(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解物から核酸を得る方法であって、下記工程Ａ〜Ｅ：
Ａ）核酸が含まれていると思われる溶解物と、前記溶解物中に存在する全ての核酸との水不溶性析出物を形成させるのに十分量のポリエチレンイミンとを接触させる工程；
Ｂ）前記水不溶性析出物と前記溶解物とを分離する工程；
Ｃ）前記分離された水不溶性析出物と強塩基とを接触させて前記核酸を前記ポリエチレンイミンから解放させる工程；
Ｄ）工程Ｃと同時に又は工程Ｃに続いて、前記核酸とアニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤とを接触させて前記解放された核酸を溶液中に保つ工程；及び
Ｅ）前記解放された核酸を含有する溶液のｐＨを約６〜約９に調整する工程を含む、溶解物から核酸を得る方法。
【請求項２】
前記強塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム又は水酸化アンモニウムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程Ａにおける前記ポリエチレンイミンの使用量が約０．００５〜約１重量％である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記溶解物が、非イオン界面活性剤を含有する溶液中で被検体試料を加熱することによって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記工程Ｄにおける前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤の使用量が約０．０５〜約１．５重量％である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤が非芳香族フッ素化リン酸エステル又は非芳香族非フッ素化オキシアルキル化アルキルリン酸エステルである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤が、
構造式：[F(CF２-CF２)３−８CH２CH２]１，２-OP(O)(OM)２，１
（上式中、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムカチオンである）で示される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
約１５分以内で実施される請求項１記載の方法。
【請求項９】
標的核酸を増幅して検出するための方法であって、
１）下記工程Ａ〜Ｅ：
Ａ）核酸が含まれていると思われる溶解物と、標的核酸を含む前記溶解物中に存在する全ての核酸との水不溶性析出物を形成させるのに十分量のポリエチレンイミンとを接触させる工程；
Ｂ）前記水不溶性析出物と前記溶解物とを分離する工程；
Ｃ）前記分離された水不溶性析出物と強塩基とを接触させて前記核酸を前記ポリエチレンイミンから解放させる工程；
Ｄ）工程Ｃと同時に又は工程Ｃに続いて、前記核酸とアニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤とを接触させて前記解放された核酸を溶液中に保つ工程；及び
Ｅ）前記解放された核酸を含有する溶液のｐＨを約６〜約９に調整する工程を使用して溶解物から標的核酸を得る段階と、
２）前記解放された核酸の中で前記標的核酸を増幅する段階と、
３）前記増幅された標的核酸を検出する段階とを含む、標的核酸を増幅して検出するための方法。
【請求項１０】
前記増幅段階が、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒され且つ少なくとも１種の標識プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記標識プライマーがビオチンで標識されており、且つ増幅後に得られたビオチン化標的核酸がアビジン及び酵素の複合体との反応によって検出される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記強塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム又は水酸化アンモニウムであり、
前記工程Ａにおける前記ポリエチレンイミンの使用量が約０．００５〜約１重量％であり、
前記工程Ｄにおける前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤の使用量が約０．０５〜約１．５重量％であり、そして
前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤が非芳香族フッ素化リン酸エステル又は非芳香族非フッ素化オキシアルキル化アルキルリン酸エステルである、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記強塩基が水酸化ナトリウムであり、前記工程Ａにおける前記ポリエチレンイミンの使用量が約０．０１〜約１重量％であり、前記工程Ｄにおける前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤の使用量が約０．１〜約１．５重量％であり、そして前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤が、
構造式：[F(CF２-CF２)３−８CH２CH２]１，２-OP(O)(OM)２，１
（上式中、Ｍはアルカリ金属又はアンモニウムカチオンである）で示される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、プロウイルスＨＩＶ１、プロウイルスＨＩＶ２、サイトメガロウイルス、マイコバクテリウム(Mycobacterium)種、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウイルス又はヒト遺伝疾患に付随した標的核酸を、前記標的核酸の鎖に特異的であり且つハイブリダイズ可能なプライマーを用いて増幅し検出するための、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
下記ａ〜ｃ：
ａ）１種又は２種以上の増幅試薬を含む増幅反応混合物；
ｂ）ポリエチレンイミン；及び
ｃ）アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤
が個別に包装されて含まれている、標的核酸を増幅するための試験キット。
【請求項１６】
前記増幅反応混合物が、少なくとも一方が標識化されている一組のプライマーと、複数種のｄＮＴＰと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを含む、請求項１５記載の試験キット。
【請求項１７】
前記アニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤が非芳香族フッ素化リン酸エステル又は非芳香族非フッ素化オキシアルキル化アルキルリン酸エステルである、請求項１５記載の試験キット。
【請求項１８】
１個又は２個以上のキット部品を有する試験装置を含む、請求項１５記載の試験キット。
【請求項１９】
標的核酸を検出するための方法であって、
１）下記工程Ａ〜Ｅ：
Ａ）核酸が含まれていると思われる溶解物と、標的核酸を含む前記溶解物中に存在する全ての核酸との水不溶性析出物を形成させるのに十分量のポリエチレンイミンとを接触させる工程；
Ｂ）前記水不溶性析出物と前記溶解物とを分離する工程；
Ｃ）前記水不溶性析出物と強塩基とを接触させて前記核酸を前記ポリエチレンイミンから解放させる工程；
Ｄ）工程Ｃと同時に又は工程Ｃに続いて、前記核酸とアニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤とを接触させて前記解放された核酸を溶液中に保つ工程；及び
Ｅ）前記解放された核酸を含有する溶液のｐＨを約６〜約９に調整する工程を使用して溶解物から標的核酸を得る段階と、
２）ハイブリダイゼーションアッセイにおいて前記解放された核酸の中で前記標的核酸を検出する段階とを含む標的核酸を検出するための方法。
【請求項２０】
溶解物から核酸を得る方法であって、下記工程Ａ〜Ｄ：
Ａ）核酸が含まれていると思われる溶解物と、前記溶解物中に存在する全ての核酸との水不溶性析出物を形成させるのに十分量のポリエチレンイミンとを接触させる工程；
Ｂ）前記水不溶性析出物と前記溶解物とを分離する工程；
Ｃ）前記分離された水不溶性析出物と強塩基とを接触させて前記核酸を前記ポリエチレンイミンから解放させる工程；及び
Ｄ）工程Ｃと同時に又は工程Ｃに続いて、前記核酸とアニオン性非芳香族リン酸エステル系界面活性剤とを接触させて前記解放された核酸を溶液中に保つ工程を含む、溶解物から核酸を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検出するための核酸を捕捉して選択的に解放させることにより試料を調製する方法に関する。より詳細には、本発明は、増幅などの後処理のための核酸を捕捉して解放させる方法に関する。本発明はまた、この方法において用いられる試験キットにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような高度に複雑化した増幅技法の開発をはじめとして、微量の核酸を検出する技術はこの二十年間で急速に進歩した。研究者たちは、ヒトや動物の被検体における疾患や遺伝的特徴を検出するこのような技法の価値を認識している。このような技法におけるプローブやプライマーの使用は、相補性という概念、すなわち相補的ヌクレオチド間の水素結合による核酸２本鎖の結合、に基づくものである。
