(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィド架橋により連結された２又はそれ超のシステインを含む水溶性の自然に折りたたまれる真核生物ポリペプチドを生産するための方法であって、当該方法が、以下のステップ：
Ｎ末端に原核生物シグナル配列を含む前記ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む原核生物細胞を、当該ポリペプチドがペリプラズム又は培地に分泌される条件下で培養するステップ；及び
前記シグナル配列を開裂し、そして前記ペリプラズム又は培地から前記ポリペプチドを単離するステップ；
を含み、ここで、前記培養が、少なくとも０．１ｍｏｌ／ｌ培地の濃度の、アルギニン、又は化合物であってホルムアミド、メチルホルムアミド、アセトアミド、メチルウレア及びエチルウレアから成る群から選ばれるものの存在下で、行われる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核生物細胞内での発現の後に、水溶性で、自然に折りたたまれ、そして分泌されるポリペプチドを生産するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
翻訳とも呼ばれる原核生物におけるタンパク質合成は、細胞質内のリボソームでおこる。組換えＤＮＡを原核宿主生物において発現させる場合、この過程において得られる組換え遺伝子産物又はタンパク質を、細胞質から内部細菌膜を介してその内膜と外膜との間のペリプラズム間隙に分泌することがしばしば要求される。次に、分泌されたタンパク質はそのペリプラズムから栄養培地に、例えば浸透圧衝撃によって遊離させることができる。この方法の欠点は、その分泌されるポリペプチドは、しばしば、ネイティブの生物学的に活性なコンホメーションを形成しないことである（Hockney, TIBTECH 12 (1994) 456〜463; Baynex, Curr.Opin.Biotechnol. 10 (1999) 411〜421)。
【０００３】
現在、生体内でホールディングされる場合のネイティブの組換えタンパク質の収率を増加させるために、分子シャペロン及びホールディング触媒、例えばペプチジル−プロリル−シス／トランス−イソメラーゼ又はプロテインジスルフィドイソメラーゼ（Glockshuber ら、ＥＰ−Ａ  ０  ５１０  ６５８）が用いられている（Thomasら、Appl.Biochem.Biotechnol. 66 (1997) 197〜237)。特定の場合において、これは、発現、例えばリブロースビスホスフェートカルボキシダーゼ（RUBISCO; Goloubinoffら、Nature 337 (1989) 44〜47）、ヒトプロコラゲナーゼ（Lee & Olins, J.Biol.Chem. 267 (1992) 2849 〜2852）又はラットからのニューロンの酸化窒素シンターゼ（Roman ら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92 (1995) 8428〜8432）の発現においてかなりの改善を導いている。これらの例において、大腸菌からのＧｒｏＥＬ／ＥＳ又はＤｎａＫシステムがサイトソル内で同時に過剰発現された。そのプラスの効果は、通常、可溶化型の要求されるタンパク質の収率の増加である。
【０００４】
シャペロンの同時発現も、組換えタンパク質を大腸菌のペリプラズムに分泌させる場合に検査されている。しかしながら、この場合、シャペロンのサイトソル過剰発現のみがペリプラズムへの分泌を最適化するために評価された（Perez-Perez ら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 210 (1995) 524-529; Satoら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 202 (1994) 258-264; Bergesら、Appl.Environ.Microbiol. 62 (1996) 55-60)。大腸菌における同時分泌の以前の試みは、ホールディング触媒、例えばプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；Glockshuber ら、ＥＰ−Ａ  ０  ５１０  ６５８）又は大腸菌からのペプチジル−プロリル−シス／トランス−イソメラーゼもしくはＤｓｂタンパク質（Knappik ら、Bio/Technology 11 (1993) 77-83; Qiu ら、Appl.Environm.Microbiol. 64 (1998) 4891-4896及びSchmidt ら、Prot.Engin. 11 (1998) 601-607)に関するだけであった。現在、ペリプラズムＳｋｐタンパク質の同時過剰発現は、ファージディスプレイのより効率の高いホールディング及びペリプラズムに分泌される抗体フラグメントのより高い収率を導いた（Bothman 及びPlueckthum, Nat.Biotechnol. 16 (1998) 376 〜380; Hayhurst 及びHarris, Prot.Expr.Purif. 15 (1999) 336〜343)。
【０００５】
