(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一のループ領域を含むステム−ループ構造を有する少なくとも６０ヌクレオチド長の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物であって、該ループ領域は、ターゲットｍＲＮＡ領域に相補的である一以上のアンチセンス配列を有しかつ２本鎖のステム領域に結合する、共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項２】
ターゲットｍＲＮＡ領域に相補的である複数のアンチセンス配列を有する、請求項１に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項３】
該ターゲットｍＲＮＡ領域は、異なるｍＲＮＡ上に存在する、請求項２に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項４】
該ターゲットｍＲＮＡは、異常な遺伝子発現によって疾患を引き起こすタンパク質をコード化する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項５】
該疾患を引き起こすタンパク質は、腫瘍を引き起こすタンパク質である、請求項４に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項６】
ループ領域は、２本鎖のステム領域によって他のループ領域に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項７】
少なくとも１１６ヌクレオチド長である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項８】
該腫瘍を引き起こすタンパク質は、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂまたはｋ−ｒａｓである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項９】
（ｉ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物；および（ｉｉ）リポソームを有する組成物。
【請求項１０】
該リポソームは、カチオン性リポソームである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物；および（ｂ）該共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物に特異的に結合するｍＲＮＡを有する組成物。
【請求項１２】
（ｉ）（ａ）１本鎖の付着末端領域、及び（ｂ）ターゲットｍＲＮＡ領域に相補的である一以上のアンチセンス配列を有する複数の非共有結合で閉環されたＤＮＡ化合物を合成し；さらに
（ｉｉ）該非共有結合で閉環されたＤＮＡ化合物を一緒に連結して、共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物を形成する
段階を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物の製造方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞の成長を阻害するのに使用される請求項１〜８のいずれか１項に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項１４】
該腫瘍細胞は、前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０、慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２、または結腸直腸腺癌細胞ＨＴ−２９である、請求項１３に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項１５】
少なくとも一のループ領域を含むステム−ループ構造を有する共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物であって、該ループ領域は、ターゲットｍＲＮＡ領域に相補的である複数のアンチセンス配列を有し、かつ２本鎖のステム領域に結合する、共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項１６】
該ターゲットｍＲＮＡ領域は、異なるｍＲＮＡ上に存在する、請求項１５に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１５または１６に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物；および（ｉｉ）リポソームを有する組成物。
【請求項１８】
（ｉ）（ａ）１本鎖の付着末端領域、及び（ｂ）ターゲットｍＲＮＡ領域に相補的である一以上のアンチセンス配列を有する複数の非共有結合で閉環されたＤＮＡ化合物を合成し；さらに
（ｉｉ）該非共有結合で閉環されたＤＮＡ化合物を一緒に連結して、共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物を形成する
段階を有する請求項１５または１６に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物の製造方法。
【請求項１９】
腫瘍細胞の成長を阻害するのに使用される請求項１５または１６に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項２０】
該腫瘍細胞は、前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０、慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２、または結腸直腸腺癌細胞ＨＴ−２９である、請求項１９に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項２１】
該ターゲットｍＲＮＡは、異常な遺伝子発現によって疾患を引き起こすタンパク質をコード化する、請求項１７または１８に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【請求項２２】
該疾患を引き起こすタンパク質は、腫瘍を引き起こすタンパク質である、請求項２１に記載の共有結合で閉環されたアンチセンスＤＮＡ化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ターゲット配列の特異性及びヌクレアーゼ活性に対する安定性を改善するためのより小さい２次構造を有するｍＲＮＡ領域に対する一以上のアンチセンス配列を含む新規なアンチセンスオリゴに関するものである。
【０００２】
特に、本発明は、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃまた、ｋ−ｒａｓなどの多様な癌原遺伝子のｍＲＮＡに対する多重ターゲットアンチセンス配列(multiple target antisense sequence)を含む共有結合で閉環された多重アンチセンス（ＣＭＡＳ）(covalently-closed multiple antisense)−オリゴに関するものである。このＣＭＡＳ−オリゴは、相補的プライマーを用いたライゲ−ションにより、閉環された型を形成するように構築される。
【０００３】
さらに、本発明は、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃまた、ｋ−ｒａｓなどの多様な癌原遺伝子のｍＲＮＡに対する多重ターゲットアンチセンス配列(multiple target antisense sequence)を含むリボン型のアンチセンス（ＲｉＡＳ）(ribbon-type antisense)−オリゴに関するものである。このＲｉＡＳ−オリゴは、双方の主な末端で相補的配列を用いたライゲ−ションにより、ステム−ループ(stem-loop)構造を形成するように構築される。
【０００４】
本発明は、異常な遺伝子発現(aberrant gene expression)により引き起こされる癌、免疫疾患、感染性疾患、及び他のヒトの疾患の処置を目的とする新規な型のＡＳ−オリゴを含む薬剤組成物に関するものである。
【０００５】
背景
アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotides、以下、「ＡＳ−オリゴ」と称する）は、配列に特異的に遺伝子の発現の抑制することによって遺伝子の機能研究に重要である(Tompson, C.B.,et al., Nature, 314, 363-366, 1985)。また、腫瘍の発病と進行に関与する遺伝子の異常な発現を除去する分子的アンチセンス剤を開発するために、多くの努力が重ねられてきた(Chavany, C., et al.,Mol. Pharm., 48, 738-746, 1995)。
【０００６】
合成ＡＳ−オリゴは、設計及び合成を容易にするために、さらには疾患を引き起こす遺伝子に対する潜在的な特異性のために、広く利用されて来た。長さの短い（１３〜３０ヌクレオチド）のＡＳ−オリゴが、ワトソン−クリック塩基対合(Watson-Crick base pairing)を形成することによって相補的配列と結合するように設計され、これにより、特異性及び親和性が提供される。遺伝子発現の阻害は、ＤＮＡ−ｍＲＮＡデュプレックスの形成後のＲＮａｓｅＨ活性またはリボソーム複合体(ribosomal complex)の結合の立体障害を介して達成されると考えられる(Dolnick, B.J., Cancer Inv., 9, 185-194,1991)。また、ＡＳ−オリゴは、ゲノムＤＮＡと結合してトリプルヘリックス(triple-helix)の形成または主な目的であるデュプレックスオリゴ−デコイを用いるまたはゲノムＤＮＡのプロモーター領域と競合させることによって遺伝子発現を阻害する努力もなされてきた(Young, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 10023-10026, 1991)。
