(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３１９から３２１までのヌクレオチドトリプレットがアスパラギン酸をコードするトリプレットで置換されていることを除き、配列番号：３に示されるＢＭＰ−４をコードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
１６６から１６８までのヌクレオチドトリプレットがヒスチジンをコードするトリプレットで置換されていることを除き、配列番号：５に示されるＢＭＰ−５をコードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
１６６から１６８までのヌクレオチドトリプレットがヒスチジンをコードするトリプレットで置換されていることを除き、配列番号：７に示されるＢＭＰ−６をコードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
１８７から１８９までのヌクレオチドトリプレットがヒスチジンをコードするトリプレットで置換されていることを除き、配列番号：９に示されるＢＭＰ−７をコードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
１８７から１８９までのヌクレオチドトリプレットがヒスチジンをコードするトリプレットで置換されていることを除き、配列番号：１１に示されるＢＭＰ−８をコードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
アミノ酸残基１０７におけるグルタミン酸がアスパラギン酸で置換されている配列番号：４のアミノ酸配列からなる変異体ＢＭＰ−４。
【請求項７】
アミノ酸残基５６におけるアラニンがヒスチジンで置換されている配列番号：６のアミノ酸配列からなる変異体ＢＭＰ−５。
【請求項８】
アミノ酸残基５６におけるアラニンがヒスチジンで置換されている配列番号：８のアミノ酸配列からなる変異体ＢＭＰ−６。
【請求項９】
アミノ酸残基６３におけるアラニンがヒスチジンで置換されている配列番号：１０のアミノ酸配列からなる変異体ＢＭＰ−７。
【請求項１０】
アミノ酸残基６３におけるセリンがヒスチジンで置換されている配列番号：１２のアミノ酸配列からなる変異体ＢＭＰ−８。
【請求項１１】
ＢＭＰ−２および請求項６記載の変異体ＢＭＰを含むＢＭＰヘテロダイマー。
【請求項１２】
ＢＭＰ−２および請求項７記載の変異体ＢＭＰを含むＢＭＰヘテロダイマー。
【請求項１３】
ＢＭＰ−２および請求項８記載の変異体ＢＭＰを含むＢＭＰヘテロダイマー。
【請求項１４】
ＢＭＰ−２および請求項９記載の変異体ＢＭＰを含むＢＭＰヘテロダイマー。
【請求項１５】
ＢＭＰ−２および請求項１０記載の変異体ＢＭＰを含むＢＭＰヘテロダイマー。
【発明の詳細な説明】
本発明は、骨形態形成蛋白の変異体に関する。これらの変異体は有用であり、特に、細菌細胞培養物から不溶性形態として生産される生物学的に活性のあるダイマー組み換え骨形態形成蛋白の改良された製造方法において使用される。
発明の背景
当該分野において骨形態形成蛋白（ＢＭＰｓ）と呼ばれる多くの蛋白は、近年、哺乳動物中に移植された場合、骨または軟骨の形成を誘導しうることが確認されている。例えば、ワン（Wang）ら,米国特許第５,０１３,６４９号（参照により本明細書に取り入れる）には、ウシおよびヒトの骨形態形成蛋白２Ａ（現在、骨形態形成蛋白−２）および２Ｂ（現在、骨形態形成蛋白４）をコードするＤＮＡ配列；それらのＤＮＡ配列によりコードされる対応蛋白、およびＢＭＰ−２Ａ（現在、ＢＭＰ−２）ならびにＢＭＰ−２Ｂ（現在、ＢＭＰ−４）蛋白の組み換え製造法が記載されている。ウォズニー（Wozney）ら,米国特許第５,１０６,７４８号（参照により本明細書に取り入れる）には、ウシおよびヒトの骨形態形成蛋白−５（ＢＭＰ−５）のＤＮＡおよびアミノ酸配列のみならずＢＭＰ−５蛋白の組み換え製造法が記載されている。米国特許第５,１８７,０７６号（参照により本明細書に取り入れる）において、ウォズニーらは、ヒトおよびウシの骨形態形成蛋白−６（ＢＭＰ−６）のＤＮＡ配列、アミノ酸配列、およびその組み換え製造法を開示している。骨形態形成蛋白−７（ＢＭＰ−７、時々ＯＰ−１と呼ばれる）をコードするＤＮＡならびにアミノ酸配列、およびＢＭＰ−７の組み換え製造法が、ローゼン（Rosen）ら,米国特許５,１４１,９０５（参照により本明細書に取り入れる）に記載されている。ＢＭＰ−８をコードするＤＮＡ配列はＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示されている。ＢＭＰ−９をコードするＤＮＡ配列はＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示されている。これらの文献を参照により本明細書に取り入れる。これらの蛋白は、哺乳動物における骨および軟骨の傷害および疾患の治療において広範な医学的適応性を有することが期待されている。これらの骨形態形成蛋白に対する医学的必要性を充足するためには、大量の生物学的に活性のある蛋白が必要である。
骨形態形成蛋白の組み換え製造は、真核細胞および原核細胞双方の培養系において可能である。細胞のごとき原核細胞における異種蛋白の組み換え製造における共通の出来事は、封入体として知られる不溶性細胞内沈殿の形成である。一般的に、細菌は異種蛋白をコードするＤＮＡ配列を正確に転写し翻訳することができるが、これらの原核細胞は、いくつかの異種蛋白を十分かつ正確に折り畳んで可溶性形態として生産することができない。このことは、骨形態形成蛋白のごとき真核細胞由来の蛋白の原核細胞における発現に関して、特に真実である。正確に折り畳まれない異種蛋白の形成により、組み換え哺乳動物蛋白の製造のための細菌醗酵の有用性がある程度限定されている。組み換え骨形成蛋白は、細菌において生産される場合、しばしば同様に、凝集した、生物学的に不活性な形態となって封入体中に見いだされる。
正しく折り畳まれた異種蛋白を細菌の封入体から得るためのいくつかの方法が知られている。一般的に、これらの方法は封入体から蛋白を可溶化させ、次いで、カオトロピック（chaotropic）試薬を用いて蛋白を完全に変性させることを包含する。蛋白の１次アミノ酸配列中にシステインが存在する場合、ジスルフィド結合が正しく形成する環境（酸化還元系）における再生を行うことがしばしば必要である。再生の一般的方法は、コーノ（Kohno）,メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth.Enzymol.）第１８５巻：１８７〜１９５頁（１９９０年）に記載されている。
ＥＰ０４３３２２５には、カオトロピック試薬および酸化還元系のほかに、界面活性剤の形態の可溶化剤を用いる、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）様蛋白の再生方法が記載されている。ＥＰ０４３３２２５には、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー間の相同性の程度に基づいて、そこに開示された方法は「ＴＧＦ−β様蛋白」の再生に広く適用できることが予測されている。しかしながら、本発明者らは、ＥＰ０４３３２２５開示の方法は、細菌により生産されたＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７に適用すると、理由は不明であるが、該方法は、正しく折り畳まれた、生物学的に活性のあるダイマー蛋白を望ましくない低収率で生じることを見いだした。
発明の概要
意外なことに、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−８のごとき蛋白のごときいくつかの骨形態形成蛋白は、細菌により生産された場合には、正しく折り畳まれた生物学的に活性のあるダイマー蛋白を生じないが、これらの蛋白のある種の変異体はかかる蛋白を生じうることが見いだされた。また、以外なことに、ある種の変異体形態の骨形態形成蛋白もまた、ＢＭＰ−２／５およびＢＭＰ−２／６のごとき正しく折り畳まれた、生物学的に活性のあるヘテロダイマーを良好な収量で生じることができ、その一方では、ネイティブ（native）な形態のこれらの蛋白は、望ましくない低収率の正しく折り畳まれた、生物学的に活性のあるヘテロダイマーを生じるが、その収率は本発明方法により改善されることがさらに見いだされた。
したがって、１の具体例において、本発明は、正しく折り畳まれた、生物学的に活性のある形態のＢＭＰ−４を得るための細菌による生産プロセスにおいて有用な変異体形態のＢＭＰ−４からなる。
もう１つの具体例において、本発明は、正しく折り畳まれた、生物学的に活性のある形態のＢＭＰ−２／５、ＢＭＰ−２／６、ＢＭＰ−２／７およびＢＭＰ−２／８のヘテロダイマーを得るための細菌による生産プロセスにおいて有用な変異体形態のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−８からなる。
