(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼとセルロース粒子または油滴とを有効成分として含有することを特徴とする創傷治療剤。
【請求項２】
カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼとセルロース粒子または油滴とを有効成分として含有することを特徴とする瘢痕拘縮防止剤。
【請求項３】
カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼとセルロース粒子または油滴とを有効成分として含有することを特徴とする創傷被覆剤。
【請求項４】
カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼとセルロース粒子または油滴とを有効成分として含有することを特徴とする止血剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、有効成分としてトランスグルタミナーゼと蛋白質または／および粒子とを含有することを特徴とする創傷治療剤、瘢痕拘縮防止剤、創傷被覆剤及び止血剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスグルタミナーゼの医療関連用途に関しては、次のような事実が知られている。まず、特開昭６２−７４３６０号明細書には、蛋白質および／またはペプチドを含有する溶液にトランスグルタミナーゼを添加して得られる膜を成分として含有する人工皮膚が開示され、この人工皮膚は、引張強度、伸度、柔軟性や酸素透過性にすぐれているのみならず、すぐれた水蒸気透過性を有する生体適合性の強いものである。また、特開平２−１０８６３１号明細書には、トランスグルタミナーゼを有効成分とする免疫抑制剤が開示されているが、開示されているところはｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験でしかも免疫学的な考察にとどまっているに過ぎず、ｉｎ  ｖｉｖｏ  での現実の創傷治療は示唆さえするものではない。また、このようなトランスグルタミナーゼの用途は、後述するところから理解されるように、本発明のそれとは明らかに異なっている。
【０００３】
ところで、創傷治療に関しては、消毒後一次縫合等の治療法が一般的に施されるが、これには外科手術が必須である。しかしながら、皮膚破損が大きい場合や熱傷等には、外科縫合は難しい。
【０００４】
一方、創傷治療においては、いかにして創傷の後を残さずに治療するかということが器質的、機能的観点からのみならず、美容的観点からも極めて重要である。
【０００５】
このような、瘢痕拘縮防止には植皮、矯正装具の使用、薬物療法、放射線治療などが知られているが、いずれにも難点がある。すなわち、植皮には、外科療法が必要であるのに加えて、重度熱傷のように創傷が広範囲に及ぶ場合は恵皮部に著しい制限があって理想的な植皮は困難である、また植皮により直ちに創収縮が停止せず、植皮片と創面との接着癒合部をはじめ植皮片縁の縫合線などにかなりの期間にわたって創収縮が進行する、といった問題点が指摘される。矯正装具の使用については、それが補助的手段であり、長期使用が必要であるにも拘わらず、実際には長期使用が困難である、といった問題点がある。薬物療法に関しては、ステロイド軟膏剤は明確な効果が期待できず、肥満細胞の脱顆粒を抑制する作用を有するトラニラストは補助的な効果しか期待できない。放射線治療は、創収縮の機転を抑制するが、他方、創の治癒を阻害するという難点がある。
【０００６】
また、創傷被覆剤もいくつか提案され、使用されているが、いずれも難点がある。すなわち、凍結乾燥豚皮は、創傷面で融解するために張りかえの必要があり、また使用前に生理食塩水で再生する必要がある。コラーゲン製人工皮膚は、ときに軽い疼痛や不快感をきたすことがある。人の血液からつくったプラズマ膜やフィブリン膜は、分泌のある創面の場合は分泌液流出が十分でなく、また人血を原料とするため供給に限度がある。また、装着時の疼痛や不快感は、これらの創傷被覆剤に共通してみられる。更に、これらの創傷被覆剤は、患部の乾燥、止血、感染防止、その他の治療過程に必要な作用を十分には有していない。
【０００７】
止血剤としては、ゼラチン、微繊維性コラーゲン、トロンビン、などが知られているが、更により優れた止血剤の開発が望まれている。
【０００８】
【発明か解決しようとする課題】
