(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がH2N-Glu-Asp-Gly-Ilu-Lys-Arg-Ilu-Gln-Asp-Asp-COOHであるペプチドによって生成されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統株であって、
前記モノクローナル抗体は、アンギオテンシンIIレセプタの哺乳類AT1サブタイプに結合可能であることを特徴とする。
【請求項２】
ほ乳類AT1レセプターのアミノ酸残基8-17に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産する請求項1記載のハイブリドーマ細胞系統株。
【請求項３】
ハイブリドーマ細胞系統株は、上記定義されたアミノ酸配列を有するペプチドでマウスを免疫付与すると共に、免疫付与されたマウスからの脾細胞をマウスミエローマに結合させることによって得られることを特徴とする請求項１又は２記載のハイブリドーマ細胞系統株。
【請求項４】
英国ポートンダウンの動物細胞培養物欧州収集所に寄託された細胞系統株の受託番号が930720117であることを特徴とする請求項1記載のハイブリドーマ細胞系統株。
【請求項５】
アミノ酸配列がH2N-Glu-Asp-Gly-Ilu-Lys-Arg-Ilu-Gln-Asp-Asp-COOHであるペプチドによって生成されたモノクローナル抗体であって、
前記モノクローナル抗体は、アンギオテンシンIIレセプタの哺乳類AT1サブタイプに結合可能であることを特徴とする。
【請求項６】
ほ乳類AT1レセプターのアミノ酸残基8-17に結合する請求項５記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
アンギオテンシンIIレセプターのAT1サブタイプの検出のための請求項５又は６記載のモノクローナル抗体の使用，
【請求項８】
検出可能な標識に付着させた請求項５、６又は７記載のモノクローナル抗体であることを特徴とする診断試験キット。
【請求項９】
請求項５、６又は７記載のモノクローナル抗体の治療上有効な量を含有することを特徴とする高血圧症の治療用薬物組成。
【請求項１０】
請求項５、６又は７記載のモノクローナル抗体の治療上有効な量を含有することを特徴とする子宮収縮を調節する薬物組成。
【請求項１１】
付着されていて検出可能な標識を有することを特徴とする請求項５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記標識が蛍光標識であることを特徴とする請求項５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記標識が放射性同位体標識であることを特徴とする請求項５記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記標識が蛍光標識であることを特徴とする請求項８記載の診断試験キット。
【請求項１５】
前記標識が放射性同位体標識であることを特徴とする請求項８記載の診断試験キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は新規なハイブリドーマ細胞系統株に関し、詳しくは、アンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプ（ＡＴ1レセプター）に結合可能なモノクローナル抗体を分泌する新規なハイブリドーマ細胞系統株に関する。又、本発明は数種の診断及びモニター申請用試験キットに使用可能な抗体であるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体に関する。更に、本発明は平滑筋刺激の調節の様な治療用途でのモノクローナル抗体の使用に関する。
背景技術
ホルモンであるアンギオテンシンIIは体内の電解質や血圧の調節を補助するレニン・アンギオテンシン系の部分を成す。アンギオテンシンIIが作用する数種の組織が体内に存在し、これらの中には副腎、子宮、肝臓、脳及び腎臓も含まれる。
アンギオテンシンIIの数種の発見されている作用としては、平滑筋収縮が知られている。血管壁で平滑筋細胞の収縮刺激は血管収縮を生じ、高血圧症を引き起こす。ほとんどの高血圧治療はいずれにせよアンギオテンシン作用の阻害等である。平滑筋は、又、例えば、子宮や胃腸管、その他の部位でも生じる。
更に、アンギオテンシンIIは副腎皮質によるアルドステロンの分泌を刺激する。アルドステロンは主として腎臓に作用してナトリウムの保持を促進する作用をする効能のホルモンであり、中でも、血管系に直接作用するアンギオテンシンの高血圧症効果を高める。
アンギオテンシンIIは脳の種々の部位に作用することが知られていて、動物での作用の一つは渇き及び飲水行為の調節である。
