(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異物代謝系第二相を恒常的に活性化させた生存可能な非ヒト動物であって、Ｋｅａｐ１ホモ欠損で且つＮｒｆ２ヘテロ欠損の遺伝子型を有する非ヒト動物。
【請求項２】
請求項１に記載の非ヒト動物を作出するための親動物として使用するための非ヒト動物であって、Ｋｅａｐ１ヘテロ欠損で且つＮｒｆ２ヘテロ欠損の遺伝子型を有する生存可能な非ヒト動物。
【請求項３】
請求項２に記載の生存可能な非ヒト動物を作出する方法であって：
Ｋｅａｐ１遺伝子を破壊した胚幹細胞クローンから、Ｋｅａｐ１へテロ欠損非ヒト動物を作出する第一の工程と；
該第一の工程で得た非ヒト動物と、Ｎｒｆ２ホモ欠損非ヒト動物とを交配させて、生存可能なＫｅａｐ１ヘテロ欠損で且つＮｒｆ２ヘテロ欠損の遺伝子型を有する非ヒト動物を作出する第二の工程と；
を具備する方法。
【請求項４】
請求項２に記載の生存可能な非ヒト動物を繁殖させる方法であって：
請求項２に記載の非ヒト動物同士を交配させて、親と同じ遺伝子型を有する生存可能な非ヒト動物の子を作出する工程を具備する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の異物代謝系第二相を恒常的に活性化させた生存可能な非ヒト動物を作出する方法であって：
請求項２に記載の非ヒト動物同士を交配させて、Ｋｅａｐ１ホモ欠損で且つＮｒｆ２ヘテロ欠損の遺伝子型を有する非ヒト動物を作出する工程を具備する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異物代謝系第二相酵素群を恒常的に活性化させた非ヒト動物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
産業の発達に伴って、発癌性や催奇形性を有する環境化学物質は年々増大しており、それら化学物質の体外排出能を向上させることは、より安全な畜産動物の開発に繋がる基本的技術である。そしてこれら化学物質に対する代謝能を増強した、環境化学物質が体内に残留しにくい家畜などの非ヒト動物の作製は、非常に興味深い課題である。
【０００３】
生体が生体異物に暴露されると生体内で解毒酵素群が誘導され、これらの酵素により生体異物をより水溶性の高い誘導体へと変換する。このような環境化学物質に対する生体反応は、異物代謝系第一相とその後引き続いて起こる第二相の反応からなる。第一相反応は、主にチトクロームＰ−４５０モノオキシダーゼ系による官能基付加反応であり、化学的に不活性な化合物を反応性に富んだ代謝中間体に変換する。続いて起こる第二相反応は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素（ＮＱＯ１）などの酵素による反応であり、第一相で得られた中間体を一般的により毒性の低い誘導体へと変換する。
【０００４】
異物代謝系第一相の誘導はレセプター型転写因子であるアリルハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ：別名ダイオキシンレセプター）により制御されていることが明らかとなっている。
【０００５】
一方、これまでに異物代謝系第二相を活性化する薬剤として、幾つかの化合物が知られていたがその作用機序は不明であった。また、その誘導は一過性であり、恒常的な活性化を誘導するためには薬剤を持続的に投与する必要があった。
【０００６】
また異物代謝系第二相を制御する転写因子については明らかとされていなかったが、本件の発明者等は既に、Ｎｒｆ２が異物代謝系第二相酵素群の転写活性化因子であることを世界に先駆けて報告している。さらに、本件の発明者等は細胞質タンパク質Ｋｅａｐ１が、ＣＮＣ群（Ｃａｐ’ｎ’ ｃｏｌｌａｒ ｆａｍｉｌｙ）において最強の転写活性を有するＮｒｆ２の核移行を制御することにより異物代謝系第二相を制御していることも明らかにしている(Itoh, K.ら, Genes & Development 13: 76〜86, 1999年)。即ち、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２機能複合体に関与する以下の分子メカニズムを提唱した。非ストレス条件下において、Ｎｒｆ２は細胞質に局在するＫｅａｐ１のβプロペラドメインに結合しているが、酸化的ストレス又は第一相解毒酵素により代謝された第二相基質のような刺激に対する細胞防御反応が起こると、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から放出され、すばやく核に移行する。その結果、Ｎｒｆ２は小Ｍａｆ（以下、ｓＭａｆとも表記する）のような別のｂＺｉｐパートナーとヘテロ二量体を形成する(Marini, M. G.ら, J Biol Chem 272, 16490〜16497, 1997年；Motohashi, H.ら, Nucleic Acids Res 25, 2953〜2959, 1997年)。結果として、ヘテロ二量体は標的遺伝子の遺伝子調節領域（以下、ＧＲＲとも表記する）に存在する抗酸化剤応答配列（以下、ＡＲＥとも表記する）(Xie, T.ら, J Biol Chem 270, 6894〜6900, 1995年；Venugopal, R.and Jaiswal, A. K., Oncogene 17, 3145〜3156, 1998年)を介して、標的遺伝子の発現（例えば、第二相解毒酵素や酸化的ストレス低減タンパク質）をトランス活性化させる。
【０００７】
既に樹立されたＮｒｆ２欠損マウスの個体レベルの解析及びそのマウスより単離した初代培養マクロファージの解析では、それらの標的遺伝子の誘導発現は観察されなかった(Itoh, K.ら, Biochem Biophys Res Commun 236, 313〜322, 1997年；Itoh, K.ら, Free Radic Res 31, 319〜324, 1999年)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、異物代謝系第二相を制御する転写因子Ｎｒｆ２及び細胞質タンパク質Ｋｅａｐ１に注目し、Ｋｅａｐ１の役割及びＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２機能複合体の生体内での機能及び制御機構を解明し、異物代謝系第二相を恒常的に活性化させた生存可能な非ヒト動物を作製することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、Ｋｅａｐ１遺伝子を破壊した胚幹細胞クローンを用いて、Ｋｅａｐ１ヘテロ欠損非ヒト動物を作出する方法、前記方法を用いて作出したＫｅａｐ１へテロ欠損非ヒト動物を交配させることにより異物代謝系第二相を恒常的に活性化させたＫｅａｐ１ホモ欠損非ヒト動物を作出する方法、Ｋｅａｐ１へテロ欠損非ヒト動物とＮｒｆ２ホモ欠損マウスを交配して、生存可能なＫｅａｐ１へテロ欠損Ｎｒｆ２ヘテロ欠損非ヒト動物を作出する方法、並びに前記方法を用いて作出したＫｅａｐ１へテロ欠損Ｎｒｆ２ヘテロ欠損非ヒト動物を交配させて、生存可能なＫｅａｐ１へテロ欠損Ｎｒｆ２ヘテロ欠損非ヒト動物又は異物代謝系第二相を恒常的に活性化させた生存可能なＫｅａｐ１ホモ欠損Ｎｒｆ２ヘテロ欠損非ヒト動物を作出する方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、異物代謝系第二相を恒常的に活性化させた非ヒト動物を作製する方法を提供する。具体的には、Ｋｅａｐ１を欠失させることにより、異物代謝系第二相酵素群を恒常的に発現させた非ヒト動物を作製する。