【０００７】
ＡＳ−オリゴの効能は、いくつかの動物モデル及びヒトの疾患に関する最近の臨床研究を通じて確認された。ホスホロチオエート（phosphorothioate、以下、「ＰＳ」と称する）ＡＳ−オリゴを１０日間、静脈注射すると、家鴨の肝臓からＢ型肝炎ウイルスＤＮＡが消えた(Offenserger, W.B., et al.,EMBO J., 12, 1257-1262, 1993)。アンギオテンシノゲンに対するＡＳ−オリゴは、高血圧の近親交配されたラットに注射すると、血圧を下げるのに有効であることが分かった(Tomita, N., et al., Hypertension, 26, 131-136, 1995)。ヌードマウスの皮下にタンパク質キナーゼＡのＲＩαサブユニットに対するホスホロチオエートＡＳ−オリゴを適用すると、腫瘍の成長が停止した(Nesterova, M., et al., Nat. Med., 1, 528-533, 1995)。また、様々な疾患を引き起こす異なる遺伝子に対するＡＳ−オリゴを使用した様々な臨床試験により、卵巣癌及びクローン病で結果が得られつつある(Roush, W., Science, 276, 1192-1193, 1997)。
【０００８】
しかしながら、多くの研究者からの結果が必ずしも明瞭ではなく、矛盾することもあるため、遺伝子に対するその配列の特異性及びゆえに疾患に関する可能性という利点を有するＡＳ−オリゴの高い期待は、しばしば失望に終わった。ＡＳ−オリゴの著しい問題点は、ヌクレアーゼに対する不安定性及び効率の悪い細胞吸収であった。
【０００９】
ＡＳ−オリゴの安定性は、ヌクレアーゼに対する安定性を増加させるために使用されるＰＳ−及びメチルホスホネート（methylphosphonate、以下、「ＭＰ」と称する）−オリゴ等の修飾されたオリゴを使用することによりある程度改善された。しかしながら、修飾されたヌクレオチドは、それぞれ、配列特異性の欠如やＲＮａｓｅＨに対する非感受性という問題がそれ自体にある。さらに、加水分解されたヌクレオチドの再環化時に望ましくない突然変異を導入される懸念が長く存在する。
【００１０】
ＡＳ−オリゴは、有効である相補的なターゲット配列に結合する。ｍＲＮＡの全ての配列がＡＳ−オリゴに対して同一な接近性をみせるわけではない。ＡＳ−オリゴの等しくない結合は、少なくても部分的に、ターゲットｍＲＮＡの２次および／または３次構造によって説明されうる(Gryaznov, S.,et al., Nucleic Acids Res., 24, 1508-1514, 1996)。したがって、より小さい２次構造を持つ領域がＡＳ−オリゴでは容易に標的にされると考えられる。
【００１１】
ＡＳ−オリゴの安定性を増加させるために、本発明者らは、ステム−ループ構造または共有結合で閉環された多重アンチセンス配列を有するＡＳ−オリゴを構築するために、ｍＲＮＡの２次構造を予測するコンピュターシミュレーションを使用してより良いターゲット部位を探し出す合理的な方法を考案した。
【００１２】
ｃ−ｍｙｂ遺伝子に対するＡＳ−オリゴは、腫瘍細胞の成長を阻害するのに使用可能である。
【００１３】
ｃ−ｍｙｂ癌原遺伝子によりコード化される、Ｍｙｂタンパク質は、主に、核内に位置し、細胞周期間のＧ１／Ｓ期の移行に転写調節因子として機能する。癌原遺伝子ｃ−ｍｙｂは、造血細胞の増殖と分化に重要な役割を果たす。造血細胞は、ｃ−ｍｙｂの分化発現(differential expression)を示し、分化の最後の段階では、ほとんど発現を示さない(Melani, C., et al., Cancer Res., 51, 2897-2901, 1991)。白血病細胞では、ｃ−ｍｙｂが過剰発現(overexpression)することがしばしば分かった。
【００１４】
ＡＳ−オリゴによるｃ−ｍｙｂの発現の遮断は、前骨髄癌(promyelocytic cancer)細胞系ＨＬ−６０及び慢性骨髄性白血病(chronic myelogenous leukemia)細胞系Ｋ５６２の成長を抑制することが報告される(Kimura, S., et al., Cancer Res., 55, 1379-1384, 1995)。しかしながら、上記実験で使用されたｃ−ｍｙｂ  ＡＳ−オリゴは、部分的な効果があることが示される。上記実験で使用されたｃ−ｍｙｂ  ＡＳ−オリゴは、ホスホジエステル（以下、「ＰＯ」と称する）−オリゴまたはＰＳキャップド−オリゴ(PS capped-oligo)である(Anfossi, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3379-3383, 1989)。これらのオリゴ分子、特にＰＯ−オリゴは、安定でなく、部分的なアンチセンス効果を説明する可能性がある。
【００１５】
合理的なターゲット部位探索により選択された、改善された安定性を併せ持つＡＳ−オリゴは、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡを完全に除去することに使用され、これにより白血病細胞の成長をより良好に抑制することができる。近年、ヒトの悪性疾患(malignancies)に対するＡＳ−オリゴストラテジーを基礎とする分子治療(molecular therapeutics)の開発に非常な興味が集まっている。したがって、白血病細胞の成長を完全に遮断する改善されたｃ−ｍｙｂ  アンチセンス分子を発見することが望まれている。
【００１６】
したがって、より良好な安定性及びアンチセンス効果を有する新規な構造を有するＡＳ−オリゴを開発するために、本発明者らは、好ましい実施態様において２次構造分析からｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの８つの部位を選択し、選択されたｃ−ｍｙｂのアンチセンス配列を組み合わせて新規な大きなアンチセンス分子、即ち、共有結合で閉環された多重アンチセンス（covalently-closed multiple antisense、以下、「ＣＭＡＳ」と称する）−オリゴならびにループ及びステム構造を有するリボン型のアンチセンス（ribbon-type antisense、以下、「ＲｉＡＳ」と称する）−オリゴを構築した。ゆえに、本発明者らは、これらの新規なＡＳ−オリゴがヌクレアーゼに対して安定であり、遺伝子発現抑制する有意な特異性を示すことを示した。
【００１７】
発明の要約
本発明の目的は、ターゲット配列に対する特異性及びヌクレアーゼ活性に対する安定性を改善させるためにより小さい２次構造を有するｍＲＮＡ領域について一以上のアンチセンス配列を含む新規なＡＳ−オリゴを提供することである。
【００１８】
本発明によれば、前記目的及び利点が容易に得られる。
【００１９】
本発明のこのような概念においては、本発明は、より小さい２次構造を有するｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、またはｋ−ｒａｓのｍＲＮＡ領域から選択されたアンチセンス配列を提供する。
【００２０】
本発明は、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡに対する多重アンチセンス配列を含む共有結合で閉環された多重アンチセンス（ＣＭＡＳ）−オリゴを提供する。このＣＭＡＳ−オリゴは、相補的プライマーを用いたライゲ−ションにより閉環された型を形成するように構築される。
【００２１】
本発明はまた、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡに対する多重アンチセンス配列を含むリボン型のアンチセンス（ＲｉＡＳ）−オリゴを提供する。このＲｉＡＳ−オリゴは、多重アンチセンス配列を含む２つのループ及び双方の５’−末端の相補的配列を用いたライゲ−ションによって構築される２つのループを結ぶステムから構成される。加えて、本発明は、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡまたはｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡに対する多重アンチセンス配列を含むＲｉＡＳ−オリゴを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、癌、免疫疾患、感染性疾患、及び異常な遺伝子発現により引き起こされる他のヒトの疾患の処置を目的とする新規な型のＡＳ−オリゴを含む薬剤組成物を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる目的及び利点は以下に示されるであろう。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１は、ｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴの構築に関するスキームを示すものである。
【００２５】
図２は、ＣＭＡＳ−オリゴの電気泳動の移動パタ−ンを示すものである。
【００２６】
