(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
使い捨て試験用細片および血液試料を受容し、試料中の血液アナライトの量の電気化学的分析を行う形式のテストメーターで用いられる使い捨て試験用細片であって、
(a) 基体；
(b) 基体上に配置されている第一導電性素子；
(c) 基体上に、第一導電性素子に充分に近接して配置されている第二導電性素子であって、これにより血液試料が試験用細片上に置かれると、第一導電性素子と第二導電性素子との間の電気回路を完成させることができる第二導電性素子；
(d) 第一導電性素子を覆って配置されている非導電性の一体化した試薬／血液分離層であって、可溶性電気活性成分により第一導電性素子に接近することを可能にしながら、疎水性表面と親水性表面との両方を有する充填剤を含み、かつ、血液細胞を第一導電性素子の表面から排除するのに有効な非導電性マトリックス中に分散されているアナライトを電気化学的に検出するための試薬を含有する非導電性の一体化した試薬／血液分離層；および
(e) 第一および第二導電性素子とテストメーターとの間を電気的に接続するコンタクト、
を含む、使い捨て試験用細片。
【請求項２】
少なくとも第一導電性素子を覆って配置されており、第一導電性素子と整合している第一開口部をそこに有する絶縁層であって、上記非導電性の一体化した試薬／血液分離層は絶縁層に存在する開口部を経て第一導電性素子と接触する、絶縁層をさらに含む、請求項１記載の試験用細片。
【請求項３】
非導電性の一体化した試薬／血液分離層は第一開口部全体を覆っており、これにより第一導電性素子の試験用細片に適用された試料に直接にさらされる部分が残らないようにされている、請求項２記載の試験用細片。
【請求項４】
一体化した試薬／血液分離層が、グルコース酸化酵素および電子を酵素から第一導電性素子に輸送するのに有効なレドックスメディエーターを含有する、請求項１または３に記載の試験用細片。
【請求項５】
充填剤がシリカである、請求項４記載の試験用細片。
【請求項６】
第一導電性素子および第二導電性素子が導電性カーボンを含有する、請求項５記載の試験用細片。
【請求項７】
酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項６記載の試験用細片。
【請求項８】
レドックスメディエーターがフェリシアニドである、請求項７記載の試験用細片。
【請求項９】
一体化した試薬／血液分離層が、結合剤２〜１０重量％；シリカ３〜１０重量％；レドックスメディエーター８〜２０重量％；および酵素１０００〜５０００単位／水性組成物グラムを含有する水性組成物から形成されている、請求項５記載の試験用細片。
【請求項１０】
第一導電性素子および第二導電性素子が導電性カーボンを含有する、請求項９記載の試験用細片。
【請求項１１】
酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項９記載の試験用細片。
【請求項１２】
レドックスメディエーターがフェリシアニドである、請求項１１記載の試験用細片。
【請求項１３】
使い捨て試験用細片および血液試料を受容し、試料中の血液アナライトの量の電気化学的分析を行う形式のテストメーターで用いられる使い捨て試験用細片の製造方法であって、
(a) 基体上に第一導電性素子および第二導電性素子を形成し；
(b) 第一導電性素子を覆う絶縁体の層を形成し、この絶縁体層は第一導電性素子の試料適用領域部分と整合している第一開口部をそこに有しており；次いで
(c) 絶縁層上に配置されており、絶縁層に存在する第一開口部を経て第一導電性素子と接触する非導電性の一体化した試薬／血液分離層であって、可溶性電気活性成分により第一導電性素子に接近することを可能にしながら、疎水性表面と親水性表面との両方を有する充填剤を含み、かつ、血液細胞を第一導電性素子の表面から排除するのに有効な非導電性マトリックス中に分散されているグルコースの電気化学的検出用試薬を含有し、これにより第一導電性素子が試験用細片に適用された試料への直接接触から分離される、非導電性の一体化した試薬／血液分離層を形成する、
工程を包含する、製造方法。
【請求項１４】
非導電性の一体化した試薬／血液分離層を、第一開口部全体を覆って形成し、これにより第一導電性素子の試験用細片に適用された試料に直接にさらされる部分が残らないようにする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
一体化した試薬／血液分離層が、グルコース酸化用酵素および電子を酵素から第一導電性素子に輸送するのに有効なレドックスメディエーターを含有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
充填剤がシリカである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第一導電性素子および第二導電性素子が導電性カーボンを含有する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
レドックスメディエーターがフェリシアニドである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
