(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされる塩基配列のうち１０塩基から１００塩基からなる塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列であって、配列番号３で表わされる塩基配列のうち少なくとも１０以上の塩基からなる塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有する核酸断片。
【請求項２】
請求項１記載の核酸断片から選ばれるペニシリン耐性肺炎球菌検出用のプライマー又はプローブ。
【請求項３】
請求項２記載のプライマー又はプローブを用いるペニシリン耐性肺炎球菌の検出法。
【請求項４】
請求項２記載のプライマー又はプローブを含むペニシリン耐性肺炎球菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ペニシリン耐性肺炎球菌を検出するために有用な核酸断片、ペプチド、ＤＮＡプローブ及びプライマー、並びにこれらを用いた該菌の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
１９６７年オーストラリアでペニシリンに対して耐性を有する肺炎球菌が報告されて以来、この耐性菌は世界各地で分離が報告され、その数は年々増加している。
【０００３】
ペニシリン耐性肺炎球菌は、現在臨床で用いられているすべてのβ−ラクタム剤に交叉性を示すため、正確には、β−ラクタム耐性肺炎球菌といえるものである。更に、β−ラクタム剤以外の薬剤にも耐性を示す菌株も多く、臨床上きわめて重大な問題となっている。
【０００４】
斯かる実状において、ペニシリン耐性肺炎球菌の迅速かつ高感度な検出方法が求められているが、従来の薬剤感受性試験では、迅速性及び再現性に問題があり、満足できる方法とは言い難いものであった。
【０００５】
一方、ペニシリン耐性肺炎球菌の機序の研究から、β−ラクタム剤の標的酵素であるペニシリン結合蛋白質の変異が耐性に直接関与していると考えられていた。すなわち、肺炎球菌のペニシリン結合蛋白質にはＰＢＰ１Ａ，１Ｂ，２Ａ，２Ｂ，２Ｘ及び３の６種類があり、世界各地で分離されるペニシリン耐性肺炎球菌の多くは、ＰＢＰ１Ａ，２Ｘ／２Ａ，２Ｂに対する親和性が同時に低下している場合が多い。その後の研究により、ペニシリン耐性菌のＰＢＰ  ２Ｂの遺伝子のある領域に感受性菌のＰＢＰ  ２Ｂの遺伝子と塩基配列のかなり異なる部位（耐性ブロック）が存在することが認められた（Ｄｏｗｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８６，８８４２−８８４６（１９８９））。その変異には大きく分けてＣｌａｓｓ  Ａ及びＣｌａｓｓ  Ｂの２種類が存在し、それらの変異が耐性と密接に関っていることが示唆された。また、わが国で分離されたペニシリン耐性肺炎球菌の多くにもそれらの変異が見い出され、感受性株からは検出することができなかったことより、それらの遺伝子変異と耐性の関連が裏づけられる結果となった（清水ら，第４２回，日本感染症学会東日本地方会総会抄録（１９９３））。
【０００６】
このことから、前記２種類の遺伝子変異を検出することによって、ペニシリン耐性肺炎球菌を迅速に高感度で検出できると考えられたが、臨床上重要とされる高度耐性菌と遺伝子変異が必ずしも一致するとは限らないことが判明した。
従って、臨床上重要な高度耐性菌とより相関性の高い遺伝子断片の発見及びこれを用いたペニシリン耐性肺炎球菌の正確な検出法が希求されていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、臨床分離された耐性菌の薬剤感受性と上記遺伝子変異との相関を調べた結果、高度耐性にもかかわらず、上記変異をもたない新規の耐性菌を多数分離し、この菌の遺伝子配列を決定したところ、下記に示す配列番号１等で表わされる塩基配列をもつ核酸断片がペニシリン高度耐性に特徴的であることを見い出し、これを用いれば該耐性菌が迅速かつ高感度で検出でき、更に、その遺伝子のコードするペプチドの特徴的なアミノ酸配列を利用して免疫学的手法により耐性株の迅速な検出ができることを見い出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１で表わされる塩基配列のうち１０塩基から１００塩基からなる塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列であって、配列番号３で表わされる塩基配列のうち少なくとも１０以上の塩基からなる塩基配列若しくはこれと相補的な塩基配列を有する核酸断片を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、上記核酸断片から選ばれるペニシリン耐性肺炎球菌検出用のプライマー又はプローブ、並びに当該プライマー又はプローブを用いる当該耐性菌の検出法及び当該プライマー又はプローブを含む当該耐性菌検出用キットを提供するものである。