原核生物細胞内で組換えＤＮＡの細胞質発現の間に形成される不溶性タンパク質凝集物（封入体）の試験管内再生のための方法において、尿素もしくは尿素誘導体、ホルムアミド、アセトアミド又はＬ−アルギニンのような化合物が用いられる。添加物としてのＬ−アルギニンは、試験管内再生において自然にホールディングするタンパク質の収率をかなり改善することができる（Rudolph ら、米国特許第５，５９３，８６５号；Buchner & Rudolph, Bio/Technology 9 (1991) 157-162; Brinkmann ら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 89 (1992) 3075-3079; Lin & Traugh, Prot.Express.Purif. 4 (1993) 256-264) 。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、原核生物内での発現の後に水溶性の自然にホールディングされる真核生物のポリペプチドを生産するための方法であって、簡単な様式で行うことができ、かつ、封入体の可溶化、還元及び再生、還元並びに再生のような労力を要する試験管内後処理を必要としない方法を供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
その目的はジスルフィド架橋により連結された２又は数個のシステインを含む水溶性の自然に折りたたまれる真核生物ポリペプチドを生産するための方法であって、該方法が、
Ｎ末端に原核生物シグナル配列を含む前記ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む真核生物細胞を、該ポリペプチドがペリプラズム又は培地に分泌される条件下で培養し、
前記シグナル配列を開裂し、そして前記ペリプラズム又は培地から前記ポリペプチドを単離することにより、ここで、前記培養が、アルギニン又は一般式Ｉ：
Ｒ2 −ＣＯ−ＮＲＲ1     （Ｉ）
（式中、Ｒ及びＲ1 は、水素又は飽和もしくは不飽和の分枝もしくは非分枝Ｃ1 −Ｃ4 アルキル鎖であり、そして
Ｒ2 は、水素、ＮＨＲ1 、又は飽和もしくは不飽和の分枝もしくは非分枝Ｃ1 −Ｃ3 アルキル鎖である）
の化合物の存在下で行われることを特徴とする方法により達成される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
アルギニン又は一般式Ｉの化合物の濃度は、好ましくは少くとも０．１mol ／Ｌであるが、アルギニン又は前記化合物の溶解性が保証されるなら、かなり高くてもよい。アルギニン又は一般式Ｉの化合物は、好ましくは、０．１〜１．５mol ／Ｌの濃度で用いられる。
【０００９】
ホルムアミド、アセトアミド、尿素又は尿素誘導体、例えばエチルウレア又はメチルウレアが、好ましくは一般式Ｉの化合物として、原核生物細胞を培養するために用いる栄養培地に添加される。アルギニンは、例えば塩酸塩として又はアルギニン塩基の別の滴定形態として用いることができる。しかしながら、Ｌ−アルギニンが、好ましくは用いられ、Ｌ−アルギニンの塩酸塩型が特に好ましい。
【００１０】
本発明による方法の好ましい実施形態において組換え生産されるタンパク質の収率を更に増加させる原核生物細胞を培養するために用いる栄養培地（発酵培地）に、ＳＨ基を含む還元試薬が更に添加される。０．１〜１５mmol／Ｌのチオール試薬が好ましくは添加される。本発明によれば、用語“チオール試薬”は、ＳＨ基を有する還元（還元された）試薬又はＳＨ基を有する還元試薬及びジスルフィド基を有する酸化試薬の混合物のいずれかを意味する。好ましい物質は、還元された及び酸化されたグルタチオン（ＧＳＨ）、システイン、シスチン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、β−メルカプトエタノール及び類似化合物である。チオール試薬は、単独で及び混合物として用いることができる。分子当り１つのＳＨ基を有するグルタチオン（ＧＳＨ）が特に適している。チオール試薬、例えばグルタチオンは、組換えＤＮＡを原核生物細胞において発現させる場合に、自然にホールディングされたタンパク質の収率を改善することが知られている（Glockshuber ら、ＥＰ−Ａ  ０  ５１０  ６５８）。
【００１１】
本発明による方法の更に好ましい実施形態において、分子シャペロンは、更に過剰発現され、そして同時分泌される。シャペロンは、本発明に従って、他の非ネイティブタンパク質を生体内凝集から保護し、それらのネイティブコンホメーションの形成を促進するタンパク質として理解される。分子シャペロンは、タンパク質を安定化し、それによりそれらを凝集及び不活性化から保護するために先行技術において用いられる（Buchner ら、ＥＰ−Ａ  ０  ５５６  ７２６  Ａ１）。好ましくは、ＨＳＰ４０型（分子量約４０kDa ）のＡＴＰ依存性シャペロン又は小さなヒート・ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）が好ましくは用いられる。ＤｎａＪは大腸菌の細胞質内にある４０kDa ヒートショックタンパク質でいわゆるＨｓｐ７０シャペロンシステムの一部である（Bukau, B. & Horwich, A., Cell 92 (1988) 351 〜366)。ＤｎａＫ（Ｈｓｐ７０）及びＧｒｐＥもこのシステムに属する。特定のタンパク質はＡＴＰ依存過程においてＤｎａＫシステムによりネイティブコンホメーションに折りたたまれる（Schroeder ら、EMBO J. 12 (1993) 4137〜4144; Langerら、Nature 356 (1992) 683 〜689)。ＤｎａＪはＤｎａＫ及びＡＴＰの欠如下で非ネイティブタンパク質を凝集から保護し、ホールディング−コンピテント状態を媒介する（Schroeder ら、EMBO J. 12 (1993) 4137〜4144）。サイトソル内のＤｎａＪの同時発現は可溶性タンパク質の収率を増加させることができることが示されている（Yokoyamaら、Microbiol.Ferment.Technol. 62 (1998) 1205 〜1210）。アミノ酸１〜１０８を含み、以後、Ｊドメインと呼ぶＤｎａＪのＮ末端フラグメントの同時分泌（Kelley, TIBS 23 (1998) 222〜227 ）が更に好ましい。Ｊドメイン及びＤｎａＫとの相互作用のための原因であるＧ／Ｆが豊富なドメインがこの領域に位置する（Wallら、J.Biol.Chem. 270 (1995) 2139〜2144）。
