(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型から誘導され、野生型に比べて高められた内因性Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−形成性及び野生型に比べて増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性を有する微生物−菌株を発酵培地中で培養することによりＯ−アセチル−Ｌ−セリンを発酵法で製造する場合に、発酵培地中でｐＨ値を５.１〜６.５の範囲内に調節することを特徴とする、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを発酵法で製造する方法。
【請求項２】
発酵法による製造の間の発酵培地のｐＨ値は、５．５〜６．５のｐＨ範囲内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
野生型に比べて高められた内因性Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−形成性を低下されたフィードバック阻害を有するセリン−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ−アレルにより達成させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
野生型に比べて高められたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性をｙｄｅＤ−遺伝子により達成させる、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
微生物菌株はエセリキア・コリーである、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
発酵槽中の微生物菌株を、連続的培養法、回分培養法又は有利には流加培養法として培養する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
栄養培地は、硫黄５〜５０ｍＭの濃度でＳ−源を含有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
発酵法での製造の間に、Ｃ−源を連続的に供給する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｃ−源を、糖、糖アルコール又は有機酸の群から選択する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ−源を、グルコール、ラクトース又はグリセリンの群から選択する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃ−源を、発酵の間にそれが０.１〜５０ｇ／ｌの範囲内で存在するように供給する、請求項８から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｎ−源として、アンモニア、アンモニウム塩又は蛋白質加水分解生成物を添加する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
発酵培地に、元素  リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩及び微量の（即ちμＭ濃度の）元素  モリブデン、硼素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルの塩を添加する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
有機酸、アミノ酸及びビタミンを発酵培地に添加する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
酵母エキス、コーンステイープリカー、大豆粉又は麦芽エキスを発酵培地に添加する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
インキュベーション温度は１５〜４５℃である、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
好気性成長条件下に実施する、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
圧搾空気及び純粋酸素を用いて発酵槽中に酸素を導入することにより好気性成長条件を製造する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
１〜３日の発酵時間を選択する、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法を用いてＯ−アセチル−Ｌ−セリンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸の製造のための発酵法は、今日広く普及している。これは、殊に、経済的に著しく重要な２０の蛋白質アミノ酸の代表、例えばＬ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−スレオニンの製法である。しかしながら、年間１０００〜１００００トンの範囲の小さい市場での蛋白質アミノ酸、例えばＬ−フェニルアラニン、Ｌ−システインの製造のための方法に関する報告も増大している。
【０００３】
これに反して、２０の蛋白質アミノ酸の生合成前駆物質を製造するための相応する方法は全く知られていない。しかしながら、これらの前駆物質は屡々キラル中心を有し、薬剤有効物質の合成のための構成要素として使用できるので、正にこの前駆物質は重要な生成物でありうる。国際特許出願ＷＯ  ００／４４９２３明細書中には、例えばシキミ酸、芳香族アミノ酸の生合成の中間体の製造が記載されている。もう一つの例は、欧州特許出願ＥＰ  ０９９４１９０Ａ２であり、ここには、発酵法によるＬ−ホモセリン、Ｌ−メチオニンの前駆物質の製造が報告されている。
【０００４】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは、Ｌ−システインの生合成前駆物質である。これ自体はアミノ酸であり、細菌及び植物の物質代謝で、ヒドロキシル官能基の所でのＬ−セリンのアセチル化により生じる。この反応は、ｃｙｓＥ−遺伝子によりコードされる酵素セリン−Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼ［ＥＣ  ２．３．１．３０］により触媒作用される。Ｏ−アセチル−セリンは、細胞中で更にＬ−システインまで変換される。この場合には、チオール−官能基へのアセテート−官能基の置換が行われる。
