(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光による生物学的流体の細胞成分の確認及び計数方法であって、
細胞成分を有する生物学的流体の試料を取得するステップと、
蛍光性複合体を生成するため、試料を、細胞成分に存在する結合部位に向けられる過剰量の蛍光標識した結合剤と反応させるステップと、
試料を、特定した寸法および長手方向軸を有する細管内に仕込むステップと、
蛍光性複合体を励起するよう選択された波長を有する光の入射ビームであって、複数のカラム状領域を照すため、特定した直径の複数のビームスポットとして細管と逐次交差する入射ビームを用いて、試料を光学的に走査するステップと、
各カラム状領域の内部深さ寸法に限られた放射された蛍光を逐次検知するステップと、
高くなった蛍光強度の各カラム状領域から、放射された蛍光を記録するステップと、
放射された蛍光から試料の細胞成分の計数をするステップとを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試料を蛍光標識した結合剤と反応させるステップの後に、かつ前記試料を細管に仕込むステップの前に、試料を希釈するステップを更に含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料を光学的に走査するステップは、細管の真上に位置する入射ビームを、水平に配置された細管に交差させるステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
試料を光学的に走査するステップは、６００〜１０００ｎｍの波長の入射ビームで走査するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
試料を蛍光標識した結合剤と反応させるステップは、６００〜１０００ｎｍの範囲の励起波長で活性化される発蛍光団で標識した結合剤を用いるステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
試料を光学的に走査するステップは、入射ビームと細管との交差点での直径が５〜１５ミクロンの入射ビームで走査するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
試料を細管に仕込むステップは、細管の深さを画定する断面の短い方の寸法と、細管の巾を画定する断面の長い方の寸法とを有する長方形断面の細管に、試料を仕込むステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
試料を細管に仕込むステップは、２５〜２２５ミクロンの深さ寸法を有する細管に、試料を仕込むステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
試料を光学的に走査するステップは、細管の長手方向軸に対して横断方向の第一の方向及び細管の長手方向軸に沿う第二の方向に経路を縦走するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
試料を、細管の長手方向軸に対して横断方向の第一の方向に光学的に走査するステップは、細管のそれぞれの外側の境界を越える点に始まり終る走査経路を縦走するステップを含んでいることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
試料を光学的に走査するステップは、固定位置にある細管を走査するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
細管の長手方向軸に沿う方向における走査の始点及び終点と細管の断面積とによって決定される細管の特定した容積当りの計数した成分の量を計算することによって、試料の細胞成分の濃度を決定するステップを更に含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
試料の異なる細胞成分の比を、計数した各成分の量を計算して計数した各成分の相対量を比較することによって決定するステップを更に含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
蛍光による全血における白血球サブクラスを確認及び計数するためのアッセイであって、
凝固していない全血の試料を取得するステップと、
蛍光性複合体を生成するため、試料を、試料中の白血球サブクラスの特定細胞表面マーカーに向けられる過剰量の蛍光標識した抗体と反応させるステップと、
試料を、特定した寸法を有する細管内に直接仕込むステップと、
蛍光性複合体を励起し、試料中に存在する赤血球からの干渉を最小限にするよう選択された波長を有する光の入射ビームであって、複数のカラム状領域を照すため、特定した直径の複数のビームスポットとして細管と逐次交差する入射ビームを用いて、試料を光学的に走査するステップと、
各カラム状領域の内部深さ寸法に限られた放射された蛍光を逐次検知するステップと、
高くなった発光強度の各カラム状領域から、放射された蛍光を記録するステップと、