本出願人は、従来からトランスグルタミナーゼの製造法及びその広汎な用途開発に注力し、その成果につき既に多数の特許出願を行なっているが、本発明の目的は、このような背景下において、かつ前記の従来技術の背景下において、トランスグルタミナーゼに新たな用途を加えることともなる、トランスグルタミナーゼを有効成分とする新規な創傷治療剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本出願人は、前項記載の課題を達成すべく鋭意研究の結果、トランスグルタミナーゼが広く創傷治療作用を有すること、この作用には瘢痕拘縮防止作用、さらには疼痛抑制、患部乾燥、止血などの作用を合せ有する創傷被覆作用が含まれることを見出し、このような知見に基いてトランスグルタミナーゼを有効成分として含有することを特徴とする創傷治療剤の発明を完成し、これについて既に特許出願を行なっていたところ（国際公開番号ＷＯ９３／２０８３７）、今回このような創傷治療剤の作用が蛋白質または／および粒子を配合することで顕著に向上することをも見出し、本発明を完成するに至った。なお、止血作用について若干付言すれば、トランスグルタミナーゼに蛋白質または／および粒子を併用したものの止血作用は、創傷被覆の作用による場合のみならず、外科的領域や事故などによる創傷の救急処置等においてももちろん有用である。
【００１０】
すなわち、本発明は、トランスグルタミナーゼと蛋白質または／および粒子とを有効成分とすることを特徴とする創傷治療剤、瘢痕拘縮防止剤、創傷被覆剤及び止血剤に関する。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の創傷治療剤の有効成分の１つであるトランスグルタミナーゼには、カルシウム非依存性のものと依存性のものとがある。前者の例としては、微生物由来のもの（例えば、特開昭６４−２７４７１  参照）を挙げることができ、後者の例としては、モルモット由来のもの（例えば、特公平１−５０３８２  参照）、魚由来のもの（例えば、関信夫ら「昭和６３年度日本水産学会秋季大会講演要旨集」  １６７頁及び「平成２年度日本水産学会春季大会講演要旨集」  ２１９頁参照）及びヒト由来のもの（例えば、血液のＸＩＩＩ因子など）を挙げることができる。これらのうち、カルシウム非依存性のものが好ましく、その製造は、例えば上記特開昭６４−２７４７１の方法によることができる。
【００１３】
他の有効成分である蛋白質としては、トランスグルタミナーゼの基質となり得るアミノ酸残基、すなわちグルタミン残基およびリジン残基を有する蛋白質、例えばコラーゲンを挙げることができる。
【００１４】
粒子としては、溶液中に存在するトランスグルタミナーゼが分配しない性質を有する粒子を挙げることができ、このような性質を有するものであれば固体粒子および液体粒子のいずれでもよい。このような性質を有する固体粒子の具体例には、セルロースの粒子がある。また、同様の性質を有する液体粒子の具体例には、水溶液中に界面活性剤等の添加により分散させた油よりなる滴（油滴）がある。油滴は例えばエマルジョンの形態で配合することができる。
【００１５】
もちろん、本発明の効果の奏せられる限りは、蛋白質は複数種類を併用することができ、粒子も２種以上を併用することができ、更には蛋白質および粒子はいずれか一方を単独にまたは双方を同時にトランスグルタミナーゼに配合することができる。
【００１６】
本発明の創傷治療剤の剤形には、本発明の効果の奏せられる限りは特別の制限はなく、有効成分の混合物そのもの、これを含有する溶液、半液体の賦形剤もしくは補助剤を用いた局所適用に適した投与形態のもの、などを挙げることができるが、溶液、軟膏、有効成分の混合物を含有するガーゼなどの局所保護剤、スプレー、エマルジョンなどの形態が投与上好ましい。溶液は、滅菌水、各種緩衝液、などの溶媒にトランスグルタミナーゼ及びその他の有効成分を溶解するなどして調製することができる。軟膏は、その基剤には特別の制限はなく、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、懸濁化剤など通常の原料から適宜採用して基剤とすることができる。
【００１７】
これらの溶液、軟膏、局所保護剤、スプレー、エマルジョンなどにおけるトランスグルタミナーゼの含有量にも特別の制限はないが、  ０．１〜１，０００  Ｕ／ｇ、好ましくは  ０．５〜５００  Ｕ／ｇ程度とするのが投与に便利である。また、蛋白質および粒子の配合量にも、創面に適用する以前には反応を進行させず、またトランスグルタミナーゼの失活も起さない限りは特別の制限はなく、当業者であれば所与の場合に応じて適当な配合量を容易に定めることができる。
【００１８】
本発明の創傷治療剤は、散布、噴霧、塗布、湿布、などの方法により創傷に投与する。
【００１９】
