(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータ・システムにおいて、基板上にプローブを合成するためのレチクルのレイアウトを決定するための方法であって、
標的単量体配列の入力を受け取る段階と、
前記標的配列中の単量体の種類を選択する段階と、
ｎ×（ｉ−１）＋１
によって指定される単量体付加領域を有するレチクルを設計する段階と
を含み、
上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第１の単量体の位置である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記レチクルを設計する前記段階が、
ｎ×（ｉ−１）＋２
によって指定される単量体付加領域を有するレチクルを形成する段階をさらに含み、上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第２の単量体の位置であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マスクを生成するためのコンピュータ・システムに関する。より詳細には、本発明は、マスクを生成し利用して、基板上にプローブを形成するためのシステムおよび方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第５，４２４，１８６号には、特に、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ペプチド、多糖およびその他の物質などの高密度分子アレイを形成し、使用する先駆的手法が記載されている。この特許は、あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる。光学的に除去可能な基を表面から逐次的に除去し、この表面の露出した領域に単量体を結合し、このプロセスを繰り返すことによって、例えば、オリゴヌクレオチドまたはペプチドのアレイをこの表面上に形成させる。これらの手法は、オリゴヌクレオチド、ペプチドおよびその他の物質の超高密度アレイを形成するのに使用されている。このようなアレイは例えば、薬品の開発、オリゴヌクレオチドの配列決定、オリゴヌクレオチド配列の検査、およびその他のさまざまな用途に役立つ。この発明に関連した合成技術は、「ＶＬＳＩＰＳ」技術、または「超大規模固定化ポリマー合成（Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis）」技術として知られるようになった。
【０００３】
このようなアレイを形成し使用するさらなる手法が、やはり、あらゆる目的で参照によって組み込まれる米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。該手法は、基板（またはチップ）の部分を機械的に保護し、選択的に、基板の保護除去／基板への物質結合を実施するシステムを含む。現在、これらの手法は「ＶＬＳＩＰＳ  ＩＩ」として知られている。アレイ合成のさらなる手法が、やはり、あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる米国出願第０８／３２７，５１２号に記載されている。
【０００４】
これらの手法に基づいて製作された高密度アレイは例えば、プローブのアレイをスクリーニングして、関心の標的に相補的なプローブがどれかを決定するのに使用される。前述の発明の特定の一態様によれば、このアレイを、標識した標的に露出させる。標的は、広範な物質で標識することができるが、代表的な標識はフルオレセイン標識である。次いでこのアレイを、共焦点顕微鏡ベースの検出システムまたはその他の関連システムで走査し、アレイのどこに標的が結合しているかを識別する。標識にはその他、放射性標識、大分子標識などがある。ただしこれらに限定されるわけではない。
【０００５】
このような方法によって劇的な成果が得られる一方で、いくつかの状況では限界が見られる。例えば、前述の手法に従ったアレイ中の分子レイアウトの設計では、その際に、基板上の露光する位置を区画する「マスク」を設計する必要がある。このようなマスクの製作は容易であるが、費用がかさむ傾向がある。このようなマスクの設計が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５７１，６３９号に記載されている。
【０００６】
特定の用途に対して、アレイ中で特定の分子レイアウトを用意することが望ましい場合も多い。例えば、あらゆる目的のために参照によって組み込まれるＰＣＴ  ＷＯ９５／１１９９５には、ＨＩＶ診断、ある種のガンに関係する遺伝子の診断、ミトコンドリア・オリゴヌクレオチドの評価、およびその他の用途に使用する特定のアレイの合成が記載されている。これらの用途の多くでは、ＨＩＶ診断でのように、同一のチップが大量に要求される。多くの状況では、特定のプローブ・アレイの製造に、１００またはそれ以上ものレチクルを有するマスク（またはマスク・セット）が必要となる。これらの状況では、マスクのコストは、マスク１枚当たりにすれば高いものとなるが、特定の１つのマスクを用いて合成することができる同一のアレイの数を考慮すれば、かなり小さいものとなる。
【０００７】
多くのその他の用途、例えば特定の研究用途などでは、特定のプローブ・レイアウトを有するアレイを、おそらくは１つだけといった比較的少ない数で合成することが望ましい。これは確かに可能であり、当技術分野において広範にその有用性が認められているが、たった数個のプローブ・アレイを製造するために単一のマスク（またはマスク・セット）を製作するとコストがかさむ。したがってこれらの状況での「チップあたり」のマスクのコストはかなり高い（数千ドル程度）ものになる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、プローブ・アレイ製造におけるリソグラフィック・マスクの設計および使用のより効率的な手法を見つけ出すこと、具体的には、少量設計の際に、必要なレチクルの数を減らすことが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明はプローブのアレイをより経済的に基板上に合成する手法を提供する。１つまたは複数の「シフト」レチクルを利用して、多くの異なるプローブ・セットを基板上に合成する。シフト・レチクルは、単量体付加段階後に（位置１つ分またはそれ以上）シフトされ、その後、再使用されるレチクルであり、これは、必要なレチクル（またはマスク）の数を低減させる。さらにこのシフト・マスクは合成時に、基板の、あるプローブ場所に単量体を一様に追加する。本発明の実施態様によって、プローブの長さおよび照会位置を合成時に指定することができるようになり、そのため、チップ合成における柔軟性が向上する。
【００１０】
本発明の一実施態様は、基板上にプローブを合成する方法であって、基板上の、少なくとも１つのシフト・レチクルによって指定された場所に単量体を結合する段階、前記少なくとも１つのシフト・レチクルを基板に対してシフトさせる段階、前記少なくとも１つのシフト・レチクルをシフトさせた後に、前記基板上の、前記少なくとも１つのシフト・レチクルによって指定された場所に単量体を結合する段階を含み、単量体を含むプローブを基板上に合成する方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の実施態様は、基板上にプローブを合成する方法であって、基板の指定の場所に単量体を一様に追加するための少なくとも１つのレチクルを用意する段階、所望のプローブの特性に関する入力を受け取る段階、および前記少なくとも１つのレチクルを利用して、基板上に前記所望のプローブを合成する段階を含む方法が提供される。前記特性を、所望のプローブの長さ、照会位置、または、所望のプローブを合成するための単量体付加順序とすることができる。
【００１２】
本発明の他の実施態様では、基板上にプローブを合成する方法であって、単量体付加領域を有し、それぞれのレチクルが、異なる種類の単量体を基板上に結合するためのレチクルであるレチクル・セットを用意する段階、前記セットのそれぞれのレチクルを利用して、異なる種類の単量体を含む単量体の第１の層を基板上に結合する段階、および前記セットのそれぞれのレチクルを基板に対してシフトさせ、前記第１の層の上に、異なる種類の単量体を含む単量体の第２の層を結合する段階を含み、２つの単量体を含む複数のプローブが基板上に形成される方法が提供される。
【００１３】
他の実施態様では、基板上にプローブを合成するためのレチクルのレイアウトを決定するための方法であって、標的単量体配列の入力を受け取る段階、前記標的配列中の単量体の種類を選択する段階、および前記標的配列中の前記選択した種類のそれぞれの単量体の位置に対応する単量体付加領域を有するレチクルを設計する段階を含む方法が提供される。
【００１４】
他の実施態様では、基板上にプローブを合成する方法であって、基板上の、レチクルの単量体付加領域セットによって指定された場所に、複数の第１の単量体を結合する段階、前記レチクルを基板に対してシフトさせる段階、および前記第１の単量体の１つの単量体の上の、前記レチクルの単量体付加領域セットによって指定された場所に、少なくとも１つの第２の単量体を結合する段階を含み、前記第１および第２の単量体を含むプローブが基板上に形成される方法が提供される。
【００１５】
他の実施態様では、コンピュータ・システムによって実現される、基板上にプローブを合成するためのレチクルのレイアウトを決定するための方法であって、標的単量体配列の入力を受け取る段階、前記標的配列中の単量体の種類を選択する段階、および
ｎ×（ｉ−１）＋１
によって指定された単量体付加領域を有するレチクルを設計する段階を含み、上式で、ｎ＝種類の異なる単量体の数、ｉ＝標的配列中の第１の単量体の位置である方法が提供される。
【００１６】
他の実施態様では、基板上に合成されたプローブを含む基板のレイアウトを指定するための方法であって、基板上に合成するプローブを、それぞれがプローブを含む分析領域の配列リストとして定義する段階、分析領域の前記配列リストの特性に関する入力を受け取る段階、および前記入力された特性を用いて、それぞれの分析領域のプローブを基板上に合成するために、少なくとも１つのレチクルを設計する段階を含む方法が提供される。入力される特性は一般に、分析領域の場所、スケールまたは向きを含む。
【００１７】
他の実施態様では、シフト・マスクを利用して、標的中の塩基位置を照会するための多様なプローブを合成する。例えば、全ての可能な照会位置を含む特定の長さのプローブを合成する。さらに、異なる照会位置を有する異なる長さのプローブをチップ上に同時に合成する。
【発明の効果】
【００１８】
上述のように、プローブの長さおよび照会位置を合成時に指定することができるようになり、そのため、チップ合成における柔軟性が向上する。また、プローブの特性を、所望のプローブの長さ、照会位置、または、所望のプローブを合成するための単量体付加順序とすることができる。
【００１９】
本明細書に記載の発明の性質および利点は、明細書の残りの部分および添付図面を参照することによってさらに理解することができよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