【００１１】
本明細書において、「異物代謝系」とは、暴露により生体に取り込まれた物質を水溶化することで無毒化する系を意味する。
「異物代謝系第二相酵素群」とは、チトクロームＰ−４５０モノオキシダーゼをはじめとした異物代謝系第一相酵素群の作用により生成した原癌性を有するような代謝中間体を、より毒性の低い中間体へと代謝する一連の代謝関連酵素群を意味する。第二相酵素としては、例えばＧＳＴπやＧＳＴμのようなグルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴとも表記する）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素（以下、ＮＱＯ１とも表記する）又はエポキシドヒドラターゼ等が挙げられる。
【００１２】
ここで異物代謝系応答を引き起こす環境化学物質としては、例えば、発ガン性物質、催奇形性物質、慢性毒性物質、亜急性毒性物質又は急性毒性物質等が挙げられる。
【００１３】
本明細書において「恒常的に活性化する」とは、酸化的ストレス又は第一相解毒酵素により代謝された第二相基質を投与したときのような刺激条件下でなくても、第二相酵素群が誘導的でなく恒常的に発現することを意味する。
【００１４】
本明細書において、「非ヒト動物」とは、ヒトを除く動物を意味し、例えばヒトを除く哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ等）、鳥類（例えば、ニワトリ等）、両生類（例えば、カエル等）、爬虫類又は昆虫が挙げられる。
【００１５】
本発明の態様の一つに従って、Ｋｅａｐ１を欠損させたマウスを作製することにより、Ｎｒｆ２の細胞内制御タンパク質であるＫｅａｐ１の生体内での機能を明らかにすることができる。
ここで、「Ｎｒｆ２」は上述の通りＣＮＣ群の転写因子であり、小Ｍａｆ群タンパク質とヘテロ二量体を形成して抗酸化剤反応配列に結合することが可能なタンパク質で、第二相酵素群の制御因子であることを意味する。
【００１６】
「Ｋｅａｐ１」（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ１）は、Ｎｒｆ２に直接結合する分子として、Ｎｒｆ２において種間で保存されたＮｅｈ２ドメインをベイトとした酵母ツーハイブリッドシステムを用いてクローニングされたタンパク質である(Itoh, K.ら, Genes Dev 13, 76〜86, 1999年)。Ｋｅａｐ１はＮｒｆ２の細胞質制御タンパク質であり、Ｎｒｆ２を細胞質に局在化することでＮｒｆ２活性を抑制している。
【００１７】
Ｋｅａｐ１遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、次に示す方法により得ることができる。まず例えば相同組換えにより少なくとも一方の対立遺伝子を破壊した胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞とも表記する）を、受精卵の胚盤胞に注入してキメラ非ヒト動物を得る。得られたキメラ動物を相当する野生型非ヒト動物と交配させて、対立遺伝子の一方のみが破壊されたヘテロ接合体非ヒト動物（以下、Ｋｅａｐ１＋／−とも表記する）を作出することができる。さらにこれら得られたヘテロ接合体非ヒト動物を交配させて、両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合体非ヒト動物（以下、Ｋｅａｐ１−／−とも表記する）を作出することができる。野生型はＫｅａｐ１＋／＋で表現される。
【００１８】
ＥＳ細胞として、マウスの場合には、Ｅ１４、ＣＣＥ、Ｊ１又はＴ２等を用いることができる。
ＥＳ細胞の相同組換えは、例えばＫｅａｐ１発現を妨害し得る任意のＤＮＡ配列を挿入した組換えＤＮＡを、ＥＳ細胞に導入することにより行うことができる。前記Ｋｅａｐ１発現を妨害し得る任意のＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡのＥＳ細胞への導入を確認できるような薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ））等を用いるのが好ましく、またレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ））等を用いるのが好ましいが、特に限定されない。
【００１９】
上述のＤＮＡ導入法としては、例えば電気穿孔法又はマイクロインジェクション法が挙げられる。ＥＳ細胞におけるＫｅａｐ１遺伝子破壊は、常法に従って、例えばＰＣＲとサザンブロットハイブリダイゼーションで確認することができる。
【００２０】
相同組換えによりＫｅａｐ１遺伝子を破壊したＥＳ細胞を有するキメラ非ヒト動物の作出方法は、例えば胚盤胞マイクロインジェクション法等が挙げられる。胚盤胞インジェクション法は、非ヒト動物の胚盤胞にＫｅａｐ１を破壊したＥＳ細胞をマイクロインジェクションし、処理した胚盤胞を擬妊娠非ヒト動物に移植することにより所望のキメラ非ヒト動物を作出することができる。
【００２１】
上述のように得られたキメラ非ヒト動物を相当する野生型非ヒト動物に交配させることで得られるヘテロ接合体非ヒト動物、あるいは該へテロ接合体非ヒト動物を更に交配させることで得られるホモ接合体非ヒト動物は、例えば、尾部から採取したＤＮＡを用いたサザンブロット法によりその遺伝子型を確認することができる。またＲＮＡブロット分析によりＫｅａｐ１遺伝子の発現の有無を確認することができる。
【００２２】
また、本発明は、Ｋｅａｐ１ヘテロ欠損非ヒト動物とＮｒｆ２ホモ欠損非ヒト動物を交配させて、生存可能なＫｅａｐ１へテロ欠損Ｎｒｆ２ヘテロ欠損非ヒト動物を作出する方法を提供する。
更に、本発明は、上記方法により作出したＫｅａｐ１へテロ欠損Ｎｒｆ２ヘテロ欠損非ヒト動物同士を交配させて、異物代謝系第二相酵素群を恒常的に発現させた生存可能な非ヒト動物を作出する方法を提供する。
【００２３】
Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合変異非ヒト動物の作出方法は、上述の本発明に従った方法により得られるＫｅａｐ１＋／−非ヒト動物とＮｒｆ２−／−非ヒト動物を交配させて、野生型非ヒト動物となんら差異のないＫｅａｐ１＋／−Ｎｒｆ２＋／−（これは、Ｋｅａｐ１に関してヘテロ欠損体、即ち一方の対立遺伝子のみ破壊、Ｎｒｆ２に関してもヘテロ欠損体、即ち一方の対立遺伝子のみ破壊されていることを意味する、これ以降、Ｋ１Ｎ１とも表記する）の遺伝子型を有する非ヒト動物を作出する。該非ヒト動物同士を交配させることにより、全ての遺伝子型を有する非ヒト動物を作製することができ、従ってＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２の両方を欠損した非ヒト動物を容易に得ることができる。
