(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨芽細胞の増殖を刺激するために十分な量のビタミンＤとともに血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を当該骨芽細胞に適用することを含む当該骨芽細胞の増殖を刺激する方法であって、ここで当該組成物はＰＤＧＦのＡ鎖を含まず、かつ、上記骨芽細胞は、当該ＰＤＧＦの存在下、かつ、当該ビタミンＤの不在下での細胞増殖に比較して3Ｈ−チミジンの取り込みにより計測されるとき少なくとも２倍、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖される、前記方法。
【請求項２】
前記組成物が組換えＰＤＧＦのＢ鎖ホモダイマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物中のＰＤＧＦの濃度が１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物中のＰＤＧＦの濃度が５ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの重量比が６：１〜６：５００である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの重量比が６：１０〜６：１００である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ビタミンＤが９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエン−３−オールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカリフェロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
製剤学的に許容される担体中に血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及びビタミンＤを含む、骨芽細胞の増殖を刺激するための医薬組成物であって、ここで、当該組成物はＰＤＧＦのＡ鎖を含まず、かつ、上記骨芽細胞は、当該ＰＤＧＦの存在下、かつ、当該ビタミンＤの不在下での細胞増殖に比較して3Ｈ−チミジンの取り込みにより計測されるとき少なくとも２倍、増殖される、前記組成物。
【請求項９】
前記ビタミンＤが９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエン−３−オールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカリフェロールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中のＰＤＧＦの濃度が１０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの重量比が６：１〜６：５００である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物中のＰＤＧＦ：ビタミンＤの重量比が６：１０〜６：１００である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
骨の改造は組織の質量および骨格の構築を維持する動力学的方法である。この方法は骨の吸収と骨の形成との間の釣り合いであり、２つの細胞の型は主要な演技者であると考えられる。これらの細胞は溶骨細胞および骨芽細胞である。骨芽細胞は新しい骨を合成しそして、溶骨細胞が掘った空洞の中に新しい骨を沈積する。骨芽細胞および溶骨細胞の活性は、成長因子を包含する、系統的および局所的な、多数の因子により調節される。
骨の恒常性に関係すると信じられる遺伝暗号の１つは、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）である。生物学的に活性なＰＤＧＦは成分ＡおよびＢ鎖のホモダイマーおよびヘテロダイマーである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究はＰＤＧＦが骨芽細胞のために有糸分裂誘発因子であることを示した（Ａｄｂｅｎｎａｇｙら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｒｅｐ． １６（３）：２３５−２４７、１９９２）。ＰＤＧＦに関連する有糸分裂誘発活性ならびに走化活性は、成長因子を正常骨芽細胞様細胞（Ｔｕｓｋａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１７５（３）：７４５−７４７、１９９１）および一次骨芽細胞培養物（Ｃｅｎｔｒｅｌｌａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１２５、（１）：１３−１９、１９８９）に添加したとき、証明された。最近の研究は、骨芽細胞がＰＤＧＦのＡＡイソ形態を生産することを証明した（Ｚｈａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６１：ｃ３４８−３５４、１９９１）。ＰＤＧＦが骨芽細胞の成長に影響を与える正確なモードはまだ明瞭に理解されていないが、成長因子が正常の骨格の改造および骨折の修復の両方の調節において重要な役割を演ずるいうコンセンサスが存在するように思われる。
ＰＤＧＦのための治療的応用は、例えば、治癒するために骨芽細胞の増殖を必要とする損傷、例えば、骨折の処理を包含する。間充織細胞の増殖の刺激および膜内骨の合成は、骨折の修復の面として示された（Ｊｏｙｃｅら、３６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ５−８、１９９０。ルイジアナ州ニューオルレアンス）。
ビタミンＤは伝統的にくる病、すなわち、不適切な骨の無機質化の病気、の予防のために必須であると考えられてきている。この重要性は、カルシウムの胃腸の吸収の促進におけるビタミンＤの役割および骨の恒常性のための血清カルシウムのレベルの重要性に関連する。最近の証拠は骨芽細胞がビタミンＤ代謝物１α，２５−ジヒドロキシコレカリフェロールのためのレセプターをもつことを示唆し、骨芽細胞がホルモンのための主要な標的であることを示す（Ｓｕｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：５３−５８、１９９２）。ビタミンＤは破骨細胞仲介吸収の骨芽細胞による活性化において重要な部分を演ずると信じられる（Ｗａｔｒｏｕｓら、Ｓｅｍ．ｉｎ  Ａｒｔｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍ．、１９（１）：４５−６５、１９８９）。ビタミンＤは骨芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において使用されてきており（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１８（３）：９４０−９４７、１９８６）そしてアルカリ性ホスファターゼ、すなわち、骨芽細胞の表現型への細胞の分化のマーカー、の増加に関連づけられた。しかしながら、ヒトの骨の細胞において、アルカリ性ホスファターゼの刺激は細胞の分化の減少に関連づけられた（Ｈｕｆｆｅｒ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．、５９（４）：４１８−４４２、１９８８）。頭蓋冠の培養において、ビタミンＤの添加は培地の中へのカルシウムの放出を増加し、そして骨の吸収活性に相関関係づけられた（Ｂｅｌｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７６：１−６、１９８５）。オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、すなわち、骨芽細胞のマーカー、の発現はビタミンＤの誘発を必要とする（Ｙｏｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７：８５２１−８５２６、１９８８）。骨の恒常性におけるビタミンＤの正確な役割およびそれが骨芽細胞および破骨細胞に作用する方法は明らかにすべきままである。
