(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1で示されるヌクレオチド配列もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はその縮退変異体を含む、乳酸菌シャトルベクター。
【請求項２】
配列番号：2で示されるヌクレオチド配列もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はその縮退変異体を含む、乳酸菌シャトルベクター。
【請求項３】
（a）pCLP7（図４における制限酵素部位の配位を有する。ATCC受入番号PTA-2661）と、
（b）pCLP8（図４における制限酵素部位の配位を有する。ATCC受入番号PTA-2663）とからなる群より選ばれる、乳酸菌シャトルベクター。
【請求項４】
（a）請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌シャトルベクターと、
（b）内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子が正常な酵素機能を生じることができない宿主細胞と、
（c）真核細胞遺伝子
とを含む、異種遺伝子発現用キット。
【請求項５】
請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌シャトルベクターを含むDNAワクチンキャリア。
【請求項６】
（i）宿主細胞に、請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌シャトルベクターを導入する工程と（前記宿主細胞の内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子は正常な酵素機能を生じることができない）、
（ii）工程（i）で形質転換した前記宿主細胞を、ラクトースが唯一の炭素源である条件下で培養する工程
とを含む、ベクターを含有する宿主細胞の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳酸菌シャトルベクター及びその用途、特に、選択マーカーとしての非抗生物質耐性遺伝子を特徴とする乳酸菌シャトルベクターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）やリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｇｅｎｅ）等といった細菌の摂取によって、多くのＤＮＡワクチンが哺乳動物に投与されている（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｇ．ら、１９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １６：１８１〜１８５；  Ｌｏｗｒｉｅ，  Ｄ．Ｂ．，  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ４：１４７〜１４８）。その長所は、ＤＮＡワクチンを免疫細胞に直接投与することが可能であり、あるいはＤＮＡワクチンで免疫システムを刺激することにより免疫反応を高めることが可能なことである。通常、このような細菌の投与により生じる効果は、ワクチンとしてＤＮＡのみを用いることにより生じる効果よりも優れている。しかしながら、この種の弱毒化細菌は治療される哺乳動物にとって有害であり、あるいはこれらの細菌の突然変異誘発により病原性細菌になりうる。
【０００３】
遺伝子工学において、プラスミドは、プラスミドを含む細胞（例：細菌）を選択する選択マーカーを有していなければならない。一般に、大部分の商品化したプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を選択マーカーとして有している。これらのプラスミドは殆どが実験室で用いられるため、安全性が重要視されていない。しかしながら、生物中に存在する細菌株のうち、自然界の形質導入作用によって抗生物質耐性遺伝子を含み得るものもある。これらのプラスミドを薬学的ワクチン組成物または食品添加物として用いた場合、プラスミド又はその派生物で治療する生物を害する可能性がある。また、精製したＤＮＡ内に抗生物質が残留すると、治療される生物にアレルギー反応が生じうるため、抗生物質の使用には問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
以上により、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含まないベクターを構築し、生物中の異種遺伝子を発現する無害の宿主細胞をＤＮＡワクチン又は健康食品として用いることにより、安全性及び免疫反応を高めることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＤＮＡワクチンに用いられる従来の弱毒化細菌は病原性を生じうるため、上述の目的を達成するために、本発明ではワクチン媒体として乳酸菌を選んだ。乳酸菌は病原性のないグラム陽性菌であり、乳製品や食品産業において大量に使用される。また、乳酸菌は消化管に存在する正常な細菌叢である（Ｂｏｍｂａ  Ａ．ら、１９９４，  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  （ｐｒａｈａ），  ３９：７０１−７１０；  Ｎｅｍｃｏｖａ  Ｒ．ら、１９９８，  ＤＴＷ  Ｄｔｓｃｈ  ｔｉｅｒａｒｚｔｌ  ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｅｒ，  １０５：１９９−２００）。さらに、乳酸菌の細胞壁中のある化学組成物はヒトの免疫反応を刺激しうる（Ｖｉｌｍａ  Ｍ．Ａ．ら、１９９６，  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．，  ４４（１２）：２２６３−２２６７）。異種遺伝子を生じるよう、あるいはＤＮＡワクチンとして用いるために乳酸菌株を改変した場合、このような改変された乳酸菌を摂取した生物の免疫又は健康を改善することが可能である。また、組換え型のプラスミド又はベクターが遺伝子工学によって調製されることにより、食品産業において有用な、より価値のある乳酸菌株を得ることができる。
【０００６】