又、アンギオテンシンは動脈壁における平滑筋の成長を促進し、血管系における栄養の効果を持つ。更に、例えば血管新生による新しい組織の発育を生じるような脈管形成が考えられる。
細胞中のアンギオテンシンIIの作用は二つの重要な細胞内シグナル機構に介在する。このホルモンがレセプターに結合する時、ホスフアチジル・イノシトールと呼ばれる細胞膜の構成成分に作用する特殊な酵素ホスホリパーゼＣを活性化する。ホスフアチジル・イノシトールはこの酵素によりイノシトール三燐酸（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）と呼ばれる二つの成分に分けられる。いずれの作用も標的細胞内で更に引き起こされる効果に含まれる。ジアシルグリセロールがプロテインキナーゼＣと呼ばれる別の特殊な酵素を刺激するのに対して、イノシトール三燐酸は細胞内サイトゾールのカルシウム濃度を増加する刺激を与え、次々に他の細胞反応を呼び起こす。
アンギオテンシンIIの知られている効果のほとんどは、７回膜貫通領域レセプターであるアンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプ経由で生じることが発見されている。このレセプターは種々の組織からクローン化されて配列され、しかも、予想分子量約４０ｋＤを有する３５９アミノ酸のポリペプチドであることが分かっている（ベルンシュタイン及びアレキサンダー、（１９９２）、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３、３８１−３８６）。光親和性標識及び交差試薬を使用する研究は、細胞外領域内にアスパラギン残基のグリコシル化に影響を及ぼすかもしれない、それぞれ、近似的に６５ｋＤ及び１１６ｋＤの成熟レセプターの分子量が示唆されている。
ポリクローナル抗体及び抗遺伝型抗体がすでにアンギオテンシンIIレセプターに調整されていた場合、これらのことから、このレセプターに対するモノクローナル抗体の調整に誰かが成功する日までに、レセプターが、それぞれ、６０乃至９５ｋＤ、及び６３ｋＤの分子量を有することは自明のことであった。
ガルシア等（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，５０２−５０７，（１９９２））はホルモンであるアンギオテンシンIIそのものに対するモノクローナル抗体の調整について記載していた。
コーラウド（Ｃｏｕｒａｕｄ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８（４），１１６４−８，（１９８７））は、或ろ抗アンギオテンシンIIモノクローナル抗体で免疫付与したラビットから抗遺伝子型血清の調整を記載していた。フィスター等（Ｐｆｉｓｔｅｒ，Ｒｅｑｕｌ．Ｐｅｐｔ．，４４（２），１０９−１７，（１９９３））は、アンギオテンシンIIレセプターに結合した抗遺伝子型抗体の調整を記載していた。アンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプに対するポリクローナル抗体の調整はゼレズナ等（Ｚｅｌｅｚｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８３（２），７８１−７８８，（１９９２））、及びパクストン等（Ｐａｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２１（６），１０６２−１０６５，（１９９３）））により記載されていた。リチャード等（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，２１（６），１０６２−１０６５，（１９９３）））がモノクローナル抗体の調整に言及せずにラット血管ＡＴ1レセプター配列のアミノ酸１４−２３に対して増加する抗血清に全く言及していないのに対して、フイリップス等（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６４（６）９８９−９５，（１９９３））はＡＴ1レセプタータンパク質のアミノ酸２２５−２５７へのポリクローナル抗体の調整を記載していた。
ラット血管平滑筋ＡＴ1レセプターのアミノ酸残基８〜１７に相当する合成ペプチドを持つ免疫付与マウスによりマーフィー、Ｔ．Ｊ等、（（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ、３５１、２３３−２３６）、及び、その後のマウスミエローマ細胞を持つ免疫マウス由来の融合脾細胞により、新規ハイブリドーマ細胞株が生産され、アンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプに対するモノクローナル抗体を分泌することが、現在判明している。
発明の開示