【００２４】
Ｎｒｆ２−／−非ヒト動物の作製方法は、Ｋｅａｐ１−／−と同様の方法に従って、まず相同組換えにより少なくとも一方の対立遺伝子を破壊した胚幹細胞を、受精卵の胚盤胞に注入するか、あるいは桑実胚と会合させた後に、擬妊娠非ヒト動物に移植することにより、ＥＳ細胞由来の細胞と胚由来の細胞とが混ざったキメラ非ヒト動物が得られる。得られたキメラ動物を相当する野生型非ヒト動物と交配させて、対立遺伝子の一方のみが破壊されたヘテロ接合体非ヒト動物（以下、Ｎｒｆ２＋／−とも表記する）を作出することができる。さらにこれら得られたヘテロ接合体非ヒト動物を交配させて、両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合体非ヒト動物（以下、Ｎｒｆ２−／−とも表記する）を作出することができる（特願平１１−０６４７７２参照）。野生型はＮｒｆ２＋／＋で表現される。
【００２５】
上述の方法により得られたＫ１Ｎ１非ヒト動物、Ｋ０Ｎ０非ヒト動物（Ｋｅａｐ１−／−Ｎｒｆ２−／−非ヒト動物）やＫ０Ｎ２非ヒト動物（Ｋｅａｐ１−／−Ｎｒｆ２＋／＋）等について、例えば、尾部から採取したＤＮＡを用いたサザンブロット法によりその遺伝子型を確認することができる。
【００２６】
以下、実施例に従って、本発明をより詳細に説明するが、これによって如何なる意味においても本発明の範囲を限定されると解釈されるべきではない。
【００２７】
【実施例】
実施例１：Ｋｅａｐ１欠損マウスの作出
（１）ターゲティングベクターの作製
１２９・ＳｖＪマウスゲノムライブラリー（ストラタジーン）をスクリーニングすることにより、完全長のＫｅａｐ１遺伝子とターゲティングベクターを作製するのに十分な長さの５’及び３’フランキング配列を含む、２つのファージクローン（以下、クローン１及びクローン２と称する）を分離した。
【００２８】
得られた２つのファージクローンのうちターゲティングベクター作製に適した、即ち相同組換えを実施するのに十分なフランキング配列を有するクローン１を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ストラタジーン）にクローン化してターゲティングベクターを作製した。このターゲティングベクターは、核移行シグナル（Nuclear localization Signal：以下、ＮＬＳとも表記する）−β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をＨｉｎｄIIIとＳｍａＩ部位間のＫｅａｐ１ｃＤＮＡのオープン読み取り枠（以下、ＯＲＦとも表記する）領域に挿入しており、該遺伝子をＫｅａｐ１遺伝子と置換されるように設計されている。また形質転換体を選択するために、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子をＮＬＳ−ｌａｃＺ遺伝子下流に配置し、更に非相同性組換え体のネガティブ選択のために、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）遺伝子（東京大学、Ｄｒ．Ｍ．Ｔａｋｅｔｏｈより分与）をＫｅａｐ１遺伝子下流に挿入した。
【００２９】
該ベクターは、５’ゲノム配列と３’ゲノム配列を、それぞれ５．５ｋｂ及び２．７ｋｂ含有しており、更にネオマイシンと隣接して５．７ｋｂのＮＬＳ−ｌａｃＺ ｃＤＮＡを配置するように設計されている。このターゲティングベクターは、Ｋｅａｐ１の８番目から２０４番目の１９７のアミノ酸残基をコードする配列を欠失させるように設計されており、Ｋｅａｐ１のＮ末端側の７つのアミノ酸残基をＮＬＳ−ＬａｃＺに連結している。
【００３０】
ターゲティングベクター、野生型Ｋｅａｐ１遺伝子座、及びターゲティングベクターを用いた相同組換えにより得られると予想される破壊されたＫｅａｐ１遺伝子座（組換え体）の構造を図１に示す。
【００３１】
（２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入と確認
実施例１（１）で得られたターゲティングベクター２５μｇをリニア化した。ＥＳ細胞（Ｅ１４）約１×１０7個を懸濁した培地０．６ｍＬに、リニア化したターゲティングベクター２０μｇを添加し、ジーンパルサー（バイオラッド）を用いて、０．２１ｋＶ／０．５Ｆの条件で、電気穿孔法により前記ＥＳ細胞に遺伝子を導入した。該細胞懸濁液に、０．３ｍｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ギブコ）を含有する培地３０ｍＬを添加し、３７℃にて９日間培養した。
【００３２】
Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞のコロニー約３６０個が得られ、該ＥＳクローンを常法に従って、高分子量ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲとも表記する）により組換え体をスクリーニングした。ＰＣＲは、ｎｅｏ遺伝子にアニーリングすることができるスクリーニングブライマー１：５’−ＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴ−３’（配列表の配列番号１の配列）、及びターゲティングベクターの外側のＫｅａｐ１遺伝子とアニ−リングすることができるプライマー２：５’−ＡＣＣＣＡＧＴＣＧＡＴＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＣＧＧ−３’（配列表の配列番号２の配列）を用いて、９８℃で１０秒間及び６８℃で５分間からなるサイクルを３０サイクル行った。
【００３３】
上述の通り、ＰＣＲを実施したところ、３６０個のクローンのうち、所望の相同的組換えが起こっている陽性クローン（約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を生じるクローン）は１７個であった。これら陽性クローンについて、サザンブロット法により更に詳細に解析して遺伝子型を決定したところ、該１７種類のＥＳクローンの遺伝子座何れにおいてもＫｅａｐ１破壊が見られ、すべてＫｅａｐ１ヘテロ欠損であることが確認された。野生型（＋／＋）、ＥＳクローン１（ＥＳ１）及びＥＳクローン２（ＥＳ２）に実施したサザンブロット結果を図２Ａに示す。なお、サザンブロット法による解析は、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した際に生じるＤＮＡ断片（野生型：〜７．７ｋｂ、組換え体：〜８．７ｋｂ）をターゲティングの外側に配置する５’プローブ（ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメント：１４０ｂｐ）とハイブリダイゼーションさせて、またゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化した際に生じるＤＮＡ断片（野生型：〜４．５ｋｂ、組換え型：〜６．６ｋｂ）をターゲティングベクターの外側に配置する３’プローブ（ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩフラグメント２００ｂｐ）とハイブリダイゼーションさせることにより実施した（図１参照）。