本発明の創傷治療剤を特に瘢痕拘縮防止剤として使用する場合、対象となる創傷は、例えば、熱傷、外科的手術などの外傷などの創傷である。
【００２０】
創傷被覆剤として使用する場合、対象となる創傷は、上記創傷に加えて、例えば、糖尿病アンジオパシー、慢性皮膚潰瘍、血栓症後の潰瘍、褥瘡潰瘍などの創傷である。本発明の創傷被覆剤は、創傷感染防止作用、創傷鎮痛作用、患部乾燥作用、などを有する。因みに、従来知られている感染防止処置中、消毒薬等を使用する創の清浄化は一時的処置に過ぎず、抗菌剤の使用には耐性菌汚染の懸念がある。また、従来の創傷被覆剤などによる創の保護は、接着のための固定が必要であり、また使用時及び着脱等の疼痛、不快感、分泌液の流出などの問題がある。
【００２１】
止血剤として使用する場合は、外科的領域をはじめとした各種の出血の止血に有効である。
【００２２】
本発明の創傷治療剤は、その他の創傷にも広く治療効果を呈する。
【００２３】
本発明の創傷治療剤によれば、瘢痕拘縮防止、創傷被覆及び止血を極めて簡便に行ない得る。
【００２４】
本発明の創傷治療剤は、ヒトの創傷治療に使用されるのみならず、ヒト以外の動物の創傷治療にも使用されることは勿論である。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に説明する。
【００２６】
本実施例において使用したトランスグルタミナーゼは、前掲特開昭６４−２７４７１号公報に記載の実施例１の方法に準じて製造した微生物由来のトランスグルタミナーゼであり、以下、ＴＧと略記する。
【００２７】
実施例１（治療剤の調製）
治療剤３、４および６〜９が本発明のものであり、治療剤１、２および５はコントロールである。
【００２８】
（ａ）治療剤１（ネガティブコントロール）：
実施例２の検査において、ガーゼの交換のみを行なう場合であるが、便宜上治療剤１と称する。
【００２９】
（ｂ）治療剤２（治療剤３および４に対するポジティブコントロール）：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）のＴＧ３ユニット／ｍｌ液で、この溶液１ｍｌをガーゼ１枚に滴下した。
【００３０】
（ｃ）治療剤３（固体粒子配合）：
約２０ｗ／ｖ％セルロースＴＧ３ユニット／ｍｌ溶液で、旭化成工業（株）製白色粉末セルロース「アビセルＰＨ−Ｍ１５」３ｇにＴＧ３ユニット／ｍｌ液１５ｍｌ加えて溶解して作成したもの。その総容量を１５で除した値（１匹当り約１．１〜１．２ｍｌ）をガーゼ１枚に滴下した。
【００３１】
（ｄ）治療剤４（液体粒子配合）：
ＴＧ３ユニット／ｍｌ・エマルジョン溶液で、ＴＧ３０ユニット／ｍｌ液０．１ｍｌとエマルジョン液１ｍｌをシリンジで採取し、混合して作成したもの。この１．１ｍｌをガーゼ１枚に滴下した後、広げた。なお、このエマルジョン液の組成は、コーン油３０ｗ／ｗ％、水７０ｗ／ｗ％および乳化剤（対コーン油）０．６ｗ／ｗ％（「シュガーエステルＳ−１１７０」０．３ｗ／ｗ％およびキサンタンガム０．３ｗ／ｗ％）で、平均エマルジョン径５μｍであった。
【００３２】
（ｅ）治療剤５（治療剤６〜９に対するポジティブコントロール）：
ＴＧ３０ユニット／ｍｌ・ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ溶液で、ＴＧ３０ユニット／ｍｌ液１ｍｌと５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）１ｍｌをシリンジで採取し、混合して作成したもの。これをガーゼ２枚に滴下した。
【００３３】
（ｆ）治療剤６（蛋白質配合（その１））：
ＴＧ３０ユニット／ｍｌ・コラーゲン１．５ｍｇ／ｍｌ溶液で、ＴＧ３０ユニット／ｍｌ液１ｍｌとコラーゲン１．５ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌをシリンジで採取し、混合して作成したもの。これをガーゼ２枚に滴下した。なお、コラーゲン溶液は、高研製「アテロコラーゲン」で、蛋白質純度９９％以上、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）の３％溶液であった。
【００３４】
（ｇ）治療剤７（蛋白質配合（その２））：
ＴＧ３０ユニット／ｍｌ・コラーゲン３ｍｇ／ｍｌ溶液で、ＴＧ３０ユニット／ｍｌ液１ｍｌとコラーゲン３ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌをシリンジで採取し、混合して作成したもの。これをガーゼ２枚に滴下した。なお、コラーゲン溶液は、濃度以外は治療剤６におけると同じであった。
【００３５】
（ｈ）治療剤８（蛋白質配合（その３））：
