(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キラール化合物をその構成対掌体に分離する方法であって、該キラール化合物を下記一般式を有するキラール界面活性剤の有効量と、電気泳動の毛管クロマトグラフィー条件下で接触させることを含む方法。
0003699115.tif 000018
式中、Ｒ1＝Ｃ4〜Ｃ18の直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18の分岐鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のハロゲン置換直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のポリエーテル炭化水素、キラール中心をもつＣ4〜Ｃ18のアルキル、上記のすべてのアルキルは不飽和結合を有していてもよく、及びコレステロール炭化水素（cholesterolic hydrocarbons）であり、Ｙ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であり、Ａ＝ＮＨ、ＣＯ、ＳＯ又はＳＯ2であり、Ｘ＝ＣＯ、Ｏ又はＮＨであり、Ｃ＝炭素であり、ａとｂは同一でなく、ｎは１から５までであればよく、Ｚ＝ＣＯＯ-、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ3-、ＰＯ4-、ＮＲ’3+、ＰＲ’3+、−ＯＨ、ポリエーテル類、両性イオン類、ポリアルコール類であり、Ｒ’＝Ｈ又はＣ1〜Ｃ4の直鎖又は分岐の炭化水素であり、ハロゲン化されていてもよく、不飽和結合を有していてもよい、そしてＲ1が直鎖の炭化水素であり、Ｙ＝ＣＨ2であり、Ａ＝ＣＯであり、Ｘ＝ＮＨであり、Ｚ＝ＣＯＯ-であり、ａ又はｂ＝Ｈであるがａとｂは同一でないときは、ａ又はｂは低級アルキルでない。
【請求項２】
Ｙ＝Ｏ、Ａ＝ＣＯ、Ｘ＝ＮＨ、ａ＝アミノ酸側鎖かつｂ＝Ｈ、又はその逆、そしてＺ＝ＯＨ、ＳＯ4-、又はＣＯＯ-である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｙ＝ＮＨ、Ａ＝ＣＯ、Ｘ＝ＮＨ、ａ＝アミノ酸側鎖かつｂ＝Ｈ、又はその逆、そしてＺ＝ＯＨ、ＳＯ4-、又はＣＯＯ-である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｙ＝ＣＨ2、Ａ＝ＳＯ2、Ｘ＝ＮＨ、ａ＝アミノ酸側鎖かつｂ＝Ｈ、又はその逆、そしてＺ＝ＯＨ、ＳＯ4-、又はＣＯＯ-である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｙ＝ＣＨ2、Ａ＝ＣＯ、Ｘ＝ＮＨ、ａ＝低級アルキル以外のアミノ酸側鎖かつｂ＝Ｈ、又はその逆、そしてＺ＝ＯＨ、ＳＯ4-、又はＣＯＯ-である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｙ＝ＣＨ2、Ａ＝ＮＨ、Ｘ＝ＣＯ、ａ＝アミノ酸側鎖かつｂ＝Ｈ、又はその逆、そしてＺ＝ＮＲ’3+、ここで、Ｒ’＝Ｈ又はＣ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐の炭化水素であり、ハロゲン化されていても不飽和であってもよい、請求項１記載の方法。
【請求項７】
キラール界面活性剤が下記式を有するものからなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項１記載の方法。
0003699115.tif 000019
0003699115.tif 000020
0003699115.tif 000021
【請求項８】
該キラール化合物を第２のキラール界面活性剤を含む第２の容器と接触させることを含む請求項１記載の方法であって、該キラール界面活性剤が混合キラール界面活性剤処方となるように混合されるものである方法。
【請求項９】
該キラール界面活性剤が実質的水性溶液中でその臨界ミセル濃度、又はそれより高い濃度で存在する、請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該電気泳動条件が実質的電気浸透流を含むものである、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該キラール化合物がアスパルテームである、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
該キラール化合物が生体液（biological fluid）中に混在しているものである、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該生体液が尿である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アスパルテームを分析する方法であって、アスパルテームの試料を、請求項１〜７いずれか１項に記載のキラール界面活性剤を含む電解質を有するミセル電気動力学毛管電気泳動装置中に注入する工程、アスパルテームの対掌体を分離する工程、及び次いで分離された対掌体を検出する工程を含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１〜７いずれか１項に記載のキラール界面活性剤とを組合わせた、キラールな化合物をそれらの構成対掌体に分離するための装置であって、
（ａ）ミセル・キラール毛管電気泳動に有効な電解質、
（ｂ）該電解質を含むことができるチャンネル（channel）、
（ｃ）少なくとも約１０Ｖ／ｃｍ〜約１ｋＶ／ｃｍの電界強度を作りだすことができる電源、
（ｄ）該チャンネルの該両端に電気的に連結された少なくとも１個の陽極と陰極、そして
（ｅ）該分離された対掌体の存在を検知するための検出器、
を含んでなる装置。
【発明の詳細な説明】
１．技術分野
本発明は、クロマトグラフィーの分野におけるものである。殊に、本発明はミセル電気動力学的毛管クロマトグラフィーによるキラール化合物分離法の改良に関する。
２．背景技術
毛管電気泳動（“ＣＥ”）は良く知られた分離技術であり、分離に関与している者の関心が高まっている技術である。それは電気泳動の改良法であり、典型的には、紙又はゲルのような２次元の表面の代わりに薄いガラス製毛細管中で実施される。この技術は、競合する分析技術、例えばゲル電気泳動、ガスクロマトグラフィー、及び液体クロマトグラフィーと比較すると、高効率、高分離能、迅速分離、少試料分析能、及び必要な装置の観点から望ましい単純さなどの利点を提供する。すべての分離システムと同様に、高い分離能が最終目的であり、そして他のシステムと同様に分離能は効率（理論段数(theoretical plates)と選択性の関数である（ワインバーガー（Weinberger,R.“Practical Capillary Electrophoresis”,Academic Press,San Diego,CA 1993）。
毛管電気泳動の利点は、大部分、分離過程で発生する熱の効果的な除去を可能とする狭い直径の毛細管を使用することから生ずる。この熱の除去により、分離能を低下させる対流による混合が阻止される。狭い直径の管は、電流を制限し従って熱の発生を制限しつつ毛細管内に電場を作りだすために高い電圧をかけることも可能とする。
ＣＥ分離は、支持電解質で毛細管を充填することから開始する。次に少量の試料を毛細管の一端に注入する。試料注入量の範囲は典型的には１〜２０ナノリットルである。試料注入後、高電圧を毛細管に加える、そして試料成分を荷電／質量比の相違に基づき分離する。毛管電気泳動分離は電気浸透流と呼ばれる大量液流で増強することもできる。これが存在すると、すべての成分が同じ速度で毛細管中を移動し、そして一般的には異なる試料成分の分離能には寄与しない。最後に、試料成分はＵＶ検出器のような適当な検出器を通過する。これは分離されたそれぞれの試料帯の検出と定量を行うことができる。
ミセルとは界面活性剤分子から形成されるコロイド粒子である。ミセルの存在下に毛管電気泳動を実施することは、通常ミセル電気動力学クロマトグラフィー（micellar electrokinetic chromatography）と呼ばれる（Terabe,S.,Otsuka,K.,Ichikawa,K.,Tsuchiya,A.,and Ando,T.Analytical Chemistry,1984,(56)111-113、Terabe,S.,Otsuka,K.,and Ando,T.Analytical Chemistry,1985,(57)834-841）。この用語は、ミセル電気泳動分離（micellar electrophoretic separations）（電気浸透流が無視できる場合の分離）とミセル動力学的分離（micellar electrokinetic separations）（電気浸透流が分離時間に影響を与える場合の分離）の双方を指すために使用される。ＭＥＫＣにおける滞留と分離能に対する方程式は方程式１及び２のように示される（Terabe,S.,et al.上記）。
0003699115.tif 000002
式中、ｔr＝溶質の滞留時間
ｔo＝ミセルが存在しない場合の溶質の滞留時間
ｔmc＝ミセルの滞留時間
そしてｋは溶質の容積因子（capacity factor）である。
0003699115.tif 000003
式中、Ｎ＝効率（理論段数（theoretical plates））
α＝選択性。
方程式３は、ＨＰＬＣのための分離能方程式（resolution equation）であり、用語はすべて上記のとおりである。
0003699115.tif 000004
ＭＥＫＣの分離能方程式はＨＰＬＣの分離能方程式に極めてよく似ている。事実、ｔmcが無限大に近づくにつれて方程式は同一（方程式３）になる。ｔmc又はｔoが無限大に等しい場合を考えると、ＨＰＬＣとＭＥＫＣの間の相違を容易に知ることができる。ＨＰＬＣとＭＥＫＣの間の実際的相違は分離能方程式の効率の項に関連する。ＨＰＬＣでは、Ｎ（理論段数）の典型値は５０００であるが、ＭＥＫＣのＮの典型値は１００，０００である。定量的面では、二つのピークの分離に対する広く受入れられている目標値は１．５という値である。ｋ’＝１と仮定すれば、１．５という分離能の要求はＨＰＬＣの場合１．２０というαの値が要求されることになる。しかしながら、ＭＥＫＣの効率がはるかに高いため同じ１．５という分離能を達成するためには極めて小さなα値である１．０４でよいことが分かる。従って、多くの部分的ＨＰＬＣ分離に伴う小さなα値がＭＥＫＣ系で達成され得るであろうときは、有用な分離能が得られるであろう。（分離能は、（（α−１）／α）の項に依存しており、１．０４というα値は１．０２というα値の２倍の分離能を与える点に注意せよ。）
キラール分離は種々の技術を用いて達成できる。過去３０年にわたって、研究者はキラール分離が、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及び液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（Zief,M.and Crane,L.J.編“Chromatographic Chiral Separations”Marcel Dekker,Inc.,New York,Basel,1988）、ゲル電気泳動（Barton,J.K.,J.Biomolecular Structure and Dynamics,1983,(1)621-632）、ペーパー電気泳動（Fanali,S.,Cardaci V.,Ossicini.L.,J.Chromatogr.1983,(265)131-135）、及び毛管電気泳動（ＣＥ）（Snopek,J.,Jelinek,I.and Smolkova-Keulemansova,E.Journal of Chromatography,1992,(609)1-17）を用いて可能であることを明らかにした。これらの分離は、試料中の対掌体が分離系の一部であるキラール相と異なる相互作用をするという能力に基づく。
キラール相は様々な方法で具体化することができる。クロマトグラフィーではキラール相は通常固定相即ちカラムの一部である。ＧＣ、ＬＣ共に多様なキラールカラムが入手可能である。固定相による対掌体の吸着が非キラール相互作用とキラール相互作用両者の総和である。非キラール相互作用にはイオン相互作用、水素結合、及び疎水性吸着が含まれるかも知れない。キラール相互作用は非キラール相互作用の空間的関係から生ずる。このキラール相互作用が寄与するエネルギー差はキラール分離の基礎である。
キラールクロマトグラフィー系の電流発生効率は一般に低い。従ってキラールモディファイアーと対掌体との間の相互作用の自由エネルギー差は適当な分離能を得るためには比較的大きくなければならない。この大エネルギー差という要求は多くのキラールＨＰＬＣ系の低効率（５０００〜１００００段数）に寄与しており、そしてピークのテーリングが多くのキラールカラムで観察される。この大エネルギー差という要求はキラールＨＰＬＣカラムが一般的に使用されるのを妨害してもいる。今日、キラールＨＰＬＣカラムは小型の化合物に選択的であり、５０以上のキラール相が市販されている。この状況で、方法の開発は高度に経験的であり、そして極めて退屈なものである。キラール分離それ自体は今日ほとんど新規性はない。チャレンジすべきは、より大型の対掌体を分離する系を創り出すこと又はより簡便な方法の開発を提供することにある。
通常の電気泳動では、キラール相はゲルバッファーにキラールモディファイアーを添加することにより又はゲルマトリックスにモディファイアーを共有結合的に結合させることにより作られる（Barton,J.K.,J.Biomolecular Structure and Dynamics,1983,(1)621-632）。その分離は、クロマトグラフィーにおけるように、個々の対掌体とキラール相との相互作用の差により生ずる。ゲル電気泳動では、これは二つのキラール分子の全体としての電気泳動の移動度における変化を生ずる。二つの対掌体が異なる速度でゲルを通過するとき、分離が行われる。ゲルの存在により大量液体移動は厳しく低減されるので、電気泳動分離において普通に見られる浸透流は最小に抑えられる。従って、最終的キラール分離は二つの対掌体の電気泳動の移動度における変化に大部分依存することになる。