【０００５】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法による製造の際の問題は、この物質が非常に不安定であり、４.０より大きいｐＨ値で異性化してＮ−アセチル−Ｌ−セリンになる事実から生じる。この反応の速度は、７.６のｐＨ値で１％×ｍｉｎ-１の速度を有する（Tai 等、１９９５，Biochemistry ３４：１２３１１−１２３２２）。このことは、このような条件下で、通常少なくとも一日半かかる発酵法の後に、有意義な量のＯ−アセチル−セリンが検出されないことを意味する。この異性化反応は、不可逆的であり、ｐＨ値の増加に伴いその速度が更に上昇する。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとは反対に、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンは、アミノ官能基のブロッキングに基づき、もはやペプチド合成のためには使用できない。
【０００６】
細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−濃度は非常に低く、強力な調節（Regulation)が根底にあることがもう一つの問題である。一方で、セリン−アセチル−トランスフェラーゼは、Ｌ−システインによりアロステリックに抑制され、これに伴い、μＭ−濃度のＬ−システインの存在時には、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの合成は不可能である。他方、異性化生成物Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンは、硫黄レギュロン（Regulon）のインジューサーとしての作用をし、これに伴い、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンと硫化物とが迅速に反応して、Ｌ−システインをもたらす。
【０００７】
Dassler 等（２０００、Mol. Microbiol．３６：１１０１−１１１２）により、膜蛋白質ＹｄｅＤ（＝Ｏｒｆ２９９）を過剰生産する細胞は、培地中にＬ−システイン、２−メチル−チアゾリジン−２，４−ジカルボン酸及び更にＯ−アセチル−Ｌ−セリンをも分泌することが記載された。しかしながら、後者は０．１２ｇ／ｌの非常に少量でのみ、かつ振動フラスコ実験においてのみ検出できた。これに反して、より良好な栄養物質供給に基づきより高い収率を可能とする発酵実験では、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンのみが得られた。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは、４〜５のｐＨ範囲の場合にのみ充分に安定であることが論じられた。しかしながら、このｐＨ範囲は、好中球性細菌、例えばエセリキア・コリーの悪い成長に基づき発酵法的製造のためには好適ではない。
【０００８】
ｐＨ７.０で、Ｏｒｆ２９９の使用下でのＮ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法による製造が、同様に欧州特許出願ＥＰ  ０８８５９６２Ａ１に記載された。ここでは，ｏｒｆ２９９−遺伝子（この出願中でＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３で示されている）が適当なｃｙｓＥ−アレルと組み合わされた。これは、Ｌ−システインによる低下されたフィードバック−阻害の基礎になっているセリン−アセチル−トランスフェラーゼをコードしていた。これによって、細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セリンの増強された生産が達成され、最終的に迅速な異性化に基づきＮ−アセチル−Ｌ−セリンが蓄積された。
【０００９】
国際特許出願ＷＯ  ９７／１５６７３明細書中に記載のような低下されたフィードバック阻害を有するｃｙｓＥ−アレルの単独使用は、同様にＯ−アセチル−Ｌ−セリンの蓄積をもたらさない。細胞内ではＯ−アセチル−セリンの増大した形成が得られる。しかしながらこの処置法では、細胞外で−従って初めて生成物として補足可能である−Ｌ−システインが検出できただけである。
【００１０】
更に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの製造の場合の大きな問題は、Dassler 等（２０００，Mol. Microbiol.３６：１１０１−１１１２）により記載された事実、即ち、Ｏｒｆ２９９の過剰生産が、細菌成長の強力な妨害をもたらす事実である。このことは、インジューサーであるＮ−アセチル−Ｌ−セリンの細胞内での不足に基づく硫黄レギュロンの誘導不足に基づく。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの不安定性及び細胞からの有効なＯ−アセチル−Ｌ−セリン−エクスポート（Exports)の負の生理学的結果にも関わらず、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い収率を生じる発酵法を提供することであった。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この課題は、１野生型から誘導され、野生型に比べて高められた内因性Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−形成性及び野生型に比べて増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性（Efflux)を有する微生物−菌株を、発酵培地中で培養することにより解決され、この際、発酵培地中のｐＨ値を５.１〜６.５の範囲内に調節することを特徴とする。
【００１３】
即ち、意外にも、次のことが判明した：
-  前記のような特徴を有する微生物菌株は、多量のＯ−アセチル−Ｌ−セリンを分泌する、
-  Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは５.１〜６.５のｐＨ値で発酵培地中で充分安定であり、かつ
-  同時に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの増加供給によるＯ−アセチル−Ｌ−セリン−分泌細胞の前記の生理学的問題は、フィードバック抵抗性のｃｙｓＥ−アレルを用いて充分に取り除くことができる。
【００１４】
この発酵の間の発酵培地のｐＨ値は、有利に５.５〜６.５のｐＨ範囲、特に有利に５.５〜６.０のｐＨ範囲である。
【００１５】
本発明の方法で使用できる微生物菌株は、それらが、
