(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（１）抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト哺乳動物を、抗原の投与間隔が１〜５日毎、及び初回免疫から最終免疫までの期間が１〜２５日となるように、免疫する工程、
（２）最終免疫の１〜４日後に該動物から抗体産生細胞を取り出す工程、
（３）該抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて融合細胞を取得する工程、並びに
（４）目的の抗原に特異的なIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞をクローニングする工程、
を含む、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の製造方法。
【請求項２】
免疫する工程が、２〜４日毎に２〜４回、抗原を投与するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
非ヒト哺乳動物がNC/Ngaマウスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
抗体産生細胞が、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血リンパ細胞からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ミエローマ細胞が、非ヒト哺乳動物と同種の動物に由来する細胞、又はヒトに由来する細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物と同種の動物に由来する細胞がP3U1株である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗原が卵白アルブミン、オボムコイド、ラクトグロブリン、カゼイン及びダニ抗原からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて製造される、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により融合細胞を製造し、製造された融合細胞を培養し、分泌された抗原特異的IgEモノクローナル抗体を取得することを含む、抗原特異的IgEモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１１】
下記工程：
（１）抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト哺乳動物を、抗原の投与間隔が１〜５日毎、及び初回免疫から最終免疫までの期間が１〜２５日となるように、免疫する工程、
（２）最終免疫の１〜４日後に該動物から抗体産生細胞を取り出す工程、
（３）該抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて融合細胞を取得する工程、並びに
（４）目的の抗原に不応性のIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞をクローニングする工程、
を含む、目的の抗原に対して不応性の抗原不応性IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により融合細胞を製造し、製造された融合細胞を培養し、分泌された抗原不応性IgEモノクローナル抗体を取得することを含む、目的の抗原に対して不応性の抗原不応性IgEモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１３】
下記a)〜e)のいずれかである、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて製造された、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
a) 受託番号がFERM P-18517である、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて製造された卵白アルブミン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞；
b) 受託番号がFERM P-18519である、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて製造されたオボムコイド特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞；
c) 受託番号がFERM P-18523である、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて製造されたβラクトグロブリン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞；
d) 受託番号がFERM P-18524である、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて製造されたカゼイン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞；及び
e) 受託番号がFERM P-18526である、NC/Ngaマウス由来の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて製造されたダニ抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体、融合細胞及びその作製方法に関する。具体的には、本発明は、抗原特異的IgEモノクローナル抗体、抗原不応性IgEモノクローナル抗体、それらを産生する融合細胞、及びそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
KohlerとMilshtein (1975)によりモノクローナル抗体の製造方法が開発されて以来、多種多様の抗原に対するモノクローナル抗体が提供されてきた。モノクローナル抗体は、単一エピトープに特異的に結合する特性を有するため、免疫学の分野のみならず、医学、基礎生物学、農学、工学などの多分野において広く利用されている。
【０００３】
研究用試薬として市販されているモノクローナル抗体だけでも10000種類程度あると推定されるが、そのほとんどはIgGクラス（IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3）又はIgMクラスのモノクローナル抗体である。一方、IgEクラスのモノクローナル抗体を産生する融合細胞株は、現在のところTNP（2,4,6-トリニトロフェニル）、DNP（ジニトロフェニル）、Ars（p-azophenylarsonate）、日本住血吸虫、宮崎肺吸虫、卵白アルブミン、βラクトグロビン、メリチン（Melittin[蜂毒]）、ベンジルペニシロール（benzylpenicilloyl）、及び哺乳動物腫瘍ウイルス（mammary tumour virus）の１０種類の融合細胞株が報告されている（例えば、Boettscher I., Haemmerling G. and Kapp J. F., Nature, 275, 761, 1978, Eshhar Z., Ofarim M. and Waks T, J. Immunol., 124, 775-780, 1980など）。このうち一般に入手可能なものはSPE-7株に由来するDNPに対するIgEクラスモノクローナル抗体のみであるため、アレルギー研究の進展の大きな障害となっている。
【０００４】
モノクローナル抗体産生融合株を得るため細胞融合を行う場合、血清中のイムノグロブリン濃度を反映する頻度で各クラスのイムノグロブリン産生融合細胞が得られるものと考えられる。ヒト血清中にはイムノグロブリンが約19 mg/ml、IgEは約0.00005 mg/ml、マウス血清中にはイムノグロブリンが約５mg/ml、IgEは約0.00005 mg/ml存在する。また、通常モノクローナル抗体産生融合細胞を得る際には目的の抗原に対する抗体産生細胞の数を上げるため、融合に用いるマウスを過度に免疫するために、IgG又はIgMを産生するB細胞の数が増加する。この細胞集団を用いて融合すると通常はIgG又はIgMを産生する融合細胞が作製される。これらの事実から、IgE産生融合細胞を得る確率は1/100,000以下と推察され、「IgE産生融合細胞を得ることは確率的に極めて低く」、IgE産生融合細胞を得ることは非常に困難であると判断される。現在までに確立された抗原特異的IgEクラスモノクローナル抗体産生融合細胞株は、養子免疫法や血清中のIgE抗体濃度を上昇させると考えられている方法を用いて作出されているが、前記の抗原特異的IgEクラスモノクローナル抗体産生融合細胞株以外の報告は見当たらない。
