(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）下部ガス透過性フィルム120と、潅流させる（perfuse）べき培養の化合物を選択的に透過し得る上部シート20とによって画定されかつ培養培地50を該上部シート20と下部ガス透過性フィルム120との間に存在させるように適応された細胞培養区画室40;
ｂ）基本培地区画室30であって、それの一部は該上部シート20よりも上にあるものであり、かつ基本培地60を該上部シート20上に存在させるように適応された基本培地区画室30;
ｃ）該細胞培養区画室40への１つのアクセス口70;
ｄ）該基本培地区画室30へのアクセス口90;及び
ｅ）ガス透過性フィルム120の主部分は、懸濁細胞が該ガス透過性フィルム120の水平部分を横断して分布することができかつ該細胞培養区画室40に出入りするガス移動が実質的に損なわれないように実質的に水平な位置に保たれるところの、該ガス透過性フィルム120の下にかつ該フィルム120と一部接触するガスフィルム支持体130
を有する容器を含む自蔵（self−cotanined）非潅流の細胞培養装置。
【請求項２】
前記上部シート20の表面積が前記下部ガス透過性フィルム120の表面積の少なくとも四分の一である請求項１の装置。
【請求項３】
前記下部ガス透過性フィルム120の実質的に水平な部分と前記上部シート20との間の平均の間隔が15ミリメートルよりも短い請求項１の装置。
【請求項４】
前記ガスフィルム支持体130が、周囲環境とのガス状連絡に開放する該ガスフィルム支持体130の最も小さい断面積が、ガスと接触する前記下部ガス透過性フィルム120の全表面積よりも小さくなるように適応される請求項１の装置。
【請求項５】
上部シート支持体110が、前記上部シート20の下にかつ該シート20と部分接触状態にある請求項１の装置。
【請求項６】
前記基本培地区画室30へのアクセス口90の入口が、該基本培地区画室30の上面よりも高く位置される請求項１の装置。
【請求項７】
前記下部ガス透過性フィルム120が、前記細胞培養区画室内に突き出るセクションを含む請求項１の装置。
【請求項８】
前記ガスフィルム支持体130の少なくとも周囲が、該ガスフィルム支持体130の最も低い部分を含みかつ該細胞培養装置を平坦な表面上に置く場合に、該ガスフィルム支持体130の該最も低い部分の表面全体が平坦な表面と接触するように実質的に水平な平面上にある請求項１の細胞培養装置。
【請求項９】
複数の細胞培養区画室40が存在する請求項１の細胞培養装置。
【請求項１０】
複数の基本培地区画室30が存在する請求項９の装置。
【請求項１１】
ａ）下部ガス透過性フィルム120及び選定したサイズの化合物を選択的に透過し得る上部シート20によって構成されかつ適した手段によって培養培地50を該上部シート20と下部ガス透過性フィルム120との間に存在させるように適応された細胞培養区画室；
ｂ）基本培地区画室30であって、それの一部は該上部シート20よりも上にあるものであり、かつ基本培地60を該上部シート20上に存在させかつガスを基本培地60上に基本培地60と接触状態に存在させるように適応された基本培地区画室30;
ｃ）該細胞培養区画室40へのアクセス口70;
ｄ）該基本培地区画室30へのアクセス口90;
ｅ）該ガス透過性フィルム120の主部分は、懸濁細胞がガス透過性フィルム120の水平部分を横断して分布することができかつ該細胞培養区画室40に出入りするガス移動が実質的に損なわれないように実質的に水平な位置に保たれるところの、ガス透過性フィルム120の下にかつ該フィルム120と一部接触するガスフィルム支持体130;及び
ｆ）適した手段によって該基本培地区画室30の該ガスと該ガス透過性フィルム120の下面との間のガス状連絡をもたらすように適応されたガス交換区画室
を有する容器を含む細胞培養装置。
【請求項１２】
前記下部ガス透過性フィルム120が、細胞培養区画室内に突き出るセクションを含む請求項11の装置。
【請求項１３】
前記ガス交換区画室が、前記基本培地60を該ガス交換区画室に入らせないように適応された請求項11の装置。
【請求項１４】
前記ガス交換区画室がアクセス口210を有し、それにより凝縮を取り出すことができかつ前記基本培地区画室のガスと異なるガスが前記ガスフィルムの下面と連絡することができる請求項11の装置。
【請求項１５】
複数の細胞培養区画室40が存在する請求項11の細胞培養装置。
【請求項１６】
複数の基本培地区画室30が存在する請求項15の装置。
【請求項１７】
ａ）第一ガス透過性フィルム120と、選定したサイズの化合物を選択的に透過し得る上部シート20とによって画定されかつ培養培地50を該上部シート20と該第一ガス透過性フィルム120との間に存在させる適した手段によって分離された細胞培養区画室；
ｂ）基本培地区画室30であって、それの一部は該上部シート20よりも上にあるものであり、かつ適した手段によって基本培地60を該上部シート20と接触状態に存在させるように適応された基本培地区画室30;
ｃ）該細胞培養区画室への１つのアクセス口70;
ｄ）該基本培地区画室へのアクセス口90;
ｅ）該ガス透過性フィルム120の大部分は、懸濁細胞がガス透過性フィルム120の水平部分を横断して分布することができかつ該細胞培養区画室40に出入りするガス移動が実質的に損なわれないように実質的に水平な位置に保たれるところの該第一ガス透過性フィルム120の下にかつ該フィルム120と一部接触するガスフィルム支持体130;
ｆ）該第一ガス透過性フィルム120の下に水平な位置に配置された第二ガス透過性フィルム230;
ｇ）流体を収容するように適応された酸素圧力制御区画室220を形成する該第一ガス透過性フィルム120と該第二ガス透過性フィルム230との間の分離用手段；及び
ｈ）液体を加え又は取り出してガス輸送の速度を調節することができる該酸素圧力制御区画室250へのアクセス口
を有する容器を含む細胞培養装置。
【請求項１８】
前記第一ガス透過性フィルム120が、細胞培養区画室内に突き出るセクションを含む請求項17の装置。
【請求項１９】
複数の細胞培養区画室40が存在する請求項17の細胞培養装置。
