(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的液体サンプル中の被検物質の免疫化学的検出方法において以下の工程、すなわち、
ａ）  被検物質の第一の非標識特異的結合パートナーを、ピペットで吸引可能な粒状固相上に固定化する工程、
ｂ）  固定化された非標識特異的結合パートナーにサンプルを添加する工程、
ｃ）  反応混合物の１回目のインキュベーションを行う工程、
ｄ）  標識された特異的検出物質の既定量を添加する工程、
ｅ）  反応混合物の２回目のインキュベーションを行う工程、
ｆ）  以下の沈殿物質
ｉ）  固相に向けられた特異的結合パートナー
ii）  検出すべき物質に向けられた特異的結合パートナー
iii）  固相上に固定化された繋留物質に向けられた特異的結合パートナー
よりなる群からの物質の少なくとも１種を添加して固相を沈殿させる工程、
ｇ）  反応混合物を１０〜１０００×ｇで遠心分離する工程、
ｈ）  工程ｇ）で生じた上清の少なくとも一部を第二の測定チャンバーに移す工程、
ｉ）  第二の測定チャンバーにおいて検出反応を開始する工程、
ｊ）  検出反応から被検物質の濃度を決定する工程
を包含する方法。
【請求項２】
標識された特異的検出物質は標識された被検物質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標識された特異的検出物質は被検物質に対する少なくとも１種の付加的な標識特異的結合パートナーである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
検出すべき被検物質は１個または２個以上の特異的エピトープを有するハプテンまたはタンパク質である請求項１〜３の少なくとも一つに記載の方法。
【請求項５】
被検物質は１個のみの特異的エピトープを有するタンパク質である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被検物質は、天然たとえば動物もしくはヒト材料から単離されたかまたは遺伝子操作もしくは合成によって製造された請求項２に記載の方法。
【請求項７】
被検物質は検出が望まれる被検物質に部分的にのみ一致するかまたは化学的もしくは生化学的に改変されている請求項２に記載の方法。
【請求項８】
特異的結合パートナーは以下の物質、すなわち抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、もしくはそれらの誘導体、補体因子Ｃ１、マンナン−結合タンパク質または補因子からなる群より選択される請求項３に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識は放射化学的に検出可能な元素、蛍光もしくは化学発光化合物、または適当な二次的反応によって検出可能な酵素もしくは補因子である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酵素が標識として用いられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
免疫複合体の形成は硫酸デキストランおよび／またはポリエチレングリコールによって加速される請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
沈殿物質は被検物質に向けられている請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
結合体は沈殿物質と反応しない標識された改変被検物質からなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
沈殿物質はさらに第一の非標識特異的結合パートナーに付加的にカップリングされる物質に向けられる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
沈殿物質は沈降速度を増大させるために、不溶性の固相上にそれ自体が固定化される請求項１〜１４の一つに記載の方法。
【請求項１６】
第一の非標識特異的結合パートナーは固相には結合しない請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
固定化に用いられる固相は、本技術分野の熟練者にそれ自体既知の、ガラス、ゼラチン、アガロース、脂質、赤血球、血小板、白血球、金属コロイド、合成材料および磁化可能な合成材料のような粒子の群より選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
合成粒子は、ポリスチレン、ポリデキストラン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリルアミドまたはスチレン−ブタジレン、スチレン−メタクリル酸もしくはメタクリレート−メタクリル酸の共重合体からなる群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
