(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非感染性単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）プレ−ウイルスＤＮＡ複製包膜粒子（ＰＲＥＰＳ）を含む組成物であって、当該粒子は（ａ）ウイルスキャプシドを欠き；（ｂ）ウイルスＤＮＡを欠き；（ｃ）ＨＳＶ−１  Ｌ粒子と比較して、タンパク質２７３Ｋ（ＶＰ１−２）、８２／８１Ｋ（ＶＰ１３／１４）、５７Ｋ（ＶＰ１７、ｇＤ）、および４０Ｋの量が少なく；（ｄ）ＨＳＶ−１  Ｌ粒子と比較して、タンパク質１７５Ｋ（ＶＰ４、ＩＥ３）、９２／９１Ｋ（ＶＰ１１／１２）、および３８Ｋ（ＶＰ２２）の量が多いことを特徴とする組成物。
【請求項２】
更に感染性ＨＳＶ−１ビリオンを含み、ＰＲＥＰＳの感染性ビリオンに対する数量比が少なくとも１０7：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＰＲＥＰＳが、ＰＲＥＰ粒子が由来するウイルス株に固有のものではない外部タンパク質またはペプチドを組み込んでいる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物を調製する方法であって、宿主細胞をＨＳＶ−１で感染して培養物を形成し、該培養物にＨＳＶ−１ウイルス複製を抑止するのに有効な量の、ＤＮＡ合成の化学的インヒビターを添加し、該培養物から前記ＰＲＥＰＳを回収することを包含する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を調製する方法であって、宿主細胞の培養物にウイルスＤＮＡ合成を抑止するのに有効な様にＨＳＶ−１の複製欠陥性ＵＬ８突然変異株を感染させ、該培養物から前記ＰＲＥＰＳを回収することを包含する方法。
【請求項６】
タンパク質２７３Ｋ（ＶＰ１−２）、８２／８１Ｋ（ＶＰ１３／１４）、５７Ｋ（ＶＰ１７、ｇＤ）、および４０Ｋをコードする少なくとも１つのＨＳＶ−１遺伝子が、初期転写のためのプロモーターのコントロール下におかれ、そのため正常なプロモーターのコントロール下にある場合よりも多くの当該タンパク質をＰＲＥＰＳ中に産生する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞に感染するＨＳＶ−１が、そのＨＳＶ−１の株に固有でない、少なくとも１つの発現可能遺伝子を含む請求項４、５または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明はワクチン注射において好適に使用されるヘルペスウイルス粒子の１形態、そのような粒子の調製法、ならびにそれらを含むワクチンに関する。
２．関連技術の説明
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ライト粒子（Ｌ−粒子）は、非感染性のウイルス関連粒子で、ＢＨＫ細胞内のウイルス複製サイクルの全期間を通して、ビリオンとほぼ同数が産生されるものである（ジラギー[Szilagyi]およびカニンガム[Cunningham]、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２、６６１〜６６８；リクソン[Rixon]ら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２７７〜２８４）。同様のＬ粒子が、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）；ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）（マクロークラン［McLauchlan］およびリクソン、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２６９〜２７６）；ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）（ダーガン[Dargan]およびスバック−シャープ[Subak-Sharpe]、未刊）およびＨＳＶ−２（マクリーン[MacLean]、未刊）から単離されている。Ｌ粒子は非感染性という特性を有することから、ワクチン材料の候補として有望である（国際出願公開第９２／１９７４８号）。
ＨＳＶ−１、ＰＲＶおよびＥＨＶ−１のＬ粒子のタンパク質組成とビリオンとの比較分析によって、Ｌ粒子中にはほとんどまたはすべてのビリオンテグメント（外皮）およびエンベロープタンパク質が存在するが、ヌクレオキャプシドタンパク質（核酸−タンパク質複合体）は存在しないことが判明している。ＨＳＶ−１ビリオン中には検出されない５種類のリンタンパク質は、ＨＳＶ−１  Ｌ粒子に関係したものである（ジラギーおよびカニンガム、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２、６６１〜６６８；マクロークランおよびリクソン、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２６９〜２７６）。
ＨＳＶ−１  Ｌ粒子は標的細胞に機能性テグメントタンパク質を供給する点において、ビリオンと同じように効率的であることが示されている。したがって、Ｌ粒子は生物学的能力があり、ＨＳＶ−１感染の初期の段階に関与する可能性を有する（マクロークランら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９０、６８２〜６８８）。
遺伝子ＵＬ２６に突然変異を有するＨＳＶ−１ｔｓ（高温感受性）変異株（ｔｓ１２０１）（プレストン[Preston]ら、１９８３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４５、１０５６〜１０６４）を用いて、リクソンら（１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２７７〜２８４）はＬ粒子がビリオンの成熟とは無関係に産生されることを示した。非許容状態でｔｓ１２０１は感染性ビリオンを産生しなかったが、典型的な野生型ウイルスのＬ粒子と外見もタンパク質組成も同じＬ粒子を産生した。ウイルスＤＮＡは通常、非許容状態下でｔｓ１２０１に感染した細胞中で合成されるが、ビリオン中へのウイルスＤＮＡの組み込みは阻止される（プレストンら、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５、１０５６〜１０６４）。
Ｌ粒子は感染性ビリオンを実質的に含まない状態で調製することができ、ＨＳＶ−１  Ｌ粒子の典型的な調製品は、Ｌ粒子と感染性ビリオンの比率が３×１０3：１〜１×１０4：１であるが、この比率を改善するには問題がある。さらに、Ｌ粒子はその中にキャプシドおよびＤＮＡを含まないが、Ｌ粒子調製品にはそれでも混入ビリオンの中および／またはおそらくフリー新生ウイルスＤＮＡの形で、いくらかのウイルスＤＮＡが存在する。Ｌ粒子調製品中に存在するそのようなＤＮＡの量を減らすことは、それらを含むワクチンについて、安全性監督当局をより容易に説得するために有利なこととなるであろう。
