(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリゲネス属に属し、Ｌ−タリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌を、Ｌ−タリトールを含有する水溶液に接触させてＬ−プシコースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−プシコースの製造方法。
【請求項２】
アルカリゲネス属に属する細菌が、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロソキシダンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ）７０１Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７３５）であることを特徴とする請求項１記載のＬ−プシコースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｌ−プシコースの製造方法に関するものであり、更に詳細には、アルカリゲネス属に属し、Ｌ−タリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌を用いて、Ｌ−タリトールからＬ−プシコースを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−プシコースは、ケトヘキソースに分類される単糖類で、自然界には殆ど存在しない希少糖質である。その製造方法としては、原理的には、有機化学的手法によりＬ−アルトロース又はＬ−アロースをカセイソーダ、ピリジンなどのアルカリ性薬剤の共存下で異性化させ、Ｌ−プシコースを製造することが可能である。しかし、実際には、原料となるＬ−アルトロース又はＬ−アロースを入手することが困難であり、Ｌ−プシコースを十分量製造する適当な方法は現在まで報告されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
近年、生化学工業が急速に発達し、糖質化学の分野においても、新たな糖質の開発が望まれている。Ｌ−プシコースは、大量製造方法が確立されておらず、試薬としても市販されていない。従って、未だ、食品工業、医薬品工業、化学工業などの工業原料として使用されるに至っていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、Ｌ−プシコースを生化学的手段により大量、安価に製造することを目的に鋭意研究した。
【０００５】
その結果、本発明者等が特開平５−７６３７９号公報で開示した、アルカリゲネス属に属する細菌が、水溶液中のＬ−タリトールを、容易にＬ−プシコースに変換することを見い出し、これを採取することにより、Ｌ−プシコースが高収率で製造されることを確認して、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明において、Ｌ−タリトールからＬ−プシコースを製造するのに使用される細菌は、アルカリゲネス属に属し、Ｌ−タリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌である。
【０００７】
本発明でいう、アルカリゲネス属に属し、Ｌ−タリトール  から  Ｌ−プシコース産生能を有する細菌は、Ｌ−タリトールを含有する水溶液に接触し、Ｌ−タリトールからＬ−プシコースを産生しうる微生物であればよく、例えば、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロソキシダンス  ７０１Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７３５）又は、この変異株などの細菌が好適であり、通常、これら細菌を栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通気攪拌などの好気的条件下で培養し、培養中に、又は得られた細菌（生菌体）を用いて、水溶液中に含有せしめたＬ−タリトールをＬ−プシコースに変換させて、生成するＬ−プシコースを採取すればよい。
【０００８】
培養方法としては、アルカリゲネス属に属する細菌が必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩などを含有する栄養培地、望ましくは、微酸性乃至微アルカリ性の液体培地に、Ｌ−タリトールからＬ−プシコース産生能を有する細菌を植菌し、温度約２０乃至３５℃で、１乃至１０日間好気的条件下で培養すればよい。とりわけ、炭素源として、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノースあるいはＬ−ソルボース等の１種又は２種以上の炭素源とともに他の各種栄養源を含有する液体培地で好気的に培養するのが望ましい。
【０００９】
