(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2、１，２５−ジヒドロキシ−２２（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3、及び１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3からなる群から選択される化合物の有効量を含有する多発性硬化症症状を軽減又は治療する剤。
【請求項２】
症状が麻痺症状である請求項１記載の剤。
【請求項３】
投与される化合物の量が患者１６０ポンドにつき１日当り０．５〜５０μｇである請求項１記載の剤。
【請求項４】
投与される化合物の量が患者１６０ポンドにつき１日当り０．５〜０．７５μｇである請求項１記載の剤。
【請求項５】
投与される化合物の量が患者１６０ポンドにつき１日当り３．０〜１０μｇである請求項１記載の剤。
【請求項６】
剤が経口的に投与されるものである請求項１記載の剤。
【請求項７】
剤が夜に投与されるものである請求項１記載の剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は多発性硬化症の治療に関するものである。より詳細に述べるならば、本発明は特定の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3類似体による多発性硬化症の治療に関する。
背景
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、慢性炎症性自己免疫反応による中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄に起因すると考えられている（参照：スタインマン（Steinmann）ら、Annu.Rev.Neurosci.１７巻：２４７ページ、１９９３；ミラー（Miller,S.D．）ら、Immunol.Today １５巻：３５６ページ、１９９４；フレンチ−コンスタント（Ffrench-Constant,C．）Lancet ３４３巻：２７１−２７４ページ、１９９４；ブロック（Brocke,S．）ら、Trend in Microbiol．２巻：２５０ページ、１９９４）。動物モデルにおいて、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、感受性げっ歯類系統のＣＮＳタンパク質、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）による免疫は、ＭＳ様麻痺性疾患を起こす。炎症を起こしたＭＳおよびＥＡＥ病変部には、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２（ＭＳ）またはネズミＩ−Ａu（ＥＡＥ）のようなＭＨＣクラスＩＩ分子によって代表される自己抗原に反応する侵潤性ＣＤ４Ｔ−細胞がある（正常な白質にはこれはない）。侵潤性ＣＤ４Ｔ−細胞（Ｔｈ１細胞）は前炎症性サイトカイン類（インターロイキン（ＩＬ）−２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α）を産生し、これらはマクロファージのような抗原提示細胞を活性化して炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８）およびＩＬ−１２を産生する。ＩＬ−１２はさらにＩＦＮ−γ合成を誘起する。このような循環的方法で、慢性自己抗原駆動免疫反応はＣＮＳに対する脱髄攻撃を行うと考えられる。
ＭＳにおける免疫仲介性ＣＮＳ損傷を制限するために、活性化Ｔｈ１細胞およびマクロファージのエフェクター機能を標的にする少なくとも３種類の一般的治療法が試みられた。抗原非特異的免疫抑制剤および治療は、ＭＳ治療薬として現在用いられ、研究されている薬剤の大きな部分を占めている（参照：ノーズワーシー（Noseworthy,J.H．）ら「多発性硬化症の免疫抑制治療：プロス  アンド  コンズ（pros and cons）」International MS Journal１巻：７９−８９ページ、１９９４）。その作用メカニズムはまだ明らかにされていないが例えば副腎皮質刺激ホルモン、コルチコステロイド、プレドニソーン、メチルプレドニソーン、２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、ミトキサントロン、スルファサラジン、メトトレキセート、総リンパ球照射、および、もしかするとインターフェロン−ベータが挙げられる。試みたが失敗に終わった免疫抑制剤もある；その例はアザチオプリン、シクロホスファミドおよびシクロスポリンなどである。このアプローチを制限するものは、非特異的免疫抑制中の感染リスク、並びに若干の細胞毒素のある薬剤における毒性副作用である。