【請求項２０】
複数の基本培地区画室30が存在する請求項19の装置。
【請求項２１】
下記の工程：
ａ）下部ガス透過性フィルム120と、選定したクラスの化合物を選択的に透過し得る上部シート20とで構成する細胞培養区画室40を形成し；
ｂ）該細胞培養区画室40に入る１つのアクセス口を形成し；
ｃ）該下部ガス透過性フィルム120を実質的に水平な位置に保ち；
ｄ）基本培地60を第二区画室内に該上部シート２０よりも上に入れ、該基本培地60は該上部シート20の上部表面に接触し；
ｅ）細胞及び細胞培養培地50を該細胞培養区画室40内に入れ、該細胞培養培地50は該上部シート20に接触し；
ｆ）細胞を選定した温度に保ち；及び
ｇ）該下部ガス透過性フィルム120を通るガス交換をもたらし、それにより細胞を該下部ガス透過性フィルム120の表面上で増殖させる
を含む細胞を培養する方法。
【請求項２２】
前記下部ガス透過性フィルム120が、細胞培養区画室40内に突き出るセクションを含む請求項21の方法。
【請求項２３】
複数の前記細胞培養区画室40を形成する請求項21の方法。
【請求項２４】
下記の工程：
ａ）ガス透過性フィルム120を、選定したクラスの化合物を透過し得る上部シート20の下に配置させて構成する細胞培養区画室40を形成し；
ｂ）該細胞培養区画室40に入る１つのアクセス口を形成し；
ｃ）該ガス透過性フィルム120の下に配置させかつガスを該ガス透過性フィルム120の下面に接触させながら、該ガス透過性フィルム120を実質的に水平な位置に保つように適応させたガスフィルム支持体130を形成し；
ｄ）基本培地60を基本区画室30内に該上部シート20よりも上に入れ、該基本培地60は該上部シート20の上部表面に接触し；
ｅ）細胞及び細胞培養培地50を該細胞培養区画室30内に入れ、該細胞培養培地50は該上部シート20に接触し；
ｆ）細胞を選定した温度に保ち；及び
ｇ）該下部ガス透過性フィルム120を通るガス交換をもたらし、それにより細胞を該下部ガス透過性フィルム120の表面上で増殖させる
を含む細胞を培養する方法。
【請求項２５】
前記下部ガス透過性フィルム120が、細胞培養区画室40内に突き出るセクションを含む請求項24の方法。
【請求項２６】
前記上部シート20と前記下部ガス透過性フィルム120の実質的に水平な部分との間の平均の間隔が15ミリメートルを越えない請求項24の方法。
【請求項２７】
複数の前記細胞培養区画室40を形成する請求項24の方法。
【請求項２８】
下記の工程：
ａ）ガス透過性フィルム120を、選定したクラスの化合物を透過し得る上部シート20の下に配置させて構成する細胞培養区画室40を形成し；
ｂ）該細胞培養区画室40に入る１つのアクセス口を形成し；
ｃ）基本培地60を第二区画室内に該上部シート20よりも上に入れ、該基本培地60は該上部シート20の上部表面に接触し；
ｄ）細胞及び細胞培養培地50を該細胞培養区画室40内に入れ、該細胞培養培地50は該上部シート20に接触し；
ｅ）細胞を適した温度に保ち；及び
ｆ）該下部のガス透過性フィルム120を通るガス交換をもたらす
を含む細胞を培養する方法。
【請求項２９】
前記下部のガス透過性、液透過性フィルム120が、細胞培養区画室40内に突き出るセクションを含む請求項28の方法。
【請求項３０】
複数の前記細胞培養区画室40を形成する請求項28の方法。
【請求項３１】
下記の工程：
ａ）ガス透過性フィルム120を、選定したクラスの化合物を透過し得る上部シート20の下に配置させて構成する細胞培養区画室40を形成し；
ｂ）該細胞培養区画室40を、上部支持体メッシュ270及び底部の第二ガス透過性フィルム230とで構成する酸素制御区画室220に置き、該支持体メッシュ270は、該下部の第一ガス透過性フィルム120を実質的に水平な位置に保ち；
ｃ）基本培地60を基本培地区画室30内に該上部シート20よりも上に入れ、該基本培地60は該上部シート20の上部表面に接触し；
ｄ）細胞及び細胞培養培地50を該細胞培養区画室30内に入れ、該細胞培養培地50は該上部シート20に接触し；
ｅ）選定した容積の液体260を該酸素制御区画室220の中に入れ；
ｆ）細胞を適した温度に保ち；及び
ｇ）酸素及び二酸化炭素を、該下部ガス透過性フィルム120を該液体260を経てかつ該酸素制御区画室220の該底部第二ガス透過性フィルム230を通して拡散させ、それにより細胞を該下部の第一ガス透過性フィルム120の表面上で増殖させ、該細胞培養培地50の蒸発を制限し、かつ該細胞培養区画室40内の酸素圧力を、該液体260を該酸素制御区画室220に加え又はそこから取り出すことによって変えることができる
を含む細胞を培養する方法。
【請求項３２】
前記下部の第一ガス透過性フィルム120が、細胞培養区画室40内に突き出るセクションを含む請求項31の方法。
【請求項３３】
前記酸素制御区画室220が前記基本培地60と連絡しておりかつ適した手段によって選定した容積の該基本培地60を該酸素制御区画室220内に存在させるように適応させた請求項31の方法。
【請求項３４】
複数の前記細胞培養区画室40を形成する請求項31の方法。
【請求項３５】
下記の工程：
ａ）下部ガス透過性フィルム120と、選定したクラスの化合物を透過し得る上部シート20とで構成する細胞培養区画室40を形成し；
ｂ）基本培地60を該細胞培養区画室40の該上部シート20に接触状態に保つように適応させた基本培地区画室30を形成し；
ｃ）該細胞培養区画室40への１つのアクセス口70を形成し；
ｄ）該下部ガス透過性フィルム120を実質的に水平な位置に保ち；
ｅ）基本培地60を該基本培地区画室30中に入れ；
ｆ）細胞及び細胞培養培地50を該細胞培養区画室40内に入れ、該細胞培養培地50は該上部シート120の下面に接触し；
ｇ）該細胞培養区画室40の該上部シート20を横切って圧力平衡を達成させ；
ｈ）細胞を選定した温度に保ち；及び
ｉ）該下部ガス透過性フィルム120を通るガス交換をもたらし、それにより細胞を該下部ガス透過性フィルム120の表面上で増殖させる
を含む細胞を培養する方法。
【請求項３６】
複数の前記細胞培養区画室40を形成する請求項35の方法。
【請求項３７】
