(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬に結合した、メラニン細胞膜のレセプターに接近可能なフコース残基からなる少なくとも一つのリガンドを、化粧品に許容できる賦形剤と混合して含む、局所用化粧品組成物。
【請求項２】
試薬に結合した、メラニン細胞膜のレセプターに接近可能なフコース残基からなる少なくとも一つのリガンドを、製剤学的に許容できる賦形剤と混合して含む、メラニン細胞関連疾患を治療するための局所用医薬組成物。
【請求項３】
前記フコース残基がアルファ-Ｌ-フコース残基である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ヘテロ二重機能性試薬および炭水化物鎖から選択されるスペーサーアームを介して結合した、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記試薬がリポソームおよび重合性ナノ粒子から選択される、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記試薬が蛋白質である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記試薬が血清アルブミンである、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記試薬が化粧用活性物質である、請求項１および３から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記試薬が薬学的活性物質である、請求項２ないし７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記活性物質がメラニン細胞の代謝調節剤である、請求項８または９記載の組成物。
【請求項１１】
前記活性物質が、メラニン産生刺激剤、プロテインキナーゼＣ刺激剤、メラニン産生阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、および漂白剤からなる群から選択される、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記メラニン産生刺激剤が、チロシンおよびフォルスコリンからなる群から選択され、プロテインキナーゼＣ刺激剤がリノール酸および１−オレイル−２−アセチルグリセロールからなる群から選択され、前記メラニン産生阻害剤がチロシナーゼ阻害剤であり、プロテインキナーゼＣ阻害剤がスフィンゴシンであり、かつ漂白剤がレチン酸とその誘導体およびカロチノイドから選択される、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記活性物質がガン化したメラニン細胞の治療に有効な薬剤を含む、請求項２ないし７、および９ないし１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ガン化したメラニン細胞の治療に有効な薬剤がメトトレキサートである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記試薬がフコ脂質およびフコ蛋白質からなる群から選択される、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記フコ脂質が、アルファ-Ｌ-フコース残基を炭水化物鎖の末端基として有するセラミドオリゴサッカライドであり、フコ蛋白質が血清アルブミンとフコースとを組み合わせたネオグリコプロテインである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記試薬がフコース残基を有する脂質を含む二重層を有するリポソームである、請求項１ないし１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記フコース残基が、ヘテロ二重機能性試薬または炭水化物鎖を含むスペーサーアームの末端に配置される、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記試薬が、セラミドオリゴサッカライドがアルファ-Ｌ-フコース残基を炭水化物鎖の末端基として有するフコ脂質である、請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記フコ脂質が豚精巣または豚消化器粘膜から抽出されるフコシル化セラミドオリゴサッカライドである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
試薬がリポソームであって、ここで脂質を有するフコース残基の比率が、全ての両親媒性脂質に対して、リポソームの二重層を形成する全ての脂質分子のモルパーセントとして、１０％ないし１００％である、請求項１ないし２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
試薬が少なくとも２０のフコース残基を有するネオグリコプロテインである、請求項１ないし２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
皮膚日焼けクリームとして調合された、請求項１、３から８、１０から１２、および１５から２２のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項２４】
白髪を処理するためのローションとして調合された、請求項１、３から８、１０から１２、および１５から２２のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項２５】
化粧用抗斑リポソーム状ゲルとして調合された、請求項１、３から８、１０から１２、および１５から２２のいずれか一項に記載の化粧品組成物。
【請求項２６】
抗斑リポソーム状ゲル組成物として調合された、請求項２から７、および９から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
試薬としてフコース残基を有するリポソームと保持されたメトトレキセートとを含む皮膚病学的抗メラノーマリポソーム状ゲルとして調合された、請求項２から７、および９から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
フコース残基が、Ｇａｌ(アルファ１−３)ＬａｃもしくはＧａｌ(１−３)ＧａｌＮＡｃ(１−４)Ｇａｌ(１−４)Ｇｌｃ部位から選択されるスペーサーアームの末端に配置される、請求項１ないし２７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、リガンド−レセプター結合により色素細胞（メラニン細胞）の膜にフコース含有組成物を結合させる方法、前記組成物の製造方法、前記組成物を含有し、かつ色素沈着に有効な化粧品もしくは薬品組成物、およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞を認識する方法、たとえば、タンパク質などの物質または他の細胞に対して細胞を認識する方法は、従来より知られており、それは、細胞の表面のレセプタとリガンドとの反応により、認識されるものである。
たとえば、モノクローナル抗体による表面抗原の認識が知られており、この現象は、治療もしくは診断において利用されている。たとえば、仏国特許第Ａ１−２６０６０３４号による記載が挙げられるが、これには、新しい表面プロテインを認識することができ、抗原抗体反応に基づいた技術において特に試薬として使用されることが可能な抗体が、開示されている。
【０００３】
認識プロセスは、糖を含むものとしても知られている。糖は、膜レセプターによって特異的に認識される。しかし、認識された糖は、他のものと細胞のある型のものと同一ではない。例えば、ラットの肝細胞はガラクトースを特異的に認識するが（アッシュウエル  ジー．およびモレル  エー．ジー．，アドバンス  エンザイモロジー  （Ashwell G. and Moarell A.G., Advan. Enzymol.）（１９７４）  ４１巻  ９９−１２８）、ヒト繊維芽細胞はマンノース−６−リン酸塩を認識する。
