(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検定用動物として、養殖ヒラメを用いることを特徴とするブリ属魚類の連鎖球菌症ワクチンの検定方法。
【請求項２】
ワクチン投与時点におけるヒラメの魚体の体重が２〜１５ｇ未満である請求項１記載のブリ属魚類の連鎖球菌症ワクチンの検定方法。
【請求項３】
攻撃試験時の試験水槽の水温を２０〜３０℃に設定してなる請求項１又は２に記載のブリ属魚類の連鎖球菌症ワクチンの検定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブリ、カンパチ、ヒラマサなどのブリ属魚類に対するワクチンの安全性および力価の検定を行う方法に関し、特に養殖ブリ属魚類用ワクチンの連鎖球菌症に対するワクチンの力価検定に有効な方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ブリ、カンパチ、ヒラマサなどブリ属魚類に多発する連鎖球菌症は、ラクトコッカス・ガルビアエ（Lactococcus garvieae）の感染によって引き起こされる細菌性感染症であり、上記のような各種ブリ属魚類の養殖現場において、魚体の日齢に関わらず発生し、養殖業者に甚大な経済的被害をもたらせている。
【０００３】
上記ブリ属魚類の連鎖球菌症の予防を目的とするワクチンとしては、ラクトコッカス・ガルビアエの全菌体を用いた経口投与型ワクチンが実用化されている。しかし、現在、国家検定においてワクチンの効力を判定する力価試験法では、哺乳動物用ワクチンにおけるマウス、モルモット等のような適当な実験動物による検定方法がない。このため、毎年春先に外洋で採取される幼魚（モジャコ）を用いてワクチンの力価検定がなされている。そのため、ワクチンの検定が可能な期間が幼魚の捕れる春先から秋口に限定され、ワクチンの検定結果がその年の養殖シーズンに間に合わず、せっかく検定したワクチンを使用できるのが翌年以降になってしまうということがあった。更に、天然の幼魚を用いて検定を行う場合、年毎に採取量や質に大きなばらつきがあることから、検定用に確保した幼魚が多数死亡するなどの事故により、検定が大きく遅れ、やはりその年の養殖シーズンに間に合わない、といった場合もある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような不安定要素の多い天然の幼魚を用いたブリ属魚類用ワクチンの検定方法における問題点に鑑み、時期を選ばず、必要に応じてワクチンの検定が可能な方法を提供せんとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するため、本発明では、検定用動物として天然の幼魚に代えて養殖魚を用いること、更にその養殖魚として、ラコトコッカス・ガルビアエに感受性がある養殖魚を用いること、その場合にラコトコッカス・ガルビアエの感染によりその多くが死亡の転帰を示すこと、また、孵化からの完全養殖法が確率していて病気の発生が少ない養殖魚を用いること、以上により、時期を選ばす必要に応じてブリ属魚類用ワクチンの検定を行うことができるとの着想を得、上記のような全ての要件を満足する検定動物として、陸上飼育による養殖が可能なヒラメを選択することで、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、検定用動物として、養殖ヒラメを用いることを特徴とするブリ属魚類の連鎖球菌症ワクチンの検定方法である。前記ヒラメは、肉食である点及び胃を有している点でブリ属魚類と共通しており、また陸上飼育が可能であることから海洋飼育の養殖魚のような病気の発生が少ないという点で、本発明が目的とするブリ属魚類の検定用動物として好適である。
【０００７】
更に、本発明に係るブリ属魚類のワクチンの検定方法においては、ワクチンの投与による免疫効果を明確に判定するためには、強毒菌攻撃によるヒラメの死亡率をできるだけ高くすることが望ましい。そのため、検定用動物としてのヒラメの魚体の大きさについて、ワクチン投与時点、即ち免疫開始時の魚体の体重が、好ましくは２〜１５ｇ、より好ましくは３〜９ｇ、更に好ましくは４〜７ｇのヒラメを選定するようにした。免疫開始時の魚体の体重が１５ｇより多い場合には死亡率が低下してワクチンの免疫効果が明確でなくなる場合があり、また２ｇより少ない場合には、免疫のための注射が困難である。更に、ヒラメの育成飼育における水温は、通常１０〜２０℃であるが、攻撃試験時の試験水槽の水温は、好ましくは２０〜３０℃、より好ましくは２５〜２８℃、更に好ましくは２５〜２７℃に上昇させるようにした。攻撃試験時の試験水槽の水温が３０℃より高い場合には、ヒラメの育成温域を越えてしまうため飼育が困難となり、２０℃より低い場合には死亡率が低くワクチンの免疫効果が明確にならない場合がある。
【０００８】
【実施例】
［実験１］強毒菌攻撃における通常飼育水温とヒラメの感受性との関係
養殖ヒラメを飼育水温１０℃、１５℃、２０℃又は２５℃で１週間馴致飼育し、体重４〜６ｇとなった時点で、ラクトコッカス・ガルビアエ強毒菌を１０８ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内接種し、生残率を調べた。結果を図１に示す。この結果、飼育水温が２０℃を越えると感染する割合が増加することが確認された。また、図１から明らかなように、試験魚の体重が４〜６ｇであれば、安定した成績が得られた。
【０００９】
［実験２］強毒菌攻撃における飼育温度の変化とヒラメの感受性との関係
平均体重４．２ｇの養殖ヒラメを飼育温度１０℃で１週間馴致飼育し、平均体重６．３ｇとなった時点で、上記実施例１と同じ条件で強毒菌を感染させ、感染直後に飼育温度を５℃、１０℃又は１５℃上昇させ、生残率を調べた。結果を図２に示す。この結果、感染直後に飼育温度を上昇させることにより、感染死亡率が激増し、１０℃以上の急激な水温上昇がある場合には、極めて強い感染を起こし、全例発病して死亡することが確認された。