抗原特異的免疫抑制剤および治療が現在開発されつつあり、有望であることが示された（ノーズワーシー、同上、１９９４）。例えばミエリンのようなＣＮＳ抗原を与えて起脳炎Ｔ−細胞を寛容にすること（ワイナー（Weiner,H.L．）ら、Science ２５９巻：１３４ページ、１９９３）、病原性Ｔ−細胞（Ｔ−細胞注射（バクシネーション））または合成Ｔ−細胞受容体ペプチドを注射して、病原性Ｔ−細胞の免疫仲介性排除を誘導すること（ボーデット（Bourdette,D.N.）ら、J.Immunol.１５２巻：２５１０ページ、１９９４）、ミエリンのようなＣＮＳ抗原の起脳炎性ペプチドに関連する寛容原（tolerogenic）ペプチド類を注射すること（ガー（Gaur,A．）ら、Science ２５８巻：１４９１ページ、１９９２）、および静脈内の免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）を与えることである。このアプローチの制限は、自己抗原エピトープがヒトではほとんど決定されておらず（ヴァン  ノルト（van Noort,J.M.）ら、Nature３７５巻：７９８ページ、１９９５）、これらのエピトープおよびＴＣＲ配列がＭＳ対象（患者）間で、および１人のＭＳ対象内でも、異なるかも知れないことである；というのは自己免疫反応は１つのタンパク質内の別のエピトープに、そしてその他のタンパク質にも広がるからである（レーマン（Lehmann）ら、Nature３５８巻：１５５ページ、１９９２）。
サイトカイン特異的治療が開発中である（ノーズワーシー、同上、１９９４）。例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する中和抗体、可溶性ＴＮＦ受容体、可溶性インターロイキン−１拮抗物質、などである。これらのアプローチの制限は、中和剤の十分量をそれを必要とするＣＮＳ組織部位に運搬する問題および長期サイトカイン中和活性の免疫学的副作用である。
ここに提案する治療は、レミール（Lemire）らの実験によって予備的洞察が行われた（レミールら、J.Clin.Invest.８７巻：１１０３ページ、１９９１）。彼はマウスを低カルシウム食餌で飼育し、この疾患の誘発前後に１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を注射することによって疾患の発生率および重症程度を低下させたが、ＥＡＥを予防することはできなかった。これらの実験においては、低カルシウム食餌および１，２５（ＯＨ）2Ｄ3投与のどちらが有効であったかは明らかでない。
１，２５（ＯＨ）2Ｄ3および類似体
ビタミンＤの１α−ヒドロキシル化代謝産物−−最も重要なのは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3および１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2である−−は動物およびヒトにおけるカルシウムホメオスタシスの高度に強力な調節剤として知られている。より最近になって、細胞分化におけるそれらの活性も確立された。その結果、これらの代謝産物の多くの構造的類似体、例えば異なる側鎖構造、異なるヒドロキシル化パターン、または異なる立体化学を有する化合物が作られ、試験が行われた。このような類似体の重要な例は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の種々の側鎖がフッ素化された誘導体、側鎖が均一な類似体などである。これら公知の化合物のいくつかはインビボおよびインビトロで非常に強力な活性を示し、好都合な活性プロファイルを有し、したがって種々の疾患、例えば腎臓骨ジストロフィー、ビタミンＤ−抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬、ある種の悪性腫瘍などに使用されており、または使用が提案されている。
発明の開示
本発明によれば多発性硬化症症状を有効に軽減するためのビタミンＤ化合物、好適には特定の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3類似体のある量を投与することによって多発性硬化症の対象（患者）を治療または予防することができる。この治療または予防は多発性硬化症の対象を選択し、多発性硬化症症状を軽減する十分量のビタミンＤ類似体をその対象に投与することを含む。
その反応の特に好都合な型では、投与する化合物が１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５−（ＯＨ）2Ｄ2）、１，２５−ジヒドロキシ−２２（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2−２４−ホモＤ3）、または１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−（ＯＨ）2−２１−エピ−Ｄ3）のいずれかである。なお、参考化合物として１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）、または２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）が挙げられる。
