(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）結合パートナーを使用するＡＧＥの検出または測定のためのアッセイに使用される試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法であって、前記試薬または前記被覆固相成分をＡＧＥ含量について試験し、且つ前記アッセイを実施するために使用されるＡＧＥ結合パートナーと反応しない試薬または被覆固相成分のみを選択することを特徴とする、試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法。
【請求項２】
選択または品質保証がＡＧＥ結合アッセイにおけるシグナル対ノイズ比を計算することにより行われることをさらに特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
固相材料、およびそのコーティングに使用される試薬が前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を含有しないことを特徴とする、ＡＧＥを測定するためのアッセイにおける使用のための、ＡＧＥを含有しない固相成分の製造方法であって、固相材料および試薬をＡＧＥ含量について試験し、且つ前記アッセイを実施するために使用されるＡＧＥ結合パートナーと反応しない固相材料および試薬を選択する工程を含む、固相成分の製造方法。
【請求項４】
該試薬が特異的結合対のメンバーである請求項３記載の固相成分の製造方法であって、以下の工程：
ａ）前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を含有しない特異的結合対のメンバーで固相材料をコーティングする工程、
ｂ）固相成分を洗浄する工程、および
ｃ）ＡＧＥを含有せず、かつ還元性カルボニル基を有しないブロッキング溶液または安定化溶液を添加する工程、
をさらに含む、固相成分の製造方法。
【請求項５】
請求項３または４記載の方法により製造されてなるＡＧＥ非含有固相成分（ただし、前記方法以外の方法により製造されたＡＧＥ非含有固相成分を除く）。
【請求項６】
ＡＧＥ抗原の検出または測定のための特異的結合アッセイにおける、請求項３または４記載の方法に基づいて製造されてなるＡＧＥ非含有固相成分（ただし、前記方法以外の方法により製造されたＡＧＥ非含有固相成分を除く）の使用。
【請求項７】
少なくとも（ａ）ＡＧＥ非含有固相成分、（ｂ）ＡＧＥ抗原含有試薬および（ｃ）ＡＧＥ含有試薬のＡＧＥに結合する結合パートナーを含んでなる、試料におけるＡＧＥの検出または測定のための試験キットであって、（ａ）ＡＧＥ非含有固相成分が請求項３または４記載の方法により製造されてなる（ただし、前記方法以外の方法により製造されたＡＧＥ非含有固相成分を除く）、試験キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を検出および測定する分野に関し、特にＡＧＥアッセイに適した試薬類または被覆固相成分の選択方法および／または品質保証方法に関する。また本発明は、ＡＧＥ非含有固相成分の製造方法、固相成分、および固相成分の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコースなどの還元糖またはカルボニル基は、タンパク質アミノ基と非酵素的に反応して、しばしば蛍光性と架橋性を持つ多様な一連のタンパク質結合部分を形成することが明らかになっている。前進性グリコシル化終末産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔまたはａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔ；「ＡＧＥ」）と呼ばれるこれらの化合物は、老化および特定の疾患（例えば長期糖尿病）におけるタンパク質の構造的および機能的変化に関連づけられている。デノボ合成および組織単離法に基づいて、いくつかのＡＧＥが同定されている。
【０００３】
第一段階では、グルコースおよび他の還元糖がタンパク質のアミノ基に非酵素的かつ濃度依存的に結合する。時間が経つと、これら初期アマドリ付加生成物は、さらなる転位反応、脱水および他のタンパク質基との架橋などといった二次反応を起こして、ＡＧＥと呼ばれる複雑な構造のファミリーとして蓄積することがある。
【０００４】
前進性グリコシル化終末産物の生物学的役割および臨床的意義の解明に向けてかなりの進歩がなされている。これまで老化過程に起因するまたは糖尿病などの疾患の病理学的結果に起因すると考えられてきた状態の多くが、少なくとも部分的には、生体内でのＡＧＥの形成、蓄積および／または活性に起因すると考えられることは、現在では広く一般に受け入れられている知見である。
【０００５】
これらの二次反応はゆっくりと起こるので、タンパク質は、測定可能な量のＡＧＥが生体内に蓄積する前に、かなりの量のアマドリ生成物を蓄積するだろう。これらのＡＧＥは受容体、他のすべての膜構成成分、または酵素活性を修飾しうる。ＡＧＥはタンパク質の架橋を引き起こすことができ、結果として、器官および器官要素の構造的および／または機能的完全性を低下させることにより、最終的には器官機能を低下させまたは損なうだろう。
【０００６】
前進性グリコシル化過程（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）は、糖濃度が比較的高い条件下（例えば真性糖尿病など）で半減期の長いタンパク質（コラーゲンなど）に特に作用するという点で、とりわけ注目に値する。老化および慢性疾患においてタンパク質で起こる構造的および機能的変化にＡＧＥが重要な役割を果たすことは、極めて多くの研究によって示唆されている。
【０００７】
グルコースとタンパク質上の遊離アミノ基との非酵素的反応は、アマドリ生成物として知られる安定なアミノ、１−デオキシケトシル付加生成物を与える。これは、例えばヘモグロビンで起こることが明らかにされている。ヘモグロビンでは、グルコースとの反応によるヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端の転位が付加生成物を形成して、ヘモグロビンＡ1cとして知られる生成物を与える。同様の反応は水晶体クリスタリン、コラーゲンおよび神経タンパク質などの他の様々な身体のタンパク質で起こることも見いだされている（バン（Ｂｕｎｎ，Ｈ．Ｆ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９７５）１０３−９；コーニグ（Ｋｏｅｎｉｇ，Ｒ．Ｊ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９７７）２９９２−７；モニアー（Ｍｏｎｎｉｅｒ）およびセラミ（Ｃｅｒａｍｉ）、「食品および栄養素におけるメイラード反応（Ｍａｉｌｌａｒｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」ワーラー（Ｗａｌｌｅｒ，Ｇ．Ａ．）編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９８３）４３１−４４８；モニアー（Ｍｏｎｎｉｅｒ）およびセラミ（Ｃｅｒａｍｉ）、Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １１（１９８２）４３１−４５２を参照されたい）。
【０００８】
また、前進性グリコシル化終末産物は、糖尿病、ガラクトース血症および他の疾患組織では正常組織よりも迅速に形成されることが注目される。
【０００９】
例えば「酸化ストレス」として知られる条件下で起こるような酸化過程はＡＧＥ形成過程を持続することもわかっている（ナウロス（Ｎａｗｒｏｔｈ，Ｐ．Ｐ．）ら，Ｍｅｄ  Ｋｌｉｎ（１９９９）２９−３８）。
【００１０】
ＡＧＥ「ファミリー」には、化学構造によって単離し特徴づけることができる分子種が含まれ、その一部は極めて安定であり、また一部は不安定もしくは反応性である。前進性グリコシル化過程は還元糖とタンパク質の反応性基との反応によって開始されうる。この過程は典型的には、還元糖と例えばタンパク質上の感受性基との可逆的反応によってシッフ塩基を形成し、それが転位を起こして共有結合型アマドリ転位生成物を与えることによって始まる。アマドリ生成物がひとたび形成されると、それはさらなる非酵素的な転位および反応を経て、ＡＧＥ修飾化合物を与える。
