(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス活性化作用が天然型ＨＩＶ−１ ＴＡＴ蛋白の５０％以下であり、変異体ＴＡＴ／天然型ＴＡＴが１０／１の濃度比に基づいて、天然型ＴＡＴ機能阻害活性が、５０％以上であるＨＩＶ−１ ＴＡＴ蛋白のトランスドミナント変異体であって、以下の変異体：
（ｉ）３８位の野生型アミノ酸をアスパラギン酸へ変化させる、３８位での単一置換変異を含む変異体；および
（ｉｉ）４１位の野生型アミノ酸をグルタミン酸へ変化させる、４１位での単一置換変異を含む変異体；
からなる群から選択される、変異体。
【請求項２】
請求項１記載のＴＡＴ蛋白質変異体をコードするＤＮＡフラグメント。
【請求項３】
その発現を許容する適切なエレメントの制御下に置かれる請求項２記載のＤＮＡフラグメントを含む発現カセット。
【請求項４】
請求項３記載の発現カセットを含む原核または真核細胞。
【請求項５】
以下の工程：
− 請求項４記載の原核または真核細胞を適切な培養培地で培養すること、および
− 生産された変異体を培養培地または前記細胞から採集することを含む請求項１記載の変異体の製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法を用いて得たＴＡＴ蛋白質変異体。
【請求項７】
ＨＩＶウイルスの複製を阻害するための医薬生成物を製造するための、請求項１記載の変異体、請求項３記載の発現カセットまたは請求項４記載の細胞の使用方法。
【請求項８】
治療または予防剤として、請求項１記載の変異体、請求項３記載の発現カセットまたは請求項４記載の細胞を含むＨＩＶ感染の治療または予防用の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴ蛋白の新規な変異体、ならびにこの変異体をコードするＤＮＡフラグメント、組換え経路によりその発現を可能とする発現カセットおよびこの発現カセットを含む細胞に関する。ＴＡＴ蛋白変異体、カセットおよび細胞は、ＨＩＶ感染の予防或いは治療に特に有用である。
【０００２】
【従来技術とその問題点】
後天性免疫不全症候群（エイズ）は、ＨＩＶウイルスによる個体のＴ４リンパ球の感染に引き続いて、進行する。感染後も、多年に亘り無症候性である場合もあるが、細胞が活性化されると直ちに、ＨＩＶウイルスは、急速に複製を開始し、細胞を破壊する。エイズは、日和見感染症に対して感染者を特に鋭敏にさせる効果を有する細胞性免疫の欠陥により特徴付けられる。ＷＨＯは、１９９２年７月に世界中で５０１２７２件のエイズの症例を記録している（「後天性免疫不全症候群とそれに関連するレトロウイルス類についてのＡＩＤＳ国際文献」、Ａ．Ｗ．ボイルストン編、１９９２、８、リーズ  ユニバーシティー  プレス、リーズ）。しかしながら、幾つかのアフリカ諸国においては、この病気は、真の流行病となっているので、これらの数値は、実際の値よりも低い。
【０００３】
エイズは、１９９２年においても、その死亡率が非常に高い病気である。実際、エイズの発病から２年以内に、９０％以上のヒトが死亡する。これまでにも、多大の努力が払われてきたにも拘らず、完全に満足すべきことが証明された治療法は存在しない。効果的な治療法の開発は、ＨＩＶウイルスの特異的な複雑さの故に、妨げられてきた。
ＨＩＶは、レンチウイルス科に属するレトロウイルスの一種である。他のレトロウイルスと同様に、ＨＩＶは、蛋白性のカプシドを囲むエンベロープにより構成されており、カプシドは、複製サイクルの最初の段階で必要とされる種々のウイルス蛋白と結合したＲＮＡ分子からなる遺伝材料を含んでいる。
【０００４】
Ｔリンパ球の感染後、ＲＮＡ分子は、ウイルスの逆転写酵素によりコピーされ、ＤＮＡとなる。ＤＮＡは、細胞ゲノム内に組み込まれ、通常プロウイルスと呼ばれるものを形成する。プロウイルス性のＤＮＡは、潜伏状態でそこにとどまり続けることもできるし、或いは細胞の機構によりＲＮＡに転写されて、一方ではウイルスのゲノムＲＮＡを形成し、他方ではウイルス蛋白に翻訳されるべきメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。
新しいウイルス粒子、即ちビリオンの形成は、ウイルスのゲノムＲＮＡのカプシド内への包み込みにより、生ずる。この様にして形成された粒子は、ウイルスエンベロープグリコプロテインが組み込まれる細胞膜の一部で発生する破れ（ｂｕｄｄｉｎｇ）により、細胞から分離する。この様にして放出されたビリオンは、Ｔ４リンパ球の表面で発現されるＣＤ４レセプターとＨＩＶエンベロープ蛋白との特異的で且つ相互的な認識により、他のリンパ球に感染することができる。
【０００５】
図１に示す様に、一般にＨＩＶゲノムは、以下の構成を備えている：
−３つの構造遺伝子；カプシド、エンベロープおよび逆転写酵素蛋白をそれぞれコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、
−少なくとも６つの遺伝子；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ。これらは、いまだ僅かにしか判明していないものもある制御機能を恐らく有している蛋白をコードしている、および
−シス−制御配列（ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）。これは、転写のために必須であり、ＬＴＲｓ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）のレベルでプロウイルスＤＮＡの５′末端および３′末端の両方に局在する。５′末端のＬＴＲは、転写の開始に必要なプロモーター配列と制御エレメントとを含むのに対し、３′末端のＬＴＲは、転写の停止に関与する。さらに、ウイルス遺伝子の転写は、特にウイルス蛋白ＴＡＴおよびＲＥＶによりコントロールされる複合制御の対象となる。
ＴＡＴ蛋白は、ウイルスサイクルの初期段階で発現される制御蛋白である。その作用部位は、核である。その役割は、全てのＨＩＶ蛋白をコードする遺伝子の発現をトランス活性化すること（ｔｒａｎｓａｃｉｔｉｖａｔｉｎｇ）にある。ＴＡＴ蛋白は、ウイルスゲノムの短鎖ヌクレオチド配列と特異的に相互作用する。即ち、ＴＡＲ（トランス活性化反応性部位（Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｒｅｇｉｏｎ））配列は、５′末端のＬＴＲの−１７と＋８０ヌクレオチド（ｎｔ）の間でＨＩＶゲノムの５′末端に局地的に存在する。従って、この配列は、全てのウイルスｍＲＮＡにおいて部分的に存在する。ＴＡＴ−ＴＡＲコンプレックスは、恐らく他の細胞性因子（ｃｅｌｌｕｌａｒｆａｃｔｏｒｓ）とともにウイルス遺伝子の転写に有利に働き、この様にして得られたｍＲＮＡを安定化させ、これらのｍＲＮＡの蛋白への翻訳を改善するものと推測される。かくしてウイルスは、ｔａｔ遺伝子が活性化されるや否や、急速に増殖する。
【０００６】
ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子の様な、その発現を容易に測定できる指標遺伝子（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｇｅｎｅ）を使用して、ＴＡＴ蛋白質により誘導されるトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｉｔｉｖａｔｉｏｎ）の効果をインビトロで評価することは、可能であった。ＴＡＲ配列を含むＨＩＶウイルスの５′ＬＴＲの制御下に置かれたＣＡＴ遺伝子が、トランスフェクションにより、動物細胞内に導入された。ＴＡＴを発現しない細胞、例えば、ＨＩＶウイルスにより感染されていない細胞においては、ウイルスプロモーターからのＣＡＴ遺伝子の転写は、ブロックされるか最小限にまで減少するので、ＣＡＴ遺伝子生成物は全く或いは殆ど検知されない。これに対し、ＴＡＴ蛋白の存在下では、細胞の種類にもよるが、１００〜１０００というファクターでの遺伝子発現の増大が観察された。この結果は、翻訳の効率の改善と関連する転与の促進によるものである。
