(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性金属元素結合部分を含むペプチドであって、該結合部分が、次の構造式：
0003647881.tif 000013
を含み、
ここで、R1、R2、またはR3の少なくとも一つがＨであることを条件として、R1、R2、およびR3が、Ｈ、C1−C6アルキル基、置換基を有するC1−C6アルキル基、シクロアルキル基、置換基を有するシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、ヘテロアリール基、置換基を有するヘテロアリール基、アルカリール基、および、ペプチド合成条件下で除去することができる保護基からなる群より独立に選択され、
R5、R7、R8、R9、およびR10が、Ｈ、C1−C6アルキル基、置換基を有するC1−C6アルキル基、アリール基、および置換基を有するアリール基からなる群より独立に選択され、またはR8とR9が一緒に、またはR7とR9が一緒に、シクロアルキル環、または置換基を有するシクロアルキル環を形成することができ、
R4とR6が一緒に直接的な結合を形成し、またはC1−C6アルキル基、置換基を有するC1−C6アルキル基、アリール基、および置換基を有するアリール基からなる群より独立に選択され、
ここで前記置換基は、C1−C6アルコキシ基、C1−C6アルキルチオ基、C6−C12アリールC1−C6アルコキシ基、アラルキルチオ基、アミノ基、C1−C6アルキルアミノ基、C6−C12アリールC1−C6アルキル基、C6−C12アリール基、C3−C8シクロアルキル基、C3−C8シクロアルキルC1−C6アルキル基から選択され、
NR10が、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在し、
任意選択的に、99mTc、186Re、および188Reからなる群より選択される結合金属元素を含むペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、
（Che1）γAbuNleDHFdRWK−NH2、
（Che1）γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
KPRRPYTDNYTRLRK（Che1）QMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
HSDAVFTDNYTRLRK（Che1）QMAVKKYLNSILN−NH2、
＜GHWSYK（Che1）LRPG−NH2、＜GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
（Che1）γAbuSYSNleDHFdRWK−NH2、（Che1）γAbuNleDHFdRWK−NH2、
（Che1）NleDHFdRWK−NH2、
Ac−HSDAVFTENYTKLRK（Che1）QNleAAKKYLNDLKKGGT−NH2、
（Che1）γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
0003647881.tif 000014
＜GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
＜GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、＜GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、
NaldCpadWdSRKd（Che1）WKPG−NH2、＜GHWSYKd（Che1）LRPG−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、＜GHWSYK（Che1）LRPG−NH2、
AcK（Che1）FdCFWdKTCT−OH、AcK（Che1）DFdCFWdKTCT−OH、
AcK（Che1）FdCFWdKTCＴ−ol、AcK（Che1）DFdCFWdKTCＴ−ol、
（Che1）DFdCFWdKTCＴ−OH、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−ol、
Ｋ（Che1）KKFdCFWdKTCＴ−ol、Ｋ（Che1）KDFdCFWdKTCＴ−OH、
Ｋ（Che1）DSFdCFWdKTCＴ−OH、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−OH、
Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＤ−NH2、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−NH2、
Ｋ（Che1）KDFdCFWdKTCＴ−NHNH2、AcK（Che1）FdCFWdKTCＴ−NHNH2、
Ｋ（Che1）FdCFWdKTCＴ−ol、およびFdCFWdKTCTK（Che1）−NH2、
からなる群より選択され、ここで（Che1）が前記放射性金属元素結合部分である請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
放射性金属元素結合部分を含むペプチド溶液をスズイオンと接触させるステップであって、該結合部分が、以下の構造式：
0003647881.tif 000015
を含み、
ここで、R1、R2、またはR3の少なくとも一つがＨであることを条件として、R1、R2、およびR3が、Ｈ、C1−C6アルキル基、置換基を有するC1−C6アルキル基、シクロアルキル基、置換基を有するシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、ヘテロアリール基、置換基を有するヘテロアリール基、アルカリール基、および、ペプチド合成条件下で除去することができる保護基からなる群より独立に選択され、
R5、R7、R8、R9、およびR10が、Ｈ、C1−C6アルキル基、置換基を有するC1−C6アルキル基、アリール基、および置換基を有するアリール基からなる群より独立に選択され、R8とR9が一緒に、またはR7とR9が一緒に、シクロアルキル環、または置換基を有するシクロアルキル環を形成することができ、
R4とR6が一緒に直接的な結合を形成し、またはC1−C6アルキル基、置換基を有するC1−C6アルキル基、アリール基、および置換基を有するアリール基からなる群より独立に選択され、ここで前記置換基は、C1−C6アルコキシ基、C1−C6アルキルチオ基、C6−C12アリールC1−C6アルコキシ基、アラルキルチオ基、アミノ基、C1−C6アルキルアミノ基、C6−C12アリールC1−C6アルキル基、C6−C12アリール基、C3−C8シクロアルキル基、C3−C8シクロアルキルC1−C6アルキル基から選択され、
NR10が、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在することを特徴とするペプチド溶液をスズイオンと接触させるステップと、
該溶液を、188Re過レニウム酸塩、186Re過レニウム酸塩、99Tc過テクネチウム酸塩からなる群より選択される放射性核種に接触さるステップと、
該放射性標識されたペプチドを回収するステップと
を含む放射能標識されたペプチドを製造する方法。
【請求項４】
腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、血栓、アテローム硬化斑、または正常な器官もしくは組織を画像化し、治療するための、請求項１または２に記載の放射能標識されたペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、ペプチド鎖に連結した１個以上のアミノ酸側鎖またはセグメントが、放射性核種を含む金属元素イオンに緊密に結合することができるキレート部位を含んでいる、生物学的に有用な環状および非環状のペプチドの誘導体を提供する。標識されたペプチドは、レセプターや抗原などの特定のインビボの標的に金属元素を輸送し、放射線診断用の画像化、治療、および放射線治療に有用である。このペプチドを調製するための新しい方法も提供されている。
放射性標識されたペプチドは、ペプチドホルモンレセプターが過剰発現するという特徴をもつヒトのさまざまな疾病状態の診断および治療において有用である。すなわち、例えば、放射性標識されたLHRH（黄体形成ホルモン放出ホルモン）とソマトスタチンの放射性標識した類似化合物が、LHRHホルモンレセプターが細胞表面で過剰に発現するという特徴をもつホルモン感受性腫瘍に選択的に結合することが示されている。同様に、123I血管作用性腸管ペプチド（VIP）、99mTc−P829、111In−DTPAオクトレオチド、および111In−ビスMSH−DTPAなどのペプチドホルモン類似体を用いて、それぞれ、VIPレセプター、ソマトスタチンレセプター、ソマトスタチンレセプター、およびメラニン細胞刺激ホルモン（MSH）レセプターを過剰発現させるヒト腫瘍が画像化されている。Virgoliniら、Engl.J.Med.169巻:1116頁（1994年）;Virgoliniら、J.Nucl.Med.36巻:1732頁，（1995年）;Lister−Jamesら、J.Nucl.Med.,36巻,91頁，＃370,1995年  学会抄録;Pearsonら、J.Med.Chem.39巻:1361頁，（1996年）;Krenningら、J.Nucl.Med.33巻:652頁，（1992年）；およびWraightら、Brit.J.Radiol.65巻:112頁，（1992年）を参照のこと。
チロシンを含むペプチドの多くは、既知の方法によって125Iで標識し、レセプター結合実験に用いることができる。例えば、放射性リガンドとして125I−［Tyr10］−VIPを用いて、広範なタイプの癌におけるインビトロでのVIPレセプターのアップレギュレーションの発生が研究されている。Reubi,Nucl.Med.36巻:1846頁（1995年）を参照のこと。乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌、SCLC、星状細胞腫、グリア芽腫、髄膜腫、褐色細胞腫、リンパ腫、神経芽腫、腺腫、およびGEFの腫瘍を含む、広範なタイプの癌において、VIPレセプターが検出された。また、ヨウ素化されたVIP類似体である123I−［Tyr10］−VIPを用いて、ヒトにおけるVIPレセプターに富む腫瘍が画像化されてきた。Virgoliniら、前記参照。
しかし、放射性ヨウ素を、診断及び治療に利用するためインビボで用いることには、明らかな不都合がある。インビボで最も有用な123Iは、非常に高価（45.30ドル/mCi）で、サイクロトロンで製造しなければならない。さらに、この同位元素の半減期は、僅か13.2時間であるため、放射性ヨウ素化した画像化剤を使用すべき場所に、地理的に近接したところで製造される必要がある。診断および治療で用いるためには、それぞれ、99mTc、188Reなど、これ以外の放射性同位元素が好ましい。例えば、99mTcは、高価ではなく（0.5ドル/mCi）、容易に利用することができ（原子炉の産物である99Moから、発生機の中で製造される）、ガンマ線カメラで画像化するために理想的なガンマ線の放射エネルギーをもっている。
99mTcおよび188Reなどの放射性金属元素をペプチドに直接結合させる残基を、直接に含むか、またはそれの導入を許すペプチドがある。例えば、ソマトスタチンは、還元されると、99mTcに直接結合することができる、スルフヒドリル基を含むシステイン側鎖を２つ提供するジスルフィド結合を持っている。米国特許第5,225,180号を参照のこと。また、国際公開公報第94/28942号、国際公開公報第93/21962号、および国際公開公報第94/23758号も参照のこと。しかし、この型の複合体は、不均質で不安定な傾向にあり、臨床的な有用性には制限がある。その上、この態様における解離したスルフヒドリル基を使用することは、ペプチドを標識するために用いることのできる放射性金属元素を、解離したＳ−Ｈ基に緊密に結合する放射性金属元素だけに制限することになる。さらに、この方法には、金属元素がアミノ酸側鎖に直接結合するとペプチドの構造に大きく影響する可能性があり、これによって、化合物のレセプター結合特性が有害な方向に変化するという問題がある。
ほとんどのペプチドは、金属元素が結合するアミノ酸配列モチーフをもたず、また、前記したようなさまざまな理由で、そのようなモチーフの導入を可能にするような適当な配列の変更も受けつけない。したがって、ペプチドが放射性金属元素を結合できるようにする手段をペプチドに導入する必要がある。好ましい方法は、単一の明確で、安定した複合体が形成されるように、ペプチドの特定の部位に金属結合リガンドを付加させることである。金属元素を結合させるために用いられるリガンドは、しばしば、窒素、硫黄、リン、および酸素など、金属元素に強い親和性をもつ、さまざまなヘテロ原子を含んでいる。
キレート化合物は、従来、ペプチド部分とキレート部分を独立に合成した後、共有結合によって、ペプチド、またはペプチド類似体のＮ末端に付加させられてきた。例えば、Mainaらは、ソマトスタチン類似体のＮ末端にテトラ・アミン・キレート化因子を結合させて、ペプチドを99mTcで標識することを説明している。J.Nucl.Biol.Med.38巻,452頁（1994年）を参照のこと。しかし、ペプチドのＮ末端が、そのレセプター結合特性に重要な役割を果たしているときには、このようにして結合することは望ましくない。したがって、この方法を適用するには、ペプチドのＮ末端が、ペプチドの結合特性に有害な影響を与えることなく、（通常は、立体的に巨大な）キレート化因子を受け入れる必要があるということによる制約がある。