【００１１】
試験管内で製造された特定のＡＧＥ構造またはＡＧＥタンパク質に対して抗ＡＧＥ抗体を開発しようとする初期の試みでは、生体内で形成されたＡＧＥの検出には適さない抗血清が得られる（ナカヤマ（Ｎａｋａｙａｍａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２（１９８９）７４０−７４５；ホリウチ（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１）７３２９−７３３２）。
【００１２】
生体由来のＡＧＥを認識し結合する抗体は国際公開第９３／１３４２１号パンフレットに初めて記載された。これらの抗体は競合イムノアッセイに使用された。方法論の詳細は記載されていない。
【００１３】
米国特許第５，６１０，０７６号明細書には、ＡＧＥ構造を持つヘモグロビン（Ｈｂ−ＡＧＥ）の特異的検出が記載されている。この特許に記載されている改良点は、試料を界面活性剤および／またはカオトロピック試薬で前処理することにある。このような前処理のプラスの効果は、このような前処理を施さなければ抗ＡＧＥ抗体に接近できないであろうＨｂ−ＡＧＥエピトープの露出によって説明されている。競合イムノアッセイの設定ではＢＳＡ−ＡＧＥが抗原として使用され、マイクロタイタープレートの固相に直接コーティングされる。
【００１４】
米国特許第５，６９８，１９７号明細書には、生体内で生成したＡＧＥと反応するモノクローナル抗体（４Ｇ９）が記載されている。一つの態様として、この抗体は、アポ−Ｂ−ＡＧＥ、ＩｇＧ−ＡＧＥ、コラーゲン−ＡＧＥ、血清ＡＧＥペプチド、血清ＡＧＥタンパク質、並びに尿ＡＧＥペプチドおよび尿ＡＧＥタンパク質を検出するためのサンドイッチ型ＥＬＩＳＡに使用されている。これらのＡＧＥサンドイッチアッセイを行うために、モノクローナル抗体４Ｇ９またはその免疫反応性断片は、固相に直接コーティングされる。４Ｇ９を用いる競合イムノアッセイの設定も記載されている。このようなアッセイではＢＳＡ−ＡＧＥが使用され、固相にコーティングされる。
【００１５】
商品として実用的なアッセイには、なかんずく、当該アッセイを使って得られる結果に研究室間でもロット間でも再現性があることが要求される。ＡＧＥアッセイの安全かつ日常的な使用には、輸送および／または貯蔵中の試薬またはキットの安定性も極めて重要な基準である。
【００１６】
試験管内で製造されたＡＧＥと生体内で形成されたＡＧＥとの間で交差反応する適当な（モノクローナル）抗体の作製には著しい進歩があったにもかかわらず、またＡＧＥエピトープを露出させる薬剤の使用が有益であるにもかかわらず、実用的な市販のＡＧＥアッセイを利用できるようにはなっていない。
【００１７】
上述のように、ＡＧＥは、例えば糖尿病または酸化ストレス状態によって起こるような病的過程の顕著な特徴である。したがって、信頼でき再現性のあるルーチンアッセイが至急必要とされている。上記の特許文献などから当該技術分野で知られているＡＧＥアッセイは全て、試験管内で製造されたタンパク質−ＡＧＥ物質の直接コーティングまたは抗ＡＧＥモノクローナル抗体の直接コーティングのいずれかを利用している。多大な努力にもかかわらず、これらの方法に基づいてルーチンアッセイを確立することは、今まで不可能だった。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、従来技術の方法で直面する問題の原因を突き止めて明確にし、それらの問題を克服するのに役立つアプローチを開発し、ＡＧＥの検出法または測定法を改良することを、本発明の目的とした。このような改良は、もちろん、ＡＧＥに対する抗体を検出または定量するためのアッセイにも同様に使用できる。
【００１９】
上記の解決すべき課題は極めて重要であった。というのも、当技術分野では様々な問題が知られており、なかでも、高いロット間変動、高いバックグラウンド反応およびキット安定性は、特に言及されるべき問題だからである。特に、ＡＧＥに関するアッセイに使用される固相成分の安定性は最も複雑で最も重大な問題である。
【００２０】
意外にも、ＡＧＥ結合アッセイに使用される試薬類および／または被覆固相成分ならびにそれらの製造に使用される試薬類は、ＡＧＥで「汚染」されている可能性があることを見いだした。換言すれば、試薬類および／または固相成分は様々な程度にＡＧＥを含有するか、またはＡＧＥの形成につながる構造を含有している。このようなＡＧＥ汚染物質はＡＧＥアッセイに干渉する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、ＡＧＥ結合アッセイに適した試薬類または特に固相成分（これらはＡＧＥを含まないので、ＡＧＥを検出および測定するための改良されたＡＧＥ結合アッセイに使用することができる）を選択するために使用される。
【００２２】
意外にも、本明細書に記載する方法を用いることにより、ＡＧＥ結合アッセイのためのＡＧＥ非含有試薬類および／または固相成分を提供することが可能であることを見いだした。ここに、適切な試薬類および被覆固相成分の選択および／または品質保証が可能となる。
【００２３】
安定なＡＧＥ非含有固相成分の製造方法も提供する。
【００２４】
さらに本発明は、ＡＧＥを検出および測定するための特異的結合アッセイにＡＧＥ非含有固相材料を使用する方法、ならびに少なくともＡＧＥ非含有被覆固相成分とＡＧＥ特異的結合対の少なくとも一方のメンバーとを含んでなるキットに関する。
【００２５】
発明の要旨
本発明は、ＡＧＥ結合アッセイに関して今までに直面してきた課題を解決するための新規方法および技術的アプローチを提供する。ＡＧＥを検出または測定するためのアッセイに使用されるＡＧＥ結合パートナーのＡＧＥ結合を妨害しない適切な試薬類または固相成分の選択および／または品質保証を可能にする方法を開示する。
【００２６】
本発明は、少なくとも１つのＡＧＥ結合パートナーを使用する前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）検出または測定のためのアッセイに使用される試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法であって、前記試薬または前記固相成分をＡＧＥ含量に関して試験し、且つ前記アッセイを実施するために使用されるＡＧＥ結合パートナーとは反応しない試薬または被覆固相成分のみを選択することを特徴とする、試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法に関する。
【００２７】
また、固相成分の製造方法であって、前記固相を製造するために使用される化合物の少なくとも１つが、本発明の選択方法を用いて選択されるＡＧＥ非含有試薬であることを特徴とする方法も開示する。
【００２８】
また本発明は、ＡＧＥを検出および測定するための特異的結合アッセイにＡＧＥ非含有固相材料を用いる方法、ならびに少なくともＡＧＥ非含有固相とＡＧＥ特異的結合対の少なくとも一方のメンバーとを含んでなるキットに関する。
【００２９】
また本発明は、前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を測定するためのアッセイに使用される被覆固相成分であって前記ＡＧＥを含まないものも提供する。これらの固相成分は通常の貯蔵条件下で安定である。
【００３０】
また、ＡＧＥを含有しない、前記ＡＧＥを測定するためのアッセイに使用される固相成分の製造工程であって、ａ）ＡＧＥを含有しない特異的結合対のメンバーで固相材料をコーティングする工程、ｂ）固相成分を洗浄する工程、およびｃ）ＡＧＥを含有せず、かつ還元性カルボニル基を有しないブロッキング溶液または安定化溶液を添加する工程、を含む方法も開示する。
【００３１】
すなわち、本発明は、