前述のような培養方法によって得られた細菌（生菌体）を、Ｌ−タリトールを含有する水溶液と接触、望ましくは、振盪、通気攪拌、酸素の圧入などの好気的条件下で接触させ、その糖質を、Ｌ−プシコースに有利に変換させることができる。
【００１０】
この変換に用いられる細菌は、培養液中のそれを利用することも、また、培養液から分離された生菌体を利用することも随意である。必要ならば、生菌体を半透膜製のホローファイバーに封入し固定化した細菌、又は、寒天、ゼラチン、アルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、シート状などの各種形状に固定化した細菌などとして、該固定化細菌をＬ−タリトールからＬ−プシコースへの変換反応に連続して利用することも、また、繰返し利用することも有利に実施できる。
【００１１】
以上述べた各種の方法により生成、蓄積したＬ−プシコースを含有する水溶液は、適当な分離方法、例えば、遠心分離、濾過などの方法によって細菌など不溶物と分離され、採取される。
【００１２】
得られたＬ−プシコース水溶液は、必要により、例えば、硫安塩析、水酸化亜鉛吸着などによる除蛋白、活性炭吸着による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの方法で精製し、濃縮してシラップ状のＬ−プシコース製品を採取することができる。更にイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー、例えば、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックス５０ＷＸ４』、『ダウエックスＷＧＲ』、東京有機化学工業株式会社製造の商品名『アンバーライトＸＴ−１００８』、『アンバーライトＩＲＡ４７』、三菱化成工業株式会社製造の商品名『ダイヤイオンＳＫ１０６』、『ダイヤイオンＷＡ１１』などを用いるカラムクロマトグラフィーで分画、精製、濃縮することにより、９９％以上の高純度の製品も容易に得ることができる。
【００１３】
このようにして製造されるＬ−プシコースは、通常、原料のＬ−タリトールに対し約４０ｗ／ｗ％以上の収率で得られ、大量、安価に供給する工業的製造方法として好適である。
【００１４】
従って、本発明の方法で得られるＬ−プシコースは、試薬用途のみならず、食品工業、医薬品工業、化学工業などの工業用途にその原料、中間体などとして有利に利用できる。
【００１５】
以下、本発明の実施例を述べる。
【００１６】
【実施例１】
硫酸アンモニウム０．２ｗ／ｖ％，リン酸一カリウム０．２４ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．５６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１ｗ／ｖ％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、Ｄ−ソルビトール２ｗ／ｖ％及び脱イオン水からなる培養液１００ｍｌずつを５００ｍｌ容振盪フラスコ１０本にとり、１２０℃２０分間オートクレーブした後、放冷し、これにアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシス・キシロソキシダンス  ７０１Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７３５）を１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。
【００１７】
培養後、遠心分離により集菌し、得られた生菌体約２ｇをＬ−タリトール２ｗ／ｖ％を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに加え混合し、これを５００ｍｌ容振盪フラスコにとり、３０℃で２日間振盪し、Ｌ−タリトールをＬ−プシコースに変換させた。次いで遠心分離して細菌を除去した。
【００１８】
得られた上清に２５ｗ／ｖ％硫酸亜鉛を１／１０容加えｐＨ７．６に調整し、遠心分離して上清を採取した。この上清を、常法に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、三菱化成工業株式会社製造の商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ』（Ｈ型）及び三菱化成工業株式会社製造の商品名『ダイヤイオンＷＡ３０』（ＯＨ型）を用いて脱塩し、減圧濃縮して濃度約６０％の透明なシラップを得た。
【００１９】
本品を、カルシウム型カチオン交換樹脂、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックス５０ＷＸ４』を用いるカラムクロマトグラフィーにより、純度９８％以上の高純度Ｌ−プシコース画分を採取し、これを精製、濃縮して濃度約７０ｗ／ｗ％のシラップ状製品を原料に対して固形物当たり約４０％の収率で採取した。
【００２０】
本菌はＬ−タリトール、Ｌ−プシコースに対する資化性が存在しないので、変換反応で減少したＬ−タリトールに対するＬ−プシコースの生成率は９５％以上に達した。また、変換反応後生産物のＬ−プシコースから分離したＬ−タリトールは、基質として再度利用できる。
