(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランダム化された配列からなるリンカーを介して、機能性RNAをコードする遺伝子をtRNAプロモ−ターに結合した核酸分子のプールを、tRNAプロモーターの調節下に発現ベクターに組み込んだ発現ベクタープールを構築し、
該発現ベクタープールを細胞に導入し、該細胞を培養して該核酸分子を発現させ、該細胞を回収し破壊して全細胞抽出液、細胞質画分または核画分を調製し、該全細胞抽出液または該画分の各々を一定時間インキュベートし、該全細胞抽出液、細胞質画分または核画分中に残留した該核酸分子の発現物を得るサイクルで該核酸分子の発現物（ジェネレーション１）を選択し、
得られた発現物をコードするDNAを含む発現ベクターを構築し、細胞に導入し、該細胞を培養して発現させ、該細胞を回収し破壊して全細胞抽出液、細胞質画分または核画分を調製し、該全細胞抽出液または該画分の各々を直前のサイクルよりも長くインキュベートし、該全細胞抽出液、細胞質画分または核画分中に残留した該核酸分子の発現物（次のジェネレーション）を得るサイクルを繰り返すことを含む、
細胞内、細胞質内又は核内で機能する、機能性RNAをコードする遺伝子をリンカーを介してtRNAプロモ−ターに結合した核酸分子の選択方法。
【請求項２】
機能性RNAがアンチセンスRNA、アプタマー又はリボザイムである請求項１記載の選択方法。
【請求項３】
機能性RNAがリボザイムである請求項２記載の選択方法。
【請求項４】
前記核酸分子の発現物の存在量の増加を指標として細胞内、細胞質内または核内での安定性または転写量を評価することを更に含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記機能性RNAの活性を指標として機能を評価することを更に含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞質画分または核画分中における前記機能性RNAの存在を指標として、該機能性RNAの細胞内局在を評価することを更に含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リボザイムがハンマーヘッド型リボザイムである、請求項３〜６いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、細胞内で高安定で高機能な核酸分子の選択方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８０年初頭、米国コロラド大学のＣｅｃｈらによるテトラヒメナのｒＲＮＡのセルフスプライシング現象の発見（Ｋ．Ｋｒｕｇｅｒ，  Ｐ．Ｊ．Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ，  Ａ．Ｊ．Ｚａｕｇ，  Ｊ．Ｓａｎｄｓ，  Ｄ．Ｅ．Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，  Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，  Ｃｅｌｌ，  ３１，  １４７−１５７（１９８２））  と、米国エール大学のＡｌｔｍａｎが行ったＲＮＡとタンパク質の複合体酵素であるリボヌクレアーゼＰの解析結果（Ｃ．Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ，  Ｋ．Ｇａｙｄｉｎｅｒ，  Ｔ．Ｍａｒｓｈ，  Ｎ．Ｐａｃｅ，  Ｓ．Ａｌｔｍａｎ，  Ｃｅｌｌ，  ３５，  ８４９−８５７（１９８３）  ）から、触媒機能を有するＲＮＡであるリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｃｉｄ＋ｅｎｚｙｍｅ）  が見いだされた。以降、様々なリボザイムが発見され（Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｔｒｅｎｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  １４，  ４４５−４５０（１９８９）  ；Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６１，  ６４１−６７１（１９９２）；Ｊ．Ｂｒａｔｔｙ，  Ｐ．Ｃｈａｒｔｒａｎｄ，  Ｇ．Ｆｅｒｂｅｙｒｅ，  Ｒ．Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２１６，  ３４５−３５９（１９９３）  ；Ｈａｓｅｈｏｆｆ．  Ｊ  ａｎｄ  Ｗ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４，  ５８５−５９１（１９８８）  ；Ｃ．Ｊ．Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ，  Ａ．Ｃ．Ｆｏｒｓｔｅｒ，  Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １４，  ３６２７−３６４０（１９８６））、逆転写酵素、イントロンの発見、ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  などとあわせて、不動のセントラルドグマの概念をゆるがしたのである。同時に、それまでＤＮＡとタンパク質の間で情報の仲介屋程度にしか認識されていなかったＲＮＡが、（遺伝）情報と（触媒）機能の二役を兼ね備えていることから、ＲＮＡ分子こそが生命の起源とする“ＲＮＡワールド”説の中心的分子として注目されるようになった（Ｇ．