(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原タンパク質。
【請求項２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原タンパク質。
【請求項３】
配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸の保存的アミノ酸置換により異るアミノ酸配列の、動物に投与した場合にアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）−特異的抗体を誘導するのに使用し得るタンパク質。
【請求項４】
配列番号：４に記載のアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸の保存的アミノ酸置換により異るアミノ酸配列の、動物に投与した場合にアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）−特異的抗体を誘導するのに使用し得るポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４に記載のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基21のアミノ酸配列の、請求項１又は３に記載のタンパク質のシグナルペプチドとして有用なポリペプチド。
【請求項６】
キャリヤー又は融合パートナーに連結された、配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合パートナーが、保護ペプチド、β−ガラクトシダーゼ、trpE、マルトース−結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ及びポリヒスチジンから成る群から選択される請求項６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記融合パートナーが、アミノ酸配列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg （配列番号96）を含んで成る保護ペプチドである請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】
配列番号３に記載のnt439〜nt1023のヌクレオチド配列の、配列番号４のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列をコードする請求項９記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
配列番号４に記載のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】
配列番号３に記載のnt376〜nt1023のヌクレオチド配列の、請求項11記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
配列番号３に記載のnt376〜nt1023のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド分子の相補体に対して高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし；且つ、アクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）に感染したブタからの流体サンプルもしくは組織サンプル中のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）−特異的ポリヌクレオチド分子の存在を検出する診断剤として使用することができる、ポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】
配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】
配列番号３に記載のnt376〜nt438のヌクレオチド配列のヌクレオチド分子であり；且つ、アクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）に感染したブタからの流体サンプルもしくは組織サンプル中のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）−特異的ポリヌクレオチド分子の存在を検出する診断剤として使用することができる、ヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
配列番号４に記載のアミノ酸残基１〜アミノ酸残基21のアミノ酸配列の、アクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原タンパク質のシグナルペプチドとして有用なペプチドをコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３のnt376〜nt438のヌクレオチド配列である請求項17記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項１９】
キャリヤー又は融合パートナーに連結された、配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項２０】
前記融合パートナーが、保護ペプチド、β−ガラクトシダーゼ、trpE、マルトース−結合タンパク質、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ及びポリヒスチジンから成る群から選択される請求項１９記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２１】
前記融合パートナーが、アミノ酸配列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg （配列番号96）を含んで成る保護ペプチドである請求項20記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２２】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド分子、又は配列番号3に記載のヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列のポリヌクレオチド分子、に対して高い緊縮条件下でハイブリダイズすることができ、且つ、アクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）に感染したブタからの流体サンプル又は組織サンプル中のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）−特異的ポリヌクレオチド分子の存在の検出に使用することができる、オリゴヌクレオチド分子。
【請求項２３】
請求項９〜22のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えベクター。
【請求項２４】
配列番号３に記載のnt439〜nt1023のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド分子を含んで成る請求項23記載の組換えベクター。
【請求項２５】
株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416と同じであるプラスミドである請求項24記載の組換えベクター。
【請求項２６】
配列番号４のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２７】
診断用キットであって、アクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原に対して向けられたブタ抗体に特異的に結合する、（ａ）配列番号４のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のポリペプチド；或いは（ｂ）キャリヤー又は融合パートナーに連結された、（ａ）のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を含んで成る第１容器；並びにブタ抗体に対して向けられた第２抗体を含んで成る第２容器、を含んで成るキット。
【請求項２８】
診断用キットであって、配列番号４に記載のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基215のアミノ酸配列のアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原タンパク質に結合する一次抗体を含んで成る第１容器；並びにアクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原タンパク質上の異なったエピトープに結合し、又は前記一次抗体に対して向けられる第２抗体を含んで成る第２容器を含んで成るキット。
【請求項２９】
診断用キットであって、アクチノバチルス・プレウロニウモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）抗原−特異的ポリヌクレオチド分子に対して特異的にハイブリダイズするか、又は前記分子を増幅することができる請求項９〜21のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子又は請求項22に記載のオリゴヌクレオチド分子を含んで成る容器を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
１．発明の分野
本発明は、動物健康の分野に関し、そしてアクチノバチルス・プレウロニウモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae）に対してブタを保護するワクチンに向けられる。より詳しくは、本発明は、Ａ．プレウロニウモニアの複数の血清型により共有される新規の抗原性タンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ分子、前記タンパク質を含んで成る、APP に対するワクチン、及び診断用試薬に向けられる。
【０００２】
【従来の技術】
２．発明の背景
Ａ．プレウロニウモニア（この後、“APP ”と称する）は、最とも重要なブタ肺病原体の１つとして認識されているグラム陰性ココバチルス(cocobacillus)である（Shope, R.E., 1964, J. Exp. Med. 119 : 357-368 ; Sebunya, T.N.K. 及びSaunders, J.R., 1983, J. Am. Vet. Med. Assoc. 182 : 1331-1337)。地理的分布において異なる１２種の異なった血清型が認識されている（Sebunya, T.N.K. and Saunders, J.R., 1983、上記；Nielsen, R., 1985, Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 18-22 ; Nielsen, R., 1986, Acta. Vet. Scand. 27 : 453-455) 。
【０００３】
APP に対するワクチン接種に対する免疫応答は、主に血清型−特異的であり、このことは、ワクチン−誘発された免疫性が血清型−特異的莢膜(capsular)抗原に向けられていることを示す（Moclnnes, J.I. and Rosendal, S., 1988, Can. Vet. J. 29 : 572-574 ; Fedorka-Cray, P.J.,など., 1994, Comp. Cont. Educ. Pract. Vet. 16 : 117-125 ; Nielsen, R., 1979, Nord. Vet. Med. 31 : 407-413 ; Rosendal, S., など., 1986, Vet. Microbiol. 12 : 229-240)。
【０００４】
対照的に、いづれか１種の血清型に対する天然の免疫性は、他の血清型により引き起こされる疾病からの有意な保護を付与すると思われ、このことは、天然の暴露が共有される抗原に対して交差反応免疫性を誘発することを示している（Sebunya, T.N.K. and Saunders, J.R., 1983、上記；Maclnnes, J.I. and Rosendal, S., 1988, above ; Fedorka-Cray, P.J.,など., 1994 、上記；Nielsen, R., 1979 、上記；及びRosendal, S., など., 1986 、上記）。
【０００５】
交差反応性に寄与する次のようなビルレンス因子が、可能なワクチン候補体として提案されて来た：外毒素(Apx)(Nakai, T.,など., 1983, Am. J. Vet. Res. 44 : 344-347 ; Frey, J. など., 1993, J. Gen. Microbiol. 139 : 1723-1728 ; Fedorka-Cray, P.J., など., 1993, Vet. Microbiol. 37 : 85-100) ; 莢膜抗原（Rosendal, S., など., 1986, above) ; 外膜タンパク質(OMP)(Denee, H. and Potter, A., 1989, Infect. Immune 57 : 798-804 ; Niven, D.F.,など., 1989, Mol. Microbiol. 3 : 1083-1089 ; Gonalez, G., など., 1990, Mol. Microbiol. 4 : 1173-1179 ; Geriach, G.F., など., 1992, Infect. Immun. 60 : 3253-3261) ; 及びリポポリサッカライド(LPS)(Fenwick, B.W. and Osborn, B., 1986, Infect. Immun. 54 : 575-582)。
【０００６】
しかしながら、そのような化合物により誘発される交差−反応性／交差−保護のパターンは、すべての１２種のAPP 血清型を満たしていない。さらに、APP からの単離された個々の成分、又は個々の成分の組合せによる免疫化は、いくつかの異種血清型による攻撃からの保護を付与するのに、これまでは失敗している（未公開の観察）。従って、天然の感染により誘発される交差−保護応答は特定の血清型群に制限されることが推定される。
【０００７】
あるいは、天然の感染の後に観察される交差−保護を担当する抗原のいくつかはまだ同定されていない。APP 抗原に関するほとんどの研究は、抗体を用いての回復期(convalescent)血清中に検出される免疫優性抗原の特徴化に集中して来た。そのようなアプローチは、一次応答対二次応答を示す抗体特異性間の可能な差異の同定も、又は病原体との二次遭遇に対する保護を担当するかも知れない感染での優性特異性の同定も可能にしていない。
【０００８】
病原体への二次暴露が存在する場合に宿主が疾病からうまくのがれることができように、一次感染の間、リンパ球は教育される(educated)ことが一般的に許容される（Mackay, C.R., 1993, Adv. Immunol. 53 : 217-240) 。この活性を担当する記憶細胞（抗原を経験したＴ及びＢリンパ球）は、長時間持続し、そして抗原との適切な続く遭遇に従って、再活性可能にある。未経験の細胞に比較して、それらは一般的により早い応答時間、特殊化された組織局在化、及びより効果的な抗原認識及びエフェクター機能を示す（Mackay, C.R., 1993, above ; Linton, P. and Klinman, N.R., 1992, Sem. Immun. 4 : 3-9 ; Meeusen, E.N.T.,など., 1991, Eur. J. Immunol. 21 : 2269-2272) 。
【０００９】
二次応答の生成の間、特定の抗原に応答することができる前駆体細胞の頻度は、一次応答の間に示される頻度よりも高い。二次応答に続く記憶細胞サブセットの密集パターンはまた、未経験細胞のパターンとは異なっている。未経験細胞は二次リンパ細胞のパターンとは異なっている。未経験細胞は二次リンパ組織に対して比較的均質に移動するが、しかしそれらは非リンパ組織に対しては良好に進行しなかった。これに対して、記憶細胞は異種密集性(hetero geneous trafficking)を示し、そして多くの場合、移動は一定の二次リンパ組織及び非リンパ部位に制限されることが示されている（Mackay, C.R., 1993、上記；Gray, D., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11 : 49-77 ; Picker, L.S., など., 1993, J. Immunol. 150 : 1122-1136) 。
【００１０】
げっ歯動物及び羊の両者における研究は、腸からのリンパ球が腸とは反対方向に選択的に移動し、そして皮膚又はリンパ節からの細胞はその皮膚又はリンパ節とは反対方向に選択的に移動することを示した（Gray, D., 1993、上記；Picker, L.S., など., 1993 、上記）。従って、病原体との二次遭遇に基づいて、細胞−介在性免疫性及び抗体分泌のための特定のエフェクター細胞が感染部位及びリンパ節の方により効果的に進むことができる（Meeusen, E.N.T.,など., 1991 、上記）。結果的に、浸潤性リンパ球は、急速に増殖し、そしてそれらの特異性は再感染の初期段階の間、卓越しているであろう。
【００１１】
再感染の後、初期の組織及び排出するリンパ節からの局部Ｂ細胞の回収は、より狭い特異性範囲を有する抗体を獲得するいくつかの研究を可能にした（Meeusen, E.N.T. and Brandon, M., 1994, J. Immunol. Meth. 172 : 71-76) 。そのような抗体は、いくつかの病原体に対しての可能性ある保護抗原を同定するために都合良く使用されて来た（Meeusen, E.N.T. and Brandon, M., 1994 、上記；Meeusen, E.N.T. and Brandon, M., 1994, Eur. J. Immunol. 24 : 469-474 ; Bowies, V.M.,など., 1995, Immunol. 84 : 669-674) 。
【００１２】
本明細書に開示される発明は、このアプローチの変法に基づいており、ここでは、同種及び異種APP 攻撃の後に誘発される局部記憶応答に関連する抗体−分泌性細胞(ASC）プローブが回収された。異種攻撃の後、気管支リンパ節(BLN）培養物から得られた抗体は、すべての１２種のAPP 血清型に存在するまだ認識されていない４種のタンパク質を認識した。個々のタンパク質についての部分アミノ酸配列が得られており、そしてそれらをコードする５種の新規のAPP タンパク質及びポリヌクレオチド分子の同定を可能にするPCR プライマーを生成するために使用された。
【００１３】
３．発明の要約
本発明は、APP から単離された５種の新規の低分子量タンパク質を提供し、それらは、本明細書においては、“Omp20 ”，“OmpW”，“Omp27 ”，“OmpA1 ”、及び“OmpA2 ”と称す。それらの“APP タンパク質”及びそれらをコードするポリヌクレオチド分子は、APP に対してブタを保護するためのワクチンにおける抗原性成分として、又はAPP により感染される又は感染されているか、又は本発明のワクチンによりワクチン接種されているブタに同定するための診断試薬としても有用である。
【００１４】
Omp20 のアミノ酸配列は、株Pz416(ATCC 98926）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmp20 −コードORF によりコードされ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜１９のシグナル配列を含んで成る配列番号２として表わされる。OmpWのアミノ酸配列は、株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に存在するプラスミドpER418のOmpW−コードORF によりコードされ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜２１のシグナル配列を含んで成る配列番号４として表わされる。Omp27 のアミノ酸配列は、株Pz417(ATCC 98927）の宿主細胞に存在するプラスミドpER417のOmp27 −コードORF によりコードされ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜７のシグナル配列を含んで成る配列番号６として表わされる。
【００１５】
OmpA1 のアミノ酸配列は、株Pz419(ATCC 98929）の宿主細胞に存在するプラスミドpER419のOmpA1 −コードORF によりコードされ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜１９のシグナル配列を含んで成る配列番号８として表わされる。OmpA2 のアミノ酸配列は、株Pz420(ATCC 98930）の宿主細胞に存在するプラスミドpER420のOmpA2 −コードORF によりコードされ、そしてその推定されるアミノ酸配列は、アミノ酸残基１〜１９のシグナル配列を含んで成る配列番号１０として表わされる。実質的に純粋な形でのそれらのAPP タンパク質の個々が、本発明により供給される。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の前記APP タンパク質のいづれかに対して相同である実質的に精製されたポリペプチドを供給する。本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質又は相同ポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントを供給する。本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに連結された、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質を供給する。本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の類似体及び誘導体を供給する。
【００１７】
本発明はさらに、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmp20 をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp20 −コードポリペプチド分子は、約nt３２９〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様におては、本発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt２７２〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１８】
本発明はさらに、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmpWをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpW−コードポリペプチド分子は、約nt４３９〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、約nt３７６〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１９】
本発明はさらに、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmp27 をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp27 −コードポリペプチド分子は、約nt２３８〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt１５７〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００２０】
本発明はさらに、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmpA1 をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリペプチド分子は、約nt６７１〜約nt１７０８の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt６１４〜約nt１７０８の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００２１】
本発明はさらに、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで、APP タンパク質、すなわちOmpA2 をコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリペプチド分子は、約nt２５４〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt１９７〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかに対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質のいづれかに対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。本発明はさらに、本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成る単離されたポリヌクレオチド分子を供給する。非制限的態様において、本発明のポリヌクレオチド分子の実質的部分は、本発明のAPP タンパク質又は相同ポリペプチドのペプチドフラグメントをコードする。本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに連結される、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を供給する。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかを増幅するためのプライマーとして、又は診断用試薬として有用であるオリゴヌクレオチド分子を供給する。そのようなオリゴヌクレオチド分子の特定の非制限的態様は、配列番号１５〜４７及び４９〜９３のいづれかから成る群から選択されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド分子を包含する。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかをクローニングし、そして発現するための組成物及び方法、本発明のポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えクローニングベクター及び組換え発現ベクター、前記ベクターのいづれかにより形質転換された宿主細胞、及びそれらに由来する細胞系を提供する。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされる、組換え的に発現されたAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、又は融合タンパク質を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、ブタにおいてAPP に対しての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原；及び獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成る、APP に対してブタを保護するためのワクチンを提供する。本発明のワクチンはさらに、アジュバント又は他の免疫調節成分を含むことができる。
【００２６】
非制限的態様においては、本発明のワクチンは、APP 及び任意には、１又は複数の他の疾病又は病理学的状態に対してブタを保護するための組合せワクチンであり得、この組合せワクチンは、ブタにおいてAPP に対しての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原を含んで成る第１成分；ブタを苦しめる疾病又は病理学的状態に対する保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することができる、免疫学的有効量の異なった抗原を含んで成る第２成分；及び獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を有する。
【００２７】
本発明の方法はさらに、APP に対してブタを保護することができるワクチンを調製するための方法を提供し、ここで前記方法は、ブタにおいてAPP に対しての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原との獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤とを、ブタへの投与のために適切な形で、組合すことを含んで成る。
本発明はさらに、ブタに本発明のワクチンを投与することを含んで成る、APP に対してブタを予防接種する方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、APP に対してブタを予防接種するためのワクチン用キットを提供し、ここで前記キットは、ブタにおいてAPP に対しての保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体、又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原を含んで成る容器を含んで成る。前記キットはさらに、獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成る第２容器を含むことができる。
