(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン線維とフォスフォフォリンを、ジビニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結乾燥して作製される、フォスフォフォリンがコラーゲンに架橋されたスポンジ状複合生体材料。
【請求項２】
前記コラーゲンがコラーゲンタイプＩである、請求項１記載の複合生体材料。
【請求項３】
さらにハイドロキシアパタイト、βＴＣＰ、αＴＣＰ、ポリグリコール酸およびポリ乳酸から選ばれる少なくとも１以上を含む、請求項１または２に記載の複合生体材料。
【請求項４】
さらに骨髄由来細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合生体材料。
【請求項５】
前記細胞が患者から採取された細胞である、請求項４記載の複合生体材料。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合生体材料からなる人工骨材。
【請求項７】
コラーゲン線維とフォスフォフォリンを、ジビニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結乾燥することを特徴とする、複合生体材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フォスフォフォリンとコラーゲンを含む複合生体材料および該複合生体材料上に骨髄由来細胞を培養して得られる人工骨材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、整形外科の領域における骨欠損部の修復は、人工材料を用いた人工骨の移植が行われることが多い。こうした人工骨には生体骨類似の機械的特性に加えて、生体適合性や骨誘導性−すなわち、生体適用後徐々に吸収され、骨再生サイクルに取り込まれて自身の骨に置換していく性質−が求められる。
【０００３】
人工骨材料としては、セラミックス系材料、有機材料等の種々の材料が考案されているが、骨再生を積極的に誘導する材料としては、ＢＭＰ(BoneMorphogenic Protein)とコラーゲンとの複合材料が有力で、他の材料にはその能力は小さい。しかし、ＢＭＰは強い骨形成能を有しているが、水に溶解しにくく、コラーゲンを担体として用いる試みがなされてはいるものの、最適担体が未だ見つかっていない。また、ラット、マウスレベルではＢＭＰによる骨形成能は高いが、ヒトでは有効な骨形成を得るのに０.４ｍｇ/ｍｌ（担体体積）程度の多量のＢＭＰが必要と考えられており、現状では高額医療に治療が限定されると予想される。したがって、ＢＭＰに代わる、安全かつ安価な、骨形成能を有する生体吸収性の骨修復材料の開発が望まれている。
【０００４】
発明者らは、これまで、歯に含まれるリン酸タンパク質である、フォスフォフォリンやフォスビチンが単独で骨形成能を有することを見出している（Saito, et al.,Bone 21(4) 305-311 (1997))が、これらが実際に骨形成や人工骨開発に応用されたとの報告はない。
【０００５】
一方、人工骨材は生体吸収性であると同時に、複雑な形状の骨欠損部を適切に埋めるため、成形容易であることが望まれる。これに対し、コラーゲンタイプＩは柔軟な構造を持ち、元来骨形成の核になる性質を有しているため、３次元構造を持つ骨修復材料としての有望な可能性を有している。また、多孔質の硬材料（ハイドロキシアパタイトやβＴＣＰ、ポリ乳酸等）と複合化することにより、高品質の移植材料やスキャホールドとして使用できる可能性も有している。問題は、このコラーゲンスポンジに骨形成能を付加することであり、ＢＭＰ以外の安価な活性成分を利用した方法の開発が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、骨形成能（骨誘導能）が高く、Biodegradableで、かつ成形容易な人工骨材を安価に提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、フォスフォフォリンと呼ばれるリン酸蛋白質をコラーゲンタイプＩに架橋したスポンジ状構造を有する複合材料が、優れた骨形成能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供するものである。
（１）  コラーゲン線維とフォスフォフォリンを、ジビニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結乾燥して作製される、フォスフォフォリンがコラーゲンに架橋されたスポンジ状複合生体材料。
（２）  前記コラーゲンがコラーゲンタイプＩである、上記（１）記載の複合生体材料。
（３）  さらにハイドロキシアパタイト、βＴＣＰ、αＴＣＰ、ポリグリコール酸およびポリ乳酸から選ばれる少なくとも１以上を含む、上記（１）または（２）に記載の複合生体材料。