本発明は、（ａ）プラスミド複製数を調節し、大腸菌複製起点配列を含む領域と；（ｂ）真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列、異種遺伝子が挿入されるマルチクローニングサイト、及び転写終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセットと；（ｃ）複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミドの複製に関連するタンパク質をコードする核酸配列とを含む乳酸菌プラスミド配列と；（ｄ）非抗生物質耐性選択遺伝子及びそのプロモーター配列とを有する乳酸菌シャトルベクターを提供する。
【０００７】
また、本発明は、異種遺伝子の発現に用いるキットを提供する。そのうち、異種遺伝子が組込まれる上述の乳酸菌シャトルベクターは、適当なシステムに導入されて異種タンパク質を発現する。
【０００８】
さらに、本発明は、遺伝子ワクチンキャリアを提供する。そのうち、病原体または癌から得られる抗原遺伝子は、上述の乳酸菌シャトルベクターに組込まれる。
【０００９】
またさらに、本発明は、（ｉ）宿主細胞に前述の乳酸菌シャトルベクターを導入する工程と（そのうち、前記宿主細胞の内因性β−ガラクトシダーゼ遺伝子は正常な酵素機能を生じることができない）、（ｉｉ）ラクトースが唯一の炭素源である条件下で、工程（ｉ）で形質転換した前記宿主細胞を培養する工程とを含む、ベクターを含有する宿主細胞の選択方法を提供する。
【００１０】
本発明に係るベクターにおいては、（１）（ａ）プラスミド複製数を調節し、大腸菌複製起源配列を含む領域と、
（ｂ）真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列、異種遺伝子が挿入されるマルチクローニングサイト、及び転写終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセットと、
（ｃ）複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミドの複製に関連するタンパク質をコード化する核酸配列とを含む乳酸菌プラスミド配列と、
（ｄ）非抗生物質耐性選択遺伝子及びそのプロモーター配列
とを有する乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係るベクターにおいては、（２）前記真核細胞遺伝子の転写プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係るベクターにおいては、（３）前記乳酸菌プラスミド配列は、ラクトバチルスプランタルムから単離した２．１ｋｂのプラスミドである、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係るベクターにおいては、（４）前記乳酸菌プラスミドの複製に関連する前記タンパク質は、３１７のアミノ酸を含むＲｅｐＡタンパク質である、上記（３）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係るベクターにおいては、（５）前記非抗生物質耐性選択遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子である、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係るベクターにおいては、（６）前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子の前記プロモーターは、エリスロマイシン耐性遺伝子プロモーターである、上記（５）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係るベクターにおいては、（７）配列番号：１で示される前記ヌクレオチド配列もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はその縮退変異体を含む、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係るベクターにおいては、（８）配列番号：２で示される前記ヌクレオチド配列もしくはそれに相補的なヌクレオチド配列又はその縮退変異体を含む、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係るベクターにおいては、（９）（ａ）ｐＣＬＰ７（図３における制限酵素部位の配位を有する。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２６６１）と、
（ｂ）ｐＣＬＰ８（図３における制限酵素部位の配位を有する。ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２６６３）とからなる群より選ばれる、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係るベクターにおいては、（１０）形質転換する宿主細胞がグラム陽性菌であり、前記宿主細胞の内因性β−ガラクトシダーゼ遺伝子が正常な酵素機能を生じることができない、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係るベクターにおいては、（１１）前記宿主細胞が、Ａｎａ−１（Ｌａｃ−突然変異体）（ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２６６２）と称するラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）の突然変異体である、上記（１０）に記載の乳酸菌シャトルベクターであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係るキットにおいては、（１２）（ａ）上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターと、
（ｂ）内因性β−ガラクトシダーゼ遺伝子が正常な酵素機能を生じることができない宿主細胞と、
（ｃ）真核細胞遺伝子
とを含む、異種遺伝子発現用キットであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係るキャリアにおいては、（１３）上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターを含むＤＮＡワクチンキャリアであることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る方法においては、（１４）（ｉ）前記宿主細胞に、上記（１）に記載の乳酸菌シャトルベクターを導入する工程と（そのうち、前記宿主細胞の内因性β−ガラクトシダーゼ遺伝子は正常な酵素機能を生じることができない）、