キラール分離におけるＣＥの主要な潜在的長所の一つは、この技術の比較的高い効率である。この高効率のため、二つの対掌体とキラールモディファイアーとの間の自由エネルギー差が僅かしか生じないようなモディファイアーを利用することが可能となる。ＣＥではキラール相は、一般に支持電解質に加えられる。通常のゲル電気泳動におけるように、二つの対掌体はキラールモディファイアーに異なる結合をし、その結果電気泳動の移動度に変化をもたらす。その結果生ずる二つの対掌体の移動度間の差がそれらの分離をもたらす。電気浸透流がＣＥ分離に存在することも時にはあるが、それは一般的にはキラール分離の質に重要な寄与をすることはない。
キラールＣＥ分離は最初１９８５年に開示された（Zare,R.N.and Gassmann,E.U.S.Patent 4,675,300,June 23, 1987）、そして幾つかの試料が今日までに分析されている。しかしながら、現在の技術水準では幅広い多様な化合物の有用な分離を行うことはできない。即ち、キラールＨＰＬＣ分離と同様な制限を受け、方法開発が大変であり、そして選択性が狭い。すべての分離は支持電解質へのキラールモディファイアーの添加により行われている。使用されるキラールモディファイアーの種類は三つのカテゴリーに分けられる。第１はアミノ酸／金属錯体（Zare,R.N.and Gassmann,E.U.S.Patent 4,675,300,June 23, 1987、Gassmann,E.,Kuo,J.E.and Zare,R.N.Science,1985,(230)813-814、Gozel,P.,Gassmann,E.,Michelsen,H.and Zare,R.N.Analytical Chemistry,1987,(59)44-49）の使用である。このタイプの錯体は高度に水溶性であり、キラールアミノ酸の分離に巧く機能する。この系は既に同じ試料セットについてＬＣ及びゲル電気泳動を用いて機能することが示されている。第２のカテゴリーのキラールモディファイアーはシクロデキストリンと呼ばれる炭水化物の１群である（Guttmann,A.,Paulus,A.,Cohen,A.S.,Grinberg,N.and Karger,B.L.Journal of Chromatography,1988,(448)41-53、Fanali,S.Journal of Chromatography,1989,(474)441-446）。これらのモディファイアーも高度に水溶性であり、ＬＣに広く使用されてもいる。第３のカテゴリーのキラールモディファイアーはキラール洗浄剤（chiral detergent）である（Cohen,A.S.,Paulus,A.and Karger,B.L.Chromatographia,1987,(24)15-24、Dobashi,A.,Ono,T.,Hara,S.and Yamaguchi,J.Analytical Chemistry,1989,(61)1984-1986、Terabe,S.,Shibata,M.and Miyashita,Y.Journal of Chromatography,1989,(480)403-411）。
キラール洗浄剤（Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジデシルアラニンは、キラール分離を行うためにドデシル硫酸ナトリウムミセルと共にそして銅錯塩形成をさせて使用されている（Cohen,A.S.,Paules,A.and Karger,B.L.Chromatographia,1987,(24)15-24）。そのキラール分離のメカニズムは上記ザーレ（Zare）により報告された系におけると同様にリガンド交換に基づく。キラール洗浄剤を支持電解質中でその臨界ミセル濃度以上の濃度で使用することは、ソジウム  ドデカノイルバリンの使用（Dobashi,A.,Ono,T.,Hara,S.and Yamaguchi,J.Analytical Chemistry,1989,(61)1984-1986、Dobashi,A.,Ono,T.,Hara,S.and Yamaguchi,J.Journal of Chromatography,1989,(480)413-420）及び胆汁酸塩の使用（Terabe,S.,Shibata,M.and Miyashita,Y.Journal of Chromatography,1989,(480)403-411）の両方で実施されてきた技術である。これらの洗浄剤から形成されるミセルは、多数の個々の洗浄剤分子から構成される一つの構造である。ミセルの内部は一般に疎水性環境であり、逆相クロマトグラフィー充填の疎水性層と非常によく似ている。ミセルの外部には親水性基が存在し、時にはイオン化しており、その結果ミセル粒子に水溶性を付与する。この界面活性剤のどこかにミセル環境にキラリティーを与える一つ又は複数のキラール中心が存在する。
ＣＥ及び特にＭＥＫＣの今日の技術水準は、広い適用可能性を示す系が存在しないという点でＨＰＬＣの技術水準に似ている。ザーレ（Zare）らは、キラール電気泳動分離及びキラールＨＰＬＣ分離の両分野でよく知られており、他の型の化合物の大部分には有用でない銅錯体に基づくアミノ酸分離を明らかにしている。シクロデキストリン分離はシクロデキストリン空洞と相互作用をすることができる分子に限られる。キラールＭＥＫＣ分離は酸性化合物にも一定のクラスの化合物範囲にも適用されていない。ハラ（Hara）によって報告されたソジウム  ドデカノイルバリンは中性アミノ酸誘導体並びに他の幾つかの中性化合物のキラール分離を可能とする。このキラール界面活性剤を用いて有機塩基又は有機酸の分離に成功したとは示されていない。胆汁酸塩は、縮合環系を含む極めてリジッドな構造をもつ被分析化合物のキラール分離を示すことができるにすぎない。
３．本発明の開示
本発明は、一組のキラール界面活性剤及びその使用方法、すなわちキラール分離を行うことを目的として毛管電気泳動装置と組合せて使用される方法を提供する。本発明は単純な、効率的な、そして高速の方法であって、良好な分離能と高い感度を有する方法を提供し、そして広範かつ多様なキラール化合物を効率的に分離するための容易な方法開発を提供する。そのようなものとして本発明は初めて、困難な分離のため特殊な固定相カラムに頼ることなく、キラール化合物を分離する普遍的方法を提供する。
本発明の好ましい態様によれば、キラール界面活性剤は次の部分から構成されるものと定義される。第１に、キラール選択部。これはアミノ酸もしくはそれらの誘導体、又はアミノアルコール、または酒石酸誘導体のいずれであってもよい。それはキラール分子と相互作用をする機能を有する。第２に、キラール選択部に連結されている親水性頭部であって、ミセルに全体的溶解性を付与し、そして対掌体選択性を強化（増強）もする。第３に、キラール選択部に尾部を連結している“リンカー”基。この“リンカー”基はキラール選択部のキラール選択性を強化するためにも用いられる。第４に、疎水性炭素鎖すなわち尾部。それは疎水性を示し及び／又はキラール界面活性剤分子中に被分析分子を分配するように機能する限り、鎖長は変わってもよく、直鎖、分岐鎖、置換、その他の形でもよい。この尾部はキラール選択部のキラール選択性を強化もする。
本発明は下記一般式を有するキラール界面活性剤を含む。
0003699115.tif 000005
上式中、Ｒ1＝Ｃ4〜Ｃ18の直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18の分岐鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のハロゲン置換直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のポリエーテル炭化水素、キラール中心をもつＣ4〜Ｃ18のアルキル、上記のすべてのアルキルは不飽和結合を有していてもよく、及びコレステロール炭化水素（cholesterolic hydrocarbons）であり、
Ａ＝ＮＨ、ＣＯ、ＳＯ又はＳＯ2であり、Ｙ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であり、Ｘ＝ＣＯ、Ｏ又はＮＨであり、Ｃ＝炭素であり、ａとｂは同一でなく、ｎは１から５までであればよく、
Ｚ＝ＣＯＯ-、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ3-、ＰＯ4-、ＮＲ’3+、ＰＲ’3+、−ＯＨ、ポリエーテル、両性イオン、ポリアルコールであり、
Ｒ’＝Ｈ又はＣ1〜Ｃ4の直鎖又は分岐の炭化水素であり、ハロゲン化されていてもよく、不飽和結合を有していてもよい、そして
Ｒ1が直鎖の炭化水素であり、Ｙ＝ＣＨ2であり、Ａ＝ＣＯであり、Ｘ＝ＮＨであり、Ｚ＝ＣＯＯ-であり、ａ又はｂ＝Ｈであるがａとｂは同一でないときは、ａ又はｂはメチル又はイソプロピルでない。
本発明は下記一般式を有するキラール界面活性剤をも含む。
0003699115.tif 000006
上式中、Ｒ1＝Ｃ4〜Ｃ18の直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18の分岐鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のハロゲン置換直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のポリエーテル炭化水素、キラール中心をもつＣ4〜Ｃ18のアルキル、上記のすべてのアルキルは不飽和結合を有していてもよく、及びコレステロール炭化水素であり、
Ｒ2，Ｒ3＝Ｈ又はＣ1〜Ｃ8の直鎖又は分岐のアルキル又はアルケニル炭化水素であり、
Ｙ＝ＣＨ2、Ａ＝ＮＨ、Ｘ＝ＣＯ、Ｃ＝炭素、
Ｚ＝ＣＯＯ-、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ3-、ＰＯ4-、ＮＲ’3+、ＰＲ’3+、−ＯＨ、ポリエーテル、両性イオン、ポリアルコールであり、及び
Ｒ’＝Ｈ又はＣ1〜Ｃ4の直鎖又は分岐の炭化水素であり、ハロゲン化されていてもよく、不飽和結合を有していてもよい。
本発明はまた、下記一般式を有するキラール界面活性剤を含む。
0003699115.tif 000007
上式中、Ｒ1＝Ｃ4〜Ｃ18の直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18の分岐鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のハロゲン置換直鎖アルキル、Ｃ4〜Ｃ18のポリエーテル炭化水素、キラール中心をもつＣ4〜Ｃ18のアルキル、上記のすべてのアルキルは不飽和結合を有していてもよく、及びコレステロール炭化水素であり、
Ｒ’＝Ｈ又はＣ1〜Ｃ4の直鎖又は分岐の炭化水素であり、ハロゲン化されていてもよく、不飽和結合を有していてもよく、
Ｙ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であり、Ａ＝ＣＯ、ＳＯ又はＳＯ2であり、Ｘ＝Ｏ又はＮＨであり、ａとｂは同一でなく、ｎは１から５までであればよく、及び
Ｚ＝ＣＯＯ-、ＳＯ4-、ＳＯ3-、ＰＯ3-、ＰＯ4-、ＮＲ’3+、ＰＲ’3+、−ＯＨ、ポリエーテル、両性イオン、又はポリアルコールである。
本発明は、
少なくとも一つのキラール中心を持つキラール選択部、
該キラール選択部に結合する親水性頭部であって該キラール選択部との組合せによりキラール化合物の実質的分離を行うのに充分な程該キラール界面活性剤のキラール選択性を強化するもの、
該キラール選択部に結合するリンカーであって、該キラール選択部との組合せによりキラール化合物の実質的分離を行うのに充分な程該キラール界面活性剤のキラール選択性を強化するもの、及び
該リンカーに結合する疎水性尾部であって、該キラール選択部との組合せによりキラール化合物の実質的分離を行うのに充分な程該キラール界面活性剤のキラール選択性を強化するもの、を含むキラール界面活性剤をも含む。
この頭部は第４級アンモニウム類、アンモニウム塩類、カルボキシレート類、アルコール類、スルフェート類、スルホン酸類、ポリアルコール類、両性イオン類、及びこれらの各塩からなる群より選ばれるものである。スルフェート頭部の代表例は（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデコキシ）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタンである。カルボキシレート頭部群としては、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン、（Ｒ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン、（Ｓ）−Ｎ−テトラデコキシカルボニルバリン、及び（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルフェニルグリシンが挙げられる。アルコール頭部群としては、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリノール、（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリノール、及び（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリノールが挙げられる。
