(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、被検遺伝子上のノンセンス変異、またはフレームシフト変異を検出する方法。
１）プロモーター配列、クローニング領域、およびレポーター遺伝子とから構成され、両末端にクローニング領域を持つ直線状ベクターを用意する工程、
ただし、直線状ベクターは、クローニング領域にインサートＤＮＡを組み込むことによって、前記要素をこの順に含み、プロモーター配列の制御下に、インサートＤＮＡとレポーター遺伝子との融合転写産物を発現することができるベクターを与える、
２）前記クローニング領域と相同な10bから50bの長さからなる塩基配列を、インサートＤＮＡの末端に付加したＤＮＡ断片を用意する工程、
３）工程１）記載のベクターのクローニング領域に、２）記載のＤＮＡ断片を、相同組換えによって組み込む工程、
４）工程３）によって得られるベクターのレポーター遺伝子の発現を指標として前記変異を検出する工程。
【請求項２】
クローニング領域と相同な塩基配列の長さが10bから30bである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程４）のレポーター遺伝子が、該遺伝子を発現した細胞と、発現しない細胞とで、視覚的に判別可能なシグナルを生成する遺伝子である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
細胞が酵母であり、レポーター遺伝子がＡＤＥ２遺伝子である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ベクターが、CENおよび／またはARS配列を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
工程２）記載のインサートＤＮＡ断片を相同組換えにより組み込んだベクターで形質転換した細胞を単離し、該細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを指標として被検遺伝子における変異を検出する請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項７】
工程２）におけるインサートＤＮＡが、クローニング領域と相同な塩基配列を5'末端部分に付加したプライマー対によって被検遺伝子を鋳型とするＰＣＲ増幅によって得られたものである、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項８】
直線状ベクターの両末端が平滑末端である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項９】
直線状ベクターの両末端が脱リン酸化処理されたものである、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項１０】
以下の要素を含む、インサートＤＮＡ上のノンセンス変異、またはフレームシフト変異の検出用キット。
ａ）プロモーター配列、クローニング領域、およびレポーター遺伝子とから構成され、両末端にクローニング領域を持つ直線状ベクター、
ただし、直線状ベクターは、クローニング領域にインサートＤＮＡを組み込むことによって、前記要素をこの順に含み、プロモーター配列の制御下に、インサートＤＮＡとレポーター遺伝子との融合転写産物を発現することができるベクターを与える、
ｂ）クローニング領域と相同な10bから50bの長さからなる塩基配列を5'末端部分に付加した、インサートＤＮＡ増幅用プライマー対、および
ｃ）レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬
【請求項１１】
クローニング領域と相同な塩基配列の長さが10bから30bである、請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子ＤＮＡに生じたノンセンス変異、またはフレームシフト変異を検出するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子DNAに生じる変異は特殊なものを除けば塩基の置換、欠失、あるいは挿入が大部分を占める。塩基置換には、ミスセンスとノンセンス変異とがある。ミスセンス変異は、コドンの１塩基に変異が生じて、異なるアミノ酸をコードするようになる変異である。一方、コドンがTGA、TAA、あるいはTAGに変化し、蛋白合成(翻訳)をその部位で終止させてしまうノンセンス変異も変異として重要である。欠失や挿入が遺伝子の広範囲に及べば、蛋白の機能を消失させることになる。現実には、コドン読み枠がずれるフレームシフトによって、その部分以降のアミノ酸が全て代わることになる。あるいは変異によって終止コドンを生じ、翻訳が変異部分で停止してしまうために断列した蛋白が産生されることになる。ヒトの遺伝性疾患を網羅したOn-line MendelianInheritance in Man (OMIM)によれば、半数以上がノンセンス変異、またはフレームシフトによって起こることが知られている。
【０００３】
たとえば、BRCA1はその不活性化によって家族性乳がんの原因となるがん抑制遺伝子である。その不活性化は、ゲノムに生じたノンセンス変異、またはフレームシフト変異によってもたらされるとされている。このような疾病原因遺伝子の変異を簡便に見出すことができる手法は、ゲノム解析情報の蓄積とともに重要性を増している。
遺伝子の塩基配列のわずかな相違を見出すための一般的な手法として、PCR-SSCP(PCR single strand conformation polymorphism)が公知である。DNAを１本鎖の状態で電気泳動すると、自己アニールによってもたらされる立体構造の違いによって泳動度が影響を受ける。この違いに基づいて、わずかな塩基配列の違いを見出すのが、PCR-SSCPの分析原理である。しかしその原理上、PCR-SSCP法ではサイレント変異(アミノ酸置換を伴わない変異)を含むあらゆる変異が変異として検出されてしまう。先に述べたように、変異として重要なノンセンス変異やフレームシフト変異に対して有効な変異の検出方法が提供されれば、より合理的な検査が可能である。
【０００４】
このようなノンセンス変異、またはフレームシフト変異を酵母を用いて効率的に診断する方法が、遺伝性非ポリポーシス大腸癌の原因遺伝子の１つであるMSH2について報告されている(Andreutti-Zaugg, et al. Cancer Res. 57: 3288-3293, 1997)。この方法は、ノンセンス変異によって生じたストップコドンを検出することから、ストップコドンアッセイと呼ばれている。なおストップコドンアッセイは、その原理上、フレームシフト変異を検出することができる。ストップコドンアッセイを行うベクターの上では、フレームシフトがレポーター遺伝子の翻訳にも及ぶためである。
ストップコドンアッセイでは、レポーター遺伝子を含むベクターを利用する。このベクターは、まずMSH2のcDNAと、レポーター遺伝子のADE2 (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, E.C. 4.1.1.21)とがキメラ蛋白を形成するように読み枠を合わせて組み込み、更にMSH2遺伝子部分の中間部分を5'および3'断端を残す形で切り取って線形化ベクターとしたものである。切り取ったMSH2遺伝子部分にインサートＤＮＡである被検MSH2遺伝子を挿入すれば、被検MSH2遺伝子とレポーター遺伝子とのキメラタンパク質を発現する。
【０００５】
この線形化ベクターとともにRT-PCR増幅した被検MSH2 cDNAを酵母に導入すれば、MSH2遺伝子の5'および3'断端部分への相同組換えが酵母内で起こる。その結果ベクターへのインサートＤＮＡの組み込みが完成し、MSH2とADE2遺伝子のキメラ蛋白が酵母内に発現する。使用する酵母をADE2欠損株としておけば、ADE2活性が発現したときにのみ酵母が正常に増殖する。しかし、MSH2 cDNA内にノンセンス変異またはフレームシフト変異があれば、途中で蛋白合成が終止したり、読み枠がずれたADE2が生成する。その結果、アデニン合成経路の中間代謝産物が蓄積、結晶化して酵母コロニーが赤色となり(Weisman, et al. J. Cell Biol. 105: 1539-1547, 1987)、変異の存在を肉眼的に知ることができる。
【０００６】