（ｉｉ）工程（ｉ）で形質転換した前記宿主細胞を、ラクトースが唯一の炭素源である条件下で培養する工程とを含む、ベクターを含有する宿主細胞の選択方法であることを特徴とする。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明の以下の説明および添付の図面を参照することにより、本発明がさらに理解され、さらなる利点が明らかになると考えられる。
【００２５】
本明細書で用いられる「乳酸菌シャトルベクター」という用語は、大腸菌及びラクトバチルスの両方のプラスミド複製起点が存在するベクターを表しており、このベクターが大腸菌及び乳酸菌の両方において複製し増殖可能であることにより、細菌種間の障壁を打ち破る。
【００２６】
上述の目的及び後に続く操作の便宜のため、本発明の乳酸菌シャトルベクターは、大腸菌内におけるベクターの複製に必要な複製起点Ｃｏｌ  Ｅ１を含む。
【００２７】
真核細胞内の異種タンパク質を発現する、あるいはＤＮＡワクチンキャリアとして用いるため、本発明の乳酸菌シャトルベクターは、少なくとも１つの真核細胞遺伝子転写プロモータ配列、マルチクローニングサイト、及び転写終結配列を有する真核細胞遺伝子発現カセットを含む。そのうち、所望の異種遺伝子がベクター内のマルチクローニングサイトに挿入される。上述のベクターに用いることのできる要素は限定されないことが当業者には理解されると思われる。例えば、本発明に適した真核細胞遺伝子転写プロモーター配列には、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター等が含まれる。
【００２８】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、結合した他の核酸を移送することが可能な核酸分子を意味する。好ましいベクターの一つはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、自律複製及び結合している核酸の発現が可能なベクターである。作動的に結合された遺伝子の発現を指向できるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、環状二本鎖ＤＮＡループを表す「プラスミド」の形となっている（但し、ベクターの形は染色体に限定されない）。
【００２９】
本明細書で用いられる「調節」又は「調節する」などという用語は、反応又は作用の制御に関連する配列を意味することが理解されると思われる。これには、遺伝子の発現の調節、制御、作用、あるいはプラスミドの複製、選択、維持に関係した配列が含まれる。例えば、アティニュエーター、オペレーター、プロモーターなどが含まれる。
【００３０】
本明細書で用いられる「複製起点」という用語は、核酸配列を複製するためのＤＮＡ合成を開始するヌクレオチド配列を表す。これは、一般にｏｒｉ部位と呼ばれる。通常、バクテリアは単一のｏｒｉ部位を有しているのに対し、真核細胞の染色体はそれぞれ多くのｏｒｉ部位を有している。この用語には、ＤＮＡ複製の間、自律単位として作用する遺伝因子を表すレプリコンが含まれる。細菌のうち、染色体は単一レプリコンとして機能するのに対し、真核細胞の染色体は一連のレプリコンを数百個含む。
【００３１】
本明細書で用いられる「抗生物質耐性」という用語は、事前に薬剤によって不利に作用する微生物により、特定の抗生物質に対する耐性を得たことを意味する。通常、このような耐性は、突然変異、あるいは微生物を形質転換する耐性遺伝子を含むプラスミドによる耐性の獲得により生じる。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列はＣＭＶプロモーター（以下ｐＣＭＶと称する）であり、転写終結配列は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の合成を終了し安定させるＢＧＨポリＡ（ウシ成長ホルモンポリアデニル酸）領域である。
【００３３】
ラクトバチルス菌株には多くの天然プラスミドが含まれており、複製起点及び必須タンパク質をコードする遺伝子は、本発明に係るベクターの構築に適している。ラクトバチルスプランタルム（ＡＴＣＣ  ８０１４、ＣＣＲＣ  １０３５７）に含まれる天然プラスミドには３種類あり、それぞれ２．１ｋｂ、１０．５ｋｂ、３８．８ｋｂである（Ｙａｎ  Ｔ−Ｒら、１９９６，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｇｒｉ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ３４：７２３−７３１）。便利性と安定性の要件により、３つのプラスミドのうち最小のものが本発明のベクターに選ばれる。２．１ｋｂのプラスミドは、複製のプラス起点、転写解読枠、及び１３回反復した１７ヌクレオチドの配列群を備えた複製調節領域を含む。そのうち、転写解読枠は３１７のアミノ酸からなり、プラスミドの複製に関連した機能を有するタンパク質（Ｒｅｐ  Ａタンパク質）を翻訳する（Ｂｏｕｉａ  Ａ．ら、１９８９，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ２２：１８５−１９２；  Ｂｒｉｎｇｅｌ  Ｆ．ら、１９８９，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  ２２：１９３−２０２）。本発明は、上述した２つの重要な因子が破壊されない条件の下、プラスミドを線形化するＢｃｌＩのような適当な制限酵素を選択することにより、線状プラスミドを本発明のベクターに組込むのを容易にする。
【００３４】
抗生物質耐性遺伝子の代わりに選択マーカー遺伝子として、ラクトバチルスデルブレッキイ（亜種ブルガリクス）のゲノムにおけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が選ばれる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の生成物は、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解する代謝酵素である（Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｂ．Ｆ．ら、１９８９，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７１：６２５−６３５）。このため、細菌が酵素を欠き（例：大腸菌ＪＭ１０９菌株）、ラクトースが唯一の炭素源である条件下で増殖させた場合、細菌はプラスミドに存在する遺伝子にコードされるβ−ガラクトシダーゼを用いてラクトースを代謝させ、増殖に必要なグルコースを得る（Ｈａｓｈｉｄａ  Ｈ．，  １９９２，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６：１９０−１９４）。