キラール選択部は、アミノ酸類、アミノアルコール類、及びタートレーツ（tartrates）及びそれらの塩類からなる群より選ばれる。キラール選択部としてアミノ酸を用いる本発明の代表的化合物の例としては、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルセリン、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルアラニン、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルロイシン、及び（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルプロリンが挙げられる。キラール選択部としてアミノアルコールを用いる本発明の代表的化合物の例としては、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリノール、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−ドデカノイルエフェドリン、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−アミノ−１−フェニル−１，３−プロパンジオールドデカンアミド、及び（Ｓ）−２−〔（オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタンが挙げられる。キラール選択部として酒石酸誘導体を用いる本発明の代表的化合物の例としては、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−ドデシル−Ｏ，Ｏ’−ジアセチル酒石酸モノアミド、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−ドデシル酒石酸モノアミド、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル−Ｏ，Ｏ’−ジアセチル酒石酸モノアミド、及び（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル酒石酸モノアミドが挙げられる。
本発明は、リンカーがアミド類、カルバメート類、スルホンアミド類、及びウレア類からなる群より選ばれるキラール界面活性剤をも含む。カルバメート含有リンカーとしては、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン、（Ｒ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン、（Ｓ）−Ｎ−テトラデコキシカルボニルバリン、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルフェニルグリシンが挙げられる。スルホンアミド含有リンカーとしては（Ｓ）−Ｎ−ドデシルスルホニルバリンが挙げられる。ウレア含有リンカーとしては（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリン、及び（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリノールが挙げられる。アミド含有リンカーとしては、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル酒石酸モノアミド、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホキシブタン、及びＮ−ドデシル−（Ｓ）−ロイシンアミドヒドロクロリドが挙げられる。
本発明は、その尾部が直鎖アルキル類、置換直鎖アルキル類、直鎖アルケニル類、置換直鎖アルケニル類、コレステロール炭化水素類、及びポリエーテル炭化水素類からなる群より選ばれるものであるキラール界面活性剤をも含む。これらには、Ｃ4〜Ｃ18の直鎖アルキル類、Ｃ4〜Ｃ18の分岐アルキル類、Ｃ4〜Ｃ18のハロゲン置換直鎖アルキル類、Ｃ4〜Ｃ18のポリエーテル炭化水素類、キラール中心を有するＣ4〜Ｃ18のアルキル類を含み、不飽和結合を有するこれらのすべてのアルキル類、及びコレステロール炭化水素が含まれる。異なる長さの尾部の例としては、（Ｓ）−Ｎ−オクタノイルバリノール、（Ｓ）−Ｎ−オクトキシカルボニルバリン、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン、及び（Ｓ）−Ｎ−ペンタデカフルオロオクタノイルバリンと（Ｓ）−Ｎ−テトラデコキシカルボニルバリンが挙げられる。ハロゲン置換尾部としては、フルオロカーボン尾部、特に（Ｓ）−Ｎ−ペンタデカフルオロオクタノイルバリンが挙げられる。ポリエーテル炭化水素尾部もここに例示され、（Ｓ）−Ｎ−ドデシルポリオキシエチレン（４）オキシカルボニルバリンが挙げられる。コレステロール尾部もここに例示され、（Ｓ）−Ｎ−コレステロキシカルボニルバリノールが挙げられる。
本発明はキラール化合物をそれらの構成対掌体に分離するためのキットをも含む。このキットは、本発明のキラール界面活性剤単独、又は本発明のキラール界面活性剤とキラール毛管電気泳動用の効果的電解質、電解質を入れることができるチャンネル、少なくとも約１０Ｖ／ｃｍから約１ｋＶ／ｃｍの電界強度を発生することができる電源、少なくともチャンネルの両端に電気的に連結された１個の陽極及び陰極、及び分離された対掌体の存在を感知するための検出器との組合せを含んでなるものである。
本発明はキラール化合物をそれらの構成対掌体に分離するためのキットであって、１個以上の容器が狭い区域内に生ずるように仕切られたキットてあり、本発明のキラール界面活性剤のいずれかを含む第１の容器を組合せの場合に含むものをも含む。このキットは少なくとも本発明の異なるキラール界面活性剤を含む第２の容器を含んでいてもよい。この場合、該別種のキラール界面活性剤は混合キラール界面活性剤処方となるように混ぜ合わされる。このキットには、非キラールな界面活性剤を含む容器をさらに含めることもできる。
本発明はキラール化合物をその構成対掌体に分離する方法をも含む。この方法は、電気泳動毛管クロマトグラフィー条件下にミセルキラール界面活性剤の有効量と該キラール化合物とを接触させる工程を含み、該キラール界面活性剤は、少なくとも一つのキラール中心を持つキラール選択部、該キラール選択部との組合せによりキラール化合物の実質的分離を行うのに充分な程該キラール界面活性剤のキラール選択性を強化する、該キラール選択部に結合している親水性頭部、該キラール選択部との組合せによりキラール化合物の実質的分離を行うのに充分な程該キラール界面活性剤のキラール選択性を強化する、該キラール選択部に結合しているリンカー、及び該キラール選択部との組合せによりキラール化合物の実質的分離を行うのに充分な程該キラール界面活性剤のキラール選択性を強化する、該リンカーに結合している疎水性尾部を含んでなるものである。この方法は、キラール界面活性剤が実質的に水性の溶液中でその臨界ミセル濃度で又はそれ以上の濃度で存在する場合にも適用され、また電気泳動条件が実質的電気浸透流を含む場合にも適用される。
本発明は、ジペプチドであるアスパルテームの新規な分析方法をも含む。この方法は、本発明のキラール界面活性剤を含有する電解質を有するミセル電気動力学的毛管電気泳動装置にアスパルテームの試料を注入する工程、アスパルテームの対掌体を分離する工程、及び次いで分離された対掌体を検出する工程を含んでなる方法である。本発明は食物市場や飲料市場における迅速な試験方法を提供する。
本発明の目的は、単一の又は少数のキラール界面活性剤を用いて広範かつ多様な化合物を分離する能力を付与する広い選択性を持つキラール界面活性剤を提供することにある。
他の目的は、広いｐＨ範囲及び広い濃度範囲にわたって溶解性を有するキラール界面活性剤のタイプを増大させることにある。これにより、さらにキラール分離を発展させる場合の柔軟性とより広い選択性とを与えることができる。
さらに他の目的は、リンカーグループ、親水性頭部グループ、及び疎水性尾部グループを変えることにより対掌体選択性を調整する能力を提供することにある。
さらに別の目的は、より良好なＵＶ透過性を与えることにある。これによりより良好な感度と定量の直線性が得られる。
本発明の他の側面、長所、及び目的は下記の詳細な説明と併記する図面とから明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、典型的な毛管電気泳動系のブロックダイヤグラムである。
図２（Ａ）は、本発明で述べるキラール界面活性剤のブロックダイヤグラム構成の重要な要素、すなわち尾部、リンカー、キラール選択部及び頭部を示す。
図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のブロックダイヤグラムに相当する典型的なキラール界面活性剤の化学構造である。
図３は、本発明で調製され、対掌体選択性を評価された界面活性剤の構造のリストである。
図４は、１例としてドデシル硫酸ナトリウムを用い、ミセルの構造の概念図を示す。
図５は、典型的な低電気浸透流キラールＭＥＫＣ分離におけるミセル、電気浸透及び被分析化合物の移動度のベクトルダイヤグラムである。
図６は、アテノロールのキラール分離に対する、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンの濃度を２５ｍＭから１０ｍＭまで増加させた場合の影響を示す。
図７は、疎水性被分析化合物であるプロプラノロールのキラール分離を行うために、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンの濃度を２５ｍＭから５ｍＭまで下げることができることを示す。
図８は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデシルポリオキシエチレン（４）オキシカルボニルバリンで得られた疎水性被分析化合物オクスプレノロール（oxprenolol）のキラール分離である。
図９は、５０ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ペンタデカフルオロオクタノイルバリンで得られたブピバカイン（bupivacaine）のキラール分離である。
図１０は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンと３０％アセトニトリルを用いて疎水性被分析化合物プロプラノロールのキラール分離である。
図１１は、バリン、フェニルグリシン、プロリン、及びセリンベースのキラール界面活性剤を用いる数種のＰＴＨ−アミノ酸の分離を示す。
図１２（Ａ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリノール／２５ｍＭドデシル硫酸ナトリウムで得られたＰＴＨ−トリプトファンのキラール分離を示す。
図１２（Ｂ）は、２５ｍＭの（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−ドデシル酒石酸モノアミドのナトリウム塩／２５ｍＭドデシル硫酸ナトリウムで得られたテルブタリン（terbutaline）のキラール分離を示す。
図１２（Ｃ）は、１５ｍＭの（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−アミノ−１−フェニル−１，３−プロパンジオール  ドデカンアミド／１５ｍＭドデシル硫酸ナトリウムで得られたブピバカイン（bupivacaine）のキラール分離を示す。
図１３（Ａ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデシルスルホニルバリン（スルホンアミドリンカー）で得られたメトプロロール（metoprolol）のキラール分離を示す。
図１３（Ｂ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリン（ウレアリンカー）で得られたメトプロロール（metoprolol）のキラール分離を示す。
図１３（Ｃ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（カルバメートリンカー）で得られたメトプロロール（metoprolol）のキラール分離を示す。
図１４（Ａ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（カルバメートリンカー）を用い、α１．０１で行われたケタミンのキラール分離を示す。
図１４（Ｂ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリン（ウレアリンカー）を用い、α１．０４で行われたケタミンのキラール分離を示す。
図１５は、プログルミド（proglumide）とＣＢＺ−トリプトファンの構造を示す。
図１６（Ａ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタンでｐＨ３．０で得られたプログルミド（progulumide）のキラール分離を示す。
図１６（Ｂ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタンでｐＨ３．０で得られたＣＢＺ−トリプトファンのキラール分離を示す。
図１７は、Ｎ−６−キノリルアミノカルボニル標識誘導体を作成するための１級又は２級アミンの反応順序を示す。
図１８は、１００ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンを用いてラセミのＮ−６−キノリルアミノカルボニルアルギニンのキラール分離を示す。
図１９（Ａ）は、２０ｍＭの（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタンを用い、１．４×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ（ｐＨ４．０）の電気浸透移動度で得られたベンゾインのキラール分離を示す。