【００３４】
（３）Ｋｅａｐ１遺伝子破壊マウスの作出
実施例１（２）で得られた１７種類のクローンのうち、３種類のＥＳクローン生殖細胞系キメラ作製用クローン（以下、それぞれＥＳクローン１、ＥＳクローン２及びＥＳクローン３と称する）として用い、胚盤胞マイクロインジェクション方法によりキメラマウスを作製した。即ち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胚盤胞に、前記３種類のうち１種のＥＳ細胞をマイクロインジェクションして、処理した胚盤胞を偽妊娠マウスに移植してキメラマウスを作出した。
【００３５】
前記３種類のＥＳクローンのうち２種類のクローン（ＥＳクローン１及びＥＳクローン２）を用いて作出したキメラマウス雄を用いて、これをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交配させて、アグーチの毛の色を呈するＦ１子孫を得た。Ｆ１子孫における変異遺伝子の生殖系列への伝播を、尾部のゲノムのサザンブロット解析により確認した。更に、前記Ｆ１子孫のうちで、Ｋｅａｐ１ヘテロ欠損体同士を交配させることでＦ２子孫を作出し、同様にサザンブロット法により遺伝子型を決定した。
【００３６】
上記ＥＳクローンを用いて作出したＦ１同士のかけ合わせにより作出したＦ２子孫に実施したサザンブロット解析の結果を図２Ｂに示す。図２Ｂにおいて、＋／＋は野生型マウスを表し、＋／−はＫｅａｐ１ヘテロ欠損マウスを表し、−／−はＫｅａｐ１ホモ欠損マウスを表す。サザンブロット解析の結果、相同組換えにより得られると予想される、破壊されたＫｅａｐ１遺伝子座由来のＤＮＡ断片のバンドが見られることから、Ｆ２子孫にはＫｅａｐ１遺伝子座に関してヘテロなマウス及びホモなマウスが含まれており、これらのマウスにおいてはＫｅａｐ１遺伝子の破壊が起きていることが確認された。
【００３７】
（４）Ｋｅａｐ１ノックアウトマウスのＲＮＡブロット解析
実施例１（３）で得られたＫｅａｐ１ヘテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスと、野生型マウスから、胚線維芽細胞（以下、ＭＥＦとも表記する）を取り出し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてＲＮＡを分離した。該ＲＮＡ２５μｇを、ホルムアミド／１．２％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ+、アマルシャム）に転写した後に、ｐＣＭＶ−ＥＣＦＰ−ｍＫｅａｐ１発現ベクター由来のマウスＫｅａｐ１ｃＤＮＡの完全なＯＲＦを含有するＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメント（１９２４ｂｐ）をランダムプライマーラベルキット（宝酒造）を用いて放射ラベルして、これをプローブとして用いた。５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（なお、２０×ＳＳＣは、３Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍ クエン酸ナトリウム含有水溶液：ｐＨ７．０を意味する）、５×デンハルト試薬、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳとも表記する）中にて、４２℃、一晩で上述の転写膜と該プローブとをハイブリダイゼーションさせた。０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中にて、処理した転写膜をまず５８℃で１０分間洗浄し、続いて５８℃で１時間洗浄し、最後に０．１％ＳＤＳを含む０．４×ＳＳＣ中にて、６０℃０．５時間洗浄した。
【００３８】
またコントロールとしてＧＡＰＤＨプローブを用いた。上述のＫｅａｐ１ｃＤＮＡプローブと同様に上記転写膜をＧＡＰＤＨプローブとハイブリダイゼーションさせた後に、０．５％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６０℃で２０分間洗浄し、次に０．２％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中にて６０℃で４５分間、最後に０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中にて室温で２０分間洗浄した。
増感スクリーンを用いて、この転写膜を−８０℃で一晩Ｘ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ又はＸＯＲ、コダック）に感光させた。
【００３９】
上述の通りに実施したＲＮＡブロット解析の結果を図３に示す。図３において、＋／＋は野生型マウスを表し、＋／−はＫｅａｐ１へテロ欠損マウスを表し、−／−はＫｅａｐ１ホモ欠損マウスを表す。図３中の下方のパネルはコントロールを意味する。その結果、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウスのＭＥＦ中に存在するＫｅａｐ１ＲＮＡレベルは、野生型マウスのＭＥＦ中に存在するレベルの約半分であり、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスのＭＥＦにおいては、Ｋｅａｐ１ＲＮＡは検出されなかった。このことから、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて、Ｋｅａｐ１破壊が起こっていることがわかる。
【００４０】
（５）免疫ブロット解析によるｌａｃＺｃＤＮＡのノックインの確認
野生型マウス、実施例１（３）で得られたＫｅａｐ１ヘテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスから摘出した肝臓の全核タンパク質をディグナム法(Dignam, J. D., Methods Enzymol 182, 194〜203, 1990年)により調製した。  上述の方法により得られた核抽出物のタンパク質濃度は、タンパク質アッセイ試薬（バイオラッド）を用いて決定し、この際、標準物質としてウシ血清アルブミンを使用した。
【００４１】
肝臓の核抽出物（タンパク質量で２０μｇ）に等容量の２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸：ｐＨ６．８、２００ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴとも表記する）、４％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）を加えた後に、すぐに５分間煮沸させた。これを適切なＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（以下、ＰＡＧＥとも表記する）で分離し、更にＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。続いて抗β−ガラクトシダーゼ抗体（ＩＣＮ）を用いて免疫染色した。