ＴＧ３０ユニット／ｍｌ・コラーゲン１０ｍｇ／ｍｌ溶液で、ＴＧ３０ユニット／ｍｌ液１ｍｌとコラーゲン１０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌをシリンジで採取し、混合して作成したもの。これをガーゼ２枚に滴下した。なお、コラーゲン溶液は、濃度以外は治療剤６におけると同じであった。
【００３６】
（ｉ）治療剤９（蛋白質配合（その４））：
ＴＧ３０ユニット／ｍｌ・コラーゲン３０ｍｇ／ｍｌ溶液で、ＴＧ３０ユニット／ｍｌ液１ｍｌとコラーゲン３０ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌをシリンジで採取し、混合して作成したもの。これをガーゼ２枚に滴下した。なお、コラーゲン溶液は、濃度以外は治療剤６におけると同じであった。
【００３７】
実施例２（創傷治療効果の検査）
（ａ）試験動物：年令
７週齢のＣｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）系ＳＰＦラット（日本チャールス・リバー（株）の雄１０８匹を各群同数（１２匹）の群９つに分けて試験に供した。
【００３８】
（ｂ）創傷の作製方法：
創傷部位は、ラットをｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｓｏｄｉｕｍ（４０ｍｇ／ｋｇ，  ｉ．ｐ．）で麻酔した後、背部をバリカンで刈毛（約７ｃｍ×７ｃｍ）し、ヒビテンで消毒後、ハサミを用いて約５ｃｍ四方の大きさに皮膚を剥離して作製した。
【００３９】
（ｃ）投与方法および検査期間：
治療剤１〜９を９つの群を使用して検査した。各群を被検治療剤の番号に対応して群１〜９とそれぞれ称する。
【００４０】
治療剤は、創傷部位を完全に覆う程度の大きさのガーゼ１枚（群２〜４）あるいは２枚（群５〜９）に、１匹あたり約１ｍｌ（群２〜４）あるいは２ｍｌ（群５〜９）をしみこませて、創傷部位に貼付した。その後、貼付部位を粘着性伸縮繃帯（「ハイラテックス中」イワツキ（株）製）で覆い、さらにその上にサージカルテープ（３Ｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ−Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製）を用いて約２４時間固定した。
【００４１】
投与期間は、群２〜４で創傷作製後０〜１４日の毎日、そして群５〜９で創傷作製後、０、４、８および１２日目とし、群５〜９の非投与日にはガーゼの交換のみを行った。群１（対照群）はガーゼ１枚のみを貼付し、連日交換した。
【００４２】
なお、動物は創傷作製後２、７および１４日に各群各４匹について採血と創傷部位の採取を行った。
【００４３】
群構成は、上記の如く、各治療剤を連日あるいは４日間隔にそれぞれ投与する計８群に、無投与の対照群を加え９群を設けた。１群の動物数は雄１２匹としたことは前記の通りである。
【００４４】
（ｄ）創傷の観察：
創傷部位は、観察期間中毎日、下記第１〜４表に掲げる状態を指標として観察した。なお、観察結果を数量化するためのスコアも各表に併記する。
【００４５】
【表１】
0003620055.tif 000002
【００４６】
【表２】
0003620055.tif 000003
【００４７】
【表３】
0003620055.tif 000004
【００４８】
【表４】
0003620055.tif 000005
【００４９】
（ｅ）観察結果：
（１）  創傷面における被膜様物質の形成状態についての結果を図１Ａ〜図１Ｉに示す。
【００５０】
創傷面の被膜様層のの形成は、群４＞群３＞群２＞群９≧群８≧群７≧群６＞群５＞群１（対照群）の順により広範囲に、より厚く認めた。なお、群２および３の被膜は創傷作製後６〜９日に黄色調を帯びる動物がみられるとともに、被膜の一部がガーゼ交換時に剥離し、剥離部位は鮮桃〜赤色調で不整であった。その後、被膜様層の一部は痂皮状となり、被膜様層と同じくガーゼ交換時に一部が剥離し、剥離部位は白みを帯びていた。群４の被膜も同様の経過を示したが、被膜の黄色調変化およびその一部剥離した時期が創傷作製後７〜１２日と延長し、被膜様層が痂皮状あるいはその一部が剥離した時期も創傷作製後１３または１４日と延長した。一方、被膜様層の薄かった群５〜９では、被膜の一部剥離、部分的な痂皮形成およびその痂皮の一部剥離が極少数例にみられたのみであった。
【００５１】
（２）  創傷面における滲出液の状態についての結果を図２Ａ〜図２Ｉに示す。
【００５２】