現在のところ、「目的とする抗原特異的IgEクラスモノクローナル抗体産生融合細胞を効率的に製造する技術」は開発されていない。
【０００５】
また、本邦人口の１／３が何らかのアレルギー疾患に罹患し、さらにアレルギー患者は年々増加傾向にあり、アレルギー研究の重要性は加速度的に増している。アレルギーは主として以下に示す機序により起こる。生体内で何らかの抗原刺激により産生されたIgEが体内に分布している肥満細胞（マスト細胞）にIgEレセプターを介して結合する。さらに抗原が肥満細胞上の複数のIgEと結合し架橋反応が誘導され、その刺激が肥満細胞内に伝達され、肥満細胞内のヒスタミンなどのケミカルメディエーターが生体内に放出される。このケミカルメディエーターがさまざまな生体反応を引き起こし、その結果現れた症状がアレルギーであると考えられている。このように抗原特異的IgE抗体がアレルギー疾患の最も重要な起点である。モノクローナル抗体の抗原に対する特異的結合能を使用目的とする場合にはモノクローナル抗体のクラスやサブクラスを特に問題としないが、アレルギーにおける生物活性を目的として用いる場合にはモノクローナル抗体はIgEクラスであることが重要である。アレルギー研究及び抗アレルギー剤の開発等において、抗原特異的IgE抗体を多量に入手することは非常に重要なポイントであり、多種多様なアレルゲンに対するIgEクラスモノクローナル抗体の供給が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、現在までに開発されていない抗原特異的IgEクラスモノクローナル抗体産生融合細胞株を効率的に製造する方法を提供し、該融合細胞株を用いて抗原特異的IgEクラスモノクローナル抗体を安定的に供給することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト動物を目的の抗原で免疫するにあたり、免疫間隔及び免疫期間を従来より短くすると、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株を効率的に取得し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００８】
１．  下記工程：
（１）抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト哺乳動物を、抗原の投与間隔が１〜５日毎、及び初回免疫から最終免疫までの期間が１〜２５日となるように、免疫する工程、
（２）最終免疫の１〜４日後に該動物から抗体産生細胞を取り出す工程、
（３）該抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて融合細胞を取得する工程、並びに
（４）目的の抗原に特異的なIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞をクローニングする工程、
を含む、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の製造方法。
【０００９】
２．  下記工程：
（１）抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト哺乳動物を、抗原を１回投与して免疫する工程、
（２）免疫の１〜４日後に該動物から抗体産生細胞を取り出す工程、
（３）該抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて融合細胞を取得する工程、及び
（４）目的の抗原に特異的なIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞をクローニングする工程、
を含む、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の製造方法。
【００１０】
上記の１又は２の方法において、免疫する工程は、例えば２〜４日毎に２〜４回、抗原を投与するものであり得る。
また非ヒト哺乳動物としては、NC/Ngaマウスが挙げられる。
また抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血リンパ細胞が挙げられる。
【００１１】
ミエローマ細胞としては、例えば、非ヒト哺乳動物と同種の動物に由来する細胞又はヒトに由来する細胞が挙げられ、さらにその非ヒト哺乳動物と同種の動物に由来する細胞は例えばP3U1株である。
さらに抗原としては、卵白アルブミン、オボムコイド、ラクトグロブリン、カゼイン及びダニ抗原が例示される。
【００１２】
３．  上記１又は２の方法により製造された融合細胞。
４．  上記３の融合細胞を培養し、分泌された抗原特異的IgEモノクローナル抗体を取得することを含む、抗原特異的IgEモノクローナル抗体の製造方法。
５．  上記４の方法により製造された抗原特異的IgEモノクローナル抗体。
６．  下記工程：
（１）抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト哺乳動物を、抗原の投与間隔が１〜５日毎、及び初回免疫から最終免疫までの期間が１〜２５日となるように、免疫する工程、
（２）最終免疫の１〜４日後に該動物から抗体産生細胞を取り出す工程、
（３）該抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて融合細胞を取得する工程、並びに
（４）目的の抗原に不応性のIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞をクローニングする工程、
を含む、抗原不応性IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の製造方法。
【００１３】
７．  下記工程：
（１）抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生し得る非ヒト哺乳動物を、抗原を１回投与して免疫する工程、
（２）免疫の１〜４日後に該動物から抗体産生細胞を取り出す工程、
（３）該抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させて融合細胞を取得する工程、及び
（４）目的の抗原に不応性のIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞をクローニングする工程、
を含む、抗原不応性IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の製造方法。
【００１４】
上記６又は７の方法において、免疫する工程は、例えば２〜４日毎に２〜４回、抗原を投与するものであり得る。
また非ヒト哺乳動物としては、NC/Ngaマウスが挙げられる。
また抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血リンパ細胞が挙げられる。
【００１５】
ミエローマ細胞としては、例えば、非ヒト哺乳動物と同種の動物に由来する細胞又はヒトに由来する細胞が挙げられ、さらにその非ヒト哺乳動物と同種の動物に由来する細胞は例えばP3U1株である。
さらに抗原としては、卵白アルブミン、オボムコイド、ラクトグロブリン、カゼイン及びダニ抗原が例示される。
【００１６】
８．  上記６又は７の方法により製造された融合細胞。
９．  上記８の融合細胞を培養し、分泌された抗原不応性IgEモノクローナル抗体を取得することを含む、抗原不応性IgEモノクローナル抗体の製造方法。
１０．  上記９の方法により製造された抗原不応性IgEモノクローナル抗体。
【００１７】
１１．  受託番号がFERM P-18517又はFERM P-18528である、卵白アルブミン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
