(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式Ｉの化合物又はその生理学的に許容しうる塩：
【化１】
0003684432.tif 000010
ここで、ＲはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＡｂｕおよびＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸の基、またはＰｈｅ−Ａｌａ−なる基である。
【請求項２】
Ｒが天然アミノ酸の基である、請求項１記載の式Ｉの化合物又はその生理学的に許容しうる塩。
【請求項３】
上記アミノ酸がＡｌａ、Ｉｌｅ、ＬｙｓまたはＰｈｅである、請求項２記載の式Ｉの化合物又はその生理学的に許容しうる塩。
【請求項４】
上記アミノ酸がＡｌａである、請求項３記載の式Ｉの化合物又はその生理学的に許容しうる塩。
【請求項５】
ＲがＰｈｅ−Ａｌａ−である、請求項１記載の式Ｉの化合物又はその生理学的に許容しうる塩。
【請求項６】
上記アミノ酸のアミンの窒素が除去可能な保護基を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の式Ｉの化合物又はその生理学的に許容しうる塩。
【請求項７】
Actinoplanes liguriae, DSM 11797 または Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796 を発酵させることにより得られる、請求項１記載の式ＩにおいてＲがＡｌａである化合物又はその生理学的に許容しうる塩。
【請求項８】
アクタガルジンをＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＡｂｕおよびＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸またはジペプチドＰｈｅ−Ａｌａと反応させることからなる、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の製造法。
【請求項９】
アクタガルジンをＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＡｂｕおよびＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸またはジペプチドＰｈｅ−Ａｌａと反応させ、そしてその生成物を生理学的に許容しうるその塩に変換することからなる、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の生理学的に許容しうる塩の製造法。
【請求項１０】
微生物 Actinoplanes liguriae, DSM 11797 または Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796 を培地内で発酵させ、請求項１記載の式ＩにおいてＲがＡｌａである化合物を分離することからなる、式ＩにおいてＲがＡｌａである化合物の製造法。
【請求項１１】
微生物 Actinoplanes liguriae, DSM 11797 または Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796 を培地内で発酵させ、請求項１記載の式ＩにおいてＲがＡｌａである化合物を分離し、そしてそれを生理学的に許容しうるその塩に変換することからなる、式ＩにおいてＲがＡｌａである化合物の生理学的に許容しうる塩の製造法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項記載の化合物又はその生理学的に許容しうる塩を含む細菌感染疾病の治療または予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アクタガルジン（actagardine）に関連した新規なランチビオティック（lantibiotic）、特にＡｌａ0−アクタガルジンの表示を有するランチビオティック、その製造法、該ランチビオティックから誘導された化学的誘導体及び該ランチビオティックの薬剤としての使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
比較的多くのランチビオティックが既に知られている。ランチビオティックは、特徴的な性質としてアミノ酸ランチオニン又はメチルランチオニンを含む多環式ペプチド抗生物質である。それらは微生物により得られる天然物質であり、人間の治療に抗菌活性化合物として、保存料として又は酵素阻害剤として使用される（G. Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1991, 30, 1051-1068)。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】