〔１〕少なくとも１つの前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）結合パートナーを使用するＡＧＥの検出または測定のためのアッセイに使用される試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法であって、前記試薬または前記被覆固相成分をＡＧＥ含量について試験し、且つ前記アッセイを実施するために使用されるＡＧＥ結合パートナーと反応しない試薬または被覆固相成分のみを選択することを特徴とする、試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法、
〔２〕選択または品質保証がＡＧＥ結合アッセイにおけるシグナル対ノイズ比を計算することにより行われることをさらに特徴とする、前記〔１〕記載の方法、
〔３〕結合アッセイで得られるＡＧＥ特異的シグナルが系のバックグラウンドと比べて少なくとも５倍高いことを特徴とする、前記〔１〕または〔２〕記載の方法、
〔４〕選択または品質保証がＡＧＥ用競合イムノアッセイを用いて行われることをさらに特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の方法、
〔５〕競合型ＡＧＥアッセイにおいて、試薬または被覆固相成分のバックグラウンドシグナルが試験中の特異的なＡＧＥ抗原により有意には低減されえないことを特徴とする前記〔１〕記載の方法、
〔６〕コーティングに使用される試薬が前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を含有しないことを特徴とする、ＡＧＥを測定するためのアッセイにおける使用のための、ＡＧＥを含有しない固相成分の製造方法、
〔７〕ブロッキング溶液または安定化溶液がＡＧＥを含有しないことをさらに特徴とする、前記〔６〕記載の方法、
〔８〕以下の工程：
ａ）前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を含有しない特異的結合対のメンバーで固相材料をコーティングする工程、
ｂ）固相成分を洗浄する工程、および
ｃ）ＡＧＥを含有せず、かつ還元性カルボニル基を有しないブロッキング溶液または安定化溶液を添加する工程、
を含む、ＡＧＥを測定するためのアッセイにおける使用のための、ＡＧＥを含有しない固相成分の製造方法、
〔９〕結合対のメンバーがアビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする前記〔６〕〜〔８〕いずれか記載の方法、
〔１０〕結合対のメンバーが重合されてなることをさらに特徴とする前記〔６〕〜〔９〕いずれか記載の方法、
〔１１〕前記〔６〕〜〔１０〕いずれか記載の方法により製造されてなる固相成分、
〔１２〕ＡＧＥ抗原の検出または測定のための特異的結合アッセイにおける、前記〔６〕〜〔１０〕いずれか記載の方法に基づいて製造されてなるＡＧＥ非含有固相成分の使用、
〔１３〕少なくとも（ａ）ＡＧＥ非含有固相成分、（ｂ）ＡＧＥ抗原含有試薬および（ｃ）ＡＧＥ含有試薬のＡＧＥに結合する結合パートナーを含んでなる、試料におけるＡＧＥの検出または測定のための試験キット、
〔１４〕固相成分がマイクロタイタープレート、アッセイチューブ、試験ストリップおよびアビジンまたはストレプトアビジンで被覆されたアッセイビーズからなる群より選択されることをさらに特徴とする、前記〔１３〕記載の試験キットに関する。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明は、第一の態様として、少なくとも１つのＡＧＥ結合パートナーを使用する前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）検出または測定のためのアッセイに使用される試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法であって、前記試薬または前記固相成分をＡＧＥ含量に関して試験し、前記アッセイを実施するために使用されるＡＧＥ結合パートナーと反応しない試薬または被覆固相成分のみを選択することを特徴とする、試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法に向けられる。
【００３３】
本発明にいう試薬とは、ＡＧＥアッセイで使用される生体分子であって前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）につながる過程を導きうるもの、例えば安定化タンパク質のような緩衝成分、ＡＧＥ結合パートナー、および固相成分を製造するために使用される特異的結合対のメンバーなどである。上述したように、特にタンパク質はＡＧＥを導く過程を起こしやすい。したがって、緩衝成分として使用されるタンパク質、または固相成分を製造する際に固相をコーティングするためもしくは固相の非特異的結合をブロックするために使用されるタンパク質をＡＧＥ汚染物質に関して試験することは、特に好ましい。ＡＧＥを含まない試薬類、または少なくとも本質的にＡＧＥを含まない試薬類を選択し使用する。
【００３４】
「固相材料」という用語は、結合アッセイに通常使用される固相または担体材料を記述するために使用される。これらの材料は、なかんずく、例えばガラス、ラテックスまたはプラスチック材料のような様々なポリマー性を持つマイクロタイタープレート、チューブまたはビーズ、ドライケミストリー装置に使用される膜、および炭水化物や（合成）ポリペプチドのようなポリマー担体材料を含む。
【００３５】
本発明において、「固相成分」という用語は、特異的結合対の少なくとも一方のメンバーでコーティングされた任意の上記固相材料を含むと解釈し、使用することが好ましい。このような固相成分を製造する方法、すなわち特異的結合対のメンバーを担体材料にコーティングし、所望により、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング試薬を追加使用することによって望ましくない非特異的反応をブロックする方法が数多く存在することは、当業者には理解されるだろう。固相成分は、その最終段階では（すなわち顧客に提供される安定な梱包された状態では）被覆固相であると解釈することが、最も好ましい。
【００３６】
「選択」という用語は、製造工程および貯蔵条件が異なるので、信頼のおける形でＡＧＥアッセイを生じるには、試薬類または固相成分の適切なロットを選ぶ必要があることを強調するために使用される。
【００３７】
もちろん、ＡＧＥを含むように製造される試薬類（例えばＡＧＥ抗原物質またはＡＧＥ標準物質）は、本明細書に記載し特許請求する選択方法の対象にはならない。
【００３８】
ＡＧＥを含まないＡＧＥアッセイのための被覆固相成分は、本発明の方法に従って選択されることが好ましい。加えて、反応性カルボニル基も有しない固相成分を選択することが、さらに好ましい。
【００３９】
「品質保証」という用語は、製品（例えば試薬または固相成分）が、例えばＡＧＥ汚染の相対量などに関して評価されることを示すために使用される。
【００４０】
上記の選択方法または品質保証方法は、少なくとも１つのＡＧＥ結合パートナーを使用することに基づいている。典型的なＡＧＥ結合パートナーは、例えば国際公開第９３／１３４２１号パンフレット、米国特許第５，６１０，０７６号明細書または米国特許第５，６９８，１９７号明細書に記載されているようなポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体からなる。
【００４１】
試料中のＡＧＥの評価にはポリクローナルまたはモノクローナル抗ＡＧＥ抗体に基づく特異的結合アッセイを使用し、選択または品質保証方法には同じまたは類似のアッセイ主成分を使用することが好ましい。
【００４２】