【００１１】
本発明の核酸断片である配列番号１で示される塩基配列を有する核酸断片及び配列番号３で示される塩基配列を有する核酸断片は、例えば次の（１）、（２）及び（３）の工程により分離、決定することができる。
【００１２】
（１）既知の変異遺伝子を有さないにもかかわらず、ペニシリン耐性を有する肺炎球菌を分離し、（２）当該分離株の遺伝子から既知の変異遺伝子以外の変異遺伝子を分離・決定し、（３）次いで当該新規変異遺伝子の検出に必要な核酸断片を設計・決定する。以下、この工程をより詳細に説明する。
【００１３】
（１）既知の変異遺伝子を有さない、ペニシリン耐性肺炎球菌の分離：
この菌の分離は、例えば既知のＰＢＰ２Ｂの遺伝子変異を薬剤感受性試験の相関性の検討から、上記の性質を有する菌株を分離することにより行われる。すなわち、数多くの臨床分離株について、ＰＢＰ２ＢのＣｌａｓｓ  Ａ変異遺伝子を増幅するプライマー、ＰＢＰ２Ｂの  Ｃｌａｓｓ  Ｂ変異遺伝子を増幅するプライマー及び肺炎球菌に特異的な溶血酵素（Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ）遺伝子を増幅するプライマーの３種を用いたＰＣＲによりＰＢＰ２Ｂ遺伝子変異を有するペニシリン耐性肺炎球菌を検出する。一方、同じ臨床分離株について数種類のβ−ラクタム系抗生物質を用いてペニシリン耐性の有無を検討する。これらの結果を対比することにより、上記性質を有する菌株を分離する。
【００１４】
（２）（１）で得た分離株の遺伝子配列の決定：
例えばＰＣＲ直接シークエンシング法により、部分的に塩基配列を決定できる。
配列番号１で示される塩基配列は、ＫＫ−３株について、活性セリン残基を含む７８８塩基配列を決定したものである。この配列は正常、Ｃｌａｓｓ  Ａ及びＣｌａｓｓ  Ｂのいずれとも異なることが確認された（図５，６参照）。
【００１５】
（３）ペニシリン耐性肺炎球菌を検出できる核酸断片の設計：
配列番号１の核酸もしくはその相補核酸から、プローブを設計するには、配列番号３もしくはその相補配列の少なくとも１０塩基以上を有する核酸断片を用いればよい。
一方、配列番号１の核酸もしくはその相補核酸からプライマーを設計するには、例えばＰＣＲ法で遺伝子増幅を行った場合、遺伝子増幅物が配列番号３で示される塩基配列の、少なくとも１０塩基対以上を含むように設計すればよい。
具体的には、配列番号１で表わされる核酸において、一方のプライマー（以下、プライマー１）と略す）が配列番号３で表わされる塩基配列の少なくとも１０塩基以上を含むように設計すれば、もう一方のプライマー（以下、プライマー２）と略す）は、配列番号１で表わされる核酸の相補鎖においてプライマー１）と相補的な配列より、５′側の任意の配列から選べばよい。
また、配列番号１で表わされる核酸において、プライマー１）を配列番号３で示される塩基配列より、５′側の配列から選べば、プライマー２）は配列番号１で表わされる核酸の相補鎖において、配列番号３で示される塩基配列の相補配列より５′側の配列から選べばよい。プライマーの大きさは配列番号１の核酸もしくはその相補核酸と特異的に結合可能なものであれば特に限定されないが、好ましくは１０塩基から１００塩基の核酸断片である。このようなプライマーから増幅された生成物は、上記プローブで検出するか鎖長を比較することにより同定することができる。
【００１６】
本発明の核酸断片における、配列番号３のうち少なくとも１０塩基を有する核酸断片とは、配列番号３の１８塩基のうちの連続した少なくとも１０塩基を有するものであり、１０塩基の具体例としては配列番号２のうち１−１０、２−１１、３−１２、４−１３、５−１４、６−１５、７−１６、８−１７、９−１８の各１０塩基である。
【００１７】
本発明の核酸断片は、ＤＮＡ合成機により合成することもできる。
【００１８】
また、本発明のペプチドは配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち少なくとも４アミノ酸を有するものであり、当該ペプチドはペプチド合成機により合成することもできるし、また公知の遺伝子組換え技術を用いて微生物などに生産させることもできる。
【００１９】
本発明の核酸断片をプライマー又はプローブとして用いることにより、ペニシリン耐性肺炎球菌が検出できるが、高感度検出を達成するには遺伝子増幅法を用いるのが好ましい。
