがＰＡＣＥコンセンサス部位(配列番号：１のアミノ酸３８-４１)で切断されていることが示された。共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を３５Ｓ-メチオニンで放射線標識し、続いてＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーに付すと、両方の共トランスフェクションにおいて同等量のＰ-セレクチンリガンドが分泌されていることが示された。
【００５４】
Ｄ．ＣＨＯ細胞におけるＰ-セレクチンリガンド蛋白質の発現
Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の全長形態(アミノ酸１-４０２)を、ＣＨＯ(ＤＵＫＸ)細胞系(ウルラーブ(Ｕrlaub)およびカシン(Ｃhasin)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)第７７巻、４２１６-４２２０頁(１９８０年))で以下のごとく発現させた：約２５μｇのｐＭＴ２１:ＰＬ８５プラスミドおよび約８μｇの(ｐＥＡ.３/４ＦＴをＥcoＩおよびＸbaＩで制限酵素消化し、得られた断片をｐＥＤプラスミドに挿入することにより作製した)ｐＥＤ.３/４ＦＴを、リン酸カルシウム法を用いて、ＣＨＯ(ＤＵＫＸ)細胞に共トランスフェクトさせた。トランスフェクト細胞を、メトトレキセートに対する耐性につき選択した。２週間後に、塩化クロム(ＩＩＩ)法(ゴディング,ジェイ・ダブリュ(Ｇoding,Ｊ.Ｗ.)、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(Ｊ.Ｉmmunol.Ｍethods)第１０巻:６１-６６頁(１９７６年))により作製した抗ＳＬｅｘ抗体(ＣＳＬＥＸ-１、米国特許第４,７５２,５６９号)とヒツジ赤血球細胞(ｓＲＢＣ)との複合体を用いることにより、ＳＬｅｘ発現につき、個々のコロニーを以下のごとく選択した：洗浄液が透明になるまでｓＲＢＣを０.１５ＭのＮａＣlで洗浄し、次いで、０.１５ＭのＮａＣl中でｓＲＢＣの５０％懸濁液を調製した。０.０１％の塩化クロム(ＩＩＩ)溶液１ｍlをボルテックス撹拌しつつ、５０μｇのＣＳＬＥＸ-１を含有するｓＲＢＣ懸濁液０.２ｍlに滴下した。３７℃にて３０分間インキュベートした後に、１０ｍlのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)溶液を該反応液に滴下した。１０ｍlのＰＢＳに再懸濁する前に、該複合体を一回洗浄した。トランスフェクト細胞を含有するプレートをＰＢＳで洗浄し、次いで、３ｍlのＰＢＳおよび１ｍlのｓＲＢＣ/ＣＳＬＥＸ-１コンジュゲートを各プレートに添加した。陽性コロニーは、トランスイルミネーター上で赤色を呈し、これを１０％ウシ胎児血清を含むアルファ培地に拾い上げた。２週間後に、２、１０、２５、１００、２５０ｎＭ濃度のメトトレキセートを用いて、該コロニーを段階的増幅に付した。得られた安定な細胞系をＣＤ-ＰＳＧＬ-１(Ｒ３.４)と命名した。Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の発現は、実施例７(Ａ)の抗-Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質ポリクローナル抗体を用いた免疫沈降実験により確認した。実施例４(Ａ)のごとくＬＥＣ-γ１への結合につきトランスフェクトされた細胞をアッセイすることにより、ＣＤ-ＰＳＧＬ-１(Ｒ３.４)細胞系により産生されるＰ-セレクチンリガンド蛋白質の機能性を試験した。
アデノシン・デアミナーゼ選択下にて、配列番号５に記載したＰＡＣＥコードｃＤＮＡをすでに発現している安定なＣＨＯ-ＰＡＣＥ系において、該ｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白質を発現させた(カウフマン(Ｋaufman)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユーエスエイ(ＰＮＡＳ(ＵＳＡ)第８３巻：３１３６-３１４０頁(１９８６年)))。リン酸カルシウム法を用いて、該ｐｓＰＳＬ.Ｔ７プラスミド(２５μｇ)およびｐＥＤ.３/４ＦＴプラスミド(８μｇ)をＣＨＯ-ＰＡＣＥ細胞に共トランスフェクトさせた。メトトレキセートに対する耐性につきトランスフェクト細胞を選択し、ｓＲＢＣ/ＣＳＬＥＸ-１複合体に結合した個々のコロニーを拾い上げた。