ＨＩＶトランス活性化遺伝子（ｔａｔ）は、２つのコード化エクソンを有している。第１のエクソンは、ゲノムの中心領域で、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子をコードする配列間に位置しており、蛋白の大部分、即ち、Ｎ末端の７２個のアミノ酸をコードしている。Ｃ末端の１４個のアミノ酸のみをコードする第２のエクソンは、生物学的活性のためには、必須ではない。
【０００７】
ＴＡＴ蛋白の構造は、その機能が示唆している。ＴＡＴ蛋白は、ウイルス遺伝子の転写の活性化を可能とする、活性化ドメインと呼ばれる少なくとも１つのドメイン、ＴＡＲヌクレオチド配列に結合する１つのドメイン、そのターゲット配列、およびその核局在化（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を可能とする１つのドメインをを備えている。
多くの研究によれば、ＴＡＴ蛋白は、以下の５つのドメインを備えている（図２参照）：
−第１のドメイン（アミノ酸１〜３７）は、システインに富む配列を有しているが、その機能は未だ不明である。幾つかの研究は、この領域が、蛋白の折りたたみおよびＴＡＴ分子のダイマー化に関与しており、プロテアーゼに対して蛋白を保護しているものと考えれることを示唆している。
−第１の活性化ドメインに対応するアミノ酸３８〜４８からなるドメイン。
−アミノ酸４９〜５７からなるドメインは、核局在化およびＴＡＲエレメントへの結合のための配列を有している。
−アミノ酸５８〜７２からなるドメインは、第２のＴＡＴ活性化ドメインに対応する。
−アミノ酸７３〜８６からなるドメインは、ＴＡＴ活性には必須ではない。
多くのＨＩＶ関連レトロウイルスは、ＬＴＲからのウイルス遺伝子の転写を活性化し得る蛋白をコード化するトランス活性化遺伝子を有する。過去数年間に、異なるタイプのウイルスから得られたこれらのトランス活性化蛋白の種々の変異体が発表されている。それらの中には、ネガティブおよびドミナント変異体（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ）があり（ワックスマンら、サイエンス、１９８７，２３５，６７４−６７７；フリードマンら、ネイチャー、１９８８，３３５，４５２−４５４）、これらを以後トランスドミナント変異体という。
【０００８】
トランスドミナント変異体は、以下の様に定義されている。即ち、ウイルスプロモーターの制御下におかれた遺伝子の発現の活性化を誘導する能力の低下（低下したトランス活性化作用）を呈するが、このプロモーターのレベルにおかれたそのターゲット配列を認識する能力を有しているので、野生型（ｎａｔｉｖｅ）トランス活性化蛋白の機能を拮抗的に抑制することができるものである。
これらの変異体は、野生型蛋白の機能にドミナント的に（ｉｎ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｍａｎｎｅｒ）干渉するので、感染した細胞の「細胞内免疫化（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」を促進し得る新たな種類の抗ウイルス剤となり得る。
一般にいえば、この技術は、細胞に特異的な利点を付与する蛋白または核酸を合成させる様に、細胞を遺伝学的に改良することにある。例えば、ディー・ボルチモアー（ネイチャー、１９８８，３３５，３９５−３９６）により定義されている様に、ＨＩＶウイルスの様な特定のウイルスによる感染に対する抵抗性を付与することである。
【０００９】
かくして、グリーンら（セル、１９８９，５８，２１５−２３３）は、ＨＩＶウイルスＴＡＴ蛋白の第１の活性化ドメインにおいて修飾されたトランスドミナント変異体を生成させている。グリーンらは、ＴＡＴ蛋白のペプチドフラグメントから得られた４つの変異体を開示している。これらの２つ、即ち、変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１−＞Ａｌａ）およびＴＡＴ（Ｔｙｒ４７−＞Ａｌａ）は、有効なトランスドミナントであるであると述べられ、他の２つ、即ち、変異体ＴＡＴ（Ｓｅｒ４６−＞Ａｌａ）および二重変異体ＴＡＴ（Ｓｅｒ４６、Ｔｙｒ４７−＞Ａｌａ、Ａｌａ）は、温和なトランスドミナント（ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔｓ）であると述べられている。
それにも拘らず、上記の文献に記載された変異体には、疑問が投げ掛けられている様である（フランケルら、プロシージャー  オブ  ナショナル  アカデミーオブ  サイエンス  ユーエスエー、１９８９，８６，７３９７−７４０１）。本発明者も、変異体（Ｌｙｓ４１−＞Ａｌａ）について得られた結果を再現しようと試みたが、下記に示すように、不成功に終わった。
さらに、ピアソンら（プロシージャー  オブ  ナショナル  アカデミー  オブサイエンス  ユーエスエー、１９９０，８７．５０７９−５０８３）は、トランスドミナント表現型の形成に際してのアミノ酸４８〜５４からなる領域の重要性を示している。事実、５４位においてグルタミン（Ｇｌｎ）をコードするコドンをストップコドンで置換することにより、その様な表現型を示す先端を切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ΔＴＡＴ変異体が得られる。
【００１０】
現在、トランスドミナント表現型を示し且つ活性化ドメインの或る残基にレベルで修飾された、ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白の新しい変異体が見出されている。
これらの変異体は、より低いトランス活性化作用を示し、且つ天然のＴＡＴ蛋白の機能に支配的に関与するので、抗エイズ治療の枠組みにおいて、極めて有用である。これらの新変異体は、ＨＩＶウイルスの複製および伝播を抑制するに効果的な抗ウイルス剤となり得るものである。事実、これらのトランスドミナント変異体の作用は、ウイルスが新しいウイルス粒子の形成に必要な蛋白とＲＮＡとを合成することができる以前においてさえも、初めの感染サイクルから生じていると考えられる。
従って、本発明の課題は、少なくとも１つの変異を含むＨＩＶウイルス  ＴＡＴ蛋白またはこの蛋白の機能性フラグメントのトランスドミナント変異体を提供することにある；この変異は、３８位、４０位、４１位、４５位及び４７位で天然の残基と異なるアミノ酸残基の存在により特徴付けられる。しかしながら、該条件において、４１位のアミノ酸はアラニンまたはスレオニンとは異なり、４７位はアラニンまたはヒスチジンとは異なる。
一般に、ウエイン−ホブソンら（セル、１９８５，４０，９−１７）により開示されているように、ＨＩＶ１ウイルスＬａｉ単離体（ＨＩＶ１  ｖｉｒｕｓ  Ｌａｉ  ｉｓｏｌａｔｅ）のＴＡＴ蛋白の配列に基づくＴＡＴ蛋白の変異体の配列を記載することが認められている。
【００１１】