骨の治癒および再生のプロセスにおいて骨芽細胞は重要な役割を有するので、これらの細胞の増殖を増強する能力は望ましい目的に止まる。本発明は、次の詳細な説明および添付図面から明らかなように、この能力および他の有利を提供する。
発明の要約
本発明は、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）を含んでなる組成物の適用により、骨芽細胞の成長を刺激する方法に関する。１つの態様内で、組成物はＰＤＧＦのＡ鎖を本質的に含まない。関係する態様内で、組成物は組換えＰＤＧＦ−ＢＢを含む。他の態様内で、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させる。
本発明の他の面は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の有効量を患者に投与することからなる、患者における骨の成長を刺激する方法を提供する。ある種の好ましい態様内で、ビタミンＤは９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエン−３−オールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールである。
他の面内で、本発明は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の有効量の存在下に特に骨芽細胞を培養することからなり、前記組成物はＰＤＧＦのＡ鎖を本質的に含まない、骨芽細胞の成長を刺激する方法を提供する。
本発明のこれらおよび他の面は、次の詳細な説明および添付図面を参照すると明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ビタミンＤが骨芽細胞における3Ｈ−チミジンの吸収のＰＤＧＦ−ＢＢの刺激を増加することを図解する。
第２図は、有糸分裂誘発の２倍の増加を観察するためには、ＰＤＧＦおよびビタミンＤの両方が同時に存在しなくてはならないことを図解する。
第３図は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤの相乗効果がビタミンＤの濃度とともに変化することを図解する。
第４図は、塩基性ＦＧＦおよびビタミンＤを使用するとき、相乗効果が存在しないことを図解する。
第５図は、ビタミンＤがスイス（Ｓｗｉｓｓ）３Ｔ３線維芽のＰＤＧＦ誘発の有糸分裂誘発に影響を与えることを図解する。
第６図は、マウス骨芽細胞系、ＭＣ３Ｔ３のためのビタミンＤの不存在下におけるよりビタミンＤの存在において、ＰＤＧＦがより大きい倍数で誘発することを図解する。
第７図は、別々の頭蓋冠の培養物に添加するとき、ＰＤＧＦおよびビタミンＤは骨の吸収を刺激するが、一緒に頭蓋冠の培養物に添加したＰＤＧＦおよびビタミンＤは骨の吸収の減少を示すことを図解する。
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＤＧＦおよびビタミンＤが骨芽細胞の成長に対して相乗効果を示すという本発明者らによる発見に一部分基づく。さらに、本発明者らはＰＤＧＦがビタミンＤ誘発の骨の吸収を抑制できることを発見した。前述したように、骨芽細胞は一般に骨の形成および骨の恒常性において主要な役割を演ずる。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養およびｉｎ  ｖｉｖｏで（例えば、骨折の修復において）骨芽細胞の成長を刺激し、これにより治癒を促進するために有用である。
本発明の関係内で、ＰＤＧＦはＰＤＧＦのＡＡ、ＢＢ、およびＡＢイソ型を、個々にまたは組み合わせで、ならびにそれらの生物学的に活性な類似体を包含することが理解されるであろう。さらに、ＰＤＧＦのＢＢイソ型はそのウイルスの相同体（ｖ−ｓｉｓ遺伝子産生物）を包含することが理解される。ＰＤＧＦは天然源または組み換え源から得ることができる。組み換えＰＤＧＦおよびＰＤＧＦの類似体を製造する方法は、米国特許第４，７６９，３２２号；米国特許第４，８０１，５４２号；および米国特許第４，７６６，０７３号および欧州特許（ＥＰ）第２８２，３１７号（これらの全体をここに引用によって加える）に記載されている。ＰＤＧＦは、また、細菌の中で生成することができる（参照、Ｔａｃｋｎｅｙら、ＷＯ第９０／０４０３５号）。天然源からＰＤＧＦを精製する方法は、ＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：５１５４−５１６０、１９８２）、Ｈａｒｔら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１６６−１７２、１９９０）、および米国特許第４，４７９，８９６号に記載されている。
前述の発行された特許のあるものに論じられているように、組み換えＰＤＧＦを発現する真核細胞の分泌経路を利用することによって、生物学的に活性な物質を直接得ることができる。真核細胞からの適当な遺伝子産生物の発現および分泌は適切なプロセシングおよびアセンブリーを可能とし、天然の生物学的に活性なコンフォメーションをもつ分子を生ずる。適当な転写プロモーターおよび分泌シグナルの配列を利用するかぎり、一般に真核細胞は本発明の範囲内の使用のために生物学的に活性な形態でＰＤＧＦを発現しかつ分泌することができる。別法において、ＰＤＧＦのポリペプチド鎖を原核細胞中で発現させ、単離し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで組立てて生物学的に活性な分子を生成する。
酵母中のＰＤＧＦの発現のために、ＤＮＡ配列（例えば、ＰＤＧＦのＡ鎖およびＰＤＧＦのＢ鎖）をエンコードするＤＮＡ配列を適当なプロモーターおよび分泌シグナルの配列に結合する。酵母において利用できるプロモーターは、酵母のアルファ−因子（ＭＦα１）プロモーターおよび酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ１）プロモーター（米国特許第４，５５９，３１１号）を包含する。プロモーターは、また、他の酵母遺伝子、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）またはアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）から得ることができる。また、他の真核生物種のための適当なプロモーターは使用可能であり、そして当業者において明らかである。ＰＤＧＦ遺伝子産生物の分泌は、酵母交配フェロモンのアルファ−因子のｐｒｅｐｒｏ分泌シグナル配列（ＫｕｒｉｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｃｅｌｌ、３０：９３３、１９８２；Ｊｌｉｕｓら、Ｃｅｌｌ、３６：３０９、１９８４；およびＢｒａｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：４６４２、１９８４）、または酵母ＢＡＲ１遺伝子リーダーおよび第３ドメイン配列（参照、米国特許第５，０３７，７４３号）の使用により達成できるが、他の配列シグナル使用できる。ｍＲＮＡの効率よい転写停止およびポリアデニル化を保証するために、酵母ターミネーター配列、例えば、トリオースホスフェートイソメラーゼターミネーターを添加することができる（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：４１９、１９８２）。ＤＮＡ断片の結合方法は詳細に記載されており（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）そして当業者の水準の範囲内に十分に入る。発現単位構成体の調製後、それらを適当な発現ベクターの中に挿入する。
