(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常または異常の全血サンプルにおいて、個々の細胞ベースで、他の細胞から血小板を正確に区別するための、かつ定性的および定量的血小板パラメーターを測定するための自動化方法であって、以下のステップ：
ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプルのアリコートを分析する、ただし、上記の光散乱強度は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔にわたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすように増加された第１および第２の光学チャンネル信号値で測定され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高角度検出器のゲインの増加から得られ、第２の光学チャンネル信号値は低角度検出器のゲインの増加から得られる；そして
ｂ）該サンプル中の血小板を非血小板から区別し、そして体積対屈折率マップ内における光散乱で得られた血小板信号の存在により血小板パラメーターを測定する；
を含んでなる方法。
【請求項２】
血小板が血小板の屈折率の正規分布に基づいて非血小板からさらに区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾燥質量のパラメーターを測定し、さらに以下のステップ：
ｃ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換する；
ｄ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する；そして
ｅ）スッテプｃ）とｄ）の血小板成分濃度値と血小板体積値の積として血小板乾燥質量を計算する；
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
血小板数のパラメーターを測定し、以下のステップ：
ｆ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾燥質量のヒストグラムを表示する；そして
ｇ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることにより、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定する；
をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）において、高角度検出器のゲインの増加が約８から１５倍であり、そして低角度検出器のゲインの増加が約２０から３５倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）において、高角度検出器のゲインの増加が約１２倍であり、そして低角度検出器のゲインの増加が約３０倍である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
変換ステップｄ）の血小板成分濃度値が、粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、その結果を屈折率増加の平均でわり算して決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
血小板が非球形である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血小板がほぼ等容性(isovolumetric) を保っている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
赤血球数が高ゲインチャンネルＸ＝99，Ｙ＝99の信号を赤血球として数えることにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
血小板の分析と赤血球の分析が同時に行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
体積および屈折率の範囲が、通常のゲイン条件下で大きい血小板の体積と屈折率の分析を得るために標準信号ゲイン条件下で使用される表を下方に拡大することにより、大きくかつ高密度の血小板での第１および第２光学チャンネルの飽和による誤差を避けるために拡大される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
高角度検出器のゲインの増加が約１０倍であり、そして低角度検出器のゲインの増加が約２５倍である、請求項５または１３に記載の方法。
【請求項１５】
２つの光散乱測定値が血小板の活性化状態を決めるのに使われ、その際、活性化された血小板は活性化されていない血小板よりも測定可能に低い屈折率と低い成分濃度（ＭＰＣ）を有する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１６】
血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血小板が生体内または生体外で活性化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
血小板の活性化状態が血小板サンプルのin vitro年齢の関数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｄ）で得られる血小板の成分濃度値が室温または４℃において約１時間から約２４時間貯蔵された血液サンプルのin vitro年齢を決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
ステップｅ）で得られる血小板の乾燥質量、血小板数、および血小板の顆粒含量、またはこれらの組合せが癌治療または癌処置を受けている患者における前記の治療または処置の効果を決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
血小板数、血小板体積、血小板乾燥質量、および血小板成分濃度のパラメーターを、個々の細胞ベースで、正確に測定し、かつ正常または異常の全血サンプル中の血小板を他の細胞から区別するための自動化方法であって、以下のステップ：
ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプルのアリコートを分析する、ただし、上記の光散乱強度は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔にわたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすように増加された第１および第２の光学チャンネル信号値で測定され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高角度検出器のゲインの増加から得られ、第２の光学チャンネル信号値は低角度検出器のゲインの増加から得られる；
ｂ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換する；
ｃ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する；
ｄ）スッテプｂ）とｃ）の血小板成分濃度値と血小板体積値の積として血小板乾燥質量を計算する；
ｅ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾燥質量のヒストグラムを表示する；そして
ｆ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることにより、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定する；
を含んでなる方法。
【請求項２４】
ステップａ）において、高角度検出器での増加が約８から１５倍であり、そして低角度検出器での増加が約２０から３５倍である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップａ）において、高角度検出器での増加が約１２倍であり、そして低角度検出器での増加が約３０倍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
変換スッテプｃ）の血小板成分濃度値が、計算した粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、その結果を屈折率増加の平均でわり算して決定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
血小板が非球形である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
血小板がほぼ等容性を保っている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
赤血球数が高ゲインチャンネルＸ＝99，Ｙ＝99の信号を赤血球として数えることにより得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
血小板の分析と赤血球の分析が同時に行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
体積および屈折率の範囲が、通常のゲイン条件下で大きい血小板の体積と屈折率の分析をえるために標準信号ゲイン条件下で使用される表を下方に拡大することにより、大きくかつ高密度の血小板での第１および第２光学チャンネルの飽和による誤差を避けるために拡大される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
高角度検出器の前記増加が約１０倍であり、そして低角度検出器の前記増加が約２５倍である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
２つの光散乱測定値が血小板の活性化状態を決めるのに使われ、その際、活性化された血小板は活性化されていない血小板よりも測定可能に低い屈折率と低い成分濃度（ＭＰＣ）を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
血液サンプルがＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムで抗凝固されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
血小板がＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウム中に集められる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
血小板がＥＤＴＡ中に集められる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
血小板が生体内または生体外で活性化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
血小板の活性化状態が血小板サンプルのin vitro年齢の関数である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
ステップｃ）で得られる血小板の成分濃度値が室温または４℃において約１時間から約２４時間貯蔵された血液サンプルのin vitro年齢を決定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
ステップｄ）で得られる血小板の乾燥質量、血小板数、および血小板の顆粒含量、またはこれらの組合せが癌治療または癌処置を受けている患者における前記の治療または処置の効果を決定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
血小板数、血小板体積、血小板乾燥質量、および血小板成分濃度のパラメーターを正確に測定し、かつ正常または異常の全血サンプル中の血小板を他の細胞から区別するための自動化装置であって、以下の手段：
ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプルのアリコートを分析する手段、ただし、上記の光散乱強度は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔にわたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすように増加された第１および第２の光学チャンネル信号ゲインで測定され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高角度検出器の高ゲイン出力から得られ、第２の光学チャンネル信号値は低角度検出器の高ゲイン出力から得られる；
ｂ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換する手段；
ｃ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する手段；
ｄ）スッテプｂ）とｃ）の血小板成分濃度値と血小板体積値の積の関数として血小板乾燥質量値を計算する手段；
ｅ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾燥質量のヒストグラムを表示する手段；および
ｆ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることにより、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定する手段；
を含んでなる装置。
【請求項４３】
ステップａ）において、高角度検出器の高ゲイン出力が約８から１５倍であり、そして低角度検出器の高ゲイン出力が約２０から３５倍である、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
高角度検出器の高ゲイン出力が約１２倍であり、そして低角度検出器の高ゲイン出力が約３０倍である、請求項４３に記載の装置。
【請求項４５】
血小板成分濃度値変換手段が、計算した粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、その結果を屈折率増加の平均でわり算して血小板成分濃度を決定する、請求項４２に記載の装置。
【請求項４６】
屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
血小板が非球形である、請求項４２に記載の装置。
【請求項４８】
血小板がほぼ等容性を保っている、請求項４２に記載の装置。
【請求項４９】
血小板を分析すると同時に赤血球数を数える手段をさらに含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項５０】
血小板の活性化状態を血小板成分濃度に基づいて決定できる、請求項４２に記載の装置。
【請求項５１】
完全な赤血球分析と血小板分析が同時に行われる、請求項１または２３に記載の方法。
【請求項５２】
完全な赤血球分析と血小板分析を同時に行う手段をさらに含む、請求項４２に記載の装置。
【請求項５３】
