(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、複数種のポリペプチドの混合物を含むサンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付けるための方法。
（ａ）ポリペプチドフラグメントを生成させるため、前記サンプルを第１の開裂試薬と接触させる工程；
（ｂ）生成された１以上のポリペプチドフラグメントを単離する工程（ここで、各フラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端の断片化されたポリペプチドを含有している）；
（ｃ）単離したフラグメントをマススペクトル分析によって同定する工程；
（ｄ）第１の開裂試薬とは異なる部位で開裂する第２の開裂試薬を使用し、サンプルに対し上記工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程；ならびに
（ｅ）前記工程（ｃ）および（ｄ）で同定されたフラグメントから、前記サンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付ける工程。
【請求項２】
前記工程（ｄ）が、工程（ａ）〜（ｃ）を２回以上繰り返す工程を含み、各回では、先の開裂試薬とは異なる部位で開裂する開裂試薬を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記工程（ａ）に先立って更に保護工程を含み、該保護工程は、ポリペプチドの１以上の反応性側鎖上に保護基を導入するため、サンプル中のポリペプチドを１以上の保護試薬と反応させることを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記保護工程および工程（ａ）〜（ｃ）が、１回、２回またはそれ以上繰り返され、各回では、先の保護工程と同じ側鎖に保護基を導入するが、先の保護工程で用いた対応する保護基とは異なる質量を有する保護基を使用する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、複数種のポリペプチドの混合物を含むサンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付けるための方法。
（ｆ）ポリペプチドの１以上の反応性側鎖に対して保護基を導入するため、第１の保護工程で、前記サンプルを第１の保護試薬と接触させる工程、
（ｇ）ポリペプチドフラグメントを生成させるため、前記（ｆ）工程で処理されたサンプルを開裂試薬と接触させる工程、
（ｈ）生成された１以上のポリペプチドフラグメントを単離する工程（ここで、各フラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端の断片化されたポリペプチドを含有している）；
（ｊ）単離したフラグメントをマススペクトル分析によって同定する工程；
（ｋ）第１の保護工程と同じ側鎖に保護基を導入するが、第１の保護工程で用いた保護基とは異なる質量を有する保護基を使用する、第２の保護試薬を用いてサンプルに対し工程（ｆ）〜（ｊ）を繰り返す工程；ならびに
（ｌ）工程（ｊ）および（ｋ）で同定したフラグメントから前記サンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付ける工程。
【請求項６】
前記工程（ｆ）〜（ｊ）が、２回以上繰り返され、各回では、先の保護工程と同じ側鎖に保護基を導入するが、先の保護工程で使用した対応する保護基とは異なる質量を有する保護基を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｋ）が、工程（ｆ）〜（ｊ）を１回、２回またはそれ以上繰り返す工程を含み、各回では、先の開裂試薬とは異なる部位で開裂する開裂試薬をさらに使用する、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記保護される側鎖が、１以上の以下のものを含む請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
アルギニン中のＮＨ2側鎖；
アスパラギン中のＮＨ2側鎖；
グルタミン中のＮＨ2側鎖；
リジン中のＮＨ2側鎖；
アスパラギン酸中のＣＯＯＨ側鎖；
グルタミン酸中のＣＯＯＨ側鎖；
セリン中のＯＨ側鎖；
スレオニン中のＯＨ側鎖；
チロキシン中のＯＨ側鎖；
チロシン中のＯＨ側鎖；および
システイン中のＳＨ側鎖。
【請求項９】
前記フラグメントが、固相上での捕捉によって単離される、前記請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記固相がＤＩＴＣガラスまたはポリスチレンイソチオシアネートである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉が、固相にフラグメントを共有結合させることを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記フラグメントが、それらのＮ末端を通じて固相に結合される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
単離された各フラグメントが、断片化されたポリペプチドのＣ末端を含む前記請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
使用される前記開裂試薬が、エンドペプチダーゼまたは化学的な開裂試薬を含む前記請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
使用される開裂試薬が、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ、チオシアン酸化合物、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、トリプシン、チモトリプシン、および／またはトロンビンを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記各保護工程で使用される前記保護試薬が、ヨード酢酸化合物、イソシアン酸化合物、シリル化合物、酸無水物、ビニルスルホン酸化合物およびビニルピリジン誘導体から選ばれる１種である請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記請求項１〜１６のいずれか１つで定義される方法によってポリペプチドの混合物を特徴付ける工程を含む、組織中における１以上のタンパク質の構造を決定するための方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項で定義される方法によってサンプル中の複数種のポリペプチドの混合物を特徴付ける工程、およびポリペプチドに対応する１以上の特異的なフラグメントの存在または非存在から１以上の特異的なポリペプチドの存在または非存在を決定する工程を含む、サンプル中の１以上の特異的なポリペプチドを同定するための方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法において、さらにデータベースとの比較により前記サンプル中のポリペプチドを特徴付けることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリペプチドの末端のフラグメントを同定するため、マススペクトル分析を使用してポリペプチドを特徴付けるための方法に関するものである。この方法は、ポリペプチドを開裂する工程、および集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中の各々のタンパク質に由来する単一の末端ペプチドを単離する工程を包含する。本発明はさらに、組織、細胞タイプ、または亜細胞成分におけるタンパク質の構造（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を決定する方法、および大きなタンパク質複合体を分析する際における、上記方法の使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質をプロファイルするための技術、すなわち、組織中におけるタンパク質の実態および量を分類するための技術は、自動化または高い処理能力に関する限り十分とはいえない。タンパク質集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）をプロファイリングするための伝統的な方法は、二次元電気泳動である（Ｒ．Ａ．Ｖａｎ  Ｂｏｇｅｌｅｎ．，Ｅ．Ｒ．Ｏｌｓｏｎ，「バイオテクノロジーにおける二次元タンパク質ゲルの適用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，１：６９−１０３、１９９５）。
【０００３】