本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質に対して特異的に結合する抗体を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、診断用キットも提供する。非制限的態様においては、その診断用キットは、APP タンパク質に対して向けられた、ブタ用抗体に対して特異的に結合するであろう本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体又は誘導体を含んで成る第１容器；及びブタ用抗−APP 抗体に対して向けられた第２抗体を含んで成る第２容器を含んで成る。前記第２抗体は好ましくは、検出できるラベルを含んで成る。そのような診断用キットは、APP により現在感染されているか、又は前に感染されたことがあり、又は本発明のワクチンによる予防接種の結果として血清転換されているブタを検出するために有用である。
【００３０】
異なった非制限的態様においては、診断用キットは、本発明のAPP タンパク質に結合する第１抗体を含んで成る第１容器；及びAPP タンパク質上の異なったエピトープに結合するか、又は前記第１抗体に結合する第２抗体を含んで成る第２容器を含んで成る。前記第２抗体は好ましくは、検出できるラベルを含んで成る。異なった非制限的態様においては、診断用キットは、本発明のAPP 特異的ポリヌクレオチド分子を特異的に増幅するために有用である本発明のポリペプチド分子又はオリゴヌクレオチド分子を含んで成る容器を含んで成る。それらの後者の２種の診断用キットは、APP により現在、感染されているブタを検出するために有用である。
【００３１】
４．図面の説明
図１：APP 血清型−５により攻撃され、そしてAPP 血清型−７により異種的に再攻撃されたブタNo．803 からの（ａ）血清、及び（ｂ）気管支リンパ節（BLN ）組織外植体上清液に存在する抗体のウェスターンブロット分析。２４又は４８時間のインキュベーションの後に集められたすべてのBLN 組織外植体上清液は、APP タンパク質を特異的に認識した抗体を含んだ、BLN 組織外植体上清液からの抗体は、APP 血清型−１，５及び７に存在するいくつかの低分子量タンパク質を強調した。
【００３２】
図２：１２種の異なったAPP 血清型の個々からの完全な細菌細胞抗原に対するブタNo．803 からのBLN 組織外植体上清液に存在する抗体の交差−反応性のウェスターンブロット分析であって、これは、異種再攻撃により誘発された抗体により認識される少なくとも３種の低分子量タンパク質がすべての１２種のAPP 血清型に存在したことを示す。この特定のBLN 上清液に存在する抗体はまた、他のタンパク質バンドによっても認識される。
【００３３】
図３：低分子量タンパク質に対するブタNo．803 からのBLN 組織外植体上清液における抗体の反応性が細菌細胞上清液（Sups）よりもむしろ、細胞ペレット（細胞）に存在するタンパク質に対して制限されることを示すウェスターンブロット分析。
図４：APP 血清型−７から精製されたタンパク質に対するブタNo．803 からの（ａ）BLN 組織外植体上清液及び（ｂ）血清の反応性の、連続流動電気泳動によるウェスターンブロット分析。それぞれ、約１９〜２０、約２３、約２７及び約２９kDa の分子量を有する４種のタンパク質バンドが、この方法を用いて同定された。
【００３４】
図５：APP OmpA1 及びAPP OmpA2 タンパク質の推定されるアミノ酸配列の列挙。それらの２種のタンパク質は、７３．１％のアミノ酸同一性を共有する。
図６：ビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae)からのOmpWタンパク質及びAPP からのOmpWタンパク質のアミノ酸配列の列挙。それらの２種のタンパク質は、４４．９％のアミノ酸同一性を共有する。
【００３５】
５．発明の特定の記載
５．１．複数のAPP 血清型により共有される新規タンパク質
Omp20 のアミノ酸配列は、株Pz416(ATCC 98926）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmp20 −コードORF によりコードされる。Omp20 の推定されるアミノ酸配列は、配列番号２として示される。
【００３６】
配列番号２で示されるタンパク質の最初の１９個のアミノ酸はシグナル配列を示し、そして本発明は、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１７２（すなわち、シグナル配列を欠いている）のみを有するOmp20 タンパク質、及び配列番号２の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOmp20 タンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番号２のおよそアミノ酸残基２０〜およそアミノ酸残基１７２のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質を提供する。本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質も供給する。
【００３７】
OmpWのアミノ酸配列は、株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に存在するプラスミドpER418のOmpW−コードORF によりコードされる。OmpWの推定されるアミノ酸配列は、配列番号４として示される。配列番号４で示されるタンパク質の最初の２１個のアミノ酸はシグナル配列を示し、そして本発明は、配列番号４のアミノ酸残基２２〜２１５（すなわち、シグナル配列を欠いている）のみを有するOmpWタンパク質、及び配列番号４の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOmpWタンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番号４のおよそアミノ酸残基２２〜およそアミノ酸残基２１５のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質を供給する。本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質も供給する。
【００３８】
Omp27 のアミノ酸配列は、株Pz417(ATCC 98927）の宿主細胞に存在するプラスミドpER417のOmp27 −コードORF によりコードされる。Omp27 の推定されるアミノ酸配列は、配列番号６として示される。配列番号６で示されるタンパク質の最初の２７個のアミノ酸はシグナル配列を示し、そして本発明は、配列番号６のアミノ酸残基２８〜２５８（すなわち、シグナル配列を欠いている）のみを有するOmp27 タンパク質、及び配列番号６の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOmp27 タンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番号６のおよそアミノ酸残基２８〜およそアミノ酸残基２５８のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質を供給する。本発明はさらに、配列番号６のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質も供給する。
【００３９】
OmpA1 のアミノ酸配列は、株Pz419(ATCC 98929）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmpA1 −コードORF によりコードされる。OmpA1 の推定されるアミノ酸配列は、配列番号８として示される。配列番号８で示されるタンパク質の最初の１９個のアミノ酸はシグナル配列を示し、そして本発明は、配列番号８のアミノ酸残基２０〜３６４（すなわち、シグナル配列を欠いている）のみを有するOmpA1 タンパク質、及び配列番号８の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOmpA1 タンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番号８のおよそアミノ酸残基２０〜およそアミノ酸残基３６４のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質を供給する。本発明はさらに、配列番号８のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質も供給する。
【００４０】
OmpA2 のアミノ酸配列は、株Pz420(ATCC 98930）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のOmpA2 −コードORF によりコードされる。OmpA2 の推定されるアミノ酸配列は、配列番号１０として示される。配列番号１０で示されるタンパク質の最初の１９個のアミノ酸はシグナル配列を示し、そして本発明は、配列番号１０のアミノ酸残基２０〜３６９（すなわち、シグナル配列を欠いている）のみを有するOmpA2 タンパク質、及び配列番号１０の配列（すなわち、シグナル配列を含む）を有するOmpA2 タンパク質を包含する。従って、本発明は、配列番号１０のおよそアミノ酸残基２０〜およそアミノ酸残基３６９のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質を供給する。本発明はさらに、配列番号１０のアミノ酸配列を含んで成る実質的に精製されたタンパク質も供給する。
【００４１】
本発明のAPP タンパク質、すなわちOmp20, OmpW, Omp27, OmpA1 、及びOmpA2 は、それらの電気泳動移動度に基づいて、それぞれ約１９〜２０、約２３、約２７、約２９、及び約２９kDa の分子量；及びシグナル配列を有さないそれらの推定されるアミノ酸配列に基づいて、それぞれ約２０、約２３、約２７、約３５及び約３５kDa の分子量を有する。
【００４２】
本発明は、本発明のAPP タンパク質に対して相同であるポリペプチドを提供する。ポリペプチドを言及するために本明細書において使用される場合、用語“相同”とは、配列番号２，４，６，８及び１０から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列、又は１又は複数のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基により保存的に置換されている、それらの天然のシグナル配列を有さない前記群のアミノ酸配列と同じアミノ酸を有するポリペプチドを言及し、ここで前記相同ポリペプチドは、いづれか標準のアミノ酸分析アルゴリズム（たとえば、GENBANK のBlastPアルゴリズムの１つ）により決定される場合、配列番号２，４，６，８及び１０から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、約７０％、より好ましくは約８０％、及び最とも好ましくは約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、そしてその得られる相同ポリペプチドは、本発明の実施において有用である。
【００４３】
保存性アミノ酸置換は当業界において良く知られている。そのような置換を行なうための規則は、中でも、Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3により記載される規則を包含する。より特定には、保存性アミノ酸置換は、それらの側鎖の酸度、極性又は嵩高性に関係しているアミノ酸ファミリー内で一般的に起こる置換である。遺伝子的にコードされたアミノ酸は一般的に次の４種のグループに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンはまた、芳香族アミノ酸として分類される。
【００４４】
いづれかの特定のグループ内での１又は複数の置換、たとえばイソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの、又は構造的に関係するアミノ酸残基、たとえば側鎖の類似する酸度、極性、嵩高度、又はそのいくつかの組合せでの類似性を有するアミノ酸残基によるいづれか他のアミノ酸残基の置換は一般的に、ポリペプチドの機能又は免疫原性に対して有意な効果を有さないであろう。
【００４５】
本明細書において使用される場合、ポリペプチドは、“本発明の実施において有用であり”、ここで前記ポリペプチドは、（ａ）免疫原性であり、すなわち、APP に対してブタにおける保護応答を誘発するのに単独で、又はAPP に対してブタにおける保護応答の誘発に寄与する本発明の他の抗原と組合して、ワクチン組成物に使用され得；又は（ｂ）哺乳類種のメンバーに投与される場合、診断試薬として有用であるAPP −特異的抗体の生成を誘発するために使用され得；又は（ｃ）APP による感染又は本発明のワクチンによる予防接種のいづれかに起因するブタからの血液又は血清サンプルにおける抗−APP 抗体の存在を検出するために診断試薬として使用され得る。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質又は相同ポリペプチドのペプチドフラグメントを供給する。本明細書において使用される場合、“ペプチドフラグメント”とは、シグナル配列を有するか又は有さない、その対応する十分な長さのAPP タンパク質の完全なアミノ酸配列よりも少ないアミノ酸配列から成るポリペプチド、又はそのアミノ酸配列の少なくとも約１０個、より好ましくは少なくとも約２０個及び最とも好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸残基の副配列を含んで成る前記ポリペプチドの相同ポリペプチドを意味し、そしてポリペプチドについての有用性が上記に定義されるように、本発明の実施において有用な前記ポリペプチド及びその相同体を意味する。
【００４７】
本発明のペプチドフラグメントは、本発明の十分な長さのタンパク質又は相同ポリペプチドの１以上の副配列を含むことができる。たとえば、十分な長さのAPP タンパク質又は相同ポリペプチドからの複数の異なった副配列は、それらがAPP タンパク質又は相同ポリペプチドにおいて非連続性である場合、一緒にされ、そしてペプチドフラグメントにおいてお互い接触せしめられ得る。好ましい態様においては、本発明のペプチドフラグメントは、抗体が生ぜしめられ得る、APP タンパク質又は相同ポリペプチドの１又は複数のエピトープ、又はエピトープの複数のコピーを表わす１又は複数の副配列を含んで成る。
【００４８】
非制限的な態様において、本発明は、APP タンパク質の天然のシグナル配列を含んで成る、本発明のAPP タンパク質のペプチドフラグメントを供給する。好ましい態様において、ペプチドフラグメントは、配列番号２のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９(Omp20）、配列番号４のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２１（OmpW）、配列番号６のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２７（Omp27)、配列番号８のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９(Omp1)、及び配列番号１０のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９（OmpA1 ）から成る群から選択されたアミノ酸配列から成る。
【００４９】
そのようなシグナル配列、及びそれらをコードするポリヌクレオチド分子は、種々の目的のために、たとえば、APP 又は他の細菌宿主細胞において発現される組換えタンパク質の細胞密集を方向づけるために、又は感染された動物からの流体又は組織サンプルにおけるAPP −特異的ポリヌクレオチド分子を検出するための診断用プローブとして有用である。
【００５０】
本発明はさらに、十分な長さのAPP タンパク質又は相同ポリペプチドを提供し、ここでその副配列は、ポリペプチドの抗原性を高め、変更し、又は他方では、改良するために、天然の分子に見出される副配列に比較して、お互いに対して異なった相対的順序で配置されている。
本明細書において使用される場合、用語“抗原”、“抗原性”及び同様のものは、体液性及び／又は細胞性抗原−特異的応答を生成するために宿主の免疫システムを刺激する１又は複数のエピトープを含む分子を意味する。この用語はまた、“免疫原”とも互換的に使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“エピトープ”又は“エピトープ領域”とは、特定の抗体分子が結合する抗原又はハプテン上の部位を意味する。この用語はまた、“抗原決定基”とも互換的に使用される。
【００５１】
本発明はさらに、ポリペプチドについての有用性が上記で定義されたように、本発明の実施において有用である、キャリヤー又は融合パートナーに連結された、本発明のAPP タンパク質パートナー（天然のシグナル配列を有するか、又は有さない）、その相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質を提供する。融合パートナーの例については下記セクション５．４．１を参照のこと。
【００５２】
融合タンパク質は、種々の理由のために、たとえば組換え的に発現されたAPP タンパク質の安定性を高めるために、APP ワクチンにおける抗原性成分として、特定のAPP タンパク質パートナーに対しての抗血清を高めるために、APP タンパク質パートナーの生化学的性質を研究するために、異なった又は増強された抗原性質を有するAPP タンパク質を構築するために、診断用試薬として作用せしめるために、又はたとえば、下記セクション５．４．１に記載されるように、発現されたAPP タンパク質の同定又は精製において助けになるために有用である。
【００５３】
本発明の融合タンパク質はさらに、特定のプロテアーゼ切断部位を含むよう、標準的技法を用いて構築され得、その結果、特定のAPP タンパク質パートナーが特定のプロテアーゼによる処理により、キャリヤー又は融合パートナーから放たれ得る。たとえば、本発明の融合タンパク質は、中でも、トロンビン又は第Ｘａ因子切断部位を含むことができる。
【００５４】
本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の類似体及び誘導体を提供し、ここでそのような類似体及び誘導体は、ポリペプチドについての有用性が上記で定義されたように、本発明の実施において有用である。類似体の生成をもたらす操作は、類似体が調製される特定のポリペプチドの生物学的又は免疫学的特徴を改良し、又は他方では変えるために、遺伝子レベルで又はタンパク質レベルで、又は両レベルで実施され得る。
【００５５】
たとえば、遺伝子レベルでは、本発明のAPP タンパク質をコードするクローン化されたＤＮＡ分子が、そのタンパク質の類似体をコードするよう、１又は複数の既知の方法により修飾され得る。そのような修飾は、エンドヌクレアーゼ消化、及び翻訳、開始、又は終結配列を創造し、又は破壊し、又はコード領域における変動を創造する突然変異、又はその組合せを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００５６】
そのような技法は、中でも次の文献に記載される：Maniatisなど., 1989, Molecualr Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Ausubelなど., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Geene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY ; Sambrookなど., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ; Innis など., (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego ; 及びErlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York (それらの開示は引用により本明細書中に組込まれる）。
【００５７】
これに代って又はこれに加えて、本発明の類似体は、タンパク質レベルでは、本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプチドの修飾により調製され得る。タンパク質の１又は複数の化学的修飾は、既知の技法、たとえば次の技法（但し、それらだけには限定されない）を用いて実施され得る：カルバゼート又は三次中心を生成するために、タンパク質の１又は複数のＬ−アミノ酸のその対応するＤ−アミノ酸、アミノ酸類似体又はアミノ酸擬似物によ置換；又は特定の化学的修飾、たとえばトリプシン、キモトリプシン、パパイン又はＶ８プロテアーゼによるタンパク質分解、又はNaBH4 又は臭化シアンによる処理、又はアセチル化、ホルミル化、酸化又は還元、等。
【００５８】
本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプチドは、１又は複数の次の化学基の接合により誘導体化され得る：アセチル基、硫黄架橋基、グリコシル基、脂質、及びホスフェート、及び／又は本発明の第２のAPP タンパク質又は他のポリペプチド、又は他のタンパク質、たとえば結成アルブミン、キーホールリンペット（アカ貝）ヘモシアニン、又は市販の活性化されたBSA 、又はポリアミノ酸（たとえばポリリシン）、又はポリサッカライド（たとえば、セファロース、アガロース又は変性された又は変性されていないセルロース）。そのような接合は好ましくは、APP タンパク質のアミノ酸側鎖及び／又はＮ−末端又はＣ−末端で存在する。そのような接合反応を実施するための方法は、タンパク質化学の分野においては、良く知られている。
【００５９】
本発明の実施において有用な誘導体はまた、水溶性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールが本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプチド、又はその類似体に接合されている誘導体を包含し、それにより、APP タンパク質の免疫原性を少なくとも一部、保持し、又は改良すると共に、追加の所望する性質を提供する。それらの追加の所望する性質は、たとえば、水溶液における高められた溶解性、貯蔵における高められた安定性、タンパク質分解性劣化に対する高められた耐性、及び高められたインビボ半減期を包含する。
【００６０】
本発明のAPP タンパク質又は他のポリペプチドへの接合のために適切な水溶性ポリマーは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ポリエチレングリコールホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー（ここで前記ホモポリマー及びコポリマーは未置換であり、又はアルキル基により一端で置換されている）、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、ポリビニルエチルエーテル、及びβ，β−ポリ〔２−ヒドロキシエチル〕−ＤＬ−アスパルタミド。ポリエチレングリコールは特に好ましい。
【００６１】
ポリペプチドの水溶性ポリマー接合体を製造するための方法は、当業界において知られており、そして中でも、次の特許に記載されている：アメリカ特許第3,788,948 号；第3,960,830 号；第4,002,531 号；第4,055,635 号；第4,179,337 号；第4,261,973 号；第4,412,989 号；第4,414,147 号；第4,415,665 号；第4,609,546 号；第4,732,863 号；第4,745,180 号；ヨーロッパ特許（EP）第152,847 号；EP第98,110号；及び日本特許（JP）第5,792,435 号（それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【００６２】
“APP タンパク質”及び同様のものに関するすべての続く言及は、特にことわらない限り、上記で定義されたように、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体及び誘導体を包含するつもりである。
【００６３】
５．２．新規APP タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子
本発明はさらに、APP タンパク質をコードするヌクレアーゼ配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、用語“ポリヌクレオチド分子”、“ポリヌクレオチド配列”、“コード配列”、“オープンリーディングフレーム（ORF ）”、及び同様のものは、１又は複数の原核配列、cDNA配列、ゲノムDNA 配列（エキソン及びイントロンを包含する）、又は化学的に合成されたDNA 及びRNA 配列を包含することができ；そしてセンス及びアンチセンス鎖の両者を含むことができる、一本鎖又は二本鎖のいづれかであり得るDNA 及びRNA 分子の両者を言及するつもりである。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語“ORF ”とは、いづれの介在性終結コドンも有さない本発明の特定のAPP タンパク質をコードすることを必要とされる最小ヌクレオチド配列を言及する。ポリヌクレオチドコード配列の境界は一般的に、５’（アミノ）末端での開始コドンの存在、及び３’（カルボキシ）末端での翻訳停止の存在により決定される。
【００６５】
下記に開示されるポリヌクレオチド分子及びオリゴヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者の範囲内であり、そして中でも、次の文献に記載される組換え技法に従って実施され得る：Maniatisなど., 1989 、上記；Ausubel など., 1989 、上記；Sambrookなど., 1989 、上記；Innis など., 1995 、上記；及びErlich, 1992、上記。
【００６６】
５．２．１．Omp20 をコードするポリヌクレオチド分子
配列番号１からのヌクレオチド配列、及びその選択され、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特にことわらない限り、株Pz416(ATCC 98926）の宿主細胞に存在するプラスミドpER416のその対応するOmp20 −関連ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラグメントについての言及はまた、特にことわらない限り、プラスミドpER416のOmp20 −関連ヌクレオチド配列によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及するつもりである。
【００６７】
本発明は、APP タンパク質、すなわちOmp20 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt３２９〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt２７２〜約nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたOmp20 −コードポリヌクレオチド分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００６８】
本発明はさらに、本発明のAPP Omp20 −コードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、Omp20 −コードポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）nt３２９〜nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4，７％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, p 2.10.3を参照のこと）下で、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１７２をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００６９】
好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4 ,7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 1989 、上記）下で、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１７２をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt３２９〜nt７９０の配列番号１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド分子は、次の場合、“本発明の実施において有用である”：（ａ）ポリヌクレオチド分子がAPP に対してブタにおいて保護応答を、単独で誘発するか、又はその誘発に１又は複数の他の抗原と組合して寄与するようワクチン組成物に使用され得るポリペプチドをコードする場合；又は（ｂ）ポリヌクレオチド分子がAPP に対してブタにおいて保護応答を、単独で誘発するか、又はその誘発に１又は複数の他のポリヌクレオチド分子又は１又は複数の他の抗原と組合して寄与するようDNA ワクチン組成物に直接的に使用される場合；又は（ｃ）ポリヌクレオチド分子が、哺乳類種のメンバーに投与される場合、診断試薬として有用であるAPP −特異的抗体の生成を誘発するために使用され得るポリペプチドをコードする場合；又は（ｄ）ポリヌクレオチド分子がブタからの血液又は血清サンプルにおけるAPP −特異的抗体の存在を検出するために診断試薬として使用され得るポリペプチドをコードする場合；又は（ｅ）ポリヌクレオチド分子がAPP −感染されたブタからの流体又は組織サンプルにおけるAPP −特異的ポリヌクレオチド分子の存在を検出するために診断試薬として使用される場合。
