(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チトクロムＰ−４５０酵素活性を決定するためのアッセイであって、以下：Ｐ−４５０酵素活性のための条件下で、水素供与体補因子を有するＰ−４５０酵素と、メチレンに結合したエーテル基を有することによって特徴付けられる少なくとも１つの基質とを組み合わせる工程であって、ここで該メチレンが、酵素的にアルデヒド基に酸化される、工程；蛍光ヒドラジンを添加して、該少なくとも１つの基質の各々の該アルデヒド基と反応させて、ヒドラゾンを形成する工程；消光剤で酵素活性をクエンチする工程；およびキャピラリー電気泳動を使用して該ヒドラゾンについてアッセイする工程であって、それによって、分離したピークが各基質について得られる、工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項２】
前記メチレン基が、芳香族基に結合される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記メチレン基が、脂肪族基または水素に結合される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記エーテル基が、フェノールの酸素であり、そして炭素環式基または複素環式基に結合される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記少なくとも１つの基質が、７−ベンジルオキシキノリンおよび７−ベンジルオキシレゾルフィンの少なくとも１つを含む、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記組み合わせる工程が、酵素を活性化する量の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
少なくとも２つの基質を添加する工程を包含する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
チトクロムＰ−４５０酵素活性を決定するためのアッセイであって、以下：
６〜８の範囲でのｐＨおよび２０℃〜５０℃の範囲での温度を含むＰ−４５０酵素活性のための条件下で、ＮＡＤＰＨを有するＰ−４５０酵素と、メチレンに結合したエーテル基を有することによって特徴付けられる少なくとも１つの基質とを組み合わせる工程であって、ここで、該メチレンが酵素的にアルデヒド基に酸化される、工程；蛍光ヒドラジンを添加して、該少なくとも１つの基質の各々の該アルデヒド基と反応させて、ヒドラゾンを形成する工程；消光剤で酵素活性をクエンチする工程；およびキャピラリー電気泳動を使用して該ヒドラゾンについてアッセイする工程であって、それによって、分離したピークが各基質について得られる、工程、
を包含する、アッセイ。
【請求項９】
前記蛍光ヒドラジンが、フルオレセインヒドラジンである、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記酵素の濃度が、１ｎＭ〜５００ｎＭの範囲内である、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記反応体積が、０．１〜５０μｌの範囲内である、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記組み合わせる工程が、酵素を活性化する量の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１３】
少なくとも２つの基質を添加する工程を包含する、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１４】
チトクロムＰ−４５０酵素、メチレンに結合したエーテル基を含む少なくとも１つのＰ−４５０酵素基質であって、ここで該メチレンが該Ｐ−４５０酵素によってアルデヒドに酸化される、Ｐ−４５０酵素基質、ならびに蛍光ヒドラジンを含む、キット。
【請求項１５】
前記Ｐ−４５０酵素が、３Ａ４アイソフォームであり、そして前記蛍光ヒドラジンがフルオレセインヒドラジンである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記Ｐ−４５０酵素基質が、７−ベンジルオキシレゾルフィンまたは７−ベンジルオキシキノリンのうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記フルオレセインヒドラジンが、Ｎ−（α−ヒドラジルアセチル）５−アミノフルオレセインである、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明の分野は、モノオキシゲナーゼアッセイである。