図１９（Ｂ）は、２０ｍＭの（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタンを用い、３．１９×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ（ｐＨ６．０）の電気浸透移動度で得られたベンゾインのキラール分離を示す。
図２０（Ａ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンを用い、０．７×１０-4ｃｍ2／Ｖｓの電気浸透移動度、ｐＨ７、被覆された毛細管中で得られたエフェドリンのキラール分離を示す。
図２０（Ｂ）は、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンを用い、５．７×１０-4ｃｍ2／Ｖｓの電気浸透移動度、ｐＨ７、被覆されない毛細管中で得られたエフェドリンのキラール分離を示す。
図２１（Ａ）〜（Ｃ）は、尿中のエフェドリンの分離のクロマトグラフである。
図２２（Ａ）〜（Ｂ）は、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−４−メチル−１−スルホオキシペンタンを用い、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アラニンの分離を示すクロマトグラムである（図３ｂｄ，Ｃ１２−アミド−ロイシノール−スルフェート）、図２２（Ｂ）は、Ｎ−ドデシル−（Ｓ）−ロイシンアミドヒドロクロリド（図３ｂ１，Ｃ１２−アミド−ロイシン−アンモニウム塩）上での同じ化合物の分離を示す。
図２３は、キラール界面活性剤（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルロイシン（図３ａｋ）を用いるアンフェタミン分離のクロマトグラムである。
図２４（Ａ）〜（Ｂ）は、キラール界面活性剤（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルシクロヘキシルアラニン（図３ａｏ，図２４Ａ）及び（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル酒石酸モノアミドナトリウム塩（図３ａｇ，図２４Ｂ）を用いるアンフェタミン分離のクロマトグラムである。
図２５は２５ｍＭのＮ−ドデシル−（Ｓ）−プロリンアミドヒドロクロリド（図３ｂｎ），ｐＨ３．０を用いる陰イオン性化合物であるカルボキシベンゾイル−ＤＬ−アラニンの分離を示すクロマトグラムである。
図２６（Ａ）〜（Ｂ）は、図２６Ａでは１００ｍＭの（Ｓ）−ドデシルアミノカルボニルバリン（図３ｇ，Ｃ１２尾），ｐＨ８．０で得られたニコチンの分離を示し、図２６Ｂでは１００ｍＭの（Ｓ）−デシルアミノカルボニルバリン（図３ａｙ，Ｃ１０尾），ｐＨ７．５で得られたニコチンの分離を示すクロマトグラムである。
図２７は、２５ｍＭの（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）−アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３ｍ），ｐＨ３．５を用いるアスパルテームの４種の立体異性体のすべての分離を示すクロマトグラムである。
５．本発明の実施の態様
本発明はキラール界面活性剤、それを作成する方法及び使用する方法、本発明の新規化合物を用いるキラール分離を実施するための装置及びキットを含む。ミセルを形成する能力に加えて、本発明のキラール界面活性剤は幾つかのその他の特徴をも有している。第１に、それらは対掌体混合物に対して対掌体選択性、即ちアルファを示す。第２に、それらは問題の化合物を分配する能力を示す。第３に、それらは高い効率、即ちＭＥＫＣ系で用いられたとき、高い段数を示す。第４に、それらは検出様式に関して望ましい諸性質を有する。最後に、ＭＥＫＣ緩衝液の伝導度に対する寄与は極小である。下記の図及び実施例はこれらの特性をさらに明らかにする。
図１は、ＣＥシステムのブロックダイヤグラムを示す。このシステムは約５μｍ〜５００μｍの範囲の内径、約１００μｍ〜１０００μｍの範囲の外径、そして約５ｃｍ〜２００ｃｍ範囲の長さを有する溶融シリカ毛細管１０を含む。この毛細管は、電解質を含む貯蔵室３０に浸漬された入口端２０及び電解質５０に浸漬された出口端４０を有する。入口及び出口の電解質貯蔵室は毛細管と同様にキラール界面活性剤を含む支持緩衝液から構成される電解質で満たされる。毛細管も電解質で満たされる。二つの貯蔵室を接続するのは高電圧電源１００の出力端子８０及び９０に連結されている別々の電極６０及び７０である。電気回路は、入力電極から充填された毛細管を通って毛細管の出口端そして出口貯蔵室に浸漬されている高電圧電極までで完成する。高電圧電源出力は制御器１１０で設定され、分離はＵＶ／Ｖｉｓ検出器１２０でモニターされる。
本発明のキラール界面活性剤の構造的成分は図２に示される。これらの界面活性剤は四つの構造単位に分けることができる。左から始めると、第１は親水性尾部であり、これは界面活性剤のミセル形成能を決定する助けとなる。この尾部は、ミセルの疎水性環境と水相との間で被分析化合物分子の分配を可能とするミセルの疎水性部分を提供する。尾部は鎖長か４から２０炭素まで変えることができるが、好ましい態様は６から１８炭素であり、そして直鎖でも分岐の構造でもよい。尾部の長さを変えると臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）も変わる。界面活性剤の濃度を変えることにより分配を調整することができる。尾部はその疎水性部分に加えてエーテルやポリエーテル部分を含んでもよい。炭素骨格上の水素をハロゲンで置換してもよい。特に、ハロゲンとしては塩素、フッ素、臭素及びヨウ素が好ましい。最も好ましいのは塩素とフッ素である。実施例２１では、尾部の長さが対掌体選択性に影響しうることを明らかにする。尾部内のキラール中心の位置は、分岐の程度と同様に、得られうるアルファ値に影響することが示される。
キラール界面活性剤の第２の部分はこの分子の疎水性尾部部分とキラール中心との間の連結部である。この連結部を変えると対掌体選択性が顕著に変わる。これは、おそらくこのリンカーがキラール選択部に物理的に隣接しているからであろう。四つのタイプのリンカーが研究され、本明細書に記載される。それらは、アミド類、カルバメート類、スルホンアミド類、及びウレア類である。アミドリンカーとしては図２（Ｂ）中にＲ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’ユニットで示されている。カルバメートリンカーは、図３（Ａ）にＲ−ＯＣＯ−ＮＨ−Ｒ’ユニットで示されている。スルホンアミドリンカーは、図３（Ｈ）にＲ−ＳＯ2−ＮＨ−Ｒ’ユニットで示されている。ウレアリンカーは、図３（Ｇ）にＲ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’ユニットで示されている。本発明の驚くべき結果の一つは、リンカーが分離に対してかくも強力な影響を有するという事実である。実施例で示すように、一つの型のリンカーを他のものに置換することにより、限界的分離を分離可能なものに形質を変換することができる。本発明のいかなる理論によっても限定することを意図するものではないが、正しいリンカーの選択はキラール選択部のキラール選択性を強化ないし増強すると考えられる。本発明に記載されていない他のリンカーも、キラール選択部を強化するものであれば、本発明の範囲に含まれることになる。
この分子の第３の部分はキラール中心である。キラール中心はいかなるキラール化合物から誘導することもできる。キラール分子とは偏光面を回転させるものである。キラール分子はその鏡像に重ね合わせることができないものと定義される（March,J.,Advanced Organic Chemistry,Third ed.,John Wiley & Sons,New York,1985,p82）。本発明はアミノ酸類、アミノアルコール類、及び酒石酸誘導体を含むキラール化合物を例示する。アミノ酸類及びそれらの誘導体は、両方の対掌体が利用可能であるので特に好ましいキラール選択部である。本明細書に記載される２０種の必須アミノ酸だけでなく、少なくとも１個のキラール中心を有する他のすべてのアミノ酸も本発明の範囲に含まれる。実施例には、少なくとも８種の異なるアミノ酸、即ちフェニルグリシン、セリン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、ロイシン、イソロイシン、及びｔｅｒｔ−ロイシンなどを含む選択部の合成を提供する。アミノアルコールもキラール選択部として例示される。アミノアルコールの代表例は、バリノール−、エフェドリン−、及びアミノプロパンジオール−ベースのキラール界面活性剤である。酒石酸誘導体はその分子の中心に２個のキラール中心を、そして両端に２個のカルボキシル基を有する（図３ａｆ−ａｉ参照）。界面活性剤への酒石酸の連結はカルボキサミド基の形成による。酒石酸誘導体は一つの前駆体分子中に二つの官能部（頭部とキラール選択部）を取り込ませたものであり、必要な合成工程数を低減できる。本発明のキラール界面活性剤の４個の官能基の中の２個以上を取り込んでいる他の２官能性分子を作成することもできる。
この分子の最後の部分は頭部である。この部分の構造はミセルのサイズ、集合数、及び溶解性に強く影響する。ミセルでは、頭部は周辺に位置し、水相に向かって外側に向いている。頭部は水相との溶解性を高めるためイオン化可能な部分を含まなければならない。中性ｐＨでイオン化しない部分はｐＨを上げ又は下げるとき荷電し、その結果溶解性を高めるようになればよい。本発明は３種の型の頭部基、すなわちカルボキシレート類、スルフェート類、及びアルコール類を開示する。カルボキシレート類（Ｒ−ＣＯＯＨ）は、数が最も多く、１例を図３（ａ）に示す。スルフェート類（ＳＯ3Ｏ-Ｍ+）は、図３（ｐ）に示すように、頭部基としても有用である。アルコール類、−ＯＨも図３（ｉ）に示すように溶解性を高めるために用いることもできる。アルコール性頭部基は、イオン化可能な化合物の例である。アルコール類は低いｐＨではプロトン化されるようになり、高いｐＨでは脱プロトン化されるようになり、その結果純荷電を生じ、水性媒体中での溶解性を高める。他のイオン化可能な基、例えばアミン類（ＮＨ）、特に第４級アミン（ＮＲ4+）及びアンモニウム塩ＮＨ3+、スルフヒドラル類（ＳＨ）、スルホネート類（ＳＯ3-）、アミド類（ＣＯＮＨ）、アミジン類、及びグアニジン類なども本発明の範囲に含まれる。
表１は調製された４種の構造単位の異なる型を要約する。
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図３は、合成されそして毛管電気泳動を用いて対掌体選択性を試験された多様なキラール界面活性剤の一覧表である。これらの界面活性剤は、１群のカルバメート結合界面活性剤、１群のウレア結合界面活性剤、スルホンアミド結合界面活性剤、ポリエーテル炭化水素尾部界面活性剤、１群のフルオロヒドロカーボン尾部界面活性剤、１群のコレステロール尾部界面活性剤、尾部長の異なる１群のキラール界面活性剤、１群のアルコール頭部基界面活性剤、１群のスルフェート頭部基界面活性剤、１群のカルボキシレート頭部基界面活性剤、１群のアミド結合界面活性剤、タートレーツ（tartrates）由来のキラール選択部を含む１群の界面活性剤、アミノ酸由来のキラール選択部を含む１群の界面活性剤、及びアミノアルコール由来のキラール選択部を含む１群の界面活性剤からなる。一部の例では、キラール界面活性剤の対掌体の両方を用い、対掌体移動の順序の逆転が示された。今日まで、全部で６８種の界面活性剤が合成され、試験された。
実施例
特記のない限り、化学品はアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）またはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）より購入した。
実施例１−（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンの合成（図３ａ）
温度計、追加したロート及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に（Ｓ）−バリン〔アルドリッチケミカル社〕（３４．１７ｇ、２９１ｍｍｏｌ）、水（１８０ｍＬ）とアセトン（１２０ｍＬ）を加えた。そのスラリーを０〜５℃まで冷却した。温度を５〜１０℃の間に維持しながら、水酸化ナトリウムのペレット（２１．２５ｇ、５３１ｍｍｏｌ）を徐々にスラリーに加えた。リヒターとテュッカーの方法〔リヒターとテュッカー（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｔｕｃｋｅｒ，Ｂ．），Journal of Organic Chemistry，１９８３，（４８）２６２５−２６２７〕により調製したドデシルクロロホルメート（４８．２１ｇ、２０７ｍｍｏｌ）を反応混合液に１時間かけて滴下して加え、その間温度は５〜１０℃に保った。反応混合液を０〜５℃で１時間攪拌し、室温まで温め、１６時間攪拌した。反応混合液は透明で微黄色溶液であった。その溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた水相を水（７００ｍＬ）で希釈して酢酸エチル（６×２５０ｍＬ）で抽出した。水相を５〜１０℃まで冷却して濃ＨＣｌを加えｐＨを１に下げた。水相と油状の沈澱物を酢酸エチル（４×２５０ｍＬ）で抽出した。有機相を蒸発させ白色固体（４７．６ｇ、７３％）を得た、その固体は、１Ｈ−ＮＭＲにより目的物であり、ＨＰＬＣ（Ｃ１８逆相、メタノール／水／酢酸移動相）により純品であった。
