(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質を、アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼで処理することを特徴とする、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く、且つトリプシン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質の調製方法。
【請求項２】
小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質を、アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼおよびトリプシンで処理することを特徴とする、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く、且つトリプシン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質の調製方法。
【請求項３】
アミラーゼ阻害活性が、最初に用いた小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質の８５〜９５％になった時点で、アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼによる反応を停止させることからなる請求項１または２の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高純度アミラーゼ阻害物質の調製方法に関する。より詳細には、本発明は、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く且つトリプシン阻害活性の極めて低い高純度アミラーゼ阻害物質を、簡単な操作により生産性よく調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年我が国では食生活が豊かになり、糖尿病をはじめとする代謝性疾患が急増している。過剰の栄養摂取はインシュリンの大量分泌を誘導し、間接的に代謝バランスの崩壊をもたらし、耐糖機能の低下（高血糖）、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等を引き起こす。特に、糖尿病患者ではインシュリン作用が不足し耐糖能が低下しているため、食後の血糖値の上昇が著しく、毛細血管の損傷や動脈硬化などの合併症の原因となっている。
【０００３】
上記のような疾患の予防および治療には、必要な栄養を摂取しても血糖値が上昇しにくかったり、インシュリンの大量分泌を抑制し得る食品や物質の摂取が有効であるとされている。そのため摂取した澱粉が少糖類に分解するのを抑制または阻害し得る物質およびインシュリンの分泌を抑制できる物質が求められてきた。
【０００４】
上記の点から、澱粉を糖に分解するアミラーゼの活性を阻害する作用を有するいわゆるアミラーゼ阻害物質に対する研究が色々行われるようになっており、小麦中にもアミラーゼ阻害物質が含まれていることが報告されて以来、小麦由来のアミラーゼ阻害物質に関する研究や開発が種々なされるようになった（例えば特開昭４６−１８３３号公報、特開昭６１−１７１４３１号公報）。
【０００５】
しかしながら、上記した従来の小麦由来のアミラーゼ阻害物質は、人間に経口で投与した場合に期待どおりの効果がみられず、特に米飯のような加熱調理した澱粉の消化に対しては糖への分解抑制作用が低く、しかも高価であるなどの欠点を有していた。したがって、近年、加熱調理した澱粉の消化に対しても、経口投与により糖への分解抑制作用を有する有効なアミラーゼ阻害物質を経済的に得る方法が求められていた。
【０００６】
【発明の内容】
本発明者らは小麦から有用成分を得ることについて長年研究を行ってきたが、そのような研究の一環として、小麦からのアミラーゼ阻害物質の取得についても研究を続けてきた。その結果、工業的に高純度のアミラーゼ阻害物質を製造する方法として、アミラーゼ阻害物質含有液にアルギン酸などの多糖類を加えて不溶性の複合体を形成させて分取し、次いでこの複合体より多糖類を分離除去した後に、更に陽イオン交換体で処理する工程を施し、その陽イオン交換体通過画分からアミラーゼ阻害物質を回収する方法を確立して先に出願した（特開平５−３０１８９８号）。
【０００７】
本発明者らによる上記の方法で得られるアミラーゼ阻害物質は、極めて高いアミラーゼ阻害活性を有する一方で、有害なトリプシン阻害物質の含有量が少ないことから、体内においてアミラーゼ阻害物質のアミラーゼ阻害活性を妨害することがなく、しかもトリプシン阻害物質に起因する膵臓の肥大や膵臓癌の発生がないという良好な特性を有しており、そのためインシュリン分泌抑制に極めて有効である。そして、上記した特開平５−３０１８９８号公報に記載の方法では、陽イオン交換体による処理が純度の向上および有害なトリプシン阻害物質の除去の点で大きな効力を発揮している。
【０００８】
しかしながら、上記の方法は、イオン交換樹脂（イオン交換体）の使用を必須にしているため、イオン交換樹脂筒（カラム）などの設備、イオン交換樹脂の再生などが必要であり、その操作性や生産性の点で未だ十分には満足し得る方法ではない。そこで、イオン交換樹脂を用いずに、上記した方法と同様に、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く、しかもトリプシン阻害物質の含有量の少ない、高純度のアミラーゼ阻害物質を簡単な操作で生産性良く調製し得る方法が求められている。また、イオン交換樹脂を用いる上記した特開平５−３０１８９８号公報に記載された方法などにより得られる高純度のアミラーゼ阻害物質の場合でも、そこで得られたアミラーゼ阻害物質を、簡単な操作でより一層高純度のものにすることのできる方法が、アミラーゼ阻害物質の有効利用などの点から求められている。
【０００９】
そこで、本発明者らは、純度が高くて且つトリプシン阻害活性の少ないアミラーゼ阻害物質を、簡単な操作で生産性良く調製し得る方法を開発すべく更に色々検討を重ねてきた。その結果、アスペルギルス・オリゼーに由来するＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）で４０Ｋ（分子量約４００００）のプロテアーゼが、アミラーゼ阻害物質に対してはあまり分解作用を示さず、アミラーゼ阻害物質中に夾雑物として含まれる蛋白質（以下「夾雑蛋白質」という）を優先的に分解して低分子化し得ることを見出した。そしてそのような知見に基づいて、粗製アミラーゼ阻害物質をアスペルギルス・オリゼー由来の該ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼで処理したところ、アミラーゼ阻害物質中に含まれるトリプシン阻害物質や夾雑蛋白質がまず最初に優先的に分解されて低分子化され、その一方でアミラーゼ阻害物質が分解されないため、その処理物から分解により生じた低分子化物を除去すると、トリプシン阻害物質や夾雑蛋白質の含有量が大幅に低減された、アミラーゼ阻害物質の含有量の極めて多い、高純度のアミラーゼ阻害物質を簡単な操作で生産性良く調製することができた。