白血球のサブクラスを、放射された蛍光から試料中のサブクラスの存在を決定することによって、計数するステップとを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記試料を蛍光標識した抗体と反応させるステップの後に、かつ前記試料を細管に仕込むステップの前に、試料を希釈するステップを更に含んでいることを特徴とする請求項１４記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記試料を蛍光標識した抗体と反応させるステップは、複数の蛍光標識した抗体を用いて反応させるステップを含んでおり、各抗体は、白血球サブクラスの異なった特定の細胞表面マーカーに向けられ、異なる光学特性を有する異なる発蛍光団で標識されていることを特徴とする請求項１４記載のアッセイ。
【請求項１７】
細管内の非流動流体用の走査結像血球計算器であって、
細胞と蛍光標識した結合剤との複合体を有する遊離の蛍光標識した結合剤を含む懸濁状態の非流動流体を収容し、外壁及び内壁を有する透明な細管と、
前記細管の長手方向軸に対して横断方向に、流体のカラム状領域を照す第一の直径を有するビームスポットとなって、前記細管の外壁に当る光のビームであって、前記光のビームは、複合体及び遊離の結合剤からの蛍光放射を刺激する励起波長を有しているビームと、
前記細管から間隔をおいて位置し、蛍光放射に反応する光検知要素と、
照されたカラム状領域からの蛍光放射を集め、蛍光放射を光線として前記光検知要素に向けて送るように構成され、前記細管に近接して位置決めされる広角集光要素と、
ピンホール孔部を有し、前記集光要素と前記検知要素との間に位置決めされる空間フィルターであって、ピンホール孔部は、光線を遮るように配置され、光線の一部だけを前記検知要素へと通す第二の直径を有し、前記細管の内部深さ寸法に検知の深さを限るために、ピンホール孔部の第二の直径は、ビームスポットの第一の直径よりもかなり大きい空間フィルターと、
前記光のビームを前記細管に複数のビームスポットとして逐次当て、合計容積を測定することのできる複数のカラム状領域を細管内に照すための前記細管と前記光のビームとの相対運動を与える手段とを備えていることを特徴とする走査結像血球計算器。
【請求項１８】
蛍光標識した結合剤は、６００〜１０００ｎｍの範囲の励起波長で活性化される発蛍光団を含んでいることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項１９】
結合剤は、抗体であることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２０】
結合剤は、細胞表面マーカーに対して特異性であることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２１】
結合剤は、介在染料であることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２２】
結合剤は、核酸プローブであることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２３】
結合剤は、特定の受容体に反応することを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２４】
細管の外壁に当る光のビームは、広角集光要素の中央部を通過した後、細管の外壁に当り、細管の内部深さに合焦されていることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２５】
遊離の結合剤に関連するバックグラウンド蛍光と複合体に関連する蛍光とを識別するため、検知要素と連携する粒子計数手段を更に備えていることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２６】
運動を与えるための手段は、複数のスポットを互いに部分的に重複させることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２７】
運動を与えるための手段は、前記光のビームを細管の側方の縁を越えて走査させることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２８】
運動を与えるための手段は、前記光のビームをスポットの二次元配列に細管に逐次当て、合計容積を測定することのできるカラム状領域の二次元配列を照すことを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項２９】
前記光検知要素は、前記空間フィルターと第１および第２の光電性部材との間に位置決めされたスペクトル分散装置を含み、スペクトル分散装置は、複数の蛍光放射の波長を分離し、分離された波長を第１および第２の光電性部材に向けるために構成されることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項３０】
探査容積は、細管の既知の断面積と、細管に沿って走査した距離とによって決定されることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項３１】
容積は、細管の既知の断面積と、距離を規定するため、特定の識別マークを細管に付すこととによって決定されることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項３２】
ビームは、細管内の或る位置に合焦されることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項３３】
光のビームは、６００〜１０００ｎｍの範囲の波長を有していることを特徴とする請求項１７記載の走査結像血球計算器。
【請求項３４】
