(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性状を有する抗生物質、MJ654−NF4物質およびその塩。
(1)  物質の性状：黄褐色飴状である。
(2)  分子式：C21H33O7P
(3)  分子量：428（FAB−MS法により測定）
(4)  紫外線吸収スペクトル：
λmaxMeOH nm（E1cm1%）：204（259）、260（sh、634）、267（778）、277（592）
(5)  赤外線吸収スペクトル：添付図面の図１に示す通りである。
(6)   1H−核磁気共鳴スペクトル（400 MHz）：添付図面の図２に示す通りである。重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用して測定した。
(7)  13C−核磁気共鳴スペクトル（100 MHz）：添付図面の図３に示す通りである。重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用して測定した。
(8)  溶解性：メタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶であるがヘキサン及び水に難溶である。
【請求項２】
ストレプトミセス属に属するMJ654−NF4株（FERM P−13600）を培養し、その培養物から請求項１に記載の抗生物質、MJ654−NF4物質を採取することを特徴とする、抗生物質、MJ654−NF4物質の製造法。
【請求項３】
請求項１に記載のMJ654−NF4物質を生産する特性を持つストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）MJ654−NF4株（FERM P−13600）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は抗腫瘍活性を有する新規な制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の生産する物質はこれまで多く報告されており、癌及び感染症の治療に広く用いられている。このうちストレプトミセス属に属する微生物の生産する抗腫瘍性抗生物質としてはアクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、アドリアマイシン等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は抗腫瘍活性を有する有用な新規抗生物質を得ることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物の生産物中に有用な新規な生理活性物質を見いだす目的で、天然の土壌より数多くの微生物を単離し、その生産物について種々の研究を行った。
【０００５】
その研究の結果、本発明者らは、土壌より分離したストレプトミセス属に属する微生物であるＭＪ６５４−ＮＦ４株の培養液中に抗腫瘍活性を有する抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質が生産され蓄積されていることを認め、その物質を単離して物理化学的性状と生物学的活性を調べ、この物質が抗腫瘍活性を有する新規化合物であることを見いだして本発明を完成した。
【０００６】
本発明を概説すれば、本発明は抗腫瘍活性を有する新規な制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質及びその製造法を提供するものである。
【０００７】
詳しく言えば、第１の本発明によると、下記の物理化学的性状を有する新規な制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質及びその塩が提供される。
【０００８】
〔１〕ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の物理化学的性質
（１）物質の色および性状：黄褐色飴状である。
（２）分子式：Ｃ21Ｈ33Ｏ7 Ｐ
高分解ＦＡＢ−ＭＳ〔Neg.〕により決定した。
Ｃ21Ｈ33Ｏ7 Ｐ〔Ｍ−Ｈ〕- として
実測値  ４２７．１８９８
計算値  ４２７．１８８６
なお、基準物質はＰＥＧ４００を用いた。
（３）分子量：４２８
0003674955.tif 000002
【０００９】
（４）紫外線吸収スペクトル：
0003674955.tif 000003
【００１０】
５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）：添付図面の図１に示す通りである。
（６） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル (４００MHz)：添付図面の図２に示す通りである。重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用して測定した。
（７）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル (１００MHz)：添付図面の図３に示す通りである。重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用して測定した。
（８）溶解性：メタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶。ヘキサン及び水に難溶である。
【００１１】
(9)  薄層クロマトグラフィー：
Rf値は0.29である。
吸着剤：シリカゲル（メルク社製、Art 5554）
展開溶媒：n−ブタノール：酢酸：水（4：1：1）
(10)  呈色反応：アニスアルデヒド−硫酸、リンモリブデン酸、塩化第二鉄の反応に対して陽性、ニンヒドリン反応に対して陰性である。
【００１２】
〔２〕ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の生物学的活性
第１の本発明によるＭＪ６５４−ＮＦ４物質は、種々の癌細胞の増殖に対し阻害活性を示した。更に、in vivo においてマウス白血病Ｌ−１２１０癌細胞を腹腔内に移植したマウスの実験系において延命効果を示した。また、in vivo においてマウス黒色腫Ｂ１６癌細胞を静脈内に移植したマウスの実験肺転移系においてＢ１６癌細胞の肺転移に対し抑制効果を示した。
【００１３】
以上要約すると、本発明によるＭＪ６５４−ＮＦ４物質はある種の癌細胞に対して抗癌活性を有して有用な抗癌剤としての用途がある。