上記のように結合アッセイは当業者にはよく知られている。結合アッセイの使用はおよそ３０年前に始まった（エングバール（Ｅｎｇｖａｌｌ  Ｅ．）およびパールマン（Ｐｅｒｌｍａｎｎ  Ｐ．）（１９７１），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，８７１；バン・ウィーメン（ｖａｎ  Ｗｅｅｍｅｎ，Ｂ．Ｋ．）およびシュルス（Ｓｃｈｕｕｒｓ  Ａ．Ｈ．Ｗ．Ｍ．）（１９７１），ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ  １５，２３２）。それ以来著しい進歩があり、特異的結合アッセイを実施する方法とその実用的応用は、当業者の一般的な知識になっている。関連教科書に要約されている方法および手順は参照によって本明細書に組み込まれるが、ここでは数例だけを特に挙げる：ティジセン（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ）著「酵素イムノアッセイの実践と理論（Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）」（１９９０）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（コロビィック（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  Ｓ．Ｐ．）、カプラン（Ｃａｐｌａｎ  Ｎ．Ｏ．）編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）のうち、免疫学的検出法を扱っている様々な巻（例えば第７０、７３、７４、８４、９２および１２１巻など）。
【００４３】
結合アッセイは多くの異なる方法で設定することができる。周知の例は例えば均一系または不均一系の競合アッセイおよびサンドイッチ型アッセイである。多様な検出形式が知られているが、ここでは数例だけ、すなわち酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、（電気）化学発光イムノアッセイ（（Ｅ）ＣＬＩＡ）および比濁法を、特に挙げる。
【００４４】
免疫学的結合対の少なくとも一方のメンバーを含む結合アッセイが最も好ましい。好ましい態様では、前記結合対がＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体とからなる。化学的に定義づけられたＡＧＥ構造とそれに対する抗体は特に好ましい。ＡＧＥ決定のための固相結合アッセイには、ＡＧＥ結合対の一方のパートナーを固相に直接的または間接的に結合させる必要がある。
【００４５】
ＡＧＥ特異的結合対の一方のメンバーを固相に直接的または間接的に結合するには、抗原／抗体もしくはハプテン／抗体系の使用、またはアビジン／ビオチンもしくはストレプトアビジン／ビオチン系の使用が好ましい。最も好ましくは、ストレプトアビジン／ビオチン系を使用する。好ましい態様では、固相成分が、ＡＧＥ非依存的ハプテン様結合対のメンバーとしてアビジンまたはストレプトアビジンを含む。また、前記固相成分を、検査対象であるＡＧＥ構造を含むビオチン化物質と組み合わせて使用することも好ましい。
【００４６】
抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、例えばファージディスプレイ法またはコンビナトリアルケミストリーの方法などによって得られる抗体様結合パートナー、およびそれらの免疫反応性変異体または断片を含むと解釈されるものとする。
【００４７】
標準的な手順によれば、ＡＧＥ結合アッセイでは、例えば試験管内で「ＡＧＥ化」したタンパク質に対して産生させたポリクローナル抗体を用いることなどにより、様々なＡＧＥ構造が検出されように構成され得る。好ましくは、１つまたは極めて少数の（好ましくは化学的に特徴づけられた）ＡＧＥ構造だけが特異的に検出されるように、ＡＧＥアッセイを設定する。このようなアッセイでは、少なくとも１つの十分に特徴づけられた成分をＡＧＥ抗原系に利用することが好ましい。好ましくは、ＡＧＥ構造を化学的に特徴づけるか、または使用する抗体を単一特異性抗体もしくはモノクローナル抗体とするかのいずれかである。
【００４８】
当該技術分野で知られている課題を検討した。様々なタイプの固相成分を解析したところ、標準的手順で得られる被覆固相または異なる販売元から得られる被覆固相は、ＡＧＥアッセイでは、かなり高くて一定でないバックグラウンドシグナルを生じることを見いだした。
【００４９】
例えばバックグラウンド問題を低減させるなどの目的で、イムノアッセイを改良するために一般に使用される多種多様な標準的アプローチ（例えば緩衝条件の変更、ビオチン化ＡＧＥ抗原と抗ＡＧＥ抗体の両方の化学量論の変更など）を適用した。これらの定型的な方法はいずれも、検討したＡＧＥアッセイではうまくいかず、高くて一定でないバックグラウンド反応は解消されなかった。
【００５０】
最後に、このバックグラウンド問題が、当該アッセイに使用される固相成分上のＡＧＥ構造に起因する可能性がないかどうかを検討した。固相成分のＡＧＥ汚染について試験するために、基本的に以下の３つのアッセイ成分を用いて競合実験を設定した：ストレプトアビジン被覆固相、合成ＡＧＥ抗原およびＡＧＥ特異的抗体。
【００５１】
これらの実験により、意外にも、固相成分そのものが、ＡＧＥ構造または「ＡＧＥ汚染物質」を様々な程度に含有していることが裏付けられた。この意外な知見は本発明への手がかりになった。適当な物質または被覆固相成分の選択を可能にする方法が、ここに開発された。以下に詳述するように、本質的にＡＧＥを含有しない固相成分の製造方法を確立することも可能になった。好ましくは、本固相成分は、使用されるＡＧＥ結合パートナーとは反応しない。キット成分の製造に使用される緩衝液などの試薬類または固相成分が、時間が経つにつれて（妨害物質となる）ＡＧＥの形成を引き起こすであろう還元性カルボニル基を有しないように選択することも好ましい。
【００５２】
極めて多種多様なＡＧＥ構造が知られているので、適切な試薬または固相成分の選択は、ＡＧＥを検出および測定するためのアッセイで使用されるＡＧＥ特異的結合パートナーと同じＡＧＥ特異的結合パートナーの使用に基づくことが好ましい。上述のように、ＡＧＥのアッセイに使用されるＡＧＥ結合パートナーとは反応しない試薬または固相成分を選択する。
【００５３】
例えば、被覆固相成分などに含まれる低レベルの上記ＡＧＥ汚染物質は許容できる。そのような物質も、当該汚染がアッセイの結果に有意な影響を及ぼさない限り、本質的には反応しないという。許容できるレベルは、使用するＡＧＥ結合対および要求されるアッセイ系の感度に依存して変動する。「反応しない」という用語は、本発明の方法または本発明の方法と等価な方法および手順を用いた場合に、ＡＧＥ含量が見いだされなかったか、少なくとも本質的には見いだされなかったか、または許容できる程度に低いＡＧＥ含量（別の用語でＡＧＥ汚染）が見いだされたことを述べるために使用される。ＡＧＥ汚染は存在しないか、または本質的にＡＧＥ汚染は存在しないことが好ましい。選択した物質中または固相成分中にはＡＧＥは存在しないことが最も好ましい。
【００５４】
本明細書に記載し実施例の項に例示する方法および手順は、改良された（例えば市販の）ＡＧＥアッセイでの使用に適した試薬類または被覆固相成分の製造、選択および品質保証を可能にする。これらのＡＧＥアッセイは、特に研究室間の変動、ロット間の変動および長期安定性に関して、必須条件を満たす。試薬類および／または被覆固相成分のＡＧＥ含量を評価するには様々な方法および技術を設計することができるが、少なくとも１つのＡＧＥ結合パートナーを使用する前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）検出または測定のためのアッセイに使用される試薬または被覆固相成分の選択および／または品質保証の方法であって、前記試薬または前記固相成分をＡＧＥ含量に関して試験し、前記アッセイを実施するために使用されるＡＧＥ結合パートナーとは本質的に反応しない試薬または被覆固相成分だけを選択することを特徴とする方法を使用することが好ましい。
【００５５】
ほとんどの結合アッセイの品質、特に感度がシグナル対ノイズ比に大きく依存することは、よく知られている。言い換えると、特異的シグナルが高く、系のバックグラウンドが低いほど、良いアッセイになる。
【００５６】
好ましい態様として、本発明の選択方法および品質保証方法は、当該選択または当該品質保証が、ＡＧＥ結合アッセイにおけるシグナル対ノイズ比を解析し、計算することによってなされることを特徴とする。