Ａは、５％メタファー(Metaphor)アガロ−スゲルで分析されたオリゴであり、この際、レーン１；サイズマーカー、レーン２；１４ｍｅｒのライゲ−ションプライマー、レーン３；リニアな６０ｍｅｒのオリゴ、及びレーン４；ＣＭＡＳ−オリゴ。
【００２７】
Ｂは、変性ポリアクリルアミドゲルにおけるリニアな及び共有結合で閉環されたオリゴの安定性を示すものであり、この際、
レーン１及び３；エキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理なし、ならびにレーン２及び４；エキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理。
【００２８】
図３は、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの構築に関するスキームを示すものである。
【００２９】
図４は、ＲｉＡＳ−オリゴの電気泳動の移動パタ−ンを示すものである。
【００３０】
Ａは、１５％変性アガロ−スゲルで分析されたオリゴであり、この際、
レーン１；５８ｍｅｒのＭＩＪ−７８分子、及びレーン２；１１６ｍｅｒのＲｉＡＳ−オリゴ。
【００３１】
Ｂは、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理時のＭＩＪ−７８及びＲｉＡＳ−オリゴの安定性試験を示すものであり、この際、
レーン１及び３；エキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理なし、ならびにレーン２及び４；エキソヌクレアーゼＩＩＩによる処理。
【００３２】
図５は、血清の存在下でのリニアな及びＣＭＡＳ−オリゴの分解パターンを示すものである。
【００３３】
Ａは、リニアなＡＳ−オリゴの安定性試験を示すものであり、この際、
レーン１；血清未処理（ネガティブコントロール）、レーン２；５０％生血清(raw serum)による処理、レーン３；ＦＢＳ処理、及びレーン４；ＣＳで、それぞれ２４時間。
【００３４】
Ｂは、ＣＭＡＳ−オリゴの安定性試験を示すものであり、この際、
レーン１；血清未処理（ネガティブコントロール）、レーン２；５０％生血清(raw serum)による処理、レーン３；ＦＢＳ処理、及びレーン４；ＣＳで、それぞれ２４時間。
【００３５】
図６は、血清の存在下でのリニアな及びＲｉＡＳ−オリゴの分解パターンを示すものである。
【００３６】
Ａは、ＭＩＪ−７８分子の安定性試験を示すものであり、この際、
レーン１；血清未処理（ネガティブコントロール）、レーン２；５０％生血清(raw serum)による処理、レーン３；ＦＢＳ処理、及びレーン４；ＣＳで、それぞれ２４時間。
【００３７】
Ｂは、ＲｉＡＳ−オリゴの安定性試験を示すものであり、この際、
レーン１；血清未処理（ネガティブコントロール）、レーン２；５０％生血清(raw serum)による処理、レーン３；ＦＢＳ処理、及びレーン４；ＣＳで、それぞれ２４時間。
【００３８】
図７は、ＨＬ−６０細胞におけるｃ−ｍｙｂ発現に関するｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【００３９】
Ａは、全ＲＮＡ及び２つのｃ−ｍｙｂプライマーを使用して行なったＲＴ−ＰＣＲを示すものであり、この際、
レーン１；６０ｍｅｒのＣＭＡＳ−オリゴ０．３μｇ＋リポフェクチン(lipofectin)１μｇ、レーン２；６０ｍｅｒのＣＭＡＳ−オリゴ１μｇ＋リポフェクチン１μｇ、レーン３；スクランブルされた(scrambled)ＡＳ−オリゴ１μｇ＋リポフェクチン１μｇ。
【００４０】
Ｂは、全ＲＮＡ及び２つのｃ−ｍｙｂプライマーを使用して行なったＲＴ−ＰＣＲを示すものであり、この際、
上段；ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡのハイブリッド形成されたＲＴ−ＰＣＲバンド、及び下段；β−アクチンｍＲＮＡのハイブリッド形成されたＲＴ−ＰＣＲバンド。
【００４１】
図８は、ＨＬ−６０細胞におけるｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの発現に関するｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【００４２】
Ａは、２つのｃ−ｍｙｂプライマーを用いて全ＲＮＡで行なわれるＲＴ−ＰＣＲを示すものであり、この際、
レーン１；ＲｉＡＳ−オリゴ  ０．１μｇ＋リポフェクチン(lipofectin)  ０．８μｇ、レーン２；ＲｉＡＳ−オリゴ  ０．２μｇ＋リポフェクチン  ０．８μｇ、及びレーン３；ＳＣ−オリゴ  ０．２μｇ＋リポフェクチン  ０．８μｇ。
【００４３】
Ｂは、全ＲＮＡ及び２つのｃ−ｍｙｂプライマーを用いて行なわれるＲＴ−ＰＣＲを示すものであり、この際、
上段；ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡのハイブリッド形成されたＲＴ−ＰＣＲバンド、及び下段；β−アクチンｍＲＮＡのハイブリッド形成されたＲＴ−ＰＣＲバンド。
【００４４】
図９は、ＨＬ−６０細胞の増殖に関する６０ｍｅｒ  ＣＭＡＳまたはリニアなＡＳ−オリゴの効果を示すものであり、この際、
−◆−；ＣＭＡＳ−オリゴ（１）、−■−；ＣＭＡＳ−オリゴ（２）、−●−；ＡＳ−オリゴ、−▲−；Ｓ−ＭＩＪ−７、●；リポフェクチン単独、〇；非処理コントロール、及び（１）または（２）；ＡＳ−オリゴの処理回数。
【００４５】
図１０は、ＨＬ−６０細胞の増殖に関するｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【００４６】
Ａは、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴのＭＴＴアッセイを示すものである。
【００４７】
Ｂは、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの［3Ｈ］−チミジンの取込みを示すものである。
【００４８】
図１１は、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＬ−６０細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【００４９】
Ａは、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴであり、Ｂは、ＳＣ−オリゴであり、及びＣは、リポフェクチン単独である。
【００５０】
図１２は、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＴ−２９細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【００５１】
Ａは、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴであり、Ｂは、ＳＣ−オリゴであり、及びＣは、リポフェクチン単独である。
【００５２】
図１３は、ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＴ−２９細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【００５３】
Ａは、ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴであり、Ｂは、ＳＣ−オリゴであり、及びＣは、リポフェクチン単独である。
【００５４】
図１４は、ｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＴ−２９細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【００５５】
Ａは、ｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴであり、Ｂは、ＳＣ−オリゴであり、及びＣは、リポフェクチン単独である。
【００５６】
好ましい実施態様の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５７】
一態様によると、本発明は、より小さい２次構造を有する領域に対する一以上のアンチセンス配列を含む新規なＡＳ−オリゴを提供するものである。
【００５８】
特に、好ましい実施態様においては、アンチセンスオリゴのターゲット部位として、癌原遺伝子の一つである、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの８つの異なる領域が選択された。ＡＳ−オリゴに関する合理的なターゲット部位の探索を用いて、天然の２次構造を予想すするチャンスを改良する。上記８つのアンチセンス配列は、選択されたターゲット部位の配列と相補的である。ＡＳ−オリゴに関する８つの選択されたターゲット部位のうち、最小限の分子内２次構造を形成する（表１を参照）ため、４つの部位（ＭＩＪ−１、ＭＩＪ−２、ＭＩＪ−３、及びＭＩＪ−４）を、ＣＭＡＳ分子を形成する際に最終的に組み合わせて選択し、３つの部位（ＭＩＪ−３、ＭＩＪ−４、及びＭＩＪ−１７）を組み合わせてＲｉＡＳ分子を形成する。
【００５９】
ホスホジエステル骨格(phosphodiester backbone)を有するＡＳ−オリゴは、良好なアンチセンスの適用に必須である安定性が欠如していた。ＰＳ−オリゴまたはＭＰ−オリゴ等の、修飾されたオリゴは、改善された安定性を発揮したが、安定性の増加は部分的でしかなく、ＤＮＡ複製または修復中の加水分解された修飾ヌクレオチドの潜在的な危険な誤取込み(misincorporation)を内包していた。カチオン性リポソーム(cationic liposome)と複合するステム−ループオリゴもまた部分的な安定性の増加を示すことは既に報告された。しかしながら、ＡＳ−オリゴに関しては、安定性が未だ重要な関心がある。このため、本発明者らは、より良好な安定性を有する改善されたＡＳ−オリゴの開発を試みた。