その他の先行技術については、その関連性が本発明の詳細な説明の中ではじめて明確なものとなってくるが、これについては“発明の要旨”の後で述べる。
発明の要旨
本発明者らは新しいタイプのヘルペスウイルス粒子を発見するに至ったが、この粒子を本明細書ではプレ−（ウイルスＤＮＡ複製）包膜粒子（ＰＲＥＰＳ）と呼ぶ。Ｌ粒子と同様、それらは非感染性である。これらの粒子はＰＲＥＰＳ：感染性ビリオンの高い比率、典型的にはＨＳＶ−１の場合にはその比率が６×１０5：１〜３．８×１０8：１でしばしば少なくとも１０7：１のものを高信頼度で調製することができる。基礎となる実験上の知見は、ＨＳＶ−１  ＰＲＥＰＳはウイルスＤＮＡの複製を薬剤（たとえば、アシクロビール[Acyclovir:ACV]；エリオンら、１９７７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、７４、５７１６；シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド[ara C]；（ウォード[Ward]およびスティーブンス[Stevens]、１９７５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５、７１〜８０）を使用するか、またはウイルスＤＮＡ合成欠陥のＨＳＶ−１突然変異体を使用することによって、ウイルス複製が阻止される条件下で産生することができることである。
以下に報告するデータは、ウイルスのＤＮＡ合成がない場合に、ＨＳＶ−１、ならびにＨＳＶ−２や仮性狂犬病ウイルスのようなその他のα−ヘルペスウイルス類は、感染細胞からＰＲＥＰＳを合成することができ、感染性ビリオンは合成しないことを示している。さらに、ＰＲＥＰＳ調製品は新生（＝新たに合成された）ウイルスＤＮＡを含まないものとすることができ、したがってワクチン１単位当りのウイルスＤＮＡの全体量を減らすことができるため、より安全なワクチンの製造が可能であるという利点がある。この研究結果によれば、ＰＲＥＰＳは、複製タンパク質のいずれかが欠損しているＨＳＶ−１変異株を使用するか、あるいはウイルスＤＮＡ合成またはウイルスＤＮＡ複製に必須のタンパク質に対するインヒビターで処理したＨＳＶ−１感染細胞培養によって製作することができることを示している。本発明は主としてＨＳＶ−１を取り上げて説明するが、この発明はヘルペスウイルス科のあらゆるウイルス、特にＬ粒子に関連して先に挙げたようなα−ヘルペスウイルス科のものに適用が可能な基本原理に関わる先駆的発明である。さらにＰＲＥＰＳにはリコンビナントＤＮＡ技法により外部タンパク質類を組み込むようにすることもできる。
本発明の重要な特徴は：（１）キャプシドおよびウイルスＤＮＡを含まないヘルペスウイルスの、ウイルス関連非感染性粒子であるヘルペスウイルスをベースとした、ビリオンを実質的に含まないウイルス調製品であって、それらは通常ウイルスＤＮＡの複製後だけに産生されるいわゆる真の後期タンパク質類の少なくとも１つを欠くかあるいは極く少量だけ（対応するＬ粒子との対比で少なく）含むが、その他のウイルスタンパク質の少なくとも１つを多量に（対応するＬ粒子との対比で多く）含むことを特徴とするプレ−（ウイルスＤＮＡ複製）粒子（ＰＲＥＰＳ）であって、さらに任意的特徴として、電子顕微鏡で観察した場合に、Ｌ粒子よりもエンベロープの糖タンパク質スパイクが少なく；且つ（２）ウイルス調製品を調製する方法が、ウイルスＤＮＡの複製を防止するのに効果的な条件下で宿主細胞をヘルペスウイルスで感作して、ウイルスタンパク質の合成およびＰＲＥＰの形成を行わせ、細胞または細胞外培地から、ビリオンを実質的に含まない、ウイルス関連の非感染性粒子を回収することを包含する点に存する。
追加の先行技術
極く最近、モリソン[Morrison]およびクナイプ[Knipe]、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、６８９〜６９６、は、ＨＳＶ−１に対する免疫感作を、マウスモデルでＨＳＶ−１の複製欠陥株の直接注入により実施した。検定によればこの突然変異ウイルス保存株は、突然変異ウイルス１０7ｐｆｕ当り１ｐｆｕ以下の野生型ウイルスを含むものである。この突然変異ウイルス調製品のウイルスＤＮＡ含有量は野生型ウイルスのそれと同等であった。しかしながらこれらの著者は、これらの突然変異ウイルス保存株をＰＲＥＰＳを製作するために使用すること、またはそのようなＰＲＥＰＳがそれらのタンパク質に対する免疫応答を作り出すために外部タンパク質を担持させることができるベクターとして使用できることは考慮していない。換言すれば、これらのウイルス保存株は補足細胞系を使用して製作され、かつそれらは本発明の方法で使用される開始接種材料に相当する段階にあるということができる。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）から１（ｄ）はすべてＨＳＶ−１の、野生型コントロール（１ａ）、ａｍｂ  ＵＬ８（１ｂ）、アシクロビール処理（１ｃ）、およびａｒａ  Ｃ処理調製品（１ｄ）を含んだ“フィコール[Ficoll]”の密度勾配を示すものである。ビリオン（Ｖ）、Ｌ粒子（Ｌ）およびＰＲＥＰＳに相当するバンドが示されている。
図２（ａ）および図２（ｂ）はそれぞれ、ＨＳＶ−１  Ｌ粒子およびＰＲＥＰ粒子の電子顕微鏡写真を示す。
図３は銀染色ゲルの写真で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはＨＳＶ−１のビリオン（Ｖ）、Ｌ粒子（Ｌ）およびＰＲＥＰＳ（Ｐ）のタンパク質プロフィルを示す。
好ましい実施態様の説明
本発明のウイルス調製品において、ＰＲＥＰＳと感染性ビリオンの数の比（プラーク形成ユニットと定義される）は、通常少なくとも７×１０6：１で、普通は少なくとも１×１０7：１である。ＰＲＥＰＳの数は電子顕微鏡により求めることができる。ｐｆｕ数は適当な細胞の単層上で増殖させたウイルスのプラーク検定により求めることができる。Ｌ粒子に比べてＰＲＥＰＳが大きな比率で発見されることの、少なくともその一因はＤＮＡ合成抑制のために、新しい感染性子孫がＰＲＥＰＳによって作られないからであろう（ＷＯ  ９２／１９７４８の小規模実験においてＬ粒子／ビリオン比が約１０6：１と記述されているが、これはＬ粒子／ｐｆｕ比率と対比できるものではない）。
粒子それ自体で見てみると、これらのＰＲＥＰＳは“真の後期[true late]”タンパク質が欠如またはその量が少ないという点で、Ｌ粒子とは異なる（ジョンソン[Johnson]ら、１９８６、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７、８７１〜８８３）。真の後期タンパク質はウイルス成長サイクルの遅い段階で作られ、オリジナルＤＮＡの新生コピーの転写によってできるものと考えられる。したがって、ＤＮＡ合成が抑制されると、真の後期タンパク質は作られないか、あるいは少量、即ち、対応するＬ粒子に存在するものよりも少ない量だけ作られることになる。“対応”Ｌ粒子とは同じ株の野生型ウイルスから（即ち、僅かな遺伝子的差異は無視して）得られるものである。