さらなる具体例において、本発明は、上記変異体形態の骨形態形成蛋白をコードするＤＮＡ配列よりなるＤＮＡ分子からなる。
さらに本発明は、改善された再生特性を有する骨形態形成蛋白の他の変異体形態を得る方法、および該方法により得られる変異体蛋白からなる。
配列の簡単な説明
配列番号：１はＢＭＰ−２をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：２はＢＭＰ−２に関するアミノ酸配列である。
配列番号：３はＢＭＰ−４をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：４はＢＭＰ−４に関するアミノ酸配列である。
配列番号：５はＢＭＰ−５をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：６はＢＭＰ−５に関するアミノ酸配列である。
配列番号：７はＢＭＰ−６をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：８はＢＭＰ−６に関するアミノ酸配列である。
配列番号：９はＢＭＰ−７をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１０はＢＭＰ−７に関するアミノ酸配列である。
配列番号：１１はＢＭＰ−８をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１２はＢＭＰ−８に関するアミノ酸配列である。
図面の説明
図１はＢＭＰ−２、４、５、６、７および８の配列の比較である。
発明の詳細な説明
本発明によれば、組み換え骨形態形成蛋白−４（ＢＭＰ−４）（配列番号：３および４）；ＢＭＰ−５（配列番号：５および６）；ＢＭＰ−６（配列番号：７および８）；ＢＭＰ−７（配列番号：９および１０）；およびＢＭＰ−８（配列番号：１１および１２）の変異体形態を用いて大量のＢＭＰホモダイマーまたはヘテロダイマーを細菌から製造し、生物学的に活性のあるダイマー分子に再生することができる。
本発明ＤＮＡ分子は、残基１０７におけるグルタミン酸をコードするヌクレオチドトリプレット（すなわち、配列番号：３のヌクレオチド３１９から３２１まで）が残基１０７におけるアスパラギン酸をコードするヌクレオチドトリプレットにより置換（例えば、突然変異により、あるいは合成的に）されていることを除いて、ＢＭＰ−４をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子を包含する。
本発明のもう１つの具体例は、ＢＭＰ−５もしくはＢＭＰ−６の残基５６におけるアラニンをコードするヌクレオチドトリプレット（すなわち、配列番号：５もしくは７のヌクレオチド１６６から１６８まで）、またはＢＭＰ−７の残基６３におけるアラニンをコードするヌクレオチドトリプレット（すなわち、配列番号：９のヌクレオチド１８７から１８９まで）が、ヒスチジンをコードするヌクレオチドトリプレットにより置換（例えば、突然変異により、あるいは合成的に）されていることを除き、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７をコードするヌクレオチド配列よりなるＤＮＡ分子からなる。
本発明のもう１つの具体例は、ＢＭＰ−８の残基６３におけるセリンをコードするヌクレオチドトリプレット（すなわち、配列番号：１１のヌクレオチド１８７から１８９まで）がヒスチジンをコードするヌクレオチドトリプレットにより置換（例えば、突然変異により、あるいは合成的に）されていることを除き、ＢＭＰ−８をコードするヌクレオチド配列よりなるＤＮＡ分子からなる。
さらに本発明は、残基１０７におけるアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸により置換されていることを除き、ＢＭＰ−４のアミノ酸配列からなる蛋白の精製組成物からなる。この修飾されたＢＭＰ−４蛋白をＢＭＰ−４（Δ１０７Ａｓｐ）と命名して呼んでもよい。
もう１つの具体例において、本発明は、ＢＭＰ−５もしくはＢＭＰ−６の残基５６におけるアミノ酸であるアラニン、またはＢＭＰ−７の残基６３におけるアミノ酸であるアラニンがヒスチジンにより置換されていることを除き、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７のアミノ酸配列よりなる蛋白の精製組成物からなる。修飾されたＢＭＰ−５蛋白を、例えば、ＢＭＰ−５（Δ５６Ｈｉｓ）と命名して呼んでもよい。もう１つの具体例において、本発明は、ＢＭＰ−８の残基６３におけるアミノ酸であるセリンがヒスチジンにより置換されていることを除き、ＢＭＰ−８のアミノ酸配列よりなる蛋白の精製組成物からなる。修飾されたＢＭＰ−８蛋白を、例えば、ＢＭＰ−８（Δ６３Ｈｉｓ）と命名して呼んでもよい。
本明細書の用語「相関的な（correlative）」は以下のことを意味する。ＢＭＰ−２は、それぞれが長さ１１４アミノ酸であってもよいポリペプチド鎖のダイマーからなることが知られている。ＢＭＰ−４は、それぞれが長さ１１６アミノ酸であってもよいポリペプチド鎖のダイマーからなる。ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６は、それぞれが長さ１３２アミノ酸であってもよいポリペプチド鎖のダイマーからなる。ＢＭＰ−７は、それぞれが長さ１３９アミノ酸であってもよいポリペプチド鎖のダイマーからなる。ＢＭＰ−８は、それぞれが長さ１３９アミノ酸であってよいポリペプチド鎖のダイマーからなる。さらに、残基１９のロイシン（ＢＭＰ−４の残基２１に対して相関的）から残基１１４のアルギニンまでのＢＭＰ−２のアミノ酸は、残基２１のロイシンから残基１１６のアルギニンまでのＢＭＰ−４に対して非常に相同的であることが知られている。同様に、残基１９のロイシンから残基１１４のアルギニンまでのＢＭＰ−２のアミノ酸は、ＢＭＰ−５ならびにＢＭＰ−６のロイシン３６からヒスチジン１３２までのアミノ酸、およびＢＭＰ−７のロイシン４３からヒスチジン１３９までのアミノ酸、さらにＢＭＰ−８のロイシン４３からヒスチジン１３９までのアミノ酸に対して非常に相同的であることが知られている。よって、ＢＭＰ−２の残基１９のロイシンは、ＢＭＰ−４の残基２１、およびＢＭＰ−５ならびにＢＭＰ−６の残基３６、およびＢＭＰ−７の残基４３、さらにＢＭＰ−８の残基４３と相関的であると言われる。同様に、ＢＭＰ−２の残基１０５のアスパラギン酸は、ＢＭＰ−４の残基１０７におけるグルタミン酸と相関的であると言われ、ＢＭＰ−２の残基３９におけるヒスチジンは、ＢＭＰ−５ならびにＢＭＰ−６の残基５６におけるアラニン、およびＢＭＰ−７の残基６３のアラニン、さらにＢＭＰ−８の残基６３のセリンと相関的であると言われる。別法として、ＴＧＦ−βの１１２個のアミノ酸の配列を、相関的なアミノ酸を確定するためのリファレンス点として用いてもよい。
図１を調べることにより、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４は、１番目のシステイン（ＢＭＰ−２の残基１４；ＢＭＰ−４の相関残基１６）から始めて非常に相同的であることが理解できる。異なる相関的な残基はわずか８個しか存在しない。これらは、それぞれ、ＢＭＰ−２の残基１５、３９、４６、７３、９５、９６および１０５に存在する。しかし、出願人らは、満足できる量のＢＭＰ−２を再生することに関して有効であるＥＰ０４３３２２５開示の方法は、細菌により生産されたＢＭＰ−４に適用した場合、望ましくない低収率の正しく折り畳まれた、生物学的に活性のあるダイマー蛋白を生じることを見いだした。出願人らは、これらの残基のはじめの４つ（Ｎ−末端）がＢＭＰ−２の残基に似ているが、これらの残基のおわりの４つ（Ｃ−末端）が相関的なＢＭＰ−４の残基に似ている分子（「ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４」と呼ぶ）を構築した。さらに出願人らは、これらの残基のＮ−末端側の４つがＢＭＰ−４に似ているが、これらの残基のＣ−末端側の４つが相関的なＢＭＰ−４の残基に似ている分子（「ＢＭＰ−４／ＢＭＰ−２」）と呼ぶ）を構築した。実施例２において説明するように、出願人らは、ＢＭＰ−４／ＢＭＰ−２は良好な収量で再生するが、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４は良好な収量で再生しないことを見いだした。本発明は、少なくとも、残基１０７におけるアミノ酸であるグルタミン酸をコードするヌクレオチドがアスパラギン酸をコードするＢＭＰ−２の相関的なヌクレオチド配列により置換されている、ＢＭＰ−４をコードするＤＮＡ配列よりなるＤＮＡ分子を包含する。さらに、１０７におけるグルタミン酸残基がＢＭＰ−２の相関的なアスパラギン酸残基により置換させているかぎり、ＢＭＰ−４の他のヌクレオチド配列がＢＭＰ−２の相関的なヌクレオチド配列により置換されていてもよいと考えられる。かかるＤＮＡ分子はキメラであってもよく、すなわち、ＢＭＰ−２をコードする配列の一部とＢＭＰ−４をコードする配列の一部が当業者に容易に知られている方法により結合されていてもよい。別法として、このＤＮＡ分子を、合成的に、あるいは化学的手段のごとき突然変異により構築してもよい。当業者に知られた方法により、生成されたＤＮＡ分子を、それ自身とともに（ホモダイマー）あるいはＢＭＰファミリーの別のメンバーとともに（ヘテロダイマー）ダイマー化することができる。
