(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１５塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、
のいずれかを含有するＤＮＡからなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ。
【請求項２】
下記の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を有し、かつクラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するＤＮＡからなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ。
（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１５塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ
【請求項３】
請求項１または２記載のプローブを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法。
【請求項４】
請求項１または２記載のプローブを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬。
【請求項５】
（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１５塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、
のいずれかを含有するＤＮＡからなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プライマー。
【請求項６】
下記の（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を有し、かつクラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するＤＮＡからなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プライマー。
（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１５塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ
【請求項７】
配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、又は該ＤＮＡに相補的なＤＮＡのいずれかを含有するＤＮＡからなるプライマーと、配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、又は該ＤＮＡに相補的なＤＮＡのいずれかを含有するＤＮＡからなる別のプライマーとを含む、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プライマーセット。
【請求項８】
請求項５もしくは６記載のプライマー、または請求項７記載のプライマーセットを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法。
【請求項９】
配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを含有するプライマーと配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを含有するプライマーとを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法。
【請求項１０】
請求項５もしくは６記載のプライマー、または請求項７記載のプライマーセットを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬。
【請求項１１】
配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡを含有するプライマーと配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを含有するプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ及びプライマー、該プローブ又はプライマーを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法、並びに該プローブ又はプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬に関する。本発明は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の診断薬の製造において有効に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
クラミジア(Chlamydia)属に属する微生物は、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クラミジア・シッタシ(Chlamydia psittaci)、クラミジア・ペコラム(Chlamydia pecorum)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)等の種（Species）が知られている。
クラミジア・ニューモニエは肺炎、上気道炎などの呼吸器感染症の原因菌として広く蔓延していることが知られており、クラミジア・ニューモニエ感染症の治療には適切な抗生物質を投与することが必要である。しかし、クラミジア・ニューモニエが引き起こす呼吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエやインフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのため、治療に際してはクラミジア・ニューモニエに感染しているか否かを調べる必要がある。
【０００３】
特定の微生物に感染しているか否かを調べる方法としては遺伝子検査法がある。これは、核酸プローブ等を用いて検体中に検出対象の微生物の遺伝子が存在するか否かを調べる方法である。
クラミジア・ニューモニエの遺伝子検査法としては、特表昭６４−５０００８３号公報、米国特許第５，２８１，５１８号公報、及びＷＯ９４／０４５４９号公報に記載された方法が知られている。
しかし、特表昭６４−５０００８３号公報及び米国特許第５，２８１，５１８号公報には、クラミジア・ニューモニエ染色体ＤＮＡそのもの又は染色体ＤＮＡを制限酵素等で分解して得られるＤＮＡ断片をプローブとして用いることが記載されているだけであり、これらのＤＮＡの塩基配列は明らかではなく、それゆえ、プローブの特異性が定かではなく、また反応条件の設定も困難である。
【０００４】
一方、ＷＯ９４／０４５４９号公報に記載された方法は、リボソームＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いるものであるが、リボソームＲＮＡはすべての生物において比較的相同性が高いため、このプローブの特異性も定かではない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適なプローブを提供するものである。
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に好適なプローブを提供するものである。
請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に好適なプローブを提供するものである。
請求項４記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定法を提供するものである。
請求項５記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定用試薬を提供するものである。
【０００６】
請求項６記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適なプライマーを提供するものである。
請求項７記載の発明は、請求項６記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に好適なプライマーを提供するものである。
請求項８記載の発明は、請求項６記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に好適なプライマーを提供するものである。
請求項９記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定法を提供するものである。
請求項１０記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適な測定用試薬を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡから、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを取得し、その塩基配列を解読・解析することによって本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１０）に関するものである。
