(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニン含有媒質中で発酵させるとマスカット様芳香を生成し、４，４，４−トリフルオロ−ＤＬ−バリン含有媒質中で生育し、３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性である、マスカット様芳香を産生する酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）。
【請求項２】
３−クロロ−Ｌ−アラニン１００ｍｇ％以下で生育し、２００ｍｇ％以上では生育しない、請求項１記載の酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）。
【請求項３】
請求項１又は２記載の酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）を用いて発酵して得られたマスカット様芳香をもつ飲食品。
【請求項４】
飲食品が、アルコール含有飲料、発酵調味料又は菓子製品である、請求項３記載のマスカット様芳香をもつ飲食品。
【請求項５】
アルコール含有飲料が、ビール、ワイン、サイダー、清酒、果実酒、雑種発酵酒、老酒、ウイスキー、ブランデー又は焼酎である、請求項４記載のマスカット様芳香をもつ飲食品。
【請求項６】
発酵調味料が、味噌、醤油又は酢である、請求項４記載のマスカット様芳香をもつ飲食品。
【請求項７】
菓子製品が、パン、酒饅頭又は中華饅頭である、請求項４記載のマスカット様芳香をもつ飲食品。
【請求項８】
酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）を用いて発酵させることを特徴とする、マスカット様芳香をもつ飲食品の製造方法。
【請求項９】
酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）が、３−クロロ−Ｌ−アラニン１００ｍｇ％以下で生育し、２００ｍｇ％以上では生育しない酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
マスカット様芳香をもつ飲食品が、アルコール含有飲料である、請求項８又は９記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なマスカット様芳香産生酵母及びそれを用いて発酵を行いマスカット様芳香をもつ飲食品、例えばアルコール含有飲料などを提供することに関する。
【０００２】
【従来技術及び解決すべき課題】
酵母を使用して得られる飲食品、特には発酵飲食品、例えば、ワイン、ビール、清酒などのアルコール含有飲料、味噌、醤油、酢などの発酵調味料、パンなどは、その使用される酵母の産生する香気成分、例えば、エステル類やアルコール類により、それらが有する香りの特性が決定され、それにより発酵生産物の品質に大きな影響を与えていると考えられている。したがって、それら香気成分、例えば、エステル類やアルコール類を如何なる割合で含むようにさせるかにより、得られた製品の香気特性が大きく異なることとなり、得られた製品品質に大きく影響することとなり、酵母を利用する産業にとってそれらの成分を制御することは重要な課題となっている。
【０００３】
例えば、日本酒の香りには、日本酒らしい香り「基調香」と、「上立香」及び「含み香」とがある。「上立香」は盃に鼻を近づけるとふわっと香る果実のような、そして花のような香を言い、吟醸香が代表的なものである。「含み香」は、口の中に入れたとき口中に広がる落ちついた香で、揮発性の弱い成分で構成されている。日本酒の香りの成分は３００種類近くが報告されており、主な香り成分は上記したように高級アルコール類、エステル類などの系統に分けられている。なかにはアルデヒド類や揮発酸類のように個々には歓迎されない香りもあるが、総合的には日本酒様の風味に大切な役割を果たしている。
【０００４】
吟醸香としては、イソアミルアルコールなどの高級アルコール類、その酢酸エステルなどが、デリシャスリンゴのような軽くて芳しい香りとして重要である。最近では、洋梨のようなやや重い香りのカプロン酸などのエチルエステルや、バラ様の香りのβ−フェネチルアルコールや酢酸β−フェネチルが注目されている（「日本酒」、２６〜２７頁、岩波新書、１９９４年）。特に、それらイソアミルアルコール、その酢酸エステルなどは、酵母を利用して得られる飲食品の芳香を大きく特徴付ける重要な成分であることが知られている。
こうして最近では、吟醸酒の主要香気成分である高級アルコール類、その酢酸エステルなど、例えば、イソアミルアルコール、β−フェネチルアルコール、酢酸イソアミル、カプロン酸エチルエステル、酢酸β−フェネチルなどを高度に生産する酵母の育種が試みられている（「清酒酵母の研究」、７９〜９４頁、清酒酵母研究会、１９９２年）。
【０００５】