ＨＳＶ−１中の重要な真の後期タンパク質は、“８２／８１Ｋ”（ＶＰ１３／１４）（マクリーン[McLean]ら、１９９０、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１、２９５３〜２９６０）、２７３Ｋ（ＶＰ１−２）（マクナブ[McNabb]およびコートニー[Courtney]、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０、２２１〜２３２）およびｇＣ（ＶＰ８）（ピーク[Peake]ら、１９８２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４２、６７８〜６９０）である。これらの１つまたはそれ以上のタンパク質類が存在しないかまたはその量が少ないことは、ＨＳＶ−１のＰＲＥＰＳの際だった特徴として役に立つものであろう。一般に、ヘルペスウイルスの場合、Ｌ粒子に比べてＰＲＥＰＳ中の少なくとも１つ、通常は少なくとも２つの真の後期タンパク質が欠如しているか、または存在してもその量が少ないものと考えられる。
多くの目的において、真の後期タンパク質の欠如、またはその量が少ないことはＰＲＥＰＳをＬ粒子と区別するには十分である。しかしながら、この差異は単にＰＲＥＰＳによるウイルスＤＮＡの複製がないということを示しているだけである。もしウイルスゲノムが“初期”プロモーターのコントロールのもとで、１つまたはそれ以上の真の後期タンパク質をコードするように変えられた場合、ＰＲＥＰＳによる多量の真の後期タンパク質を含ませることができるようになる。すなわち、粒子形成の早い段階でｍＲＮＡ転写を起こさせるプロモーターを使用すれば、真の後期タンパク質を粒子のウイルステグメント中に産生させることができる。真の後期タンパク質を転写するための“初期”ウイルスプロモーターの使用については文献に記述されており、したがってこれは実施可能である。ＰＲＥＰＳに真の後期タンパク質を含ませるようにすることは可能であるので、それらの欠如、またはその量が少ないということはすべてのＰＲＥＰＳに特徴的なことではないことになる。しかしながら、他のある種のウイルスタンパク質が、Ｌ粒子に比べてＰＲＥＰＳ中に多量に存在するということも発見されている。ＨＳＶ−１においては、１７５Ｋ（ＶＰ４、ＩＥ３）、９２／９１Ｋ（ＶＰ１１／１２）および３８Ｋ（ＶＰ２２）タンパク質がそれである。一般的にヘルペスウイルスの場合、Ｌ粒子との比較において、少なくとも１つ、通常は少なくとも２つのウイルスタンパク質がＰＲＥＰＳ中に多量に産生されるものと考えられる。
本発明の調製法において、ヘルペスウイルスの開始接種材料にはＤＮＡが含まれていなければならない。なぜならば粒子構造（テグメントタンパク質、エンベロープタンパク質など）を製作するためのウイルスタンパク質の製造にはＤＮＡが必要とされるからである。したがって、ＰＲＥＰＳを合成するためにウイルスＤＮＡ複製陰性の変異株が使用される場合、細胞のウイルス処理を開始するために使用されるウイルス接種材料はそれ自体、ウイルスＤＮＡ合成の全機能を回復するために、突然変異機能を特異的に補完するある種のヘルパーを使用して作り出さねばならない。例えば、欠如している機能を発現する人工的な細胞、またはその機能を発現するヘルパーウイルスの使用である。
開始ヘルペスウイルスはＤＮＡ合成を防ぐためにいくつかの方法で不能化させることができる。これは、ウイルスＤＮＡ合成に必要なタンパク質をコードしたＤＮＡに、欠失、挿入、変異または停止信号を導入することによって簡単に行うことができる。例えば、ＨＳＶ−１ではＵＬ８タンパク質をコードしたＤＮＡを突然変異させるのが特に効果的である。ＵＬ８、ＵＬ５およびＵＬ５２タンパク質は合同して、ＤＮＡ−ヘリカーゼ−プリマーゼ活性に関連する複合体を形成する（クルート[Crute]ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、２１８６〜２１８９）。この特定の機能はＵＬ５およびＵＬ５２だけで供給されるものではあるが（カルダー[Calder]ら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、５３１〜５３８）、この複合体もＤＮＡ複製を可能とするために別の形での働きもし、その機能のためにＵＬ８が必須である。その他ＨＳＶ−１のＤＮＡ複製必須タンパク質であって不能化できるものを実施例３に列挙した。ＶＺＶまたはＥＨＶ−１に相当するそれぞれの遺伝子は、ＶＺＶ遺伝子５５、５２、５１、２９、２８．１６および６（ダビソン[Davison]およびスコット[Scott]、１９８６、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７、１７５９〜１８１６）、ならびにＥＨＶ−１遺伝子５７、５４、５３、３１、３０、１８および７（テルフォード[Telford]ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１８９、３０４〜３１６）である。その他のヘルペスウイルスのＤＮＡ複製必須タンパク質をコードする遺伝子は当業者には周知であるか、またはＨＳＶ−１、ＶＺＶおよびＥＨＶ−１で使用されるのと類似の方法により決定することができる。
開始ヘルペスウイルスを不能化するもう１つの方法は、アシクロビール、ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）またはシトシン−β−Ｄ−アラビノフラロシド（ａｒａＣ）のような特異的または一般的なＤＮＡ合成の化学的インヒビターにより、ＤＮＡの複製を阻止することである。それら個々の作用の形態は（エリオン[Elion]ら、１９７７、上記；マオ[Mao]ら、１９７５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５、１２８１〜１２８３ならびにマック[Mach]ら、１９７５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５、１２８１〜１２８３）に記載されている。
ＤＮＡ合成を不能化または干渉する別の形も工夫することができるが（例えば、遺伝子の転写関連プロモーターの除去または不活化）、本発明はそれらすべての形を包含する。基本的な要件は、宿主細胞がヘルペスウイルスビリオンで感染され、ウイルスＤＮＡ合成の抑止に効果的な条件下で粒子の合成が進められることである。例えば、阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ合成に必要とされるタンパク質またはタンパク質複合体に結合するペプチドインヒビター；あるいは複製に必須のタンパク質−タンパク質複合体またはタンパク質−核酸複合体の形成を阻止または破壊する薬剤とすることができる。
