(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号４および配列番号５からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
請求項２記載のペプチドを含有することを特徴とする、少なくとも１種のデング熱ウイルス血清型のための診断試薬。
【請求項５】
請求項３記載のペプチドを含有することを特徴とする、デング熱ウイルス血清型２に対するワクチン。
【請求項６】
請求項２に記載のペプチドを抗原として使用することを特徴とする、デング熱ウイルスに対する抗体の製造方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法によって製造された、デング熱ウイルス血清型1,2,3または４に対する抗体。
【請求項８】
配列番号６、７、８および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
【請求項９】
アミノ酸配列が配列番号８または９である、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項８または９記載の少なくとも１つの融合タンパク質を含有することを特徴とする診断試薬。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は生物工学分野のものであり、組換えDNA技術、特に、デング熱ウイルスの血清型２のプレM/Mタンパク質をコードする合成ペプチドの産生、およびデング熱ウイルス血清型２および４のプレM/Mタンパク質エピトープを含むキメラタンパク質に関する。
技術上の目的は、デング熱ウイルスの血清型すべてに対して交差反応性を有するプレM/M中和および防御エピトープを同定し、ヒト予防接種用免疫原を入手することにある。
発明の背景
デング熱ウイルスはフラビウイルス科のフラビウイルス属に属する（ウエスタウエイ（Westaway,E.G.）ら、1985、Flaviviridae.Intervirol.24、183ページ）。このものは遺伝物質として陽極性の単鎖RNA鎖を有するエンベロープウイルスであり、該RNA鎖は細胞性およびウイルス性プロテアーゼにより共同−および後−形質導入加工処理されたポリタンパク質をコードする。
ウイルス膜には２つの構造タンパク質、Ｅ（エンベロープ）およびＭ（膜）があるが、一方で、異性体ヌクレオカプシドを形成する他の構造タンパク質Ｃ（カプシド）のいくつかのコピーがある。他にも、少なくとも７種の非構造タンパク質が同定されている（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）。
糖タンパク質ＥおよびNS1は、それぞれがデング熱ウイルスの相同血清型に対し能動的および受動的防御作用を提供することができるが、一方で、関連するエピトープの高度な高次構造の複雑さを保持している。このような理由で、組換え真核細胞系がこれらタンパク質の免疫学的評価のために主に選択されている。例えば、ワクチンウイルス（ブレイ（Bray,M.）ら、1989。非構造タンパク質NS1を有するもしくは有しないデング熱−４構造タンパク質を発現する組換えワクチニアウイルスにより免疫したマウスは致死的デング熱ウイルス脳炎に対し防御的である。J.Virol.63、2853ページ）およびバキュロウイルス（ツアン（Zhang,Y.M.）ら、1988。デング熱構造タンパク質および組換えバキュロウイルスにより発現された非構造タンパク質NS1でマウスを免疫すると、デング熱ウイルス脳炎に対する抵抗性を誘発する。J.Virol.62、3027ページ）である。
小タンパク質Ｍ（8kDa）はプレ−Ｍ（約22kDa）と呼ばれる糖化前駆体同様に合成されるが、このものは感染細胞がウイルスを放出する直前または直後に後期エンドタンパク質分解切断を受ける（マーレイ（Murray,J.M.）ら、1993。デング熱ウイルス２型タンパク質prMおよびＣ−prMの加工処理。J.Gen.Virol.74、175ページ）。恐らく細胞性プロテアーゼによりなされるこの切断はゴルジ後酸性小胞にて起こり、この小胞の低pH値を不安定とする試薬により阻害されると思われる（ランドルフ（Randolph,V.B.）ら、1990。好酸性アミンはフラビウイルスprMタンパク質のタンパク質分解過程を阻害する。Virol.17、450ページ）。プレ−断片は細胞外媒体においてのみin vitroで同定されているが、そのin vivoでの命運は未知である（マーレイ（Murray,J.M.）ら、1993。デング熱ウイルス２型タンパク質prMおよびＣ−prMの加工処理。J.Gen.Virol.74、175ページ）。
フラビウイルスのエキソサイトーシスに際してのプレM/Mの機能は、酸性pH環境によるＥの融合誘導膜の活性化を回避することである（ランドルフ（Randolph,V.B.）ら、1990。好酸性アミンはフラビウイルスprMタンパク質のタンパク質分解過程を阻害する。Virol.17、450ページ）。もしこの事象が起きるならば、そのときはウイルスの放出が防止される。事実、プレ−ＭおよびＥは未熟な細胞内ビリオン内で相互作用していることが決定されており（ウエングラーおよびウエングラー（Wengler,G.y Wengler,G.）、1989。細胞介在ウエストナイル・フラビウイルスは、ウイルスが放出された際にタンパク質分解切断により破壊され、認識されるＥ＋プレ−Ｍタンパク質ヘテロ二量体により被覆されている。J.Viol.63、2521ページ）、また、Ｅの未変性コンホメーションはプレ−Ｍの存在下においてのみ獲得されることが決定されている（小西およびマソン（Konishi,E.y Mason,P.W.）1993。日本脳炎ウイルス・エンベロープ糖タンパク質の適切な成熟には前膜タンパク質との共同合成を必要とする。J.Virol.67、1672ページ）。更に、すでに放出されたビリオンは、その膜中にプレ−Ｍを有するのみであるが、それは一般に完全に成熟したビリオンよりも低い感染性を示し（ウエングラーおよびウエングラー（Wengler,G.y Wengler,G.）、1989。細胞介在ウエストナイル・フラビウイルスは、ウイルスが放出された際にタンパク質分解切断により破壊され、認識されるＥ＋プレ−Ｍタンパク質ヘテロ二量体により被覆されている。J.Virol.63、2521ページ）、そこではＭとプレ−Ｍが存在するが、前者が優位である。