この方法は、ノンセンス変異、またはフレームシフト変異を簡便な操作で知ることができる極めて優れた遺伝子診断法である。しかし、ベクターとインサートＤＮＡとの相同組み換えを可能とするために、ベクター側に常にインサートＤＮＡの塩基配列に相同な領域を用意しなければならない。この目的のために、ストップコドンアッセイにおいては、いったん被検遺伝子であるMSH2遺伝子に由来するインサートＤＮＡをベクターに組み込み、その一部を切り出した直線状ベクターがアッセイに用いられる。このような原理に基づく限り、ある遺伝子のために調製したベクターは、その遺伝子の試験にしか用いることができない。すなわち、被検遺伝子ごとに専用のベクターを構築する必要がある。そのため、多種類の遺伝子診断に応用することは現実的でない。特定の遺伝子のみならず、幅広い遺伝子を対象として、簡便な手法によってノンセンス変異、またはフレームシフト変異を知ることができる手法の提供が待たれている。
【０００７】
たとえば、代表的な遺伝子疾患と言えるがんにおいては、多くのがん関連遺伝子の変異が見出されている。がん関連遺伝子の変異による活性化や不活性化が、がんの原因と密接に関連するとされている。したがって、がん遺伝子は変異の検出対象として重要である。
がん遺伝子の変異は、特定の部位に集中するいわゆるホットスポットとして検出される場合もあるが、変異の多くは特定の領域に集中せず遺伝子の全体にわたって広く見出されている。したがって、がん遺伝子の変異の検出においては、遺伝子の全領域を検出対象とする必要がある。ところが、BRCA1(5592bp)やAPC(8975bp)のような長い遺伝子については、その全領域をストップコドンアッセイに適用することは困難である。まず、このような長い領域を正確にPCRによって増幅することが難しい。加えて、ストップコドンアッセイのための相同組み換えと、レポーター遺伝子との融合タンパク質の発現が困難である。したがって、このような大きな遺伝子をストップコドンアッセイによって解析するには、どうしても遺伝子をいくつかの領域に分割する必要があった。公知のストップコドンアッセイでは、このようなケースでは、分割される数に応じた種類のベクターを構築しなければならないことになる。すなわち、単一の遺伝子であっても、複数のベクターが必要となるのである。このような背景からも、汎用性に優れるストップコドンアッセイの提供が求められている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子に生じたノンセンス変異、またはフレームシフト変異を検出するための、汎用性の高い方法の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、公知のストップコドンアッセイにおいて、汎用性を達成できない原因の一つがベクターの構造にあると考えた。相同組み換えのためのクローニング領域として、被検遺伝子に由来する塩基配列を利用するかぎり、被検遺伝子に合わせて専用のベクターを調製しなければならない。そこで本発明者らは、ベクターの構造を一定としながら、被検遺伝子を自由に組み込むことが実現できれば、ストップコドンアッセイの汎用性を飛躍的に向上させることができると考えた。
【００１０】
本発明者らはこの目的を達成するために、ベクターのクローニング領域に合わせた塩基配列を被検遺伝子の側に付加することができないか検討を重ねた。いわば、これまでのストップコドンアッセイとは、まったく逆の発想に基づく被検遺伝子の挿入方法を試みたのである。その結果、ベクターに組み込むべき遺伝子断片（インサートＤＮＡ）の調製にあたり、特定の塩基配列をその両端に連結しておくことにより、ベクターへの組み込みが可能となることを見出した。この方法を利用すれば、原理上、あらゆる遺伝子の変異を単一のベクターで試験することができる。すなわち本発明は、以下のような、遺伝子上のノンセンス変異、またはフレームシフト変異の検出方法に関する。
【００１１】
〔１〕以下の工程を含む、被検遺伝子上のノンセンス変異、またはフレームシフト変異を検出する方法。
１）プロモーター配列、クローニング領域、およびレポーター遺伝子とから構成され、両末端にクローニング領域を持つ直線状ベクターを用意する工程、
ただし、直線状ベクターは、クローニング領域にインサートＤＮＡを組み込むことによって、前記要素をこの順に含み、プロモーター配列の制御下に、インサートＤＮＡとレポーター遺伝子との融合転写産物を発現することができるベクターを与える、
２）前記クローニング領域と相同な塩基配列を、インサートＤＮＡの末端に付加したＤＮＡ断片を用意する工程、
３）工程１）記載のベクターのクローニング領域に、２）記載のＤＮＡ断片を、相同組換えによって組み込む工程、
４）工程３）によって得られるベクターのレポーター遺伝子の発現を指標として前記変異を検出する工程。
〔２〕工程４）のレポーター遺伝子が、該遺伝子を発現した細胞と、発現しない細胞とで、視覚的に判別可能なシグナルを生成する遺伝子である、〔１〕記載の方法。
〔３〕細胞が酵母であり、レポーター遺伝子がＡＤＥ２遺伝子である、〔２〕記載の方法。
〔４〕ベクターが、CENおよび／またはARS配列を含む、〔３〕記載の方法。
〔５〕工程２）記載のインサートＤＮＡ断片を相同組換えにより組み込んだベクターで形質転換した細胞を単離し、該細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを指標として被検遺伝子における変異を検出する〔１〕記載の方法。
〔６〕工程２）におけるインサートＤＮＡが、クローニング領域と相同な塩基配列を5'末端部分に付加したプライマー対によって被検遺伝子を鋳型とするＰＣＲ増幅によって得られたものである、〔１〕記載の方法。
〔７〕直線状ベクターの両末端が平滑末端である、〔１〕記載の方法。
〔８〕直線状ベクターの両末端が脱リン酸化処理されたものである、〔１〕記載の方法。
〔９〕以下の要素を含む、インサートＤＮＡ上のノンセンス変異、またはフレームシフト変異の検出用キット。
ａ）プロモーター配列、クローニング領域、およびレポーター遺伝子とから構成され、両末端にクローニング領域を持つ直線状ベクター、
ただし、直線状ベクターは、クローニング領域にインサートＤＮＡを組み込むことによって、前記要素をこの順に含み、プロモーター配列の制御下に、インサートＤＮＡとレポーター遺伝子との融合転写産物を発現することができるベクターを与える、
ｂ）クローニング領域と相同な塩基配列を5'末端部分に付加した、インサートＤＮＡ増幅用プライマー対、および
ｃ）レポーター遺伝子の発現を評価するための試薬
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の変異の検出方法には、次の構成要素からなり、両末端にクローニング領域を持つ直線状ベクターが用いられる。このベクターを本発明においてはギャップベクターと呼ぶ。
・プロモーター配列、
・クローニング領域、および
・レポーター遺伝子
本発明におけるギャップベクターは、クローニング領域にインサートＤＮＡを組み込むすることによって、前記要素をこの順に含み、プロモーター配列の制御下に、インサートＤＮＡとレポーター遺伝子との融合転写産物を発現することができるベクターである。インサートＤＮＡは最終的にクローニング領域に挟まれて配置されることになる。
【００１３】
本発明におけるギャップベクターを構成するクローニング領域は、以下に述べるインサートＤＮＡの両端に付加する塩基配列と相同な塩基配列からなる。言いかえれば、ギャップベクターに用いたクローニング領域に相同な塩基配列をインサートＤＮＡに付加する。
本発明において塩基配列が相同であることとは、２つの２本鎖ＤＮＡが相同性の高い塩基配列を備えていることを意味する。相同性が高いことは、かならずしも両者の塩基配列が完全に一致することを意味しない。本発明においては、用いる宿主細胞において、あるいはin vitroにおいて、一定の確率で相同組み換えによってインサートＤＮＡを前記直線状ベクターに組み込むことができるものであれば良い。たとえば３０塩基の相同的な塩基配列において、少なくとも２０塩基、望ましくは２５塩基以上の塩基配列が一致していれば、実用的な確率で相同組み換えを達成することができる。
クローニング領域の長さについても、一定の確率で相同組み換えによってインサートＤＮＡを前記直線状ベクターに組み込むことができるものであれば制限されない。具体的には、たとえば酵母細胞においてインサートＤＮＡの組み込みを行う場合には、１０〜２００塩基、望ましくは１０〜５０、より望ましくは１０〜３０塩基からなる相同的な塩基配列をクローニング領域として用いることができる。本発明においては、クローニング領域と相同的な塩基配列をなんらかの手段によってインサートＤＮＡに付加しなければならないことから、不必要に長いクローニング領域は不利である。したがって、１０〜３０塩基で構成されるクローニング領域は、本発明におけるクローニング領域として望ましい。