培養のプロセスにはウイルスで規定される産物が合成されるように、適当なインキュベーション期間が設けられる。インプットされたウイルスＤＮＡを転写することによって、エンベロープ、テグメントおよびその他種々のタンパク質が作成され、粒子アセンブリーの生成ひいてはＰＲＥＰＳが合成されることになるが、真の後期タンパク質は非常に少量（極微量）産生されるだけか、または全く産生されない。ＰＲＥＰ調製品に混入する感染性ビリオンの量をさらに減らすためには、細胞に吸着しているが中へは侵入していない開始接種材料中のビリオンを可能な限り完全に除去しなければならない。代わりに、あるいは付加的に、例えば、ローゼンタールら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９、９８０〜９８３に記述されているように、酸グリシン洗浄によってビリオンを不活化させることもできる。
ＰＲＥＰ調製品に対する免疫応答によって、ＰＲＥＰＳが由来するある型のヘルペスウイルスに対する防御が与えられることが考えられる。ＰＲＥＰＳはＰＲＥＰＳの関連タンパク質を与える株のヘルペスウイルス感染に対する防御を誘発するものと考えられるが、多くの場合これは間違いなく一血清型内の他の株、あるいは異なる血清型の株に対してさえも、ある程度の防御を与えることになる。
ここまで説明してきた本発明は、ＰＲＥＰＳ全体がヘルペスウイルスの成分で構成されたものに関するものであったが、無関係のウイルスまたは他の型のヘルペスウイルスあるいはその他の微生物から作り出される外部タンパク質またはエピトープ性のペプチドをＰＲＥＰＳに組み込む形で挿入された外部ＤＮＡを発現するリコンビナントヘルペスウイルスを製作することによって、より広範な防御を与えることもできる（“外部”という用語は、ここではＰＲＥＰＳが由来するヘルペスウイルスの株に固有のものではないものを意味する）。
外部ＤＮＡという意味が、単にＨＳＶの別の株または別の型に由来するものであるという意味で外部であるということから、ほとんどの場合外部ＤＮＡを含むリコンビナントＨＳＶが外部ＤＮＡを発現するのは難しくなく、したがってこのようにして産生されるタンパク質がＰＲＥＰＳ中に（例えば、エンベロープまたはテグメント中に）組み込まれることになる。外部タンパク質を発現するリコンビナントウイルスは標準手法を使用して、そのタンパク質の遺伝子を適当なＨＳＶ信号のコントロールのもとで、野生型ＨＳＶ−１ウイルスまたはＤＮＡ複製陰性のＨＳＶ−１いずれかのゲノム中に挿入することによって構築することができる（リクソンおよびマクロークラン、１９９３、「分子ウイルス学、実践的アプローチ」、ｐ．２８５〜３０７；ダビソン[Davison]Ａ．Ｊ．およびエリオット[Elliot]Ｒ．Ｍ．編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。外部遺伝子を含む野生型ウイルスは、ＤＮＡ複製インヒビターとともに使用（上記参照）するか、またはさらにＤＮＡ複製をしないようなものにまで改変することもできる。外部タンパク質を含むＰＲＥＰＳはまた、適当なヘルペスウイルス信号を含み、外部遺伝子を発現するように作られた細胞を、ＤＮＡ複製陰性のＨＳＶ−１で、またはＤＮＡ複製インヒビターの存在下で野生型ＨＳＶで処理することによって製作することもできる。
これらの細胞または特異的に構築されたＨＳＶ変異株相補性細胞系はワクチン用として適当なものとすることができ、また監督当局の承認を得ることができるものにすることができる。これらの例としては、例えばベビーハムスターの腎細胞である。相補性細胞系は接種用に使用される欠陥ウイルスを純粋に培養するためのものであり、これは次にＰＲＥＰ産生のための非相補性細胞を感作するために使用される。感作された培養物は次に、好ましくは少なくとも２４時間インキュベートし、実質的にビリオンを含まず、リコンビナントヘルペスウイルスＤＮＡから発現されたタンパク質またはペプチドを含むＰＲＥＰＳを産生させる。上記の記述は必要な変更（mutatis mutandis）を加えてその他のヘルペスウイルス類に適用される。
本発明の粒子調製品は通常、無細胞の形で創製される。即ち、分泌された細胞の上澄み液からＰＲＥＰＳを分離するか、またはそれらを含む細胞から回収する。このようにして、これらの調製品は可能な限り細胞全体および細胞の破片を含まないものとするのが望ましい。
ＰＲＥＰＳの用途の可能性を拡げるために、ＨＳＶに固有のものではない外部遺伝子、例えば、ヒト唾液腺ウイルス（ＨＣＭＶ）または水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のようなその他のヘルペスウイルス類、あるいは免疫不全グループウイルスまたは乳頭腫ウイルスのような無関係のウイルス類、あるいはバクテリアまたは非ウイルス性寄生虫、などの発現に相当な興味が注がれてきた。このためには外部ＤＮＡに、発現されるタンパク質がＰＲＥＰＳを標的とするようなＨＳＶ信号を備えさせるように工作することが必要であろう。このように作られた外部ＤＮＡは次いで、ヘルペスウイルスゲノムの適当に選択された部位または領域に組み込むことができる。ＰＲＥＰＳを標的とする信号を見つけだすのは試行錯誤的に行うことになるが、すでにＷＯ９２／１９７４８の実施例３に、ＨＳＶ−１ビリオン宿主遮断（ｖｈｓ）タンパク質遺伝子はＬ粒子中に入り込むのに必要な信号を与えることができることが示されている。その実施例中に示されている細胞系とマーカー遺伝子との実験により、必要なリコンビナントの構築のための適当なヘルペスウイルスゲノム配列は容易に与えられる。
上述の方法によりＨＳＶ−１  ＰＲＥＰＳ中に導入することができる外部タンパク質およびペプチドまたは異種抗原は、ＨＳＶ−２構造タンパク質、またはｇＤ２、ｇＢ２、タンパク質合成前（即時型）Ｖｍｗ１８３のようなその他のタンパク質、あるいはＶｍｗ６５などに相当するＨＳＶ−２、ならびにＨＣＭＶ  ｇＢなどのようなその他のヘルペスウイルスのタンパク質、またはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２  ｇｐ１２０またはｇｐ１６０などのようなヒト免疫不全ウイルスタンパク質（またはペプチド）、原核生物または真核生物により自然に産生されるすべてのタンパク質類である。
もし１つまたはそれ以上のＨＳＶ−１の真の後期タンパク質の存在がＰＲＥＰＳの免疫原性またはその他の特性を改善するのに有用であることが判明すれば、適当な初期またはタンパク質合成前プロモーターのコントロールのもとに、これらの遺伝子をウイルスＤＮＡ複製陰性ウイルスのゲノム中に再導入することが可能であろう。そのような条件下においては、これらの真の後期タンパク質は初期またはタンパク質合成前（即時型）遺伝子産物として発現されるものと考えられる。