細管内の非流動流体用の走査結像血球計算器であって、
細胞と蛍光標識した結合剤との複合体を有する非流動流体を収容し、外壁及び内壁を有する透明な細管と、
前記細管の長手方向軸に対して横断方向に、流体のカラム状領域を照す第一の直径を有
するビームスポットとなって、前記細管の外壁に当る光のビームであって、前記光のビームは、複合体からの蛍光放射を刺激する励起波長を有しているビームと、
前記細管から間隔をおいて位置し、蛍光放射に反応する光検知要素と、
照されたカラム状領域からの蛍光放射を集め、蛍光放射を光線として前記検知要素に向けて送るように構成され、前記細管に近接して位置決めされる広角集光要素と、
ピンホール孔部を有し、前記集光要素と前記検知要素との間に位置決めされる空間フィルターであって、ピンホール孔部は、光線を遮るように配置され、光線の殆どを前記検知要素へと通す第二の直径を有し、前記細管の内部深さ寸法に検知の深さを限るために、ピンホール孔部の第二の直径は、ビームスポットの第一の直径よりもかなり大きい空間フィルターと、
前記光のビームを前記細管に複数のビームスポットとして逐次当て、合計容積を測定することのできる複数のカラム状領域を細管内に照すための前記細管と前記光のビームとの相対運動を与える手段とを備えていることを特徴とする走査結像血球計算器。
【請求項３５】
細胞懸濁液の容量蛍光測定を行なうための装置であって、
長方形断面の細管であって、前記細管の深さを画定する断面の短い方の寸法と、前記細管の巾を画定する断面の長い方の寸法とを有し、その中に細胞懸濁液を収容する細管と、
細管の細胞懸濁液を励起するよう選択された波長の入射ビームを生成するための光学的走査手段であって、入射ビームは、複数のカラム状領域を照すため、特定した直径の複数のビームスポットとして細管と逐次交差する光学的走査手段と、
蛍光放射を検知するための光電性部材を有する検知手段と、
カラム状領域からの蛍光放射を集め、蛍光放射を前記検知手段へと向けるための集光手段と、
カラム状領域全体から放射された蛍光の検知を可能にするための特定したピンホール孔部を有し、前記細管の内部深さ寸法に検知の深さを限るために、前記集光手段と前記検知手段との間に配置された空間フィルターと、
蛍光放射信号の記録のため、前記検知手段と連絡しているデータリーダーとを備えていることを特徴とする装置。
【請求項３６】
細管は、水平に配置されており、光学的走査手段の入射ビームは、細管の真上の位置から細管と交差することを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項３７】
入射ビームの波長は、６００〜１０００ｎｍであることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項３８】
ビームスポットの直径は、５〜１５ミクロンの範囲であることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項３９】
細管は、２５〜２２５ミクロンの範囲の深さを有していることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項４０】
光学的走査手段の入射ビームは、細管の巾に沿う第一の方向及び細管の長手方向軸に沿う第二の方向に経路を縦走することを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項４１】
光学的走査手段は、細管の巾に沿う方向の経路を進行し、経路は、細管の外側の境界を越える点に始まって終ることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項４２】
検知手段は、少なくとも一つのスペクトル分散装置によって隔てられた複数の光電性部材を含み、それにより、複数の蛍光放射の波長を分離することを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項４３】
更にレンズを備えており、レンズの中央部は、入射ビームが細管と交差する前にビームを通過させるため光学的走査手段によって用いられ、レンズ全体は、細管からの蛍光放射を集めるため集光手段によって用いられることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項４４】
血球のサブクラスの検知のための装置であって、
既知の長方形断面積および既知の深さを有して既知の容量を規定し、深さは実質的に１０ミクロンを超える透明な細管と、
少なくとも６００ｎｍの励起波長を有し、前記細管の上表面に当って少なくとも５ミクロンの直径を有するビームスポットを与えるよう構成された光のビームを生成するための手段と、
光のビームを前記細管に複数のビームスポットとして当て、既知の容量の複数のカラム状領域を細管内に照すための前記細管と光のビームとの相対運動を与える手段と、
前記細管に近接して位置決めされ、前記光のビームを生成するための手段によって生じる蛍光放射を集めるように構成され、蛍光放射を光線として送るようにさらに構成される集光要素と、
蛍光放射に反応し、前記細管から離れて位置決めされ、前記集光要素からの光線によって当てられるように位置決めされる光検知要素と、
前記集光要素と前記検知要素との間に位置決めされる空間フィルターであって、光線を遮るように配置され、光線の一部のみを前記検知要素へと通し、検知された光を、単一のビームスポットによって照され各カラム状領域の内部深さ寸法に限られる単一のカラム状領域に制限するように構成された空間フィルターとを備えていることを特徴とする装置。