１２．  オボムコイド特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
１３．  受託番号がFERM P-18522又はFERM P-18523である、βラクトグロブリン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
【００１８】
１４．  カゼイン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
１５．  ダニ抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
１６．  抗原不応性IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞。
１７．  上記１１の融合細胞により産生される卵白アルブミン特異的IgEモノクローナル抗体。
１８．上記１２の融合細胞により産生されるオボムコイド特異的IgEモノクローナル抗体。
【００１９】
１９．上記１３の融合細胞により産生されるβラクトグロブリン特異的IgEモノクローナル抗体。
２０．  上記１４の融合細胞により産生されるカゼイン特異的IgEモノクローナル抗体。
２１．  上記１５の融合細胞により産生されるダニ抗原特異的IgEモノクローナル抗体。
２２．  上記１６の融合細胞により産生される抗原不応性IgEモノクローナル抗体。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．抗原
本発明においては、生体内でIgE抗体の産生を誘導し得るものならば、いずれの抗原を用いてもよい。例えば、卵白アルブミン、オボムコイド、ラクトグロブリン（例えばβラクトグロブリン）、カゼイン（例えばαカゼイン）、ダニ抗原（例えばコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原）、花粉抗原（例えばスギ花粉）、ウシ血清アルブミンなどの、抗原となりうるすべての物質を抗原として好適に使用することができる。これらの抗原は、通常用いられるアジュバント、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣＧ、ハンターズ、タイターマック、ゲルブアジュバント、百日咳毒素、リン酸アルミニウムゲル、水酸化アルミニウムゲルなどの１種類以上を含む適当な緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝液等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくてもよい。
【００２１】
本明細書において用いる用語「アジュバント」とは、抗原と共に投与したとき、その抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。また、本発明で動物を免疫する際に投与する「抗原」には、抗原に上記のようにアジュバントを加えたものも包含するものとする。
【００２２】
２．免疫に用いる動物
免疫に用いる動物としては、ヒト以外の哺乳動物、すなわち非ヒト哺乳動物を用いることができる。具体的には、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、及びマウスなどが挙げられる。また、他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることもできる。
【００２３】
本発明において用いられる非ヒト哺乳動物は、抗原特異的IgE抗体産生能の高いモデル動物であるのが好ましい。その具体的な例として、アトピー性皮膚炎発症マウスモデルであるNC/Ngaマウス、BALB/cマウス、C57BL/6マウス、A/Jマウス、C3H/Heマウス、(BALB/c×A/J)F1マウスなどが挙げられる。例えば、NC/Ngaマウスは、日本チャールズリバー株式会社等から入手することができる。
免疫に用いる動物としてマウスを用いる場合には、３〜１０週齢、特に３〜４週齢のマウスを用いることが好ましい。
【００２４】
３．免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のような抗原を上記のような非ヒト哺乳動物に投与して免疫する。
投与の方法としては、当業者には公知のいずれの方法を使用してもよく、例えば、静脈内投与、皮下投与、又は腹腔内投与を使用することができる。
抗原の投与量は、必要に応じて適宜増減できるが、例えば、非ヒト哺乳動物がマウスの場合、マウス１匹当たり、抗原単独では、１〜５０００μg、好ましくは１００〜１０００μgであり、アジュバントと共に投与するときには、抗原量として０.１〜１０００μg、好ましくは１〜２００μgである。
【００２５】
本発明では、抗原の投与を１回以上行って動物を免疫する。抗原投与は１回でもよいが、１回目の抗原投与（初回免疫）後、所定の間隔を空けて、さらに同じ抗原を投与する追加免疫を行うことがより好ましい。本発明では、初回免疫と追加免疫、及び追加免疫と追加免疫との間の間隔を免疫間隔と呼び、また最後の追加免疫を最終免疫と呼ぶ。抗原の投与が１回のみである場合には、その免疫は初回免疫でありかつ最終免疫となる。
【００２６】
免疫間隔は、従来の方法では通常、１〜８週、好ましくは１〜２週といった期間が用いられてきたが、本発明の方法では、より短い間隔で免疫を行うのが好ましい。具体的には、本発明の方法では、１〜５日の間隔、より好ましくは２〜４日の間隔で免疫を行う。最も好ましくは、免疫間隔は、３日である。免疫間隔は、例えば１〜５日毎の免疫間隔と言う場合は、免疫と免疫との間隔が１〜５日である限り初回免疫から最終免疫まで５日毎などの同じ間隔で免疫するものでもよいし、抗原投与毎に異なる間隔で免疫するものでもよい。
【００２７】
さらに本発明では、抗原投与を２回以上行う場合、初回免疫から最終免疫までの期間（免疫期間と呼ぶ）が１〜２５日、好ましくは１〜２１日、より好ましくは１〜１４、最も好ましくは１〜８日となるような免疫スケジュールで免疫する。従って本発明においては、免疫スケジュールは、上記免疫期間の範囲内となるように免疫間隔と免疫の回数とを定めることによって計画され得る。このようにして定められる免疫の回数は、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜６回である。より好ましくは、３回免疫を行う。
【００２８】
上記の免疫方法に従った具体的な免疫スケジュールとしては、例えば２〜４日毎に２〜４回免疫することが好ましい。さらに好ましくは、３日毎に３回免疫する。この場合初回免疫から最終免疫までの期間は、６日となる。
続いて本発明では、最終免疫から１〜４日後、より好ましくは１〜３日後、最も好ましくは２日後に、抗体産生細胞を採取する。採取する抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ細胞などが挙げられるが、通常は脾臓細胞を用いることが好ましい。
本明細書で用いる場合、１日とは、１２〜２４時間の時間範囲を指す。
【００２９】
４．細胞融合
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が入手可能である株化細胞を使用する事ができるが、そのような株化細胞を新たに作製して使用することもできる。目的の抗体の安定的な産生のためには、抗体産生細胞とミエローマ細胞は同種の動物に由来するものである方がよいが、異種の動物に由来するものでもよい。またミエローマ細胞としてヒト由来のミエローマ細胞を用いることも、目的の抗体をヒト型IgE抗体として産生することができるため有用である。
【００３０】
ミエローマ細胞は、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば、HAT培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ該選択培地で生存できる性質を有するものが好ましい。一般的には、８-アザグアニン耐性株を使用することができる。この細胞株は、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し（HGPRT-）、HAT培地で生育できない。
【００３１】