（１）（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ。
（２）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記（１）記載のプローブ。
（３）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記（１）記載のプローブ。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法。
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のプローブを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬。
【０００９】
（６）（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プライマー。
（７）塩基配列が配列番号２の塩基配列である、上記（６）記載のプライマー。
（８）塩基配列が配列番号３の塩基配列である、上記（６）記載のプライマー。
（９）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のプライマーを用いる、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法。
（１０）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のプライマーを含有してなるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において使用した略号の意味は以下の通りである。
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン−５′−三リン酸（deoxyadenosine 5′-triphosphate）
ｄＣＴＰ：デオキシシチジン−５′−三リン酸（deoxycytidine 5′-triphosphate）
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン−５′−三リン酸（deoxyguanosine 5′-triphosphate）
ｄＴＴＰ：デオキシチアミン−５′−三リン酸（deoxythiamin 5′-triphosphate）
【００１１】
クラミジア・ニューモニエ遺伝子
本発明において、クラミジア・ニューモニエ遺伝子としては、例えば、クラミジア・ニューモニエに特異的な遺伝子が挙げられ、クラミジア・ニューモニエに特異的な遺伝子としては、例えば、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの遺伝子が挙げられる。
クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列を有する。この抗原ポリペプチドは、配列番号１において併記されるアミノ酸配列を有し、クラミジア・ニューモニエに特異的である。
【００１２】
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用プローブ及びプライマー
本発明のプローブ及びプライマーは、
（ａ）配列番号１のＤＮＡの中の連続した少なくとも１０塩基の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）上記（ａ）のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、又は
（ｃ）上記（ａ）若しくは（ｂ）のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、のいずれかを含有するＤＮＡからなる。
塩基配列の長さとしては、１０〜５０塩基が好ましく、より好ましくは１５〜２０塩基である。
本発明のプローブ及びプライマーの具体例としては、例えば、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡや配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００１３】
本発明のプローブ及びプライマーは市販のＤＮＡ合成装置を使用して容易に合成することができる。ＤＮＡ合成装置はアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社等で販売されている。また、予め短いＤＮＡ断片を化学合成し、これをプライマーとして後述のＰＣＲ法を行って長いＤＮＡ断片を作製することもできる。
【００１４】
本発明のプローブ及びプライマーには、上記ＤＮＡを標識物で標識されたものも含まれる。
標識物としては、例えば、ビオチン（Biotin）、アビジン（Avidin）、ストレプトアビジン（Streptoavidin）、ディゴキシゲニン（Digoxigenin）等の化学物質、アルカリフォスファターゼ（Alkaline phosphatase）、ルシフェラーゼ（Luciferase）、ペルオキシダーゼ（Peroxidase）、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）等の酵素、フルオレセイン（Fluorescine）等の蛍光物質がある。プローブにビオチンを付加させるには、例えば、ターミナルトランスフェラーゼ（Terminal transferase）存在下で、プローブにビオチン化されたデオキシウリジン−５′−三リン酸（deoxyuridine 5′-triphosphate）を添加する。ターミナルトランスフェラーゼやビオチン化されたデオキシウリジン−５′−三リン酸はキットとしてベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)社から購入できる。ビオチン以外の標識物を付加する場合も市販のキットを使用することができ、このようなキットは宝酒造(株)や東洋紡(株)から購入できる。また、「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニング第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）(1989年)」（J.Samblook et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）、以下、本文献を文献″モレキュラー・クローニング″という）に記載されている方法に従って標識物を付加させてもよい。
【００１５】
また、標識物としては放射性同位元素を利用することもでき、その場合は例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）存在下、これに（γ−32Ｐ）ｄＡＴＰを添加する。放射性同位元素で標識する一般的手法は文献”モレキュラー・クローニング”に記載されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼは東洋紡(株)から、（γ−32Ｐ）ｄＡＴＰは(株)アマシャムから購入できる。
【００１６】
なお、構成成分がＤＮＡである本発明のプローブやプライマーの代わりに、本発明のプローブやプライマーの塩基配列に対応するＲＮＡ、即ち、塩基としてチミンがウラシルに置換され、糖としてデオキシリボースがリボースに置換された核酸、も本発明のプローブやプライマーとして使用でき、これらの構成成分がＲＮＡであるプローブやプライマーも本発明の測定法や測定用試薬に使用することがてきる。
【００１７】
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法
本発明のプローブを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法としては、例えば、検体中のＤＮＡを電気泳動して分子量で分離し、そのＤＮＡをニトロセルロースフィルターやナイロンメンブレン等に移して固定し、標識化された本発明のプローブを添加し、標識を測定する方法を利用することができる。この方法は、一般にサザンブロット法と呼ばれており、その一般的手法は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
なお、本発明において、「測定」は定量的又は半定量的な測定だけでなく、定性的な測定（検出等）も意味する。
【００１８】
本発明のプライマーを用いるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定法としては、例えば、ＰＣＲ法を利用することができる。ＰＣＲ法については後述するが、本発明のプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用してクラミジア・ニューモニエ遺伝子を測定する方法の具体的な工程としては、例えば、下記の工程が挙げられる。
（ア）ＤＮＡを含む検体に、本発明のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む緩衝液を添加し、加熱する。
（イ）冷却し、保温し、加熱する。
（ウ）（イ）の操作を繰返す。
（エ）反応液に含まれるＤＮＡを測定する。
【００１９】
工程（ア）のＤＮＡを含む検体としては、例えば、患者の咽頭部綿棒擦過材料等から核酸を抽出したものがある。
工程（ア）のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼを使用することができる。タックポリメラーゼは東洋紡(株)から購入できる。
工程（ア）の加熱は、例えば、９０℃〜１００℃で０．５〜１０分間静置する。
