(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有するデアミノノイラミニダーゼ。
▲１▼作用：
デアミノノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質に作用し、デアミノノイラミン酸ケトシド結合を加水分解して、デアミノノイラミン酸を含有しない複合糖質もしくは糖質、またはデアミノノイラミン酸が部分的に除去された複合糖質もしくは糖質と遊離のデアミノノイラミン酸とを生成する。
▲２▼基質特異性：
デアミノノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質には作用するが、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質における、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結合には作用しない。
▲３▼至適反応pH:
pH6付近
▲４▼安定pH範囲：
25℃においてpH4〜９で安定
▲５▼至適反応温度：
25℃付近
▲６▼熱安定性：
25℃で少なくとも48時間失活しない。
▲７▼阻害及び安定化：
遊離のデアミノノイラミン酸によって阻害される。ウシ血清アルブミンなどのタンパク質存在下で安定化される。
▲８▼分子量
ゲル濾過により測定される分子量：約50,000
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定される分子量：約57,000
【請求項２】
スフィンゴバクテリウムmOL12−4s（FERM  BP−5116）によって産生されることを特徴とする請求項１に記載のデアミノノイラミニダーゼ。
【請求項３】
スフィンゴバクテリウム属に属し、デアミノノイラミニダーゼ生産能を有する細菌を培養し、その培養物から請求項１記載のデアミノノイラミニダーゼを採取することを特徴とするデアミノノイラミニダーゼの製造方法。
【請求項４】
デアミノノイラミン酸と、糖質及び／又は複合糖質と、請求項１記載のデアミノノイラミニダーゼとを共存させることを特徴とするデアミノノイラミン酸含有糖質及び／又は複合糖質の製造方法。
【請求項５】
請求項１記載のデアミノノイラミニダーゼ生産能を有するスフィンゴバクテリウムmOL12−4s（FERM  BP−5116）。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規なデアミノノイラミニダーゼに関し、詳しくは、シアリダーゼ活性を有しないデアミノノイラミニダーゼに関するものである。
背景技術
デアミノノイラミン酸（３−deoxy−Ｄ−glycero−Ｄ−galacto−nonulosonic acid、あるいは２−keto−３−deoxy−Ｄ−glycero−Ｄ−galacto−nononic acid;以下、「KDN」という）は、シアル酸の５位の炭素に結合するＮ−アシル基が水酸基に置き換わっている以外は、シアル酸と同一の構造をしている。これまでに、KDNはシアル酸と同様、複合糖質の構成成分として生物界に広く分布し、多様な存在様式をもつことが判明している。また、KDNはシアル酸と異なるユニークな性質をもち、KDN含有複合糖質が受精時の卵−精子相互作用において重要な役割を果たすことなどが明らかにされてきており、KDN含有糖タンパク質や糖脂質の構造や機能の解明には大きな興味がよせられている。
ところで、KDNを含有する複合糖質におけるKDNケトシド結合を切断する酵素（デアミノノイラミニダーゼ；以下、「KDNase」ともいう）として、ドジョウの肝臓に存在するKDN−シアリダーゼ（Li,Y.−T.ら,Archives of Biochemistry and Biophysics,第310巻，第１号，第243−246頁（1994年））が知られている。また本発明者らは、魚類のニジマスの卵巣等の組織に、シアリダーゼ活性とデアミノノイラミニダーゼ活性とを有する酵素が存在することを見い出している（Angata,T.ら,Glycobiology,第４巻，第517−523頁（1994年））。
しかし、いずれの酵素も、KDNケトシド結合を特異的に切断する酵素ではなく、KDNケトシド結合切断活性と同程度（上記ドジョウ由来の酵素）もしくはそれ以上（上記ニジマス由来の酵素）のシアリダーゼ活性を含んでおり、KDNのみに特異的に作用する酵素は知られていない。また、上記の酵素の至適pHは、ドジョウ由来のものがpH4.5付近であることが知られており、本発明者らはニジマス由来のものがpH4.4付近であることを見い出している。
上記ドジョウ由来の酵素のpH6付近におけるデアミノノイラミニダーゼ活性は、至適pHにおけるデアミノノイラミニダーゼ活性の65％であることが知られており、また、本発明者らは上記ニジマス由来の酵素はpH6.5付近ではデアミノノイラミニダーゼ活性が検出されないことを見い出しており、中性pH条件下でデアミノノイラミニダーゼ反応を行なうことは困難であった。さらに、上記のデアミノノイラミニダーゼはいずれも動物由来の酵素であり、微生物由来のデアミノノイラミニダーゼは全く知られておらず、得られる酵素量にも限界があった。
発明の開示
デアミノノイラミン酸の構造や機能の解析などの研究にとって、活性が高く、しかも中性付近で活性を有するデアミノノイラミニダーゼは極めて有用であることが期待される。また、活性の高いデアミノノイラミニダーゼが得られれば、KDNケトシド結合加水分解の逆反応を行なわせることにより、新しいデアミノノイラミン酸含有複合糖質または糖質等を創出できることが期待される。
本発明は、上記観点からなされたものであり、中性域においても高いKDNase活性を有し、しかも従来知られているKDNase活性を有するシアリダーゼと異なり、Ｎ−アシルノイラミン酸残基には作用せず、KDNケトシド結合に極めて特異的なKDNaseを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、KDNaseを産生する微生物を鋭意検索した結果、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌の一種がKDNaseを産生することを見出し、さらにこのKDNaseは中性域で高い活性を有し、しかもシアリダーゼ活性を示さないことを見出し、本発明に至った。
すなわち本願発明は、下記の酵素学的性質を有するデアミノノイラミニダーゼである。
▲１▼作用：
デアミノノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質に作用し、デアミノノイラミン酸ケトシド結合を加水分解して、デアミノノイラミン酸を含有しない複合糖質もしくは糖質、またはデアミノノイラミン酸が部分的に除去された複合糖質もしくは糖質と遊離のデアミノノイラミン酸とを生成する。
▲２▼基質特異性：
デアミノノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質には作用するが、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合糖質もしくは糖質における、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結合には作用しない。
本発明の具体的な態様として、本願発明のデアミノノイラミニダーゼは、さらに以下の理化学的性質を有する。
（ｉ）至適反応pH:
pH6付近
（ii）安定pH範囲：
25℃においてpH4〜９で安定
（iii）至適反応温度：
25℃付近
（iv）熱安定性：
25℃で少なくとも48時間失活しない。
（ｖ）阻害及び安定化：
遊離のデアミノノイラミン酸によって阻害される。ウシ血清アルブミンなどのタンパク質存在下で安定化される。
また本願発明は、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sにより産生されることを特徴とし、かつ前記の性質を有するデアミノノイラミニダーゼである。