【請求項４５】
前記細管の深さは、２５〜２２５ミクロンの範囲であることを特徴とする請求項４４記載の装置。
【請求項４６】
前記生成するための手段からの光のビームの励起波長は、６００〜１０００ｎｍであることを特徴とする請求項４５記載の装置。
【請求項４７】
ビームスポットの直径は、５〜１５ミクロンの範囲であることを特徴とする請求項４６記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、自動化した血球計算装置及び手法に関し、生物学的流体の細胞成分の確認及び計数に関するものである。
【０００２】
【背景技術】
生物学的流体の種々の成分の迅速な確認及び計数が重要な研究及び診断の目的である。試料の最小限の処置及び取り扱いが、斯かる技術の広範な用途に貢献するであろう。
人間の血液の白血球サブクラスの計数の場合には、改良された技術の要求が特に強い。例えば、HIV 陽性状態からエイズへの進行の注視におけるCD4 ＋リンパ球レベルを監視することの有用性は、患者の血液試料を分析するための速やかで、低廉で、信頼性のある方法の必要性を強めてきた。
AIDS 4、479 〜497 頁(1990 年) のLanday等の「流動血球計算のHIV 感染の研究への応用(Application of flow cytometry to the study of HIV infection) 」は、HIV 感染の生物学の理解における技術の実用を記載している。種々のモノクローナル抗体を用いて血液試料の表現分析を行なうことによって、複数色流動血球計算分析を、HIV 疾患の研究に応用することができる。この技術は、器官移植又は白血病の患者の状態評価におけるように、他の免疫系の測定にも有用である。
【０００３】
流動血球計算は、細胞を、蛍光放射に基づいて特徴付けて分離することのできる周知の技術である。標識した単分散(mono-dispersed)細胞懸濁液が、細い流体の流れになって管を通って進行し、励起ビームに露呈される。各細胞の放射された蛍光は、適当な検知器によって測定され、細胞は、小滴に分けられ、電気的及び機械的手段によって所定のパラメータにしたがって種別される。
流動血球計算は、血液細胞の特定のサブクラスを確認し、計数するのに用いることができる。例えば、Hansen等の米国特許第4,284,412 号では、蛍光標識したノモクローナル抗体と反応させたリンパ球が赤血球から分離され、一つ一つ流動血球計算システムの固定した検知器にかけられる。各細胞は、前方光散乱、直角散乱(right angle scatter) 、及び蛍光の分析によって特徴付けされる。この方法は、複雑な試料調製及び計測を必要とする。流動血球計算は、この用途におけるアッセイの信頼性及び再現性を向上させたが、一般には、リンパ球サブセットの絶対細胞数を直接もたらすことができない。独立白血球数(independent white blood counts)及び差分白血球数(differential white counts) が、単位容積あたりの絶対細胞数を計算するのに必要である。通常の流動血球計算の実践においては、リンパ球を、単球及び顆粒球と識別するためには、前方及び側方光散乱パターンに基づくリンパ球ゲートを、各試料毎に得なければならない。
【０００４】
Recktenwald の米国特許第4,727,020 号は、反対の例を提供しているが、流動血球計算は、赤血球の存在下でのリンパ球サブクラスの確認及び計数には、通常は用いられない。赤血球の除去は、密度勾配分離又は溶解によると、アッセイあたりの時間、費用及び血液処理工程がふえる。追加の血液処理工程は、血液媒介の感染に晒す可能性を増すものである。先に述べたように、流動血球計算法によって得られたデータは、或る目的には不十分である。単位容積あたりの絶対細胞数を計算するためには、流動血球計算データを、他の方法から得られた追加のデータと組み合わせなければならないのが一般的である。更に、流動血球計算は、小さなノズルを通過する流体の流れを従来利用するため、研究所の職員に生物学的有害物質の追加の源をもたらすエーロゾルを発生させることがある。
他には、試料の位置を励起ビームに対して固定することがある。例えば、Tomei 等の米国特許第4,758,727 号及びその分割の米国特許第4,877,966 号には、低レベルレーザー誘発蛍光の測定方法及び装置が記載されている。この発明では、コヒーレントレーザービームが三次元スキャナーを通過し、静止した標的に合焦される。標的は、単層培養細胞又は組織片等の対象物である。1 ミクロンといった小さなサイズを有するビームスポットが、経路及び運動速度がコンピュータ制御されたスキャナーによって標的を越えて行き来する。蛍光が、バイアスカットした光ファイバーベースプレートによって集められ、ビームからは標的の反対側に位置する検知器に中継される。
【０００５】
やはりTomei 等に許与された米国特許第5,037,207 号が、支援コンピュータシステムのデータ検索及び記憶限界によっては、いろいろなサイズの標的のデジタル結像を可能にする高められた空間解像度及び集光効率を有するレーザー結像システムを開示している。このシステムは、各レーザースポットから全ての光を集めて標的の表面に関する画像の定量的デジタル再生をなすため、新規な光ファイバー検知器アセンブリ及び迅速な走査を利用している。