正常または異常の全血サンプルにおいて、個々の細胞ベースで、他の細胞から血小板を正確に区別するための、かつ定性的および定量的血小板パラメーターを測定するための自動化装置であって、以下の手段：
ａ）散乱角の関数として単位散乱角あたりの散乱光強度を表す前方光散乱パターンをつくるために、集束させた光源に本質的に１度に１個の細胞を通過させて該サンプルのアリコートを分析する手段、ただし、上記の光散乱強度は、２つの光学チャンネルにおいて２つの円錐角間隔にわたって、該サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２つの散乱強度測定値をもたらすように増加された第１および第２の光学チャンネル信号ゲインで測定され、ここで、第１光学チャンネル信号値は高角度検出器のゲインの増加から得られ、第２の光学チャンネル信号値は低角度検出器のゲインの増加から得られる；および
ｂ）該サンプル中の血小板を非血小板から区別し、そして体積対屈折率マップ内に置くことにより血小板パラメーターを測定する手段；
を含んでなる装置。
【請求項５４】
血小板の屈折率の正規分布に基づいて血小板を非血小板からさらに区別する手段をさらに含む、請求項５３に記載の装置。
【請求項５５】
血小板体積、血小板成分濃度および血小板乾燥質量のパラメーターを測定し、以下の手段：
ｃ）第１および第２光学チャンネルの光散乱信号のゲイン値を血小板の体積値および血小板の屈折率値に変換する手段；
ｄ）血小板屈折率値を血小板成分濃度値に変換する手段；および
ｅ）スッテプｃ）とｄ）の血小板成分濃度値と血小板体積値の積として血小板乾燥質量値を計算する手段；
をさらに含んでなる、請求項５３に記載の装置。
【請求項５６】
血小板数のパラメーターを測定し、以下の手段：
ｆ）血小板の体積、血小板の成分濃度および血小板の乾燥質量のヒストグラムを表示する手段；および
ｇ）体積対屈折率マップ内に血小板を位置させることにより、粒子体積と屈折率に基づいて血小板数を決定する手段；
をさらに含んでなる、請求項５５に記載の装置。
【請求項５７】
ステップａ）において、高角度検出器でのゲインの増加が約８から１５倍であり、そして低角度検出器でのゲインの増加が約２０から３５倍である、請求項５３に記載の装置。
【請求項５８】
ステップａ）において、高角度検出器でのゲインの増加が約１２倍であり、そして低角度検出器でのゲインの増加が約３０倍である、請求項５７に記載の装置。
【請求項５９】
変換ｄ）の前記手段により決定される血小板成分濃度値が、計算した粒子信号の屈折率から水の屈折率を引き、その結果を屈折率増加の平均でわり算して決定される、請求項５５に記載の装置。
【請求項６０】
屈折率の増加が 0.0018 g/dlである、請求項５９に記載の装置。
【請求項６１】
血小板が非球形である、請求項５３に記載の装置。
【請求項６２】
血小板がほぼ等容性を保っている、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
高ゲインチャンネルＸ＝99，Ｙ＝99の信号を赤血球として数えることにより赤血球数を得る手段をさらに含む、請求項５３に記載の装置。
【請求項６４】
血小板の分析と赤血球の分析を同時に行う手段をさらに含む、請求項６３に記載の装置。
【請求項６５】
通常のゲイン条件下で大きい血小板の体積と屈折率の分析を得るために、標準信号ゲイン条件下で使用される表を下方に拡大することにより、大きくかつ高密度の血小板での第１および第２光学チャンネルの飽和による誤差を避けるべく、体積および屈折率の範囲を拡大する手段をさらに含む、請求項５３に記載の装置。
【請求項６６】
高角度検出器のゲインの増加が約１０倍であり、そして低角度検出器のゲインの増加が約２５倍である、請求項６５に記載の装置。
【請求項６７】
２つの光散乱測定値が血小板の活性化状態を決めるのに使われ、その際、活性化された血小板は活性化されていない血小板よりも測定可能に低い屈折率と低い成分濃度を有する、請求項５５に記載の装置。
【請求項６８】
血小板がＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウム中に集められる、請求項６７に記載の装置。
【請求項６９】
血小板がＥＤＴＡ中に集められる、請求項６８に記載の装置。
【請求項７０】
血小板が生体内または生体外で活性化される、請求項６７に記載の装置。
【請求項７１】
血小板の活性化状態が血小板サンプルのin vitro年齢の関数である、請求項６７に記載の装置。
【請求項７２】
手段ｄ）で得られる血小板の成分濃度値が室温または４℃において約１時間から約２４時間貯蔵された血液サンプルのin vitro年齢を決定する、請求項５５に記載の装置。
【請求項７３】
手段ｅ）で得られる血小板の乾燥質量値、血小板数、および血小板の顆粒含量、またはこれらの組合せが癌治療または癌処置を受けている患者における前記の治療または処置の効果を決定する、請求項５５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、自動血液学システムを使用した血小板の分析および定量の改善された方法に関する。特に、本発明は、正常および異常の血液サンプルの両方に使用することができる、数あるパラメーターの中でもとりわけ、血小板の総数、血小板の体積、血小板の成分濃度または密度および血小板の乾燥質量を、他の方法と比較してより高い正確度および精密さで測定するための、高ゲイン(gain)方法に関する。
【０００２】
【従来の方法および発明が解決しようとする課題】
血小板総数を測定するために、半および全自動化分析システムが、現在、日常的に使用されているが、現在の自動化された血小板の測定および定量法は、不正確であり、精密さおよび再現性に欠けるという問題がなおも存在することが当分野では認められる。これは、血小板減少症（血小板の数の減少）、血小板増加症などの多数の血液疾患および血栓障害に苦しむ人または患者から得られるような異常血液サンプルの分析において特に明らかである。血小板計数の正確さを管理するうえでの困難および挑戦に対するいくつかの理由は、１）患者の血小板の総数および大きさの範囲が大きく変化する；２）血小板の大きさが小さい；３）分析を受けるサンプルに血小板大の妨害粒子が存在する；および４） in vitro 加齢時の血小板の挙動；に起因すると考えられる。
【０００３】
血小板の分析および定量は、特に、血液サンプル中の血小板数が減少した、または低い、血小板減少症患者の場合に特に困難であると考えられる。この症状は、しばしば、血栓傾向の低い癌患者に通常使用される処置および治療から生じる。さらに、ある種の免疫疾患、特に特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自己免疫疾患に苦しむ人は、しばしば血小板損傷および破壊を受け、その結果、血小板数が低下する。さらに、再生不良性貧血に苦しむ人も、血小板数が低下する。例えば、正常な範囲の血小板数が約 150,000〜400,000 ／μl であるのに比較して、血小板減少症患者のサンプルでは、血小板数がしばしば 50,000 ／μl 未満である（J.C Dacie および S.M. Lewis, 1984, Practical Haematology, 6th Edition, Churchill Livingstone, London）。
【０００４】
実際、血小板の正確な計数は、血小板減少症患者に対して広く利用できる血小板置換療法の出現とともに、より一層重要になってきた。さらに、血小板機能の種々のより精巧な研究（例えば、血小板の活性化および／または接着性の測定）の開発および使用は、研究室での血液学テストの欠くことのできない部分として、正確かつ精密な血小板計数を必要とする。また、輸血用に調製した血小板パックの品質保証は、正確な血小板計数法が利用できて、適切であることを必要とする（R.K. Wertzおよび J.A. Koepke, 1977, Am. J. Clin. Path., 68(1):195-201 ）。
【０００５】
当技術分野において必要とされるのは、正常および異常の両方の血液サンプルに対する血小板のパラメーターの検出、識別、定量および特性付けのより正確かつ精密で感度の高い方法である。さらに、全血サンプルを使用して行うことができる正確かつ精密な血小板分析法があれば、いくつかの方法で必要とされる、分画遠心分離または沈降法による血小板に富む血漿の最初の調製が不要となる。そのような全血血小板分析法は、思いもよらない血小板の異常性を診断したり、正常な人および障害の発症時および病気の治療または進行中の患者の血小板総数およびパラメーターをモニターするうえで有用であると考えられる。さらに、特に血小板数の低い場合は、信号の分解能および血小板の識別を改善することができる自動化システムでの使用法が当分野で必要とされる。記載した本発明は、当技術分野にそのような利点および改善を提供するものである。
【０００６】
現在、二つの完全に自動化された血小板計数法および大きさの測定法が当分野で知られており、使用されている。一つは開口インピーダンス法である。水性懸濁液中の全血血小板を、二つの電極の間にある狭い開口部を通過するときに検出する。通過により、その開口部における電気インピーダンスは、懸濁媒体の電気インピーダンスに対し、血小板の体積に大体比例して増加する。すなわち、血小板のパルスから血小板の総数および血小板の体積が得られる。血小板は、開口インピーダンス法で、その大きさに基づいて赤血球と区別される。というのは、グループとしての血小板がグループとしての赤血球より小さいからである。この方法のいくつかの適用例において、血小板の数および大きさの測定は、血小板の大きさの分布形状を数学的に分析することにより改善される。これらの分布を常用対数曲線に適合させ、適合させた曲線のパラメーターから血小板の総数および大きさが得られる。この処理の意図するところは、存在すると血小板体積の常用対数分布をゆがめる粒子破片および小さい赤血球を排除することであるが、そのような汚染粒子および細胞がいつも排除されるわけではない。
【０００７】
第二の完全に自動化された方法は、レーザー光散乱法である。この方法では、水性懸濁液中の全血血小板を、それらがレーザービームを遮り、こうして入射光が固有の角度で散乱して、光学検出器が置いてある行路に入るときに検出する。血小板の体積は散乱強度に比例すると考えられるので、血小板信号パルスから体積情報および総数が得られる。そのような光散乱法を行うために設計され、使用されている自動フローサイトメトリー機器の例としては、Ｈ・TMシステム機器（TECHNICON Ｈ・TMシステム、例えば、Ｈ・TM１、Ｈ・TM２、Ｈ・TM３などの商標で、その譲受人により市販されている。）および ORTHO ELT-8（Ortho Diagnostics ）がある。
【０００８】
ORTHO ELT-8 システムでは、血小板が、一つの円錐角に対する散乱強度の違いにより単純に赤血球から区別される。TECHNICON Ｈ・TMシステムでも、血小板は、一つの円錐角に対する散乱強度に基づいて大きさが測定される。しかし、それらは、一対の適切に選択された検出器に入る固有の散乱強度に基づいて赤血球と区別される。血小板の散乱強度分布は常用対数的であるが、第二のレーザー光散乱法は、得られたデータを常用対数曲線を使用して適合させることによって、計数または大きさの測定を改善するものではない。この方法では、粒子破片が、散乱強度が選択された閾値以下になる信号を含んでいる。
【０００９】
上述したように、開口インピーダンス法は、血小板を、粒子の大きさおよび血小板の大きさの常用対数分布に基づいて赤血球および粒子破片から区別するものである。血小板と他の粒子の大きさが重複する場合、これらの区別は不鮮明となり、その方法で最善を尽くすことは、精々、この不十分さを認識することである。さらに、光散乱法は、二次元の境界に基づいて血小板を赤血球から区別するものであり、赤血球が小さくなるとき、または分解してばらばらになる場合には交差する可能性がある。すなわち、この場合も、異なる細胞集団間の区別が不鮮明になる。
【００１０】
血小板を識別するための第三の半自動化法は、レーザー光散乱と蛍光とを組み合わせて血小板を赤血球および粒子破片から区別することを含む。水性懸濁液中の全血血小板を、血小板に特異的な抗体（ＣＤ４２Ａなど）で標識する。抗体は次いで、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識試薬に結合される。標識した血小板は、入射光を散乱し、Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson) などの蛍光フローサイトメーターを通過するときに蛍光を発する。血小板および血小板大の粒子は、二次元散乱パターン（前方散乱および横散乱）に基づいて赤血球と区別される。これらの「門をくぐった(gated) 」細胞は、さらに、蛍光強度に基づいて分類され、血小板のみが著しい蛍光を示す（W. Groner ら、1994, Blood, No. 10 Supplement, 687a; R. Dickerhofおよび A. von Ruecker, 1995, Clin. Lab. Hematol., 17:163-172）。
【００１１】
上記した最後二つの方法は、血小板を他の血液細胞型および破片と区別することができるが、血小板の絶対総数を与えるものではない。さらに、それらの方法は、血小板の大きさを測定するものではない。なぜならば、それらの方法をキャリブレートする簡単な方法およびこの目的でその方法を行う装置がないからである。さらに、標識技術は、多くの労力を必要とし、比較的高価である。
【００１２】
血液サンプル中の血小板を区別し、定量することの他に、血小板の活性化（または活性化状態）を測定するための、簡単でコストが低く、正確かつ再現性のある方法が必要である。血小板の活性化状態は、下記に述べるように、血小板機能の重要なパラメーターである。
【００１３】
活性化した血小板は、うっ血および血栓において欠くことのできない役割を果たすので、血小板の活性化は、血小板の基本的な機能特性である。血管の損傷が生じると、損傷部位の内皮下表面が露出され、その結果、活性化した血小板が内皮下表面に付着する。この後、血小板顆粒の放出、血小板の凝集および血栓の生成が続く。血栓は、フィブリン、血小板凝集体および赤血球で構成される。
【００１４】
活性化した血小板は、付着過程に関連する表面糖タンパク質を発現する点で、静止血小板と異なる。また、活性化した血小板は、顆粒成分を放出し、円盤状から球状への形状変化および凝集などの過程を経る。膨潤も形状変化に伴う。
血栓症は、血管の損傷に対する正常な応答の一部である。しかし、末梢血管疾患（D.V. Devine ら、1993, Arteriosclerosis and Thrombosis, 13:857-62）、心臓虚血（D. McTavish ら、1990, Drugs, 40:238; G. DiMinno ら、1985, J. Clin. Invest., 75:328）、糖尿病（D. Tschoepe ら、1991, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 17:433-438 ）および狭心症（R.C. Becker ら、1994, Coronary Artery Dis., 5:339 ）などの症状では、負の作用により、血栓活性の増加も生じる。また、血液バンクの血小板の濃縮物は保存中に活性化され、その結果、その効力の一部を失うことが知られている（H.M. Rinder および E.L. Snyder, 1992, Blood Cells, 18:445 ）。さらに、血液透析および血液の体外循環を含む外科的処置は、血小板の活性化を生じることが知られている（例えば、J.C. Reverter ら、1994, J. Lab. Clin. Med., 124:79; Y.T. Wachtfogel ら、1993, J. Thoracic and Cardiovascular Surg.,106:1-10; R.E. Scharfら、1992, Arteriosclerosis and Thrombosis, 12:1475-1487)。従って、血小板の活性化状態を ex vivoで確認し、モニターすることができれば、本発明によってもたらされる有益で有用なスクリーニング法が得られる。