【０００２】
（発明の背景）
モノオキシゲナーゼとしては、チトクロムＰ−４５０酵素の多くのアイソフォームが挙げられる。これらの酵素の重要性、特に肝臓におけるその活性に起因して、その活性についてアッセイし得、かつその活性を調整し得る化合物を同定し得ることに、重要な目的が存在する。これらの酵素は、血液から外来因子を除去するように作用する。不幸にも、多くの場合、これらの外来因子は薬物であり、その半減期はＰ−４５０酵素によって不活性な生成物にプロセスされるおかげで、実質的に減少される。また、Ｐ−４５０酵素の減少または改変された活性は、正常なヒトにおいては迅速に解毒される種々の薬剤に対する中毒または感受性を導き得る。この酵素の調製物は、非常に高価であり、そして各酵素は、複数の結合部位を有する。従って、複数のアッセイが、この酵素をスクリーニングするために実行されねばならない。
【０００３】
ナノ技術の到来により、非常に小さい体積で多くの化学的操作および物理的操作を実行する能力が増大しつつある。この機会は、検出可能なシグナルを与えるために存在するより少ない分子を検出するために、感受性を増強した測定の必要性と共に到来する。増大した感受性の一部は、より高感度な検出剤に由来し得るが、これらは通常、より高価であり、そしてほとんどの研究室において容易に利用可能ではない。他の機会は、検出可能な生成物を提供することにおいてより効果的なアッセイ、酵素によって基質として容易に受容される化合物の使用を提供することであり、そして強いシグナル（蛍光化合物については高い発光効率）を有する生成物を提供することである。
【０００４】
従って、迅速、正確、かつ低レベルの酵素および高価な試薬によって小さな体積で実施され得るＰ−４５０アッセイを提供することにおいて、重要な目的が存在する。
【０００５】
（先行技術の簡単な説明）
米国特許第５，１７９，０１３号およびそこで引用される参考文献は、新規チトクロムＰ−４５０酵素についてのアッセイを記載する。Ｐ−４５０酵素についてのアッセイはまた、Ｓｃｈｗａｎｅｂｅｒｇら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９９、１：２６９：３５９−６６；Ｔｒｅｍｂｌａｙら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９９、２７６：２１５−２６；Ｊａｎｓｅｎら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｐｐｌ  １９９６、６８４：１３３−４５およびＥｇｕｃｈｉら、Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  １９９６、２６：７５５−６３に記載される。興味深いものであり得る他の参考文献としては、ＨａｒｔｍａｎｎおよびＦｒｏｔｓｃｈｅｒ、Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  １９９９、３３２：３５８−６２；Ｕｂｅａｕｄら、Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  １９９９、８：２５５−６０；Ｅｒｔｌら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍｃｏｌ  １９９９、１５７：１５７−６５；およびＳａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９６、１３７：３１６−２５が挙げられる。
【０００６】
（発明の要旨）
アルデヒド生成物を生じる酸化可能なα−水素を含むエーテル基を有する基質を使用する、モノオキシゲナーゼ酵素、特にＰ−４５０酵素の測定のための方法および組成物が提供される。このアルデヒドは、インサイチュで蛍光ヒドラジンと反応され、生じる反応混合物はキャピラリー電気泳動によって分離される。このヒドラゾン生成物は、この反応の発生およびピークの下の面積が定量のために使用され得ることを示す。このアッセイを実施するためのキットが、提供され得る。
【０００７】
（特定の実施形態の説明）
モノオキシゲナーゼ活性、特にチトクロムＰ−４５０酵素のアイソフォーム（例えば、３Ａ４、２Ｅ１、１Ａ２、２Ａ６など）の高感度な検出のための方法および組成物が、提供される。この方法は、インビトロ酵素調製物、補酵素、および少なくとも１つの基質を使用する。この基質は、アッセイ条件下での１０−５分−１、好ましくは少なくとも約１０−３分−１の代謝回転数を有することによって、そしてエーテルを含むことによって特徴付けられる（ここで、１つの基が芳香族化合物、通常は複素環式化合物であり、そして他の基がアルデヒドを生成する酸化可能なα−水素を有する（すなわち、α−炭素原子が２つの水素を有する））。基質の混合物がこのアッセイの測定に含まれる場合、各基質は、蛍光ヒドラゾンの形態において異なる移動度を有する生成物を生成する。アルデヒド生成物の形成の前、その間またはそのために十分な時間の後に、蛍光ヒドラジンを添加し、そして反応混合物の成分を、キャピラリー電気泳動によってマイルドな酸性条件下で分離する。
