(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ白血病ウイルス（BLV）に対するヒツジの白血病発症の可能性を判定する方法であって、ヒツジ個体のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGlnーThrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する方法。
【請求項２】
ウシ白血病ウイルス（BLV）に対するヒツジの白血病発症の可能性を判定する方法であって、ヒツジ個体のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する方法。
【請求項３】
両方の対立遺伝子において上記アミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
両方の対立遺伝子において上記アミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ウシ白血病ウイルスに対するヒツジの白血病発症の可能性を判定する方法であって、下記の工程：（１）ヒツジ個体から分離したゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅してヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコードするDNAを含むPCR産物を調製する工程：及び（２）上記PCR産物に含まれるDNAによりコードされるアミノ酸配列において、ヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する工程、又はヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工程；
を含む方法。
【請求項６】
下記のプライマー・セット：
0003613571.tif 000005
を用いる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウシ白血病ウイルスに対するヒツジの白血病発症の可能性を判定するために用いるプライマー・セットであって、請求項６に記載のＡプライマー及びＢプライマーからなるセット。
【請求項８】
ヒツジ個体のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体以外のヒツジを、ウシ白血病ウイルスに対するワクチンの評価用の実験動物、又はウシ白血病ウイルスの白血病発症モデル実験動物として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ウシ白血病ウイルスに対するヒツジの白血病の発症可能性を評価する方法に関する。
背景技術
主要組織適合抗原（MHC）は、生体の感染防御機構において自己−非自己の識別に関与する分子であり、α鎖及びβ2MからなるクラスＩとα鎖及びβ鎖からなるクラスIIとからなり、それぞれのα１及びα２ドメイン並びにα１及びβ１ドメインには抗原ペプチドを噛み込む溝が存在している。そして、この溝に収容された断片化ペプチドのみがＴ細胞レセプターによって認識されるという特徴を有しており、クラスＩを認識したCD8＋細胞によって細胞死（細胞性免疫）が達成され、クラスIIを認識したCD4＋細胞によって主として抗体産生（液性免疫）が誘導される。
MHCは最も多型に富んだ遺伝子群であり、そのハプロタイプによってペプチド収容溝のポケットの位置、形、大きさ、及び性状が異なり、それに伴って噛み込まれる断片化ペプチドの結合状態が変化し、個体ごとの免疫応答及び疾患感受性を決定しているものと考えられている。MHCハプロタイプと疾患抵抗性（抗病性）又は発症可能性（易病性）との相関については、例えば、ヒト免疫不全ウイウス（HIV）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV）、及びマラリヤに関する報告がある。一方、ウシMHC（BoLA）クラスII遺伝子については、これまでにDQA,DQB,DRA,DRB,DNA,DOB,DYA,及びDYB遺伝子の存在が推測されている。なかでも、DRB遺伝子座において同定されている３つの遺伝子（DRB1〜B3）のうち、DRB3については機能的な蛋白質をコードすることが知られており、現在までに73種類の対立遺伝子の存在が明らかにされている。しかしながら、ウシの感染性疾患とウシMHC（BoLA）ハプロタイプとの相関については従来ほとんど報告がない。