前記下部ガス透過性フィルム120が、細胞培養区画室40内に突き出るセクションを含む請求項35の方法。
【発明の詳細な説明】
背景−発明の分野
本発明は、細胞又は組織をインビトロで成長させるための装置及び方法に関する。
背景−従来技術の説明
哺乳動物の細胞のインビトロ成長は、組織培養フラスコ（1969年６月10日に発行された米国特許第3,449,210号及び1992年９月29日に発行された米国特許第5,151,366号）、スピナフラスコ、及びマルチプルウエルプレート組織培養プレート（1971年８月３日に発行された米国特許第3,597,3326号及び1977年３月15日に発行された米国特許第4,012,288号）のような静的培養容器において行われるのが普通である。このタイプの培養では、細胞が栄養を消費しかつ老廃物を生成するにつれて、細胞培養培地の一部が定期的に取り出されかつ取り替えられる。このプロトコルは、細胞密度を制限し、細胞分泌生成物濃度を制限し、及び栄養濃度が定期的にシフトするに至る。
Marbrookは、細胞及び細胞分泌生成物を基本培地から分離するのに透析膜を使用した（Marbrook  J.、「Primary  Immune  Response  in  Cultures  of  Spleen  Cells」、the  Lancet,2,1279〜1281［1967］）。この装置では、内部同心室は、外部同心室内にある。内部室の底部は、外部室中に収容される基本培地中に入れられた透析膜で構成される。細胞は、栄養を受け入れかつ老廃物を排出する膜上にある。膜が、その上にある細胞マスにより基質輸送能力を失うにつれて、連続透析は制限されるようになる。これより、長期の培養を実施する能力は、弱められる。
Verma（1081年10月20日に発行された米国特許第4,296,205号）は、細胞が直接透析膜に接触しかつ透析膜を詰まらせないようにするために、組織培養棚を組織培養区画室内に置いて使用することを教示している。組織培養棚は、組織が細胞に移動するのを可能にするために、穿孔を有する。懸濁細胞を培養する間、細胞及び細胞デブリは、穿孔を通って移動して透析膜上に静止するようになることができ、長期培養における連続透析を制限する。また、棚の構築上の構造も、濃度勾配がプレートの表面を横断して一様でなく分布されるのにつれて、小繁殖圏に至り得る。
Vogler（1988年５月31日に発行された米国特許第4,748,124号）は、下部のガス透過性、液不透過性シート及び上部の透析膜によって画定される細胞培養区画室について記載している。この構造は、細胞が透析膜上に静止しないので、透析膜を詰まらせないが、それでも透析は、その他の手段によって制限されるようになり得る。また、酸素圧力を変える能力も、MarbrookやVermaに比べて制限される。その上に、ガス移送を可能にするのに用いる材料の表面化学は制限され、タンパク質又は細胞接触のために望ましくないものになり得る場合がいくつかある。最後に、その教示は、慣用の静的培養法に比べて高密度細胞培養に至らない。
Voglerの構築は、細胞区画室の透析を制限されるようにならせ得る。主たる問題は、液体が成長室から蒸発するにつれて起き得る。透析膜との液体接触がやむにつれて、ガス透過性表面を横断するベーパー透過は相当になり得かつ液体の損失は透析を停止するに至ることになる。透析の損失もまた、細胞培養培地のオフガス化から生じ得る。細胞培養培地は４℃で貯蔵されるのが典型的である。培地の温度が上昇するにつれて、ガス収容力は減少され、気泡が生じて透析膜に接触する。
細胞培養区画室のガス透過性、液不透過性シートは、細胞周囲のpH及びPO2を調節するために利用可能な選択肢を制限する。MarbrookやVermaの従来の構造では、酸素圧力は、細胞培養区画室の液体レベルを調節することによって変えられることができよう。Voglerによって教示される構造及び方法は、酸素圧力を、装置を囲む雰囲気の周囲条件を変えることによって変えることを要する。
酸素圧力は、細胞生活能力及びタンパク質分泌にとって極めて重要である（Reuveny等、「Factors  Affecting  Cell  Growth  and  Monoclonal  Antibody  Production  in  Stirred  Reactors」、Journal  of  Immunological  Methods、86、53〜59［1986］）。市販されている液不透過性シートのガス透過性並びに細胞周囲のpH及びPO2に与える影響は、Jenson等（Jenson  M.D.,Wallach  D.F.H.、及びSherwood  P.、「Diffusion  in  Tissue  Cultures  on  Gas−permeable  and  Impermeable  Supports」、J.Ther.Biol.（1976）56、443〜458）によって詳細に記載されている。種々の細胞タイプの酸素要求量は、種々のガス透過性、液不透過性シートのガス透過性と組み合わさって、各々の組合せについて特定の定常状態の細胞周囲のpH及びPO2を指図することになる。これは、細胞系が極めて限られた細胞周囲条件を受けることを意味する。異なる細胞周囲条件を生じることは、装置が中に存在するインキュベーターの周囲条件を変えることによって達成される。実用的な事として、これは、インキュベーターを広範囲の同時使用について標準条件に保つ研究員について困難なことである。
ガス透過性、液不透過性シートは、また、細胞及びタンパク質構造の支持体について利用可能な表面化学を制限する。多数の細胞タイプの増殖及び機能は、それらが存する表面の化学的性質によって強く影響される。液不透過性材料の表面化学は、数多くの細胞タイプ及びタンパク質構造と不適合性である。また、しばしばガス透過性、液不透過性フィルム用のベースになる疎水性材料は、非特異的タンパク質結合を引き起こし得る。これは、立ち代わって可溶性成長因子の枯渇に至り得る。これにより、細胞環境を最適にするために、材料へのそれ以上の改質が、要求され得る。
