(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図２Ａに記載のヌクレオチド配列の少なくともヌクレオチド１３３５から１５２７にわたる配列からなるヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター配列。 
【請求項２】
図２Ｂに記載の配列の少なくともヌクレオチド１５６９から１７６８にわたる配列からなるヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター配列。 
【請求項３】
図２Ｂに記載の配列のヌクレオチド１から１５６９にわたる配列からなる転写抑制領域。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ｐ７５腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）のプロモーター配列、その製造法および用途に関する。
背景技術
ＴＮＦは、広範囲の細胞機能に影響を及ぼす多機能な前炎症性（pro-inflammatory）サイトカインである。ＴＮＦは、一方では生物の防御に関与するが、他方では、過剰に産生されると、いくつかの疾患においておもな病原体の役割を果たすことがある。ＴＮＦは、炎症のプロセスに関与し、敗血症性ショック（１）、移植片対宿主反応（２）およびリウマチ性疾患（３）における組織損傷のメディエーターであることが知られている。
ＴＮＦは、２つの個別の細胞表面受容体に結合することによりこれらの効果を及ぼす。これらの２つの細胞表面受容体は、大きさが異なり（約５５および７５ｋＤａ）、かつ構造的に異なる細胞内ドメインを有する。このことはそれらが別々にシグナルを示すことを示唆している（４〜１１）。この２つの受容体の量および相対比は異なる種類の細胞において変化するものの、ほとんど全ての細胞はＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒ）を発現する。これらの変動は、部分的には発生上制御され、それらは細胞の表現型およびその分化の状態に関与し、部分的には、サイトカインおよび病原の免疫促進成分によって一時的に誘導されることもできる（１２〜２２）。この２つのＴＮＦ−Ｒの機能の研究は、それらが異なってはいるが相互に作用する活性を有し（２３〜２８）、かつそれらの活性レベルが細胞によるそれらの発現の程度に相関する可能性があることを示している（２９、３０）。これらの発見は、２つのＴＮＦ−Ｒの量および相対比に影響を及ぼす機構がＴＮＦに対する細胞応答の特性および程度の両者に多大な影響を及ぼし、したがって、このサイトカインの病理学的な機能の発現に加えて生理学的な機能の発現に対して重要な決定をすることを暗示する。
ＴＮＦの有害な効果を抑制するために、ＴＮＦがその受容体に結合するのを妨げる方法が探求された。こうして、ＴＮＦに対する中和抗体が作製された（ＥＰ  １８６  ８３３）。ＴＮＦの作用を抑制する別のアプローチは、細胞表面ＴＮＦ−ＲとＴＮＦの結合を競合する可溶性ＴＮＦ受容体を提供することであった（ＥＰ  ３０８  ３７８およびＥＰ  ３９８  ３２７）。
ＴＮＦにとっては、その作用を及ぼすためにはその受容体に結合することが必要であるため、発現する細胞表面受容体が少ないか、もしくは全く発現しなければ、ＴＮＦの有害効果を減少させるかまたは阻害することが可能になるはずである。同様に、特定の場合にＴＮＦの有益な作用を増大させることが望ましいことがあり、そのような場合には発現する細胞表面受容体の量を増大させることによりこれを達成することが可能となるであろう。
発明の開示
本発明は、ヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター配列であって、前記遺伝子の５′末端の上流に位置する配列および前記遺伝子の第１イントロンに位置する配列から選択されるプロモーター配列を提供する。５′上流プロモーター配列（５′領域プロモーター配列という）は２．１ｋｂｐ配列に含まれ、イントロンプロモーター配列は１．９ｋｂｐ配列に含まれる。５′領域プロモーター配列は、ネイティブ（native）のｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子産生物の発現を制御することが可能であるのに対して、イントロン領域プロモーター配列は、不完全な（truncated）ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子産生物の発現を制御することが可能である。さらに、イントロン領域プロモーターは、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の転写に関するエンハンサー要素としても機能するかもしれない。さらにまた、イントロン領域プロモーターは、イントロンプロモーターの上流に、不完全なｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子産生物の発現に関するモジュレーターとして役立つかもしれない転写抑制領域を有する。
本発明は、好ましい態様において、５′領域プロモーター配列をコードする２．１８ｋｂｐのＮｃｏＩフラグメント、およびイントロンプロモーター配列をコードする１．８ｋｂｐのＳｍａＩフラグメントであって、いずれの配列もヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒを含むゲノムライブラリーに由来する配列を提供する。本発明によって提供されるほかの好ましい態様は、本質的なプロモーター活性を有し、かつ図２Ａに示される配列の少なくともヌクレオチド１３３５から１５２７にわたる５′領域プロモーター配列部分、本質的なプロモーター活性を有し、かつ図２Ｂに示される配列の少なくともヌクレオチド１５６９から１７６８または少なくともヌクレオチド１５６９から１８２７にわたるイントロンプロモーター配列部分ならびに転写抑制領域を有し、かつ図２Ｂに示される配列のヌクレオチド１から１５６９にわたるイントロンプロモーター領域配列部分である。
別の側面において、本発明は、イントロン領域の転写抑制領域に加えて５′上流およびイントロン領域のプロモーターを含む、前述のプロモーター配列中に存在する配列モチーフを提供する。このようなモチーフは、プロモーター活性に必要である可能性があり、かっこのプロモーターの調節に関与するであろう特定の転写因子に結合することが示されていた。
このモチーフは、全配列における所望のモチーフの上流および／または下流の望ましくない配列を欠失させることにより、すなわち、全プロモーター配列の切断に制限酵素を用いて所望のモチーフに到達することにより製造することが可能であり、ついで、適切な原核生物株に挿入し、この株を培養すると前記所望のモチーフを発現することが可能なベクターをえるために必要な適切な制御配列およびほかの通常の手段と共にえられたモチーフをベクターに挿入することができる。
このようにしてえられたモチーフは、それらに結合する因子、たとえば転写因子をヒトゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングするために用いることができる。一度これらの因子が通常の手段で単離され、精製され、かつ同定されると、それらを抑制することによりＴＮＦ−Ｒの形成は抑制されるべきであり一方、それらの産生を増大することにより所望の効果、すなわち、ＴＮＦのその受容体への結合の抑制または増強を導くＴＮＦ−Ｒの発現が増大されるべきである。
生体内に存在する特定の転写因子の量は無制限ではないため、ゆえに、ＴＮＦ−Ｒ発現の抑制および有害なＴＮＦ効果の抑制もまた、多数のモチーフまたはモチーフ領域の発現によっても達成することが可能であろう。これらはこのようなモチーフまたはモチーフ領域を含むプロモーターと転写因子の結合を競合する。「モチーフ領域」は、モチーフそれ自体をその両側に並列する配列と共に、または全プロモーター配列の一部分によって連結され、配列の一部分によってその両側に並列する数種のモチーフを含む。前述のように、また以下に説明するように、本発明のモチーフまたはモチーフ領域は、本発明の活性プロモーター領域および転写抑制領域の両者に存在するものを含むと理解される。同様に、本発明の転写因子は、活性プロモーター領域に結合するものおよび転写抑制領域に結合するものを含む。
また、本発明は、本発明の配列モチーフを含有する医薬組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、本発明のモチーフ領域を含有する医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に記述したように５′上流領域、第１エキソン、第１イントロンおよび第２エキソンを含む、ヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′領域の部分的な制限酵素地図および様々なpBluescriptサブクローンを模式的に示す。
図２（ＡおよびＢ）は、実施例２に記述したように、５′上流プロモーター領域（図２Ａ）およびイントロンプロモーター領域（図２Ｂ）のヌクレオチド配列を模式的に示す。
図３は、実施例３に記述したように５′上流およびイントロンプロモーター領域の活性の測定結果であって、これらのプロモーター領域が、ルシフェラーゼをコードする発現ベクターにおけるルシフェラーゼ遺伝子の発現（相対光単位−ＲＬＵで与えられる）の制御に用いられたアッセイでの測定結果を図式的に示す。
発明を実施するための最良の形態
ヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒを含むヒトゲノムライブラリーはストラタジーン（Stratagene）からえた。このライブラリーはファージライブラリーであり、そこから８つのファージがヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子を担持するものとしてポジティブに同定され、これらのファージのうち６つは異なるものであった。これらのポジティブなファージから様々なフラグメントを単離し、クローン化し、シークエンスした。
以下に実施例に詳述したように、我々はヒトｐ７５ＴＮＦ受容体遺伝子の５′領域の配列を決定した。我々は、第１イントロンの３′部分における領域に加えて、公表されているｃＤＮＡの５′上流の２ｋｂ領域がプロモーター活性を有することを示す。ｐ７５−Ｒのための異なるｍＲＮＡの大きさについての報告があり、これは異なる３′末端だけではなく異なる５′末端にも起因するものであると思われる。我々がシークエンスした遺伝子領域にプロモーター活性を見出したことは、我々がヒトｐ７５ＴＮＦ受容体遺伝子のプロモーターの少なくとも１つをクローン化した強力な証拠である。プライマー伸長分析およびＲＡＣＥにより、遺伝子の５′末端がどこにあり、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の発現が異なるプロモーター領域によって制御されるばあいにこの遺伝子のどのような産生物がえられるかがわかるであろう。（実施例１および２に記載したように）全５′上流プロモーター領域もしくはそれらの一部分、または全イントロンプロモーター領域もしくはそれらの一部分をコードする、多数のクローンが誘導された。５′上流およびイントロンプロモーター領域の活性は、これらの領域をルシフェラーゼをコードするベクターに挿入し、続いてこれらがルシフェラーゼ遺伝子の発現をポジティブに制御することが可能であることを示すことにより証明された（実施例３）。
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′上流領域および第１イントロン領域に位置するプロモーター配列の検討（以下の実施例２参照）により、たとえば、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＰ部位ならびにＡＰ−２およびＮＦ−κＢのコンセンサス配列を含む、誘導剤の影響を受ける転写因子に応答させるかもしれない様々な配列モチーフを明らかにする（図２Ａおよび２Ｂも参照）。これらの調節要素は、炎症部位で形成される特定のサイトカイン類の効果によっておそらく、受容体の構成的発現のパターンに重ね合わされた、誘導された一時的変化を可能にするかもしれない。
プロモーター領域（５′上流および第１イントロン領域）内に認められた推定モチーフのうち、つぎのもの、すなわち５′上流プロモーター領域に存在する３つの規定（canonical）ＴＡＴＡボックス、そのうちの２つにはきわめて接近してＣＡＰ部位が続く、３つの、接近して位置し、かつ等間隔に位置するカッパ−Ｅ２モチーフ、４つの隣接するＧＣボックス、ならびにＮＦ−κＢ、サイトカイン−２モチーフおよびＡＰ−２を含む、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ発現を増強することが知られているいくつかの誘導因子の効果を媒介しうるいくつかの転写因子の結合モチーフは、とくに興味深いものであると思われる。第１イントロンプロモーター領域とくに第１イントロンの３′末端に、ほかのものに囲まれてＴＡＴＡボックスが存在し、２５ｂｐ下流のＣＡＰ部位およびｐ５５ＴＮＦ−Ｒプロモーター領域に２回現れるＴＣＣ繰り返しモチーフが３回これに続く。
したがって、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′上流プロモーター領域は、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター活性、すなわち、最終的に正常なｐ７５ＴＮＦ−Ｒ受容体産物を産生する結果となるような遺伝子の発現の制御、に必要な領域であり、一方、第１イントロンのプロモーター領域は、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子が別の形態の受容体をコードすることを示している。さらにまた、第１イントロンのプロモーター領域はｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の転写に関するエンハンサー要素としても機能する。さらに、第１イントロンのプロモーター領域は活性イントロンプロモーター領域の上流に転写抑制領域をも含み、この抑制領域は別の形態のｐ７５ＴＮＦ−Ｒの発現の調節に関与する可能性がある。
また、本発明は、薬学的に許容しうる担体ならびに本発明の配列モチーフもしくはモチーフ領域を含有する医薬組成物にも関する。これらの組成物は、内在的に存在するか、あるいは外因的に投与されたかのいずれかの過剰のＴＮＦによって引き起こされるいかなる疾患に対しても用いることができる。疾患の例は、敗血症性ショック、移植片対宿主反応、リウマチ性疾患およびほかの自己免疫疾患である。
投与方法は、類似薬剤の許容しうる投与様式のいかなるものであってもよく、治療しようとする状態に依存し、必要に応じて、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、局所注射または局所適用である。
本発明の医薬組成物は、活性成分、すなわちモチーフ配列、を選択された標的細胞、すなわちｐ７５ＴＮＦ−Ｒを発現する細胞、に導入するために設計されたものである。ここで、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの発現はそのプロモーターの制御によって制御されることが望ましく、その制御はプロモーター活性の増強であっても抑制であってもよい。そのようなモチーフ配列を細胞に導入するための多くの操作が公知である。たとえば、
(i)標準的な操作により組換え動物ウイルスベクター（たとえば、ワクチニア由来）を構築することが可能である。ここで、前記ウイルスのＤＮＡには２つの遺伝子が導入され、その１つは標的細胞が特異的に発現する細胞表面タンパク質に結合するリガンドをコードし（たとえば、ＣＤ４リンパ球および関連白血病のばあい、ＡＩＤＳ  ｇｐ１２０タンパク質がこれらの細胞に特異的に結合する）、したがって、この遺伝子の発現により前記ウイルスが特異的に所望の細胞を標的とする。２つ目はモチーフ配列をコードし、この遺伝子はウイルスを介してこれらの細胞内に導入され、続いて発現する。
(ii)細胞に導入することが可能なモチーフ配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を軟膏の形態で調製することが可能である（たとえば、イボ誘導因子、パピロウイルスをブロックするオリゴヌクレオチド配列が軟膏製剤を用いて皮膚細胞に導入されるイボ治療に用いられるように）。前記オリゴヌクレオチド配列を前記組換え動物ウイルスを用いて細胞に導入することが可能であり、ここで、このウイルスによって担持される第２配列がオリゴヌクレオチド配列となる。
(iii) 近年開発されたリボザイムアプローチを用いることが可能である。リボザイムはＲＮＡを特異的に切断する触媒性RNA分子である。リボザイムは、選択した標的ＲＮＡ、たとえば、本発明の新規なタンパク質および因子をコードするｍＲＮＡまたは本発明のモチーフ配列をコードするｍＲＮＡ、を切断するように工作されてもよい。このようなリボザイムは、選択したｍＲＮＡまたはモチーフ配列に特異的な配列を有し、それらと相互作用（相補的結合）したのちそのｍＲＮＡまたはモチーフ配列を切断し、その結果抑制することが望ましいタンパク質または抑制することが望ましいモチーフ配列の発現を低下（または完全に消失）させる。ここで、発現の低下のレベルは標的細胞中におけるリボザイム発現のレベルに依存する。選択した細胞（たとえば、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒを担持するもの）にリボザイムを医薬組成物の形態で導入するために、この目的に通常用いられる適切なベクター、たとえば、プラスミド、動物ウイルス（レトロウイルス）ベクター、のいかなるものを用いてもよい（ウイルスが、選択したリボザイム配列をコードするｃＤＮＡを第２配列として有するばあいには、前記(i)も参照）。さらに、たとえば、１またはそれより多くのタンパク質または本発明の配列モチーフの発現の抑制に用いることが可能な、複数の標的を有するリボザイム（多標的リボザイム）を構築することができる（リボザイムに関する方法などの再検討には、６５〜７３を参照）。
このように、この医薬組成物は前記組換え動物ウイルスを活性成分として含有するものでもよく、あるいは、モチーフ配列をコードするオリゴヌクレオチドを含有する軟膏であってもよい。投与される活性化合物の量は、投与経路、治療しようとする疾患および患者の状態に依存する。
本発明をつぎの実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
細胞系および培養条件：
ベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞を成長させ、標準ＢＨＫ細胞培養条件（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミン）中に維持した。