用語
以下の用語は、本明細書で使用するとき、以下の意味を有するものとする。
「マスク」は、光を選択的に通過させるいくつかの開口を有する、通常はガラス製のプレートであるリソグラフィ部材について言う。マスクは、１つまたは複数のレチクルを含むことができる。
「レチクル」は、露光中に基板に光を導くのに使用するマスク全体またはマスクの特定の部分について言う。
【００２１】
導入
本明細書では、光誘導合成手法を使用し、高密度で小型の分子プローブ・アレイを製作する。該アレイを、オリゴヌクレオチド、ペプチド、小分子（ベンゾジアザピン、プロスタグランジン、βターン・ミメティックなど）、非天然配位子、または酵素のアレイ、あるいは、オリゴ糖など「ビルディング・ブロック」形式で合成されるその他の広範な分子のアレイとすることができる。オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイは、本明細書の発明の特定の例に従って使用することができるアレイの代表的なものである。
【００２２】
オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイの設計および製造は、本発明の特定の例に基づくＶＬＳＩＰＳ技術に依存する。オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイ製作の最初の段階は、チップ上に合成するオリゴヌクレオチド・プローブ・セットを選択することを含む。例えば、遺伝子中の単一位置での塩基変更突然変異の検出が望ましいと仮定する。本明細書の手法は、先の単一位置の周囲の短領域と相補的な４つのプローブからなるプローブ・セットを用意する。第１のプローブは、遺伝子のその領域の野生型（正常）配列と正確に相補的である。その他の３つのプローブは、照会をする位置（すなわち、照会位置）の塩基が、野生型配列とは相補的でない３つの塩基で置換されていることを除き、第１のプローブと同一である。
【００２３】
こうすると、塩基変更突然変異の如何に関係なく、プローブのうちの１つが、標的オリゴヌクレオチド配列と完全に相補的となる。遺伝子中のこのような突然変異を検出する、すなわち、遺伝子を再配列するには、遺伝子中のそれぞれの位置に対して同様のプローブ・セットを定義すればよい。例えば、薬剤耐性に関係する突然変異の検出に必要なＨＩＶの１０４０個の塩基を再配列するには、一般に４１６０個のプローブが必要である。このような手法は、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ  ＷＯ９５／１１９９５に詳細に記載されている。当然ながら、ペプチド・アレイなどのアレイでは、プローブ選択の手法は異なったものとなる。
【００２４】
プローブ・セットを選択した後、チップ上でのプローブのレイアウトを決定する。このレイアウトを使用して、チップ合成プロセスで使用するフォトリソグラフィ・マスクを設計する。これらの設計は、一般に電子形態で生成され、これらを使用して、半導体産業で広く使用されているようなマスクをマスク製造工場で製作する。
【００２５】
図１に、チップ合成用のマスクを生成するための本発明のソフトウェア実施形態を実行するのに使用されるコンピュータ・システムの一例を示す。図１には、モニタ３、画面５、キャビネット７、キーボード９およびマウス１１を含むコンピュータ・システム１が示されている。マウス１１は、マウス・ボタン１３などの１つまたは複数のボタンを有することができる。キャビネット７は、本発明を組み込んだコンピュータ・コードを含むソフトウェア・プログラムを格納し、取り出すのに利用できるＣＤ−ＲＯＭドライブ１５およびハード・ドライブ（図示せず）を収容する。コンピュータ可読媒体としてＣＤ−ＲＯＭ１７を示したが、フロッピー（登録商標）・ディスク、ＤＲＡＭ、ハード・ドライブ、フラッシュ・メモリ、テープなどを含むその他のコンピュータ可読媒体を利用することもできる。キャビネット７はさらに、プロセッサ、メモリなどのよく知られたコンピュータ構成要素（図示せず）を収容する。
【００２６】
図２に、本発明のソフトウェア実施形態を実行するのに使用されるコンピュータ・システム１のシステム・ブロック図を示す。図１のとおり、コンピュータ・システム１は、モニタ３およびキーボード９を含む。コンピュータ・システム１はさらに、中央処理装置１０２、システム・メモリ１０４、入出力制御装置１０６、ディスプレイ・アダプタ１０８、リムーバブル・ディスク１１２、固定ディスク１１６、ネットワーク・インタフェース１１８およびスピーカ１２０などのサブシステムを含む。リムーバブル・ディスク１１２は、フロッピー、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、リムーバブル・ハード・ドライブ、フラッシュ・メモリなどの、取り外し可能なコンピュータ可読媒体を代表する。固定ディスク１１６は、内部ハード・ドライブなどを代表する。本発明との使用に適したその他のコンピュータ・システムには、追加のサブシステムを含むもの、またはこれより少ないサブシステムを含むものがある。例えば、別のコンピュータ・システムとして、２つ以上のプロセッサ１０２を含むもの（すなわちマルチプロセッサ・システム）、またはメモリ・キャッシュを含むものが可能である。
【００２７】
１２２などの矢印は、コンピュータ・システム１のシステム・バス・アーキテクチャを表す。ただしこれらの矢印は、サブシステムを連結する働きをする任意の相互接続方式を示すものである。例えば、ディスプレイ・アダプタ１０８をローカル・バスを介して中央処理装置１０２に接続すること、または、このシステムがメモリ・キャッシュを含むことができる。しかし、図２に示したコンピュータ・システム１は、本発明の使用に適したコンピュータ・システムの一例に過ぎない。本発明との使用に適したその他のサブシステム構成を明らかにすることは、当業者にとって容易であろう。例えば、本発明のソフトウェア実施形態を、ＩＢＭ互換コンピュータ、サン・マイクロシステムズ社のワークステーションなどの上に実装することができる。
【００２８】
光誘導化学合成は、半導体ベースのフォトリソグラフィと固相化学合成を結合する。このプロセスを開始するにあたって、光化学的に除去可能な保護基で修飾したリンカーを、固体基板またはチップ表面に付与する。光は、フォトリソグラフィ・マスクまたはレチクルを通して合成面の特定の領域に誘導され、それらの領域を化学結合に対して活性化する。一連の化学ビルディング・ブロック（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴ）の最初のブロックをチップとともにインキューベートし、先段階で露光したサイトで化学結合を起こさせる。次に光を、新しいマスクを通して基板の異なる領域に導き、この化学サイクルを繰り返す。
【００２９】
光のパターンおよび化学試薬の順序が、チップ表面上でのそれぞれのオリゴヌクレオチド・プローブの識別を指示する。組合せ合成法を使用して、非常に少ないプロセス段階で何百万もの化合物を短時間に作り出すことができる。
【００３０】
オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイは、（例えば患者のサンプルの）より長い標的オリゴヌクレオチド配列の認識に使用することができる数千または数百万のオリゴヌクレオチド・プローブを含む。チップ上のオリゴヌクレオチド・プローブ・セットによるオリゴヌクレオチド・サンプルの認識は、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の機構を通して実施される。オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、２本の相補的オリゴヌクレオチド鎖が互いに結合する（ＡがＴと、ＧがＣと対をなす）単純なプロセスである。オリゴヌクレオチド標的が、オリゴヌクレオチド・プローブのアレイとハイブリット形成するとき、標的は、標的オリゴヌクレオチド配列の一部と相補的なプローブに結合する。
【００３１】
標的オリゴヌクレオチドの配列に関する情報は、どのプローブが標的とハイブリット形成したかに基づいて決定することができる。このようなアレイは、オリゴヌクレオチド・プローブ・アレイの、オリゴヌクレオチド配列分析、オリゴヌクレオチド配列検査、突然変異分析、ｍＲＮＡ発現モニタリング、および医療診断上の研究における用途を有する。
【００３２】
本明細書の発明は、マスク製造のコストを低減させるプローブ・アレイ合成手法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、基板上にプローブ・アレイを合成するのに使用することができる１個または数個のシフト・レチクルを設計することによって、マスクのコストが低減される。したがって、このシフト・レチクルを使用して、「カスタムメイド」のプローブ・アレイを合成することができるが、それにも関わらず、このようなカスタムメイド・プローブ用のマスク・セットを製作するチップ１枚当たりのコストは大幅に低減する。
【００３３】
図３Ａに、配列ＴＧＡＣＡＴを含むことが期待される核酸サンプルの評価に望ましいと考えられるプローブ・セットを示す。サンプルを評価して、その配列が実際にＴＧＡＣＡＴであるかどうかを判定するためには、図３Ａに示すような３量体プローブのセットを基板上に合成する。特定のサンプルが、配列ＴＧＡＣＡＴ（「標的」配列）を確かに有する場合、プローブＡＣＴ、ＣＴＧ、ＴＧＴおよびＧＴＡはそれの相補配列であるので、サンプルは、それぞれのプローブとハイブリッド形成することが期待される。しかし２番目の塩基位置（「Ｇ」）に変更がある場合、１つの塩基が標的とミスマッチなので、ＡＣＴプローブ領域で観測されるハイブリッド形成はおそらく減るであろう。例えば、特定のサンプルが配列ＴＡＡＣＡＴを有すると仮定する。ＡＣＴは、配列ＴＡＡＣＡＴのどの位置においても完全には相補的ではないので、おそらくＡＣＴプローブ領域ではハイブリッド形成は観測されない。
【００３４】
ＰＣＴ  ＷＯ９５／１１９９５に開示されているように、追加のプローブを合成して、特定の位置にどの変更が存在するかを求めることができる。例えば、ＡＣＴプローブに加えて、プローブＡＡＴ、ＡＴＴおよびＡＧＴを基板上に合成する（照会位置を下線で示す）。例えば、プローブＡＴＴのハイブリッド形成が強ければ、それは、サンプルがＴＡＡＣＡＴである可能性が高いことを示す。
【００３５】
図３Ｂに、配列ＴＧＡＣＡＴを含むと期待されるサンプル中の突然変異を求めるのに望ましいと考えられるプローブ・セットを示す。それぞれの列は、照会位置に対応するサンプル中のヌクレオチドを決定するための４つのプローブのプローブ・セットを含む。図示のとおり、列のそれぞれの４つのプローブは、照会位置のところが異なっている。好ましい実施形態では、それぞれの照会位置のヌクレオチドが同じプローブが１つの行に配置されており、これによって、Ａレーン、Ｃレーン、ＴレーンおよびＧレーンが形成される。図３Ａの野生型プローブは、プローブ領域に「＊」を付して示されている。一般に、１つのプローブ領域またはセルの中には、同一のプローブが数多くある（例えば、数百または数千）。
【００３６】