【００１２】
（例えばマウスからの）Ｈｓｐ２５は、偏在するクラスのシャペロンである小さなヒートショックタンパク質（Gaestel ら、Eur.J.Biochem. 179 (1989) 209 〜213 ）の代表である。これらのタンパク質の分子量は１５〜３０kDa である。熱ショックの間、細胞内にｓＨｓｐｓの実質的な蓄積がある（全細胞タンパク質の１％まで−Arrigo & Landry (1994), In Morimoto (Hrsg): The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones. Cold Spring Harbour Press, 335 〜373)。ＤｎａＪタンパク質と同様に、ｓＨｓｐｓは、非ネイティブタンパク質の凝集を防止し、ホールディング−コンピテント状態にこれらを維持する特性を有する（Jakob ら、J.Biol.Chem. 268 (1993) 1517〜1520; Ehrspergerら、EMBO J. 16 (1997) 221 〜229)。
【００１３】
本発明による用語“過剰発現”は、各々の原核宿主生物の野生型における発現と比べての、分泌されるタンパク質、例えばＤｎａＪ及びＨｓｐ２５の発現の増加（好ましくは少くとも１００％だけ）を意味する。このような過剰発現は例えば、（タンパク質、シャペロン及び／又はシグナルペプチドのための）遺伝子が強力な原核生物の、好ましくは誘導性の発現シグナル（例えばｌａｃ又はＴ７プロモーターのもの又はそれらの誘導体）の制御下にある場合に達成することができる。
【００１４】
組換えＤＮＡ上の調節領域（プロモーター及びターミネーター）を含むポリペプチド（タンパク質）の過剰発現のための分泌構成物は、好ましくは、原核生物内でまれであるアルギニン−ｔＲＮＡAGA/AGG を更にコードするベクターに組み込まれるか、又はこのｔＲＮＡをコードするベクターと同時発現される（Brinkmann ら、Gene 85 (1989) 109〜114)。これは、各々のタンパク質の細菌ペリプラズムへの同時発現及びまれなｔＲＮＡArg AGA/AGG の転写を可能にし、しばしば細菌宿主生物における要求されるタンパク質の合成を増加させる。
【００１５】
本発明における原核生物シグナル配列は、原核生物由来、好ましくはグラム陰性細菌由来の核酸フラグメントとして理解され、そしてシグナルペプチドに結合したタンパク質が、内部細菌膜を通過することができることを確実にする。結果として、タンパク質はペリプラズム内及び細胞上清内に位置する。このようなシグナル配列は、通常、１８〜３０アミノ酸の長さを有し、例えばMurphy & Beckvith: Export of Proteins to the Cell Envelope in Escherichia coli in Neidhardt ら (editors): Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Vol 1, ASM Press, Washington, 1996, p.967〜978 に記載される。細菌のシグナル配列の開裂は、例えばＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ配列の後に行うことができる（von Heijneら、J.Mol.Biol. 184 (1985) 99 〜105)。細菌のシグナルペプチダーゼの構造はPaetzel ら、Nature 396 (1998) 186 〜190 に記載される。原核生物細胞のペリプラズムに位置したプロテアーゼにより要求されるタンパク質から再び開裂されるシグナル配列が好ましくは用いられる。あるいは、このようなプロテアーゼは、シグナル配列を開裂するために、細胞上清に又は単離されたタンパク質に添加することができる。
【００１６】
本発明による方法は、多数の真核生物タンパク質、例えばプロテアーゼ、インターフェロン、タンパク質ホルモン、抗体又はそのフラグメントの異種発現を改良することができる。その方法は、ネイティブ状態でジスルフィド架橋により連結された少くとも２のシステインを含むタンパク質の異種生産のため、特にそれが、Ｎ末端に融合した原核生物シグナル配列を有さず、不溶性封入体がそれらの原核生物発現の間に形成される場合に特に適している。その方法はネイティブ状態で５超のジスルフィド架橋を含むタンパク質のために特に適している。このようなタンパク質は、例えば、組換えプラスミノーゲンアクティベーターである（以後、ｒＰＡと呼ぶ、Martinら、Cardiovasc.Drug Rev. 11 (1993) 299〜311 、米国特許第５，２２３，２５６号）。ｒＰＡは大腸菌の還元サイトソルに形成されない９のジスルフィド架橋を有する。
【００１７】
タンパク質及び任意にシャペロンのペリプラズム位置は、内部細菌膜を通過するためのシグナルペプチドとの作用的連結により確実にされる。
（ＤｎａＪ、Ｊドメイン、Ｈｓｐ２５及びｓｃＦｖの同時分泌の場合の）０．４mol ／Ｌ  Ｌ−アルギニン及び５mmol／Ｌグルタチオン又は（ＤｎａＪの同時分泌なしの）グルタチオンなしの０．４mol ／Ｌ  Ｌ−アルギニンの濃度は、このようなプラスミノーゲンアクティベーターの発現のために最適であると判明している。