初期遺伝子をタンパク質合成前プロモーターのコントロールのもとでＨＳＶ−１に入れ、コンピテントなウイルス粒子を得る研究についてはいくつかの参考文献がある。例えば、Ｌ．Ｅ．ポスト[Post]ら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２４、５５５〜５６５および２５、２２７〜２３２；Ｊ．Ｍ．カルダーら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、５３１〜５３８；ならびにＨ．Ｍ．ウイア[Weir]ら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７、１４０９〜１４２５参照。さらに、真の後期遺伝子はバクテリアプラスミド中でも、初期またはタンパク質合成前プロモーターのコントロール下に置くことができることも判明している。したがって当業者はこれらの技術を組み合わせ、それらを本発明に応用することができる。
本発明のワクチンはどのような処方のものでもよく、それによってＰＲＥＰＳが関連するタンパク質に対する抗体の形成を刺激したり、および／または細胞仲介の免疫を刺激するものであればよい。したがってワクチンにはしばしば本発明のウイルス粒子調製品とともに、免疫刺激剤（例えばアジュバント）またはビヒクルを含む。これにはもちろんその他補形剤および補助アジュバントのような従来の添加剤も含むことができる。ワクチン中のＰＲＥＰ粒子は無処理の形、または照射あるいはホルムアルデヒドのような薬剤で化学的に処理した形でもよい。照射された、または化学的に処理されたＰＲＥＰワクチンは全体を使用してもよく、あるいはテグメントからタンパク質を放出させるために破壊または破砕した形として使用してもよい。ワクチンは単位処方の形とするのが望ましい。適切な処方量は、例えばＨＳＶ−１またはＶＺＶウイルスのようなヘルペスウイルスワクチンの使用上の知識から導き出すことができるが、ＰＲＥＰＳをヘルペスウイルス感染の予防のために使用するのか、あるいは主として免疫原性の外部タンパク質またはペプチドを用いて免疫システムを刺激するために使用するかによっても異なる。後者の場合には、外部タンパク質またはペプチドに対する適切な処方量は、そのタンパク質またはペプチドに関する既存の知識を使用して計算しなければならない。
本発明の調製品を適当な哺乳類へ投与する場合、ウイルスワクチンの分野で使用されている従来のいずれの経路も使用することができる。最も広く行われるのは皮下または筋肉内注射であろうが、場合によってはその他の経路、例えば経口、経静脈、経膣、腹腔内および鼻腔内投与がより適当なこともある。これらはヘルペスウイルスに対する予防的または治療的ワクチンとして投与することができ、あるいはもし外部タンパク質がＰＲＥＰＳ中に組み込まれている場合は、免疫システムを刺激してヘルペスウイルスに対する免疫防御効果を高めるために投与することができる。この意味において、本発明はＨＩＶ陰性のエイズの予防に有益である（ただし個々のリスク負担において）と考えられる。
本発明は基本的にヒト患者での使用を目的としたものであり、その場合にはヘルペスウイルスは非感染性粒子の形でヒトに耐容されるもの、特に単純ヘルペスウイルス、さらにはＨＳＶ−１が好ましい。
しかしながら、ヒト以外の動物に使用する場合は、例えば馬に対してはウマヘルペスウイルスのような、他の種類のヘルペスウイルスがより好ましい。
下記の実施例は本発明を説明するものである。“フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）”および“ソルバール（Ｓｏｒｖａｌ）”は登録商標である。
実施例１
ＤＮＡ合成インヒビターを使用して処理した感染細胞培養中に産生されたＨＳＶ−１  ＰＲＥＰＳ
ＢＨＫ−２１細胞のコンフルエントな回転瓶培養物（２×１０8細胞個／回転瓶）を、ｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）５ｐｆｕ／細胞で、５％新生子ウシ血清（ＥＣ5）を添加したグラスゴー変性イーグル培地１５ｍｌ中で、ＨＳＶ−１株１７により感作した。この細胞を２時間３７℃に保ち、ウイルスを吸収させた。接種物を傾瀉し、細胞シートを酸性グリシンで洗浄し、インプットされた残存ウイルスを不活化した。各回転瓶の洗浄手順は次のとおりであった（ローゼンタール[Rosental]ら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９、９８０〜９８３）。
１．  ０．１４Ｍ  ＮａＣｌ  ２０ｍｌで１回洗浄。
２．  ０．１４Ｍ  ＮａＣｌに２０ｍｌの０．１Ｍグリシンを溶解したもの（ｐＨ３．０）で１分間洗浄。
３．  酸を中和するために２０ｍｌのＥＣ5で１回洗浄。
この細胞を、薬剤非含有ＥＣ5または１０μＭのアシクロビール（ＡＣＶ）（シグマ社）若しくは１００μｇ／ｍｌのシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（ａｒａＣ）（シグマ社）を含むＥＣ5の３０ｍｌ／回転瓶で塗布した。４８時間３１℃で増殖させた後に、感染培養物を採取した。
細胞外物質を“ソルバール”ＧＳＡローターを使用して清澄化（４０００ｒｐｍ、２０分／４℃）し、同じローターを使用して（１２０００ｒｐｍ／２時間／４℃）沈澱させた（ジラギーおよびカニンガム、１９９１、前記）。これにより細胞から放出された粒子を得た。
沈殿物を静かに再懸濁させた後、ジラギーおよびカニンガムの手順（１９９１、前記）を使用した密度勾配遠心法により分離した。
無薬剤調製品を含む“フィコール”勾配はビリオンおよびＬ粒子の特徴的なバンドを呈したのに対し、ＡＣＶおよびａｒａＣの存在下で産生された物質を含む勾配においては、無薬剤の“Ｌ粒子”バンドに相当する拡散バンドは存在したが、明らかなビリオンのバンドは示さなかった（図１ｃおよび１ｄ）。
これらのバンドを側面窄刺で集め、フェノールレッドを含まないイーグル培地（Ｅｐｒ-）で３７ｍｌとし、ソルバールＡＨ６２９ローター中、１９，０００ｇで１６時間４℃、遠心分離してペレット化し、次いで少量のＥｐｒ-中に再懸濁し、−７０℃で保存した。この材料を次に電子顕微鏡で検査したところ、野生型Ｌ粒子に似た数多くの粒子が認められた（図２ｃおよびｄ）。ウイルスＤＮＡ複製がない場合に産生された粒子をＰＲＥＰＳと命名した。無薬剤調製品中のビリオンバンドの位置に相当する勾配の範囲を同様に取り出して分析した。この分析結果を実施例４の後に示す。
同様の結果が、ガラスビーズを用いて機械的切断により細胞から放出させ、前述のように精製した、細胞内ＰＲＥＰＳを含む感染細胞抽出材料においても得られた。
実施例２
ＢＨＫ細胞またはヒトメラノーマ細胞（ＭｅＷＯ）を、１０％新生子ウシ血清を添加したイーグル培地、または１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ10）中で、それぞれ増殖させた。薬剤（１０μＭ  ＡＣＶ、１００μｇ／ｍｌ  Ａｒａ  Ｃまたは３００μｇ／ｍｌ  ＰＡＡ）は感作の１時間前に添加し、ＨＳＶ−１の感染全期間にわたって存在させた。３７℃でのインキュベーションの後、ＰＲＥＰＳを実施例１に述べたように、培地から精製した。
