(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．ＨＢ  １１８３４と命名されたハイブリドーマ細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、供試試料中のバンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）の定量化に関する。特に、本発明は、免疫原、このような免疫原から調製した抗体、および好ましくは蛍光偏光免疫検定法に用いる、供試試料中のバンコマイシンの特異的定量化用標識試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去３０年間、バンコマイシンは、メチシリン耐性スタヒロコッカス  アウレウス（黄色ブドウ球菌）によって引き起こされるグラム陽性感染症の治療のための最上の薬物であった。また、これは、β−ラクタム抗生物質にアレルギーのある患者の細菌感染症の治療薬である。バンコマイシンは、アミコラトプシス  オリエンターリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（以前にはノカルジア  オリエンターリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）およびストレプトマイセス  オリエンターリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）と命名された）により産生される。バンコマイシンは、グラム陰性菌に耐性である。他の抗生物質との交叉耐性は知られておらず、その長期使用にもかかわらず、治療中の耐性菌の出現の報告はほとんどない。バンコマイシンは、胃腸管から吸収されず、この抗生物質は、腸内の特にクロストリジウム  ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）により引き起こされる小腸結腸炎を治療するのに用いられる。バンコマイシンは、細菌の細胞壁のペプチドグリカンの生合成に関連するペプチド中間物質に優先的に結合することによりその抗菌作用を発揮する。
【０００３】
バンコマイシンは、腎臓を介して除去される。通常の患者で５−１１時間であるこの薬物の半減期は、腎不全の患者で２−５日に延び、透析患者では更に長くなる。バンコマイシンは、比較的安全な薬物であるが、観察されてきた有害作用としては腎毒性および自己毒性が挙げられる。
【０００４】
バンコマイシンの安全な投与のために、患者の血液中のそのレベルを定量化することが慣例となっている。この薬物が、腎的に害された患者の体内により長くとどまることから、より長期間の内部体温への露出は、結晶性分解産物ＩおよびＩＩ（ＣＤＰ−１およびＣＤＰ−ＩＩ）として知られている分解産物の蓄積に帰することが指摘されてきている。ＣＤＰ−１およびＣＤＰ−ＩＩは、別々に単離することのできる回転異性体である。バンコマイシン並びにその２種の主要な分解産物ＣＤＰ−１およびＣＤＰ−ＩＩを、それぞれ図１−３に示す。
【０００５】
バンコマイシンは、水性環境で不安定であることが公知である。Ｈａｒｒｉｓ等の米国特許４，６７０，２５８は、バンコマイシンと水溶液中の薬物を安定化すると言われるトリペプチドとの組成物を開示する。
【０００６】
歴史的に、生物体液中のバンコマイシン濃度は、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素多重免疫測定法（ＥＭＩＴ）または微生物学的技法により測定されてきた。ＨＰＬＣは、バンコマイシンの定量化の全ての方法の中で最も正確であると当業者等にみなされているが、臨床セッティングにおいていつも手に入るとは限らない高度な訓練を受けた職員および専門の装置を必要とする時間のかかる労働集約的方法である。
【０００７】
更に最近では、蛍光偏光技法を用いてバンコマイシンを測定してきた。蛍光偏光技法は、競合的結合免疫測定原理に基づいている。蛍光偏光を支持する原理は、蛍光標識化合物が、直線偏光により励起した場合、その回転速度に反比例した偏光度の蛍光を発するというものである。従って、蛍光標識トレーサー−抗体複合体が直線偏光により励起する場合、発蛍光団は、光を吸収し発する間に回転を余儀なくされることから、発した光は高度に偏光したままである。“遊離の”トレーサー化合物（即ち、抗体に結合していない）が、直線偏光により励起する場合、その回転は、競合的結合免疫測定で作成した相当するトレーサー−抗体結合物よりずっと速い。
【０００８】
蛍光偏光技法および蛍光標識としての用途に好適な化合物は、業界で具体的に述べられてきた。例えば、Ｋｉｒｋｅｍｏ等の米国特許第４，５１０，２５１および４，６１４，８２３は、それぞれ、トレーサーとしてアミノメチル  フルオレセイン誘導体を用いるリガンドの蛍光偏光測定法、およびアミノメチル  フルオレセイン誘導体を開示する。Ｆｉｎｏ等の米国特許第４，４７６，２２９は、蛍光偏光免疫検定法に用いる、バンコマイシン類似体を含有するものを含む置換カルボキシフルオレセインを開示する。Ｗａｎｇ等の米国特許第４，４２０，５６８および５，０９７，０９７は、トレーサーとして置換トリアジニルアミノフルオレセインを用いる蛍光偏光免疫検定法を開示する。Ｗａｎｇは、米国特許第４，４２０，５６８において、バンコマイシンとジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）との反応を開示する。しかしながら、この特許は、このような反応の生成物の構造または不均一系におけるその適用については述べていない。Ｇｒｉｆｆｉｎ等（ＪＡＣＳ  １１５，６４８２（１９９３））は、Ｃ−末端に結合した、アルキル、イミダゾールおよびアミン官能基を有するバンコマイシン誘導体合成のための選択的方法を説明しており、異なる官能基を有する誘導体調製のためのこの方法の有用性を示した。しかしながら、免疫原物質または免疫成分の合成およびバンコマイシンの定量化のためのそれらの使用についての記述は一切ない。
【０００９】
商業的に入手可能なバンコマイシン蛍光偏光測定（ＦＰＩＡ）キットは、利用可能である。例えば、商業的に入手可能な測定キット（Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤＸ（登録商標），  ＴＤＸＦＬＸ（登録商標）  ａｓｓａｙｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，  Ｉｌ．；以後“商業的に入手可能なＡｂｂｏｔｔバンコマイシン測定キット”と称する）は、血清または血漿試料中のバンコマイシンの定量的測定用試薬を含んでいる。これらの測定キットは、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）（以後、“商業的に入手可能なトレーサー”と称する）で標識したバンコマイシン誘導体、およびバンコマイシンに対するヒツジ  ポリクローナル抗体（以後、“商業的に入手可能な抗体”と称する）を用いる。
【００１０】
