(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の認識塩基配列を認識してＤＮＡを切断する反応を触媒する制限酵素を含有する制限酵素溶液中で、一分子のＤＮＡの第１の分子鎖末端を１つの位置に固定した後に前記ＤＮＡの分子鎖を伸張する第１のステップと、（ａ）前記制限酵素の活性を制御して前記制限酵素を不活性化する不活性化の工程と、
（ｂ）前記ＤＮＡの第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍で局所的に前記制限酵素の活性を制御して前記制限酵素を局所的に活性化し、前記ＤＮＡをＤＮＡフラグメントと新たな第２の分子鎖末端を含む前記ＤＮＡとに切断する切断の工程と、
（ｃ）前記ＤＮＡフラグメントを回収する回収の工程と
から成るサイクルを複数の回数行い、複数のＤＮＡフラグメントを得る第２のステップと、
前記ＤＮＡフラグメントの塩基配列を同定する第３のステップと、
前記ＤＮＡフラグメントの塩基配列を、前記切断の工程が行われた順に並べて、前記ＤＮＡの全体の塩基配列を同定する第４のステップと
を含むことを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２】
前記制限酵素の活性が、前記制限酵素溶液中のマグネシウムイオンの濃度の変化により制御されることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項３】
前記第２のステップの前記不活性化の工程が、前記制限酵素溶液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加して前記制限酵素の活性を制御する操作を含むことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項４】
前記第２のステップの前記切断の工程が、マグネシウムイオンを第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍に局所的に供給して前記制限酵素の活性を局所的に制御する操作を含むことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項５】
前記第２のステップの前記切断の工程が、マグネシウムイオンを含有する液体を包含するマイクロカプセルを第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍に局所的に供給して前記制限酵素の活性を局所的に制御する操作を含むことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項６】
前記第２のステップの前記切断の工程が、前記マイクロカプセルにレーザー光を照射して前記マイクロカプセルを第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍に移動させる操作を更に含むことを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項７】
前記制限酵素の活性が、温度の変化により制御されることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項８】
前記第２のステップの前記不活性化の工程が、前記制限酵素溶液を低温にして前記制限酵素を不活性にする操作を含み、且つ、前記切断の工程が、前記制限酵素溶液を局所的に加熱して前記制限酵素を局所的に活性化する操作を含むことを特徴とする請求項７に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項９】
前記第２のステップの前記切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍に、レーザー光を照射し又はスポット光源からの光を照射して前記制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１０】
前記第２のステップの前記切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍に、自身の電気抵抗により発熱する絶縁性の微小なプローブを接近させ前記制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１１】
前記第２のステップの前記切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍の前記ＤＮＡ分子に、電界が集中する導電性の微小なプローブを接触させて前記制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１２】
前記第２のステップの前記切断の工程が、微小な振動子が第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍の前記溶液を振動させて前記制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１３】
前記第２のステップの前記切断の工程が、前記ＤＮＡを中心にして対称に設置された対面する２台の微小な振動子が第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍の前記溶液を振動させて定常波を形成し前記制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴とする請求項１２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１４】
前記第２のステップの前記切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い前記認識塩基配列の前記近傍に、前記制限酵素溶液の温度よりも高い温度の液体を局所的に供給して前記制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１５】
前記第１のステップが、微粒子の表面と前記ＤＮＡの第１の分子鎖末端とを化学結合させる操作と、前記微粒子を１つの位置に固定して前記ＤＮＡの第１の分子鎖末端を１つの位置に固定する操作とを含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１６】
前記第１のステップが、前記微粒子に光を照射し前記微粒子を光圧力によって１つの位置に固定する操作を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１７】
前記第１のステップが、前記微粒子に電界を印加して前記微粒子を電気力によって１つの位置に固定する操作を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１８】
前記第１のステップが、前記微粒子を、前記微粒子よりも大きな固体に係合させて１つの位置に固定する操作を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項１９】
前記第１のステップが、前記微粒子を、電気力により電極に吸着させて１つの位置に固定する操作を含むことを特徴とする請求項１５に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２０】
前記第１のステップが、前記ＤＮＡを含む前記制限酵素溶液に電界を印加して前記ＤＮＡの分子鎖を伸張させる操作を含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２１】
前記第１のステップが、前記ＤＮＡの周囲に単一の方向をもつ流体の流れを形成して前記ＤＮＡの分子鎖を伸張する操作を含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２２】
前記第２のステップの前記回収の工程が、液滴を形成した後に前記液滴に前記ＤＮＡフラグメントを含有させて前記液滴を回収する操作と、回収された複数の前記液滴を前記回収の工程が行われた順に基板上に並べる操作とを含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２３】
前記回収の工程が、前記液滴の方向への前記制限酵素溶液の流れを形成して、前記ＤＮＡフラグメントを前記液滴へ移動させる操作を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２４】
前記回収の工程が、前記基板上に並べられた前記液滴に電気力を作用し前記ＤＮＡフラグメントを浮上させて、前記液滴内に含有される前記ＤＮＡフラグメントの前記基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２５】
前記回収の工程が、密度の大きい液体から成る前記液滴中に前記ＤＮＡフラグメントを含有させ前記ＤＮＡフラグメント自身の浮力を生じさせて、前記液滴内に含有される前記ＤＮＡフラグメントの前記基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２６】
前記回収の工程が、前記液滴が並べられた前記基板を振動させて、前記液滴内に含有される前記ＤＮＡフラグメントの前記基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２７】
前記回収の工程が、前記液滴が表面にシリコンの被覆を施した前記基板上に並べられて、前記液滴内に含有される前記ＤＮＡフラグメントの前記基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ塩基配列決定方法。
【請求項２８】
微粒子と、前記微粒子に表面に結合されたＤＮＡとを収容する収容部と、
前記収容部の前記微粒子を、前記収容部内の１つの位置に固定する固定手段と、
固定された前記微粒子の表面に結合した前記ＤＮＡを伸張する伸張手段と、
伸張した前記ＤＮＡを前記ＤＮＡとＤＮＡフラグメントとに切断する切断手段と、
前記切断手段で得られた前記ＤＮＡフラグメントを回収する液滴を形成する液滴形成手段と、
前記液滴に前記ＤＮＡフラグメントを含有させ、前記ＤＮＡフラグメントを含む前記液滴を回収する液滴回収手段と
前記収容部に収容されている前記ＤＮＡを観察する観察手段と、
を備えることを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項２９】
前記固定手段が、前記収容部内に収容された前記微粒子にレーザー光を照射する手段を備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３０】
前記固定手段が、前記微粒子を吸着する電極を前記収容部内に備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３１】
前記固定手段が、前記微粒子を係合させる固体を前記収容部内に備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３２】
前記伸張手段が、前記収容部に収容された液体に電界を印加する電界印加手段を含むことを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３３】