【００６０】
したがって、本発明は、共有結合で閉環された多重アンチセンス(covalently-closed multiple antisense)（ＣＭＡＳ）−オリゴを提供するものである。
【００６１】
特に、ＡＳ−オリゴの細胞内の２次構造は、ＡＳ−オリゴ及びターゲットｍＲＮＡ間にデュプレックスの形成を伴わずに構築された。好ましい実施態様においては、ループにおいて配列番号１、２、３及び４によって記載される４つのアンチセンス配列（ＭＩＪ−１、ＭＩＪ−２、ＭＩＪ−３、及びＭＩＪ−４）を含むＣＭＡＳ（共有結合で閉環された多重アンチセンス）−オリゴの形態を称するこれらのＡＳ−オリゴが、ＣＭＡＳ−オリゴの長さを増すためにタンデムに置かれる（図１を参照）。ＣＭＡＳ−オリゴは、１５％変性ＰＡＧＥゲル上でリニアな前駆体に比して約１０％遅い電気泳動の移動パターン(electrophoretic mobility pattern)を示す（図２のＡを参照）。ＣＭＡＳ−オリゴは、予想されるとおり、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して耐性を有し、変性ＰＡＧＥゲル上で多重のバンドで示され、この際、モノマー（６０ｍｅｒ）が最も豊富であり、ダイマー（１２０ｍｅｒ）及びトリマー（１８０ｍｅｒ）がある。ＣＭＡＳ−オリゴとは反対に、リニアなオリゴは、エキソヌクレアーゼＩＩＩで２時間インキュベーションした後完全に分解する（図２のＢを参照）。
【００６２】
本発明はまた、リボン型のアンチセンス（ＲｉＡＳ）−オリゴを提供するものである。
【００６３】
ＣＭＡＳ−オリゴは、非常に安定しているが、後に除去されなければならない分子内ライゲ−ションのためのプライマーを必要とする。このため、ライゲ−ションプライマーの使用を避け、ＡＳ−オリゴの相同的な集団を得るために、本発明者らは、２つのＡＳ−オリゴを酵素的に結合させることによって、ＲｉＡＳ−オリゴと称するリボン形の閉環分子を形成する。
【００６４】
ＲｉＡＳ−オリゴ（１１６ｍｅｒ）は、２つのループと２つのループを連結する一つのステムから構成される（図３を参照）。好ましい実施態様においては、ループにおいて配列番号３、４及び５によって記載される３つのアンチセンス配列（ＭＩＪ−３、ＭＩＪ−４及びＭＩＪ−１７）が、ＣＭＡＳ−オリゴの長さを増すためにタンデムに置かれる。その結果、３つの異なるアンチセンス配列の２コピー（全６つのアンチセンス配列）がＲｉＡＳ−オリゴにある。ＲｉＡＳ−オリゴにおけるこのような伸長した長さのループは、ターゲットｍＲＮＡ配列とデュプレックスを形成することによって生じるねじり応力をやわらげる。ＲｉＡＳ−オリゴは、変性ＰＡＧＥゲル上でそのリニアな前駆体（ＭＩＪ−７８）より顕著に遅いことが分かる（図４のＡを参照）。ＲｉＡＳ−オリゴは、予想どおり、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して耐性を有し、ＰＡＧＥゲル上で主要なバンド（１１６ｍｅｒ）に示される。ＲｉＡＳ−オリゴとは反対に、ＭＩＪ−７８は、エキソヌクレアーゼＩＩＩで２時間インキュベーションした後完全に分解する（図４のＢを参照）。
【００６５】
本発明のＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴのヌクレアーゼ活性に対する促進された安定性を示すために、ＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴをヌクレアーゼ活性を維持するために熱で不活性化しない血清と共にインキュベートした。
【００６６】
その結果、リニアな６０ｍｅｒのオリゴ（ＣＭＡＳ−オリゴの前駆体、図５のＡを参照）及びリニアな５９ｍｅｒのオリゴ（ＲｉＡＳ−オリゴの前駆体、図６のＡを参照）は、血清の存在下で２４時間インキュベーション後に完全に消化される。しかしながら、ＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴは、生のヒト血清、ＦＢＳ、及びウシ血清と共に２４時間インキュベーションした後でもほとんどそのまま残ることから、ヌクレアーゼ活性に対するリニアなものに比して有意に改善された安定性を発揮する（図５のＢ及び図６のＢを参照）。
【００６７】
加えて、ＣＭＡＳ−オリゴが配列に特異的にターゲットｍＲＮＡを良好に排除するよう機能することが示される。
【００６８】
特に、ＣＭＡＳ−オリゴは、リポフェクチンと組み合わせて細胞内にデリバーされた。リポフェクチンは、細胞に毒性が少なく、再現性ある結果を出すことが分かっているので使用される。ＭＩＪ−５、即ち、ヒトｃ−ｍｙｂに対するＣＭＡＳ−オリゴは、コントロールのＳＣ−オリゴに比べてｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの９５％以上を減すことができる。一方、ＭＩＪ−５のリニアなカウンターパートである、ＭＩＪ−５Ａは、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの約３７％を減少させる（図７のＡを参照）。これらの結果は、本発明のＣＭＡＳ−オリゴが、たとえより少ない量で使用されても、ターゲットｍＲＮＡを切除するのにリニアなものより優れていることを示す。
【００６９】
ターゲットｍＲＮＡを除去するというＲｉＡＳ−オリゴの機能は、ＣＭＡＳ−オリゴにおけるのと同様の方法によって示された。
【００７０】
ＨＬ−６０細胞を、ＲｉＡＳ−オリゴ、スクランブルされた(scrambled)（ＳＣ）−オリゴ、さらにはリポフェクチン単独で試験した。ＲｉＡＳ−オリゴを、リポフェクチンと複合体を形成させた後、細胞中にデリバーする。その結果、ＲｉＡＳ−オリゴは、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡを完全に切除することができる。これに対して、ＳＣ−オリゴは、リポフェクチン単独で処理したものに比べて約３０％のｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの若干の減少を示す（図８のＡを参照）。これらの結果は、本発明のＲｉＡＳ−オリゴは、たとえ少量で使用されてもターゲットｍＲＮＡを切除するのに優れていることを示す。
【００７１】
本発明者らはまた、ＰＣＲ産物のサザンブロット法によってＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴのアンチセンス効果を調べた。
【００７２】
ＣＭＡＳ−オリゴの場合には、ｃ−ｍｙｂのメッセージがＲＴ−ＰＣＲで増幅されると、９０％超のメッセージがＭＩＪ−５の処理により減少することがわかる（図７のＢを参照）。
【００７３】
ＲｉＡＳ−オリゴでは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたｃ−ｍｙｂのメッセージが標識された内部ハイブリダイゼーションオリゴ（３０ｍｅｒ）と共に検出される（図８のＢを参照）。上記結果から、増幅されたメッセージが真にｃ−ｍｙｂ由来であることを確認される。
【００７４】
本発明はまた、癌、免疫疾患、感染性疾患、及び異常な遺伝子発現により引き起こされる他のヒトの疾患の処置を目的とする新規な型のＡＳ−オリゴを含む薬剤組成物を提供するものである。
【００７５】
ｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴまたはｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴが白血病細胞の成長を阻害することが示される。特に、白血病細胞に対するｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴ及びｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの成長阻害を、３種の方法、ＭＴＴアッセイ、［3Ｈ］チミジンの取込みまたはソフトアガロースでのコロニーの形成によって測定した。
【００７６】
ＭＴＴアッセイの結果、細胞数が、ＭＩＪ−５、即ち、ヒトのｃ−ｍｙｂに対するＣＭＡＳ−オリゴの量を増して処理すると次第に減少する。細胞の成長の阻害は、細胞をＭＩＪ−５で２回処理すると、より顕著である。ＨＬ−６０細胞の８０％超の成長の阻害が低い濃度でも観察される（図９を参照）。一方、リニアな６０ｍｅｒのＡＳ−オリゴ、即ち、ＭＩＪ−５Ａ、及びリニアなセンスオリゴは、擬似的なコントロールに比べて、細胞の成長の有意な阻害をもたらさない。これらの結果から、本発明のｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴは有用なアンチセンス剤であり、濃度に依存して腫瘍の成長に対して有効であることが示される。
【００７７】
加えて、細胞の成長がＲｉＡＳ−オリゴにより９１％以上阻害されることが観察される（図９のＡを参照）。一方、ＳＣ−オリゴ及びリポフェクチン単独は、未処理のコントロールのものに比べて細胞の成長を有意に阻害しない。これらの結果から、本発明のｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴもまた白血病細胞の成長の阻害に対して効果的なアンチセンス剤であることが示される。
【００７８】
ソフトアガロースでのコロニー形成では、ＭＩＪ−５は、９０％超、コロニーの形成数を減少する（表２を参照）。ＭＩＪ−５Ａはまた、成長の阻害では効果はより低いものの、形成されるコロニーを減少させ、約７０％のコロニーを減少する。これに対して、センスオリゴ及びＳＣ−オリゴは、各々、約１１％及び３２％という、わずかなコロニーの減少を示す。