あるいは、キレート化因子は、特定のアミノ酸残基を含む部位選択的な反応という方法によって、ペプチド側鎖の中に導入されてきた。例えば、LHRHの６番目の位置のリシン残基は、キレート基によって直接アシル化されてきた。Bajasz,Sら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86巻:6313頁（1989年）を参照のこと。この方法は、一つ以上の側鎖がキレート因子と反応する可能性があるとき、または、ペプチド配列が、このような方法で誘導体化することのできるアミノ酸を含んでいないときには、利用できる化学的な選択性を持たないことによる制約を受ける。さらに、この方法には、多座配位のリガンドを用いるときにも制約を受けることがある。単一のリガンド分子が、複数のペプチド分子と反応して、かなりの量の架橋産物が生じることがある。
Dunn T.J.らが、国際公開公報第94/26294号で説明しているように、トリスアミノ酸によって、キレート化因子がペプチドの側鎖上に導入されている。この方法は、ペプチドを環化する方法を提示していない。この研究で記述されているリガンドを導入するために用いられた側鎖保護基は、一般的に、ペプチドアミド環状化に用いられる保護基と同じものである。Felixら、Int.J.Peptide Protein Res.32巻:441頁（1988年）。
完全に保護されたBAT（ビスアミノチオール）キレート化因子が合成されて、リシン残基の側鎖に結合されて、その後、ペプチドの中に取り込まれた。Deanら、国際公開公報第93/25244号を参照のこと。これらの完全な保護された前駆体は、非常に時間がかかり、高価で、調製に手間がかかる。このような前駆体を調製するのは困難で高価なため、この方法は、金属元素をもつ標的因子を設計するのに必要な、さまざまなリンカーに付着したリガンドの多様な配列を調製するのには適さない。
この問題を解決する可能性がある方法は、ペプチド鎖の特定の位置に、キレート化因子部分を選択的に結合させる保護基法を用いることである。しかし、ペプチドのアミノ酸側鎖に存在するさまざまな化学反応性が、保護基の部位特異的な脱保護における充分な選択性を発揮することを困難にしている。また、これまで、この選択性の欠如によって、ペプチドの中の二つ以上の異なった官能基を、例えば、環状ペプチドの中のこれらの基を結合させるために選択的に脱保護しようとする努力が阻まれてきた。
Edwardsら、J.Med.Chem.37巻:3749頁（1994年）は、樹脂上に環状のジスルフィドを集合させてから、そのままのリガンド（DTPA）を付加させるフラグメント法を開示している。この方法によって、既知のソマトスタチン標的因子DTPA−オクトレオチドが作り出される。この方法は、既知の化合物を調製するために特別に設計されたものである。しかし、より典型的な状況では、特定の標的への結合を最適化するために、さまざまな標識ペプチドが必要とされる。したがって、このような状況では、多数のリガンドを集合させ、最もよく集合して断片となったものを、ペプチド配列のさまざまな位置で環化することもできる配列の望ましい位置に置くことができる、より広範な方法を必要とする。
金属元素に選択的に結合することのできるペプチドを合成するために、さらに考慮すべきことには、ペプチドの構造に対するキレート化合物の効果が含まれる。効率的なレセプターの結合には、通常、ペプチドが特定の構造をとる必要があるが、ほとんどのペプチドは、構造的に非常に変化しやすい。ペプチドが、特定の構造をとることができるか否かは、共有的に結合したキレート部分の効果を含む、電荷と親水性／疎水性の相互作用によって影響を受ける。ペプチドがとることのできる構造を限定すること、好ましくは、活性のある構造に固定することによって、ペプチドレセプターの親和性と選択性を高めることが可能である。このことは、環状ペプチドを調製することによって、しばしば、最も容易に実現される。環状ペプチドには、さらに、プロテアーゼに対する抵抗性が向上するという利点があり、そのため、しばしば、対応する直鎖状ペプチドよりも長い生物学的な半減期を示す。
ペプチドは、ジスルフィド結合、スルフィド結合、および、特に、Ｎ末端およびＣ末端、またはアミノ酸側鎖のカルボキシ官能基とアミノ官能基との間でのラクタム形成など、さまざまな方法によって環化することができる。しかし、ペプチド鎖内の官能性が過多であるということは、一般的に、最短のペプチド以外の全てのペプチドにとって、２つの望ましい官能基の間で選択的な結合を行なわせることは非常に難しいことを意味している。
このように、レセプターに対する高度の親和性によって特異的に結合する能力を保持しながら、金属イオンをキレートすることができる環状ペプチドが非常に望ましいことは明らかである。ペプチド鎖の中の予め決められた位置に、キレートする部分を付加する方法をもつことと、ペプチド鎖の中の２つの予め選ばれた位置の間で環状ペプチドを選択的に形成させる方法をもつことも望ましい。さらに、ペプチド合成過程の望ましい段階で、キレートする部分をペプチドに結合させることのできる方法を利用できることも望ましい。
発明の概要
このように、ペプチドレセプターへの特異的に結合する能力を保持しながら、放射性核種に結合することのできるペプチドを提供することが本発明の目的である。さらに、ペプチドレセプターへの特異的に結合する能力を保持しながら、放射性核種に結合することのできるペプチドを調製し、放射性標識する方法を提供することも本発明の目的である。なお、さらに、腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、血栓、アテローム硬化斑、または正常な器官もしくは組織を画像化もしくは治療するために、放射性標識したペプチドを用いる診断方法と治療方法を提供することが本発明の目的である。
前記の本発明の目的を達成するにあたって、本発明の一つの側面にしたがって、放射性金属元素結合部分を含むペプチドで、該結合部分が、次の構造式Ｉを含むペプチドが提供されていた：
0003647881.tif 000002
ここで、R1、R2、またはR3の少なくとも一つがＨであれば、R1、R2、およびR3は、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロアリール基、アルカリール基、および、ペプチド合成の状態では除去することができる保護基からなる群より独立に選択される。R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10は独立に、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より選択されるか、または、選択的には、R4とR6が、直接的な結合を形成する。R8とR9が一緒に、またはR7とR9が一緒に、シクロアルキル環、または置換されたシクロアルキル環を形成してもよく、NR10は、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または、該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在している。
本発明の好ましい態様においては、R1がＨ、R3がＨ、R4がＨであるか、または、R4とR6が一緒になって直接的な結合を形成している。別の好ましい態様においては、R2は、低級アルキル基であるか、または、置換された、もしくは置換されていないフェニル基であり、または、より好ましくは、メチル基か、またはフェニル基である。別の好ましい態様においては、R8とR9はメチル基である。
本発明のもう１つの側面によると、さらに、ペプチドは、結合した金属元素を含む。好ましい態様において、この金属元素は、99mTc、186Re、または188Reである。
本発明のさらにもう１つの側面によると、金属元素をキレートする組成物を調製する方法で、結合部分が上に示されている構造をもっている放射性金属元素結合部分をもつペプチドの溶液をスズイオンと接触させ、続いて、この溶液を放射性核種に接触させてから、放射性標識されたペプチドを回収する方法が提供されている。この方法の好ましい態様において、放射性核種は、188Re−もしくは186Re−過レニウム酸塩、または99Tc−過テクネチウム酸塩である。
さらにもう１つの本発明の側面によると、腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、血栓、アテローム硬化斑、または正常な器官もしくは組織を画像化する方法で、放射性標識されたペプチドを、ペプチドが上で示されている構造をもつ放射性金属元素結合部分を含むとき、ペプチド溶液をスズイオンと接触させてから、該溶液を放射性核種に接触させて、放射性標識されたペプチドを回収することによって調製して、放射性標識されたペプチドを、人間の患者に、薬学的に許容できる担体とともに投与し、該放射性標識ペプチドが局在して、非標的のバックグランドがきれいになるのに十分な時間を置いてから、該放射性標識ペプチドを付加した部位を、外部にある画像化カメラによって検出する方法が提供されている。
本発明の別の側面によると、（Che1）が、上記の構造をもつ放射性金属元素結合部分であるときに、
（Che1）γAbuNleDHFdRWK−NH2、
（Che1）γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
KPRRPYTDNYTRLRK（Che1）QMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
HSDAVFTDNYTRLRK（Che1）QMAVKKYLNSILN−NH2、
〈GHWSYK（Che1）LRPG−NH2、〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
（Che1）γAbuSYSNleDHFdRWK−NH2、（Che1）γAbuNleDHFdRWK−NH2、
（Che1）NleDHFdRWK−NH2、
Ac−HSDAVFTENYTKLRK（Che1）QNleAAKKYLNDLKKGGT−NH2、
（Che1）γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
0003647881.tif 000003
〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、
NaldCpadWdSRKd（Che1）WKPG−NH2、〈GHWSYKd（Che1）LRPG−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、〈GHWSYK（Che1）LRPG−NH2、
AcK（Che1）FdCFWdKTCT−OH、AcK（Che1）DFdCFWdKTCT−OH、
AcK（Che1）FdCFWdKTCＴ−ol、AcK（Che1）DFdCFWdKTCＴ−ol、
（Che1）DFdCFWdKTCＴ−OH、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−ol、
Ｋ（Che1）KKFdCFWdKTCＴ−ol、Ｋ（Che1）KDFdCFWdKTCＴ−OH、
Ｋ（Che1）DSFdCFWdKTCＴ−OH、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−OH、
Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＤ−NH2、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−NH2、
Ｋ（Che1）KDFdCFWdKTCＴ−NHNH2、AcK（Che1）FdCFWdKTCＴ−NHNH2、
Ｋ（Che1）FdCFWdKTCＴ−ol、およびFdCFWdKTCTK（Che1）−NH2、
からなる群より選択される構造をもつペプチドが提供されている。
この他の、本発明の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるはずである。しかし、この詳細な説明から、本発明の意図と範囲の中で、さまざまな変更と修正ができることが当業者に明らかになるため、詳細な説明と特異的な実施例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、例示のためだけに与えられいると理解されるべきである。
詳細な説明
本発明は、ペプチド、環状ペプチド、およびペプチド類似化合物に共有結合できる新規のキレート化部分を提供する。このキレート化部分は、ペプチド、環状ペプチド、およびペプチド類似化合物を、金属元素、特に放射性金属元素に安定して結合させる。これらのキレート化因子、ペプチド、およびペプチド類似化合物を調製する方法も提供されている。このペプチド、およびペプチド類似化合物は、固相法、または液相法によって合成されるペプチドの中に、金属元素キレート化因子を部位特異的に導入することによって調製される。キレート化部分は、ペプチド鎖の中のアミノ酸の、アミド基をもつ側鎖に付加されているか、または、ペプチドのＮ末端に付加されている。本発明に係るペプチドには、LHRHの環状金属元素結合類似体、血管作用性腸管ペプチド（VIP）、ヘレグリンズ（erbB結合ペプチド）α、β１、β２、およびβ３、メラノトロピン（α−MSH）、ソマトスタチン、カルシトニン、上皮成長因子、ゴナドトロピン放出ホルモン、ヘレグリンズ成長ホルモン放出ホルモン、ダイノルフィン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、バソトシン、メソトニン、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコトロピン、ゴナドトロピン、プロラクチン、バソプレシン、オキシトシン、Ｐ物質、Ｋ物質、およびアンギオテンシンが含まれるが、これらに限定はされない。
