(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rhodococcus globerulus K1/1（DSM10337）由来のアミンアシラーゼを含む、アミンアシラーゼ活性を示すがリパーゼまたはエステラーゼ活性を示すことのない、バイオ触媒であって、
式（１）
【化１】
0003608798.tif 000053
［式中、R2はアリールまたはアリール（C1−C4）アルキルであるか；またはR1とR2は一体となって、アリールにより置換されているかまたはアリールと縮合している５−７員環を形成し；
R3はC1−C4アルキルであり；そして
R1およびR3は共に天然アミノ酸の誘導体ではない式（１）で示される化合物が形成されるように選択される；
ただし、各々の基は置換または非置換である。］
で示されるラセミアシルアミドを立体選択的に加水分解することができるもの；ただし、上記アミンアシラーゼは次の特性を有する：
分子量:54.6kD（SDS−PAGE）;92.3kD（ゲル濾過）
等電点:pH4.0
至適pH:7.0−7.5
温度安定性：〜50℃（30分）で良好な活性維持
Ｎ末端アミノ酸配列：配列番号１。
【請求項２】
Ｒhodococcus equi Ac6（DSM10278）由来のアミンアシラーゼを含む、アミンアシラーゼ活性を示すがリパーゼまたはエステラーゼ活性を示すことのない、バイオ触媒であって、
式（１）
【化２】
0003608798.tif 000054
［式中、R2はアリールまたはアリール（C1−C4）アルキルであるか；またはR1とR2は一体となって、アリールにより置換されているかまたはアリールと縮合している５−７員環を形成し；
R3はC1−C4アルキルであり；そして
R1およびR3は共に天然アミノ酸の誘導体ではない式（１）で示される化合物が形成されるように選択される；
ただし、各々の基は置換または非置換である。］
で示されるラセミアシルアミドを立体選択的に加水分解することができるもの；ただし、上記アミンアシラーゼは次の特性を有する：
分子量:94,000±3,000
等電点:pH3.5
至適pH:6.0−8.5
温度安定性：〜37℃（４時間）で良好な活性維持
Ｎ末端アミノ酸配列：配列番号２。
【請求項３】
Arthrobacter aurescens AcR5b（DSM10280）由来のアミンアシラーゼを含む、アミンアシラーゼ活性を示すがリパーゼまたはエステラーゼ活性を示すことのない、バイオ触媒であって、
式（１）
【化３】
0003608798.tif 000055
［式中、R2はアリールまたはアリール（C1−C4）アルキルであるか；またはR1とR2は一体となって、アリールにより置換されているかまたはアリールと縮合している５−７員環を形成し；
R3はC1−C4アルキルであり；そして
R1およびR3は共に天然アミノ酸の誘導体ではない式（１）で示される化合物が形成されるように選択される；
ただし、各々の基は置換または非置換である。］
で示されるラセミアシルアミドを立体選択的に加水分解することができるもの：ただし、上記アミンアシラーゼは次の特性を有する：
分子量:220,000±10,000（ゲル濾過）；小サブユニット、16,000±1,000（SDS−PAGE）；大サブユニット、89,000±3,000（SDS−PAGE）
至適pH:7.5−9.0
温度安定性：〜30℃（30分）で良好な活性維持
Ｎ末端アミノ酸配列：小サブユニット、配列番号3;大サブユニット、配列番号４。
【請求項４】
反応（Ａ）
【化４】
0003608798.tif 000056
［式（１）から（４）において、R1は水素、C1−C8アルキル、C2−C8アルケニル、C1−C8アルコキシ、C2−C8アルキルカルボキシまたはカルボキシであり；
R2はC1−C4アルキル、C1−C4アルコキシ、C1−C4ヒドロキシアルキル、C1−C4アミノアルキル、C1−C4ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲノ、ニトロ、スルホまたはシアノで置換されていることもあるアリールまたはアリール（C1−C4）アルキルであり；または
R1およびR2は一体となって、アリールにより置換されているかまたはアリールと縮合している５−７員環を形成し、ここで環は窒素、硫黄および酸素から選択した１または２つのヘテロ原子を含むことができ；および
R3はC1−C4アルキルである。］
を触媒することができる、請求項１〜３のいずれか記載のバイオ触媒。
【請求項５】
R1が水素、C1−C4アルキル、C2−C4アルケニル、C1−C4アルキルまたはC2−C4アルコキシカルボキシである、請求項１〜４のいずれか記載のバイオ触媒。
【請求項６】
R2が式
【化５】
0003608798.tif 000057
［式中、
R4は水素またはC1−C4アルキルであり；
ｎは０、１、２、３および４から選択される整数であり；
R5およびR6は各々独立して水素、C1−C4アルキル、C1−C4ハロアルキル、ハロゲノ、アミノ、シアノ、ニトロまたはC1−C4アルコキシである。］
で示される基からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか記載のバイオ触媒。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の精製されたバイオ触媒。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のバイオ触媒を使用してラセミＮ−アシルアミドを加水分解することを特徴とする、ラセミＮ−アシルアミドの加水分解方法。
【発明の詳細な説明】
治療効果のない方のエナンチオマーによる副作用をなくした、エナンチオマー的に純粋な医薬的および農芸化学的薬剤の高くかつ継続的な需要がある。本発明は、立体選択的にラセミアシルアミドを加水分解できる新規な酵素を提供することにより、かかる需要を充足する。
今日までは、アミンまたはアミン誘導体に関する酵素反応は、ペニシリン、セファロスポリン、グルコサミン、アミノ酸、およびその誘導体に関してのみ文献で報告されてきた。この分野での公知の例には、微生物起源のアシラーゼにより適当なＮ−アシル誘導体を加水分解することによるラセミ２−アミノブタノールの分割（日本公開番号JP58−198,296およびJP59−39,294）、およびオメガアミノ酸トランスアミナーゼの作用が関与する過程により二級炭素原子上にアミノ基を有する異なるアミンのエナンチオマーが多量にとれること（Stirling et al.、米国特許番号5,300,437号）などが記載されている。JP06−253,875では、Ｓ−１−フェニルエチルアミン製造における、例えばアシネトバクター属MBA−15（FERM P−13432）の存在下でのＬ−アラニンのアミノ基のアセトフェノンへの立体特異的転移が開示されている。米国特許5,360,724号では、Bacillus megaterium由来のアミノ酸トランスアミナーゼを用いた、ラセミ体中のアミノ基のエナンチオ選択的転移による光学活性１−アリール−２−アミノプロパンの製造が開示されている。DE4332738では、光学活性一級および二級アミンの製造が開示されており、この工程では、ヒドロラーゼの存在下、アシルドナーである活性化エステルとラセミアミンとのエナンチオ選択的アシル化が使用されている。
しかしながら、本発明はエナンチオ選択的加水分解の新規バイオ触媒（生体触媒Biocatalyst）を提供するものである。
発明の目的
本発明の目的は、ラセミアシルアミド中のエナンチオマーを立体選択的に加水分解する新規なバイオ触媒を提供することである。かかるバイオ触媒は、ラセミアシルアミド中のエナンチオマーを立体選択的に加水分解できる酵素（アシラーゼ）を産生できる微生物、または酵素それ自体である。
さらに、本発明の目的は、アシルアミドを立体選択的に加水分解するための方法を提供することである。
発明の要約
本発明は、アシラーゼ酵素活性は示すが、リパーゼまたはエステラーゼ活性は示さない、バイオ触媒、すなわち、死または生微生物、または好ましくは単離形のポリペプチドに関する。バイオ触媒は、ラセミアシルアミド（これは、脂肪族アシル基を有し、天然アミノ酸の誘導体ではない）を立体選択的に加水分解することができる。
従って、本発明は、また、本発明の酵素を産生できる微生物株にも関する。これには、遺伝子修飾した微生物および天然に存在する微生物の両方が含まれる。本発明に記載の天然株は、天然サンプルを選択培地に接種することを含む選択方法によって得ることができる微生物である。
本発明の別の態様は、ラセミＮ−アシルアミド（これは、脂肪族アシル基を有し、天然アミノ酸の誘導体ではない）の加水分解法であり、本発明に記載の酵素を使用することを特徴とする。
本発明の方法は、遊離または固定酵素を用いて行うことができ、これは濃縮または精製形で、または粗細胞抽出物の形で使用することができる。本発明の別の態様において、本発明のアシラーゼを発現する微生物を反応に使用する。すなわちこの場合、酵素は細胞結合形である。
本発明の方法は、もしラセミアシルアミドの１つの立体異性体が特異的に加水分解されるのであれば、ラセミ体の分割に使用することができる。しかし、加水分解が立体選択的でないのであれば（例えば、アシルアミドがラセミでないためか、または、酵素が特定のラセミアシルアミドの両方のエナンチオマーを加水分解するために）、本発明の方法は、また、例えば保護基の化学などの他の目的にも使用できる。
本発明の詳細な記載
本発明は、アミンアシラーゼ酵素活性は示すがリパーゼまたはエステラーゼ活性は示さないバイオ触媒に関し、かかるバイオ触媒は式（１）
0003608798.tif 000002
［式中、
R2はアリールまたはアリール（C1−C4）アルキルであるか；またはR1およびR2は、共に、アリールにより置換されているかまたはアリールに融合している５−７員環を形成しており、
R3はC1−C4アルキルであり；および
R1およびR3は、共に、天然アミノ酸の誘導体ではない式（１）で示される化合物が形成されるように選択する（ただし、各々の基は置換してもまたは非置換であってもよい）
で示されるラセミアシルアミドを立体選択的に加水分解することができる。
好ましい態様は、その基質を加水分解して一級アミンにすることができるバイオ触媒である。本発明に記載のバイオ触媒は、好ましくは、（ａ）該酵素活性を有するポリペプチドおよび（ｂ）該酵素活性を有するポリペプチドを含む生微生物または死微生物またはかかる微生物の細胞抽出物からなる群から選択する。本発明に記載の死微生物は、例えば、細胞壁および／または細胞膜が機械的または化学的に崩壊または削除されている、崩壊形の微生物である。
本発明に記載のリパーゼまたはエステラーゼ活性を示さないという語は、ApiZym Test
0003608798.tif 000003
において全く酵素活性が検出できないことを意味する。この試験で、C4エステラーゼ活性は酪酸２−ナフチルを用いて、C8エステラーゼ活性はカプロン酸２−ナフチルを用いて、およびC14リパーゼ活性はミリスチン酸２−ナフチルを用いて試験する。
特に、本発明は、アミンアシラーゼ活性は示すが、リパーゼまたはエステラーゼ活性は示さない酵素、および、アシラーゼ活性は示すが、リパーゼまたはエステラーゼ活性は示さない、該アシラーゼの突然変異体、変異体および断片に関する。好ましい態様は、基質を加水分解して一級アミンにすることができるポリペプチドである。
本発明のポリペプチドもまた、本明細書において、「本発明のアシラーゼ」または「本発明の酵素」と呼ばれる。特記しない限り、これら全ての用語は、天然に存在する本発明のポリペプチドの標準配列（これが本発明の好ましい態様である）だけでなく、また、アシラーゼ酵素活性、好ましくは天然酵素と同じ立体選択的活性を示す全てのその突然変異体、変異体および断片をも包含する。本発明のポリペプチドは濃縮形、または好ましくは精製形で使用することができる。
本発明の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、特に、下記の立体選択的反応（Ａ）
0003608798.tif 000004
を触媒することができ、ここで、式（１）で示されるラセミアシルアミドは、本発明のアミンアシラーゼ（これはアミンアシラーゼ酵素活性を示すが、リパーゼまたはエステラーゼ活性は示さないポリペプチドであり、式（１）で示されるラセミアシルアミドを立体選択的に加水分解することができる）により立体選択的に加水分解され、この加水分解により式（２）で示されるＲ−（またはＳ−）アミン、および式（３）で示される酸、および式（４）で示されるＳ−（またはＲ−）アミドが生成し、ここで、式（１）から（４）において、
