(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物誘引剤を含有する乾燥された選択的微生物富化培地が表面に付着されている固相支持体を含む、環境サンプルから微生物の集団を採取するための装置。
【請求項２】
微生物誘引剤がグルコサミン、セルロース、ペンタノン酸若しくはその他の酸、キシラン、リグニン、キチン、アルカン類、芳香族化合物、有機塩素化合物、スルホニル化合物および重金属からなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
選択的微生物富化用培地が真核生物に対する増殖阻害剤を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
真核生物に特異的な増殖阻害剤がナイスタチン、シクロヘキシミドおよびピマリシンからなる群から選択される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
選択的微生物富化用培地が原核生物に対する増殖阻害剤を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
原核生物に特異的な増殖阻害剤がポリミキシン、ペニシリンおよびリファンピンからなる群から選択される、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
固相支持体がガラスビーズ、シリカエーロゲル、アガロース、セファロース（Sepharose）、セファデックス（Sephadex）、ニトロセルロース、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ならびに細孔ポリビニリデンジフルオライド膜からなる群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
微生物の集団が培養されていない微生物の集団である、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
培養されていない微生物が土壌（陸上）微生物の混合物、海洋微生物の混合物、または土壌(陸上)微生物と海洋微生物との混合物を含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
培養されていない微生物が好極限性細菌（extremophiles）である、請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
好極限性細菌が好熱菌、高度好熱菌、好冷菌、好塩菌、好酸菌、好圧菌および低温生育菌からなる群から選択される、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
a) 微生物誘引剤を含有する乾燥された選択的微生物富化培地が表面に付着されている固相支持体を含む装置にサンプルを接触させ、そして、
b)該装置から微生物の集団を単離する、
ことを含む、環境サンプルから微生物の集団を単離するための方法。
【請求項１３】
微生物誘引剤がグルコサミン、セルロース、ペンタノン酸若しくはその他の酸、キシラン、リグニン、キチン、アルカン類、芳香族化合物、有機塩素化合物、スルホニル化合物および重金属からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
選択的微生物富化用培地が真核生物に対する増殖阻害剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
真核生物に特異的な増殖阻害剤がナイスタチン、シクロヘキシミドおよびピマリシンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
選択的微生物富化用培地が原核生物に対する増殖阻害剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
原核生物に特異的な増殖阻害剤がポリミキシン、ペニシリンおよびリファンピンからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
固相支持体がガラスビーズ、シリカエーロゲル、アガロース、セファロース（Sepharose）、セファデックス（Sephadex）、ニトロセルロース、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ならびに細孔ポリビニリデンジフルオライド膜からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
