(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分分析用試薬において、一般式（１）で表わされるアルケニルエーテルおよび無水マレイン酸を単量体成分として含む共重合体に酵素を化学的に結合してなる修飾酵素を含むことを特徴とする成分分析用試薬。
【化１】
0003684591.tif 000013
【請求項２】
検体中の測定対象成分を測定する方法において、検体を一般式（１）で表わされるアルケニルエーテルおよび無水マレイン酸を単量体成分として含む共重合体に酵素を化学的に結合してなる修飾酵素と酵素反応させたのち、得られる反応生成物を測定することを特徴とする成分分析方法。
【化２】
0003684591.tif 000014
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、修飾酵素、修飾酵素を含む成分分析用試薬および修飾酵素を用いる成分分析方法に関する。修飾酵素、修飾酵素を含む成分分析用試薬および修飾酵素を用いる分析方法は各種診断薬、免疫学的診断方法などの分野に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
血中のタンンパク質などの分析、あるいは酵素などを用いて目的成分を分析する場合には、その測定系における非特異的なタンパク質の測定容器への付着は、測定目的成分の分析値に誤差を生じさせるため問題となっている。例えば、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ等の酵素は、臨床診断薬等の分野で広く使用されているが、これらの酵素は水溶液状態ではそれを入れる容器に強く吸着する性質があり、とくに容器が合成高分子物質である場合、その吸着が著しい。そのため、容器内面に該酵素が吸着したまま残り、目的を達し得ないことがある。また、臨床検査で用いられる自動分析機においては、同一セルを種々の検体、種々の検査項目に共用していることが多く、例えば、これを用いて総コレステロ−ルを測定した後、遊離型コレステロ−ルを測定する場合、総コレステロ−ル測定試薬中のコレステロールエステラーゼがセルに吸着し、遊離型コレステロール値に大きな正誤差を生じることが報告されている。また、中性脂肪を測定する場合にも、試薬中のリポプロテインリパーゼがセルに吸着して、測定値に負誤差を与えることが報告されている。
【０００３】
近年、臨床化学などの分野においては、各種酵素などのタンパク質を用いて、検体中の目的成分を選択的に分析することが重要となっている。そのため、タンパク質の吸着を抑制し、選択的に目的成分を分析するために、測定系に各種添加剤を添加する方法などが検討されてきた。
しかしながら、これら公知の方法では必ずしも十分な結果が得られていない。例えば、酵素阻害剤を測定試薬中に共存させる方法（特開昭５８−４１３５７号、特開昭５８−６７１９７号）は、吸着した酵素に対しては有効であるが、酵素の吸着そのものを防止するものではないので、リポプロテインリパーゼあるいはコレステロールエステラーゼを含む測定試薬を使用した後、次に防止策をほどこしていない試薬を使用する場合には全く効果がない。また、ある種のノニオン系界面活性剤を測定試薬中に共存させる方法（特開昭６１−１０４７９８号）は、総コレステロールを測定した後、この防止策を施した遊離型コレステロール測定試薬を用いても、その防止効果が充分に発揮されるのは２回目以降の測定であり、１回目の測定は正誤差を生じるなどの問題がある。
【０００４】
また、本発明に類似の酵素は、特開昭６３−２２６３５８号、ＥＰ２８２９５１号、特開平１−１５３０８８号、特開平４−４３１１８３号などに記載されている。
【０００５】
従って、酵素を含有する成分分析用試薬においては、測定容器に酵素が吸着しない修飾酵素、修飾酵素を含む測定試薬および修飾酵素を用いる測定方法の開発が望まれている。
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、酵素を含有する成分分析用試薬において、測定容器に酵素が吸着しない修飾酵素、成分分析用測定試薬および成分分析方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、一般式（１）で表わされるアルケニルエーテルおよび無水マレイン酸を単量体成分として含む共重合体に酵素を化学的に結合してなる修飾酵素を含むことを特徴とする成分分析用試薬および検体中の測定対象成分を測定する方法において、検体を該重合体に酵素を化学的に結合してなる修飾酵素と酵素反応させたのち得られる反応生成物を測定することを特徴とする成分分析方法である。
【０００８】
【化４】
0003684591.tif 000002
【０００９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