【００５７】
ＡＧＥ特異的シグナル（＝陽性シグナル）の測定は、ＡＧＥ抗原およびＡＧＥ結合パートナーを市販品が意図する方法または当該市販品に推奨される方法と同じ方法で用いることによって実施される。系のバックグラウンドは、全ての必須アッセイ工程を同じ方法で、ただし一次ＡＧＥ結合対メンバーを省略して実施することによって決定される。
【００５８】
サンドイッチ型アッセイの場合、陽性シグナルは、例えば一次抗ＡＧＥ抗体、ＡＧＥ抗原または標準物質（すなわちＡＧＥ担持分子）と二次ＡＧＥ抗体との間で形成される免疫学的サンドイッチ（これらの抗体の一方は直接的または間接的に検出可能であるか標識される）から測定される。陽性シグナルは、説明書に従ってアッセイを行った場合に、対応する市販品の最も高度の標準物質を使って得られる結果と定義される。標準物質がアッセイと共に提供されない場合は、陽性シグナルを評価するために使用するＡＧＥ濃度を、意図するまたは所定の測定範囲の上限と一致するように選択する。系のバックグラウンドに関する値は、同じ試薬を使用し、ＡＧＥ抗原を除くことによって得られる。サンドイッチアッセイにおける捕捉抗体は好ましくはビオチン化し、アビジンまたはストレプトアビジンマトリックスを含む固相成分に間接的に結合させる。
【００５９】
競合アッセイ型式の場合、ＡＧＥ抗原は固相成分に間接的に結合させることが好ましい。最も好ましくは、ＡＧＥ抗原をビオチン化し、アビジンまたはストレプトアビジンを含む固相に間接的に結合させる。このような競合アッセイ型式の場合、バックグラウンドシグナルは、間接的に結合するＡＧＥ抗原を添加せず、競合する抗原を何も添加しないで、ＡＧＥ結合試薬（例えばペルオキシダーゼ標識抗ＡＧＥ抗体）をアッセイの説明書に従って使用することによって得られる。系のバックグラウンドはこのようにして決定される。陽性シグナルは間接的に結合する（例えばビオチン化）抗原を使用し、競合する抗原を使用しない（例えば０−検定物質を試料として使用する）ことによって得られる。このような競合アッセイにおけるシグナル対ノイズ比は、系の陽性シグナルをバックグラウンドシグナルで割ることによって計算される。そのような計算の一例は実施例２に見ることができる。
【００６０】
上記結合アッセイで得られるＡＧＥ特異的陽性シグナルは系のバックグラウンドと比較して少なくとも５倍は高いこと、すなわちシグナル対ノイズ比は少なくとも５であることが、さらに好ましい。
【００６１】
ＡＧＥ結合アッセイにおけるＡＧＥ特異的シグナルは系のバックグラウンドと比較して少なくとも１０倍は高いことが、より一層好ましい。
【００６２】
適切な品質の被覆固相成分を選択するには、間接競合ＡＧＥアッセイを使用することが最も好ましい。
【００６３】
シグナル対ノイズ比は、適切な試薬を選択するため、また特に、適切な被覆固相成分を選択するための一方法である。さらにまた、異なるタイプの競合実験によって、ＡＧＥ汚染を確認することが可能であることもわかった。
【００６４】
抗ＡＧＥ抗体を使用したところ、一部の試薬類および従来技術の被覆固相成分は、これらの抗体と反応することがわかった。また、検査対象であるＡＧＥ構造を含有することがわかっている試薬を使用することにより、必須試薬類または固相成分に見られるバックグラウンドシグナルの少なくとも一部を競合除去できることも見いだされた。これらの知見から、上記の必須試薬類または被覆固相は検査対象であるＡＧＥ構造と同じか少なくとも類似するＡＧＥ構造を持つらしいことがわかる。これは、試験したかなり多くの必須試薬類および／または固相成分にＡＧＥ汚染物質が存在することを示す明快な証拠である。
【００６５】
極めて意外なことに、ＡＧＥ汚染物質がＡＧＥアッセイに関する問題の主原因であることを確認するために使用した実験と類似する競合型実験が、材料もしくは被覆固相成分を選択し、またはその品質を保証するのに、極めて有用であることがわかった。
【００６６】
好ましくは、本方法は、競合型ＡＧＥアッセイにおいて、試薬または被覆固相成分のバックグラウンドシグナルが、検査対象である特異的ＡＧＥ抗原によって有意に低下しえないことを特徴とする。この方法では、アッセイと共に用意される標準物質に含まれるものと同じＡＧＥ抗原および同じ抗体を使用する。
【００６７】
検査すべき試薬を、被覆固相成分を製造するのに使用するものと同じ固相材料にコーティングする。このコーティングは定型的な手順による直接吸着で行われる。適切な試薬ロットまたは適切な固相成分を選択するために、競合ＡＧＥアッセイを行うのに必要なアッセイ工程を実施する。ただしＡＧＥ抗原による間接的コーティングは施さない。その代わりに、被覆固相成分または試験対象試薬でコーティングされた固相材料を直接使用して、ＡＧＥ標準物質の競合能力を調べる。
【００６８】
好ましい態様として、ＡＧＥアッセイに供給される標準物質の最高濃度、またはこの必須材料または被覆固相を使用しようとする測定範囲の最高点に相当するＡＧＥ濃度は、このような競合型ＡＧＥ抗体アッセイにおけるバックグラウンドを有意に低下させない。
【００６９】
１０００ｍＥ（ミリ吸光度単位）の範囲の陽性シグナルを持つＥＬＩＳＡアッセイの場合、最も高濃度のＡＧＥ検定物質によるバックグラウンドの低下は、≦１００ｍＥであることが好ましい。
【００７０】
したがって、≧１０００ｍＥの陽性シグナルを持つＥＬＩＳＡ法において、提供される最高濃度の標準物質に含まれる分析対象ＡＧＥ抗原または要求される測定範囲の最高点に相当する分析対象ＡＧＥ抗原によって競合除去されうる総バックグラウンドシグナルが１００ｍＥ未満、より好ましくは５０ｍＥ未満であることを特徴とする試薬類または固相成分を選択することが、さらに好ましい。
【００７１】
より一般的には、間接競合型ＡＧＥアッセイにおいて競合抗原を何も使用しないで得られる総陽性シグナルのうち、固相のＡＧＥ汚染によるものが１０％未満、より好ましくは５％未満であるような被覆固相成分を選択する。このような汚染は、好ましくは上記競合型アッセイにより、バックグラウンドシグナルの低下として測定される。
【００７２】
本発明は、さらなる試薬品質評価方法を提供する。この方法では、上記のＡＧＥアッセイ（上記または実施例４参照）を使用する。臨界試薬の標本を、試料と同様に評価する。試薬を５０μｇ／ｍｌに希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、記載のようにアッセイする。好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満（すなわち５０μｇあたり１０ｎｇ未満）のＡＧＥを含有する試薬を選択する。最も好ましくはＡＧＥを含まない、すなわち検出できるレベルのＡＧＥを含有しない試薬を選択する。
【００７３】
結合アッセイ、特にイムノアッセイにおける固相成分は、通常、特異的結合対のメンバーを固相にコーティングすることによって製造される。このコーティングは技術文献に記載の標準的手順に従って行われる。一般的には、特異的結合対のメンバーをコーティングする固相を１〜５回洗浄する。しかし所望により、このような洗浄工程は省略してもよい。ほとんどの場合、ブロッキング試薬および／または安定化試薬によって付着性部位をブロックするためおよび／またはコーティングした結合対メンバーを安定化するために、補助試薬を使用することが極めて有益であることは、当該技術分野ではよく知られている。例えばＢＳＡ、カゼイン、デキストラン、糖類および／または界面活性剤などがよく使用される。通常は、所望する効果の両方をカバーする１つの試薬溶液が使用される。
【００７４】
本発明が提供する手近な方法を用いることにより、ＡＧＥ結合アッセイの設定に際して最も適切な試薬類を選択することが可能になることは明らかである。被覆固相成分の製造に使用される試薬類の少なくとも１つが、本発明の方法に従って選択されたＡＧＥ非含有試薬であることは、本発明の好ましい態様である。固相にコーティングする特異的結合対のメンバーがＡＧＥを含まないことは、特に好ましい。
【００７５】
コーティングに使用される試薬類が前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を含有しないことを特徴とする、該ＡＧＥ測定のためのアッセイにおける使用のための、ＡＧＥを含有しない固相成分の製造方法が好ましい。