Ｆ．Ｊｏｙｃｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３８，  ２１７−２２４（１９８９）  ；Ｎ．Ｒ．Ｐａｃｅ，  Ｔ．Ｌ．Ｍａｒｓｈ，  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ，  １６，  ９７（１９８５）；Ａ．Ｌａｚｃａｎｏ，  Ｒ．Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，  Ｊ．Ｏｒｏ，  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．，  ２７，  ２８３（１９８８）  ；Ｌ．Ｅ．Ｏｒｇｅｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５８，  ２０３（１９９２）  ；Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，  Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ，  Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ，  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ２４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３））。
【０００３】
なかでもハンマーヘッド型リボザイムは、これまで最も良く研究がなされてきたリボザイムの一つである（図１ａ）。これは、天然においては自己切断反応（シス型）として機能するリボザイムであるが（Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５９，  ５４３（１９９０）；Ａ．Ｃ．Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｃｅｌｌ，  ４９，  ２１１（１９８７）  ；Ａ．Ｃ．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，  Ｒ．Ｈ．Ｓｙｍｏｎｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７，  １３７１（１９８９））、  ＵｈｌｅｎｂｅｃｋらとＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ  らのグループによって２本のＲＮＡ鎖（基質領域と酵素活性保持領域）に分割（トランス化）されたことから（Ｏ．Ｃ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２８，  ５９６（１９８７）  ；Ｊ．Ｈａｓｅｈｏｆｆ，  Ｗ．Ｌ．Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４，  ５８５（１９８８））  、リボザイムによる遺伝子治療への応用の可能性が示唆された（図１ｂ）。以降、癌やエイズなどを標的とした様々な応用研究が、数多く報告されている（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，  Ｍ．Ｌ．Ｂｉｍｓｔｉｅｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ８，  ８６１（１９８９）；Ｎ．Ｓａｒｖｅｒ，  Ｅ．Ｃａｎｔｉｎ，  Ｏ．Ｃｈａｎｇ，  Ｏ．Ｌａｎｄｅ，  Ｄ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｊ．Ｚａｉａ，  Ｊ．Ｒｏｓｓｉ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，  １２２２（１９９０）；Ｍ．Ｈｏｍａｎｎ，  Ｍ．Ｔｚｏｒｔｚａｋａｒｉ，  Ｋ．Ｒｉｔｔｎｅｒ，  Ｓ．Ｓｃｚａｋｉｅｌ，  Ｍ．Ｔａｂｌｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１，  ２８０９（１９９３）；  Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ０，  ９２６（１９９３）；Ｓ．Ａｌｔｍａｎ：Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０．  １０８９８（１９９３）  ；Ｐ．Ｍａｒｓｃｈａｌｌ，  Ｊ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １４，  ５２３（１９９４）  ；Ｓ．Ｍ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １０３，  ８５（１９９４）；Ｆ．Ｈ．Ｃａｍｅｒｏｎ，  Ｐ．Ａ．Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．，  ４，  ８７（１９９４）  ；Ｌ．Ｑ．Ｓｕｎ，  Ｄ．Ｗａｒｒｉｌｏｗ，  Ｌ．Ｗａｎｇ，  Ｃ．Ｗｉｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｊ．Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ，  Ｇ．Ｓｙｍｏｎｄｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ９７１５（１９９４）；Ｒ．Ｅ．Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，  Ｊ．Ｊ．Ｍａｒｒ，  Ｊ．Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．３８，  ２０２３（１９９５）  ；Ｇ．Ｆｅｒｂｅｙｒｅ，  Ｊ．Ｂｒａｔｔｙ，  Ｈ．Ｃｈｅｎ，  Ｒ．Ｃｅｄｅｒｇｅｒｎ，  Ｇｅｎｅ  １５５，  ４５（１９９５）  ；Ｍ．Ｋｉｅｈｎｔｏｐｆ，  Ｅ．Ｌ．Ｅａｑｕｉｖｅｌ，  Ｍ．Ａ．Ｂｒａｃｈ，  Ｆ．Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，７３，  ６５（１９９５）  ；Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．Ｍａｃｅｊａｋ，  Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，  Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  １，  ２７７  （１９９５）；Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｊ．Ｂ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ２９６  （１９９５））。
【０００４】
リボザイムは、基質と相補的な塩基対を形成することによって、基質ＲＮＡと結合する。その後、反応に必須となるマグネシウムイオン存在下で、基質ＲＮＡ分子の切断が起こる。基質の認識は、ＳｔｅｍＩとＳｔｅｍ  ＩＩＩ  の双方の基質結合領域がそれに対応した基質配列と適切な塩基対を形成することによってなされるので、リボザイムの基質特異性は非常に高い。基質特異性が非常に高いと、細胞内においてほとんど副作用が起こらないため、リボザイムを遺伝子発現阻害剤として用いる場合の大きなメリットとなる。しかし、必ずしも細胞内で効率よくリボザイムが機能しない事も分かってきた。この原因は、リボザイムの発現効率や局在の問題に加え、リボザイム自身の細胞内での安定性や活性の低下が考えられる。細胞内では様々なタンパク質がリボザイムやターゲットＲＮＡと相互作用するため、リボザイムのＲＮＡ切断反応が阻害される。また、リボヌクレアーゼの存在がリボザイムの安定性と活性に影響する可能性も十分考えられる。これを克服するため、リボザイムの化学修飾による安定化が当初提案されたが、細胞毒性を考慮するとあまり有効な手段とはいえない（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｄ．Ｍ．Ｊ．  Ｌｉｌｌｅｙ  （ｅｄｓ．），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．１０  （１９９６）；Ｌ．Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ，  Ｊ．Ａ．ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，  Ｋ．Ｇ．Ｄｒａｐｅｒ，  Ｃ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｋ．Ｊｅｎｓｅｎ，  Ａ．Ｍ．Ｋａｒｐｅｏｓｋｙ，  Ａ．Ｓ．Ｍｏｄａｋ，  Ｊ．Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ，  Ａ．Ｂ．ＤｉＲｅｎｚｏ，  Ｐ．Ｈａｅｂｅｒｌｉ，  Ｄ．Ｓｗｅｅｄｌｅｒ，  Ｄ．Ｔｒａｃｚ，  Ｓ．Ｇｒｉｍｍ，  Ｆ．Ｅ．  Ｗｉｎｃｏｔｔ，  Ｖ．Ｇ．  Ｔｈａｃｋｒａｙ，  Ｎ．Ｊ．Ｕｓｍａｎ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７０，  ２５７０２  （１９９５））。
【０００５】
現在では、リボザイムをコードする遺伝子をプラスミドの形で導入し、細胞内で転写させる方法が主として用いられており、この方法では、リボザイムを安定なＤＮＡの状態で導入でき、細胞内の転写系を利用して持続的なリボザイムの生産が期待できる。また、化学修飾などの必要性がなく細胞への毒性はほとんどない。
【０００６】
しかし、細胞内で効果的なリボザイムを生産するためには、１）リボザイムの転写量、２）細胞内での安定性、３）細胞内局在、４）リボザイムそのものの活性の４点に優れた発現系を開発する必要がある。リボザイム発現系として、従来はｍＲＮＡの転写系であるポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）系が多く用いられてきた。しかし、本発明者らは、ｐｏｌ  ＩＩ系よりも２〜３桁ほど転写量が高く（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎ，  Ｍ．Ｌ．Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ８，  ３８６１  （１９８９））、余分な付加配列の付きにくいポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）系のｔＲＮＡＶａｌプロモーターを利用しており、リボザイムはｔＲＮＡの３’側にリンカーを介し連結された形で転写される。このｔＲＮＡとリボザイムを繋ぐリンカーは、高次構造だけではなく、細胞内でのリボザイムの安定性に大きく影響するが（Ｓ．Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｔ．Ｔａｎａｂｅ，  Ｋ．Ｔａｎｉ，  Ｓ．Ａｓａｎｏ，  Ｔ．Ｓｈｉｏｄａ，  Ｔ．Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｙ．Ｎａｇａｉ，  Ｊ．Ｏｈｋａｗａ，  Ｋ．Ｔａｉｒａ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８  （１９９９））、最適なリンカーの長さならびに配列は全く分かっておらず、このリンカー配列の選択は未だトライアルアンドエラーと直感に頼っている。
