(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＦ−IIを有効成分とする、急性肝炎または脂肪肝の肝臓疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヒト線維芽細胞の生産する糖蛋白質、ＴＣＦ−ＩＩを有効成分とする肝臓疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト由来の線維芽細胞が生産する生理活性物質、例えば腫瘍細胞障害性因子としてβ−インターフェロンが存在することは広く知られている。またこのβ−インターフェロン以外にも線維芽細胞が生産する生理活性物質としては特開昭５８−１４６２９３号公報に記載のＣＢＦとよばれる腫瘍細胞障害性糖蛋白質、特開昭６１−３３１２０  号公報記載の分子量３５，０００〜４５，０００の腫瘍増殖阻害因子（ＩＮＦ）、特開昭６１−１８７２号公報記載の腫瘍増殖因子ＦＮＦ、６２−１０３０２１号公報記載の分子量４０，０００〜６０，０００、等電点ｐＨ  ５．０±０．５  の細胞障害作用を有する生理活性物質、特開昭６４−１０９９８号公報記載のヒト由来の線維芽細胞の培養上澄みから得られる分子量３６，０００±１，０００  、等電点ｐＨ１０．５以上で特定のアミノ酸配列を示す腫瘍細胞障害因子等が知られている。本発明者らはヒト線維芽細胞由来の抗腫瘍性蛋白質を研究する過程において、これまで報告されたこれらの蛋白質と全く異なる新規な抗腫瘍性物質を発見し、さらにこの蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功し、その全アミノ酸配列を確定するとともに、有用性を確認した。この新規な抗腫瘍性蛋白質とその遺伝子は、本出願人によって出願され、国際公開９０／１０６５１  号として公開されている。この新規抗腫瘍性蛋白質はＴＣＦ−ＩＩと命名されている。
このＴＣＦ−ＩＩは強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性を合わせもち、さらに肝臓実質細胞の増殖因子であるＨＧＦの多様なファミリーの一種であることが確認された。ＴＣＦ−ＩＩはＳＤＳ電気泳動による分子量測定では７８，０００±２，０００  または７４，０００±２，０００  の分子量を示し、還元した場合５２，０００±２，０００  の共通のバンドであるＡ鎖と３０，０００±２，０００  または２６，０００±２，０００  の２本のバンド（Ｂ鎖、Ｃ鎖）を示す。
ＴＣＦ−ＩＩは肝臓実質細胞の増殖因子であることから肝切除後の肝臓再生を目的とした利用が可能であり、このような研究が行われているが、まだ動物実験によりその効果を確認した例がなく、肝臓疾患の治療薬として使用できることは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らはＴＣＦ−ＩＩの生理活性に注目し、抗腫瘍剤としての利用や疾病の診断のマーカーとしての利用を検討してきた。
本発明者らは、ＴＣＦ−ＩＩの肝臓に対する作用を研究する過程から、ＴＣＦ−ＩＩが単に肝実質細胞の増殖をもたらすだけでなく、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、脂肪肝、胆汁鬱血型肝障害等の種々の肝臓疾患に対し治療効果を有する事を見いだした。これまでＴＣＦ−ＩＩが種々の肝臓疾患に対し治療効果を有することは確認されておらず、本発明者らによりはじめて種々の肝臓疾患に対し治療効果を有することが見い出された。
本発明は、ＴＣＦ−ＩＩを有効成分とする肝臓疾患治療剤を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＣＦ−IIを有効成分として含有する、急性肝炎または脂肪肝の肝臓疾患治療剤に関する。
本発明の有効成分は、前記したようにヒト線維芽細胞由来の公知の糖蛋白質である。
このＴＣＦ−IIは、ＳＤＳ電気泳動法による分子量測定で、非還元では78,000±2,000 又は74,000±2,000 であり、還元下では52,000±2,000 の共通バンドＡと、30,000±2,000 のバンドＢ及び26,000±2,000 のバンドＣの２本のバンドとを示す。また等電点は 7.4〜8.6 で 723個のアミノ酸配列よりなる糖蛋白である。
上記ＴＣＦ−IIは、ヒト線維芽細胞培養液を濃縮し、イオン交換体に吸着させ、その溶出液をアフィニティクロマトグラフィーを行って得ることもできるし（ＷＯ90／10651 号公報）あるいは遺伝子工学的手法（ＷＯ92／01053 号公報）によって得ることもできる。
【０００５】
すなわち、ＴＣＦ−ＩＩは先に示したＷＯ９０／１０６５１  号公報に開示された方法によって得られた、ヒト線維芽細胞由来のものを用いることが可能である。また同公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微生物や他の細胞により遺伝子組み換え操作により生産されたものであっても差し支えない。遺伝子操作によりＴＣＦ−ＩＩを製造する方法については、本発明者らにより出願され、ＷＯ９２／０１０５３  号公報として公開されている方法で生産したものを用いることができる。また宿主細胞、微生物の違いにより糖鎖の異なったものや、糖鎖の結合していないものであっても使用可能である。しかし糖鎖は生体内の代謝速度に関係しているため糖鎖の結合しているものが望ましい。
