(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）標的DNAにプライマーをハイブリダイズさせ、蛍光標識されたdNTP、α−チオdNTPを含む相補鎖合成用基質を用いて相補鎖伸長を行いDNA鎖を得る工程と、（２）前記DNA鎖を切断して断片を生成する工程と、（３）前記断片を分離して検出する工程とを有し、前記DNA鎖の切断がエンドヌクレアーゼによる切断であることを特徴とするDNA検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のDNA検出方法において、前記相補鎖合成用基質はビオチン化dNTPを含み、前記断片の分離をビオチン−アビジン反応を用いて行うことを特徴とするDNA検出方法。
【請求項３】
（１）標的DNAにプライマーをハイブリダイズさせ、α−チオdNTPを含む相補鎖合成用基質を用いて相補鎖伸長を行い前記標的DNAの相補鎖を合成鎖として得る工程と、（２）前記合成鎖にα−チオdNTPから合成されているプライマーをハイブリダイズさせる工程と、（３）蛍光標識されたdNTPを含む相補鎖合成用基質を用いて、前記合成鎖にハイブリダイズしたプライマーの前記相補鎖伸長を行いDNA鎖を得る工程と、（４）前記DNA鎖をエンドヌクレアーゼにより切断して断片を生成する工程と、（５）前記工程（３）及び（４）を繰返す工程と、（６）前記断片を分離して検出する工程とを有することを特徴とするDNA検出方法。
【請求項４】
請求項３に記載のDNA検出方法において、前記相補鎖合成用基質はビオチン化dNTPを含み、前記断片の分離をビオチン−アビジン反応を用いて行うことを特徴とするDNA検出方法。
【請求項５】
（１）標的DNAにRNAプライマーをハイブリダイズさせ、蛍光標識されたNTP、NTPを含む相補鎖合成用基質を用いて相補鎖伸長を行いRNA鎖を得る工程と、（２）前記RNA鎖をエンドヌクレアーゼにより断片に切断する工程と、（３）前記断片を分離して検出する工程とを有することを特徴とするDNA検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載のDNA検出方法において、前記相補鎖合成用基質はビオチン化dNTPを含み、前記断片の分離をビオチン−アビジン反応を用いて行うことを特徴とするDNA検出方法。
【請求項７】
相補鎖合成用基質として蛍光標識されたdNTPと、α−チオdNTPと、エンドヌクレアーゼとを含む請求項１に記載のDNA検出方法のための試薬キット。
【請求項８】
相補鎖合成用基質として蛍光標識されたdNTP、α−チオdNTP、ビオチン化dNTPを含む請求項１に記載のDNA検出方法のための試薬キット。
【請求項９】
相補鎖合成用基質として蛍光標識されたNTP、NTPを含む請求項５に記載のDNA検出方法のための試薬キット。
【請求項１０】
相補鎖合成用基質として蛍光標識されたNTP、NTP、ビオチン化NTPを含む請求項５に記載のDNA検出方法のための試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNA等の検出方法およびそれに用いる試薬キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスなどの感染症の診断、遺伝子診断では微量のDNAあるいは多種のDNAの中から特定の配列を持ったDNAの存否を調べることが行われる。この場合、特にサンプル中に含まれるDNAは微量の事が多く、そこでDNAの増幅法を活用した検出法が広く行なわれている。最も広く用いられているのはPCR（Polymerase Chain Reaction）を利用して標的DNAにハイブリダイズする２つのオリゴマーで挟まれた領域のDNAコピーを増やしてから検出する方法である。また他の方法に特定の部位にハイブリダイズするDNAプローブを用意し、標的DNAがあるとこれにハイブリダイズし２本鎖を形成した後、２本鎖DNAを末端から分解するエキソヌクレアーゼ（exonuclease）を作用させる方法がある。この場合ハイブリダイズしたDNAプローブ１つだけを分解・短小化し、これを検出する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