（４）  さらに骨髄由来細胞を含む、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の複合生体材料。
（５）  前記細胞が患者から採取された細胞である、上記(４)記載の複合生体材料。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれか１に記載の複合生体材料からなる人工骨材。
（７）  コラーゲン線維とフォスフォフォリンを、ジビニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結乾燥することを特徴とする、複合生体材料の製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の内容について詳述する。
１．複合生体材料
本発明にかかる複合生体材料は、フォスフォフォリンとコラーゲンを必須の構成成分とする複合生体材料である。該複合生体材料において、フォスフォフォリンはコラーゲン繊維に架橋されていることが好ましい。また、該複合生体材料は、スポンジ状の微小多孔質構造を有することが好ましい。この構造は、後述する細胞培養の足場に適した特性を与える。なお、「スポンジ状構造」とは、柔軟性を有する微小多孔質構造（数μm〜数10μ程度の無数の孔（空隙）が存在する構造）を意味するものとする。
【００１０】
前記複合生体材料に含まれるフォスフォフォリンは、哺乳類の歯に含まれるリン酸タンパク質であることが知られている。
また、本発明で用いられるコラーゲンとしては、コラーゲンタイプＩを用いることが好ましい。該コラーゲンタイプＩは、骨、歯の有機質の大部分を占めており、生体親和性が高いからである。
【００１１】
本発明の複合生体材料において、フォスフォフォリンとコラーゲンの配合比（質量比）は、１：１０〜１：５０であることが好ましく、１：２０〜１：４０であることがより好ましい。また、本発明の複合生体材料総量（合計質量）に対し、フォスフォフォリンは２〜１０質量％（以下、単に「質量％」を％と記載する。）配合されることが好ましく、２．５〜５％配合されることがより好ましい。フォスフォフォリンの量が少なすぎると骨形成能が不十分となり、一方、フォスフォフォリンの量が多すぎると複合生体材料のコストが高くなるからである。
【００１２】
本発明の複合生体材料において、空隙率は好ましくは４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％である。この範囲を超えると、生体適用後の細胞の侵入が不十分となり骨誘導性が悪くなるとともに、複合生体材料自体の強度が低下するからである。
【００１３】
本発明の複合生体材料は、必須の成分であるフォスフォフォリンおよびコラーゲンに加えて、本発明の目的・効果を損なわない範囲で、さらにハイドロキシアパタイト、βＴＣＰ、αＴＣＰ、ポリグリコール酸およびポリ乳酸等の多孔質の硬材料を含んでいてもよい。
【００１４】
２．複合生体材料の製造方法
(1) フォスフォフォリンの調製
本発明の複合生体材料に用いられるフォスフォフォリンは、市販のもの（和光純薬社製等）を用いてもよいが、例えば以下のようにして得ることができる。哺乳類（例えば、ウシ等）の歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エナメル質、セメント質を除去する。残った象牙質を細かく粉砕し、これを、蛋白質分解酵素を含む適当な緩衝液（例えば、0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4）を用いて脱灰し、透析した後に凍結乾燥する。次に、得られた凍結乾燥物を緩衝液（例えば20mM Tri-HCl, pH 7.4〔蛋白質分解酵素含有〕）に溶解し、塩化カルシウムを添加する。生じた沈殿物を緩衝液（例えば、0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4〔蛋白質分解酵素含有〕）に溶解し、透析後、再び凍結乾燥する。最後に、前記凍結乾燥物を尿素溶液（例えば、4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0）に溶解後、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、DEAE-Sepharose等）等により分離する。目的とするフォスフォフォリンは、リン酸分析およびアミノ酸分析により同定することができる。
【００１５】
(2)コラーゲンタイプＩの精製
本発明で用いられるコラーゲン（コラーゲンタイプＩ）は、特に限定されず、市販のものを用いても、コラーゲンを含む適当な材料（例えば、ウシ皮膚等の動物の結合組織）から公知の方法に従い、抽出・精製して用いてもよい。
【００１６】
(3) フォスフォフォリンとコラーゲンからなる複合生体材料の調製