前記伸張手段が、前記収容部内に単一の方向をもつ液体の流れを形成する流れ形成手段を含むことを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３４】
前記切断手段が、レーザー光を発生する手段と前記収容部への該レーザー光の光導波路又は光入射路とを備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３５】
前記観察手段が、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡフラグメントから発せられた蛍光の１つの光導波路又は光入射路と、該蛍光を検出する手段とを備えることを特徴とする請求項２８又は３４のいずれかに記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３６】
前記切断手段のレーザー光の前記光導波路又は光入射路が、前記観察手段の蛍光の前記光導波路又は光入射路と同一であることを特徴とする請求項３５に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３７】
前記切断手段のレーザー光の前記光導波路又は光入射路が、前記観察手段の蛍光の前記光導波路又は光入射路と異なることを特徴とする請求項３５に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３８】
前記切断手段が、微小スポット光を発生する手段と前記収容部への該微小スポット光の光導波路又は光入射路とを備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項３９】
前記切断手段が、絶縁性の微小なプローブと、前記プローブに電流を供給する手段とを備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４０】
前記切断手段が、導電性の微小なプローブと、前記プローブの先端に電界を発生させる手段とを備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４１】
前記切断手段が、微小な振動子を備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４２】
前記切断手段が、前記収容部の伸張された前記ＤＮＡを中心にして対称に設置された、２台の対面する微小な振動子を備えることを特徴とする請求項４１に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４３】
前記切断手段が、前記収容部に局所的に液体を供給する微小なキャピラリを備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４４】
前記観察手段が、前記ＤＮＡが切断されたことを検出する切断終了検出手段を更に備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４５】
前記切断終了検出手段が、前記収容部に収容された前記ＤＮＡから発せられる蛍光を含む光像を撮像して、撮像された視野内に含まれる蛍光の強度変化を検出する視野内ＤＮＡ蛍光強度測定装置を備えることを特徴とする請求項４４に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４６】
前記切断終了検出手段が、前記ＤＮＡが切断されて生じた前記ＤＮＡフラグメントから発せられる蛍光を検出するＤＮＡフラグメント蛍光検出装置を備えることを特徴とする請求項４４に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４７】
前記液滴形成手段が、形成された液滴の径を検出する液滴径検出装置を更に備えることを特徴とする請求項２８または４４のいずれかに記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４８】
前記液滴形成手段が、形成された液滴を振動させる振動装置を更に備えることを特徴とする請求項２８又は４４のいずれかに記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項４９】
前記液滴形成手段が、前記ＤＮＡが切断されたことを前記切断終了手段が検出した後に前記液滴を振動させる制御手段を更に備えることを特徴とする請求項４８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５０】
前記液滴回収手段が、液滴が並べられる基板を備えることを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５１】
前記液滴回収手段が、前記基板を可動させる装置を更に備えることを特徴とする請求項５０に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５２】
前記基板が、表面にシリコンの被覆を有することを特徴とする請求項５０に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５３】
前記液滴形成手段が、密度１．７［ｇ／ｃｍ3 ］の液体から成る前記液滴を形成することを特徴とする請求項２８に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５４】
前記液滴回収手段が、前記基板上に並べられて回収された前記液滴内に含有される前記ＤＮＡフラグメントの前記基板への付着を防止する付着防止手段を更に備えることを特徴とする請求項５０に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５５】
前記付着防止手段が、前記基板と電気的に接続される、前記基板の前記液滴を有する面との間に電界を発生させる電極を備えることを特徴とする請求項５４に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【請求項５６】
前記付着防止手段が、前記基板を振動させる振動装置を備えることを特徴とする請求項５４に記載のＤＮＡ塩基配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法及びＤＮＡの塩基配列を決定する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物細胞からＤＮＡ分子を分離してその塩基配列を知ることは、遺伝子工学の発展に欠かせない技術である。ＤＮＡ分子の塩基配列の決定法には、サンガー法が多用されている。
【０００３】
図１４は、従来から広く行われているサンガー法によりＤＮＡの塩基配列を決定する方法の一例を表すフロー図である。図１４に示されるように、サンガー法では、まず、染色体（図１４（ａ））から分離されたコスミドライブラリ（図１４（ｂ））から１種類のコスミドＤＮＡを選択して分離し（図１４（ｃ））て、１種類のコスミド多数を得て、これらを制限酵素を用いてランダムに切断して５００〜２０００塩基のＤＮＡフラグメントを非常に多数得る（図１４（ｄ））。このように得られた夥しくも多数のＤＮＡフラグメントは、同一種類の分子多数をランダムに切断したものであるため、重複部分をもったＤＮＡフラグメントが多数存在する。次に、この多数のＤＮＡフラグメントの塩基配列を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により決定する（図１４（ｅ））。そして、得られた多数のＤＮＡフラグメントの塩基配列の重複部分をコンピュータを用いて検索して、これを結合させることにより、コスミドＤＮＡの塩基配列を推定する（図１４（ｆ））。
【０００４】
このような検索による推定に基づく決定方法によって、例えばヒトゲノムのように数千Ｍｂ（塩基数が数十億）のＤＮＡ全体の塩基配列を正確に決定するためには、コンピュータを用いても、検索作業及びＤＮＡフラグメントのコスミド中の位置の推定作業が膨大なものとなる。そのため、塩基配列の決定には多大な時間と経費を要するのみならず、得られたコスミドＤＮＡの塩基配列の正確さにも影響を与える。
【０００５】
これに対して、複数の同一ＤＮＡを一定方向に配向させて並べ、これらを末端から順次レーザー光の照射によって切断してＤＮＡフラグメントを得て、これらＤＮＡフラグメントの塩基配列をつなぎ合せてＤＮＡの塩基配列を決定する方法が、特願平６−１８５２３に開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記文献では、ＤＮＡの切断にレーザー光の照射を用いるため、切断時に分子を損傷してしまう。このため、その構造に欠損した部分をもつＤＮＡフラグメントの塩基配列をもとにＤＮＡ全体の塩基配列を推定して決定することになり、決定された塩基配列の正確さの点で問題がある。また、この方法においても、同一の塩基配列をもつＤＮＡ分子を多数必要とするが、これらを得る作業は多大な労力と時間とを要する。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、簡便に且つ高い正確さをもって、ＤＮＡ分子の塩基配列を決定できる方法及びその装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、特定の認識塩基配列を認識してＤＮＡを切断する反応を触媒する制限酵素を含有する制限酵素溶液中で、一分子のＤＮＡの第１の分子鎖末端を１つの位置に固定した後にＤＮＡの分子鎖を伸張する第１のステップと、（ａ）制限酵素の活性を制御して制限酵素を不活性化する不活性化の工程と、（ｂ）ＤＮＡの第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍で局所的に制限酵素の活性を制御して制限酵素を局所的に活性化し、ＤＮＡをＤＮＡフラグメントと新たな第２の分子鎖末端を含むＤＮＡとに切断する切断の工程と、（ｃ）ＤＮＡフラグメントを回収する回収の工程とから成るサイクルを複数の回数行い、複数のＤＮＡフラグメントを得る第２のステップと、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を同定する第３のステップと、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を、切断の工程が行われた順に並べて、ＤＮＡの全体の塩基配列を同定する第４のステップとを含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、制限酵素の活性が、制限酵素溶液中のマグネシウムイオンの濃度の変化により制御されることを特徴としてもよい。