本発明のビタミンＤの好適用量は対象が耐えることができ、重大な過カルシウム血症を発生しない最大量である。そのビタミンＤ化合物が１α−ヒドロキシ化合物でない場合、ビタミンＤ化合物の特に好適な１日当りの投与量は対象１６０ポンドで１日当り５．０〜５０μｇである。ビタミンＤ化合物が１α−ヒドロキシ化合物である場合は、好ましい１日当りの投与量は対象１６０ポンドで１日当り０．５〜１０μｇである。対象が通常のカルシウム摂取をしている場合は、対象１６０ポンドにつき１日当り０．５〜０．７５μｇを超える１，２５（ＯＨ）2Ｄ3類似体量は好ましくない。対象が低カルシウム食餌を摂取しており、および／または夜遅く服用する場合はより多量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3類似体の摂取も可能であり、好ましいかも知れない。本発明のこの実施態様では、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3類似体の投与量は対象１６０ポンドで１日当り５μｇにも増やすことができる。好適用量は対象１６０ポンドで１日当り３μｇである。
本発明の利点はこの剤の投与が多発性硬化症の症状を軽減することである。
本発明のもう一つの利点はこの剤の投与が自己反応性エフェクター細胞を抑制することである。
本発明のもう一つの利点はこの剤の投与がＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−α遺伝子の活性化を減らすことである。
本発明のもう一つの利点はこの剤の投与がトランスフォーミング成長因子ＴＧＦ−β遺伝子発現を高めることである。
また別の利点は、この剤の投与を用いて、遺伝的に多発性硬化症の素質のある対象における上記疾患を予防できることである。
本発明のその他の利点および特徴は明細書、請求の範囲および図の考察によって明らかになる。
図面の説明
図１は、本発明に適したビタミンＤ化合物の図式である。
図２は、ＥＡＥ重症度と、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3または模擬治療後の日数との関係を示す図である。
図３は、ＥＡＥ重症度と、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3投与を続けながら免疫した後、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3投与を中止して免疫した後、または模擬治療を行って免疫した後の日数との関係を示す図である。
発明の説明
１．概論
我々は多発性硬化症を治療するためにビタミンＤ化合物を用いる根本的に異なるアプローチを考えている。
我々のこれまでの実験も（カントルナ（Cantorna,M.T．）ら、Eur.J.Immunol.２５巻：１６７３ページ、１９９５；カルマン（Carman,J.A．）ら、J.Exp.Med.１７５巻：１１１ページ、１９９２；カントルナら、J.Immunol.１５２巻：１５１５ページ、１９９４；チャン（Chun.T．）ら、J.Nutr．１２２巻：１０６２ページ、１９９２）、レミールらの実験も（レミールら、J.Cellular Biochem．４９巻：２６ページ、１９９２）、ビタミンＤがプライミング段階に作用してＴｈＯ前駆体のＴｈ１またはＴｈ２細胞への分化を調節し、さらにエフェクター段階に作用してサイトカイン遺伝子発現の調節もするかどうかという重要な問題には取り組んでいない。この問題はＭＳ治療には重要である、なぜならばこの疾患が進行するにつれて自己免疫反応が付加的ＭＰＢエピトープに、そして付加的タンパク質に広がり、脳炎Ｔｈ１細胞プライミングの進行プロセスが示唆されるからである（レーマン（Lehmann,P.V.）ら、同上、１９９２）。ビタミンＤはＴｈ０前駆体の分化を調節し、かつＴｈ１エフェクター機能を調節することができるため、我々はビタミンＤ治療が炎症サイクルを制限することができると仮定した。
我々の以下の実験は、多発性硬化症の容認される実験モデル、再発−回復型ヒト疾患に組織病理学的および臨床的類似性を有することが知られているＢ１０．ＰＬマウス、で行われている（ミラー（Miller）およびカルパス（Karpus）、Immun.Today １５巻［８号］：３５６ページ、１９９４）。これらのマウスはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）注射に反応して実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を表す。ＥＡＥは、ＣＮＳミエリンのタンパク質成分に向けられた、実験的に誘起されたＣＤ４+Ｔ−細胞−仲介性自己免疫病である（ミラーら、同上、１９９４）。ＥＡＥの特徴は罹患マウスの肢の一過性上行性麻痺である。
２．ＭＳ対象の治療
ａ．多発性硬化症症状の軽減。
本発明は多発性硬化症症状を軽減するのに適する。“多発性硬化症症状”とは、多発性硬化症に共通して認められる症状、例えばルディック（Rudick）およびグッドキン（D.Goodkin）編、「多発性硬化症の治療：トライアル計画、結果、および将来の展望」（Treatment of Multiple Sclerosis: Trial Design,Results,and Future Perspectives）、Springer-Verlag、New York、１９９２、に記載されているもの、特に４８−５２ページに記載されている症状を意味する（この参考資料はほとんどそのまま本明細書に参考として組み入れられている）。
これらの多発性硬化症症状は錐体機能の動揺、例えば不全対麻痺、片側不全麻痺、単不全麻痺および四肢不全麻痺の発生、および単麻痺、対麻痺、四肢麻痺および片側麻痺の発生などを含める。多発性硬化症の症状は小脳機能の動揺も含める。これらの動揺は、トルンカル（ｔｒｕｎｃａｌ）および肢失調を含む失調の発生を含める。我々が“多発性硬化症の麻痺症状”と言う場合、錐体−および小脳機能におけるこれら動揺を指している。