R1は水素、C1−C8アルキル、C2−C8アルケニル、C1−C8アルコキシ、C2−C8アルキルカルボキシまたはカルボキシ；好ましくは、C1−C4アルキル、C2−C4アルケニル、C1−C4アルコキシまたはC2−C4アルキルカルボキシ；より好ましくは、C1−C3アルキル、C2−C3アルケニル、C1−C3アルコキシまたはC2−C3アルキルカルボキシ；および最も好ましくは、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ピロピル−１−エン、ピロピル−２−エン、プロップ−２−イレン、およびメトキシからなる群から選択し；
R2はC1−C4アルキル、C1−C4アルコキシ、C1−C4ヒドロキシアルキル、C1−C4アミノアルキル、C1−C4ハロアルキル、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲノ、ニトロ、スルホまたはシアノで置換されていることもあるアリールまたはアリール（C1−C4）アルキルであり；
またはR1およびR2は、共に、アリールにより置換されているかまたはアリールに融合している５−７員環を形成し、ここで、環は、窒素、硫黄および酸素から選択した１または２つのヘテロ原子を含み得；好ましくは、非置換であるか、またはメトキシ、エトキシ、ハロゲノ、メチル、エチル、ニトロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、トリフルオロメチルで置換されているインダン、テトラリンまたはクロマンであり；および
R3は好ましくはC1−C4アルキル；より好ましくはメチルである。
アリールは、例えば、同素環式または複素環式である。適当な環系は、例えば、３−10環式原子を有する単環または二環系であり、炭素原子または窒素原子を介して結合し、および、酸素、窒素、硫黄、および１−２酸素原子に結合した硫黄から選択した４つまでのヘテロ原子を含み；さらにまた、これは１または２つのフェニル基あるいは１または２つのシクロアルキル基（シクロアルキルは好ましくは５−７環式原子を有する）と融合し得；これは不飽和であるか、または部分的にまたは完全に飽和されていてもよい。
アリールの例は、フェニル、ナフチル、ビフェニルイル、アントリル、フルオレニル、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、3,1−ベンゾフラニル、クロマニル、シクロヘキサ［ｂ］ピロリル、シクロヘキサ［ｂ］ピリジル、［ｂ］ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、シクロヘキサ［ｂ］ピラジニル、シクロヘキサ［ｂ］ピリミジニル、イミダゾリジル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、S,S−ジオキソ−チオモルホリニル、インドリニル、イソインドリニル、4,5,6,7−テトラヒドロインドリル、1,2,3,4−テトラヒドロキノリルまたは1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリル、例えば、前記した基の１つにおいて、非置換であるか、または、低級アルキル、例えばメチル、フェニル、１−または２−ナフチル、フェニル−低級アルキル、例えばベンジル、ヒドロキシ−低級アルキル、例えばヒドロキシメチルまたは２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、例えばメトキシまたはエトキシ、アミノ、低級アルキルアミノ、例えばメチル−、エチル−またはtert−ブチル−アミノ、ジ−低級アルキルアミノ、例えばジメチル−またはジエチル−アミノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、例えばメトキシ−、イソプロポキシ−、sec−ブトキシ−またはtert−ブトキシ−カルボニル、フェニル−またはナフチル−低級アルコキシカルボニル、例えばベンジルオキシカルボニル、ハロゲン、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素、特に塩素または臭素、低級アルカノイル、例えばアセチルまたはピバロイル、ニトロ、オキソおよび／またはシアノから選択された１つ以上の置換基により置換されているものである。
好ましい態様において、アリールは非置換であるか、または、メチル、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチル−アミノ、エチル−アミノ、tert−ブチル−アミノ、ジメチルアミノ、ジエチル−アミノ、カルボキシ、メトキシ−カルボニル、イソプロポキシ−カルボニル、sec−ブトキシ−カルボニル、tert−ブトキシ−カルボニル、フッ素、塩素、臭素、アセチルまたはピバロイル、ニトロ、オキソおよび／またはシアノから選択された１つ以上の置換基により置換されている。
上記反応Ａの好ましい態様において、R3がC1−C3アルキル、より好ましくはC1アルキルであるラセミアシルアミドが加水分解される。特に、もしRhodococcus globerulusまたはRhodococcus equiから得られたアシラーゼを使用するのであれば、R3は最も好ましくはC1−C3アルキルであり；もしArthrobacter aurescensから得られたアシラーゼを使用するのであれば、R3は最も好ましくはC1アルキルである。
「置換」なる語は、問題となる部分が、１−３つの同一または異なる置換基、好ましくは１または２つの同一または異なる置換基、最も好ましくは、C1−C8アルキル（好ましくはメチル）、ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）、ハロゲン（好ましくはフッ素または塩素）、アミノ、ニトロおよびC1−C8アルコキシ（好ましくはメトキシ）からなる群から選択された１つの置換基により置換できることを意味する。
本発明により、単独で存在するか、または一部分であるまたはアラルキル部分として存在するアリールは、少なくとも１つの環が６員芳香環（すなわち、ベンゼン環）の形である炭素環式基である。好ましいのは、フェニル、ナフチル、例えば１−または２−ナフチル、ビフェニルイル、例えば、特に、４−ビフェニルイル、アントリル、およびフルオレニル、およびまた１つ以上の融合飽和環を有するかかる環系である。
好ましい態様において、アラルキルは、アリール部分により置換されている脂肪族基を意味し、ここで、脂肪族基は非分枝または分枝C1−C8アルキレン（好ましくは、C1−C3アルキレン、最も好ましくはメチレンまたはエチレン）であり、アリール部分は上記で定義したように炭素環式基である。より好ましい態様において、アラルキルは、式10、11または12
0003608798.tif 000005
［式中、
R4は水素またはC1−C4アルキル；好ましくは水素またはメチル；より好ましくは水素であり；
ｎは０、１、２、３および４から選択した整数であり；好ましくは、０、１、２および3;より好ましくは０、１および２であり；
R5およびR6は、各々独立して、水素、C1−C4アルキル、C1−C4ハロアルキル、ハロゲノ、アミノ、シアノ、ニトロまたはC1−C4アルコキシ；好ましくは水素、メチル、エチル、トリフルオロメチル、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、アミノ、ニトロ、シアノまたはメトキシ；より好ましくは水素、メチル、フッ素、塩素、シアノ、ニトロまたはメトキシである］
で示される基を意味する。
さらに好ましい化合物は、式13、14および15
0003608798.tif 000006
［式中、
ｎは０、１および２から選択した整数であり;R5およびR6は各々独立して水素またはシアノである］
で示される。
さらに好ましい化合物は、式16および17
0003608798.tif 000007
［式中、
Ｘは酸素、炭素または窒素であり；好ましくは酸素および炭素であり；およびR5およびR6は、各々独立して、水素、C1−C4アルキル、C1−C4ハロアルキル、ハロゲノ、アミノ、シアノ、ニトロまたはC1−C4アルコキシ；好ましくは水素、メチル、エチル、ヨード、ブロモ、トリフルオロメチル、クロロ、フルオロ、アミノ、シアノ、ニトロ、メトキシまたはエトキシである］
で示される。
もしR1およびR2が、共に、非置換または置換環式複素脂肪族基を形成するならば、かかる基は好ましくは式（18）
0003608798.tif 000008
で示される化合物を意味する。
適当な化合物の別の例は、次の通りである：
0003608798.tif 000009
0003608798.tif 000010
本発明のアシラーゼは、土壌、水または植物サイレジ（silage）などの天然サンプルを選択培地に接種することを含む方法により選択できる微生物から得られ、かかる選択培地は唯一の炭素源としてアシルアミドを含む。アシルアミドはラセミのものを、またはもし、Ｒ−またはＳ−エナンチオマー特異的アシラーゼを前以て選択するのであれば、Ｒ−またはＳ−エナンチオマーのものを使用できる。選択における好ましい態様において、加水分解反応で上記したアシルアミドを、選択に使用する。
炭素源とは別に、選択培地はまた、微生物の生育に必要な全ての必須成分、例えばミネラル塩、窒素源、および微量元素などを含む。
最も好ましい態様において、選択培地は、ラセミまたはＳ−またはＲ−エナンチオマーのＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミン、および、ラセミまたはＳ−またはＲ−エナンチオマーのＮ−アセチル−２−アミノ−１−フェニル−４−ペンテンからなる群から選択されたアシルアミドを含む。
本発明を実施するために使用する適当な選択培地は、3gのアシルアミドを含み、およびさらに3mlの微量元素溶液SL−６、および1lのミネラル塩溶液ML1（pH7.0）を含み、ここで、ミネラル塩溶液ML1の成分は、5g K2HPO4、0.2g MgSO4×7H2O、20mg CaCl2、20mg FeSO4×7H2O、1.5g（NH4）2SO4、および1l脱イオン水（pH7.0）であり；および微量元素溶液SL−６の成分は、20mg NiCl2×6H2O、200mg CoCl2×6H2O、30mg MnCl2×4H2O、10mg CuCl2×2H2O、300mg H3BO3、30mg Na2MoO4×2H2O、100mg ZnSO4×7H2O、および1l脱イオン水である。しかし、この組成は、もちろん、十分な微量元素、ミネラル塩、および窒素源が提供される限り変化させてもよい。
好ましくは、本発明のアシラーゼは、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、およびArthrobacter aurescensからなる群から選択した微生物、より好ましくは、Rhodococcus globerulusK1/1、DSM 10337、Rhodococcus equi Ac6、DSM 10278、およびArthrobacter aurescens AcR5b、DSM 10280からなる群から選択した微生物から得られる。
本発明に記載のバイオ触媒なる語は、また、本発明のアシラーゼ酵素活性を発現する生または死微生物も含む。従って、本発明はまた、本発明のアシラーゼを発現する微生物にも関する。これには、遺伝子修飾した微生物および天然に存在する微生物の両方が含まれる。前者は、変異または遺伝子操作（すなわち、例えば大腸菌などの細菌または例えばHansenulaまたはSaccharomycesなどの酵母といった微生物を、本発明のアシラーゼをコードする遺伝子を用いて形質転換する）のいずれかにより産生できるが、後者は、土壌、水、植物サイレジなどの天然サンプルを、選択培地に接種することを含む選択方法により天然源から得ることができる。
本発明のアシラーゼをコードする遺伝子は、例えば、本発明の単離アシラーゼの配列の少なくとも一部を同定し、部分的タンパク質配列をコードするDNA配列を推定し、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物を調製し（遺伝子コードの縮重を考慮に入れる）、所望のアシラーゼを天然に発現している微生物株由来のDNAライブラリーを探索し、遺伝子を単離し、遺伝子修飾すべき微生物の形質転換に適当なベクターにクローニングすることにより得ることができる。別の方法では、単離アシラーゼの全配列を決定でき、タンパク質をコードするDNAを合成的に作製できる。また、例えば、アシラーゼを発現する形質転換クローンを得るために、唯一の炭素源である対応するアミド上で生育する適当な大腸菌DNAライブラリーをスクリーニングすることも非常に容易に行うことができる。
アシラーゼ活性を示す天然の微生物は、後述する方法により得ることができ、それ自体公知の方法で、例えば、一般的に知られている変異原、例えばUV線またはＸ線、または変異原性化学物質を用いて変異することにより、例えば低栄養培地要求、速い生育速度、および特に高いアシラーゼ活性などの亢進した特性において、その親とは異なっている変異体に変換することができる。かかる変異体はまた自発的に生じることもある。かかる変異体の同定および単離も、それ自体公知の方法で行う：かかる変異体のコロニーのアシラーゼ活性は、例えば、細胞破砕後、特定量の適当なアシルアミド基質を、細胞残渣のアリコートに加え、形成された反応産物を、クロマトグラフィー、特にHPLCにより、定性的または定量的に測定することにより確認する。