工程（イ）の冷却は、例えば、４５℃〜６５℃で０．５〜５分間静置し、保温は、例えば、７０℃〜８０℃で１〜１０分間静置し、加熱は、例えば、９０℃〜１００℃で０．５〜５分間静置する。
工程（ア）の加熱操作や工程（イ）の冷却、保温及び加熱の操作は、ＤＮＡサーマルサイクラー（DNA thermal cycler）(登録商標)（パーキン−エルマー  シータス（Perkin-elmer Cetus）製）を使用して行うことができる。
【００２０】
工程（ウ）の繰返し回数は特に限定されないが、通常、３０回程度繰り返す。工程（エ）の反応液に含まれるＤＮＡを測定する方法としては、例えば、反応液を臭化エチジウム含有アガロースゲルを用いて電気泳動して反応液に含まれているＤＮＡを分子量で分離し、紫外線を照射する方法を利用することができる。使用した本発明のプライマーが標識物で標識されている場合はその標識を利用してＤＮＡを測定することができる。
なお、一度工程（ア）〜工程（ウ）を行った後、添加する本発明のプライマーを別の塩基配列のものにし、再度工程（ア）〜工程（ウ）を行ってから工程（エ）に入ってもよい。
【００２１】
クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬
本発明のクラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定用試薬としては、例えば、本発明のプローブ又はプライマーを含む水溶液が凍結された状態でプラスチック製の容器に納められているものがある。
【００２２】
次に、クラミジア・ニューモニエからクラミジア・ニューモニエ遺伝子をクローニングする方法について詳しく説明する。
クラミジア・ニューモニエの培養
培養したＨＬ細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを感染させておき、この細胞をＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した水溶液、pH７．４〜７．６）に懸濁し、この動物細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して上清（クラミジア・ニューモニエの浮遊液）を取得する。クラミジア・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニューモニエＹＫ４１株(金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジー、37巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et al., Microbiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))が使用できる。培養したＨＬ細胞等から細胞浮遊液を調製し、培養上清を除去した後に前記クラミジア・ニューモニエ浮遊液を添加して培養し、遠心分離し、細胞内でクラミジア・ニューモニエが増殖したクラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を取得する。
【００２３】
クラミジア・ニューモニエの基本小体の精製
クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリング社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されていることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンドを回収する。
【００２４】
クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡの調製
クラミジア・ニューモニエの基本小体を、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸  （ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）（以下、ＴＥ緩衝液という。）に懸濁し、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液を加えて保温し、基本小体を溶解させる。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌し、遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得する。
【００２５】
ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及びＡｌｕＩで消化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化ＤＮＡを取得する。この部分消化ＤＮＡにリンカー、アデノシン−５′−三リン酸（adenosine 5′-triphosphate、以下、ＡＴＰと略す。）及びＴ４リガーゼを添加して、部分消化ＤＮＡにリンカーを付加させる。
これを、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン６０００（Chroma spin 6000）カラムにかけ、溶出液を分取し、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収する。得られた分画にＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化する。反応液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、５′端がリン酸化されたＤＮＡ断片を取得する。
【００２６】
このＤＮＡ断片に、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断しておいたλgt11ＤＮＡ、ＡＴＰ及びＴ４リガーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングし、ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを作製する。
【００２７】
クラミジア・ニューモニエの遺伝子のクローニング
次に、クラミジア・ニューモニエに特異的である５３ＫＤａの抗原ポリペプチドの遺伝子を例に挙げ、クラミジア・ニューモニエの遺伝子のクローニング方法を説明する。
【００２８】
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の培養液に上記ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーを感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルターを利用して、挿入ＤＮＡの発現により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロースフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清アルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次いでフィルターをクラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体と反応させる。クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体としては、例えば、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８やＳＣＰ５３を使用することができる。ＡＹ６Ｅ２Ｅ８を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１５４として寄託されている。また、ＳＣＰ５３を産生するハイブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー、132巻、583-588頁(1994)（J. Clin. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994）に記載されている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダーゼ等の酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を反応させる。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加して反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水素水溶液及び４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィルターを洗浄し、風乾させる。
【００２９】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性の前記ポリペプチドを発現するλファージを取得する。
【００３０】
抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの取得