実施例１
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′領域を含むクローンのクローニングおよび分析
２つのヒトゲノムライブラリーをヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ（ＴＮＦ−ＲIIとしても知られる）をコードする全長ｃＤＮＡを用いて（標準のハイブリダイゼーション法を用いて）スクリーニングした。このｃＤＮＡはスミス(Smith)ら（１０）の配列のうち塩基９０〜１４７５の配列を含んでいた。組換えファージライブラリーの形態のつぎのヒトゲノムライブラリー、すなわちヒト染色体１に特異的なＡＴＣＣライブラリー（ＡＴＣＣ番号５７７３８）およびストラタジーンヒトリンパ球ライブラリー（ストラタジーン番号９４３２０２）を用いた。ＡＴＣＣライブラリーの数回のスクリーニングでは、ポジティブのファージは見られなかった。すなわち、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズしうる配列を含むファージはそのライブラリーには含まれていなかった。ストラタジーンライブラリーのスクリーニングでは８つのポジティブファージが示され、そのうちの６つは、制限酵素比較分析によって示されるように、互いに異なっていた（結果は示さず）。
前記の異なるポジティブファージのうちの２つ、ＵおよびＨという、をｐ７５ＴＮＦ−Ｒ  ｃＤＮＡの異なるフラグメントに対するハイブリダイゼーションによりさらに検討した。ＵおよびＨの両者とも、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むｃＤＮＡ５′末端の２５０ｂｐフラグメントにハイブリダイズしたが、前記２５０ｂｐフラグメント内のその５′末端の先端に含まれるやや短い１６０ｂｐフラグメントｃＤＮＡにはハイブリダイズしなかった。前記の異なるファージのうち３番目のファージ、Ｇという、は前述のｃＤＮＡ５′領域の１６０ｂｐフラグメントを用いて単離された。したがって、Ｇもまたｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′領域をコードしている。
５′ｃＤＮＡフラグメント（プローブ）に対するハイブリダイゼーションによる３つのファージ（Ｕ、Ｈ、Ｇ）のさらなる特徴付けによって、（ｉ）ＵおよびＨについては、大きさが１．９および３．６ｋｂのこれらファージに含まれるｐ７５ＴＮＦ−Ｒ配列からえられる２つのＳｍａＩ制限フラグメントが前述の２５０ｂｐのｃＤＮＡプローブにハイブリダイズし、（ii）Ｇについては、ファージＧに含まれるｐ７５ＴＮＦ−Ｒ配列からＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩフラグメントのすべてをえたとき、前記１６０ｂｐのｃＤＮＡプローブが大きさが２および１．１ｋｂの２つのＮｃｏＩフラグメントにハイブリダイズし、２．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントおよび１．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントにもハイブリダイズする、ということが明らかになった。そののち、２５０または１６０ｂｐのｃＤＮＡプローブにハイブリダイズする、ファージＵ、ＨおよびＧからえられる前述のすべてのフラグメントをプラスミドにサブクローン化した。サブクローニングは、プラスミドpBluescript（ストラタジーン）を用いて、標準の操作からなる方法により行った。サブクローニングに続いて、ファージＵ、ＨおよびＧのサブクローン化された種々のフラグメントを制限酵素分析により分析し、制限酵素地図をえた。ヒトｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′領域を含むプラスミドクローンの制限酵素地図（一部）を模式的に図１に示す。図１に示したプラスミドはファージＧ由来のものであった（ｇＮｃｏ１、ｇＮｃｏ２、ｇＰｓｔ、ｇＥｃｏ、およびｇＮｃｏ２の下に示されているｇＮｃｏ２の種々のサブクローン類）が、ＳｍａＩクローン（ＵＳｍ１）はファージＵ由来であったことに注目すべきである。図１において、黒の縦線は現在シークエンスした領域（すなわち、サブクローンｇＮｃｏ２、ｇＮｃｏ１およびＵＳｍ１から、以下の実施例２を参照）を示し、囲みはスミスら（１０）の既知のｃＤＮＡ配列領域を示し、そしてエキソン／イントロンの境界は「ＧＴ」（イントロンＩの始まり／エキソンＩの終わり）および「ＡＧ」（エキソンIIの始まり／イントロンＩの終わり）により示されている。
前記ストラタジーンライブラリーのファージがｐ７５遺伝子のゲノム構成(organization)に相当し、組換えの結果ではないことを確かめるために、つぎのテスト（または「縦点検(check-ups)」）を行った。
（ｉ）１．９ｋｂのＳｍａＩフラグメントがゲノムＳｍａＩフラグメントに相当するということは、２種の独立したファージ（ＵおよびＨ）が２５０ｂｐのｃＤＮＡプローブにハイブリダイズする同一のフラグメントを含む、という事実から間接的に示しうる。
（ii）唯一単離されたファージＧのまさに(the very)５′領域（すなわち、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′末端の先端）がゲノム構成に相当するかどうかをテストするために、このファージの制限パターンとＵ９３７細胞由来のネイティブのゲノムＤＮＡのパターンとの比較を、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いて前記ファージおよびゲノムＤＮＡを消化し、続いて２ｋｂのＮｃｏＩフラグメント（サブクローンｇＮｃｏ２由来）とのハイブリダイゼーションにより行った。ゲノムとファージの制限酵素パターンならびに２ｋｂのＮｃｏＩフラグメントプローブに対する制限酵素フラグメントのハイブリダイゼーションとを比較することにより、ファージＤＮＡとゲノムＤＮＡの両者はこのプローブにハイブリダイズする同一のフラグメントと同一の制限酵素パターンを有することが示された（結果は示さず）。したがって、唯一単離されたファージＧはｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′領域の実際のゲノム構成に相当する。
さらに、前記クローニング、ハイブリダイゼーションおよび制限酵素分析から、つぎの事実が明らかになった。ａ）公表されたｃＤＮＡの初めの部分（９０〜１４７５ｂｐ）をプローブとして用いることにより、約１５〜２０ｋｂｐのインサートをそれぞれ有する８つの独立したファージ（そのうち６つは互いに異なっている）をストラタジーンライブラリーから単離することができ、このことにより、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子はかなり大きく、数ダースｋｂｐにわたって広がっていることが暗示され、そしてｂ）ファージＵおよびＨは、独立する一方、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のまさに５′領域を含まなかったという事実からみて、第１イントロン（イントロンＩ）もまたかなり長い（＞１０ｋｂ）。
実施例２
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′領域のシークエンスおよびキャリクタリゼーション
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′領域の構造、すなわちプロモーター領域の位置および特性を解明するために、種々のクローン（pBluescriptにおけるサブクローン、前記実施例１参照）を部分的にまたは完全にシークエンスした（図１の黒い縦線を参照）。とりわけ、クローンｇＮｃｏ２およびＵＳｍ１を完全にシークエンスし、一方クローンｇＮｃｏ１、ｇＰｓｔおよびｇＥｃｏを部分的にシークエンスした。図２（ＡおよびＢ）に、充分にシークエンスされたｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′領域の２カ所の配列を模式的に示す。シークエンスは標準の操作で行われ、前記pBluescript中のクローンはシークエナーゼ・バージョン２．０・キット（Sequenase Version 2.0 kit、ユー・エス・ビー（ＵＳＢ））を用いるかまたはアプライド・バイオシステムズ・自動シーケンサ（Applied Biosystems Automated Sequencer）、（Model 737A DNAシーケンサ（Model 737A DNA Sequencer）、アプライド・バイオシステムズ、米国）を用いて自動的かのいずれかにより両方向からシークエンスした。シークエンスに続いて、一般的なシークエンス分析をＧＣＧ（ジェネティックス・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group)、マディソン(Madison)、米国、標準コンピュータソフトウエアパッケージ(Standard computer software package)）パッケージを用いて行い、特定のシークエンス分析、すなわち転写因子結合モチーフの同定を、前記標準ソフトウエアパッケージのFINDPATTERNSオプションを用いて行った。図２Ａに、第１エキソンおよびエキソン／イントロン境界（スミスらのｃＤＮＡ配列（１０）を考慮することにより決定された第１エキソン配列およびエキソン／イントロン境界）を含むｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のまさに５′領域配列を示す。ｃＤＮＡのアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示す。ほかの転写因子結合部位（たとえば、カッパ−Ｅ２部位およびＧＣ−ボックス）と同様に規定の４つのＴＡＴＡ−ボックスに下線をひく。アスタリスク（＊）はスミスら（１０）のｃＤＮＡの開始点を示す。図２Ｂに、第１イントロン末端および第２エキソンの一部の配列（これもまた、スミスら（１０）のｃＤＮＡ配列からの情報にもとづく）を示す。推定のＴＡＴＡ−ボックス、ＴＣＣ繰り返しであるＳ１ヌクレアーゼ高感受性部位（Ｓ１−ＨＳ）、ＣＡＰ−部位、および種々のほかの推定の転移因子結合部位に下線をひく。ｃＤＮＡのアミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示す（すなわち、これは第２エキソンの開始点である）。