感染細胞が増殖する温度は、細胞が完全な細胞変性効果（ｃｐｅ）状態に到達する限り、あまり重要でないことが判明した。この状態は当業者によく知られているものであり、細胞が糸状の外観を失い、完全に丸くなるのを目視により判断することができる。この実施例においては３１℃で４８時間、または３７℃で２４時間のいずれかの条件を使用した。
このようにして得られたＰＲＥＰＳを、実施例４の後に記載する方法で分析した。
実施例３
ＨＳＶ−１のＤＮＡ複製陰性アンバーノンセンス変異株の単離
ＨＳＶ−１遺伝子の命名およびＤＮＡ配列は、マクゴーシュ[McGeoch]ら、１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９、１５３１〜１５７４に記述されている。
ＨＳＶ−１遺伝子ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ４２およびＵＬ５２は、組織培養細胞中でのウイルスＤＮＡ合成に必要とされるタンパク質類をコードする（ウー[Wu]ら、１９８９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６２、４３５〜４４３；ウェラー[Weller]ら、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、１０５〜１３５）。これら遺伝子の１つの機能でも失った変異株は、感染細胞中でウイルスＤＮＡ合成を誘発することができない。これらの複製タンパク質類について現在までに判明している生化学的機能は次のとおりである。ＵＬ５、ＵＬ８およびＵＬ５２の産物は、ＤＮＡヘリカーゼ−プリマーゼ活性を示す異種トリマー複合体を形成する（クルートら、１９８９、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、８６、２１８６〜２１８９）。遺伝子ＵＬ９はオリジン結合タンパク質をコード（ウイアら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒc ｈ、１７、１４０９〜１４２５）し；ＵＬ２９は主要ＤＮＡ結合タンパク質をコード（ウェラーら、１９８３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４５、３５４〜３６６）し；ＵＬ３０およびＵＬ４２はそれぞれ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびその補助タンパク質をコードする（ドースキーら[Dorsky]ら、１９８７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６１、１７０４〜１７０７；パリス[Parris]ら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、８１８〜８２５；ウーら、上記；マーシー[Marcy]ら、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒc ｈ、１８、１２０７〜１２１５）。
ウイルスＤＮＡ合成に欠陥のあるＨＳＶ−１変異株を構築するために、ＵＬ８タンパク質のアミノ酸２６７位置のセリンコドンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位指向突然変異誘発により、枠内アンバー停止コドンに置き換えた。突然変異された遺伝子を次に、同種組み換えにより野生型ウイルスゲノム中へ導入した。得られた突然変異ウイルスＨＳＶ−１  ａｍｂ  ＵＬ８は、Ｓ．ウェラー博士の好意により提供された許容細胞系（Ｓ２２）中で単離したが（カーマイケル[Carmichael]ら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、９１〜９９）、細胞系Ａ２６（下記）も同様に使用することができる。このａｍｂ  ＵＬ８突然変異株は、Ｖｅｒｏ細胞中で増殖させた場合プラークを産生せず、あるいはウイルスＤＮＡを合成しなかったが、これはＵＬ８がウイルスＤＮＡ合成に必須であるという従来の観察と一致した（カーマイケルおよびウェラー、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、５９１〜５９９）。単回増殖分析（single-step growth analysis）で測定したＶｅｒｏおよびＳ２２細胞中でのａｍｂ  ＵＬ８ウイルス産生効率は、突然変異株はＶｅｒｏ細胞上では増殖しないのに対し、Ｓ２２細胞で得られたウイルスは野生型ウイルスの場合に匹敵するものであることを示した。ＵＬ８タンパク質特異性モノクローナル抗体を使用したウエスタンイムノブロット分析では、ａｍｂ  ＵＬ８感染Ｖｅｒｏ細胞中にＵＬ８遺伝子産物を検出できなかった。ここで報告した研究においては、ウイルスを下記のようにして構築された別の相補細胞系（Ｖｅｒｏ由来のＡ２６細胞）でも増殖させた。
デルーカ[DeLuca]ら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６、５５８〜５７０の方法に従い、Ｖｅｒｏ細胞にＨＳＶ−１ゲノムのＢｇｌ１１ｋフラグメントを有するプラスミド（ＨＳＶ−１遺伝子ＵＬ６、ＵＬ７、ＵＬ８、ＵＬ９およびＵＬ１０の完全なヌクレオチド配列を含む配位化合物１４５８９〜２５１４９；マクゴーシュら、１９８８、上記）、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターのコントロールのもとでネオマイシン耐性遺伝子を含むもう１つのプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（サザン[Southern]およびバーグ[Berg]、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７〜３４１）を一緒に感作させた。感作した細胞は密集増殖して、トリプシン化し、８００μｇ／ｍｌの抗生物質ゲネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ：Ｇ４１８、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含む培地上に１：２５の希釈率で塗布した。３７℃で２週間のインキュベーション（培地を定期的に取り替え）後、Ｇ４１８耐性の個々のコロニーは目視することができた。これらのコロニーを単離し、増幅させた。１つのコロニーを選択したところ、これはプラークを形成し、この細胞系上にｃｐｅを示し、ＨＳＶ−１  ａｍｂ  ＵＬ８変株異の増殖を維持できるものであることが判明し、これをＡ２６と命名した。このＡ２６細胞系もまた、ＵＬ９中の温度感受性変異株ｔｓＳ（マースデン[Marsden]ら、１９７６、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３１、３４７〜３７２；ダーガンおよびスバック−シャープ、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４、１３１１〜１３２６）の３８．５℃での増殖を維持することができるものであった。
