(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗核抗体を検出するために使用するマクロファージ系細胞株ＩＴ−１（ＫＣＣＭ−１００３８）。
【請求項２】
マクロファージ系細胞株ＩＴ−１（ＫＣＣＭ−１００３８）を被験対象から採取した体液試料と接触させ、次いでフルオレシン・イソチオシアネートでラベルした抗ヒトガンマグロブリン抗体と反応させることを特徴とする、体液中の抗核抗体を検出する方法。
【請求項３】
被験対象が自己免疫疾患を保有するものであることを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
孔に固定されたマクロファージ系細胞株ＩＴ−１（ＫＣＣＭ−１００３８）を含むことを特徴とする抗核抗体検出用のスライド。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はマクロファージ系細胞株ＩＴ−１、ならびにこれを利用して抗核抗体（anti-nuclear antibody，以下「ＡＮＡ」と略称する）を検出する方法および抗核抗体検出用スライドを製作する方法に関する。
発明の背景
血清内自家抗体の存在を検査するＡＮＡ検査は、自家免疫疾患である全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus，以下「ＳＬＥ」と略称する）、シェーグレン（Sjogren）症候群、硬皮症、混合性結合組織病、リウマチ性関節炎、小児慢性多発性関節炎、その他の自己免疫性疾患などの全身性リウマチ疾患に適用される。
ＡＮＡ検査によって一次的に自己免疫疾患と判定された患者は、ＤＮＡ、ヒストン、抽出性核抗原（extractable nuclear antigen: ＥＮＡ）たとえばＳｍ(Smith)、nＲＮＰ(nuclear ribonucleoprotein)、ＳＳ−Ａ(Sjogren associated antigen  Ａ)、ＳＳ−Ｂ、Ｓｃｌ−７０、Ｊｏ−１、ｒＲＮＰなどの抗原に対する具体的な抗体検定試験を行なって、その病名を決定する。
抗体の特性と力価は、１９８２年にＡＦ−ＣＤＣ（Arthritis Foundation-Centers for Disease Control）の「抗核抗体に関する血清標準化会議」〔Arthritis Rheum. 25, 1003, 1982〕で開発した標準血清によって標準化され、同時に、免疫蛍光方法を利用する検査において蛍光の等級がきめられたスライドを利用することによって、蛍光顕微鏡の不一致または質的差が改善された。また、フルオレシン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合した抗血清の濃度、蛍光物質と蛋白質との混合比なども改善された〔Am. J. Clin. Pathol. 82, 57, 1984〕。
自己免疫疾患の診断において不可欠なＦＡＮＡ（Fluorescent Antinuclear Antibody）検査にとって最も重要なことは、基質の選択である。従来のＡＮＡ検査において、実験動物の肝臓、腎臓など臓器の冷凍組織切片(cryostat tissue section)が基質として用いられたが、最近は培養された人間由来細胞が主に使用され、ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２３）がその代表である。このようにして、種−属の特異性や臓器の特異性を克服することができた。
培養された細胞は、冷凍組織の切片より通常核が大きく、特定の核抗原の含有量が多く多用であり、蛍光様相の判読がやさしいので、偽陰性判定の可能性を著しく小さくする。細胞株をスライドで培養すると分裂中の細胞が観察され、これによって抗動原体（anti-centromere）抗体、増殖細胞だけに見られる抗ＰＣＮＡ（proliferating cell nuclear antigen）抗体など、従来診断と鑑別がむずかしかった蛍光様相を、より客観的かつ正確に判断できる。
しかしながら、ＨＥｐ−２細胞は人体に由来する細胞であるが、喉頭癌から分離した腫瘍細胞であるため、単純スライドに培養する際に、その付着率が思わしくない。また、いわゆるＡＮＡ陰性狼蒼（ＡＮＡ negative lupus）と呼ばれる患者群からは、ＡＮＡが検出されない欠点がある。
以上の欠点を改良するために本発明者は、新しい基質の開発に着手した結果、正常な人の骨髄から誘導したマクロファージ株（以下「ＩＴ−１」と略称する。ＫＣＣＭ−１００３８）が、上記した欠点がなく、ＡＮＡ検査の基質として有用であることを発見して本発明を完成するに至った。