培養２週間後に、該コロニーを前記の段階的増幅に付した。得られた安定な細胞系を、ＣＰ/ＰＳＬ-Ｔ７(Ｒ４.１)と命名した。ｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白質の発現は、Ｔ７特異的モノクローナル抗体または実施例４(Ａ)のＬＥＣ-γ１・キメラを用いる標準的な免疫沈降法により確認した。同様にして、ｐＭＴ２１:ＰＬ８５およびｐＥＤ.３/４ＦＴをＣＨＯ-ＰＡＣＥ系に共トランスフェクトさせることにより、Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の全長形態(アミノ酸４２-４０２)を発現する安定な細胞系を得た。
実施例５(Ｂ)のｓＰＳＬ.Ｑ蛋白質および実施例５(Ｄ)のｓＰＳＬ.Ｆｃ蛋白質を発現する安定な細胞系は以下のごとく構築した：
プラスミドｐＥＤ.sＰＳＬ.Ｑ(２５μｇ)またはｓＥＤ.sＰＳＬ.Ｆｃ(２５μｇ)を、約２５μｇの前記ｐＥＤ.３/４ＦＴプラスミドと前記配列番号５のＰＡＣＥｃＤＮＡならびにネオマイシン抵抗性遺伝子を含有する約２０μｇのプラスミドとで、リン酸カルシウム法を用いてＣＨＯ(ＤＵＫＸ)細胞中に共トランスフェクトさせた。メトトレキセートおよびＧ４１８抗生物質の耐性につきトランスフェクトした細胞を選択した。約２週間後に、ｓＲＢＣ/ＣＳＬＥＸ-１複合体の結合性を用いて、ＳＬｅｘ発現につき個々のコロニーをスクリーニングした。陽性コロニーをＧ４１８培地に１ｍｇ/ｍl濃度で拾い上げた。培養２-３週間後に、段階的選択のメトトレキセートで該細胞を増幅させた。得られた安定な細胞系は、各々、ＣＤ-ｓＰＳＬ.Ｑ(Ｒ８.２)おおびＣＤ-ｓＰＬＳ.Ｆｃ(Ｒ８.１)と命名した。ｓＰＳＬ.ＱおよびｓＰＳＬ.Ｆｃ蛋白質の発現は、実施例７(Ａ)の抗Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質ポリクローナル抗体を用いる標準的な免疫沈降法により確認した。
【実施例４】
【００５５】
Ｐ-セレクチン-媒介細胞間接着のアッセイ
Ａ．ＬＥＣ-γ１結合アッセイ
公知の方法(アルッホ(Ａruffo)ら、セル(Ｃell)第６７巻、３５-４１頁(１９９１年))を用いてヒトＩｇＧγ１(ＬＥＣ-γ１)のＦｃ部位に結合させたキメラ型Ｐ-セレクチンをコードするＤＮＡを構築し、ｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞(ＣＨＯ ＤＵＫＸ)に安定にトランスフェクトして、高レベルのキメラＬＥＣ-γ１蛋白質を産生させ、以下に記載する結合アッセイに用いるためそれを精製した。  ペトリ皿を、最初に抗-ヒトＩｇＧγ１ Ｆｃポリクローナル抗体、次いで、ＬＥＣ-γ１で被覆した。この方法により、キメラ分子のＰ-セレクチン部位が該プレートの表面に示されるようにＬＥＣ-γ１構築体を方向付けた。ＨＬ６０細胞の方向付けたＬＥＣ-γ１に対する接着を、カルシウムの存在および不存在下で定量した。ＨＬ６０接着がカルシウム依存性であることが示され、これにより、ＨＬ６０細胞上のそのリガンドに対するＰ-セレクチンの機能的な結合を該キメラ分子が有することが確認された。ＨＬ６０細胞の方向付けたＬＥＣ-γ１への結合は、Ｐ-セレクチンに対する中和モノクローナル抗体の遮断によっても示され、Ｐ-セレクチン結合の特異性を証明している。
【００５６】
Ｂ．蛍光ＣＨＯ-Ｐ-セレクチン結合アッセイ
Ｐ-セレクチンリガンド遺伝子および３/４ＦＴ遺伝子で共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の表面に結合してクラスターを形成できる蛍光標識ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞系(ラーゼン(Ｌasen)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)第２６７巻、１１１０４-１１１１０頁(１９９２年))を、このアッセイは用いる。該ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞を、ＤＭＥ培地中の１％ウシ胎児血清中に１.５×１０６個の細胞/ｍlで懸濁し、６-カルボキシフルオレセイン二酢酸(６-ＣＦＤ)を最終濃度１００μｇ/ｍlで添加することにより標識した。３７℃にて１５分間インキュベートした後に、該細胞を培地中で洗浄し、１×１０５個の細胞/ｍlで再懸濁させた。５ｍlの該標識細胞を、アッセイすべき各洗浄済みＣＯＳトランスフェクト細胞含有プレートに添加し、室温にて１０分間インキュベートした。非接着性細胞は、培地での４回の洗浄によって除去した。次いで、接着性ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞のロゼットにつき、該プレートを蛍光顕微鏡により検鏡した。