実施例２−図３ｂ〜３ｆ、図３ａｊ〜３ａｘの化合物の合成
この方法により、（Ｒ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（図３ｂ）、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニル−ｔｅｒｔ−ロイシン（図３ｃ）、（Ｓ）−Ｎ−テトラデコキシカルボニルバリン（図３ｄ）、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルフェニルグリシン（図３ｅ）及び（Ｓ）−Ｎ−ドデシルポリオキシエチレン（４）−オキシカルボニルバリン（図３ｆ）も合成した。（Ｓ）−Ｎ−ドデシルポリオキシエチレン（４）−オキシカルボニルバリンの合成の出発物質は、Ｂｒｉｊ３０〔アルドリッチケミカル社〕すなわちポリオキシエチレン（４〜１２）ラウリルエーテルとミリスチルエーテルとの混合物であった。こうして生成したキラールな界面活性剤もまた混合物であった。
上記概略の合成方法に従って、図３ａｊ〜３ａｘの化合物も調製した、但し、合成される相当する界面活性剤の尾部構造に基づきクロロホルメートを使用したことを除く。
実施例３−図３ｇ、３ａｙの化合物の合成
実施例１と同様の方法を用いて該ウレアリンカー化合物を合成した、但し、ドデシルクロロホルメートの代わりにドデシルイソシアネート〔コダック社〕を使用したことを除く。生成物は７３％の収量で得られ、１Ｈ−ＮＭＲとＨＰＬＣにより純品であった。
上記概略の合成方法に従って、図３ａｙの化合物も調製した、但し、ドデシルイソシアネートの代わりにデシルイソシアネートを使用したことを除く。
実施例４−図３ｈの化合物の合成
実施例１と同様の方法を用いて該スホンアミド（ｓｕｆｏｎａｍｉｄｅ）を合成した、但し、ドデシルクロロホルメートの代わりにドデシルスルホニルクロリド〔ランカスターラブス（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  ｌａｂｓ）〕を使用したことを除く。反応中に目的物とドデカンスルホン酸よりなる沈澱物が生成した。目的物は調製用ＨＰＬＣ（Ｃ１８逆相、メタノール／水／酢酸、５０％収量）で単離し、１Ｈ−ＮＭＲとＨＰＬＣにより純品であった。
実施例５−図３ｓ〜３ｙの化合物の合成
実施例１と同様の方法を用いて該アミドリンカー、図３ｗを合成した、但し、ドデシルクロロホルメートの代わりにドデカノイルクロリドを使用したことを除く。メチレンクロリド抽出により生成物を９７％収量で単離した。続いてその生成物をそのまま（ラウリン酸を３％含む）ＣＥ実験に使用し；又は調製用ＨＰＬＣ（Ｃ１８逆相、メタノール／水／酢酸）で純品を単離した。
（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルフェニルグリシン（図３ｓ）、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルセリン（図３ｔ）、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルプロリン（図３ｕ）、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルアスパラギン酸（図３ｖ）、（Ｓ）−Ｎ−オクタノイルバリン（図３ｘ）及び（Ｓ）−Ｎ−ヘキサデカノイルバリン（図３ｙ）も同様に合成した。
実施例６−図３ａｂ〜ａｅ、及び図３ａｚ〜３ｂｃの化合物の合成
温度計、追加したロート及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に（Ｓ）−バリノール（２５．９ｇ、２５１ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（１８０ｍＬ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下、０〜５℃まで冷却した。温度を５〜１０℃の間に維持しながら、ジクロロメタン（１２０ｍＬ）中のドデカノイルクロリド（２７．３ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を反応混合液に１．５時間かけて滴下して加えた。その反応混合液を０〜５℃で１時間攪拌し、室温まで温め、１７時間攪拌した。白色沈澱物が見られた。アンモニウム塩を除くため、反応混合液を水（１×２５０ｍＬ）、０．１モルの塩酸水溶液（１×２５０ｍＬ）及び水（１×２５０ｍＬ）で抽出した。有機相をロータリーエバポレーターで濃縮し、生成する白色固体を一晩真空乾燥させ、目的物（３５．０ｇ、９８％収量）を得た。その生成物（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリノール（図３ａｂ）はＨＰＬＣと１Ｈ−ＮＭＲにより純品であった。
（Ｓ）−Ｎ−オクタノイルバリノール（図３ａｃ）、（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−ドデカノイルエフェドリン（図３ａｄ）及び（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−アミノ−１−フェニル−１，３−プロパンジオールドデカンアミド（図３ａｅ）も同様に合成された。
上記概略の合成方法に従って、図３ａｚ〜３ｂｃの化合物も調製した。
実施例７−図３ｉ〜ｋの化合物の合成
該カルバメートリンカー、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリノールもアミド、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリノール（実施例６）と同様な方法で合成した、但し、酸クロリドの代わりにドデシルクロロホルメートを使用したことを除く。
（Ｓ）−Ｎ−コレステロキシカルボニルバリノール（図３ｊ）も同様にバリノールとコレステリルクロロホルメートから合成された。
（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリノール（図３ｋ）も同様にバリノールとドデシルイソシアネートから合成された。
実施例８−図３ｌ〜ｏ、図３ｂｄ〜ｂｇの化合物の合成
温度計、追加したロート及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリノール（５．００ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（１２０ｍＬ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下、０〜５℃まで冷却した。温度を５〜１０℃の間に維持しながら、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のクロロスルホン酸（２．０４ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を反応混合液に０．５時間かけて滴下して加えた。その反応混合液を０〜５℃で２時間攪拌した。溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残留する白色固体を真空乾燥させた。その固体に、メタノール（１００ｍＬ）、Ｒ．Ｏ．水（１０ｍＬ）及び水酸化ナトリウムのペレット（０．７００ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を加えた。ペレットが完全に溶解した時、溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残留する白色固体を２５℃で１７時間真空乾燥させた。生成物、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシ−ブタン（図３ｍ）、（６．６４ｇ、９８％収量）の同定を１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。
（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデコキシ）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３ｌ）、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシルアミノ）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３ｎ）及び（Ｓ）−〔オキソコレステロキシルアミノ〕−３−メチル−１−スルホキシブタン（図３ｏ）も同様な方法で合成した。
上記概略の合成方法に従って、図３ｂｄ〜３ｂｇの化合物も調製した。
実施例９−（Ｓ）−Ｎ−ペンタデカフルオロオクタノイルバリンメチルエステルから図３ｚ（（Ｓ）−Ｎ−ペンタデカフルオロオクタノイルバリン）の化合物の合成
温度計、追加したロート及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に（Ｓ）−バリンメチルエステルヒドロクロリド（５．８１ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（３５０ｍＬ）及びトリエチルアミン（８．５３ｇ、８４．３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下、０〜５℃まで冷却した。温度を５〜１０℃の間に維持しながら、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のペンタデカフルオロオクタノイルクロリド（１５．０ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を０．５時間かけて滴下して加えた。その反応混合液を０〜５℃で１時間攪拌し、室温まで温め、２時間攪拌した。白色沈澱物が見られた。反応混合液を水（１×２５０ｍＬ）、０．１モルの塩酸水溶液（１×２５０ｍＬ）及び水（１×２５０ｍＬ）で抽出した。溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、生成する白色固体を一晩真空乾燥させ、目的物（１８．２ｇ、９９％収量）を得た。生成物はＨＰＬＣと１３Ｃ−ＮＭＲにより純品であった。
温度計、ストッパー及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に（Ｓ）−Ｎ−ペンタデカフルオロオクタノイルバリンメチルエステル（２．００ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）及び水（２２ｍＬ）を加えた。溶液を０〜５℃まで冷却した。水酸化カリウムのペレット（０．７０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。１２時間後反応容器に栓をし、さらに１２時間冷蔵庫内に置いた。溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残留溶液を水（１５０ｍＬ）で希釈し、５〜１０℃まで冷却した。溶液を濃ＨＣｌでｐＨ１まで酸性にした。添加の間、温度を５〜１５℃に維持した。白色沈澱物が生成した。水相と沈澱物を酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機相をロータリーエバポレーターで濃縮し、白色固体を得、一晩真空乾燥させ、目的物（２．０２ｇ、９７％収量）を得た。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルとＨＰＬＣ分析はその生成物が純品であることを示した。
実施例１０−図３ａｇ〔（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−ドデシル−Ｏ，Ｏ−ジアセチル酒石酸モノアミドから（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−ドデシル酒石酸モノアミド〕、図３ａｉ、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル酒石酸モノアミド及び図３ｂｆ、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−オクチル酒石酸モノアミドの化合物の合成
温度計、追加したロート及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に１−ドデシルアミン（１７．１５ｇ、９２．５ｍｍｏｌ）、テトラビドロフラン（３５０ｍＬ）及びトリエチルアミン（９．３６ｇ、９２．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下、０〜５℃まで冷却した。温度を５〜１０℃の間に維持しながら、テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）中の（Ｒ，Ｒ）−Ｏ，Ｏ−ジアセチルタータリックアンヒドリド（２０．０ｇ、９２．５ｍｍｏｌ）を反応混合液に１時間かけて滴下して加えた。その反応混合液を１時間０〜５℃で攪拌し、室温まで温め、４時間攪拌した。溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、生成した褐色の粘性油を一晩真空乾燥させ、粗生成物（４６．１ｇ）を９９％収量で得た。
