(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キラヤサポナリアから得られ、流速１ml／分で、水／アセトニトリル（１５／８５％，v/v）中ｐＨ６.０の１０ｍＭ ＴＥＡＰ溶媒中で５μｍの粒子径、４.６mmＩＤ×２００mmＬをもつＰｏｌｙ ＬＣ ＰＨＥＡカラム上のＨＩＬＩＣでの６.４分のピークを与え、免疫アジュバント活性を有し、かつアジュバントとしてＱｕｉｌ Ａより毒性が低い、実質的に純粋なＱＡ−２１−Ｖ１サポニン。
【請求項２】
キラヤサポナリアから得られ、１ml／分の流速で水／アセトニトリル（１５／８５％，v/v）中ｐＨ６.０の１０ｍＭ ＴＥＡＰ溶媒中で５μｍの粒子径、４.６mmＩＤ×２００mmＬをもつＰｏｌｙ ＬＣ ＰＨＥＡカラム上のＨＩＬＩＣでの６.９分のピークを与え、免疫アジュバント活性を有し、かつアジュバントとしてＱｕｉｌ Ａより毒性が低い、実質的に純粋なＱＡ−２１−Ｖ２サポニン。
【請求項３】
ＱＡ−２１−Ｖ１またはＱＡ−２１−Ｖ２のいずれかの実質的に純粋なサポニンまたはそのいずれかのサポニンのアルカリ加水分解物を含有するサポニン／抗原共有結合複合体であって、該サポニンまたはそのアルカリ加水分解物は直接に又は結合基を介して抗原に結合しており、該結合は動物における免疫反応を刺激する該サポニン又はアルカリ加水分解物の能力を阻害しないものである複合体。
【請求項４】
該結合基が二機能性分子である請求項３記載のサポニン／抗原共有結合複合体。
【請求項５】
該結合基が次の基から選ばれる請求項３記載のサポニン／抗原共有結合複合体：
0003717511.tif 000015
アミノ酸の活性エステル。
【請求項６】
サポニンまたはサポニンアルカリ加水分解物がグルクロネート・カルボキシ基を含んでおり、該サポニンまたは該サポニンアルカリ加水分解物が該グルクロネート・カルボキシ基において抗原と共有結合している、請求項３記載のサポニン／抗原共有結合複合体。
【請求項７】
実質的に純粋なサポニンが、流速１ml／分で、水／アセトニトリル（１５／８５％，v/v）中ｐＨ６.０の１０ｍＭ ＴＥＡＰ溶媒中で５μｍの粒子径、４.６mmＩＤ×２００mmＬをもつＰｏｌｙ ＬＣ ＰＨＥＡカラム上のＨＩＬＩＣでの６.４分の保持時間を有するＱＡ−２１−Ｖ１である、請求項３の記載のサポニン／抗原共有結合複合体。
【請求項８】
サポニンが乾燥重量あたり約２２％炭水化物を含み、該炭水化物が末端アラビノース、末端アピオース、末端キシロース、４−ラムノース、末端ガラクトース、２−フコース、３−キシロース、および２,３−グルクロン酸からなる単糖類組成を有している、請求項４記載のサポニン／抗原共有結合複合体。
【請求項９】
実質的に純粋なサポニンが、１ml／分の流速で水／アセトニトリル（１５／８５％，v/v）中ｐＨ６.０の１０ｍＭ ＴＥＡＰ溶媒中で５μｍ粒子径，４.６mmＩＤ×２００mmＬをもつＰｏｌｙ ＬＣ ＰＨＥＡカラム上のＨＩＬＩＣで６.９分の保持時間を有するＱＡ−２１−Ｖ２である、請求項３記載のサポニン／抗原共有結合複合体。
【請求項１０】
サポニンが乾燥重量あたり約２２％炭水化物を含み、該炭水化物が末端アラビノース、２つの末端キシロース、４−ラムノース、末端ガラクトース、２−フコース、３−キシロース、および２,３−グルクロン酸からなる単糖類組成を有している、請求項４記載のサポニン／抗原共有結合複合体。
【請求項１１】
ＱＡ−２１−Ｖ１またはＱＡ−２１−Ｖ２のいずれかの実質的に純粋なサポニンまたはそのいずれかのサポニンのアルカリ加水分解物と直接に又は結合基を介して結合した抗原からなるサポニン／抗原共有結合複合体と、医薬的に許容される担体を含有するワクチンであって、該結合が動物における免疫反応を刺激する該サポニン又はアルカリ加水分解物の能力を阻害しないものであるワクチン。
【請求項１２】
サポニンまたはサポニンアルカリ加水分解物がグルクロネート・カルボキシ基を含んでおり、該サポニンまたは該サポニンアルカリ加水分解物が該グルクロネート・カルボキシ基において抗原と共有結合している、請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
該結合基が二機能性分子である請求項１２記載のワクチン。
【請求項１４】
該結合基が次の基からのものである請求項１２記載のワクチン：
0003717511.tif 000016
アミノ酸の活性エステル。
【請求項１５】
さらにアジュバントを含む請求項１３記載のワクチン。
【請求項１６】
該アジュバントがサポニンである請求項１３記載のワクチン。
【請求項１７】
免疫学的有効量の抗原、および抗原に対する個体の免疫反応を高めるに充分な量の、少なくともひとつの請求項１または２記載の実質的に純粋なサポニンを含む、個体において抗原に対する抗体の生成を誘発するための医薬組成物。
【請求項１８】
該個体が哺乳動物である請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
１）ＱＡ−２１−ＶＩおよびＱＡ−２１−Ｖ２からなる群から選択されるサポニン、および
２）共有結合している結合基またはブロック基
を含有している、動物における免疫反応を刺激する能力を保持している実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項２０】
サポニンがグルクロネート・カルボキシ基を含んでおり、サポニンが該グルクロネート・カルボキシ基において共有結合している、請求項１９記載の実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項２１】
該ブロック基がエチルアミンである請求項１９記載の実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項２２】
該結合基が二機能性である請求項１９記載の実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項２３】
該結合基が次から選ばれ請求項１９記載の実質的に純粋な変性サポニン：
0003717511.tif 000017
アミノ酸の活性エステル。
【請求項２４】
該結合基がエチレンジアミンである請求項２３記載の実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項２５】
該結合基がグリシンである請求項２３記載の実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項２６】
免疫学的有効量の抗原、および抗原に対する個体の免疫反応を高めるに充分な量の、少なくともひとつの請求項１９〜２５記載の実質的に純粋な変性サポニンを含む、個体において抗原に対する抗体の生成を誘発するための医薬組成物。
【請求項２７】
該個体が哺乳動物である請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＱＡ−２１−Ｖ１またはＱＡ−２１−Ｖ２のいずれかの実質的に純粋なサポニンまたはそのいずれかのサポニンのｉ）１Ｎ ＮａＯＨでの室温１５分の加水分解またはｉｉ）ＮＨ4ＨＣＯ3中の温和なアルカリ加水分解によって調製されるそのいずれかのサポニンのアルカリ加水分解物を含有するサポニン／抗原共有結合複合体であって、該サポニンまたはそのアルカリ加水分解物は直接に又は結合基を介して抗原に結合しており、該結合は動物における免疫反応を刺激する該サポニン又はアルカリ加水分解物の能力を阻害しないものである複合体。
【請求項２９】
ＱＡ−２１−Ｖ１またはＱＡ−２１−Ｖ２のいずれかの実質的に純粋なサポニンまたはそのいずれかのサポニンのｉ）１Ｎ ＮａＯＨでの室温１５分の加水分解またはｉｉ）ＮＨ4ＨＣＯ3中の温和なアルカリ加水分解によって調製されるそのいずれかのサポニンのアルカリ加水分解物と直接に又は結合基を介して結合した抗原からなるサポニン／抗原共有結合複合体と、医薬的に許容される担体を含有するワクチンであって、該結合が動物における免疫反応を刺激する該サポニン又はアルカリ加水分解物の能力を阻害しないものであるワクチン。
【請求項３０】
１）ＱＡ−２１−Ｖ１およびＱＡ−２１−Ｖ２からなる群から選択されるサポニン；および
２）共有結合しているアミノ酸
を含有している、動物における免疫反応を刺激する能力を保持している実質的に純粋な変性サポニン。
【請求項３１】
該アミノ酸がグリシンである請求項３０の実質的に純粋な変性サポニン。
【発明の詳細な説明】
関連出願への参照文献
この出願は１９９１年９月１８日出願の、共に係属中のアメリカ出願番号０７／７６２７５４の部分継続出願であり;該件は１９９０年８月２７日出願のアメリカ出願番号０７／５７３２６８（１９９１年１０月１５日付発行）の部分継続出願であり;該件は１９８８年５月３１日出願のアメリカ出願番号０７／２００７５４(放棄済)の包袋継続出願であり;該件は１９８７年５月２９日出願のアメリカ出願番号０７／０５５２２９(放棄済)の部分継続出願であり;そしてこれらの開示はここ参照により充分に包含される。
発明の背景
(発明の分野)
本発明は医薬の化学の領域におけるものである。特に本発明はサポニンから成るワクチン、それを生産する方法及び動物を免疫するためのその用途に関するものである。
(背景技術の簡単な説明)
キラヤサポニンはキラヤサポナリアＱnillaja  sapomariaの樹皮から抽出したトリテルペングルコシドの混合物である。粗サポニンは、足や口の病気に対するワクチンにおけるアジュバントとして、及び例えばＴrypanosoma  cruziプラスモジウムのような原生動物寄生虫や、またヒツジ赤血球細胞(ＳＲＢＣ)への体液性反応に対する実験的ワクチンによって与えられる保護的免疫性を増幅におけるアジュバントとして広く用いられてきた。(Ｂomford:Ｉnt. Ａrch. Ａllerg. Ａpple. Ｉmmun. ６７:１２７(１９８２))。
サポニンとして、数々の一般性質で特徴づけられてきた天然物である。水溶液中で泡を生ずる能力が、そのグループにそのような名称を与えた。それ以外の特性は溶血活性、魚に対する毒性、コレステロールとの結合及びある場合には抗生物質である。Ｋofler:Ｄie  Ｓaponine(Ｓpringer  Ｖerlag)、Ｂerlin, １９２７;Ｔschescheほか:Ｃhemie  und  Ｂiologie  der  Ｓaponine, Ｆortscher. Ｃhem. Ｏrg. Ｎaturst. ＸＸＸ:４６１(１９７２)。
サポニンの一般性質は、一般の化学反応中に反映されていない。すべてのサポニンはグルコシドであるけれども、そのアグリコンはステロイド,トリテルペノイド又はステロイドアルカロイドに属することがある。糖及びグルコシド結合につく糖鎖の数は大いに変り得る。サポニンは商業的に生産されており多くの用途をもっている。商業的に入手できるキラヤサポニンは粗混合物であって、それは変化しやすいので獣医学方面又はヒトのための医薬組成物における用途には適当でない。その変りやすさや不均一性の故に、各バッチはアジュバント活性や毒性を決定するために動物実験でテストせねばならない。商業的に入手できる製品中の不純物は副反応を起し得る。加えて、与えられたバッチのサポニン中の活性物質の量は変化し得、そのためにバッチからバッチへの再生産性を減少させる。
キラヤサポニンを精製する初期の試みはＤalsgaard:Ａrchivfuer  die  gesamte  Ｖirusforschung,４４:２４３(１９７４)によって行われた。ＤalsgaardはＱuillaja  saponaria  Ｍolinaからのサポニン−アジュバント材料の水性抽出物を部分的に精製した。“Ｑuil−Ａ”の名称でスーパーフォスから商業的に入手できるＤalsgaardの製剤は南米の樹木であるＱuillaja  saponaria  Ｍolinaの樹皮から単離され、そしてトリテルペノイド・キラヤ酸(quillaic acid)へのグルコシド結合の炭水化物部分として化学的に特徴づけられる。然しながら、ＤalsgaardのサポニンＱuil−Ａは、それ迄に入手できた商業的なサポニンよりも決定的な改良があるものの、それはまた可成りの不均一性がある。
ヒグチほか(Ｐhytochemistry,２６:２２９(１９８７年１月))は、粗キラヤサポニン混合物を、５０％メタノール中の６％ＮＨ4ＨＣＯ3中でのアルカリ性加水分解で処理して、ＤＳ−１及びＤＳ−２と命名される２つの主なデスアシルサポニンを生成させた。ＤＳ−１はグルクロン酸,ガラクトーズ,キシローズ,フコーズ,ラムノーズ,アピオーズ及びキラヤ酸を含み、一方ＤＳ−２はそれらの成分に加え更にグルコースを含むとされている。この脱アシル化の副生成物は、３,５−ジヒドロキシ−６−メチルオクタン酸、３,５−ジヒドロキシ−６−メチルオクタン酸−５−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシド及び−５−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−α−Ｌ−アラビノフラノシドを含むいくつかの成分を生成した(Ｈiguchiほか:phytochemistry, ２６:２３５７(１９８７年８月))。
【図面の簡単な説明】
図１は、逆相ＨＰＬＣ上での、透析されメタノールに溶かしたキラヤ樹皮抽出物の屈折率プロフィルである。
図２は、上記サンプルの屈折率ピークが炭水化物ピークに対応することを示すものである。
図３は、スーパーフォスＱuil−Ａと、ＨＰＬＣによる透析されたメタノール可溶樹皮抽出物の比較を示す。
図４は、粗サポニン混合物のＱuil−Ａからシリカクロマトグラフィー(４Ａ)及び引き続いての逆相クロマトグラフィー(４Ｂ,４Ｃ,４Ｄ)によるＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８,ＱＡ−１９及びＱＡ−２１の精製を示す。