本発明のアシラーゼを天然に発現する微生物の単離は、土壌、水、または植物サイレジなどの天然サンプルを、唯一の炭素源としてアシルアミドを含む選択培地に接種することを含む選択方法により実施することができる。アシルアミドはラセミのものを、または、もし、Ｒ−またはＳ−エナンチオマー特異的アシラーゼを前以て選択するのであればＲ−またはＳ−エナンチオマーのものを使用できる。選択方法の好ましい態様において、加水分解反応で上記したアシルアミドを、選択に使用する。
炭素源とは別に、選択培地はまた、微生物の生育に必要な全ての必須成分、例えばミネラル塩、窒素源、および微量元素などを含む。
最も好ましい態様において、選択培地は、ラセミまたはＳ−またはＲ−エナンチオマーのＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミン、および、ラセミまたはＳ−またはＲ−エナンチオマーの２−アミノ−１−フェニル−４−ペンテンからなる群から選択されたアシルアミドを含む。
本発明を実施するために使用する適当な選択培地は、3gのアシルアミドを含み、およびさらに3mlの微量元素溶液SL−６、および1lのミネラル塩溶液ML1（pH7.0）を含み、ここで、ミネラル塩溶液ML1の成分は、5g K2HPO4、0.2g MgSO4×7H2O、20mg CaCl2、20mg FeSO4×7H2O、1.5g（NH4）2SO4、および1l脱イオン水（pH7.0）であり；および微量元素溶液SL−６の成分は、20mg NiCl2×6H2O、200mg CoCl2×6H2O、30mg MnCl2×4H2O、10mg CuCl2×2H2O、300mg H3BO3、30mg Na2MoO4×2H2O、100mg ZnSO4×7H2O、および1l脱イオン水である。しかし、この組成は、もちろん、十分な微量元素、ミネラル塩、および窒素源が提供される限り変化させてもよい。
好ましい微生物は、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、およびArthrobacter aurescensからなる群から選択し、より好ましくは、Rhodococcus globerulusK1/1、DSM 10337、Rhodococcus equi Ac6、DSM 10278、およびArthrobacter aurescens AcR5b、DSM 10280からなる群から選択する。
アシラーゼは、当該分野でよく知られている方法により、特に実施例に記載の方法により微生物から単離する。
好ましいのは、上記で定義した微生物から単離した、精製されたバイオ触媒であり；より好ましくは配列番号１、２、３および４からなる群から選択したアミノ酸配列を含む。
本発明の重要な態様は、脂肪族アシル基を有し天然アミノ酸の誘導体ではないラセミＮ−アシルアミドの加水分解を含む方法に関し、本発明のアシラーゼを使用することを特徴とする。方法は、上記で示した反応Ａを含む。方法の好ましい態様において、R1、R2およびR3基およびアシラーゼは、上記の意味を有する。Rhodococcus globerulusK1/1、DSM 10337またはRhodococcus equi Ac6、DSM 10278のアシラーゼの場合、R1は尿素であってもよい。
本発明の方法（上記方法Ａ参照）は、本発明の酵素活性を有する任意の「バイオ触媒」を用いて行うことができる。本発明に記載の「バイオ触媒」は、例えば、本発明のアシラーゼを発現する微生物、例えば、上記で定義した天然に存在する変異または組換え微生物、かかる微生物の粗細胞抽出物、本発明に記載の濃縮または精製酵素である。本明細書における微生物なる語は、例えば、細胞壁および／または細胞膜が機械的または化学的に崩壊または削除されている崩壊形の、生微生物または死微生物を含む。
本発明の方法で使用する「バイオ触媒」は固定化し得る。かかる「バイオ触媒」の固定化は、それ自体公知の方法で、例えば、固相支持体に結合させるかまたは酵素膜リアクターに封入することにより行うことができる。
アシラーゼ酵素活性を発現する微生物は、天然に存在する微生物、上記のように所望により変異により変換された微生物、または、所望のアシラーゼを産生できるように、本発明のアシラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子工学技術により形質転換を行った微生物のいずれかであってもよい。アシルアミド基質の微生物細胞抽出物による加水分解は、好ましくは、pH5−10.5、より好ましくはpH6−9.5の均質水溶液中で行う。pH値の安定化のために、反応は、それ自体公知の方法で緩衝溶液中またはpHスタットを用いて行う。反応温度は約10−65℃、より好ましくは20−50℃、さらにより好ましくは20−30℃である。アシルアミド基質は、好ましくは、1mM−1mM、より好ましくは10mM−100mMの濃度で使用する。しかし、もし基質があまり溶けないのであれば、基質懸濁液を使用することもできる。
Rhodococcus equi Ac6、DSM 10278、およびArthrobacter aurescens AcR5b、DSM 10280から単離した酵素は、至適pHおよびおよび温度が異なる。
Rhodococcus equi Ac6、DSM 10278の酵素では、好ましいpH範囲は５−10.5、より好ましくは６−８、さらにより好ましくは6.5−7.5であり、好ましい温度範囲は、10−65℃、より好ましくは20−37℃、さらにより好ましくは25−30℃である。Arthrobacter aurescens AcR5b、DSM 10280の酵素について、好ましいpH範囲は5.5−10.5、より好ましいのは７−9.5であり、好ましい温度範囲は10−65℃、より好ましいのは45−50℃（最大活性を望むのであれば）または20−30℃（もし最大酵素安定性を望むのであれば）である。
本発明に記載の方法は、バッチ方法で、または、連続的に酵素膜リアクター（EMR）中でのいずれかで行うことができる。後者の場合、酵素膜リアクターは、好ましくは、分離限界が約30000以下である限外濾過膜を具備しており、それ故、反応混合物に含まれる酵素は押し留まり、一方、低分子量生成物および未反応物は膜を通過し、生成物を流出物から単離することができる。リアクターは好ましくは使用前に滅菌するため、抗菌剤の添加を省くことができる。反応は、上記の方法と類似した方法で行う。
本発明に記載の方法はまた、アシルアミド基質を含む溶液（適当なpH値に調節されている）を、粗微生物抽出物のアシラーゼが固定されている固相担体を通して、浸出させることにより実施することができる（マトリックス結合酵素調製物は、例えば、CNBr活性化セファロース、オイペルギット（eupergite）またはその他を通して粗微生物抽出物を浸出することにより得られる）。
反応混合物の後処理、および本発明に記載の生成物および加水分解を受けなかった反応物または加水分解を受けなかったエナンチオマーの精製は、最先端技術として知られる慣用的な方法により行うことができる。例えば、反応混合物を、濾過、または好ましくは遠心により清澄にし、次いで、酵素を限外濾過（分離限界≦30000ダルトンである膜）により分離し、保持されている生成物をダイアフィルトレーションにより残余物から洗浄して出すことができる。次いで、例えば、クロマトグラフィー法、例えばゲルクロマトグラフィー（すなわちセファデックスＧ−25）、イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、HPLCまたはその他により実際に精製を行う。アミノの選択的抽出は、例えば、好ましくは低pH値で行い、その後、アミンを好ましくはアルカリ性pH値で抽出することができる。
方法に使用する細胞抽出物を得るために、アシラーゼ活性を有する微生物、特に上記の１つを、同化可能な炭素および窒素源、およびまたミネラル塩を含む水性栄養培地中、pH値約６−９、好ましくは約6.5−７、温度約28−40℃、特に約28−30℃で培養し、バイオマスを取り除き、細胞抽出物を得る。発酵時間は、アシラーゼ活性における至適力価が得られるように選択する。
細胞密度が適当な値に達した時、培養を停止する。培養ブロスを公知の方法、例えば遠心により分離し、沈降した細胞を慣用的な方法、例えば微細ガラスビーズと共に振盪することにより、超音波処理により、またはフレンチプレスを用いて破砕する。不溶性細胞成分、およびもし使用したのであればガラスビーズを、例えば遠心により取り除き、残渣を酵素源（粗抽出物）として使用する。残渣であるアシラーゼ含有粗抽出物は、本発明に記載の方法に直接使用できる。しかし、有利には、核酸（粘性溶液！）を取り除くために、粗抽出物をポリカチオン性試薬、例えばポリエチレンイミン、ポリアミン、例えばスペルミジン、ストレプトマイシン−スルフェート、またはリボヌクレアーゼまたはMn2+塩で処理し、沈殿した核酸を遠心により取り除く。
好ましくは、抽出物の妨害成分を取り除くために、粗細胞抽出物について、１つ以上の慣用的な精製段階を行う。
本発明の方法は、もしラセミアシルアミドの１つの立体異性体が特異的に加水分解されるのであれば、ラセミ体の分割に使用することができる。しかし、加水分解が立体選択的でないのであれば（例えば、アシルアミドがラセミでないためか、または酵素が特定のラセミアシルアミドの両方のエナンチオマーを加水分解するために）、本発明の方法は保護基の化学に使用することができる。この場合、基質においてR2およびR3が結合しているＣ原子はキラルである必要はない。この場合、100％の基質を加水分解することができる。１つの例において、R2およびR3は共有結合してベンゼン環を形成し；別の例では、R2およびR3は共有結合して、ベンゼンと融合したシクロペンタン環を形成する。両方の場合において、R1は好ましくはメチルである。
下記の実施例は、説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例：
実施例1:（Ｓ）−１−フェニルエチルアミンアシラーゼ活性を示す微生物の単離
前もってオートクレーブ中で120℃で20分間滅菌しておいた下記のミネラル塩溶液ML1中に16個の土壌サンプルを懸濁する。この溶液の0.1ml、および天然由来および汚水浄化植物由来の12個の水サンプルを、4ml液体培地（＝富化培地）に接種する。平行して、ラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含まない富化培地の対照培養物に接種する。ミネラル塩溶液ML1の成分は次の通りである：
0003608798.tif 000011
富化培地は以下から構成される：
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微量元素溶液SL−６は以下から構成される：
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接種前に、培地を16ml試験チューブに入れ、オートクレーブ中で20分間121℃で滅菌する。
チューブを、28℃にて220rpmで回転振盪器中で傾けてインキュベートする。Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンの存在下で濁度として観察されるがその非存在下では観察されない生育させた培養物を、さらに、4ml滅菌富化培地に接種し、また、基質を含まない対照チューブにも接種する（＝第二生育）。
５次生育の培養物を、無菌69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）で105および106倍に希釈し、富化培地および20g/l寒天からなる固体培地および
Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含まない対照プレートに撒く。対照プレート上のものとは形態学的に異なるコロニーを、細胞単離およびＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミン利用におけるエナンチオ選択性を決定するために、富化培地および20g/l寒天を含む選択的寒天プレート上でストリークする。ここで、ラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンは、ａ）3g/l（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンまたはｂ）（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンで置きかえている。プレートを３−10日間28℃でインキュベートする。Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンのエナンチオマーの一方の上でのみ生育し、コロニー形態から純粋と思われる株を、24−48時間、28℃、220rpmの振盪器で以下の成分（＝（Ｒ）または（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含む基本培地）をもつ25ml培地（100mlフラスコ）中で培養する：