発明の第一の見解によれば、アンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプに対して結合できるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統株を提供する。ハイブリドーマ細胞系統株は、ブダペスト条約に基づき、英国ポートンダウン動物細胞培養物欧州収集所に１９９３年７月２２日に寄託番号９３０７２１１７で寄託されたこの様なモノクローナル抗体を分泌する。
この様なハイブリドーマ細胞系統株は、ラット血管平滑筋ＡＴ1レセプターのアミノ酸残基８〜１７に特異的に結合する抗体を生産する。しかしながら、このモノクローナル抗体はラットの組織中と同様にウシ及びヒト組織中でもＡＴ1レセプターに対して結合することが発見された。これゆえ、アミノ酸残基のこの配列が発見される日まで、全ほ乳類のＡＴ1レセプターにおいて保存され、更に、クローン化されている。これ故、ハイブリドーマ細胞系統株は、以下のアミノ酸配列：
0003727946.tif 000002
を有するペプチドに特異的に結合する抗体を生産する。
発明の第二の見解によれば、アンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプに結合するモノクローナル抗体が提供される。この様なモノクローナル抗体は、上記アミノ酸配列を有するペピチドに特異的に結合する、ほ乳類ＡＴ1レセプターのアミノ酸残基８〜１７に、特異的に結合する。
本発明によれば、ハイブリドーマ細胞系統株は、当業者に容易に成しうる技術により、同系統繁殖マウスに免疫付与することにより調整されうる（コーラー及びマイルシュタイン、（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５−４９７）。ペプチドは公表されたラット血管平滑筋ＡＴ1レセプターのアミノ酸残基８〜１７（細胞外）に相当するものが合成された。このペプチドは、この時、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合し、免疫付与したマウスに使用される。
次に、マウス脾臓に結合したペプチド−ＢＳＡのブースター注入物を除き、脾細胞をマウスミエローマに結合させた。ミエローマー白血球混合ハイブリッドは適当な細胞培養培地でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン中で生育して選択した。
アンギオテンシンIIレセプターのＡＴ1サブタイプに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統株の存在は、まず第一に、ラット肝細胞懸濁液に結合する様にしたハイブリドーマ条件培地のスクリーニングによって検出された。この様な結合陽性はラビット抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体に結合したペルオキシダーゼを用いて検出した。次に、最初のスクリーニングは、陽性結果を示す細胞培養物を、ラビットウサギ抗マウス（IgG）抗体結合蛍光物質を用いて、凍結切片及び懸濁細胞塗抹標本の両方において、ラット副腎の糸球に特異的に結合する様に増殖して試験した。ハイブリドーマによって生じた完全な抗ＡＴ1レセプターモノクローナル抗体は、形質転換したＣｏｓ−７細胞によって一次的に発現されたラットＡＴ1Aレセプターに結合することにより確認できた。
本発明のモノクローナル抗体は種々の波長で蛍光を示す化合物とつなぐことができ、体組織中のＡＴ1レセプターの位置及び分布は免疫組織学的技術により決定しうる。例えば、乳ガンで発見されたこのモノクローナル抗体ＡＴ1レセプターの用途は、これ故、抗体が癌診断分野に使用できることである。
更に、本発明のモノクローナル抗体を用いて、アンギオテンシンIIの未知の作用部位が発見された。それはラットとヒトの精子の尾部の両方でアンギオテンシンIIレセプターを発現するものとして発見され、その発現の規則性は、雄の生殖力に陽性の効果を持つそのホルモンが精子の運動性の制御において大変重要で有り得る可能性を生理学的に導く。本発明のモノクローナル抗体は、これゆえ、避妊用に使用されるだけでなく、精子運動能力を研究し測定するために、標準的ラジオイムノアッセイや酵素結合イムノソルベントアッセイに使用できる。
本発明の別の見解によれば、検出可能な標識を付した本発明のモノクローナル抗体からなる診断試験キットが提供される。この様な検出可能な標識には、ラジオアイソトープ、酵素及び蛍光化合物が含まれる。
生存細胞に対する本発明のモノクローナル抗体の付加はＩＰ３応答を生ずるアンギオテンシンIIを抑制するが、ＰＫＣ活性における作用を持たない。これゆえ、アンギオテンシンIIにより刺激された二つの主要な信号伝達経路のひとつだけに特異的に高い相互作用をする。この性質は、治療への適用と同様に、これら二つの経路間の結果を区別するために実験的に使用されることができる。モノクローナル抗体は、例えば、月経の規則性及び流産の防止のための子宮収縮の調節と同様に、血管収縮及びこれによる高血圧の治療に使用しうる。