【００７９】
また、細胞中にトランスフェクトされたｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴは、未処理のコントロールに比して約９２％ほど（表３を参照）コロニーの形成数を減少できる。一方、ＳＣ−オリゴ及びリポフェクチン単独は、各々、約７．９％及び７．１％という、わずかなコロニーの減少を示す。
【００８０】
加えて、白血病細胞に対するｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの成長の阻害を［3Ｈ］チミジンの取込みによって観察する。特に、ＲｉＡＳ−オリゴは、ＨＬ−６０細胞の成長を９３％阻害する。一方、ＳＣ−オリゴ及びリポフェクチン単独は、それぞれ、約１６．８％及び１５．４％という、ゆるやかな細胞成長の阻害を示す（図１０のＢを参照）。顕微鏡観察では、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴで処理した後に、ＨＬ−６０細胞の成長は、スクランブルされた(scrambled)オリゴ及びリポフェクチン単独で処理された細胞に比べて著しく阻害される（図１１を参照）。
【００８１】
本発明におけるｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの顕著な阻害活性によって鼓舞されて、本発明者らは、２つの異なる癌原遺伝子、ｃ−ｍｙｃ及びｋ−ｒａｓに対する他のＲｉＡＳ−オリゴを構築して、ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴが細胞成長の阻害に良好に機能するかどうかを調べた。
【００８２】
顕微鏡観察の結果では、ＨＴ−２９細胞の成長は、スクランブルされた(scrambled)オリゴ及びリポフェクチン単独で処理した細胞に比して、すべてのＲｉＡＳ−オリゴ、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴ、ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴによって顕著に阻害される（図１２、図１３及び図１４を参照）。
【００８３】
したがって、本発明の新規なＲｉＡＳ−オリゴは、様々なターゲット配列に対する腫瘍細胞の有効な成長阻害、さらにはヌクレアーゼ活性に対する促進された安定性を示す。このため、本発明の新規なＲｉＡＳ−オリゴは、様々なヒトの疾患を治療するための分子状アンチセンスオリゴの開発に有用に使用される。
【００８４】
実施例
本発明の実際の及び現在の好ましい実施態様を、以下の実施例で示されるように、詳述する。
【００８５】
しかしながら、当業者は、この開示を考慮して、本発明の精神及び概念内で修飾及び改良をすることは考えられる。
【００８６】
実施例１：ＡＳ−オリゴに対するターゲット部位の選択
ＡＳ−オリゴのターゲット部位の選択は、アンチセンス効果、ターゲットｍＲＮＡの減少または切除を達成するために重要であることは分かっていた。しかしながら、ターゲット部位の選択方法はむしろ任意であった。このため、本発明者らは、推定の２次構造に関してヒトのｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの完全な配列をスキャンして、好ましい実施態様における合理的なターゲット部位を探索した。
【００８７】
特に、２次構造のシミュレーションは、ＤＮＡｓｉｓプログラム（Hitachi Software、日本）を使用して行なった。完全なｃ−ｍｙｂ配列を、１００塩基の連続したフレームにおける２次構造の形成に関して順次スキャンした。次に、２次構造のシミュレーション用のフレームを、３０塩基ずつずらしていき、５’側の６０塩基の重複を得た。このプロセスを、所定の配列を３つの異なるフレームにおける潜在的な２次構造に関してスキャンするように、再度繰り返した。
【００８８】
その結果、３つの異なるフレームにおける最小の２次構造を有する８つの配列がｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡ配列から選択された（表１）。ＡＳ−オリゴに関する合理的なターゲット部位の探索を用いて、天然の２次構造を予想できるチャンスが改良された。
【００８９】
【表１】
0003721308.tif 000002
【００９０】
表１に示されるように、上記８つのアンチセンス配列は選択されたターゲット部位に対して相補的であった。ＡＳ−オリゴに関する８つの選択されたターゲット配列のうち、最小限の内部分子の２次構造を形成するので、４つの部位（ＭＩＪ−１、ＭＩＪ−２、ＭＩＪ−３、及びＭＩＪ−４）がＣＭＡＳ分子を形成する際に組み合わせて選択され、３つの部位（ＭＩＪ−３、ＭＩＪ−４、及びＭＩＪ−１７）がＲｉＡＳ−オリゴを形成するのに組み合わせて選択された。
【００９１】
実施例２：共有結合で閉環された多重アンチセンス（ＣＭＡＳ）−オリゴの構築
本発明者らは、より良好な安定性を有する改善されたＡＳ−オリゴの開発を試みた。
【００９２】
実施例１によって得られた４つの異なるＡＳ−オリゴ（（ＭＩＪ−１、ＭＩＪ−２、ＭＩＪ−３、及びＭＩＪ−４）を用いてＣＭＡＳ−オリゴを構築した。より容易にターゲット部位に結合するように、２次構造を最小化する組み合わせの４つの異なるアンチセンス配列を収容させて、一つのＣＭＡＳ−オリゴを構築した。ＡＳ−オリゴは、５’末端での合成中にリン酸化された後、分子内または分子間共有結合によるライゲーションが起こる（図１）。４つの異なるアンチセンス配列を含む６０ｍｅｒのＡＳ−オリゴの配列は、配列番号６によって記載される。ＡＳ−オリゴの両末端は、６０ｍｅｒのＡＳ−オリゴの両末端配列（各側で７塩基）に双方の半分が相補的な配列を有するライゲーションプライマーで結合している。１４ｍｅｒのライゲーションプライマーの配列は、配列番号６によって記載される。ライゲーションプライマーをＡＳ−オリゴと混合して、８５℃で２分間加熱した後、周囲温度にまで徐々に冷却した。１ユニットのＴ４リガーゼを添加して、１６℃で１６時間、インキュベートして、共有結合で閉環された分子を生成した。ＣＭＡＳ−オリゴを、５％メタファーアガロ−スゲル(MetaphorT M agarose gel)(FMC,USA)でまたは１２％変性ＰＡＧＥで電気泳動して、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対する耐性及びリニアな６０ｍｅｒのオリゴに比した若干のゲルの遅延で同定した。ライゲーションプライマーは、エキソヌクレアーゼＩＩＩにより分解されたまたは９０℃でオリゴを加熱させた後、変性ゲルで泳動することによってＣＭＡＳ−オリゴから脱離した。
【００９３】
その結果、ＡＳ−オリゴの細胞内２次構造を、ＡＳ−オリゴ及びターゲットｍＲＮＡのデュプレックス形成をせずに構築した。このＡＳ−オリゴを、ＣＭＡＳ（共有結合で閉環された多重アンチセンス）−オリゴと命名した。ＣＭＡＳ−オリゴは、１５％変性ＰＡＧＥゲルでリニアな前駆体に比して約１０％程度遅い電気泳動の移動パターンを示した（図２のＡ）。ＣＭＡＳ−オリゴは、予想どおり、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して耐性があり、変性ＰＡＧＥゲル上に多数のバンドで示され、この際、モノマー（６０ｍｅｒ）が最も豊富であり、次にダイマー（１２０ｍｅｒ）及びトリマー（１８０ｍｅｒ）であった（図２のＢ）。ＣＭＡＳ−オリゴとは反対に、リニアなオリゴは、エキソヌクレアーゼＩＩＩで２時間インキュベーションした後完全に分解した。
【００９４】
実施例３：リボン型のアンチセンス（ＲｉＡＳ）−オリゴの構築
本発明者らは、２つのＡＳ−オリゴを酵素的に連結させて、ＲｉＡＳ−オリゴと称するリボン型の閉環分子を形成した。
【００９５】
特に、ＲｉＡＳ−オリゴは、２つのループと２つのループを連結する一つのステムから構成される。それぞれのループは、配列番号３、４、及び５によって記載される３つの異なるアンチセンス（ＭＩＪ−３、ＭＩＪ−４、及びＭＩＪ−１７）配列を含んだ。ターゲット部位により容易に結合するために、可能なかぎり小さい２次構造を有する３つのアンチセンス配列の組み合わせをＡＳ−オリゴのために選択した。Ｃ−ｍｙｂ  ＡＳ−オリゴ（ＭＩＪ−７８）は、５’末端でリン酸化された。５８ｍｅｒのＭＩＪ−７８の配列は配列番号７によって記載される。ＭＩＪ−７８は、ステム−ループ構造を形成する。ステムは、それぞれのオリゴの両末端の相補的な配列により形成された。ステムの５’末端は、５’−（ｐ）ＧＡＴＣ−３’の単一の標準的な配列の４塩基を持っていた。２つのＭＩＪ−７８分子を、両５’末端の相補的４塩基配列により結合した。ＭＩＪ−７８分子を混合して、８５℃で２分間加熱した後、周囲温度まで徐々に冷却した。１ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加して、１６℃で２４時間、インキュベートして、ダイアド(diad)−対称を有する共有結合で連結された分子を生成した（図３）。ＲｉＡＳ−オリゴを１５％変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対する耐性及びゲルの遅延を調べた。
【００９６】