さらに本発明は、ＢＭＰ−５もしくはＢＭＰ−６の残基５６におけるアミノ酸であるアラニン、またはＢＭＰ−７もしくはＢＭＰ−８の残基６３におけるアラニンをコードするヌクレオチド配列がＢＭＰ−２の相関的なヌクレオチド配列により置換されている、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、またはＢＭＰ−８をコードするＤＮＡ配列よりなるＤＮＡ分子を包含する。さらに、５６（ＢＭＰ−７の６３）におけるアラニン、またはＢＭＰ−８の６３におけるセリン残基がＢＭＰ−２の相関的なヒスチジン残基により置換されているかぎり、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−８の他のヌクレオチド配列がＢＭＰ−２の相関的なヌクレオチド配列により置換されていてもよいと考えられる。かかるＤＮＡ分子はキメラであってもよく、すなわち、ＢＭＰ−２をコードする配列の一部とＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７またはＢＭＰ−８をコードする配列の一部が当業者に容易に知られた方法により結合されていてもよい。別法として、このＤＮＡ分子を、合成的に、あるいは化学的手段のごとき突然変異により構築してもよい。当業者に知られた方法により、生成されたＤＮＡ分子をダイマー化することができる。
さらに本発明は、改善された再生特性を有する骨形態形成蛋白の他の変異体を得る方法、および該方法により得られる変異体蛋白からなる。該方法は、まず、本明細書記載の再生方法を用いて十分に再生することがわかっているＢＭＰ（ＢＭＰ+）アミノ酸配列を、かかる方法を用いても十分に再生しないことがわかっているＢＭＰ（ＢＭＰ-）のアミノ酸配列と比較し、次いで、相関的アミノ酸位置における相違を調べることからなる。次に、ＢＭＰ+の相関的なアミノ酸のものとは異なる１個またはそれ以上のアミノ酸がＢＭＰ+の相関的なアミノ酸により置換されるように、ＢＭＰ-のアミノ酸配列を変更する。例えば、ＢＭＰに関するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列における１個またはそれ以上のヌクレオチド突然変異または置換を起こさせることによりかかる修飾アミノ酸を形成することができ、その結果、ＤＮＡ配列は修飾ＢＭＰ蛋白を発現するであろう。次いで、修飾ＢＭＰ蛋白をその再生能に関して試験する。ＢＭＰ+およびＢＭＰ-の配列が異なっている各アミノ酸位置に関してこの方法を繰り返して行って、再生の相違に対して重要であるそれらのアミノ酸残基を同定する。さらに、ＢＭＰ-のアミノ酸配列に対して多数の変化を行ってＢＭＰ+由来の相関的アミノ酸によるアミノ酸置換を行い、修飾ＢＭＰ-蛋白の再生をさらに改善する。修飾ＢＭＰ-蛋白およびそれらをコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内である。
蛋白および核酸の突然変異法は知られており、例えば、サムブルック（Sambrook）ら,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）第２版（コールド・スプリング・ハーバー,Ｎ.Ｙ.:コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor, N.Y.:Cold Spring Harbor press））（１９９０年）参照。さらに、１のアミノ酸残基をコードする１個以上のヌクレオチドトリプレットが存在しうることが知られている。例えば、ヒスチジン残基はＣＡＴまたはＣＡＣのいずれによってコードされていてもよく、アスパラギン酸残基はＧＡＴまたはＧＡＣのいずれによってコードされていてもよい。レーニンジャー（Lehninger）,バイオケミストリー（Biochemistry）,（ワース・パブリッシャーズ（Worth Publishers）,Ｎ.Ｙ.,Ｎ.Ｙ.）。
いずれの細菌種を用いても、本発明方法において再生される組み換えＢＭＰを得ることができる。好ましくは、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）を用いてＢＭＰを含有する封入体を生産する。より好ましくは、シュードモナス（Pseudomonas）を用いて本発明方法において再生されるＢＭＰを含有する封入体を生産する。最も好ましくは、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）を用いて本発明方法において再生されるＢＭＰを含有する封入体を生産する。イー・コリ（E.coli)のいずれの株を用いても、その株が異種蛋白を発現することができるかぎり、本発明方法において再生されるＢＭＰを含有する封入体を生産することができる。１の好ましい株であるイー・コリ株ＧＩ７２４（Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.受託番号５５１５１）を用いて本発明方法において再生されるＢＭＰを含有する封入体を生産してもよい。
本発明の変異体形態のＢＭＰを、知られた方法を用いて細菌において生産してもよい。変異体形態のＢＭＰのＮ末端配列を修飾して細菌における発現を最適化する必要があるかもしれない。例えば、ホルミル−メチオニンとグルタミン間の結合の開裂はイー・コリにおいては能率的でないので、ネイティブな成熟ＢＭＰ−２蛋白のＮ末端（Ｍｅｔ−ｇｌｎ−ａｌａ−ｌｙｓ）をグルタミン残基の欠失により修飾してイー・コリにおける生産により適したＮ末端（Ｍｅｔ−ａｌａ−ｌｙｓ−ｈｉｓ）を得る。他の細菌種は、得られる変異体ＢＭＰの収率を最適化するために類似の修飾を必要とするかもしれない。
ＢＭＰ−４をコードする配列番号：３、ＢＭＰ−５をコードする配列番号：５、ＢＭＰ−６をコードする配列番号：７、ＢＭＰ−７をコードする配列番号：９、またはＢＭＰ−８をコードする配列番号：１１の修飾または未修飾ヌクレオチド配列を、形質転換および細菌におけるそれらの異種蛋白の発現に適したプラスミド中に挿入することができる。選択された細菌においてＢＭＰのごとき異種蛋白の発現を指令することができるかぎり、いかなる細菌発現プラスミドを用いてもよい。満足のできる細菌種は、ビー・ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナスの種、およびイー・コリである。これらの種のそれぞれに適した発現プラスミドは当該分野において知られている。細菌におけるＢＭＰの生産に適するベクターは、タニグチ（Taniguchi）ら,ＰＮＡＳ：ＵＳＡ,第７７巻：５２３０〜５２３３頁（１９８０年）に記載されている。
知られた方法を用いて細菌の発現プラスミドを受容細菌細胞中に形質転換することができる。薬剤耐性を選択圧として用いる場合には適当な薬剤を含有する培地上での増殖に関して、あるいは栄養要求性を選択圧として用いる場合には適当な栄養素を欠損した培地上での増殖に関して形質転換体を選択する。知られた方法を用いて異種蛋白の発現を最適化することができる。かくして得られたＢＭＰは、破砕され遠心分離された細菌のペレット中に見いだされうる不溶性で屈折性の封入体として存在するであろう。
変性剤を用いるかまたは酢酸もしくはトリフルオロ酢酸で酸性にすることにより、かくして得られた封入体を可溶化する。変性剤を用いて可溶化する場合、β−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールのごとき還元剤を変性剤とともに添加する。酸性化により蛋白を可溶化する場合、酸性化の前に蛋白を還元しなくてはならない。サイズ排除クロマトグラフィーまたは交換クロマトグラフィー、あるいは逆相高品質液体クロマトグラフィーのごとき知られたクロマトグラフィー法を用いて可溶化された異種蛋白をさらに精製してもよい。
次いで、ＢＭＰ含有溶液の体積を減じるかまたは真空乾燥してクロマトグラフィー緩衝液を除去し、媒体［適当な媒体は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１.０Ｍ  ＮａＣｌ、２％  ３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルフェート（ＣＨＡＰＳ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  グルタチオン（還元型）、１ｍＭ  グルタチオン（酸化型）；ｐＨ約８.５のもの；再溶解に適する他の媒体は、本明細書のどこかに記載した別の再生用緩衝剤を含む］中に溶解して１ないし１００μｇ／ｍｌの蛋白濃度とする。本発明によれば、より高濃度の蛋白、例えば約１ｍｇ／ｍｌまでの蛋白を再生することもできるが、１００μｇ／ｍｌ以上の濃度では沈殿または凝集物が存在し、よって、活性ＢＭＰホモダイマーまたはヘテロダイマーの収率は低下しうる。