キレート化部分は、次の一般的で表すことができる。
0003647881.tif 000004
ここで、R1、R2、およびR3は、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロアリール基、アルカリール基、および、ペプチド合成の状態では除去することができる保護基からなる群より独立に選択される。R1、R2、またはR3の少なくとも一つはＨでなければならない。R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10は、独立に、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より選択される。R4とR6は、一緒に、直接結合を形成することもでき、また、R8とR9が一緒に、またはR7とR9が一緒に、シクロアルキル環、または置換されたシクロアルキル環を形成することができる。NR10は、キレート化因子が付加される、該ペプチドのＮ末端に存在するか、または、該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在している。R1、R2、R3またはR6が、ヘテロ原子に置換される官能基を持っているときには、さらに別のペプチド結合反応を行なうために、このヘテロ原子を用いることもできる。
低級アルキル基の例には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、およびｎ−ヘキシル基のような、直鎖または分枝状のC1−C6アルキル基が含まれるが、これらに限定はされない。シクロアルキル基には、シクロヘキシル基などのC3−C6シクロアルキル基が含まれる。ヘテロシクロアルキル基には、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピロリジン、およびピペレジンが含まれる。ヘテロアリール基には、ピロリル基、フラニル基、チエニル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、オキサゾリルチオ基、チオゾリル基、ピラゾリル基、ピロリジニル基、ピリジニル基、ピリミジニル基、モルホリニル基、およびピペリジニル基が含まれる。アリール基には、フェニル基、α−ナフチル基、またはβ−ナフチル基などのC6−C12アリール基が含まれる。
アルカリール基には、フェニルC1−C6アルキル基などの、C6−C12アリールC1−C6アルキル基、または、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、α−もしくはβ−ナフチルメチル基、ナフチルエチル基、ナフチルプロピル基、ナフチルブチル基、またはナフチルペンチル基などの、α−もしくはβ−ナフチルC1−C6アルキル基が含まれる。
置換基の例には、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などのC1−C6アルコキシ基、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基などのC1−C6アルキルチオ基、例えば、ベンジルオキシ基のようなフェニルC1−C6アルコキシ基などの、C6−C12アリールC1−C6アルコキシ基、例えば、ベンジルチオ基のようなフェニルC1−C6アルキルチオ基などのアラルキルチオ基、アミノ基、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基のようなC1−C6アルキルアミノ基などの、置換されたアミノ基、例えば、ベンジル基などのフェニルC1−C6アルキル基のような、C6−C12アリールC1−C6アルキル基、フェニル基などのC6−C12アリール基、シクロヘキシル基などのC3−C8シクロアルキル基、およびシクロヘキシメチル基などのC3−C8シクロアルキルC1−C6アルキル基が含まれる。
本発明の好ましい態様には、R2がＨ、メチル基、またはフェニル基であり、R8およびR9がメチル基である化合物が含まれる。この他の好ましい態様は、R1、R3、R5、R7、およびR10がＨの場合である。
このペプチドは、いずれかのアミノ官能基が選択的に脱保護されているかもしれない、特異的に保護されたビス−アミノ酸誘導体を用いて合成することができる。常法のペプチド結合法によるペプチド合成過程で、伸長しているペプチド鎖の中に、これらの誘導体を導入する。そして、アミノ官能基の一つを脱保護し、続いて、キレート化分子の全部、または一部を結合させるか、または、ペプチド合成を続けるために、さらに、アミノ酸残基を付加させる。従来のアミドバックボーンをもつペプチドを作出するよう、α−アミノ基で結合させるか、または、アミドバックボーンが側鎖構造によって中断されているペプチドを産生するために、側鎖のアミノ基で結合させて、ペプチド合成を続けることができる。あるいは、解離したアミノ官能基を用いて、ペプチドのいずれかの位置にある反応性の官能基と環状化して、それによって、環状ペプチドを産生することができる。当業者には、適当なビス−アミノ酸は、一見して明らかであり、リシン、オルニチン、および2,3−ジアミノプロピオン酸（アミノ−セリン）が含まれる。あるいは、樹脂に結合しているペプチドの、脱保護したＮ末端にキレート化部分を結合させることによって、ペプチド合成の最後にキレート化部分を導入することもできる。キレート化部分は、保護された形態にしても、脱保護された形態にしても、完全なユニットとして付加するか、または、完全なキレート化構造を構築するような段階的方法で合成することができる。
本発明において用いられるビス−アミノ酸は、一般的に、化学式:ZHN−CH（−Ｒ−NHY）−CO2Hで表される。但し、Ｒは、Ｘが、Ｏ、Ｓ、またはＮのヘテロ原子で、ｎ＝１〜20のときに、（CH2）ｎ、または（CH2）ｎ−Ｘ−（CH2）ｎである。あるいは、CH2基の水素原子を、低級アルキル基、置換された低級アルキル基もしくはアルケニル基、または、シクロヘキサン、ベンゼン、およびピペルミジンなどの、環状もしくはヘテロ環状環、または、当業者に周知の、その他の基によって置換することができる。置換基Ｚ及びＹは、それぞれ独立に、Ｈ、Ｎ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、または置換されたアリール基とすることができる。
ペプチド合成を続けた場合、キレート化部分を導入するために、ペプチド合成過程のいかなるところにおいても、ビス−アミノ酸の第２のアミノ基を選択的に脱保護することができる。ペプチドに結合させる前に、完全なキレート化部分を合成するか、または、連続的に、ペプチドに分節を結合させて、完全なキレート化部分を合成することができる。全部のペプチド／キレート化因子構造の組み立てが完成したら、切断、脱保護、および精製によって、望ましいペプチド誘導体が作出される。そして、放射線診断及び放射線治療への応用で用いるために、この誘導体を放射性金属元素で標識する。
あるいは、全部または一部のキレート化分子が、まず、脱保護されたアミノ酸基に結合する場合には、第２段階は、その他のアミノ基を脱保護して、ペプチド合成を継続させることである。この段階で、一部のキレート化分子だけがペプチドに結合するのであれば、適当な脱保護と結合反応によるペプチド鎖合成の最中、またはその後のいかなる時点でも、キレート化因子の合成を完了させることができる。切断、脱保護、および精製の最終段階で、再び、純粋なペプチド誘導体が得られるので、これを、前記のように放射性標識する。
樹脂から切断する前に、キレート化因子をペプチドに付加すると、DTPA−二無水物などの活性化された多座配位のキレート化因子が用いられたときでも、架橋された産物の形成が減少する結果になる。
ペプチド配列の特定の位置において、２つの親和性のある官能基部分を選択的に脱保護し、続いて、この親和性のある部分の間を環化することによって、環状ペプチドの調製が行なわれる。Ｎ末端とＣ末端の間、末端と、ペプチド配列内の中間にある官能基との間、または中間にある２つの官能基の間など、ペプチド配列のいずれの２つの部位の間でも環化を行なうことができる。液相、または固相のペプチド合成のいずれかを用いて、環化を行なうことができるが、好ましくは、固相技術を用いて実施される。
最終的な脱保護反応の前に、ペプチド合成過程のいずれの時点でも、脱保護と環化を行なうことができる。例えば、環化する前に、全体を保護したペプチド配列を調製するか、または、保護されたペプチド中間体について環化を行なって、その後、合成を完成することができる。同様に、金属元素キレート化部分の全部または一部をペプチドに結合させる前か後に、環化を行なうことができる。光学的に切断可能な樹脂、または、当業者に既知の別の樹脂を、固相ペプチド合成機で用いると、固相担体から保護されたペプチドを解離させることもでき、続いて、液相で選択的な脱保護と環化を行なうことができる。あるいは、樹脂から切断する前に、環化すべき側鎖を選択的に脱保護し、液相中で環化を行なうことができる。
環化反応を含むが、それに限定されない、ペプチドのＣ末端に関わる反応を、上記した態様で、樹脂から保護されたペプチドを解離させることによって行なうことができる。あるいは、伸長中のペプチド鎖を、ある残基の側鎖、および、適当に保護されたＣ末端のカルボキシ基によって、樹脂に付着させることができる。Ｃ末端のカルボキシ基との反応が望ましいときには、それを選択的に脱保護して、反応を進めるようにする。環化反応の場合には、Ｃ末端の脱保護は、親和性のある反応基を脱保護する前、途中、または後に行なうことができる。
放射性金属元素をキレートする、本発明のペプチドは、血液、および、その他の体液ならびに組織の中で、放射性核種を安定して保持する。本方法における試薬と条件の両者とも、先行する技術よりも大幅に簡易化されており、標識されたペプチドは、テクネチウム、またはレニウム標識を用いた放射線診断と放射線治療に応用するのに、特に適している。
上に概述した方法によって、ペプチド配列のどこかに放射性金属元素結合部分を設けることができる。直接に、またはスペーサー基によって、アミノ酸側鎖上にキレート化部分を設置することには、ペプチドのバックボーンから金属元素複合体を空間的に離しておくことができ、それによって、ペプチドの構造に対する金属元素複合体の効果を最小にできるという、さらなる利点がある。また、これによって、必要ならば、ペプチドのＮ末端をペプチドの環化に用いることができるようになる。
ペプチドの構造が、電荷、および親水性／疎水性の相互作用によって大きく影響を受けることが知られているため、ペプチドに用いるべきキレート化リガンドを設計するときには、これらの変数を考慮することが重要である。さまざまな電荷と親水性をもち、さまざまな長さスペーサー基をもつ、さまざまなキレート複合体を調製、試験して、標的選択性、薬物動力学、およびキレート安定性の最適な組合せを示す金属元素複合ペプチドを選択する。当業者は、このような試験が当技術分野において日常的な作業であると認識していよう。
本発明の放射性標識ペプチドは、高いレセプター密度と、ペプチドに対する高い親和性とを示す、病気の細胞、または組織に対して特異的に結合する。放射性核種の放射活性によって、腫瘍、または病気の組織の診断、および／または治療が可能になる。また、本発明には、有効用量の本発明の放射性標識ペプチドを少なくとも一つ、例えば、Remingtonの薬剤科学；薬物レセプターとレセプター理論（Pharmaceutical Science;Drug Receptor and Receptor Theory;18巻.,Mack Publishing株式会社Easton,PA 1990年）に記載されているような薬学的に許容できる滅菌された賦形劑とともに含む薬学的組成物も含まれる。また、本発明には、臨床環境において用いるのに便利で簡易な、ペプチドを標識するためのキットも含まれる。
A.キレート化部分を組み込んだ直鎖状ペプチド類の設計及び合成
（ｉ）一般
本発明のペプチド類は、少なくとも１個のチオール又はチオカルボニル基の存在を特徴とする放射性金属キレート化アミノ酸誘導体類と、さらに第三級アミン、ヒドラゾン、又は第二級アミンもしくはヒドラジンのいずれかとして存在する少なくとも１個の窒素とを含有している。金属イオンを堅固かつ優先的に結合できる多座配位子を形成するために、硫黄及び窒素原子が適切に配置されている。多座配位子はさらに、ペプチドの残りからキレート化金属を分離するのに役立つスペーサー基を含有することもできる。好ましくは、金属イオンは還元放射性核種であり、好ましい実施態様では99mTC、186Re、又は188Reである。
本発明はさらに、ペプチド配列のどこかの個所で他の金属のための配位子を配置するための方法を提供する。これらの配位子には例えばDTPAを無傷で、又は断片として導入できる。この方法を用いると、ペプチド標的配列中に医学的に重要なIn、Ga、Ｙ、Cu、Pt、Mn、Gd、Au、Ag、Hg、及びLuを含むがそれらに限定されないその他の金属に対する配位子を配置できる。
本方法は、ペプチド合成に対して適切に保護されたあらゆる金属キレート又はキレート断片の導入を可能にする。本方法はさらに又、それが合成の最後に導入される限りにおいて、ペプチド配列のどの個所にも配置できる塩基感受性配位子誘導体類を導入するための方法も提供する。１つの例は、次の配位子断片トリチル−Ｓ−COCH2N（Boc）CH2CO2Hを使用してリシンの側鎖へ付加された配位子の合成である。Ｓ−トリチルエーテルは塩基に対して高感度であろうから、合成における余り早期にペプチド上にこの配位子断片を配置するのは不可能であろう。