【００１４】
第１の本発明によるＭＪ６５４−ＮＦ４物質の生理活性を後記の試験例で評価した。
【００１５】
試験例１
各種の癌細胞に対する増殖阻害活性
各種の動物癌細胞を培養し、これら培養癌細胞に対する本発明の制癌性抗生物質の増殖阻害活性 (IC50) 値を測定し、その結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
0003674955.tif 000004
【００１７】
試験例２
マウスの白血病Ｌ−１２１０癌細胞に対する制癌効果
ＣＤＦ1 マウスにＬ−１２１０癌細胞（１×１０5 個／マウス）を腹腔内に移植し、供試化合物としてＭＪ６５４−ＮＦ４物質は移植後１〜９日目まで腹腔内に注射した。生理食塩水を投与した対照群のマウスの生存日を１００とした場合の次式で算出される延命率（％）で評価した。
延命率（％）＝Ｔ／Ｃ×１００
ただし、Ｔは供試化合物を投与した時の生存日を表し、Ｃは供試化合物無投与の時の生存日を表す。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
0003674955.tif 000005
【００１９】
マウスのメラノーマＢ１６細胞の高転移株癌細胞に対する肺転移阻害効果
ＢＤＦ1 マウスにメラノーマＢ１６細胞（５×１０5 個／マウス）を静脈内に移植し、供試化合物としてＭＪ６５４−ＮＦ４物質は移植後１〜９日目又は１〜１９日目まで腹腔内に注射した。移植後２０日目に肺を摘出し、メタノール固定を行い顕微鏡下にて細胞集団を数えた。この抑制効果は次式で算出される阻害率（％）で評価した。
【００２０】
阻害率（％）＝１００−（Ｔ／Ｃ×１００）
ただし、Ｔは供試化合物を投与した時の肺転移したメラノーマＢ１６細胞数を表し、Ｃは供試化合物無投与の時の肺転移したメラノーマＢ１６細胞数を表す。その結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
0003674955.tif 000006
【００２２】
更に、第２の発明によると、ストレプトミセス属に属するMJ654−NF4株（FERM P−13600）を培養し、その培養物から前記のMJ654−NF4物質を採取することを特徴とする、抗生物質、MJ654−NF4物質の製造法が提供される。
【００２３】
本発明の方法に用いるストレプトミセス・エスピーMJ654−NF4株は、茨城県つくば学園都市で採取された土壌より分離された放線菌でMJ654−NF4株の菌株番号が付された菌株である。
【００２４】
以下、ＭＪ６５４−ＮＦ４株の菌学的性状について述べる。
１．形態
ＭＪ６５４−ＮＦ４株は、分枝した基生菌糸より気菌糸を伸長し、その先端は２〜５回転のらせんを形成する。輪生枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子鎖には３０個以上の円筒形の胞子の連鎖を認め、胞子の大きさは約0.7 〜0.8 ×1.1 〜1.3 ミクロンであった。なお、胞子の表面は平滑である。
【００２５】
２．各種培地における生育状態
色の記載について〔  〕内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル(Container Corporation of America の color harmony manual)を用いた。
【００２６】
（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
無色の発育上に明るい茶灰〔3dc, Natural〕の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養）
うす黄〔1ga, Lt Lemon Yellow〕〜うす黄茶〔3gc, Lt Tan 〕の発育上に、明るい灰〔3fe, Silver Gray〕の気菌糸を部分的に着生し、溶解性色素は認められない。
（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培地５、２７℃培養）
うす黄〔3gc, Lt Tan 〜3le, Cinnamon 〕の発育上に、明るい茶灰〔3dc, Natural〕〜明るい灰〔3fe, Silver Gray〕の気菌糸を着生する。培養後２１日目頃より、気菌糸の湿潤化が観察される。溶解性色素は認められない。
（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２７℃培養）
うす黄〔2gc, Bamboo 〕の発育上に、白〜明るい灰〔3fe, Silver Gray〕の気菌糸を部分的に着生するが、培養後１０日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色素は認められない。
【００２７】
（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培養）
うす茶〔4gc, Nude Tan 〜4ie, Cork Tan 〕の発育上に、明るい茶灰〔3dc,
Natural〕〜明るい灰〔3fe, Silver Gray〕の気菌糸を着生する。培養後２１日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色素はわずかに茶色味を帯びる。
（６）栄養寒天培地（２７℃培養）
発育はうす黄〔2gc, Bamboo 〕、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められない。
（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７℃培養）
うす黄茶〔3ie, Camel〜3le, Cinnamon 〕の発育上に、明るい灰〔3fe,SilverGray〕の気菌糸を着生するが、培養後１４日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色素は認められない。
（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃培養）
うす黄〔2ca, Lt Ivory 〜2gc, Bamboo 〕の発育上に、明るい灰〔3fe,  Silver Gray 〕の気菌糸を着生するが、培養後１０日目頃より湿潤化し、黒色を呈する。溶解性色素は認められない。
（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
