(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又は担体を含む、リウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性硬化症からなるグループから選択される自己免疫機能不全を処置するための、ヒト患者への非経口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて前記ポリペプチドはＩＬ−１に結合することが可能であり、そして、以下の：
ａ）配列番号２のアミノ酸１ないし３３３を含むポリペプチド；及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸−１３ないし３３３を含むポリペプチド
からなるグループから選択される、前記薬剤組成物。
【請求項２】
有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又は担体を含む、リウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性硬化症からなるグループから選択される自己免疫機能不全を処置するための、ヒト患者への非経口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて前記ポリペプチドは配列番号２のｘないしｙの配列を含み、前記ｘは配列番号２のアミノ酸−１３又は１であり、そしてｙはアミノ酸３３０ないし３３３のいずれかであり、前記ポリペプチドはＩＬ−１に結合することが可能であるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの生物学的に活性なポリペプチドである、前記薬剤組成物。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸１−３３３を含む、有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又は担体を含む、リウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性硬化症からなるグループから選択される自己免疫機能不全を処置するための、ヒト患者への非経口適用に適した薬剤組成物であって、前記ポリペプチドはＩＬ−１に結合することが可能であるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの生物学的に活性なポリペプチドである、前記薬剤組成物。
【請求項４】
有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又は担体を含む、リウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性硬化症からなるグループから選択される自己免疫機能不全を処置するための、ヒト患者への非経口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて、前記ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１ないしｙを含み、ｙは配列番号２のアミノ酸３３０ないし３３３のいずれかであり、前記ポリペプチドはＩＬ−１に結合することが可能であるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの生物学的に活性なポリペプチドである、前記薬剤組成物。
【請求項５】
自己免疫機能不全がリウマチ様関節炎である、請求項１−４のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的にサイトカイン受容体に関し、特にインターロイキン−１受容体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は免疫制御及び、炎症反応において中心的役割を果たす、遠い関係にあるポリペプチド性ホルモンである。これら２つのタンパク質は各種の細胞に働き、複数の生物学的活性を持っている。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに帰する生物学的活性の相違は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方に結合する、特異的原形質膜受容体による。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βによる広範囲に及ぶ生物学的活性のために、ＩＬ−１受容体は様々な種の間で高度に保存され、多様な細胞で発現されているに違いないと元来信じられてきた。
【０００３】
リガンド親和性クロス−リンキング技術による構造評価の結果、配列上の顕著な相違にもかかわらず、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは、Ｔ細胞と繊維芽細胞の、同じ細胞表面受容体分子に結合することがわかった（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：２６６，１９８６；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：２６３，１９８６；Ｄｏｗｅｒｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：１０６０，１９８６）。ｃＤＮＡ発現クローニング及び、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに結合し、８０，００ｋＤａの分子量を持つ膜内在性糖タンパク質としてのＮ端側配列分析から、ネズミとヒトのＴ細胞のＩＬ−１受容体が同定された（シムズら（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５８１，１９８８；シムズら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６；８９４６，１９８９）。
【０００４】
しかしながら、現在では、この８０ｋＤａ  ＩＬ−１受容体タンパク質がＩＬ−１の種々の生物学的効力のすべてを伝達しているわけではないことが明らかになっている。更なる親和クロス−リンキング解析は、エプシュタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）−形質転換ヒトＢ細胞系ＶＤＳ−Ｏ及び３Ｂ６、ＥＢＶ−陽性バーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫細胞系ラジ（Ｒａｊｉ）、そしてネズミ前Ｂ細胞系７０Ｚ／３におけるＩＬ−１受容体が６０，０００から６８，０００ｋＤａの分子量であるこおを示唆している（マツシマら（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４９９６，１９８６；ベンシモンら（Ｂｅｎｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２２９０，１９８９；ベンシモンら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３；１１６８，１９８９；ホルークら（Ｈｏｒｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６２７５，１９８７；チゾニッテ（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８０２９，１９８９；ボムスツィックら（Ｂｏｍｓｚｔｙｋ  ｅｔａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８０３４，１９８９）。さらに、ラジＢ細胞系と、ＥＬ−４ネズミＴリンパ腫細胞系のＩＬ−１受容体の生物学的特性及び動的解析を比較したところ、ラジ細胞は、ＥＬ−４Ｔ細胞のサブクローンよりも、低い結合親和性を持つが、細胞あたり、より高密度に受容体を持つことが分かった（ホールク（Ｈｏｒｕｋ）ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６２７５，１９８７）。ラジ細胞はまた。ＩＬ−１を吸収することができず、ＩＬ−１類似物に対して異なった受容体結合親和力を示した（ホルクら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６２７５，１９８７）。これらのデータはＢ細胞上で発現されたＩＬ−１受容体（ここではタイプＩＩＩＬ−１受容体と呼ぶ）は、Ｔ細胞及びその他の細胞種で発見されたＩＬ−１受容体（ここではタイプIＩＬ−１受容体と呼ぶ）と異なっていることを示唆している。
【０００５】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの構造的及び生物学的特性、そしてＩＬ−１刺激に対する様々な細胞母集団の反応におけるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの果たす役割を解析するために、あるいは、治療、診断、分析においてタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを有効に用いるために、均質な組成物が必要である。そのような組成物は、培養細胞で発現している受容体の精製によって、あるいは、受容体をコードしている遺伝子のクローニング及び発現によって理論的には得ることができる。しかしながら本発明以前には、いくつかの障害があり、目的は達成されなかった。
【０００６】
まず、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを高いレベルで構成的に、連続的に発現する細胞系が以前には知られておらず、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現するとして知られていた細胞系は少ない数（５００から２，０００受容体／細胞）しか発現しなかったために、アミノ酸の配列情報を得たり、モノクローナル抗体を作製するのに充分な量の受容体の精製への努力が妨げられた。受容体の数が少ないために、また、実用的な転写分析に基づいたクローニング法も不可能であった。
【０００７】
次に、タイプIＩＬ−ＲとタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲのＤＮＡ配列における顕著な相違のため、ネズミタイプＩＬ−１ＲｃＤＮＡを用いたクロス−ハイブリダイゼーションも不可能であった（ボムスチック（Ｂｏｍｓｚｔｙｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８０３４，１９８９，及びチゾニッテ（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８０２９，１９８９）。
【０００８】
三番目として、仮に、Ｎ端側タンパク質配列決定を行うことができるほど充分に精製されたタンパク質組成物が得られたとしても、そこから得られる遺伝コードの退歩（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）は、更にかなりの実験をしなければ、適切なプローブを決定できないであろう。ｃＤＮＡライブラリーにおいてハイブリダイズする配列を決定するのに必要な特異性を持つプローブを決定するのに、多くの反復する試行が要求されるだろう。直接的発現クローニング技術は、未知の特異性を持つ異なったプローブを用いた反復したスクリーニングの必要を避けており、他の受容体（例えばタイプIＩＬ−１Ｒ）のクローニングにおいては有用であったが、少ない数のタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現している細胞から得られたｃＤＮＡライブラリーから、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローンを固定するために用いるのにふさわしいほどに充分に感度が高くない。
【０００９】
したがって、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを精製したり、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをコードする遺伝子をクローニングしたり発現したりする努力は、精製した受容体、受容体ｍＲＮＡの適切な供給源が欠落していること、そして、充分に感度のあるクローニング技術の欠落によって著しく妨げられた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、精製した、均質なタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質及び、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質をコードする単離したＤＮＡ配列、特に、ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ又はその類似物（ａｎａｌｏｇｓ）を提供する。そのようなＤＮＡ配列は、好ましくは、（ａ）クロ−ン７５のように、天然タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ遺伝子のコード部分に由来するヌクレオチド配列を持つｃＤＮＡクローン；（ｂ）ゆるやかなストリンジェント条件下で（ａ）のｃＤＮＡクローンとハイブリダイズでき、生物学的活性のあるＩＬ−１Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；そして（ｃ）（ａ）及び（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列の遺伝コードの結果として退歩し、かつ生物学的活性のあるＩＬ−１Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列から成る群から選択される。本発明はまた、上に定義されたＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、組換え発現ベクターを用いて産生された組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ分子、そして、発現ベクターを利用した組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ分子の産生方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、実質的に精製され、均質なタンパク質と、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを含む、タンパク質組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、療法、診断、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの分析又は、タイプＩＩＩＬ−１Ｒに対する抗体の作製において使用するための、上述の方法に従って調製された可溶性天然又は組換え受容体タンパク質の有効量を含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明のこれらの、また他の側面は、以下の詳細な説明を参照すると明白になるであろう。
【００１４】
定義
“ＩＬ−１”は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βをあわせて指す。
【００１５】
“タイプＩＩ  インターロイキン−１受容体”及び“タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ”はインターロイキン−１（ＩＬ−１）分子を結合することができ、ホ乳類原形質膜タンパク質のような本来の構造をとるとき、ＩＬ−１から細胞への信号を伝達する役割を果たす分子を指す。成熟した全長ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、みかけの分子量が約６０−６８ｋＤａの糖タンパク質である。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の具体例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されている。ここで用いられているように、上述の用語は、ＩＬ−１結合活性又は信号伝達活性を持つ天然タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の類似物又はサブユニットを含んでいる。特に、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の先端を欠いた形や、可溶性の形状のものも、下記で定義するように、含まれている。種の指定がない場合は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、ヒト、ネズミ、ウシタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを含むがそれらに限定されない、ホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを総称する。同様に、欠損変異に対する特別な指定がない場合、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒという用語は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの生物学的活性を持つ変異体又は類似物を含むすべての形態のタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを意味する。“インターロイキン−１受容体”又は“ＩＬ−１Ｒ”とは、タイプIＩＬ−１受容体及びタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体をあわせて指す。
【００１６】
