(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬組成中にビリルビンオキシダーゼと緩衝液とを必須として含有し、そのビリルビンオキシダーゼを反応させて生体液試料中の抱合ビリルビンを測定するための試薬であって、ビリルビンオキシダーゼがマンネンタケ科のエビタケ属に属する菌株が生産するビリルビンオキシダーゼであることを特徴とする抱合ビリルビン測定試薬。
【請求項２】
試薬組成が、ビリルビンオキシダーゼと緩衝液に加え、芳香族カルボン酸、界面活性剤、アミノ酸、フッ化物、タンパク質、還元剤の１種または２種以上を含有する請求項１の抱合ビリルビン測定試薬。
【請求項３】
緩衝液が、pH4.5〜6.0であり、陰イオン性界面活性剤を含有しない請求項１または２の抱合ビリルビン測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
この発明は、肝・胆道疾患の診断の指標として重要な生体液試料中の抱合ビリルビンを測定するための試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンはテトラピロール類に属する黄色色素であって、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁色素の主成分をなすものであることが知られている。血清等の生体液中においてビリルビンは主に三種類の形態で存在する。すなわち、抱合ビリルビン、非抱合ビリルビンおよびデルタビリルビンの三種類であり、これらの合計が総ビリルビンと称される。抱合ビリルビンは、ビリルビンが肝臓中でグルクロン酸抱合を受けて生成したもので、グルクロン酸１分子が結合したモノグルクロナイドビリルビンまたは２分子結合したジグルクロナイドビリルビンが存在する。非抱合ビリルビンは上記の抱合作用を受けていないビリルビンである。抱合および非抱合ビリルビンは血清中ではアルブミンと比較的緩く結合した状態で存在する。また、デルタビリルビンは血清アルブミンと不可逆的に共有結合した状態で存在する。上記の各形態のビリルビンの分別定量は肝・胆道疾患の診断の指標として重要である。特に、グルクロン酸抱合ビリルビンの測定は、胆汁分泌停止障害の良い指標となる。
【０００３】
従来より、ビリルビンの定量法としては、ジアゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)を利用する方法、バナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオン等の酸化剤を利用する方法、ビリルビンオキシダーゼ（BOD）等の酸化酵素を利用する方法等が知られている。
生体液中のビリルビンは、ジアゾ法により反応促進剤の添加を必要としない直接ビリルビンと、それを必要とする間接ビリルビンに大別されている。直接および間接の呼称は、ジアゾ反応に対するビリルビンの反応性の違いによる命名であり、それぞれが血中に存在する抱合および非抱合ビリルビンに対応するものではなく、直接ビリルビンとして測定されるビリルビンには、抱合ビリルビンおよびデルタビリルビンの約８割程度とが含まれている〔クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）第28巻、第629頁（1982年）〕。さらに、ジアゾ法では、非抱合ビリルビンの一部も直接ビリルビンとして測り込まれている〔クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）第31巻、第1560頁（1985年）〕。ジアゾ反応を利用する代表的な試薬としては、マロイおよびエヴェリン（Malloy & Evelyn）による試薬〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第119巻、第481頁（1937年）〕等がある。
【０００４】
高速液体クロマトグラフィーによって分画定量する方法には、逆相HPLCカラムを使用して各種ビリルビンをリン酸緩衝液およびイソプロパノールのグラジェントによって溶出、分析するラウフ（Lauff）らの方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、第226巻、第391頁（1981年）〕等がある。
【０００５】