酵母によるこれら高級アルコールの生成には、二つの経路が提唱されている。第１のものは、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）経路と呼ばれているもので、その経路では菌体外アミノ酸を酵母が取込み、脱アミノ化及び脱炭酸後、炭素数の１つ少ないアルコールに還元されて、高級アルコールが生成されるもので、他のものは酵母のアミノ酸生合成経路の中間体であるオキソ酸が脱炭酸後アルコールに還元され、高級アルコールが生成されるものものである（「ザ・イースト」〔Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ〕、Ｖｏｌ．３、ｐｐ．１７９−１９５、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７０年）。
所望アルコールの生成量の増加を上記第１の経路、すなわちＥｈｒｌｉｃｈ経路を利用し、アミノ酸を添加して得ようとする試みが既に報告されている。またアルコール飲料においは、アミノ酸のロイシンあるいはバリンなどを添加する方法が知られている（「ジャーナル・オブ・ザ・インスティチュート・オブ・ブリューイング」〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ〕、Ｖｏｌ．５９、ｐｐ．４２１−４２９、１９８１年）。ところが、酵母はその生育にあたり窒素源利用に階層性が認められ、例えば他にアンモニアなどの窒素源があると、培地などにアミノ酸が存在するとそれにより生育阻害を受けることが知られており、単に所望の風味を求めて特定のアミノ酸を添加するだけでは所期の目的を達成できない。
【０００６】
これを解決するため、上記第２の経路を活性化した酵母を探索することが試みられている。こうして所望アルコールの生成量の増加を上記第２の経路を利用し酵母のアミノ酸生合成系の活性化により図る試みもされている。ロイシンアナローグである５’，５’，５’−トリフルオロ−Ｄ，Ｌ−ロイシン耐性株酵母による、イソアミルアルコール及び酢酸イソアミルの高生産方法（特開昭６２−５６６９号公報）、アルギニンアナローグであるカナバニン耐性株酵母による、イソアミルアルコール及びその他の高級アルコールの高生産方法（「発酵工学」、Ｖｏｌ．６７、ｐｐ．７、１９８９年）、フェニルアラニンアナローグであるｐ−フルオロフェニルアラニン耐性株酵母による、β−フェネチルアルコール及び酢酸β−フェネチルの高生産方法（「ジェイ・ファーメント・バイオエンジ」〔Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．〕、Ｖｏｌ．１６９、ｐｐ．１２５、１９９０年）、セレルニン耐性株酵母による、カプロン酸及びカプロン酸エチルエステルの高生産方法（「アグリ・バイオル・ケム」〔Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．〕、Ｖｏｌ．５５、ｐｐ．２１５３、１９９１年）、アラニンアナローグである３−クロロアラニン耐性株酵母による、イソアミルアルコール及びイソブチルアルコールの高生産方法（特開平３−７５７９号公報）などが知られている。
【０００７】
最近では、食生活の変化などに伴い、フルーティな香りを持った飲食物、特にはワイン、ビール、清酒などのアルコール含有飲料、味噌、醤油、酢、漬物などの発酵調味料、パン、菓子などが好まれている。特に、清酒などにおいて、マスカットのような高貴で好ましい香りをもつアルコール含有飲料、さらには食品材料などは、強く求められている。しかしながら、これらの香りはほんの僅かな香気成分組成の違いにより大きく異なるので、このような目的のためにはそれに見合った新しい酵母を得る必要がある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、これら香気特性に優れた飲食物を酵母を用いて簡単かつ効率よく得るための道を見いだすべく鋭意研究した結果、新規なマスカット様芳香産生酵母を作出することに成功し、その酵母を使用すればマスカット様芳香をもつアルコール含有飲料等の飲食品が得られることを見出し、本発明に到達したものである。
かくして、本発明はマスカット様芳香産生酵母、該マスカット様芳香産生酵母を用いて発酵することを特徴とするマスカット様芳香をもつ飲食品、特にはアルコール含有飲料、その他の発酵製品の製造方法、並びにマスカット様芳香産生酵母を用いて発酵して得られたマスカット様芳香をもつ飲食品、特にはアルコール含有飲料などを提供する。
本発明の酵母により得られるマスカット様芳香は高貴で好ましい香りであり、非常に上品なものである。
【０００９】
本発明のマスカット様芳香産生酵母は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属し、アラニン含有媒質中で発酵させるとマスカット様芳香を生成し、４，４，４−トリフルオロ−ＤＬ−バリン含有媒質中で生育し、３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性を有するものであればいずれも用いられる。