プレ−ＭおよびＭはそれらが組替えワクチニアウイルスにおいて実現された場合、能動的な防御を提供するが、この防御はプレ−断片では起きないが（ブレイおよびレイ（Bray,M.y Lai,C.−J.）1991。デング熱ウイルス前膜および膜タンパク質は防御的免疫応答を引き出す。Virol.185、505ページ）、プレ−ＭまたはＭを同じ組換えワクチニアウイルスの糖タンパク質Ｅと組合わせると、一般に、各個々のタンパク質が到達する防御レベルよりも高いレベルとなる。同様に、プレM/Mに対する特定の抗体は、マウスで能動的に防御することができる（カウフマン（Kaufman,B.M.）ら、1989。デング熱ウイルスprM糖タンパク質用のモノクローナル抗体は致死的デング熱感染からマウスを防御する。Am.J.Trop.Med.＆ Hyd.41、576ページ）。
合成ペプチドの使用は、関与する抗原の空間的コンホメーションおよび免疫学的性質に従って、抗原性の分子的基礎を確立することを可能としている［アーノンおよびセラ（Arnon,R.y Sela,M.）1985。合成ワクチン：現状と未来。Ann.Inst.Pasterur/Immunol.136D、271〜282］。抗デング熱ワクチン・サブユニットとしての合成ペプチドは、最終の形態において、免疫増幅を引起こさない防御エピトープのみ包含することを可能とし（ハルシュテッドおよびオー‘ルアーク（Halstead,S.B.y O'Ruourke,E.J.）1977。デング熱ウイルスおよび単核食細胞、Ｉ。非中和性抗体による感染増強。J.Exp.Med.146、201ページ；ハルシュテッド（Halstead,S.B.）1979。受動的に移入した抗体によるアカゲザルのデング熱ウイルス感染症のin vivo増強。J.Infect.Dis.140、527ページ）、またあるいは、４つの血清型のそれぞれの防御的ペプチドを包含することを可能とする。ＥおよびNS1の抗原性決定子の特性化は成功裏に実施されている。しかし、この重要なタンパク質プレM/Mに関する同様な研究はなく、それが何故本報告の結果がその方向性の第一段階であるかの理由である。
フラビウイルス・タンパク質プレＭ、ＭおよびＥを大腸菌で発現する努力が常に成功するとは限らない（チャンバー（Chambers,T.J.）ら、1990。感染細胞での黄熱病ウイルスの生産：領域特異ポリクローナル抗血清を用いる個別ポリタンパク質の同定と切断速度の分析。Virol.177、159ページ；ヤン（Yan,B.−S.）ら、1994。推定膜関連領域の末端切除が、大腸菌でのＣ型肝炎ウイルスタンパク質E1発現の難しさを回避する。J.Virol.Meths.49、343ページ）。明らかに、これらのタンパク質がＣ−末端領域にもつ疎水性領域が、低いまたは検出不能の非相同発現レベルの原因である（ヤン（Yan,B.−S.）ら、1994。推定膜関連領域の末端切除が、大腸菌でのＣ型肝炎ウイルスタンパク質E1発現の難しさを回避する。J.Virol.Meths.49、343ページ）。
E.coliにおける上記蛋白質の発現は（NS1と同様）、一般的に、他の細菌タンパク質、例えば、β−ガラクトシダーゼ（Cane,P.A.およびGould,E.A.1988  yellow  fever  mouse  neurovirulence  by  immunization  with  ａ  bacterially  synthesized  non−structural  protein（NS1）fragment.J.Gen.Virol.69 p1241）、TRPE（Megret,F.et al.1992.Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the Dengue envelope glycoprotein.Virol.187 p.480.）、および黄色ブドウ球菌のタンパク質Ａ（Murray,J.M.et al.1993 processing of the dengue virus type 2 proteins prM and C−prM.J.Gen.Virol.74 p.175.）に融合すること（フラグメントまたは非フラグメント）で得られる。これらの融合タンパク質において、適切な立体配座エピトープは存在せず、なぜならそれらに対して生じた抗血清が全てのウイルスを認識できるとしても、それを中和させたり、血球凝集を抑制することはできないためである（Megret,F.et al.1992.Use of recombinant fusion proteins and monoclonal antibodies to define linear and discontinuous antigenic sites on the Dengue envelope glycoprotein.Virol.187 p.480）。しかしながら、最近の報告では、融合タンパク質の溶解度と、結果としてその精製のために非変性方法を使用することで、変性（Seif,S.A.et al.1995.Finer mapping of neutralizing epitope（ｓ）on the C−terminal of Japanese encephalitis virus E−protein expressed in recombinant Escherichia coli system.Vaccine 13 p.1515.）とそれらが持つ防御エピトープ（Srivastava,A.K.et al.1995.Mice immunized with a dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made in Escherichia coli are protected against lethal dengue virus infection.Vaccine 13 p.1251.）の多くを保存することができることが示されている。
