(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列(配列番号：１)：
Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe
5                  10                  15
Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala
20
で表される大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチドが、下記：
(ａ)第４アスパラギンがトレオニンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｂ)第４アスパラギンがトレオニンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｃ)第４アスパラギンがリジンで、第５イソロイシンがトレオニンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｄ)第４アスパラギンがセリンで、第２２チロシンがグルタミンで置換されている；
(ｅ)第４アスパラギンがセリンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｆ)第４アスパラギンがトレオニンで、第１２メチオニンがグリシンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｇ)第４アスパラギンがトレオニンで、第１２メチオニンがロイシンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｈ)第４アスパラギンがリジンで、第５イソロイシンがセリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｉ)第２リジンがバリンで、第４アスパラギンがリジンで、第５イソロイシンがトレオニンで、第２２チロシンがグルタミンで各々されている；および
(ｊ)第４アスパラギンがリジンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている：
のように置換されていることを特徴とする、大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体(ＭＳＴ)。
【請求項２】
請求項１に記載の大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体をコードする遺伝子。
【請求項３】
異種タンパク質をコードする遺伝子と融合した請求項２に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項４】
前記異種タンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の遺伝子の開始コドンの直前に挿入される、下記塩基配列(配列番号：２)：
5'-GAGGTGTTTT-3'
の大腸菌エンテロトキシンIIシャイン−ダルガノ配列変形体をさらに含む、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項６】
発現ベクターがpT14S1SH-4T22QまたはpT14S1SH-4T20V22Qである、請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項８】
微生物が形質転換された大腸菌である、請求項７記載の微生物。
【請求項９】
形質転換された大腸菌が大腸菌HM10011(KCCM-10137)または大腸菌HM10012(KCCM-10138)である、請求項８記載の微生物。
【請求項１０】
請求項７に記載の形質転換された微生物を培養して異種タンパク質を生産してペリプラズムに分泌させ；ペリプラズムから異種タンパク質を回収する工程を含む、微生物内異種タンパク質を生産する方法。
【請求項１１】
形質転換された微生物が、大腸菌HM10011(KCCM-10137)またはHM10012(KCCM-10138)である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
異種タンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体、そのペプチド変形体をコードする遺伝子、異種タンパク質をコードする遺伝子と融合した前記遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された微生物およびその微生物を用いて異種タンパク質を産生する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
多くの異種タンパク質は、遺伝的に組換えられた宿主微生物を用いて細胞内方法と分泌方法によって生産された。
【０００３】
細胞内方法においては、異種タンパク質をコードする遺伝子が微生物の細胞質内で発現され、蓄積される。この方法では、比較的高い異種タンパク質収率が得られることが知られているが、発現された異種タンパク質は天然の活性形態でなく、Ｎ−末端にメチル化された形態である。さらに、この方法によって生産された生物学的に不活性な異種タンパク質はしばしば不溶性の封入体を形成するため、リフォールディング工程によって可溶化させた後、天然の活性形態に転換しなければならない。
【０００４】
分泌方法においては、シグナルペプチドと異種タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子が微生物の細胞質で発現され、次いで融合タンパク質が微生物のシグナルペプチダーゼによって切断されて、細胞膜を通過しながらシグナルペプチドが除去される。切断されたタンパク質は、微生物の細胞(内)膜と外膜との間の細胞周辺腔(periplasm space、ペリプラズム)に分泌される。しかし、この方法は、細胞内方法に比べて低い異種タンパク質収率しか得られないことが知られている。したがって、分泌方法の生産性を改善する必要がある。このような観点から、発現された融合タンパク質のシグナルペプチド部分をシグナルペプチダーゼによって正確で、かつ効率的に切断することが分泌された異種タンパク質の収率を高めるのに重要であることが報告されている(Akita, M. et al., J. Biol., Chem., 265, 8164(1990))。
【０００５】
一般に、シグナルペプチドは親水性シグナルペプチドと疎水性シグナルペプチドの二つのグループに分類される。親水性シグナルペプチドは、通常１２〜７０個のアミノ酸からなっている。大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチドのような典型的な疎水性シグナルペプチドは１２〜３０個のアミノ酸を含み、１つまたは２つの塩基性アミノ酸を含むＮ−末端親水性領域；約１０個の塩基性アミノ酸を含む中間の疎水性領域；および小さい側鎖を有するアミノ酸を含むＣ−末端親水性領域の３領域からなる。
【０００６】
シグナルペプチドと融合した形で発現される異種タンパク質は、しばしば細胞質タンパク質分解酵素によって迅速に分解され、シグナルペプチドの分泌効率が低くなるにつれて分泌される異種タンパク質の収率も減少する。したがって、分泌される異種タンパク質の収率は、宿主微生物内に発現される融合タンパク質のシグナルペプチド部分を変形させることによって高められる。
【０００７】
ヒト成長ホルモン(hＧＨ)は、１９１個のアミノ酸残基からなり、２１,０００Ｄａの分子量を有する。１９５６年初めてヒト脳下垂体から精製された形態のhＧＨが分離された後(Li and Papkoff, Science, 124, 1293(1956))、ヒト代謝へのhＧＨの影響(Beck, J. C. et al Science, 125, 884(1957))、および脳下垂体性矮小症に対するhＧＨの抑制活性(Raben, M. S., J. Clin., Endocrinol., 18, 901(1958))など、hＧＨを明らかにしようとする多くの研究が行われた。最近は、hＧＨがターナー症候群、骨多孔症、創傷および火傷の治療に有用であることが報告された。
【０００８】