【００１０】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの不活性化の工程が、制限酵素溶液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加して制限酵素の活性を制御する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１１】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、マグネシウムイオンを第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍に局所的に供給して制限酵素の活性を局所的に制御する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１２】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、マグネシウムイオンを含有する液体を包含するマイクロカプセルを第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍に局所的に供給して制限酵素の活性を局所的に制御する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、マイクロカプセルにレーザー光を照射してマイクロカプセルを第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍に移動させる操作を更に含むことを特徴としてもよい。
【００１４】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、制限酵素の活性が、温度の変化により制御されることを特徴としてもよい。
【００１５】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの不活性化の工程が、制限酵素溶液を低温にして制限酵素を不活性にする操作を含み、且つ、切断の工程が、制限酵素溶液を局所的に加熱して制限酵素を局所的に活性化する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１６】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍に、レーザー光を照射し又はスポット光源からの光を照射して制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１７】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍に、自身の電気抵抗により発熱する絶縁性の微小なプローブを接近させ制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１８】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍のＤＮＡ分子に、電界が集中する導電性の微小なプローブを接触させて制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００１９】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、微小な振動子が第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍の溶液を振動させて制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２０】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、ＤＮＡを中心にして対称に設置された対面する２台の微小な振動子が第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍の溶液を振動させて定常波を形成し制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２１】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの切断の工程が、第２の分子鎖末端に最も近い認識塩基配列の近傍に、制限酵素溶液の温度よりも高い温度の液体を局所的に供給して制限酵素を局所的に加熱する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２２】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、微粒子の表面とＤＮＡの第１の分子鎖末端とを化学結合させる操作と、微粒子を１つの位置に固定してＤＮＡの第１の分子鎖末端を１つの位置に固定する操作とを含むことを特徴としてもよい。
【００２３】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、微粒子に光を照射し微粒子を光圧力によって１つの位置に固定する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２４】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、微粒子に電界を印加して微粒子を電気力によって１つの位置に固定する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２５】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、微粒子を、微粒子よりも大きな固体に係合させて１つの位置に固定する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２６】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、微粒子を、電気力により電極に吸着させて１つの位置に固定する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２７】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、ＤＮＡを含む制限酵素溶液に電界を印加してＤＮＡの分子鎖を伸張させる操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２８】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第１のステップが、ＤＮＡの周囲に単一の方向をもつ流体の流れを形成してＤＮＡの分子鎖を伸張する操作を含むことを特徴としてもよい。
【００２９】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、第２のステップの回収の工程が、液滴を形成した後に液滴にＤＮＡフラグメントを含有させて液滴を回収する操作と、回収された複数の液滴を回収の工程が行われた順に基板上に並べる操作とを含むことを特徴としてもよい。
【００３０】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、回収の工程が、液滴の方向への制限酵素溶液の流れを形成して、ＤＮＡフラグメントを液滴へ移動させる操作を更に含むことを特徴としてもよい。
【００３１】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、回収の工程が、基板上に並べられた液滴に電気力を作用しＤＮＡフラグメントを浮上させて、液滴内に含有されるＤＮＡフラグメントの基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴としてもよい。
【００３２】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、回収の工程が、密度の大きい液体から成る液滴中にＤＮＡフラグメントを含有させＤＮＡフラグメント自身の浮力を生じさせて、液滴内に含有されるＤＮＡフラグメントの基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴としてもよい。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、回収の工程が、液滴が並べられた基板を振動させて、液滴内に含有されるＤＮＡフラグメントの基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴としてもよい。
【００３４】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法は、回収の工程が、液滴が表面にシリコンの被覆を施した基板上に並べられて、液滴内に含有されるＤＮＡフラグメントの基板への付着を防止する操作を更に含むことを特徴としてもよい。
【００３５】
本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、微粒子に表面に結合されたＤＮＡとを収容する収容部と、収容部の微粒子を、収容部内の１つの位置に固定する固定手段と、固定された微粒子の表面に結合したＤＮＡを伸張する伸張手段と、伸張したＤＮＡをＤＮＡとＤＮＡフラグメントとに切断する切断手段と、切断手段で得られたＤＮＡフラグメントを回収する液滴を形成する液滴形成手段と、液滴にＤＮＡフラグメントを含有させ、ＤＮＡフラグメントを含む液滴を回収する液滴回収手段と収容部に収容されているＤＮＡを観察する観察手段とを備えることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、固定手段が、収容部内に収容された微粒子にレーザー光を照射する手段を備えることを特徴としてもよい。
【００３７】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、固定手段が、微粒子を吸着する電極を収容部内に備えることを特徴としてもよい。
【００３８】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、固定手段が、微粒子を係合させる固体を収容部内に備えることを特徴としてもよい。
【００３９】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、伸張手段が、収容部に収容された液体に電界を印加する電界印加手段を含むことを特徴としてもよい。
【００４０】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、伸張手段が、収容部内に単一の方向をもつ液体の流れを形成する流れ形成手段を含むことを特徴としてもよい。
【００４１】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、レーザー光を発生する手段と収容部への該レーザー光の光導波路又は光入射路とを備えることを特徴としてもよい。
【００４２】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、観察手段が、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡフラグメントから発せられた蛍光の１つの光導波路又は光入射路と、該蛍光を検出する手段とを備えることを特徴としてもよい。
【００４３】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段のレーザー光の光導波路又は光入射路が、観察手段の蛍光の光導波路又は光入射路と同一であることを特徴としてもよい。