一般式（１）において、Ｚを残基とする２〜８個の水酸基を持つ化合物としては、たとえば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、スチレングリコール、炭素数８〜１８のアルキレングリコール、ネオペンチルグリコール等のグリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、トリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、１，３，５−ペンタントリオール、エリスリトール、ペンタエリスリトール、ジペンタエリスリトール、ソルビトール、ソルビタン、ソルバイド、ソルビトールとグリセリンの縮合物、アドニトール、アラビトール、キシリトール、マンニトール等の多価アルコール、あるいはそれらの部分エーテル化合物またはエステル化合物；キシロース、アラビノース、リボース、ラムノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、トレハロース、シュークロース、ラフィノース、ゲンチアノース、メレジトース等の糖、あるいはそれらの部分エーテル化物またはエステル化物；カテコール、レジルシノール、ヒドロキノン、フロログルシン等のフェノール類などが挙げられる。
【００１０】
ＡＯで表わされるオキシアルキレン基としては、たとえば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基、オキシスチレン基、オキシドデシレン基、オキシテトラデシレン基、オキシヘキサデシレン基、オキシオクタデシレン基等が挙げられ、これらは１種だけ付加していてもよく、２種以上が同時に付加していてもよい。また、２種以上が同時に付加している時は、ブロック状付加でもランダム状付加でもよい。
【００１１】
Ｒ1 で表わされる炭素数２〜５のアルケニル基としては、たとえば、ビニル基、アリル基、メタリル基、１，１−ジメチル−２−プロペニル基、３−メチル−３−ブテニル基等が挙げられる。
【００１２】
Ｒ2 で表わされる炭素数１〜２４のアルキル基としては、たとえば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、イソノニル基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、イソセチル基、オクタデシル基、イソステアリル基、オレイル基、オクチルドデシル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基、ベンジル基、クレジル基、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ドデシルフェニル基、ジオクチルフェニル基、ジノニルフェニル基、スチレン化フェニル基等が挙げられる。
【００１３】
Ｒ2 で表わされる炭素数１〜２４のアシル基としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、桂皮酸、没食子酸等に由来するアシル基が挙げられる。
【００１４】
一般式（１）のアルケニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体は、酵素を直接結合させるための酸無水物構造と界面活性作用を有するポリオキシアルキレン構造を有している。一般式（１）のアルケニルエーテルにおいて、遊離の水酸基が多いアルケニルエーテルを用いると無水マレイン酸との重合の際に酸無水構造とエステル結合を生成する結果、得られる共重合体の酵素との反応性が低下したり、共重合体の溶媒への溶解性が低下したりするので、ｎ／（１＋ｍ＋ｎ）≦１／２である。
【００１５】
本発明で用いる共重合体は一般式（１）で表わされるアルケニルエーテルと無水マレイン酸とをラジカル重合触媒を用いて共重合させることによって、容易に得ることができる。その際、更に他の単量体を加えて共重合させても良い。
【００１６】
他の単量体としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸、不飽和カルボン酸のアルキルエステル、不飽和カルボン酸のアルキルアミド、スチレン、メチルスチレン等の芳香族ビニル化合物、塩化ビニル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニル化合物、イソブチレン、ジイソブチレンなどのオレフィン、そのほか酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリルアミド等がある。
他の単量体は共重合体に粘着性を持たせるなどの物性改良を行う際に加えることができる。
【００１７】