微生物の集団が培養されていない微生物の集団である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
培養されていない微生物が土壌（陸上）微生物の混合物、海洋微生物の混合物、または土壌（陸上）微生物と海洋微生物との混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
培養されていない微生物が好極限性細菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
好極限性細菌が好熱菌、高度好熱菌、好冷菌、好塩菌、好酸菌、好圧菌および低温生育菌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は評価のためのサンプルの捕捉方法に関する。さらに特定すると、本発明は水系または土壌環境中の複合的または希薄な微生物集団からの、特定の酵素または小分子経路をコードする遺伝子を保有する微生物の採取および濃縮を可能にする方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
化学工業において、光学的に純粋な物質の実用的な合成のための効果的な触媒に対する重大な需要がある。酵素は最適な解決法を提供することができる。確立されたおよび現われつつある化学、医薬、繊維、食品・飼料、洗剤市場において利用される全ての種類の分子および化合物は厳しい経済的および環境的標準に適合しなければならない。ポリマー、医薬、天然産物および農薬の合成は有害な副産物を産生し、また低度エナンチオ選択性に悩まされる、費用がかかるプロセスに束縛されることが多い。酵素は触媒作用においてこれらの問題を克服することができる多数の顕著な利点を有する：酵素は単一の官能基に作用し、１分子中の類似する官能基を識別し、そしてエナンチオマーを識別する。さらに、酵素は生分解性であり、反応混合物中で非常に低モル分率で機能する。これらの化学的、位置的および立体的特異性によって、酵素は所望の選択的変換を最適に達成するための独特の好機を提供する。これらを化学的に、特に１段階反応で再現することは非常に困難なことが多い。保護基の必要性の回避、選択性、多段階変換を１つの反応容器中で実施する能力、および環境的な束縛下での混入物の低減は化学および医薬工業における酵素の需要の増大を導いてきた。従来の多くの化学を基礎とする方法から酵素を基礎とするプロセスに次第に交替されてきている。さらに広範な工業的用途に対する現在の制限は主として市販の酵素の数が比較的少ないことによるものである。これまでに開示されている3000を越える非DNA改変酵素活性の内、（DNA改変酵素を除いて）わずか300程度の酵素が現在市販されている。
【０００３】
工業技術的な適用のための酵素の使用には過酷な工業条件下での性能も要求される。このような性能としては、そのために現在公知の酵素の種類が進化論上選択されなかったような、環境または基質における活性が含まれる。酵素は中程度の温度、pHおよび塩濃度の条件下での生存生物の環境中で非常に特異的な生物学的機能を発揮するために、選択圧（淘汰の強度）によって進化してきた。大部分について、これまでに開示されている非DNA改変酵素の活性は中温性生物から単離されており、これらは利用し得る系統発生的多様性の中の非常に小比率を占めているものである。生物触媒の勢力分野は極端な環境中で生存する微生物から単離した酵素を使用する新たな局面に入る。こうした酵素は陸上の温泉および深海の出熱孔中の100℃を超える温度、北極の水中の0℃未満の温度、死海の飽和塩環境、炭鉱および地熱硫黄泉の0に近いpH値、または下水汚泥の11を超えるpHで機能しなければならない。これらの好極限性生物から得られる酵素は生物触媒における規な分野を開く。
【０００４】
例えば、好極限性生物（extremophilic organisms）からクローン化され、発現されたいくつかのエステラーゼおよびリパーゼは著しく強力で、広範囲の温度およびpHにわたって高活性を示す。これらのエステラーゼのうち５種類のもののフィンガープリントは最適反応温度の差異とともに多様な基質スペクトルを示す。図１に示すように、エステラーゼ５（EST5）は短鎖基質のみを認識し、一方エステラーゼ２（EST2）は長鎖基質にだけ作用し、その上最適反応温度にも顕著な差異がある。これらの結果は生物の多様性をスクリーニングすることによって、新規な生物触媒の要件を満足するさらに多様な酵素を発見することができることを示唆している。
【０００５】