【００５７】
Ｃ．放射線標識ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞を用いた定量的接着アッセイ
スクリーニングの初期段階で用いたのと同一の方法により、実施例１のｐＭＴ２１:ＰＬ８５プラスミドおよび実施例２のｐＥＡ.３/４ＦＴプラスミドでＣＯＳ細胞を共トランスフェクトさせた。対照として、ＣＯＳ細胞をｐＭＴ２１:ＰＬ８５単独、またはｐＥＡ.３/４ＦＴ単独、あるいはインサートを含有しない同様のプラスミド(「モック(mock)」)でトランスフェクトした。
トランスフェクション２４時間後に、該トランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、コースター６-ウェル組織培養プレートに撒いた。ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞は、公知方法を用いて３Ｈ-チミジンで１６時間標識し、１％ＢＳＡを含有するα培地中(対照)；１％のＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのＥＧＴＡを含有するα培地；１％のＢＳＡおよび１０μｇ/ｍlの中和抗Ｐ-セレクチン・モノクローナル抗体ならびに、１％のＢＳＡおよび非-中和抗-Ｐ-セレクチン・モノクローナル抗体を含有するα培地中で、０.５×１０６個の細胞/ｍl、４℃にて３０分間前インキュベートさせた。次いで、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を含有するウェルに該前インキュベート細胞を添加した。１０分間のインキュベーションの後に、培地を４回交換することにより非結合細胞を除去した。該結合ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞は、トリプシン処理によって放出させ、シンチレーション計測によって定量した。
Ｐ-セレクチンリガンドおよび３/４ＦＴで共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞は、ＣＯＳモック細胞に比して約５.４倍高いＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞の結合を誘導した；ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡ存在下のアッセイは、モック・トランスフェクトＣＯＳ細胞のレベルに対する結合を低下させた。同様にして、中和抗-Ｐ-セレクチン抗体でのインキュベーションも特異的な結合を消失させたが、非-中和抗体は何等影響を有しなかった。それに対して、Ｐ-セレクチンリガンド単独でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞に対するＣＨＯ:Ｐ-セレクチンの結合は、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ、または抗-Ｐ-セレクチン抗体の存在下または不存在下の双方におけるモック-トランスフェクトＣＯＳに対する結合と統計的に差がなかった。３/４ＦＴ単独でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞に対する
ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞の結合は、モック-トランスフェクトＣＯＳより約２倍高かかったが、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの存在または不存在によっては影響されなかった。
【実施例５】
【００５８】
可溶性Ｐ-セレクチンリガンドの構築