特に、ヒト免疫不全ウイウス（HIV）と同様にウイルス増殖を調節する遺伝子pXを有しており、HTLV−Ｉに最も近縁のレトロウイルスであるウシ白血病ウイルス（BLV）については、ウシMHC（BoLA）ハプロタイプとの相関に関して米国のグループが抗病性を中心に報告しているが、白血病発症可能性との関連性の報告は全くない。このウイルスに感染したウシの割合（日本における感染率）は10〜20％であり、そのうちの１〜２％は10〜15年程度という長期の潜伏期間の後に極めて悪性の地方病性ウシ白血病を発症して死に至るので、このウイルスが引き起こす畜産農家への経済的損失は非常に深刻である。ウシMHC（BoLA）ハプロタイプの解析によってBLV感染後のウシの発症可能性を簡単に判定できるようになれば、発症抵抗性のウシを予め選択して飼育することが可能になり、極めて安全にウシの飼育を継続することが可能になるものと期待される。
本発明者は、ウシMHC（BoLA）クラスII遺伝子のうち、DRB遺伝子座の構造を解析して、DRB3遺伝子（BoLA−DRB3）及びその遺伝子産物の構造を明らかにした（Biochem.Biophys.Res.Commun.,209,pp.981−988,1995）。本発明者はさらにこの遺伝子の機能を研究し、白血病発症牛と未発症牛とでは、BoLA−DRB3の中で特に多型が認められる第二エクソン（β１ドメイン）からの遺伝子産物において明らかにアミノ酸配列の異なる部分が存在すること、及び、このアミノ酸置換が、BLVに対する発症可能性に直接関与していることを見いだした。そして、ウシMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号75から78で特定される位置にアミノ酸配列:Val−Asp−Thr−Thyを含む対立遺伝子をホモ接合で有するウシ個体は白血病の発症可能性があると判定すべきことを見いだした（平成８年７月19日出願の特願平８−190933号明細書；第19回日本分子生物学会、札幌市、平成８年８月28日、演題番号３−Ｐ−1124、同要旨集526頁、平成８年７月25日発行）。
ウシ白血病ウイルスはヒツジに対しても感染し、ヒツジ白血病を引き起こすことが知られている。自然宿主であるウシにおいては抗体陽性の未発症健康、持続性リンパ球増多症（PL）、さらには長い潜伏期間の後にＢリンパ腫である地方病性牛白血病の３つの病態を引き起こすが、ヒツジに感染した場合には、未発症健康と白血病発症の２つのステージのみを示し、より短期間で発症するという特徴がある。このため、ヒツジはウシ白血病ウイルスの実験感染動物として用いることができ、ワクチンの効果判定実験に有用である（Aida,Y.,et al.,Am.J.Vet.Res.,50,pp.1946−1951,1989;Aida,Y.,et al.,実験医学，増刊AIDSとATL−分子レベルから予防・治療まで−,11（５）,pp.547−557,1993）。また、ウシ白血病ウイルスをイン・ビトロの培養細胞に感染させてもトランスフォーム（癌化）を導くことができないが、ウイルスを接種すると容易に癌化を誘発するヒツジはウシ白血病ウイルスの癌化能を調べるために不可欠である。
しかしながら、ウシ白血病ウイルスに対するワクチンの効果判定にヒツジを用いると、データがばらついて実験結果の評価が困難になるという問題があり、これがワクチン開発の効率を低下させる原因となっている。このばらつきはヒツジのMHC（OLA）ハプロタイプに由来する可能性があるが、ヒツジのハプロタイプと白血病発症との相関については従来全く報告がない。ヒツジ個体のウシ白血病ウイルスに対する白血病発症の抵抗性を確実に予知することができ、一定の免疫応答性を有するヒツジ個体を選別することができれば、ウシ白血病ウイルスに対するワクチン開発の効率を飛躍的に高めることができる可能性がある。
発明の開示
従って、本発明の課題は、ウシ白血病ウイルスのヒツジに対する感染及び発症とヒツジMHC（OLA）ハプロタイプとの相関を解明し、ウシ白血病ウイルスに対するヒツジ個体の白血病発症の可能性を遺伝子工学的な手法で簡便に判定する方法を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記の判定方法に有用なプライマー・セットを提供することにある。
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ヒツジMHC（OLA）Class II DRβ鎖のβ１ドメインの特定のアミノ酸配列がヒツジ白血病の発症に関与していることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、ウシ白血病ウイルス（BLV）に対するヒツジの白血病発症の可能性を判定する方法であって、ヒツジ個体のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する方法、又はヒツジ個体のヒツジHMC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する方法を提供するものである。ウシ白血病ウイルスに対して実験的に感染したヒツジに対して行う上記方法は本発明の好ましい態様である。
