(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物にウイルス病を引き起こすウイルスの遺伝子に、部位非特異的に変異を導入し、弱毒変異株を選抜することにより弱毒ウイルスを作出する方法であり、ウイルス遺伝子への変異の導入を、DNA の修復系に欠損を有する宿主に感染性ウイルスゲノムを合成しうるプラスミドを導入し、該宿主を培養することにより行う、前記方法。
【請求項２】
弱毒ウイルスが、ウイルス遺伝子に生じたサイレントミューテーションにより弱毒化したものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがカピロウイルス属のウイルスであり、プラスミドが感染性ウイルスRNA を転写しうるものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ウイルスがリンゴステムグルービングウイルス（apple stem grooving virus)またはカンキツタターリーフウイルス（citrus tatter leaf virus) である請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法により作出され、ウイルス遺伝子に生じたサイレントミューテーションにより弱毒化した、カピロウイルス属のリンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの弱毒変異株。
【請求項６】
リンゴステムグルービングウイルスの弱毒変異株RM21。
【請求項７】
野生株と比べて、ゲノムRNA の塩基配列中、4646番目が変異している、請求項６記載の弱毒変異株RM21。
【請求項８】
請求項１記載の方法により作出され、ウイルス遺伝子に生じたサイレントミューテーションにより弱毒化したカピロウイルス属ウイルスの弱毒変異株を植物の幼苗に接種することを特徴とするカピロウイルス属ウイルスの防除方法。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれかの項記載の弱毒変異株を植物の幼苗に接種することを特徴とするリンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの防除方法。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれかの項記載の弱毒変異株を有効成分として含有するリンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの防除剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、植物のウイルス病の防御に有効な弱毒ウイルス（防御ウイルス）を作出する方法およびそれにより得られた弱毒ウイルス、並びにその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物がある種のウイルスに感染していると、それと近縁なウイルスには抵抗性を示すという干渉作用と呼ばれる現象が、７０年ほど前にＭｃｋｉｎｎｅｙによって発見され、今日、ウイルス病防除法に利用されている。すなわち、感染しても植物にほとんど生育異常をもたらさない病原性の弱いウイルスを予め植物に感染させておき、それと干渉作用が働く病原性の強いウイルスの感染を防ぐという方法が実用化されており、ウイルスの生物学的防除法として有効な方法である。この防除法の利点は、弱毒ウイルスが分離あるいは作出されれば直ちに作物に利用でき、しかも農薬のように人の健康を損なう環境汚染の心配のない点であり、現代社会に歓迎される環境にやさしい生物学的防除法といえる。
【０００３】
このような弱毒ウイルスの作出法には、温度処理による方法、自然界からの選抜、亜硝酸処理、病原性を低下させるサテライトＲＮＡ  の利用などがある  （「植物のウイルス病」福士貞吉・鈴木直治・四方英四郎，  １９８６，  養賢堂，  ５１４  頁；「弱毒ウイルスと植物保護」西口正通，１９９３  ，  続医薬品の開発第１８巻，  広川書店，３２０−３２８頁；「植物病理学事典」岸国平・日野稔彦ら編，１９９５，養賢堂，７２１−７２６頁）  。しかし、これらの方法では、変異が導入される部位は完全に未知であり、いつどの程度の変異が導入されるかについても全く不明である。また、偶然、あるいは温度・薬剤処理等による一定のストレス環境下において導入された株であり、安定した弱毒株である可能性は低いという欠点がある。また、現在実用化されている弱毒ウイルスの中には、使用中に病原性が回復する可能性が懸念されているものもある。
【０００４】
また、分子生物学の発展により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで変異を導入して病原性を弱めたウイルスを作出する方法も現在研究されている  （農業有用微生物−その利用と展望−，  梅谷献二・加藤肇共編，養賢堂，５９２頁）  。変異の導入により弱毒ウイルスを作出する方法としてこれまで一般的に考えられてきたのは、病原性に関与する遺伝子をターゲットとして部位特異的に変異を導入する方法である。しかし、既知の部位に既知の方法で変異を導入するこの方法では、物理化学的にも生物学的にも安定性を考慮せずに、意図的に導入した変異であるため、安定性が悪い、すなわち病原性が回復する恐れがあるなど実用性に問題があった。また、既知の知見に基づいて変異を導入するため、周知のレベルの効果しか期待されない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、これまでの弱毒ウイルス作出法では、使用中に病原性が回復することのない安定した変異株で、かつ病原性ウイルスの生物学的防除に有効なものを得ることは難しかった。