本発明の文脈で用いられている“可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ”はタンパク質、又は、実質的に同等な類似物で、天然タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの細胞外部分の全て又は一部と実質的に類似しており、細胞から分泌されるが、ＩＬ−１と結合する能力を持っているか、又は細胞表面に結合したＩＬ−１Ｒタンパク質を通じたＩＬ−１の信号伝達を阻害する能力のあるものを指している。可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、細胞から分泌されることができるのなら、膜貫通領域の一部を含んでいるかもしれない。可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の具体例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１−３３０又は１−３３３アミノ酸配列を持つタンパク質、そして、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の１−３４２及び１−３４５アミノ酸配列を持つタンパク質を含んでいる。ＩＬ−１信号伝達活性の阻害は、初代細胞又は、内在性ＩＬ−１Ｒを発現し、ＩＬ−１に生物学的に反応するか、組換えＩＬ−１ＲＤＮＡを導入するとＩＬ−１に生物学的に反応するような細胞系を用いて決定することができる。細胞は、ＩＬ−１と接触を受け、それによって起きる代謝影響が解析される。もしリガンドの働きによる影響が出れば、組換え受容体は信号伝達活性を持つ。ポリペプチドが信号伝達活性を持つかどうかを決定するための典型的な手法は、イゼルダ（Ｉｄｚｅｒｄａ）ら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１（１９９０）；カーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３０４５（１９８９）；プリウェス（Ｐｒｙｕｅｓ）ら．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２１７９（１９８６）及びコウ（Ｃｈｏｕ）ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１８４２（１９８７）によって明らかになった。
【００１７】
“単離された”又は“精製された”という用語は、本明細書の文脈中でタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質又はタンパク質組成物の純度を定義するために用いられている場合、タンパク質又はタンパク質組成物が、実質的に、他の、天然の、又は内在性由来のタンパク質の混入を受けておらず、生産過程の混入タンパク質残余が１％以下であることを意味する。このような組成物はしかし、安定剤、担体賦形剤または共治療剤として他のタンパク質を含むことがある。タイプＩＩＩＬ−１Ｒは、ポリアクリルアミドゲルを銀染色した時に、１本のバンドとして検出可能ならば“単離されて”いる。
【００１８】
“実質的に類似”という用語が、アミノ酸もしくは核酸配列を定義する時に用いられる場合、特有の従属配列、例えば、変異型配列が、もとの配列から、１つ又はそれ以上の置換、欠失、付加を受けて変化しており、それらの全影響が、例えば、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ結合分析において、実施例５で以下に記述したように、決定された、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の生物学的活性を保っていることを意味している。あるいは、核酸サブユニットまたは類似物は、もし、（ａ）ＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のコード領域から得られたものなら、（ｂ）ＤＮＡ配列が、ゆるやかなストリジェントな条件下（２５％  ホルムアミド，４２℃，２×ＳＳＣ）で、もしくはその代わりに、よりストリンジェントな条件下（５０％ホルムアミド，５０℃，２×ＳＳＣ，又は５０％ホルムアミド４２℃，２×ＳＳＣ）で（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができ、生物学的活性のあるＩＬ−１Ｒ分子をコードしているのなら、あるいは、（ａ）又は（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果生じたＤＮＡ配列で、生物学的活性のあるＩＬ−１Ｒ分子をコードするものなら、ここで明らかにした特定のＤＮＡ配列に“実質的に類似”している。
【００１９】
ここで用いられる“組換え”とは、タンパク質が組換え（例えば微生物又はホ乳類の）発現系で得られることを意味する。“微生物の”とは、細菌または菌類（例えば酵母）の発現系で作製された組換えタンパク質を指す。産生品として、“組換え微生物の”は、天然の内在性物質を本質的に含まず、天然の糖鎖付加のないタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養、例えばＥ．ｃｏｌｉで発現されたタンパク質は、グリカンを含まない。酵母で発現されたタンパク質は、ホ乳類細胞で発現されたものとは異なるパターンの糖鎖付加を受ける可能性がある。
【００２０】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの特性として本明細書を通じて用いられている“生物学的活性”とは、測定可能な量のＩＬ−１、できれば少なくともタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ１ナノモルあたり、０．０１ナノモルのＩＬ−１を結合できるだけの充分なアミノ酸配列類似性をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３との間に共有する特定の分子、又は、そのかわりに、例えば、雑種受容体構造の一部のように、ＩＬ−１刺激を細胞へ伝達できるだけの充分なアミノ酸配列類似性を共有する特定の分子を意味する。さらに、できれば、本発明の範囲では生物学的に活性のあるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、受容体１ナノモルあたり、０．１ナノモル以上のＩＬ−１を結合する能力があり、最も望ましくは、受容体１ナノモルあたり０．５ナノモルのＩＬ−１を結合することができる。
【００２１】
“ＤＮＡ配列”とは、ＤＮＡ重合体を指し、１つの分離した断片状又は、より大きなＤＮＡ構造の一部分であり、少なくとも１度は、実質的に純粋な形状として、すなわち、内在性物質の汚染がなく、そして、配列の同定、操作、回収が可能なだけの量を持った形状で単離されたＤＮＡ由来で、例えばクローニングベクターを用いた標準生物化学的手法で得たヌクレオチド配列の部分である。このような配列は、真核生物遺伝子に特徴的に存在する内在非翻訳領域すなわちイントロンに中断されないオープンリーディングフレームをもつ形状で供給されることが望ましい。しかし、適切な配列を含むゲノムＤＮＡも使用され得ることは明らかである。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５′又は３′側に存在し、そこでは、操作又は、コード領域の発現に干渉しない。
【００２２】
“ヌクレオチド配列”は、デオキシリボヌクレオチドのヘチロ重合体を指している。本発明で供給されたタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び、短いオリゴヌクレオチドリンカー又は、組換え転写単位で発現され得る合成遺伝子を供給するための一連のオリゴヌクレオチドから集められた。
【００２３】
“組換え発現ベクター”は、（１）例えばプロモーター又はエンハンサーのような、遺伝子発現制御をになう単一又は複数の遺伝因子、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、構造的あるいは、コード配列、（３）適当な転写および翻訳開始及び終止配列、の集まりを含む転写単位を含むプラスミドを指す。酵母発現系で用いるための構造因子は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質が細胞外へ分泌されるようになるリーダー配列を含むことが望ましい。かわりに、リーダー又は輸送配列を持たずに発現された組換えタンパク質は、Ｎ端メチオニン残基を含むかもしれない。この残基は、最終産物を供給するために、発現組換えタンパク質から任意に、さらに切断されるかもしれない。
【００２４】
“組換え微生物発現系”とは、例えばＥ．ｃｏｌｉのような細菌や、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母といった、宿主微小有機体の実質的に均質な単一培養を意味し、それら宿主は、染色体ＤＮＡ中に組換え転写単位を安定して組み込んでいるか、もしくは、常在性プラスミドの構成物の１つとして組換え転写単位を持っている。一般に、系を構成する細胞は、単独の祖組換え体の子孫である。ここで定義される組換え発現系は、ＤＮＡ配列又は、発現される合成遺伝子に連結した制御因子の誘導によってヘテロなタンパク質を発現する。
【００２５】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質と類似物
本発明は単離された組換えホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒポリペプチドを提供する。本発明におけるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、例として、霊長類、ヒト、ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ及びブタタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを含んでいる。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、ヒト又はマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲＤＮＡ配列から得られた一本鎖ｃＤＮＡを用いた、種間ハイブリダイゼイションによって、例えば、ホ乳類のｃＤＮＡライブラリーから、タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡを単離するために、ヒトクローン７５を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、得ることができる。多くのホ乳類遺伝子同様、ホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、おそらく複数のエキソンにコードされている。転写後の異なったｍＲＮＡスプライシングによって生じ得る、本特許請求の範囲中にあるｃＤＮＡと同一又は類似性のある広範囲を共有するオールタータティブｍＲＮＡ構成物は、本発明の範囲に含まれるとみなされている。ＩＬ−ＩＲ−ＩＩ  をコードするＤＮＡ配列はおそらく、別のスプライシング配置の形状にあるが、次の細胞及び組織から単離され得る：Ｂリンホブラストイド系（ＣＢ２３、ＣＢ３３，ラジ，ＲＰＭＩ１７８８，ＡＲＨ７７のようなもの）、休止状態及び特に活性化状態にある末梢血液Ｔ細胞、単球、単球細胞系ＴＨＰ１、好中球、骨髄、胎盤、内皮細胞、角化細胞（特に活性化状態）、及びＨｅｐＧ２細胞。
【００２６】
本発明の範囲内のタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの誘導物もまた、生物学的活性のある本来のタンパク質の様々な構造物形状を含んでいる。例えば、イオン化可能なアミノ及びカルボキシル基のためタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、酸性又は塩基性の塩として、あるいは中性の形状をとる可能性がある。個々のアミノ酸残基も酸化あるいは還元によって修飾を受ける可能性がある。
【００２７】
アミノ酸の一次構造は糖鎖群、脂質、リン酸、アセチル群、および同様のものといった他の化学的部分と共有又は擬集結合を形成することで、あるいは変異型アミノ酸配列を作成することで修飾される可能性がある。共有誘導物は特に機能的な群をタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒのアミノ酸側鎖又は、Ｎ端又はＣ端に結合することで調製される。本発明の範囲内でのタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの他の誘導体は、Ｎ端又はＣ端の融合のような組換え培養における合成によるような、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ又はその断片と、他のタンパク質又はポリペプチドの共有又は擬集結合を含んでいる。例えば、結合したペプチドは、翻訳と同時に、あるいは翻訳後、タンパク質を、その合成部位から機能部位へ、細胞膜又は壁の内側あるいは外側へ輸送するような、タンパク質のＮ端部分にあるシグナル（又はリーダー）ポリペプチド配列かもしれない（例えば酵母のα−因子リーダー）。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質融合は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの精製と同定を促進するためのペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含むこともできる。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒのアミノ酸配列はまた、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（ホップ（Ｈｏｐｐ）ら．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８）と結合されることも可能である。後者の配列は、高い抗原性があり、特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合する抗体認識部位を供給し、発現された組み換えタンパク質の素速い分析と、容易な精製を可能にした。この配列は、また、ウシムコサル  エンテキロナーゼ（ｍｕｃｏｓａｌ  ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）によって、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対の直後で特異的に切断される。この配列でキャップされた融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で細胞内消化に耐性になる可能性がある。
【００２８】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ誘導体は、また、免疫原、受容体に基づいた免疫分析の試薬、あるいは、ＩＬ−１又は他の結合リガンドの親和精製手法のための結合試薬としても、使用することができる。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ誘導体はまた、Ｍ−マレイミドベンゾイルサクシニドエステル及びＮ−ヒドロキシサクシニドといったシステイン及びリジン残基に働くクロス−リンキング試薬を用いて得られる可能性もある。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、また、シアノゲンブロマイド、ビソキシレン、カルボニルジイミダゾール、又は、トシルによって活性化されたアガロース構造といった、様々な不溶性基質と、反応側基を通じて、あるいは、ポリオレフィン表面（グルタルアルデヒド  クロスリンキングの有無にかかわらず）に吸着することで、共有結合される可能性をもつ。いったん基質と結合するとタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは（分析又は精製の目的で）抗−タイプＩＩＩＬ−１Ｒ抗体又はＩＬ−１に選択的に結合するために用いることができるかもしれない。
【００２９】
本発明は、また、天然型糖鎖付加のある、あるいはない、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒも含んでいる。酵母あるいは、例えばＣＯＳ−７細胞といったホ乳類発現系で発現されたタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、その発現系に依存して、天然の分子とは、分子量及び糖鎖付加の型が類似するか、もしくはわずかに異なる可能性がある。Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌でタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲＤＮＡを発現すると、糖鎖付加されない分子が作られる。Ｎグリコシル化部位が不活性化された、ホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの機能変異類似物は、オリゴヌクレオチド合成及びライゲーション又は、部位特異的変異導入技術によって作製することができる。これらの類似タンパク質は、酵母の発現系を用いて、よい収率で均質で炭水化物還元型で作製されることが可能である。真核生物タンパク質のＮ−グリコシル化部位は、３つのアミノ酸、Ａｓｎ−Ａ1−Ｚで特徴づけられており、ここでＡ1は、Ｐｒｏをのぞく任意のアミノ酸で、ＺはＳｅｒ又はＴｈｒである。この配列中に、炭水化物の共有付加用の側鎖アミノ酸を、アスパラギンが供給している。ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲのＮ−グリコシル化部位の例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸６６−６８、７２−７４、１１２−１１４、２１９−２２１及び２７７−２７９である。このような部位は、Ａｓｎ又はＺ残基を別のアミノ酸に置換したり、Ａｓｎ又はＺを削除したり、Ａ1とＺとの間にＺでないアミノ酸を挿入したり、ＡｓｎとＡ1の間にＡｓｎ以外のものを挿入することで減少されることができる。
【００３０】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ誘導体はタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ又はそのサブユニットを変異型にすることで得られる。ここで示されているように、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ変異体は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒとポリペプチドは類似しているが、天然タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒとは欠失、挿入、置換のため、異なったアミノ酸配列を持っている。