【００７６】
コーティングに使用される試薬類は、被覆固相成分の品質にとって極めて重要である。しかし、非特異的結合を防ぐために使用されるポストコーティング溶液（これは例えば既に固相にコーティングされている特異的結合対のメンバーなどを安定化する成分を含んでいてもよい）に含まれる試薬類もＡＧＥを含有しないべきである。したがって、ブロッキング溶液または安定化溶液は、ＡＧＥを含有しないことが好ましい。
【００７７】
また、試薬溶液、特にＡＧＥアッセイの固相成分を製造するために使用される試薬溶液には、糖または還元性カルボニル基を含む物質を避けることが有利であることもわかった。また、例えば、インキュベーション緩衝液のようなキットに含まれる試薬組成物も糖類を含まないことが好ましい。したがって、さらに好ましい態様として、固相成分は糖類非含有試薬溶液を使って製造される。特に、該固相成分をブロックおよび／または安定化する手段として使用される試薬類には、糖類または他の反応性カルボニル分子種でないものを選択する。糖類非含有とは非妨害的糖類濃度を指すと解釈されるものとする。糖類濃度は０．１％未満であるか、または試薬類は還元糖を本質的に含まないことが好ましい。
【００７８】
一般に、還元性カルボニル基、特に糖分子のカルボニル官能基、またはグリオキサールまたはメチルグリオキサールのような化学的反応性がより一層高い分子のカルボニル基は、例えばインキュベーション緩衝液などの試薬組成物の製造において、また特に、ＡＧＥアッセイのための被覆固相成分の製造において、重大な意味を持つことがわかった。
【００７９】
試薬類および固相成分は、定型的な検出手段により、還元性カルボニル官能基に関して容易に試験できる。還元性カルボニルの最も便利な検出はＰｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７９）１８０３−１８１４に記載のオキシム反応によって、または感度がさらに高い酵素法によって行われる。好ましくは、検出可能なレベルの還元糖を含有しない試薬または固相成分を選択する。最も好ましくは、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼを使用し、ＮＡＤＨを基質として、試薬または被覆固相成分を還元性カルボニル基について試験する。定型的な手順に従ってＮＡＤＨの変化を測定し、還元性カルボニル基の量に相関させる。マイクロタイターウェルの場合は、反応生成物を適当なＵＶキュベットに移して測定する。
【００８０】
ＡＧＥ非含有固相の製造方法では、好ましくは、少なくとも、還元性カルボニル基を含まない安定化またはブロッキング溶液を利用する。
【００８１】
また、特異的結合対のメンバーを固相にコーティングするために使用する試薬類および溶液類も、還元性カルボニル基を含まないことが好ましい。
【００８２】
もちろん、ＡＧＥに関する試験とカルボニル基に関する試験を組み合わせた方法も、本発明の範囲に包含される。このような方法では、例えば臨界物質（コーティングすべき結合対メンバーの標本など）をＡＧＥ汚染に関して試験し、ポストコーティング（＝ブロッキングまたは安定化）試薬をカルボニル基に関して試験する。試薬類と固相成分をＡＧＥ含量とカルボニル含量の両方に関して試験することも考えられる。
【００８３】
被覆固相成分の好ましい品質保証方法は、ＡＧＥ汚染に関する試験と還元性カルボニル基の存在に関する試験の両方を含む。
【００８４】
本発明のさらなる好ましい態様は、前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）を含有しない、該ＡＧＥ測定のためのアッセイに使用される固相成分の製造方法であって、
ａ）ＡＧＥを含有しない特異的結合対のメンバーで固相材料をコーティングする工程、
ｂ）固相成分を洗浄する工程、および
ｃ）ＡＧＥを含有せず、かつ還元性カルボニル基を有しないブロッキング溶液または安定化溶液を添加する工程、
を含む方法である。
【００８５】
もう一つの好ましい方法では、ＡＧＥを含有せず、かつ還元性カルボニル基を有しない結合対のメンバーと、還元性カルボニル基を有しないポストコーティング溶液とを使用する。
【００８６】
結合対のメンバーがアビジンまたはストレプトアビジンである方法はさらに好ましい。
【００８７】
最も好ましくは、アビジンまたはストレプトアビジンを、欧州特許第３３１  １２７号明細書に記載されているように重合させる。
【００８８】
上記の方法によって製造される被覆固相成分は本発明の好ましい態様を表す。
【００８９】
当該技術分野で知られている手順に従って製造される固相成分に関して、それをＡＧＥ結合アッセイに使用すると、大きな問題が生じていた。これらの問題は下記実施例で実証するように、今や克服され、ＡＧＥ汚染物質を含まない固相成分を提供することができるようになった。
【００９０】
負荷安定性試験は被覆固相成分の品質を保証する独立した一方法であり、本発明によるもう１つの方法を表す。上記の方法に従って製造される固相成分は通常の貯蔵条件で極めて安定であることがわかった。例えば、上記固相成分は４℃で１２ヶ月間保存することができる。また、上記固相成分は３７℃の負荷貯蔵条件でも３週間にわたって安定である。貯蔵中に妨害物質となるＡＧＥ構造は形成されない。
【００９１】
したがって、ＡＧＥアッセイのための安定な被覆固相成分は、本発明のさらなる好ましい態様を表す。
【００９２】
本発明に従って製造されたＡＧＥ非含有固相成分を、ＡＧＥ抗原を検出または測定するための特異的結合アッセイに使用することも、さらに好ましい態様である。
【００９３】
ＡＧＥ結合アッセイはＡＧＥ構造に結合することができる任意の結合パートナーに基づいてもよい。そのような結合パートナーは、例えば、国際公開第９５／２９６９２号パンフレットなどに記載されているＡＧＥ結合能を持つ受容体であってよい。しかし、ＡＧＥ結合アッセイには免疫学的結合パートナーを使用することが好ましい。好ましい態様では、ＡＧＥ抗原を検出または測定するための特異的結合アッセイに、ＡＧＥ非含有固相成分を使用する。
【００９４】
本発明のさらなる実施形態として、医学、臨床または研究実務用の市販の試験キットを調製することができる。上述したアッセイ技術に従って、そのようなキットは、少なくともＡＧＥ非含有固相成分と、ＡＧＥ結合対の少なくとも一方のメンバーとを含むだろう。好ましい実施形態は、少なくとも（ａ）本質的にＡＧＥを含まない固相成分、（ｂ）ＡＧＥ抗原含有試薬、および（ｃ）ＡＧＥ含有試薬のＡＧＥに結合する結合パートナーを含んでなる、試料中のＡＧＥを検出または測定するための試験キットである。このようなキットは、標準物質または陽性対照の形でＡＧＥ構造を含んでもよい。本発明のキットは、緩衝液、安定化剤、酵素基質などといった「周辺」試薬類を、さらに含んでもよい。
【００９５】
好ましい実施形態では、上記の試験キットに使用される固相成分がマイクロタイタープレート（またはストリップから構成されるマイクロタイタープレート）である。好ましくは、このようなマイクロタイタープレートをストレプトアビジンでコーティングし、ＡＧＥ結合対の一方のパートナーをビオチン化した形で使用する。
【００９６】
さらに好ましい実施形態における本発明の試験キットは、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート、アッセイチューブ、試験ストリップおよびアッセイビーズからなる群より選択される固相成分を含む。好ましくは、この固相材料は、重合ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートであるか、または微粒子、特に磁気微粒子からなる。
【００９７】
【実施例】
以下の実施例、参考文献および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その本来の範囲は、添付の請求項に示される。本発明の意図を逸脱することなく改変が成されうることが理解される。
【００９８】
実施例１
間接競合ＡＧＥアッセイ用のマイクロタイタープレート（またはストリップ）のウェルのコーティング