当該技術分野におけるＰＣＲの著しい進歩は、極わめて低濃度の標的核酸の検出を可能にしている。ＰＣＲの詳細については、例えば、米国特許出願第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）及び同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）明細書に記載されている。しかしながら、この分野における文献は急激に増加している。
【０００３】
標的核酸を効果的に増幅して検出するためには、その核酸を細胞やその他の被検体残渣から単離しなければならないのが普通である。様々な溶解手法が知られており、凍結法、プロテアーゼ（例、プロテイナーゼＫ）などの消化酵素による処理法、煮沸法、各種洗剤を使用する方法（例えば、１９８８年４月６日出願のＨｉｇｕｃｈｉの米国特許出願第１７８，２０２号明細書及び１９９１年５月２２日発行の欧州特許出願公開第０  ４２８  １９７号公報を参照のこと）、溶剤析出法並びに加熱プロトコールがある。
しかしながら、核酸を抽出すると、溶解物(lysate)中にインヒビター又は干渉因子(interferent) が存在するために、核酸と溶解物中の他の物質とを分離しなければならない場合がある。核酸と複合体を形成することが知られている物質の一つにポリエチレンイミンがある。ポリエチレンイミンは、Ｑベータレプリカーゼのような酵素を単離するための方法において汚染物である核酸を析出するために用いられている（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏの米国特許出願第５，１４１，８５７号明細書を参照のこと）。例えば、米国特許出願第５，０９２，９９２号明細書（Ｃｒａｎｅら）に記載されているように、核酸を捕捉するためにポリエチレンイミンの誘導体を含有するアフィニティーカラムも用いられている。
【０００４】
さらなる処理にとって有用な標的アナライトを得るためには、単にポリエチレンイミンを使用して核酸を析出させるだけでは不十分である。析出物をそのままの形態で使用することはできず、またその析出物から核酸を解放させることは困難である。その上、ポリエチレンイミンに結合されている核酸を常用の増幅技法で増幅することはできない。このため、標的核酸を後処理にかけるために選択的に捕捉して解放させることについて一連の問題があり、既知の手法ではこれらの問題を容易に解決することはできない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、増幅又はその他のハイブリダイゼーション法のために試料中の核酸を調製する効率的且つ簡便な手段が必要とされている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の問題は、下記工程Ａ〜Ｄ：
Ａ）核酸が含まれていると思われる溶解物と、前記溶解物中に存在する全ての核酸との水不溶性析出物を形成させるのに十分量のポリエチレンイミンとを接触させる工程；
Ｂ）前記水不溶性析出物と前記溶解物とを分離する工程；
Ｃ）前記分離された水不溶性析出物と強塩基とを接触させて前記核酸を前記ポリエチレンイミンから解放させる工程；及び
Ｄ）工程Ｃと同時に又は工程Ｃに続いて、前記核酸とアニオン性リン酸エステル系界面活性剤とを接触させて前記解放された核酸を溶液中に保つ工程を含む、溶解物から核酸を得る方法によって解決される。
【０００７】
本発明はまた、上記工程Ａ〜Ｄの他に、下記工程Ｅ：
Ｅ）前記解放された核酸を含有する溶液のｐＨを約６〜約９に調整する工程、を含む方法をも提供する。
【０００８】
本発明は、標的核酸を増幅して検出するための方法であって、
１）下記工程Ａ〜Ｅ：
Ａ）核酸が含まれていると思われる溶解物と、標的核酸を含む前記溶解物中に存在する全ての核酸との水不溶性析出物を形成させるのに十分量のポリエチレンイミンとを接触させる工程；
Ｂ）前記水不溶性析出物と前記溶解物とを分離する工程；
Ｃ）前記分離された水不溶性析出物と強塩基とを接触させて前記核酸を前記ポリエチレンイミンから解放させる工程；
Ｄ）工程Ｃと同時に又は工程Ｃに続いて、前記核酸とアニオン性リン酸エステル系界面活性剤とを接触させて前記解放された核酸を溶液中に保つ工程；及び
Ｅ）前記解放された核酸を含有する溶液のｐＨを約６〜約９に調整する工程を使用して溶解物から標的核酸を得る段階と、
２）前記解放された核酸の中で前記標的核酸を増幅する段階と、
３）前記増幅された標的核酸を検出する段階とを含む、標的核酸を増幅して検出するための方法をも提供する。
【０００９】
さらに、下記ａ〜ｃ：
ａ）１種又は２種以上の増幅試薬を含む増幅反応混合物；
ｂ）ポリエチレンイミン；及び
ｃ）アニオン性リン酸エステル系界面活性剤
が個別に包装されて含まれている、標的核酸を増幅するための試験キットが提供される。
【００１０】
本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅法のようなさらなる処理に供される核酸を選択的に単離して提供するための迅速、簡便且つ効果的な方法を提供するものである。本発明は、ポリエチレンイミンの従来の使用法に関する上記問題を、捕捉された核酸をポリエチレンイミンから解放しそしてその核酸がポリエチレンイミンと再び複合体を形成しないように核酸を分散させたままにしておく方法を提供することによって解決した。本発明の試料調製法は簡易であり、また最小限の段階しか必要としない。この方法は、通常であれば１５分以内（好ましくは１０分以内）で実施することができる。本発明では、常用の方法で用いられる有機溶剤は使用せず、比較的安価な試薬が用いられる。
【００１１】
ポリエチレンイミンは被検体中の核酸を捕捉する有用な機能を発揮するが、その核酸はポリエチレンイミンと複合体を形成したままでは利用することができない。このため、核酸とポリエチレンイミンの析出物に強塩基を接触させて核酸を解放させる。解放された核酸を溶液中に分散させておくため、ｐＨを高くしながら特定の界面活性剤、すなわちアニオン性リン酸エステルをその核酸に接触させる。一般に、その後ｐＨを低下させないと核酸を何らかの方法に利用することはできない。上記の界面活性剤は、ｐＨを低くした場合にも核酸を溶液中に維持する。
【００１２】
本発明は、植物、動物、ヒト又は環境から集められたいずれの種類の被検体試料中に存在する１種又は２種以上の標的核酸の抽出及び検出にも特に適している。こうして得られた核酸は、常用のハイブリダイゼーションアッセイ法に供することによってさらに検出することができる。ハイブリダイゼーションアッセイ法については当該技術分野ではよく知られている（例えば、ハイブリダイゼーション技術に関しては本明細書中に参照することにより取り入れる米国特許出願第４，９９４，３７３号明細書を参照のこと）。
【００１３】
しかしながら、簡潔にするため、以下の説明では核酸を増幅手順、特にＰＣＲに供する好ましい実施態様について行うものとする。しかしながら、本発明の範囲をそのように限定するつもりはない、というのは別の増幅技法（例えば、ＬＣＲ）を利用することも可能だからである。
【００１４】
ポリメラーゼ連鎖反応を利用した核酸の増幅及び検出についての一般的な原理及び条件はよく知られている。その詳細については米国特許出願第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）、同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）及び国際特許出願第９１／１２３４２号明細書をはじめとする数多くの文献に記載されている。上記の米国特許明細書は参照することによって本明細書に取り入れることとする。当該技術分野における教示や本明細書中に記載した具体的な教示を鑑みれば、当業者であれば、本発明の試料調製法とポリメラーゼ連鎖反応法とを組み合わせることによって本発明を実施することに何ら困難はないはずである。
【００１５】
本発明を実施する上で採用することができる他の増幅手順には、例えば、欧州特許出願第０  ３２０  ３０８号（１９８７年１２月発行）や同第０  ４３９  １８２号（１９９０年１月発行）に記載されているリガーゼ連鎖反応が含まれる。
被検体には、細胞又はウイルス性の物質、毛髪、体液又はその他核酸を含有する物質が含まれる。標的核酸は、適当ないずれのヒト、動物、細胞培養物、微生物、ウイルス、植物又は環境ソースからでも抽出されることができる。
【００１６】
検出可能な細菌には、血液中で見つけることができる細菌、サルモネラ（Salmonella) 種、ストレプトコッカス (Streptococcus)種、クラミジア (Chlamydia)種、ナイセリア (Neisseria)種、マイコバクテリウム (Mycobacterium)種 (例、結核菌やトリ型結核菌複合体) 、マイコプラズマ (Mycoplasma) 種 (例、肺炎マイコプラズマ) 、レジオネラ症 (Legionella pneumophila) 、ボレリア・ブルグドルフェレイ (Borrelia burgdorferei)、ニューモシスチス・カリニ (Pneumocystis carinii) 、クロストリジウム・ディフィシル (Clostridium difficile)、カンピロバクター (Campylobactor)種、エルシニア (Yersinia) 種、シゲラ (Shigella) 種及びリステリア・モノシトゲネス (Listeria monosytogenes) が含まれるが、これらに限定はされない。検出可能なウイルスには、単純ヘルペスウイルス、Epstein Barrウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、肝炎ウイルス並びにレトロウイルス（例、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ１及びＨＩＶ２）が含まれるが、これらに限定はされない。原生動物寄生体や（酵母やカビを含む）菌類を検出することもできる。その他検出可能な種については当業者であれば容易に想到することができる。本発明は、各種の細菌又はウイルスに付随した核酸の存在を検出するのに特に有用である。