このようなミエローマ細胞としては、P3X63Ag8U1（P3U1）、P3-X63Ag8、P3/NS1/1-Ag4-1（NS-1）、P3X63Ag8.653（653; ATCC No.CRL1580）、Sp2/0-Ag14、Sp2/0/FO-2等のマウスミエローマ細胞株、210.RCY.Ag1.2.3等のラットミエローマ細胞株、SKO-007等のヒトミエローマ細胞株等を使用できる。特定の抗原で免疫した非ヒト哺乳動物がNC/Ngaマウスの場合、ミエローマ細胞はマウス由来のミエローマ細胞を用いるのが好ましい。特に好ましいミエローマ細胞として、P3U1株が挙げられる。
【００３２】
細胞融合は、例えば、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを混合比１：１０〜１：５の割合で、RPMI1640培地等の培地中で融合促進剤の存在下、室温で１〜７分間細胞同士を接触させることにより行うことができる。このとき、融合促進剤としては、平均分子量１５００〜６０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等を使用することができる。
【００３３】
５．融合細胞の選択及び一次スクリーニング
細胞融合の後、融合した細胞を選択し、さらに一次スクリーニングを行う。
融合細胞の選択方法は、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。融合細胞は、例えば、該融合細胞を選択培地（例えばHAT培地）で培養することにより選択することができる。この際の培養は、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。通常は、３０〜３７℃で１０〜１４日間培養すればよい。
次いで、一次スクリーニングとして、例えば以下のELISA法を用いたIgE産生融合細胞の同定を行うことができる。
【００３４】
抗マウスIgEモノクローナル抗体(例えば、1:100〜1:200希釈、6HD5、YAMASA)をELISAプレートに固相化した後、余剰の抗体を洗い流し、ブロックエース(大日本製薬)等のブロッキング剤でブロックし、余剰のブロッキング液を洗い流す。次に該マイクロプレートの各ウェルに融合細胞の培養上清を加え、反応させた後、余剰の培養上清を洗い流す。次いで、ビオチン化抗マウスIgEモノクローナル抗体(例えば、1:1000〜1:2000希釈、HMK12、YAMASA)を分注、反応させ、余剰の抗体を洗い流す。次に、アルカリフォスファターゼ標識アビジン(例えば、1:10000〜1:200000希釈、アビジン-ALP、Sigma)を分注、反応させ、余剰のアビジン-ALPを洗い流す。アルカリフォスファターゼの基質液を分注し、３０分反応させた後、ELISAプレートリーダーで陽性を示すウェルを選択する。陽性を示したものがIgE産生融合細胞の存在するウェルである。このIgE産生融合細胞は、次のクローニング工程に供する。
【００３５】
なお、上記一次スクリーニングに続いて、陽性を示したウェルの培養上清について、下記の「８．PCA反応」に記載するPCA反応を利用したスクリーニングを行うことにより、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞の存在するウェルを同定してもよい。クローニング工程に供する前に行う、この一次スクリーニングに続くPCA反応を利用したスクリーニングは、任意の工程である。
【００３６】
また、上記一次スクリーニングを行わずに、選択した融合細胞の培養上清について「８．PCA反応」に記載のPCA反応によりスクリーニングを行い、抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞を直接同定し、その融合細胞を次のクローニング工程に供することも可能である。
【００３７】
６．クローニング
上記の通りIgE抗体産生融合細胞が確認されたウェルから目的の融合細胞をクローニングする。クローニング法は、通常の方法に従えばよく、特に限定されないが、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などが挙げられる。さらに、所望の融合細胞株を樹立するために、クローニングされた融合細胞について、下記「７．抗原特異性の確認」〜「９．クラス特異性の確認」に記載されるようにして抗原特異性及びクラス特異性を確認する。
【００３８】
７．抗原特異性の確認
クローニングされた融合細胞株について、目的の抗原特異性を示すことを確認する。この確認には当業者に公知の任意の方法を用いることができるが、例えば好適には、クローニングされた融合細胞株の培養上清又はそれに由来する腹水について、下記「８．PCA反応」に記載のPCA反応を利用した抗原特異性の確認を行うことにより、目的の抗原特異性を示す融合細胞株であることを確認することができる。本発明において「抗原特異性」「抗原特異的」とは、抗体が特定の抗原に対して特異的に抗原抗体反応を引き起こすことを言い、「抗原特異的抗体」とは、目的の抗原に対して特異的に抗原抗体反応を引き起こす抗体を言う。「目的の抗原」とは、その抗原に対する抗体産生細胞を得るために動物を免疫する際に使用した抗原を指す。
【００３９】
なお本工程においては、「５．融合細胞の選択及び一次スクリーニング」に記載の一次スクリーニングでIgE・ELISA陽性（すなわちIgEクラスの抗体を産生すること）が確認された融合細胞株の中から、PCA反応が陰性であり目的の抗原に対し抗原特異性が示されない融合細胞株も同時に得ることができる。そのような融合細胞株から産生されるモノクローナル抗体は、PCA反応において目的の抗原に対してはアレルギー反応を惹起しないIgEクラス抗体であり、本発明では、このようなIgEモノクローナル抗体を「抗原不応性IgEモノクローナル抗体」、該抗体を産生する融合細胞株を「抗原不応性IgE産生融合細胞株」と言う。抗原不応性IgEモノクローナル抗体には、目的の抗原に対し特異的結合を示さない抗体以外に、目的の抗原に対してアレルギー反応を引き起こす生物学的活性を有しない抗体も含まれ得る。これらの抗体については、例えば抗原を固相結合して用いるELISA法により抗原との結合性を確認することができ、また例えば「５．融合細胞の選択及び一次スクリーニング」に記載のELISA法あるいは「９．クラス特異性の確認」に記載のゲル内沈降反応によって、IgEクラスであることを確認することができる。抗原不応性IgEモノクローナル抗体は、本発明の方法により得られる目的の抗原に特異的なIgE抗体の対照として、利用することができる。これらの抗原不応性IgEモノクローナル抗体、該抗体を産生する融合細胞株、該抗体の製造方法も、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００４０】
８．PCA反応
受け身皮膚アナフィラキシー（PCA反応）とは、即時型アレルギーの基本的な反応を測定するための反応である。生体内の肥満細胞の表面に免疫グロブリン（IgE、IgG）が固着し、抗原などで固着した免疫グロブリンの架橋反応が起こると、その刺激が、肥満細胞内にある顆粒の脱顆粒を引き起こし、ヒスタミンやセロトニンなどの化学伝達物質が放出され、アレルギー反応が起こる。PCA反応では、IgE又はIgG（あるいは抗原）をラットなどの皮内に投与し、エバンスブルーなどの色素と抗原液（先に抗原を投与した場合はIgE又はIgG）を静脈内投与し、その結果皮下に漏出した色素のスポットを計測することによりこの反応を測定することができる。本発明では、目的の抗原に対する特異性とIgE抗体活性を確認するために、Ovaryらのラットを用いたPCA反応を利用することができる。なお、抗原特異性の確認のためには他の免疫学的方法を用いることもできるが、PCA反応を利用すると、IgE抗体の生物学的活性も同時に確認することができて有用である。
【００４１】
本発明において、PCA反応に基づいて抗原特異性及びIgE抗体活性を確認する具体的方法として、まずPCA術式を、例えば以下の通りに行うことができる。