無色〜うす黄の発育上に白の気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素は認められい。
（10）スターチ寒天培地（２７℃培養）
発育はうす黄色〔1ca, Pale Yellow〜1ea, Canary Yellow〕、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。
【００２８】
（11）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
（12）セルロース（濾紙片添加合成液。２７℃培養）
３６日間の培養では生育しなかった。
（13）ゼラチン穿刺培養
１５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認められない。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（２７℃培養）の場合、発育はうす黄〜うすだいだい、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められない。
（14）脱脂牛乳（３７℃培養）
発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められない。
【００２９】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース  1.0 ％、Ｌ−アスパラギン 0.05 ％、リン酸水素二カリウム  0.05％、ひも寒天  3.0 ％、ｐＨ6.8 〜7.0 ）を用い、１０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、５０℃の各温度で試験した結果、１０℃、５０℃を除き、そのいずれの温度でも成育する。生育至適温度は２７℃〜３０℃付近と思われる。
【００３０】
（２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃培養）
１５％単純ゼラチン培地の場合、培養後１０日目頃より液化を認めるが、その作用は極めて弱く、２５日目後も液化の進行はほとんど認められない。グルコース・ペプトン・ゼラチン培地では培養後２１日目頃より液化が始まり、極めてゆっくりと進行し、その作用は弱い。
【００３１】
（３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ＩＳＰ−培地４及びスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養）
いずれの培地においても培養後３日目頃より水解性は認められ、その作用は強い。
（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃培養）
培養後、１２日目頃より凝固状を呈し、２〜３日で完了後、ペプトン化が始まるが、その作用は弱い。
（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培地、ＩＳＰ−培地７；いずれも２７℃培養）
いずれの培地でも陰性である。
【００３２】
（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養）
Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトースを利用して発育し、イノシトール、ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトール、ラクトースは利用しない。シュクロースはおそらく利用しないと思われ、Ｄ−キシロースの利用は判然としない。
【００３３】
（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地２７℃培養）
陰性である。
（８）硝酸塩の還元反応（0.1 ％硝酸カリウム含有ペプトン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養）
おそらく陽性である。
（９）セルロースの分解（濾紙片添加合成液、２７℃培養）
３６日間培養の観察で分解は認められない。
【００３４】
以上の性状を要約すると、ＭＪ６５４−ＮＦ４株は、その形態上、気菌糸がらせんを形成し、輪生枝及び胞子のうは認められない。成熟した胞子鎖には３０個以上の円筒形の胞子を連鎖し、その表面は平滑である。種々の培地で、発育はうす黄〜うす黄茶、気菌糸は明るい灰を呈し、湿潤化が観察される。溶解性色素は認められない。生育至適温度は２７℃〜３０℃付近である。メラニン様色素の生成は陰性、スターチの水解性は強いほう、蛋白の分解力は弱い。なお、細胞壁に含まれる２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型であった。
【００３５】
これらの性状より、ＭＪ６５４−ＮＦ４株は、ストレプトミセス(Streptomyces)属に属すると考えられる。近縁の既知菌種を検索するとストレプトミセス・シラツス(Streptomyces cirratus, The Journal of Antibiotics A，16巻、59頁、1963年) 、ストレプトミセス・フミズス(Streptomyces humidus, InternationalJournal of Systematic Bacteriology, 18巻、 334頁、1968年) 、ストレプトミセス・エンズス(Streptomyces endus, International Journal of Systematic  Bacteriology, 18巻、 316頁、1968年) 及びストレプトミセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscospicus, International Journal of Systematic   Bacteriology, 22巻、 307頁、1972年) があげられた。現在、上記４種の当研究所保存菌株とＭＪ６５４−ＮＦ４株とを実地に比較検討中である。そこで現時点では、ＭＪ６５４−ＮＦ４株をストレプトミセス・エスピー(Streptomyces sp.)ＭＪ６５４−ＮＦ４とする。なお、ＭＪ６５４−ＮＦ４株をつくば市所在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成５年４月１２日、ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６００として受託された。