この方法では、生物学的サンプルから抽出されたタンパク質サンプルが、狭いゲル小片（ｇｅｌ  ｓｔｒｉｐ）上で分離される。この最初の分離においては、通常それらの等電点に基づいてタンパク質を分離する。次いで、全体のゲル小片（ｇｅｌ  ｓｔｒｉｐ）は、長方形ゲルの１つの縁に対し横向きに配置される。小片中の分離されたタンパク質は、次いでそれらの大きさに基づいて、第２のゲル上で電気的に分離される。この技術は、遅く且つ自動化が非常に難しい。これはまた、その最も単純な典型においても比較的感度が低い。
【０００４】
２−Ｄゲル電気泳動によるタンパク質の分解能力を増大させるため、又このシステムの感度を改善するために、多くの改良が行われている。２−Ｄゲル電気泳動の感度とその解析能力を改善するための１つの方法は、マススペクトルによりゲル上で特異的なスポット中のタンパク質を分析することである（Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  Ｐ．Ｔｈｉｅｄｅ  Ｂ．「ＭＡＬＤＩマススペクトルによる２−ＤＥゲルからのタンパク質の同定（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ２−ＤＥ  ｇｅｌ  ｂｙ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．）」Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．１６：１４５−１６２、１９９７）。
【０００５】
この方法は、ゲル中でのトリプシン性消化（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、それに続くマススペクトルによるトリプシン性フラグメント（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の分析であり、これによってペプチドの質量のフィンガープリントを生じる。配列情報が必要とされる場合は、タンデムなマススペクトル分析が行われ得る。
【０００６】
より最近の試みでは、液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動によって、断片化された（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）全タンパク質を分析するためにマススペクトル分析が利用されている（Ｄｏｌｎｉｋ  Ｖ．「タンパク質のキャピラリーゾーン電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｚｏｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８、２３５３−２３６１頁、１９９７）。キャピラリー電気泳動マススペクトル分析を利用したインラインシステムが試験されている。
【０００７】
しかし、マススペクトル分析による全タンパク質の分析には多くの問題がある。第１の問題は、個々のタンパク質によって接近され易い複数のイオン化状態によって生じる複雑なマススペクトルの分析である。第２の主な欠点は、マススペクトル分析における質量の解析能力が、高分子量の種（すなわち、約４キロダルトンの質量よりも大きなイオン）について極めて低いことである。そのため、質量の近いタンパク質を解析することは難しい。第３の欠点は、タンデムなマススペクトル分析による全タンパク質の更なる分析が、全タンパク質についての断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のパターンが極端に複雑で且つ解析が困難であるため、難しいことである。
【０００８】
ＷＯ９８／３２８７６号は、集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中の各タンパク質に由来する単一のペプチドを単離することによって、タンパク質集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をプロファイルするための方法を開示している。この出願に開示されている方法は、以下の工程を包含する：
１．集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中における各タンパク質の一方の末端によって固相支持体上にタンパク質集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を捕捉する工程、
２．配列特異的開裂試薬で捕捉されているタンパク質を開裂する工程、
３．固相支持体上に保持されていない、開裂試薬によって生成されたタンパク質を洗い流す工程、
４．固相支持体上に残っている末端ペプチドを解離させる工程、
５．解離された末端ペプチドを分析する、好ましくは、混合物中の各ペプチドを同定および定量する工程。分析は、好ましくは、マススペクトル分析によって行われる。
【０００９】
この出願では、タンパク質集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を捕捉するうえで、Ｃ末端が末端としてより好ましいと指摘している。なぜなら、Ｎ末端はしばしばブロックされているからである。Ｃ末端によってタンパク質集団を捕捉するには、Ｃ末端のカルボキシル基は、タンパク質上の他の反応基から区別されなければならず、そして有効な固定を行うことのできる試薬と特異的に反応させられなければならない。多くのＣ末端配列の化学的性質では、Ｃ末端のカルボキシル基は、Ｃ末端でオキサゾロン基の形成を促進する様に活性化される。Ｃ末端カルボキシルの活性化の間に、側鎖のカルボキシルもまた活性化されるが、これらはオキサゾロン基を形成し得ない。Ｃ末端のオキサゾロンは、活性化された側鎖のカルボキシルよりも、塩基性条件下では求核剤に対してあまり反応性がなく、これにより、側鎖のカルボキシル基を選択的に保護（ｃａｐｐｉｎｇ）する方法を提供する（Ｖ．Ｌ．Ｂｏｙｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：１０９−１１８、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｚ．ＡｔａｓｓｉおよびＥ．Ａｐｐｅｌｌａ編、１９９５）。より反応性の高い他の側鎖は、従来の種々の試薬を用いてカルボキシルを活性化する前に保護（ｃａｐｐｉｎｇ）され得る。この方法によれば、全ての反応性側鎖を保護（ｃａｐｐｉｎｇ）することができ、そしてＣ末端が特異的に標識され得る。
【００１０】
ＥＰ−Ａ−０５９４１６４には、Ｎ末端の配列決定試薬を用いてＣ末端ペプチドの配列決定を行なう方法において、タンパク質からＣ末端のペプチドを単離する方法が記載されている。この方法によれば、目的とするタンパク質は、リジン残基のＣ末端側で開裂するエンドヌクレアーゼで消化される。得られるペプチドは、全ての遊離アミノ基と反応するＤＩＴＣポリスチレンと反応させられる。ＤＩＴＣポリスチレンと反応したＮ末端アミノ基は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で開裂させることができ、従って、全てのペプチドのＮ末端が解離される。リジンのイプシロンアミノ基は開裂されないが、しかし従って、全ての非末端ペプチドが支持体上に保持されたままであり、そしてＣ末端ペプチドのみが解離させられる。この特許に従えば、Ｃ末端ペプチドはミクロ配列決定（ｍｉｃｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のために回収される。
【００１１】
しかし上記の方法のいずれも、集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中に存在するタンパク質の全て同定することは容易でなく、実際、多くのこれらの方法は、全てにおいて存在するタンパク質の全てを独自に同定することはできない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、先行技術に関連する課題を克服すること、およびサンプル中に存在するタンパク質のより大きな集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を独自に同定することができ、次いで先行技術の方法を使用することのできる、ポリペプチドを特徴付けるための方法を提供することである。従って、本発明の目的は、（任意の方法で調製された）混合物、複合物、または集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中の各タンパク質に由来する単一の末端ペプチドを単離するための改良された方法を提供することである。本発明の更に他の目的は、容易に自動化することのできる方法を提供することである。本発明の方法によって生成される末端ペプチドのマススペクトル分析の感度を改良するための方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、複数種のポリペプチドの混合物（以下、集団ということがある）を含むサンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付けるための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する。