【００７１】
本発明はさらに、“相同ポリペプチド”について上記セクション５．１において定義されるように、本発明のOmp20 タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７２】
本発明はさらに、本発明の前記Omp20 −関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、Omp20 −関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十分な長さのOmp20 −関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかしその特定の十分な長さのOmp20 関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、そしてより好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定義されているように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様においては、Omp20 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義されたように、本発明の上記Omp20 −関連タンパク質又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコードする。
【００７３】
本発明はさらに、配列番号２のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９の生来のOmp20 シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様においては、Omp20 シグナル配列−コードポリヌクレオチド分子は配列番号１の約nt２７２〜約nt３２８を含んで成る。
本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに融合される、Omp20 タンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７４】
５．２．２．OmpWをコードするポリヌクレオチド分子
配列番号３からのヌクレオチド配列、及びその選択され、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特にことわらない限り、株Pz418(ATCC 98928）の宿主細胞に存在するプラスミドpER418のその対応するOmpW−関連ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配列番号４に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラグメントについての言及はまた、特にことわらない限り、プラスミドpER418のOmpW−関連ヌクレオチド配列によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及するつもりである。
【００７５】
本発明は、APP タンパク質、すなわちOmpWをコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、約nt４３９〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、約nt３７６〜約nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたOmpW−コードポリヌクレオチド分子は、配列番号３のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００７６】
本発明はさらに、本発明のAPP OmpW−コードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、OmpW−コードポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）nt４３９〜nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など. (eds.)、上記）下で、配列番号４のアミノ酸残基２２〜２１５をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００７７】
好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 1989 、上記）下で、配列番号４のアミノ酸残基２２〜２１５をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt４３９〜nt１０２３の配列番号３のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
【００７８】
本発明はさらに、“相同ポリペプチド”について上記において定義されるように、本発明のOmpWタンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、本発明の前記OmpW−関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７９】
本明細書において使用される場合、OmpW−関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十分な長さのOmpW−関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかしその特定の十分な長さのOmpW−関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びより好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定義されているように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様においては、OmpW−関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義されたように、本発明の上記OmpW−関連タンパク質又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコードする。
【００８０】
本発明はさらに、配列番号４のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２１の生来のOmpWシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様においては、OmpWシグナル配列−コードポリヌクレオチド分子は配列番号３の約nt３７６〜約nt４３８を含んで成る。
本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに融合される、OmpWタンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８１】
５．２．３．Omp27 をコードするポリヌクレオチド分子
配列番号５からのヌクレオチド配列、及びその選択され、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特にことわらない限り、株Pz417(ATCC 98927）の宿主細胞に存在するプラスミドpER417のその対応するOmp27 −関連ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配列番号６に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラグメントについての言及はまた、特にことわらない限り、プラスミドpER417のOmp27 −関連ヌクレオチド配列によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及するつもりである。
【００８２】
本発明は、APP タンパク質、すなわちOmp27 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt２３８〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt１５７〜約nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたOmp27 −コードポリヌクレオチド分子は、配列番号５のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００８３】
本発明はさらに、本発明のAPP Omp27 −コードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、Omp27 −コードポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）nt２３８〜nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など. (eds.)、上記）下で、配列番号６のアミノ酸残基２８〜２５８をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００８４】
好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 1989 、上記）下で、配列番号６のアミノ  酸残基２８〜２５８をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt２３８〜nt９３３の配列番号５のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
本発明はさらに、“相同ポリペプチド”について上記において定義されるように、本発明のOmp27 タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８５】
本発明はさらに、本発明の前記Omp27 −関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、Omp27 −関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十分な長さのOmp27 −関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかしその特定の十分な長さのOmp27 −関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びより好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定義されているように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様においては、Omp27 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義されたように、本発明の上記Omp27 −関連タンパク質又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコードする。
【００８６】
本発明はさらに、配列番号６のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基２７の生来のOmp27 シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様においては、Omp27 シグナル配列−コードポリヌクレオチド分子は配列番号５の約nt１５７〜約nt２３７を含んで成る。
本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに融合される、Omp27 タンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００８７】
５．２．４．OmpA1 をコードするポリヌクレオチド分子
配列番号７からのヌクレオチド配列、及びその選択され、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特にことわらない限り、株Pz419(ATCC 98929）の宿主細胞に存在するプラスミドpER419のその対応するOmpA1 −関連ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配列番号８に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラグメントについての言及はまた、特にことわらない限り、プラスミドpER419のOmpA1 −関連ヌクレオチド配列によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及するつもりである。
【００８８】
本発明は、APP タンパク質、すなわちOmpA1 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt６７１〜約nt１７０８の配列番号７のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt６１４〜約nt１７０８の配列番号７のヌクレオチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたOmpA1 −コードポリヌクレオチド分子は、配列番号７のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００８９】
本発明はさらに、本発明のAPP OmpA1 −コードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、OmpA1 −コードポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）nt６７１〜nt１７０８の配列番号７のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など. (eds.)、上記）下で、配列番号８のアミノ酸残基２０〜３６４をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００９０】
好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 1989 、上記）下で、配列番号８のアミノ酸残基２０〜３６４をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt６７１〜nt１７０８の配列番号７のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
【００９１】
本発明はさらに、“相同ポリペプチド”について上記において定義されるように、本発明のOmpA1 タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はさらに、本発明の前記OmpA1 −関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、OmpA1 −関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十分な長さのOmpA1 −関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかしその特定の十分な長さのOmpA1 関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びより好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定義されているように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様においては、OmpA1 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義されたように、本発明の上記OmpA1 −関連タンパク質又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコードする。
【００９２】
本発明はさらに、配列番号８のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９の生来のOmpA1 シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様においては、OmpA1 シグナル配列−コードポリヌクレオチド分子は配列番号７の約nt６１４〜約nt６７０を含んで成る。
本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに融合される、OmpA1 タンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００９３】
５．２．５．OmpA2 をコードするポリヌクレオチド分子
配列番号９からのヌクレオチド配列、及びその選択され、且つ実質的な部分についての下記言及はまた、特にことわらない限り、株Pz420(ATCC 98930）の宿主細胞に存在するプラスミドpER420のその対応するOmpA2 −関連ヌクレオチド配列を言及するつもりである。さらに、配列番号１０に示されるアミノ酸配列及びそのペプチドフラグメントについての言及はまた、特にことわらない限り、プラスミドpER420のOmpA2 −関連ヌクレオチド配列によりコードされるその対応するアミノ酸配列を言及するつもりである。
【００９４】
本発明は、APP タンパク質、すなわちOmpA2 をコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列と共に又はそれを伴わないで含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt２５４〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る。より好ましい態様においては、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分子は、約nt１９７〜約nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る。非制限的態様においては、本発明の単離されたOmpA2 −コードポリヌクレオチド分子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含んで成る。
【００９５】
本発明はさらに、本発明のAPP OmpA2 −コードポリヌクレオチド分子に対して相同である単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。用語“相同”とは、OmpA2 −コードポリヌクレオチド分子を言及するために使用される場合、（ａ）nt２５４〜nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするが、しかし遺伝子コードの縮重に従ってヌクレオチド配列に対する１又は複数のサイレント変化を包含し；又は（ｂ）中位いの緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS）、１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び４２℃で、0.2 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など、上記）下で、配列番号１０のアミノ酸残基２０〜３６９をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味し、そして本発明の実施において有用である。
【００９６】
好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件、すなわち６５℃で、0.5MのNaHPO4, 7% SDS，１mMのEDTAにおいてのフィルター結合されたDNA へのハイブリダイゼーション、及び６８℃で0.1 ×SSC/0.1% SDSによる洗浄（Ausubel など., 1989 、上記）下で、配列番号１０のアミ  ノ酸残基２０〜３６９をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。より好ましい態様においては、相同ポリヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、nt２５４〜nt１３０６の配列番号９のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子の補体にハイブリダイズし、そして本発明の実施において有用である。
本発明はさらに、“相同ポリペプチド”について上記において定義されるように、本発明のOmpA2 タンパク質に対して相同であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００９７】
本発明はさらに、本発明の前記OmpA2 −関連ポリヌクレオチド分子のいづれかの実質的部分であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において使用される場合、OmpA2 −関連ポリヌクレオチド分子の“実質的部分”とは、特定の十分な長さのOmpA2 −関連ポリヌクレオチド分子の完全なヌクレオチド配列よりも少ない配列から成るが、しかしその特定の十分な長さのOmpA2 関連ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列の少なくとも約１０％、及びより好ましくは少なくとも約２０％を含んで成り、そしてポリヌクレオチド分子についての“有用性”が上記で定義されているように、本発明の実施において有用であるポリヌクレオチド分子を意味する。非制限的な態様においては、OmpA2 −関連ポリヌクレオチド分子の実質的な部分は、用語“ペプチドフラグメント”として上記で定義されたように、本発明の上記OmpA2 −関連タンパク質又はポリペプチドのいづれかのペプチドフラグメントをコードする。
【００９８】
本発明はさらに、配列番号１０のおよそアミノ酸残基１〜およそアミノ酸残基１９の生来のOmpA2 シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリペプチドを提供する。好ましくは非制限的態様においては、OmpA2 シグナル配列−コードポリヌクレオチド分子は配列番号９の約nt１９７〜約nt２５３を含んで成る。
本発明はさらに、キャリヤー又は融合パートナーに融合される、OmpA2 タンパク質、相同ポリペプチド、又はペプチドフラグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を提供する。
【００９９】
５．３．オリゴヌクレオチド分子
本発明は、さらに、本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかにハイブリダイズし、又は本発明の前記ポリヌクレオチド分子のいづれかの相補体であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子を提供する。そのようなオリゴヌクレオチド分子は好ましくは、少なくとも約１０〜１５個の長さのヌクレオチドであるが、しかし配列番号１，３，５，７又は９のいづれかの副配列、又はその相同ポリヌクレオチド分子の長さまで及び、そして高い緊縮条件下で、前記１又は複数のポリヌクレオチド分子にハイブリダイズすることができる。
【０１００】
より短いオリゴヌクレオチド分子に関しては、高い緊縮条件の例は、約１４個の塩基のオリゴヌクレオチドに関して、約３７℃、約１７個の塩基のオリゴヌクレオチドに関して、約４８℃、約２０個の塩基のオリゴヌクレオチドに関して、約５５℃、及び約２３個の塩基のオリゴヌクレオチドに関して約６０℃の温度での6 ×SSC/0.5%ピロリン酸ナトリウム溶液による洗浄を包含する。より長いオリゴヌクレオチド分子（すなわち約１００nt以上）に関して、高い緊縮条件の例は、上記セクション５．２に提供されている。他の適切なハイブリダイゼーション条件は、使用される特定のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド分子に依存して、当業界において知られているようにして決定され、そして調節され得る。
【０１０１】
好ましい態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、高い緊縮条件下で、配列番号１，３，５，７、又は９から選択されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子に、又は配列番号１，３，５，７又は９から選択されたヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする。
非制限的態様においては、本発明のオリゴヌクレオチド分子は、配列番号１５〜４７及び４９〜９３から成る群から選択されたヌクレオチド配列、及び前記配列の補体を含んで成る。非制限的態様においては、オリゴヌクレオチド分子は、配列番号１５〜４７及び４９〜９３から成る群から選択されたヌクレオチド配列及び前記配列の補体を含んで成る。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチド分子は、種々の目的のために、たとえば示差疾病診断への使用のためにAPP タンパク質−コードポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーとして、又は遺伝子調節において有用なアンチセンスをコードするために又はアンチセンスとして作用するために有用である。増幅は、組織又は流体サンプル、たとえば感染された動物の粘膜又は気管支においてAPP タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の存在を検出するために使用され得る。特定の増幅生成物の生成はAPP 細菌感染の診断の維持を助けると共に、増幅される生成物の欠失はそのような感染の欠失を示すことができる。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド分子はまた、アクチノバチルスの他の種又は株、又は他の細菌から相同遺伝子を単離するためにも使用され得る。
【０１０３】
増幅は、当業界において知られている他の増幅技法、たとえばリガーゼ鎖反応が使用され得るが、標準技法、たとえば“ポリメラーゼ鎖反応(PCR）により、適切に企画されたオリゴヌクレオチド分子を用いて実施され得る。たとえば、ＰＣＲに関しては、適切に企画されたプライマー、増幅されるべきヌクレオチド配列を含む鋳型、及び当業界において知られている適切なＰＣＲ酵素及び緩衝液を含んで成る混合物が、鋳型の特定のAPP −関連ポリヌクレオチド配列を増幅するために、標準のプロトコールに従って調製され、そして処理される。ＰＣＲを実施するための方法は、中でも、Innis など. (eds), 1995 、上記；及びErlich (ed), 1992 、上記に記載されている。
【０１０４】
５．４．組換え発現システム
５．４．１．クローニング及び発現ベクター
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいづれかをクローニングし、そして発現するための組成物、本発明のポリヌクレオチド分子を含んで成る組換えクローニングベクター及び組換え発現ベクター、前記いづれかのベクターにより形質転換された宿主細胞、及びそれに由来する細胞系を提供する。本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子のコード配列（この後、“APP コード配列”と称する）が、ポリペプチドを生成するためにAPP コード配列の転写及び翻訳のために必要な１又は複数の調節要素と作用可能に関連して存在するよう、好ましくは構成される。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、用語“調節要素”とは、ポリヌクレオチドコード配列の発現を駆動し、そして／又は調節するよう作用する当業界において知られている、誘導性及び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター及び他の要素をコードするヌクレオチド配列を包含するが、但し、それらだけには限定されない。また、本明細書において使用される場合、APP コード配列は、１又は複数の調節要素と“作用可能に関連して”存在し、ここで前記調節要素はコード配列の転写又はそのmRNAの翻訳、又は両者を効果的に調節し、そして可能にする。
【０１０６】
適切な調節要素と作用可能に関連して、特定のコード配列を含む組換えベクターを構成するための方法、たとえばインビトロ組換え技法、合成技法、及びインビボ遺伝子組換え法は、当業界において良く知られている。たとえば、Maniatisなど., 1989 、上記；Ausubel など., 1989 、上記；Sambrookなど., 1989 、上記；Innis など., 1995 、上記；及びErlich, 1992、上記を参照のこと。
【０１０７】