【００４４】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段のレーザー光の光導波路又は光入射路が、観察手段の蛍光の光導波路又は光入射路と異なることを特徴としてもよい。
【００４５】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、微小スポット光を発生する手段と収容部への該微小スポット光の光導波路又は光入射路とを備えることを特徴としてもよい。
【００４６】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、絶縁性の微小なプローブと、プローブに電流を供給する手段とを備えることを特徴としてもよい。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、導電性の微小なプローブと、プローブの先端に電界を発生させる手段とを備えることを特徴としてもよい。
【００４８】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、微小な振動子を備えることを特徴としてもよい。
【００４９】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、収容部の伸張されたＤＮＡを中心にして対称に設置された、２台の対面する微小な振動子を備えることを特徴としてもよい。
【００５０】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断手段が、収容部に局所的に液体を供給する微小なキャピラリを備えることを特徴としてもよい。
【００５１】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、観察手段が、ＤＮＡが切断されたことを検出する切断終了検出手段を更に備えることを特徴としてもよい。
【００５２】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断終了検出手段が、収容部に収容されたＤＮＡから発せられる蛍光を含む光像を撮像して、撮像された視野内に含まれる蛍光の強度変化を検出する視野内ＤＮＡ蛍光強度測定装置を備えることを特徴としてもよい。
【００５３】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、切断終了検出手段が、ＤＮＡが切断されて生じたＤＮＡフラグメントから発せられる蛍光を検出するＤＮＡフラグメント蛍光検出装置を備えることを特徴としてもよい。
【００５４】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、液滴形成手段が、形成された液滴の径を検出する液滴径検出装置を更に備えることを特徴としてもよい。
【００５５】
液滴形成手段が、形成された液滴を振動させる振動装置を更に備えることを特徴としてもよい。
【００５６】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、液滴形成手段が、ＤＮＡが切断されたことを切断終了手段が検出した後に液滴を振動させる制御手段を更に備えることを特徴としてもよい。
【００５７】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、液滴回収手段が、液滴が並べられる基板を備えることを特徴としてもよい。
【００５８】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、液滴回収手段が、基板を可動させる装置を更に備えることを特徴としてもよい。
【００５９】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、基板が、表面にシリコンの被覆を有することを特徴としてもよい。
【００６０】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、液滴形成手段が、密度１．７［ｇ／ｃｍ3 ］の液体から成る液滴を形成することを特徴としてもよい。
【００６１】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、液滴回収手段が、基板上に並べられて回収された液滴内に含有されるＤＮＡフラグメントの基板への付着を防止する付着防止手段を更に備えることを特徴としてもよい。
【００６２】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、付着防止手段が、基板と電気的に接続される、基板の液滴を有する面との間に電界を発生させる電極を備えることを特徴としてもよい。
【００６３】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、付着防止手段が、基板を振動させる振動装置を備えることを特徴としてもよい。
【００６４】
本発明では、不活性化させた制限酵素溶液中に含まれる１つのＤＮＡ分子に対して、制限酵素を局所的に活性化してＤＮＡ分子を切断するため、構造の欠損のないＤＮＡフラグメントが得られる。
【００６５】
また、本発明では、ＤＮＡを微粒子に結合させた後この微粒子を１つの位置に固定するため、その後のＤＮＡの伸張の操作を、流体の流れを用いる方法等の容易な方法により行うことが可能となる。また、このように伸張されたＤＮＡは、溶液の中で固定された状態であるため、容易に一方の末端から順に切断する操作ができるようになる。
【００６６】
また、本発明では、ＤＮＡ分子の一方の末端からＤＮＡ分子を順次切断してＤＮＡフラグメントを得て、これを切断された順に回収するため、その後決定された各ＤＮＡフラグメントの各塩基配列は、ＤＮＡ分子内におけるこれらのもとの順序の情報をも有することになる。このため、ＤＮＡ全体の塩基配列の決定のために、ＤＮＡ分子をただ１分子必要とするだけである。
【００６７】
以下、添付した図面を参照して、本発明を更に詳細に説明する。尚、添付した図面においては、共通の要素には共通の番号を付し、重複する説明を省略した。
【００６８】
（制限酵素）
本発明には、公知の制限酵素を特に制限なく用いることが可能である。この制限酵素は、６塩基を認識するものであってもよく、または８塩基を認識するものであってもよい。このような制限酵素の中でも、扱い易さの点から、認識塩基配列に対して特定の位置でＤＮＡ分子鎖を切断するクラスII制限酵素が好適に使用される。
【００６９】
本発明に好ましく用いることができる制限酵素の例は、以下の表１に挙げられる。
【００７０】
【表１】
0003727369.tif 000002
【００７１】
また、このような制限酵素の溶媒には、制限酵素を変性しない水溶液であれば、制限酵素の活性化に適した公知の溶媒を特に制限なく用いることができる。上記の制限酵素の一部に関して、好ましい溶媒の組成、及びこれらの活性化のためのｐＨ及び温度を以下の表２に示す。
【００７２】
【表２】
0003727369.tif 000003
【００７３】
（制限酵素の活性の制御）
本発明では、制限酵素の活性を制御する方法として、温度、ｐＨ、マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）の濃度、ＡＴＰ（アデノシン三燐酸）の濃度等、制限酵素の活性に影響を与える公知の条件を、特に制限なく用いることができる。この中でも、局所的に活性を与え易い点から、Ｍｇ2+の濃度により活性を制御する方法及び温度により活性を制御する方法が好適に用いられる。
【００７４】
（ＤＮＡ切断のための局所的活性化の大きさ）
本発明においては、制限酵素を用いてＤＮＡを切断するため、係る制限酵素が認識する特定の塩基配列（認識塩基配列）が１つ以上含まれているＤＮＡ分子鎖の部分だけを局所的に活性制御できればよく、好ましくは、認識塩基配列がただ１つ含まれているＤＮＡ分子鎖の部分だけを局所的に活性制御すればよい。
【００７５】
ただ１つの認識塩基配列を含むＤＮＡ分子鎖の部分の大きさ（長さ）は、以下のようである。例えば、６塩基を認識する制限酵素を用いる場合は、この特定の６塩基の配列は、４6 ＝４, ０９６配列に１つ含まれる確率をもつ。従って、ＤＮＡ分子鎖の約４．１ｋｂの大きさを局所的に活性化できればよく、この大きさは、約１．６μｍである。また、８塩基を認識する制限酵素を用いる場合は、この特定の８塩基の配列は、４8 ＝６５, ５３６配列に１つ含まれる確率をもつ。従って同様に、ＤＮＡ分子鎖の約６５．５ｋｂの大きさ、即ち約２５μｍを局所的に活性化できればよい。
【００７６】
本発明におけるＤＮＡの切断では、このただ１つの認識塩基配列を含むＤＮＡ分子鎖の部分の大きさを局所的に活性化してもよく、または、これより小さい大きさを活性化させて、その活性化をＤＮＡの末端から他方の末端の方向へ順次移動させてもよい。
【００７７】
（Ｍｇ2+の濃度による制限酵素の活性制御）
Ｍｇ2+の濃度により制限酵素を不活性にする場合は、公知のキレート剤を過剰に添加することによって、制限酵素溶液中のＭｇ2+を捕捉することが好ましい。Ｍｇ2+を捕捉する能力の点から、キレート剤にはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を用いることが好ましい。ここに、ＥＤＴＡ等を「過剰に」添加するとは、係る溶液に含まれるＭｇ2+を捕捉するに充分であるが、その後の切断工程において局所的に供給されたＭｇ2+を直ちに捕捉しない程度の量のＥＤＴＡ等を添加することである。
【００７８】
（Ｍｇ2+の濃度による局所的活性化）
図８は、Ｍｇ2+の濃度により制限酵素を制御する態様において、上述した局所的活性化の大きさの部分のＭｇ2+濃度を高めて、制限酵素を局所的に活性化させる好ましい方法の例を示す、微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図である。本発明においてＭｇ2+の濃度により制限酵素を局所的に活性化させる方法は、他の場所のＭｇ2+の濃度を上昇させずに目的とする箇所にＭｇ2+を充分に供給できる方法であれば、特にその供給方法は制限されない。好ましくは、図８（ａ）に示されるように、その一端が微粒子８２に結合したＤＮＡ８０に対して、微粒子８２を１つの位置に固定してＤＮＡ８０を伸張させた後、キャピラリ８３を目的とする箇所に接近させ、このキャピラリによってＭｇ2+を含有した水溶液を、矢印８３１の様にこの箇所に局所的に供給して、制限酵素を局所的に活性化させてＤＮＡ８０とＤＮＡフラグメント８０１とに切断する態様であってもよく、図８（ｂ）に示されるように、Ｍｇ2+を含有したマイクロカプセル８４を制限酵素溶液の中に供給し、目的の箇所に微弱なレーザー光（矢印８５で図示）を照射してマイクロカプセルを破壊することにより、Ｍｇ2+を局所的に供給する態様であってもよい。この場合、例えば、キャピラリは内径０．５μｍ程度のものが好適に使用可能である。また、マイクロカプセルは、制限酵素溶液に多数供給してもよい。
【００７９】
（温度による制限酵素の活性制御）
温度により制限酵素を不活性化する場合は、酵素を活性化温度より低温にしてもよく、また高温にしてもよいが、制限酵素を変性させない点から、低温にして制限酵素を不活性化させることが好ましい。従ってこの場合は、このように不活性化された制限酵素溶液に含有されているＤＮＡ分子の一方の末端附近を局所的に加熱して、局所的に制限酵素を活性化させることが好ましい。
