(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)の蛋白質をコードする遺伝子：
(a) 配列番号：37で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) 配列番号：37で示されるアミノ酸配列において一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列からなり且つ脳神経成長活性および／または神経再生活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子：
(a) 配列番号：38で示される塩基配列からなるDNAおよびこれと相補的な配列のDNA
（ｂ）  配列番号：38で示される塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つ脳神経成長活性および／または神経再生活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項３】
配列番号：37で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする請求項１に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号：38で示される塩基配列からなるDNAである請求項２に記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号：39で示される塩基配列である請求項２に記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項1または3に記載のアミノ酸配列からなる脳神経成長活性および／または神経再生活性を有する組換え体ポリペプチド。
【請求項７】
請求項2または4に記載のDNAを含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの疾患の予防、診断及び治療の指針として有用な遺伝子、より詳しくはラット、マウス、酵母、線虫やヒト遺伝子などと類似性を有する新規なヒト遺伝子に関し、該遺伝子のｃＤＮＡ解析、ｃＤＮＡ染色体へのマッピング及びｃＤＮＡの機能解析により、該遺伝子を用いた遺伝子診断並びに新しい治療法の開発に利用可能な新規なヒト遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物の遺伝情報は、細胞の核内に存在するＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの４種の塩基の列び(ＤＮＡ)として蓄積され、この遺伝情報は個々の生物の系統維持と個体発生のために保存されている。
【０００３】
ヒトの場合、その塩基数は約３０億(３ｘ１０9)といわれ、その中に５−１０万の遺伝子があると推測されている。これらの遺伝情報は遺伝子(ＤＮＡ)からｍＲＮＡが転写され、次に蛋白質に翻訳されるという流れに沿い、調節蛋白質、構造蛋白質あるいは酵素が作られ、生命現象を維持している。上記遺伝子から蛋白質翻訳までの流れの異常は、細胞の増殖・分化などの生命維持システムの異常を惹起し、各種疾患の原因となるとされている。
【０００４】
これまでの遺伝子解析の結果から、インスリン受容体やＬＤＬ受容体などの各種受容体や細胞の増殖・分化に関わるもの、プロテアーゼ、ＡＴＰａｓｅ、スーパーオキシドディスムターゼのような代謝酵素などの医薬品開発にとって有用な素材となると思われる遺伝子が多く見つかっている。
【０００５】
しかしながら、ヒト遺伝子の解析とそれら解析された遺伝子の機能及び解析遺伝子と各種疾患との係わりについての研究は、まだ始まったばかりであり、不明な点が多く、更なる新しい遺伝子の解析、それらの遺伝子の機能の解析、解析された遺伝子と疾患の係わりの研究、惹いては解析された遺伝子の利用による遺伝子診断、該遺伝子の医薬用途への応用研究などが当業界で望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記新たなヒト遺伝子が提供できれば、各細胞での発現レベルやその構造及び機能を解析でき、またその発現物の解析などにより、これらの関与する疾患、例えば遺伝子病、癌などの病態解明や診断、治療などが可能となると考えられ、本発明は、かかる新たなヒトの遺伝子を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、以下の知見を得、ここに本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明者らは、ヒト胎児脳、成人血管、胎盤などの各種組織より抽出したｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、これをベクターに組込んでライブラリーを構築し、該ライブラリーでトランスフォームした大腸菌コロニーを寒天培地上に形成させ、該コロニーをランダムにピックアップして９６ウェルマイクロプレートに移し、ヒト遺伝子を含む多数の大腸菌クローンを登録した。
【０００９】
登録した各クローンは、少量培養後、ＤＮＡを抽出精製し、抽出したｃＤＮＡを鋳型としてデオキシターミネーター法により４種の塩基特異的に停止する伸長反応を行ない、自動ＤＮＡシークエンサーにより、遺伝子の５’末端から約４００塩基配列を決定した。かくして得られた塩基配列情報について、公知のバクテリアから酵母、線虫、マウス及びヒトなどの動植物種に類似性を有する新規なファミリー遺伝子を検索した。
【００１０】
上記ｃＤＮＡ解析方法については、本発明者のひとりである藤原らによって細述されている(藤原  力, 細胞工学, 14, 645-654(1995))。
【００１１】
このグループの中には新しいレセプター、ＤＮＡ結合ドメインを有する転写調節因子やシグナル伝達系因子、代謝酵素などがあり、遺伝子解析によって得られた本発明の新規な遺伝子と類似性ある遺伝子との相同性から、およそのその遺伝子産物、即ち蛋白質がどのような機能を有するか類推することが可能である。更に、その候補遺伝子を発現ベクターに組込み、リコンビナントを作製し、酵素活性や結合活性などの機能を調べることができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、配列番号：１、：４、：７、：１０、：１３、：１６、：１９、：２２、：２５、：２８、：３１、：３４、：３７及び：４０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことを特徴とする新規なヒト遺伝子、前記各アミノ酸をコードする配列番号：２、：５、：８、：１１、：１４、：１７、：２０、：２３、：２６、：２９、：３２、：３５、：３８及び：４１で示される塩基配列を含むことを特徴とするヒト遺伝子、並びに配列番号：３、：６、：９、：１２、：１５、：１８、：２１、：２４、：２７、：３０、：３３、：３６、：３９及び：４２で示される塩基配列であることを特徴とする新規なヒト遺伝子が提供される。
【００１３】
以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書などの作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１４】
かかる本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例１〜１１に示される「ＧＥＮ−５０１Ｄ０８」、「ＧＥＮ−０８０Ｇ０１」、「ＧＥＮ−０２５Ｆ０７」、「ＧＥＮ−０７６Ｃ０９」、「ＧＥＮ−３３１Ｇ０７」、「ＧＥＮ−１６３Ｄ０９」、「ＧＥＮ−０７８Ｄ０５ＴＡ１３」、「ＧＥＮ−４２３Ａ１２」、「ＧＥＮ−０９２Ｅ１０」、「ＧＥＮ−４２８Ｂ１２」、「ＧＥＮ−０７３Ｅ０７」、「ＧＥＮ−０９３Ｅ０５」及び「ＧＥＮ−０７７Ａ０９」とそれぞれ名付けられた各クローンの有するＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができ、それらの各塩基配列は、配列表に示される通りである。
【００１５】
また、これら各クローンは、同配列表に示される各アミノ酸でコードされるヌクレオチド（核酸）のオープンリーディングフレームを有しており、それぞれ後記実施例に示される分子量を有していると計算された。従って、本発明の各ヒト遺伝子を、以下後記実施例１〜１１に示される通りにいうことがある。
【００１６】
【発明の実施の態様】
以下、本発明ヒト遺伝子につき詳述する。
【００１７】
上述の如く、本発明ヒト遺伝子のそれぞれは、ラット、マウス、酵母、線虫及び公知のヒト遺伝子などと類似性を有し、それら類似性ある遺伝子の情報に基づくヒト遺伝子の解析とそれら解析された遺伝子の機能及び解析遺伝子と各種疾患との係わりについての研究に利用でき、遺伝子と関係ある疾患への遺伝子診断並びに該遺伝子の医薬用途への応用研究に用いることが可能である。
【００１８】
本発明遺伝子は、例えば配列番号：２に示されるように、一本鎖ＤＮＡ配列で表されるが、本発明はかかる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列やこれらの両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚、配列番号：３ｎ−１（ｎ＝１〜１４の整数）に示す本発明遺伝子の配列は、これによりコードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合わせ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合わせ選択したＤＮＡ塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮することができる〔Ncl.Acids Res., 9, 43-74 (1981)〕。
【００１９】
更に本発明遺伝子には、上記で示されるアミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変してなり、同様の機能を有する同効物をコードするＤＮＡ配列もまた包含される。これらポリペプチドの製造、改変（変異）などは天然に生じることもあり、また翻訳後の修飾により、或は遺伝子工学的手法により天然の遺伝子（本発明遺伝子）を、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987)；同100, p468 (1983) ；Nucleic Acids Research, 12, p9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986) 〕などの方法により改変したり、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, p4801 (1967)；同91, p3350 (1969)；Science, 150, p178 (1968) ；Tetrahedron Lett., 22, p1859 (1981)；同24, p245 (1983)〕により変異させたＤＮＡを合成したり、それらの組合せにより収得することができる。
【００２０】
本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された微生物を培養することによって、上記各遺伝子によりコードされる蛋白を容易にかつ安定して発現できる。
【００２１】
また本発明の遺伝子を利用して得られる各蛋白は、これを用いて、特異抗体を作成することもできる。ここで抗原として用いられるコンポーネントは、上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生される蛋白を用いることができ、得られる抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、これら抗体はそれぞれの蛋白の精製、測定、識別などに有利に利用できる。
【００２２】
本発明遺伝子の製造は、本発明によって開示された本発明遺伝子についての配列情報によれば、一般的遺伝子工学的手法により容易に実施できる〔Molecular Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編 (1986) など参照〕。
【００２３】
これは、例えばヒトｃＤＮＡライブラリー（各遺伝子の発現される適当な起源細胞より常法に従い調製されたもの）から、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6613 (1981) ; Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００２４】
上記方法において、起源細胞としては、目的の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示され、これからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変換（合成）とそのクローニングなどはいずれも常法に従い実施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab. Inc.）より市販の各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００２５】
ｃＤＮＡライブラリーからの本発明遺伝子のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施することができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃＤＮＡの産生する蛋白質に対して、該蛋白質特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより、対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せを例示できる。ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ配列などを用いるのが一般的であり、勿論既に取得された本発明遺伝子やその断片もかかるプローブとして利用できる。
【００２６】
更に各細胞、組織より抽出、単離精製された天然抽出物の部分アミノ酸配列情報に基づき、センス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００２７】
また、本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350-1354 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合に、レース法（ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35-38 (1994)）、殊に５′レース（５′ＲＡＣＥ）法（Frohman,M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998-9002(1988)）の採用が好適である。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従い合成することができる。
【００２８】
尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
上記で得られる本発明遺伝子或は各種ＤＮＡ断片などの塩基配列の決定も、常法に従うことができ、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Method in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などにより行なうことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキットなどを用いても容易に行ない得る。
【００２９】
本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, p1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, p692 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, p5990 (1983)及び前記引用文献など参照〕に従うことにより、各組換え体蛋白を得ることができる。該蛋白の製造は、より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより行なわれる。
【００３０】
ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23, 175-182 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)〕などがよく用いられているが、これらに限定される訳ではない。
脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列などを保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981）〕などを例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)〕などを利用できる。
【００３１】
また、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、原核生物遺伝子融合ベクターを好ましく利用することができ、該ベクターの具体例としては、例えば分子量２６０００のＧＳＴドメイン（S.japonicum 由来）を有するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２などを例示することができる。
【００３２】
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。これらを宿主とする場合、本発明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、PL/PRプロモーターなどを使用できる。
【００３３】
かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺伝子によりコードされる目的の蛋白が生産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００３４】