Voglerの構築は、また、細胞密度の制限に至る。成長室は、その上に在る液の重量及び流体膨張の圧力により形状が変形し、ガス透過性シートが垂れ下がるに至ることになる。これは、懸濁細胞をシートの低い部分に移住させる。シートの低い部分における高い局在化細胞密度は、栄養のフラックスへの過度の抵抗及び細胞生活能力の局在化低下に至る。その上に、細胞は、ガス透過性シートの他の領域に膨張することができない。
よって、本発明の目的は、足場依存性細胞及び懸濁細胞を高い密度で長期培養し、同時に可変酸素圧力、培養区画室の底部を横断する細胞の一様な分布、連続した透析、及び広範囲の表面化学選択肢を可能にする方法及び装置を提供するにある。なおそれ以上の目的及び利点は、次の記述及び図面を考察することから明らかになるものと思う。
発明の要約
従来技術の問題の多くは、細胞を高い密度で長期に渡って培養することを可能にする本発明に従って構築する区画された細胞培養装置によって解決される。
詳細には、下部のガス透過性フィルムと、それと垂直に間隔を開けた、選定したサイズの化合物を選択的に透過し得る上部のシートと、培地を該上部のシートと該下部のガス透過性フィルムとの間に存在させるように該フィルムを該シートから間隔を開ける手段を含む細胞培養区画室を提供する。基本培地を該上部シート上に存在させるために基本培地区画室を画定する手段がある。該細胞培養区画室及び該基本培地区画室へのアクセス口がある。該ガス透過性フィルムの下にかつ該フィルムと一部接触するガスフィルム支持体が存在し、それにより該ガス透過性フィルムの主部分は、細胞が該ガス透過性フィルムの水平部分を横断して分布することができかつ該細胞培養区画室に出入りするガス移動が実質的に損なわれないように実質的に水平の位置に保たれる。ガス透過性フィルムは、特定の細胞培養用途について適した細胞周囲環境及び表面化学をもたらす任意の生適合性の液透過性又は不透過性、疎水性又は親水性、多孔質又は非多孔質物質にすることができる。
上部の基本培地区画室及び下部の細胞培養区画室は、ピペットアクセスを可能にしかつ温度上昇による昇圧を防ぐように形造る。細胞培養区画室は、蒸発又はオフガス化による透析の損失を防ぎ、基本培地リザーバーからの液体フラックスを補い、かつ高い細胞密度培養を長期間にわたって保つことを可能にするように形造る。
発明の一特徴に従えば、細胞培養培地の蒸発損失を、細胞培養区画室のガス状交換を上部の基本培地区画室の加湿したガスとして供することによって周囲条件に関係なく制御することができる。
発明の第二の特徴に従えば、細胞培養区画室内の酸素圧力を、酸素圧力を変えるのに可変レベルの液体を利用する第三の区画室を加えることによって周囲条件に関係なく精確に制御することができる。
発明の第三の特徴に従えば、細胞培養区画室容積を、作業中透析を妨げないで変えることができる。
発明の第四の特徴に従えば、細胞培養区画室への空気の移入を、日常の取り扱の間最少にしてpH変動を最少にすることができる。
発明の別の実施態様に従えば、複数の細胞培養区画室であって、各々は下部のガス透過性フィルムと、それと垂直に間隔を開けた、選定したサイズの化合物を選択的に透過し得る上部のシートと、培地を該上部のシートと該下部のガス透過性フィルムとの間に存在させるように該フィルムを該シートから間隔を開ける手段を含む複数の細胞培養区画室を提供する。基本培地を該上部シート上に存在させるために基本培地区画室を画定する手段が存在する。該細胞培養区画室及び該基本培地区画室へのアクセス口がある。該ガス透過性フィルムの下にかつ該フィルムと一部接触するガスフィルム支持体が存在し、それにより各々の該ガス透過性フィルムの主成分は、懸濁細胞がガス透過性フィルムの水平部分を横断して分布することができかつ該細胞培養区画室に出入りするガス移動が実質的に損なわれないように実質的に水平の位置に保たれる。
これらの構造により、細胞を高い密度で培養する方法が利用可能になる。また、細胞を囲む酸素圧力を調節する方法が、酸素フラックスへの液体バリヤーを利用することによって利用可能になる。
そのように述べた発明により、従来技術に付随する問題の多くが解決される。懸濁及び粘着の両方の細胞の長期の高密度インビトロ培養が可能になり、同時に可変酸素圧力、蒸発制御、小細胞区画室液体容積の長期維持、及び連続透析を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、区画された細胞培養フラスコの中央を切欠いた図である；
図２は、ガス透過性膜であって、その一部が細胞培養区画室内に突き出るものを使用した実施態様を示す区画された組織培養フラスコの断面図である。
図３は、２つの区画室における静水圧をバランスさせる実施態様を示す区画された組織培養フラスコの断面図である。
図４は、蒸発を制御する実施態様を示す区画された組織培養フラスコの断面図である；及び
図５は、日常の取り扱の間pH変動を最少にする区画されたフラスコの切欠き図である。
図６は、端部で立つ区画されたフラスコの側面図である。
図７は、可変酸素圧力を可能にする実施態様を示す区画された組織培養フラスコの断面図である。
図８は、本発明に従う区画されたマルチプルウエル組織培養プレートの平面図である；
図９は、図８のマルチプルウエル組織培養プレートのＡ−Ａセクションに関する部分断面図である；及び
図10は、基本培地が共通のリザーバー中にある区画された組織培養プレートの平面図である。
図面中の参照番号
10    区画された組織培養フラスコ
15    区画されたマルチプルウエル組織培養プレート
20    膜
30    基本培地区画室
40    細胞培養区画室
50    培養培地
60    基本培地
70    細胞培養区画室アクセス口
80    細胞培養区画室アクセス口キャップ
85    上蓋
90    基本培地アクセス口
100  基本培地アクセス口キャップ
110  膜支持体
120  ガス透過性フィルム
130  ガスフィルム支持体
140  ガスアクセス開口部
150  足
170  基本培地ヘッドスペース
180  培養培地ヘッドスペース
190  ガスアクセスチャンネル
200  ガスアクセスチャンネル蓋
210  排水口
220  可変酸素制御区画室
230  下部ガス透過性フィルム
240  酸素制御区画室底部