【０００８】
多数のモノオキシゲナーゼ基質が公知であり、これらは所望の必要性を満たす。これらのエーテルは、通常フェノールのエーテルであり、ここで、芳香族基は、炭素環式であるかまたは複素環式であり得る。一般的に、この芳香族基は、少なくとも約４個の炭素原子、通常少なくとも約５個の炭素原子（１環あたり、６環員）であり、そして約３０個以下の炭素原子、通常約２０個以下の炭素原子であり、そして０〜８個のヘテロ原子、通常０〜６個のヘテロ原子（ほとんどの部分についてＯ、Ｎ、Ｓである）を有する。例示的な芳香族基としては、フェニル、ベンジル、ナフチル、アセナフチル、クマリン、レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）、キノリン、ワルファリン、メトキシメフェニトイン、メフェニトイン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、デブリソキン、ブフラロール、ミダゾラム、事実上、カルボニルを生じる酵素の触媒的酸化を可能にする任意の基が挙げられる。例えば、Ｇｅｎｔｅｓｔ  Ｃｏｒｐ．の１９９９−２０００カタログ（さらなる情報についてはｉｎｆｏ＠ｇｅｎｔｅｓｔ．ｃｏｍ）を参照のこと。エーテルの他の基は、エーテルの酸素に結合したメチレンを有し、ここで残りの部分は、水素、脂肪族、脂環式、芳香族または複素環式であり得る。水素以外の基の場合、残りの部分は、少なくとも１個の炭素原子、通常少なくとも約２個の炭素原子であり、そして約１６個以下の炭素原子、通常約１２個以下の炭素原子である。０〜４個のヘテロ原子、通常０〜３個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＳおよびＮ）が存在し得る。このアルデヒドは、一置換ヒドラジンと迅速に反応して、キャピラリー電気泳動におけるヒドラジンの移動度を変化させる。
【０００９】
特定の基質としては、７−ベンジルオキシキノリン、７−メトキシキノリン、ＡＨＭＣ、７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリン、７−メトキシ−４−（トリフルオロメチル）クマリンなどが挙げられる。
【００１０】
メチレンオキシに結合した種々の基としては、メチル、置換されたメチルが挙げられ、ここで、エーテル酸素に結合した基は、ヒドロキシエチル、カルボキシメチルのエチルエステル、メトキシプロピル、シクロヘキシルメチル、ベンジルおよび置換ベンジル（例えば、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｍ−トリル、ｏ−アニソールなど）である。
【００１１】
一置換ヒドラジンは、都合の良い蛍光剤で置換され、ここで、このヒドラゾン生成物は、親のヒドラジンとは異なる移動度を有する。マイルドな酸性ｐＨを使用することによって、このヒドラジンはプロトン化されるが、このヒドラゾンは、たとえあったとしても部分的にのみプロトン化される。ヒドラジン反応物との比較における、生成物の分子量および電荷における差異は、移動度に有意な変化を提供する。ヒドラゾンの形成は二次的な反応であり、そしてＰ−４５０酵素は関与しないので、種々の蛍光剤を使用し得る。蛍光剤の選択は、簡便性、反応速度、水溶性、励起波長および発光波長ならびに量子収量（発光効率）に基づく。慣用的な蛍光剤（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ダンシル、Ｃａｓｃａｄｅ青、ＮＢＤ、Ｃｙ−５、スクアラート、Ｌｕｃｉｆｅｒ黄、Ｒｈｏｄａｌ緑、ピレン、アクリジンオレンジなど）が使用され得る。
【００１２】
このアッセイの実行において、酵素濃度は、慣用的に約１ｎＭ〜５００ｎＭの範囲内、より通常は約２５ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲内であり、そしてチトクロムＰ−４５０のアイソフォームに依存して、示された範囲の外側で変動し得る。酵素の基質プロフィールを決定するために、個々の基質または基質混合物を使用し得る。各基質は、ヒドラゾンとして誘導体化された場合に、異なる移動度を有するアルデヒド生成物を生成する。異なる移動度を得るために、相同な系、差次的な置換、電荷および／または質量における差異などを使用し得る。相同な系としては、脂肪族分子、脂肪族置換芳香族などが挙げられ得る。あるいは、置換されたベンゼンを有し得、ここで、異なる置換基（例えば、ハロゲン、オキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、例えば、エステルなど）を有し得る。酵素の濃度、基質の性質、および水中の溶解性、各基質についての代謝回転速度、置換されたヒドラジンと各生成物の反応速度およびその量子収量、ならびに基質の総数に依存する。各基質の濃度範囲は、約５０μＭ〜５０００μＭ、より通常は、１００μＭ〜２０００μＭである。一般的に、基質の濃度は、Ｋｍの約０．２５〜０．７５の範囲内である。