具体例としては、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＤ−１（「醸協」、第８３巻、第１１号、７２３〜７２８頁、１９８８年及び「清酒酵母の研究（−８０年代の研究−）」、１１１〜１１２頁、清酒酵母研究会、平成４年６月１９日）から選抜して得られ、アラニン含有媒質中で発酵させるとマスカット様芳香を生成する酵母ＨＤ−１（Ｋ−６）（以下、単に「ＨＤ−１（Ｋ−６）」と称す）を育種して選抜されたもの、例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＡ−５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０）あるいはそれから誘導されたもの、その変異株などが挙げられる。
こうして酵母ＨＤ−１（Ｋ−６）から育種され、マスカット様芳香を生成し、４，４，４−トリフルオロ−ＤＬ−バリン含有媒質中で生育し、３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性を有するものであれば、本発明のマスカット様芳香をもつという目的に合致する限りいずれも用いられる。
しかし、本発明においては、１００ｍｇ％以下では生育し、２００ｍｇ％以上では生育しない菌株のものが好ましい。
【００１０】
本発明のマスカット様芳香産生酵母は、例えばビール酵母、ワイン酵母、清酒酵母、ウイスキー酵母、焼酎酵母、パン酵母などの市販の酵母から、当該分野で公知の変異誘発法、例えば、紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線等の照射、化学的変異誘発剤、例えば、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、アクリジン色素誘導体などを接触させる方法を適宜適用し、次に選択培地で生育させ選択して得ることができる。一旦得られたマスカット様芳香産生酵母は、プロトプラストを利用した細胞融合等の手法、遺伝子組換えの手法を用いても育種、改良でき、こうして得られたマスカット様芳香産生酵母は、すべて本発明に含めることができる。好ましくは、アラニン含有媒質中で発酵させるとマスカット様芳香を生成する酵母を選択し、こうして得られたマスカット様芳香産生酵母、例えば、ＨＤ−１（Ｋ−６）を上記した変異誘発法を適用して選択することにより得ることができる。
【００１１】
酵母プロトプラストは、酵母を酵母細胞壁溶解酵素、例えばザイモリアーゼ、ヘリカーゼ、グルスラーゼなどで処理することにより得られる。この処理は、好ましくは２−メルカプトエタノール存在下行われることができ、好ましくは菌体はソルビトール液などで洗浄処理される。酵母細胞壁溶解酵素としては、好ましくはザイモリアーゼ６０，０００が使用され、その使用濃度は約０．０２〜０．１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０４〜０．０５ｍｇ／ｍｌ程度であり、該酵素の処理時間は、約２０〜８０分間である。酵素処理後、直ちに約０．４〜１．２Ｍのソルビトール液あるいは約０．４〜１．２Ｍの塩化カリウムなどで菌体は洗浄処理される。
例えば、酵母を一夜培地（１０ｍｌ、酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％、ｐＨ５．３）中で前培養した菌体液２．０ｍｌを、１００ｍｌの同じ組成の栄養培地に加え対数増殖中期まで３０℃で振とう培養し、得られた菌体約１ｇに３０μｌの２−メルカプトエタノール及び６．０ｍｌの高張液（０．０２ＭのＮａ2 ＨＰＯ4 、０．０２Ｍのクエン酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、１Ｍのソルビトール）を加えて均一に懸濁し、次に１ｍｇ／ｍｌのザイモリアーゼ６０，０００を０．５ｍｌ添加し、３０℃で約３０〜６０分間インキュベーション処理する。
【００１２】
こうしてプロトプラスト化した酵母は、５ｍｌの１Ｍのソルビトールで３回洗浄した後、１Ｍのソルビトール及び１０ｍＭのＣａＣｌ2 を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて、プロトプラスト液とされる。酵母の融合は、ポリエチレングリコールを用いて行うことができる。例えば、約０．４〜１．２Ｍのソルビトール液及び約８〜５０ｍＭのＣａＣｌ2 を含む約３０〜３５％ポリエチレングリコール中に上記したような洗浄プロトプラスト化した酵母をいれ、３０℃で約２０〜６０分間処理することにより、プロトプラスト融合したものが得られる。
融合プロトプラストの再生は、約０．４〜１．２Ｍのソルビトール液を含む高張液（例えば、約０．４〜１．２Ｍのソルビトール、酵母エキス１％、ポリペプトン１％、グルコース２％、寒天２％）で上記融合プロトプラストを２５〜３０℃で２〜５日間培養することによりなされる。
プロトプラスト融合による育種で、キラー性因子、抗細菌性因子を付与することができ、こうした酵母もマスカット様芳香を生成する酵母であるものは本発明の範囲内のものである。
【００１３】
本発明の酵母は、専門家パネラーによる官能試験において、マスカット様香気検定培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％、グルコース１０％、アラニン０．５％）に接種し、３０℃で３週間培養した後、パネラーによる官能試験にかけた結果、すべてマスカット様のさわやかな香りが感じられると評価される。
【００１４】