上記により、形質転換体の細胞内、細胞外乃至は細胞膜上に目的とする組換え蛋白が発現、生産、蓄積乃至分泌される。
【００３５】
各組換え蛋白は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313-321 (1987) など参照〕により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示でき、特に好ましい上記方法としては所望の蛋白を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーを例示できる。
【００３６】
また、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種ヒト組織における本発明遺伝子の発現の検出を行なうことができる。これは常法に従って行なうことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Reverse transcribed-Polymerase chain reaction）（Kawasaki, E.S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27(1991)）によるＲＮＡ増幅により、またノーザンブロッティング解析（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)）などにより、いずれも良好に実施し得る。
【００３７】
尚、前記ＰＣＲ法を採用する場合において、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる本発明遺伝子に特有のものである限りなんら限定はなく、本発明遺伝情報に基いてその配列を適宜設定することができる。通常これは常法に従って２０〜３０ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとすることができる。その好適な例は、後記実施例１−１１に示すとおりである。
【００３８】
しかして、本発明はかかる新規なヒト遺伝子に特有の検出に有用なプライマー及び／又はプローブをも提供するものである。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なヒト遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、その構造及び機能を解析でき、また、該遺伝子でコードされるヒト蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、その発現物の解析などや、これらの関与する疾患、例えば遺伝子病、癌などの病態解明や診断、治療などが可能となる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【００４１】
【実施例１】
ＧＤＰ解離促進蛋白遺伝子
（１）ＧＤＰ解離促進蛋白遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
ヒト胎児脳、成人血管、胎盤の各組織より抽出したｍＲＮＡをクローンテック社より購入し、出発材料とした。
【００４２】
上記各ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、ベクターλＺＡＰII（ストラタジーン社製）に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した（大塚ＧＥＮリサーチ・インスティチュート、大塚製薬株式会社）。
【００４３】
インビボ・エキシジョン法（in vivo excision : Short, J. M., et al., Nucleic Acids Res., 16, 7583-7600 (1988)）によって、寒天培地上にヒト遺伝子を含む大腸菌コロニーを形成させ、ランダムにそのコロニーをピックアップし、９６ウエルマイクロプレートにヒト遺伝子を含む大腸菌クローンを登録した。登録されたクローンは、−８０℃にて保存した。
【００４４】
次に登録した各クローンを１．５ｍｌのＬＢ培地で一昼夜培養し、プラスミド自動抽出装置ＰＩ−１００（クラボウ社製）を用いてＤＮＡを抽出精製した。尚、コンタミした大腸菌のＲＮＡは、ＲＮase処理により分解除去した。最終的に３０μｌに溶解し、２μｌは、ミニゲルによりおおまかにＤＮＡのサイズ、量をチェックし、７μｌをシークエンス反応用に用い、残りの２１μｌは、プラスミドＤＮＡとして４℃に保存した。
【００４５】
この方法によれば、若干のプログラム変更によって、後記各実施例で示されるＦＩＳＨ（fluoresence in situ hybridization）のプローブ用としても使用可能なコスミドを抽出することができる。
【００４６】
続いて、Ｔ３、Ｔ７或は合成オリゴヌクレオチド・プライマーを用いるサンガーらのジデオキシターミネーター法（Sanger, F., et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)）或はジデオキシターミネーター法にＰＣＲ法を加味した方法であるサイクルシークエンス法（Carothers, A.M., et al., Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989)）を実施した。これらは、少量のプラスミドＤＮＡ(およそ０．１−０．５μｇ)をテンプレート(鋳型)として４種の塩基特異的に停止する伸長反応させる方法である。
【００４７】
シークエンスプライマーとしては、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）の蛍光標識したものを使用し、Ｔａｑポリメラーゼにより通常約２５サイクル反応させた。そのＰＣＲ産物はポリアクリルアミド・尿素ゲルで分離し、蛍光標識したＤＮＡ断片を自動ＤＮＡシークエンサー、ＡＬＦTMＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）によりｃＤＮＡの５’末端側から約４００塩基の配列を決定した。
【００４８】
また、３’非翻訳領域は各遺伝子のヘテロジェナイティ(heterogeneity)が高く、個々の遺伝子を区別するには適しているので、場合によっては、３’側のシークエンスも行なった。
【００４９】
ＤＮＡシークエンサーで得られた膨大な塩基配列情報は、６４ビットのコンピューターＤＥＣ３４００に転送し、コンピューターによるホモロジー解析に用いた。ホモロジー解析には、ＵＷＧＣＧのＦＡＳＴＡプログラム（Pearson, W.R. and Lipman, D. J., Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 85, 2444-2448(1988)）によるデーターベース（GenBank, EMBL）検索により行なった。
【００５０】
上記方法によって任意に選択し、ｃＤＮＡの配列解析により、ＧＥＮ−５０１Ｄ０８と名付けた０．８キロベースの挿入を持つ一つのクローンがヒトＲａｌＧＤＰ解離促進蛋白(ＲａｌＧＤＳ: Ral guanine nucleotide dissociation stimulator）の遺伝子のＣ末端領域に対して高い相同性を示した。ＲａｌＧＤＳは、シグナルの伝達経路になんらかの役割を演ずると考えられるので、更にそのヒト相同物を提供するｃＤＮＡ挿入部の完全塩基配列を決定した。
【００５１】
低分子ＧＴＰアーゼは、細胞の増殖、分化、転写を含む多くの細胞の機能に対してシグナルを送ることにおいて重大な役割を演じている（Bourne, H. R., et al., Nature, 348, 125-132 (1990); Bourne et al., Nature, 349, 117-127 (1991)）。
【００５２】
それらの間で、ｒａｓ遺伝子ファミリーによってコードされた蛋白は、分子スィッチとして機能すること、即ち、ｒａｓ遺伝子ファミリーの機能が生物学的に非活性なＧＤＰ結合蛋白或は活性ＧＤＰ結合蛋白などの結合蛋白の異なる条件下によって調整されること、これら２つの条件がＧＴＰアーゼ活性化蛋白(GAPs)或はＧＤＳによって誘導されることがよく知られている。前者の酵素は結合ＧＴＰの加水分解を刺激することによってＧＤＰ結合を誘導し、後者の酵素は、結合ＧＤＰを遊離することによって定められたＧＴＰ結合を誘導する（Bogusuki, M.S. and McCormick, F., Nature, 366, 643-654 (1993)）。
【００５３】
ＲａｌＧＤＳは、形質転換活性のないｒａｓ遺伝子ファミリーのメンバーの一つとして、ＲＡＳに対する特異的なＧＤＰ解離促進蛋白として、最初に見つけられた（Chardin, P. and Tavitian, A., EMBO J., 5, 2203-2208(1986); Albright, C. F., et al., EMBO J., 12, 339-347 (1993)）。
【００５４】
Ｒａｌに加えて、ＲａｌＧＤＳは、これらの蛋白との相互作用によってN-ras，H-ras，K-ras，Rapのエフェクター分子として機能することが見つけ出された（Spaargaren, M. and Bischoff, J. R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91,
１２６０９−１２６１３  （１９９４））。
配列番号：３にＧＥＮ−５０１Ｄ０８と命名されたｃＤＮＡクローンの核酸配列、配列番号：２にそのクローンのコードディング領域の核酸配列並びに配列番号：１に該核酸配列でコードされるアミノ酸配列を示す。
【００５５】
このｃＤＮＡは、８４２塩基からなり、１２２アミノ酸をコードする３６６塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。転写開始コドンは２８番目の核酸残基に位置していた。
【００５６】
一般のデータ・ベース中において知られているＲａｌＧＤＳ蛋白とこのｃＤＮＡによって推定されたアミノ酸配列を比較した結果、このｃＤＮＡをコードする蛋白は、ヒトのＲａｌＧＤＳのＣ末端領域に対する相同物であることが明らかとなった。この新規な遺伝子でコードされるアミノ酸配列は、ｒａｓに結合するために必要であると考えられているＲａｌＧＤＳのＣ末端領域に対して３９．５％の同一性を持っていた。
【００５７】
従って前述のごとく、この遺伝子産物がｒａｓファミリー蛋白と相互作用をしているかもしれないこと、或はｒａｓ介在シグナル変換経路に影響を与えるかもしれないと考えられる。しかしながら、この新規な遺伝子は、ＧＤＳ活性領域をコードする領域を含んでおらず、ＧＤＳ蛋白と異なる機能を有しているようである。しかして、本発明者らはこの遺伝子をヒトＲａｌＧＤＳと名付けた。
【００５８】
（２）ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるＲａｌＧＤＳ蛋白のｍＲＮＡの発現をランダム・オリゴヌクレオチド・プライミング法によって標識したヒトｃＤＮＡクローンをプローブとするノーザンブロットにより評価した。
【００５９】
ノーザンブロット分析は、製品使用法に従い、ヒトＭＴＮブロット（Human Multiple Tissue Nothern blot ; クローンテック社製、パロ・アルト、カリフォルニア、米国）を用いて実施した。
【００６０】
即ち、上記ＧＥＮ−５０１Ｄ０８クローンのＰＣＲ増幅産物を〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識してプローブとした。
【００６１】
ブロッティングは、４２℃で一晩、５０％ホルムアミド／５×ＳＳＣ／５０×デンハルツ溶液／０．１％ＳＤＳ溶液（１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有）の溶液中でハイブリダイズした。２×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳにて室温下にて２回洗浄後、次いで０．１×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳにて５０℃下に４０分間で３回洗浄した。フィルターは−７０℃下に１８時間、Ｘ線フィルム（コダック社製）に対して露光した。
【００６２】
その結果、９００塩基の転写体が、試験した全てのヒト組織内に発現していることが明らかとなった。加えて、３．２キロ転写体が心臓と骨格筋内に特異的に観察された。これらの異なるサイズを有する転写体の発現は、二者択一的なスプライシングに負うか或は相同遺伝子に対するクロス−ハイブリダイゼーションに負うのかもしれない。
【００６３】
（３）ＦＩＳＨによるコスミド・クローンと染色体の局在
ＦＩＳＨは、コスミド・ベクターｐＷＥ１５中にクローン化されたヒト染色体のライブラリーをｃＤＮＡクローンの０．８キロ塩基挿入部をプローブとしてスクリーニングすることにより実施した（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., pp.3.1-3.58, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York(1989)）。
【００６４】
染色体の座位決定のためのＦＩＳＨは、Ｇバンドパターンを比較することによって確認するイナザワらの方法と同様に実施した（Inazawa, J.. et al., Genomics, 17, 153-162 (1993)）。
【００６５】
染色体のスクリーニングから得られたＧＥＮ−５０１Ｄ０８に対応するコスミドＤＮＡ０．５μｇをニック・トランスレーションによってビオチン１６ｄＵＴＰで標識し、プローブとした。
【００６６】
また、反復配列に起因するバック・グラウンド・ノイズを取り除くために、超音波処理したヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）の０．５μｌをプローブ液の９．５μｌに加えた。混合液は８０℃で５分間変性させ、２０％デキストラン硫酸を含む４ｘＳＳＣの等量を混合した。ついでハイブリダイゼーション混合液を、変性したスライド上に播種し、パラフィンで覆った後、３７℃で１６−１８時間、湿箱内にてインキュベートした。５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣで３７℃で１５分間洗浄後、２ｘＳＳＣで１５分間、更に１ｘＳＳＣで１５分間それぞれ洗浄を行なった。
【００６７】
ついでスライドは、アビジン−ＦＩＴＣ（５μｇ／ｍｌ）を含む商品名「１％ＢｌｏｃｋＡｃｅ」（大日本製薬社製）を加えた４ｘＳＳＣ中で３７℃、４０分間インキュベートした。その後、スライドは４ｘＳＳＣ、０．０５％トリトンＸ−１００を含む４ｘＳＳＣで各々１０分間洗浄し、１％ＤＡＢＣＯ（ＰＢＳ（−）：グリセロールを１：９（ｖ：ｖ）に１％ＤＡＢＣＯ、シグマ社製）を含む抗除色液ＰＰＤ液（ＰＰＤ（和光カタログＮｏ．１６４−０１５３２１）１００ｍｇ及びＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４）１０ｍｌを０．５Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3／０．５ＭＮａＨＣＯ3（９：１，ｖ／ｖ）の緩衝液（ｐＨ９．０）でｐＨを８．０に調整した後、グリセリンを追加し、総容量を１００ｍｌとしたもの）中に浸して、ＤＡＰＩ(４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール：シグマ社製)で対比染色した。
【００６８】
試験した１００以上の分裂中期の細胞から、他の染色体上のシグナルがない特異的なハイブリダイゼーションシグナルを染色体バンド６ｐ２１．３上に観察し、ＲａｌＧＤＳ遺伝子が染色体６ｐ２１．３に座位していることを確認した。
【００６９】
この実施例で得られた本発明の新規なヒトＲａｌＧＤＳ関連遺伝子の利用によれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＲａｌＧＤＳ蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、発現蛋白とｒａｓ介在のシグナルの形質導入経路への役割の研究やこれらの関与する疾患、例えば癌などの病態解明や診断、治療などが可能となると考えられるほか、本発明ＲａｌＧＤＳ蛋白遺伝子の染色体の転座を同じくする強直性脊椎炎、心房中隔欠損症、色素性網膜症、失読症などの各種疾患の発生と進展との係わりを研究することが可能となる。
【００７０】
【実施例２】
細胞骨格関連蛋白２遺伝子(ＣＫＡＰ２遺伝子)
（１）細胞骨格関連蛋白２遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析により、ヒト細胞骨格関連蛋白遺伝子（cytoskeleton-associated protein : ＣＡＰ）のＣＡＰ−グリシン領域を含有するいくつかのＣＡＰファミリー遺伝子と相同性の高い塩基配列を有するクローンを見いだし、これをＧＥＮ−０８０Ｇ０１と名付けた。
【００７１】
ところで、細胞骨格は真核生物の細胞の細胞質や細胞膜のすぐ内側に存在し、線維状物質が複雑に絡み合った網目状の構造体である。該細胞骨格は、チューブリンからなる微小官、アクチンからなる微小線維、デスミンやビメンチンからなる中間径線維などから構成されている。細胞骨格は細胞の骨組み的な役割を担うだけでなく、線維系の重合・脱重合により細胞の形態的変化を起こすなど動的な機能も果たしている。細胞骨格は、細胞内小器官や細胞膜の受容器、イオン・チャンネルと結合し、それらの細胞内での移動や局在性の保持に重要な役割を果たしているほか、活性の調節や相互の情報伝達の機能を有するとされ、細胞全体の生理活性の調節において、非常に重要な位置を占めていると推測される。特に癌細胞は、正常細胞と違った形態、認識反応応答を示すことから、細胞の癌化と細胞骨格の質的変化の関係が注目される。
【００７２】
この細胞骨格の活性は、多くの細胞骨格関連蛋白（ＣＡＰｓ）によって調節されている。ＣＡＰｓのひとつのグループは、微小官との関連に貢献していると推定されている高く保存されたグリシン・モチーフによって特徴付けられている（CAP-GLY領域: Riehemann K. and Song C., Trends Biochem. Sci., 18, 82-83(1993)）。