-  Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性形成性を有し、かつ
-  増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性を有する
ことで優れている。
【００１６】
このような菌株は、技術水準で公知である。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの高い内因性形成は、修飾されたｃｙｓＥ−アレル（Allel)を、例えば
-  ＷＯ  ９７／１５６７３（ここで、参照文献として添付）又は
-  Nakamori S. 等の,1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 (ここで、参照文献として添付）又は
-  Takagi H. 等の 1999, FEBES Lett. 452: 323-327
に記載のように、微生物菌株中に入れることにより達成することができる。
【００１７】
ｃｙｓＥ−アレルは、システインによる低下されたフィードバック-阻害の基礎となっているセリン−Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。これによって、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの形成は、充分に細胞のシステイン−濃度により止められる。
【００１８】
増強されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−流出性(Efflux)は、その遺伝子産生物がＯ−アセチル−Ｌ−セリンのエクスポートに作用するエフラックス−遺伝子（Efflux-Gen)の高められた発現によって得ることができる。
【００１９】
特に有利なこのようなエフラックス−遺伝子は、Dassler等により（２０００、Mol. Microbiol. 36: 1101-1112) 及びＥＰ０８８５９６２Ａ１（整理番号ＳＮ０９／０９７７５９の米国特許出願に相当：ここで、参考文献として添付）に記載されたｙｄｅＤ−遺伝子である。
【００２０】
修飾されたｃｙｓＥ−アレル又はエフラックス−遺伝子は、使用菌株中に単独コピー又は高いコピー数で存在しうる。これらは染色体コードしているか又は自己複製因子、例えばプラスミド上に局在することができる。
【００２１】
この遺伝子の増強された発現は、例えば当業者に公知である適当なプロモーター系の使用により行うことができる。
【００２２】
本発明の有利な１実施形では、ｃｙｓＥ−アレル又はｙｄｅＤ−遺伝子を、本来の又はｇａｐＤＨ−プロモーターと共に含有する微生物をプラスミド上で中程度のコピー数で使用する。このような構造は、例えばｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６であり、これはＥＰ０８８５９６２Ａ１中に詳細に記載されている。
【００２３】
このような菌株の製造のためには、原則的に、遺伝学的方法に使用でき、発酵法で良好に培養できる全ての微生物菌株が好適である。腸内菌（Enterobakteriacee)類の細菌が有利に使用される。特に有利に大腸菌（Escherichia  coli)類の微生物が使用される。このような菌株の製造は、前記の文献中に記載されており、本発明の部分ではない。
【００２４】
本発明の方法に好適な菌株は、ＥＰ ０８８５９６２Ａ１（米国特許出願整理番号ＳＮ ０９／０９７７５９に相当：ここで参考文献として添付）に記載のように、システイン及びシステイン−誘導体の製造のためにも好適である。しかしながら、後者のためには、Ｌ−システイン又はその誘導体の最適量を得るために、無機硫黄源、例えば硫酸塩又はチオ硫酸塩の充分な供給が必要である。
【００２５】
しかしながら、本発明の方法では、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンが更にシステインまで変換することは望ましくないので、この発酵の間に硫黄源は供給されない。単に、培地中に充分な量の硫黄源（例えば硫酸塩、チオ硫酸塩）が存在して、細胞の蛋白質合成のためのシステインの需要がカバーされることが確保されるべきであるだけである。栄養培地中の充分量は、有利に硫黄５〜５０ｍＭである。
【００２６】
微生物菌株を用いるＯ−アセチル−Ｌ−セリンの製造のための本発明の方法は、発酵槽中で、公知方法であるが、発酵の間の著しく低いｐＨ値の調節下に実施される。
【００２７】
発酵槽中での微生物菌株の培養は、連続的培養法として、回分式培養法として又は有利には流加培養法として行われる。この発酵の間にＣ−源を連続的に供給することが特に有利である。
【００２８】
C−源としては、有利に糖、糖アルコール又は有機酸が使用される。本発明の方法では特に有利にＣ−源としてグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。
【００２９】
Ｃ−源の配量添加は、発酵の間の発酵槽中の含分が０.１〜５０ｇ／ｌの範囲内に保持されることを確保する形であるのが有利である。０.５〜１０ｇ／ｌの範囲が特に有利である。
【００３０】
Ｎ−源として、本発明の方法では有利にアンモニア、アンモニウム塩又は蛋白質加水分解生成物が使用される。ｐＨ安定化のための調整剤としてのアンモニアの使用の際には、この発酵の間に、このＮ−源が定期的に後供給される。
【００３１】
更なる培地添加物として、元素  リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩及び微量（即ちμＭ濃度で）の元素  モリブデン、硼素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルの塩を添加することができる。
【００３２】
更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン（例えばＢ１、Ｂ６）をこの培地に添加することができる。
【００３３】
複合栄養源として、例えば酵母エキス、コーンステイープリカー、大豆粉又は麦芽エキスを使用することができる。
【００３４】
インキュベーシヨン温度は、１５〜４５℃である。３０〜３７℃の温度が有利である。
【００３５】
この発酵は、好気性成長条件下に実施するのが有利である。発酵槽中への酸素導入は、圧搾空気又は純粋酸素を用いて行われる。
【００３６】
記載の方法で発酵される微生物は、１〜３日の発酵時間内に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを高い効率で培地中に分泌する。
【００３７】
【実施例】