0003608798.tif 000014
これらのプレ培養物0.5mlを用いて、同じ培地および量を有する主培養物に接種する。220rpm、28℃で24−48時間インキュベートした後、フラスコの内容物を冷却超高速遠心機（Dupont Co.、Welmington、Delaware、USA）で遠心（15分間、9000×ｇ）し、沈降した細胞を1mlの69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に懸濁する。エッペンドルフ・バイアルに、この懸濁液0.6mlを、1.2gガラスビーズ（直径0.1−0.25mm、Carl Roth GmbH、Karlsruhe、Germany）と混合し、10分間、ガラスビーズミル（Retsch Co.、Haan、Germany）にて最大反応速度で振盪する。細胞片およびガラスビーズを取り除くために、氷浴でバイアルを冷却し、Biofuge 15（Heraeus Sepatech、Osterode Germany）中で11500rpmで遠心した後、上清（＝粗細胞抽出物）を酵素源として使用する。
アシラーゼ活性のアッセイ液は、エッペンドルフ・バイアル中で以下のように調製する：
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30℃で０−3mMの１−フェニルエチルアミンが遊離する時間インキュベートした後、400μｌの氷冷アセトンを加え反応を停止する。チューブを激しく混合し、約15分間氷上に置き、次いで、Biofuge 15（Heraeus Sepatech、Osterode Germany）にて11500rpmで４分間遠心する。上清をHPLC定量分析にかける。もし活性アッセイ液が、Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン存在下で生育した細胞の粗抽出物を含むのであれば、基質を含まない対照アッセイを、粗抽出物の１−フェニルエチルアミン含量を決定するために平行して作製しなければならない。HPLC分析のために、20μｌの用量のサンプルを、RP−８カラム（LiChroCART 125−４、LiChrospher 100 RP−８（5mm）、ガードカラム:LiChroCART 4−４、LiChrospher 100 RP−８（5mm）、Merck Co.、Darmstadt Germany）に注入する。以下の勾配を、流速1.25ml/分でアプライし、基質Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンおよび生成物１−フェニルエチルアミンを分離する：
溶媒A:リン酸カリウム緩衝液、3mM、pH3
溶媒B:10％v/v溶媒Ａおよび90％v/vアセトニトリル
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溶出液中の物質は、215nmにおけるUV吸収を測定することにより検出される。反応生成物１−フェニルエチルアミンの濃度は、０−5mMの検量線を用いてピーク面積から計算する。
１単位（Ｕ）のアシラーゼ活性は、１分間あたりの１μmolの１−フェニルエチルアミンの遊離を触媒する酵素量として定義する。サンプル中のアシラーゼ濃度は、以下の式により計算する：
U/ml［μmol/（ml×分）］＝HPLCバイアル中の１−フェニルエチルアミン濃度［mM］／（インキュベーション時間［分］×アシラーゼ含有サンプルの用量［20μｌ］×最終アッセイ用量［800μｌ］×希釈ファクター（試験前のアシラーゼ調製物の希釈）。
比活性は、BioRad Protein Assay（Biorad Co,、Glattbrugg、Switzerland）により決定した、酵素調製物におけるタンパク質1mgあたりのアシラーゼ活性単位として表される。サンプルのタンパク質濃度は、０−1mg/mlウシ血清アルブミンの検量線を用いて計算する。
（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンアシラーゼ活性を有する26個の細菌株を単離した。（Ｒ）−特異的酵素を含む株は全く得られなかった。表１は４つの最善の微生物の比活性を示す。Rhodococcus equi Ac6（＝DSM 10728）は粗抽出物において最も高い比活性、およびまた最も高い酵素収量（45.2U/I培養ブロス）を示すため、これを（Ｓ）−１−フェニルエチルアミンアシラーゼの産生体として選択する。以下において、Ac6株のアシラーゼは、Ac6−アシラーゼと呼ぶ。下記した実施例において、Ac6株の振盪フラスコ培養物の標準的なインキュベーション時間は48時間である。
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実施例2:Rhodococcus equi Ac6の生育およびアシラーゼの誘導
ａ）アシラーゼ反応の誘導物質の変化およびエナンチオ選択性の検討
R.equi Ac6を、実施例１に記載の振盪フラスコ培養技術により、91時間、3g/l（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンまたは3g/l（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含むか、または全くＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含まない基本培地中で生育させる。実施例１に記載の方法によって、粗抽出物を調製し、基質として（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンおよび（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを用いてタンパク質濃度およびアシラーゼ活性を測定する。
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表２のデータは、アシラーゼ発現を誘導するためには（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンが生育培地に存在しなければならないことを示す。
（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンは、Ac6株のアシラーゼ誘導物質としては効果がなく、細菌の生育を阻害する。さらに、アシラーゼは非常に（Ｓ）−エナンチオ特異的に作用する。
ｂ）（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンの濃度変化
R.equi Ac6細胞を、追加的栄養物である10g/l酵母抽出物および10g/l肉抽出物と共に100ml基本培地を各々含む３つの1lのエーレンマイヤーフラスコに接種する。細胞を、OD660が約２になるまで生育させる（振盪フラスコ技術については実施例１参照）。次いで、培養物を８部の25mlに分割し、（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを、1g/l刻みで終濃度が０−7g/lとなるように振盪フラスコに加える。さらに細胞を25時間インキュベートする。次いで、粗抽出物のタンパク質濃度およびアシラーゼ活性を、実施例１に記載のように測定する。
培地中の2g/l以上の（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンは、アシラーゼ産生に負に作用する。（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンは細胞の生育を阻害し、すなわち、培地中の（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン濃度の増加に伴ってOD660は減少する。
別の実験において、振盪フラスコの１つのシリーズで接種した直後（実施例１参照）、および他では接種して72時間生育後、（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを培養培地に1g/l刻みで終濃度１−5g/lとなるように加える。20g/l肉抽出物および20g/l酵母抽出物を補足したペプトンを含まない基本培地を使用する。接種96時間後、細胞を遠心により採取し、粗抽出物中のタンパク質濃度およびアシラーゼ活性を測定する（実施例１参照）。
もし誘導物質を接種直後に培地に加えれば、3g/l（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンにより最大アシラーゼ収量（60U/I培養培地）が得られ、他方、もし誘導物質を接種72時間後に加えれば、2g/l（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンにより最大アシラーゼ産生量（20U/I培養培地）が得られる。（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンの存在下で培養を開始することにより、アシラーゼ収量は、誘導物質を生育の72時間後に加えた培養物よりも３倍高くなる。
ｃ）開始pH値の変化
0.5pH単位刻みでpHを2.5−9.5に変化させながら、3g/l（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンと共に基本培地を含む振盪フラスコ培養物を65時間生育させる。次いで、培養物のO.D.660並びに粗抽出物のタンパク質濃度およびアシラーゼ活性を測定する（実施例１参照）。
Rhodococcus equi Ac6の至適生育および最大アシラーゼ収量の両方共が、pH5.5ないし７で得られる。しかし、アシラーゼ比活性は、pH5.5−9.0の広範囲に及びかなり一定である。
ｄ）栄養物の変化
ペプトンを含まず、0.5g/lの低い酵母抽出物含量、3g/lラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミン、および2g/l追加的栄養物と共に基本培地を含む振盪フラスコ培養物を、それぞれ、45および111時間インキュベートする。O.D.660を測定した後、細胞を採取し、破砕し、粗抽出物のタンパク質濃度およびアシラーゼ活性を測定する（実施例１参照）。
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インキュベーションの45時間後並びに111時間後に、酵母抽出物において最も高いアシラーゼ収量が得られる（表３参照）。アシラーゼ発現は、培地中のＬ−グルタミン酸および複合栄養物の存在により正の効果を受け、これにより、アシラーゼ収量（U/I培地）が高くなるが、比活性は増加しない。追加的栄養物非存在下で生育した培養物では、アシラーゼ比活性は最も高いが、全酵素収量［U/I培養ブロス］は低く、細胞密度（O.D.660）も低いことが示される。
実施例3:20l規模での発酵によるRhodococcus equi Ac6のアシラーゼの産生
20l規模でRhodococcus equiを発酵させるために、pH、温度、および溶存酸素濃度（pO2）の自動制御および消泡システムを具備した30lのバイオリアクターを使用する。発酵槽に、3g/lラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンおよび5g/l酵母抽出物を含む基本培地20lを満たす。培地を121℃で30分間オートクレーブにかけ、28℃に冷却した後、バイオリアクターに、最初O.D.660が0.05である1lの振盪フラスコ培養物を接種する。ここで、この培養物は84時間、28℃、220rpmで５部の1lエーレンマイヤーフラスコ中200mlで前以て生育させておく。発酵の条件は下記の通りである：
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25ml培養培地のサンプルを、異なる時間点でとる。培養ブロスのO.D.660値並びに粗抽出物のタンパク質含量およびアシラーゼ活性を測定する（実施例１参照）。
30時間インキュベートした後に最大酵素収量（U/I培養培地）に達し、少なくとも次の18時間は一定である。48時間培養した後、発酵ブロスを15℃に冷却する。冷却Sorvall RC5B超高速遠心機（Dupont Co.、Wilmington、Delaware、USA）中でSorvall TZ−28ローターを用いて連続フロー遠心することにより、粗抽出物中に0.19U/mgタンパク質の比活性を有するAc6−アシラーゼ680Uを含む、41gの細胞（湿潤重量）を獲得する。細胞を103mlの69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に再懸濁し、−20℃で貯蔵する。