図５は、単一ピーク(５Ａ)としてＱＡ−２１の逆相ＨＰＬＣ、及び親水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＬＩＣ)(５Ｂ)でのＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２の２つのピークへの分解を示す。
図６は、逆相(６Ａ)及び通常相(６Ｂ)薄層クロマトグラフィーによるＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１の精製をあらわす。
図７ＡはＱＡ−７のＵＶスペクトルを;図７ＢはＱＡ−１７のＵＶスペクトルを;図７ＣはＱＡ−１８のＵＶスペクトルを;そして図７ＤはＱＡ−２１のＵＶスペクトルを表わす。
図８ＡはＱＡ−７の1Ｈ核磁気共鳴(ＮＭＲ)を;図８ＢはＱＡ−１８の1Ｈ  ＮＭＲを;そして図８ＣはＱＡ−２１の1Ｈ  ＮＭＲをあらわす。
図９は、ＱＡ−７(９Ａ),ＱＡ−１７(９Ｂ),ＱＡ−１８(９Ｃ),ＱＡ−２１(９Ｄ),ＱＡ−２１−Ｖ１(９Ｅ)及びＱＡ−２１−Ｖ２(９Ｆ)の質量分光高速原子衝撃(ＭＳ−ＦＡＢ)をあらわす。
図１０はＱＡ−１７,ＱＡ−１８,ＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２の提案構造をあらわす。
図１１は、同一サポニンの臨界的ミセラ濃度で平衡化されたＰＢＳ中のＢio−Ｇel  Ｐ−２００上でのゲル濾過による純粋なＱＡ−１８ミセルと純粋なＱＡ−２１ミセルの溶離プロフィル、及び標準蛋白の溶離位置との比較をあらわす。
図１２は、ヒツジ赤血球細胞のＱＡ−７,ＱＡ−８,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８,ＱＡ−２１及びスーパーフォスのＱuil−Ａによる溶血をあらわす。
図１３は、樹皮抽出物のＨＰＬＣ−精製分画の存在下でのＢＡＳ抗原による免疫のための典型的な終末点力価（タイター）を示す。抗原特異的な抗体結合に起因する吸収な血清稀釈の対数の関数としてプロットされている。
図１４は、抗体ＢＳＡによる免疫でのフロインドの完全アジュバントでの、及び種々の抗原濃度におけるＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１のアジュバント効果の比較をあらわす。
図１５は、ＩgＧタイターのサブクラスＩgＧ１(１５Ａ),ＩgＧ２b(１５Ｂ)及びＩgＧ２a(１５Ｃ)ならびに全ＩgＧ(１５Ｄ)へのブーストにおけるＱＡ−２１(混合物)、ＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２のアジュバント効果を示す。図１５Ｅは、全ＩgＧタイターをブーストしたときのＱＡ−２１,ＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２の用量反応曲線である。
図１６は、抗原gp７０Ｒ−デルタでの免疫化において他のアジュバントＡl(ＯＨ)3と共に用いられるＨＰＬＣ精製したアジュバントのアジュバント効果を示す。
図１７は、抗原アルキル化gp７０Ｒ−デルタで免疫化したときのＨＰＬＣ精製キラヤサポニンと他のアジュバント、それの相互の結合及びそれ単独の効果の要約である。
図１８は、抗原ＢＳＡで免疫したときのＱＡ−１８,ＱＡ−１８Ｈ,ＱＡ−２１及びＱＡ−２１Ｈのアジュバント効果の比較である。
図１９は、リゾチームとＱＡ−２１の反応のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動である。
図２０は、リゾチーム単独(１０μg)で免疫しアジュバントなしの;リゾチーム(１０μg)とフリーの(共有結合のない)ＱＡ−２１(１６μｇ;モル比１:１)で免疫した;及びＱＡ−２１−リゾチーム複合体(１１．６μg;モル比１:１)で免疫したマウスの総ＩgＧタイターである。
図２１は、リゾチーム単独(１０μg);リゾチーム(１０μg)及び遊離のＱＡ−２１(１０μg);ならびにＱＡ−２１−リゾチーム複合体(１１.６μg)及び遊離のＱＡ−２１(１０μg)で免疫したマウスの総ＩgＧタイターである。
図２２は各々のマウスのグループで生成されたＩgＧのアイソタイプである。
図２３は、グルクロネート・カルボキシル(２３Ａ);還元的アミノ化によるトリテルペンアルデヒド(２３Ｂ);及びアルコールへの還元によるトリテルペンアルデヒド(２３Ｃ)における変性サポニンＱＡ−２１のアジュバント活性を示す。
図２４は、グルクロネート・カルボキシルに結合したエチレンジアミンによってビオチンに結合したＱＡ−２１のアジュバント活性を示す。
発明の要旨
アジュバント・サポニンは、南米の樹木Ｑuillaja  Ｓaponaria  Ｍolinaの樹皮の水性エキスから見出され精製された。少くとも２２のサポニン活性のピークが分離されている。最も多い精製キラヤサポニンはＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１(またはそれぞれＱＳ−７,ＱＳ−１７,ＱＳ−１８及びＱＳ−２１)として同定されている。これらのサポニンは高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)及び低圧液体クロマトグラフィーによって精製されている。これら４つのサポニン−はマウスでアジュバント効果をもつ。予期せぬことに、ＱＡ−２１は、親水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＬＩＣ)で更に精製してＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２の２つのピークに分解され、これらの別個の化合物であるとされている。本発明の実質的に純粋のサポニンは免疫アジュバントとして有用であり、そして粗サポニン製剤に伴う毒性のないところの以前に得られた不均一なサポニン製造に比べて、一層低い濃度で個々に免疫反応を高める。
本発明は抗原に結合したサポニンから成るサポニン／抗原結合体に関するもので、ここで該結合は動物の免疫反応を上昇させるサポニンの能力を実質的に妨害しない。
本発明はまた結合分子で変性したサポニンから成るところの変性サポニンに関するもので、ここで該変性は動物の免疫反応を上昇させるサポニンの能力を実質的に妨害しない。
本発明はまた、抗原に結合したサポニン加水分解生成物から成るサポニン加水分解物／抗原複合体に関するもので、ここで該結合は動物の免疫反応を上昇させるサポニン加水分解生成物の能力を実質的に妨害しない。
本発明はまた本発明のサポニン／抗原結合体、医薬的に許容される担体及び必要に応じ１つ又はそれ以上のアジュバントから成るワクチンに関するものである。好ましくは該アジュバントは本発明のサポニンである。
本発明はまた本発明のサポニン／抗原結合体を医薬的に許容される担体から成るワクチンに関するものである。
好ましい実施態様の説明
本発明のサポニンは、樹木Ｑuillaja  Ｓaponaria  Ｍolinaから得ることができる。
ここで用いる「サポニン」という用語は、水溶液中で泡を形成し、多くの場合に溶血作用をもち、そして免疫アジュバント活性をもつところのグリコシド  トリテルペノイド化合物を包含する。本発明はサポニンそれ自体のほかに、天然のそして医薬的に許容される塩や医薬的に許容される該導体を含む。「サポニン」という用語はまた、その生物学的に活性なフラグメントをも含む。
本発明はまた、一つ又はそれ以上の実質的に純粋なサポニン分画又はその加水分解物から成る組成物たとえば免疫組成物に関するものであり、またそれらの組成物のワクチンや免疫アジュバントとしての使用方法にも関する。
ここで使用する「免疫アジュバント」という用語は、個体に投与され又はインビボでテストした時に、抗原が投与された個体又はテスト系中に該抗原に対する免疫反応を増大させるような化合物を指す。いくつかの抗原に、単独投与では弱い免疫性であり、又は個体に免疫反応を発生させる濃度では該個体に対し毒性をもつ。免疫アジュバントは、抗原をもっと強力に免疫的にすることにより該抗原に対する個体の免疫反応を高めうる。このアジュバント効果はまた、該個体中の免疫反応をうるに必要な該抗原の用量を低下させうる。
サポニンは、もし抗原に結合すれば、たとえ抗原が非免疫的であつてもその抗原に対する免疫反応を顕著に高めうることが見出された。また、本発明のサポニン複合体は抗体の多くのサブタイプの生産を高める。予期せぬことには、本発明のサポニン／抗原複合物をサポニンアジュバント(抗原と結合していないもの)と一緒に投与すると、免疫反応が極めて大きく高められる。すなわち本発明は、これ迄不可能であったところの、ある抗原に対する活性免疫の発生をおこさせるという偉大な技術上の進歩をなしたものである。
本発明のサポニン複合物及びサポニンアジュバントの免疫活性は、当業者に公知の多くの方法の何れかによって決定され得る。本発明のワクチン及び／又はアジュバントの投与による特定の抗原に対する抗体のタイターの上昇は、免疫活性の判断に用いうる(Ｄalsgaard,Ｋ. (１９７８):Ａcta  Ｖeterinia  Ｓcandinavica,６９:１−４０,Ｓcottほか:Ｉnt. Ａrchs. Ａllergy  Ａppl  Ｉmmun. ７７:４０９−４１２(１９８５))。簡単に云えば、ひとつのそのようなテストは、いろんな量の潜在的アジュバントと混合しうるサポニン／抗原複合物のＤＣ−１マウスへの皮内注射を含む。セラを２週間後にマウスから採集し、ＥＬＩＳＡによって抗免疫原抗体をテストする。
透析したメタノール可溶の樹皮エキスとＱuil−Ａのアジュバント効果を比べると、抗原ＢＳＡをサポニン製剤の存在下に投与したときの抗体タイターはＢＳＡをＰＢＳ単独で投与した時よりも２倍大きいことがわかった。樹皮エキスは、１２μgの炭水化物(アンスロンで試験)又はそれ以上のアジュバント用量で投与すると、良好なアジュバント活性を示した。Ｑuil−Ａに対するアジュバント反応は樹皮に対してよりも弱いが、９〜２３μgの用量の炭水化物では明瞭である。炭水化物の量(グルコースを標準物質とし、アンスロンにより定量)はこれらの粗アジュバントエキスの乾燥量の大凡３０％である。
「実質的に純粋」という用語、天然状態のサポニンと通常共存する化合物を実質的に含んでおらず、そして一定かつ再現可能のクロマトグラフ反応、溶離プロフィル及び生物活性をもつことを意味する。「実質的に純粋」という用語は、天然又は合成されたところのサポニンと他の化合物との混合物を除外することを意味しない。
好ましくは、実質的に純粋なサポニンは次の標準の一つ又はそれ以上にまで精製する。１)クロロホルム／メタノール／水(６０／４５／１０,v／v／v)中の４０mＭ酢酸の溶媒系でのシリカゲルＴＬＣ(ＥＭ  ＳcienceＨＰＴＬＣ  Ｓi６０)上で、唯ひとつの主要炭水化物着色バンドとして出現する。２)メタノール／水(７０／３０,v／v)の溶媒系での逆相ＴＬＣ(ＥＭ  ＳcienceシリカゲルＲＰ−８)上で、唯ひとつの主要炭水化物着色バンドとして出現する。３)メタノール／水(５８／４２,v／v)中の４０mＭ酢酸のＶydac  Ｃ４(粒子径５μm,３３０Å細孔,４.６mmＩＤ×２５cmＬ)上の逆相ＨＰＬＣで唯ひとつの主要ピークとして出現する。
ＱＡ−２１とは、メタノール／水(５８／４２,v／v)中の４０mＭ酢酸中のＶydac  Ｃ４(５μm粒子径,３３０Å細孔,４.６mmＩＤ×２５cmＬ)上の逆相ＨＰＬＣで単一のピークとして現われるＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２成分の混合物をあらわす。これら成分の分画は、さらに精製した成分について行われる実験や結果を述べる時には、特にＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２と呼ばれる。
好ましい実施態様において、本発明のサポニンはＱuillaja  Saponaria  Ｍolina樹皮から精製する。Ｑuillaja  Ｓaponaria  Ｍolinaの樹皮の水性エキスを水に対して透析する。透析したエキスは凍結乾燥し、メタノールで抽出し、メタノール可能エキスはさらにシリカゲルクロマト及び逆相高圧液体クロマト(ＲＰ−ＨＰＬＣ)で分画する。個々のサポニンを、実施例１に述べるように逆相ＨＰＬＣで分離する。少くとも２２のピーク(ＱＡ−１〜ＱＡ−２２と命名)が分離される。各ピークは図２に示す炭水化物ピークに対応しており、逆相薄層クロマト上では唯一の単一バンドを与える。個々の成分はＶydac  Ｃ4ＨＰＬＣカラム上で次のような保持時間を示す。
0003717511.tif 000002
免疫アジュバント活性は、外来投与抗原に対しマウス中での免疫反応を高める精製サポニンの能力を測定してテストする。本発明の精製サポニンは、粗エキスよりも低い用量でアジュバント効果を示す。特に、樹皮中に多くあるサポニン(ＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１)は、４.５μg又はそれ以下の用量の炭水化物(アンスロンでのアッセイ)でアジュバント活性を示す。精製したサポニンは、炭水化物含量、逆相及び通常相ＴＬＣ,ＵＶ,赤外,ＮＭＲスペクトル及びＦＡＢ−ＭＳによりさらに特徴づけられる。
更に好ましい精製サポニンの幾つかの２０５nmにおけるメタノール中の１％(w／v)溶液における大凡の吸光係数は次のとおりである。
0003717511.tif 000003