シークエンス分析によりｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′領域のつぎの特有の特徴がわかった。
（ｉ）ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ遺伝子５′末端の先端（すなわち、図２Ａの配列および図１に示し、かつ実施例１に記載したファージＧの種々のサブクローンのシークエンスされた領域）において、この領域におけるｃＤＮＡ配列と我々のゲノム５′領域クローンとの比較により、ｃＤＮＡ配列の塩基１〜１６６は同一の領域、すなわちアミノ酸１〜２６のコード配列を含むこの領域の３′末端において我々の配列と一致し、そして、イントロンの５′境界で特有のＧＴジヌクレオチドコンセンサススプライス部位を有するイントロン配列が連続的に続くことがわかった。前述の配列の前には、公表されたｃＤＮＡ配列（１０）の８９ヌクレオチドの５′非翻訳領域（ＵＴＲ）がある。ｐ７５−ＲｃＤＮＡについて同様のＵＴＲ長が別のグループによって記載されている（３５）ので、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒメッセージ(message)の真正(genuine)サイズに相当するであろう。転写開始部位であるかもしれないこのＵＴＲ配列における１番目のヌクレオチドをアスタリスクで示す。その上流の配列は３つの規定のＴＡＴＡ−ボックスを含み（図２Ａの配列の１１３９位、１１８３位および１４３１位）さらに１３１８位に従来のとは異なるＴＡＴＡ−ボックスを含む。前記ＴＡＴＡ−ボックスのうち、１３１８位および１４３１位の２つのあとにＣＡＰ−部位が続く。しかしながら、両者のばあいにおいて、ＣＡＰ−部位とＴＡＴＡ−ボックスとの間の距離は異常に小さい（５ｂｐ）。１つ（またはすべて）の前記ＴＡＴＡボックスが機能的に活性であることは、標準の分析により決定することができる。この配列にはＣＣＡＡＴ−モチーフは存在しない。転写開始部位の定義に関連すると示されたイニシエーターモチーフ（３６）に類似の配列は、１９１８位に位置している（ＹＹ１）。２つの重なっているＧＣ−ボックスは、図２Ａの配列の１９３８位および１９４３位に存在し、ほかの２つは２０８２位および２１６４位に存在する。前記２つの重なっているＧＣ−ボックスは、２２ｂｐのＧＣ−ストレッチ内に存在する。そのような長さのＧＣ配列は転写因子ＥＴＦの結合部位として提案されている（３７、３８）。１５６６位では、ＨＭＧＩ−結合モチーフとして働くことのできる３１ｂｐのＡＴ−リッチの配列がある。あるプロモーターでは、そのようなモチーフがプロモーター効力に寄与することが示されている（３９）。イムノグロブリンカッパＬ鎖遺伝子のエンハンサーの一部を構成（４０）する、カッパＥ２モチーフの３回の繰り返しが図２Ａの配列の１７３２位、１７４７位および１７６２位にみられる。３回の繰り返しはきわめて接近し、同一の２つのヘキサヌクレオチド（ＡＧＧＣＣＧ）によって等距離に位置する。
５′フランキング配列における推定の転写因子結合モチーフ間では、ｐ７５−Ｒの発現に影響を与えると示される試薬に対する応答を与えることのできる数種が存在する。図２Ａの配列の１３０位（リバース）、１９４位（リバース）および５７７位にＮＦ−κＢモチーフ（３２）をならびに１９４位でＮＫ−κＢモチーフに重なるサイトカイン−１モチーフと相同な部位（４１）をこれらは含む。ＮＦ−κＢ部位がＴＮＦおよびＩＬ−１に対する応答性を与えうる（４２）一方で、サイトカイン−１モチーフはＴＮＦ誘導因子と結合する。ＴＮＦおよびＩＬ−１の両者は、ある細胞でｐ７５−Ｒの発現を促進することが示されている（４３、４４）。反復の形態でインターフェロン応答  モチーフを構成するヘキサヌクレオチド、ＡＡＧＴＧＡ（４５）が、５９９位（リバース）、１３５６位（リバース）および１６１６位にある。最近定義されたコンセンサス配列であり、インターフェロン誘導転写因子、ＩＲＦ−１と結合する、Ｆ６コンセンサスＧ  Ａ／Ｇ  ＡＡＧＣＮＧＡＡＡＧ（４６）は、１９８２位（リバース）に位置する。ＡＰ−２のコンセンサス部位、Ｔ／Ｃ  Ｃ  Ｇ／Ｃ  Ｃ  Ｃ  Ａ／Ｃ  Ｎ  Ｇ／Ｃ  Ｇ／Ｃ  Ｇ／Ｃ（４７）は、潜在的な(potential)ＥＴＦ部位と重なる１９３８位でみられ、このエレメントのリバースコピーは、図２Ａの配列の２６９位、８７４位および１９０４位に位置する。しかしながら、このコンセンサス配列は、ほぼ完全に縮重した塩基からなっているので、その大きさは不確かである。ＡＰ−２はｃＡＭＰに対するのと同様にＰＭＡに対する応答に関係している（３３）。両試薬はｐ７５ＴＮＦ−Ｒメッセンジャーを誘導することがわかっている（４８、４９、５０）。ｃＡＭＰ応答エレメント、ＴＧＡＧＴＣＡ（５１）に類似の配列が、２カ所の不適合（ミスマッチ）があるが、１２４２位に見出される。ｐ７５メッセンジャーもまた、ＴおよびＢ細胞活性化を誘導することが報告されている。この過程では、８量体結合因子（ＢおよびＴ細胞用）（５２、５３）およびＩＬ−４プロモーター、ＣＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣのＰ配列に結合する因子（Ｔ細胞用）（５４）が役割を果たすことがわかっている。８量体−モチーフに類似の配列ＡＴＧＴＡＡＡＴが図２Ａの配列の９１８位に見出され、Ｐコア配列、ＡＡＡＴＴＴＴＴが１２２２位に見出される。
（ii）イントロン配列：第１イントロンのみが部分的にシークエンスされた（図１の黒い縦線参照、図２Ａの配列の末端、すなわちＧＴジヌクレオチドから始まり、そしてシークエンスされていない長い（約１０ｋｂ）ストレッチののち離れて図２Ｂの完全な配列まで、示されている翻訳された配列のすぐ直前のＡＧジヌクレオチドを含む）。
ｃＤＮＡとクローン化された１，８２８ｂｐのゲノムＳｍａＩフラグメント（図２Ｂ）の配列との比較により、それはそのまさに３′末端にｃＤＮＡの延長を含み、イントロンの３′境界、すなわち３′コンセンサススプライス部位：（Ｃ／Ｕ）11ＮＣＡＧ（５）に特有のＡＧジヌクレオチドを再び有する。それはｐ７５ＴＮＦ−Ｒのリーダーにおいて、Ｖａｌ２７に始まる、図２Ｂの配列の１７９５位のコード配列の前にある。したがって、この配列はｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の第１イントロンの一部であると考えられる。驚くべきことに、このイントロン配列内（図２Ｂの下線部参照）に、プロモーターおよびサイトカイン誘導性の特徴である数カ所の部位または領域を定義することができるであろう。６３０位に規定のＴＡＴＡ−ボックスがあり、その２６ｂｐ下流にイニシエーター結合部位ＹＹ１（３６）に類似の配列が続いている。ＴＡＴＡ−ボックスの上流にＣＣＡＡＴ−モチーフは認められないが、そのエレメントの逆方向のコピーが、イニシエーターモチーフの下流のちょうど６６８位に見出される。様々なプロトオンコジーンおよびハウスキーピングプロモーターに見られる、ＴＣＣ繰り返しモチーフが、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒプロモーターで２回繰り返される（５６）と同様に、図２Ｂの配列の２３８位および１３１０位（逆方向）に見出される。
イントロン配列はまた、ｐ７５−Ｒ発現の調節に加わるかもしれない転写因子のコンセンサス部位を含む。これらは、２５５位にＮＦ−Ｂコンセンサス配列を（３２）、２８８位と４２２位にヒトＧＭ−ＣＳＦプロモーターに見出されるようにサイトカイン−１モチーフ（これもＴＮＦに対して応答すると報告された）の形態の２つのコピーを（４１）、３８８位、５６７位（リバース）および７５７位にインターフェロン−応答配列、ＡＡＧＴＧＡ（４５）（前記参照）を、７０９位にサイトカイン−２エレメントを（５７）、そして３５９位、４０６位および７７４位にＡＰ−２コンセンサス配列の３つの逆方向のコピーＧＧＧ／ＣＣＡ／ＴＧ／ＣＧ／ＣＣを（４７）含む。グルココルチコイドレセプターのコンセンサス部位、ＡＧＡＷＣＡＧＷ（５８）は１０２５位に認めることができる。この部位はグルコステロイド類によってＵ９３７細胞におけるｐ７５−ＲｍＲＮＡについて報告されているアップレギュレーション（upregulation）（５９）に寄与しているかもしれない。ｃＡＭＰ−応答エレメントＴＧＡＣＧＴＣＡ（５１）に類似するが、２カ所不適合がある配列を、３８１位および５３０位にみることができる。