遺伝子増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法等がある（Ｍａｎａｋ，Ｍ．Ｍ．ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｐ２５５−２９１，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３））が、本発明の核酸断片は、これらの増幅反応のプライマー（ＬＣＲ法においてはプローブ）として利用するか、増幅物に本発明核酸断片が存在するかどうかを検出するためのプローブとして利用することができる。
なお、本発明核酸断片をプライマー又はプローブとして使用する場合、該プライマーあるいはプローブに標識物又は固相担体と結合可能な部位を導入したり、プローブ又は該プローブを含む一本鎖核酸を固相化担体に固定化することにより、検出を容易にすることができる。
ここで標識物としては、非放射性、放射性物質のどちらを用いてもよいが、好ましくは非放射性物質である。非放射性の標識物としては、直接測定可能なものとして蛍光物質〔例えばフルオレッセイン及びその誘導体（フルオレッセインイソチオシアネート等）、ローダミン及びその誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッド等）〕、化学発光物質（例えばアクリジン等）や遅延蛍光を発する物質（ＤＴＴＡ：ファルマシア社製）などが挙げられる。
【００２０】
なお、これらの標識物を検出するにあたっては、標識物と特異的に結合する物質を利用すれば、間接的に標識物を検出することもできる。こうした場合の標識物としては、ビオチンあるいはハプテン等が挙げられ、ビオチンの場合は、これに特異的に結合するアビジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場合は、これに特異的に結合する抗体が利用できる。ハプテンとしては２，４−ジニトロフェニル基を有する化合物、ジゴキシゲニンを使うことができ、更にはビオチンあるいは蛍光物質などもハプテンとして使用することができる。これらの標識物はいずれも単独又は必要であれば複数種の組み合わせで公知手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）により、プライマー又はプローブに導入することができる。
また、当該固相担体と結合可能な部位（固相担体結合部位）の一例としては、上記非放射性標識物質を利用することもできる。その好ましい具体例としては、ビオチン、あるいはフルオレッセインなどの蛍光物質又は２，４−ジニトロフェニル基を有する化合物あるいはジゴキシゲニンなどのハプテンが挙げられ、これらは単独又は必要であれば複数種の組み合わせであらかじめ本発明プライマーに導入しておくことができる（詳細は、特開平１−２５２３００号公報参照）。
更に、本発明プローブ又は該プローブを含む一本鎖核酸を固相担体へ固定化する方法としては、上記した固相担体と結合可能な部位を導入する方法以外に、アミノ基を導入した固相担体と核酸をグルタルアルデヒドのような架橋剤を用いて結合させる方法、あるいは核酸に官能基を導入し、適当な架橋剤を用いて固相担体上に導入された官能基と結合させる方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，５３７３−５３９０（１９８７））あるいは吸着などの非特異的結合により固定化することもできる（特開昭６１−２１９４００、特開平５−１９２１９８号公報）。
本発明検出法は、例えば、被検体に本発明プライマーを加え、遺伝子増幅反応を行い、目的とする遺伝子増幅反応生成物を検出することができるが、簡易性、迅速性の点で、非放射性標識プライマーを利用するＥＤ−ＰＣＲ法（Ｕｂｕｋａｔａ，Ｋ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０，ｐ１７２８−１７３３（１９９２））が好ましい。
また、本発明核酸断片をプローブとして使用する場合は、プローブをあらかじめマイクロプレートに固定化して使用するマイクロプレートハイブリダイゼーション法（Ｋａｗａｉ，Ｓ．等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９，６３−６９（１９９３））が自動化が可能なことより好ましい。
【００２１】
本発明の免疫学的検出法は、前記ペプチド又は当該ペプチドに対する抗体を用いて行われるが、ここで用いられる抗体はポリクローナル及びモノクローナルのいずれでもよい。ポリクローナル抗体としては、通常の手段により動物を免疫して得られた抗血清又はその精製物を用いることができる。また、モノクローナル抗体としては、通常の細胞融合法により得られたハイブリドーマを増殖させて採取したものを用いることができる。