このような既知の事実をもとに、組織中にある特異的認識部位に到達して作用することが求められる標的薬物搬送システムの開発が試みられている。リポソームは、この目的のために特に利用されている。
【０００４】
バングハム（BANGHAM）（分子生物学雑誌（J. Mol. Biol.）１３巻、２３８−２５２（１９６５）によるリポソームの発見以来、リポソームは薬物または他の活性成分を運ぶ手段として用いられてきた（例えば、仏国特許文献Ａ−２  ２２１  １２２、Ａ−２  ４１５  ４６０またはＡ−２  ５４０  ３８１を参照せよ）。
仏国特許文献Ａ−２  ６０９  ３９７は、炭水化物型組成物または物質を、皮膚病学的、化粧品学的、製剤学的組成物の活性成分または細胞や組織に生物エネルギー的ポテンシャルを与えるための細胞刺激組成物の活性成分として（請求の範囲第１項参照）、あるいはその組成物の保湿効果、肌を滑らかにする効果あるいは柔軟効果によって肌の状態を整える活性成分として用いることに関連したものである（３ページ、３３行目から４ページ、１０行目まで、そこには抗炎症作用さえも示されている）。
【０００５】
よって、前記文献は、一般的なことを示唆しているだけで、メラニン細胞特有の問題には触れていない。
バイオコンパチブル社（BIOCOMPATIBLES LTD）の特許文献ＰＣＴ／ＷＯ８７／０５３００は、水依存性構造を有する物資を保護するための方法に関するもので、この方法は物質をポリヒドロキシル組成物かなる水溶液に接触させて物質から水分を取り除くもので、ヘモグロビン、赤血球、リポソームおよび細胞のような生物学的物質を長期間にわたって保存することを目的としている（１ページ、１から４行目参照）。
【０００６】
前記文献は、化学的および物理的減衰過程をさけるためにサッカロイド含有水溶液からのタンパク質を乾燥させるという問題に関したものである（３ページ、第二段落参照）。
より最近になって、リポソームに特異性を与えることが提案されている（バーベット  ジェー (BARBET J.)らによる、「リポソームに共有的に結合するモノクローン抗体：細胞に対する特異的認識」、超分子構造細胞生化学雑誌（J. Supramol. Struct. Cell. Biochem.）１６巻、２４３−２５８（１９８１）、レセレ ルマン  エル．デー（LESERMAN L.D.）らによる、「モノクローン抗体またはプ ロテインＡに共有的に結合したフルオレセントリポソームの細胞への特異的認識」、ネイチャー、２２８巻、６０２−６０４（１９８０））。
【０００７】
さらに、特許文献ＷＯ  ８８／００４７４は、薬物を含有した脂質ベシクルと、胆道・胆のう（hepatobiliary）のレセプターに特異的な残基を含むリガンド を有し、さらに肝細胞に対して有効に作用することが可能な構造となった脂質膜構造を開示している。
欧州特許文献Ａ−Ｏ  ０２８９１７は、治療および診断を目的としたリンパ球を標的とした搬送体として、炭化水素表面を有する脂質ベシクルに関するものである。しかし、この文献ではメラニン細胞を標的とすることに関しては、何ら述べられていない。
【０００８】
欧州特許Ａ−Ｏ  ２８５  １７４は、肝臓のクッパー細胞に対して特異的親和性を持ち、またリポソームにような薬学的調整物を修飾するための成分として効適なマンノビオース誘導体に関するものである。
１９８７年６月発行のカールスルー・エス・テー・エヌ・データベース（STN   database of KARLSRUHE）第１０６巻のアブストラクト１９３５７９ｊは、皮 膚科学関係の雑誌（Journal of Investment Dermatology, 88(4),412-417）に掲載されたトダの論文に関するもので、フィブロネクチン、コラーゲンまたは構造膜のような、異なるリガンドを結合した基質上での単離ヒト皮膚細胞の培養をあつかっている。
【０００９】
したがって、前記文献は、本発明とは解決しようとする課題およびそのための手段が異なるものである。
実際のところ、この文献ではリガンドを被覆したすべての基質上での増殖能を活性化させるために表皮細胞のの培養方法を推薦している。
この文献は、下記の発明が、当業者にとって全く明らかにされたものではないことを示している。
【００１０】
最後に、バイオカーブ（BOICARB）の特許出願ＰＣＴ／ＷＯ  ８６／０５７８ ９も、治療または診断目的のための特異的認識に関係した炭化水素誘導体に関するものであり、この特異的認識はヒトを含む哺乳類の異なる組織の分子に対して有効的になされる（１ページ、４ないし８行目参考）。
第２ページに示した目的から、前記文献に記載された発明は、特定のレセプターによる病原性細菌の検出に関連していることが明かである。
従って、前記文献は、以下に記述される本発明とは異なり、メラニン細胞を標的するという問題に関してはなんら言及されていない。
皮膚に関するかぎり、メラニン細胞に対して優先的かつ特異的に、また、局所的に与えられる皮膚科学、特に化粧品に有益性があることが明かである。メラニン細胞膜レセプターへの結合は、この問題の解決となる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
いままでのところ、メラニン細胞表面上の糖レセプターは知られていない。
本発明によれば、フコース残基、特にアルファ−Ｌ−フコース残基からなる少なくともひとつのリガンドを持つ組成物をもちいた場合、リガンド−レセプター結合手段によって、その組成物がメラニン細胞の膜に結合できるということを、まったく偶然にも発見した。フコース残基、特にアルファ−Ｌ−フコース残基は、メラニン細胞のレセプター部位に対する特異的リガンドであるという、実際に予想もつかないようなことを発見した。
【００１２】
さらに、メラニン細胞膜のレセプターに対して特異的なリガンドを形成するこの糖を持つ組成物がいろいろな形状をとることが示されてきた。例えば、リポソームまたは重合性ナノ粒子のような微小粒子、または天然あるいは合成の分子または巨大分子、例えばタンパク質のような形状をとることが可能である。また、糖はこの組成物の表面へ種々の方法によって結合可能なリガンドを形成する。この場合、共有化学結合、好ましくはスペーサーアームを介して結合することが有益である。
【００１３】
よって、本発明の目的は、メラニン細胞をとりまく他の細胞の犠牲を払うことなしに、リガンド−レセプター結合によって、メラニン細胞の膜へ組成物を特異的に結合させることを可能とする溶液を提供することからなる新しい技術的問題を解決することを目的とする。
本発明は、非常に単純で、素早く、実際的で、かつ信頼性のある方法によって新しい技術的問題を解決することを目的とする。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、リガンド−レセプター結合によって、メラニン細胞の膜へリガンド−レセプター結合特異的に結合することが可能な組成物を調製するための、単純で、すばやく実施できて、実際的かつ信頼性のある方法を提供することによって、前述した新しい技術的問題を解決することを目的とする。本発明のさらなる目的は、リガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜へ特異的結合をすることが可能な組成物を提供することによって前述した新しい技術的問題を解決することを目的とするもので、前記組成物は、取扱いが容易で、信頼性を有し、そして特別のステップをふまずに素早く用いることが可能な形状となっている。本発明のさらなる目的は、化粧品用または、薬学的組成物、特に皮膚科学的組成物と、そのような特徴的組成物を調製および取り込ませる方法とを提供することによって、前述した新しい技術的問題を解決するもので、前記方法は急速かつ実質的な方法を用いて、リガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜への特異的結合の信頼性に関した前記の決定的技術的利点をすべて有するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、工業的規模で利用可能な、非常に簡単な前記した方法で、前記した溶液を提供することによって前記した技術的問題を解決する。