ＦＰＩＡは、処分すべき放射性能物質が無いこと及び容易且つ迅速に実施することのできる均一系測定法である点で放射免疫測定法（ＲＩＡ）にまさる。しかしながら、商業的に入手可能なバンコマイシン測定キットは、ＨＰＬＣ測定値と一致しないバンコマイシン測定値の時折の増加を示すことが報告されてきた。これらの増加は、ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交叉反応性が増加したためであった。上述したように、異性体ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩは、別々に単離することができる。予想されるように、ＣＤＰ−Ｉから作成したいずれの溶液も、常に、両方の異性体の平衡混合物を含有する。従って、本明細書で報告されるＣＤＰ−Ｉ交叉反応性の測定値は、平衡混合物の交叉反応性を測定している。
【００１１】
従って、生物体液中の交叉反応性分解産物の存在下バンコマイシン濃度を迅速且つ正確に測定することのできる改良された測定法に対する継続的ニーズがある。よって、本発明は、供試試料中のバンコマイシンの定量化のための特異的な（ｕｎｉｑｕｅ）抗体試薬および標識試薬を提供する。また、本発明は、これらの特異的な試薬を用いる免疫検定法も提供する。やはり、提供されるものは、このような抗体試薬の製造に用いる免疫原を調製する合成方法およびこのような標識試薬を調製する方法である。
【００１２】
本発明によれば、標識試薬および抗体試薬は、供試試料中のバンコマイシンの定量化のための免疫検定に用いる場合、当業界に既に公知の手法を超えた進歩を提供する。詳しくは、本発明の抗体試薬は、代謝物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩとの交叉反応性が実質的にないことを見い出した。
【００１３】
発明の概要
本発明は、
（ａ）供試試料を、バンコマイシンに特異的に結合することができ図６の免疫原（ここで、Ｐは、免疫原担体物質であり、Ｘは、直鎖または分枝鎖または環式部分として配置された飽和または不飽和の１０個以下のヘテロ原子を含む０から５０個の炭素およびヘテロ原子の結合部分であり、但し、２個以下のヘテロ原子は、順次直接結合してもよい、この配列は−Ｏ−Ｏ結合を含有することはできず、環式部分は６員以下であり、分枝は炭素原子上にのみ存在してもよい）を用いて産生される抗体を含有する抗体試薬および図８の標識試薬（ここで、Ｑは検出可能部分であり、Ｘは、直鎖または分枝鎖または環式部分として配置された飽和または不飽和の１０個以下のヘテロ原子を含む０から５０個の炭素およびヘテロ原子であり、但し、２個以下のヘテロ原子は、順次直接結合してもよい、この配列は−Ｏ−Ｏ結合を含有することはできず、環式部分は６員以下であり、分枝は炭素原子上にのみ存在してもよい）と接触させて反応溶液を形成し；および
（ｂ）供試試料中のバンコマイシンの量の関数として、抗体と結合しているか又は結合していない反応溶液中の標識試薬の量を測定する、
供試試料中のバンコマイシンの定量化の方法を提供する。
【００１４】
本発明は、更に、蛍光偏光を用いる上記方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい方法において、抗体は、図６の免疫原を用いて生産され、標識試薬は、図８に示す通りであり。
【００１６】
本発明は、更に、バンコマイシンに特異的に結合する抗体を製造するのに有用である図６の新規な免疫原を提供する。
【００１７】
また、本発明は、ＨＢ  １１８３４と命名されたハイブリドーマ細胞系及びそれにより生産されるモノクローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル抗体は、最も好ましくは蛍光偏光によるバンコマイシンの定量化に最も好ましい。
【００１８】
さらに、本発明は、図６の抗体試薬および図８の標識試薬を有する、供試試料中のバンコマイシンの定量化に有用なキットを提供する。好ましいキットは、図６の免疫原から作る抗体を有し；最も好ましいものは、図５の免疫原から作るモノクローナルＩｇＧ抗体である。
【００１９】
また、本発明は、このような抗体試薬の製造に用いる免疫原及びこのような標識試薬を調製する合成法を提供する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本明細書および添付の請求の範囲で使用する場合、以下の用語は、これらのそれぞれの意味を有する：
“ヘテロ原子”は、窒素、酸素、硫黄および燐を意味する。
【００２１】
“ＣＨＣｌ３”はクロロホルムを意味し、“ＣＤＣｌ３”は重クロロホルムを意味し、“ＭｅＯＨ”はメタノールを意味し、“ＤＭＦ”はジメチルホルムアミドを意味し、“ＣＨ２Ｃｌ２”は塩化メチレンを意味し、“Ｅｔ２Ｏ”はジエチルエーテルを意味し、“ＤＭＳＯ”はジメチルスルホキシドを意味する。
【００２２】
“結合部分”、“つなぎ”、“スペーサー”、“スペーサーアーム”および“リンカー”は、相互交換可能に用いられ、一つの所定の物質（例えばハプテン）を第二の所定の物質（例えば免疫原担体または検出可能部分）から分離する共有結合した任意の化学物質を定義することを意味する。
【００２３】
本発明は、免疫原、このような免疫原から調製した抗体、およびバンコマイシンの定量化に用いるのに適する標識試薬を提供する。バンコマイシンの特異的定量化は、まず、供試試料を本発明の標識試薬（トレーサーとも称する）および本発明の抗体試薬と同時に又はいずれかの順で逐次的に接触させ、次いで、供試試料中のバンコマイシンの量の関数として、抗体試薬との結合反応に関与したか又は関与しなかったかのいずれかである標識試薬の量を測定することにより達成する。本発明の抗体および標識試薬は、バンコマイシンの特異的定量化のための蛍光偏光免疫検定法（ＦＰＩＡ）に特に有用である。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、標識試薬および抗体試薬を、特異性と均一系方法のスピードおよび利便性とを組み合わせて供試試料中のバンコマイシンの信頼できる定量化およびバンコマイシンの主要な代謝物、即ち、ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩによる妨害の回避を提供する蛍光偏光免疫検定法に用いる。
【００２５】
供試試料は、いかなる天然に存在する体液、又はその抽出物もしくは希釈物であってもよく、それとしては、これらに限定されないが、全血、血清、血漿、尿、大便、唾液、脳脊髄液、脳組織等が挙げられる。
【００２６】
当業者に公知であるように、特異的抗体および相補的な標識ハプテンを調製する場合、抗体反応を引き出すために用いる免疫原および標識ハプテンの両方の化学構造を考慮する必要がある。伝統的に、選択的抗体を得るのに重要であるハプテンの独特の特徴的部分から遠位にあるハプテン上の部位を介してハプテンを担体蛋白質に結合させる。同様に、このような抗体に結合することのできる標識ハプテンを調製する場合、担体蛋白質をハプテンに結合させるために用いる部位と同じようなハプテン上の部位を介して標識に結合させるのが通例である。このようなアプローチを支持する一つの理由は、担体蛋白質が、ハプテンのその部分への免疫系の接近を立体的に遮断することができることである。相補的な標識ハプテンは、ハプテンの重要な特徴的部分に結合した抗体を妨害しないように、免疫原をその担体蛋白質の結合に用いる場合と同じようなハプテン上の部位にその標識を結合させることにより合成する。