ＴＡＴ蛋白およびＴＡＴ蛋白をコードするＤＮＡフラグメントは、最初にウイルス株ＨＩＶ１  Ｌａｉ単離体から記載された。しかしながら、ウイルス株及びウイルス単離体は、多数存在する同一の株の中で記載された。さらに、特定のウイルスはその増殖中に変異可能である。結果として、ＴＡＴ蛋白をコードするＤＮＡフラグメントは、ウイルスによって異なるヌクレオチド配列を有するかもしれない。同様に、ＴＡＴ蛋白は、ウイルスによって異なるアミノ酸配列を有するかもしれない。しかしながら、共通の標準は、ウイルスゲノムの５´ＬＴＲ中に含まれるＨＩＶウイルスプロモーターのようなＴＡＲ標的配列を含むプロモーターの制御下に置かれた遺伝子の発現をトランス活性化する蛋白質の機能である。ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白は、ＨＩＶ１ウイルスＬａｉ単離体のＴＡＴ蛋白により発現されるのと実質的に同一のトランス活性化の結果を与える全ての蛋白であると理解される。
実際に、ＴＡＴ蛋白の変異体の配列は、ＨＩＶ１ウイルスＴＡＴ蛋白の変異体の配列と整列させる。ＴＡＴ蛋白の変異体の配列におけるアミノ酸の番号付けは、それゆえＨＩＶ１ウイルスＴＡＴ蛋白で確立された配列に基づくであろう。例えば、ＴＡＴ蛋白の変異体の配列における４１位のアミノ酸残基は、実際、整列後のＨＩＶ１ウイルスの天然のＴＡＴ蛋白の配列の４１位に相当するアミノ酸である。
【００１２】
より詳細には、本発明のＴＡＴ蛋白変異体は、トランス活性化作用が天然型ＴＡＴ蛋白の約５０％以下、有利には２０％以下、好ましくは１０％以下であり、変異体／天然型ＴＡＴが１０／１の濃度比で測定されたものとして、天然型ＴＡＴ機能阻害活性が、５０％以上、有利には７５％以上、好ましくは９０％以上であることで特徴付けられるトランスドミナント表現型を示す。トランス活性化作用を測定する種々の方法が現在知られている。それらは使用されるリポーター遺伝子により変化するが、以下の実施例に記載される、ＨＩＶウイルスの５´ＬＴＲの制御下におかれたＣＡＴ遺伝子を用いる方法が挙げられる。
本発明のＴＡＴ蛋白変異体は、該蛋白の機能性フラグメントから得ることもでき、上記に記載されたような残基のレベルで変異することもでき、アミノ酸の番号付けは対照のＨＩＶ１ウイルスの天然のＴＡＴ蛋白で確立されたものと整列させる。ＴＡＴ蛋白の機能性フラグメントは、ＨＩＶウイルスプロモーターのようなＴＡＲ配列を含むプロモーターの制御下に置かれた遺伝子の発現のトランス活性化を誘導することのできる前記蛋白の全てのフラグメントとして理解される。例えば、本発明のＴＡＴ蛋白変異体は、アミノ酸１位から始まりアミノ酸７２位で終わるフラグメントのようなＴＡＴ蛋白のフラグメントの突然変異後に製造できる。
【００１３】
本願に従うＴＡＴタンパク質の変異体は、ＨＩＶの天然のＴＡＴタンパク質と比べて、幾つかの突然変異を含み得る。それは、上述のように、少なくとも２個の突然変異の組合せを含み得る。
より詳細には、本願に従うＴＡＴタンパク質変異体は、特に、ＨＩＶ１の天然のＴＡＴ配列との相同性の程度が、７５％より多く、有利には９０％より多く、好ましくは９５％より多い配列を有する。
無論、突然変異されるべき残基は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンで置換され得る４１位の残基、およびアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンで置換され得る４７位の残基を除き、天然の残基以外のあらゆるアミノ酸残基で置換されることができる。
【００１４】
本願の特に有利な局面に従うと、ＴＡＴの変異体は、以下のものから選択される。
（１）３８位に、酸性の側鎖を有するアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、好ましくはアスパラギン酸を含む変異体、
（２）４０位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、好ましくはアラニンを含む変異体、
（３）４１位に、酸性の側鎖を有するアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、好ましくはグルタミン酸を含む変異体、
（４）４５位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくはセリンを含む変異体、
（５）４７位に、塩基性の側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジンまたは好ましくは、アルギニンを含む変異体、
（６）５９位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、グリシンを含む変異体、
（７）６０位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンまたは好ましくは、トリプトファンを含む変異体、
（８）６１位に、塩基性の側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジンまたは好ましくは、アルギニンを含む変異体、
（９）６２位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンまたは好ましくは、アラニンを含む変異体、
（１０）６３位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、セリンを含む変異体、
【００１５】
（１１）６４位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンまたは好ましくは、ロイシンを含む変異体、
（１２）６５位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンまたは好ましくは、ロイシンを含む変異体、
（１３）６６位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、チロシンを含む変異体、
（１４）６７位に、塩基性の側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジンまたは好ましくは、アルギニンを含む変異体、
（１５）６８位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、アスパラギンを含む変異体、
（１６）６９位に、塩基性の側鎖を有するアミノ酸、例えばリシン、アルギニン、ヒスチジンまたは好ましくは、アルギニンを含む変異体、
（１７）７０位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、グルタミンを含む変異体、
（１８）７１位に、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、または好ましくは、スレオニンを含む変異体、
（１９）７２位に、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンまたは好ましくは、ロイシンを含む変異体。
【００１６】
本願はまた、該ＴＡＴタンパク質変異体をコードするＤＮＡフラグメントにも関する。ＴＡＴタンパク質変異体をコードする配列は、慣用されている遺伝子工学的技術、例えば、部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。従って、ＨＩＶの天然ＴＡＴタンパク質または該配列の一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、Ｍ１３タイプのファージにクローン化される。この配列は、所望の突然変異（１箇所または複数箇所）を得るために、適切なオリゴヌクレオチドを使用して、改変される。