よって、第一の態様によれば、本発明はリガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜へ組成物を結合させる方法を提供するもので、この方法は膜レセプターに接近可能なオシド残基からなる少なくともひとつのリガンドに結合した基本構造からなる組成物を用いるものである。このオシド残基は、フコース残基、特にアルファ−Ｌ−フコース残基である。
ひとつの有益な特徴にもとづけば、リガンドは共有結合によって前記基本構造の表面へ結合する。
【００１６】
本発明に基づく方法の別の有益な特徴にもとづけば、リガンドは前記基本構造表面と結合するもので、その結合は、スペーサーアーム、例えばヘテロ二重機能剤の残基または炭水化物鎖、例えばＧＡＬアルファ１−３ＬＡＣまたはＧＡＬ（１−３）ＧＡＬＮＡｃ（１−４）ＧＡＬ１−４）ＧＬｃ基のような基を介しておこなわれる。そのようなスペーサーアームは、当業者にとって既知であり、例えばジェー・エス・スラマ（J.S. Slama）およびアール・アール・ランドー（R.R. Rando）の論文、生科学（Biochemistry）、１９８０年１９巻、４５９５−４６００ページを参照することができる。
【００１７】
本発明に基づく方法の他の、特に有益な特徴によれば、前記組成物は、リポソームまたは重合性ナノ粒子のような準微小粒子である。
例えば、▲１▼  プコ脂質、好ましくは炭水化物鎖の末端基としてアルファ−Ｌ−フコース残基を有するセラミドセラミドオリゴサッカライド、特に好ましくはブタ消化粘膜から抽出されたフコ脂質（Slomiany B.L. et al., European Journal of Biochemistry, 1974, 43, 161-165）、もしくは雄ブタの精巣から抽出されたフコ脂質（Suzuki A. et al; Journal of Biochemistry (Tokyo) (1975, 78, 947-954)、▲２▼  フコペプチド、▲３▼  フコプロテイン、特に例えば血清アルブミン（ＳＡ）、例えば牛またはヒトの血清アルブミンと、フルコース、特にアルファ−Ｌ−フルコースとを化合させて得られるネオグリコプロテイン等が挙げられる。
【００１８】
本発明にかかる方法の他の特に有益な特徴によれば、上記リポソームの二重層はフコース残基に関係する脂質、特にα−Ｌ−フコース残基を含んでおり、このフコース残基は、先に限定したようにスペーサーアームの端部に有利に位置されている。たとえば上記脂質はフコ脂質、特に先に限定したように、フコース化されたセラミドオリゴ糖でも差し支えない。
リポソームの表面に存在するフコース残基はそれが有する疎水特性のため、とくに炭水化物鎖の端部に存在すると、メラニン細胞膜レセプターに対して容易に接近する。
【００１９】
本発明に基づく方法の他の目的に基づけば、前記組成物は、化粧用品としてまたは薬剤学的なものとして興味ある物質、特に皮膚科学的に興味ある物質、例えばメラニン細胞の代謝を変えるための試薬またはそれを含むものである。
第２の態様によれば、本発明はまた、リガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜へ結合する組成物を選択する方法を提供するもので、この方法は、レセプターに接近可能なオシド残基からなる少なくともひとつのリガンドと結合した基本構造からなる組成物の群れから選択され、さらにオシド残基はフコース残基、特にアルファ−Ｌ−フコース残基である。
【００２０】
第３の態様によれば、本発明はまた、リガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜へ結合する組成物を調製する方法を提供するものであり、この方法は膜レセプターへ接近可能なオシド残基からなる少なくともひとつのリガンドへ対応するオシド残基が結合することが含まれる。この場合、用いられるオシド残基は、フコース残基、特にアルファ−Ｌ−フコース残基である。
特に有益な特性のひとつに基づけば、前記リガンドは共有化学結合によって基本構造へ結合する。この結合は、マック・ブルーム（Mac Broom）の論文、酵素学の方法（Methods in Enzymology）、第２８巻、２１２−２２２ページに記載 された一般的方法、またはエフ・ジェー・マーチンおよびデー・パパハジョポーロス（F.J. Martin & D. Papahadjopoulos）の論文、生化学雑誌（Journal of Biological Chemistry）（１９８２）、第２５７巻Ｎｏ．１，２８６−２８８ペ ージに記載された方法によってなされる。
【００２１】
本発明に基づく方法の他の有益な特徴に基づけば、前記リガンドはすでに述べられたようなスペーサーアームを介して基本構造に結合する。
本発明に基づく方法の、別の有益な特徴に基づけば、基本構造は、リポソームまたは重合性のナノ粒子のような準微小粒子からなる。
本発明にかかる方法のさらに他の特に有益な特徴によれば、上記リポソームの二重層は、先に限定したように、フコース残基に関係する脂質、たとえばフコ脂質を含んでいる。
本発明に基づく他の特徴に基づけば、前記基本構造は、天然または合成の分子または巨大分子であって、例えば血清アルブミンのようなタンパク質である。さらに、本発明の優れた特徴のひとつは、前記組成物は、化粧用または薬剤学的に興味ある物質、特に皮膚科学的物質そのもの、あるいはそれを含むもので、例えばメラニン細胞の代謝を変えるための試薬である。
【００２２】
第４の態様によれば、本発明は、リガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜へ結合する組成物を包含するもので、この組成物はすでに述べた方法のひとつによって得られる。また、本発明はリガンド−レセプター結合によってメラニン細胞の膜に結合することが可能な新規な組成物を包含するものであり、前記組成物は膜レセプターに接近可能なオシド残基からなる少なくともひとつのリガンドを含むものである。このオシド残基は、フコース残基、特にアルファ−Ｌ−フコース残基であり、基質と結合する。この基質は、リポソームまたは重合性ナノ粒子のような準微小粒子、血清アルブミンのようなタンパク質などの分子または巨大分子、そして化粧品としてまたは薬剤学的、特に皮膚科学的に興味ある物質から選択されるものである。有益な特徴にもとづけば、この結合はヘテロ二重機能性剤の残基のようなスペーサーアームまたはＧＡＬ（アルファ１−３）ＬＡＣまたはＧＡＬ（１−３）ＧＡＬＮＡｃ（１−４）ＧＡＬ（１−４）ＧＬｃ基のような、いくつかの糖の基を介してなされる。
本発明にかかる方法のさらに他の特に有益な特徴によれば、上記リポソームの二重層は、先に限定したように、フコース残基に関係する脂質、たとえばフコ脂質を含んでいる。
【００２３】
第５の態様に基づくと、本発明は化粧用または薬剤学組成物、特に皮膚病学的組成物を提供するものである。この組成物は、前記したまたは前記のように定義された方法によって得られる少なくともひとつの組成物を含む。
本発明の有益な特徴によれば、前記組成物は、メラニン細胞のいかなる治療または処置、例えばメラニン産生機能の活性、すなわちメラニン産生活性の増進または阻害、癌性メラニン細胞の活性、すなわち黒色腫の治療等に有効であると同時に、このような場合において、本発明の組成物は、いかなる化粧品用もしくは薬学的、特に皮膚生理学的に活性な化合物もしくは物質と、当業者にとって自明な方法により化合しもしくは組み合わせることが可能である。この物質もしくは化合物としては、例えばチロシン(tyrosine)、フォルスコリン(forskoline)等のメラニン産生刺激剤、もしくはリノール酸、１−オレイル−２−アセチルグリセロール等のプロテインキナーゼＣ、例えばコジック酸(kojic acid)といったチロシナーゼ阻害剤等のメラニン産生阻害剤、特にスフィンゴシン(sphingosin)といったプロテインキナーゼＣ阻害剤、特にレチン酸もしくはその誘導体等の漂白剤、ベータカロチン等のカロチノイドなどが挙げられる。これらの薬剤の中で、癌性メラニン細胞の治療に有効名ものとしては、メトトレキセートが挙げられる。
【００２４】
最後に、本発明はさらに化粧用、もしくは薬学的組成物、特に皮膚生理学的組成物の調製のための方法に関するものである。ここで、上記方法の一つにより得られるような、もしくは上記定義のような少なくとも一つの生産物は、化粧品もしくは薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルもしくはキャリアーと共に用いることができる。
