(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象の抗原または抗体を含む測定試料、磁性粒子表面上に結合した測定対象の抗原または抗体に対応する抗体または抗原、ならびに、蛍光標識された抗原または抗体とを混合して抗原抗体反応させた後、磁力によって磁性粒子を固定し、蛍光偏光解消度の変化を測定することを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】
蛍光寿命がｌμ秒よりも長い蛍光物質を用いて前記蛍光標識を行う請求項１記載の免疫測定法。
【請求項３】
前記蛍光物質が希土類錯体である請求項２記載の免疫測定法。
【請求項４】
前記希土類錯体がユーロピウムキレートである請求項３記載の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗原あるいは抗体の測定法に関するもので、特に蛍光偏向解消度を利用したホモジニアスイムノアッセイに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分を検出する方法には様々なものがある。例えば抗原性を有するような物質であれば、特定の成分に対して親和性を有する抗体を作成することが可能であり、そのような抗体を使用して特定の生体成分を高感度で測定することが可能である。このような方法はイムノアッセイと呼ばれ、生体成分の検出に広く用いられている。
【０００３】
イムノアッセイでは抗原抗体反応でとらえた成分を様々な方法で検出することによって、その成分の存在を明らかにすることができる。そのような検出のための物質としてはラジオアイソトープや酵素、蛍光色素や発光試薬などが使用されている。
【０００４】
試料中の抗原濃度を測定するイムノアッセイ法として最も一般的な方法はサンドイッチ法と呼ばれている。これは２種類の抗体を使用し、片方を何らかの固相に結合し、もう片方に何らかの標識を行ったものを用意する。固相の抗体と標識物を結合した抗体は試料中の抗原と反応して抗原を挟み込んだサンドイッチのような形で固相に結合することになる。固相に結合できなかった標識抗体を除去した後、固相に残存した標識体の量を測定することによって試料中の抗原濃度を知ることができる。
【０００５】
サンドイッチ法においては固相に結合した標識抗体と結合しなかった標識体とを何らかの方法で分離する必要がある。この操作をＢ／Ｆ分離といい、この操作を行うようなイムノアッセイをへテロジニアスイムノアッセイと呼んでいる。ヘテロジニアスなイムノアッセイは感度が高く、試料の影響もあまり受けない良い方法ではあるが、Ｂ／Ｆ分離という操作が煩雑であり手間がかかる。現在全自動のイムノアッセイ装置の多くがこのようなヘテロジニアスな方法を採用しており、洗浄操作を行うために大がかりで高価な機構を備えている。
【０００６】
一方、Ｂ／Ｆ分離を行わずにイムノアッセイを行う方法も数多く考案されておりそれらはホモジニアスイムノアッセイと呼ばれている。この方法ではＢ／Ｆ分離を行う必要がないので、手技が単純であり自動化した場合も機械が簡単につくれるという利点がある。しかしながらホモジニアスイムノアッセイは多くの場合あまり検出感度が高くない。また試料が最後まで存在するため試料の影響を大きく受けるという欠点があった。特に感度の面ではヘテロジニアスイムノアッセイにかなわない。
【０００７】
ホモジニアスイムノアッセイの１つの方法として、蛍光偏光解消度を利用した方法が考案され実用化されている。この方法はハプテンなどの低分子に蛍光色素を結合する。低分子に結合した蛍光色素は液体中でその分子運動が大きい。この蛍光色素標識抗原が抗体と反応し抗原抗体複合物を形成するとその分子量が大きくなり全体としての分子運動が小さくなる。このとき標識している蛍光物質の蛍光偏光を測定することにより分子運動の変化を知ることができる。この系に試料中の抗原が入ってくることにより、抗体と結合する蛍光色素標識抗原の量は少なくなり、試料全体の蛍光色素分子の運動量は大きくなる。この変化を蛍光偏光度を測定することにより知ることができるので、試料中の抗原の測定に利用できる。この方法はホモジニアスイムノアッセイとして簡単な操作で測定できることから薬物などの測定に広く利用されている。しかしながらこの方法は蛍光色素を標識した分子の分子運動が抗体と結合することによって大きく変化する必要があるため、ハプテンのような低分子にしか利用できないという欠点があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来の蛍光偏光解消度の測定系ではハプテンなどの低分子の抗原しか測定することができなかった。より大きな抗原分子を測定しようとしても抗体との反応における分子量の変化が小さくなり、検出しようとする蛍光偏光解消度の変化が小さくなりその結果検出できないという問題があった。