多くの抗生物質が細菌感染疾病の治療に使用されている。しかしながら、病原体は使用した薬剤にだんだん耐性になり、いわゆる多耐性微生物により大きな危険の恐怖さえもある。該多耐性微生物は、例えばβ−ラクタム抗生物質又はグリコペプチド又はマクロライドのような個々の抗生物質群に耐性であるだけでなく、同時にいくつかの耐性を有する。全ての市販の抗生物質に耐性となった病原体さえもある。これらの微生物によって引き起こされる感染性疾病はもはや治療できない。従って、耐性の微生物に対して使用できる新規な薬剤が非常に必要とされている。文献には何千もの抗生物質が記載されているが、殆どのものは非常に毒性が高く薬剤として使用できない。
【０００４】
アクタガルジンは、Antimicrob. Agents Chemother. 11, 396-401, 1977, S. Somma外が初めて記載したランチビオティックである。その構造はごく最近正確に解明されたにすぎない（N. Zimmermann外, Eur. J. Biochem. 1995, 228, 786-797)。
【０００５】
驚くべきことに、菌株Actinoplanes liguriae 及び Actinoplanes garbadiensis はそれぞれ少なくとも一つの新規な抗生物質、例えばＡｌａ0−アクタガルジンを生成することができることが見いだされた。該Ａｌａ0−アクタガルジンは非常に高い抗菌活性を有するばかりでなく、非常に高い耐容性を有している。Actinoplanes liguriae の単離体は、ブタペスト条約の規則に従って、1997年９月24日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH［Germann Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH], Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Germany（以後、“ＤＳＭ”という）に、下記の番号で寄託された：ＤＳＭ １１７９７。Actinoplanes garbadiensis の単離体は、ブタペスト条約の規則に従って、1997年９月24日に、ＤＳＭに、下記の番号で寄託された：ＤＳＭ １１７９６。
【０００６】
【問題点を解決するための手段】
これに対応して、本発明は下記の式Ｉの化合物、及びそれらの生理学的に許容しうる塩を提供する：
【化２】
0003684432.tif 000002
ここで、Ｒはアミノ酸の基である。Ｒは、アミノ基がα−ないしω−位にありそしてＤ配置又はＬ配置の、置換された又は非置換のアミノ酸の基であることができる。Ｄ配置又はＬ配置の、置換された又は非置換のα−アミノ酸が特に好ましい。
【０００７】
好ましくは、Ｒは、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＶａｌから成る群から選ばれた天然アミノ酸の基である。該アミノ酸は、特に好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ又はＳｅｒであり、特に非常に好ましいアミノ酸はＡｌａ0である。
Ｒはまた、置換された又は非置換のジアミノアルカン酸基、例えば２,４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であることもできる。
【０００８】
本発明はさらに、Actinoplanes liguriae, DSM 11797 若しくは Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796、又はそれらの変種及び／又は突然変異体の１種を培地内で、化合物Ａｌａ0−アクタガルジンが培養肉汁内で蓄積するまで発酵させ、そして引続き該化合物を分離することにより得られる、実験式：Ｃ84Ｈ129Ｎ21Ｏ25Ｓ4（Ａｌａ0−アクタガルジン）の化合物、及びその薬理学的に許容しうる塩に関する。
【０００９】
本発明はさらに、Actinoplanes liguriae, DSM 11797 若しくは Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796、又はそれらの変種及び／又は突然変異体の１種を培地内で、化合物Ａｌａ0−アクタガルジンが培養肉汁内で蓄積するまで発酵させ、そして引続き該化合物を分離し、そして化学的誘導体に変換することにより得られる、実験式：Ｃ84Ｈ129Ｎ21Ｏ25Ｓ4（Ａｌａ0−アクタガルジン）の化合物から誘導される化学的誘導体、及びその薬理学的に許容しうる塩に関する。
【００１０】