また本願発明は、スフィンゴバクテリウム属に属し、デアミノノイラミニダーゼ生産能を有する細菌を培養し、その培養物から前記性質を有するデアミノノイラミニダーゼを採取することを特徴とするデアミノノイラミニダーゼの製造方法、及びデアミノノイラミニダーゼ生産能を有するスフィンゴバクテリウムmOL12−4sを提供する。
さらに本願発明は、デアミノノイラミン酸と、糖質及び／又は複合糖質と、上記性質を有するデアミノノイラミニダーゼとを共存させることを特徴とするデアミノノイラミン酸含有糖質及び／又は複合糖質の製造方法を提供する。
尚、本発明のKDNaseを、「本発明酵素」ということがある。また、KDN含有複合糖質または糖質とは、糖タンパク質もしくは糖脂質等の複合糖質または単糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類などの糖質にKDNがケトシド結合により結合しているものをいい、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸を含む）含有複合糖質または糖質とは、複合糖質または糖質にシアル酸がケトシド結合により結合しているものをいう。さらに、本明細書において、「シアリダーゼ活性」とは、シアル酸含有複合糖質または糖質におけるシアル酸ケトシド結合を分解する活性をいい、従来知られているシアリダーゼが有するKDNase活性を含まない。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のKDNase
（１）本発明酵素の取得法
本発明のデアミノノイラミニダーゼは、上記性質を有する新規酵素である。本発明酵素は、例えば、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌を培養し、その培養物から採取することができる。スフィンゴバクテリウム属に属する細菌としては、スフィンゴバクテリウム  マルチボラム（Sphingobacterium multivorum）が挙げられ、具体的には本発明により分離されたスフィンゴバクテリウムmOL12−4sが挙げられる。
具体的には、本発明酵素を生産する微生物を適当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体培養のときは培養液）から菌体を遠心分離などによって収集し、菌体を超音波処理などにより破砕して得られる菌体破砕液、または浸透圧ショックによって菌体外に放出される酵素活性を持つ画分等を出発物質として、次いでKDNase活性を指標として一般的な酵素の分離法を適用することにより、所望の精製度の酵素標品を採取することができる。
本発明酵素を産生する微生物の培養は、この微生物が資化可能な炭素源、（KDNを含むオリゴ糖、グルコースなど）、窒素源（酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕、カゼインの加水分解物（casamino acids）などの有機窒素源；塩酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、無機塩（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）などを含む培地中で、好気的な培養法（振盪培養、通気撹拌培養など）によって生育に適した温度で数時間〜数日間培養することによって行うことができる。
また、培地中にKDNやKDN含有オリゴ糖アルコール（以下、「KDNオリゴ糖アルコール」ともいう）等のKDNケトシド結合を有する物質を添加しておくと、KDNaseが誘導されて菌体数あたりの酵素活性が上昇するため、本発明酵素を産生する微生物に、効率よく本発明酵素を産生させることができる。またこの効果は、KDNよりもKDNオリゴ糖アルコール等のKDNケトシド結合を有する物質を培地に添加したほうが顕著である。なお、培地に添加するKDNオリゴ糖アルコール等のKDNケトシド結合を有する物質は、必ずしも純粋である必要はなく、粗精製物等を用いることもできる。
培養物から収集した菌体から、超音波処理などによる破砕、あるいは浸透圧ショック等の適当な方法によって放出された酵素を含む画分から、例えば、硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム等による塩析；透析；限外ろ過法；吸着クロマトグラフィー、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー；疎水性クロマトグラフィー；ゲル濾過法；電気泳動法など公知の酵素精製法、さらにはKDN含有糖タンパク質（KDN−gp）を結合させたアガロースゲル等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって目的とする精製度の酵素標品を得ることができる。
本発明酵素のKDNase活性は、KDNを含有する複合糖質または糖質等に本発明酵素を作用させて、KDNのケトシド結合を加水分解させ、遊離するKDNを定量することによって測定することができる。具体的には、本発明酵素を４−メチルウンベリフェリルKDN（４−MU−KDN）に作用させ、ケトシド結合が酵素的に加水分解されて遊離される４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定する方法が挙げられる。また、ニジマス卵巣液由来のKDN含有糖タンパク質等を基質として用い、これに本発明酵素を加えて反応させ、この反応液に塩化セチルピリジニウム（CPC）を加え、遠心分離して得られる上清中のKDN量をチオバルビツール酸法（Analytical Biochemistry第205巻、244−250,（1992））で定量することによっても、KDNase活性を測定することができる。KDN含有糖タンパク質は、CPC存在下で複合体を形成して沈殿するが、酵素反応によって遊離するKDNは沈殿しないので、未反応のKDN含有糖タンパク質は遠心分離によって反応系から除くことができる。これらの方法は、後記実施例に、より具体的に説明した。
（２）本発明酵素の理化学的性質
本発明酵素として、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sが産生するKDNaseの理化学的性質を示す。
▲１▼作用
KDNを含有する複合糖質もしくは糖質に作用し、KDNと、それが結合している複合糖質あるいは糖質との結合を加水分解して、KDNを持たない複合糖質もしくは糖質、またはKDNが部分的に除去された複合糖質もしくは糖質と遊離のKDNとを生成する。また、例えば４−メチルウンベリフェリルKDNのような、複合糖質及び糖質以外の化合物とKDNとのケトシド結合にも作用し得ることが確認されている。
さらに、KDNとラクトースとの混合液に本発明酵素を作用させたところ、反応液中にKDN含有オリゴ糖鎖の存在が認められ、上記反応の逆反応も触媒することが確認されている。この反応を利用して、KDNと、糖質及び／又は複合糖質等と本発明酵素とを共存させることによって、KDN含有糖質及び／又は複合糖質等を製造することができる。
▲２▼基質特異性
デアミノノイラミン酸（KDN）ケトシド結合に作用して分解するが、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結合には作用しない。
本発明酵素は、以下に示すKDN含有複合糖質または糖質等に存在するKDN残基のすべてを切断し、KDN残基の天然において既知な結合様式α２→3,α２→6,α２→８のケトシド結合のいずれにも作用する。
（ａ）KDN含有糖タンパク質,3つの異なるKDN結合（KDNα２→3Gal,KDNα２→8KDN,KDNα２→6GalNAc）を有する糖鎖を多数本結合しているムチン様糖タンパク質。
（ｂ）KDN含有糖タンパク質からアルカリ−ボロヒドリド処理して得られたKDNオリゴ糖アルコール：一般式（→8KDNα２→）ｎ→8KDNα２→６［KDNα２→3Galβ１→3GalNAcα１→３］GalNAc−o1,nは２〜９であり、平均は５。