【００４２】
免疫染色方法について以下に示す。３％スキムミルク及び二次抗体源と同じ動物の２％正常血清／ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭトリス塩酸：ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ツィーン２０）を用いて前記転写膜を、室温で１時間ブロックして、その後、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ中で１時間、抗β−ガラクトシダーゼ抗体と処理した転写膜を反応させて、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させた適切な二次抗体を用いてＥＣＬ発色キット（アマルシャム）を用いて検出した。抗ラミンＢポリクローナル抗体（サンタクルーズ）により検出される核ラミンＢのバンドコントロールとした。
【００４３】
上述のように実施した免疫ブロット解析の結果を図４に示す。図４において、＋／＋は野生型マウスを表し、＋／−はＫｅａｐ１へテロ欠損マウスを表し、−／−はＫｅａｐ１ホモ欠損マウスを表す。その結果、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスの肝臓抽出物中のＮＬＳ−ＬａｃＺレベルは、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウスの肝臓抽出物中のＮＬＳ−ＬａｃＺレベルの約２倍であり、野生型マウスの肝臓抽出物にはＮＬＳ−ＬａｃＺは検出されなかった。このことから、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスに、ｌａｃＺ遺伝子がノックインされていることが確認された。
【００４４】
さらに、β−ガラクトシダーゼ染色法(Maniplating the Mouse Embryo, A Laboratory Method 2nd Edition 参照)を用いて、Ｋｅａｐ１＋／−マウス又はＫｅａｐ１−／−マウスにおけるＮＬＳ−ＬａｃＺ発現は、Ｋｅａｐ１ｍＲＮＡを発現する組織の細胞と重複しており、またＬａｃＺが核内に位置していることを確認した（データは示していない）。
【００４５】
（６）Ｋｅａｐ１欠損マウスの表現型の観察
Ｆ１交配によって得られる、同じ母体から生まれたヘテロ欠損体マウスと野生型マウスの表現型には、なんら差異を見出すことはできなかった。しかしホモ欠損体マウスにはいくつか異なる表現型が見られた。
【００４６】
ホモ欠損体Ｋｅａｐ１−／−マウスは、同じ母体から生まれた野生型マウスやヘテロ欠損体マウスと、体の大きさや行動においてはなんら差異はなく、正常に誕生した。しかし生後４日目から成長遅延が観察された。そして生後５、６日目には体表面一帯にふけが見られた。また野生型マウスやヘテロ欠損体マウスと比較して、ホモ欠損体は、マウスの腹側の皮膚のケラチン層が明らかに厚くなっていた。一方、毛や歯の生え方に異常は見られなかった。該ホモ欠損体マウスは衰弱を伴い、３週間以内に全て死亡した。
【００４７】
（７）Ｋｅａｐ１欠損マウスの解剖学的分析
解剖学的分析により、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスの各器官の大きさは、体の大きさに比例していることがわかった。また食道や噴門洞を除く全ての器官には組織学的に異常は見られなかったが、食道や噴門洞の内壁には、皮膚と同様に異常ケラチン層が観察された。さらにＫｅａｐ１ホモ欠損マウスの胃の噴門部に巨大な腫瘍が見られた。胃の切片の分析から、この腫瘍が多層のケラチンから構成されていることがわかった。個体を用いたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込み実験から、野生型マウスやヘテロマウスと比較して、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスの食道や噴門洞において未熟な扁平上皮細胞の割合に大きな差がないことがわかった（データは示していない）。
【００４８】
（８）Ｋｅａｐ１欠損マウスにおける免疫組織化学分析
各遺伝型マウスに関して、表皮細胞に関連する分化マーカーや増殖マーカーの発現について免疫組織化学分析により解析した。
野生型マウス、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスの食道切片を、数種のサイトケラチンに対する抗体で処理した。用いた各サイトケラチンに対する一次抗体は、抗ｃＫ１、抗ｃＫ１３、抗Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、抗ｃＫ１４である（これら全てＤｒ．ＤｅｎｎｉｓＲｏｏｐからご好意で頂いた）。調製した切片を顕微鏡（ＬｅｉｃａＤＭＲＤ、ＤＭＲＥ）で観察した。
【００４９】
その結果、同じ母体から生まれた野生型マウス、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて、幾つかのサイトケラチンに強烈な変化が見られた。Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて、サイトケラチンｃＫ１に増加が見られ、特に分化マーカーＬｏｒｉｃｒｉｎは著しく増加した。一方、サイトケラチンｃＫ１３の発現は減少し、ｃＫ１４は野生型マウスとほぼ同等の発現レベルを示した。
【００５０】
（９）免疫ブロット解析によるサイトケラチン変化の確認
プロテアーゼ抑制因子カクテル（Ｂｉｏｌａｂ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸：ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）中に、各遺伝型のマウスから摘出した食道５ｍｍをホモジナイズさせた。
【００５１】
サンプル緩衝液のＳＤＳ濃度が１０％ＳＤＳである以外は、実施例１（５）の記載に従って、タンパク質濃度を測定し、ホモジナイズした食道（タンパク質量で５μｇ）を用いて、実施例１（５）の記載に従って、免疫ブロット解析を行った。なお、用いた抗体は抗ｃＫ６（Ｄｒ．Ｄｅｎｎｉｓよりご好意で頂いた）及び抗Ｌｏｒｉｃｒｉｎであり、抗ｃＫ１４（ＣＯＶＡＮＣＥ）により得られたバンドをコントロールとした。
その結果、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて、サイトケラチンｃＫ６に増加が見られ、また実施例１（８）の結果と同様にＬｏｒｉｃｒｉｎは著しく増加し、ｃＫ１４は野生型マウスとほぼ同等の発現レベルを示した。
【００５２】
実施例１（８）及び実施例１（９）の結果に見られるように、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて幾つかのサイトケラチンに変化が起こった理由は明らかでないが、しかし、これら変化がＫｅａｐ１ホモ欠損マウスの成長遅延や短命の一因となっていると予想される。