ＡＮＡ検査用基質としてマクロファージを研究することになった理論的背景は次のようである。
第一に、マクロファージは免疫反応で抗原伝達細胞(antigen presenting cell)の作用をするので、自身（self）と非自（non-self）を区別するためにも自己免疫抗原を均しくそして豊富に含有する可能性が大なことである。
第二に、マクロファージはガラス付着率が高いので、基質用スライドの製作が簡便で経済的なことである。
第三に、ＩＴ−１細胞が腫瘍に由来する細胞ではないので、ＡＮＡ検査の偽陰性の可能性が減少できることである。
従来は、マクロファージは培養によっては細胞株として株立されないというのが通説であった。しかし、本発明者は後述する実施例にもみるように、細胞株の株立に成功し本発明を完成した。
発明の要約
従って、本発明の目的は、ＡＮＡ検査で基質として用いられるマクロファージ系細胞株を提供することである。
本発明のいまひとつの目的は、マクロファージ系細胞株を利用して抗核抗体を検出する方法を提供することである。
本発明のなお別の目的は、マクロファージ系細胞株を固定したＡＮＡ検査用スライドを提供することである。
本発明の他の目的および利点は、以下に詳細な記述が進むにつれて明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明において、マクロファージ系細胞株の株化に用いるマクロファージは、正常な人の骨髄から無菌条件下、穿刺採取されたものである。
分離されたマクロファージは、５〜２０％の牛胎児の血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で継代培養することによって細胞株を確立できる。また、Ham's Ｆ12Ｋ培地またはDulbecco's Modified Eagle's培地においても培養が可能である。とくにビタミンなどの添加剤を要しないで、１０％牛胎児の血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０で１×１０5cells/mlの濃度を保ち０.１mlを接種すれば、５日目には分芽が密生し、その増殖力も旺盛である。
上記の方法によってつくられた細胞株を、「ＩＴ−１」と命名した。
マクロファージ細胞株は、ＡＮＡ検査に利用するとき、ガラススライドに固定することができる。固定化の方法は通常の細胞担体固定化方法で実施することができる。たとえば、培養されたＩＴ−１細胞培養液を、牛胎児の血清を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地で稀釈したのちスライドに接種し、３０〜４２℃の培養器で１８〜３０時間ほど培養し、有機極性溶媒たとえば、メタノール、エタノール、アセトンなどを使って固定化する。
マクロファージ細胞株ＩＴ−１を用いてＡＮＡ検査用スライドを製作すれば、ガラスへの付着性がすぐれ、不良品が減じ、接種細胞株と培養液の量および培養時間が節約されるなど、多くの利点がある。
ＩＴ−１を用いたＡＮＡ検査は次のように実施することができる。すなわち、ＩＴ−１と標準血清を接触させた後、ＦＩＴＣ−ラベル化した人のガンマグロブリンに対して兎の抗体を反応させ、蛍光顕微鏡で観察する。
以下、本発明により提供されるＩＴ−１細胞株の特性を記述する。
１．形  態
類上皮細胞（epitheloid）形態が主であり、マクロファージ形（macrophage-like）および多核巨大細胞形態も時として見うけられる。
２．サイズ
ＨＥｐ−２細胞にくらべ１．５倍お大きさである。
３．細胞化学検査（cytochemistry; Color Atlas of Clinical Hematology 50, Igaku-Shoin, 1986）
α−ナフチルアセテートエステラーゼ：強い酸性
定期的Acid-Schiff：陽性
ナフトールＡＳＤクロロアセテートエステラーゼ：陰性
ペルオキシダーゼ：陰性
スーダンブラックＢ：陰性
４．リゾソーム活性能（lysosomal activity）
アクリジンオレンジ染色において、核の周辺に多数のオレンジレッド色のリゾソーム顆粒が観察された（Atlas of Blood Cells 195, Lea & Febiger, 1988）。
５．Ｆｃ収容体および貪食作用（phagocytosis）