プレM/Mの場合には、そのプレ−ドメインが３つのジスルフィドブリッジに関与する６つのシステイン、ならびにアスパラギン69にＮ−グリコシル化部位をもつ。ＥおよびNS1の構造は更により複雑である。このもは６つのジスルフィドブリッジと幾つかのＮ−グリコシル化部位をもつ。しかし、Ｍの小さなエクトドメインは、システインをもたず、その天然型はグリコシル化されていないので、明らかにこれらのコンホメーションの複雑さがない。
免疫原タンパク質の可能な領域に非相同断片を挿入することは、そのトポロジーも多少知られており、また、これらの融合物での免疫は、合成ペプチドの使用に補足的に替わり得るものである。双方の戦略は連続的なＢ細胞の存在、ならびにＴ細胞エピトープの明確化を可能とする。これらエピトープの生物学的重要性は実験的に評価し、所定のワクチン製剤の何処にそれらを含まれせるかを決定することが可能である。
発明の開示
アミノ酸配列（97/166AA）の58％に及ぶデング熱２ウイルスのプレM/Mタンパク質からの５種のペプチドを化学的に合成した。そのペプチドは３−31、45−67、57−92、69−93および103−124であり、それぞれ、B19−６、B20−２、B19−５、B20−１、B20−３と命名した。
これらのペプチドを担体タンパク質に結合させ、あるいは結合させずにBalb/cマウスに接種した。複合ペプチドでの免疫後得られた血清をin vitroで中和して、プラーク数の減少およびELISAにより試験した。我々はまた、免疫したマウスについてデング熱２ウイルスの感染に対する能動的防御を検討した。
非複合ペプチドで免疫したマウスの場合には、抗体応答をELISAにより評価し、デング熱２ウイルスに対する脾臓Ｔリンパ球の増殖性応答も評価した。
融合タンパク質を取得し、ペプチドによりカバーされる４つの領域の内、２つの領域（１〜42および92〜133）をそれらに挿入し、大腸菌中で発現させた。これらの融合物での免疫が、合成ペプチドにより得られた結果を補足するだろう。
マウスおよびヒトの双方においてＢ細胞エピトープが存在することは、該ペプチドが免疫したマウスからの抗体により、また、デング熱ウイルスにつき臨床診断および血清学診断を受けた患者の血清により認識されたことで証明したが、これらには両方ともELISAを使用した。ペプチド19−６および20−３は４種のデング熱ウイルス血清型に対し中和性抗体の産生を誘導することができる。
ウイルス特異的増殖応答は、非複合ペプチド19−６および19−５で免疫したマウスにて証明した。複合ペプチド19−６、20−１および19−５で免疫したマウスは、デング熱２ウイルスで感染させたとき、統計的に有意な防御レベルを示した。
かくして、デング熱２ウイルスのプレM/Mタンパク質に連続的エピトープの存在することが証明された。同時に、それらのフラビウイルスに対する免疫応答における関連性も証明された。
発明の実施の形態
実施例１  デング熱ウイルスのプレM/Mタンパク質の抗原性領域とＴ細胞エピトープの予測
理論的に異なる方法を、D2ウイルスのプレM/Mタンパク質における抗原性領域を予測するために適用した。これらの領域は、恐らく、該ウイルスタンパク質に対して得られた抗体により認識されるものであり、同時に、原タンパク質を認識する抗体を産生するものである。Ｔ細胞エピトープを予測する幾つかの方法を適用した。
可能なＢ−およびＴ−細胞エピトープを有する５種の原ペプチドを見出した（プレ−で４種、Ｍで１種）。これらタンパク質の抗原性構造および可能な免疫学的に重要なペプチドの実験的決定の研究はこの知見に基づいている。
1.1.  体液性抗原性の予測
抗原性を予測するのに使用した方法はアミノ酸配列に基づいた。その理由はデング熱ウイルスのプレM/Mタンパク質の三次元構造が実験的に決められず、また、既知三次元構造のいずれのタンパク質についても配列レベルで有意な同一性がないからである。
1981年にキューバで単離されたデング熱２のA15株（クーリ（Kouri,G.）ら、1986。キューバでの出血性デング熱；伝染病流行の歴史。Bull.P.A.H.O 20、24ページ）をこの実験の実施のために用いた。潜在的抗原性領域を以下の基準に従って選択した。
ａ）親水性に基づく異なる予測方法に従い高い抗原性を有する領域（フープおよびウッド（Hoop,T.P.y Woods,K.R.）1981。アミノ酸配列からタンパク質抗原性決定子を予測。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78、3824ページ；パーカー（Parker,J.M.R.）ら、1986。HPLCペプチド保持データから誘導される新しい親水性：予測される表面残基と抗原性との相関およびＸ線誘導接近可能部位、Biochemistry 25、5425ページ）、たわみ性（カープラスおよびシュルツ（Karplus,P.A.y Schultz,G.E.）1985。タンパク質における鎖可撓性の予測。ペプチド抗原の選択手段。Naturwissenschaften 72、212ページ）および接近可能性（エミニ（Emini,E.A.）ら、1985。ウイルス特異合成ペプチドによるＡ型肝炎ウイルス中和抗体の誘導。J.Virol.55、836ページ）。
ｂ）PHDを使用する二次構造の予測に従いループおよび折り返し形成の高い可能性をもつ領域（ロストおよびサンダー（Rost,B.y Sander,C.）1993。70％以上の確かさでタンパク質二次構造を予測。J.Mol.Biol.232、584ページ；ロストおよびサンダー、1994。タンパク質二次構造を予測させる進化論的情報および中立のネットワークを組合わせること。Proteins 19、55ページ；ロストおよびサンダー、1994。タンパク質類における溶媒の接近可能性の保存と予測。Proteins 20、216ページ）。
ｃ）他のフラビウイルスに関して挿入／抑制を含む、または含まない高次可変性の領域、ならびにデング熱ウイルスにおいて用いられる、または用いられない他のフラビウイルスにおけるグリコシル化の潜在的領域。