沈殿物質は、抗体、レクチン、基質もしくはその類縁体、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンもしくはその誘導体、補体因子Ｃ１、マンナン−結合タンパク質、補因子または所望の反応パートナーとの特異的結合に加わる他の物質である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
沈殿物質は抗体である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
沈殿反応（ｆ）は反応メジウムを変更することによって加速する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
分離はpHを変化えることにより加速する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞をピペットで吸引可能な粒状固相として使用し、これらの細胞の１種または２種以上の表面抗原に対する抗体を沈殿物質として使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
磁化可能な粒子をピペットで吸引可能な粒状固相として使用し、磁性粒子を沈殿物質として使用するか、またはその逆の方法で、磁性粒子を固相として使用し、他の磁性粒子または磁化可能な粒子を沈殿のために使用する請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
沈殿物質の特異的結合パートナーが第一の特異的結合パートナーとは異なる種からのものである請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
反応混合物を２００〜８００×ｇで遠心分離する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は不均一系イムノアッセイを実施する方法に関し、さらに詳しくはコーティングされた固相を液相から沈殿ついで遠心分離によって分離し、検出可能な活性を液相に残留させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
被検物質、たとえば、生物学的液体中には低濃度でしか存在しないがその検出は疾患の診断および治療に重要な抗体の検出には、免疫化学的方法が頻繁に用いられる。
【０００３】
免疫化学定量法は均一法と不均一法に区別される。均一法においては結合パートナーが検出反応に先立って分離されることはないが、不均一法では、結合反応および検出反応は、結合および検出パートナーの物理的分離後に順次行われる。均一系検出法たとえば粒子−増幅凝集法における濁度の測定は、不均一法に比べて、速やかに行われることが多い反面、分離工程がないことにより干渉を受けやすくそして感度は低いことが多い。
【０００４】
さらに、直接検出法と競合検出法によっても区別される。直接検出法では、結合反応および検出反応は被検物質上で、たとえば被検物質を固相上の第一の抗体に結合させ、この複合体に、検出可能な構成成分をもつ第二の抗体の結合体を結合させることにより、たとえばサンドイッチアッセイ法で行われる。これとは対照的に、競合検出法では、サンプルの被検物質は、たとえば被検物質−特異的抗体でコーティングされていてもよい固相への結合に際して、標識された被検物質または被検物質様化合物と競合する。競合は、均一系においてもたとえば凝集反応の阻害により、また不均一系においてもたとえば固相に結合した標識被検物質の量の定量により、いずれの系でも検出できる。このような競合法は、ただ１個の特異的結合部位をもつ被検物質の検出、または１回の結合反応のみが可能で直接検出法の場合に要求されるような２回の結合反応（固相および結合体）は不可能な極めて小さい分子（ハプテン）の場合の検出に有利に用いられる。
【０００５】
ただ１個の特徴的エピトープを有するタンパク質の検出ならびにハプテンの検出には、試験のデザインに特別な要求が提起される。すなわち、凝集原理による均一系イムノアッセイはたとえば、せいぜい競合的デザインでのみ可能である。これらのアッセイの感度は、最初に述べたように通常低いことから、不均一法が要求される。被検物質または結合してまだ溶液中にある被検物質結合体の分離には、慣用の不均一系免疫学的方法では、被検物質に相補性で、支持体たとえば小チューブまたはマイクロタイトレーションプレート上に固定され、したがって洗浄可能な結合パートナーが利用される。さらに発展した不均一法では、ピペットで吸引可能な固相は様々な量の様々な被検物質の測定を可能にするので（「ランダムアクセス」）その使用が有利である。たとえば、コーティングされた粒子がピペットで吸引可能な固相として用いられる。
【０００６】