多発性硬化症の症状は脳幹機能の変化、例えば眼振の発生、構音障害を伴う外眼脆弱の発生などをも含める。その他の症状は、触感または体位感覚の低下および肢の知覚喪失を含む感覚機能の喪失である。腸および膀胱機能の障害、例えば腸および膀胱の躊躇、逼迫、貯溜、または失禁も起こり得る。視覚機能、例えば暗点の発生など、も多発性硬化症によって影響を受ける。精神機能減退および痴呆発生などの脳機能変性も１症状である。
本発明は多発性硬化症のいずれかまたはすべての症状、特に麻痺症状の発生を遅らせ、重症度を軽減すると考えられる。この病気の重症度およびそれに続く軽快はルディックおよびグッドキン（同上）記載の拡大性無能力状態スケール（Expanded Disability Status Scale）（ＥＤＳＳ）のようなスケールによって、または再発頻度の減少、または持続的進行までの時間の増加、または頻繁に逐次的に行われたＭＲＩ検査における磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）挙動の改善によって測定される。
ｂ．治療計画
我々は対象１６０ポンドに対しビタミンＤ化合物の用量または“有効量”１日当り０．５〜５０μｇを提案する。その化合物が１α−ヒドロキシ化合物である場合は好適用量は対象１６０ポンドで１日当り０．５〜１０μｇである。好適には用量は１日当り０．７５〜１０μｇである。最も好適には用量は１日当り３〜１０μｇである。通常用量は対象が耐え得るビタミンＤ化合物の最大量である。その用量を１日当り２または３回投与に分割するのが好ましい。
米国における正常のカルシウム摂取をしている対象では１，２５（ＯＨ）2Ｄ3および１９−ノル−２１−エピ−１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の許容安全量は、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3では１日当り０．５〜１５μｇ、１９−ノル−１，２５（ＯＨ）2Ｄ2では１日当り１０〜２０μｇである。そこで、正常カルシウム摂取量の対象の好適用量は投与化合物に応じて、対象１６０ポンドで１日当り０．５〜０．７５μｇである。
対象が低カルシウム食餌に移行し、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3（カルシトリオール）投与および／またはビタミンＤ化合物の夜間投与を受ける場合は、より多量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3（１日当り３μｇまで）に耐えることができる。そこで本発明の好適１実施態様は、対象が重大な過カルシウム血症にならずに耐えることができる最大量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で対象を治療することである。この付加的レベルのカルシトリオール治療は１日当り３μｇもの用量を可能にし、多分１日当り１０μｇも可能である。そのため、カルシウム濃度を操作した対象では好適１日量は上記のように１日当り０．７５〜１０μｇであり、最も好適には１日当り３〜１０μｇである。
１９−ノル−１，２５（ＯＨ2）Ｄ2および２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５（ＯＨ2）Ｄ3の安全用量範囲は対象１６０ポンドで１日当り１０〜２０μｇである。
このビタミンＤ用量をカプセル、ピルまたはトローチとして経口投与してもよいし、注射、皮膚パッチまたは座薬によって投与してもよい。経口投与が好適方法である。
ビタミンＤ投与が対象のためになっているかどうかを評価するために、対象の症状を定量的に、例えば上記のＥＤＳＳによって（ルディックおよびグッドキン、同上）、または再発率の減少、または持続的進行までの時間の増加、または頻繁に逐次的に行われるＭＲＩ検査における磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）挙動の改善によって調べ、対象の状態の測定値を治療前と後とで比較する。治療が成功した場合は対象の状態は改善している（すなわちＥＤＳＳ測定値または再発頻度は減少し、または持続的進行までの時間は増加し、またはＭＲＩスキャンはより少ない病変を示す）。
好適には、治療は多発性硬化症症状が疑われ、または観察される限り続けるべきである。
３．ビタミンＤ類似体
本発明の実施のための好適化合物には、多発性硬化症の対象の症状、特に麻痺症状を緩和し、その間より少ない副作用をもたらす、１，２５（ＯＨ2）Ｄ3にほぼ匹敵するビタミンＤ化合物が含まれる。好適には１α−ヒドロキシビタミンＤ化合物が選択される。出願人は図１に示す化合物を試験し、これらの化合物で成功することを証明した。本発明に用いられる特定の化合物は、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５−（ＯＨ）2Ｄ2）、１，２５−ジヒドロキシ−２２（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2−２４−ホモＤ3）、および１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−（ＯＨ）2−２１−エピ−Ｄ3）である。