Sprague Dawley (SD)ラットの背部の毛をバリカンで刈り、１カ所当たり100μlの希釈サンプルを背部皮内に投与する。希釈サンプルとは、ここでは抗原特異性を確認すべき融合細胞株の培養上清又はそれに由来する腹水を、蒸留水で順次希釈することにより作製した一連の希釈系列を言う。その希釈率は実験条件に合わせて好適に設定することができるが、通常は1:100〜1:25600の希釈率である。希釈サンプル投与から２時間経過以降、好ましくは２時間後〜７２時間の間に、対象の抗原(1 mg/ml)を含む0.5％エバンスブルー溶液を1 ml尾静脈から投与し、その３０分後に皮膚を剥ぎ、皮下に認められるエバンスブルーの漏出スポットの直径を計測する。このPCA術式では、サンプル投与後２時間以上経過して抗原とエバンスブルー溶液を投与し、エバンスブルーの漏出スポットが認められた場合、抗原特異的IgE抗体の反応であることが報告されている。なお、免疫されていない通常の血清サンプルを投与する場合、原液(１倍希釈)を用いてもエバンスブルーの漏出は認められない。
【００４２】
さらに、PCA術式により計測したエバンスブルーの漏出スポットの直径とそれに対応するサンプルの希釈率とに基づき、抗体特異性及び抗体活性を判断する基準となるPCA価を求めることができる。
PCA価は、直径５mm以上の漏出スポットが認められた希釈サンプルに対応する希釈率のうちの最高希釈倍率で表す。一連の希釈サンプルの投与により直径５mm以上の漏出スポットが認められ、PCA価が求められた場合、その対象とした融合細胞株は抗原特異性を示すと判断できる。またPCA価が高いほど、すなわち最高希釈倍率が大きいほど、対象とした融合細胞は抗体活性が高く、IgE抗体を高力価で産生することが示される。具体的にはそのような抗体活性は、例えば、PCA価が1:10〜1:40では低く、1:40〜1:100では中程度であり、1:100〜1:1000では高く、1:1000以上では非常に高いものと判断され得る。通常、PCA価が1:1000以上あれば、十分に高力価の抗体を産生し得る融合細胞であるといえる。
【００４３】
９．クラス特異性の確認
上記のクローニングされた融合細胞株については、「７．抗原特異性の確認」に記載したPCA反応により、IgEクラスの確認が行われる。
また本発明では、例えば、樹立された上記の融合細胞株について新たに形成させた腹水を用いてPCA反応を測定し、目的の抗原特異性及びクラス特異性をさらに確認することもできる。
【００４４】
また、クローニングされた融合細胞株由来の腹水について寒天ゲル内で抗IgEポリクローナル抗体との沈降反応を行い、その融合細胞株が産生する抗体がIgEクラスモノクローナル抗体であることを確認することができる。具体的には、この寒天ゲル内沈降反応において、融合細胞株由来の腹水と隣接した既知IgE抗体とがそれぞれ抗IgEポリクローナル抗体とバンドを形成し、かつそのバンド同士が交叉しうる部分（先端部）が完全融合してバンドの交叉が見られない場合、該腹水にはIgEクラス抗体が含まれると判定される。さらに該融合細胞株由来の腹水と抗IgEポリクローナル抗体との間に明瞭なバンドが形成される場合、該IgEクラス抗体は高濃度で含まれていると判断される。
【００４５】
１０．抗原特異的IgEモノクローナル抗体の製造
取得した融合細胞から抗原特異的IgEモノクローナル抗体を製造する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等を用いることができる。細胞培養法においては、例えば、融合細胞をウシ胎児血清含有RPMI1640培地、MEM培地、E-RDF培地又は無血清培地等の動物細胞培地中で、通常の培養条件（例えば、３７℃、５％CO2濃度）で３〜４日間培養し、その培養上清から目的とするIgEモノクローナル抗体を取得することができる。腹水形成法においては、例えば、プリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン)等の鉱物油を投与したミエローマ細胞が由来する哺乳動物と同種の動物あるいは免疫能の欠損した動物（例えば、ヌードマウス及びヌードラット）の腹腔内に融合細胞１×１０６〜１×１０７個を投与する。投与した哺乳動物を１〜２週間飼育した後、腹水又は血清を採取することにより目的のIgEモノクローナル抗体を取得することができる。
【００４６】
上記抗体の製造方法において、抗体の精製が必要とされる場合には、硫酸アンモニュウム塩析法、DEAE-セルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインLセファロース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の当業者に公知の方法を適宜選択し、これらを単独で又は組み合わせて用いることにより精製を行うことができる。
【００４７】
１１．抗原不応性IgEモノクローナル抗体
上記「７．抗原特異性の確認」の工程で取得した抗原不応性IgEモノクローナル抗体産生融合細胞株についても、「１０．抗原特異的IgEモノクローナル抗体の製造」と同様の方法に従って、抗原不応性IgEモノクローナル抗体を取得し、精製することができる。
【００４８】
このような抗原不応性IgEモノクローナル抗体は、目的の抗原特異性を示す融合細胞株から産生される抗原特異的IgE抗体の対照として、利用することができる。すなわち、例えば抗原特異的IgEモノクローナル抗体を用いて抗原特異的アレルギーモデルを構築する際、その目的の抗原に対して抗原不応性のIgEモノクローナル抗体を使用して、対照モデルを構築することができる。抗原特異的アレルギーモデルだけでなくこのような対照モデルも利用して実験を行い、比較対照とすると、例えば薬剤の抗アレルギー効果について、より信頼性の高いデータを得ることができる。
【００４９】
具体的な例としては、培養肥満細胞又は肥満細胞腫瘍株などの肥満細胞を含む細胞培養液中に目的の抗原特異的IgEモノクローナル抗体を添加して、抗原特異的アレルギーモデルを作製する。同じ系に、目的の抗原に対する抗原不応性IgEモノクローナル抗体を添加して、対照モデルを作製する（第一の対照）。さらに、細胞だけの系を用意し、第二の対照としておく。これら３つのモデルそれぞれについて、目的の抗原のみを添加した群、並びに目的の抗原及び候補薬剤の系列希釈したものを添加した群を用意する。これらの投与の３０〜６０分後、各培養液を８００〜１０００×ｇで１５〜２０分遠心分離し、得た上清のヒスタミンの濃度を液体クロマロトグラフィー法あるいはELISA法により測定して、その結果から肥満細胞からのヒスタミンの放出が抑制されているか否かを判定する。抗原特異的IgEモノクローナル抗体で感作し抗原と被検薬剤で刺激した群で得られたヒスタミン濃度が、抗原特異的IgEモノクローナル抗体で感作し抗原のみで刺激した群で得られたヒスタミン濃度に比較して優位に低く、さらに抗原不応性IgEモノクローナル抗体で感作し抗原と被検薬剤で刺激した群で得られたヒスタミン濃度、および細胞のみを抗原と被検薬剤で刺激した群で得られたヒスタミン濃度と、同等あるいはそれ以下であるならば、その薬剤は優れた抗アレルギー効果を有する候補薬剤として判定することができる。
【００５０】
従って、本発明の抗原不応性IgEモノクローナル抗体は、このような抗原特異的アレルギーモデル-対照モデル系を構築し、有効な実験データを得るための試薬として使用することができる。このような試薬は、アレルギー反応機構の解明、抗アレルギー薬剤の開発等において、非常に有用に使用され得る。
【００５１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕  卵白アルブミンに対するIgEモノクローナル抗体産生融合細胞の作製
a. 動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
抗原としての卵白アルブミン100μg/マウスを水酸化アルミニウムゲル2 mg/マウスと共に腹腔内投与により３日毎に３回投与して、４週齢のNC/Ngaマウスを免疫した。最終免疫の２日後、該マウスから抗体産生細胞である脾臓細胞を取り出し、細胞融合に用いた。
【００５２】
b. 細胞融合及び融合細胞の選択
Kohler及びMilshtein(1975)の方法に従い、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3U1株とを使用して、ポリエチレングリコール(分子量：1500)を用いて細胞融合を行い、それを９６ウェルプレートに分注し、HAT培地で培養し、融合細胞株を選択した。
【００５３】
c. IgE産生融合細胞株のスクリーニング及びクローニング
融合の確認されたウェルのIgE産生融合細胞株の一次スクリーニングをマウスIgE検出ELISA法に従って行った。実施の詳細は以下の通りであった。