図４に、図３ＡのＡＣＴ、ＣＴＧ、ＴＧＴおよびＧＴＡプローブを合成するのに利用される従来技術のレチクルを示す。レチクル１および６は、基板上にヌクレオチドＡを追加するためのものである。レチクル２は、基板上にヌクレオチドＣを追加するためのものである。レチクル４は、基板上にヌクレオチドＧを追加するためのものである。最後に、レチクル３および５は、基板上にヌクレオチドＴを追加するためのものである。これらのレチクルを利用すると、この合成を、不必要な追加段階を省いた、Ａ、Ｃ、Ｔ、そしてＧの繰り返し追加と見ることができる。
【００３７】
レチクルを示した図で、陰を付けた部分はレチクルを貫通する開口を表し、光は、この開口を通して基板上の領域の保護を除去する（deprotect）。次いで、単量体（例えば、ヌクレオチド）が、保護除去された領域に結合することができるように、単量体を基板上に流す。好ましい実施形態では、レチクルの単量体付加領域が開口であるが、同様の方法において、単量体付加領域をレチクル上で閉じることもできる。
【００３８】
図５に、プローブ・セットを生成するための従来技術のヌクレオチド単量体の追加を示す。レチクル１〜６を利用して、基板２０２に単量体を逐次的に追加する。図５の最上段では、レチクル１を利用して、基板の、このレチクルの単量体付加領域によって指定された場所にヌクレオチドＡを追加する。次いで、レチクル２を利用して、このレチクルの指定のとおりに基板にヌクレオチドＣを追加する。このプロセスをレチクル６まで続け、これによって、標的配列の分析に利用できる４つのプローブを得る。
【００３９】
図５のプロセスを、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧの繰り返し追加と見ることができるが、ある場合には、特定の単量体付加段階を「省く」ことができる。例えば図５では、２回目のＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ追加サイクルで、Ｇ追加後のＡおよびＣの追加が省かれている。したがって、これらのプローブの合成には６つのレチクルが必要となる。最悪の場合、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧの追加が、プローブ中のｎ個の単量体のそれぞれに必要となる。したがって最悪の場合には、プローブ・セットを合成するためにｎ×４個のレチクルが必要となる。多くの場合、この数は、上の例のように配列が許すある数ｍにまで低減される。上の例では、ｍは６であり、最悪の場合の１２（３×４）レチクルよりもよい。しかし、プローブ中の単量体の数が増えるにつれて、必要なレチクルの数はかなり大きくなり、そのためコストも増大する。
【００４０】
本発明は、はるかに少ないレチクルを使用してプローブ・アレイを合成する手法を提供する。これによってコストは大幅に低減する。本発明の一実施形態では、わずか１つのレチクルを使用して、例えば、正確な相補的プローブ・セットを作成することができる。追加のレチクルを利用して、照会位置のヌクレオチドを変更したプローブを製作すること、および別のレチクルを利用して、基板上に異なるプローブ・セット（例えば、異なるプローブ長を有するプローブ・セット）を製作することができる。
【００４１】
シフト・レチクル・セット
一実施形態で、本発明は、所望のプローブを基板上に合成するのにシフト・レチクルのセットを利用する。シフト・レチクル・セットは、基板に追加するそれぞれの単量体に対して１つのレチクルを含む。これらのレチクルを利用して、プローブの長さおよび照会位置を、合成時に、例えばレチクルを生成した後に指定することができる。
【００４２】
図６に、シフト・レチクル・セットを生成するプロセスの高水準流れ図を示す。段階２５２で、標的配列と完全に相補的な配列のヌクレオチドに番号を付ける。したがって、図３Ａに示した標的配列では、ヌクレオチドに１〜６の番号を付ける。続いて、標的配列を検出するためのプローブを合成する４つの１×６レチクルを形成する。４つのレチクルをそれぞれ利用して、基板上に異なる単量体（例えばＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を追加する。
【００４３】
段階２５４で、ヌクレオチドＡ追加用のレチクルを基板に作成する。このレチクルは、標的配列に完全に相補的な配列中のそれぞれのＡに対応する開口を有するように設計される。したがって、完全に相補的な配列ＡＣＴＧＴＡでは、レチクルが、ヌクレオチド１および６に対応する開口を有する。図７のレチクル１に、このように生成されたレチクルを示す。
【００４４】
段階２５６で、ヌクレオチドＣ追加用のレチクルを同様の方法で作成する。このレチクルは、標的配列と完全に相補的な配列中のそれぞれのＣに対応する開口を有するように設計される。したがってこのレチクルは、標的のヌクレオチド２に対応する開口を有するように設計される。図７のレチクル２に、ヌクレオチドＣ追加用のレチクルを示す。段階２５８および２６０では、図７に示したレチクル３および４を、それぞれヌクレオチドＧおよびＴに対して同様の方法で作成する。
【００４５】
段階２６２で、これらのマスクの設計を含むコンピュータ・ファイルを出力する。このファイルを、マスク生成システムで利用して、合成に使用するマスクを生成することができる。マスクを設計するためのシステムが、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる米国出願第０８／２４９，１８８号に記載されている。
【００４６】
図８Ａ〜図８Ｃに、これらのシフト・レチクルを使用して先のプローブ・セットを生成する、単量体の追加を示す。図８Ａでは、シフト・レチクルを使用して、単一の単量体「層」を基板３０２上に生成する。単量体「層」の意味するところは、単量体付加段階のそれぞれの合成サイクルによって、基板上の指定場所に単量体が一様に追加されるということである。図８Ａに示すように、指定場所が、基板の活性領域全体を含んでもよい。しかし図１８に示すように、指定場所が、活性領域の場所のサブセットだけを含むのでもよい。
【００４７】
続けて図８Ａを参照する。レチクル１を最初に使用して、基板上にへヌクレオチドＡを追加する。続いてレチクル２を利用し、基板にヌクレオチドＣを追加し、その後、レチクル３および４を利用して、ヌクレオチドＧおよびＴをそれぞれ追加する。Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの１回の合成サイクルで、単一の単量体層が、基板上の中央の４つの位置として示した基板の活性領域に追加された。かっこ内の番号は、使用するレチクルを指示する。矢印は、レチクルが基板と位置合せする場所（すなわち、それぞれのレチクル中の可能な最初の開口）を示す。それぞれの合成サイクルの終了後、全てのレチクルを位置１つ分だけシフトさせる。
【００４８】
図８Ｂでは、図中の矢印で示すように、レチクルが、基板に対して位置１つ分だけ左にシフトされている（図８Ａと比較されたい）。次いでそれぞれのレチクルを１サイクルさせ、異なるそれぞれの単量体を、基板上のレチクルによって指定された場所に追加する。このときもやはり、レチクルによって、単一の単量体層が基板の活性領域に追加される。レチクルを左にシフトさせる、すなわち左に平行移動させるように示したが、当然ながら、レチクルを右、またはその他の任意の方向にシフトさせることもできる。
【００４９】
図８Ｃで、レチクルを再び、図中の矢印に示すように位置１つ分だけ左にシフトさせる。レチクルを１サイクルさせ、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔを、基板上のレチクルの開口によって指定された場所に追加する。最後のレチクルを利用し終わると、図８Ｃの最下段に示すとおり、基板の中央の位置に、標的配列に完全に相補的な４つのプローブが合成されている。これらの４つのプローブは基板の活性領域を表す。図中の、基板の活性領域内にないプローブを基板の「エッジ」と呼ぶ。サンプルの分析または配列決定時、これらのエッジ・プローブは一般に無視される。
【００５０】
単純にするため、レチクルの単量体付加領域が、対象基板上に単一の単量体を付加するものとして示した。しかし実際には、レチクルのそれぞれの単量体付加領域は、開口によって指定された領域に数百ないし数千の単量体を付加する。同様に、レチクルは一般に、数百行のプローブを基板上に合成する。好ましい実施形態では、プローブが４行の倍数に合成され、それぞれの行の中のプローブが、その他のプローブと、照会位置のヌクレオチド１つだけ異なる。
【００５１】
図９Ａ〜図９Ｂに、図３に示した標的配列用の複数のプローブ・セットを生成するのに使用することができるレチクルを示す。図９Ａは、図７のレチクル１と同様のレチクルを示す。ただしこのレチクルは、４行のプローブ、２セットを生成するのに利用される。同様に図９Ｂは、図７のレチクル２と同様ではあるが、４行のプローブ、２セットを生成するのに利用されるレチクルを示す。ヌクレオチドＧおよびＴ用のレチクルについては図示しないが、これらも同じように生成される。
【００５２】
これらの４つのそれぞれのシフト・レチクルを利用して、標的配列に相補的と考えられる４行のプローブ、２セットを基板上に生成する。この合成のそれぞれの合成サイクルで、この標的に相補的な１セットのｎ量体プローブが生成される。したがってこれらのシフト・レチクルを通して３サイクルさせると、基板は、１セットの３量体相補プローブを含む。相補プローブの長さを、使用する単量体付加段階の合成サイクル数によって合成時に選択することができる。「合成サイクル」は、基板に追加するそれぞれの単量体を通したサイクルと定義される。１回の合成サイクルによって、一般には基板の活性領域である基板上の指定の場所に１層の単量体層が追加される。
【００５３】
図１０に、線状レチクルから方形レチクルへの変形を示す。シフト・レチクルを長い線状のレチクルとして示してきたが、線状レチクルを、方形のシフト・レチクルに変形することができる。線状レチクル３０２は、１６個の活性セルおよび３個の余分のセルを含む。余分のセルは、基板に対してシフトさせるためにレチクルに追加したセルである。線状シフト・レチクル中のセルの数は一般にこれよりもかなり大きいが、図示の目的から単純なレチクルを示した。
【００５４】
線状レチクルを方形レチクルに変形する際、１６個の活性セルは方形の領域内に配置され、適当な余分のセルがエッジに配置される。こうして、このレチクルの正方形領域にセル１〜１６を配置することによって、方形レチクル３０４が形成される。方形レチクルのそれぞれの行末には、線状レチクル中の余分のセルと同数の余分のセルが置かれ、これらの余分のセルは、活性セルの後に順番に続く。その結果生じる方形レチクルは、標的配列用のプローブ行を形成するシフト・レチクルである。
【００５５】
照会位置に異なる単量体を付加するには、図１１Ａおよび図１２Ａに示すようなレチクルを利用する。図１１Ａに、照会位置単量体を基板上に結合するのに使用するレチクルを示す。このレチクルは、単量体をプローブに付加するのに利用する複数の開口行を含む。これらの行は、図９Ａおよび図９Ｂに示したレチクルと垂直である。
【００５６】