【００１３】
補酵素は、存在する場合には、律速とならないように過剰で存在する。一般的に、上記に示された酵素の濃度で、補酵素の濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、通常少なくとも約１ｍＭでありかつ約２５ｍＭ以下である。この補酵素溶液は、測定の各系のために新鮮に調製されるべきである。
【００１４】
酵素活性を妨害しない種々の緩衝液が、使用され得る。これらの緩衝液としては、ＰＢＳ、トリス、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ホスフェートなどが挙げられる。ｐＨは、アッセイされる特定のモノオキシゲナーゼに依存して異なり、一般的には約７〜７．５の範囲内であり、ここで、このｐＨは、少なくともほぼ最大の酵素活性を提供するように選択される。緩衝液の濃度は、反応の過程の間にｐＨにおける有意な変化を防止するために十分であり、一般的には約０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、より通常は約０．５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲内である。
【００１５】
反応時間は、温度、酵素および基質の濃度などに依存して、通常少なくとも約５分、より通常は少なくとも約３０分であり、かつ約１８０分以下、好ましくは約１２０分以下である。反応のために特定の時間を使用するか２つの異なる時間でアリコートを取ることによって、この反応速度は、他の測定との比較のために決定され得る。この温度は、一般的に約２０℃〜５０℃の範囲内であり、より通常は約２５℃〜４０℃の範囲内である。
【００１６】
多くの場合において、少量の非イオン性界面活性剤を添加することが有利であり得る。一般的に、この界面活性剤は、約０．０１〜０．１容量％で存在する。例示的な非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンジオール（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）が挙げられる。
【００１７】
検出可能な量の生成物のために十分な時間の後、この反応はクエンチされる。物理的および化学的両方の種々の消光剤が、使用され得る。都合の良いように、少量の水溶性インヒビター（例えば、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＳＤＳ、メタノール、ＤＭＦなど）が、添加され得る。インヒビターの量は、インヒビターの性質によって異なり、実験的に決定され得る。次いで、十分な量の蛍光ヒドラジン誘導体が、通常は少なくとも化学量論的に、一般的には、予測された生成物の最大量よりも少なくとも約２倍（そして５倍以上であり得る）過剰に添加される。多すぎるヒドラジンを添加するべきではない（これは、ヒドラゾン生成物からの分離において妨害し得る広いバンドを回避するように実験的に決定され得る）。ヒドラゾン形成反応を、この反応が少なくとも実質的に完全になるために十分な時間にわたって進めさせ、次いで、この反応混合物を、約４〜８、より通常は４〜６の範囲内のｐＨで、このｐＨを達成するための慣用的な緩衝液（例えば、アセテート、カルボネート、ＥＤＰＡなど）を使用する慣用的な条件下で、キャピラリー電気泳動を使用して分離する。ヒドラゾンのピークを読み取り、そして酵素の活性を決定するために積算する。キャピラリー電気泳動の条件は、慣用的であり、そして各ヒドラゾンについて最適化され得る。
【００１８】
蛍光ヒドラジン誘導体は、新規の化合物である。この化合物は、Ｎ−（α−ヒドラジニルアシル）５−アミノフルオレセインであり、ここで、このアシル基はは、２〜６個、通常２〜４個の炭素原子のものである。この生成物は、５−ハロアセトアミドフルオレセインおよびヒドラジンから作製される。
【００１９】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のためにではない。
【００２０】
（実験）
（表１．Ｆ１−ＮＨ２およびベンズアルデヒドの反応からの結果）
【００２１】