ヒトの脳下垂体から得られるhＧＨ量は限られているため、遺伝的に組換えられた大腸菌を用いた細胞内方法によって大量のhＧＨを生産することが試みられた(Goeddel, D.V. et al., Nature, 281, 544(1979))。しかし、この方法は、ヒトへの適用に合わない前記メチル化されたhＧＨを生産するという問題を有する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩを用いてこのメチル化されたhＧＨからメチオニンを除去してみたが非常に低いhＧＨ収率を示した。
【０００９】
したがって、天然hＧＨの分泌生産が試みられた。たとえば、ヨーロッパ特許第５５９４２号、第２０１４７号および第１１４６９５号は、天然型hＧＨを発現させ、分泌させて回収する方法を開示している。しかし、これらの方法によって生産されたhＧＨの回収量は微々たるものであった。
【００１０】
ヨーロッパ特許第１７７,３４３号は、hＧＨとアルカリ性ホスファターゼまたはエンテロトキシンシグナルペプチドの融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現誘導剤としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトサイド(ＩＰＴＧ)の存在の下で発現させ、hＧＨをペリプラズムに分泌させる工程を含むhＧＨの生産方法を開示している。しかし、この方法は、低いhＧＨ収率を示し、しかも高価な発現誘導剤であるＩＰＴＧを用いなければならない。
したがって、高収率でhＧＨを効果的に生産する方法の開発が求められていた。
【００１１】
発明の要約
したがって、本発明の主な目的は、異種タンパク質を生産する分泌方法において分泌効率を増加させるために用いられる大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ペプチドをコードする遺伝子を提供することである。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、異種タンパク質をコードする遺伝子と融合した前記遺伝子を含むベクターを提供することである。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、前記ベクターで形質転換された微生物を提供することである。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、前記微生物を用いて異種タンパク質を生産する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の一実施態様によって、下記アミノ酸配列(配列番号：１)で表される大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチドの第２、第４、第５、第１２、第２０および第２２アミノ酸の少なくとも一つが他のアミノ酸で置換され、第２および第４アミノ酸の少なくとも一つがリジンであることを特徴とする、大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体(ＭＳＴ)が提供される：
【化３】
0003701201.tif 000002
【００１７】
図面の簡単な説明
本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な説明によって明らかになる。
図１は、ベクターｐＴ−hＧＨの構築過程を示す。
図２は、ベクターｐＵＣ１９ＳＴおよびｐＵＣ１９ＳＨの構築過程を示す。
図３は、ベクターｐＴ１４ＳＳＨの構築過程を示す。
図４は、ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨの構築過程を示す。
図５は、精製されたhＧＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体(ＭＳＴｓ)のうち、
第２アミノ酸リジンが置換されておらず；
第４アミノ酸アスパラギンがセリン、トレオニン、リジンまたはグルタミンで置換され；
第５アミノ酸イソロイシンが置換されていないか、または、トレオニンまたはセリンで置換され、
第１２アミノ酸メチオニンが置換されていないか、または、アラニン、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換され；
第２０アミノ酸アスパラギンが置換されていないか、または、イソロイシン、フェニルアラニンまたはバリンで置換され；また
第２２アミノ酸チロシンが置換されていないか、または、グルタミン、アスパラギン、アラニンまたはリジンで置換されていることが好ましい。
【００１９】
また、
第２アミノ酸リジンが他のアミノ酸で置換され；
第４アミノ酸アスパラギンがリジンで置換され；
第５アミノ酸イソロイシンがセリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミンまたはアルギニンで置換され；
第１２アミノ酸メチオニンが置換されていないか、または、アラニン、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換され；
第２０アミノ酸アスパラギンが置換されていないか、または、イソロイシン、フェニルアラニンまたはバリンで置換され；また
第２２アミノ酸チロシンが置換されていないか、または、グルタミン、アスパラギン、アラニンまたはリジンで置換されていることが好ましい。
【００２０】
さらに好ましいＭＳＴｓは、下記アミノ酸置換セットのいずれか一つを有するものである：
(ａ)第４アスパラギンがトレオニンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｂ)第４アスパラギンがトレオニンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｃ)第４アスパラギンがリジンで、第５イソロイシンがトレオニンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｄ)第４アスパラギンがセリンで、第２２チロシンがグルタミンで置換されている；
(ｅ)第４アスパラギンがセリンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｆ)第４アスパラギンがトレオニンで、第１２メチオニンがグリシンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｇ)第４アスパラギンがトレオニンで、第１２メチオニンがロイシンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｈ)第４アスパラギンがリジンで、第５イソロイシンがセリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている；
(ｉ)第２リジンがバリンで、第４アスパラギンがリジンで、第５イソロイシンがトレオニンで、第２２チロシンがグルタミンで各々されている；および
(ｊ)第４アスパラギンがリジンで、第２０アスパラギンがバリンで、第２２チロシンがグルタミンで各々置換されている。
【００２１】
本発明のＭＳＴは、遺伝コードによってＭＳＴアミノ酸配列から類推される塩基配列を含む遺伝子によってコードされる。コドン縮重性によって同一アミノ酸をコードする種々のコドンが存在することは周知の事実であるため、本発明のＭＳＴはＭＳＴアミノ酸配列から類推されるすべての塩基配列を含む。好ましくは、ＭＳＴ遺伝子が一つ以上の大腸菌選好コドンを含む。
【００２２】
ＭＳＴ遺伝子は、天然型大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子(STII遺伝子)のヌクレオチドの一つ以上を部位−特異的突然変異法(Papworth, C. et al., Strategies, 9, 3(1996))を用いて変異させることによって製造することができる。大腸菌ＳＴＩＩ遺伝子は、通常の方法(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA(1989))を用いて得られる。また、ＭＳＴ遺伝子は化学的に合成することができる。
【００２３】