炭水化物含量はいくつかの例でサポニンの定量に用いる。炭水化物アッセイは、実施例１のようにグルコースを標準物質として用いるＳcott及びＭelvinのアンスロン法(Ａnal. Ｃhem. ２５:１６５６(１９５３))で行なった。このアッセイは、特定製造の乾燥重量をアンスロン法で求められるように、精製サポニン１mg(乾燥重量)あたりのアンスロン反応(グルコース当量であらわす)の比を測定するのに用いられた。いろんなサポニンについてのアンスロンとの反応の差は、このアッセイでは異ったモノサッカライドは異なる反応をするために量よりはむしろ炭化水素の組成によるものであろう、という事に注意すること。
実質的に純粋なＱＡ−７サポニンは次の点により特徴づけられる。免疫アジュバント活性をもつこと;乾燥重量あたり約３５％の炭水化物(アンスロンでアッセイ)を含むこと;メタノール／水(５８／４２;v／v)中の４０mＭ酢酸溶媒中の５μmの粒子径，３３Å細孔，４.６mmＩＤ×２５mＬのＶydac  Ｃ4カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣで、１ml／分の流速で約９〜１０分の保持時間の、２０５−２１０nmのuv吸収極大をもつこと、但し５０〜８０％メタノールの勾配溶離で４０mＭ酢酸溶媒中、５μm粒子径，３３０Å細孔，１０mmＩＤ×２５mＬをもつＶydac  Ｃ4カラムから５２−５３％メタノールで溶離;水中で約０．０６％，そしてリン酸緩衝食塩水で０．０７％の臨界ミセル濃度をもつこと;２００μg／ml又はそれ以下の濃度ではヒツジ赤血球細胞に対して検出できる溶血をおこさぬこと;そして末端ラムノース,末端キシロース,末端グルコース,末端ガラクトース,３−キシロース,３,４−ラムノース,２,３−フコース及び２,３−グルクロン酸及びアピオース(結合は決定せず)の単糖類残渣を含んでいること。
実質的に純粋のＱＡ−１７サポニンは次の点で特徴づけられる。アジュバント活性をもっていること;乾燥重量あたり約２９％の炭水化物(アンスロンでアッセイ)を含むこと;２０５−２１０nmの紫外吸収極大をもつこと、但し５０−８０％メタノールからの勾配溶離で、５μm粒子径，３３０Å細孔，１０mmＩＤ×２５mＬのＶydac  Ｃ4カラム(４０mＭ酢酸中)６３−６４％メタノールで溶離し、１ml／分の流速でメタノール／水(５８／４２,v／v)中の４０mＭ酢酸中の５μm粒子径，３３０Å細孔，４.６mmＩＤ×２５mＬのＶydac  Ｃ4カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣ上で約３５分の保持時間をもつこと;水中で０.０６％(w／v)そして燐酸塩緩衝食塩水中で０.０３％(w／v)の臨界ミセル濃度をもつこと;２５μg／ml又はそれ以上でヒツジ赤血球細胞に溶血をおこさぬこと;そして、単糖類残渣として末端ラムノース,末端キシロース,２−フコース,３−キシロース,３,４−ラムノース,２,３−グルクロン酸，末端グルコース,２−アラビノース,末端ガラクトース及びアピオース(結合は未決定)を含んでいること。
実質的に純粋なＱＡ−１８サポニンは次のように特徴づけられる。免疫アジュバント活性をもっていること;乾燥重量あたり約２５−２６％の炭水化物(アンスロンでアッセイ)を含んでいること;２０５−２１０nmのＵＶ吸収極大をもっていること;但し５μm粒子径，３３０Å細孔，１０mmＩＤ×２５mＬで４０mＭの酢酸溶媒中のＶydac  Ｃ4カラムを５０−８０％メタノールから勾配溶離で、６４−６５％メタノールで溶離し、１ml／分の流速で、メタノール／水(５８／４２,v／v)中の４０mＭ酢酸溶媒中の５μm粒子径，３３０Å細孔，４.６mmＩＤ×２５mＬのＶydac  Ｃ4カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣで約３８分の保持時間があること;水中で０．０４%(w／v)そして燐酸塩緩衝食塩水中で０．０２％(w／v)の臨界ミセル濃度をもつこと;２５μg／ml又はそれ以上でヒツジ赤血球細胞に溶血をおこさぬこと;そして次の単糖類末端アラビノース,末端アピオース,末端キシロール,末端グルコース,末端ガラクトース,２−フコース,３−キシロース,３,４−ラムノース及び２,３−グルクロン酸を含むこと。
実質的に純粋なＱＡ−２１は次によって特徴づけられる。免疫アジュバント活性をもつこと;乾燥重量あたり約２２％炭水化物(アンスロンでアッセイ)を含むこと;２０５−２１０nmのＵＶ吸収極大をもつこと、但し５０−８０％勾配溶離で４０mＭ酢酸中の５μm粒子径，３３０Å細孔，１０mmＩＤ×２５mＬのＶydac  Ｃ4カラムから６９−７０％メタノールで溶離し、但し１ml／分の流速でメタノール／水(５８:４２;v／v)中の４０mＭ酢酸中の５μm粒子径，３３０Å細孔，４.６mmＩＤ×２５mＬのＶydac  Ｃ4カラム上のＲＰ−ＨＰＬＣで約５１分の保持時間;水中で約０．０３％(w／v)そして燐酸塩緩衝食塩水内で０．０２％(w／v)の臨界ミセル濃度をもつこと;そして２５μg／ml及びそれ以上の濃度でヒツジ赤血球細胞に溶血をおこさぬこと。成分分画すなわち実質的に純粋なＱＡ−２１−Ｖ１とＱＡ−２１−Ｖ２はＦＡＢ−ＭＳで同一のスペクトルと分子量を示す。それらは、ＱＡ−２１−Ｖ１は末端アピオースをもち、それはＱＡ−２１−Ｖ２ではキシロースである(従ってそれは２つのキシロースがあり、アピオースはない)という点のみで異っている。これら２成分はさらに単糖類末端アラビノース,末端アピオース,末端キシロース,４−ラムノース,末端ガラクトース,２−フコース,３−キシロース及び２,３−グルクロン酸をもつ、サポニンの構造は以下の実施例で更にくわしく示す。
本発明の複合物は、個体中の抗原に活性免疫を発生させるワクチンとして有用である。好ましくはそれら個体はヒトであるがそれには限定されない。発明のワクチンの有益な効果を示すどんな動物もまた、クレームされた本発明によって処理できる動物の範囲に入る精製したサポニンは、投与すべき抗原に対して広範囲の比率で、広範囲の用量で投与したときにアジュバント効果を示す。一つの態様ではサポニンを、アジュバント対免疫原(w／w)比３．０又はそれ以下(好ましくは１.０またはそれ以下)の比で投与する。
精製したサポニン及びサポニン−抗原複合体は個々に、又は他の実質的に純粋なアジュバントと共に投与し、抗原に免疫反応をおこさせる。さらに本発明のサポニン／抗原複合体は単一サポニン又は抗原に結合したサポニン混合物より成り得る。抗原に結合したサポニンの混合物は特製サポニン又はサポニンの粗混合物であって良い。粗サポニン混合物は毒性がありふつうは動物に投与しないけれども、サポニン−抗原複合物の生成は組成物の毒性減少に役立ち、即ち複合物は好ましくない効果をおこすことなく動物に投与できる。
本発明で有効なサポニン混合物のなかには分画ＱＡ−７とＱＡ−１７;ＱＡ−７とＱＡ−１８;ＱＡ−１７とＱＡ−１８;又はＱＡ−７,ＱＡ−１７とＱＡ−１８の同時投与がある。精製サポニンとその複合物はまた非サポニンアジュバントと共に投与できる。本発明で有用なそのような非サポニンアジュバントは次のようである。即ちオイルアジュバント(たとえば、フロイントの完全及び不完全),リポソーム,ミネラル塩(たとえばＡlＫ(ＳＯ4)2,ＡlＮa(ＳＯ4)2,ＡlＮＨ4(ＳＯ4),シリカ,明ばん,Ａl(ＯＨ)3,Ｃa3(ＰＯ4)2,カオリン及び炭素),ポリヌクレオチド(たとえばポリＩＣ及びポリＡＵ酸)及び特定の天然物(たとえばＭycobacterium  tuberculosisからのロウＤや、Ｃorynebacterium  parvum, Ｂordetella  pertussis及び多くのＢrucella属に見出される物質)，ウシ血清アルブミン,ジフテリアトキソイド,テタヌストキソイド,エデスチン,かぎ穴リンペットヘモシアニン,シュードモナルトキシンＡ,コレラゲノイド,コレラトキシン,百日せきトキシン,ウイルス蛋白,及び真核生物蛋白たとえばインターフェロン,インターロイキン及び腫瘍壊死因子。そのような蛋白は当業者に公知の方法で天然又は組換原料から入手できる。組換原料から入手したときは、非サポニンアジュバントは、分子の少くとも免疫原部分から成る蛋白部分から成っている。本発明に用いる他の公知の免疫原高分子には次のようなものであるが、これに限定されるものではない。すなわち多糖類,tＲＮＡ,非代謝性合成高分子たとえばポリビニルアミン,ポリメタクリル酸,ポリビニルピロリドン,４',４'−ジアミノジフェニル−メタン−３,３'−ジカルボン酸と４−ニトロ−２−アミノ安息香酸の混合共重合物(比較的高い分子量の)(Ｓela. Ｍ:Ｓcience,１６６:１３６５−１３７４(１９６９))又は糖脂質，脂質又は炭水化物。
本発明のサポニンは抗原と直接に結合しても、または結合基を介して結合してもよい。「結合基」という用語は、サポニン又はサポニン混合物を抗原に共有的に結合する用いられ、そして生体内で抗原特異的な抗体の生成を妨げぬような１つ又はそれ以上の二機能性分子をあらわす。結合基は、その結合点が生体内の抗原特異的な抗体の生成を妨げず、そして活性免疫の発生を妨げぬ限り、サポニンのいかなる位置にも結合できる。
サポニンを抗原に結合するのに用いる結合基の例は次のようである。
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典型的には、サポニンはサポニンの成分のグルクロン酸の活性エステルの生成により抗原に結合され、次いで抗原の求核機能基と活性エステル反応する。本発明に用いられる活性エステルの例はＮ−ヒドロキシサクシニシド,スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシニシド,ヒドロキシベンゾトリアゾールやp−ニトロフェノールのグルクロン酸塩である。これら活性エステルは、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ),１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド(ＥＤＣ)や１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミド・メケオダイド(ＥＤＣＩ)のような脱水剤の存在下に、サポニンのカルボキシル基をアルコールと反応させて作る。複合物を作るためのＥＤＣの使用は、アメリカ特許第４,５２６,７１４号(Ｆeijenほか)及びＰＣＴ出願公告ＷＯ９１／０１７５０及びＡrnon,Ｒ. ほか:Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. (ＵＳＡ)７７:６７６９−６７２２(１９８０)に開示され、それら開示は全て本明細書に包含される。ついで抗原を水溶液中で活性エステルと混合して複合物とする。
サポニンと抗原の間の結合基を所望のときは、サポニン・グルクロネートの活性エステルを上述のようにして作り、そして結合基たとえば２−アミノエタノール,アルキレンジアミン,アミノ酸たとえばグリシン又はカルボキシが保護されたアミノ酸たとえばグリシンのtert−ブチルエステルと反応させる。もしも結合基が、保護されたカルボキシ基をもっているときは、その保護基を除き、結合基の活性エステルとする(上述のようにして)。この活性エステルを次いで抗原と反応して複合物とする。又は抗原を無水コハク酸と反応させ抗原−コハク酸塩複合物とし、これを結合基上に遊離のアミノ又はヒドロキシ基をもつサポニン−結合基誘導体と、ＥＤＣ又はＥＤＣＩの存在下に縮合させる。ＷＯ９１／０１７５０参照。
ひとたびグルクロネート・カルボキシが結合基と反応すれば、サポニンはアジュバント活性を保持する。トリテルペンアルデヒドにおいて還元的アルキル化によって作られたサポニン誘導体は、４０μgより低い用量ではアジュバント活性がよい。しかしナトリウム・ボロヒドリドによってアルコールにまで還元されたサポニントリテルペンアルデヒドの誘導体は若干の活性をもっている。
結合基と遊離アミノ基(アルキルレンジアミンから誘導されたもの)と、そして遊離アミノ基と異節二機能架橋(たとえばスルホサクシニミジル  ４−(Ｎ−マレイミドシクロヘキサン)−１−カルボキシレート(それは蛋白抗原の遊離スルフヒドリル基と反応する)をもつサポニン複合物をつくることもできる。
サポニンはまた、キラヤ酸残基のアルデヒド基とアミノ結合基と反応させて中間体のイミン複合物をつくり、次いでナトリウム・ボロヒドリド又はナトリウム・シアノボロヒドリドで還元して結合基に結合させることができる。そのような結合基の例はアミノアルコール、たとえば２−アミノエタノール及びジアミノ化合物たとえばエチレンジアミン,１,２−プロピレンジアミン,１,５−ペンタンジアミン,１,６−ヘキサンジアミン等である。次いで抗原を、まず無水コハク酸とでコハク酸化した誘導体とし、それからＤＣＣ,ＥＤＣ又はＥＤＣＩと共にサポニン−結合基複合物と縮合して結合基とカップリングさせる。
さらに、サポニンは過ヨード酸塩で酸化し、得たジアルデヒドは上記のアミノアルコール又はジアミノ化合物と縮合させてもよい。次いで結合基の遊離水酸基やアミノ基は、ＤＣＣ,ＥＤＣ又はＥＤＣＩの存在下に抗原のサクシネート誘導体と縮合してもよい。
サポニン分子と抗原分子の比は、抗原の分子量や、サポニンに結合できる抗原上の結合部位の数や、特定のサポニンの抗原特性によって大幅に変りうる。一般にサポニン分子と抗原分子の比は約０.１:１から約１０:１であり、好ましくはその比は約１:１から約３:１の範囲である。
本発明のサポニンは、いかなる抗原にも免疫反応を高めるために用いうる。本発明の免疫反応生起組成物に適当な典型的な抗原は次のものから誘導された抗原を含む。すなわちウイルス、たとえばインフルエンザ、ネコ白血病ウイルス,ネコ免疫不全ウイルス,ＨＩＶ−１,ＨＩＶ−２,狂犬病,ハシカ,Ｂ型肝炎,又は足や口の病気;バクテリア,たとえば脾脱疽,ジフテリア,ライム(Ｌyme)病,又は結核;又は原生動物たとえばＢabeosis  bovis又はＰlasmodium。抗原は蛋白,ペプチド又は多糖類であってよい。蛋白やペプチドは天然材料から精製してもよく固相合成手段で合成してもよく又は遺伝子組換え手段で得てもよい。