【表１】
0003689370.tif 000002
反応条件は、ホスフェート緩衝液（３．３ｍＭおよびｐＨ＝５．６）中であり、フルオレセインヒドラジン（「Ｆ１−ＮＨ２」）濃度は、１．６ｍＭであり、そして注入前に５０倍に希釈した。分離のために、分離緩衝液、ホスフェート（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．１）：２７ｃｍのキャピラリー（Ｉ．Ｄ．５０μｍ、Ｏ．Ｄ．３６０μｍ）；圧力注入および１０ｋＶ。図１は、キャピラリー電気泳動技術（ＰＡＧＥ）を使用した、フルオレセインとのベンズアルデヒドの反応の電気泳動図を示す。
【００２２】
直線の較正曲線をベンズアルデヒドについて（図２を参照のこと）、３〜１３３μＭの範囲内で達成した（３０分間のインキュベーションおよび注入前に５０倍希釈）。より高い感度を、より低い希釈を使用して達成した（表１を参照のこと）。この反応の速度論的な研究からの結果を、図３に示す。これは、反応生成物の最大が、３０分後に達成され、次いでレベルが下がることを示す。
【００２３】
ＣＹＰ３Ａ４：マイクロタイタープレートを使用した２−チトクロムＰ−４５０アッセイ。このアッセイを評価するために、２組の基質を選択した：第一の組は、７−ベンジルオキシレゾルフィン（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）（７−ＢＲ）であり、そして第二の組は７−ベンジルオキシキノリン（７−ＢＱ）であった。
【００２４】
（Ｉ：７−ベンジルオキシレゾルフィン（７−ＢＲ））
酵素および基質の濃度ならびにインキュベーション時間の、ＣＹＰ３Ａ４についての酵素活性に対する効果を、マイクロタイタープレートを使用して評価した（反応体積は５０μｌであった）。これらの研究からの結果を、図４〜図６に示す。図４は、時間の関数として７−ＢＲ濃度の効果を示す（酵素濃度は２００ｎＭであった）。観察され得るように、基質濃度にかかわらず、反応は、約３０〜４０分後に最大に達し、次いでレベルが下がった。さらに、この活性は、基質濃度の増大に応じて有意に増大する。図５は、４つの異なる基質濃度についての酵素活性に対する酵素濃度の効果を示す。この図において観察され得るように、この特定の基質に対する酵素濃度の効果は、それほど有意ではない。なぜなら、酵素の反応性は、基質の溶解性によって制限されるからである（７−ＢＲは、水中での非常に制限された溶解性を有する）。図６（Ａ）および図６（Ｂ）は、５〜５０，０００ｎＭの濃度範囲にわたるレゾルフィン（酵素活性の生成物）についての較正曲線を示す。
【００２５】
（ＩＩ：７−ベンジルオキシキノリン（７−ＢＱ））
酵素および基質の濃度ならびにインキュベーション時間の、ＣＹＰ３Ａ４および７−ＢＱについての酵素活性に対する効果を、マイクロタイタープレートを使用して評価した（反応体積は５０μｌであった）。これらの研究からの結果を図７〜図８に示す。
【００２６】
図７は、７−ＢＱ濃度の効果を時間の関数として示す（酵素濃度は４０ｎＭであった）。観察され得るように、基質濃度にかかわらず、この反応は、２５〜３０分後に最大に達し、次いでレベルが下がった。さらに、７−ＢＲの場合のように、この活性は基質濃度の増大に応じて有意に増大する。図８は、４つの異なる基質濃度についての酵素活性に対する酵素濃度の効果を示す。この図において観察され得るように、酵素濃度の増大は、この特定の基質についての酵素活性における増大を引き起こす。
【００２７】
（ＩＩＩ．Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の効果）
マイクロタイタープレート上で、基質として７−ＢＱを使用したＣＹＰ３Ａ４の酵素活性に対するＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の添加の効果を、研究した。これらの研究からの結果を図９〜図１１に示す。図９は、時間の関数として７−ＢＱ濃度の効果を示す（酵素濃度は１５０ｎＭであった）。観察され得るように、基質の濃度にかかわらず、反応は２５分後に最大に達し、次いでレベルが下がった。さらに、上記の場合と同様、この活性は、基質濃度の増大に応じて有意に増大する。図１０は、３つの異なる基質濃度についての酵素活性に対する酵素濃度の効果を示す。この図において観察され得るように、酵素濃度の増大は、酵素活性における増大を引き起こす。図１１は、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性に対するＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の存在（Ａ）の効果と、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の非存在（Ｂ）の効果との間の比較を示す。これら２つの較正曲線の傾きの比較は、０．０２６％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の添加に対して酵素活性が９６％増大することを示す。