【００１５】
血小板の活性化は、蛍光フローサイトメトリーを使用して研究されている（例えば、S.J. Shattilら、1987, Blood, 70:307; C.S. Abramsら、1990, Blood, 75:128; L. Corash, 1990, Blood Cells, 16:97-108）。蛍光法を使用すると、血小板が、糖タンパク質に特異的な蛍光結合抗体で標識され、糖タンパク質は、血小板活性化の結果として血小板表面上に発現され、またコンホメーション的に変化する。フローサイトメーターで計数される蛍光陽性事象の数は、活性化した血小板の数を表し、事象あたりの蛍光強度は、一つの細胞表面に対する標識部位の数を表す。この方法は特異的であり、感度が高いが、いくつかの点では不利でもある。すなわち、高価であり、サンプルの調製に時間がかかり、データの分析が自動化されていない。さらに、蛍光陽性閾値を設定するための標準的方法は何も確立されていない。これは、一部には閾値位置の不確定性のためであり、一部には実験的設計の相違性のためである。
【００１６】
血小板の活性化は、密度勾配分析によっても研究されている（B. van Oost ら、1983, Blood, 62:433-38）。血小板の密度は、それらが活性化されると低下する。それは、第一に膨潤のためであり、第二に、血小板細胞質より密度が高いα−および高密度−顆粒の放出のためである（S. Holmeら、1981, J. Lab. Clin. Med., 97:610-22; S. Holme ら、1988, J.Lab. Clin.Med., 112:223-231)。その結果、活性化した血小板サンプルは、密度勾配分離において、非活性化サンプルの場合よりも低密度血小板の割合が高い。密度勾配分離法は時間を要し、熟練した技術者を必要とする。さらに、密度勾配画分の各々における血小板の数を測定するために、細胞計数器が必要である。
【００１７】
従って、血小板の活性化を測定するための、新規で、安価かつ感度の高い吸収光散乱法を提供する本発明は、当技術分野に進歩と利益を提供するものである。血小板の活性化を測定する本発明方法は自動化され、従って臨床用途に対して効率的であり、時間の節約になる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、全血サンプルにおける血小板の定量および分析のための、感度が高く、正確かつ精密な方法を提供し、特に、血小板の数および／または識別に悪影響を及ぼす、血液状態が異常な人の血液サンプルの分析に有用である。本発明はまた、血小板の識別および分析のための、迅速で簡単かつ安価な方法、システムおよび装置を提供する。
【００１９】
本発明の目的は、血小板の総数、大きさ、成分濃度および乾燥質量などの血小板データを集めるための自動血液学システムを使用した、血小板分析の改善された方法を提供することである。本発明の別の目的は、より多くの血小板分析データを提供し、血液サンプルの血小板以外のものを血小板と区別するための蛍光強度、散乱強度および開口インピーダンスを使用する方法よりも安価かつ容易に結果を与える、血小板計数精度に対する高ゲインまたは高増幅方法および装置を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、血小板の総数が約 1,000から約 50,000 個／μl である血液サンプルに対して、高感度で正確な血小板の計数、信号分解および識別法を提供することである。特に、本発明は、血小板減少症サンプルに対する改善された血小板計数精度を提供する。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、血小板大の領域における粒子型分布の輪郭が十分に描かれた詳細な描写を提供するサイトグラム（細胞所見）結果を得ることである。
【００２２】
本発明の別の目的は、血小板の計数および分析の改善された方法を行うために、少なくとも二つのチャンネルを付加することによる、現在の自動血液分析器を改変および改善するための手段を提供することである。その改変または改善は、本発明の方法および装置の性能を達成するために、現在のシステムに Mie散乱理論をベースとした信号分析をプラスしたものに、低散乱角／高ゲイン増幅チャンネルおよび高散乱角／高ゲイン増幅チャンネルを付加するものである。
【００２３】
本発明の別の目的は、小赤血球および赤血球断片の同定および定量を可能とすることである。
【００２４】
本発明のさらに別の発明は、血小板成分濃度（ＭＰＣ）の測定による血小板の活性化度の測定を提供することである。本発明によれば、ＭＰＣ値は、血小板の活性化状態と関連する。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、血小板の活性化性を予示する血小板の乾燥質量の測定を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、in vitro血液サンプル年齢の測定を可能にする血小板成分濃度の測定を提供することである。
【００２７】
さらに別の目的および本発明によって得られる利点は、以下の詳細な記載から明らかである。
【００２８】
【図面の説明】
添付する図面は、本発明をさらに説明し、種々の発明を明らかにすることによりその理解を助けるものである。下記に記載する散乱／散乱サイトグラムは、本発明による自動血液分析器の電気−光検出システムを使用する血小板の測定および分析に本発明の装置および方法を使用して得られたものである。下記に示す図において、ＲＢＣは赤血球数（106 ／μl ）であり、ＰＬＴは血小板数（103 ／μl ）であり、ＭＰＶは平均血小板体積（10-15l (fl) ）であり、ＭＰ＋ＣはＭＰＣに等しく、平均血小板成分濃度（g/dl）であり、ＭＰ＋ＭはＭＰＭに等しく、平均血小板乾燥質量（pg) である。
【００２９】
図１は、散乱／散乱サイトグラム上での血小板体積（Ｖ）対屈折率（ｎ）（すなわち、Ｖ／ｎ）のマップを示す。サイトグラムに示す各曲線は、分析で測定され、図３の記載で確認される特定の粒子型を表す。
【００３０】
図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、各々、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンの油滴の散乱／散乱サイトグラムを示す。サイトグラムに示す各曲線は、分析で測定され、図３の記載で確認される特定の粒子型を表す。
【００３１】
図３は、種々の粒子、すなわち、赤血球、大きい血小板、赤血球ゴースト、血小板、赤血球断片、および原点の破片の、粒子型マッピング散乱／散乱サイトグラムにおける位置を示す。この記載は、図４、５、６、８および１３に示すサイトグラムにも適用される。
【００３２】
図４は、本発明の血小板測定法およびシステムを使用した正常なサンプル結果を示す代表的サイトグラムおよびヒストグラムを示す。
【００３３】
図５Ａは、赤血球希釈剤（例えば、TECHNICON RBC 希釈剤）に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルにおける血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを示す。図５Ｂは、等張性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルにおける血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを示す。なお、サンプルは、たとえ室温で保存していなかったとしても、室温で分析される。
【００３４】
図６Ａは、赤血球希釈剤（例えば、TECHNICON RBC 希釈剤）に懸濁したＡＣＤ−抗凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラムを示す。図６Ｂは、等張性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁したＡＣＤ−抗凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラムを示す。
【００３５】
図７Ａは、正常な血液ドナーサンプルの平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）対時間を示す代表的グラフである。ＭＰＭは、室温で保存した 24 時間齢の正常なサンプル対１時間齢の正常なサンプルに対して測定した。図７Ｂは、異常な血液ドナーサンプルの平均血小板乾燥質量対時間の代表的グラフを示す。ＭＰＭは、室温で保存した 28 時間齢の異常なサンプル対４時間齢の異常なサンプルに対して測定した。
【００３６】
図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、いくつかの自動化法、すなわち本発明のＰＬＴＩシステム（図８Ａ）、TECHNICON Ｈ・TM２システム（図８Ｂ）および Coulter STKS システム（図８Ｃ）によって得た異常サンプルの血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
【００３７】
図９Ａ〜９Ｄは、TECHNICON Ｈ・TM２システムまたは Coulter STKS システムを使用して得た平均血小板体積（ＭＰＶ）対異常血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。図９Ａは、４時間齢の異常血液サンプルを使用してTECHNICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示す。図９Ａでは、ｒ＝0.59、Syx ＝0.88（ｒは相関係数であり、Syx 推定値の標準誤差である）、勾配＝0.14、および切片＝4.5 である。図９Ｂは、 28 時間齢の異常な血液サンプルを使用してTECHNICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示す。図９Ｂでは、ｒ＝0.72、Syx ＝0.54、勾配＝0.13、および切片＝3.29である。図９Ｃは、４時間齢の異常な血液サンプルを使用して Coulter STKS システムから得た結果を示す。図９Ｃでは、ｒ＝0.13、Syx ＝0.95、勾配＝0.02、および切片＝8.06である。図９Ｄは、 28 時間齢の異常な血液サンプルを使用して Coulter STKS システムから得た結果を示す。図９Ｄでは、ｒ＝0.66、Syx ＝1.09、勾配＝0.18、および切片＝6.31である。
【００３８】
図１０Ａおよび１０Ｂは、本発明の新規なＰＬＴ１システムおよび方法を使用して得た異常な血小板減少症の血液サンプルに対する平均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。図１０Ａは、４時間齢の異常な血液サンプルを使用してＰＬＴ１システムから得た結果を示す。図１０Ａでは、ｒ＝0.32、Syx ＝0.89、勾配＝0.06、および切片＝10.02 である。図１０Ｂは、 28 時間齢の異常な血液サンプルを使用してＰＬＴ１システムから得た結果を示す。図１０Ｂでは、ｒ＝0.32、Syx ＝1 、勾配＝0.07、および切片＝11.79 である。
【００３９】
図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、種々の自動化法、すなわち、TECHNICON Ｈ・TM２システム、 Coulter STKS システムおよび本発明のＰＬＴ１システムを使用して得た、異常な血液サンプルに対して行った平均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）総数の測定を示す。図１１Ａは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用してTECHNICON Ｈ・TM２システムから得た結果を示す。図１１Ｂは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用して Coulter STKS システムから得た結果を示す。図１１Ｃは、１時間齢の正常な血液サンプルを使用して本発明のＰＬＴ１システムから得た結果を示す。
【００４０】
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＰＬＴ１の方法およびシステムを使用した異常なサンプルに対する平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）および平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）の精度データを示す。図１２Ａは、室温で保存し、分析した、 28 時間齢の異常なサンプル対４時間齢の異常なサンプルに対するＭＰＭの精度データを示す。図１２Ａでは、ｒ＝0.75、Syx ＝0.13、勾配＝0.74、切片＝0.49、４時間齢のサンプルの平均値＝2.04、および 28 時間齢のサンプルの平均値＝1.99である。図１２Ｂは、室温での 28 時間齢の異常なサンプル対４時間齢の異常なサンプルに対するＭＰＣの精度データを示す。図１２Ｂでは、ｒ＝0.35、Syx ＝1.3 、勾配＝0.3 、切片＝12、４時間齢のサンプルの平均値＝22.1、および 28 時間齢のサンプルの平均値＝18.7である。
【００４１】
図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、異常な血小板減少症サンプル＃70に対して表８で示した結果に対応する血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。図１３Ａは、本発明のＰＬＴ１分析法を使用して得たヒストグラム結果を示し、図１３Ｂは、TECHNICON Ｈ・TM２システムによる分析を使用して得たヒストグラム結果を示し、図１３Ｃは、 Coulter STKS システムによる分析法を使用して得たヒストグラム結果を示す。
【００４２】
図１４Ａ〜１４Ｄは、本発明による新規な光散乱法と血小板の活性化を測定するための蛍光法を比較して示す。図１４Ａ〜Ｄは、本発明の新規な光散乱法（図１４Ｃおよび１４Ｄ）および蛍光法（図１４Ａおよび１４Ｂ）が、クエン酸ナトリウム処理した血液サンプルおよびＥＤＴＡ処理した血液サンプルの両方に対して同様のトロンビン用量−血小板活性化の関係を記録することを示す。本発明方法の用量反応曲線は、ＭＰＣ増加による標準様式（図１４Ｃ）およびＭＰＣ減少による「逆の(upside down) 」様式で示す。逆および標準の様式による曲線は共に同じ結果を示すが、前者の方向は、二つの方法の結果を目でより直接的に比較することができる（すなわち、図１４Ｂは、図１４Ｄと直接比較することができる）。