従って、本発明の目的は、野生株の感染に対して干渉作用が強く、しかも病原性の安定した安全な弱毒ウイルスを作出することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、分子生物学的手法によりウイルス遺伝子に変異を導入する際に、部位非特異的  （ランダム）  変異導入法によれば、安定した変異株を作出できるという全く新しい発想に基づき研究を行った結果、本発明を完成した。このような方法は、従来の、病原性に関与することが既知の限られた遺伝子領域への部位特異的変異導入法とは全く発想を異にした新しい方法である。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は、植物にウイルス病を引き起こすウイルスゲノムに、部位非特異的に変異を導入し、弱毒変異株を選抜することにより弱毒ウイルスを作出する方法であり、ウイルス遺伝子への変異の導入を、ＤＮＡ  の修復系に欠損を有する宿主に感染性ウイルスゲノムを合成しうるプラスミドを導入し、該宿主を培養することにより行うことを特徴とする方法である。この方法は、ウイルス一般に適用できるが、ウイルスがカピロウイルス属のウイルスであり、プラスミドが感染性ウイルスＲＮＡ  を転写しうるものである場合、特に、ウイルスがリンゴステムグルービングウイルス（ａｐｐｌｅ  ｓｔｅｍ  ｇｒｏｏｖｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）またはカンキツタターリーフウイルス（ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｔｔｅｒ  ｌｅａｆ  ｖｉｒｕｓ）  である場合に好適に適用される。
【０００８】
また、本発明は、上記方法により作出され、ウイルス遺伝子に生じたサイレントミューテーションにより弱毒化した、カピロウイルス属のリンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの弱毒変異株にも関する。この弱毒変異株の好適な例としては、リンゴステムグルービングウイルスの弱毒変異株ＲＭ２１が挙げられ、これは、野生株と比べて、ゲノムＲＮＡ  の塩基配列中、４６４６番目が変異している弱毒変異株である。
【０００９】
さらに、本発明は、前記弱毒ウイルスの作出方法により作出され、ウイルス遺伝子に生じたサイレントミューテーションにより弱毒化したカピロウイルス属ウイルスの弱毒変異株を植物の幼苗に接種することを特徴とするカピロウイルス属ウイルスの防除方法も提供する。特に、リンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの弱毒変異株ＲＭ２１を植物の幼苗に接種することを特徴とするリンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの防除方法に関する。また、これらの弱毒変異株を有効成分として含有するリンゴステムグルービングウイルスまたはカンキツタターリーフウイルスの防除剤も提供される。
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の弱毒ウイルス作出法は、ウイルス遺伝子に部位非特異的に変異を起こさせて弱毒変異株を作り出すものであり、変異は遺伝子の機能に関係なくランダムに生じる。
【００１１】
ウイルス遺伝子にランダムに変異を導入する具体的方法は、ＤＮＡ  修復系に欠損をもつ菌株に、目的遺伝子断片を含むプラスミドを導入し、この菌を培養することにより目的遺伝子に変異を導入する方法である。ＤＮＡ  修復系に欠損をもつ菌株としては、例えば、大腸菌野生株と比較して、ＤＮＡ  の修復系に３つの欠損をもつ大腸菌株、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ（（株）ストラタジーン）  を用いることができる。この３つの欠損の部位は、ｍｕｔＳ  （ミスマッチ修復遺伝子）  、ｍｕｔＤ  （３’−５’  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩＩＩ  のエンドヌクレアーゼ遺伝子）  、およびｍｕｔＴ  （８−ｏｘｏｄＧＴＰ  の加水分解に関与する遺伝子）  である。Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄにプラスミドを導入し、この大腸菌を培養することによりｉｎ  ｖｉｖｏ  でプラスミドに変異を導入する方法はＧｒｅｅｎｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｍ．，  ＸＬ１−Ｒｅｄ：Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ，  ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３２−３４  に記載されている。本発明においては、この方法を弱毒ウイルスの作出に利用することにより安定した弱毒変異株を得るものである。