本発明はまた、本発明に従うＴＡＴタンパク質変異体をコードするＤＮＡフラグメントを含む発現カセットをも包含し、該発現カセットは、その発現を可能にする適切なエレメントの制御下に置かれる。発現カセットは、異種の発現システム中でＴＡＴタンパク質変異体を合成することを可能にするために、または代替的に、遺伝子治療に意図されるベクター、例えばレトロウィルスあるいはアデノウィルスベクターのエレメントとして、特に有用である。ＴＡＴタンパク質変異体をコードするＤＮＡフラグメントの発現を可能にする適切なエレメントとして、該ＤＮＡフラグメントのｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を可能にする全てのエレメントが包含される。
【００１７】
これらのエレメントは、特に、適切なプロモーターを含む。本発明における用語「プロモーター」は、保持される宿主細胞によるＤＮＡフラグメントの発現に関連するあらゆる転写の制御用のエレメントを意味する。そのような制御用エレメントは、当業者に周知であり、慣用されている遺伝子工学技術によって、発現カセット中に挿入される。
保持されるプロモーターは、細胞またはウィルス起源のものであって良い。プロモーターは、ＤＮＡフラグメントの恒久的発現を可能にする遍在性タイプのものであって良い。酵母中で機能するＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターまたはＳＶ４０ウィルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）の後期プロモーター（ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＨＭＧ（ヒドロキシ−メチル−グルタリル補酵素Ａリダクターゼ）遺伝子のプロモーター、単純ヘルペスＩ型ウィルス（ＨＳＶ１）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、動物細胞で機能するアデノウィルスのＥＩＩＩプロモーターおよびＭＬＰ（主要後期プロモーター（Ｍａｊｏｒ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ））、並びにＭｏＭｕＬＶウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙマウスリンパ白血病ウィルス）のＬＴＲなどが、そのようなプロモーターとして例示される。
【００１８】
用語「プロモーター」はまた、調節可能なタイプのプロモーター、例えば、リンパ球細胞に特異的な免疫グロブリン遺伝子のプロモーターのような、組織特異的プロモーターも含む。
さらに、発現カセットは、以下を含み得る。
（１）ＵＡＳ（上流活性化配列）、例えば酵母のＧＡＬ４（ガラクトース）遺伝子のＵＡＳ、
（２）プロモーターの上流またはＤＮＡフラグメントの下流に設置され得、発現レベルを増加させることが可能なエンハンサーで、例えばヒトＣＤ２遺伝子のエンハンサー。さらに、後者は、Ｔ型リンパ球細胞中のＤＮＡフラグメントの発現を選択的に標的とすることが可能なエレメントを含む、
（３）高等な真核生物中での遺伝子発現を改善するものとして知られる介在配列、例えばＳＶ４０ウィルスのイントロン、
（４）タンパク質に翻訳されることを意図して、ｍＲＮＡから介在配列を除去可能にする、例えばＳＶ４０ウィルスのもののような、スプライシングシグナル、  （５）転写の終結に関連するエレメント、例えばＳＶ４０ウィルスのポリアデニル化シグナル。
【００１９】
一般に、発現カセットは、宿主細胞の中で、好ましくはリンパ球の中で、ＴＡＴタンパク質変異体の発現を行わせることができる。
発現カセットはまた、ＴＡＴタンパク質変異体の、それが容易に回収され得る培養培地においての産生を行わせることもできる。この場合、ＤＮＡフラグメントは、宿主細胞から該変異体の分泌を行わせるシグナルペプチドを成熟配列の上流に含む、ＴＡＴタンパク質変異体の前駆体をコードしている。そのようなシグナルペプチドは、当業者に周知であり、例えば酵母のＭａｔアルファ因子のシグナル配列である。
発現カセットは、発現ベクターに挿入され、プロモーターおよび適切なエレメントが機能する宿主細胞を形質転換するのに使用される。そのようなベクターは、プラスミドまたはウィルスベクターの形態で有り得、例えばＭｏＭｕＬＶ由来のレトロウィルスベクターまたはアデノウィルス５型由来のアデノウィルスベクターである。
本発明は、本発明に従う発現カセットを含む細胞まで範囲が広がり、真核または原核起源の細胞に対しても可能である。宿主細胞は、細菌、真菌、例えば酵母、または哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、造血系のヒト細胞である。
【００２０】
本発明はまた、本発明に従うＴＡＴタンパク質変異体の調製のための方法にも関する。それは、以下の通りである。
（１）該変異体をコードするＤＮＡフラグメントを含む、本発明に従う、真核または原核細胞が、適切な培養培地で培養され、および
（２）変異体は、培養培地または該細胞から回収される。
本発明はまた、該方法を使用して得られるＴＡＴタンパク質変異体をも包含する。
本発明はまた、ＨＩＶウィルスの複製を阻害するために、本発明に従うＴＡＴタンパク質変異体、発現カセット、または該変異体を産生する細胞を治療的に使用することにも範囲が広がる。好ましくは、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおける、ＡＩＤＳの治療または予防を意図した医薬生成物の生産のための、ＴＡＴタンパク質変異体、発現カセット、該変異体を産生する細胞の使用に関する。
有利には、本発明に従う発現カセットまたは細胞は、抗ＡＩＤＳ遺伝子治療の目的のために使用され得る。発現カセットは、レトロウィルスのタイプのベクターに挿入され、該ベクターは、個体（好ましくは、ＨＩＶに感染している個体）の骨髄から採集される造血系の幹細胞に導入される。
【００２１】
このようにしてトランスフェクトされた幹細胞は、ドナーに再注入される。それらは、分裂し、なかんずくリンパ球に分化することができる。レトロウィルスベクターを含むリンパ球は、ＴＡＴタンパク質のトランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）変異体をコードする遺伝子を、長期間にわたって発現するレトロウィルスベクターを含み、該細胞をＨＩＶ感染に耐性とさせる。
本発明はまた、本発明に従う変異体、発現カセットまたはそのような変異体を産生する細胞を治療または予防剤として含む薬学的組成物にも関する。本発明に従う薬学的組成物は、通常の使用における技術に従って調製され得る。例えば、受容可能な担体、希釈剤またはアジュバントが、治療的に有効な量の、治療または予防剤と組み合わせられる。
最後に、本発明は、本発明に従うＴＡＴタンパク質変異体、発現カセットまたはそのような変異体を産生する細胞の、治療的に有効な量が患者に投与される、治療方法に関する。
【００２２】
【実施例】
実施例１：発現プラスミドｐＴＣ２３３２の構築、変異ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）の発現及びトランスドミナント表現型の確認。