【００３１】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の生物学的に同等の類似物は、例えば、残基又は配列の様々な置換、又は、末端又は内部の生物学的活性に不要な残基又は配列の欠失、によって作成される可能性がある。例えば、システイン残基は、再生にあたって、不必要もしくは間違った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐため、欠失又は他のアミノ酸と置換されうる。変異導入の他の手段は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母の系での発現を強めるために、隣接した２価塩基性アミノ酸残基の修飾も含んでいる。一般的に、置換は保存的でなければならない。すなわち、最も好ましいアミノ酸置換は、物理化学的性質の似かよった残基を置き換えるものである。同様に欠失または挿入を行おうとするとき、生物学的活性に対する欠失又は挿入の与え得る影響を考慮しなければならない。実質的に類似したポリペプチド配列は、上で定義したように、一般に、同じくらいの数のアミノ酸配列を含むが、可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを作成するためにＣ端を切断したものは、より少ないアミノ酸残基を含むことになる。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの生物学的活性を保存するために、欠失と置換は類似した、あるいは保存した置換配列で行われること、すなわち、当該の残基が生物学的に類似した残基と置換されることが望ましい。保存した置換の例は、Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，又はＡｌａを互換するといった、疎水性残基どうしの置換や、ＬｙｓとＡｒｇ，ＧｌｕとＡｓｎ，ＧｌｎとＡｓｎといった極性残基どうしの置換を含んでいる。例えば類似した疎水性を持つ領域全体の置換といった、その他の保存した置換もよく知られている。さらに、ヒト、ネズミ、及びその他のホ乳類のタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの間で異なっている特定のアミノ酸は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの本質的な生物学的特性を変えることのない、更なる保存した置換を示唆している。
【００３２】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒのサブユニットは、末端あるいは内部の残基又は配列を欠失させて作製できる。本発明は、例えば、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの細胞外領域の全部又は一部に相当する可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを生じるＣ端欠失を意図している。生じるタンパク質はＩＬ−１に結合能があることが望ましい。特に望ましい配列は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの膜貫通領域と細胞内領域が欠失しているか、親水性残基に置換しており、受容体の細胞培養液への分泌を促進する配列である。可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、細胞から可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質が分泌可能であるならば、膜貫通領域を一部含んでいる可能性がある。例えば、可溶性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列１−３３３又は１−３３０を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列１−３４５及び１−３４２を含んでいるかもしれない。かわりに可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質はＩＬ−１結合に必要でない細胞外領域中のタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲのＣ端領域の欠失から得られたかもしれない。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の配列で、それぞれ３１３、及び３２５アミノ酸以降を持つようなタンパク質を作成するためにＣ端欠失が行われたかもしれない。これらのアミノ酸はシステインで、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ分子の３次構造を保つのに必要であると信じられており、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ分子がＩＬ−１に結合するのを許している。可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ構造は、タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡの３′領域を欠失させ、適当な発現ベクターにＤＮＡを挿入し、発現させた。このような可溶性タンパク質の構築の典型的な方法は実施例２及び４に述べている。生じたタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、実施例５で述べるように、ＩＬ−１に結合する能力を測定される。このような、可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡ配列及びこのような構造から生じる生物学的活性のある可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、どちらも本発明の範囲内に含まれるよう意図されている。
【００３３】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ類似物の発現用に作製されたヌクレオチド配列中の変異は、当然、コード配列の読み枠の相を保存しており、受容体ｍＲＮＡの翻訳に負に影響するような、ループ、ヘアピンといったｍＲＮＡの２次構造を生じるようにハイブリダイズ可能な相補領域を生じないことが望ましい。変異を導入する部位は前もって決定されるが、変異それ自体の性質が前もって決定される必要はない。例えばある部位の変異の最適の性質を選択するために、標的コドンに対するランダムな変異導入が行われ、発現された変異型タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは望ましい活性を持つものがスクリーニングされる。
【００３４】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをコードするヌクレオチド配列中のすべての変異が、最終産物として発現されるわけではない。例えば、ヌクレオチドの置換は、発現を強め、基本的に、転写されたｍＲＮＡ中のループ等の２次構造を避けるように起きる（ＥＰＡ７５，４４４Ａ参照、参考文献でここに含まれている）か、例えば有名なＥ．ｃｏｌｉの発現用のＥ．ｃｏｌｉが好むコドンのような、選択された宿主によってより素早く翻訳されるようなコドンを供給するように、起きる。
【００３５】
変異は、本来の配列の断片とライゲーションできるような制限酵素部位を横に持った、変異配列を含む合成オリゴヌクレオチドによって、意図した位置へ導入することができる。ライゲーション後、生じた再構築された配列は、目的のアミノ酸の挿入、置換、欠失を持った類似物をコードする。
【００３６】
そのかわりに、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法を用いて必要な置換、欠失、挿入を持つように変化させた特別のコドンを持つ、改変遺伝子を作製することもできる。上述した改変を作製する典型的方法は、ワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）ら、（Ｇｅｎｅ４２：１３３，（１９８６）；ボイヤ−（Ｂａｕｅｒ）ら，（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５）；クレイク（Ｃｒａｉｋ）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ１９８５，１２−１９）；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；によって明らかにされ、そして米国特許４，５１８，５８４号及び４，７３７，４６２号は適切な技術を開示し、参考文献中に編入されている。
【００３７】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの単価型及び多価型のどちらも、本発明における組成物及び方法の点で有用である。多価型はＩＬ−１リガンドに対する複数のタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ結合部位を持っている。例えば２価の可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、リンカー領域で分離された、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの細胞外領域の２つの縦方向くり返し構造をとっている。その他の多価型も、例えば臨床用として使用可能な担体一般、フィコール、ポリエチレングリコール、又はデキストランを含む群から選択した重合体に、従来のカップリング技術を用いて、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを化学的に結合させたものも作製される可能性がある。かわりに、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、ビオチン化学的に結合されると、ビオチン−タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは次にアビジンと結合し、アビジン／ビオチン／タイプＩＩＩＬ−１Ｒ分子の４量体が生じる。タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、またジニトロフェノール（ＤＮＰ）又は、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）と共有結合し、生じる複合体は抗ＤＮＰ又は抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈降され、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ結合サイトが１０価ある１０価複合体を形成する。
【００３８】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ配列を免疫ブロブリン分子の重鎖又は軽鎖のどちらか一方又は両方と置換し、修飾を受けない不変領域を持つことで、組換えキメラ抗体を作製可能である。例えば、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ／ＩｇＧ1キメラは、２つのキメラ遺伝子−タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ／ヒトκ軽鎖キメラ（タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ／Ｃκ）及びタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ／ヒトγ１重鎖キメラ（タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ／Ｃγ-1）−から生じる。２つのキメラ遺伝子の転写及び翻訳の後、遺伝子産物は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを持つ１つキメラ抗体分子に集合し、２価を示す。このようなタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの多価型はＩＬ−１リガンドに対して強められた結合親和性を持つであろう。このようなキメラ抗体分子の構築に関する更なる詳細は、ＷＯ８９／０９６２２及びＥＰ３１５０６２に開示されている。
【００３９】
組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの発現
本発明はタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡを増幅、又は、発現させるための組換え発現ベクターを提供する。組換え発現ベクターはホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ又はその生物学的類似物をコードする、合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を持ち、ホ乳類、微生物、ウイルス又は昆虫由来の適切な転写又は翻訳調節因子と、実行可能なように結合した、複製可能なＤＮＡ構造物である。転写単位は一般に、（１）例えば転写プロモーター又はエンハンサーのように、遺伝子発現制御をになう、単一又は複数の遺伝因子、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される、構造的あるいは、コード配列、（３）適当な転写および翻訳開始および終止配列、の集まりを含むが、それについては以下で詳細に記述する。そのような制御因子は、転写を制御するオペレーター配列、すなわち、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列を含むかもしれない。通常複製開始点によって得られる宿主中での複製能、及び形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子も付加的に含まれている。ＤＮＡ領域は、機能的に互いに関連している場合は、実行可能に結合されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）ＤＮＡは、もしポリペプチドの分泌を担う前駆体として発現されるなら、ポリペプチドのＤＮＡに実行可能に結合されている。プロモーターは、もし、配列の転写を制御するなら、コード配列に、実行可能に結合されている。あるいは、リボソーム結合部位は、もし、翻訳を許すために加えられているなら、コード配列に実行可能に結合されている。一般的に、実行可能に結合されている、とは、連続的に、そして分泌リーダーの場合は、連続的かつ読み枠に合って結合していることを意味する。酵母発現系において用いようとする構造因子は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質が細胞外に分泌されることを可能にするリーダー配列を含むことが望ましい。かわりに、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしで発現した場合、Ｎ端メチオニン部位を含むことになる。この残基は、最終産物を供給するために発現された組換えタンパク質から続いて任意に切断される。
【００４０】
微小有機体で発現されることになる、ホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写を未熟なうちに停止させ得る。しかし、転写の未熟な停止は、望ましい。例えば、細胞膜に結合しない可溶性受容体を得るために、例えば膜貫通部分を欠失した有利切断されたＣ端を持つ変異体が得られる場合などである。コードが縮重しているため、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にはかなりの変化が起こり得る。他の態様はゆるやかなストリンジェントな条件（５０°Ｃ，２×ＳＳＣ）下でクローン７５とハイブリダイズできる配列及び、生物学的に活性のあるタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒポリペプチドをコードするものとハイブリダイズするか、あるいは、縮重している配列を含んでいる。
【００４１】
組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲＤＮＡは、染色体ＤＮＡ中に組換え転写単位を（形質転換又は形質導入によって）安定して組み込んでいるか、もしくは、常在性プラスミドの構成物の１つとして組換え転写単位を持っているような、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌や、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母といった、宿主微小有機体の実質的に均質な単一培養を含む組換え発現系の中で発現されるか、増幅される。一般に、系を構成する細胞は、単一の祖形質転換体の子孫である。ここで定義された組換え発現系は、発現されるべきＤＮＡ配列または、合成遺伝子に結合した制御因子の誘導によって異種タンパク質を発現するであろう。
【００４２】
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたタイプＩＩＩＬ−１Ｒベクターで形質転換または形質導入された細胞である。形質転換された宿主細胞は通常、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現するが、タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲＤＮＡをクローニング又は増幅させるために形質転換された宿主細胞は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現する必要がない。発現されたタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、選択されたタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲＤＮＡに依存して、細胞膜に置かれるが、培養液上清に分泌される。ホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの発現用にふさわしい宿主細胞には、適切なプローモーターの制御下にある原核生物、酵母あるいはより高等な真核細胞が含まれる。原核生物は、例えばＥ．ｃｏｌｉ又はバチルスといった、グラム陰性又はグラム陽性菌が含まれる。高等真核細胞は、下に記述するような、ホ乳類由来の確立された細胞系を含んでいる。本発明のＤＮＡ構成物から得られたＲＮＡを用いて、無細胞系によってホ乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを産生することも可能である。細菌、菌類、酵母及びホ乳類宿主細胞は、ポウウエルス（Ｐｏｕｗｅｌｓ）らによって記述されており（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）、それに関連する開示はこの中で参考文献中に含まれている。
【００４３】
大規模なタンパク質分解及びジスルフィド反応を必要としないタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの発現のためには、原核生物の発現宿主細胞が使用される。原核細胞の発現ベクターは一般に、例えば、抗生物質耐性を賦与するタンパク質をコードする遺伝子や、栄養要求性を補う遺伝子、といった、１つまたはそれ以上の表現型を持つ選択マーカーと、宿主内での増幅を保証する、宿主が認識する複製開始点を含んでいる。形質転換にふさわしい原核宿主生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳｔａｐｈｙｏｌｏｃｏｃｃｕｓ属に含まれる様々な種が含まれるが、その他のものも選択の問題で用いられる。
【００４４】