その結果、２つのループと２つのループを連結する一つのステムから構成されるＲｉＡＳ−オリゴ（１１６ｍｅｒ）が構築された。ループ中の３つのアンチセンス配列をＲｉＡＳ−オリゴの長さを増加させるためにタンデムに置いた。その結果、３つの異なるアンチセンス配列の２コピー（全６つのアンチセンス配列）がＲｉＡＳ−オリゴにあった。ＲｉＡＳ−オリゴにおけるこのような伸長した長さのループは、ターゲットｍＲＮＡ配列とデュプレックスを形成することによって生じるねじり応力をやわらげた。ＲｉＡＳ−オリゴは、変性ＰＡＧＥゲル上でそのリニアな前駆体（ＭＩＪ−７８）より顕著に遅いことが分かった（図４のＡ）。ＲｉＡＳ−オリゴは、予想どおり、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して耐性を有し、ＰＡＧＥゲル上で主要なバンド（１１６ｍｅｒ）に示された（図４のＢ）。ＲｉＡＳ−オリゴとは反対に、ＭＩＪ−７８は、エキソヌクレアーゼＩＩＩで２時間インキュベーションした後完全に分解した。
【００９７】
実施例４：ヌクレアーゼ活性に対するＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴの促進された安全性
ヌクレアーゼ活性に対する本発明のＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴの安定性を試験するために、ＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴをヌクレアーゼ活性を維持するために熱で不活性化しない血清と共にインキュベートした。
【００９８】
特に、非特異的なコントロール−ホスホジエステルオリゴ（リニアな６０ｍｅｒ）の各々の１μｇ及びＣＭＡＳ−オリゴを、生のヒト血清、ＦＢＳ及びウシ血清（加熱せずに不活性化された；HyClone, Logan, Utah, USA）またはエキソヌクレアーゼＩＩＩと共にインキュベートした。１５％の血清をそれぞれ、１００μｌの反応容積のＡＳ−オリゴに添加して、３７℃で２４時間、インキュベートした。次に、ＡＳ−オリゴをフェノール及びクロロホルムで抽出して、１５％変性ＰＡＧＥゲルで調べた。１６０Ｕ／μｇオリゴのエキソヌクレアーゼＩＩＩ(Takara, Japan)をリニアな及びＣＭＡＳ−オリゴに添加して、３７℃で２時間、インキュベートした。エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理されたＡＳ−オリゴをまた、上記と同じ方法で抽出し、電気泳動した。
【００９９】
ＣＭＡＳ−オリゴの結果、リニアな６０ｍｅｒのオリゴは、血清の存在下で２４時間インキュベーション後に、完全に消化された（図５のＡ）。しかしながら、本発明のＣＭＡＳ−オリゴは、生のヒト血清、ＦＢＳ、及びウシ血清と共に２４時間インキュベーションした後でも、大部分がそのまま残っていることから、ヌクレアーゼに対してリニアなものより有意に改善された安定性を示した（図５のＢ）。
【０１００】
ＲｉＡＳ−オリゴの場合では、リニアな５８ｍｅｒは、各々の異なる血清の存在下で２４時間インキュベーション後、完全に加水分解された（図６のＡ）。しかしながら、本発明のＲｉＡＳ−オリゴは、生の血清と共に２４時間インキュベーションした後でも、大部分がそのまま残っていることから、ヌクレアーゼに対してリニアなものより有意に改善された安定性を示した（図５のＢ）。
【０１０１】
実施例５：ＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴによるｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの特異的な減少
本発明におけるＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴの顕著な安定性に鼓舞されて、本発明者らは、ＡＳ−オリゴが配列に特異的にターゲットｍＲＮＡを除去するよう良好に機能するかどうを調べた。
【０１０２】
＜５−１＞細胞系及び組織培養
白血病細胞系である、ＨＬ−６０（前骨髄性白血病細胞系(promyelocytic leukemia cell line)及びＫ５６２（慢性骨髄性白血病細胞系(chronic myelogenous leukemia cell line)を、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, USA)から得て、１０％熱で不活性化されたＦＢＳ(HyClone, USA)及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ  １６４０(Gibco BRL, USA)で培養した。細胞を３７℃でＣＯ2インキュベーターに維持した。定常的な細胞培養のプラクティスは、適正な細胞密度を維持し、ストックバイアルを解凍してから５世代を越えないように細胞を培養するように、厳格に実行された。培養液は、ＡＳ−オリゴで処理する一日前に交換した。
【０１０３】
＜５−２＞カチオン性リポソームと複合体を形成したＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴのトランフェクション
０．３μｇのＣＭＡＳ−オリゴと０．８μｇのLipofectinTM(Gibco BRL, USA)または０．２μｇのＲｉＡＳ−オリゴと０．８μｇのLipofectinTMを、２０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭTMにそれぞれ稀釈して、周囲温度で４０分間インキュベートした。それぞれの成分を、周囲温度で１５分間複合体を形成するように混合した。オリゴを添加する一日前に、細胞を、抗生物質を含まない新鮮な培養液（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ）に添加し、実験をする前にＯＰＴＩ−ＭＥＭで２回洗浄した。細胞密度を５×１０5細胞／ｍｌに調節して、４８ウェルプレート(Falcon, USA)に１００μｌずつ分注した。４０μｌのリポソーム−オリゴ複合体を、細胞に、１回は０日目に及び１回は１日目の、２回、添加した。オリゴで処理された細胞を３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ１００μｌを添加した。次の日、１００μｌの上清を注意しながら除去し、オリゴ−リポソーム複合体を含む新鮮なＯＰＴＩ−ＭＥＭ  ２０μｌに交換した。４時間後、細胞に抗生物質を含む完全培地１００μｌをさらに添加し、アッセイ前にもう一日３７℃でインキュベートした。
【０１０４】
＜５−３＞全ＲＮＡの単離及びＲＴ−ＰＣＲ
製造会社によって推奨された方法に従って、ＴｒｉｐｕｒｅTM単離試薬(TripureTM Isolation Reagent)(Boehringer Manhein, Germany)を用いて、全ＲＮＡを単離した。簡単には、集めた細胞に、０．４ｍｌのＴｒｉｐｕｒｅ試薬、１０μｇのグリコーゲン及び８０μｌのクロロホルムを添加して、全ＲＮＡを得た。ＲＴ−ＰＣＲを、ＡｃｃｅｓｓTM  ＲＴ−ＰＣＲキット(Promega, USA)を使って一つの反応チューブで行なった。ＰＣＲチューブに、ＲＮＡ、ＰＣＲプライマー、ＡＭＶ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ、１μｌ）及びＭｇＳＯ4（２５ｍＭ、２．５μｌ）を添加した。第一の鎖(first strand)ｃＤＮＡの合成は、４８℃で４５分間、ＤＮＡターマルサイクラー(termal cycler)(Hybaid, USA)で行った。次に、ＰＣＲ増幅を、製造会社によって推奨された方法に従って、２５サイクル行なった。増幅されたＰＣＲ産物は、１％アガロ−スゲルで確認され、ゲルドキュメンテーションプログラム(gel documentation program)(Bio-Rad, USA)で定量が行なわれた。
【０１０５】
＜５−４＞ＲＴ−ＰＣＲ断片のサザンハイブリダイゼーション
ＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロ−スゲルで電気泳動した。ＤＮＡを、０．４Ｍ  ＮａＯＨ中で４時間、ナイロン膜(New England Biolab, USA)上に移した。膜をＥＣＬ３’末端オリゴラベリングで標識された３０ｍｅｒの内部プライマー及び検出システム(Amersham Life Science, England)でハイブリダイゼーションした。３０ｍｅｒの内部プライマーの配列は、配列番号９によって記載される。ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、０．０２％ＳＤＳを含む６ｍｌのバッファー中で６２℃で、６０分間行なった。膜を、１５分ずつ、０．１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣで２回洗浄し、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで２回洗浄した。膜をブロッキング溶液でブロックした後、オートラジオグラフィ前に３０分間、ＨＲＰ（西洋ワサビのペルオキシダーゼ）抗フルオレセイン接合抗体で処理した。
【０１０６】
本発明のＣＭＡＳ−オリゴは、配列に特異的にターゲットｍＲＮＡを除去するよう良好に機能をすることが示された。
【０１０７】
特に、ＣＭＡＳ−オリゴは、リポフェクチンと複合体を形成して、細胞内にデリバーされた。リポフェクチンは、細胞に毒性が少なく、再現性ある結果を出すことが分かっているので使用された。その結果、０．３μｇのＭＩＪ−５、ヒトのｃ−ｍｙｂに対するＣＭＡＳ−オリゴを、ＨＬ−６０細胞にトランスフェクションするために１μｇのリポフェクチンと複合体を形成させた。ＭＩＪ−５は、コントロールＳＣ−オリゴに比べて９５％超のｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡを減少させることができた。一方、ＭＩＪ−５のリニアなカウンターパートである、ＭＩＪ−５Ａは、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの約３７％を減少させた（図７のＡ）。これらの結果から、本発明のＣＭＡＳ−オリゴは、たとえより少ない量で使用されても、ターゲットｍＲＮＡを切除するのにリニアなものより優れていることが示された。