【０００７】
また、ｔＲＮＡ  転写系により発現したリボザイムはその高次構造の違いにより細胞内局在が変化する。リボザイムが標的とするｍＲＮＡはイントロンを含む前駆体として転写された後、核内でスプライシングを受けて成熟し、すみやかに細胞質に輸送される。核内ではスプライソソームや多くのＲＮＡ結合タンパクが未成熟ｍＲＮＡに付着していると考えられ、リボザイムが核内でｍＲＮＡを標的とするのはかなり難しい（Ｓ．Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｔ．Ｔａｎａｂｅ，  Ｋ．Ｔａｎｉ，  Ｓ．Ａｓａｎｏ，  Ｔ．Ｓｈｉｏｄａ，  Ｔ．Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｙ．Ｎａｇａｉ，  Ｊ．Ｏｈｋａｗａ，  Ｋ．Ｔａｉｒａ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８  （１９９９））。従って、リボザイムの標的として、細胞質に存在するｍＲＮＡを狙ったほうが有利であり、転写されたリボザイムが細胞質に移行し、そこで標的ｍＲＮＡと共存することができれば、より高い効果が期待できる。ｔＲＮＡ  転写系により発現したリボザイムのうち、前半のｔＲＮＡ部分の２  次構造がｔＲＮＡ本来の構造に類似した（ただし全く同一ではない）クローバーリーフ構造をとるリボザイムのみが細胞質に効率よく移行し、完全にこの構造が崩れたものは核に蓄積することが分かっている（Ｓ．Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｔ．Ｔａｎａｂｅ，  Ｋ．Ｔａｎｉ，  Ｓ．Ａｓａｎｏ，  Ｔ．Ｓｈｉｏｄａ，  Ｔ．Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｙ．Ｎａｇａｉ，  Ｊ．Ｏｈｋａｗａ，  Ｋ．Ｔａｉｒａ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８  （１９９９））。今まで作製したｔＲＮＡ類似構造を持つリボザイムは全て細胞質に移行し、有効な活性を示すことが確かめられている（Ｈ．  Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３，  ２８４  （１９９８）；Ｔ．  Ｋｕｗａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６，  ９６１  （１９９８）；Ｔ．  Ｋｕｗａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ２，  ６１７  （１９９８）；Ｔ．  Ｋｕｗａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  １８８６  （１９９９））。
【０００８】
ｔＲＮＡに連結されたリボザイムの高次構造はリンカーの配列および長さにより調節されているが、その３  次構造についてはまだ解析されておらず、細胞質への輸送される機構もほとんど分かっていない。このため、最適リンカーにより高次構造が調節された、非常に高効率に細胞質に輸送されるｔＲＮＡに連結されたリボザイムはまだ得られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下、本発明者らは、細胞内から最適なリンカー配列を持つ、安定性、局在性に優れたリボザイムをスクリーニングするためのシステムを構築することを試みた。
すなわち、本発明は細胞内で安定な機能性核酸分子を選択する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は以下のとおり要約される。
（１）  核酸分子の一部か、または該核酸分子に連結する他の核酸、にランダム化配列を含む候補核酸配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを細胞に導入し、該細胞を培養して該核酸分子を発現させ、該細胞を回収し破壊して全細胞抽出液、細胞質画分または核画分を調製し、該全細胞抽出液または該画分の各々を一定時間インキュベートし、該全細胞抽出液、細胞質画分または核画分中に残留した核酸分子を得ることを含む、細胞内、細胞質内または核内で機能する機能性核酸分子の選択方法。
【００１１】
（２）  前記得られた機能性核酸分子に対して同じサイクルを１回以上繰り返すが但し前記全細胞抽出液、細胞質画分または核画分をインキュベートする時間を直前のサイクルよりも長くとることをさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）  前記核酸分子の存在量の増加を指標として細胞内、細胞質内または核内での安定性または転写量を評価する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  前記核酸分子の活性を指標として機能を評価する、（１）または（２）に記載の方法。
（５）  前記細胞質画分または核画分中における前記核酸分子の存在を指標として、該核酸分子の細胞内局在を評価する、（１）または（２）に記載の方法。