まず、図１１Ａのレチクルを用いて、ヌクレオチドＡのような単量体をある列のプローブ（すなわち、Ａ−レーン）に付加する。次いで、レチクルを次の列のプローブへと下方に移動し、次いで、ヌクレオチドＣのような異なる単量体をこの列のプローブ（すなわち、Ｃ−レーン）に付加する。異なる単量体が１セットのプローブ中の各列における照会位置に付加されるまで、このプロセスを続ける。削除の場合には、単量体をその列のプローブに付加しない。
【００５７】
したがって、プローブ中の第３の位置に照会位置を有する５量体プローブを生成させるため、まず、基板の活性領域中に２量体プローブを生成させるべく、シフト・レチクルにより単量体付加段階の合成サイクルを２回行う。次いで、照会位置レチクルを用いて、シフト・レチクルの移動方向に対して直交する方向にマスクを移動させることにより、各列のプローブに異なる単量体を付加する。削除の場合を除き、照会位置レチクルは、１回の合成サイクルによって基板の活性領域中に一層の単量体を付加する。次いで、シフト・レチクルを２つの位置に移動させた後（余分な位置は、照会位置レチクルによって用いられる合成サイクルを反映する）、シフト・レチクルを用いて、単量体付加段階の合成サイクルを２回行うことにより、最後の２つの単量体をプローブに付加する。
【００５８】
照会位置が異なるチップ上のプローブを、図１１Ｂに示す。上半分のチップには、プローブ中の３番目のヌクレオチドに照会位置を有する４量体プローブが含まれる（容易に確認できるように、照会ヌクレオチドを丸で囲んである）。図に示すように、チップのこの半分の活性領域には４量体プローブがある。チップの下半分には、異なる長さのプローブをチップ上で同時に合成することができる１つの追加レチクルとともに、同一のシフト・レチクルおよび照会位置レチクルを同時に用いて合成した活性領域中の３量体プローブが含まれる。このレチクルについて、図１３Ａを参照しながらより詳細に説明する。
【００５９】
本発明のシフト・レチクルは、標的構造特異的であるが、配列特異的ではない。例えば、シフト・レチクルを用いて、ＤＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖に相補的なプローブを合成することができる。さらにＴＧＡＣＡＴに相補的なプローブを生成させるシフト・レチクルを用いて、シフト・レチクルを用いたＡおよびＴヌクレオチドを交換することによりＡＧＴＣＴＡに相補的なプローブを生成させることもできる。したがって、合成時に、合成サイクル中のシフト・レチクルの順序、合成サイクル中の単量体、各シフト・レチクルに関係する単量体、および照会位置を選択することにより、プローブの特徴を指定することができる。
【００６０】
図１１Ｃは、前述の方法で生成されたチップのイメージである。チップは、中央位置に照会位置を持つ２０量体プローブを有する。このチップは、１０００塩基対配列のＨＩＶを配列決定するためのものである。前述の例は、本発明を理解してもらうために簡略化してあることを理解されたい。チップ・イメージは、実際のチップを示し、したがって、より複雑であるが、より大きなスケールに拡張された本発明の原理を利用する。
【００６１】
基板のエッジ領域のプローブは、図１１Ｃのチップの右側に示すように、様々なハイブリッド形成強度で標識された標的に結合する。しかし、チップの活性領域がどこで始まり、どこで終わるかを視覚的に確認することは困難である。好ましい実施形態においては、図１２Ａに示すように、照会位置レチクルを使用する。このレチクルは、基板の活性領域に対応、またはさらに大きな開口を有している。開口は基板のエッジ領域の上方にはならないため、基板のエッジ領域のプローブは照会位置ヌクレオチドを受け取らない。このように、エッジ領域における各コラムのプローブは同一となり、したがって、エッジ領域はチップ・イメージ中のストライプのように見えるため、活性領域の開始はより容易に確認できる。これは、図１１Ｃ中のチップの左側に示される。
【００６２】
照会位置が異なるが図１２Ａに示すレチクルを用いて合成されたチップ上のプローブを、図１２Ｂに示す。チップの上半分には、プローブの３番目のヌクレオチドに照会位置を有する４量体プローブが含まれる。示すように、チップのこの半分の活性領域レーンには４量体プローブがある。円で囲んだ照会ヌクレオチドは活性領域だけに付加された。したがって、活性領域外（エッジ）の各コラム中のプローブは、同一である。同一であるため、得られるストライプを用いて、ハイブリッド形成および走査後にチップのエッジを確認することができる。チップの下半分には、図１３Ａに示すレチクルを用いて合成された３量体プローブが含まれる。
【００６３】
前述のようにして合成されたチップを図１２Ｃに示すが、エッジ領域はストライプにより容易に確認できる。チップは、中央位置に照会位置を持つ２０量体プローブを有する。このチップは、２，５００塩基対配列のＨＩＶを配列決定するためのものである。
【００６４】
これらのシフト・レチクルおよび照会位置レチクルを用い、レチクルのサイズによってのみ制限される標的配列用に、任意の置換位置を有する任意の長さのプローブが合成できる。通常、レチクルのサイズは、基板の列に沿った標的のサイズに所望の長さの合成プローブを加え１を減じたものに等しい。例えば、チップ上に１００列のセルがあり、標的配列が１００単量体と等しいか長い場合には、レチクルは、１２量体プローブに対して１１１セル（または可能な単量体付加領域）幅となる（すなわち、１００＋１２−１）。
【００６５】
本発明では、５種類のレチクルを用いて、標的配列に対し任意の照会位置を有する任意の長さのプローブを配列決定できる。さらに、合成前に、プローブの長さおよび照会位置を決める必要がない。レチクルを生成させた後、基板上に生成される特定のプローブは、単量体付加段階のサイクル数および照会位置レチクルを用いるサイクルを示すことにより合成時に決めることができる。
【００６６】
図１３Ａに示すレチクルを用いて、所望ならば、合成時に決められた長さを有する様々な長さのプローブを生成させることができる。レチクルには、１セットのプローブに光を当てることができる開口が含まれる。チップの上半分だけが脱保護されるように、このレチクルをシフト・レチクルと組み合わせて用いることができる。例えば、このレチクルを用いて、第１層のヌクレオチドをチップの上半分だけに付加することができる。第１層のヌクレオチドを加えた後、チップ全体にヌクレオチドを付加することにより合成を続けることができる。このようにして、図１１Ｂおよび図１２Ｂの４量体および３量体プローブが生成された。
【００６７】
あるいは、図１３Ａのレチクルを用い、合成を停止することができる。ある領域でプローブを合成した後、レチクルによって特定された領域を脱保護し、次の露光がこの領域のプローブを脱保護しないようにキャップ付け試薬を基板に加えることができる。キャップ付け試薬は、ＤＭＴまたは他の既知のキャップ付け試薬でもよい。このレチクルを用い、基板の１つの領域は、基板の他の領域とは異なる長さのプローブを含むことができる。例えば、図１３Ｂに示す基板には、８量体プローブおよび１２量体プローブが含まれる。８量体プローブがまずチップ全体に生成し、次いで図１３Ａのレチクルを用い、続く露光が続く単量体の付加を引き起こさないように、チップの上半分をキャップする。１２量体プローブの領域はキャップされていないので、続く単量体付加によって１２量体プローブが生じる。
【００６８】
さらに、図１３Ａに示すレチクルを用い、ヌクレオチド削除を有するプローブを合成することができる。例えば、ヌクレオチド付加サイクルをスキップするレチクルを用いることによって、削除を有するプローブを合成することができる。
【００６９】
図１４Ａは、複数のレチクルを含むマスクである。マスク５００には、各ヌクレオチド単量体あたり１つの、シフト・レチクル５０２、５０４、５０６、５０８が含まれる。このマスクには、基板の活性領域に優先して照会位置に単量体を付加する照会位置レチクル５１０も含まれる。さらに、このマスクには、合成後にプローブをキャップするため基板の全表面を脱保護するために用いるレチクル５１２が含まれる。複数のレチクルを含むマスクを図１４Ａに示すが、本発明は、各マスクが単一のレチクルを含むようなシステムに、有利に用いることができる。
【００７０】
一実施形態におけるレチクルのレイアウトを図１４Ｂに示す。大部分のレチクルには、基板のＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンの連続するグループのための単量体付加領域を有する列が含まれる。レーンの各グループに対する単量体付加領域は通常、図９Ａおよび図９Ｂに示すものと同一である。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンに対応する各グループの列は、標的の異なるセクションに相補的なプローブを合成するために異なる。例えば、１つのグループは５００〜５９９位のヌクレオチドを確認するためのプローブを合成するためのものであるが、次のグループは、６００〜６９９位のヌクレオチドを確認するためのプローブを合成するためのものである。
【００７１】
図１４Ｂの最上段および最下段のレチクルは、対照オリゴヌクレオチド配列に相補的なプローブを生成させるためのものである（すなわち、対照プローブ・レーン）。対照配列は、走査後にチップの活性領域をより容易に確認および／または調整できるようにするために標的に付加される既知の配列である。
【００７２】
２つのチップ上にプローブを同時に合成するためのレチクルを、図１４Ｃに示す。示すように、各チップに対し同一のＡレチクル、Ｃレチクル、Ｇレチクル、Ｔレチクルおよび照会位置レチクルがある（チップ１およびチップ２と表記する）。２つの同一チップを同時に生成できるように、これらのレチクルは同一ガラス片上に置かれる。したがって、合成サイクルがＡで始まると、２つのＡレチクルが用いられる。次いで、合成サイクルで次のヌクレオチドを付加するため次のヌクレオチド・レチクルがチップの上になるようにガラスを移動する。次の合成サイクルでは、チップに対して水平に移動した位置のチップ上にレチクルを位置させる。したがって、ヌクレオチド・レチクルはチップよりも幅広い。
【００７３】
照会位置レチクルを用い、チップ上のプローブの照会位置でヌクレオチドを合成することができる。照会位置ヌクレオチドを付加するように指定された合成サイクルでは、ガラスはチップに関して垂直に移動する。ヌクレオチド・レチクルは水平に移動し、また照会位置レチクルは垂直に移動するように説明したが、レチクルが任意の方向に移動できることを理解されたい。また、チップ１およびチップ２に対するレチクルは同一である必要はなく、２つのチップに限定されるものではない。したがって、本発明により、複数の異なるチップを同時に合成することができる。
【００７４】
２つのチップ上に様々な長さのプローブを同時に合成するためのマスクを、図１４Ｄに示す。様々な長さのプローブを合成するためにチップの領域を選択し、レチクルを用いる方法はすでに説明した（例えば、図１３Ａおよび図１３Ｂを参照）。この目的を達成するための別法を図１４Ｄ中のマスクで説明する。
【００７５】