さらに、これまで知られている酵素のほとんど全部が培養生物由来であり、大部分は細菌、そしてさらに最近では古細菌由来である。伝統的な酵素の発見プログラムはそのスクリーニングプログラムのためにもっぱら培養した微生物に頼るものであり、したがって天然の多様性のほんの一部についてのみ評価するものである。いくつかの最近の研究では、天然環境中に存在する生物のわずかな割合、高々1％未満のみが培養されたものと見積もられている（表１参照）。Amannら、Microbiol.Rev.59:143(1995)；Barnesら、Proc.Natl.Acad.Sci.91:1609(1994)；Torviskら、Appl.Environm.Microviol.56:782(1990)。したがって、この非常に大多数の微生物が新規な生物触媒の発見のための未開発源となる。
【０００６】
過去10年のうちに、新規な活性を有する生物活性化合物の必要性も劇的に増大してきた。この需要は、世界の人口統計の変化とともに現在利用し得る抗生物質に耐性な病原生物の数の明らかな増大傾向から主として発生した。例えば、若年人口を有する新興国では抗細菌薬剤の需要傾向があるが、米国などの高齢人口国では癌、糖尿病、関節炎およびその他の衰弱症状に対する範囲を広げた薬剤が必要とされる。感染症による死亡率は1980年と1992年の間に58％増大し、抗生物質耐性微生物の出現によって米国のみで保健医療費に毎年＄300億の超過が加わったものと見積もられた。この傾向に呼応して、製薬会社は独特の活性または特異性を有する化合物についての微生物の多様種のスクリーニングを顕著に増大させてきた。
【０００７】
有望な化合物（薬剤の候補）にはいくつかの共通の供給源がある。これらとして、天然産物群、合成化学物質群および合成的コンビナトリアル化学物質ライブラリーが含まれ、核酸、ペプチドまたはその他の高分子量分子などがある。これらの供給源のそれぞれが長所および短所を有する。これらの候補をスクリーニングするプログラムが成功するかどうかは、主としてプログラムに入る化合物の数次第であり、製薬会社は今日まで有望な化合物の探索に幾十万もの合成および天然化合物をスクリーニングしてきた。残念なことに、すでに発見された化合物に対する新規なものの割合は時とともに減少してきている。製薬会社の最大の努力にもかかわらず、新規な有望化合物の発見の割合は需要に追い付いていない。有力な薬剤候補の新規な供給源を評価することが強く必要とされている。
【０００８】
現在使用されている生物活性化合物の大部分は土壌微生物由来である。土壌およびその他の複合的な生態群落に生息する多くの微生物はその生存および増殖能力を増大させる様々な化合物を産生する。これらの化合物は一般的には、その生物の生育には必須ではなく、中間代謝に関与する遺伝子によって合成されるものと考えられる。したがってそれらは「二次代謝物」と称される。別の生物の生育または生存に影響を与える二次代謝物は「生物活性」化合物として知られ、微生物および巨大生物の両方の化学的防御物質の鍵となる成分として働く。人間は、広範囲の原核および真核病原体に対する活性を有する抗生物質、抗感染剤およびその他の生物活性物質として使用するために、これらの化合物を開発してきた。約6,000種の微生物起源の生物活性化合物が特性決定されているが、その60％以上がStreptomyces属のグラム陽性土壌細菌によって産生される。これらの中で、少なくとも70種が生物医薬および農業での用途のために現在使用されている。生物活性化合物の最大のクラスであるポリケチドは広範囲の抗生物質、免疫抑制剤および抗癌剤を含み、これらを併せて年間50億＄を超える販売額となる。
【０００９】
見掛け上多数の利用可能な生物活性化合物があるにもかかわらず、現代の生物医療科学が直面する最大の課題の１つが抗生物質耐性病原体の増殖であることは明らかである。これらの短い世代時間および遺伝情報を容易に交換し得る能力のため、病原微生物は急速に進化し、ほとんどすべてのクラスの抗生物質化合物に対する耐性メカニズムを広げた。例えば、現在唯一の抗生物質、バンコマイシンのみによって治療することができるヒト病原体 Staphylococcusおよび Streptococcus のビルレント株があるが、この化合物に対する耐性を出現させるには、これに対して耐性のEnterococcus種由来の１個の遺伝子vanAを転移させるだけでよい。新規な抗細菌性化合物に対するこの重大な必要性を酵素阻害剤、免疫抑制剤および抗癌剤に対する増大している需要と重ね合せると、なぜ製薬会社が新規な特性を有する生物活性化合物のために微生物の多様種のスクリーニングを発展させてきたかが容易に明らかになる。有望な化合物の供給源として、なお巨大な生物多様種が未開発のままで残っている。
【００１０】