本発明のAPP コード配列のいづれか、たとえばAPP コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA 、プラスミドDNA 及びコスミドDNA 発現ベクターを発現するために使用され得る種々の発現ベクターは当業界において知られている。本発明のAPP コード配列を含むよう構築され得る典型的な原核発現ベクタープラスミドは、中でも、pUC8, pUC9, pBR322及びpBR329（Biorad Laboratories, Richmond, CA)，pPL 及びpKK223（Pharmacia, Piscataway, NJ)，pQE50(Qiagen, Chatsworth, CA) 、及びpGEXシリーズのプラスミド(Pharmacia）を包含する。本発明のAPP コード配列を含むよう構築され得る典型的な真核発現ベクターは、エクジソン−誘発性哺乳類発現システム(Invitrogen, Carlsbad, CA)、サイトメガロウィルスプロモーター−エンハンサーに基づくシステム（Promega, Madison, WI ; Stratagene, La Jolla, CA ; Invitrogen) 、バキュロウィルス−に基づく発現システム(Promega）、及び植物−に基づく発現システムを包含する。
【０１０８】
それらの及び他のベクターの調節要素は、それらの強さ及び特異性において変化することができる。使用される宿主／ベクターシステムに依存して、多くの適切な転写及び翻訳要素のいづれかが使用され得る。たとえば、哺乳類細胞系においてクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムから単離されたプロモーター、たとえばマウスメタロチオネインプロモーター、又はそれらの細胞において増殖するウィルスから単離されたプロモーター、たとえばワクシニア  ウィルス７．５Ｋプロモーター又はMoloney ネズミ肉腫ウィルスの長い末端反復体が使用され得る。組換えDNA 又は合成技法により得られたプロモーターもまた、挿入されたコード配列の転写を付与するために使用され得る。
【０１０９】
さらに、一定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサー、たとえばメタロチオネインプロモーターのための亜鉛及びカドニウムイオンの存在下で高められ得る。転写調節領域又はプロモーターの非制限的例は、細菌に関しては、β-galプロモーター、Ｔ７プロモーター、TAC プロモーター、λ左及び右プロモーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、trp-lac 融合プロモーター、等；酵母に関しては、解糖酵素プロモーター、たとえばADH-I 及びIIプロモーター、GPK プロモーター、PGI プロモーター、TRP プロモーター、等；及び哺乳類細胞に関しては、SV40初期及び後期プロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【０１１０】
特定の開始シグナルがまた、挿入されたコード配列の十分な翻訳のために必要とされる。それらのシグナルは典型的には、ATG 開始コドン及び隣接する配列を包含する。それ自体の開始コドン及び隣接する配列を含む本発明のAPP コード配列が適切な発現ベクター中に挿入されている場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、APP コード配列の一部のみが挿入されている場合、ATG 開始コドンを包含する外因性翻訳制御シグナルが必要とされる。それらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の種々の源から得られる。さらに、開始コドンは、完全な挿入体のイン−フレーム翻訳を確保するために、コード領域のオープンリーディングフレームと整合して存在すべきである。
【０１１１】
キャリヤー又は融合パートナーに融合される本発明のAPP −関連ポリペプチドのいづれかを含んで成る融合タンパク質を発現するであろう発現ベクターがまた構成され得る。そのような融合タンパク質は、種々の目的のために、たとえば組換え的に発現されたAPP タンパク質の安定性を高めるために、APP タンパク質に対する抗血清を高めるために、APP タンパク質の生化学的性質を研究するために、変更された免疫学的性質を示すAPP タンパク質を構築するために、又は組換え的に発現されたAPP タンパク質の同定又は精製を助けるために使用され得る。
【０１１２】
可能な融合タンパク質発現ベクターは、保護ペプチド、たとえば下記セクション８．２に記載されるもの、並びにβ−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合体、マルトース−結合タンパク質融合体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(GST）融合体、及びポリヒスチジン融合体（キャリヤー領域）をコードする配  列を組込んでいるベクターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。それらの及び他の融合タンパク質をコードする発現ベクターを構成するために使用され得る方法は、当業界において良く知られている。
【０１１３】
融合タンパク質は、発現されたタンパク質の精製を助けるために有用である。非制限的な態様においては、たとえばAPP タンパク質−マルトース−結合融合タンパク質はアミロース樹脂を用いて精製され得；APP タンパク質−GST 融合タンパク質はグルタチオン−アガロースビーズを用いて精製され得；そしてAPP タンパク質−ポリヒスチジン融合タンパク質は二価のニッケル樹脂を用いて精製され得る。他方では、キャリヤータンパク質又はペプチドに対する抗体は、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために使用され得る。
【０１１４】
たとえば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列が調節要素と作用可能に関連して発現ベクター中に構築され、そして位置決定され、その結果、発現されたエピトープが本発明のAPP タンパク質に融合される。非制限的な例においては、親水性マーカーペプチドである、FLAGTMエピトープ標識(International Biotechnologies Inc.)をコードするヌクレオチド配列は、APP タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端に対応する点で発現ベクター中に標準技法により挿入され得る。次に、発現されたポリペプチド−FLAGTMエピトープ融合生成物が検出され、そして市販の抗−FLAGTM抗体を用いてアフィニティー精製され得る。
【０１１５】
本発明の発現ベクターはまた、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含むよう構築され得、その結果、発現されたAPP タンパク質は、特定のプロテアーゼによる処理によりキャリヤー領域又は融合パートナーから開放され得る。たとえば、融合タンパク質ベクターは、中でも、トロンビン又は第Ｘａ因子切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１１６】
APP コード配列から上流に及び前記配列とオープンリーディングフレームを整合して存在するシグナル配列は、発現されたAPP ポリペプチドの密集及び分泌を方向づけるために、既知の方法により発現ベクター中に構築され得る。シグナル配列の非制限的例は、本明細書に開示されるような本発明のAPP タンパク質に対して生来である配列、並びにα−因子、免疫グロブリン、外層膜タンパク質、ペニシリナーゼ及びＴ−細胞受容体からのシグナル配列を包含する。
【０１１７】
本発明の組換えベクターにより形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助けるために、ベクターは、レポーター遺伝子生成物又は他の選択マーカーのためのコード配列をさらに含んで成るよう構築され得る。そのようなコード配列は好ましくは、上記のように、調節要素と作用可能に関係して存在する。本発明の実施において有用であるレポーター遺伝子は、当業界において良く知られており、そして中でも、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT）、緑色螢光タンパク質、ホタル、ルシフェラーゼ及びヒト成長ホルモンをコードする遺伝子を包含する。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、当業界において良く知られており、そして抗生物質又は抗−代謝物に対して耐性を付与する遺伝子生成物をコードし、又は栄養要求必要条件を供給する、それらの配列を包含する。そのような配列の例は、中でも、チミジン  キナーゼ活性、又はメトトレキセート、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、テトラサイクリン、及びカルベニシリンに対する耐性をコードするそれらの配列を包含する。
【０１１８】
特定の非制限的態様においては、本発明は、American Type Culture Collection(ATCC)に寄託されている宿主に存在する、下記セクションに記載されるように構成された次のプラスミドクローニングベクターを供給する：株Pz416(ATCC 98926) の宿主細胞に存在し、そしてOmp20 のORF を含んで成るプラスミドpER416；株Pz418(ATCC 98928) の宿主細胞に存在し、そしてOmpWのORF を含んで成るプラスミドpER418；株Pz417(ATCC 98927) の宿主細胞に存在し、そしてOmp27 のORF を含んで成るプラスミドpER417；株Pz419(ATCC 98929) の宿主細胞に存在し、そしてOmpA1 のORF を含んで成るプラスミドpER419；及び株Pz420(ATCC 98930) の宿主細胞に存在し、そしてOmpA2 のORF を含んで成るプラスミドpER420。
【０１１９】
５．４．２．宿主細胞の形質転換
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターにより形質転換された宿主細胞、及びそれらに由来する細胞系を提供する。本発明の実施において有用な宿主細胞は、原核細胞か又は真核細胞のいづれかであり得る。そのような形質転換された宿主細胞は、微生物、たとえば組換えバクテリオファージDNA 、プラスミドDNA 又はコスミドDNA 発現ベクターにより形質転換された細菌細胞；又は組換え発現ベクターにより形質転換された酵母細胞；又は動物細胞、たとえば組換えウィルス発現ベクター、たとえばバキュロウィルスにより感染された昆虫細胞、又は組換えウィルスベクター、たとえばアデノウィルス又はワクシニアウィルスにより感染された哺乳類細胞を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１２０】
細菌細胞は一般的に、宿主細胞として好ましい。Ｅ．コリ株、たとえばGibcoBRL, Life Technologies(Gaithersburg, MD) から入手できる株DH5 α、又は下記に記載されるようなＥ．コリ株LW14が典型的には使用され得る。真核宿主細胞、たとえば酵母細胞、及び哺乳類細胞、たとえばマウス、ハムスター、ブタ、牛、サル又はヒト細胞系からの細胞がまた、効果的に使用され得る。本発明の組換えタンパク質を発現するために使用され得る真核宿主細胞の例は、Chinese ハムスター卵巣(CHO）細胞（たとえば、ATCC受託番号(CL61)及びNIH Swiss マウス胚細胞NIH/3T3(たとえばATCC受託番号CRL1658)を包含する。
【０１２１】
本発明の組換えベクターは好ましくは、実質的に均質な細胞培養物中の１又は複数の宿主細胞中に形質転換され、又はトランスフェトされる。ベクターは一般的に、既知技法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換えされたウィルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン  トランスフェクション、トランスダクション、接合、又は微小発射物衝撃により、宿主細胞中に導入される。形質転換体の選択は、標準方法により、たとえば組換えベクターに関係する選択マーカー、たとえば耐抗生物質性を発現する細胞を選択することによって実施され得る。
【０１２２】
ベクターが宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノムにおける、又はエピソーム的に、APP コード配列の組込み及び維持が、予測されるタンパク質生成物を検出するために、標準の技法、たとえばサザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、PCR 分析、たとえば逆転写酵素PCR(rt-PCR) 、又は免疫学的アッセイにより確かめられ得る。APP コード配列を含み、そして／又は発現する宿主細胞は、当業界において良く知られている次の少なくとも４種の一般的アプローチのいづれかにより同定され得る：（ｉ）DNA-DNA ，DNA-RNA 又はRNA −アンチセンスRNA ハイブリダイゼーション；（ii）“マーカー”遺伝子機能の存在の検出；（iii ）宿主細胞におけるAPP −特異的mRNA転写体の発現により測定されるような転写のレベルの評価；及び（iv）たとえばイムノアッセイにより測定されるような成熟APP タンパク質生成物の存在の検出。
【０１２３】
５．４．３．組換えポリペプチドの発現
APP コード配列が適切な宿主細胞中に安定して導入されると、形質転換された宿主細胞はクローン的に増殖し、そしてその得られる細胞がAPP タンパク質の最大生成の助けとなる条件下で増殖せしめられる。そのような条件は、典型的には、そのような細胞を高密度に増殖することを包含する。発現ベクターが誘発性プロモーターを含む場合、適切な誘発条件、たとえば温度シフト、栄養物の消耗、無償性誘発物質（たとえば炭水化物の類似体、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)）の添加、過剰の代謝副生成物の蓄積、又は同様のことが、発現を誘発するために、必要により使用される。
【０１２４】
組換え的に発現されたAPP タンパク質が宿主細胞の内部に保持される場合、細胞は収穫され、そして溶解され、そしてAPP タンパク質がその溶解物から、タンパク質分解を最小にするために当業界において知られている抽出条件；たとえば４℃で、又はプロテアーゼインヒビターの存在下で、又は両者の存在下で、実質的に精製され、又は単離される。組換え的に発現されたAPP タンパク質が宿主細胞から分泌される場合、消耗された栄養培地が単純に集められ、そしてAPP ポリペプチドがそれから実質的に精製され、そして単離される。
【０１２５】
組換え的に発現されたAPP タンパク質は、標準の方法、たとえば次の方法のいづれかの組合せを用いて、細胞溶解物又は培養培地から部分的又は実質的に精製され又は単離され得る：硫酸アンモニウム沈殿、サイズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、密度遠心分離、及びアフィニティークロマトグラフィー。本発明のAPP ポリペプチドの高まる純度は、たとえばサイズ、又はAPP ポリペプチドに対して特異的な抗体との反応性に基づいて、又は融合標識の存在により決定され得る。
【０１２６】
本発明の実施に、たとえばワクチン組成物への使用のためには、APP タンパク質は、培養流体中に分泌されるような精製されていない状態で、又は宿主細胞又は細胞溶解物に存在するものとして、又は実質的に精製された又は単離された形で使用され得る。本明細書において使用される場合、APP タンパク質は“実質的に精製され”、ここで前記タンパク質は、特定の調製物におけるタンパク質の約２０％重量％以上を構成する。また、本明細書において使用される場合、APP タンパク質は“単離され”、ここで前記タンパク質は特定の調製物におけるタンパク質の少なくとも約８０重量％を構成する。
【０１２７】
従って、本発明は、本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の調製方法を提供し、ここで前記方法は、組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、ここで前記組換え発現ベクターは、次のものをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子を含んで成り：（ａ）生来のシグナル配列を伴って、又は伴わないで、配列番号２，４，６，８又は１０のアミノ酸配列を含んで成るAPP タンパク質；又は（ｂ）前記（ａ）のAPP タンパク質に対して相同であるポリペプチド；あるいは（ｃ）前記（ａ）のAPP タンパク質、又は（ｂ）の相同ポリペプチドのペプチドフラグメント；あるいは（ｄ）融合パートナーに融合された、（ａ）のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ポリペプチド、又は（ｃ）のペプチドフラグメント、を含んで成る融合タンパク質；前記ポリヌクレオチド分子は、APP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合タンパク質の生成の助けとなる条件下で、宿主細胞におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する１又は複数の調節要素と作用可能に関連して存在し；そして前記細胞培養物からAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント又は融合タンパク質を回収することを含んで成る。
【０１２８】
本発明のAPP タンパク質が十分な純度で得られると、それは標準の方法、たとえばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、血清学的反応性、等により特徴づけられ得る。APP タンパク質のアミノ酸配列は、標準のペプチド配列決定技法を用いて決定され得る。APP タンパク質はさらに、親水性分析（たとえば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 3824を参照のこと）、又は類似ソフトウェアアルゴリズムを用いて、特徴づけられ、疏水性及び親水性領域が同定され得る。
【０１２９】
構造分析は、特定の二次構造を仮定するAPP タンパク質の領域を同定するために実施され得る。生物物理学的方法、たとえばＸ−線結晶学（Engstram, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11 : 7-13)、コンピューターモデリング（Fletterick and Zoller (eds.), 1986, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 、核磁気共鳴(NMR）及び質量分光学がまた、タンパク質を特徴づけるために使用され得る。それらの研究から得られる情報は、たとえばより効果的なワクチン組成物を企画するために、又はAPP タンパク質の特定部分のみを含んで成るワクチンを選択するために使用され得る。
【０１３０】
本発明の実施において有用であるAPP タンパク質は、（ａ）免疫原性であり、すなわちブタに投与される場合、APP に対する保護応答を単独で誘発することができ、又はその誘発に、他のAPP タンパク質又は他のAPP −関連抗原と組合して寄与することができ；あるいは（ｂ）哺乳類種のメンバーに投与される場合、抗−APP 抗体の生成を誘発することができ；あるいは（ｃ）APP による感染、又は本発明のワクチンによる予防接種に起因するブタからの血液又は血清サンプルにおける抗−APP 抗体の存在を検出するために診断用試薬として使用され得るポリペプチドである。
【０１３１】
そのようなタンパク質は、調製されると、当業界において知られている通常のスクリーニング方法を用いて同定され得る。たとえば、APP に対する係免疫応答を誘発し、又はその誘発に寄与する能力は、ブタにAPP タンパク質を単独で、又は他のAPP タンパク質又は他のAPP −関連抗原と組合して投与し、そしてAPP −中和抗体のその得られる誘発について、又は予防接種されていない対照に比較して、APP による続く攻撃を耐える予防接種された動物のその得られる能力について試験することによって同定され得る。
【０１３２】
APP −特異的抗体の生成を誘発する能力は、モデル動物、たとえばマウス、ブタ、羊、ヤギ、馬、牛、等にAPP タンパク質を投与し、そして標準の技法を用いて、APP −特異的抗体の存在について動物の血清を試験することによって同定され得る。診断用試薬としてAPP タンパク質を使用する能力は、APP により前に又は現在、感染されているか、又は本発明のワクチンにより前もって予防接種されている動物の血液又は血清サンプルにAPP タンパク質を暴露し、そして前記サンプルからのAPP タンパク質又はAPP −特異的抗体への結合性を、標準の技法、たとえばELISA アッセイを用いて検出することによって、決定され得る。
【０１３３】
５．５．APP ワクチン
本発明は、次の１又は複数の成分の免疫学的有効量：（ａ）その生来のシグナル配列を伴って、又は伴わないで、配列番号２，４，６，８又は１０から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るAPP タンパク質；（ｂ）前記（ａ）のAPP タンパク質に対して相同であるポリペプチド；（ｃ）前記（ａ）のAPP タンパク質の副配列又は（ｂ）の相同ポリペプチドから成るペプチドフラグメント；（ｄ）融合パートナーに融合された、（ａ）のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ポリペプチド、又は（ｃ）のペプチドフラグメント；（ｅ）前記（ａ）のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ポリペプチド、（ｃ）のペプチドフラグメント、又は（ｄ）の融合タンパク質の類似体又は誘導体；あるいは（ｆ）前記（ａ）のAPP タンパク質、（ｂ）の相同ペプチド、（ｃ）のペプチドフラグメント、（ｄ）の融合タンパク質又は（ｅ）の類似体又は誘導体；ここで前記APP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体又はポリヌクレオチド分子は、ブタにおいてAPP に対しての保護応答を、単独で、又は１又は複数の他のそのような抗原と組合わせて、誘発し、又はその誘発に寄与することができ；及び獣医学的に許容できるキャリヤーを含んで成る、APP に対してブタを保護するためのワクチンを提供する。本明細書において使用される場合、用語“免疫学的有効量”とは、１回の投与の後又は複数回の投与の後、APP の１又は複数の血清型に対してのブタにおける保護免疫応答を誘発することができ、又はその誘発に寄与することができるその抗原の量を意味する。
【０１３４】
用語“保護免疫応答を誘発することができる”とは、APP に対して予防接種された動物を保護するよう作用する予防接種に応答してブタにおけるいづれかの免疫に基づく応答、たとえば抗体又は細胞介在性免疫応答を誘発し、又は高めるために本明細書において広く使用される。用語“保護免疫応答”、“保護する”、及び同様のものは、本明細書において使用される場合、APP −関連のブタ肺炎の絶対的な予防又はAPP によるブタの感染の絶対的な予防に限定されるものではなく、しかし病原体による感染の程度又は速度のいづれかの低下、又は疾病の重症度又は病原体による感染に起因するいづれかの徴候又は症状のいづれかの低下、たとえば肺病理学におけるいづれかの検出できる低下を、予防接種されていない、感染された対照動物において生じる症状に比較して言及することを意図する。
【０１３５】
本発明のワクチン組成物は、標準の緩衝液、キャリヤー、安定剤、希釈剤、保存剤及び溶解剤を用いて、許容された慣例に従って配合され得、そしてまた、持効性を促進するためにも配合され得る。希釈剤は、水、塩溶液、デキストロース、エタノール、グリセロール及び同様のものを包含することができる。等張性のための添加剤は、中でも塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを包含することができる。安定剤は、中でも、アルブミンを包含する。
【０１３６】
アジュバントは任意には、ワクチンに使用され得る。アジュバントの非制限的例は、RIBIアジュバントシステム(Ribi Inc.）、みょうばん、水酸化アルミニウムゲル、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、たとえばフロイント完全及び不完全アジュバント、ブロックコポリマー(CytRx, Atlanta GA) 、SFA-M(Chiron, Emeryville CA)、AMPHIGEN登録商標アジュバント、サポニン、QuilA, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、又は他のサポニン画分、SEAM-1、モノホスホリル脂質Ａ、アビリジン脂質−アミンアジュバント、Ｅ．コリ（組換え体又は他）からの熱不安定性エンテロトキシン、コレラトキシン、又はムラミルジペプチドを包含する。ワクチンはさらに、１又は複数の免疫調節剤、たとえばインターロイキン、インターフェロン、又は他のサイトカインを含むことができる。
【０１３７】
適切な獣医学的に許容できるワクチンビークル、キャリヤー、及び添加剤は、知られており、又は当業者に明らかであろう。たとえば、Remnington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., 1990, Mack Publishing（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。ワクチンは、溶液で、又は他方では、投与の前、無菌希釈剤溶液により再構成され得る凍結乾燥された形で貯蔵され得る。
【０１３８】
本発明はさらに、抗原の持効性開放のためのワクチン配合物を提供する。そのような持効性開放配合物の例は、生物適合性ポリマー、たとえばポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲン及び同様のものの複合材料と組合しての抗原を包含する。薬物供給ビークルにおける分解性ポリマーの構造、選択及び使用は、いくつかの出版物、たとえばA. Domb など., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3 : 279-292 （引用により本明細書に組込まれる）に再考されている。
【０１３９】
医薬製剤におけるポリマーの選択及び使用についての追加の手引きは、M. Chasin and R. Langer (eds.), 1990, “Biodegradable Polymers as Drug Debivery Systems ”, Drugs and the Pharmaceutical Science, Vol. 45, M. Dekker, NY（これもまた、引用により本明細書に組込まれる）によるテキストに見出され得る。他方では、又はさらに、抗原は、投与性及び効能を改良するためにマイクロカプセル封入され得る。抗原をマイクロカプセル封入するための方法は、当業界において良く知られており、そして中でも、アメリカ特許第3,137,631 号；第3,959,457 号；第4,205,060 号；第4,606,940 号；第4,744,933 号；第5,132,117 号；国際特許公開WO95/28227（それらのすべては、引用により本明細書に組込まれる）に記載される技法を包含する。
【０１４０】
リポソーム及びリポソーム誘導体（たとえば蝸牛状物（cochleate)、小胞(vesicles)がまた、抗原の持効性を提供するために使用され得る。リポソーム配合物をいかにして製造し、そして使用するかに関する詳細は、中でも、アメリカ特許第4,016,100 号；第4,452,747 号；第4,921,706 号；第4,927,637 号；第4,944,948 号；第5,008,050 号；及び第5,007,956 号（それらのすべては、引用により本明細書に組込まれる）に見出され得る。
【０１４１】
非制限的な態様においては、本発明のワクチンは、APP 、及び任意には、ブタを苦しめる１又は複数の他の疾病又は病理学的状態に対してブタを保護するための組合せワクチンであり得、ここで前記組合せワクチンは、ブタにおいてAPP に対して保護応答を誘発することができ、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の本発明の抗原を含んで成る第１成分；ブタを苦しめる疾病又は病理学的状態に対しての保護応答を誘発することができ、又はその誘発に寄与することができる、第１成分における抗原とは異なる、免疫学的有効量の抗原を含んで成る第２成分；及び獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成る。
【０１４２】
組合せワクチンの第２成分は、APP 、又は当業界において知られているように、ブタを苦しめる他の病原体、疾病、又は病理学的状態に対する保護応答を誘発し、又はその誘発に寄与するその能力に基づいて選択される。ブタのためのワクチン組成物において有用であることが現在知られているか、又は未来において決定されるべきいづれかの免疫原性組成物がその組合せワクチンの第２成分に使用され得る。
【０１４３】
そのような免疫原性組成物は、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis) 、パステウレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida) 、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerosuis)、ストレプトコーカス・スイス(Streptococcus suis)、エリシペロスリックス・ルシオパチアエ(Erysipelothrix rhusipathiae）、レプトスピラ sp.(Leptospira sp.)、スタフィロコーカス・ヒカス(Staphylococcus hyicus) 、ハエモフィラス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica) 、マイコプラズマ・ハイプネウモ・ニアエ(Mycoplasma hyopneumoniae)、ラウソニア・イントラセルラリス(Lawsonia intracellularis)、エスシュリシア・コリ(Escherichia coli)、ブタ生殖及び呼吸症候群ウィルス、ブタ、インフルエンザウィルス、感染性胃腸炎ウィルス、脳心筋炎ウィルス、コロナウィルス、仮性狂犬病ウィルス、及びサーコウィルス(circovirus)に対して保護性を提供するものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。非制限的な例においては、その組合せワクチンは、本発明の１又は複数のAPP タンパク質を含む成分、及び１又は複数の他APP 細菌成分、たとえばAPXI, APXII 及びOmlAの組合せを含んで成る。