同様に、本発明はまた、メラニン細胞の影響、例えば特にメラニン産生の増進もしくは阻害といったメラニン産生の活性に関するもの、癌のようなメラニン細胞の疾患に関するものを治療および監視する方法であって、治療される範囲に局所的に用いられる方法、および上述した方法の一つにより得られる、もしくは上記定義により定義される生産物であって、好ましくは任意に化粧用もしくは薬学的に許容されるビヒクル、キャリアーもしくは賦形剤と共に用いられる生産物をも含むものである。
【００２５】
本発明は、細胞を組成物の標的化とすることを可能とするもので、フコース残基、特にα−Ｌ−フコース残基からなる少なくともひとつの特異的リガンドの存在によってメラニン細胞に特異的に集中する。
本発明において、フコース残基からなる特異的リガンドが結合する組成物は、任意の性質（arbitrary nature）のものである。
例えば、合成方法によって前記フコースが結合するタンパク質を用いることが可能である。
本発明の有益な実施態様によれば、タンパク質によって運ばれる前記したようなオシド残基の数は、少なくとも約２０である。
利用可能な他の基本的な組成物は、リポソーム形状脂質ベシクルのような準微小粒子である。
【００２６】
本発明において、「脂質」という用語は、５つの炭素原子よりも一般的に長い、いわゆる脂肪炭素鎖を含む全ての物質を含むもので、一般に「脂質」と呼ばれているものを指す。
本発明によれば、両親媒性脂質、すなわちイオン性または非イオン性の親水基と、親脂質性基とを有する分子からなる脂質は、前記リポソームを形成するための脂質として用いられる。このような両親媒性脂質は脂質ラメラ相特に水相の存在におけるリポソームを形成することができる。
このような両親性脂質のなかでも以下のものが好適である。すなわち、リン脂質、アミノリン脂質、グリコ脂質、ポリエトキシル化脂肪アルコールおよびポリエトキシル化または非ポリエトキシル化されたポリオールエステルである。これらの物質は、たとえばタマゴまたは大豆レクチン、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、セレブロシドまたはエトキシル化ポリグリセロールステアレート等が好ましい。
【００２７】
本発明の有益な特徴によれば、リポソームに関するかぎり、本発明に基づくフコースの誘導体の比は、リポソームの二重層を形成するすべての脂質分子のモノパーセントとして、リポソームに含まれるすべての両親媒性質に対して少なくとも１０％から１００％の範囲内、好ましくは少なくとも１５％から５０％の範囲内である。
注目すべきことに、フコース残基の親水性によって、フコース残基は、リポソームの脂質二重層の外側に配設される。また、オシド残基のいくつかは、内側方向に配向し、残りのものはリポソームの外側に向けて配向する。さらに、リポソームがより小さければ、外側方向に配向したフコース残基の数は増える。よって、フコース残基の多くが、メラニン細胞に容易に接近することが可能となる。このように接近することは、オシド残基がスペーサーアームの端に位置した場合、より好ましくなされる。
【００２８】
本発明によれば、用いることができる他の基本的組成物は、１マイクロメートルよりも小さな次元からなる重合性ナノ粒子、好ましくは本発明に基づくフコース残基に容易に結合することを許すＮＨ2基、アルコール基、またはチオール基 を有する重合性ナノ粒子である。また、好ましくは、ポリラクテートのような生物学的に消滅可能なナノ粒子を選ぶことが好ましく、このことは当業者にとっては既知のことである。このようなＮＨ2基を含む特定の粒子は、商業的に、例え ばインターフェーシャル・ダイナミックス・コーポレーション（Interfacial Dynamics Corporation）（米国オレゴン州ポートランド）から入手可能である。
本発明の有益な特徴によれば、前記重合性ナノ粒子の表面に結合したフコース残基は、アルファ−Ｌ−フコース残基である。
【００２９】
活性物質を含むために孔質性のナノ粒子を好適にもちいることができる。
本発明の有益な態様によれば、前記リポソームまたはナノ粒子のような基本的粒子のような基本的組成物は、ひとつ以上の化粧品または薬剤として関心のもたれる物質、たとえばメラニン細胞の代謝を整えるもの、すなわちキサンチンのようなホスフォジエステラーゼの阻害剤、特に３−メチルキサンチン、またはイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、フォルスコリンのようなアデニレートサイクラーゼ活性剤、リンクル酸（lincleic acid）または１−オレイル−２−アセ チル−グリセロールのようなプロテインキナーゼＣ活性剤、スフインゴシンのようなプロテインキナーゼＣ阻害剤、またはメトトレキサートのような抗ガン剤である。
【００３０】
本発明に基づいて使用される基本組成物は、化粧品または薬剤として、特に皮膚科学的に関心がもたれる実際に活性のある物質である。
本発明の他の目的、特徴および利点は、本発明のいくつかの実施例のたすけをかりた説明的記載によって明らかにされよう。また、本発明はそのような記載によって限定されるものではない。実施例において、特に指示がないかぎり、全てのパーセントは重量パーセントを意味する。
【００３１】
【実施例】
実施例１：フコース残基を有するリポソームの調製
Ａ、α−Ｌ−フコースのリン脂質へのカップリング
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ：ｄｅｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）の分子と、α−Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）の分子とのカップリングは、ｐ−フェニルイソチオシアナート−α−Ｌ−フコピラノシド（ＰＰＩＴＣ−α−Ｌ−フコピラノシド：ｐ−ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ−α−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を、ＤＰＰＥのアミン基と反応させることにより、行なわれる。
【００３２】
ＰＰＩＴＣ−α−Ｌ−フコピラノシドは、Ｃ. Ｒ. マックブルームらによる文献、酵素化学における方法（１９７２）２８巻、２１２−２２２ページに記載された方法に基づいて、ｐ−アミノフェニル−α−Ｌ−フコシドから、チオホスゲンと反応させることにより、得られるものである。
市販されているＤＰＰＥおよびＰＰＩＴＣ−α−Ｌ−フコピラノシドは、等モルで、重炭酸塩緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ  ９.５）およびエタノールからなる混合物に、５０℃において溶解される。温度は、５０℃で３時間保持され、混合物は撹拌される。この反応媒体は、次いで、約４℃に冷却され、遠心分離される。
蒸留水で洗浄された後に得られた固体を、凍結乾燥したところ、フコシレート化されたＤＰＰＥ（ＤＰＰＥ−Ｒｈａ）が得られた。
【００３３】
Ｂ、リポソームの調製
以下のものを計量した。
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）          ４８.６ｍｇ
コレステロール（ｃｈｏｌ）                              ２５.６ｍｇ
ジセチルリン酸（ＤＣＰ）                                  ９.１ｍｇ
本発明による組成物＝ＤＰＰＥ−Ｆｕｃ                    １６.７ｍｇ
【００３４】
上記組成物が、たとえば１００ｍｌ容量の平底フラスコで混合された後、バンガムらの文献、Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ.、１３、２３８−２５２（１９６５）に 記載された回転式フラスコ方法に基づいて、クロロホルム／メタノール、７／１の混合液に溶解される。溶媒は、次いで、５５℃において減圧蒸留され、残った少量の溶媒は、前記フラスコの壁部に形成された”グリース状（ｇｒｅａｓｙ）”のフィルムに、窒素をふきこむことにより、除去可能である。