細菌用の有用な発現ベクターは、よく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子を含む市販の入手可能なプラスミド由来の、選択マーカーと細菌の転写開始点を含みうる。そのような市販されているベクターは例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＧＥＭ１（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を含んでいる。これらｐＢＲ３２２を“背骨”とする種類は、適切なプロモーターと、発現されるべき構造遺伝子が組合わさっている。Ｅ．ｃｏｌｉは、あるＥ．ｃｏｌｉ種から得られたプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて典型的に形質転換される（ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら，Ｇｅｎｅ２：９５，１９７７）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、形質転換された細胞の同定が容易になっている。
【００４５】
組換え微生物発現ベクターで一般に用いられているプロモーターは、β−ラクタマ−ゼ（ペニシリナ−ゼ）及びラクロースプロモーター系（チャンら（Ｃｈａｎｇ），Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８及びゴッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら，Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４，１９７９）トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２，１９８２）を含んでいる。特に便利な細菌の発現系は、λファージＰLプロモーター及びｃＩ８５７ts温度依存リプレッサーを利用している。λＰLプロモーターの誘導体を含む、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）株に常在するｐＨＵＢ２プラスミド、及びＥ．ｃｏｌｉＲＲ１株（ＡＴＣＣ５３０８２）に常在するｐＰＬｃ２８プラスミドを含んでいる。
【００４６】
組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は、酵母宿主細胞中、とりわけ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種においても発現される。ＰｉｃｈｉａあるいはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓといった他の属の酵母もまた、利用される。酵母のベクターは一般に酵母２μプラスミド由来又は、自律転写配列（ＡＳＲ）由来の複製開始点、プロモーター、タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡ、ポリアデニル化のための配列及び転写終結と、選択遺伝子を含んでいる。好適には、酵母のベクターは複製開始点を含み、酵母にも、Ｅ．ｃｏｌｉにも、形質転写できるような、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子及び、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのトリプトファン中では生育できない酵母の変異株の選択マーカーになる、ＴＲＰ１あるいはＵＲＡ３遺伝子、そして、下流の構造遺伝子の転写を誘導するための、高発現の酵母の遺伝子由来のプロモーターを含むことが望ましい。したがって、酵母宿主細胞のゲノム中にＴＲＰ１又はＵＲＡ３の損傷が存在すると、トリプトファンまたはウラシルの欠落した中での生育によって、形質転換を検出する効果的な環境を与えることになる。
【００４７】
酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は、メタロチオネイン、３−ホスフォグリセレートキナーゼのプロモーター（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）又は、他のエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェイトイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼといった解糖系酵素のプロモーター（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；及びホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）を含む。酵母発現系で用いるのに適切なベクター及びプロモーターについて、Ｒ．ヒッツェマン（Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら．，ＥＰＡ７３、６５７に更に述べられている。
【００４８】
望ましい酵母のベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択と複製のための（Ａｍｐγ遺伝子及び複製開始点）ｐＵＣ１８由来のＤＮＡ配列と、グルコースで抑制できるＡＤＨ２プロモーターと、α−因子分泌リーダー配列を含む酵母ＤＮＡから組み立てることができる。ＡＤＨ２プロモーターに関してはラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）及びベイヤー（Ｂｅｉｅｒ）ら，（Ｎａｔｕｒｅ３００：７２４，１９８２）によって記述されている。異種タンパク質の分泌を促す酵母α−因子のリーダー配列は、プロモーターと発現するべき構造遺伝子の間に挿入することができる。例えば、クルジャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら，Ｃｅｌｌ３０：９３３，１９８２；及びビッテル（Ｂｉｔｔｅｒ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５３３０，１９８４を参照されたい。リーダー配列は、その３′端に、リーダー配列と外来遺伝子の融合を促進する１つかそれ以上の制限酵素部位を持つように改変されるかもしれない。  適切な酵母形質転換法は、当業者に知られている；典型的な技法は、ハイネン（Ｈｅｉｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９，１９７８に記述されており、Ｔｒｐ+形質転換体の選択に、０．６７％イーストナイトロジェンベース，０．５％カザミノ酸，２％グルコース，１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルを含む選択培地；又は、ＵＲＡ+形質転換体用には、０．６７％ＹＮＢと、シェルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６に記述されているようにアミノ酸と塩基を加えた培地を用いている。
【００４９】
ＡＤＨ２プロモーターから成るベクターにより形質転換された宿主の株は、発現のために、８０μｇ／ｍｌアデニンと８０μｇ／ｍｌウラシルを補われた、１％酵母エキストラクト、２％ペプトンそして１％または４％グルコースから成る富栄養培地で増殖されることもあるだろう。粗酵母の上清を濾過より回収し、更に精製するまで４℃に保持しておく。
【００５０】
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳類あるいは昆虫の培養細胞系も有利に用いられる。哺乳類の細胞における組換えタンパク質の発現は、作られたタンパク質が一般的に正しく折りたたまれ、適切に修飾され完全に機能的であるということから、特に好まれる。適した哺乳類の細胞系の実施例は、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）により記述された（Ｃｅｌｌ２３：１７５，１９８１）、サルの腎臓の細胞からのＣＯＳ−７系統、及び例えばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３，チャイニーズ  ハムスター  オバリー（ＣＨＯ），ＨｅｌａそしてＢＨＫ細胞系を含めた適当なベクターを発現することのできる他の細胞系を含んでいる。哺乳類の発現ベクターは、複製開始点、発現される遺伝子につながった適当なプロモーター及びエンハンサー、そして５′または３′に隣接した非転写配列のような非転写要素とリボゾーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプライシングドナー及びアクセプターサイト、そして転写終了配列のような５′または３′非翻訳配列を含むこともあるだろう。昆虫の細胞でヘテロなタンパク質を生産するためのバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）の系についてはルカウ（Ｌｕｃｋｏｗ）とサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）によるレビューがある、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）。
【００５１】
セキツイ動物の細胞を形質転換するのに用いられることになる発現ベクターでの転写及び翻訳制御の配列は、ウイルスのソースから提供されることもあるだろう。例えば、最もよく用いられるプロモーター及びエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０オリジン、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライシングそしてポリアデニル化サイトは、ヘテロなＤＮＡ配列の発現に要求される他の遺伝子要素を供給するために用いられることもあるだろう。初期及び後期プロモーターは、共にＳＶ４０ウイルス複製オリジンも含んだ断片としてウイルスから容易に得られるので、特に有用である（フィアーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら．，Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３，１９７８）。ウイルス複製開始点に位置しているＨｉｎｄ３サイトからＢｇｌｌサイトへの約２５０ｂｐの塩基配列を含んでいるならば、より小さなあるいはより大きなＳＶ４０断片も用いられることがあると思われる。更に、哺乳類のジェノミックタイプＩＩ  のＩＬ−１Ｒプロモーター、コントロール、そして／またはシグナル配列が、そうしたコントロール配列が、選択された宿主の細胞とおりあうならば利用されることもあるだろう。組換えた哺乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを生産する哺乳類高発現ベクターについての更なる詳細は、以下の実施例２で示される。典型的なベクターは、オカヤマ及びバーグ（Ｂｅｒｇ）により発表されたようにして構築することができる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）。
【００５２】
Ｃ１２７マウス乳腺上皮細胞において、哺乳類のレセプターｃＤＮＡを安定に高レベルで発現させるのに有用な系は、実質的にコスマン（Ｃｏｓｍａｎ）らにより記述されたようにして作製することができるだろう（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８６）。
【００５３】
本発明の利点においては、タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターが安定に宿主細胞のＤＮＡにインテグレートされることである。発現産物の上昇したレベルは、ベクターＤＮＡの数が増幅された細胞系を選択することにより、達成される。ベクターＤＮＡの数が増幅された細胞系は、例えば、既知の薬剤により阻害される酵素をコードしたＤＮＡ配列を含むベクターで宿主の細胞を形質転換することにより選択される。ベクターは、また、目的とするタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含んでいてもよい。また、宿主細胞を、目的とするタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含む第２のベクターでコトランスフォーム（Ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ）してもよい。トランスフォームあるいはコトランスフォームした宿主の細胞を、それから、既知の薬剤の濃度を増やしながら培養し、それにより、薬剤耐性の細胞を選択する。そのような薬剤耐性の細胞は、しばしば、酵素をコードしている遺伝子の増幅の結果として、薬剤により阻害される酵素の過剰生産により毒性の薬剤の濃度が増加しても生き残る。阻害される酵素をコードしているベクターＤＮＡのコピー数の増加により薬剤耐性が生じている場合は、宿主細胞のＤＮＡで目的とするタンパク質（例：タイプＩＩＩＬ−１Ｒ）をコードしているベクターＤＮＡの随伴性の共増幅が存在している。
【００５４】
そのような共増幅のためのより好ましい系は、薬剤メトレキセート（ＭＴＸ）により阻害されうるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の遺伝子を用いている。共増幅を達成するため、ＤＨＦＲをコードしている活性のある遺伝子を欠いている宿主細胞を、ＤＨＦＲ及び目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフォームするか、もしくは、ＤＨＦＲをコードしているＤＮＡ配列を含むベクターと目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターとでコトランスフォームする。トランスフォームまたはコトランスフォームした宿主細胞を、増加したレベルのＭＴＸを含む培地で培養して、生き残った細胞系を選択する。
【００５５】
特に好ましい共増幅の系は、グルタミン酸とアンモニアから、ＡＴＰをＡＤＰとリン酸に加水分解して反応を進ませてグルタミンを合成するのにあずかっているグルタミン合成酵素（ＧＳ）の遺伝子を用いている。ＧＳは様々な阻害剤、例えばメチオニンスルフォキシイミン（ＭＳＸ）により阻害を受ける。従って、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、ＧＳと目的とするタンパク質のＤＮＡ配列から成るベクターでトランスフォーム、あるいはＧＳをコードしたＤＮＡ配列を含むベクターと目的とするタンパク質をコードしたＤＮＡ配列を含むベクターとでコトランスフォームした細胞を共増幅させ、増加したレベルのＭＳＸを含む培地で宿主細胞を培養し、生き残った細胞を選択することにより高濃度で発現されることができる。ＧＳ共増幅システム、適当な組換え発現ベクター及び細胞系は以下のＰＣＴ出願に記述されている：ＷＯ８７／０４４６２，ＷＯ８９／０１０３６，ＷＯ８９／１０４０４及びＷＯ８６／０５８０７。
【００５６】
組換えタンパク質は、チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞系統、あるいはまたＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４がＮＳＯのようなマウスミエローマ細胞系もしくはＹＢ２／３．０−Ａｇ２０のようなラットミエローマ細胞系（ＰＣＴ出願ＷＯ／８９／１０４０４及びＷＯ８６／０５８０７にて開示されている）でも、ＤＨＦＲがＧＳの共増幅により好ましく発現されている。
【００５７】
タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲＤＮＡの発現のためのより好ましい真核細胞のベクターは以下の実施例２で開示される。このベクターはｐＤＣ４０６と名づけられているが、哺乳類の高発現ベクターｐＤＣ２０１由来で、ＳＶ４０、ＨＩＶ及びＥＢＶからの制御配列を含んでいる。
【００５８】
組換え体タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの精製
本発明のＤＮＡの翻訳産物を発現する適当な宿主／ベクター系を培養し、その培地又は細胞抽出液から精製を行うことにより、精製哺乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ又はそのアナログが調製される。
【００５９】
例えば、組換え体可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質を培地中に分泌する系での上澄は、初めに商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はミリポア  ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニットを用いて濃縮され得る。濃縮に続き、濃縮液は適当な精製担体にアプライされる。例えば、適当なアフィニティー担体は、ＩＬ−１又はレクチンあるいは抗体分子を適当な支持体にに結合させたものから成る。別法として、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）付加を有する担体又は基質のような陰イオン交換樹脂も用いられ得る。担体としては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースあるいはタンパク質精製に一般に用いられる他のタイプのものを使用できる。適当な陽イオン交換体は、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む多様な不溶性担体を含む。スルホプロピル基がより好ましい。
【００６０】
最終的に、疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）担体、例えば、メチル基あるいは他の脂肪族基の付加を有するシリカゲル、を用いた１回あるいはそれ以上のＲＰ−ＨＰＬＣを行って、さらに、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ構成物を精製でき得る。上述の精製操作のいくつか又はすべては、多様な組合わせにより、同種の組換えタンパク質の調製にも用いられ得る。
【００６１】
バクテリアの培養で作られた組換えタンパク質は通常、初めに細胞ペレットからの抽出により分離され、１回又はそれ以上の濃縮、塩析、水相イオン交換あるいはサイズ排除クロマトグラフィー操作が行われる。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製操作として行われ得る。組換え哺乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの発現に用いた微生物の細胞は、凍結−融解サイクリング、ソニケーション、機械的破壊、又は細胞溶菌試薬の利用を含むいかなる簡便な方法によっても破壊され得る。
【００６２】