PCR法は高感度検出可能な方法ではあるが、２つのDNAプローブを用意する必要があるため、すべての場合に適用できるわけではない。一方、エクソヌクレアーゼを用いて分解する方法は、１ヶのプローブを用いて検出可能であるが、ハイブリダイズしたDNAプローブばかりでなく、１本鎖をもエクソヌクレアーゼは切断するためにこれに起因した背景信号のため高感度が得られない難点があった（Anal.Biochem.228,101-108(1995)）。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明はエンドヌクレアーゼ（endouclease）を用いた新しいDNAプローブ検出法を提供するものでPCRと異なり熱サイクルを必要とせず、生成標識DNA断片は標的量と反応時間にリニヤーに比例するため(PCR は指数的に増加) 、定量などに都合のよい方法である。
【０００５】
すなわち、本発明は、（１）標的DNAにオリゴマーからなるプライマーをハイブリダイズさせ、少なくとも蛍光標識デオキシヌクレオチドトリフォスフェートおよびデオキシヌクレオチドαーチオトリフォスフェートを基質として相補鎖を合成するプロセス、（２）化学反応あるいは酵素反応により、相補鎖合成で生成したDNAを鎖の途中から切断し、少なくとも１種以上のオリゴマーを生成するプロセス、及び（３）生成した断片を分離し、蛍光検出するプロセスを少なくとも含むDNA検出法である。
【０００６】
そして、上記相補鎖基質としては少なくとも蛍光標識デオキシヌクレオチドトリフォスフェート及びαーチオデオキシヌクレオチドトリフォスフェートを含むものがあげられる。また、上記方法において相補鎖合成で生成したDNAの鎖の途中からの切断は、エンドヌクレアーゼによりおこなわれる。上記オリゴマーとしては、酵素切断を受けない修飾オリゴマーが用いられ、この修飾オリゴマーとしてはリン酸ジエステル結合部がホスホチオエートあるいはその誘導体、ペプチド結合したもの等が利用できる。さらに、生成した断片の分離は、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフなどクロマトグラフを用いた方法またはビオチンーアビジンあるいは抗原抗体反応を利用した方法により行われる
さらに、本発明は、（１）標的DNAにDNA/RNAオリゴマーをハイブリダイズさせ、少なくとも蛍光標識リボヌクレオチドトリフォスフェートおよびビオチン標識リボヌクレオチドトリフォスフェートを基質として相補鎖合成を行なうプロセス、（２）合成したRNA鎖をRNA分解酵素により小断片に分解するプロセス及び（３）生成した断片を分離し、蛍光検出するプロセスを少なくとも含むDNA検出法である。
【０００７】
さらに、本発明は相補鎖合成用基質としての蛍光標識デオキシヌクレオチドトリフォスフェート又は蛍光標識デオキシヌクレオチドαーチオトリフォスフェート及びデオキシヌクレオチドαーチオトリフォスフェートを少なくとも含む上記DNA検出法用の試薬キット、相補鎖合成用基質としての蛍光標識デオキシヌクレオチドトリフォスフェート又は蛍光標識デオキシヌクレオチドαーチオトリフォスフェート及びデオキシヌクレオチドαーチオトリフォスフェート並びにビオチン又はつり出し用のプローブをを少なくとも含む上記DNA検出法用の試薬キット、相補鎖合成用基質としての蛍光標識リボヌクレオチドトリフォスフェート及びリボヌクレオチドトリフォスフェートを少なくとも含む上記DNA検出法用の試薬キット、或いは相補鎖を合成用の基質として蛍光標識リボヌクレオチドトリフォスフェート及びリボヌクレオチドトリフォスフェート並びにビオチンまたはつり出し用のプローブを少なく含む上記DNA検出法用の試薬キットである。
【０００８】
以下に本発明について詳細に述べる。なお、以下の説明のおいてdNTPはデオキシヌクレオチドトリフォスフェートを、α−チオdNTPはデオキシヌクレオチドα−チオトリフォスフェートを、NTPはリボヌクレオチドトリフォスフェートを、α−チオdCTPはデオキシシトシンα−チオトリフォスフェートを、dATPはデオキシアデニントリフォスフェートを、α−チオdATPはデオキシアデニンα−チオトリフォスフェートを、α−チオdGTPはデオキシグアニンα−チオトリフォスフェートを、α−チオdTTPはデオキシチミンα−チオトリフォスフェートをそれぞれ意味する。
【０００９】