培養単位につきいっそう多い生物学的活性を生成するために、宿主細胞内で安定に維持される発現ベクターを使用することが好ましい。これに関して適当な酵母の発現ベクターはプラスミドｐＣＰＯＴ（ＡＴＣＣ  ３９６８５）およびｐＭＰＯＴ２（ＡＴＣＣ  ６７７８８）であり、これらは解糖酵素のトリオースホスフェートイソメラーゼをエンコードするシゾサッカラロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の遺伝子（ＰＯＴ１遺伝子）を包含する。遺伝子の含有は、米国特許第４，９３１，３７３号（これをここに引用によって加える）に開示されているように、宿主細胞中の遺伝子の欠失を相補するその能力のために、ＴＰＩ遺伝子の欠失を有する宿主細胞の中のプラスミドの安定な維持を保証する。
ＰＯＴ１選択可能なマーカーおよび、例えば、ＴＰＩ１プロモーター、ＢＡＲ１リーダーおよび第３ドメインの配列、ＰＤＧＦをエンコードする適当なＤＮＡ配列、およびＴＰＩ１ターミネーターからなる発現単位を取り込んだＤＮＡ構成体の調製後、構成体はＴＰＩ１遺伝子の欠失をもつ酵母宿主の中に形質転換する。酵母を形質転換する手順はよく知られており、そして文献に記載されてきている。
形質転換された酵母細胞は、ＰＯＴ１遺伝子を選択可能なマーカーとして利用するとき、グルコースを含有する普通の複合培地上で成長させることによって選択することができる。普通の培地、例えば、ＹＥＰＤ（２０ｇのグルコース、２０ｇのバクト−ペプトン、１０ｇの酵母エキス／ｌ）を使用することができる。いったん選択されると、適当な発現構成体を含有する形質転換体を普通の複合培地上で定常期に成長させ、細胞を遠心または濾過により除去し、そして培地を濃縮する。ＰＤＧＦは高度にカチオン性および疎水性のたんぱく質である（ＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ、前掲；Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：７３１４、１９８１；Ｄｅｕｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：８８９６、１９８１）ので、組み換えＰＤＧＦは同様にその精製においてイオン交換クロマトグラフィーの使用を可能とする特性を有する。例えば、酵母発酵ブロス中の組み換えＰＤＧＦ−ＢＢを細胞から分離し、そしてカチオン交換クロマトグラフィーにより分画する。カラムから脱着されたＰＤＧＦ−ＢＢを酸性化し、そしてバッチの条件下に逆相クロマトグラフィーによりさらに分画する。ＰＤＧＦを含有する流出液を酸性化し、そして強いカチオン交換カラムに通過させ、そしてＮａＣｌ段階の勾配で溶離する。流出液を集め、そしてＰＤＧＦ−ＢＢを（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈澱させる。生ずる物質をゲル濾過により脱塩し、そして電荷に従い分離する。流出液を酸性化し、そして強いカチオン交換カラムに適用し、そしてｐＨ８〜１０においてＮＨ4ＨＣＯ3の線状勾配で溶離する。流出液を集め、そしてＰＤＧＦ−ＢＢを（ＮＨ4）2ＳＯ4の添加により沈澱させる。生ずる沈澱を酢酸中に溶解し、そしてゲル濾過により分画する。流出液を脱塩しそして凍結乾燥する。
酵母細胞以外の真核細胞中の生物学的に活性なタンパク質の発現は、適当な発現／調節シグナルの使用して当業者により達成されることができる。ＰＤＧＦ配列の発現を指令することができる転写プロモーターは、特定の真核細胞の型における効率よいおよび／または調節された発現を与えるそれらの能力について選択する。遺伝子産生物を細胞の分泌経路の中に向けることができるシグナル配列を、宿主細胞におけるそれらの機能について選択する。他の有用な調節シグナル、例えば、転写停止シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび転写エンハンサー配列の選択は、個々の当業者にとって明らかである。
組み換えＰＤＧＦは天然のＰＤＧＦと実質的に同一の生物学的活性を有することが示された。ＰＤＧＦの基本的生物学的活性、特に応答性細胞の型（線維芽細胞、骨芽細胞および平滑筋細胞を包含する）における化学走性および有糸分裂誘発の誘発は、組織の修復におけるその役割を包含する、このタンパク質の生理学的役割の多数の下に横たわる。
本発明の好ましい態様の範囲内で、ＰＤＧＦはＡ鎖を本質的に含まない。ＰＤＧＦのホモジマーのイソ形態（ＡＡおよびＢＢ）は相同性であるが、同一ではなく、そしてモノマーは１２．５〜１４．３ｋＤ（Ａ鎖）および１３〜１４ｋＤ（Ｂ鎖）の分子量を有するが、純度はポリアクリルアミドゲル上の単一の、主要なバンドの収量により確認することができる。
本発明のある種の態様の範囲内で利用されるＰＤＧＦ組成物は好ましくは実質的に純粋である、すなわち、それらの治療的使用を妨害する不純物または汚染物質を一般にに含まない。毒性、抗原性、炎症性、パイロジェン性物質または他の有害な物質を含まず、そして９０％より大きい、好ましくは９９％より大きい純度を有する調製物は特に好ましい。
ここにおいて使用するとき、ビタミンＤは化合物の生物学的に活性な形態およびｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的に活性な形態に変換されうるその前駆体の両方を呼ぶ。したがって、ビタミンＤは、なかでも、ビタミンＤ2、ビタミンＤ3およびそれらの活性な代謝物を包含すると理解されるであろう。ビタミンＤ2（９，１０−セコエルゴスタ−５，７，１０［１９］，２２−テトラ−３−オール）はビタミンＤの合成形態（Ｉｎｈｏｆｆｅｎ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．、７２：８７５、１９６０）であり、そしてその生物学的に活性な形態は２５−ヒドロキシエルゴカルシフェロール（Ｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、３５：１８２、１９６９）である。また、これらの化合物の他の代謝可能な形態および類似体を使用することができ、これらは１−α−ヒドロキシビタミンＤ3、２５−ヒドロキシビタミンＤ3、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、２５−ヒドロキシビタミンＤ2、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ2およびこの分野において知られている他のものを包含する。好ましい化合物はビタミンＤ3（９，１０−セココレスタ−５，７，１０［１９］−トリエン−３−オール）であり、そしてこの化合物の生物学的に活性な形態、すなわち、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールは最も好ましく、それらの両方は商業的に入手可能である。