【００１０】
さらに、本発明者らは、上記の研究の一環として、アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼと共にトリプシンを用いてアミラーゼ阻害物質の処理を行ったところ、該プロテアーゼ処理によって完全に分解されずに場合により少量残存しているトリプシン阻害物質がトリプシンにてブロックされてそのトリプシン阻害活性がなくなって、トリプシン阻害活性の極めて低い、高純度のアミラーゼ阻害物質を調製することができた。
【００１１】
したがって、本発明は、小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質を、アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼで処理することを特徴とする、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く、且つトリプシン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質の調製方法である。
【００１２】
さらに、本発明は、前記したアスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼで処理する方法に加えてトリプシンで処理することを特徴とする、高純度アミラーゼ阻害物質の調製方法である。
そして、本発明のこれらの方法による場合は、夾雑蛋白質がアスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼで分解されて低分子化されるのでそれを適当な方法でアミラーゼ阻害物質から分離・除去し、さらに系に残存しているトリプシン阻害物質をトリプシンで不活化してそのトリプシン阻害活性を消失または低減させることによって、アミラーゼ阻害活性の高い高純度のアミラーゼ阻害物質が好ましく調製される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明でいう小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質とは、アミラーゼ阻害物質と共にトリプシン阻害物質やその他の夾雑蛋白質を含有する小麦由来のアミラーゼ阻害物質を言う。本発明で用いる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質は特に制限されず、小麦に由来しアミラーゼ阻害物質と共に夾雑蛋白質を含有するものであればいずれでもよく、例えば該粗製アミラーゼ阻害物質の製造方法、該粗製アミラーゼ阻害物質におけるアミラーゼ阻害物質の含有量（粗製アミラーゼ阻害物質の純度）、該粗製アミラーゼ阻害物質に含まれる夾雑蛋白質の種類や含有量などは特に制限されない。
例えば、本発明で用いる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質が低純度（アミラーゼ阻害物質含有量が低い）ものである場合には、本発明の方法を行うことによって、それよりもアミラーゼ阻害物質含有率の高いアミラーゼ阻害物質を調製することができ、また本発明で用いる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質が比較的純度の高いもの（アミラーゼ阻害物質の含有率の高いもの）である場合には、本発明の方法を行うことによって純度の一層高い（アミラーゼ阻害物質の含量量の一層多い）アミラーゼ阻害物質を得ることができる。
【００１５】
何ら限定されるものではないが、本発明で用いられる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質としては、例えば、上記した特開平５−３０１８９８号公報に記載されている方法で得られる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質、特開平７−４８２６８号公報、特開平７−４８４００号公報、特開平７−４１４９９号公報、特願平８−２３４４６号などに記載されている小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質などをあげることができる。
（以下、本発明で用いる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質を単に「粗製アミラーゼ阻害物質」ということがある。）
【００１６】
また、本発明で用いる粗製アミラーゼ阻害物質、および本発明の調製方法により得られる高純度アミラーゼ阻害物質中には、１種のアミラーゼ阻害物質のみが含まれていても、または２種以上のアミラーゼ阻害物質が含まれていてもよい。例えば、小麦由来のアミラーゼ阻害物質には、Davis らの方法（Annals New York Academy of Science，121，ｐ404，1985）に準じて、ポリアクリルアミド電気泳動にかけたときに、移動度約０．１９の位置にバンドとして現れる分子量約２４０００の蛋白質（以下これを「０．１９ＡＩ」ということがある）、移動度約０．２６の位置にバンドとして現れる蛋白質（以下これを「０．２６ＡＩ」ということがある）、移動度０．２８の位置にバンドとして現れる蛋白質（以下これを「０．２８ＡＩ」ということがある）、移動度０．５３の位置にバンドとして現れる蛋白質（以下これを「０．５３ＡＩ」ということがある）（前記した０．１９ＡＩ、０．２６ＩＡ、０．２８ＡＩ、０．５３ＡＩのアミノ酸配列については特開平７−４１４９９号公報を参照）、移動度約０．２６の位置にバンドとして現れるが上記した０．２６ＡＩよりも２残基欠落したアミノ酸配列を有する蛋白質（特願平８−２３４４６号参照）などがあり、本発明で用いる粗製アミラーゼ阻害物質および本発明の調製方法で得られる粗製アミラーゼ阻害物質は、上記したアミラーゼ阻害物質のうちの１種のみを含有していても、または２種以上を含有していてもよい。
【００１７】
アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）は、複数種のプロテアーゼを産生するが、本発明でそれらのプロテアーゼのうちで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼを用いることが必要である。本発明で用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼは、上記したように、アミラーゼ阻害物質に対する分解作用が小さく、その一方で小麦由来のアミラーゼ阻害物質以外の夾雑蛋白質に対する分解作用が大きくて、該夾雑蛋白質を優先的に分解するという性質を有している。そのため、アミラーゼ阻害物質と夾雑蛋白質を含有する粗製アミラーゼ阻害物質に対してこのプロテアーゼを作用させると、アミラーゼ阻害物質以外の夾雑蛋白質が最初に優先的に分解されて低分子化され、その低分子化物を適当な方法でアミラーゼ阻害物質から分離・除去することによって、高純度のアミラーゼ阻害物質を得ることができる。
【００１８】
ここで、本発明でいうアスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼとは、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素を含む原料（酵素製剤等）を緩衝液に溶解し、これをゲル濾過カラムにかけてクロマトグラフィーを行い、その溶出液の各フラクションごとの酵素活性（蛋白質分解活性）を調べ、アミラーゼ阻害物質に対しては分解能が低く他の蛋白質に対しては分解能の高いフラクションを選び出し、前記で選び出したフラクションをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、分子量既知の蛋白質混合物との関係から求められた、４０Ｋ（分子量４００００）の位置にバンドとして析出するプロテアーゼであり、その詳細については下記の実施例の項で説明するとおりである。
【００１９】
アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼ（以下これを「Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼ」ということがある）は、純品でも、またはＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと本発明の目的にかなう悪影響のない他の酵素（プロテアーゼ）との混合物でもよい。Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを含有する酵素製剤は既に色々市販されており、例えばスミチームＬＰ（新日本化学工業株式会社製）、デナチームＡＰ（ナガセ生化学工業株式会社製）、プロテアーゼＡ（天野製薬株式会社製）などを挙げることができ、本発明ではそれらのいずれもが使用できる。
【００２０】
粗製アミラーゼ阻害物質を、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼで処理して夾雑蛋白質を分解するに当たっては、粗製アミラーゼ阻害物質を水、水／アルコール混合液などに溶解または分散させ、液のｐＨを３〜５に調整し、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを添加して４０〜６０℃程度の温度で粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれる夾雑蛋白質の分解を行う方法が好ましく用いられる。その場合に、粗製アミラーゼ阻害物質は濃度が約０．０１〜３０重量％程度の水溶液または分散液にしてＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼで処理するのが、夾雑蛋白質の分解が円滑に行われると共に、トリプシン阻害物質も大幅に低減される。また、上記のｐＨ調整は無機酸および／または有機酸のいずれを用いて行ってもよく、一般的には塩酸、クエン酸、リン酸、乳酸などを用いて行うのが安全性の点から好ましい。
【００２１】
一般的な酵素処理では、酵素添加量と酵素反応時間は深く関係しており、酵素量が多い場合は反応時間が短くなり、一方酵素量が少ない場合は反応時間が長くなることが知られている。したがって、本発明においても、添加するＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの量に応じて反応時間を調節することが必要であり、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの添加量が多い場合は反応時間を短くし、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの添加量が少ない場合は反応時間を長くするのがよい。また、使用する酵素製剤中におけるＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの含有量、粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれる夾雑蛋白質の量などによっても反応時間を調節する必要がある。そのため、粗製アミラーゼ阻害物質に対するＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの添加量および反応時間は一概には決められないが、一般的には粗製アミラーゼ阻害物質（基質蛋白質）の全重量に基づいてＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを含有する酵素製剤を０．１〜５重量％の割合で添加して、１〜２４時間の反応時間で夾雑蛋白質の分解処理を行うのが好ましい。
【００２２】
そして、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを用いて粗製アミラーゼ阻害物質の分解処理を行うと、反応の初期の段階ではアミラーゼ阻害物質は分解されずに粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれている夾雑蛋白質が優先的に分解されるが、反応が進行して夾雑蛋白質の量が少なくなるとアミラーゼ阻害物質自体の分解も生ずるようになる。そのため、アミラーゼ阻害物質を高純度で且つ高収率で得るためには、アミラーゼ阻害物質の分解が大きくならない段階で反応を停止する必要がある。一般には、被処理物のアミラーゼ阻害活性が、最初のアミラーゼ阻害活性（Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼによる分解処理を行う前の粗製アミラーゼ阻害物質のアミラーゼ阻害活性）の８５〜９５％程度になった時点で分解反応を停止させると、夾雑蛋白質の殆どが分解されて純度が高くなり、しかもアミラーゼ阻害物質の分解を防止できるために、高純度のアミラーゼ阻害物質を高収率（高歩留り）で得ることができる。