【００１４】
遺伝子組み換えの手法として最も一般的なのは、制限酵素の切断とライゲーションを利用する方法である。しかしストップコドンアッセイにおいては、レポーター遺伝子に対してインサートＤＮＡの翻訳フレームを常に一定の関係で連結しなければならないことから、相同組み換えが用いられる。制限酵素を用いた方法では、インサートＤＮＡに合わせたクローニングサイトをベクター側に用意しなければならなくなるので汎用性を期待できない。
あるいは、クローニングサイトに合う塩基配列を付加したプライマーでPCRし、クローニング用の断片を得る方法も公知である。しかしこのような手法を用いても、インサートＤＮＡの読み取り枠をレポーター遺伝子に合わせられないケースが生じる。このような理由により、相同組み換えはストップコドンアッセイに好適な組み換え手法である。
【００１５】
本発明において、クローニング領域は任意の塩基配列であることができる。後に述べるように、インサートＤＮＡへの付加がPCR用のプライマーとして行われる場合を考慮すれば、PCRの障害となりにくい塩基配列とするのが望ましい。具体的には、プライマー内で自己アニールしない塩基配列が望ましい。また、被検遺伝子に類似する塩基配列が見出しにくいものとすることにより、非特異的なアニールの可能性を小さくすることができる。もちろんクローニング領域に相同的な塩基配列をPCR以外の手法に基づいてインサートＤＮＡに付加する場合には、その手法の障害とならないような塩基配列を選択することができる。
【００１６】
本発明のギャップベクターを構成する各要素は、クローニング領域を除き、公知のストップコドンアッセイに利用されていたものであればそのまま利用することができる。以下に、残る要素について具体的に述べる。
まず本発明におけるベクターを構成するプロモーターには、アッセイに用いる宿主細胞において有効なあらゆるプロモーターを用いることができる。本発明におけるプロモーターは、前記融合転写産物を発現させることができるものであれば限定されない。ギャップベクターにインサートＤＮＡが組み込まれた状態では、プロモーターの下流には、インサートＤＮＡおよびレポーター遺伝子、がこの順に配置させられる。プロモーターとインサートＤＮＡとの距離は、発現に有利なように適宜調節することができる。本発明においては、このようにして、プロモーターの下流にインサートＤＮＡとレポーター遺伝子を同一の読み取り枠で翻訳されるように配置し発現させることを、プロモーターの制御下に前記融合転写産物を発現させると言う。たとえば酵母のような真核生物においては、次のようなプロモーターが有効である。
CYCプロモーター
アルコールデヒドロゲナーゼ1遺伝子（ADH1）のプロモーター
分裂酵母(S. pombe)のnmt1プロモーター等
【００１７】
一方レポーター遺伝子としては、各種のアッセイ系に用いられている幅広いレポーター遺伝子を用いることができる。すなわち、宿主細胞の薬剤耐性や栄養要求性を変化させる遺伝子、あるいはその遺伝子の発現によってなんらかのシグナルが生成される遺伝子などを用いることができる。具体的には、次のような遺伝子が公知である。
栄養要求性の変化をもたらすレポーター遺伝子
ADE1
ADE2: phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
HIS3: imidazoleglycerolphosphate dehydratase等
シグナルを生成する遺伝子
GFP: Green Fluorescent Protein
ｌａｃＺ：  Ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
Luc: Firefly luciferase 等
【００１８】
本発明におけるギャップベクターには、更に付加的にアッセイ系の効率を上げたり、操作性を改善するためのさまざまな公知の機能を付加することができる。たとえば、CEN遺伝子やARS遺伝子を備えるベクターは、酵母において少ないコピー数で安定的な自律複製を可能とする。その結果、酵母１細胞当たりベクター１分子で形質転換することができる。このようなベクターを用いることにより、レポーター遺伝子の発現頻度を酵母細胞の数としてとらえることができる。すなわち、変異の頻度をレポーター遺伝子を指標として酵母の細胞数で知ることができるのである。その他、融合タンパク質の発現を増強するためのエンハンサーやターミネーターを組み合わせることができる。
本発明のストップコドンアッセイによって変異の頻度を明らかにすることにより、具体的には次のような遺伝子変異の解析を行うことができる。たとえば、ある個体のゲノムDNAにおける変異の頻度を明らかにすることにより、その変異がヘテロであるのかホモなのかを決定することができる。あるいは、がんが疑われる組織や細胞の遺伝子について本発明のストップコドンアッセイを行えば、組織や細胞集団における変異の頻度を知ることができる。これにより、腫瘍細胞集団における変異を持つ細胞クローンの増加の動態を把握できることになり、発癌機構の解析に重要な手段が提供される。
【００１９】
本発明においては相同組み換えによってインサートＤＮＡを組み込むので、ギャップベクターは直線状として使用する。酵母細胞における相同組み換えは、環状のベクターに対しては事実上行えない。ギャップベクターの切断末端は、平滑末端とするのが望ましい。平滑末端とすることにより、インサートＤＮＡを介さない環状化を起こしにくくすることができる。インサートＤＮＡを介さないベクターの環状化は、インサートＤＮＡの変異とは無関係にレポーター遺伝子の発現をもたらす可能性がある。インサートＤＮＡをともなわない環状化ベクターによるレポーター遺伝子の発現は、本発明のアッセイ系においてはノイズとして作用することから、これをできるだけ小さくすることが望ましい。平滑末端化に加え、末端を脱リン酸化しておくことによって、環状化をより確実に阻止することができる。脱リン酸化された平滑末端は、リガーゼ等によるライゲーションを起こさない。脱リン酸化は、アルカリフォスファターゼによって行うことができる。このような直線状ベクターは、相同組み換えによってインサートＤＮＡが組み込まれたときにのみ、特異的に環状化される。
【００２０】
ギャップベクターの自己環状化によるレポーター遺伝子の発現を、塩基配列によって制御することもできる。たとえば、プロモーター制御下に有効な開始コドンATGが、インサートＤＮＡの組み込みによって初めてもたらされるようにしておくことができる。すなわち、インサートＤＮＡが組み込まれない限り、ベクターの自己環状化ではレポーター遺伝子に適切な開始コドンが与えられないように設計するのである。そのためには、たとえば次のような方法を利用することができる。
(1)被検遺伝子に由来する開始コドンを用いる
(2)インサートＤＮＡとしてatgで始まる塩基配列を選択する
(3)クローニング領域とインサートＤＮＡを跨いでatgを配置する
アッセイ系におけるノイズの発生は、先に述べたベクターの構造的な改変に合わせて、このような塩基配列上の工夫も組み合わせることによって、より効果的に抑制することができる。
【００２１】
本発明におけるギャップベクターは、アッセイに用いる宿主細胞に合った発現ベクターやシャトルベクターを公知の方法に基づいて改変することにより構築することができる。たとえば宿主としてSaccharomyces cerevisiaeのような酵母を用いる場合には、pLS381（スイス国立癌研究所(ISREC) Richard Iggo博士より分与）のようなシャトルベクターを用いることができる。pLS381は、CYCプロモーターの制御下にレポーター遺伝子として機能するADE2を発現し、加えて栄養要求性マーカーやCEN/ARS配列を含んだ望ましいベクターとして挙げられる。同様のベクターにpLF-ADE2 (Furuuchi, Tada, Moriuchi et al. Am J Pathol印刷中)を示すことができる。
【００２２】
以下に、本発明におけるギャップベクターを構築するための代表的な方法を述べる。具体的には、公知のストップコドンアッセイに用いられていたベクターに、インサートＤＮＡの構造遺伝子ではなく、クローニング領域を与えるDNAを利用すれば良いのである。
クローニング領域DNAは化学的に合成し、更に相補鎖とアニールさせることによって２本鎖とすることができる。あるいは、他のベクターや各種の遺伝子を鋳型として合成したPCR産物等から制限酵素等で切り出した断片を用いることもできる。クローニング領域DNAそのものの塩基配列は任意とすることができる。このとき、平滑末端を与える制限酵素の認識配列を含む塩基配列からなるDNAを挿入すれば、先に述べた平滑末端を備えた直線状ベクターを容易に得ることができる。平滑末端を与える制限酵素としては、たとえばSfo Iを示すことができる。Sfo Iは、ggCGccからなる塩基配列を認識し、そのCG間を切断して平滑末端とする制限酵素である。また直線状としたときに、その末端同士で相同組み換えが起きないように、注意する。