【００５３】
（１０）組織化学分析
各遺伝型の１０日後のマウスの肝臓をヘマトキシリン−エオシン染色（以下、ＨＥ染色とも表記する）した。
その結果、ＨＥ染色切片の組織化学的分析からは、野生型、Ｋｅａｐ１ヘテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウス全てに差異は見られなかった。
【００５４】
（１１）ＲＮＡブロット解析による第二相解毒酵素群の発現の確認
上述の通り、Ｎｒｆ２は核内で第二相解毒酵素の誘導的発現に重要な役割を果たす。またＫｅａｐ１はＮｒｆ２を細胞質にトラップし、正常な細胞状態においてはＮｒｆ２の核への移行を妨げる。これらの観点から、Ｋｅａｐ１と第二相酵素群の発現との関係が非常に興味深いと考えられた。
【００５５】
そこでＫｅａｐ１欠損マウスの肝臓における第二相解毒酵素群の発現について検討した。
まずＲＮＡブロット分析により、数種の第二相酵素群の発現（ＮＱＯ１及びＧＳＴπ）を確認した。
【００５６】
実施例１（４）と同様に、Ｋｅａｐ１ヘテロ欠損マウス及びＫｅａｐ１ホモ欠損マウスと、野生型マウスから、胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、１２日目の胚全量（Ｅ１２．５）、新生児及び生後１０日目の肝臓（Ｐ１０肝臓）から全ＲＮＡを分離した。ここで、ＮＱＯ１の全ＯＲＦ領域及びＧＳＴπのＯＲＦ領域の一部をプローブとして用いた。またコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。
【００５７】
ＲＮＡブロット解析の結果を図５に示す。図５において、Ｗｔは野生型マウスを表し、ＨｔはＫｅａｐ１へテロ欠損マウスを表し、ＨｍはＫｅａｐ１ホモ欠損マウスを表す。その結果、Ｋｅａｐ１へテロ欠損マウスにおいて、ＮＱＯ１及びＧＳＴπの遺伝子の発現は、野生型マウスやＫｅａｐ１へテロ欠損マウスと比較し、ＭＥＦ、肝臓等の全てのＲＮＡにおいて著しく増加した。このことからＫｅａｐ１欠損マウスにおいて第二解毒酵素であるＮＱＯ１及びＧＳＴπの発現が増加することがわかった。
【００５８】
これまでの知見では、これら第二相酵素群遺伝子の発現は、第一相を経由して通常誘導されるが、驚くべきことに、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて、これら第二相酵素のＲＮＡは恒常的に高レベルであることがわかった。
【００５９】
従って、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいては、Ｎｒｆ２は、正常な細胞条件でさえ、もはやＫｅａｐ１にトラップされることなく核に移行して、恒常的に活性化していると考えられる。Ｎｒｆ２やＫｅａｐ１の発現は、通常体内のいたるところで検出されるために、このＫｅａｐ１欠損によるＮｒｆ２の増加現象は、解毒代謝臓器のみならず種々の組織でも起こり得る。そのためＫｅａｐ１を欠損させることで、未知のＮｒｆ２標的遺伝子の発現レベルも変化している可能性があり、これが原因でＫｅａｐ１ホモ欠損マウスが死に至るのかもしれない。
【００６０】
（１２）ＣＢＢ染色法及び免疫ブロット分解析による第二相解毒酵素群の発現の確認
プロテアーゼ抑制因子カクテル（Ｂｉｏｌａｂ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸：ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）中に、各遺伝型の生後１０日目のマウスから摘出した肝臓０．２ｇをホモジナイズさせた。
上述の方法により得られた肝臓抽出物のタンパク質濃度は、タンパク質アッセイ試薬（バイオラッド）を用いて決定し、この際、標準物質としてウシ血清アルブミンを使用した。
【００６１】
肝臓抽出物（タンパク質量で１０μｇ）に等容量の２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸：ｐＨ６．８、２００ｍＭ ＤＴＴ、４％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）を加えた後に、すぐに５分間煮沸させた。これを適切なＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（以下、ＰＡＧＥとも表記する）で分離し、クマシーブリリアントブルー（以下、ＣＢＢとも表記する）で染色した。なお、サイズマーカーとしてブロードプレステインドマーカー（バイオラッド）を使用した。
ＣＢＢ染色の結果を図６の上部パネルに示す。その結果、ＧＳＴタンパク質の明らかな誘導が確認された。その誘導は、ＣＢＢ色素によるタンパク質染色法で確認できるほど強力なものであった。
【００６２】
さらに、実施例１（５）の記載に従って、上述の通り得られた肝臓抽出物（タンパク質量で１０μｇ）を用いて、実施例１（５）の記載に従って、免疫ブロット解析を行い、数種のＧＳＴタンパク質の発現レベルを解析した。なお、マウスのＧＳＴサブユニット（α、μ及びπクラス）については、すでに報告されている各サブユニットに特異的に反応するウサギ抗体を用いて免疫染色した（Itoh, K.ら, Biochem Biophys Res Commun 236, 313〜322, 1997年）。ＮｕｃｌｅａｒＬａｍｉｎＢバンドをコントロールバンドとした。
【００６３】
その結果を図６に示す。図６において、Ｗｔは野生型マウスを表し、ＨｔはＫｅａｐ１へテロ欠損マウスを表し、ＨｍはＫｅａｐ１ホモ欠損マウスを表す。構成的に発現するＧＳＴαに関しては全ての遺伝子型のマウスは等しい発現レベルを示したが、通常誘導的に発現するＧＳＴμ及びＧＳＴπは、雄雌ともにＫｅａｐ１ホモ欠損マウスの肝臓において顕著に増加した。
従って、Ｋｅａｐ１を欠失させることで、異物代謝系第二相解毒酵素群を恒常的に増加させることが明らかとなった。
【００６４】
（１３）免疫ブロット法によるＮｒｆ２発現の確認
Ｋｅａｐ１の破壊によりＮｒｆ２は細胞質にトラップされることなく、自動的に核へ移行すると予想できる。従って、Ｎｒｆ２は核内に蓄積されると考えられる。この仮説を検証するために、免疫ブロット法によりＮｒｆ２発現を確認した。
【００６５】
実施例１（５）に従って、各遺伝子型を有する生後１０日目のマウスの肝臓の核抽出物に対して、免疫ブロット解析を実施した。なお、用いた抗Ｎｒｆ２抗体は、アジュバンド系（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）を用いて日本シロウサギにＮｒｆ２のＮ末端領域組換え型ポリペプチドを免疫して産生した。また抗Ｎｒｆ２ポリクローナル抗体を用いて、ｐＥＦｍｏｃｋ又はｐＥＦＮｒｆ２発現ベクターでトランスフェクションした２９３Ｔ由来の細胞の全タンパク質をＮｒｆ２検出用基準物質として用い、Ｄ３Ｔで処理したマウスの肝臓の全タンパク質を肝臓Ｎｒｆ２検出のコントロールとして用い、ＮｕｃｌｅａｒＬａｍｉｎＢバンドをローディングコントロールとした。
【００６６】