一体化した試薬／血液分離層を、結合剤２〜１０重量％；シリカ３〜１０重量％；レドックスメディエーター８〜２０重量％；および酵素１０００〜５０００単位／水性組成物グラムを含有する水性組成物から形成する、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
第一導電性素子および第二導電性素子が導電性カーボンを含有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
レドックスメディエーターがフェリシアニドである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
絶縁層を第一導電性素子および第二導電性素子の両方を覆って形成し、およびこの絶縁層は、第二導電性素子と整合している第二開口部を備えている、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（説明）
（発明の背景）
本出願は、グルコースなどの血液アナライトの電気化学的測定に用いられる使い捨て試験用細片（test strip）およびこのような細片の製造方法および製造用組成物に関する。
グルコースモニタリングは、糖尿病の人々の毎日の日常的仕事であり、このようなモニタリングの精度は、生と死との間の差を実際的に意味することができる。グルコースレベルの頻繁なモニタリングの必要性に通常の生活スタイルを順応させるために、現在、多くのグルコースメーターを利用することができ、これにより個人が少量の血液中のグルコースレベルを試験することが可能にされている。
【０００２】
これらのメーターの多くは、一回使用の電極システムの一部として付与されている酵素、例えばグルコースオキシダーゼを用いる血液中のグルコースの酸化により、血液試料中のグルコースを電気化学的に検出するものである。この形式のデバイスの例は、欧州特許No.0127958および米国特許No.5,141,868、同No.5,286,362、同No.5,288,636および同No.5,437,999に記載されており、これらの記載をこのような組み入れを許可するこれらの国々の目的にかかわり引用して、ここに組み入れる。
【０００３】
一般に、電気化学的測定に用いられる現存のグルコース試験用細片は、基体、この基体の表面上に形成された作用電極および対照電極、およびメーターを包含する。作用電極は、グルコースを酸化することができる酵素およびグルコースが存在する場合、酵素から電極に電子を輸送し測定可能な電流を生成するメディエーター化合物で被覆されている。代表的メディエーター化合物は、フェリシアニド、メタロセン化合物、例えばフェロセン、キノン類、フェナジニウム塩、レドックス指示薬DCPIPおよびイミダゾール置換オスミウム化合物を包含する。
【０００４】
この種の作用電極は、多くの方法で製造することができる。例えば、導電性カーボン、グルコースオキシダーゼおよびメディエーターの混合物を、ペースト状またはインキ状に調製し、次いで基体に適用する。EP 0127958およびUS5,286,362。使い捨てグルコース細片の場合、小型の薄い試験用細片に適する薄膜を得るために、この適用はスクリーン印刷によって行われる。しかしながら、スクリーン印刷の使用は、電極動作に問題をもたらす。
【０００５】
測定期間中、堅く接着したままで濃厚なカーボンペースト電極とは異なり、カーボンペーストまたはインキから形成されているスクリーン印刷された電極は、試料との接触に際して、破壊されることが証明された。この破壊の結果は、２重である。第一に、電極組成物の成分が溶液中に放出される。これらの成分が、その下に存在する電極層から拡散距離よりも離れて一度移動すると、これらの成分はもはや測定に寄与することができず、むしろ実際には、内部に向って拡散するアナライトの枯渇による応答を減少させる。第二に、スクリーン印刷された電極の破壊は、有効電極面積が経過時間にわたり低下することを意味する。
【０００６】
これら二つの作用の組み合わせにより、電流過渡（current transient）の測定期間中にわたる初期ピークからの急速な低下および酵素用メディエーターと急速に競合する酸素に対する高感受性が生じる。この事実は、血液試料で測定された電流が血漿試料または他の水性媒質で測定された電流に比較して少ないことによって明白に証明され、またこの事実は読み取り誤差をもたらすことができる。これに引き続いて、この過渡はしばしば、電極が無秩序の様相で破壊される結果として、「不揃い」（lumpy）になる。この不揃いの過渡電流は、誤った読みを生じさせるか、または細片拒絶を生じさせ、これらはどちらも、許容できるものではない。
【０００７】
スクリーン印刷されたカーボンを基材とする電極の電極破壊にかかわる問題に加えて、使い捨てグルコース試験用細片に用いられる公知電極は、動態的に制御されるものである。すなわち、その電流は酵素によるグルコースの変換速度に依存する。メーターにより測定される応答は、酵素とメディエーターとの間の反応、酵素とグルコースとの反応および酵素と酸素との反応の間の平衡を表わすことから、またこれらの反応はそれぞれ、それ自体が温度に依存することから、動態的に制御される試験用細片の応答は、試料温度に対して非常に敏感である。測定されたグルコース値における実質的な差異が試料の取り扱いの相違の結果として生じることがある。