実施例4:Rhodococcus equi Ac6のアシラーゼの精製
ａ）製造規模の粗抽出物の調製
実施例３に記載のように調製した100ml細胞懸濁液を解凍し、150mlガラスビーズ（直径0.1−0.25mm）を含む600mlガラスビーカーに注ぐ。ビーカーを氷浴で冷却しながら、Philips HR1385プロフェッショナル・ハンドブレンダーを２分間６−８回、５分間中断して用いることにより細胞を破砕する。ガラスビーズを沈降させた後、上清を取り出し、150mlの69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）をガラスビーズに加える。簡潔に混合し、ガラスビーズを沈降させることにより二番目の上清を得る。２つの上清を合わせ、Sorvall GS−３アルミナローターを用いてSorvall RC5B冷却超高速遠心機で遠心（20分間、9000rpm）する。遠心の上清は、アシラーゼ精製の粗細胞抽出物として使用する。粗抽出物は−20℃で少なくとも２ヶ月間、活性が減少することなく貯蔵でき、中間体の解凍および冷凍でも活性消失はわずか５％である。
ｂ）硫酸アンモニウム沈降
100ml氷冷粗抽出物（調製は実施例4a参照）に、結晶硫酸アンモニウムをゆっくりと終濃度が25％飽和になるように加える。穏やかに撹拌しながら硫酸アンモニウムを溶かした後、溶液を氷上に約30分間置き、次いで、沈降タンパク質を60分間、9000rpmで、Sorvall GS−３アルミナローターを用いてDuPont RC5B冷却超高速遠心機で遠心することにより沈降させる。さらに硫酸アンモニウムを上清に加えて終濃度を85％とし、上記のように第二のタンパク質沈降を行う。Ac6−アシラーゼを含む沈降タンパク質を、69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）中150ml硫酸アンモニウム溶液（濃度30％飽和）に溶かす。
ｃ）ブチル−フラクトゲルの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）
HICのために、Merck Fraktogel TSKブチル−650（Ｓ）カラム（26×310mm）を、30％飽和（NH4）2SO4溶液（リン酸緩衝液中、69mM、pH7.0）で平衡化する。カラムに、実施例4b）の硫酸アンモニウム沈降後に得られた最終タンパク質溶液75mlをのせた後、カラムをUV検出信号を再び基線レベルに戻るまで、30％飽和硫酸アンモニウム溶液（リン酸緩衝液中、69mM、pH7.0）で洗浄する。次いで、勾配を30％から０％に減少させながら、流速1.8ml/分で、全用量825mlの硫酸アンモニウムをカラムにアプライする。フラクション・サイズは12mlである。フラクションのAc6−アシラーゼ活性を測定する（実施例１参照）。
Ac6−アシラーゼは、８−４％飽和硫酸アンモニウムのカラムから溶出される。５つの最も活性のあるフラクションを集め、ダイアフィルトレーションにより脱塩し、YM30000膜を具備したCECカラム濃縮機（Amicon Inc.、Beverly、MA、USA）で濃縮して最終用量23mlとする。ダイアフィルトレーションは、リン酸カリウム緩衝液69mM（pH7）を濃縮タンパク質溶液に繰り返し添加し、再度濃縮することにより行う。
表４で、精製の結果を要約する。１回きりのクロマトグラフィー法により得られたAc6−アシラーゼ調製物は、10−15型の勾配Phast Gel（10−15％ポリアクリルアミド含有）を用いたPhast System
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により行うSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー染色により均質であると考えられる。電気泳動および染色には、Phast Gel勾配媒体用にPharmaciaにより提供された標準的な方法を使用する（Pharmacia Phast System分離技術ファイル番号110:「SDS−PAGE」、およびファイル番号200:「ファースト・クーマシーブルー染色」、Pharmacia、Uppsala、Sweden）。
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より低い比活性の粗抽出物を使用する場合、均質な酵素調製物を得るために、アシラーゼをさらにクロマトグラフィー精製段階、例えば実施例５に記載のMono−Ｑでのアミノ交換クロマトグラフィーまたはSuperose 12 HR（Pharmacia、Uppsala、Sweden）でのゲル濾過にかけることが必要である。
実施例5:分子量およびAc6−アシラーゼのサブユニット構造の決定
Pharmacia Superrose 12 HR 10/30ゲル濾過カラム（10×300mm）を使用し、未変性Ac6−アシラーゼの分子量を測定する。溶出は、Nacl 100mMを補足した69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）を用いて、流速0.3ml/分で行う。実施例４で得られた50μｌの精製および濃縮Ac6−アシラーゼをカラムにアプライする。未変性酵素の分子量を、分子量の対数に対する検量タンパク質（表５参照）のKAV値を示す検量線を用いて測定する。KAV値は下記のように定義する：
KAV＝（Ｖ溶出−V0）／（Ｖカラム−V0）
V0＝空隙容量＝デキストランブルーのＶ溶出＝7.65ml
Ｖカラム＝カラム容量＝23.6ml
未変性Ac6−アシラーゼの分子量は94000±3000（KAV＝0.33±0.04）と測定される。
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サブユニット構造を決定するために、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施例4cに記載のように行う。変性アシラーゼの分子量は、Pharmacis低分子量検量線キットのマーカータンパク質の分子量の対数に対する移動距離を示す検量線を用いて測定する。
変性Ac6−アシラーゼは分子量が50000±2000である。未変性酵素について測定した分子量と比べることで、この結果により、Ac6−アシラーゼがホモダイマー構造であることが示唆される。
実施例6:等電点（IEP）の測定
等電点電気泳動（IEF）を、Pharmacia Phast Systemを用いてPharmacia Phast Gel IEF 3−９型のゲル（pH3−pH9）の勾配を形成）で行う。酵素のIEPは、Pharmacia低pI検量キットのタンパク質（pH2.5−pH6.5）と比較して決定する。等電点電気泳動および染色には、Phast Gel IEF媒体についてPharmaciaにより提供される標準的な方法を使用する（Pharmacia Phast System）分離技術ファイル番号100:「IEFおよび滴定曲線分析」、およびファイル番号200:「ファースト・クーマシーブルー染色」、Pharmacia、Uppsala、Sweden）。Ac6−アシラーゼのIEPは約pH3.5である。
実施例7:Ac6−アシラーゼ反応速度のpH値依存性
実施例１に記載の酵素試験を、pH5.71−9.88の範囲の緩衝液（pH5.71、6.09、6.58、7.0、7.47:リン酸カリウム緩衝液、69mM;pH7.48、8.0、8.4、8.82、9.10:トリス−HCl緩衝液、100mM:pH9.38、9.88:グリシン−NaOH緩衝液、100mM）中で行う。インキュベーション時間は30分間であり、酵素源として20倍に希釈した実施例4cで得られた最終アシラーゼ調製物を使用する。
Ac6−アシラーゼにより、pH6.0ないしpH8.5で広範な至適活性を示し、最大pH6.5ないし7.0である。
実施例8:Ac6−アシラーゼ活性に対するアクチベーターおよび阻害剤の影響
種々の潜在的酵素アクチベーターおよび阻害剤の存在下、以下の条件および終濃度を適用することにより実施例１で示されるスキームに従って活性アッセイを行う：
0003608798.tif 000024
0003608798.tif 000025
0003608798.tif 000026
括弧内に示した相対活性は、酵素アッセイの間の沈殿物形成を示す。
Ni2+およびある程度においてZn2+を除いた試験した金属カチオンは、いずれも1mM濃度ではアシラーゼ活性にあまり影響を与えない（表６参照）。10mM濃度では、Zn2+、Ni2+、Cu2+およびCd2+はアシラーゼをかなり阻害する。キレート剤およびチオール還元剤はアシラーゼ活性に影響を及ぼさないが、すでに0.01mMの濃度である10mMヨードアセトアミドおよびフェニルメチルスルホニルフルオライドには強力な阻害作用がある。フェニルメチルスルホニルフルオライドによる強力な阻害は、Ac6−アシラーゼがセリンプロテアーゼ反応機構であることを示唆する。
実施例9:Ac6−アシラーゼの温度安定性
実施例4cで得られた最終アシラーゼ調製物のサンプルを、69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）で45倍に希釈し、種々の温度、種々の時間でインキュベートする。温度処理の後、標準的活性アッセイ（実施例１参照）を30℃で行う。
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表６から分かるように、30および37℃で４時間インキュベーションした後ではアシラーゼの最初の活性のほぼ全てが保持されているが、39.5℃および44℃では、酵素はかなり不活性化される。
30℃では34日後でさえ、最初のアシラーゼ活性の94％が依然として存在する。
実施例10:Ac6−アシラーゼの反応速度の（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン濃度依存性
実施例１に記載した標準的条件下におけるインキュベーション時間が10分間の活性アッセイを、酵素源として、様々な開始濃度の（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンおよび実施例4cで得られた最終Ac6−アシラーゼ調製物（これは69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）で５倍に希釈しておく）を用いて行う。ミカエリス定数Kmを、基質濃度および対応する反応速度から、および式:v＝Vm×S/（Ｓ＋Km）v:反応速度（U/ml＝mM/分）、Vm:最大反応速度（U/ml）、Ｓ＝（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン濃度（mM）への「SigmaPlot for Windows」（Jandel Scientific GmbH、Schimmelbusch、Germany）プログラムを用いた非直線回帰法により計算する。
（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンのKm値は0.6mM±0.1mMである。
実施例11:（Ｒ）−１−フェニルエチルアミンアシラーゼ活性を示す微生物の単離
一般的に、実施例１で示した方法を、以下の修飾法に適用する：
・43個の土壌および水サンプルを調査する。
・富化培養用の液体培地および選択的寒天プレート（この上に希釈した富化培養物をまき、単一のコロニーを得る）は、ラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンの代わりに3g/l（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン、さらに2ml/lの以下のビタミン溶液を含む：
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・富化の初めに酢酸消費微生物の生育を促進するために、一次増殖の液体培地に、0.5g/l酢酸ナトリウム、二次増殖においては、0.2g/l酢酸ナトリウムを補足する。
・わずか３つの富化培養物について増殖を行う。
・活性試験において細胞を生育させる基本培地は、わずか1g/lの酵母抽出物およびペプトンを含む。
・（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを、AcR5b−アシラーゼの活性アッセイにおける基質として使用する。
（Ｒ）−特異的アシラーゼ活性を示す株がわずか３つ単離できた（表７参照）。Arthrobacter aurescens AcR5b（＝DSM 10280）は、最も高い比活性を示し、（Ｒ）−Ｎ−１−フェニルエチルアミンアシラーゼ（これは以下においてAcR5b−アシラーゼと呼ぶ）の産生体として選ぶ。下記した実施例において、AcR5b株の振盪フラスコ培養物の標準的インキュベーション時間は23時間である。