【００１０】
［実施例１］腹腔内注射によるヒラメの免疫試験
平均体重４．１ｇの養殖ヒラメに０．２％ホルマリン不活化ラクトコッカス・ガルビアエ全菌体を２×１０９ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内注射して免疫し、１５℃の水温で２週間飼育し、平均体重が６．２ｇになった時点で強毒菌を２×１０６〜９ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内注射して感染させ、免疫しないヒラメ（対照群）と免疫したヒラメ（免疫群）との生残率を調べた。その結果、攻撃菌数２×１０８ＣＦＵ／尾において、図３に示すように、危険率Ｐ＜０．０１で免疫群と対照群で有意差が認められた。
【００１１】
［実施例２］経口投与によるヒラメの免疫試験
平均体重４．３ｇの養殖ヒラメに、湿重量１ｇ中にホルマリン不活化ラクトコッカス・ガルビアエ全菌体を２×１０１０ＣＦＵを含有するように調製した人工飼料を０．３ｇ／尾となるように７日間連続して経口投与して免疫し、最終投与の２週間後、平均体重が６．２ｇになった時点で、強毒菌を２×１０６〜９ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内注射して感染させ、免疫しないヒラメ（対照群）と免疫したヒラメ（免疫群）との生残率を調べた。その結果、図４に示すように、危険率Ｐ＜０．０１で免疫群と対照群で有意差が認められた。
【００１２】
［比較例１］腹腔内注射によるブリの免疫試験
平均体重５０ｇのブリの幼魚に実施例１と同様の不活化菌体を５×１０９ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内注射して免疫し、１８〜２３℃の水温で２週間飼育し、平均体重が７２ｇになった時点で強毒菌を２×１０５〜７ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内注射して感染させ、免疫しないブリ（対照群）と免疫したブリ（免疫群）との生残率を調べた。その結果、攻撃菌数２×１０６ＣＦＵ／尾において、図５に示すように、危険率Ｐ＜０．０１で免疫群と対照群で有意差が認められた。
【００１３】
［比較例２］経口投与によるブリの免疫試験
平均体重５０ｇのブリの幼魚に、実施例２と同様に湿重量１ｇ中にホルマリン不活化ラクトコッカス・ガルビアエ全菌体を２×１０１０ＣＦＵを含有するように調製した人工飼料を３．５ｇ／尾となるように７日間連続して経口投与して免疫し、最終投与の２週間後、平均体重が７４ｇになった時点で、強毒菌を２×１０５〜７ＣＦＵ／尾の割合で腹腔内注射して感染させ、免疫しないブリ（対照群）と免疫したブリ（免疫群）との生残率を調べた。その結果、攻撃菌数２×１０６ＣＦＵ／尾において、図６に示すように、危険率Ｐ＜０．０１で免疫群と対照群で有意差が認められた。
【００１４】
［ブリとヒラメにおけるブリ用ラクトコッカスガルビアエワクチンの効果判定と相関］
上記実施例１、２及び比較例１、２の試験成績の相関性を確認するため、攻撃接種菌数と生残数の回帰直線からの傾きの差の検定を行い、２つの回帰直線の傾きには有意な差がないことから、攻撃菌数ｌｏｇ６におけるブリの感染防御試験成績と、攻撃菌数ｌｏｇ８におけるヒラメの感染防御試験成績は相関することが確認された。
【００１５】
また、上記実施例１、２及び比較例１、２の試験成績から、ブリとヒラメにおけるワクチン効果の相関について表１に示した。この結果、腹腔内注射による免疫及び経口投与による免疫のいずれの場合にも、ブリとヒラメとにおけるブリ用ラクトコッカスワクチンの免疫試験成績には高い相関性がみられ、ブリ属魚類の連鎖球菌症ワクチン検定用試験動物としてヒラメを用いることが可能であることが分かった。
【００１６】
【表１】
0003620433.tif 000002
【００１７】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、不安定要素の多い、天然のブリの幼魚を用いた従来のブリ、カンパチ、ヒラマサなどのブリ属魚類に対するワクチンの安全性および力価の検定、特に養殖魚用ワクチンの連鎖球菌症に対するワクチンの力価の検定に際し、陸上飼育による養殖が可能なヒラメを用いることで、時期を選ばず、必要に応じてワクチンの検定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なる飼育水温におけるヒラメの人工感染を示す生残率と攻撃菌注射後日数の関係を示すグラフ。
【図２】異なる変化温度での飼育水温の急激な上昇におけるヒラメの人工感染を示す生残率と攻撃菌注射後日数の関係を示すグラフ。
【図３】ヒラメの腹腔内注射免疫によるブリ用ラクトコッカスワクチンの予防効果を示す生残率と攻撃菌注射後の関係を示すグラフ。
【図４】ヒラメの経口投与によるブリ用ラクトコッカスワクチンの予防効果を示す生残率と攻撃菌注射後の関係を示すグラフ。
【図５】ブリの腹腔内注射免疫によるブリ用ラクトコッカスワクチンの予防効果を示す生残率と攻撃菌注射後の関係を示すグラフ。
【図６】ブリの経口投与によるブリ用ラクトコッカスワクチンの予防効果を示す生残率と攻撃菌注射後の関係を示すグラフ。
【図１】
0003620433.tif 000003
【図２】
0003620433.tif 000004
【図３】
0003620433.tif 000005
【図４】
0003620433.tif 000006
【図５】
0003620433.tif 000007
【図６】
0003620433.tif 000008