【００３５】
本発明のベクターに選ばれたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、プロモーターによる制御の下で発現される。プロモーターは、遺伝子生成物を過度に発現する強力な転写プロモーターであるのが好ましい（Ｈａｓｈｉｄａ  Ｈ．，  １９９２，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６：１９０−１９４）。本発明の好ましい態様の１つにおいて、プロモーターはエリスロマイシン耐性遺伝子プロモーター（以下ＥｍｒＰと称する）である。
【００３６】
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を選択マーカーとして用いることは、抗生物質耐性遺伝子に代替できるだけでなく、薬剤及び食品の安全性の要件に応えることができる。
【００３７】
本発明の構成によると、宿主細胞（すなわち、内因性β−ガラクトシダーゼ）自体の遺伝子にコードされたβ−ガラクトシダーゼの機能は破壊されなければならない（すなわち、宿主細胞は正常な酵素活性を有するβ−ガラクトシダーゼを発現することができない）ため、宿主細胞は生存のために本発明の組換えベクターに頼らなければならない。本発明は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を用いて対数増殖期にある宿主細菌を処理する。ＭＮＮＧは、グアニン及びチミンを活性化し易くしてＤＮＡの突然変異を生じさせるアルキル化剤である。したがって、欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する細菌株が選ばれる。
【００３８】
本発明での使用に適している宿主細菌株にはラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）が含まれる（但しこれに限定されない）。この菌株を用いる長所としては、（１）この細菌株は食品の安全性要件を満たしたチーズを製造するのに用いられる菌株の１つであること、（２）この細菌株は腸内に付着してコロニーを形成できること、（３）本発明のシャトルベクターが乳酸菌プラスミドの複製プラス起点を含んでいることにより、ベクターは乳酸菌宿主菌株において複製できるとともに着実に隔離できることが挙げられる（Ｌｅｅｒ  Ｒ．ら、１９９２，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２３４：２６５−２７４；  Ｐｏｓｎｏ  Ｍ．ら、１９９１，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５７：１８２２−１８２８）。乳酸菌株はグラム陽性菌の１つであり、本発明のシャトルベクターは大腸菌及びラクトバチルスの両方の複製起点を有していることを理解されたい。したがって、乳酸菌に類似した遺伝子的特徴を有するグラム陽性菌も、本発明において宿主細胞として使用できることが、当業者には理解されると思われる。つまり、突然変異して欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を得るいかなる適当な細菌株も、あるいは内因性β−ガラクトシダーゼ遺伝子が正常な酵素活性を有していない適当な細菌株も、本発明で用いることができる。好ましい態様において、ラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）はＭＮＮＧで処理された後、Ｘ−ｇａｌ及び選択培地でスクリーニングされて、Ｌａｃ−突然変異体（Ａｎａ−１と命名する）を得る。Ａｎａ−１は、２０００年１１月１０日にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０，  ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−２６６２が付与されている。
【００３９】
本発明の乳酸菌シャトルベクターのマルチクローニングサイトに、病原体又は癌から派生する適当な抗原遺伝子を挿入することにより、遺伝子ワクチンキャリアを得る。そして、この遺伝子ワクチンキャリアは、欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する細菌株に形質転換した後、経口又は注射（例：静脈注射、動脈注射、皮下注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、または筋肉内注射等）により生物に投与される。このため、遺伝子ワクチンキャリアはエンドサイトーシス又は食作用により生物の細胞に組込まれる。また、真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列（例：ｐＣＭＶ）の構築により、マルチクローニングサイト中の抗原遺伝子が即座に発現しうる。
【００４０】
遺伝子ワクチンとして欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する宿主細胞と結合する乳酸菌シャトルベクターを使用することには、以下の長所がある：（１）乳酸菌は毒性でも病原性でもない；（２）乳酸菌の細胞壁内のある化学組成物は、哺乳類の免疫反応を刺激し増強することができる；（３）遺伝子ワクチンとして用いられる乳酸菌シャトルベクターの用量はＤＮＡワクチンの直接注射の用量よりはるかに少なく、前者が約１ｍｇ／用量未満であるのに対して、後者は約１００ｍｇ／用量であり、注射部位は、例えば体表付近の部位等に限られている；および（４）乳酸菌シャトルベクターは、ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）を使用するよりも安全性がはるかに高い。
【００４１】