【００１７】
好ましい実施態様では、本発明は、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、プロウイルスＨＩＶ１、プロウイルスＨＩＶ２、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、マイコバクテリウム (Mycobacterium)種、肝炎ウイルス又はヒト遺伝疾患に付随した標的核酸を単離、増幅及び検出するのに有用である。
【００１８】
ポリエチレンイミンと接触させる前に、被検体から核酸を適当な何らかの方法で抽出してもよい。当該技術分野では、Laure らのThe Lancet, pp. 538-540 (1988 年 9月 3日) 、ManiatisらのMolecular Cloning: A Laboratory Mannual, pp. 280-281 (1982) 、Gross-Belland らのEur. J. Biochem., 36, 32 (1972) 及び米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書（上記）に記載されているものをはじめとする各種溶解手法が知られている。全血又はその成分からＤＮＡを抽出する方法については、例えば、欧州特許出願第０  ３９３  ７４４号（１９９０年１０月２４日発行）及び米国特許出願第５，２３１，０１５号明細書(Cumminsら) に記載されており、本明細書では Cumminsらの特許明細書を参照することによって取り入れることとする。
【００１９】
本発明の実施にとって溶解手法の種類は問題ではないが、好ましい溶解手法として適当な非イオン界面活性剤の存在下で被検体を加熱する方法が挙げられ、そのいくつかについては当該技術分野ではよく知られている。代表的な溶解手法を以下の実施例５に記載する。
【００２０】
次いで、溶解物にポリエチレンイミンを混合してその最終重量％を０．００５以上にする。ポリエチレンイミンはいくつかの市販品を使用することができる。この量は、溶解物中に存在する全ての核酸と水不溶性析出物を形成させ、よってそれらの核酸を溶解物から析出させるのに通常は十分な量である。もちろん、当業者であれば、核酸の全量を収容するためのポリエチレンイミンの量を調節する方法については周知である。ポリエチレンイミンの最終溶液濃度は約０．０１〜約１重量％とすることが好ましい。混合は最長で３０分までの適当な任意の時間で、また適当な任意の温度（一般には１５〜３０℃）で行うことができる。
【００２１】
所望であれば、強塩基との混合前に、析出物を溶解物から除去することで、インヒビター若しくは干渉因子を、又は細胞残渣を除去するか、或いは核酸を濃縮することができる。例えば、析出物を含有する溶解物を遠心分離にかけてその上澄液を廃棄することができる。
【００２２】
捕捉された核酸は、水不溶性析出物に強塩基を接触させることによってその析出物から解放（又は脱複合体化）される。強塩基とは、溶液のｐＨを１０以上（好ましくは１１以上）に上昇させることができる塩基を意味する。このような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム及びその他当業者であれば容易に想到する有機又は無機の塩基が含まれるが、これらに限定はされない。強塩基の使用量は、塩基の強さ及び溶液の体積に応じて、当業者であれば容易に想到することができる。本発明の実施には水酸化ナトリウムが好ましい。
【００２３】
強塩基との混合は、当業者であれば容易に想到することができる適当な何らかの混合手段を、適当な時間（一般には１分以上）、適当な温度（一般には約１５〜約３５℃）で使用して実施することができる。得られた混合物のｐＨは、一般に１１以上である。
【００２４】
特殊な化合物の１種以上の界面活性剤を用いて核酸を溶液中に保つ。この界面活性剤は、上記の強塩基の添加と同時に析出物と混合してもよいが、好ましくは強塩基が核酸を解放させる時間が経過した後に界面活性剤を添加する。
有用な界面活性剤は、水溶性のアニオン性非芳香族リン酸エステルである。このような物質は、ＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰ（ＤｕＰｏｎｔ社）やＥＭＰＨＯＳ（商標）（Ｗｉｔｃｏ社）をはじめとするいくつかの市販品から得ることができる。ＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤及びＥＭＰＨＯＳ（商標）ＰＳ４１３アニオン界面活性剤が代表的であるが、中でも前者の界面活性剤が好ましい。
【００２５】
より具体的には、非芳香族フッ素化リン酸エステル又は非芳香族非フッ素化オキシアルキル化アルキルリン酸エステル（モノエスエル及びジエステルを含む）並びに等価塩が有用な界面活性剤である。
【００２６】
一般に、非芳香族フッ素化リン酸エステルは、少なくとも一つのペルフルオロ脂肪族基（すなわち、Ｃn Ｆ2n+1基）を有し、また、ＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤のように、その分子における脂肪族基の大部分が過フッ素化されていることが好ましい。こうした化合物の一部を示すより一般的な構造式は〔（Ｒf Ｑa ）n Ｚ〕m Ｍ+ (3m-mn) である。ここで、Ｒf は最大で１０個までの炭素原子を有するフルオロ脂肪族基であり、Ｑは鎖中に最大で１０個までの炭素及び異種原子を含む多価結合基、例えば、アルキレン基、スルホンアミドアルキレン基、カルボンアミドアルキレン基及び等価な炭化水素基であり、Ｚはホスフェートであり、Ｍ+ はアルカリ金属（例、ナトリウム若しくはカリウム）又はアンモニウムカチオンであり、ｍは１又は２、ｎは１又は２、そしてａは０又は１である。Ｍは、当業者であれば容易に想到できる別の一価カチオンであってもよい。
【００２７】
このエステルはアルカリ金属塩、アンモニウム塩又はアルキルアンモニウム塩の形態で使用することができる。
本発明において有用な好ましいアニオン性フッ素化リン酸エステルは、構造式：[F(CF2-CF2)3-8CH2CH2]1,2-OP(O)(OM)2,1 （式中、Ｍは先に定義したカチオンである）で示されるＺｏｎｙｌ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤である。
【００２８】
この時点で用いられるアニオン性過フッ素リン酸エステルの最終溶液濃度は一般に約０．０５重量％以上であるが、中でも約０．１〜約１．５重量％であることが好ましい。この量は、界面活性剤の種類によって、また得られた溶液中に存在するポリエチレンイミンや核酸の量によって変わる場合がある。界面活性剤の中には他の界面活性剤が有効ではない濃度で最適に機能するものもある。この界面活性剤は、核酸がポリエチレンイミンと再複合体化しないようにし、よって核酸を低いｐＨでのさらなる処理に利用できる状態に保つ。このようにして解放され可溶化される核酸の量は、もちろん、核酸やポリエチレンイミンの存在濃度、界面活性剤の使用量及び混合の時間や温度に依存する。標的核酸が非常に少ない量で存在すると考えられる場合、当業者であれば試薬の量及び混合といった各種条件を選択する上でこの因子を考慮することができる。
【００２９】
解放された核酸と界面活性剤との混合は、当業者であれば容易に想到できる適当な時間（一般には１分以上）、適当な温度（一般には約１５〜約３５℃）で実施することができる。
【００３０】
得られる解放された核酸を含有する溶液のｐＨは高いので、一般にはそのｐＨをさらなる処理、例えば効率的な増幅又はハイブリダイゼーションアッセイのために調整する。ｐＨの調整は、典型的には、適量の適当な緩衝剤、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩やその他当業者であれば容易に想到できるものを上記溶液と混合することによって行われる。最終混合物のｐＨは、一般に約６〜約９の範囲にある。
この工程はすぐに実施してもよいし、また解放された核酸を高いｐＨで保存した後の遅れた時点で実施することもできる。
【００３１】
記載してきた本発明の核酸を捕捉して解放する方法は約１５分以内、好ましくは約１０分以内で実施されることが典型的である。
（特に断らない限り）本明細書中で量及び時間を規定する際に用いられている用語「約」は、記載の値には±１０％の変動が含まれることを意味する。ｐＨを規定する際の「約」は、±０．５ｐＨ単位を意味する。
【００３２】
さらに本発明は、上記の方法によって捕捉し解放された１種以上の標的核酸中に存在する１種以上の特異的核酸配列の増幅又は検出にも関する。その上、複数種の標的核酸を、対応するプライマー組と各特異的核酸に対する検出手段とを使用することによって同時に増幅して検出することができる。また、同一の核酸に含まれる複数の配列を増幅し検出することも可能である。
【００３３】