【０１４４】
第２成分を含んで成る抗原は、任意には、キメラ分子を生成するために、第１成分の抗原に共有結合され得る。非制限的態様においては、第２成分の抗原は、ハプテンを含んで成り、その免疫原性は、第１成分の抗原への接合により検出できるほどに高められる。組合せワクチンの第１及び第２成分の共有結合される抗原を含んで成るキメラ分子は、当業界において知られている１又は複数の技法を用いて合成され得る。
【０１４５】
たとえば、キメラ分子は、標準の化学的合成方法を利用して、市販のペプチド合成機を用いて合成的に生成され得る（たとえば、Merrifield, 1985, Science 232 : 341-347 を参照のこと）。他方では、別の抗原が別々に合成され、そして次に、当業界において知られているように、化学結合基により一緒に連結され得る。他方では、キメラ分子は組換えDNA 技法を用いて生成され得、それにより、たとえばキメラ分子の異なった抗原をコードする配列を有する別のポリヌクレオチド分子が一緒にスプライシングされ、そしてキメラ融合ポリペプチドの続く単離のために、適切な形質転換された宿主細胞において発現される。
【０１４６】
本発明のワクチンがポリペプチドよりもむしろポリヌクレオチド分子を含む場合、そのスプライシングされたポリヌクレオチド分子はワクチン組成物にそれ自体使用され得る。そのような組換え技法を実施するための十分な手引きは、中でも、Maniatisなど., 1989 、上記；Ausubel など., 1989 、上記；Sambrookなど., 1989 、上記；Innis など., 1995 、上記；及びErlich, 1992、上記に提供される。
【０１４７】
本発明はさらに、APP に対してブタを保護するためのワクチンの調製方法を提供し、ここで前記方法は、ブタにおいてAPP に対する保護応答を誘発することができ、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の本発明の１又は複数の抗原と、獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤とを、ブタへの投与のために適切な形で組合すことを含んで成る。
【０１４８】
本発明はさらに、ブタへの本発明のワクチンを投与することを含んで成る、APP に対してブタを予防接種する方法を提供する。投与される抗原の量は、予防接種される動物の年齢、体重、健康及び一般的な物理的特徴のような要因、及び投与される特定のワクチン組成物に依存する。個々のパラメーターのための最適な用量の決定は、経験的研究の観点から通常の方法を用いて行なわれ得る。投与されるAPP タンパク質の量は、約０．１μｇ〜約１０mg、より好ましくは約１０μｇ〜約１mg、及び最とも好ましくは約２５μｇ〜約０．１mgのポリペプチドであろう。DNA ワクチンに関しては、ポリヌクレオチド分子の量は、好ましくは約０．０５μｇ〜約５００mg、より好ましくは約０．５μｇ〜約５０mgの範囲であろう。さらに、ワクチンの典型的な用量は、約０．５ml〜約５ml／用量／動物の範囲であろう。
【０１４９】
動物はいづれか適切な時期、たとえば生後１週間以内で、又は乳離れの時期で、又は交配の直前又はその時期で、又はAPP 感染が動物集団の１又は複数のメンバーに最初に出現し始める時期で予防接種され得る。補充の投与、又は追加免疫は、十分な保護を達成するために必要とされ得る。適切な免疫保護が動物において達成されているかどうかを決定するための方法は、当業界において良く知られており、そしてたとえばセロコンバージョンの決定を包含する。
ワクチンは、いづれか適切な経路、たとえば経口、鼻腔内、筋肉内、リンパ節内、経皮内、腹腔内、皮下、直腸又は膣内投与により、又はそれらの経路の組合せにより投与され得る。当業者は、選択される経路に従ってワクチン組成物を容易に配合することができるであろう。
【０１５０】
本発明はさらに、APP により引き起こされる感染又は疾病に対してブタを予防接種するためのワクチン用キットを提供し、ここで前記キット、ブタにおいてAPP に対する保護応答を誘発でき、又はその誘発に寄与することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、誘導体又はポリヌクレオチド分子から成る群から選択された、免疫学的有効量の１又は複数の本発明の抗原を含んで成る第１容器を含んで成る。前記キットは任意には、獣医学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成る第２容器をさらに含むことができる。ワクチン組成物は、溶液で、又は第２容器のキャリヤー又は希釈剤を用いて再構成されるべき凍結乾燥された形で第１容器において貯蔵され得る。
【０１５１】
５．６．抗−APP 抗体
本発明はさらに、本発明のAPP タンパク質に結合する単離された抗体を提供する。そのような抗体は、種々の目的のために、たとえばAPP タンパク質を精製するための親和性試薬として、又はたとえばELISA 又はウェスターンブロットアッセイの使用により、APP −感染された動物から集められた細胞、組織又は流体サンプルにおけるAPP タンパク質の存在を検出するために、又はAPP 感染を予防し、制御し、又は処理するための治療剤として有用である。
【０１５２】
本発明のAPP タンパク質に対する抗体は、本発明の適切な抗原を、ブタ、牛、馬、ウサギ、ヤギ、羊、及びマウスから選択された宿主動物に投与することによって、既知方法に従って生ぜしめられ得る。種々のアジュバント、たとえば上記に記載されるアジュバントが、抗体生成を増強するために使用され得る。本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいづれかであり得る。ポリクローナル抗体は、免疫化された動物の血清から調製され、そして単離され、そして標準の技法を用いて、抗−APP タンパク質特異性について試験され得る。
【０１５３】
他方では、APP タンパク質に対するモノクローナル抗体は、培養における連続した細胞系による抗体分子の生成を提供するいづれかの技法を用いて、調製され、そして単離され得る。それらは、Kohler and Milstein(Nature, 1975, 256 : 495-497)により最初に記載されるハイブリドーマ技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Koskorなど., 1983, Immunology Today 4 : 72 ; Cote など., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA  80 : 2026-2030)；及びEBV −ハイブリドーマ技法（Coleなど., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) を包含するが、但しそれらだけには限定されない。他方では、一本鎖抗体の生成について記載する技法（たとえば、アメリカ特許第4,946,778 号を参照のこと）が、APP タンパク質−特異的一本鎖抗体を生成するために適合され得る。
【０１５４】
本発明のAPP タンパク質のための特異的結合部位を含む抗体フラグメントもまた、本発明の範囲内に包含される。そのようなフラグメントは、損なわれていない抗体分子のペプシン消化により生成され得るF(ab')2 フラグメント、及びF(ab')2 フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって生成され得るFab フラグメントを包含するが、但し、それらだけには限定されない。他方では、Fab 及び／又はscFv発現ライブラリーが、本発明のAPP タンパク質に対する所望する特異性を有するフラグメントの急速な同定を可能にするために構成され得る（たとえば、Huseなど., 1989, Science 246 : 1275-1281を参照のこと）。
【０１５５】
モノクローナル抗体及び抗体フラグメントの生成及び単離のための技法は、当業界においてよく知られており、そして中でも次の文献にさらに記載される：Harlow and Lane, 1988, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory、及び in J.W. Goding, 1986, Monoclonal Antlbodies : Principies and Practice, Academic Press, London。上記引用されるすべての出版物は、引用により本明細書中に組込まれる。
【０１５６】
５．７．診断用キット
本発明はさらに、診断用キットを提供する。非制限的態様においては、本発明の診断キットは、APP タンパク質に対して向けられた抗体に対して特異的に結合することができる本発明のAPP タンパク質、相同ポリペプチド、ペプチドフラグメント、融合タンパク質、類似体、又は誘導体を含んで成る第１容器；及びブタ抗体に対して向けられた第２抗体を含んで成る第２容器を含んで成る。第２抗体は好ましくは、検出できるラベルを含んで成る。そのような診断キットは、APP により現在感染されているか、又はすでに感染されたことがあるか、又は本発明のワクチンによる予防接種の結果としてセロコンバートされているブタを検出するために有用である。
【０１５７】
もう１つの態様においては、本発明は、APP タンパク質に対して結合する第一抗体を含んで成る第１容器；及びAPP タンパク質上の異なったエピトープに結合し、又は前記一次抗体に対して向けられる第二抗体を含んで成る第２容器を含んで成る診断用キットを提供する。第二抗体は好ましくは、検出できるラベルを含んで成る。他の態様においては、診断用キットは、APP −特異的ポリヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズするか、又はそれを増幅することができる本発明のポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子を含んで成る容器を含んで成る。それらの後者の２種の診断用キットは、APP により現在、感染されているブタを検出するために有用である。
【０１５８】
５．８．アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム
本発明はさらに、APP タンパク質コードのmRNAに結合し、分解し、そして／又は阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート、及びリボザイムを包含するオリゴヌクレオチド分子を提供する。
アンチセンスRNA 分子及びアンチセンスDNA 分子を包含するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化されたmRNAに結合することによってmRNAの翻訳を直接的に阻止するよう作用し、そしてそれにより、タンパク質翻訳を妨げる。たとえば、少なくとも約１５個の、及びAPP タンパク質をコードするmRNA転写体配列のユニーク領域に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、たとえば従来のホスホジエステル技法により合成され得る。
【０１５９】
リボザイムは、RNA の特定の分解を触媒することができる酵素性RNA 分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNA へのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続くエンドヌクレオチド分解性切断を包含する。APP タンパク質mRNA配列のエンドヌクレオチド分解性切断を特異的且つ効果的に触媒する構築されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子はまた、本発明の範囲内である。
【０１６０】
いづれかの可能性あるRNA 標的物内の特定のリボザイム切断部位は、最初に、次の配列：GUA, GUU及びGUC を包含するリボザイム切断部位のための標        的分子を走査することによって同定される。同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いDNA 配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適切にする予測される構造特徴、たとえば二次構造のために評価され得る。候補体標的物の適合性がまた、たとえばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそれらの接近性を試験することによっても評価され得る。
【０１６１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両者は、既知の方法により調製され得る。それらは、化学合成、たとえば固相ホスホラミジット化合合成のための技法を包含する。他方では、アンチセンスRNA 分子は、RNA 分子をコードするDNA 配列のインビトロ又はインビボ転写により生成され得る。そのようなDNA 配列は、適切なRNA ポリメラーゼプロモーター、たとえばＴ７又はSP6 ポリメラーゼプロモーターを組込む広範囲の種類のベクター中に組込まれ得る。
【０１６２】
本発明のオリゴヌクレオチドに対する種々の修飾が、細胞内安定性及び半減期を高める手段として導入され得る。可能な修飾は、分子の５’及び／又は３’末端へのフランキング配列、又はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの付加、又はオリゴヌクレオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりもむしろホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
次の例は、例示的であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６３】
【実施例】
６．例：新規APP タンパク質の同定
次の実験の結果は、APP 血清型−５により前に攻撃されたブタがAPP 血清型−７により異種的に再攻撃された場合に誘発される局部抗体応答の特異性を示す。抗体特異性は、これまで認識されていないAPP タンパク質を同定するために使用され、それらのタンパク質のうち３種（Omp20, OmpW, Omp27）が、すべての１２種のAPP 血清型に存在することが、ウェスターンブロット分析により示された。２種の追加の新規タンパク質（OmpA1, OmpA2）が、タンパク質画分単離及び濃縮に従って同定された（下記、セクション６．１．６．を参照のこと）。
【０１６４】
６．１．材料及び方法
６．１．１．細菌攻撃
ブタ攻撃材料を調製するために使用されるAPP 血清型−５培養物（株K-17）を、Dr. R.A. Schulz, Avaca, IA, USA から得た。ブタ攻撃材料を調製するために使用されるAPP 血清型−７培養物（株WF-83 ）を、Dr. E. Jones, Swedeland, PA, USAから得た。
【０１６５】
臨床学的に健康な生後７〜８週目の接種のブタを、APP 感染のこれまでの病歴を有さないネバラスカ州のブタから得、そしてIACUC ガイドラインに従って、Pfizer Animal Health, Lincoln, NE での分離用施設に収容した。動物は、研究の開始の前、それらの健康状態を決定するために獣医により試験された。２週間の順化に続いて、約１ml／５０ポンド体重の割合で投与される、１００mg／mlのテラゾール、５０mg／mlのキシラジン及び５０mg／mlのカテミンの組合せを用いて、ブタに麻酔をし、そして２．６×１０6 cfu のAPP 血清型−５を鼻腔内接種した。
【０１６６】
一次攻撃の後７８日で、臨床学的APP 疾病を示したが、しかし回復した生存するブタの６匹に対して、再び上記のように麻酔をした。それらの６匹のブタの第１及び第２のブタを、１×１０7 cfu のAPP 血清型−５により鼻腔内再攻撃し、（同種再攻撃）；それらのブタの第３及び第４のブタを、１×１０6 cfu のAPP 血清型−７により鼻腔内再攻撃し、（異種再攻撃）；そして第５及び第６のブタを、細菌増殖培地のみ（対照）により鼻腔内接種した。
【０１６７】
すべてのブタを、再攻撃の４８時間後に殺害し、それらの血清及び器官を集め、そして器官からの組織片を、下記セクション６．１．２及び６．１．３に記載のようにして、２４又は４８時間、インビトロで培養した。組織外植片培養物からの抗体−含有上清液を用いて、同種再攻撃又は１回の攻撃（対照）により誘発される記憶抗体プロフィールと異種再攻撃により誘発される記憶抗体プロフィールとを比較した。組織外植片によりインビトロで生成される抗体の特異性を、すべての１２種のAPP 血清型を表わす完全な細菌細胞調製物のパネルに対して、ウェスターンブロット分析により決定した。この分析は、同種再攻撃又は１回の攻撃（対照）に続く抗体プロフィールとは異なる、異種再攻撃に続く抗体プロフィールの存在を示した。
【０１６８】
ウェスターンブロットのための材料を調製するために使用されるAPP 血清型−１（株4074）、血清型−２（株226 ）、血清型−３（株1421）、血清型−４（株M62 ）、血清型−５（株K-17）、血清型−６（株Femo FE 171D）、血清型−７（株WF-83 ）、血清型−８（株405 ）、血清型−９（株CVJ-13261 ）、血清型−１０（株13039 ）、血清型−１１（株56153 ）及び血清型−１２（株8329）対照培養物は、Dr. B. Fenwick, Kansas State University, Manhattan, KS, USA から得られた。
【０１６９】
６．１．２．組織収集
血清サンプルを、再攻撃の前、及び検死の前（再攻撃の４８時間後）再びブタから得た。ブタを、静脈内ペイントバルビタールの過剰用量により再攻撃の４８時間後、安楽死せしめた。肺を除き、そしてAPP 感染に寄与する特徴的な大まかな病巣について試験し、そして完全な肉眼での試験をすべての主要器官に対して行なった。肺、リンパ節（腸間膜、膝窩、気管支）、Peyer パッチ及び扁桃の組織サンプルを集め、７０％エタノールにより洗浄し、そしてRPMI輸送媒体（１０mMのHEPES ，５％のFBS, 50U／mlのペニシリン及び５０μｇ／mlのストレプトマイシンにより補充されたＲＰＭＩ媒体（Gibco/BRL, Grand Island, NY ））により３度すすいだ。
【０１７０】
洗浄の後、組織を、１０mlの輸送媒体を含む５０mlの遠心分離管に入れ、そして実験において処理されるまで氷上に配置した（収集の３時間以内）。追加の組織サンプルを、後でのmRNA単離及び免疫組織化学のために、液体窒素において凍結し、又は組織病理学のためにホルスリンに固定した。肺組織のサンプルをまた、細菌同定のために、University of Nebraska-Lincoln診断実験室に提出した。
【０１７１】
６．１．３．組織外植片培養物
組織を、約５mlの輸送媒体を含む個々のペトリ皿に配置した。約２×２mmの小さな組織片を、解剖用メス及び／又はハサミによりオリジナルサンプルから切断し、そして２mlの洗浄媒体（１０mMのHEPES 及び及び50μg/mlのゲンタマイシンにより補充された、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないハンクス溶液（HBSS))を含む１２−又は２４−ウェルプレート（Costar, Cabridge, MA）の個々のウェルに配置した。組織片を洗浄媒体によりすすぎ、そして洗浄媒体を含むもう１つのウェルに移した。
【０１７２】
この洗浄／すすぎ操作を４度くり返し、そして次に、組織片を、１０％のFBS ，１０mMのHEPES ，２mMのグルタミン、５０μｇ／mlのゲンタマイシン、６２μｇ／mlのアンホテリシンＢ、４０μｇ／mlのナトリウムデノキシコレート、５０Ｕ／mlのペニシリン及び５０μｇ／mlのストレプトマイシンにより補充されたRPMI培地を含むウェルに移した。プレートを、５％ CO2の湿潤されたチャンバーにおいて、３８．５℃で２４又は４８時間インキュベートした。
【０１７３】
６．１．４．ウェスターンブロット分析
組織外植片上清液における回収された抗体の特異性を、次のようにしてウェスターンブロットにより試験した。12APP 血清型の個々の代表的な単離物をそれぞれ別々に増殖し、上清液を試験するために完全な細菌細胞抗原を生成した。個々の株を、１０μｇ／mlのβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β−NAD ）により補充された最少培地−３（ＭＭ３）（１．８％のBacterin HP 媒体、１．７％の乳酸、０．３％のグリセロール、0.05M のHEPES, 0.011M のＬ−グルタミン酸（−ナトリウム塩）、5 ×10-5M のニコチンアミド及び０．２％のカサミノ酸）において、３７℃で５〜６時間、約０．５〜０．６のＯＤ560 まで、１８０rpm で撹拌しながら培養した（１％の種子）。
【０１７４】
細胞を12,000×g での１０分間の遠心分離によりペレット化し、培地を分析のために除去し、そしてペレットを５mlのダルベッコリン酸緩衝溶液（DPBS）に再懸濁した。タンパク質アッセイの前、その再懸濁されたペレットを−２０℃で凍結し、そして次に、融解し、いづれかの損なわれていない細菌細胞を溶菌した。個々の分離物のタンパク質濃度を、BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce, Rockford, IL）を用いて決定した。APP 抗原調製物（５μｇ／レーン）を、４〜２０％のトリス−グリシンゲル（Novex, San Diego, CA）上に負荷し、そしてタンパク質を、室温で、２０mAの一定の電流を用いて、電気泳動により分離した。
【０１７５】
分離されたタンパク質を、単一乾燥グラッファイトエレクトロブロッター（Milliblot, Millipore, Seattle, WA ）を用いて、ProBlot TM膜（Applied Biosystems, Foster City, CA ）に移した。移行は、室温で３０分間、２００mAの一定電流を用いて実施された。移行の完結後、膜を、緩衝液Ａ（５０mMのトリスHCl ，１５０mMのNaCl，pH７．４、及び５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳）と共に室温で一晩インキュベートすることによってブロックした。
【０１７６】
次に、そのブロック用緩衝液をデカントし、そして緩衝液Ａ中、血清（１：１００の希釈度）又は組織外植片培養上清液（１：３の希釈度）により置換し、そして膜を室温で１時間、インキュベートし、続いて、緩衝液Ｂ（０．２％（ｖ／ｖ）のTriton X-100を含む緩衝液Ａ）により１０分間の洗浄及び緩衝液Ａにより２回の１０分間の洗浄を行なった。洗浄の完結後、膜を、緩衝液Ａにより１：１０００に希釈された、ホスファターゼ接合されたヤギ抗−ブタ抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD ）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、膜を緩衝液Ａにより１０分間、洗浄し、そして５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT）基質系（Kirkegaad & Perry Laboratories）と共に１５分間インキュベートした。
【０１７７】
６．１．５．APP 血清型−７膜の調製
APP 血清型−７のアリコートを、10μg/mlのβ-NADにより補充されたMM３中に接種し（１％）、そして３７℃で一晩培養した（180rpm）。一晩の培養物の一部を、新鮮な培地中に接種し（細菌接種物は合計体積の３％であった）、そして５〜６時間、又は247Klett単位の培養物密度までインキュベートした。細胞を、4,500rpmで４０分間、１０℃での遠心分離によりペレット化し、上清液を除去し、そしてペレットを、５０mMのトリス−HCl(pH8.0)5ml 及び１mMのPMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）の最終濃度をもたらすために十分なPMSFと共に５０mMのトリス−HCl(pH8.0)5 mlに再懸濁した。
【０１７８】
細菌細胞を、40K PSI 圧力セルにおいて16,000ポンド／インチ2 下でFrench Press(Sim Aminco., Rochester, NY)を用いて溶菌した。破壊された細胞を1,000 ×g で１５分間、遠心分離し、大きな細菌残骸を除去した。全粗膜を、45,000rpm で６０分間、１８℃での遠心分離により集めた。上清液を捨て、ペレットを５０mMのトリス−HCl(pH8.0)に再懸濁し、そしてタンパク質をBradford Standard Protein Assay を用いて決定した。
【０１７９】
３mlの体積における１５mgの粗膜に、１００mMのPMSF30μl 及び2.5 ％サルコシル（sarkosyl）７５０μｌを添加し、そして全体積を十分に混合した。氷上での３０分間のインキュベーションの後、膜を、２００，０００×ｇで１５分間、１０℃での遠心分離によりペレット化した。上清液を、ペレット化された膜画分から除去し、そしてペレットを５０mMのトリス−HCl ／１００mMのNaCl（pH８．０）溶液３mlに再懸濁した。APP 血清型−７の膜抗原を表わしたこの膜調製物を、−２０℃で貯蔵した。
【０１８０】
６．１．６．膜タンパク質分別及び精製
Ｎ−末端配列決定のためのAPP タンパク質の精製を、BioRad Model 491 Prep Cell(BioRad, Richmond, CA ）を用いて、連続−溶出SDS-PAGEを通して行なった。１０mlの体積（４．５mgの合計タンパク質）のAPP 血清型−７膜タンパク質画分を、等体積の非還元性サンプル緩衝液（１２５mMのトリス−HCl, pH6.8, 4%のSDS, 20%のグリセロール、及び０．１％のブロムフェノールブルー）と共に混合した。このタンパク質−緩衝液混合物を５分間、煮沸し、そして３％の積重ね用／１５％の分離用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用した。サンプルを２０mAの一定電流（初期電圧１７５〜２５０Ｖ、最終電圧２００〜３００Ｖ）で、７２時間、電気泳動した。
【０１８１】
約８００×５mlの画分を、１ml／分の流速で、その実験を通して集め、そしてＡ260 での分光測光によりタンパク質含有率について分析した。１０番目ごとの画分を、SDS-PAGE及び銀染色（Bio-Rad, Richmond, CA ）により分析した。分子量により決定されるように、推定上、同じタンパク質を含む画分をプールし、そして４℃で貯蔵した。プールされたサンプルを脱塩し、そしてＮ−末端配列決定のために濃縮した。脱塩は、プールされたサンプルのアリコートを、１０mlの層体積を有するPrestoTM脱塩カラム（Pierce, Rockford, IL）に適用することによって実施された。
【０１８２】
個々のタンパク質プールのアリコート３mlを別々のカラムに適用し、そしてddH2O により溶出し、１０×２mlの画分を得た。これを、３０mlが脱塩されるまで、個々のタンパク質プールのために１０度くり返した。ウェスターンブロット分析により決定される場合、脱塩されたタンパク質の大部分は、画分No．２に見出された。従って、個々の１０回の溶出からの第２画分を、それぞれ個々のタンパク質のためにプールした。得られる２０mlのサンプルを凍結乾燥せしめ、そしてＮ−末端配列決定のために、０．５mlのddH2O に再懸濁した。Ｎ−末端配列は、Pfizer Central Research Molecular Science Sequence Facility で得られた。
【０１８３】
６．２．結果
６．２．１．再攻撃後の臨床学的徴候及び病理学的発見
ブタは、同種（血清型−５）又は異種（血清型−７）の再攻撃の後、臨床学的疾病のいづれの徴候も示さなかった。病理学的試験は、動物が、再攻撃に続く急性APP 感染と一致する肺病巣を進行しなかったことを確かめた。しかしながら、血清型−７により再攻撃された動物の気管支リンパ節は、血清型−５により再攻撃された動物又は対照動物からのリンパ節に比較して、出血性であり、そして拡大された。
【０１８４】
６．２．２．再攻撃により誘発される抗体の特異性
血清及び組織外植片上清液に存在する抗体の特異性を、上記のようにして、ウェスターンブロット分析により評価した。２４又は４８時間のインキュベーションの後に集められたすべての組織由来の上清液は、APP タンパク質を特異的に認識する抗体を含んだ。一般的に、血清型−５抗原に対する反応性は、血清型−７又は血清型−１の抗原に対する反応性よりも高かった。しかしながら、ほとんどの組織由来の上清液の反応性は、血清の反応性よりも弱く、そしてスペクトルにおいては、狭かった（図１ａ）。
【０１８５】
一般的に、組織外植片上清液の反応性は、特定のパターンを有さなかった。それにもかかわらず、１つの特定の動物（No．８０３、血清型−７により異種的に再攻撃された）からの組織外植片上清液のウェスターンブロット反応性のパターンは、強く、そしてAPP 血清型−１，−５、及び−７に存在するいくつかの低分子量タンパク質を強調した（図１ｂ）。この上清液は、APP 血清型−５より始め、攻撃されたブタにおいて、APP 血清型−７による異種再攻撃により誘発される二次（記憶）抗体応答の交差反応性の程度をさらに特徴づけるために抗体源として使用された。
【０１８６】