【００２７】
従って、バンコマイシン上の異なる結合部位に由来する、本発明のバンコマイシン免疫原および標識バンコマイシンが、バンコマイシンに特異的な抗体およびバンコマイシンの主要な代謝物の卓越した交叉反応性プロフィールを示す検定法の開発をもたらすことを驚くべき且つ予想外のこととして見い出した。最も驚くべき発見の一つは、検定法の感度の限界に基づき、ＨＢ  １１８３４により分泌されるモノクローナル抗体が、ＣＤＰ−Ｉとの検出可能な交叉反応性を全く示さないことである。これは、バンコマイシンの定量化のための改良された測定法をもたらすものである。
【００２８】
免疫原の合成
本発明のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、両方とも、Ｐが免疫原担体物質でありＸが結合部分である図６の一般式に示すようなバンコマイシンのカルボン酸末端を介して担体蛋白質に結合しているバンコマイシン分子から調製した免疫原を用いて産生される。
【００２９】
本発明の免疫原において、Ｘは、好ましくは、直鎖または分枝鎖または環式部分に配置された飽和または不飽和の１０個以下のヘテロ原子を含む０から５０個の炭素およびヘテロ原子から成る結合部分であり、但し、２個以下のヘテロ原子は、直接結合してもよく、環式部分は６員以下であり、分枝は炭素原子上にのみ存在してもよい。
【００３０】
当業者には当然のことであるが、免疫原担体物質Ｐは、従来の公知のものから選択することができる。適するサイズおよび免疫原性の炭水化物、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、ポリ（アミノ）酸、核酸等のような他の物質も用いることができるが、ほとんどの場合、Ｐは、蛋白質またはポリペプチドである。好ましくは、免疫原担体物質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン等のような蛋白質である。
【００３１】
好ましい免疫原において、Ｐは、チログロブリンであり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−である。最も好ましい免疫原を図７に示す。しかしながら、図７の化合物は、当業者が認めるように、バンコマイシンと免疫原担体との単一の結合体に限定されるわけではない。むしろ、免疫原担体に対するバンコマイシン誘導体の比は、免疫原担体Ｐ上の化学的に利用可能な官能基の数により規定にされ、合成における２つの物質の比により制御される。バンコマイシン誘導体によるＰ上の置換の度合いは、免疫原担体上の利用可能な官能基の１から１００％まで変えることができる。置換の水準は、好ましくは１０％から９５％であり；更に好ましくは１５％から８５％である。
【００３２】
上記のように、本発明の免疫原結合体は、バンコマイシンのカルボン酸末端を介してバンコマイシンを担体物質に結合させることにより調製される。図４ａから４ｃに示すように、バンコマイシンは、当業者等に公知の方法により、Ｖ−Ｘ−Ｙ（ここで、Ｘは、結合部分であり、Ｖ−および−Ｙは、その一方がバンコマイシン（Ｉ）のカルボキシレートと、他方がＰ上の化学的に利用可能な官能基と反応することができる官能基である）と命名された二官能性化合物と結合する。多くの二官能性リンカーが、当業界で公知である。例えば、ヘテロ二官能性リンカーは、例えば、Ｂｉｅｎｉａｒｚ等の米国特許５，００２，８８３に述べられている。ヘテロ二官能性リンカーは、一方または他方の官能基に対するその末端の特異性のため、ある場合には好ましいかもしれない。同様に、免疫原合成の便宜上、官能基Ｖ−および−Ｙは、当業者に周知の又は容易に獲得される技法（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｔｓ，  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．”  １９９１，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ参照）に従って、保護され、所望の時点で脱保護される。
【００３３】
通常、本発明の免疫原の調製において、Ｖは、−ＯＨ、−ハロ（−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、−ＳＨ、または−ＮＨＲ′−（ここで、Ｒ′は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールから選ばれる）から成る群から選ばれる。Ｙは、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ２）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））、またはアジド（−Ｎ３）から成る群から選ぶことができる。上記のように、Ｘは、直鎖または分枝鎖または環式部分に配置された飽和または不飽和の１０個以下のヘテロ原子を含む０から５０個の炭素およびヘテロ原子の結合部分であり、但し、２個以下のヘテロ原子は、直接結合してもよく、配列Ｖ−Ｘ−Ｙは−Ｏ−Ｏ結合を含有することはできず、環式部分は６員以下であり、分枝は炭素原子上にのみ存在してもよい。
【００３４】
図４ａ−４ｃに示す代表的合成スキームに言及すると、バンコマイシン（図４ａ）とＶ−Ｘ−Ｙとの反応は、官能基Ｙが結合した結合部分Ｘを有する結合した中間化合物（図４ｂ）を生成する。官能基−Ｙは、当業者等に公知のいくつかの方法のいずれにても、免疫原担体上の官能基と反応することができる。典型的には、かなり安定であるアミド結合を形成するのが好ましい。アミド結合は、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドのような活性化試薬およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような添加剤との反応によりスペーサーアームのカルボン酸部分［Ｙ＝（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）］を初めに活性化することにより形成する。活性化型（図４ｂ）を、次いで、免疫原担体物質を含有する緩衝溶液と反応させる。あるいは、カルボン酸基を、単離して又は単離することなく、高反応性混合酸無水物、アシルハライド、アシルイミダゾリド、または混合炭酸エステルに変換し、次いで、免疫原担体物質と結合させることができる。当業者に容易に明らかであるように、上記のもの以外にアミド結合を形成するのに用いることのできる多数の試薬があり、このような試薬は、特別に述べる必要が無い。
【００３５】