【００３６】
次に、第２の本発明の方法による新規制癌性抗生物質、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の製造法について説明する。
【００３７】
本発明による抗生物質、MJ654−NF4物質はストレプトミセス属に属するMJ654−NF4物質生産菌であるMJ654−NF4株（FERM P−13600）を適当な培地で培養することにより、好ましくは好気的条件下に培養することにより、培地中に目的物質を産生、蓄積させ次いで培養物から目的のMJ654−NF4物質を採取することにより製造することができる。
【００３８】
培地はＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌が利用しうる任意の栄養源を含有するものでありうる。例えば、炭素源としてグルコース、マルトース、スターチ、ダイズ油、グリセロールなどが使用でき、窒素源としては、大豆粉、酵母エキス、小麦胚芽油、フィッシュミール、グルテンミール、トーストソーヤ、プロリッチなどが使用できる。又必要に応じて食塩、炭酸カルシウム、リン酸塩、重金属塩などの無機塩類を添加することができる。その他、必要に応じて適当な消泡剤、例えばシリコーン系消泡剤を添加することもできる。
【００３９】
培養方法としては、一般に行われている生理活性物質の生産のための醗酵的方法であればよく、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の製造には好気的液体深部培養法が適している。培養温度はＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌が発育しＭＪ６５４−ＮＦ４物質を生産する範囲で使用でき通常２７〜３２℃である。
培養は以上述べた条件を使用しＭＪ６５４−ＮＦ４物質生産菌の性質に応じて適宜選択して行うことができる。このようにしてＭＪ６５４−ＮＦ４物質の蓄積された培養物が得られる。
培養物中ではＭＪ６５４−ＮＦ４物質は菌体中および培養液中に存在するが、特に培養濾液中により多く存在する。
【００４０】
ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の採取に当っては、培養濾液より酢酸エチル、ｎ−ブタノール等の有機溶媒でＭＪ６５４−ＮＦ４物質を抽出することができる。この抽出液を減圧下濃縮し、遠心液液分配クロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いたクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることによってＭＪ６５４−ＮＦ４物質を単離、精製して純粋に採取することができる。
【００４１】
本発明の別の要旨においては、第１の本発明のMJ654−NF4物質を産生する特性を持つストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）MJ654−NF4株（FERM P−13600）が提供される。
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１
（１）種母の調製
種母の調製に使用した培地は下記の成分を１ｌの水に溶解した組成をもつものである。
0003674955.tif 000007
【００４３】
上記培地１１０ｍｌを５００ｍｌのワッフル付三角フラスコに分注し、ＭＪ６５４−ＮＦ４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３６００）をスラントより１白金耳摂取し、上記培地に接種して３０℃で３日間培養した。
【００４４】
（２）培養
ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の醗酵的製造に使用した培地は、下記の成分を１ｌの水に溶解した組成をもつものである。
0003674955.tif 000008
【００４５】
上記培地を１１０ｍｌずつ５００ｍｌの三角フラスコへ分注したものへ、上記種母２．２ｍｌを添加し、ロータリーシェーカーを用いて２７℃、１８０ｒｐｍにて３日間振盪培養した。
【００４６】
（３）ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の採取
上記（２）の条件で３日間培養の後、得られた培養液約１０ｌをとり、遠心分離により菌体を除去し、培養濾液を酢酸エチルで２回抽出し抽出液を減圧下濃縮し0.8 ｇの粗物質を得た。この粗物質を遠心液液分配クロマトグラフィー（三鬼エンヂニアリング社製、分配液、クロロホルム：メタノール：水＝２：２：１）移動相として上層、回転数４００ｒｐｍ、流量１ｍｌ／分の条件で溶出分画し活性分画を集め、減圧下濃縮した。
【００４７】
このようにして得られた粗精製物質１２７ｍｇをメタノールに溶解し、その一定量をカプセルパック５Ｃ18（資生堂社製）のカラム（２０ｍｍφ×２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにかけ、展開溶媒としてメタノール−水（６０：４０）にて溶出しＭＪ６５４−ＮＦ４物質含有フラクションを得た。これらを減圧下濃縮後、少量のメタノールに溶解しセファデックスＬＨ−２０を担体としたゲル濾過クロマトグラフィーに付し、ＭＪ６５４−ＮＦ４物質を含むフラクションを集め、減圧下濃縮乾燥するとＭＪ６５４−ＮＦ４物質が黄褐色飴状物質18.9ｍｇとして得られた。
【００４８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明した通り、本発明により抗腫瘍活性を有する新規抗生物質としてＭＪ６５４−ＮＦ４物質が得られ、またその製造方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＭＪ６５４−ＮＦ４物質のKBr ディスク法による赤外部吸収スペクトル図である。
【図２】ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の重メタノール中における４００MHz での 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図３】ＭＪ６５４−ＮＦ４物質の重メタノール中における１００MHz での13Ｃ−ＮＭＲスペクトル図である。
【図１】
0003674955.tif 000009
【図２】
0003674955.tif 000010
【図３】
0003674955.tif 000011