まず、コラーゲン線維を炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の炭酸塩水溶液に溶かして室温でインキュベートする。該炭酸塩水溶液の濃度は、好ましくは０．１Ｍ〜０．２Ｍ、より好ましくは０．４Ｍ〜０．５Ｍである。これに、架橋剤、例えば、ジビニルスルフォン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミド等を加え、予めコラーゲン繊維上に架橋鎖を導入する。添加する該架橋剤の量は、ジビニルスルフォンであれば５質量％程度が好ましい。
【００１７】
次に、フォスフォフォリンを添加してインキュベートし、コラーゲンと架橋させる。添加するフォスフォフォリンの量は、コラーゲンに対して１／１０〜１／５０が好ましく、１／２０〜１／４０がより好ましい（質量比）。これを、蒸留水、続いて重炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等）溶液で洗浄し、余剰のフォスフォフォリンや架橋剤を除去する。最後に、重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加して架橋反応を止め、蒸留水でよく洗浄してから凍結乾燥する。該凍結乾燥の条件（例えば、温度、凍結時間、水中での凍結乾燥等）は、所望の複合生体材料の構造、すなわち比表面積、空隙率、孔（空隙）の大きさ等に応じて、適宜調整することができる。また、得られた凍結乾燥物は、必要に応じて成形し、例えば後述する人工骨材等として利用することができる。
【００１８】
３．人工骨材
(1) 複合生体材料からなる人工骨材
本発明により得られる複合生体材料は、水を吸うとスポンジのような弾性を有し、優れた生体親和性、骨誘導能ないしは骨伝導能を有する。すなわち、骨組織に埋入した場合は速やかに骨組織と結合し、ドナー側の硬組織と本発明により得られる複合材料との界面は完全に一体化しうる。したがって、本発明の複合生体材料は、それ自体、骨欠損部の修復・再生させるための人工骨材として利用することができる。
【００１９】
前記人工骨材の形態および形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、およびペースト状等、任意の形態および形状を用いることができる。こうした形態や形状は、人工骨材の目的に応じて適宜選択すればよい。
【００２０】
(2) 骨髄由来細胞を含む人工骨材
本発明の複合生体材料は、これに骨髄由来細胞を播種して、生体類似環境下あるいは生体内で組織培養を行うことにより、より効果的に骨再生が可能な人工骨材として利用することができる。
【００２１】
前記人工骨材で用いられる細胞は、分化・増殖能力を有する未分化の細胞であり、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および肝臓幹細胞等を挙げることができる。特に、骨髄由来の胚幹細胞（ＥＳ細胞）および間葉系幹細胞が好ましい。また、細胞は、樹立された培養細胞株のほか、患者の生体から単離された細胞を好適に用いることができる。
【００２２】
前記増殖因子遺伝子を導入した細胞の培養は、適当な生体適合性材料からなる足場に、該細胞を播種して、通常の方法により行えばよい。細胞の播種は、足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよく、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、あるいはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種してもよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズに入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。
【００２３】
播種する細胞の数（播種密度）は細胞の形態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用いる細胞や足場材料に応じて適宜調整することが望ましい。例えば、骨芽細胞であれば、播種密度は１００万個／ｍｌ以上であることが望ましい。
【００２４】
細胞培養に用いられる培地としては、ＭＥＭ培地、α-ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、公知の培地を細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。また、該培地には、ＦＢＳ（Sigma社製）、Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL社製）等の抗生物質や抗菌剤、増殖因子、転写因子等を添加しても良い。培養は、３〜１０％ＣＯ2、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ2、３７℃の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも３日以上行うことが望ましい。