この欠点を解消すべく鋭意研究を行った結果、抗体あるいは抗原を磁性を有する粒子上に結合し、蛍光物質を結合した抗原あるいは抗体との免疫反応を行った後に磁石によりその磁性粒子の運動を完全に停止することによって、最大限の蛍光偏光解消度が得られることを見いだし本発明を完成した。またこの方法に使用する蛍光物質として、従来使用していたような短い蛍光寿命を持つ物質ではなく、長い蛍光寿命を有する蛍光物質を使用することにより、従来では蛍光偏光度では測定することがで不可能だと考えられてきたサンドイッチイムノアッセイについても大きなシグナルの変化が得られることが判明した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、測定対象の抗原または抗体を含む測定試料、磁性粒子表面上に結合した測定対象の抗原または抗体に対応する抗体または抗原、ならびに、蛍光標識された抗原または抗体とを混合して抗原抗体反応させた後、磁力によって磁性粒子を固定し、蛍光偏光解消度の変化を測定することを特徴とする免疫測定法を提供する。
【００１０】
本発明の方法では、抗体あるいは抗原を表面に結合した磁性粒子と、蛍光物質を結合した抗原あるいは抗体を用い、試料中の測定対象物との間で、粒子表面を固相と考えたサンドイッチイムノアッセイあるいは競合イムノアッセイを行うことにより、粒子表面に蛍光標識物を結合する。反応終了後に溶液中の磁性粒子を磁石を使用してその動きを完全に停止することにより粒子表面に結合した蛍光物質の分子運動をほぼ完全に停止することができる。溶液中の分子に結合している蛍光物質の分子運動は大きいが、粒子表面の蛍光物質の分子運動はほとんどない。この差を蛍光偏光度を測定することによって知り、そこから試料中に存在している測定対象物の濃度を知ることのできる免疫測定法である。
【００１１】
本発明で使用できる磁性粒子は、例えば粒径０．１μｍ〜１００μｍ、好ましくは粒径０．２μｍ〜１０μｍのＮｉ，Ｃｏあるいはそれらの合金からなる強磁性体で自発磁化のない粒子であり、例えば市販のダイナビーズTM（ベリタス社製）などを使用できる。
【００１２】
本発明の測定対象は抗原または抗体であり、抗原としてはタンパク質、糖質などの従来の蛍光偏光解消度を利用する方法では測定できない高分子のものが特に適しており、例えば、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシンなどのホルモン、グロブリン、アルブミンなどの血漿タンパク質などを挙げることができる。また、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
【００１３】
磁性粒子表面には、測定すべき抗原または抗体に対応する、すなわちこれと特異的に結合する抗体または抗原を結合する。磁性粒子表面に抗原または抗体を結合させる方法は常法を用いることができ、例えばＰＢＳなどの緩衝液中に調製したに磁性粒子に抗原または抗体を加えて反応させ、遠心処理を行い、ＢＳＡを含むＰＢＳ中に分散させて得ることができる。あるいは、ビオチン−アビジンまたはストレプトアビジン、リガンド−レセプターなどの特異的結合を利用して抗原または抗体を磁性粒子表面に結合させることもできる。例えば、ダイナビーズＳＴＡTM（ベリタス社製）は粒子表面にストレプトアビジンが結合されており、この場合には粒子に結合すべき抗原または抗体をビオチンで標識することにより磁性粒子表面上に結合させることができる。
【００１４】
一方、蛍光標識された抗原または抗体を調製する。本発明の蛍光偏光解消度を利用する免疫測定法では蛍光寿命が蛍光偏光解消度に大きく影響するので蛍光物質の選択が重要である。蛍光寿命が１μ秒よりも長い蛍光物質を用いて蛍光標識することが好ましく、例えば希土類錯体を挙げることができる。希土類錯体としてはユーロピウム、ガドリウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウムなどの金属の蛍光キレート化合物が好ましく、例えばＥｕ3+（ＢＣＰＤＡ）n（式中、ｎは２または３；ＢＣＰＤＡは4,7-ビス（クロロスルフォニル）-1,10-フェナントロリン-2,9-ジカルボン酸）、あるいは特開平２−８８９６９号、特開平１−１２７９５７号、特開昭６４−４７９５２号、特表平６ー５１０２９６号に記載のものを使用できる。
【００１５】
本発明の免疫測定法は競合法またはサンドイッチ法により実施できる。例えば、競合法を用いて抗原タンパク質を測定する場合には、抗原タンパク質に対応する抗体を磁性粒子表面に結合させ、一方、蛍光物質で標識した抗原を調製する。また、サンドイッチ法を用いて抗原タンパク質を測定する場合には、適当な第二抗体を蛍光標識する。このような抗体の作製方法、および抗体または抗原を蛍光物質で標識する方法は常法により行うことができる。