被処理物のアミラーゼ阻害活性が最初のアミラーゼ阻害活性の８５％よりも低くなるまで分解処理を行うと、純度は高くなるが、アミラーゼ阻害物質の歩留りが低くなる。適当な反応終点を求めるに当たっては、粗製アミラーゼ阻害物質（被処理物）中に含まれる、特定のアミラーゼ阻害物質（例えば０．１９ＡＩ）に着目し、それを指標としてそのアミラーゼ阻害物質の被処理物中における含有量（減少程度）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって調べることによって行うことができる。
【００２３】
粗製アミラーゼ阻害物質の分解反応が所定の状態に達した段階で、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを失活させて反応を停止させる。酵素の失活は一般に加熱により行うことができる。加熱温度が高すぎたり加熱時間が長すぎると、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの失活のみならずアミラーゼ阻害物質のアミラーゼ阻害活性も低下するので、一般には、７０〜８５℃の温度で１０〜６０分間程度の加熱を行ってＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを失活させるのがよい。
【００２４】
次いで、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼによる分解処理によって低分子化された夾雑物をアミラーゼ阻害物質から分離して除去する。夾雑物の分離法としては、アミラーゼ阻害物質から低分子化された夾雑物を円滑に分離できる方法であればいずれも採用でき特に制限されない。そのうちでも、限界濾過膜を使用して行うと夾雑物の分離・除去が円滑に行われるので望ましい。その場合の限外濾過膜のポアサイズは、分子量１００００以下から２００００以下のものが分離できるようなサイズであるのが好ましい。
【００２５】
そして、上記で夾雑物を除去した後に残留するアミラーゼ阻害物質を含有する液を乾燥することによって目的とする高純度のアミラーゼ阻害物質を粉末などの固形状で高収率で得ることができる。その際の乾燥処理は、例えば凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥などによって行うことができる。また、乾燥をいわゆるボール乾燥法によって行ってもよく、ボール乾燥法による場合は、アミラーゼ阻害物質を含有する液をボール表面に被覆してボールを流動状態や転動状態で乾燥することによって、ボール表面に形成されたアミラーゼ阻害物質の被覆層が乾燥してボール表面から剥離して分離・回収される。
【００２６】
上記した処理を行うことによって、例えば、処理を行う前の粗製アミラーゼ阻害物質中における０．１９ＡＩの含有量が２５重量％程度であったのが、処理後には０．１９ＡＩの含有量が約４５重量％以上にも達するような、高純度のアミラーゼ阻害物質を簡単な操作で、円滑に得ることができる。しかも、その際にトリプシン阻害物質もＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼによって分解されて低分子化されるために、最終的に得られるアミラーゼ阻害物質におけるトリプシン阻害物質含有量（トリプシン阻害活性）も大幅に低減されたものとなっている。
【００２７】
さらに、本発明において、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを用いる上記した処理方法において、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共にさらにトリプシンを用いて処理を行うと、トリプシン阻害活性の一層低減された、高純度アミラーゼ阻害物質を高収率で得ることができる。
すなわち、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを用いる分解処理においても、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの添加量を多くしたり、処理時間を長くすれば、トリプシン阻害物質の分解をも完全に行うことができてトリプシン阻害物質の含有量の極めて少ないアミラーゼ阻害物質を得ることができるが、その場合にはアミラーゼ阻害物質の分解も生じて、アミラーゼ阻害物質の収率が低くなり易い。
【００２８】
また、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共にトリプシンを用いて粗製アミラーゼ阻害物質の処理を行う本発明のこの第２の方法を採用する場合は、アミラーゼ阻害物質を高収率で得るためにトリプシン阻害物質の分解が完全に行われない段階で夾雑蛋白質の分解処理を停止させても、そのときに反応系に残存しているトリプシン阻害物質のトリプシン阻害活性をトリプシンによって消失または低減させることができるので、最終的に得られるアミラーゼ阻害物質中におけるトリプシン阻害活性が極めて低いものとなっている。その理由は明確ではないが、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共にトリプシンを用いることによって、分解されないで残存しているトリプシン阻害物質が何らかの形態でトリプシンと複合体を形成してそのトリプシン阻害活性を失うことによるものと推定される。
【００２９】
Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共にトリプシンを用いる場合は、トリプシンとして純品を使用しても、または他のものとの混合物を使用してもよく、トリプシン含有製剤の調製法、由来などは何ら制限されない。コストの点からは、純品（試薬）に比べて安価な、トリプシンを含有する酵素製剤が好ましく、例えば、ＰＴＮ３.０ Ｓ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）などのような市販の酵素製剤を用いることができる。
【００３０】