本発明の精製サポニンの用途の特定の一例は、免疫反応をgp７０組換え蛋白にまで高めることである。ひとつのgp７０組換え蛋白は、ＦeＬＶgp７０のエンベロープ蛋白のポリペプチド部分を含む抗原である。この組換え抗原はgp７０Ｒ,rec−gp７０又はＲgp７０と呼ばれる。ＦeＬＶgp７０のポリペプチド部分を４０のアミノ−末端アミノ酸(Ｒgp７０−デルタと呼ぶ)又はＦeＬＶサブグループＡのp１５eエンベロープ蛋白の全アミノ酸配列(Ｒgp９０と呼ぶ)を共に含む他の抗原蛋白は、組換えＤＮＡ技術で作られる。これらの組換えgp７０−含有ポリペプチド,gp７０Ｒ,gp７０Ｒ−デルタ及びgp９０Ｒは、以下において一括してgp７０−含有蛋白と呼ぶ。gp７０−含有蛋白という用語は、天然産のgp７０−含有蛋白及びその同族体と同じアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。「同族体」という用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、削除又は置換によって該ポリペプチドがgp７０蛋白の生物活性を実質的にもつ点においてgp７０,gp７０−デルタ又はgp９０と異る蛋白やポリペプチドを含む。
本発明の方法で有用な化合物の投与は、非経口,静脈内,筋肉内,皮下,鼻内その他の適当な手段で行いうる。用量は年令,体重,もし同時に治療をしておればそのタイプ及び投与抗原の性質などに依存しうる。ふつうはサポニン／抗原複合物は個体の体重について約０.０１〜約１.０mg／kgの用量で投与する。初期用量にくらべ、免疫反応を示す約４週間あとの用量は増大してもよい。それ以上の大用量を投与してもよい。
本発明方法で有用な有効化合物はカプセル,溶液,経口用の懸濁液又はエリキシル,又は無菌の液状たとえば溶液の懸濁液の形で用いうる。本発明の方法に用いる化合物が本発明の用途のための適当な溶解度をもつような不活性担体、たとえば食塩水,リン酸塩緩衝食塩水その他が好ましく用いられる。
本発明のサポニン／抗原複合物はまたアメリカ特許第４,２３５,８７７号(Ｆullerton)のリポソーム中に包接した形で用いうる。
本発明はまた、第１のコンテナーは本発明のサポニン／抗原複合物を含むような１つ又はそれ以上のコンテナーをもつ仕切られた担体から成る個体用の免疫用キットをも提供する。このキットはまた、上述のサポニンアジュバント又は他のアジュバントを含む少なくとも１コの他のコンテナー手段をも含みうる。
さて本発明を一般的に説明してきたので、次に実施例によってさらにくわしく説明する。これらは特に述べぬ限り本発明を限定するものでない。
実施例１．Ｑuillaja  saponaria  Ｍolina樹皮エキスの予備製剤。
キラヤ・サポナリア樹皮を過剰の水(１０％w／v)かくはんしてサポニンを抽出する。水性エキスを濾過し０.１ＮaＮ3中に貯える。このエキス１５０mlを２０,０００xgで３０分遠心分離し、残りの樹皮分を除く、淡褐色の上澄を凍結乾燥し、１６mlの水にとかし、１Ｎ酢酸１６０μlを加えてpＨを４より低くする。この溶液を１２,０００ＭＷ除去用の透析管に入れ、水１リットルに透析する。８時間透析のあと水を替え、透析を一夜つづける。第１と第２の透析サイクルのあと透析物のサンプルを除去する。透析したエキスを凍結乾燥し、６０℃で１５分間メタノール４０mlで抽出し、１０００xgで１０分間遠心し不溶物を沈下させる。これをメタノールで更に２回抽出する。メタノール抽出液を貯え、回転エバポレーターで蒸発乾固し、メタノール５.５mlに再びとかし０.２μナイロン６６メッシュで濾過して残った不溶物を除く。分画を７０％メタノール／３０％水の溶媒系中のＣ８プレート(ＥＭ. ＳcienceＲＰ−ＴＬＣ,Ｃ８)上の逆相薄層クロマト(ＲＰ−ＴＬＣ)又はn−ブタノール,エタノール,水及びアンモニア(３０／６０／２９／２１,v／v／v／v)の溶媒系中のシリカゲル６０ＴＬＣプレート上の順相ＴＬＣにより分析する。炭化水素のバンドをＢial試薬で可視化する。これは硫酸炭化法で上昇した感度をもつ硫酸炭化で検出可能のすべての主要バンドを検出するものである。Ｂial試薬での炭水化物の着色はＴＬＣプレート上の検出試薬としてふつうに用いられる。すべての主要バンドはグリコシル化されていた。
透析によって、主な炭水化物含有バンド(ＲF＝０．８２,ＥＭＳcience  ＲＰＴＬＣ,Ｃ８,メタノール／水(７０／３０,v／v)中)及び若干の微小成分は除かれた。また透析により、２８０及び３１０nmに強い吸収極大をもつ成分も除かれた。炭水化物の約８０％(アンスロンでのアッセイ)が透析で除かれたが、溶血活性の約９５％は透析中も残っていた。
殆どのサポニンアジュバントは洗剤活性、たとえば赤血球細胞の溶血作用をもっているので溶血活性の保持はアジュバントサポニンの保持の大まかな表示となる。いくつかのバンドは透析により残され、洗剤性質を示す。メタノールは、ひとつのＴＬＣバンド(ＲF＝０,逆相及び順相ならびにシリカＴＬＣプレート上で)を除き、透析エキス中のすべてのＴＬＣバンドを溶かした。メタノール不溶物は赤褐色であった。メタノール可溶物は凍結乾燥後、白色となった。
炭水化物濃度はＳcott及びＭelvin(Ａnal. Ｃhem. ２５:１６５６(１９５３))の方法で定量した。かんたんに云うと、検査すべき水性サンプル又は標準炭水化物液(４５０μl)としてのグルコースを、硫酸中０.２％(w／v)アセトン９００μlと混ぜ、９０−１００℃で１６分培養する。吸収は６２５nmでみた。グルコースを標準物質として使った。
サンプルの溶血活性は次のようにして測定した。サンプルを、連続した列(１０μl／ウエル)のリン酸緩衝食塩水中の１:２稀釈で、丸底マイクロタイタープレート中で稀釈した。Ａlsevers液(Ｈazelton)中の通常のウサギの血液１０μlを各ウエルに加え混合した。プレートを室温で１時間培養し、Ｓorvall  ＲＴ６０００中でプレートを遠心して、未溶血細胞を沈降させた。溶血のないことを、ウエルの底の未溶血細胞のペレットの存在によって決定した。
実施例２．  透析したメタノール可溶の樹皮エキスと、スーパーフォス(Superfos)のＱuil−Ａの、ＴＬＣとＨＰＬＣによる比較
スーパーフォスのＱuil−Ａと、実施例１の透析したメタノール可溶の樹皮成分を、実施例１の逆相ＴＬＣで比較した。透析及びメタノールで溶解後の樹皮エキス中のすべてのバンドはＱuil−Ａ中に存在していた。さらにＱuil−Ａは逆相ＴＬＣプレート上でrf＝０のバンドをもっていた。この成分は上述のようにメタノール溶解で除去した。透析したメタノール可溶の樹皮エキスとＱuil−Ａの組成の類似性はＨＰＬＣで確認した。樹皮の個々の成分は、メタノール／水(５８／４２,v／v)中の４０mＭ酢酸中の５μm粒子径，３３０Å細孔，４.６mmＩＤ×２５cmＬのＶydac  Ｃ4上の逆相ＨＰＬＣで分離できた。個々の分画の屈折率を求めた。図１はＲＰ−ＨＰＬＣからのピークの屈折率プロフィル(保持時間の増加の順にＱＡ−１からＱＡ−２２へラベル)をあらわす。樹皮中の各ピークとスーパーフォスのＱuil−Ａの相対比率を下の表１に示す。
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個々のピークは逆相ＴＬＣプレート上の単一のＴＬＣバンドと対応する。図２の他の代表的な実験は、屈折率はまた炭水化物のピークに対応することを示し、これにすべての主要な樹皮エキス成分は配糖体であることを表わす(アンスロンアッセイによる炭水化物のためにアッセイしたＨＰＬＣ分画)。
透析したメタノール可溶の樹皮エキスとＱuil−ＡはこのＨＰＬＣ系で直接比較した。個々の成分は保持時間で同定した。透析したメタノール可溶の樹皮エキス中のすべてのピークはまたＱuil−Ａ中にも同じ比率で存在した。但しＱuil−ＡのＱＡ−８成分とＱＡ−１７成分の比率は樹皮中のそれらよりも夫々高くそして低かった。図３は半調製Ｖydac  Ｃ4(１０mmＩＤ×２５cmＬ,細孔サイズ３３０Å,粒子径５μm)を用いての透析したメタノール可溶の樹皮エキスとスーパーフォス  Ｑuil−Ａの比較をあらわす。サンプルは４０mＭ酢酸中の５０％メタノールにロードさせ、そして４０mＭ酢酸中のメタノール勾配(図３に示す)を用いてサンプルを溶離した。吸収は２１４nmでしらべた。
キラヤ樹皮のいろんなサンプルを抽出しＨＰＬＣで分析した。ピークの相対比には若干の変動があったが、同じピークがいつも出現した。比率の変動が抽出工程の効率の違いによるのか又は樹皮原料の相違によるのかは今のところ不明である。
Ｑuil−Ａは容易に入手でき樹皮エキスと組成が類似しているので、Ｑuil−Ａをmg量の材料を生成するのに使った。ＢＳＡを抗原として用いてのマウスでのアジュバント活性は、炭水化物の３.０μgの用量(アンスロンアッセイで定量)で４,７,１１,１２,１５,１６,１７,１８,１９及び２０のピーク(表２)と共に見出された。セラ稀釈１:１０における抗原特異的抗体結合(２週間の前免疫,ＥＬＩＳＡで定量)による吸収はアジュバント活性の半定量結果を与えた(アジュバントなしで免疫したマウスの０.０７から、ＱＡ−２０存在下で免疫したマウスの１.２４までの範囲)。
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樹皮エキスＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１の主なピークにより、これら４成分は下の実施例３及び４に示すように大スケールで精製した。
実施例３．  シリカクロマトグラフィーによる精製
Ｑuil−Ａ  １gをメタノール７５mlにけんだくし、６０℃に１５分熱し、濾過した。不溶物を再びメタノール５０mlを６０℃で抽出し濾過した。濾液を回転エバポレーターで蒸発乾固した。ＬichropepシリカＳi６０カラム(Ｅ.Ｍ  Ｓcience,２５mmＩＤ×３１０mmＬ,粒子径４０−６３μm)をクロロホルム／メタノール／水(６２／３２／６,v／v／v)中３０mＭ酢酸中で前平衡化した。
サポニンの粗混合物である乾燥したＱuil−Ａをカラム溶媒５mlにとかし、１ml／分の流速でこの溶媒系中でシリカ中を無勾配で溶離した。ＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１分画のモニターのために炭水化物分析、ＴＬＣ及びＨＰＬＣを用いた。１９〜３０の分画がＱＡ−２１に富んでおり、ＱＡ−２１をさらに精製するためにプールした。３１〜６０の分画はＱＡ−８とＱＡ−１８に富んでおり、これら成分の精製のためにプールした。８５−１０４の分画はＱＡ−７とＱＡ−１７に富んでおり、これら成分の精製のためにプールした。これらプールしたものを精製に先立ちフラッシュ蒸発させた。
実施例４  逆相ＨＰＬＣによる精製
シリカ分画が図４のＶydacＣ4(１０mmＩＤ×２５cmＬ)上の半調製逆相ＨＰＬＣにより更に精製した。シリカ分画(１０−２０mg)を適当な溶媒にとかし、ＶydacＣ4に負荷した。分画を溶離するためにメタノール勾配を用いた。流速は毎分３mlとした。分画に２１４nmの吸収でモニターした。図４Ｂは、５８％メタノール／４２％水中での４０mＭ酢酸中の非勾配分離を用いてのシリカ分画１９−３０からＱＡ−２１の精製を示す。６５〜７２分の保持時間で溶離した分画は、逆相ＴＬＣによりＱＡ−２１と同定され、ひきつづく特性化のためにプールした。図４Ｃは、４０mＭ酢酸(５０−５６％メタノール／０〜１０分;５６−６９％メタノール／１０〜７９分)中のメタノール勾配を用いてのシリカ分画３１〜６０からのＱＡ−１８の精製を示す。４６〜４８分の間の保持時間で溶離した分画に、逆相ＴＬＣによりＱＡ−１８として同定され、ひきつづく特性化のためにプールした。図４Ｄは、図４Ｃと同じ勾配を用いてのシリカ分画８５〜１０４からのＱＡ−７及びＱＡ−１７の精製を示す。２１〜２３分の間の保持時間で溶離した分画は、逆相ＴＬＣによってＱＡ−７と同定され、ひきつづく特性化のためにプールした。４４−４６分の間の保持時間で溶離した分画は、逆相ＴＬＣによりＱＡ−１７と同定され、ひきつづく特性化のためにプールした。
実施例５  ＱＡ−２１のＨＩＬＩＣによる精製
ＨＰＬＣで純粋となったＱＡ−２１(図５Ａ)を、水／アセトニトリル(１５／８５％,v／v)中の１０mＭトリエチルアミンホスフェート(ＴＥＡＰ)(ｐＨ６.０)中に３mg／mlでとかした。５０μlのアリコートを、同じ溶媒(１５％Ｈ2Ｏ／８５％アセトニトリル中１０mＭ  ＴＥＡＰ)中で平衡化したポリＬＣ ＰＨＥＡカラム(粒子径５μm,４.６mmＩＤ×２０mmＬ)上に負荷した。このサンプルを、１ml／分の流速で無勾配で溶離し、２１４nmの吸収でモニターした。２つのピークが得られ、そのひとつは６.４分(ＱＡ−２１−Ｖ１)そして第二のものは６.９分(ＱＡ−２１−Ｖ２)。第１ピークと第２ピークの比は典型的に３:２(図５Ｂ)であった。半調製スケールのＰＨＥＡカラムを用い、分析用のサンプルを作った。
実施例６  シリカ及び逆相クロマトグラフィーで精製したアジュバントの精製と特性化
（純度）図６は逆相ＴＬＣ(Ｅ. Ｍ. Ｓcience  ＲＰ−ＴＬＣ,Ｃ８［溶媒は７０％メタノール,可視化用スプレーはＢial試薬］)をあらわす。ＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１の各５μg(実施例３及び４のようにして精製したもの)をクロマト化する。各アジュバントはこのＴＬＣ系で単一バンドとして現れる。
図６Ｂは、ＥＭ  Ｓi６０ＨＰＴＬＣプレート(溶媒:クロロホルム／メタノール／水(６０／４５／１０,v／v／v)中の４０mＭ酢酸;可視化スプレー:Ｂialの試薬)上のＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８,ＱＡ−２１及びＱuil−Ａを示す。実施例３及び４で精製したＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１の各２μg及び粗サポニンであるＱuil−Ａの２０μgをクロマト処理する。ＨＰＬＣで精製した材料はまず単一バンドとして現れるが、実施例５で述べたように、ＱＡ−２１は次いで二成分に分離する。