【００１２】
本発明方法により弱毒ウイルスを作出するには、感染性ウイルスゲノムを合成  （ＲＮＡ  ウイルスの場合は感染性ゲノムＲＮＡ  を転写）  できるプラスミドを作製し、これに上記方法によりランダム変異を導入し、弱毒変異株を選抜する。
【００１３】
弱毒株の作出方法と得られた弱毒株の確認を、ウイルスとしてリンゴステムグルービングウイルス  （ａｐｐｌｅ  ｓｔｅｍ  ｇｒｏｏｖｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）  （以下、ＡＳＧＶと称する）  を用いた場合について詳細に説明する。
【００１４】
ＡＳＧＶは、カピロウイルス属  （Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）  のタイプ種  （代表ウイルス）  で、リンゴ、洋ナシ  （ｐｅａｒ）  、ナシ  （Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐｅａｒ）、アンズ  （Ｊａｐａｎｅｓｅ  ａｐｒｉｃｏｔ）  などバラ科の果樹を栽培する世界中の地域に広く発生し、接ぎ木部異常などの症状を引き起こすウイルスである。なお、このウイルスに極めて近く、遺伝子の塩基配列がほぼ同じウイルスとしてカンキツタターリーフウイルス  （ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｔｔｅｒ  ｌｅａｆ  ｖｉｒｕｓ）（以下、ＣＴＬＶと称する）  がある。ＣＴＬＶは、１９０８年に中国からアメリカに導入された品種「マイヤーレモン（Ｍｅｙｅｒ  ｌｅｍｏｎ）」（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｙｅｌｉ）  樹に潜在感染しているところを発見された  （Ｗａｌｌａｃｅ  ＆  Ｄｒａｋｅ，  １９６２）。このウイルスは、Ｃｉｔｒｕｓ  ｅｘｃｅｌｓａにタターリーフ  （ボロ布状奇形葉）  症状を示すことから、ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｔｔｅｒ  ｌｅａｆ  ｖｉｒｕｓと命名された。また、このウイルスはトロイヤーシトレンジを台木とするウンシュウミカンに接ぎ木部異常症状  （ｂｕｄｕｎｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）  を引き起こすことが知られている  （Ｃａｌａｖａｎ，Ｅ．Ｃ．，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｄ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｒｏｉｓｔａｃｈｅｒ，Ｃ．Ｎ．，  １９６３，  Ｓｙｍｐｔｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔａｔｔｅｒ−ｌｅａｆ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｙｅｒ  ｃｉｔｒａｎｇｅ  ｒｏｏｔｓｔｏｃｋｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ４７：９７１−９７５）  。日本においてもウンシュウミカンの接ぎ木部異常樹からＣＴＬＶと特定できるウイルスが検出されることが報告された  （宮川経邦，  １９７５，  カンキツの接ぎ木部異常症とウイルス、植物防疫  ２９，３７１−３７６）。接ぎ木部異常の障害により、穂と台の接合部分に離層が形成されるため、穂と台木間の養分の移動が妨げられる。その結果、樹勢が衰弱し、時には強風によって折損することもある。カンキツ生産上重要なウイルスで、草本植物のユリにも、他のウイルスとの混合感染により激しい生育阻害を引き起こす  （井上成信他，１９７９，ユリから分離されたｃｉｔｒｕｓ  ｔａｔｔｅｒ  ｌｅａｆ  ｖｉｒｕｓ、日本植物病理学会報  ４５，７１２−７２０）。
【００１５】
ＡＳＧＶおよびＣＴＬＶは、全長６４９６塩基の１本鎖のプラス鎖ＲＮＡ  をゲノムとしてもつカピロウイルス  （Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ）  属のウイルスである。ゲノムＲＮＡ  には、２４１ｋＤａのタンパク質をコードするＯＲＦ１と、それに重複して異なるフレームに３６ｋＤａ  のタンパク質をコードするＯＲＦ２がある  （Ｏｈｉｒａ，  Ｋ．，  Ｎａｍｂａ，Ｓ．，  Ｒｏｚａｎｏｖ，  Ｍ．，  Ｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｔｓｕｃｈｉｚａｋｉ，Ｔ．，  （１９９５）  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｔｔｅｒ  ｌｅａｆ  ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：２３０５−２３０９）。ＡＳＧＶおよびＣＴＬＶのゲノムＲＮＡ  の遺伝子構造を図１に示す。
