(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ) または (II）で表される新規カロテノイド。
【化１】
0003668278.tif 000007
【化２】
0003668278.tif 000008
【請求項２】
アグロバクテリウム属に属し、請求項１記載のカロテノイド生産能を有する微生物を培地に培養し、培地中に請求項１記載のカロテノイドを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のカロテノイドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規カロテノイドであるアスタキサンチングルコサイド及びアドニキサンチングルコサイド、並びにその製造法に関するものである。アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドは、養殖魚介類の色調改善剤、食品添加物等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ベータカロテンをはじめとするカロテノイドは、微生物、植物のほか、各種動物に広く分布している。アスタキサンチンについては、特にエビ、カニ、マダイの体表や、サケの筋肉に分布する赤色カロテノイドとして知られており、養殖魚介類の色調改善剤、色揚げ剤として利用されている。また、近年抗酸化作用を有することも報告され（清水延寿、幹渉、海洋生物のカロテノイド、幹渉編、恒星社厚生閣、平成５年）食品添加物等への応用も期待されている。
【０００３】
しかしながら、アスタキサンチンは、脂溶性物質であることから水溶性溶媒への溶解性や、水溶性化合物への添加等溶解性の面で問題がある。このため新規な高極性カロテノイド、特にアスタキサンチンと同一の基本骨格を有する高極性カロテノイドの開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑み、本発明は、新規な高極性カロテノイド、及びその製造法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高極性カロテノイドに着目し、天然界より検索した結果、新規化合物アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、下記の式（Ｉ) または (II）で表される新規カロテノイドである。
【０００６】
【化３】
0003668278.tif 000002
【０００７】
【化４】
0003668278.tif 000003
【０００８】
また、本発明は、アグロバクテリウム属に属し、上記記載のカロテノイド生産能を有する微生物を培地に培養し、培地中に上記記載のカロテノイドを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記記載のカロテノイドの製造法である。
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００９】
最初に本発明の新規カロテノイドであるアスタキサンチングルコサイド及びアドニキサンチングルコサイドについて説明する。
アスタキサンチングルコサイド［式（Ｉ）の化合物］の理化学的性質は以下の通りである。
１．物質の色：赤色粉末
２．分子量：758
３．分子式：Ｃ46Ｈ62Ｏ9 
0003668278.tif 000004
５．可視部吸収スペクトル（ベンゼン中）：λmax 487nm
６．1Ｈ-ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定，500MHz)
δppm(水素数、多重度、結合定数）: 1.21(3H,s), 1.23(3H,s), 1.32(3H,s),1.35(3H,s), 1.81(1H,t,13), 1.91(3H,s), 1.94(3H,s), 1.99-2.01(12H,s),2.04(1H,t,14), 2.15(1H,dd,6,14), 2.16(1H,dd,6,13), 3.41(1H,m), 3.45(1H,dd,8,9), 3.61(2H,m), 3.83(1H,m), 3.93(1H,m), 4.32(1H,ddd,2,6,13), 4.40(1H,dd,6,14), 4.57(1H,d,8), 6.20-6.70(14H,m)
７．13Ｃ-ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定、125MHz)
δppm(多重度）: 12.58(q), 12.59(q), 12.83(q), 12.84(q), 14.0(q), 14.1(q), 26.2 (q), 26.6(q), 30.6(q), 30.8(q), 36.8(s), 37.4(s), 44.7(t),45.5(t), 62.7(t), 69.2(d), 70.3(d), 74.3(d), 75.7(d), 77.2(d), 77.6(d),104.9(d), 123.0(d), 123.3(d), 124.5(d), 124.7(d), 126.9(s), 127.9(s), 130.6(d),   130.8(d), 133.8(d), 134.0(d), 134.4(s), 134.6(s), 135.1(d), 135.5(d),   136.7(s), 136.8(s), 139.7(d), 140.0(d), 142.3(d), 142.7(d), 162.2(s),   162.4(s), 199.3(s), 200.4(s)