しかも、このモノクローナル抗体は免疫組織学的及び免疫電子顕微鏡的の両方に使用可能で、イムノブロッテイング及び免疫細胞学的染色に適用できる。
本発明は以下の実施例により説明する。
発明を実施するための最良の形態
＜実施例１＞
（ペプチド合成）
ペプチドは、公表されているラットの血管平滑筋ＡＴ1レセプターのアミノ酸残基８−１７（細胞外）に相補的に合成し、Ｎ−スクシミニジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）ブリッジ経由で、次にカルボキシ末端又はアミノ末端のそれぞれの位置で、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する結合を容易にするシステイン残基の付加をした。合成は自動シンセサイザーでＦＭＯＣ化学を用いて実施され、次に逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定された。ＦＭＯＣ化学はペプチド合成にフッ化メトキシカルボニル基保護アミノ酸を用いる。
（イミュノジェン調整及び免疫付与）
ペプチド−ＢＳＡ結合物を調整するために、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有するガス抜きした１００ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液中（ＳＰＳＣ緩衝液、ＰＨ７．５）で、０．２２ｍＭのＢＳＡ溶液は９：１（ｖ／ｖ）の比で（無水エタノール中で）２０ｍＭのＳＰＤＰを用いて、室温で６０分間インキュベーションすることにより活性化し、次にＳＰＳＣ緩衝液中で透析した。又、１．２ｍｌＳＰＳＣ緩衝液中で３ｍｇペプチドは６０分間室温で６ｍｌの活性化したＢＳＡを用いてインキュベートされ、次に、更に、ＳＰＳＣ緩衝液で透析した。Ｂａｌｂ  Ｃ／ｃマウス（８週齢）はＳＰＳＣ緩衝液（約４００μｇ／ｍｌのペプチドを示す）中で０．２ｍｌペプチド−ＢＳＡ結合物の１：１懸濁液及びフロインドの完全アジュバントを用い、皮下注射することにより免疫付与された。これは、フロインドの不完全アジュバント中のペプチド結合物の同じ懸濁液を用い、４週間後ブースター投与が続けられる。４日後、マウス脾臓が取り除かれる。
（ハイブリドーマの生産）
Ｓｐ２／０−Ａｇ−１４マウスミエローマ細胞は、２０％（ｖ／ｖ）胎児牛血清（ＦＢＳ）に追加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養された。これらミエローマ細胞は、免疫付与したマウスから得られた脾細胞と併せ、また、融合ハイブリドの形成は４０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコールを用いて促進した。ミエローマ−白血球混合ハイブリッドは、２０％ＦＢＳ含有するＲＰＭＩ及び１３．６ｍｇ／ｌヒポキサンチン、０．１９ｍｇ／ｌアミノプテリン及び３．８８ｍｇ／ｌチミジンを用いる９６−ウエル・プレート（ＨＡＴ）で培養することにより選択される（ガルファー及びマイルシュタイン、（１９８１）、Ｍｅｔｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６））。
１４日間のＨＡＴ選択後、ポリ−Ｌ−リジン塗膜９６−ウエル・プレート上で、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）中の３．７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを用いて、完全な無血清倍地で洗って固定した、ラット肝細胞懸濁液に結合する様に、ハイブリドーマ条件倍地を取り除きスクリーニングした。ラビット抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体に結合したペルオキシダーゼが陽性結合を検出するために使用したが、これはイミダゾールを含有するジアミノベンジデン（ＤＡＢ）試薬を用いて、茶色の着色の様に、視覚化された。初期スクリーニング後、陽性ウエルの細胞を２４ウエル−プレート中で増殖し、２０％ミオクローン（英国ユーエックスブリッジ、ギブコＢＲＬから得た）を含有するＲＰＭ１６４０、及び１３．６ｍｇ／ｌヒポキサンチン及び０．１９ｍｇ／ｌチミジンを、１０％ｖ／ｖ胸腺細胞条件倍地に補って培養した。又、増殖倍地から条件倍地は、Ｓ．Ｍ．レアード等（Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ（Ｃｏｐｅｎｈ．）（１９８８），１９，４２０−４２６））によって記載されたラビット抗−マウスＩｇＧ結合蛍光物質を用いて、凍結切片及び懸濁細胞塗抹標本の両方のラット副腎糸球に特異的に結合する様に試験された。更に、糸球特異的個体群はＪ．Ｗ．ゴデイング（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）、３９、、２８５−３０６）によって記載の限界希釈によりクローン化された。