マスクには、図１４Ｃで説明したレチクルと同様なレチクルが含まれ、実際、マスクの左最下段のレチクルは、これらのレチクルと同一である。下のチップは、チップのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーン５つのグループを有する。示すように、マスクの左最下段中のレチクルは、５つのグループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンのそれぞれに対応する単量体付加領域の列を有する。各グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンは同一であるが、すべてのレチクルが同数のグループを有するとは限らない。１、２，３、および４グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンを持つ他のレチクルがある。
【００７６】
様々な長さのプローブを有するチップを合成するため、チップ上の所望の領域で単量体を付加するレチクルを選択する。例えば、プローブ中央に照会位置を有する２つのチップ上で同時に３、５、７、９、および１１量体プローブを合成したいときには、１つの合成サイクルに対し単一グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンを持つレチクルを最初に用いることができる。その結果、単量体は、チップの先頭部分に結合する。
【００７７】
次に、１つの合成サイクルに対し２つのグループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンを持つレチクルを用いることができる。２層の単量体を持つ先頭領域（すなわち、２量体プローブ）および１層の単量体を持つ隣接領域が合成される。チップ上に５、４、３、２、および１層の単量体を有する領域が得られるまで、３、４および５グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンを持つレチクルを用いてこのプロセスを繰り返すことができる（チップの最上段から最下段まで）。
【００７８】
次いで、マスクの下半分で照会位置レチクルを用い、照会位置ヌクレオチドをすべてのチップ上のプローブに付加することができる。照会位置レチクルを用いた後、ヌクレオチドを付加する前のプロセスを逆転させることができる。合成後、オープン・チップ・レチクルを用い、プローブをキャップすることによってプローブの中央に照会位置を持つ３、５、７、９、および１１量体プローブを有する２つのチップを生成させることができる。これらのチップのうち１つのレイアウトを図１４Ｅに示す。
【００７９】
遺伝子型決定または遺伝子発現の応用分野で通常用いられる別の実施形態におけるチップのレイアウトを、図１５Ａに示す。図１５Ａに示されるように、チップ５５０は、完全相補レーン５５２，突然変異レーン５５４および対照レーン５５６を有する。完全相補レーンは、標的配列に対し完全に相補的なプローブを有する。突然変異レーンは、突然変異位置を除いて標的配列に対して相補的なプローブを有する。突然変異レーンを用いて、データの妥当性をチェックする。したがって、完全相補レーンのハイブリッド形成強度を突然変異レーンのハイブリッド形成強度と比較する。
【００８０】
特定の単量体を一対の列中のチップ上に結合するためのシフト・レチクルを、図１５Ｂに示す。このレチクルを用いて、完全相補および突然変異列の双方にヌクレオチドを付加することができる。通常、各合成サイクルにおいて使用される、各ヌクレオチド１つずつの４つのレチクルがある（図７を参照）。しかし、１つのレチクルのみを示す。
【００８１】
単一のレーン中のチップ上に特定の単量体を結合させるためのシフト・レチクルを、図１５Ｃに示す。図１５Ｃに示すシフト・レチクルを用い、完全相補のプローブとは異なるプローブを突然変異レーンに生成させることができる。前と同様に、通常は各ヌクレオチドを付加するために１つずつ、４つのレチクルがあるが、話を簡単にするために１つを示す。１回の合成サイクルで、これらのシフト・レチクルを用い、図１５Ｂに示すレチクルで行ったように、完全相補レーン中の標的配列に完全に相補的なヌクレオチドを付加することができる。
【００８２】
本発明により、図１５Ｃに示したものと同一のシフト・レチクルを用い、突然変異レーン中のプローブに突然変異ヌクレオチドを付加することができる。単量体付加領域が突然変異レーンの上にくるようにシフト・レチクルを垂直に移動する。突然変異ヌクレオチドを突然変異レーン中のプローブに付加するため、合成サイクル中のヌクレオチド付加段階の順序を変更することができる。例えば、ある合成サイクルでヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、次いでＴを付加する時には、Ｔ、Ｇ、Ｃ、次いでＡという逆の順序で付加することができる。したがって、突然変異レーンの各プローブは、付加された突然変異ヌクレオチドを有することになる。
【００８３】
あるいは、ヌクレオチド付加段階の順序はもとのままにして、用いるシフト・レチクルの順序を変えることができる。突然変異レーン中のプローブに突然変異ヌクレオチドを付加するという同一の効果があることは明らかであろう。
【００８４】
対照プローブを含む対照レーンを生成させるためのシフト・レチクルを、図１５Ｄに示す。この対照プローブは、走査結果を解析するためチップとハイブリド化する既知のオリゴヌクレオチドと完全に相補的であってよい。この場合も、１つのシフト・レチクルを示すが、通常各単量体について１つずつある。
【００８５】
前記実施形態は、標的配列に相補的な様々な長さのプローブを生成させるために用いることができるシフト・レチクルを提供する。照会位置ヌクレオチドを有するプローブまたは前記と同一の基板上に様々な長さのプローブを生成させるために、これらのシフト・レチクルを１つまたは複数のマスクとともに用いることができる。レチクル数を大幅に減らすことができることから（例えば、５レチクルまたはそれ以下）、基板上にプローブを生成させるためのコストが低下する。合成時にプローブの特徴を特定できるので、柔軟性が増す。
【００８６】
単一シフト・レチクル
別の実施形態において、本発明は、標的配列に相補的なプローブを合成するために用いることができる単一シフト・レチクルを提供する。本発明の本実施形態に従って生成させるための方法の高水準流れ図を、図１６に示す。段階６０２で、標的配列の完全相補ヌクレオチドの番号付けを行う。図３Ａに示すように標的配列がＴＧＡＣＡＴのとき、完全相補はＡＣＴＧＴＡとなる。したがって、完全相補中のヌクレオチドは、始めのＡが１、Ｃが２、始めのＴが３のように、１〜６の番号が振られる。
【００８７】
次いで、単一シフト・レチクルを、段階６０４〜６１０に従って生成させる。これらの段階は、任意の特定の順序で行う必要はなく、実際、平行して行えることに注意されたい。さらに、各式は、示したヌクレオチドに特有ではない。しかし、各段階が各ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴについて、順番に行われるように説明する。
【００８８】
段階６０４では、式ｎ×（ｉ―１）＋１に従って、完全相補の各Ａに対する単一レチクル中に開口が生成され、ここで、ｎは、異なるタイプの単量体（例えば、ヌクレオチド）数に等しく、ｉは、完全相補（または所望のプローブ）中の単量体の位置に等しい。ヌクレオチドＡは、完全相補中の基本位置１および６にあることから、ｎは、４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴに対して４に等しく、ｉは、始めのＡに対して１、および第２のＡに対して６となり、開口は位置１および２１の単一レチクル中に生成される。得られる単一レチクルを、図１７Ａに示す。
【００８９】
段階６０６では、式ｎ×（ｉ−１）＋２に従って、完全相補の各Ｃに対する単一レチクル中に開口が生成され、ここで、ｎは、異なるタイプの単量体数に等しく、ｉは、完全相補中の単量体の位置に等しい。ヌクレオチドＣは、完全相補中の基本位置２にあることから、ｎは、４に等しく、ｉは、２となり、開口は位置６の単一レチクル中に生成される。ＡおよびＣ双方に開口を有する単一レチクルを、図１７Ｂに示す。
【００９０】
段階６０８では、式ｎ×（ｉ−１）＋３に従って、完全相補の各Ｇに対する単一レチクル中に開口が生成される。ヌクレオチドＧは、完全相補中の基本位置４にあることから、ｎは、４に等しく、ｉは、４となり、開口は位置１５の単一レチクル中に生成される。Ａ、ＣおよびＧに開口を有する単一レチクルを、第１７Ｃ図に示す。
【００９１】
段階６１０では、式ｎ×（ｉ−１）＋４に従って、完全相補の各Ｔに対する単一レチクル中に開口が生成される。ヌクレオチドＴは、完全相補中の基本位置３および５にあることから、ｎは、４に等しく、ｉは、初めのＴに対して３、第２のＴに対して５となり、開口は位置１２および２０の単一レチクル中に生成される。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに開口を有する単一レチクルを、第１７Ｄ図に示す。
【００９２】
段階６１２では、単一レチクルを含むマスクを生成させるためのマスク・ファイルが出力される。通常、このマスク・ファイルはコンピュータ作動システムによって用いられ、マスクを生成させる。
【００９３】
図３Ａのプローブ・セットを生成させる単一シフト・レチクルおよびこのレチクルを用いる単量体の付加を、図１８に示す。レチクル６５２は、図１６を参照して説明したプロセスに従って製造される。示すように、このレチクルには、６サイクルのＡ、Ｃ、ＧおよびＴ（前記レチクル１〜６で表示する）が含まれる。各サイクルには、示すような様々な位置の単一開口が含まれる。
【００９４】
まず、マスクを用い、マスクによって特定される領域でヌクレオチドＡを基板に付加する。各連続合成段階ごとに、１つの位置または各段階のセルの分だけレチクルを移動すると、各ヌクレオチド合成サイクルに対し４シフトが生ずる。表の左に順に列挙するヌクレオチド付加段階とともに、レチクルの下、表６５４にこのプロセスを示す。表の点線は、基板の活性領域の右境界を示す。言い換えると、点線の右へのヌクレオチドは、基板とは結合しない。
【００９５】
通常、この表を合成中に用いることはないが、本実施形態で基板上のプローブをいかにして生成させるかを理解してもらう目的で示す。表中の各コラムは、基板上のプローブを示す。しかし、モノマーが付加されるに従って表が下方へ伸びるため、各コラム中の先頭から１番目のヌクレオチドが基板により近い。
【００９６】
基板の下の４本の矢印によって示される所望の３量体プローブを有する基板６５６が得られる。各サイクルは、各所望のプローブに１つのヌクレオチドを付加するため、所望のプローブは、これら特定領域におけるヌクレオチドの規則的付加によって生成される。したがって、照会位置ヌクレオチドを付加するために、図１１Ａおよび図１２Ａに示す位置と同様な照会位置レチクルを用いることができる。照会位置ヌクレオチドを付加した後、次いで、単一シフト・レチクルの合成サイクルをスキップさせてレチクルを４つの位置またはセルの分移動させる（例えば、図１８の左方に）。
【００９７】
示すように、所望のプローブの周囲に多くの「ジャンク」プローブがある。通常、標的の配列決定の間は、これらのプローブを無視する。話を簡単にするために、単一レチクルを直線レチクルとして示した。しかし、図１９に示すように、２セットの４列のプローブを生成させるためにレチクルを用いることができる。本発明の原理を拡張することにより、さらに多くの列のプローブを生成させることができる。
【００９８】