好ましい化学的誘導体は：Ｉｌｅ0−、Ｌｙｓ0−、Ｐｈｅ0−、Ｖａｌ0−、Ｇｌｕ0−、Ａｓｐ0−、Ｈｉｓ0−、Ｌｅｕ0−、Ａｒｇ0−及びＳｅｒ0−アクタガルジンである。Ａｌａ0−アクタガルジンの上記化学的誘導体への変換は、当業者に知られた方法により実施できる。
【００１１】
抗生物質Ａｌａ0−アクタガルジンは文献で知られた物質と、表示の構造式において相違する。アクタガルジンのほかに、いくつかのアクタガルジンの二次成分が追加的に記載されているが（米国特許第4,022,884号、1976年５月10日、及び A. Malabarba外、J. Antibiotics, 1985, 38, 1506-1511)、これらはすべて極性において、アクタガルジンに関して、アミノ酸組成において、抗菌活性において、又は本発明による化合物の別の物性において、相違する。
【００１２】
菌株 Actinoplanes liguriae, DSM 11797 はアクタガルジン、及びグルコース−、澱粉−又はグリセロール−含有栄養液についての文献から知られている副生物を生成する。驚くべきことに、該生物は本発明の抗生物質ＮＨ2−Ｒ−アクタガルジンを低消化性のマンニトール含有培地上で非常に良好な収率で生成し、ここでＲは、天然アミノ酸、特にアラニンであるが、記載した公知の化合物は生成せず、アクタガルジン自体はほんの微量しか生成しないことが見いだされた。
【００１３】
従って本発明は、さらに式Ｉの化合物の製造法に関し、該方法は、微生物Actinoplanes liguriae, DSM 11797 若しくは Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796、又はそれらの変種及び／又は突然変異体の１種を水性栄養培地内で培養し、式Ｉの化合物を分離及び精製し、そして適当ならばそれを薬理学的に許容しうる塩に変換することを含む。
上記の方法は、Actinoplanes liguriae, DSM 11797 若しくは Actinoplanes garbadiensis, DSM 11796、又はその突然変異体及び／又は変種を好気性条件下にて、炭素及び窒素源、並びに無機塩及び微量元素を含む培地内で培養することを含む。
培養は、好ましくは２０℃〜３６℃の温度で、ｐＨ４〜１０で実施する。
【００１４】
本発明は更に式Ｉの化合物の製造法に関し、該方法は化合物アクタガルジンをアミノ酸と反応させることを含む。
例えば、活性化アミノ酸エステルを、アクタガルジンの末端アミノ基と反応させることができる。例えば、tert.−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ−）のような保護基をアミノ酸のアミノの窒素に結合させて、活性化アミノ酸エステル同士の反応を防止するのが好ましい。活性化エステルは、例えば、それぞれのアミノ酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。保護基を除去し、そして次に反応混合物を精製する。
【００１５】
Actinoplanes はオレンジ色基質菌糸体を有し、空中生活の菌糸体を含まない。それはActinoplanes特有の胞子嚢を形成する。細胞壁は固有のアミノ酸としてメソジアミノピメリン酸及びグリシンを含み、そして糖類としてキシロース及びアラビノースを含む。これらはActinoplanes属固有の特徴である。
【００１６】
菌株DSM 11797 又は 11796の代わりに、その突然変異体及び変種も、もしそれらが本発明の化合物を合成するならば、使用することができる。かかる突然変異体は、公知の方法により、例えば紫外線若しくはＸ−線を用いた照射のような物理的手段、又は例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）若しくはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）のような化学的変異誘発素により生成できる。
本発明の抗生物質を生成する突然変異体及び変種のふるい分けは、培養肉汁に蓄積した活性化合物の生物学的活性を、例えば抗菌作用を試験することにより、測定して実施することができる。
【００１７】
好気性発酵に適した好ましい炭素源は、同化性であるが低消化性の炭水化物及びマンニトール及びイノシトールのような糖アルコール、並びに、例えば大豆粉のような炭水化物−含有天然生成物である。適した窒素含有栄養物は、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質、並びにそれらの分解生成物、例えばペプトン又はトリプトン、そして更に肉抽出物、粉砕した種子、例えばトウモロコシ、小麦、豆、カラスムギ、大豆若しくは綿の粉砕した種子、アルコール製品からの蒸留残留物、ミートミール（meat meals）又は酵母抽出物だけでなく、アンモニウム塩及び硝酸塩である。該栄養液が含むことができる無機塩は、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルト及びマンガンの塩酸塩、炭酸塩、硫酸塩又はリン酸塩である。