ＨＩＶ−Ｌａｉ単離体ゲノムのｔａｔ遺伝子の２エクソンに対応するコピーＤＮＡを包含するＤＮＡフラグメント（ヴアイン−ホブソン〔Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ〕ら，セル〔Ｃｅｌｌ〕，１９８５，４０，９−１７；ゾドロスキ〔Ｓｏｄｒｏｓｋｉ〕ら，サイエンス〔Ｓｃｉｅｎｃｅ〕，１９８５，２２９，７４−７７〕を修飾してイニシエーターＡＴＧの５´にＢａｍＨＩを形成した。さらに、ＢａｍＨＩ部位は、天然にｔａｔ遺伝子の停止コドンの下流５３ｂｐに存在する。突然変異していないｔａｔ遺伝子を包含する３００ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントを、ジーン  クリーン  キット〔Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ｋｉｔ〕（バイオ〔Ｂｉｏ〕  １０１，Ｉｎｃ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ２２８４，ラ  ジョラ〔Ｌａ  Ｊｏｌｌａ〕）を用いて精製し、ベクターＭ１３ＴＧ１３０に導入して（キニー〔Ｋｉｅｎｙ〕ら，ジーン〔Ｇｅｎｅ〕，１９８３，２６，９１−９９）ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を得た。該ベクター上で突然変異誘発を行う。
Ｍ１３ＴＧ２３０６における残基３８をコードするコドンの突然変異には、アメルシャム  キット〔Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｋｉｔ〕（インビトロでの突然変異誘発システム  バージョン〔ｖｅｒｓｉｏｎ〕２．１  ＲＰＮ  １５２３に関与するオリゴヌクレオチド）を使用し、該オリゴヌクレオチドは配列番号１に記載する。
【００２３】
オリゴヌクレオチドを設計して、３８位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基をコードするコドンをアスパラギン酸（Ａｓｐ）で置換し、また、コードするアミノ酸を修飾することなくＴＡＴ配列の４２位の残基をコードするコドンのレベルでＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を形成した。制限部位の存在により、マニアティス〔Ｍａｎｉａｔｉｓ〕ら（モレキュラー  クローニング〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ〕：ア  ラボラトリー  マニュアル〔ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ〕，１９８９，コールドスプリグハーバーラボラトリー〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〕）に記載のミニプレパレイション法〔ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ〕により、バクテリオファージＤＮＡの解析において、突然変異ベクターを、親のもの〔ｐａｒｅｎｔａｌｓ〕から容易に同定できる。
突然変異誘発させた後、突然変異したｔａｔ遺伝子を包含するＢａｍＨＩフラグメントを、図３に記載の真核発現ベクターｐＳＧ５（グリーン〔Ｇｒｅｅｎ〕ら，ヌクレイック  アシッド  レス〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ〕，１９８８，１６，３６９）に挿入する。結果として得られるプラスミドｐＴＧ２３３２は変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）を発現できる。
従来技術のトランスドミナントＴＡＴ変異型、即ち、変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）及びΔＴＡＴ（Ｇｌｎ５４→停止）のそれぞれの合成を、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド（４１位のリシン残基をコードするコドンをアラニンに変更することを可能にする）及び配列番号３に記載の（５４位のグルタミン残基をコードするコドンの位置に停止コドンを形成することを可能にする）オリゴヌクレオチドを使用し、ベクターＭ１３ＴＧ２３０６の部位特異的突然変異により行った。
【００２４】
突然変異誘発させた後、突然変異したｔａｔ遺伝子を真核発現ベクターｐＳＧ５に挿入し、それぞれ、突然変異ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）の合成を可能にするｐＴＧ２３５１、及び、ΔＴＡＴの合成を可能にするｐＴＧ２３５２を得る。これら従来技術の突然変異体〔ｍｕｔａｎｔｓ〕は、トランスドミナンスに対するポジティブ・コントロールとして有用である。それらのトランス活性化作用及び、天然のＴＡＴタンパク質を阻害する能力は、以下に記載される本発明のＴＡＴ変異型に適用するのと完全に同一の条件で評価される。
変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）のトランス活性化作用は、リポーターベクターＬＴＲ−ＣＡＴ（エメルマン〔Ｅｍｅｒｍａｎ〕ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８７，６，３７−５５）を用いた発現ベクターｐＴＧ２３３２のＨｅＬａ細胞への一時的なトランスフェクションにより評価する。細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム法により行う（マニアティス〔Ｍａｎｉａｔｉｓ〕ら，モレキュラー  クローニング〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ〕：ア  ラボラトリー  マニュアル〔ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ〕，１９８９，コールドスプリングハーバーラボラトリー〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ〕）。核酸を細胞に導入できる他の手段も利用できる。例えば、デキストラン硫酸法、電気溶出、浸透圧ショック、又は、選択細胞〔ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ〕へのマイクロインジェクションに基づく方法も利用できる。
ヒトＨｅＬａ細胞の培養は、３７℃で、５％ＣＯ２の存在下、ＭＥＭ培地（イーグルの〔Ｅａｇｌｅ´ｓ〕最小必須培地）中で、１０％のウシ胎児血清、１％の非必須アミノ酸、１％のグルタミン及び１％のゲンタマイシンを添加して行う。
【００２５】
プラスミドＤＮＡは、塩化セシウムグラジエントで精製する。ｐＴＧ２３３２１μｇ及びプラスミドＬＴＲ−ＣＡＴ  ０．５μｇを培地中のＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、ディッシュ当り４×１０５個の細胞の割合でプレートに配置する。ｐＨＭＧ−Ｔａｔ（図４）１μｇ及びＬＴＲ−ＣＡＴ  ０．５μｇのトランスフェクションにより、トランス活性化に対するポジティブ・コントロールを構築する。ベクターｐＨＭＧ−ｔａｔは、ＴＡＴタンパク質の８６のアミノ酸をコードするｔａｔ遺伝子のコピーＤＮＡを包含するＢａｍＨＩフラグメントのベクターｐＨＭＧのＢａｍＨＩ部位へのクローニングに由来する（メエタリ〔Ｍｅｈｔａｌｉ〕ら，ジーン〔Ｇｅｎｅ〕，１９９０，９１，１７９−１８４）。トランスフェクトされるべきプラスミドＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）４２０μｌ中に回収し、２Ｍ  ＣａＣｌ２６０μｌと混合する。該混合物をチューブを静かに振りながら、２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏを、ＮａＯＨでｐＨ７．１２に調節したもの）４８０μｌに加える。１５分後、沈殿物を滴状に細胞の上に注ぐ。培地をトランスフェクションの２４時間後に取替えて、過剰の沈殿物を除去する。細胞抽出液の分析を形質転換の４８時間後に行ってＣＡＴ遺伝子の発現を評価する。