そして、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共にトリプシンを用いる本発明のこの第２の方法による場合は、トリプシンに比べて一般に安価に入手できるＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼがアミラーゼ阻害物質中に含まれるトリプシン阻害物質の大半を分解してアミラーゼ阻害物質中のトリプシン阻害物質の含有量を大幅に低減できるので、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを用いずにトリプシンのみを使用してアミラーゼ阻害物質中に含まれるトリプシン阻害物質のトリプシン阻害活性を低減させる場合に比べて、高価なトリプシンの使用量を大幅に低減することができ、それによって有害なトリプシン阻害物質の含有量の極めて少ない、高純度のアミラーゼ阻害物質を、高収率に且つ低コストで得ることができる。
【００３１】
Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼとトリプシンを用いて粗製アミラーゼ阻害物質の処理を行うに当たっては、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼおよびトリプシンは、粗製アミラーゼ阻害物質を含有する上記した水性溶液または分散液に同時に添加しても、または別々に添加してもよい。
そのうちでも、粗製アミラーゼ阻害物質を含有する水性溶液または水性分散液に、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを最初に添加してＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼによる夾雑蛋白質の分解処理を行った後に、トリプシンを添加して処理を行うと、両酵素の機能を充分に発揮させることができるので望ましい。
【００３２】
本発明の適当な高純度アミラーゼ阻害物質の製造法としては、例えば、ｐＨを３〜５に調整した粗製アミラーゼ阻害物質を含有する水性溶液または分散液にＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを添加し、４０〜６０℃の温度で夾雑蛋白質の分解処理を行い（好ましくは被処理物のアミラーゼ阻害活性が最初の８５〜９５％程度になるまで分解処理を行い）、反応終了後に液のｐＨを７．５〜９に調整してトリプシンを加えて同温度で１０〜６０分間トリプシンと反応させ、次いで液のｐＨを再度３〜５に調整して７０〜８５℃の温度で１０〜６０分間加熱処理して酵素を失活させると、高純度のアミラーゼ阻害物質を高い収率で得ることができる。
また、他の態様として、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼとトリプシンとを前記粗製アミラーゼ阻害物質を含有する水性溶液または水性分散液にはじめに加えて、前記と同様に処理してもよい。
【００３３】
そして、上記したいずれの場合にも、酵素を失活させた後の液を、分子量２００００万以下のもの、特に望ましくは分子量１００００〜２００００のものを分離できるようなポアサイズを有する限界濾過膜によって濾過して夾雑物を分離・除去し、次いで乾燥することによってアミラーゼ阻害物質含有率が高く且つトリプシン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質を粉末などの固形状で高収率で得ることができる。
【００３４】
本発明により得られるアミラーゼ阻害物質は、特に体内におけるアミラーゼ阻害物質のアミラーゼ阻害活性の妨害や膵臓の肥大や膵臓癌の発生の原因ともなるトリプシン阻害活性が極めて少ないために、膵液中に含まれるアミラーゼに対する阻害活性が高くて、インシュリンの分泌抑制に有効であり、米飯のように加熱調理された澱粉の消化抑制、すなわち糖への分解抑制に対して高い効果があり、しかも膵臓の肥大や膵臓癌の発生の危険が少ない。
【００３５】
本発明により得られるアミラーゼ阻害物質は、そのままで、または公知の担体や助剤等を使用して液剤、顆粒剤、錠剤等の形態にして血糖値上昇抑制剤および／またはインシュリン分泌調節剤として用いることができる。
更に、食品、特に澱粉質を多く含むパン、クッキー等の炭水化物系食品に添加して使用したり、お茶類、スープ類、ふりかけやバター、ジャム等のスプレッド類に添加して使用することができる。該アミラーゼ阻害物質の投与量や食品への添加量は、投与される対象の状態、症状、食品の種類やその摂取量等に応じて適宜調節することができ、例えば食品に添加して摂取する場合は、一回の食事当たりの該アミラーゼ阻害物質の摂取量を約０．１〜２０ｇ、好ましくは約０．４〜８ｇの範囲にするのがよい。
【００３６】
【実施例】
以下に本発明を実施例などにより具体的に説明するが、本発明はそれらの例により何ら限定されない。以下の例において、得られた生成物中の０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性は下記の方法により測定した。
【００３７】
０．１９ＡＩの含有量：
試料１００ｍｇを０．１％トリフルオロ酢酸水溶液１００ｍｌに溶解し、下記の表１に示す条件下に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、クロマトグラム中の０．１９ＡＩのピーク面積を測定した。一方、０．１９ＡＩ標品（純度１００％）１００ｍｇを同じ条件下にＨＰＬＣに供してクロマトグラム中の０．１９ＡＩのピーク面積を測定し、下記の数式１により試料中の０．１９ＡＩ含量を算出した。
【００３８】
【表１】
0003717242.tif 000002
【００３９】
【数１】
試料中の０.１９ＡＩ含量(％)＝（Ｓａ／Ｓｔ）×１００
式中、Ｓａ＝試料の０.１９ＡＩのピーク面積
Ｓｔ＝標品の０.１９ＡＩのピーク面積
【００４０】
トリプシン阻害活性の測定：
１．試薬
（Ａ）トリス−ＨＣｌ緩衝液：
２０ｍＭ塩化カルシウムを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．２）
（Ｂ）基質液：
ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（シグマ社製「Ｂ−４８７５」）２０ｍｇを０．５ｍｌのジメチルスルホキシドに加えて３７℃で溶解させ、この溶液を３７℃に保温した上記（Ａ）のトリス−塩酸緩衝液５０ｍｌに加えて基質液を調製する。
（Ｃ）トリプシン液：
１ｍＭ塩酸５０ｍｌにトリプシン（シグマ社製「Ｔ−８６４２」）１ｍｇを加えてトリプシン液を調製する。
（Ｄ）反応停止液：
３０％酢酸。
【００４１】
２．操作
（１）  試料液４００μｌと上記（Ｃ）のトリプシン液４００μｌを混合して３７℃で５分間プレインキュベートした後、３７℃に保温してある上記（Ｂ）の基質液を１ｍｌ加えて反応を開始させる。３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、上記（Ｄ）の反応停止液２００μｌを加えて反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、下記の数式２および数式３によりトリプシン阻害活性を求める。