更に発現される融合蛋白の３次元構造によりADE2活性中心が被覆され、ADE2酵素活性が十分発現しないときには、被検遺伝子とADE2との間にスペーサーとして短いペプチド鎖に相当する配列を挿入することもできる。この挿入ペプチド鎖としてポリヒスチジンタグ、FLAGタグ、 c-mycタグ、 HAタグのような抗体によって検出できるものを採用すれば、酵母内でのタンパク質発現を免疫学的に確認することができる。
一方ベクターpSL381は、レポーター遺伝子の上流に位置するクローニングサイトにおいて切断し、ここに別に調製したクローニング領域を挿入する。クローニング領域は、ライゲーションや相同組み換えによって挿入される。そしてクローニング領域が挿入されたベクターを回収し、Sfo Iで消化すれば、本発明における直線状ベクターとすることができる。直線状としたベクターの平滑末端は、必要に応じて脱リン酸化することができる。この方法に基づいて本発明のためのベクターを構築する例を実施例に具体的に示した。
【００２３】
このとき大切なことは、直線化したベクターに対して、インサートＤＮＡを組み込んだときに、その下流に配置したレポーター遺伝子との翻訳フレームを合わせておくことである。言いかえれば、本発明においては、インサートＤＮＡがコードするアミノ酸配列のC末端側に、レポーター遺伝子のN末端が連続した融合タンパク質を発現させなければならない。両者は連結されていても良いし、リンカーペプチドを介した状態であっても良い。また、レポーター遺伝子やインサートＤＮＡが、かならずしもコドン単位で構成されていなくても良い。すなわち、両者を連結する部分がコドンを跨ぐこともできる。いずれにせよ、ノンセンス変異やフレームシフト変異を含まない場合には、インサートＤＮＡがコードするアミノ酸配列がレポーター遺伝子がコードするタンパク質と同一のフレームで翻訳されるようにする。つまり両者の間にノンセンスコドンが生じないように配置する。翻訳フレームは、インサートＤＮＡの末端に付加される相同組み換えのための塩基配列と、インサートＤＮＡとの位置関係によって調整することができる。具体的には、たとえば以下のような配置を示すことができる。
【００２４】
(1)クローニング領域によってリンカーペプチドがコードされるようにする
この例では、インサートＤＮＡがコードするアミノ酸配列と、レポーター遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の間に、クローニング領域を構成する塩基配列によってコードされるリンカーペプチドが介在することになる。このリンカーペプチドを、スペーサーとして機能するペプチド鎖とすることができる。
(2)レポーター遺伝子の末端をクローニング領域として利用する
この例では、インサートＤＮＡでコードされたアミノ酸配列がレポーター遺伝子に直接つながった融合ペプチドが発現する。
(3)(1)と(2)を組み合わせて利用する
この例では、クローニング領域としてレポーター遺伝子の一部が利用される。インサートＤＮＡがコードするアミノ酸配列とレポーター遺伝子がコードするアミノ酸配列の間には、(1)と同様にリンカーペプチドが位置する。ただし、リンカーペプチドはクローニング領域の一部によってコードされたものである。
【００２５】
本発明においては、クローニング領域を末端に付加したインサートＤＮＡが用いられる。インサートＤＮＡにクローニング領域を付加したインサートＤＮＡによって、本発明の最大の課題である高度な汎用性が達成される。すなわち、クローニング領域に相同な塩基配列を付加することによって、インサートＤＮＡの塩基配列とは無関係に、単一のベクターであらゆる被検遺伝子にストップコドンアッセイを適用することが可能となった。
【００２６】
このようなインサートＤＮＡは、様々な方法によって得ることができる。もっとも有利な方法のひとつに、PCRに基づく方法を挙げることができる。以下に、PCRによって本発明におけるインサートＤＮＡを得る方法を具体的に述べる。まず、インサートＤＮＡを得るためのPCR用プライマーを合成する。このプライマーは、被検遺伝子の変異を含む領域を増幅することができるプライマーに対して、その5'側に前記クローニング領域に相同な塩基配列を付加した構造からなる。このプライマーは、はじめに、その3'側において被検遺伝子にアニールし、PCRを開始する。その結果として得られる増幅生成物は、全てその5'末端にクローニング領域に相同な塩基配列を備えたものとなる。すなわち、PCRによってクローニング領域に相同な塩基配列を付加したインサートＤＮＡとすることができるのである。同様の構造は、一般的なPCRによって得ることができる産物に、クローニング領域に相同な塩基配列からなる２本鎖のオリゴヌクレオチドリンカーを連結することによって得ることもできる。
インサートＤＮＡの取得において、被検遺伝子に由来する塩基配列のみでアミノ酸配列をコードできるものでなくともよい。つまり最終的にインサートＤＮＡがギャップベクターに組み込まれたときに、正しいフレームでレポーター遺伝子との融合タンパク質を発現できるように設計されていれば、本発明のストップコドンアッセイに用いることができる。たとえば被検遺伝子に由来する塩基配列が、その末端においてコドンの２塩基のところで中断されていても、ギャップベクターやプライマーに由来する塩基配列によって残る３つ目の塩基が与えることができる。
【００２７】
本発明は、変異の検出を目的とすることから、PCRにあたっては塩基の誤った取りこみをできるだけ防ぐことが正確な結果につながる。一般に、PCRの増幅対象となる塩基配列は、短い方が正確な合成が期待できる。またDNAポリメラーゼとして、校正機能を備えた酵素を利用することによって、相補鎖合成を正確に進めることができる。このようなDNAポリメラーゼとしては、pfu DNAポリメラーゼを挙げることができる。PCRに一般に用いられるTaq DNAポリメラーゼは、およそ４００塩基に１つの割合で誤った塩基を取り込むと言われているので、本発明におけるインサートＤＮＡの合成には不向きである。
PCRに用いるプライマーは、プライマーが互いにアニールして増幅生成物を生じないように、プライマーセットを構成するオリゴヌクレオチドの3'側の塩基配列の設定に注意する。プライマー同士のアニールは、標的遺伝子に由来しないインサートＤＮＡを生じ、誤った結果の原因となる。更に、鋳型となる標的遺伝子の塩基配列を忠実に合成したPCR産物を多量に得るために、nested PCRを利用することができる。nested PCRは、ある鋳型塩基配列に対して、入れ子の関係にある２組のプライマー対によって行われるPCRである。まず、外側に位置するプライマー対によるPCRを行い、その増幅生成物を鋳型として更に内側のプライマーセットでPCRを行う。nested PCRによって増幅効率が飛躍的に高まると同時に、たとえばプライマー同士のアニールによって生じた生成物などは、２回目のPCRにおいては鋳型として利用されないため、正確な合成を行うことができるとされている。
【００２８】
本発明において、「クローニング領域に相同な塩基配列を付加する」とは、原則として被検遺伝子に由来する塩基配列に、ギャップベクターとの間で相同組み換えを達成することができる人為的な塩基配列を付加することを意味する。ギャップベクターとの間で効率的にインサートＤＮＡとの相同組み換えを達成するためには、クローニング領域と相同な塩基配列として、１０〜５０b、より具体的には１０〜３０b程度の長さの人為的な配列を付加するのが望ましい。
【００２９】
続いて本発明におけるインサートＤＮＡと被検遺伝子の関係について述べる。本発明においてインサートＤＮＡとは、被検遺伝子に由来する塩基配列からなり、実際にギャップベクターに組み込まれるＤＮＡを意味する。インサートＤＮＡは、被検遺伝子のタンパク質コード領域の全長を含むものであることもできるし、その一部であることもできる。遺伝子の一部をインサートＤＮＡとするときには、ギャップベクターに組み込んだときにその遺伝子本来の翻訳フレームを維持するべきであることは言うまでも無い。インサートＤＮＡは、必ずしもコドン単位で取得する必要はない。インサートＤＮＡの3'側がコドンの途中で終わる場合には、以下に示すようにギャップベクターの側にそのコドンを補充できる塩基を用意することによってコドンを構成することができる。
インサートＤＮＡ→| |←ギャップベクター
.... nnn nnn nn n nnn nnn nnn ....