抗マウスIgEモノクローナル抗体(1:100希釈、6HD5、YAMASA)をELISAプレートに固相化後、余剰の抗体を洗い流した。次いで、ブロッキング剤(ブロックエース、大日本製薬)でブロッキングし、余剰のブロッキング液を洗い流した。次に、該マイクロプレートの各ウェルに融合細胞の培養上清50〜100μlを加え、反応させた後、余剰の培養上清を洗い流した。次いで、ビオチン化抗マウスIgEモノクローナル抗体(1:1000希釈、HMK12、YAMASA)を分注、反応させ、余剰の抗体を洗い流した。次いで、アルカリホスファターゼ標識アビジン(1:10000希釈、アビジン-ALP、Sigma)を分注、反応させ、余剰のアビジン-ALPを洗い流した。アルカリホスファターゼの基質液を分注し、３０分間反応させた後、ELISAプレートリーダーで陽性を示すウェルを選択した。
【００５４】
一次スクリーニングの結果、マウスIgE抗体を産生する融合細胞株が１１株得られ、それらを限界希釈法によりクローニングして、融合細胞株として増殖可能であるものを５株樹立した。また、これらの樹立した融合細胞株をヌ−ドマウスに投与し、それぞれの融合細胞株に由来する腹水を得た。
【００５５】
d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認
次に、クローニングされた各融合細胞株に由来する腹水について、PCA反応を行い、抗原に対する特異性とIgE抗体活性を検討した。PCA術式の概略は以下の通りであった。
【００５６】
Sprague Dawley (SD)ラットの背部の毛をバリカンで刈り、１カ所当たり100μlの腹水サンプルを背部皮内に投与した。腹水の希釈系列は、1:100〜1:25600であった。投与２４時間後に対象の抗原(1 mg/ml)と0.5％エバンスブルー溶液を1 ml尾静脈から投与し、その３０分後に皮膚を剥ぎ、皮下に認められるエバンスブルーの漏出スポットの直径を計測した。
【００５７】
腹水のPCA反応の結果、卵白アルブミン特異的反応を示す２株の融合細胞株が得られ、これらをOVA 17株及びOVA 20株と名付けた。これらの融合細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に、受託番号FERM P-18517（OVA 17株）、FERM P-18528（OVA 20株）として寄託した。OVA 17株及びOVA 20株由来の腹水のPCA価は各々1:12800及び1:6400であった（表１）。この結果から、OVA 17株及びOVA 20株由来の腹水には、卵白アルブミン特異的IgE抗体が高力価で含まれていることが示された。
【００５８】
一方、上記「c. IgE産生融合細胞株のスクリーニング及びクローニング」で得られた融合細胞株５株の内の３株（OVA 18株、OVA 21株、OVA 23株）は、PCA反応において、卵白アルブミンに対し抗原特異性を示さなかった（表１）。これらの融合細胞株は、上記と同様に、受託番号FERM P-18527（OVA 18株）、FERM P-18518（OVA 21株）、FERM P-18529（OVA 23株）として寄託した。なお、表１は卵白アルブミン特異的IgE産生融合細胞株由来腹水を用いたPCA反応の結果を示しており、表１に示された数値はエバンスブルーの漏出スポットの直径(mm)、「>20」との表示は当該スポットの直径が20mm以上であることを示す。
【００５９】
【表１】
0003721126.tif 000002
【００６０】
e. クラス特異性の確認
OVA 17株、OVA 20株、OVA 18株、OVA 21株及びOVA 23株由来の腹水について抗マウスIgE抗体との寒天ゲル内沈降反応を行い、各融合細胞株が産生する抗体がIgE抗体であるかどうかを確認した。
【００６１】
ゲル内沈降反応で、OVA 17株及びOVA 20株由来腹水は抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図１）、またそれぞれの腹水と既知のIgEモノクローナル抗体（SPE-7株由来抗DNP抗体）では先端部は完全に融合し交叉反応は認められなかった（図１）ことから、それぞれの腹水にはIgEクラス抗体が高濃度で存在していることが示された。一方、OVA 18株、OVA 21株及びOVA 23株由来腹水は抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図４）、またそれぞれの腹水と既知のIgEモノクローナル抗体(SPE-7株由来抗DNP抗体)では先端部は完全に融合し交叉反応は認められなかった（図１）ことから、それぞれの腹水にはIgEクラス抗体が高濃度で存在していることが示された。図１及び図４において、OVA 17、OVA 20、OVA 18、OVA 21及びOVA 23はそれぞれOVA 17株(FERM P-18517)、OVA 20株(FERM P-18528)、OVA 18株(FERM P-18527)、OVA 21株(FERM P-18518)及びOVA 23株(FERM P-18529)由来腹水を示し、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP IgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
【００６２】
以上のように、卵白アルブミン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株OVA 17株、OVA 20株、及び卵白アルブミンに対する抗原不応性IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株OVA 18株、OVA 21株及びOVA 23株を取得することができた。
【００６３】
〔実施例２〕  オボムコイドに対するIgEモノクローナル抗体産生融合細胞の作製
a. 動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
抗原としてオボムコイド100μgを用いたこと以外は実施例１に記載した方法と同様にして、脾臓細胞を調製した。
b. 細胞融合及び融合細胞の選択
実施例１に記載した方法と同様にして、融合細胞を選択した。
【００６４】
c. IgE産生融合細胞株のスクリーニング及びクローニング
実施例１に記載した方法と同様にして、一次スクリーニングを行ったところ、マウスIgE抗体を産生する融合細胞株が１２株得られた。これらの培養上清を用いて、実施例１の「d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認」に記載した方法でPCA反応を行ったところ、抗原特異的IgE産生融合細胞株として増殖するものが６株得られた。これらを限界希釈法によりクローニングし、さらに培養上清を用いたPCA反応を行い、PCA反応陽性を示す３株（OVM 3B7株、OVM 5D7株、OVM 3F5株）を樹立した。これらの融合細胞株を、上記と同様に、受託番号FERM P-18519（OVM 3B7株）、FERM P-18520（OVM 5D7株）、FERM P-18521（OVM 3F5株）として寄託した。さらに、樹立したIgE産生融合細胞株をヌードマウスに接種し、腹水を形成させて採取した。
【００６５】
d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認
実施例１に記載した方法と同様にして、融合細胞株由来の腹水のPCA反応を行った。OVM 3B7株、OVM 5D7株、OVM 3F5株由来の腹水のPCA価は各々1:6400、1:6400、1:25600であった（表２）。この結果から、OVM 3B7株、OVM 5D7株、OVM 3F5株由来の腹水には、オボムコイド特異的IgE抗体が高力価で含まれていることが示された。なお、表２はオボムコイド特異的IgE産生融合細胞株由来腹水を用いたPCA反応の結果を示しており、表２に示された数値はエバンスブルーの漏出スポットの直径(mm)、「>20」との表示は当該スポットの直径が20mm以上であることを示す。
【００６６】
【表２】
0003721126.tif 000003
【００６７】
e. クラス特異性の確認