（分光法）メタノール中のＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１のＵＶスペクトルはそれぞれ図７Ａ〜Ｄに示すとおりである。Ｄalsgaard(Ａcta  Ｖeterinaria  Ｓcandinavica  Ｓupp. ６９:１〜４０(１９７８))のアジュバント分画は２８０nmに吸収ピークがある。しかし本発明のＨＰＬＣ精製したフラクションは２８０nmにピークがなく、２６０nmに中心のショルダーをもつ２００−２２０nmの範囲に主なピークがある。
フーリエ変換赤外共鳴(ＦＴ−ＩＲ)スペクトルはアジュバント間のわずかの差を示し、これはそれらのすべてが同一の機能基をもつことを示唆する。構造の同定はＩＲからは出来ないけれども、スペクトル値はＤalsgaard(既出)が示唆したようなカルボキシル基の存在と一致する。
ＣＤ3ＯＤ中の精製サポニンの２５０ＭＨzにおける1Ｈ−ＮＭＲは、精製サポニンＱＡ−７(図８Ａ)、ＱＡ−１８(図８Ｂ)及びＱＡ−２１(図８Ｃ)の複雑な性質を表わしている。４.１〜５.４ppmの間のシグナルは、単糖類のアノマープロトンからの複数のシグナルの存在を明らかに示し、これは単糖類の多様性の存在を示している。しかしサポニンのＮＭＲスペクトルは余りにも複雑で、構造決定ができない。
精製サポニンＱＡ−７,ＱＡ−１７及びＱＡ−２１(それぞれ図９Ａ,９Ｂ及び９Ｃ)のＭＳ−ＦＡＢは夫々１８７０,２３１０及び１９８８の大凡の擬分子イオン質量を示す。ＱＡ−７,ＱＡ−１７及びＱＡ−２１の反復してのＭＳ−ＦＡＢ(データは示してない)は夫々１８５５,２３２１及び２０２１のイオン質量を示すが、これが真のイオン質量であろう。ＭＳ−ＦＡＢはまた、更に精製したサポニンＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２(それぞれ図９Ｅ及び９Ｆ)についても行われ、それぞれについて２０１２の大凡の擬分子イオン質量を示した。これは予期した通りである。何故ならばこの２つの構造に末端ペントース(それぞれアピオースとキシロース)でのみ相異しているからである。精製サポニンＱＡ−１８(図９Ｃ)のＭＳ−ＦＡＢは２１７４のイオン質量を示す。これらの分子量は８〜１０コの単糖類残基に結合したトリテルペンに予想されたものと一致しており、そしてメタノール中の精製サポニンのサイズ排除ＨＰＬＣで定められたモノマー分子量と同じ範囲である(Ｚorbax  ＰＳＭ  ６０Ｓiカラム，２５cm×６.２mm，流速１ml／分，分子量標準物質＝１８β−グリシルレチン酸及びジネノサイドＲb1)。このことはＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８及びＱＡ−２１の大凡の分子量がそれぞれ２６００,２４００,１８００及び２４００であることを示す。ＦＡＢ−ＭＳとサイズ排除ＨＰＬＣの差は、サポニンと分子量標準物質間の形状の差に起因するものであろう。
（炭水化物組成）後記の表３は精製サポニンＱＡ−７,ＱＡ−１７,ＱＡ−１８,ＱＡ−２１及びＱＡ−１９の炭水化物組成と、結合分析を示す。後記の表４はさらに精製したサポニンＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２の炭水化物組成と結合分析を示す。サポニン中の炭水化物を、０.１mg／mlのイノシトールを含む２Ｎのトリフルオロ酢酸０.３ml中で０.２mgのサポニンを１２０℃で２時間加熱してアルジトール・アセテートに変換した。酢を空気の流れの中で除き、残った酢をイソプロパノール(２×０.２５ml)の添加で除き、次いで空気を吹き込んで乾燥する。得られた乾燥残渣を、１０mg／mlのナトリウム・ボロジウテライドを含む１Ｍ水酸化アンモニウム(０.２５ml)中にとかし、室温で１時間保つ。氷酢酸０.１mlを加え、この液に空気を吹きこんで乾燥させる。残ったボレートを、メタノール中の１０％酢酸(３×０.２５ml)及び最終的にメタノール(２×０.２５ml)で共蒸留して除去する。無水酢酸０.１ml及びピリジン０.１ml中の乾燥残渣を１２０℃で２０分加熱する。トルエン９.０２mlを冷液に加え、溶媒を空気流下に除く。このトルエン添加及びピリジンと無水酢酸除去の操作を２度くりかえす。得た残渣をジクロロメタン０.５mlにとり、水０.５mlで抽出する。有機相をきれいなチューブに移し乾燥する。ＧＬＣ(ガス液体クロマト)による分析の前に、残渣をアセトン０.１mlにとかす。アルジトール・アセテートを、ＳＰ２３３０毛管ＧＬＣカラム(３０m×０.２５mm)上で、２３５℃の炎イオン化検出法で分析する。サポニン中の炭水化物を、５０μg／mlイノシトールを含むメタノール性ＨＣl０.３ml中でサンプル０.１mgを８０℃で１６時間熱してトリメチルシリル化されたメチルグルコシドに変える。サンプルに空気を吹きこんで乾燥させ、残った酸を３級ブチルアルコール(２×０.２５ml)の添加により除去し次いで空気流で乾燥する。乾燥残渣を、ピリジン／ヘキサメチルジシラザン／トリメチルクロロシラン(５／１／０.５,v／v,「トリシル」)を含む溶液０.２mlにとかし８０℃で２時間加熱する。シリル化試薬を室温でとばし、残渣をヘキサン１mlにとかす。不溶残渣をグラスウールプラグを用いての濾過で除去し、濾液を清潔なチューブに移し蒸発させる。残渣をＧＬＣ分析に先立ってヘキサン０.２mlにとかす。トリメチルシリル化したメチルグルコシドを、溶融シリカＤＢ１(２５m×０.２５mm)のＧＬＣカラム上で１６０℃で３分間、次いで２℃／分の割合で２００℃とし、そして１０℃／分の割合で２６０℃とし水素炎イオン検出器で分析する。
グリコシド結合の分析は次のようにして行う。乾燥ジメチルスルホキシド０.２mlにとかしたサンプル約１mgにカリウムジメチルスルフィニル陰イオン２Ｍの０.２mlを加え、混合物をアルゴン下に１２時間かくはんする。反応混合物を氷冷し、ヨードメチル０.２mlを滴下する。得た混合物を音波処理し室温で１時間かくはんする。メチル化された材料を、エタノール２０ml,アセトニトリル８ml及び水１０mlでコンディション化したＳep−Ｐak Ｃ１８カートリッジを用いて単離する。水１mlをメチル化反応混合物を加え、過剰のヨードメチルを、溶液に窒素を通じて除去する。清澄な液を、水８ml及び２０％アセトニトリル５mlで洗ったカートリッジに入れる。メチル化物をカートリッジから１００％アセトニトリル４ml及びエタノール４mlで溶離する。溶媒を空気流で除く。乾燥したメチル化物を室温で１時間、「スーパー・ジュテライド」液０.３１mlで処理してウロン酸残基を対応するヘキソーズに還元する。過剰の試薬を氷酢酸１mlで分解したあと、反応混合物を１００％酢酸／メタノールを用い空気で乾燥させ、もう２回空気を吹き込み乾燥させる。得られたメタノール中の還元メチル化物をダウエックス５０Ｗ(Ｈ+)のカラムを通し、得た流出液を乾燥する。還元したメチル化物を上のセクション１で述べたようにしてメチル化アルジトールとしＧＬＣで分析する。すなわちＳＰ２３３０熔融シリカカラム(３０m×０.２５mm)、１７０℃で３分、次いで４℃／分で２４０℃とする。次いでＧＬＣ−ＭＳにかける。すなわちＳＰ２３３０熔融シリカカラム(３０m×０.２５mm),８０℃で２分、次いで３０℃／分で１７０℃まで、次いで４℃／分で２４０℃まで、次いで２４０℃に１０分保持。ヒューレットパッカードＭＳＤによる質量分析。
炭水化物組成の類似にもかかわらず、微妙な相異が個々のサポニンを区別した。即ちたとえばＱＡ−７は他のサポニンに比べてアラビノーズがない。
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図１０は、提案構造とこれらの化合物のうち３個の間の関係を示す。基本的構造、そこで報告されたＱＡ−１７の分子量と炭水化物組成にマッチするところの、キラヤ・サポナリアからの化合物(ＱＳIIIと命名されている)の構造決定をしたヒグチ(Ｐhytochemistry,２７:１１６５−１１６８(１９８８))の報告からとった。ＱＡ−１８及びＱＡ−２１に対するこの構造からの変化は、炭水化物組成と結合分析、ＦＡＢ−ＭＳで測定した分子量そしてふつうの加水分解副生物の比較分析によって決定した。配糖体組成における大きな変化は末端の単糖類におけるものまであった。ＱＡ−１８とＱＡ−２１はt−アラビノースを、そしてＱＡ−１７は２−アラビノースを含んでいる。ＱＡ−１７はt−ラムノース(ＱＡ−１８とＱＡ−２１にはない)を含み、これはt−ラムノースはＱＡ−１７では２−アラビノースに結合しており、一方アラビノースはＱＡ−１８とＱＡ−２１では末端残基であることを示唆する。またＱＡ−１７とＱＡ−１８は３,４−ラムノースとt−グルコースを含み、一方ＱＡ−２１は４−ラムノースを含みグルコースを含まない。これはＱＡ−１７とＱＡ−１８の３,４−ラムノースの３−位にグルコースが置換していることを示す。ＦＡＢ−ＭＳで決定した分子量はこれらの構造と合致する。これは更に加水分解副生物の分析で支持される。ヒグチは、ＱＳIIIのおだやかなアルカリ性加水分解は、脂肪酸残基をフコースに結合しているエステル結合の分解を生じることを証明している。この部位でのＱＡ−１７,１８及び２１の分解は、ＱＡ−１７及び１８とは同一でありまたＱＡ−２１とはもっと疎水性である(グルコースがないので)ところのトリテルペングリコシドフラグメント(Ａ)を理論的に生じる;これにこれら化合物からのフラグメントの逆相ＨＰＬＣ保持時間の分析により実験的にたしかめられた。これらの化合物はもっと強い条件下で加水分解されて、フコースを結合するエステル結合をキラヤ酸骨格に分解しうる;この分解から生じる限定されたトリテルペングリコシドフラグメント(Ｂ)は理論的にはすべての３つの化合物について同じである(ＨＰＬＣ分析で確認)。
すべての３化合物は、類似の用量反応曲線でマウスにおいて、体液免疫反応を増大させる。したがって末端ラムノース及びグルコース残基はこれら化合物のアジュバント機能のこの面においては臨界的でないようである。
(洗剤としてのサポニンの特性)
アジュバントＱＡ−７,１７,１８及び２１の臨界ミセル濃度はＤeＶendittisほかの方法(Ａnal. Ｂiochem. １１５:２７８−２８６(１９８１))により次のように測定した。水中の１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸(ＡＮＳ)の発光スペクトルは、下記の範囲と上記の臨界ミセル濃度をカバーする０.０１〜０.１０％(w／v)範囲のアジュバント乾重量濃度で測定した。臨床ミセル濃度をこえると、蛍光染料のミセルへの分解のために極大発光波長は減少しＡＮＳ収率は上昇する水中のＱＡ−７,１７,１８及び２１について類似の臨界ミセル濃度(それぞれ０.０６％,０.０６％,０.０４％及び０.０３％)が認められ、一方リン酸緩衝食塩水中のそれは、それぞれ０.０７％,０.０３％,０.０２％及び０.０２％と少し低かった。
図１１は、モノマー／ミセル平衡を見掛けのミセル半径減少から防ぐためのリン酸緩衝食塩水中のそのサポニンの臨界ミセル濃度に対応する純粋サポニンの濃度に予備平衡化したＢio−Ｇel  Ｐ−２００(６.６mmＩＤ×９０cmＨ)上の純粋のＱＡ−１８及び２１により形成されるミセルのゲル濾過クロマトグラフである。ＱＡ−１８及び２１ミセル溶離物のサイズは蛋白ウシ血清アルブミンのそれに似ている。
アジュバントの溶血活性は次の方法できめた。アジュバントＱＡ−７,８,１７,１８,２１及びスーパーフォス  Ｑuil−Ａの希釈を丸底マイクロタイタープレート(ウェル毎に７５μl)上で行った。ＰＢＳで３度洗ったヒツジ赤血球細胞(ＳＲＢＣ)を、ＰＢＳで４％にうすめた。ＳＲＢＣ２５μlを各ウェルに加えアジュバントと混ぜた。室温で３０分培養してからプレートをＳorvall  ＲＴ６０００,Ｈ−１０００ローター中で１,０００rpmに５分間回転させ非溶血細胞を沈降させた。各ウェルの上澄５０μlを同じウェルの平底マイクロタイタープレートに移し、水で２００μlに薄めた。吸収を、Ｄynatech  マイクロタイタープレートリーダー(図１１)を用い５７０nmで測定した。溶血は、分解された細胞からのヘモグロビンの離脱のために５７０nmの吸収を増大させた。溶血における著しい差がアジュバント間でみられた。ＱＡ−１７,１８,２１及びスーパーフォス  Ｑuil−Ａは、２５μg／mlという低濃度で部分的溶血をおこし、一方ＱＡ−８は１５０μg／mlで部分的溶血をみた。テスト濃度(２００μg／ml及びそれ以下)ではＱＡ−７は溶血をおこさなかった。
実施例７  毒性成分ＱＡ−１９の単離
毒性成分ＱＡ−１９はシリカ上ではＱＡ−１８と共にクロマト分離され、シリカ分画３１〜６０に豊富に存する。これら分画をプールし、次の精製前にフラッシュ蒸発させた。図４Ｃは、メタノール勾配を用いたＶydac Ｃ4(１０mmＩＤ×２５cmＬ)上の逆相ＨＰＬＣによるＱＡ−１８からのＱＡ−１９の分離を示す。５０−５２分の間の保持時間で溶離する分画は、逆相ＴＬＣ及び分析ＨＰＬＣによってＱＡ−１９と同定され次の特性化のためにプールした。ＱＡ−１９は狭いメタノール勾配中の再精製により２コのピークに分離でき、短い保持時間のピークをＱＡ−１９a、長いほうをＱＡ−１９bと称した。ＱＡ−１９bよりも、マウスで毒性の高いＱＡ−１９aのピークの炭水化物分析は、他のサポニンのそれと類似の炭水化物組成を示す(表３)。
実施例８  アルカリ加水分解生成物の単離
かんたんなアルカリ加水分解によるＱＡ−１８処理は、一つの大きな炭水化物含有アルカリ水解物(ＱＡ−１８Ｈとよぶ;図１０のフラグメントＡ)を与えた。精製ＱＡ−１８ＨはＱＡ−１８から作られ次のようにして単離された。