Kamentsky の米国特許第5,072,382 号及びKamentsky 等の米国特許第5,107,422 号が、ビームを用いて細胞個体数を走査し、各細胞の特定の位置に基づいて複数パラメータ光学データを作成するための装置及び方法を開示している。この走査は、細胞を付着させた面についてなされる。バックグラウンドレベルが、デジタルデータに基づいて各細胞を取り囲む近隣域に関して推定され、バックグラウンドレベルに関して補正がなされる。
Cytometry 9 、101 〜110 ページ(1988 年) のBurger及びGershmanの「音響光学的レーザー走査血球計算器(Acousto-Optic Laser-Scanning Cytometer)」及びGershman等の米国特許第4,665,553 号には、レーザー走査血球計算器が開示されている。光学的走査が、ブラッグ細胞制御スキャナー(Bragg cell-controlled scanner) によって、キュベット内の溶解及び洗浄を行なった試料に対して行なわれる。キュベットは、スキャナーに対して一方向に段階的態様で移送される。スキャナーは、キュベット移送の方向と垂直の方向に作用し、走査は、キュベットの側部に沿って行なわれる。細胞が配置されると、ビーム最適化アルゴリズムが働いてビームを細胞に固定し、前方光散乱、垂直光散乱、及び蛍光の測定が行なわれる。次いで、この過程が繰り返される。
【０００６】
Buican等の米国特許第5,117,466 号には、流動血球計算器からのデータが、試料の細胞成分を実質上種分けするため共焦レーザー顕微鏡によって用いられる確認基準を確立する蛍光分析システムが記載されている。複屈折光学及びフーリエ変換技術が、所望のスペクトル特性を有する細胞又は亜細胞(subcellular) 構造体を視覚的に選択及び表示するのに用いられている。
Analytical Biochemistry 102 、90〜96頁(1980 年) の「ピコリットル試料の蛍光分析(Fluorescence Analysis of Picoliter Samples)」で、Mroz及びLechene は、蛍光データを集めるためのピコリットル容積の試料の処理方法を教示している。試料が、シリンジによって、単一のシリコン処理した細管内に試料の間に油がある状態に採取される。ピンホールダイヤフラム、顕微鏡の対物レンズ、及び細管の直径によって画定される光学的蛍光チャンバーに対して測定がなされる。
Mathies 等に許与された米国特許も本発明の分野に関連するものである。米国特許第4,979,824 号には、高感度検知装置が記載されている。この装置は、流動血球計算システムに基づいており、空間フィルターを利用して個々の蛍光性の粒子及び分子の検知を可能にする小さなプローブ容積を規定している。最も良い信号対ノイズ比が得られるよう、レーザー出力及び試料の曝露時間が選択される。蛍光粒子からの光子バースト(photon bursts) のリアルタイムの検知が、粒子の数、位置又は濃度をバックグラウンドエネルギーから識別するのに用いられている。
【０００７】
Mathies 等の米国特許第5,091,652 号には、共焦顕微鏡を用いて分離した試料を走査するためのレーザー励起蛍光スキャナーが開示されている。この試料は、電気泳動したどろどろの(slab)ゲルによって分離され、斯かるゲルから検知されるのが好ましいが、膜、ろ紙、ペトリ皿又はガラス基板に載っていてもよい。共焦顕微鏡は、ゲルに照明容積を形成し、ビームは、バックグラウンド散乱が散乱光の偏光特性によって最小限になるように方向付けされる。
やはりMathies 等に許与され、上記特許の一部継続である米国特許第5,274,240 号が、レーザー励起細管列スキャナーを教示している。この発明は、細管電気泳動によって分離した試料を収容する細管の列からの蛍光の検知を主として意図するものである。この蛍光検知アセンブリは、各細管の内部容積からの蛍光を検知するのに共焦システムを用いている。
現在の血球計算技術は、時間がかかり、潜在的に有害な試料の処理及び成分の分離工程を要するのが一般的である。斯かる技術は、混合個体群中に存在する細胞懸濁液の下位(sub) 個体群の迅速な容量測定による確認及び計数をすることができない。この先行技術のテクニックは、訓練した職員を必要とすることがしばしばである。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、生物学的流体における特定の細胞サブセットの数を、容量測定の態様で直接得るための、少ない容量の試料及び試薬しか要しない迅速で、使用が簡単で、費用がより少なく、より安全で、自動化された装置及び方法を提供することである。
【０００９】
【発明の概要】
上記の目的は、生物学的流体の細胞成分を、蛍光性複合体の形成と、静止した最小限の処理をした状態の試料を容れた細管の光学的走査とに基づいて、容量測定の態様で確認し、計数するための装置及び方法を用いて達成された。非流動細胞懸濁液全体から蛍光が検知され、絶対細胞数を得る目的で、正確な容積において計数を行なうことができる。本明細書で定義される「絶対」とは、走査した容積によって表わされる容積あたりの細胞の絶対数を意味する。本明細書で定義する「細胞」とは、細胞全体又は細胞の一部を意味する。複合体は、蛍光標識した結合剤と流体の細胞成分に存在する対応する結合部位との反応の結果である。励起レーザービームが、光学スキャナーによって細管のカラム状領域に送られる。カラム状領域は、通常、細管の内側深さ寸法とレーザーのビームスポットとによって画定される。カラム状領域全体から放射された蛍光を選択的に検知するため、十分なピンホール孔部が選択され、細管と検知手段との間に配置されている。試料における結合した蛍光標識した結合剤と未結合の蛍光標識した結合剤との分離が必要でないため、どちらも蛍光として検知手段によって観察される。しかしながら、標識した結合剤が集合する、即ち試料の細胞成分に存在する結合部位に集合する、蛍光強度が高くなった領域が現れる。したがって、検知手段は、単一の細胞に対応するバックグラウンド蛍光の所定の閾値を越える高くなった蛍光強度の信号を記録する。