【０１０８】
本発明のＲｉＡＳ−オリゴが配列に特異的にターゲットｍＲＮＡを除去するよう良好に機能をすることもまた示された。
【０１０９】
ＨＬ−６０細胞を、ＲｉＡＳ−オリゴ、ＳＣ−オリゴ、さらにはリポフェクチン単独でトランスフェクションした。ＲｉＡＳ−オリゴを、リポフェクチンと複合体を形成させた後、細胞中にデリバーした。ヒトのｃ−ｍｙｂに対するＲｉＡＳ−オリゴ（０．１μｇまたは０．２μｇ）を、ＨＬ−６０細胞中にトランスフェクションするために０．８μｇのリポフェクチンと複合体を形成させた。その結果、０．２μｇのＲｉＡＳ−オリゴ（４０ｎＭ）は、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡを完全に切除することができた。一方、０．１μｇのＲｉＡＳ−オリゴはｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの約７０％を減少した（図８のＡ）。これに対して、ＳＣ−オリゴは、リポフェクチン単独で処理したものに比べて約３０％のｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの若干の減少を示した。しかしながら、下段に示されたβ−アクチンの発現は、ＲｉＡＳ−オリゴの処理、さらには他の処理条件による影響を受けなかった。これらの結果から、ＲｉＡＳ−オリゴは、たとえ少量で使用されてもターゲットｍＲＮＡを切除するのに優れていることが示された。
【０１１０】
本発明者らはまた、ＰＣＲ産物によるサザンブロット法によってＣＭＡＳ−オリゴ及びＲｉＡＳ−オリゴのアンチセンス効果を調査した。ＨＬ−６０細胞をＭＩＪ−５及び、ントロールオリゴなどのオリゴでトランスフェクションし、これらの細胞を全ＤＮＡを単離するために使用した。
【０１１１】
ＣＭＡＳ−オリゴの場合では、ｃ−ｍｙｂのメッセージをＲＴ−ＰＣＲですると、９０％超のメッセージがＭＩＪ−５の処理により減少することが分かった（図７のＢ）。しかしながら、下段に示されたβ−アクチンの発現は、ＭＩＪ−５の処理の影響を受けなかった。
【０１１２】
ＲｉＡＳ−オリゴの場合には、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＣ−ｍｙｂメッセージが、標識された内部ハイブリダイゼーションオリゴ（３０ｍｅｒ）で検出された（図８のＢ）。これらの結果から、増幅されたメッセージは確かにｃ−ｍｙｂ由来であり、０．２μｇのｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴで処理することによってメッセージを完全に除去できることが確認された。
【０１１３】
実施例６：ｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴ及びｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴによる白血病細胞の有効な成長の阻害
ｃ−ｍｙｂが白血球の増殖に対して重要な役割を果たすことが報告された。ｃ−ｍｙｂに対するＡＳ−オリゴの作用も、白血病細胞の成長を選択的に遮断することが報告された。このため、本発明者らは、白血病細胞の成長の阻害について本発明のｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴ及びｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴを試験した。
【０１１４】
特に、白血病細胞に対するｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴ及びｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの成長の阻害は、３種の方法、即ち、ＭＴＴアッセイ、［3Ｈ］チミジンの取込みまたはソフトアガロースでのコロニー形成によって測定された。
【０１１５】
＜６−１＞ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴ（３，−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(3,-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)、以下、「ＭＴＴ」と称する）アッセイを目的として、ＨＬ−６０細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭで２回洗浄し、５０μｌずつ９６ウェルプレート（５×１０3細胞／ウェル）に分注した。細胞を、異なる量のオリゴ（ＣＭＡＳ−オリゴでは、０．０１〜１μｇ／１５μｌまたはＲｉＡＳ−オリゴでは、０．２μｇ／１５μｌ）及びリポフェクチン（０．２μｇ／１５μｌ）間で行なわれた複合体で５時間処理し、５日間培養した。次に、細胞を１００μｌ容積で集め、２０μｌ（１００μｇ）のＭＴＴ試薬（ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌ；Sigma, USA)を添加した後、３７℃で４時間インキュベートした。１００μｌのイソプロパノール（０．１Ｎ  ＨＣｌを含む）を細胞に添加し、周囲温度でさらに１時間インキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで５７０ｎｍで測定して、生きている細胞の量を計測した。
【０１１６】
ＣＭＡＳ−オリゴでは、細胞数は、ＭＩＪ−５の量を増やして処理すると次第に減少した。細胞をＭＩＪ−５で２回処理した場合には、細胞成長の阻害がさらに環著になった。８０％超のＨＬ−６０細胞の成長阻害が、低濃度、即ち、０．１３μｇ（全体０．２４μｇ）のＣＭＡＳ−オリゴでさえ観察された（図９）。一方、リニアなの６０ｍｅｒのＡＳ−オリゴ、ＭＩＪ−５Ａ及びリニアなセンスオリゴは、擬似コントロールと比較して、細胞成長の有意な阻害はもたらされなかった。これらの結果から、ｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴは、効果的なアンチセンス剤であり、濃度に依存して腫瘍の成長に対する有効な薬剤であることが示された。
【０１１７】
ＲｉＡＳ−オリゴでは、細胞の成長は、ＲｉＡＳ−オリゴで９１％阻害されることも観察された（図１０のＡ）。一方、ＳＣ−オリゴ及びリポフェクチン単独は、未処理のコントロールのものと比較した場合、細胞の成長を有意に阻害しなかった。これらの結果から、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴは、白血病細胞の成長を阻害するための効果的なアンチセンス剤であることが示された。
【０１１８】
＜６−２＞ソフトアガロースでのコロニー形成
白血病細胞に対するｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴ及びｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの成長阻害を、他の方法としてのソフトアガロースでのコロニー形成によっても測定した。
【０１１９】
特に、Ｋ５６２細胞を実施例６に記載されたのと同様にしてトランスフェクションし、３７℃で、５％ＣＯ2で２４時間培養した。０．８％の低融点アガロース及び２（２０％ＦＢＳ及び抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０の等容の混合物を細胞に添加し、６ウェルプレートに播種して固化させた。６ウェルプレートを４℃にまで５分間で冷却し、１５日間インキュベートした。２０個超の細胞を含むコロニーを陽性として計測した。
【０１２０】
その結果、ＣＭＡＳ−オリゴ  ＭＩＪ−５は、９０％超、コロニーの形成数を減少させた（表２）。ＭＩＪ−５Ａはまた、成長の阻害では効果はより低いものの、形成されるコロニーを減少させ、約７０％のコロニーが減少した。これに対して、センスオリゴ及びＳＣ−オリゴは、各々、約１１％及び３２％という、わずかなコロニーの減少を示した。
【０１２１】
【表２】
0003721308.tif 000003
【０１２２】
これに対して、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴでトランスフェクションされた細胞は、未処理のコントロールと比較して、コロニーの形成数を約９２％（表３）減少させることができた。一方、ＳＣ−オリゴ及びリポフェクチン単独は、各々約７．９％及び７．１％というわずかなコロニーの減少を示した。
【０１２３】
【表３】
0003721308.tif 000004
【０１２４】
＜６−３＞［3Ｈ］チミジンの取り込み
ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴによる白血病細胞の成長阻害を、［3Ｈ］チミジンの取り込みによっても測定した。
【０１２５】
［3Ｈ］チミジンの取り込みでは、ＨＬ−６０細胞を上記したのと同様にしてＡＳ−オリゴで処理した。細胞に、０．５μＣｉの［3Ｈ］チミジン（２．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Amersham, England）を添加し、３連で１６時間インキュベートした。次に、細胞をガラスミクロ繊維フィルター(Whatman GF/C, England)上に集めた。フィルターを冷ＰＢＳ、５％ＴＣＡ及び無水エタノールの順で洗浄した。［3Ｈ］チミジンの取り込みは、トルエン、トリトン(Triton)Ｘ−１００、ＰＰＯ及びＰＯＰＯＰを含むカクテル溶液で液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０１２６】