【００１６】
ＡＳＧＶ（またはＣＴＬＶ）の弱毒変異株の作製方法を以下に説明するが、方法の概略は図２に模式的に示される通りである。
（１）  感染性転写ＲＮＡ  合成プラスミドの構築
ＡＳＧＶのｃＤＮＡをもとにｐＵＣ１８  等のプラスミドベクターを用いて、感染性転写ＲＮＡ  合成プラスミド（  例えばｐＩＴＣＬ）を構築する。プラスミドｐＩＴＣＬ  にはインサートの上流にＴ７プロモーター、下流にｐｏｌｙＡ  およびＮｏｔ  Ｉ  サイトが挿入されている。
【００１７】
（２）  変異株の作出
（ａ）  ランダム変異の導入
感染性転写ＲＮＡ  合成プラスミド（例えばｐＩＴＣＬ）を用いてＤＮＡ  修復系に欠損を有する大腸菌株、例えばＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄを形質転換する。この大腸菌を培養して増殖させると、複製中に生じる塩基対合の間違い（ミスマッチ）やＤＮＡ  の損傷を修復することができず、プラスミドにランダムに変異を高率  （変異導入効率：１塩基／２０００塩基）  で生じさせることができる。次いで、抗生物質を含有する選択培地上に現れたコロニーを培養し、培養液からプラスミドを精製する。精製はＰＩ−５０  （（株）クラボウ）  やＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｐ−２０  （（株）フナコシ）  によればよい。
【００１８】
（ｂ）  変異プラスミドの分離
精製したプラスミドを用いて、修復遺伝子に欠損がない大腸菌、例えば  ＪＭ１０１株またはＨＢ１０１  株を形質転換する。上記Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄを用いて作製した変異プラスミドは、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄの菌体内では変異が引き続き導入されるため、修復系に欠損がない大腸菌に導入して、変異株の遺伝子の固定を行うためである。各変異株を抗生物質含有培地上で培養し、各クローン当たり１個の単一コロニーを分離して培養を行い、プラスミドを精製する。プラスミドの精製はＰＩ−５０  やＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｐ−２０  などを使用して行えばよい。
【００１９】
（３）  変異株の全塩基配列の決定
適宜プライマーを用いて各変異株の全塩基配列を決定する。例えば、ｐＵＣ１８  上の−２１Ｍ１３  Ｄｙｅプライマー（（株）パーキンエルマージャパン）  、Ｍ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマーおよびウイルスシークエンス内部に合成したＡＳＧＶ特異的プライマーを用いることができる。シークエンスにはＤｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（（株）パーキンエルマージャパン）  やＤｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（（株）パーキンエルマージャパン）  などを使用して行えばよい。
【００２０】
（４）  感染性ＲＮＡ  の転写
精製したプラスミドｐＩＴＣＬ  を制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ  で処理して、ＡＳＧＶ  ｃＤＮＡ  の直下流で切断後、プロテアーゼ処理により酵素を不活化し、フェノール／クロロホルム抽出によりタンパク質を除去する。ＤＮＡ  をエタノール沈殿により回収し、Ｔ７ＲＮＡ  ポリメラーゼを用いて感染性ＲＮＡ  の転写を行わせる。
このようにして得られた感染性ＲＮＡ  転写合成物について、下記試験を繰り返し、病原性をもとにスクリーニングして目的の弱毒変異株を得る。
【００２１】
（５）  感染性転写ＲＮＡ  の植物への接種試験
上記で得られた感染性転写ＲＮＡ  を検定植物、例えばケノポディウム・キノア  （Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）  の葉に接種する。感染の成立は、接種葉の局部病斑、上葉の病徴の観察結果、およびウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ  、ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ−ＲＴ−ＰＣＲ等によるウイルス検出により確認できる。
【００２２】
（６）  継代接種試験
各変異株の感染性ＲＮＡ  転写合成物が、植物体上で病原性の変異やゲノムＲＮＡ  の塩基配列の変異を生ずるかどうかを調べるため、感染発病葉に緩衝液を加え破砕したものを接種源として、検定植物に接種する。
【００２３】
（７）  交叉防御  （交叉防衛）  試験