１つの態様内で、本発明はｉｎ  ｖｉｖｏで骨芽細胞の成長を刺激する働きをする。骨芽細胞が一次培養物、すなわち、細胞の型の異質集団を含有する組織から直接得られた培養物、から誘導されることがしばしばある。骨組織からの一次培養物は溶骨細胞、線維芽細胞、骨芽細胞の子孫細胞および内皮細胞を含有することができる。一次培養物はいくつかのこの分野においてよく知られている方法により確立することができる。例えば、粉砕しそしてコラゲナーゼの存在下にインキュベーションした胎児頭蓋冠を使用して一次培養物を確立することができる。コラゲナーゼ消化により解放される細胞を集めそして培養する（Ａｕｂｉｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、９２：４５２−４６１、１９８２）。別法は新しく分離した骨のチップを使用し、これらをコラゲナーゼ処理しそして洗浄し、次いで培養して骨にチップからの細胞の移動およびコラゲナーゼ処理後に骨芽細胞の成長について選択する低いＣａ++の培地の使用を可能とする（Ｒｏｂｅｙら、Ｃａｌｉｆ．Ｔｉｓｓ．、３７：４５３−４６０、１９８５）。一次培養物内の骨芽細胞の同定は主として表現型である。骨芽細胞の表現型のマーカーは、アルカリ性ホスファターゼの発現（Ｍａｎｄｕｃａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、８：２８１、１９９３）、１型コラーゲンの合成（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１８（３）：９４０−９４７、１９８６）、オステオカルシンの産生（Ｙｏｏｎら、前掲）および副甲状腺ホルモンに対する応答（Ａｕｂｉｎら、前掲）を包含する。骨芽細胞は典型的には３７℃において５％ＣＯ2中で増殖培地の中で培養し、ここで増殖培地は炭酸源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび一般に胎児仔ウシ血清により供給される成長因子を含む。種々の適当な培地はこの分野において知られている。
本発明は、また、確立された骨芽細胞系の成長を刺激するために使用できる。このような細胞系の例は次のものを包含する：Ｓａｏｓ−２、ヒト一次骨原性肉腫（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ  ８５）；Ｕ−２  ＯＳ、ヒト一次骨原性肉腫（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ  ９６４）；ＨＯＳ（ＴＥ８５）、ヒト骨肉腫（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １４２７）およびＵＭＲ  １０６、ラット骨肉腫（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６６１）。
本発明の他の態様において、ＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物を治療薬として使用して骨芽細胞仲介の骨の形成を増強する。本発明の方法は骨の欠陥および欠損、例えば、閉鎖骨折、解放骨折および非結合骨折において起こるもの、の修復を促進するために；形成外科における骨の治癒を促進するために；非セメント人工関節および歯の移植片の中への骨の内部成長を刺激するために；歯周の病気および欠陥の処置において；伸延骨形成の間の形成を増加するために；および骨芽細胞の活性の刺激により処置できる他の骨格の疾患、例えば、オステオポローシスおよび関節炎の処置において；適用することができる。
本発明の組成物は局所的または全身的に投与できる。局所的投与は、障害または欠陥の部位における注射によるか、あるいはその部位における固体担体の挿入または取り付けによるか、あるいは粘性液体の直接の、局所的適用によることができる。
生物学的に活性なＰＤＧＦおよびビタミンＤの創傷部位への送り出しは、調節して解放される組成物、例えば、係属中の米国特許出願第０７／８７１，２４６号（ＷＩＰＯ公開ＷＯ９３／２０８５９号）（この全体をここに引用によって加える）に記載されている組成物の使用により増強することができる。簡単に述べると、ＰＤＧＦを含有する生物分解性フィルム、例えば、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリジオキサノンまたはポリ酢酸／ポリグリコール酸のコポリマーのフィルムを製造しそして取り付けのためにピン、プレート、ネジなどに製作するか、あるいは骨の中に挿入する。これらの組成物は標的部位においてＰＤＧＦを持続的に放出する。５０：５０のＰＬＡ：ＰＧＡフィルムが好ましい。これらのフィルムはさらに担体、例えば、アルブミン、ポリオキシエチレンソルビタンの洗浄剤またはグルタミン酸を含むことができる。アルブミンを含有させるとき、ＰＤＧＦ／アルブミンの比は、一般に、０．１２５〜２．５μｇ／ｍｌの間に維持されるであろう。原理的には、ポリマーの分解を増強する物質はフィルムの中に孔をつくるか、あるいはフィルムへの１または２以上の成長因子の吸収を減少する物質を担体として使用できる。アルブミンは特に好ましい担体である。担体として有用であるポリオキシエチレンソルビタンの洗浄剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレエートを包含する。
この型のフィルムは人工装置および外科用移植片のためのコーティングとして特に有用である。フィルムは、例えば、外科用ネジ、ロッド、ピン、プレートなどの外表面の回りに巻き付けることができる。この型の移植可能な装置を整形外科において日常的に使用される。フィルムは、また、骨充填物質、例えば、ヒドロキシアパタイトのブロック、脱ミネラル化骨マトリックスのプラグ、コラーゲンマトリックスなどをコーティングするために使用できる。一般に、ここに記載するフィルムまたは装置は骨に骨折部位において骨に適用される。適用は、一般に、標準の外科的手順を使用する骨の中への移植または表面への取り付けによる。
コポリマー、前述の成長因子および担体に加えて、フィルムは他の活性または不活性の成分を含むことができる。組織の成長または浸潤を促進する因子は特に重要である。骨の成長を促進する因子、例えば、骨の形態発生タンパク質（米国特許第４，７６１，４７１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３６６号）、オステオゲニン（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７１０９−７１１３、１９８７）およびＮａＦ（Ｔｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．、２３：５７１−５８９、１９８９）は特に好ましい。
フィルムを負荷するために、ＰＤＧＦおよび担体を粉剤または液体溶液としてフィルムに適用する。例えば、液化ＰＤＧＦおよびアルブミンをフィルムの１つの表面の上に均一に分散させ、そしてフィルムを上に折り畳むことができる。別法において、タンパク質を水溶液（例えば、リン酸塩緩衝液または０．１Ｍの酢酸中の）として適用することができ、これらの溶液を乾燥する。
ＰＤＧＦを含有する生物分解性物質を、また、この分野において知られている手順に従い種々の移植片に成形することができる。ピン、プレート、ブロック、ネジなどを、骨折または他の欠陥の部位において骨の中に挿入するか、あるいは骨に取り付けるために製作することができる。
生物分解性物質は、典型的には、０．０３７５〜１．２５μｇのＰＤＧＦ／ｍｇのコポリマーを含有するように配合する。
ＰＤＧＦおよび／またはビタミンＤの局所的送り出しの別法は、ＡＬＺＥＴ浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州パロアルト）；持続放出性マトリックス物質、例えば、Ｗａｎｇら（ＷＯ第９０／１１３６６号）に開示されているもの；Ｂａｏら（ＷＯ第９２／０３１２５号）に開示されているような帯電デキストランのビーズ；例えば、Ｋｓａｎｄｅｒら（Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ、．２１１（３）：２８８−２９４、１９９０）に開示されているようなコラーゲンに基づく送り出し系；Ｂｅｃｋら（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、６（１１）：１２５７−１２６５、１９９１）に開示されているようなメチルセルロースゲル系およびＥｄｅｌｍａｎら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１２：６１９−６２６、１９９１）に開示されているようなアルギン酸塩に基づく系の使用を包含する。骨における持続局所的送り出しのためのこの分野においてよく知られている他の方法は、含浸できる多孔質被覆金属プロテーゼおよび治療組成物を内部に混入した固体のプラスチックロッドを含む。