【０００８】
電気化学的グルコース検出用センサーが直面するもう一つの挑戦は、試料中に存在する血液細胞からの干渉の結果として生じる。赤血球レベルは、ヘマトクリットの読みに反映する。代表的に、高ヘマトクリット試料は、真正値よりも低い読みをもたらし、他方で、低ヘマトクリット試料は、この血液細胞が電極表面を汚し、電子輸送を制限する傾向を有することから、真正値よりも高い読みをもたらす。また、赤血球のヘモグロビンに結合した酸素は、還元酵素に対するメディエーターと競合し、これによりグルコース応答をさらに減少させる。血液成分を濾別するために、膜を付加することによってヘマトクリット作用を制限することが試みられている（米国特許No.5,658,444参照、これらの記載をこのような組み入れを許可するこれらの国々の目的にかかわり引用して、ここに組み入れる）。しかしながら、この方法は製造方法に追加の工程を付加し、従って価格を高め、また精度などの別の観点でもしばしば、性能を悪化させる。
【０００９】
メーターおよび使い捨て試験用細片を用いる患者の福利に対応して正確なグルコース値を得ることは重要なことであることから、これらの欠点を被ることなく、従って実施条件に関係なく、実際の血液中グルコース値の高い一貫性および信頼できる指示を提供するグルコース試験用細片を得ることが非常に望まれている。従って、本発明の目的は、試料中のヘマトクリットから実質的に独立している読みを提供し、また一体化した試薬／血液分離層を備えている使い捨てグルコース試験用細片を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、使い捨てグルコース試験用細片の改良された製造方法を提供することにある。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、使い捨て試験用細片および患者からの血液試料を受容し、試料中のグルコースなどの血液アナライトの量の電気化学的分析を行う形式のテストメーターで用いられる使い捨て試験用細片を提供する。この試験用細片は、
(a) 基体；
(b) 基体上に配置されている第一導電性素子；
(c) 基体上に、第一導電性素子に充分に近接して配置されている第二導電性素子であって、これにより血液試料が試験用細片上に配置されると、第一導電性素子と第二導電性素子との間の電気回路を完成させることができる第二導電性素子；
(d) 第一導電性素子を覆って配置されている非導電性の一体化した試薬／血液分離層；および
(e) 第一および第二導電性素子とテストメーターとの間を電気的に接続するコンタクト；
を備えている。
【００１１】
この一体化した試薬／血液分離層は、可溶性電気活性成分により第一導電性素子に接近することを可能にしながら、血液細胞を第一導電性素子の表面から排除するのに有効な非導電性マトリックス中に分散されているアナライトの電気化学的検出用の試薬を含有する。本発明の一態様において、グルコース試験用細片は、疎水性表面領域と親水性表面領域との両方を有する充填剤、グルコース酸化用酵素、例えばグルコースオキシダーゼおよび電子を酵素から第一導電性素子に輸送するのに有効なメディエーターを備えている。この充填剤は、乾燥すると、一体化した試薬／血液分離層が導電性素子の表面上で二次元ネットワークを形成するような疎水性と親水性とのバランスを有するように選択する。好適な一体化した試薬／血液分離層は、ヒドロキシエチルセルロース（HEC）などの材料と組み合わされている非導電性シリカ充填剤を含有する。シリカおよびHECは、赤血球細胞を排除する二次元ネットワークを形成し、従って当該試験用細片を患者のヘマトクリットに対して実質的に不感受性にする。
【００１２】
本発明の好適態様において、この試験用細片は、少なくとも第一導電性素子全体を覆って配置されている絶縁層を備えて製造される。この絶縁層は、第一導電性素子と整合するように形成されている第一開口部をそこに有しており、また一体化した試薬／血液分離層がこの開口部を経て第一導電性素子と接触するように配置されている。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
図１Ａおよび１Ｂには、本発明による使い捨て試験用細片に有用な電極が示されている。図示されているように、この電極は基体１０上に形成される。基体１０上に、２種の導電性素子１４’および１６を配置し、これらの素子を導線１４および１５により導電性コンタクト１１、１２および１３に接続する。次いで、絶縁層１８を形成し、導電性素子１４’および１６の少なくとも一部分を残し、またコンタクト１１、１２および１３が露出されるようにする。次いで、非導電性の一体化した試薬／血液分離層１７を絶縁マスク１８全体上に適用し、コンタクトを導電性素子１６と接触させる。
【００１４】