すなわち、たとえばＤＥ４１ ２６ ４３６号には、被検物質の免疫化学的単離を行うためにアガロース粒子にカップリングさせた抗体のイムノクロマトグラフィーにおける使用が記載されている。そのほか、コーティングされた微粒子を被検物質の分離に使用する他の方法も記載されている。これらの方法は互いにコーティングされた粒子の分離を行う方法が相違する。
【０００７】
検討する溶液中の微粒子懸濁液をろ過することによる分離も、以前にたとえばＤＥ４１ ２４ ７７８号に記載されている。また類似の方法を競合イムノアッセイの場合に採用することもできる。測定されるものは固相上に残存する被検物質の量、または競合法においては、ろ液中に残存する遊離被検物質／酵素結合体の量である。さらに他の変法では、免疫複合体中に残存する被検物質／酵素結合体を再び遊離させて酵素の活性が測定される。
【０００８】
コーティングした粒子を被検物質含有溶液と接触させたのち手操作で分離し、結合した被検物質を洗浄したのちさらに分析に付す方法も記載されている。
【０００９】
たとえば、ＵＳ（９１／７１６,１４４）にはコーティングされた磁性粒子を磁石の近接によって固定化する方法、およびこうして洗浄したのちに結合した被検物質をさらに分析に付す方法が記載されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに記載されているこれらのすべての方法は分離系に特異的に連動した装置を必要とする。したがって、特別の洗浄および／または分離装置を必要としないで現在行われている臨床化学的分析装置にも適用可能な固相の分離方法が求められている。
【００１１】
ＪＰ ８６−２３０９２５では、被検物質／酵素結合体の存在下に被検物質を抗体でコーティングされたポリスチレン粒子に結合させ、遠心分離によって反応溶液から分離し洗浄する。沈澱の酵素活性が測定される。しかしながら、この方法は極めて強い遠心力を必要とし、したがって現在用いられている遠心分離分析装置では使用できない。その上、記載された方法では別個の洗浄工程が必要になる。現在用いられている遠心分離分析装置の作動加速度は最高約１５００×ｇまでである。
【００１２】
ＪＰ ８８−１４３２５７では、被検物質に向けられたコーティング粒子および抗体結合体で構成される混合物を直接法で形成させ、この混合液を被検物質含有溶液とともに室温で数時間放置する。ついで上清中に残存する抗体結合体の可溶性活性を別個に測定する。この方法の説明はこの点には触れていないが、生成した粒子−被検物質−抗被検物質／結合体から構成される複合体が長時間のインキュベーションの間に沈降して、上清中の抗−被検物質／結合体は遊離被検物質の量に相当する程度まで除去されることが明白である。この方法は、沈降に必要な時間として極めて長いためインキュベーション時間が要求され、またこれらの結合体含有複合体も機械的振動またはピペットアームの浸漬の深さの変動により結合体の定量に関与するようになる可能性があることから、極めて不満足なものである。
【００１３】
ＧＢ ８４−１１７０６では、被検物質（ハプテン）、抗−被検物質抗体／標識１結合体および被検物質／標識２結合体から構成される混合物が、第一のインキュベーションにおいて、抗被検物質抗体標識１結合体と遊離被検物質とから、または競合的に被検物質／標識２結合体とから複合体が形成されて分離される。結合した被検物質／標識２結合体は、その後の工程で、標識１を結合することによりそれを固相上に固定化して分離される。この目的では、標識１に向けられた抗体でコーティングされた小チューブがとくに使用される。他の変法では、標識１に対する抗体を最初に添加し、ついでこれらの抗−標識１抗体に対する抗体でコーティングされたカオリンを添加する。この第二の変法においては、分離は遠心分離により達成される。次いで、沈殿中の標識２の活性が検出されるが、沈殿は溶液中からの相当する持ち込みを除去するためにさらに洗浄しなければならない。この方法は極めて複雑である．すなわち、第二の変法では３種の異なる抗体が用いられる。これにより、必要なインキュベーション時間は数時間にも及ぶことになる。さらに、この方法はハプテンの検出に限定される。
【００１４】
以前に記載された方法の一部は既に実用化されているが、現在用いられている遠心分離分析装置での使用に最適な慣用方法は見出されていない。
【００１５】
本発明の基盤にある技術的問題は、したがって、現在用いられている遠心分離分析装置の一つでの使用に適当な不均一系免疫化学的検出方法を見出すことであった。
【００１６】
【発明を解決するための手段】
この技術的問題は請求範囲に記載の実施態様の条項により解決される。
【００１７】
驚くべきことに、このような方法は、サンプルを固定化された特異的結合パートナーおよび標識された特異的検出物質とインキュベートしたのち以下の物質、すなわち、
ｉ）  固相に向けられた特異的結合パートナー
ii）  検出すべき物質に向けられた結合パートナー
iii） 固相上に固定化された繋留物質に向けられた結合パートナー
（これらの抗体は非標識特異的結合パートナーの抗体とは異なる種からのものであることが好ましい）よりなる群からの物質少なくとも１種を添加して固相を沈殿させ、現在用いられている遠心分離分析装置により約２００〜８００×ｇの加速度で遠心分離し、次いで検出のために、使用されなかった標識特異的検出物質の濃度を上清中で定量することによって実行可能であることが観察された。