【００４３】
【作用】
本発明は、自動血液分析システムで使用するための、血小板を定量し、特性付けする、感度および精度の高い方法を提供する。本発明はさらに、記載した血小板の定量および特性付けを行うための装置を提供する。本明細書で用いる場合、血小板をしばしば「ＰＬＴ」と略称する。本明細書でしばしば使用する他の略号は次の通りである。すなわち、ＲＢＣは赤血球であり、ＭＰＭは平均血小板乾燥質量であり、ＭＰＶは平均血小板体積であり、ＭＰＣは平均血小板成分濃度であり、ＴＣＰは血小板減少症であり、ＴＣＰＳは血小板減少症患者から得た異常な血液サンプルに使用する名称であり、ＭＣＶは平均細胞体積であり、ＭＣＨＣは平均細胞ヘモグロビン濃度であり、ＨＣＴはヘマトクリットである。
【００４４】
本発明に使用するのに適する現在ある自動血液分析システムとしては、その譲受人によりTECHNICON Ｈ・TM１、Ｈ・TM２、Ｈ・TM３などの商標で市販されているＨ・TMシステムがある。そのようなシステムでは、血小板（または粒子）の検出は、光散乱を測定することにより電子光学的に、また電気インピーダンスを測定することにより電気的に行われる。当業者に対して、本発明を得るために該システムに成される変更を明確に記載するために、TECHNICON Ｈ・TM自動分析システムの操作原理を赤血球および血小板分析に関してここに記載する。これらのシステムでは、赤血球および血小板を、ヘリウム−ネオンレーザー光源、フローセルおよび二つの光学検出器を含む単一の光学測定チャンネルで一緒に分析する。その通常の操作法の一部として、自動システムでは、２μl の全血を、本明細書で説明する Mie散乱理論を使用して適切に分析することができるように、赤血球を等容的に丸くする試薬溶液であるTECHNICON Ｈ・TMシステムＲＢＣ希釈剤 1.25 mlに懸濁する。本発明の血小板分析法およびシステムに使用するのに適する赤血球を丸くする試薬および希釈剤は、米国特許 No. 5,284,771、5,360,739 および 5,411,891（以上、S.S. Fanら）；米国特許 No. 5,350,695および 5,438,003（以上、G. Colellaら）；ならびに米国特許 No. 4,575,490および 4,412,004（以上、Kim および Ornstein ）に記載されている。
【００４５】
次いで、この懸濁物の約 10 μl の流れを、屈折率の適合する試薬流体、すなわちTECHNICON Ｈ・TMシステムＲＢＣ／Basophil界面活性剤シースで覆う。ＲＢＣ／Basophilシースは、血球と直接相互作用しない「受身(passive) 」試薬であるが、その代わりに、その流れを取り囲み、フローセルの中心に置く。また、分析のための単一粒子の列を提供する。例えば、ＲＢＣ／Basophil界面活性剤シース試薬組成物は、無機塩、例えば、塩化ナトリウム 7.7 g/l、リン酸ナトリウム二塩基性 2.4 g/l、リン酸ナトリウム一塩基性 0.3 g/lなど；ポリエトキシレート非イオン性非溶血性界面活性剤 Pluronic P-105 1.0 g/l ；３，３’−チオジプロピオン酸 0.10 g/l などの酸化防止剤；および Proclin 150（ 0.40 g/l ）などの抗菌性試薬を含み、ｐＨは約 7.0〜7.5 であり、容量オスモル濃度は約 285〜305 mOsmol/kg である。
【００４６】
懸濁物中の赤血球および血小板は、覆われた細胞流がフローセルを通過するとき、入射レーザー光の一部を散乱する。二つの検出器は、入射軸に対して特定の角度間隔で散乱した光を感知する。検出器の信号は、正常なサンプルの場合、赤血球によって生じる平均信号が、赤血球に関連した信号振幅の範囲の中央になるように増幅される。本発明によれば、光散乱強度が、二つの光学チャンネルで二つの円錐角間隔にわたって、サンプル中の血小板を非血小板から区別するのに十分な２つの散乱強度測定値を得るために、増加された第一および第二の光学チャンネル信号ゲイン(gain)で測定される。第一の光学チャンネル信号値は、高角度検出器のゲインの増加から得られ、第二の光学チャンネル信号値は、低角度検出器のゲインの増加から得られ、それによって、低角度出力および高角度出力の新規な高ゲイン型が得られる。また、本発明によれば、そのシステムにより、約 5〜20度、より好ましくは 7〜15度、最も好ましくは 5〜15度の散乱度による信号が散乱／散乱サイトグラムのＸ−軸に示される。さらに、そのシステムにより、約 1〜7 度、より好ましくは 1〜5 度、最も好ましくは 2〜3 度の散乱度による信号が散乱／散乱サイトグラムのＹ−軸に示される。これらの信号を使用すると、本明細書にさらに記載するように、赤血球の体積およびヘモグロビン濃度などのパラメーターが測定される。
【００４７】
赤血球は、通常、両凹の平円盤状であり、その散乱特性は、上記光学システムのフローセルを横切るときの方向に敏感である。信号強度に対する粒子方向の影響を取り除くために、赤血球は、TECHNICON Ｈ・TMシステムＲＢＣ希釈剤（例えば、米国特許 No.4,575,490 および 4,412,004（Kim および Ornstein ））にいれて球状にする。さらに、球状化した粒子（球状化した赤血球など）に対して角散乱強度プロフィルを提供する Mie散乱理論により、散乱強度は屈折率および細胞体積に敏感であることが予示される。すなわち、体積は同じであるが、屈折率の異なる二つの粒子は、散乱プロフィルが異なる。赤血球の屈折率は、細胞ごとに変わる細胞のヘモグロビン濃度に直線的に依存するので（R. Barerおよび S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95:399-423）、一つの円錐角間隔にわたる散乱強度の測定は、たとえ球状の赤血球であっても、細胞体積を唯一決定するものではない。従って、赤血球の体積を唯一決定するために、散乱強度を、少なくとも二つの離れた円錐角間隔にわたって測定する必要がある。細胞ヘモグロビン濃度は、二つの角度による測定の副次的結果として求められる。
【００４８】
Mie 理論を使用するアルゴリズムにより、一定の体積および屈折率を有する粒子に関連する角散乱パターンが得られる。問題の赤血球の大きさおよび濃度の範囲（すなわち、各々、約 30 〜 180 fl および約 19 〜 49 g/dl）にわたって、１） 2〜3 度および 5〜15度の一対の散乱強度と、２）赤血球の体積および濃度との間に１対１の対応が存在することが決定された（米国特許 No.4,735,504 (Tycko) ）。TECHNICON Ｈ・TMシステムの場合、その組の対応が二次元マトリックスの形で表される。マトリックスの指数は、Ｘ−およびＹ−チャンネル信号値を含み、マトリックスのエントリーが関連する体積および濃度である。球状粒子に対する電磁気散乱理論（すなわち、Mie 理論）は、例えば、M. Kerker, 1969, The Scattering of Light, Academic Pressに詳細に記載されている。
【００４９】
そのシステムでは、Mie の表に自動的に当てはめる前に、予め定めた信号閾値を越える全粒子を血液細胞として計数する。その際、上記の二つの円錐角による測定値を使用して、赤血球または血小板のいずれかに指定する。二種類の粒子は、体積／屈折率空間の別個の領域を占め、赤血球の方がかなり大きく、またはかなり高い屈折率を有する。しかし、これらのシステムで現在使用されている信号ゲインは、血小板と非血小板（赤血球ゴースト、赤血球断片および細胞破片など）との区別がはっきりしない。さらに、大きさの違いを利用して血小板を他の粒子と区別する現在の開口インピーダンス法は、体積が血小板の体積と似ている赤血球断片または破片と血小板とを十分区別するものではない。
【００５０】
これに対して、現在の電子光学装置は、一つの角間隔測定値を利用して血小板の体積を測定するものである。現在のＨ・TMシステムでは、血小板の体積は、 5〜15度の散乱強度に比例すると考えられる。実際、本明細書に記載するように、この強度は、血小板膨潤により in vitro サンプル年齢とともに減少する（実施例１参照）。その結果、報告される平均血小板体積は、真の平均血小板体積の増加とともに減少する。また、単一角による方法は、実際は同じ体積であるが、密度（すなわち、屈折率）は異なる粒子に対して種々の体積を報告する可能性がある。さらに、電子光学装置および開口インピーダンス装置は共に、血小板減少症サンプルのＭＰＶ値を低く報告する場合が多い。なぜならば、これらの異常サンプルでは、典型的には、低信号の破片が全粒子数のかなりの部分を含むからである。
【００５１】
本発明者らは、例えばTECHNICON Ｈ・TM分析システムなどの自動分析システムにおいて行うための、より高感度で正確かつ精密な血小板分析を達成するための努力の一部として、TECHNICON Ｈ・TM１を使用するテストステーションを採用し、本発明に記載した方法およびシステム（Ｘ−およびＹ−赤血球光学チャンネル信号増幅の増加（信号ゲインの増幅）を含む）を使用して血小板データを集めるために、本明細書に記載するように適合させた。
【００５２】
血小板を識別する本発明の分析を行うための新しく適合させた自動システムを、本明細書では、本発明のＰＬＴ１システムおよび方法と呼ぶ。血小板を正確に分析するために、Mie 散乱理論を使用して、本明細書に記載した適切な増幅増加要因を見いだした。最初に、Mie 解析のために体積および屈折率範囲を選択した。選択した体積範囲は、約 1〜60 fl （fl＝10-15l）、好ましくは 1〜30 fl であった。この範囲は、正常な全てのサンプルおよびほとんどの異常なサンプルの血小板の大きさをカバーするように選択した（J. M. Paulus, 1975, Blood, 46(3):321-336）。選択した屈折率の範囲は、約 1.340〜1.400 、好ましくは 1.350〜1.400 であった。下限は、血小板の屈折率がその血漿媒体よりも高い（そうでないと、目に見えない）という観察に基づいており、血漿の屈折率は、典型的には約 1.345より大きい（屈折率測定法により測定）。上限は、ほとんどの血小板が、赤血球より密度が小さい（すなわち、屈折率がより低い）という観察に基づいている。赤血球の屈折率は、1.390 より下がることはめったにない（細胞ヘモグロビン濃度は 23 g/dl）。上限は、好ましくは、いくつかの赤血球と密度が同じ位である血小板の小さい断片を説明するために、約 1.400に広げた。これらの体積および屈折率の範囲ならびに Mie理論に基づき、本発明に従って、標準的なＨ・TMシステムのＸ−チャンネル信号を約 8〜15倍、好ましくは約 12 倍に増加または増幅し、Ｙ−信号は、約 20 〜 35 倍、好ましくは約 30 倍に増加または増幅した。
【００５３】
これらの信号ゲイン増幅では、細胞破片、赤血球断片および赤血球ゴーストなどの妨害物質から血小板を区別するのに、例えば 2〜3 度および例えば 5〜15度の光散乱強度で十分であった。また、赤血球もその方法ではっきり見分けられた。なぜならば、それらの信号が飽和チャンネルＸ＝99、Ｙ＝99で現れたからである。従って、本発明に対して記載された組合せ散乱測定により、現在の自動化方法よりも正確な血小板数が得られ、特に、典型的には妨害物質の断片が増加する血小板減少症サンプルの場合はそうである。さらに、本発明により得られる散乱／散乱サイトグラムにより、サンプルに含まれる血小板の数、平均の大きさおよび平均の屈折率の視覚評価が可能である。サイトグラムにより、サンプルに存在する可能性がある他の血小板大の粒子の数および種類の視覚評価も得られる。
【００５４】
さらに、本発明の別の発明では、本発明独自のものである二角散乱測定により、顆粒を放出した血小板（すなわち、活性化した血小板）を、放出していないものと区別することができる。というのは、活性形の血小板の屈折率は、非活性形のものより低いからである。この区別は、現在の自動装置では行われない。
【００５５】
さらに、本発明の血小板測定システムは、高増幅により、血小板に対して Mie理論分析を行うことができ、それにより、経験的観察よりも理論に基づく体積および屈折率の情報が得られる。ＰＲＬ１テストステーションシステムでは、本発明により測定される５個のパラメーターが、赤血球数（ＲＢＣ数、106/μl ）、血小板数（ＰＬＴ数、103/μl ）、平均血小板体積（ＭＰＶ、fl）、平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ、pg）および平均血小板成分濃度または密度（ＭＰＣ、g/dl）であった。
【００５６】
理解されるように、本明細書に記載した自動テストシステムで血小板を測定し、テストするための方法が新しく発見される以前は、ＭＰＭおよびＭＰＣの分析用測定パラメーターは、従来公知で使用されていた自動血小板分析・測定方法およびシステムでは得られなかった。すなわち、本発明の方法およびシステムにより、血小板数、平均血小板体積、平均血小板乾燥質量および平均血小板成分濃度など、サンプルの正確で完全な血小板分析が得られる。さらに、本発明は、下記にさらに記載するように、完全な血小板分析を与えると同時に、サンプルの赤血球数も提供する。
【００５７】
本発明の高増幅法を、血小板の計数および測定の正確さ、感度、ならびに定性的および定量的再現性に関して、他の方法と比較した。比較しうる他の方法としては、散乱強度法（例えば、TECHNICON Ｈ・TM２システム、Bayer Corporation, Tarrytown, NY）、開口インピーダンス法（例えば、Coutler STKS Modelシステム、Coulte Electronics, Dade, Fla ）、位相差顕微鏡法、および組織学的血液塗抹評価があった。
【００５８】
ＰＬＴ１の高増幅システム
本発明の一態様によれば、本発明の血小板を区別・定量する方法およびシステムは、新しく決定された高増幅法を使用する。本発明に対して独自に開発された測定を、改良したTECHNICON Ｈ・TM１システムにおいて行った。これは、血小板に関するパラメーターを独自に測定および定量することができ、現在の自動システムおよび装置と区別されるので、ＰＬＴ１モデルまたは模範システム／方法と名付けた。赤血球分析に対しては、ＰＬＴ１システムのＸ−チャンネル信号を公称値の約 12 倍に増幅し、Ｙ−チャンネル信号を約 30 倍に増幅した。
【００５９】
すなわち、上述したように、本発明により、約 1〜30 fl の球および約 1.350〜1.400 の屈折率に対して Mie散乱理論表を作成した。その表は、赤血球分析に対して使用したものと同じ様式である。その表に対応する体積／屈折率（Ｖ／ｎ）マップを図１に示す。Ｘ−およびＹ−チャンネルゲインを、ｎ−ペンタン（ｎ＝1.3577）、ｎ−ヘキサン（ｎ＝1.3776）およびｎ−ヘプタン（ｎ＝1.3884）の小滴懸濁物を使用して標準化した。各炭化水素 50 mlを 1 ml のＲＢＣ／Basoシース試薬とともに 10 秒間撹拌し、サンプルを直接、サイトメトリーにより分析した。すなわち、サンプルをさらに希釈することなくフローセルに通した。３種類の炭化水素の各々に対する表から誘導される一定の屈折率の曲線を含む体積／屈折率マップを、小滴によって形成される実際の曲線とともに記録スクリーンに示した。各炭化水素の実際の曲線が表から誘導される関連曲線と重なるまで信号ゲインを調節し、必要であればサンプルを再分析した。得られたパターンの例を図２に示す。すなわち、本発明によれば、血小板は、体積／屈折率マップ内での存在により、非血小板から特定して区別され、血小板の屈折率の特徴的なガウス分布に基づいてさらに区別される。