（形質転換したＡＴ1レセプターの調整）
ラットＡＴ1AレセプターはＳ．バーカー等（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、（１９９３）、１９２、３９２−３９８）によって記載の様にＣＯＳ−７細胞中に一次的に発現された。細胞は、１μｇ／ｍｌアプロチニン含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７・４）、１μｇ／ｍｌダイズ・トリプシン・インヒビター、３０μｇ／ｍｌフッ化フェニル・メチル・スルフォン酸、３００μｇ／ｍｌエチレン・ジアミン・テトラ酢酸ＥＤＴＡ中で、氷を用い、超音波処理し、又、４℃で５分間８００ｇで遠心する。得られた上清は４℃で１時間１００，０００ｇで遠心分離した。又、微粒子沈澱画分は上記緩衝液で再懸濁し、２５μｇ当りタンパク質１００μｇになる様に希釈した。
（スクリーニング及びクローニング）
更に、スクリーニングし、クローニングした調整物は、可溶化膜タンパクに対し、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００（商標）の存在下、４℃、３０分間インキュベートされる。偽形質転換ＣＯＳ−７細胞も同様に処理された。
（ゲル電気泳動及びイムノブロッテイング）
上述の様に調整し、ＣＯＳ−７細胞の膜画分から得られた１００μｇ可溶化タンパクを各ウエル中に入れ、ソジウム・ドデシル・硫酸・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）により８％ゲル上で、２００Ｖ、約４時間実施して、タンパク質を分離した。分子量マーカー（１０６ＫＤ〜１８．５ＫＤ）も加えられた。又、タンパク質は、２００ｍＡで一夜、ハイボンド・エンハンスト・ケミルミネセンス（ＥＣＬ）ニトロセルロース膜に対して電気泳動した。この膜は、室温で一時間１０％（ｗ／ｖ）ミルク・タンパク質を用いて、阻害された。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０（商標）含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で完全に洗浄された後、膜は、一時間、室温で、一次抗体（ＰＢＳ−Ｔ中１：２０ｖ／ｖ）と共にインキュベートした。膜は、インキュベート前にＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔで１：５０００に希釈した西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗−マウスＩｇ抗体を用いて、室温で、更に一時間インキュベートする。更に、次に、ＰＢＳ−Ｔを用いた洗浄により、膜をＥＣＬ試薬を用いて処理し、ハイパーフイルムに暴露することによりケミルミネセンスを検出した。
（結果）
関与するハイブリドーマクローンのうちの一つが抗体を分泌し、これは、英国ポートン・ダウンの欧州動物細胞培養物収集所に細胞系統株寄託番号９３０７２０１１７号として、寄託されている。この細胞系統株が本当に抗体を生産したかどうかを確かめるために、ラット副腎ＡＴ1Aレセプター相捕ＤＮＡを用いて形質転換したＣＯＳ−７細胞の膜画分から得られた可溶化タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動及びイムノブロッテイングでＡＴ1Aレセプターを認識した。第一図は、分子量約４０〜６０ＫＧを有する二つの顕著な蛋白種を認識するこの細胞系統株により生産される抗体を示す。これらは、偽形質転換ＣＯＳ−７細胞対照試料と試料とを比較して検出したものではなかった。
＜実施例２＞
（精子運動性を制御するモノクローナル抗体の使用）
ヒト精子試料は、ニューハム病院不妊治療診療科に通っている１２人の健常人志願者及び患者から得た。試料をアールの塩及びグルタミン酸を用いた改変最少倍地（ＨＥＭ）中に懸濁し、オリンパスＡＲＴＦ−２ビデオカメラを取り付けたオリンパス逆相顕微鏡使用のマックラー・チャンバーで観測する。映像面はビデオテープ上に記録され、運動度パーセンテージを評価する。
視野に入る全精子を計数するためのフレームを凍結し、又、その時、「フォワード・モード」で非運動性精子の計数、例えば、観察時間内にマクラー・チャンバー格子に隣接する区域（１００μｍ）へ移動しなかった精子の計数により、運動度パーセンテージをビデオテープの録音再生で評価した。実際上、精子が完全に非運動性であるか、自由に進行できるかについて、この定義の厳格な使用の必要性は、全くなかった。