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のイントロンに意外にもプロモーター活性が見出されたことは、この既知のレセプターのほかに、この遺伝子にさらなる翻訳産物が存在する可能性があることを示している。この配列には推定のイニシエーション結合モチーフの下流に多数のＡＴＧが存在している。最も長いＯＲＦ（１５０ｂｐ）の前の８７４位に見出される１つは、最も完全なコザック−ボックス内に位置している。この点から始まる、推定の５０アミノ酸配列は、スイス−プロテイン・データベース(Swiss-Protein data base)の中のいかなるタンパク質とも類似性を示さなかった（ＦＡＳＴＡプログラムを用いてチェックした（ＧＣＧ、１９９１、参考文献番号６０参照）。イントロンの３′末端に接近する１７６８位に、レセプターのコード配列を有するフレームの状態で、ＡＴＧ開始コドンがある。このＡＴＧを囲む配列は、コザックによって提案されたコンセンサス配列（６１）とうまく一致しない、というのもそれは、コザックにより分析された６９９配列のうちたった１％だけ見出される、−３位のＴを有するからである。しかしながら、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒの翻訳開始点もまた、この配列の３％だけその−３位にＣが見出されるので、コンセンサス配列と正確には一致しない。この「イントロンの」ＡＴＧで翻訳が開始されることは、記載されたＴＮＦ−Ｒのリーダー配列の主な部分を構成する２６のＮ末アミノ酸がほかの９残基によって置換されている、不完全な形態のレセプターが生じることになり、その結果、このタンパク質産物は細胞内タンパク質となるかもしれない。分泌されることがわかっているタンパク質もまた、ＩＬ−１レセプターアンタゴニストについて示されたように、細胞内の形態で存在することも注意すべきである。さらにほかの可能性は、リーダー配列ばかりではなく、細胞外ドメインも欠いているレセプターをコードするｍＲＮＡの翻訳がＳｍａＩクローンのｃＤＮＡ下流部内のＭｅｔで開始されるということである。
いずれにしても、前述の分析から、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のイントロン配列内のプロモーター領域は２つの新規タンパク質すなわち、新規なタンパク質および新規なリーダー、をコードするように思える。しかしながら、クローン化された第１イントロン領域、とくにクローン化された約１．９ｋｂのイントロン領域（つぎの実施例３参照）についての我々の最近の欠失分析では、提案されている新規なタンパク質の上流に、活性プロモーターはなく、したがってその新規なタンパク質がどのようにして発現されるかということは明らかではない。よって、ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の第１イントロン内の配列（観察されたＯＲＦ）によってコードされる、そのような新規なタンパク質はおそらく発現されないであろう。しかしながら、新規なリーダー配列は、ストロングなプロモーターがそのリーダーの開始点のちょうど上流に存在することを示す、この最近の欠失分析を考慮すれば、きわめて可能性があるとまさに考えられる。
つぎの配列は、この新規なリーダーの配列であり、ヌクレオチドの番号付けは図２Ｂに示したものに対応する。
新規なリーダー
0003663211.tif 000002
前記配列では配列の番号付けが図２Ｂのようにヌクレオチド配列で始まり、続いてアミノ酸配列の番号が付く、たとえば初めの配列（新規リーダー）ではヌクレオチド配列は１７６８〜１８２７であり、アミノ酸配列は１〜２０である、ことに注意すべきである。
さらに、前述の新規なリーダー産物の発現を調節する能力を有するほかに、プロモーター配列のイントロン領域がｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の転写のためのエンハンサーエレメントとして機能するかもしれない、という可能性もある。
また、イントロンプロモーター領域が活性なイントロンプロモーターの上流に転写抑制領域を含み、この抑制領域がｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の発現、とくに前記新規なリーダーから始まる新規なｐ７５ＴＮＦ−Ｒ産物の発現、すなわち本来のｐ７５ＴＮＦ−Ｒの不完全な形態ののモジュレーションに関係していることが今見出された（つぎの実施例３参照）。
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の２カ所のプロモーター領域（５′上流のプロモーターおよびイントロンのプロモーター）の前述の配列分析をさらに明確にするために、クローンＧからの配列（５′上流プロモーター領域）およびクローンＵからの配列（イントロンプロモーター領域）ならびに「ｒｅｆ」として示される既知の配列モチーフの比較についての概要をつぎに記す。
モチーフは２つのグループに存在する、すなわちそれらはほかの人によって報告された正確な形態にみられる（「不適合（ミスマッチ）なし」）とわずかに異なる形態にみられる（「不適合（ミスマッチ）」）。したがって、各モチーフに対してつぎの情報が与えられる、すなわちモチーフの名称およびその報告されたヌクレオチド配列ならびに本発明のｐ７５−Ｒプロモーター配列に見出される関連配列である。
前記情報はつぎの方法で表される、すなわち、
(i)関連するモチーフを我々が観察したファージ。Ｇは、５′上流プロモーター配列が見出されたファージクローンを表す。Ｕは、イントロン内にプロモーター配列が見出されたファージクローンを表す。
(ii)我々がモチーフとモチーフの正確な配列を観察した、図２Ａ（クローンＧ）および２Ｂ（クローンＵ）に関する配列内の位置ならびに
(iii)ｒｅｆ、すなわちモチーフが定義された（その正確な配列を含む）文献に関する。
つぎにあげたモチーフのいくつかは、前記に記載されておらず、５′上流および第１イントロンプロモーター類の追加の推定モチーフであることに注意すべきである。
0003663211.tif 000003
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実施例３
機能分析−ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′領域および第１イントロン領域のプロモーター活性
ｐ７５レセプター遺伝子のいくつかの５′領域について機能的な重要性への最初の洞察をえるために、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を担持するベクターに数種の領域をクローン化した。構築物をＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。これはプロモーター活性について最初の着想をえるためには最も好都合な系であることを我々の手によって証明した。我々のおもな興味はｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のまさに５′部であったが、イントロンに推定のＴＡＴＡ−ボックスおよびＣＡＰ−部位を見出したことによりこの領域も機能的アッセイでテストすることになった。
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のプロモーター（類）の機能的アッセイのために、つぎの操作を行った。すなわち、サムロック(Sambrook)ら（３１）にしたがい、カルシウム−リン酸法によって、ＢＨＫ細胞をトランスフェクトした。各実験において、１０ｇのプラスミドＤＮＡをセミ−コンフルエントな６ｃｍ皿にトランスフェクトした。一晩（８〜１２時間）インキュベーションしたのち、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、新鮮な培地で補足した。さらに２４時間インキュベーションしたのち、細胞を採取し、ルミトロン・ルミノメータ・セット(Lumitron Luminometer set)を用いて、１０秒のインテグレーション(integration)で溶菌液の上清におけるルシフェラーゼ活性を測定した（６２）。値は相対光単位（ＲＬＵ）として計算した。ルシフェラーゼ遺伝子をコードする種々のベクターは、異なるプロモーターをそれらにクローン化し、つぎのようにしてルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御した。すなわち、
ｉ）ＣＭＶ：ポジティブ・コントロール（ＣＭＶ−プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子）、ＬＵＣ−０：ネガティブ・コントロール（配列を調節することのないルシフェラーゼ遺伝子）、ｇＢＸ：「センス」オリエンテーション(orientation)にＡＴＧがないｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′領域（図２Ａのｎｔ  １〜２０８９）、ｇＢＳ：「アンチセンス」オリエンテーションにＡＴＧがない５′領域（図２Ａのヌクレオチド１〜２０８９）、ＵｓＢＸ：「センス」オリエンテーションにおけるイントロンフラグメント（図２Ｂのｎｔ  １〜１８２７）、ＵｓＢＨ：「アンチセンス」オリエンテーションにおけるイントロンフラグメント（図２Ｂのｎｔ  １〜１８２７）、ＵＢＸ：「センス」オリエンテーションにＡＴＧがないイントロンフラグメント（図２Ｂのｎｔ  １〜８６９）、ＵＢＳ：「アンチセンス」オリエンテーションにＡＴＧがないイントロンフラグメント（図２Ｂのｎｔ  １〜８６９）。