本発明の酵母は、次のような菌学的性質を有する。すなわち、この酵母は、
（１）マスカット様香気体検定培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％、グルコース１０％）での３０℃で３週間液体培養で、マスカット様の香りを示す。
（２）麹エキス・α−麹培地（ファルコンチューブ入り麹エキス（Ｂｅ  ６．０）２０ｍｌ及びα−麹８ｇ）での３０℃、１０日間培養で、マスカット様の香りを示す。
（３）胞子形成能を有する。
【００１５】
本発明の酵母は、さらに次のような菌学的性質を有する。
栄養細胞が球形ないし卵形で、多極出芽によって増殖する。
平滑子嚢胞子を形成する。
乳糖及び硝酸塩を資化しない。
真菌糸を欠くかまたは僅かしか形成しない。
成熟子嚢は容易に開裂しない。
胞子の形状は球形ないし卵形である。
グルコースをよく発酵する。
麦芽汁培地に皮膜を形成しない。
パラフィンを資化しない。
【００１６】
本発明の酵母の培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じ有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、グルコース、ガラクトース、フラクトース、マンノース、シュクロース、デンプン加水分解物、果汁、セルロース分解物などの炭水化物が良好に用いられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、硫安、カザミノ酸、ペプトンなどが使用される。また、リン酸、鉄、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、銅、カルシウムなどの無機塩類を適宜使用することができる。さらに必要に応じ菌の生育に必要なアミノ酸、ビオチン、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、パントテン酸、葉酸、チアミンなどのビタミン類などを培地に添加して用いることができる。例えば、麦芽汁培地、麦芽汁寒天培地、ＹＭ寒天培地（酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、グルコース、寒天、蒸留水、ＰＨ５〜６）、ＰＧＹ培地（酵母エキス、ペプトン、グルコース、蒸留水、ＰＨ５〜６）、Ｖ−８ジュース培地Ｖ−８ジュース、圧搾パン酵母、ＫＯＨ、寒天、蒸留水）、ゴロドワ（Ｇｏｒｏｄｋｏｗａ）寒天培地（グルコース、ペプトン、ＮａＣｌ、寒天、蒸留水）などが挙げられる。
【００１７】
特に好適な培地は、酵母エキス、ポリペプトン、グルコースなどよりなる培地が挙げられる。また、培地中に、アラニンを添加して、マスカット様芳香を生成する酵母を優先的に保持しておくことも好ましい。この場合アラニンは、培地中に、例えば１μｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２００μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ添加しておくことができる。
培養は、温度２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、ｐＨ３．０〜７．０、好ましくは３．５〜６．０で行われる。
酵母の培養は、震盪培養、通気培養、攪拌培養、静置培養などの好気的、嫌気的培養など適宜好ましい方法を選択して行うことができる。
【００１８】
以下に、マスカット様芳香を生成する酵母の選抜法を一つの代表的な工程を示して説明する。
ＨＤ−１（Ｋ−６）株の選別
栄養培地、例えばＤｉｆｃｏ−Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ−Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ．、Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％及びグルコース２．０％に、吟醸清酒用に分譲されている酵母ＨＤ−１（「醸協」、第８３巻、第１１号、７２３〜７２８頁、１９８８年及び「清酒酵母の研究（−８０年代の研究−）」、１１１〜１１２頁、清酒酵母研究会、平成４年６月１９日）を白金耳接種し、約３０℃で約１２〜７２時間培養する。こうして得られた前培養酵母をさらに栄養培地、例えばグルコース１０％、ＹＮＢｗ／ｏ  Ａ．Ａ．（ＮＨ4）２ＳＯ4（Ｄｉｆｃｏ社製）＋硫酸アンモニウム０．１７％及びアミノ酸０．５％となるように調製した培地に接種し、約１５℃で約１〜３週間培養をする。培養終了後、培養液を約３０℃に保温し生成した香りを官能評価した。アラニンの代謝により得られたマスカット様の香りを産生するものを選抜する。こうしてＨＤ−１（Ｋ−６）株が選抜された。
アラニン代謝による香気生成
こうして得られたＨＤ−１（Ｋ−６）株をアラニン培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ、（ＮＨ4）２ＳＯ4（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％、グルコース１０％、アラニン０．５％）に接種し、３０℃で３週間培養した。再度専門家パネラーによる官能試験にかけた結果、マスカット様のさわやかな香りが感じられると評価された。
