(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織特異的に発現する遺伝子に蛍光色素タンパク質遺伝子を連結し、得られる遺伝子複合体を動物に導入してトランスジェニック動物を作製したのち、前記トランスジェニック動物から目的の組織切片を厚さ50〜500μmの範囲で作製し、得られる切片を培養しながら蛍光色素を検出することによって、組織形成過程を観察することを特徴とする、細胞の経時的検出方法。
【請求項２】
組織特異的に発現する遺伝子がT-α-1チューブリン遺伝子又はネスチン遺伝子である請求項1記載の検出方法。
【請求項３】
蛍光色素タンパク質が緑色蛍光タンパク質又は増幅化黄色蛍光タンパク質である請求項1記載の検出方法。
【請求項４】
組織が神経系組織である請求項1記載の検出方法。
【請求項５】
神経系組織が脳原基又は脳皮質である請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
組織特異的に発現する遺伝子に蛍光色素タンパク質遺伝子を連結し、得られる遺伝子複合体を動物に導入してトランスジェニック動物を作製したのち、前記トランスジェニック動物から目的の組織切片を厚さ50〜500μmの範囲で作製し、得られる切片を培養することを特徴とする組織培養方法。
【請求項７】
組織特異的に発現する遺伝子がT-α-1チューブリン遺伝子又はネスチン遺伝子である請求項６記載の培養方法。
【請求項８】
蛍光色素タンパク質が緑色蛍光タンパク質又は増幅化黄色蛍光タンパク質である請求項６記載の培養方法。
【請求項９】
組織が神経系組織である請求項６記載の培養方法。
【請求項１０】
神経系組織が脳原基又は脳皮質である請求項９記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織形成過程における細胞のリアルタイム検出方法及び組織培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の器官・組織の発生を研究するためには種々の手法がある。第一の方法は、発生過程のさまざまな時期に固定した脳を組織学的に解析する方法である。この方法は、切片の写真を言わば「紙芝居」又は「パラパラマンガ」的に見比べることによって発生過程を知るというものである。第二の方法は、一般的な意味での「細胞培養」を用いた手法である。この方法は、細胞の振る舞いを生かしたままで観察することで、発生現象をより動的に把握することが可能となった。第三の方法は、遺伝子に注目した方法である。この方法は、異なる動物種においても似たような発生プランを遂行する同様の遺伝子が存在するという事実に基づいて、単純な又は下等な動物種の発生研究で得られた知見を、遺伝子ノックアウトなどを通じてより高等な動物に応用する方法であり、近年最も重要度の高いものとして考えられている。
【０００３】
しかし、第一の方法では組織の組み立てをある程度再現できるものの、その組み立ての過程を知ることができる時期は、培養後切片を作り、染色するという手続きを経た後である。従って、組み立ての動態を時間的に振り返って観察するこの方法では、実際の「組み立て」の瞬間をリアルタイムに解析することはできない。また、第二の方法は、単一に分散した細胞を培養皿の上で２次元的に育てるというものであるため、ある分子の組織レベルの発現パターンを細胞レベルで解析することが困難である。さらに、第三の方法は、複雑かつ整然とした３次元構造、例えばヒトに代表される哺乳類の脳（特に大脳や小脳などの皮質）の発生メカニズム解析に際しては、そのような構造を持たない下等動物を使用してもヒトとの間で相関関係を有するとは限らない。
【０００４】
従って、組織の形成・組み立てを解析するには、３次元構造を有する培養系の利用が必要である。3次元培養法には、いわゆるスライス（組織）培養という手法が採用されている。この方法は、スライスした組織切片を作製し、その組織中の細胞を、細胞膜に親和性のある生体色素でラベルしておいて、蛍光顕微鏡で観察するというものであり、例えば脳の発生現象、特に細胞の移動や神経突起の伸長を培養下に再現して、それらに関わるとされる生体分子の機能を調べる目的で用いられている。
【０００５】