単一シフト・レチクルを長い直線レチクルとして示したが、この直線レチクルは、図１０に示すように矩形シフト・レチクルに変換することができる。単一シフト・レチクルを各単量体付加段階とともに移動させるため、得られる矩形レチクル中の各列末端の余分なセル数は本質的に多くなる。
【００９９】
本発明の本実施形態により、標的配列に完全に相補的なプローブを単一シフト・レチクルにより基板上に合成することが可能となる。追加のレチクルを用い、照会位置ヌクレオチドを有するプローブまたは前述のような様々な長さのプローブを合成することができる。必要なレチクル数が減少することにより、本実施形態は、プローブ・アレイ合成のためのマスクを生成させるコストを大幅に低減する。さらに、合成時に所望のプローブの特徴を特定できることから、柔軟性も増す。
【０１００】
他のシフト・レチクルの実施形態
別の実施形態において、本発明は、突然変異、削除などを検出するためのプローブを合成するために用いることができるシフト・レチクルを提供する。これらのシフト・レチクルは標的配列構造特異的ではないので、標的配列は合成時に指定することができる。言い換えれば、１セットの「一般」シフト・レチクルを用いて、任意の標的配列を解析するためのプローブを合成することができる。さらに、これらのプローブは極めて少ないレチクルで生成させることができる。
【０１０１】
突然変異および削除を検出するための複数の単量体を含むプローブを合成するためのシフト・レチクルを、図２０Ａ〜図２０Ｄに示す。シフト・レチクルがどのように働くかを説明するために、例を示すのが有益であろう。１５量体標的の中間（または８番目）位置における突然変異または削除を検出するようなプローブを合成したいと仮定しよう。通常、標的配列はもっと長いが、この例は本発明を例示するために用いることを理解されたい。
【０１０２】
標的配列がＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＴＡＣＧのとき、以下のプローブを合成するのが望ましい。ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＧＡＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＧＴＣＧＡＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＣＴＣＧＡＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＡＴＣＧＡＴＧＣ、ＡＴＧＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧＣ。第１のプローブが標的配列の完全相補であることを示す照会位置ヌクレオチドに下線を引いた。続く３プローブは照会位置に突然変異を有し、最後のプローブは照会位置に削除を有する。
【０１０３】
４つのシフト・レチクル（またはそれ以下）を用い、これらのプローブを合成することができる。図２０Ａのシフト・レチクルは、非照会位置単量体を基板に結合させるために用いる。標的配列の相補に対応するヌクレオチド付加段階をサイクルさせる。シフト・レチクルの前記ヌクレオチドによって指示されるように、始めのＡを付加し、次いで、Ｔ、次いでＧなどを付加する。各単量体付加段階の後、シフト・レチクルを左に１位置移動する。シフト・レチクルは５列上にあるように示されるため、第８単量体付加段階までに５つの同一プローブが生成される。
【０１０４】
完全相補中のＴに対応する第８単量体付加段階では、ただ１つの単量体付加領域がプローブの上に来る。したがって、Ｔは、図２０Ａの先頭プローブであるプローブの１つに付加されるだけである。
【０１０５】
単一単量体付加領域を有するレチクルを、図２０Ｂに示す。このレチクルを用い、先頭から２番目のプローブの８番目の位置にＧを付加することができる。同様に、図２０Ｃおよび図２０Ｄのレチクルを用い、レチクルの一単量体付加領域に対応するプローブの８番目の位置にＣおよびＡを付加することができる。この位置の削除が検出できるように、最下段のプローブは８番目の位置に付加された単量体を有しない。図２０Ｂ〜図２０Ｄは、３種類のシフト・レチクルを示しているが、垂直に移動する単一シフト・レチクルを用いることができる。
【０１０６】
照会位置ヌクレオチドを付加した後、図２０Ａのシフト・レチクルを用い、残りのヌクレオチドをプローブに付加する。これらのプローブを含むチップを図２０Ｅに示す。チップ８００には、完全相補的プローブ、照会位置プローブ、および削除を検出するためのプローブが含まれる。
【０１０７】
前述のシフト・レチクルを改変して様々な長さのプローブを生成させることができる。様々な長さの関連プローブを基板上に合成するためのシフト・レチクルを図２１Ａに示す。このシフト・レチクルは、９、１１、１３  １５、１７、１９、および２１量体プローブを生成させるために幅を変化させた単量体付加領域を有する。図２１Ａ中の矢印で指示された方向に沿ってシフト・レチクルを移動させながら、単量体を基板に付加する。
【０１０８】
様々な幅の単量体付加領域をデザインして、標的配列の同一位置の周りに中心を置く様々な長さのプローブを得ることができる。例えば、図２１Ａに示すように、各単量体付加段階を１〜２１に標識する。段階１では、ただ１つの領域が付加された単量体を有する。続くそれぞれの段階は、この領域およびその上の領域に単量体を付加する。このように、シフト・レチクルの階段段階デザインにより、種々の長さのプローブを基板上で合成することが可能になる。シフト・レチクルの各末端で階段段階デザインを用いることにより、単一階段段階で遂行されるプローブの代わりに、このプローブは、２つの単量体が異なる。
【０１０９】
基板上に合成することができるプローブのレイアウトの一例を、図２１Ｂに示す。チップ８５０には、９、１１，１３、１５、１７、１９、および２１量体を含む領域が含まれる。それぞれの長さのプローブに対して一列あることを説明しただけであるが、それぞれの長さのプローブに対して複数の列があり得る。例えば、照会位置のヌクレオチドに対して１つ、それぞれの長さのプローブに対して４列ある。照会位置において、図１１Ａおよび図１２Ａを参照しながら説明したような照会位置レチクルを用い、シフト・レチクルを用いる代わりに照会位置ヌクレオチドを付加することができる。本発明の利点は、プローブの配列、プローブの長さ、および照会位置が合成時に選択できることである。
【０１１０】
本発明の本実施形態は、様々な長さを有し、標的配列中のある位置の周りに中心を置くプローブの合成を可能にする。シフト・レチクルを照会位置レチクルとともに用い、突然変異を検出する様々な長さのプローブを生成させることができる。
【０１１１】
本発明の本実施形態は、シフト・レチクルが標的配列構造特異的ではないという顕著な利点を有する。したがって、標的の配列を合成時に特定し、「一般的」セットのシフト・レチクルを用い、標的配列を解析するためのプローブを合成することができる。本発明の他の実施形態に関して言えば、必要なレチクル数が顕著に減少し、チップを生成させるためのコストが低下する。また、所望のプローブの特性（例えば、照会位置）を合成時に特定できるため、柔軟度も増す。
【０１１２】
スペックル・マスク
本発明のいくつかの実施形態ではスペックル・マスクを利用する。「スペックル・マスク」は、結論から言うと、各位置に開口を有し、それによって実際にフル・オープン・マスクを生成できると言われている１セットのレチクルである。スペックル・マスクの簡単な例を図２２に示す。示すように、３つのレチクルは、異なる位置に単一単量体付加開口を有している。開口を加え合わせると、フル・オープン・マスクが生成する。これがスペックル・マスクの性質である。
【０１１３】
スペックル・マスクの別の例は、図７に示すレチクル・セット（またはマスク）である。これらのマスクには、レチクル中の各単量体付加領域あたり１つおよびただ１つの開口が同時に含まれる。フル・オープン・マスクを生成させるまでどのようにシフト・レチクル開口が追加するかを、図２３に示す。
【０１１４】
スペックル・マスクの基本的性質は、合成サイクルにすべてのレチクルを用いたときに、正確に１つの単量体が基板の活性領域中の各プローブに付加されることである。この性質を用いると、任意の長さのプローブおよび照会位置を合成時に構築することが可能となる。
【０１１５】
スペックル・マスクの別の応用は、単一スペックル・セットから多くの異なるチップを生成させることである。各セルに１〜４の無作為番号を割り付ける（または、単量体の番号がたまたま割り付けられる）ことによりグリッドを得て、スペックル・セットを構築する。この番号は、どのレチクルがその位置に開口を有するかを示す。合成サイクルの中でＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴのいくつかの過突然変異（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）によって４つのすべてのレチクルをサイクルさせると、１セットの「無作為」ヌクレオチドが基板上の各プローブに付加する。いくつかの任意の（ｘおよびｙ）オフセットを各段階に用いたときには、各プローブに付加されるヌクレオチド間の関連性はほとんど期待されない。それぞれの異なるセットのオフセットの場合、極端に異なるプローブのセットを生成させることができる。したがって、規則的な長さのプローブを有する「無作為」チップ（チップのエッジ上のプローブは無視する）を生成させることができる。
【０１１６】
スペックル・セットのもう１つの応用は、規則的長さのプローブの選択されたセットを生成させることである。そのプローブ・セットを含む配列を取り出し、その配列に対するシフト・マスクを生成させることによって、特定のプローブ・セットを生成するシフト・マスクを生成させることができる。しかし、通常、いくつかのプローブ・セットを含む配列は、プローブの全長よりはるかに長い。シフト・マスクは、配列の全長とほぼ等しい多くのセルを含むため、いくつかのプローブ・セットを生成させるには非能率な方法かもしれない。
【０１１７】
シフト・マスクは１次元オフセットを用いてプローブを生成させる。これを見る方法は、各プローブをストリップｌ×ｎ（ここで、ｎは、プローブの長さ）としてマスク上にコードしなければならない。このストリップをマスク・セット上に集めて、プローブ・セットを生成させる。どのストリップ対も矩形を重ね合わせることのできる方法の数に対応してＯ（ｎ）通りに相互作用することができるだけである。
【０１１８】
スペックル・セット上にプローブを詰めるよりよい方法は、二次元オフセットを用いるものである。二次元オフセットにより、「スペックル」中のマスク上にプローブをコードする−−いくつかのｎセル配列（ここで、ｎは、プローブの長さ）。通常、２つのスペックルが相互作用する方式Ｏ（ｎ2 ）通りがある。このことは、二次元オフセットを用いてスペックル・セット中に効率よくプローブを詰めることができることを示唆している。しかし、この問題は、オフセットを選択する自由度、各合成サイクルで用いる塩基過突然変異、およびプローブ位置が与えられても、計算上は極めて困難に見える。オフセットの選択されたセットおよび塩基過突然変異が与えられれば、いくつかの形の模擬的アニーリングを用いて位置を選択できるかもしれない。
【０１１９】