【００２８】
図１２は、１〜５００μＭの濃度範囲にわたる７−ヒドロキシキノリン（酵素活性の生成物）についての較正曲線を示す。
【００２９】
以下の表は、レゾルフィンと７−ＢＱとの間の代謝回転速度（ＴＯ）の比較を示し、これは、レゾルフィンと比較した場合、７−ＢＱについて有意に高い数を示す。２．４５×１０−３±１．９±１０−３分−１；７−ＢＱ、１７±１１分−１。
【００３０】
（汎用基質としてＦ１−ＮＨ２を使用し、そしてキャピラリー電気泳動を使用した、ＣＹＰ４５０アッセイ）
（Ｉ−アッセイのプロトコール）
（Ｉ．酵素反応）この反応混合物は、１０μｌのＣＹＰ３Ａ４用緩衝溶液（ＰａｎＶｅｒａにより提供された。ｐＨ＝７．４）、１０μｌの酵素ＣＹＰ３Ａ４（ＰａｎＶｅｒａ）、１μｌの７−ＢＱ（２０ｍＭ）、２９μｌの水、および１０μｌの新鮮なＮＡＤＰＨ溶液（１０ｍＭ）を含む。この反応混合物を、ＮＡＤＰＨの添加後３７℃で１２０分間インキュベートした。次いで、この反応を、２μｌのＦ１−ＮＨ２（５ｍＭ）の添加の前に、１０μｌのアセトニトリルの添加によって停止させた。分離条件は、以下の通りであった：分離のために、緩衝液、１０ｍＭのアセテートおよび５ｍＭのＳＤＳ（ｐＨ＝４．９５）；２７ｃｍのキャピラリー（Ｉ．Ｄ．５０μｍ、Ｏ．Ｄ．３６０μｍ）；圧力注入５秒間および２０ｋＶ。
【００３１】
（２．コントロール１（酵素なし））この反応混合物を、１０μｌの緩衝液（ｐＨ＝７．４、ＣＹＰ３Ａ４のためにＰａｎＶｅｒａから提供された）、２９μｌの水、１μｌの７−ＢＱ（２０ｍＭ）、および１０μｌのＮＡＤＰＨ（１０ｍＭ）を含んで調製し、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、２μｌのＦ１−ＮＨ２（５ｍＭ）の添加の前に１０μｌのアセトニトリルの添加によって、反応を停止させた。
【００３２】
（３．コントロール２（ＮＡＤＰＨなし））この反応混合物を、１０μｌの緩衝液（ｐＨ＝７．４、ＣＹＰ３Ａ４のためにＰａｎＶｅｒａから提供された）、１０μｌのＣＹＰ３Ａ４（ＰａｎＶｅｒａ）、２９μｌの水、および１μｌの７−ＢＱ（２０ｍＭ）を含んで調製し、次いで、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、２μｌのＦ１−ＮＨ２（５ｍＭ）の添加の前に１０μｌのアセトニトリルの添加によって、反応を停止させた。
【００３３】
（４．コントロール３（７−ＢＱなし））この反応混合物を、ＣＹＰ３Ａ４のための１０μｌの緩衝液（ＰａｎＶｅｒａによって提供された、ｐＨ＝７．４）、１０μｌの酵素ＣＹＰ３Ａ４（ＰａｎＶｅｒａから）、２０μｌの水、および１０μｌの新鮮なＮＡＤＰＨ溶液（１０ｍＭ）を含んで調製し、ＮＡＤＰＨの添加後、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、２μｌのＦ１−ＮＨ２（５ｍＭ）の添加の前に１０μｌのアセトニトリルの添加によって、この反応を停止させた。
【００３４】
図１３は、チトクロムＰ４５０アッセイのために使用される条件下での、フルオレセインヒドラジンとのベンズアルデヒド（１６０μＭ）の反応を示す。フルオレセインヒドラジンとの反応前の、７−ＢＱとのＣＹＰ３Ａ４の酵素反応からの結果を、図１４に示す。観察され得るように、この生成物（ベンズアルデヒド）のピークを、Ｆ１−ＮＨ２またはおそらく他の酵素反応生成物のいずれかから生じる他のピークから、明らかに同定し得る。このようなピークは、第一のコントロール（図１５、酵素を添加しなかった）においても第二のコントロール（図１６、ＮＡＤＰＨなし）においても第三のコントロール（図１７、７−ＢＱなし）においても、観察されなかった。
【００３５】
（ＩＶ．７−ＢＱについてのＣＥおよびマイクロタイタープレートからの結果の比較）
図１８は、ＣＥからの感度とマイクロタイタープレートからの感度との間の比較を示す。観察され得るように、マイクロタイタープレートからの感度と比較した場合、有意により高い感度を、ＣＥによって達成した（ＣＥの結果からの較正曲線の傾きは、マイクロタイタープレートからの０．００５２と比較して、０．１５９３であった）。
【００３６】