なお、参考化合物として１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）、１α−ヒドロキシビタミンＤ3（１α−ＯＨ−Ｄ3）、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ2）、１α−ヒドロキシビタミンＤ2（１α−ＯＨ−Ｄ2）、２６，２７−ヘキサフルオロ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｆ6−１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）、１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ3トリアセテートまたは２５−アセチル−１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ3が挙げられる。
候補であるビタミンＤ類似体が本発明に適するかどうかを評価するためには、その類似体を１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3と並べて試験し、その化合物の過カルシウム血症を生ずる用量に対する多発性硬化症症状を軽減する有効量を決定する。成功する化合物は、過カルシウム血症をひきおこす能力に対し多発性硬化症に対する活性の比率が高い。１，２５（ＯＨ）2Ｄ3より優れた、またはこれに等しい比率を表す化合物はかなり高い成功率を示す。
本発明に有効であると思われる化合物は下記の構造のものを含む：
0003701687.tif 000002
（式中、Ｘ1およびＸ2は各々水素およびアシルからなる群から選択され；
Ｙ1およびＹ2は水素であってもよいし、またはその１つがＯ−アリールもしくはＯ−アルキルであり、他の１つが水素であってβまたはα配置をとることができ；Ｚ1＝Ｚ2＝Ｈ、またはＺ1およびＺ2は一緒にＣＨ2であり；そして
Ｒはアルキル基、ヒドロキシアルキル基もしくはフルオロアルキル基であるか、またはＲは下記側鎖を表してもよく：
0003701687.tif 000003
式中、ａはＳまたはＲ配置を有してもよく、Ｒ1は水素、ヒドロキシまたはＯ−アシルであり、Ｒ2およびＲ3は各々アルキル、ヒドロキシアルキルもしくはフルオロアルキルからなる群から選択され、または一緒になって−（ＣＨ2）m−基を表し、ここでｍは２から５までの値を有する整数であり、Ｒ4は水素、ヒドロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択され、Ｒ5は水素、フッ素、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選択され、またはＲ4およびＲ5は一緒になって二重結合酸素を表し、Ｒ6およびＲ7は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ8はＨまたはＣＨ3であってもよく、ｎは１から５までの値を有する整数であり、側鎖の２０、２２または２３位のどの位置の炭素がＯ、Ｓ、またはＮ原子によって置換されていてもよい。
本明細書および請求の範囲において、用語“アルキル”は、炭素１〜５のあらゆる異性体型のアルキルラジカル、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチルなどを意味し、用語“ヒドロキシアルキル”および“フルオロアルキル”はそれぞれ１つ以上のヒドロキシまたはフルオロ基によって置換されたアルキルラジカルを表す。用語“アシル”は炭素１〜５の脂肪族アシル基、例えばホルミル、アセチル、プロピオニルなど、または芳香族アシル基、例えばベンゾイル、ニトロベンゾイルまたはハロベンゾイルを意味する。用語“アリール”はフェニル−、またはアルキル−、ニトロ−もしくはハロ置換フェニル基を意味する。
４．作用メカニズム
以下の例において示す我々のデータに基づくと、下記の考察をすることができる：ビタミンＤはプライミング中のＴｈ１細胞の頻度を減少させる（表４のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α測定値によって証明される）。ビタミンＤはプライミング中のＴｈ２細胞頻度を増加させる（表４のＩＬ−４測定値によって証明される）。ビタミンＤはＴＧＦ−β合成を増加する（表５および表６のＴＧＦ−β測定値によって証明される）。ビタミンＤは起脳炎性細胞エフェクター機能を低下させる（図２および図３によって証明される）。
そのため、もう一つの実施態様では本発明の剤はＴｈ１細胞頻度の抑制に用いられる。この抑制は下記の例に記載のように測定される。
ヒトＨＩＶ患者では、Ｔｈ１細胞頻度はリンパ節生検およびサイトカイントランスクリプト分析によって試験されている（グラジオス（Grazios,C.）ら、Science ２６５巻：２４８ページ、１９９４）。
例
１．概論