その結果を図７に示す。図７において、Ｗｔは野生型マウスを表し、ＨｔはＫｅａｐ１へテロ欠損マウスを表し、ＨｍはＫｅａｐ１ホモ欠損マウスを表す。Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスの肝臓においてＮｒｆ２の発現は増加した。
従って、Ｋｅａｐ１破壊マウスにおける異物代謝系第二相解毒酵素の高レベルの発現は、Ｎｒｆ２の恒常的な活性化によることがわかった。
【００６７】
以上の実施例１の結果から、Ｋｅａｐ１遺伝子を破壊することにより、非ヒト動物においてＮｒｆ２の発現を増加させ、さらにそれに伴い異物代謝系第二相酵素群を恒常的に活性化させることが可能となることが明らかとなった。
しかし、実施例１で作出した恒常的に第二相酵素群が活性な非ヒト動物は、成長遅延が見られ、しかも短命であるという決定的な欠点を有する。
【００６８】
実施例２：Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２欠損マウスの作出
実施例１に記載するように、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスは、野生型と比較して成長遅延や異なる種々の表現型が見られ、最終的には死に至ってしまう。上述のように、Ｋｅａｐ１を欠損することによりＮｒｆ２の制御がなされずに恒常的に活性化された状態となり、このことがこれら表現型や死の一因となっていると示唆される。そのことから本発明者等は、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスからさらにＮｒｆ２の発現を低減させることで、種々の表現型や死を回避できると考え、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスにおいて、Ｎｒｆ２遺伝子も半分欠失したマウスを作出することにした。
【００６９】
（１）Ｎｒｆ２欠損マウスの作出
１）ターゲティングベクターの作出
Ｎｒｆ２ ｃＤＮＡ全長をプローブとして用いて、１２９・ＳｖＪマウスゲノムライブラリー（ストラタジーン）をスクリーニングすることにより、ターゲティングベクターを作出するのに十分な長さの５’及び３’フランキング配列とを含む、配列の一部が重複する２つのゲノムファージクローンを得た。
２つのゲノムクローンのうち、２．５ｋｂの５’フランキング配列と９．５ｋｂの３’フランキング配列とを含むファージクローンを用いてターゲティングベクターを作出した。このターゲィングベクターは、ＳＶ４０ＮＬＳ−ｌａｃＺリコンビナント遺伝子と、Ｎｒｆ２遺伝子のｂ−Ｚｉｐ領域とを置換するように設計されている。また、形質転換体を選択するために、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子をＮＬＳ−ｌａｃＺ遺伝子下流に配置し、更に、非相同性組み換え体に対するネガティブセレクションのために、ジフテリア毒素（ＤＴ−Ａ）遺伝子をＮｒｆ２遺伝子の上流に配置するように設計されている。
【００７０】
２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入と確認
上記実施例２（１）の１）で得られたターゲティングベクターを制限酵素でリニア化し、４×１０7個のＥＳ細胞に電気穿孔装置を用いて遺伝子導入した。その後、０．３ｍｇ／ｍＬ−Ｇ４１８（ギブコ社）を含有する培地中で、３７℃にて９日間培養した。その結果、Ｇ４１８耐性のＥＳ細胞コロニー約１０００個が得られ、そのうち９６個のコロニーから、常法により、高分子ＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法によって組み換え体の一次スクリーニングを実施した。その結果、所望の相同性組み換えが起こっているクローンは２１種類であった。これらについて、サザンブロット法により詳細に解析したところ、前記の２１種のクローンはＮｒｆ２の遺伝子座に関してすべてへテロであることが確認された。
【００７１】
３）上記実施例２（１）の２）で得られた２１種類のクローンのうち、２種類のＥＳクローン（以下、ＥＳ細胞クローンＮｏ．６８及び細胞ＥＳクローンＮｏ．２０と称する）を生殖細胞系キメラ作製用として使用し、以下に示す２種類の異なる方法により、キメラマウスを作出した。第一の方法、すなわち胚盤胞マイクロインジェクション法では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの３．５日目の胚盤胞にＥＳ細胞クローンＮｏ．６８をマイクロインジェクションし、処理した胚盤胞をＩＣＲ偽妊娠マウスに移植した。第二の方法、すなわち、会合法では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの２．５日目の桑実胚と、ＥＳクローンＮｏ．２０とを会合させ、それをＩＣＲ偽妊娠マウスに移植した。ＥＳ細胞クローンＮｏ．６８又はＥＳ細胞クローンＮｏ．２０を用いて作出した雄性キメラマウスと、雌性ＩＣＲマウス又は雌性ＢＡＬＢ／ｃＡマウスとを交配することにより、チンチラ色を呈するＦ１子孫を得た。Ｆ１子孫における変異遺伝子単位の生殖系列への伝播を、尾部ＤＮＡのサザンブロット解析により確定した。さらに、前記Ｆ１子孫のうち、Ｎｒｆ２遺伝子座に関してヘテロなマウス同士をかけ合わせることにより、Ｆ２子孫を作出し、サザンブロット解析により遺伝子型を確認した。なお、これにより得られるＮｒｆ２ホモ欠損マウスは生存可能であることは既に確認されている。
【００７２】
（２）Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２遺伝子欠損マウスの作出
実施例１（３）で得られるＫｅａｐ１へテロ欠損マウスと実施例２（１）で得られるＮｒｆ２ホモ欠損マウスを交配させて、Ｋ１Ｎ１の遺伝型を有するマウスを作出した。更に、該Ｋ１Ｎ１マウス同士を交配させて、種々の遺伝子型のマウスを作製した。
【００７３】
それぞれのマウスの遺伝子型は下記のプライマーを用いてＰＣＲにより決定した。Ｎｒｆ２遺伝子型決定は、９６℃で２分間の反応により開始し、次に９６℃で２０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で４５秒間からなるサイクルを３５サイクル行うことでＰＣＲを実施した。用いたプライマーは、Ｎｒｆ２遺伝子にアニーリングすることができるプライマー３：５’−ＴＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧ−３’（配列表の配列番号３の配列）及びプライマー４：５’−ＧＣＣＧＣＣＴＴＴＴＣＡＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧ−３’（配列表の配列番号４の配列）、ノックイン対立遺伝子に位置するｌａｃＺ遺伝子にアニーリングすることができるプライマー５：５’−ＧＣＧＧＡＴＴＧＡＣＣＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧ−３’（配列表の配列番号５の配列）である。７３４ｂｐ及び５１１ｂｐバンドのＰＣＲ生成物は、それぞれ野生型対立遺伝子及び突然変異体対立遺伝子を示す。
【００７４】