本発明は、最終的には新規な生物活性の発見における使用を含む、各種の目的のための生物多様種の評価経路を提供する。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は固相表面に化学的に結合(conjugate)させた特定の基質に微生物を選択的に誘引するための手段を提供する。本発明はこれらの微生物の富化をさらに提供する。この方法は、水系または陸上環境中の複合的または希薄な微生物集団から、特定の酵素または小分子経路をコードする遺伝子を保有する微生物の濃縮および採取を可能にする。誘引および引き続いて行われる富化の基礎となるものは、微生物が特定の基質への化学走性をシグナリングする特定の受容体を保有することである。基質を表面に結合させ、続いてこの基質-表面結合体を混合微生物集団の存在下でインキュベートすることによって、この集団の特定のメンバーを採取することができる。
【００１２】
本発明の目的の１つは、周囲の環境マトリックスから特定の微生物を選択的に富化する手段を提供することである。これらおよびその他の目的を達成するために、本発明の１つの態様にしたがえば、選択性(selectable)微生物富化用培地(media)を付着させる表面を有する固相支持体を含む、環境サンプルから微生物の集団を採取するための装置(device)が提供される。
【００１３】
本発明の１態様において、環境群落のメンバーを装置に選択的に誘引するために、微生物誘引剤を含有する微生物富化用培地を使用する。本発明の別の態様においては、所望の微生物の選択をさらに強化するため、望ましくない生物の生育を阻害する生物活性化合物を微生物富化用培地中に含ませる。
本発明のさらに別の態様において、固相支持体と選択性微生物富化用培地を付着させるための表面とを有する装置にサンプルを接触させ、そしてその装置から集団を単離することを含む、環境サンプルから微生物を単離するための方法が提供される。
【００１４】
本発明のその他の目的、様相および利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および特定の例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、説明のためにのみ提供するものである。なぜならば、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の各種の変更および改変が当業者に明らかになるからである。
【００１５】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は微生物の単離および拘束（containment）のための装置ならびに培養されていない微生物のin situ富化をもたらすための方法を提供する。この富化プロセスは微生物集団の希少種および予め培養されていないメンバーを回収する可能性を増大させることができる。
【００１６】
本発明において、周囲環境マトリックスのメンバーを選択的に誘引する目的で、増殖用基質および栄養改良剤からなる微生物拘束装置を使用することによって、in situ富化を達成することができる。基質（炭素源）および栄養改良剤（すなわち、窒素、リン、その他）の選択は富化しようとする群落のメンバーに応じて決まる。正確な組成は群落のどのメンバーの富化を所望し、そして群落のどのメンバーの阻害を所望するかによる。つぎに所望の微生物の誘引および増殖をさせるため、一定の期間、これらの拘束装置を所望のバイオトープに配置する。
【００１７】
本発明の基質にはモノマーおよびポリマーが含まれる。一定のタイプの微生物を誘引するために、グルコサミン、セルロース、ペンタノン酸若しくはその他の酸、キシラン、キチン、その他などのモノマーの基質を利用することができる。モノマーを使用した場合、細胞上の基質受容体の存在に対して、採取のための誘引に頼ることが可能になる。これはより多くの生物多様種を獲得することが可能になるという、さらに別の利益を提供し得る。ポリマーもまた、これを分解することができる微生物を誘引するために使用することができる。
【００１８】
水系環境中の希薄集団から目的の特定の微生物を捕捉し、濃縮することによって、大量の水から微生物を濃縮する必要を解消することができる。これらの装置を土壌環境中に埋め込んで、生息土壌から微生物を富化することができる。表面材料にセルロースまたはキチンなどの基質を付着させて、放線菌などの特定のクラスの微生物を誘引することができ、これらは二次代謝物の豊富な原料となる。
【００１９】