本発明の全身的に投与される組成物の送り出しは、ＰＤＧＦおよびビタミンＤの一方または両方をターゲッティング分子に結合することによって増強することができる。「ターゲッティング分子」は問題の組織に結合する分子を意味する。例えば、骨ターゲッティング分子は、テトラサイクリン；カルセイン；ビスホスホネート；ポリアスパラギン酸；ポリグルタミン酸；アミノホスホ糖類；骨のミネラル相に関連することが知られているペプチド、例えば、オステオネクチン、骨シアロタンパク質およびオステオポンチン；骨特異的抗体；ミネラル結合ドメインをもつタンパク質などを包含する。参照、例えば、Ｂｅｎｔｚらの開示（欧州特許（ＥＰ）第０５１２８４４号）およびＭｕｒａｋａｍｉら（欧州特許（ＥＰ）第０３４１９６１号）。
本発明の範囲内で使用する組成物は、製剤学的に許容されうる塩類、殊に有機酸および鉱酸の塩類を包含する酸付加塩の形態であることができる。このような塩類の例は、有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸などを包含する。塩基性アミノ酸残基のアミノ酸配列はペプチドを当業者によく知られている手順に従い適当な酸またはミネラルで処理することによって調製するか、あるいは所望の塩は適当な酸を凍結乾燥することによって直接得ることができる。これらの塩類はさらに注射可能な調製物、局所薬および本発明の組成物の局所的または全身的デリバリーのための水溶液において使用することができる。注射可能な調製物および局所薬の製造のための材料および方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５（この全体をここに引用によって加える）の中に見出すことができる。
本発明の範囲内で、組成物の「有効量」は満足に有意な作用を生成する量である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞の成長を刺激するために使用するとき、3Ｈ−チミジンの取り込みにより測定して、ＰＤＧＦの存在およびビタミンＤの不存在下に成長した細胞に比較して、少なくとも５０％の成長の増加を生成することが一般に望ましい。治療的使用のために、「有効量」は骨折の修復において治癒速度の臨床的に有意な増加、オステオポローシスにおける骨の損失の逆転、非結合骨折における骨の形成および伸延骨形成の刺激および／または増大、人工装置の中への骨の成長および歯の欠陥の修復の増加および／または加速を提供するために要求されるＰＤＧＦおよびビタミンＤを含んでなる組成物の量である。このような量は、一部分、処置すべき特定の状態および当業者にとって明らかな他の因子に依存するであろう。例えば、オステオポローシスにおいて、骨の形成の増加は処置群と対照群との間の骨の質量における統計学的に有意な差として発現される。これは、例えば、骨の質量の１０〜２０％またはそれ以上の増加として見ることができる。治癒における臨床的に有意な増加の他の測定は、例えば、破壊の強さおよび張力、破壊の強さおよびねじれ、４点の曲げについての試験、およびこの分野においてよく知られている生物機械的試験を包含することができる。処置の養生法のための一般的指針は、問題の疾患の動物モデルにおいて実施する実験から得られる。
７０ｋｇの患者の全身的処置のためにビタミンＤの好ましい投与量の範囲は、約１ｎｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０ｎｇ〜約５００μｇ、そして最も好ましくは約２０ｎｇ〜１μｇである。ＰＤＧＦと組み合わせたビタミンＤの局所的適用のためのビタミンＤについて好ましい投与量の範囲は、約１ｎｇ〜１ｍｇ、好ましくは約５ｎｇ〜約５００μｇ、そして最も好ましくは約１０ｎｇ〜１００ｎｇである。
７０ｋｇの患者の全身的処置のためにＰＤＧＦの好ましい投与量の範囲は、約１ｐｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約１００ｐｇ〜約１ｍｇ、最も好ましくは約１０ｎｇ〜１００μｇである。ビタミンＤと組み合わせたＰＤＧＦの局所的適用のための好ましい投与量の範囲は、約１ｎｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは約１０μｇ〜５００ｎｇである。一般に、持続放出性組成物は述べた範囲の上限における投与量を提供するように配合されるであろう。投与量は放出速度に調節されるであろう。液体組成物は典型的には１〜１００μｇ／ｍｌのＰＤＧＦ、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍｌを含有するであろう。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＤＧＦ濃度について好ましい範囲は約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌそして最も好ましくは６ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌである。
ＰＤＧＦおよびビタミンＤの相乗効果は６：０．１〜６：１０００（ＰＤＧＦ：ビタミンＤ）、好ましくは６：１〜６：５００、より好ましくは６：１０〜６：１００、最も好ましくは約６：４０の比でＰＤＧＦおよびビタミンＤを組み合わせることによって最もく得られることが発見された。
前述の組成物は、処置すべき状態に依存して、１日から６カ月またはそれ以上にわたって投与される。一般に、投与量は５回／日〜１回／月そして好ましくは１回／日〜１回／月で、治癒が実質的に完結するまで、投与されるであろう。実際の処置の養生法は、因子、例えば、患者の年令および一般的状態、処置すべき状態、および送り出しのルートに依存するであろう。処置の養生法の決定は当業者のレベルの範囲内である。
本発明を次の非限定的実施例により例示する。
実施例Ｉ
ブタの一次骨芽細胞培養物を確立した。未成熟ブタ（ほぼ３０ポンド）の大腿骨から小柱の骨の部分を取り出した。骨を小さいチップ、ほぼ２×２ｍｍに切断し、そしてリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で室温において多数回洗浄してすべての血液を除去した。骨をチップを、ダルベッコ培地（ＤＭＥＭ）（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ワシントン州シアトル）中で希釈しそして使用前に滅菌濾過した１ｍｇ／ｍｌのクロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミゾリー州セントルイス）の中にいれた。チップをコラゲナーゼ培地の中で３７℃において震盪しながら２時間インキュベーションした。コラゲナーゼのインキュベーション後、培地を除去し、そして骨のチップをＰＢＳの中に入れ、そして洗浄培地の中に細胞がそれ以上存在しなくなるまで洗浄した。
チップを１０％の胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ロウガン）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび０．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンを含有する低濃度のイーグル−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）の中に入れ、そして３７℃および５％ＣＯ2においてインキュベーションした。培地を４〜５日毎に交換した。骨のチップからの骨芽細胞の移動は７〜１０日に見られた。細胞はいったんコンフルエントになったときアッセイのために直ちに使用し、次いで廃棄した。