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実施例12:Arthrobacter aurescens AcR5bの生育およびアシラーゼの誘導
ａ）（Ｒ）−アセチル−１−フェニルエチルアミンの濃度の変化
Arthrobacter aurescens AcR5bを、基本培地を用いて振盪フラスコ中で培養し（実施例11参照）、（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンの濃度を0.5g/l刻みで0.5から4g/lに変化させた。O.D.660、アシラーゼ活性、および粗抽出物中のタンパク質含量は実施例11に記載のように測定する。
AcR5b−アシラーゼの最大量は、（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含有しない培地で産生される。それ故、酵素は構造的に発現される。さらに、アシラーゼの比活性は、培養ブロス中に（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン濃度が増加するに伴って減少する。
ｂ）開始pH値の変化
0.5pH単位刻みでpHを3.5−11に変化させながら、（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含有しない基本培地を含む振盪フラスコ培養物を23時間生育させる。次いで、培養物のOD660並びに粗抽出物のタンパク質濃度およびアシラーゼ活性を測定する（実施例11参照）。
Arthrobacter aurescens AcR5bの至適生育および最大アシラーゼ収量（U/I培養ブロス）の両方が、pH5.5ないし９で得られる。pH4.5ないしpH10では全く生育しない。さらにAcR5b株の培養ではpH7を選択する。
ｃ）温度の変化
O.D.660、アシラーゼ活性、および粗抽出物中のタンパク質含量の測定を含めた振盪フラスコ培養は、実施例11に記載のAcR5b株を用いて、２℃刻みで22−36℃の間で温度を変化させることにより行う。（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含有しない基本培地を使用する。
AcR5b株は28ないし32℃で最も急速に生育する。36℃では全く生育しない。28℃で、最大酵素収量（U/I培養ブロス）が得られる。
ｄ）栄養物の変化
AcR5b株の振盪フラスコ培養において、（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを含有しない基本培地に、それぞれ、5g/lの濃度で種々の栄養物を補足する。O.D.660、アシラーゼ活性、および粗抽出物中のタンパク質含量は実施例11に記載のように測定する。
全酵素収量（U/I培養ブロス）に関する最善の結果は、ソルビトールおよび肉抽出物で得られたものであり、これを選択してAcR5b株をさらに培養する。
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0003608798.tif 000031
ｅ）炭素および窒素源間の濃度比の変化
AcR5b株の振盪フラスコ培養物において、硫酸アンモニウムを含有しないミネラル溶液ML1に、ソルビトールおよび肉抽出物を異なる比で補足するが、両方の栄養物の全濃度は、常に7g/lとする。O.D.660、アシラーゼ活性、および粗抽出物のタンパク質含量を実施例11に記載のように測定する。
AcR5b−アシラーゼの最高収量（375U/I培養ブロス）が、ソルビトール対肉抽出物比4:3で得られた。
ｆ）全栄養物濃度の変化
硫酸アンモニウムを含有しないミネラル溶液ML1に、ソルビトールおよび複合窒素源を、濃度比4:3で、両方の栄養物の全濃度を変化させながら（７、14、21、28および42g/l）補足する。肉抽出物、カゼイン由来ペプトン、および技術グレードの酵母抽出物を、複合窒素源として使用する。振盪フラスコ培養（実施例11参照）を、3mlのプレ培養物を接種した200ml培地を満たした1lエーレンマイヤーフラスコ中で行う。11、20、27、35、46.5および70時間インキュベートした後、25mlのサンプルをフラスコから取り出し、O.D.660、アシラーゼ活性、および粗抽出物中のタンパク質含量を測定する。
最大AcR5b−アシラーゼ収量が、70時間インキュベートした後にペプトン（表８）で得られた。
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実施例13:20l規模での発酵によるArthrobacter aurescens AcR5bのアシラーゼの産生
20l規模でのAcR5b−アシラーゼの発酵産生を、以下の修飾法を用いて実施例３に記載のように行う：
・培養培地の成分は、硫酸アンモニウム（pH7）を含有しないミネラル塩溶液ML1（実施例１）に溶解した、カゼイン由来ペプトン12g/l、ソルビトール16g/l、消泡剤SAG471の1ml/lである。
・撹拌速度は500−800rpmに、溶存酸素濃度の設定は40％飽和に、通気速度は15l/分（＝0.75VVM）に調整する。
・バイオリアクターに、28℃、220rpmで19時間、1lエーレンマイヤーフラスコ中250mlの２部で生育させた0.5lプレ培養物を接種する。
・細胞を33時間培養後連続遠心により採取する。
比活性およびまた全アシラーゼ収量は、O.D.660値25で、それぞれ、5.26U/mgタンパク質および6420U/mg培養ブロスまでの静止増殖期でも依然として顕著に増加する。湿潤細胞塊を、69mMリン酸緩衝液（pH7）に懸濁して、終濃度を40％重量／容量にする。
実施例14:Arthrobacter aurescens AcR5bのアシラーゼの精製
ａ）製造規模での粗細胞抽出物の精製
実施例13で得られた100ml解凍細胞懸濁液を氷浴で冷却し、1/2''の標準的なホーンを用いて以下の条件下、ソニケーターＷ−385（Heat System Ultrasonics、Farmingdale、USA）で超音波処理する：サイクルタイム１秒間、デューティーサイクル（duty cycle）50％、アウトプット・コントロール８、および超音波処理時間25分間。細胞片を13400gで20分間冷却遠心機で遠心することにより取り除き、上清をさらに精製するために粗細胞抽出物として使用する。
ｂ）ポリエチレンイミンを用いた核酸の沈殿
実施例14a）で得られた粗抽出物を、10％（重量／容量）ポリエチレンイミン溶液（分子量30000−40000、pH7）と混合し、終濃度0.3％のポリマーとする。溶液を０℃で、30分間撹拌し、沈殿物を27000g、４℃で30分間遠心することにより取り除く。
ｃ）硫酸アンモニウム沈殿
実施例14b）の上清に、終濃度が30％飽和の固体硫酸アンモニウムを加える。混合物を穏やかに０℃で撹拌し、次いで、４℃、27000gで30分間遠心する。上清に、さらに終濃度が70％飽和の硫酸アンモニウムを加える。アシラーゼを含有する沈降タンパク質を遠心により（上記参照）沈降させ、40mlの69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）に溶かす。
ｄ）ブチル−フラクトゲルにおけるHIC
5.76gの硫酸アンモニウムを、実施例14c）の最終タンパク質溶液に溶かし、終濃度を25％飽和にする。HICを実施例4c）に従って行い、ただし、カラムは25％硫酸アンモニウム溶液でプレ平衡化し、勾配を硫酸アンモニウム25から０％飽和とする。
カラムの非結合タンパク質を25％硫酸アンモニウム溶液で洗浄した後、AcR5b−アシラーゼが13ないし10％硫酸アンモニウムで溶出する。酵素は全クロマトグラムのタンパク質ピークのみで示される。活性フラクションを、回収し、脱塩し、実施例4c）に記載のように濃縮する。
ｅ）Macro Prep High−Ｑにおける陰イオン交換クロマトグラフィー
Macro Prep High−Ｑ支持体を充填した16×125mmカラム（Biorad、Glattbrugg、Switzerland）を250mlの69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）を用いて平衡化する。実施例14d）で得られた濃縮タンパク質溶液の半量をゲルにのせた後、125ml容量の70mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）中、０から1Mの勾配のNaClをカラムにアプライする。流速は1ml/分であり、フラクション・サイズは1.5mlである。溶出液中のタンパク質濃度を、UV検出シグナルを介して監視し、活性フラクションのアシラーゼ活性およびタンパク質含量を実施例11に記載のように測定する。
アシラーゼ活性は、0.4ないし0.6M NaCl間に溶出する。活性ピークは、クロマトグラムのUV検出ピークとのみ一致する。活性フラクションを回収し、限外濾過により濃縮（実施例4c参照）し、最終タンパク質濃度を2mg/mlとする。
表10は、AcR5b−アシラーゼ精製の要約である。陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたAcR5b−アシラーゼフラクションは全てSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE、実施例4c参照）にて２本のバンドを示し、ネイティブPAGEにより均質であることがわかり、これはまた、８−25型の勾配Phast Gel（８−25％ポリアクリルアミド含有）を用いてPhast System
0003608798.tif 000033
で行う。ネイティブPAGEのために、Phast Gel勾配媒体用に、Pharmaciaにより提供された標準的な方法を使用する（Pharmacia Phast System分離技術ファイル番号120:「ネイティブPAGE」。
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実施例15:分子量およびサブユニット構造の決定
未変性AcR5b−アシラーゼの分子量は、実施例５に記載のゲルクロマトグラフィーにより測定したところ、220000±10000である。SDS−PAGE（実施例５参照）において、Arthrobacter aurescens AcR5bの変性アシラーゼは、分子量89000±3000および16000±1000に対応する２本のバンドを示す。これらの結果は、AcR5b−アシラーゼが、２つの同一の大および２つの同一の小サブユニットから構成される（α２β２型のサブユニット構造）四量体であることを示唆する。
実施例16:AcR5b−アシラーゼ反応速度のpH値依存性
（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンを用いた、実施例１に記載の酵素試験を、pHを5.5−11.0の範囲の緩衝液（pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0:リン酸カリウム緩衝液、69mM;pH7.5、8.0、8.5、9.0:トリス−HCl緩衝液、100mM;pH8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0:グリシン−NaOHl緩衝液、100mM）中で行う。インキュベーション時間は３分間であり、実施例4dで得られた最終アシラーゼ調製物を酵素源として用いる。
アシラーゼ活性は、pH7.5ないし９で広範な至適pHを示し、最大pH8である。
実施例17:AcR5b−アシラーゼ活性に対するアクチベーターおよび阻害剤の影響
実施例4d）の濃縮酵素溶液40μｌを、100mMトリス−HCl緩衝液（pH8）中、１および10mMの潜在的アクチベーター／阻害剤溶液36μｌと混合し、室温で30分間インキュベートする。これらのプレインキュベートしたアシラーゼ溶液を、プレインキュベートに使用した濃度のアクチベーター／阻害剤（実施例８参照）の存在下、活性アッセイの酵素源として使用する。インキュベート時間は12分間である。EDTA再活性化のために、アシラーゼを初めに1mM濃度の金属カチオンと共にプレインキュベートする（上記参照）。EDTAを、100mMトリス−HCl（pH8）の110mM溶液の形で終濃度10mMに加えた後、標準活性アッセイを行う前に、アシラーゼを２回目は30分間プレインキュベートする。
６つの二価金属カチオンは酵素を顕著に阻害するが、全ての場合において、活性はEDTAにより少なくとも部分的に回復する。EDTA単独およびFeCl3はアシラーゼ活性を亢進する。ジチオトレイトール、ヨードアセトアミド、およびフェニルメチルスルホニルフルオライドは低から中程度に酵素を阻害する。
0003608798.tif 000035