ブタNo．803 からのBLN 組織外植片上清液における抗体の交差反応性の程度を、１２種の異なったAPP 血清型の個々から調製された完全な細菌細胞抗原を用いて、ウェスターンブロット分析により評価した。この分析は、抗体により認識される３種の低分子量タンパク質がすべての１２種の血清型に存在したことを示した（図２）。このＢＬＮ組織外植片上清液に存在する抗体はまた、他のタンパク質バンドも認識した。
【０１８７】
外毒素ApxII （Nakai, 1983 、上記を参照のこと）に対応する、血清型−１，２，４，５，６，７，８及び９に存在する高分子量バンド、及び血清型２，５，８及び１０に存在するもう１つのタンパク質バンドは、第２の最とも交差反応性のパターンを表わした。APP 細胞ペレット及び上清液のウェスターンブロット分析は、低分子量タンパク質に対する、ＢＬＮ組織外植片上清液における抗体の反応性が、細胞ペレットに存在するタンパク質に制限されることを示し（図３）、このことは、そのタンパク質が細菌細胞に関係し、そして分泌されないことを示す。
【０１８８】
６．２．３．交差反応性抗体により認識されるタンパク質
低分子量タンパク質を上記のようにして精製し、次のものを用いてウェスターンブロット分析により同定されるような興味あるタンパク質を含む部分精製された調製物を生成する：（ａ）分析No．803 からのBLN 組織外植片上清液；又は（ｂ）ブタNo．803 からの血清（図４）。膜タンパク質の分別に基づいて、それぞれ約１９〜２０、約２３、約２７及び約２９kDa の分子量を有する４種のタンパク質バンドが、この方法を用いて同定された。
【０１８９】
前記４種のバンドにおけるタンパク質のＮ−末端配列分析は、下記表１に示されるように、一次配列及び推定上の残基（括弧内）を示し、そして本明細書においては、“Pep-1 ”（配列番号１１）、“Pep-2 ”（配列番号１２）、“Pep-3 ”（配列番号１３）及び“Pep-4 ”（配列番号１４）と命名した。時おり、第２シグナルが観察され、そしてたぶん、少々の汚染物の存在によるものであった（データは示されていない）。表１に示される部分Ｎ−末端配列を用いてプローブ及びプライマーを企画し、交差反応性APP タンパク質をコードする一次DNA 配列を得た。配列相同性の比較は、異種再攻撃の後、誘発される優性の局部抗体応答により認識される前記４種のタンパク質がこれまでAPP に関して記載されたことがなかったことを示した。
【０１９０】
【表１】
0003699421.tif 000002
【０１９１】
１：Xaa は、特定位置でのアミノ酸残基が決定され得なかったことを示す。
７．例：APP タンパク質をコードするDNA の分子クローニング
７．１．染色体DNA の単核及びゲノムライブラリーの構成
１２種のAPP 血清型の個々からのゲノムDNA を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）−プロティナーゼＫ方法（Ausubel など., 1988, Curr. Protocols Mol. Biol. Wiley Interscience, NY) 、又はDNA Isolator Genomic DNA Isolation Reagent（Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, Texas)のいづれかにより、別々に単離した。APP DNA をＴＥ緩衝液（１０mMのトリス−HCl ，pH８．０，１mMのEDTA）に、１μｇ／ml以下で溶解し、そしてＵＶ分光計により定量化した。
【０１９２】
Omp20, OmpW, Omp27及びOmpAをコードするAPP 遺伝子配列のクローニングを促進するために、いくつかのゲノムライブラリーを構成した。それらのライブラリーを、供給者により実質的に推薦されるようにして、制限されたDNA フラグメントの５’及び３’末端への既知の配列(Vectorette IITM，Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX) の連結により特別に修飾した。従って、Vectoretteライブラリーを、APP7-1（血清型７、継代１）からの染色体DNA ２μｇを、制限エンドヌクレアーゼBamHI, BglII, HindIII, EcoRI, DraI、又はHpaIにより３７℃で一晩、別々に消化することによって構成した。
【０１９３】
次に、反応を、追加の新鮮な制限酵素により封じ、そして２mMのATP ，２mMのDTT に最終濃度を調節した。Vectorette末端化を、T4 DNAリガーゼ（４００Ｕ）及び３ｐモルの適切な適合性Vectoretteリンカー（BamHI Vectorette：BamHI, BglII；HindIII Vectorette：HindIII ；EcoRI Vectorette：EcoRI ；ブラントVectorette：DraI, HpaI）の添加により実施した。その混合物を２０℃で、６０分間、３サイクル、インキュベートし；３７℃で３０分間で、その末端化反応を完結し；そして次に、dH2Oにより２００μｌに調節し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０１９４】
７．２．Omp20 の分子クローニング
Vectoretteライブラリーのスクリーニングを実施し、Ｏｍｐ２０及びフランキング領域をコードするDNA フラグメントを得た。変性オリゴヌクレオチドER49（配列番号３９）を、このタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列に基づいて企画した（表１，Pep-1 （配列番号１１），aa1-9 ）。
【０１９５】
Omp20 遺伝子のフラグメントのPCR 増幅のために、オリゴヌクレオチドＥＲ４９（配列番号３９）を、１×PCR 緩衝液II（Perkin Elmer）、１．５mMのMgCl2 , 200 μM の個々のデオキシ−NTP, 100p モルの個々のプライマー、及び２．５ＵのAmpliTaq Gold(Perkin Elmer) 熱安定性ポリメラーゼを含む反応物５０μｌにおいて、Vectorette特異的プライマーER70（配列番号４８）と組合して使用した。複数回の単一反応を、DNA 鋳型としてVectoretteライブラリー５μｌを用いて、実施した。増幅は次の通りに実施された：変性（９５℃，９分）；３５サイクルの変性（９５℃，３０秒）；アニーリング（５５℃，１分）；及び重合（７２℃，３分）；続いての最終延長（７２℃，７分）。
【０１９６】
増幅された生成物を、１．２％アガロースゲル（Sigma ）上での分離により可視化した。４３３−bpの生成物は、EcoRI Vectoretteライブラリーの増幅に起因した。フラグメントを、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター（Promega, Madison, WI）中にクローン化し、そして配列決定した。配列の分析は、Ｎ−末端アミノ酸配列（Ｐｅｐ−１）に基づいてOmp20 を部分的にコードするようなフラグメントの同一性を確かめた。
【０１９７】
この部分遺伝子の新しく同定された配列に基づいて、特定のプライマーER67（配列番号４６）及びER68（配列番号４７）を企画し、上記のようなPCR 増幅によるVectoretteライブラリーの第２回目スクリーニングにより、追加の５’及び３’フランキング配列を得た。ER68（配列番号４７）及びER70（配列番号４８）を用いてのPCR によるEcoRI, HindIII, DraI、及びHpaI Vectorette ライブラリーのスクリーニングは、DraI Vectorette ライブラリーからの約６００bpのフラグメントの成功した増幅をもたらした。このフラグメントを、配列決定し、Omp20 遺伝子の３’末端を決定した。
【０１９８】
ユニークな生成物はER67（配列番号４６）及びER70（配列番号４８）を用いてのそれらのライブラリーのスクリーニングの間、観察されなかったので、追加の特定のプライマーER71（配列番号４９）、ER72（配列番号５０）、ER76（配列番号５２）及びER77（配列番号５３）を企画し、ER47結合部位の５’側に位置するDNA フラグメントを得た。多くのVectorette DNAライブラリーからの増幅によるそのような“ゲノムウォーキング（genome walking）”を、ORF の外側の境界、すなわち翻訳開始及び停止コドン及びフランキングヌクレオチド配列が特徴づけられるまで、反復した。一般的に、PCR 生成物は、配列分析の前、直接的にクローン化され、又はpGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化された。
【０１９９】
７．３．Omp27 の分子クローニング
Omp27 のためのVectoretteライブラリーのスクリーニングを、上記Omp20 についての記載のようにして実質的に実施した。但し、精製されたOmp27 タンパク質（表１，Pep-3 （配列番号１３），aa13-24 ）のＮ−末端アミノ酸配列に基づいて企画された変性オリゴヌクレオチドER50（配列番号４０）を使用した。上記のようなVectoretteライブラリーのPCR 増幅に続いて、152-bpのフランキングを、Pep-3 （配列番号１３）のＮ−末端アミノ酸配列に基づいてOmp27 の一部をコードすることを確かめた。
【０２００】
BamH2, BglII, HindIII, EcoRI, HpaI、及びDraI Vectorette ライブラリー及び特定のプライマーER88（配列番号６４）及びER89（配列番号６５）を用いての第２回目のゲノムウォーキングは、DraIライブラリーからの約２kbのフラグメント、及びHindIII ライブラリーからの約１．５kbのフラグメントのPCR 増幅をもたらした。それらのDNA フラグメントを、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化し、それぞれ、Omp27 遺伝子の５’及び３’側のヌクレオチド配列の誘導体化を可能にした。
【０２０１】
７．４．OmpA1 及びOmpA2 の分子クローニング
精製された２９kDa のタンパク質（表１，Pep-4 （配列番号１４））から得られたＮ−末端アミノ酸配列を用いて、APP 染色体DNA からの２９kDa のタンパク質をコードする遺伝子の直接的なPCR 増幅への使用のための変性Ｎ−末端プライマーRA22（配列番号７３）及びRA34（配列番号７７）を企画した。
【０２０２】
Pep-4 の配列を、GenBank タンパク質データベース（Altschulなど., 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-10)に対して、Blastpコンピュータープログラム比較（National Center for Biotechnology Information)を用いて分析し、そして次のいくつかの異なったコ−バクテリアのOmpAタンパク質との相同性を示すことを見出した：パステウレラ・ムルトシタ（Pasteurella multocida ）、Ｐ．ハエモリチカ（P.haemolytica ）、ハエモフィラス・ドクレイ（Haemophilus ducreyi ）、Ｈ．ソムナス（H.somnus）、Ｈ．インフルエンザ（H.influenzae）、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、Ｅ．コリ、シゲラ（Shigella）及びサルモネラ（Salmonella）。パステウレラセアエ（Pasteurellaceae ）からのOmpA−関連タンパク質のＮ−末端配列を一列に並べ、次のコンセンサス配列を生成した：Ala-Pro-Gln-Ala/Glu-Asn-Thr-Phe-Tyr-Ala/Val-Gly-Ala-Lys-Ala （配列番号９４）。
【０２０３】
それらの一列配列を分析し、そしてそれを用いて、いくつかの追加のＮ−末端変性プライマーを企画した。オリゴヌクレオチドプライマーRA53（配列番号８１）、RA54（配列番号８２）、RA55（配列番号８３）、RA56（配列番号８４）及びRA57（配列番号８５）はお互いオーバーラップし、そしてこのコンセンサスペプチドのそれぞれ、aa4-11, aa5-12, aa3-10, aa1-8 、及びaa1-7 をコードする領域に結合するよう企画された。
【０２０４】
他の変性オリゴヌクレオチドプライマーを、OmpA−関連タンパク質のＣ−末端領域の一列配列に従って企画した。この一列配列は、アミノ酸配列Cys-Leu-Ala-Pro-Asp-Arg-Arg-Val-Glu-Ile （配列番号９５）を包含するＣ−末端近くの高く保存された領域を示した。RA49（配列番号７８）及びRA50（配列番号７９）逆方向プライマーを、OmpAのこの領域における負のDNA 鎖に結合せしめるよう企画した。
【０２０５】
それらの逆方向プライマーを、二次元マトリックスに適用し、このマトリックスにおいては、RA49（配列番号７８）及びRA50（配列番号７９）が、組合されたKlen Taq1 及びPfu ポリメラーゼを用いて、HotStart 50 TM管（Molecular Bioproducts Inc., San Diego, CA)において、RA22（配列番号７３）、RA34（配列番号７７）、RA53（配列番号８１）、RA54（配列番号８２）、RA55（配列番号８３）、RA56（配列番号８４）及びRA57（配列番号８５）と、それぞれ対のように組合された。
【０２０６】
次の文献は、“ホットスタート”方法を記載する：D'Aquilaなど., 1991, NuCl, Acids Res. 19 : 3749 ; 及びHortonなど., 1994, Biotechniques 16 : 42-43 。PCR のサイクルプログラムは“タッチダウンPCR ”プロトコートの変法であり、そして次の通りに実施された：変性（９４℃，５分）；３０サイクルの変性（９４℃，３０秒）、アニーリング（５９℃，３０秒の初期サイクル、次に、追加のサイクル当たり−０．１℃）、及び重合（７２℃，１分）；続いての最終延長（７２℃，１５分）。次の文献が“タッチダウンPCR ”プロトコールを記載する：Roux, 1994, BioTechniques, 16 : 812-814 ; 及びHecker and Roux, 1996, BioTechniques 20 : 478-485 。
【０２０７】
生成されるPCR 生成物の中で、約９５０−bpのバンドを、個々が前方向プライマーRA34（配列番号７７）、RA53（配列番号８１）、RA56（配列番号８４）又はRA57（配列番号８５）と対のように組合される場合、RA49（配列番号７８）又はRA50（配列番号７９）のいづれかとの反応から生成した。それらのDNA フラグメントを、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化し、そして配列決定した。それらの配列決定されたフラグメントの分析は、２種の変異体配列の存在を示した。
【０２０８】
RA49（配列番号７８）／RA57（配列番号８５）、及びRA50（配列番号７９）／RA56（配列番号８４）に由来する生成物は、変異体Ａ１を示し、そして部分的にコードされたタンパク質を“OmpA1 ”と命名した。RA50（配列番号７９）／RA34（配列番号７７）、及びRA50（配列番号７９）／RA53（配列番号８１）に由来する生成物は、変異体Ａ２を表わし、そして部分的にコードされたタンパク質を、“OmpA2 ”と命名した。
【０２０９】
２種の類似するが、まだ異なっているOmpA部分DNA 配列を、前記Vectoretteライブラリーの適用によりゲノムウォーキングを通して、完全なORF 及びフランキング５’及び３’配列を含むよう延長した。部分OmpA1 及びOmpA2 DNA 配列の一列配列は、それらの密接に関連する遺伝子配列を区別することができる特定のオリゴヌクレオチドプライマーの企画を可能にした。それぞれ、OmpA1 の５’又は３’領域、すなわちER55（配列番号４１）、ER58（配列番号４２）に対して特異的な、及びOmpA2 、すなわちER59（配列番号４３）、ER62（配列番号４４）に対して特異的な、外側に面する異なったプライマーを用いて、上記のようなVectoretteライブラリーをプローブした。
【０２１０】
約１１００，４００，４５０及び２８０−bpのユニークフラグメントが、それぞれ、ER70（配列番号４８）及び、ER55（配列番号４１）、ER58（配列番号４２）、ER59（配列番号４３）、又はER62（配列番号４４）のいづれかによりプローブされる場合、EcoRI Vectoretteライブラリーから得られた。得られるフラグメントの配列の分析は、OmpA1 及びOmpA2 ORF 両者のエンドポイント及びフランキング領域の決定を可能にした。
【０２１１】
７．５．OmpWの分子クローニング
精製された２３kDa のタンパク質（表１，Pep-2 （配列番号１２））から得られたＮ−末端アミノ酸を用いて、RA20（配列番号７２）、すなわちPep-2 のアミノ酸１−８に対応する変性オリゴヌクレオチドプライマーを企画した。
【０２１２】
精製されたAPP DNA を、“遺伝子ウォーキングPCR ”方法の変法において鋳型として使用した。単一PCR プライマーRA20（配列番号７２）を、組合されたKlen Taq1 （Ab Pentides, Inc., St. Louis, MO) 及びＰｆｕ（Stratagene, Inc., La Jolla, CA) ポリメラーゼとの“ホットスタート”反応に使用した。PCR のためのサイクルプログラムは、“タッチダウンPCR ”プロトコールの変法であり、そして次の通りに実施された：変性（９４℃，５分）；４０サイクルの変性（９４℃，１分）、アニーリング（６３℃，２分の初期サイクル、次に、追加のサイクル当たり−０．２℃及び−２秒）、及び重合（７２℃，１５分）；続いての最終延長（７２℃，１０分）。
【０２１３】
生成される多くのPCR 生成物の中で、約２２０−bpの生成物を得、そしてｐＧＥＭ登録商標−T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化した。このプラスミド挿入体の配列分析は、クローン化されたPCR 生成物が、Ｐｅｐ−２（配列番号１２）のＮ−末端アミノ酸配列に基づいて、２３kDa のタンパク質の一部に対応するアミノ酸をコードしたことを確かめた。
【０２１４】
この新しく同定された配列に基づいて、特定のプライマー、すなわちＲＡ２３（配列番号７４）を、下流の配列の増幅のために生成した。APP 血清型−７  DNA のゲノムミニ−ライブラリーを、Taq a I 又はHinPII（両者とも、５’−ＣＧオーバーハングを創造する）による制限消化により構成した。このDNA をBspDI −切断されたpUC21 又はpUC128中に連結し、そしてＥ．コリDH5 αを形質転換し、ゲノムライブラリーを生成した。
【０２１５】
それらのプラスミド−ホモゲノムライブラリーのMini-prepsを、“ホットスタート”方法を用いて“遺伝子ウォーキングPCR ”における鋳型として使用した。ベクター特異的M13 前方向及びM13 逆方向配列決定プライマーに加えて、その特定のプライマーRA23（配列番号７４）を、組合されたKlen Taq及びPfu ポリメラーゼと共に使用した。PCR のためのサイクルプログラムは次の通りに実施された：変性（９４℃，５分）；３２サイクルの変性（９４℃，３０秒）、アニーリング（６３℃，３０秒の初期サイクル、次にサイクル当たり−０．２℃）、及び重合（７２℃，３０秒）；続いての最終延長（７２℃，７分）。
【０２１６】
生成される多くのPCR 生成物の中で、０．８kbの生成物及び１．４kbの生成物を、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター中にクローン化し、そして配列決定した。その得られる配列、及び上記で得られた配列の分析及び一例配列は、成熟タンパク質の配列を生成した。OmpW遺伝子の５’フランキング領域の配列を得るために、特定のプライマーRA24（配列番号７５）及びRA26（配列番号７６）を、上記のようにして、多くのVectoretteライブラリーをプローブするために使用した。
【０２１７】
増幅を次の通りに実施した：変性（９５℃，９分）；４０サイクルの変性（９５℃，３０秒）、アニーリング（６０℃，１分）及び重合（７２℃，３分）；続いての最終延長（７２℃，７分）。特定の６００及び７００−bpの生成物は、それぞれ、HpaI及びDraI Vectorette ライブラリーのプロービングに起因した。その７００−bpの生成物を、５’−フランキング領域を包含するヌクレオチド配列を得るために直接的に配列決定し、そして２３kDa のタンパク質のＮ−末端をコードしていた。予測されるAPP   ２３kDa タンパク質と予測されるビブリオコレラOmpWタンパク質との間の部分的な類似性のために、APP 遺伝子フラグメントを、“OmpW”と命名した。
【０２１８】
７．６．APP タンパク質をコードする遺伝子の分子分析
７．６．１．DNA の特異的PCR 増幅
上記のように、新規APP タンパク質のクローニング及び予備的な配列決定からの結果を用いて、APP 血清型−７染色体DNA から直接的に、損なわれていないOmp20, Omp27, OmpA1, OmpA2及びOmpW遺伝子の特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーを企画した。このアプローチは、Ｅ．コリにおける遺伝子フラグメントのクローニングの間に生じる可能性ある突然変異のために、配列決定人工物の導入を排除する所望に基づいて選択された。
【０２１９】
従って、上記の損なわれていないAPP 遺伝子を端に有するオリゴヌクレオチドは、染色体DNA からのそれらの領域を特別に増幅するために使用された。個々の遺伝子増幅のために利用される５’及び３’プライマー対は次の通りであった：Omp20 のためには、プライマーはER80（配列番号５６）及びER81（配列番号５７）であり；Omp27 のためには、プライマーはER95（配列番号６９）及びER96（配列番号７０）であり；OmpA1 のためには、プライマーはER84（配列番号６０）及びER86（配列番号６２）であり；OmpA2 のためには、プライマーはER87（配列番号６３）及びER66（配列番号４５）であり；そしてOmpWのためには、プライマーはER82（配列番号５８）及びER83（配列番号５９）である。
【０２２０】
PCR 反応を三重反復して実施し、そしてそれは、２６０ngの精製された染色体DNA ，1 ×PC2 緩衝液（Ab Peptides, Inc.)、２００μＭの個々のｄＮＴＰ，１００ｐモルの個々のプライマー、７．５ＵのKlenTaq1及び０．１５Ｕのクローン化されたＰｆｕ熱安定性ポリメラーゼを、１００μｌの最終サンプル体積において含んだ。増幅のため条件は、変性（９４℃，５分）、続いて３０サイクルの変性（９５℃，３０秒）、アニーリング（６５℃，３０秒）、及び重合（７２℃，２分）から成った。
【０２２１】
最終延長（７２℃，７分）は、標的の損なわれていない遺伝子領域の増幅を完結せしめた。増幅に続いて、三重反復サンプルの個々をプールし、そして特定の生成物を、ABI 自動DNA 配列決定機（Applied Biosystems, Foster City, CA)に基づいてDyeDeoxy終結反応を用いての直接的な配列分析の前、アガロースゲル電気泳動及び回転クロマトグラフィー（QIAquickTM，QIAGEN Inc., Santa Clarita, CA) による抽出により精製した。
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、APP 血清型−７からの増幅された生成物の両DNA 鎖を配列決定した。APP タンパク質遺伝子を配列決定するために使用されるプライマーは、下記表２に示されている。
【０２２２】
Omp20 のORF のヌクレオチド配列は、nt２７２〜７９０の配列番号１に示される。OmpWのORF のヌクレオチド配列は、nt３７６〜１０２３の配列番号３に示される。Omp27 のORF のヌクレオチド配列は、nt１５７〜９３３の配列番号５に示される。OmpA1 のORF のヌクレオチド配列は、nt６１４〜１７０８の配列番号７に示される。OmpA2 のORF のヌクレオチド配列は、nt１９７〜１３０６の配列番号９に示される。
【０２２３】
【表２】
0003699421.tif 000003
【０２２４】
７．６．２．APP 血清型−7 OmpA1 及びOmpA2 タンパク質の類似性
OmpA1 タンパク質（配列番号８）及びOmpA2 タンパク質（配列番号１０）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び９から推定し、そしてそれらの類似性を比較するために一列配列した。推定されるOmpA1 タンパク質は、３６４個の長さのアミノ酸であり、これは推定されるOmpA2 タンパク質よりも５個のアミノ酸が短い。図５に示されるAPP タンパク質の一列配列は、２種のタンパク質が73.1%(270/369)のアミノ酸同一性を共有することを示す。
【０２２５】
７．６．３．ビブリオコレラOmpWとAPP 血清型−7 OmpWとの比較
２３kDa のAPP OmpWタンパク質をコードするORF のヌクレオチド配列（配列番号３）から推定されるアミノ酸配列（配列番号４）は、ビブリオコレラについて記載されるOmpWタンパク質に最とも類似することが決定された（Jalajakumari, M.B., など., 1990, Nucleic Acids Res. 18 (8) : 2180)。それらの２種のタンパク質のアミノ酸配列を、Clustal W(ver 1.4)Multiple Sequence Alignment Algorithm （Thompson, J.D., など., 1994, Nucleic Acids Res., 22 : 4673-4680)を用いて一列配列した。この比較は、それぞれ、２１５及び２１６の長さの残基を有するAPP OmpW及びＶ．コレラが44.9%(97/216) のアミノ酸同一性を共有することを示した。この一列配列されたタンパク質は、図６に示される。
【０２２６】
７．７．サザンブロットハイブリダイゼーション
異なったAPP 血清型間でOmp20, OmpW, Omp27, OmpA1 及びOmpA2 タンパク質をコードするDNA 配列の保存性が、異なった血清型からのAPP DNA に対するプローブとして５種の異なったコード配列の個々を用いてサザンブロットハイブリダイゼーション分析を実施することによって決定された。プローブは、PCR DIG TM Probe Synthesis Kit（Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Indiana) により、製造業者の説明書に従って生成された。たとえば、OmpWプローブは、次の態様で構成された。
【０２２７】
OmpWコード配列を包含するPCR 生成物を、OmpW特異的プライマー、及びAPP 血清型−7 DNA を用いて生成した。APP 血清型−７ゲノムDNA （０．２μｇ）、１μＭのMW3 プライマー（配列番号７１）、１μＭのプライマーＲＡ５２（配列番号８０）、７．５ＵのKlenTaq1ポリメラーゼ（Ab Peptides, Inc.)、０．０７５ＵのPfu ポリメラーゼ（Stratagene）、１×KlenTaq1緩衝液及び０．２mMのdNTPを、５０μｌの体積において組合した。PCR を次の通りに実施した：変性（９４℃，５分）；３５サイクルの変性（９４℃，３０秒）、アニーリング（５８℃，３０秒）及び重合（７２℃，１分）；及び最終延長（７２℃，７分）。
【０２２８】
約６５０−bpのOmpW PCR生成物を、JETsorb TMキット（GENUMED, Inc., Research Triangle Park, NC)を用いて、アガロースゲル電気泳動に従って精製した。精製されたDNA を、Low Mass DNA Ladder TM質量標準（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD ）を用いて定量化した。ジゴキシゲニル−ラベルされたプローブを、製造業者の説明書に従って、PCR DIG TM Probe Synthesis Kitを用いて、上記のようにして生成された２４pgのOmpW PCR生成物のPCR 増幅により生成し、そしてPCR −生成されたプローブを、精製しないで−２０℃で貯蔵した。
【０２２９】
APP 血清型１，２，５，７，８及び９の個々から得られた、ＥｃｏＲＩ−消化されたAPP ゲノムDNA （１．５μｇ）を、アガロースゲル電気泳動により分離した。DNA プロフィールを、製造業者の説明書に従って、TurboblotterTM Kit（Schleicher & Schuell, Inc., Keene, New Hampshire) によるアルカリトランスファーを用いて、Hybond-N  0.45μM のナイロン膜（Amersham, Inc. Cloveland, OH) にトランスファーした。DNA を、自動−架橋説定（１２０mJ／cm2 ）で、StratalinkerTM UV Cross-Linker(Stratagene ）を用いて、ＵＶ照射により前記膜に共有結合せしめた。ブロットを乾燥せしめ、そして室温で貯蔵した。
【０２３０】
ナイロンDNA ブロットを、複数のAPP 血清型におけるプローブ配列の検出のためのハイブリダイゼーションを可能にするためにプローブの存在下でインキュベートした。ブロットを、過剰（０．２ml／cm2 ）の1 ×Prehybridization Solution(GIBCO/BRL ）を用いて、６８℃で２．５時間、プレ−ハイブリダイズした。プローブ−ハイブリダイゼーション溶液を、５００μｌの1 ×Hybridization Solution(GIBCO/BRL) に５．４μｌの精製されていないジゴキシゲニン−ラベルされたプローブを添加し、そして１００℃で１０分間、煮沸することによって調製した。
【０２３１】