ＱＡ−１８(５mg／ml)１mlを、室温で１５分間、１Ｎ ＮaＯＨ２５μlで培養し、反応を１Ｎ酢酸１００μlの添加で止め、この加水分解条件を用いてＱＡ−１８を完全にその主水解物ＱＡ−１８Ｈに変換した。このものは非水解のＱＡ−１８の保持時間が６６.８分であるのに対して８.０分というピーク中に溶離され、０.１％トリフルオロ酢酸(５５／４５メタノール／水(v／v)中)のＶydac Ｃ4(４.６mmＩＣ×２５cmＬ)のクロマトでＱＡ−１８Ｈの上昇した親水性を示し、そして流速１ml／分で６４／３６メタノール／水(v／v)の１８０分の勾配で溶離される。純粋のＱＡ−１８Ｈ(保持時間８分)を含むピークを次の特性化のためにプールした。ＱＡ−２１の水解物(ＱＡ−２１Ｈと命名)も同様に生成させ精製した。ＱＡ−２１Ｈの保持時間は９.３分、一方未水解のＱＡ−２１は８０.４分であった。これら水解物は逆相ＨＰＬＣ及びＨＰＬＣ上の保持時間によって、ＮＨ4ＨＣＯ3中の温和なアルカリ加水分解を用いるヒグチほかの方法(Ｐhytochemistry,２６:２２９(１９８７))で作った主水解物と同定された(表５)。またこれら生成物(ＱＡ−１８Ｈと２１Ｈ)は、ＱＡ−７,１７,１８,２１及びその他から成る粗サポニン混合物の加水分解からの主生成物であった。このことは水解物ＱＡ−２１ＨとＱＡ−１８Ｈは、構造決定のためにヒグチほか(上述)によって単離された水解物と同一であることをあらわす。ＱＡ−１８ＨとＱＡ−２１Ｈはアジュバント活性の特性化のために保存した。
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実施例９  抗原としてＢＳＡを使用したときのアジュバント効果のテスト
簡単にいうとアジュバント効果は、免疫処方中の有効アジュバント添加による抗原特異性抗体タイターの上昇で評価される。上昇したタイターは、上昇した抗体濃度又は／及び上昇した抗原抗体親和性から生ずる。サポニンのアジュバント効果は、モルモットの足及び口の病気のワクチンの抗体を中和するタイターの上昇(Ｄalsgaard,Ｋ:Ａrchiv  fur  die  gesamte  Ｖirusforschung,４４:２４３−２５９(１９７４));ＢＳＡ／サポニン混合物でワクチン化したモルモット中のＢＳＡ(放射免疫拡散法で測定)の沈降抗体のタイターの上昇(Ｄalsgaard,Ｋ.:Ａcta  Ｖeteriaria  Ｓcandinavica,６９:１−４０(１９７８));及びＫＬＨ／サポニンで免疫したマウス中の抗かぎ穴リンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)抗体(ＥＬＩＳＡで測定)のタイターの上昇(Ｓcoffほか:Ｉnt. Ａrth. Ａllergy  Ａppl. Ｉmmun. ７７:４０９−４１２(１９８５))によってこれ迄測定されてきた。
本研究におけるアジュバント効果の評価は、サポニン不存在下のＢＳＡでの免疫と比較したＢＳＡ／サポニンでの免疫を伴う、抗ＢＳＡ抗体中の上昇によって行った。精製分画中のアジュバント活性は次のようにして測定した。ＣＤ−１マウス(８−１６週令)を次の処方で皮内免疫した。ＢＳＡ１０μg(シグマ７０３０,脂肪酸なし)及びキラヤアジュバント(アンスロンで測定して１.５〜４.５μgの炭水化物範囲の用量)、但しＰＢＳ２００μl中。Ｓeraを２週間予備免疫し採取。抗ＢＳＡ抗原はＥＬＩＳＡで測定。イムロンIIプレートを、Ａ,Ｃ,Ｅ及びＧ列で、脂肪酸のないＢＳＡ(ＰＢＳ中１０μg／ml)１００μlで４℃で一夜被覆した。プレートをＰＢＳで２回洗浄、非特異的結合は、すべてのウェルにおいて１ウェルあたり１００μlの希釈液(ＰＢＳ中２％のカゼイン酸の水解物[Ｏxoid,w／v])により３７℃で１.５時間培養して保護した。プレートは蒸留水中０.０５％ツイーン２０で４回洗浄、１０,１０2,１０3及び１０4希釈のセラを室温で１時間、Ａ＋Ｂ、Ｃ＋Ｄ、Ｅ＋Ｆ及びＧ＋Ｈの列でそれぞれ(１００μl／ウェル)培養。プレートを上述のようにして洗浄。ベーリンガーマンハイムの西洋ワサビのパーオキシダーゼ複合物のヤギ抗マウス抗体(希釈剤中５％ＢＳＡ中１／５０００)を室温で３０分培養(すべてのウェルで;１ウェル当り１００μl)、プレートを上述のように洗浄。パーオキシダーゼ反応の程度を２,２'−アジノ−ビス(３−エチルベンズチアゾリン)−６−スルホネート(室温で３０分反応、４１０nmの吸収で測定)又は３,３',５,５'−テトラメチルベンジジン(室温で１０分反応、４５０nmの吸収で測定)との反応で測定。総抗体結合に対する非特異性抗体結合の貢献は、各セラ希釈に対する抗原陽性ウェルの吸収から、抗原陰性ウェルの吸収を差引きで除去された。抗原特異結合による吸収は、セラ希釈(図１３)の対数の関数としてプロットされた。終末タイターの典型は、アジュバントなしの免疫に対しては１０又はそれ以下の血清希釈であり、サポニンアジュバント存在下では１０3と高かった。１２μg炭水化物又はそれ以上のアジュバント用量での透析されたメタノール可溶樹皮エキス(炭水化物はアンスロンでアッセイ)はＰＢＳ中でＢＳＡに比べ２オーダーだけタイターが上昇した。炭水化物９〜２３μgのＱuil−Ａ用量において、良好なアジュバント効果がみられた。
実施例１０  ＨＰＬＣで精製したエキス成分のアジュバントテスト
実施例９で述べた標準によりＱＡ−７,１１,１２,１５,１６,１７,１８,１９及び２０のピークは本特定実験における炭水化物３.０μg用量で特に効果的なＱＡ−１５,１７,１８,１９及び２０でのアジュバント効果において相異を示す。免疫(２)に使用したマウス数が少なく、また個々のマウス間の免疫反応の自然差のために、この実験はこれらのピークの相対的アジュバント効果を定量的に評価するために使用できない。しかしそれはアジュバント活性の存在の定性的評価になりうる。またＱＡ−２,３,１０,１３及び１４との見掛け上の効果の不存在は、異なるアジュバント用量又はアジュバント／蛋白比におけるアジュバント効果を規正するものでないことに注意すべきである。
さらにＱＡ−７,１７及び１８を用い、異なる蛋白／アジュバント比でのアジュバント試験を行った。一般に良好なアジュバント効果はＱＡ−７,１７及び１８において蛋白／アジュバント比(蛋白重量／炭水化物重量)が約３:１〜９:１(図１４)で用いた時に得られた。ＱＡ−２１(本例では蛋白／炭水化物重量比６:１の場合のみ)もまたアジュバント効果を示した。然し、最適免疫反応の適当なアジュバント対蛋白の比は、使用された特定のサポニンアジュバント及び特定抗原の双方の関数であることに注意すべきである。抗原と共同のアジュバントは、サポニンアジュバント効果の作用機作において重要な役割を果たす。蛋白へのサポニン結合の場合、疎水性の内部反応は大きな因子である。したがってＨＰＬＣで精製したアジュバントの疎水性の差は、疎水性蛋白の結合定数に影響する。また蛋白における疎水性結合部位の数も、サポニンアジュバントと共同する能力に影響する。よって個々のアジュバントや抗原に対する最適アジュバント用量をきめる必要がある。そのような最適値決定は公知の範囲に属する。
ＨＰＬＣで精製したアジュバントはまたフロイントの完全アジュバントと比較されそして類似の免疫反応を示すことがわかった(図１４,パネルb)
実施例１１  ＱＡ−２１−Ｖ１とＱＡ−２１−Ｖ２のアジュバント・テスト
Ｃ５７bl／６マウス(８週令,一群５匹)を、個々の成分(１０〜２０μg用量)又はＱＡ−２１(１０μg)と共に、又はそれなしに食塩水中のチキン卵アルブミン(オボアルブミン)２５μgで皮下的に免疫した。ブースター免疫を２週間あとに行ないそして血清をブースター免疫後１週間で分析した。分析はオボアルブミン特異性のＩgＧサブクラスの酵素イムノアッセイで行った。ＱＡ−２１−Ｖ１及びＱＡ−２１−Ｖ２は共にアジュバント活性において、ＩgＧサブクラスのＩgＧ１(図１５Ａ)、ＩgＧ２(図１５Ｂ)及びＩgＧ２a(図１５Ｃ)ならびに総ＩgＧタイター(図１５Ｄ)のブーストにおいてもとのＱＡ−２１ピーク(ＱＡ−２１−Ｖ１:ＱＡ−２１−Ｖ２＝３:２の混合物を含む)へのアジュバント効果において比較しうるものであった。すなわちＱＡ−２１−Ｖ１及びＶ２は共に、その混合物ＱＡ−２１におけるように、抗原オボアルブミンに対する抗体反応を上昇させるためのアジュバントである。
この実験は、２週間大２のブースターでくりかえされ、用量曲線を与えるいろんな量のサポニン(図１５Ｅ)を用いて血清を３週間分析した。全ＩgＧタイターのみが曲線に含まれていた。
実施例１２  ＦＥＬＶ組換えＧＰ７０Ｒ−デルタの製造
(封入体の製造)  組換えＥ. coliクローンＲ１６−３８は、０.４−０.６の光学濃度(５６０nm)に至るまで３２℃で、グルコース１％及びカサミノ酸０.１％を加えたＬＢ培地中で生育した。培養物を４２℃とし更に２時間培養した。それが終了してから、細胞を遠心(４,０００gで３０分)で集め、５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.５)で洗い、そしてイソプロパノール中０.１Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド０.１Ｍ(最終濃度０.５)１ml及び５mg／mlのアプロチニン(最終濃度１０.０μg／ml)０.４mlを加えた５０mＭトリスＨＣl２００ml中に再けんだくした。細胞を、０.２％トリトンＸ−１００存在下にリゾチーム(最終濃度:０.５mg／ml)による酵素的消化で分解した。３０分かくはん後、ＭgＣl2(０.５Ｍ)２ml、ＤＮase(１mg／ml)５ml及び０.１Ｍフェニルメチルスルホニルフルロオライド１を加えた。さらに３０分間かくはん後、ＥＤＴＡ(０.２５Ｍ,pＨ７.５)４０ml及びトリトンＸ−１００(１０％w／v)４mlを加えた。得たものを４℃で１０,０００×gで３０分遠心し、ペレットを５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.５)５０mMに再けんだくした。ペレットを低速で１５分間ホモジナイズした。リゾチームを０.５mg／mlで加え、１０％トリトンＸ−１００  ０.６mlを加えた。１５分かくはん後、ＭgＣl2(０.５Ｍ)１０mlとＤＮaseＩ(１mg／ml)１mlを加え、さらに１５分かくはんした。５０mＭトリスＨＣl(pＨ９.０)で容量を３００mlとした後、１０％トリトンＸ−１００  ４０ml及びＥＤＴＡ(０.２５Ｍ,pＨ７.５)５１.２mlを加え、最終容量を５０mＭトリス(pＨ９.０)で４００mlとして。３０分かくはん後、けんだく液を４℃で３０分間１０,０００×gで遠心し、ペレットを４Ｍ尿素、５０mＭ ＥＤＴＡ及び１％トリトンＸ−１００含有の５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.５)４００mlに再けんだくした。１５分間かくはん後、けんだく液を１０,０００×gで３０分、４℃で遠心し、ペレットを１０mＭ ＮaＣl含有の５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.５)４００mlに再けんだくした。１５分間かくはん後、けんだく液を１０,０００×gで３０分、４℃で遠心し、ペレットを６Ｍ尿素及び５０mlＥＤＴＡ含有の５０mlトリスＨＣl(pＨ７.５)４００mlに再けんだくした。１５分間かくはん後、けんだく液を１０,０００×gで３０分、４℃で遠心した。この時点で封入体のペレットがあとの使用のために凍結するか、又は６ＭグアニジンＨＣl、５０mＭ ＥＤＴＡ及び０.５％β−メルカプトエタノール含有５０mＭトリスＨＣl(pＨ７.５)にとかした。ついでgp７０Ｒ−デルタポリペプチドを下の実施例１３に示す方法の何れかによって精製した。
実施例１３  ＦeＬＶ組換えＧＰ７０Ｒ−デルタの精製
(方法１)  実施例１２の可溶化蛋白を６Ｍ尿素、トリス−Ｃl、pＨ８.０、５ＥＤＴＡ及び１ジチオスレイトール(ＤＴＴ)に透析した。蛋白約１２０mgが、同じ緩衝液で平衡化したＣＭ−ＴＳＫカラム(ＥＭ  Ｓcience、１.５cmＩＤ×４cm)に用いられた。蛋白は同じ緩衝液中でＮaＣl(０−１.０Ｍ／１５０ml)の直線勾配で溶離された。分画を集め、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で分析した。クーマシー染色を用いてgp−７０Ｒ−デルタ蛋白を同定した。約０.１Ｍ ＮaＣlで溶離する分画２５−３１をプールし、免疫に用いた。
(方法２)  gp７０Ｒ−デルタの疎水性を減ずるために、スルフヒドリル基をヨードアセタミドでアルキル化し、リジン残基を無水シトラコン酸でＮ−アシル化した。実施例８で作った蛋白を５mＭボレート、２pＨ９.０、０.５％β−メルカプトエタノール(v／v)中の６ＭグアニジンＨＣlにとかした。ヨードアセタミドは１:１のモル比(ヨードアセタミド:総スルフヒドリル基)で加える。アルキル化は室温で１時間、暗所で行った。(蛋白及びβ−メルカプトエタノール)中のすべてのスルフヒドリル基のアルキル化は、完全なアルキル化の保障のためＤＴＮＢ(エルマンの試薬)でモニターした。蛋白濃度は２mg／mlに調整した。
蛋白は、無水シトラコン(０.００２２ml／mg蛋白;遊離リジンに対して約５０モル過剰)の添加によって、暗所でシトラコニル化した。これを何度も暗所で５０mＭボレート、pＨ９.０に対し透析した。蛋白リジン基のアシル化の終了は、残った遊離リジン基を測定するトリニトロベンゼンスルホン酸(ＴＮＢＳ)との反応で測定した。５０mＭナトリウムボレート(pＨ９.０)１ml中の、アルキル化され、シトラコニル化され、透析されたgp７０Ｒ−デルタ２００μgにＴＮＢＳ(１０mＭ、２００μl)を加えた。混合物を暗所で４０℃で２時間培養し、これを１Ｎ ＨＣl１０.５mlと１％ＳＤＳ０.５mlで失活させ、３４０nmでの吸収をみた。ＴＮＰ−リジン濃度は１０,４００のモル吸光係数を使って測定した。