【００１２】
（６）  前記プロモーターと前記核酸分子との間に存在するリンカーがランダム化されている、（１）または（２）に記載の方法。
（７）  前記核酸分子がアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アプタマーおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドからなる群から選択される、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  前記核酸分子が核酸酵素である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）  前記核酸酵素がリボザイムである、（８）に記載の方法。
（１０）  前記リボザイムがハンマーヘッド型リボザイムである、（９）に記載の方法。
【００１３】
（１１）  （１）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって選択された、対応の対照核酸分子と比較して細胞内の転写量、安定性または活性が増大したか、あるいは細胞内局在性が変化した、機能性核酸分子。
（１２）  リボザイムである、（１１）に記載の機能性核酸分子。
（１３）  前記リボザイムが細胞質局在性、高安定性および高活性である、（１２）に記載の機能性核酸分子。
【００１４】
定義
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
「機能性核酸」とは、生体内または細胞内で特定の生物学的機能、例えば酵素機能、触媒機能、生物学的阻害もしくは亢進機能、をもつ核酸を意味する。
「核酸酵素」とは、酵素活性を発現する核酸を指し、例えばリボザイム、ＤＮＡエンザイム、ＤＮＡ酵素（金属を取り込んで酵素活性を発現する核酸）などが例示される。
【００１５】
「リボザイム」とは、触媒機能をもつＲＮＡを指す。触媒機能とはＲＮＡの特定の部位を特異的に切断する働きをいう。
「ハンマーヘッド型リボザイム」は、基質であるＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）と相補的塩基対を形成して結合し、ＮＵＨ（ＮはＡ，Ｇ，Ｃ，Ｕであり、  ＨはＡ，Ｃ，Ｕである。いずれの組み合わせでもよいがＧＵＣがもっともよく切断される。）配列の３’側でそのリン酸ジエステル結合を切断するリボザイムである（図１）。
【００１６】
「アンチセンスＲＮＡ」、「アンチセンスＤＮＡ」とは、標的となるＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）またはＤＮＡに相補的に結合し、それらの機能を阻害する核酸をいう。標的がｍＲＮＡの場合、アンチセンスＲＮＡがｍＲＮＡに結合し、これによってタンパク質への翻訳が阻害される。
「アプタマー」とは、ある特定のタンパク質に高い親和性をもって結合するＲＮＡ分子をいう。病原性の原因となるタンパク質に特異的に作用するアプタマーは、そのタンパク質の機能を細胞内で阻害できると考えられる。
【００１７】
「ポリメラーゼＩＩＩ（「ｐｏｌ  ＩＩＩ」ともいう）プロモーター」は、リボザイム等の短いＲＮＡ分子の発現に適したプロモーターであり、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーターなどが例示される。
「ｔＲＮＡｖａｌプロモーター」（「ｔＲＮＡｖａｌ」ともいう）とは、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの一種でありｔＲＮＡ等の短いＲＮＡ分子の転写に関与するプロモーターを意味する。
「ターミネーター」とは、ｍＲＮＡ転写終結部分の遺伝子をいう。
「ランダム化」とは、リンカー配列の塩基において各塩基に対しＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃすべての塩基が導入されたもののプールを作製することである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は細胞内、細胞質内または核内で高安定で高機能な核酸を選択する方法を提供する。本発明は、実施態様により、ｔＲＮＡプロモーター  とリボザイムとを繋ぐリンカー部分をランダム化したｔＲＮＡリボザイム発現プラスミドのプールから、高安定で高活性なリボザイムを一定の選択圧のもとで選択可能にする方法を提供する。
【００１９】
本発明方法で選択される核酸分子は高機能性であることを特徴とするが、ここで「高機能性」とは核酸分子の転写量、細胞内での安定性、細胞内局在性、活性を含めて全体的に優れていることを意味し、選択圧の種類、強度を変化させることにより様々な高機能核酸の選択が可能である。細胞内での機能性核酸の機能が変わる原因としては、該核酸が配列依存的に様々な高次構造をとり、様々なタンパクによる認識パターンが変化するためと考えられる。例えば核酸分解酵素により認識されやすい核酸は細胞内で不安定になるし、あるいは、輸送受容体に認識された核酸は適切な場所に局在することになる。
【００２０】
本発明により選択された高機能核酸の塩基配列を調べることで、細胞内で効率的に機能するために必要な配列ならびに高次構造上の特徴を知ることができるが、このような情報は将来的な個体への応用に向けた高効率核酸発現系の開発に役立つだけでなく、細胞内での核酸の運命を決定づけるタンパク、経路、機構の解析にも役立てることができる。
【００２１】
細胞内で高機能な核酸分子を選択する方法について説明する。