ヘテロダイマーの製造のためには、それぞれが異なるＢＭＰに関するコーディング配列を有する等量の２種のプラスミド（例えば、ＢＭＰ−２をコードしているｐＡＬＢＰ２およびＢＭＰ−ＸをコードしているｐＡＬＢＰＸ（ここにＸは５、６、７または８））を用いて上記方法を行う。プラスミドを別々に培養し、得られる封入体を本明細書記載の方法に従って可溶化し再生させる。再生した蛋白モノマーを等しい割合で一緒に混合し、上のパラグラフにおいて説明したように処理する。ヘテロダイマーを得るためには、培地にＣＨＡＰＳを再生緩衝剤として使用する。得られたダイマー蛋白は、ＢＭＰ−２のホモダイマーならびにＢＭＰ−２／Ｘのヘテロダイマーを含んでいることが観察される。当該分野において知られた方法によりこれらの種を互いに分離することができる。ＢＭＰのヘテロダイマーの製造は、ＷＯ９３／０９２２９においてより完全に説明されており、その開示を参照により本明細書に取り入れる。
蛋白を再生するために、以下の条件および媒体を用いてもよい：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１.０Ｍ  ＮａＣｌ、２％  ３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルフェート（ＣＨＡＰＳ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  グルタチオン（還元型）、１ｍＭ  グルタチオン（酸化型）；ｐＨ約８.５。少し変更を行って、非イオン性界面活性剤、例えばディジトニン、または３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート）のごとき双性イオン性界面活性剤、あるいはＮ−オクチルグルコシドを本発明に用いてもよい。例えば、下記のごとく上記条件および媒体を変更してもよいことを当業者は認識するであろう。かかる変法および変更は本発明の範囲内である。
ＢＭＰｓはその活性状態においてジスルフィド結合したダイマーであるので、本発明方法においてチオール／ジスルフィド結合を形成させる酸化還元系を包含することが有用である。いくつかのかかる酸化還元系が知られている。例えば、酸化または還元された形態のグルタチオン、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトメタノール、システインおよびシスタミンを、オキシダントに対するレダクタントの割合を約１：１０ないし約２：１にして、酸化還元系として用いることができる。グルタチオン酸化還元系を用いる場合、酸化型グルタチオンに対する還元型グルタチオンの割合は、好ましくは０.５：５；より好ましくは１：１；最も好ましくは２：１である。
さらなる変更については、本発明変異体に関する正しく再生された蛋白を生産するためには尿素、グアニジン、アルギニンおよび他の再生手段のごとき他の再生剤が有用である。一般的には、カオトロピック薬剤が１ないし９Ｍの濃度範囲で使用される。尿素が再生剤である場合、好ましくは、尿素は約０.１Ｍないし約３Ｍ、より好ましくは約０.５Ｍないし２.５Ｍ、あるいは約１.０Ｍないし約２.０Ｍの濃度範囲で存在する。
グアニジン塩酸を再生剤として用いる場合、好ましくは、最初にこれを高濃度、例えば７〜８Ｍで添加し、次いで、グアニジン濃度を低下させて再生を誘導する。希釈によりグアニジン濃度の低下は即座に起こり、あるいは透析により徐々に起こりうる。好ましくは、グアニジン濃度を最終濃度約１.５Ｍ未満、より好ましくは約１Ｍ未満にまで低下させる。グアニジン濃度を徐々に低下させる場合、再生蛋白からグアニジンを完全に除去してもよい。グアニジンの希釈は透析よりも好ましい。
アルギニンを再生剤として用いる場合、好ましくは、アルギニンは約０.４Ｍないし約１.５Ｍ、より好ましくは約０.６Ｍないし約１.２５Ｍ、あるいは約０.６Ｍないし約１.０Ｍの濃度範囲で存在する。再生剤のほかに、塩部分を本発明方法に使用してもよい。ＣＨＡＰＳのごとき界面活性剤を用いる場合、塩部分は、好ましくは濃度約０.５Ｍないし約２.０Ｍ、好ましくは約１.０Ｍの、好ましくはＮａＣｌである。尿素が再生剤である場合、塩部分は、好ましくは濃度約０.２５Ｍないし約２Ｍの、好ましくは塩化ナトリウムである。より好ましくは、尿素が再生剤である場合、塩化ナトリウムは約０.５Ｍないし約１.５Ｍの濃度範囲で存在する。最も好ましくは、尿素が再生剤である場合、塩化ナトリウムは約０.７５Ｍないし約１.２５Ｍの濃度範囲で存在する。グアニジンを再生剤として用いる場合、グアミジン濃度を上昇させると塩化ナトリウム濃度も上昇させなくてはならない。例えば、０.２Ｍのグアニジン中での再生に関しては、最適なＮａＣｌ濃度範囲は０.２５Ｍないし０.５Ｍであるが、１.０Ｍのグアニジン中での再生に関しては、最適な再生のために１.０ないし２.０ＭのＮａＣｌが必要である。
尿素が再生剤である場合の本発明の再生反応のｐＨは、好ましくは約７.５ないし約１１；より好ましくは約８.５ないし約１０.５である。ＣＨＡＰＳのごとき界面活性剤を再生剤として用いる場合、ｐＨは、好ましくは約７.５ないし約９.５；より好ましくは約８.５；最も好ましくは約９.５である。アルギニンを再生剤として用いる場合には、好ましくは、ｐＨは約８ないし約１０；より好ましくは約８.５ないし約１０；最も好ましくは約９.５ないし約１０である。
好ましくは、蛋白の再生反応を、約４℃ないし約２３℃の温度範囲で行う。より好ましくは、再生反応を４℃で行う。本発明の再生反応を完了するまで、好ましくは約１６時間進行させる。
得られた骨形態形成蛋白の再生の程度を、非還元または還元的条件下でのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりモニターする。ＢＭＰ−４ホモダイマーは、１６パーセントのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の非還元的条件下で約３０ｋＤのバンドとして出現するであろうし；ＢＭＰ−４モノマーは還元的条件下で約１３ｋＤのバンドとして出現する。ＢＭＰ−２／５ヘテロダイマーは、１６パーセントのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の非還元的条件下で約３５ｋＤのバンドとして出現するであろうし；ＢＭＰ−２モノマーは還元的条件下で約１３ｋＤのバンドとして出現し；ＢＭＰ−５モノマーは還元的条件下で約１５ｋＤのバンドとして出現する。ＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーは、１６パーセントのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の非還元的条件下で約３５ｋＤのバンドとして出現するであろうし；ＢＭＰ−２モノマーは還元的条件下で約１３ｋＤのバンドとして出現し；ＢＭＰ−６モノマーは還元的条件下で約１５ｋＤのバンドとして出現する。ＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーは、１６パーセントのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の非還元的条件下で約３５ｋＤのバンドとして出現するであろうし；ＢＭＰ−２モノマーは還元的条件下で約１３ｋＤのバンドとして出現し；ＢＭＰ−７モノマーは還元的条件下で約１５ｋＤのバンドとして出現する。
再生された骨形態形成蛋白のインビトロでの生物学的活性を、実施例９に示すＷ−２０アッセイによりモニターする。インジケーター細胞系としてのＷ−２０−１７骨髄基質細胞の利用は、ＢＭＰでの処理後におけるこれらの細胞の骨芽細胞様細胞への変化に基づく［アール・エス・シース（R.S.Thies）ら,ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Journal of Bone and Mineral Research）第５巻（２）：３０５頁（１９９０年）；およびアール・エス・シースら,エンドクリノロジー（Endocrinology）第１３０巻：１３１８〜１３２４頁（１９９２年）］。Ｗ−２０−１７細胞は、マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children's Hospital）のディー・ナサン（D.Nathan）博士の研究室の研究者によって、成体マウスから誘導されたクローン性の骨髄基質細胞系である。ＢＭＰでのＷ−２０−１７細胞の処理は、（１）アルカリホスファターゼ産生の増大、（２）甲状腺ホルモンにより刺激されるｃＡＭＰの誘導、および（３）細胞によるオステオカルシン合成の誘導を引き起こす。（１）および（２）は骨芽細胞の表現型に関連した特徴を示すものであり、オステオカルシン合成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される表現型の特性である。さらにそのうえ、現在まで、Ｗ−２０−１７基質細胞の骨芽細胞様細胞への変化は、骨形態形成蛋白での処理によってのみ観察されている。再生された骨形態形成蛋白のインビボでの生物学的活性を、実施例１０に示すように、サムパス（Sampath）およびレディ（Reddi）,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８０巻：６９５１〜６５９５頁（１９８３年）に記載されたラット・骨形成アッセイの改変バージョン（本明細書においてはローゼン−改変サムパス−レディアッセイ（Rosen-modofied Sampath-Reddi assay））と呼ぶ）によりモニターする。