その結果、ＲｉＡＳ−オリゴ（０．２μｇ）は、ＨＬ−６０細胞の成長を９３％阻害した（図１０のＢ）。一方、ＳＣ−オリゴ及びリポフェクチン単独は、各々約１６．８％及び１５．４％程の軽い細胞の成長の阻害を示した。顕微鏡で観察すると、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴで処理した後は、スクランブルされた(scrambled)オリゴ及びリポフェクチン単独で処理された細胞と比較した際、ＨＬ−６０の成長が顕著に阻害された（図１１）。
【０１２７】
実施例８：ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴの効果的な成長阻害
本発明におけるｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの顕著な阻害活性に鼓舞され、本発明者らは、実施例３におけるのと同様の方法で、２個の異なる癌原遺伝子、ｃ−ｍｙｃ及びｋ−ｒａｓに対する他のＲｉＡＳ−オリゴを構築した。
【０１２８】
次に、ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴが細胞の成長を阻害するように良好に機能するかどうかを調べた。
【０１２９】
特に、本発明者らは、異なる細胞系である、結腸直腸腺癌細胞系ＨＴ−２９を使用した。腫瘍細胞に対するｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴの成長阻害は、実施例＜６−３＞におけるのと同様の方法である［3Ｈ］チミジンの取込みによって測定した。ＨＴ−２９細胞は、それぞれ、０．２μｇのｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴ及び０．６μｇのリポフェクチンまたは０．５μｇのｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及び１．５μｇのリポフェクチンまたは０．５μｇのｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴ及び１．５μｇのリポフェクチンのカチオン性リポソーム複合体で処理した。それぞれのＲｉＡＳ−オリゴで５日間処理した後、顕微鏡を使用してＨＴ−２９細胞の成長を観察した。各顕微鏡写真は、ＲｉＡＳ−オリゴ（Ａ）、スクランブルされたオリゴ（Ｂ）及びリポフェクチン単独（Ｃ）で処理された後の成長阻害に関する効果を示した。
【０１３０】
顕微鏡写真を観察した結果、ＨＴ−２９細胞の成長は、スクランブルされたオリゴ及びリポフェクチン単独で処理された細胞と比較して、すべてのＲｉＡＳ−オリゴ、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴ、ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴによって顕著に阻害された（図１２、図１３及び図１４）。
【０１３１】
したがって、本発明の新規なＲｉＡＳ−オリゴは、様々なターゲット配列に対する腫瘍細胞の効果的な成長阻害、さらにはヌクレアーゼ活性に対する促進された安定性を示した。このため、本発明の新規なＲｉＡＳ−オリゴは、様々なヒトの疾患に対する分子状アンチセンスオリゴの開発に効果的に使用される。
【０１３２】
産業上利用可能性
本発明は、より小さい２次構造を有するｍＲＮＡ領域に対する一以上のアンチセンス配列を含み、より良好なターゲット配列の特異性及びヌクレアーゼ活性に対する安定性を有する新規なＡＳ−オリゴを提供するものである。
【０１３３】
特に、本発明は、相補的プライマーを用いたライゲーションによって閉環型を形成するように構築されるｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡに対する多重ターゲットアンチセンス配列を含む共有結合で閉環された多重アンチセンス（ＣＭＡＳ）−オリゴを提供するものである。加えて、本発明は、両５’末端で相補的な配列を用いたライゲーションによってステム−ループ構造を形成するように構築されるｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡに対する多重ターゲットアンチセンス配列を含むリボン型のアンチセンス（ＲｉＡＳ）−オリゴを提供するものである。
【０１３４】
ヒトンの腫瘍細胞を、ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴ、さらにはｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴ及びｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴで処理すると、異常な遺伝子の発現が本発明の新規なＡＳ−オリゴによって効果的に除去されることが示される。したがって、本発明の新規なＡＳ−オリゴは、疾患を引き起こす様々な遺伝子に対する分子状アンチセンス剤を開発するのに、さらには遺伝子の機能的な研究に使用されることが示唆される。特に、本発明の新規なＡＳ−オリゴは、癌、免疫疾患、感染性疾患、または異常な遺伝子の発現により引き起こされる他のヒトの疾患の処置を目的とする薬剤組成物の開発に使用される。
【０１３５】
当業者は、前記記載で開示された概念及び特定の実施態様は、本発明の同一な目的を遂行するために異なる実施態様を修飾するまたは設計するための基礎として容易に利用できると考えるであろう。当業者はまた、このような等価の実施態様が添付の請求の範囲に記載されるような本発明の精神及び概念から逸脱しないと考えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴの構築に関するスキームを示すものである。
【図２】  ＣＭＡＳ−オリゴの電気泳動の移動パタ−ンを示すものである。
【図３】  ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの構築に関するスキームを示すものである。
【図４】  ＲｉＡＳ−オリゴの電気泳動の移動パタ−ンを示すものである。
【図５】  血清の存在下でのリニアな及びＣＭＡＳ−オリゴの分解パターンを示すものである。
【図６】  血清の存在下でのリニアな及びＲｉＡＳ−オリゴの分解パターンを示すものである。
【図７】  ＨＬ−６０細胞におけるｃ−ｍｙｂ発現に関するｃ−ｍｙｂ  ＣＭＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【図８】  ＨＬ−６０細胞におけるｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡの発現に関するｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【図９】  ＨＬ−６０細胞の増殖に関する６０ｍｅｒ  ＣＭＡＳまたはリニアなＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【図１０】  ＨＬ−６０細胞の増殖に関するｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴの効果を示すものである。
【図１１】  ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＬ−６０細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【図１２】  ｃ−ｍｙｂ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＴ−２９細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【図１３】  ｃ−ｍｙｃ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＴ−２９細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【図１４】  ｋ−ｒａｓ  ＲｉＡＳ−オリゴによるＨＴ−２９細胞の成長の阻害に関する顕微鏡写真を示すものである。
【配列表】0003721308.tif 000005
0003721308.tif 000006
0003721308.tif 000007
0003721308.tif 000008
0003721308.tif 000009
【図１】
0003721308.tif 000010
【図２】
0003721308.tif 000011
【図３】
0003721308.tif 000012
【図４】
0003721308.tif 000013
【図５】
0003721308.tif 000014
【図６】
0003721308.tif 000015
【図７】
0003721308.tif 000016
【図８】
0003721308.tif 000017
【図９】
0003721308.tif 000018
【図１０】
0003721308.tif 000019
【図１１】
0003721308.tif 000020
【図１２】
0003721308.tif 000021
【図１３】
0003721308.tif 000022
【図１４】
0003721308.tif 000023