本発明の方法は、核酸分子の一部か、または該核酸分子に連結する他の核酸、にランダム化配列を含む候補核酸配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを細胞に導入し、該細胞を培養して該核酸分子を発現させ、該細胞を回収し破壊して全細胞抽出液、細胞質画分または核画分を調製し、該全細胞抽出液または該画分の各々を一定時間インキュベートし、該全細胞抽出液、細胞質画分または核画分中に残留した核酸分子を得ることを含む（図３）。
【００２２】
本方法の特徴は、核酸分子の一部か、または該核酸分子に連結する他の核酸（特に一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ）において、その構造が変化しうる部分がランダム化されていること、また細胞を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで安定性、転写量、細胞内局在、活性などの選択圧に基づいてスクリーニングが行われることである。さらに、得られた所望の核酸分子に対して上記と同じサイクルを１回以上繰り返すが但し全細胞抽出液、細胞質画分または核画分をインキュベートする時間を直前のサイクルよりも長くとる場合には、分子内でより安定性の増した核酸分子、すなわちより高活性な核酸分子を得ることができる（図４、図５）。
【００２３】
本発明において対象となる核酸分子の種類は特に制限されないものとする。例えば核酸酵素（リボザイム、ＤＮＡエンザイム、ＤＮＡ酵素など）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アプタマー、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドなどが例示される。好適な核酸分子はリボザイム、特にハンマーヘッド型リボザイムである（図１）。
ランダム化の例として、核酸分子をコードする配列とプロモーター配列との間に存在させるリンカー配列がランダム化される（図２ａ）。リンカー配列の長さは特に制限はなく、１塩基以上、通常１〜１，０００塩基、好ましくは１０〜１００塩基である。
【００２４】
発現ベクターは、核酸分子を細胞内で発現可能にするためにプロモーターを含んでいる。プロモーターは特に制限はないが、核酸分子がリボザイムである場合、プロモーターとしてポリメラーゼＩＩプロモーター、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用可能であり、とりわけポリメラーゼＩＩＩプロモーター、特にｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーターが例示され、ｔＲＮＡプロモーターが好ましく、ｔＲＮＡＶａｌプロモーター（「ｔＲＮＡＶａｌ」ともいう）またはその改変体がより好ましい。ｔＲＮＡＶａｌを含む発現ベクターの例はｐＵＣ  ｄｔプラスミドであり、ユニークなＥｃｏＲ  ＩとＰｓｔ  Ｉ部位を含み、またアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を含有している（Ｋｏｓｅｋｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：１８６８−１８７７  （１９９９））。発現系を構築するためのベクターとしては、その他に、ｐＵＣ１９（寶酒造）、ｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ（ライフテックオリエンタル）、ｐＨａＭＤＲ  （Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９０５−９１５  （１９９５））、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが例示できる。ベクターには目的の遺伝子およびプロモーターの他に、複製開始点、ターミネーター（転写終結配列）、選択マーカー遺伝子（抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子など）等のエレメントを必要に応じて含み得る。
【００２５】
ベクターの細胞への導入法は、慣用のものが使用でき、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リポソームによる方法などをあげることができる。
ランダム配列を含む合成ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ増幅（条件についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）参照）  を行い増幅ＤＮＡ断片を得る。この場合断片の各末端に所望の制限酵素部位（好ましくは発現ベクターのユニーク制限部位と同一）が形成されるようにプライマーが設計されるのがよい。ＤＮＡ断片を、制限処理された発現ベクターに組み込み、このベクターで大腸菌等の細菌宿主を形質転換し、適当な培地にてインキュベーション（または培養）を行い、抗生物質耐性なクローンを選択し、ランダム化プールとする（図２ｂ）。
【００２６】