ａ）  抗原性のプロフィール
図１は抗原性に関係するアミノ酸の４つの性質をプレ−およびＭセグメントに適用するとき得られるプロフィールを示す。
該プレ−領域には、残基６〜９、16〜21、28〜31、42〜47、58〜65および82〜91を有する領域に高い親水性と接近可能性値がある。注目すべきことは、残基41〜76間の広範な疎水性領域の存在であり、この領域は免疫系に露出されていないと考えられる経膜ラセンに相当することである。Ｍの小さなエクトドメイン（残基１〜40）には、主要親水性／接近可能性の領域がアミノ酸の13〜31の間、とりわけ、その始まり（AA13〜16）にある。
ｂ）  二次構造の予測
図２はPHDプログラムによるプレ−およびＭセグメントの二次構造と接近可能性の予測を示す。予測の結果は、多くの潜在的に抗原性の領域（図１のプロフィールによる）が、タンパク質表面の露出された残基をもつループ/b−折り返しを形成するように仕向けることを示している。タンパク質Ｍのアミノ酸41〜76の領域には経膜ラセンの形成が予測され、このことはこの領域の疎水性と調和し、Ｍの抗原性ペプチドが主にエクトドメイン（１〜40）にあることを示唆している。
ｃ）  デング熱タンパク質および他のフラビウイルスタンパク質のプレ−およびＭのアライメント。可変性およびグリコシル化。
一般に、溶媒に露出されていない領域は相同タンパク質類に大きな保存部分を有する。従って、高次可変性領域は露出されるべき高い確率を有する。
ウイルスの場合には、可変性が免疫圧に対する逸脱メカニズムでもある；勿論、このことが、一部の保存領域が抗原性であること、あるいはその表面に保存領域が存在することの可能性を排除するものではない。
デング熱ウイルスの４種の血清型においける15種分離株のプレ−およびＭ領域の配列について分析すると、少なくとも69％の残基が完全に保存されていることが分かる。より重要な可変残基はプレ−の28〜30、55〜59、69〜72、および80〜83位、ならびにＭの27〜30位にある。一般に、これらのゾーンは、図１の抗原性プロフィールの最大値に匹敵する。
30種以上のフラビウイルス分離株でのこれら領域の配列を比較すると、プレの１〜33の領域が高度に可変性であり、（８位と30位に）挿入／抑制に方向づけられた可能なループとＮ−グリコシル化の幾つかの潜在的部位をもつことが分かる。これに対し、プレ−のドメイン33〜91では可変性が低い；すべてのフラビウイルスには幾つかの完全に保存された部位がある；例えば、３つのジスルフィドブリッジを形成する６個のシステイン、40〜65の領域における少なくとも５つの酸残基、ならびに塩基性配列87〜91があって、その後で内タンパク質分解切断が成熟ウイルス放出の直前またはその間に起こる（図３）。
抗原性デング熱複合体の保存残基であるAsn−69は、複合体のプレM/Mタンパク質において唯一Ｎ−グリコシル化されている。しかし、フラビウイルス科ではこの領域が高次可変性をもつ恐らく露出したループ内にある。同時に、他のフラビウイルスの潜在的Ｎ−グリコシル化部位（例えば、JE、SLE、MVE、YFのAA14、およびLI、LAN、YF TBEのAA32）に匹敵するデング熱ウイルスのプレM/M残基は抗原性と考えられるゾーンに近接したｂ−折り返しである。
1.2.  Ｔ細胞エピトープの予測
当該予測は２つの独立した方法により実施した：ロットバード−テイラーのパターン法（Rothbard,J.B.y Taylor,W.R.,1988、Ｔ細胞エピトープに共通の配列パターン。EMBO J.7、93ページ）およびアルファ−ヘリックス構造を形成する傾向をもつ断片の決定（AMPHI7および11）（マルガリット（Margalit,H）ら、1987。免疫優性ヘルパーＴ細胞抗原性部位を一次配列から予測。J.Immunol.138、2213ページ）。結果を図４に示す。
1.3  関連エピトープの同定用に提案されたペプチド
一般に、中和性および防御性ペプチドの決定は、より有効なワクチン開発のために非常に重要であり、高い抗原性を有する領域からのペプチド、とりわけ、直鎖性のものはそれらを同定するために非常に有用である。
表１は（本実施例に用いた幾つかの予測方法に従い）D2ウイルスプレM/Mタンパク質について、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープをもつように仕向けた領域を含むペプチドセットを示す。もしその予測の有効性が実験的に証明されるならば、各領域の免疫的に重要なエピトープが、それぞれにおいて小サイズのペプチドを設計することにより正確に置き換えられるだろう。
0003647048.tif 000002
実施例２  オリゴペプチドとオリゴヌクレオチドの化学合成
1.オリゴペプチドの合成
ペプチドは全て、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ｐ−metyl−benzhydrilamine resin）（resin MBHA,BACHEM,Switzerland）によって、固相中で、Bocアプローチによって合成された。
保護されたアミノ酸は、BACHEMによって提供された。アミノ酸鎖の反応性基の保護は、Arg（Tos）、Asp（OBzl）、Cys（４−Me−BZL）、Glu（OBzl）、Lys（２−Cl−Ｚ）、Trp（CHO）、Tyr（Cl2−Bzl）、Thr（Bzl）であった。Asn、GlnおよびProは、側鎖を保護せずに使用された。
Bocアミノ保護基の脱保護は、37.5％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液を用いて実施された。ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）のin situでの活性化は、各残基のカップリング反応に使用されたが、アミノ酸AsnとGlnについては、N,N−ジメチルホルムアミド中で、DICと１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて活性化された。