ａｍｂ  ＵＬ８ウイルスが非許容条件下（すなわち、非相補性細胞系を使用するＨＳＶ−１  ＤＮＡ複製の非許容条件下）でウイルス様粒子を合成する能力を試験した。回転瓶中のＢＨＫ細胞を、ｍ．ｏ．ｉ．５ｐｆｕ／細胞でａｍｂ  ＵＬ８または野生型ウイルスに感染させ、前記実施例１に述べたように酸性グリシン洗浄を行った。感染した細胞をさらに、２％子ウシ血清を含むイーグル培地（ＥＣ2）中、３７℃で３．５時間インキュベートした。細胞培地を、０．５ｍｃｉ35Ｓ−メチオニンを含む無メチオニンＥＣ2に取り替え（銀染色に代わる、オートラジオグラフィを行うため；実施例４参照）、さらにインキュベーションを４３時間続けた。上澄み培養液の細胞外物質をペレット化し、再懸濁して、ジラギーおよびカニンガム記述の方法（１９９１、上記）により、５〜１５％“フィコール”勾配で分析した。野生型ウイルス調製品の勾配は、ビリオンおよびＬ粒子に相当するバンドを含んでいた。ａｍｂ  ＵＬ８調製品勾配では、野生型ウイルスのＬ粒子バンドに相当する拡散上部バンドは存在したが、ビリオンバンドは存在しなかった（図１ａおよびｂ）。ａｍｂ  ＵＬ８を含む勾配においては、野生型ビリオンバンドと一緒に移動する物質も収集された。分析結果を以下に記載する。
実施例４
薬剤を使用しないこと以外、実施例２のすべての段階の条件を踏襲して、ａｍｂ  ＵＬ８  ＨＳＶ−１からのＰＲＥＰＳをウイルス処理ＢＨＫ及びＭｅ  ＷＯ細胞から調製した。
ＰＲＥＰＳの分析
ネガティブ染色電子顕微鏡写真：
Ｌ粒子またはＰＲＥＰＳのサンプル５μｌを、“フォームバール[Formvar]”塗布の電子顕微鏡グリッド上に滴下し、乾燥させた。このグリッドを次に、５μｌのタングストリン酸（ＰＴＡ）で５秒間処理し、余剰のＰＴＡを吸い取り紙により除去した。これらのサンプルを“Ｊｅｏｌ”１０１電子顕微鏡で検査した。
電子顕微鏡によるＨＳＶ−１  Ｌ粒子の詳細な検討により、Ｌ粒子とＰＲＥＰＳの間に外観上の差があることが見い出された：すなわちＰＲＥＰＳは１粒子当りのエンベロープ糖タンパク質のスパイクの数が少ない。この差は、染色したＬ粒子とＰＲＥＰＳのそれぞれの電子顕微鏡写真、図２ａおよび２ｂ（実施例４からのものであるが他の実施例のものも同様に判別可能）を精査することにより知ることができる。これらのスパイクが明確に認められる典型的な粒子が矢印で示されている。図２ｂではスパイクの間にギャップが認められる。示されている直線の長さは１００ナノメートルである。
糖タンパク質スパイクはすべてのヘルペスウイルスが有している。ＨＳＶ−１以外でも、同じ特徴がそのようなウイルスのＬ粒子およびＰＲＥＰＳの電子顕微鏡写真において見られるものと考えられる。
感染性：
収集したＰＲＥＰＳのサンプルをＢＨＫまたはＡ２６細胞の単層の上に添加し、感染性をｐｆｕ／ｍｌ単位で求めた。粒子数／ｍｌの値は電子顕微鏡により求めた。
結果を表に示す。実施例１と２のＢＨＫ細胞の値は同じであり、また実施例３と４の値もまた同じである。これらを表に示す。
勾配を含むＰＲＥＰＳ中に目視可能なバンドを形成するには不充分な数でしか存在しないが、ＷＴコントロールビリオンバンドに相当する領域のサンプリングによっていくつかのビリオン粒子が電子顕微鏡で検出された。ＢＨＫおよびＭｅＷＯ培養の両方で、ウイルスＤＮＡ合成が薬剤によって生物化学的に阻止されたか、または遺伝子的に阻止されたかには関係なく、ＰＲＥＰＳはＷＴコントロールＬ粒子と同様の数が産生された。すべてのＰＲＥＰＳ調製品において少量の感染性が認められたが、得られた粒子：ｐｆｕの比率は概ね、ＷＴコントロールＬ粒子調製品の１００から１０，０００倍大きいものであった。ＰＲＥＰＳ勾配から得られたＰＲＥＰＳバンドと電子顕微鏡で検出されたビリオンの高い粒子：ｐｆｕの比率は、存在しているビリオンのほとんどが非感染性であることを示している。これは恐らく、洗浄操作にもかかわらず、吸着され、酸により不活化され、培養中に生存し、後で細胞表面から放出された接種ウイルスを表わしているものであろう。少量の感染性がＰＲＥＰＳに認められたが、それはＬ粒子よりも少ないものであった。
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各種タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動、銀染色およびウエスタンイムノブロッティング：
精製されたビリオン、Ｌ粒子またはＰＲＥＰ粒子を可溶化し、２×１０9相当分を９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付した（マースデンら、１９７６、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３１、３４７〜３７２）。タンパク質はマクリーンら、１９９０、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１、２９５３〜２９６０の記述による、銀染色により視覚化した。
図３は下記のポリペプチドのプロフィルを示す：
トラック１（Ｖ）無処理のＷＦ感作ＢＨＫ細胞からのビリオン（実施例２）
トラック２（Ｌ）ＢＨＫ細胞からのＬ粒子（実施例２）
トラック３（Ｐ  ａｍ）ａｍｂ  ＵＬ８感作したＢＨＫ細胞からのＰＲＥＰＳ（実施例４）
トラック４（Ｐ  ａｍ）ａｍｂ  ＵＬ８感作したＭｅＷＯ細胞からのＰＲＥＰＳ（実施例４）
トラック５（Ｐ  ＡＣＶ）アシクロビール処理のＷＦ感作したＭｅＷＯ細胞からのＰＲＥＰＳ（実施例２）
トラック６（Ｐ  ａｒｃ）ａｒａＣ処理のＷＴ  ＭｅＷＯからのＰＲＥＰＳ（実施例２）
トラック７（Ｐ  ＰＡＡ）ＰＡＡ処理のＷＴ感作したＭｅＷＯ細胞からのＰＲＥＰＳ（実施例２）
トラック８（Ｌ）ａｒａＣ処理のＷＴ感作したＭｅＷＯからのＰＲＥＰＳ（実施例２）
トラック９（Ｖ）無処理ＷＴ感作したＭｅＷＯからのビリオン（実施例２）
図３の記号の説明：
黒丸●はＬ粒子タンパク質バンドを示す。
白丸○はキャプシドタンパク質バンドを示す。
黒四角■は対応するＬ粒子タンパク質バンドより強度が大きいＰＲＥＰＳタンパク質バンドを示す。
白菱形◇は対応するＬ粒子タンパク質バンドより強度が小さいＰＲＥＰＳタンパク質バンドを示す。
多くの点において、ＰＲＥＰＳおよびＷＴ  Ｌ粒子のプロフィルは似ている（トラック２と３、ならびに８と４を比較されたい）。しかしながら、バンドにおける下記の顕著な差が、調製品が感作ＢＨＫまたはＭｅＷＯ細胞から得られたものかどうかには関係なく常に認められた。すなわち、２７３Ｋ（ＶＰ１−２）、８２／８１Ｋ（ＶＰ１３／１４）、５７Ｋ（ＶＰ１７、ｇＤ）、および４０Ｋのタンパク質バンドは明らかにその量が少ないが、ＢＨＫ産生のＰＲＥＰＳはＭｅＷＯ細胞で作られるものよりかなり多くの８１／８２およびｇＤを含んでいる。１７５Ｋ（ＶＰ４、ＩＥ３）、９２／９１Ｋ（ＶＰ１１／１２）、および３８Ｋ（ＶＰ２２）は量が増えている。