（２）  ポジティブコントロール（Ｐ．Control）は、試料液の代わりに蒸留水４００μｌを用いて上記（１）と同様の操作を行う。
（３）  ブランクは、試料液の代わりに蒸留水４００μｌを用いて、上記の（１）において基質液を加える前に反応停止液を加える。
（４）  試料ブランクは、上記（１）の操作において、トリプシン液を反応停止液添加後に添加して行う。
【００４２】
３．トリプシン阻害活性の計算
４１０ｎｍにおける吸光度をブランクを対照として測定する。使用したトリプシン阻害物質のトリプシン阻害活性は下記の数式２より求め、試料添加物のトリプシン阻害活性は下記の数式３より求める。使用したトリプシン阻害物質のトリプシン阻害活性と試料添加物におけるトリプシン阻害活性の差を求めて、試料１ｍｇ当たりのトリプシン阻害活性をもって、トリプシン阻害活性とする。
【００４３】
【数２】
使用したトリプシン阻害物質のトリプシン阻害活性（ｕ）＝｛Ｐ．Controlの410ｎｍ吸光度)／５｝×１００
【００４４】
【数３】
試料添加物のトリプシン阻害活性＝｛(試料添加物の410ｎｍ吸光度−ブランクの410ｎｍ吸光度)／５｝×１００
【００４５】
《参考例  １》［粗製アミラーゼ阻害物質の製造］
（１）  小麦粉８００ｋｇに水４００リットルを加え、混練して生地を形成させた。この生地を６０００リットルの水を用いて洗浄して、グルテン４００ｋｇおよび小麦澱粉５００ｋｇを回収した。その際に５７８０リットルの洗浄液が生じたので、この洗浄液（水抽出液）に塩酸を加えてｐＨ３に調整し、３０分放置した後、アンモニアでｐＨを６．５に調整すると不溶物が沈殿した。沈殿を除去して上澄み液５２００リットルを回収した。
（２）  上記（１）で回収した上澄み液１００リットルにアルギン酸ナトリウム３００ｐｐｍを加えた後、ｐＨを４．０に調整して生成したゲル４０リットルを回収した。この回収したゲル４０リットルに、カルシウム濃度が４００ｐｐｍとなるように塩化カルシウムを加えて充分撹拌した後、１時間放置した。次いでゲルをドラバル型遠心分離機にかけて約１０リットルの沈殿物を回収した。沈殿物にさらに水３０リットルを加えて充分に撹拌し、ドラバル型遠心分離機にかけ６．５ｋｇの沈殿物を回収した。
【００４６】
（３）  上記（２）で回収した沈殿物６．５ｋｇに水２５リットルを加え、カルシウム濃度が３０００ｐｐｍとなるように塩化カルシウムを添加して充分撹拌し、ドラバル型遠心分離機を使用して上澄み液２５リットルを回収した。一方、この遠心分離によって沈殿物５リットルが同時に生成したので、これに塩化カルシウム水溶液（３０００ｐｐｍ）１２リットルを加えて充分洗浄し、洗浄液をドラバル型遠心分離機を使用して回収し、この液と前記２５リットルの上澄み液を併せて３９リットルの溶出液を得た。
（４）  上記（３）で得られた溶出液３９リットルに、リン酸二水素ナトリウム塩２９．１ｇを加えてｐＨを７．２に調整した。この液を８０℃まで加熱して、熱に不安定な物質を沈殿させて、それをドラバル型遠心分離機を使用して分離除去した。
【００４７】
（５）  上記（４）で熱に不安定な物質を除去した後の液を限外濾過膜［日東電工株式会社製「ＮＴＵ−３２５０ＣＩＲ」（２万分画）］を用いて濃縮し、併せて余剰カルシウム塩の脱塩を行って濃縮液を得た。
（６）  上記（５）で得られた濃縮液を凍結乾燥して３００ｇの粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質を得た。この乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は２５重量％、トリプシン阻害活性は１０ｕ／ｍｇであった。
【００４８】
《参考例  ２》［粗製アミラーゼ阻害物質の製造］
（１）  参考例１の（１）〜（５）と全く同じ工程を行って濃縮液を調製した。
（２）  上記（１）で得られた濃縮液をアンモニアでｐＨ７．５に調整し、フィルタープレスにて夾雑物を除去した後、３ｋｇの陽イオン交換樹脂（三菱化成株式会社製「ダイヤイオンＨＰＫ−５５」）で処理し、処理液のｐＨをクエン酸を用いて４に調整した。
（３）  上記（２）でｐＨ４に調整した液を８０℃で加熱処理した後、凍結乾燥して約２５０ｇの粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質を得た。この乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は３０重量％、トリプシン阻害活性は１．５ｕ／ｍｇであった。この参考例２ではイオン交換樹脂による処理を行っていることによって、イオン交換樹脂処理を行っていない参考例１に比べて、粗製アミラーゼ阻害物質中における０．１９ＡＩの含有量が高く、且つトリプシン阻害物質の含有量（トリプシン阻害活性）が低くなっていた。
【００４９】
《参考例  ３》［夾雑蛋白質の分解作用を有するプロテアーゼの検出］
（１）  ゲル濾過カラム（ファルマシア社製「Ｓｅｐａｈｃｒｙｌ  Ｓ−２００」；２．６ｃｍφ×７８ｃｍ）を作製し、流速１ｍｌ／分にて１００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化した。
（２）  ３００ｍｇのスミチームＬＰ（新日本化学工業株式会社製）に上記(１)の平衡化に用いたのと同じ緩衝液（４℃）５ｍｌを加えて、充分に撹拌した後、メンブランフィルター［（株）バイオフィールド社製「クロマトディスク２５Ａ」；膜厚０．４５μｍ）で濾過し、濾過液を上記（１）で準備しておいたゲル濾過カラムにかけて平衡化と同じ条件下にてグロマトグラフィーを行い（実験はすべて４℃で実施）、溶出してきた液を１０ｍｌごとにフラクションコレクターで分取し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、フラクション８、９、１０、１６および１７に蛋白質が含有されていることが確認された。
【００５０】
（３）  上記の参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質２ｇに蒸留水１６０ｍｌを加え、塩酸にてｐＨを４に調製した後、全量が２００ｍｌになるように蒸留水でメスアップし、それにより得られた液を濾過して基質液を調製した。