試料の一群は、対照試料として保管された。第二群として、アンギオテンシンIIアミド（１０ｎｍｏｌｅ／ｌ））が添加された。第三群としては、アンギオテンシンが添加される前に、ＡＴ1レセプターに対するモノクローナル抗体で処理された。
速度は、マクラー・チャンバーの格子を通過する運動性精子のフォワード・モードでのタイミング及びマニュアルでのタイミングにより測定した。
第二図（ａ）から、モノクローナル抗体の添加がアンギオテンシンIIにより抑制される時、アンギオテンシンIIにより著しく刺激を受けた精子は、未処理対照試料に比べて前進進行速度が刺激されたことが分かる。
第二図（ｂ）から、運動性精子のパーセンテージへの影響として同様の結果を得た。
＜実施例３＞
（ラット子宮中の平滑筋収縮におけるモノクローナル抗体の効果）
子宮を３５０ｇウイスター・ラットから切除し、最少実質倍地（ＨＥＭ）におかれ、室温に保つ。器官の組織片を取り除き、或る角質構造から切り出された３ｃｍ長の組織片は、ベイサル・アイソトニック・トランスデューサー上で、アナログ−デジタル・コンバーターに対して結びつける、縫合手段を用いて結合した。結果のシグナルを、チャート・ソフトウエアー使用のコンピューターにより分析した。約１ｇほどの少量の塩基性等張液を組織の緩みを取るために加えた。又、組織は、３７℃に維持してある器官分離用湯槽中のインキュベーション・メデイアム（ＭＥＭ）に全体を浸し、一定の幅の規則的収縮がみつかるまでインキュベートした。新鮮倍地を使用し、組織を、又、再び平衡状態にした。アンギオテンシンIIの影響、及び、筋収縮の幅及び速度におけるモノクローナル抗体の影響は、これらの試薬を直接器官に添加することにより見積った。組織は、異なる試験条件で改変した数種の倍地において、洗浄した。
第三図（ａ）から、０．１ｎｍｏｌ／ｌのアンギオテンシンIIを添加した時、矢印（Ａ）の様に、続いて起こる子宮収縮の振幅及び周期が顕著に増加したことを示す。
第三図（ｂ）から、矢印（Ｂ）の様に、次のモノクローナル抗体の添加が、子宮収縮の速度及び強度をアンギオテンシン刺激レベル以下というだけでなく、基準レベル以下に抑制したことが分かる。
配列表
（１）一般情報
▲１▼  出願人
（Ａ）氏名：クイーン・メアリー・アンド・ウエストフィールド・カレッジ
（Ｂ）通り：マイル・エンド・ロード
（Ｃ）都市：ロンドン
（Ｅ）国：英国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：イ−１  ４エヌエス
（Ａ）氏名：ギャビン・ポール、
クイーン・メリー・アンド・ウエストフィールド・カレッジ
（Ｂ）通り：マイル・エンド・ロード
（Ｃ）都市：ロンドン
（Ｅ）国：英国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：イ−１  ４エヌエス
（Ａ）氏名：バーカー・スチワート
クイーン・メアリー・アンド・ウエストフィールド・カレッジ
（Ｂ）通り：マイル・エンド・ロード
（Ｃ）都市：ロンドン
（Ｅ）国：英国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：イ−１  ４エヌエス
▲２▼  発明の名称：新規なハイブリドーマ及びこれによって生じるモノクローナル抗体
▲３▼  配列数：１
▲４▼  コンピューター判読可能様式：
（Ａ）媒体：フロッピー・デイスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換性
（Ｃ）オペレーテイング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエアー：ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ
＃１．０、バージョン  ＃１．２５（ＥＰＯ）
▲５▼  最新出願データー：
出願番号：ＰＣＴ／ＧＢ９４／
▲６▼先願データー：
（Ａ）出願番号：ＧＢ  ９３１９８７７．８
（Ｂ）提出日：２７−ＳＥＰＴ−１９９３
（２）ＳＥＱ  ＩＤ番号の情報：１：
▲１▼配列の特徴
（Ａ）鎖長：
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）ストランデドネス：未知
（Ｄ）トポロジー：線形
▲２▼分子型：ペプチド
▲４▼オリジナル・ソース
（Ｈ）細胞株  ハイブリドーマ
▲６▼配列描写  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １：
0003727946.tif 000003
【図１】
0003727946.tif 000004
【図２（ａ）】
0003727946.tif 000005
【図２（ｂ）】
0003727946.tif 000006
【図３（ａ）】
0003727946.tif 000007
【図３（ｂ）】
0003727946.tif 000008