細胞中のRNAを検出する場合、目的とするRNAは生体中に存在する酵素により分解してしまうのでこれを避けるためにDNAプローブを目的とするRNAにハイブリダイズさせ相補鎖(C-DNA鎖)を合成することで目的RNAの存在を検出するものである。もちろんDNAを検出する場合同様のDNAプローブを用いて検出できる。本発明の特徴はこうして得たC-DNAあるいは目的DNAを鋳型として得られる相補合成鎖を分解して、それを短断片とし多数の短断片を検出したことにある。合成プロセスを経ることで異なる物質で標識化された少なくとも２種のdNTPあるいはNTPを結合させ、結合した断片を検出することで未反応のdNTPあるいはNTPと区別する。このプロセスは相補鎖合成と分解を同時に繰り返し行ない得るもので、鋳型DNAが分解しないようにしておくと効率良く目的生成物が得られる。このためまずターゲットDNAを鋳型とし、また基質としてα−チオフォスフォヌクレオチドを用い相補鎖合成を行い酵素分解しない第２の鋳型をつくる。これはデオキシヌクレオチドトリフォスフェートを基質に用いた場合と異なり加水分解を受けにくく、次の相補鎖合成および、分解プロセスで鋳型が酵素分離しにくい。この相補鎖を今後は標的DNAの代わりに用いる。これからαーチオDNA鎖だけを除去する。次いで別途用意したαチオDNAオリゴマーをプライマーとし、ビオチン化α−チオdCTP、蛍光標識α−チオdATP、α−チオdGTPおよびdTTPを基質として相補合成を行なう。この時、エンドヌクレアーゼを共存させておくと、チミン（T）塩基の前で切断され、種々のDNA小断片が生じる。プライマーおよび鋳型はα−チオdNTPより構成された鎖なので分解されない。一連の反応の後、ビオチンと蛍光体を持ったDNA断片が多数できるのでアビジンを表面に持った粒子でビオチンを捕獲し蛍光を測定して標的DNAの有無を調べる。もちろん目的とするDNA鎖を鋳型としてRNA鎖をRNAポリメラーゼを用いて生成しても同様のことができる。この場合、基質として蛍光標識NTPおよびビオチン標識NTPを使用する。これらは相補鎖合成反応により相互に結合するが、RNase Hによりエンドヌクレアーゼ的に分解し、小断片を与える。分解はRNA鎖にだけおこるのでDNA鎖は引き続き鋳型として活用可能である。
【００１０】
次に本発明の作用について説明すると次のとおりである。すなわち、 DNA ポリメラーゼによりビオチン標識αーチオdNTPと蛍光標識αーチオdNTPを合成鎖内に取り込むことにより、これら２つを直接あるいはdNTPを介して結合させる。この結果、プライマーが標的にハイブリダイズし、相補鎖合成が起きると蛍光標識はDNA鎖を通してビオチンと結合する。蛍光標識dNTPはいくつもDNA鎖に取り込まれるが、蛍光体同志の相互作用のため発する蛍光強度は取り込まれた蛍光体数から期待されるより小さい。しかし、エンドヌクレアーゼで分解することで蛍光体数に比例した強度を得ることができる。ビオチンと結合した蛍光体だけを抜き出すことで未反応の蛍光dNTPと取り込まれた蛍光dNTPとを区別することができる。また、相補鎖合成とエンドヌクレアーゼによる分解とを同時に行なうと、プライマーはαチオdNTPから合成されているので分解せず標的にハイブリダイズしたままであるが、合成相補鎖はエンドヌクレアーゼでαーチオフォスフェートを含む部分以外は加水分解される。DNA鎖が切断され小断片になるとその部分は標的DNAから脱離し、代わって新しいDNA鎖が合成される。このように定温で合成・分解のサイクルがまわることにより、ビオチンと蛍光体を含むフラグメントが増加する。これを検出するので１つの標的DNAからこれよりはるかに多い蛍光体が入りDNAフラグメントが生成でき高感度の計測が行なえる。単に蛍光強度を計るばかりでなく生成物を電気泳動に掛けてその電気泳動図のパターンを調べることで標的DNAの種類を識別することもできる。RNAを用いた時も同様であるが、RNaseHはDNA-RNAハイブリッドのRNA鎖だけを分解するので、わざわざαーチオdNTP を用いて鋳型DNAを調製する必要がない利点がある。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下本発明を実施例を用いて、具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
この実施例はポリメラーゼによる相補鎖伸長の後にエンドヌクレアーゼで相補合成鎖を分解する例である。その工程を図１に示した。標的DNAとしてM１３ mp８を用いた。相補鎖合成用の基質としてビオチン化dATP（Yで表示）、蛍光標識α−チオdGTP（＊で表示）、α−チオdCTP、α−チオdTTPを用いた。ビオチン化dNTPおよび蛍光標識dNTPとαチオdNTPが含まれていれば他の組み合わせでもよい。DNAポリメラーゼとして逆転写酵素（AMV Reverse Transcriptase）を用いたが、T７ポリメラーゼ、Tagポリメラーゼなどを用いてもよい。なお、蛍光体としてはTexas Red (620nm) 、FITC(520nm) 、Cys(650nm)等が使用できる。ここでは、Texas Red を用いた。