エンベロープタンパク質の可溶化：
約４×１０10のビリオン、Ｌ粒子およびＰＲＥＰＳ（図３の場合）を、ＥＰｒ-に１％ＮＰ４０を溶解したもので、０℃で３０分処理した。次いで、可溶性（エンベロープ）上清および不溶性ペレット（テグメント）分画を１３，０００ｒｐｍで５分間、ＭＳＥマイクロ遠心分離機で遠心分離した。サンプル緩衝液に溶解した後（マースデンら、１９７６、Ｊｏｕｒａｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１、３４７〜３７２）、４×１０9粒子に相当する量をそれぞれのゲルトラックに充填した。下記のタンパク質類、すなわち１７５Ｋ多重バンド（ＶＰ４；ＩＥ３）、１２０Ｋ、１１８Ｋ、９２／９１Ｋ（ＶＰ１１／１２）、ｇＥ（ＢＨＫ細胞のみ）、６７Ｋ（ＶＰ１５）（ＭｅＷＯ）、および３８Ｋ（ＶＰ２２）はＰＲＥＰＳのテグメント分画で量が増えたのに対し、２７３Ｋ（ＶＰ１−２）および８２／８１Ｋ（ＶＰ１３／１４）、４０Ｋ（ＭｅＷＯ）および３７．５Ｋ（ＭｅＷＯ）は減少した。エンベロープ分画では、ｇＢ、ｇＣおよびｇＨを表すバンドでは、Ｌ粒子およびＰＲＥＰＳ中のこれらのタンパク質量は、ほとんどまたはまったく差が認められない。しかしながら、ＰＲＥＰＳ中のｇＤの量は減少した。糖タンパク質ｇＥは、ＭｅＷＯ細胞中で製作された全ての型の粒子において、まったくないか極微量だけであったのに対しＢＨＫ細胞中に産生されたａｍｂ  ＵＬ８  ＰＲＥＰＳ中に検出されたｇＥの量はＬ粒子コントロールに比べて明らかに増加した。
ウエスタンイムノブロット分析のため、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離されたエンベロープおよびテグメントタンパク質を“ハイボンド−ＥＣＬ”ニトロセルロースシート（アマーシャム社）に移し、ブロック用緩衝液（０．０５％トゥイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）および２％“マーベル”ミルク粉末）で１昼夜処理し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔで調製したテストマウスモノクローナルまたはウサギポリクローナル抗体とともに１８℃で２時間インキュベートした。さらにＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ブロットを抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼで（適当に）処理し、標識されたタンパク質を増感化学発光（アマーシャム社）により検出した。使用した抗体はモノクローナル抗体（ＭＡＢ）４８４６（抗ｇＤ）；ＭＡＢ３１１４／１０９（抗ｇＥ）；およびウサギポリクローナル抗体９４４９７（抗８２／１Ｋ）である。
ウエスタンイムノブロット分析の主な結果は次のとおりである：
真の後期タンパク質８２・８２Ｋは、ＢＨＫまたはＭｅＷＯ細胞系で製作されたビリオンおよびＬ粒子のテグメント中に存在したが、すべてのＰＲＥＰＳ（調製はしたものの）には存在しなかった。別の真の後期タンパク質ｇＣはＬ粒子およびビリオン両方のエンベロープ分画中に相当量が存在したが、ＰＲＥＰＳ中の量がかなり少なく、これはウイルスＤＮＡ合成が少し起きたか、あるいはインプットしたゲノムからいくらかのｇＣが産生されたか、のいずれかを示唆する。ＰＲＥＰＳ中の抗ｇＤの量は少なかった。
Ｖｍｗ６５Ｋタンパク質産生欠陥ＨＳＶ−１細胞系の相補性：
この実験では、ＨＳＶ−１  Ｖｍｗ６５Ｋ（α−ＴＩＦ、ＶＰ１６）欠陥変異株ｉｎ１８１４と相補的に作用するＰＲＥＰＳの能力（エース[Ace]ら、１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９、２５９５〜２６０５および１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６３、２２６０〜２２６９）を検討した。Ｖｍｗ６５Ｋテグメントタンパク質は、Ｌ粒子およびＰＲＥＰＳ中に同程度の量において存在することがすでに示されている（図３、レーン１−９）。マクロークランら、１９９２、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、２６９〜２７６は、ｉｎ１８１４突然変異株に相補的に作用するのに、Ｌ粒子はビリオンと同様に効果的であるということを示している。
２４穴組織培養皿上のヒト新生児肺細胞単層（Ｆｌｏｗ  ２０２）（１０％ＦＣＳ添加ＧＭＥＭ中で増殖）をｉｎ１８１４により、０．１、１．０または１０ｐｆｕ／穴で感作した。１時間の吸収期間の後、取り込まれなかったウイルスを５％ＦＣＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して除去し、次いでその単層をＨＳＶ−１  Ｌ粒子またはＰＲＥＰＳいずれかの０．１、１．０または１００粒子／細胞で１時間３７℃で処理した。結合しなかった粒子を除去するために５％ＦＣＳを含むＰＢＳで３回洗浄後、この単層にＥＣ5を塗布し、３７℃で４８時間インキュベートし、次いで固定し、染色してプラーク数を計測した。
Ｌ粒子またはＰＲＥＰＳのいずれも、それ自体には検知できるような感染性は認められなかったが、それぞれｉｎ１８１４変異株と相補性を有することができた。しかしながらＰＲＥＰＳ相補性の効率はコントロールＬ粒子の約１０〜３０％であった。実施例５および６
これら２つの実施例は、ＨＳＶ−２およびＭｅＷＯ細胞からの仮性狂犬病ウイルスのＰＲＥＰＳを、１００μｇ／ｍｌのａｒａＣの存在下およびＬ粒子の非存在下で調製する方法に関するものである。方法は実施例２と同じく、感作細胞のインキュベーションは３７℃で４８時間である。ここで使用したウイルス株はスコットランドのグラスゴー大学、ＭＲＣウイルス学ユニットで使用されているＨＳＶ−２株ＨＧ５２と、同じくＭＲＣウイルス学ユニットで使用されている野生型仮性狂犬病ウイルス保存株である。これらのウイルスおよびここで述べたその他すべての開始ウイルス株ならびにＡ２６細胞系は、スコットランド、グラスゴーＧ１１  ５ＪＲ、チャーチ通り、ウイルス研究所、ＭＲＣウイルス学ユニットの理事（ディレクター）から入手できる。
得られたＰＲＥＰＳおよびＬ粒子は、電子顕微鏡により、エンベロープの周囲に糖タンパク質の少ないＨＳＶ−１  ＰＲＥＰＳと同様のものであることが明らかになった。ポリペプチド分析はまだ実施していないが、このＰＲＥＰＳはこの分析によってもやはり、真の後期タンパク質の量が対応するＬ粒子と比較して少ないことが特徴づけられるものと強く確信する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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