実施例ＩのＨＬ６０細胞からのｃＤＮＡライブラリーを生成させるのに用いるＥcoＲＩアダプターは、ｐＭＴ２１：ＰＬ８５プラスミド中に位置されるよう、配列番号：１の最初の丁度５'側にＸbaＩ制限サイト(ＴＣＴＡＧＡ)を含有する。ＰＳＬの可溶性形態を生成させるために、該ｐＭＴ:２１ＰＬ８５プラスミドをＸbaＩおよび(配列番号：１のヌクレオチド９４４以後を切断する)ＨincＩＩで制限酵素消化した。バリン２９５についてのコドンまでの、およびそれを含むリガンドの、コードされた細胞外セグメントの全てを含有するかく生成した約９５０bpの断片を単離し、以下のセクションＡないしＤに記載するＰ-セレクチンリガンド蛋白質の可溶性形態をコードするＤＮＡを生成させるのに用いた。
【００５９】
Ａ．ｐｓＰＳＬ.ＯＣの構築
該断片を精製し、Ａsn２９６-Ｃys３１０のコドンを再生し、かつＣys３１０の直後に新規の終始コドンを導入した二本鎖合成オリオヌクレオチドＤＮＡと共に、哺乳動物発現ベクターｐＥＤに、ＸbaＩおよびＥcoＲＩ部位の間に連結された。該オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：
【化５】
0003668242.tif 000006
得られたプラスミドはｐＥＤ.ｓＰＳＬ.ＱＣと命名し、該プラスミドから発現される蛋白質をｓＰＳＬ.ＱＣと命名した。
【００６０】
Ｂ．ｐｓＰＳＬ.Ｏの構築
該断片を精製し、Ａsn２９６ないしＧln３０９のコドンを再生し、かつＧln３０９の直後に新規の終始コドンを導入した二本鎖合成オリゴヌクレオチドＤＮＡと共に、ｐＥＤプラスミド(カウフマン(Ｋaufman)ら、１９９１年)に、ＸbaＩおよびＥcoＲＩサイトの間に連結させた。該オリゴヌクレオチドの配列は以下の通り：
【化６】
0003668242.tif 000007
得られたプラスミドはｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｑと命名し、該プラスミドから発現される該蛋白質をｓＰＳＬ.Ｑ.と命名した。
【００６１】
Ｃ．ｐｓＰＳＬ.Ｔ７の構築
ファージＴ７の主要カプシド蛋白質由来のエピトープを含有する１４個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、該エピトープ「タッグ(ｔａｇ)」と該ベクター配列由来のさらなる３２個のアミノ酸とのＣ-末端融合物を生成させた。配列：
【化７】
0003668242.tif 000008
を有する２個のオリゴヌクレオチドを二本鎖化し、哺乳動物発現プラスミドｐＥＤの大きなＸbaＩ-ＥcoＲＩ断片と連結させた。得られたプラスミドｐＥＤ.Ｔ７を、ＸbaＩおよびＳmaＩで制限酵素消化し、前記の９５０ｂｐのＸbaＩ-ＨincＩＩ断片に連結させて、プラスミドｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７を得た。ｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７の発現から得られる該蛋白質をｓＰＳＬ.Ｔ７と命名した。
【００６２】
Ｄ．可溶性Ｐ-セレクチンリガンド-ＩｇＧＦｃキメラの構築
ヒト・免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部位に融合させた可溶性のＰ-セレクチンリガンド蛋白質の細胞外形態をコードするプラスミドＤＮＡは、以下のごとく構築した：該哺乳動物発現ベクターｐＥＤ.Ｆｃは、唯一のＸbaＩ制限部位を介してアミノ末端からヒンジ領域をコードする配列を融合させることができる新規なリンカー配列を有するヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする配列を含有する。３個の断片の連結を行った：ｐＥＤ.ＦｃをＸbaＩで制限酵素消化させ、線状形態にてゲル精製した。前記のｐＭＴ２１：ＰＬ８５からの９５０ｂｐの断片は第二断片を含む。第三断片は、以下の配列：
【化８】
0003668242.tif 000009
を有するアニール化させた合成オリゴヌクレオチドＤＮＡよりなる。
該連結生成物を、プラスミドＤＮＡとして増幅させ、正確な立体配置を有する個々のクローンをＤＮＡ配列決定により同定した。該プラスミドは、pＥＤ.ＰＳＬ.Ｆｃと命名した。得られた可溶性Ｐ-セレクチンリガンド/Ｆｃ融合蛋白質の
ＤＮＡコード領域を配列番号：６に示す。
【実施例６】
【００６３】
発現したＰ-セレクチンリガンドの特徴付け
Ａ．ＣＯＳ細胞上に発現された全長Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の結合の特徴付け
実施例２のｐＥＡ.３/４ＦＴプラスミドおよび実施例１の