（４）  上記（３）で調製した基質液の４ｍｌごとに、上記（２）で分取したフラクション８、９、１０、１６および１７の１ｍｌずつを加えて５０℃で３０分間インキュベートした。インキュベートの終了後、メンブランフィルター［（株）バイオフィールド社製「クロマトディスク２５Ａ」；膜厚０．４５μｍ）で濾過した後、上記の表１に示したのと同じ条件下にＨＰＬＣ分析を行って、上記した０．１９ＡＩの含有量の測定法と同様にして各フラクションを加えた基質液における０．１９ＡＩ含有率の増加状態を調べた（すなわち各フラクションに含まれている酵素による粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれている夾雑蛋白質の分解状況を調べた）ところ、フラクション８、９および１０については、夾雑蛋白質に対する０．１９ＡＩ含有率の相対的増加が認められ、これらのフラクション中に粗製アミラーゼ阻害物質に含まれる夾雑蛋白質を分解するプロテアーゼが存在することが確認された。一方、フラクション１６および２０では０．１９ＡＩの含有率に変化がなく、したがってフラクション１６および２０に存在する酵素は、粗製アミラーゼ阻害物質中の夾雑蛋白質の分解作用をもたないプロテアーゼであることが確認された。
【００５１】
（５）  上記（４）で粗製アミラーゼ阻害物質中の夾雑蛋白質を分解し得るプロテアーゼの存在が認められたフラクション８、９および１０、酵素が存在しないことが上記（２）で確認されているフラクション１１、並びに分子量既知の蛋白質の混合物を含む液を、共にＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（ファルマシア社製「ファストシステム」）にかけたところ、図１に示す結果が得られ、フラクション８、９および１０では約４０Ｋ（分子量約４００００）の位置にメインバンドが認められ、さらにフラクション９および１０では３０Ｋ（分子量約３００００）の位置にサブバンドが認められた。
（６）  上記（５）の結果から、スミチームＬＰに含まれる複数種のアスペルギルス・オリゼー由来のプロテアーゼのうちでも、分子量が約４００００のプロテアーゼが、粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれる夾雑蛋白質の分解作用を有することが確認された。
【００５２】
《実施例  １》［高純度アミラーゼ阻害物質の調製］
（１）  参考例１で得られた乾燥粉末（粗製アミラーゼ阻害物質；０．１９ＡＩ含有量２５重量％；トリプシン阻害活性１０ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加え、塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製した。
（２）  一方、２０ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水２ｍｌを加えて酵素液を調製した。
（３）  上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌに、上記（２）で調製した酵素液１ｍｌを加えて（基質に対して１重量％）、５０℃で３時間インキュベートした。インキュベート終了後、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた。
（４）  上記（３）で得られた酵素処理液を限外濾過膜（アミコン社製「セントリプレップ１０」；通過分子量１００００）に通して限外濾過を行って、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。その際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末６６０ｍｇを得た。
（５）  上記（４）で得られた乾燥粉末中における０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は４４重量％およびトリプシン阻害活性は２．８ｕ／ｍｇであり、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方で、トリプシン阻害活性が大幅に低下していた。
【００５３】
《実施例  ２》［高純度アミラーゼ阻害物質の調製］
（１）  参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質（０．１９ＡＩ含有量２５重量％；トリプシン阻害活性１０ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加え、塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製した。
（２）  一方、１００ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水５ｍｌを加えて酵素液を調製した。
（３）  上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌに、上記（２）で調製した酵素液２．５ｍｌを加えて（基質に対して５重量％）、５０℃で１時間インキュベートした。インキュベート終了後、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた。
（４）  上記（３）で得られた酵素処理液を実施例１で使用したのと同じ限外濾過膜に通して限外濾過を行って、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。その際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末５４０ｍｇを得た。
（５）  上記（４）で得られた乾燥粉末中における０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は５０重量％およびトリプシン阻害活性は２．３ｕ／ｍｇであり、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方で、トリプシン阻害活性が大幅に低下していた。
【００５４】
《実施例  ３》［高純度アミラーゼ阻害物質の調製］
（１）  参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質（０．１９ＡＩ含有量２５重量％；トリプシン阻害活性１０ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加え、塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製した。
（２）  一方、１００ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水５ｍｌを加えて酵素液を調製した。