アルキル化され、シトラコニル化されたgp７０Ｒ−デルタの精製は、リジン基のデブロッキックを防ぐためにpＨ９.０で行った。変成蛋白に、最終濃度４Ｍで尿素を加えた。蛋白は、限外濾過によって３mg／mlまで濃縮しそしてセファローズ６Ｂ−Ｃ1カラム(１.５×８６cm)に加えた。gp７０Ｒ−デルタ蛋白は、４Ｍ尿素及び５０mＭナトリウムボレート(pＨ９.０)で６.６ml／時の流速で溶離した。分画(５.３ml／分画)をあつめ、gp７０Ｒ−デルタを蛋白アッセイ及びＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分画１３〜１５中で測定した。
gp７０Ｒ−デルタのシトラコニル化を、室温で４８時間、アルキル化されシトラコニル化されたgp７０Ｒ−デルタ(１.０mg／ml)５mlを５０mＭナトリウムボレート(pＨ８.８)中の６Ｍ尿素に対し透析することで元にもどした。このgp７０Ｒ−デルタを、１００mＭ重曹(pＨ８.０)中の６Ｍ尿素に対して透析し、アルブミンヒドロキシサイドに吸収させる前に蛋白濃度を０.８mg／mlに調節した。
(方法３)  アルキル化されシトラコニル化されたgp７０Ｒ−デルタの上記の精製の変法を発展させた。簡単にいうと、アルキル化しシトラコニル化したgp７０Ｒ−デルタを変成させ、上述のように５０mＭナトリウムボレート(pＨ９.０)に透析した。尿素に最終濃度８.０Ｍで加えた。蛋白は、ＰＭ−３０膜で限外濾過して濃縮し２.５mg蛋白／mlを得た。蛋白液を、８Ｍ尿素を含む５０mＭナトリウムボレート緩衝液(pＨ９.０)中のセファクリルＳ−４００カラム(１.５×９０cm)にかけ、同じ緩衝液で溶離した。分画(２.９mg／分画)を集め、gp７０Ｒ−デルタを含む３４−３７分画をプールした。これらの分画からの蛋白２１mgを５０mＭナトリウムボレート(pＨ９.０)で４Ｍ尿素の最終濃度まで希釈し、ＤＡＥＫ−ＴＳＫのカラム(１.５×１１cm)にかけた。蛋白を、４Ｍ尿素含有の５０mＭナトリウムボレート(pＨ９.０)中のＮaＣl(０−０.５Ｍ)の直線勾配で溶離した。３mlの分画を採取した。gp７０Ｒ−デルタを含む分画８９−９５をプールし、gp７０Ｒ−デルタ１５mgを回収した。
実施例１４  水酸アルミニウム吸収gp７０Ｒ−デルタによる免疫
水酸化アルミニウムは多くの蛋白にアジュバント効果をもつことが知られており、ワクチンに対してgp７０Ｒ−デルタの担体として用いられている。実施例１３の方法１で作ったgp７０Ｒ−デルタは、６Ｍ尿素を含む５０mＭトリス−Ｃl(pＨ８.０)の存在下に１０％水酸化アルミニウムを強固に吸収する。水酸化アルミニウム１００μgあたり約３μgのgp７０Ｒ−デルタが吸収される。水酸化アルミニウムに吸収されたgp７０Ｒ−デルタはリン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)で洗い、ＰＢＳに再けんだくし、そして動物の免疫に用いる。
ＣＤ−１マウス(８−１０週令)を、ＨＰＬＣ精製のサポニンＱＡ−１７若くは１８又はＱＡ−１７と１８の混合物の存在又は不存在下に全量２００μlのＰＢＳ中にＡl(ＯＨ)3に対し吸収されたgp７０Ｒ−デルタで皮下的に免疫する。一用量あたり２０〜２５μgのgp７０Ｒ−デルタを注射する。ＨＰＬＣ精製サポニンＱＡ−１７若しくは１８又はＱＡ−１７と１８の混合物を１０μgの乾燥重量で用いる。各処方についてマウス２匹を使う。マウスは最初の注射のあと６週間たってgp７０Ｒ−デルタ／水酸化アルミニウムによるブースター注射を行う。マウスのセラを、ＥＬＩＳＡイムノアッセイにより、２,４及び８週の後免疫でＦＥＡ,ＦeＬＶサブグループ,に対する反応性について分析する。免疫のあと４週間、組換えgp７０Ｒ−デルタで誘発された抗ＦeＬＶ反応がみられる。ＨＰＬＣ精製サポニンアジュバントＱＡ−１７及び１８はこの反応をブーストする。この反応は、サポニンアジュバントの不存在での免疫に比べて、ＱＡ−１７存在下では４週間の後免疫において２オーダー大きい。この実験の結果を図１６に示す。
抗ＦＥＡ抗体ＥＬＩＳＡアッセイでしらべる。ＦＥＡウイルス(１０μg／mlＰＢＳ)を、４℃で一夜イムロンIIプレート吸収させる(１００μl／ウェル)。プレートをＰＢＳで洗い、非特異性抗体結合を、室温でＰＢＳ(１０μl／ウェル)中の１０％正常ヤギ血清で１時間培養してブロックする。次いでプレートを蒸留水中の０.０５％ツイーン２０で洗う。セラを、ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清で希釈し、１０,１０2,１０3及び１０4(１００μl／ウェル)のセラム希釈でプレート上で室温において１時間培養する。蒸留水中０.０５％のツイーン２０によりプレートを洗ったあと、ＰＢＳ中で１／５０００に希釈したパーオキシダーゼ結合したヤギ抗マウスＩgＧ(ベーリンガーマンハイム)１００μl／mgを用い室温で３０分培養する。蒸留水中０.０５％のツイーン２０でプレートを洗ったあとＩgＧ結合量をＤynatechマイクロタイタープレートリーダー上で求めた４５０nmでの吸収からの３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンとのパーオキサイド反応によって測定する。
実施例１５  水酸化アルミニウムに吸収されたアルキル化gp７０Ｒ−デルタによる免疫
ＣＤ−１マウス(８〜１０週令)を、ＰＢＳ２００μl中で実施例１３の方法２で精製された(実施例１４にのべた水酸化アルミニウムに吸収された)アルキル化gp７０Ｒ−デルタの１５μg／用量で皮内的に免疫する。ＨＰＬＣで精製したアジュバントＱＡ−７,１７,１８及びこれら三者の混合物を１０μgの乾燥重量で用いる。各処方についてマウス３匹を使用。マウスのセラを、実施例１４にのべたように２及び４週の後免疫で、ＦＥＡに対する反応についてＥＬＩＳＡにより分析する。実施例１４に示した未変成gp７０Ｒ−デルタでの免疫に関して、アルキル化gp７０Ｒ−デルタによる免疫は４週間の後免疫により抗ＦeＬＶウイルス反応を生ずる。ＨＰＬＣ精製アジュバントＱＡ−７,１７及び１８はすべて、サポニンアジュバント不存在での免疫に比べて免疫反応を上昇する。ＱＡ−１７及びＱＡ−１７と１８の混合物は最高の反応を示し、サポニンアジュバント不存在時の免疫に比べ殆ど２オーダー高い最終タイターを示す。この実験の結果を図１７に要約する。
実施例１６  ＱＡ−７,１７,１８,１９,２１及びＱuil−Ａの毒性
洗キラヤサポニンに関しては、マウスにおける主な毒性症状は肝壊死のようである。肝に対する効果をみるために精製サポニンをマウスに注射する。マウスに各１５０μgのＱＡ−７,１７,１８,２１及びＱuil−Ａを皮内注射する。他の成分の精製のための粗原料として粗サポニンエキスを使用。ＱＡ−７,１７及び２１を注射したマウスは当初すこし病的であったが、注射後数時間のうちにちゃんと回復した。Ｑuil−Ａは４８時間にもわたる重篤な病状を示した。すべてのマウスを４８時間に殺し、肝の死後検査を行った。Ｑuil−Ａは、急性壊死が多部位にある重篤な肝障害をおこした。ＱＡ−７,１７及び２１は肝に対し顕著な影響をみられなかった。ＱＡ−１７はまた小猫に対して８及び１０週間に各１００μg皮下注射してテストしたが、臨床的にもまた血液化学的にも毒性はみられなかった。これに対してＱuil−Ａは、小猫で数時間にもわたる発熱現象をみた。したがって精製サポニンはマウス及び小猫の双方でＱuil−Ａよりも毒性が低く、精製操作は粗キラヤエキス中にある１つ又はそれ以上の毒性成分をこれらサポニンから分離して了うことがわかる。それら毒性成分のひとつはＱＡ−１９として同定され、それは数日の注射でマウスに対し５０μg又はそれ以上の致死量であった。ＱＡ−１９をさらに精製したところ、ＱＡ−１９a及びＱＡ−１９bの２つのピークに分かれることがわかった。ＱＡ−１９aはマウスで１００μg又はそれ以上の致死量であり、一方ＱＡ−１９bは１５０μgまでの用量では致死的でなかった。したがってＱＡ−１９aと１９bの混合物で大きな毒性を生じる相剰効果は導き出せない。新しいデータはまたＱＡ−１８も毒性をもつこと示す(ここには示さず)。Ｑuil−Ａから単離した他のマイナーなピークな予備スクリーニングしたところ、他の分画もまた毒性でありうることがわかった。したがって精製のプロトコールは、アジュバント活性サポニンを、もっと毒性のあるか又は毒性共存物と共にクロマトされる類似の但し別個の化合物からの分離を行うものである。
実施例１７  構造変性アジュバント活性への影響
サポニンの変性を、アジュバント活性に及ぼす効果をみるために行った。ＱＡ−１８を過ヨード酸で酸化し、t−ガラクトースとt−アピオースの隣接する水酸基間で分解してジアルデヒドとし、アジュバント活性へのこれら単糖類の分解の効果をみた。
ＱＡ−１８の過ヨード酸酸化は、非変性ＱＡ−１８に比べて抗体タイターが５倍減少した。残った活性は、比較的おだやかな酸化条件で生成したこのものの中の非変性ＱＡ−１８の小部分(約１０％)によるものであろう。したがって、キラリア・サポナリアからのすべてのアジュバント活性化合物に共通な残基であるガラクトース又はアピオース(又はその双方)はアジュバント効果に必須のものであろう。
実施例９で述べたようにして作ったＱＡ−１８Ｈ(ＱＡ−１８のＡフラグメント;図１０)及びＱＡ−２１Ｈ(ＱＡ−２１のＡフラグメント;図１０)を、実施例３及び４で作った非水解のもとの生成物のＱＡ−１８及び２１と直接比べながら、そのＢＳＡに対するアジュバント効果をテストした。ＱＡ−１８と２１は、２週間の後免疫により少なくとも１オーダーだけマウスにおいてＢＳＡに体液免疫反応を増加させた。しかし同量の水解物ＱＡ−１８Ｈと２１Ｈは著しい反応の増加がなかった(図１８)。したがって最適のアジュバント効果は、手をつけてないサポニンにおいてみられ、もしＱＡ−１８や２１がそれぞれ１８Ｈや２１Ｈに加水分解されるとアジュバント活性に必要な必須構造が消失又は変化してしまう。
すなわち脂肪酸とアラビノースを取り除くと、アジュバント活性は実質的に減少する。しかし乍らこれがレセプター結合におけるこの特異構造の必要性に因るものなのか、または細胞膜もしくは抗原へのＱＡ−１８や２１の疎水性内部作用に実質的に影響する変化である本来の部分と比べてのフラグメントＡの疎水性の著しい増大に因るものかは明らかでない。疎水性の減少はまた最近のテストによるとＣＭＩの発生にも変化を与えるようである。
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実施例１８  サポニンＱＡ−２１とリゾチームの複合
あまり免疫性がなく極めて親水性の蛋白であるリゾチームを、サポニンＱＡ−２１との複合のために選んだ。ＱＡ−２１のグルクロン酸残基を、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)及びスルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド(ＮＨＳ)で活性化し、次のようにしてリゾチームと結合させた。
次のＤＭＳＯ溶液をつくった。
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溶液Ａを溶液Ｃ１００μlと合し、溶液Ｂ５０μlを加えた。１５分、９０分及び２６０分後に反応をＨＰＬＣ(検出器を２８０nmにセット)でモニターした。３２０分後に溶液Ｂをさらに５０μl加え反応をつづけＱＡ−２１のＮＨＳ溶液をつくった。
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(５ml,pＨ７)中のリゾチーム液(７２mg,分子量１４,４００ｇ／モル)を作った。リゾチーム液は、活性エステルの加水分解を制御するためよく濃縮すべきである。ついで粗ＮＨＳエステル(約５μモル)をアリコート２００μl中のリゾチーム(５μモル)に加えた。最初のアリコートを加えたあと、溶液は曇った。８０分及び１３５分あとにＨＰＬＣで反応をモニターした。ついで反応混合物を濾過し、水に透析しそして凍結乾燥して粗製のリゾチーム・ＱＡ−２１複合物を得た。
ついで凍結乾燥粉末を１０mＭ燐酸ソーダ緩衝液(pＨ７)約１mlにとかしその液を濾過して約８００μlとする。その約３００μlをＳemiprep Ｃ4カラムに入れ、勾配溶離(１０〜８０％の緩衝液Ｂで６０分;緩衝液Ａ＝０.１５％のトリフルオロ酢酸水溶液;緩衝液Ｂ＝０.１５％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液)で精製した。分画２mlを２２分後にあつめた。１１〜１７分画をプールし、窒素下で乾燥し、凍結乾燥した。ついでこの方法を粗製のリゾチーム−ＱＡ２１複合物４００μlについてくりかえした。
このリゾチーム−ＱＡ２１複合物は、リゾチームとＱＡ２１の１:１モル比に相当するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量に増大を示した。この複合物はまたリゾチームへの炭水化物ＱＡ−２１の付加によるところの炭水化物呈色ＰＡＳへの陽性反応を示した。ＱＡ−２１の活性エステルの増大量がリゾチームに加えられたときの複合反応の一例を図１９に示す。
実施例１９  ＱＡ−２１−リゾチーム複合物によるマウスの免疫
実施例１８のＱＡ−２１−リゾチーム複合物を、アジュバントとしてＱＡ−２１の添加と共に又はなしに、マウス(Ｃ５７bl／６)の免疫に用いた。１０匹のマウス(免疫開始時には９週令)を１群として免疫した。免疫は、総量０.２ml(ＰＢＳバッファー,pＨ７)で０日め及び１４日めに皮内注射で行った。ワクチンは次の用量の抗原とアジュバントを含んでいた。