以下に示す例は本発明のいくつかの実施態様を示すために計画された。例３（Ａ）は、疾患誘発後の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3治療がＢ１０．ＰＬマウスのＥＡＥの進行を阻止することを示す。例３（Ｂ）は、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の中止がＢ１０．ＰＬマウスの進行性ＥＡＥの再発をおこすことを示す。例３（Ｃ）は、他のどの研究とも異なり、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3およびその類似体を疾患誘発前に投与したとき、ＥＡＥを完全に阻止し、またはＥＡＥの発症を遅らせ、重症度を軽減することを示す。例３（Ｄ）はビタミンＤ不足がＥＡＥ発症日を促進することを示し、例３（Ｅ）は低カルシウム食餌がＥＡＥ発症マウスの割合を減らすことを示している。例３（Ｆ）はインビボビタミンＤ治療がＭＢＰ反応性Ｔｈ１細胞発生およびサイトカイン遺伝子活性化を抑制し、ＭＢＰ反応性Ｔｈ２細胞発生およびサイトカイン遺伝子活性化を高めることを示す。例３（Ｇ）および３（Ｈ）は、インビボおよびインビトロ１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3治療がＴＧＦ−β遺伝子発現を高めることを示す。
２．材料および方法
動物。Ｂ１０．ＰＬマウス繁殖対をジャクソン研究所（バーハーバー（Bar Harbor、ME））から入手した。下記の実験には齢５〜８週の、体重が一致した雄および雌マウスを用いた。それらのマウスはビタミンＤ欠乏食餌で飼育するか（ビタミンＤ欠乏）または通常量のビタミンＤ（ビタミンＤ＋分量）で飼育した。付加的ビタミンＤを含まない実験用食餌（スミス（Smith,S.M.）ら、J.Nutr．１１７巻：８５７ページ、１９８７、に、ヤング（Yang）ら、Arch.Biochem.Biophys．３０３巻：９８−１０６ページ、１９９３が変更を加えたもの）を作り、実験期間中２〜３日おきに取り代えた。
低カルシウム食餌を用いた実験では；付加的ビタミンＤを含まない、食餌のカルシウム源（炭酸カルシウム）は加えないことを除けば同じである実験食餌を作った（０．０２％Ｃａ2+食餌）。
マウスを８〜１２匹のマウス群に分けた；１群には実験食餌のみを与えた。他の群には実験食餌プラス種々濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）または１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2（１９−ノル−１，２５（ＯＨ）2Ｄ2）、または１，２５−ジヒドロキシ−２２（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2−２４−ホモＤ3）、または１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ3（１９−ノル−１，２５−（ＯＨ）2−２１−エピ−Ｄ3）を与えた。
実験の終わりにマウスを殺し、秤量し、血清カルシウム分析のために瀉血した。
試薬。ダイブラー（Deibler,G.E.）らの方法（ダイブラーら、Prep.Biochem．２巻：１３９ページ、１９７２）によってミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）をモルモット脊髄から分離した。ＭＢＰを凍結乾燥し、−２０℃で保存した。免疫のためにＭＢＰを０．１Ｍ酢酸に８ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解した。百日咳毒素はＬＩＳＴ生物学研究所（キャンベル（Campbell,CA））から購入し、滅菌生理食塩液に再懸濁した。ＭＢＰを、マイコバクテリウムツベルクローシスＨ３７Ｒａ（４ｍｇ／ｍｌ）を含むフロインド完全アジュバント（ＣＦＡ）の等容量に乳濁させた。
ＥＡＥ誘発。エーテル麻酔したマウスを、ＣＦＡに乳濁させたＭＢＰ０．１ｍｌ（４００μｇ／マウス）の皮下注射で免疫した。免疫の日とその２日後に、マウスに付加的に百日咳毒素２００ｎｇを腹腔内注射した。この免疫プロトコルは実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）またはヒト多発性硬化症に匹敵するものを誘発した。
疾患程度。マウスＥＡＥの標準的採点システムを用いてマウスを毎日採点した（クレイトン（Clayton,J.P.）ら、J.Exp.Med.１６９巻：１６８１ページ、１９８９）。採点は次のように行われた；０−麻痺なし、１−よろよろした尾／緩慢／鈍い目、２−部分的後脚麻痺または肢脆弱、３−回転困難、重度の肢脆弱または軽度麻痺、４−重度麻痺〜全身麻痺、５−瀕死／死亡。
ビタミンＤ治療。例３（Ａ）および３（Ｂ）では、疾患誘発後治療した。齢および性別が合った１２匹のＢ１０．ＰＬマウスの２群を上記のようにＣＦＡ中ＭＢＰで免疫した。個々のマウスが１つまたはそれ以上のＥＡＥ症状を示した場合は、それらにエタノール中に溶解した１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の３００ｎｇを含む腹腔内注射か、等量のエタノールからなる模擬注射を行った。１，２５（ＯＨ）2Ｄ3治療時には食餌も、付加的ビタミンＤを供給しない実験用食餌、またはマウス１匹につき１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の２０ｎｇ／日を含む食餌に切り替えた。すべてのマウスは免疫後１０日目までにＥＡＥ症状を示した。免疫後１８日目に、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3投与マウスの半数のマウスの食餌から１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を除いた。
