(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、
対物レンズと、
落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、
前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、
前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第２のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を透過させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を反射し前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた２種類の蛍光を前記戻り光として透過させる落射蛍光照明手段と
を備えたことを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、
対物レンズと、
落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、
前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、
前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第２のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を反射させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を透過させ前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた２種類の蛍光を前記戻り光として反射させる落射蛍光照明手段と
を備えたことを特徴とする顕微鏡。
【請求項３】
前記光源の出力光若しくは前記落射蛍光照明光のどちらか一方の光束を遮ることを特徴とする
請求項１若しくは請求項２記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも長いことを特徴とする
請求項１若しくは請求項２記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも短いことを特徴とする
請求項１若しくは請求項２記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡に関し、特に落射蛍光像及び共焦点像を任意に得ることが可能な顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の落射蛍光像を得る落射蛍光顕微鏡では対物レンズを共用して蛍光色素を発光させる励起光をダイクロイックミラーで反射させて試料に照射すると共に励起光により発生した蛍光をダイクロイックミラーで透過させて通常の光学顕微鏡で観察するものである。
【０００３】
また、従来の共焦点像を得る共焦点顕微鏡は複数の集光手段及び開口の設けられた２枚の円板を回転させてこの円板にレーザ光を照射して開口を通過した光で試料を光走査し、試料からの蛍光を再び前記開口を介して観察することにより共焦点像を得るものである。
【０００４】
図５はこのような従来のニポーディスク方式の共焦点顕微鏡の一例を示す構成ブロック図である。図５において１は光源（図示せず。）から出力される励起光であるレーザ光、２は集光手段としてピンホールアレイと同一の配置でマイクロレンズが形成された円板（以下、マイクロレンズ板と呼ぶ。）、３はダイクロイックミラー、４は開口としてピンホールアレイが形成された円板（以下、ピンホール板と呼ぶ。）、５は対物レンズ、６は試料、７はリレーレンズ、８はＣＣＤカメラ等の２次元画像を得ることができる光検出器である。また、２〜４及び７は共焦点光スキャナ５０を構成している。
【０００５】
レーザ光１はマイクロレンズ板２に入射され、マイクロレンズ板２に設けられた各々のマイクロレンズによりダイクロイックミラー３を介してピンホール板４上の各々のピンホールに集光される。ピンホール板４上の各々のピンホールを通過した光は対物レンズ５を介して試料６の上を走査する。
【０００６】
励起光であるレーザ光１により試料６で生じる蛍光は戻り光として再び対物レンズ５を介してピンホール板４に入射され、ピンホール板４上の各々のピンホールを通過した光はダイクロイックミラー３で反射され、リレーレンズ７を介して光検出器８に入射される。
【０００７】
また、マイクロレンズ板２及びピンホール板４は同一の軸に固定され、この軸に取付けられたモータ等の駆動手段（図示せず。）によって同期して回転される。
【０００８】
ここで、図５に示す共焦点顕微鏡の動作を説明する。レーザ光１は同期して回転するマイクロレンズ板２上の各々のマイクロレンズ及びピンホール板４上の各々のピンホールを通過することにより試料６表面を走査する。そして、試料６からの蛍光は再び同一のピンホールを通過してダイクロイックミラー３で反射されリレーレンズ７を介して光検出器８に入射されて蛍光の共焦点像が結像される。
【０００９】
また、光検出器８で蛍光の共焦点像を得るためにはダイクロイックミラー３は励起光であるレーザ光１を透過させ、戻り光である蛍光を反射させる必要がある。図６は励起光であるレーザ光１の波長が、例えば、”４８８ｎｍ”である場合のダイクロイックミラー３の透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【００１０】