【００８０】
（加熱による局所的活性化）
図９及び図１０は、温度により制限酵素を制御する態様において、上述の局所的活性化の大きさの部分を加熱して、制限酵素を局所的に活性化させる好ましい方法の例を示す、微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図である。本発明において加熱により制限酵素を局所的に活性化させる方法は、他の場所の温度を上昇させずに目的とする箇所を充分に加熱でき且つ過熱させない方法であれば、特にその加熱方法は制限されない。このような加熱の方法の好ましい例としては、以下の加熱方法が列挙できる。例えば、図９（ａ）に示されるように、ＤＮＡ分子８０の目的の箇所に直接レーザー光（矢印８６で図示）を照射する態様であってもよい。この場合は、用いられるレーザー光は、上述の局所的活性化の大きさの範囲内のみを加熱でき且つＤＮＡに損傷を与えない４００ｎｍ以上の波長を有していればよく、好ましくは、６００ｎｍ以上の波長を有するレーザー光が用いられる。溶液を発熱させ易い点から、約１０６４ｎｍのＹＡＧレーザー光が特に好ましい。また、図９（ｂ）に示されるように、目的とする箇所に可視光線（８７で図示）を照射して加熱する態様であってもよい。この態様において使用できる光源は、上述の局所的活性化の大きさの範囲内のみを加熱でき且つ他の部分を加熱しない限り、特に制限なく公知のスポット光源を用いることができる。
【００８１】
また、図９（ｃ）に示されるように、絶縁性の微小なプローブ８８を目的の箇所に接近させ、このプローブ８８の表面に電流を流してプローブ自身を加熱させる態様であってもよい。この場合、上述の局所的活性化の大きさのみを加熱するためには、プローブ８８の先端部の曲率半径が１００μｍ程度のものを用いてもよい。このような先端部の曲率半径が１００μｍ程度のプローブは、電界研磨法等で容易に作製できる。または、図９（ｄ）に示されるように、電界をその先端に集中させた導電性の微小なプローブ８９をＤＮＡ分子鎖の目的の箇所に接触させて加熱する態様であってもよい。このプローブ８９も同様に１００μｍ程度の曲率半径を有していてもよく、このような先端部の曲率半径が１００μｍ程度のプローブは、同様に電界研磨法等で容易に作製できる。
【００８２】
また、図１０（ａ）に示されるように、微小な振動子９０による振動を伝播させて（矢印９０１で図示）目的の箇所の周囲の溶液を振動させて、目的の箇所を局所的に加熱する態様であってもよい。上述の局所的活性化の大きさのみを加熱するためには、この振動子は、振動部が１００μｍ程度の大きさであればよい。このとき振動によるエネルギー伝達の効率の点から、図１０（ａ）に示されるように、好適には振動部が球面であってもよい。また、更に好適には、図１０（ｂ）に示されるように、２台の振動子９０ａ及び９０ｂをＤＮＡを中心に対称に配置して振動を伝播させて（矢印９０１で図示）定常波を形成してもよい。
【００８３】
また、図１０（ｃ）に示されるように、微小なキャピラリ９１を目的の箇所に接近させ、係る制限酵素が活性化する温度の液体を流し（矢印９１１で図示）て、目的の箇所を局所的に加熱する態様であってもよい。この態様の場合、上記の局所的活性化の大きさの範囲内に流体を供給する点から、内径が０．５μｍ程度のキャピラリを用いてもよい。また、キャピラリ９１を介して流す液体の組成は、係る制限酵素の活性を阻害する物質及び制限酵素を変性させる物質が含まれていない限り、特に制限されない。
【００８４】
（ＤＮＡの微粒子表面への結合）
ＤＮＡ分子を微粒子に結合させる方法は特に制限されないが、操作の行い易さの点から、化学結合による方法が好ましい。このような化学結合の中でも、結合の強度の点から、ビオチン−アビジン結合を利用してＤＮＡと微粒子表面とを結合させることが特に好ましい。
【００８５】
このようにＤＮＡと結合させるための微粒子には、公知の微粒子を特に制限なく用いることができるが、後述するレーザートラップによる微粒子の固定のため、０．５〜３μｍ程度の大きさの微粒子が好ましい。また、後述するＤＮＡの観察のため、透明度が高く自身の蛍光が小さい微粒子が好ましい。また、ＤＮＡの切断操作等が行われる際、ＤＮＡを沈ませないため、制限酵素溶液の比重よりも低い比重の粒子が好ましい。このような粒子には、好適には０．５〜３μｍ程度の大きさのラテックス粒子が用いられる。また、ビオチン−アビジン結合を用いてＤＮＡを微粒子表面に結合させる態様においては、微粒子表面にアビジン標識が施された粒子を用いる必要がある。このような粒子としては、表面にアビジン標識が施された０．５〜３μｍ程度の大きさのラテックス粒子が特に好適に用いられる。
【００８６】
（微粒子の固定）
図１１は、本発明において微粒子を１つの位置に固定する好適な方法の例を示す、微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図である。ここで図１１でのＤＮＡはまだ伸張されていない。本発明において、ＤＮＡを結合させた微粒子を１つの位置に固定する方法は、その後のＤＮＡ伸張の操作、切断操作及び回収操作に支障をきたさずに上記の微粒子を固定できる方法である限り、特に限定されない。このような微粒子の固定方法の例としては、次に挙げる方法が好ましい。例えば、図１１（ａ）に示されるように、微粒子にレーザー光９２を照射して微粒子をトラップし（９２１で模式的に図示）、この光圧力によって微粒子を１つの位置に固定してもよい。この場合は、連続発振のレーザーであれば、公知のレーザー光を特に制限なく用いることができる。このようなレーザー光には、可視光レーザーを用いてもよく、または赤外光レーザーを用いてもよい。このようなレーザー光の強度は、好ましくは、シングルモードで１００ｍＷ程度の強度であってもよい。また、レーザー光の代りに、微粒子に電界を印加し微粒子をトラップして固定する態様であってもよい。
【００８７】
また、図１１（ｂ）に示されるように、ＤＮＡを結合させた微粒子よりも大きな固定された電極９３に、係る微粒子を電気力によって吸引させて、微粒子を１つの位置に固定してもよい。また、図１１（ｃ）に示されるように、微粒子の大きさよりも小さな隙間を有する固定された固体９４に微粒子を係合させて、微粒子を１つの位置に固定してもよい。
【００８８】
（ＤＮＡの伸張）
図１２は、本発明でＤＮＡ分子鎖を伸張する好ましい例を表す、微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図である。本発明においては、前述のＤＮＡが結合された微粒子を固定した後、係るＤＮＡ分子鎖を伸張する。この伸張の操作には、例えば、図１２（ａ）に示されるように、固定された微粒子８２の周囲の制限酵素溶液に単一方向の流れ（矢印９５で図示）を形成して、ＤＮＡ分子鎖８０を伸張してもよい。このように流れの形成によるＤＮＡ分子鎖８０の伸張の場合は、例えばヒトゲノムの場合は、少なくとも１０μｍ／ｓｅｃ．程度の流速を与えれば、ＤＮＡ分子はその後の切断操作を行うに充分な程度に伸張する。
【００８９】
また、図１２（ｂ）に示されるように、固定された微粒子８２を含む制限酵素溶液に電界を印加し（矢印９６で図示）、ＤＮＡ８０を１方向に配向させて分子鎖を伸張してもよい。この場合には、好ましくは、高周波電界が印加される。このように高周波電界を印加してＤＮＡ分子鎖８０を伸張させる場合には、１０6 ｖ／ｃｍ程度の電界を印加すればよい。
【００９０】
ちなみに、静電気中でのＤＮＡ分子の配向に関する研究が、静電気学会講演論文集（鷲津ら、３６９〜３７２頁、１９８８年１０月）に記載されている。また、ＤＮＡ分子を一定方向に静電配向させる方法が、静電気学会講演論文集（鷲津ら、１７３〜１７６頁、１９８９年１０月）に記載されている。
【００９１】
（ＤＮＡフラグメントの回収）
本発明では、ＤＮＡ分子鎖を切断して得られたＤＮＡフラグメントは、各切断操作の直後に、それぞれ別々の液滴中に含有されて、それぞれ回収される。このとき、簡単な装置により簡単な操作を行う点から、変動ステージを用いて次のような操作を行うことが好ましい。液滴がＤＮＡフラグメントを含んだ直後に変動ステージ上に液滴を滴下させる。変動ステージを動かしステージ上の別の位置に次のＤＮＡフラグメントを含む液滴を滴下させる。この操作を順次繰り返して、ＤＮＡフラグメント毎に液滴を回収する。このとき、液滴を回収順に並べることにより、回収されたＤＮＡフラグメントには、もとのＤＮＡ分子鎖の末端からの構成順位の情報が与えられる。
【００９２】
（液滴）
本発明に好適に使用される液滴の組成は、ＤＮＡに対して化学的に不活性な、常温で揮発しない液体であれば、ＤＮＡに用いられる公知の液体を特に制限なく用いることが可能である。
【００９３】
ここで、液滴を得る方法は、特に制限なく公知の方法を用いることが可能であり、例えば、非常に低い速度でキャピラリやノズルに液体を流下させることにより、キャピラリやノズルの先端に液滴を形成する方法を用いてもよい。
【００９４】
また、本発明において高い比重の液体から成る液滴を用いて、液滴を基板上に回収後にＤＮＡフラグメント自身の浮力によってＤＮＡフラグメントの基板底面付着を防止する態様では、液滴を形成する液体に添加して比重の高い液滴を得るための物質には、ＤＮＡフラグメントを変質させない物質である限り、水和ないし水中に分散して水溶液の比重を上昇させる公知の物質を特に制限無く用いることが可能である。このような物質を例示すれば、好適には、以下の物質を含んだ水溶液が用いられる；サッカロース；マンニトール；フィコール；ポリエチレングリコール等。
【００９５】
このように密度の高い液滴中でＤＮＡフラグメント自身の浮力を生じさせるためには、液滴を形成する密度が１．７［ｇ／ｃｍ3 ］以上であればよく、好ましくは、２．０［ｇ／ｃｍ3 ］以上であればよい。
【００９６】
（液滴によるＤＮＡフラグメントの回収）
本発明において、ＤＮＡフラグメントを含む液滴を回収する操作は、切断操作毎に液滴を形成し、各ＤＮＡフラグメントを別々の液滴に含有させて、これらの液滴を切断操作の行われた順に回収することにより行われる。ここにおいて、液滴の回収には、各切断操作の各液滴を別々に回収できる操作であれば、その方法及び用いられる装置は特に限定されない。
【００９７】
このような回収操作には、操作の容易さ及び装置の簡便さの点から、基板上に液滴を滴下させて液滴を基板上に置くことにより回収することが好ましい。更に、係る基板が可動であり、従って、各液滴を置く位置を変えることにより１枚の基板上に複数の液滴を相互に接触しないように並べることが更に好ましい。
【００９８】
（ＤＮＡフラグメントの塩基配列の決定）
本発明に従って得られたＤＮＡフラグメントに対して、各ＤＮＡフラグメント毎に塩基配列の決定が行われる。ここで、各ＤＮＡフラグメント毎の塩基配列の決定の方法は、公知の塩基配列の決定方法を特に制限なく用いることが可能である。このようなＤＮＡフラグメントの塩基配列の決定方法には、ＤＮＡフラグメントの一端を標識した後、塩基特異的な化学修飾（例えば、グアニンに対してメチル硫酸によるメチル化等）を施して修飾塩基との間の燐酸ジエステル結合を切断することにより末端に標識を持った断片を得て、これをゲル電気泳動により塩基配列の決定を行う、化学的切断を利用する方法や、ＤＮＡポリメラーゼの重合反応を利用して断片を得て、これをゲル電気泳動により塩基配列の決定を行う、酵素的切断を利用する方法等がある。化学的にＤＮＡフラグメントを切断する方法には、代表的には、マクサム・ギルバート法が挙げられ、酵素的にＤＮＡフラグメントを切断する方法には、代表的には、サンガー法が挙げられる。これらの中でも、比較的大きな塩基数のＤＮＡフラグメントの塩基配列の決定に適する点から、本発明にはサンガー法が特に好適に用いられる。