【００１６】
このようにして調製した磁性粒子表面上に結合した抗原または抗体、蛍光標識した抗原または抗体と、測定対象の抗原または抗体を含む測定試料とを透明チューブ（セル）中で混合して抗原抗体反応をさせた後、蛍光偏光解消度を測定する。次いで、磁力によって磁性粒子を固定して再度蛍光偏光解消度を測定する。これによって蛍光偏光解消度の変化が得られる。
【００１７】
本発明の方法では、磁力によって磁性粒子を固定することにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、大きな分子であっても測定感度が向上する。なお、磁性粒子の固定には永久磁石または電磁石を使用できる。永久磁石の場合には、抗原抗体反応を行っている間は磁石を反応セルから離しておき、反応終了後セルに近づけて磁性粒子をセルの側面に捕捉する。また、電磁石の場合には、セルに接した形で配置した電磁石を反応終了後に作用させて磁界を発生させて磁性粒子をセルの側面に捕捉する。
【００１８】
蛍光偏光解消度の測定は公知の装置を用いて行うことができ、例えばＪＩＭＣＯ  ＭＡＣ−ＩＩ、ＩＢＦー１２９などの装置を使用することができる。蛍光偏光解消度の測定装置の概略を図１に示す。
【００１９】
蛍光偏光解消度による測定の利点として以下の点が挙げられる：１）沈殿や遠心分離操作を要せずに反応混合物をそのまま測定できるので操作が簡単である、２）ラジオイムノアッセイや酵素抗体法に比べて測定が迅速であり、秒単位〜数分以内で測定可能である、３）ラジオアイソトープに匹敵する感度で測定が可能である、４）基質成分の安定性が高く、保存後の再現性も高い、５）放射能を使用しないので安全である、６）短時間にデータが得られるので、同一試料の経時的測定ができる。
【００２０】
この方法を用いることにより、従来では蛍光偏光度では測定できなかったような分子量の大きい抗原の測定ができるようになったばかりでなく、サンドイッチ法の検出にも利用できるようになり、より簡便で高感度なホモジニアスの免疫測定法を提供することができる。
【００２１】
【実施例】
実施例１：競合法を用いる甲状腺ホルモンＴ３の測定
（１）抗Ｔ３抗体結合磁性粒子の調製
磁性粒子としてはダイナビーズを用いた。使用した粒子は粒径４μｍ〜５μｍのダイナビーズＳＴＡであり、この粒子表面にはストレプトアビジンが結合している。
【００２２】
抗体としてはスクリプス社の抗Ｔ３モノクローナル抗体ＭＴ２３１を使用した。抗体には同仁化学のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを使用してビオチンを標識した。抗体に１０倍量の分子数のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを添加し、室温で３時間反応後、未反応のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎをファルマシア社製のゲルろ過カラムＰＤ−１０を使用して分離した。調製したビオチン標識抗体は０．ｌｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１ＭＰＢＳに保存し、使用時に適宜希釈して使用する。
【００２３】
ダイナビーズＳＴＡ１ｍｌ当たり、ビオチン標識抗体１００μｇを添加し、３７℃で３時間反応させる。その後１２０００ｒｐｍの遠心処理を行い、上清に残っている未反応のビオチンン標識抗体を除去し、最初の磁性粒子分散液の１０倍量のｌｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む０．１ＭＰＢを加えて分散し、抗Ｔ３抗体結合磁性粒子を調製した。
【００２４】
（２）ユーロピウム標識Ｔ３の調製
ユーロピウム標識Ｔ３はＴ３に分子数で２倍のユーロピウムキレート（イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+）を添加し、室温で２時間反応させた。反応後のサンプルはＨＰＬＣで分離し、ユーロピウム標識体を得た。なお、イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+はイソチオシアネート基を介して１級アミノ基と共有結合を生じるため、水溶液中でＴ３とこの物質とを混合することにより、ユーロピウムキレートを標識したＴ３を得ることができる。
【００２５】
（３）蛍光偏光解消法を用いたＴ３の測定
透明のセルに抗Ｔ３抗体を結合させた磁性粒子溶液１０μｌ、適当に希釈したＴ３−ユーロピウム標識体１０μｌ、種々の濃度を有するＴ３試料１０μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡと０．６ｍｇ／ｍｌＡＮＳを含む溶液７０μｌを添加した。