【００７３】
ＣＡＰｓのこのグループのメンバーは、ＣＬＩＰ−１７０，１５０ｋＤａ  ＤＡＰ（dynein-associated protein, or dynactin）、D. melanogaster ＧＬＵＥＤ, S. cerevisiae ＢＩＫ１，リスティン（restin: Bilbe G., et al., EMBO J., 11, 2103-2113 (1992); Hilliker C., et al., Cytogenet. Cell Genet., 65, 172-176(1994)）とC. elegansの１１３．５ｋＤａ蛋白（Wilson R., et al., Nature, 368, 32-38(1994)）を含んでおり、後者の２つの蛋白を除いて、それらは、微小官と相互作用を及ぼすことのできることが直接的或は間接的証拠によって提言されている。
【００７４】
上記ＣＬＩＰ−１７０は、インビトロにおいて微小官に対する内分泌の小胞の結合にとって重要であり、内分泌細胞小器官とともに局在する（Rickard J.E. and Kreis T.E., J. Biol. Chem., 18, 82-83 (1990); Pierre P., et al., Cell, 70, 887-900 (1992)）。
【００７５】
上記ダイナクチンは、逆行性の小胞の輸送に働く（Schroer T.A. and Sheetz M.P., J. Cell Biol., 115, 1309-1318(1991)）か或は多分、有糸分裂期間中の染色体の動きに働くとされる（Pfarr C.M., et al., Nature, 345, 263-265(1990); Steuer E.R., et al., Nature, 345, 266-268 (1990); Wordeman L., et al., J. Cell Biol., 114, 285-294(1991)）細胞質のダイニン運動を構築している因子のひとつである。
【００７６】
哺乳動物のダイナクチンの相同遺伝子のショウジョウバエ(Drosophila)ＧＬＵＥＤは、ほとんど全ての細胞の生存にとって重要であり、いくつかの神経細胞の形成にとって重要である（Swaroop A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 6501-6505 (1987); Holzbaur E.L.F., et al., Nature, 351, 579-583 (1991)）。
【００７７】
ＢＩＫ１は微小官と相互作用を示し、酵母の有糸分裂期間中のスピンドル形成に重要な役割を演じている（Trueheart J., et al., Mol. Cell. Biol., 7, 2316-2326 (1987); Berlin V., et al., J. Cell. Biol., 111, 2573-2586 (1990)）。
【００７８】
現在、これらの遺伝子は、ＣＡＰファミリー(ＣＡＰｓ)と分類されている。
【００７９】
データ・ベースの検索の結果、４６３塩基(ポリＡシグナルを除いて)の上記ｃＤＮＡクローンは、レスティンとＣＬＩＰ−１７０をコードする遺伝子と有意な核酸配列相同性を示した。しかしながら、レスティン遺伝子と比較した時、このクローンは５’部分を欠いていたので、この欠けているセグメントを単離するために５’レースの技術を用いた（Frohman M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 8, 8998-9002 (1988)）。
【００８０】
（２）５′レース法（５’ＲＡＣＥ：5'rapid amplification of cDNA ends）
本発明遺伝子の５′部分を含むｃＤＮＡクローンの単離・解析は、製品使用プロトコールの一部修飾させ、市販キット（5'-Rapid AmpliFinder RACE Kit, クローンテック社）を用いた５′レース法により、以下の通り単離した。
【００８１】
ここで用いた遺伝子特異的プライマーＰ１及びプライマーＰ２は常法に従い合成されたものであり、その塩基配列は下記表１に示す通りである。またアンカー・プライマーは、市販キットに付属のものを用いた。
【００８２】
【表１】
0003646191.tif 000002
ヒト胎児脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの０．１μｇを逆転写酵素（Superscript TMII RNase H Reverse Transcriptase, Life Technologies社）を用いたランダムヘキサマーにより逆転写してｃＤＮＡを得、これをＰ１プライマー及びアンカープライマーを用いた第１のＰＣＲによるワタナベらの方法（Watanabe T., et al., Cell Genet., ）により増幅させた。
【００８３】
即ち、上記ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの０．１μｇに２．５ｍＭｄＮＴＰ／１ｘＴａｑ緩衝液(宝酒造社製)／０．２μＭ  Ｐ１プライマー、０．２μＭアダプター・プライマー／ＥｘＴａｑ酵素(宝酒造社製)０．２５単位を併せて全量を５０μｌとし、これにアンカー・プライマーを加えて室温で反応させた後、ＰＣＲに供した。即ち、９４℃１分間、次いで９４℃４５秒、６０℃４５秒、７２℃２分のサイクルを３５サイクル行ない、７２℃で５分間反応させた。
【００８４】
その後、第１のＰＣＲ反応物５０μｌ中の１μｌを特異的ネスティッドＰ２プライマーとアンカー・プライマーを用いる第２のＰＣＲ反応により増幅させた。第２のＰＣＲ産物は、１．５％アガロース・ゲル電気泳動により分析した。
【００８５】
アガロース・ゲル電気泳動により、およそ６５０塩基の大きさを示す単一のバンドを検出し、このバンドの産物をベクター（ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ，ノバゲン(Novagen) 社）に挿入し、適当なサイズの挿入がみられる複数のクローンを選別した。
【００８６】
ＰＣＲ反応物から得られた５’レース・クローンの６つが同じ配列を有しているが、異なる長さであった。ＧＥＮ−０８０Ｇ０１とＧＥＮ−０８０Ｇ０１４９の２つの重なりを持つｃＤＮＡクローンをシークェンシングすることによって、蛋白質をコードしている配列と、５’と３’フランキング配列と全長１０１５塩基の配列を決定し、該遺伝子を細胞骨格関連蛋白２遺伝子(ＣＫＡＰ２遺伝子)と命名した。
【００８７】
配列番号：６に上記ＧＥＮ−０８０Ｇ０１とＧＥＮ−０８０Ｇ０１４９の２つの重なっているｃＤＮＡクローンから得られた核酸配列、配列番号：５にそのクローンのコードディング領域の核酸配列、並びに配列番号：４に核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００８８】
ＣＫＡＰ２遺伝子は、配列番号：６で示されるように、その５’非コード領域が相対的にＧＣ−リッチであり、（ＣＡＧ）４（ＣＧＧ）４（ＣＴＧ）（ＣＧＧ）の不完全なトリプレットが４０−６９塩基の位置に存在していた。
【００８９】
その２７４−２７６塩基の位置のＡＴＧは、推定されるスタート・コドンである。ストップ・コドン（ＴＧＡ）は、８５３−８５５塩基に位置していた。ポリアデニレーション・シグナル(ＡＴＴＡＡＡ)は、ポリ(Ａ)スタートの前の１６塩基にあった。推定されたオープン・リーディング・フレームは、２１，８００の計算された分子量を持つ１９３アミノ酸をコードする５７９塩基からなっている。
【００９０】
更にＲＴ−ＰＣＲによってコード領域を増幅し、得られた合成配列がｃＤＮＡのキメラであるという可能性を排除した。
【００９１】
（２）他のＣＲＰｓとＣＫＡＰ２との類似性
ＣＫＡＰ２の配列は、レスティンとＣＬＩＰ−１７０の配列との相同性を明らかにしたが、相同性領域は、ＣＡＰ−ＧＬＹドメインの短い配列に限定されていた。アミノ酸レベルにおいて、推定されたＣＫＡＰ２は、他の５つのＣＡＰｓとも高い相同性を示した。
【００９２】
ＣＫＡＰ２は、アルファ−ヘリックス・ロッド、亜鉛フィンガー・モチーフのようないくつかのＣＡＰｓの特徴的な他のモチーフを保有していなかった。アルファ−ヘリックス・ロッドは、２量体形成や微小管結合能を増加させることに貢献していると思われた（Pierre P., et al., Cell, 70, 887-900, (1992)）。アルファ−ヘリックス領域の欠失は、ＣＫＡＰ２がホモ−或はヘテロ−・ダイマー形成することのできないことを意味するかもしれない。
【００９３】
これらの蛋白のＣＡＰ−ＧＬＹ領域を並べると、グリシンの他に保存された残基もまたＣＫＡＰ２中にあることが明らかとなった。また、ＣＡＰ−ＧＬＹ領域を持つＣＡＰｓは、細胞小器官の活動において、そして微小官とそれらの相互作用に関係すると考えられた。ＣＫＡＰ２は、上記の如くＣＡＰ−ＧＬＹ領域を含んでいるので、これらのファミリーの中に位置付けされる。
【００９４】
Ｇｌｕｅｄの変異体を用いた研究によれば、Ｇｌｕｅｄ産物は、ほとんど全ての細胞において重大な役割を演ずること（Swaroop A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 6501-6505 (1987)）及び神経細胞内において他の神経−特異的な機能を演じること（Meyerowizt E.M. and Kankel D.R., Dev. Biol., 62, 112-142 (1978)）が明らかにされている。これらの微小官関連蛋白は、小胞輸送と有糸分裂に働くと思われている。故に、神経細胞における小胞輸送システムの重要性は、これらのコンポーネントの欠損が異常な神経細胞系に導くかもしれない。
【００９５】
このようなことから、ＣＫＡＰ２は本質的な細胞機能と同様に特異的な神経細胞の機能に関係しているかもしれない。
【００９６】
（３）ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるヒトＣＫＡＰ２ｍＲＮＡの発現を、実施例１−（２）と同様にしてＧＥＮ−０８０Ｇ０１クローン（５５３−１０１５塩基に相当する）をプローブとするノーザンブロットにより評価した。
【００９７】
その結果、試験したヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓の８つの全ての組織において、ＣＫＡＰ２のｃＤＮＡのサイズに一致する１．０kbの転写体を検出した。該１．０ｋｂの転写体は、試験した他の組織より、心臓、脳において有意に高いレベルで発現されていた。３．４ｋｂと４．６ｋｂの２つの弱いバントがそれぞれ全ての組織において検出された。
【００９８】
ノーザン・ブロット分析によれば、上記３．４ｋｂと４．６ｋｂの転写体は、選択的スプライシングによって、ＣＫＡＰ２の１．０ｋｂ転写体をコードする同じ遺伝子から誘導されているか、もしくは、別の関連遺伝子から転写されたものである可能性も存在する。これらの転写体の特徴は、ＣＫＡＰ２が、ＣＡＰ−ＧＬＹ領域を有し、α−ヘリックスも有するような蛋白をもコードしているかもしれない。
【００９９】
（４）ダイレクト・Ｒ−バインディングＦＩＳＨによるコスミド・クローンと染色体上の局在
ＣＫＡＰ２ｃＤＮＡに対応する２つのコスミドを得た。それらの２つのコスミド・クローンを実施例１−（３）と同様にしてダイレクト・Ｒ−バインディングＦＩＳＨによってＣＫＡＰ２の染色体の座位のマッピングを行なった。
【０１００】
また、反復配列によるバックグラウンドの抑制のために、リヒター（Lichter P. et al., Proc. Natl. Sci. U.S.A., 87, 6634-6638(1990)）によって記載されたように２０倍過剰のヒトＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡ(ＢＲＬ社製)を加えた。プロビア１００フィルム(フジＩＳＯ１００；フジ・フィルム社製)を、顕微鏡写真撮影のために用いた。
【０１０１】
その結果、ＣＫＡＰ２は、染色体バンド１９ｑ１３．１１−ｑ１３．１２上にマップされた。
【０１０２】
ＤＮＡマーカーＤ１９Ｓ２２１とＤ１９Ｓ２２２の間のＣＡＤＡＳＩＬ（大脳皮質梗塞及び大脳白質萎縮を持つ大脳の常染色体優性動脈疾患）とＤ１９Ｓ２１５とＤ１９Ｓ２１６の間のＦＨＭ(家族性片麻痺性偏頭痛)の２つの常染色体性の優性神経疾患が、連鎖分析によってこの領域に局在されている。これら２つの疾患は、同じ遺伝子の対立遺伝子による疾患であるかもしれない（Tournier-Lasserve E. et al., Nature Genet., 3, 256-259(1993); Joutel A. et al., Nature Genet., 5, 40-45(1993)）。
【０１０３】
ＦＨＭと、或はＣＡＤＡＳＩＬ候補遺伝子としてＣＫＡＰ２を支持するための証拠はないが、その変異体は、なんらかの神経細胞の疾患に導くかもしれないと考えられる。
【０１０４】
この実施例により得られる本発明の新規なヒトＣＫＡＰ２遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＣＫＡＰ２の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前述したように多様で且つ細胞に本質的な活動に深く関与しているヒトＣＫＡＰ２システム乃至ヒトＣＫＡＰ２の機能の解析や、これが関与する各種神経疾患、例えば家族性偏頭痛、などの診断などを行なうことができ、またこれらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
【０１０５】
【実施例３】
ＯＴＫ２７遺伝子
（１）ＯＴＫ２７遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、酵母核蛋白（Saccharomyces cerevisiae: Kolodrubetz, D. and Burgum, A., YEAST, 7, 79-90 (1991)）、ＮＨＰ２に対して高い相同性を有する蛋白をコードするｃＤＮＡクローン、ＧＥＮ−０２５Ｆ０７を見出し、ＯＴＫ２７と命名した。
【０１０６】
核蛋白質は、染色体、リボソームなどの細胞の基本構成成分であり、この核蛋白質は細胞増殖、生存能力に対して本質的な役割を演じていると考えられている。酵母の核蛋白質であるＮＨＰ２は、High-mobility group（ＨＭＧ）−like proteinで、ＨＭＧと同様に細胞の生存能力に対して必須の機能を有していると報告されている（Kolodrubetz, D. and Burgum, A., YEAST, 7, 79-90 (1991)）。
【０１０７】
上記酵母ＮＨＰ２に高い相同性を有する本発明の新規なヒト遺伝子、ＯＴＫ２７遺伝子もまた同様な機能を有していると推測される。
【０１０８】
上記該ＧＥＮ−０２５Ｆ０７クローンの塩基配列は、配列番号：９で示されるように１４９３塩基からなり、配列番号：８で示される３８４塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでおり、これによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号：７に示される通り１２８アミノ酸からなっていた。開始コドンは、配列番号：９の塩基配列番号の９５−９７番目から始まり、４７９−４８１番目が終始コドンを示していた。
【０１０９】
ＯＴＫ２７ペプチドは、ＮＨＰ２とアミノ酸レベルにおいて３８％の高い相同性を示した。また、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana: Newman, T., unpublished ; GENEMBL Accession No. T14197）からのｃＤＮＡの核酸配列から推定された蛋白に対して８３％同一であった。
【０１１０】
（２）ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるヒトＯＴＫ２７ｍＲＮＡの発現を、ＯＴＫ２７ｃＤＮＡクローンのインサート部分をＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識してプローブとし、実施例１−（２）に準じてノーザンブロッティングを行なった。
【０１１１】
ノーザンブロット分析の結果、この遺伝子からの２つの可能性ある転写体を示しているおよそ１．６キロ塩基と０．７キロ塩基の位置に２つのバンドを検出した。両サイズの転写体が試験した全ての正常成人組織に発現されていたが、０．７キロ塩基の転写体の発現は脳において有意に減少し、試験した他の組織に比べて心臓、骨格筋、睾丸においてより多く発現されていた。
【０１１２】
これらの２つの転写体の更なる試験のために睾丸ｃＤＮＡライブラリーから１１のｃＤＮＡクローンを単離し、実施例１−（１)と同様にそれらＤＮＡ配列を決定した。
【０１１３】
その結果、６つのクローンにおいて、それらは０．７キロ塩基の転写体に一致しており、ポリＡ配列は６００番目辺りの塩基に始まり、これらのクローンのうち２つのクローンにおいてポリＡ配列が５９８番目の塩基、３つのクローンが６０６番目の塩基、１つのクローンが６１３番目の塩基で始まっていた。
【０１１４】
これら６つのクローンにおいて、５８３−５８８番目の塩基で“ＴＡＴＡＡＡ”配列が、ポリＡシグナルとしておそらく認められた。また、この遺伝子の上流ポリＡシグナル“ＴＡＴＡＡＡ”は、脳においてほとんど影響せず、他の組織より上記した３つの組織においてより効果的であると認識され、各転写体の安定性は種々の組織間で異なっている可能性も考えられた。
【０１１５】
更に、ズー・ブロット分析の結果より、この遺伝子は他の脊椎動物においてもよく保存されていることが示された。この遺伝子は、正常成人組織のいたるところで発現されており、種間の広い範囲で保存されていたので、その遺伝子産物は重要な生理学的な役割を演じると考えられる。ＮＨＰ２を欠いている酵母は生存できないことから、ヒトの相同物もまた細胞の生存能力に対して本質的であるかもしれないと提言され得る。
【０１１６】
（３）ダイレクト・Ｒ−バィンディングＦＩＳＨによるＯＫＴ２７染色体の局在
プローブとしてＯＴＫ２７ｃＤＮＡのインサートを用いてcＤＮＡ ＯＴＫ２７に対応する１つのコスミド・クローンを全ヒト染色体コスミド・ライブラリー（５ゲノムに相当）から単離し、実施例１−（３）に準じてダイレクト・Ｒ−バィンディングＦＩＳＨを実施し、ＯＴＫ２７の染色体の局在を決定した。