８．溶解性：含水メタノール、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチルに易溶。ヘキサンに難溶。
【００１０】
アドニキサンチングルコサイド［式（II）の化合物］の理化学的性質は以下の通りである。
１．物質の色：赤色粉末
２．分子量：744
３．分子式：Ｃ46Ｈ64Ｏ8 
0003668278.tif 000005
５．可視部吸収スペクトル（ベンゼン中）：λmax 476nm
６．1Ｈ-ＮＭＲ（重クロロホルム中で測定，500MHz)
δppm(水素数、多重度、結合定数）: 1.08(6H,s), 1.23(3H,s), 1.35(3H,s),1.48(1H,t,12), 1.74(3H,s), 1.77(1H,ddd,2,4,12), 1.91(3H,s), 1.98-2.00(12H,s), 2.04(1H,m), 2.05(1H,m), 2.15(1H,dd,6,14), 2.39(1H,ddd,2,6,17),3.41(1H,m), 3.45(1H,dd,8,9), 3.61(2H,m), 3.83(1H,m), 3.93(1H,m), 4.00(1H,m), 4.40(1H,dd,6,14), 4.57(1H,d,8), 6.10-6.70(14H,m)
７．溶解性：含水メタノール、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチルに易溶。ヘキサンに難溶。
【００１１】
次に、アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドの製造法について説明する。
アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドは、例えば、N-81106 株を培地に培養し、培地中にこれらのカロテノイドを生成蓄積せしめ、そして、これらを採取することにより製造することができる。このN-81106 株は、沖縄県慶良間列島海域の海水より分離した菌株で、以下のような菌学的性質を示す。
【００１２】
なお、この菌株の詳細な性質については Journal of Marine Biotechnology（泉田仁、足立恭子、西島美由紀、遠藤衛、幹渉, (1995)）により公表される予定であるが、本出願の出願時点では未公表である。
（１）形態
菌の形・大きさ：桿状、0.９μｍ×1.２μｍ
運動性：あり
鞭毛：周毛あり
細胞の多形成：なし
胞子の形成：なし
グラム染色：陰性
（２）各培地における生育状況
肉汁寒天平板培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の円形コロニーを形成する。
【００１３】
肉汁寒天斜面培養：非拡散性で光沢を有する、橙色の円形コロニーを形成する。
肉汁液体培養：培地全体に均一に生育し、橙色を示す。
肉汁ゼラチン穿刺培養：ほとんど生育しない。
（３）生理学的性質
硝酸塩の還元：陽性
脱窒反応：陰性
インドールの生成：陰性
クエン酸の利用：陰性
色素の生成：脂溶性の赤橙色色素
ウレアーゼ活性：陰性
オキシダーゼ活性：陽性
カタラーゼ活性：陽性
β−グルコシダーゼ活性（エスクリン分解性）：陽性
β−ガラクトシダーゼ活性：陽性
生育の範囲：pH  ５〜９、温度  10〜40℃
酸素に対する態度：好気性
海水耐性：陽性
Ｏ−Ｆテスト：酸化
糖類の同化能：
陽性：Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、乳糖、麦芽糖、ショ糖、グリコーゲン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
陰性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンニトール、イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ソルビトール
有機酸の同化能：
陽性：乳酸塩
陰性：クエン酸塩、リンゴ酸塩、グルコン酸塩、カプリン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩
他の有機物の資化能
陽性：イノシン、ウリジン、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸
陰性：ゼラチン、Ｌ−アルギニン、ＤＮＡ、カゼイン
（４）化学的性質
Ｇ＋Ｃ含量  67.4％
ユビキノンの型  Ｑ-10
以上の菌学的性質をバージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジーにもとづき検索し、本菌株をアグロバクテリウム・アウランティアカスに属するものと同定した。また、本菌株は、Agrobacterium aurantiacus. nov N-81106として工業技術院生命工学技術研究所にFERM P-14023として寄託されている（原寄託日：平成５年12月16日) 。
【００１４】
アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドの製造に用いる菌株は、上記の N-81106株だけでなく、アグロバクテリウム属に属し、アスタキサンチングルコサイドまたはアドニキサンチングルコサイド生産能を有する菌株であれば特に限定されない。また、アグロバクテリウム属バクテリアの人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤処理などあるいは自然発生による変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でも、アスタキサンチングルコサイドまたはアドニキサンチングルコサイドを生産するものであればいずれも本発明に用いることができる。