しかし、この方法はランダムな（細胞タイプに関して非選択的な）ラべリング法を用いているため、ある目的とする細胞種を特異的に識別することが困難である。また、スライスの中で起こる細胞の分化や移動をリアルタイムにとらえることは極めて困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、組織の形成過程をリアルタイムで観察することができる培養方法及び細胞の検出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、組織特異的遺伝子に蛍光色素を発現する遺伝子が連結した遺伝子複合体を保有するトランスジェニック動物由来の組織であってその遺伝子が発現する組織を培養することにより、リアルタイムに組織の形成過程を細胞レベルで観察し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、組織特異的に発現する遺伝子に蛍光色素タンパク質遺伝子を連結し、得られる遺伝子複合体を動物に導入してトランスジェニック動物を作製したのち、前記トランスジェニック動物から目的の組織切片を作製し、得られる切片を培養しながら蛍光色素を検出することを特徴とする、組織形成過程における細胞の検出方法である。
【０００９】
さらに、本発明は、組織特異的に発現する遺伝子に蛍光色素タンパク質遺伝子を連結し、得られる遺伝子複合体を動物に導入してトランスジェニック動物を作製したのち、前記トランスジェニック動物から目的の組織切片を作製し、得られる切片を培養することを特徴とする組織培養方法である。
【００１０】
上記組織特異的に発現する遺伝子としては、T-α-1チューブリン遺伝子又はネスチン遺伝子が挙げられ、蛍光色素タンパク質としては緑色蛍光タンパク質又は増幅化黄色蛍光タンパク質が挙げられる。また、本発明において使用する組織としては、神経系組織、特に脳原基又は脳皮質が好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、検出の対象とする細胞が含まれる組織において、蛍光色素タンパク質が特異的に発現するように遺伝子操作し、その操作された遺伝子を動物に組み込んでトランスジェニック動物（蛍光タンパク質発現トランスジェニック動物）を作製し、その動物（例えば胎仔）からその検出目的である細胞を含む組織を採取し、スライス培養を行うことにより、蛍光を指標に細胞の分化、移動をリアルタイムに観察することを可能にしたものである。本発明の方法は、脳の皮質に代表される複雑かつ規則的な３次元構造組織のダイナミックな「組み立て」を「生きた組織のなか」で解析する新技術であり、脳組織においては皮質形成にかかわる基本的な分子・細胞メカニズムの解明に大きく貢献するとともに、疾患モデル動物との交配を介してヒトにおける病態の追求にも役立つものである。
【００１２】
１．蛍光タンパク質発現トランスジェニック動物の調製
蛍光タンパク質の遺伝子を、特定の細胞において活性化されることがわかっている遺伝子（「X遺伝子」と称する）のDNA転写開始指示領域と人工的に連結し、遺伝子複合体を作製する。これによって、蛍光タンパク質遺伝子の発現がX遺伝子の「スイッチオン」に依存して起こるという基本的な仕掛けができあがる。次いで、この仕掛けを生きている細胞の中で起こすために、細胞に対して上記の人工的遺伝子複合体を動物に導入する。
【００１３】
ここで、X遺伝子は、組織に特異的に発現する遺伝子、すなわち特定の臓器又は組織の特定の領域に位置する特定の細胞種に、しかもその細胞のある発生段階においてのみ発現されるということがわかっているもの（組織特異的遺伝子という）を使用する。従って、外来の蛍光タンパク質遺伝子も、そうしたX遺伝子発現の本来の生体スケジュールどおりに「スイッチオン」となり、蛍光色素タンパク質がつくられ、その結果、特定の細胞が特定の時期に蛍光を発することになる。こうした仕掛けを有する遺伝子複合体導入動物（トランスジェニック動物）から組織材料を取り出して、細胞の蛍光に基づいた細胞の検出をすることができる。
【００１４】
本発明において検出の対象となる細胞は特に限定されるものではなく、任意のものを選択することができる。例えば、脳（大脳、間脳、中脳、小脳、延髄）又は脊髄などの中枢神経系組織由来の細胞、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓などの消化器系組織由来の細胞、心筋、骨格筋などの筋肉系組織由来の細胞、そして精巣、卵巣などの生殖器系組織由来の細胞が挙げられる。
【００１５】
神経系組織（脳原基又は脳皮質）由来細胞としては、例えばニューロン、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞、グリア細胞などが挙げられる。なお、脳原基とは神経組織発生初期（ニューロン産生期）のものを、脳皮質とは神経組織発生後期（ニューロン、グリア細胞によって複雑かつ秩序だった脳の構築が形成されつつある時期）のものをいう。