ＨｅＬａ細胞をＣＡＴ緩衝液（１５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８；６０ｍＭＫＣｌ；１５ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５ｍＭスペルミン；１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）；０．４ｍＭフェニルメチルスルホニル  フルオリド（ＰＭＳＦ））にすり落として回収する。３凍結融解サイクル〔３  ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅｓ〕を液化窒素中で行った後、３７℃で４分間インキュベーションする。このようにして得られたライゼートを６５℃で１０分間インキュベートし、遠心分離を１０，０００ｒｐｍで１０分間行って細胞破壊片〔ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｂｒｉｓ〕を分離する。上澄みを回収し、そのタンパク質濃度をバイオラド比色試験〔Ｂｉｏｒａｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｓｔ〕により測定する。
【００２６】
必要に応じて水で希釈して８００μｌに調節した細胞抽出液１５μｌと水中のバイオラド試薬〔Ｂｉｏｒａｄ  ｒｅａｇｅｎｔ〕２００μｌとを室温で１０〜６０分間インキュベートする。タンパク質濃度は、５９５ｎｍにおける光学密度をウシ血清アルブミン検定系列〔ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ〕と対比して測定して決定する。
ＣＡＴ遺伝子の発現は、タンパク質１０〜２０μｇに対応する抽出液の一部で測定する。細胞抽出液の適当量を事前に３００μｌに０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）で調節し、５ｍＭアセチル補酵素Ａ  ３２μｌ及び１４Ｃ−クロラムフェニコール２０μｌ（０．５μＣｉ）と一緒に３７℃で１時間３０分間インキュベートする。酢酸エチルで抽出して１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上相を凍結乾燥する。後者を酢酸エチル１５μｌに取り、６０Ｆ２３４シリカゲルプレート（メルク）上に保持させて薄層クロマトグラフィーにより分析する（クロロホルム／メタノール  １９／１緩衝液中で１時間３０分間泳動する）。クロマトグラムをオートラジオグラフィーで視覚化し、アセチル化クロラムフェニコールに対応するバンドを切り出す。放射能レベルをシンチレーション計数により評価する。突然変異体のトランス活性化のパーセントを、ポジティブ・コントロール（ｐＨＭＧ−Ｔａｔ  ＋  ＬＴＲ−ＣＡＴ）（これは１００％のトランス活性化作用を示す）により測定したレベルと対比して計算する。
【００２７】
変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）のトランスドミナント活性は、天然のＴＡＴタンパク質のトランス活性化機能を阻害する能力を測定することにより評価する。トランスドミナント活性は、レポーターベクターＬＴＲ−ＣＡＴ及び天然のＴＡＴタンパク質発現ベクターｐＨＭＧ−Ｔａｔを用いた、ＨｅＬａ細胞への発現ベクターｐＴＧ２３３２の一時的なトランスフェクションにより決定する。すなわち、ｐＴＧ２３３２  １０μｇ、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ  １μｇ及びＬＴＲ−ＣＡＴ  ０．５μｇを上記の手順に従って一緒にトランスフェクトする〔ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ〕。
トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出液を調製し、それらのタンパク質濃度を測定する。タンパク質１０〜２０μｇに対応する抽出液の一部をＣＡＴアッセイにより検定する。適用する技術的条件は、既に詳細に記載してある。天然のＴＡＴタンパク質の変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）による阻害パーセントは、０％を示すｐＨＭＧ−ＴａｔとＬＴＲ−ＣＡＴとのコトランスフェクション〔ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ〕に由来する活性化のためのポジティブ・コントロールと対比して計算する。得られた結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
0003613734.tif 000002
0003613734.tif 000003
【００２９】
変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）は、そのトランス活性化作用が非常に小さいために（ＣＡＴ遺伝子の発現は、天然のＴＡＴタンパク質により測定されたものと対比して１．４％と評価された）、また、それが天然のＴＡＴタンパク質の活性を強く阻害するために（ｐＴＧ２３３２の存在下において９８％阻害）、効果的なトランスドミナント突然変異体である。
グリーン〔Ｇｒｅｅｎ〕らにより報告されたＴＡＴ変異体（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）は、報告者によりトランスドミナント表現型を有すると考えられているが、完全に反対の結果が、これらの実験で得られた。確かに、それは、特に高いトランス活性化作用（１７２％）を示し、その結果、天然のＴＡＴタンパク質と共同作用するように見える。加えて、このベクターは、天然のＴＡＴ機能に対し優性の効果を与えない（０％トランスドミナント活性）。
従来技術のｐＲＧ２３５２によって合成される変異体ΔＴＡＴは、事実上、トランスドミナンスに関して、コントロールを形成し、これらの実験の正当性を裏付ける。それは、天然のＴＡＴタンパク質のトランス活性化作用を９２％阻害する。それにもかかわらず、この変異型は、ＨＩＶ  ＬＴＲ（２８％）の制御下にあるＣＡＴ遺伝子の発現を誘発する能力を有する。そのトランス活性化は、しかしながら、ポジティブ・コントロールのｐＨＭＧ−Ｔａｔで測定したものより少ない。
【００３０】
実施例２：発現ベクターｐＴＧ２３３３の構築、ＴＡＴ変異体（Ｔｈｒ４０→Ａｌａ）の発現及びトランスドミナント表現型の確認。
ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘発させて、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の４０位のスレオニン（Ｔｈｒ）残基をコードするコドンを、アラニン（Ａｌａ）残基をコードするコドンで置換し、更に、サイレント突然変異を導入し、突然変異ベクターの速やかな決定を可能にするＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、残基４２をコードするコドンのレベルに形成する。使用するオリゴヌクレオチドは配列番号４に記載されている。突然変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５中に転移し、ｐＴＧ２３３３を生じさせる。これにより変異体ＴＡＴ（Ｔｈｒ４０→Ａｌａ）を生産することができる。