本発明においてはインサートの中にノンセンス変異や、フレームシフト変異が存在することを検出するので、被検遺伝子の一部をインサートＤＮＡとする場合には、検出の対象となる変異の予想される領域が、インサートＤＮＡの中に含まれるようにする。あるいは、被検遺伝子の全長をインサートＤＮＡとすることによって、部位に関わらず遺伝子全体の中の変異を検出することもできる。本発明におけるインサートＤＮＡの長さは、相同組み換えと、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質との融合タンパク質が発現が可能であれば、特に制限されない。たとえば酵母による相同組み換えを利用する場合には、一般的に500〜3000bp、望ましくは500〜2000bp、より具体的には1000〜1500bpの長さとすることによって、相同組み換えの効率を高く維持することができる。更に、PCRによってインサートＤＮＡを得る場合には、後に述べるように塩基の誤った取り込みが起きにくい長さとするのが望ましい。
【００３０】
本発明において、被検遺伝子とは、変異を検出すべき遺伝子を指す用語として用いる。したがって、被検遺伝子は、cDNA、ゲノムDNA、あるいはmRNAなど、あらゆる遺伝子ソースに求めることができる。これらの遺伝子を鋳型として、先に述べたようなクローニング領域を構成する塩基配列を付加したプライマーを用いてPCRを行えば、インサートＤＮＡとすることができる。鋳型がRNAであれば、RT-PCRを利用すれば良い。あるいはこれらの遺伝子が２本鎖として十分な量を得られる場合には、制限酵素などで切断後に、クローニング領域に相当する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをライゲーションして本発明のためのインサートＤＮＡとすることもできる。
【００３１】
本発明の変異の検出方法は、あらゆる種類の遺伝子の変異の検出に応用することができる。具体的には、ゲノムにおける変異や、mRNAにおけるスプライシングの異常等の検出が可能である。更に具体的には、以下のような遺伝子の変異の検出を行うことができる。
BRCA1
BRCA1はその不活性化によって家族性乳がんの原因となるがん抑制遺伝子(Bishop DT: BRCA1 and BRCA2 and breast cancer incidence: a review. Ann. Oncol. 10 Suppl 6: 113-119, 1999, GenBank Accession # U14680)である。 家族性乳癌の他，若年性乳癌、両側性乳癌、多臓器癌（卵巣癌など）合併乳癌、男性乳癌、家族性卵巣癌などで変異が認められている。コ−ディング領域は5592bpで、1864個のアミノ酸がコードされる長大な遺伝子である。変異としては80％をノンセンスまたはフレームシフト変異が占めるため、ストップコドンアッセイが有用であるが、変異の分布は全領域に拡がるため、数個の領域に分けてそれらの断片をインサートDNAとして、本発明に基づくストップコドンアッセイにより、変異を検出することができる。このように変異検出を行うべき領域が広い場合に本発明の汎用性が特に有用である。
【００３２】
APC
APCは胚細胞変異による不活性化により、家族性大腸ポリポーシスとそれに続発する大腸がんを好発することが知られている(Groden J, et al.: Identification andcharacterization of the familial adenomatous polyposis coli gene. Cell 66: 589-600, 1991, GenBank Accession # M74088)。また、弧発性の大腸がんをはじめとして、膵がん、胃がん、食道がんでも体細胞変異が知られている。更に最近、本発明者らは、乳がんでも変異が認められることを見出した(Furuuchi K, Tada M, Moriuchi T et al.: Am J Pathol in press)。変異は胚細胞、体細胞変異とも約95%がストップコドンとなる。変異の部位は変異クラスター領域(mutation cluster resion)といわれる好発部位がとくに体細胞変異で見られるが、変異部位の報告は多数で広範囲にわたっている。この遺伝子も2843個のアミノ酸をコードする長大な遺伝子であり、いくつかの領域に分け本発明の汎用性を利用することで変異検出が可能である。
【００３３】
hMSH2 (L47581〜3), hMLH1 (U07343), hMSH6 (U73732〜7)
いずれも遺伝性非腺腫性大腸癌の原因遺伝子として同定されたミスマッチ修復遺伝子である。これらの遺伝子に異常があるとミューテーター表現型として発生する腫瘍に複製エラー(replication error; RER)、またはマイクロサテライト不安定性(microsatellite instability; MSI)を高頻度に認めることとなる(Lynch HT, de la Chapelle A: Genetic susceptibility tonon-polyposis colorectal cancer. J. Med. Genet. 36:801-18, 1999)。特にhMSH2とhMLH1の胚細胞変異の頻度が高い。変異の型別ではストップコドン型となるものがhMSH2で約90%、hMLH1で約70%、hMSH6でも報告は少ないがほとんどフレームシフト変異である。変異の部位はhMSH2、hMLH1とも変異集中部位はなく広範囲にみられる。これらはそれぞれ934、756、1361個のアミノ酸をコードする遺伝子であるため、分割なしあるいは2〜3の領域に分割してストップコドンアッセイを行うことができる。これらの複数の遺伝子の変異をセットとして検出するためにはベクターをそれぞれ別に用意しなくてもよい本発明の汎用性が重要となる。
【００３４】
その他ストップコドンアッセイが有用ながん抑制遺伝子としては次のような例を挙げることができる。
MEN1 (U93236〜7)
多発性内分泌腫瘍症１型の原因遺伝子である。胚細胞変異の約70%がストップコドン型となる。変異の部位は特に頻度の高いホットスポットといえる領域はなくすべてのエクソンに存在する。
【００３５】
WT1 (X51630)
Wilms腫瘍の発生に関連する遺伝子として同定された。仮性半陰陽、糸球体腎炎を合併するDenys-Drash症候群では原因遺伝子である。 散発性Wilms腫瘍でも約15%に異常がある。変異の型別では約40%がストップコドン型となる変異である。変異の部位はほとんどのエクソンにわたっている。
【００３６】
NF1 (M82814)
神経線維腫症1(Reclinghausen病)の原因遺伝子でrasタンパクの制御に関与している。変異の部位は60あるエクソンに広く分布しホットスポットはない。 変異の型は約70%がストップコドン型となる変異である。