また、本発明の乳酸菌シャトルベクターのマルチクローニングサイトに異種遺伝子を挿入して、組換え発現ベクターを得る。これにより、興味深い異種タンパク質が体内又は体外で、ベクターの真核細胞遺伝子の転写プロモーターによって、適当な真核細胞において過度に発現する。真核細胞遺伝子の転写プロモーターを適当な原核細胞遺伝子の転写プロモーターで置き換えることにより、この興味深い異種タンパク質を適当な原核細胞中で過剰発現させられることが当業者には理解されると思われる。
【００４２】
当業者によって知られている多様なメカニズムにより、ベクターの細胞への形質転換を達成することができる。例えば、形質転換（二価カチオン、ＤＭＳＯ、還元剤、塩化ヘキサミンコバルトなどによる処理を含む）、エレクトロポレーション、または粒子の衝撃などである。
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明について詳しく説明するが、この実施例はいかなる様式においても本発明を限定するものではない。
【００４４】
【実施例】
以下の実施例で用いられる上述の細菌株にはラクトバチルスデルブレッキイ（亜種ブルガリクス）（ＣＣＲＣ１４００８）、ラクトバチルスプランタルム（ＣＣＲＣ１０３５７）、及びラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）（ＣＣＲＣ１０６９７）が含まれ、これらは台湾・新竹のＣＣＲＣ（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）で入手できる。この３種類の細菌全てをラクトバチルスＭＲＳブイヨン（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ）（プロテオースペプトンＮｏ．３  １０ｇ／Ｌ、牛肉エキス１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌデキストロース、Ｔｗｅｅｎ−８０  １ｇ／Ｌ、クエン酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ  ５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ６．２〜６．５である）中で、３７℃で増殖させた。
【００４５】
実施例１．
Ｌａｃ−突然変異宿主菌株（Ａｎａ−１）の調製
一夜培養したラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）２０μｌをＭＲＳブイヨン１ｍｌに接種して、３７℃で４時間インキュベートした。スピンダウンによりペレットを得て、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐｈ７．２）で２度洗浄した。この細菌ペレットをＰＢＳ緩衝液０．９ｍｌ中で再懸濁し、ＭＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；  ０．０５Ｍ酢酸中に５ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌで処理した。３７℃で１時間ゆっくり回転させた後、細菌を遠心分離して沈殿させ、ＰＢＳ緩衝液で３度洗浄してから、ＭＲＳブイヨン０．１ｍｌ中に再懸濁した。ＭＲＳブイヨンで１０倍の連続希釈を行い、各希釈度のＭＲＳ中の細菌０．１ｍｌを、４０μｌのＸ−ｇａｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）を塗布した直径１００ｍｍの寒天平板に接種した。これらの平板を３７℃で１〜３日培養した。ラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）のＬａｃ−突然変異体（Ａｎａ−１）として白色コロニーを選択した。
【００４６】
実施例２．
１．ラクトバチルスプランタルムプラスミドの単離
一夜培養したＭＲＳブイヨン１５ｍｌからラクトバチルスプランタルムを収集し、この細菌を４．７５５ｍｌの溶液Ｉ（ショ糖６．７％、ｐＨ７．６の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の１ｍＭ  ＥＤＴＡ、リソチーム１００μｌ）を用いて３７℃で２０分間溶解した。溶液ＩＩ（ｐＨ７．６の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ）４８２μｌ及び溶液ＩＩＩ（ＳＤＳ２０％、ｐＨ７．６の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）２７６μｌを加えた後、この混合液を３７℃で２０分間インキュベートして３０秒間激しく振った。それから、３Ｎ  ＮａＯＨ  １．２７６ｍｌを加えて１０分間回転し、２Ｍ  Ｔｒｉｓ４９６μｌを加えてさらに１０分間回転した。細菌のタンパク質を抽出するために、５Ｍ  ＮａＣｌ  ７１７μｌ及び３％のＮａＣｌで飽和したフェノール７００μｌに細菌溶菌液を加えた。遠心分離した後、液相を等容量のクロロホルムイソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。混合、遠心分離した後、等容量のイソプロパノールを用いて液相を０℃で１時間沈殿させてから、５分間遠心分離してＤＮＡペレットを得た。このＤＮＡペレットを自然乾燥させてＨ２Ｏ  ２０μｌ中に溶かした。プラスミドＤＮＡの質及び量は、１％のアガロース電気泳動法及び臭化エチジウム染色により評価した。
【００４７】
２．ラクトバチルスプランタルム２．１ｋｂプラスミドのクローニング
ラクトバチルスプランタルムから単離したプラスミドを、１％のアガロースゲルを用いた電気泳動法によって分別し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＩキット（Ｂｉｏ  １０１，  Ｌａ  Ｊｏｌｌｉａ，  ＣＡ）で精製した。プラスミドｐＣＬＰ１及びｐＣＬＰ２を生成するため、プラスミド２．１ｋｂを制限酵素ＢｃｌＩで消化し、ＣＭＶプロモーター、ＢＧＨポリＡ配列、Ｃｏｌ  Ｅ１複製起点、及びＡｍｐＲ転写解読枠を含有するｐＣＬＰ０（図１参照）のＢｇｌＩＩ部位に連結した。
【００４８】
実施例３．
１．ラクトバチルスデルブレッキイ（亜種ブルガリクス）染色体ＤＮＡの単離
一晩培養したＭＲＳブイヨン２０ｍｌからラクトバチルスデルブレッキイ（亜種ブルガリクス）を収集し、細菌ペレットをＴＥＳ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ショ糖２０％、リソチーム１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ中に、３７℃で３０分間再懸濁した。それから細胞に、ドライアイス−エタノールのバス中で凍結させ３７℃の水浴で融解する、凍結融解サイクルを５回施した。体積が１／２である１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を加えて細胞を溶解した。３度フェノール抽出を行うことにより、染色体ＤＮＡを精製した。最後にＤＮＡをエタノールで沈殿し、風乾させてから、Ｈ２Ｏ中に溶かした。