「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに必須であると考えられるすべての試薬、すなわち、それぞれの標的核酸に対する一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼコファクター及び２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）を意味する。
本明細書中でプライマー又はプローブをさす際の用語「オリゴヌクレオチド」は、４個以上の、好ましくは１０個を越えるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子を意味する。その正確な大きさは重要ではないが、そのオリゴヌクレオチドの最終的な用途又は作用をはじめとする多くの因子に依存する。このオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知のいずれの方法でも誘導化することができる。
【００３４】
用語「プライマー」とは、核酸鎖（すなわち、鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下に置かれた場合に合成の開始点として作用することができる天然又は合成のオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件は、ヌクレオチド（例、標準的な４種のデオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸）、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼコファクターの存在、並びに好適な温度及びｐＨを含むものである。通常、このような条件は非特異的増幅が最小限に抑えられるような「ストリンジェンシーの高い」条件として当該技術分野で知られている条件とする。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長生成物の合成を開始させるのに十分な長さを有する必要がある。各プライマーの正確な大きさは、考えられている用途、標的配列の複雑さ、反応温度及びプライマーの出所に依存して変化する。一般に、本発明で用いられるプライマーは１０〜６０個のヌクレオチドを有する。
【００３５】
本発明において有用なプライマーは、いくつかの出所から入手するか、或いは、例えば、ＡＢＩ  ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されている）又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ８６００シリーズ若しくは８８００シリーズの合成機（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社から市販されている）をはじめとする周知の技法及び装置、並びにそれらの使用法（例、米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書に記載されている）によって調製することができる。生物学的ソースから単離された天然のプライマー（例、制限エンドヌクレアーゼ消化物）も有用である。本明細書中の用語「プライマー」は、プライマー混合物をも意味する。こうして、ある特定の標的核酸に対する各プライマー組は、対向する標的核酸鎖の各々に対して２種以上のプライマーを含む場合もある。
【００３６】
増幅された生成物を検出又は捕捉するために、プライマーの一方又は両方を同じ又は異なる標識で標識化することができる。当該技術分野では標識を結合させてプライマーを調製する手順については周知であり、例えば、ビオチン標識に関するＡｇｒａｗａｌらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，ｐｐ．６２２７−４５（１９８６）、米国特許出願第４，９１４，２１０号明細書（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら）、酵素標識に関する米国特許出願第４，９６２，０２９号明細書（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら）、及びその中に記載されている文献、に記載されている。また、有用な標識には、放射性同位元素、電子高密度試薬、色素原、蛍光原、リン光部位、フェリチン及びその他の磁性粒子（Ｏｗｅｎらの米国特許出願第４，７９５，６９８号及びＰｏｙｎｔｏｎらの米国特許第４，９２０，０６１号明細書を参照のこと）、並びにその他特異的結合種（アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、糖類又はレクチン）が含まれる。好ましい標識は酵素、放射性同位元素及び（ビオチンのような）特異的結合種である。有用な酵素にはグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ(uricase) 、アルカリ性ホスファターゼ及びその他当該技術分野で周知の酵素が含まれる。これらの酵素は周知の手順によってオリゴヌクレオチドに結合させることができる。これらの酵素と共に比色信号又は化学発光信号を提供する試薬がよく知られている。
【００３７】
標識がペルオキシダーゼのような酵素である場合には、アッセイのある時点において、検出可能な色素を提供するために過酸化水素と適当な色素形成性組成物を添加する。例えば、有用な色素提供試薬には、テトラメチルベンジジン及びその誘導体、並びに（Ｂｒｕｓｃｈｉの米国特許出願第４，０８９，７４７号明細書に記載されている）水不溶性トリアリールイミダゾール系ロイコ色素のようなロイコ色素、又はその他ペルオキシダーゼと過酸化水素との存在下で反応して色素を提供する化合物が含まれる。特に有用な色素提供性化合物が欧州特許出願第０  ３０８  ２３６号（１９８９年３月２２日発行）に記載されている。適当な試薬を用いることで、ペルオキシダーゼ標識に応答する化学光信号を発生させることもできる。
【００３８】
プライマーの一方又は両方がビオチン化されている場合には、検出できるように標識化したアビジン又はその等価物（例、ストレプトアビジン）を用いて、増幅された核酸を検出することができる。例えば、アビジンを酵素と複合体化することや、周知の技法で放射性同位元素をアビジンに導入することができる。増幅生成物に結合されているビオチンはアビジンと複合体を形成し、そして放射性同位元素、比色信号又は化学光信号を検出するための適当な検出技法を使用する。
【００３９】
本明細書中の用語「捕捉プローブ」は、標的核酸の１本以上の鎖の核酸配列に実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドであって、増幅後の核酸を不溶化するために用いられるものである。一般に、プローブのオリゴヌクレオチドは適当な水不溶性担体、例えば、ポリマービーズやガラスビーズ、マイクロタイタープレートウェル、ポリマー若しくはセルロース系の薄膜又はその他当業者であれば容易に想到できる材料、に結合される。このオリゴヌクレオチドの長さは、一般にヌクレオチド約１２〜約４０個分であるが、この長さは特に問題ではない。
【００４０】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型の複合体においてプライマーの３’−ヒドロキシ末端にデオキシヌクレオシド一リン酸分子を付加する酵素であるが、この付加は鋳型依存型（すなわち、鋳型内のヌクレオチド種に依存する）である。当該技術分野では有用なＤＮＡポリメラーゼが数多く知られている。このポリメラーゼは「耐熱性」、つまり熱に対して安定であること、とりわけＤＮＡ鎖を変性するために適用される高温に対して安定であることが好ましい。より具体的には、この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載するＰＣＲにおいて適用される高温によって実質的に不活性化されることはない。
【００４１】
当該技術分野では、参照することにより本明細書に取り入れることとする米国特許出願第４，９６５，１８８号（上記）及び同第４，８８９，８１８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）明細書に詳細に記載されているものをはじめとし、いくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが報告されている。特に有用なポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス (Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィリス (Thermus thermophilis) 、サーマス・フィリフォルミス (Thermus filiformis) 又はサーマス・フラバス (Thermus flavus) のような各種耐熱細菌種から得られるものである。その他の有用な耐熱性ポリメラーゼは、サーモコッカス・リテラリス (Thermococcus literalis) 、ピロコッカス・フリオサス (Pyrococcus furiosus)、サーモトガ種(Thermotoga sp.)及び国際特許出願第８９／０６６９１号（１９８９年７月２７日発行）明細書に記載されているものをはじめとする他の様々な微生物源から入手される。有用なポリメラーゼの中には市販品もある。このパラグラフで引用した技術分野で記載されているように、生物体から天然のポリメラーゼを単離する技法や、組換え技法によって遺伝子組換酵素を製造する技法がいくつか知られている。
【００４２】