酸化剤を利用する方法は、酸化剤を作用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン自体のもつ450nm付近の黄色を消失させ、反応前後の吸光度変化量によりビリルビンを測定するものである。この場合、反応条件を種々変えることにより、直接ビリルビンを酸化させることができる。この方法において使用される試薬としては、例えばバナジン酸イオンを用いる試薬〔臨床化学、第22巻、第116頁（1993年）〕があり、間接ビリルビンの反応抑制剤、緩衝液等の選定によって直接ビリルビンに酸化剤が働く条件を設定した直接ビリルビン測定用試薬が提案されている。このような直接ビリルビン測定用試薬としては、例えば酸化剤としてバナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオンを用い、間接ビリルビンの反応抑制剤としてヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子およびHLB値が15以上の非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物を使用して、直接ビリルビンを定量する試薬（特開平5-18978号公報）がある。
【０００６】
酸化酵素を利用する方法は、酸化酵素を作用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン自体のもつ450nm付近の黄色を消失させ、反応前後の吸光度変化量よりビリルビンを測定するものである。この場合も、反応条件を種々変えることにより直接ビリルビンを酸化させることができると報告されている。この方法において使用される試薬としては、例えばBODを用いる試薬〔クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、第20巻、第783頁（1974年）〕、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化酵素を用いる試薬（特公昭62-33880号公報）があり、pH、緩衝液、界面活性剤の選定、酵素の特異性を向上させる化合物の添加によって、直接ビリルビンにBODが働く条件を設定した直接ビリルビン測定試薬が提案されている。このような直接ビリルビン測定試薬としては、例えばpH3.5〜4.5の緩衝液中でBODを作用させて直接ビリルビンを定量する試薬（特公昭61-44000号公報）、pH2.0〜3.3のフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムを含有する緩衝液中でBODを作用させて直接ビリルビンを定量する試薬（特開平1-5499号公報）、チオール化合物および／またはフッ化物を共存させ、間接ビリルビンへの反応を抑制した直接ビリルビン測定試薬（特開平5-276992）等がある。また、ジアゾ法、バナジン酸等を用いた化学酸化法およびBOD等を利用した酵素法においてテトラピロール化合物を共存させて間接ビリルビンとの反応を抑制した直接型ビリルビン測定試薬（特開平7-231795）もある。さらに、pH、緩衝液の選定によって抱合ビリルビンのみにBODが働く条件を設定した抱合ビリルビン測定用試薬も提案されている。このような抱合ビリルビン測定用試薬としては、例えば陰イオン性界面活性剤を含有するpH9〜11の範囲の緩衝液中でBODを作用させて抱合ビリルビンを定量する試薬（特公平5-68240号公報）、陰イオン性界面活性剤を含有するpH5〜6の酸性緩衝液中でBODを作用させて抱合ビリルビンを定量する試薬（特公平5-9066号公報）がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
デルタビリルビンは肝・胆道疾患等で、肝細胞から血中に逆流した抱合ビリルビンの一部が血中でアルブミンと共有結合して生成される。デルタビリルビンの半減期はアルブミンに依存して、抱合ビリルビンと比較して極端に長く、肝・胆道機能が正常化して抱合ビリルビンが正常値まで低下した患者においてもデルタビリルビンは低下しない。このような患者においては、デルタビリルビンの大部分および非抱合ビリルビンの一部を測定する従来の直接ビリルビン測定試薬では異常と診断されるが、抱合ビリルビンとデルタビリルビンを精密に分別する抱合ビリルビン測定試薬では肝機能の回復を反映して正常と診断することができる。したがって、抱合ビリルビンをデルタビリルビンと分別して精密に定量することは、臨床検査の現場において非常に有用である。
【０００８】
前掲のジアゾ試薬、バナジン酸イオンまたは三価のマンガンイオン等の酸化剤、およびBOD等の酸化酵素を利用した直接ビリルビン測定用試薬では、抱合ビリルビン、非抱合ビリルビンおよびデルタビリルビンを完全に分別定量することは不可能であり、高速液体クロマトグラフィーによる測定に頼らなければならない。しかしながら、高速液体クロマトグラフィーによるビリルビン測定では、抱合、非抱合およびデルタビリルビンを十分な分別性を持って定量可能ではあるものの、高価で特殊な装置を使用すること、分析時間が長いこと、一度に多数検体を処理できない等の問題点があり、臨床検査の現場等、日常検査には使用困難な方法である。
【０００９】