【００１８】
大腸菌内で機能的形態の分泌ｒＰＡタンパク質を単離するために、プラスミドｐＡ２７ｆｄ７（Kohnert ら、Protein Engineering ら (1992) 93〜100 ）からのこのタンパク質のための遺伝子を、遺伝子工学的方法により、グラム陰性細菌の原核生物シグナル配列、例えばエルウィニアーカロトボーラからのペクテートリアーゼＢ（ＰｅｌＢ）のシグナル配列に融合させた。その遺伝子融合物は、ベクターｐＥＴ２０ｂ（＋）（Novagen Inc., Madison, USA）にクローン化することにより作製した。結果として、遺伝子発現はＴ７プロモーターの制御下にある。融合タンパク質中に存在するシグナル配列はペリプラズムへの分泌を媒介する。シグナル配列は、内膜に位置したペプチダーゼにより、分泌の間又は後に開裂される。次に、分泌されるタンパク質は、ペリプラズム内で折りたたまれ得る。このコンパートメント内の酸化条件は、ジスルフィド架橋の形成を可能にする（Wuelting and Plueckthun, Mol.Microbiol. 12 (1994) 685 〜692)。栄養培地中でのホールディング及びチオール試薬を改良する低分子量添加物の本発明による添加及び同時のペリプラズム中でのＤｎａＪ、Ｊ−ドメイン又はＨｓｐ２５の同時発現は１００倍超だけ、機能的タンパク質の収率を増加させることができる。
【００１９】
本発明によるポリペプチドの他の例は、抗体又は抗体フラグメント、例えば一本鎖Ｆｖ−フラグメント（ｓｃＦｖ、例えば甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨに対するもの）である。ＳｃＦｖは、短いペプチドリンカー（通常、Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ3 ）を介して人工的に融合させた抗体の重及び軽鎖の可変領域（Ｆｖ）からのみ構成される短くした抗体である（Hudson, Curr.Opin.Biotechnol. 9 (1998) 395〜402)。ＳｃＦｖは、通常、抗原に対して父系のＦｖ鎖と同じアフィニティーを有するが、大腸菌内で過剰発現させることができる。それらは安定性のために本質的である安定化ドメイン内ジスルフィド架橋を有するので、サイトソルにおける発現は、通常、封入体の形成を導く（Shibuiら、Appl.Microbiol.Biotechnol. 37 (1992) 352〜357)。ＳｃＦｖは、ランダム変異誘発及び次のファージディスプレイ選択により要求される抗原への結合について特異的に最適化させることができる（Allen ら、TIBS 20 (1995) 511〜516; Hoogenboom ら、Immunotechnology 4 (1998) 1 〜20）。５mM  ＧＳＨ及び０．４Ｍ  Ｌ−アルギニンの添加は、機能的なＳｃＦｖ−ＴＳＨの収率を、添加物なしの培養内と比べて、ペリプラズム中で７倍、培養上清中で４３倍、改良する。
【００２０】
以下の例、出版物、配列プロトコル及び図面は、本発明を更に説明する。その保護範囲は特許請求の範囲に基づく。その記述される方法は改良後でさえ本発明の対象をなお記述する例として理解されるはずである。
配列表の記載
配列番号：１及び２は、ｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｄｎａＪから増幅した、調節配列（プロモーター、ターミネーター）を伴うＯｍｐＡシグナル配列及びＤｎａＪから構成される融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪの部分の配列を示す。
【００２１】
配列番号：３及び４は、ｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｄｎａＪから増幅した、調節配列（プロモーター、ターミネーター）を伴うＯｍｐＡシグナル配列及びＪドメインから構成される融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−Ｊ−ドメインの部分の配列を示す。
配列番号：５及び６は、ｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｈｓｐ２５から増幅した、調節配列（プロモーター、ターミネーター）を伴うＯｍｐＡシグナル配列及びＨｓｐ２５から構成される融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｈｓｐ２５の部分の配列を示す。
【００２２】
配列番号：７及び８は、ｐＨＥＮ−ｓｃＦｖ又はｐＩＮIII ｏｍｐＡ３から増幅した、調節配列（プロモーター、ターミネーター）を伴うＰｅｌＢシグナル配列及びＳｃＦｖＯｘａｚｏｌｏｎから構成される融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｓｃＦｖＯｘの部分の配列を示す。
配列番号：９及び１０は、ＰｅｌＢシグナル配列及びｒＰＡから構成される融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡの部分の配列を示す。
【００２３】
全般：