前記脂質層から形成されたリポソームの内側にカプセル封止される水溶液１０ｍｌが、フラスコに添加される。この実施例において水溶液は、たとえば、４０ｍｌの蒸留水に対して８ｇの割合で、５−（６）−カルボキシフルオレセインのカリウム塩からなる、蛍光マーカーを含有してもよい。
【００３５】
また、他の実施例においては、等量のカルセインブルーもまた、蛍光マーカーとして、使用されることも可能である。
カプセル封止されるべき上記水溶液１０ｍｌが添加された後、この混合物は、暗所にて、１５時間から２４時間、磁気的に撹拌される。
光学顕微鏡でみると、大きな脂質胞の形成が観察される。
フラスコの内容物は、とけている氷により冷却された３０ｍｌの容器に移される。
【００３６】
好ましくは、懸濁液は、２００Ｗの電力で、４℃において２分間、３回にわたって、音波処理にふされる。これにより、実質的に均一で、概ね顕微鏡サイズの、リポソームを形成することが可能である。
このようにして得られたリポソームの懸濁液は、４℃において、保存可能である。
好ましい実施態様においては、リポソームは、従来から知られているリポソーム精製方法にしたがって、ゲル濾過により、カプセル封止されなかった水溶液層から分離することによって、精製される。
【００３７】
実施例２：スペーサーアームを介してアルファ−Ｌ−フコース残基を有するリポソームの調製
Ａ、スペーサーアームを有するアルファ−Ｌ−フコースの調製
【００３８】
【化１】
0003727073.tif 000002
【００３９】
”活性化されたオシド”は、α−Ｌ−フコピラノシル残基からなり、１位の炭素に結合する水酸基が、末端にＳＨ基を有する直鎖により置換されたものであるが、この糖は、順次、以下の過程を経ることにより、調整されるものである。
２、３、４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコラムノピラノシド（２）の合成
前記誘導体（２）は、ケンペン（Ｋｅｍｐｅｎ）  Ｈ. Ｊ. Ｍ. らによる文献、Ｊ. Ｍｅｄ. Ｃｈｅｍ. （１９８４）２７、１３０６−１３１２に基づいて、臭化リン、ＰＢｒ3、（７当量）、および、水（５０当量）を、撹拌しながら、０℃で、無水酢酸中、１、２、３、４−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコース（１）と反応させることにより得られる。この生成物（２）は、ジイソプロピル  エーテル／ヘキサンの混合溶媒により再結晶される。
【００４０】
２−Ｓ−（２、３、４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコピラノシル）−２−チオプセウドウレア  ハイドロブロマイド（２−Ｓ−（２、３、４−ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−２−ｔｈｉｏｐｓｅｕｄｏｕｒｅａ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）（３）の合成
前記誘導体（３）は、チポウスキ−（Ｃｈｉｐｏｗｓｋｙ）  Ｓ. らによる文献、Ｃａｒｂｏｈｙｄ. Ｒｅｓ. （１９７３）３１、３３９−３４６にしたがって、等モルの、前記誘導体（２）およびチオウレアを、無水アセトンにおいて、アルゴン雰囲気下、３時間、還流することにより得られる。この生成物（３）は、イソプロパノールから、再結晶される。
【００４１】
１−（２−カルボキシエチル）チオ−２、３、４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコピラノシド（４）の合成
生成物（４）は、等モルの、前記誘導体（３）および３−イオドプロピオン酸を、水／アセトン、１：１の混合溶媒において、１.１５当量の炭酸ナトリウム および２当量の異性重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ5）の存在下、反応させることにより、得られる。この反応は、酢酸エチル／酢酸／水、８：２：１の混合溶媒において、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を展開することにより、その進行を追うことができる。
【００４２】
１−（２−カルボキシエチル）チオ−α−Ｌ−フコピラノシド（５）の合成
誘導体（５）は、メタノール溶媒において、４当量のトリエチルアミン、および３当量の水の存在下、生成物（４）を脱アシル化反応させることにより、得られる。この反応は、酢酸エチル／酢酸／水、８：２：１の混合溶媒において、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を展開することにより、その進行を追うことができる。６日後、反応が完結する。脱アシル化した生成物は、前記反応媒体ｗｏ、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ２カラム（ＨＣＯＯ−）に通過させることにより、単離される。
【００４３】
１−（２−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルアミノカルボニル）エチル）チオ−β−Ｄ−フコピラノシド  ハイドロクロライド（６）の合成
０.５ｇの誘導体（５）（１.８ミリモル）、および０.８ｇの１、３−ジアミ ノプロパン−２−オール（９ミリモル）が、２０ｍｌの水に溶解される。この溶液のｐＨは、５.５（塩酸）に調整され、１.１ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５.４ミリモル）が添加される。この反 応は、撹拌しながら、室温にて、２４時間で進行する。生成物（６）は、前記反応媒体を、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ２（Ｎａ+）に通過させることにより、単離される。（溶出液：モノアミンを分離するには、０.３３Ｎ塩酸、およびジアミンを 分離するには、２Ｎ塩酸）。生成物（６）が、最終的に得られる。
【００４４】
生成物（６）およびＳ−アセチルチオグリコール酸から形成されるアミド（７）の合成
生成物（７）は、等モルの、誘導体（６）およびスクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ、デュカン（Ｄｕｃａｎ）らによる文献、Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. （１９８３）１３２、６８−７３により、合成された）が、無水ジメチルホルムアミド溶媒において、トリエチルアミン（１当量）の存在下、反応させることにより、得られる。このようにして得られた生成物（７）は、特に精製することなく、以下の工程において、使用される。
【００４５】
生成物（７）のチオール基の脱保護：
化１の誘導体の合成
チオール基は、アルゴン雰囲気下、ｐＨ＝７.５、０.１５ＭのＥＤＴＡ水溶液において、大過剰のヒドロキシルアミン（５０当量）を添加することにより、発生する。この反応は、Ｐ. Ｗ. リドルス（Ｒｉｄｄｌｅｓ）らによる文献、Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. （１９７８）９４、７５−８１に記載の方法に従って、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ’ｓ）試薬を用いて、チオールの分光光度定量により、追うことができる。１時間後に、反応は終了する。化１式の生成物は、リポソームに合体用として使用される。
【００４６】
Ｂ、マレイミド基を有するリポソームの調製
これらのリポソームは、たとえば、実施例１に記載されているような、従来の方法により、調製される。この脂質層の組成は、以下の組成物：
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ：ｄｅｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｌｏｒｉｎｅ）；
Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＢ−ＤＰＰＥ：Ｎ−［４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒｙｌ］ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）；コレステロール（ｃｈｏｌ）が、モル比１０：２：７の割合である混合物である。