最終的な脱保護と樹脂からのペプチドの遊離は、特殊な装置で達成された。使用した手順は、Low−High  HFとして知られている。
この手順の第１の部分（Low  HF）の間、保護された樹脂系は、HF（25％）:DMS（65％）:p−クレゾール（10％）で、120分間、０℃で処理された。該混合物は、Trp含有ペプチドの場合、HF（25％）:DMS（60％）:EDT（10％）:p−クレゾール（５％）によって代替した。次に、該樹脂ペプチドを、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、２−プロパノールで数回洗浄し、真空乾燥を行った。
この手順の第２の部分（High  HF）の間、該樹脂ペプチドは、HF（90％）：アニソール（10％）で、60分間、０℃で処理された。
該生成物は、エタノールで洗浄され、30％の酢酸水溶液で抽出され、最後に凍結乾燥された。
ペプチドは、BAKER  Ｃ−18（4.6×100mm）カラムにおけるRP−HPLCとJEOL  HX−110  HF装置における電離方法としてFAB（高速原子衝撃）を使用する質量分析により特徴づけた。
アミノ酸配列およびそのデング熱ウィルスのプレM/Mタンパク質中での位置が表１に示されている。
2.2.  オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミド法に従って、Gene Assmbler Plus装置で自動合成された。
６つのオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。
その後の操作のために各端に作成されたXba IおよびEcoR I部位は、それぞれ一重および二重の下線が引かれている。コードされるタンパク質のリーディングフレームは３塩基コドンによって示されている。
0003647048.tif 000003
実施例３  担体タンパク質へのペプチドの合成、および免疫方法
3.1  ペプチドのBSAへの結合
ペプチドの結合は以下の方法でおこなわれた。
1.  BSAの活性化：ウシアルブミン分画Ｖ（BSA）2.8mgをPBS250μｌに溶解した溶液に、ジメチルホルムアミドに溶解した５μg/μｌ濃度のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの溶液80μｌを一滴ずつ攪拌して加えた。室温で30分間かき混ぜて、PD10カラムに混合物を通した。
2.  ペプチドの活性化BSAへのカップリング:1mgのペプチドが300mlのPBSに溶解した溶解液を、振とうしながら、活性化BSA溶液に１滴ずつ加えた。それを室温で３時間放置し、ローリー（Lowry）法によって濃度を測定した。
3.2  免疫方法
BSAに結合させたペプチドの免疫方法は以下の通りである。
４〜６週齢の雄性バルブシーマウスを、50mgのペプチド−BSA複合体を用いて腹膜腔内免疫した。さらに、BSAおよびPBSをそれぞれ用いた、２つの免疫方法を行った。全体として４回の接種を、それぞれ15日間の間隔を空けて行った。最初の投与にはフロイント（Freund）のコンプリートアジュバントを用い、その他の投与にはフロイント（Freund）のインコンプリートアジュバントを用いた。最後の接種から７日後に、血液試料をレトロ−オービタル（retro−orbital）静脈から採取した。
各方法で得られた血清を、後で用いるために−20℃で保存した。
実施例４  in vitroプラーク減少中和試験（PRNT）
中和は、モーレンス（Morens）（Morens,D.M.et al.,1905,BHK−21細胞中におけるセミミクロ法によるデング熱ウイルスの簡単なプラーク減少中和アッセイ：標準的なプラーク減少中和とのBHK懸濁試験の比較J.Clin.Microbiol.22 p.250）に従って行った。
抗ペプチド血清および抗BSAコントロールおよびネガティブ血清の、10〜640倍希釈液を調製した。各血清の希釈液と15〜20PFU/50mlの、ウイルス（デング熱２の株A15）の希釈液とを合わせた。
その混合物を、37℃で１時間インキュベートした。総量50mlの各混合物を、24ウエルのプレート中のBHK−21細胞に対して３倍の量で加え、それらをCO2インキュベータ中で、37℃で４時間インキュベートした。次に、0.5mlのカルボキシメチルセルロースを含有する培地を加え、それを、用いたウイルス性の血清型を考慮して、さらに数日間インキュベートした。その後、染色と、ウイルスによって産生された、溶解したプラークの計数とを行った。
どの場合においても、力価は50％のプラーク数の減少が観測される希釈度として表した。
結果を表３に示す。
0003647048.tif 000004
実施例５  Ｔ細胞エピトープの単離
プレＭのペプチドにおけるＴ細胞エピトープの存在は、免疫されたマウスの遊離ペプチド（非結合）から引き出された抗ペプチド抗体の反応の研究を通して調べられた。壮年期の動物は、実験を受けたことのない動物と比較して、抗原のブースター量に反応して高い血清抗体生成を示した。これらの結果は、これらのペプチドにおけるＢ細胞エピトープの存在を実証し、またこれらの配列がＴ細胞エピトープを含み、in vivoでのTh活性を刺激して、抗体反応の力価を向上させることができることを示す。
脾臓Ｔリンパ球のウイルス特異的増殖反応は、ペプチド免疫されたBALB/cマウスにおいて実証された。19−６と19−５の免疫されたマウスからのＴ細胞は、デング熱２ウイルスと培養された場合、in vitro幼若化アッセイにおいて増殖した。しかしながら、20−２ペプチドは、ウイルスに対して有為な増殖応答を引き起こさなかった。それは、遊離した形のペプチドにおいて認められるが、免疫優性のエピトープの提示および自然感染でのウイルスのプロセシングの結果においては認められないため、Ｔ細胞クリプティックエピトープが含まれると思われた。
実施例６  保護アッセイ