【０１１７】
その結果、明瞭な２つのスポットが染色体１２ｑ２４．３のバンド上に観察された。
【０１１８】
本発明ＯＴＫ２７遺伝子は、ヒト核蛋白質、ＯＴＫ２７蛋白の発現及び検出に利用でき、かくして該蛋白の関与する各種の疾患の診断、病態解明、例えば細胞増殖や分化に関わることからある種の癌の治療及び予防薬のスクリーニングや評価に利用できる。
【０１１９】
【実施例４】
ＯＴＫ１８遺伝子
（１）ＯＴＫ１８遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
亜鉛−フィンガー蛋白は、真核生物の転写調節を行なう蛋白の大きなファミリーと定義されており、進化的に保存された構造モチーフを含んでいる（Kadonaga, J. T., et al., Cell, 51, 1079-1090 (1987); Klung, A. and Rhodes, D., Trends Biol. Sci., 12, 464-469 (1987); Evans, R. M. and Hollenberg, S. M., Cell, 52, 1-3 (1988)）。
【０１２０】
亜鉛イオンと、システィンとヒスチジンの２残基の相互作用によって形作られたループ様モチーフである亜鉛フィンガーは、ＲＮＡ又はＤＮＡに対する蛋白の特異的結合に関係している。亜鉛フィンガー・モチーフは当初、カエル(Xenopus)の転写因子IIIＡのアミノ酸配列内において確認されていた（Miller, J., et al., EMBO J., 4, 1609-1614 (1986)）。
【０１２１】
Ｃ2Ｈ2フィンガーモチーフは、通常いくつか繰り返され、その間には７或は８アミノ酸の介在配列が進化的に保存されている。この介在している広がりは、当初、ショウジョウバエのクルッペルセグメンテーション遺伝子において確認された（Rosenberg, U. B., et al., Nature, 319, 336-339 (1986)）。それ以来、脊椎動物ゲノムは、数百のＣ2Ｈ2亜鉛フィンガー蛋白をコードする遺伝子が発見されている。
【０１２２】
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、亜鉛フィンガー構造を含むいくつかのクローンを確認し、ここにクルッペル・タイプの亜鉛フィンガー構造をもつクローンを見い出した。
【０１２３】
このクローンは転写体の５’部分が欠けていたので、プローブとしてｃＤＮＡクローンの約１．８キロ塩基のインサートを使用し、胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをプラーク・ハイブリダイゼーションして、３つのクローンを単離し、実施例１−（１）と同様にそれらの塩基配列を決定した。
【０１２４】
この３つクローンのうちインサートの最も大きいクローンは、７１１アミノ酸をコードする２１３３塩基のオープン・リーデイング・フレームを持つ３７５４塩基長に及んでおり、該クローンは、ヒトＺＮＦ４１とショウジョウバエのクルッペル遺伝子に対して、亜鉛フィンガー領域で高い類似性を有するペプチドをコードする新規なヒト遺伝子を含んでいた。この遺伝子をＯＴＫ１８遺伝子（ＧＥＮ−０７６Ｃ０９クローン由来）と命名した。
【０１２５】
ＯＴＫ１８遺伝子のｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：１２で示され、またコード領域を含む塩基配列は、配列番号：１１で示され、該ＯＴＫ１８遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列は、配列番号：１０で示される通りである。
【０１２６】
尚、配列番号：１２から、ＯＴＫ１８の推定されたペプチド配列は、その蛋白がそのカルボキシ側で１３のフィンガー・モチーフを含んでいることが判明した。
【０１２７】
（２）他の亜鉛フィンガー・モチーフを有する遺伝子との比較
ＯＴＫ１８、ヒトＺＮＦ４１、ショウジョウバエのクルッペル遺伝子の比較により、各フィンガー・モチーフは、共通配列ＣＸＥＣＧＫＡＦＸＱＫＳＸＬＸ2ＨＱＲＸＨに対して大部分保存されていた。
【０１２８】
ヒトＺＮＦ４１とショウジョウバエのクルッペル遺伝子に対するＯＴＫ１８の亜鉛フィンガー・モチーフの共通配列の比較は、クルッペルタイプ・モチーフがＯＴＫ１８遺伝子によりコードされた蛋白内によく保存されていた。しかしながら、配列の類似性は亜鉛フィンガー領域に限定されており、他の領域では有意なホモロジーは示さなかった。
【０１２９】
また、亜鉛フィンガー領域は、標的ＤＮＡと特異的相互作用し、約５塩基の配列を認識して、ＤＮＡのヘリックスと特異的に結合する（Rhodes, D. and Klug, A., Cell, 46, 123-132 (1986)）。
【０１３０】
このことからマルチ・モデュール（亜鉛フィンガーがタンデムにつながっていること）は、ＤＮＡの広い範囲と相互作用することができるとする考えに基づいて、１３の繰り返し単位を含んでいるこの遺伝子産物の標的ＤＮＡは、およそ６５塩基長のひとつのＤＮＡ断片であることが推測される。
【０１３１】
（３）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるヒトＯＴＫ１８ｍＲＮＡの発現を、ＯＴＫ１８ｃＤＮＡクローンのインサートをＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識してプローブとしてＭＴＮブロットを用いて実施した。
【０１３２】
ノーザンブロット分析の結果、ＯＴＫ１８の転写体がおよそ４．３キロ塩基の長さであることが明らかとなり、これは種々の正常成人組織内いたるところに発現されていた。しかしながら、肝臓と末梢血リンパ球における発現のレベルは試験した他の臓器においてより低いと思われた。
（４）ダイレクト・Ｒ−バィンディングＦＩＳＨによるコスミド・クローンと染色体の局在
ＯＴＫ１８の染色体の局在を実施例１−（３）に準じて行なった。
【０１３３】
その結果、８サンプルで２つの完全なスポットが確認され、２３サンプルはどちらか一方或は両方に不完全なシグナル又は２つのスポットを呈した。全てのシグナルは染色体１９のｑ１３．４バンドに現われた。他の染色体上には２つのスポットは観察されなかった。
【０１３４】
このようにＦＩＳＨの結果、この遺伝子が染色体バンド１９ｑ１３．４に局在することが判った。この領域は亜鉛フィンガー領域のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする多くのＤＮＡセグメントを含んでいることが知られている（Hoovers, J. M. N., et al., Genomics, 12, 254-263 (1992)）。しかも、亜鉛フィンガー蛋白をコードする少なくとも一つの他の遺伝子は、この領域で見つけられている（Marine, J.-C., et al., Genomics, 21, 285-286 (1994)）。
【０１３５】
このことから染色体１９ｑ１３は、転写を調節する蛋白をコードする多くのマルチ遺伝子が集まっている部位であると推測される。
【０１３６】
この実施例により提供される新規なヒトＯＴＫ１８遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＯＴＫ１８蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前述したように多様で且つ細胞に基本的な活動に深く関与しているヒト転写調節蛋白質遺伝子システム乃至ヒト転写調節蛋白質の機能の解析や、これが関与する各種疾患、例えば発生分化異常の奇形や癌、或は神経系発生異常の精神、神経障害などの診断などを行なうことができ、またこれらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
【０１３７】
【実施例５】
ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ４２蛋白質及びＰ２７蛋白質遺伝子
（１）ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ４２蛋白質及びＰ２７蛋白質の各遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
多機能プロテアーゼであるプロテアソームは、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在し、細胞内でエネルギー依存的にユビキチン結合蛋白質を分解する酵素である。該プロテアソームは、構造的には分子量２１〜３１キロダルトンの種々の構成成分からなる２０Ｓプロテアソームと、３０〜１１２キロダルトンの種々の構成成分からなる沈降係数２２ＳのＰＡ７００制御蛋白質群とで構成され、全体として沈降係数２６Ｓ、分子量約２００万ダルトンの巨大分子を形成している〔Rechsteiner, M., et al., J.Biol.Chem., 268, 6065-6068 (1993)、Yoshimura, T., et al., J.Struct.Biol., 111, 200-211 (1993)、Tanaka, K., et al., New Biologist, 4, 173-187 (1992)〕。
【０１３８】
その構造的及び機械的な解析からも尚、該プロテアソームの全容は明らかになっていないが、主として酵母とマウスを用いた研究から、以下の機能が報告され、その機能は次第に明らかになりつつある。
【０１３９】
即ち、細胞内におけるエネルギー依存性の蛋白質分解機構は、ユビキチン結合による蛋白質の選別にはじまるが、ユビキチン化蛋白質を分解するＡＴＰ依存的な活性は２０Ｓプロテアソームにはなく、２６Ｓプロテアソームにある〔Chu-Ping et al., J.Biol.Chem., 269, 3539-3547 (1994)〕。このことから、ヒト２６Ｓプロテアソームは、エネルギー依存性の蛋白質分解機構の解明に有用であると考えられる。
【０１４０】
細胞周期の調節に関与する因子は、一般に半減期が短く、厳格な量的制御を受けている場合が多い。実際、癌遺伝子産物であるＭｏｓ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓなどはエネルギー、ユビキチン依存的に２６Ｓプロテアソームにより分解されることが明らかにされ〔Ishida, N., et al., FEBS Lett., 324, 345-348 (1993)、Hershko,A., and Ciechanover, A., Annu.Rev.Biochem., 61, 761-807 (1992)〕、細胞周期制御におけるプロテアソームの重要性が認識されつつある。
【０１４１】
また免疫系における重要性も指摘されており、クラスＩ主要組織適合複合体抗原提示において、プロテアソームが積極的に関与していることも示唆され〔Michalek MT., et al., Nature, 363, 552-554 (1993)〕、さらにアルツハイマー患者の脳内において、ユビキチン化蛋白質が異常に蓄積してるという現象〔Kitaguchi, N., et al., Nature, 361, 530-532 (1988)〕から、アルツハイマー病にもプロテアソームが関与していることが示唆されるなど、プロテアソームは多彩な機能を有するという点で、各種病態の診断や治療にその有用性が注目されてきている。
【０１４２】
また、２６Ｓプロテアソームの主たる機能は、ユビキチン化蛋白質を分解する活性である。中でもｃ−Ｍｙｃをはじめとする癌遺伝子産物やサイクリンのような細胞周期関連遺伝子産物の分解が、ユビキチン依存の経路で分解されることが判明している。また肝癌細胞、腎癌細胞、白血病細胞などにおいてプロテアソーム遺伝子は、正常細胞に比較して異常発現しており〔Kanayama, H., et al., Cancer Res., 51, 6677-6685 (1991)〕、腫瘍細胞核にプロテアソームが異常蓄積していることが観察されている。このことから、ヒトプロテアソームの構成成分はこれらの癌化のメカニズムの解明や癌の診断あるいは治療に有用となることが期待される。
【０１４３】
更に、プロテアソームの発現がインターフェロンγなどによって誘導され、細胞内での抗原提示に深く関与することが知られている〔Aki, M., et al., J.Biochem., 115, 257-269 (1994)〕。このことから、ヒトプロテアソームの構成成分は免疫系の抗原提示のメカニズムの解明や免疫制御剤の開発にも期待できる。
【０１４４】
加えて、プロテアソームはアルツハイマー患者の脳内に異常蓄積しているユビキチンとも深く関わっているとも考えられ、この点より、ヒトプロテアソームの構成成分は、アルツハイマー病の原因解明やその治療にもその有用性が示唆されている。
【０１４５】
このように、多機能が期待できるプロテアソームは、該酵素自体の利用以外にも、その各構成成分を抗原として抗体を作製すれば、かかる抗体が免疫測定法により各種病態の診断に用い得るとも考えられ、この診断分野での有用性も着目されている。
【０１４６】
ところで、ヒト２６Ｓプロテアソームの特性を有する蛋白質については、例えば特開平５−２９２９６４号に開示があり、また、ラットプロテアソーム構成蛋白質については、特開平５−２６８９５７号及び特開平５−３１７０５９号に開示があるが、ヒト２６Ｓプロテアソームの構成成分については知られていない。そこで本発明者らは、ヒト２６Ｓプロテアソームの構成成分について更なる検索を行い２つの新たなヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分蛋白質であるヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ４２蛋白質及びヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ２７蛋白質を得、以下に示される方法にて該遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシングを行なった。
【０１４７】
（１）ヒト２６Ｓプロテアソーム構成成分Ｐ４２蛋白質及びＰ２７蛋白質の精製
新鮮なヒト腎臓約１００ｇを用い、特開平５−２９２９６４号公報に記載されているヒトプロテアソームの精製法に従い、バイオゲルＡ−１．５ｍ（５×９０ｃｍ、バイオラッド製）、ハイドロキシアパタイト（１．５×１５ｃｍ、バイオラッド製）、Ｑ−セファロース（１．５×１５ｃｍ、ファルマシア製）によるカラムクロマトグラフィー及びグリセロール密度勾配遠心法により、ヒトプロテアソームの精製を行なった。
【０１４８】
得られたヒトプロテアソームを、日立Ｌ６２００型高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムより、逆相ＨＰＬＣを行なった。カラムは、Shodex RS Pak D4-613（０．６×１５ｃｍ、昭和電工製）を用い、以下の２液によるグラジエント溶出を行なった。
【０１４９】
第１液：０．０６％トリフルオロ酢酸
第２液：０．０５％トリフルオロ酢酸、７０％アセトニトリル
各溶出画分につき、その一部をジチオスレイトール還元下、８．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行ない検出し、Ｐ４２蛋白質及びＰ２７蛋白質をそれぞれ単離精製した。
【０１５０】
精製したＰ４２及びＰ２７蛋白質について、それぞれ０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．８）、２Ｍ尿素中、１μｇのトリプシンにより３７℃で８時間消化を行ない、得られた部分ペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで分離し、エドマン分解により配列を決定した。その結果は、それぞれ下記表２に示す通りであった。
【０１５１】
【表２】
0003646191.tif 000003
（２）ｃＤＮＡライブラリーの検索、クローンの単離及びｃＤＮＡ塩基配列の決定
本発明者らは、実施例１−（１）に示すように、ヒト胎児脳、血管動脈、胎盤ｃＤＮＡライブラリーの大量ＤＮＡ配列の決定から、約３万個のｃＤＮＡデーターを含むデーターベースを構築している。
【０１５２】
上記（１）で得られた各アミノ酸配列をもとにコンピューターによるＦＡＳＴＡ検索（アミノ酸配列に対して、ＤＮＡデーターベースから推測されたアミノ酸配列とのホモロジー検索）を行なった結果、Ｐ４２については、２つのアミノ酸配列（表２に示す（２）及び（７））が一致するクローン（ＧＥＮ−３３１Ｇ０７）を、またＰ２７についても、２つのアミノ酸配列（表２に示す（１）及び（８））が一致するクローン（ＧＥＮ−１６３Ｄ０９）を見出した。
【０１５３】
これら各クローンにつき、実施例２−（２）と同様にして、５′ＲＡＣＥ法により、５′側の配列を決定し、合わせて、それぞれの全配列を決定した。
【０１５４】
その結果、上記Ｐ４２クローンであるＧＥＮ−３３１Ｇ０７は、配列番号：１５に示される１５６６塩基配列から構成され、その中に配列番号：１４で示される１１６７塩基の翻訳領域を含み、これによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１３に示す３８９アミノ酸配列であることが明らかとなった。
【０１５５】
Ｐ４２蛋白質は、コンピューターを用いたホモロジー検索の結果、ＡＡＡ（ATPases associated with a variety of cellular activities）蛋白質ファミリー（例えば、Ｐ４５、ＴＢＰ１、ＴＢＰ７、Ｓ４、ＭＳＳ１など）と、有意なホモロジーを有することが認められ、このことからＡＡＡ蛋白質ファミリーの新しい一員であると示唆された。
【０１５６】
また、Ｐ２７クローンであるＧＥＮ−１６３Ｄ０９は、配列番号：１８に示される１１２８塩基配列から構成され、その中に配列番号：１７で示される６６９塩基の翻訳領域を含み、これによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１６に示す２２３アミノ酸配列であることが明らかとなった。
【０１５７】
Ｐ２７蛋白質は、コンピューターを用いたホモロジー検索の結果、パブリックなデーターバンク内にホモロジーを示す遺伝子は認められず、未知の機能を持つ新規な遺伝子と考えられた。
【０１５８】