あるいは、末端アミン官能性（Ｙ＝ＮＨ２）を有するスペーサーアームを、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドのような適切な溶媒中のＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジル  カーボネートとの反応により高反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド  ウレタンに変換する。その結果できたウレタンを、次いで、緩衝水溶液中の免疫原担体物質と反応させて免疫原を得る。
【００３６】
更に、末端アルデヒド官能性［Ｙ＝−ＣＨ（＝Ｏ）］を有するスペーサーアームは、当業者等に公知の方法による還元アミノ化により、水素化シアノ硼素ナトリウムの存在下、緩衝水溶液中の免疫原担体物質に結合することができる。
【００３７】
あるいは、免疫原担体物質とホスゲンまたは、ジ−もしくはトリホスゲンまたはカルボニルジイミダゾールのようなホスゲン等価物とを初めに反応させることにより、アルコール基［Ｙ＝−ＯＨ］を含有するスペーサーアームを免疫原担体物質に結合させて、高反応性クロロホルメートまたはイミダゾロホルメート誘導体の形成に帰することができる（通常、単離しない）。その結果できた活性ギ酸エステルを、次いで、緩衝水溶液中の免疫原担体物質と反応させて免疫原を得る。
【００３８】
あるいは、Ｙ＝−Ｎ３の場合、結合した中間物質を、水性緩衝溶液中で光分解により免疫原担体に結合させることができる。
【００３９】
図６の好ましい免疫原は、従って、図５ａから５ｄのスキームにより調製する。バンコマイシン（図５ａ）のカルボキシル基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシ  ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）で活性化する。リンカー、即ち、４−アミノ  酪酸メチルエステル「Ｖ＝−ＮＨ２，Ｘ＝−（ＣＨ２）３−，Ｙ＝−ＣＯ２Ｈ］、との更なる反応は、加水分解後、結合した中間物質［Ｘ＝−（ＣＨ２）３−，Ｙ＝−ＣＯ２Ｈ］を与える。Ｙを、次いで、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）で活性化し、Ｐに結合させる。他のペプチド結合形成法を用いても同じく成功することは当業者等の認識するところであろう。
【００４０】
従って、今述べた方法において、バンコマイシンは、分子上のこの又は他のアミン類またはアルコール類のような反応部位を介して、Ｐが前述のような免疫原担体物質である、当業界で公知の種々の慣用技法により免疫原担体物質に結合することができる。
【００４１】
更に、ハプテンを担体物質に結合するのと同様の方法で、スペーサーアーム上の反応基と相補的意味で反応性であるアミノ、ヒドロキシルまたはカルボキシル基のような官能基を有する固体支持体にスペーサーアームを結合することができる。その結果物は、ハプテンから抗体を分離または精製するのに用いることができる固相である。このような結合技法も当業界で周知である。
【００４２】
抗体の作製
本発明の免疫原は、当業界で周知の方法により、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体を調製するのに用いることができる。通常、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、またはウマのような宿主動物の１個所以上の種々の部位に免疫原、通常はアジュバントとの混合物を注射する。同じ部位または異なる部位に規則的または不規則な間隔で更に注射し、その後、最適のタイターに到達したことを決定するまで、抗体価を評価するために採血を行う。一定容量の抗血清を得るために宿主動物を出血させるか又は体細胞雑種形成技法もしくはモノクローナル抗体を得るための当業界で公知の他の技法のいずれかにより抗体を得、例えば−２０℃で貯蔵することができる。完全な免疫グロブリンの他に、本明細書で用いる抗体という用語には、抗原が結合する、公知の方法により作製することのできる免疫グロブリンの断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２およびＦｖが含まれる。
【００４３】
商業的に入手可能な抗体を本発明の好ましい抗体と置換するだけでもバンコマイシン検定法の性能を改善することを特記する。
【００４４】
本発明の好ましい方法は、そのような結合が測定の精確さを妨害する程度には検出することを意図しない代謝物、例えばＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩ、と結合しない抗体を用いることも特記する。
【００４５】
標識試薬の調製
上記のように、本発明の標識バンコマイシン試薬は、バンコマイシンの二次アミノ末端、即ち担体蛋白質が結合する位置と異なる位置、で標識を結合することにより調製する。
【００４６】
バンコマイシン用の本発明の標識試薬は、Ｑが検出可能部分、好ましくは蛍光部分であり；Ｘが結合部分である図８に示す一般式を有する。好ましい標識試薬において、Ｑは、４′−アミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチルフルオレセイン、６−アミノメチルフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５および６−アミノフルオレセイン、チオウレアフルオレセイン、およびメトキシトリアジニルアミノフルオレセインから成る群から選ばれるフルオレセイン誘導体であり；Ｘは、好ましくは、直鎖または分枝鎖または環式部分に配置された飽和または不飽和の１０個以下のヘテロ原子を含む０から５０個の炭素およびヘテロ原子から成る結合部分であり、但し、２個以下のヘテロ原子は、直接結合してもよく、環式部分は６員以下であり、分枝は炭素原子上にのみ存在してもよい。更に好ましい標識試薬において、Ｑは、クロロトリアジニルアミノフルオレセインであり、Ｘ＝０、即ち、バンコマイシン誘導体は、フルオレセイン誘導体に直接結合している。本発明の好ましい標識試薬は、図９に示す構造を有する。
【００４７】
本発明の標識試薬は、免疫原結合体の合成と同様の方法で、初めに一次アミノ基を区別して保護し（Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅとＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｔｓ，  “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．”  １９９１，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ参照）、続いて二次アミノ基を検出可能な部分と選択的に反応させることによりバンコマイシンから合成する。
【００４８】
更に詳しくは、好ましい標識試薬は、図１０ａおよび１０ｂに示すように（ｉ）バンコマイシン塩基とｐＨ６．０の希ＨＣｌとを反応させて四級化窒素として一次アミノ基を保護し、続いて（ｉｉ）これとジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）とを反応させて標識試薬を得ることにより合成することができる。
【００４９】