このＨＤ−１（Ｋ−６）株は、基本培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％，グルコース２％、寒天２％）に、アラニンアナローグである４，４，４−トリフルオロ−ＤＬ−バリンを１００ｍｇ％の濃度となるように加えた寒天プレート培地に塗抹し、３０℃で１週間培養した。プレート全面にコロニーが出現し、生育阻止は認められなかった。一方、３−クロロ−Ｌ−アラニンを上記基本培地に０〜１００ｍｇ％の濃度となるように加えた寒天プレート培地に塗抹し、同様に培養した結果、１．０ｍｇ％のプレートではコロニーが出現したが、２．５ｍｇ％以上ではまったくコロニーは出現しなかった。
【００１９】
ＨＤ−１（Ｋ−６）株からの変異株の選択
栄養培地、例えばＹＥＰＤ培地に、酵母ＨＤ−１（Ｋ−６）を接種し、約３０℃で約１２〜４８時間振とう培養する。こうして得られた前培養酵母液をさらに同じ組成の培地に接種し、約３０℃で５〜３０時間の往復振とう培養をする。遠心し、滅菌水などで２回程度洗浄した。得られた酵母菌体を、緩衝液、例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）液を添加する。次に約３０℃で約３０〜６０分間緩やかに振とうする。
遠心し、菌体を集め、次に約５％チオ硫酸ソーダ中に静置して中和した後、遠心分離した。菌体は更に滅菌水などで２回程度洗浄し、次に滅菌水などに懸濁する。こうして変異処理された酵母菌体液を、選抜培地、例えば、基本培地（ＹＮＢｗ／ｏ  Ａ．Ａ．、（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％，グルコース２％、寒天２％）に、３−クロロ−Ｌ−アラニンを加えた平板プレート培地を耐性株選抜培地としてこれにに塗抹し、約３０℃で約３日間〜３週間培養する。こうしてアラニンアナログ耐性株が選別される。
【００２０】
本発明の酵母を用いてマスカット様芳香アルコール含有飲料を製造する場合、酵母は予め前培養しておくことが好ましい。例えば、寒天斜面培地などに保持されている酵母は、適当な液体栄養培地で静置培養され、それを酵母源とされることができる。清酒製造などでは、例えばもろみの約７％にあたる米と麹を用い酒母の製造がなされる。
発酵の原料としては、糖質を含有するもの、セルロース質あるいはデンプン質のもの、例えば、サトウキビやこれから採った糖蜜、サツマイモ、ジャガイモ、トウモロコシ、キャサバ、テンサイなど、果物あるいは野菜の汁、例えば、麦芽汁、ブドウ、リンゴ、マルメロ、グレープフルーツ、オレンジ、ミカンなどの柑橘類、カリン、ナシ、西洋ナシ、ビワ、アンズ、ウメ、カキ、サクランボ、スモモ、ナツメ、モモ、ネクタリン、イチジク、キイチゴ、グミ、ザクロ、キウイフルーツ、マンゴー、バナナ、パインアップル、パパイア、グアバ、ヤシなどの果汁、穀物、例えば、米、小麦などから調整されたもろみなど、小麦粉を主として含むもの、例えば、パン生地、菓子パン生地、饅頭生地などが挙げられる。穀物、例えば、米、小麦など、ジャガイモ、サツマイモなどのイモ類などに含まれるセルロース質あるいはデンプン質のものを利用する場合、それらセルロース質あるいはデンプン質のものを予め発酵可能な糖類に変換しておくことが好ましい。清酒用のもろみは特に好ましく用いられる。
【００２１】
アルコール含有飲料を製造する場合などでは目的とする飲料の種類に応じ、酒税法及び酒税法施行令や規則などの法令に定められた原料を用いることがこのましい。例えば、清酒では、米、麦、ヒエ、アワ、トウモロコシ、コウリャン、キビ、及びこれらから得られる糖質を用いることができる。
糖質は酵母によりそのまま発酵しうるが、デンプン質、セルロース質などのものはまず液化酵素、糖化酵素などにより発酵可能な糖質に転化された後、本酵母の作用を受け発酵せしめられる。このような酵素源としては当該分野で公知のもののうちから選択して用いることができ、例えば、麦芽、麹などに含まれるもの、乳酸菌、糸状菌、例えば、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などの麹生産菌などが生産するもの、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ジアスターゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ラクターゼなどの酵素などを挙げることができる。
醸造は、所望製品により異なるが、例えば、清酒では温度５〜２０℃、好ましくは１０〜１７℃で行われる。
【００２２】
例えば、清酒では、まずもろみの約７％にあたる蒸米と麹を用い酵母の培養物たる酒母の製造がなされる。次に炭素源とする原料、水及び無機塩類を温度管理のできるタンクに仕込み、酒母を添加して発酵を開始する。一般に清酒、焼酎などの製造では、発酵の始めに炭素源の一部を仕込み、発酵に伴い残りの炭素源を追加していく段仕込みが行われる。もろみの製造は、清酒では、おおよそ約１５℃を中心に約１０℃から約１８℃で管理されるが、より低温で処理し香りを重視した方法を採ることもできる。もろみの発酵は、約１５日から４５日程度で終了されるのが一般的である。焼酎製造では、清酒よりやや高い温度で処理され、かつもろみの期間も短縮できる。