しかして、上記Ｐ４２及びＰ２７の両遺伝子産物は、もともとプロテアソーム複合体の調節サブユニット成分として精製されたものであり、これらは、いずれも蛋白質分解を介して種々の生体機能にとって重要な役割、例えばＡＴＰ分解によるエネルギー供給のための役割を演じるていると考えられ、これらの点よりヒト２６Ｓプロテアソームの機能解明のみならず、上記生体機能の低下などに起因する各種病態の診断、治療などに有用であると考えられる。
【０１５９】
【実施例６】
ＢＮＡＰ遺伝子
（１）ＢＮＡＰ遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
ＤＮＡとヒストンで構成されるヌクレオソームは、真核生物の細胞において染色体を構成する基本構造で、種を越えてよく保存されている。この構造は、ＤＮＡの複製過程と転写に強く関連している。しかしながら、ヌクレオソームの形成については、完全には理解されておらず、ヌクレオソーム構築（nucleosome assembly: NAPs）に係わるいくつかの特異的な因子が確認されているのみである。
即ち、既に２つの酸性蛋白であるヌクレオプラスミン(nucleoplasmin)とＮ１が、ヌクレオソーム構築を容易にすることが確認されている（Kleinschmidt, J.A., et al., J. Biol. Chem., 260, 1166-1176 (1985): Dilworth, S. M., et al., Cell, 51, 1009-1018 (1987)）。
【０１６０】
モノクローナル抗体を用いて、酵母ＮＡＰ−Ｉの遺伝子が単離され、その組換え蛋白が、イン・ビトロにおいてヌクレオソーム構築活性を保有するかどうかが調べられた。
【０１６１】
更に近年、酵母のＮＡＰ−Ｉの哺乳動物相同物であるマウスのＮＡＰ−Ｉ遺伝子（Okuda, A.: registered in database as an accession number D12618）、マウスＤＮ３８遺伝子（Kato, K., Eur. J. Neurosci., 2, 704-711 (1990)）及びヒトヌクレオソーム構築蛋白（human nucleosome assembly protein: hNRP）がそれぞれクローニングされ（Simon, H. U., et al., Biochem. J., 297, 389-397(1994)）、ｈＮＲＰ遺伝子は、多くの組織において発現され、Ｔ−リンパ球の増殖に関連することが示された。
【０１６２】
本発明者らは、実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、１１２５塩基ｃＤＮＡクローンのＧＥＮ−０７８Ｄ０５(ポリＡを含んでいない）が、ヌクレオソーム構築に関連しているヌクレオソーム構築蛋白(ＮＡＰｓ)の遺伝子であるマウスＮＡＰ−Ｉの遺伝子、マウスの部分ｃＤＮＡクローンＤＮ３８及びｈＮＲＰと有意に高い相同性を有することを解明した。
【０１６３】
該ＧＥＮ−０７８Ｄ０５は、５’領域を欠いていたので、全体のコード領域を得るために、実施例２−（２）と同様の方法で５’レース法を行なった。この５’レース法のために、下記表３に示す塩基配列のプライマーＰ１及びＰ２を用いた。
【０１６４】
【表３】
0003646191.tif 000004
最初の５’レースの後、得られたものは配列長が１３００塩基のシングルバンドであった。この産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）Ｔ−Ｖｅｃｔｅｒに挿入し、適当なサイズのインサートを持ついくつかのクローンを選択した。
【０１６５】
２つの独立したＰＣＲ反応から得られた、５’レース・クローン、１０クローンを配列決定し、最も長いクローンＧＥＮ−０７８Ｄ０５ＴＡ１３(およそ１３００塩基長)を更に分析した。
【０１６６】
２つの重複しているｃＤＮＡクローンＧＥＮ−０７８Ｄ０５とＧＥＮ−０７８Ｄ０５ＴＡ１３の両ストランドを配列決定することによって、２つのクローンがまだ全体のコード領域をカバーしていないことを確認したので、更なる第２の５’レース法を実施した。２回目の５’レース法には、下記表４に示す塩基配列のプライマーＰ３及びＰ４を用いた。
【０１６７】
【表４】
0003646191.tif 000005
２回目の５’レース法によって得られたクローンＧＥＮ−０７８Ｄ０５０８は、３００塩基長であった。このクローンは推定の開始コドンと３つの先行するイン−フレーム停止コドンを含んでいた。これらの重複している３つのクローンから２６３６塩基からなる全体のコード配列が明らかとなり、この遺伝子を脳特異的ヌクレオソーム構築蛋白(Brain-specific Nucleosome Assembly Protein:ＢＮＡＰ)遺伝子と命名した。
【０１６８】
ＢＮＡＰ遺伝子は、配列番号：２０で示される１５１８塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされるアミノ酸は、配列番号：１９で示されるように５０６アミノ酸残基を有し、ＢＮＡＰの全ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：２１で示されるとおりである。
【０１６９】
配列番号：２１で示されるように、該遺伝子の５’非コード領域は、総体的にＧＣリッチであった。開始コドンの候補配列は、塩基配列番号２６６−２６８番目、２８７−２８９番目及び３２９−３３１番目に見られた。これらの３つの配列は、すべて開始コドン周辺でよく保存されている配列を持っていた（Kozak, M., J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991)）。
【０１７０】
スキャンニング・モデルに従えば、ｃＤＮＡクローンの最初のＡＴＧ（塩基配列番号２６６−２６８番目）が開始コドンであるかもしれない。停止コドンは、塩基配列番号１７８４−１７８６番目に位置していた。
【０１７１】
３’非コード領域は全体的にＡＴリッチであり、２つのポリ・アデニレーション・シグナル(ＡＡＴＡＡＡ)は、塩基配列番号２６０６−２６１１番目と２６１０−２６１５番目にそれぞれ位置していた。
【０１７２】
最も長いオープン・リーディング・フレームは、５０６のアミノ酸をコードしている１５１８塩基からなり、ＢＮＡＰ遺伝子産物の計算された分子量は、５７，６００ダルトンであった。
【０１７３】
親水性プロットは、ＢＮＡＰが他のＮＡＰｓのように極めて親水性であることを示した。
【０１７４】
組換えＢＮＡＰの発現と精製、そしてＢＮＡＰの遺伝子配列が５’レースの段階によって３つのキメラのクローンを構成しているかもしれないと考えられる可能性を排除するために、センス・プライマーとして配列番号３２６−３５６番目の配列と、アンチ・センスプライマーとして配列番号１７５８−１７８６番目の配列とを用い、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１７５】
その結果、単一の約１５００塩基対の産物が得られ、該配列がキメラではなく、単一転写産物であることが確認された。
【０１７６】
（２）ＢＮＡＰとＮＡＰｓとの比較
ＢＮＡＰの推定アミノ酸配列は、ｈＮＲＰと４６％の同一性と６５％の類似性を示した。
【０１７７】
推定されたＢＮＡＰ遺伝子産物は、既に報告されたＮＡＰｓにおいて見られたものとＢＮＡＰに特徴的なモチーフを持っていた。一般にＣ末端の半分はヒト及び酵母の間で強く、よく保存されていた。
【０１７８】
第１のモチーフ(ドメインＩ)は、ＫＧＩＰＤＹＷＬＩ（３０９−３１７番目のアミノ酸残基に相当）で、これはｈＮＲＰ（ＫＧＩＰＳＦＷＬＴ）及び酵母ＮＡＰ−Ｉ（ＫＧＩＰＥＦＷＬＴ）においても認められた。
【０１７９】
第２のモチーフ(ドメインII)は、ＡＳＦＦＮＦＦＳＰＰ（４３７−４４６番目のアミノ酸残基に相当）で、これはｈＮＲＰにおいては、ＤＳＦＦＮＦＦＡＰＰとして、酵母ＮＡＰ−Ｉにおいては、ＥＳＦＦＮＦＦＳＰとして表わされた。
【０１８０】
これら２つのモチーフもまたマウスＮＡＰ−ＩとＤＮ３８の推定ペプチドにおいて保存されていた。両者の保存されたモチーフは、親水性のクラスターで、４０２番目のＣｙｓもまた保存されていた。
【０１８１】
Ｎ末端の半分は酵母から哺乳動物の種にいたるまで厳格に保存されたモチーフを有しておらず、一方では、哺乳動物種の間で保存されたモチーフが見つけられた。
【０１８２】
例えば、哺乳動物特異的機能に関係しているかもしれない、ＨＤＬＥＲＫＹＡ（１３０−１３７番目のアミノ酸残基に相当）とＩＩＮＡＥＹＥＰＴＥＥＥＣＥＷ（１５０−１６４のアミノ酸残基に相当）は、厳格に保存されていた。
【０１８３】
ＮＡＰｓは、ヒストン又は他の塩基性蛋白に結合し易いと信じられている酸性のストレッチを有していた。全てのＮＡＰｓは３つの酸性のストレッチを持っていたが、それらのストレッチの位置は保存されていなかった。
【０１８４】
ＢＮＡＰはそのような３つの酸性ストレッチを有しておらず、代わりとして、９８アミノ酸残基のうち４１の酸性アミノ酸残基を含んでいるひとつの長い酸性のクラスターを有していた３つのくり返し配列（１９４−２０７番目、２０８−２２１番目及び２２２−２３５番目のアミノ酸残基に相当）があり、そのコンセンサスは、ＥｘｘＫＥｘＰＥＶＫｘＥＥＫ（ｘは保存されておらず、たいていは疎水性残基である)であった。
【０１８５】
更に、ＢＮＡＰ配列は、いくつかのＢＮＡＰ特異的モチーフを有していることが明らかとなった。即ち、４９アミノ酸残基のうち３３残基（６７％）がセリンである極端にセリンーリッチ領域(２４−７２番目のアミノ酸残基に相当)がＮ末端部分に見られた。それは核酸レベルでは不完全なＡＧＣくり返しとして見出された。
【０１８６】
このセリンーリッチ領域に続いて、１９のうち１０の塩基性アミノ酸残基を含んでいる塩基性領域(７１−８９番目のアミノ酸残基に相当）が現れた。
【０１８７】
ＢＮＡＰは核に局在すると考えられ、２つの可能性のある核局在シグナルが見られた(ＮＬＳｓ)。第一のシグナルはＢＮＡＰの塩基性ドメインに見つけられ、その配列ＹＲＫＫＲ（７５−７９番目のアミノ酸残基に相当）は、ＨＩＶ−１のＴａｔのＮＬＳ（ＧＲＫＫＲ）に類似していた。第二のシグナルは、Ｃ末端に位置しており、その配列ＫＫＹＲＫ（５０２−５０６番目のアミノ酸残基に相当）は、ＳＶ４０のラージＴ抗原のＮＬＳ（ＫＫＫＲＫ）に類似していた。これら２つの推定ＮＬＳｓがあることから、ＢＮＡＰは核に局在しているようであったが、他の塩基性クラスターがＮＬＳｓとして働くという可能性を排除できなかった。
【０１８８】
ＢＮＡＰはいくつかのリン酸化部位を有しており、リン酸化によりＢＮＡＰの活性を調節するかもしれない。
【０１８９】
（３）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるＢＮＡＰｍＲＮＡの発現を、クローンＧＥＮ−０７８Ｄ０５ＴＡ１３(ＢＮＡＰ遺伝子の配列番号３２３から１５５８番目に相当する)をＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識し、プローブとしてＭＴＮブロットに用いて試験した。
【０１９０】
ノーザンブロット分析の結果、試験した８つのヒト成人組織、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び膵臓のうち、脳においてＢＮＡＰの３．０キロの転写体が検出された(８時間露光)、そしてより長い露光(２４時間露光)で同じサイズのぼんやりしたバンドが心臓において検出された。
【０１９１】
ＢＮＡＰは試験した脳のいくつかの部位で等しく発現していたが、他の組織においては、７２時間露光によってもいかなるシグナルも検出されなかった。ｈＮＲＰｍＲＮＡは、試験したヒト組織においていたるところに発現されていたけれども、ＢＮＡＰｍＲＮＡは組織特異的な手法で発現されていた。
【０１９２】
（４）ラディエーション・ハイブリッド・マッピング（Radiation Hybrid Mapping）
ラディエーション・ハイブリッド・マッピングによって、ＢＮＡＰのクローンの染色体マッピングを行なった（Cox, D.R., et al., Science, 250, 245-250 (1990)）。
【０１９３】
即ち、全ヒト・ゲノムのラディエーション・ハイブリッド・クローン(Ｇ３ＲＨ)のパネルをリサーチ・ジェネティックス社(Research Genetics, Inc., AL, U.S.A.)より購入し、製品の使用説明書に従い、表５に示す塩基配列のＡ１プライマーとＡ２プライマーを用いて染色体マッピング分析のためのＰＣＲ反応を実施した。
【０１９４】
【表５】
0003646191.tif 000006
得られた結果をインターネット上で使用可能なソフトウェアによって分析した（Boehnke, M., et al., Am. J. Hum. Genet., 46, 581-586 (1991)）。
【０１９５】
その結果、ＢＮＡＰ遺伝子はマーカーＤＸＳ９９０（ＬＯＤ＝１０００，ｃＲ８０００＝−０．００）に強く連鎖していた。マーカーＤＸＳ９９０は、染色体上のＸｑ２１．３−ｑ２２に局在したマーカーであることから、ＢＮＡＰは、いくつかのＸ染色体と連関する精神遅延が局在する染色体位置Ｘｑ２１．３−ｑ２２に局在されていることが確認された。
【０１９６】
ヌクレオソームの構造真核生物に特徴的で基本的な染色体の構造単位だけでなく、遺伝子発現の調節単位である。いくつかの結果から、転写活性の高い遺伝子は、ヌクレアーゼ処理に感受性があり、転写活性により染色体の構造が変化することを示唆している（Elgin, S.C.R., J. Biol. Chem., 263, 19259-19262(1988)）。
【０１９７】
ＮＡＰ−Ｉは、酵母、マウス、ヒトにおいてクローニングされており、イン・ビトロにおいてヌクレオソーム構築を促進する能力を持つ因子の一つである。実施された配列に関する研究において、特異抗体４Ａ８のエピトープを含んでいるＮＡＰｓがヒト、マウス、カエル、ショウジョウバエ、酵母(サッカロミセス・セレビシェ:S. cerevisiae)において検出された（Ishimi, Y., et al., Eur. J. Biochem., 162, 19-24 (1987)）。
【０１９８】
これらの実験においてＮＡＰｓは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって５０−６０ｋＤａの間に電気泳動されたが、組換えＢＮＡＰは、およそ８０ｋＤａの位置にゆっくりと電気泳動された。４Ａ８のエピトープは、２番目のよく保存された疎水性モチーフの中に局在されていることが示された。そして、ＦＮＦのトリプレットが、エピトープの一部として重要であることが同時に示された（Fujii-Nakata T., et al., J. Biol. Chem., 267, 20980-20986 (1992)）。
【０１９９】
ＢＮＡＰもまたこの一致モチーフをドメインIIに含んでいた。ドメインIIは、著しく疎水的である事実とドメインIIが免疫システムによって認識されることができる事実は、それがＢＮＡＰ表面でおそらく提示され、蛋白−蛋白相互作用に関与する可能性を持つことが提言される。
【０２００】
ドメインＩもまた蛋白−蛋白相互作用に関与しているかもしれない。保存された領域の機能的な意味はいまだに不明であるが、これらのＮＡＰｓ間の比較的低いが総体的に保存されていることを考えると、それらはヌクレオソーム構築のためには本質的であらねばならないと考えられる。
【０２０１】
ｈＮＲＰ遺伝子は、甲状腺、胃、腎臓、腸、白血病、肺癌、乳癌などに発現される（Simon, H. U., et al., Biochem. J., 297, 389-397 (1994)）。一方、ＮＡＰｓは、いたるところに発現されていて、基本的なヌクレオソーム形成において重要な役割を演じていると考えられる。
【０２０２】
ＢＮＡＰは、脳特異的ヌクレオソーム形成に関与するかもしれず、その不全は、逸脱した神経細胞の機能の結果として神経学上の疾患や精神的な遅延を起こすかもしれない。
【０２０３】
ＢＮＡＰは、いくつかのＸ染色体と連鎖した精神的な遅延が、局在されるＸ染色体ｑ２１．３−ｑ２２上のマーカーに対して強く連鎖していた。このＸ染色体の中心周囲領域は、α−サラセミアや精神的遅延(ＡＴＲ−Ｘ)のような、精神的な遅延に対して責任ある遺伝子が多かった（Gibbons,  R. J., et al., Cell, 80, 837-845 (1995)）。ヌクレオソーム構造を調節すると思われるＡＴＲ−Ｘ遺伝子の分析と同様に、本発明者らは、ＢＮＡＰがＸ染色体と連鎖した精神遅延のあるタイプに関係しているかもしれないと考える。
【０２０４】
本実施例によれば、新規なＢＮＡＰ遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ＢＮＡＰ蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前述したように多様で且つ細胞に基本的な活動に深く関与している脳ヌクレオソーム形成の研究や脳神経細胞の機能の研究及びこれらが関与する各種神経学上の疾患や精神遅延の診断などを行なうことができ、これらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
【０２０５】
【実施例７】
ヒト骨格筋特異的ユビキチン結合酵素遺伝子（ＵＢＥ２Ｇ遺伝子）
ユビキチン・システムは、細胞プロセスに必須の酵素グループのひとつであり、酵母からヒトにいたるまで保存されている。該システムは、ユビキチン活性酵素(ubiquitin-activating enzymes: UBAs)、ユビキチン結合酵素(ubiquitin-conjugating enzymes: UBCs)、ユビキチン蛋白リガーゼ(ubiquitin protein ligases: UBRs)及び２６Ｓプロテアソーム粒子から構成されている。
【０２０６】
ユビキチンは、上記ＵＢＡから数種のＵＢＣに移されて活性化される。ＵＢＣは、ＵＢＲの関与を受けるものと、もしくは受けないで、ユビキチンを目標蛋白にトランスファーする。これらユビキチン化された目標蛋白は、多くの細胞応答、例えば蛋白分解、蛋白修飾、蛋白輸送、ＤＮＡ修復、細胞サイクル制御、複製制御、ストレス応答などや免疫応答を引き起こすとされている（Jentsch, S., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1089, 127-139 (1991): Hershko, A. and Ciechanover, A., Annu. Rev. Biochem., 61, 761-807 (1992) : Jentsch, S., Annu. Rev. Genet., 26, 179-207 (1992): Ciechanover, A., Cell, 79, 13-21 (1994)）。