本発明の共重合体において、全単量体単位中の一般式（１）のアルケニルエーテル単位と酸無水物単位とその他の単量体単位とのモル％比は特に限定されるものではないが、好ましくは５〜６０：２０〜９０：０〜３０、特に好ましくは、１５〜５０：３０〜８０：０〜２０である。全単量体単位中の他の単量体のモル比が３０モル％を超えると、修飾酵素の吸着を防止するためのオキシアルキレン基および酵素の修飾に必要な酸無水物基の含量が低下して酵素修飾がうまくできなくなることがある。
【００１８】
また、共重合体において、一般式（１）のアルケニルエーテル単位と酸無水物単位のモル比は特に限定されるものではないが、酸無水物単位のモル比が少なくなりすぎると酵素との反応が起こりにく、酸無水物単位のモル比が多くなりすぎると修飾酵素の吸着防止能がそれぞれ低下する傾向にある。
【００１９】
本発明で用いる共重合体は、重合開始剤の種類あるいは一般式（１）のアルケニルエーテルの構造を変化させることにより、種々の重合度の共重合体を得ることができ、その重量平均分子量は特に限定されるものではないが、好ましくは１０００〜２００万、特に好ましくは３０００〜１０万が挙げられる。
【００２０】
本発明の一般式（１）で表わされるアルケニルエーテルと無水マレイン酸を単量体成分として含む共重合体に結合させる酵素は、たとえば、アスコルビン酸オキシダーゼ、マルトースホスホリラーゼ、ヘキソキナーゼ、ペルオキシダーゼ、α−アミラーゼ、ピラノースオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、リポプロテインリパーゼ、キサンチンオキシダーゼ、タクテートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等が挙げられ、好ましくは、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼである。
【００２１】
本発明の一般式（１）で表わされる、アルケニルエーテルおよび無水マレイン酸を単量体成分として含む共重合体に酵素を化学的に結合してなる修飾酵素において、共重合体と酵素との間は直接もしくはスペーサーを介することにより結合が可能である。尚、修飾酵素は、「酵素免疫測定法、編集石川栄治、河合忠、宮井潔、医学書院（１９８７）」「生化学実験法２７、酵素標識法、石川栄治著、学会出版センター（１９９１）」に例示されている結合様式を用いて調製することができる。
【００２２】
本発明の修飾酵素の調製方法の例としては、酵素の水溶液に共重合体を直接添加する方法が好ましく、共重合体が水に溶解しにくい場合、あるいは水に不溶の場合は、共重合体を予め水と相溶性のある、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドあるいはアセトン等の溶剤に溶解した後、酵素水溶液に添加する方法が容易であり、かつ好ましい方法である。
また、本発明の修飾酵素の調製の際、ｐＨは特に限定されるものではないが、好ましくはｐＨ６〜１０が挙げられ、特に好ましくは、修飾率が低下することのないｐＨ８〜９である。
【００２３】
本発明の修飾酵素の、共重合体と酵素との結合比率は、特に限定されるものではないが、好ましくは酵素１００重量部に対して、共重合体５０〜４００重量部である。
【００２４】
本発明の成分分析用試薬には、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、卵白アルビミン、ウシ胎児血清等の蛋白質、Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社製；登録商標）等の界面活性剤、あるいはジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤は成分分析用試薬に対して０．０１〜２０重量％、有機溶媒は成分分析用試薬に対して０．０１〜２０体積％添加するのが好ましい。
【００２５】
また、本発明の成分分析用試薬を用いて、検体中の測定対象成分の測定を実施する際に使用するその他の試薬には、前記界面活性剤あるいは、有機溶媒を任意に添加することができる。
【００２６】
本発明の成分分析用試薬は凍結乾燥などの手法により、乾燥しても、あるいは、生理食塩水、リン酸緩衝液（あるいはリン酸緩衝化生理食塩水）、トリス塩酸緩衝液（トリス塩酸緩衝化生理食塩水）もしくは慣用の緩衝液等に溶解してもよい。
【００２７】
本発明の修飾酵素を製造する際、酵素に結合しなかった共重合体は、適当な分画用ゲルを用いたゲル瀘過、あるいは、適当な分画分子量をもつメンブランを用いた限外瀘過などによって分離または除去しても、あるいは、分離または除去を行わなくても良い。
【００２８】
本発明の成分分析用試薬に用いる修飾酵素の調製において、修飾酵素はその分子量を適当な分画用ゲルを用いたゲル瀘過などによって分画しても、あるいは、分画を行わなくても良い。更に、本発明の成分分析用試薬は、分子量を分画した修飾酵素あるいは、分子量を分画していない修飾酵素の双方で、成分分析を実施することが可能である。