創傷面における滲出液は、被膜様層が広範囲に厚くなった群４で創傷作製後７または８日に、群３で創傷作製後４〜８日に、群２で創傷作製後７日に少なくなったが、対照群を含む他の投与群の滲出状態については、常に滲出液が認められ、差はないものと考えられた。
【００５３】
（３）  疼痛の状態についての結果を、図３Ａ〜図３Ｉに示す。
【００５４】
貼付ガーゼを取る時に痛がる動物数は、創傷面の被膜様層が広範囲に厚かった群４で最も少なく、以下群９≦群８＝群７＝群６＝群５＝群３＝群２＜群１（対照群）の順であった。
【００５５】
（４）  創傷面における出血状態についての結果を、図４Ａ〜図４Ｉに示す。
【００５６】
貼付ガーゼを取り除いた後の創傷面の出血は、創傷面の被膜様層が広範囲に厚くなる程少なくなり、平均スコアは群４＜群３＜群２＝群９＝群８＝群７＝群６＝群５＜群１（対照群）の順で、群４が最も出血は少なかった。各群の出血は創傷作製後１１日以降少なくなった。
【００５７】
（ｆ）考察およびまとめ
７週齢のＣｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）系ＳＰＦラット（１群雄１２匹）の背部創傷に治療剤２〜４を１４日間反復貼付し、また、治療剤５〜９を４日間隔で４回それぞれ２４時間反復貼付し、創傷作製後２、７および１４日に各群各４匹について採血と創傷部位の採取を行い、最も効果的な治療効果が得られる治療剤を検討した。因みに、治療剤３〜４および６〜９が本発明に係わるものであることは先に述べた通りである。
【００５８】
創傷面の被膜様層の形成は、群４＞群３＞群２＞群９≧群８≧群７≧群６＞群５＞群１の順により速く、より広範囲に、より厚く形成された。
【００５９】
この被膜様層の形成が最も厚かった群４では、貼付ガーゼを取る時動物は痛がらず（鳴かない）、貼付ガーゼを取り除いた後の創傷面の出血も少なかった。しかし、創傷作製後７または８日に滲出液が少なくなり、創傷作成後７日の創傷面積の縮小が遅延する弱点が認められた。
【００６０】
群４の次に被膜様層の形成が厚かった群３および２では、貼付ガーゼを取り除いた後の創傷面の出血は少なかったが、その効果は群４より弱かった。また、貼付ガーゼを取る時の痛みも抑えたが、その効果は群４および９より弱く、創傷作製後４〜８日の間に一時的に滲出液が少なくなる弱点が認められた。
【００６１】
群５〜９では、コラーゲン濃度が最も高かった群９で貼付ガーゼを取る時の痛みを抑えたが、その効果は群４より弱く、また、貼付ガーゼを取った後の創傷面の出血も抑えたが、その効果は群４および３より弱かった。しかし、創傷面の滲出液は常に認められ、創傷面積の縮小にも影響を与えなかった。群８、７、６および５では、群９と比べ痛みおよび出血を抑える効果は同程度もしくはやや弱いものであった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、創傷治療剤、特に瘢痕拘縮防止、創傷被覆及び止血が簡便に行ない得る優れた創傷治療剤が新たに提供されるところとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｂ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｃ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｄ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｅ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｆ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｇ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｈ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ｉ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ａ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｂ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｃ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｄ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｅ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｆ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｇ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｈ】実施例２における検査結果を示す。