実施例１
ＣＨＡＰＳ系を用いるＢＭＰ−４の再生
−８０℃に保存されている１.０ｇの細胞を測定する。溶液（３.４ｍｌ  １００ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.５）を添加する。細胞が十分に懸濁されるまで溶液をボルテックスで撹拌する。４０μｌのイソプロパノール中１００ｍＭ  ＰＭＳＦを添加する。フレンチプレスにおいて１０００ｐｓｉで細胞を溶解する。封入体をエッペンドルフ微量遠心機中、４℃で２０分間遠心分離してペレットを形成する。上清を傾斜法により捨てる。１個のペレットに１.０ｍｌの脱気した８.０Ｍグアニジン塩酸、０.５Ｍ  ＴＲＩＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.５（２５０ｍＭ  ＤＴＴ含有）を添加する。ペレットを溶解し、アルゴンを液体に３０分間吹き付ける。次いで、溶液を３７℃において１時間インキュベーションする。エッペンドルフ微量遠心機で、２３℃において２〜３分、不溶性物質をペレット化する。０.５〜１.０ｍｌの上清をスペルコ（Supelco）の２ｃｍのガードカートリッジ（ＬＣ−３０４）に注入し、０.１％ＴＦＡ中１〜７０％のアセトニトリルのグラジエント（３５分）を用いて溶離する。ＢＭＰ−４は３０ないし３２分の間に溶離される。フラクションをプールし、アミノ酸含量に基づく理論吸光係数を用いて、０.１％ＴＦＡに対するＡ２８０により蛋白濃度を決定する。
十分な体積のＢＭＰ−４プールを凍結乾燥して１０μｇの蛋白を得る。ガラス製装置で蒸留された水５μｌを添加して残渣を溶解し、次いで、１００μｌの再生混合物（ＴＲＩＳ、塩、ＣＨＡＰＳ等）を添加する。溶液をゆるやかに混合し、２３℃で１〜４日保存する。部分試料を、１２５ボルトで２.５時間ノベックス（Novex）の１６％トリシンゲル上を泳動させ、次いで、クーマシーブルー染色および脱色を行うことによりダイマー形成をアッセイする。
実施例２
他のＢＭＰダイマーの再生
図１を調べることにより、ＢＭＰ−２とＢＭＰ−４は、１番目のシステイン（ＢＭＰ−２の残基１４；ＢＭＰ−４の相関的残基１６）以降は非常に相同的であることがわかる。異なる相関的残基はわずかに８個しかない。これらは、それぞれ、ＢＭＰ−２の残基１５、３９、４６、７３、９５、９６および１０５に存在する。しかし、出願人らは、満足できる量のＢＭＰ−２を再生することに関して有効であるＥＰ０４３３２２５開示の方法は、細菌により生産されたＢＭＰ−４に適用した場合、望ましくない低収率の正しく折り畳まれた、生物学的に活性のあるダイマー蛋白を生じることを見いだした。出願人らは、これらの残基のはじめの４つ（Ｎ−末端）がＢＭＰ−２の残基に似ているが、これらの残基のおわりの４つ（Ｃ−末端）が相関的なＢＭＰ−４の残基に似ている分子（「ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−４」と呼ぶ）を構築した。さらに出願人らは、これらの残基のＮ−末端側の４つがＢＭＰ−４に似ているが、これらの残基のＣ−末端側の４つが相関的なＢＭＰ−４の残基に似ている分子（「ＢＭＰ−４／ＢＭＰ−２」と呼ぶ）を構築した。野生型ＢＭＰ−４に関して上で説明したようにこれらの分子の仕上げを行った。適当な対照蛋白（例えば、野生型ＢＭＰ−４の隣にＢＭＰ−４変異体；ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−５（Δ５６Ｈｉｓ）に対する対照としてＢＭＰ−２および野生型ＢＭＰ−５の混合物）とともにゲル上を泳動させた。
野生型ＢＭＰ−４は十分には再生しなかった。ＢＭＰ−４／ＢＭＰ−２は良好な収率で再生した。しかしながら、ＢＭＰ２／ＢＭＰ−４は良好な収率では再生しない。ＢＭＰ−４（Δ１０７Ａｓｐ）ホモダイマーは野生型ＢＭＰ−４とは対照的に良好な収量で再生する。
ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−５ヘテロダイマーは十分には再生しなかった。ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−５（Δ３９ＨＩＳ）ヘテロダイマーは、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−５とは対照的に良好な収率で再生した。
ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−６ヘテロダイマーは十分には再生しなかった。ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−６（Δ３９ＨＩＳ）ヘテロダイマーは、ＢＭＰ−２／ＢＭＰ−６とは対照的に良好な収率で再生した。
実施例３
イー・コリにおけるＢＭＰの発現
以下の主要な特徴を有する発現プラスミドｐＡＬＢＰ２−７８２を、イー・コリにおけるＢＭＰ−２の生産のために構築した。ヌクレオチド１〜２０６０は、宿主イー・コリ株において抗生物質アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼに関する遺伝子を含む配列を有するプラスミドｐＵＣ１８［ノランダー（Norrander）ら,ジーン（Gene）第２６巻：１０１〜１０６頁（１９８３年）］由来のＤＮＡ配列、および複製開始点由来のｃｏｌＥ１を含んでいる。ヌクレオチド２０６１〜２２２１は、３つのオペレーター配列ＯL１、ＯL２およびＯL３を含むバクテリオファージλ［サンガー（Sanger）ら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）第１６２巻：７２９〜７７３頁（１９８２年）］の大左方プロモーター（ｐＬ）に関するＤＮＡ  ５の配列を含んでいる。該オペレーターはλｃＩリプレッサー蛋白の結合部位であり、該蛋白の細胞内レベルはｐＬからの転写開始量を調節している。ヌクレオチド２２２２〜２７２３は、サンガーら,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー第１６２巻：７２９〜７７３頁（１９８２年）に記載されたバクテリオファージλ由来のヌクレオチド３５５６６から３５４７２までおよび３８１３７から３８３６１までに由来する配列上に含まれている強力なリボゾーム結合配列を含んでいる。ヌクレオチド２７２４〜３１３３は、さらに３'−非翻訳配列の６２個のヌクレオチドを伴う成熟ＢＭＰ−２蛋白をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。ヌクレオチド３１３４〜３１４９は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む「リンカー」ＤＮＡ配列を提供する。ヌクレオチド３１５０〜３２１８は、イー・コリのａｓｐＡ遺伝子［タカギ（Takagi）ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.）第１３巻：２０６３〜２０７４頁（１９８５年）］の転写終結配列を基にした転写終結配列を提供する。ヌクレオチド３１２９〜３６２３はｐＵＣ１８由来のＤＮＡ配列である。
当該分野において知られた制限エンドヌクレアーゼおよび方法を用いて、ｐＡＬＢＰ２−７８１中に含まれるＢＭＰ−２に関するコーディング配列を、イー・コリにおいて生産されることが望まれている別のＢＭＰに関するコーディング配列と容易に置換することができる。ｐＡＬＢＰ２−７８１プラスミドにおいてこの置換を用い、以下の実施例を用いて本発明のすべてのＢＭＰを発現させ再生することができる。ダゲート（Dagert）およびエールリッヒ（Ehrlrich）,ジーン第６巻：２３頁（１９７９年）の方法により、プラスミドｐＡＬＢＰ２−７８１をイー・コリ宿主株ＧＩ７２４（Ｆ,ｌａｃＩq,ｌａｃｐL8,ａｍｐＣ：：λｃＩ+）中に形質転換した。ＧＩ７２４（ＡＴＣＣ受託番号５５１５１）は、ａｍｐＣ遺伝子座の染色体中に安定に組み込まれた野生型λｃＩリプレッサー遺伝子の１コピーを含んでいる（該遺伝子座において該コピーはサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella Typhimurium）のｔｒｐプロモーター／オペレーター配列の転写調節下に置かれている）。ＧＩ７２４においては、最少培地または上記ＩＭＣのごときカザミノ酸補足最少培地のごときトリプトファン不含培地中で増殖している間にのみλＣＩ蛋白が作られる。ＧＩ７２４培養物へのトリプトファンの添加はｔｒｐプロモーターを抑制し、λｃＩ合成をオフにし、ｐＬプロモーターが細胞中に存在すればｐＬプロモーターからの転写誘導を引き起こす。