【００２１】
このようにして得られた高純度製品を同定するため、実験により理化学的性質を調べ、その性質を文献値と比較するとともに、シグマ社が標準物質として市販している試薬Ｄ−プシコースの測定値と比較した。
【００２２】
（１）比旋光度の測定
本製品の測定値
［α］２０Ｄ＝−３．０（ｃ＝１０％、Ｈ２Ｏ）
Ｄ−プシコースの文献値
［α］２０Ｄ＝＋３．１（Ｈ２Ｏ）
文献：チャップマン・アンド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ）社、『ディクショナリー・オブ・オーガニック・コンパウンズ（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）』、第４８１６頁（１９８２年）
【００２３】
（２）１３Ｃ−ＮＭＲの測定
本製品の１３Ｃ−ＮＭＲの測定を、『バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第１３巻、第１４６乃至１５３頁（１９７４年）に記載している方法に準じて行った。結果は表１に示した。表１の結果から明かなように、本品のケミカルシフトは、文献のＤ−プシコースのそれとよく一致した。
【００２４】
【表１】
0003623000.tif 000002
【００２５】
（３）水素化ホウ素ナトリウムによる還元物質の確認
本製品及び試薬Ｄ−プシコースを水素化ホウ素ナトリウムによって還元し、その生産物の同定を行った。本製品及び試薬Ｄ−プシコースからの還元生産物は、いずれもアリトール及びタリトールであった。
【００２６】
（４）高速液体クロマトグラフィーによる分析
本製品を高速液体クロマトグラフィー（日本分光工業社製８８０−ＰＵ；カラム、日立製作所ＧＬ−Ｃ６１１；溶離液、１０−４Ｍ水酸化ナトリウム、６０℃；流速、１ｍｌ／ｍｉｎ；検出、島津製作所ＲＩＤ−６Ａ）で分析したところ、その溶出位置は、標準物質としての試薬Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ソルボースなどのケトヘキソースとは異なり、試薬Ｄ−プシコースと同一の２８．６分であった。
【００２７】
以上の結果から明らかなように、１３Ｃ−ＮＭＲの測定、還元生産物の分析、高速液体クロマトグラフィーについては、Ｄ−プシコース及びＬ−プシコースの文献値又はＤ−プシコース標準物質としての試薬の値とよく一致し、比旋光度については、Ｄ−プシコースの実測値と絶対値がよく一致するものの＋、−逆であったことから、本発明の方法で得られた製品は、Ｌ−プシコースであると判断される。
【００２８】
本製品は、試薬用途のみならず、食品工業、医薬品、化学工業などの原料、中間体などとして有利に利用できる。
【００２９】
【実施例２】
実施例１の培養液のうち、Ｄ−ソルビトールをＤ−フラクトースに置換えた以外は、実施例１と同組成の培養液１５ｌを３０ｌ容ジャーファーメンターにとり、１２０℃、２０分間滅菌した後、３０℃に冷却し、これに同組成の培養液３０℃で１日間振盪培養したアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブ・スピーシーズ・キシロソキシダンス  ７０１Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７３５）の種培養液を１ｖ／ｖ％植菌し、３０℃で２日間通気撹拌培養し、次いで遠心分離して菌体を採取した。このようにして得た生菌体約２ｇをＬ−タリトール２ｗ／ｖ％を含有する０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに加えて混合し、以後、実施例１と同様に、Ｌ−プシコースに変換せしめ、次いで、常法に従って、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩して精製し、濃縮して、Ｌ−タリトールとＬ−プシコースとを約２：３の割合で含有する濃度約７０％の透明なシラップを原料に対して固形物当たり約９０％の収率で得た。
【００３０】
本製品は、食品工業、医薬品工業、化学工業などの原料、中間体などとしても有利に利用できる。
【００３１】
【発明の効果】
上記したことから明らかなように、本発明は、従来得ることの極めて困難であったＬ−プシコースを、生化学的方法により容易に製造する方法を確立するものである。特に、アルカリゲネス属に属する微生物を用いて、Ｌ−タリトールという糖アルコールを原料としてＬ−プシコースを生産できることを見出だしたことは、Ｌ−プシコースの製造方法にとって、極めて有利である。すなわち、原料となるＬ−タリトールはＤ−タガトースの還元反応によって容易に得られるので大量のＬ−プシコースの生産に有利に利用できる。
【００３２】
従って、本発明の方法は、Ｌ−プシコースの工業的製造方法として好適であり、大量、安価な供給を容易にし、希少糖質としての試薬用途のみならず、従来予想すらできなかった食品工業、医薬品工業、化学工業など広範な工業用途への利用の道を拓くものである。