細胞をアルカリ性ホスファターゼの発現について試験して、骨芽細胞の表現型を確証した。ＡＰ組織化学的染色キット（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス）を製造業者の使用説明書に従い使用して、組織化学的染色を実施した。結果は異質一次細胞集団の３０〜７０％がアルカリ性ホスファターゼ陽性であり、そして細胞密度の増加がＡＰ＋細胞の百分率を増加することを示した。
実施例ＩＩ
ブタ一次骨芽細胞（前述したように調製した）を、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、および１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール単独の存在下に相対的有糸分裂誘発活性について試験した。有糸分裂誘発活性をＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０９：７４９−７７３、１９８５）の方法に基づく3Ｈ−チミジンの取り込みの測定によりアッセイした。簡単に述べると、細胞を３×１０4細胞／ｍｌの密度で９６ウェルのプレート中の１０％胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）を含有するイーグルＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）の中にプレートし、そして３〜４日間それらを成長させることによって、休止一次ブタ骨芽細胞を得た。培地を除去し、そして０．１％のＦＣＳを含有するＤＦＣ（表１）の１８０μｌ／ウェルを添加した。ウェルの半分はそれらに添加された１０ｎＭの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（Ｂｉｏｍｏｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ペンシルベニア州プライモスミーティング）を有した。細胞を３７℃において５％ＣＯ2中で３日間インキュベーションした。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールをエタノール中に溶解させたので、他の組のウェルを１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの添加により導入したのと等しい量のエタノールを含有する対照として調製した。２０μｌの１０×ＰＤＧＦを最終濃度が０．２〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲であるように添加した。添加したＰＤＧＦ−ＢＢを含まずかつ＋／−ビタミンＤ添加の陰性の対照を構成した。プレートを３７℃において２０時間インキュベーションしそして培地を除去した。０．１％のＦＣＳおよび２μＣｉ／ｍｌの3Ｈ−チミジンを含有するＤＦＣの１００μｌを各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃においてさらに３時間インキュベーションした。培地を吸収除去し、そして１５０μｌのトリプシンを各ウェルに添加した。細胞が分離するまで（少なくとも１０分）プレートを３７℃においてインキュベーションした。分離した細胞をＬＫＢワラック（Ｗａｌｌａｃ）１２９５−００１細胞収獲器（ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、マリイランド州ガイサーバーグ）を使用してフィルターの中に収獲した。フィルターを高周波炉中の加熱により１０分間乾燥し、そしてＬＫＢベータプレート（Ｂｅｔａｐｌａｔｅ）１２５０シンチレーションカウター（ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ）中で供給会社が記載するように計数した。
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第１図に図解する結果が示すように、ＰＤＧＦ−ＢＢは一次ブタ骨芽細胞培養物におけるチミジンの吸収を刺激する。最大の刺激は６〜１０ｎｇ／ｍｌにおいて起こる。１０ｎＭの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールをＰＤＧＦとともに含有させると、チミジンの最大吸収は２倍となる。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール単独の存在下に、成長の刺激は観察されなかった。
実施例ＩＩＩ
相乗成長効果を観察するためには１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦが同時に存在しなくてはならないかどうかを決定するために、次の変更を加えて有糸分裂誘発アッセイを実施例ＩＩに記載するように実施した：ａ）１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの最終濃度は１００ｎＭであった；ｂ）１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールで細胞を前処理するために使用した培地を除去しそしてＰＤＧＦの適当な希釈物のみを含有する新鮮な培地を添加することによって、ＰＤＧＦの存在下に１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを含まない追加の組のウェルを調製した。
第２図に図解する結果が証明するように、有糸分裂誘発の２倍の増加を観察するためには、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの両方が存在しなくてはならない。
実施例ＩＶ
一次ブタ骨芽細胞上のＰＤＧＦ誘発有糸分裂誘発への１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの効果が投与量依存性であるかどうかを決定するために、次の変更を加えてアッセイを実施例ＩＩに記載するように実施した：ａ）１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの濃度は０．０１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲でありそしてｂ）ＰＤＧＦは６．２ｎｇ／ｍｌの単一濃度で存在した。第３図に図解する結果が証明するように、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの相乗効果は１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの濃度とともに変化する。
実施例Ｖ
ビタミンＤを使用して見られる効果がＰＤＧＦについて特異的であるかどうか決定するために、ビタミンＤを塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と組み合わせて試験した。ヒト組み換え塩基性ＦＧＦ（ＢＲ−ＧＩＢＣＯ）を、実施例ＩＩに記載する有糸分裂誘発アッセイにおいて、０．４ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で試験した。第４図に図解する結果が示すように、塩基性ＦＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを使用するとき、効果は存在しない。
実施例ＶＩ
線維芽細胞、すなわち、骨からの一次培養物中の潜在的汚染細胞型が、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを使用して見られた相乗効果の原因となるかどうかを決定するために、アッセイを実施した。マウス線維芽細胞の細胞系スイス３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ９２）を使用して、繊維芽細胞を１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３×１０4細胞／ｍｌの密度でプレートした以外、実施例ＩＩに記載するようにアッセイを実施した。第５図に図解する結果が証明するように、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールはこれらの線維芽細胞のＰＤＧＦ誘発有糸分裂誘発に影響を与えない。