本発明のＭＳＴは、異種タンパク質と融合すると大腸菌のような微生物の細胞膜を通過して異種タンパク質を非常に効率的に分泌する。したがって、異種タンパク質をコードする遺伝子と融合したＭＳＴ遺伝子を含む発現ベクターを用いて、ＭＳＴと異種タンパク質の融合タンパク質(ＭＳＴ／異種タンパク質)を大腸菌の細胞質で発現させ得、この融合タンパク質は効率的に切断されてＭＳＴ残基が除去されることによって、異種タンパク質が大腸菌のペリプラズムに迅速に放出され得る。
【００２４】
ＭＳＴ遺伝子と異種タンパク質をコードする遺伝子の融合は通常の連結反応(Sambrook et al., vide supra)に従って行い得る。
【００２５】
代表的な異種タンパク質としては、ヒト成長ホルモン(hＧＨ)、顆粒球−コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、インターフェロン、インターロイキン、プロウロキナーゼ、インスリン、第VIII因子、ヒルジン、スーパーオキシドジスムターゼおよびカルシトニンを挙げることができるが、これらは本発明に使用され得る異種タンパク質を限定するものではない。異種タンパク質をコードする遺伝子はcＤＮＡライブラリースクリーニングおよびポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)のような通常の方法によって得られる。
【００２６】
本発明の発現ベクターは、ＭＳＴ遺伝子の開始コドンの直前に挿入される、下記塩基配列(配列番号：２)の大腸菌エンテロトキシンIIシャイン−ダルガノ配列変形体(ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体)をさらに含み得る：
【化４】
5'-GAGGTGTTTT-3'
【００２７】
ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体は、４つのヌクレオチド長さのＳＴＩＩ  ＳＤ配列(ＧＡＧＧ)と６つのヌクレオチド長さのＴが豊富な配列からなる。ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体のＳＴＩＩ  ＳＤ配列は非常に強いリボゾーム結合部位を提供することによって、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトサイド(ＩＰＴＧ)のような発現誘導剤がなくても発現レベルを増加させる。ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体のＴ−豊富配列は、これらから転写されたｍＲＮＡの２次構造の形成を防ぐ役割をすることによって発現効率を増加させる。ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体は、化学合成のような通常の方法(Sambrook et al.,上記参照)に従って製造することができる。また、下記塩基配列(配列番号：３)を有するＳＤＩＩ  ＳＤ遺伝子を部位−特異的突然変異法を行うことによってＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体を得る。
【化５】
5'-GCTCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGAAAAAGAATA-3'
【００２８】
ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体をＭＳＴ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの前に挿入するか、ＭＳＴ遺伝子のＡＴＧコドン前のＳＴＩＩ  ＳＤ配列を変形させ得る。
【００２９】
本発明の発現ベクターの例としては、実施例１〜１０で製造されるpT14S1SH-4T22Q, pT14S1SH-4T20V22Q, pT14S1SH-4K5T22Q, pT14S1SH-4S22Q, pT14S1SH-4S20V22Q, pT14S1SH-4T12G20V22Q, pT14S1SH-4T12L20V22Q, pT14SSH-4K5S22Q, pT14SSH-2V4K5T22QおよびpT14SSH-4K20V22Qがあり、好ましいベクターはpT14S1SH-4T22QおよびpT14S1SH-4T20V22Qである。
【００３０】
本発明の発現ベクターは通常の形質転換方法(Sambrook et al.,上掲)に従って大腸菌のような微生物に導入され得る。形質転換された微生物のうち、特許手続の目的で微生物寄託の国際的認定に関するブダペスト条約に基づいて、韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)(住所：120-749大韓民国ソウル西大門区延世大学工学部食品工学科)に１９９８年８月１２日付で寄託番号第ＫＣＣＭ−１０１３７号および第ＫＣＣＭ−１０１３８号として寄託された形質転換体大腸菌ＨＭ１００１１およびＨＭ１００１２が好ましい。
【００３１】
異種タンパク質は、形質転換体微生物を培養してＭＳＴ／異種タンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させ、異種タンパク質をペリプラズムに分泌させた後、ペリプラズムから異種タンパク質を回収することによって生産される。形質転換体微生物は通常の方法(Sambrook et al.,上掲)に従って培養することができる。微生物培養液を遠心分離または濾過して異種タンパク質を分泌する微生物を収穫する。形質転換された微生物を通常の方法 (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989))に従って破砕してペリプラズム溶液を得る。たとえば、微生物を蒸留水のような生理水溶液中で浸透圧衝撃によって破砕することができる。ペリプラズム溶液中の異種タンパク質の回収は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーまたはイムノカラムクロマトグラフィーのような通常の方法(Sambrook et al.,上掲)に従って行い得る。たとえば、hＧＨはＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーおよびセファデックスＧ−１００カラムクロマトグラフィーを順次行って精製することができる。
【００３２】
本発明によって生産される異種タンパク質は、Ｎ−末端がメチル化されていない天然型であるため、そのまま種々の用途に使用できる。
【００３３】
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３４】
製造例１：ヒト成長ホルモンcＤＮＡ遺伝子のスクリーニング
(段階１)ヒト脳下垂体ＤＮＡライブラリーの製造
ヒト脳下垂体１ｇにグアニジン溶液１０ml(４Ｍグアニジンイソシアネート、５０ｍＭ  Ｔris−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％２−メルカプトエタノール)を加え、均質化した。この均質化溶液を６℃、１０,０００rpmで１０分間遠心分離した。上澄液に２％エーテルサルコシル(Sigma,米国)を１／１０容量で加え、この混合物を６５℃で２分間維持した。この溶液に塩化セシウムを０.１ｇ／mlの濃度で加え、この混合物を緩衝液(５.７Ｍ  ＣｓＣｌおよび０.１ｍＭ  ＥＤＴＡ)９ml上で２５,０００rpmで１６時間遠心分離してＲＮＡ沈澱物を得た。沈澱物を懸濁溶液(５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５％サルコシルおよび５％メルカプトエタノール)３mlに溶かした後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(２５：２４：１、ｖ／ｖ／ｖ)混合液とクロロホルム／イソアミルアルコール(２４：１、ｖ／ｖ)混合物で順次抽出した。この混合抽出物に３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０容量、エタノールを２.５容量で加え、この混合物を通常の方法(Sambrook et al.,上掲)に従って遠心分離してＲＮＡ沈澱物を得た。このＲＮＡ沈澱物を蒸留水に溶かした後、７０℃で１０分間維持した。これに塩化リチウムを０.