励起光により生じる蛍光は励起光波長よりも長いので図６に示すダイクロイックミラー３では”４８８ｎｍ”の励起光を透過させると共に”５１５ｎｍ”以上の蛍光を反射する透過反射分光特性を有している。このため、ダイクロイックミラー３をレーザ光１は透過して、試料６からの戻り光である蛍光はダイクロイックミラー３で反射されるので光検出器８で蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【００１１】
また、図７は励起光であるレーザ光が２波長の周波数成分を含む場合に用いるダイクロイックミラー３の透過反射分光特性を示す特性曲線図である。例えば、励起光であるレーザ光１の波長が”４８８ｎｍ”及び”５６８ｎｍ”であるとすれば、ダイクロイックミラー３では”４８８ｎｍ”及び”５６８ｎｍ”の励起光を透過させると共に”５１５〜５４０ｎｍ”の蛍光及び”６００ｎｍ以上”の蛍光をそれぞれ反射する透過反射分光特性を有している。
【００１２】
すなわち、このような透過反射分光特性を有するダイクロイックミラー３を用いることにより２波長のレーザ光１であっても共焦点像を得ることが可能になる。
【００１３】
また、複数種類の蛍光試薬を試料に用いる多重染色法は広く用いられており、付加された複数の蛍光試薬により生じる蛍光信号を同時に観察することは試料の特定部位を同定するのに極めて有効であり、例えば、図７に示すような透過反射分光特性を有するダイクロイックミラーを用いることによりそれが可能になる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、複数の蛍光試薬により生じる蛍光信号を同時に観察するためには異なる波長の励起光を同時に試料に照射する必要がある。この場合、１つのレーザ光源に必要な励起波長が全て含まれていない場合には複数のレーザ光源を用いたり、あるいは、蛍光試料の吸収波長の一致した波長を出力するレーザ光源が無い場合には水銀ランプやキセノンランプなどのインコヒーレントな光源から必要な波長成分を得る必要があると言った問題点があった。
【００１５】
また、複数の光源から得られた光束を同一光軸上に一致させて混合させるための光学系が別途必要であり、装置が大型化してしまうと言った問題点があった。
【００１６】
さらに、特に紫外領域に吸収波長を有する蛍光試薬に対しては紫外線レーザ光源を用いることにより、複数波長の励起光を用いる必要がなくなるものの紫外線レーザ光源は高価であり、短寿命で不安定であると言った問題点があった。
従って本発明が解決しようとする課題は、安価で小型であって落射蛍光像及び共焦点像を任意に得ることが可能な顕微鏡を実現することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、対物レンズと、落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第２のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を透過させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を反射し前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた２種類の蛍光を前記戻り光として透過させる落射蛍光照明手段とを備えたことにより、安価で小型であって落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００１８】
請求項２記載の発明は、
複数の集光手段を有する円板及び前記集光手段と同一パターンの複数の開口を有する円板を同期して回転させ前記集光手段及び前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点像を得る顕微鏡において、
単一のレーザ光源と、対物レンズと、落射蛍光像及び共焦点像を撮影する光検出器と、前記対物レンズを介して前記レーザ光源の出力光で前記試料を走査すると共に前記試料からの戻り光をダイクロイックミラーで反射させて前記光検出器に出力する共焦点光スキャナと、前記共焦点スキャナと前記対物レンズとの間に設けられ、第２のダイクロイックミラーにより前記レーザ光源の出力光を反射させると共に落射蛍光照明用光源から出力される落射蛍光照明光を透過させ前記対物レンズを介して前記試料に照射させ、前記レーザ光源の出力光及び前記落射蛍光照明光の照射により前記試料で生じた２種類の蛍光を前記戻り光として反射させる落射蛍光照明手段とを備えたことにより、安価で小型であって落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００１９】
請求項３記載の発明は、
請求項１若しくは請求項２記載の発明である顕微鏡において、
前記光源の出力光若しくは前記落射蛍光照明光のどちらか一方の光束を遮ることにより、任意に落射蛍光像若しくは蛍光の共焦点像を選択することが可能になる。
【００２０】
請求項４記載の発明は、
請求項１若しくは請求項２記載の発明である顕微鏡において、
前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも長いことにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００２１】
請求項５記載の発明は、
請求項１若しくは請求項２記載の発明である顕微鏡において、