プローブを０℃に１分間冷却し、そして次に、十分な1 ×Hybridization Solutionに添加し、合計０．０２５ml／cm2 のブロットを付与した。ブロットを、このプローブ−ハイブリダイゼーション溶液混合物において、６８℃で１６時間、ハイブリダイズせしめた。緊縮洗浄を次の通りに、ブロットに対して実施した：（ｉ）過剰（０．２ml／cm2 ）の2 ×SSC/0.1% SDSによる２５℃で５分間の２回の洗浄；（ii）過剰（０．２ml／cm2 ）の0.1 ×SSC/0.1% SDSによる６８℃で１５分間の２回の洗浄。次に、ブロットを、DIG TM High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 、及びDIG TM Wash and 3lock Buffer Set（Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Indiana) による化学発光法を用いて、製造業者の説明書に従って展開せしめた。
【０２３２】
プローブを、試験されるすべてのAPP 血清型（血清型１，２，５，７，８及び９）におけるDNA によるハイブリダイズされた、Omp20, OmpW, Omp27, OmpA1 、及びOmpA2 に対して上記のようにして生成した。検出されるEcoRI バンドのサイズは、OmpA1 及びOmpA2 に関してすべての血清型を通して同一であったが、しかしOmp20, OmpW 及びOmp27 に関しては保存されなかった。
【０２３３】
個々の血清型においてOmp20 プローブによりハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは次の通りであった：血清型１，２，７及び９は５．８kbのフラグメントを付与し；血清型−５は６．１kbのフラグメントを付与し；血清型−８は５．０kbのフラグメントを付与した。
個々の血清型においてOmpWプローブによりハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは次の通りであった：血清型−１は１．５kbのフラグメントを付与し；血清型−２は１．１kbのフラグメントを付与し；血清型−５は１．０kbのフラグメントを付与し；血清型−７は０．９kbのフラグメントを付与し；血清型−８は１．０５kbのフラグメントを付与し；そして血清型−９は１．２kbのフラグメントを付与した。
【０２３４】
個々の血清型においてOmp27 プローブによりハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは次の通りであった：血清型−１，２及び９は約９．５kbのフラグメントを付与し；血清型−５，７及び８は約１０．５kbのフラグメントを付与した。
OmpA1 プローブによりハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは、すべての血清型において２．３kbであった。０．５５kb及び０．８５kbの弱いハイブリダイズするフラグメントをまた検出した。
OmpA2 プローブによりハイブリダイズされるEcoRI フラグメントのサイズは、すべての血清型において０．８５kbであった。０．５５kb及び２．３kbの弱いハイブリダイズするフラグメントをまた検出した。
【０２３５】
８．例：組換えAPP タンパク質の発現
８．１．宿主株
組換えタンパク質発現のために使用されるＥ．コリ宿主は、Ｅ．コリLW14であった。この株の遺伝子型は、λ-IN(rrnD-rrnE)1galE::Tn10 λC 1857ΔH1bio である。この株は、Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, USA により供給され、そして３０℃でλプロモーターからの発現を阻害する感温性λリプレッサーλC ／８５７を含む。４２℃で、このリプレッサーは不活性化され、そしてλプロモーターからの発現が可能にされ、高レベルの転写及びタンパク質合成が生成される。Ｅ．コリＬＷ１４は、３０℃で増殖された。
【０２３６】
８．２．プラスミド発現ベクター
組換えタンパク質合成のために使用される発現ベクターは、pEA181であり、これは他方では、pEA181KanRBS3 とも称す。このベクターは６．７６６kbのサイズであり、耐カナマイシン性（Kan ）をコードし、そして強いλプロモーターＰL を含む。このベクターは、最適化されたリボソーム−結合部位のすぐ下流にNdeI部位を含む；このNdeI部位の存在は最適な発現のためのタンパク質のMet 開始コドンの正確な配置を可能にする。ベクターはまた、不良に発現されたタンパク質の増強された発現を可能にするためにNS1 リーダー融合タンパク質をコードする。このベクターは、Smith Kline Beecham Pharmaceuticals により供給された（また、アメリカ特許第4,925,799 号及びRosenberg など., 1983, Meth. Enzymol. 101 : 123-138 も参照のこと）。
【０２３７】
５種のAPP タンパク質の個々のコード配列を、Ｍｅｔ開始コドン（ATG ）をオーバーラップするNdeI部位（CATATG）を生成するよう企画された５’特異的プライマー、及びpEA181における3'XbaI部位中へのクローニングのために企画された３’特異的プライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。それぞれのPCR 生成物を、始めに、pGEM登録商標−T Easy PCRクローニングベクター（Promega Corp）中にクローン化し、そして市販のコンピテントＥ．コリDH5 α（MAX Efficiency DH5α Competent Cells, GIBCO/BRL ）を形質転換した。
【０２３８】
PCR 生成物をそれらのプラスミドクローンから、NdeI-XbaI 又はNdeI-SpeI フラグメントとして切り出し、そしてNdeI/XbaI 切断のpEA181をクローン化した。強いλプロモーターＰL の存在のために、pEA181誘導体は、感温性λリプレッサーλC /857の活性によりベクターからの発現を抑制するＥ．コリLW14のみを形質転換することができた。形質転換及びpEA181及びその誘導体を担持する形質転換体の増殖は、３０℃で行なわれた。Ｅ．コリLW14は、凍結されたコンピテント細胞の調製のためのHanahan の方法によりコンピテントにされた（Hanaban, 1985, DNA Cloning : A Practical Approach (Glover, D., ed.) Vol 1, pp. 109-135, IRL Press, Oxford, England) 。
【０２３９】
Ｅ．コリLW14における成熟OmpWの発現に関する困難性のために、増強されたタンパク質合成を可能にするリーダーペプチドを使用した。“保護ペプチド”又は“ｐｐ”と称するこのリーダーペプチドは、Sungなど., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 561-565 ; Sung など., 1987, Meth. Enzymol. 153 : 385-389 ; 及びアメリカ特許第5,460,954 号（それらは引用により本明細書中に組込まれる）からの情報に基づけば、タンパク質加水分解から組換えタンパク質を保護する。
【０２４０】
アミノ酸配列Met-Asn-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Thr-Ser-Arg （配列番号９６）から成る保護ペプチドが、APP コード配列から上流の保護ペプチドコード配列を含むようにPCR プライマーを企画することによって、APP タンパク質の個々のＮ−末端に融合された。そのようなプライマーによる別のAPP コード配列の増殖は、成熟（すなわち、生来のシグナル配列を欠いている）APP タンパク質における最初のアミノ酸に融合されるＮ−末端保護ペプチドをコードする配列を生成した。NdeI部位は、保護ペプチドにおけるMet コドンに位置し、その結果、それはpEA181のNdeI部位中に凍結され得た。
【０２４１】
保護ペプチド−APP タンパク質コード配列の増幅のためのプライマー対は、次の通りであった：OmpWに関しては、MW3 （配列番号７１）及びRA52（配列番号８０）；OmpA1 に関しては、RA78（配列番号８８）及びRA71（配列番号８７）；OmpA2 に関しては、RA78（配列番号８８）及びRA69（配列番号８６）；Omp20 に関しては、ER78（配列番号５４）及びER73（配列番号５１）；及びOmp27 に関しては、ER92（配列番号６７）及びER94（配列番号６８）。
【０２４２】
８．３．組換えタンパク質の発現
それぞれの成熟APP タンパク質OmpA1, OmpA2, Omp20, OmpW 及びOmp27 と共に保護ペプチド融合体をコードするｐＥＡ１８１誘導体を担持するＥ．コリLW14形質転換体を、３０℃でLB Km 50（50μg/mlのカナマイシンスルフェートを含むLuria ブイヨン）において一晩、増殖した。その培養物を、2 × YT K m 50培地（５０μｇ／mlのカナマイシンスルフェートを含む、１．６％トリプトン、１％酵母抽出物、０．５％  NaCl、及び１．２５mMのNaOH溶液）中に１：１００で希釈し、そして３０℃で、Ａ600 が０．８〜１．０になるまで、増殖した。次に、培養物を水浴インキュベーターにおいて４２℃に移し、そして３〜４時間インキュベートした。
【０２４３】
２× YT K m 50培地において増殖し、そしてpp-OmpA1, pp-OmpA2又はpp-OmpW のいづれかを発現する５ｌの発酵物からのＥ．コリLW14形質転換体の湿潤細胞を、遠心分離により収穫した。細胞を0.1Mのトリス−ＨＣｌ（pH８．０）に懸濁し、そして高圧ホモジナイザーにより溶解した。封入体を遠心分離により集め（12,000RCF, 30 分）、そして2 ×RIPA/TET（５：４）により１度又は２度、洗浄した。２×RIPAは、２０mMのトリス（pH７．４）、０．３ＭのNaCl，２．０％のナトリウムデオキシコレート及び２％（ｖ／ｖ）のLgepal CA-630 TM（Sigma ）である。TET は、０．１Ｍのトリス（pH８．０）、５０mMのEDTA及び２％（v/v)Triton X-100を含む。封入体を、５Ｍのグアニジン−塩酸に溶解し、２．５Ｍのグアニジン−塩酸塩において１．４mg／ml以上のタンパク質に調節し、そしてフィルター殺菌した（０．２μｍ）。この調製物を、下記のように、予防接種のために使用した。
【０２４４】
２×YT Km 50培地において増殖され、そしてpp-Omp20を発現する、５ｌの発酵物からのＥ．コリLW14形質転換体の湿潤細胞を、遠心分離により収穫した。細胞を、リゾチームを含む、２５％スクロース−５０mMのトリス-HCl（pH8.0)溶液に懸濁し（５０mlの培養物に関しては、細胞は０．５mlのスクロース緩衝液に分散された；各mlのスクロース緩衝液に関しては、１０mg／mlでのリゾチーム溶液０．１２５mlが添加された）、そして音波処理した。封入体を遠心分離（12,000RCF, 30 分）により集めし、上記のような2 ×RIPA/TETにより洗浄し、遠心分離により再び集め、そしてpH１１での０．１Ｍのグリシン及びZwittergent 3-14(Calbiochem)溶液により洗浄した。pHを７．０に調節し、そして封入体を遠心分離（12,000RCF, 30 分）により集め、3.5Mのグアニジン塩酸塩に溶解し（最終タンパク質濃度、６．３６mg／ml）、そしてフィルター殺菌（０．２μｍ）した。この調製物を、下記のように、予防接種試験のために使用した。
【０２４５】
上記のようにして２×YT Km 50培地において増殖され、そしてpp-Omp27を発現する、１６００mlの発酵物からのＥ．コリLW14形質転換体の湿潤細胞を、遠心分離により収穫した。細胞を、上記のように、リゾチームを含む、２５％スクロース−５０mMのトリス−HCl （pH８．０）溶液に懸濁し、音波処理し、上記のように２×RIPA/TETにより洗浄し、そして遠心分離により集めた。封入体を遠心分離（12,000RCF, 30 分）により集め、５Ｍのグアニジン塩酸塩に溶解し（最終タンパク質濃度、２．４６mg／ml）、そしてフイルター殺菌（０．２μｍ）した。この調製物を、下記のように予防接種試験のために使用した。
【０２４６】
９．例：組換えAPP タンパク質の免疫学的特徴化
９．１．材料及び方法
９．１．１．ウェスターンブロットのためのAPP 完全細胞抗原の調製及び定量化
完全な細菌細胞抗原を、上記セクション６．１．４に記載のようにして調製した。但し、ＨＰ増殖培地を、MM3 培地の代わりに用い、そして細胞を、５mlのDPBSの代わりに１０mlのDPBSに懸濁した。個々の調製物のタンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kit(Pierce) を用いて決定した。手短に言及すると、個々のサンプルを、脱イオン化された、無菌の蒸留水（ddH2 O）により１／１０，１／２０，１／４０及び１／８０に希釈した。BSA （タンパク質標準）を、２００〜８００μｇ／mlの範囲の濃度に希釈した。２０μｌの体積のサンプル又は標準を、９６−ウェルマイクロタイタープレート１〜におけるウェルに三重反復して添加し、そして試薬Ａに１／５０に希釈された試薬Ｂの溶液２００μｌを個々のウェルに添加した。プレートを、３７℃で３０分間インキュベートした。サンプルの吸光度を５６０nmで測定した。個々のサンプルについてのタンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線を用いて、外挿により計算した。
【０２４７】
９．１．２．抗体
ウェスターンブロットのために使用される二次抗体は、アルカリホスファターゼ接合のヤギ抗−ブタIgG(H+L)及びヤギ抗−マウスIgG(H+L)（Kirkegaard and Perry Laboratories)を含んだ。それらの抗体は、ウェスターンブロット分析により、血清又は上清液サンプルにおけるAPP タンパク質−特異的抗体を可視化するために使用された。両抗体を、使用の前、希釈緩衝液（PBS, 0.05% Tween 20.5%脱脂乳粉末）により１／１０００に希釈した。
【０２４８】
９．１．３．予防接種プロトコール
セクション８．３に記載のようにして調製された、組換え的に発現されたタンパク質調製物を、DPBSに希釈し、８０μｇ／mlにし、そして次に、２倍に濃縮されたSEAM-1アジュバント（８０μｇ／mlのQuilA, 16 μg/mlのコレステロール、５％のスクアレン、１％のSpan 85 ，０．１％のビタミンＡアセテート、０．１％のエタノール及び０．０１％の４メロゾール）により１：１に組合した。雄のＣＦ１マウスに、組換えタンパク質１０μｇ，QuilA   １０μｇ及びコレステロール２μｇを含むタンパク質／アジュバント調製物０．２５mlをｓ．ｃ．注射した。負（アジュバント）の対照のグループは、１：１でアジュバントと共混合されたDPBS  ０．２５mlを受けた。マウスは、一時予防接種の後、２０〜２２日で、同じタンパク質調製物により２度目の予防接種を受けた。２度目の予防接種後２週間で、動物をCO2 により麻酔し、そして気管支動脈又は心臓穿刺により採血した。血清を個々の血液サンプルから分離し、そして同じグループ内のマウスからの血清プールを−２０℃で貯蔵した。
【０２４９】
９．１．４．ウェスターンブロット分析
１０μｇのタンパク質に対応する体積のAPP 完全細菌細胞溶解物（APP 血清型１，２，５，７、又は９からの；セクション９．１．１に記載のようにして調製された）を、水と共に混合し、１０μｌの最終体積にし、そして２μｌの５×還元サンプル緩衝液（Pierce）を添加した。類似する態様で、組換えタンパク質（上記セクション８．３を参照のこと）（タンパク質負荷は不定であった）のアリコートをまた調製した。サンプルを１００℃で５分間加熱し、そして全体積を、１４％トリス−グリシンゲル（Novex ）を含む、１．５mmの厚さの１５−ウェルの別々のウェル中に負荷した。予備染色された、広範囲の分子量マーカー（５μｌ／ウェル）（BioRad）がまた、個々のゲルに含まれた。選択されたゲルにおける分離されたタンパク質をクーマシーブルーにより染色した。
【０２５０】
SDS-PAGEにより分離されたタンパク質を、２００mAの一定の電流で、１．５時間、PVDF膜（BioRad）にトランスファーした。ブロットを、（ｉ）ブロッキング緩衝液（５％脱脂乳粉末及びPBS 中、０．０５％  Tween 20）において直接的にインキュベートし；又は（ii）室温で乾燥せしめ、必要まで、−２０℃で凍結貯蔵し、次にメタノールに再水和化し、水によりすすぎ、そして続いて、ブロッキング緩衝液においてインキュベートした。膜を、軽く撹拌しながら、ブロッキング緩衝液（希釈緩衝液としても使用される）において一晩インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、そして希釈された血清又は上清液サンプルを前記膜に添加し、続いて、室温で１時間、インキュベートした。
【０２５１】
試験サンプルの除去の後、膜をPBST（０．０５％のTween 20を含むPBS ）により、それぞれ５〜１０分間、３度洗浄した。アルカリホスファターゼ−接合された抗−ネズミ又は抗−ブタIgG(H+L)抗体を希釈し、洗浄された膜に添加し、そして室温で１時間インキュベートした。膜をPBSTにより洗浄し、そして基質BCIP/NBT（Kirkegaard and Perry Laboratories)を前記膜に添加し、そして軽く撹拌しながら、適切な色の反応が進行するまで、インキュベートした。次に、膜を水によりすすぎ、反応を停止し、そして室温で乾燥せしめた。
【０２５２】
９．２．結果
新規APP タンパク質の抗原性特徴を、次の３種の方法を用いて決定した。第１の方法は、ブタ抗体プローブ、すなわちAPP 血清型−１又は血清型−５、又は血清型−５、続く血清型−７による再攻撃により実験的に感染された動物から得られた回復期ブタ血清又はASC 上清液を、組換え発現されたAPP タンパク質を含むウェスターンブロットにおける免疫学的プローブとして使用した（表３）。第２の方法は、APP 抗原（完全な細菌細胞ペレット）を含むウェスターンブロットをプローブするために組換え発現されたAPP タンパク質により免疫化されたマウスから得られた血清を使用した（表４）。第３の方法は、組換え発現されたAPP タンパク質を含むウェスターンブロットをプローブするために組換え発現されたAPP タンパク質により免疫化されたマウスからの血清を使用した（表６）。個々の方法の結果は、下記に記載される。
【０２５３】
９．２．１．APP 血清型に対して生成されたブタ抗体プローブによる組換えAPP タンパク質の認識
抗体プローブ（血清又はASC 上清液）を、APP 血清型−１、又は血清型−５のいづれかによる実験的な攻撃、又は血清型−５による攻撃、続く血清型−７による再攻撃に続いてブタから得た。血清は、新規APP タンパク質を同定するために使用された（図１〜４）。表３は、ウェスターンブロットによる組換え発現されたAPP タンパク質と抗体プローブとの反応性を要約する。血清型−５による攻撃及び血清型−７による再攻撃に続いて生成されたASC プローブは、OmpW, OmpA1, OmpA2及びOmp20 組換えタンパク質を認識した。ASC プローブは、組換えOmp27 とは免疫学的に反応しなかった。
【０２５４】
対照的に、血清型−１、又は血清型−５により攻撃され、又は血清型−５により攻撃され、続いて血清型−７により再攻撃された動物に由来する血清は、単に、OmpA1 及びOmpA2 組換えタンパク質を認識した。攻撃されていない対照ブタ（No．780 ）から得られたＡＳＣプローブは、組換え発現されたタンパク質のいづれとも反応しなかった。しかしながら、追加の攻撃されていない対照ブタ（No．779 ）は、すべての組換え発現されたタンパク質と反応した。さらに、攻撃されていない対照ブタ（No．1421）からの血清は、OmpA1 及びOmpA2 と反応した。それらの後者の２匹の動物は、APP により潜在的に感染されていると思われた。
【０２５５】
９．２．２．組換えAPP タンパク質に対して生成されたマウス抗血清によるAPP タンパク質の認識
組換え発現されたAPP タンパク質により免疫化されたマウスからの抗血清を、細菌細胞ペレットからのAPP 抗原を含むウェスターンブロットをプローブするために使用した。結果は表４に要約される。組換えpp-OmpW 、又はpp-OmpA1、又はpp-OmpA2により免疫化されたマウスは、特定のAPP タンパク質の予測される分子量と一致する特定のバンドを認識した血清抗体を生成した。しかしながら、組換えOmp20 又はOmp27 のいづれかにより免疫化されたマウスからの血清は、試験されたいづれかの血清型において、特定の生来のタンパク質と特異的に反応しなかった。
【０２５６】
９．２．３．組換えAPP タンパク質に対して生成されたマウス抗血清による組換えAPP タンパク質の認識
組換え発現された新規タンパク質により免疫化されたマウスからの抗血清を、組換えAPP タンパク質を含むウェスターンブロットをプローブするために使用した。結果は表５に要約される。組換えOmpWにより免疫化されたマウスの血清は、GST 又はpp融合タンパク質のいづれかとして、組換えOmpW, OmpA1 及びOmpA2 タンパク質を認識した。組換えOmpA1 又はOmpA2 のいづれかにより免疫化されたマウスからの血清は、OmpA1 及びOmpA2 免疫原と強く反応した。
【０２５７】
組換えOmp20 により免疫化されたマウスからの血清は、組換えOmp20 と強く反応し、そして組換えOmpA1 及びOmpA2 とは、いくらか低く反応した。対照的に、組換えOmp27 により予防接種されたマウスからの血清は、組換えOmp27 を認識しなかったが、しかし組換えOmpA1 及びOmpA2 とは反応した。PBS により予防接種された対照マウスからの血清は、組換えOmpA1 及びOmpA2 とはひじょうに弱く反応し、そして組換えOmpW, Omp20 又はOmp27 を認識しなかった。
【０２５８】
要約すると、APP により実験的に感染されたブタは、OmpW, OmpA1, OmpA2及びOmp20 組換えタンパク質を認識した局部抗体（ASC プローブ）を生成し、ところが血清抗体は、ウェスターンブロットにより示されるように（表３）、組換えOmpA1 及びOmpA2 とは反応した。従って、血清は、ASC プローブよりも、免疫学的反応性に関して、より一層制限されると思われる。血清もASC プローブも、組換え発現されたOmp27 を認識しなかった。Omp27 は、アッセイの変性のために、ウェスターンブロットアッセイにおいては、たぶん認識されない。
【０２５９】
組換えOmpW, OmpA1 及びOmpA2 の免疫学的特徴化は、それらのタンパク質が、血清型１，２，５，７，８及び９に見出される生来のタンパク質（予測される分子量に基づく）を認識し（表４）、そしてそれらのタンパク質の組換え的に誘導された形を認識する（表５）血清抗体を誘発することができ、そして組換えOmp20 がまた認識されることを示す。
【０２６０】
組換えOmp20 又はOmp27 により免疫化されたマウスからの血清を、インビトロ増殖されたAPP 血清型１，２，５，７，８、及び９に由来する完全な細菌細胞抗原を含むウェスターンブロットをプローブするために使用した（表４）。それらの血清は、試験されるAPP 血清型のいづれにおいても、それらの生来の形と一致するバンドを認識しなかった。Omp20 及びOmp27 はたぶん、インビボでのみ発現されるAPP の抗原を表わし、そして従って、実験室において調製された細菌細胞ペレットには存在しないであろう。他方では、それらの２種のタンパク質は、ウェスターンブロット方法により変性されており、そして特定抗体に認識できなくされている。
【０２６１】
【表３】
0003699421.tif 000004
【０２６２】
１：組換えタンパク質の個々は、保護ペプチド（ｐｐ）を含み、生来のシグナル配列を欠いており、そして封入体（ＩＢ）に由来した。
２：１／１２５に希釈された血清、又は１／４に希釈されたＡＳＣプローブが、組換えタンパク質の個々に対して特異的な抗体について試験された。
３：動物は示されるAPP 血清型により攻撃された。動物No．803 及び808 は、血清型−５により攻撃され、感染からの回復を可能にされ、そして次に、血清型−７により再攻撃された。
４：（＋）は示された組換えタンパク質に対応するバンドの存在を示し；（−）は、血清又はASC プローブが特定の組換えタンパク質と反応しなかった事を示す。
５：ＮＤ＝測定されなかった。
【０２６３】
【表４】
0003699421.tif 000005
【０２６４】
１：完全な細菌細胞調製物（レーン、当たり１０μｇ）におけるタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、PVDF膜にトランスファーし、そしてマウス血清（１／５０）によりプローブした。
２：マウスを、組換えAPP タンパク質調製物又はPBS （対照）のいづれかにより２度、s.c.免疫化した。
３：マウス免疫化のために使用されるすべての組換えAPP タンパク質は、溶解された封入体調製物であった。すべてのAPP タンパク質は保護ペプチドを含んだが、但しOmpW-GST融合タンパク質又はpp-OmpW 融合タンパク質のいづれかとして利用されるOmpWを除く。
４：（＋）は動物を免疫化するために使用される組換えタンパク質に対応するバンドの存在を示し；（−）は特定バンドの不在を示す。
【０２６５】
【表５】
0003699421.tif 000006
【０２６６】
１：SDS-PAGEにより分離された組換えタンパク質が、PVDF膜にトランスファーされ、そしてマウス血清（１／５０）によりプローブされた。
２：マウスは、組換えタンパク質調製物又はＰＢＳ（対照）により２度、ｓ．ｃ．免疫化された。
３：SDS-PAGEゲルにおける組換えAPP タンパク質の個々は、保護ペプチド（pp）を含み、そして生来のシグナル配列を欠いた。
４：マウス免疫化のために使用されるすべての組換えAPP タンパク質は、溶解された封入体調製物からであった。すべてのタンパク質は保護ペプチドを含んだが、但しOmpW-GST融合タンパク質又はpp-OmpW 融合タンパク質のいづれかとして利用されるOmpWは除かれ、そしてすべてのタンパク質は生来のシグナル配列を欠いた。
【０２６７】
５：（＋）は、試験血清が特定の組換えタンパク質と反応したことを示し；（−）は、特定のバンドの不在を示し；ＰＢＳ対照に関して、（＋／−）は、それらのバンドが見えたが、しかし免疫化された動物からの血清に比較して、ひじょうに弱いことを示す。（＋＋）はひじょうに強い免疫反応性を示す。
６：ＮＤ＝測定されなかった。
【０２６８】
１０．例：種々の抗原組合せの効能を試験するための動物研究
１０．１．材料及び方法
５０匹の明らかに健康な雑種のブタ（生後、約６．５週）を、APP 疾病又は予防接種の病歴を有さない動物群から得た。動物は、１０匹のブタからそれぞれ成る５つのグループに、同腹子により、又はＡｐｘII細胞溶解性中和抗体力価によりランダムに割当てられた（９８％の動物は、研究の開始の前、≦１：２００の血清中和力価を有した）。ブタは、研究の開始の前、１週間、順化された。
【０２６９】
動物は、生後約７．５週目である１０日目、２mlの適切なワクチン（ｐｐを有し、そしてシグナル配列を有さないAPP タンパク質）又はプラセーボを、筋肉内経路（ＩＭ：左の首の筋肉）により予防接種された。３週間後、動物は、２回目の２mlの用量（ＩＭ：左の首の筋肉）により追加免疫化された。表６は、５つのグループのブタの第１及び第２予防接種のために使用されるワクチンを同定する。
【０２７０】
【表６】
0003699421.tif 000007
【０２７１】
すべてのブタは、予防接種の後、約１時間、嘔吐、うつ病、下痢、運動失調−協調不能、高められた呼吸、及び震えについて観察された。さらに、毎日の観察は、最初及び２回目の予防接種に続いて、３日間行なわれた。直腸温度を、予防接種の１日前、予防接種の直前、予防接種の６時間後及び予防接種の１日後に記載された。
【０２７２】
２回目の予防接種の２週間後、ブタは、非免疫ブタにおいて約５０％の死亡率を引き起こすAPP 血清型−１（ATCC株27088 ）の生存ビルレント培養物により鼻腔内攻撃された。1.5 ×10R7 cfu/ml を含む培養物１．０ml（０．５ml／外鼻孔）の用量が使用された。すべての動物は、１．０ml／５０ポンドの体重の速度で、１ml当たり５０mgのテラゾール、５０mgのキシラジン及び５０mgのケタミンの組合せから成るｉ．ｍ．注射により、攻撃の前、麻酔された。
【０２７３】
１０．２．結果
有意な体温の上昇は、本発明の組換えタンパク質による第１回又は第２回目の予防接種の後、見出されなかった。有意な後−ワクチン部位反応は、すべての他のグループに比較して、市販のワクチンを受けた動物に観察された（表７）。新規のAPP タンパク質のみを受けた動物（グループＣ）は、後−ワクチン部位反応を示さず、そして新規のAPP タンパク質及びApxI/ApxII/OmpA （５）の組合せの第２回目の予防接種を受けた１匹の動物のみが、後−ワクチン部位反応を示した。
【０２７４】
【表７】
0003699421.tif 000008
【０２７５】
新規APP タンパク質及びApxI/ApxII/OmpA （５）のすべてにより予防接種されたグループＡは、市販のワクチンを含めて、いづれの他のグループよりも低い死亡率を有した（30% vs.60%）（表８）。肺損傷の量（％外傷率）はまた、グループＢ，Ｃ及び対照に比較して、グループＡにおいては低かったが、しかし市販のワクチンを受けた動物（グループＤ）において見られる肺損傷には類似した。
【０２７６】
【表８】
0003699421.tif 000009
【０２７７】
それらの結果は、本発明の新規APP タンパク質と毒素抗原との組合せから成るワクチンが異種APP 攻撃に対しての保護を付与することを示しており、この保護は、市販のワクチンの保護に等しいか又は卓越している。
【０２７８】
１１．例：プラスミド及び寄託材料の調製
American Type Culture Collection(ATCC)への寄託のために個々のAPP タンパク質をコードする別々のプラスミド構造体を調製した。個々の構造体は、その生来のシグナル配列と共に、特定のAPP タンパク質をコードする全ORF を含んだ。ORF は、ラクトースプロモーターに対して反対方向に、pCR2.1TopoのＴＡクローニング部位において挿入された。ORF は、下記表９に列挙されるプライマーを用いて、APP 血清型−７ゲノムDNA からのPCR により得られた。宿主細胞及びベクターの両者は、Invitrogen(Carlsbad, CA)から入手できる。５’プライマーはすべて、それぞれのORF のATG 開始コドンで開始する。