ＴＣＦ−ＩＩは通常の単離精製法によってさらに濃縮・精製することができる。例えば、有機溶媒による沈殿法、塩析、ゲル濾過クロマト、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法などが上げられる。これらの精製法の内モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトについては、本発明者により特願平３−１７７２３６号として出願されているモノクローナル抗体を用いて精製することができる。
得られた精製ＴＣＦ−ＩＩは、凍結乾燥若しくは凍結保存することができる。
【０００６】
本発明の肝臓疾患治療剤は注射剤として投与することができる。この場合、静注、動注、筋注あるいは皮下注射のいずれでもよい。また必要に応じて、アミノ酸、ビタミン、リン脂質、マロチレート、プレドニゾロン、グリチルリチンなどの肝臓障害治療に用いられている薬物と併用することができる。
本発明の肝臓疾患治療剤に含まれる、ＴＣＦ−ＩＩの投与量は、投与患者の症状や、病状、年令等によって定められるが、成人一人あたり精製ＴＣＦ−ＩＩとして１００−３０，０００μｇ好ましくは、５００−３０００μｇを含有する製剤を１週間に１〜７回投与することができる。また患者の症状によっては長期間の投与も可能である。
【０００７】
以下に実施例を示しさらに本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
ＴＣＦ−ＩＩの精製
ＷＯ９０／１０６５１  号公報に開示された方法及び東尾らの方法（Ｈｉｇａｓｉｏ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，ｖｏｌ．１７０，３９７−４０４，１９９０）に準じて細胞を培養し精製ＴＣＦ−ＩＩを得た。
ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８６）細胞を５％子牛血清を含むＤＭＥＭ  １００ｍｌをいれたローラーボトルに３×１０６  個移植し、０．５  〜２回転／分の回転速度で回転させながら７日間培養を続けた。総細胞数が１×１０７  個になったところでトリプシンにより細胞を剥離し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッシュのセラミック  １００ｇ（東芝セラミック社製）を殺菌して投入し、２４時間精置して培養した。その後上記培養液を  ５００ｍｌ加え、培養を継続した。７〜１０日ごとに培地を全量回収し、新鮮培地を補給した。このようにして２ケ月間の生産を継続し、ローラーボトル一本あたり４ｌの培養液を回収した。
このようにして得た培養液当たりの比活性は３２μ／ｍｌであった。
培養液  ７５０ｌをアミコン社製メンブランフィルター（ＭＷ  ６０００  カット）処理によりＵＦ濃縮し、ＣＭセファデックスＣ−５０（ファルマシア社製）、ＣｏｎＡセファロース（ファルマシア社製）、ＭｏｎｏＳカラム（ファルマシア社製）ヘパリンセファロース（ファルマシア社製）による５段階のクロマト精製を行い、比活性５２４８０００  ｕ／ｍｇの精製ＴＣＦ−ＩＩを得た。
【０００８】
【実施例２】
遺伝子組換ＴＣＦ−ＩＩの生産
ＷＯ９２／０１０５３  号公報に開示された方法に従い、ＴＣＦ−ＩＩ遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ−ＩＩを得た。形質転換ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞を培養し、培養液２０ｌ  を得た。この培養液をＣＭ−セファデックスＣ−５０クロマト、Ｃｏｎ−Ａ  セファロースＣＬ−６Ｂ  クロマト、ＭｏｎｏＳ  カラムを装着したＨＰＬＣの順に処理を行い、約１１ｍｇの活性ＴＣＦ−ＩＩを得た。
【０００９】
【実施例３】
ＴＣＦ−ＩＩ製剤の生産例
本実施例においては、上記実施例２の方法により得ることのできた遺伝子組み換えＴＣＦ−ＩＩの静注用、皮下用、筋注用注射製剤の生産例を示した。
0003619526.tif 000002
上記組成をｐＨ７．０  の０．０１Ｍ  のＰＢＳ  で溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に  ２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
0003619526.tif 000003
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に  ２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００１０】
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上記組成をｐＨ７．０  の０．０１Ｍ  のＰＢＳ  で溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に  ２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に  ２ｍｌずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００１１】