マウスは、生の、マウスに適合したデング熱２ウイルス（株A15）の2500倍の希釈液での頭蓋内注射による最後の免疫の、７日間後から試験した。病的状態および死亡率について、マウスを21日間まで観察した。データを、フィッシャー（Fisher）の試験を用いて統計上の有意性についてテストした。ペプチド免疫された動物およびコントロールの動物における生存百分率を図６に示す。ペプチド19−5,19−６および20−１に対して誘導された保護のレベルは、統計上有意である（ｐ＜0.05）。
実施例７  抗ペプチド抗体を検出するための間接ELISA
ヒト血清：
ペプチド19−6,20−1,20−2,20−３を、コーティングバッファー中10mg/mlの濃度でプレートに固定し、それを４℃で一晩インキュベートした。PBS−Tween20中200倍に希釈された血清を加えた。最後に、全ヒト／ペルオキシダーゼ抗免疫グロブリン複合体を加え、続いて、基質（オルトフェニレンジアミン、H2O2、0.05Mリン酸クエン酸緩衝液、pH5）を加えた。読取は、ELISA読取装置において492nmにて行い、各ペプチドのカットオフ値が測定された。
使用された血清は、全ての抗デング熱抗体について、血球凝集阻止実験（Clarke,D.H.y Casals,J.1958.節足動物媒介ウイルスを用いた血球凝集実験および血球凝集阻止実験Am.J.Trop.Med.Hyg.7 p.561）と阻止のELISA（Vazquez,S.,Fernandez,R.1989.Utilizacion de un metodo de ELISA de Inhibicion en el diagnostico serologico de dengue.Rev.Cub.Med.Trop.41（１）p18−26）によって血清学的にデング熱と診断されたウイルスに臨床感染している被験者由来であった。
1981年キューバ、1994年パナマ、および1994年コスタリカで発生した流行病の患者からの118の血清を調べた。コスタリカでの血清型１および４に加えて、デング熱ウイルス２が、これらの流行病において単離され、それらは、血球凝集阻止の阻止抗体の力価に従って、初感染および２次感染の症例に分類された。
血清の46.6％は、使用された４ペプチドに対して陽性であった。ペプチドＢ  19−６、20−１、20−２、および20−３に対する陽性率56.8％、79.6％、77.1％、および83.1％がそれぞれ得られた。
各ペプチドについて、試料／カットオフ値の光学濃度値で計算された反応指数の平均値は、それぞれ1.07、1.52、1.57、および1.49であった。
マウスの血清：
使用された間接ELISAは、上述のようであったが、ペルオキシダーゼに接合した抗マウスIgを使用した。抗ペプチド血清中で得られた抗体の力価は、概して1/10000以上であった。
実施例８  Neisseria meningtidisのP64kタンパク質中へのプレM/M断片の挿入
本実施例においては、デング熱２（A15株）およびデング熱４（814669株）のプレタンパク質の断片を、我々のグループにおいて以前にキャラクタリゼーションを行ったN.meningtidisタンパク質（Silva,R.et al.1992.Neisseria meningitidis由来の外膜タンパク質をコードする塩基配列およびワクチン調製における該タンパク質の用途。欧州特許第0474313号、1997年）、すなわちP64kタンパク質に挿入して発現させた（Zhao,B.et al.1986.タイプ４デング熱ウィルスの全長DNA配列のクローニング。構造タンパク質をコードする遺伝子の解析。Virol.155 p.77）。前記P64kは、いくつかの動物モデルにおいて高い免疫原性を示した。そのうえ、大腸菌（E.coli）におけるP64kの発現レベルは、菌体の全タンパク質の30％を越える。
P64kタンパク質（64kDa）は２量体を形成する性質を有し、それぞれのサブユニット内に２つの機能性ドメインを有する。一方のドメイン（１〜100）は、リポ酸結合活性を有し、他方のドメイン（117〜594）は、リポアミド−デヒドロゲナーゼ活性を有する。いずれのドメインも、Ｘ線結晶構造解析によって、相互に独立した配座ドメインであると同定されている（Li de laSierra,I.et al.1994.,Neisseria meningitidis由来の組換え型外膜タンパク質の結晶化と予備的Ｘ線調査。J.Mol.Biol.235 p.1154、および、Neisseria meningitidis由来の表面抗原のリポアミドデヒドロゲナーゼドメインの分子構造。J.Mol.Biol.269 p.129）。
プレM/Mタンパク質の断片１〜42および断片92〜133の挿入を行うにあたって、前記一方のドメイン（アミノ酸位置45において）を選択した。というのも、この小さなドメインは露出度がより高く、２量体形成に関与していないと考えられるためである。このことは、天然のP64kに対するキメラタンパク質の全体構造の変化が、挿入部位を２量体の形成に直接関与するドメイン117〜594に選んだ場合よりも、小さいことを示唆した。
融合タンパク質の産生に使用されるP64k遺伝子の、リポ酸結合領域を含む、アミノ酸44〜53（TLETDKATMD）をコードする領域を、予めTLDLEMDに改変しておいた。この改変は、原発性肝硬変を有する患者の血清によってP64kが認識されることを阻止するために行ったものであり、これらの患者は、ヒトジヒドロリポアミドアセチル基転移酵素ミトコンドリア内に存在する相同エピトープに対する自己抗体を有する（Tuaillon,N.et al.1992.原発性胆汁性肝硬変内の抗M2自己抗体によって特異的に認識されるジヒドロリポアミドアセチル基転移酵素のリポイル合成オクトデカペプチド。J.Immunol.148 p.445）
２つのクローンを作製するための戦略を以下に説明する。