OVM 3B7株、OVM 5D7株及びOVM 3F5株由来の腹水を用いて、寒天ゲル内沈降反応を実施例１に記載したのと同様に行ったところ、これらは抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図２）、またそれぞれの腹水と既知のIgEモノクローナル抗体(SPE-7株由来抗DNP抗体)では先端部は完全に融合し交叉反応は認められなかった（図２）ことから、それぞれの腹水にはIgEクラス抗体が高濃度で存在していることが示された。図２において、OVM 3B7、OVM 5D7及びOVM 3F5はそれぞれOVM 3B7株(FERM P-18519)、OVM 5D7株(FERM P-18520)及びOVM 3F5株(FERM P-18521)由来腹水を示し、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP IgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
以上のように、オボムコイド特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株OVM 3B7株、OVM 5D7株及びOVM 3F5株を取得することができた。
【００６８】
〔実施例３〕  βラクトグロブリンに対するIgEモノクローナル抗体産生融合細胞の作製
a. 動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
抗原としてβラクトグロブリン100μgを用いたこと以外は実施例１に記載した方法と同様にして、脾臓細胞を調製した。
b. 細胞融合及び融合細胞の選択
実施例１に記載した方法と同様にして、融合細胞を選択した。
【００６９】
c. IgE産生融合細胞株のスクリーニング及びクローニング
実施例１に記載した方法と同様にして、一次スクリーニングを行ったところ、マウスIgE抗体を産生する融合細胞株が１２株得られた。各々の培養上清について実施例１の「d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認」に記載した方法でPCA反応により抗原特異性を検討したところ、抗原特異的IgE産生融合細胞株として増殖するものが２株得られた。これらを限界希釈法によりクローニングし、さらに培養上清を用いたPCA反応を行い、PCA反応陽性を示した抗原特異的IgE産生融合細胞株を２株樹立した（βラクトグロビン10C11株、βラクトグロビン10H9株）。これらの融合細胞株は、上記と同様に、受託番号FERM P-18522（βラクトグロビン10C11株）、FERM P-18523（βラクトグロビン10H9株）として寄託した。さらに、樹立したIgE産生融合細胞株をヌードマウスに接種し、腹水を形成させて採取した。
【００７０】
d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認
実施例１に記載した方法と同様にして、βラクトグロビン10C11株及びβラクトグロビン10H9株由来の腹水を用いてPCA反応を行ったところ、βラクトグロブリン特異的反応を示し、そのPCA価は各々1:25600及び1:6400であった（表３）。この結果から、βラクトグロビン10C11株及びβラクトグロビン10H9株由来の腹水には、βラクトグロブリン特異的IgE抗体が高力価で含まれていることが示された。なお、表３はβラクトグロブリン特異的IgE産生融合細胞株由来腹水を用いたPCA反応の結果を示しており、表３中、10H9はβラクトグロビン10H9株、10C11はβラクトグロビン10C11株を表す。表中に示された数値はエバンスブルーの漏出スポットの直径(mm)を表し、「>20」との表示は当該スポットの直径が20mm以上であることを示す。
【００７１】
【表３】
0003721126.tif 000004
【００７２】
e. クラス特異性の確認
βラクトグロビン10C11株及びβラクトグロビン10H9株由来の腹水を用いて、寒天ゲル内沈降反応を実施例１に記載したのと同様に行ったところ、これらは抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図１）、またそれぞれの腹水と既知のIgEモノクローナル抗体(SPE-7株由来抗DNP抗体)では先端部は完全に融合し交叉反応は認められなかった（図１）ことから、それぞれの腹水にはIgEクラス抗体が高濃度で存在していることが示された。図１において、bLG 10C11及びbLG 10H9はそれぞれβラクトグロビン10C11株(FERM P-18522)及びβラクトグロビン10H9株(FERM P-18523)由来腹水を示し、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP IgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
以上のように、βラクトグロブリン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株βラクトグロビン10C11株及びβラクトグロビン10H9株を取得することができた。
【００７３】
〔実施例４〕  αカゼインに対するIgEモノクローナル抗体産生融合細胞の作製a. 動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
抗原としてαカゼイン100μgを用いたこと以外は実施例１に記載した方法と同様にして、脾臓細胞を調製した。
b. 細胞融合及び融合細胞の選択
実施例１に記載した方法と同様にして、融合細胞を選択した。
【００７４】
c. IgE産生融合細胞株のスクリーニング及びクローニング
実施例１に記載した方法と同様にして、一次スクリーニングを行ったところ、マウスIgE抗体を産生する融合細胞株が１２株得られた。各々の培養上清について実施例１の「d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認」に記載した方法でPCA反応により抗原特異性を検討したところ、抗原特異的IgE産生融合細胞株として増殖するものが２株得られた。これらを限界希釈法によりクローニングし、さらに培養上清を用いたPCA反応を行い、PCA反応陽性を示した抗原特異的IgE産生融合細胞株を２株樹立した（カゼイン2C3株、カゼイン6G5株）。これらの融合細胞株は、上記と同様に、受託番号FERM P-18524（カゼイン2C3株）、FERM P-18525（カゼイン6G5株）として寄託した。さらに、樹立したIgE産生融合細胞株をヌードマウスに接種し、腹水を形成させて採取した。
【００７５】
d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認
実施例１に記載した方法と同様にして、カゼイン2C3株、カゼイン6G5株由来の腹水を用いてPCA反応を行ったところ、αカゼイン特異的反応を示し、そのPCA価は各々1:12800及び1:6400であった（表４）。この結果から、カゼイン2C3及びカゼイン6G5株由来の腹水には、αカゼイン特異的IgE抗体が高力価で含まれていることが示された。なお、表４はαカゼイン特異的IgE産生融合細胞株由来腹水を用いたPCA反応の結果を示しており、表４中、2C3はカゼイン2C3株、6G5はカゼイン6G5株を表す。表中に示された数値はエバンスブルーの漏出スポットの直径(mm)を表し、「>20」との表示は当該スポットの直径が20mm以上であることを示す。
【００７６】
【表４】
0003721126.tif 000005
【００７７】
e. クラス特異性の確認
カゼイン2C3株及びカゼイン6G5株由来の腹水を用いて、寒天ゲル内沈降反応を実施例１に記載したのと同様に行ったところ、これらは抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図３）、またそれぞれの腹水と既知のIgEモノクローナル抗体(SPE-7株由来抗DNP抗体)では先端部は完全に融合し交叉反応は認められなかった（図３）ことから、それぞれの腹水にはIgEクラス抗体が高濃度で存在していることが示された。図３において、カゼイン2C3及びカゼイン6G5はそれぞれカゼイン2C3株(FERM P-18524)及びカゼイン6G5株(FERM P-18525)由来腹水を示し、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP IgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
以上のように、αカゼイン特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株カゼイン2C3株及びカゼイン6G5株を取得することができた。