【０２０７】
ＵＢＣｓは、このシステムの重要な構成成分であり、異なる基質特異性を有し、異なった機能を調節すると思われる。例えば、サッカロミセス・セレビシェ(S. cerevisiae)のＵＢＣ７は、カドミウムによって誘導され、カドミウム中毒に対する抵抗性に関与していると思われる（Jungmann, J., et al., Nature, 361, 369-371 (1993)）。ＭＡＴ−α２の分解もまたＵＢＣ７とＵＢＣ６によって実行される（Chen, P., et al., Cell, 74, 357-369 (1993)）。
【０２０８】
本実施例で得られた新規な遺伝子は、酵母細胞周期遺伝子ＵＢＣ９とＨｕｓ５に対して高い相同性を持っていて、ヒト骨格筋において強く発現するヒトＵＢＣ７様遺伝子であり、以下にそのクローニング及びＤＮＡのシークェンシングについて述べる。
【０２０９】
（１）ヒト骨格筋特異的ユビキチン結合酵素遺伝子（ＵＢＥ２Ｇ遺伝子）のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、ＧＥＮ−４２３Ａ１２ｃＤＮＡクローンが様々な種のユビキチン結合酵素(ubiquitin-conjugating enzymes: UBCs)をコードする遺伝子と有意に高い相同性を有する持つことが分かった。
【０２１０】
該ＧＥＮ−４２３Ａ１２は、５’側が欠けていたので、全体のコード領域を得るために実施例２−（２）と同様の方法で５’レース法を行なった。
【０２１１】
５’レース法のために、表６に示す塩基配列のＰ１プライマー及びＰ２プライマーを用いた。
【０２１２】
【表６】
0003646191.tif 000007
５’レース産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）Ｔ−Ｖｅｃｔｅｒに挿入し、適当なサイズのインサートを持ついくつかのクローンを選択した。
【０２１３】
２つの独立したＰＣＲ反応から得られ、５’レース・クローンの４つのクローンが同じ配列を持っているが異なった長さであった。
【０２１４】
上記クローン配列決定によって、新しい遺伝子の翻訳配列と隣接する５’−と３’−フランキング配列を決定した。
【０２１５】
その結果、全配列が６１７塩基の新しい遺伝子が明らかとなり、この遺伝子をヒト骨格筋特異的ユビキチン結合酵素遺伝子（ＵＢＥ２Ｇ遺伝子）と命名した。
【０２１６】
また、この配列がキメラ・クローンである可能性を排除するために、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから増幅するために前記実施例６−（１）に準じて、センス・プライマーを用いＲＴ−ＰＣＲを実施した。その結果、単一のＰＣＲ産物が得られ、その配列がキメラでないことが確認された。
【０２１７】
ＵＢＥ２Ｇ遺伝子は、配列番号：２３で示される５１０塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされるアミノ酸は、配列番号：２２で示されるように１７０アミノ酸残基を有し、ＵＢＥ２Ｇの全ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：２４で示されるとおりである。
【０２１８】
配列番号：２４で示されるように推定された開始コドンは、ｃＤＮＡクローンの最初のＡＴＧトリプレットである塩基配列番号１９−２１番目に位置していた。このＡＴＧに先行したイン・フレーム停止コドンがなかったので、このクローンは、以下の理由から全体のオープン・リーディング・フレームを含んでいると演繹した。
【０２１９】
即ち、（ａ）サッカロミセス・セレビシェ（S. cerevisiae）ＵＢＣ７とアミノ酸配列の相同性が高く、酵母のＵＢＣ７の開始コドンと一致しておりこのＡＴＧを支持した。
【０２２０】
（ｂ）ＡＧＧＡＴＧＡの配列は、開始コドン周辺のコンセンサス配列（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ（Kozak, M., J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991)）に類似していた。
【０２２１】
（２）ＵＢＥ２ＧとＵＢＣｓとのアミノ酸配列との比較
ＵＢＥ２ＧとＵＢＣｓとのアミノ酸配列の比較から、ユビキチンに結合することができる活性部位システィンは、９０番目のシスティン残基であるように思えた。これらの遺伝子でコードされるペプチドは、同じファミリーに属しているようである。
【０２２２】
（３）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるＵＢＥ２ＧｍＲＮＡの発現を、ＵＢＥ２Ｇの全配列をＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識し、プローブとして用い、メンブレンは、ＭＴＮブロットを用いて実施した。
【０２２３】
ノーザンブロット分析の結果、試験した１６のヒト成人組織、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、甲状腺、膀胱、睾丸、卵巣、小腸、大腸及び末梢血白血球において、１８時間の露光の後、４．４キロ塩基対、２．４キロ塩基対、と１．６キロ塩基対の転写体が検出可能であった、そして骨格筋においてこれらの転写体の強い発現が観察された。
【０２２４】
（４）ラディエーション・ハイブリッド・マッピング（Radiation Hybrid Mapping）
ラディエーション・ハイブリッド・マッピングによって前記実施例６−（４）と同様の方法でＵＢＥ２Ｇのクローンの染色体マッピングを行なった。
【０２２５】
尚、染色体マッピング分析のためにＰＣＲ反応のために用いたＣ１プライマー及びＣ４プライマーは、配列番号：２４の配列の配列番号４１５−４３５番目及び配列番号５０９−５２８番目にそれぞれ相当しており、その塩基配列は下記表７に示す通りである。
【０２２６】
【表７】
0003646191.tif 000008
その結果、ＵＢＥ２Ｇ遺伝子はマーカーＤ１Ｓ４４６（ＬＯＤ＝１２．５２，ｃＲ８０００＝８．６０）とＤ１Ｓ２３５（ＬＯＤ＝９．１４，ｃＲ８０００＝２２．４６）に連鎖していた。これらのマーカーは、染色体バンドｌｑ４２．１３−ｑ４２．３に局在した。
【０２２７】
ＵＢＥ２Ｇは、骨格筋において強く発現し、試験した全ての組織において非常に弱く発現された。全ての他のＵＢＣｓは細胞サイクルの調節のような必須の細胞機能に関係しており、それらＵＢＣｓは組織のいたるところに発現している。しかしながら、ＵＢＥ２Ｇの発現パターンは、筋肉特異的な役割が提言されるかもしれない。
【０２２８】
３つの異なるサイズの転写体が検出されたが、それらのどれがｃＤＮＡクローンに相当するものであるかを確認することはできなかった。ＵＢＥ２Ｇ産物の主要な構造は、酵母のＵＢＣ７に対して強い相同性を示した。また、線虫類のＵＢＣ７は、一方では酵母ＵＢＣ７に対して強い相同性を示した。それは、レプレッサーの分解に関連しており、更に酵母におけるカドミウムに対する抵抗を与える。これらの蛋白間の類似性から、それらが同じファミリーに属していることが提言される。
【０２２９】
ＵＢＥ２Ｇは、筋特異的蛋白の分解に関与しており、該遺伝子の不全は、結果として筋ジストロフィーのような疾患になると考えられる。近年、別の蛋白質分解酵素、カルパイン３（Calpain3）が肢体筋ジストロフィー・タイプ２Ａの原因であると証明された（Richard, I., et al.,Cell, 81, 27-40 (1995)）。該遺伝子がＵＢＥ２Ｇの染色体の位置からいかなる遺伝性筋疾患とも現在のところ有意な関連はないが、今後のリンケージ解析から、該遺伝子との関係が見つかる可能性があると思われる。
【０２３０】
本実施例によれば、新規なＵＢＥ２Ｇ遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ＵＢＥ２Ｇ蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前述したように多様で且つ細胞に基本的な活動に深く関与している筋特異的蛋白分解の研究や骨格筋の機能の研究及びこれらが関与する各種筋疾患、例えば筋ジストロフィーの診断などを行なうことができ、これらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
【０２３１】
【実施例８】
ＴＭＰ−２遺伝子
（１）ＴＭＰ−２遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、膜蛋白遺伝子(transmembrane protein:アクセッションＮｏ．；Ｕ１９８７８)に相同性の高いｃＤＮＡ配列を有するクローン（ＧＥＮ−０９２Ｅ１０）を見出した。
【０２３２】
しかして従来、膜蛋白遺伝子は、カエル(Xenopus laevis)とヒトにおいてクローニングされており、之等はフォリスタチン・モデュル(follistatin module)とＥＧＦ領域(epidermal growth factor domain)を有する細胞膜貫通型のタンパク質の遺伝子であると考えられる（アクセッションＮｏ．；Ｕ１９８７８)。
【０２３３】
上記タンパク質遺伝子の配列情報から、ＧＥＮ−０９２Ｅ１０クローンは、５’領域を欠いていたので、λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー（Human Fetal Brain 5'-STRETCH PLUS cDNA; クローンテック社製）を、ＧＥＮ−０９２Ｅ１０クローンをプローブとしてスクリーニングすることにより、さらに５’上流を含むｃＤＮＡクローンを単離した。
【０２３４】
このｃＤＮＡクローンの両ストランドを配列決定することによって、全体のコード領域をカバーしている配列が明らかになり、この遺伝子をＴＭＰ−２遺伝子と命名した。
【０２３５】
ＴＭＰ−２遺伝子は、配列番号：２６で示される１１２２塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされるアミノ酸は、配列番号：２５で示されるように３７４アミノ酸残基を有し、ＴＭＰ−２の全ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：２７で示されるとおり、１７２１塩基からなっていた。
【０２３６】
配列番号：２７で示されるように５’非コード領域は、総体的にＧＣリッチであった。開始コドンの候補配列は、いくつか存在したが、スキャンニング・モデルに従えば、ｃＤＮＡクローンの５番目のＡＴＧ（塩基配列番号３６８−３７０番目）が開始コドンと推定された。停止コドンは、塩基配列番号１４９０−１４９２番目に位置していた。ポリ・アデニレーション・シグナル(ＡＡＴＡＡＡ)は、塩基配列番号１７０３−１７０８番目位置していた。ＴＭＰ−２遺伝子産物の計算された分子量は、４１，４００ダルトンであった。
【０２３７】
上記したように膜蛋白遺伝子は、フォリスタチン・モデュルとＥＧＦ領域を有しているが、本発明の新規なヒト遺伝子においても、これらのモチーフが保存されていた。
【０２３８】
また、本発明のＴＭＰ−２遺伝子は、ＴＧＦ−α（transforming growth factor-α; Derynck, R., et al., Cell, 38, 287-297 (1984)）、beta-cellulin（Igarashi, K. and Folkman, J., Science, 259, 1604-1607 (1993)）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（heparin-binding EGF-like growth factor; Higashiyama, S., et al., Science, 251, 936-939 (1991)）及びシュワノマ誘導成長因子（Schwannoma-derived growth factor; Kimura, H., et al., Nature, 348, 257-260 (1990)）と、ＥＧＦ領域を超えてアミノ酸レベルで相同性を有することなどから、細胞の増殖や細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たすと考えられる。
【０２３９】
（２）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるＴＭＰ−２ｍＲＮＡの発現を、クローンＧＥＮ−０９２Ｅ１０をＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識し、プローブとしてＭＴＮブロットを用いて実施した。
【０２４０】
ノーザン分析の結果、脳と前立腺において高い発現が検出された。該ＴＭＰ−２遺伝子のｍＲＮＡのサイズは、約２ｋｂであった。
【０２４１】
本発明によれば、新規なヒトＴＭＰ−２遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＴＭＰ−２蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前述したように細胞増殖や細胞間コミュニケーションに深く関与している脳腫瘍や前立腺癌の研究及びこれらの疾患の診断等を行なうことができ、これらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行なうことができる。
【０２４２】
【実施例９】
ヒトＮＰＩＫ遺伝子
（１）ヒトＮＰＩＫ遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
実施例１及び２と同様の方法で、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、フォスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)３及び４キナーゼに保存されているアミノ酸配列をコードする遺伝子（Kunz, J., et al., Cell, 73, 585-596 (1993)）に高い相同性を有する２つのｃＤＮＡクローンを得、これらをＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１及びＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ２と命名し、これらの全配列を、前記各実施例に準じて決定した。
【０２４３】
その結果、ＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１ｃＤＮＡクローンとＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ２クローンは、５’末端の１２のアミノ酸残基のみが異なるコード配列を有することが判明し、ＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１ｃＤＮＡクローンが１２アミノ酸残基長かった。
【０２４４】
ヒトＮＰＩＫ遺伝子のＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１ｃＤＮＡ配列は、配列番号：３２で示される２４８７塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされるアミノ酸は、配列番号：３１で示されるように８２９アミノ酸残基を有し、全長ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：３３で示されるとおり、３３２４塩基からなっていた。
【０２４５】
配列番号：３３で示されるように推定された開始コドンは、ｃＤＮＡクローンの２番目のＡＴＧトリプレットである塩基配列番号１１５−１１７番目に位置していた。また、停止コドンは塩基配列番号の２６０２−２６０４番目に位置していた。ポリ・アデニレーション・シグナル(ＡＡＴＡＡＡ)は塩基配列番号３３０５−３３１０番目位置していた。
【０２４６】
一方、ヒトＮＰＩＫ遺伝子のＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ２ｃＤＮＡ配列は、配列番号：２９で示される２４５１塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされるアミノ酸は、配列番号：２８で示されるように８１７アミノ酸残基を有し、全長ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：３０で示されるとおり、３６０２塩基からなっていた。
【０２４７】
配列番号：３０で示されるように推定された開始コドンは、ｃＤＮＡクローンの７番目のＡＴＧトリプレットである塩基配列番号４２９−４３１番目に位置していた。また、停止コドンは塩基配列番号の２８８０−２８８２番目に位置していた。ポリ・アデニレーション・シグナル(ＡＡＴＡＡＡ)は塩基配列番号３５８３−３５８８番目位置していた。
【０２４８】
（２）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるヒトＮＰＩＫｍＲＮＡの発現を、ヒトＮＰＩＫの全配列をＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識し、プローブとして用い、メンブレンは、ＭＴＮブロットを用いて実施した。
【０２４９】
ノーザン分析の結果、ヒトＮＰＩＫ遺伝子は、試験した１６のヒト成人組織の様々な臓器でその発現が認められ、約３．８ｋｂと約５ｋｂの転写体が検出可能であった。
【０２５０】
ＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ２ｃＤＮＡ配列の開始コドンを含む、下記表８に示す塩基配列のプライマーＡと終止コドンを含むプライマーＢとを用いてHuman Fetal Brain Marathon-Ready cDNA（クロンテック社製）をテンプレートとしてＰＣＲを行ない、該ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
【０２５１】
【表８】
0003646191.tif 000009