【図２Ｉ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ａ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｂ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｃ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｄ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｅ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｆ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｇ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｈ】実施例２における検査結果を示す。
【図３Ｉ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ａ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｂ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｃ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｄ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｅ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｆ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｇ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｈ】実施例２における検査結果を示す。
【図４Ｉ】実施例２における検査結果を示す。
【図１Ａ】
0003620055.tif 000006
【図１Ｂ】
0003620055.tif 000007
【図１Ｃ】
0003620055.tif 000008
【図１Ｄ】
0003620055.tif 000009
【図１Ｅ】
0003620055.tif 000010
【図１Ｆ】
0003620055.tif 000011
【図１Ｇ】
0003620055.tif 000012
【図１Ｈ】
0003620055.tif 000013
【図１Ｉ】
0003620055.tif 000014
【図２Ａ】
0003620055.tif 000015
【図２Ｂ】
0003620055.tif 000016
【図２Ｃ】
0003620055.tif 000017
【図２Ｄ】
0003620055.tif 000018
【図２Ｅ】
0003620055.tif 000019
【図２Ｆ】
0003620055.tif 000020
【図２Ｇ】
0003620055.tif 000021
【図２Ｈ】
0003620055.tif 000022
【図２Ｉ】
0003620055.tif 000023
【図３Ａ】
0003620055.tif 000024
【図３Ｂ】
0003620055.tif 000025
【図３Ｃ】
0003620055.tif 000026
【図３Ｄ】
0003620055.tif 000027
【図３Ｅ】
0003620055.tif 000028
【図３Ｆ】
0003620055.tif 000029
【図３Ｇ】
0003620055.tif 000030
【図３Ｈ】
0003620055.tif 000031
【図３Ｉ】
0003620055.tif 000032
【図４Ａ】
0003620055.tif 000033
【図４Ｂ】
0003620055.tif 000034
【図４Ｃ】
0003620055.tif 000035
【図４Ｄ】
0003620055.tif 000036
【図４Ｅ】
0003620055.tif 000037
【図４Ｆ】
0003620055.tif 000038
【図４Ｇ】
0003620055.tif 000039
【図４Ｈ】
0003620055.tif 000040
【図４Ｉ】
0003620055.tif 000041