【００２２】
本発明の免疫学的検出法は、例えば酵素免疫法（ＥＩＡ）、ラジオアイソトープ免疫法（ＲＩＡ）、蛍光免疫法などが挙げられるが、ＥＩＡが好ましい。また、免疫反応は、競合法、サンドイッチ法のいずれでもよいが、このうちサンドイッチ法、特に固相抗原又は固相抗体を用いたＥＬＩＳＡが好ましい。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
なお、以下の実験例における遺伝子工学的手法は、マニアティスらのモレキュラークロニング第２版〔Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕に従って行った。また、ＰＣＲのプライマーに使用するオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステム社の自動合成機モデル３８１Ａを用いて行い、一般的手法〔Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８４）〕により、脱保護及び精製して使用した。また、シークエンシングに使用するビオチン標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成の最後にアミノリンクII（商標）（アプライドバイオシステム社製）を付加してアミノ基を導入し、米国特許第４，８４９，３３６号公報に記載の方法に従ってビオチンコハク酸イミドエステルと反応して得た。蛍光標識プライマーも、同様に調製したアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドをフルオレッセインイソチオシアネートを用いて標識し調製した。
シークエンシングは、直接シークエンシング法により（Ｒａｏ，Ｖ．Ｂ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６，１−１４（１９９４））島津ＤＮＡシークエンサー（ＤＳＱ１）を用いて行った。
【００２４】
実験に用いた臨床分離株は、オプトヒン感受性試験、イヌリン分解試験及び胆汁溶解試験を実施した。併せて、ＡＰＩ−２０  ＳＴＲＥＰによりその性状を調べ、ＡＰＩコードでも肺炎球菌であることを確認した。
【００２５】
被験菌の各種β−ラクタム系薬に対する感受性は、日本化学療法学会の標準法（日本化学療法学会：最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定法再改定について：Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２９，７６−７９，１９８１）に従って測定した。培地はミューラーヒントン寒天培地（栄研化学社製）を用い、綿羊の脱線維血液を５％の割合に加えて使用した。
【００２６】
実施例１
ＰＣＲによる、ａｕｔｏｌｙｓｉｎ遺伝子、正常なＰＢＰ２Ｂ遺伝子、Ｃｌａｓｓ  Ａの変異ＰＢＰ２Ｂ遺伝子及びＣｌａｓｓ  Ｂの変異ＰＢＰ２Ｂ遺伝子の検出：
薬剤感受性試験にはペニシリンＧ（ＰＣＧ）、オキサシリン（ＭＰＩＰＣ）、アンピシリン（ＡＢＰＣ）、イミペネム（ＩＰＭ）、セフォタキシム（ＣＴＸ）及びセフジニール（ＣＦＤＮ）の６種類の抗菌薬を使用した。また、遺伝子検出はＰＣＲにより行った。
下記に示す４種のプライマーペアはそれぞれ２組づつ混合して下記に示すＰＣＲミックス１及びＰＣＲミックス２とした。
【００２７】
ａｕｔｏｌｙｓｉｎ遺伝子を増幅するプライマー
5′TGAAGCGGATTATCACTGGC AUT-1
5′GCTAAACTCCCTGTATCAAGCG AUT-2
【００２８】
正常なＰＢＰ２Ｂを増幅するプライマー
5′ATCAATTCTTGGTATACTCAGG PBP-N1
５′AGTAGATTCATCTGGTAGGTC PBP-N2
【００２９】
Ｃｌａｓｓ  Ａの変異ＰＢＰ２Ｂ遺伝子を増幅するプライマー
5′CTAGGCCAATGCCGATTACG PBP-A1
5′AGTAGATTCATCTGGTAGGTC PBP-A2
【００３０】
Ｃｌａｓｓ  Ｂの変異ＰＢＰ２Ｂ遺伝子を増幅するプライマー
5′CCAAACCTTAACAGATCAGC PBP-B1
５′AGTAGATTCATCTGGTAGGTC PBP-B2
【００３１】
ＰＣＲミックス１
５μg ／ml  ＡＵＴ−１、５μg ／ml  ＡＵＴ−２、５μg ／ml  ＰＢＰ−Ａ１、５μg ／ml  ＰＢＰ−Ａ２、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．９、１．５mM  ＭｇＣｌ2、８０mM  ＫＣｌ、０．５mg／ml  ＢＳＡ、０．１（ｗ／ｖ）％コール酸ナトリウム、０．１（ｗ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１mMｄＡＴＰ、１mM  ｄＧＴＰ、１mM  ｄＣＴＰ、１mM  ｄＴＴＰ、１００Ｕ／mlＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ