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でおおわれているラテックス粒子（Behring社，ドイツ）とともに培養したところ、ＩＴ−１細胞の周辺に多数のラテックス粒子が結合されることと、貪食されることが観察された。
Zena Werbの分類法（Basical and Clinical Immunology, 98, Appleton and Lange, 1987）によれば、ＩＴ−１はマクロファージ系列の細胞であることが明らかである。
またラッキー社のガンマインターフェロン(ＬＢＤ−００１)が１０００単位／ml添加された際、ＩＴ−１の増殖が停止し、ＨＬＡ−ＤＲの出現が増加することが観察された。Beckton-Dickinson社のＡnti−ＭＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ５μlをＲＰＭＩ培地で１：１０の比で稀釈し、ＩＴ−１細胞浮游液５０μl（１×１０8）に入れ、氷水浴の中で３０分間反応させ、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝生理食塩水）で洗浄し、蛍光顕微鏡で観察。
上記のすべての記述により、ＩＴ−１は増殖能力のある反応性マクロファージ細胞であることが確認される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明により提供されるＩＦスライドを実寸大で示す。図において、Ａはガラス板をあらわし、Ｂ（小円で示した）はスライド上に固定されたマクロファージ系細胞をあらわす。
以下実施例を示して本発明をより詳しく説明する。ただし本発明はこれらの例に限られるものではない。
実施例
実施例１  マクロファージ細胞の分離および細胞株の株化
正常な人の骨髄を無菌条件下に穿刺して骨髄細胞を採取し、シグマ社のヒストパク（Histopaque）１０７７を入れてある遠心分離チューブに注ぎ、２０℃の温度と４００Ｇの速度で３０分間遠心分離し、単核細胞だけを得た。この単核細胞を、１０％の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０（Gibco社製品）１５mlを含有している７５cm2の培養フラスコに接種し、５％の炭酸ガスを含むように調整された３７℃の培養器で３日間培養したのち、付着しないリンパ球などの細胞を培養液で洗浄して取り除いた。培養器に付着した細胞は、２０％の牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０で継続的に増殖し、７日後トリプシンを用いて処理した。培養増殖は２個のフラスコで繰返えされ、５日目の終りごろ二度目のトリプシン処理を行ない、４個の培養器に分株して培養した。培養液を３日ごとに換え、２８日経過後は牛胎児の血清濃度を１０％に減じた培養液で培養した。この方法でマクロファージ系細胞株ＩＴ−１を得ることができた。
この細胞株は１９９２年７月１５日付で韓国種菌協会（Korean Federation of Culture Collection of Micro-organism）にＫＦＣＣ−１０７７２号で寄託された。この寄託は、１９９３年７月１４日付でブタペスト条約にもとづく国際寄託に切換えられ、ＫＣＣＭ−１００３８の受託番号が与えられた。
実施例２  スライドの準備
培養されたＩＴ−１細胞液を２×１０4cell/mlになるように１０％の牛胎児血清を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地で稀釈し、免疫蛍光法に用いるためのスライド（以下「ＩＦスライド」と略称する）を滅菌し、孔ごとに稀釈液３０μlを接種した。５％炭酸ガスに調整された３７℃の培養器で２４時間培養した。各スライドから培養液を除き、ＰＢＳで洗浄し、９５％メタノール中に１０分間浸して細胞を固定した。このように調製したスライドは４℃で一年ほど保存することができた。
比較例  ＨＥｐ−２細胞を利用したスライドの準備
市販されているＡＮＡ検査用スライドがＨＥｐ−２細胞を用いているので、この細胞株を培養してスライドを調製する方法を比較例にとりあげた。
ＨＥｐ−２細胞を１×１０5cell/mlになるように仔牛の１０％血清が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で稀釈した後、ＩＦスライドに３０μlを接種した。細胞が沈んで付着した時、１２０μlの培地を各孔に分株してスライドの表面が培地でおおわれるようにし、５％炭酸ガスに調整された３７℃培養器で４８時間培養した。培地を取り除いた後、ＰＢＳで洗浄し、９５％メタノールに１０分間浸して固定した。