全ての実験に、マイクロタイターＦ８ストリップＭａｘｉｓｏｒｐ品質（Ｎｕｎｃ  ＧｍｂＨ、ドイツ・ウィースバーデン）を、固相材料として使用した。
品質１：ストレプトアビジン被覆ストリップ、標準品質、ロシュ製品番号１３０２５４０
品質２：ストレプトアビジン被覆ストリップ、高結合品質、ロシュ製品番号１９６５９０５
品質３および４：コーティングはＴＲＳＡ−Ｂｉ（＝ビオチン化型熱処理ウシ血清アルブミン）および（欧州特許第０  ３３１  １２７号明細書に記載の）均一に架橋されたストレプトアビジンを使って行った。室温で１８時間後に、ウェルを空にして、ポストコーティング溶液：品質３にはデキストランＴ４０  １０ｇ／ｌ（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）、品質４には同じ緩衝液中のデキストランＴ４０  １０ｇ／ｌ＋ＢＳＡ（３ｇ／ｌ）を再び充填した。３０分後に、プレートを完全に空にして、２５℃、相対湿度５％で３時間乾燥し、気密性バッグに密封し、４〜８℃で保存した。
【００９９】
品質５：
１．コーティング
欧州特許第０  ３３１  １２７号明細書に記載されているように製造した重合ストレプトアビジン（＝ＳＡ−ポリ）３０ｍｇを１リットルの４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解する。高い結合容量を持つポリスチロール製マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標））のウェルを、この溶液３００μｌで満たし、室温で１８時間インキュベートした後、溶液を除去する。
【０１００】
Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｍａｋｒｏｌｏｎ  ６００またはＣｏｓｔａｒ高結合固相材料も試験し、同様に機能することがわかった。
【０１０１】
２．洗浄
全てのウェルを、０．００２５％（ｗ／ｖ）Ｔｈｅｓｉｔ（Ｗ．Ｋｏｌｂ  ＡＧ、スイス・ヘディンゲン；「Ｓｙｍｐａｔｅｎｓ−ＡＬ／０９０  Ｐ」）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）３００μｌで満たし、室温で１時間インキュベートする。プレートを空にして、洗浄操作をもう１度繰り返す。
【０１０２】
３．ポストコーティング
全てのウェルに、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中３ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ロシュ・ダイアグノスティクス・ゲーエムベーハー、製品番号１  ７２６  ５３６）３００μｌを充填し、室温で１時間インキュベートする。溶液を吸引除去する。
【０１０３】
４．乾燥
プレートを２５℃、相対湿度５％の気候室で４時間乾燥する。次に、プレートを気密性カバーに密封し、４〜８℃で保存する。
【０１０４】
【表１】
0003646097.tif 000002
【０１０５】
実施例２
ＡＧＥ−ＣＭＬ測定
１．ＡＧＥ修飾ウシ血清アルブミンの製造およびビオチン化
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、製品番号１２６５７）をインビトロで前進性グリコシル化にかけた。この目的を達するために、ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｌ；５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、２０μｍｏｌ／ｌ硫酸銅、ｐＨ７．４中）をＤ−グルコース（０．５ｍｏｌ／ｌ）の存在下に３５℃で３週間インキュベートした。５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、１００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して十分に透析することにより、Ｄ−グルコースを除去した。
【０１０６】
ＢＳＡ−ＡＧＥのビオチン化は、１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液、１００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）中で、Ｄ−ビオチノイル−［ε］−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを１０：１のチャレンジ比で使用することによって行った。９０分後にリジン一塩化物を最終濃度が１０ｍＭになるように添加することによって反応を停止した。５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析することによって、過剰のラベルを除去した。このビオチン化生成物を「Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ」と呼ぶ。
【０１０７】
２．ＥＬＩＳＡ法で使用する試薬類および溶液類
２．１．インキュベーション緩衝液：ロシュＦＭアッセイ（製品番号５６５４４０）のインキュベーション緩衝液を使用する。
２．２．Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ：このビオチン化ＡＧＥ抗原はインキュベーション緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈する。
２．３．標準物質：６−（Ｎ−カルボキシメチルアミノ）カプロン酸（＝ＣＭＬ）二ナトリウム塩（分子量２３３）を標準物質として使用する。インキュベーション緩衝液中に０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌの溶液を調製する。（０ＣＭＬの溶液は０−検定物質ともいう）。
２．４．コンジュゲート：西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したモノクローナル抗ＣＭＬ、クローン４Ｇ９をインキュベーション緩衝液で９０ｍＵ／ｍｌに希釈する。
２．５．洗浄媒体：１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｎ−メチルイソチアゾロン、０．０１％（ｗ／ｖ）２−クロロアセトアミド、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含む溶液（ｐＨ７．４）を洗浄緩衝液として使用する。
２．６．基質：２，２’−アジノ−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（６）］（ロシュ・バイオケミカルズ、製品番号１６８４３０２）を基質として使用する。
２．７．マイクロタイター「プレート」：実施例１に従って製造したＳＡ被覆固相成分１〜５。
【０１０８】
３．ＥＬＩＳＡ手順
３．１．Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ（溶液２．２）の結合：１００μｌ／ウェルを加え、室温で振とうしながら１時間インキュベートする。
３．２．洗浄媒体（１ウェルにつき３００μｌの溶液１．５）で３回洗浄。特に最後の洗浄操作後は、残っている液体を全て除去するために、プレートを吸い取り紙の上で十分に（逆さまにして）タッピングする。
３．３．試料とコンジュゲートの同時インキュベーション：
アッセイは二重決定を用いて行う。１ウェルにつき５０μｌの未知試料、標準物質または対照試料をそれぞれピペッティングした後、直ちに１ウェルにつき５０μｌのコンジュゲート（溶液２．４）を加え、その混合物を室温で振とうしながら１時間インキュベートする。
３．４．上記のように３回洗浄。
３．５．基質インキュベーション：１ウェルにつき１００μｌの基質（溶液２．６）を加え、室温で振とうしながら１５〜３０分間インキュベートする。
３．６．マイクロタイター光度計を使って４０５ｎｍの吸光度を測定する。二重または多重決定の平均値を計算し、試料のＣＭＬ含有量を検量線から読みとる。結果を表２および３に記載する。