本発明の各キレート化部分は、有機合成の分野の当業者にはよく知られている方法によって調製できる。キレート化部分はアミノ、ヒドラジノ又はヒドラジド官能基と活性化カルボキシル基との縮合、ヒドラジン類とアルデヒド類との結合、又はアミン類とアルデヒド類との間の還元アミン化反応のような単純な結合又は縮合反応によって連結されているサブユニット類から構築する。本書で使用されている用語「縮合」は、キレート化部分のサブユニット類を一緒に結合する反応を含んでいることが意図されているので、従って縮合反応の伝統的定義に一致する反応に加えて還元アミン化のような反応を含んでいる。
縮合反応の後に、サブユニット上の追加の官能基類は追加の縮合反応が可能になるように保護を除去することができる。例えば、遊離カルボキシル基と保護されたアミノ官能基とを持っている第２サブユニットは、より大きな適切に保護された金属結合配位子の断片を産生するために第１サブユニット上でアミノ、ヒドラジノ、又はヒドラジド官能基と一緒に縮合することができる。第２サブユニット成分上のアミノ官能基はその後保護を除去して、さらに第３サブユニットに結合させることができる。本書で使用されている用語「断片」は、金属結合配位子の全部又は一部を含んでいるサブユニット又はサブユニットのアッセンブリーを含んでいることが意図されている。
そうした縮合反応のためにカルボキシル基を活性化する方法は、有機合成及びペプチド合成の分野における当業者にはよく知られており、活性エステル類及びカルボジイミド及びホスホリルアジド結合剤の使用を含んでいる。官能基の反応性がサブユニットを結合するために使用される反応又はペプチド鎖の合成のために使用される反応と不適合である場合は、サブユニット上の官能基を保護するために適切な保護剤を使用する。メルカプト、アミノおよびカルボン酸官能基に対する保護基は技術分野においてよく知られている。例えば、Greeneの有機合成における保護基（PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTESIS;Wiley Interscience,NY,1981年）を参照。キレートを構成するために使用されるサブユニットは、技術分野においてよく知られている方法によって容易に調製するか、又は例えばアドヴァンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech,Lexington,KY）、ミリゲン社（Milligen,Burlington,MA）、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems,Foster City,CA）、又はアルドリッヒ・ケミカル社（Aldrich Chemical Corp.,Milwaukee,WI）のような供給業者から市販で入手できる。
キレート試薬サブユニットを一緒に結合するために使用する縮合反応は，ペプチド合成の前に、又はペプチド配列の合成中のどちらかに実施できる。ペプチド合成の前にアミノ酸誘導体をそのサブユニットから集合させる場合は、α−アミノ及びα−カルボキシル官能基を引き続いて選択的保護除去及びペプチド合成を行うためのこれらの官能性の活性化と適合する方法で適切に保護しなければならない。そうした保護基の例は技術分野においてよく知られているが、アミノのための保護基には、フルオレンメチルオキシカルボニル（Fmoc）、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、ブトキシカルボニル（Boc）、アリルオキシカルボニル（aloc）、４−メトキシトリチル（mtt）、及び１−（4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘクス−１−イリデン）エチル（Dde）基が含まれている。カルボキシルの保護基にはメチル（Me）、ベンジル（Bn）、‘ブチル（‘Bu）、及びアリルエステル類が含まれている。
アミノ及びカルボキシルの保護基は、他の基の存在下では各々から選択的に保護を除去できるように選択しなければならない。そうした保護部分は直交性であると言われる。直交性保護基が使用される要件は、例えばベンジルエステルとして保護されたカルボキシル基の存在下では、アミノ官能基を保護するためのCbz基の使用を前もって排除する。上記のGreeneを参照。好ましい実施態様では、α−アミノ基はFmoc基として、α−カルボキシル基はメチルエステルとして保護される。本発明の化合物において使用されるチオール保護基は、タンパク質の活性を実質的に変化させずにペプチドの存在下で遊離スルフヒドリルを再生する温和な条件下で容易に除去されるあらゆる有機基又は無機基であってよい。適切な保護基は上記のGreene、193−217頁に列挙されている。適切な保護基の例には、置換又は非置換トリチル基類、チオールエステル類、チオカルバメート類及びジスルフィド類が含まれている。好ましい実施態様では、チオール保護基はトリチル基又は４−メトキシトリチル基である。当業者は、チオール基を保護する、又は保護を除去する方法に熟達している。例えば、安息香酸チオエステル類はヒドロキシルアミンを使用して温和かつ選択的条件下で保護を除去することができる。保護されたキレート化部分の集合が完了すると、α−カルボキシ官能基の保護が除去され、ペプチド合成の従来型方法を用いてペプチド鎖のアミノ末端へ結合させられる。Bodanszkyらのペプチド合成の実践（THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS,Springer Verlag,Heidelberg,1984年）参照。
ペプチド合成中に金属キレート化アミノ酸誘導体がそのサブユニットから集合させられる場合は、ペプチド鎖は従来型液相法によって、又は好ましくは誘導体が組み込まれる個所まで固相合成法によって集合させる。個別に保護されたビス−アミノ酸はその後ペプチド鎖のアミノ末端へ結合させる。引き続いて誘導体中のアミノ基の１つから選択的に保護を除去すると、ペプチド合成又はキレート試薬合成のどちらかの継続が可能になる。
最初にα−アミノ官能基の保護を除去する場合は、残っているアミノ酸残基の全部又は一部をその後従来型方法でペプチド鎖に結合させる。その後で誘導体の側鎖アミノ官能基の保護を除去し、上記のようにキレート化部分が集合させる。その後に完全ペプチドの保護を除去し、標準方法によって精製する。
最初に側鎖アミノ官能基の保護を除去する場合は、その後キレート化部分の全部又は一部を上記のように集合させ、その後にα−アミノ基の保護の除去を行う。ペプチド合成は上記のと同様の従来型方法で完了する。
ペプチド合成が完了したら、完全に保護されたペプチドの保護を除去して精製する。合成ペプチド類から保護を除去して精製する方法は技術においてよく知られている。例えば、上記のBodanszkyを参照。ペプチドが固相法によって合成した場合は、ペプチドはさらに合成のための固相担体として使用した樹脂から開裂させなければならない。この開裂を達成するための方法も又技術においてよく知られている。本発明のペプチド類のような合成ペプチド類を精製するための方法も又当業者にはよく知られている。そうした方法には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、及び逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HPLC）が含まれる。本発明の好ましい実施態様では、ペプチドは予備スケールのオクタデシルシラン（CIB）シリカカラムパッキンを用い、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）中に溶解させたアセトニトリルの勾配を用いて溶離させるRP−HPLCによって精製する。ペプチドの純度は、分析的RP−HPLC又はキャピラリー電気泳動法のような標準方法によって確認できる。ペプチドの同一性は、NMR分光検査法、又は本発明の好ましい実施態様では質量スペクトロメトリーによって確認できる。
上述のように、キレート化部分が適切な受容体へのペプチド結合を妨害しないことが重要である。受容体結合に有害な影響を及ぼさずに置換できるペプチド内の残基の測定は、各連続残基が例えばアラニンと置換される一連のペプチド類を調製すること（「アラニンスキャン」）によって、系統立った簡単な方法で実行できる。その後、アラニン置換ペプチド類を生物学的活性についてスクリーニングする。最新のペプチド合成機はこの方法で極めて簡単にペプチド類の合成を行うので、当業者にとっては極めて多数のペプチド類をスクリーニングすることは日常の作業である。そうしたアラニン置換を含有しているペプチド内の高い受容体結合親和性の保持は、置換アミノ酸が受容体結合にとって余り重要ではないことを意味しており、金属結合残基を置換できる位置を示している。その後はこれらの位置の各々でキレート試薬が配置されているペプチド類を合成することは簡単で、日常のスクリーニングによってキレート試薬にとっての至適位置を確認できる。
上述のように、本発明の方法を使用すると、金属結合配位子を含有している極めて多数のペプチド類を調製することができる。クレームされた発明の方法を使用して金属キレート化ペプチド類を調製する追加の方法は当業者には明白になるであろう。本発明をさらに詳細に例示するために、これらの方法を使用する特異的適用を下記に記載するが、これらの実施例は単に例示的なものであって、本発明の適用の範囲を制限することを意味していないことは理解されるであろう。
（ii）キレート化部分の調製
好ましい実施態様では、キレート試薬はチオール基と一緒にチオセミカルバジド又はチオセミカルバゾン基を含有しており、下記の一般式Ｉによって表すことができる：
0003647881.tif 000005
ここで、R1、R2及びR3は独立してＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリル及びペプチド合成の条件下で除去できる保護基からなる基から選択される。R1、R2、又はR3のうちの少なくとも１つはＨでなければならない。R4、R5、R6、R7、R8、R9及びR10は独立してＨ、低級アルキル、置換低級アルキル、アミド及び置換アミドからなる基から選択される。R4及びR6は又一緒に任意で直接結合を形成していてもよく、R8及びR9、又はR7及びR9は一緒にシクロアルキル又は置換シクロアルキル環を形成していてもよい。NR10は、キレート試薬が付加されているペプチドのＮ−末端に位置しているか、又はペプチドのアミノ酸側鎖上に位置している。R1、R2、R5又はR6がヘテロ原子置換官能基を持っている場合は、ヘテロ原子は又追加のペプチド結合反応を実施するために使用されてもよい。
本発明を実施するためにキレート化部分による金属結合のメカニズムを理解することは必要ではないが、いかなる理論を結びつけることを願わなくとも、金属は２個の硫黄原子プラス２個の窒素原子によってキレート試薬へ結合されると考えられている。金属結合性窒素類はβ−チオール含有アミノ酸のα−窒素とチオカルボニル基に遠位のチオカルバジド／チオカルバゾン窒素であると仮説が立てられている。金属が還元放射性過レニウム酸塩又は還元放射性下テクネチウム酸塩である場合は、２個の硫黄原子及び２個の窒素原子が金属上の４つの配位位置を提供する。
これらの化合物は有機合成の分野においてよく知られているによって調製することができる。そこで、例えば式Ｉを有する化合物は、保護された、又は保護されていないβ−チオール含有側鎖（「システイン型アミノ酸」）を有するα−カルボキシル保護アミノ酸部分とカルボキシル含有チオセミカルバゾン又はチオセミカルバジド部分との間のアミド結合によって調製できる。この結合は、カルボジイミド媒介結合のようなよく知られている方法を使用して実施できる。アミノ酸からα−カルボキシル基の保護を除去するとキレート化部分がペプチドのアミノ側鎖又はアミノ末端へアミド結合することが可能になる。或いは又、側鎖を含有しているβ−チオールを有するＮ−及びＳ−保護システイン型アミノ酸は最初にペプチドへ結合させ、その後にＮ−の保護を除去し、さらにカルボキシル含有チオセミカルバゾン又はチオセミカルバジド成分へアミド結合させてもよい。
システイン型アミノ酸はアミノ酸合成の標準方法によって調製できる。α−炭素での立体配置は（Ｒ）又は（Ｓ）であってよく、又はアミノ酸はブドウ酸であってよい。同様に、β−炭素での立体配置は、非対称的に置換された場合は（Ｒ）、（Ｓ）であるか、（R/S）であってよい。アミノ酸は、標準方法を用いてその後の結合反応のために保護する。
チオセミカルバゾン類は、セミカルバジド類とカルボニル化合物との縮合によって調製できる。例えば水素化ホウ素ナトリウムを用いてチオセミカルバゾン類を還元させると、置換チオセミカルバジド類が生じる。好ましい実施態様では、チオセミカルバジドはグリオキシル酸と反応して対応するチオセミカルバゾンを形成するが、これを任意で還元させると置換チオセミカルバジドが形成される。
多数のチオセミカルバジド類は、例えばアルドリッヒ社（Aldrich Chemical Company,Milwaukee,WI）から市販で入手できる。その他のチオセミカルバジド類は、ヒドラジンと例えばイドチオシアン酸塩との反応によって調製できる。非対称的に置換されたヒドラジン類もまた市販で入手できるか、又はアミンをニトロサミンへニトロ化し、その後にヒドラジンへ還元することによって調製できる。イソチオシアン酸塩はアミンとチオホスゲンとの反応によって調製できる。その他のチオセミカルバジド類の調製方法は当業者にはよく知られている。