【００４９】
２．β−ガラクトシダーゼ遺伝子のクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ラクトバチルスデルブレッキイ（亜種ブルガリクス）の染色体ＤＮＡからβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅は、０．０７５ユニットのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（商標）  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）と、それぞれ１μＭのフォワードプライマー（５’−ａａｇｃｔｃａｔｇａＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣ−３’（配列番号：３））及びリバースプライマー（５’−ｇａｃｃｔｃａｔｇａＡＣＣＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＡＣＡＣＧＣＣ−３’（配列番号：４））とからなる。ＰＣＲは、（ｉ）９５℃を５分間、（ｉｉ）９４℃を３０秒間、５４℃を３０秒間、７２℃を３分間、を３０回繰り返す、（ｉｉｉ）７２℃を１０分間、（ｉｖ）４℃に維持する、の４段階で行った。増幅したＤＮＡ生成物を０．８％アガロース電気泳動法及び臭化エチジウム染色により評価した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＩキット（Ｂｉｏ  １０１，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）により精製した。精製したβ−ガラクトシダーゼＤＮＡの断片３ｋｂをｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＥ）のＥｃｏＲＶ部位に連結した。そして、ライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ５α菌株に形質導入した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドを含む青色のクローンをＸ−ｇａｌ／Ａｍｐ  ＬＢ寒天平板から選択した。
【００５０】
実施例４．
エリスロマイシンｒＥｎｈ／プロモーター（ＥｍｒＰ）ＤＮＡ断片のクローニング及びＥｍｒｐ−β−ガラクトシダーゼＤＮＡ断片
ＣＣＲＣ（台湾、新竹）より入手したプラスミドｐＶＡ８３８をＰＣＲによる（ＥｍｒＰ）ＤＮＡ断片のクローニング用の鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅は、０．０７５ユニットのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（商標）  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）と、それぞれ１μＭのフォワードプライマー（５’−ＴＴＡＡＣＧＡＴＣＧＴＴＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号：５））及びリバースプライマー（５’−ＴＴＡＡＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＣＴＣＣＴＴＣＴ−３’（配列番号：６））とからなる。ＰＣＲは、（ｉ）９５℃を５分間、（ｉｉ）９４℃を３０秒間、５０℃を３０秒間、７２℃を３分間、を３０回繰り返す、（ｉｉｉ）７２℃を１０分間、（ｉｖ）４℃に維持する、の４段階で行った。増幅したＤＮＡ生成物を１％アガロース電気泳動法及び臭化エチジウム染色により評価した後、フェノール／クロロホルム抽出による精製及びエタノール沈殿を行った。精製した１２０ｂｐのＥｍｒＰ  ＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＥ）に連結した。ｐＣＲＩＩ／ＥｍｒＰプラスミドを有するこれらのクローンを、Ｘ−ｇａｌ／Ａｍｐ  ＬＢ寒天平板から白色コロニーとして選択し、さらにＰＣＲ及び制限酵素解析により調べた。
【００５１】
ｐＣＲＩＩ／ＥｍｒＰプラスミドはＧＦＸマイクロプラスミドプレップキット（ＧＦＸ  ｍｉｃｒｏ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製し、ＢａｍＨＩで線形化してＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。プラスミドｐＣＲＩＩ／ＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼを構築するために、β−ガラクトシダーゼＤＮＡ断片をＰＣＲによってｐｃＤＮＡ３／β−ガラクトシダーゼプラスミドから増幅し、線形化したｐｃＲＩＩ／ＥｍｒＰの平滑末端に連結した。ｐｃＲＩＩ／ＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼプラスミドを有するこれらのクローンを、Ｘ−ｇａｌ／Ａｍｐ  ＬＢ寒天平板から青色コロニーとして選択し、さらにＰＣＲ及び制限酵素解析により調べた（図２参照）。
【００５２】
実施例５．
乳酸菌シャトルベクターのクローニング
ＰＣＲによって増幅したＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＩキット（Ｂｉｏ  １０１，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）により精製し、プラスミドｐＣＬＰ１及びｐＣＬＰ２のＮｒｕＩ部位に連結してプラスミドｐＣＬＰ３−６（図３参照）を得た。このライゲーション混合物をエレクトロポレーションにより大腸菌ＪＭ１０９菌株に形質導入した。ＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドを有するこれらのクローンを、Ｘ−ｇａｌ／Ａｍｐ  ＬＢ寒天平板から青色コロニーとして選択し、さらにＰＣＲ及び制限酵素解析により調べた。
【００５３】