【００１８】
Ａｌａ0−アクタガルジンの形成は特に、例えば、約０.５〜５％、好ましくは１〜３％のマンニトール、０.５〜５％、好ましくは１〜３％の大豆粉、及び０.１〜０.５％、好ましくは０.２〜０.３％の濃度の微量元素溶液を含む栄養液中で進行する。該微量元素溶液はＣａＣｌ2、クエン酸Ｆｅ(III)、ＭｎＳＯ4、ＺｎＣｌ2、ＣｕＳＯ4、四硼酸ナトリウム、ＣｏＣｌ2、及びモリブデン酸ナトリウムを含む。
【００１９】
培養は、好気的に、即ち、例えばシェーカーフラスコ又は発酵器中で振り混ぜながら又は撹拌しながら水中で、適当ならば空気又は酸素を導入して、実施する。発酵は、例えば、いろいろな容積の広口瓶若しくは丸底フラスコ内で、ガラス発酵器内で、又はＶ2Ａスチールタンク内で実施することができる。発酵は約２０〜３５℃の温度範囲で、好ましくは約２５〜３０℃の温度範囲で実施できる。ｐＨは４〜１０、有利には５.５〜８.５としなければならない。微生物は一般に、これらの条件下で２０〜３００時間、好ましくは２４〜１４０時間にわたって培養される。培養は有利には数段階で実施される。即ち、一つ以上の予備培養物をまず液状栄養媒体中で調製し、それを次に実際の生成媒体、即ち主な培地、に例えば１：１０の容積比で移す。該予備培養物は、例えば菌糸体を栄養液中に移し、そしてそれを約２０〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間、生長させることにより得られる。菌糸体は、例えば、菌株を約１〜４０日間、好ましくは３〜１０日間、固体又は液体の栄養媒体上で、例えば酵母−麦芽寒天又はオートミル寒天上で、生長させることにより得ることができる。
【００２０】
発酵過程及び本発明による抗生物質の形成は、当業者に公知の方法に従って、例えば、生物検査における生物学的活性の検査によって、又は薄層クロマトグラフィー（ＴＣＬ）若しくは高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー法によって、監視することができる。
【００２１】
抗生物質Ａｌａ0−アクタガルジンは、菌糸体中及び培養濾液中の両方に生成し、通常、大部分の量は培養濾液中に生成し得る。従って、発酵溶液を濾過又は遠心分離によって分離するのが好都合である。濾液を、吸着樹脂を固体相として使用して抽出する。菌糸体はメタノール又はアセトンで抽出するのが好都合であるが、他の溶媒も使用できる。
【００２２】
抽出は、広いｐＨ範囲で実施できるが、中性又は弱酸性培地中、好ましくはｐＨ３〜ｐＨ７の間、で行うのが好都合である。
本発明による抗生物質の一つの分離方法は、それ自体は公知の溶液分配である。
【００２３】
精製の別の方法は、吸着樹脂、例えば Diaion（商標）HP-20（三菱化成株式会社、東京）、Amberlite（商標）XAD7（Rohm and Haas社、米国）、Amberchrom（商標）CG（Toso Haas社、フィラデルフィア、米国）又は同様の樹脂のクロマトグラフィーである。多くの逆相支持体、例えば、ＲＰ8及びＲＰ18のような、例えば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）として一般に知られたものが更に適当である。
本発明による抗生物質の別の可能な精製法は、例えばシリカゲル、Ａｌ2Ｏ3又はその他のような、いわゆる標準相クロマトグラフィー支持体を、それ自体は公知の方法で使用することから成る。
【００２４】
別の分離法は、例えば、Fractogel（商標）TSK HW-40、Sephadex（商標）G-25等のようなモレキュラーシーブを、それ自体は公知の方法で使用することである。更に該Ａｌａ0−アクタガルジンを、濃厚材料から結晶化により得ることも可能である。例えば、無水の又は水を加えた有機溶媒及びそれらの混合物はこの目的に適する。本発明による抗生物質の別の分離及び精製法は、陰イオン交換体を好ましくは４〜１０のｐＨ範囲で、及び陽イオン交換体を好ましくは２〜５のｐＨ範囲で使用することからなる。ある量の有機溶媒を添加した緩衝溶液の使用は、この目的に特に適する。
【００２５】
Ａｌａ−アクタガルジン、前述のその化学的誘導体及びその自明な化学的同等物は、当業者に公知の方法で、相当する薬理学的に許容されうる塩に変換することができる。
【００２６】
本発明による化合物の自明な化学的同等物は、僅かな化学的差異を有する化合物、即ち、同じ活性を有するか又は穏やかな条件下で本発明の化合物に変換される化合物である。該同等物には、例えば本発明の化合物のエステル、アミノ誘導体、複合体又は付加物が含まれる。
【００２７】