【００１８】
この新規な効果はおそらく、粒子の沈殿が、これらの粒子に対して高い親和性を有する「結合パートナー」（実施例４参照）の添加により、粒子の沈殿速度が、現在用いられている遠心分離分析装置でも分離は約０.１〜１０分好ましくは１〜３分という短時間で起こる程度にまで上昇することによるものと考えられる。本技術分野の熟練者は適当な実験により、結合パートナーの濃度を、たとえば高用量−フック効果の回避を期待して、適当な様式で容易に調整することができる。
【００１９】
検出感度はラテックス懸濁液を希釈することにより改良することができる（実施例５）。しかしながら、被検物質／酵素結合体の濃度はそれに応じて低下することから、上清中に存在する酵素活性を間接的に、すなわち付加的な下流反応を用いて測定することが必要になる場合も考えられる（実施例６）。
【００２０】
この新規な方法の顕著な特徴は、ピペットによる吸引工程数が少ないこと、必要な成分数が少ないこと、およびとくに実行時間が著しく短く、通常１〜６０分の範囲好ましくは１０〜３０分の範囲で行われることである。すなわち、この新規方法では２種からの抗体を必要とするのみである。さらに、この新規方法では、測定は上清に対して直接行われる。しかも、この方法は特別の洗浄または分離装置を必要とせず、したがって現在用いられている臨床化学的分析装置に適用可能である。その上、この方法論的アプローチは競合および直接検出法の両者に用いることができる。最後に、この方法はハプテンおよび１個のみの特異的エピトープを有する物質の検出、ならびに複数個の特異的エピトープを有する物質の検出いずれにも使用可能であり、したがって以前に報告されている方法に比べてその適用可能範囲はかなり広い。
【００２１】
【発明の実施の形態】
測定方法に応じて、標識特異的検出物質は、競合アッセイの場合には標識被検物質であり、またサンドイッチアッセイの場合には標識特異的結合パートナーである。
【００２２】
標識特異的結合パートナーは、検出可能な標識を直接もっているか、さもなくばそれを介して標識または検出反応に連結できる基をもっている特異的結合パートナーである。
【００２３】
本発明の意味の範囲内では、標識被検物質は、たとえば、被検物質、被検物質誘導体および検出可能な標識を直接もっているかさもなくばそれを介して標識に連結できる基をもっている被検物質類縁体である。
【００２４】
本発明の意味の範囲内では、標識は、たとえば酵素、同位元素、蛍光もしくは化学発光基、または他の染色もしくは着色粒子とすることができる。
【００２５】
本発明の意味の範囲内では、特異的結合パートナーは、たとえば、抗−被検物質抗体、特異的レクチン、受容体または類似の分子である。
【００２６】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００２７】
実施例１ａ）
抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬の調製
ラテックス試薬は、Kapmeyer W．H．ら、J．Clin．Lab．Anal. 2：76〜83(1988)に従って調製された。１mlのグラフトポリマーを０.１mlの抗体溶液〔Ｆ１＋２プロトロンビンフラグメントのＣ末端に対する特異的ウサギ抗体（その調製についてはＥＰ ０ ３０３ ９８３参照；濃度：０.５ mg／ml）〕および０.０５mlの２０％Tween（登録商標）２０水溶液と混合した。シェルポリマー上の保護アルデヒド基を活性化するため、約０.０１mlの１Ｎ ＨＣｌ溶液を用いて懸濁液をpH２.５に調整した。室温で３０分間インキュベートしたのち、２５mgの水素化ホウ素ナトリウムを１mlの１Ｍリン酸水素ナトリウムの溶液（pH６.５）に溶解し、この溶液０.２５mlをコーティング溶液に添加した．抗体を室温で１時間、活性化したアルデヒド基にカップリングさせた。次いで、ラテックス／抗体結合体を遠心分離して（Beckman 遠心分離装置、４０,０００×ｇ、３０分）、ペレットを０.１モルのグリシン緩衝液〔pH８.２；０.１７Ｍ ＮａＣｌおよび０.５％Tween（登録商標）２０含有〕１.５mlに再懸濁した。溶液を約５秒間超音波処理した（Bronson B 15 Sonifier）。この保存溶液は＋４℃で貯蔵した。
【００２８】
実施例１ｂ）
アルカリホスファターゼ(ＡＰ)または西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)とのＦ１＋２ペプチド結合体の調製
ａ）  方法の原理