【００１４】
（ａ）ポリペプチのドフラグメントを生成するため、前記サンプルを第１の開裂試薬と接触させる工程；
（ｂ）生成された１以上のポリペプチドフラグメントを単離する工程（ここで、各フラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端の断片化されたポリペプチドを含有している）；
（ｃ）単離したフラグメントをマススペクトル分析によって同定する工程；
（ｄ）第１の開裂試薬とは異なる部位で開裂する第２の開裂試薬を使用し、サンプルに対し上記工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す工程；ならびに
（ｅ）前記工程（ｃ）および（ｄ）で同定されたフラグメントから前記サンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付ける工程。
【００１５】
本発明においてポリペプチドは、２以上のアミノ酸を有する任意のペプチドを含み、且つ任意のタンパク質を包含する。本発明において、繰り返し工程（ｄ）で使用されるサンプルは、工程（ａ）で使用されるサンプルと同じサンプルである。ここで「同じサンプル」とは、例えば１つの元のサンプルから分けられた集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の部分の１つを意味する。これらは、工程（ａ）〜（ｃ）の各繰り返しについて１つの部分である。
【００１６】
工程（ａ）〜（ｃ）は任意の回数（例えば、１回、２回またはそれ以上の回数）繰り返すことができる。各繰り返しを行なうに当たり、先に使用した開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）とは異なる部位で開裂する開裂試薬が使用される。これにより、同じサンプルを処理した場合でも、それぞれの繰り返しについて末端フラグメントの異なるセットが生じる。２以上のタンパク質が、特定部位での開裂によって生じるそれら末端フラグメントの方法によっては区別できない場合（２以上のタンパク質が同じ、もしくは区別できない質量の末端フラグメントを有する場合）は、異なる部位での開裂によって、（同じ２以上のタンパク質について）異なる質量の末端フラグメントを生じさせることができる。従って、この方法による解析能力は、異なる複数の開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）用いた繰り返しによって増強される。
【００１７】
本発明で使用される開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）は、特には限定されない。好ましい開裂試薬としては、エンドペプチダーゼ、または化学的開裂試薬が挙げられる。使用されるより好ましい開裂試薬には、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ、チオシアン酸塩化合物、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、トリプシン、チモトリプシン、および／またはトロンビンが含まれる。
【００１８】
本発明はまた、複数種のポリペプチドの混合物を含むサンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付けるための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する。
【００１９】
（ｆ）ポリペプチドの１以上の反応性側鎖に対して保護基を導入するため、第１の保護工程で、前記サンプルを第１の保護試薬と接触させる工程、
（ｇ）ポリペプチドフラグメントを生成させるため、前記（ｆ）工程で処理されたサンプルを開裂試薬と接触させる工程、
（ｈ）生成された１以上のポリペプチドフラグメントを単離する工程（ここで、各フラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端の断片化されたポリペプチドを含有している）；
（ｊ）マススペクトル分析によって単離したフラグメントを同定する工程、
（ｋ）第１の保護工程と同じ側鎖に保護基を導入するが、第１の保護工程で用いた保護基とは異なる質量を有する保護基を使用する、第２の保護試薬を用いてサンプルに対し工程（ｆ）〜（ｊ）を繰り返す工程；ならびに
（ｌ）工程（ｊ）および（ｋ）で同定したフラグメントから前記サンプル中の１以上のポリペプチドを特徴付ける工程。
【００２０】
この方法は、異なる質量を有する保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）が各繰り返して使用される限りは、各繰り返しについて同じ開裂試薬を使用してもよく、または異なる開裂試薬を使用してもよい。工程（ｆ）〜（ｊ）は、任意の回数（例えば、１回、２回またはそれ以上の回数）繰り返してもよい。各繰り返しを行なう際には、対応する先の保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）とは異なる質量を有する保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）が使用される。これによって、同じサンプルを同じ開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）で処理する場合でも、各繰り返し毎に、末端フラグメントの異なるセットが生じる。２以上のタンパク質が、特定の保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）（単数または複数）で保護（ｃａｐｐｅｄ）されたそれらの末端フラグメントと区別できない場合（例えば、２以上のタンパク質が、同一もしくは区別できない質量を有する末端フラグメントを有する場合）は、先の保護工程（ｃａｐｐｉｎｇ  ｓｔｅｐ）で使用した対応する基とは異なる質量を有する１以上の保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）を使用することによって、（同じ２以上のタンパク質について）異なる質量の末端フラグメントを得ることができる。従ってこの方法の解析能力は、夫々が異なる質量を有する複数の保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）を用いた繰り返しによって増強される。
【００２１】
上記方法において、集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中のタンパク質の側鎖が保護される（ｃａｐｐｅｄ）場合は、保護される（ｃａｐｐｅｄ）側鎖は、次に示す１以上を含み得る。
【００２２】
アルギニン中のＮＨ2側鎖；
アスパラギン中のＮＨ2側鎖；
グルタミン中のＮＨ2側鎖；
リジン中のＮＨ2側鎖；
アスパラギン酸中のＣＯＯＨ側鎖；
グルタミン酸中のＣＯＯＨ側鎖；
セリン中のＯＨ側鎖；
スレオニン中のＯＨ側鎖；
チロキシン中のＯＨ側鎖；
チロシン中のＯＨ側鎖；および
システイン中のＳＨ側鎖。
【００２３】
本発明で使用される保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）は、特に限定されない。好ましい保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）としては、ヨードアセトン（ｉｏｄｏａｃｅｔａｎｅ）化合物、イソシアネート化合物（例えば、フェニルイソシアネート）、シリル化合物（例えば、トリメチルクロロシラン）、無水化合物（例えば、無水酢酸およびトリメチル酢酸無水物）、ビニルスルホン化合物（例えば、フェニルビニルスルホンおよびメチルビニルスルホン）、ならびにビニルピリジン誘導体（例えば、４−ビニルピリジン）が挙げられる。保護基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ）の質量は、置換によって変更され得る。このような置換は、保護反応（ｃａｐｐｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を生じる得る限り特に限定されない。重水素または沃素の様なハロゲンで置換したものも好ましい。
【００２４】