断片Pre−２、Ｍ−２、およびＭ−４は、それぞれ、オリゴヌクレオチド１と２、３と４、および５と６を用い（図２を参照）、鋳型としてpD−５プラスミドを用いて、鎖長延長反応によって増幅した。このpD−５プラスミドは、ｐブルースクリプト（pBluescript）ベクター（stratagene）中にクローン化されたデング熱２ウィルス（Ａ−15株）由来のプレM/M遺伝子のコピーを含む。それぞれの場合で得られたDNAバンド（120bp）を、Xba I（Pre−２およびＭ−２）またはXba I/EcoR I（Ｍ−４）によって消化し、ベクターpM−92にクローン化されたP64k遺伝子の135〜145位に人工的に作成された対応部位に、クローン化した。さらに、三種連結反応により、前記Xba IおよびEcoR I部位内にＭ−２およびＭ−４バンドを含むキメラクローンを作製した。順方向の挿入箇所を有する組換え型クローンは、制限酵素分析およびDNA配列決定によって同定した。
Pre−２（pD31）、Ｍ−２（pD30）、Ｍ−2/M−４（pD33）およびＭ−４（pD34）のクローンによって産生される融合タンパク質を、トリプトファンオペロン（ptrp）のプロモータ作用下に、大腸菌MM294株（Ｆ−endA1 hasdR17（rk-mk+）supE44 thi−1 relAl? RfbD1? SpoT1?）内で発現させた。すべての場合について、予想どおりのサイズのタンパク質が得られ、それらの発現レベルは、細菌の全タンパク質の30％に達したが、PD31タンパク質は非常に不安定であった（図７）。すべての融合タンパク質は、ELISA（図示せず）およびウェスタンブロッティング（図８）において、いくつかの抗P64kマウスモノクローナル抗体によって認識され、全細胞抽出液中においては顕著な分解が認められた。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、配列リストに示した。
非変性プロトコールによって粗精製したPD33およびPD34融合タンパク質によるマウス免疫化の結果、ELISAにおいてこれらのタンパク質に対する高い力価（1/100000）が認められ、同時にELISAにおいて1/4000の力価を有する合成ペプチドに対する抗体が得られた。
図面の説明
図1.デング熱ウィルスのプレタンパク質（Ａ）およびＭタンパク質（Ｂ）の、疎水性、接近可能性、および、たわみ（フレキシビリティ）プロファイル。
図2.プレタンパク質（Ａ）およびＭタンパク質（Ｂ）の２次構造および接近可能性予測。AA:アミノ酸、PHD sec:2次構造予測（Ｅ＝ベータ、Ｈ＝ヘリックス、Ｌ＝ループ）、Ｐ−3 acc:接近可能性予測（ｅ＝露出、ｂ＝非露出）、Sub sec（Subacc）:2次構造（接近可能性）予測が82.4％（70％）有効である残基。
図3.プレタンパク質およびＭタンパク質の可変性プロファイル。可変性は、３組のフラビウィルス配列を考慮して算出した。Dengue:15のデング熱単離体の配列、MBV:デング熱ウィルスを保有する蚊によって伝達されたフラビウィルス配列（Kunjin,West Nile Virus,Murray Valley Encephalitis and Sait Louis Encephalitis）、Flavivirus:30より多くの異なるフラビウィルス単離体の配列（MBV＋黄熱病（FA）、Langat（LAN）、Louping I11（L1）、ダニ媒介脳炎（ETG））
図4.プレタンパク質（Ａ）およびＭタンパク質（Ｂ）のＴ細胞エピトープの予測。AMPHI 7（11）:7（11）残基の両親媒性セグメントの予測であり、両親媒性ブロックの中央のアミノ酸残基（＋印を付した）が潜在的に抗原性を有する。RT4（５）:4（５）残基の抗原プロファイルの予測であり、＋印を付した残基はプロファイルを満たす残基である。
図5.ペプチド19−6,19−５および20−２によって免疫化されたマウスの脾臓Ｔ細胞のデング熱ウィルス抗原（濃度:10,20,および40μg/ml）に対する増殖応答である。
図6.ペプチドによって免疫化されたマウスおよび対照のマウスの生存百分率。ペプチド19−5,19−６および20−１に対して誘導された防御のレベルは統計上有意であった。
図7.融合タンパク質およびP64kタンパク質（プラスミドpM−92）によって形質転換した大腸菌MM294株の10％SDS−PAGEである。レーン1:形質転換されていないMM294株、レーン2:pM−92/MM294、レーン3:pD−30/MM294、レーン4:pD−31/MM294、レーン5:pD−33/MM294、レーン6:pD−34/MM294。
図8.融合タンパク質およびP64kタンパク質（pM−92プラスミド）で形質転換した大腸菌MM294株のAcM114を用いたウェスタンブロット。レーン1:形質転換されていないMM294株、レーン2:pM−92/MM294、レーン3:pD−30/MM294、レーン4:pD−31/MM294、レーン5:pD−33/MM294、レーン6:pD−34/MM294。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名前：セントロ  デ  インヘニエリア  ヘネティカ  イ  ビオテクノロヒア
（Ｂ）通り：プラヤ  アベニダ  31  エントレ  158  イ  190
（Ｃ）都市：ハバナ
（Ｅ）国：キューバ
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:10600
（Ｇ）電話:53  ７  218466
（Ｈ）ファックス:53  ７  218070/336008
（Ａ）名前：インスティトゥト  デ  メディシナ  トロピカル“ペドロ  コウリ”
（Ｂ）通り：ラ  リサ  アウトピスタ  ノビア  デル  メディオディア  キロメトロ  ６
（Ｃ）都市：ハバナ
（Ｅ）国：キューバ
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:11100
（Ｇ）電話:53  ７  220633
（Ｈ）ファックス:53  ７  335061
（ii）発明の名称：デング熱ウイルスのプレM/Mエピトープ、合成ペプチド、キメラタンパク質およびその用途
（iii）配列の数:9