大腸菌内でのＤｎａＪ、Ｊ−ドメイン及びＨｓｐ２５のペリプラズム過剰発現のために、これらのタンパク質をコードするＤＮＡを、大腸菌の外側膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）のシグナル配列に、遺伝子工学により融合し、その融合物を、ｌａｃ−ｌｐｐプロモーターの制御下で組換えプラスミド上で大腸菌内で発現させた。結果として、ＤｎａＪ及びＨｓｐ２５のポリペプチド鎖は原核生物宿主生物のペリプラズムに輸送され、そこで自然に折りたたまれる。それらの位置及び自然のホールディングは、トリプシンによる限られたタンパク質分解により及びウェスタン・ブロットにより証明された。
【００２４】
【実施例】
〈実施例１〉
発現プラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｄｎａＪの作製
分子遺伝学技術はAusubel ら (ed.) J.Wiley & Sons, 1997, Curr.Protocols of Molecular Biologyに基づいた。オリゴヌクレオチドはMWG Biotech, Ebersberg又はGIBCO Life Sciences, Eggenstein, DE から得た。
【００２５】
ＤｎａＪをコードする遺伝子（Gene Bank Accession No. M12565）をＰＣＲにより増幅し、形成された制限開裂部位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより発現プラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３（Ghayreb ら、EMBO J. 3 (1984) 2437 〜2442）にクローン化した。そのクローン化したＰＣＲフラグメントの配列は、ジデオキシ配列決定（LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG.Biotech, Ebersberg）により確認した。生じたプラスミドをｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｄｎａＪと名づけた。ペリプラズムにおいて発現されるＤｎａＪの配列は野生型タンパク質のそれと、ポリペプチド配列がＭｅｔのかわりにＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏで始まり、従って２アミノ酸のＮ末端伸長部が存在する点で異なる。従って、ＤｎａＪはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）で誘導されるｌａｃ−ｌｐｐプロモーターの制御下にある。
【００２６】
〈実施例２〉
発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪの作製
ｌａｃ−ｌｐｐオペロン、シグナル配列、ｄｎａＪ遺伝子及びオペロンのターミネーター領域をコードするプラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｄｎａＪからの領域をＰＣＲにより増幅した（配列番号：１）。そのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢｇIII で開裂し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで直鎖化したベクターｐＵＢＳ５２０にクローン化した。生じたプラスミドをｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪ（図３）と名づけた。
【００２７】
〈実施例３〉
発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−Ｊ−ドメインの作製
２つの終止コドンをヌクレオチド３２４の後に、Quick Change mutagenesisシステム（Promega, Mannheim, DE ）により、最初の１０８アミノ酸のみが発現されるように、プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪに挿入した。その変異誘発した領域の配列をジデオキシ配列決定（LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg）により決定し、その短くしたタンパク質フラグメントの発現をウェスタン・ブロッティング及び抗ＤｎａＪ抗体での検出により検出した。形成されたプラスミドをｐＵＢ５２０−ｐＩＮ−Ｊ−ドメインと名づけた（図４）。
【００２８】
〈実施例４〉
発現プラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｈｓｐ２５の作製
Ｈｓｐ２５をコードする遺伝子（Gene Bank Accession No. L07577）をＰＣＲにより増幅し、形成された制限開裂部位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより発現プラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３（Ghayreb ら、EMBO J. 3 (1984) 2437 〜2422）にクローン化した。そのクローン化したＰＣＲフラグメントの配列は、ジデオキシ配列決定（LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG.Biotech, Ebersberg）により検査した。生じたプラスミドをｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｈｓｐ２５と名づけた。ペリプラズムにおいて発現されるＨｓｐ２５の配列は野生型タンパク質のそれと、ポリペプチド配列がＭｅｔのかわりにＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕで始まり、従って２アミノ酸のＮ末端伸長部が存在する点で異なる。従って、Ｈｓｐ２５はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）で誘導されるｌａｃ−ｌｐｐプロモーターの制御下にある。