その結果、発現されたヒトＮＰＩＫｍＲＮＡには、ＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１ｃＤＮＡ配列の配列番号：３３の塩基配列番号１０６０−１１０４番目(アミノ酸残基の配列番号：３１のアミノ酸配列番号３１６−３３０番目)を欠くもの及び配列番号：３３の塩基配列番号１８９７−１９１１番目(アミノ酸残基の配列番号：３１のアミノ酸配列番号５９５−５９９番目)を欠くものがあることが判明した。
【０２５２】
更にこの遺伝子には、ＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１ｃＤＮＡ配列の配列番号：３３の塩基配列番号１９４１−１９６６番目の領域に、下記表９に示されるポリモルフィズムが存在し(428B12c1.fasta)、これによりＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１アミノ酸残基の配列番号：３１のアミノ酸配列番号６１０−６１８番目のＩＱＤＳＣＥＩＴＴがＹＫＩＬＶＩＳＡに変異した変異体タンパク質がコードされることが判明した。
【０２５３】
【表９】
0003646191.tif 000010
（３）ＦＩＳＨによるヒトＮＰＩＫ遺伝子の染色体のマッピング
実施例１−（３）に準じてＦＩＳＨによるヒトＮＰＩＫ遺伝子の染色体のマッピングを行なった。
【０２５４】
その結果、ヒトＮＰＩＫ遺伝子は、染色体の座位が１ｑ２１．１−ｑ２１．３の位置にあることが判明した。
【０２５５】
本発明の新規なヒト遺伝子であるヒトＮＰＩＫ遺伝子は、上記したように、５’領域の異なる２つのｃＤＮＡが存在し、それらは、それぞれ８２９と８１７のアミノ酸をコードしうる領域を含んでいた。また、この遺伝子のｍＲＮＡに２つの欠失しうる部位が存在すること並びにＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ１アミノ酸残基の配列番号：３１のアミノ酸配列番号６１０−６１８番目に相当する特定領域にポリモルフィズムが存在し、変異タンパク質がコードされることから、ヒトＮＰＩＫには、いくつかの組合わせから成るヒトＮＰＩＫ、ヒトＮＰＩＫ欠失体、ヒトＮＰＩＫ変異体及び／又はヒトＮＰＩＫ変異・欠失体の存在することが考えられる。
近年、上記ＰＩ３及び４キナーゼのファミリーに属する数種類のタンパク質に、タンパク質キナーゼ活性があることが示された（Dhand, R., et al., EMBO J., 13, 522-533 (1994): Stack, J. H. and Emr, S. D., J. Biol. Chem., 269, 31552-31562 (1994): Hartley, K. O., et al., Cell, 82, 849-856 (1995)）。
【０２５６】
また、このファミリーに属するタンパク質がＤＮＡの損傷の修復に関与していること（Hartley, K. o., et al., Cell, 82, 849-856 (1995)）、アタキシア（運動失調症）の原因遺伝子であることが明らかとなった（Savitsky, K., et al., Science, 268, 1749-1753 (1995)）。
【０２５７】
これらＰＩキナーゼのファミリーと高い相同性を有するヒトＮＰＩＫ遺伝子でコードされるタンパク質は、脂質あるいはタンパク質をリン酸化する新しい酵素であることが予想できる。
【０２５８】
本実施例によれば、新規ヒトＮＰＩＫ遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＮＰＩＫ蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前述したように脂質あるいはタンパク質のリン酸化酵素の研究、ＤＮＡの修復の研究及びこれらが関与する疾患、例えば癌の研究や診断等を行なうことができ、これらのの治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行なうことができる。
【０２５９】
（４）融合蛋白発現ベクターの構築
まず、ヒトＮＰＩＫ遺伝子（ＧＥＮ−４２８Ｂ１２ｃ２）のコード領域をサブクローニングするために、上記（１）で得られたＤＮＡ配列情報を基に、下記表１０に示す配列の２つのプライマー、Ｃ１プライマー及びＣ２プライマーを作製した。
【０２６０】
【表１０】
0003646191.tif 000011
尚、上記Ｃ１及びＣ２プライマーは、共にＢｇｌIIサイトを含んでおり、Ｃ２プライマーはアンチセンスプライマーであった。
【０２６１】
上記各プライマーを利用して、ヒト胎児脳ｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行ない、ｃＤＮＡを増幅させて、およそ２５００塩基長さの産物を得た。増幅させたｃＤＮＡをエタノール沈殿させた後、ｐＴ７BlueＴ−Vector（Novagen）社製に挿入し、サブクローニングした。この全配列を前記各実施例に準じて決定したところ、これは上記表９に示されるポリモルフィズムを有するものであった。
【０２６２】
該ｃＤＮＡをＢｇｌIIにより切断し、切断された産物をアガロースゲル電気泳動後、アガロースゲルより切り出し、GENECLEAN II KIT (BIO 101社)を用いて、ＤＮＡを回収した。回収されたｃＤＮＡをpBlueBacHis2Bベクター（Invitrogen社）のＢｇｌII部位に挿入し、サブクローニングした。
【０２６３】
得られた融合ベクターは、ＢｇｌII切断部位を有し、目的の遺伝子産物（およそ９１ｋｄ）とpBlueBacHis2Bベクター由来のポリヒスチジン領域及びAnti−ＸpressTM抗体（Invitrogen社）の認識エピトープを含む３８アミノ酸領域との融合蛋白を発現するベクターである。
【０２６４】
（５）昆虫細胞Ｓｆ−９へのトランスフェクション
本遺伝子の発現は、バキュロウイルス発現系を用いて行なった。バキュロウイルスは、環状２本鎖の昆虫病原性ウイルスであり、昆虫の細胞の中で多角体と呼ばれる封入体を大量に作ることができる。本発現系は、その特徴を生かして開発されたInvitrogen社のBac-N-BlueTM Transfection Kitを用いて以下の通り行なった。
【０２６５】
より詳しくは、ヒトＮＰＩＫをコードする領域を含むｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｂ４μｇとＢａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅTMＤＮＡ（Invitrogen社）１μｇをInsectinTMLiposome(Invitrogen社)の存在下で、Ｓｆ−９細胞にコトランスフェクト（co-transfect）した。
【０２６６】
Ｂａｃ−Ｎ−ｂｌｕｅTMＤＮＡには、ＬａｃＺ遺伝子が、ＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ｂと相同組換えを起こしたときにのみ発現するように組み込んであり、寒天下で培養すれば、青のプラークを選択することによって目的遺伝子を発現するウイルスを簡単に選択できるようにデザインされている。
【０２６７】
青のプラークを寒天ごと切り出し、培地４００μｌに懸濁させてウイルスを培地に拡散させた。遠心してウイルスを含む上清を得た後、Ｓｆ−９細胞に再度感染させ、力価を上昇させ、また多量のウイルス感染液を得た。
【０２６８】
（６）ヒトＮＰＩＫの調製
目的のヒトＮＰＩＫが発現しているか否かは、ウイルスを感染させてから３日後の細胞を用いて以下の通り確認した。即ち、細胞を回収してＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と共に５分間煮沸してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、Anti−Xpress抗体を用いたウエスタンブロッティング法によって、推定分子量位置に目的蛋白質を確認した。尚、ウイルス非感染の細胞を対照とした同試験では目的とするＮＰＩＫのバンドは認められなかった。
【０２６９】
より詳しくは、Ｓｆ−９細胞の７０乃至８０％集合した（semi-confluent）１７５ｃｍ2フラスコ１５枚を用いて、大規模にウイルスを感染させて、目的蛋白質を発現させた。ウイルス感染３日後の細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後、細胞を緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭＤＴＴ）に懸濁させ、４℃下、３０秒間隔で３０秒ずつ４回超音波処理して破壊溶解させ、得られる細胞破砕物を遠心分離後、上清を回収し、上清中の蛋白質をAnti−Xpress抗体を用いて免疫沈降させ、プロティンＡセファロースビーズのスラリーとして得た。該スラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と共に５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＮＰＩＫの回収の確認と定量を行なった。尚、上記スラリーはそのままアッセイ系に供した。
【０２７０】
（７）ＰＩ４キナーゼ活性の確認
ＮＰＩＫの予想される活性は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のイノシトール環の４位にリン酸を付加する活性、即ちＰＩ４キナーゼ活性である。
【０２７１】
アッセイは、竹縄らの方法〔Yamakawa,A. and Takenawa,T., J.Biol.Chem., 263, 17555-17560 (1988)〕を用いて以下の通り検討した。即ち、ＮＰＩＫスラリー１０μｌ（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ及び５０％プロテインＡビーズ）、ＰＩ溶液（ＰＩ含有市販クロロホルム溶液５ｍｇをガラス容器に入れ、窒素気流下で乾固させ、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌに溶解させた後、超音波でミセル化したもの）１０μｌ、反応用緩衝液（２１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＧＴＡ及び１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2）１０μｌ及び蒸留水１０μｌを入れ、最後にＡＴＰ溶液（５００μＭ  ＡＴＰ５μｌ、蒸留水４．９μｌ及びγ−32ＰＡＴＰ（６０００Ｃｉ／mmol、ＮＥＮ社）０．１μｌ）１０μｌを入れて、３０℃にて反応を開始させた。反応は、２、５、１０及び２０分間行ない、後記アッセイにて、リン酸のＰＩへの取り込みが直線的に増加する領域にある１０分をアッセイのインキュベーションタイムと設定した。
【０２７２】
反応終了後、ＰＩを溶媒抽出法にて分画し、最終的にクロロホルムに再懸濁させ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて展開し、反応生成物ＰＩ４Ｐの位置の放射活性をBio-Image analyzer（Fuji film社）を用いて定量化した。
【０２７３】
結果を図１に示す。図１は、上記ＴＬＣからの放射活性の定量結果を解析した図であり、右のレーン（２）はＮＰＩＫを含むウイルスを感染させたＳｆ−９細胞の細胞質画分を、左のレーン（１）は感染していない同細胞質画分を示し、矢印のスポットがＰＩ４Ｐを示す。
【０２７４】
また、上記において、反応系にトリトン−Ｘ１００又はアデノシンの所定量を添加してＮＰＩＫのＰＩ４キナーゼ活性に及ぼす之等の影響を同様にして調べた。得られた結果は図２に示す通りであり、ＮＰＩＫは、トリトン−Ｘ１００によって活性化され、該トリトン−Ｘ１００によって活性化された活性がアデノシンによって阻害される、典型的なＰＩ４キナーゼ活性を有することが判った。
【０２７５】
尚、図２において、（１）は無添加を、（２）はトリトン−Ｘ１００の０．４％添加を、（３）はトリトン−Ｘ１００の０．４％＋アデノシンの２５μＭ添加を、（４）はトリトン−Ｘ１００の０．４％＋アデノシンの５０μＭ添加を、（５）はトリトン−Ｘ１００の０．４％＋アデノシンの１００μＭ添加を、（６）はトリトン−Ｘ１００の０．４％＋アデノシンの２００μＭ添加を、それぞれ示す。
【０２７６】
【実施例１０】
ｎｅｌ関連蛋白タイプ１(ＮＲＰ１）遺伝子及びｎｅｌ関連蛋白タイプ２(ＮＲＰ２）遺伝子
（１）ＮＲＰ１遺伝子及びＮＲＰ２遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
ＥＧＦ様反復配列は、多くの膜蛋白質において確認されており、成長調節と分化に関連する蛋白中において確認されている。このモチーフは蛋白間相互作用に関係しているように思われている。
【０２７７】
近年５つのＥＧＦ様反復配列を含んでいる新規なペプチド、ｎｅｌをコードする遺伝子がニワトリ胚のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Matsuhashi, S., et al., Dev. Dynamics., 203, 212-222(1995)）。この産物は、細胞外ドメインにそのＥＧＦ様反復配列を持っている膜分子であると考えられている。ｎｅｌｍＲＮＡの４．５ｋｂの転写体が胚期において様々な組織において発現され、生後は、脳と網膜にもっぱら発現されている。
【０２７８】
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、上記ｎｅｌと有意に相同性の高い２つのｃＤＮＡクローンを見出し、それぞれＧＥＮ−０７３Ｅ０７とＧＥＮ−０９３Ｅ０５と名付けた。
【０２７９】
両クローンとも５’領域を欠いていたので、全体のコード領域を得るために実施例２−（２）と同様の方法で５’レース法を行なった。
【０２８０】
５’レース法のためのプライマーを、上記クローンのｃＤＮＡ配列から得た任意の配列を有するプライマーを合成し、アンカープライマーは市販のキットに付属のものをプライマーとして用いた。
【０２８１】
ＰＣＲ反応から得られた５’レース・クローンのいくつかを配列決定し、全体のコード領域をカバーしていると思われる配列を明らかにし、この遺伝子をそれぞれｎｅｌ関連蛋白１(nel-related protein type 1：ＮＲＰ１）遺伝子とｎｅｌ関連蛋白２(nel-related protein type 2：ＮＲＰ２）遺伝子とそれぞれ命名した。
【０２８２】
ＮＲＰ１遺伝子は、配列番号：３５で示される２４３０塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされる推定アミノ酸は、配列番号：３４で示されるように８１０アミノ酸残基を有しており、該ＮＲＰ１遺伝子の全ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：３６で示されるとおり２９７７塩基からなっている。
【０２８３】
一方、ＮＲＰ２遺伝子は、配列番号：３８で示される２４４８塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされる推定アミノ酸は、配列番号：３７で示されるように８１６アミノ酸残基を有しており、該ＮＲＰ２遺伝子の全ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：３９で示されるとおり３１９８塩基からなっている。
【０２８４】
更にＲＴ−ＰＣＲによってコード領域を増幅し、得られた配列がｃＤＮＡのキメラであるという可能性を排除した。
【０２８５】
推定されたＮＲＰ１とＮＲＰ２遺伝子産物の両者は、膜挿入のためのシグナル・ペプチドとして機能することができる高い疎水性のＮ末端を有していた。ニワトリ胚のｎｅｌと比較すると、どちらも疎水性の膜貫通ドメインを保有していないように見えた。ＮＲＰ１、ＮＲＰ２及びｎｅｌ間の推定ペプチド配列を比較したところ、アミノ酸レベルでＮＲＰ２は８０％の相同性を有しており、ＮＲＰ１のそれの５０％よりｎｅｌにより近い関連があった。システィン−リッチ・ドメインとＥＧＦ様反復配列内のシスティン残基は、完全に保存されていた。
【０２８６】
ＮＲＰｓとニワトリ蛋白の最も目立つ差異は、ヒト相同物がｎｅｌの推定膜ドメインを欠いていることであったが、この欠けている領域においてもＮＲＰｓとｎｅｌの核酸配列は、大変類似していた。更に２つのＮＲＰは、６つのＥＧＦ様反復配列を保有していたが、一方、ｎｅｌは５つのみであった。
【０２８７】
マツハシらによって報告されたｎｅｌの他のユニークなモチーフ（Matsuhashi, S., et al., Dev. Dynamics., 203, 212-222(1995)）は、同じ位置でＮＲＰｓにおいても見つけられた。上記したように２つのＮＲＰの推定されたペプチドは、膜貫通タンパクではないことを示しており、ＮＲＰｓは分泌された蛋白或は翻訳後修飾によって膜に対して固定された蛋白であるかもしれない。
【０２８８】
本発明者らはＮＲＰｓがＥＧＦレセプターのような他の分子を刺激することによってリガンドとして機能するかもしれないと考えている。また本発明者らは、ｎｅｌの膜ドメイン領域をフレーム−シフトすることによってｎｅｌに余分のＥＧＦ様反復配列がコードされることを見つけ出した。
【０２８９】
ＮＲＰ２とｎｅｌを整列比較した時、このフレーム−シフトされた３アミノ酸配列は、ＮＲＰ２とｎｅｌ間の全領域で類似性を示した。このことは、ＮＲＰ２がｎｅｌのヒトの対応物であるかもしれないことを提言している。対照的に、ＮＲＰ１はヒトのｎｅｌ対応遺伝子ではなく類似性遺伝子であると考えられる。
【０２９０】
（２）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるＮＲＰｓｍＲＮＡの発現を、両クローンしたｃＤＮＡｓの全体の配列をＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識し、２つのプローブとしてＭＴＮブロットに用いて実施した。
【０２９１】
１６の成人組織と４つのヒト胎児組織において２つのＮＲＰｓの発現パターンを評価した。
【０２９２】
ノーザン分析の結果、ＮＲＰ１の３．５ｋｂの転写体が、胎児と成人の脳と腎臓において弱く発現されていることが分かった。ＮＲＰ２の３．６ｋｂの転写体が、成人と胎児の脳においてのみ強く発現されたが、胎児の腎臓においてもわずかであるが発現されていた。