【００６０】
ＰＬＴ１法によって行うことができるＲＢＣ計数は、Ｈ・TMシステムと同様に、製造元の説明書に従ってTECHNICON キャリブレーターにより検定した。希釈に関与するＲＢＣ計数のキャリブレーション係数は、血小板の計数にも適用した（例えば、Ｈ・TMシステムと同様に）。サンプル中の血小板および赤血球が同じ希釈率に付されるからである。しかし、本発明によれば、比較しうる自動方法とは対照的に、独立した血小板計数キャリブレーション係数はＰＬＴ１システムおよび方法には適用されなかった。従って、ＰＬＴ１と他の方法との血小板計数の相違が、比較のための人為的なキャリブレーション係数によりおおい隠されることはない。
【００６１】
ＰＬＴ１システムは、ＲＢＣ／ＰＬＴチャンネルの水力学、気体力学、化学、反応時間および計数時間を使用して全血サンプルを処理するために設計されている。また、血小板チャンネル信号は、ＲＢＣ／ＰＬＴチャンネルで使用されるものと同じ二つの光学検出器から得られる。しかし、上述したように血小板を測定・定量するために得られた高められた信号ゲイン増幅は、ＰＬＴ１システム独自のものであり、現在当分野で使用されているシステムおよび方法の一部ではない。以下に記載し、例示するように、そのシステムに対して得られた信号が分析される。
【００６２】
信号は、 １）Ｖ／ｎマップの外にある場合（これらは「その他」を表す）；２）検出器を飽和させる場合（Ｘ＝99、Ｙ＝99）（これらはＰＢＣを表す）；または ３）Ｘ＜80、Ｙ＝99のチャンネルにある場合（これらは「その他」を表す）、非血小板（すなわち、ＲＢＣまたは「その他」）であることを表す。マップ上と原点付近のマップの左側の信号は、細胞破片を表す。チャンネルＸ＜80、Ｙ＝99にあるものを含むより大きい信号は、赤血球ゴーストを表す。飽和信号は、ＲＢＣおよび非常に大きい血小板によるものである。マップの下部および右側の信号もＲＢＣ断片によるものである（図３参照）。
【００６３】
マップの残りの信号は、次のように分析される。最初に、このシステムでは、Ｘ＝18以上のチャンネルの信号の平均屈折率および標準偏差（ＳＤ）を、Mie 変換表を使用して計算する。破片が混入する可能性があるので、この部分の分析からＶ／ｎマップ上のＸ＝18以下のチャンネルの信号を排除する。次いで、屈折率の値が平均の約＋2 〜−1.8 ＳＤである粒子信号を血小板として指定する。粒子信号の残りは「その他」として指定する。これにより３種類の粒子、すなわちＰＬＴ（Ｐ）、ＲＢＣ（Ｒ）および「その他」（Ｏ）の計数が得られる。このシステムによって検出された粒子の数（Ｖsig と言う）は、分析した粒子数より大きい。従って、Ｐ、ＲおよびＯは、各々の種類の実際の生の計数値というより各種類の粒子の相対数を表す。生の計数を得るためには、このシステムでは下記の変換を行う。
【００６４】
【式１】
【００６５】
Ｎr＝(Ｒ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×Ｖsig；ＮP＝(Ｐ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×Ｖsig；
Ｎo＝(Ｏ/(Ｒ＋Ｐ＋Ｏ))×Ｖsig；
［式中、Ｎr は生の赤血球計数値であり、ＮP は生の血小板計数値であり、Ｎo は生の「その他」の計数値であり、Ｖsig は検出した粒子の総数である。］次いで、生の計数値を「コインシデンス」、すなわち、検出器が一つの粒子として計数する、検出器チャンネルにおける２個以上の粒子の同時存在、に対して補正する。「その他」は、コインシデンスに関してはＰＬＴとして挙動すると考えられるので、コインシデンス補正計算ではそれらとともに分類する。コインシデンス頻度は、当業者であれば理解されるように、ポアソンの統計学によって正確に予測される。補正された生のＲＢＣ、ＰＬＴおよび「その他」の計数値は、ＲＢＣ’、ＰＬＴ’および「その他」’と呼ぶ。最後に、ＲＢＣキャリブレーション係数をＲＢＣ’、ＰＬＴ’および「その他」’に適用して、次の値：ＲＢＣ（106/μl ）、ＰＬＴ（103/μl ）および「その他」（103/μl ）を得る。
【００６６】
改善されたＰＬＴ１自動法およびシステムの体積および屈折率の動的範囲を効果的に拡張して、ときどき出現するＸ＝99、Ｙ＝99の飽和チャンネルにある大きくて密度の高いＰＬＴを処理することができると考えられる。ＰＬＴ１は、これらを赤血球として同定する。これは、現在のＨ・TMシステム Mie変換表の下限をＶ＜8 flおよびｎ＜1.400 まで拡張することにより行うことができる。ＰＬＴ１システムで使用されるＲＢＣ／ＰＬＴチャンネル増幅は、拡張された表の適用に対して、より大きい血小板信号の十分な分解を提供するので、正確なＶおよびｎ値が得られる。
【００６７】
本発明のＰＬＴ１システムは、Mie の表に基づいて、平均血小板体積（ＭＰＶ、fl）および平均屈折率を計算するものである。そのシステムはまた、下記に説明するように、屈折率および体積の平均から平均血小板成分濃度（ＭＰＣ、g/dl）および平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ、ｐｇ）も誘導する。
【００６８】
【式２】
【００６９】
ＭＰＣ(g/dl)＝平均屈折率−1.333)/(0.0018/(g/dl))
［式中、1.333 は水の屈折率であり、0.0018（g/dl）は平均の屈折率（ＲＩ）増加である。］
当業者であれば理解されるように、または下記でさらに示すように、ＲＩ増加の値は、細胞間の変数としてのそれを排除するため、この式では定数として処理される。
【００７０】
【式３】
ＭＰＭ(pg)＝ＭＰＣ(g/dl)×ＭＰＶ(fl)/100 (注: g/dl＝100 × pg/fl)
平均の屈折率増加の値は、血小板乾燥質量の主な成分がタンパク質（57 %）、脂質（19 %）および炭水化物（8.5 % ）であることに基づいている（Wintrobe's Clinical Hematology, Ninth Edition, 1993, page 515 ）。これらの成分の屈折率増加は、各々、0.00187/(g/dl)、0.0017/(g/dl) および 0.00143/(g/dl) である（S.H. Armstrongら、1947, J.A.C.S., 69:1747-1753; R. Barerおよび S. Joseph, 1954, Quartely Journal of Microscopical Science, 95:399-423 ）。これらの成分の相対的濃度を使用して平均の屈折率増加を血小板に当てはめると、0.0018/(g/dl) の値が得られる。それらの少量成分のうち、いくつかは屈折率増加がより大きく、いくつかは増加がより小さい。これらの成分の平均の増加が、当てはめた値をかなり変化させるとは予想されない。なお、0.0018/(g/dl) は、公知文献によって、原形質にも当てはめられた値である（R. Barerおよび S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95:399-423）。本発明のシステムは、ＲＢＣおよびＰＬＴ計数、ＭＰＶ、ＭＰＣおよびＭＰＭを記録することの他に、血小板体積、血小板成分濃度および血小板乾燥質量のヒストグラムを示す（図４）。
【００７１】
ＰＬＴ１システムおよび方法は、現在のTECHNICON Ｈ・TMシステムで使用されるＲＢＣ／ＰＬＴチャンネル法で使用するのと同じ化学試薬を使用することができ、使用される球状化試薬は、血小板に悪影響を及ぼしたり、作用したりしない。さらに、本発明に従ってＫ3 ＥＤＴＡ抗凝固剤中に採取し、分析した血小板に対して、さらに球状化を施す必要はない。例えば、図５Ａは、抗凝固のために Ｋ3 ＥＤＴＡに入れ、次いでＲＢＣ希釈溶液に再懸濁した血小板に対して、本発明のＰＬＴ１システムおよび方法により作成したＰＬＴ１散乱／散乱サイトグラムを示す。当分野で報告されているように、不完全とはいえ、Ｋ3 ＥＤＴＡは血小板を球状化する（S. Holmeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96:480-493, G.V.R. Born, 1970, J. Physiol., 209:487-511 ）。図５Ｂは、同じサンプルを等張性リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁した同一サンプルの第二のアリコートに対するＰＬＴ１散乱／散乱サイトグラムを示す。図５Ａおよび５Ｂを比較して分かるように、本発明の方法およびシステムから得られた二つのサイトグラムの外観は同じである。さらに、記録されたパラメーターの値も、装置の誤差範囲内で同じである。これらの結果は、本発明方法に対しては、正確なＲＢＣ計数および血小板パラメーター結果を得るのに、赤血球球状化試薬は必要ないことを示す。
【００７２】
さらに、図６Ａおよび６Ｂは、同じドナーの血小板を評価する、ＰＬＴ１によって作成した対応する一対の散乱／散乱サイトグラムであり、ただし抗凝固剤として市販の酸／クエン酸／デキストロース（ＡＣＤ）溶液を使用した。Ｋ3 ＥＤＴＡの作用とは対照的に、ＡＣＤは、血小板を球状化しないことが知られている（S. Holmeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96:480-493; G.V.R. Born, 1970, J. Physiol., 209:487-511; G.V.R. Bornら、1978, J. Physiol., 208:193-212; M. Frojmovicおよび R. Panjwani, 1976, Biophys. J., 16:1071-1089 ）。この場合も、サイトグラムの外観は同じであったが、ＡＣＤに懸濁したサンプルは、Ｋ3 ＥＤＴＡに懸濁したサンプルに対して得られたものよりも拡散の度合いが大きいサイトグラムになった。この拡散特性は、球状でない血小板がフローセル内で無秩序に配向していることによるが、本発明のシステムおよび方法を使用して得られる結果の感度および正確さに悪影響を及ぼすものではない。これらの結果は、その赤血球希釈剤が血小板を球状化するものでなく、実際、血小板の球状化は、本発明においては結果の正確さに必要でないことを示す。
【００７３】
本明細書に記載したように、本発明は、たとえ血小板が完全に球状化されていなくて、いろいろな種類、数および屈折率の顆粒を含んでいても、赤血球と同様に、球状化した血小板が選択された測定条件下で均一な球として「有効に」挙動することを初めて示すものである。本発明以前には、この分析法は、球状で均一な粒子に対してのみ有効であると考えられた（例えば、米国特許 No. 4,735,504
(D.H. Tycko) 参照）。
【００７４】
本発明の別の態様は、赤血球分析に適する同一かまたは類似した角間隔を使用して、血小板分析のための２角散乱測定にMie 散乱理論を適用することである。
本発明以前、当業者は、赤血球分析に使用した選択された一対の円錐角範囲はこの種の細胞に特異的であることに気づいていた。なぜなら、赤血球の場合でさえ、すべての対の角度が正確な分析をもたらしたわけではないからである（米国特許 No. 4,735,504 (Tycko)参照）。さらに、Tycko の分析は、球状の赤血球に対してのみ有効であることを示した。赤血球は、典型的には血小板の約 10 倍大きく（すなわち、赤血球のＭＣＶが 85 flであるのに対して、血小板のＭＣＶは 8.5 fl である。）、従って、赤血球は分析に対してかなり大きい信号を生じる。
また、本明細書に記載した本発明が行われるまで、当業者は、均一で完全に球状である粒子に対しては２角間隔で十分であることを知っていたが、球状が不完全である粒子は、分析に少なくとも３角間隔が必要であると考えられた。本発明は、以前は赤血球分析に対してのみ使用された上記パラメーター（すなわち、一対の円錐角および２角間隔）が、血小板など、通常の体積範囲が約 2〜20 fl である、球状が不完全で均一でない粒子の正確かつ高感度の定量および測定に対しても有効であることを初めて示したものである。
【００７５】
現在の自動化法（TECHNICON Ｈ・TMシステムおよび米国特許 No. 4,735,504 ( Tycko) に記載の方法など）は、赤血球体積および細胞ヘモグロビン濃度の定量など、赤血球の分析に対してのみ設計されたものである。これに対して、本発明のＰＬＴ１法は、本明細書に記載し、例示するように、血小板および赤血球の同時分析を有益に行うことができる。一般に、ＰＬＴ１法は、自動化法、例えばＨ・TMシステムを、本発明の新規方法に従って、共通の光学システムでの血小板および赤血球の同時定量に、いかなる定量の正確さおよび感度も犠牲にすることなく適合させることができることを初めて示したものである。血小板および赤血球の別々の Mie理論分析を、本発明に従って、一対の光学検出器により集めた信号に対して行うことができる。全血サンプル中の血小板は、信号増幅条件下、ＰＬＴ１システムおよび方法で血小板細胞型に特に適した Mie散乱理論表を使用して分析され、一方、全血サンプル中の赤血球は、増幅条件下、赤血球に適した Mie散乱表を使用して分析されるからである。
【００７６】
本発明のＰＬＴ１法およびシステムのみにより、平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）の自動測定を、個々の細胞基準でまたはサンプル平均のいずれかで行うことができる。原則的には、ＭＰＭ（ただし、細胞１個ずつの乾燥質量またはその分布ではない）は、平均血小板成分濃度、ＭＰＶおよび血小板の水分（％）の測定値から次のように求めることができる
【００７７】
【式４】
【００７８】
ＭＰＭ(pg)＝血小板の平均全質量(pg)×(100−水分％)/100
［式中、血小板の平均全質量（pg）＝血小板の平均密度（g/ml＝pg/fl ）ｘＭＰＶ（fl）］
しかし、これらの測定には、血小板の密度の測定（D.G. Peningtonら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376; L. Corashら、1977, Blood, 49(1):71-85; C.B. Thompson ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519;および L. Corashら、1984, Blood, 64(1):185-193）と、水分％の測定（F. Gorstein ら、1967, J. Lab. and Clin. Med., 70:938-950）の両方が必要であり、これらの測定は、退屈で時間がかかり、高処理量の自動化には適さない。
【００７９】