ｐＭＴ２１:ＰＬ８５プラスミドでのＣＯＳ細胞の共トランスフェクトにより、ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞に特異的結合するＣＯＳ細胞を得る。この結合は、ｐＥＡ.３/４ＦＴおおびｐＭＴ２１:ＰＬ８５で共トランスフェクトさせた場合にのみ認められた；いずれかのプラスミド単独の使用では、ＣＨＯ：Ｐ-セレクチン細胞に結合しないＣＯＳ細胞を生成した。Ｐ-セレクチンを発現していない親ＣＯＳ(ＤＵＫＸ)と、ｐＥＡ.３/４ＦＴおよびｐＭＴ２１:ＰＬ８５で共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞との間に結合は認められなかった。該共トランスフェクトＣＯＳ細胞とＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞との間の結合は、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡのごとき二価イオンのキレート剤に敏感であり、このことは、Ｐ-セレクチン媒介細胞接着のＣａ２＋依存性と一致する。中和抗-Ｐ-セレクチン・モノクローナル抗体が、ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞と、ｐＥＡ.３/４ＦＴおよびｐＭＴ２１:ＰＬ８５で共トランスフェクトさせたＣＯＳ細胞との間の結合を遮断する一方、非-中和抗Ｐ-セレクチン・モノクローナル抗体は、該結合に何等影響を有さなかった。該抗体の結果は、Ｐ-セレクチンの機能性ドメインが、ＣＯＳ細胞表面上に発現されているＰ-セレクチンリガンド蛋白質への結合に必要であることを示している。
【００６４】
Ｂ．ＣＯＳ細胞に発現される全長Ｐ-セレクチンリガンドの電気泳動的特徴付け
共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の活性剤抽出物は以下のごとく調製した：共トランスフェクト４５時間後に、約１.５×１０７個の細胞を５ｍlの溶解緩衝液(１０ｍＭのピペリジン-Ｎ,Ｎ'-ビス[２-エタンスルホン酸](ＰＩＰＥＳ)、ｐＨ７.５、１００ｍＭのＫＣl、３ｍＭのＭｇＣl２、１ｍＭのベンズアミジン、０.５μｇ/ｍlのロイペプチン、０.７５μｇ/ｍlのペプスタチン、１ｍＭのエチルマレイミドおよび１μｇ/ｍlのアプロチニン)に懸濁し、超音波により溶解した。低速遠心(５００×ｇ、１０分間)により細胞夾雑物を除去し、超遠心(１００,０００×ｇ、６０分間)により膜画分を採取した。高速の膜ペレットを抽出緩衝液(１ｍＭの３-[Ｎ-モルホリノ]プロパンスルホン酸)(ＭＯＰＳ)、ｐＨ７.５、０.１ＭのＮａＣl、０.０２％のＮａＮ３、１％のセジットＲ(ＴhesitＲ)(シグマ社(Ｓigma)、１ｍＭのベンズアミジン、０.５μｇ/ｍlのロイペプチン、０.７５μｇ/ｍlのペプスタチン、１ｍＭのエチルマレイミド、および１μｇ/ｍlのアプロチニン)に再懸濁した。次いで、試料をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、以下のごとくニトロセルロース・ブロットに移行させた：活性剤抽出物のアリコットを１％ＳＤＳ付加緩衝液に懸濁し、８-１６％ポリアクリルアミドゲル(還元)または６％ゲル(非還元)上に負荷する前に、１００℃にて５分間加熱し、ラエムリ緩衝液系(Ｌaemmli buffer system)で電気泳動に付した。ブロットは、イモビロン-ＰＲトランスファー膜(Ｉmmobilon-ＰＲtransfer membrane)を用いて調製した。該ブロットを１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７.５、０.１ＭのＮａＣl、０.０２％のＮａＮ３、１ｍＭのＭｇＣl２、１ｍＭのＣａＣl２、および１０％の脱脂ミルク中に４℃にて一晩浸漬した。ブロットを、脱脂ミルクを含有しない前記緩衝液中で１回濯ぎ、ブロッティング緩衝液(１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７.５、０.１ＭのＮａＣl、１％の牛血清アルブミン、０.０５％のセジット、１ｍＭのＭｇＣl２、１ｍＭのＣａＣl２)中で室温にて３０分間インキュベートした。