従って、本発明の１つの好ましい態様では、２以上のタンパク質の構造（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロフィールを組み合わせることによって、改善された解析能力を有するタンパク質の構造（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロフィールを形成する方法を提供する。ここでは、プロフィールが、同じタンパク質の混合物から形成されているが、２以上の異なる配列特異的開裂試薬で処理される。異なる配列特異的開裂試薬が、各々個々のプロフィールの形成に使用される。この状況では、解析能力は、それら末端ペプチドの質量のみに基づくデータベースから独自に同定することのできる集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中のタンパク質の割合をいう。
【００２５】
本発明の更に好ましい態様では、２以上の構造（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロフィールを組み合わせることによって、改善された解析能力を有するタンパク質の構造（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロフィールを形成する方法を提供する。ここでは、プロフィールが、同じタンパク質の混合物から生成されており、且つ同じ配列特異的開裂試薬で開裂されているが、しかし特異的側鎖（例えば、アミノ酸側鎖）は異なる質量を有する２以上の保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）で保護（ｃａｐｐｅｄ）されている。保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の異なるセットが、各々個々のプロフィールの形成に使用される。
【００２６】
本発明のより好ましい態様は、本明細書中で詳細に記載される。本発明の第１の好ましい態様では、以下の工程を包含する末端ペプチド集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｏｔｉｄｅｓ）を形成する方法を提供する。
【００２７】
１．固体支持体上にタンパク質集団を固定する工程、
２．固定化されたタンパク質集団を、タンパク質のＮ末端α−アミノ基および任意のリジンのイプシロンアミノ基と反応する試薬と接触させる工程。この試薬はまた、必要によりそれらを保護（ｃａｐ）するために、任意のセリンおよびスレオニン側鎖とも反応する場合がある。この場合、保護（ｃａｐ）とは、側鎖を、該側鎖が本発明法に続く工程で使用される任意の他の試薬とは反応しない様にする試薬と反応させることを意味する。試薬がアミノ基以外の側鎖を保護しない場合には、更なる保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を他の反応性の側鎖を保護するために用いてもよく、その結果、実質的に全ての反応性側鎖が保護される。
【００２８】
３．タンパク質集団を、タンパク質の遊離カルボキシル基を活性化する試薬と接触させる工程。活性化試薬は、好ましくは、集団中におけるタンパク質のＣ末端の活性化されたカルボキシルでオキサゾロン基の形成を促進するはずである。
【００２９】
４．活性化された側鎖のカルボキシル誘導体を保護するため、得られる誘導されたタンパク質を塩基性の条件下で求核剤と接触させる工程。Ｃ末端オキサゾロンは、活性化された側鎖のカルボキシルよりも求核剤に対する反応性が低い。この方法では、全ての反応性側鎖の官能性が保護される（ｃａｐｐｅｄ）。好ましくは、求核剤は、チオシアン酸塩として添加される。
【００３０】
５．反応混合物を、チオシアン酸塩とＣ末端オキサゾロン基との反応を促進する適切な酸（好ましくは、ＴＦＡ）と接触させ、Ｃ末端チオヒダントイン誘導体を生じさせる工程。
【００３１】
６．誘導されたタンパク質に由来するＣ末端チオヒダントインを開裂するため、タンパク質を開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）と接触させ、各タンパク質中の最後から２番目のアミノ酸のカルボキシルを露出させる工程。
【００３２】
７．Ｃ末端によってタンパク質の固相を捕捉し得る様、露出された最後から２番目のカルボキシルを適切な試薬と接触させる工程。
【００３３】
８．Ｃ末端を変性したタンパク質を配列特異的開裂試薬と接触させる工程。
【００３４】
９．固相支持体上にＣ末端ペプチドを捕捉する工程、および非末端ペプチドを洗い流す工程。
【００３５】
１０．必要に応じて、捕捉されているペプチドの末端アミノ基をマススペクトル分析の増感試薬（ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）と反応させる工程。
【００３６】
１１．捕捉されているＣ末端ペプチドを固相支持体から解離させる工程。
【００３７】
１２．解離されたペプチドを回収する工程。
【００３８】
１３．マススペクトル分析によってＣ末端ペプチドを分析する工程。
【００３９】
上記好ましい工程の任意の１つ、もしくは上記好ましい工程の任意の組み合わせが、前述した如く本発明の一般的な方法において利用され得る。
【００４０】
本発明における第２の好ましい態様は、以下の工程を包含する、末端ペプチド集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）を生成する方法を提供する。
【００４１】
１．固体支持体上にタンパク質集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を固定する工程。
【００４２】
２．固定化されたタンパク質集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を、タンパク質のＮ末端α−アミノ基および任意のリジンのイプシロンアミノ基と反応する試薬と接触させる工程。この試薬はまた、必要によりそれらを保護するため、任意のセリンおよびスレオニン側鎖とも反応させることがある。この場合の保護は、側鎖を、該側鎖が本発明の方法に続く工程で使用される任意の他の試薬とは反応しない様にする試薬と反応させることを意味する。試薬がアミン基以外の側鎖を保護しない場合には、更なる保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を他の反応性側鎖を保護するために適用してもよく、その結果、実質的に全ての反応性側鎖が保護される（ｃａｐｐｅｄ）。
【００４３】
３．タンパク質集団（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を、タンパク質の遊離カルボキシル基を活性化する試薬と接触させる工程。活性化試薬は、好ましくは、集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中におけるタンパク質のＣ末端の活性化されたカルボキシルでオキサゾロン基の形成を促進するはずである。
【００４４】
４．活性化された側鎖のカルボキシル誘導体を保護するため、得られる誘導されたタンパク質を塩基性の条件下で求核剤と接触させる工程。Ｃ末端オキサゾロンは、活性化された側鎖のカルボキシルよりも求核剤に対する反応性が低い。この方法で、全ての反応性側鎖の官能性が保護される（ｃａｐｐｅｄ）。求核剤は、好ましくはチオシアン酸塩として添加される。
【００４５】
５．Ｃ末端のカルボキシル種を再生するため、Ｃ末端オキサゾロンを加水分解する工程。
【００４６】
６．Ｃ末端カルボキシル基を活性化するため、タンパク質を活性化試薬と接触させる工程。
【００４７】
７．Ｃ末端によってタンパク質の固相を捕捉し得る様に、活性化された末端カルボキシル基を適切な試薬と接触させる工程。
【００４８】
８．Ｃ末端を変性したタンパク質を配列特異的開裂試薬と接触させる工程。
【００４９】
９．固相支持体上にＣ末端ペプチドを捕捉する工程、および非末端ペプチドを洗い流す工程。
【００５０】
１０．必要により、捕捉されているペプチドの末端アミノ基をマススペクトル分析器の増感試薬（ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）と反応させる工程。
【００５１】
１１．捕捉されているＣ末端ペプチドを固相支持体から解離させる工程。
【００５２】
１２．解離されたペプチドを回収する工程。
【００５３】
１３．マススペクトル分析によってＣ末端ペプチドを分析する工程。
【００５４】
上記好ましい工程の任意の１つ、若しくは上記好ましい工程の任意の組み合わせが、前述した如く本発明の一般的な方法において利用され得る。
【００５５】
本発明の第３の好ましい態様では、以下の工程を包含する、タンパク質集団に由来する末端ペプチドの集団を生成する方法を提供する。
【００５６】
１．Ｌｙｓ−Ｃ特異的開裂酵素（すなわち、その残基のＣ末端側上のリジン残基に対し速やかにのペプチド結合で切断する試薬）を用いて、タンパク質集団を完全に消化する工程。
【００５７】
２．得られるペプチドを、遊離アミノ基と反応する活性化された固体支持体と接触させる工程。
【００５８】
３．捕捉されているペプチドを、支持体上の各ペプチドのα−アミノ基で開裂する試薬と接触させる工程。Ｃ末端でない全てのペプチドは、固体支持体上にそれを共有結合するリジン残基を有する。従って、遊離のＣ末端ペプチドが選択的に解離される。