【００３２】
ＰＣＲミックス２
５μg ／ml  ＰＢＰ−Ｎ１、５μg ／ml  ＰＢＰ−Ｎ２、５μg ／ml  ＰＢＰ−Ｂ１、５μg ／ml  ＰＢＰ−Ｂ２、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．９、１．５mM  ＭｇＣｌ2、８０mM  ＫＣｌ、０．５mg／ml  ＢＳＡ、０．１（ｗ／ｖ）％コール酸ナトリウム、０．１（ｗ／ｖ）％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１mMｄＡＴＰ、１mM  ｄＧＴＰ、１mM  ｄＣＴＰ、１mM  ｄＴＴＰ、１００Ｕ／mlＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ
【００３３】
血液寒天培地上に発育した肺炎球菌は、２０μl の溶菌液（１１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  pH８．９、１．５mM  ＭｇＣｌ2、８０mM  ＫＣｌ、０．５mg／mlＢＳＡ、０．１（ｗ／ｖ）％コール酸ナトリウム、０．１（ｗ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４５（ｗ／ｖ）％  ＮＰ４０、０．４５（ｗ／ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．２mg／mlプロテアーゼＫ）をあらかじめ分注したマイクロチューブへ白金耳を用いて１コロニー釣菌した。なお、１株につき上記マイクロチューブを２本使用して溶菌した。チューブは、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ  ９６００−Ｒ（日本ロシュ社製）にセットし、６０℃で２０分、続いて９０℃で１０分処理した。次いで前記のＰＣＲミックス１及びＰＣＲミックス２をそれぞれのチューブにべつべつに５μl ずつ加えた。ＰＣＲは５０℃−３０秒、７０℃−３０秒、９４℃−１５秒の温度条件で３０サイクル行った。反応後は３％アガロース電気泳動を用いて解析した。
【００３４】
薬剤感受性試験のペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰと略す）とペニシリン感受性肺炎球菌（ＰＳＳＰと略す）の識別はＮＣＣＬＳの勧告〔ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｋ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ．４ｔｈ．ｅｄ．  Ｍ２−Ａ４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，Ｐａ．（１９９０）〕に従い、ＰＣＧに対して０．１μg ／ml以上のＭＩＣを示す株、あるいはＭＰＩＰＣに１．０μg ／ml以上のＭＩＣを示す株をＰＲＳＰとした。また、ＰＣＲによる遺伝子検査ではアガロース電気泳動で目的の位置にバンドが見られたものについてその遺伝子があるものとした。臨床分離株３０株について行った遺伝子検査と薬剤感受性試験の関係を図１〜４に示した。この結果、ＰＲＳＰであるにもかかわらず、Ｃｌａｓｓ  ＡあるいはＣｌａｓｓ  Ｂの変異遺伝子をもたないものが４株見い出された。なお、同等の試験を臨床分離株の数を増やして行ったところ、Ｃｌａｓｓ  ＡあるいはＣｌａｓｓ  Ｂに属さない耐性株は肺炎球菌全体の１０％程度存在することが明らかとなった。
【００３５】
実施例２
ペニシリン耐性肺炎球菌ＰＢＰ２Ｂの部分的塩基配列の決定：
図１０に示すシークエンシングプライマーを用いてＰＣＲ直接シークエンシング法によってＣｌａｓｓ  Ａ及びＣｌａｓｓ  Ｂに属さないペニシリン耐性肺炎球菌のＰＢＰ２Ｂ遺伝子の部分塩基配列を決定した。まず、実施例１によってＣｌａｓｓ  Ａ及びＣｌａｓｓ  Ｂに属さないペニシリン耐性肺炎球菌臨床分離株から、Ｓｐｒａｔｔら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，９５−１０２（１９８９））のプライマーを使用して１４８１塩基の遺伝子増幅物を得た。この遺伝子断片をテンプレートとし、図１０に示したＰＢＰ２とＰＢＰ５、ＰＢＰ１とＰＢＰ６のプライマーの組み合わせで遺伝子増幅を行い、得られた増幅物をシークエンシング法のテンプレートとした。