本発明を利用して、in situ富化を容易に達成することができる。図２は本発 明において詳細を示すように、各種の生息地からの微生物の捕捉を証明している。これらの写真は、２種の異なる基質（セルロースおよびキシラン）を利用した時の土壌環境から採取した微生物のタイプの違いを証明している。これらの写真はまた、ビーズのみを使用した場合と、基質（キチン）を付着させたビーズを使用した場合との差異をも証明している。
【００２０】
好ましい１つの実施形態において、本発明は、選択性微生物富化用培地を付着させる表面を有する固相支持体を含む、環境サンプルから微生物の集団を採取するための微生物拘束装置に関する。
本発明の好ましい別の１つの実施形態において、固相支持体と選択性微生物富化用培地を付着させるための表面とを有する装置とサンプルを接触させ、その装置から集団を単離することを含む、環境サンプルから微生物を単離するための方法が提供される。
【００２１】
本明細書で使用する「選択的(selective)微生物富化用培地(media)」とは、周囲環境中に存在する特定の生物の増殖を強化し、かつ／またはその他の生物の増殖を阻害する要素（element）を含有するあらゆる培地である。本発明の培地は富化の対象となる生物が周囲マトリックス中で増殖しているその他の生物と比較して比較的少数である場合に有用である。例えば、抗生物質であるコリスチンおよびナリジキシン酸を含有する選択的微生物富化用培地はグラム陰性細菌の増殖を阻害するがグラム陽性菌の増殖は阻害しない。この微生物富化用培地の選択性は、コリスチンおよびナリジキシン酸を含有する培地に特定の基質、例えばセルロースを添加することによって、さらに強化することができる。これによって、前記の微生物富化用培地を組み込んだ微生物拘束装置はエネルギー源としてセルロースを利用することができるグラム陽性生物に対して選択性を持つことになる。
【００２２】
本明細書で使用する用語「固相支持体」は、選択性微生物富化用培地の付着のための支持表面を提供するあらゆる構造体である。本発明のスクリーニングアッセイのために使用することができる周知の固相支持体としては、ガラスビーズ、シリカエーロゲル、アガロース、Sepharose、Sephadex、ニトロセルロース、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ならびに細孔ポリビニリデンジフルオライド膜が挙げられるが、これらに限定されない。選択性培地の付着および支持を可能にするあらゆる材料が本発明に含まれるものと解釈される。表面積の大きな材料、例えばガラスビーズまたはシリカエーロゲルなどを使用することによって、基質-表面結合体の多重集合体を保持する比較的小さな装置で高濃度の微生物を採取することができる。
【００２３】
本発明の１つの態様において、選定した環境に配置する前に、基質を固相表面に結合させる。こうした結合は好ましくは化学的結合である。本発明における表面として、表面積の大きな材料、例えばガラスビーズまたはシリカエーロゲルなどを好ましくは利用する。本発明において効果的に利用することができる各種の表面積材料があることが予想される。表面材料への基質の結合または固定化は当業者にとって明らかな各種の方法によって実現することができる。ガラスビーズの誘導体化の１例を下記の実施例において記載する。本発明における表面に基質を固定化するためには、各種の結合または固定化戦略のどれでも利用することができるものと期待される。
【００２４】
本発明の誘導体化表面積材料（例えば、ガラスビーズまたはシリカエーロゲル）を、対象とする環境中に設置する前に、別の装置（群）中に入れる。好ましくは、こうした拘束装置はこの誘導体化材料を同時に含んだまま微生物の移動を可能にするタイプのものである。例えば、特に好ましい容器は誘導体化材料を含むように操作された、Spectrum(Houston,Texas)から入手し得るようなメッシュフィルタ ーである。例えば、フィルターを正方形に切り取り、誘導体化材料を中央に置き、フィルターを半分に折り、そして三方を接着して拘束装置を作製する。次に、環境中に設置するために、メッシュフィルターを含む固相支持体として使用することができる任意の装置中にメッシュフィルターまたは類似品を入れる。特に好ましい装置は不活性材料、プレキシガラスなどで製造されたものである。
【００２５】
あるいは、材料を同時に含んだままま微生物の移動を可能にするどんな装置も本発明で利用することができる。例えば、Falconチューブ（VWR,Fisher Scientific）または類似のものを利用して誘導体化した材料を直接含ませることができる。鋭利な道具を使用してこのチューブに穴を開けて、この装置内または外に微生物を移動させる装置を作製することができる。
【００２６】