【００２９】
〈実施例５〉
発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｈｓｐ２５の作製
ｌａｃ−ｌｐｐオペロン、シグナル配列、ｈｓｐ２５遺伝子及びオペロンのターミネーター領域をコードするプラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３−ｈｓｐ２５からの領域をＰＣＲにより増幅した（配列番号：５）。そのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢｇIII で開裂し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで直鎖化したベクターｐＵＢＳ５２０にクローン化した。生じたプラスミドをｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｈｓｐ２５（図５）と名づけた。
【００３０】
〈実施例６〉
プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｓｃＦｖＯｘの作製
シャペロン特性を有さないハプテンオキサゾロンに対する一本鎖Ｆｖフラグメント（scFvOxazolon: Fielder 及びConrad, Bio/Technology 13 (1995) 1090 〜1093）の同時発現を陰性対照として検査した。
【００３１】
ｌａｃプロモーター、シグナル配列ｐｅｌＢ及びｓｃｆｖｏｘ遺伝子をコードするプラスミドｐＨＥＮ−ｓｃＦｖＯｘからの領域をＰＣＲにより増幅した。ｌｐｐターミネーターをコードするプラスミドｐＩＮIII ｏｍｐＡ３からの領域を第２のＰＣＲにおいて増幅した。次のＰＣＲにおいて２つのフラグメントを融合した。この方法で形成されたＰＣＲ産物（配列番号：７）を制限エンドヌクレアーゼＢｇIII で開裂し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで直鎖化したベクターｐＵＢＳ５２０にクローン化した。生じたプラスミドをｐＵＢＳ５２０−ｓｃＦｖＯｘと名づけた（図６）。
【００３２】
〈実施例７〉
発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡの作製
プラスミドベクターｐＡ２７ｆｄ７（Kohnert ら、Protein Engineering 5 (1992) 93 〜100 ）からのプラスミノーゲンアクティベーター（ｒＰＡ）の遺伝子を、ＰＣＲ法により増幅した。そのＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで開裂し、プラスミドベクターｐＥＴ２０ｂ（＋）（Novagen Inc., Madison, USA）にクローン化した。そのプラスミドは、ＰｅｌＢ（エルウィニアーカロトボーラからのペクテートリアーゼ）のシグナル配列及びｒＰＡから構成される融合タンパク質をコードし、ｒＰＡのペリプラズムへの分泌をジデオキシ配列決定により検査した（LiCor DNA-Sequencer 4000, MWG Biotech, Ebersberg, DE）。その構成物をｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ（図７）と名づけた。ｒＰＡはＴ７プロモーターの制御下でそのプラスミドから発現され、ここで、株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ）内のＴ７−ＲＮＡポリメラーゼはｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。ＩＰＴＧを加えることにより誘導を行った。ペリプラズムにおいて発現されたｒＰＡは、Kohnert らにより記載されるプラスミノーゲンアクティベーターと、２番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）がＡｌａにより置換されている点で異なる。
【００３３】
〈実施例８〉
培地添加物グルタチオン及びＬ−アルギニンを用いる大腸菌のペリプラズムにおけるｒＰＡの機能的発現
ｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ及びｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪで形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Studier & Moffat, J.Mol.Biol. 189 (1986) 