ただし、ＰＢＰ４あるいはＰＢＰ５をシークエンシングのプライマーとする場合、ＰＢＰ２とＰＢＰ５の組み合わせによるＰＣＲには、ビオチン標識したＰＢＰ５を使用し、ＰＢＰ３あるいはＰＢＰ６をシークエンシングのプライマーとする場合は、ＰＢＰ１とＰＢＰ６の組み合わせによるＰＣＲにはビオチン標識したＰＢＰ６を使用した。それぞれビオチン標識プライマーによって調製した遺伝子増幅物はダイナビーズＭ−２８０  ストレプトアビジン（ベリタス）を用いてプロトコールに従って固相に捕獲し、アルカリ変性にてビオチン標識した鎖とは反対の鎖を溶液中に遊離させてシークエンシング反応のテンプレートとした。シークエンシング反応には島津蛍光式ＤＮＡシークエンサー専用キット（島津製作所社製）を使用した。
【００３６】
上記の方法に従い、Ｃｌａｓｓ  Ａ及びＣｌａｓｓ  Ｂのいずれにも属さないペニシリン耐性肺炎球菌を数種類選択し、トランプペプチダーゼ領域の活性セリン残基からカルボキシ末端の方向についてＰＣＲ直接シークエンシング法によって部分的に塩基配列を決定した。
【００３７】
その結果、アミノ酸変異を伴う特徴的な遺伝子変異が数株で共通に見い出された。この中から、一種類の株（ＫＫ−３，この株は、平成６年９月１９日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請したが受託を拒絶されたので湧永製薬（株）広島研究所に分譲可能な状態で保存されている。）を選択し、活性セリン残基を含む７８８塩基の塩基配列を決定したのが配列番号１で示すものである。（以下この変異と同様な変異をもつものをＣｌａｓｓ  Ｃと呼ぶ）。
図５、６、７において正常、Ｃｌａｓｓ  Ａ、Ｃｌａｓｓ  Ｂ及び今回塩基配列を決定したものＣｌａｓｓ  Ｃの塩基配列及び図７においてアミノ酸配列の比較を行った。
【００３８】
実施例３
臨床分離したペニシリン耐性肺炎球菌中の新しい変異株（Ｃｌａｓｓ  Ｃ）の検索：
上記の遺伝子変異をもつ耐性株が臨床分離株中にどの程度の割合で存在しているかをＰＣＲ法を用いて検出した。
【００３９】
まず、Ｃｌａｓｓ  ＣのＰＢＰ２Ｂ遺伝子のみを増幅できるプライマーを設計・合成した。
【００４０】
5′ATTCCTTGGGAACGGTAACC PBP-C1
５′TAAGCCTGAGTATACCAAGT PBP-C2
【００４１】
実施例１と同様にしてＰＣＲミックスを調製しコロニーを用いて検出を行った。なお、正常遺伝子との区別が明確にできる条件を種々検討し、ＰＣＲ条件を９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で６０秒の３０サイクルと決定した。
本法を用いてＣｌａｓｓ  ＡあるいはＣｌａｓｓ  Ｂに属さない耐性株（４８株）を調べたところ１１株で目的の遺伝子増幅物が得られた（図８及び９）。
【００４２】
この結果より、臨床分離株中のＣｌａｓｓ  ＡあるいはＣｌａｓｓ  Ｂに属さない耐性株のうちおよそ２３％がＣｌａｓｓ  Ｃに属することが明らかとなった。これらはすべて高度耐性であり、臨床上重要な株である。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、従来判定が不正確になりやすかったペニシリン耐性肺炎球菌が、正確、簡便かつ早期にペニシリン耐性であると判定できる。従って、早期に適切な化学療法が可能となる。
【００４４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：７７７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：センス
起源
生物名：肺炎球菌
株名：ＫＫ−３
配列
AAAACAGGTG CTGTTTTGTC TATGTCAGAA CTCAAACATG ACCTGAAAAC GGGAGACTTG  60
ＡＣＧＣＣＴＧＡＴＴ  ＣＣＴＴＧＧＧＡＡＣ  ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＴ  ＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣ  ＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴ  ＴＧＴＣＡＡＧＧＣＴ  １２０
ＧＣＧＡＣＣＡＴＣＡ  ＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧ  ＧＧＡＡＡＡＴＧＧＡ  ＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧ  ＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣ  ＣＴＴＧＡＣＡＧＡＣ  １８０