【００２９】
本発明における成分分析測定対象成分は、特に限定されるものではないが、たとえば、リン脂質、β−リポ蛋白、過酸化脂質、クレアチニン、アンモニア、尿酸、尿素窒素、グルコース、乳酸、ピルビン酸、シアル酸、アミラーゼ、コリンエステラーゼ、トランスアミラーゼ、γーグルタルトランスペプチダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、中性脂肪、遊離脂肪酸、遊離コレステロール、総コレステロール等が挙げられ、好ましくは、中性脂肪、遊離脂肪酸、モノアミンオキシダーゼ、遊離コレステロール、総コレステロールである。
【００３０】
本発明の成分分析用試薬は全ての測定方法に応用可能であり、具体的には放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス比濁法、免疫比濁法、生化学的分析等に使用可能であり、特に好ましくは酵素免疫測定法、生化学分析等である。
【００３１】
また、本発明の成分分析用試薬を用いる場合の測定原理、測定手順、測定のための装置は、特に限定されるものではないが、例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、ラテックス比濁法、免疫比濁法、生化学分析等に用いられている測定原理、測定手順、測定装置が使用可能であり、特に好ましくは生化学分析等に用いられている測定原理、測定手順、測定装置である
【００３２】
本発明の修飾酵素を用いて、検体中の測定対象物の成分分析を実施するには、例えば、測定しようとする測定対象物に反応する本発明の修飾酵素あるいは測定対象物を測定する際の関連物質に反応する本発明の修飾酵素を含有する生理食塩水あるいは慣用の緩衝液および試料あるいは試料の希釈液を一定量の割合にて混合後、一定温度（４℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４０℃）一定時間（１０秒〜６時間、特に好ましくは１分〜３０分）にて反応させた後、ある種の発色剤、蛍光剤あるいは発光剤等により、呈色反応、蛍光反応あるいは発光反応を起こさせ、例えば比色計、蛍光分析器あるいは発光分析器等の適当な計測器で読み取る。
検体中の測定対象物の濃度の定量は、既知濃度の対照試料のものと比較することにより測定することができる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、ポリオキシアルキレン基をもつアルケニルエーテルと無水マレイン酸を含む共重合体と酵素とが化学的に結合してなる新規な修飾酵素を提供することができ、これら修飾酵素を成分分析に用いると酵素が反応容器等に吸着しないので、測定誤差の少ない成分分析を実施することが可能となる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を参考例、実施例、および比較例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
参考例１−１
表１に示すアルケニルエーテル（１．０mol）、無水マレイン酸１０３．０ｇ（１．０５mol）、過酸化ベンゾイル１０３ｇ（１．０５mol）を１リットルのトルエンに溶解し、窒素雰囲気下に８０±２℃で７時間の重合反応を行った。
次いでトルエンおよび未反応の無水マレイン酸を１０〜３０mmHgの減圧下に１００±１０℃で留去し、１４５０ｇの共重合体No.１を得た。得られた共重合体No.１は淡黄色のワックス状の固体で、融点は４５℃、ケン化価は６８．５であった。
【００３６】
参考例１−２
過酸化ラウロイル１９．９ｇ（０．０５ｇ）を１リットルのベンゼンに溶解し、窒素雰囲気下に攪拌しながら７０℃に昇温した後、表１に示すアルケニルエーテル(計１．０mol)、無水マレイン酸１０３．０ｇ(１．０５mol)の３リットルのベンゼン溶液を滴下して７０±２℃で重合反応を行った。
全量滴下後、同じ温度で３時間保持した後、ベンゼンおよび未反応の無水マレイン酸を１０〜３０mmHgの減圧下に１２０±１０℃で留去し、１２９３ｇの共重合体No.２を得た。得られた共重合体No.２は液体であり、ケン化価は８１．５であった。
【００３７】
参考例１−３〜１−８
参考例１−２と同様の方法により共重合体No.３〜No.８を表１〜２に示す反応のモル比および反応条件で調製した。得られた共重合体の分析値および溶解性を表３に示した。
【００３８】
【表１】
0003684591.tif 000003
【００３９】
【表２】
0003684591.tif 000004
【００４０】
【表３】
0003684591.tif 000005
【００４１】
実施例１−１〜１−８：修飾リポプロテインリパーゼの調製