取得したλファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株に感染させ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキットを用いてλファージからＤＮＡを取得・精製する。このＤＮＡにプライマー、タックポリメラーゼ（Taq Polymerase）及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたＤＮＡを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11・フォワード・プライマー（λgt11 forward primer）及びλgt11・リバース・プライマー（λgt11 reverse primer）（いずれも宝酒造株式会社製、商品名）が挙げられ、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリタック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA Polymerase）（宝酒造株式会社製、商品名）がある。このＤＮＡ増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００３１】
増幅されたＤＮＡを取得し、塩基配列を決定・解析する。ＤＮＡの取得には市販のキットを使用することができ、例えばウイザード・ＰＣＲ・プレップキット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製、商品名）を使用することができる。また、塩基配列を決定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売されているキットを使用することができる。また、分析にあたっては市販の機械、例えば、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社）を利用することができる。
【００３２】
塩基配列の決定後、得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトとしては、「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いることができる。
解析の結果、完全長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されているＤＮＡの前後のＤＮＡをゲノムウォーキングによって取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造(株)から販売されているキットを使用することができる。
一旦、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡが取得されると、遺伝子組換え法や前述したＰＣＲ法を利用することによって、そのＤＮＡを複製させることができるので、クラミジア・ニューモニエの基本小体から抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを再度取得する操作は不要である。
【００３３】
遺伝子組換え法を用いる方法は、例えば、次のようにして行うことができる。まず、取得された前記ＤＮＡを上述したように既存のプラスミドベクターやファージベクター等に挿入して組換えベクターを作製し、その組換えベクターを宿主に入れて形質転換体を作製し、その形質転換体を培養する。この培養により形質転換体内で組換えベクターが増幅されるので、その形質転換体から増幅された組換えベクターを取得し、制限酵素を用いて前記ＤＮＡを切り出す。形質転換体から増幅された組換えベクターを取得する操作は、例えば、次のようにして行うことができる。組換えベクターがプラスミドである場合、その形質転換体を破砕し、フェノール／クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、ＤＮＡを取得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用い、取得したＤＮＡを超遠心分離し、組換えベクターをプラスミドＤＮＡとして取得する。一方、組換えベクターがファージである場合、その形質転換体を破砕し、ファージ粒子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベクターをファージＤＮＡとして取得する。
【００３４】
ＰＣＲ法を利用する方法としては、例えば、増幅させようとするＤＮＡの両末端の塩基配列を基にして化学合成法によりプライマーＤＮＡを作製し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行えばよい。
遺伝子組換え法やＰＣＲ法を用いてＤＮＡを複製させる方法の一般的手法は文献″モレキュラー・クローニング″に記載されている。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
以下の実施例において、使用したモノクローナル抗体は、ＳＣＰ５３及びＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。ＳＣＰ５３は、本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニエＫＫｐｎ−１株を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブリドーマＳＣＰ５３が分泌する抗体であり、また、ＡＹ６Ｅ２Ｅ８は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体を抗原として、マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合させて得られたハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が分泌する抗体ＡＹ６Ｅ２Ｅ８である。
【００３６】
表１に示されるように、モノクローナル抗体のＳＣＰ５３及びAY6E2E8は C.ニューモニエに特異的である。
【００３７】
【表１】
0003711613.tif 000002
【００３８】
モノクローナル抗体の作製方法については後述する。
以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドの遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定まで、順を追って説明する。
【００３９】
実施例１  クラミジア・ニューモニエ特異的５３Ｋ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製
（Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養
予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm2）の底面いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液８mlと１０％牛胎児血清含有ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混合液４mlずつを６ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。
【００４０】
（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１の培養
クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株（金本ら：Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,1993）を用いた。取得したＨＬ細胞に予めクラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株を感染させておき、この細胞をＳＰＧ液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、これに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、クラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。
６ウェルプラスチック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラミジア・ニューモニエ浮遊液を１ウェルあたり２ml加えて、２，０００rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/mlシクロヘキシミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収した。これを８，０００rpmで３０分間遠心分離して、沈殿をＳＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。
【００４１】
（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１の基本小体の精製
−７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹＫ−４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧに懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【００４２】