【００９９】
また、このようなＤＮＡフラグメントの塩基配列の決定に先立ち、上記のＤＮＡ切断工程及び回収工程によって得られる各ＤＮＡフラグメントは１フラグメントずつであるため、これらを増幅することが望ましく、このような増幅の方法には、好ましくは、ＰＣＲ(Polymerase chain reaction) を用いることができる。
【０１００】
（得られた各ＤＮＡフラグメントの塩基配列からのＤＮＡ全体の塩基配列の決定）
本発明では、各ＤＮＡフラグメントはＤＮＡから切断された順番の情報をもって回収され得るため、上記のように決定された各ＤＮＡフラグメントの塩基配列を、その回収順に並べれば、求めるＤＮＡの全体の塩基配列を得ることが可能である。ここで、本発明に従えば、制限酵素によってＤＮＡを一方の末端から順に切断するため、レーザー光の光エネルギーによる切断方法に見られるような分子鎖の一部の破壊が生じない。従って、得られた各ＤＮＡフラグメントの塩基配列をそのまま回収順に並べれば、もとのＤＮＡの塩基配列にほぼ一致する。
【０１０１】
（ＤＮＡ塩基配列決定装置）
本発明のＤＮＡ塩基配列決定の方法の実施には、微粒子と、微粒子に表面に結合されたＤＮＡとを収容する収容部と、収容部の微粒子を収容部内の１つの位置に固定する固定手段と、固定された微粒子の表面に結合したＤＮＡを伸張して、ＤＮＡをＤＮＡとＤＮＡフラグメントとに切断する切断手段と、切断手段で得られたＤＮＡフラグメントを回収する液滴を形成する液滴形成手段と、液滴にＤＮＡフラグメントを含有させ、ＤＮＡフラグメントを含む液滴を回収する液滴回収手段と収容部に収容されているＤＮＡを観察する観察手段とを備えている装置を用いればよい。この中で、収容部は、観察のため透明な容器であれば、公知の容器を特に制限なく用いることが可能であるが、下記の固定手段、伸張手段、切断手段及び観察手段を包含又は設置できるものであることが好ましい。また、固定手段及び／又は切断手段にレーザー光を用いる態様では、容器内部の所望の場所にレーザー光を指向性高く到達させるため、レーザー光が通過する際にこれを散乱しない部分を容器壁に有することが好ましい。また、収容部は、液滴形成手段及び／又は液滴回収部と独立の構造であってもよく、液滴形成手段及び／又は液滴回収部を包含していてもよい。
【０１０２】
（固定手段）
本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置の固定手段には、好ましくは、収容部内にレーザー光を照射させるレーザー光源等のレーザー照射手段、オーミック電極等の微小な電極、又はＤＮＡが結合した微粒子のサイズよりも小さな隙間を有し微粒子を係合させるガラスキャピラリやノズル等の隙間素子を含んでいてもよい。この中で、レーザー照射手段は、収容部の外側に設置される態様であってもよい。
【０１０３】
（伸張手段）
伸張手段には、好ましくは、収容部内に高周波電界等の電界を印加する電界印加手段、又は、収容部内に単一方向の流体の流れを形成する流れ形成手段が含まれていてもよい。電界印加手段は、収容部に付属して設置されていてもよく、収容部の外側に設置される態様であってもよい。流れ形成手段は、収容部に包含されていてもよく、収容部の外側に設置されていてもよい。
【０１０４】
（制限酵素を不活性化するための手段）
本発明では、好ましくは、制限酵素を不活性化するために、収容部の収容された制限酵素溶液にＥＤＴＡ等のＭｇ2+のキレート剤を（過剰に）添加するか、又は収容部に収容された制限酵素溶液を冷却する。ＥＤＴＡ等を添加する態様においては、制限酵素溶液に予めＥＤＴＡ等を過剰に加えておいてもよく、又は、収容部にＥＤＴＡを含む溶液を供給できる供給口等が具備されていてもよい。制限酵素溶液を冷却する態様では、不活性化の状態を安定にする点から、収容部全体を冷却することが望ましい。この場合は、収容部の外側を包囲して公知の冷却装置を設置してもよく、収容部自身が壁面等に公知の冷却装置を具備していてもよく、又は、収容部全体を氷温の水浴中に置いてもよい。
【０１０５】
（切断手段）
Ｍｇ2+の濃度によって制限酵素の活性を制御する態様においては、切断手段には、好ましくは、Ｍｇ2+を含む溶液を含有するマイクロカプセルを制限酵素溶液中に含ませてこれをレーザー光で破壊するためのレーザー光照射手段、又は、キャピラリ等によってＭｇ2+を含む溶液を局所的に供給する手段が用いられる。
【０１０６】
温度によって制限酵素の活性を制御する態様においては、切断手段には、好ましくは、レーザー光を発生する手段、微小スポット光を発生する手段、絶縁性のプローブとプローブに電流を供給する手段、導電性のプローブとプローブの先端に電界を発生させる手段、微小な振動子、又は微小なキャピラリのいずれか１つが含まれていてもよい。
【０１０７】
レーザー光を発生する手段及び微小スポット光を発生する手段は、好ましくは、収容部の外側に設置され、収容部への光導波路又は光入射路を含む。絶縁性のプローブ、導電性のプローブ、微小な振動子、及び微小なキャピラリは、その構造上、収容部に包含されており、それらにそれぞれ対応して、電流、電界、振動を発生させるためのエネルギー及び高温の液体は、収容部の外部から供給されることが好ましい。ここで、振動子を含む切断手段では、振動により局所的に与えられるエネルギーの効率を高める点で、定常波を形成するために振動子を２台対面して設置することが好ましい。
【０１０８】
また、切断手段には、切断の操作が１回終了しＤＮＡフラグメントが１つ得られたことを検出する切断終了手段が更に備えられていてもよい。
【０１０９】
（液滴形成手段）
液滴形成手段に関しては、液滴を所望の速度で形成できれば、その形成手段の態様及び構成は、特に制限されない。例えば、キャピラリやノズルを用いて、非常に低い速度でキャピラリやノズルに液体を流下させることにより、キャピラリやノズルの先端に液滴を形成する態様であってもよい。
【０１１０】
また、液滴形成手段は、形成された液滴の径を検出する液滴径検出装置を更に備えていてもよい。この液滴径検出装置は、例えば、キャピラリやノズルの先端部等の液滴が形成されている箇所を撮像して画像処理を行うことにより液滴の径を検出する装置であってもよい。
【０１１１】
また、液滴形成手段は、形成された液滴を振動させて落下させるための振動装置を更に備えていてもよい。この場合は、更に、ＤＮＡの切断の操作が１回終了してＤＮＡフラグメントが１つ得られたことを上記の切断終了検出手段が検出した後に、振動を開始して液滴を回収する制御手段を備えていることが特に好ましい。
【０１１２】
（液滴回収手段）
液滴回収手段に関しては、得られた各ＤＮＡフラグメントを１つずつ含んだ液滴を別々に回収できるものであれば、その態様及び構成は特に限定されない。このような液滴回収手段としては、簡便な装置であるという点から、変動ステージに固定された基板又は容器であることが好ましい。この場合は、ＤＮＡフラグメントを含む各液滴を、変動ステージによって収容する（又は置く）基板／容器の位置を変えながら、回収された順に並べていくことが好ましい。
【０１１３】
ここで、変動ステージに固定された基板の態様においては、所望の数の液滴を別々に置くことができる大きさを有していればよく、基板の形状は特に限定されない。基板上での液滴の並べ方は、円板状、螺旋状、直線状、複数の直線状等であってもよい。
【０１１４】
図１３は、液滴９７を回収した基板７５の断面図であり、回収されたＤＮＡフラグメント８０１の基板７５表面への付着を防止する手段を表す。基板上に液滴を回収する場合、回収された液滴内に含まれるＤＮＡフラグメントが基板の底面へ付着することを防止するために、液滴回収手段には回収付着防止手段が更に具備されていてもよい。このような付着防止手段には、例えば、図１３（ａ）に示されるように、液滴９７が密度の高い液体から構成され液滴に含有されるＤＮＡフラグメント８０１自身の浮力を生じさせる態様によって、ＤＮＡフラグメント８０１の基板７５表面への付着を防止してもよい。また、図１３（ｂ）に示されるように、基板７５と電気的に接続された電極９８を設置して、基板７５表面上に電界を発生させる態様であってもよく、あるいは、図１３（ｃ）に示されるように、振動装置９９によって基板７５を振動させる態様であってもよい。また、液滴回収手段が付着防止手段を更に具備するのではなく、例えば、図１３（ｄ）に示されるように、基板７５自身の表面が付着性の低いシリコン被覆７５１を有する態様であってもよい。
【０１１５】
【実施例】
以下、添付した図面を参照して、本発明の実施例を詳細に説明する。尚、添付した図面においては、同一要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【０１１６】
図１は、本実施例におけるＤＮＡ分子の塩基配列決定のフローを表すフロー図であり、図２は、本実施例に用いたＤＮＡ塩基配列決定装置の構成図である。
【０１１７】
まず、図１を参照して、本実施例のＤＮＡ塩基配列決定のフローを説明する。図１に示されるように、ＤＮＡ分子のマニピュレーションによって、ＤＮＡ１分子を分離して取り出した（図１（ａ））。次に、このＤＮＡ１分子を含んだ制限酵素溶液を、約４℃に冷却して、制限酵素の活性を不活性化させた。そして、アビジン標識したラテックス粒子にＤＮＡ分子の一方の末端を結合させ、このラテックス粒子にレーザー光線を照射して光圧力により所定の位置に固定した。この状態で、ＤＮＡ１分子を含んだ制限酵素溶液に約１０μｍ／ｓｅｃ．の流れを形成して、ＤＮＡ分子を伸張させた（図１（ｂ））。
【０１１８】
約４℃制限酵素溶液中でＤＮＡ分子を伸張させた状態で、ＤＮＡに損傷を与えない波長１０６４ｎｍのＹＡＧレーザー光をＤＮＡ分子の微粒子側ではない末端附近に局所的に照射し、ＤＮＡを切断して得られたＤＮＡフラグメント１分子を液滴に含ませて回収した（図１（ｃ１），（ｄ））。この切断操作を繰り返し  （図１（Ｃ２）〜（Ｃｎ），（ｄ））、回収されたＤＮＡフラグメントを別々の液滴に含ませ、回収順に回収用基板上にそれぞれ離して並べた。
【０１１９】
回収された各液滴に含まれるＤＮＡフラグメントをそれぞれ、ＰＣＲにより増幅した（図１（ｅ））。増幅された各ＤＮＡフラグメントは、サンガー法によるシーケンス反応の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって塩基配列が決定された（図１（ｆ））。
【０１２０】
決定された各ＤＮＡフラグメントの塩基配列を、回収順に並べ（図１（ｇ））、ＤＮＡ分子全体の塩基配列が決定された（図１（ｈ））。
【０１２１】
次に、本実施例で用いたＤＮＡ塩基配列決定装置を説明する。図２に示されるように、本実施例で用いたＤＮＡ塩基配列決定装置１０は、ＤＮＡを収容して、固定操作、伸張操作、切断操作並びに回収用の液滴の形成操作を行う本体部１２と、本体部１２に収容されているＤＮＡを観察する観察部１４と、本体部１２にて切断されて液滴に含められたＤＮＡフラグメントを液滴ごと回収する液滴回収部１６とから成る。