（ｃ）KDNダイマー,KDNα２→8KDN。
（ｄ）α２→3Galで結合したKDN残基を２つ有するＮ−型糖鎖,KDNα２→3Galβ１→4GlcNAcβ１→2Manα１→６［KDNα２→3Galβ１→4GlcNAcβ１→2Manα１→３］Manβ１→4GlcNAcβ１→4GlcNAc。
（ｅ）KDNをもつスフィンゴ糖脂質,KDN含有ガングリオシドGM3,KDNα２→3Galβ１→4Glcβ１→Cer。
（ｆ）４−メチルウンベリフェリルKDN。
一方、本発明酵素は、既知のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸）を含有する複合糖質もしくは糖質における、シアル酸ケトシド結合の加水分解は触媒せず（後記実施例２参照）、本発明酵素はデアミノノイラミン酸ケトシド結合に対して極めて特異性が高い。
▲３▼至適反応pH
本発明酵素は、pH6付近で最も高い活性が得られる。
なお、後記実施例２に示すように、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sの菌体破砕液上清の50〜70％硫安沈澱画分を、２回のセファクリル（Sephacryl）Ｓ−200（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、KDN含有糖タンパク質（KDN−gp）を結合させたアガロースゲル（Affi−gel 15、バイオラッド社製）カラムクロマトグラフィーにより精製して得られる本発明酵素のアフィニティー精製酵素画分の、pHと酵素活性との関係は、図８に示される通りである。また、後記実施例２に示すように、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sの菌体破砕液上清の90％硫安沈澱画分を、CM−Toyopearl 650M（東ソー製）、DEAE−Toyopearl 650M（東ソー製）、及びCM−Toyopearl 650M（東ソー製）を用いたカラムクロマトグラフィーをそれぞれ順に行うことにより精製して得られる、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドとなるまで精製した酵素（以下、「単一精製酵素」ともいう）の、pHと酵素活性との関係は、図９に示される通りである。
▲４▼至適反応温度
本発明酵素は、25〜30℃付近で、高い酵素活性が得られる。
▲５▼安定性
本発明酵素は、25℃、pH4〜９において、数時間放置した後、比較的安定である。また、本発明酵素は、25℃で少なくとも48時間失活しない。ただし、本発明酵素は数10μg/ml以下の濃度では、pH及びイオン強度に拘わらず不安定であるが、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質存在下で安定化される。
▲６▼阻害及び活性化
本発明酵素の活性は、各々1mMのカルシウムイオン（Ca2+），マグネシウムイオン（Mg2+），マンガンイオン（Mn2+）及びEDTA（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）によって影響されない。
本発明酵素の活性は、イオン強度の増加にともなって急激に上昇する。NaClの場合、300mM NaCl存在下で最高値を示し、50mM以下の低イオン強度下では、活性は極めて低い。
本発明酵素は、遊離のKDNによって阻害される（3mMの濃度で）。一方、デアミノノイラミン酸（KDN）の構造アナログである遊離のシアル酸、本発明酵素の基質とならないＮ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸をもつ複合糖質もしくは糖質によっては阻害されない。また、公知のシアリダーゼ（Ｎ−アシルノイラミン酸のケトシド結合を切断）の特異的な阻害剤である2,3−デヒドロ−２−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸によって阻害されない。
また、界面活性剤であるTriton X−100は本発明酵素の酵素活性を阻害しない。0.5％コール酸ナトリウム（sodium cholate）は本発明酵素の酵素活性を消失させるが、0.1％存在下では約90％の酵素活性が保たれる。このことから、KDN含有ガングリオシドのようなKDN含有糖脂質に本発明の酵素を作用させる場合には、例えばTriton X−100等を添加しておくことも可能である。
▲７▼分子量
本発明酵素の分子量は、後記実施例２に示すように、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sの菌体破砕液上清の50〜70％硫安沈澱画分を、２回のセファクリル（Sephacryl）Ｓ−200（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、KDN含有糖タンパク質（KDN−gp）を結合させたアガロースゲル（Affi−gel 15、バイオラッド社製）カラムクロマトグラフィーにより精製して得られる本発明酵素のアフィニティー精製酵素画分においては、ゲル濾過（セファクリルＳ−200カラム,1.8cm×135cm;20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）/0.5M NaClで溶出）により、およそ50,000、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、約57,000と推定される。
また、後記実施例２に示すように、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sの菌体から、NossalとHeppelの方法（J.Biol.Chem.,第241巻，第3055−3062頁（1966年）、ただし、1mM Mg（CH3COO）２で10分間処理した後遠心して上清を得る操作を、1mM Mg（CH3COO）２で10分間処理した後、２倍容の1M NaCl−1M Tris−HCl（pH7.1）を加えた後、遠心して上清を得るように変更）である浸透圧ショック法によって菌体から浸出するペリプラズム（周縁細胞質）液の90％硫安沈澱画分を、CM−Toyopearl 650M（東ソー製）、DEAE−Toyopearl 650M（東ソー製）、及びCM−Toyopearl 650M（東ソー製）を用いたカラムクロマトグラフィーをそれぞれ順に行うことにより精製して得られる単一精製酵素においては、ゲル濾過（セファクリルＳ−200カラム,1.8cm×135cm;20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）/0.2M NaClで溶出）により、およそ40,000、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、約42,000と推定される。
▲８▼ミカエリス定数
４−メチルウンベリフェリルKDN（４−MU−KDN）を基質としたときの本発明酵素のミカエリス定数（Km）及び酵素反応最大速度（Vmax）は以下の通りである。
Km  :19μＭ
Vmax:0.19μM/minまたは7.4mM/min/mgタンパク質
▲９▼アミノ酸組成
本発明酵素のアミノ酸組成は以下の通りである。なお、数字はモル％を表す。
アスパラギン及びアスパラギン酸: 5.3
グルタミン及びグルタミン酸    : 5.5
セリン                        :13.6
グリシン                      :19.8
ヒスチジン                    : 2.0
アルギニン                    : 2.0
スレオニン                    : 6.7
アラニン                      : 9.0
プロリン                      : 3.5
チロシン                      : 5.6