一方、特公平5-9066号公報記載のBODを利用した抱合ビリルビン測定試薬は公知のジアゾ法と非常に高い相関を示しており、抱合ビリルビンおよび一部のデルタビリルビンを含む直接ビリルビンを測定していることは明確である。また、特公平5-68240号公報の方法はBODの至適pH範囲を大きく外れたpHで測定する必要があるため、抱合ビリルビンに対する反応性が低いという問題がある。
【００１０】
この発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであって、従来の抱合ビリルビン測定試薬におけるこれらの問題点を解消し、BODを利用して抱合ビリルビン、非抱合ビリルビンおよびデルタビリルビンを完全に分別定量することのできる抱合ビリルビン測定試薬を提供することを目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者は、上記の課題を解決するための検討を進めた結果、マンネンタケ科の菌株由来のBODを利用することにより、ビリルビン含有試料中の非抱合ビリルビンおよびデルタビリルビンに反応することなく、しかもBODの至適pH範囲内で抱合ビリルビンを精度良く測定できることを見い出し、この発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、この発明は、試薬組成中にBODと緩衝液とを必須として含有し、そのBODを反応させて生体液試料中の抱合ビリルビンを測定するための試薬であって、BODがマンネンタケ科の菌株が生産するBODであることを特徴とする抱合ビリルビン測定試薬を提供する。
また、この発明の抱合ビリルビン測定試薬においては、上記マンネンタケ科の菌株がエビタケ属に属する菌株であること、試薬組成が、ビリルビンオキシダーゼと緩衝液に加え、芳香族カルボン酸、界面活性剤、アミノ酸、フッ化物、タンパク質、還元剤の１種または２種以上を含有すること、緩衝液が、pH4.5〜6.0であり、陰イオン性界面活性剤を含有しないこと等を好ましい態様としてもいる。
【００１３】
以下、この発明のさらに詳細な実施形態について説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の抱合ビリルビン測定試薬は、緩衝液等からなる第１試薬と、マンネンタケ科の菌株の生産するBODを含む第２試薬とからなり、使用時にこれらの第１試薬と第２試薬とを混合して使用する形態のものでもよく、あるいはまた、すべての組成を予め混合した試薬からなる形態のものであってもよい。
【００１５】
この発明の測定試薬に使用するBODは、マンネンタケ科に属する菌株から得られるBOD、望ましくはエビタケ属に属する菌株から得られるBODであり、その必量は0.001〜200単位/mL、望ましくは0.005〜20単位/mLである。
なお、BODの活性は、0.02mMビリルビン、0.04mM人血清アルブミン、25mM p-ルエンスルホン酸を含有する100mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）0.54mLを37℃で３分間予備加温した後に100mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で希釈したOD溶液0.06mLを添加して、更に37℃で保温した際に460nmにおける吸光度（光路長1cm）を１分間あたり１減少させる能力を０．１単位とするものである。
【００１６】
用いる緩衝液はpH8.0以下、望ましくは使用する酵素の安定性、活性の面で有利となるpH4.5〜6.0までの間に緩衝能をもつものであればよく、例えば、フタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、MES−水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は20〜500mM、好ましくは30〜300mMである。
【００１７】
その他の成分として、p-トルエンスルホン酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル等の陰イオン性でない界面活性剤、アラニン、セリン等のアミノ酸、マンニトール等の糖類、ポリエチレングリコール等のポリオール類、NaCl等の塩類、アルブミン等のタンパク質、NaF等のフッ化物、ジチオスレイトール、Ｎ−アセチルシステイン等のＳＨ化合物等の還元剤、ビリルビン等のテトラピロール化合物等を適宜に添加することができる。界面活性剤として陰イオン性界面活性剤を用いると、抱合ビリルビンだけでなく、非抱合ビリルビンの一部も測定されることがあり、正確な値が測定できないことがある。また、その他の試薬類、例えば防腐剤等は、公知の化学的酸化法やBOD法等において使用される例えばパラベン等の防腐剤から必要に応じて適宜選択して用いることができ、それらの使用濃度や測定試薬のpH等も公知の方法において採用されている測定試薬のそれに準じて適宜設定することができる。