括弧内の相対活性は酵素アッセイの過程における沈殿物の形成を示す。n.d.非決定。
実施例18:AcR5b−アシラーゼの安定性
ａ）温度安定性
実施例14dで得られた最終アシラーゼ調製物のサンプルを、69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）で10倍に希釈し、30分間様々な温度でインキュベートする。氷上でインキュベートしたサンプルを、100％標準物質として使用する。その後、サンプルの残存アシラーゼ活性を標準的な活性アッセイにより測定する（実施例11参照）。
21ないし30℃では全くアシラーゼ活性の消失は観察されない（表12参照）。50℃では最初の活性の60％がインキュベーションの30分後にも依然として保持されているが、56℃では酵素は完全に不活性化される。
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希釈アシラーゼ（上記参照）を０−４℃で16日間および135日間インキュベートする場合、相対残存活性は依然として最初の値の100および95％である。23℃および30℃で16日間インキュベートした後、最初の活性の86および65％が保持される。
ｂ）pH安定性
実施例4d）の最終酵素調製物を、実施例16の緩衝液で20倍に希釈し、室温（約23℃）で一週間インキュベートする。次いで、サンプルの残存活性を実施例11に記載のように測定する。100％活性は、pH緩衝液で希釈した直後に得られた値に相当する。
酵素はpH7ないし９でかなり安定である（100％残存活性）が、これらの限界を越えると鋭く下降する。
ｃ）凍結時の安定性
実施例14d）で得られた最終アシラーゼ調製物を、凍結保護剤（表13参照）を添加しておよび添加せずに、69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）で20倍に希釈する。酵素溶液を−20℃および−80℃に冷凍する。2.5時間および９日後に、サンプルを解凍し、アシラーゼの残効性を実施例11に記載のように測定する。
表13で示したデータは、アシラーゼは凍結状態で貯蔵することにより不活性化されることを示している。安定性は、凍結保護剤を添加することにより、顕著に高めることができる。
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実施例19:AcR5b−アシラーゼ反応速度の基質濃度依存性
活性アッセイを、実施例11で示した標準的条件下、インキュベーション時間30分間で、様々な開始濃度の（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンおよびラセミＮ−アセチル−（ｍ−シアノ−フェニル）エチルアミンを用いて行う。実施例4dで得られた最終AcR5b−アシラーゼ調製物を69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）で20倍に希釈したものを酵素源として使用する。ミカエリス定数（Km）および最大反応速度を実施例９に記載のように計算する。
（Ｒ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンおよびラセミ（ｍ−シアノ）誘導体のKm値は、5.7および10.4mMであり、相対最大反応速度は、それぞれ、100および23％である。
実施例20:（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−４−ペンテンアシラーゼ活性を示す微生物の単離
一般的に、実施例１で示した方法を、以下の修飾法に適用する：
・74の土壌および水サンプルを使用してpH6、pH7、およびpH9の富化培養物に接種し、28℃でインキュベートし、pH7、37℃でインキュベートする。
・一次増殖の培地には、唯一の炭素源である0.5g/l酢酸ナトリウム、二次および三次増殖の培地には1g/lラセミ２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンが含まれる。
・株培養は、対応する富化培養物で使用したものと同じ温度およびpHで行う。
・富化培養物の微生物は、Plate Count Agar（Fluka Co.、Buchs、Switzerland）上で単離する。
・活性アッセイ用の株を生育させる培地は、1g/lラセミ２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテン、1g/l酵母抽出物、および1g/lペプトンのミネラル塩溶液ML1からなる。振盪フラスコ培養物のインキュベーション時間は、48−72時間である。
・活性およびアシラーゼ活性のエナンチオ選択性を試験するために、アッセイを、基質であるそれぞれ5.47mMの（Ｓ）および（Ｒ）−２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテン、および酵素源である40μｌ粗細胞抽出物を用いて全量400μｌで行う。適当なインキュベーション時間の後、200μｌ氷冷アセトンを200μｌアッセイ液と混合する。600μｌの69mMリン酸カリウム緩衝液（pH7）を加え、11500rpmで遠心した後、上清中の２−アミノ−１−フェニル−４−ペンテン濃縮液をHPLCにより分析する（検出波長210nm）。
２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンの一方のエナンチオマーのみを優先的に加水分解する18つの微生物を単離し、酵素アッセイにおいて、１つの株、Rhodococcus globerulusK1/1（DSM 10337）以外は、（Ｓ）−エナンチオマーの排他的開裂が観察された。
実施例21:Rhodococcus globerulusK1/1の生育およびアシラーゼ誘導
ａ）誘導物質の変化
K1/1株を、実施例21の培地を用いて、ただし、各々2g/lの酵母抽出物およびペプトン、０、4.92、7.38および9.84mMの濃度である誘導物質のラセミ２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンまたは任意によりラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンと共に、振盪フラスコ培養物中で生育させる。
アシラーゼ活性およびO.D.660の測定により、アシラーゼは、ラセミ２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンまたはラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンのいずれかであり得る誘導物質の存在下、K1/1株によりのみ形成されることが示される。4.92mM以上の濃度の２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンは、K1/1株の生育および酵素形成に阻害作用を示す。しかし、7.38および9.84mMの濃度のＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミンでは、生育を阻害せず、また、細胞密度もアシラーゼ収量（U/I培養ブロス）も増加しない。
ｂ）開始pH値および温度の変化
K1/1株を、振盪フラスコ（実施例21a参照）中、4.92mMラセミ２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンの存在下、28℃で、0.5pH刻みで開始pH値を４ないし９に変化させることにより、およびpH7でインキュベーション温度を５℃刻みで20ないし40℃に変化させることにより生育させる。72時間インキュベーションした後、粗抽出物のO.D.660およびアシラーゼ活性を測定する。
Rhodococcus globerulusK1/1の最大アシラーゼ産生は、pH6.5および30℃で得られる（28U/I培養ブロス、0.4U/mg粗抽出物中のタンパク質）。
実施例22:Arthrobacter aurescens AcR5b由来の高度に精製したアシラーゼを用いた酵素的加水分解
10mlの下記で示した各20mMラセミアミドの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）溶液に、5ml（1.3単位）の酵素を加え、溶液を100rpmおよび30℃で振盪する。
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変換が約50％に達すれば（HPLCにより確認）、溶液に1N HClを加えてpH2に酸性化し、３回ジクロロメタンで抽出し、非変換アミドを得る。水層を1N NaOH溶液で中和し、再度ジクロロメタンで３回抽出し、形成したアミンを回収する。両方の有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸留除去する。アミドは光学純度測定（HPLC）に直接使用し、ここで、得られたアミンは、100μｌのトリエチルアミンおよび100μｌの無水酢酸を各サンプルに加えることによりアセトアミドに変換し、次いで「キラル」HPLCにより光学純度を分析する。結果は表14に要約する。
0003608798.tif 000040
実施例23:Rhodococcus equi Ac6の部分精製アシラーゼによる酵素的加水分解
この実験は実施例22に記載のものと同じ方法で行う。200ml（1.1単位）の酵素を、表15に記載の各基質に使用する。
0003608798.tif 000041
実施例24:Rhodococcus globerulusK1/1の全細胞によるアミド加水分解
50mlの表16に記載の各ラセミアミドの10mMリン酸緩衝溶液（pH7.0）に、Rhodococcus globerulusK1/1の全細胞（各々、50ml振盪培養フラスコから得られる（実施例21参照）、OD660＝2.0）を加える。脱アセチル化は、30℃で連続的に振盪しながら（200rpm）行う。反応をHPLCにより監視し、約50％変換した後、反応混合物を実施例22に記載のものと類似の方法で後処理する。結果は表16に要約する。
0003608798.tif 000042
実施例25:Arthrobacter aurescens AcR5bのアシラーゼを用いたラセミ1aの製造用加水分解
100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に部分的に溶解した1g（6.13mmol）ラセミＮ−アセチル−１−フェニルエチルアミン（＋／−）−1aに、100ml（25.3単位）のArthrobacter aurescens AcR5bのアシラーゼを加え、混合物を、20℃で27時間振盪（100rpm）する。HClを加えて酸性化（pH2）した後、反応混合物を３回100mlジクロロメタンで抽出する。合わせた有機層を乾燥（MgSO4）させ、溶媒を濾過後に蒸留除去すると、0.496g（49.6％）の（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミン（−）−1a（［α］D20＝−138.0゜（ｃ＝1.0 EtOH）、エナンチオ比S/R＝96.8:3.2）が白色固体で得られる。水層をNaHCO3を添加して中和し、再度ジクロロメタンを用いて抽出する。通常の後処理を行うと、0.323g（43.5％）の（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン（＋）−1b（［α］D20＝＋29.4゜（ｃ＝2.2 EtOH）、エナンチオ比R/S＝99.7:0.3）が無色の油状物で得られる。
実施例26:Rhodococcus globerulusK1/1のアシラーゼの精製
26.1.製造規模における粗抽出物の精製
100ml細胞懸濁液（40％ w/w）を、600mlのガラスビーカーに注ぎ、氷受けに置く。ビーカーは超音波処理の間氷浴に置かなければならない。１インチの標準的ホーンを下記の条件下で使用する：
サイクルタイム:1秒間
デューティーサイクル（duty cycle）:50％
アウトプット・コントロール:8
全超音波処理時間:20分間（間断なし）
20分間超音波処理した後（40分間間断する）、サンプルをSorvall GS−３アルミナローターを用いて、Sorvall RC5B冷却（４℃）超高速遠心機にて、9000rpmで20分間遠心する。上清は粗抽出物である。
精製の監視および酵素学的同定に使用したK1/1−アシラーゼ活性の標準的アッセイは、20μｌの酵素サンプルを380μｌの5.55mM（Ｓ）−２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンの69mMリン酸カリウム緩衝溶液（pH7）と混合し、23℃でインキュベートすることにより行う。アシラーゼの希釈およびインキュベーション時間は、1.3mM以上の生成物が形成されないように選択する。反応は、800μｌの氷冷メタノールを加えて停止する。Biofuge 15（Heraeus Sepatech、Osterode、Germany）にて11500rpmで４分間遠心した後、上清をHPLC定量分析にかける（実施例１参照）。