ＰＬＴ１システムおよび方法によって測定した平均ＭＰＭ値は、血小板の密度、ＭＰＶおよび血小板の水分％の確立された平均値に基づく間接的な推定値と比較することができる。一般に、ＡＣＤ中で抗凝固され、ストラクタン(stractan)勾配上で分離される血小板の場合、血小板の平均密度は約 1.065 g/ml であり（D.G. Peningtonら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376; L. Corashら、1977, Blood, 49(1):71-85; C.B. Thompson ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519;および L. Corashら、1984, Blood, 64(1):185-193）、ＭＰＶは約 6.5 fl （E.A. Trowbridge ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238; L. Corash ら、1977, Blood, 49(1):71-85; C.B. Thompson ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519 ）であることが当技術分野では認められている。しかし、従来技術から誘導されるＭＰＶ値は、球状ポリスチレンビーズでキャリブレートされた装置によって行われる開口インピーダンス測定に基づくものである。従って、球状でないＡＣＤ血小板に対するＭＰＶ推定値は、決まって低い（N.B. Grover ら、1969, Biophys. J., 9:1398; J. Hurley, 1974, Biophys. J., 10:74）。他の全てが等しいとすると、Ｋ3 ＥＤＴＡ−血小板に対する開口インピーダンス測定（すなわち、球状化した血小板）の方が正確である。これらの型の測定により、新しい（約１時間齢）サンプルに対しては、約 8.5 fl のＭＰＶ値が得られる（E.A. Trowbridge ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238）。
【００８０】
血小板の球状化の他に、Ｋ3 ＥＤＴＡが血小板を膨潤させるか否かに関しては、当業者の間で一致していない（例えば、S. Hlomeおよび S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96:480-493; E.A. Trowbridge ら、1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238; G.V.R. Born, 1970, J. Physiol., 209:487-511; G.V.R.. Born ら、1978, J. Physiol., 280:193-212参照）。Ｋ3 ＥＤＴＡ血小板の密度勾配測定では、1.060 g/mlの平均密度が得られることが報告されている（H.H.K. Watson および C.A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62:117-124 ）。
この値をＡＣＤ−血小板に対する 1.065 g/ml の値と比較すると、Ｋ3 ＥＤＴＡは約 8 %だけ血小板を膨潤させることが示唆される。これに基づくと、膨潤していない」血小板に対するＭＰＶは 7.8 fl である（これは、thrombocrit 測定に基づく公表値（S. Karpatkinおよび A. Charmatz, 1969, J. Clin. Invest., 48:1073-1082）および視覚顕微鏡検査（M. Frojmovicおよび R. Panjwani, 1976, Biophys. J., 16:1071-1089 ）とかなりよく一致する。）。ＭＰＶ範囲として 7.8〜8.5 flを使用すると、全血小板の平均質量は 8.31 pg〜9.05 pg である。血小板の水分含量％は、74.6 %〜77 %の範囲であると推定される（F. Gorstein ら、1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938-950; S. Karpatkin, 「血小板の組成物」, Hematology, 2nd Ed. 1977, McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178 ）。この結果、1.91 pg 〜 2.30 pgのＭＰＭ範囲が得られる。ＰＬＴ１を使用して得られる 2.02 pgの平均値は、この範囲内である。これに対して、公表された最も高いＭＰＭ値の 2.8 pg （S. Karpatkin, 「血小板の組成物」, Hematology, 2nd Ed. 1977, McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178 ）は、この範囲からかなり外れている。さらに、この値は、恐らく物理的根拠に基づくものではない。というのは、それが、赤血球の成分濃度範囲である 35 g/dl〜38 g/dl （ＭＣＨＣの場合は 32 g/dl〜35 g/dl ）と重複する 32.9 g/dl〜35.9 g/dl の成分濃度範囲に一致するからである（J.W. Harris および R.W. Kellermeyer, 1972, The Red Cell, 2nd Ed., Harvard University Press, p.282 ）。従って、平均密度の血小板は、正常な赤血球集団の低密度画分内に見いだされるはずである。しかし、実際は、通常の実施によって示されるように、こうではない。
【００８１】
別の発明では、本発明の方法およびシステムによって提供される血小板活性の測定が臨床的に有用である。現在、血小板の活性を予測するために、蛍光フローサイトメトリー（G.I. Johnston ら、1987, Blood, 69(5):1401-1403; J.N. George ら、1986, J. Clin. Invest., 78:340-348）、血小板密度測定（D.G. Pennington ら、1976, Br. J. Hematol., 34:365-376; L. Corashら、1977, Blood, 49(1):71-85; A.J. Friedhoffら、1978, Blood, 51(2):317-323; C.B. Thompson ら、1982, Br. J. Hematol., 50:509-519; L. Croashら、1984, Blood, 64(1):185-193）およびＭＰＶ測定（C.B. Thompson ら、1983, J. Lab. Clin. Med., 101:205-213 ）が使用されている。上述したように、これらの方法の第一である蛍光フローサイトメトリーは、退屈で時間がかかり、高価である。第二の方法である血小板密度測定は、さらに間接的でもある。第三の方法であるＭＰＶ測定は、間接的であり、採取および保存条件により影響される。従って、血小板の活性を予測するための簡単、迅速、安価かつ他の影響を受けない方法が当技術分野では望ましい。
【００８２】
血小板の潜在的活性は、α−および高密度顆粒の数および質量とともに増加する（L. Corash ら、1977, Blood, 49(1):71-85および L. Corashら、1984, Blood, 64(1):185-193）。血小板の乾燥質量は顆粒含量と相関するので（前掲）、血小板の潜在的活性は、ＭＰＭとともに増加する。従って、本発明のＰＬＴ１方法の一面は、血小板の活性を予測するための、簡単で正確かつ安価な方法を提供する。さらに、ＭＰＭは、室温ですら、分析前に約 24 時間まで保存しておいたサンプル中でほとんど変化しないので、影響を受けないパラメーターである。さらに、ＭＰＭは、相関係数（ｒ）に基づいて、時間経過とともに予想通りに挙動する（表１参照）。表１は、ＰＬＴ１システムおよび方法によって得た、正常な血液ドナーサンプルのＭＰＭおよびＭＰＣ測定値と時間および温度との関係を示す（室温で８時間対１時間；室温で 24 時間対１時間；室温で８時間対４℃で８時間；室温で 24 時間対４℃で 24 時間）。下記に示す関連する表において、「ｒ」は相関計数であり、「Syx 」は推定値の標準誤差であり、「Ｘ平均」は独立変数に対する平均値であり、「Ｙ平均」は従属変数に対する平均値である。すなわち、新しいサンプルに対してさらに精密なＭＰＭ値を、加齢した、または保存したサンプルの任意の in vitro サンプル年齢および保存温度から外挿により得ることができる。例えば、室温で 24 時間につき 4 %の割合で減少し、24時間でのＭＰＭが 2.00 pgであるとすると、新鮮なサンプルのＭＰＭは 2.08 pgとなる。ＰＬＴ１システムにより、ＡＣＤ−およびＫ3 ＥＤＴＡ抗凝固血液サンプルに対して本質的に同じＭＰＭ値が記録されることは注目すべきことである（表２ならびに図５Ａおよび５Ｂ）。これは、血小板がＡＣＤでは球状化されないが、Ｋ3 ＥＤＴＡでは球状化されるという点で驚くべきことである。従って、本発明のＰＬＴ１法は多目的であり、両方の種類の抗凝固剤に懸濁した血小板の分析に対して正確かつ信頼できるＭＰＭ結果を与える。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
ＭＰＣは、血小板の屈折率に比例し、屈折率は血小板の密度に比例する。本発明方法に従って得たＭＰＣ値を、血小板アゴニストのトロンビンに対する正常な血小板の用量反応に対する蛍光フローサイトメトリーデータと比較した下記実施例４の結果は、ＭＰＣ値がＰＬＴ活性化状態と相関することを示す（図１４Ａ〜１４Ｄ）。ＰＬＴ活性化を調べる本発明方法は、はるかに安価で迅速であり、使用が非常に簡単である。さらに、データ分析は容易に自動化される。さらに，本発明方法を使用することにより得ることができる情報は、その方法を行うために種々の機器を使用しても、本質的に機器によって変わることはない。
【００８５】
その方法は、クエン酸ナトリウムまたはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（好ましくは、Ｋ3 ＥＤＴＡ）で抗凝固させた血液サンプルの分析に特に適する。当業者であれば理解されるように、クエン酸ナトリウムまたはＫ3 ＥＤＴＡの溶液は、血液サンプルと混合することができ、あるいは、乾燥形態のクエン酸ナトリウムまたはＫ3 ＥＤＴＡ（すなわち、粉末）を血液サンプルに溶解して抗凝固剤として使用することができる。一般的指針として、 7 cc の管につき約 7〜14 mg の粉末状のＫ3 ＥＤＴＡを使用する。クエン酸ナトリウムは、慣例的には、管ごとに 2.0〜5 g/dl、好ましくは 3.2〜3.8 g/dlの溶液として使用し、最終的にはクエン酸ナトリウム１部に対して全血が９部の割合にする。当業者であればさらに理解されるように、Ｋ3 ＥＤＴＡが、自動血液分析に対して最も普通に使用される抗凝固剤である。これに関しては有利なことに、本発明は、抗体を使用する血小板および活性血小板の従来の測定法に代わる価値ある方法を提供する。というのは、従来の方法は、抗体と抗体が結合する分子構造との間のエピトープ結合部位の完全性に対して有害な作用を及ぼすためにＥＤＴＡ含有溶液を使用することができないからである。
【００８６】
本発明の別の発明は、ＭＰＭ値と病気の状態および/ または病気の治療法との間の関係を評価するための方法および自動システムを提供することである（実施例２参照）。本発明は、ＭＰＭを測定することによる、例えば患者の血小板顆粒含量に対する化学療法または放射線治療の効果を測定するための、便利な方法を提供する。現在、血小板の末梢破壊を伴う血小板減少症は正常よりも大きい血小板を生じ、一方、血小板新生の低下による同じ症状は大きさが正常または小さい血小板を生じると考えられる（J.D. Bessmanら、1982, Am. J. Clin. Pathol., 78:150-153; R.B. Nelson および D. Kehl, 1981, Cancer, 48:954-956）。さらに、血小板サイズの増加は、心筋梗塞に関連する（A. Eldorら、1982, Br. Med. J., 285:397-400; H.A. Cameronら、1983, Br. Med. J., 287:449-451; J.F. Martin ら、1983, Br. Med. J., 287:486-488）。ＭＰＶと血小板乾燥質量との相関の点から見ると（L. Corash ら、1977, Blood, 49(1):71-85および L. Corashら、1984, Blod, 64(1):185-193 ）、高ＭＰＭ値は破壊的血小板減少症と関連し、低ＭＰＭ値は血小板新生の低下に関連することが予想される。さらに、高ＭＰＭは、恐らく血栓の潜在性を示す。
【００８７】
【表２】
0003704654.tif 000003
【００８８】
下記実施例により本発明を説明する。下記実施例は、本発明の概念の理解をさらに容易にするためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８９】
【実施例】
実施例１
本実施例では、およそ７５種の正常血液サンプル（Bayer Corporationのドナ ーから入手したもの）で試験した本発明の高ゲイン（high-gain）ＰＬＴ１チャ ンネル及び血小板分析方法の実施について記載する。本発明のＰＬＴ１法及びシステムと、この分野で用いられているシステム及び方法との比較のために、血小板サンプルをTECHNICON HTM2自動分析器、コールターSTKS分析器、及びその改  良型である、より正確なＰＬＴ１システムを用いて分析した。視覚的な評価のために、染色した血液塗抹標本のスライドも、それぞれのサンプルについて調製した。血小板数、ＭＰＶ値、及びＲＢＣ数は上記の分析法で比較した。自動化方法論にとって新規であり、本発明のＰＬＴ１システム及び方法によってこの分野に導入する２つのパラメーター、すなわち平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）と平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）のためにもデータを集めた。
【００９０】
全てのサンプルをＫ3ＥＤＴＡを含有する吸引器の中に採取した。サンプルは 、１時間の室温保存の後、８時間の室温及び４℃保存の後、及び２４時間の室温及び４℃保存の後に分析した。
【００９１】
TECHNICON HTM2及びコールターSTKSシステムを用いた血小板分析を実施する  ために、メーカーの説明書に従ってシステムを標準化し、キャリブレートした。
全てのサンプルを２回の反復実験に供し、分析した。更に、上記のようにして標準化し、キャリブレートしたＰＬＴ１試験システムでサンプルを２回の反復実験に供し、分析した。
【００９２】
血液塗抹標本のフィルムスライドは、全てのサンプルで２つずつ調製した。次いで市販のHema-Tek 2000 Slide Stainer（Bayer Corporation）によってスラ  イドにライト−ギームザ染色を行った。スライドは血小板計数及び相対的な大きさの基準のために保存した。
【００９３】
正常血液の分析及びＰＬＴ数の比較精度データの結果を表３に挙げる；ＭＰＶ比較精度データを表４に挙げる；ＲＢＣ数の比較精度データを表５に挙げる；そしてＭＰＭとＭＰＣの精度データを表１に挙げる。
【００９４】
【表３】
0003704654.tif 000004
【表４】
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【表５】
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【００９５】