酵素／ペプチド結合体は、最近の原理に従い、たとえばP．Tijssen（Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology；Vol 15，Elsevier Sciences Publishers B．V.，Amsterdam-New York-Oxford，1988）に記載のような異種二官能性リンカーを用いて調製される。合成的に調製した抗原（Ｆ１＋２ペプチド；Behringwerke AG より入手）のアミノ末端にシステインを付加した（ＥＰ ０ ３０３ ９８３参照）。ペプチドのＮ−末端システインのＳＨ基と、結合する酵素のＮ−末端のアミノ官能基の間の結合はｍ−マレイミドブチリル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＭＢＳ；Servaより）を用いて行う。酵素／酵素結合体の形成を回避するために、実際のカップリングの前にＮ-エチルマレイミド（ＮＥＭ；Servaより）を用いて酵素上の遊離ＳＨ基はすべて保護される。
【００２９】
ｂ）  ＳＨ−保護酵素の調製
８.８mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）あるいは１５mgのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（両者ともBehringer Mannheimより入手）を１mlのカップリング緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）中に溶解させる。０.１mlのＮＥＭ溶液（Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中１８mg／ml）を室温で撹拌しながら滴加する。容器を密閉し室温で１時間撹拌しながらインキュベートする．ついで溶液を反応緩衝液（０.１ mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、pH８.０；ＡＰの場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）に対して透析し、必要な場合はCentrikons（Amiconより；排除サイズ＜１０kD）で約１mlに濃縮する。
【００３０】
ｃ）  酵素への反応性マレイミド官能基の挿入
０.１mlのＭＢＳ溶液（Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中１００mg／mlのｍ−マレイミドブチリル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル）を実施例１ｂ）からの反応緩衝液約１ml中のＳＨ−保護酵素に、室温で撹拌しながら滴加する．混合物を１時間撹拌し、溶液をカップリング緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）に対して透析する。必要な場合には、活性化酵素溶液をCentrikons（Amiconより）を用いて約２mlに濃縮する。
【００３１】
ｄ）  ペプチドの活性化酵素へのカップリング
Ｆ１＋２ペプチド２mgを、２mlのカップリング緩衝液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０；ＡＰの場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）中に溶解する。実施例１ｂ．ｃ）からの活性化酵素溶液２mlをついで撹拌しながら添加する。密閉した容器を室温で１時間、撹拌しながらインキュベートする。
【００３２】
ｅ）  残留マレイミド基の飽和
新たに調製された４００μlのシステイン溶液（０.１mol／リットル リン酸ナトリウム緩衝液、５mM ＥＤＴＡ、pH６.０中１０mmol／リットル；ＡＰの場合には、さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）を実施例１ｂ．ｄ）からのカップリング溶液に添加し、ついで混合物を約１０分間撹拌する。
【００３３】
ｆ）  Ｆ１＋２ペプチド／酵素結合体の透析および保存
実施例１ｂ．ｅ）からのカップリング溶液を結合体透析メジウム（５mmol／リットル トリス塩酸塩、０.９ｇ／リットル フェノール、pH７.４；ＡＰの場合さらに１mmol／リットルＭｇＣｌ2および１μmol／リットルＺｎＣｌ2）に対して透析し、−２０℃で保存する。
【００３４】
実施例１ｃ）
Ｆ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体を用いるＦ１＋２ペプチドの直接測定