250  酸素制御区画室アクセス口
260  液体抵抗装置
270  上部膜支持体
280  スカート
290  ノッチ
300  ノッチ蓋
310  ノッチ蓋ヒンジ
詳細な説明
今一層詳細に図面を参照すると、図１は、区画された組織培養フラスコ10の実施態様における発明の切欠き図を示す。膜20は、区画された組織培養フラスコ10を基本培地区画室30及び細胞培養区画室40に分ける。細胞又は組織を含有する培養培地50が細胞培養区画室40内に存在する。基本培地60が基本培地区画室30内に存在する。細胞培養区画室40へのアクセスを、細胞培養区画室アクセス口70によって供し、該アクセス口70を細胞培養区画室アクセス口キャップ80で蓋をする。基本培地区画室30へのアクセスを、基本培地アクセス口90によって供し、該アクセス口90を基本培地アクセス口キャップ100で蓋をする。膜支持体110は、膜20を安定にする。ガス透過性フィルム120は、ガスフィルム支持体130の上面上にあり、該ガスフィルム支持体130は、ガスをガスアクセス開口部140によってガス透過性フィルム120の表面の大部分に接触させるように適応させる。足150は、ガスフィルム支持体130を区画された組織培養フラスコ10がのっている表面よりも上に持ち上げる。
作業においては、関心のある細胞又は組織を含有する培養培地50を、細胞培養区画室アクセス口70より細胞培養区画室40の中に、膜20の下面に完全に接触するまで導入する。基本培地60を、基本培地アクセス口90より基本培地区画室30の中に導入する。基本培地60と基本培地区画室30の上面との間に基本培地ヘッドスペース170を保つことになりかつ基本培地アクセス口キャップ100をわずかにゆるめることにするのが好ましい。これは、周囲ガスに基本培地60のpHに影響を与えさせる。Falcon（登録商標）組織培養フラスコ（Becton  Dickinson  Labware−英国、ポリマスから市販されている）において用いられるタイプの基本培地アクセスキャップを、汚染問題によりキャップをしっかりと締めたままにさせるべき場合に、用いてよい。
区画された組織培養フラスコ10は、それをインキュベーターに入れる時に、それが収容するガス及び液の温度が上昇するにつれて昇温するのを防ぐようにデザインする。細胞培養アクセス口キャップ80及び基本培地アクセス口キャップ100をゆるめて膨張するガスを周囲大気にベントさせることができる。培養培地50は自由に膨張して培養培地ヘッドスペース180の中に入り、基本培地60は自由に膨張して基本培地ヘッドスペース170の中に入る。この方式では、圧力はガス透過性フィルム120の扁平度、或は膜20か又はガス透過性フィルム120のいずれかを通る液体フラックスに影響を与えない。
温度上昇の結果、流体膨張の外に、別の現象が起きる。液体培地のガス収容能力が低下される。培養培地50により放出される気泡は、区画された組織培養フラスコ10を少しの間傾けることによって培養培地ヘッドスペース180に移動させることができる。これは、ガスが膜20の底部に対して補足されて透析を制限することのないようにする。
培養培地ヘッドスペース180は、据え付け時の基本培地60と培養培地50とのヘッド高さ差から生じる静水圧差により膜50を通って生じ得る液体移動を釣り合わせるようにデザインする。液体が膜20を通って細胞培養区画室40の中に移動するにつれて、ヘッドスペース180中の培養培地のレベルが上昇する。細胞培養区画室アクセス口キャップ80がしっかりと締められた位置にあるならば、液体は、培養培地ヘッドスペース180内で、培養培地50の静水圧が押し退けられるガスの圧力によってバランスされるまで上昇し続けることになる。細胞培養区画室アクセス口キャップ80がゆるめられた位置にあるならば、液体は、培養培地ヘッドスペース180内で、それが、膜50を横断する差圧が減少して液体移動を停止するレベルに達するまで上昇することになる。好適な実施態様では、流れが停止した後の培養培地50の容積は、培養の開始時の培養培地50の容積の２倍よりも大きくならないであろう。
膜20は、分子類を選択的に透過し得る材料である。セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリカーボネート、及びポリアクリロアミドを含むいくつかのタイプの材料が容認し得る。例えば、マウスのハイブリドーマ細胞を培養するのに、分子量が15,000よりも大きな分子や化合物をとどめる透析膜が一般に用いられる。この特性を有する膜を使用することによって、細胞、成長因子、及び分泌される抗体が細胞培養区画室40中にとどめられる。他の用途では、一層大きな分子や化合物を基本培地60と培養培地50との間を自由に通過させるのが有利になるかもしれない。例えば、リンパ球の高密度培養は、多量の生育促進因子を存在させることを要するかもしれない。インターロイキン２のようなこれらの因子を基本培地60及び培養培地50中に導入することができる。膜20の細孔寸法を適当に選択することによって、これらの因子の大きな源をリンパ球に対して利用可能にさせることができる。
膜20は、ほとんどの用途で、分子量カットオフ150,000ダルトンを越えないことになろう。それでも、更に大きな細孔寸法が望ましくなり得る用途がある。例えば、目的がただ多数の細胞を培養することだけにあるならば、細胞を細胞培養区画室40中にとどめる任意の細孔寸法を用いることができる。この場合、Poretics  Corporation（カリフォルニア、リバーモア）から市販されているような0.2〜0.45μＭ微孔質ポリカーボネート膜を使用することができよう。
膜支持体110は、膜20を安定にする。基本培地60を基本培地区画室30に加えるにつれて、その重さが膜20に転嫁される。膜支持体110は、膜20にたるませかつ培養培地50を培養培地ヘッドスペース180中に押しのけさせないようにする。膜支持体110は、透析の表面を実質的に減少させるために、膜50との接触を最小にさせる。膜支持体110は、気泡を自由に培養培地ヘッドスペース180に移動させるようにデザインする。膜支持体110は、任意の生適合性材料で造ることができる。好適な実施態様では、それは、ポリスチレン又はポリカーボネートのような透明プラスチックにする。膜20が、堅いメッシュバッキングにキャストした材料であるか或はガス透過性フィルム120よりも上にある培養培地50の容積を精確に制御することを必要としないならば、膜支持体110は随意である。