このようにして作製された人工骨材は、骨欠損部に埋入あるいは注入することで、患者体内に適用することができる。
【００２５】
４．その他
本発明の複合生体材料は他の生理活性物質、薬剤等のスキャホールドとして利用することもできる、例えば、骨肉腫などの切除骨の再建に、本発明により得られる複合材料に抗癌剤を含浸させたものを用いることで、癌再発の防止とともに生体硬組織の誘導を行うことができる。
【００２６】
したがって、本発明によって得られる複合生体材料の用途としては、骨誘導および骨伝導能を有する生体骨置換型骨再建材としての利用法、アミノ酸、糖質、サイトカインを含有する組織工学に用いられる生体活性基材、および生体融和型薬剤徐放性基材としての利用法を挙げることができ、具体的には、人工骨、人工関節、腱と骨との接合材、歯科用インプラント材、カテーテル用経皮端子、薬剤徐放性基材、骨髄誘導チャンバー、組織再建用チャンバー・基材等を挙げることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１：フォスフォフォリン/コラーゲン複合生体材料の製造
(1) フォスフォフォリンの精製
まず、ウシ顎骨から永久歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エナメル質、セメント質を除去する。残った象牙質を液体窒素下にて200メッシュ以下の細粒子に粉砕する。象牙質粉を0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4［蛋白質分解酵素：100mM 6-aminohexanoic acid（和光純薬社製）, 5mM benzamidine-HCl, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride含有］で4℃にて脱灰する。
【００２８】
つぎに、EDTA脱灰液を、4℃にて脱イオン蒸留水に対し、透析膜(SPECTRUM MWCO 3500, 132725)を用いて透析して、凍結乾燥（東京理科機械製： EYELA FREEZDRYER 90500042）する。EDTA抽出物は20mM Tris-HCl, pH 7.4（蛋白質分解酵素含有）に溶解し、最終濃度が1MになるようにCaCl2を添加する。沈殿物を遠心分離（日立工機製：HIMAC CENTRIFUGE345043）により回収し、再び0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4（蛋白質分解酵素を含有）に溶解し、脱イオン蒸留水に対して透析して、凍結乾燥する。凍結乾燥物を4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0に溶解してDEAE-Sepharose(Sigma Chem. Co. 製) Column Chromatographyにて、0-1M NaCl直線勾配により溶出させる。
最後に、リン酸分析およびアミノ酸分析によりフォスフォフォリンを同定する。
【００２９】
(2)コラーゲンタイプＩの精製
ウシ皮膚を細切し、4℃にて蒸留水、20% NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4にて洗浄する。次に、1M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4にてovernightで抽出し、遠心分離により上清を回収し、0.5M酢酸、1M NaClを加えovernightで撹拌する。
【００３０】
遠心分離により残渣を回収し、0.5M 酢酸に溶かして、さらに遠心分離を行う。上清を5M NaOH, 4.4M NaClで中和し、overnightで撹拌し、遠心分離する。この残渣に4.4M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。
【００３１】
残渣に2.4M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。残渣に1.7M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を添加しovernightで撹拌し、遠心分離する。得られた上清を0.1M 酢酸に対して透析し、凍結乾燥する。
凍結乾燥したコラーゲンと50mM 酢酸を用いて、0.3%コラーゲン酢酸溶液を作成する。0.15M NaClに続き、0.6N NaOH, 0.1M Hepes（和光純薬社製）を添加して３７℃にてインキュベートすることにより、再構成コラーゲンタイプＩ線維が得られる。
【００３２】
(3) フォスフォフォリンのコラーゲンへの架橋結合