本発明による化合物の薬理学的に許容しうる塩とは、無機塩および有機塩の両方を意味するものと解され、例えば Remington's Pharmaceutical Sciences（17版、1418頁（1985年））に記載されたものである。可能な塩は特に、アルカリ金属塩、アンモニウム塩、アルカリ土類金属塩、生理学的に許容されるアミンの塩、及び無機酸又は有機酸の塩、例えばＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、マレイン酸、フマル酸の塩である。
【００２８】
本発明による抗生物質の物理化学的性質及び分光的性質は、以下のように要約できる：
Ａｌａ0−アクタガルジン：
外観：
メタノール及び水に可溶な無色の物質。中性及び緩アルカリ性の培地中で安定であるが、強酸性及び強アルカリ性の溶液中では不安定である。
実験式：Ｃ84Ｈ129Ｎ21Ｏ25Ｓ4
分子量：１９６１.２１
1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲ：表１及び２参照
ＵＶ最大（ｌｏｇε）：280nm（3.71）、288nm（肩部）
【００２９】
【表１】
0003684432.tif 000003
【００３０】
【表２】
0003684432.tif 000004
【００３１】
アミノ酸分析で、アクタガルジンのアミノ酸のほかに別のＡｌａを生じる［１Ｓｅｒ、２Ｇｌｙ、１Ｔｒｐ、２Ｖａｌ、１Ｌｅｕ、２Ｉｌｅ、１Ｇｌｕ、１Ａｌａ、１ランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）及び３βーメチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ）］。
本発明による化合物は、強い抗菌作用を有することが見いだされた。表３はＡｌａ0−アクタガルジンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を例によって要約する。
【００３２】
【表３】
0003684432.tif 000005
【００３３】
【発明の作用及び効果】
本発明による化合物は、グラム陽性微生物に対してアクタガルジンの約２倍の抗菌活性を有するだけでなく、同時に従来の抗生物質、例えばβ−ラクタム（ペニシリン、セファロスポリン）、アミノグリコシド（ストレプトマイシン）、マクロライド（エリスロマイシン）、キノロン（シプロフロキサシン）、スルホンアミド又はグリコペプチド（バンコマイシン）等との交差耐性が全くないことは特に注目する価値がある。更に強調すべきことは、手に負えない実際生命を脅かす伝染性疾病を引き起こし得る嫌気性生物に対する、強い阻害作用である。
Ａｌａ0−アクタガルジンは特にかかる障害の治療に適する。
Ａｌａ0−アクタガルジンの耐容性は、活性濃度及びそれ以上で良好である。
細胞毒性作用又はその他の毒性は観察されなかった。
【００３４】
従って、本発明はまた、本発明による化合物の薬剤としての使用、及び細菌感染の治療及び／又は予防用の薬剤の製造への該化合物の使用に関する。
更に本発明は、本発明による化合物を含む薬剤に関する。
上記の薬剤は、式Ｉの化合物の少なくとも１種を、生理学的助剤及び／又は賦形剤と混合し、そしてそれを適当な投与形態にすることにより製造される。
【００３５】
本発明による薬剤は、経腸（経口）、非経口（筋肉内又は静脈内）、直腸内または局部的（局所的）に投与できる。該薬剤は、溶液、粉末（錠剤、マイクロカプセルを含むカプセル）、軟膏（クリームまたはゲル）または座薬の形態で投与できる。このタイプの配合物に可能な助剤は、製薬に慣用の液体または固体の充填剤および増量剤、溶媒、乳化剤、潤滑剤、風味矯正剤、着色料および／または緩衝（バッファ）物質である。好都合な投与量として、０.１〜１０００mg／体重kg、好ましくは０.２〜１００mg／体重kgが投与される。該薬剤は、本発明による化合物の少なくとも有効な一日量、例えば３０〜３０００mg、好ましくは５０〜１０００mgを含む投与単位で投与するのが好都合である。
本発明を、下記の例及び特許請求の範囲により、更に詳しく例示する。
【００３６】
【実施例】
例１：生成菌株の菌糸体懸濁液の調製
５００mlの滅菌三角フラスコに入れた１００mlの培養栄養液（１リットルの水道水中に１０ｇの澱粉、１０ｇのグリセロール、１０ｇのグルコース、２.５ｇのコーンスチープ（Cornsteep）、５ｇのペプトンおよび２ｇの酵母抽出物、殺菌前のｐＨ：６.０）を菌株に接種し、そして回転シェイカーにて２８℃そして１４０rpmで７２時間インキュベートする。次いで寒天１５ｇ／リットルを固化用に前以て追加した栄養培地オートミール浸出液２.０ｇ／リットルを含む滅菌の５００ml三角フラスコ中に、１２０mlの培養液を均一に分散しそしてデカントする。該培養物を２８℃にて１０日〜１４日インキュベートする。この時点後に生成したフラスコからの菌糸体を取り出し、直ちに再使用するか、または−２２℃にて５０％のグリセロール中に若しくは１０％のジメチルスルホキシド中に−１４０℃にて貯蔵する。