温度計、ストッパー及び機械的攪拌装置を付けた三つ口の丸底フラスコ中に（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−ドデシル−Ｏ，Ｏ−ジアセチル酒石酸モノアミド（トリエチルアミン型；６．１８ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）、メタノール（１５０ｍＬ）及び水（１５ｍＬ）を加えた。水酸化ナトリウム（１．６２ｇ、４１．０ｍｍｏｌ）を反応混合液に加えた。０．５時間後、白色沈澱物が生成した。その反応混合液を５５℃まで加熱し、１８時間攪拌した。固体をろ取し、真空乾燥させ、生成物（３．９６ｇ、９５％収量）を得、１Ｈ−ＮＭＲにより純品であることが明らかになった。
（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル酒石酸モノアミド（図３ａｉ）（ナトリウム型）及び図３ｂｆ、（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−オクチル酒石酸モノアミドも同様な２段階法により合成された。
実施例１１−図３ｂｈ〜ｂｎの化合物の合成
温度計、追加したロート及び機械的攪拌装置を付けた５００ｍＬの三つ口の丸底フラスコ中にＮ−ｔ−ＢＯＣ−（Ｓ）プロリン（シグマケミカル社、１３．６９ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（６．４４ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下、０〜５℃まで冷却した。温度を５〜１０℃の間に維持しながら、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のイソブチルクロロホルメート（アルドリッチケミカル社、８．６９ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）を反応混合液に０．５時間かけて徐々に滴下して加えた。添加完了後、反応混合液を０〜５℃で１５分間攪拌した。それから、温度を５〜１０℃の間に維持しながら、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１−ドデシルアミン（１１．７９ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）を反応混合液に０．５時間かけて徐々に滴下して加えた。反応混合液を２時間０〜５℃で攪拌し、室温まで温め、それから１６時間攪拌した。反応混合液を塩酸水溶液（０．１Ｎ；２×１００ｍＬ）、水酸化ナトリウム水溶液（０．１Ｎ；２×１００ｍＬ）及びＲ．Ｏ．水（２×１００ｍＬ）で抽出した。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残留する白色固体を一晩真空乾燥させ、粗生成物（２４．０２ｇ）を９９％収量で得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとＨＰＬＣ分析（Ｃ１８逆相、メタノール／水／酢酸移動相）により、目的物が得られた純品であることが明らかになった。
上述の粗生成物（２４．０ｇ、６２．７ｍｍｏｌ）をメタノール（１６０ｍＬ）中、濃塩酸（１２Ｎ、４８０ｍｍｏｌ）と２５℃で１６時間反応させることにより、Ｎ−ドデシル−（Ｓ）−プロリンアミドヒドロクロリドを得た。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残留する白色固体を一晩真空乾燥させ、粗生成物（１９．６８ｇ）を９８％収量で得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとＨＰＬＣ分析（Ｃ１８逆相、メタノール／水／酢酸移動相）により、目的物が得られ純品であることが明らかになった。
この同じ方法を用いて、Ｎ−オクチル−（Ｓ）−バリンアミドヒドロクロリド（図３ｂｉ）、Ｎ−デシル−（Ｓ）−バリンアミドヒドロクロリド（図３ｂｈ）、Ｎ−テトラデシル−（Ｓ）−バリンアミドヒドロクロリド（図３ｂｊ）、Ｎ−ドデシル−（Ｓ）−アラニンアミドヒドロクロリド（図３ｂｋ）、Ｎ−ドデシル−（Ｓ）−ロイシンアミドヒドロクロリド（図３ｂｌ）及びＮ−ドデシル−（Ｓ）−イソロイシンアミドヒドロクロリド（図３ｂｍ）を合成した。
実施例１２〜１７  対掌体の分離
界面活性剤をその臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）以上に水性環境に加えたとき、個々の界面活性剤分子は集合し、ミセルと呼ばれる構造を形成する。この構造のモデルを図４（界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウムを例として示す）に示す。界面活性剤の長い疎水性尾部はその構造内に埋もれ、一方、極性の頭部の基は電解質の水と水和している。いったん試料を毛管内に注入すれば、電解質中で形成されたキラールなミセルと相互作用をする機会がある。もし、化合物またはその一部分が疎水性であるなら、ミセルの疎水環境内に分配されるであろう。
そのミセルはミセルに電気泳動的移動度を与える特有の電荷／質量比率を持つ。本発明の界面活性剤の移動度は約１〜５×１０-4ｃｍ2／Ｖｓｅｃの間で変化する。その電気泳動的移動度の結果として、ミセルは特有の移動時間、ｔmcで毛細管を通って移動するであろう、ｔmcは毛細管の長さと電界強度に依存する。被分析化合物がミセル内に分配されるとき、それもミセルの見かけ上の移動度を示すであろう。それから、もし分子が全て水相内に分配されるなら、電荷／質量比率で定義されたそれ自体の特有の電気泳動的移動度を持つだろう。図５において、ミセル移動度（−４×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ）及び電気浸透移動度（＋１×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ）、並びにミセル内で５０％、ミセル外の溶液中で５０％の時間を過ごす中性の被分析化合物の見かけの移動度（−１．５×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ）のベクトル図を示す。いったんミセル内に分配されると、試料の被分析化合物はキラール中心と相互作用する機会を持つ。もし試料分子が一部の時間のみミセル内に分配し、試料の対掌体はキラール中心と異なる相互作用をするなら、２つの対掌体がわずかに異なった見かけの移動度を持ち、そして分離できるであろう。最大の分解能を与える分配の最適レベル、すなわちｋは、方程式２で示すように分離系の効率と選択性により決定される。
実施例１２〜１７のための実験装置と条件
Ｗａｔｅｒｓ  Ｑｕａｎｔａ▲Ｒ▼４０００ＣＥユニットを用いて、毛管電気泳動分離を行った。５０μｍ内径×６０ｃｍの非被覆もしくはポリエチレングリコールで被覆した〔Ｊ＆Ｗ  サイエンティフィック社（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）〕溶融シリカ毛細管内で、検出のために５２．５ｃｍの注入で分離を行った。印加電圧は１２ｋＶで、２０〜６０μＡの範囲の電流が生じた。試料溶液に浸した毛細管の入口の末端を出口の末端より１０ｃｍの高さまで２〜５秒間上げることにより、注入を行った。カラム上でのＵＶ検出は２１４ｎｍで行った。緩衝液をリン酸塩もしくはリン酸塩／ホウ酸塩ストックから調製し、界面活性剤を溶解させた後、所望のｐＨに調整した。データ収集は、Ｗａｔｅｒｓ  ＥｘｐｅｒｔＥａｓｅTMもしくはＭｉｌｌｅｎｉｕｍTMソフトウエア〔ウォーターズ株式会社（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ〕を用いて行った。
実施例１２−アテノロールの分離と分配に対する界面活性剤濃度の効果
分配を調節できることは本発明の重要な要素である。図６に示したＣ１２−カルバメート−連結バリン界面活性剤（図３ａ）を使用したアテノロールの分離でこのことを証明した。２５ｍＭ（図６Ａ）の界面活性剤の濃度では、ｋ＝０．８、α＝１．０４及び分解能Ｒｓ＝１．０であった。界面活性剤の濃度を１００ｍＭ（図６Ｂ）にまで上げたとき、ｋは２．２及び分解能は２．５に上昇し、αは変わらなかった。このような方法で界面活性剤の濃度を変化させることにより分配を最適化した。大きなｋ値を持つ試料のためのシステムを最適化するために、はるかに低い濃度の界面活性剤を使用することができる。図７に示すように、２５ｍＭ（図７Ａ）ではプロプラノロールはほとんど全てミセル内に分配し、対掌体は分離しなかった。しかし、５ｍＭ（図７Ｂ）まで濃度を下げｋを減少させることにより、分離が見られた。しかし、界面活性剤の濃度をｃｍｃの範囲まで下げると、段数は急速に減少した。
実施例１３−疎水性の変動の効果
分配を調節するもう１つの方法は、界面活性剤の疎水性を変化させることである。図８は、バリンで修飾したＢｒｉｊ−３０界面活性剤（図３ｆ）を使用した疎水性ラセミ体、オクスプレノロールのキラール分離を示す。Ｂｒｉｊ界面活性剤は前に用いた炭化水素よりも親水性であるので、前述の実施例のミセル内に非常に強く分配する疎水性被分析化合物は分配における望ましい減少と改良された分離を示す。ポリエーテルやグリコールのような他の鎖の組成物も可能である。
実施例１４−ハロゲン化した尾部の炭化水素の効果
界面活性剤の炭化水素鎖のハロゲン化を通して、分配を調節することも可能である。図９は、フッ素化した炭化水素で修飾したバリン（図３ｚ）を使用したブピバカインの分離を示す。対応する炭化水素の界面活性剤は、これらの条件下ではミセル形成さえもしない。
実施例１５−電解液の疎水性の変動の効果
ＭＥＫＣ緩衝液に有機溶媒を加えることにより、分配も変化させ得る。このことを図１０に示す、ここでプロプラノロールは２５ｍＭ（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（図３ａ）と３０％アセトニトリルで分離される。図７Ａでは、有機溶媒の非存在下で２５ｍＭではプロプラノロールは完全にミセル内に分配されていたことを想起せよ。
実施例１６−選択性に対するキラール選択部を変えることの効果
キラール分離の選択性は、キラール選択部を変えることにより調節できる。種々のアミノ酸が使用され得るであろう。図１１は、いくつかのＰＴＨ−アミノ酸の分離におけるいくつかのアミノ酸で修飾した界面活性剤の２５ｍＭの濃度での使用を示す。図１１Ａは、バリンを基部とする界面活性剤（図３ｑ）とフェニルグリシンを基部とする界面活性剤（図３ｓ）を用いるＰＴＨ−アラニンの分離を示し、フェニルグリシンの界面活性剤が分離を示した。図１１Ｂは、プロリン（図３ｕ）、フェニルグリシン及びバリンを基部とする界面活性剤を用いるＰＴＨ−ノルバリンの分離を示す。この場合、三者すべていくらかの分離を示すけれども、フェニルグリシンの界面活性剤が最良の分離を示す。図１１Ｃと１１Ｄは、セリン（図３ｔ）、バリン、プロリン及びフェニルグリシンを基部とする界面活性剤におけるＰＴＨ−トリプトファンの分離を示し、バリンの界面活性剤が最良の分離を示す。試料の被分析化合物のスクリーンを使用することにより、ある種のアミノ酸の選択部が他の物より良く作用することが明らかである。これらのデータを表２にまとめる。
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非アミノ酸のキラールな選択部も使用され得る。アミノアルコール、酒石酸を含む有機酸、シクロデキストリン、単糖類、オリゴサッカリド及び他の有機キラール分子はこの目的のために使用され得る。バリノール（図３ｋ）（１２Ａ）、酒石酸（図３ａｇ）（１２Ｂ）及び（１Ｓ，２Ｓ）−Ｎ−２−アミノ−１−フェニル−１，３−プロプランジオールドデカンアミド（図３ａｅ）（１２Ｃ）を用いる実施例を図１２に示す。
実施例１７−選択性に対するリンカーの効果
キラール中心に隣接する化学的な環境も選択性に重要な変化を導き得る。キラール中心の環境を調節する予期されぬ効果的な方法は、界面活性剤の疎水性尾部にキラール中心を連結させる化学基を変えることである。図１３に示すように、スルホンアミドリンカー（図３ｈ）（１３Ａ）、ウレアリンカー（図３ｇ）（１３Ｂ）及びカルバメートリンカー（図３ａ）（１３Ｃ）の使用は、特定の分離の選択性を劇的に変化させることができる。表３は、これらの３つのリンカーを含む界面活性剤を使用した１セットの条件下でスクリーニングされた１４個の化合物のリストを示す。
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明らかに、最適の選択性と分解能は試料である被分析化合物と界面活性剤の特異的な相互作用に依る。表３に示されるα値の差異は小さいようであるけれども、０．０１〜０．０３の違いは劇的に性能を改良できる。図１４は、１．０１のα値（１４Ａ、カルバメートリンカー）及び１．０４のα値（１４Ｂ、ウレアリンカー）を用いたキラールの分離の１例を示す。これは同様な段数と分配で、分解能では４倍の増加を示す。分離の質における改良は劇的である。界面活性剤は混合物でも使用でき、単一の界面活性剤よりも良い分離が行われる。表４は、これらの界面活性剤の３分子混合物におけるデータを示し、１４個の化合物中、１３個の分離に効果がある。
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すべての課題を解決する普遍的なキラール中心、リンカー、尾部もしくは頭部基は存在しない。選択性と分配を変動させる柔軟性は、キラール分離を総体的に成功させるためには決定的である。カラムの交換がオペレーターの介入を含むＨＰＬＣやＧＣの状況と異なり、多くのＣＥ機器は自動的な緩衝液の選択が可能である。このように、本明細書中に述べられた界面活性剤の１セットは最良の分離を見つけ出すために自動的にスクリーニングできる。
実施例１８−キラール分離に対するｐＨの効果