これらの発明の好ましい態様によれば、両方の対立遺伝子ともヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する方法；並びに、両方の対立遺伝子ともヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する方法が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、ウシ白血病ウイルスに対するヒツジの白血病発症の可能性を判定する方法であって、下記の工程：
（１）ヒツジ個体から分離したゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅してヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインの一部又は全部をコードするDNAを含むPCR産物を調製する工程：及び
（２）上記PCR産物に含まれるDNAによりコードされるアミノ酸配列において、ヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する工程、又はヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する工程；
を含む方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、ウシ白血病ウイルスに感染したヒツジ個体に対して行う上記方法；両方の対立遺伝子ともヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体を白血病の発症危険性ありと判定する方法；並びに、両方の対立遺伝子ともヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体を白血病の発症抵抗性ありと判定する方法が提供される。
さらに、下記のプライマー・セット:Aプライマー:5′−TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′及びＢプライマー:5′−CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC−３′を用いる上記方法；ウシ白血病ウイルスに対するヒツジの白血病発症の可能性を判定するために用いるプライマー・セットであって、上記のＡプライマー及びＢプライマーを含むセットが提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、制限酵素サイトを付加したプライマー・セットとして、プライマー・セット（２）:Aプライマー:5′−GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′；及びＢプライマー:5′−AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC−３′を用いて、ヒツジMHC Class IIのDRβ鎖のβ１ドメイン（OLA−DRB1）遺伝子の第二エクソンに相当する遺伝子を増幅し、このPCR産物をサブクローニングして片方の対立遺伝子のシークエンシングを行った結果及び推定アミノ酸配列を示した図である。図中、下線はPCRプライマーの位置を示す。
第２図は、ウシ白血病ウイルスに感染した後、白血病を発症したヒツジ（16頭）由来のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸（アミノ酸番号８〜86）を比較した結果を示す図である。図中、アミノ酸は一文字表記で示してあり、上段の矢印はアミノ酸番号70から71の位置を示す。
第３図は、ウシ白血病ウイルス感染未発症ヒツジ（未発症健康ヒツジ12頭）由来のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸（アミノ酸番号８〜86）を比較した結果を示す図である。図中、アミノ酸は一文字表記で示してあり、上段の矢印はアミノ酸番号70と71の位置を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、ウシ白血病ウイルスに感染したヒツジについて、又はウシ白血病ウイルスに未感染のヒツジが将来ウシ白血病ウイルスに感染した場合について、そのヒツジ個体の白血病発症の可能性を判定する方法である。ヒツジはウシ白血病ウイルスの自然宿主ではなく、自然感染することはほとんどないが、実験的に感染を成立させることができる。