【００１８】
また、この発明においては、前記成分を適宜選択して常法により混合することにより、抱合ビリルビン測定用試薬を得ることができる。好ましい具体例としては、例えば第１試薬はpH4.5〜6.0に調整されたフタル酸緩衝液10〜200mM、ポエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル0.005〜0.5%、アラン5〜100mM、p-トルエンスルホン酸1〜100mM、ヒト血清アルブミン0.001〜フッ化ナトリウム0.05〜200mM、N-アセチルシステイン0.02〜10mMおよびビリルビン0.1〜10μg/mLを含み、第２試薬はトラキデルマ属の菌株由来のBOD0.001〜0単位/mL、およびpH4.5〜6.0に調整されたフタル酸緩衝液10〜200mMを含むができる。
【００１９】
例えば、以上のようにして得られたこの発明の試薬を用いて抱合ビリルビンを測定するための方法は、具体的には以下の通りである。
まず、緩衝液を第１試薬とし、これに各種ビリルビンを含む検体（血清、血漿、尿等の生体液等）を適量加え溶液とし、分光光度計のセル室内にて予備加温後、この溶液の特定波長（460 nm付近）における吸光度を測定する（吸光度１）。これにBODを含む第２試薬を添加し、１〜10分間反応させて抱合ビリルビンのみを酸化させた後、460nm付近における吸光度を再度測定する（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に液量補正値等を乗ずる等した後、上記の特定波長における吸光度変化量（Ａ）を求める。次に、既知濃度のジタウロビリルビンを含む標準物質を同様に測定し、吸光度変化量（Ｂ）を求める。この吸光度変化量（Ｂ）から作成した検量線に上記の吸光度変化量（Ａ）を当てはめることによって試料中の抱合ビリルビン量を測定することができる。また、吸光度変化量（Ａ）および（Ｂ）から、次式により検体中の抱合ビリルビン含量を求めることができる。
【００２０】
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なお、検体量としては0.005〜0.1mLが好ましい。特定波長は460nmに限定されるものではなく、400〜480nmの任意の波長を選ぶことができる。また第１、第２試薬、検体の液量は適宜変化させることができる。
【００２１】
反応は通常の条件下で行い、例えば、反応温度は20〜45℃、好ましくは30〜40℃であり、反応時間は１〜30分、好ましくは３〜15分である。
【００２２】
【実施例】
以下に、実施例および比較例を示し、この発明の抱合ビリルビン測定試薬についてさらに具体的に説明するが、この発明は以下の例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
以下の組成の試薬１および試薬２からなる抱合ビリルビン測定試薬を調製した。
【００２３】
試薬１：pH5.5のフタル酸緩衝液120mM、ポリエチレングリコールモノ-p-イ  ソオクチルフェニルエーテル0.05%、アラニン50mM、p-トルエンスル  ホン酸50mM、ヒト血清アルブミン0.005%、フッ化ナトリウム2.5mM、
およびN-アセチルシステイン2.5mM
試薬２：エビタケ属の菌株由来のBOD4単位/mL（宝酒造より購入）、および
pH5.5のフタル酸緩衝液120mM。
【００２４】
次いで、以下の方法によりヒト血清の各種ビリルビンを分画定量した。0.8mLの試薬１と0.03mLのヒト血清とを混合し37℃で５分間インキュベートした。この溶液0.2mLをHPLCに供してBOD作用前の各種ビリルビンを分画定量した。残りの液から0.42mL分取し0.1mLの試薬２を添加して37℃で５分間インキュベートした。この反応液0.2mLをHPLCに供してBOD作用後の各種ビリルビンを分画定量したBODを含む試薬２添加前後（BOD作用前後）の各種ビリルビンピークのピーク面を液量の変化を考慮して補正した。結果は表１に示したとおりである。なお、ビリルビンのHPLCによる分画は、ラウフらの方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、第226巻、第391頁（1981年）〕に基づいて実施したが、HPLCに供するサンプは除蛋白せずに直接カラムに供した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
実施例２
実施例１の試薬１および試薬２を用い、実施例１とは異なるヒト血清を検体として実施例１と同様の方法で各種ビリルビンを分画定量した。結果は表２に示したとおりである。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実施例１および実施例２の結果から、この発明の測定試薬は非抱合ビリルビンに殆ど反応せず抱合ビリルビンに特異的に反応することが確かめられた。