あるウイルスに感染した植物は、近縁な系統のウイルスには感染しない。これを交叉防御  （クロスプロテクション）  と呼ぶ。交叉防御は干渉作用によるものであり、植物のウイルス防除の手段として利用される。
交叉防御試験は、検定植物Ｃ．ｑｕｉｎｏａに、ＡＳＧＶの弱毒変異株の感染性転写ＲＮＡ  を感染させて、その１〜２週間後に野生株を接種して、病徴の発現を観察する。
【００２４】
（８）  感染植物体内における変異株の塩基配列の再変異の有無
変異株を検定植物Ｃ．ｑｕｉｎｏａに接種した際、感染植物細胞内で導入された変異が野生株型に復帰するか否か、あるいはそれ以外の変異を起こすかどうかを調べるため、各変異株のゲノムＲＮＡ  の全塩基配列を決定して確認する。すなわち、感染植物からｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成し、ＡＳＧＶ特異的プライマーを用いてその全塩基配列を決定する。塩基配列の決定におけるシークエンス反応は、上記（３）  に記載の塩基配列の決定と同じ方法を用いる。
【００２５】
上記のようにして作出された弱毒変異株の１つであるＲＭ２１は、野生株に比べ病徴の発現が遅く、ほぼ無病徴である。この変異株は、ゲノムＲＮＡ  の４６４６番目の塩基がウラシル  （ｃＤＮＡにおいてはチミン）  からシトシンへ置換したサイレント・ミューテーション  （ｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する。すなわちこのような塩基の置換があってもアミノ酸はグリシンのままである。タンパク質の変化を伴わないサイレント・ミューテーションによっても病原性の変化が生じることは、従来の知見からは予想外のことである。
【００２６】
また、変異株ＲＭ２１を感染させた場合、感染植物内におけるウイルス増殖量は、野生株とほとんど差がないことが確認された。従って、病徴の軽減が単なるウイルス増殖量の低下によるものではないことは明らかである。また、植物体に感染後、遺伝子および表現型に新たな変異が起こることはなく、継代してもその病原性およびゲノムＲＮＡ  の塩基配列は安定している。さらに、予めＲＭ２１を接種したＣ．ｑｕｉｎｏａに野生株を接種すると、野生株の感染に対して防御反応を起こすという干渉作用を示す。このように、ＲＭ２１は安全で、かつ野生株と同等の増殖能力をもつ、効率のよい防御ウイルスである。
【００２７】
現在実用化されている防御ウイルスの中には、使用中に病原性が回復する可能性が懸念されているものもあるが、本発明方法により作出された変異株は病原性が安定しており、安全である。また、本発明の変異ウイルス作出法である、ＤＮＡ  修復系に欠損をもつ菌を用いる方法はきわめて有効な方法である。すなわち、塩基配列に導入される変異は遺伝子の機能に関係なくランダムに起こり、しかも各変異株の確立過程で安定なもののみ選抜されるので、実用的な弱毒ウイルス作出法の新たな方法である。
【００２８】
本発明の弱毒変異株ＲＭ２１は、Ｃ．ｑｕｉｎｏａ、リンゴ  （無病徴）  、カンキツ等の各種果樹やユリ等の植物の幼苗に予め接種しておくことにより、ＡＳＧＶやＣＴＬＶ等のカピロウイルス属ウイルスの防除を効果的に行うことができる。ウイルスは、一度感染すると治癒することは不可能であり、ウイルスによる病害を抑えるためには、有効な防除法を確立することが重要である。弱毒ウイルスによる防除法は、育苗時などに予め弱毒ウイルスを噴霧器等で接種しておくなどの簡便な方法で行うことができ、また大量に苗を扱うときにも有効である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【００２９】
【実施例】
【００３０】
【実施例１】
ＡＳＧＶ弱毒ウイルスの作出
１．感染性転写ＲＮＡ  合成プラスミドｐＩＴＣＬ  の構築
ＡＳＧＶゲノムＲＮＡ  のｃＤＮＡをもとに、ｐＵＣ１８  を用いて感染性転写ＲＮＡ  合成プラスミドｐＩＴＣＬｐを構築した。このプラスミドにはインサートの上流にＴ７プロモーターを、下流にｐｏｌｙＡ  およびＮｏｔ  Ｉ  サイトが挿入されている。
【００３１】
２．変異株の作出
（ａ）  ランダム変異の導入
プラスミドｐＩＴＣＬ  で大腸菌Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄ（（株）ストラタジーン）  を形質転換した。手順は次の通りである。
【００３２】
Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄのコンピーテントセル１００  μｌを氷中で融解して、１．５  ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。これにβ−メルカプトエタノール（１．４２  Ｍ）を１．７  μｌ加え、最終濃度を２５ｍＭとした。２分ごとに穏やかに混和しながら氷上に１０分間保った。次いで、ｐＩＴＣＬ  ３００  ｎｇを穏やかに混和し、氷中で３０分間、４２℃で４５秒間、次いで氷中で３０分間静置した。さらに、予め４２℃に保温したＳＯＣ  培地  （トリプトン２０．０ｇ、酵母エキス５．０  ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解後オートクレーブ滅菌し、使用直前に、１Ｍ  ＭｇＣｌ２  １０  ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １０  ｍｌを加えフィルター濾過滅菌して作製したＳＯＢ  培地に、２０％（ｗ／ｖ）  グルコース溶液  ２ｍｌ添加後フィルター濾過滅菌  ）を  ９００μｌ加え、ファルコンチューブに移して６０分間３７℃において振盪培養した。