その最も好ましい態様において、上記合成法を用いて図９の標識試薬を作成する。
【００５０】
蛍光偏光免疫検定法を用いたバンコマイシン測定法
本発明の試薬を用いる蛍光偏光免疫検定法（ＦＰＩＡ）フォーマットに従うことにより、供試試料中のバンコマイシンの濃度または量を正確に定量化することができる。バンコマイシンの特異的定量化のためＦＰＩＡを実施するに当たって、既知の濃度のバンコマイシンを有する検量物から検量線を得る。
【００５１】
一般的に、蛍光偏光法は、蛍光トレーサーが、特徴的波長の平面偏光により励起される場合、所定の媒体中のトレーサーの回転速度と逆関係にある入射刺激光に関連する偏光度を保持する別の特徴的波長（即ち、蛍光）で光を発するという原理に基づいている。この特性の結果として、粘稠な溶液相内でかまたは比較的遅い回転速度を有する別の溶液成分に結合した場合のような回転が抑制されたトレーサー物質は、遊離の溶液中におけるより相対的に大きい偏光度の発光を保持する。従って、リガンドおよびトレーサーが抗体に結合しようとして拮抗する時間枠内で、トレーサーおよびリガンドの結合速度は、選択性、感度、および正確さのような重要な性能パラメーターを保持する適切な割合の遊離および結合トレーサーをもたらす。
【００５２】
本発明によるバンコマイシンの特異的定量化のため蛍光偏光免疫検定を行う場合、バンコマイシンを含有すると思われる供試試料を、本発明の標識試薬の存在下、本発明の免疫原を用いて調製した抗血清またはモノクローナル抗体と接触させる。次いで、この溶液に平面偏光を通過させて蛍光偏光応答を得、この応答を、供試試料中に存在するバンコマイシンの量の尺度として検出する。
【００５３】
蛍光偏光測定法は、商業的に入手可能な自動化装置（例えば、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＴＤｘ（登録商標）、およびＴＤｘＦＬｘ（登録商標），  Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により行うことができる。
【００５４】
本発明により、図８に示す蛍光標識試薬を有する図６に示す免疫原由来の抗体を用いる場合、バンコマイシン定量化の卓越した蛍光偏光免疫検定の検定結果が得られることを予想外且つ驚くべきこととして見い出した。
【００５５】
特に、図７の免疫原に応答して生成したモノクローナル抗体と組み合わせた図９の標識試薬の使用は、バンコマイシンの主要な代謝物ＣＤＰ−ＩおよびＣＤＰ−ＩＩに対する非常に低い、実質的にゼロ（即ち、測定の感度の限界以下）の交叉反応性を示す測定に帰したことを予想外且つ驚くべきこととして見い出した。最も好ましいものは、ＡＴＣＣ  ＨＢ  １１８３４と命名されたハイブリドーマにより産生したモノクローナルＩｇＧ抗体を用いる蛍光偏光法である。
【００５６】
抗体に結合したトレーサーの量は、供試試料中に存在するバンコマイシンの量と逆に変化する。よって、バンコマイシンおよびトレーサーの抗体結合部位に対する相対的結合親和性が、検定系の重要なパラメーターである。
【００５７】
他の検定フォーマット
蛍光偏光免疫検定法の他に、本発明によるバンコマイシンの定量化のための種々の他の免疫検定フォーマットに従うことができる。通常、このような免疫検定系は、標識した又は検出可能な試薬を用いて結合の程度を測定する、供試試料由来の特異的分析物に結合する免疫グロブリン、即ち全抗体又はその断片、の能力に依存する。このような検出可能な標識としては、酵素、放射性標識、ビオチン、トキシン類、薬物、ハプテン類、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学ルミネッセンス、着色粒子および着色微粒子、並びに前述したもののような蛍光化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５８】
典型的には、このような免疫検定系フォーマットにおける結合の程度は、分析物との結合反応に参加した又は参加しなかった標識試薬に存在する検出部分の量により測定され、検出され測定された検出可能部分の量を供試試料中に存在する分析物の量に相関させることができることが必要である。例えば、競合免疫検定系において、測定しようとする物質（しばしばリガンドと称する）は、検出可能な部分（しばしばトレーサーと称する）に結合するリガンドとよく似た構造の物質と、リガンドおよび構造的に似たトレーサーの一部分に特異的な抗体上の限定された数の結合部位に対し競合する。
【００５９】
試験キット
本発明の試験キットは、供試試料中のバンコマイシンの定量化のため所望の免疫検定を実施するのに必要な試薬を含む。試験キットは、必要な試薬を保持する１つ以上の容器の組み合わせとして、および／または試薬の相容性を可能にする組成物もしくは混合物として商業的にパッケージにした形態で存在することができる。好ましくは、試験キットは、測定を行うのに必要な全ての試薬、標準、緩衝液、希釈剤等を含む。
【００６０】
特に好ましいものは、バンコマイシンの定量化で上述したような蛍光トレーサー化合物および抗体を含む、供試試料中のバンコマイシンの定量化のための蛍光偏光免疫検定用試験キットである。試験キットは、当業界で公知であり、試料前処理溶液、緩衝液、希釈剤、標準等のような使用者の見地から望ましい他の物質を当然のことながら含むことができることは理解されよう。
【００６１】
本発明を以下の実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されない。
【実施例１】
【００６２】
バンコマイシン免疫原の合成
ａ）  ４−アミノ酪酸メチルの合成
４−アミノ酪酸（５．００ｇ、４８．５ミリモル）を、２００ｍＬの丸底フラスコに入れる。ジメトキシプロパン（８０ｍＬ、６５ミリモル）を攪拌しながらフラスコに加える。濃塩酸（１５ｍＬ）を反応物に加え、室温で一晩攪拌する。溶媒を、減圧下、加熱することなくロータリーエバポレーターで除去する。固形物を最小量のＭｅＯＨに溶解し、エーテルで再沈殿させる。沈殿した固形物を吸引濾過し、Ｅｔ２Ｏ（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄する。固形物（収量：６．９ｇ（９６％））を、次いで、真空下で乾燥する。
【００６３】
遊離アミンの１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２．１（五重線，２Ｈ），２．５（三重線，２Ｈ），３．２（幅広三重線，２Ｈ），３．７（一重線，３Ｈ），８．１（一重線，２Ｈ）
ｂ）  バンコマイシン−アミノ酪酸誘導体の合成
バンコマイシン（５００ｍｇ、０．３４ミリモル）塩基を、２５ｍＬの丸底フラスコに入れる。ＤＭＳＯ（４ｍＬ）を加え、必要に応じて温めながら透明な溶液になるまで攪拌する。実施例１（ａ）から得た４−アミノ酪酸メチル．ＨＣｌ（５０６ｍｇ、３．４ミリモル）を反応液に加え、続いてヒドロキシベンゾトリアゾール（１０５ｍｇ、０．６９ミリモル）およびトリエチルアミン（０．０９７６ｍＬ、０．６９ミリモル）を加える。反応物を、Ｎ２下、室温で３から７日間攪拌する。反応物を続いてＨＰＬＣにかける。出発物質が消費された後、沈殿した固形物を濾過により除去し、濾液を、下記のようなＣ−１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製する。集めた画分（収量：３１０ｍｇ）を凍結乾燥する。