【００４７】
ＭＰＢ−ＤＰＰＥは、マレイミド基を有するリン脂質であり、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）  Ｆ. Ｊ. およびパパハドジュポロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）  Ｄ. の文献、Ｊ. Ｂｉｏ. Ｃｈｅｍ. （１９８２）２５７、２８６−２８８に記載の方法にしたがって、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを、サクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）と反応させることにより、調製される。
【００４８】
Ｃ、フコシレート化されたリポソーム
マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）  Ｆ. Ｊ. およびパパハドジュポロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）  Ｄ. の上記文献に記載された方法は、以下のようなものである。
ステップＡにおいて調製された化１の生成物、６マイクロモルが、ステップＢにおいて調製されたリポソーム、これはｐＨ６.５に緩衝されているが、このリ ポソームの水懸濁液、０.６７ｍｌに添加される。
【００４９】
この混合物は、アルゴン雰囲気下、室温で、１２時間、穏やかに撹拌される。化１の生成物のチオール基は、次いで、付加反応によりマレイミド基の２重結合に結合される。
このようにして、化１の組成物の鎖に相当する（スペーサーアーム）原子の鎖の末端に位置する、フコシレート残基を、その表面に含有する、リポソームが得られる。
【００５０】
実施例３：表面にフコース残基を有するナノ粒子の調製
主に、ポリスチレンからなり、その表面にＮＨ3+基を有し、約０.５μｍの 平均径を有するビーズ形状の、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、商業的に入手可能である。このようなナノ粒子は、たとえば、インターフェイシャルダイナミックス社（Ｉ. Ｄ. Ｃ. 、ポートランド、オレゴン、米国）から、入手可能である。
【００５１】
したがって、実施例１のステップＡにしたがって操作することにより、フコース残基を、このようなナノ粒子にカップリングさせることが可能となる。
これは、重炭酸塩緩衝液、５ｍｌにおいて、α−Ｌ−フコピラノシド  フェニルイソチオシアネートの９マイクロモルを、これらのビーズ、０.６ｇと、ｐＨ ９.５において、４℃で、５時間反応させることにより、完了する。
このビーズは、次いで、収集され、ＰＢＳにより、２度洗浄される。
このようにして、表面にラムノシレート残基を有するナノ粒子が得られる。
【００５２】
実施例４：フコース残基を有するネオグリコプロテインの調製
たとえば、子牛血清アルブミン、ＢＳＡの蛋白質が、本ケースにおいては使用され、約２０ユニットのラムノースが、この蛋白質に結合されて、ネオグリコプロテインが得られる。
このネオグリコプロテインは、フコシレート化されたＢＳＡといわれているものであるが、マックブルーム（ＭｃＢｒｏｏｍ）らによる文献、酵素学における方法（１９７２）２８、２１２−２２２に記載の方法に基づいて、得られるものである。
【００５３】
この方法は、実施例１に記載されたように調製された、２５０ｍｇ（約１ミリモル）のＰＰＩＴＣ−α−Ｌ−フコピラノシドを、０.１５Ｍ食塩水溶液、２ｍ ｌに溶解し、ＢＳＡを３００ｇ添加することからなる。このｐＨは、水酸化ナトリウム（１Ｎ）により、９.０に調整される。室温で６時間撹拌したのち、反応 混合物を、ｐＨ７.０の０.１５Ｍ食塩水溶液、２リットルに対して、４℃において、１６時間、透析する。フコシレート化されたＢＳＡは、セファデックスＧ２５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（０.５Ｘ２０ｃｍのカラムに、ＢＳＡによって あらかじめ飽和されたゲル、１０ｍｌ）に通過させることにより、精製される。フコース残基がないことにより、いかなる不純物をも含有しないことは、薄層クロマトグラフィーにより、確認される。ここで、フコース化された試薬は、０. ３２（クロロフォルム／メタノール＝１／１）のＲｆを有するが、フコース化されたＢＳＡは、移動しないものである。前記糖の定量分析に関連した、蛋白質の定量分析をおこなうことにより、１つのＢＳＡ分子に対して、１０から３０のフコース残基の、グラフト比を決定することが可能である。
【００５４】
実施例５：メラニン細胞の膜に対する本発明による組成物の特異性決定
メラニン細胞の膜に対して、オシド（ｏｓｉｄｅ）配位子を有する本発明による組成物の特異性は、本発明者らにより合成された、蛍光ネオグリコプロテインを用いることにより、決定することが可能である。蛍光ネオグリコプロテインのエンドサイトーシスは、種々の方法により、特に、フローサイトメトリー分析により、観察することが可能である。このエンドサイトーシスが大きければ大きいほど、細胞膜における結合の特異性がより多くなり、その結果、エンドサイトーシスの観察により、間接的に、本発明による組成物の結合の特異性が測定されるということに注目すべきである。
【００５５】
Ｉ、材料および方法
Ａ、材料
ＲＰＭＩ  １６４０、ゲンタマイシン、ファンギゾーンおよびトリプシンは、ギブコーヨーロッパ社（ＧｉｂｃｏーＥｕｒｏｐｅ  ｌｔｄ）から得られ、また、牛の胎児の血清は、フローラボラトリ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、スコットランド、英国）から入手された。合成メラニン、および、ヨウ化プロピジウムは、シグマケミカル社（セントルイス、ＭＰ、米国）から入手され；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、メルク社（ダームスタッド、ＦＲＧ）から入手され；１−オレオイル−２−アセチルーグリセロール（ＯＡＧ）およびモネンシンは、カルバイオケム（ラ  ジョラ、ＣＡ、米国）から、入手された。子牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＩＢＦ−バイオテクニックス（ビルヌール、ラジェルマン、フランス）から、入手された。
【００５６】
Ｂ、細胞培養
Ｃ32ヒトメラニン欠乏性メラノーマ細胞線は、Ｂ.  ホ−ンメル博士（トロピ カルメデシンのリバプールスクール、リバプール、英国）から提供された。この細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０培地で、３７℃の温度下、５％の二酸化炭素と９５％の空気において、培養された。なお、これは、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の熱不活性な牛の胎児の血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、２.５μ ｇ／ｍｌのファンギゾーン、および、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するものであり、以下、これを、完全培地と呼ぶ。細胞は、０.０２％のＥＤＴＡ のＰＢＳ溶液（ｗ／ｖｏｌ）を用いて、対数的な成長相において、収穫された。
【００５７】
Ｃ、色素沈着のＯＡＧ刺激
ＯＡＧは、プロテインキネーゼＣの活性を通して、特にヒトメラニン細胞により、著しく、メラニン産生を誘導することが知られている（ゴードンら、（１９８９）９３、７００−７０２）。
メラニン細胞は、フェノールレッドなしに培養培地において、ファルコン（ベクトン、およびディキンソン、グレノーブル、フランス）から得られた、直径が３.５ｃｍである６−平底ウエル組織培養プレートの１ウエル あたり、２.５×１０5の細胞が存在するようにまかれた。これに、ＯＡＧ（５から３００μＭ ）が、２４時間後、添加された。４８時間刺激を与えた後、ディッシュは収穫され、細胞数はマラッセスハエモシトメータ（Ｍａｌｌａｓｓｅｚ  ｈａｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いることにより、測定された。