５．０ｍｇのリポプロテインリパーゼを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２．０ｍｌに溶解させた。これに参考例１−１〜１−８で合成した重合体０．５ｇを粉末状態で加え、４℃で一晩攪拌した。反応終了後、反応液を０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＧ−１００（Pharmacia社製）カラムに供し、未反応の重合体を除去し、修飾リポプロテインリパーゼを精製した。得られた修飾リポプロテインリパーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分析したところ、未反応のリポプロテインリパーゼは存在せず、すべてのリポプロテインリパーゼが参考例１−１〜１−８で合成した重合体と結合して高分子化していることが確認された。
【００４２】
実施例２−１〜２−８：修飾コレステロールエステラーゼの調製
１０．０のコレステロールエステラーゼを０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）２．０ｍｌに溶解させた。これに参考例１−１〜１−８で合成した重合体０．５ｇを粉末状態で加え、４℃で一晩攪拌した。反応終了後、反応液をそのままで、以下に示す遊離型コレステロール測定実験に供した。
また、反応液をＳＤＳーポリアクリルアミド電気泳動で分析したところ、未反応のコレステロールエステラーゼは存在せず、参考例１−１〜１−８で合成した重合体と結合して高分子化していることが確認された。
【００４３】
実施例３−１〜３−８：中性脂肪測定
自動分析機（日立製作所製、「日立７１５０自動分析機」）の反応容器に
検体および表４に示す試薬Ｒ１を添加し、３７℃、５分間反応させて遊離グリセロールを消去させた。次いで実施例１−１〜１−８で調製した修飾リポプロテインリパーゼを含む表４に示す試薬Ｒ２を添加して、３７℃、５分間反応させ、脂肪の加水分解反応および発色系に導く酵素反応を行った後、反応容器の吸光度を測定することにより第１回の測定を終了した。測定終了後、反応容器内の溶液を廃棄し、内部を水洗いした後、２回、３回と同じ測定を繰り返した。第１回の測定には未使用の反応容器を用い、同一の検体を同一反応容器で３回測定した。測定した検体中の中性脂肪含量を表５に示した。
【００４４】
比較例１：中性脂肪測定
実施例３−１で用いた、実施例１−１で調製した修飾リポプロテインリパーゼの代わりに未修飾リポプロテインリパーゼを用いた以外は実施例３−１と同様に行った。
測定した検体中の中性脂肪含量を表５に示した。
表５の結果から中性脂肪を本発明の方法で測定した場合は３回ともほぼ同じ結果が得られるのに対し、未修飾プロテインリパーゼを用いた比較例は２回目以降の測定値が低くなっている。
【００４５】
【表４】
0003684591.tif 000006
【００４６】
【表５】
0003684591.tif 000007
【００４７】
実施例４−１〜４−８：遊離脂肪酸測定
実施例３−１〜３−８の中性脂肪を測定した後、今度は同一の反応反応容器および表６に示す試薬を用いて、検体中の遊離脂肪酸含量を測定した。測定結果を表７に示した。
【００４８】
比較例２：遊離脂肪酸測定
比較例１の中性脂肪を測定した後、今度は同一の反応反応容器および表６に示す試薬を用いて、検体中の遊離脂肪酸含量を測定した。測定結果を表７に示した。
表７の結果から遊離脂肪酸を本発明の方法で測定した場合はいずれの場合もほぼ同じ結果が得られるのに対し、未修飾プロテインリパーゼを用いた比較例は正しい結果が得られない。
【００４９】
【表６】
0003684591.tif 000008
【００５０】
【表７】
0003684591.tif 000009
【００５１】
実施例５−１〜実施例５−８：遊離コレステロール測定
実施例３−１と同様の自動分析機を用い、実施例２−１〜２−８で調製した修飾コレステロールエステラーゼを含む表８に示す試薬を用いて検体中の総コレステロールを測定した後、同一の反応容器および表９に示す試薬を用いて検体中の遊離コレステロールを測定した。測定結果を表１０に示した。尚、総コレステロールの測定には未使用の反応容器を用いた。
【００５２】
比較例３：遊離コレステロール測定
実施例５−１の修飾コレステロールエステラーゼの代わりに、未修飾コレスレロールエステラーゼを用いた以外は、実施例５−１と同様に行った。測定結果を表１０に示した。
表１０の結果から遊離型コレステロールを本発明の方法で測定した場合はいずれの場合もほぼ同じ結果が得られるのに対し、未修飾プロテインリパーゼを用いた比較例は正しい結果が得られない。
【００５３】
【表８】
0003684591.tif 000010
【００５４】
【表９】
0003684591.tif 000011
【００５５】
【表１０】
0003684591.tif 000012