次いで、該ブロットを以下のごとくＰ-セレクチンに対するプローブとした：５０ｎｇのＰ-セレクチン/Ｆｃキメラを、ブロッティング緩衝液中の３μＣｉの１２５Ｉ-プロテインＡと室温にて３０分間、前インキュベートした。この時点で、該前インキュベーション混合物にさらなる補形薬(例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、モノクローナル抗体)を添加して、Ｐ-セレクチンリガンドへの該キメラの結合に対するそれらの効果を評価できる。次いで、該前-インキュベート混合物を、(前記のごとく調製した)該ブロットと室温にて６０分間インキュベートし、続いて該ブロットを(牛血清アルブミンを含有しない)同一のブロッティング緩衝液で４回洗浄した後、風乾し-７０℃にてオートラジオフラフィーに付した。
非還元条件下では、この技術において、共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞から調製した膜抽出物につき、２本のバンドが認められた。濃い方のバンドが約２２０ｋＤの分子量と見積もられるよう移動した一方、薄い方のバンドは約１１０ｋＤの分子量で移動した。還元条件下で、約１１０ｋＤの分子量で単一バンドのみが観察されたことは、非還元条件下では、該Ｐ-セレクチンリガンドがホモダイマーとして存在することを示している。該還元モノマーのおよその分子量が該ｃＤＮＡクローン(４５ｋＤ)の予想アミノ酸配列から想定されるよりも大きいことは、該発現蛋白質が大きく翻訳後修飾を受けていることを示している(実施例６(Ｃ)参照)。Ｐ-セレクチン/Ｆｃキメラの特異性は、非特異的なＩｇＧ１プローブが該ブロット上にバンドを得られなかったという観察結果により確認された。さらに、該Ｐ-セレクチン/Ｆｃキメラの該ブロットに対する結合は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、および中和抗-Ｐ-セレクチン・モノクローナル抗体により中断された。該ｐＥＡ.３/４ＦＴおよびｐＭＴ２１:ＰＬ８５プラスミドで共トランスフェクトしたＣＯＳ細胞の膜抽出物からのみ、該ブロット上に特異的なバンドが認められた。対照トランスフェクト細胞(ｐＥＡ.３/４ＦＴまたはｐＭＴ２１:ＰＬ８５単独)からの膜抽出物では、ブロット上に観察できるバンドが得られなかった。
【００６５】
Ｃ．Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質の糖付加
組換えＰ-セレクチンリガンド上に共有的に結合している炭水化物の存在およびＰ-セレクチンへの結合におけるその役割は以下のごとく検証した:実施例５(Ｃ)のｐＥＤ.ｓＰＳＬ.Ｔ７プラスミドおよび実施例２のｐＥＡ.３/４ＦＴプラスミドでＣＯＳ細胞を共トランスフェクトさせた。４８時間後に、該細胞を３５Ｓ-メチオニンで標識した。２００μlの３５Ｓメチオニン-標識ｓＰＳＬ.Ｔ７条件培地を、２ｍＭのＣａＣl２および１ｍｇ/ｍlの牛血清アルブミン(ＢＳＡ)の存在下にて、５μｇのＬＥＣ-γ１と共にインキュベートした。４℃にて２時間回転撹拌させた後に、プロテインＡ-セファロース・ビーズ(ファルマシア社(Ｐharmacia))を４℃にて１時間添加し、遠心によりペレットとし、２ｍＭのＣａＣl２および１ｍｇ/ｍlのＢＳＡを含有するトリス緩衝化セーライン(２０ｍＭのＴris-ＨＣl、１５０ｍＭのＮａＣl、ｐＨ７.５、以後ＴＢＳとする)中で２回洗浄した。次いで、該ペレットを再懸濁し、ノイラミニダーゼ(ストレプトコッカス・ニューモニエ(Ｓtreptococcus pneumoniae))、Ｏ-グリカナーゼおよびＮ-グリカナーゼ(全てゲンザイム社(Ｇenzyme)から入手)で以下のごとく処理した。全てのグリコシダーゼ消化は、３７℃にて一晩行った。ノイラミニダーゼ消化については、５０μlの２-(Ｎ-モルホリノ)-エタンスルホン酸(ＭＥＳ)緩衝液、ｐＨ６.５(カルバイオケム社(Ｃalbiochem))および０.１％のＳＤＳ中に該ペレットを再懸濁して９５℃にて５分間加熱し、次いで、ペレットとした。１.４％のｎ-オクチル Ｂ-Ｄ-グルコピラノシド(ＯＧＰ)、１０ｍＭの酢酸カルシウム、２０ｍＭのカコジル酸ナトリウムおよび２.５ｍＭのＰＭＳＦ、最終ｐＨ７.０を含むよう該上清を修飾した。８μlのノイラミニダーゼを最終濃度１単位/ｍlで添加した。ノイラミニダーゼ/Ｏ-グリカナーゼ消化については、前記のごとく試料を調製し、該ノイラミニダーゼと共に、該Ｏ-グリカナーゼも最終濃度０.１単位/ｍlで添加した。Ｎ-グリカナーゼ消化について、５４μlのＭＥＳ緩衝液および１％のＳＤＳ中に該ペレットを再懸濁し、９５℃にて５分間加熱し、次いで、ペレットとした。０.２Ｍのリン酸ナトリウム、３.５％のＯＧＰ、および２.５ｍＭのＰＭＳＦ、最終ｐＨ８.５を含むよう該上清を修飾した。Ｎ-グリカナーゼを最終濃度１２単位/ｍlで添加し、前記のごとくインキュベートした。