【００３７】
例２：三角フラスコ中の生成菌株の培養物または予備培養物の調製
例１に記載した１００mlの培養栄養液を含有する滅菌の５００ml三角フラスコを傾斜管中でまたは寒天を用いて生長した培養物に接種し、そしてシェイカーを用いて暗所にて１４０rpmそして２８℃でインキュベートする。式Ｉの化合物の最高生成値は約７２時間後に達成される。同じ栄養液表面からの７２時間経過液内培養物（接種量約５％）は１０リットルおよび１００リットルの発酵器に接種するのに十分である。
【００３８】
例３：Ａｌａ0−アクタガルジンの調製
１０リットルの発酵器を下記の条件下で操作する：
0003684432.tif 000006
インキュベーション時間：２４または４８時間
インキュベーション温度：２８℃
撹拌速度：２００rpm
エアレーション：空気５リットル／分
泡の形成は数滴のエタノール系ポリオール溶液を繰り返し添加して抑制できる。生成最大値は４８時間後に達成される。
【００３９】
例４：抗生物質Ａｌａ0−アクタガルジンの分離
例３によって得られた２７リットルの培養液を遠心分離し、そして透明な培養物濾液を、吸着樹脂ＭＣＬＧｅｌ（商標）ＣＨＰ２０Ｐを充填した３リットル容量のカラムに供給する。カラムの寸法：幅×高さ：１１.３cm×３０cm。該カラムを水中の５％イソプロパノール〜５０％イソプロパノールまでの溶剤勾配を用いて溶出し、そしてカラムの溶出液を各２リットルの分別部分にて回収する。ＨＰＬＣ分析にて判定されるＡｌａ0−アクタガルジン含有フラクションを回収し、真空濃縮し、そして凍結乾燥する（４ｇ）。
【００４０】
例５：Ａｌａ0−アクタガルジンの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
カラム：Nucleosil（商標）１００−５Ｃ18ＡＢ，２５０／４
移動相：１０ミリモルのリン酸カリウム中の３２％アセトニトリル
バッファー  ｐＨ７
流速：  毎分１ml
２１０nmでＵＶ吸収による検出
Ａｌａ0−アクタガルジンについて、１６分５０秒の滞留時間が認められ、アクタガルジンについては、１１分２０秒であった。
【００４１】
例６：Ａｌａ0−アクタガルジンの濃度
例４により得られた生成物３ｇを、Fractogel（商標）TSKHW-40s を充填した３リットル容量のカラムに供給する（幅×高さ＝１０cm×５０cm）。水中の５０％メタノールである溶出液を毎分５０mlの流速にてポンプで該カラムに流通し、該カラムの溶出液をフラクション（６５ml）ごとに回収する。抗生物質Ａｌａ0−アクタガルジン１４０mgは主に２４〜２８のフラクションに見出だされる。
【００４２】
例７：該Ａｌａ0−アクタガルジンの最終精製
例６にて得られた濃厚な抗生物質Ａｌａ0−アクタガルジン（２８０mg）を、Nucleosil（商標）１２Ｃ１８ＡＢ−ＨＰＬＣカラム（幅×高さ＝３.２cm×２５cm）に５％〜３０％のアセトニトリルおよび０.０５％のトリフルオロ酢酸を用いて勾配法にて供給する。ＨＰＬＣ分析（例５を参照）にて調べられるフラクションを対応して集め、真空濃縮しそして凍結乾燥する。これによって純度９８％のＡｌａ0−アクタガルジン１８５mgが得られる。
ＥＳＩ＋質量分析法によって決定されるＡｌａ0−アクタガルジンの分子量：Ｍ＋Ｈ+＝１９６２.６
【００４３】
例８：Ｌｙｓ0−アクタガルジンの調製
９４.５mg（０.０５ミリモル）のアクタガルジンを１０mlの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および２２mg（０.０５ミリモル）のジ−Ｂｏｃ−リシンＯ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに溶解し、そして１００μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加し、そして該混合物を室温で放置する。反応の過程をＨＰＬＣ（例５を参照）によって分析的に監視する。９６時間後に高真空にて該ＤＭＦおよびＴＥＡを抜き取ることにより反応を中止し、反応生成物を０.０５％強度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の２５％〜５０％のアセトニトリルを使用する勾配法による分取ＨＰＬＣによって精製する。該カラムの寸法は幅×高さ＝２５mm×２５０mmであり、支持体は SelectＢ（商標）である。反応生成物を含むフラクションの凍結乾燥の後に、３３mg（０.０１５ミリモル）のジ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ0−アクタガルジンが得られる。