113〜130)（ＤｎａＪの同時分泌）の静置の一晩の培養物、ｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ及びｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−Ｊ−ドメインで形質転換されている大腸菌（ＤＥ３）（Ｊ−ドメインの同時分泌）の一晩培養物、ｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ及びｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｈｓｐ２５で形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｈｓｐ２５の同時分泌）の一晩培養物、ｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ及びｐＵＢＳ５２０−ｓｃＦｖＯｘで形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｓｃＦｖＯｘの同時分泌）の一晩培養物、ｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ及びｐＵＢＳ５２０で形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩の培養物又はｐＥＴ２０ｂ（＋）及びｐＵＢＳ５２０で形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩の培養物（対照培養）を、アンピシリン（１００μｇ／ml）及びカナマイシン（５０μｇ／ml、Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE）を含む１００mL  ＬＢ培地中に１：５０の比で希釈し、２４℃及び１７０rpm で振とうした。３時間の増殖後、その培養物の５mLアリコートを、上述の量のアンピシリン及びカナマイシン並びに種々の濃度のＧＳＨ（０〜１０mM、Fluka, DE ）及びＬ−アルギニンＨＣｌ（０〜０．４Ｍ、ＩＣＮ）を含む１０mL  ＬＢ培地に加え、各々を１mM  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、Appli Chem, Darmstadt, DE ）で誘導した。その細胞を更に２１時間、２４℃及び１７０rpm で振とうし、ＯＤ600 を測定した後、１mLサンプルをとった。これらの１mL細胞サンプルを、Jacobiら（J.Biol.Chem. 272 (1997) 21692 〜21699 ）に従う改良したプロトコルにより、２mL  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器内に分画した。詳細は、５００μＬの分画緩衝液（１５０mM  ＮａＣｌ（Roth GmbH ）、５０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（Roth GmbH ）、５mM  ＥＤＴＡ（Biomol）及び１mg／mLポリミキシンＢスルフェート（Sigma ）、pH７．５を細胞ペレットに加え、１４００rpm でＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモシェーカーで１０℃で１時間、振とうし、次に１０℃に冷やしたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機で１４，０００rpm で１５分、遠心して可溶性ペリプラズムタンパク質を含む画分（上清）及び残存画分（ペレット）を形成した。
【００３４】
ｒＰＡの活性は、Verheijen ら（Thromb.Haemostasis 48 (1982) 266〜269 ）の方法に従って測定した。
細胞抽出物中の全ての測定したｒＰＡ濃度を、異なる緩衝液で測定した場合に生ずる誤差を補正するために、ＯＤ600 ＝１の細胞懸濁液に標準化した。
〈実施例９〉
培地添加物としてのホルムアミド、メチルホルムアミド、アセトアミド、メチルウレア及びエチルウレアとのグルタチオンの混合物を用いる大腸菌のペリプラズムにおけるｒＰＡの機能的発現
ｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡ及びｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪで形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の静置の一晩の培養物（ＤｎａＪの同時分泌）を、実施例８に言及される通り培養した。式Ｉの化合物及び各々の場合５mMのグルタチオンを培養培地に更に加えた。対照培養物は添加物なしでＬＢ中で培養した。式Ｉの化合物及び用いた濃度を表３に列記する。サンプル調製、ペリプラズム分画及びｔＰＡ活性についての酵素テストを実施例８に言及される通り行った。
【００３５】
表１及び２並びに図１及び２はｒＰＡ発現の結果を示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
培養を５mM  ＧＳＨの存在下で行った。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
〈実施例１０〉
還元グルタチオン及びＬ−アルギニンの培養培地への添加を伴う機能的一本鎖Ｆｖフラグメントの発現