一部の例では、チオセミカルバジド類はシステイン型アミノ酸への結合のために使用される溶媒類への溶解性が低いことが発見されている。そうした場合は、チオセミカルバゾンを使用し、その後にペプチドへ結合させることによって結合を実施できる。次に、チオセミカルバゾンは水酸化ホウ素ナトリウムまたは他の適切な還元剤を用いて還元され得る。チオセミカルバジドが直接使用できるほど十分に溶解性の場合は、結合の前に最初にα−窒素を保護しなければならない。適切な保護基は技術においてよく知られており、Boc及びCbz基が含まれる。
（iii）直鎖状VIP受容体標的物質
天然に発生するVIPは下記の配列を有している：
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
アラニンスキャンによって、アラニンとの置換が受容体結合に大きな影響を及ぼさない数個の残基が判明した。これらの残基には、Lys−15、Gln−16、Val−19、Lys−21、Asn−24、Ser−25及びＮ及びＣ末端が含まれる。これらの場所は本発明に記載の金属結合配位子を付着させる可能性がある部位である。
これらの場所での金属結合配位子の付着に基づくキレート誘導体類には、リシン又は他のビス−アミノ酸残基の側鎖アミンによって薬作用発生団へ直接に、又はスペーサー基によって付着させられている金属結合成分を含む誘導体類が含まれるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が含まれるが、これらに限定されない：
MaGCγAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
AcCGCHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
KPRRPYTDNYTRLRK（PtscGC）QMAVKKYLNSILN−NH2
MaGCγAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
AcCGCVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
MaGCγAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
HSDAVFTDNYTRLRK（PtscGC）QMAVKKYLNSILN−NH2
HSDAVFTDNYTRLRK（Dtpa）QMAVKKYLNSILN−NH2
HSDAVFTDNYTRLRK（AGC）QMAVKKYLNSILN−NH2
ここで、Maはメルカプト酢酸であり、
PtscGは２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸もしくはPhNHCSNHNHCH2CO2Hであり、
γAbuはγ−アミノブチル酸であり、及び
Ｋ（PtscGC）においては、括弧は封入されたアミノ酸類がリシンのεアミンへ付着させられており、付着した第１アミノ酸が、その後にPtscGの続くＣであることを意味している。
上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と置換できる。
（iv）直鎖LHRH受容体標的物質
天然に発生するLHRHは、〈GHWSYGLRPG−NH2（ここで、＜Ｇはピログルタミン酸（pyroglutamic acid）である）という配列を有している。さらに、次の二環式ペプチド
AcNaldCpadWd（cyclo4−10）Ｄ（cyclo5−８）ERdLKPDap−NH2
（ここで、Wdはアミノ酸のＤ異性体が使用されていることを示しており、Nalは２−ナフチルアラニンであり、Cpaは４−クロロフェニルアラニンであり、Dapは2,3−ジアミノプロピオン酸である）がLHRH受容体に結合することはよく知られている。Bienstockら,J.Med.Chem.36:3265（1993）を参照。さらに又、LHRHの第６位の側鎖が極めて塊状耐性であることも知られている。Barbacciら,J.Biol.Chem.270:9585（1995）を参照。この場所は、本発明に記載の金属結合配位子を付着させる可能性がある部位である。
この位置での金属結合配位子の付着に基づく直鎖状キレート誘導体類には、リシン又は他のビス−アミノ酸残基の側鎖アミンによって薬作用発生団へ直接に、又はスペーサー基によって付着させられている金属結合成分を含む誘導体類が含まれるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が含まれるが、これらに限定されない。
〈GHWSYK（MaGC）LRPG−NH2
〈GHYSLK（MaGC）WKPG−NH2
〈GHWSYK（Ma−azaGC）LRPG−NH2
〈GHYSLK（PtscGC）WKPG−NH2
〈GHYSLK（PtscGDap）WKPG−NH2
〈GHWSYKd（MaGC）LRPG−NH2
〈GHYSLK（azaGC）WKPG−NH2
〈GHWSYK（iEGC）LRPG−NH2
〈GHWSYKd（MtaGCa）LRPG−NH2
〈GHWSYK（iECiD）WKPG−NH2
〈GHYSLK（DiGlyGDap）WKPG−NH2
〈GHYSLK（iDGDap）WKPG−NH2
〈GHWSYK（MtaGC）LRPG−NH2
〈GHWSK（MaGC）WdLRPG−NH2
〈GHWSYKd（MtaGDap）LRPG−NH2
〈GHWSYKd（PtscGC）LRPG−NH2
〈GHWSYKd（Ｅ）LRPG−NH2
〈GHWSYKd（MtscGC）LRPG−NH2
〈GHWSYKd（Mta（hgss）GDap）LPG−NH2
AcNaldCpadWdSRKd（MaGC）LRPAd−NH2
NaldCpadWdSRKd（PtscGC）LRPAd−NH2
AcNaldCpadWdSRKd（MaFC）LRPAd−NH2
AcNaldCpadWdSRKd（azaGFC）LRPAd−NH2
ここで、
＜Ｇはピログルタミン酸であり、
Maはメルカプト酢酸であり、
azaGはアザグリシンもしくはH2NNHCH2CO2Hであり、
PtscGは２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸もしくはPhNHCSNHNHCH2SO2Hであり、
Dapは2,3−ジアミノプロピオン酸であり、
iDは側鎖カルボキシル基によって結合させられたアスパラギン酸であり、
iEは側鎖アミノ酸基によって結合させられたグルタミン酸であり、
DiGlyはHOOCCH2NHCH2COO−であり、
Mta（hgss）はＳ−（2,5−ジヒドロキシフェニル−Ｓ−メチル）スルホニウムアセチルであり、
CaはAcm保護システインであり、
Mtaはメルカプト酢酸のメチルチオエステルであり、
Nalは２−ナフチルアラニンであり、
Cpaは４−クロロフェニルアラニンであり、
Kdでは、下付き文字ｄはＤ異性体が使用されたことを意味しており、
Ｋ（MaGC）では、括弧は封入されたアミノ酸類がリシンのεアミンへ付着させられており、付着した第１アミノ酸が、その後にＧが続いてMaで終わるＣであることを意味している。
さらに、これらのペプチド類と放射性金属との錯体を調製できる。そうした錯体には下記が含まれる：
〈GHWSYK（MaGC）LRPG−NH2ReO
〈GHYSLK（MaGC）WKPG−NH2ReO
〈GHYSLKd（MaGC）LRPG−NH2ReO
上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と置換できる。
（ｖ）直鎖状α−MSH受容体標的物質
天然に発生するα−MSHは下記の配列を有している：
Ac−SYSMEHFRWGKPV−NH2
以前に、環状ペプチドNleDHFdRWK−NH2（ここで、Nleはノルロイシンであり、FdはＤ−Pheを表している）がα−MSH受容体に対して高い親和性を有しており、インビボにおいて比較的に安定性であることは証明されている。Al−Obeidiら,J.Amer.CHem.Soc.111巻:3413頁（1989年）;Haskell−Luevanoら、J.Med.Chem.39巻:432頁（1996年）を参照。下線の引かれた部分は、それらがペプチドの環化部分内の残基であり、さらに環状構造の末端であること、つまりペプチドがアスパラギン酸およびリシンの側鎖からアミド結合によって環化されていることを示している。
これらのよく知られているα−MSH受容体結合ペプチド類の構造をベースとする直鎖状キレート誘導体類には、直接に、又はγ−アミノブチル酸（γ−Abu）のようなスペーサー基によってペプチドのＮ−末端へ付着させられているキレート誘導体類が含まれるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が含まれるが、これらに限定されない：
MaCGγAbuSYSNleDHFdRWK−NH2、及び
MaGCγAbuSYSNleDHFdRnWK−NH2
ここで、γ−Abuはγ−アミノブチル酸であり、RnWはニトロ化されたアルギニン残基である。
上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と置換できる。
B.キレート化アミノ酸誘導体類を結合した環状ペプチド類の設計及び合成
（ｉ）一般
環状金属キレート試薬／ペプチド錯体を調製するプロセスは、ペプチド鎖合成中又は合成後のある時点に環化を実行すること以外は、上記の直鎖状ペプチド類について記載したプロセスに類似している。環化は、ペプチド末端又はアミノ酸側鎖のようなペプチド上のいずれか２個の官能基間で行うことができる。環化は、ジスルフィドもしくはスルフィド形成によって、又は好ましくはラクタム形成によって達成できる。部位選択的環化には、ペプチド上の２個の官能基から保護を選択的に除去することが必要である。ラクタム形成のためには、これは他のアミノ及びカルボキシル保護基の存在下で保護を除去できるアミノ及びカルボキシル保護基を使用することが必要である。この作業は、これらの他の保護基間で選択的保護除去が達成されることをペプチド合成がさらに必要とする場合にはより困難になる。したがって、そうした高度に洗練された保護基戦略はこれまでは実際に達成することは困難なことが証明されていた。
本発明の方法は、環化およびペプチドへのキレート試薬成分の結合の両方をペプチド合成中のあらゆる時点に達成すること可能にする。適切な保護基の使用によって、望ましいあらゆる順番でペプチドの合成、配位子の集合及びペプチドの環化を達成することが可能である。このアプローチは、ペプチドを樹脂から分離して環化する固相法又は環状ペプチドの合成後に溶液中で配位子を付着させる方法より効果的である。
本発明の方法は液相においても使用できるが、好ましくは全自動固相ペプチド合成機を使用して実施する。マルチ−ウェル全自動合成機を使用すると、キレート試薬成分の付着点又は環化部位が相違する極めて多量のペプチド類を同時に調製することが可能である。ペプチド類を含有している配位子の保護は除去されているがまだ固相に付着しているこれらのいわゆる「組合せライブラリー」は、適切な金属と反応して錯体類を形成することができ、その後に適切な生物活性アッセイでスクリーニングして受容体結合及び安定性に関する最高に望ましい特徴を有する化合物を選択できる。
組合せ合成は、「分割（split）」合成又は「平行（parallel）」合成によって実施できる。分割合成では、ビーズへ結合させた合成ペプチド中間物を各連続ステップにおいて次のアミノ酸付加のために相違するグループに分ける。各ステップ後、次の反応のためにビーズを相違するグループに分ける。平行合成では、相違する化合物を例えばペプチド合成機のウェルのような相違する反応容器内で合成する。分割合成は少量ずつ多種類の化合物を生じさせるが、他方平行合成は少ない種類の大量の化合物を生じさせる。
組合せ合成はさらに、個々の各化合物をスクリーニングステップにおいて同定できるように何らかの方法で標識することを必要とする。この目的で化合物を標識する種々の手段は技術において知られている。例えば、ガスクロマトグラフィーによって同定できる標識として不活性ハロゲン化芳香族化合物類が使用される。これにより引用することにより全体が本明細書に組み込まれているBorman、Chem.Eng.New 74巻:29頁（1996年）を参照。
本発明の好ましい実施態様では、環化はラクタム形成によって達成される。最も好ましくは、アミノ官能基はaloc基を使用して保護され、カルボキシル官能基はアリルエステルとして保護される。これによりアリル基（allyl）に対する求核剤の存在下でPd（PPH3）４を使用してアミノ官能基とカルボキシ官能基の保護を同時に除去することが可能になる。典型的に使用される求核剤は水素化トリ−ｎ−ブチルスズ（nBu3SnH）である。
本発明の以前に、アミン類がPd0触媒作用下でアリルイオン類と反応するであろうことは知られていた。例えば、Roosら,J.Org.Chem.60巻:1733頁（1955年）及びHeck,有機合成におけるパラジウム試薬類（PALLADIUM REAGENTS IN ORGANIC SYNTHESES,Academic Press,1995年,122〜131頁を参照。本発明の発明者らは、新たに保護を除去されたアミノ官能基がアリル基によってアルキル化される副反応が生じるので、アリル保護アミノ及びカルボキシル官能基から同時に保護を除去することに関する問題を惹起することを発見した。しかし、Pd触媒aloc開裂反応中におけるアリルスカベンジャー（捕捉剤）としてのピペリジン付加が望ましくない副反応を抑制することが発見された。これは、望ましくないN4−アリルリシンの形成を大きく減少させながら、例えばアスパラギン酸およびリシン側鎖の選択的及び同時の保護除去を可能にした。当業者であれば、他の第一級又は第二級アミン類もまた適切なアリルスカベンジャーであることを認識するであろう。