前述のように、様々の推定プロモーター担持フラグメント（およびコントロールプロモーターおよびフラグメント）は、プロモーターのない、発現ベクターｐＢＬＣＡＴ６（６４）でＣＡＴ遺伝子と置換されるルシフェラーゼ遺伝子を含む（６３）ルシフェラーゼベクターＬＵＣＯにクローン化されたことに注意すべきである。
３つの独立したトランスフェクションおよびそれに続くルシフェラーゼアッセイの平均的な結果（標準偏差）を図３に示す。まさに５′領域（ｇＢＸ）はポジティブコントロール（ＣＭＶプロモーター）と比べてきわめて高い活性を示す。シャープな活性の低下が観察されるアンチセンスオリエンテーション（ｇＢＳ）における同一のフラグメントで示されることができるように、この領域のプロモーター活性はオリエンテーション依存である。興味深いことに、イントロン領域（ＵｓＢＸ）もまた著しいプロモーター活性を示し、ここでもまたアンチセンスオリエンテーション（ＵｓＢＨ）での内部制御はかなり低い活性を示す。観察されたプロモーター活性は下流部（すなわち、ＵｓＢＸの適当な「センス」オリエンテーション）によっておもに決まることが示されているので、イントロンプロモーターのこの活性は、第１のＡＴＧの上流部（ＵＢＸまたはＵＢＳ）のみがルシフェラーゼ遺伝子に連結するばあいには、もはや検出することはできない。これらの２つの推定プロモーターを標準的な操作によりさらに分析する。
ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の５′プロモーター領域および第１イントロンプロモーター領域の欠失分析
５′上流のプロモーターおよびイントロンプロモーターを含むプロモーター領域の欠失分析を活性プロモーターを決める配列領域をより正確に確かめることにより行った。この目的で、追加の構築物を前述のように作製した。ここでは５′上流プロモーター領域の様々な欠失フラグメントおよび第１イントロンプロモーター領域３′末端の様々な欠失フラグメントを、ルシフェラーゼリポーター遺伝子を担持する発現ベクターに挿入し、トランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるプロモーター活性をテストした。すべて標準的な操作により、全長の５′上流プロモーター領域およびイントロンプロモーター領域を含む前記ベクターを用いて欠失フラグメントを生じさせ、ついでこれらプロモーター領域５′末端から様々な部分を欠失させ、それらの欠点フラグメントをえた。これら欠失フラグメントについてのプロモーター活性の機能的アッセイは、前述のようにして行った。
５′上流プロモーター領域の欠失フラグメントは、（ｉ）図２Ａの配列のヌクレオチド番号１９７からヌクレオチド番号２０８６までに及ぶ「ＧＮ２ＢＸ」と表されるフラグメント、（ii）図２Ａの配列のヌクレオチド番号６８２からヌクレオチド番号２０８６までに及ぶ「７５」と表されるフラグメント、（iii）図２Ａの配列のヌクレオチド番号７０９からヌクレオチド番号２０８６までに及ぶ「ＰIII」と表されるフラグメント、（iv）図２Ａの配列のヌクレオチド番号１３３５からヌクレオチド番号２０８６までに及ぶ「７６」と表されるフラグメント、ならびに（ｖ）図２Ａの配列のヌクレオチド番号１５２７からヌクレオチド番号２０８６までに及ぶ「ＰＩ」と表されるフラグメントを含む。
イントロンプロモーター領域の欠失フラグメントは（vi）図２Ｂの配列のヌクレオチド番号８７２からヌクレオチド番号１８２７までに及ぶ「７４」と表されるフラグメント、および（vii）図２Ｂの配列のヌクレオチド番号１５６９からヌクレオチド番号１８２７までに及ぶ「ＵＩＩＰ」と表されるフラグメントを含む。
前記欠失フラグメント（ｉ）〜（vii）のすべてを、標準的な方法およびすべてが「センス」オリエンテーションとなる方法で発現ベクターにクローン化した。
結果（表示せず）から、
（ａ）５′上流プロモーター領域については、欠失フラグメント（ｉ）〜（iv）すなわち「ＧＮ２ＢＸ」、「７５」、「ＰIII」および「７６」、のすべては、欠失されていない、クローン化したプロモーター領域（図２Ａのヌクレオチド１〜２０８９、前記参照）のプロモーター活性に匹敵する充分なプロモーター活性を有していたが、欠失フラグメント（ｖ）すなわち「ＰＩ」はきわめて低下したプロモーター活性を有していた。
（ｂ）イントロン領域プロモーターについては、欠失フラグメント（vi）、すなわち「７４」は、クローン化された全長フラグメント（「ＵＳＢＸ」、図２Ｂのヌクレオチド１〜１８２７）およびイントロンプロモーター領域の５′領域（図２Ｂのヌクレオチド１〜８７４）のみを有するほかのクローン化されたフラグメントのきわめて低いプロモーター活性（たとえあるとしても）に匹敵するほど、きわめて少ないプロモーター活性を示した。しかしながら、欠失フラグメント（vii）、すなわち「ＵＩＩＰ」はきわめて著しく増大したプロモーター活性（前述の「７５」、「ＰIII」および「７６」の活性に匹敵する）を有していたことが明らかとなった。
したがって、前記結果から、
（ａ）５′上流プロモーターについては、プロモーターの５′末端が欠失フラグメント（iv）、すなわち「７６」の５′末端（図２Ａのヌクレオチド番号１３３５）と欠失フラグメント番号（ｖ）、すなわち「ＰＩ」の５′末端（図２Ａのヌクレオチド番号１５２７）との間に位置する。
（ｂ）第１イントロンプロモーター領域については、イントロンの３′末端に約１．９ｋｂフラグメントの唯一１つのプロモーターが存在する。このプロモーターの５′末端は、欠失フラグメント（vii）、すなわち「ＵＩＩＰ」の５′末端（図２Ｂのヌクレオチド番号１５６９）と１７６８（新規なリーダーの開始、前記参照）との間に位置する。さらにこの結果は全長イントロンフラグメントの５′末端（図２Ｂのヌクレオチド１）と「ＵＩＩＰ」の５′末端（図２Ｂのヌクレオチド１５６９）との間に位置する抑制領域がある、という驚くべき観察をももたらした。この抑制領域配列の少なくとも一部分は、欠失フラグメント（vii）、すなわち「７４」の５′末端（図２Ｂのヌクレオチド８７２）と「ＵＩＩＰ」の５′末端（図２Ｂのヌクレオチド１５６９）との間に位置する、ということが結論付けされるであろう。
こうしてもはや５′上流プロモーターは、図２Ａのヌクレオチド１３３５〜１５２７によって決まる領域内に存在するということが、充分に定義されたのである。
イントロンプロモーターについては、図２Ｂのヌクレオチド１と「７４」の５′末端（図２Ｂのヌクレオチド８７２）との間の領域に、プロモーターは存在せず、むしろ転写抑制領域が存在するということが結果より示される。さらに、この抑制領域はより小さい「ＵＩＩＰ」フラグメントの５′末端（図２Ｂのヌクレオチド１５６９）にまで「７４」フラグメントに及ぶことが明らかである。
したがって、イントロンプロモーター領域は、「ＵＩＩＰ」の５′末端（図２Ｂのヌクレオチド１５６９から図２Ｂのヌクレオチド１７６８まで）から新規なリーダーの開始点まで存在する。
１つのＴＣＣ繰り返し（前記および図２Ｂ参照）を除いてすべての観察されたモチーフが、いまや抑制的であると信じられている領域の上流に存在するので、この新規なイントロンプロモーターは、イントロンに存在するということのほかに、通常プロモーターに存在する多数のモチーフを明らかに欠いているという点においてもユニークである。
イントロンにこのプロモーターが存在することにより、ｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの別の形態、すなわち、推定の新規リーダー配列、それに続くｐ７５−ＴＮＦ−Ｒ遺伝子のエキソン２およびその残りのエキソンによってコードされている領域を有するものが作製されるかもしれない。そうすると、このｐ７５ＴＮＦ−Ｒの別の形態は、第１エキソンによってコードされている領域、すなわち、システイン−リッチな領域（ＴＮＦ結合領域）のすぐ上流にあると知られている細胞外ドメイン領域のＮ末端部を欠くこととなる。
タンパク質が異なるプロモーターから転写されるばあいには、選択的スプライシング機構が同時に生じることが、ほかのタンパク質（たとえばジストロフィン）では知られている。したがって、イントロンプロモーターから転写されるｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの推定の新規な形態にも選択的スプライシングが行われ、ＴＮＦ−結合領域であるシステイン−リッチなドメインのみを含むｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの可溶性形態である最終産物がえられる可能性がある。イントロンプロモーターから転写されるｐ７５ＴＮＦ−Ｒ転写のこの選択的スプライシング機構は、自然に生ずる可溶性の形態のｐ７５−ＴＮＦ−Ｒが産出されるほかの方法（以前に述べたプロテアーゼ分解法のほかに）であるかもしれない。
イントロンプロモーターのイントロン上流に転写抑制領域を見出したことにより、この抑制領域が、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒ遺伝子の発現、さらにはｐ７５−ＴＮＦ−Ｒの推定の新規な形態の発現のモジュレーターとして働くことが示される。このモジュレーションは、サイトカイン、とくにＴＮＦおよびＩＬ−１の作用を介するかまたは分化誘導される変化を介するであろう。予備実験の結果（表示せず）によれば、実際のところ、ＴＮＦは抑制領域を抑制することによりイントロンプロモーターの機能を増大することが示された。さらに、イントロンプロモーターの細胞に特異的な発現もみられ、ある細胞はこのプロモーターを自然に多く発現し、ある細胞は発現していない。これらの違いは明らかにいくつかの細胞の種類における抑制領域の不活性化による分化の変化に関係する。