実施例３  細胞株を用いたＡＮＡ検査
ＡＦ−ＣＤＣ標準血清＃１，＃２，＃３，＃６を２倍ずつに稀釈して、１：２０〜１：１２８０の比の血清溶液とした。それぞれ３０μlをＩＴ−１およびＨＥｐ−２スライドに与え、高湿度下、３０分間、室温で反応させた。反応後、ＰＢＳを満たしたコプラン瓶に入れ、シェーカーにより２００rpmで振とうし、洗浄して乾燥した。１：４０に稀釈されたＦＩＴＣラベル化のヒトガンマグロブリンに対する兎の抗体（Dako社製品）３０μlを各スライドに適用して、高湿度下、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで１０分間洗い、０．２エバンスブルー溶液（防腐剤を加えて４℃で保管する）でカウンター染色を施し、再びＰＢＳで洗浄した。残ったＰＢＳを濾紙で吸い取り、グリセロール−ＰＢＳ溶液を用いて蛍光顕微鏡下で４００倍で観察した。
顕微鏡で観察した蛍光様相は、標準血清＃１においては休息細胞と分裂細胞が、核全体または周囲だけを染められ、標準血清＃２と＃３は部分的に染められないところのある斑点的形態であり、標準血清＃６においては核小体（nucleolar）型に着色されていた。標準血清＃２，＃３，＃６の上記結果は、休息細胞において観察されたことである。これらの結果は、ＡＦ−ＣＤＣで提示した蛍光様相と一致する。
さらに、蛍光の強度をつぎのように区分して、稀釈倍率に伴う力価を比較した。結果を表１に示す。
等級    蛍光の強度
４＋    強い
３＋    十分
２＋    識別可能
１＋    かろうじて識別可能
表１によれば、ＨＥｐ−２細胞の場合、標準血清＃１と＃２，＃６は、１：３２０、＃３は１：６４０の稀釈比率において充分な蛍光を発し、ＩＴ−１の場合も同じ様相を示した。ＡＦ−ＣＤＣでは、標準血清＃１，＃３に対して１：１６０〜１：６４０、＃２と＃６に対しては１：８０〜１：３２０の患者血液稀釈比を推めている。ＨＥｐ−２細胞およびＩＴ−１細胞の両細胞とも、ＡＦ−ＣＤＣ推薦の範囲内に入った。
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その他の標準血清（ＡＦ−ＣＤＣ標準血清＃４，＃５，＃７，＃８および＃９）をＩＴ−１スライドに適用し各血清に関しあらわれた蛍光パターンを、上記と同様にして観察した。この試験においては、ＡＦ−ＣＤＣ＃４と＃５は１：１２８０まで斑点形態、＃７は１：３２０まで斑点形態、＃８は１：１２８０まで分散的斑点形態で分裂細胞にも陽性を示し、＃９は１：６４０まで斑点形態であった。
また、Immunovision社の標準血清中、抗Jo−１は１：３２０まで抗ｒＲＮＰは１：６４０までみな細胞質（cytoplasmic）型が観察された。
顕微鏡で観察する時、スライドの１２個の孔にすべて細胞が付着していれば判読が容易であるが、はがれていった不良率は、ＩＴ−１細胞においては９／６００、ＨＥｐ−２細胞において９５／６００であった。これによって付着率が優秀であることが知られる。かつ、スライドの上に接種する細胞の数と培養液を１／５に、また培養時間も半分に減らすことができた。
実施例４  臨床実験での応用結果
ＡＮＡ検査において偽陰性を示す傾向のある、抗ＳＳ−Ａ／Ｒｏ抗体だけをもっている患者６７名（二重免疫拡散法で確認）の血清を採取して実験したところ、ＩＴ−１においては１００％、ＨＥｐ−２細胞においては８８％のＡＮＡ陽性率を示した。
患者群：ＳＬＥ患者６１名（グループＡ）、全身性硬化症患者２０名（グループＢ）、混合性結合組織病１８名（グループＣ）、を対象にして実験したところ、ＨＥｐ−２においてそれぞれ９５％，８５％，１００％の陽性、ＩＴ−１においてはそれぞれ１００％，９５％，１００％の陽性を示し、本発明の細胞株を用いた場合には正確なＡＮＡ検査が可能であることを証明した。
本明細書に記載された実施例および実施態様は単に例示的なものであって、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば、これらの例を基礎にして多くの変形と変更を加えることができようが、このような変形と変更は、本発明の要旨および範囲と、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【図１】
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