５Ｍの濃度で加えた後、オリゴ−ｄＴ−セルロースクロマトグラフィー(Type 3, Collaboratory Research, 米国)を行ってアビブおよびレダーの方法 (Aviv, H and Leder P., J. Mol. Biol., 134, 743 (1972)) に従ってポリ(Ａ)＋ ＲＮＡを分離した。得られたポリ(Ａ)＋ ＲＮＡを６５℃で５分間処理した後、０℃まで冷却し、直ちにこれに５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ２０μl、５ｘ緩衝液４０μl(0.25 M Ｔris-HCl, pH 8.3, 0.5 M KCl, および50 ｍＭ MgCl2)、２００ｍＭ  ＤＴＴ  １０μl、０.５ｍｇ／mlオリゴ(ｄＴ１２−１８)(Pharmacia Inc., スウェーデン)２０μl、蒸留水８０μl、ＲＮＡｓｉｎ(Promega, 米国)１０μl(１０単位)およびＡＭＶ逆転写酵素 (Life Science Inc., 米国) ２０μl(２０単位)を加えた。この混合物を４２℃で９０分間反応させた後、この反応混合物に０.５Ｍ  ＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)５μlとＴris緩衝フェノール２００μlを加えて混合した後、室温で１０,０００rpmで１０分間遠心分離した。上澄液をジエチルエーテルで２回抽出した後、混合した抽出液を３Ｍアセト酸ナトリウム２０μlと９５％エタノール１mlと混合して一本鎖cＤＮＡ(ｓｓ  cＤＮＡ)を沈澱させた。
【００３５】
このｓｓ  cＤＮＡから二本鎖cＤＮＡ(ｄｓ  cＤＮＡ)を合成するために、ｓｓ  cＤＮＡ沈澱物を蒸留水２８４μlに溶かした後、これに５ｍＭ  ＮＴＰｓ  ４０μl、５ｘ第２鎖(ＳＳ)緩衝液(250ｍＭ Ｔris-HCl(pH 7.2), 450ｍＭ KCl, 15ｍＭジチオトレオトール, 15ｍＭ MgCl2 および0.25mg/mlウシ血清アルブミン)８０μl、５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋  １２μl、３０００Ｃｉ／ｍＭｏｌ[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰ  ２μl、大腸菌ＤＮＡリガーゼ４μl(４単位)および大腸菌ポリメラーゼＩ  １０μl(１００単位)を加えた。混合物を１４℃で１６時間反応させた後、反応混合物を前述のようにフェノール抽出とエタノール沈澱を行ってｄｓ  cＤＮＡ沈澱物を得た。
【００３６】
ｄｓ  cＤＮＡの平滑断面を作るために、ｄｓ  cＤＮＡ沈澱物を蒸留水４２μlに溶かし、これにdNTPｓ  ５μl、５ｘＳＳ緩衝液１６μl、５ｍＭβ−ＮＡＤ＋  １μl、ＲＮアーゼ  Ａ  ４μl(２μｇ／ml、Biolabs、米国)、ＲＮアーゼＨ  ４μl(４単位)、大腸菌ＤＮＡリガーゼ２μl(２０単位)およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ４μl(８単位)を加え、この混合物を３７℃で４５分間反応させた。反応が終了した後、反応混合物を前述のようにフェノール抽出とエタノール沈澱を行って平滑末端のｄｓ  cＤＮＡ沈澱物を得た。
【００３７】
ｄｓ  cＤＮＡのＥcoＲＩ制限部位をメチル化によって保護するために、平滑末端ｄｓ  cＤＮＡ沈澱物を蒸留水２５μlに溶かし、これに２ｘメチラーゼ緩衝液(１００ｍＭ  Ｎａｃｌ、１００ｍＭ  Ｔris−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ)２７μl、５０ｘＳＡＭ溶液(酢酸ナトリウム(ｐＨ５.２)０.１４ml)１μlに溶かしたＳ−アデノシルメチオニン１ｍｇ)およびＥcoＲＩメチラーゼ(Biolabs、米国) １０μl(１０単位)を加えた。この混合物を３７℃で２時間反応させた後、反応混合物を前述のようにフェノール抽出およびエタノール沈澱を行う。沈澱したcＤＮＡをＥcoＲＩリンカー(Biolabs、米国)とＴ４  ＤＮＡリガーゼと合せた後、混合物を４℃で１６時間反応させてＥcoＲＩリンカーが連結されたcＤＮＡを得た。
【００３８】
ＥcoＲＩリンカーが連結されたcＤＮＡをＥcoＲＩで処理した後、セファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーを行って残留リンカーを除去した。ＥcoＲＩリンカーが連結されたcＤＮＡをλgt１１(Amersham、米国)のＥcoＲＩ部位に挿入した。得られたλgt１１をλインビトロパッケージングキット(Amersham Co.,米国)を用いてインビトロパッケージングを行い、これから大腸菌Ｙ１０８８(ＡＴＣＣ３７１９５)を形質移入させてヒト脳下垂体cＤＮＡライブラリーを得た。
【００３９】
(段階２)ヒト成長ホルモンcＤＮＡ遺伝子のスクリーニング
段階１で製造したcＤＮＡライブラリーからヒト成長ホルモンクローンをスクリーンするために、プラークハイブリッド形成法を次のように行った。
【００４０】
報告されたヒト成長ホルモンのＮ−末端のアミノ酸配列(Liu, W. K., et al, Biochem. Biophys. Acat., 93, 428 (1964); Li, C. H., et al., J. Amer. Chem. soc., 88, 2050(1966))に基づき、下記塩基配列で表される３０ヌクレオチド切片の混合配列オリゴヌクレオチドプローブを考案した：
【化６】
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg(配列番号: 4)
【化７】
5'-TTCCCAACCATTCCCTTATCCAGG-3'(配列番号: 5)
【００４１】
１次プラークハイブリッド形成法は、混合配列オリゴヌクレオチドプローブを用いてベントン等の方法(Benton, W. E., et al., Science, 196, 180 (1977)に従って行うことによって陽性クローンを得た。これらのクローンは、２次および３次プラークハイブリッド形成法を行ってヒト成長ホルモンcＤＮＡ遺伝子を得た。
【００４２】
このクローンがヒト成長ホルモン遺伝子を有するかを確認するために、クローニングされたファージＤＮＡをＥcoＲＩで切断し、次いでＤＮＡ切片を混合配列オリゴヌクレオチドプローブを用いてサーザーンブロット(Southern, E., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975))を行った。また、ヒト成長ホルモン遺伝子を含む０.６５ｋｂ  ＥcoＲＩ切片をＭ１３ｍｐ１８ベクター(Pharmacia、米国)のＥcoＲＩ部位に挿入してベクターＭ１３−hＧＨを得た。ベクターＭ１３−hＧＨのヒト成長ホルモン遺伝子の塩基配列をジデオキシ−媒介連鎖終結方法(dideoxy-mediated chain-termination method)(Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977))を用いて決定した。
【００４３】
製造例２：成熟ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子の製造
成熟ヒト成長ホルモンをコードするcＤＮＡ遺伝子を製造するために、製造例１の段階２から得られたベクターＭ１３−hＧＨを下記のプライマーＳ１とＡＳ１を用いてＰＣＲを行った。センスプライマーＳ１は、成熟ヒト成長ホルモンの１番目アミノ酸(フェニルアラニン)に対するコドンから上流にＮdeＩ制限部位(5'-CATATG-3')を提供するように考案され、アンチセンスプライマーＡＳ１はこれらの停止コドンから下流にＢamＨＩ制限部位(5'-GGATCC-3')を提供するように考案された。
【化８】
センスプライマー  S1(配列番号: 6):
5'-CCGCATATGTTCCCAACCATTCCC-3'
【化９】
アンチセンスプライマー  AS1(配列番号: 7):
5'-GCTGGATCCTAGAAGCCACAGCTGC-3'
【００４４】
増幅されたヒト成長ホルモン遺伝子をＮdeＩおよびＢamＨＩで切断して成熟ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子(hＧＨ遺伝子)を得た。hＧＨ遺伝子をベクターｐＥＴ１４ｂ(Movagen、米国)のＮdeＩ／ＢamＨＩ部位に挿入してベクターｐＴ−hＧＨを得た。