【００５９】
４．解離されたペプチドを回収する工程。
【００６０】
５．必要に応じて、反応性側鎖を保護するため、解離されているペプチドを試薬と接触させる工程。
【００６１】
６．必要に応じて、捕捉されているペプチドの末端アミノ基をマススペクトル分析の増感試薬（ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）と反応させる工程。
【００６２】
７．マススペクトル分析によってペプチドを分析する工程。
【００６３】
上記好ましい工程の任意の１つ、もしくは上記好ましい工程の任意の組み合わせが、記述の如く本発明の一般的な方法において利用され得る。
【００６４】
リジン残基を含むフラグメントだけが、２つのアミノ基を通じて固体支持体に結合されたままとなる（その結果、リジン基を有するものを除く全てのフラグメントが、解離工程の間に固体支持体から解離される）ためには、フラグメントは、好ましくは、リジンの側鎖ＮＨ2がプロトン化されないｐＨで固相に付着させられる。従ってこの工程は、好ましくはｐＨ１１〜１５で行われる。
【００６５】
Ｃ末端ペプチド集団の生成
Ｃ末端の配列決定試薬の使用
本発明に係る上記種々の好ましい実施態様が、以下に吟味される。
【００６６】
本発明に係る第１および第２の好ましい態様の工程１では、タンパク質集団は固相支持体上に（好ましくは、非共有的に）固定される。Ｚｉｔｅｘ（Ｎｏｒｔｏｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｗａｙｎｅ、ＮＪによる有孔性のＴｅｆｌｏｎ）メンブレムが、固相支持体上へのタンパク質の非共有的な固定を行うために使用され得る（Ｂａｉｌｅｙら、「ジフェニルホスホロイソチオ−シアナチデートを使用するペプチドおよびタンパク質の自動化されたカルボキシ末端配列分析（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｓｏｔｈｉｏ−ｃｙａｎａｔｉｄａｔｅ）」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：１６２２−１６３３、１９９２；Ｂａｉｌｅｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：３６６−３７４、１９９３）。ポリビニリデンジフルオライドメンブレム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）もまた、タンパク質を固定化するために使用され得る。
【００６７】
本発明に係る第１および第２の好ましい態様における工程２は、タンパク質集団の反応性側鎖を保護することを含む。反応性側鎖の官能性が選択的に保護され得ることは当該分野で周知である。反応性側鎖としては、リジン、セリン、スレオニン、チロシンおよびシステインが挙げられる。システインは、しばしばそれ自体が架橋してジスルフィド結合を形成する。本発明の目的のためには、これらの架橋が崩壊されることが好ましい。これは、メルカプトエタノールでチオールの対に対するジスルフィド結合を還元することによって達成され得る。チオールは、チオール酸イオンの形成を促進する中程度の塩基性の条件下で、ヨードアセトン（Ａｌｄｒｉｃｈ）によって選択的に保護され得る（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５：２２９３、１９９１）。適切な中程度の塩基は炭酸である。
【００６８】
他の実施態様では、タンパク質集団は、イソシアネート化合物を用いて処理され得る。イソシアネートは、タンパク質のＮ末端α−アミノ基と、およびリジンのイプシロン−アミノ基とほぼ排他的に（すなわち、穏やかな条件下（すなわち、中性の溶媒中室温）で主にアミンと）反応して尿素誘導体を生じる。これらの試薬、またはセリン、スレオニンおよびチロシンの側鎖の如く、任意のカルボキシル基を有している側鎖と、適切な触媒（例えば、ピリジンまたはジブチルスタニルラウレートの如きスズ化合物）の存在下で反応させられてウレタン誘導体を生じる。
【００６９】
別の実施態様では、タンパク質集団は、トリメチルクロロシラン（Ｓｉｇｍａ）の如きシリル化合物を用いて処理され得る。これらの化合物は、最も反応性である官能基と容易に反応する。アミド誘導体は、水性条件下では安定でないので、必要によっては、加水分解によって遊離のアミンに戻され得る。上記の例は、反応性側鎖の官能性を保護する方法を例示的に示したものであり、本発明の範囲を限定する趣旨ではない。広範な様々の保護基が当該分野で知られており、それらの殆どが本発明の工程を完了させるために使用できると予想される。
【００７０】
本発明に係る第１および第２の好ましい態様における工程３では、次いで、カルボキシル側鎖が「活性化」される。無水酢酸は、この目的のために広く使用される。これは、カルボキシル基で混合された無水物を生じる。幾つかの実施態様では、本発明に係る第１および第２の好ましい態様における工程２を、工程３と組み合わせることができる。無水化合物による側鎖のカルボキシルの活性化もまた、リジン、セリン、スレオニンおよびチロシンの如き反応性側鎖を保護し得る。
【００７１】
工程２と３を組み合わせた実施態様では、幾つかの無水物の誘導体は塩基性または酸性の条件下において安定でないので、選択される活性化試薬は、反応性側鎖について保護試薬（ｃａｐｐｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）として安定であることが好ましい。トリメチル酢酸無水物は、例えば、立体的な影響によってこれらの条件下でより安定である。
【００７２】
別のより好ましい活性化試薬は、Ｗｏｏｄｗａｒｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋ（Ｓｉｇｍａから入手可能なＮ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３−スルホネート）である。本発明におけるこの場合の他の好ましい実施態様では、テトラフェニルピロホスフェート（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはジフェニルホスホクロリデートの如き反応性ホスフェートで処理することによって活性化される。
【００７３】
米国特許第５，６６５，６０３号によれば、チオヒダントインを形成する様に反応し得るペプチド、またはポリペプチドのＣ末端でカルボキシル誘導体を生成するペプチド配列決定方法において必要とされる活性化工程は、ジフェニルホスホクロリデートまたはテトラフェニルピロホスフェート（Ａｌｄｒｉｃｈ）の様なアシルホスフェート化合物を使用し、穏やかな条件下でより効果的に行なわれる。
【００７４】
Ｃ末端のカルボキシルは、カルボキシル基を脱プロトン化するため、塩基の存在下で反応性ホスフェートと反応させられる。好ましい塩基はトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンまたはピリジン（すなわち、得られるアシルホスフェートとは反応しない塩基）である。Ｃ末端のカルボキシルを活性化するためのリン酸化反応には、好ましくは、等モル量の反応性のリン酸塩および塩基が使用される。これら２つの試薬は、極性のアプロチック（ａｐｒｏｔｉｃ）溶媒（例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ））、ジメチルホルムアミドまたはエーテル（好ましくは、ＡＣＮ）中でポリペプチドに対して過剰に添加される。
【００７５】
反応は、代表的には５〜１０分間で完了し、そして通常は室温下に３０分未満で完了する。温度は変更され得る。反応は、他の反応が起こる工程では、自動化された配列決定装置（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）中、５５℃で行われる。カルボキシル基のＣ末端が活性化された誘導体は、自発的に環化してオキサゾロン中間体を形成する反面、側鎖のカルボキシルは活性化されたままである。
【００７６】
活性化された側鎖のカルボキシル誘導体は、塩基性条件下で明らかに求核剤と反応するが、その反面、Ｃ末端オキサゾロン基の求核剤との反応性ははるかに小さい（Ｖ．Ｌ．Ｂｏｙｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：１０９−１１８、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｚ．ＡｔａｓｓｉおよびＥ．Ａｐｐｅｌｌａ編、１９９５）。
【００７７】
従って、本発明の第１および第２の好ましい態様における工程４では、タンパク質集団は、塩基性の条件下で求核剤と接触させられる。好ましい求核剤は１級アミン化合物である。アミン求核剤を使用する場合は、側鎖がアミド化され得る。好ましいアミン求核剤は、ピペリジン、メチルアミン、エチルアミン、その他のアミンであり、適切な塩基と共に添加される。アミド化反応を行うため、等モルの塩基および求核剤が、極性のアプロチック（ａｐｒｏｔｉｃ）溶媒（好ましくは、アセトニトリル）中に、タンパク質の混合物よりもはるかに多い試薬と共に添加される。