バリン                        : 5.9
メチオニン                    : 7.6
イソロイシン                  : 3.5
ロイシン                      : 4.9
フェニルアラニン              : 3.2
リジン                        : 2.0
＜２＞本発明のスフィンゴバクテリウムmOL12−4s
本発明の微生物スフィンゴバクテリウムmOL12−4sは、養魚場の汚泥から、デアミノノイラミン酸（KDN）を含有するオリゴ糖アルコールを唯一の炭素源とする集積培地で培養し、菌体破砕液中に４−MU−KDNを加水分解する活性を有するものとして選択された微生物であり、シアリダーゼ活性を有しない上記KDNaseを産生することを特徴とする。
本微生物は、同様に、養魚場などの汚泥あるいは土壌から、KDNを含む複合糖質または糖質等を唯一の炭素源とする集積培地で培養し、KDNase活性を有するか否かを指標としてスクリーニングすることによって、取得することができる。尚、本発明により分離されたスフィンゴバクテリウムmOL12−4sは、平成６年５月24日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  Ｐ−14325の受託番号で寄託され、平成７年５月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM  BP−5116の受託番号で寄託されている。
本発明の微生物の菌学的性状は後記実施例１に示す通りであり、これらの性質からスフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌であると同定された。尚、本菌は、スフィンゴバクテリウム  マルチボラム（Sphingobacterium multivorum）である可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
図１は、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sを0.1％の粗KDN−OS（ニジマスから調製した、KDNオリゴ糖アルコール（KDNα２→3Galβ１→3GalNAcα１→３［KDNα２→（8KDNα２→）ｎ→６］GalNAcolでｎ＝５のもの）が豊富な画分）を添加した培地中で培養した時の、菌体数1010個あたりのKDNase活性を、経時的に測定した結果を示す図である。
図２は、本発明酵素の精製において、一回目のセファクリルＳ−200ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線はタンパク質量を示す紫外吸収（A280）を表す。
図３は、本発明酵素の精製において、二回目のセファクリルＳ−200ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線は、タンパク質量を示す紫外吸収（A280）を表す。
図４は、本発明酵素の精製において、一回目のKDN−gp結合アガロース・ゲルによるアフィニティークロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線はタンパク質量を示す紫外吸収（A230）を表す。
図５は、本発明酵素の精製において、二回目のKDN−gp結合アガロース・ゲルによるアフィニティークロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線はタンパク質量を示す紫外吸収（A220）を表す。
図６は、本発明酵素（単一精製酵素）の精製において、２回目のCM−Toyopearl 650Mカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線は溶出に用いたNaClの濃度を表す。
図７は、アフィニティー精製酵素画分の10％アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。銀染色後の各バンドの位置及び染色強度をデンシトメーター（600nmの吸収を測定）を用いて解析した。
図８は、本発明酵素のアフィニティー精製酵素画分の至適pHを示すpH−酵素活性曲線である。
図９は、本発明酵素の単一精製酵素の至適pHを示すpH−酵素活性曲線である。
図10は、本発明酵素の至適イオン強度を示すイオン強度−酵素活性曲線である。イオン強度は、添加したNaClの濃度で表した。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。この実施例は本発明の一例を示すものであり、これに限定されるものではない。尚、本実施例において、KDNase活性の測定は、下記の方法によって行った。
＜酵素活性測定法＞
（１）４−メチルウンベリフェリルKDNを用いる方法（４−MU−KDN法）
４−メチルウンベリフェリルKDN（４−MU−KDN）のケトシド結合が酵素的に加水分解される（次の反応）と、蛍光性の４−メチルウンベリフェロンが遊離される。その蛍光を測定する。
４−メチルウンベリフェリルKDN→KDN＋４−メチルウンベリフェロン
具体的には、1.4nmolの４−MU−KDNを、20μｌの0.1Mトリス酢酸緩衝液（pH6.0）/0.1M NaClに溶解した酵素溶液に加えて、25℃、30分間反応させ、反応後、反応液20μｌをとって、2.5mlの85mMグリシン炭酸塩緩衝液（pH9.3）と混合して、蛍光強度を測定した（励起波長365nm、測定波長450nm）。蛍光強度測定については、Biochemistry第18巻、第13号、2783−2787ページを参照した。酵素を加えずに上記と同様の反応を行ったときの蛍光強度をコントロールとした。25℃において、１分間に1nmolの４−MU−KDNを加水分解する酵素量を１ユニットと定義した。
本方法に用いた４−MU−KDNは、以下に示すDr.Thomas  G.Warnerによって開発された方法によって得られたものであり、Dr.Thomas  G.Warnerから恵与されたものを用いた。
KDNは、酵素的に既知の方法［Auge,C.,ら,Tetrahedron 46,201−214（1990）］にしたがって、Ｄ−マンノースとピルビン酸からNeu5Acアルドラーゼを用いて合成した。KDNを乾燥後、10mlの無水酢酸、10mlのピリジンに懸濁し、室温で一晩反応させた。反応液を氷冷し、メタノールを加えて反応を停止させ、溶媒を除去した。残渣をメタノールに溶かし、Dowex50（H+）カラム（４×5cm）にかけて、メタノールで溶出した。溶出物は溶媒除去後、エチルエーテル中で過剰量のジアゾメタンを加えて、メチルエステルとした。生成した完全アセチル化メチルエステル物は、シリシック酸カラム（2.5×17cm）にかけて、ヘキサン中で酢酸エチルの濃度勾配をかけて溶出し、メチル2,4,5,7,8,9−ヘキサ−Ｏ−アセチルKDN（K1）を得た。次いで、既知の方法［Warnerら,Biochemistry 18,2783−2787（1979）］にしたがってK1をグリコシルクロリドに変え、４−メチルウンベリフェロン（４−MU）のナトリウム塩と反応させて、K1と４−MUを重合させ、４−メチル−２−オキソ−2H−１−ベンゾピラン−７−イル  4,5,7,8,9−ペンタ−Ｏ−アセチルKDN（K2）を得た。
K2 0.5gに4mlのメタノール、続いて4mlの0.5Nの水酸化ナトリウムを加えて懸濁し、37℃で１時間置いた。さらに、4mlの水酸化ナトリウムを加え、37℃で90分間置いた後、pHをDowex50（H+）樹脂を加えて中和して、pH6.0とした。濾過して樹脂を除き、溶媒を除去した。残渣に対して、少量の10mMアンモニア水を加えて、pH9とした後、セファデックス（Sephadex）Ｇ−25ゲル濾過によって高純度の４−MU−KDNが精製された。
尚、４−MU−KDNは、Schreiner,E.and Zbiral,E.（1990）Liebigs Ann.Chem.,581−586に記載の方法によっても得られる。