実施例ＶＩＩ
１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦの相乗効果が骨芽細胞において見られることを評価するために、確立された骨芽細胞のマウス細胞系、ＭＣ３Ｔ３（Ｓｕｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９６：１９１−１９８、１９８３）を使用した。細胞を１０％のＦＣＳを含むα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中で３×１０4細胞／ｍｌの密度でプレートする以外、本質的に実施例ＩＩに記載するようにアッセイを実施した。スイス３Ｔ３線維芽細胞および一次ブタ骨芽細胞の両方と対照的に、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールはＭＣ３Ｔ３細胞の成長を阻害した。したがって、データをチミジンの吸収の誘発倍数で分析した。誘発倍数はＰＤＧＦの存在下に取り込まれた3Ｈ−チミジンのｃｐｍ／ＰＤＧＦの不存在下に得られたものの比として定義される。第６図に図解する結果が示すように、ＰＤＧＦはビタミンの不存在下より１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの存在下により大きい誘発倍数で誘発する。
実施例ＶＩＩＩ
ブタ一次骨培養物中の骨芽細胞がＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールに対して応答することを評価するために、アッセイを有糸分裂誘発およびアルカリ性ホスファターゼの発現について実施した。ブタ一次骨細胞を同一細胞内の3Ｈ−チミジンの吸収および骨芽細胞マーカーのアルカリ性ホスファターゼの発現についてアッセイした。次の例外を使用して前述したようにブタ一次骨細胞をプレートしそして処理した：ａ）細胞をラブ−テク（Ｌａｂ−ｔｅｋ）チャンバースライドＮｏ．１７７４４５（Ａｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ワシントン州シアトル）中でプレートした；ｂ）１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの単一濃度を使用した；そしてｃ）１０ｎＭの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの単一濃度を使用した。3Ｈ−チミジンの取り込み後、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、そして前述したようにアルカリ性ホスファターゼの発現について染色した。染色後、スライドを空気乾燥しそしてＮＴＢ３エマルジョン（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州ロチェスター）で被覆した。エマルジョンを空気乾燥し、そしてスライドを４℃において配置し、そして１週間露出した。露出後、スライドを室温においてＤ−１９現像液（Ｋｏｄａｋ）中で５分間現像し、水中ですすぎ、そして急速定着液中で５分間定着した。原液を水中で１：１００に希釈しそして細胞に１分間適用することによって、スライドをメチレンブルー（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。
アルカリ性ホスファターゼを発現する細胞（ＡＰ＋）はそれらのピンク色で同定されたが、取り込んだ3Ｈ−チミジンを有する細胞はそれらの核の上の銀粒子の蓄積により同定された。ＰＤＧＦ−ＢＢの不存在下に、細胞の２〜４％のみが3Ｈ−チミジンを取り込み、そしてこの百分率は１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの添加により影響を受けなかった。ＰＤＧＦ−ＢＢの添加は、取り込まれた3Ｈ−チミジンを有する細胞の百分率をほぼ３倍増加した。ＡＰ＋およびＡＰ−の両方の細胞はＰＤＧＦ−ＢＢに対して応答性であった。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの存在または不存在下にＰＤＧＦに応答する取り込んだ3Ｈ−チミジンを有するＡＰ＋細胞の百分率を計算した。同様な計算をＡＰ−細胞について行った。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの添加は取り込まれたチミジンを有するＡＰ＋細胞の数をほとんど２倍に増加したが、より適度な増加はＡＰ−細胞について観察された。これらの結果が証明するように、ＡＰのそれらの発現により同定される、培養物中の骨芽細胞は１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦ−ＢＢに対して相乗的応答を示す。１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールおよびＰＤＧＦ−ＢＢに対する相乗的応答を示すＡＰ−細胞の同一性は、骨芽細胞がそれらの分化のすべての段階においてＡＰを発現しないので、骨芽細胞であるか、あるいは骨芽細胞でないことがある。
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実施例ＩＸ
ビタミンＤは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの頭蓋冠アッセイに添加したとき、骨の吸収の効力のある刺激因子であることが知られており、そしてＰＤＧＦはこのアッセイにおいて適度な骨吸収作用を有することが示された。骨の吸収は骨の形成の刺激と矛盾するので、骨の吸収アッセイにおけるＰＤＧＦとビタミンＤとの相互作用の評価を行った。
矢状縫合とともに頭頂骨を含む頭蓋冠を、４日齢のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）から集めた。１ｍｌの成長培地（ＤＭＥＭ、０．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１５％の熱不活性化ウマ血清（ＨＩＨＳ））を有する６ウェルのペトリ皿（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、イリノイ州マクグローパーク）の中に骨を入れ、そして３７℃において５％ＣＯ2中でおだやかに振とうしながら２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、培地をウェルから除去し、そして２００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ、１０-8Ｍの１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、あるいはＰＤＧＦおよびビタミンＤの両方を含有する１．５ｍｌの成長培地と置換した。５つの骨が各試料群に存在し、そして群を揺動しながら３７℃、５％ＣＯ2において７２時間インキュベーションした。インキュベーション後、培地をウェルから取り出し、そして製造業者の使用説明書に従いＮＯＶＡ−７合計のカルシウム分析器（ＮＯＶＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、マサチュセッツ州ウォルサム）を使用してＣａ++レベルについて分析した。試料培地に加えて、２４時間のインキュベーションからの培地を分析して、骨のいずれもが収集プロセスの間に損傷されなかったがことを保証した。損傷した骨は高いレベルのカルシウムを培地の中に放出し、そして最終の分析において使用しなかった。