この方法は、Fmocをベースにしたペプチド合成と適合性であるため有用かつ有益である。これは、Aloc側鎖保護に加えてBOc又はFmoc両方の側鎖保護を使用できるHMP及びPAM樹脂上での環状ペプチド類の調製を可能にする。この技術はさらに、ペプチド鎖のいずれかの個所のアミノ酸の側鎖へ付加された金属結合配位子を含有している環状ペプチド類の合成を可能にする。そこで３個の直交窒素保護基を使用する。１番目はFmoc又はBocのようなペプチド鎖を作り上げるためのもの、２番目は４−メチルトリチル（mtt）又は１−（4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘクス−１−イリデン）エチル（Dde）のようなビスアミノ酸の側鎖へ金属結合配位子を付着させるためのもの、そして、３番目はAlocのような側鎖−側鎖環化を達成するためのものである。Boc、Cbz、'Bu及びベンジル基のようなその他の保護基は、ペプチド合成が終了するまで保護が除去されない他の側鎖アミノ及びカルボキシル官能基を保護するために使用できる。これらの保護基の組合せは、固相ペプチド合成のためのRink、Wang、Merrifield、PAM及びHMPタイプの樹脂類の使用を可能にする。樹脂からのペプチド類の開裂はトリフルオロ酢酸（Fmocをベースとする合成）又はHF又はトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸塩（Bocをベースとする合成）を用いて遂行できる。
本発明の環状ペプチド類は残基数４〜100の長さで、５個までの金属キレート化基を有している。これらのペプチド類は長さがアミノ酸数２〜60の環化領域を含有でき、さらに１個以上の環状部分を含有できる。
環化は、ラクタム端を形成するためには好ましくはアミノとカルボキシアミノ酸側鎖との間であるが、ラクタム架橋を形成するための側鎖アミンとカルボキシ末端との間でも、ラクタム架橋を形成するための側鎖酸とＮ末端アミンとの間でも、ジスルフィド架橋を形成するためのチオール間でも、ヒドラジドを形成するためのヒドラジンとエステルとの間でも、ヒドラゾンを形成するためのヒドラジンとアルデヒドとの間でも、スルフィドを形成するためのチオールと適切な離脱基との間でも、又はエーテルを形成するためのヒドロキシル基と別の適切な離脱基との間でもよい。化合物中に１以上の環状領域が存在するときは、環状領域における架橋は同一タイプであっても相違するタイプであってもよい。
環状ジスルフィドを形成しなければならない場合は、好ましくは、重要なペプチドはチオール上のAcm保護及びアミノ側鎖上のaloc保護を用いて合成する。alocを開裂させ、キレート化配位子をペプチドに結合させる。その後Acm基を開裂させ、タリウムトリフルオロ酢酸塩を用いてジスルフィドを環化させる。或いは又、チオール類はＳ−トリチル基を用いて保護でき、環化を樹脂からの開裂後に溶液中で実施することができる。
環状スルフィドの調製は、例えばアミン側鎖上に存在するαハロアミド官能基上へチオールを環化させることによって達成できる。従って、例えばペプチドはＮ末端上のFmoc保護及びチオール上のＳ−トリチル保護を用いて合成することができる。その後aloc保護リシン側鎖の保護を除去し、キレート試薬を上記のようにリシンに結合させる。Fmocは開裂させ、塩化クロロアセチル又は等価の試薬と反応させる。例えば光開裂性のBromo Wang樹脂（Wang、J.Org.Chem.41巻:3258頁（1976年））のような酸安定性樹脂を使用した場合は、チオール保護を除去し、ペプチドを樹脂上で環化させる。
側鎖残基間の環状スルフィド類は、２つの独立に保護されたアミノ側鎖での選択的保護除去を可能にするペプチドのＮ末端上の適切な保護基を用いて調製する。例えば、Ｎ末端はアセチルもしくはBoc基として保護することができ、側鎖はFmoc及びaloc基として保護できる。ペプチド合成後、１個のアミノ酸側鎖（例えば、Fmoc）の保護を選択的に除去し、上記のようにキレート化部分と結合させる。その後もう１つのアミノ酸側鎖（例えばaloc又はDde）の保護を除去し、ハロアセチル又はマレイミドのようなスルフィド求電子剤に結合させる。重要な硫黄上の保護基を開裂させ、塩基触媒を使用して樹脂上で環化を実施する。或いは又、ペプチドを開裂でき、環化を溶液中で実行することができる。
上述のように、本発明の方法を使用すると多種多様な環状ペプチド類を調製できる。本書にクレームされた方法を使用して環状金属キレート化ペプチド類を調製する追加の方法は当業者には明白であろう。本発明を詳細に例示するために、これらの方法を使用する特異的適用を下記で述べるが、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の適用範囲を制限することが意図されていないことは理解されるであろう。
（ii）環状α−MSH受容体標的物質
天然に発生するα−MSHは配列Ac−SYSMEHFRWGKPV−NH2を有している。以前に、環状ペプチドNleDHFdRWK−NH2（Nleはノルロイシン、FdはＤ−Pheを意味している）がα−MSH受容体に高い親和性を有しており、インビボで相当に安定性であることは証明されている。Ao−Obeidiら,J.Amer.Chem.Soc.111巻:3413頁（1989年）;Haskell−Luevanaら,J.Med.Chem.39巻:432頁（1996年）を参照。下線が引かれた部分は、それらがペプチドの環化部分内の残基である、さらに環状構造の末端であることを意味しているので、つまりペプチドはアスパラギン酸およびリシンの側鎖からのアミド結合によって環化されている。この環状構造は本発明に記載の標識ペプチド類を構築するための基礎として使用されている。
既知のα−MSH受容体結合配位子の構造を基礎とする環状キレート誘導体類には、直接に、又はγ−アミノブチル酸（γ−Abu）のようなスペーサー基によってのいずれかでペプチドのＮ−末端へ付着させられているキレート誘導体を有するものが含まれる。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が含まれるが、これらに限定されない。
MaGCγAbuNleDHFdRWK−NH2
PtscGCNleDHFdRWK−NH2
AcCGCNleDHFdRWK−NH2
DTPA−NleDHFdRWK−NH2
ここで、
Maはメルカプト酢酸であり、
γAbuはγ−アミノブチル酸であり、
PtscGは２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸であり、及び
DTPAはジエチレントリアミンペンタ酢酸である。
上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と置換できる。
（iii）環状VIP受容体標的物質
天然に発生するVIPは下記の配列を有している：
HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2
天然VIPは溶液中でらせん構造を形成すると考えられている。Mussoら,Biochemistry 27:8174（1988）を参照。推定上のらせん構造は、らせん構造によって空間的近傍に配置された残基の側鎖による分子内環化によって安定化させることができる。その例には下記が含まれる：
Ac−HSDAVFTENYTKLRKQNeAAKKYLNDLKKGGT−NH2
Ac−HSDAVFTDNYTKLRKQNleAVKKYLNSVLT−NH2
（ここで、Nleはノルロイシンである）。Ｏ‘Donnellら,J.Pharm.Exp.Ther.270巻:1282頁；米国特許第4,822,890号;Bolin、欧州特許出願第0536741A2号を参照。下線が引かれた部分はそれらがペプチドの環化部分内の残基である、さらに環状構造の末端であることを意味しているので、つまりペプチドはアスパラギン酸とリシンの側鎖間のアミド結合によって環化されている。この環状構造は本発明に記載の標識ペプチド類を構築するための基礎として使用されている。
これらの構造を基礎とする環状キレート誘導体類は、直接に、又はスペーサー基によってリシンの側鎖アミンもしくはその他のビス−アミノ酸残基によって薬作用団へ付着させられた金属結合成分を有する誘導体類が含まれるが、これらに限定されない。この一般構造を持つ特異的キレート誘導体類には下記が含まれるが、これらに限定されない：
Ac−HSDAVFTENYTRLRK（PtscGC）QNleAAKKYLNDLKKGGT−NH2
（ここで、PtscGは２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸である）、及び
Ac−HSDAVFTENYTRLRK（DPTA）QNleAAKKYLNDLKKGGT−NH2
（ここで、DTPAはジエチレントリアミンペンタ酢酸である）
上記の各化合物において、キレート化部分は上述の一般式Ｉのキレート試薬と置換できる。
以下に本発明の好ましい態様を挙げて説明する。
放射性金属元素結合部分を含むペプチドであって、該結合部分が、次の構造式：
0003647881.tif 000006
を含み、
ここで、R1、R2、またはR3の少なくとも一つがＨであることを条件として、R1、R2、およびR3は、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、シクロアルキル基、置換されたシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、置換されたアリール基、ヘテロアリール基、置換されたヘテロアリール基、アルカリル（alkaryl）基、および、ペプチド合成条件下で除去することができる保護基からなる群より独立に選択され、
R5、R7、R8、R9、およびR10は、Ｈ、低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より独立に選択され、R8とR9が一緒に、またはR7とR9が一緒にシクロアルキル基、または置換されたシクロアルキル環を形成してもよく、
R4とR6が一緒に直接的な結合を形成し、または低級アルキル基、置換された低級アルキル基、アリール基、および置換されたアリール基からなる群より独立に選択され、
NR10が、該ペプチドのＮ末端に位置するか、または該ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在することを特徴とするペプチドが、好ましい第１の態様として提供される。
第２の態様は、R1がＨである第１の態様によるペプチドである。
第３の態様は、R3がＨである第１の態様によるペプチドである。
第４の態様は、R4がＨである第１の態様によるペプチドである。
第５の態様は、R4とR6が一緒に直接的な結合を形成する第１の態様によるペプチドである。
第６の態様は、R5がＨである第１の態様によるペプチドである。
第７の態様は、NR10が、前記ペプチドのＮ末端に位置する第１の態様によるペプチドである。
第８の態様は、NR10が、前記ペプチドのアミノ酸側鎖の上に存在する第１の態様によるペプチドである。
第９の態様は、R2が低級アルキル基、置換されたフェニル基、または置換されていないフェニル基である第２の態様によるペプチドである。
第10の態様は、R2がＨである第９の態様によるペプチドである。
第11の態様は、R3がＨである第10の態様によるペプチドである。
第12の態様は、R4とR6が一緒に直接的な結合を形成する第11の態様によるペプチドである。
第13の態様は、R5がＨである第11の態様によるペプチドである。
第14の態様は、R7、R8及びR9が各々Ｈである第13の態様によるペプチドである。
第15の態様は、R2がフェニル基である第14の態様によるペプチドである。
第16の態様は、R2がメチル基である第14の態様によるペプチドである。
第17の態様は、R8とR9がメチル基である第１の態様によるペプチドである。
第18の態様は、前記ペプチドが以下の群、
（Che1）γAbuNleDHFdRWK−NH2、
（Che1）γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
KPRRPYTDNYTRLRK（Che1）QMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
HSDAVFTDNYTRLRK（Che1）QMAVKKYLNSILN−NH2、
〈GHWSYK（Che1）LRPG−NH2、〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
（Che1）γAbuSYSNleDHFdRWK−NH2、（Che1）γAbuNleDHFdRWK−NH2、
（Che1）NleDHFdRWK−NH2、
Ac−HSDAVFTENYTKLRK（Che1）QNleAAKKYLNDLKKGGT−NH2、
（Che1）γAbuHSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
（Che1）γAbuVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN−NH2、
0003647881.tif 000007
〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、〈GHYSLK（Che1）WKPG−NH2、
NaldCpadWdSRKd（Che1）WKPG−NH2、〈GHWSYKd（Che1）LRPG−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、
AcNaldCpadWdSRKd（Che1）LRPAd−NH2、〈GHWSYK（Che1）LRPG−NH2、
AcK（Che1）FdCFWdKTCT−OH、AcK（Che1）DFdCFWdKTCT−OH、
AcK（Che1）FdCFWdKTCＴ−ol、AcK（Che1）DFdCFWdKTCＴ−ol、
（Che1）DFdCFWdKTCＴ−OH、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−ol、
Ｋ（Che1）KKFdCFWdKTCＴ−ol、Ｋ（Che1）KDFdCFWdKTCＴ−OH、
Ｋ（Che1）DSFdCFWdKTCＴ−OH、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−OH、
Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＤ−NH2、Ｋ（Che1）DFdCFWdKTCＴ−NH2、
Ｋ（Che1）KDFdCFWdKTCＴ−NHNH2、AcK（Che1）FdCFWdKTCＴ−NHNH2、
Ｋ（Che1）FdCFWdKTCＴ−ol、およびFdCFWdKTCTK（Che1）−NH2、
からなる群より選択される構造を有する第１の態様によるペプチドであって、ここで（Che1）が前記放射性金属元素結合部分であるペプチドである。
第19の態様は、99mTc、186Re、または188Reからなる群から選択される結合金属原子をさらに含む第１〜18の態様によるペプチドである。
第20の態様は、第１〜17の態様のいずれかよるペプチドの溶液をスズイオンと接触させるステップと、該溶液を、186Re過レニウム酸塩、188Re過レニウム酸塩、99Tc過テクネチウム酸塩からなる群より選択される放射性核種に接触させるステップと、該放射性標識されたペプチドを回収するステップとを含む金属キレート組成物を調製する方法である。
第21の態様は、前記ペプチドが少なくとも１のジスルフィド結合を含有する第20の態様による方法である。
第22の態様は、前記ペプチドがポリペプチドである第24の態様によるペプチドである。
第23の態様は、前記ペプチドがタンパク質である第24の態様によるペプチドである。
第24の態様は、腫瘍、感染性病変、心筋梗塞、血栓、アテローム硬化斑、または正常な器官もしくは組織を画像化し、治療するための第19の態様による放射性標識されたペプチドの使用である。
このように一般的に説明された本発明は、例示のために提供されていて本発明を限定することは意図されていない下記の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
実施例
実施例1:NαAlloc−N4−Fmoc−Ｌ−リシンの合成
N4−Fmoc−Ｌ−リシン（10.00g、27.1mmol、100mol％、Bachem  Biosciences,Inc）をジオキサン（100ml）及びNa2CO3（1M、33ml）の混合液中に懸濁させ、乳濁液を形成させた。ジオキサン（10ml）にクロロギ酸アリル（3.2ml、30.2mmol、111mol％）を添加し、この溶液を10分間かけてN4−Fmoc−Ｌ−リシンの懸濁液に滴下法で添加した。炭酸ナトリウム（1M、20ml）を２回に分けて添加し、さらに追加量のクロロギ酸アリル（0.3ml）を添加した。この反応液を室温で16時間攪拌した。還元圧力下で揮発性溶媒を取り除き、残留物をジエチルエーテル（50ml）を用いて洗浄した。残留液をその後HCl（1M）を用いて酸化させ、酢酸エチル（２×150ml）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和NaCl（50ml）を用いて洗浄し、Na2So4の上を通して乾燥させ、還元圧力下で蒸発させて粗油性生成物（16g）を入手した。この粗生成物をエーテル（100ml）中に溶解させ、形成した白色固体をろ過によって取り除いた。還元圧力下でろ液から溶媒を除去すると粘性の青色がかった黄色の油（8.34g、収率68％）が得られ、これは最終的にはガラス様固体を形成した。
実施例2:2−（トリフェニルメチルメルカプト）アセチルヒドラジンの合成
２−（トリフェニルメチルメルカプト）酢酸（20.35g、60.9mmol、100mol％）を無水THF（150ml）中に溶解させ、氷水浴中で冷却した。ｔ−ブチルカルバゼート（8.61g、65.1mmol、107mol％）を反応溶液に添加し、その後ジイソプロピルカルボジイミド（10.0ml、63.9mmol、105mol％）を添加した。この反応液を緩徐に室温まで加温し、28時間攪拌した。反応混合液をろ過して形成した白色沈殿物を取り除き、還元圧力下で溶媒を除去することによってろ液を白色泡となるまで濃縮した。この物質をクロロホルム（75ml）に溶解させた。その後酢酸（75ml）を添加し、さらに三フッ化ホウ素エーテレート（10.0ml、81mmol、134mol％）を添加した。この反応液を室温で６時間攪拌し、その後酢酸ナトリウム（30g）を含有している水（200ml）中に反応混合液を注入することによってクエンチした。この混合液をクロロホルム（２×100ml）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和NaCl（150ml）を用いて洗浄し、Na2So4の上を通して乾燥させ、ろ化した。還元圧力下で溶媒を除去して、青色がかった金色の油を入手したところ、放置すると固体化した。この固体を1:1ジエチルエーテル／ヘキサン（200ml）中に懸濁させ、ろ化によって収集した。その固体を追加量の1:1ジエチルエーテル／ヘキサン（100ml）を用いて洗浄して乾燥させると、ESMS  MH+（計算値:349、実測値:349）を有する所望の生成物（15.44g、収率73％）を入手できた。
実施例3:Nβ−［２−（トリフェニルメチルチオ）アセチル］アザグリシンの合成
グリオキシル酸一水化物（0.59g、6.41mmol、110mol％）をメタノール（20ml）中に溶解させ、２−（トリフェニルメチルメルカプト）アセチルヒドラジド（2.03g、5.82mmol、100mol％）を添加した。この濁った反応混合液にジオキサン（20ml）を添加し、反応液を室温で18時間攪拌した。ホウ水素化ナトリウム（1.76g）をこの反応混合液に添加し、30分後、さらに異なる量のホウ水素化ナトリウム（0.60g）を添加した。この反応液を室温で３時間攪拌し、その後反応混合液をHCl（1M、60ml）内に注入することによってクエンチした。この混合液を酢酸エチル（２×50ml）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和NaCl（40ml）を用いて洗浄し、Na2So4の上を通して乾燥させ、ろ化し、ロータリーエバポレーター上で還元圧力下で濃縮し、ESMS  MH+（計算値:407、実測値407）を有する固体（2.5g）を入手した。
実施例4:Nα−Boc−Ｎβ−［２−（トリフェニルメチルチオ）アセチル］アザグリシン
Ｎβ−［２−（トリフェニルメチルチオ）アセチル］アザグリシン（2.39g、5.89mmol、100mol％）をジオキサン（50ml）中に溶解させた。この反応溶液に二炭酸ジ−ｔ−ブチル（BOC）2O（2.07g、9.48mmol、161mol％）を添加し、さらにNa2Co3（1M、15ml）を添加した。この混合液を室温で15分間攪拌し、その後追加量のNa2Co3（1M、10ml）及び（BOC）2O（1.41g）を添加した。この溶液を室温で18時間攪拌し、その後NaOH（6M、3ml）及びBOC）2O（1.4g）と１時間反応させた。粗反応混合液をその後クエン酸（1M）を用いてpH3へ酸化させ、酢酸エチル（200ml）を用いて抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液（60ml）を用いて洗浄し、Na2So4の上を通して乾燥させ、ろ化し、還元圧力下で濃縮して粗生成物を入手した。この粗生成物をエーテル中に溶解させ、ヘキサンを用いて希釈して1:1混合液を入手したところ、白色沈殿物が形成された。白色固体をろ化によって収集し、ESMS  MH+（計算値:507、実測値:507）を有する所望の生成物（1.48g、収率50％）を入手した。
実施例5:2−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸の合成
４−フェニル−３−チオセミカルバジド（6.02g、36mmol、100mol％）をメタノール（40ml）中に懸濁させた。グリオキシル酸一水化物（3.32g、36.1mmol、100mol％）を添加し、反応液を室温で２時間攪拌した。ホウ化水素ナトリウム（1.50g）を注意深く添加し、反応混合液を極めて力強く泡立たせた。この反応混合液を室温で１時間攪拌し、その後NaBH4（0.66g）を添加し、さらに氷酢酸（6ml）を添加した。15分後、NaBH4（1.08g）を添加し、さらに反応液を室温で15分間攪拌した。その後追加量のNaBH4（1.66g）を添加し、反応液を室温で３時間攪拌して、HCl（1M、200ml）を用いてクエンチした。この混合液をその後酢酸エチル（２×150ml）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和NaCl（100ml）を用いて洗浄し、Na2So4の上を通して乾燥させ、ろ化し、還元圧力下で溶媒を除去してESMS陰イオンモードＭ−H+（計算値:224、実測値:224）を有する黄色の固体（9.03g）を入手した。
実施例6:Nβ−Boc−２−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸の合成
２（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸（8.93g、37.9mmol、100mol％）及び（BOC）2O（9.10g）をジオキサン（100ml）中に溶解させた。炭酸ナトリウム（1M、50ml）及び水（50ml）を添加し、その混合液を室温で５時間攪拌した。水酸化ナトリウム（1M、40ml）及び追加量の（BOC）2O（6.21g）を添加し、その反応液を室温で一晩かけて攪拌した。その反応液をクエン酸（1M）を用いてクエンチし、酢酸エチル（２×100ml）を用いて抽出した。有機相を結合し、飽和NaCl（50ml）を用いて洗浄し、Na2So4の上を通して乾燥させ、ろ化した。ろ液を還元圧力下で濃縮してゴム状固体（19g）を入手した。この粗個体をエーテル中に懸濁させ、ろ化によって白色個体を収集した。この固体をエーテル（100ml）を用いて洗浄し、ESMS  MH+（計算値:326、実測値:326）を有する所望の生成物（3.17g）を入手した。
実施例7:Nα−（トリフェニルメチルスルフェニル）−Ｎβ−（Boc）アザグリシンの合成
ｔ−ブチルカルバゼートをメタノールに溶解させたグリオキシル酸一水化物を用いて凝縮させた。この粗ヒドラゾンをその後10％Pd/C上での接触水素化によって還元させた。この生成物をその後ジオキサン及び塩基と一緒に混合し、塩化トリフェニルメタンスルフェニルのジオキサン溶液を滴下法で添加した。その結果、所望のＮα−（トリフェニルメチルスルフェニル）−Ｎβ−（Boc）アザグリシン（25g）を入手した。
実施例8:Alloc及びFmoc保護基を使用したペプチド類の固相ペプチド合成
固相ペプチド合成法は396型と同一方法で窒素圧下で作動するように修正したAdvanced  ChemTech  348型ペプチド合成機を使用して0.050mmolの規模で実施した。窒素保護のためにはアリルオキシカルボニル（aloc）及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基を使用し、結合のためにカルボキシル基を活性化させるためにジイソプロピルカルボジイミド（DIC）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）を使用した。Ｃ末端アミド基のためにはRink、Pal、及びTnetaGel  Ｓ  Ram、Ｃ末端酸基のためにはWang、２−クロロトリチル、又はTentaGel  Ｓ  PHBのような種々の樹脂を使用した。
金属結合キレート化部分を導入するため及び／又は選択的の保護を除去されたアミノ酸側鎖による環化を可能にするために、個別に保護されたビス−アミノ酸をペプチド合成に使用した。選択された個別に保護されたビス−アミノ酸誘導体類は、α−Aloc−Lys（ε−Fmoc）OH及びα−Fmoc−Lys（ε−Aloc）OHであった。α−Aloc−Lys（ε−Fmoc）OH誘導体は、日常のFmoc法を使用して側鎖上に配位子片を導入することを可能にした。