分泌タンパク質として可溶性哺乳類タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現する酵母の発酵は精製を著しく簡便化する。ラージスケールの発酵から生じた分泌組換えタンパク質はアーダルら（Ｕｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）により開示されたのと類似の手法により精製され得る。この引用文献は、調製用ＨＰＬＣカラムで、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦの精製を行うための、連続した２回の逆相ＨＰＬＣ操作を記述している。
【００６３】
組換え体培養中で合成されたヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、培養中からヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを回収するための精製操作に依存する、タンパク質を含む非ヒト細胞成分の量や性質によって格付けされる。これらの成分は通常、酵母、原核生物又は非ヒト高等真核生物起源のもので、重量にして約１％未満の程度で、存在が無害な夾雑物質量であることが望ましい。さらに、組換え体細胞培養は、例えば細胞内、細胞滲出液又は体液中のような天然起源では通常タイプＩＩＩＬ−１Ｒと結合しているタンパク質を含まない、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの製造を可能にする。
【００６４】
組換え体可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの治療投与
本発明は、有効量の可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質と適当な希釈液及びキャリアー（担体）から成る治療用構成品を使用する方法、並びに有効量の可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質の投与によって、ヒトのＩＬ−１依存免疫反応で抑制する方法で提供する。
【００６５】
治療用には、患者、望ましくはヒトに、精製可溶液タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質を徴候に応じた適切な処理により投与する。従って、可溶性タイプＩＩＩＬ−１Ｒタンパク質構成品は丸薬注入、連続的点滴、インプラントからの持続的放出又は他の適切な技法により投与され得る。典型的には、可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ治療薬は生理的に受容可能なキャリアー、賦形剤又は希釈液と結合させた精製タンパク質から成る構成品の形で投与される。このようなキャリアーは使用量及び濃度で受容者に対し毒性の無いものである。一般に、このような構成品の調製は、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをバッファー、アスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、ブドウ糖、ショ糖又はデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオン並びに他の安定剤及び賦形剤との組み合わせを伴う。中性の緩衝塩水又は同種の血清アルブミンを混合させた塩水が典型的な、適当な希釈液である。好ましくは、製品は希釈液として適当な賦形剤液（例えばショ糖）を用いた凍結乾燥品として定型化されるのが良い。適切な投与量は試験により決定され得る。一般に、ｓｈｕＩＬ−１Ｒ投与量は約１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日で、好ましくは約５００μｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日で生理作用を誘導することが期待される。
【００６６】
ＩＬ−１Ｒ−１とタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は双方ともＩＬ−１Ｒに結合するため、可溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒタンパク質は同一ではないにしても、同様の治療上の活性が期待される。例えば、可溶性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは例えばヒトの免疫反応で抑制する目的に投与され得る。同種移植拒絶及び移植片対被植者間の反応を含め、多様な病気及び症状がアロ抗原に対する免疫反応に起因する。アロ抗原で誘導される免疫反応では、ｓｈｕＩＬ−１ＲはＴ細胞活性化を引き起こすリンパ球増殖及び炎症を抑制する。従ってｓｈｕＩＬ−１Ｒは、例えば同種移植（皮膚、腎臓、心臓移植のようなもの）並びに骨髄移植を受けた患者の移植片−被植者間の反応などの臨床処置において、アロ抗原によって誘導される免疫反応を有効に抑制するのに用いられる。
【００６７】
可溶性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは、自己固有のものとして認識されない抗原に対するＴ細胞の活性化に依存するリウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性硬化症などの自己免疫機能不全の臨床処置にも用いられ得る。
【００６８】
以下の実施例は例証として示され、制限的なものではない。
【００６９】
【実施例１】
ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞内での活性タンパク質の直接的発現によるヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡの単離
Ａ．ｒＩＬ−１βのラジオラベル  組換えヒトＩＬ−１βを、クローンハイムら（Ｋｒｏｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）により記載されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現し同室になるように精製して、調製した。（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１０７８，１９８６）ＩＬ−１βをジ−ヨード（125Ｉ）ボルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−ｈｕｎｔｅｒ）試薬（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，Ｇｌｅｎｏｌｄｅｎ，ＰＡ）でラベルした。１０ｕｌのリン酸（０．０１５ｍｏｌ／Ｌ）緩衝塩溶液（ＰＢＳ：０．１５ｍｏｌ／Ｌ），ｐＨ７．２に懸濁した１０マイクログラム（０．５７ｎｍｏｌ）のタンパク質をホウ酸ナトリウム（０．１ｍｏｌ／Ｌ）−緩衝塩溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ）、ｐＨ８．５，１０ｕＬと混合し、ボルトン−ハンター試薬１ｍＣｉ（０．２３ｎｍｏｌ）と製造業者の指示に従い、８℃で１２時間反応した。次に、２％ゼラチン３０ｕＬと１ｍｏｌ／Ｌグリシン  エチル  エステルを加え、タンパク質を１ｍＬ容量ＢｉｏｇｅｌTMＰ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）にかけて未反応のボルトン−ハンター試薬から分離した。常に５０％から６０％のラベルの結合がみられた。ヨードラベルは１×１０15から５×１０15ｃｐｍ／ｍｍｏｌ−１（０．４から２原子Ｉタンパク質分子あたり）の範囲の比活性を生じ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気永動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、１７．５ｋＤの一種のラベルされたポリペプチドが検出され、その分子量はＩＬ−１の既に報告されている値と一致した。ラベルしたタンパク質は９８％以上ＴＣＡ沈殿可能であり、これによりＩ125はタンパク質に共有結合していることが示唆された。
【００７０】
Ｂ．ＣＢ２３ｃＤＮＡライブラリーの作成とスクリーニング  ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）及びエプシュタイン−バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）の調節配列を含む哺乳類発現ベクター（ｐＤＣ４０６）を使用して、集めておいたｃＤＮＡクローンのサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１（以下に示すようにＣＶ−１細胞系をＥＢＮＡ−１をコードする遺伝子で形質転換したものに由来する）での直接的発現により、ＣＢ２３ライブラリーを作成及びスクリーニングした。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の直接初期からきくエンハンサー／プロモーターによって制御をうけてＥＢＶ核抗原−１を構造的に発現しており、従ってＥＢＶ複製起源を含むｐＤＣ４０６のような発現ベクターの自律複製を可能にする。使用した発現ベクターはｐＤＣ４０６で、ＨＡＶ−ＥＯ由来でドーワーら（Ｄｏｗｅｒｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４２：４３１４，１９８９）に記載されており、それは今度はｐＤＣ２０１由来で、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系中で高レベル発現が可能である。ｐＤＣ４０６はＨＡＶ−ＥＯ（ドーワーら、前出）とはＨＡＶ−ＥＯ中の２型アデノウィルスの３部リーダー配列中のイントロンがないという点が異なる。
【００７１】
ＣＢ２３ｃＤＮＡライブラリーは、大体は、アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９８７に記載してあるようにして、Ｂ細胞リンパ胸腺系ＣＢ２３から抽出した全ＲＮＡより分離してポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを逆転写して作成した（ベンジャミンとドーワー（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ＆  Ｄｏｗｅｒ），Ｂｌｏｏｄ７５：２０１７，１９９０）。ＣＢ２３細胞系はＥＢＶ感染索状血球（ＣＢ）リンパ細胞系であり、ベンジャミンら（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５４７，１９８４記載の方法を用いて派生された。ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡをオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより分離し、大体、グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ２５：２６３、１９８３の記述に従い、二重鎖ｃＤＮＡを作成した。簡単に言うと、ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを、ランダム  ６ヌクレチドをプライマーとして利用して逆転写酵素により、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに変えた。その後ＤＮＡポリメラーゼＩと共同でＲＮＡアーゼＨを使用し、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを二重鎖ｃＤＮＡに変えた。その結果生じた二重鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑端にした。逆の２重のリン酸化していないオリゴヌクレオチドをアニールし、生じた平滑端ｃＤＮＡの末端とＤＮＡリガーゼで平滑端ライゲーションをハイメルら（Ｈａｙｍｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：８６１５，１９８６の記述に従い行った。
【００７２】
【化１】
0003652582.tif 000002
【００７３】
この場合２４マーのオリゴしかｃＤＮＡにライゲーションしないと予測される。ライゲーションしていないオリゴを６８℃でゲル濾過クロマトグラフィーにより除去し、ｃＤＮＡ上に２４ヌクレオチド非自己相補的突出部分を残した。同様の方法を用いて、哺乳類発現ベクターｐＤＣ４０６ＳａｌＩ切断５′端をｃＤＮＡに付加したものと相補的な２４ヌクレオチド突出部分に変えた。アダプター付ベクターとｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ存在下で最適比率でライゲーションした。ライゲーション混合物を透析しＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αにエレクトロポレーションした。約３．９×１０6クローンが生じ、約３０００個ずつの集団プレートした。各集団のサンプルを凍結グリセロール保存用に使用し、プラスミドＤＮＡの集団を得るためにも使用した。集められたＤＮＡをその後、ＤＥＡＥ−デキストランを使用したサルＣＶ１／ＥＢＮＡ−１細胞擬集密的細胞層にトランスフェクションし、ルースマンら（Ｌｕｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：１２９５（１９８３）及びマックカッチャンら（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，４１：３５１（１９８６）に記載されているものに類似した、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）処理を行った。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞は以下のようにして、派生した。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系は構造的に、ＣＨＶの即時初期のエンハンサー／プロモーターにより制御されているＥＢＶ核抗原−１を発現している。アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）に、５μｇのｐＳＶｇｐｔ［マリガンとバーグ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２，１９８１］と２５μｇのｐＤＣ３０３／ＥＢＮＡ−１をリン酸カルシウム共沈技術（アウス−ベルら．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）をコトランスフェクションした。ｐＤＣ３０３／ＥＢＮＡ−１はｐＤＣ３０２［モーズレイら（Ｍｏｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．），Ｃｅｌｌ５９：３３５，１９８９］から２段落で作成された。はじめにアテツウィルス３部リーダー配列に存在するイントロンを、以下の合成オリゴヌクレオチドの一対で、イントロンをまたぐＰｖｕＩＩ  からＳｃａIの断片を入れかえることにより除去しプラスミドｐＤＣ３０３をつくった。
【００７４】
【化２】
0003652582.tif 000003
【００７５】
次に、エプシュタイン−バーウィルス核抗原Ｉ（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ＥＢＶ地図の１０７，９３２から１０９，８９４から本来なるＨｉｎｄIII−ＡｈａＩＩ  制限断片（バウルら（Ｂａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ３１０：２０７，１９８４）をその後ｐＤＣ３０３のマルチプルクローニングサイトに挿入し、プラスミドｐＤＣ３０３／ＥＢＮＡ−１をつくった。標準的方法（オースベルら．，前出；マリガンとバーク前出）に従い、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン、キサンチン及びマイコフェノリン酸の存在下でトランスフェクションした細胞を増殖し、トランスフェクトしたプラスミドを安定に混入した細胞を選択した。得られた薬剤耐性コロニーを分離し、解析のため各々細胞系に拡大した。細胞系を機能するＥＢＮＡ−１の発現によりスクリーニングした。１つの細胞系クローン６８がこのアッセイを用いて、ＥＢＮＡ−１を発現していることがわかりＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１と選定された。
【００７６】
ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞にｃＤＮＡライブラリーをトランスフェクトするため、細胞を完全培地（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｏｏ）改良イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）１０％（ｖ／ｖ）胎盤ウシ血清（ＦＣＳ），５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミンを含む）で維持し、２×１０5細胞／ウェルの密度で６ウェル皿（Ｆａｌｃｏｎ）又は１ウェルチェンバーつきスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）にプレートした。皿及びスライドとも、１ｍｌヒトフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ中）で３０分前処理した後ＰＢＳで１回洗った。培地を接着細胞層から除去し、６６．６μＭクロロキン硫酸を含む１．５ｍｌ完全培地にかえた。０．２ｍｌのＤＮＡ溶液（クロロキン入り完全培地中２μｇＤＮＡ，０．５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン）をその後細胞に加え５時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除き、細胞を１０％ＤＭＳＯを含む完全培地を２．５から２０分加えてショックを与え、次に、新たな完全培地により溶液をとりかえた。細胞は培養中一時的に挿入した配列が発現できるように増殖するようにした。これらの条件では生き残るＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の８０％のトラスフェクション効率を得た。
【００７７】