図１に示されている構造体は、メーターに接続した場合、血液アナライトの測定に対して充分に機能する組立て装置を提供する。しかしながら、有利には、本発明による細片状電極は、一体化した試薬／血液分離層１７の位置により定められる電極構造体２２の試料適用領域全体を覆ってナイロンまたはポリエステルメッシュを適用することにより、および次いで血液試料の放散を防止するためのトップカバー２３を適用することにより仕上げられている（図２）。このポリエステルメッシュは、試料を対照電極、導電性素子１４’に導くために作用し、これにより当該デバイスが始動され、試験が開始される。
【００１５】
非導電性の一体化した試薬／血液分離層を使用することによって、試薬の印刷に導電性試薬含有スラリーを用いる公知試験用細片との重要な相違点が付与され、また公知試験用細片に優る利点が得られる。これらのシステムにおいて、印刷されたスラリーは、電極の機能的部分になり、電荷移送を試薬層の外側表面で生じる。この層が血液と直接接触すると、すなわち介在する分離層が配置されていないと、赤血球細胞および白血球細胞、脂肪および試料中に存在する成分が試薬層と相互反応し、試料中のアナライトの量の測定が干渉される。
【００１６】
これに対して、本発明において、一体化した試薬／血液分離層は非導電性であり、従って構造的にも、または機能的にも、電極の一部ではない。電気活性成分が一体化した試薬／血液分離層の開口部／孔を通過し、その下に存在する導電性素子に到達しないかぎり、電荷移送は生じない。従って、この一体化した試薬／血液分離層は細胞および巨大分子などの干渉物質の通過に対する障壁を提供し、優れた性能を有するデバイスをより簡単なものにする結果をもたらす。
【００１７】
この結果を達成するためには、試料を試料適用領域に配置した場合、導電性素子１６の一部が試料にさらされないような様相で、一体化した試薬／血液分離層を配置することが特に望ましい。導電性素子１４’および１６を横切って付与されている開口部を備えた絶縁層を用いる上記方法は、この結果の達成に特に適している。従って、図９Ａ〜９Ｃに示されているように、この方法は、３工程のみで試験用細片の形成を可能にする。第一工程において（図９Ａ）、２個の導電性素子１４’および１６および付随する導線およびコンタクトを基体上に設置する。第二工程において（図９Ｂ）、絶縁性材料の層を導電性素子全体を覆って沈着させる。この絶縁性材料は２個の孔９４および９６を有し、その一方は導電性素子１４’および１６とそれぞれ整合させる。第三工程において（図９Ｃ）、一体化した試薬／血液分離層１７を孔９６を覆って配置する。この配置された層１７を孔９６よりも大きくすることによって、試料が導電性素子にさらされないようにされ、試薬層がその下の導電性素子を完全に覆い、これにより効果的な血液分離が得られる。
【００１８】
導電性素子の完全被覆はまた、電気化学的酸化の結果として、または試料中に存在することがあるアスコルビン酸、尿酸およびアセトアミノフェンなどの小型分子により生じることがある、もう一つの誤認原を提供する。存在する場合、電極表面におけるこれらの分子の酸化は、見せかけの電流レベル上昇を導き、所望のアナライト、例えばグルコースの不正確な測定値をもたらす。本発明による一体化した試薬／血液分離層は一般に、これらの分子が見出される孔寸法に比較して小さいことから、これらの分子を排除する。しかしながら、この一体化した試薬／血液分離層にｐＨ緩衝剤を包含させることによって、電極表面の局所ｐＨを、これらの成分の電気化学的電力がより高いレベルにまで移動させることができる。従って、一例として、そのｐＨがｐＨ５付近のレベルに緩衝されている一体化した試薬／血液分離層を用いると、これらの干渉による衝撃が実質的に減少される。しかしながら、露出されている（緩衝されていない）電極表面の面積が比較的小さくても、大量の干渉電流が生じることがあることから、この緩衝効果を最大にするためには、導電性素子全体を被覆しなければならない。
【００１９】
本発明の試験用細片は、血液試料からの導電性素子の分離をもたらす性能上の利点を提供するばかりでなく、また本発明の試験用細片は別の誤差発生原に対する抵抗性を有する。一例として、試験期間中、試薬は元の貯蔵槽から横方向に拡散放出されることがある。試薬層を導電性素子に直接に沈着させることによって、これらの試薬は測定信号に関与し続ける。試験毎との伝達変化（例えば、デバイスの取り扱いにおける変化または温度の相違の結果として生じる）にかかわる全ての変化は非再現性の信号として現れる。しかしながら、試薬層を絶縁印刷物で覆うと、孔からの横方向拡散放出は、信号に関与せず、従って信号の変化は生じないものと見做される。
【００２０】
有利な性質を有する試験用細片を提供することに加えて、図９Ａ〜Ｃに概略が示されている方法は、その製造法からも数種の利点をもたらす。第一に、試薬層を導電性素子上に直接に印刷した場合、「活性面積」は、試薬層の面積により定められる。従って、試験の精度は、試薬層を印刷することができる精度により決定される。これに対して、試薬層とその下の導電性素子との間の接触領域を定める有孔絶縁層を最初に沈着させることによって、活性面積は絶縁層に存在する孔の寸法により定められる。絶縁層は代表的に、微細スクリーンを用いて印刷されることから、縁端限定がより良好になり、従ってより大きいデバイス精度を得ることができる。すなわち、最終試験用細片の性能上の特性にかかわり、導電性素子１６の面積も、また一体化した試薬／血液分離層の面積も、臨界的ではなくなる。従って、導電性素子および一体化した試薬／血液分離層は、別の方法で用いることができるよりも精度の低い技術を用いる場合にも、使用することができる。