２５μｌのＦ１＋２ペプチド（サンプル）を、実施例１に従って調製してその保存溶液を試験メジウム（０.０２mol／リットル トリス塩酸塩、９ｇ／リットルＮａＣｌ、０.５ｇ／リットルTween２０、pH８.２）中１：３０に希釈した抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬５０μlに添加し、この混合物を＋３７℃で１５分間インキュベートする。ついで２５μlのＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体（実施例１ｂに従い西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて調製；試験メジウム中１：５０００に希釈）を混合し、この新たな混合物を＋３７℃でさらに１０分間インキュベートする。ヤギ抗−ウサギ抗体溶液（Behringwerkeより；１０mmol／リットル トリス塩酸塩、０.４５ｇ／リットルＮａＣｌ、０.２５ｇ／リットルTween２０、５０ｇ／リットル ポリエチレングリコール６０００、pH８.０中０.０５６ｇ／リットル）を添加し、混合物を＋３７℃でさらに３分間インキュベートする。沈澱した粒子をついで、３分間、４００×ｇでの遠心分離によって分離する。１０μlの上清を採取し、１００μlのＰＯＤ基質溶液（Behringwerke AGより）と室温暗所で３０分間インキュベートする。１００μlの０.５Ｎ硫酸を添加して基質反応を停止させ、吸光度を４９２nmで測定する。１.９〜１９１９０nmol／リットルのＦ１＋２ペプチドの測定範囲で得られた吸光度を表１に掲げる。
【００３５】
この実験デザインは検査室においてエッペンドルフ管中で行われた。このデザインはまた、臨床化学用遠心分離分析装置を適当にプログラムすればそれを用いて行うことも可能であり、したがって自動化の可能性も提供される。
【００３６】
【表１】
0003684454.tif 000002
【００３７】
実施例２
本発明に従って固相を沈澱させることによる分析感度の上昇
標準曲線はＦ１＋２ペプチドを濃度範囲１.９〜１９１９０nmol／リットルで用い、実施例１ｃ）の試験デザインを使用してプロットした。実施例３の試験デザインからの変法として抗−ウサギ抗体での抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬の沈澱を行わずに測定を実施した。さらに遠心分離条件を加速度（２００〜４００×ｇ）および持続時間（２〜１０分間）に関して変動させた。結果は表１にまとめる。
【００３８】
とくに、臨床化学用遠心分離分析器で通常得られる低遠心加速では、固相を本発明に従って沈澱させた場合にのみＦ１＋２の測定が可能である（図１）。標準曲線は沈澱抗体が添加された場合の方が急峻であり、すなわち、より良好な精度および感度が得られる。さらに、バックグラウンド（Ｆ１＋２ペプチド非添加）がより低下し、すなわちシグナル対バックグランド比の改善が認められる。被検物質および被検物質／酵素結合体の拡散経路が可能な限り短くなることを保証するためインキュベーション相または混合相で固相が沈澱してはならないことから、沈澱試薬の不存在下にはほとんど沈降がないこともまた有用である。しかしながら、この差は高遠心加速時にも持続する（図２および３）。沈降は加速度と時間の積によって決定されるので、分析感度は加速度の長時間の継続（図４；沈澱抗体の存在下、２００×ｇで２〜１０分間）ならびに加速度の増強（図５、沈澱抗体の存在下、２００〜８００×ｇで５分間）の両者によって達成することができる。
【００３９】
実施例３
ラッテックス試薬濃度の変化による測定範囲の調整
一般に、例２に述べたような、遠心加速度および／または遠心持続の増大による分析感度および精度を向上させる能力は、装置のデザインによって制限される。これに加えて、遠心分離時間が長すぎるとその試験の単位時間処理能力が実質的に低下する。ラテックス試薬の量を減少させこれに応じて被検物質／酵素結合体の量も減少させることによって測定範囲を変更することの方がかなり有利である。
【００４０】
０.６〜５７５７５nmol／リットルの範囲での標準曲線を、新規な方法に従い、Ｆ１＋２ペプチドを用いて作成した。実施例１ｃ）の試験デザインからの変法として、１：１５または１：３０に希釈した抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬および１：３０００または１：５０００に希釈したＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体を用いて試験を行った。さらに、遠心分離は３０００×ｇで行った。しかしながら、基質のインキュベーションは１５分のみに限定した。反応試薬（固相および結合体）を大幅に希釈した結果として、測定可能領域、すなわち分析感度は約５０〜５０,０００nmolから約２〜２０００nmolに移動した（表２）。これは図６に明瞭に示されている。図中には、結合体の濃度差によりグラフ表示中にバックグランドシグナル（０ng／ml）による修正を行った。
【００４１】
【表２】
0003684454.tif 000003
【００４２】
実施例４
下流増幅反応を用いるＦ１＋２ペプチドの測定