【００５８】
メラニン濃度を測定するために、細胞ペレットは、１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解され、１５分間、激しく撹拌された。メラニン濃度は、分光光度計（コントロンーユニコン）を用いて、４７５ｎｍにおける光学濃度の測定を行い、そして合成メラニンを用いた標準曲線（フリードマンおよびギルチェスト、１９８７）と比較して、計算された。対照実験は、刺激を受けていない細胞で行われた。ＯＡＧにさらされた後のメラニン化反応の時間過程は、最良の濃度でのＯＡＧの存在下で１２〜７２時間に渡って培養することにより測定された。
【００５９】
Ｄ−ネオグリコプロテイン合成および蛍光ラベリング
実施例４では、フコシレート化されたネオグリコプロテイン、すなわちＦｕｃ−ＢＳＡの調製が開示されている。
他のグリコシレート化−ＢＳＡは子牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）に相当するグリコシド−フェニル−イソチオシアネートの反応により調製された。これらのネオグリコプロテインは、前記のロッシュら（文献：Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３），２２，１３１−１４０））により記載されているように、フルオレセイニル−イソシアネート異性体１（ＦＩＴＣ−１）と反応させることにより、フルオレセイン化された。フルオレセインによりラベルされたネオグリコプロテイン（Ｆ−ネオグリコプロテイン）は、ブタノール／水（５：９５）の溶媒で、ＩＢＦリアクティフ社（ビルヌール、ラジェルマン、フランス）から入手された、ウルトロゲルＧＦ０５のカラムにより、ゲル濾過することによって精製され、凍結乾燥された。
【００６０】
使用されたすべてのネオグリコプロテインは、２０±５の糖ユニットを含有する。ネオグリコプロテインの中性糖濃度は、レゾルシノール硫酸ミクロ方法（モンサイニらによる文献、Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.（１９８８）
、１７５、５２５−５３０）を用いることにより、測定された。
ネオグリコプロテイン分子に結合したフルオレセイン残基の平均数（Ｆ／Ｎ比）は、プロナーゼによるタンパク質的消化ののち、４９５ｎｍにおける吸収から、決定されるものである。（Ｍｉｄｏｕｘら、シトメトリ（１９８７）、８、３２７−３３４）。これらの実験において使用されたネオグリコプロテインとしては、２±０.５であるということがわかった。
【００６１】
Ｅ、ＯＡＧ刺激されたＣ32メラノーマ細胞による、ネオグリコプロテインの内部移行および結合
指数的に成長しているメラノーマ細胞は、２４時間、３７℃において、１００μＭのＯＡＧにより、刺激された。刺激されていない細胞は、比較例として使用された。細胞は、ＰＢＳにおける０.０２％ＥＤＴＡ（ｗ／ｖｏｌ）により、収 穫され、遠心分離により収集されて、ｃ−ＰＢＣで洗浄され、０.２％ＢＳＡを含有するｃ−ＰＢＳ（ｃ−ＰＢＳ−ＢＳＡ）にお いて、３７℃で１時間、インキュベートされた。ここで、”ＰＢＳ”は、”燐酸緩衝液”ｐＨ７.４を意味し、”ｃ−ＰＢＳ”は、”完全なＰＢＳ”を意味する。すなわち、１ｍＭ  Ｃａ++および０.５ｍＭ  Ｍｇ++（抑制剤なし）を含有するＰＢＳで ある。次いで、ｃ−ＰＢＳ−ＢＳＡにおいて、蛍光ネオグリコプロテインの１００μｇ／ｍｌ存在下、細胞は、４℃で１時間（結合実験）、または、３７℃で９０分間（エンドシトシス実験）インキュベートされた。α−Ｌ−ラムノシル（Ｆ−、Ｒｈａ−ＢＳＡ）、６−ホスホ−β−Ｄ−ガラクトシル（Ｆ−、６Ｐ−Ｇａｌ−ＢＳＡ）、α−Ｌ−フコシル（Ｆ−、Ｆｕｃ−ＢＳＡ）、α−Ｄ−グリコシル（Ｆ−、Ｇｌｃ−ＢＳＡ）、ラクトシル（Ｆ−、Ｌａｃ−ＢＳＡ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニル（Ｆ−、ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ）置換された、子牛の血清アルブミンが、使用された。
【００６２】
インキュベーションの後、細胞は、ｃ−ＰＢＳ−ＢＳＡにおいて洗浄され、ｃ−ＰＢＳにおいて、再懸濁された。酸性条件下で吸収されて蛍光性がなくなった場合には、５０μＭのモネンシンの存在下、４℃で３０分間後処理することにより、蛍光性が戻る（モンサイニーらの文献、Ｂｉｏｌ. Ｃｅｌｌ、１９８４、５１、１８７−１３６、ミドーらによる文献、チトメトリ、１９８７、８、３２７−３３４参照）。モネンシンにより、エンドシトシス小胞内におけるｐＨが上昇して、マスキング効果が除去されることによって、蛍光強度を、正確に測定することができるものである。
【００６３】
Ｆ、フローサイトメトリ分析および分類
細胞は、ＦＡＣＳ４４０（蛍光活性細胞ソータ、ベクソン  アンド  ディッキンソン、サニーベール、ＣＡ、米国）を用いることにより、分析された。４つのパラメータが、同時に、各細胞に対して、８００細胞／秒の速度で、記録された。４つのパラメータとは、ＦＳＣ、フロント（または小さな角度、１２度より小さい角度）散乱光シグナル、ＳＳＣ、サイド（または９０度）散乱光シグナル、および、２つの蛍光シグナルＦＬ１、ＦＬ２である。アルゴンイオンレーザーの４８８ｎｍライン（スペクトラ  フィジックス、モーテイン  ビュー、ＣＡ、米国）が、励起ビーム（レーザーパワーは３００ｍＷ）として、使用された。蛍光シグナルは、フルオレセイン放射用の光学フィルタ（ＢＰ＞５３０±３０ｎｍ）、および、プロピジウムイオダイド放射用の光学フィルタ（ＬＰ＞６２５ｎｍ）を使用することにより、収集された。死亡細胞は、ＤＮＡ挿入−プロピジウムイオダイド（佐々木らによる文献、シトメトリ（１９８７）、８、４１３−４２０）の赤蛍光放射に基づいて、排除された。
【００６４】
分類は、ＦＡＣＳ４４０を用いることにより、おこなわれた。１００μＭのＯＡＧにより刺激され、ＥＤＴＡにより収穫された細胞は、αーＬーフコシルーＢＳＡの１００μｇ／ｍｌの存在下、３７℃で９０分間、インキュベートされた。副集団分類は、以下の条件において、行なわれた。１秒あたり１２００細胞の速度、大きな細胞を決定するサイド散乱チャンネル５５−２５５およびＦＬ１用グリーンチャンネル１４４および２５５をセットした、ソートウインドが使用され、これらは、小エレメント集団を決定する、サイド散乱チャンネル１−２８、および、蛍光チャンネル１−１３２の間に、セットされた。ドロップディレイは、１２  １／４において設定され、ディフレクションプレート電圧は、２５００ボルトであった。
【００６５】
ＩＩ．  結果
Ｃ32メラニン細胞における膜レクチン発現メラニンを形成している間の調整
図１に示された結果は、刺激されたまたは刺激されていない細胞の蛍光ネオグリコプロテインの細胞膜親和性に関連し、またエンドサイトーシスの程度に関係した相対的蛍光強度を示すものである。
アルファ−Ｌ−フコシル−ＢＳＡおよびアルファ−Ｌ−ラムノシル−ＢＳＡを除いて、グリコシル化−ＢＳＡは、一般にメラノーマ細胞によっては十分認識されない。蛍光シグナルは、アルファ−Ｌ−フコシル−ＢＳＡおよびアルファ−Ｌ−ラムノシル−ＢＳＡでのインキュベーション（３７℃）において顕著に増加した。しかし、アルファ−Ｌ−グリコシル−ＢＳＡのメラノーマ細胞膜による認識は、アルファ−Ｌ−ラムノシル−ＢＳＡよりも不十分であった。このような認識は、メラニン細胞のＯＡＧ刺激によって一層増加する。そして、このことは、モネシン後処理によって改善される。
【００６６】
したがって、このような膜レクチンの発現は、ヒトメラノーマ細胞のメラニン含有量増加という条件下でのＯＡＧ処理によって増加する。
また、低部（low side）および前方拡散（forward scatters）（これは、小さなエレメントを予想する）によって特徴づけられる第二群（セカンド  ポピュレーション）の膜レクチン発現についても分析された。