１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０.５％  ｗ／ｖグルコース、０.２％  ｗ／ｖカザミノ酸および１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを補足したＭ９培地［ミラー（Miller）,「イクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiments in Molecular Genetics）」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー,ニューヨーク（Cold spring Harbor Laboratory, New York）（１９７２年）］からなるＩＭＣ培地を含有する１.５％  ｗ／ｖ寒天プレート上で形質転換体を選択し、ｐＡＬＢＰ２−７８１で形質転換されたＧＩ７２４を３７℃において１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＩＭＣ培地中でＡ550が０.５になるまで増殖させた。次いで、トリプトファンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとして添加し、アンピシリン含有培地でさらに４時間インキュベーションして培養を行った。この間にＢＭＰ蛋白が蓄積し、全細胞蛋白の約１０％となり、すべてが「封入体」フラクション中にあった。
上記イー・コリ形質転換体から得た９グラムの凍結細胞ペレットを、３０ｍｌのＴＥ８.３（１００：１０）緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.３、１０ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル［ＰＭＳＦ］）中で融解した。マイクロフルイダイザー（Microfluidizer）TM［＃ＭＣＦ１００Ｔ型］に３回通すことにより細胞を溶解した。ＴＥ８.３  １００：１０緩衝液で溶解物を希釈して約１２０ｍｌとした。１５０００ｘｇで遠心分離することにより封入体材料を得た。上清を傾斜法で捨て、さらに封入体材料を１％トリトン−Ｘ１００を含有する５０ｍｌのＴＥ８.３（１００：１０）に懸濁した。再懸濁された封入体を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を傾斜法で捨てた。さらにペレットを１％ジチオスレイトール［ＤＴＴ］を含有するＴＥ８.３（２０：１）緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.３,１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に懸濁した。懸濁物をホイートン（Wheaton）のガラスホモジナイザーで均質化した後、氷酢酸でｐＨ２.５にまで酸性化し、次いで、１５０００ｘｇで２５分間遠心分離した。この遠心分離からの上清を集め、セファロース（Sepharose）Ｓ−１００TMサイズ排除カラム（８３ｃｍ  ｘ  ２.６ｃｍ；ベッド約４４０ｍｌ）により２０ｍｌずつクロマトグラフィーを行った。流速１.４ｍｌ／分の１％酢酸移動相を用いてセファロースＳ−１００TMカラムを操作した。２８０ｎｍにおける吸光度により、そしてコンピューターにより計算された吸光係数１８２００Ｍ-1ｃｍ-1ならびに分子量（１２７７７ダルトン）を用いてＢＭＰ−２モノマーに対応するフラクションを検出した。このサイズ排除カラムによりプールした材料を、再生反応の出発物質として用いた。
別法として、上記のごとく細胞を溶解したが、最初の封入体材料ペレットを、８Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ＴＥ８.５（１００：１０）緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８.５、１０ｍＭ  Ｎａ2−ＥＤＴＡ）（１００ｍＭ  ＤＴＴを含有）中に溶解し、３７℃で１時間インキュベーションした。この材料を１２０００ｘｇで１５分間室温で遠心分離した。１％Ｂ緩衝液で平衡化したＣ４分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高品質液体クロマトグラフィー）カラム（ビダック（Vydac）２１４ＴＰ５４）に上清を注入し、流速を１ｍｌ／分とした（Ａ緩衝液＝０.１％トリフルオロ酢酸、Ｂ緩衝液＝９５％アセトニトリル、０.１％トリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］）。５分後、Ｂ緩衝液を３５分かけて１％から７０％にする直線グラジエント（Ａ緩衝液中に希釈）を行い、その間に蛋白が溶離する。２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白をモニターした。ピークのＢＭＰ−２フラクション（２５分ないし３５分の間に溶離）をプールした。２８０ｎｍにおける吸光度により、そして上記のコンピューターにより計算された吸光係数ならびに分子量を用いて濃度を決定した。このＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ４カラムによりプールされた材料もまた再生反応のための出発物質として用いた。
実施例４
イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２の尿素／ＮａＣｌ中での再生
１％酢酸中または０.１％ＴＦＡ、３０〜４０％アセトニトリルを含有する逆相用緩衝液中のＢＭＰ−２を、スピードバキューム（speed vacuum）用いて乾燥または体積を減じ、２〜３マイクロリットルの０.０１％ＴＦＡに再溶解し、５ないし１０分間完全に溶解させた。７Ｍないし８Ｍの尿素、１００ｍＭ  ２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸［ＣＨＥＳ］ｐＨ９.５、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液をＴＦＡ中のＢＭＰ−２に添加し、室温（ＲＴ、約２３℃）で２０分インキュベーションし、次いで、希釈した。用いた蛋白濃度は、希釈状態の最終ＢＭＰ−２濃度が１０ないし１００μｇ／ｍｌとなるようなものであった。再生用緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および使用尿素濃度に応じた望ましい濃度の塩を含有していた。尿素、ＮａＣｌ、ｐＨ、および酸化還元条件のいくつかの範囲を試験してＢＭＰ−２再生条件を最適化した。
１６％トリシン−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いる還元的および非還元的条件下でイー・コリにより生産されたＢＭＰ−２の尿素／ＮａＣｌ中での再生を分析した。
ＢＭＰ−２が非還元的条件下で適切な分子量のダイマーとして現れ、還元的条件下で適切な分子量のモノマーとして現れた場合に再生をポジティブであると評価した。クーマシーブルーまたは銀染色ゲル上のバンドをスキャンすることにより、再生されたＢＭＰ−２の収率を決定した。下記実施例９および１０のアッセイを用いてＢＭＰ−２ダイマーの生物学的活性を試験した。
イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２の尿素およびＮａＣｌ中での再生は、１.０ないし２.０Ｍ尿素および０.７５ないし１.２５Ｍ  ＮａＣｌの範囲において起こった。０.５ないし１.０Ｍならびに２.０ないし２.５Ｍの尿素、および０.５ないし０.７５Ｍならびに１.２５ないし１.５ＭのＮａＣｌの濃度範囲において中程度の強さのＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された。０.１ないし０.５Ｍならびに２.５ないし３Ｍの尿素、および０.２５ないし０.５Ｍならびに１.５ないし２ＭのＮａＣｌの濃度範囲において、再生されたＢＭＰ−２に対応するかすかなバンドが生じるのが観察された。ＢＭＰ−２の再生は７.５ないし１１のｐＨ範囲で起こり、より良好な再生は８.５ないし１０.５のｐＨ範囲で起こり、最適な再生は９ないし１０のｐＨ範囲で起こった。
実施例５
イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２のグアニジン／ＮａＣｌ中での再生