【００３３】
培養液を１００  μｌずつ選抜用ＬＢ寒天培地  （トリプトン１０．０ｇ、酵母エキス５．０  ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、Ａｇａｒ  １５  ｇ／ｌ）  に塗布後、３７℃で２４〜３０時間静置した。この選抜用培地はアンピシリンを２００  μｇ／  ｍｌを含む。選択培地上に現れたコロニー約１００  個をそれぞれ５ｍｌの液体ＬＢ培地  （含アンピシリン２００  μｇ／  ｍｌ）  で１６時間培養した。培養はＥＹＥＬＡ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｈａｋｅｒ  ＭＭＳ（（株）東京理科機械）  を用いて２００ｒｐｍで行った。培養後、ＰＩ−５０  （（株）クラボウ）  によりプラスミドの精製を行った。
【００３４】
（ｂ）  変異プラスミドの分離
変異プラスミドを固定するために、上記のようにして得た精製プラスミドを大腸菌  （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＪＭ１０１  株  （またはＪＭ１０９  株）  に導入した。これは、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（（株）ニッポンジーン）  を用いた形質転換系により以下の手順で行った。
【００３５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１株  （または  ＪＭ１０９）  のコンピーテントセル１００  μｌを氷中で融解して１．５  ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。これにプラスミド  ５μｌを加え、氷中で２０分間、４２℃で４５秒間、氷中で５分間静置した。さらに、予め３７℃に保温したＨｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ  ４００μｌを加え、ファルコンチューブに移して６０分間３７℃において振盪培養した。各変異株をＬＢ寒天培地  （含アンピシリン１００  μｇ／  ｍｌ）  で１２時間培養し、各クローン当たり１個の単一コロニーを分離して培養を行い、ＰＩ−５０  （（株）クラボウ）  によりプラスミドの精製を行った。
【００３６】
３．変異株の全塩基配列の決定
変異株の塩基配列の決定を、ｐＵＣ１８  上の−２１Ｍ１３  Ｄｙｅプライマー（（株）パーキンエルマージャパン）  、Ｍ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマーおよびウイルスシークエンス内部に合成した２６個のＡＳＧＶ特異的プライマーを用いて、Ｄｅｙ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（（株）パーキンエルマージャパン）  を用いたシークエンス反応により行った。
【００３７】
４．感染性ＲＮＡ  の転写
変異を導入したプラスミドｐＩＴＣＬ  （ｐＩＴＣＬ−ＲＭ）を用いて以下のようにして感染性ＲＮＡ  転写物を合成した。
【００３８】
変異プラスミドｐＩＴＣＬ  （ｐＩＴＣＬ−ＲＭ）を保持した大腸菌株  （ＪＭ１０１  またはＪＭ１０９）を、２００  ｍｌのＬＢ液体培地  （含アンピシリン１００  μｇ／ｍｌ）で１４時間培養後、ＱＩＡＧＥＮ−Ｔｉｐ５００  （（株）フナコシ）  を用いてプラスミドの大量精製を行った。得られたプラスミドｐＩＴＣＬ−ＲＭ  １０  μｇを制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ  で処理して、ＡＳＧＶｃＤＮＡ直下流で切断後、プロテアーゼＫ（最終濃度１００  μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分間処理して酵素を不活化し、フェノール／クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した。ＤＮＡ  をエタノール沈殿により回収し、蒸留水に溶かして１μｇ／μｌに調整した後、ｍＣＡＰ  （登録商標）  ＲＮＡ  ｃａｐｐｉｎｇ  ｋｉｔ  （（株）ストラタジーン）  により感染性ＲＮＡ  転写物を合成した。転写条件は、５×Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、プラスミドＤＮＡ    １μｇ／１０  μｌ、ｒＮＴＰ  １μｌ、ＣＡＰ  ａｎａｌｏｇ  ２．５μｌ、０．７５Ｍ  ＤＴＴ  １  μｌにＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏを液量が最終で２４μｌになるように添加し、ついでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを１０ｕ／μｌとなるように添加し、３７℃で３０分間保温した。接種試験には、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｈ２Ｏの添加により濃度を調整して使用する。