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌ  ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
0003619526.tif 000007
上記組成をｐＨ７．０  の０．０１Ｍ  のＰＢＳ  で溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌ  ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００１２】
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上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌ  ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
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上記組成をｐＨ７．０  の０．０１Ｍ  のＰＢＳ  で溶解し、全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌ  ずつ分注し、凍結乾燥密封した。
【００１３】
【発明の効果】
本発明によりＴＣＦ−ＩＩを有効成分として含有する肝臓疾患治療剤が提供される。以下に本実施例により製造した治療剤の効果を確認した実験例を示し、本発明の効果を説明する。
【００１４】
【実験例１】
急性肝障害、慢性肝障害、肝硬変に対する治療効果
（１）  方法
７０％肝切除をおこなった正常肝、急性障害肝（肝炎型、実質細胞障害型）、慢性障害肝および肝硬変に対する治療効果を確認した。
ウィスター系雄ラットを用い、７週齢（体重  ２００ｇ）で肝臓の７０％切除を行った正常肝ラット（ｎ＝６）  、肝切除直後に  ５００μｇ／ｋｇのガラクトサミンを皮下投与した急性肝炎ラット（ｎ＝９−１０）、肝切除直後に０．３ｍｌ／ｋｇの四塩化炭素を経口投与した急性実質細胞障害肝ラット（ｎ＝１０）をそれぞれ作製した。また、７週齢から０．７ｍｌ／ｋｇの四塩化炭素を週２  回４  週間または１０週間の反復経口投与を行ったラットに同様の肝切除を施し、慢性障害肝ラット（ｎ＝１０）と肝硬変ラット（ｎ＝９−１０）をそれぞれ作製した。なお、慢性障害肝ラットでは肝切除直後に０．３ｍｌ／ｋｇの四塩化炭素を経口投与して急性実質細胞障害肝ラットと同様の急性症状を惹起し、ＴＣＦ−ＩＩに対する反応性を比較した。
ＴＣＦ−ＩＩは肝切除直後から１２時間間隔で静脈内に投与し、正常肝切除ラットには２０、１００  、５００  μｇ／ｋｇの３容量を、それ以外のラットには  ５００μｇ／ｋｇを投与して  ０．１％ヒト血清アルブミン添加ＰＢＳ  投与群と比較した。
正常肝切除ラットに対するＴＣＦ−ＩＩの作用を検討するために、術後４８時間目でトロンボテスト値と血清トリグリセリド、術後７２時間目で血清総蛋白と血清ＨＤＬ  コレステロール、術後９６時間目で肝重量、肝ＤＮＡ  量および肝総蛋白量を測定した。
（２）  結果
７０％肝臓切除術によりトロンボテスト値の遅延、血清トリグリセリド、血清総蛋白およびＨＤＬ  コレステロールの低下が観察されたが、ＴＣＦ−ＩＩはいずれのパラメータも用量依存的に改善させた。
正常肝、急性障害肝、慢性障害および肝硬変ラットにおいて、それぞれ肝切除４８時間目のトロンボテスト値（図１）、血漿フィブリノーゲン（図２）、血清トリグリセリド（図３）及び血清総蛋白（図４）、肝重量（図５）、肝総蛋白量（図６）、肝ＤＮＡ  量（図７）は、いずれの場合もＴＣＦ−ＩＩ投与群が  ０．１％ヒト血清アルブミン添加  ＰＢＳ投与群よりこれらのパラメーターが改善した。
【００１５】
【実験例２】
脂肪肝に対する効果
（１）  方法
７週齢のウィスター系雄ラットにＤＬ−エチオニンを２５０ｍｇ／ｋｇの投与量で４日間繰り返し腹腔内に投与した。これらのラット（ｎ＝１０）にＴＣＦ−ＩＩ（５０  および  ５００μｇ／ｋｇ）  を１２時間間隔で静脈内に投与し、４８時間目のプロトロンビン時間（ｐＴ）、アンチトロンビＩＩ活性（ＡＴ  ＩＩＩ）、尿素態窒素（ＢＵＮ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）  、リン脂質（ＰＬ）、ＨＤＬ  コレステロール（ＨＤＬ）  および肝実質細胞１０００個当たりの分裂期細胞数（Ｍｉｔｏｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ）  ならびに７２時間目の血清中の総蛋白（ＴＰ）、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）  および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）  を測定した。
（２）  結果
各測定値の平均値と標準誤差値を表１  に示した。ＴＣＦ−ＩＩは５０μｇ／ｋｇ以上の投与量でエチオニン脂肪肝ラットの諸症状を容量依存的に改善した。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
【実験例３】
胆汁鬱滞型肝障害に対する効果
（１）  方法