上記のようにして調製、そして下記表９に列挙される菌株は、１９９８年１０月１５日、10801 University Blvd, Manassas, VA, 20110, USA のATCCに寄託され、そして下記列挙される受託番号を割り当てられた。
【０２７９】
【表９】
0003699421.tif 000010
【０２８０】
上記に引用されるすべての特許、特許出願及び出版物は、引用により本明細書に組込まれる。
本発明は、記載される特定の態様により範囲を限定されるものではなく、それらの態様は、本発明の個々の観点を単に例示するためのものである。機能的に同等の組成物及び方法は、本発明の範囲内である。
【０２８１】
【配列表】
0003699421.tif 000011
0003699421.tif 000012
0003699421.tif 000013
【０２８２】
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【０２８３】
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【０２８４】
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【０２８５】
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【０２８６】
0003699421.tif 000023
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【０２８７】
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【０２８８】
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【０２８９】
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【０２９０】
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【０２９１】
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【０２９２】
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【０２９３】
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【０２９４】
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【０２９５】
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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aaaaatttgc gaaaaacgac                                               20
【０２９６】
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 16
acttctacat tacttgatac                                               20
【０２９７】
<210> 17
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 17
tccgtatgtc aaagtcgatg                                               20
【０２９８】
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 18
taaacaatca accggtcctg                                               20
【０２９９】
<210> 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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ttaccttgta caacaccgac                                               20
【０３００】
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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aaaagcagta ttagcggcag                                               20
【０３０１】
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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ttgatgtgcc attgccgaac                                               20
【０３０２】
<210> 22
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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gttttaaact ttcagcactg                                               20
【０３０３】
<210> 23
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 23
agttcgtcca tacgttggtg                                               20
【０３０４】
<210> 24
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 24
aatatatctc tatcggtaag                                               20
【０３０５】
<210> 25
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 25
ctaaacctat aatttagatc                                               20
【０３０６】
<210> 26
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 26
tgtttccgca cgacgttgtg                                               20
【０３０７】
<210> 27
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 27
aagtaaacgg ttacacggac                                               20
【０３０８】
<210> 28
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 28
atcaaccgta attcagtaac                                               20
【０３０９】
<210> 29
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 29
atagtcataa cctaattcag                                               20
【０３１０】
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 30
gtatgggtgc aactgactac                                               20
【０３１１】
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 31
aacacgtgcc gctaattcag                                               20
【０３１２】
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 32
tgcttgagct accgctgcag                                               20
【０３１３】
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 33
gcgaaagttg gtcaatcatc                                               20
【０３１４】
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 34
ataacgatca tcgtgaccag                                               20
【０３１５】
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 35
tgcgtctaaa gctgttgctg                                               20
【０３１６】
<210> 36
<211> 20
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 36
atcaagctta aaaccagcag                                               20
【０３１７】
<210> 37
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 37
ctataaatcc tatggtgcag                                               20
【０３１８】
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 38
tgcacctaaa atagttgatg                                               20
【０３１９】
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 39
ggggatccgc dccdgtdggh aatacnttta cngg                               34
【０３２０】
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 40
ggggatccat ytattatwsw aaacataaag tdgcdacnaa tcc                     43
【０３２１】
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 41
ggggatccgt accgcgatct gtgtttttag                                    30
【０３２２】
<210> 42
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 42
ggggatccgg tgctccggca gctaacg                                       27
【０３２３】
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 43
ggggatccat acttacgtgt tttatcatta taacg                              35
【０３２４】
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 44
ggggatccgg tcaaaaccct gcaaacg                                       27
【０３２５】
<210> 45
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 45
tttgcccggg ctcttttatt gatttaagtt act                                33
【０３２６】
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 46
gactaacgca ggaccggttg attg                                          24
【０３２７】
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 47
ggggatccgt gggtgcggaa tatacgcgca g                                  31
【０３２８】
<210> 48
<211> 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 48
caacgtggat ccgaattcaa gcttc                                         25
【０３２９】
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 49
gtcaccgtaa tccataccgt aatg                                          24
【０３３０】
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 50
gattgtttac ctttcacacc gtccac                                        26
【０３３１】
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 51
tcacccggga aaaatatcta gaaacgg                                       27
【０３３２】
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 52
ccgtggtgag atcaacgcct acgcctac                                      28
【０３３３】
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 53
cctttcacac cgtccacttt atattttacc gtggtgag                           38
【０３３４】
<210> 54
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 54
gcgcatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtgcac cggtcggaaa tacctttacc   60
ggcgtagg                                                            68
【０３３５】
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 55
caagactaaa aatgaccggt cgtg                                          24
【０３３６】
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 56
tgaatttacg accacgtaaa tgttt                                         25
【０３３７】
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 57
ctatgtgaaa gcaaaagcgg attgg                                         25
【０３３８】
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 58
ccgtccggtt gtttgactaa cgc                                           23
【０３３９】
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 59
tcgaacaagc acaccagccg gatg                                          24
【０３４０】
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 60
ggcggaatac ggtaactact tattc                                         25
【０３４１】
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 61
cgcataaaaa atgatctaaa ttatagg                                       27
【０３４２】
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 62
ggggaattca acgattttgc ttgc                                          24
【０３４３】
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 63
gaattcttgc tcgtttgaat tagaag                                        26
【０３４４】
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 64
ggtaattttt atatgagagg gactg                                         25
【０３４５】
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 65
caaacagtga tacgctgaaa ttgtc                                         25
【０３４６】
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 66
gcaacacaca taggtattaa tactg                                         25
【０３４７】
<210> 67
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 67
gcgcatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtgccg aaattggatt gggaggagcc   60
cgtgag                                                              66
【０３４８】
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 68
gtattctctc tagaatattc tattttag                                      28
【０３４９】
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 69
gccacatgaa gaattattat ttgagct                                       27
【０３５０】
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 70
acgtgaaaaa taatctcttg ataat                                         25
【０３５１】
<210> 71
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 71
cgccatatga acaccaccac caccaccacc tctcgtcatc aggcgggaga tgtgattttc   60
【０３５２】
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 72
caycargcdg ghgatgtdat ytt                                           23
【０３５３】
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 73
gcdgadccdg araayacdtt yta                                           23
【０３５４】
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 74
accggtacct atatgttaag tg                                            22
【０３５５】
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 75
ataggtaccg gttaaaccaa gc                                            22
【０３５６】
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 76
gttgccgcta ataattcaag acc                                           23
【０３５７】
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 77
aayacnttyt ayccdggngc naa                                           23
【０３５８】
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 78
nacdckdckr tcnggngcna rrca                                          24
【０３５９】
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 79
datytcnacd ckdckrtcng g                                             21
【０３６０】
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 80
cgctctagag attttttaca acaaaaaggg                                    30
【０３６１】
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 81
gmnaayacnt tytaygyngg ngc                                           23
【０３６２】
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 82
aayacnttyt aygynggngc naar                                          24
【０３６３】
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 83
cargmnaaya cnttytaygy ngg                                           23
【０３６４】
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 84
gcnccncarg mnaayacntt yta                                           23
【０３６５】
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 85
cgcgcnccnc argmnaayac ntt                                           23
【０３６６】
<210> 86
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 86
cggtcgactg atttaagtta ctaaaaccc                                     29
【０３６７】
<210> 87
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 87
cggtcgacgg gttactaatt taactttag                                     29
【０３６８】
<210> 88
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 88
gcgtcgacca tatgaacacc accaccacca ccacctctcg tgcgccacaa caaaatactt   60
tytacgc                                                             67
【０３６９】
<210> 89
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 89
atgaaaaatt taacagtttt agcattagca gg                                 32
【０３７０】
<210> 90
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 90
atgaaacata gcaaattcaa attatttaaa tattattt                           38
【０３７１】
<210> 91
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 91
atgaaaaaag cagtattagc ggcagtatta gg                                 32
【０３７２】
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 92
atgaaaaaat cattagttgc tttaacagta ttatcg                             36
【０３７３】
<210> 93
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer<400> 93
atgaaaaaat cattagttgc tttagcagta ttatca                             36
【０３７４】
0003699421.tif 000040
【０３７５】
0003699421.tif 000041
【０３７６】
0003699421.tif 000042
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、APP 血清型−５により攻撃され、そしてAPP 血清型−７により再攻撃されたブタからの（Ａ）血清及び（Ｂ）気管支リンパ節（BLN ）組織外植体上清液に存在する抗体のウェスターンブロットを示す。
【図２】これは、１２種の異なったAPP 血清型からの細菌細胞抗原に対するブタからのBLN 組織外植体上清液に存在する抗体の交差反応性のウェスターンブロット分析を示す。
【図３】これは、低分子量タンパク質に対するブタからのBLN 組織外植体上清液及び細胞ペレット（細胞）に存在する抗体の反応性のウェスターンブロット分析を示す。
【図４】これは、APP 血清型−７に対するブタからの（Ａ）BLN 組織外植体上清液、及び（Ｂ）血清の反応性の電気泳動によるウェスターンブロット分析を示す。
【図５】これは、APP OmpA1 及びAPP OmpA2 タンパク質の推定されるアミノ酸配列の列挙を示す。
【図６】こけは、ビブリオコレラからのOmpWタンパク質及びAPP からのOmpWタンパク質のアミノ酸配列の列挙を示す。
【図１】
0003699421.tif 000043
【図２】
0003699421.tif 000044
【図３】
0003699421.tif 000045
【図４】
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【図５】
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【図６】
0003699421.tif 000048