ＣＡＧＴＣＣＡＴＴＧ  ＴＣＴＴＴＣＡＡＧＧ  ＴＴＣＡＴＣＴＣＣＣ  ＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴ  ＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧ  ＧＴＡＴＡＣＴＣＡＧ  ２４０
ＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴ  ＣＡＴＴＣＣＣＴＡＴ  ＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣ  ＣＡＡＧＣＴＣＴＧＧ  ＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣ  ＴＡＡＴＡＧＣＴＡＴ  ３００
ＡＴＧＧＴＣＣＡＡＡ  ＣＡＧＣＴＣＴＡＧＧ  ＴＣＴＴＡＴＧＧＧＧ  ＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣ  ＡＡＣＣＣＡＡＴＡＴ  ＧＴＴＴＧＴＣＧＧＣ  ３６０
ＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣ  ＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣ  ＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡ  ＴＴＧＣＧＴＴＣＡＡ  ＣＣＴＴＴＧＧＴＧＡ  ＡＴＡＴＧＧＴＴＴＧ  ４２０
ＧＧＧＧＣＴＧＣＧＡ  ＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡ  ＣＣＴＡＣＣＡＧＡＴ  ＧＡＡＴＣＴＡＣＴＧ  ＧＡＴＴＴＧＴＴＣＣ  ＣＡＡＡＧＡＧＴＡＴ  ４８０
ＡＧＣＴＴＴＧＣＴＡ  ＡＴＴＡＣＡＴＴＡＣ  ＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴ  ＧＧＧＣＡＧＴＴＴＧ  ＡＴＡＡＣＴＡＴＡＣ  ＧＣＣＧＡＴＧＣＡＧ  ５４０
ＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴ  ＡＴＧＴＡＧＣＡＡＣ  ＴＡＴＴＧＣＡＡＡＴ  ＧＡＴＧＧＴＧＴＴＣ  ＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣ  ＴＣＧＴＡＴＴＧＴＴ  ６００
ＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴ  ＡＴＧＧＴＡＡＴＡＡ  ＴＧＡＴＡＡＧＧＧＡ  ＧＧＣＣＴＡＧＧＣＧ  ＡＣＴＴＧＡＴＴＣＡ  ＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡ  ６６０
ＣＣＧＡＣＡＧＡＧＡ  ＴＧＡＡＴＡＡＧＧＴ  ＣＡＡＴＡＴＡＴＣＣ  ＧＡＣＴＣＣＧＡＴＡ  ＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴ  ＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴ  ７２０
ＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧ  ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧ  ＴＡＣＴＣＧＴＧＧＧ  ＴＴＧＡＣＡＡＣＴＧ  ＧＡＣＧＴＧＣＣＴＴ  ＴＴＣＡＡＡＴ        ７７７
【００４５】
配列番号：２
配列の長さ：２５９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル：ＹＥＳ
起源
生物名：肺炎球菌
株名：ＫＫ−３
配列
Lys Thr Gly Ala Val Leu Ser MET Ser Glu Leu Lys His Asp Leu Lys  16
Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ    ３２
Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ    ４８
Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ    ６４
Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎ    ８０
Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ    ９６
Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  ＭＥＴ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  ＭＥＴ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  １１２
Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  ＭＥＴ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  ＭＥＴ  １２８
Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  １４４
Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  １６０
Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  １７６
Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  ＭＥＴ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  １９２
Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  ２０８
Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  ＭＥＴ  ２２４
Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  ＭＥＴ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  ２４０
Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  ２５６
Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ                                                      259
【００４６】
配列番号：３
配列の長さ：１８
配列の型：核酸
鎖の数：
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ
アンチセンス：センス
起源
生物名：肺炎球菌
株名：ＫＫ−３
配列
5′TGGTATACTTGGTATACT
【００４７】
配列番号：４
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：ＹＥＳ
起源
生物名：肺炎球菌
株名：ＫＫ−３
配列
Trp Tyr Thr Trp Tyr Thr
1               5
【図面の簡単な説明】
【図１】遺伝子検査と薬剤感受性試験の関係を示す図である。
【図２】遺伝子検査と薬剤感受性試験の関係を示す図である。
【図３】遺伝子検査と薬剤感受性試験の関係を示す図である。
【図４】遺伝子検査と薬剤感受性試験の関係を示す図である。
【図５】正常、Ｃｌａｓｓ  Ａ、Ｃｌａｓｓ  Ｂ及びＣｌａｓｓ  Ｃの塩基配列を示す図である。
【図６】正常、Ｃｌａｓｓ  Ａ、Ｃｌａｓｓ  Ｂ及びＣｌａｓｓ  Ｃの塩基配列を示す図である。
【図７】正常、Ｃｌａｓｓ  Ａ、Ｃｌａｓｓ  Ｂ及びＣｌａｓｓ  Ｃのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】Ｃｌａｓｓ  Ｃ遺伝子をもつペニシリン耐性肺炎球菌と薬剤感受性の関係を示す図である。
【図９】Ｃｌａｓｓ  Ｃ遺伝子をもつペニシリン耐性肺炎球菌と薬剤感受性の関係を示す図である。
【図１０】実施例２において直接シークエンシングに使用したプライマーを示す図である。
【図１】
0003652387.tif 000002
【図２】
0003652387.tif 000003
【図３】
0003652387.tif 000004
【図４】
0003652387.tif 000005
【図５】
0003652387.tif 000006
【図６】
0003652387.tif 000007
【図７】
0003652387.tif 000008
【図８】
0003652387.tif 000009
【図９】
0003652387.tif 000010
【図１０】
0003652387.tif 000011