７週齢のウィスター系雄ラットに５０ｍｇ／ｋｇ  のα−ナフチルイソチオシアネートを経口投与した。ＴＣＦ−ＩＩはα−ナフチルイソチオシアネート投与直後より１２時間間隔で２  回静脈内に投与した。ＴＣＦ−ＩＩ投与後１２時間目に採血を行い、血清中のトランスアミナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）  、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）Ｐ、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、総ビリルビン（Ｔ−ＢＩＬ）  、直接型ビリルビン（Ｄ−ＢＩＬ）  および肝異物排泄機能検査（ＢＳＰ試験）  を行った。
（２）  結果
各測定値の平均値と標準誤差値を表２  に示した。ＴＣＦ−ＩＩは５００  μｇ／ｋｇの投与量で各パラメーターとも改善を示し、胆汁鬱滞型肝障害の諸症状を改善した。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
【実験例４】
急性肝炎に対する効果
（１）  方法
７週齢のウィスター系雄ラット（ｎ＝８）  に１ｇ／ｋｇ  のガラクトサミンを皮下投与した。ＴＣＦ−ＩＩはガラクトサミン投与直後より２５０  μｇ／ｋｇを４  時間間隔で４  回静脈内に投与し、これを２  日間繰り返した。ガラクトサミン投与後４８時間目に採血を行い、血清中のトランスアミナーゼ（ＧＯＴ，ＧＰＴ）  、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、血清総蛋白（ＴＰ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）  、トリグリセリド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、β−リポ蛋白（β−Ｌｉｐｏ）  ならびに、肝重量、肝蛋白量、肝ＤＮＡ  量を測定した。
（２）  結果
各測定値の平均値と標準誤差値を表３  に示した。ＴＣＦ−ＩＩは２５０  μｇ／ｋｇの投与量で各パラメーターとも改善を示し、急性肝炎の諸症状を改善した。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
【実験例５】
投与方法による治療効果
（１）  方法
ウィスター系雄ラットを用い、７週齢（体重  ２００ｇ）で肝臓の７０％切除を行った正常肝ラットに肝切除直後よりＴＣＦ−ＩＩを１２時間間隔の間歇静脈内投与法（ｎ＝６）  と昼夜持続点滴静脈内注入法（ｎ＝１２）の２  投与方法による作用強度を比較した。投与量はいずれも１  日当たり１ｍｇ／ｋｇとなるように設定し、肝切除４８時間目の血清総蛋白、アルブミン、トリグリセリド、ＨＤＬ−コレステレロールならびにトロンボテスト値を測定し、さらに肝臓重量を測定し、肝臓再生率を切除肝重量から産出した。
（２）  結果
７０％肝臓切除後のＴＣＦ−ＩＩ投与による、血清総蛋白（図８）、アルブミン（図９）、ＨＤＬ−コレステロール（図１０）、トリグリセリド（図１１）、再生率（図１２）及びトロンボテスト値（図１３）のそれぞれの変化を示す。いずれのパラメータも持続点滴を採用したほうが改善効果を示した。
以上の実験結果により本発明による肝臓疾患治療薬は、これまで治療の困難であった人の肝臓疾患に対し有効に働くものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】肝臓切除各種病態ラットに対するトロンボテスト値を示す。
【図２】肝臓切除各種病態ラットの血清フィブリノーゲン量を示す。
【図３】肝臓切除各種病態ラットの血清トリグリセリド量を示す。
【図４】肝臓切除各種病態ラットの血清総蛋白量を示す。
【図５】肝臓切除各種病態ラットの肝臓重量を示す。
【図６】肝臓切除各種病態ラットの肝臓蛋白量を示す。
【図７】肝臓切除各種病態ラットの肝臓ＤＮＡ量を示す。
【図８】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−ＩＩを間歇投与または持続投与した場合の血清総蛋白量を示す。
【図９】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−ＩＩを間歇投与または持続投与した場合の血清アルブミン量を示す。
【図１０】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−ＩＩを間歇投与または持続投与した場合のＨＤＬ−コレステロール値を示す。
【図１１】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−ＩＩを間歇投与または持続投与した場合の血清トリグリセリド値を示す。
【図１２】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−ＩＩを間歇投与または持続投与した場合の肝再生率を示す。
【図１３】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−ＩＩを間歇投与または持続投与した場合のトロンボテスト値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0003619526.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
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