ｓＰＳＬ.Ｔ７に対するグリコシダーゼ処理の効果は、２種の方法によって評価した。これに関しては、各消化蛋白質試料を２つの等量画分に分けた。実施例７(Ａ)の該Ｐ-セレクチン・ポリクローナル抗体で１画分を沈殿させ、電気泳動移動度に消化の効果を示した。実施例４(Ａ)の該ＬＥＣ-γ１キメラで他の画分を沈殿させ、消化後に残存しているＰ-セレクチンリガンド結合活性を評価した。該免疫沈降試料は、還元条件下のＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析した。
グリコシダーゼ処理無しでは、オートラジオグラフィーにより各沈殿に(１１０ｋＤの分子量で)相当のバンドが現れた。Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質をノイラミニダーゼで処理した場合、抗-Ｐ-セレクチンリガンド・ポリクローナル抗体沈殿は移動度においてわずかに低下し、これはシアル酸残基の除去と一致する。ＬＥＣ-γ１により沈殿させたＰ-セレクチンリガンド蛋白質量は、ノイラミニダーゼ処理後にわずかに低下し、これはＰ-セレクチン/Ｐ-セレクチンリガンド相互作用におけるシアル酸の役割と一致する。Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質をノイラミニダーゼおよびＯ-グリカナーゼの双方で処理した場合において、抗-Ｐ-セレクチンリガンド・ポリクローナル抗体で沈殿させた後に電気泳動移動度に実質的な上昇が認められたことは、多数のＯ-連結オリゴ糖鎖が除去されたことを示している。しかしながら、Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質からのＯ-連結オリゴ糖の除去は完全ではないようである。なぜなら、該電気泳動移動度が、配列番号：１に記載したアミノ酸配列から予想されるごとき、分子量３８ｋＤの蛋白質に相当しなかったためである。該ノイラミニダーゼ/Ｏ-グリカナーゼ消化Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質がＬＥＣ-γ１にほとんど結合しないことも、さらに、該Ｐ-セレクチン/Ｐ-セレクチンリガンド相互作用におけるオリゴ糖の役割を示している。精製Ｐ-セレクチンリガンドをＮ-グリカナーゼで処理すると電気泳動移動度がわずかに上昇することは、Ｎ-連結糖化に対するいくつかの共通サイトが占有されていることを実証している。ＬＥＣ-γ１により沈殿させたＰ-セレクチンリガンド蛋白質量がわずかに低下することは、シアル化およびＯ-結合糖化のごとき顕著ではないが、Ｎ-連結糖化もＰ-セレクチン/Ｐ-セレクチンリガンド相互作用に寄与していることを示している。
【実施例７】
【００６６】
Ｐ-セレクチンリガンドの特異的なポリクローナル抗体
Ａ．ウサギ抗-Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質/マルトース結合蛋白質融合蛋白質ポリクローナル抗体
該抗-Ｐ-セレクチンリガンド・ポリクローナル抗体は、イー・コリ(Ｅ.coli)で生成させた融合蛋白質でウサギを免疫することにより生成した。該融合蛋白質は、マルトース結合蛋白質に枠で融合させたＰ-セレクチンリガンドのアミノ末端の１/３(配列番号：１のアミノ酸１ないし１１０)よりなる(マイナ，シィ・ブイ(Ｍaina,Ｃ.Ｖ.)ら、ジーン(Ｇene)第７４巻、３６５-３７３頁(１９８８年)；リッグス,ピィ(Ｒiggs,Ｐ.)「分子生物学における最近のプロトコル(Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology)」エフ・エム、アウセベル(Ｆ.Ｍ.Ａusebel)ら編、グリネ・アソシエーツ/ウィリ・インターサイエンス(Ｇreene Ａssociates/Ｗiley Ｉnterscience)(ニュー・ヨーク(Ｎew Ｙork)、１９９０年、第１６.６章)。本明細書で用いた条件下では、該融合蛋白質抗体は該Ｐ-セレクチンリガンド蛋白質を認識する。
【００６７】
Ｂ．ポリクローナル・ウサギ抗-ｓＰＳＬ.Ｔ７蛋白質