実施例４
プロモーター領域に結合する転写因子の精製
プロモーター領域（すなわち、５′上流および第１イントロンプロモーター）および第１イントロン領域上流のイントロンプロモーターに存在する抑制領域（実施例３参照）における機能的なモチーフを、従来の手段（Erase-a-Base  キット、プロメガ・コープ(Promega Corp.)）により、プロモーターおよび／または抑制領域の３′および／または５′末端から段階的に核酸配列を欠失して同定することができる。そこで、欠失したプロモーターのフラグメントまたは抑制領域のフラグメントの活性をテストする。同様に、試験管内での突然変異誘発またはリンカースキャング（３１）により、内部配列を欠失させるかまたは変化させることができる。活性化転写因子と結合するモチーフは、欠失されるかまたは突然変異されてプロモーター活性を失うことにより明らかとなる。逆に、プロモーター活性を抑制する転写因子と結合するモチーフは、野生型プロモーターに比べて活性が高まった、突然変異されたまたは欠失されたプロモーターフラグメントにより同定される。同様に、転写抑制領域の活性化または抑制に関与し、抑制因子または抑制サプレッサー因子と結合するモチーフもまた、同定されうる。したがって、これらモチーフの詳細な分析は、オリジナルのモチーフの配列およびその突然変異された形態を用いてオリゴヌクレオチドを化学的に合成することにより行われる。これらのオリゴヌクレオチドは対応するモチーフを欠くプロモーターフラグメントに連結され、えられた構築物のプロモーター活性をテストする。オリジナルの活性が復元されれば、このモチーフは機能的に変化していない、すなわち、このモチーフに導入されたこれらの突然変異はその機能を妨げない、と見なすことができる。一方、突然変異されたモチーフに関してプロモーター活性がほとんど観察されないばあいは、野生型モチーフに比べて変化したヌクレオチドがその機能に必須であると結論付けることができる。
したがって、５′上流およびイントロンプロモーター領域内の、前記実施例２で述べた様々なモチーフを、どれが充分な機能を有するものか決定するために、前記分析操作に付すことができる。
モチーフに結合する転写因子がいったん同定されると、対応する転写因子が単離される。この目的で、数種のソースからの抽出物がその転写因子を多く発現しているかについてスクリーンされる。存在する転写因子の量は、５′末端を標識した機能モチーフの配列を含む前述のオリゴヌクレオチド、ｄｓ−ＤＮＡプローブを用いて、ゲルシフトアッセイにより測定されることができる。
転写因子を豊富に含むソースが同定されれば、最適な結合に必要な条件を決定することができる。ｐＨ、様々な１価および２価のカチオンの存在、塩濃度ならびに還元剤、たとえばＤＴＴまたはメルカプトエタノールの存在などの異なった化学的パラメーターを調整してこの目標は達成される。
転写因子の最適な結合条件が決定されれば、従来の手段、たとえば塩沈殿、ホスホセルロースおよび／またはＤＥＡＥクロマトグラフィーなどによって精製が行われる。そののち、濃縮された転写因子の沈殿をＤＮＡアフィニティーカラムにてさらに精製する。ここでは、対応するモチーフを含むオリゴヌクレオチドが不溶性のマトリックスに結合し、そして転写因子を含む溶液が結合に最適な条件下でカラムを通過する。不純物を洗い出したのち、ＤＮＡが結合しない条件、たとえばｐＨシフト、変化された塩濃度、またはＤＮＡの結合に必要な２価の塩（通常Ｚ++）のキレートによって精製された転写因子を溶出する。
転写因子が精製されれば、その分子に「逆遺伝学」を適用する、すなわちタンパク質シークエンシング、タンパク質配列に対応する変性したオリゴヌクレオチドを用いるｃＤＮＡクローニングおよび最終的にはプローブとしてｃＤＮＡを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによる転写因子をコードする遺伝子のクローニングの適用をする。
これらすべての手段、すなわちゲノムクローン、ｃＤＮＡおよび精製された転写因子を用いれば、つぎの手段、(1)そのプロモーターに影響を与えること、(2)ｐ７５遺伝子プロモーターにおけるターゲットに対するその結合に影響を与えること、または(3)その活性をモジュレートすることのうちの１つによって、転写因子の活性を調節する方法を決めることができる。
(1)についての詳細な操作を実施例５に記載する。(2)および(3)の方法は、この転写因子の機能に対応する妨害に関して多数の薬剤をスクリーニングすることにより達成されることができる。
同様に、クローンを同定し、第１イントロン上流のイントロンプロモーターに存在する抑制領域（実施例３参照）を認識する因子の活性を確認し、調節するために、前述と類似の操作を行ってもよい。
実施例５
特定の配列領域によるプロモーター活性のモジュレーション
不充分に供給される転写因子の不要物を除去する(Scavenge)ことにより、プロモーターの活性を調節することができる。これは、転写因子が結合する対応モチーフの多数のコピーを発現することにより行うことができる。この機構は、ハムスターＣＨＯ細胞株のｃ−ｍｙｃプロモーターのネガティブプロモータードメインを発現させ、増幅させたパイ(Pai)らによって最近示された（３４）。それに引き続き、著者らはハムスターｃ−ｍｙｃの増大した発現ならびにｍｙｃタンパク質によって誘導される細胞増殖および形態における対応する変化を観察した。ほぼ同じ方法で、プロモーター活性を活性化し、増強するプロモーター領域を増幅すること、およびそれにより対応するタンパク質の発現を低下させることが可能となる。
ｐ７５プロモーターについては、５′領域プロモーターの先端全体または第１イントロンのプロモーター全体（実施例２参照）のいずれかまたはネガティブもしくはポジティブ調節ドメインとして同定されたそれらの部分が、制限酵素の消化によってまたは不適当な配列のエキソヌクレアーゼの欠失により、プロモーター配列から与えられうる。えられたフラグメントは、そののち遺伝子を増幅させるベクターに連結され、細胞系、たとえばＣＨＯ細胞、これは増幅させたベクター配列を選択する、にトランスフェクトされる。選択および増幅ののちに、ＣＨＯ細胞からえられたクローンをｍＲＮＡでのｐ７５遺伝子発現およびタンパク質レベルについてチェックする。加えて、イスラエル国特許出願第１０３０５１号に記載されているように、ＴＮＦまたはＴＮＦ模擬(mimicking)抗体を用いる細胞障害アッセイにより、レセプターの機能をチェックする。
このシステムで増幅すると、ｐ７５レセプターの活性をモジュレートするプロモーター領域を確立すれば、２つの方法で増幅された遺伝子産物を選択させない細胞にこれらと同じ領域を導入する。すなわち、
(1)ウィルスの複製起点を含むベクター（たとえばＳＶ４０またはＥＢＮＡ）に連結されたプロモーター領域と、Ｔ抗原（ＳＶ４０の）またはＥＢＮＡ抗原を発現するベクターとをともに発現させる。このことにより、標的細胞の核において誘導されたプロモーターフラグメントのエピゾームの多数のコピーを複製することが可能となり、したがって、組み込まれた配列のＤＮＡ増幅の効果を模擬する。
(2)プロモータードメインからなるｄｓオリグヌクレオチドの化学的合成およびそのオリゴヌクレオチドの充分な量の細胞への適用により、対応する転写因子のスカベンジ(scavenge)およびプロモーター活性への影響が可能となる。(a)オリゴヌクレオチドをさらに親油性とし、その結果それが細胞膜を通過できるようにするために、(b)最小限の分解のためにその安定性を増強させるために、オリゴヌクレオチドの化学的性質を変化させなければならない。これは通常の手段により、たとえばホスホチオエート結合オリゴヌクレオチドを用いることにより行われる。
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配  列  表
(1)一般情報
(i)出願人：
(A)名称：イエダ  リサーチ  アンド  ディベロップメント  カンパニーリミテッド
(B)街路：ピーオー  ボックス  95、ワイズマン  インスティチュート  オブ  サイエンス
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：76100
(G)電話：011-972-847-0617
(H)ファクシミリ：011-972-847-0733
(A)氏名：ヘンリー  ウェインワーゼル
(B)街路：ハーツァル  ストリート  43
(C)都市：ラーナナ
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：43353
(A)氏名：デイビッド  ワラック
(B)街路：ボロチョフ  ストリート  24
(C)都市：レホボト
(E)国：イスラエル国
(F)郵便番号：76406
(A)氏名：ペーター  クーネルト（ウニバーシティ  オブ  ベルン、インスティチュート  オブ  ベタリナリー  バクティーリアロジー）
(B)街路：ランガス−シュトラッセ  122
(C)都市：ベルン
(E)国：スイス連邦
(F)郵便番号：ツェーハー−3012
(A)氏名：ゴッツ  エールハルト
(B)街路：タールシュトラーセ  35
(C)都市：シュテイスリンゲン
(E)国：ドイツ連邦共和国
(F)郵便番号：78256
(A)氏名：オーリバー  ケンパー
(B)街路：アネモネン  ヴェーク  10
(C)都市：ボケンハイム
(E)国：ドイツ連邦共和国
(F)郵便番号：6719
(ii)発明の名称：ｐ７５ＴＮＦ受容体プロモーター
(iii)配列の数：２３