この分析によって、フコース、特にアルファ−Ｌ−フコースに対するメラニン細胞膜レセプターの特異的親和性の存在が示される。したがって、それらの活性化の目的、特にメラニン産生機能の活性を発揮させるために、もしくは疾患に関連するメラニン細胞を治療するために、特異的なメラニン細胞へ、本発明のフコスレート化された化合物を用いることを可能とする。
本発明による組成物を含有した、種々の化粧品または薬品組成物、特に皮膚科学的組成物が得られる。
【００６７】
実施例６：日焼け肌用化粧クリーム
このクリームは、以下の組成を有するリポソームのゲル化懸濁液、およびエマルジョンを混合することにより得られる。
0003727073.tif 000003
【００６８】
パーヒドロスクワレン（３９.２ｇ）、および大豆レシチン（０.８ｇ）の混合物が、１５分間、７０℃において、水浴中で加熱される。ここで得られたオイル相は、蒸留水、１８０ｍｌと混合され、レイネリ（Ｒａｙｎｅｒｉｅ）撹拌機により、エマルジョンとされる。
【００６９】
別の操作として、リポソームのゲル化した懸濁液が、以下の工程で調製される。このリポソームは、実施例１に示したように調製される。脂質相Ａの成分は、ロータリーエバポレータ内の、７：１のクロロホルム／メタノール混合溶液に溶解される。得られた有機溶液は、減圧下、ロータリーエバポレータで蒸発され、そして脂質残差は、カプセル化されるべき水相Ｂを含有する水Ｄの一部からなる水溶液の４９ｇに溶解される。音波処理ののち、リポソームの均一化された懸濁液が得られる。最後に、この懸濁液は、従来の方法により調製され、水Ｄの残りで調整されたトリエタノールアミンにより中性化された２％カルボポール９４０Ｒ（Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９４０）ゲルを添加することにより、ゲル化される。
この日焼けクリームは、日焼け促進のために、陽にさらされた皮膚に付けるものである。
【００７０】
0003727073.tif 000004
【００７１】
脂質粉は、本発明の実施例８にしたがって、脂質または疎水性の成分を含有する混合液である、８：２の塩化メチレン／メタノール混合液に溶液に噴霧乾燥することにより、調製される。
この粉はその後、蒸留水５０ｍｌの中で攪拌することにより分散され、この分散液は、当業者に公知の方法によって、超音波を用いて、均一化される。
これにより、表面にフコース残基を含有するリポソームの懸濁液が得られる。最後に、この懸濁液は従来の方法により調製された、中性化したカルボポール９４０Ｒゲルの約４５ｇと、混合される。
得られたローションは、１日に２回、白髪処理用ローションとして頭皮に付けることが可能である。
【００７２】
実施例８：化粧用抗メラノブラストリポソーム状ゲル
Ａ．スペーサーアームを介してフコシル化残基を有するリポソームの調製
脂質リポソーム組成物は、下記の化合物の混合物である。
ブタ消化器粘膜から得たフコ脂肪・・・・・・・・１部
大豆レシチン              ・・・・・・・・・・６部
コレステロール            ・・・・・・・・・・０．５部
スフインゴシン            ・・・・・・・・・・１部
乾燥マルベリー根樹皮抽出物・・・・・・・・・・０．５部
【００７３】
フコ脂質を、ジョン・Ｍ・マックキビンの論文（John M. Mackibbin "Jornal of lipid research" 19,131-147, 1978、特にこの論文の133から134ページにか けて、ブタ消化器粘膜に関するところ）に記載された単離方法にもとづいて調製した。
用いたマルベリーの根の樹皮から得られた粗抽出物は、日本のマルゼン製薬株式会社から商業的に入手した。この抽出物は、弱い特有のにおいがあり、かすかに黄味がかった茶色の透明な液体で、ｐＨが約４．４、密度が約０．９５、蒸発後の残基の比が約１．８％重量／容量である。
このマルベリー抽出物を、蒸発乾固させて、乾燥マルベリー根樹皮抽出物を得た。
【００７４】
上記脂質相の成分は、塩化メチレンとメタノールとの混合液（体積比で８０：２０）中に約１０％の濃度で溶解されている。
米国特許出願第４，５０８，７０３号に開示された方法にもとづいてパウダーを得るために、約６０℃で、有機溶液を噴霧乾燥させる。
この粉末を、水溶液１００部に対して１部の粉末の割合でカプセル化されるべき水溶液中で攪拌することにより拡散させる。この溶液は、例えば水に０．０１％重量の濃度で存在するナトリウムアスコルベートを含むことができる。
【００７５】
リポソーム懸濁液は、米国特許出願第４，６２１，０２３号に開示されたように例えば圧力下での均質手段により均質化された形状が好ましい。
これによりＧａｌ（アルファ−３）Ｌａｃからなるスペーサーアームによって脂質二重層に結合したフコシル化残基を表面に含んだリポソーム懸濁液が得られる。
Ｂ．化粧用抗メラノブラストリポソーム状ゲルの調製
リポソームの液体懸濁液をゲル化させるために、中和カルボポール（Ｒ）９４０を２．５％含有しているゲルをリポソームの水溶液に重量比１／１で混合した。
これによって得られる化粧用抗メラノブラストリポソーム状ゲルは、治療を必要とする皮膚領域に局所的に投与されることが可能である。
【００７６】
実施例９：化粧用抗斑化リポソーム状ゲル
乾燥マルベリー根抽出物を０．２５パーセントのベータ／カロイエン（Beta/Caroiene）と０．２５パーセントのビタミンＡプロピオネートとに置き換えて実施例８と同様に実施した。さらに水溶液に関しては、水相におけるナトリウムアスコルベートを、０．０１重量％のオラポシド（Oraposide）と０．０１重量％の商業的に入手可能なメリサ抽出物とに置き換えた。
【００７７】
実施例１０：皮膚病学的抗メラノーマリポソーム状ゲル
組成物：
Ａ：脂質相成分
ＤＬ−アルファ−ジポルミトイルホスファチジルコリン・・・・４部
コレステロール    ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３部
雄豚精巣フコ脂質  ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３部
【００７８】
Ｂ：液相
０．５重量％メトトレキセート／NaHCO3水溶液１ｇの脂質相成分Ａを梨形フラスコ中においてクロロホルム：メタノール（２：１Ｖ／Ｖ）混合液１００ｍｌに溶解し、真空ロータリーエバポレーターで蒸留した。残った脂質からなる膜をフラスコ内壁から取り、１００ｍｌのメトトレキセートの水性緩衝液Ｂを含むフラスコに添加し，フラスコを５５℃０．５時間、つづいて室温で１時間機械的に振ることにより水和させた。
このようにして得られたリポソーム懸濁液に含まれるリポソームは、脂質二重層を有するもので、そん表面は、炭水化物鎖によってなるスペーサーアームの一端に位置したフコース残基が分布している。
【００７９】
好適には、リポソーム封入メトトレキセートは、最初に０．５％ＮａＣＯ3緩 衝液で４８時間透析し、つづけてセファデックスＧ−２５Ｍカラムで抽出させて、遊離メトトレキセートと分離される。
精製されたリポソームからなる懸濁液は、当業者によって既知の方法により等量のゲル化溶液性付加形剤（０．１重量％中和カルボポール９４０（Ｒ）を含む）と混合することによってゲル化される。この抗メラノーマリポゾーム状ゲルは、メラノーマへの局所投与に使用され、ずいいにまた抗ガン療法の一部として使用される。
【００８０】
【発明の効果】
本発明にもとづくメラニン細胞膜特異性リガンド組成物製造方法は、リガンド−レセプター結合によってメラニン細胞膜に化合物を結合させる方法であって、この方法は、膜のレセプターに接近可能なオシド残基からなる少なくとも一つのリガンドに結合する基本構造からなる化合物を用いることを含むもので、そのオシド残基は、フコース、好ましくはα−Ｌ−フコース残基から選択されることを特徴とするものである。したがって本発明にもとづいて製造されたリガンド組成物は、メラニン細胞に特異的に結合することが可能であり、化粧品、医薬品などの皮膚科学的作用を呈する製品に含有されることによってそれら化粧品、医薬品などの皮膚科学的作用を高める効果を呈する。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ32メラノーマ細胞におけるＯＡＧ刺激によるメラニン産生の結果を示す図である。
【図１】
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