【００４５】
図１は、前記ベクターｐＴ−hＧＨの構築過程を示す。
【００４６】
製造例３：大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
(段階１)大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子のクローニング
大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子を製造するために、大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチドの塩基配列に基づいて下記の相補的なオリゴヌクレオチド一対を考案し、ＤＮＡ合成器(Model 380B, Applied Biosystem, USA)を用いて合成した。
【化１０】
センス鎖オリゴヌクレオチド  STII S1(配列番号: 8)
5'-TCATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTT
TTCTATTGCTACAAATGCCTACGCGT-3'
【化１１】
アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドSTII AS1(配列番号: 9)
5'-ACGCGTAGGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAACATAGATGCA
AGAAGAAATGCGATATTCTTTTTCATGA-3'
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、大腸菌エンテロトキシンIIの開始コドンから上流にＮcoＩおよびＢspＨＩ制限部位と他の末端にサイレント変異によって導入されたMluＩ制限部位を有するように考案された。
【００４８】
二つのオリゴヌクレオチドは、９５℃でアニーリングして大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチドをコードする塩基配列(ＳＴＩＩ遺伝子)を有する、平滑末端のｄｓ  ＤＮＡ切片を得た。
【００４９】
ＳＴＩＩ遺伝子をベクターｐＵＣ１９(Biolabs、米国)のＳｍａＩ部位に挿入してベクターｐＵＣ１９ＳＴを得た。
【００５０】
(段階２)ＳＴＩＩ／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子の製造
ＳＴＩＩ／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を製造するために、製造例２から得られたベクターｐＴ−hＧＨを製造例２で使用されたプライマーＳ２とＡＳ１を用いてＰＣＲを行った。センスプライマーＳ２は、成熟ヒト成長ホルモンの第１アミノ酸(フェニルアラニン)に対するコドンから上流にMluＩ制限部位(5'-CATATG-3')を提供するように考案された。
【化１２】
センスプライマー  S2(配列番号: 10)
5'-GCGACGCGTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3'
【００５１】
増幅されたＤＮＡ切片をＭluＩとＢamＨＩで切断した後、段階２で得られたｐＵＣ１９ＳＴのＭluＩ／ＢamＨＩ部位に挿入した。得られたベクターｐＵＣ１９ＳＨは、ＳＴＩＩ／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子(ＳＴＩＩ−hＧＨ遺伝子)を含む。
【００５２】
図２は、前記ベクターｐＵＣ１９ＳＴとｐＵＣ１９ＳＨの構築過程を示す。
【００５３】
(段階３)ＳＴＩＩ−hＧＨ遺伝子に大腸菌エンテロトキシンIIシャイン−ダルガノ配列の添加
段階２で得られたベクターｐＵＣ１９ＳＨをＢspＨ１とＢamＨＩで切断して６４０ｂｐ  ＳＴＩＩ−hＧＨ切片を得、これをベクターｐＥＴ１４ｂ(Novagen、米国)のＮcoＩ／ＢamＨＩ部位に挿入してベクターｐＴ１４ＳＨを得た。
【００５４】
ベクターｐＴ１４ＳＨをプライマーＳ３およびＡＳ３を用いてＰＣＲを行った。センスプライマーＳ３は大腸菌エンテロトキシンIIシャイン−ダルガノ配列(ＳＴＩＩ  ＳＤ配列)とＸbaＩ制限部位を提供するように考案され、アンチセンスプライマーＡＳ３は、成熟hＧＨの停止コドンから下流にＢamＨＩ制限部位を提供するように考案され、その結果、ＳＴＩＩ  ＳＤとＳＴＩＩ−hＧＨの融合遺伝子を含むＤＮＡ切片(ＳＴＩＩ  ＳＤ‐ＳＴＩＩ−hＧＨ)を得た。
【化１３】
センスプライマー  S3(配列番号: 11)
5'-GCTCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATA-3'
【化１４】
アンチセンスプライマー  AS3(配列番号: 12)
5'-GGATGCCACGCTGGATCCTAGAAAGCCACAGCTGC-3'
【００５５】
ＳＴＩＩ  ＳＤ−ＳＴＩＩ−hＧＨ切片をＸbaＩとＢamＨＩで切断した後、ベクターｐＥＴ１４ｂ(Movagen、米国)のＸbaＩ／ＢamＨＩ部位に挿入してベクターｐＴ１４ＳＳＨを得た。大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene、米国)をベクターｐＴ１４ＳＳＨで形質転換させて大腸菌ＨＭ１００１０と命名された形質転換体を得た。
【００５６】
図３は、前記ベクターｐＴ１４ＳＳＨの構築過程を示す。
【００５７】
実施例４：ＳＴＩＩ−hＧＨ遺伝子を用いたhＧＨの生産
大腸菌エンテロトキシンII  ＳＤ配列がhＧＨ生産に及ぼす影響を調査するために、製造例３の段階３で得られたベクターｐＴ１４ＳＨで形質転換された大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)と製造例３の段階３で得られた大腸菌ＨＭ１００１０を各々発現誘導体(ＩＰＴＧ)の存在下および非在下でＬＢ培地(１％バクト−トリプトン、０.５％バクト酵母抽出物および１％ＮａＣｌ)中、３７℃で２４時間培養した。各培養液を１０,０００rpmで１０分間遠心分離して細菌細胞を沈澱させ、この沈澱物を１／１０体積の上澄液(２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７.０を含む１０ｍＭ  Ｔris−Ｃｌ緩衝液)に懸濁させた。この懸濁液を室温で３０分間放置した後、１０,０００rpmで１５分間遠心分離して細菌細胞を集めた。細胞を４℃で蒸留水にさらに懸濁した後、１２,０００rpmで２０分間遠心分離してペリプラズム溶液として上澄液を得た。ペリプラズム液中のhＧＨ濃度は、hＧＨに対する抗原(Boehringer Mannheim)を用いてＥＬＩＳＡ方法に従って分析し(Kato, K. et al., J. IｍＭunol., 116, 1554(1976))、これを培養液１ｌ当りhＧＨ生産量として計算した。結果を表Ｉに示す。
【表１】
表Ｉ
0003701201.tif 000003
【００５８】
表Ｉから分かるように、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列を含むベクターｐＴ１４ＳＳＨは発現誘導剤ＩＰＴＧがなくてもhＧＨを高レベルで生産する。
【００５９】
(実施例１〜１０)
実施例１〜１０は、ＭＳＴ／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作を記載し、ここでＭＳＴは大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体を意味する。製造例３の段階３で得られたプラスミドｐＴ１４ＳＳＨのＳＴＩＩ遺伝子またはＳＴＩＩ  ＳＤ配列を、部位−特異的突然変異法(Papworth, C. et al., Strategies, 9, 3(1996))に従って変形された塩基配列を有するセンスプライマーとセンスプライマーに相補的な塩基配列を有するアンチセンスプライマーを用いてプラスミドＰＣＲを行って変形させた。
【００６０】
実施例１〜１０で得られた大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド変形体ＭＳＴｓ(ＭＳＴ１〜ＭＳＴ１０)は、ＳＴＩＩとともに表ＩＩに特徴づけられており、実施例１〜１０の準備過程は下記の通りである。