別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液  （pH７．４）、次いで、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量との混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量のＳＰＧ液を加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧ液に懸濁した。遠心分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００rpmで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエＹＫ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁したバンドを回収し、これをＳＰＧ液で２倍に希釈し、１００００rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳＰＧ液に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標準とした）後、−７０℃で保存した。
【００４３】
（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡの調製
上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本小体の懸濁液３００μｌ（タンパク質濃度：１．３７mg/ml）を４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。沈殿に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液pH８．０（以下、ＴＥ緩衝液という）５００μｌを加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を３００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。１％ＳＤＳ水溶液３０μｌ及び１mg/mlプロテイナーゼＫ水溶液３０μｌを加え、５６℃で３０分間インキュベートし、基本小体を溶解させた。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽出）。この抽出操作はもう一度繰り返した。１０mg/mlのＲＮａｓｅ溶液を２μｌ加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＲＮＡを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）の混合液（以下、ＰＣＩという。）３００μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した。この操作を合計５回繰り返した。
【００４４】
得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分間放置し、ＤＮＡを析出させた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、これにＴＥ２００μｌを加えて溶かし、−２０℃に保存した。
【００４５】
（Ｅ）ゲノムＤＮＡ発現ライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡ溶液１００μｌに、制限酵素用M-buffer１０μｌ、制限酵素混合液（ＡｃｃＩ、ＨａｅIII及び１／５０希釈のＡｌｕＩ各０．４μｌとＴＥ２０μｌを混合）１０μｌを加え、３７℃で２０分間反応させた。なお、上記２０分の反応時間は、ＤＮＡが１ｋｂｐ〜７ｋｂｐの大きさの部分消化ＤＮＡに分解される時間で、予め少量のゲノムＤＮＡを用いて試験した。上記反応液にＰＣＩを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーでよく混ぜ、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した。これに３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１０μｌ及びエタノール２２０μｌを加え、−８０℃に１５分間静置し、部分消化ＤＮＡを析出させた。４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、沈殿に７０％エタノール水溶液５００μｌを加えて混ぜ、再び、１２，０００rpmで５分間遠心分離した。上清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
【００４６】
得られた部分消化ＤＮＡを精製水２０μｌに溶かし、その１９μｌをとり、これに下記化１で示すリンカー（２０pmole/μl）１４μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ４ ．５μｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール及び５００μg/ml牛血清アルブミン含有０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液という）４．５μｌ、精製水２μｌ及びＴ４リガーゼ１μｌを加え、１６℃で４時間反応させ、リンカーを付加させた。
【化１】
0003711613.tif 000003
【００４７】
リンカーを付加させた部分消化ＤＮＡを、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラムにかけた。溶出液２滴ずつを分取し、各分画の一部を０．８％アガロースゲル電気泳動で分析して、１ｋｂｐから７ｋｂｐのＤＮＡ断片を含む分画を回収した。得られた分画１４４μｌに、精製水１３μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２０μｌ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン塩酸塩及び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．６、以下、１０倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。）２０μｌ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ３μｌを加え、３７℃で３０分間反応させ、ＤＮＡ断片の５′端をリン酸化した。ＰＣＩ ２００μｌを加えてよく振り混ぜた後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、水層を回収した。２０mg/mlグリコーゲン水溶液１μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液２０μｌ及びエタノール４００μｌを加えてヌクレオチドを析出させた。４℃、１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿に７０％エタノール２００μｌを加え混ぜ、再び遠心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水１μｌを加え溶かした。
【００４８】
この液０．６μｌに、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したλgt11 ＤＮＡ（１μg/μl、ストラタジーン（Stratagene）社）１μｌ、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液０．５μl、１０ｍＭ ＡＴＰ０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．４μｌ及び精製水２μｌを加え、４℃で一晩反応させた。次いで、ギガパック（Gigapack）II Goldパッケージングキット（ストラタジーン社）を用い、得られた組換えλgt11ＤＮＡをパッケージングした。
【００４９】
（Ｆ）クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体の作製
骨髄腫細胞株の培養及び継代
モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）である。１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、継代した。細胞融合に供する２週間前に、０．１３ｍＭの８−アザグアニン、０．５μg/mlのＭＣ−２１０（マイコプラズマ除去剤、大日本製薬(株)製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養し、その後の１週間は通常の培地で培養した。
【００５０】
マウスの免疫
タンパク質の濃度が２７０μg/mlの上記基本小体の懸濁液２００μｌを、１２０００rpmで１０分間遠心分離し、沈殿に２００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁した。これに２００μｌのフロイントコンプリートアジュバントを加え、エマルジョンとし、その１５０μｌをマウスの背中の皮下に注射した（この日を０日目とする）。１４日目、３４日目及び４９日目に、タンパク質の濃度が２７０μg/mlの精製基本小体の懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射した。更に、６９日目にタンパク質の濃度が８００μg/mlの精製基本小体の懸濁液５０μｌ、９２日目に同懸濁液１００μｌをマウスの腹腔内に注射し、９５日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。