（２）塩化セチルピリジニウム（CPC）法
基質として、ニジマス卵巣液由来のKDN含有糖タンパク質を用いた。酵素反応を上記（１）項に述べた条件と同様に行なった後、反応液に2mlの0.1％塩化セチルピリジニウム（CPC）を加えた。KDN含有糖タンパク質は、CPC存在下で複合体を形成して沈殿するが、酵素反応によって遊離するKDNは沈殿しない。反応液を30分放置した後、遠心分離（3000rpm、10分間）し、得られる上清のKDN量をチオバルビツール酸法（Analytical Biochemistry第205巻、244−250,（1992））で定量することによって酵素活性を測定した。25℃において、１分間に1nmolのKDN含有糖タンパク質を加水分解する酵素量を１ユニットと定義した。
実施例１  スフィンゴバクテリウムmOL12−4sの取得
養魚場の汚泥を、KDNオリゴ糖アルコール（J.Biol.Chem.265,21811−21819（1990）記載の方法で調製）0.05％を添加したM9液体培地（1L中に、Na2HPO4 6.0g、KH2PO4 3.0g、NH4Cl 1.0g、NaCl 0.5g、MgSO4 1mM、CaCl2 0.1mMを含む）に接種して25℃で48時間培養した。培養液を、KDNオリゴ糖アルコールを含むM9寒天培地プレートにストリークして25℃で48時間培養し、KDNオリゴ糖アルコールを唯一の炭素源として生育する微生物として、66コロニーが得られた。
各々のコロニーを形成する微生物を、KDNオリゴ糖アルコール0.05％を含むM9液体培地に接種して培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体を超音波処理により破砕し、破砕液中のKDNase活性及びシアリダーゼ活性を、４−MU−KDN法により測定した。これらのうち、KDNase活性が認められ、シアリダーゼ活性が認められなかった破砕液が由来する微生物をmOL12とし、以下の選択に用いた。
mOL12株のコロニーをKDNオリゴ糖アルコール0.05％を含むM9寒天培地にストリークし、４株のコロニーを分離し、各々mOL12−１、mOL12−２、mOL12−３及びmOL12−４とした。各々のコロニーをLB平板培地にストリークし、単一コロニーをKDNオリゴ糖アルコール0.05％を含むM9液体培地に接種して培養し、菌体破砕液のKDNase活性及びシアリダーゼ活性を、各々４−MU−KDN法及び塩化セチルピリジニウム法により測定した。mOL12−４をLB平板培地にストリークした際に形成されたコロニーは、「大」、「中」及び「小」の３種類の大きさに分かれ、それらのうち、「大」コロニー及び「中」コロニーを形成する株には、KDNase活性が認められなかったが、「小」コロニーを形成した株は、KDNase活性を示し、シアリダーゼ活性を示さなかった。これらのKDNase活性のみを示した株のうちの１株をmOL12−4sとした。
上記のようにして分離されたmOL12−4sの同定を、市販の腸内細菌以外のグラム陰性桿菌同定キット（ビオメリュー社、API 20NE）を用いて行った。試験された主な菌学的性状を以下に示す。
形態                ：桿菌
グラム染色性        ：陰性
胞子形成性          ：−
運動性              ：−
酸素に対する態度    ：好気性
インドール生成      ：−
グルコース発酵性    ：−
尿素分解            ：＋
エスクリン分解      ：＋
資化性
グルコース        ：＋
Ｌ−アラビノース  ：＋
Ｄ−マンノース    ：＋
Ｄ−マンニトール  ：−
マルトース        ：＋
カタラーゼ          ：＋
オキシダーゼ        ：＋
β−ガラクトシダーゼ：＋
以上の結果から、mOL12−4sは、スフィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌であると同定され、スフィンゴバクテリウムmOL12−4sと命名された。本菌は、平成６年５月24日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM  Ｐ−14325の受託番号で寄託され、平成７年５月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM  BP−5116の委託番号で寄託されている。尚、本菌は、菌学的性状から、スフィンゴバクテリウム  マルチボラム（Sphingobacterium multivorum）である可能性が高い。
実施例２  KDNaseの生産
ミラーのルリア・ブロス（LB）培養液（ギブコ・BRL）を２リットルの三角フラスコに800ml分注し、オートクレーブした。この培地にスフィンゴバクテリウムmOL12−4sを接種した後、振盪培養機を用いて、25℃で、48時間培養した。
＜１＞KDNaseの抽出及び硫安分画
（１）菌体破砕によるKDNaseの抽出及び硫安分画
培養終了後、遠心分離（15,000×g,40分間）により、培養液から菌体を集めた。得られた菌体を、氷冷した0.1M NaClを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に懸濁し、再び遠心分離を行うことによって菌体を洗浄した。この洗浄操作を３回行なった後、菌体に対して1/2容量の0.1M NaCl−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に菌体を懸濁し、超音波処理（50ワット,5分間）して菌体を破砕した。
この菌体破砕液を遠心分離（17,000×g,40分間）して得られる上清を冷却し、この上清に硫酸アンモニウムを50％飽和になるまで加え、４℃で１時間放置した。これを、150,000×ｇで１時間遠心分離して沈殿物を除去し、得られる上清に対して70％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置した。これを再び150,000×ｇで１時間遠心分離して沈殿を得、10mlの0.5M NaCl−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解した。この溶液に、43％飽和となるよに飽和硫酸アンモニウム水溶液を加え、４℃で１時間放置した。これを、150,000×ｇで１時間遠心分離して得られる上清に、85％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置した。生じた沈殿を、150,000×ｇで１時間遠心分離により回収し、これを10.9mlの0.5M NaCl−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解した。こうして得られた画分を、50〜70％硫安沈殿画分とした。
（２）浸透圧ショックによるKDNaseの抽出及び硫安分画
菌体からKDNaseを抽出する他の方法として、菌体に浸透圧ショックを与えて菌体外に酵素を遊離させ、その菌体外液を硫安分画することによりKDNaseの精製を行った。
上記と同様にしてスフィンゴバクテリウムmOL12−4sを培養し、遠心分離（15,000×g,40分間）により集菌、洗滌を行った。この菌体を、既知の方法［Nossal,N.G.and Heppel,L.A.（1966）J.Biol.Chem.241,3055−3062］に従って、浸透圧ショック処理し、菌体外に酵素を遊離させた。すなわち、菌体1gに対して40mlの蔗糖20％を含む20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.1）に菌体を懸濁し、10分間放置した後、菌体を遠心操作（13,000×g,30分間）して沈澱させた。この菌体を、1mM塩化マグネシウムを含む20mMのトリス塩酸緩衝液（pH7.1）に懸濁して10分間放置することにより浸透圧ショックを与えた。