【００２６】
３７℃で１０分間反応後、自作の蛍光偏光解消度測定装置で測定を行った。結果を図２中に実線でに示す。Ｔ３濃度の変化とともに偏光解消度の値も変化し、Ｔ３が測定可能であることを示している。またこの装置のセルの横に、磁石をセットした場合の測定結果を同じく図２中に破線でに示す。セルの横に磁石をセットすることにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、Ｔ３の測定感度が上昇することが認められた。なお、図２は、抗原Ｔ３を含まないときの解消度を１としたときと比較した相対蛍光偏光解消度を示す。
【００２７】
実施例２：サンドイッチ法を用いる甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の測定
（１）抗ＴＳＨ抗体結合磁性粒子の調製
磁性粒子としては実施例１と同じストレプトアビジンを結合した磁性粒子ダイナビーズＳＴＡを使用した。
【００２８】
抗体としてはスクリプス社の抗ＴＳＨモノクローナル抗体ＭＴ０１１を使用した。
【００２９】
抗体へのビオチン標識は実施例１と同じようにＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを使用して行い、抗体１分子当たり子の１０分子のＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを添加して室温で３時間反応した。その後ＰＤ−１０によるゲルろ過を行いビオチン標識抗ＴＳＨ抗体を得た。
【００３０】
抗体は０．ｌｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１ＭＰＢＳに保存し、使用時に適宜希釈して使用する。
【００３１】
ダイナビーズＳＴＡ１ｍｌ当たり、ビオチン標識抗体１００μｇを添加し、３７℃で３時間反応させる。
【００３２】
１２０００ｒｐｍの遠心処理を行い、上清に残っている未反応のビオチン標識抗体を除去し、最初の磁性粒子分散液の１０倍量のｌｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む０．１ＭＰＢを加えて分散し、抗ＴＳＨ抗体結合磁性粒子を調製した。
【００３３】
（２）ユーロピウム標識抗ＴＳＨ抗体の調製
サンドイッチ法での測定を行うため第二抗体としてバイオスライド社製の抗ＴＳＨポリクローナル抗体（ヤギ）を使用し、これをユーロピウム（イソシアナトフェニル−ＥＤＴＡ−Ｅｕ3+）で標識した。抗体溶液に分子数で１０倍量のユーロピウムを添加し室温で３時間反応し、ＰＤ−１０でゲルろ過してユーロピウム標識抗ＴＳＨ抗体を得た。なお、抗体へのユーロピウムの標識にはＤＥＬＦＩＡｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔを用いた（1244-302: Wallac Oy, Turku, Finland）。標識方法はJournal of Immunological Methods 190(1996), 171-183の方法に準じて行った。
【００３４】
（３）蛍光偏光解消法を用いたＴＳＨの測定
透明のセルに抗ＴＳＨ抗体を結合させた磁性粒子溶液１０μｌ、種々の濃度を有するＴＳＨ試料１０μｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡと０．６ｍｇ／ｍｌＡＮＳを含む溶液７０μｌを添加した。
【００３５】
３７℃で１０分間反応後、ユーロピウム標識抗ＴＳＨ抗体溶液１０μｌを添加し３７℃で１０分間反応した。
【００３６】
その後自作の蛍光偏光解消度測定装置で測定を行った。結果を図３中に実線でに示す。Ｔ３の時とは異なりＴＳＨでは濃度の変化と共に偏光解消度の値はほとんど変化しなかった。そこでこの装置のセルをセットする場所の横に、磁石をセットして測定を行ったところ同じく図３中に破線で示すように偏光解消度に変化がみられた。これは、セルの横に磁石をセットすることにより、偏光解消度のＳ／Ｎが向上し、普通の状態では検出できなかったＴＳＨの反応が検出できるようになったことを示す。なお、図３は、抗原ＴＨＳを含まないときの解消度を１としたときと比較した相対蛍光偏光解消度を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光偏光解消度の測定装置の概略図である。
【図２】競合法を用いた甲状腺ホルモンＴ３の測定結果を示す。
【図３】サンドイッチ法を用いた甲状腺刺激ホルモンＴＳＨの測定結果を示す。
【図１】
0003647587.tif 000002
【図２】
0003647587.tif 000003
【図３】
0003647587.tif 000004