【００２１】
当業者にとって明白なように、両方の導電性素子は、試料適用領域に配置された試料中の電気活性成分を需要することができなければならないばかりでなく、また絶縁マスクの重要な機能は、導電性素子１６と一体化した試薬／血液分離層１７との間の接触領域を明確に規定することにある。すなわち、制限しようとする場合、絶縁層に１個の孔を形成する必要があるのみである。第二導電性素子は、絶縁層の縁端に沿って露出させることができ、または重ねられた電極構造体と対面させて位置させることもできる。
【００２２】
本発明による試験用細片の製造に用いられる基体１０は、グルコーステストメーターに挿入するのに適する全部の非導電性で寸法的に安定な材料であることができる。適当な材料には、ポリエステル薄膜、例えば３３０ミクロンのポリエステル薄膜、およびその他の絶縁性基体材料、例えばポリビニルクロライド（PVC）およびポリカーボネートが包含される。
【００２３】
導電性素子および付随する導線およびコンタクトは、銀、Ａｇ／ＡｇＣｌ、金またはプラチナ／カーボンを包含するいずれかの導電性材料から形成することができ、これら全部を同一材料から製造する必要はない。導電性素子１６は好ましくは、導電性カーボンから形成される。好適導電性カーボンは、ERCON ERC1,ERCON ERC2 およびアチェソンカーボンエレクトロダグ（Acheson Carbon Electrodag） 423 である。これらの仕様を有するカーボンは、エルコン社［Ercon Inc.(Waltham,Massachusets,USA)］またはアチェソンコロイド社［Acheson Colloids(Princes Rock,Plymouth,England)]から入手することができる。導電性素子１６は、作用電極トラック１５と接触させ、次いでそこを閉鎖させるが、対照電極トラック１４の末端として設置される導電性素子とは接触させない。
【００２４】
絶縁層18は、ポリエステルを基材とする印刷可能な誘電性材料、例えばERCON R488-B(HV)-B2 ブルーから形成することができる。トップカバー２３は、ポリエステル片からまたは「ホットメルト」被覆プラスティックから適当に形成することができる。
本発明による試験用細片は、試料が電極室に入るのに従いデバイスからの空気の排除を可能にする分離した出口開口部を形成する必要はないが、その代わりに、メッシュの縁端全体に沿って分布している出口を用いることができる。試料流体がメッシュに沿って弾かれるに従い、空気は最上層の下側のデバイス全体を取り囲むメッシュの縁端から滲出する。試料流体は、絶縁層がメッシュの一部に格別の疎水性を付与することから、滲出しない。従って、液状試料は中央の親水性領域にとどまる。
【００２５】
本発明を用いて達成される性能の鍵は、一体化した試薬／血液分離層の性質にある。この層は、疎水性表面と親水性表面との両方を有する充填剤を含有し、またグルコース試験用細片の場合、グルコースを酸化することができる酵素および酵素からその下の導電性素子層１６に電子を輸送することができるメディエーターを含有する混合物から形成することができる。この層は、充填剤、酵素およびメディエーターを適当な担体中に含有するインキを形成し、このインキを用いて、当該デバイス上に層１７を印刷する。
【００２６】
層１７に用いるのに好適な充填剤は、シリカである。シリカは、種々の等級で、また種々の表面修飾をもって入手することができる。試験された全部のシリカ化合物が、或る条件下にグルコースを測定することができる生成物をもたらすが、本発明のグルコース試験用細片の優れた性能特性は、これを部分的に疎水性にする表面修飾を有するシリカを用いた場合に得られる。この種の材料には、Cab-O-Si TS610（これは、メチルジクロロシランで部分的に表面処理されたシリカである）、Cab-O-Sil 530（これは、ヘキサメチルジシラザンで完全に表面処理することによって修飾されたシリカである）、スフェリソルブ（Spherisorb）C4シリカ（これは、４炭素鎖で表面修飾されたシリカである）およびその他の類似の修飾されたシリカまたはその組合わせが包含される。過度に疎水性である表面修飾を有するシリカは回避すべきである。例えば、C18修飾シリカは、印刷可能なインキの形成には疎水性過ぎることが見出された。
【００２７】
本発明のインキの製造操作中、粒子はホモジネーションにより分解され、シリカ粒子の親水性内部部分が露出される。従って、インキ中に実際に存在する粒子は、疎水性領域と親水性領域との両方を有する。この親水性領域は、相互に、および水と水素結合を形成する。
【００２８】