(2)で得られたコラーゲン線維を0.5M 炭酸ナトリウムで室温にてovernightでインキュベートする。さらにジビニルスルフォン(Sigma Chem. Co. 製)を添加し、２時間インキュベートする。0.5M 炭酸ナトリウムでコラーゲン線維をよく洗浄後、フォスフォフォリンを添加し、overnightでインキュベートして架橋させる。これを蒸留水で洗い、さらに0.5M 重炭酸ナトリウムでよく洗浄して、過剰なフォスフォフォリンとジビニルスルフォンを除去する。
【００３３】
次いで、0.5M 重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加し、overnightでインキュベートして架橋反応を止める。得られた複合体は蒸留水で洗い、さらに0.5M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4および蒸留水で洗浄する。これを凍結乾燥し、コラーゲン−フォスフォフォリン複合体（スポンジ状シート）を作製した。また、フォスフォオリンを加えないコラーゲン線維のみを、蒸留水でよく洗った後、凍結乾燥し、フォスフォフォリンを含まないコラーゲン複合体（スポンジ状シート）を作製した。
【００３４】
実施例２：ラット大腿骨への移植実験
1．細胞培養
８週齢のFischer系ラットの大腿骨を摘出し、この大腿骨より、骨髄中の細胞を常法に従い抽出した。抽出した細胞は、以下の条件で、１０日間培養した。なお、培養期間中は、２日おきに培地交換を行ない、浮遊する血球系細胞を除去し、底面に接着する骨芽細胞を精製していった。
培養条件）温度：３７℃、ＣＯ2濃度：５％、培地：αMEM（10％FBS＋1％グルタミン＋抗生物質）
上記のようにして１０日間培養した骨芽細胞を継代し（細胞数：106cells/ml）、以下の条件で、コラーゲン−フォスフォフォリンシート（10mmφ、５枚）またはコラーゲンシート（10mmφ、５枚）とともに、２週間の共存培養を行なった。
培養条件）温度：３７℃、ＣＯ2濃度：５％、培地：αMEM(10％FBS＋1％グルタミン＋抗生物質)＋10mM β-Glycerophosphate＋50μg/ml Vitamin C phosphate+10-8 M Dexamethasone
こうして得られた、培養細胞を含むシートを、移植用サンプルとした。
【００３５】
２．移植実験
８週齢のFischer系ラット（ｎ＝５）の大腿部に、ドリルで穿孔した（直径２mm）。この穿孔部に、調製した移植用サンプルを挿入可能な程度の大きさに切断して、移植した。なお、各ラットの右脚にコラーゲンシートを、左脚にコラーゲン・フォスフォフォリンシートを移植した。移植後、１、２、４、６、８週目に、移植した大腿骨を摘出した。
【００３６】
３．移植部位の観察
移植用サンプルの摘出日数に達したラットを、７％包水クロラールで麻酔した（ラット体重100ｇあたり、0.4mlの包水クロラールを腹腔に静注）。麻酔したラットの胸部を開き、心臓より固定液（４％パラホルムアルデヒド／0.25％グルタールアルデヒド）を注入し、還流固定法によりラットを固定した（還流時間：１５min）。還流固定終了後、ラットより大腿骨を摘出した。摘出した大腿骨に対し、脱脂、脱灰、アルコール脱水、透徹を施し、サンプル面が見えるように、パラフィンで包埋した。包埋したサンプルは、ミクロトームで厚さ5μmに薄切してスライドグラスに貼付し、パラフィン伸展器上で伸展した。伸展したパラフィン切片は、ヘマトキシリン・エオジン染色で染色し、顕微鏡下で観察した。組織像を図１および図２に示す。
【００３７】
４．結果（図１および図２）
コラーゲン−フォスフォフォリンシートを移植した大腿骨では、１週目より、コラーゲンシートに比べて骨化が進行し、２週目以降もコラーゲンシートに比較して骨化が進行していた。コラーゲンシートのみの場合でも骨化は若干起こるが、コラーゲン−フォスフォフォリンシートの方が骨化が進行していることが確認された。また、炎症等の所見は特に認められなかった。
【００３８】
５．結論
以上のとおり、本発明のコラーゲン−フォスフォフォリンシートは生体親和性が高く、コラーゲンシートに比較して優れた骨形成能を有することが確認された。また、移植後の炎症反応も認められず、本発明の複合生体材料は安全性の面でも優れていることが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、生体適合性、骨誘導性に優れた新規複合生体材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例２におけるコラーゲン−フォスフォフォリンシートまたはコラーゲンシート移植１、２週間後のHE染色した組織像を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２におけるコラーゲン−フォスフォフォリンシートまたはコラーゲンシート移植６、８週間後のHE染色した組織像を示す写真である。
【図１】
0003646167.tif 000002
【図２】
0003646167.tif 000003