ＤＮＡポリメラーゼコファクターは、酵素活性に影響を与える非タンパク質化合物を意味する。このような物質のいくつかは、マンガン塩やマグネシウム塩をはじめとする既知のコファクターである。有用なコファクターには、マンガン及びマグネシウムの塩化物、硫酸塩、酢酸塩並びに脂肪酸塩（例、酪酸塩、カプロン酸塩、カプリル酸塩、カプリン酸塩及びラウリン酸塩）が含まれるが、これらに限定はされない。より小さな塩、すなわち塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。
【００４３】
ＰＣＲには、２種以上のデオキシリボヌクレオシド−５’−三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ又はｄＴＴＰも必要である。通常のＰＣＲではｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをすべて使用する。また、ｄＩＴＰや７−デアザ−ｄＧＴＰも有用である。
【００４４】
本発明の実施では、約５０℃よりも低い温度ではＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害するがより高温では不活性化される、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体も有用である。こうした特性を有する代表的なモノクローナル抗体が米国特許出願第５，３３８，６７１号明細書（Ｓｃａｌｉｃｅら）に記載されており、本明細書ではこれを参照することにより取り入れることとする。同等の特性を有するものであれば、抗体分子全体の代わりに抗体フラグメントを使用することもできる。
【００４５】
ＰＣＲにおいて本明細書に記載したＰＣＲ試薬を適当な濃度で提供し使用することで標的核酸を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼの最少量は一般に溶液１００μｌにつき約１単位以上であるが、好ましくは約４〜約２５単位／１００μｌとする。ここで「単位」とは、７４℃において伸長する核酸中に３０分間で１０ナノモルの全ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を導入するのに必要な酵素活性量として定義される。各プライマーの濃度は約０．０７５μモル以上であるが、約０．２〜約１μモルとすることが好ましい。ほとんどの場合、どのプライマーもほぼ同じ量で存在する（変動は各々１０％以内）。しかしながら、場合によっては個々のプライマーの量を変更することで複数の標的を最も効率よく同時増幅させることができる。一般に、反応混合物中には、コファクターは約１〜約１５ミリモルの量で存在し、また各ｄＮＴＰは約０．１〜約３．５ミリモルで存在する。このパラグラフ中の用語「約」は、示した値には±１０％の変動が含まれることを意味する。
【００４６】
ＰＣＲ試薬は、個別に供給するか、或いは適当な何らかの緩衝液を用いてｐＨを約７〜約９にした緩衝化溶液として供給することができる。
増幅し検出すべき標的核酸は二本鎖であることが普通であるため、この二本鎖を分離（すなわち、変性）しなければプライミングは起こらない。この分離は抽出工程中に起こりうるが、後の別工程において行う方が好ましい。適当な温度（本明細書中では「第一温度」又はＴ1 とする）へ加熱する方法が、変性の好ましい方法である。一般に、この第一温度は約８５〜約１００℃の範囲にあり、好適な時間は、例えば１〜約２４０秒（好ましくは１〜約４０秒）である。この最初の変性工程は、第一の増幅サイクルに含めることもできる。このような場合には、第一サイクルにおける変性はより長く（例、最長で２４０秒）する一方、以降のサイクルにおける変性ははるかに短く（例、最長で３０秒）することがある。
【００４７】
次いで、その反応混合物を、一般に約５５〜約７５℃の範囲内の第二温度（Ｔ2 ）まで冷却することによって、変性鎖に適当なプライマーをプライムさせる。冷却はできるだけ迅速に行うことが望まれるが、現在知られている装置では、一般に約５〜約４０秒、より好ましくは約５〜約２０秒の時間がかかる。
【００４８】
変性鎖を冷却したら、ＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を第三温度（Ｔ3 ）で一般に１〜約１２０秒、好ましくは１〜約８０秒の間インキュベートし、プライマー伸長生成物を形成させる。一般に、第三温度は約５５〜約７５℃の範囲にある。第三温度は約６２〜約７０℃の範囲にあることが好ましい。
最も好ましい実施態様では、第二温度と第三温度を同じにし、約６２〜約７０℃の範囲内にする。こうして、プライミングとプライマー伸長を同じ工程で実施することが好ましい。
【００４９】
このように、増幅サイクルは、上記の変性工程、プライミング（又はアニーリング）工程及びプライマー伸長工程を含む。一般に、本発明を実施する際にはこのような増幅サイクルを少なくとも１５回行うが、サイクルの上限回数は特定のユーザーが決める問題である。ほとんどの場合、本発明の方法では１５〜５０回の増幅サイクルが行われ、中でも１５〜４０回が好ましい。各増幅サイクルは一般に約２０〜約３６０秒間であるが、約３０〜約１２０秒間が好ましく、さらに約３０〜約９０秒間がより好ましい。しかしながら、所望であれば上記サイクル時間よりも短時間又は長時間を採用することもできる。
【００５０】
増幅法における特定の工程の時間に対して用いられる「約」は、その時間限界値に±１０％の幅があることを意味する。さらに、温度に対して用いられる「約」は±５℃の幅があることを意味する。
【００５１】
本発明の増幅法を、自動化された連続法で実施することにより、反応混合物に所望の回数の温度サイクルをかけることが好ましい。当業者であれば周知であるように、こうした目的の装置がいくつか開発されている。また、用いる装置は、所望のいかなるタイプの増幅サイクルに対してもプログラム可能であることが好ましい。
【００５２】
この目的に対する装置の一種が米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書及び欧州特許出願第０  ２３６  ０６９号明細書に詳しく記載されている。一般に、この装置には、反応混合物を含有するいくつかの反応管を保持するための熱伝導性容器と、加熱、冷却及び温度維持のための手段と、増幅序列、温度変化及びタイミングを制御するための信号を発生する計算手段とが含まれる。
【００５３】
欧州特許出願第０  ４０２  ９９４号明細書は、米国特許出願第５，０８９，２３３号明細書（Ｄｅｖａｎｅｙ，Ｊｒ．ら）に記載の装置を用いて処理することができる有用な化学試験パックについて詳述している。本明細書ではこれらの明細書を参照することにより取り入れることとする。それらの中にはまた、本発明の方法に適した反復されたインターバルで（すなわち、サイクルによって）試験パックを加熱、冷却するための手段についても記載されている。有用なＰＣＲ処理装置に関するさらなる詳細は、当該技術分野における相当数の文献から得ることができ、当業者であれば容易に知ることができる。
【００５４】
上記の化学試験パックの他、本発明の方法は、米国特許出願第４，９０２，６２４号明細書（Ｃｏｌｕｍｂｕｓら）、同第５，１７３，２６０号明細書（Ｚａｎｄｅｒら）及び同第５，２２９，２９７号明細書（Ｓｃｈｎｉｐｅｌｓｋｙら）に詳細に記載されているような別の容器で実施することもできる。本明細書ではこれら明細書を参照することにより取り入れることとする。また、当業者であれば容易に想到できる他の適当ないずれの容器でも本発明の方法を実施することができる。このような試験パックはまた、本発明の方法で用いられる各種試薬のために区分された区分室を有する自蔵式(self-contained)試験装置としても知られている。これらの区分室は、装置を開放しなくても適当な時間に試薬及びアッセイ溶液を捕捉試薬と接触させることができるように適当に連絡されている。
【００５５】
増幅生成物の検出は、米国特許出願第４，９６５，１８８号明細書（上記）に記載されているサザンブロッティング法をはじめとする既知のいずれかの方法によって、或いは当該技術分野で知られている標識プローブ又はプライマーを利用することによって、行うことができる。
上記の態様の別法として、プライマー伸長生成物の一方に相補的である標識オリゴヌクレオチドを用いて増幅生成物を検出することもできる。
【００５６】
本発明の不均一検出システムでは、増幅生成物をある種の水不溶性担体表面に捕捉し、反応混合物中のその他の物質は適当な方法、例えば濾過法、遠心分離法、洗浄法又は他の分離技法によって除去される。
既知の結合技法（吸収反応や共有反応を含む）を採用して水不溶性担体に捕捉プローブを結合させることができる。このような技法の一つが欧州特許出願０  ４３９  ２２２号明細書（１９９１年９月１８日発行）に記載されている。その他の技法が、例えば、米国特許出願第４，７１３，３２６号（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら）、同第４，９１４，２１０号（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら）及び欧州特許第００７０  ６８７号（１９８３年１月２６日発行）明細書に記載されている。有用な分離手段として、Ｐａｌｌ社より市販されているポリアミド微孔質メンブレンのような膜による濾過手段が含まれる。
【００５７】