（３）  また、トリプシンを含有する酵素製剤（ノボノルディスクバイオインダストリー社製「ＰＴＮ３.０ Ｓ」）１００ｍｇに蒸留水５ｍｌを加えて、トリプシン液を調製した。
（４）  上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌに、上記（２）で調製した酵素液（スミチームＬＰ液）２．５ｍｌを加えて（基質に対して５重量％）、５０℃で１時間インキュベートした。次いで、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８に調整した後、上記（３）で調整したトリプシン液５００μｌを加え（基質に対して１重量％）、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベート終了後に、塩酸でｐＨを４に再調整し、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた。
（５）  上記（４）で得られた酵素処理液を実施例１で使用したのと同じ限外濾過膜に通して限外濾過を行って、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。その際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末５５０ｍｇを得た。
（６）  上記（５）で得られた乾燥粉末中における０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は４９重量％およびトリプシン阻害活性は１．１ｕ／ｍｇであり、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方で、トリプシン阻害活性がトリプシン処理を行うことによって一層低下していた。
【００５５】
《実施例  ４》［高純度アミラーゼ阻害物質の調製］
（１）  参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質（０．１９ＡＩ含有量３０重量％；トリプシン阻害活性１．５ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加え、塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全量を１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製した。
（２）  一方、１００ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水５ｍｌを加えて酵素液を調製した。
（３）  また、トリプシンを含有する酵素製剤（ノボノルディスクバイオインダストリー社製「ＰＴＮ３.０ Ｓ」）１００ｍｇに蒸留水５ｍｌを加えて、トリプシン液を調製した。
（４）  上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌに、上記（２）で調製した酵素液（スミチームＬＰ液）１．５ｍｌ（基質に対して３重量％）、および上記（３）で調製したトリプシン液２５０μｌ（基質に対して０．５重量％）を加えた。それを５０℃で１時間インキュベートした後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８に調整し、さらに５０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後に、塩酸でｐＨを４に再調整し、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた。
（５）  上記（４）で得られた酵素処理液を実施例１で使用したのと同じ限外濾過膜に通して限外濾過を行って、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。その際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末５２０ｍｇを得た。
（６）  上記（５）で得られた乾燥粉末中における０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は５２重量％およびトリプシン阻害活性は０．７ｕ／ｍｇであり、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方で、トリプシン阻害活性がトリプシン処理を行うことによって一層低下していた。
【００５６】
【発明の効果】
アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼを用いて小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質を処理する本発明の方法による場合は、極めて簡単な操作で小麦由来のアミラーゼ阻害物質中に含まれる夾雑蛋白質を優先的に分解して除去することができて、純度が高く、しかもアミラーゼ阻害物質のアミラーゼ阻害活性の妨げとなったり膵臓肥大や膵臓癌の発生原因ともなるとトリプシン阻害活性の極めて低い、高品質のアミラーゼ阻害物質を高収率で生産性よく製造することができる。
そして、アスペルギルス・オリゼー由来のＳＤＳ−ＰＡＧＥで４０Ｋのプロテアーゼと共にトリプシンを用いて小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質を処理する本発明のよる場合は、アミラーゼ阻害物質の純度が一層高く且つトリプシン阻害活性の一層低減されたアミラーゼ阻害物質を良好な操作性で、高収率で得ることができる。
本発明により得られるアミラーゼ阻害物質は、純度が高く、しかもトリプシン阻害活性が極めて低いため、人膵臓α−アミラーゼに対して高い阻害活性を有し、しかも膵臓肥大や膵臓癌の発生の心配が少ないので、人間に極めて有効であり、血糖値の上昇抑制、インシュリン分泌の調節に高い効果を有し、満腹感を持続させて食欲抑制を容易にすることができ、更に高血糖症、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、肥満などの予防および治療に極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例３において、アスペルギルス・オリゼー由来のプロテアーゼを含む酵素製剤をＨＰＬＣにかけて得られる各フラクション、および分子量既知の蛋白質の混合物を含む液を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて得られた結果を示す図である。
【図１】
0003717242.tif 000003