上記菌体懸濁液を再び遠心分離（13,000×g,30分間）し、菌体を除去した。得られた上清に、速やかに硫酸アンモニウムを90％飽和となるように加え、４℃で一晩放置した。生じた沈澱を遠心分離（15,000×g,30分間）によって集め、50％飽和硫安に懸濁・溶解し、不溶性の懸濁物を遠心分離（15,000×g,30分間）によって除去した。得られた上清に対して70％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置した。これを、再び遠心分離（15,000×g,30分間）し、得られた沈澱画分を50〜70％硫安沈澱画分として集めた。
（３）スフィンゴバクテリウムmOL12−4sにおけるKDNaseの誘導
（３−１）誘導物質の調製
KDN及びKDNオリゴ糖アルコール（KDNα２→3Galβ１→3GalNAcα１→３［KDNα２→（8KDNα２→）ｎ→６］GalNAcolでｎ＝５のもの、以下、「KDN−OS」ともいう）は、公知の方法（Kitajima,K.ら、J.Biol.Chem.269,21415−21419（1994））で調製した。KDN−OSが豊富な分画（以下、「粗KDN−OS」ともいう）は、次のように調製した。ニジマスの卵巣液（12.3L）を濃縮し、凍結乾燥して、110gの乾燥粉末を得た。凍結乾燥した粉末（50g）は、1.0Lのクロロホルム／メタノール（2:1,v/v）で一回抽出し、そして1.0Lのクロロホルム／メタノール（1:2,v/v）で室温において２時間抽出した（Yu,S.ら、Biochemistry 32,9221−9229（1993）参照）。脱脂した残渣を風乾し、計量したところ39gであった。脱脂した卵巣液粉末（10g）を100mlの1M NaBH4/0.1M NaOHに懸濁し、撹拌しながら37℃でインキュベートした。24時間インキュベーションした後、50mlの同じ溶液（1M NaBH4/0.1M NaOH）を添加し、さらに24時間インキュベートした。反応混合物を9,000×ｇで20分間遠心し、氷酢酸で〜pH6程度に中和した後、上清をセファデックスＧ−25（Sephadex G−25、ファルマシア製）クロマトグラフィー（2.0×150cm。水により溶出した。）により脱塩した。脱塩した分画はKDN−OSを豊富に含んでおり、粗KDN−OSと名付けた。KDNはTBA法（Kitajima,K.ら、Anal.Biochem.205,244−250（1992））により定量した。
（３−２）酵素誘導実験
スフィンゴバクテリウムmOL12−4sの細菌細胞（4.0×108）を、１％（w/v）のカゼイン加水分解物（casamino acid、ギブコ製）および１％（w/v）のグルコース（Glc）を含む、40mlのM9液体培地に接種し、25℃で44時間培養した。増殖期の菌体（細胞）を集め、M9液体培地で２回洗浄した。それぞれ0.1％（w/v）の粗KDN−OS、KDN−OS、KDN、Neu5Ac、コロミン酸の緩和酸加水分解物（オリゴNeu5Ac;Kitazume,S.ら、Anal.Biochem.202,25−34（1992））、Glcを含む、それぞれ2.0mlのM9液体培地に6.1×1010個の菌体細胞を接種し、25℃で24時間インキュベートし、増殖可能な細胞数及びKDNase活性を測定した。細胞数は、それぞれインキュベートした細胞培養液を希釈して、LB寒天培地プレートに接種し、生育したコロニー数をカウントすることによって決定した（Kitajima,K.ら、J.Biol.Chem.269,21415−21419）。細胞のKDNase活性を測定するために、5,000rpmまたは1,500×ｇで10分間遠心することにより集めた細胞を、100mM NaClを含む100mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）、0.5mlに懸濁し、超音波破砕した（50ワット、１分間）。これを10,000rpmまたは6,000×ｇで10分間遠心した後に得られた上清のKDNase活性を測定した。結果を表１に示す。なお、表１中の［  ］内の数字は、添加前を１としたときの比を表す。
0003647873.tif 000002
また、0.1％の粗KDN−OSを添加した場合の、細胞数1010個あたりのKDNase活性を、経時的に測定した結果を図１に示す。
この結果、KDN、KDN−OS及び粗KDN−OSはKDNaseを誘導するが、他の単糖及びオリゴ糖は酵素の誘導に対して効果がなかった。遊離のKDNもKDNaseを誘導するが、KDN−OS及び粗KDN−OSほどの効果は見られなかった。このことから、KDNのケトシド結合を有する物質が誘導物質として好ましいことが示唆された。
また図１から、増殖している細胞（6.0×1010）を0.1％KDN−OSを含むM9培地中で培養すると、24時間から43時間のインキュベーションの後には、細胞あたりのKDNase活性が当初の活性に比べて非常に高いレベルまで増加することが示された。
＜２＞KDNaseの精製
上記（１）のようにして得られた50〜70％硫安沈殿画分の全量を、セファクリルＳ−200（ファルマシア社製）カラム（1.8×135cm）にかけて、0.5M NaClを含む20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、ゲル濾過分画を行った（図２）。各溶出画分について、KDNase活性を４−MU−KDN法により測定し、活性画分を集め、これに90％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩放置した。これを150,000×ｇで１時間遠心分離して得られる沈殿を、4.7mlの20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）/0.5M NaClに溶解し、再び、上記と同様にしてセファクリルＳ−200カラムを用いたゲル濾過を行い、KDNase活性画分を集めた（図３）。
上記KDNase活性画分を集め、これに90％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩放置し、150,000×ｇで１時間遠心分離して得られる沈殿を、4.8mlの20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）/0.05M NaClに溶解した。この溶解を、KDN含有糖タンパク質（KDN−gp）を結合させたアガロースゲル（Affi−gel 15、バイオラッド社製）を充填したカラム（2.0×15cm）にかけ、90mlの20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）/0.05M NaCl、135mlの20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）/0.5M NaClを順次用いて溶出させた（図４）。カラムの結合能力容量をこえて未吸着となった活性画分は、そのまま再び上記カラムにかけて吸着させた後、20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）/0.5M NaClで溶出させた（図５）。このようにしてKDN−gpを結合させたアガロースゲルに吸着後、高イオン強度で溶出される酵素画分をすべて集め（15ml）、限外濾過（セントリフローCF25、アミコン社製）によって2mlまで濃縮し、アフィニティー精製酵素画分とした。
得られた酵素画分についての各精製段階ごとに酵素活性、タンパク質量、収率及び精製度を測定した。KDNase活性は、４−MU−KDN法により測定し、25℃で１分間に1nmolの４−MUを生成する酵素量を１ユニットとした。また、タンパク質量の定量は、ローリー法の改変法（BCA reagent;Pierce,U.S.A.）でウシ血清アルブミン（BSA）を標準として230nmにおける吸収を測定することにより行った。結果を表２に示す。
0003647873.tif 000003