ＰＬＴ数：本発明のＰＬＴ１法で得られる血小板数は、共に広く受け入れられている血小板計数装置であるＨ・TM２及びＳＴＫＳシステムでのカウント数と よく合致していた。ＰＬＴ１法では血小板数のキャリブレーション係数は用い られなかったが、Ｈ・TM２及びＳＴＫＳでのキャリブレーション係数はそれぞれ０．８５及び１．０２であったことに留意すべきである。このことから、現在のＨ・TMシステムの技術では生の血小板数に非常に多くの非血小板が含まれていることが示唆される。
【００９６】
ＭＰＶ：現在のＭＰＶを測定するための方法には、この分野で標準とすべきものと考えられるものはない。従って、各方法間の比較は血小板の質的な挙動に関する。図４に、ＰＬＴ１法における典型的な正常サンプルの血小板体積のヒストグラムを示す。これは血小板体積の対数−正規分布を示し、公表されている結果と一致する（J.M.Paulus, 1975, Blood, 46(3):321-336）。Ｈ・TM２及びＳＴ  ＫＳシステムでの典型的な血小板体積分布も対数−正規である。
【００９７】
正常なサンプルでは、本発明のＰＬＴ１システム及び比較としてのコールターＳＴＫＳシステムを用いて得られたＭＰＶ値は、共にＭＰＶが保存時間と共に増加することを示したが、TECHNICON Ｈ・TM２システムを用いて得られた値では減少を示した（表４参照）。ＳＴＫＳ及びＰＬＴ１に対するＨ・TM２でのこのパターンは、Trowbridgeらによって報告されたコールターＳ＋システムに対し、TECHNICON H6000TMシステムを用いて得られたパターンと一致した（E.A.Trowbridge ら, 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-2382）。Trowbridgeらの論 文で報告されたように、（TECHNICON Ｈ・TM２システムと同様に）TECHNICON H6000TMシステムでは、血小板体積は高角度散乱強度に比例する（H6000TMで５−  １０度、及びＨ・TM２システムで５−１５度）。本発明の詳細な説明で先に説明したように、Mie 散乱理論では、これらの角度への散乱は屈折率に敏感であることが示されている。血小板をex vivoで加齢すると、水の取り込みのためにそれ らは膨潤し、屈折性が低くなる（S.HolmeとS.Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Me d., 96:480-493）。この膨潤によって高角度散乱強度は減少し、従ってＭＰＶが実際には増加しているときにH6000TM及びＨ・TM２システムでＭＰＶの減少が報 告されることになる。しかしながら、コールターＳ＋システム及びコールターＳＴＫＳシステムによって、また他の開口インピーダンス装置によって得られる測定値によれば、血小板体積は電気的インピーダンスに比例する。従って、これらの後者のシステムでは、細胞が膨潤するにつれてインピーダンスが増加するため、膨潤に起因するＭＰＶの増加が正しく報告される。本発明のＰＬＴ１システムは、上記のように、Mie 散乱理論を用いて低−及び高−角度散乱信号を体積及び屈折率に変換するため、ＰＬＴ１システム及び方法でも膨潤に起因するＭＰＶの増加が正しく報告される。
【００９８】
ＲＢＣ数：本発明のＰＬＴ１システムで測定したＲＢＣ数は、共に受け入れられているＲＢＣ計数装置であるTECHNICON Ｈ・TM２システム及びコールターＳＴＫＳシステムで測定したＲＢＣ数とよく合致していた。
ＭＰＭ：図４は、典型的でかつ代表的なＰＬＴ１血小板乾燥質量ヒストグラムを示し、血小板乾燥質量がサンプル内で対数−正規的に分布していることが示唆される。このことは電子顕微鏡による研究の結果（G.F.BahrとE.Zeitler, 1965,Lab. Invest., 14(6):217-239）及び密度勾配測定に基づく結論（L.CorashとB. Shafer, 1982, Blood, 60(1):166-171）と一致する。ＰＬＴ１システムの測定  によれば、室温に１時間保存した正常サンプルの典型的なＭＰＭ値は２．０２ｐｇである。この値は、それぞれ２．５、２．８、２．０６、２．１、２．０６ｐｇである公表された値のほとんどと非常によく合致する（G.F.BahrとE.Zeitler, 1965,Lab. Invest., 14(6):217-2393；F.Gorsteinら, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938-950;S.Karpatkin, 1977,  Hematology. 2nd Ed. McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178;T.C.Bithell, 1993の中の“血小板の組成(Composition of platelets)”, Wintrobe's Clinical Hematology, 9th Ed. Vol.1. LeaとFebiger, Philadelphia, PA., pp.511-529の中の“血小板と巨核球(Platelets and megakaryocytes)” ;及びE.E.WoodsideとW.Kocholaty, 1960,Blood, 16:1173-1183）。
２４時間を超えるとＭＰＭ値はわずかに、すなわち、サンプルを室温で保存した場合は３．５％、サンプルを４℃で保存した場合は１．５％だけ落ちた（表１）。
【００９９】
ＭＰＣ：図４はまた新鮮なサンプルにおける、正常に分布している（すなわち、正常またはガウス分布を示す）典型的、かつ代表的なＰＬＴ１血小板成分濃度のヒストグラムを示す。これは、密度勾配測定の結果（H.H.K.WatsonとC.A.Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62:117-124; J.F.Martinら, 1983, Br. J. Hemat ol., 54:337-352）と一致する。室温で１時間保存したサンプルにおいてＰＬＴ １システムを用いて得られたＭＰＣの平均値は２５．６ｇ／ｄｌであった。この値を公表されている固体の％値と比較するためには、非−水性成分の密度を決定することが必要である。記載したように、血小板のタンパク質／脂質／炭水化物の相対組成は５７／１９／８．５であり、これらの成分のそれぞれの密度は、それぞれ１．３３ｇ／ｍｌ、０．９３ｇ／ｍｌ及び１．５０ｇ／ｍｌである（R.BarerとS.Joseph, 1954, “細胞化学の一般法(General Cytochemical Methods)” , Quarterly Journal of Microscopical Science, 95:399-423）；ゆえに固体成分の平均密度は１．２６ｇ／ｍｌである。従って、血小板１ｄｌ中で血小板成分２５．６ｇの占める体積は以下のように計算される：
【０１００】
２５．６ｇ×（１ｍｌ／１．２６ｇ）＝２０．３ｍｌまたは０．２０３ｄｌ。ｄｌ当たりの残りの体積（すなわち水）は：１．０００ｄｌ−０．２０３ｄｌ＝０．７９７ｄｌ。１ｇ／ｍｌの密度では、この体積の水の重量は７９．７ｇである。従って固体の％＝（２５．６／（７９．７＋２５．６））×１００＝２４．３％である。上記のように、もしＫ3ＥＤＴＡが血小板を８％膨潤させていると すれば、固体の％＝２５．８％である。この２４．３％から２５．８％の範囲は、公表されている値、すなわち２３％から２５．４％の範囲に近い（F.Gorsteinら, 1967, J. Lab. Clin. Med., 70:938-950;S.Karpatkin, Hematology. 2nd E d. 1977. McGraw-Hill, N.Y., pp.1176-1178の中の“血小板の組成(Composition
of platelets)”）。
【０１０１】
ＭＰＣは２４時間を超えると顕著に減少した；４℃で保存したサンプルでは１４％、室温で保存したサンプルでは２２％減少した（表１）。種々の時間及び温度で測定したＭＰＣの統計を表６に表す。データからは、室温において、１、８、及び２４時間で分析したサンプルのＭＰＣ値がそれぞれ１．５ＳＤ内で互いに重ならないことが示される。よってそのＭＰＣを測定することによって、サンプルが１、８または２４時間齢のものであるかどうかを８７％の信頼性で決定することができる。そのために、ＭＰＣ値はin vitroでのサンプル年齢をモニターするために使用することができる。ＭＣＶ、ＭＣＨＣ、ＨＣＴ及びＭＰＶのような種々の血液学的パラメーターはサンプル年齢に敏感である。従って、サンプル年齢の影響を無視し、また時間のたったサンプルから正確で信頼し得るデータが得られなければ、大赤血球増多症、血色素減少、貧血、また血小板血栓症のおそれと言ったような条件に関しては誤った結論が引き出されることがある。従って、本発明の血小板分析並びに計数方法及びシステムを用い、ＭＰＣ値を介してサンプル年齢をモニターすることは、重要な臨床的価値があると考えられる。
【０１０２】
実施例２
本実施例では、およそ７０種の異常血液サンプル（Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC), New Yorkから入手したもの）で試験した本発明の増加 ゲイン（expanded gain）ＰＬＴチャンネル（ＰＬＴ１）及び血小板分析法の実 施について記載する。全てのサンプルは100,000／μｌ未満の血小板数を有し、 実施例１に記載のように分析した。更に、自動血小板計数の妥当性が現時点において全ての血小板減少症のサンプルではよく確立されていないため、血小板数は位相差顕微鏡で測定した（K.Mayerら, 1980, Am. J. Clin. Pathol., 74:135-1 50; P.J.CornbleetとS.Kessinger, 1985,Am. J. Clin. Pathol., 83:78-80）。
サンプルは採取のおよそ４時間後にBayer Corporationに運ばれ、到着後すぐに 室温で分析した。室温で２８時間保存した後、サンプルを再度分析した。結果を下記及び表７及び図１２に示す。
【０１０３】
ＰＬＴ数：本発明のＰＬＴ１システム及び方法を用いて得られた血小板数は、室温で４時間保存したサンプルについて位相差顕微鏡を用いて得られる血小板数とよく合致した。ＰＬＴ１血小板数はまた、その一つを下記の実施例３で更に記載した顕著な例外と共に、TECHNICON H.TM2システムの計算値及びコールターST KSシステムの計算値とも一致した。
【０１０４】
ＭＰＶ：正常サンプルでは逆であるが、異常サンプルでは、TECHNICON H.TMシステム及びコールターSTKSシステムの結果は、ＰＬＴ１を用いて得られた結果とよりも、互いでよく一致していた。この理由は、代表的な血小板体積ヒストグラムを比較すれば明らかになる。図８は、TECHNICON H.TM2システム及びコールタ ーSTKSシステムによって作成した血小板体積ヒストグラムで、低いチャンネルにおいて妨害粒子が含まれることを示す。これらの粒子は血小板体積の対数−正規分布を歪め、システムをＭＰＶ値が報告できないものにする。反対に、本発明のＰＬＴ１法では、その血小板体積の対数−正規分布で示すように、これらのタイプの妨害粒子のほとんどが排除された。従って、ＰＬＴ１法では他のシステムより高いＭＰＶ値が報告された。更に、図９Ａ−９Ｄには、H.TM2システム及びコ ールターSTKSシステムの測定値によれば、ＭＰＶはＰＬＴ数（20,000個／μｌまで）に直接関連していることが示されるが、一方図１０Ａ及び１０Ｂには、ＰＬＴ１測定値によればＭＰＶ及びＰＬＴ数は逆の関係があることが示される。更に、文献の報告によれば、ＭＰＶとＰＬＴ数は、正常サンプル及びほとんどの血小板減少症サンプルにおいて逆の関係がある（J.D.Bessmanら, 1982, Am. J. Cli n. Path., 78:150-153; J.LevinとJ.D.Bessman, 1983,J. Lab. Clin. Med., 10 1:295-307; J.D.Bessmanら, 1981, Am. J. Clin. Path., 76:289-293; C.Gile  s, 1981,Br. J. Hematol., 48:31-37）。従って文献の報告は本発明のＰＬＴ１ システムによって得られた結果と一致する。また、染色した血液スライドフィルムでの顕微鏡による相対的な大きさの測定では、ＴＣＰサンプルが正常サンプルよりも比較的大きな血小板を含有していることが示された。正常サンプルでは、３つのシステム全てでＭＰＶとＰＬＴ数が逆に関連していることが示され（図１１）、この分野でこれらによって報告されている知見と一致した。
【０１０５】
現時点において、ＭＰＶは、種々の血液学的障害を区別するために使用できるにも関わらず、血小板分析では大抵無視されるパラメーターである（J.Zeigler ら, 1978, Blood, 51(3):479-486; M.Kraytman, 1973,Blood, 41(4):587-597;   J.D.Bessmanら, 1982, Am. J. Clin. Path., 78:150-153; J.LevinとJ.D.Bess man, 1983,J. Lab. Clin. Med., 101:295-307; C.Giles, 1981,Br. J. Hematol ., 48:31-37; A.Eldorら, Br. Med. Journal, 1982, 285:397-400; H.A.Came   ronら, Br. Med. Journal, 1983, 287:449-451; J.F.Martinら, Br. Med. Jou rnal, 1983, 287:486-488; G.A.Threatte, Clin. Lab. Med., 1993, 13(4):93  7-950）。この分野でＭＰＶ値を軽視する理由は、本発明以前には、以下の起こ り得る理由でＭＰＶ値は信頼できないと考えられたことである（E.A.Trowbridgeら, 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238; G.A.Threatteら, 19  84, Am. J. Clin. Path., 81:769-772）：１）伝統的なTECHNICON H.TMシステム及び開口（aperture）インピーダンス装置でのＭＰＶ値において、しばしば血液サンプルの保存条件に起因する顕著な違いが得られた（E.A.Trowbridgeら, 1985, Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3): 221-238; G.A.Threatte, 1993,Clin. Lab. Med., 13(4):937-950; U.Lippiら,  1987, Am. J. Clin. Pathol., 87:391-393）；２）伝統的なＨ・TMシステムでも開口インピーダンス装置でも、上記のように血小板減少症サンプルでの正確なＭＰＶ値が報告されていない；及び
３）ＭＰＶは採取及び保存の条件に敏感である（C.B.Thompsonら, 1983, Am. J. Clin. Path., 80:327-332; S.MurphyとF.H.Gardner, 1971,J. Clin. Invest., 50:370-377; B.S.FullとM.B.Zucker, 1965, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 120:296-301; J.G.WhiteとW.Krivit, 1967, Blood, 30(5):625-635）。