【００７８】
アンモニアは、活性化されたアスパラギン酸残基からアスパラギンを、またグルタミン酸残基からグルタミンを生成する。これによって、ペプチドの質量における情報を少なくすることができる。そしてアンモニアは好ましい求核剤でない場合がある。別の実施態様においては、アルコールが、酸性の条件下で活性化された側鎖のカルボキシル誘導体をエステル化するために使用され得る。適切なアルコール（例えば、メタノール）を、適切な無水の酸性溶媒（例えば、ＴＦＡ）中に添加することができる。
【００７９】
本発明における第１の好ましい態様では、求核剤はチオシアン酸塩として添加され得る。オキサゾロンは、酸性条件下でイソチオシアネートと反応し、その結果、アミド化を促進するための塩基性条件下での最初の期間の後、反応物は、Ｃ末端チオヒダントインの形成を促進するためにトリフルオロ酢酸を用いて酸化される。
【００８０】
本発明における第２の好ましい態様では、アミン求核剤（ａｍｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）は、不活性なグループ（例えば、炭酸塩）を使用し塩として添加され得る。好ましくは、揮発性物質の塩が、使用されていない試薬の除去を容易にするために使用される。この方法において、オキサゾロンは反応を妨害するので、オキサゾロンはＣ末端に遊離のカルボキシルを再生するように加水分解され得る。更なる実施態様では、アミン求核剤が、オキサゾロンと反応する適切な官能性を有するものとして、ビオチニル化試薬と共に塩として添加され得る。
【００８１】
求核剤がチオシン酸塩として添加される本発明の第１の態様では、反応混合物は適切な酸（好ましくは、ＴＦＡ）を用いて酸化される。これによって、Ｃ末端オキサゾロン基とチオシアネートとの反応が促進され、Ｃ末端チオヒダントイン誘導体が生成する。次いで、Ｃ末端チオヒダントインは、各タンパク質中の最後から２番目のアミノ酸のカルボキシルを露呈する様に、誘導されたタンパク質から開裂される。Ｃ末端からのチオヒダントインの開裂は、酸または塩基による加水分解を含む種々の方法によって行なうことができる。開裂は、より好ましくはアルコール性溶媒中でチオメチルシラン酸ナトリウムの如き試薬によって行なわれる（Ｊ．Ｍ．Ｂａｉｌｅｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：６８−８０、１９９２）。
【００８２】
本発明に係る第１および第２の好ましい態様における工程７では、次いで、露呈された末端カルボキシルが、Ｃ末端によるタンパク質の固相への捕捉を可能にする適切な試薬と反応させられる。ビオチンアミドカプロイルヒドラジドの様な試薬は、遊離のカルボン酸と反応する。５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンの様な試薬は、アビジンによる捕捉を可能にするために使用され得る。このビオチニル化試薬（ｂｉｏｔｉｎｙｌｓｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）との反応の前に、遊離のカルボキシル末端が活性化されなければならない。種々の活性化試薬を使用できるが、好ましいのはオキサゾロンの形成を促進しないものである。立体的に妨害される無水化合物も適切であり得る。
【００８３】
別の実施態様では、活性化された末端カルボキシルは、活性化されたカルボキシルと反応する様に、適切な基で官能化された固相支持体と反応させてもよい。遊離のアミノ基が適切である。選択的な解離を促進するため、カルボキシル反応官能性（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）が、開裂可能なリンカーによって支持体に連結させられるはずである。開裂可能なリンカーは当該分野で広く公知であり、光によって開裂可能なリンカーが当該分野で周知である（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：１１０６５−１１１３３、１９９３）。これらはまた、多数の化学的に開裂可能なリンカーであり、例えば、チオエステルはヒドロキシル−アミンによって開裂され得る。
【００８４】
次いで、本発明の第１および第２の好ましい態様における工程８では、Ｃ末端を変性されたタンパク質が配列特異的開裂試薬で処理される。好ましい開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）は、未反応の試薬の除去を容易にする揮発性の薬剤である。適切な化学的開裂試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）としては、臭化シアン（これは、メチオニン残基で開裂する）、およびＢＮＰＳ−スカトール（これは、トリプトファン残基で開裂する）が挙げられる（Ｄ．Ｌ．Ｃｒｉｍｍｉｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７；２７−３８、１９９０）。他の実施態様では、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、または他の酵素の様な配列特異的エンドプロテイナーゼが使用され得る。
【００８５】
本発明の第１および第２の好ましい態様における工程９では、末端を変性されたペプチドが、固相支持体上に捕捉される。末端カルボキシルがビオチニル化されている場合は、次いで、Ｃ末端ペプチドがストレプトアビジンで誘導された固相支持体上に捕捉され得る。次いで、非末端のペプチドは洗い流され得る。
【００８６】
本発明の第１および第２の好ましい態様における工程１０では、捕捉されたＣ末端ペプチドは、必要によりマススペクトル分析の増感試薬（ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）と反応させられる。マススペクトル分析器のイオン検出装置は極めて敏感であり、単一のイオンを検出し得る。従ってイオンの検出は、マススペクトル分析器の感度を決定する限定要因ではない。一般的には、最大の限定要因は分析物のイオン化である。典型的な電子噴霧源またはＦＡＢ源においては、無数に存在する分析物の分子の僅か１つでも、実際にイオン化して検出される。このプロセスを改良するには、ペプチドを予めイオン化して検出するため、ペプチド中に増感化合物を導入することが望ましい。好ましい化合物として、第４アンモニウムイオン、または金属イオンキレート化剤が挙げられる。化合物の例としては、４−（３−ピリジルメチルアミノカルボキシプロピル）フェニルイソシアネートが挙げられる（Ｅ．Ｊ．Ｂｕｒｅｓら、「ポリペプチドの段階的な分解のための新規試薬のパネル合成および評価（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５は、マススペクトル分析の増感剤としてこの化合物のイソチオシアネート形態の使用を開示している）。増感基の導入は、感度を改善するだけでなく、分析される分子によるイオン化のための競合因子のリスクをも軽減する。このことは、全てのペプチドがマススペクトルにおいてより均一に検知され得ることを意味している。
【００８７】
本発明の第１および第２の好ましい態様における工程１１では、次いで、捕捉されたＣ末端ペプチドが、固相支持体から解離させられる。末端カルボキシルがビオチニル化されている実施態様では、アビジンで捕捉されたペプチドを、酸処理によって解離させることができる。解離されたペプチドの回収を容易にするため、好ましくはＴＦＡを使用できる。なぜなら、これは揮発性物質であり、容易に蒸発してペプチドの回収を可能にするからである。
【００８８】
本発明の第１および第２の好ましい態様における工程１２では、解離されたペプチドの回収が行われる。本発明における第３および第４の態様における工程１３では、ペプチドがマススペクトル分析によって分析される。１つの実施態様では、ペプチドは適切な支持体上のＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、ケイ皮酸）中に埋めこまれ、そしてＣ末端ペプチド集団について、ペプチドの質量のフィンガープリントを決定するため、ＭＡＬＤＩマススペクトル分析によって分析される。ＭＡＬＤＩは好ましい分析技術である。なぜなら、このイオン化技術は［Ｍ＋Ｈ］+イオンの形成に好ましいからである。従って、通常は、夫々のペプチドについて、マススペクトルで僅か１つの主要ピークのみが存在する。
【００８９】