本発明の好ましい態様では、ヒツジ個体からゲノムDNAを分離した後、PCR法によってヒツジMHC Class IIのDRβ鎖のβ１ドメイン（OLA−DRB1）遺伝子の第二エクソンの一部又は全部をコードする遺伝子を特異的に増幅し、得られたPCR産物のシークエンシングを行ってβ１ドメインのアミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列を推定する。アミノ酸番号70−71のアミノ酸配列がSer−Arg（SR）又はGln−Thr（QT）であるヒツジ個体は、ウシ白血病ウイルスにすでに感染している場合、又はウシ白血病ウイルスに将来感染した場合に、白血病を発症する危険性がある。一方、アミノ酸番号70−71のアミノ酸配列がArg−Lys（RK）であるヒツジ個体は、ウシ白血病ウイルスにすでに感染していても、ウシ白血病ウイルスに将来感染した場合にも、白血病の発症に対して抵抗性である。
上記の判定において、対立遺伝子（ハプロタイプ）における上記アミノ酸配列を比較することも判定精度を高めるために有用である。すなわち、両方の対立遺伝子においてアミノ酸番号70−71のアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrである場合（SRホモ又はQTホモ）、又は対立遺伝子の一方のアミノ酸配列がSer−Argであり、他方がGln−Thrである場合（SR/QTヘテロ）には、その個体は白血病の発症に対して高い危険性を有している。一方、両方の対立遺伝子においてアミノ酸番号70−71のアミノ酸配列がArg−Lysである場合（RKホモ）にも、その個体は白血病の発症に高い抵抗性を有している。
ヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸配列については、シュワイガーらによる報告があり、当業者はその配列の情報を容易に利用できる（Schwaiger,F.,et al.,Mol.Biol.Evol.,11,pp.239−249,1994）。また、核酸配列の情報については、バリンガルらの報告に記載された配列情報を利用可能である（Ballingall,K.T.,et al.,Animal Genetics,23,pp.347−359,1992）。参考のため、Ａプライマー:5′−GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′；及びＢプライマー:5′−AAGTCGACCGCTGCACAGTGAAACTC−３′を用いて、ヒツジ個体から分離したゲノムDNAをPCR法によって増幅し、ヒツジMHC Class IIのDRβ鎖のβ１ドメイン（OLA−DRB1）遺伝子の第二エクソンに相当するPCR産物を得、このPCR産物をサブクローニングして片方の対立遺伝子のシークエンシングを行った結果及び推定アミノ酸配列を図１に示す。
本発明の判定方法の対象となるヒツジは特に限定されず、ウシ白血病ウイルスに対して感染する可能性があり、感染により白血病を発症する可能性があるものであれば、いかなる種のヒツジを対象としてもよい。具体的には、例えば、ムフロン、レッドムフロンなどの野生のヒツジ；湖羊、蒙古羊などの中国の羊；ブラックヘッド・ペルシアン、カラクなどの西アジアのヒツジ；ソーイ、マンクス・ロフタン、ヤコブ、サフォークなどのイギリスのヒツジ；テクセル、チュロなどのヨーロッパ大陸のヒツジ；又はオーストラリアン・メリノー、コリデールなどの大洋州のヒツジなどを挙げることができるが、これらの品種に限定されることはない。ヒツジ個体がウシ白血病ウイルスに感染しているか否かは、血清中の抗ウシ白血病ウイルス抗体を検出する試験あるいは抗ウイルス抗体を用いた試験により容易に確認することが可能である。
ヒツジ個体からゲノムDNAを調製するための試料としては、末梢血や臓器などを利用することができる。臓器としては、例えば、リンパ節などの組織片を用いることができる。上記の試料からゲノムDNAを調製する方法としては、当業者に利用可能なものであればいかなるものを利用してもよい。試料として末梢血白血球、又は末梢血リンパ球を用いる場合には、例えば、Hughesらの方法（Hughes,S.H.et al.,Cell,15,pp.1397−1410,1978）を用いることができる。臓器を用いる場合には、例えば、凍結した組織片をハサミで薄切した後、ドデシル硫酸ナトリウム、フェノール−クロロホルム法（Mcknight,G.S.,Cell,14,pp.403−413,1978）により調製することができる。また、細胞からのゲノムDNAの簡便抽出法を用いてもよいが、その詳細は実施例に記載した。