【００３９】
５．感染性転写ＲＮＡ  の植物への接種試験
上記のようにした得た感染性転写ＲＮＡ  を検定植物に接種した。検定植物としては、ガラス温室内で長日条件下２５℃で栽培した、５〜１０葉期のＣ．ｑｕｉｎｏａを用いた。中位葉２〜４葉にカーボンランダム  （４００  〜６００  メッシュ）  をふりかけた後、接種葉１枚当たり約４８ｎｇの転写ＲＮＡ  を接種した。接種植物は温室内で管理した。接種葉および上葉を採取し、接種葉の局部病斑  （ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）  、上葉の病徴を観察した。次いで、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ  により感染組織内におけるウイルス量を推定した。ウエスタンブロットでは１次抗体として抗ＡＳＧＶポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ウサギＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートを用いた。ＥＬＩＳＡ  では１次抗体として抗ＡＳＧＶポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ＡＳＧＶモノクローナル抗体を用いた。
【００４０】
６．継代接種試験
感染発病葉の重量の約１０倍量の０．１Ｍリン酸緩衝液  （０．１  ％１−チオグリセリンを含む）  を加え磨砕し、これを接種源として、Ｃ．ｑｕｉｎｏａに接種した。対照としてリン酸緩衝液を接種源とした。
７．交叉防御  （交叉防衛）  試験
Ｃ．ｑｕｉｎｏａに、ＡＳＧＶの弱毒変異株の感染性転写ＲＮＡ  を感染させて、その１週間後に野生株を接種して、観察した。
【００４１】
８．感染植物体内における変異株の塩基配列の再変異の有無
作製した変異株の感染植物細胞内での再変異の有無を調べるため、変異株のゲノムＲＮＡ  の全塩基配列を決定し確認した。すなわち、変異株をＣ．ｑｕｉｎｏａに接種し、感染葉から  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成し、ＡＳＧＶ特異的プライマーを用いてその全塩基配列を決定した。塩基配列の決定におけるシークエンス反応は、上記３に記載の塩基配列の決定と同じ方法を用いた。
【００４２】
〔結果〕
上記２の方法で種々の変異を導入した株を、病原性をもとにスクリーニングした結果、野生株に比べ病徴の発現が遅く、ほぼ無病徴である変異株ＲＭ２１が作出された。野生株および変異株ＲＭ２１をそれぞれ感染させたＣ．ｑｕｉｎｏａの反応を以下の表１に示す。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
変異株ＲＭ２１のゲノムＲＮＡ  の変異解析の結果、４６４６番目がウラシルからシトシンへ置換した  ｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  （アミノ酸はグリシンのまま）  であった  （図３）。
また、変異株ＲＭ２１を感染させた植物についてウエスタンブロットを行った結果、感染植物内におけるウイルス増殖量は、野生株とほとんど差がなく、病徴の軽減が単なるウイルス増殖量の低下によるものではなかった。また、植物体に感染後、遺伝子および表現型に新たな変異が起こることはなく、継代してもその病原性およびゲノムＲＮＡ  の塩基配列は安定していた。さらに、ＲＭ２１の交叉防御試験では、病徴の発現が遅れ、野生株本来の病原性が低下、すなわち両者の間に干渉作用が働いた。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、植物のウイルス防除に効果的な弱毒ウイルスの新規な作出方法が提供される。この方法は、ウイルス遺伝子に部位非特異的に変異を導入することにより、安定した弱毒変異株を作製しうるものである。本発明で得られたＡＳＧＶの弱毒ウイルスは、病原性の強い野生株の感染を防ぐ干渉作用を有し、しかも使用中に病原性が回復することなく安全であり、かつ野生株と同等の増殖能力をもつ、効率のよい防御ウイルスである。従って、このウイルスを予め幼苗に接種しておけば簡便な方法で効率的にＡＳＧＶを防除することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＳＧＶゲノムＲＮＡ  の遺伝子構造を示す図である。
【図２】ＡＳＧＶ弱毒変異株の作製方法を模式的に示す図である。
【図３】ＡＳＧＶ野生株と弱毒変異株ＲＭ２１の塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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