本発明を更に詳述するために次の実施例を使用する。例を実施するために使用されている細菌菌株エセリキア・コリーＷ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６は、ＤＳＭ(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、 D-38142 Braunschweig) にＤＳＭ１３４９５なる番号で寄託された。
【００３８】
例１：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンをＮ−アセチル−Ｌ−セリンにする異性化
発酵に近い条件下での異性化反応を介しての正確な印象を得るために、発酵培地１００ｍｌ中でＯ−アセチル−Ｌ−セリン（例３参照）０.９ｇを使用した。更に２５％アンモニアを用いてｐＨ７.０にｐＨ値を調節し、３２℃の反応温度で、種々異なる時点で試料を取り出した。これらを逆相ＨＰＬＣによりＬＵＮＡ５μＣ１８（２）−カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, Deutschland ) で分析した。溶離液として、希リン酸（濃リン酸０.１ｍｌ／ｌ）を、流速０.５ｍｌ／ｍｉｎで用いた。結果は図１に示されている。
【００３９】
例２：生産菌株の前培養液
この発酵のための前培養液として、付加的にテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを含有するＬＢ−培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）２０ｍｌに、菌株Ｗ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６（米国特許出願整理番号ＳＮ  ０９／０９７７５９に相当するＥＰ  ０８８５９６２Ａ１（ここで参考文献として添付）に記載されている）を接種し、３０℃及び１５０ｒｐｍで振動装置中でインキュベートした。７時間後に、全内容物を、グルコース  ５ｇ／ｌ；ビタミンＢ１  ０.５ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン  １５ｍｇ／ｌが補充されたＳＭ１−培地（Ｋ２ＨＰＯ４  １２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０.０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０.００２ｇ／ｌ；Ｎａ３クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ  １ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ０.１ｇ／ｌ：微量元素溶液（Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ０.１５ｇ／ｌ；Ｎａ３ＢＯ３２．５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ０.７ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ０.２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ１.６ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.３ｇ／ｌからなる）１ｍｌ／ｌ）１００ｍｌ中に移した。３０℃、１５０ｒｐｍで更に１７時間インキュベートを行った。
【００４０】
例３：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵法による製造
発酵槽として、最大培養液量２リットルを有するFirma Braun Biotech (Melsungen, D)社のＢｉｏｓｔａｔ  Ｍ−装置を用いた。例２に記載の前培養液（６００ｎｍでの光学密度約３）を、発酵培地９００ｍｌ（グルコース１５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母エキス５ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４１.５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ０.５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０.０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０.０７５ｇ／ｌ；Ｎａ３クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ１ｇ／ｌ及び前記の微量元素溶液１ｍｌ／ｌ、ビタミンＢ１  ５ｍｇ／ｌ及びテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを２５％アンモニアでｐＨ６.０に調節）を有する発酵槽に接種した。この発酵の間に、３２℃の温度に調節し、ｐＨ値を２５％アンモニアの配量添加により６.０の値で一定に保持した。この培養液に除菌した圧搾空気を１.５ｖ／ｖ／ｍｉｎで通気し、２００ｒｐｍの撹拌回転数で撹拌した。酸素飽和が５０％の値まで低下した後に、５０％酸素飽和を保持するために（ｐＯ２−ゾンデを用いて測定、９００ｒｐｍで１００％飽和に対して較正）、コントロール装置を用いて回転数を１２００ｒｐｍの値まで高めた。発酵槽中のグルコース含分が当初の１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌまで低下したら直ちに、５６％グルコール溶液の配量添加を行った。この供給を６〜１２ｍｌ／ｈの流速で行い、この際に、発酵槽中のグルコース濃度を０.５〜１０ｇ／ｌの間に保持した。グルコース測定は Firma YSI (Yellow Springs, Ohio, USA) 社のグルコース分析装置(Glukose-Analysator)を用いて実施した。発酵時間は、２８時間であった。この時間の後に、試料を取り出し、細胞を遠心分離により培養培地から分離した。生じた培養上澄みを逆相ＨＰＬＣにより例１に記載と同様に分析した。第１表は、培養上澄み中の得られた主要物質代謝生成物の含分を示している。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
ｐＨ５.５までの範囲で、類似の値が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】例１で取り出された試料の逆相ＨＰＬＣによる分析結果を示す図
【図１】
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