例１で下述するように、この材料をインキ中に配合し、導電性素子１６上にスクリーン印刷すると、この材料の二重の性質が、この二つに二次元ネットワークの層を形成させる。このネットワークは、顕微鏡検査で見ることができる蜂の巣状体として形成される。再水和させると、この層は分解しないが、膨潤して、その下に存在する導電性素子１６付近にゲル化した反応帯域を形成する。酵素、メディエーターおよびグルコースなどの反応は、この帯域内で自由に移動するが、酸化されたヘモグロビンを含有する赤血球細胞などの干渉成分は排除される。この結果として、一定量のグルコースに対する応答で生じる電流の量が、４０〜６０％のヘマトクリット範囲にわたり１０パーセントよりも少なく変化し、従って、試料がヘマトクリットに対して実質的に不感受性であり、また細胞を含有していない対照溶液におけるのと実質的に同様の性能が血液で得られるデバイスが得られる（図３Ａ〜Ｃ、図４および図５Ａ〜５Ｃ）。
【００２９】
さらにまた、ゲル化した反応帯域は、動態的に制限されるというよりは、むしろ当該デバイスを拡散するグルコースなどの血液アナライトの流入に対するより大きい障壁を提供する。これは、測定された電流が２０℃〜３７℃の温度範囲にわたり１０パーセントよりも少なく変化し、また実質的に温度独立性であるデバイスを導く（図６Ａおよび６Ｂ）。
【００３０】
グルコース試験用細片を製造する場合、一体化した試薬／血液分離層は、ヒドロキシエチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースとアルギネートもしくはその他の増量剤との混合物などの結合剤を、２〜１０重量％、好ましくは４〜１０重量％、さらに好ましくは約４．５重量％の量で、シリカを３〜１０重量％、好ましくは３〜５重量％、さらに好ましくは約４重量％の量で、フェリシアニドなどのメディエーターを８〜２０重量％、好ましくは１４〜１８重量％、さらに好ましくは約１６重量％の量で、およびグルコースオキシダーゼなどの酵素を０．４〜２重量％、好ましくは１〜２重量％、さらに好ましくは約１．６重量％の量（この量は、約２５０単位／mgの比活性またはインキ組成物１gあたり約１０００〜５０００単位／mgに相当する）で含有する。
【００３１】
一体化した試薬／血液分離層はまた、本発明の範囲から逸脱することなく、追加の成分を含有することができる。一例として、非導電性層は、発泡防止剤を含有することができる。さらに、非導電性層は、反応帯域のｐＨを制御するために、緩衝剤を用いて組成することができる。このｐＨは、約ｐＨ３からｐＨ１０までの範囲内のレベルに維持することができる。本発明の一態様において、デバイスのｐＨを８以上のレベルに維持すると、特に有利であり、これはこのｐＨにおいて、ヘモグロビンに結合した酸素が放出されないからである。さらに、このｐＨにおいて、グルコースオキシダーゼと酸素との反応は、非常に遅い。従って、適当なｐＨの選択は、変化するヘマトクリットの作用に対する当該試験用細片の性能をさらに安定化する。本発明の別の態様において、低ｐＨの維持が好適であることもある（ｐＨ５．５以下、このｐＨはグルコースオキシダーゼと酸素との反応にとって最適ｐＨである）。例えば、アスコルビン酸、尿酸またはアセトアミノフェンなどの干渉物質の酸化から生じる電気化学的干渉を排除することが主目的である場合、ｐＨをｐＨ５に維持すると好ましい。この理由は、これらの化合物が低ｐＨでは酸化させることがより困難であるからである。
【００３２】
本発明の好適態様は、上記のグルコース試験用細片であるが、本発明の試験用細片はグルコースの検出に制限されるものではない。例えば、フラクトサミン試験用細片は、導電性素子上に配置されている２枚の層を含んでいる。第一の下方の層は、例 7に実質的に記載されているようなシリカマトリックス中にカーボネート緩衝剤（ｐＨ＞１０）を含有するが、酵素、メディエーターまたはクエン酸塩緩衝剤を含有していないインキから形成する。第二の上方の層は、フェリシアニドなどの酸化剤をさらに含有するインキから形成する。
【００３３】
図７は、本発明のもう一つの態様を示している。この態様においては、第二の非導電性層７１を、一体化した試薬／血液分離層１７上に配置する。この層は、酵素または酵素とメディエーターの両方が省略されている以外は第一の一体化した試薬／血液分離層と同一である組成物から形成する。この層はまた、導電性層16を酸素担持赤血球細胞との接触から分離し、これにより酸素の作用が減少される。さらにまた、酵素が測定中に電極の表面から離れて分散される傾向を有することができる程度にまで、このようなメディエーター含有層の電子輸送に利用することができるメディエーター含有領域を増加させることができる。
【００３４】
例１
一体化した試薬／血液分離層１７を製造するための非導電性組成物を、下記のとおりにして製造した。２０mM水性クエン酸三ナトリウム１００mlのｐＨを、０．１Mクエン酸の添加により、ｐＨ６に調整した。ここに、ヒドロキシエチルセルロース（HEC）６gを添加し、次いでホモジネーションにより混合した。この混合物を一夜にわたり放置し、空気泡を分散させ、次いでコーティング組成物形成用の原料溶液として使用した。
このＨＢ溶液５０gに、Cab-o-Sil TS610 シリカ２gおよびダウコーニング（Dow Corning）発泡防止化合物０．１gを、手で撹拌しながら全量の4/5が添加されるまで徐々に添加した。残りはホモジネーションによる混合によって添加した。この混合物を次いで、冷凍庫内で１０分間冷却させた。次いで、カリウムヘキサシアノフェレート(III)８gを添加し、完全に溶解するまで混合した。最後に、グルコースオキシダーゼ酵素製剤０．８g（２５０単位／mg）を添加し、次いで溶液中に充分に混合した。生成する組成物は印刷用に整えられており、または冷蔵して保存することができる。