次にランダム化プールを用いて哺乳動物細胞（例えばＨｅＬａ細胞、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞など）をトランスフェクションし、選択圧に掛ける。すなわち培養後、細胞を機械的（例えばホモジナイゼーション等）または化学的（例えば低浸透圧、リゾチーム等）方法によって破壊し、細胞抽出液、細胞質画分または核画分を調製し、一定時間（例えば３０分、６０分、１２０分など）インキュベートする。これにより、安定性の高い核酸分子が残留するので、これを回収する。このとき、核酸分子に相補的な配列をもつＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、核酸分子の存在量（または転写量）をハイブリダイゼーションの程度（例えばスポットの大きさや濃淡）から決定できる。あるいは、核酸分子が核酸酵素である場合には、その酵素活性を測定することによって機能の程度を確認できる。リボザイムの活性は、基質ＲＮＡの活性を指標に、その切断活性を測定することによって評価される（Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１８８６−１８９１  （１９９９））。つまり、基質ＲＮＡの活性が低いほど、切断活性が高いことを示す。あるいは、細胞質画分および核画分における核酸分子の存在（例えばハイブリダイゼーション法により決定）から局在を決定することができる。
【００２７】
本発明方法では、得られた機能性核酸についてさらに、ベクターへの組み込み、哺乳動物細胞のトランスフェクション、全細胞抽出液、細胞質画分または核画分の調製とインキュベーションを含む上記サイクルを１回以上繰り返すことができる。むしろサイクルを繰り返すことによって、より安定で機能性の核酸分子を得ることができる場合が多い（図４、図５）。この場合、インキュベーション時間は直前のサイクルよりも長くとるとよい。例えば前回のサイクルで３０分のインキュベーション時間であれば、今回のサイクルでは６０分、次回のサイクルでは１２０分のインキュベーション時間とすることができる。
【００２８】
細胞内安定性については以前から研究が行われており、細胞内で安定なリボザイムは不安定なものに比べ高い活性を示すことが確認されている（Ｓ．  Ｋｏｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １８６８  （１９９９））。しかし、リボザイムの高次構造と安定性の相関性については全く分かっておらず、高機能リボザイムを設計するためにも早期の解明が望まれてきたが、本発明において細胞内からスクリーニングした安定性の高いリボザイムをＺｕｋｅｒ法（Ｚｕｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：１３３−１４８  （１９８１））により二次構造予測を行うことで、高次構造と安定性の相関性が解明できる。これにより、二次構造の予測から安定で活性の高いリボザイムを容易に設計できるようになる。
【００２９】
細胞内局在性については、細胞内からのスクリーニングにより、さらに高効率に輸送されるリボザイムを選択することができる。例えば、リボザイムの輸送と競合するＲＮＡをコードしたプラスミドを過剰に加え、リボザイムの輸送経路を飽和状態にさせることにより、より高効率に細胞質に輸送されるリボザイムの選択が可能である。
【００３０】
本発明ではｉｎ  ｖｉｖｏでのスクリーニングを行うため、実際に選択されたリボザイムが細胞内で効果的に働くことは確実である。また、発現系とリボザイムのつなぎ方について注目され研究された例はほとんどなく、特に今回のようにリンカーの最適化を目指した研究は初めての試みである。スクリーニングにより得られたリボザイムの特徴から、さらに高機能なリボザイム発現系を設計し、従来の発現系と比較して高いリボザイム活性を示すことが明らかとなれば、個体への応用が可能である。
【００３１】
本発明はさらに、上記方法によって選択された、細胞内で高安定で高機能な核酸分子を提供する。該核酸分子の例は、リボザイムである。本発明では、対応の対照核酸分子と比較して細胞内の転写量、安定性または活性が増大したか、あるいは細胞内局在性が変化した核酸分子を特徴としている。そのような分子の例は、細胞質局在性、高安定性および高活性のリボザイムである。本発明の方法で選抜可能な、上記の特徴をもつ核酸分子はすべて、本発明に包含されるものとする。
【００３２】
【実施例】
本発明を以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されることはない。
（実施例１）初期プールの構築と安定性に優れたリボザイムのスクリーニング
公知の方法（Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：２８４−２８９  （１９９８）；  Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ２：６１７−６２７  （１９９８））に従って、ｔＲＮＡＶａｌプロモーターの下流にランダムな配列のリンカーを介してリボザイム配列を挿入した発現ベクターを構築した（図２）。この初期プールには塩基配列の異なるリンカーをもつリボザイム発現ベクターが多数含まれている。
【００３３】
この発現ベクターを一定量、トランスフェクション試薬（Ｔｒａｎｓ  １Ｔ−ＬＴ１試薬；Ｐａｕ  Ｖｅｒａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を用いＨｅＬａＳ３  細胞にトランスフェクションした。約２４時間後、細胞を回収し、細胞抽出液を調製した。この抽出液を３７ｏＣで一定時間保温し、細胞内の核酸分解酵素への耐性により安定性の高いリボザイムの選択を行った。
【００３４】
リボザイムを精製後、ＲＴ−ＰＣＲにより選択されたリボザイム配列をコードした二本鎖ＤＮＡを得た。これらの遺伝子配列をプラスミドに挿入し、リボザイム発現ベクターとして調製した。一部のリボザイムについてはクローニング後、シークエンシングを行いランダム部分の配列を確かめた。操作の一連の流れを図３に示す。
【００３５】