【００３７】
PTEN (U92436)
Cowden病の原因遺伝子でフォスファチジル・イノシトール三リン酸の脱リン酸化に関与しPKB/Aktシグナルを負に制御する遺伝子である。脳腫瘍，膵がんなどで体細胞変異が知られている。その70%がストップコドン型変異である。
【００３８】
本発明による変異の検出方法は、予め変異の位置が特定できている場合のみならず、変異の位置が不明な遺伝子について、その変異部位を明らかにするために利用することもできる。すなわち、正常な遺伝子の構造が明らかな被検遺伝子について、変異を生じている部位を明らかにするために、本発明に基づいて次のような解析を行うことができる。まず、標的遺伝子を任意の領域に分け、各領域を増幅することができるプライマーを設計する。各領域は、連続するように設定しても良いし、部分的に重複するように設定することもできる。各プライマーの5'側には、前記ギャップベクターにおけるクローニング領域に相同な塩基配列を連結する。一連のプライマーセットによって合成されたインサートＤＮＡをギャップベクターに組み込んで変異を検出すれば、どの領域に変異を生じているのかを明らかにすることができる。更に、変異を含むベクターを単離し、その塩基配列を明らかにすることもできる。
【００３９】
本発明のストップコドンアッセイは、インサートＤＮＡを組み込んで環状化されたギャップベクターにおける、レポーター遺伝子の発現状態を指標として変異の有無を検出する。つまり、インサートＤＮＡにノンセンスコドン変異やフレームシフト変異が無ければ、レポーター遺伝子との正常な融合転写産物が得られるはずである。レポーター遺伝子が正常なアミノ酸配列を持つタンパク質であれば、その活性を検出することができる。融合転写産物は、環状化されたギャップベクターをin vivo、あるいは in vitroで翻訳することによって得ることができる。たとえば、相同組み換えを行った酵母細胞がそのまま環状化されたギャップベクターによって形質転換体となり、前記融合転写産物を与える。
この工程は、公知のストップコドンアッセイと基本的に同じである。なお公知のストップコドンアッセイにおいては、インサートＤＮＡの組み込みによってギャップベクターを環状化する工程を、修復(repair)と表現している。実際には、レポーター遺伝子として用いた遺伝子の発現産物の活性に応じた様々な確認方法を行うことができる。
【００４０】
レポーター遺伝子として望ましい活性は、着色や蛍光を生じる活性である。このような活性は肉眼的に確認することができるので、アッセイ系を簡便にする。具体的には、酵母におけるADE2遺伝子の欠損は、アデニン制限培地上で赤いコロニーとして検出することができる。従って、ADE2をレポーター遺伝子として用い、ADE2欠損酵母を宿主として組み合わせることにより、インサートＤＮＡにおける変異を赤色コロニーとして検出することができる。ベクターの形質転換によってADE2が発現した場合には、ADE2欠損酵母が正常に発育できるようになり正常な白いコロニーを生じる。ADE2欠損酵母としては、yPH857(ATCC# 76628)、yPH500(ATCC# 76626)、yPH499(ATCC# 76625)等を用いることができる。これらの酵母は、ATCC(American Type Culture Collection; http://bioscience.igh.cnrs.fr//urllists/atcc.htm)より入手することができる。
なお、アデニン制限培地とは、ADE2が発現しない細胞でも増殖発育はできるが、赤色のコロニー色を生じる培地である。この培地は、培地１L当たり以下の組成を含む。L-tryptophane以下の各アミノ酸の混合物としてカザミノ酸10ｇを使用することもできる。
0003639853.tif 000002
同様のレポーター遺伝子に、ADE1やGFPを挙げることができる。ADE1は、ADE2と同様の原理で変異によって着色コロニーを生じる。GFPでは、正常な場合に蛍光を発し、異常によって蛍光を消失することになる。
【００４１】
あるいは、ルシフェラーゼのような酵素活性タンパク質をコードする遺伝子をレポーター遺伝子に用いることができる。このようなレポーター遺伝子を用いる場合には、形質転換体を単離した上で、その酵素活性を測定することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを確認することもできる。
【００４２】
本発明に用いるギャップベクター、およびレポーター遺伝子を検出するための試薬を予めセットにして、変異検出用のキットとすることができる。レポーター遺伝子の検出のための試薬としては、たとえばADE2欠損酵母の培養を行うためのアデニン制限培地などが含まれる。
このキットには、ギャップベクター、ギャップベクターによる形質転換を行うための宿主細胞等を組み合わせることもできる。更に、変異を検出すべき遺伝子に合わせて設計したPCR用のプライマーを組み合わせておくこともできる。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。
〔実施例１〕  ストップコドンアッセイによる、BRCA1遺伝子変異の検出
（１）  使用酵母株、培地、および遺伝子導入方法
ADE2を欠損した発芽酵母S. cerevisiae株であるyPH857(ATCC# 76628)を使用した。遺伝子型は[MATa ura3-53 lys2-801 ade2-101 his3-D200 trp1-D63 leu2-D1 cyh2R] である。通常培養用の完全培地としてはYPDA++を使用した。 ウラシル非添加、アデニン制限ストップコドンアッセイ用培地としてはCAu10を使用した。
培地の組成は以下の通りである。
・YPDA++培地：
10 g/L 酵母エキストラクト
20 g/L ペプトン
2% グルコース
200 mg/L アデニン
・CAu10培地：
0.67% 酵母ニトロゲンベース
2% グルコース
1% カザミノ酸
20 mg/L L-トリプトファン
10 mg/L アデニン
2.5% 寒天
【００４４】
（２）本発明によるギャップベクターの作製
ギャップベクターは、pLS381（スイス国立癌研究所(ISREC) Richard Iggo博士より分与）を改良することによって構築した。pLS381は、URA3マーカー遺伝子とCEN/ARS配列、AmpおよびColE1 Oriを持ち、CYCプロモータで駆動されADE2を発現する酵母/大腸菌シャトルベクターである。すなわち、ギャップベクターの自己再環状化を最小限に抑えるために、CYCプロモーターとADE2遺伝子の間のBamH I切断部位をSfo I部位に変更した。Sfo Iは、次の認識配列の|で示したc|g間を切断して平滑末端を生じる制限酵素である。
....ggC|Gcc....
....ccG|Cgg....