また、消化器系由来細胞としては、例えば膵臓のインスリン分泌細胞などが挙げられる。さらに、筋肉系組織由来の細胞としては、例えば心筋細胞又は骨格筋細胞などが挙げられる。
【００１６】
上記X遺伝子としては、中枢神経系組織由来の細胞を検出する場合は、例えばニューロン（神経細胞）特異的に発現するT-α-1チューブリン遺伝子（Glosterら, J. Neuroscience 14巻, 7319-7330, 1994）、脳の細胞の源である神経幹細胞に強く発現するネスチン（nestin）遺伝子（Lothian & Lendahl, Eur. J. Neurosci. 9巻, 452-462, 1997）、グリア細胞に特異的に発現するGFAP遺伝子（Zhuoら, Developmental Biology, 187巻, 36-42, 1997）などが挙げられる。
【００１７】
消化器系組織由来の細胞を検出する場合は、インスリン遺伝子（Hanahanら, Nature, 35巻, 112-115, 1985）、ニューロD遺伝子（Miyataら, Genes & Development, 13巻, 1647-1652, 1999）などが挙げられる。
生殖器系組織由来の細胞を検出する場合は、Oct4遺伝子（Andersonら, Development, 126巻, 1655-1664, 1999）などが挙げられる。
【００１８】
蛍光タンパク質としては、緑色に発色する緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein :GFP）、黄色に発色する増幅化黄色蛍光タンパク質（enhanced yellow fluorescent protein ：EYFP)、赤色に発色する赤色蛍光タンパク質（red fluorescent protein :RFP）、青色に発色する青色蛍光タンパク質（blue fluorescent protein :BFP）又はこれらの誘導体が挙げられ、1個又は2個以上（好ましくは２個〜3個）を適宜組み合わせて使用することができる。
なお、各遺伝子は、J. Sambrookらの一般的遺伝子工学的手法（J. Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Press, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に基づいて取得することができる。
【００１９】
上記X遺伝子の種類及び蛍光タンパク質遺伝子の種類は、適宜組み合わせることができる。例えば、あるX遺伝子及び蛍光タンパク質遺伝子を連結した複合体と、他のX遺伝子及び他の蛍光タンパク質遺伝子を連結した別の複合体とを連結して、2組の遺伝子複合体が連結された複合体を作製したり、X遺伝子は1種類であるが蛍光タンパク質を2種類以上連結した複合体を作製することもできる。2種類以上の蛍光タンパク質遺伝子を連結した場合は、各X遺伝子の発現に応じてそれぞれの色が発色するように、それぞれ色の異なるものを使用することが好ましい。例えばネスチン遺伝子には緑色の蛍光色素タンパク質遺伝子を連結し、神経細胞に特異的に発現するチューブリン遺伝子には黄色の蛍光色素タンパク質遺伝子を連結すると、神経組織の発生初期の段階（例えば脳原基段階）では緑色に、発生後期の段階（例えば脳皮質段階）では黄色に発色する過程をリアルタイムに観察することができる。
【００２０】
DNA転写開始指示領域としては、例えばプロモーター、エンハンサー又はこれらの組み合わせが挙げられる。前記遺伝子複合体を保有するベクターとしては、例えばpBluescript(Stratagene社)、pSP72(Promega社)等が挙げられる。いずれの場合にも、遺伝子の選択のためのポジティブ選別用の薬剤耐性遺伝子 (例えばネオマイシン耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子等)を連結させておく。
【００２１】
トランスジェニック動物の対象となる動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタなどの実験動物が挙げられる。