シャトルベクターｐＣＬＰ３及びｐＣＬＰ５からアンピシリン耐性遺伝子を削除するために、この２つのプラスミドをＢｓｐＨＩで消化した。大きいＤＮＡ断片のゲル溶出によってアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片１ｋｂを除去した。精製されたＤＮＡ断片をさらにライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９菌株に形質導入した。プラスミドを有するこれらのクローンを、Ａｍｐ／ＬＢ寒天平板ではなく、Ｌ−Ｍ９寒天平板（Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ラクトース０．１％、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  プロリン、及び５０μＭ  チアミンを含む）上で増殖させることにより選択し、さらにＰＣＲ及び制限酵素解析により調べた（図４参照）。
【００５４】
実施例６．
Ａｎａ−１コンピテント細胞の調製
エレクトロポレーションに用いるコンピテント細胞を調製するため、ラクトバチルスカゼイ（亜種カゼイ）（実施例１）からの一夜培養したＬａｃ−突然変異体宿主菌株１ｍｌを、グリシン１．２５％を含むＭＲＳブイヨン５０ｍｌに接種し、３７℃で３時間インキュベートした。この細胞を遠心分離して沈殿させ、氷冷したポレーション（ｐｏｒａｔｉｏｎ）／貯蔵緩衝液（スクロース０．５Ｍ及びグリセロール１０％）で４回洗浄し、氷冷したポレーション／貯蔵緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁した。このプラスミドＤＮＡをＱＩＡプレップ・ミニプレア・キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｒ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。使い捨てキュベット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）；電極間距離０．２ｃｍ）中でプラスミドＤＮＡ１μｇとコンピテント細胞１００μｌとを混合した。２５００Ｖ（６００Ω、２５μＦ）の単一パルスをこのＤＮＡ細胞混合液に与えた。パルスに従って、細胞懸濁液を直接ＭＲＳブイヨン０．４ｍｌで希釈し、３７℃で１．５時間インキュベートすることにより、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させた。Ｌ−ＭＲＳ寒天平板上に細胞懸濁液の希釈液１００μｌをプレーティングすることにより、形質転換体を選択した。形質転換体の化学式は、デキストロースがラクトース２％に代替すること以外は、ＭＲＳと同一である。
【００５５】
図１を参照すると、ＢｃｌＩ及びＢｇｌＩＩの消化により形成された５’−突出末端の配列は同一であるため、線形化乳酸菌プラスミド（ＬＰ）はｐＣＬＰ０に２方向に挿入される。その結果、ＰＣＲ増幅及び制限酵素解析により異なるプラスミドが得られる。そのうち、ＲｅｐＡ遺伝子とＣＭＶプロモーターとの方向が同じプラスミドをｐＣＬＰ１と称する。これに対して、ＲｅｐＡ遺伝子とＣＭＶプロモーターとの方向が異なるプラスミドをｐＣＬＰ２と称する。ｐＣＬＰ１とｐＣＬＰ２とは共に大腸菌中で何代も複製することができ、その制限酵素地図は変わらないため、乳酸菌プラスミドが大腸菌プラスミド（ｐＣＬＰ０）に挿入された後、大腸菌内の組換えシャトルベクターの複製数及び安定性に影響しない。
【００５６】
欠陥β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドが、染色体中に欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する細菌へ形質転換される場合、選択培地（唯一の炭素源としてグルコースではなくラクトースを含む）上で生存し、複製するために、細菌はβ−ガラクトシダーゼ等の選択マーカー遺伝子の生成物を過度に発現し、必要な元素を代謝する必要がある。このため、強力な転写プロモーターであるＥｍｒＰが本発明のシャトルベクター内で用いられる。図３を参照すると、ＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼの構築後、ＤＮＡ断片をプラスミドｐＣＬＰ１及びｐＣＬＰ２に挿入する。平滑末端のライゲーションにより、ＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼのＤＮＡ断片が２方向に挿入される。ＰＣＲ増幅及び制限酵素解析により４種の異なるプラスミドが得られ、それぞれｐＣＬＰ３、ｐＣＬＰ４、ｐＣＬＰ５、ｐＣＬＰ６と称する。それから、これらのプラスミドの継代培養が何代も行われる。そのうち、ｐＣＬＰ４及びｐＣＬＰ６の複製数、及びこの２つのプラスミドにより形質転換された宿主細胞の増殖は有意に減少する。このことにより、プラスミドｐＣＬＰ４及びｐＣＬＰ６が構造的に不安定であるのに対し、ｐＣＬＰ３及びｐＣＬＰ５は比較的安定していると推測される。
【００５７】
次に、選択マーカーとして非抗生物質耐性遺伝子を有するプラスミドを構築するため、ｐＣＬＰ３及びｐＣＬＰ５のアンピシリン耐性遺伝子を欠失させ、プラスミドｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８を得る（図４参照）。細菌は、大腸菌に形質転換した後、ラクトースが唯一の炭素源である培地で十分に増殖することができる。また、制限酵素地図解析によると、継代培養の後、ｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８の構造が安定していることが示されている。このため、シャトルベクターｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８の安定性により、それらを遺伝子操作の際に適用することができる。ｐＣＬＰ７のヌクレオチド配列は図５〜１１（配列番号：１）に示されており、ｐＣＬＰ８のヌクレオチド配列は図１２〜１８（配列番号：２）に示されている。さらに、原ベクターであるｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８の制限酵素地図は図１９Ａに示されており、そのうち、レーン１はＤＮＡマーカー（Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ（商標）  １ｋｂ  Ｌａｄｄｅｒ，  ＭＢＩ）であり、レーン２、３は未処理のベクターであり、それぞれレーン３、７はＸｂａＩで、レーン４、８はＥｃｏＲＩで、レーン５、９はＨｉｎｄＩＩＩで処理したベクターであり、レーン１０は別のＤＮＡマーカー（Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ（商標）  １００ｂｐ  Ｌａｄｄｅｒ，  ＭＢＩ）である。レーン２〜５はベクターｐＣＬＰ７であり、レーン６〜９はベクターｐＣＬＰ８である。