もろみは発酵が順調に進むように攪拌することもできるし、その温度も各段階に応じて変化調整することができる。
清酒では、こうして得られたもろみは圧搾濾過などにより酒粕と分離されて原酒となる。
本発明の酵母を用いて得られるマスカット様芳香アルコール含有飲料としては、ビール、ワイン、サイダー、清酒、老酒、紹興酒など、また発酵製品をさらに蒸留して得られるウイスキー、ブランデー、焼酎、ジン、テキーラ、ウオッカ、その他の酒類などが挙げられる。特に好ましいものとしては清酒が挙げられる。果実から得られる果汁、例えば、ブドウ果汁、ミカン果汁を利用すれば、ワインが得られる。
パンの製造には、酵母が用いられ、得られる製品の風味は使用する酵母の産生する香気成分に大きな影響を受けている。パン生地は、小麦粉を主な原料とし、食塩、油脂、水に、酵母を加えて形成される。必要に応じ、砂糖、脱脂粉乳、製パン用改良剤（フード）、卵、その他調味剤などが配合されてよい。代表的な製パン法としては、直捏法と中種法が挙げられる。パン生地の配合例としては、例えば、２ｋｇの全小麦粉使用の場合の７０％中種製パン法では、小麦粉７０重量％、酵母２．２重量％、フード０．１重量％及び水４３重量％を中種とし、約２４℃で捏ね、次に小麦粉３０重量％、砂糖５重量％、食塩２重量％、油脂５重量％、脱脂粉乳３重量％及び水２８重量％の本捏とするなどが挙げられる。この他、中華饅頭、酒饅頭などの和菓子、中華料理材料の製造に利用できる。
また調味料、発酵飲料などの製品の風味はその使用する酵母の産生する香気成分に大きな影響を受けている。焼肉のタレは、例えば、薄口醤油２０重量％、砂糖１０重量％、味噌５重量％、白ゴマ０．５重量％、水６３．５重量％、そして酵母１重量％を含むといった組成を有する。また、漬物、食酢、例えば、米酢、リンゴ酢、ワインビネガーなど、ミリン製造などにも応用できる。
本発明の酵母を利用する際、酵母は固定化して用いることもできる。酵母の固定化は、通常当該分野で一般的に用いられている方法によることができるが、例えば、アルギン酸カルシウムゲル法（「バイオリアクターの応用技術、−固定化生体触媒の製法と利用−」、１９頁、シーエムシー発行、１９８６年）などが挙げられる。
【００２３】
【実施例】
次に実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこの具体例により限定されるものでなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できることは理解されるべきである。
【００２４】
実施例１：
ＨＤ−１（Ｋ−６）株の選別
Ｄｉｆｃｏ−Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ−Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏａｃｉｄ（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ．（ＮＨ4）２ＳＯ4、（Ｄｉｆｃｏ社製））０．６７％及びグルコース２．０％を含む培地１０ｍｌに、吟醸清酒用に分譲されている酵母ＨＤ−１（「醸協」、第８３巻、第１１号、７２３〜７２８頁、１９８８年及び「清酒酵母の研究（−８０年代の研究−）」、１１１〜１１２頁、清酒酵母研究会、平成４年６月１９日）を白金耳接種し、約３０℃で約２日間培養する。こうして得られた前培養酵母液をさらにグルコース１０％、ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ．（Ｄｉｆｃｏ社製）＋硫酸アンモニウム０．１７％及び各アミノ酸０．５％となるように調製した培地に接種し、約１５℃で約２週間培養をする。培養終了後、培養液を約３０℃に保温し生成した香りを官能評価した。アラニンの代謝により得られたマスカット様の香りを産生するものを選抜する。こうしてＨＤ−１（Ｋ−６）株が選抜された。
【００２５】
アラニン代謝による香気生成
こうして得られたＨＤ−１（Ｋ−６）株をアラニン培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ．（ＮＨ4）２ＳＯ4（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７％、グルコース１０％、アラニン０．５％）に接種し、３０℃で３週間培養した。再度専門家パネラーによる官能試験にかけた結果、マスカット様のさわやかな香りが感じられると評価された。
【００２６】
アラニンアナローグ耐性
このＨＤ−１（Ｋ−６）株は、基本培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７％，グルコース２％、寒天２％）に、アラニンアナローグである４，４，４−トリフルオロ−ＤＬ−バリンを１００ｍｇ％の濃度となるように加えた寒天プレート培地に塗抹し、３０℃で１週間培養した。プレート全面にコロニーが出現し、生育阻止は認められなかった。一方、３−クロロ−Ｌ−アラニンを上記基本培地に０〜１００ｍｇ％の濃度となるように加えた寒天プレート培地に塗抹し、同様に培養した結果、１．０ｍｇ％のプレートではコロニーが出現したが、２．５ｍｇ％以上ではまったくコロニーは出現しなかった。