１％酢酸中または０.１％ＴＦＡ、３０〜４０％アセトニトリルを含有する逆相用緩衝液中のＢＭＰ−２を、スピードバキューム（speed vacuum）用いて乾燥または体積を減じ、２〜３マイクロリットルの０.０１％ＴＦＡに再溶解し、５ないし１０分間完全に溶解させた。８Ｍないし８.５ＭのグアニジンＨＣｌ（グアニジン）、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９.５、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液をＴＦＡ中のＢＭＰ−２に添加し、室温で２０〜３０分インキュベーションし、次いで、希釈した。用いた蛋白濃度は、希釈状態の最終蛋白濃度が１０ないし１００μｇ／ｍｌとなるようなものであった。
適当量のＮａＣｌおよび５０〜１００ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９.５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、１ｍＭ  酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を用いてグアニジン／ＢＭＰ溶液を冷再生用緩衝液（氷上）中に希釈した。氷上にある間（１５分）、試料にアルゴンをバブリングし、次いで、４℃でインキュベーションした。
上記実施例４で説明したように、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて還元的および非還元的条件下でイー・コリにより生産されたＢＭＰ−２のグアニジン中での再生を分析した。
イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２のグアニジン中での再生は０.１８ないし１.０Ｍのグアニジンの範囲で最適に起こった。０ないし０.１８Ｍならびに１.０ないし１.２５Ｍのグアニジンの濃度範囲で中程度の強度のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された。１.２５ないし１.５Ｍのグアニジンの濃度範囲において、再生されたＢＭＰ−２に対応するかすかなバンドが生じるのが観察された。ＢＭＰ−２の再生は７.５ないし９.５のｐＨ範囲で起こり、より良好な再生はｐＨ８.５で起こり、最適な再生はｐＨ９.５で起こった。ＢＭＰ−２の再生は、ある程度の再生は室温（約２３℃）で観察されたが４℃において最適であった。
実施例６
イー・コリにより生産されたＢＭＰ−２のアルギニン／ＮａＣｌ中での再生
１％酢酸中または０.１％ＴＦＡ、３０〜４０％アセトニトリルを含有する逆相用緩衝液中のＢＭＰ−２を、スピードバキューム（speed vacuum）用いて乾燥または体積を減じ、２〜３マイクロリットルの０.０１％ＴＦＡに再溶解し、５ないし１０分間完全に溶解させた。用いた蛋白濃度は、希釈状態の最終蛋白濃度が１０ないし１００μｇ／ｍｌとなるようなものであった。再生用緩衝液は、適当なｐＨに滴定された１００ｍＭの緩衝剤、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび望ましい濃度の塩を含有していた。上記実施例４で説明したように、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて還元的および非還元的条件下でイー・コリにより生産されたＢＭＰ−２のグアニジン中での再生を分析した。ＢＭＰ−２を再生させるために用いたすべてのアルギニン濃度においてはっきりとしたバンドが観察された；しかしながら、ＢＭＰ−２の最大収率は、０.６Ｍないし０.８Ｍのアルギニンおよび０ないし０.２５ＭのＮａＣｌを用いて得られた。ＢＭＰ−２再生を促進させる能力に関していくつかのタイプの塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、Ｎａ2ＳＯ4）を試験した。これらのうち、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ2は最適量の再生ＢＭＰ−２を生じ、ＭｇＳＯ4は中程度の再生ＢＭＰ−２を生じた。アルギニン中におけるＢＭＰ−２再生に最適なｐＨ範囲はｐＨ９.５ないし１０である。再生はｐＨ８.５においても起こった。アルギニン中のＢＭＰ−２再生は、室温（約２３℃）においてある程度の再生が観察されたが、４℃において最適であった。
実施例７
有機アルコールを用いるＢＭＰ−２の再生
すでに説明したように調製した１％酢酸中の変性したモノマーＢＭＰ−２（およびＢＭＰ−６）をエッペンドルフ管に入れ、凍結乾燥した。ペレットを０.０１％トリフルオロ酢酸２０μｌに溶解した。次いで、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１.０Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  還元型グルタチオン、１ｍＭ  酸化型グルタチオン、および１０〜２０％メタノール、エタノールまたはイソプロパノールを含有する緩衝液５００μｌを添加した。試料を室温で３日間インキュベーションし、１６％ノベックス（Novex）トリシンゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりダイマー形成について評価した。銀染色後、少量であるが明確な量のＢＭＰ−２ダイマーが検出された。同じゲル上にはＢＭＰ−２／６ヘテロダイマーまたはＢＭＰ６／６ホモダイマーは確認されなかった。
実施例８
ダイマーＢＭＰ−２の精製
尿素により再生されたＢＭＰ−２蛋白を、流速１ｍｌ／分の１０％のＢ緩衝液に対して平衡化したＨＰＬＣ  Ｃ４カラム（ビダック  ２１４ＴＰ５４）上に注入した（Ａ緩衝液＝０.１％ＴＦＡ、Ｂ緩衝液＝９５％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡ）。１５分後、１０％から５０％までのＢ緩衝液の直線的グラジエントを４０分間にわたり行い、その間、ダイマーＢＭＰ−２蛋白が溶離した。２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白をモニターした。ピークＢＭＰ−２ダイマーフラクション（４５ないし４８分の間に溶離）をプールし、１６％トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、実施例９および１０において説明するアッセイにおいて生物学的活性について試験した。
実施例９
Ｗ−２０アルカリホスファターゼアッセイプロトコール
Ｗ−２０細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにウェルあたり２００μｌの培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥ）中１００００個の割合で撒く。９５％空気、５％ＣＯ2のインキュベーター中３７℃において細胞を一晩付着させる。
マルチチャンネルピペッターで各ウェルから２００μｌの培地を除去し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するＤＭＥ中の同体積の試験試料で置換した。試験物質を３系で分析する。
試験試料および標準をＷ−２０インジケーター細胞とともに２４時間インキュベーションする。２４時間後、３７℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。
Ｗ−２０細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝化セイラインで３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。
ガラス製装置で蒸留された５０μｌの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍するためにドライアイス／エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイス／エタノール浴から取り出し、３７℃で融解させる。この工程を２回以上繰り返して全部で３回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスファターゼを測定に用いることができる。
５０μｌの分析混合物（５０ｍＭグリシン、０.０５％トリトンＸ−１００、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  リン酸ｐ−ニトロフェノール、ｐＨ＝１０.３）を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、１分間に６０回振盪しながら３７℃で３０分インキュベーションする。
３０分間のインキュベーションの終わりに、１００μｌの０.２Ｎ  ＮａＯＨを各ウェルに添加し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。
各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知基準と比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量のリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Ｉに示す。