アフィニティー精製酵素画分の10％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を行った。泳動後、ゲルを銀染色キット（和光純薬工業株式会社製）を用いて染色し、染色された５〜６本のバンドの位置及び濃度を、デンシトメーター（600nmの吸収を測定）を用いて測定した。結果を図７に示す。
この酵素画分を、更にセファクリルＳ−200ゲル濾過カラムを用いて分画し、Kav0.3〜0.4に溶出されたKDNase活性を有する７本の画分について、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出されるバンドの挙動とKDNase活性との関係を詳しく調べた結果、バンドの出現パターンと活性の大小が一致するバンドが一成分見いだされ、KDNaseのバンドであると推定された。このバンドの見かけの分子量は、分子量マーカー（生化学工業株式会社製）との比較から57,000と計算された。一方、ゲル濾過クロマトグラフィーから推定される活性成分の分子量は、分子量マーカー（生化学工業株式会社製）との比較から50,000と計算され、SDS−PAGEによる結果とほぼ一致した。図７には、アフィニティー精製酵素画分のSDS−PAGEのパターンと、KDNaseと思われるバンドの位置を示した。
上記の精製工程によっては、KDNaseは完全には精製されていないが、菌体破砕液などの粗酵素液、及びアフィニティー精製酵素画分ともにシアリダーゼ活性を有しないKDNaseとして使用することができる。また、必要に応じて、通常の酵素の精製方法によってさらに精製すればよい。その際、KDNase活性及び推定される分子量を指標とすることができる。
例えば次のような方法を用いることにより、KDNaseをSDS−PAGEで均一なレベルまで精製することができた。菌体を浸透圧ショック処理することによって得られた菌体破砕液の上清に、固体の硫酸アンモニウムを緩やかに撹拌しながら90％飽和まで少しづつ添加し、４℃で一晩放置した。沈澱を17,000×ｇ、30分間の遠心で回収し、10mlの0.1M NaCl−100mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）で溶解し、0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）に対して透析した。この溶液を、同じ透析緩衝液（0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0））で平衡化したCM−Toyopearl 650Mカラム（2.2×11cm、42ml;東ソー製）にアプライし、最初に60mlの同じ緩衝液（0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0））で溶出させ、続いて400mlの、0.25Mスクロース−20mMトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）中のNaClの直線濃度勾配（0.1Mから0.6Mまで）で溶出させた。通り抜けた画分（pass−through fractions）を合わせて、限外濾過（YM10、アミコン社製）により15mlに濃縮し、0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したDEAE−Toyopearl 650Mカラム（2.2×11cm、42ml;東ソー製）にアプライし、最初に平衡化に用いたものと同じ緩衝液（0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0））60mlで溶出し、次いで60mlの0.5M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出させた。カラムに吸着しない画分をプールして、限外濾過により13mlに濃縮し、0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）で平衡化したCM−Toyopearl 650Mカラムにアプライし、まず0.1M NaCl−0.25Mスクロース−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）、次いで0.25Mスクロース−20mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）中のNaClの直線濃度勾配（0.1Mから0.6M）により溶出させ、KDNase活性を有する画分（NaCl0.17〜0.2M付近）を集めた。この画分をSDS−PAGEに付したところ、単一のバンドが確認された。
こうして得られた単一精製酵素は、SDS−PAGEにおいて分子量マーカーとの比較から、見かけの分子量は約42,000と計算された。また、ゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−200カラム,1.8cm×135cm;20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）/0.2M NaClで溶出）から推定される分子量は、分子量マーカーとの比較から、約40,000と計算された。
＜３＞本発明酵素の性質
上記で得られたアフィニティー精製酵素画分を用いて、本発明酵素の性質を調べた。
（１）基質特異性
種々のKDN含有複合糖質及び糖質、シアル酸含有複合糖質及び糖質について、本発明酵素の反応性を調べた。
用いたKDN含有複合糖質及び糖質、シアル酸含有複合糖質及び糖質の入手法あるいは入手先を以下に示す。
KDNダイマー、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）ダイマー、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）ダイマー:Anal.Biochem.202,25−34（1992）。
KDN含有二本鎖Ｎ型糖鎖:Biochemistry 33,6495−6502（1994）
KDNオリゴ糖アルコール、KDN含有糖タンパク質:J.Biol.Chem.265,21811−21819（1990）。
KDN含有ガングリオシドGM3:J.Biol.Chem.266,21929−21935（1991）
４−メチルウンベリフェリルNeu5Ac、コロミン酸：半井化学より購入。
Ｎ−アセチルノイラミン酸ラクトース、ヒトトランスフェリン、ウシ胎仔血清フェツイン：シグマ社より購入。
Neu5Ac含有二本鎖Ｎ型糖鎖:J.Biol.Chem.264,18520−18526（1989）。
ブタ顎下腺ムチン:Arch.Biochem.Biophys.129,49−56（1969）。
レイクトラウトポリシアロ糖タンパク質、ニジマスポリシアロ糖タンパク質、イワナポリシアロ糖タンパク質:J.Biol.Chem.268,23675−23684（1993）。
Neu5Ac含有ガングリオシドGM3、Neu5Ac含有ガングリオシドGM1:Biochem.J.441,488−497（1976）。
Neu5Acα２→６（Galβ１→３）GalNAcol、ヒキガエル卵ゼリー糖タンパク質:Eur.J.Biochem.223,223−231（1994）
KDNまたはＮ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）として５μｇの上記KDNまたはシアル酸含有複合糖質または糖質を、10μｌの0.1M NaClを含む0.1Mトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）中で、本発明酵素80ミリユニットとともに25℃で20時間おいた。
上記反応液を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー用プレート（メルク社製）にスポットし、１−プロパノール:25％アンモニア水：水＝6:1:2.5（体積比）中で７時間展開した。展開後、風乾し、10％硫酸エタノール溶液を噴霧し、120℃で加熱して、複合糖質または糖質、及び遊離したKDN、Neu5AcまたはNeu5Gcを発色させた。酵素を加えずに反応させたものをコントロールとした。結果を表３に示す。尚、KDN、Neu5AcまたはNeu5Gcを遊離するものを「＋」とし、まったく遊離しないものを「−」で表した。