比較例１
実施例１の試薬２の代わりに、不完全糸状菌の菌株由来のBOD4単位/mL（天野製薬より購入）およびpH5.5のフタル酸緩衝液120mMからなる試薬３を調製し、施例１の試薬１とこの試薬３を用いて、実施例１と同じヒト血清を検体として各種ビリルビンの変化をHPLCで観察した。結果は表３に示したとおりである。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
比較例２
実施例１の試薬１と試薬３を用いて、実施例２と同じヒト血清を検体として各種ビリルビンの変化をHPLCで観察した。結果は表４に示したとおりである。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
比較例１および比較例２の結果から、BODとして不完全菌類の菌株の産生する酵素を用いる試薬は、抱合ビリルビンのみならず非抱合ビリルビンおよびδビリルビンにも反応することが明白である。
実施例３
実施例１の試薬１および試薬２を用いて、抱合ビリルビンを主成分とするハイレベルチェック・BIL（国際試薬社製）溶液を４％牛血清アルブミン溶液を用いて段階的に希釈した溶液の抱合ビリルビンを測定した。標準液は、ジタウロビリルビン（ポーフィリンプロダクツ社製）を用いて調製した。測定は日立7070形自動分析装置を用いて、0.28mLの試薬１と0.014mLの試料を混合し約５分間インキュベートした後に0.07mLの試薬２を添加して約５分間反応させた。測定温度は37℃、測定波長は主波長450nm（副波長546nm）である。図１に測定値と試料の希率との関係を示した。
【００３３】
この図１に示した結果から、この発明の測定試薬は、抱合ビリルビンの日常的測定に十分な測定範囲を有すことが確認された。
実施例４〜７および比較例３〜５
試薬１と同じ組成で、pHのみを4.0、4.5、5.0、6.0または6.5とした試薬４、５、６、７および８を調製した。さらに、試薬２と同じ組成で、pHのみを4.0、4.5、5.0、6.0または6.5とした試薬９、１０、１１、１２および１３を調製した。
【００３４】
以上の試薬４〜８と試薬９〜１３、および試薬１、２を用いて、実施例３と同様の方法でヒト血清中の抱合ビリルビンを測定した。各試薬の組合せは以下のとおりである。
実施例４：試薬５（pH 4.5）＋試薬１０（pH 4.5）
実施例５：試薬６（pH 5.0）＋試薬１１（pH 5.0）
実施例６：試薬１（pH 5.5）＋試薬２  （pH 5.5）
実施例７：試薬７（pH 6.0）＋試薬１２（pH 6.0）
比較例３：試薬４（pH 4.0）＋試薬９  （pH 4.0）
比較例４：試薬８（pH 6.5）＋試薬１３（pH 6.5）
さらに、比較例５として同じヒト血清中の抱合ビリルビン量をHPLCによって定量した。
【００３５】
以上の各測定結果は表５に試薬のpHと測定値との関係を示したとおりである。この結果から、pHが4.5〜6.0の範囲にある測定試薬（実施例４〜７）の場合には、そのビリルビン測定値が比較例５のHPLC法による抱合ビリルビンの測定値とよく一致し、正確に測定できていることが確認された。一方、pHが4.0または6.5の測定試薬（比較例３および４）では、測定値が比較例５とかけ離れており、正確な測定ができていないことは明らかである。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
比較例６
実施例１の試薬のポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルの代わりに陰イオン性界面活性剤であるラウリル硫酸ナトリウムを0.1％添加した試薬１４を調製し、試薬２と組み合わせて、実施例６と同じヒト血清の抱合ビリルビンを測定した。その結果、0.14mg/dlの測定値を得た。この結果から、陰イオン性界面活性剤は、この発明の試薬成分としては好ましくないことが判明した。
【００３８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によれば、閉塞性黄疸等の患者の生体液中において顕著に増大することが知られている抱合ビリルビンのみを正確に分別し測定することができ、臨床検査その他において有用性の高い抱合ビリルビン測定試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】抱合ビリルビンを主成分とするハイレベルチェック・BILの段階的希釈溶液における各々の抱合ビリルビン測定値を示した相関図である。
【図１】
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