抗ＴＳＨ抗体の一本鎖Ｆｖフラグメントをコードするプラスミド（米国特許第５，６１４，３６７号）及びｐＵＢＳ５２０（Brinkmann ら、Gene 85 (1989) 109〜114 ）で形質転換されている大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の静置の一晩の培養物を、アンピシリン（１００μｇ／ml）及びカナマイシン（５０μｇ／ml、Fluka Chemica, Neu-Ulm, DE）を含む１００ml  ＬＢ培地中１：５０の比で希釈し、２４℃で１７０rpm で振とうした。３時間の培養の後、その培養物の５mlアリコートを、上述の量のアンピシリン及びカナマイシン並びに種々の濃度のＧＳＨ（０〜１０mM、Fluka ）及びＬ−アルギニンＨＣｌ（０〜０．４Ｍ，ＩＣＮ）を含む１０mLのＬＢ培地に加え、各々を１mM  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、Appli Chem, Darmstadt ）で誘導した。その細胞を更に２１時間、２４℃及び１７０rpm で振とうし、ＯＤ600 を測定した後、１mLサンプルをとった。これらの１mL細胞サンプルを、Jacobiら（J.Biol.Chem. 272 (1997) 21692 〜21699 ）に従って、改良したプロトコルにより、２mL  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ反応容器内に分画した（実施例８を参照）。更に、培地上清のサンプル（１mL）をとった。そのサンプルを、機能的抗体についてそれらを分析するためにＥＬＩＳＡテストにかけた。
【００４０】
ネイティブｓｃＦｖ−ＴＳＨのＴＳＨへの結合を、ｓｃＦｖ−ＴＳＨ  Ｓｔａｎｄａｒｄで標準化し、ＲＰＡＳシステム（Pharmacia Biotech, Germany）で精製した（１ユニットは、ＴＳＨでコートされたマイクロタイタープレートへの１μＬ標準の結合に相当する）。Ｌ−アルギニンの培養培地への添加も、大腸菌のペリプラズム及び培養上清におけるネイティブｓｃＦｖ−ＴＳＨの収率に対してプラスの効果を有した。０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン及び５mM  ＧＳＨの添加は、ＥＬＩＳＡにより検出される抗体フラグメントの量を、５mM  ＧＳＨでの培養と比べて、培養上清において７倍、ペリプラズム画分において４３倍、増加させることができた（図８）。
【００４１】
実施の態様
発明の実施の態様としては次のものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
（１）アルギニンが塩酸塩として又は別の滴定される形態として用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【００４２】
（２）還元チオール試薬が前記栄養培地に添加されることを特徴とする請求項１又は（１）に記載の方法。
（３）グルタチオン（ＧＳＨ）が前記還元チオール試薬として用いられることを特徴とする（２）に記載の方法。
（４）前記シグナル配列が、グラム陰性細菌由来であることを特徴とする請求項１又は（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記原核生物細胞が、分子シャペロンをコードする更なる発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１又は（１）〜（４）のいずれか一に記載の方法。
【００４３】
（６）前記分子シャペロンが、大腸菌からのＤＮＡＪ又はＨＳＰ２５であることを特徴とする（５）に記載の方法。
（７）前記分子シャペロンをコードする組換えＤＮＡが、内部細菌膜を通るためのシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントに作用的に連結されていることを特徴とする（５）又は（６）のいずれか一に記載の方法。
【００４４】
（８）前記分泌される分子シャペロン及び／又は前記分泌されるタンパク質をコードするＤＮＡが、誘導性発現シグナルの制御下にあることを特徴とする（５）〜（７）のいずれか一に記載の方法。
（９）前記ポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、インターフェロン、タンパク質ホルモン又はプロテアーゼであることを特徴とする請求項１又は（１）〜（８）のいずれか一に記載の方法。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
【表４】
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【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ−アルギニン濃度及び種々の同時分泌構成物に対する、５mM  ＧＳＨでの大腸菌のペリプラズムにおけるネイティブｒＰＡの発現の依存性を示す図である。
【図２】ＤｎａＪと同時分泌した場合並びに５mM  ＧＳＨ及びホールディングを改良する種々の低分子物質を培地に加えた場合の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のペリプラズムにおけるｒＰＡの発現の比較を示す図である。
【図３】発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｄｎａＪの概略図である。
【図４】発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−Ｊ−ドメインの概略図である。
【図５】発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｐＩＮ−ｈｓｐ２５の概略図である。
【図６】発現プラスミドｐＵＢＳ５２０−ｓｃＦｖＯｘの概略図である。
【図７】発現プラスミドｐＥＴ２０ｂ（＋）−ｒＰＡの概略図である。
【図８】ペリプラズム中及び培養培地中で５mM  ＧＳＨの存在下でのＬ−アルギニンの濃度に対する機能的ｓｃＦｖ−ＴＳＨの発現の依存性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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