具体的には、次の塩基配列で示される2本鎖のオリゴヌクレオチドを、BamH Iにて線形化したpLS381に組み込んだ。
5'-CACTAAATT AATAATGACC GGCGCC ATGGATTCTA GAACAGTTG-3'（配列番号：１）
3'-GTGATTTAA TTATTACTGG CCGCGG TACCTAAGAT CTTGTCAAC-5'
すなわち、BamH Iで消化したpSL381、および上記2本鎖オリゴヌクレオチドを酵母株yPH857に同時導入した。酵母コロニーから回収したプラスミドクローンのうち、Sfo Iにて切断できるものを選択し、DNA塩基配列決定により挿入塩基配列を確認して、目的とする塩基配列を持つものを選択しpMT18と命名した。pMT18をSfo Iで切断して得られるギャップベクターの末端を構成するクローニング用の塩基配列は、それぞれ次の24 bとなる。
5'-端：... CAC ACT AAA TTA ATA ATG ACC GGC（配列番号：２）
3'-端：GCC ATG GAT TCT AGA ACA GTT GGT ...（配列番号：３）
線形化ベクターは仔牛腸アルカリホスファターゼ処理を行って脱リン酸化し自己再環状化を防止した。BamH I線状化pLS381およびSfo I線状化pMT18を、単独でそれぞれ100 ngまたは50ngを酵母株yPH857に導入し、自己環状化により生じるコロニー数を比較した。
【００４５】
（３）臨床サンプルからのRNAおよびゲノムDNAの抽出
北海道大学医学部附属病院第一外科およびその関連施設で手術が行われた大腸癌患者から摘出された大腸癌および周辺正常大腸粘膜を液体窒素にて凍結保存した。-80℃で保存されたサンプルからTrizol Reagent (Gibco)を用いて全RNAおよびゲノムDNAを抽出した。
【００４６】
（４）プライマーの設計
BRCA1遺伝子を対象として、本発明によるストップコドンアッセイを評価した。
まず、BRCA1のエキソン11について表１に示すようなプライマー対を設計して臨床サンプルゲノムDNAについてPCR増幅を行った。表中、アンダーラインを付けた部分がクローニング領域に相同な塩基配列である。得られたPCR産物をインサートＤＮＡとして、本発明によるストップコドンアッセイを実施した。
【表１】
0003639853.tif 000003
a:INに付けた−番号は、イントロンスプライス供与部位からイントロン−エキソン接合部までの塩基数
b:INに付けた＋番号は、イントロンスプライス需要部位からイントロン−エキソン接合部までの塩基数
c:ATG開始コドンとクローニング領域に相同な塩基配列までを含む断片全体の長さ
d:エキソン１１における5'末端を１としたときの位置
【００４７】
プライマーはエキソン11を全長 (set 1)、中間部1/3 (set 2)、前2/3 (set 3)、後2/3(set 4) の各部に分けて増幅するように設定した。set １による通常のPCRと、効率良く増幅生成物を得るために、nested PCR（set 2〜set 4）を利用した。すなわち、各セットについてexternalプライマー対によるPCR増幅ののち、その産物を鋳型としてinternalプライマー対でさらにPCR増幅した。Internalプライマー対には5'側(forward)プライマーには上記pMT18の5'-断端24 bと蛋白合成開始コドンATGを付加し、3'側(reverse)プライマーにはpMT18の3'-断端24 bを付加した。set 2においてはinternalプライマー対に付加するクローニング領域に相同な塩基配列の長さを変化させた。すなわち、pMT18の末端に相同な塩基配列として、18 b、30 b、および39 b付加するものを別に作成した。
【００４８】
（５）PCR増幅
PCR反応はPerkin Elmer 2400 Thermal Cyclerを用いて行った。
セット1ではinternalプライマー対(gBR1EX11F/gBR1EX11R)を直接用い、LA Taqポリメラーゼ (TAKARA)にて反応を行った。反応液は添付1x バッファー (MgCl2+), 2.0 mM dNTP, 0.4 μM 各プライマー, 2.5 U LA Taq ポリメラーゼに鋳型 ゲノムDNA 50 ng/μlを2μl加えて、全量25μlとした。ホットスタートを行い、94℃ 40秒, 56℃ 40秒, 68℃ 5分を35サイクル行った後、68℃ 7分の後伸展を加えた。
使用したプライマーの配列は以下の通りである。
gBR1EX11F（配列番号：４）：5'-CACACTAAATTAATAATGACCGGCATGGCTGCTTGTGAATTTTCTGAGACG-3'
ｇＢＲＥＸ１１Ｒ（配列番号：５）：5'-ACCAACTGTTCTAGAATCCATGGCTCCAATACCTAAGTTTGAATCCATGC-3'
【００４９】
セット2ではinternalプライマー対(BR1EX11F2/BR1EX11R2)ではPfu TURBO ポリメラーゼ (Stratagene) 1.25 U, 添付1x buffer, 2.0 mM dNTP, 0.4 μM 各プライマー, 鋳型 100 ngを全量25μlでホットスタートにて行った。95℃ 40秒, 58℃ 40秒, 78 ℃ 2.5分を10サイクル行った後、78℃ 7分の後伸展を行った。この反応液を1/100に希釈したもの2μlを鋳型として同組成反応液にてexternalプライマー対(gBR1EX11F2/gBR1EX11R2-2)を用いてnested PCRの第2段反応を行った。PCRサイクルは95℃ 40秒, 58℃ 40秒, 78℃ 2分を35サイクル行った後、78℃ 7分の後伸展を行った。またクローニング領域部分の長さが異なる次のプライマー対を用いて同様の第２段反応を行った。
(g18BR1EX11F2/g18BR1EX11R2-2)
（ｇ３０ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２／ｇ３０ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２）
（ｇ３９ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２／ｇ３９ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２）
【００５０】
使用したプライマーの配列は以下の通りである。
BR1EX11F2（配列番号：６）：5'-AAAAGAATAGGCTGAGGAGGAAGTC -3'
ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２（配列番号：７）：5'-CTCATTTCCCATTTCTCTTTCAGGT -3'
ｇＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２（配列番号：８）：5'-CACACTAAATTAATAATGACCGGCATGAGAAATCTAAGCCCACCTAAT -3'
ｇＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２（配列番号：９）：5'-ACCAACTGTTCTAGAATCCATGGCAGTAATGAGTCCAGTTTCGTT -3'
ｇ１８ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２（配列番号：１０）：5'-AAATTAATAATGACCGGCATGAGAAATCTAAGCCCACCTAAT -3'
ｇ１８ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２（配列番号：１１）：5'-TGTTCTAGAATCCATGGCAGTAATGAGTCCAGTTTCGTT -3'
ｇ３０ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２（配列番号：１２）：5'-AATACACACACTAAATTAATAATGACCGGCATGAGAAATCTAAGCCCACCTAAT -3'
ｇ３０ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２（配列番号：１３）：5'-TAATATACCAACTGTTCTAGAATCCATGGCAGTAATGAGTCCAGTTTCGTT -3'
ｇ３９ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２（配列番号：１４）：5'-GCAAACACAAATACACACACTAAATTAATAATGACCGGCATGAGAAATCTAAGCCCACCTAAT -3'
ｇ３９ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２（配列番号：１５）：5'-TCCCCCTCCTAATATACCAACTGTTCTAGAATCCATGGCAGTAATGAGTCCAGTTTCGTT -3'
【００５１】
セット3ではinternalプライマー対(BR1EX11F-new/BR1EX11R2)ではPfu TURBO ポリメラーゼ (Stratagene)にて95℃ 40秒, 58℃ 40秒, 78℃ 5分を10サイクル行った後、78℃ 7分の後伸展を行った。この反応液を1/100に希釈したもの2μlを鋳型としてexternalプライマー対(gBR1EX11F/gBR1EX11R2-2)を用いてnested PCRの第2段反応を行った。PCRサイクルは95℃ 40秒, 58℃ 40秒, 78℃ 5分を35サイクル行った後、78℃ 7分の後伸展を行った。
【００５２】
使用したプライマーは以下の通りである。
BR1EX11F-new（配列番号：１６）：5'-GTACCTTGTTATTTTTGTATATTTTCAG -3'
ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２（配列番号：１７）：5'-CTCATTTCCCATTTCTCTTTCAGGT -3'
ｇＢＲ１ＥＸ１１Ｆ（配列番号：１８）：5'-CACACTAAATTAATAATGACCGGCATGGCTGCTTGTGAATTTTCTGAGACG -3'
ｇＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２−２（配列番号：１９）：5'-ACCAACTGTTCTAGAATCCATGGCAGTAATGAGTCCAGTTTCGTT -3'
【００５３】
セット4ではinternalプライマー対(BR1EX11F2/BR1EX11R-new)ではPfu TURBO ポリメラーゼ (Stratagene)にて95℃ 40秒, 60℃ 40秒, 78℃ 4.5分を10サイクル行った後、78℃ 7分の後伸展を行った。この反応液を1/100に希釈したもの2μlを鋳型としてexternalプライマー対(gBR1EX11F2/gBR1EX11R)を用いてnested PCRの第2段反応を行った。PCRサイクルは95℃ 40秒, 58℃ 40秒, 78℃ 5分を35サイクル行った後、78℃ 7分の後伸展を行った。
【００５４】
使用したプライマーは以下の通りである。
BR1EX11F2（配列番号：２０）：5'-AAAAGAATAGGCTGAGGAGGAAGTC -3’
ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ−ｎｅｗ（配列番号：２１）：5'-GGGCAAACACAAAAACCTGGTTCC -3’
ｇＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２（配列番号：２２）：5'-CACACTAAATTAATAATGACCGGCATGAGAAATCTAAGCCCACCTAAT -3'
ｇＢＲ１ＥＸ１１Ｒ（配列番号：２３）：5'-ACCAACTGTTCTAGAATCCATGGCTCCAATACCTAAGTTTGAATCCATGC -3'
【００５５】
（５）本発明によるストップコドンアッセイ
PCR産物を1% アガロースゲルにて電気泳動した。臭化エチジウム(ethidium bromide)染色の後にUV下で写真撮影して良好なPCR増幅を確認した。PCRバンドの濃さに基づいて測定した1〜10μlのPCR産物を、線形化pMT18とともにリチウム酢酸(Lithium acetate)法にて酵母株yPH857に導入した(Gietz, et al. Yeast 11: 355-360, 1995)。 形質転換した酵母をCAu10プレート上にて30℃、2〜3日間培養し、4℃にて発色を増強したのち、白色および赤色コロニーを計数した。
【００５６】
（６）プラスミド抽出、制限酵素切断、DNA配列決定
赤色または白色酵母コロニーをYPDA++培地にて１晩培養後、ザイモリアーゼ(Zymolyase) 100T (生化学工業)にて処理し、酵母莢膜を除去した後、アルカリSDS溶解法(QIAprep Spin Miniprep kit; Qiagen)にてプラスミドを抽出した。このプラスミドを電気穿孔法にて大腸菌株XL-1 Blueに導入、培養したものからアルカリSDS溶解法にてプラスミドを抽出した。これを制限酵素切断にてインサートの有無をチェックし、DNA配列を決定した。
【００５７】
（７）結果
（ｉ） Sfo I平滑末端作成による自己環状化防止効果
BamH I線状化pLS381とSfo I線状化pMT18を単独でそれぞれ100 ngまたは50ngを酵母株yPH857に導入し、自己環状化により生じるコロニー数を計数した。この結果BamH I線状化pLS381では115 (100ng), 77 (50 ng), 72 (50ng)個のコロニーが生じたのに対し、Sfo I線状化pMT18では67 (100ng), 42 (50 ng), 38 (50ng)個のコロニーが生じ、約45%自己環状化が防止できることが判明した。しかし白色コロニーとはほぼ同等数の赤色コロニーが生じた。これはベクター内部での偶発的相同組換えによるものと考えられた。末端平滑化のみでは高度な自己環状化防止作用を期待できないと考えられた。
【００５８】
（ｉｉ） セット1プライマー対によるアッセイ結果
nested PCRではなく、クローニング領域に相同な塩基配列を付加したプライマー対(set 1)で直接3.4 kbのフラグメントをLA Taqを用いて増幅し、６サンプルについて本発明による検出方法を試みた。その結果、６サンプルとも十分な数のコロニー(400個以上)を確認することができた。しかし、赤色コロニーが27.4%〜82.0% (平均45%)となり、バックグラウンドの赤色コロニーが多く出現した。白色コロニー６個をとってプラスミドを抽出し、制限酵素切断で調べたところ、すべてにおいて期待される3.4 kbのインサートが入っておらず、DNA配列決定ではプライマー対が二本鎖を形成したと考えられる短いフラグメントが入っていた。赤色コロニーを６個とって調べたところ、２個に3.4 kbのインサートが入っていたが、4個においては白色コロニーと同様に短いフラグメントが入っていた。
【００５９】
（ｉｉｉ）セット2, 3, 4プライマー対によるアッセイ結果
2の結果をふまえ、セット2, 3, 4では以下の改良点を加えた。
1) 増幅サイズの制限と校正機能を持ったDNAポリメラーゼ
PCRでの誤った塩基の取り込みによる赤色コロニー（バックグラウンド）を抑える目的で増幅サイズを制限し、校正機能のあるPfu TURBOポリメラーゼを使用した。
2) プライマー同士のアニールを防止
また各プライマー設計にあたっては、プライマー同士のアニーリングによる二本鎖断片増幅を避けるため、プライマーの3'末端において二本鎖が形成されないようにコンピュータで検証した。
3) nested PCRの採用
非特異的アニーリングによる非目的産物の生成をできるだけ抑えるため、nested PCRを行うようにした。
【００６０】
以上の３つの改良の結果、次のとおり赤色コロニーの著しい現象を見た。
プライマーセット2：4.0〜10.7% (n=10, 平均8.1%)
（ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２／ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２およびgBR1EX11F2/gBR1EX11R2-2)
プライマーセット3：3.8〜7.3 (n=6, 平均5.5%)
（ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ−ｎｅｗ／ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ２およびgBR1EX11F/ gBR1EX11R2-2)
プライマーセット4：10.3〜16.0 (n=6, 平均13.3%)
（ＢＲ１ＥＸ１１Ｆ２／ＢＲ１ＥＸ１１Ｒ−ｎｅｗおよびgBR1EX11F2/gBR1EX11R)
【００６１】
さらにクローニング領域の長さが、相同組換え率に与える影響を確認するために、様々な長さのクローニング領域について、赤色コロニー（バックグラウンド）と、白色コロニーにおけるインサートＤＮＡを比較し、適正な相同組み換えが起きている割合を調査した。
18b、24b、30b、および39bのクローニング領域を持つプライマーで細胞株MCF-7、ZR-75-1から抽出したゲノムDNAについて本発明に基づいて変異の検出方法を行った。赤色コロニーバックグラウンドはそれぞれの細胞株サンプルで以下のように生じた。
18b 4.8% 7.9%
２４ｂ  ９．８％  ７．２％
３０ｂ  １１．１％  １２．７％
３９ｂ  ７．７％  ８．５％
30bのクローニング領域を持つプライマーを除いて、10%以下にバックグランドを抑えることができた。バックグランドの値が10%とは、実用的に許されるレベルである。また白色コロニー各20個からプラスミドを抽出して制限酵素切断にて適正インサートの有無を確認したところ、すべてに適正にインサートＤＮＡが入っていることが確認された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子中に生じるノンセンス変異、またはフレームシフト変異を、検出するための汎用性に優れた方法が提供された。本発明では、被検遺伝子に由来するインサートＤＮＡの両端に、ギャップベクターのクローニング領域と相同な配列を付加する。そのため、インサートＤＮＡの塩基配列に関わらず、共通のギャップベクターに組み込むことが可能となる。すなわち本発明による変異検出方法は、被検遺伝子ごとにベクターを構築する必要がなく、高い汎用性を有する。
本発明を利用することにより、がん遺伝子のように長い遺伝子の全領域を対象にストップコドンアッセイを行う場合であっても、単一のベクターで変異の検出が可能となった。本発明によるストップコドンアッセイの汎用性の高さは、単に多種類の遺伝子に対応できることだけでなく、がん遺伝子のような大きな遺伝子を分割して解析する場合においても有利である。単一のベクターを用いて様々な遺伝子断片の変異を検出することができることから、大きな遺伝子を細かく分割して解析することにより、変異の位置を細かく特定することも容易である。
本発明のためのインサートＤＮＡは、たとえばクローニング領域を5'側に付加したプライマーを用いたPCRによって容易に合成することができる。したがって、本発明による変異検出方法は、任意の被検遺伝子について、簡便でかつ迅速な検査を可能とする。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による変異の検出方法の原理を模式的に示す図。
【図１】
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