【表２】
表II
0003701201.tif 000004
【００６１】
実施例１：ＭＳＴ１／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
(段階１)
製造例３の段階３で得られたベクターｐＴ１４ＳＳＨを、ＳＴＩＩの第４コドン(ＡＴＴ)がトレオニンコドン(ＡＣＡ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ４とＡＳ４を用いてＰＣＲを行った。
【化１５】
センスプライマー S4(配列番号: 23):
5'-GGTGTTTTATGAAAAAGACAATCGCATTTCTTC-3'
【化１６】
アンチセンスプライマー AS4(配列番号: 24):
5'-GAAGAAATGCGATTGTCTTTTTCATAAAACACC-3'
【００６２】
得られたベクターをＸbaＩとMluＩで切断して０.１ｋｂ  ＸbaＩ／MluＩ切片を得、これをベクターｐＴ１４ＳＳＨのＸbaＩ／MluＩ部位に挿入してベクターｐＴ１４ＳＳＨ−４Ｔを得た。ベクターｐＴ１４ＳＳＨ−４ＴはＳＴＩＩの第４アミノ酸の代りにトレオニンを有するＳＴＩＩ変形体／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００６３】
(段階２)
ベクターpT14SSH-4Tを、ＳＴＩＩの第２２コドン(ＡＡＴ)がグルタミンコドン(ＣＡＡ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ５とＡＳ５を用いてＰＣＲを行うことによってベクターpT14SSH-4T22Qを得た。
【化１７】
センスプライマー S5(配列番号: 25):
5'-CAAATGCCCAAGCGTTCCCA-3'
【化１８】
アンチセンスプライマー AS5(配列番号: 26):
5'-TGGGAACGCTTGGGCATTTG-3'
【００６４】
ベクターpT14SSH-4T22Qは、ＳＴＩＩの第４と第２２アミノ酸が各々トレオニンとグルタミンに置換されたＭＳＴ１／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００６５】
(段階３)
ベクターpT14SSH-4T22Q を、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列から転写されたｍＲＮＡの２次構造の形成を防ぐためにＳＴＩＩ  ＳＤ配列5'-GAGG-3'とＳＴＩＩ開始コドンの間に下記６個の塩基配列を有する下記の相補的なプライマーＳ６とＡＳ６を用いてＰＣＲを行った。
【化１９】
センスプライマー S6(配列番号: 27):
5'-TCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGA-3'
【化２０】
アンチセンスプライマー AS6(配列番号: 28):
5'-TCATAAAACACCTCAACCTCTAGA-3'
【００６６】
このように得られたベクターpT141SH-4T22Qは、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩ第４と第２２アミノ酸が各々トレオニンとグルタミンに置換されたＭＳＴ１／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００６７】
図４は、前記ベクターpT14S1SHの構築過程を示す。
【００６８】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14S1SH-4T22Qで形質転換して大腸菌ＨＭ１００１１と命名された形質転換体を得たが、この形質転換体は、韓国微生物保存センター(ＫＣＣＭ)に１９９８年８月１２日付で寄託番号第ＫＣＣＭ−１０１３７号として寄託した。
【００６９】
実施例２：ＭＳＴ２／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
ＳＴＩＩの第２０と第２２コドン(ＡＡＴとＴＡＡ)が各々バリンとグルタミンコドン(ＧＴＴとＣＡＡ)に置換されるように考案された下記の相補的なＳ７とＡＳ７を用いたことを除いては、実施例１の段階２の手順を繰返してベクターpT14SSH-4T20V22Qを得た。
【化２１】
センスプライマー S7(配列番号: 29):
5'-GTTTTTTCTATTGCTACAGTTGCCCAAGCGTTCCCAACCATTCCC-3'
【化２２】
アンチセンスプライマー AS7(配列番号: 30):
5'-GGGAATGGTTGGGAACGCTTGGGCAACTGTAGCAATAGAAAAAAC-3'
【００７０】
次いで、ベクターpT14SSH-4T20V22Qを用いたことを除いては、実施例１の段階３の手順を繰返してベクターpT14S1SH-4T20V22Qを得た。ベクターpT14S1SH-4V20V22Qは、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩの第４、第２０および第２２アミノ酸が各々チロシン、バリンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ２／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００７１】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をpT14S1SH-4T20V22Qで形質転換して大腸菌HM10012と命名された形質転換体を得たが、この形質転換体は、韓国微生物保存センター(ＫＣＣＭ)に１９９８年８月１２日付で寄託番号第ＫＣＣＭ−１０１３８号として寄託した。
【００７２】
実施例３：ＭＳＴ３／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
ＳＴＩＩの第４と第５コドン(ＡＡＴとＡＴＣ)が各々リジンとトレオニンコドン(ＡＡＧとＡＣＡ)に置換されるように考案された下記の相補的なＳ８とＡＳ８を用いたことを除いては、実施例１の段階１の手順を繰返してpT14SSH-4K5Tを得た。
【化２３】
センスプライマー S8(配列番号: 31):
5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGACAGCATTTCTTC-3'
【化２４】
アンチセンスプライマー AS8(配列番号: 32):
5'-GAAGAAATGCTGTCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3'
【００７３】
ベクターpT14SSH-4K5Tを用いて実施例１の段階２の手順を繰返してベクターpT14SSH-4K5T22Qを得た。
【００７４】
次いで、ベクターpT14SSH-4K5T22Qを用いて実施例１の段階３の手順を繰返してベクターpT14S1SH-4K5T22Qを得た。ベクターpT14S1SH-4K5T22Qは、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩの第４、第５および第２２アミノ酸配列が各々リジン、トレオニンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ３／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００７５】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14S1SH-4K5T22Qで形質転換して大腸菌HM10013と命名された形質転換体を得た。
【００７６】
実施例４：ＭＳＴ４／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
ＳＴＩＩの第４コドン(ＡＡＴ)がセリンコドン(ＴＣＴ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ９とＡＳ９を用いたことを除いては、実施例１の段階１の手順を繰返してベクターpT14SSH-4Sを得た。
【化２５】
センスプライマー S9(配列番号: 33)
5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGTCTATCGCATTTCTTC-3'
【化２６】
アンチセンスプライマー AS9(配列番号: 34)
5'-GAAGAAATGCGATAGACTTTTTCATAAAACACCTC-3'
【００７７】
ベクターpT14SSH-4Sを用いて実施例１の段階２の手順を繰返すことによってベクターpT14SSH-4S22Qを得た。
【００７８】
次いで、ベクターpT14SSH-4S22Q を用いて実施例１の段階３の手順を繰返すことによってベクターpT14S1SH-4S22Qを得た。ベクターpT14S1SH-4S22Qは、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩの第４、第２２アミノ酸配列が各々セリン、グリシンに置換されたＭＳＴ４／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００７９】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14S1SH-4S22Qで形質転換して大腸菌HM10014と命名された形質転換体を得た。
【００８０】
実施例５：ＭＳＴ５／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
実施例４で得られたベクターpT14SSH-4Sと実施例２で用いられたプライマーＳ７とＡＳ７を用いたことを除いては、実施例１の段階２の手順を繰返してベクターpT14SSH-4S20V22Qを得た。
【００８１】
次いで、ベクターpT14SSH-4S20V22Qを用いて実施例１の段階３の手順を繰返すことによってベクターpT14S1SH-4S20V22Qを得た。ベクターpT14S1SH-4S20V22Q は、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩの第４、第２０および第２２アミノ酸配列が各々セリン、バリンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ５／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００８２】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14S1SH-4S20V22Q で形質転換して大腸菌HM10015と命名された形質転換体を得た。
【００８３】
実施例６：ＭＳＴ６／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
実施例２で得られたベクターpT14SSH-4T20V22Q を、ＳＴＩＩの第１２コドン(ＡＴＧ)がグリシンコドン(ＧＧＴ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ１０とＡＳ１０を用いてＰＣＲを行うことによってベクターpT14SSH-4T12G2OV22Qを得た。
【化２７】
センスプライマー S10(配列番号: 35):
5'-GCATTTCTTCTTGCATCTGGTTTCGTTTTTTCTATTGC-3'
【化２８】
アンチセンスプライマー AS10(配列番号: 36):
5'-GCAATAGAAAAAACGAAACCAGATGCAAGAAGAAATGC-3'
【００８４】
次いで、ベクターpT14SSH-4T12G20V22Qを用いて実施例１の段階３の手順を繰返すことによってベクターpT14S1SH-4T12G20V22Qを得た。ベクターpT14S1SH-4T12G20V22Qは、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩの第４、第１２、第２０および第２２アミノ酸配列が各々トレオニン、グリシン、バリンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ６／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００８５】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14S1SH-4T12G20V22Q で形質転換して大腸菌HM10016と命名された形質転換体を得た。
【００８６】
実施例７：ＭＳＴ７／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
実施例６で得られたベクターpT14SSH-4T12G20V22Q を、ＭＳＴ６の第１２コドン(ＧＧＴ)がロイシンコドン(ＣＴＴ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ１１とＡＳ１１を用いてＰＣＲを行うことによってベクターpT14SSH-4T12L2OV22Qを得た。
【化２９】
センスプライマー S11(配列番号: 37):
5'-GCATTTCTTCTTGCATCTCTTTTCGTTTTTTCTATTGC-3'
【化３０】
アンチセンスプライマー AS11(配列番号: 38):
5'-GCAATAGAAAAAACGAAAAGAGATGCAAGAAGAAATGC-3'
【００８７】
次いで、ベクターpT14SSH-4T12L20V22Qを用いて実施例１の段階３の手順を繰返すことによってベクターpT14S1SH-4T12L20V22Qを得た。ベクター pT14S1SH-4T12L20V22Qは、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体とＳＴＩＩの第４、第１２、第２０および第２２アミノ酸配列が各々トレオニン、ロイシン、グリシン、バリンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ７／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００８８】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14S1SH-4T12L20V22Q で形質転換して大腸菌HM10017と命名された形質転換体を得た。
【００８９】
実施例８：ＭＳＴ８／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
ＳＴＩＩの第４と第５コドン(ＡＡＴとＡＴＣ)が各々リジンとセリン(ＡＡＧとＴＣＴ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ１２とＡＳ１２を用いてＰＣＲを行ったことを除いては、実施例１の段階１の手順を繰返してベクターpT14SSH-4K5Sを得た。
【化３１】
センスプライマー S12(配列番号: 39):
5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGTCTGCATTTCTTC-3'
【化３２】
アンチセンスプライマー AS12(配列番号: 40):
5'-GAAGAAATGCAGACTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3'
【００９０】
ベクターpT14SSH-4K5Sを用いて実施例１の段階２の手順を繰返すことによってベクターpT14SSH-4K5S22Qを得た。ベクターpT14SSH-4K5S22Qは、ＳＴＩＩの第４、第５および第２２アミノ酸が各々リジン、セリンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ８／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００９１】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14SSH-4K5S22Q で形質転換して大腸菌HM10018と命名された形質転換体を得た。
【００９２】
実施例９：ＭＳＴ９／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
ＳＴＩＩの第２、第４および第５コドン(ＡＡＡ、ＡＡＴおよびＡＴＣ)が各々バリン、リジンおよびトレオニンコドン(ＧＴＴ、ＡＡＧおよびＡＣＡ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ１３とＡＳ１３を用いたことを除いては、実施例１の段階１の手順を繰返してベクターpT14SSH-2V4K5T を得た。