【００１０】
好ましい実施態様では、レーザーは、600 〜1000nmの波長の励起ビームを発生させ、励起ビームは、長方形断面の細管の真上の位置から細管に合焦される。レーザービームが細管と交差する箇所におけるレーザービームのスポットサイズは、予期される細胞の大きさによるが、直径が5 〜15ミクロンであり、細管の照される深さ寸法は、25〜225 ミクロンである。以下に説明するように、スポットサイズと細管の深さ寸法との間には関係がある。本発明では、励起ビームを、二方向に走査させ、固定位置にある透明な細管の外壁に当てる。第一の走査方向は、細管の長手方向軸に対して横断方向の経路、即ち、細管の長方形断面の巾部分を辿り、細管の側方の境界を越える点に始まって終る。第二の走査方向は、細管の長手方向軸に沿う経路を辿る。細管の断面積が既知なので、第二の走査方向における始点及び終点を測定することによって、又は規定した位置で走査を開始し、終了することによって、達成される既知容積の走査を、単位容積あたりの細胞成分の特定の下位個体群の存在を計算するのに用いることができる。本発明の装置は、血球のサブクラスの検知の特に好適である。典型的なアッセイでは、凝固していない全血を取得し、血球サブクラスに存在する種々の細胞表面マーカーに向けられる過剰量の蛍光標識した抗体を用いて反応させる。発蛍光団は、それらが、励起ビームの波長の範囲で活性であるように選択される。この波長範囲も、意図しない血液成分からの自発蛍光(autofluorescence)に起因する干渉を最小限にするよう選択される。複合及び遊離の両形態の蛍光標識した抗体を含む試料は、通常、希釈した後、細管内に仕込む。次いで、細管を、発蛍光団を励起するのに必要な波長で光学的に走査する。特定の抗体を標識するのに用いた特定の発蛍光団からの蛍光放射に基づき、血液又は他の生物学的流体試料に存在する細胞種の比を速やかに決定することができるように、或る種類の細胞の単位容積あたりの数を、速やかに決定することができる。
【００１１】
本発明の機器及び技術は、正確な容積の生物学的流体の細胞成分を速やかに検知し、試料の最小限の処理しか必要でない。本発明は、アッセイ時間及び費用を削減し、試料の処理、特に重要なのは血液試料の検査中の予防措置、が最小限でよい。試料を処理するのに特別の機器が必要ではなく、必要な試薬の数が最小限に保たれるので、臨床の状況に用いるのに非常に適している。
【００１２】
【実施例】
図１を参照すると、レーザー１０が、パワーモニター１１と光学的に連絡しているガラスプレート１２を先ず通過し、次いで、レーザーラインフィルター１３及び選択したレーザービーム波長に対して鏡として作用するスペクトル分散手段１４を通過する励起ビーム８０を発生させる。スペクトル分散装置は、例えば、二色ビームスプリッター、プリズム、又は格子でよい。励起ビームは、次いで、鏡１５に送られ、直角プリズム１６を通り、走査アセンブリ３４に送られる。図１では、走査アセンブリ３４は、ガルボミラー１８、レンズ２６及び２７、並びにレンズ１９が取り付けられた検流計１７を備えている。その他、走査アセンブリは、多面を有する多面体鏡でもよい。本発明の励起ビーム８０は、ガルボミラー１８に当り、ガルボミラー１８は、検流計１７と連絡しているため、絶えず位置を変化させ、それにより、励起ビームの位置の変化を生じさせる。走査アセンブリ３４内で、励起ビームは、ガルボミラー１８から、レンズ２７を通り、次いでレンズ２６を通って進行する。レンズ２６から、励起ビームは、ビームの焦点が、透明な細管２０の外壁に当ることができるよう、レンズ１９を通して送られる。
【００１３】
外壁に当る励起ビームは、外壁を横切って試料のカラム状領域を照らし、試料から蛍光放射を生じさせる。集光が、エピイルミネーション(epi-illumination)の態様で生じる。放射された蛍光は、レンズ１９によって集められ、光線８３として、走査アセンブリ３４を通って送り戻される。レンズ１９は、図２で分るように、入射ビーム８０を通過させ、細管２０を通る入射ビーム８０の一様な焦点深度を得るするための中央部を有している。蛍光放射は、光線３２ａ及び３２ｂによって表わすような非常に広い角度にわたっているため、蛍光の集光が、対物レンズ１９のより広い部分にわたって行なわれる。図１に戻ると、光線８３は、走査アセンブリ３４から直角プリズム１６へと進行し、鏡１５及びスペクトル分散装置１４へと進行する。光線８３は、その蛍光放射の波長のため、スペクトル分散装置１４を通り、帯域通過フィルター２１を通って鏡２２へと伝播され、鏡２２で、光線８３は、視準レンズ２３へと送られてこれを通過する。光線８３は、次いで、空間フィルター２４を選択的に通過し、検知手段３５に進入する。空間フィルター２４は、細管内の照らされたセグメントによって規定される領域からの蛍光放射のみを通過させる直径の所定のピンホール孔部を有している。
【００１４】