上記遺伝子複合体を動物に導入するには、上記動物の受精卵に注入することが好ましい。その結果、このX遺伝子-蛍光タンパク質遺伝子複合体が受精卵の染色体に組み込まれ、その後の受精卵の分裂に伴って、全身の細胞の染色体に上記遺伝子複合体がコピーされる。
【００２２】
動物への遺伝子の導入は、受精卵に直接 DNAを注入する方法を採用することができる。あるいは、ES細胞は、培養が可能でしかもこの細胞からマウス等を発生させることができるという利点を有しているため、ES 細胞を用いる方法も採用し得る。ES細胞としては、例えばR1系細胞が挙げられる（Nagyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90巻, 8424-8428, 1993）。そして、遺伝子複合体を含む上記ベクター DNAを受精卵に直接注入するか、エレクトロポレーション、リポフェクション法等により ES 細胞に導入し、ネオマイシン、プロマイシン等でポジティブ選別した後、目的の受精卵又はES細胞を得る。上記受精卵又はES細胞を、胚胎盤胞又は８細胞期胚に毛細管等を用いて注入する。その後、胚胎盤胞又は８細胞期胚を直接仮親の卵管に移植するか、一日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラの寄与率が高い動物は、生殖系列の可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配することにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。生殖系列のキメラ動物と正常動物との交配により、ヘテロ接合体動物が得られ、ヘテロ接合体同士の交配によりホモ接合体動物を得ることができる。
【００２３】
２．組織培養
本発明者は、組織構造（例えば脳）の組み立てという３次元的な現象の理解とその応用の必要性を考慮した。そして、組織を単一細胞に分散させて（バラバラにして）細胞を取り出したり集めることなく、組織の中で蛍光タンパクの発現を検出し、細胞がいかにして脳を形成するかを解析するために、上記トランスジェニック動物から、バラバラの細胞ではなく、発生途中の構築を保たせたままの生きた組織を採取し、培養に供する。
【００２４】
トランスジェニック動物から採取した組織を、組織の内部構造を把握できる断面が得られるようスライスにする。スライス切片は、組織の破損を避ける目的から薄すぎず、かつ、培養の際に栄養や酸素の浸透性と蛍光透過性を良くするために厚すぎないことが必要である。本発明においては、50〜500μm、好ましくは50-200μmの範囲でスライス切片を調製する。
【００２５】
切片は、凝固点の低い寒天に組織を包埋した後市販の生体組織スライサーを用いてスライスしてもよく、手製の微小メスによって実体顕微鏡下に非包埋の組織を直接切り分けてもよい。上記方法は、採取組織の発生段階・大きさ・硬度等に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
作製したスライスは、市販の支持体（例えばコラーゲンゲル）を用いてプラスティック培養皿上に保持する。一般的な基本培地（例えばDMEM/F12）に各種組織培養に頻用される添加物を添加し、培養する。添加物としては、胎生期脳細胞の場合は例えばトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、セレニウム等が挙げられる。また、対象に応じてはさらに上皮細胞増殖因子(EGF)や塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を加えて培養することもできる。
培養は、市販のインキュベーターを用いて36〜38℃、好ましくは37℃で２〜10日行う。
【００２７】
３．組織の観察及び細胞の検出
培養期間中、組織について、細胞蛍光装置付きの倒立顕微鏡およびカメラ又はビデオを用いて、経時的観察及び記録を行う。蛍光物質を指標とした細胞の検出をビデオ撮影することにより、その動きを把握することができる。
【００２８】
本発明の方法は、組織をバラバラに細かくする操作をすることなく、統合的に組織レベルで培養し細胞を検出することを可能とするものである。従って、本発明は、ニューロンの分化・移動と、皮質構造の組み立てを組織の中でリアルタイムにとらえることを可能にした点で、意義深いものである。
【００２９】