【０１２２】
図３及び図４は、図２に示されるＤＮＡ塩基配列決定装置の更に詳細な構成図であり、図４には、図３に示される装置を一部改良した装置が示される。以下、まず図３を参照して、ＤＮＡ塩基配列決定装置１０を更に詳細に説明する。図３に示されるように、ＤＮＡ塩基配列決定装置１０の本体部１２は、ＤＮＡ収容部２０を包含する。本体部１２は、更に、局所加熱により制限酵素を局所的に活性化してＤＮＡを切断するためのレーザー光を発生するレーザー光源２２と、ビームエキスパンダ２４と、光学フィルタ２６と、ハーフミラー２８と、ダイクロックミラー３０と、対物レンズ３２とを包含し、レーザー光源２２から発せられたレーザー光は、点線３４で示される光導波路ないし光入射路を通り、ＤＮＡ収容部２０へと到達する。この構成は、公知の蛍光顕微鏡の構成に見られる構成である。本実施例で用いられたレーザー光源２２は、ＹＡＧレーザー（連続発振、波長１０６４ｎｍ、出力８Ｗ）である。尚、このレーザー光源２２は、この他にも、例えばアルゴンレーザー（連続発振、波長４８８ｎｍ、出力２Ｗ）であってもよい。
【０１２３】
尚、本実施例では、ＤＮＡ及びＤＮＡフラグメントの検出観察に、ＤＮＡ及びＤＮＡフラグメントを蛍光染色し、これに蛍光光源からの光を照射してＤＮＡ及びＤＮＡフラグメントを蛍光させこの蛍光を検出する方法を用いている。このため、図３に示されるように、本体部１２は更にＤＮＡの観察のための蛍光光源３６を包含する。蛍光光源３６から発せられた可視光は、ハーフミラー２８の光を反射しない側に入射してこれを通過し、ダイクロックミラー３０によって反射されて二点鎖線３８で表される光導波路ないし光入射路を通り、対物レンズ３２を介してＤＮＡ収容部２０に入射する。図３では、図示のために、レーザー光の光導波路ないし光入射路３４と観察用蛍光光源からの光導波路ないし光入射路３８とを少し離して描いているが、実際には、これらの光導波路ないし光入射路３４及び光導波路ないし光入射路３８とは同一である。光導波路ないし光入射路３８を通って収容部２０に入射した可視光により、ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントは蛍光を発し、一点鎖線３９で示される光導波路ないし光入射路を通って観察部１４へと入射する。
【０１２４】
観察部１４は、収容部で反射散乱したレーザー光をカットする光学フィルタ５０ａ及び５０ｂと、高感度ＴＶカメラ５２とを備える。本体１２の収容部２０に収容されたＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントから発せられた蛍光は、一点鎖線３９で示される光導波路ないし光入射路を通って高感度ＴＶカメラ５２に入射する。また、高感度の測定を必要としない場合のために、観察部１４は、移動可能なミラー５４と、ＴＶカメラ５６とを備え、光学フィルタ５０ａと５０ｂとの間にミラー５４を移動させることにより、光導波路ないし光入射路３９をＴＶカメラ５６へと向けることが可能である。このとき、光導波路ないし光入射路３９は、高感度カメラ５２へは形成されていない。このような高感度ＴＶカメラ及びＴＶカメラには、光像を２次元的に撮像できるものが好ましく、更に好ましくは、ＣＣＤカメラ又はビジコンカメラが用いられる。本実施例に用いた装置では、高感度ＴＶカメラにはＣ２４００−８型（浜松ホトニクス社製）、ＴＶカメラには、Ｃ５４０５−０１型（浜松ホトニクス社製）を用いた。
【０１２５】
高感度ＴＶカメラ５２又はＴＶカメラ５６によって撮像された光像は、画像処理装置５８に転送されて、バックグラウンドノイズの低減や輝点の抽出等の処理が行われた後、ビデオレコーダ６０によって記録され、また、モニタ６２によってモニタされる。本実施例では、画像処理装置、ビデオレコーダ及びモニタにはＡＲＧＵＳ１００システム（浜松ホトニクス社製）を用いた。
【０１２６】
尚、図３に示されるように、ＤＮＡ塩基配列決定装置１０の本体部１２において、レーザー光の光導波路ないし光入射路３４と観察用蛍光光源からの光導波路ないし光入射路３８とが同一である場合は、レーザー光源からのレーザー光と蛍光光源からの可視光との波長の違いから、観察焦点距離とレーザー焦点距離とに差が生じる場合があり、１つの対物レンズでは観察と切断のどちらかに支障をきたす場合もある。この問題を解決するために、図４に示されるように、レーザー光源２２からのレーザー光を収容部２０に入射させるための第２の対物レンズ４０及び第２の対物レンズ４０へレーザー光を入射させるためのミラー４２を別に設置し、切断用のレーザー光の光導波路ないし光入射路を点線３４のように、蛍光光源３６からの光導波路ないし光入射路３８とは別に設けてもよい。この装置では、切断用レーザー光と観察用可視光とが波長の異なる場合でも、対物レンズがそれぞれ異なるため、それぞれ異なった焦点距離を設定することが可能である。
【０１２７】
尚、図３では図示されないが、本実施例で用いたＤＮＡ塩基配列決定装置１０の本体部１２には、後述する微粒子固定のために、切断のための局所加熱用レーザー光源２２とは別のレーザー光源を包含する。この別のレーザー光源は、局所加熱用レーザー光源２２の近傍に配置され、発せられたレーザー光は同じ光導波路ないし光入射路３４を通って収容部２０へと入射する。この別のレーザー光源は、ＹＡＧレーザー（連続発振、波長１０６４ｎｍ、出力１００ｍＷ）である。
【０１２８】
図５（ａ）及び（ｂ）は、観察部で観察されたＤＮＡからの蛍光の情報に基づいてＤＮＡ切断処理の制御を行うための情報のフローを表したフロー図である。以下、図５（ａ）及び（ｂ）を参照して、観察部において得られたＤＮＡからの蛍光の情報に基づくＤＮＡ切断処理の制御の流れを説明する。尚、各要素の中で、装置の図に図示を省略した要素がある。
【０１２９】
本実施例のＤＮＡ塩基配列決定装置では、図５（ａ）にその制御の流れが示されるように、ＤＮＡ収容部を撮像し、収容されたＤＮＡからの蛍光強度の変化を検出する方法により、ＤＮＡ切断操作の制御を行っている。図５（ａ）に示されるように、収容部２０内のＤＮＡ８０から発せられている蛍光は、レンズ３２、フィルタ５０を通って蛍光強度検出器５９１へと入射し、検出された強度の経時的変化は信号変位検出器５９２によって検知されＤＮＡ切断操作１回の終了を検知し、この情報を基にコントローラ７８がレーザー光源を制御する。ここで、蛍光強度検出器５９１及び信号変位検出器５９２は、図３及び図４では高感度ＴＶカメラ５２と画像処理装置５８がその機能を果たしているが、コントローラ７８は図３及び図４では図示されていない。
【０１３０】
尚、図５（ｂ）に示されるように、ＤＮＡ収容部において切断されＤＮＡ収容部から液滴回収部へと移動するＤＮＡフラグメントを検出する方法によってＤＮＡの切断操作の終了を検知してレーザー光源を制御する態様であってもよい。この態様では、ＤＮＡの切断が行われる箇所５９５と液滴回収部５９５との間の部分を撮像する。ＤＮＡの切断が行われる箇所５９４でＤＮＡを切断して得られたＤＮＡフラグメントが液滴回収部５９５へ移動する（矢印５９６で指示）過程で、ＤＮＡフラグメントの通過により発せられた蛍光がレンズ３２１、フィルタ５０１を通ってＤＮＡ蛍光検出器５９７に入射し、切断操作が終了したことがＤＮＡ蛍光検出器５９７に検知される。そして、この情報によってコントローラ５９８がレーザー光源を制御する。
【０１３１】
図６は、本実施例で用いられたＤＮＡ収容部２０及び液滴回収部１６の構成図であり、ＤＮＡ収容部は模式的な断面図として表した。以下、図６を参照して、本実施例で用いられたＤＮＡ収容部２０と液滴回収部１６とを詳細に説明する。本実施例で用いられたＤＮＡ収容部２０は、ＤＮＡを収容する容器７０と、振動体７２と、冷却装置７４とから成る。図６に示されるように、透明なプラスチック製の容器７０は、その内部に、微粒子とこの微粒子に結合したＤＮＡとを収容するための内部管７０１を包含し、一方の端がその先端が先細になり開口を有するノズル部７０２を備える。ノズル部７０２の先端の開口７０３は、液滴（７０４で図示）が形成される液滴形成部である。振動部７２は、容器７０の上部に設置される。冷却装置７０４は、容器７０を包囲して設置される。
【０１３２】
また、図６に示されるように、容器７０は内部管７０１によって、微粒子とこの微粒子に結合したＤＮＡとを収容する第１の内部７０５と、その外側の第２の内部７０６とに区分される。第１の内部７０５及び第２の内部７０６には共に、制限酵素を含有する制限酵素溶液が収容される（図示せず）。第１の内部７０５には、ＤＮＡ分子８０と、ＤＮＡ分子８０が表面に付着された微粒子８２とが収容される。本実施例では、微粒子８２には直径１μｍのラテックス粒子を用いた。
【０１３３】
図６に示されるように、容器７０の第１の内部７０５には、ＤＮＡを伸張するために第１の流れ（矢印７０７で図示）が形成されている。この第１の流れは、振動体７２の方から開口７０３の方へと向かう単一な方向をもち、本実施例におけるその流速はおよそ１０μｍ／ｓｅｃ．であった。一方、第２の内部７０６には、ノズル部７０２の先端の開口７０３に７０４で図示される液滴を形成するための第２の流れ（矢印７０８で図示）が形成されている。これら第１の流れ及び第２の流れ共に、容器７０に設置された約１００μｍのノズルチップ（図示せず）により噴出する流れにより形成される。尚、この流れの形成方法は、公知のフローサイトメトリーにて用いられる方法である。
【０１３４】
図６に示されるように、液滴回収部１６は、表面にシリコンの被覆を施された円盤状の基板７５と、基板７５の下に固定されて基板７５を動かす変動ステージ７６と、容器７０のノズル部７０２の開口７０３に形成された液滴（７０４で図示）の径を検出する液滴成長検出装置７７と、液滴成長検出装置７７で検出された径の情報を時系列的に処理するコントローラ７８と、コントローラ７８からの指示により振動子７２を振動させて液滴（７０４）を振動させて基板７５へと落下させるための振動子駆動装置７９とから成る。
【０１３５】
図７は、ＤＮＡフラグメントの回収のための液滴形成及び液滴を振動させて落下回収する制御の流れを表すフロー図である。以下、図７及び図６を参照して液滴を介してＤＮＡフラグメントを切断された順序で１つづつ回収する工程を説明する。尚、各要素の中で、装置の図に図示を省略した要素がある。
【０１３６】
図７に示されるように、液滴成長検出装置７７が液滴形成部（本実施例では図６の容器７０の開口７０３）に形成されつつある液滴の径を撮像し、コントローラ７８がこれを経時的に監視する。検出された液滴の径に基づき、コントローラ７８は、図６に示される第２の内部７０６内における制限酵素溶液の流量を制御する第２の微小流量制御装置８５を制御して、第２の内部７０６の流量を制御することにより液滴の形成の速度を制御する。
【０１３７】
そして、ＤＮＡの切断終了の情報がコントローラ７８に入力され（矢印７８１で図示）た後は、コントローラ７８は、図６に示される第１の内部７０５内における制限酵素溶液の流量を制御する第１の微小流量制御装置８３を制御して、ＤＮＡフラグメントを液滴形成部まで流下させる。この時同時に、制限酵素溶液の温度の変化を防止するために、液体温度制御装置８４も制御する。そして、一定時間経過後、コントローラ７８は振動子制御装置７９を制御して液滴を振動させ、ＤＮＡフラグメントを含んだ液滴を回収用の基板７５上に落下させる。コントローラ７８は同時に、基板に接続された変動ステージ７６も制御して基板を移動させることにより、切断操作毎に異なる基板上の位置に液滴を落下させる。