スペックル・マスクのパッキングを図２４に示す。共通配列ＣＴＧを利用することにより、２つの配列ＡＣＴＧＴおよびＡＴＣＴＧを詰めることができる。スペックル・マスクのパッキングは、示すようなｘおよびｙオフセットの双方を含む。
【０１２０】
スペックル・セットのいくつかの可能な一般化が存在する。用いる塩基セットより多くのマスクを用いて自由度数を増加させることができる。いくつかのオープン・マスクになるマスク・セットを生成させることもできる（マスクのフルセットを合わせたとき、各セルは正確にｋ回開く）。さらに、オープン・マスクになる多くの異なるサブセットを有するマスク・セットを生成させることができる。
【０１２１】
ポスト・チップ合成
前述の実施形態においては、矩形グリッドとしてレチクルをデザインした。矩形グリッドは、マトリックス表示を切り換えるのに適しているために用いられる。スイッチ・マトリックスは、組合せマスクの優れた生成を提供するが、通常、すべてのセルが同一サイズである矩形セルのアレイを含むチップを要求する。ブランク・レーン（プローブを含まないレーン）がプローブを含むレーンと同一のサイズであるため、これらのチップには無駄な空間を含む。
【０１２２】
ポスト・チップ合成により、関連する各プローブ・セット（例えば、照会位置で単一塩基が異なるプローブ）はテキスト・ドキュメント中のキャラクタとして扱われる。関連プローブのセットを「解析領域」と呼ぶ。キャラクタは現代のプリンタ中の矩形グリッドに限定されないため、解析領域も制限されず、代わりに増減、回転、伸縮、または操作できる。したがって、解析領域を配列リストとして入力することができる。
【０１２３】
ポスト・チップ合成の一実施形態におけるチップのレイアウトを図２５に示す。解析領域９００には、Ｇ、Ｔ、Ａ、およびＣと表示された４つのセルが含まれ、各セル中のプローブの照会位置のヌクレオチドを示している。示すように、解析領域は、円型パターンで配置する。解析領域のただ１つのリングを示すが、さらに多くのリングを中心の周囲に生成させることができる。この解析領域パターンを拡張し、コンピュータ制御機器で読みとるためのセクタおよびトラックを含むハード・ドライブ上に格納されるデータと類似するようにできる。
【０１２４】
ポスト・チップ合成に用いる別のチップのレイアウトを図２６に示す。この実施形態で、解析領域は、蓄音機レコードと同様、スパイラル・パターンで合成される。さらに、チップ上にプローブを合成するマスクは、矩形セルにヌクレオチドを付加しなかった。代わりに、プローブは、照会ヌクレオチド文字、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴの輪郭でチップ上に合成された。予想通り、示された試料配列と最もよくハイブリッド形成するプローブは、最高の強度を生成し、これらキャラクタのうちの１つに最も明るい輪郭を生成する。言い換えれば、走査イメージの右に塩基を読み取ることができる。
【０１２５】
あるいは、コンピュータ・システムが光学的キャラクタ認識技術を利用し、走査イメージから照会塩基を示すキャラクタを読み取ることができる。解析領域のスパイラル配置により、このプロセスをさらに追加することができる。
【０１２６】
ポスト・チップ合成により、解析領域を様々な方位、スパイラル、または解析領域間の空間を様々に変えて配置することができる。チップをレイアウトする際の柔軟性も生まれ、多くの応用で非常に有益であると実証できる。
【０１２７】
エッジ最小化
基板の活性領域を最大限利用するため、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーン群をブランク・レーンなしに詰めることは有益であることがある。複数グループのＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーン１００２を含む基板活性領域１０００を図２７Ａに示す。示すように、レーン１００２の各グループを隔てるブランク・レーンはない。活性領域の物的財産の最も優れた利用に見えるが、あるグループのＴレーンにおけるプローブの合成は、別のグループの隣接するＡレーンにおけるプローブの合成に悪影響を与えることがある。
【０１２８】
あるグループの合成が他のグループにどのように影響を与えるかを示すため、図２７Ａからの８セル分のサブ領域１００４を図２７Ｂに示す。示すように、４つのセル１０５０、１０５２、１０５４、および１０５６はＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンの第１グループからのもので、４つのセル１０５８、１０６０、１０６２、および１０６４は隣接するグループからのものである。３番目の位置（下線で示す）に照会位置を有する５量体プローブが各セルの中にある。通常、実際のプローブは５量体より長いが、読者に利するためにより短いプローブを示す。
【０１２９】
基板上のセルを隙間なく詰めると、他のセル群に隣接するセル（例えば、セル１０５６および１０５８）から得られるデータは正確ではない。その理由は、セル１０５６からのプローブＡＧＴＡＴおよびセル１０５８からのプローブＡＧＡＡＡに共通するのは１つの塩基のみであり、いずれのプローブも４番目の塩基がＡであるためである。したがって、合成中、多くのマスクがこれらのセルのうちただ１つのための開口となり、これが２つのセル間のマスク上に「エッジ」を生成する。したがって、セル１０５８および１０６０中にプローブを生成させるために用いるレチクル上には４つのエッジがあるということが言える。
【０１３０】
まったく対照的に、セル１０５４からのプローブＡＧＧＡＴおよびセル１０５６からのプローブＡＧＴＡＴは４つの共通塩基を有する。これら２つのプローブは同一のプローブ・グループ由来であるため、照会位置塩基のみが異なる。したがって、セル１０５６および１０５８中にプローブを生成させるために用いるレチクル上にはただ１つのエッジがあるということが言える。エッジ数の意義を以下に説明する。
【０１３１】
光は、レチクルのエッジの周りにいくらか拡散する傾向があるため、２つのセル間にエッジが多ければ多いほど、エッジ近くにセルが不正確なプローブを有することが多くなる。前述のように、セル１０５６と１０５８の間には４つのエッジがあり、一方セル１０５４と１０５６の間には１つのエッジのみがある。したがって、セル１０５６と１０５８の間の境界近くのプローブからのデータは、正確性に劣ることになる。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンの群の間にブランク・レーンを合成することにより、この「エッジ効果」は減少するが、ブランク・レーン生成のためのエッジがあることから、この減少は約半分に過ぎない。
【０１３２】
本発明は、照会位置塩基を合成する領域よりも広い領域で非照会位置塩基を合成するシフト・レチクルを用いることによりエッジ数を減少させる。例えば、図９Ａおよび図９Ｂに示すシフト・レチクルは、４セル幅の単量体付加領域を有する。非照会位置塩基が５セル幅のチップ上の領域で合成されるように、単量体付加領域を５セル幅まで広げることができる。次いで、図１１Ａおよび図１２Ａに示すような照会シフト・レチクルを用い、非照会位置塩基によって占有される領域より狭い（例えば、４セル幅）領域中で照会位置レチクルを合成することができる。
【０１３３】
本発明が、どのようにエッジの低減をもたらすかをさらに明確に示すため、エッジを減らして合成できる図２７Ｂのサブ領域を図２７Ｃに示す。サブ領域１００４’には、同一の参照番号を有する図２７Ｂのセルと同一の８セル、１０５０、１０５２、１０５４、１０５６、１０５８、１０６０、１０６２および１０６４が含まれる。しかし、サブ領域１００４’では、５セル幅で非照会位置塩基を合成する。したがって、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴレーンの複数グループ１００２の周囲にはハーフ・セル１０７０および１０７２がある。
【０１３４】
ハーフ・セル１０７０には、単一追加塩基すなわち照会塩基を除いたセル１０５０および１０５６中のプローブと同一の塩基が含まれる。したがって、ハーフ・セル１０７０および境界となるフル・セルの間には１つのエッジの違いしかない。前述のように、例えば、セル１０５４および１０５６の間には１つのエッジの違いしかない。したがって、１０５０、１０５２、１０５４、および１０５６の各セルは、それらの境界に同数のエッジを有することから、より正確なデータが得られるはずである。
【０１３５】
好ましい実施形態において、非照会位置塩基は５セル幅の領域中で合成するが、その正確なサイズは必要ではない。照会位置塩基を合成する領域よりも広い領域で非照会位置塩基を合成する場合に、エッジを減少させることができる。レーンのグループ間に未使用の空間を有することは、チップ上の活性領域中の物的財産を浪費すると思われるかもしれない。しかし、データはより正確になるため、セルの濃度が実際に増加するように見かけのサイズをさらに減少させることができる。
【０１３６】
プローブ最適化
いくつかの例において、標的中の特定の塩基位置を照会する種々のプローブを合成することは有益かもしれない。例えば、遺伝子中の特定の点突然変異にのみ興味を持つこともある。特定の塩基を十分に照会するため、位置を照会する多数の異なるプローブ（例えば、長さおよび／またはプローブ中の照会位置）を手にすることは有益であろう。
【０１３７】
本発明のある実施形態により、特定の塩基位置を照会するための異なるプローブを合成することが可能になる。概念的には、本発明は、非照会塩基レチクルを照会位置レチクルと組み合わせる。異なる照会位置を有する等しい長さのプローブを生成するシフト・レチクルを図２８に示す。この場合、「照会位置」は、標的中の位置を照会するプローブ中の位置を意味する。「照会位置」は、照会中の標的中の位置を指すこともある。
【０１３８】
標的がＡＧＣＧＡＴＡＮＣＴＧＣＧＴＡであって、下線のＮが照会位置にある未知の塩基を表すと仮定する。図２８のシフト・レチクルは図７に関して説明したようにして生成させることができる。シフト・レチクルの先頭に示す塩基は、標的中の対応する塩基を示しているに過ぎず、星印を付けた１１０２が、照会位置を示す。レチクル中のこの位置のセルは、図１１Ａまたは図１２Ａの照会位置レチクルと同様に生成する。示すように、照会位置では、各レチクルに対して異なる単量体付加領域が生成する。例えば、レチクル１（Ａの場合）は、Ａレーン中に単量体付加領域を有し、レチクル２（Ｃの場合）は、Ｃレーン中に単量体付加領域を有し、以下同様である。
【０１３９】
図２８のシフト・レチクルを用いるときには照会位置レチクルは必要ない。シフト・レチクルによるＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴの付加による８サイクルの後、プローブ中にすべての可能な照会位置を有する８量体プローブが合成される。
【０１４０】
８量体プローブの位置の例を図２９に示す。チップ１１５０は、その活性領域に異なる８セットの４プローブを有する。下の番号（１〜８）は、図２８のシフト・レチクルを各単量体付加段階後に左へ移動した場合のプローブ中の照会位置の場所を示す。１は、照会位置がプローブ中のチップにより近いことを示し、一方、８は、照会位置がプローブ中のチップからより遠いことを示している。