【００５１】
細胞融合
免疫したマウスの脾臓から得られた脾細胞１０8個に対して骨髄腫細胞１０7個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、１４００rpmで５分間遠心分離し、上清を除去した後、細胞を更によく混合した。予め３７℃に保温しておいた３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含むＲＰＭＩ１６４０培地０．４mlを加え、３０秒間放置した。７００rpmで６分間遠心分離した後、ＲＰＭＩ１６４０培地１０mlを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転させ、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に５mlのＨＡＴ培地を加え、５分間放置した。更に１０〜２０mlのＨＡＴ培地を加え、３０分間放置した後、骨髄腫細胞濃度が３．３×１０5/mlとなるようにＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピペットを用い９６ウェルプラスチック製培養容器のウェルに２滴ずつ分注した。５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、１日後、７日後及び１４日後にウェルにＨＡＴ培地を１〜２滴加えた。
【００５２】
抗体生産細胞のスクリーニング
精製したクラミジアニューモニエＹＫ４１の基本小体を１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで可溶化し、０．０２％アジ化ソーダ含有０．０５Ｍ重炭酸ソーダ緩衝液（pH９．６）に対して透析したのち、タンパク質濃度が１μg/mlとなるように希釈した液を、塩化ビニル製９６ウェルＥＩＡ用プレートのウェルに５０μｌとり、４℃で一晩放置し、抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳ１５０μｌを加え、３分間放置し、その後除去・洗浄した。洗浄操作を更に１回行なった後、ウェルに１％（ｖ／ｖ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ１００μｌを加え、４℃で一晩放置し、ブロッキングを行なった。牛血清アルブミンを含むＰＢＳを除いた後、０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に２回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を５０μｌ加え、室温で２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルに２５ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を５０μｌ加え、室温で２時間放置した。０．０２％（ｗ／ｖ）ツィーン２０を含むＰＢＳで同様に３回洗浄後、ウェルにＡＢＴＳ溶液（ＫＰＬ社製）を５０μｌ加え、室温で１５分〜１時間放置して発色反応させた後、９６ウエルＥＩＡプレート用光度計で４０５nmの吸光度を測定した。
【００５３】
この結果、陽性のウエルが見出され、その培養上清中には基本小体と反応する抗体が含まれていることが分かった。このウェル中の細胞をそれぞれパスツールピペットで回収し、２４ウェルプラスチック製培養容器に移し、ＨＡＴ培地１〜２ｍｌを加え、同様に培養した。
【００５４】
限界希釈法によるクローニング
２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が２０個／mlとなるようそれぞれをＨＴ培地で希釈した。別にＨＴ培地に懸濁した４〜６週齢のマウス胸腺細胞を９６ウェルプラスチック製培養容器に２×１０5個／ウェルとり、これに上記の融合細胞（細胞濃度が２０個／ml）を５０μｌ／ウェルずつ加え、５％（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下、３６℃で培養し、その１日後、７日後及び１４日後にＨＴ培地を１〜２滴／ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェルの培養上清を５０μｌ回収し、上記と同様の方法で抗体の生産を確認した。
ウェル中に単一の細胞コロニーしか存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもので、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き２４ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を得た。
【００５５】
モノクローナル抗体の生産
ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８を、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地２０mlを入れた７５cm2プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、３〜４日ごとにその培養液から１６〜１８mlを抜き取り、代わりに新鮮な１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地を総量で２０mlとなるように補い、継代培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、１２００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗体含有培養上清）を回収した。
また、予め２週間前にプリスタン０．５mlを腹腔内に注射しておいたＢａｌｂ／ｃマウスのその腹腔内に、１×１０6個／mlとなるようＰＢＳで懸濁したハイブリドーマ株を１ml注射した。３週間後、ｂａｌｂ／ｃマウスの腹水を回収し、１２００rpmで５分間遠心分離し、上清（モノクローナル抗体含有腹水）を回収した。
【００５６】
モノクローナル抗体の精製
ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８が生産するモノクローナル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマＡＹ６Ｅ２Ｅ８をマウス腹腔内に注射して得られたモノクローナル抗体含有腹水１容に３容のＰＢＳを加えて混合し、３０００rpmで１０分間遠心分離し、その上清をポアサイズ０．２２μｍのフィルタで濾過後、これをクロマトップスーパープロテインＡカラム（径４．６mm×１００mm、日本ガイシ(株)製）を用いるＨＰＬＣで精製した。カラムは予め、ＰＢＳで平衡化しておいた。
０．２２μｍフィルタで濾過後のサンプル１ｍｌをカラムに注入後、ＰＢＳを１ml/minで３分間流し、次いで、５ml/minで４分間流してカラムを洗浄した後、精製水１ＬにＮａＣｌ ８．７７ｇ、クエン酸（一水和物）１６．７ｇ及びＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ １４．７２ｇを溶かした液を２ml/minで５分間流してモノクローナル抗体を溶出した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、ＴＴＢＳ溶液で希釈した。
【００５７】
クラミジア・ニューモニエの基本小体を溶解し、基本小体に含有されているペプチドを取得した。このペプチドと上記モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行い、取得したモノクローナル抗体の特異性を確認した。
その結果、取得したモノクローナル抗体はクラミジア・ニューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識することがわかった。
ハイブリドーマ ＡＹ６Ｅ２Ｅ８と同様にして、ハイブリドーマＳＣＰ５３を取得した。上記の方法と同様にしてハイブリドーマＳＣＰ５３が産生するモノクローナル抗体の特異性を調べた結果、このモノクローナル抗体は、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識することがわかった。
また、ハイブリドーマ ＡＹ６Ｅ２Ｅ８及びハイブリドーマＳＣＰ５３が産生するモノクローナル抗体のサブクラスを調べた結果、これらの抗体のサブクラスは、それぞれ、ＩｇＧ2b及びＩｇＧ1であった。
【００５８】
（Ｇ）抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング
大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株の一白金耳を１０ｍＭ ＭｇＳＯ4３ml、０．２％マルトース及び５０μg/mlアンピシリン含有のＬＢ（水１Ｌ中にＮａＣｌ ５ｇ、ポリペプトン１０ｇ及び酵母エキス５ｇを含む）培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した後、これを２，０００rpmで１０分間遠心分離した。沈殿（大腸菌）に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4水溶液９mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液の０．３５mlを採り、これにλgt11（ＤＮＡライブラリー）懸濁液を０．１μｌ加え、３７℃で２０分間インキューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予め４７℃に保温した液状ＬＢ寒天培地２．５mlに、上記λgt11感染大腸菌を加え、これを直ちにＬＢ寒天培地上に撒いた。上層寒天培地が固化した後、４２℃で３〜４時間培養し、プラークが観察された時点で１０ｍＭ  ＩＰＴＧ水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター（φ８２mm）を上層寒天培地に乗せ、３７℃で１２時間培養した。黒インクをつけた注射針で非対称に３ヵ所突き刺してフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地からとり出し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０ ．１％ツィーン２０含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）（以下、ＴＴＢＳ緩衝液という）で３回洗浄した。寒天培地は冷蔵庫中に保存した。
【００５９】
フィルターを１５０ｍＭ ＮａＣｌ含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH７．５）（以下、ＴＢＳ緩衝液という）の０．１％牛血清アルブミン含有液に浸し、３７℃で１時間振とうし、ブロッキング反応を行った。次いで、フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で２回洗浄したのち、５μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体（ＡＹ６Ｅ２Ｅ８又はＳＣＰ５３）のＴＴＢＳ溶液に浸し、３７℃、１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識の（５０ng/ml）抗マウスＩｇＧ抗体溶液（ＴＴＢＳ緩衝液）中、３７℃で１時間振とうした。フィルターをＴＴＢＳ緩衝液で３回、及びＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、発色基質液（ＴＢＳ緩衝液１００mlに３０％過酸化水素水溶液６０μｌと０．３％  ４−クロロ−１−ナフトールのメタノール溶液２０mlを加えて調製）に浸漬し、室温で約３０分間放置した。十分発色した時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾した。
【００６０】
フィルターの発色スポットに対応する寒天培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパスツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回収したプラークはクロロホルム１滴を加えた０．１Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ硫酸マグネシウム及び０．０１％ゼラチン含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）  （以下、ＳＭ緩衝液という）中に採り、４℃で一晩放置しプラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化した。
このようにして、クラミジア・ニューモニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファージが得られ、これを５３−３Ｓλファージと命名した。
【００６１】
（Ｈ）５３−３Ｓλファージの培養とＤＮＡ精製
前記（Ｇ）で述べた方法と同様にしてプラークを形成させ、一つのプラークを回収し、１００μｌのＳＭ緩衝液に入れ、４℃で一晩放置しλファージを抽出した。ＬＢ培養液で一晩培養した大腸菌Ｙ１０９０ｒ−株２５０μｌに、λファージ液５μｌを加え、３７℃で２０分間放置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め３７℃に温めておいた１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地５０mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こるまで３７℃で５時間振とう培養した。２５０μｌのクロロホルムを加え、３，０００rpmで１０分間遠心分離し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λファージＤＮＡは、Wizard
λ preps キット（プロメガ社、商品名）を用いて精製した。
【００６２】
（Ｉ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの増幅
６００μｌ用のマイクロチューブに、精製水６１．５μｌ、１０倍濃度  反応用緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチンを含むトリス−塩酸緩衝液pH８．３）１０μｌ、２０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、５３−３ＳλファージＤＮＡ溶液０．１μｌ、２０ｎＭ  λgt11 forward primer（宝酒造(株)製、商品名）１μｌ、２０ｎＭ  λgt11 reverse primer（宝酒造 (株)製、商品名）１μｌ、AmpliTaq DNA Polymerase（宝酒造(株)製、商品名）０．５μｌを入れ、ミネラルオイルを２滴重層した。９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７３℃  ２分のサイクルのインキュベーションを３０回繰返し、ＤＮＡを増幅した。反応後、１．２％低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡを切り出して Wizard PCR Prep キット（プロメガ社製、商品名）で精製した。
【００６３】
（Ｊ）ＤＮＡ塩基配列分析
ＤＮＡ塩基配列分析は、ＰＣＲで増幅したＤＮＡを鋳型として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社製、商品名）で分析を行った。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト  「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名）を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行ない、配列番号４の配列を得た。配列番号４の配列の解析結果から、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドについて、そのＮ末端からＣ末端に向けて約６０％のアミノ酸配列が解明されたことが分かった。
【００６４】
上記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエに特異的で、かつ、５３ＫＤａ抗原ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を利用してクローニングされたので、このＤＮＡは、明らかに５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードしている。
配列番号４の塩基配列及びアミノ酸配列の相同性検索をＧｅｎＢａｎｋデータベースで行なった結果、高い相同性を示す既知の配列は無かった。
【００６５】
実施例２  クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡの取得
配列番号４の塩基配列を元に、配列番号５及び６の塩基配列を有するＤＮＡを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１０μｌ（ＤＮＡ含有量：約１μｇ）に、１０倍濃縮Ｋバッファ５μｌ、精製水３５μｌ及び制限酵素ＨｉｎｄIII（１９Ｕ／μｌ）５μｌを添加し、３７℃で３時間保温した。
得られた反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離して沈殿を取得した。この沈殿に、ＰＣＲ in vitro Cloning Kit(宝酒造(株)製、商品名)中のＨｉｎｄIIIカセットＤＮＡ（２０ng/μl）５μｌ、ライゲーション溶液１５μｌを添加し、１６℃で３０分間保温した。
【００６６】
取得した反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離して沈殿を取得し、これを１０μｌの精製水に溶解した。
得られた溶液１μｌに、精製水７８．５μｌ、１０倍濃縮ＰＣＲ用バッファ１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ８μｌ及びＴａｑポリメラーゼ０．５μｌ（５Ｕ／μｌ）を添加し、さらに、プライマーＤＮＡとして、配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおいて、プライマーＣ１として同封されていたもの）１μｌを添加して、これらを０．６ｍｌのマイクロチューブに入れ、ミネラルオイル２滴を重層し、９４℃３０秒、５５℃２分、７２℃３分の温度サイクルを３０回繰り返した。以上の工程をＰＣＲ工程という。