上述のように、本発明の正常な操作において被分析化合物はミセル内に分配されなければならない。いくつかの例では、この相互作用は水性環境のｐＨを変化させることにより調節できる。例えば、典型的には負に荷電した被分析化合物は、負に荷電したミセル内には分配しない。２つの酸の実施例を図１５に示す。しかし、もしｐＨを下げ被分析化合物のカルボン酸の官能基がプロトン化されたら、そのときは今中性の被分析化合物がさらに容易にミセル内に分配することができるだろう。しかし、前に述べた本発明の態様は界面活性剤の溶解性に必須のカルボン酸の官能基をも含む。これらの界面活性剤が中性になると、もはや溶解出来ない。それ故、使用可能なｐＨ範囲で荷電状態にある荷電した頭部基が酸の分離を可能にするだろう。しかし、スルフェートのような異なった頭部基の付加はこの性質を劇的に変化させる。１つの態様において、スルフェート基がＣ１２アミド連結のバリノールの界面活性剤（図３ｍ）のカルボン酸の官能基と置換される。今、この界面活性剤を使用しｐＨを２．０に下げると分離が行われ得る。図１６は、ｐＨを６又はそれ以上に上げると不可能であった図１５における有機酸のキラール分離を示す（１６Ａはプログルミド、１６ＢはＣＢＺ−トリプトファン）。スルホン酸、スルホネート、アルコール及びジオールのような他の頭部基も可能である。
図１７に示すように、本発明を使用して分離した別の型の分子は、６−キノリルアミノカルボニルを付加したアミノ含有化合物である。図１８に典型的な分離を示す。
実施例１９−電気浸透流の効果
溶融シリカ毛細管内での電気泳動の副効果の１つは、電気浸透流と呼ばれる大きな液体流動である。この液体流動は、キラール分離の分離能へ貢献することなくすべての分離組成物を同じ速度で毛細管内を移動させる。図１９にこれを示す。ｐＨ４．０（１９Ａ）では、浸透流の移動度は１．４×１０-4ｃｍ2／Ｖｓで一方、ミセルの移動度は−４．４×１０-4ｃｍ2／Ｖｓであった。ｐＨを６．０（１９Ｂ）まで上げると、ミセルの移動度は同じであるのに対し、浸透流の移動度は２．２８×１０-4ｃｍ2／Ｖｓに上昇した。この電気浸透流の増強は見かけ上の分離能に影響を与えなかったが、総体的に数分間の分析時間の増加となった。本発明の別の態様において、ある化学物質で壁を修飾した溶融シリカ毛細管を使用することにより、電気浸透流を大幅に下げた。図２０にこの態様を示す、ｐＨ７で２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンを使用した（２０Ａは被覆した毛細管、μｏｓ＝０．７×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ、２０Ｂは被覆しない毛細管、μｏｓ＝５．７×１０-4ｃｍ2／Ｖｓ）。この場合、電気浸透流の存在は分析時間を短縮するが、分離能を改良しない。
実施例２０−尿中のエフェドリン対掌体の検出
ＭＥＫＣは、生理学的試料の分離を行うためにも有用である。図２１は、未処理の尿中のエフェドリン対掌体の分離を示すエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）である。図２１（Ａ）は、１００ｕｇ／ｍＬのラセミ体エフェドリン標準液を示す。ベースラインの分離が１７分と１８分の間で起きる。図２１（Ｂ）は、同じ条件下で泳動した１００ｕｇ／ｍＬのエフェドリンをスパイクした尿の試料を示すが、ほとんど同じ時間に分離が起こる。図２１（Ｃ）は、尿の対照である。１７分と１８分の間の領域に干渉するピークが１つも見られないことに注目する。尿試料中のキラール化合物及び非キラール化合物の両者を分離する可能性は本方法の広い適応性を示すものである。
条件：毛細管５０ｕｍ内径×６０ｃｍ長さ；＋１５ｋＶ印加電圧；２１４ｎｍで検出，０．１秒間定常値；１０ポイント／秒でデータの取得、５秒間で注入。緩衝液は２５ｍＭのリン酸塩／ホウ酸塩、ｐＨ８．８と５０ｍＭのＮ−ドデコキシカルボニルバリンであった。試料の調製はろ過のみであった。
実施例２１−対掌体選択性を強化する尾部
尾部が対掌体選択性を強化することを明らかにするために、同一リンカー（カルバメート）、同一キラール選択部（バリン）及び同一頭部（カルボキシレート）を持つが、尾部の異なる４個の新しいキラール界面活性剤を使用して、１０個の被分析化合物で得られたα値を比較した。４個の新しいキラール界面活性剤は（Ｓ）−Ｎ−ドデシルオキシエチレン−（４）−オキシカルボニルバリン（図３ｆ、Ｂｒｉｊ−３０尾部）、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（図３ａ、直鎖状炭化水素尾部）、（Ｓ）−Ｎ−（２Ｒ）−オクトキシカルボニルバリン（図３ａｖ、キラール（Ｒ）、分岐状炭化水素尾部）及び（Ｓ）−Ｎ−（２Ｓ）−オクトキシカルボニルバリン（図３ａｕ、キラール（Ｓ）、分岐状炭化水素尾部）であった。すべての分離をｐＨ８．８で、２５ｍＭ（直鎖状炭化水素尾部）、５０ｍＭ（Ｂｒｉｊ−３０尾部）あるいは１００ｍＭ（Ｒ及びＳ分岐状炭化水素尾部）のいずれかの界面活性剤を用いて行った。
それぞれの尾部においてテストした化合物に対するα値を下記表５に示す。ナドロール、オクトパミン及びテルブタリンの場合を除いて、直鎖状炭化水素尾部は一般的に最も高いα値を示した。テルブタリンでは（Ｓ）−Ｎ−（２Ｒ）−オクトキシカルボニルバリン（Ｒ尾部）が最高のα値を示し、ナドロール（１）では（Ｓ）−Ｎ−（２Ｓ）−オクトキシカルボニルバリン（Ｓ尾部）が最高のα値を示し、ナドロール（２）では（Ｓ）−Ｎ−ドデシルオキシエチレン−（４）−オキシカルボニルバリンが最高のα値を示し及びオクトパミンには（Ｓ）−Ｎ−（２Ｓ）−オクトキシカルボニルバリン（Ｓ尾部）が最高のα値を示した。少なくとも１つの尾部により、すべての化合物に対するα値が異なっていたことに注目せよ。
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他の型の尾部も対掌体選択性に影響する。表６は、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリン（炭化水素尾部、アミドリンカー、バリンキラール選択部、カルボキシレート頭部）に対する（Ｓ）−Ｎ−パーフルオロオクタノイル−（Ｌ）−バリン（パーフルオロ尾部、アミドリンカー、バリンキラール選択部、カルボキシレート頭部）で得られた対掌体選択性を比較する。すべての場合において、２つの尾部は異なる対掌体の選択値を示した。条件はｐＨ８．８における２５ｍＭ界面活性剤であった。
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実施例２２−対掌体選択性を強化する頭部
親水性の頭部が対掌体選択性を強化することを示すため、６つの新しいキラール界面活性剤に基づく１１個の化合物で得られたα値を比較した。これらの６つの界面活性剤はすべてＣ１２尾部とバリンベースのキラール選択部を持つ。スルフェートとカルボキシレートの頭部基を３つのリンカー（アミド、カルバメート及びウレア）について比較した。６つの新しい界面活性剤は、（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリン（図３ｑ、アミド−バリン−カルボキシレート）、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（図３ａ、カルバメート−バリン−カルボキシレート）、（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリン（図３ｇ、ウレア−バリン−カルボキシレート）、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）−アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３ｍ、アミド−バリノール−スルフェート）、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデコキシ）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３１、カルバメート−バリノール−スルフェート）及び（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシルアミノ）アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３ｎ、ウレア−バリノール−スルフェート）である。条件は、ｐＨ８．８で２５ｍＭの界面活性剤であった。
下記表７は、それぞれのリンカーについてスルフェート対カルボキシレートの比較データを示す。ほとんどの場合、α値は２つの頭部基により異なっていた。一般的にカルボキシレート基の方が優れていた。
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頭部基の電荷を変えることによっても対掌体選択性並びに分離能に劇的に影響を及ぼすことができる。図２２Ａは、（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）アミノ〕−４−メチル−１−スルホオキシペンタン（図３ｂｄ、Ｃ１２−アミド−ロイシノール−スルフェート）を用いたＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アラニンの分離を示し、一方図２２Ｂは、Ｎ−ドデシル−（Ｓ）−ロイシンアミドヒドロクロリド（図３ｂｌ、Ｃ１２−アミド−ロイシン−アンモニウム塩）による同じ化合物の分離を示す。正に荷電したアンモニウム頭部基で、優れた対掌体選択性と分離能が得られる。条件はｐＨ３．０における２５ｍＭ界面活性剤であった。
実施例２３−対掌体選択性を強化するキラール選択部
カルバメートリンカー、Ｃ１２尾部及びカルボキシレート頭部を持つがアミノ酸のキラール選択部を異にする幾つかの新しいキラール界面活性剤の比較データを下記表８に示す。（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルアラニン（図３ａｊ）、（Ｓ）−Ｎ−デコキシカルボニルアスパラギン（図３ａｒ）、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルイソロイシン（図３ａｌ）、（Ｓ）−Ｎ−デコキシカルボニルロイシン（図３ａｋ）、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルｔｅｒｔロイシン（図３ｃ）、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルスレオニン（図３ａｓ）及び（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（図３ａ）を用いて１０個のキラール塩基を試験した。それぞれのアミノ酸誘導体による１０個の化合物で得られた対掌体選択値を下記に示す。条件はｐＨ８．８における２５ｍＭ界面活性剤であった。
全体として、ロイシン誘導体が優れた対掌体選択性を示した。さらに、それは１つの水素結合部位だけしか含まないキラール塩基のアンフェタミンに対しても対掌体選択性を示した、図２３を参照。アンフェタミンを分離する能力を示した他のキラール界面活性剤は、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルシクロヘキシルアラニン（図３ａｏ、図２４Ａ）及び（Ｒ，Ｒ）−Ｎ−デシル酒石酸モノアミドナトリウム塩（図３ａｇ、図２４Ｂ）である。
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実施例２４−親水性の頭部基は分配に影響する
前述のように、スルフェート頭部基は酸性ｐＨで使用される能力においてはカルボキシレート頭部基以上に有利な点がある。酸性ｐＨでは酸の荷電が最小であるので、親水性の酸を分離することが可能であり、それらが完全にアニオンである中性ｐＨよりも分配が高い。中性ｐＨにおける低分配の理由は、アニオンのミセルによるアニオンの被分析化合物の荷電反発によるものである。荷電の引力は分配を高めるであろうから、正に荷電した頭部基もアニオン化合物の分配と分離能の改良に導く。例えば、図２５は、ｐＨ３．０で２５ｍＭのＮ−ドデシル−（Ｓ）−プロリンアミドヒドロクロリド（図３ｂｎ）を使用したアニオン化合物のカルボキシベンゾイル−ＤＬ−アラニンの分離を示す。
実施例２５−分配と対掌体選択性に影響するｐＨ
本研究では、ｐＨ７．０と８．８において、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（図３ａ）を１２個の塩基性被分析化合物と１つの中性化合物（ベンゾイン）を分離するために使用した。下記表９は、２つのｐＨにおける１３個の化合物すべての自由溶液移動度データ（μ）、容積因子値（ｋ）及びα値を示す。ベンゾイン（両ｐＨで中性）を除くすべての被分析化合物について、自由溶液移動度はｐＨ７．０の方が高かった。すべての塩基性被分析化合物はｐＨ７〜９の範囲のｐＫａ値を持つアミノ基を含むことから、これらの結果は予想された。より低いｐＨでは、化合物はより正に荷電し移動度が増加した。ベンゾインを除くすべての被分析化合物において、容積因子値はｐＨ７．０の方が高かった。これはアニオンのミセルとカチオンの被分析化合物の間のイオン引力の増加によるものである。最後にα値はすべての塩基性化合物において同じか、ｐＨ８．８よりもｐＨ７．０の方が高かった。特にブピバカイン、ケタミン及びメトプロロールについてはα値が大きく増加していることに注目せよ。ｐＨ７．０の方が低い対掌体の選択性を示す塩基はなかった。
このデータは、アニオンミセルのカチオン被分析化合物の分配と対掌体選択性を決定する際の電荷の重要性を明らかに示している。アニオンの被分析化合物とカチオンのミセルについても同様な傾向が予想され得る。
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実施例２６−溶解性を可能にする尾部の長さ