前記落射蛍光照明光の波長が前記光源の出力光の波長よりも短いことにより、共焦点像と共焦点像よりも短波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下本発明を図面を用いて詳細に説明する。図１は本発明に係る顕微鏡の一実施例を示す構成ブロック図である。図１において１〜８及び５０は図５と同一符号を付してあり、９は落射蛍光照明用光源、１０がピンホール板４と対物レンズ５との間に設けられたダイクロイックミラーである。また、９及び１０は落射蛍光照明手段５１を構成している。
【００２４】
レーザ光１はマイクロレンズ板２に入射され、マイクロレンズ板２に設けられた各々のマイクロレンズによりダイクロイックミラー３を介してピンホール板４上の各々のピンホールに集光される。ピンホール板４上の各々のピンホールを通過した光はダイクロイックミラー１０を透過した後対物レンズ５を介して試料６の上を走査する。
【００２５】
一方、落射蛍光照明用光源９の出力である落射蛍光照明光はダイクロイックミラー１０で反射されて対物レンズ５を介して試料６に照射される。
【００２６】
励起光であるレーザ光１及び落射蛍光照明により試料６で生じる２種類の蛍光は戻り光として再び対物レンズ５を介してダイクロイックミラー１０に入射される。入射された２種類の蛍光はダイクロイックミラー１０を透過してピンホール板４に入射され、ピンホール板４上の各々のピンホールを通過した光はダイクロイックミラー３で反射され、リレーレンズ７を介して光検出器８に入射される。
【００２７】
また、マイクロレンズ板２及びピンホール板４は同一の軸に固定され、この軸に取付けられたモータ等の駆動手段（図示せず。）によって同期して回転される。
【００２８】
ここで、図１に示す実施例の動作を説明する。レーザ光１は同期して回転するマイクロレンズ板２上の各々のマイクロレンズ及びピンホール板４上の各々のピンホールを通過することにより試料６表面を走査する。そして、レーザ光１により試料６で生じる第１の蛍光は再び同一のピンホールを通過してダイクロイックミラー３で反射されリレーレンズ７を介して光検出器８に入射されて蛍光の共焦点像が結像される。
【００２９】
一方、落射蛍光照明用光源９の出力である落射蛍光照明光はダイクロイックミラー１０で反射されて対物レンズ５を介して試料６を照射し、落射蛍光照明光により試料６で生じる第２の蛍光もまた第１の蛍光と同一のピンホール板４のピンホールを通過してダイクロイックミラー３で反射されリレーレンズ７を介して光検出器８に入射されて落射蛍光像が結像される。
【００３０】
例えば、励起光であるレーザ光１の波長が”４８８ｎｍ”、落射蛍光照明用光源９の出力である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光１の波長よりも長い”５６８ｎｍ”の場合、ダイクロイックミラー３が図６に示すような透過反射分光特性、ダイクロイックミラー１０が図２に示すような透過反射分光特性をそれぞれ有するようにする。
【００３１】
励起光である”４８８ｎｍ”のレーザ光１は図６及び図２に示す特性からダイクロイックミラー３及びダイクロイックミラー１０をそれぞれ透過して試料６に入射される。励起光であるレーザ光１により生じる第１の蛍光は励起光波長よりも長いので図２に示す特性のダイクロイックミラー１０では第１の蛍光を透過させ、図６に示す特性のダイクロイックミラー３では第１の蛍光を反射させる。このため、試料６からの戻り光である第１の蛍光は光検出器８に入射されるので光検出器８で蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【００３２】
一方、落射蛍光照明用光源９の出力である波長が”５６８ｎｍ”の落射蛍光照明光は図２に示す特性からダイクロイックミラー１０により反射されて試料６に入射される。落射蛍光照明光により生じる第２の蛍光は落射蛍光照明光の波長よりも長いので図２に示す特性のダイクロイックミラー１０では第２の蛍光を透過させ、図６に示す特性のダイクロイックミラー３では第２の蛍光を反射させる。このため、試料６からの戻り光である第２の蛍光は光検出器８に入射されるので光検出器８で落射蛍光像を得ることが可能になる。
【００３３】
また、試料６で生じる第１及び第２の蛍光はそれそれ同一の光路を経て光検出器８に入射されるので光検出器８では落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像として結像されることになる。
【００３４】
この結果、ピンホール板４と対物レンズ５との間にダイクロイックミラー１０を設けて落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光を試料６に照射させて、ダイクロイックミラー１０で試料６で生じた蛍光を透過させ、ダイクロイックミラー３で前記蛍光を反射させることにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００３５】
なお、光路上でレーザ光１若しくは落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光のどちらか一方の光束を遮ることにより任意に落射蛍光像若しくは蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。また、レーザ光１若しくは落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光の出射を停止させることでも任意に落射蛍光像若しくは蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【００３６】
また、図１に示す実施例ではダイクロイックミラー１０でレーザ光１を透過させ、落射蛍光照明用光源９の出力光を反射させると共に試料６で生じた２種類の蛍光を透過させているが、その逆であっても構わない。