【００１２】
標的DNAを１アトモル（１０-18）含む試料溶液５０μlにプライマー、DNAポリメラーゼおよび上記基質を入れて相補鎖合成を37℃で行なう。もちろん、耐熱性酵素を用いて高温で行ってもよいが、サイクルは原則必要ない。相補鎖合成はDNAの構造に起因する合成反応阻害により反応停止がおこるまで鎖伸長が行なわれ、通常は百〜数百塩基の長さの相補鎖ができる。蛍光体を取り込むので配列にもよるが 200〜300 塩基になることが多い。実施例では３００近い鎖長の相補鎖を得た。この中に入っている蛍光標識グアノシンホスフェートの平均個数は約１／４の７５であるが蛍光強度は６〜８個の蛍光体と同強度である。これは蛍光体同志が近くにくると相互に干渉し、蛍光強度が独立の場合に比べて減少するからである。相補鎖合成終了後、エンドヌクレアーゼ（Deoxyribonuclease I）を加え、DNA鎖を分解する。チオフォスフェート結合が酵素による分解を阻害し、その結合は分解されないが、通常のリン酸結合部分は分解されるので、小さな多数のフラグメントに分解される。こうして生じた断片はすべてビオチンを含んでいる。なぜならビオチン化されたアデニンの前で結合が切断されるからである。これをアビジンを表面に持つ磁気ビーズ、あるいは底面に持つタイタープレートでトラップし、洗浄して未反応の蛍光標識ATPを除去した後に励起光として He-Neレーザー(594nm) を用いて蛍光検出する。DNAは切断化されており、蛍光体同志がDNA鎖上で近くにくる確立は低くなっており大きな蛍光強度が得られる。切れ目の入るのは４種の塩基のうちアデニン（Ａ）だけであり、300 塩基中にＡのある確率は75なので平均断片数は約75個になる。このうちＡが続く配列ではＡのモノマーが切断生成物としてできる確率が高い。Ａ−Ａの配列のある確率は１／１６であり、これからアデニンモノマーの生じる平均個数は19となる。例えば鎖長が３００の時１つのDNAから生じる小断片の平均数は７５個でこのうち配列がAAとなった部分から生じるアラニンモノマー数は平均１９で、残り５６個はダイマー以上の長さを持つ。全フラグメントのうち蛍光標識のついたGが含まれているフラグメントの平均数は約半分である。これは、グアニン（Ｇ）の含まれる確率は、切れる部位はＧ又はＡであるから１／２となる。この結果、１本の長鎖DNAを分解して生じた断片の発する蛍光強度は約３０個の蛍光体から出る蛍光強度と同程度となり、長鎖の場合蛍光体同志の干渉で蛍光強度は個数に比例せず蛍光体が一個増えると0.2 〜0.5 位増加するに過ぎない。この場合はそれぞれ蛍光体がついたDNAを切断し、相互に蛍光体が干渉しないようにするので長鎖の場合に比べて４〜５倍の蛍光強度を得ることができる。
【００１３】
〔実施例２〕
この実施例は相補鎖合成とエンドヌクレアーゼによる分解を同時に行なう例である。この工程を図２に示す。この例はDNA鎖合成とその後に分解して生じる短いDNA断片の生成を繰り返し行ない、小断片数を増やすものである。この例を実施するために、Hot TubTMDNAポリメラーゼ（アマシャム社）およびDNase Iを用いる。DNase Iはヌクレオチドの隣を選択的に切断し、末端に５'リン酸基を持つほぼ４塩基長のオリゴヌクレオチドを作るエンドヌクレアーゼである。標的DNA（鋳型I）がDNase Iにより分解されることを阻止するため、基質としてデオキシンヌクレオチドαチオトリフォスフェートを用いて相補鎖合成し、新しい合成DNA（鋳型II）とする。これを取り出し、次いでDNase Iを加えチオフォスフェート結合からなるDNA鎖以外は分解する。鋳型IIのDNAにハイブリダイズし、プライマーとして機能するチオフォスフェート結合を持つオリゴマーおよびビオチン化dTTP、ビオチン化dCTP、蛍光標識dATP、dGTPおよびDNAポリメラーゼ（Hot TubTM）を加えて相補鎖合成を行なう。DNase Iを加えてリン酸エステル結合を分解する。分解はランダムにおこり、短小化したオリゴマーは鋳型から遊離する。ビオチン化チミン塩基を持つ短いオリゴマーが生成するが、この中には蛍光標識dATPを含むものも多く含まれる。これらはハイブリダイゼーション力が弱く、鋳型II DNAから遊離する。プライマーはすべてαS'dNTPから合成されているので分解せずハイブリダイズしたままである。このため引き続いてプライマーとして機能し、相補鎖合成が行なわれる。また、生成した断片のうち長いものはハイブリダイズしたままであるが、これもプライマーとして機能するので３'側に相補鎖を伸長する。再度生成したDNA鎖は再び分離される。このサイクルを繰り返す。この結果、DNA小断片が多数生成される。この断片にはビオチンなどつり出し用標識に加えて蛍光標識が結合しており、ビオチンをつり出すことでDNA鎖に取り込まれた蛍光体をdNTPについた蛍光体と識別して計測することができる。また、生成したDNA断片の長さをゲル電気泳動や液体クロマトグラフィなどで分析すれば、生成したDNA断片長の分布からもとのDNA鎖を区別することもできる。