更なる実施態様では、回収されたペプチドが適切な溶媒に溶解され、そして電子噴霧イオン化マススペクトル分析の如き噴霧入口システム（ｓｐｒａｙｉｎｇ  ｉｎｌｅｔ  ｓｙｓｔｅｍ）によって分析され得る。同様に、Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ＦＡＢ）および関連するインターフェースが、使用され得る。これは、マススペクトル分析による分析を行なう前に行なわれる、インラインの液体クロマトグラフィー分離を含み得る。キャピラリー電気泳動、またはＨＰＬＣ、もしくはキャピラリー等電点電気泳動を使用してもよい。動的なＦＡＳは特に好ましい方法である。なぜならこのイオン化方法は、マススペクトル分析器にそれらを導入するために用いられるマトリックス中にそれらが存在する形態で、イオンの生成を促進するからである。このことは、液体マトリックスを使用する際に、マススペクトル中に存在するイオンが、それらが溶液中に存在する場合と同様であると考えられることを意味する。
【００９０】
本発明においては、側鎖を保護することができ、そしてマススペクトル分析の増感試薬を、分析されるペプチド中に導入することができるので、全てのペプチドが溶液中に単一の電荷のみを有することを確実にする。これは、ポリペプチド集団の最終的なマススペクトルにおいて単一の質量ピークとして示される。タンデムなマススペクトル分析は、噴霧インターフェースまたはＦＡＢインターフェースと組み合わせてもよい。タンデムなマススペクトル分析により、ペプチドについて配列情報の決定を可能とし、そしてタンパク質の共有的な変性物の同定を可能にする。
【００９１】
ＤＩＴＣガラスの使用
本発明における第３の好ましい種々の実施態様がここで吟味される。
【００９２】
本発明における第３の好ましい態様における工程１では、タンパク質集団は、Ｌｙｓ−Ｃ特異的開裂酵素（例えば、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によるエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ）で完全に消化される。
【００９３】
本発明における第３の好ましい態様における工程２では、得られるペプチドは、アミンと反応する固体支持体と接触させられる。１つの実施態様では、ペプチド集団が塩基の存在下でイソチオシアネートガラス（ＤＩＴＣガラス、Ｓｉｇｍａ）と反応させられる。これによって、任意の遊離アミノ基を通じて全てのペプチドを支持体に捕捉する。
【００９４】
本発明における第３の好ましい態様における工程３では、捕捉されたペプチドが、支持体上の各ペプチドのα−アミノ基で開裂する試薬と接触させられる。ＤＩＲＣガラスが使用される実施態様では、ペプチドは適切な揮発性物質である酸（ＴＦＡ）で処理される。これは、支持体上の各ペプチドからＮ末端アミノ酸を開裂する。Ｃ末端でない全てのペプチドは、固体支持体にそれを共有結合するリジン残基を有する。従って、遊離のＣ末端ペプチドが選択的に解離させられる。
【００９５】
本発明に係る第３の好ましい態様における工程４では、解離されたペプチドは、支持体からペプチドを開裂するために用いられるＴＦＡ溶媒を蒸発させることによって、ＴＦＡから回収され得る。
【００９６】
本発明に係る第３の好ましい態様における工程５では、解離されたペプチドは、反応性側鎖を保護するための試薬と接触させることができる。適切な試薬としては、先に挙げたものが使用できる。
【００９７】
本発明に係る第３の好ましい態様における工程６では、ペプチドは、必要によりマススペクトル測定の増感試薬と反応させられる。本発明に係る第１および第２の好ましい態様における工程１０に関する記述を参照のこと。
【００９８】
本発明に係る第３の好ましい態様における工程７では、ペプチドが、マススペクトル分析によって分析される。１つの実施態様では、末端ペプチドは、ケイ皮酸の如きＭＡＬＤＩマトリックス中に埋めこまれ、そしてＣ末端ペプチド集団についてペプチドの質量のフィンガープリントを決定するため、ＭＡＬＤＩマススペクトル分析によって分析される。
【００９９】
本発明に係る他の好ましい態様では、マススペクトル分析によってペプチドを分析する別の方法を使用してもよい。従って別の実施態様では、回収されたペプチドを適切な溶媒に溶解させ、電子噴霧イオン化マススペクトル分析の様な噴霧入口システムによって分析してもよい。同様に、Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔや関連するインターフェースを使用してもよい。これはまた、マススペクトル分析を行なう前のインラインの液体クロマトグラフィー分離を含み得る。タンデムなマススペクトル分析は、噴霧インターフェースまたはＦＡＢインターフェースと組み合わせてもよい。タンデムなマススペクトル分析は、ペプチドについての配列情報の決定を可能とし、且つタンパク質の共有的な変性の同定を可能にする。
【０１００】
【実施例】
実施例
所定の生物体について、タンパク質のどの集団がそれら末端ペプチドの質量のみに基づいて独自に同定されるかを決定するため、タンパク質配列のＳＷＩＳＳＰＲＯＴに公開されたドメインデータベースを分析するための一連の短いコンピュータープログラム（ＰＥＲＬに記載されている）を使用した。タンパク質をＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースの公表３５から抽出した。分析を、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノムからのデータについて行った。この生物体のゲノムは完全に配列決定されており、そしてほとんど全てのオープンリーディングフレームが同定されている。
【０１０１】
１８８２のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのタンパク質がこのデータベースの公表の中に存在した。臭化シアンによるメチオニンでの開裂、およびトリプトファンでの開裂によるプロフィールを試験した。これによって、末端のアミノ酸がプロファイリング化学によっては開裂されないことを確認した。
【０１０２】
全ての実施例において、マススペクトル分析器は、５０００の質量の解析能力を有することを確認している。このことは、この機器が、５０００個の中の１部の質量差を解析し得ること、換言すると、質量５０００ダルトンの分子が質量４９９９ダルトンの分子と区別され得ることを意味する。それぞれのペプチドが単一の分子性イオンピークのみを生じることもまた確認される。
【０１０３】
実施例１：Ｌｙｓ−ＣおよびＳＣＮでの開裂
この実施例では、１８８２のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質が、リジン残基のＣ末端側でタンパク質を開裂するエンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃで開裂される。次いで、ペプチドはフェニルイソチオシアネート部分で誘導された固体支持体と反応させられる。これは開裂部位で生成され、そして上記の如きリジン側鎖上に存在する１級アミンと容易に反応する。全てのペプチドは、それを有さないＣ末端ペプチドを除いて、少なくとも１つのリジン残基を有している。全てのペプチドは、それらＮ末端の１級アミンによって固体支持体上に捕捉される。
【０１０４】
全てのＣ末端でないペプチドはまた、それらのリジン側鎖によって十分に捕捉される。フェニルイソシアネートは、全てのペプチドのＮ末端残基を開裂し得る様に誘導することができる。リジン残基を有している全てのペプチドは、これらのイソチオシアネート誘導体が開裂されない限りは、支持体上に付着したままである。従って、Ｃ末端ペプチドが固相支持体から解離され、次いで、Ｃ末端ペプチドが単離される。これらは、上記理由のため必要であれば、更に変性してもよい。Ｃ末端ペプチドの単離および任意の更なる側鎖の変性の後、ペプチドはマススペクトル分析によって分析され得る。
【０１０５】
他の側鎖は保護されず、そして未変性のペプチドは直接分析されないことが確認されている。
【０１０６】
結果
分析した１８８２のタンパク質の記録。
【０１０７】
７のタンパク質は、用いた試薬について開裂部位を有さなかった。
・１のタンパク質が８７０のペプチドマスを保有（８７０  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍａｓｓ（ｅｓ）  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））、
・２のタンパクマス質が１５５のペプチドマスを共有（１５５  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍａｓｓ（ｅｓ）  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））、
・３のタンパク質が４３のペプチドマスを共有、
・４のタンパク質が１９のペプチドマスを共有、
・５のタンパク質が６のペプチドマスを共有、
・６のタンパク質が９のペプチドマスを共有、
・７のタンパク質が２のペプチドマスを共有、
・８のタンパク質が３のペプチドマスを共有、
・９のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１０のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１１のタンパク質が２のペプチドマスを共有、