（Ｖ．Ｎ−（α−ヒドラジニルアセチル）５−アミノフルオレセインの調製）  ５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（１００ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌの無水エタノールに溶解させた。ヒドラジン溶液（３．５ｍｌ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）を、攪拌しながら０℃で滴下した。反応混合物の色は、最初のヒドラジン溶液の添加後、直ぐに暗赤色に変化した。添加の完了後、温度を室温まで上昇させた。２時間後、シリカゲルでのＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ＋９０％ＣＨ２Ｃｌ２）は、非常に極性の新規の生成物が形成され、いくらかは変換されなかったことを示した。別の３．０ｍｌのヒドラジン溶液を添加し、そして出発物質がもはや検出されなくなるまで、この反応をＴＬＣでモニターした。この生成物は、赤い沈殿物として沈殿した。この反応混合物を５分間遠心分離し、溶媒をデカントし、そしてこの生成物を真空で数分間乾燥させ、−８０℃で貯蔵した。これを、そのままで使用した。Ｃ２２Ｈ１７Ｎ３Ｏ６ｍ／ｚ４２０．１（Ｍ＋Ｈ）＋についてのＥＳ／ＭＳ（１００％）。
【００３７】
アルデヒドに酸化されるエーテル基を有するチトクロムＰ−４５０基質を使用することによる上記の結果から、本方法が、Ｐ−４５０活性を決定するために単純、迅速かつ高感度なアッセイを提供することが明白である。慣用的な濃度での反応速度は、迅速かつ定量的である。この酵素活性は、基質および酵素の濃度に関連することが見出され、そして延長した時間にわたって持続する最大値に達する。従って、この速度のレベルを下げた場合、このアッセイの初期段階の反応速度に従い得るかまたはその値を決定し得る。
【００３８】
本明細書中で引用される全ての参考文献および特許出願は、その全体が示されているかのように、本明細書中で参考として援用される。
【００３９】
前述の発明を、理解の明確さの目的のために、例示および実施例によって、詳細に記載したが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本発明になされ得ることが、本発明の教示に照らして当業者にとって容易に明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、キャピラリー電気泳動技術（ＰＡＧＥ）を使用した、フルオレセインとのベンズアルデヒドの反応の電気泳動図を示す。
【図２】  図２は、ヒドラゾンを形成するベンズアルデヒドおよびフルオレセインヒドラジンについての較正曲線を示す。
【図３】  図３は、フルオレセインヒドラジンとベンズアルデヒドとの間の反応の速度論的研究のグラフである。
【図４】  図４は、酵素活性に対する７−ベンジルオキシレゾルフィンの濃度の効果のグラフである。
【図５】  図５は、酵素活性に対する、酵素濃度の効果である。
【図６Ａ】  図６Ａは、７−ベンジルオキシレゾルフィンについての異なる濃度範囲にわたる較正曲線である。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、７−ベンジルオキシレゾルフィンについての異なる濃度範囲にわたる較正曲線である。
【図７】  図７は、酵素活性に対する７−ベンジルオキシキノリンの濃度の効果のグラフである。
【図８】  図８は、酵素活性に対する酵素の濃度の効果のグラフである。
【図９】  図９は、基質としての７−ベンジルオキシキノリンを用いた、種々の濃度の基質酵素での酵素活性に対する非イオン性界面活性剤の効果のグラフである。
【図１０】  図１０は、基質としての７−ベンジルオキシキノリンを用いた、種々の濃度の基質酵素での酵素活性に対する非イオン性界面活性剤の効果のグラフである。
【図１１】  図１１は、非イオン性界面活性剤の存在下での較正曲線の比較のグラフである。
【図１２】  図１２は、７−ヒドロキシキノリンについての較正曲線である。
【図１３】  図１３は、ベンズアルデヒドおよびフルオレセインヒドラジンの生成物の電気泳動図である。
【図１４】  図１４は、フルオレセインヒドラジンとの反応の前の、ＣＹＰ３Ａ４および７−ベンジルオキシキノリンの酸化生成物の電気泳動図である。
【図１５】  図１５は、酵素が反応から除外された、コントロール反応の電気泳動図である。
【図１６】  図１６は、補因子が反応から除外された、コントロール反応の電気泳動図である。
【図１７】  図１７は、基質が反応から除外された、コントロール反応の電気泳動図である。
【図１８】  図１８は、キャピラリー電気泳動（Ａ）の結果とマイクロタイタープレートの結果（Ｂ）との間の比較のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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