しかしながら、捕捉プローブや最終的にはハイブリダイゼーション生成物を係留するためには、マイクロタイタープレート、試験管、ビーカー、磁性粒子やポリマー粒子、金属、セラミックス、ガラスウール、等をはじめとする有用ないずれの固体支持体でも使用することができる。特に有用な材料は、捕捉プローブを共有結合させるのに有用な反応性基を有するポリマー粒子又は磁性粒子である。このような粒子は一般に約０．００１〜約１０μｍである。このような材料の例についてのさらなる詳細は、米国特許出願第４，９９７，７７２号（Ｓｕｔｔｏｎら）、同第５，１４７，７７７号（Ｓｕｔｔｏｎら）、同第５，１５５，１６６号（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎら）及び同第４，７９５，６９８号（Ｏｗｅｎら）明細書に記載されており、本明細書ではこれらを参照することにより取り入れることとする。
【００５８】
捕捉プローブは、ポリマーフィルム、メンブレン、濾紙、又は樹脂被覆紙若しくは未被覆紙のような平らな担体に結合させてもよい。ポリマー粒子に結合させた捕捉プローブを、このような平らな担体上に適当な方法、例えば乾燥付着法、加熱融合付着法又は接着法で固定化することもできる。捕捉プローブは、例えば、本発明の自蔵式試験装置において平らな担体に結合させることができる。このような材料の詳細については、欧州特許出願第０  ４０８  ７３８号（１９９１年１月２３日発行）、国際特許出願第ＷＯ９２／１６６５９号（１９９２年１０月１日発行）及び米国特許出願第５，１７３，２６０号（Ｓｕｔｔｏｎら）明細書に記載されている。
捕捉プローブは、適当な担体表面で、丸い付着物が列をなした形や縞模様など、いずれの形状で配置されてもよい。
【００５９】
本発明はまた、「均一」増幅法としてしられている、捕捉試薬を使用せずに標的核酸を検出する手法にも適用することができる。このようなアッセイの詳細は、欧州特許出願０  ４８７  ２１８号（１９９２年５月２７日発行）及び同第０５１２  ３３４号（１９９２年１１月１１日発行）に記載されているように、当該技術分野では周知である。
【００６０】
この増幅反応組成物は、各種増幅アッセイに有用な試験キットの個別に包装される成分の一つとして含まれることができる。このキットは、水不溶性担体表面に固定化された捕捉試薬、洗浄液、溶解液、検出試薬及びその他当業者であれば容易に想到できる材料をはじめとする、本発明の方法に有用な他の試薬、溶液、装置及び使用説明書を含むことができる。さらに、この試験キットは、上記の別々に包装されたポリエチレンイミン、１種以上のアニオン性リン酸エステル系界面活性剤、緩衝剤、強塩基並びにその他増幅及び被検体試料調製の一方又は両方に必要な試薬を含むことができる。この試験キットは、１種以上の他のキット部材を含有する試験装置を含むこともできる。この試験装置は、当該技術分野で認識されている「自蔵式」であることが好ましい。ハイブリダイゼーションアッセイに有用な、例えば標的核酸の検出捕捉プローブを含有する、別の試験キットを組み立てることもできる。
【００６１】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の実施を例示するためのものであって、本発明を限定するものではまったくない。特に断らない限り、パーセントは重量を基準としたものである。
実施例のための材料と方法：
サーマス・アクアティカス (Thermus aquaticus)の組換えＤＮＡポリメラーゼを常用の方法で調製した。
【００６２】
ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ（商標）８７００型ＤＮＡ合成機と標準的なホスホルアミダイト化学法による既知の出発材料と手順によって、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＤＮＡの主カプシドタンパク質領域に相補的である以下の配列を有するプライマー及びプローブを調製した。
配列番号：１：  ５′-X-CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT- ３′
配列番号：２：  ５′-X-TGAGG TCGTG GAACT TGATG GCGT-３′
配列番号：３：  ５′-GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT-Y-３′
【００６３】
プライマー用の最初の二つの配列において、Ｘは、本明細書中に参照することにより取り入れる米国特許出願第４，９１４，２１０号明細書（Ｌｅｖｅｎｓｏｎら）の教示によって二つのテトラエチレングリコールスペーサー単位を介して上記配列に結合されたビオチン部分を表す。精製はすべて核酸精製カラムに続いて逆相ＨＰＬＣを用いて実施した。
３番目の配列は捕捉プローブとして使用した。ここでＹは、上記Ｌｅｖｅｎｓｏｎらの特許明細書に記載の手順によって調製された３−アミノ−１，２−プロパンジオール部分とリン酸エステル結合によって結合された二つのテトラエチレングリコールスペーサーを含有する。
【００６４】
デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と子ウシ胸腺ＤＮＡはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手した。
上記ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体は米国特許出願第５，３３８，６７１号明細書（上記）の記載に従い調製した。一般に、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，ｐｐ．４９５−４９７，１９７５に記載されているような常用の手法でＤＮＡポリメラーゼで免疫化したマウスの免疫細胞とハイブリドーマ細胞系統（ＡＴＣＣ由来のＨＢ１１１２６又は１１１２７）とからモノクローナル抗体を調製し、よってホスト動物の抗体分泌細胞をリンパ様組織（例、脾臓）から単離し、そしてポリエチレングリコール存在下でＳＰ２／０−Ａｇ１４ネズミミエローマ細胞と融合し、選択培地中で希釈し、そしてマルチウェルの組織培養皿に植え付けた。約７〜１４日後、抗体を含有するハイブリドーマ細胞が得られ、これを常用の技法で精製した。
【００６５】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体溶液は、市販のストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼとの複合体（Zymed Laboratories社）(126μL/L)、4'−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル）、カゼイン(0.5％) 及びメルチオレート(0.5％) を含むものとした。
【００６６】
洗浄液(pH 7.4)は、リン酸ナトリウム、一塩基性一水和物(25 ミリモル）、塩化ナトリウム(373ミリモル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩(2.5ミリモル）、エチル水銀チオサリチル酸、ナトリウム塩 (25マイクロモル）及びデシル硫酸ナトリウム（38ミリモル）を含むものとした。
【００６７】
色素提供性組成物(pH 6.8)は、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾール系ロイコ色素(250マイクロモル）、ポリビニルピロリドン(112ミリモル）、過酸化水素(0.03 ％) 、  ジエチレントリアミン五酢酸(100マイクロモル）、３’−クロロ−４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル）及びリン酸ナトリウム、一塩基性一水和物（10ミリモル）を含むものとした。
【００６８】
色素信号停止水溶液は０．１％アジ化ナトリウムを含有するものとした。
捕捉プローブ試薬は、以下の方法で、上記配列番号：３のオリゴヌクレオチドをポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比95:5、平均直径１μｍ）の粒子に結合させて調製した。粒子を水に懸濁させた懸濁液を、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液(0.1モル，pH６）で２回洗浄し、そして固形分が約10％となるように懸濁させた。洗浄した粒子の試料(3.3mL）を希釈して、緩衝液中固形分が3.33％(0.1モル）となるようにし、それを１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（2.1mL, 84mg/mL, 水で調製）及び適当なプローブ（22μＬ、44.44 OD/mL 、ナノ純水で調製）と混合させた。得られた懸濁液を水浴中50℃で約２時間断続的に混合しながら加熱し、そして遠心分離した。次いで、（エチレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.001 モル）を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（0.01モル，pH８）で粒子を３回洗浄し、そしてそれに再懸濁して固形分４％となるようにした。
【００６９】
ＰＣＲ反応混合物は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１０ミリモル）、塩化カリウム（５０ミリモル）、塩化マグネシウム（１０ミリモル）、ゼラチン（１００μｇ／ｍｌ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各１ミリモル）、グリセロール（９．５％）、プライマー（各０．４μモル）、上記のＤＮＡポリメラーゼ（１６単位／１００μＬ）及び上記ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比５０：１）を含むものとした。