調製したゲノムDNAをPCR法により増幅するにあたり使用するプライマーとしては、アミノ酸番号70−71部分を含むヒツジMHC Class IIのDRβ鎖のβ１ドメインの部分配列をコードするDNAを増幅可能なプライマー、あるいはβ１ドメインの全長をコードする遺伝子を含むDNAを増幅可能なプライマーであれば、いかなるものを用いてもよい。本発明の方法に特に好適に使用可能なプライマーのセットとして、サイクルシークエンシング及びダイナビーズDNA直接シークエンス等の直接シークセンス法が可能な下記のプライマーセット（１）:Aプライマー:5′−TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′；及びＢプライマー:5′−CAGGAAACAGCTATGACCCGCCGCTGCACAGTGAAACTC−３′を挙げることができる。また、制限酵素サイトを付加したプライマー・セットとして、プライマー・セット（２）:Aプライマー:5′−GGAATTCCTCTCTCTGCAGCACATTTCCT−３′；及びＢプライマー:5′−AAGTCGACCGCTGCAGTGAAACTC−３′を挙げることができる。もっとも、増幅に利用可能なプライマーはこれらに限定されることはない。
PCR法に用いるDNA量は適宜選択可能であるが、例えば、末梢血白血球又は末梢血リンパ球を用いる場合には、0.1〜0.5μｇ程度である。また、上記のようにして増幅されたDNA（PCR産物）のシークエンス決定法としては、当業者に利用可能なものであればいかなるものを利用してもよいが、例えば、直接シークエンス法などを用いることが好ましい。その具体的は実施例に詳細に記載されている。なお、多くのヒツジはヘテロ接合体（heterozygout）であり、直接シークエンス法ではどちらの対立遺伝子なのかを決定することができないことがある。このような場合、上記プライマー・セット（２）を用いて増幅されたPCR産物をサブクローニングして、片方の対立遺伝子のみの塩基配列を決定して比較することにより、もう一方の対立遺伝子の塩基配列を確実に決定することが可能になる。より正確に遺伝子情報を得るためには、PCR産物から両方の対立遺伝子をサブクローニングしてそれぞれの塩基配列を決定することが好ましい。その具体的方法及び利用可能なプライマーは下記の実施例に詳細に記載されている。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
試料としてヒツジ個体から末梢血を凝固剤入りの注射筒で採取し、４℃、3,000rpmの条件下で20分間遠心して白血球層を得た後、分離した白血球層をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、遠心によりペレットを得て末梢血白血球の試料とした。また、上記と同様にして採取した末梢血から、宮坂らの方法（Miyasaka,M.and Trnka,Z.,Immunological Metods,Vol.3,pp.403−423,1985,Academic Press,NY）により末梢血リンパ球を得て、上記と同様のペレットを得ることにより末梢血リンパ球の試料を調製した。また、BLV感染浮遊細胞液を４℃、1,100rpmの条件下で５分間遠心して培養液を除去し、細胞をPBSで洗浄した後に遠心してペレット状の試料を調製した。さらに、BLV感染リンパ肉腫を発症したヒツジのリンパ節及び腫瘍組織から組織片を分離し、無固定のまま液体窒素により急速凍結して−80℃で保存したものを組織片の試料とした。
1.5mlのミクロ遠心チューブの中で上記の各試料細胞をPBSで２回洗浄し、沈殿した細胞を再度PBSにボルテックスミキサーを用いて懸濁した。１×106個の細胞に対して200μｌの１×PCR緩衝液［10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,2.5mM MgCl2,0.5％Tween−20］と１μｌのプロテナーゼＫ（20mg/ml）を加えてボルテックスミキサーで再懸濁し、56℃で45〜60分間インキュベーションした。さらに、95℃で10分間処理した後、５分間以上氷冷して、約５〜10μｌをPCR法での増幅に用いた。
200μＭの各dNTP、0.2〜0.4μＭのプライマー、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（Gene Amp Kit;Perkin−Elmer Cetus）を含む50μｌの１×PCR緩衝液［10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.001％（w/v）ゼラチン］にゲノムDNAを溶解し、94℃で１分;61℃で１分；及び72℃で１分の処理を１サイクルとして25サイクルの増幅を行い、さらに72℃で５分間処理を行った。プライマーとしては、ヒツジHMC Class II DRβ鎖のβ１ドメイン（OLA−DRβのβ１ドメイン:DRB1遺伝子の第二エクソン）をPCR法により特異的に増幅できる以下のプライマーを用い、Ｂプライマーの５′未満には特異的なビオチン化を導入した。なお、このプライマーは、サイクル・シークエンシングに好適に使用できるものである。