【００６４】
分析用ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである：カラムは、３．０ｍｌ／分の流速でアセトニトリル：酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）（１０％アセトニトリルから５０％アセトニトリルで１５分にわたって展開）の連続勾配移動相を用いる７．８ｍｍｘ３００ｍｍ  Ｃ−１８（Ｂｏｎｄａｐａｋ  Ｃ−１８，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）である。検出は、２５４ｎｍで行う。
【００６５】
分取用ＨＰＬＣの条件は以下の通りである：カラムは、８．０ｍｌ／分の流速でアセトニトリル：酢酸アンモニウム（５０ｍＭ）（１０％アセトニトリルから５０％アセトニトリルで１５分にわたって展開）の連続勾配移動相を用いる１９ｍｍｘ２５０ｍｍ  Ｃ−１８（Ｄｙｎａｍａｘ  ６０Ａ  Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）である。検出は、２５４ｎｍで行う。
【００６６】
質量分析法（ＭＳ）：エレクトロンスプレーイオン化法（ＥＳＩ）ＭＨ＋  １５４７，（Ｍ２Ｈ）２＋  ７７４．
ｃ）バンコマイシンハプテンの合成
実施例１（ｂ）から得たバンコマイシン−アミノ酪酸誘導体（１６５ｍｇ、０．１ミリモル）を、２５ｍＬの丸底フラスコ内のＤＭＦ／水（２ｍＬ：３ｍＬ）に溶解する。フラスコを０℃に冷却し、水酸化リチウム（５６ｍｇ、１．３ミリモル）を加える。反応物を０℃で２時間攪拌し、室温に温め、続いてＨＰＬＣにかける。出発物質が消費された後、反応物を、逆相カラムを用いた分取用ＨＰＬＣにより直接精製する。溶媒を凍結乾燥して生成物（収量：１６０ｍｇ）を得る。分析用および分取用ＨＰＬＣは両方とも上記の通りである。
【００６７】
質量分析法（ＭＳ）：ＥＳＩ  ＭＳは、バンコマイシンに結合した加水分解されたリンカーの正確な分子量を示す１５３３に（ＭＨ）＋を与えた。
【００６８】
ｄ）  免疫原の合成
チログロブリン（１００ｍｇ、０．０００２ミリモル）を、燐酸ナトリウム一塩基緩衝液（５ｍＬ、ｐＨを希ＮａＯＨで６．７に調整）に溶解する。実施例１（ｃ）から得たバンコマイシン  ハプテン（５０ｍｇ、０．０３２１ミリモル）、続いてＥＤＡＣ（９．２ｍｇ、０．０４８２ミリモル）を加える。その結果できた反応物を室温で２日間攪拌する。内容物を膜に移し、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（一塩基、ＮａＯＨでｐＨ７．８に調整）で２日間溶媒を４時間毎に変えながら透析する。透析バッグ内の内容物を凍結乾燥して１３０ｍｇの所望の免疫原を得た。
【実施例２】
【００６９】
抗−バンコマイシン抗体１５−１０９−５９２の作製
雌性の６−８週齢のＲＢＦ／ＤｎＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を、フロインドアジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で乳化した実施例１のバンコマイシン免疫原で免疫する。初回免疫は、フロインドの完全アジュバント、次の追加免疫はフロインドの不完全アジュバントを用いて投与する。動物を免疫するこの長期間の動物追加免疫間隔は、１、３、５、１２、１７および２４週目であり、一匹の動物につきそれぞれ２５、１２．５、１２．５、１０、１０および１０μｇの投与量で、初めの３回の追加免疫は１個所の皮下部位および１個所の腹腔内部位に、最後の３回の追加免疫はそれぞれ２個所の皮下部位に行う。定期的に採血を行って抗体応答が現れつつあるのを確認する。融合の３日前に１０μｇの追加免疫を脾臓に投与する前に、動物に７週の休息期間を与えた。
【００７０】
融合当日、マウスをすばやい頚椎脱臼により安楽死させ、脾臓を取り出す。脾臓細胞を、イスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中で１回洗浄し、１０００ＲＰＭで１０分間遠心分離する。ペレットになった脾臓細胞を、１：１の比でＳＰ２／０ミエローマ細胞（Ｄｒ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と混合し、ＩＭＤＭ中で洗浄し、遠心分離する。上澄を除去し、１ｍｌの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を１分にわたってペレットに加え、ペレットを、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ  Ｇｉｂｃｏ）および１５％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を含有するＩＭＤＭに再懸濁する。融合頻度を強化するために、０．５％Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍマイトジェンｖ／ｖ（ＳＴＭ；ＲＩＢＩ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）および１％ｖ／ｖ  ＯＲＩＧＥＮ（Ｉｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、融合細胞懸濁液に加え、２４ウェルの組織培養プレート中にプレーティングする。
【００７１】
１０日目の集密的培養物に存在する融合の一次スクリーニング。市販の測定キット（ＴＤｘ（登録商標）；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて上澄試料における抗−バンコマイシン反応性を検出する。組織培養上澄を、重複して試料ウェルにのせ、市販の検量物質キットから得た１０μｌのＡ検量物質（０μｇ／ｍＬバンコマイシン）またはＦ検量物質（１００μｇ／ｍＬバンコマイシン）のいずれかを希釈前のウェルにのせる。希釈緩衝液を試薬パックのＳおよびＰポットに入れ、市販のトレーサーをＴポット内で用いる。ハイブリドーマ培養上澄が非常に薄いことから、試料容量を９０μｌに増やす。試料の偏光を測定し、ただ一つのハイブリッド、１５−１０９を、Ｆ検量物質の存在下での偏光減少により測定されるようにバンコマイシンに対し特異的であると同定する（表１参照）。これは、遊離のバンコマイシンが抗体に結合し、トレーサーが結合するのを遮断し、従ってシグナルの減少を引き起こすためである。
【００７２】
【表１】
0003714942.tif 000002
【００７３】
ハイブリッド１５−１０９を、１−１００から１−１００，０００の限界希釈法によりクローン化する。クローニング培地は、１０％ｖ／ｖＦＢＳおよび１％ｖ／ｖＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  （Ｇｉｂｃｏ）を有するＩＭＤＡである。９６−ウェルの組織培養プレートの各ウェルに２００μｌの細胞懸濁液を加える。