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マウスは２１日めに採血して抗リゾチームＩgＧタイターを測定した。マイクロタイタープレート(代わりにＭicromembraneのＣo−bind[登録商標]も使用できる)をＰＢＳ約１００μl中のリゾチーム１０μg／mlで一夜４℃で培養した。ついでプレートをＰＢＳで二度洗い、室温で１０％の正常ヤギ抗血清の１５０μl／ウェルで１時間ブロックした。それからプレートを０.５％ツイーン２０水溶液で２回洗った。
マウスの血清を、次のようにしてリゾチーム被覆プレートで培養した。個々の血清サンプル１０μlを１０％の正常ヤギ血清(ＰＢＳ溶液)で希釈して１００μlとしたもの及びその段階的希釈(１:１０)をウェルに加え室温で１時間培養した。次いでウェルを０.０５％ツイーン２０で４回洗った。次いでウェルを、セイヨウワサビ・パーオキシダーゼ(ＢioＲad)に結合した抗マウスＩgＧで希釈剤１００μl(ＰＢＳ中１０％の正常ヤギ血清)中で室温で２時間培養し、０.０５％ツイーン２０で４回洗い、水で２回洗った。ついで結合物をテトラメチルベンジジン基質(Ｂos,Ｅ. Ｓ. ほか:Ｊ. Ｉmmunoassay,２:１８７(１９８１))で検出した。培養後はＯＤ450を測定した。
免疫されたマウスの各グループの総抗リゾチームＩgＧタイターは図２０,２１に示すようである。図２０はアジュバントがなくリゾチームのみ(グループ１);リゾチームと遊離の(共有結合のない)ＱＡ−２１(グループ２);及びＱＡ−２１−リゾチーム結合物(グループ３)を注射したマウスについての抗リゾチームタイターを示す。図２１はリゾチームのみ;リゾチームと遊離ＱＡ−２１(グループ４);及び遊離ＱＡ−２１とＱＡ−２１−リゾチーム複合物(グループ５)を注射したマウスの抗リゾチームタイターを比較したものである。
図１９〜２１に見られるようにリゾチームは単独で又はＱＡ−２１をアジュバントとして投与すると免疫性が乏しい。しかしリゾチーム−ＱＡ−２１複合物を投与されたマウスは、遊離ＱＡ−２１を投与されたグループの何れよりも抗体タイターが高い。予期せぬことに、リゾチーム−ＱＡ−２１複合物を遊離ＱＡ−２１をアジュバントとして共に投与したとき、抗体タイターに著しい上昇がみられた。本発明者はなんら特別な理論によって拘束されることを望まないけれども、リゾチームとＱＡ−２１の複合物は、免疫反応を増大させるのに役立つ遊離ＱＡ−２１の結合部位を提供すると考えられる。
次いで各々のマウスのグループで作られた抗リゾチーム抗体をイソタイプ化した。マイクロタイタープレートを、約１００μlのＰＢＳ中の１０μg／mlのリゾチームと共に一夜４℃で培養した。次いでプレートをＰＢＳで２度洗い、室温でＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清の１５０μl／ウェルで１時間ブロックした。ついでプレートを０.０５％ツイーン２０水溶液で２度洗った。
マウスのセラを、リゾチーム被覆プレートで次のようにして培養した。血清サンプルを別々のレーンでＩgＧ１,ＩgＧ２Ｂ,ＩgＧ２Ａ,ＩgＭ及びＩgＧ３についてテストした。各々の血清サンプル(１０μl)を血清中１０％の正常ヤギ血清で薄めて１００μlとし、ウェルにその一連希釈(１:１０)を加え、室温で１時間培養した。次いでウェルを０.０５％ツイーン２０で４回洗い、１００μlの希釈剤(ＰＢＳ中１０％の正常ヤギ血清)中でアルカリ性フォスファターゼ(Ｓouthern  Ｂiotechnology)にそれぞれ結合したヤギ血清ＩgＧ１,ＩgＧ２Ｂ,ＩgＧ２Ａ,ＩgＭ又はＩgＧ３で、室温で２時間培養し、０.０５％ツイーン２０で４回洗い、そして水で２回洗った。次いで結合物を０.１ボレート(pＨ９.０)中の１mg／mlのp−ニトロフェニルホスフェートの１００μl／ウェルを加えて検出した。室温で６〜２４時間培養後にＯＤ410を測定した。
図２２に示すように、リゾチームを単独又は遊離ＱＡ−２１と共に免疫元として用いたときはＩgＭ抗体のみが生成する。リゾチーム−ＱＡ２１複合物の投与はＩgＭ,ＩgＧ１,ＩgＧ２Ｂ及びＩgＧ２Ａ抗体の生成をもたらす。驚くべきことには、リゾチーム−ＱＡ２１複合体を、アジュバントとしての遊離ＱＡ−２１と共同投与したときは、それぞれのイソタイプについて著しいタイターの上昇がみられた。
実施例２０  グルクロン酸のＱＡ−２１カルボキシル基によるＱＡ−２１のグリシン,エチレンジアミン及びエチルアミンへの複合
(ＱＡ−２１の活性エステル誘導体の製造)
ＱＡ−２１の４０mg(約２０μモル)をジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)０.４mlにとかし、スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド(Ｓ−ＮＨＳ,８.７mg,４０μモル)をこのＱＡ−２１液にとかす。ＱＡ−２１もＳ−ＮＨＳもＤＭＦには充分とけない。ＤＣＣ４５.３mg／０.５mlＤＭＦのストック液をつくる。ＤＣＣを次のようにＱＡ−２１液に加える。
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最初のＤＣＣ添加の２４時間あと、反応液を４℃に１時間冷却し、０.４５ミクロンのフィルターで濾過する。総量で３mlの酢酸エチルを、この濾過した反応混合物に加える。生じた沈澱を遠心で集める。更に３mlの酢酸エチルを沈澱に加える。沈澱を遠心して集める。酢酸エチルによる洗浄工程をくりかえす。沈澱を減圧デシケータで乾燥する。これをＨＰＬＣで分析したＱＡ−２１のＳ−ＮＨＳ誘導体であることがわかった。これをグリシン誘導体の製造に用いる。
ＱＡ−２１のエチルアミン及びエチレンジアミン誘導体をつくるために、Ｓ−ＮＨＳ  ＱＡ−２１のグリシン反応のためと同様として作る。但し反応サイズを倍にし、ＱＡ−２１液に対し一つのアリコート中にＤＣＣ ０.３００mlを加え、酢酸エチル洗浄工程前に一夜かくはんする。
(ＱＡ−２１カルボキシルとグリシンアミノ基の間のアミド結合を介してグリシンへ結合したＱＡ−２１の製造)
Ｓ−ＮＨＳ−ＱＡ２１沈澱を、０.１Ｍ燐酸ソーダ(pＨ７.０)１mlにとかしたグリシン７５mg(１ミリモル)に加える。室温で２時間反応させたあと、反応混合物を６０分間、３０％−４０％Ｂの勾配中の逆相ＨＰＬＣ(Ｖydac Ｃ4,３００Å細孔径,５ミクロン)に負荷する。溶媒Ａは０.１％トリフルオロ酢酸水溶液である。溶媒Ｂは０.１％ＴＥＡのアセトニトリル溶液である。未変成ＱＡ−２１液や未反応Ｓ−ＮＨＳ−ＱＡ２１液には存在しなかった新しいピークが３４.３０分に生じ、これを集め、窒素下で乾かし、凍結乾燥する。この新しい生成物はＦＡＢ−ＭＳで同定した。
(ＱＡ−２１カルボキシルとエチレンジアミンのアミノ基の間のアミド結合を介して結合したＱＡ−２１の製造)
エチレンジアミンとＱＡ−２１の活性エステル誘導体を反応させるために、エチレンジアミン２６６mg(２ミリモル)を０.１Ｍ燐酸カリ(pＨ７)２.０mlにとかした。pＨを、ＮaＯＨの添加で７に再調整した。最終容量２.４５ml。この液にＳ−ＮＨＳ−ＱＡ２１の２２gを加える。室温で１.５時間反応のあとＨＰＬＣで分析し、ＱＡ−２１よりも短い保持時間の新しいピークの生成をみた。反応混合物を４℃で一夜保存し、次いでグリシン誘導体のときと同じ方法で半調製ＨＰＬＣで精製する。３２.５分でのピークを集め、窒素下で乾かしてアセトニトリルをとばし、そして凍結乾燥する。この誘導体はＱＡ−２１を抗原に結合させるのに使える結合剤(リンカー)の一例である。この新しい生成物はＦＡＢ−ＭＳで確認した。
(ＱＡ−２１カルボキシルとエチルアミンのアミノ基の間のアミド結合を介して結合したＱＡ−２１の製造)
ＱＡ−２１のエチルアミン誘導体をつくるため、エチルアミン７０mlを、水を使って１００mlにうすめた。総量０.０９１mlのこのエチルアミン液を０.１Ｍリン酸カリ(pＨ７.０)１mlに加える。pＨを、リン酸で７に再調整する。総量で３２mgのＳ−ＮＨＳ−ＱＡ−２１をこの液に加える。４５分あとにＨＰＬＣで分析する。ＱＡ−２１よりも疎水性の新しいピークを検出。反応混合物を一夜４℃に保つ。混合物はわずかに曇った。これをアセトニトリル０.１mlの添加で、可溶化する。これをＨＰＬＣにかけて、他の２つの誘導体と同じ方法で精製する。５２.３分のピークを集め、窒素下にアセトニトリルをとばし、そして凍結乾燥する。この新しい生成物をＦＡＢ−ＭＳで確認した。
実施例２１  還元的アルキル化によるＱＡ−２１トリテルペンアルデヒドへのエチレンジアミンとグリシンへのＱＡ−２１の複合
(ＱＡ−２１トリテルペンアルデヒドとグリシンのアミノ基のシッフ塩基の還元による、グリシンに結合したＱＡ−２１の製造)
ＱＡ−２１トリテルペン上のアルデヒドとグリシンの反応のために、ＱＡ−２１の２０mgを５０％メタノール、５０mＭリン酸ソーダ(pＨ６.０)０.８mlにとかす。グリシン溶液０.５mlが水中でつくられる。総量で０.１mlのグリシンを、このＱＡ−２１液に加える。ナトリウム・ボロハイドライドの０.１Ｍ液をメタノール中で作る(３２mg／５ml)。総量で０.１mlのナトリウム・ボロハイドライドをＱＡ−２１液に加える。ナトリウム・ボロハイドライドの添加を、２,５,２１,２５及び４６時間めにくりかえす。反応混合物を逆相ＨＰＬＣで精製する。３１.３分での新しいピークを集める。この新しい生成物はＦＡＢ−ＭＳで確認した。
(ＱＡ−２１トリテルペンアルデヒドとエチレンジアミンのアミノ基のシッフ塩基の還元による、エチレンジアミンに結合したＱＡ−２１の製造)
ＱＡ−２１トリテルペン上のアルデヒドとエチレンジアミンの反応のために、ＱＡ−２１の６mgを５０％メタノール、２０mＭトリエチルアミノホスフェート(pＨ６)の１mlにとかす。総量で０.１５mlの０.１Ｍエチレンジアミン水溶液を加え、次いで５０mＭのナトリウム・シアノボロハイドライド(メタノール中)０.０６mlを加える。ナトリウム・シアノボロハイドライドのアリコートを更に４５分及び１６時間めに加える。反応を、３０−６０％Ｂ法で逆相ＨＰＬＣで精製する。１９．６分での新しいピークを集める。これを凍結乾燥する。得たピークを逆相ＴＬＣで分析し、ニンヒドリンと反応性のあることがわかる。これはＱＡ−２１に遊離アミノ基が付加したことを示す。この誘導体は、ＱＡ−２１の抗原への結合に使用できるリンカーの一例である。
実施例２２  ＱＡ−２１トリテルペンアルデヒドのアルコールへの還元
水４ml中のＱＡ−２１の１２mgを０.１Ｍリン酸ソーダ(pＨ６.０)８mlと混合し、最終ＱＡ−２１濃度を１mg／mlとする。１Ｍのナトリウム・ボロハイドライドのストック液を０.０１Ｍ ＮaＯＨ中で作る。総量で０.５８０mlのナトリウム・ボロハイドライドを、ＱＡ−２１の少量増加分(約５０μlのインクレメント)に加える。ナトリウム・ボロハイドライドの最終濃度は０.０５Ｍ。この反応混合物を室温で１時間培養する。反応を１Ｎ酢酸１mlで失活させる。ナトリウム・ボロハイドライドを除くためにＱＡ−２１をＣ18に吸収させる。反応混合物４mlを、Ｃ18含有のカートリッジに通す。このカートリッジを水５mlで２回洗う。次いでＱＡ−２１をＣ18から、メタノール５mlで溶離する。この工程を反応混合物の残りの８mlについて行う。メタノールをＮ2気流下で蒸発させる。還元されたＱＡ−２１を３０％アセトニトリル／０.１５％トリフルオロ酢酸に再溶解させ、ＨＰＬＣで残存する非還元のＱＡ−２１を除いて精製する。(Ｖydac Ｃ4,粒子径５μm;３ml／分の流速で６０分間、２５−４０％の勾配[溶媒Ａは０.１５％ＴＦＡ水溶液;溶媒Ｂは０.１５ＴＦＡ−アセトニトリル溶液])。還元ＱＡ−２１は４６.８分の保持時間で溶離(非還元ＱＡ−２１の保持時間は４８.１分である)。還元ＱＡ−２１に対応するピークをプールし、水で１／２にうすめ、そして上述のようにＣ18カートリッジ上に集める。最終生成物を凍結乾燥し、免疫研究に使用する。
実施例２３  変性ＱＡ−２１サポニンのアジュバント活性
実施例２０,２１及び２２で作った変性ＱＡ−２１サポニンを、実施例１１に示すようにしてテストした。Ｃ５７bl／６マウス(１群５匹)を、オボアルブミン２５μg及びＱＡ−２１又はその誘導体のうちのひとつ１０〜５０μg(食塩水中)で皮下免疫した。１４日めブースター免疫を行った。抗体反応(総ＩgＧ)を第二免疫のあと、酵素イムノアッセイでテストした。グルクロネート・カルボキシル基上での３つの誘導体(エチルアミン，エチレンジアミン，グリシン)は尚もアジュバント活性をもっていたが、最小有効量にＱＡ−２１のそれよりも高かった(図２３Ａ)。これに対して、トリテルペンアルデヒドにおける還元的アルキル化による誘導体はテスト用量ではアジュバント活性をもっていなかった(図２３Ｂ)。しかし、トリテルペンアルデヒドがアルコールに還元されている変性ＱＡ−２１は若干のアジュバント活性をもっている。但し、その最小有効量はＱＡ−２１よりも高い(図２３Ｃ)。二回のブースター免疫を２週間の間隔で行った類似の実験の結果を表７に示す。
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実施例２４  エチレンジアミン結合基を介してＱＡ−２１へのビオチンの複合商業的に入手可能なビオチンの活性エステル誘導体(Ｓ−ＮＨＳ)(Ｐierce)をこの複合物生成に使用した。この活性化されたビオチンを、実施例２０のＱＡ−２１のエチレンジアミン誘導体の遊離アミノ基に結合させた。該ビオチン誘導体もまたアジュバント活性を保持していた(図２４)。
今や本発明は充分に記述されたので、以下に示すように本発明の範囲や精神から逸脱することなく、多くの変更や改変ができることは当業者にとって明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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