【０１０６】
逆に、本発明に従ってＰＬＴ１を用いて得られるＭＰＶの結果は、以下の理由によって価値がある：
１）独立した方法、すなわちＰＬＴ１及び開口インピーダンスにより、種々の条件下で保存した正常サンプルで得られた結果の質的及び量的な一致によって、ＰＬＴ１と開口インピーダンスのＭＰＶ測定値が共により確実な立場におかれる；
２）血小板減少症のサンプルでのＰＬＴ１のＭＰＶの結果は、種々の条件下で報告されている文献の結果と質的に一致する；そして
３）先に論じたように、ＰＬＴ１ではＭＰＣを測定することによってＭＰＶに対するサンプルの保存の影響がモニターされる。
【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
ＲＢＣ数：ＰＬＴ１システムの結果は、TECHNICON H.TM2及びコールターSTKS 法の分析から得られた結果とよく一致した。
【０１０９】
ＭＰＭ：病院サンプルでは血小板乾燥質量は対数−正規分布しており、この分布は分析でわずか１５０種の生の血小板の信号が得られるサンプルにおいても認めることができる（図８）。室温で４時間保存した病院サンプルにおいては、典型的なＭＰＭ値は２．０４ｐｇであり、これは実際上室温で１時間保存した正常サンプルで得られる値に等しかった。従って、本発明のＰＬＴ１システムを用いることにより、ＭＰＭは病院サンプル及び正常サンプルの双方において同じ時間安定性を示した。
【０１１０】
図７は、室温で１時間保存したサンプルでのＭＰＭ値（Ｘ軸）に対する、種々の時間及び温度条件下での正常サンプルのＭＰＭ値（Ｙ軸）を示すグラフを表す。２ｐｇ（正常での平均値）に集中するＭＰＭ値の一つのクラスターが示される。図８は異常サンプル集団での同様なグラフを示し、２つのクラスターの存在（一つは２．０ｐｇに、一つは２．３ｐｇに集中している）を示す。クラスターの違いは潜在的な血栓形成（thrombotic）活性の差異に関連しているようである。病院サンプル、すなわち異常サンプルでのより高いＭＰＭ値は、これらの異常サンプルにおける血小板が正常サンプルのものよりもより強い潜在的活性があることを示している。先に記載したように、本発明の血小板分析法及びこれから得られるＭＰＭ値から、高いＭＰＭ値と疾病状態及び／または疾病治療の方法との関係を評価する手段が提供される。
【０１１１】
ＭＰＣ：室温で４時間保存した異常サンプルは２２．１ｇ／ｄｌ（表６）の典型的なＭＰＣ値を有し、室温で８時間保存した正常サンプルで測定した値よりも０．７ｇ／ｄｌ低かった。ＰＬＴ１を用いて得られたＭＰＣ値は病院サンプルで正常サンプルと同じ時間依存性を示した。
【０１１２】
【表７】
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【０１１３】
実施例３
使用する測定法に関わらず、実施例２で記載した異常サンプルのほとんどは類似した血小板数を与えるが、小数の異常サンプルでは分析法に依存して大きく異なる結果が得られた。血小板減少症のドナー由来のこうしたサンプルの一つについて、本実施例で記載する。表８には血小板数の比較データ（サンプルは自動システムで２回実施した）を示し、図１３には３種の自動化方法のそれぞれで得られるヒストグラムを示す。それらに示されるように、本発明のＰＬＴ１システムのみが２つの測定値の双方で位相差顕微鏡による計数値と一致する血小板数を与えた。TECHNICON H.TM2の血小板計数値は位相差顕微鏡での計数値のおよそ２倍 であった。コールターSTKSシステムは２つの値の一方のみで血小板計数値を正しく報告し、他方では空白となった。また、コールターSTKS及びTECHNICON H.TM2 の体積ヒストグラムは、赤血球断片の妨害が含まれるため、対数−正規分布ではなかった。従って、これら２つのシステムでは、血液塗末標本の顕微鏡観察に基づく実際の値よりも低いＭＰＶ値を与えた。ＰＬＴ１法及びシステムによって作成された体積ヒストグラムは対数−正規分布であり、報告されたＭＰＶは血小板減少症サンプルでレンジ内にあり、顕微鏡観察と質的にも一致していた。更に、ＰＬＴ１システムによって測定された血小板成分濃度はほぼ正規分布し、かつ血小板乾燥質量は対数正規分布しており、本発明によって異常サンプル中で血小板として計数された粒子は、同様に血小板の物理的性質を有することが証明された。
【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
実施例４
本実施例では、in vitroでのトロンビンによる血小板の活性化に対する用量応答性を測定するために実施した実験について記載する。これらの実験において、血液サンプルは非喫煙者で、アスピリン治療を行っていない正常な成人ドナーから採取した。サンプルは抗凝固剤クエン酸ナトリウム及びＫ3ＥＤＴＡの双方の 中に採取した。Ｋ3ＥＤＴＡを含有する抗凝固剤の使用に基づく結果を、クエン 酸ナトリウムを用いたものと比較することで、本発明の新規な方法を使用する血小板活性化研究におけるＫ3ＥＤＴＡの有用性が証明される。
【０１１６】
トロンビンで誘起される血小板の活性化は、フィコエリトリン結合モノクローナル抗体、ＣＤ６２−ＰＥを用い、α−顆粒タンパク質（ＧＭＰ−１４０）の細胞表面での発現の増加を蛍光フローサイトメトリーで検出することによって測定した。ＧＭＰ−１４０の発現はα−顆粒の放出と関連している。この分析は、Michelsonらの記載したテトラペプチドであるグリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アル ギニル−Ｌ−プロリン（ＧＰＲＰ）の封入によって可能となる（A.D.Michelson ら, 1991, Blood, 77:770-779）。ＧＰＲＰは血小板の凝集及びフィブリンの凝 固を阻害し、従って細胞ごとの分析が可能になる。
サンプル調製：
【０１１７】
全血を、０．３５％ウシ血清アルブミンを含有するように補充したＰＢＳで１：１０に希釈した。希釈した全血の一部（３００μｌ）を２．５ｍＭ  ＧＰＲＰ（最終濃度）の存在下で５分間インキュベートした。図１４Ａ−Ｄに示すように、α−トロンビンを最終濃度０．００２Ｕ／ｍｌから０．０８７Ｕ／ｍｌで試験サンプルに添加した。対照サンプルにはＰＢＳを添加した。サンプルを室温で１５分間インキュベートし、次いで１％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で１：１に希釈し、室温で３０分間インキュベートした。表面レセプターＧＰ１ｂＩＸ（ＣＤ４２ａ、ＦＩＴＣ結合及びＣＤ６２−ＰＥ）を標的とする飽和濃度の血小板特異的モノクローナル抗体を蛍光フローサイトメトリーで分析する全てのサンプルに添加し、サンプルを１５分間インキュベートした。この段階は、本発明に従って実施する方法によって分析するサンプルでは省略した。サンプルを分析する前に、ＰＢＳを最終希釈１：６００となるように添加した。
【０１１８】
サンプル分析
４８８ｎｍで作動するアルゴンイオンレーザーを備えたFACStation-CellQuest acquisition及び分析ソフトウェア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーでサンプルを分析した。ＦＩＴＣ及びフィコエリトリンの蛍光は、それぞれ５２５ｎｍ及び５７５ｎｍのバンド通過フィルターを用いて検出した。血小板は、ＦＩＴＣ陽性度（緑色の蛍光、ＦＬ１）と共に、側方散乱（ＳＳＣ）に対するその前方散乱（ＦＳＣ）のプロファイルによって同定した。活性化した血小板はＰＥ−陽性度（赤色の蛍光、ＦＬ２）、すなわちＦＳＣ対ＦＬ２によって同定した。
【０１１９】
光散乱ゲート及びＦＩＴＣ陽性度によって血小板を同定した後、活性化のマーカーであるＣＤ６２の結合を、ＰＥ蛍光について５，０００個の血小板の挙動を分析することによって決定した。イソタイプ抗体ＩｇＧを用いて測定した結合のバックグラウンドはそれぞれのサンプルから差し引いた。全てのサンプルについて、結果を平均蛍光強度（ＦＩ、任意の単位）で報告した。ＦＩもＭＰＣも任意の閾値の設定を必要としないことから、ＦＩは陽性率（％）よりもＭＰＣとの比較により適している。更に、採取から２時間以内に本発明の吸収／光散乱法によってサンプルを分析した。
【０１２０】
本発明の方法、及び蛍光フローサイトメトリーの方法論を、添加したトロンビンに対する血小板の活性化を測定することによって比較した（図１４Ａ−１４Ｄ）。結果から、本発明の光散乱法は、クエン酸ナトリウム（白丸）及びＫ3ＥＤ ＴＡ（白四角）で凝固防止した血液サンプルの双方においてトロンビンの用量に関連した血小板の活性化を突き止めている。示されるように、トロンビン濃度が増すにつれ、ＭＰＣが減少する。
【０１２１】
実施例５
本実施例ではin vitroでのＫ3ＥＤＴＡ中での血小板の自動活性化を測定する ために実施した実験について記載する。これらの実験において、血液サンプルは正常な成人ドナーから抗凝固剤Ｋ3ＥＤＴＡ中にとった。トロンビンによる活性 化を行わず、指示された時間にパラホルムアルデヒドを添加する以外、実施例４に記載したようにしてサンプルを調製し、分析した。表９にＫ3ＥＤＴＡの存在 下での血小板の自動活性化の経時変化の結果を示す。
【０１２２】
【表９】
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【０１２３】
表９は、ＥＤＴＡ中に保存したサンプル中の血小板が経時で増大する自動活性化を起こすことを示している。従って、血小板活性化の蛍光による、また光散乱による測定は、in vitroでのサンプル年齢を考慮しなければならない。
【０１２４】
実施例６
本実施例ではex vivoでの血小板の活性化状態を測定するために実施した実験 について記載する。これらの実験において、血液サンプルは正常なヒトドナー及び３名の糖尿病患者のドナーから得た。サンプルは抗凝固剤Ｋ3ＥＤＴＡ中に採 取した。トロンビンもパラホルムアルデヒドも添加しない以外、上記実施例４に記載したようにしてサンプルを調製した。採取７時間後にサンプルを分析した。これらの分析の結果を表１０に示す。
【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
表１０は、ＭＰＣ及びＦＩ測定の双方が、ex vivoでの血小板の活性化を示し ている血液サンプル（糖尿病患者１及び２）とそうでないもの（糖尿病患者３）を区別していることを示す。図１４Ａ−１４Ｄの実験に基づいて予想された値よりもＦＩは高く、ＭＰＣは低いことがわかる。このことから、３つの糖尿病患者のサンプルは全て活性化されているが、第三のサンプルは最初の２つよりも活性化の度合が低いことが示唆される。正常な血液サンプルでのＭＰＣは、正常サンプルにおいても、ＥＤＴＡ溶液中への採取の７時間後に測定したＭＰＣは新鮮なサンプルよりも低いことを示している。ＮＤは未決定であることを示す。ＭＰＣ値の下降及びＦＩの上昇の理由は、上記の実施例５で示したように、ＥＤＴＡ中で保存した血小板が経時で進行的に自動活性化することである。それにも関わらず、ＦＩと同様に、ＭＰＣはin vivoでの血小板の活性化をするサンプルとそう でないサンプルとを区別する。
【０１２７】
ここに引用した全ての特許出願、発行された特許、発表された論文及び文献、及び教科書の内容は、その全体を参考としてここに組み入れる。
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく上記構成及び方法に種々の変更を加えることができるため、上記の説明に含まれ、添付図面に示され、あるいは請求の範囲で定義された全ての内容は例示として解釈され、制限的な意味をもつものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  散乱／散乱サイトグラム上での血小板体積（Ｖ）対屈折率（ｎ）のマップを示す。
【図２】  ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンおよびｎ−ヘプタンの油滴の散乱／散乱サイトグラムを示す。
【図３】  赤血球、大きい血小板、赤血球ゴースト、血小板、赤血球断片、および原点の破片の、粒子型マッピング散乱／散乱サイトグラムにおける位置を示す。
【図４】  本発明の血小板測定法およびシステムを使用した正常なサンプル結果を示す代表的サイトグラムおよびヒストグラムを示す。
【図５】  Ａ. 赤血球希釈剤に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルにおける血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを示す。Ｂ. 等張性リン酸緩衝溶液に懸濁したＫ3 ＥＤＴＡ−抗凝固血液サンプルにおける血小板の分析から得られた代表的サイトグラムを示す。
【図６】  Ａ. 赤血球希釈剤に懸濁したＡＣＤ−抗凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラムを示す。Ｂ. 等張性リン酸緩衝溶液に懸濁したＡＣＤ−抗凝固血液サンプルの分析から得られた代表的サイトグラムを示す。
【図７】  Ａ. 正常な血液ドナーサンプルの平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）対時間を示す代表的グラフである。Ｂ. 異常な血液ドナーサンプルの平均血小板乾燥質量対時間の代表的グラフを示す。
【図８】  本発明のＰＬＴＩシステム（図８Ａ）、TECHNICON Ｈ・TM２システム（図８Ｂ）および Coulter STKS システム（図８Ｃ）によって得た異常サンプルの血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
【図９】  TECHNICON Ｈ・TM２システムまたは Coulter STKS システムを使用して得た平均血小板体積（ＭＰＶ）対異常血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。
【図１０】  本発明の新規なＰＬＴ１システムおよび方法を使用して得た異常な血小板減少症の血液サンプルに対する平均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）数の測定（ＰＬＴ数＜20,000／μl ）を示す。
【図１１】  TECHNICON Ｈ・TM２システム、 Coulter STKS システムおよび本発明のＰＬＴ１システムを使用して得た、異常な血液サンプルに対して行った平均血小板体積（ＭＰＶ）対血小板（ＰＣＴ）総数の測定を示す。
【図１２】  ＰＬＴ１の方法およびシステムを使用した異常なサンプルに対する平均血小板乾燥質量（ＭＰＭ）および平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）の精度データを示す。
【図１３】  異常な血小板減少症サンプル＃70に対して表８で示した結果に対応する血小板体積（ＭＰＶ）ヒストグラムを示す。
【図１４】  本発明による新規な光散乱法と血小板の活性化を測定するための蛍光法を比較して示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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