【００７４】
１５−１０９−１３３と命名したハイブリッドを、集密的培養物のクローン上澄の更なるスクリーニングに基づく更なる評価のために選択する。
【００７５】
モノクローナル抗体ハイブリッド１５−１０９−１３３を、初めに、Ａｍｉｃｏｎ濾過システムを用いて１０倍に濃縮する。次いで、未精製の抗体（抗体は、まだ牛胎児血清中に存在する）を、飽和硫酸アンモニウム（５０％）を用いて分画する。この溶液を、次いで、４０００ＲＰＭ（１分当たりの回転数）で遠心分離し、上澄を捨てる。ペレットを、濃縮後元の容量の１／１０の容量でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁する。この抗体溶液を、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析し、透析後、市販の緩衝液（燐酸、アジド、およびウシガンマグロブリン緩衝液）を用い以下の通り：そのまま、１：２、１：４、１：８、１：１６、および１：３２に希釈する。以前に考察したのと同じバンコマイシン検定モード１を用い、２（２０μＬ）の代わりに１０（１００μＬ）の試料容量を用い、試料ウェル内で試料を重複して検定する。装置は、前述のようにｍＰ（ミリ偏光値）を算定し、最も高いｍＰが得られる抗体の希釈物を、試薬キットのＳポット（抗体ポット）で用いる抗体の希釈物として選択する。１０％グリセロールおよび５％ＢＳＡを含む燐酸緩衝液で抗体を希釈する。トレーサーポットには、ＨＰＬＣにより再精製しトリス緩衝液（０．７％ＳＤＳおよび０．５％ＬＤＳ含有）で希釈した既存の市販のトレーサーを入れる。この精製したトレーサーを、トレーサーポット内で１．７μｇ／ｍＬに希釈する。ポッパーは、２０ｍＭの硫酸銅＋２．５％の５−ＳＳＡから成る。対照と共に７、３５および７５μｇ／ｍＬで重複して検量物質を検量しながら、０、５、１０、２５、５０および１００μｇ／ｍＬでバンコマイシン（分析物）と共にこの試薬パックを装置内に入れる。Ｍｏｄｅ  １で検定物１６をピペットを用いて装置にかけ、標準曲線を検量し、貯える。ＣＤＰ−１交叉反応性が存在しないことを保証するために、種々の濃度でＣＤＰ−１試料を検定にかける。
【００７６】
更なるスクリーニングに基づいて、１５−１０９−５９２と命名したクローンを、寄託用に選ぶ。
【００７７】
１５−１０９−５９２として同定された細胞系から分泌されたモノクローナル抗体のイソタイプを、抗体イソタイプ判別キット（Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，＃５０８０−０５，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）により測定する。販売元の説明書により測定を行い、その結果は、ＩｇＧ１のイソタイプ、カッパ軽鎖を示す。
【００７８】
細胞系寄託
ブダペスト条約により、ハイブリッド１５−１０９−５９２と命名したハイブリドーマ細胞系を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２０８５２，アメリカ合衆国に寄託する。寄託日は、１９９５年２月１６日であり、この細胞系に割り当てられたＡＴＣＣ番号は、ＨＢ  １１８３４である。
【実施例３】
【００７９】
バンコマイシンクロロトリアジニルアミノフルオレセイントレーサーの合成
５０ｍＬの広口の丸底フラスコ内のＤＭＦ（８ｍＬ）（必要に応じて４０℃に温める）にバンコマイシン塩基（５７６ｍｇ、０．４ミリモル、１．５当量）を溶解する。反応物のｐＨを監視するために小さいｐＨ電極を挿入する。ＤＭＦ（２ｍＬ）中のジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン．ＨＣｌ（ＤＴＡＦ；１３２ｍｇ、０．２６ミリモル、１当量）溶液をフラスコに加える。反応物は橙黄色に変わり、ｐＨは６．０±０．５に落ち、このｐＨを維持しながら一晩攪拌する。反応生成物は、分析用ＨＰＬＣにより監視する。全てのＤＴＡＦが消費された後、ＤＭＦを、約２−３ｍｌになるまで真空下で除去する。残分をＨＰＬＣにより精製する。適切な画分を集め、溶媒を凍結乾燥して橙黄色粉末（収量：３５０ｍｇ）を得る。
【００８０】
分析用ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラムは、３．９ｍｍｘ３００ｍｍ  Ｃ−１８（ＤＹＮＡＭＡＸ  Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ）で、１．５ｍｌ／分の流速で連続勾配移動相（Ａ＝酢酸アンモニウム；Ｂ＝アセトニトリル（５０ｍＭ）；％Ｂ＝１０，％Ｂ＝５０、１５分にわたって展開）を用る。検出は、２５４または４８６ｎｍのいずれかで行う。
【００８１】
分取用ＨＰＬＣは、１９ｍｍｘ２５０ｍｍ  Ｃ−１８（ＤＹＮＡＭＡＸ  Ｃ−１８，Ｒａｉｎｉｎ）を用い上記と同じ条件を用いる。
【００８２】
ＭＳ：ＥＳＭＳは１９０８にＭＨ＋、９５３に（Ｍ２Ｈ）２＋を与える。
【実施例４】
【００８３】
バンコマイシンの蛍光偏光免疫検定法
トレーサー（実施例３）およびモノクローナル抗体＃１５−１０９−５９２（実施例２）を最適化して、バンコマイシンの存在下、ＣＤＰ−１交叉反応性が無いという利点がある、ＴＤＸ（登録商標）／ＴＤＸＦＬＸ（登録商標）  Ａｂｂｏｔｔ  Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ検定キットと同様又はそれ以上の性能を得る。前に考察したように、一定濃度の抗体およびトレーサーを供試試料に加えることにより、形成されるトレーサー−抗体複合体に対するバンコマイシン−抗体複合体の比は、試料中のバンコマイシンの量に直接比例する。混合物が直線偏光で励起し、未結合のトレーサーおよびトレーサー−抗体複合体により発生した蛍光の偏光を測定する場合、供試試料中のバンコマイシンの存在を定量化または定性化することができる。結果は、正味のミリ偏光単位（ｍＰ）およびスパンにより定量することができる。正味のミリ偏光は、最大量のトレーサーが抗体に結合する（即ち、バンコマイシンの非存在下）場合に検出される偏光を示す。正味のｍＰ単位が高いほどトレーサーの抗体への結合が良い。検定スパンは、最大のトレーサーがバンコマイシンの非存在下で結合する場合に得られる正味のミリ偏光値と特定量のバンコマイシンが供試試料中に存在する場合に得られる正味のミリ偏光値との間の差である。ミリ偏光単位は、貯えた標準曲線から自動的に内挿法を行い、試料１ｍＬ当たりのバンコマイシンの量（マイクログラム）として表す。
【００８４】
精製した（硫酸アンモニウムで分画）バンコマイシン抗体１５−１０９−１３３を、２．５％ウシ血清アルブミンおよび１０％グリセロールを有する燐酸緩衝液で２０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、これを、Ｓポットに入れる。トレーサーポット（Ｔポット）は、０．７％ラウリル硫酸ナトリウムおよび０．５％ラウリル硫酸リチウムを有するトリス緩衝液で０．２７５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したバンコマイシン−ＤＴＡＦトレーサーが入っている。前処理ポット（Ｐポット）と共にこれら２種の成分を合わせることにより、３５００から４５００単位の範囲の強度を有する９６．９４ｍＰスパンを得る。（強度は、共に反応する抗体およびトレーサーの影響の尺度である。測定物中の抗体またはトレーサーのいずれかの濃度が増加するにつれて、強度は大きくなる。）