ＰＣＲ工程後の反応液１μｌに、プライマーＤＮＡとして、配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）（上記キットにおいて、プライマーＣ２として同封されていたもの）１μｌを用い、再度ＰＣＲ工程を行った。
【００６７】
２番目のＰＣＲ工程後の反応液を１．２％低融点アガロースゲル電気泳動させ、約１．４ｋｂｐの大きさのＤＮＡが含有されているアガロースゲルを切り出した。ＤＮＡの精製には Wizard PCR Prep キット（プロメガ社製、商品名）を用いた。即ち、切り出したアガロースゲルにキットに同封されている緩衝液を添加し、加熱してアガロースゲルを溶解し、キットに同封されている精製用樹脂を添加してＤＮＡを樹脂に吸着させ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿として取得した。沈殿をプロパノールで洗浄し、再度遠心分離して沈殿を取得した。沈殿に精製水を添加し、精製用樹脂からＤＮＡを溶出して、遠心分離し、上清（ＤＮＡ水溶液）を得た。以上の工程をＤＮＡ精製工程という。
【００６８】
取得したＤＮＡ水溶液を用い、含まれるＤＮＡを鋳型とするTaq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行い、３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサ（アプライドバイオシステムズ社製、商品名）でそのＤＮＡの塩基配列を分析した。得られたＤＮＡ塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名）を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の工程を塩基配列解析工程という。
【００６９】
取得したＤＮＡの塩基配列を解析した結果、このＤＮＡは実施例１で取得したクラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの中の３′末端側の約５０ｂｐの塩基配列を有していた。さらに、その塩基配列の下流には、終始コドンを含有する約０．７ｋｂのコード領域が存在していることがわかった。
配列番号４の塩基配列を元に、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流部分に相当するプライマーとして、配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡを、また、上記の約０．７ｋｂのコード領域を含む塩基配列を元に、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの下流部分に相当するプライマーとして、配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡを、それぞれ、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００７０】
実施例１で得たクラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡの水溶液１μｌを用い、プライマーＤＮＡとして配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌ及び配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡ（２０pmol/μl）１μｌを用いてＰＣＲ工程を行った。
３番目のＰＣＲ工程後の反応液を用い、上記ＤＮＡ精製工程を行い、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを取得した。
取得したＤＮＡ水溶液を用い、上記塩基配列解析工程を行った。
取得したＤＮＡの塩基配列を解析した結果、このＤＮＡは配列番号１の塩基配列を有していることがわかった。
また、５３−３ＳλファージのＤＮＡと前述のλgt11のＤＮＡライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行い、クラミジア・ニューモニエの５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮＡを取得した。
【００７１】
実施例３  ＰＣＲ法によるクラミジア・ニューモニエ遺伝子の検出
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡと配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡをアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機で化学合成し、それぞれプライマー５３Ｆ２、プライマー５３Ｒ２と名付けた。
クラミジア・ニューモニエＹＫ４１株、またはクラミジア・トラコマチスＬ２株、又はクラミジア・シッタシＢｕｇｄ．１７−ＳＬ株を感染させた細胞を遠心分離で回収し、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2  ２．５ｍＭ、ゼラチン  ０．１mg/ml、ノニデットＰ４０(Nonidet P40)  ０．４５％トゥイーン２０(Tween 20)０．４５％、プロテイネースＫ  ０．１mg/mlを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．３）０．１mlを加え、５６℃で１時間保温した後、９５℃で１０分間加熱してプロテイネースＫを失活させ、各クラミジアの遺伝子を含む試料とした。
【００７２】
各試料１μｌに、精製水７８．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ水溶液８μｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（pH８．３）１０μｌ、３０μＭの上記プライマー５３Ｆ２及びプライマー５３Ｒ２の水溶液各１μｌ、並びに５Ｕ／μｌ  タックポリメラーゼ  ０．５μｌを添加し、ミネラルオイル５０μｌを重層した後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃６０秒の加熱、冷却、保温のサイクルを３０回繰り返した。
反応終了後、反応液２μｌを取得し、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを０．５μ/mlの臭化エチジウムに浸し、紫外線照射下でＤＮＡのバンドを観察した。
その結果、クラミジア・ニューモニエＹＫ４１株から得た試料について、配列番号１の塩基配列のうち、プライマー５３Ｆ２の塩基配列とプライマー５３Ｒ２の塩基配列に相補的な塩基配列で挾まれた領域に相当する３６０ｂｐの大きさのＤＮＡのバンドが観察された。しかし、他の株から得た試料についてはバンドが観察されなかった。
【００７３】
【発明の効果】
請求項１記載のプローブは、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項２記載のプローブは、請求項１記載のプローブの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に利用できる。
請求項３記載のプローブは、請求項１記載のプローブの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に利用できる。
請求項４記載の測定法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項５記載の測定用試薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
【００７４】
請求項６記載のプライマーは、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の測定やクラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項７記載のプライマーは、請求項６記載のプライマーの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に利用できる。
請求項８記載のプライマーは、請求項６記載のプライマーの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエに特異的な塩基配列を有するので、クラミジア・ニューモニエ感染の正確な診断に利用できる。
請求項９記載の測定法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
請求項１０記載の測定用試薬は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断に好適である。
【００７５】
【配列表】
0003711613.tif 000004
0003711613.tif 000005
0003711613.tif 000006
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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