(iv)連絡先：
(A)名宛人：ブラウディ  アンド  ニーマーク
(B)街路：エヌ  ダブリュ、セブンス  ストリート  419、スイート  300
(C)都市：ワシントン
(D)州：ディストリクト  オブ  コロンビア
(E)国：アメリカ合衆国
(F)郵便番号：20004
(v)コンピュータ読取フォーム：
(A)媒体：フロッピーディスク
(B)コンピューター：ＩＢＭ製パーソナルコンピューターコンパチブル
(C)オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：PatentIn Release 1.0、バージョン 1.30（ヨーロッパ特許局）
(vi)出願データ
(A)出願番号：PCT/US95/05853
(B)出願日：1995年5月11日
(vii)優先権データ：
(A)出願番号：イスラエル国、109,633
(B)出願日：1994年5月11日
(viii)代理人情報：
(A)氏名：ブラウディ、ロジャー  エル
(B)登録番号：25,618
(C)ファイル番号：WALLACH=14 PCT
(ix)連絡先情報：
(A)電話：202-628-5197
(B)ファクシミリ：202-737-3528
(C)テレックス：248633
(2)配列番号：１
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：２１８１
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／キー：CDS
(B)位置：2094..2171
(Xi)配列：配列番号：１
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(2)配列番号：２
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：２６
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(Xi)配列：配列番号：２
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(2)配列番号：３
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１８２７
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／キー：CDS
(B)位置：1795..1827
(xi)配列：配列番号：３
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(2)配列番号：４
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１１
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：４
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(2)配列番号：５
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１２
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：５
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(2)配列番号：６
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：６
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(2)配列番号：７
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１１
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：７
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(2)配列番号：８
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１５
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：８
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(2)配列番号：９
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：６０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(ix)配列の特徴：
(A)名称／キー：CDS
(B)位置：1..60
(xi)配列：配列番号：９
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(2)配列番号：１０
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：２０
(B)配列の型：アミノ酸
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：配列番号：１０
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(2)配列番号：１１
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１１
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(2)配列番号：１２
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１２
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(2)配列番号：１３
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１３
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(2)配列番号：１４
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１４
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(2)配列番号：１５
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１５
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(2)配列番号：１６
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１６
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(2)配列番号：１７
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１７
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(2)配列番号：１８
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１６
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１８
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(2)配列番号：１９
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：２８
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：１９
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(2)配列番号：２０
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：２０
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(2)配列番号：２１
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１７
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：２１
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(2)配列番号：２２
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：２２
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(2)配列番号：２３
(i)配列の特性：
(A)配列の長さ：１０
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：他の核酸  ｃＤＮＡ
(xi)配列：配列番号：２３
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
0003663211.tif 000042
【図３】
0003663211.tif 000043