このプロトコルは３群のマウスを作り出した。第１群のマウスは模擬治療であり、ビタミンＤのない食餌が維持された。第２群のマウスには８〜１２日間、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３で処理し、その後ビタミンＤのない食餌に切り替えた。第３群のマウスには１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で処理し、残る研究期間中もマウス１匹あたり２０ｎｇ／日の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を含む食餌を続けた。
例３（Ｃ）では、疾患誘発の１日前にビタミンＤ治療を行った。疾患を誘発し、投与群および対照群を上記のように分析した。
３．結果
Ａ．１，２５（ＯＨ）2Ｄ3はＢ１０．ＰＬマウスのＥＡＥの進行を阻止する。
個々のマウスが１つ以上のＥＡＥ症状を示したとき、それらにエタノールに溶解した１，２５（ＯＨ）2Ｄ3３００ｎｇを含む腹腔内注射（●）または等量のエタノールの模擬注射（○）を行った。
治療時に、付加的ビタミンＤを含まない実験食餌、またはマウス１匹につき１，２５（ＯＨ）2Ｄ3２０ｎｇ／日を供給する食餌に変えた。図２はこの実験の結果を示す図であり、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3がＢ１０．ＰＬマウスにおいてＥＡＥの進行を阻止することを証明するものである。１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で治療したマウスが模擬治療動物より軽度のＥＡＥを示すことに注意されたい。
Ｂ．１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の除去はＢ１０．ＰＬマウスのＥＡＥ症状を高める。
図２からのマウスを新しい３群に分けた。第１群のマウスは模擬治療マウスであり、ビタミンＤのない食餌を維持した（○）。第２群のマウスは８〜１２日間１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で処理し、その後ビタミンＤのない食餌に切り替えた（▽）。第３群のマウスは１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で処理し、その後の研究期間中マウス１匹あたり２０ｎｇ／日を供給する食餌で飼育した（●）。それまで１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を投与したマウスの食餌から１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を除去すると、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を供給し続けた対照マウスに比較してＥＡＥ症状は増加した。図３はこの実験の結果を示し、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の除去がＢ１０．ＰＬマウスにおけるＥＡＥ症状を強めることを証明している。
Ｃ．１，２５（ＯＨ）2Ｄ3およびその類似体はＥＡＥ発現を遅らせるかまたは完全に阻止し、ＥＡＥの重症度を軽減する。
正常のビタミンＤレベル（ビタミンＤ十分量）を有するＢ１０．ＰＬマウスを付加的ビタミンＤを含まない食餌か、表１に示す量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3または類似体を含む食餌に切り替えることによって、ＥＡＥの発症および重症度に対する１，２５（ＯＨ）2Ｄ3またはその類似体の影響を調べた。
マウスを上記のようにＭＢＰで免疫し、疾患の発生、重症度、体重および血清Ｃａを分析した。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3およびその類似体は、他のどの研究とも異なり、ＥＡＥを完全に阻止するか、またはＥＡＥの発症を遅らせ、重症度を軽減した。表１はこの実験結果を列挙したものである。
0003701687.tif 000004
表１（Ａ）は、２０ｎｇ／日または１００ｎｇ／日の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3が与えられたマウスはＥＡＥ症状を発症せず、これに比して対照マウスでは約１８日目にＥＡＥ症状が発生したことを示す。
表１（Ｂ）は、１９−ノル−１，２５（ＯＨ）2−Ｄ2処理マウスには対照マウスより遅くＥＡＥが発症し、重症度も対照マウスより低かったことを示す。
表１（Ｃ）は、２００ｎｇ／日および４００ｎｇ／日の１９−ノル１，２５（ＯＨ）2−Ｄ2で処理したマウスにはＥＡＥが決して発生しなかったことを示す。１，２５（ＯＨ）2−２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−Ｄ3で処理したマウスには、３１日目に最大重症度が１であるＥＡＥが発症し、それに比して対照マウスは２７日目に最大重症度３．５を示した。