【０１３８】
以下、図１及び図６を参照しつつ本実施例において行われたＤＮＡの塩基配列の決定の操作を説明する。
【０１３９】
本実施例では、目的とするＤＮＡには、ＬａｍｄａＤＮＡとＴｄＣＤＮＡとを用い、これらの塩基配列を本発明に従って決定した。これらのＤＮＡの塩基数、分子量及び分子鎖の長さを纏めて表３に示した。
【０１４０】
【表３】
0003727369.tif 000004
【０１４１】
また、制限酵素には、ＬａｍｄａＤＮＡには６塩基認識のＡｐａIを用い、ＴｄＣＤＮＡには８塩基認識のＢｇｌIを用いた。これらの認識塩基配列と切断断片数とを表４に示した。また、これらの制限酵素の活性に必要な溶液の組成、ｐＨ及び温度を表５に示した。
【０１４２】
【表４】
0003727369.tif 000005
【０１４３】
【表５】
0003727369.tif 000006
【０１４４】
まず、図１に示されるように、上記の表５に従って調製された溶液中でＤＮＡ分子のマニピュレーションによって、ＤＮＡ１分子を分離して取り出した（図１（ａ））。
【０１４５】
次に、この溶液中に取り出されたＤＮＡ１分子を固定するため、表面がアビジン標識された直径１μｍのラテックス粒子を溶液に添加し、収容器を振盪してビオチン−アビジン結合によりラテックス粒子の表面にＤＮＡ分子の一端を結合させた。
【０１４６】
この溶液に制限酵素を添加して制限酵素溶液を調製した。このとき、制限酵素溶液は約４℃に冷却して、制限酵素の活性を不活性化させてあった。これを、図６に示されるＤＮＡ塩基配列決定装置のＤＮＡ収容部７０の第１の内部７０５内に移し変えた。ＤＮＡ収容部７０全体は、冷却装置７４によって充分に冷却された。
【０１４７】
そして、ラテックス粒子８２にレーザー光線（ＹＡＧレーザー、連続発振、波長１０６４ｎｍ、出力１００ｍＷ）を照射して光圧力を作用させ、ラテックス粒子８２をＤＮＡ収容部７０の第１の内部７０５内の所定の位置に固定した。この状態で、ＤＮＡ収容部７０の第１の内部７０５内のＤＮＡ１分子を含んだ制限酵素溶液に、約１０μｍ／ｓｅｃ．の流速をもつ単一方向の第１の流れ７０７を形成して、ＤＮＡ分子を伸張させた（図１（ｂ））。
【０１４８】
約４℃の制限酵素溶液中でＤＮＡ分子を伸張させた状態で、波長１０６４ｎｍのＹＡＧレーザー光（出力８Ｗ、連続発振）をＤＮＡ分子の微粒子側ではない末端附近に局所的に照射した。このとき、制限酵素溶液は、ＤＮＡ分子の粒子と結合していない末端附近で、約１μｍの長さをもって局所的に約３７℃まで加熱された。この他のＤＮＡの部分の温度は、４℃のままであった。このレーザー光の照射により、制限酵素は局所的にＤＮＡを切断したが、このレーザー光照射によるＤＮＡ分子の欠陥は認められなかった。
【０１４９】
前述の切断操作終了検出手段により、切断操作が終了したことが検知され、得られたＤＮＡフラグメント１つは液滴に含まれ、基板７５上に回収された（図１（ｃ１），（ｄ））。回収されたＤＮＡフラグメントが基板表面に付着しにくいように、基板には、図１３（ａ）の様にシリコンの被覆が施されていた。このシリコンの被覆には、シグマコート（シグマ社製）を用いた。尚、このシリコンの被覆にはこの他にも、ジクロロメチルシランを用いて基板上にシリコンの被覆を施してもよい。
【０１５０】
同様に次の切断操作を繰り返して行った（図１（Ｃ２），（ｄ））が、基板５７への回収時に、変動ステージによって基板を僅かに回転させ、２番目に回収された液滴が最初に回収された液滴に接触しないように並べられた。
【０１５１】
そして、更に同様の操作を繰り返し（図１（Ｃｎ），（ｄ））、これらの液滴を基板上に回収順に並べた。
【０１５２】
回収された各滴滴に含まれるＤＮＡフラグメントは、それぞれ、オリゴヌクレオチドとのアニーリングの後にＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成を行う反応を２０〜３０回繰り返して（いわゆるＰＣＲにより）増幅された（図１（ｅ））。
【０１５３】
増幅された各ＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡフラグメント毎に、サンガー法によるシーケンス反応の後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって塩基配列が決定された（図１（ｆ））。詳細には、サンガー法によるシーケンス反応は、基質として４種類のデオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰ）と、チェーンターミネータとして１種類のｄｄＮＰＴとを添加したＤＮＡポリメラーゼ溶液中で、相補鎖ＤＮＡ合成を行い、２本鎖のＤＮＡ断片（ポリヌクレオチド）を多数得た。次いで、サンガー法によるシーケンス反応によって得られた伸張反応生成物であるＤＮＡ断片（ポリヌクレオチド）を尿素存在下で変性させて１本鎖とし、これをアクリルアミドゲル中で電気泳動を行いその長さで分離した。この操作により、ＤＮＡフラグメントの塩基配列が決定された。
【０１５４】
このように決定された各ＤＮＡフラグメントの塩基配列を、回収順に並べ（図１（ｇ））、ＤＮＡ分子全体の塩基配列が決定された（図１（ｈ））。ここにおいて、従来の制限酵素によるランダムな切断を利用した方法では、多数のＤＮＡフラグメントの塩基配列に対して、コンピュータを用いて最良の組合わせを求める、非常に煩雑で労力及び時間を消費する操作が必要であったが、本実施例では、ＤＮＡフラグメントの切断順序の情報をもとに、多数のＤＮＡフラグメントの塩基配列をただ並べるのみであった。また、制限酵素によるＤＮＡ主鎖の切断によりＤＮＡフラグメントを得ているため、欠損部分のない塩基配列が得られた。
【０１５５】
尚、本発明は本実施例に限定されることなく、様々な変形が可能である。例えば、ＤＮＡの局所的な切断には、レーザー光以外にも前述の様にスポット光源、振動子等様々な方法を用いてもよい。
【０１５６】
【発明の効果】
以上詳細に説明してきたように、本発明のＤＮＡ塩基配列決定方法に従えば、一端から順にＤＮＡを切断しその順序の情報をもってＤＮＡフラグメントを回収するため、ＤＮＡフラグメントの塩基配列からＤＮＡ全体の塩基配列を求める際に、コンピュータを用いて最良の組合わせを求める、非常に煩雑で労力及び時間を消費する操作を要しない。また、ＤＮＡ１分子のみで塩基配列の決定を行うことができるため、塩基配列決定の操作に先立ち、煩雑で難しいＤＮＡ分子の増幅の操作の必要がない。
【０１５７】
また、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置は、一端から順にＤＮＡを切断しその順序の情報をもってＤＮＡフラグメントを回収する装置であるため、煩雑なＤＮＡの塩基配列の決定を、１つの装置で簡便に行うことが可能となる。
【０１５８】
従って、塩基数の大きなＤＮＡに対しても、その塩基配列の決定を簡便且つ正確に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例におけるＤＮＡ分子の塩基配列決定のフローを表すフロー図である。
【図２】実施例に用いたＤＮＡ塩基配列決定装置の構成図である。
【図３】図２に示されるＤＮＡ塩基配列決定装置の更に詳細な構成図である。
【図４】図３に示される装置を一部改良した装置の詳細な構成図である。
【図５】実施例において観察部で観察されたＤＮＡからの蛍光の情報に基づいてＤＮＡ切断処理の制御を行うための情報のフローを表したフロー図である。
【図６】実施例で用いられたＤＮＡ収容部２０及び液滴回収部１６の構成図である。
【図７】実施例においてＤＮＡフラグメントの回収のための液滴形成及び液滴を振動させて落下回収する制御の流れを表すフロー図である。
【図８】微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図であり、Ｍｇ2+の濃度により制限酵素を制御する態様において、Ｍｇ2+濃度を高めて制限酵素を局所的に活性化させる好ましい方法の例を示す。
【図９】微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図であり、温度により制限酵素を制御する態様において、加熱により制限酵素を局所的に活性化させる好ましい方法の例を示す。
【図１０】微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図であり、温度により制限酵素を制御する態様において、加熱により制限酵素を局所的に活性化させる好ましい方法の例を示す。
【図１１】微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図であり、微粒子を１つの位置に固定する好適な方法の例を示す。
【図１２】微粒子８２に結合されたＤＮＡ８０の形態図であり、ＤＮＡ分子鎖を伸張する好ましい例を表す。
【図１３】液滴を回収した基板の断面図であり、回収されたＤＮＡフラグメントの基板表面への付着を防止する手段を表す。
【図１４】従来からのサンガー法によりＤＮＡの塩基配列を決定する方法の一例を表すフロー図である。
【符号の説明】
１０…ＤＮＡ塩基配列決定装置、１２…本体部、１４…観察部、１６…液滴回収手段、２０…ＤＮＡ収容部、２２…レーザー光源、２４…ビームエキスパンダ、２６…光学フィルタ、２８…ハーフミラー、３０…ダイクロックミラー、３２…対物レンズ、３４…点線、３６…蛍光光源、３８…二点鎖線、３９…一点鎖線、４０…第２の対物レンズ、４２…ミラー、５０ａ，ｂ…光学フィルタ、５２…高感度ＴＶカメラ、５４…移動可能ミラー、５６…ＴＶカメラ、５８…画像処理装置、６０…ビデオレコーダ、６２…モニタ、７０…容器、７２…振動体、７４…冷却装置、７５…基板、７６…変動ステージ、７７…液滴成長検出装置、７８…コントローラ、７９…振動子駆動装置、８０…ＤＮＡ分子鎖、８２…微粒子、８３…第１の微量流量制御装置、８４…液体温度制御装置、８５…第２の微量流量制御装置、８３…キャピラリ、８４…マイクロカプセル、８５，８６…矢印、８７…光、８８…絶縁性プローブ、８９…導電性プローブ、９０ａ，ｂ…微小振動子、９１…キャピラリ、９２…矢印、９３…電極、９４…固体、９５，９６…矢印、９７…液滴、９８…電極、９９…振動装置、３２１…レンズ、５０１…フィルタ、５９１…蛍光強度検出器、５９２…信号変位検出器、５９４…箇所、５９５…液滴回収部、５９６…矢印、５９７…ＤＮＡ蛍光検出器、５９８…コントローラ、７０１…内部管、７０２…ノズル部、７０３…開口、７０４…液滴、７０５…第１の内部、７０６…第２の内部、７０７，７０８…矢印、７５１…表面、７８１，７８２…矢印、８０１…ＤＮＡフラグメント、８３１，９１１…矢印、９２１…円。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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