選択性富化培地中の固定される成分を非共有または共有結合付着によって固定化することができる。非共有結合付着は、例えば、標的生物の細胞膜上に表出する受容体によって特異的に認識されるタンパク質の溶液で固相表面をコーティングすることによって達成することができる。あるいは、固定化しようとするタンパク質に特異的な固定化された抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、固相表面にそのタンパク質を固定することができる。この表面をあらかじめ調製して保存することができる。
【００２７】
別の態様において、本発明は固相表面に付着させた微生物誘引剤を利用する、細菌および古細菌微生物の選択的 in situ富化の方法に関する。本明細書で使用する「微生物誘引剤」は、微生物を微生物富化培地を含有する装置に選択的に沈殿させるかまたは装置への移動を誘発する任意の組成物として定義される。微生物誘引剤はさらに、本発明の装置中に含有される微生物富化用培地に接触する微生物の生存を選択的に増大させる任意の組成物として定義される。例えば、微生物は通例、炭素源などのエネルギー源として感知される環境刺激に対して化学的走性応答を表示する。ある特定の炭素源が群落のあるメンバーによって利用されるが他によっては利用されないことがある。このように、炭素源の選択は、富化しようとする群落のメンバーに応じて決まる。例えば、Streptomycetalesのメンバーはセルロース、キチンおよびリグニンなどの複雑で高分子量の基質を利用する傾向がある。これらの複雑な基質はその他の属によって利用されるが、大部分の細菌にとっては利用されない。
【００２８】
別の態様において、炭素源の選択次第では、その外に窒素源の使用が必要とされることがある。例えば、キチンはＣ：Ｎ比が均衡しているが、セルロースは均衡していない。セルロース（またはその他の炭素に富む基質）の利用を強化するため、硝酸塩またはアンモニアなどの窒素源を添加するのが有用であることが多い。さらに、微量元素の添加が１群落中のあるメンバーの増殖を強化し、その他に対して阻害することがある。
【００２９】
本発明の別の態様において、真核生物の増殖阻害剤として有用な化合物を本発明の装置中に含ませることができる。真核生物の増殖阻害剤として、真核生物の生育を阻害するあらゆる化合物が含まれる。こうした阻害剤として、例えばナイスタチン、シクロヘキシミド、および／若しくはピマリシンなどの１種以上の市販の化合物またはその他の抗真菌性化合物が含まれる。これらの化合物は、粉末としてふりかけるか、または選択性微生物富化用培地中に液体として配合してもよい。所望しない種の増殖を阻害し、所望する種の増殖を促進するため、その他の選択性薬剤を利用することができるものと予想される。例えば、細菌および古細菌種を取得することは、所望の細菌種と利用し得る基質について競合することが可能な真核生物の存在によって複雑になることがある。したがって、本発明の装置中に抗真菌剤またはその他の真核増殖阻害剤などの選択用薬剤を含ませることにより、目的の微生物の増殖が促進される。
【００３０】
さらに別の態様において、いくつかの細菌種の増殖を阻害するがその他のものは阻害しない化合物を富化用培地中に配合することができる。原核生物のための増殖阻害剤として、原核細胞の増殖を阻害する任意の化合物が含まれる。こうした化合物としては、限定するわけではないが、ポリミキシン、ペニシリンおよびリファンピンが含まれる。化合物の使用はその細菌群落のどのメンバーの富化を所望するかに応じて決まる。例えば、大多数の Streptomycesはポリミキシン、ペニシリンおよびリファンピンに感受性であるが、これらは、耐性があるこの科の「希少」メンバーを富化するためにこれらを使用することができる。選択用薬剤をその群落の古細菌メンバーのための富化に使用することもできる。
【００３１】
本発明の文脈において、微生物富化用培地を含有する拘束装置に例えば誘引剤として複合炭素源、真核生物の阻害剤としてナイスタチンおよび一定の原核生物の阻害剤としてリファンピンを組み込むことができる。誘引剤、真核阻害剤および原核阻害剤は個別に、または任意の組合せで、本発明の選択性微生物富化用培地の成分として使用することができると解釈される。さらに、本発明の装置には、環境マトリックスに適する、または対象とする微生物の単離に適する任意の微生物富化用培地と組合せて、任意の適切な固相支持体を含ませることができるものと解釈される。環境マトリックスとして海洋環境、陸上環境、または海洋および陸上環境の組合せが含まれる。さらに、環境マトリックスとしては、固体でも液体でもない周囲に存在する生物、空中浮遊を続けている生物などが含まれる。大気または任意のその他の気体環境からこうした微生物をろ過するために、本発明の装置を使用することができる。非地球環境からの微生物、地球以外の惑星に存在するものなど、の単離のために、本発明の拘束装置を使用することができることもさらに意図している。例えば、火星上に存在し得る微生物を誘引するために設計した微生物富化用培地を含有する拘束装置は本発明に含まれる。こうした装置は、現在地球上で遭遇するものと実質的に差異がない環境マトリックス中に存在することができる微生物を誘引するように設計された特徴を取り入れるものとする。さらに地球以外の惑星の環境条件に関する十分な量のデータを利用することによって、これらの環境に特異的な要素を組み込むように、本発明の装置を設計することができる。