図２の実施態様は、ガス透過性フィルム120の部分が細胞培養区画室40の中に突き出て、膜支持体110を必要としないで膜20の支持になる構造を示す。シリコーンは、容易に成形して適した形状を形成することができるので、材料についての良好な選定である。壁厚みを最少にして細胞培養区画室40中への更なるガス移送を可能にする。シリコーンの場合、平均の壁厚みは、0.015インチ（0.38mm）よりも薄く、好ましくは約0.004〜0.012インチ（0.10〜0.30mm）に保つべきである。
図３に示す実施態様は、膜20をたるませないようにしかつ作業の間、液体が確実に膜20の上部及び下部表面との接触を保つようにする。それは、高い濃度の細胞を所望する用途について特に有用である。膜支持体110は存在せず、これは、極めて小容量の培養培地50を使用することを可能にし、並びに細胞除去への障害をなくす。この実施態様は、また、膜20との液接触が常に確保されるので、種々の容量の培養培地50で機能することができる。
作業中、膜20は、基本培地60の重量によってガス透過性フィルム120の表面にプレスされる。膜をこの位置に据えることは、また、細胞培養区画室40で真空を発生することによって達成することができる。次いで、所望する培養を含有する培養培地50の所定の容積を、細胞培養区画室アクセス口70により細胞培養区画室40中に導入する。基本培地アクセス口キャップ100及び細胞培養アクセス口キャップ80がベントされる位置にある場合、培養培地50は、培養培地ヘッドスペース180内の基本培地60の静水圧に釣り合うレベルで静止するようになる。
好適な実施態様では、培養培地ヘッドスペース180内にある培養培地50の容積は、膜20とガス透過性フィルム120との間にある培養培地50の容積の小フラクションになる。猛烈な浸透勾配が膜20を横断して発現するならば、培養培地50からの水が細胞培養区画室40中に移動することが可能である。この状態が起き始めるならば、細胞培養アクセス口キャップ80をかたく締めた位置に置くべきである。これは、液を培養培地ヘッドスペース180内で上昇させないことになる。
培養培地50を細胞培養区画室40中に導入することは、基本培地60の静水圧に打ち勝つだけの圧力を要することになる。これは、細胞培養区画室アクセス口70を、ピペット、注射器、又はバッグもしくはボトルのようないくつかのその他の培養培地容器を受け入れるように形造ることによって達成することができる。培養培地50を同じようにして取り出すことができる。
培養培地50を細胞培養区画室40中に導入しかつそこから取り出すこの方法は、本明細書中に記載する実施態様のすべてにおいて利用することができる。膜支持体110を使用するほとんどの実施態様では、細胞培養区画室40への及びそこからの空気アクセスを可能にするためにベントを設置することが必要になろう。ベントは、培養培地50を細胞培養区画室40中に導入する際に、ガスを置換させるのに要する。ベントは、また、培養培地50を細胞培養区画室40から取り出す際に、ガスを培養培地50に置換させる。細胞培養区画室アクセス口70は、培養培地50を加えかつ取り出す間、ガスを中に及び外に移動させるようにデザインする。こうして、細胞培養区画室40を有効にベントさせる。
図３の実施態様は、ベントを必要としない。膜20をガス透過性フィルム120に対してプレスする場合に、培養培地50を導入する前に、細胞培養区画室40から空気を置換する。培養培地50を取り出す際に、膜20は単に低下される。これより、ガス及び液が同時に細胞培養区画室40に及びそこから移動する必要が少しもない。
図３に示す実施態様を高密度培養について用いる場合に、膜20とガス透過性フィルム120との間の平均の間隔は、５ミリメートルよりも短く、好ましくは約１〜2mmにすべきである。
図３の実施態様は、また、培養培地50の蒸発が、膜20に培養培地50との接触を失わせることのないように用いることができる。膜20は、本質的に培養培地50上に浮かんでおり、培養培地50がガス透過性フィルム120を通って蒸発するにつれて、膜20は、単にガス透過性フィルム120に一層接近していくる。膜20は、常に培養培地50と接触するので、透析制限は生じない。
膜20が、湿潤させる際に膨張する又はぶくぶくになるセルロースのような材料で構成される場合、膜20を上部膜支持体270で抑えることが望ましいかもしれない。上部膜支持体270は、培養培地50が細胞培養区画室40に入るにつれて、膜20が上方向に移行するのを止める。培養培地50は、膜20を上部膜支持体270に対してプレスし、しわを伸ばす。
膜20におけるしわは、細胞を接種する間、一様でなく分布させるに致る。膜20がひどくしわをよせられるならば、培養培地50はしわの中にあることになろう。その場合、ガス透過性フィルム120よりも上のいくつかの領域は、他の領域に比べて培養培地50が一層多く上に存在することになろう。接種剤中の細胞は、培養培地50全体にわたり等しく分布さされる。これらの細胞は、終局的にガス透過性フィルム120に落ち着く。ガス透過性フィルム120の領域であって、その上に一層大きな容積の培養培地50が存在する領域は、細胞を一層多く受け入れることになる。この状態を防ぐために、膜20のちりめんじわは、最少にすべきである。
上部膜270は、バージングレードポリスチレン又はポリプロピレンのような任意の生適合性材料にすることができる。それが、確実に透析を制限しないように注意を払うべきである。好適な実施態様では、それは約70〜90％開くべきである。