【００３５】
例２
例１のインキ組成物を用いてグルコース試験用細片を製造するために、一連の組み合わせを用いて、３３０ミクロンのポリエステル基体［メリネックス（Melinex）329］上に層をスクリーン印刷した。この第一工程は、カーボンパッドの印刷である。カーボンの10X50パッドのアレーを、EC2 カーボン［エルコン（Ercon）］を用いる印刷によりポリエステル基体の表面上に形成する。この印刷された基体を次いで、加熱ドライヤーに通し、次いで所望により、高められた温度（例えば、７０℃）で１〜３週間かけて硬化させる。
次いで、銀／塩化銀接続トラックおよびコンタクトのアレーを、ERCON R-414(DPM-68)1.25バイオ電極センサーコーティング材料を用いて基体上に印刷し、次いで乾燥させる。アレーの各カーボンパッド毎に、カーボンパッドと接触させる１個の作用トラックおよび１個の対照トラックを印刷する。
【００３６】
誘電体層を次いで、ERCON R-488-B(HV)-B2ブルーを用いて印刷し、次いで乾燥させる。この誘電体層は、各デバイスの実質的に全体を覆い、未被覆のコンタクト、対照電極の最上面およびカーボンパッドのみを残す。
この誘電体層の最上面上に、例１のインキを用いて、各導電性カーボンパッドの最上面上に積層されている一体化した試薬／血液分離層を形成する。
ポリエステルメッシュ細片［スクリネル(Scrynel)PET230HC］を次いで、基体を横切る列の状態で形成し、この誘電体の窓により露出されている反応領域を覆う。５mm幅のポリエステル細片（厚さ５０ミクロン）を次いで、このメッシュ細片の最上面上に適用し、次いで電極の縁端を熱シールする。最後に、基体を切り、例えば幅５．５mmおよび長さ３０mmの大きさを有する５０個の電極を得る。
【００３７】
例３
例２に記載の方法で例１のインキ組成物を用いて製造された試験用細片を、５００mVの適用電圧を備えたテストメーターに配置し、種々のグルコース濃度および４０％〜６０％の範囲のヘマトクリットを含有する血液試料の試験に使用した。図３Ａ〜３Ｃは、電圧適用後の２５秒の時点で測定された電流をグルコース濃度の関数として示しており、また図４は、グルコースの応答の勾配をヘマトクリットの関数として示すグラフである。この図面から見ることができるように、この指示体は、ヘマトクリットとは基本的に無関係に高度の応答性を有する電流レベルを生じる。
【００３８】
例４
本発明によるグルコース試験用細片を、例２に従い製造したが、スフェリソルブ(Spherisorb)C4 7gGおよびCab-o-Sil TS610 を用いて非導電性層を形成した。この組成物を下記の３種の相違する種類のカーボン含有導電性素子上に設置した：
Ａ．エルコン(Ercon)EC1
Ｂ．エルコン(Ercon)EC2
Ｃ．アチェソンカーボン、エレクトロダグ(Acheson Carbon,Electrodag)423SSの最上面上のエルコン(Ercon)EC2。
これらの試験用細片を用いて、不活性溶液中にグルコースを含有する対照溶液（One Touch Control Solution,Lifescan Inc.）または血液中にグルコースを含有する溶液中の種々のレベルのグルコースを、４２５mVで測定した。電圧印加後の２５秒の時点で得られた電流を測定した。図５Ａ〜５Ｃに、３種の組成物Ａ、ＢおよびＣについて得られた結果をそれぞれ示す。全部の場合、グルコース濃度の相違に対するテストメーターの応答を示すラインの勾配は、測定が血液に対して行われたか、または対照溶液に対して行われたかにかかわらず、実質的に同一であった。すなわち、これは本発明による試験用細片の試料中の酸素含有量およびヘマトクリットからの独立性、ならびに導電性素子として種々の材料を使用することができることを、さらに証明している。
【００３９】
例５
例２に従い製造された試験用細片を、２種の相違する試料温度、すなわち３７℃および２０℃において、４２５mVの印加電圧を用いて試験した。図６Ａおよび６Ｂは、電圧印加後の２５秒の時点で測定された電流をグルコース濃度の関数として示している。見ることができるように、２本のラインの勾配は、実質的に同一である（２０℃において０．１０６８対３７℃において０．１００９）。すなわち、これは当該試験用細片が生理学的温度に近い温度からの温度範囲にわたり実質的に温度−独立性挙動を示すことを証明している。
【００４０】
例６
例２に従い製造された試験用細片およびカーボン含有インキを用いて製造された市販の試験用細片について、電流過渡を測定した。この結果を図８Ａおよび８Ｂに示す。示されているように、本発明による試験用細片（図８Ａ）は、試験用細片からの初期応答後の２５秒よりも長い期間にわたりピーク電流の５０％以上を維持する非常に平坦な電流過渡を提供する。これに反して、カーボンを基材とする電極は、電流のほとんど即時の減衰を示し、試験用細片からの初期応答後の１〜２秒の間にピーク電流の５０％を失う。これは、ピーク電流値を獲得しなければならない場合に測定を困難にするか、または実質的減衰が生じた後に電流を測定しなければならない場合に、メーターの動作範囲を減少させる。従って、本発明による試験用細片は、一定量のグルコースに対する応答により生じる電流が、ピーク電流発生後の５秒の時点で５０％より少なく減衰する。