【００２７】
実施例２：
ＨＤ−１（Ｋ−６）株からの耐性株の選択
ＹＥＰＤ培地（酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％、グルコース２．０％）１０ｍｌに、酵母ＨＤ−１（Ｋ−６）を接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。こうして得られた前培養酵母液１．２μｌをさらに同じ組成の培地に接種し、３０℃で１５時間１２０ｒｐｍ／ｍｉｎ．の往復振とう培養した。得られた酵母ＨＤ−１（Ｋ−６）の生菌数は、４．０×１０6 ／ｍｌであった。３，５００×ｇで１０分間遠心し、滅菌水１０ｍｌで２回洗浄した。
こうして得られた酵母菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁し、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）液０．３ｍｌを添加して、ＥＭＳの最終濃度が３０μｇ／ｍｌとなるようにし、３０℃で４５分間緩やかに振とうする。次に１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を集め、次に５％チオ硫酸ソーダ１０ｍｌで１０分間静置して中和した後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。菌体は更に滅菌水１０ｍｌで２回洗浄し、次に滅菌水１０ｍｌに懸濁した。
【００２８】
こうして変異処理された酵母菌体液を、基本培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ，（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％，グルコース２％、寒天２％）に、３−クロロ−Ｌ−アラニンを２．５ｍｇ％となるように加えた寒天プレート培地を耐性株選抜培地としてこれにに塗抹し、３０℃で１週間培養した。こうして耐性株を選別した。
寒天プレート培地に出現した３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株３６０株を耐性株選抜培地にレプリカした。レプリカ後、基本培地に３−クロロ−Ｌ−アラニンを１００ｍｇ％含有せしめた寒天プレート培地と、２００ｍｇ％含有せしめた寒天プレート培地を用意した。そして前記３６０株をレプリカしたところ、１００ｍｇ％では生育し、２００ｍｇ％では生育しない菌株が７２株確認された。
この７２株を合成斜面培地（酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％、グルコース２．０％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０５％、ＣａＣＯ3 １．０％、寒天２．０％）に移し、保存菌株とした。
【００２９】
３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株７２株の性状を調べた。
検定培地による香気生成
３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株酵母をマスカット様香気体検定培地（ＹＮＢｗ／ｏ  Ａ．Ａ（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％、グルコース１０％）に接種し、３０℃で３週間培養した。専門家パネラーによる官能試験にかけた結果、すべてマスカット様のさわやかな香りが感じられると評価された。
【００３０】
アラニンアナログに対する生育阻止性状
３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株酵母を基本培地（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  Ａ．Ａ（Ｄｉｆｃｏ社製）０．６７  ％，グルコース２％、寒天２％）に、４，４，４−トリフルオロ−ＤＬ−バリンを１００ｍｇ％の濃度となるように加えた寒天プレート培地に塗抹し、３０℃で１週間培養した。プレート全面にコロニーが出現し、生育阻止は認められなかった。
【００３１】
実施例３：
発酵試験
実施例２で得られた３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株酵母７２株について発酵試験を行い、発酵力及び産生香気成分の官能評価をした。
先ずＹＥＰＤ培地に、実施例２で得られた３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株酵母を接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。こうして得られた前培養酵母液３ｍｌを麹エキス・α−麹培地（ファルコンチューブ入り麹エキス（Ｂｅ  ６．０）２０ｍｌ及びα−麹８ｇ）に接種し、３０℃で１０日間培養した。重量減少から発酵力の強いものを１４株選抜した。発酵生成物を専門家パネラーによる官能試験にかけた。官能試験の結果すべてマスカット様香気が認められたが、マスカット様香気の評価の優れたものを９株選抜した。ＣＡ−３、ＣＡ−４、ＣＡ−１１、ＣＡ−１６、ＣＡ−３２、ＣＡ−３７、ＣＡ−４４、ＣＡ−５０、及びＣＡ−６４と名付けた。