【００７０】
ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）試験装置はイーストマン・コダック社（クリニカル・ダイアグノスティックス部門）から入手され、３個の試験ウェルを含有し、その各々にＬＯＰＲＯＤＹＮＥ（商標）微孔質膜（Ｐａｌｌ社、平均孔径５μｍ）が搭載されているものとした。この試験装置の試験ウェル内の膜上に捕捉プローブ試薬を配置して乾燥させた。
ＤＥＱＵＥＳＴ（商標）２００６アニオン性アミノトリ（メチレンリン酸）五ナトリウム塩界面活性剤はＭｏｎｓａｎｔｏ社から入手した。
【００７１】
ＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン性フッ素化リン酸エステル界面活性剤はＤｕＰｏｎｔ社から入手した。
ＭＯＮＡＷＥＴ（商標）Ｂ−１７４アニオン性ジオクチルホスホコハク酸ナトリウム界面活性剤はＭｏｎａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から入手した。
ＲＨＯＤＡＦＡＣ（商標）Ｌ０５２９アニオン性芳香族アルキレンオキシドリン酸エステル部分ナトリウム塩界面活性剤はＲｈｏｎｅ  Ｐｏｕｌｅｎｃ社から入手した。
【００７２】
ＥＭＰＨＯＳ（商標）ＣＳ４１３アニオン性オキシアルキル化アルキルリン酸エステル界面活性剤及びＥＭＰＨＯＳ（商標）ＣＳ１４１アニオン性ポリオキシアルキル化アルキルアリールリン酸エステルは、Ｗｉｔｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手した。
ポリエチレンイミンはＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した（ＢＡＳＦ社からも入手可能）。
その他の試薬及び材料は、市販品を入手したか、又は容易に入手できる出発原料と常用の手法によって調製した。
【００７３】
実施例１：ＤＮＡの捕捉及び解放
この実施例は、ポリエチレンイミンとアニオン性フッ素化リン酸エステル界面活性剤とを用いて核酸を捕捉、解放する本発明の実施を説明するものである。
蒸留水中に希釈度１：１０で１０％ポリエチレンイミンが含まれている試料（５μｌ）を子ウシ胸腺ＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ）の溶液（９５μｌ）とボルテックスで混合した。次いで得られた混合物を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＤＮＡとポリエチレンイミンの複合体の沈殿物をペレット状にした。
【００７４】
上澄液を棄てて、そのペレットが含まれている容器に水酸化ナトリウム（７５μｌ、５０ミリモル）を添加した後、ボルテックスで混合した。得られたｐＨは約１１であった。
このｐＨの高い混合物にアニオン界面活性剤の溶液（最終濃度０．５％、０．２５％又は０．１２５％のもの１０μｌ）〔表１を参照のこと〕を添加し、そしてボルテックスで混合した。次いで、得られた溶液を１５μｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝剤（１モル）を添加することによって中和してｐＨを約８とした。
【００７５】
核酸の解放は常用のゲル電気泳動法で確認した。得られた核酸と、ポリエチレンイミンと、界面活性剤とを含有する溶液のアリコート（５μｌ）を微小遠沈管中で常用の試料トラッキング色素と混合した。次いで、エチジウムブロミドで予め染色しておいた常用の０．５％アガロースゲル中に試料（４μｌ）を装填し、そして１２０ボルトで３０分間電気泳動した。ゲルバンドは紫外線下で可視化した。常用のラムダＤＮＡマーカーと同様に移動したゲノムＤＮＡバンドの存在は、核酸がポリエチレンイミンから解放されたことを示すものである。
上記試料調製法がＰＣＲによる増幅を阻害することがあるかどうかを調べるため、上記のように調製された中和済試料の各々にヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＤＮＡを添加し、下記のＰＣＲプロトコールに供した。
【００７６】
より詳細には、アニオン界面活性剤と解放された子ウシ胸腺ＤＮＡとを含有する各中和済試料のアリコート（２０μｌ）を、ｈＣＭＶゲノムの主カプシドタンパク質領域由来のｈＣＭＶ標的核酸の溶液（１０μｌ）〔１〜５×１０5 コピー／μｌを含有する原液の１：１０希釈物）と混合した。各試料の第二アリコート（２０μｌ）を標的核酸の１：１００希釈物と混合した。
得られた混合物（３０μｌ）の各々に上記のＰＣＲ増幅反応混合物（７０μｌ）を添加し、そして以下のプロトコールに従い４０サイクルの増幅を実施した：１）９５℃で３０秒間（第一サイクルについては２１０秒間）の変性を行い、２）６４℃で３０秒間のプライマーアニーリング及びプライマー伸長をした。
【００７７】
増幅後、以下の２種の方法によって増幅ｈＣＭＶ  ＤＮＡの存在を検出した。（ａ）ゲル電気泳動：各増幅生成物溶液のアリコート（１０μｌ）を４μｌの常用の試料トラッキング色素に加えた。得られた混合物（１０μｌ）を、エチジウムブロミドで予め染色しておいた２．５％アガロースゲル上に装填した。電気泳動は１２０ボルトで１．５時間実施した。ゲルバンドは紫外線下で可視化した。（ｂ）ＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）試験装置での色素信号：各増幅生成物試料の１：２０希釈物を９５℃で５分間加熱して増幅生成物を変性させ、そしてＳＵＲＥＣＥＬＬ（商標）試験装置の試験ウェルの膜上に乾燥させておいた捕捉試薬と接触させた。次いで、装置を５０℃で５分間インキュベートし、そして室温において上記の洗浄液で洗浄し、結合されなかった物質を除去した。
【００７８】
ストレプトアビジン複合化西洋ワサビペルオキシダーゼ（１３１ｎｇ／ｍｌ）の溶液（１００μｌ）を各試験ウェルに添加した後、室温で２分間のインキュベーションを施した。さらに洗浄を行った後、上記のロイコ色素溶液（１００μｌ）を添加し、室温でさらに２分間のインキュベーションを施した。アジ化ナトリウム溶液を添加することにより発色を停止させた。
以下の表１は、数種類のアニオン界面活性剤を各種量で使用して得られたいくつかの被検体についてのゲル電気泳動と色素の色評点の結果を示すものである。明らかなことは、ＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤が標的核酸の最強の信号を提供すると共に、ＰＣＲを妨害しなかったことである。色素の色評点は０〜１０（最高濃度）の濃度勾配で等級化した。電気泳動ゲルの評点は陰性（−）、若干陽性（ｗ＋）、明確に陽性（＋）及び非常に陽性（＋＋）とした。
【００７９】
ポリエチレンイミン又は界面活性剤を使用しない増幅についてもいくつか実施した。これらのアッセイ結果は表１の最後の４行に記載した。最後の２行は、界面活性剤もポリエチレンイミンも使用しなかった場合の結果を示している。信号は高い値を示しているが、これらのデータは干渉因子又はインヒビターのまったくない「きれいな」試料から得られたものであることを理解しなければならない。臨床試料では、インヒビターや干渉因子がこうした信号を低減させたり増幅を妨害したりする場合が多い。従って、本発明の目的は、このような悪影響を及ぼす物質から標的核酸を分離する方法を提供することであって、表１の結果は、本発明に従いポリエチレンイミンとフッ素化界面活性剤を使用するとこの目的が達成されることを例示している。
【００８０】
図１は、２種の好ましい界面活性剤であるＥＭＰＨＯＳ（商標）ＣＳ４１３及びＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤それぞれの各濃度レベルに対する色素の色評点を棒グラフで示したものである。ｈＣＭＶ  ＤＮＡレベルは１：１０（レベル１）及び１：１００（レベル２）とした。対照データはどちらの界面活性剤も含まれない場合のものである。
【００８１】
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0003727692.tif 000003
【００８２】
実施例２：ヒトサイトメガロウイルスＤＮＡの試料調製及び増幅
この実施例は、バックグラウンドのＤＮＡ（すなわち、子ウシ胸腺ＤＮＡ）の存在下で増幅するためにｈＣＭＶ  ＤＮＡを捕捉、解放する本発明の実施を説明するものである。
ｈＣＭＶ希釈物の試料（１０μｌ）を子ウシ胸腺ＤＮＡ（９５μｌ、０．５μｇ／μｌ）と混合した後、ポリエチレンイミン（１０％）の１：１０希釈物を混合してポリエチレンイミンと核酸との析出物を形成させた。
【００８３】
この析出物を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して溶液から分離した。上澄液を棄てて、そのペレットに水酸化ナトリウム（７５μｌ、５０ミリモル）を加えて混合した。
【００８４】
次いで、そのｐＨの高い混合物にＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤の溶液（最終濃度１．５％、１．０％、０．５％、０．２５％又は０．１２５％）（１０μｌ）を混合しながら加えた。次いで、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（１５μｌ、１モル、ｐＨ７．５）を加えて溶液を増幅のために中和した。
上記のように処理した各試料のアリコート（２０μｌ）を、上記のｈＣＭＶプライマーを含有するＰＣＲ試薬混合物（８０μｌ）に加え、そして実施例１に記載したプロトコールによって４０サイクルのＰＣＲを実施した。