26.2.核酸沈殿
3.25mlの10％PEI溶液（6N HClでpH7.5に調節）を105mlの細胞ホモジネート（超音波段階からのもの）に加え、0.3％の濃度とする。混合物を氷上に30分間置き、穏やかに撹拌する。次いで、混合物を20分間、9000rpm、４℃にて遠心する。次いで、上清を硫酸アンモニウム沈降に使用する。
26.3.硫酸アンモニウム沈降
18.81gの結晶（NH4）2SO4を、核酸沈降後ゆっくりと90mlの粗抽出物に加え、濃度を35％飽和とする。混合物を氷上に30分間置き、穏やかに撹拌する。次いで、混合物を20分間、9000rpm、４℃にて遠心する。上清をさらに精製するために、FPLC−システム（Pharmacia、Uppsala、Sweden）でクロマトグラフィーにかける。
26.4.FPLC
FPLC装置に結合した２つの異なる型のカラム（疎水性相互作用およびゲル濾過）を使用してアシラーゼを精製する。
26.4.1.疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）
HIC用に、Merck Fractogel TSKブチル−650（Ｓ）カラム（26×310mm、容量:165ml）を調製し、35％飽和（NH4）2SO4溶液（リン酸緩衝液（pH7.0））で平衡化する。カラムに、（NH4）2SO4沈殿物の上清90mlをのせた後、カラムを、35％飽和（NH4）2SO4溶液で、それ以上タンパク質が全くカラムから洗出されないようになるまで洗浄する。次いで、全容量1150mlの35％から０％飽和の（NH4）2SO4勾配をカラムにアプライする。流速を1.8ml/分に調節し、12mlのフラクションを回収し、アシラーゼ活性について試験する。
アシラーゼは11.5％ないし7.5％（NH4）2SO4で溶出する。活性フラクションを回収する（140ml）。
26.4.2.限外濾過
Rhodococcus globerulusK1/1アシラーゼを含有するHICフラクションプール（140ml）の濃縮および脱塩は、CEC1アミコン限外濾過チャンバーで行う。YM30（分子量カットオフは30000Da）膜を使用する。脱塩は、ダイアフィルトレーションおよび、繰り返し（NH4）2SO4非含有リン酸カリウム緩衝液（69mM、pH7.0）を濃縮サンプルに添加して、次いで、再び濃縮することにより行う。HICフラクションプールを4.5mlに濃縮する。
26.4.3.ゲル濾過
Pharmacia Superose 12HR 10/30ゲル濾過カラム（10×300mm）を最終精製段階で使用する。100mM NaClを補足したリン酸カリウム緩衝液（69mM、pH7.0）を用いて、流速0.3ml/分で溶出する。限外濾過から得られた濃縮および脱塩アシラーゼ・フラクション200μｌをカラムにアプライする。0.5mlのフラクションを回収し、アシラーゼの存在について分析する。
26.4.4.Phodococcus globerulusK1/1アシラーゼの精製スキーム
0003608798.tif 000043
実施例27:Rhodococcus globerulusK1/1アシラーゼの特徴データ
27.1.潜在的酵素アクチベーターおよび阻害剤の存在下におけるRhodococcus globerulusK1/1アシラーゼの活性
0003608798.tif 000044
K1/1−アシラーゼは10mM Zn2+およびフェニルメチルスルホニルフルオライドにより強力に阻害される。非常に低い濃度でも後者の化合物により強力に阻害されることにより、酵素の反応機構はセリンプロテアーゼ様であることが示唆される。
27.2.Rhodococcus globerulusK1/1アシラーゼの一般的な特徴データ：
27.2.1.アシラーゼの分子量はSDS−PAGE（実施例4.c.および５参照）では54.6kDaであり、ゲル濾過（実施例５参照）にかけた場合には92.3kDaであることから、未変性アシラーゼはホモダイマー構造であることが示唆される。
27.2.2.アシラーゼの等電点は実施例６に記載のように測定し、約pH4.0である。
27.2.3.可変pH条件下でのアシラーゼの活性および安定性の測定において、下記の緩衝溶液を使用する：
pH5.5−pH7.5   リン酸緩衝液
pH7.5−pH9.0   トリス緩衝液
pH9.0−pH10.5  グリシン緩衝液
pH安定性の決定において、アシラーゼサンプルを２時間、23℃で種々のpHの緩衝液中でインキュベートする。次いで、酵素サンプルを標準的な活性アッセイにかける（実施例26参照）。
アシラーゼは、pH5.5ないしpH7.5で広範な至適安定性を示す。
K1/1−アシラーゼの活性は、標準的な活性アッセイで、種々のpH条件下で測定する（実施例26参照）。
アシラーゼはpH7.0ないしpH7.5で至適活性を示し、至適値の酸性側では活性が鋭く減少する。
27.2.4.Rhodococcus globerulusK1/1アシラーゼの温度安定性
アシラーゼのサンプルを、０℃から65℃の範囲の種々の温度で30分間インキュベートする。氷浴で冷却した後、アシラーゼサンプルを標準的活性アッセイにかける（実施例26参照）。
50℃までで30分間インキュベートした場合、アシラーゼの活性の消失は全く認められない。55℃でインキュベートしたアシラーゼは、40％その活性を消失するが、一方、より高い温度（60℃、65℃）でインキュベートしたアシラーゼではインキュベーション30分間以内で完全に不活性化される。
27.2.5.Rhodococcus globerulusK1/1アシラーゼのＮ末端アミノ酸配列
K1/1−アシラーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定するために、HP G 1005A N末端タンパク質シークエンス・システムを利用して、強陰イオン交換カラムに結合した逆層サンプルカラムからなる小型吸着性二相カラムに保持されたタンパク質サンプルについて、自動エドマン分解化学を行う。PTH−アミノ酸の分析は、オンラインHP 1090 HPLCシステム（Hewlett Packard、Palo Alto、CA、USA）により行う。
Ｎ末端アミノ酸配列（50残基）を配列番号１に示す：
0003608798.tif 000045
実施例28:Rhodococcus equi Ac6の（Ｓ）−Ｎ−アセチル−１−フェニルエチルアミンアシラーゼのＮ末端アミノ酸配列
Ｎ末端アミノ酸配列の決定は実施例27.2.5.に記載のように行う。
Ac6−アシラーゼのＮ末端アミノ酸配列（30残基）を配列番号２に示す：
0003608798.tif 000046
実施例29:Arthrobacter aurescens AcR5bの（Ｒ）−特異的アシラーゼのＮ末端アミノ酸配列
Ｎ末端配列の決定は実施例27.2.5.に記載のように行う。
小サブユニット（16kDa）のＮ末端アミノ酸配列は配列番号３に示し：
0003608798.tif 000047
大サブユニット（89kDa）のＮ末端アミノ酸配列は配列番号４に示す：
0003608798.tif 000048
実施例30:精製K1/1アシラーゼを用いた（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−４−ペンテンの調製
50mlの10mMラセミ２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンのリン酸緩衝溶液（pH7.0）に、7mlのK1/1アシラーゼ（0.456U）を加える。このアシラーゼはHICにより精製し、限外濾過により濃縮しておく（実施例26.5および26.6参照）。脱アシル化は30℃、200rpmで連続振盪しながら行う。反応はHPLCで監視し（実施例１参照）、約50％転換した後、溶液を1N HClでpH2に酸性化し、１容量のジクロロメタンで３回抽出し、非変換アミドを得る。水層を1N NaOHで中和し、再度ジクロロメタンで３回抽出し、形成されたアミンを回収する。両方の有機層をMgSO4で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸留除去する。アミドを、下記の条件下でのHPLCによる光学純度測定に直接使用する:Chiralcel OJカラム、溶出液ヘキサン／イソプロパノール9:1、流速1ml/分、検出208nm。得られたアミンを、HPLCによる光学純度の分析を行う前に、100mlトリエチルアミンおよび100ml無水酢酸を各サンプルに添加することによりアセトアミドに変換する。
50.3％変換度では、（Ｓ）−２−アミノ−１−フェニル−４−ペンテンが87.4％eeで得られ、（Ｒ）−Ｎ−２−アセチルアミノ−１−フェニル−４−ペンテンが98.8％eeで得られ、これはＥ値74.9％に相当する。
実施例31:Rhodococcus globerulusK1/1の全細胞形であるK1/1−アシラーゼを用いた（Ｓ）−２−アミノ−１（４−クロロフェニル）−４−ペンテンの調製
K1/1株は、実施例３に従って、1g/lラセミＮ−アセチル−１−フェニルエエチルアミンを含有する20lの基本培地を満たした30l発酵槽中で生育させる。細胞を連続遠心により採取し、80gラセミ２−アセチルアミノ−１（４−クロロフェニル）−４−ペンテンの500mlメタノール溶液を20lのリン酸カリウム緩衝液（69mM、pH7）に加えることにより調製した反応混合物に再懸濁する。21時間、28℃、500rpmで撹拌した後、形成したアミンおよび未反応のアミドを分離し、実施例30で示した方法と同様にして光学純度を分析する。
31.1g（94.5％収率）の＞99.9％eeである（Ｓ）−２−アミノ−１（４−クロロフェニル）−４−ペンテンおよび38.6g（97％収率）の98.5％eeである（Ｒ）−２−アセチルアミノ−１（４−クロロフェニル）−４−ペンテンを単離する。
微生物の寄託
下記の微生物を、ブダペスト条約により、DSM−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、Ｄ−38124 Braunschweigに寄託する：
Rhodococcus globerulusK1/1、DSM 10337（1995年９月23日寄託）
Rhodococcus equi Ac6、DSM 10278（1995年９月23日寄託）
Arthrobacter aurescens AcR5b、DSM 10280（1995年９月23日寄託）
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ノバルティス  アクチエンゲゼルシャフト
（Ｂ）通り：シュバルツバルトアレー
（Ｃ）市：バーゼル
（Ｅ）国籍：スイス
（Ｆ）郵便番号（ZIP）:4002
（Ｇ）電話：＋41  61  696  11  11
（Ｈ）ファックス：＋41  61  696  79  76
（Ｉ）テレックス:962  991
（ii）発明の名称：新規バイオ触媒
（iii）配列の数:4
（iv）コンピューター解読形態：
（Ａ）媒介型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM  PC互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0、Version＃1.30（EPO）
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:50アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を示す記号：ペプチド
（Ｂ）存在位置:41
（Ｄ）他の情報:/産物＝「アミノ酸は定かでない」
（xi）配列の記載：配列番号1:
0003608798.tif 000049
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（xi）配列の記載：配列番号2:
0003608798.tif 000050
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:13アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（xi）配列の記載：配列番号3:
0003608798.tif 000051
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:18アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列の特徴を示す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:4
（Ｄ）他の情報:/産物＝「アミノ酸は定かでない」
（xi）配列の記載：配列番号4:
0003608798.tif 000052