検知手段３５は、光線８３の蛍光信号を読み取る検知要素３０のような検知チャンネルを備えており、蛍光信号をアナログからデジタル形式に変換するデータリーダー５０と連絡している。検知要素は、光電子増倍管又は光ダイオード等の光測定装置である。信号は、データリーダー５０によって、蛍光強度の単位として記録される。検知手段３５は、如何なる数の検知チャンネルを含んでいてもよい。例えば、図１において、スペクトル分散装置２５が、空間フィルター２４と検知要素３０及び３１との間に配置され、試料の蛍光放射の波長を分け、一方の波長の光を一方の検知要素へ、第二の波長の光を第二の検知要素へと選択的に送る。このようにして、複数の発蛍光団からのいろいろな波長において蛍光を検知するため、複数のスペクトル分散装置及び複数の検知要素を検知手段に組み込むことができる。同様にして、いろいろな波長で試料を励起するため、複数のレーザーを利用することができる。本発明の重要な特徴が、図２に示されている。大きな開口数にわたっって集光するが、検知の深さを細管の内部の深さ寸法に限定するピンホール孔部を有する空間フィルター２４が選択される。励起レーザービーム８０の細管２０の外壁へのスポットサイズは、ほぼ一定の直径のものであり、細管の深さ寸法に沿って一様な照明を提供するよう選択されている。そのため、本発明は、励起ビームのスポットサイズ、細管の深さ寸法、及び空間フィルターのピンホール孔部の従属関係に依存するものである。
【００１５】
細管２０は、既知寸法の透明な試料ホルダーである。細管は、25〜225 μm の内部深さを規定する短い方の寸法と1mm の巾を規定する長い方の寸法とを有する長方形の断面を有しているのが好ましい。細管の長さは、決定的なものではなく、細管の長さに沿う方向における走査の始点及び終点が、走査するセグメントの正確な体積を規定する。本発明では、40mmの細管長さを一般的に用いている。細管は、細管の走査がトップダウン方式(top-down manner) で行なわれるよう、励起ビームの真下に固定して配置される。励起ビームと細管との交差部は、図２及び図３に示すように、カラム状領域５１によって全体が画定される。カラム状領域の上部寸法は、5 〜15μm の円状ビームスポット３３である。ビームスポットのサイズは、細管の深さ寸法全体が照らされるように選択される。
細管のカラム状領域が照らされ、その内容物から放射された蛍光が検知及び記録された後、光学走査手段は、新しいカラム状領域を照すため、新しい位置へと移動される。移動は、ビームスポットのサイズの一部分にすぎない量のものであるため、各々の照明されるカラム状領域５１は、図３におけるような他の領域４４と部分的に重複する。光学走査手段は、蛍光放射が検知及び記録される領域をこの態様で照明及び蛍光性励起を継続し、次いで若干移動されて新しい領域を照明し、この過程を繰り返す。好ましい実施態様では、光学走査手段は、細管の長手方向軸を横断する方向である矢印５２によって示される、即ち、細管の巾に沿う一方の方向、及び矢印５３によって示される細管の長さに沿うもう一方の方向に走査経路を辿り、ビームスポットの二次元の配列を形成する。図１において、点線部１３４が、走査アセンブリ３４の位置の変化を示しており、したがって、点線の検流計１１７及び点線のガルボミラー１１８が、変更位置にある検流計１７及びガルボミラー１８を表わしている。同様にして、点線１２６、１２７及び１１９が、変更位置にあるレンズ２６、２７及び１９を表わしている。図３及び図４に示すように、横断方向の走査は、細管の側方の境界を越えて箇所５４に始まって箇所５４に終る。この余分目の走査(overscan)は、細管の縁の特異性を特定するのに効果的である。
【００１６】
図５は、本発明の好ましい実施態様による走査経路４８の細管２０上方からの模式図を示している。励起ビームのスポットは、横断方向の走査経路に沿って移動され、次いで、迅速に戻り、やはり横断方向の近接して間隔をおいて位置する平行な経路を辿る。この過程は、走査が、細管の長手方向軸に沿うセグメントも網羅するような頻繁さで反復される。このようにして、蛍光放射が生じ、任意の選択した長さの細管から検知される。本発明において開示された方法は、生物学的流体の試料の分析を、最小限度の準備で可能にするものである。本発明によれば、生物学的流体を、既知の光学特性の発蛍光団を含む過剰量の結合剤と反応させる。蛍光標識された結合剤は、試料に存在する結合部位と反応するように選択される。例えば、生物学的流体の何等かの細胞成分に存在する抗原に向けられた蛍光標識された抗体を、試料に加えることができる。標識された結合剤と結合部位とは、本発明の装置に用いると信号を発する蛍光性複合体を形成する。試料を標識した結合剤と反応させた後、必要であれば希釈し、次いで、細管２０内に直接仕込む。生物学的流体の成分の溶解も、結合した結合剤と未結合の結合体の分離も、本発明方法の実施の如何なる時点においても必要がない。光学的走査が、容量測定の態様で試料になされ、照された各カラム状領域から、蛍光放射が順に記録される。
【００１７】
所望の用途によっては、細管の長手方向の走査の始点及び終点をノッチでしるし、走査した距離を測定することにより、又は、細管に付した特定の識別マークの間を走査することにより、絶対容積の計数を行なってもよい。この決定した正確な容積における全ての蛍光性の標的の定量は、詳細な個体群(population)データを迅速に得る有力な方法である。この容積は、一定の断面積の細管を用いることにより、又は特定の識別マーク間の細管の容積を独立に測定することにより、決定される。その他、正確な容積の算出は行なわないが、試料の異なる成分の相対数を比較することにより、比率を得ることができる。