0003613571.tif 000002
20μｌのDYNAEADS M−280 Streptoavidin（Dynal A.S,N−0212,Oslo,Nolway）を100μｌの２×結合−洗浄用緩衝液（Ｂ＆Ｗ緩衝液:10mM Tris−HCl（pH7.5）,1.0mM EDTA,2M NaCl,0.1％Tween−20）で洗浄し、ビーズを80μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液中に再懸濁した。このビーズ懸濁液に上記のPCR産物（50μｌ）を加えて穏やかにピペッティングした後、ホイルローテーターでゆっくり回転しながら室温で15分間インキュベートした。固定化されたPCR産物を含むチューブを磁石（Dynal MPC）上に置き、上清をピペットで除去した後、100μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液を加えてビーズを洗浄した。磁石を用いて再度上清を除去した後、用事調製した0.1M NaOH50μｌに再懸濁した。
ビオチン化鎖が固定されたビーズを磁石を用いてチューブ壁に集めて上清を除き、ビーズを50μｌの0.1M NAOHで１回、100μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で３回、50μｌのTE緩衝液で１回洗浄した。全ての操作において、スムースなストロークで再懸濁を行った。さらに100μｌの蒸留水で洗浄した後に上清を除去し、蒸留水を加えて容量を調整してシークエンシングに用いた。シークエンシングはBcaBESTジデオキシ・シークエンシング・キット（タカラ・バイオメディカルズ製）を用いて、添付の説明書に記載された条件に行った。なお、シークエンスプライマーとして以下のプライマーを用いた。
0003613571.tif 000003
結果を図２及び図３に示す（図中、ヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号８から86を示す）。ウシ白血病ウイルスに感染しているものの白血病を発症していないヒツジ（未発症健康ヒツジ:12頭）、及び白血病発症ヒツジ（16頭）由来のヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸配列のアミノ酸番号70−71番目のアミノ酸を比較した結果を表１に示す。表中の遺伝子型RK/RKなどの表記は、両対立遺伝子のアミノ酸配列（ヒツジMHC Class II DRβ鎖のβ１ドメインのアミノ酸番号70から71まで）を一文字表記で記載したものであり、表中の数字は陽性個体／検査個体で示した。この結果、アミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がSer−Arg又はGln−Thrであるヒツジ個体は白血病の発症する危険性があり、両対立遺伝子において上記の各アミノ酸配列を有する個体（SRホモ、QTホモ、又はSR/QTへテロ）は特に発症の危険性が高いことが分かる。一方、アミノ酸番号70から71で特定されるアミノ酸配列がArg−Lysであるヒツジ個体は白血病に対しての発症抵抗性を有しており、とりわけ両対立遺伝子においてこの配列を有する個体は白血病に対して特に高い発症抵抗性を有していることが明らかである。
0003613571.tif 000004
産業上の利用可能性
本発明の判定方法によれば、ヒツジ個体のウシ白血病ウイルスに対する白血病発症の抵抗性を確実に予知することができ、一定の免疫応答性を有するヒツジ個体を選別することができることから、ヒツジを宿主とする各種感染症の抵抗性の判定が可能である。また、ウシ白血病ウイルスへの感染により短期間にトランスフォーム（癌化）を引き起こすヒツジのみを選別してウシ白血病ウイルスに対するワクチンの評価に用いることにより、評価の精度を高め、ワクチン開発を効率化できる。また、このようにして選別されたヒツジは、ウシ白血病ウイルスの感染力、増殖能力、特に腫瘍化能力（トランスフォーメーション活性）を調べるための実験動物（ウシ白血病ウイルスの白血病発症モデル動物）として極めて有用である。
さらに、ウシ白血病ウイルスはこのウイルスに極めて類似したヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV−Ｉ）の悪性疾患モデルとして利用されているが、本発明の方法により白血病発症に対する抵抗性及び感受性を予測したヒツジ個体を実験に供することにより、白血病発症とヒトMHC（HLA）多型との関連が未だ解明されていない成人Ｔ細胞白血病の研究の発展が期待できる。
【図１】
0003613571.tif 000006
【図２】
0003613571.tif 000007
【図３】
0003613571.tif 000008