【０１４１】
図２８のシフト・マスクを用いることにより、可能なあらゆる照会位置を有する特定の長さのプローブを合成することができる。８量体を例として説明したが、本発明は、いずれの特定のプローブ長に限定されるものではない。さらに、以下の通り、同時にチップ上に合成される種々の長さのプローブを手にすることによって、プローブをさらに最適化することができる。
【０１４２】
種々の長さおよび照会位置を有するプローブを生成させるためのシフト・レチクル１２００を、図３０に示す。上半分のシフト・レチクル１２０２は図２８のレチクル１と同一である。したがって、これを用い、異なる照会位置を有する８量体を生成させることができる。下半分のシフト・レチクル１２０４は、２つのブランク位置１２０６を有する以外は上半分と同様である。これらのブランク位置は、いずれのシフト・レチクル中にも単量体付加領域を有しない。ブランクである２つの塩基位置があるため、シフト・レチクルの下半分は、上半分と同程度に標的をカバーしない。話を簡単にするため、１つのシフト・レチクルのみを示すが、核酸への応用の場合に、他の３塩基に対しこの他に３つのシフト・レチクルがあることは容易に理解されるであろう。
【０１４３】
図３０のシフト・レチクルによって生成させることのできるプローブを、図３１に示す。チップ１２５０は、図３０のシフト・レチクルの異なる半分に対応する２つのプローブ領域を有する。第１の領域１２５２は、４つのプローブからなる８つの異なるセットを有し、ここで、下の番号（１〜８）は、プローブ中の照会位置の場所を示す。前記と同様、１は、照会位置がプローブ中のチップにより近いことを示し、一方、８は、照会位置がプローブ中のチップからより遠いことを示している。
【０１４４】
第２の領域１２５４は、４つのプローブからなる８つの異なるセットを有するが、下の番号（１〜７）で示すように、プローブ中の第５の塩基に照会位置を有する２セットのプローブがある。シフト・レチクル中のブランク位置のため、重複プローブ・セットが生成した。さらに、領域１２５４中のプローブは、７量体であり、プローブ中のそれぞれ可能な位置に照会位置を有するプローブを含む。したがって、異なる長さおよび異なる照会位置のプローブを、本発明のシフト・レチクルの実施形態で同時にチップ上に合成することができる。
【０１４５】
重複プローブ・セットの生成を用い、合成中の問題の分離および／または得られるデータの正確性を増すことができる。例えば、第５の塩基に照会位置を有する領域１２５４中の２セットのプローブは、配列に関しては同一であるが、塩基は、異なる単量体付加段階の間に合成された。したがって、Ａを追加する第４の単量体付加段階に欠点があれば、１セットのプローブに影響を及ぼすが、他には影響を及ぼさない。したがって、重複プローブ・セットからのデータの正確性を解析することにより、合成の問題点を確認することが可能であり、重複プローブ・セットがあることにより、合成の問題点は別のプローブ・セットを用いることによって説明が可能である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、重複プローブ・セットを生成させるために、ブランク・プローブはシフト・レチクル中の様々な位置に置かれる。前述のように、重複プローブ・セットを用い、合成中の問題点を分離し、おそらく誤差を説明することさえもできる。
【０１４７】
シフト・レチクルをより長くして、標的中の複数の塩基位置を照会するプローブを合成することもできる。標的中の９番目毎の塩基位置を照会するプローブを生成させるためのシフト・レチクルを図３２に示す。シフト・レチクルの第１の部分は、図２８に示したもの（レチクル１）と同一である。しかし、このシフト・レチクルはより長く、これを用いて、星印を付けた１２７５で示す塩基位置を照会することができる。図３２のプローブと同様のプローブを用い、例えば、可能な照会位置すべてを有するプローブによって標的中の９番目毎の位置を照会する８量体プローブを生成させることもできる。照会中の標的中の照会位置は、シフト・レチクルのデザインで固定するが、他のシフト・レチクルを生成させて、標的中の他の位置を照会することができる。
【０１４８】
偶数の照会位置用のシフト・レチクル１セットおよび奇数の照会位置用のシフト・レチクル１セットを用いることによって、プローブ数を低減させることもできる。双方のプローブ・セットを用い、次いで、移動させる。この方法で、他の可能な位置すべてに照会位置を有するプローブを合成できる。チップ上に合成されるプローブがより少ないことから、より多くの標的中の塩基位置をチップ上で照会することができる。２セットのシフト・レチクルで説明したが（１つは偶数位置のため、１つは奇数位置のため）、より多くのシフト・レチクルのセットを用いることができる。例えば、（塩基位置ｍｏｄ３＝０）、（塩基位置ｍｏｄ３＝１）、（塩基位置ｍｏｄ３＝２）である標的中の各塩基位置に対するシフト・レチクルの異なるセットを用いることができる。
【０１４９】
前記の説明は、例示的なものであって限定的なものではない。本開示を概観すれば、本発明の多くの変形形態が当業者には明らかになるであろう。例示のためのみに、主にオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡの合成に関して本発明を説明したが、本発明は、他の多くの分子の合成にも応用できるはずである。さらに、主に少数の同一アレイの製作に関して本発明を説明したが、本発明は、多数の同一アレイを合成する状況にも応用できる。したがって、本発明の範囲は、前記の説明に関して決定されるべきものではなく、添付の請求範囲ならびに均等物の全範囲に関して決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】本発明のソフトウェア実施形態を実施するのに使用されるコンピュータ・システムの一例を示す図である。
【図２】本発明のソフトウェア実施形態を実施するのに使用される一般的なコンピュータ・システムのシステム・ブロック図を示す図である。
【図３Ａ】標的配列の検出に利用することができるプローブ・セットを示す図である。
【図３Ｂ】一実施形態におけるこのプローブ・セットの基板上でのレイアウトを示す図である。
【図４】図３Ａのプローブ・セットを生成する従来技術のレチクルを示す図である。
【図５】図３Ａのプローブ・セットを生成するための従来技術の単量体の付加を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に基づくレチクル生成プロセスの高水準流れ図である。
【図７】図３Ａのプローブ・セットを生成するシフト・レチクルを示す図である。
【図８Ａ】これらのシフト・レチクルを使用して先のプローブ・セットを生成する単量体の付加を示す図である。
【図８Ｂ】これらのシフト・レチクルを使用して先のプローブ・セットを生成する単量体の付加を示す図である。
【図８Ｃ】これらのシフト・レチクルを使用して先のプローブ・セットを生成する単量体の付加を示す図である。
【図９Ａ】複数のプローブ・セットを生成するためのレチクルを示す図である。
【図９Ｂ】複数のプローブ・セットを生成するためのレチクルを示す図である。
【図１０】線状レチクルから方形レチクルへの変形を示す図である。
【図１１Ａ】照会位置に単量体を付加するためのレチクルを示す図である。
【図１１Ｂ】照会位置のところが異なるチップ上のプローブを示す図である。
【図１１Ｃ】図１１Ａのレチクルと同様のレチクルを用いて生成したチップの像を示す図である。
【図１２Ａ】照会位置に単量体を付加するための別のレチクルを示す図である。
【図１２Ｂ】照会位置のところが異なるチップ上のプローブを示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ａのレチクルと同様のレチクルを用いて生成したチップの像を示す図である。
【図１３Ａ】異なる長さの複数のプローブ・セットを生成するためのレチクルを示す図である。
【図１３Ｂ】複数の長さのプローブ・セットを有するチップを示す図である。
【図１４Ａ】複数のレチクルを含むマスクを示す図である。
【図１４Ｂ】一実施形態におけるレチクルのレイアウトを示す図である。
【図１４Ｃ】２枚のチップ上に同時にプローブを合成するためのレチクルを示す図である。
【図１４Ｄ】２枚のチップ上に異なる長さのプローブを同時に合成するためのマスクを示す図である。
【図１４Ｅ】サンプル・チップのレイアウトを示す図である。
【図１５Ａ】他の実施形態におけるチップのレイアウトを示す図である。
【図１５Ｂ】チップ上の行の対に特定の単量体を結合するためのシフト・レチクルを示す図である。
【図１５Ｃ】チップ上の単一のレーンに特定の単量体を結合するためのシフト・レチクルを示す図である。
【図１５Ｄ】対照レーンを形成するためのシフト・レチクルを示す図である。
【図１６】本発明の他の実施形態に基づくレチクルを生成するプロセスの高水準流れ図を示す図である。
【図１７Ａ】単一のシフト・レチクルの形成を示す図である。
【図１７Ｂ】単一のシフト・レチクルの形成を示す図である。
【図１７Ｃ】単一のシフト・レチクルの形成を示す図である。
【図１７Ｄ】単一のシフト・レチクルの形成を示す図である。
【図１８】図３Ａのプローブ・セットを生成する単一のレチクル、およびこのレチクルを使用した単量体の追加を示す図である。
【図１９】複数のプローブ・セットを生成するためのレチクルを示す図である。
【図２０Ａ】他の実施形態のシフト・レチクルを示す図である。
【図２０Ｂ】照会位置レチクルを示す図である。
【図２０Ｃ】照会位置レチクルを示す図である。
【図２０Ｄ】照会位置レチクルを示す図である。
【図２０Ｅ】完全相補プローブ、照会位置プローブ、および欠失プローブを含むチップを示す図である。
【図２１Ａ】長さの異なる関係プローブを合成するためのシフト・レチクルを示す図である。
【図２１Ｂ】基板上に合成できるプローブのレイアウトの一例を示す図である。
【図２２】スペックル・マスクの単純な例を示す図である。
【図２３】図７のシフト・レチクルがスペックル・マスクであることを示す図である。
【図２４】スペックル・マスクのパッキングを示す図である。
【図２５】ポスト・チップ合成を利用したチップのレイアウトを示す図である。
【図２６】ポスト・チップ合成を利用した他のチップのレイアウトを示す図である。
【図２７Ａ】緊密に充填されたレーンを有するチップの活性領域を示す図である。
【図２７Ｂ】図２７Ａのサブ領域を示す図である。
【図２７Ｃ】エッジを最小限に抑えるよう図２７Ｂのサブ領域を合成する方法を示す図である。
【図２８】異なる照会位置を有する等しい長さのプローブを生成するシフト・レチクルを示す図である。
【図２９】図２８のレチクルによって生成することができるプローブを示す図である。
【図３０】異なる長さおよび異なる照会位置を有するプローブを生成するシフト・レチクルを示す図である。
【図３１】図３０に基づくシフト・レチクルによって生成することができるプローブを示す図である。
【図３２】標的中の塩基位置９個ごとに照会するプローブを生成するためのシフト・レチクルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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