ガス透過性フィルム120は、細胞培養区画室40の中に及びそこから外にガスの移動を可能にすることができる生適合性材料にする。ガス透過性フィルム120は、液透過性又は不透過性、疎水性又は親水性、多孔質又は非多孔質物質のいずれかにすることができる。厚さは、0.25mmよりも厚い又はそれよりも薄い範囲にすることができる。最良の選定は、特定の用途に依存する。一般的なガイドラインとして、所定の膜のガス透過性は、膜と細胞か又はタンパク質構造のいずれかとの相互作用に加えて考えるべきである。均等の厚さの液不透過性フィルムは、細胞／フィルム界面において種々の定常状態酸素圧力を達成することになる。FEP  Teflon、シリコーン、及びシリコーンポリカーボネートコポリマーは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスルホン又はポリプロピレンに比べて一層高い酸素圧力を達成することになる。タンパク質変性、非特異的たんぱく質結合、細胞膜損傷、或は細胞付着がフィルムの表面化学によって影響される用途では、親水性表面が一層適している。細胞膜全体を水と接触させ続けることが望ましい用途では、水和されたゲルが最も適しているかもしれない。
通常ガス交換と関連付けられない所定の材料の使用は、細胞／フィルム界面における酸素圧力を制御するために利用し得る選択肢を広げることができる。例えば、非多孔質セルロースアセテートは、相対的に小さい酸素ガス透過度7.3×10-9cm3・cm/（sec・cm2・atm）程度を有する。セルロースアセテートを多孔質にさせる場合、それは、酸素透過度1.4×10-6cm3・cm/（sec・cm2・atm）で培養培地50を吸収するにつれて、酸素透過度を増大することになる。このようにして、酸素圧力を変えることは、ガス透過性フィルム210中に存在する培養培地50の量を調節することによって達成することができる。こうして、酸素圧力変動は、ガス透過性フィルム120の細孔寸法、多孔度、又はくねりのいずれかを変えることにより、生じることになる。
ガスフィルム支持体130は、ガス透過性フィルム120を実質的に水平な位置に保持し、かつガス透過性フィルム120をたるませないように安定にする。ガス透過性フィルムの平坦度を、確実に、細胞が低い点に転がり込む又はその他の方法で集まらないようなものにするように注意を払うべきである。細胞の堆積が拡散限界を生じて細胞の死にいたることになるので、これは望ましくない事である。他方、また、ガス交換が、確実に依然適したままになるように注意を払わなければならない。これより、ガスフィルム支持体130がガス透過性フィルム120と接触する最適な量は、ガス透過性フィルム120の剛性及びガス透過度並びに特定の細胞培養用途のガス交換及び代謝要求量に依存することになる。ほとんどの細胞系が、約10〜15の細胞層で拡散的に制限されるようになることは、予期されるべきである。
ガスフィルム支持体130は、また、ガス透過性フィルム120を汚染又は破壊から守る用に作用する。ガス移動のための表面積をできるだけ最大にするために、ガス透過性フィルム120との接触を最少にする。凝縮がガスフィルム支持体130を出るのを可能にするために、ガスアクセス開口部140をガスフィルム支持体130の最も低い点に配置する。それは、蒸発を最少にさせながら、細胞培養区画室40の適したガス交換をもたらす寸法に作る。ガスフィルム支持体130は、任意の構造上安定な材料で造ることができるが、好適な実施態様では、ガス透過性フィルム120が光学的に透明な場合に、培養の目視検査を可能にするために、ポリスチレン又はポリカーボネートのような光学的に透明な材料にする。足150は、区画された組織培養フラスコ10を、ガスフィルム支持体130が掻き傷を付けられる又は目視上損なわれるようにならないように持ち上げる。
ガス透過性フィルム120についての材料選定に関する別の検討は、水蒸気透過度である。培養培地50は、ガス透過性フィルム120の材料選定に応じて種々の速度で蒸発することになる。ガスアクセス開口部140の断面積を制限すれば、蒸発の速度を減少させることができるが、液体損失の速度は、また、制御するのが一層困難な周囲湿度の関数になる。図４の構造は、この問題を扱う。
基本培地ヘッドスペース170の加湿されたガスを、ガスアクセスチャンネル190によってガス透過性フィルム120の下面に連絡状態に置く。ガスアクセスチャンネルカバー200は、基本培地60をガスアクセスチャンネル190に入れさせないようにし、ガス移動を制限する。ガスアクセスチャンネルカバー200は、ガス透過性、液不透過性フィルムである。凝縮がガスアクセスチャンネルカバー200上に集積してガス移動を減少させないようにするために、それは水平位置にしない。これにより、凝縮は、重力によって基本培地60に戻ることができる。また、ガスアクセスチャンネル190は、凝縮をドレイン口210に集めることができる。
基本培地ヘッドスペース170をガス透過性フィルム120と連絡状態に置くその他の多数の方法が可能である。凝縮又は基本培地60がガス移動を減少させないように注意を払うべきである。
図４の構造は、また、装置を日常の取扱のためにインキュベーターから取り出す際に、pH調節を助成することができる。通常、区画された組織培養フラスコ10は、CO2インキュベーター内にある。これは、細胞培養区画室40の細胞周囲pHを適したレベルに保たせる。区画された組織培養フラスコ10をインキュベーターから取り出して細胞取扱のために層流フード中に入れる場合に、細胞培養区画室40のpHは、CO2が培養培地50からストリップされるにつれて、急速に変動し得る。図４の構造は、基本培地区画室30のCO2が培養培地50に容易に受け入れられるようになるのを可能にする。
この問題を扱う別の構造を図５に示す。スカート280が区画された組織培養フラスコ10の底部を囲む。スカート280は、装置が層流フード内にある場合に、ガス透過性フィルム120の下面に空気が出入りするのをきびしく制限する。これより、CO2は培養培地中に保持され、pHレベルを保つ。ほとんどのCO2インキュベーターの棚は、ガスフィルム支持体130の下面へのガスの直接の出入りを可能にすることになる開口部を有する。これにより、スカート280は、装置がほとんどのインキュベーター内にある場合に、ガス移動を妨げない。インキュベーターが孔開き棚を持たない場合について、ノッチ290をスカート280に造ることができる。ノッチカバー300がノッチ290の各々をカバーする。ノッチカバー300は、ノッチカバーヒンジ310上で回転し、装置をインキュベーターから取り出す場合に、閉止させた位置に置き、装置がインキュベーター内にある場合に、開放位置に置く。図５は、開放位置にあるノッチカバーを示す。スカートをガス出入りに開放するか或はガス出入りに閉止するかのいずれかにさせるためのその他の多数の機構が可能である。