分析感度を上昇させるため、上清に残留する酵素活性を直接測定せずそれに代えて増幅反応の下流挿入により測定した。Harborn，St.らの系〔Anal．Biochem.206：119-124(1992)；PCT WO 90/01559〕を増幅に用いた。この系は、脱リン酸化型の場合にアミノ酸オキシダーゼの補酵素としてのみ働くリン酸化フラビンアデニンジヌクレオチドの切断を基盤とするものである。アミノ酸オキシダーゼの活性は、アミノ酸の酸化時に放出されその一部は添加されたペルオキシダーゼの基質として働く過酸化水素によって検出される。ペルオキシダーゼはその基質（４−アミノアンチピレンおよび３,５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート）を変換して、最終的に５４０nmで測定可能な呈色反応を生ずる。この呈色反応が結局、形成される補酵素の量に直接依存し、この補酵素がアポ−アミノ酸オキシダーゼの活性を実質的に増幅させる。補酵素はホスファターゼによって遊離され、この理由から、この場合はＦ１＋２ペプチド／ＡＰ結合体が例２に記載のようにして調製され、新規方法に従って使用された。検出反応に必要な他の試薬はLondon Biotechnology，Londonからそのまま使用できる形で入手した。
【００４３】
実施例１ｃ）の記載のように試験を実施したが、抗−Ｆ１＋２ラッテックス試薬および、それに対応してＦ１＋２ペプチド／ＡＰ結合体の濃度は、それぞれ開始溶液を１：５００および１：１０,０００に希釈し、実施例３に比較してさらに低下させた。増幅系を用いた場合と用いない場合（実施例３より）のＦ１＋２ペプチドの検出結果を表３に比較する。関連試験−特異的バックグラウンド（０値）について補正後の結果の比較を図７に示す。上清中に残存する結合体を検出するための付加的連鎖反応の使用は、この例では、検出感度に約２nmol／リットルから少なくとも０.２nmol／リットルへの改善を生じる。
【００４４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】新規方法において固相を結合可能なリガンドとともに遠心力２００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応において得られる４９２nmでの吸光度に及ぼす影響を示す。
【図２】新規方法において固相を結合可能なリガンドとともに遠心力４００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応において得られる４９２nmでの吸光度に及ぼす影響を示す。
【図３】新規方法において固相を結合可能なリガンドとともに遠心力８００×ｇおよび遠心分離時間５分で沈澱させる効果を示す図であり、本発明に従って固相を沈澱させた場合（実線）および沈澱させなかった場合（破線）、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度が検出反応において得られる492 nmでの吸光度に及ぼす影響を示す。
【図４】新規方法においてＦ１＋２ペプチドを用いた検出反応の、遠心力２００×ｇでの遠心分離の持続に対する依存性を示す図であり、沈澱した固相を２分間（点線）、５分間（破線）および１０分間(実線)遠心分離した場合、検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対する混合物中Ｆ１＋２ペプチドの濃度の影響を示す。
【図５】新規方法においてＦ１＋２ペプチドを用いた検出反応の、５分間の遠心分離時に適用された遠心力に対する依存性を示す図であり、２００×ｇ（点線）、４００×ｇ（破線）および８００×ｇ（実線）で遠心分離した場合、検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対する、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度の影響を示す。
【図６】新規方法において、反応成分の濃度変化がＦ１＋２ペプチド検出の測定可能域および感度に及ぼす影響を示す図であり、抗−Ｆ１＋２ラテックス試薬およびＦ１＋２ペプチド／ＰＯＤ結合体のそれぞれ１：３０および１：５０００希釈を使用した場合（希釈混合物；実線）ならびにそれぞれ１：１５および１：３０００希釈を使用した場合（濃厚混合物；破線）に検出反応で得られる４９２nmの吸光度に対する、混合物中のＦ１＋２ペプチドの濃度の、試験特異的バックグランド反応（０ng／ml）を差し引いた値に及ぼす影響を示している。
【図７】新規方法において検出感度を増幅するための下流反応系の存在下および不存在下でのＦ１＋２ペプチド検出を示す図であり、Ｆ１＋２ペプチド／西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を用いた非増幅検出において４９２nmで得られた吸光度（破線）、およびＦ１＋２ペプチド／アルカリホスファターゼ結合体を用いた増幅検出系において５４０nmで得られた吸光度（実線）から試験特異的バックグランド反応（混合物中にＦ１＋２ペプチドは存在しない）を差し引いた値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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