本発明のバンコマイシン検定の正確さは、５６人の患者の試料を用い、商業的に入手可能なバンコマイシン検定と比較することにより示される。両方の検定は相関しＲ＝０．９９６およびｙ＝０．９２ｘ−０．００８を与える（図１１）。更に、本発明の検定法をＨＰＬＣ定量法と比較する。ＨＰＬＣに対する新規の本検定法の相関は、Ｒ＝０．９９８およびｙ＝１．００７＋１．０５３であり（図１２）、一方、ＨＰＬＣに対して相関させた商業的に入手可能なバンコマイシン検定法は、Ｒ＝０．９９６およびｙ＝１．０８８ｘ＋１．２５２を与えた（データは示さず）。本発明の検定法および商業的に入手可能なバンコマイシン検定法は、両方とも、２．００μｇ／ｍＬ未満の感度を有し、試料中の０から１００μｇ／ｍＬのバンコマイシンを検出することができる。１００μｇ／ｍＬを超えるバンコマイシンを含有する試料は、検定マニュアルに指示されるように試料容量を１．０または０．５に減じることにより自動的に２倍または４倍に希釈することができる。本発明の検定法および商業的に入手可能なバンコマイシン検定法の両方の精度は、同じである。分析間（ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｕｎ）、分析内（ｗｉｔｈｉｎ  ｒｕｎ）、全変動係数（ＣＶ）は全て６％未満である（表２参照）。
【００８５】
０、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍＬの量で存在する種々の交叉反応体を用い、０、４０、および８０μｇ／ｍＬの量でバンコマイシンの交叉反応性をテストする。驚くべきことには、ＣＤＰ−１を含む全ての交叉反応体が、バンコマイシンとの交叉反応性２％未満を示し、これは、全ての読み取り値が、該検定の感度（２μｇ／ｍｌ）以下であることを意味する。対照的に、商業的に入手可能なバンコマイシン検定法は、バンコマイシンの存在下または非存在下、３９．５８％から６５％の範囲の高レベルのＣＤＰ−１交叉反応性を有する。驚くべきことには、本発明の抗体は、調査した最も高い濃度でＣＤＰ−１に対する検出可能な交叉反応性を示さない。これらの結果は、既存の市販検定法にまさる著しい改良を示す。（表３のＣＤＰ−１交叉反応性データ参照。）
図１３は、実施例４の方法を用い、０−１００μｇ／ｍＬのバンコマイシンでのｍＰを示すデータを表す。
【００８６】
【表２】
0003714942.tif 000003
【００８７】
【表３】
0003714942.tif 000004
0003714942.tif 000005
【００８８】
本発明のバンコマイシン抗体（Ｓポット）１５−１０９−５９２は、４５℃で１４日間貯蔵することができ、予想外のことには、このモノクローナルが、凍結／融解サイクルによる変化に対し非常に抵抗性があることを見い出す。このモノクローナル抗体は、スパンおよび強度値における最小の変化で３回の凍結／融解サイクルを実施することができる。更に、この抗体がモノクローナルであることから、スパン、交叉反応性、および安定性のような検定パラメーターは、ロットごとに実質的に同じである。更に、ハイブリドーマを、ホローファイバー組織培養システムを用いて培養することができることから、製造能力は改善される。また、この抗体は、臨床分析器内で２つのエアセットフラクチュエーション（約１．５℃）でも生き残ることができ；従って、検定の動力学は、分析器環境（約３４＋／−０．５℃）においても安定である。最後に、前処理溶液（１０％の５−スルホサリチレート、０．１Ｍのトリス、２０ｍＭの硫酸銅）の使用は、ビリルビン妨害（３０ｍｇ／ｄＬまで）が５％未満であることを可能にし、（２５０μｇ／ｍＬバンコマイシン試料の）キャリオーバーを検定の感度以下、即ち２％以下に減じる。前処理溶液は、検定のためバンコマイシンを遊離するために全ての蛋白結合バンコマイシンから蛋白質を除去する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】バンコマイシンの構造を示す。
【図２】バンコマイシンの主要な代謝物の一つ、ＣＤＰ−Ｉの構造を示す。
【図３】バンコマイシンのもう一つの主要な代謝物、ＣＤＰ−ＩＩの構造を示す。
【図４ａ】バンコマイシンを担体蛋白質に結合させる代表的合成経路を具体的に示す。
【図４ｂ】バンコマイシンを担体蛋白質に結合させる代表的合成経路を具体的に示す。
【図４ｃ】バンコマイシンを担体蛋白質に結合させる代表的合成経路を具体的に示す。
【図５ａ】本発明の方法によりバンコマイシンをチログロブリンに結合させる合成経路を具体的に示す。
【図５ｂ】本発明の方法によりバンコマイシンをチログロブリンに結合させる合成経路を具体的に示す。
【図５ｃ】本発明の方法によりバンコマイシンをチログロブリンに結合させる合成経路を具体的に示す。
【図５ｄ】本発明の方法によりバンコマイシンをチログロブリンに結合させる合成経路を具体的に示す。
【図６】本発明の免疫原の構造を示す。
【図７】本発明の最も好ましい免疫原の構造を示す。
【図８】本発明の標識試薬の構造を示す。
【図９】本発明の最も好ましい標識試薬の一般構造を示す。
【図１０ａ】本発明の方法によりバンコマイシンをフルオレセインに結合させる合成経路を具体的に示す。
【図１０ｂ】本発明の方法によりバンコマイシンをフルオレセインに結合させる合成経路を具体的に示す。
【図１１】既存の市販検定法と本発明の最も好ましい抗体を用いた本発明の検定法との相関の結果を示す。
【図１２】本発明の検定法とＨＰＬＣとの相関を示す。
【図１３】本発明の蛍光偏光免疫検定法の結果を示す。
【図１】
0003714942.tif 000006
【図２】
0003714942.tif 000007
【図３】
0003714942.tif 000008
【図４ａ】
0003714942.tif 000009
【図４ｂ】
0003714942.tif 000010
【図４ｃ】
0003714942.tif 000011
【図５ａ】
0003714942.tif 000012
【図５ｂ】
0003714942.tif 000013
【図５ｃ】
0003714942.tif 000014
【図５ｄ】
0003714942.tif 000015
【図６】
0003714942.tif 000016
【図７】
0003714942.tif 000017
【図８】
0003714942.tif 000018
【図９】
0003714942.tif 000019
【図１０ａ】
0003714942.tif 000020
【図１０ｂ】
0003714942.tif 000021
【図１１】
0003714942.tif 000022
【図１２】
0003714942.tif 000023
【図１３】
0003714942.tif 000024