【００４１】
例７
本発明によるグルコース試験用細片印刷用インキを下記の通りに調合した：
２０mMクエン酸緩衝剤（ｐＨ６）６７．８g
ポリビニルアルコール０．６８g（MW:85,000 〜146,000 、８８％加水分解）
ポリビニルピロリドン−ビニルアセテート０．６８g
ダウコーニング(Dow Corning) DC1500発泡防止剤０．４２g
ヒドロキシエチルセルロース３．４g［ナトロゾル(Natrosol)250G,Hercules）］
表面修飾シリカ５．５g（Cabo-Sil TS610,Cabot）
グルコースオキシダーゼ１．５g
カリウムフェリシアニド２０．０g
【００４２】
例８
図１０Ａ〜１０Ｉは、本発明による試験用細片の段階的製造を示している。この試験用細片と図１の試験用細片との比較から明白なように、細片上の電極の正確な配列は臨界的ではない。さらに、相違する材料を細片の形成に使用することができる。
この試験用細片を形成する第一工程は、基体１００の銀トラック１０１，１０２の沈着である。好適基体は、バロックス（Valox）（登録商標）の商品名で販売されている５００ミクロン厚さのポリエステル薄膜である。この銀電極は、例 2で調合されたインキ組成物を用いるスクリーン印刷によって形成することができる。
【００４３】
銀電極の沈着後、第二電極の印刷を行い、図１０Ｂに示されているようにカーボン導電性素子１０３，１０４および１０５を形成する。導電性素子１０３は、銀トラック１０１と接触して形成し、次いで最終試験用細片に作用電極を形成する。カーボンパッド１０４および１０５を、銀トラック１０１および１０２の末端と電気的に接続し、当該細片とテストメーターとの間を接続させる。このカーボン導電性素子は、前記例に記載されているとおりに、導電性カーボンインキ組成物を用いるスクリーン印刷によって形成することができる。
【００４４】
製造方法の第二工程は、例えば例２の誘電体のような絶縁性インキのスクリーン印刷による絶縁層１０６の沈着である（図１０Ｃ）。図示されているように、この絶縁層は３個の窓１０７，１０８，および１０９を備えている。窓１０８は、カーボン導電性素子１０３の末端と整合している。窓１０７は、銀トラック１０２の末端と整合し、対照電極への接近をもたらす。第三の窓１０９は、第二絶縁性コーティングからメッシュ層を通る絶縁性材料の通過可能性を提供するが、不可欠ではない。
【００４５】
図１０Ｄは、本方法の引き続く工程を示しており、この工程は一体化した試薬／血液分離層１１０の形成である。この層は、窓１０８を覆って設置し、窓１０８の側面全体に沿って絶縁層１０６上に延びている。層１１０印刷に適する組成物は、下記組成を有し、約６の緩衝ｐＨを有する一体化した試薬／血液分離層を提供する：
【００４６】
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【００４７】
一体化した試薬／血液分離層１１０の形成後、メッシュ層１１１を、試験用細片の試料採取領域を覆って設置する（図１０Ｅ）。このメッシュ１１１は、当該メッシュを親水性にするために、アセトンおよびフルオラド(Fluorad)FC170C 界面活性剤により予備処理されているナイロンメッシュである。このメッシュ１１１の目的は、液状試料が作用電極と対照電極との間の帯域を均一に通過して輸送することにある。
第二の絶縁層１１２を次いで、僅かにさらに柔軟性の絶縁性インキ（ERCON 絶縁層820202）を用いて形成し、試料採取領域を限定する（図１０Ｆ）。次いで、トップカバー１１３を、例２で上記したとおりに試験用細片の最上面上に適用し、仕上げられた試験用細片を形成する（図１０Ｇ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａおよび１Ｂは、本発明による使い捨て試験用細片に有用な電極の構造を示す。
【図２】  図２は、本発明による試験用細片を示す。
【図３】  図３Ａ〜３Ｃは、３種の相違するヘマトクリットレベルについて、グルコース濃度の関数として測定された電流を示す。
【図４】  図４は、測定された電流のグルコース濃度依存性の関係をヘマトクリットの関数として示す。
【図５】  図５Ａ〜５Ｃは、３種の相違する導電性素子について、測定された電流を血液および対照溶液中のグルコースの関数として示す。
【図６】  図６Ａおよび６Ｂは、２種の相違する温度でグルコースの関数として測定された電流を示す。
【図７】  図７は、本発明によるグルコース試験用細片のもう一つの態様を示す。
【図８】  図８Ａおよび８Ｂは、本発明による試験用細片および市販のカーボンを基材とする試験用細片を用いて見出された電流過渡を示す。
【図９】  図９Ａ〜９Ｃは、本発明による試験用細片の３工程製造方法を示す。
【図１０】  図１０Ａ〜１０Ｇは、本発明による試験用細片の製造を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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