Ｂｏｃ保護基を、６０％強度のＴＦＡを用いて完全に除去する。このために、２５mg（０.０１１ミリモル）の保護誘導体を５mlの６０％強度のＴＦＡに室温にて溶解する。９０分後に除去が完了する。遊離のリシル−アクタガルジンを、分取ＨＰＬＣカラム（１０mm×２５０mm，LiChrospher（商標））にて上記のように同じ勾配法を用いて精製する。精製した物質の凍結乾燥によって、１４mg（０.００７ミリモル）のＬｙｓ0−アクタガルジンが得られる。この最終生成物の分子量を質量分析法にて調べる。実験式Ｃ87Ｈ136Ｏ25Ｎ22Ｓ4に相当して（Ｍ＋Ｈ)+：２０１９である。
【００４４】
例９：Ｉｌｅ0−アクタガルジンの調製
例８に記載のように、１８９mg（０.１ミリモル）のアクタガルジンを３３mg（０.１ミリモル）のＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｏ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる。２１０mgのＢｏｃ−Ｉｌｅ0−アクタガルジンが得られる。Ｂｏｃ保護基の除去および最終精製によって、８４mg（０.０４２ミリモル）のＩｌｅ0−アクタガルジンが得られる。質量分析法にて決定された分子量は、実験式Ｃ87Ｈ135Ｏ25Ｎ21Ｓ4に相当して（Ｍ＋Ｈ)+：２００４である。
【００４５】
例１０：Ｎ−α−アミノブチリル−アクタガルジン（Ａｂｕ0−アクタガルジン））の調製
例８に記載のように、９４.５mg（０.０５ミリモル）のアクタガルジンを１６.３mg（０.０５ミリモル）のパラ−ニトロフェニルＮ−Ｂｏｃ−α−アミノブチレートと反応させる。９日後に５４mgのＮ−Ｂｏｃ−Ａｂｕ0−アクタガルジンが得られる。保護基を除去して１９mg（０.０１ミリモル）のＮ−α−アミノブチリル−アクタガルジンが得られる。
分子量ピーク（Ｍ＋Ｈ)+：１９７６であり、実験式Ｃ85Ｈ131Ｏ25Ｎ21Ｓ4に相当する。
【００４６】
例１１：Ｇｌｎ0−アクタガルジンの調製
例８に記載のように、９４.５mg（０.０５ミリモル）のアクタガルジンを１６.４mg（０.０５ミリモル）のＢｏｃ−グルタミンパラ−ニトロフェニルエステルと反応させる。該保護基を除去して、３８mg（０.０１９ミリモル）のＧｌｎ0−アクタガルジンが得られる。
分子量ピーク（Ｍ＋Ｈ)+：２０１９であり、実験式Ｃ86Ｈ132Ｏ26Ｎ22Ｓ4に相当する。
【００４７】
例１２：Ｐｈｅ0−アクタガルジンの調製
例８に記載のように、９４.５mg（０.０５ミリモル）のアクタガルジンを１５.６mg（０.０５ミリモル）のＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｏ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる。保護基を除去した後、２６mg（０.０１３ミリモル）のＰｈｅ0−アクタガルジンが得られる。
分子量ピーク（Ｍ＋Ｈ)+：２０３８であり、実験式Ｃ90Ｈ133Ｏ25Ｎ21Ｓ4に相当する。
【００４８】
例１３：Ｐｈｅ−Ａｌａ0−アクタガルジンの調製
例８に記載のように、９４.５mg（０.０５ミリモル）のアクタガルジンを２１.７mg（０.０５ミリモル）のＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｏ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと３時間反応させる。保護基を除去した後、３７mg（０.０１８ミリモル）のＰｈｅ−Ａｌａ0−アクタガルジンが得られる。
分子量ピーク（Ｍ＋Ｈ)+：２１０９であり、実験式Ｃ93Ｈ138Ｏ26Ｎ22Ｓ4に相当する。
【００４９】
例１４：Ｄ−Ａｌａ0−アクタガルジンの調製
例８に記載のように、９４.５mg（０.０５ミリモル）のアクタガルジンを１４.５mg（０.０５ミリモル）のＢｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと２４時間反応させる。保護基を除去した後、４７mg（０.０２４ミリモル）のＤ−Ａｌａ0−アクタガルジンが得られる。
分子量ピーク（Ｍ＋Ｈ)+：１９６１であり、実験式Ｃ84Ｈ129Ｏ25Ｎ21Ｓ4に相当する。
【００５０】
表４〜６は、アクタガルジン（Ａｃｔａ）のおよび本発明による化合物の、インビトロの抗菌活性（最小阻害濃度（ＭＩＣ）値［μｇ／ｍｌ］）を示す。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
【表５】
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【００５３】
【表６】
0003684432.tif 000009