Ｋｅａｐ１遺伝子型は、９４℃で１分間の反応より開始し、次に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなるサイクルを３０サイクル行うことでＰＣＲを実施した。用いたプライマーは、Ｋｅａｐ１遺伝子とアニーリングすることができるプライマー６：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＴＴＣ−３’（配列表の配列番号６の配列）及びプライマー７：５’−ＧＡＡＧＴＧＣＡＴＧＴＡＧＡＴＡＴＡＣＴＣＣＣ−３’（配列表の配列番号７の配列）、ノックイン対立遺伝子に位置するｎｅｏ遺伝子にアニーリングすることができるプライマー８：５’−ＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡ−３’（配列表の配列番号８の配列）である。２３６ｂｐ及び４２９ｂｐのバンドのＰＣＲ生成物が、それぞれ野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子を示す。
【００７５】
（３）Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２欠損マウスの表現型の観察
同じ母体から生まれたＫｅａｐ１−／−Ｎｒｆ２＋／＋（Ｋ０Ｎ２）マウスは実施例１（３）で得られたＫｅａｐ１ホモ欠損マウスと同様に数週間後に死亡した。しかし、Ｋ０Ｎ０マウスだけでなく、Ｎｒｆ２に関してヘテロ欠損体であるＫ０Ｎ１マウスは死亡することなく生存可能であった。これらＫ０Ｎ０マウス及びＫ０Ｎ１マウスは、野生型と比較してなんら差異を認識することはなく、またＫｅａｐ１ホモ欠損マウスに見られた成長遅延やふけは見られなくなり、食道における異常ケラチン層も観察されなかった。
従って、Ｎｒｆ２は、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスの表現型に深く関与しており、また死の一因となっていることがわかった。
【００７６】
（４）組織化学分析
Ｋ０Ｎ０マウス及びＫ２Ｎ２マウスの食道をＨＥ染色して観察した。ＨＥ染色切片の組織化学的分析から、Ｋｅａｐ１ホモ欠損マウスに見られた表現型は、Ｋ０Ｎ０においては見られなかった。
【００７７】
（５）第二相酵素遺伝子の発現
実施例１（１１）に記載に従って、Ｋ０Ｎ０マウス及びＫ０Ｎ１マウスにおける第二相酵素遺伝子の発現を調べたところ、Ｋｅａｐ１ホモ欠損体マウスの肝臓抽出物に見られた恒常的な第二相酵素群の遺伝子の発現が、Ｋ０Ｎ０マウスにおいては野生型マウスの正常な発現レベルと同等であった。この発現レベルはＮｒｆ２遺伝子の割合に依存していた（データは示していない）。
従って、ＧＳＴ発現がＮｒｆ２によって制御されていることが示唆される。
【００７８】
以上の実施例２の結果から、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１ホモ欠損マウスにおける表現型を引き起こし、また死の一因である異常ケラチン層の増加を招き、また異物代謝系第二相酵素の発現に関与することが明らかとなった。
また、Ｎｒｆ２を低減させたＫ０Ｎ０マウス及びＫ０Ｎ１マウスは死に至ることはなく、生存が可能であることが明らかとなったが、Ｋ０Ｎ０マウスは、完全にＮｒｆ２遺伝子を欠損しているため、異物に暴露された場合に、それを代謝する能力はもはや備わっていない。一方、Ｎｒｆ２遺伝子を半分だけ欠損させたＫ０Ｎ１マウスは、Ｎｒｆ２が恒常的に活性化されているため、異物を体外へと排出する能力に優れており、かつＮｒｆ２の過剰発現が原因で死に至ることはない。
【００７９】
さらに、Ｋｅａｐ１遺伝子を半分欠損させたマウスで、かつＮｒｆ２遺伝子も半分欠損したマウス（Ｋ１Ｎ１マウス）は、正常に成長繁殖し、Ｋ０Ｎ１マウスの増殖に有用である。
【００８０】
従ってここではじめて、恒常的に異物代謝系第二相酵素群が活性化し、かつ生存可能な非ヒト動物を作出することが可能となった。
また実施例１と実施例２の結果から、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２の複合体がマウス個体の死を左右していることがわかる。Ｋｅａｐ１を破壊することでＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体は形成されず、Ｎｒｆ２が核へ移行する。このことによりＮｒｆ２の過剰発現が種々の表現型を引き起こし、個体に死をもたらす。従って、Ｋｅａｐ１は個体生存のために、またＮｒｆ２の機能を調節するために必須の細胞質分子であることがわかる。
【００８１】
さらにＮｒｆ２欠損マウスが第二相酵素の誘導的遺伝子を発現することなく生存できることから、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体においてＫｅａｐ１が生体異物刺激や酸化的刺激に対する細胞応答の役割を果たし、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体が解毒システムを維持するのに非常に重要な役割を果たしていることがわかる。
【００８２】
【発明の効果】
Ｋｅａｐ１遺伝子を破壊するか、あるいはＫｅａｐ１とＮｒｆ２との相互作用を妨げることで、非ヒト動物においてＮｒｆ２の発現を増加させ、さらにそれに伴いＧＳＴπやＧＳＴμのような異物代謝系第二相酵素群を恒常的に活性化させることが可能となる。
【００８３】
またＫｅａｐ１破壊マウスにおいて、さらにＮｒｆ２遺伝子の対立遺伝子の一方を欠損させることにより、Ｎｒｆ２の過剰発現することなく、かつ薬剤投与等の必要なく異物代謝系第二相が恒常的に活性化している生存可能な非ヒト動物の作出が可能になる。
【００８４】
さらに本発明は、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２の相互作用を遮断することによる異物代謝系第二相酵素群の強力な誘導剤開発の引き金となり、これによりガン予防や薬の副作用予防が可能となる。
【００８５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ターゲティングベクター、野生型Ｋｅａｐ１遺伝子座、及びターゲティングベクターを用いた相同組換えにより得られると予想される、破壊されたＫｅａｐ１遺伝子座（組換え体）の構造を示す。
【図２】ＥＳ細胞（図２Ａ）及びＦ２マウス（図２Ｂ）におけるサザンブロット解析の結果を示す。
【図３】ＭＥＦの全ＲＮＡのＲＮＡブロット解析によるＫｅａｐ１破壊の確認を示す。
【図４】免疫ブロット分析による抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いたＬａｃＺｃＤＮＡノックインの確認を示す。
【図５】ＲＮＡブロット分析による代表的な異物代謝系第二相酵素群の発現を示す。
【図６】ＣＢＢ染色及び免疫ブロット解析による異物代謝系第二相酵素群の発現を示す。
【図７】免疫ブロット法による生後１０日目の肝臓核抽出物におけるＮｒｆ２発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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