【００３２】
実施例４：
小仕込醸造試験
実施例３で得られた３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性株酵母９株について総米２００ｇを用いての小仕込試験を行い、発酵力及び産生する香気成分などの専門家パネラーによる官能評価をした。
この試験に用いた仕込配合を表１に示す。
【００３３】
【表１】
0003721383.tif 000002
【００３４】
酒母には、ボーメ６の麹エキスに各酵母を植菌し、３０℃で２日間培養した培養液３０ｍｌとした。この分、汲水をつめる。この仕込配合のもと、１０℃一定として２０日間醸造した。なお、ここでＨＤ−１株とは、ＨＤ−１（Ｋ−６）株である。
得られた結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
0003721383.tif 000003
【００３６】
重量の減少、アルコール、総酸度、アミノ酸度と専門家パネラーによる官能評価を総合し、ＣＡ−４、Ａ−４４、及びＣＡ−５０の３株を選抜した。
【００３７】
実施例５：
仕込醸造試験
実施例４で選抜した酵母３株について総米２００ｋｇを用いての仕込試験を行った。この試験に用いた仕込配合を表３に示す。
【００３８】
【表３】
0003721383.tif 000004
【００３９】
酒母歩合７％、麹歩合２０％、汲水歩合１３５％で、乳酸は汲水１００リットル当たり３００ｍｌ添加する。醸造工程の概略を図１に示す。
米は静岡県森町産の五百万石の新米で精白は５０％としたものを用いた。洗米は吟醸用洗米機を用いて行った。洗米の手順は、先ずステンレスのザルに米５キログラムを計量して入れ、水を張った半切れ中に浸漬し、手で軽く攪拌する。９０秒後水から上げて、洗米機にかけ、２０秒運転する。停止後続いて２００リットル／分の水で掛け水し、再び２０秒洗米機にかけ運転する。停止後続いてさらに２００リットル／分の水で６０秒掛け水した後、目的の吸水率になるまで浸漬する。蒸しの工程は、ホリケン社製の吟醸こしきＧ−１００型を用いて４０分間蒸しを行った。製麹は、麹室で箱麹法により行った。はぜ回り３から４割程度のつきはぜタイプのものとした。酒母は、それぞれのタンクで温度制御のできる酒母タンクで普通速醸、１２日目使用とした。仕込みは３００リットル容の温度制御醪タンクで、初添え１５℃、仲添え８℃、留添え６℃を目標に仕込みを行った。後半は切れが鈍り、最終的に４０日から４３日の長期醪になった。上槽は、３２０リットル容の油圧の自動絞り機を用い、念入りに洗浄した酒袋を用い、１本の醪を数回に分けて搾った。
得られた清酒原酒について香気成分などの分析を行った。
ガスクロマトグラフィーは島津製ＧＣ−１４Ａ、カラムはＤＢ−ＷＡＸ  ０．３２ｍｍ×３０Ｍを用い、カラム温度８５℃、注入温度２５０℃、検出器はＦＩＤ、検出温度２５０℃、キャリアガスＨｅで、３０ｍｌ／ｍｉｎ．、スプリット比１０：１の条件で行った。
試料の調製は、１０ｍｌ容ガラスバイアルに、試料の清酒を０．８ｍｌずつサンプリングし、内部標準液を０．１ｍｌ加えた後、セプタムを穴あきアルミキャップで密栓し、５０℃で３０分間加温後、予め７０℃に保温しておいた５ｍｌ容シリンジで１ｍｌ注入した。
内部標準液は、ｎ−アミルアルコール２０００ｐｐｍ、カプロン酸メチル５０ｐｐｍとし、標準試料は１７．５％アルコール溶液中、イソアミルアルコール１５０ｐｐｍ、酢酸イソアミル７．５ｐｐｍ、カプロン酸エチル４．５ｐｐｍとした。得られた結果を表４に示す。
【００４０】
【表４】
0003721383.tif 000005
【００４１】
いずれも官能試験でマスカット様の香りが優れ、すっきりしたタイプの酒に仕上がっていると評価された。酵母ＣＡ−５０は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１４３６０として寄託されている。
なお、ここでＨＤ−１株とは、ＨＤ−１（Ｋ−６）株である。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の新規な酵母を用いれば、高貴で好ましい香りであり、非常に上品なものであるマスカット様芳香の製品、特には清酒などのアルコール含有飲料を与えることのできるマスカット様芳香産生酵母を、特には３−クロロ−Ｌ−アラニン耐性の有無で選抜して得られ、この酵母を用いてフルーティな香りを持った飲食物、特にはワイン、ビール、清酒などのアルコール含有飲料、味噌、醤油、酢、漬物などの発酵調味料、パン、菓子など、特に、清酒などにおいて、マスカットのような高貴で好ましい香りをもつ飲食品を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】仕込醸造工程の概説図を示す。
【図１】
0003721383.tif 000006