【０２９３】
このことからＮＲＰｓが成長調節のためのシグナル分子のような脳特異的役割を演ずることが提言される。加えて、これらの遺伝子は、腎臓において特別な機能を持っているかもしれない。
【０２９４】
（３）ＦＩＳＨによるＮＲＰ１遺伝子及びＮＲＰ２遺伝子の染色体のマッピング
実施例１−（３）に準じてＦＩＳＨによるＮＲＰ１遺伝子及びＮＲＰ２遺伝子の染色体のマッピングを行なった。
【０２９５】
その結果、ＮＲＰ１遺伝子は、染色体の座位が１１ｐ１５．１−ｐ１５．２に、ＮＲＰ２遺伝子は、染色体の座位が１２ｑ１３．１１−ｑ１３．１２の位置にそれぞれあることが判明した。
【０２９６】
本発明によれば、新規なヒトＮＲＰ１遺伝子及びＮＲＰ２遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＮＲＰ１及びＮＲＰ２蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、脳の神経伝達経路関する研究に利用でき、更に脳の神経伝達経路に関連する各種疾患の診断等を行なうことができ、これらのの治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行なうことができる。また、ＥＧＦドメインを持つこれらＮＲＰｓは脳内に成長因子的に働いている可能性が示唆され、各種脳内腫瘍の診断や治療、更に退行性神経疾患における神経の再生に奏効すると考えられる。
【０２９７】
【実施例１１】
ＧＳＰＴ１関連蛋白(ＧＳＰＴ１−ＴＫ）遺伝子
（１）ＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子のクローニング及びＤＮＡシークエンシング
ヒトＧＳＰＴ１遺伝子は、細胞サイクルのＧ１期からＳ期転位に重要なＧＴＰ結合蛋白をコードする酵母のＧＳＴ１遺伝子のヒト相同遺伝子のひとつである。サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)の温度感受性ｇｓｔ１（Ｇ１−ｔｏ−Ｓ転位）変異体を補って完全にすることができる蛋白として、最初に特定された酵母のＧＳＴ１遺伝子は、酵母の染色体ライブラリーから単離された（Kikuchi,Y., Shimatake, H. and Kikuchi, A., EMBO J. 7, 1175-1182 (1988)）、該遺伝子は、ｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼの標的部位とＧＴＰａｓｅドメインを持つ蛋白をコードしていた。
【０２９８】
ヒトＧＳＰＴ１遺伝子は、酵母ＧＳＴ１遺伝子をプローブとして用いるハイブリダイゼーションによってＫＢ細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離された（Hoshino, S., Miyazawa, H., Enomoto, T., Hanaoka, F., Kikucho, Y., Kikuchi, a. and Ui, m., EMBO J. 8, 3807-3814 (1989)）。該ＧＳＰＴ１遺伝子の推定蛋白もまた酵母ＧＳＴ１のそれと同様に、ＧＴＰ結合領域とＧＴＰａｓｅ活性センター部位を有しており、細胞の増殖に重要な役割を演じている。
【０２９９】
更に、染色体の再配列に対する中断点は急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）を持つ患者のＧＳＰＴ１遺伝子が染色体座位１６ｐ１３．３に観察されている(Ozawa, K., Murakami, Y., Eki, T., Yokoyama, K., Soeda, E., Hoshino, S., Ui, M. and Hanaoka, F., Somatic Cell and Molecular Genet., Vol.18, 189-194 (1992)）。
【０３００】
実施例１−（１）と同様の方法でヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから任意に選択したｃＤＮＡクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、上記ＧＳＰＴ１に相同性の高い０．３ｋｂのｃＤＮＡ配列を有するクローンを見出し、ＧＥＮ−０７７Ａ０９と名付けた。ＧＥＮ−０７７Ａ０９クローンは、５’領域を欠いていると思われたので、全体のコード領域を得るために実施例２−（２）と同様の方法で５’ＲＡＣＥ法を行なった。
【０３０１】
５’ＲＡＣＥR法のために、上記ｃＤＮＡクローンの分かっているｃＤＮＡ配列から得た表１１に示す塩基配列のＰ１プライマー及びＰ２プライマーを用い、また、アンカープライマーとしては市販のキットに付属のものをプライマーとして用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃で４５秒、５８℃で４５秒、７２℃で２分を３５サイクル行ない、、最後に７２℃で７分間延長反応させた。
【０３０２】
【表１１】
0003646191.tif 000012
ＰＣＲ反応から得られた５’ＲＡＣＥ・クローンのいくつかを配列決定し、この５’ＲＡＣＥ・クローンとＧＥＮ−０７７Ａ０９クローンの２つの重複しているｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定することによって、全体のコード領域をカバーしていると考えられる配列を明らかにし、これをＧＳＰＴ１関連蛋白「ＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子」と命名した。
【０３０３】
ＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子は、配列番号：４１で示される１４９７塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいて、これによってコードされる推定アミノ酸は、配列番号：４０で示されるとおり４９９アミノ酸残基を有していた。
【０３０４】
ＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子の全ｃＤＮＡクローンの核酸配列は、配列番号：４２で示されるとおり２０５７塩基からなり、計算された分子量は５５，７４０ダルトンであった。
【０３０５】
オープン・リーディング・フレームの最初のメチオニン（ＡＴＧ）は、イン−フレームに停止コドンが存在していなかったが、このＡＴＧは転写の開始に対するコザックの一致配列に類似する配列によって囲まれていたので、この配列番号１４４−１４６番目に位置するＡＴＧトリプレットを開始コドンと結論づけた。
【０３０６】
また、１つのポリアデニールシグナルＡＡＴＡＡＡがポリアデニレーション部位から１３塩基上流に認められた。
【０３０７】
ヒトＧＳＰＴ１−ＴＫは、Ｎ末端近くにグルタミン酸リッチ領域を含んでおり、ＧＳＰＴ１−ＴＫのこの領域に存在する２０のグルタミン酸のうち１８が、保存されていて、ヒトＧＳＰＴ１蛋白のそれと完全に整列している。ＧＳＰＴ１−ＴＫ蛋白は、ヒトＧＳＰＴ１蛋白のそれらの領域と同様にグアニン核酸結合と水解を担うＧＴＰ結合蛋白のいくつかの領域(Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＧ５)が保存されていた。
【０３０８】
よって、ヒトＧＳＰＴ１−ＴＫは、細胞サイクルのＧ１期からＳ期転位に重要な役割を演じると考えられるヒトＧＳＰＴ１とＤＮＡ配列において８９．４％、推定されたアミノ酸配列において９２．４％の同一性を明らかにした。また、酵母のＧＳＴ１とはアミノ酸配列において５０．８％の同一性を示した。
【０３０９】
（２）ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例１−（２）に準じて、正常ヒト組織におけるＧＳＰＴ１−ＴＫｍＲＮＡの発現を、ＧＥＮ−０７７Ａ０９ｃＤＮＡクローンをＰＣＲにより増幅し、該ＰＣＲ産物を精製し、［32Ｐ］−ｄＣＴＰ（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社）により標識し、プローブとしてＭＴＮブロットに用いて実施した。
【０３１０】
ノーザン分析の結果、様々の組織において２．７ｋｂの主要な転写体が検出された。ヒトＧＳＰＴ１−ＴＫ発現レベルは、脳と睾丸において最も発現が高いように思われた。
【０３１１】
（３）ＦＩＳＨによるＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子の染色体のマッピング
実施例１−（３）に準じてＦＩＳＨによるＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子の染色体のマッピングを行なった。
【０３１２】
その結果、ＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子は、染色体の座位が１９ｐ１３．３の位置にあることが判明した。この染色体局在部位には急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia: ＡＬＬ）と急性ミエロイド白血病（acute myeloid leukemia: ＡＭＬ）からの相互の座位が高くしばしば観察されている。加えて、急性非リンパ性白血病（acute nonlymphocytic leukemia: ＡＮＬＬ）がヒトＧＳＰＴ１の領域を含んでいる再配列と関連されることが報告されている（Ozawa, K., Murakami, Y., Eki, T., Yokoyama, K., Soeda, E., Hoshino, S., Ui, M. and Hanaoka, F., Somatic Cell and Molecular Genet., Vol.18, 189-194 (1992)）。
【０３１３】
これらのことからＡＬＬとＡＭＬがこの遺伝子と関連している最も候補遺伝子であることが考えられる。
【０３１４】
本発明によれば、新規なヒトＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各種組織での発現の検出や、ヒトＧＳＰＴ１−ＴＫ蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらは、前述したように細胞増殖に関する研究に用いることが出来、この遺伝子の染色体の座位に関連する各種疾患、例えば急性骨髄性白血病等の診断等を行なうことも可能となる。即ち、これは、この遺伝子の転座により、ＧＳＰＴ１−ＴＫ遺伝子が破壊され、更にこの転座により発現される融合タンパクが之等の疾患の原因となっていると考えられるためである。
【０３１５】
更に、上記融合タンパクに対する抗体を作成し、細胞内局在を明らかにして、之等疾患に特異的な発現を調べることにより、その診断や治療も可能となると予想される。従って本発明遺伝子の利用によれば、これらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行なうことができると考えられる。
【０３１６】
【配列表】
【０３１７】
0003646191.tif 000013
【０３１８】
0003646191.tif 000014
【０３１９】
0003646191.tif 000015
0003646191.tif 000016
【０３２０】
0003646191.tif 000017
0003646191.tif 000018
【０３２１】
0003646191.tif 000019
【０３２２】
0003646191.tif 000020
0003646191.tif 000021
0003646191.tif 000022
【０３２３】
0003646191.tif 000023
【０３２４】
0003646191.tif 000024
【０３２５】
0003646191.tif 000025
0003646191.tif 000026
0003646191.tif 000027
【０３２６】
0003646191.tif 000028
0003646191.tif 000029
0003646191.tif 000030
0003646191.tif 000031
【０３２７】
0003646191.tif 000032
0003646191.tif 000033
【０３２８】
0003646191.tif 000034
0003646191.tif 000035
0003646191.tif 000036
0003646191.tif 000037
0003646191.tif 000038
0003646191.tif 000039
0003646191.tif 000040
【０３２９】
0003646191.tif 000041
0003646191.tif 000042
【０３３０】
0003646191.tif 000043
【０３３１】
0003646191.tif 000044
0003646191.tif 000045
0003646191.tif 000046
0003646191.tif 000047
【０３３２】
0003646191.tif 000048
0003646191.tif 000049
【０３３３】
0003646191.tif 000050
【０３３４】
0003646191.tif 000051
0003646191.tif 000052
0003646191.tif 000053
【０３３５】
0003646191.tif 000054
0003646191.tif 000055
0003646191.tif 000056
【０３３６】
0003646191.tif 000057
0003646191.tif 000058
【０３３７】
0003646191.tif 000059
0003646191.tif 000060
0003646191.tif 000061
0003646191.tif 000062
0003646191.tif 000063
【０３３８】
0003646191.tif 000064
【０３３９】
0003646191.tif 000065
【０３４０】
0003646191.tif 000066
0003646191.tif 000067
【０３４１】
0003646191.tif 000068
0003646191.tif 000069
【０３４２】
0003646191.tif 000070
【０３４３】
0003646191.tif 000071
0003646191.tif 000072
0003646191.tif 000073
0003646191.tif 000074
【０３４４】
0003646191.tif 000075
0003646191.tif 000076
0003646191.tif 000077
0003646191.tif 000078
【０３４５】
0003646191.tif 000079
0003646191.tif 000080
【０３４６】
0003646191.tif 000081
0003646191.tif 000082
0003646191.tif 000083
0003646191.tif 000084
0003646191.tif 000085
0003646191.tif 000086
0003646191.tif 000087
【０３４７】
0003646191.tif 000088
0003646191.tif 000089
0003646191.tif 000090
0003646191.tif 000091
【０３４８】
0003646191.tif 000092
0003646191.tif 000093
【０３４９】
0003646191.tif 000094
0003646191.tif 000095
0003646191.tif 000096
0003646191.tif 000097
0003646191.tif 000098
0003646191.tif 000099
0003646191.tif 000100
【０３５０】
0003646191.tif 000101
0003646191.tif 000102
0003646191.tif 000103
0003646191.tif 000104
【０３５１】
0003646191.tif 000105
0003646191.tif 000106
【０３５２】
0003646191.tif 000107
0003646191.tif 000108
0003646191.tif 000109
0003646191.tif 000110
0003646191.tif 000111
0003646191.tif 000112
0003646191.tif 000113
【０３５３】
0003646191.tif 000114
0003646191.tif 000115
0003646191.tif 000116
0003646191.tif 000117
【０３５４】
0003646191.tif 000118
0003646191.tif 000119
【０３５５】
0003646191.tif 000120
0003646191.tif 000121
0003646191.tif 000122
0003646191.tif 000123
0003646191.tif 000124
0003646191.tif 000125
0003646191.tif 000126
【０３５６】
0003646191.tif 000127
0003646191.tif 000128
0003646191.tif 000129
【０３５７】
0003646191.tif 000130
0003646191.tif 000131
【０３５８】
0003646191.tif 000132
0003646191.tif 000133
0003646191.tif 000134
0003646191.tif 000135
0003646191.tif 000136
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例９の（６）に従う蛋白発現試験における放射活性の定量結果を解析した図面に代わる写真である。
【図２】実施例９の（６）に従う蛋白発現試験において、トリトン−Ｘ１００、アデノシンの添加が、発現蛋白の活性に及ぼす影響を調べたグラフである。
【図１】
0003646191.tif 000137
【図２】
0003646191.tif 000138