４８から７２時間後、トランスフェクトしたＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞単層を、前述のように調製したラジオヨード化したＩＬ−１βの結合を、スライドオートラジオグラフィーによりみることでＩＬ−１結合タンパク質の発現についてアッセイした。トランスフェクトされたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞を結合培地（ＲＰＭＩ培地１６４０、２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２と５０ｍｇ／ｍｌ無脂肪ドライミルク（ＮＦＤＭ）を含む）で１回洗い、３×１０-9Ｍ125Ｉ−ＩＬ−１βを含む１ｍｌ結合培地+ＮＦＤＭと４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後チェンバー付スライド中の細胞を結合バッファー＋ＮＦＤＭで３回洗い次にＰＢＳ，ｐＨ７．３で２回洗い、非結合125Ｉ−ＩＬ−１βを除いた。細胞をＰＢＳ，ｐＨ７．３  １０％グルタルアルデヒド中室温で３０分インキュベートして固定し、ＰＢＳで２回洗い、風乾した。スライドをコダックＧＴＮＢ−２写真用乳剤（水で６倍希釈）にひたし、遮光箱中で４８時間から７日暗所で露光した。スライドをその後、コダックＤ１９現像液（４０ｇ／５００ｍｌ水で約５分現像し、水でリンスし、ＡｇｆａＧ４３３Ｃ定着液で固定した。スライドを各々顕微鏡で２５ー４０×倍率で観察し、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現している陽性細胞を明るいバックグラウンドの中のオートラジオグラフィー銀粒子の存在により固定した。
【００７８】
６ウェル皿中の細胞を１度結合バッファー＋ＮＦＤＭ中で洗い次にＰＢＳｐＨ７．３で３回洗い非結合125Ｉ−ＩＬ−１βを除いた。結合した細胞をその後トリプシン分解してプレートから除き、結合した125Ｉ−ＩＬ−１βをベータ計数計により計数した。
【００７９】
スライドオートラジオグラフィー法を使用したところ、約３０００ｃＤＮＡの集団ずつ２５０，０００ｃＤＮＡスクリーニングして初めてトランスフェクタント集団のアッセイが明らかにＩＬ−１β結合陽性の多くの細胞を示した。この集団をその後５００集団ずつに分け、再びスライドオートラジオグラフィによりスクリーニングしたところ、陽性集団１つが同定された。この集団をさらに７５ずつの集団に分け、６ウェルプレートにプレートし、結合した125Ｉ−ＩＬ−１βの定量により解析するプレート結合アッセイによりスクリーニングした。細胞をプレートから削りとりどの７５の集団が陽性か決めるため計数した。この７５の集団の個々のコロニーをスクリーニングして、１つのクローン（クローン７５）が、ＩＬ−１β結合アッセイで検出可能なタンパク質の合成を行っていることを同定した。このクローンを単離し、その挿入部分をシークエンスしてヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡクローン７５の配列を決定した。ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡクローン７５をもつｐＤＣ４０６クローニングベクターはｐＨｕＩＬ−１Ｒ−ＩＩ  ７５と名付けられアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ，ＵＳＡ）に１９９０年６月５日寄託番号ＣＲＬ１０４７８として寄託された。クローン７５の核酸（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１）及び予想アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２）及び関連情報を発表した配列表は本明細書の後半部に示している。
【００８０】
【実施例２】
ヒト溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡの作成と発現
ベクターｐＤＣ４０６中の全長タイプＩＬ−１ＲｃＤＮＡクローン７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を鋳型として使い、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、溶性ヒトタイプＩＩ  ＩＲ−１ＲをコードするｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１３〜３３３の配列をもつ）を作成した。次の５′オリゴヌクレチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及び３′オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を最初に作成した。
【００８１】
【化３】
0003652582.tif 000004
【００８２】
５′プライマーはヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローン７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の非翻訳領域の３１−５１ヌクレオチドに５′にＳａｌI制限酵素部位を付したものに相当しているので、このヌクレオチド配列は、ヒトクローン７５ヌクレオチド３１−５１に相補的な（−）鎖にアニールすることができる。３′プライマーはヌクレオチド１１９１−１１７２（ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローン７５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の３アミノ酸をコードするアンチ−センスヌクレオチドからなる）に相補的で、ＮｏｔI制限酵素部位を５′に付加し終止コドンを持つ。
【００８３】
次のＰＣＲ試薬を１．５ｍｌエッペンドルフ微量遠心チューブに加えた：１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，２５℃で１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン）（パーキン−エルマーシータス；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＮ）１０μｌ，各ｄＮＴＰを含む２ｍＭ溶液（２ｍＭ  ｄＡＴＰ，２ｍＭｄｃＴＰ，２ｍＭｄＧＴＰ及び２ｍＭｄＴＴＰ）１０μｌ，Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット（５００ユニット１ｍｌ溶液０．５μｌ）（パーキン−エルマーシータス）、鋳型ＤＮＡ５０ｎｇ及び各上記オリゴヌクレオチドプライマー２０μＭ溶液５μｌに７４．５μｌの水を加え最終量１００μｌとし、そして最終混合物に１００μｌのパラフィンオイルを上からのせた。最初９４℃９０秒で鋳型を変性し、５５°、７５秒で再アニールし、７２℃１５０秒でｃＤＮＡを伸長させて、ＤＮＡ温度循環器（エリコンプ（Ｅｒｉｃｏｍｐ）サン  ディエゴ  ＣＡ）を使用し、ＰＣＲを行った。ステッププログラム（９４°、２５秒変性、５５°、４５秒アニーリング、７２°１５０秒伸長）を使用した増幅をさらに２０サイクルＰＣＲを行い、次に７２°、５分間伸長した。
【００８４】
試料を、フェノール−クロロホルム抽出及びＧ−５０（ベーリンガーマンハイム）でのスパンカラムクロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きＤＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡ１０μｌ画分を１％ＳｅａＫｅｍTMアガロース（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡ断片サイズが予測された産物と同一であることを確認した。
【００８５】
そこで、２０μｌのＰＣＲ−増幅ｃＤＮＡ産物を標準的方法を用いてＳａｌI及びＮｏｔI制限酵素で消化した。ＳａｌI／ＮｏｔI制限酵素断片をその後１．２％  ＳｅａｐｌａｑｕｅTM低温溶解（ＬＧＴ）アガロース上で分離し、断片をあらわしているバンドを単離した。断片を標準的なゲル内ライゲーション法によりｐＤＣ４０６にライゲーションし、ベクターをＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトして実施例１に前述したように発現させた。
【００８６】
【実施例３】
マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡの単離
マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡｓをマウス前駆Ｂ細胞系統７ＯＺ／３（ＡＴＣＣＴＩＢ１５８）より作成されたＣＤＮＡライブラリーから、ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒプローブを用いた種間ハイブリダイゼーションにより単離した。ｃＤＮＡライブラリーは製造業者の指示に従ってλｇｔ１０アームを使用して、試験管内パッケージ（登録商標ギガパック、ストラタジーン、サンディエゴ）を行ってλファージベクタ中に作成した。２本鎖ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲプローブはヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローン７５の約１．３５ｋｂ  ＳａｌI制限酵素フラグメントを切りだして、ランダムプライマー（ベーリンガーマンハイム）を使用してｃＤＮＡを32Ｐラベルして作成した。マウスｃＤＮＡライブラリーは１回増幅し、全部で５×１０5プラークをヒトプローブで３５％ホルムアミド（５×ＳＳＣ，４２℃）中でスクリーニングした。いくつかのマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡクローン（クローンλ２を含む）を単離したが、どのクローンも全長のものではないようであった。部分的クローンから得た又クレオチド配列情報を用いて、以下のように全長のマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲｃＤＮＡをクローン化した。
【００８７】
マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをコードする全長ｃＤＮＡクローンを、フローマンら（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８に記載されているｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法によりマウス前駆Ｂ細胞系統７０Ｚ／３を用いて単離した。簡単にいうとＲＡＣＥ法はＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡ転写物の既知点（上記で得られた核酸配列より決定）から３端の間の領域のｃＤＮＡのコピーを増幅するものである。１７ｄＴ塩基対を含む配列と、３つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含むアダプター配列（便利な制限酵素部位をｃＤＮＡの３端につける）をもつアダプタープライマーを、ｍＲＮＡ集団の逆転写及び（−）鎖ｃＤＮＡの生成に使用する。上記のマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローン２ｃＤＮＡの５′非翻訳領域の配列の既知のストレッチに相補的で３′方向を向いているプライマーを（−）鎖ｃＤＮＡとアニールし、伸長して相補（＋）鎖ｃＤＮＡを生成する。結果生じた二本鎖ｃＤＮＡを本来のままの５′端と合成３′端ポリ（Ａ）尾部にアニールするプライマーを使用してＰＣＲにより増幅する。ＲＡＣＥ法の詳細は以下のとおりである。
【００８８】
下記のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー（それぞれｄ（Ｔ）17アダプター・プライマー、５′増幅プライマーと３′増幅プライマーである）を最初に作成した。
【００８９】
【化４】
0003652582.tif 000005
【００９０】
簡単に言うと、ｄ（Ｔ）17アダプタープライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）は集団のｍＲＮＡ転写物のポリ（Ａ）+領域にアニールする核酸配列を含み、ｍＲＮＡから（−）鎖ｃＤＮＡ逆転写物を生成するために使用される。またＰＣＲにより増幅されたＤＮＡに導入されるＰｓｔI，ＮａｔI及びＢａｍＨIに対するエンドヌクレアーゼ制限酵素部位を含む。５′増幅プライマー（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１０）はマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローンλ２の５′非翻訳領域のヌクレオチド１５ー３４にＳａｌI制限酵素部位を５′付加したものに相当し、この塩基配列はｄ（Ｔ）17アダプタープライマーによる逆転写により生じた（−）鎖ｃＤＮＡにアニールし、伸長して（＋）鎖ｃＤＮＡを生成する。３’プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は上記エンドヌクレアーゼ制限部位をもつ（＋）鎖ＤＮＡとアニールし、伸長してマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをコードする二本鎖全長ｃＤＮＡを生成し、それをそこで通常のＰＣＲ反応で増幅することが可能である。ＰＣＲ法の詳細は以下のとおりである。
【００９１】
マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １ａｂ．，ＮＹ，１９８２）に記載されている標準的方法を用いて７０Ｚ／３細胞から抽出した全ＲＮＡからオリゴｄＴセルロース  クロマトグラフィーによりポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを単離し、以下のように逆転写した。１６．５μｌ水中の約１μｇのポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを６８℃で３分間熱してのち氷上で冷まし、２μｌの１０×ＲＴＣバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２２℃で、ｐＨ８．７  ６０ｍＭ  ＭｇＣｌ2  ４００ｍＭ  ＫＣｌ  １０ｍＭＤＴＴ，各ｄＮＴＰ１０ｍＭ）を１０ユニットのＲＮａｓｉｎ（プロメガバイオテック；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）０．５μｇのｄ（Ｔ）17−アダプタ  プライマー及び、１０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（ライフ  サイエンス；Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を全量２０μｌに加え、２時間で４２℃インキュベートしてｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡ集団を合成した。反応混合物はＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡ）で希釈し、４℃で一晩置いた。
【００９２】
約１又は５μｌのｃＤＮＡ集団を５μｌのマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローンλ２のヌクレオチド１５−３４配列に相当する配列を含む５′増幅プライマーの２０μＭ溶液、３’増幅プライマー２０μＭ溶液の５μｌ；１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８・４，２０℃），１４ｍＭ  ＭｇＣｌ2と１ｍｇ／ｍｌゼラチン）、４μｌの５ｍＭ各ｄＮＴＰ（５ｍＭｄＡＴＰ，５ｍＭｄＣＴＰ，５ｍＭｄＧＴＰ  ５ｍＭｄＴＴＰを含む）、２．５ユニット（標準の５０００ユニット／ｍｌ溶液０．５μｌ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンーエルマーシータス  インストルメント（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）と１００μｌの容量になるように希釈して混合した。最終混合物は１００μｌパラフィンオイルを上からのせた。最初９４℃９０秒で鋳型を変性し、６４°、７５秒で再アニールし、７２°、１５０秒でｃＤＮＡを伸長させてＤＮＡ温度循環器（パーキンーエルマー／シータス）を使用しＰＣＲを行った。ステッププログラム（９４°、２５秒変性、５５°、４５秒アニーリング、７２°、１５０秒伸長）を使用した増幅をさらに２５サイクル分、ＰＣＲを行い、次に７２°で７分最終伸長をした。
【００９３】
試料をフェノールクロロホルム抽出及びＧ−５０（ベーリンガーマンハイム）でのスパンカラムクロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きＤＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡ１０μｌ画分を１％ＳｅａＫｅｍTMアガロース（ＦＭＣバイオプロダクト  ロックランド、ＭＥ）上で電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡ断片サイズが予測された産物と同一であることを確認した。ゲルをその後ブロットし、上記のマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒクローンλ２の５６１０ｂｐＥｃｏＲI断片をプローブにしてみて、マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡをそのバンドが含むことを確認した。
【００９４】
ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ産物をその後エッペンドルフ微量遠心で最高速度で２０分遠心して濃縮し、その後１／１０容酢酸ナトリウム（３Ｍ）と２．５容量エタノール中でエタノール沈澱を行った。３０μｌの濃縮物をＳａｌIとＮｏｔI制限酵素で標準的方法を使用して消化した。ＳａｌI／ＮｏｔI制限酵素断片をその後、１．２％ＬＧＴアガロースゲルで分離し、断片にあたるバンドを単離した。制限酵素断片はその後アガロースからＧｅｎｅ  ＣｌｅａｎTM（Ｂｉｏ−１０１，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から精製した。得られた精製制限酵素断片を、ｐＤＣ４０６ベクターにライゲーションしそれをＣＶ−１ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトして、実施例１中に前述されているように発現させた。拡散（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及び予想アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３）と関連情報を発表した配列表は本明細書の後半部分に示してある。
【００９５】
【実施例４】
マウス溶性タイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡの作成と発現