ベクターｐＴＧ２３３３を、ベクター  ＬＴＲ−ＣＡＴとともにＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェクトし、変異体ＴＡＴ（Ｔｈｒ４０→Ａｌａ）のトランス活性化作用を上記の手順に従って測定する。同時に、そのトランスドミナント活性を、ｐＴＧ２３３３、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の濃度比でのコトランスフェクションにより測定する。
結果を表１に示す。変異体ＴＡＴ（ＴＨＲ４０→Ａｌａ）が、本発明が規定するトランスドミナント表現型を示すことが観察される。それは、天然のＴＡＴタンパク質の機能を８３％阻害し、１５．６％の小さいトランス活性化作用を保持する。
【００３１】
実施例３：発現ベクターｐＴＧ２３４０の構築、変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ｇｌｕ）の発現及びトランスドミナント表現型の確認
ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘発させて、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の４１位のリシン（Ｌｙｓ）残基をコードするコドンを、グルタミン酸（Ｇｌｕ）残基をコードするコドンで置換し、更に、サイレント突然変異を導入し、突然変異ベクターの速やかな決定を可能にするＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、残基４２をコードするコドンのレベルに形成する。使用するオリゴヌクレオチドは配列番号５に記載されている。突然変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５中に転移し、ｐＴＧ２３４０を生じさせる。これにより変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ｇｌｕ）を生産することができる。
ベクターｐＴＧ２３４０を、ベクターＬＴＲ−ＣＡＴとともにＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェクトし、変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ｇｌｕ）のトランス活性化作用を上記の手順に従って測定する。同時に、そのトランスドミナント活性を、ｐＴＧ２３４０、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の濃度比でのコトランスフェクションにより測定する。
結果を表１に示す。変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ｇｌｕ）が、本発明が規定するトランスドミナント表現型を示すことが判る。該変異体のトランス活性化作用は低く（天然のＴＡＴタンパク質と比較して３％の活性）、また、天然のＴＡＴタンパク質のトランス活性化機能を効果的に阻害する（９７％の阻害）。
ｐＴＧ２３４０により合成される変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ｇｌｕ）と、従来技術の天然ＴＡＴタンパク質と同様に作用する変異体ＴＡＴ（Ｌｙｓ４１→Ａｌａ）とは、同じ残基において突然変異されると認められる。行われた修飾によれば、得られる変異体の表現型は全体として異なっていることもできる。こうして、Ｌｙｓ４１をＧｌｕにより置換することにより、ここに開示されているように、生成する変異型がトランスドミナント表現型を与えられる。
【００３２】
実施例４：発現ベクターｐＴＧ２３５８の構築、変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ４５→Ｓｅｒ）の発現及びトランスドミナント表現型の確認
ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘発させて、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の４５位のイソロイシン（Ｉｌｅ）残基をコードするコドンを、セリン（Ｓｅｒ）残基をコードするコドンで置換し、更に、突然変異ベクターの速やかな決定を可能にするＢａｍＨＩ制限部位を、残基４５をコードするコドンのレベルに形成する。使用するオリゴヌクレオチドは配列番号６に記載されている。突然変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５中に転移し、ｐＴＧ２３５８を生じさせる。これにより変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ４５→Ｓｅｒ）を生産することができる。
ベクターｐＴＧ２３５８を、ベクターＬＴＲ−ＣＡＴとともにＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェクトし、変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ４４→Ｓｅｒ）のトランス活性化作用を上記の手順に従って測定する。同時に、そのトランスドミナント活性を、ｐＴＧ２３５８、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の濃度比でのコトランスフェクションにより測定する。
結果を表１に示す。変異体ＴＡＴ（Ｉｌｅ４５→Ｓｅｒ）が、本発明が規定するトランスドミナント表現型を示すことが判る。それは、天然のＴＡＴ蛋白質の機能を６２．５％部分阻害し、４７％の温和なトランス活性化作用を保持する。
【００３３】
実施例５：発現ベクターｐＴＧ２３４８の構築、変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ４７→Ａｒｇ）の発現及びトランスドミナント表現型の確認
ベクターＭ１３ＴＧ２３０６を部位特異的に突然変異誘発させて、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の４７位のチロシン（Ｔｙｒ）残基をコードするコドンを、アルギニン（Ａｒｇ）残基をコードするコドンで置換し、更に、突然変異ベクターの速やかな決定を可能にするＸｂａＩ制限部位を、残基４７をコードするコドンのレベルに形成する。使用するオリゴヌクレオチドは配列番号７に記載されている。突然変異ｔａｔ遺伝子をベクターｐＳＧ５中に転移し、ｐＴＧ２３４８を生じさせる。これにより変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ４７→Ａｒｇ）を生産することができる。
ベクターｐＴＧ２３４８を、ベクターＬＴＲ−ＣＡＴとともにＨｅＬａ細胞に一時的にコトランスフェクトし、変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ４７→Ａｒｇ）のトランス活性化作用を上記の手順に従って測定する。同時に、そのトランスドミナント活性を、ｐＴＧ２３４８、ｐＨＭＧ−Ｔａｔ及びＬＴＲ−ＣＡＴの１０：１：０．５の濃度比でのコトランスフェクションにより測定する。
結果を表１に示す。変異体ＴＡＴ（Ｔｙｒ４５→Ａｒｇ）が、本発明が規定する温和なトランスドミナント表現型を示すことが判る。それは、天然のＴＡＴ蛋白質の機能を７８％阻害し、５６％のトランス活性化作用を保持する。
【００３４】
実施例６：トランスドミナントＴＡＴ変異体を発現する安定な細胞株の確立及びＨＩＶウイルスによる感染抵抗性の評価
トランスドミナントＴＡＴ変異体（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）を生産する安定な細胞株が、インビボでの可能性のある用途、例えば遺伝子治療手順のため変異体の効率を確認するために確立された。細胞のＨＩＶ感染に対する抵抗性を評価するために、それらがウイルスにより感染されることが必要であり、すなわち、該変異体が細胞表面にヒトＣＤ４レセプターを発現することが必要である。