【００３７】
また、第２のダイクロイックミラーであるダイクロイックミラー１０の位置は従来の落射蛍光顕微鏡に設けられているダイクロイックミラーに置けば良い。
【００３８】
また、上述の説明では落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光１の波長よりも長い場合に関して説明しているが、落射蛍光照明用光源９の出力である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光１の波長よりも短い場合であっても構わない。
【００３９】
例えば、励起光であるレーザ光１の波長が”４８８ｎｍ”、落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光の波長が励起光であるレーザ光１の波長よりも短い”３５０ｎｍ”の場合、ダイクロイックミラー３が図３に示すような透過反射分光特性、ダイクロイックミラー１０が図４に示すような透過反射分光特性をそれぞれ有するようにする。
【００４０】
励起光である”４８８ｎｍ”のレーザ光１は図３及び図４に示す特性からダイクロイックミラー３及びダイクロイックミラー１０をそれぞれ透過して試料６に入射される。励起光であるレーザ光１により生じる第１の蛍光は励起光波長よりも長いので図４に示す特性のダイクロイックミラー１０では第１の蛍光を透過させ、図３に示す特性のダイクロイックミラー３では第１の蛍光を反射させる。このため、試料６からの戻り光である第１の蛍光は光検出器８に入射されるので光検出器８で蛍光の共焦点像を得ることが可能になる。
【００４１】
一方、落射蛍光照明である”３５０ｎｍ”の落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光は図４に示す特性からダイクロイックミラー１０により反射されて試料６に入射される。落射蛍光照明光により生じる第２の蛍光は落射蛍光照明光の波長よりも長いので図４に示す特性のダイクロイックミラー１０では第２の蛍光を透過させ、図３に示す特性のダイクロイックミラー３では第２の蛍光を反射させる。このため、試料６からの戻り光である第２の蛍光は光検出器８に入射されるので光検出器８で落射蛍光像を得ることが可能になる。
【００４２】
また、試料６で生じる第１及び第２の蛍光はそれそれ同一の光路を経て光検出器８に入射されるので光検出器８では落射蛍光像と共焦点像の重ね合わせの像として結像されることになる。
【００４３】
この結果、ピンホール板４と対物レンズ５との間にダイクロイックミラー１０を設けて落射蛍光照明用光源９の出力光である落射蛍光照明光を試料６に照射させて、ダイクロイックミラー１０で試料６で生じた蛍光を透過させ、ダイクロイックミラー３で前記蛍光を反射させることにより、共焦点像と共焦点像よりも短波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００４４】
【発明の効果】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
請求項１及び請求項２の発明によれば、ピンホール板と対物レンズとの間に第２のダイクロイックミラーを設けて落射蛍光照明用光源の出力光を試料に照射させて、ダイクロイックミラーで試料で生じた蛍光を透過させ、ダイクロイックミラーで前記蛍光を反射させることにより、高価で不安定な紫外線レーザを用いる必要がなくなるので、安価で小型であって落射蛍光像及び共焦点像を任意に得ることが可能な顕微鏡が実現できる。
【００４５】
また、請求項３の発明によれば、レーザ光若しくは落射蛍光照明用光源の出力光のどちらか一方の光束を遮ることにより、任意に落射蛍光像、若しくは、蛍光の共焦点像を選択することが可能になる。
【００４６】
また、請求項４の発明によれば、落射蛍光照明光の波長をレーザ光の波長よりも長くすることにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【００４７】
また、請求項５の発明によれば、落射蛍光照明光の波長をレーザ光の波長よりも短くすることにより、共焦点像と共焦点像よりも長波長側の落射蛍光像の重ね合わせの像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る顕微鏡の一実施例を示す構成ブロック図である。
【図２】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図３】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図４】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図５】従来のニポーディスク方式の共焦点顕微鏡の一例を示す構成ブロック図である。
【図６】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【図７】ダイクロイックミラーの透過反射分光特性を示す特性曲線図である。
【符号の説明】
１  レーザ光
２  マイクロレンズ板
３，１０  ダイクロイックミラー
４  ピンホール板
５  対物レンズ
６  試料
７  リレーレンズ
８  光検出器
９  落射蛍光照明用光源
５０  共焦点光スキャナ
５１  落射蛍光照明手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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