【００７８】
〔実施例５〕  コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原に対するIgEモノクローナル抗体産生融合細胞の作製
a. 動物の免疫及び抗体産生細胞の調製
抗原としてコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)由来のダニ抗原100μgを用いたこと以外は実施例１に記載した方法と同様にして、脾臓細胞を調製した。
b. 細胞融合及び融合細胞の選択
実施例１に記載した方法と同様にして、融合細胞を選択した。
【００７９】
c. IgE産生融合細胞株のスクリーニング及びクローニング
実施例１に記載した方法と同様にして、一次スクリーニングを行ったところ、マウスIgE抗体を産生する融合細胞株が１０株得られた。これらの培養上清を用いて、実施例１の「d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認」に記載した方法でPCA反応を行ったところ、抗原特異的IgE産生融合細胞株として増殖するものが２株得られた。これらを限界希釈法によりクローニングし、さらに培養上清を用いたPCA反応を行い、PCA反応陽性を示す１株（DF 7G2株）と、PCA反応陰性であり抗原特異性の示されなかった１株（DF 13A3株）とを樹立した。これらの融合細胞株は、上記と同様に、受託番号FERM P-18526（DF 7G2株）、FERM P-18530（DF 13A3株）として寄託した。さらに、これらのIgE産生融合細胞株をヌードマウスに接種し、腹水を形成させて採取した。
【００８０】
d. 抗原特異性及びクラス特異性の確認
実施例１に記載した方法と同様にして、DF 7G2株、及びDF 13A3株由来の腹水を用いてPCA反応を行ったところ、DF 7G2株はコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原特異的反応を示し、PCA価は1:3200であった（表５）。この結果から、DF 7G2株由来の腹水には、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原特異的IgE抗体が高力価で含まれていることが示された。一方、DF 13A3株はコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原に対し抗原特異性が示されなかった（表５）。なお、表５はコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原特異的IgE産生融合細胞株由来腹水を用いたPCA反応の結果を示しており、表中に示された数値はエバンスブルーの漏出スポットの直径(mm)、「>20」との表示は当該スポットの直径が20mm以上であることを示す。
【００８１】
【表５】
0003721126.tif 000006
【００８２】
e. クラス特異性の確認
DF 7G2株及びDF 13A3株由来腹水を用いて、寒天ゲル内沈降反応を実施例１に記載したのと同様に行った。DF 7G2株由来腹水は抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図２）、同様にDF 13A3株由来腹水も抗マウスIgEポリクーナル抗体と明瞭なバンドを形成し（図４）、またそれぞれの腹水と既知のIgEモノクローナル抗体(SPE-7株由来抗DNP抗体)では先端部は完全に融合し交叉反応は認められなかった（図２、図４）ことから、DF 7G2株及びDF 13A3株由来腹水にはIgEクラス抗体が高濃度で存在していることが示された。図２においてDF 7G2はDF 7G2株(FERM P-18526)由来腹水を、図４においてDF 13A3はDF 13A3株(FERM P-18530)由来腹水を示す。
以上のように、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)抗原特異的IgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株DF 7G2株、及び該ダニ抗原に対し抗原不応性のIgEモノクローナル抗体を産生する融合細胞株DF 13A3株を取得することができた。
【００８３】
【発明の効果】
本発明に従えば、IgEモノクローナル抗体産生融合細胞株を効率よく意図的に作製することが可能になり、種々の抗原に特異的なIgEモノクローナル抗体を安定的に供給することができる。さらに本発明の方法により、目的の抗原に対し抗原不応性のIgEモノクローナル抗体、及び該抗体を産生する融合細胞株も作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  OVA 17株、OVA 20株、βラクトグロビン10C11株、βラクトグロビン10H9株由来腹水にそれぞれ含まれるIgE抗体及び既知のマウスIgEモノクローナル抗体と、抗マウスIgEポリクローナル抗体との交叉性が示された寒天ゲル内沈降反応の結果を示す図である。図中、OVA 17、OVA 20、bLG 10C11、及びbLG 10H9はそれぞれOVA 17株(FERM P-18517)、OVA 20株(FERM P-18528)、βラクトグロビン10C11株(FERM P-18522)、及びβラクトグロビン10H9株(FERM P-18523)由来腹水を示し、抗マウスIgE抗体は抗マウスIgEポリクローナル抗体、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP マウスIgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
【図２】  OVM 3B7株、OVM 5D7株、OVM 3F5株、DF 7G2株由来腹水にそれぞれ含まれるIgE抗体及び既知のマウスIgEモノクローナル抗体と、抗マウスIgE抗体との交叉性が示された寒天ゲル内沈降反応の結果を示す図である。図中、OVM 3B7、OVM 5D7、OVM 3F5、及びDF 7G2はそれぞれOVM 3B7株(FERM P-18519)、OVM 5D7株(FERM P-18520)、OVM 3F5株(FERM P-18521)、及びDF 7G2株(FERM P-18526)由来腹水を示し、抗マウスIgE抗体は抗マウスIgEポリクローナル抗体、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP マウスIgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
【図３】カゼイン2C3株、カゼイン6G5株由来腹水にそれぞれ含まれるIgE抗体及び既知のマウスIgEモノクローナル抗体と、抗マウスIgE抗体との交叉性が示された寒天ゲル内沈降反応の結果を示す図である。図中、カゼイン2C3及びカゼイン6G5はそれぞれカゼイン2C3株(FERM P-18524)及びカゼイン6G5株(FERM P-18525)由来腹水を示し、抗マウスIgE抗体は抗マウスIgEポリクローナル抗体、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP マウスIgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
【図４】  OVA 18株、OVA 21株、OVA 23株、DF 13A3株由来腹水にそれぞれ含まれるIgE抗体及び既知のマウスIgEモノクローナル抗体と、抗マウスIgE抗体との交叉性が示された寒天ゲル内沈降反応の結果を示す図である。図中、OVA 18、OVA 21、OVA 23、及びDF 13A3は、OVA 18株(FERM P-18527)、OVA 21株(FERM P-18518)、OVA 23株(FERM P-18529)、及びDF 13A3株(FERM P-18530)由来腹水を示し、抗マウスIgE抗体は抗マウスIgEポリクローナル抗体、抗DNP-IgE monoAbは既知の抗DNP マウスIgEモノクローナル抗体(SPE-7、1 mg/ml)を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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