これらの発現ベクターを再びＨｅＬａＳ３細胞へトランスフェクションした後、細胞の回収、抽出液の調製を同様の手順で行った。抽出液の３７ｏＣでの保温時間を２倍に延ばし、さらに安定なリボザイムの選択を行った。リボザイムの精製後、ＲＴ−ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを得、これらの遺伝子配列をプラスミドに挿入し、再びリボザイム発現ベクターを調製した。
【００３６】
さらに次のサイクルでは、保温時間を前サイクルの２倍に延ばし（最初の４倍）同様の操作を行った。
（実施例２）選択されたリボザイムの安定性
選択されたリボザイムの安定性は以下のようにして評価した。それぞれのサイクルで選択したリボザイム（ジェネレーション１〜３；Ｇ−１〜Ｇ−３）をコードした発現プラスミドをバルク（それぞれのリボザイム発現ベクターが混ざっている）の状態で、一定量ＨｅＬａＳ３  細胞にトランスフェクションし、  約２４時間後のリボザイム存在量をノーザンハイブリダイゼーション法により確認した。細胞内で安定なリボザイムほど核酸分解酵素による分解に時間がかかるので、定常状態では安定なリボザイムほど存在量が多く見える。細胞抽出ＲＮＡをアガロースゲルで泳動し、核酸吸着メンブレンにトランスファーさせた後、５’末端標識したリボザイムに相補的な配列を持つＤＮＡプローブ（５’−ａｃａ  ｔｃａ  ｃｇｔ  ｔｔｃ  ｇｇｃ  ｃｔｔ  ｔｃｇ  ｇｃｃ  ｔｃａｔｃａ  ｇｃｇ  ｃｇｇ  ａａｔ−３’；配列番号１）をハイブリダイズ（ハイブリダイゼーション条件：Ａｍｂｉｏｎ  ＵＬＴＲＡｈｙｂブッファー；４２℃；一晩）させた。その後、存在量をＳＴＯＲＭ８３０  イメージアナライザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）で検出した。その結果、ジェネレーションがあがるごとに存在量が増えていることが分かった（図４）。これは、セレクションサイクルを回すごとにより安定なリボザイムが選択されてきている結果である。これにより、本発明が細胞内で高機能な核酸の選択を行う上で効果的に機能することが確かめられた。
【００３７】
（実施例３）選択されたリボザイムの細胞内での標的ＲＮＡ切断活性効果
本発明で利用したリボザイムはルシフェラーゼの遺伝子を標的としているので、それぞれのジェネレーションで得られたリボザイムのルシフェラーゼｍＲＮＡの切断活性を調べることで、安定性の増加がリボザイム活性を上昇させるかどうかを確かめた（Ｋｕｗａｂａｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１８８６−１８９１  （１９９９））。まず、ルシフェラーゼの遺伝子をゲノム中に組み込んだＨｅＬａＳ３細胞由来の形質転換細胞に、初期プール、Ｇ−１、Ｇ−２で得られた安定性の高いリボザイム発現プラスミドをバルクの状態でトランスフェクションした。一定時間培養後、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を指標にリボザイムの効果を評価した。このときコントロールとしてルシフェラーゼの遺伝子を標的としたｔＲＮＡリボザイムについても活性の比較を行った。その結果、リボザイムのルシフェラーゼｍＲＮＡ切断効果はジェネレーションがあがるごとに顕著になり、ジェネレーション２では約８０％の抑制効果を示した（図５）。このことから、本発明が安定性に優れ、細胞内で高活性なリボザイムの選択に有効であることが確かめられた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の方法は、細胞内で効率よく機能する高活性核酸分子の選択に利用できる。また、高機能リボザイムの持つリンカー配列を元にして高効率リボザイム発現系を開発することも可能であり、この発現系は将来、癌やエイズ等の悪性疾患の治療に応用することができる。本発明はリボザイムだけでなく様々な機能性核酸の選択に有効であり、用いる核酸、選択圧の種類を変えることにより幅広い応用が可能である。
【００３９】
【配列表】
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【００４０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：人工配列の説明：ＤＮＡプローブ
配列番号２：人工配列の説明：ｔＲＮＡ−Ｌｕｃ  ＧＵＡ  Ｒｚの配列
【図面の簡単な説明】
【図１】リボザイムの基質領域と酵素活性保持領域への分割（図１ａ）、ならびにリボザイムの構造と基質切断部位（図１ｂ）を示す。
【図２】ｔＲＮＡＶａｌ−ランダム化リンカー配列−リボザイムの構造（図２ａ）、ならびに該構造を含む発現ベクターの構築（図２ｂ）を示す。
【図３】安定性に優れたリボザイムの選択手順を示す。対照としてのｔＲＮＡ−Ｌｕｃ  ＧＵＡ  Ｒｚの構造は図１ａ（配列番号２）と同じである。
【図４】ハイブリダイゼーションによる存在量を指標にしてリボザイムの安定性を調べた結果を示す。サイクルの回数が増すほど、すなわちＧ−１、Ｇ−２、Ｇ−３となるにつれて、リボザイムの存在量（初期プールを１とする相対値）が増大していることが分る。
【図５】ルシフェラーゼｍＲＮＡを基質とするリボザイムの切断活性を示す。図中、ｐＵＣ−ｄｔはリボザイム配列非含有の発現ベクター、ｔＲＮＡ−Ｌｕｃ  Ｒｚ（図１ａ）は従来のリボザイム（対照）、Ｇ−１，Ｇ−２はそれぞれ第１回、第２回目のサイクルから得られたリボザイムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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