aloc基をジクロロメタン（３×2ml分別）を用いて樹脂結合ペプチドを洗浄することによって手動モードで機械上で開裂させ、その後テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム［０］（10mg）を含有する溶液（2ml）及び酢酸（0.1ml）と一緒に樹脂を混合した。その後塩化トリブチルスズ（0.3ml）を添加し、混合液を１時間ボルテックスミキサーにかけた。その後反応セルを空にし、樹脂をジクロロメタン（３×2ml）を用いて洗浄し、その後標準Fmoc合成を再開した。23:3:1の割合のトリフルオロ酢酸（TFA）、アニソール及びエタンジチオール溶液を用いて１〜３時間かけてペプチドを樹脂から開裂させた。粗開裂混合液をその後エーテル内に注入して粗ペプチドを沈殿させ、これを適切な勾配の水に溶解させたTFA（0.1％）及び／又はアセトニトリル（90％）及び水（10％）に溶解させたTFA（0.1％）を用いて溶出するWaters Delta Pak,Prep Pak C−18カートリッジシステムを使用する逆相HPLCによって精製した。所望の精製ペプチド類を含有するフラクションを収集し、還元圧力下で揮発性溶媒を除去してペプチドの水溶液を入手し、これをその後凍結乾燥した。その後凍結乾燥性生物のサンプルを生成物の実測質量が所望のペプチドの計算値と一致していることを確認するためにエレクトロスプレー（electrospray）質量分析法（ESMS）又は高速原子衝撃質量分析法（FABMS）を受けさせるために送付した。
下記の表は上記の方法によって合成されたペプチド配列の一部を示している。
0003647881.tif 000008
ａ  HPLC法［保持時間：分］溶媒Ａは水に溶解させた0.1％トリフルオロ酢酸、溶媒Ｂは90:10アセトニトリル／水に溶解させた0.1％トリフルオロ酢酸である。溶媒流速は、10分間は3ml/分、その後５分間は5ml/分である。勾配は、10分間は０〜100％Ｂ、その後５分間は100％Ｂである。
ｂ  エレクトロスプレー質量分析法による数値（MH+）。
ｃ  下線の引かれた配列は、側鎖官能基を連結する環状アミドとして環化されている。
表の中で使用された略語の意味：
＜G:ピログルタミン酸
PtscGC:2−（４−フェニル−３−チオセミカルバジジル）酢酸もしくはPhNHCSNHNHCH2CO2H
Ma:メルカプト酢酸
azaG:アザグリシンもしくはH2NNHCH2CO2H
Dap:2,3−ジアミノプロピオン酸
γAbu:γ−アミノブチル酸
Nal:2−ナフチルアラニン
Cpa:4−クロロフェニルアラニン
Kd:下付き文字ｄは、Ｄ異性体が使用されたことを意味している。
Ｋ（MaGC）：括弧は封入されたアミノ酸類がリシンのεアミンへ付着させられており、付着した第１アミノ酸が、その後にＧが続いてMaで終わるＣであることを意味している。
iD:イソアスパラギン酸
iE:イソグルタミン酸
これらの方法で合成されるその他のペプチドには下記のようなものがが含まれる。
0003647881.tif 000009
配列の下線の引かれた部分は環状である。
TscGは、３−チオセミカルバゾニルグリオキシル、つまりH2NCSNHNCHCO−である。
MtscGは、４−メチル−３−チオセミカルバゾニルグリオキシル、つまりCH3NHCSNHCHCO−である。
Maは、メルカプトアセチル:HSCH2CO−である。
括弧内に挙げられている基は、括弧の左のアミノ酸側鎖に付着させられている。
実施例9:キレート化部分を含有している環状MSH類似化合物の調製
環状ペプチド類を合成する方法を、ホルモン（αMSH）類似化合物MAGCγ−AbuNleDHFdRWK−NH2を刺激する環状α−メラノサイトを調製することによって証明したが、下線の引かれた部分はペプチド配列がアスパラギン酸及びリシン側鎖を通してラクタムとして環化されていることを意味している。環化のために使用される残基類はaloc基（リシンのため）及びアリルエステル（アスパラギン酸塩のため）として側鎖を保護した。ペプチドは上記のようにポリスチレンをベースとするRinkアミド樹脂上でFmoc化学を使用して構築した。
アリル及びalocの保護除去は、まず最初にアリルスカベンジャーとしてのピペリジンの不在下でPd（PPh3）４、酢酸及びBu3SnHを用いて実施した。側鎖保護基の開裂後、樹脂を洗浄し、部分的に保護されたペプチドをFelixら,Int.J.Peptide Protein Res.32巻:441頁（1988年）に記載された方法を使用して環化させた。その後ペプチドを樹脂から開裂させ、精製して混合生成物からの唯一の清潔なペプチドとしてＮ−アリル置換環状アミドを単離した。
aloc開裂反応をその後アリルスカベンジャーとしてのピペリジンの添加によって修正した。
aloc及びアリル基の開裂には、0.5mlの氷酢酸、10mlのジクロロメタン、0.0563gのテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）に加えてアリルスカベンジャーとして1.0mlのピペリジンを使用した。ペプチド合成機上の各ウェルはRink樹脂上に0.05mmolのペプチドを含有しており、これを室温で１時間、ボルテックスミキサーにかけながら0.3ml/ウェルの水素化トリブチルスズを用いて処理した。側鎖保護基の開裂後、樹脂を２×2ml/ウェルのジクロロメタン、２×1ml/ウェルのメタノール、２×1ml/のジイソプロピルエチルアミン及び３×1ml/ウェルのNMPを用いて洗浄した。その後ペプチド側鎖を上記のFelixの方法によって結合させた（BOP及びDIEAを用いて15時間）。ペプチドを開裂させ、上記の通りに精製して所望の1302のESMS  MH＋を有する純粋ペプチドを入手した。Ｎ−アリル化副生成物は痕跡量しか所見されなかった。
実施例10:99mTcを用いた放射標識化
99mTc−グルセプタート錯体を形成するために、Glucoscan（Dupont社製）バイアルを1mlの生理食塩水に溶解させた2.18mCiのNaTcO4を用いて復元した。＜GHWSYK（MaGC）LRPGアミド（IMP3）は上記の通りに調製した。99mTc−IMP3は、360μｌ（874μCi）の99mTc−グルセプタートを生理食塩水に溶解させた640μｌのペプチドと一緒に混合することによって調製した。最初に形成された沈殿物は75℃で15分間加熱すると消失した。H2O:EtoH:NH4OH混合液（5:2:1）において展開させたインスタントTLC（ITLC）ストリップは、コロイドとしての起源時の6.2％の活性を示した。HPLCは、6.95分間のRT（保持時間）を用いてペプチドへ結合した100％の活性を示したが、他方非標識ペプチドは同一HPLC条件下（逆相Ｃ−18カラム、流速3ml/分での10分間における０〜100％の勾配）で6.4分間で溶出された。HPLCカラムからの回収は注入された活性の85％であった。
99mTc標識化のためにIMP3を下記に示す量で作製して凍結乾燥した：
0003647881.tif 000010
ここで、αDGはα−Ｄ−グルコヘプトネートである。凍結乾燥バイアルは生理食塩水中に溶解させた−900μμCiのNaTcO4を用いて復元した。全バイアル中で混濁が観察された。これらのバイアルを75℃で15分間加熱したが、混濁は持続した。コロイドについてのITLC分析は、バイアル１、２及び３各々について起源時の14、21及び９％のコロイド活性を証明した。
99mTc標識化中の沈殿析出を防止するために、凍結乾燥バイアル中のSn（II）に対するα−Ｄ−グルコヘプトネート（αDG）及び酒石酸塩の比率を変更した。下記に示す比率の酒石酸塩及びαDG比を有する下記のバイアルを作製し、凍結乾燥した（25μｇのSn（II）を含む250μｇのIMP3）。これらのバイアルを1mlの生理食塩水に溶解させた−500μCiのNaTcO4を用いて復元した。観察カラムに観察値が示される。75℃で15分間加熱した後で、室温で15分後にITLCストリップを展開させた。
0003647881.tif 000011
上記のプロトコルをバイアル３、７及び８について繰り返し、75℃で15分間加熱後にはコロイド活性が各々5.3、3.8及び4.6％であると測定された。逆相HPLCカラム上で７分間のRTで単一広域ピークが観察された。
生理食塩水単独には溶解性の不良なペプチド類の溶解度はエタノール又は２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのような溶解剤の添加によって上昇する。
テクネチウム99を用いての他のペプチド類の標識化からの結果は下記の表に示されている。
0003647881.tif 000012
表中で使用された略語は上記の実施例８と同一である。室温での標識化によって形成された錯体と加熱によって形成された錯体のHPLC保持時間の変化は、金属の結合における変化を意味している。
ａ  室温で15分間の反応（保持時間：分）。
ｂ  沸騰水中での15分間の加熱後。
ｃ  加熱後にピーク形状及び保持時間において有意な変化
ｄ  ピーク形状及び保持時間に変化なし。有意差なし。
ｅ  多数のピーク。
また別の標識化法において、過テクネチウム酸塩を添加する前に標識化キット内にペプチドの希釈液（30μ/ml）を作製した。最終溶液は総量1.5ml中にペプチド、10％ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（HPCD）、200mMグルコヘプトネート21mM酢酸塩緩衝液（pH5.3）、2mgの200mMグルコヘプトネート21mM酢酸塩緩衝液（pH5.3）、2mgのアスコルビン酸及び100μｇの塩化第一スズを含有していた。他のフォーミュレーションでは、15％HPCD、200mMグルコヘプトネート、及び21mM酢酸塩緩衝液（pH5.6）を含有する緩衝液中にペプチドに比較して２等量のスズイオンを添加した。
実施例11:IMP−3188Reの放射標識化
IMP3（＜GHWSYK（MaGC）LRPGアミド）を上記の通りに合成した。IMP3は、ＡがH2O中の0.1％TFAであり、Ｂが90％CH3CN、0.1％TFAであるときに、流速3ml/分、10分での０〜100％Ｂの勾配を使用する逆相Ｃ−18カラム上で6.4分の保持時間を有している。
IMP3を1mg及び250μｇの量で450μｇのSn（II）及びα−Ｄ−グルコヘプトネートと1:17.5の比で作製して凍結乾燥した。IMP3（1mg及び250μｇ）の凍結乾燥させたバイアルを生理食塩水に溶解させた617及び578μCiのNaReO4を用いて復元した。これらのバイアルを75℃で15分間加熱した。上記の条件下でのHPLC分析は、どちらのバイアルについても7.0分の保持時間で単一ピークを示した。溶離液を収集し、γ計数器上で計数した。1mgバイアルについては、活性の回収率は88％であったが、250μｇのバイアルについての回収率は77％であった。H2O:EtOH:NH4OH（5:2:1）上で展開させたITLCストリップ上のコロイド分析は、1mg及び250μｇのバイアル各々に付いて起源時の活性の1.4及び1.2％を示した。
室温での188Reの標識化は75℃におけるようには良好に進行しなかった。室温ではペプチド内にはほんの数パーセントの活性（５％）しか組み込まれず、残りの活性は空のカラムに溶離した（1.2分）。
実施例12:インビトロレセプター結合アッセイ
放射性金属標識LHRH類似化合物を試験するために、ヒト乳腺癌細胞系MCF−７、SK−BR−３、及びMDA−MB−231を使用した。標識VIP類似化合物を試験するためにはHT29細胞を使用した。全細胞系はAmerican Type Culture Collection,Rockville,MDから購入した。細胞は５％胎児ウシ血清、５％定義ウマ血清、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、及びＬ−グルタミン（2mM）を補給したDMEM中で増殖させた。細胞は日常的にトリプシン及び0.2％EDTAを用いて剥離した後に継代接種した。
非標識LHRH類似ペプチド類の特異性は競合的細胞結合アッセイによって測定する。標的細胞は新鮮培地を用いて洗浄し、５×105cell/mlとなるように調整する。96ウェルマイクロタイタープレート上の１ウェル毎に100μｌの細胞懸濁液（100μｌ）を添加する。細胞を付着させ、その後125I−LHRH（Amersham Life Science,Arlington Heights,IL,2,000Ci/mmol）の存在下で相違する濃度のペプチド類似を用いて処理する。攪拌しながら室温での２時間の培養後、細胞を２回洗浄し、細胞に結び付いている放射能を計数し、標識LH−RHの結合へ50％阻害を惹起するペプチドの濃度を比較する。
受容体結合定数を決定するために、放射標識LHRHの連続希釈液を96ウェルプレート内の５×105cellsを用いて培養する。特異的に結合したペプチドを測定できるように、すべてのアッセイは高濃度の非標識LHRHを添加して、又は添加せずに３回ずつ実施する。室温での２時間の培養後、細胞を洗浄して計数する。平衡関連定数Ka及び1cell毎の受容体部位総数をScatchard分析法によって測定する。
VIP類似化合物及びそれらの金属錯体を試験するためにはVirgoliniら,Cancer Res.54巻:690頁（1994年）によって報告されているプロトコルを使用する。手短に述べると、125I  VIPを結合緩衝溶液中に溶解させた被験ペプチドとペプチドの濃度を上昇させながら混合し、その後に各溶液を48ウェル培養プレート中のHT29細胞へ添加する。各濃度は３回ずつ試験する。細胞を４℃で２時間培養し、その後氷温結合緩衝液を用いて３回洗浄する。これらの細胞をその後５分間かけて2M  NaOHを用いて溶解させ、ウェル内の液体を綿棒で取り除く。綿棒上の活性はガンマ計数器を用いて計数する。
本発明について上記の代表的実施態様を参照しながら広範囲に開示かつ例示してきた。当業者であれば本発明の精神及び範囲から逸脱せずに本発明に様々な変更を加えることが可能であることを認識するであろう。放射性金属結合ペプチド類に関する主題はさらに、引用することによりその開示の全体が本明細書に組み入れられている同時系属出願の米国特許出願第08/474,555号にも記載されている。