カルボキシレート頭部基を含むキラール界面活性剤において、それ以下では界面活性剤が不溶化する最小ｐＨがあることがわかった。この最小ｐＨ値は炭化水素尾部の長さの関数である。例えば、カルバメートリンカー、バリンキラール選択部及びカルボキシレート頭部基を含む界面活性剤において、Ｃ１４尾部を持つ誘導体、（Ｓ）−Ｎ−テトラデコキシカルボニルバリンはｐＨ７．５以下で不溶であり、Ｃ１２尾部を持つ誘導体、（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリンはｐＨ６．５以下で不溶であり、Ｃ１０尾部を持つ誘導体、（Ｓ）−Ｎ−デコキシカルボニルバリンはｐＨ５．５以下で不溶であり、及びＣ８尾部を持つ誘導体、（Ｓ）−Ｎ−オクトキシカルボニルバリンはｐＨ４．５以下で不溶である。イオン化できる化合物において対掌体選択性と分配はｐＨに影響されるので（上記参照）、広い範囲のｐＨの溶解性を持つことは重要である。より広いｐＨ範囲の溶解性の結果、より高い臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）が得られる。
より良いｐＨ溶解性により尾部の長さが分離能をいかに改良できるかという１例を、ニコチン対掌体の分離、図２６Ａと２６Ｂで示す。図２６Ａで示す分離は、ｐＨ８．０で１００ｍＭの（Ｓ）−ドデシルアミノカルボニルバリン（図３ｇ、Ｃ１２尾部）を用いて得られた。不完全な分離能とピークのテーリングが明らかであった。テーリングは界面活性剤がｐＨ７．８では不溶であるという事実によるためであり、ｐＨ８．０の分析では界面活性剤は壁に結合していた。対掌体選択性が低過ぎたため、分離が不完全であった。図２６Ｂで示す分離は、ｐＨ７．５で１００ｍＭの（Ｓ）−デシルアミノカルボニルバリン（図３ａｙ、Ｃ１０尾部）を用いて得られた。ベースラインの分離と対称的なピークが得られた、このｐＨでは、Ｃ１０誘導体は溶解最小ｐＨ（ｐＨ６．７）より十分上であり、より高い対掌体選択性が得られたためである。
実施例２７−アスパルテーム立体異性体の分離
アスパルテーム、すなわちＮｕｔｒａｓｗｅｅｔTM（ＧＤＳｅａｒｌｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）はダイエット清涼飲料から薬剤に至る製品に使用される人工甘味料である。アスパルテームはアスパラギン酸とフェニルアラニンのジペプチドで、Ｃ末端がメチルエステルで保護されている。ジペブチドは２つのキラール中心を持つので、全部で４つの立体異性体；ＬＬ，ＤＤ，ＬＤ，ＤＬが可能である。ＬＬ異性体が甘味料として市販されている。しかし、最終生成物と原料物質の両方における他の立体異性体をも同様にモニターすることが重要である。
図２７は、ｐＨ３．５で２５ｍＭの（Ｓ）−２−〔（１−オキソドデシル）−アミノ〕−３−メチル−１−スルホオキシブタン（図３ｍ）を用いた４つの立体異性体すべての分離を示す。４つの立体異性体は１９分以内でベースラインを分離した。２２分と２４分の遅いピークはおそらく主要な異性体の分解産物によるものであろう。
実施例２８−ＵＶバックグランドに対するリンカーの効果
キラールＭＥＣＣ緩衝液のバックグランドＵＣ吸収に対するリンカーの影響を示すために、次の実験を行った：
（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリン（アミドリンカー）、（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリン（ウレアリンカー）及び（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン（カルバメートリンカー）の２５ｍＭ溶液をそれぞれ、２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4／２５ｍＭ  Ｎａ2Ｂ4Ｏ7緩衝液中で調製した。５０μｍ内径の毛細管と２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いて、脱イオン水を真空で毛細管内に吸引し吸光度を０．０００吸光度ユニットにセットした。それから、対照緩衝液、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデカノイルバリン緩衝液、２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデシルアミノカルボニルバリン緩衝液及び２５ｍＭの（Ｓ）−Ｎ−ドデコキシカルボニルバリン緩衝液を真空で毛管内に吸引し、ＵＶ吸光度を測定した。各溶液の吸光度を下記表１０に示す。
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表から明らかなように、アミドリンカーはウレアの吸光度の１．４倍でカルバメートの吸光度の５．３倍という最高の吸光度となった。ＣＥにおいて、高いバックグランドの吸光度は、ノイズレベルを上げ、検出の直線範囲を狭めるので重大な不利益である。２つのアミド基を持つ界面活性剤は、（界面活性剤の他の部分がＵＶ不活性だとすると）１つのアミド基だけを持つ界面活性剤の約２倍の吸光度を示すであろうことに注目せよ。ＵＶ吸収検出器を使用するとき、キラール界面活性剤において、カルバメートリンカーの大きな有利性ばかりでなくアミドリンカーの不利な面をこのデータは明確に示す。
上述の発明は明解さと理解容易のために図面と実施例により記述したけれども、追加した請求の範囲にのみ限定され、本発明の範囲内で一定の変化と修正をもって実施され得ることは明らかであろう。例えば、キラール選択部は１つ又はそれ以上のキラール炭素であってもよく、互いに近接して配列されてもよく、ある距離だけ離れていてもよい。しかし、ここに示す酒石酸誘導体は多数のキラール選択部の配列の１例に過ぎない。キラール選択部は特に限定されず、むしろ想像できるキラール分子のどんなクラスから選んでもよく、これらも本発明の範囲内に含まれる。同様に、その分子の尾の部分も、第一義的にはキラール被分析化合物と疎水性の相互作用（分配）を高めるために存在しているけれども、本明細書に記述するようにキラール炭素を含んでもよい。キラール中心は、被分析化合物のキラール中心と相互作用できるように尾部内のどこに位置しても構わない。頭部基は、ミセルを支持する溶媒中に分子を溶解させる第一義的機能を果たし、対掌体選択性を強化する限りはどんな構造であっても構わない。キラール選択部のキラール選択性を強化するどんなリンカー分子も本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
0003699115.tif 000032
【図３Ｉ】
0003699115.tif 000033
【図３Ｊ】
0003699115.tif 000034
【図３Ｋ】
0003699115.tif 000035
【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図３Ｔ】
0003699115.tif 000044
【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
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【図３Ｗ】
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【図３Ｘ】
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【図３Ｙ】
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【図３Ｚ】
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【図３ＡＡ】
0003699115.tif 000051
【図３ＡＢ】
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【図３ＡＣ】
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【図３ＡＤ】
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【図３ＡＥ】
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【図３ＡＦ】
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【図３ＡＧ】
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【図３ＡＨ】
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【図３ＡＩ】
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【図３ＡＪ】
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【図３ＡＫ】
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【図３ＡＬ】
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【図３ＡＭ】
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【図３ＡＮ】
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【図３ＡＯ】
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【図３ＡＰ】
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【図３ＡＱ】
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【図３ＡＲ】
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【図３ＡＳ】
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【図３ＡＴ】
0003699115.tif 000070
【図３ＡＵ】
0003699115.tif 000071
【図３ＡＶ】
0003699115.tif 000072
【図３ＡＷ】
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【図３ＡＸ】
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【図３ＡＹ】
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【図３ＡＺ】
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【図３ＢＡ】
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【図３ＢＢ】
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【図３ＢＣ】
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【図３ＢＤ】
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【図３ＢＥ】
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【図３ＢＦ】
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【図３ＢＧ】
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【図３ＢＨ】
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【図３ＢＩ】
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【図３ＢＪ】
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【図３ＢＫ】
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【図３ＢＬ】
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【図３ＢＭ】
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【図３ＢＮ】
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【図３ＢＯ】
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【図３ＢＰ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
0003699115.tif 000102
【図１１Ｂ】
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0003699115.tif 000104
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
0003699115.tif 000107
【図１２Ｂ】
0003699115.tif 000108
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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