【化３３】
センスプライマー S13(配列番号: 41):
5'-GAGGTGTTTTATGGTTAAGAAGACAGCATTTCTTC-3'
【化３４】
アンチセンスプライマー AS13(配列番号: 42):
5'-GAAGAAATGCTGTCTTCTTAACCATAAAACACCTC-3'
【００９３】
ベクターpT14SSH-2V4K5Tを用いて実施例１の段階２の手順を繰返してベクターpT14SSH-2V4K5T22Qを得た。ベクターpT14SSH-2V4K5T22QはＳＴＩＩの第２、第４、第５および第２２アミノ酸が各々バリン、リジン、トレオニンおよびグルタミンに置換されたＭＳＴ９／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００９４】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14SSH-2V4K5T22Q で形質転換して大腸菌HM10019と命名された形質転換体を得た。
【００９５】
実施例１０：ＭＳＴ１０／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの製作
ＳＴＩＩの第４コドン(ＡＡＴ)がリジンコドン(ＡＡＧ)に置換されるように考案された下記の相補的なプライマーＳ１４とＡＳ１４を用いたことを除いては、実施例１の段階１の手順を繰返してベクターpT14SSH-4K を得た。
【化３５】
センスプライマー S14(配列番号: 43):
5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGATCGCATTTCTTC-3'
【化３６】
アンチセンスプライマー AS14(配列番号: 44):
5'-GAAGAAATGCGATCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3'
【００９６】
ベクターpT14SSH-4Kを用いて実施例１の段階２の手順を繰返すことによってベクターpT14SSH-4K22Qを得た。
【００９７】
ベクターpT14SSH-4K22Qを実施例２で用いられたプライマーＳ７とＡＳ７を用いてＰＣＲを行うことによってベクターpT14SSH-4K20V22Qを得た。ベクターpT14SSH-4K20V22Qは、ＳＴＩＩの第４、第２０および第２２アミノ酸が各々リジン、バリンおよびグルタミンで置換されたＭＳＴ１０／hＧＨ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００９８】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)をベクターpT14SSH-4K20V22Q で形質転換して大腸菌HM10020と命名された形質転換体を得た。
【００９９】
実施例１１：ＭＳＴ／hＧＨ遺伝子を用いたhＧＨの生産
ＭＳＴがhＧＨの生産に及ぼす影響を調査するために、ＩＰＴＧなしに実施例１〜１０で得られた形質転換体(大腸菌HM10011〜HM10020)を用いて製造例４の手順を繰返した。製造例３の段階３で得られた形質転換体HM10010が対照群として用いられた。hＧＨの濃度は培地１ｌ当りhＧＨ生産量として計算した。その結果を表IIIに示す。
【表３】
表III
0003701201.tif 000005
【０１００】
表IIIから分かるように、ＭＳＴ遺伝子を含む本発明の各ベクターは、天然ＳＴＩＩを含む対照群ベクターｐ１４ＳＳＨより高収率でhＧＨを生産する。また、本発明のベクターのうち、ＳＴＩＩ  ＳＤ配列変形体を含むものが天然型ＳＴＩＩ  ＳＤ配列を含むベクターに比べて高い濃度のhＧＨに達している。
【０１０１】
実施例１２：hＧＨの精製
実施例１で製造された形質転換体大腸菌HM10011をＬＢ培地で培養しながらＩＰＴＧを用いてＭＳＴ／hＧＨ遺伝子の発現を誘導した後、６,０００rpmで２０分間遠心分離して製造例４の手順を繰返して細胞からペリプラズム液を得た。
【０１０２】
ペリプラズム液をｐＨ５.３〜６.０に調整した後、ｐＨ５.８に前−平衡化したＤＥＡＥ−セファロース(Pharmacia Inc., スウェーデン)カラムに吸着させた後、カラムを１０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で洗浄した。hＧＨを２０ｍＭ、４０ｍＭおよび８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出させ、hＧＨを含む分画を集めて合せた。
【０１０３】
合せた分画をフェニルセファロース(Pharmacia Inc., スウェーデン)カラムクロマトグラフィーを行って９９％の純度を有するhＧＨを得、さらにセファデックスＧ−１００(Pharmacia Inc., スウェーデン)カラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１０４】
精製したhＧＨ分画をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を行ってhＧＨの純度と大略の濃度を決定した後、ＥＬＩＳＡを行ってこの分画の正確なhＧＨ濃度を決定した。
【０１０５】
図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示し、ここで第１列はサイズ標識タンパク質であり、第２例は精製されたhＧＨである。図５から分かるように、本発明の形質転換体を培養することによって高濃度の純粋なhＧＨが得られる。
【０１０６】
また、hＧＨのＮ−末端アミノ酸配列を決定し、この結果は、本発明によって生産されたhＧＨはＮ−末端がメチル化されていないことを示す。
【０１０７】
本発明を上記に具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ることは勿論である。
【０１０８】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharma. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-第５地
下記国際寄託当局により、規則7.1に基づいて発行される原寄託についての受託証
0003701201.tif 000006
１  規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託当局の地位を獲得した日である：国際寄託当局の地位を獲得した後、ブダペスト条約外で行われた寄託をブダペスト条約に基づく寄託に移管する場合、この日は国際寄託当局が微生物受領した日である。
【０１０９】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
寄託者：Hanmi Pharma. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-第５地
下記国際寄託当局により、規則7.1に基づいて発行される原寄託についての受託証
0003701201.tif 000007
１  規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託当局の地位を獲得した日である：国際寄託当局の地位を獲得した後、ブダペスト条約外で行われた寄託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託当局が微生物受領した日である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ベクターｐＴ−hＧＨの構築過程を示す。
【図２】  図２は、ベクターｐＵＣ１９ＳＴおよびｐＵＣ１９ＳＨの構築過程を示す。
【図３】  図３は、ベクターｐＴ１４ＳＳＨの構築過程を示す。
【図４】  図４は、ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨの構築過程を示す。
【図５】  図５は、精製されたhＧＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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