（iv）コンピュータ可読形式：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM  PC  コンパーチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテント・イン・リリース（PatentIn Release）＃1.0,バージョン＃1,30（EPO）
（vi）先の出願データ：
（Ａ）出願番号:CU  13/97
（Ｂ）出願日:1997年１月15日
（２）SEQ  ID  NO:1に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:29アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（Ａ）生物名：デング熱ウイルス
（Ｂ）株名：デング熱−２
（Ｃ）個体・単離クローン名:A−15
（xi）配列:SEQ  ID  NO:1:
0003647048.tif 000005
（２）SEQ  ID  NO:2に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:23アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（Ａ）生物名：デング熱ウイルス
（Ｂ）株名：デング熱−２
（Ｃ）個体・単離クローン名:A−15
（xi）配列:SEQ  ID  NO:2:
0003647048.tif 000006
（２）SEQ  ID  NO:3に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:36アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（Ａ）生物名：デング熱ウイルス
（Ｂ）株名：デング熱−２
（Ｃ）個体・単離クローン名:A−15
（xi）配列:SEQ  ID  NO:3:
0003647048.tif 000007
（２）SEQ  ID  NO:4に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:25アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（Ａ）生物名：デング熱ウイルス
（Ｂ）株名：デング熱−２
（Ｃ）個体・単離クローン名:A−15
（xi）配列:SEQ  ID  NO:4:
0003647048.tif 000008
（２）SEQ  ID  NO:5に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（vi）起源：
（Ａ）生物名：デング熱ウイルス
（Ｂ）株名：デング熱−２
（Ｃ）個体・単離クローン名:A−15
（xi）配列:SEQ  ID  NO:5:
0003647048.tif 000009
（２）SEQ  ID  NO:6に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:635アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：タンパク質
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：融合タンパク質
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:PD31
（xi）配列:SEQ  ID  NO:6:
0003647048.tif 000010
0003647048.tif 000011
0003647048.tif 000012
（２）SEQ  ID  NO:7に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:635アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：タンパク質
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：融合タンパク質
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:PD30
（xi）配列:SEQ  ID  NO:7:
0003647048.tif 000013
0003647048.tif 000014
0003647048.tif 000015
（２）SEQ  ID  NO:8に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:677アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：タンパク質
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：融合タンパク質
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:PD34
（xi）配列:SEQ  ID  NO:8:
0003647048.tif 000016
0003647048.tif 000017
0003647048.tif 000018
（２）SEQ  ID  NO:9に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:635アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の型：タンパク質
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：融合タンパク質
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:PD33
（xi）配列:SEQ  ID  NO:9:
0003647048.tif 000019
0003647048.tif 000020
0003647048.tif 000021
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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