【００８５】
増幅生成物の検出は、実施例１に記載したようにゲル電気泳動と色素の色発信により行った。以下の表２は、各試料につき２回の繰り返し試験を行った結果を示し、また図２は色評点データを棒グラフで示したものである。
１．５％（最終濃度）の界面活性剤を用いた場合には、どのレベルの標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡについてもＰＣＲが阻害された。さらに、より低濃度である０．１２５％及び０．２５％は、高いバックグラウンドが認められたため有用ではなかった。０．５％又は１．０％を採用すると最適な結果が得られ、また標的核酸濃度が低いほど、より少量である方が有用であった。界面活性剤が使用されていない対照アッセイではＰＣＲが観測されなかった。ポリエチレンイミンも界面活性剤も使用されていない場合に信号が得られているが、これらのデータは、臨床用被検体には通常存在する干渉因子やインヒビターを含まない「きれいな」試料で得られたものである。
【００８６】
図２には、好ましい界面活性剤のＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤について各種標的核酸レベルにおける色素の色評点が示されている。対照アッセイではポリエチレンイミンも界面活性剤も用いられていない。図２及び以下の表２に記載のｈＣＭＶ濃度レベルは以下のとおりである。
レベル１：原液の１：１０希釈物
レベル２：原液の１：１００希釈物
レベル３：原液の１：１０００希釈物
レベル４：原液の１：１００００希釈物
レベル５：原液の１：１０００００希釈物
レベル６：原液の１：１００００００希釈物
レベル７：ｈＣＭＶ  ＤＮＡを含まない
【００８７】
0003727692.tif 000004
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【００８８】
実施例３：バックグラウンドＤＮＡ不在下での標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡの捕捉及び解放並びに増幅
この実施例は実施例２と全く同様に実施したものであるが、但し、ｈＣＭＶ  ＤＮＡ希釈試料は、子ウシ胸腺ＤＮＡ溶液の代わりに、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（１０ミリモル、ｐＨ８）とＴＷＥＥＮ（商標）２０非イオン性界面活性剤（０．５％）を含有する緩衝液（９５μｌ）と混合した。
【００８９】
捕捉、解放された標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡの増幅と検出は、上記と同様に行った。結果を図３及び以下の表３に示す。表示の標的核酸レベルは先の実施例２で記載したものと同じである。
これらの結果は、１．５％の界面活性剤を使用した場合は、界面活性剤が存在しない場合と同様にＰＣＲを阻害したことを示している。ほとんどのアッセイで多少のバックグラウンドが認められたが、そのレベルは一般には許容できるものであった。
【００９０】
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【００９１】
実施例４：各種量のバックグラウンドＤＮＡの存在下でのｈＣＭＶ  ＤＮＡの捕捉、解放及び増幅
この実施例は、試験試料中に様々な量のバックグラウンド子ウシ胸腺ＤＮＡが存在する場合の本発明の実施を説明するものである。この手順は実施例２と全く同様に実施したものであるが、但し、標的核酸希釈試料は、各種量（最終量で５５μｇ、２５μｇ、１０μｇ又は５μｇ）の子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する溶液（９５μｌ）と混合した。
増幅と検出は実施例２に記載したように実施した（但し、ゲル電気泳動は採用しなかった）。色素の色評点の結果を以下の表４に記載する。これらの結果は、試料中に存在するバックグラウンドＤＮＡの全レベル範囲にわたり最適に増幅できるように核酸を可溶化して保たせるのに十分な最終界面活性剤濃度が０．５％であったことを示している。界面活性剤をより少ない量で使用した場合の結果は高いバックグラウンドを示したが、この条件を調節するか又は別の界面活性剤を使用することでこの影響を最小限に抑えることができるであろう。
【００９２】
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【００９３】
実施例５：患者試料中の標的ｈＣＭＶ  ＤＮＡの捕捉及び解放並びに増幅
この実施例は、医療センターから入手した９個のｈＣＭＶ培養陽性と３個のｈＣＭＶ培養陰性の尿検体を用いての本発明の実施を説明するものである。この実施例はまた、本発明を、通常用いられている試料調製法、すなわち非イオン性界面活性剤存在下で試料を１００℃に１０分間加熱する方法、と比較する。
各尿検体の二つのアリコート（各１５０μｌ）を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（１０ミリモル、ｐＨ８）にＴＷＥＥＮ（商標）２０非イオン性界面活性剤（０．５％）を含有する緩衝液と混合した。
【００９４】
これらの混合物をそれぞれ１０分間煮沸した。被検体組の一方に１０％ポリエチレンイミン溶液の１：１０希釈物を加えて混合し、核酸とポリエチレンイミンの析出物を形成させた。得られた懸濁液を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄液を棄てて、水酸化ナトリウム（７５μｌ、５０ミリモル）を各ペレットに加えた後に混合した。このｐＨの高い懸濁液にＺＯＮＹＬ（商標）ＦＳＰアニオン界面活性剤の溶液（最終濃度０．５％）（１０μｌ）を加えた後、ボルテックスで混合した。この懸濁液を中和するためにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１５μｌ、１モル、ｐＨ７．５）を添加した。
第二の被検体組にはさらなる処理を施さなかった。
【００９５】
（処理済被検体の両方の組の）各溶液のアリコート（２０μｌ）を、上記のｈＣＭＶ  ＤＮＡプライマーを含有するＰＣＲ反応混合物（８０μｌ）に加えた。実施例１に記載したように４０サイクルのＰＣＲを実施した。そして上記のように色素の色信号（評点）を発生させてすべての増幅生成物を検出した。
図４及び以下の表４は、両方の方法の結果を培養結果との比較で示すものである。この実施例では、培養結果と比較した場合に、８９％の感度（すなわち、培養陽性被検体９個のうち８個）及び１００％の特異性（すなわち、培養陰性被検体３個のうち３個）が示された。対照の試料調製法（非イオン性界面活性剤を用いて加熱する方法）では、培養結果と比較した場合に、３３％の感度（すなわち、培養陽性被検体９個のうち３個）及び１００％の特異性（すなわち、培養陰性被検体３個のうち３個）が示された。
【００９６】
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【００９７】
この実施例は、臨床被検体中に存在しうるインヒビターから標的核酸を分離する利点を例示するものである。当該技術分野には同じ結果を達成しうる別の方法もあるが、それは退屈で、時間がかかり、また環境的にも安全ではない方法である。
本発明をその好ましい実施態様を特に参照しながら詳細に説明したが、本発明の精神及び範囲内で改変、変更が可能であることを理解されたい。
【００９８】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド（hCMV DNAのプライマー）
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源：合成
直接の起源：合成
刊行物情報：無し
配列
CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT  27
【００９９】
配列番号：２
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド（hCMV DNAのプライマー）
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源：合成
直接の起源：合成
刊行物情報：無し
配列
TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT  24
【０１００】
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成オリゴヌクレオチド（hCMV DNAの捕捉プローブ）
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
起源：合成
直接の起源：合成
刊行物情報：無し
配列
GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT  30
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたデータの一部を示した棒グラフである。
【図２】実施例２で得られたデータの一部を示した棒グラフである。
【図３】実施例３で得られたデータの一部を示した棒グラフである。
【図４】実施例５で得られたデータの一部を示した棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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