２種のタイプの細胞系が確立されている。
−  ヒトＴ細胞由来でＣＤ４レセプターを有するＣＥＭ−Ａ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）は、それゆえ当然にＨＩＶ感染性である。
−  ＨＩＶ感染に対する感受性を与えるために、ヒトＣＤ４レセプター  ｐＴＧ６２０のために普遍性の発現ベクターでコトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）。ベクターｐＴＧ６２０は、ヒトＣＤ４レセプターのコピーＤＮＡを含む大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ・クレノウ・フラグメントで処理されたＥｃｏＲＩフラグメントのベクターｐＨＭＧのＥｃｏＲＶ部位への導入により得られる（マドンら、セル、１９８６、４７、３３３−３４８）。
トランスドミナント変異体ＴＡＴ（Ｐｈｅ３８→Ａｓｐ）をコードする遺伝子を含有するＢａｍＨＩフラグメントが、レトロウイルスベクターｐＬＸＳＰ（図５）のＢａｍＨＩ部位に挿入され、ｐＴＧ２３５０を得る。ベクターｐＬＸＳＰは、ｐＬＸＳＮに由来し（ミラー及びロスマン、バイオテクニークス、７、１９８９、９８０−９８８）、ピューロマイシン耐性を与える遺伝子によりネオマイシン遺伝子を置換し、並びにＭＰＳＶ由来のそれによりＭＳＶ由来の３´ＬＴＲを置換することにより得られる。
【００３５】
ｐＴＧ２３５０のプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーションによりＣＥＭ−Ａ３細胞に導入される。塩化セシウム・グラジエントで精製されたＤＮＡ２０μｇを、２０μｌのＰＢＳ緩衝液（１ｍＭＫＨ２ＰＯ４；２ｍＭ  ＫＣｌ；１３６ｍＭ  ＮａＣｌ；３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）に加えた。ＤＮＡ調製物をエレクトロポレーション・タンク（バイオラド）中、１８０μｌのＰＢＳに再懸濁させた。該混合物は、室温で１０分間プレインキュベートする。エレクトロポレーション後（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｂｉｏｒａｄ，電圧２１０ボルト、静電容量９６０μＦ）、細胞は室温に１０分間保たれ、５％のＣＯ２の存在下にＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）６ｍｌ中、３７℃でインキュベートする。ピューロマイシン耐性ＣＥＭ−Ａ３クローンが、限界希釈（ピューロマイシン０．５μｇ／ｍｌ）により単離される。
プラスミドＤＮＡ  ｐＴＧ２３５０は、上記のリン酸カルシウムトランスフェクション技術によりｐＴＧ６２０とともにＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトされる。ピューロマイシン耐性のＨｅＬａ細胞クローンの連続継代培養（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）（ピューロマイシン  ２μｇ／ｍｌ）により単離される。細胞表面のヒトＣＤ４レセプターの発現を、該レセプター対するフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）で標識されたＬｅｕ３Ａ抗体（ベクトン  ディキンソン）を用い、フルオロサイトメトリー（ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞選別機、スキャン  ベクトン  ディキンソン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ，ｓｃａｎ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））により分析する。
【００３６】
ＣＥＭ−Ａ３細胞系におけるＴＡＴ蛋白（ｐｒｏｔｅｎ）の発現は、上記技術によるＬＴＲ−ＣＡＴおよびｐＨＭＧ−Ｔａｔベクターの一時的なトランスフェクションを行うことにより検出される。
ＣＥＭ−Ａ３細胞系に由来し、ピューロマイシンに対し耐性で、トランスドミナントＴＡＴ変異体を発現し、天然のＴＡＴ蛋白の阻害の種々の程度が観察される３種のクローンが、ＨＩＶウイルスで感染される。ウイルスの増殖は、培養上清の逆転写酵素活性を測定することにより評価できる。ウイルス増殖の２日のシフトが、トランスドミナントを発現しないＣＥＭ−Ａ３細胞で得られた結果と比較して、トランスドミナント変異体を発現するＣＥＭ−Ａ３細胞系のクローンの１つで観察された。さらに、逆転写酵素活性は、該酵素で９０％減少した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶウィルスのゲノムの構成図であり、タンパク質をコードする遺伝子は使用されるリーディングフレームに従って表示される；ＬＴＲ：黒枠、構造蛋白をコードする遺伝子：灰色枠；調節タンパク質をコードする遺伝子：白枠が示されている。
【図２】図２は、ＨＩＶウィルスの天然ＴＡＴタンパク質を構成する種々のドメインの構成図であり、各ドメインを構成するアミノ酸は、各ドメインの上に示されている。
【図３】図３は、真核発現ベクターｐＳＧ５の構成図であり、順に、ＳＶ４０のプロモーター（ＳＶ４０  ｐｒｏ；黒枠）、ウサギβ−グロビン遺伝子の非コーディング・エクソン１の３´フラグメント（白枠）、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロン（連続線）、ウサギβ−グロブリン遺伝子のエクソン２の非コーディングの開始部（白枠）、Ｔ７バクテリオファージのプロモーター（Ｔ７  ｐｒｏ；黒枠）、所望の遺伝子のクローニングを可能にするユニークなＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位、およびＳＶ４０ウィルスのポリアデニル化シグナル（ｐＡ  ＳＶ４０；灰色枠）を含む。
【図４】図４は、天然のＴＡＴ蛋白質発現ベクターであるｐＨＭＧ−Ｔａｔの構成図であり、順に、ＨＭＧ遺伝子のプロモーター（ＨＭＧ  ｐｒｏ）、ＨＭＧ遺伝子の非コーディング・エクソンＩ（斜線枠）、イントロンＩおよびＨＭＧ遺伝子のスプライシングのためのアクセプター部位、ＴＡＴタンパク質の８６アミノ酸をコードするコピーＤＮＡ（黒枠）、およびＳＶ４０ウィルスのポリアデニル化シグナル（ｐＡ；白枠）を含む。
【図５】図５は、レトロウィルスベクターｐＬＸＳＰの構成図であり、順に、ウィルスプロモーター領域を含むＭＳＶウィルス（マウスサルコーマウィルス）の５´ＬＴＲ、カプセル化領域（ｐｓｉ）、ウィルスｇａｇ遺伝子（ｇａｇ°）の５´部分、異種遺伝子（遺伝子  ｘ）の挿入を行わせる多重クローニング部位、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰＡＣ）の発現を指令するＳＶ４０ウィルスプロモーター、およびポリアデニル化シグナルを含むＭＰＳＶのウィルス（骨髄増殖性サルコーマウィルス）の３´ＬＴＲを含む。
【配列表】
0003613734.tif 000004
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0003613734.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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