0003704350.tif 000002
既知量のＢＭＰに関する吸光度値を決定し、表IIに示すような単位時間あたり開裂されたリン酸ｐ−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。
0003704350.tif 000003
次いで、これらの値を用いて既知量の新規ＢＭＰ処方の活性を既知の活性ＢＭＰ処方と比較する。
実施例１０
ローゼン−改変サムパス−レディアッセイ
上記サムパス−レディ法のエタノール沈殿工程を、アッセイすべきフラクションを水に対して透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）することに置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０.１％ＴＦＡに再溶解し、得られた溶液を２０ｍｇのラット・マトリックスに添加する。蛋白処理していない疑似ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結し、凍結乾燥して得られた粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。２１〜４９日齢のリロング・エバンズ・ラット（Long Evans rat）の腹胸部の皮下にカプセルを移植する。移植物を７〜１４日後に取る。各移植物の半分をアルカリ性ホスファターゼアッセイ［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.NAtl.Acad.Sci.）第６９巻：１６０１頁（１９７２年）］に用いる。
各移植物のもう半分を固定し、組織学的分析用に処理する。１ミクロンのグリコメタクリレート切片をフォン・コッサおよび酸フクシンで染色して各移植物において誘導された骨および軟骨の形成の評点をつける。＋１ないし＋５は、新たな骨および／または軟骨細胞ならびにマトリックスにより占められた移植物の各組織学的切片の面積を表す。＋５の評点は、移植物の５０％よりも多くの部分が、移植物における蛋白の直接の結果として生成された新たな骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１は、それぞれ、移植物の４０％、３０％、２０％および１０％よりも多くの部分が新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
（ｉｉ）発明の名称：骨形態形成蛋白変異体
（ｉｉｉ）配列の数：１２
（ｉｖ）連絡先：
（Ａ）宛て名：ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド−リーガル・アフェアーズ
（Ｂ）通り名：ケンブリッジパーク・ドライブ８７番
（Ｃ）都市名：ケンブリッジ
（Ｄ）州名：マサチューセッツ
（Ｅ）国名：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：０２１４０
（ｖ）コンピューターリーダブルフォーム：
（Ａ）メディウムタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトゥエア：PatentIn Release #1.0,バージョン#1.25
（ｖｉ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先の出願データ：
（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／１６３,８７７
（Ｂ）出願日：１９９３年１２月７日
（ｖｉｉｉ）代理人等の情報：
（Ａ）氏名：レイザー,スティーブン・アール
（Ｂ）登録番号：３２,６１８
（Ｃ）代理人等における整理番号：ＧＩ５２１９−ＰＣＴ
（ｉｘ）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話：６１７  ４９８−８２６０
（Ｂ）テレファックス：６１７  ８７６−５８５１
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｂｍｐ−２
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３４２
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：
0003704350.tif 000004
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
0003704350.tif 000005
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３４８塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｂｍｐ−４
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３４８
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：
0003704350.tif 000006
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：
0003704350.tif 000007
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３９６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｂｍｐ−５
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３９６
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
0003704350.tif 000008
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１３２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：
0003704350.tif 000009
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４０６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｂｍｐ−６
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．３９６
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：
0003704350.tif 000010
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１３２アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：
0003704350.tif 000011
（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４１７塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ｂｍｐ−７
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．４１７
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：
0003704350.tif 000012
（２）配列番号：１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：
0003704350.tif 000013
（２）配列番号：１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：２本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ＢＭＰ−８
（ｉｘ）特徴：
（Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１．．４１７
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：
0003704350.tif 000014
（２）配列番号：１２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１３９アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：蛋白
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：
0003704350.tif 000015
【図１】
0003704350.tif 000016