７０Ｚ／３ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅及びマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをコードする全長クローンに対して記述されている以下の方法により、溶性マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．１２のアミノ酸１３ー３４５の配列をもつ）を作成した。以下のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー（各々ｄ（Ｔ）17アダプタープライマー、５′増幅プライマー及び３′増幅プライマー）を作成した。
【００９６】
【化５】
0003652582.tif 000006
【００９７】
ｄ（Ｔ）17アダプタープライマーと５′増幅プライマーは実施例５に記述されていて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ；１０と同一である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の３’端はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド１１４５−１１６６と相補的であり、ＮｏｔI制限酵素部位の５’付加と終止コドンをもつ。
【００９８】
実施例３に記述したようにｄ（Ｔ）17アダプタープライマーを用いてポリ（Ａ）+ｍＲＮＡからｃＤＮＡ集団を合成した。１．５ｍｌのエッペンドルフ微量遠心チューブに、約１μｌのｃＤＮＡ集団、５μｌの５′増幅プライマー２０μＭ溶液、５μｌの３′増幅プライマー２０μＭ溶液、１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭｋＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４  ２０℃で）、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ2と１ｍｇ／ｍｌゼラチン）１０μｌ  ５ｍＭ各ｄＮＴＰ（５ｍＭｄＡＴＰ，５ｍＭｄＣＴＰ，５ｍＭｄＧＴＰ及び５ｍＭｄＴＴＰを含む）４μｌ２．５ユニット（標準５００ユニット／ｍｌ  溶液を０．５μｌ）のＴａｑＤＮＡ  ポリメラーゼ（パーキンーエルマーシータス  インストルメント）を混ぜて水７５．４μｌで希釈して容量１００μｌにした。最終混合物に１００μｌパラフィンオイルを上からのせた。最初９４℃９０秒鋳型を変性し、５５°、７５秒で再アニールし、７２°、１５０秒でｃＤＮＡを伸長させてＤＮＡ温度循環器（エリコップ）を使用しＰＣＲを行った。ステッププログラム（９４°、２５秒変性、５５°、４５秒アニーリング、７２°、１５０秒伸長）を使用した増幅をさらに２５サイクル分ＰＣＲを行い、次に７２°で７分最終伸長をした。
【００９９】
試料をフェノールークロロホルム抽出及びＧ−５０（べーリンガーマンハイム）でのスパンカラムクロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きＤＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡ１０μｌ画分を１％  ＳｅａＫｅｍTMアガロース（ＦＭＣバイオプロダクト  ロックランド、ＭＥ）上で電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡ断片サイズが予測された産物と同一であることを確認した。
【０１００】
ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ産物をその後エッペンドルフ微量遠心で、最高速度で２０分遠心して濃縮し、その後１／１０容酢酸ナトリウム（３Ｍ）と２．５容量エタノール中でエタノール沈澱を行った。５０μｌの濃縮物をＳａｌIとＮｏｔI制限酵素で標準的方法を使用して消化した。ＳａｌI／ＮｏｔI制限酵素断片をその後、１．２％ＬＧＴアガロースゲルで分離し、断片にあたるバンドを単離した。制限酵素断片はその後単離したバンドから以下の凍結融解法を用いて精製した。ゲルからのバンドを２つの１７５μｌの断片に分けて１．５ｍｌエッペンドルフ微量遠心チューブにいれた。５００μｌの分離バンド（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各チューブに加え６８℃でゲルが溶けるまでチューブを熱した。そしてドライアイスで１０分ゲルを凍結し、室温で融解し、４℃で３０分遠心した。次に上清をとって新しいチューブに移し、２ｍＬエタノールに懸濁し、４℃でさらに３０分遠心してＤＮＡ沈澱を生じさせた。ＤＮＡ沈澱を７０％エタノールで洗い５分遠心チューブからエタノールを除き、２０μｌＴＥバッファーに再び懸濁した。
【０１０１】
得られた精製済制限酵素断片をその後ｐＤＣ４０６ベクターにライゲーションした。ライゲーション試料をＤＨ５αに形質転換し、コロニーを正しいプラスミドであるかチェックするために解析した。ベクターはＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、実施例１に前述したように発現された。
【０１０２】
【実施例５】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ結合研究
上の実施例１で述べたように発現、及び精製された組換えヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの結合阻害定数は、様々な濃度の競合物質（ＩＲ−１β又はＩＬ−１α）を一定量のラジオラベルしたＩＬ−１β又はＩＬ−１αとタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現している細胞とインキュベートする阻害結合アッセイによって決定された。競合物質は受容体に結合し、ラジオラベルしたリガンドが受容体に結合するのを阻害する。結合アッセイは、大体ドーハーら（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：７５１，１９８４とパークら（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１７７，１９８６に記載されているようにフタル酸油分離法により行われた。簡単にいうと、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞を６ーウェル皿（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）ケンブリッジ，ＭＡ）で４℃で２時間125Ｉ−ＩＬー１βと１ｍｌ・結合培地（ローズウェルパーク  メモリアル  インスティチュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地で、２％ＢＳＡ，２０ｍＭＨｅｐｅｓ  バッファー０．２％アジ化ナトリウムｐＨ７．２を含む）中でインキュベートした。アジ化ナトリウムは３７℃で125Ｉ−ＩＬ−１が細胞により取り込まれて分解されることを阻害するために含まれる。プレートを回転振とう機で３７℃で１時間インキュベートした。そしてインキュベーションした混合物の複数の画分をジブチルフタル酸１．５，ビス（Ｓ−エチルヘキサル）フタル酸１の割合からなるフタル酸油性混合物を含むポリエチレン遠心チューブに移した。１００×過剰モルの未ラベルＩＬ−１βを含むコントロールチューブも、非特異的結合を決めるために含めた。結合125Ｉ−ＩＬ−１のある細胞をエッペンドルフ微量遠心で１５０００×ｇで５分遠心し結合していない125Ｉ−ＩＬ−１から分離した。細胞に結合した放射活性をガンマ計数計で決定した。このアッセイ（タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒへの125Ｉ−ＩＬ−１βの結合をラベルしないヒトＩＬ−１βを競合物として使用して阻害する）は、全長ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲはＫI1は約１９±８×１０9、ＫI2は約０．２±０．００２×１０9という２相的なＩＬ−１βへの結合を示すことを示唆した。125Ｉ−ＩＬ−１αのタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒへの結合を阻害するのにラベルしていないヒトＩＬ−１βを使用すると、全長ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲはＫI1は約２．０±１×１０9およびＫ12は約０．０１３±０．００３×１０9という２相的なＩＬ−１βへの結合を示した。
【０１０３】
上の実施例２で述べたように発現及び精製された溶解性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの結合阻害定数は、様々な濃度のＩＬ−１β競合物を一定量のラジオラベルしたＩ−ＩＬ−１βとタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現しているＣＢ２３細胞（エプシュタイン  バーウィルス  トランスフォームド・コード・血球Ｂリンパ細胞系統）とインキュベートする阻害結合アッセイによって決定された。結合アッセイもまたドーワーら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３２：７５１，１９８４及びパークらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１７７に記載されているようにフタル酸油性分離法により行われた。簡単にいうと、ＣＯＳ−７細胞を上記の溶解性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡを含むｐＤＣ４０６発現ベクターでトランスフェクトした。ＣＯＳ細胞からの上清をトランスフェクション後３日培養し、続けて結合培地  （ローズウェル  パーク  メモリアルインスティチュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地で２％ＢＳＡ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  バッファーと０．２％アジ化ナトリウム  ｐＨ７．２を含む）で、６ウェル皿内で５０μｌ／ウェルの容量になるように希釈した。上清を５０μｌの９×１０-10Ｍ125Ｉ−ＩＬ−１βと２．５×１０6ＣＢ２３細胞と共に、８℃で２時間振とうしながらインキュベートした。インキュベーション混合物の２つずつとった６０μｌ画分を、ジブチルフタル酸１．５，ビス（Ｓ−エチルヘキサル）フタル酸１の割合からなるフタル酸油性混合物を含むポリエチレン遠心チューブに移した。３×１０-6Ｍの未ラベルＩＬ−１βを含む陰性コントロールチューブも非特異的結合を決めるために含み（１００％阻害）ラジオラベルしたＩＬ−１βのみと共に５０ｍｌ結合培地を含む陽性コントロールチューブは、最大限の結合を決めるために含めた。結合125Ｉ−ＩＬ−１のある細胞をエッペンドルフ微量遠心で１５，０００Ｘｇで５分遠心し結合していない125Ｉ−ＩＬ−１から分離した。結合していない125Ｉ−ＩＬ−１βを含む上清を捨て、細胞を注意深く、氷冷した結合培地でリンスした。細胞をその後トリプシンーＥＤＴＡ１ｍｌ中で３７℃１５分インキュベートし、細胞を培養した。細胞の放射活性はガンマ計数計で決定した。このアッセイ（125Ｉ−ＩＬー１βの結合を溶解性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを使って阻害する）は、溶解性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは約３．５×１０9Ｍ-1のＫIをもつことを示した。同様の方法を用いて溶解性ヒトタイプＩＩＩＬ−１ＲによるＩＬ−１αの結合の阻害により、溶解性ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒは１．４×１０8Ｍ-1のＫIをもつことが示された。
【０１０４】
マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１ＲはＫI1０．８×１０9およびＫI2０．０１×１０9未満の２相的ＩＬ−１βへの結合を示した。
【０１０５】
【実施例６】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ  アフィニィティークロスリンキング研究
アフィニィティクロスリンキング研究を、パークら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓａｉ．ＵＳＡ  ８４：１６６９  １９８７に記載してあるように行った。このアッセインに用いられている組換えヒトＩＬ−１α及びＩＬ−１βは既に記載されているように発現精製し、ラベルを行った。（ドーワーら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：５０１，１９８５；ドーワーら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：２６６，１９８６），組換えヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を、アイゼンバーグら（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：３４１，１９９０）に公表されているｃＤＮＡ配列を用いてクローン化し、ＣＯＳ細胞に一時的にトランス・フェクションをして発現させ、ドーワーら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：４３１４，１９８９に記載されているように、親和ゲルに結合した溶解性ヒトタイプI  ＩＬ−１Ｒのカラムでのアフィニィティークロマトグラフィーにより精製し、低ｐＨで溶出した。
【０１０６】
簡単にいうと、組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを発現しているＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞（４×１０7／ｍｌ）を125Ｉ−ＩＬ−１α又は125Ｉ−ＩＬ−１β（１ｎＭ）と４℃で、特異性コントロールとして１μＭの過剰のラベルしていないＩＬ−１存在及び非存在下で、２時間インキュベートした。細胞をその後洗って、ビス（スルフォサクシニミジル）スベラートを最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。３０分２５℃に置いた後、細胞を洗い、２ｍＭロイペプチン、２ｍＭ０−フェナントロリン、及び２ｍＭＥＧＴＡをタンパク分解を防ぐために含む１００μｌのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）／１％トライトンに再び懸濁した。等量（ＣＰＭ）の125Ｉ−ＩＬ−１と等容の特異性コントロールを含む抽出上清画分を標準的技術を用いて１０％ゲルでＳＤＳ／ＰＡＧＥにより解析した。
【０１０７】
第４図は、ラジオラベルしたＩＬ−１α及びＩＬ−１βを用いて、上記されているように行われた、天然の対照物に対する、天然及び組換え型マウス及びヒトタイプＩＩＬ−１受容体と、組換えマウス及びヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体タンパク質の大きさ比較のためのアフィニィティ  クロスリンキング研究の結果を示している。通常、組換えタンパク質は恐らくＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞で過剰発現したときの糖鎖型の違いの結果として少し速く、少し広いバンドとして移動するが一時的に発現した組換え受容体の大きさは天然の受容体に類似している。この結果から、タイプＩＩ  ＩＬ−１受容体はタイプIＩＬ−１受容体より小さいことも示された。特定の組合せ（ＩＬー１βと天然ヒトタイプI受容体）は特異的クロスリンキング産物を生じることがなかった。約等量のラベルを各々の実験レーンにのせているので、ゲルの底部の未結合のリガンドバンドの強度によって示されているように、この組合せは比較的弱くクロスリンクしていると強く予想される。125Ｉ−ＩＬ−１αとクロスリンクした天然型ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体発現細胞を示しているレーンは、天然型と組換えタイプI受容体との複合体のサイズ範囲（Ｍｒ＝１００，０００）に構成成分があらわれている。このような複合体は、組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体を含むレーンでは検出されないが、恐らく、ＣＢ２３細胞は微量のタイプIＩＬ−１受容体ｍＲＮＡを含んでいるので、タイプIＩＬ−１受容体がＣＢ２３細胞で低いレベルに発現している結果であると思われる。
【０１０８】
【実施例７】
タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒのモノクローナル抗体の調製
精製した組換えタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ、例えばヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒあるいは、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを高レベル発現するトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の調製を行い、通例の技術、例えば米国特許４，４１１，９９３号明細書に開示されているような技術を用いて、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒに対するモノクローナル抗体を作成する。この抗体は、ＩＬ−１がタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒに結合するのを妨害する点、例えばＩＬ−１の毒性や他の望ましくない効果を改良するという点、ＩＬー１又は溶解性タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒの診断及び研究用アッセイの成分として、有用であると予測される。
【０１０９】
マウスを免疫するため、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ免疫源を完全フロイント（Ｆｒｅ，ｕｎｄ’ｓ）アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）に懸濁し、１０〜１００μｇの幅の量を皮下に腹膜間にＢａｌｂ／ｃマウスに注射した。１０〜１２日後、免疫された動物に不完全フロイントアドジュバントに懸濁した追加免疫源であと押ししその後一週から２週の免疫化スケジュールで周期的に、あと押しした。血清試料を周期的に、後方眼窩の出血あるいは尾端切開によって採取し、ドットブロットアッセイ（抗体サンドイッチ）又はＥＬＩＳＡ（酵素リンクイムノソルベントアッセイ）又は受容体結合阻害により検査する。他のアッセイ法も適用できる。適当な抗体価の検出に続き、陽性動物に塩水中の抗原の静脈注射をする。３〜４日後、動物を犠牲にし、ヒ臓細胞を培養し、マウスミエローマ細胞系統ＮＳ１又はＡｇ８．６５３と融合する。この方法により得たハイブリドーマ細胞系統をＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）の複数マイクロタイタープレートにプレートし、非融合細胞、ミエローマ  ハイブリッド、ヒ臓細胞ハイブリッドの増殖を阻止する。