図１のデータリーダー５０が、図６に示すように、事象、即ち、或る閾値を越える蛍光のバックグラウンドレベルより上への増加を記録する。この事象は、試料中に特定の種類の細胞が存在することに対応する。蛍光の放射は、結合剤−結合部位複合体４５からも遊離の結合剤４０からも生じるが、バックグラウンドレベル８０に対するより強い信号８５が、結合剤がクラスターになった領域、即ち、結合剤が向けられる結合部位を露呈している細胞から生じる。したがって、強くなった蛍光８５の信号が、図６に点線でつながりを示す細胞に対応し、そのように記録される。
【００１８】
本発明の方法は、未反応の蛍光標識した結合剤の除去を必要としない。光学的走査に先立つ試料の希釈が、信号対ノイズ比を向上させる役割をするので、本発明による蛍光の結像が、最小限の処理工程で迅速な態様で行なわれる。希釈は、試料中で細胞の重複が生じることを最小限度にする役割もする。本発明の実施においては、試料の細胞が10ミクロン程度の大きさで、細胞の密度がマイクロリッターあたり5000未満である時に、最適の結果が得られる。本方法の有用性の例が、血液試料中に存在する白血球のサブクラスの決定のためのアッセイによって例示される。典型的なアッセイでは、凝固していない全血の試料を、特定の細胞表面マーカーに向けられる蛍光標識された抗体と反応させる。例えば、異なる光学特性を有する発蛍光団で標識された抗CD4 及び抗CD8 を、全血と反応させることができる。試料内で、CD4 又はCD8 の何れか、或いは両方の細胞表面マーカーを帯びた白血球は、標識した抗体と反応して蛍光性複合体を形成する。十分な反応時間の後、全血試料を希釈し、細管に入れる。次いで、本発明に従って細管を光学的に走査する。使用する発蛍光団を活性化し、意図しない血液成分からの自発蛍光(autofluorescence)に起因する干渉を最小限にするよう、光学的走査の波長範囲を選択する。抗CD4 及び抗CD8 を標識するのに用いた発蛍光団に対応する蛍光放射が検知され、記録される。次いで、これらの抗体を向ける細胞表面マーカーの何れか又は両方を帯びた白血球の存在を計数する。走査の長さ及び細管の断面積によって決定される所定の容積内に存在する或るサブクラスの細胞の数を計算することによって、結果を、単位容積当りの絶対細胞数として表わすことができる。結果を、比、例えばCD4/CD8 白血球比として表わすことも、これらの細胞表面マーカー各々を帯びた細胞の数を計算して両方を比較することにより、可能である。この最も後の例示の有用性は、この比がエイズの進行の測定において重要なため、非常に明らかである。
【００１９】
凝固していない全血における白血球サブクラスの測定を行なうため、本発明の技術を用いてアッセイを行なう場合、反応した試料の細管内への仕込みと光学的走査との間の二、三分間の待機が、試料中に存在する多数の赤血球の自然密度ための余裕を与え、赤血球の細管の底への沈殿と後続する白血球の変位を生じさせる。この自然の浮力効果が、細管の上部付近の白血球の帰結位置を生じさせ、本発明のトップダウン走査形態のため、蛍光検知に役立つ。
上記の例におけるように、異なる光学特性を有する発蛍光団を、異なる結合部位に向けられる結合剤と結合させることができるため、試料中の複数の反応成分の存在を検知することができる。走査した細管の正確に分っている容積から、迅速な読み取りが、試料中に存在する単位容積あたりの特定のサブクラスの細胞の数を確認する。光学系は、単に、各発蛍光団を、その重要な波長で励起するように設定され、各発蛍光団の放射波長に対応するよう検知チャンネルが形成される。
本発明の装置及び方法は、既知容量内の絶対数を必要とする用途を含む多くの用途に適している。例えば、細胞運動学の研究、介在染料(intercalating dye) を用いる細胞毒性の研究、及び原位置ハイブリッド形成を、本発明に従う分析に適合させることができる。加えて、本発明の容量測定法は、細胞懸濁液中でなく表面に位置する細胞における免疫的及び生化学的応答を研究する場合に存在することのある人為要素の回避を可能にするものである。細胞は、細管内から検知されるが、本発明は、比較的静止した局在細胞に対する流動細胞光度測定的な分析を可能にする態様で試料を呈示するものである。したがって、細胞を、位置特異的な態様で検知すること又は後続の目視試験のために確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る装置の平面図である。
【図２】本発明の試料を充填した細管の側面図であり、カラム状領域、並びに励起ビーム及び放射ビームの両方を示す図である。
【図３】本発明による重複するビームスポット及び照されたカラム状領域を示す試料を充填した細管の斜視図である。
【図４】本発明による重複するビームスポットを示す試料を充填した細管の平面図である。
【図５】本発明の好ましい実施態様による光学的走査経路の模式図である。
【図６】標識した細胞懸濁液及び対応する検知器の信号の模式図である。
【符号の説明】
１９…レンズ
２０…細管
２４…空間フィルター
３５…検知要素
８０…励起ビーム
８３…レトロビーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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