【００１４】
生成するDNA断片の数は検出しようとするDNAのコピー数よりはるかに多くなるので、高感度検出が可能となる。
〔実施例３〕
上記の実施例１及び実施例２はDNAについてのものであったが、RNA鎖の合成と分解によっても同様のことができる。図３にその工程を示した。標的DNAを含む液にRNAプローブを加えハイブリダイズさせる。これにNTPとRNA ポリメラーゼを加えて相補鎖合成をする。NTPにはビオチン標識あるいは蛍光標識したヌクレオチドの種類を混ぜておく。例えばATPとGTPをビオチン標識し、UTPを蛍光体で標識しておく。合成された相補鎖には多数のビオチンおよび蛍光体が付加している。この反応液にRNase Hを加える。RNase HはDNA-RNA２本鎖のRNA部分をランダムに切断する酵素である。切断により４〜５マーのRNA切断が生成するが、この中には平均として少なくとも一個の蛍光体およびビオチンが含まれている。DNAにハイブリダイズしたRNAが分解すると再びRNAプライマーが付加し、合成反応がスタートする。この合成、分解のサイクルは室温で何度も繰り返される。この結果、ビオチンと蛍光体が付加した短いRNA断片が集積することになる。RNA相補鎖合成の基質の１つであるNTP中の蛍光標識とRNA断片中の蛍光標識を区別する必要があるが、電気泳動などにより長さの差により分離して計測するか、アビジンを保持したビーズにビオチンをトラップし、RNA断片中の蛍光体を分別し計測する。もちろん、ハイブリダイズしたRNAプライマーの分解を阻止したり、RNAの一部の結合を分解から保護するためにαSNTPを一部のNTPに代えて用いても良い。
【００１５】
以上の３つの実施例では蛍光標識とビオチン標識を用いたが、２つの異なる蛍光標識、酵素による標識、その他の標識を用いても良い。例えば２つの蛍光標識（NとM）を用いる場合には、ポリメラーゼにより両者が１つの断片に結合することでエネルギー移動が可能になり、Nを励起するとMBが蛍光を発するなどの現象を利用して検出する。このようなエネルギー移動による検出は既に良く知られたものであるが、DNAあるいはRNA鎖を合成し、かつ分解することで行なう例は報告されていない。
【００１６】
【発明の効果】
本発明によれば、１つの測定対象DNAを鋳型として蛍光標識された多くのDNAあるいはRNA小断片を作成できるので高感度なDNA検出が可能である。また、蛍光標識dNTPあるいはNTPを測定対象となるDNAの存在下でつり出し標識のついたdNTPあるいはNTPとDNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼで結合すること、および両者を含む小断片だけを取り出すことにより背景信号の小さい計測法を可能とする。さらに、常温でDNAあるいはRNAポリメラーゼとDNAあるいはRNAエンドヌクレアーゼを作用させることでDNAあるいはRNA小断片を繰り返し生成することができるので高感度が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】標識dNTPを用いて相補鎖合成し、合成鎖を分解、分解物を計測して目的DNAを計測する方法の工程図である。
【図２】  標識dNTPによる相補鎖合成と分解を同時に行なう場合の工程図である。
【図３】    RNA鎖の合成と分解の検出方式の工程図である。
【符号の説明】
１・・・検出しようとする標的DNA( 鋳型１），２・・・DNAプライマー，３・・・標識dNTPから合成された相補鎖DNA，４・・・蛍光標識，５・・・ビオチン標識，６・・・分解で生成した短いオリゴマー，７・・・アビジンを表面に持つビーズ，８・・・アビジン・ビオチン結合，１１・・・αSdNTPからなる合成DNA( 鋳型１１），１２・・・分解しない検出用プライマー，１３・・・標識dNTPからなる合成鎖，３２・・・RNAプライマー，３３・・・標識NTPから合成したRNA鎖，３４・・・標識物を含むRNA断片
【図１】
0003647109.tif 000002
【図２】
0003647109.tif 000003
【図３】
0003647109.tif 000004