【００３２】
別の態様において、生物矯正（bioremediation）のために有用な微生物を単離し同定するために、本発明を使用することができる。生物矯正は環境から有毒で望ましくない化学物質を除去するか無毒化するために微生物を利用するプロセスである。有毒なまたは望ましくない化学物質に付着するかまたは無毒化することができる生物を選択的に富化する培地を含有するように、本発明の装置を改変することができる。例えば、有機ハロゲン化合物は抗菌剤、除草剤、殺虫剤、殺藻剤、可塑剤、溶媒、水圧液体、冷媒および化学合成の中間体として広く使用されてきた。その結果、これらは環境汚染物質の最大のグループの１つを構成している。有機塩素化合物が過去二、三十年間にわたり大規模な工程によって合成され、これらの物質の最大の比率を占めてきた。我々の生態系におけるこれらの普遍的な使用および分布が公衆衛生および環境への影響の可能性についての関心を喚起するようになった。したがって、環境からこれら、およびその他の化学物質を除去することができる微生物の同定への必要性が存在する。例えば本発明の選択性富化用培地中に有機塩素化合物を含ませることは、こうした化合物に誘引される生物の単離に役立ち得る。同定されたら、この微生物は、こうした汚染物質を含有することが知られている環境を無毒化するための天然のかつ安価な手段として使用することができる。
【００３３】
さらに手を加えずとも、前記の記載を使用して、当業者は本発明を完全に利用することができるものと考えられる。以下の実施例は説明のためと考えるベきであり、したがっていずれにしてもその他の開示を限定するものではない。
【００３４】
（実施例１）
ガラスビーズへのN-アセチルB-D-グルコサミン-フェニルイソチオシアネート（活性化基質）の表面誘導体化
以下のようにして、ガラスビーズをN-アセチルB-D-グルコサミン-フェニルイ ソチオシアネートで誘導体化することができる。
ビーズの調製：
１．  混合する：
ガラスビーズ（Biospec Products,Bartlesville,OK） 30 ml
APS／トルエン（10％）（APS - アミノプロピルトリエトキシシラン ）（Aldrich） 50 ml。
２．  一晩還流する。
３．  デカントし、そしてトルエンで３回洗浄する。
４．  エタノールで３回洗浄し、オーブンで乾燥する。
【００３５】
以下のようにして、N-アセチルB-D-グルコサミン-フェニルイソチオシアネートで誘導体化する：
５．  Falcon Tube中で結合させる：
上記の調製ガラスビーズ 25 ml
0.1 M NaHCO３ 15 ml＋ N-アセチルB-D-グルコサミン-PITC（Sigma Ch          emical Co.）25 mg＋DMSO 1 ml。
６．  NaHCO3 10 ml＋DMSO 1ml を添加する。
７．  ガラスビーズ上に注ぎかける。
８．Falcon Tube中で一晩振盪する。
９．0.1 M NaHCO３ 20 mlで洗浄する。
10．ddH２O 50 mlで洗浄する。
11．55℃で１時間乾燥する。
【００３６】
（実施例２）
ゾルゲルへのカンバ(birchwood)キシラン（ポリマー）の表面誘導体化
ガラス混合物（スラリー）：
１．氷上で結合させる：
TMOS（テトラメチルオルトシリケート-「ゾルゲル」）(Aldrich)75 ml
H２O 30 ml
0.05 M HCl 2mlを徐々に添加する。
撹拌しながら 0.05 M NaOH 2 mlを徐々に添加してpHを上昇させる。
２．容器中の撹拌ブロック上に添加する：
カンバキシラン（Fluka）10 g
10 mM リン酸バッファー、pH 6.0 200 ml
【００３７】
３．上記のガラス混合物 105 mlと混合する。固体になるまで（4〜5分）緩やかに撹拌する。
４．＠55℃で一晩インキュベートする。
同一のプロトコルを使用して、市販のキチンまたはセルロースでビーズを誘導体化することができる。
【００３８】
（実施例３）
ガラスビーズへのキシランモノマーの表面誘導体化
１．混合する：