図６は、装置をインキュベーターから取り出す場合に、またガス移動を制限する区画された組織培養フラスコ10の別の構造を示す。構造では、装置は端部上に立つ。培養培地50は、細胞培養区画室40の下部に集まる。培養培地50とガス透過性フィルム120との間の接触面積は、有意に減少される。これより、ガス移動は、接触面積の減少に直接比例して低減される。これは、培養培地50から別の環境へのCO2の移動を減少させ、pHのシフトを遅らせる。
ガス透過性フィルム120用に利用し得るタイプの材料が所望の酸素圧力をもたらさないならば、図７に示す構造を利用することができる。可変酸素制御区画室220は、下部ガス透過性フィルム230が、酸素制御区画室底部240により水平位置に支持されて構成される。酸素制御区画室アクセス口250は、液体レジスター260を可変酸素制御区画室220中に導入させる。ガス透過性フィルム120の底部における酸素圧力は、フィックの法則に従って下部ガス透過性フィルム230上にある液体の高さを変えることによって注意深く調節することができる。下部ガス透過性フィルム230は、任意のガス透過度の高いフィルム又はシートにすることができる。好適な実施態様では、それは液不透過性でありかつ比較的に小さい水蒸気透過度を有する。酸素制御区画室底部240は、下部ガス透過性フィルム230の大部分を周囲環境と連絡させる。下部ガス透過性フィルム230と酸素制御区画室底部240との間に機密封止が存在する。その封止は、溶接、接着剤、或はその他の任意の適した方法によって造ることができる。下部ガス透過性フィルム230の上面とガス透過性フィルム120の底面との間の間隔は、約５〜20mmにするのが好ましい。
可変酸素制御区画室220上にある液体の蒸発を最少にするために、下部ガス透過性フィルム230の下面を、上記した通りに基本培地ヘッドスペース170とガス状連絡状態に置くことができる。
細胞培養区画室40の形状又は大きさに関して制限はないが、高い濃度の細胞及び細胞分泌生成物を得るには、ガス透過性フィルム120と膜20との間の有利な間隔は、約１〜５ミリメートルである。ガス透過性フィルム120が実質的に平坦でありかつ水平である場合に、細胞30×106/表面積1cm2までが生育可能なままであると予想することができる。これらの細胞は、高さ約300マイクロメートルまでさん積することができる。これにより、膜20は、ガス透過性フィルム120から少なくとも1mmにある場合に、細胞に接触したり詰まらせられるようになる危険はない。
基本培地60交換の頻度を最少にするために、基本培地30の容積は、ガス透過性フィルム120の表面積に対する大きさにする。静的培養中に細胞百万／ミリリットルで存在する懸濁細胞について、ガス透過性フィルム120  1cm2に付き基本培地60約５〜10mlを要する。単分子層で生育する足場依存性細胞を培養する場合に、基本培地60の容積は、ガス透過性フィルム120の表面積を少なくとも２倍超えるのが有利である。
区画された組織培養フラスコ10のハウジングは、任意の生適合性材料にすることができる。好適な実施態様では、ハウジングは、光学的透明度をそなえ、それで培地を、培地のpHを求め或はあり得る微生物汚染を検出するために目視モニターすることができる。ポリスチレンが好都合な選択である。区画された組織培養フラスコ10の構築は、超音波溶接、機械的ファスナー、溶媒結合又は漏れ止め結合性をもたらすその他の任意の方法によることができる。ガス透過性フィルム120と膜20とは、ｏ−リング、ガスケット、溶接、接着剤、又は漏れ止め結合性をもたらすその他の任意の方法によってシールすることができる。好適な実施態様では、区画された組織培養フラスコ10において用いる材料は、すべてガンマ滅菌に適合すべきである。
図８は、区画されたマルチプルウエル組織培養プレート15の形式での本発明の更なる実施態様の平面図である。図９は、図８のＡ−Ａセクションを示す。この構造では、多数の異なる培養を一装置で実施することができる。この図面は、６つの培養をもたらすことができる実施態様を示す。その装置は、所望ならば、一層多い又は一層少ない培養をもたらすように構築することができる。基本培地60は、基本培地区画室30内にある。頂部カバー85が基本培地区画室30上にあって基本培地60を汚染させないようにする。
図９は、区画されたマルチプルウエル組織培養プレート15のそれ以上の実施態様の平面図である。この形式では、基本培地区画室30は、１つよりも多くの細胞培養区画室40と連絡する。
図２において前記した通りに、ガス透過性フィルム120の部分が細胞培養区画室40の中に突き出て、支持体110を必要としないで膜20の支持になる構造が可能である。
図３において前記した通りに、高密度細胞培養及び培養培地50の容積に関しての可変制御について有利な特徴を含むように適応させた構造が可能である。
図４において前記した通りに、基本培地区画室30の加湿されたガスをガス透過性フィルム120の下面に連絡状態に置くための特徴を加入した構造が可能である。
図５において前記した通りに、区画されたマルチプルウエル組織培養プレート15を、前記した通りに、装置を日常の取扱のためにCO2インキュベーターから取り出す場合に、急速なpH変化を防ぐためにスカート280を含むように適応させることができる。
図７において前記した通りに、可変酸素制御区画室220の特徴を含むように形作る実施態様が可能である。
当業者であれば、多数の変更をその精神から逸脱しないでなすことができる。従って、発明の幅を例示しかつ記載する実施態様に制限するつもりではない。むしろ、発明の範囲は、添付する請求の範囲及びそれらの均等物によって決められるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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