【０１０９】
【表２】
0003646097.tif 000003
【０１１０】
【表３】
0003646097.tif 000004
【０１１１】
表２から明らかなように、ＣＭＬはモノクローナル抗体４Ｇ９の結合部位に関してＢｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥと競合することができる。
【０１１２】
しかし、様々な品質のストレプトアビジン被覆プレートにおけるバックグラウンドシグナルおよび競合を比較すると、顕著な相違がみとめられる。表３に、ビオチン化ウシ血清アルブミン−ＡＧＥを添加しなかった場合の吸光度値を示す。従来技術の方法で製造されるプレートには、様々な高レベルのバックグラウンド活性が見いだされる。このバックグラウンド反応性は、ＣＭＬの添加によって効果的に競合除去することができる。このことは品質１〜４で提供される固相成分がＡＧＥ構造で汚染されていることを意味している。
【０１１３】
新規材料（表２および３の５番）の著しい利点は、Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを添加しない場合とＢｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを添加する場合の０−検定物質の値を比較することによって得られるシグナル対ノイズ比から明らかになる。上記の実験における新規固相品質は６０というシグナル対ノイズ比をもたらすことがわかったのに対し、当技術分野で知られる他の例は１．５〜３．２のシグナル対ノイズ比しか示さない。
【０１１４】
実施例３
新規ストレプトアビジン被覆固相成分の安定性
それぞれ４〜８℃、室温または３７℃で３週間保っておいた品質５のマイクロタイターウェルをＡＧＥ−ＣＭＬアッセイで比較した。特異的シグナルはＢｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを用いて測定し、非特異的シグナルはビオチン化抗原の代わりに緩衝液だけを用いて検出した。
【０１１５】
【表４】
0003646097.tif 000005
【０１１６】
Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを用いた総競合率は同程度、すなわち示された２種類の貯蔵条件後に、それぞれ６１％または６２％だった。４℃で保存したプレートでも同様の結果を得た。
【０１１７】
表４からわかるように、非特異的シグナル（Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥなし）は３７℃で３週間の負荷貯蔵中にわずかに上昇したが、決定的なバックグラウンド値には達しなかった。当該技術分野で知られる他の被覆固相成分１〜４で観察された高いバックグラウンド値（実施例１および２参照）は、この負荷被覆固相成分と比較した場合でさえ、著しく異なっている。シグナル／ノイズ比は、当該技術分野で知られる材料が約１．５〜３．２であるのに対して、負荷貯蔵後でもなお１７であることがわかった。
【０１１８】
３７℃で３週間という貯蔵「負荷」条件での安定性は、４℃で少なくとも１２ヶ月間の貯蔵条件に等しいことが知られている。換言すると、新規固相材料は、３７℃で３週間の長期貯蔵（４℃での長期間貯蔵に相当）後でさえ、標準的手順に従って製造される固相材料として根本的に優れている（実施例２の固相成分１〜４参照）。新規固相成分は、長期貯蔵後または負荷条件での貯蔵後でさえ、≧１０のシグナル対ノイズ比を示すことも特徴とする。
【０１１９】
実施例４：臨床試料中のＣＭＬ−ＡＧＥの測定
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートのウェルをＢｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ（濃度はインキュベーション緩衝液中１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートする。１００μｌ／ウェルを室温で１時間インキュベートする。全てのウェルを３００μｌの洗浄溶液で３回洗浄することにより未結合のＢｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを除去する。
【０１２０】
試料とペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体とを同時インキュベートする。各ウェルに、プロテイナーゼＫで前処理した試料または標準物質５０μｌを加えた後、実施例２で述べたように調製したコンジュゲート溶液５０μｌを直ちに加える。この混合物を室温で１時間インキュベートする。上述のように洗浄することによって未結合の試薬を除去する。
【０１２１】
プロテイナーゼＫは広範囲の濃度およびインキュベーション時間にわたって作用する。使用する試料のタンパク質含量に合致するようにプロテイナーゼＫ前処理の条件を調節することによって最適な結果が得られる。
【０１２２】
試料がＣＳＦである場合は、６０μｌの試料を５μｌのプロテイナーゼＫ溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートすることによって、プロテイナーゼＫ前処理を行う。試薬類を混合し３７℃で３時間インキュベートする。プロテイナーゼＫ活性を阻害するために、６５μｌのＰＭＳＦを加え（最終濃度１ｍＭ）、その試薬混合物をさらに３０〜６０分間インキュベートする。これにより、前処理済ＣＳＦ試料は、ＡＧＥ−ＣＭＬ測定を行える状態になる。
【０１２３】
血清を試料として使用する場合は、１０μｌの試料を１００μｌのプロテイナーゼＫ溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートすることによって、プロテイナーゼＫ前処理を行う。試薬類を混合し３７℃で３時間インキュベートする。プロテイナーゼＫ活性を阻害するために、１００μｌのＰＭＳＦを加え（最終濃度１ｍＭ）、その試薬混合物をさらに３０〜６０分間インキュベートする。その後、前処理済血清試料は、ＡＧＥ−ＣＭＬ決定を行える状態になる。
【０１２４】
結合したペルオキシダーゼは、標準的な基質反応によって検出される。各ウェルに１００μｌの基質溶液を加え、室温で約３０分間インキュベートする。ペルオキシダーゼ活性は波長４０５ｎｍでの基質の変化によって測定される。
【０１２５】
どのインキュベーション工程でも、プレート振とう機を使って、マイクロタイタープレートのウェル中の反応混合物を穏やかに動かす。
【０１２６】
試料中のＡＧＥ−ＣＭＬ濃度測定値は、標準的手順に従って標準曲線から推定する。
【０１２７】
８人の健康な対照者と、糖尿病性腎合併症のために透析を受けている８人の患者から採取した血清試料を、本発明に従って製造されたマイクロタイタープレートを用いて測定した。結果を表５に要約し、図１に図示する。糖尿病患者では、はるかに高いレベルのＡＧＥ−ＣＭＬが測定されることがわかる。
【０１２８】
【表５】
0003646097.tif 000006
【０１２９】
参考文献のリスト
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欧州特許第０  ３３１  １２７号明細書
米国特許第５，６１０，０７６号明細書
米国特許第５，６９８，１９７号明細書
国際公開第９３／１３４２１号パンフレット
国際公開第９５／２９６９２号パンフレット
【０１３０】
【発明の効果】
本発明により、高いロット間変動、高いバックグラウンド反応およびキット安定性に優れ、特に固相成分の安定性に優れたＡＧＥの検出法または測定法を得ることができるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、臨床試料中のＡＧＥ−ＣＭＬを示す。詳しくは、健康なボランティアおよび透析処置を受けている患者から採取した試料中のＣＭＬ−ＡＧＥの値（ＡＧＥ非含有固相成分を用いて測定）を示す。
【図１】
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