0.1 M NaHCO３ 15 ml
B-d-キシロピラノシルフェニルイソチオシアネート（Sigma Chemical）25 mg
２．上記実施例１で調製したビーズ25 mlに注ぎかける。
３．0.1M NaHCO３ 10 mlを添加する。
４．一晩放置する。
【００３９】
（実施例４）
抗生物質を含む微生物拘束装置
１．15 ml Falcon Tube（VWR）の両端を切断する。
２．Spectra/メッシュナイロンフィルター（Spectrum,Houston,Texas）（メッシュ孔：70μm；開口率（％）：43；厚さ：70μm）を直径約 2.5 cmの円盤２枚に切断する。
３．Falcon Tubeの一端をこのメッシュでカバーし、Goop,Household Adhesive & Sealantを使用して接着する。
４．以下の希釈基準培地を作製し、フィルター殺菌する：
K２HPO４         1.74 g
NaH２PO４        1.38 g
(NH４)２SO４      0.5 g
MgSO４.7H２O     0.2 g
CaCl２.2H２O     0.025 g
KNO３           0.5 g
水             1 リットル
セロビオース   0.001％
【００４０】
５．希釈基準培地 10 mlで殺菌ガーゼパッド（North 3"ｘ3",Fisher）１枚を湿らせる（したたり落ちない程度に湿らせる）。これは１枚のパラフィルム(parafilm）上にガーゼを置いて、培地を滴下することによって、最もうまく取り扱われる。
６．培地をガーゼ中にしみ込ませる。
７．シクロヘキシミド粉末約 0.5 gをパッドに振り掛け、スパチュラを使用して広げる。
８．ナイスタチン（黄色）約0.5 gを同様の方法で同一のパッドに振り掛ける。
９．ピンセットを使用して、処理したガーゼパッドをFalconチューブ中に押し込む。
10．チューブの反対の端を前と同様に別の円盤でシールする。
11．乾燥させる（約２時間）。
12．所望のように配置する。
【００４１】
（実施例５）
微生物拘束装置を使用したサンプルの採取
以下の実施例では、生物を誘引するために本発明にしたがって作製することができる微生物拘束装置の１タイプについて記載する。以下のプロトコルは単純な微生物拘束装置を作成するための１方法について説明するものである。
１．加熱した針またはその他の鋭利な道具で 15 ml Falcon Tube（VWR,Fisher Scientific）に小さな穴を開ける。
【００４２】
２．実施例１、２または３からの誘導体化ビーズ約1〜5 mlを、Spectrum（Houston,Texas）から入手し得るメッシュ孔70μm；開口率43％；厚さ70μmのものなどのSpectra/メッシュナイロンフィルター中に入れる。ナイロンフィルターを、例えばGoop, Household Adhesive & Sealantを使用して、ビーズを含有する「袋」を形成するようにシールする。
３．ビーズを含有するフィルターを穴を開けたFalcon Tubeに入れて、チューブを一定期間（典型的には数日）所望のバイオトープ中に配備する。
４．微生物拘束装置および付随する生物を回収する。
【００４３】
本発明をここに完全に説明したので、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく多くの変更および改変を実施することができることは当業者にとって明らかであろう。
【００４４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  新規な５種のエステラーゼの基質スペクトルフィンガープリントおよび最適反応温度を説明する図で、これらの酵素の多様性を示すものである。EST＃は各種酵素を表し、温度はそのエステラーゼを単離した生物についての最適増殖温度を表し、「E」は指示した所与の基質のそれぞれに対する各エステラーゼ酵素の比活性を示す（ヘパノン酸を対照とする）。
【図２】  本発明で説明するような、海洋および土壌生息地からの微生物の捕捉を説明する図である。これらの写真は、２つの異なるタイプの基質（セルロースおよびキシラン）を利用した場合に、１土壌環境から採取した微生物のタイプに差異があることを証明している。これらの写真は、ビーズのみを使用した場合と基質（キチン）を付着させたビーズを使用した場合との差異をも証明している。
【図１】
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【図２】
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