・１２のタンパク質が２のペプチドマスを共有、
・１３のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１７のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１９のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・２３のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・３３のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・２０５のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
このペプチドの質量のフィンガープリントによって、それら末端ペプチドの質量基準のみに基づいて、４６．２％のタンパク質が独自に同定される。
【０１０８】
実施例２：カルボキシル基側鎖の保護
この実施例では、セリン、スレオニンおよびチロシンの、反応性カルボキシル基を有している側鎖が、例えばシリル保護基で保護され、それによってこれら側鎖でのトリメチルシリル誘導体を生成する。側鎖のカルボキシル基は、適切な試薬（例えば、テトラフェニルピロホスフェート）で活性化され、次いでこれらは、上記の様な塩基の存在下でピペリジンとの反応によりピペリジンアミドに変換させられる。
【０１０９】
結果
分析した１８８２のタンパク質の記録。
【０１１０】
７のタンパク質は、使用した試薬についての開裂部位を有さなかった。
・１のタンパク質が９３７のペプチドマスを保有（９３７  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍａｓｓ（ｅｓ）  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））、
・２のタンパク質が１４９のペプチドマスを共有（１４９  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍａｓｓ（ｅｓ）  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））、
・３のタンパク質が３４のペプチドマスを共有、
・４のタンパク質が１７のペプチドマスを共有、
・５のタンパク質が６のペプチドマスを共有、
・６のタンパク質が８のペプチドマスを共有、
・７のタンパク質が２のペプチドマスを共有、
・８のタンパク質が４のペプチドマスを共有、
・１０のタンパク質が２のペプチドマスを共有、
・１１のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１２のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１３のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１７のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・１９のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・２３のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・３３のタンパク質が１のペプチドマスを共有、
・２０５のタンパク質が１のペプチドマスを共有。
【０１１１】
このペプチドの質量のフィンガープリントによって、それら末端ペプチドの質量のみに基づいて、４９．８％のタンパク質が独自に同定される。
【０１１２】
実施例３：臭化シアンでのＣ末端の捕捉および開裂
この実施例では、１８８２のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質を、固相支持体上に非共有的に固定する。タンパク質は、無水のトリフルオロ酢酸で処理される。この試薬は、リジン、セリン、スレオニンおよびチロシンの反応性側鎖を保護して、トリフルオロアセチル誘導体を生じる。この試薬はまた、側鎖および末端のカルボキシル基を活性化する。Ｃ末端の活性化されたカルボキシルは、自発的にオキサゾロンを形成する。未反応の無水トリフルオロ酢酸は洗い流される。
【０１１３】
活性化された側鎖は、次いで、活性化された側鎖のカルボキシルでピペリジンアミドを生成する非水性塩基の存在下で、ピペリジンと反応させる。次いで、Ｃ末端オキサゾロンは元の遊離カルボキシルに加水分解されて戻される。これは次いで、例えばビオチニル化によって、固相支持体上への捕捉を可能にする様に変性される。次いで変性されたタンパク質は、メチオニン残基で開裂する臭化シアンで開裂される。得られるペプチドは、不活性な溶媒で洗浄され、そして反応が行われる固相支持体から解離させられる。Ｃ末端のペプチドは選択的にビオチニル化され、それによってアビジン化された（ａｖｉｄｉｎａｔｅｄ）支持体上にそれらが捕捉されることを可能にする。これによって、非末端のペプチドは洗い流される。次いでＣ末端のペプチドは、固体支持体から解離させられ、そしてマススペクトル分析によって分析される。
【０１１４】
結果
分析した１８８２のタンパク質の記録。
【０１１５】
１８のタンパク質は、使用した試薬についての開裂部位を有さなかった。
・１のタンパク質が１４６１のペプチドマスを保有（１４６１  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍａｓｓ（ｅｓ）  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））、
・２のタンパク質が１５７のペプチドマスを共有（１５７  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍａｓｓ（ｅｓ）  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））、
・３のタンパク質が２１のペプチドマスを共有、
・４のタンパク質が４のペプチドマスを共有、
・５のタンパク質が２のペプチドマスを共有、
・６のタンパク質が３のペプチドマスを共有。
【０１１６】
このペプチドの質量のフィンガープリントによって、それら末端ペプチドの質量のみに基づいて、７７．６％のタンパク質が独自に同定される。
【０１１７】
実施例４：ＢＮＰＳ−スカトールでのＣ末端の捕捉および開裂
この実施例では、１８８２のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質が、Ｃ末端のカルボキシルが固相支持体上に捕捉され得る様に変性された後、タンパク質が、臭化シアンよりもむしろトリプトファン残基でタンパク質を化学的に開裂するＢＮＰＳ−スカトールで開裂する以外は、実施例３と同様に処理される。得られるペプチドは、次いで、それらの固相支持体から取り除かれ、そしてアビジン化された支持体と共にインキュベートされる。これによって、非末端ペプチドは洗い流される。次いで、Ｃ末端のペプチドが固体支持体から解離され、そしてマススペクトル分析によって分析される。従ってこの実施例では、リジン、セリン、スレオニンおよびチロシンの反応性側鎖は再びトリフルオロアセチル誘導体となり、そして側鎖のカルボキシル基はピペリジンアミド誘導体である。
【０１１８】
結果
分析した１８８２のタンパク質の記録。
【０１１９】
３６１のタンパク質は、使用した試薬についての開裂部位を有さなかった。
・１のタンパク質が１４８４のペプチドマスを保有、
・２のタンパク質共が１６３のペプチドマスを保有、
・３のタンパク質が１５のペプチドマスを共有、
・４のタンパク質が５のペプチドマスを共有、
・７のタンパク質が１のペプチドマスを共有。
【０１２０】
このペプチドの質量のフィンガープリントによって、それら末端ペプチドの質量のみに基づいて、７８．９％のタンパク質が独自に同定される。
【０１２１】
実施例５：２つのプロフィールの組合わせ
前記実施例３（ここでは、臭化シアンによる開裂を使用）および実施例４（ここでは、ＢＮＰＳ−スカトールによる開裂を使用）で生成した独自のタンパク質のリストを、タンパク質の和を決定するため組み合わせた。これは、２つのプロフィールの間でそれらの質量基準のみに基づいて独自に同定される。
【０１２２】
１７７４のタンパク質が、２つのプロフィールの間で独自に解析される。これによって、末端のペプチドの質量のみに基づいて、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベールにおいて、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのタンパク質の９４．３％を独自に解析することになる。これは、より良好な個々のプロフィールを超え、解析能力において１９．５％改善される。