【００５８】
本発明の乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８がＬａｃ−突然変異株Ａｎａ−１（欠陥性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する）へと形質転換されると、細菌株は選択培地中で十分増殖する。さらに、制限酵素地図解析もまた、ｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８の構造は、１００代の継代培養後、安定していることを示している。図１９Ｂは、１００代の継代培養後のベクターの制限酵素地図を示しており、そのうちレーン１はＤＮＡマーカー（Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ（商標）  １００ｂｐ  Ｌａｄｄｅｒ，  ＭＢＩ）であり、レーン２は別のＤＮＡマーカー（Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ（商標）  １ｋｂ  Ｌａｄｄｅｒ，  ＭＢＩ）であり、レーン３、７は未処理のベクターであり、それぞれレーン４、８はＸｂａＩで、レーン５、９はＥｃｏＲＩで、レーン６、１０はＨｉｎｄＩＩＩで処理したベクターである。レーン３〜６はベクターｐＣＬＰ７であり、レーン７〜１０はベクターｐＣＬＰ８である。
【００５９】
本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し説明してきたが、様々な変更がその形式および詳細において可能であり、それらは本発明の精神および範囲を逸脱しないことが当業者には理解されると思われる。
【００６０】
【発明の効果】
本発明により、（ａ）プラスミド複製数を調節し、大腸菌複製起源配列を含む領域と、（ｂ）少なくとも一つの真核細胞遺伝子の転写プロモーター配列、異種遺伝子が挿入されるマルチクローニングサイト、及び転写終結配列を含む真核細胞遺伝子発現カセットと、（ｃ）複製のプラス起点と、乳酸菌プラスミドの複製に関連するタンパク質をコードする核酸配列とを含む乳酸菌プラスミド配列と、（ｄ）非抗生物質耐性選択遺伝子及びそのプロモーター配列とを少なくとも含有する、乳酸菌シャトルベクターが提供される。この乳酸菌シャトルベクターは選択マーカーとしての非抗生物質耐性遺伝子を特徴とし、薬剤や食品に利用することができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＣＬＰ１及びｐＣＬＰ２の構築を示す図である。
【図２】ｐＣＲＩＩ／ＥｍｒＰ−β−ガラクトシダーゼの構築を示す図である。
【図３】ｐＣＬＰ３、ｐＣＬＰ４、ｐＣＬＰ５、及びｐＣＬＰ６の構築を示す図である。
【図４】ｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８の構築を示す図である。
【図５】図５〜１１は、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列を示す図であり、図５はそのうち１位〜１２００位までを示す図である。
【図６】図５の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列の１２０１位〜２４００位までを示す図である。
【図７】図５および６の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列の２４０１位〜３６００位までを示す図である。
【図８】図５〜７の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列の３６０１位〜４８００位までを示す図である。
【図９】図５〜８の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列の４８０１位〜６０００位までを示す図である。
【図１０】図５〜９の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列の６００１位〜７２００位までを示す図である。
【図１１】図５〜１０の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ７（配列番号：１）のヌクレオチド配列の７２０１位〜８１１５位までを示す図である。
【図１２】図１２〜１８は、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列を示す図であり、図１２はそのうち１位〜１２００位までを示す図である。
【図１３】図１２の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列の１２０１位〜２４００位までを示す図である。
【図１４】図１２および１３の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列の２４０１位〜３６００位までを示す図である。
【図１５】図１２〜１４の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列の３６０１位〜４８００位までを示す図である。
【図１６】図１２〜１５の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列の４８０１位〜６０００位までを示す図である。
【図１７】図１２〜１６の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列の６００１位〜７２００位までを示す図である。
【図１８】図１２〜１７の続きであり、乳酸菌シャトルベクターｐＣＬＰ８（配列番号：２）のヌクレオチド配列の７２０１位〜８１１５位までを示す図である。
【図１９】ベクターｐＣＬＰ７及びｐＣＬＰ８の安定性テストを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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