本発明の可溶性形態(ｓＰＳＬ.Ｔ７；実施例５(Ｃ)参照)を、以下のスキームに従って明らかな均質性に精製した：ｓＰＳＬ.Ｔ７(実施例５(Ｃ))、３/４ＦＴ(実施例２)、および(配列番号：５に記載の)ＰＡＣＥの可溶性形態をそれぞれコードする３つのプラスミドでＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。７２時間後に、該条件培地を採取し、組換えｓＰＳＬ.Ｔ７を以下のごとく精製した。
条件培地を、５０ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣl、０.５ｍＭのＣａＣl２および０.５ｍＭのＭｇＣl２、ｐＨ７.２で２倍希釈し、同一緩衝液で平衡させたレンチル・レクチン-セファロース４Ｂカラムに適用した。カラムを流した後に、２８０ｎｍの光吸収が安定なベースラインに落ちるまで、該カラムを同一の緩衝液で洗浄した。次いで、該カラムを、０.５Ｍのα-メチル-マンノシドおよび０.３ＭのＮａＣlに調整した同一の緩衝液で溶出させた。組換えｓＰＳＬ.Ｔ７は、この溶出緩衝液の５-１５カラム容量にわたり採取した。次いで、４℃にて、１lのカラム溶出液当たり４７２ｇの硫酸アンモニウムを添加することにより、該レンチル・レクチン溶出液を０-７０％硫酸アンモニウム沈殿に付した。３０分間撹拌された後に、該沈殿を最小容量のＴＢＳ(２０ｍＭのＴris-ＨＣl、
１５０ｍＭのＮａＣl、ｐＨ７.５)に再懸濁し、ＴＢＳ中に平衡させたＴＳＫ Ｇ４０００ＳＷＸＬゲル濾過カラムに適用した。該カラム上の流速は０.５ｍl/分であって、ガード・カラムを用いた。＜２５０μlのアリコットにおいて、該再懸濁硫酸アンモニウム・ペレットを該カラムに注射し、画分をウエスタン分析を伴うＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した。ｓＰＬＳ.Ｔ７を含有する画分を保存し、次いで、ウサギの免疫に用いた。
ｓＰＳＬ.Ｔ７に対する抗体は、抗原初回免疫および続く３ヶ月にわたるブースター処理による標準的な様式で生成させた。詳細には、５０μｇの(０.１％のＳＤＳと混合し、１００℃にて１０分間加熱することにより変性させた)ｓＰＳＬ.Ｔ７をフロイント不完全アジュバントと混合し、皮下的に５箇所に注射することにより初回免疫を行った。２５μｇの(０.１％のＳＤＳと混合し、１００℃にて１０分間加熱することにより変性させた)[３回目以降には１２.５μｇの]ｓＰＳＬ.Ｔ７をフロイント不完全アジュバントと混合し、２週間毎に皮下的に２箇所に注射することにより２回目(およびそれ以降全ての)ブースト処理を行った。２週間毎に試験採血を行い抗体力価をモニターした。該抗体力価が安定なレベルに達したら、さらに大用量の採血を行い、全血清画分を調製した。このポリクローナル抗体調製物を用いて、実施例４の記載に類似した様式にてＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞に対するＨＬ６０細胞の特異的な結合を阻害した。
このアッセイには、マイクロタイター・プレートの底部に平板したＣＨＯ細胞に結合する(BCECFAM;２',７'-ビス-(２-カルボキシメチル)-５-(および-６)-カルボキシフルオレセイン,アセトキシメチルエステルで標識した)蛍光-標識ＨＬ６０細胞を用いる。該標識ＨＬ６０細胞を、ポリクローナル抗体を含有する血清または前-免疫血清と共に４℃にて３０分間、前インキュベートした。次いで、該細胞を洗浄し、ＣＨＯ:Ｐ-セレクチン細胞と共に１０分間インキュベートした。次いで、該プレートを洗浄し、蛍光マイクロタイター・プレート・リーダーで蛍光を読んだ。本アッセイを用いると、１:１５希釈の抗-ｓＰＳＬ.Ｔ７ポリクローナル血清が、ＨＬ６０細胞がＣＨＯ:Ｐ-セレクチンに結合するのを本質的に完全に阻害する結果となった。ＣＨＯ:Ｐ-セレクチンに対するＨＬ６０結合の実証可能な阻害は、１:１５０の血清希釈においてでさえ認められた。前-免疫血清は、ＣＨＯ:Ｐ-セレクチンにＨＬ６０細胞が結合するのに何等影響を有さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の新規Ｐ−セレクチンリガンドをコードするＤＮＡ、およびそれによりコードされる新規Ｐ−セレクチンリガンド蛋白は、Ｐ−セレクチンにより媒介される細胞間接着に起因する疾病を治療するための医薬組成物、かかる細胞間接着の阻害剤を同定するためのアッセイ等に利用できる。
【配列表】
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