【００１５】
本発明の製造法においては、上記微生物を一般に微生物の培養に用いられる培地で培養し、産生されるアスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドを常法により採取する。
まず培養法について述べる。
アグロバクテリウム属バクテリアの培養には通常の培養方法を用いることができる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュークロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。さらに、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸類なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水または天然海水中に存在する無機塩類を必要に応じて加える。また、β−カロテン生合成上の前駆体と考えられる代謝マップ（日本生化学会編、東京化学同人発行、1980年)123〜125ページ記載の前駆体やアスタキサンチン、アドニキサンチンなどのアスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１６】
培養法としては、液体培養法、とくに深部攪拌培養法がもっとも適している。培養温度は16〜40℃、特に20〜30℃が適当であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液などを添加して、４〜10、特に６〜８に維持することが望ましい。液体培養で通常１〜７日培養をおこなうと、アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドが菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１７】
培養物からアスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドの単離精製は、微生物代謝産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従っておこなわれる。例えば培養物をろ過や遠心分離により培養ろ液と菌体に分け、菌体を有機溶剤（例えば、ヘキサン、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、エーテル、酢酸エチル、エタノール、メタノールおよび以上の含水物など）で抽出する。また、培養ろ液中にアスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドが存在する場合には、酢酸エチルやジエチルエーテルなどの有機溶媒による抽出や、吸着型樹脂（Amberite XAD-2など) に吸着後、適当な有機溶媒にて抽出物を得ることが可能である。ついで抽出液を濃縮後、シリカゲル、化学結合型シリカゲル、ゲルろ過剤などを用いた液体クロマトグラフィーにより、単離精製する。アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドの動向は薄層クロマトグラフィーによるアスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドに特徴的な赤橙色を目安として追跡することができる。
【００１８】
アスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイドは、アスタキサンチン等の公知のカロテノイドと同様に養殖魚介類の色調改善剤、色揚げ剤として利用することができる。
【００１９】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
〔実施例１〕
種菌としてアグロバクテリウム・アウランティアカス（FERM P-14023) を用いた。前培養及び本培養には、 DIFCO社製「MARINE BROTH」を説明書記載の方法により調製した培地（培地組成を表１に示す）適宜培養槽に分注し殺菌後用いた。前培養として、500ml 容量三角フラスコ中の250ml の培地、計20Ｌに、該菌株を一白耳植菌し、25℃で96時間振とう（100rpm) 培養した。
【００２０】
【表１】
0003668278.tif 000006
【００２１】
培養液を遠心分離（10,000rpm)して菌体分画を得、アセトン2000mlを添加し攪拌した後、沈澱物をろ別し、抽出液を200ml に濃縮した。得られた濃縮液に酢酸エチルおよび蒸留水を各1000ml添加し、分液ロートにて酢酸エチル画分を得、濃縮・乾固した。乾固物をさらにシリカゲルカラムにクロロホルムとメタノールの混合液を溶媒に用いて供した。溶出したクロロホルム：メタノール（９：１）の画分について，TSK gel ODS-80Tsと蒸留水：メタノール（95：５）を用いた高速液体クロマトグラフィーによりアスタキサンチングルコサイド２mgおよびアドニキサンチングルコサイド0.６mgを得た。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により新規高極性カロテノイドであるアスタキサンチングルコサイドおよびアドニキサンチングルコサイド、並びにその製造方法が提供される。