表１（Ｃ）は、２００ｎｇ／日の１，２５（ＯＨ）2−２４−ホモ−２２−デヒドロ−２２Ｅ−Ｄ3で処理したマウスにはＥＡＥ症状は決して発生しなかったことを示す。
表１（Ｄ）は、１９−ノル１，２５（ＯＨ）2−２１−エピ−Ｄ3で処理したマウスにはＥＡＥ症状が決して発生しなかったことを示す。
Ｄ．ビタミンＤ欠乏はＥＡＥ発症日を速める。
ビタミンＤ欠乏Ｂ１０．ＰＬマウスは、妊娠雌にＤ−欠乏食餌を与え、その後その子マウスに同じ食餌を続けるという方法で作った。ビタミンＤ欠乏またはビタミンＤ十分−Ｂ１０．ＰＬマウスに、齢５週のときにＥＡＥを誘発せしめた。それらのマウスで疾患の発生、重症度、体重、および血清Ｃａを分析した。ビタミンＤ欠乏は、ビタミンＤ十分な対照に比べてＥＡＥ発症日を速めた。この実験結果は下の表２にした。
0003701687.tif 000005
表２は、ビタミンＤ欠乏マウスには、ビタミンＤ十分マウスより約８日早くＥＡＥ症状が発生することを示す。
Ｅ．低カルシウム食餌はＥＡＥ発症マウスの割合を低下させる。
ビタミンＤレベルが正常なマウス（ビタミンＤ十分）を、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）誘発前、正常カルシウム食餌（１．２％）を維持するか、または低カルシウム食餌（０．０２％）に移行させた。これらのマウスで疾患発生日を比較した。この実験結果を下の表３にした。表３に示すように、食餌中に含まれるカルシウム量の変化はＥＡＥ発生マウスの割合を低下させた。
0003701687.tif 000006
我々はこの結果を、低血清カルシウムが、かわって内因性１，２５（ＯＨ）2Ｄ3レベルを高める上皮小体分泌を刺激すると説明した。実際の防御は１，２５（ＯＨ）2Ｄ3レベルの増加によって起きる。
こうして、正常飼育マウスにおいて、低カルシウム食餌が好都合であり、上記のレミールらの結果を完全に説明することができた。
Ｆ．インビボビタミンＤ治療はＭＢＰ−反応性Ｔｈ１細胞の発生および／またはサイトカイン遺伝子活性化を低下させる。
マウスに、フロインド完全アジュバント中ミエリン塩基性タンパク質でプライミングした日から１０日後の細胞採集日まで、１日おきにエタノール中１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3またはエタノールを注射した。リンパ節細胞を集め、インビトロで５日間ＭＢＰで再刺激してから定量的競合的ＰＣＲによるサイトカイントランスクリプト分析を行った。結果を下の表４に示す。
表４のデータは、１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3が、インターロイキン（ＩＬ）−２、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）を作り出す自己反応性Ｔｈ１細胞の生成を抑制することによって、ＥＡＥを抑制することを示唆する。ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αは、ＥＡＥの発症に対して重要であると他人によって示された炎症の調停物質である。そのデーターはまた、１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3がインターロイキン（ＩＬ）−４をつくるＭＢＰ反応性細胞の正の調整物質であることを示唆する。ＩＬ−４は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γそしてＴＮＦ−αをつくるＴｈ１細胞の負の調整物質である。
0003701687.tif 000007
Ｇ．インビボビタミンＤはＴＧＦ−β遺伝子発現を高める。
ビタミンＤレベルが正常なマウス（ビタミンＤ十分）に付加的ビタミンＤを供給しない食餌、または１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の２０ｎｇ／日／マウスを提供する食餌に変えた。その食餌を変えたのはＥＡＥ誘発の前の日である。免疫後７および１４日目にリンパ節細胞を集め、ＲＮＡを集め、サイトカイントランスクリプトを競合的ＰＣＲで定量した。サイトカイントランスクリプトをインビトロ再刺激することなく測定した（表４と比較）。表５はこれらのデータをまとめためのである。表５のデータは、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3が免疫後１４日目にＴＧＦ−β合成を増加させることを示唆する。（ＴＧＦ−βはＴｈ１細胞およびＥＡＥの負の調節物質である。）
0003701687.tif 000008
Ｈ．インビトロビタミンＤはＴＧＦ−β遺伝子発現を高める。ｌ
ビタミンＤ欠乏マウスからのプラスチック接着性腹膜滲出細胞（主としてマクロファージ）をインビトロで１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の存在下または不在下でリポ多糖で処理した。データを下の表６にした。インビトロビタミンＤ添加はＴＧＦ−βトランスクリプトの数を３倍増加させた。これらのデータは表５の情報を裏付ける。
0003701687.tif 000009
【図１】
0003701687.tif 000010
【図２】
0003701687.tif 000011
【図３】
0003701687.tif 000012