第７図に示す結果が示すように、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールの両方は、頭蓋冠に別々に添加したとき、骨の吸収を刺激した。しかしながら、ＰＤＧＦおよび１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールを組み合わせで添加したとき、ビタミンＤで見られた骨の吸収によるＣａ++の解放のレベルは減少し、ＰＤＧＦの阻害作用を示した。
実施例Ｘ
多孔質ヒドロキシアパタイトの移植片の中への骨の内部成長を相乗的に増加するＰＤＧＦおよびビタミンＤの能力を試験するために、長さ２５ｍｍおよび４ｍｍの公称直径の円筒形移植片を１９０〜２３０μｍの孔大きさの（Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ、カリフォルニア州アービン）ヒドロキシアパタイトから機械加工した。円筒は直径１０ｍｍおよび３ｍｍのアンダーカット領域を含有する。移植片をＰＤＧＦの溶液に浸漬することによって、移植片にＰＤＧＦを付加させ、これは０．５〜５０ｎｇ／移植片の投与量を生ずる。ビタミンＤをＡＬＺＥＴミニポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）により局所的に投与しそして１０〜１００ｎｇ／移植片のビタミンＤの投与量を生成する。ＰＤＧＦ／ビタミンＤの投与量の比は１：６である。賦形剤を負荷した移植片を対照として使用する。
２４匹の平均体重３．５ｋｇの骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギを研究において使用する。５．０ｍｇ／ｋｇのキシラジンおよび３５．０ｍｇ／ｋｇのケタミンを各棘近傍筋の中に半分の投与量で注射することによって、麻酔を実施する。次いで動物に挿管し、そしてハロタンガスを使用して麻酔を維持する。
遠位アプローチ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１０：５８８−５９５、１９９２）を使用して、髄内移植片を挿入する。２．５ｃｍの横方向の膝蓋骨近傍の切開を行って、膝が膝蓋骨の腱の横方向に沿って入るようにする。膝蓋骨を脚と中間に延長して変位させる。４．０ｍｍのきり先を大腿骨の顆の間に、直接に近位させて導入する。関節軟骨および骨幹端骨をいったん通過したとき、孔を空けて髄内の位置決めを確証する。移植片を挿入し、そしてその最終位置に近位的に押す。骨ろうを使用して遠位入口孔をふさぐ。創傷を４−０吸収性縫合糸およびステンレス鋼の縫合糸で層状に閉じた。
分析は組織学的および生物機械的である。断面の切片を作って移植片を有する３．５ｍｍの長さの大腿骨の標本を生成し、こうして次の領域を研究できるようにする：基部の大腿骨の小柱領域に隣接する、ギャップ部位におけるおよび大腿骨の中央基部の骨内膜の皮質に隣接する。各部位について、標本を２つに切断し、一方を組織学のために使用し、そして他方を生物機械的研究に使用する。各実験部位を対側の大腿骨からの賦形剤負荷対照と比較する。
組織学的標本をリン酸塩緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてアルコール（ＥｔＯＨ）の上昇する系列中で脱水する：２４時間の間９５％のＥｔＯＨ、次いで各２４時間の間１００％のＥｔＯＨ中で３回の交換。最後の１００％のＥｔＯＨの処理後、標本を２回の交換のキシレン中で各２４時間の間清浄にする。プラスチックの埋め込みのための組織の浸潤を実施する。標本をプラスチックロッドにおいて横方向に切断するために配向し、そして室温においてメタクリレートプラスチックの中に真空デシケーターの中で窒素雰囲気下にＢａｉｎら（Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、６５（４）：１５９、１９９０）に開示されているように埋め込んだ。各サンプリング部位から、１５０μｍの切片を低速ダイヤモンド車のノコギリ（Ｓｔｒｕｅｒｓ  Ａｃｃｕｔｏｍ−２、カリフォルニア州トランス）を使用して調製する。次いで、１２００グリットのエメリークロスで被覆した２枚のガラス板の間で、厚い切片をほぼ３０μｍに手で磨いた。磨いた切片をイムノ−マウント（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍｏｕｎｔ）（Ｓｈａｎｄｏｎ、ペンシルベニア州ピッツバーグ）でガラススライド上にマウントする。
オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＢＨ−２光／エピフルオレセント顕微鏡（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、ワシントン州レドモンド）を有するカメラルシダーを経てインターフェースされたバイオクアント（Ｂｉｏｑｕａｎｔ）骨形態測定プログラム（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．、テネシー州ナッシュビレ）を使用して、移植片の中への骨の内部成長についての区域の性質および骨の形成の動的指数を決定する。蛍光顕微鏡検査により４０×の倍率で合計の骨の内部成長を測定する。ミネラルの付着および骨の形成のパラメーターをｉｎ  ｖｉｖｏの蛍光色素の標識から１００×の倍率で決定する。移植片の界面における平均の標識間の幅を標識間の時間で割って、ミネラルの付着速度を計算する。新しく形成した骨（すなわち、蛍光色素が結合した骨）の面積を追跡しそして合計の新しい骨の面積を標識間の時間で割ることによって、合計の骨の形成速度を決定する。
骨髄の内部成長をプッシュアウト試験を使用して機械的に評価する。試験すべき標本をインストロン試験装置にマウントし、そして一定の力を０．５ｍｍ／秒で移植片の中央に加える。Ｋｎｏｗｌｅｓｓら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１３（８）：４９１−４９６、１９９２）に開示されているように、当業者によく知られている生物機械的試験法を使用して、移植片をプッシュアウトするために要求される力を決定する。
実施例ＸＩ
ＰＤＧＦ、ビタミンＤまたはＰＤＧＦおよびビタミンＤの組み合わせを使用して、新生児のラットの大腿骨および５週齢のマウスの頭蓋冠における骨膜の骨の形成を刺激するＰＤＧＦ−ＢＢおよびビタミンＤの能力を試験する。大腿骨における試験のために、使用したＰＤＧＦの投与量の範囲は２〜２００ｎｇ／日である。使用したビタミンＤの投与量の範囲は２０ｎｇ〜２μｇ／日である。新生児のラットの子（２〜３日齢）において骨膜の中に左大腿骨の中央後面に化合物を連続１０日間注射する。対側の大腿骨は賦形剤の対照として働く。テトラサイクリン（１０ｍｇ／ｋｇ）を第５日に腹腔内注射しそしてカルセイン（１０ｍｇ／ｋｇ）を第１７および２２日に腹腔内注射することによって、骨を組織形態測定のために標識化する。８匹のラットの子を各処置群のために使用する。第２４日に、動物を安楽死させ、そして両方の大腿骨を取り出し、そして脱カルシウムしない骨の組織形態測定のために処置する。
ＰＤＧＦ、ビタミンＤまたはＰＤＧＦとビタミンＤとの組み合わせを矢状縫合の上に横たわる骨膜組織の中に皮下注射することによって、頭蓋冠における骨の形成の検査を行う。注射を１０日間１日１回実施する。使用するＰＤＧＦの投与量範囲は２〜２００ｎｇ／日である。使用するビタミンＤの投与量範囲は２０ｎｇ〜２μｇ／日である。第１日にテトラサイクリンを腹腔内注射しそしてカルセインを第１８および２５日に腹腔内注射することによって、新しい骨の形成を測定のために標識化する。マウスを第２８日に殺し、そして頭蓋冠を収獲し、そして組織学的評価のために処理する。
上の発明は理解を明瞭とするために例証および実施例により多少詳細に記載したが、本発明の範囲内である種の変化および変更を実施できることは明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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