【０１１０】
このように作られたハイブリドーマクローンを、タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒへの反応性を、例えばエンバルら（Ｅｎｇｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１（１９７１）及び米国特許４，７０３，００４号明細書に開示されている技術の適用によりＥＬＩＳＡでスクリーンすることが可能である。陽性クローンをそして同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射して高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗タイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒモノクローナル抗体を含む腹水を作成したり、フラスコや、回転ボトルで増殖させる。生じたモノクローナル抗体は、硫安沈澱後ゲルろ過クロマトグラフィー、及び／又は、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ又はストレプトコッカス属のプロテインＧへの抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１１１】
【配列表の簡単な説明】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒのヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。この配列にコードされている成熟ペプチドはアミノ酸１ー３８５と定められた。予想されるシグナルペプチドはアミノ酸−１３から−１と定められている。予想される膜貫通領域はアミノ酸３３１から３３５と示されている。
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は全長ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒをクローン化するのに用いた様々なオリゴヌクレオチドである。
【０１１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は溶解性ヒトタイプＩＩＩＬ−１Ｒをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により作成するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーである。
【０１１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は全長の及び溶解性マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒｓをクローン化するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマーである。
【０１１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は、全長マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒのヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。この配列にコードされている成熟ペプチドは、アミノ酸１ー３９７と定められた。予想されるシグナルペプチドはアミノ酸−１３から−１と定められた。予想される膜貫通領域はアミノ酸３４３ー３６８と示されている。
【０１１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４は溶解性マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒを作成するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマーである。
【０１１７】
【配列表】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の情報
（i）配列の性質
（Ａ）長さ：１３５７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：２本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）仮定：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（vi）根源的起源
（Ａ）生物：ホモ  サピエンス
（Ｇ）細胞タイプ：ヒトＢ細胞リンパ胸線
（Ｈ）細胞系統：ＣＢ２３
（vii）直接的起源
（Ａ）ライブラリー：ＣＢ２３  ｃＤＮＡ
（Ｂ）クローン：ｐＨｕＩＬ−１ＲＩＩ７５
（ix）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１５４．．１３５０
（Ｄ）他の情報：
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ｍａｔ  ペプチド
（Ｂ）位置：１９３．．１３４７
（Ｄ）他の情報：
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ｓｉｇ  ペプチド
（Ｂ）位置：１５４．．１９２
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：
配列
【０１１８】
【化６】
0003652582.tif 000007
【０１１９】
【化７】
0003652582.tif 000008
【０１２０】
【化８】
0003652582.tif 000009
【０１２１】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：３９８アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：
配列
【０１２２】
【化９】
0003652582.tif 000010
【０１２３】
【化１０】
0003652582.tif 000011
【０１２４】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：２４塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３：
配列
ＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡ  ＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣ  ＴＧＣＴ      ２４
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｙ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４：
配列
ＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣ  ＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡ                ２０
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：
配列
ＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴ  ＣＧＣＧＧＴＴＧＡＧ  ＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴ  ＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴ  ＴＣＣＡＧＴ      ４６
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：４６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｙ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６：
配列
ＧＡＣＡＡＣＣＣＧＡ  ＧＣＧＣＣＡＡＣＴＣ  ＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡ  ＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡ  ＡＧＧＴＣＡ      ４６
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）仮定：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７：
配列
ＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴ  ＡＧＴＧＡＣＧＣＴＣ  ＡＴＡＣＡＡＡＴＣ２９
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８：
配列
ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧ  ＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡ  ＣＴＧ      ３３
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９：
配列
ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧ  ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴ      ３７
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０：
配列
ＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧ  ＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ  ＣＡＡＧＧＴＡＣ      ２８
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１：
配列
ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧ  ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ      ２０
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：１３６６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：２本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（vi）根源的起源
（Ａ）生物：マウス
（Ｈ）細胞系統：７０Ｚ／３
（vii）直接的起源
（Ａ）ライブラリー：７０Ｚ／３
（Ｂ）クローン：１２
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：８５．．１３１７
（Ｄ）他の情報：
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ｍａｔ  ペプチド
（Ｂ）位置：１２４．．１３１４
（Ｄ）他の情報：
（ix）特徴：
（Ａ）名前／キー：ｓｉｇ  ペプチド
（Ｂ）位置：８５．．１２３
（Ｄ）他の情報：
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２：
配列
【０１２５】
【化１１】
0003652582.tif 000012
【０１２６】
【化１２】
0003652582.tif 000013
【０１２７】
【化１３】
0003652582.tif 000014
【０１２８】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：４１０アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：タンパク質
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：
配列
【０１２９】
【化１４】
0003652582.tif 000015
【０１３０】
【化１５】
0003652582.tif 000016
【０１３１】
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の情報
（i）配列の性質：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖：１本
（Ｄ）形態：線状
（ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム）
（iii）ハイポセティカル：Ｎ
（iv）アンチーセンス：Ｎ
（xi）配列の記載：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４：
配列
ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＧ  ＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡ  ＣＴＧＴＧＧ      ３６
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、発現プラスミドｐＤＣ４０６の概要図である。Ｓａｌ部位に挿入されたｃＤＮＡ分子は、ＨＩＶ及びアデノウイルスから得られた制御因子を用いて転写、翻訳される。ｐＤＣ４０６はＳＶ４０，エプシュタインーバー（Ｅｐｓｔｅｉｍ−Ｂａｒｒ）ウイルス及びｐＢＲ３２２由来の複製開始点を含む。
【図２】図２は、ヒト及びマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体と、配列決定に用いた様々なヒト及びマウスのクローンの概要図である。細い線は、非翻訳領域を示し、コード領域は四角で描かれている。シグナルペプチドをコードする部分は塗りつぶしてある。膜貫通部分は交差斜線で網かけしてある。そして、細胞内タンパク質は点描している。Ｎ結合糖鎖付加サイトの可能性がある部分は、逆向き三角形で示している。イムノグロブリン様のジスルフィド結合は、２つのイオウ分子をつなぐ点線で示している（Ｓ．．．．．Ｓ）。
【図３】図３は、ヒト及びマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体のアミノ酸配列（ｃＤＮＡクローンから得られたもの）を、ヒト及びマウスタイプIＩＬ−１受容体のアミノ酸配列（シムス（Ｓｉｍｓ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９４６，１９８９；シムスら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５８５、１９８８）およびＳＴ２細胞遺伝子のアミノ酸配列（トミナガ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２５８；３０１，１９８９）及びヴァシニアウイルスのＢ１５Ｒオープンリーディングフレーム（スミスとチャン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｎ），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：５１１，１９９１）と比較した図である。番号は開始メチオニンからつけている。各配列中のシグナルペプチド切断予想位置は、フォンハイネ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３，１９８６）で述べられた方法に従って決定されており、シグナルペプチドと予想される部分と、タンパク質の本体の間の空白で示している。タイプＩＩ  ＩＬ−１受容体の予想される膜貫通領域と細胞内領域は、最下段に示しており、間に空白を入れて分離している。すべての４つのＩＬ−１受容体配列に保存されている残基は黒地に白ヌキで示している。互いのタイプＩＩ受容体で保存されている残基は影がつけてあり、互いのタイプIＩＬ−１受容体で保存されている残基は四角でかこんでいる。イムノグロブリン構造に特徴的なジスルフィド結合を形成すシステイン残基には、黒丸で印をつけており、タイプIＩＬ−１受容体における２つの余分のシステインの組と、他の配列のいくつかのシステインは星印で示している。ドメイン１、２及び３の適当な境界は各行の上に示してある。タイプＩＩ  ＩＬ−１受容体において予想されるシグナルペプチド切断はＡｌａ１３の後ろであり、通常みられない短いシグナルペプチドを生じ、切断後のヒトあるいはマウスタイプIＩＬ−１受容体のＮ端の相当する位置よりも、１２（ヒト）又は２３（マウス）アミノ酸だけ長いＮ端が生じる。マウスタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体の、他の、より好ましくないが起こりうる切断部位は、Ｔｈｒ１５又はＰｒｏ１７の後ろである。この配列のならびは手で行っており、配列の客観的に最適のならびは示していない。ヒト及びマウスタイプＩＩ  ＩＬ−１受容体ｃＤＮＡの全長と可溶性のヌクレオチドとアミノ酸配列もまた、この中で、配列表に示している。
【図４】図４は、クロスリンクしたＩＬ−１受容体のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフである。ＩＬ−１受容体を発現している細胞は、同種のラベルされていないＩＬ−１競合物の非存在下、又は存在下で125Ｉ−ＩＬ−１とクロスリンクされ、抽出、電気泳動され、実施例６で述べたようにオートラジオグラフが行われた。組換え受容体はＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞で一時的に発現された。天然の受容体とのクロスリンキングのために用いた細胞系は、ＫＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１７）（ヒトタイプIＩＬ−１Ｒ用）、ＣＢ２３（ヒトタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ用）、ＥＬ４（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ３９）（ネズミタイプIＩＬ−１Ｒ用）及び７０Ｚ／３（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１５８）（ネズミタイプＩＩ  ＩＬ−１Ｒ用）である。
【図１】
0003652582.tif 000017
【図２】
0003652582.tif 000018
【図３】
0003652582.tif 000019
【図４】
0003652582.tif 000020