また、トランスジェニックマウスと病態マウス（例えば「reeler」、「yotari」又は「weaver」などの、失調症状を呈する変異マウス）とを交配させると、蛍光色素遺伝子が組み込まれた病態トランスジェニックマウスを作製することができる。このマウスから得た組織切片の発色動態と正常トランスジェニックマウスから得た組織切片の発色動態とを比較すると、その病態を検出することができる。従って、本発明の方法は、病態を検出するための基礎資料として使用することができるため、ヒトの疾患に関する基礎的データとして有用である。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕脳組織の培養及び解析
(1) トランスジェニックマウスの作製
ニューロン（神経細胞）特異的に発現するタンパク質である増幅化黄色蛍光タンパク質（enhanced yellow fluorescent protein ：EYFP)をコードする遺伝子（Baumannら, J. Histochem. Cytochem, 46巻, 1073-1076, 1998）を制限酵素BamHIで切断し、T-α-1 チューブリンをコードする遺伝子（Glosterら, J. Neuroscience 14巻, 7319-7330, 1994）のプロモーター（予め制限酵素BamHIで切断しておいた）の下流にEYFP遺伝子をつなぎ、EYFPが発現するようにした。また、ニューロンを含めたすべての脳の細胞の源である神経幹細胞に強く発現するnestin遺伝子のエンハンサー下に、増幅化緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein ：EGFP)をコードする遺伝子を連結した。なお、DNAの切断及び連結は、ライゲーションキット（宝酒造社）を用いて行った。その結果、T-α-1- EYFP遺伝子複合体及びnestin-EGFP遺伝子複合体を得た。
【００３１】
次に、得られた遺伝子複合体をマウスの受精卵に注入し、この遺伝子複合体導入受精卵を仮親に移植し飼育した。移植後仮親から誕生したマウスをトランスジェニックマウスとした。本発明においては、T-α-1チューブリン遺伝子のプロモーター下にEYFP遺伝子を連結した遺伝子複合体が導入されたトランスジェニックマウスを「Tα1-EYFPマウス」と呼び、ネスチン遺伝子のエンハンサー下にEGFP遺伝子が連結された遺伝子複合体が導入されたトランスジェニックマウスを「nestin-EGFPマウス」と呼ぶ。
【００３２】
(2) 組織切片の作製及び培養
Tα1-EYFPマウス胎生12日の大脳皮質原基を、手製の微小メス（刃渡り１mm、厚さ50μm）によって実体顕微鏡下に非包埋の脳を直接切り分けて、内部の層構造を見ることができるようにスライスした（200μm厚）。
【００３３】
作製したスライスは、市販のコラーゲンゲルを用いてプラスティック培養皿上に保持した。DMEM/F12基本培地に、胎生期脳細胞用に頻用されるトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、セレニウムを添加し、さらにEGF及びbFGFを加えて、37℃で2日培養した。
【００３４】
(3)組織の観察及び細胞の検出
蛍光装置付きの倒立顕微鏡およびデジタル蛍光カメラを用いて、経時的観察及び記録を行った。その結果、培養開始から2日までの観察において、新しく産生されたニューロンが将来の皮質形成部位に向かって移動している様子が単一細胞レベルで検出された（図１）。
【００３５】
図１において、蛍光を発する細胞が、分化しつつある生きたニューロンである。観察開始日の皮質形成箇所には、分化しているニューロンはほとんど存在しないが、培養期間中に新たなニューロンが発生していること、及びニューロンが写真下側から上側に向けて移動している様子が、生きたままの脳スライスのなかで容易に観察された。この結果は、生体内における本来の分化・移動の挙動と同様の現象を細胞レベルでリアルタイムに検出されたことを意味する。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、組織形成過程における細胞のリアルタイム検出方法及び組織培養方法が提供される。本発明の方法は、ニューロンの分化・移動と、皮質構造の組み立てを組織の中でリアルタイムにとらえることができるため、組織の構造解析の基礎資料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】大脳皮質スライス培養におけるニューロン特異的蛍光色素発現結果を示す写真である。
【図１】
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