0003647873.tif 000004
この結果から、本発明酵素は、合成基質である４−MU−KDNだけでなく、KDN残基の天然において既知な結合様式α２→3,α２→6,α２→８のケトシド結合のいずれにも作用することが明らかとなった。
一方、本発明酵素は、表３に示したいろいろなＮ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸を含む複合糖質及び糖質に対しては、Ｎ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結合の加水分解を触媒しなかった。このように、本発明酵素はデアミノノイラミン酸に対してきわめて特異性が高い。
（２）至適pH
上記のようにして得られた本発明酵素のアフィニティー精製酵素画分及び単一精製酵素を用いて、至適pHの測定を行った。緩衝液として0.1Mトリス−酢酸緩衝液を用い、pH4.0〜9.0の各pHで反応を行った他は、前記４−MU−KDN法にしたがって酵素反応を行い、各pH条件下での酵素活性を測定した。その結果、図８（アフィニティー精製酵素画分）及び図９（単一精製酵素）に示したように、pH6付近で最も高い活性が得られた。
（３）至適温度
温度条件を変えた以外は、前記４−MU−KDN法にしたがってKDNase活性を測定した。その結果、本発明酵素は、25〜30℃付近で高い酵素活性を示した。
（４）安定性
本発明酵素を25℃、pH4〜９の条件下で数時間放置した後、４−MU−KDN法によってKDNase活性を測定した。本発明酵素は、このpH範囲で比較的安定であった。
本発明酵素を0.1Mトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）/0.1M NaClに70μg/mlとなるように溶解し、種々の温度下で所定時間放置した後、４−MU−KDN法によってKDNase活性を測定した。その結果、本発明酵素は25℃で少なくとも48時間失活しなかった。
また、本発明酵素は数10μg/ml以下の濃度では、pH及びイオン強度にかかわらず、不安定であった。精製酵素は、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質存在下で安定化された。
（５）本発明酵素の阻害及び活性化
本発明酵素の活性に与える無機イオン、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）などの影響を調べるために、これらの化合物を反応液に添加し、４−MU−KDN法にしたがって酵素反応をおこなった。その結果、カルシウムイオン（Ca2+），マグネシウムイオン（Mg2+），マンガンイオン（Mn2+）の各二価陽イオン及びEDTAは、1mMの濃度で調べたところ活性に影響を与えなかった。
本発明酵素に対するイオン強度の影響を調べた結果を図10に示す。酵素活性は、イオン強度の増加にともなって急激に上昇し、300mM NaCl存在下で最高値を示した。50mM以下の低イオン強度下では、活性は極めて低かった。
本発明酵素は、遊離のKDN（3mM）によって阻害された。一方、KDNの構造アナログである遊離のシアル酸によっては阻害されなかった。本発明酵素の基質とならないことがわかったＮ−アセチルノイラミン酸またはＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合糖質及び糖質によっても阻害されなかった。また、公知のシアリダーゼ（Ｎ−アシルノイラミン酸のケトシド結合を切断）の特異的な阻害剤である2,3−デヒドロ−２−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸によって阻害されなかった。
本発明酵素は、界面活性剤であるTriton X−100によっては阻害されなかった。また、本発明酵素の酵素活性は、0.5％コール酸ナトリウム（sodium cholate）によりほぼ消失したが、0.1％のコール酸ナトリウム（sodium cholate）では約90％の活性が保持された。
（６）ミカエリス定数の測定
本発明酵素に対して、基質として４−メチルウンベリフェリルKDN（４−MU−KDN）を用いたときのミカエリス定数（Km）及び酵素反応最大速度（Vmax）を求めた。32ミリユニットの酵素と6.7μＭの基質４−MU−KDNとを216μｌの反応液（0.1mg/mlウシ血清アルブミンを含む0.1Mトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）/0.1M NaCl）中、25℃で反応させたところ、４−メチルウンベリフェロン（４−MU）の遊離は、１時間以内で直線的であった。
この酵素濃度下で４−MU−KDNを21〜167μＭの範囲の様々な濃度に変えて、同一反応液中で25℃で30分間反応させて、反応初速度を測定した。Lineweaver−Burkプロットをおこない、ミカエリス定数を算出した結果、本発明酵素に対する４−MU−KDN加水分解のVmaxは、0.19μM/minまたは7.4mM/min/mgタンパク質であり、Kmは19μＭであった。
（７）アミノ酸分析
精製したKDNase（単一精製酵素）を、6N塩酸で105℃で24時間加水分解し、アミノ酸組成を調べた。結果を以下に示す。なお、数字はモル％を示す。
アスパラギン及びアスパラギン酸: 5.3
グルタミン及びグルタミン酸    : 5.5
セリン                        :13.6
グリシン                      :19.8
ヒスチジン                    : 2.0
アルギニン                    : 2.0
スレオニン                    : 6.7
アラニン                      : 9.0
プロリン                      : 3.5
チロシン                      : 5.6
バリン                        : 5.9
メチオニン                    : 7.6
イソロイシン                  : 3.5
ロイシン                      : 4.9
フェニルアラニン              : 3.2
リジン                        : 2.0
実施例３  KDN含有糖鎖の合成
40mM KDNと40mMラクトースの混合液50μｌに、本発明酵素１ユニットを加え、0.1Mトリス−酢酸緩衝液（pH6.0）中、25℃で放置したところ、30分後の反応液中に、KDN含有ラクトースの存在が確認された。
産業上の利用可能性
本発明の微生物は、新規KDNaseを産生する。このKDNaseは、公知のシアリダーゼが作用するＮ−アシルノイラミン酸残基に対しては、反応性を持たないことに加えて、公知のシアリダーゼが極めて切断しにくいデアミノノイラミン酸残基に作用してそのケトシド結合を加水分解することができる。
本発明酵素は、デアミノノイラミン酸の構造や機能の解析などの研究に有用な試薬などへの活用が期待される。さらに本発明酵素は、KDNのケトシド結合に対して極めて特異性が高いので、KDNのケトシド結合の検出への応用が期待される。
また、本発明酵素を、加水分解反応の逆反応に利用することによって、新しいデアミノノイラミン酸含有複合糖質または糖質を創出することができる。このような新しいデアミノノイラミン酸含有複合糖質及び糖質は、そのアナログであるＮ−アシルノイラミン酸含有複合糖質及び糖質の機能改変の可能性、あるいは新しい生理活性物質としての利用などが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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