(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチトロンビン−ＩＩＩと、アスパラギン酸、酒石酸、リンゴ酸からなる群より選ばれる二塩基酸もしくはその塩と、クエン酸もしくはその塩とを含有することを特徴とするアンチトロンビン−ＩＩＩの液状製剤。
【請求項２】
さらに糖を含有する請求の範囲１に記載の製剤。
【請求項３】
さらに界面活性剤を含有する請求の範囲１に記載の製剤。
【請求項４】
ｐＨが７〜８である請求の範囲１、２および３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
製剤中のアスパラギン酸、酒石酸、リンゴ酸からなる群より選ばれる二塩基酸もしくはその塩、およびクエン酸もしくはその塩の濃度が、それら総量として０．１〜１０ｗ／ｖ％である請求の範囲１、２、３および４のいずれかに記載の製剤。
【請求項６】
ｐＨが９〜１０であることを特徴とするアンチトロンビン−ＩＩＩの液状製剤。
【請求項７】
ｐＨが９．３〜９．８である請求の範囲６に記載の製剤。
【請求項８】
アンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤に安定化剤として、アスパラギン酸、酒石酸、リンゴ酸からなる群より選ばれる二塩基酸もしくはその塩、およびクエン酸もしくはその塩を添加することからなるアンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤の保存安定化方法。
【請求項９】
補助安定化剤として、さらに糖を添加する請求の範囲８に記載の方法。
【請求項１０】
補助安定化剤として、さらに界面活性剤を添加する請求の範囲８に記載の方法。
【請求項１１】
アンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤のｐＨを７〜８に調整する請求の範囲８、９および１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
製剤中のアスパラギン酸、酒石酸、リンゴ酸からなる群より選ばれる二塩基酸もしくはその塩、およびクエン酸もしくはその塩の濃度が、それら総量として０．１〜１０ｗ／ｖ％となるように添加する請求の範囲８、９、１０および１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤のｐＨを９〜１０に調整することからなるアンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤の保存安定化方法。
【請求項１４】
アンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤のｐＨを９．３〜９．８に調整することからなる請求の範囲１３記載の方法。
【請求項１５】
アンチトロンビン−ＩＩＩおよびコハク酸もしくはその塩を含有することを特徴とするアンチトロンビン−ＩＩＩの液状製剤。
【請求項１６】
アンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤に安定化剤としてコハク酸もしくはその塩を添加することからなるアンチトロンビン−ＩＩＩ液状製剤の保存安定化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、長期保存において安定なアンチトロンビン−IIIの液状製剤およびアンチトロンビン−III液状製剤の安定化方法に関する。
背景技術
アンチトロンビン−III（以下、ＡＴ−IIIという。）は血漿中に存在するα2グロブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は65,000〜68,000である。ＡＴ−IIIはプロテアーゼ阻害活性を有しており、トロンビンの凝固活性に対する強い阻害作用、およびその他の血液凝固因子、活性化Ｘ因子、活性化IX因子などに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミンやトリプシンに対する阻害作用があることも報告されている。これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより速やかに進行することが知られている。
このような薬理作用を有するＡＴ−IIIは、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症（ＤＩＣ）の治療を目的として用いられるものである。ところで、ＡＴ−IIIは溶解状態では安定性が悪く、重合化により静注投与における副作用の原因ともなることから、これまで凍結乾燥の態様で製剤化されていた。
一方、液状製剤は、乾燥製剤に比べると使用時における注射用蒸留水への溶解の必要もなく簡便に投与でき、また製造工程で凍結乾燥操作を必要とせず製造上経済的であるなどの利点があるが、上記の如く、ＡＴ−IIIは溶液状態では安定性に劣ることからＡＴ−III液状製剤の実用化は遅れていた。僅かに試薬の分野で、ＡＴ−IIIをヘパリンの共存下、溶液状態で４℃７日間保存可能であったことを確認したにすぎない（特開昭５５−１０３４６３号）。
発明の開示
本発明の目的は、ＡＴ−IIIの溶液状態での安定性を改善し、長期保存が可能で、特に４℃から室温での長期保存において安定であり、かつ投与の簡易なＡＴ−III液状製剤を提供することである。本発明の他の目的は、ＡＴ−III液状製剤の保存安定性を改善する方法を提供することである。
前述の如き従来技術における問題を解消するため本発明者らは、溶液状態でのＡＴ−IIIの安定化について広範な検討を試みてきたところ、安定化剤として有機酸もしくはその塩、糖硫酸エステルまたは界面活性剤を配合することにより、ＡＴ−IIIの溶液状態での安定性が著しく改善され、長期保存においてもＡＴ−IIIが安定であることを見出した。また本発明者らは、ＡＴ−IIIがｐＨ９〜10の溶液中では安定化剤を添加せずとも極めて安定であることを見出した。さらにこのように調製したＡＴ−III液状製剤が、臨床面でも薬理効果および安全性において何ら問題のないことを見出し本発明を完成したものである。特に、ＡＴ−IIIは、注射剤として好ましいｐＨ範囲であるｐＨ７〜８の溶液中では安定性が悪いが、安定化剤として上記化合物を配合することにより、ｐＨ７〜８の溶液中におけるＡＴ−IIIの安定性が著しく改善される。
すなわち本発明は、
(1)ＡＴ−IIIおよび有機酸もしくはその塩を含有することを特徴とするAT−IIIの液状製剤、
(2)ＡＴ−IIIおよび糖硫酸エステルを含有し、ｐＨが７〜１０であることを特徴とするＡＴ−IIIの液状製剤、
(3)ｐＨが９〜１０であることを特徴とするＡＴ−IIIの液状製剤、
(4)ＡＴ−IIIおよび界面活性剤を含有することを特徴とするＡＴ−IIIの液状製剤、
(5)ＡＴ−III液状製剤に安定化剤として有機酸もしくはその塩を添加することからなるＡＴ−III液状製剤の保存安定化方法、
(6)ＡＴ−III液状製剤に安定化剤として糖硫酸エステルを添加し、ｐＨを７〜10に調整することからなるＡＴ−III液状製剤の保存安定化方法、
(7)ＡＴ−III液状製剤をｐＨ９〜１０に調整することからなるＡＴ−III液状製剤の保存安定化方法、並びに
(8)ＡＴ−III液状製剤に界面活性剤を添加することからなるＡＴ−III液状製剤の保存安定化方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＡＴ−III乾燥製剤を溶解して調製した水溶液中のＡＴ−IIIの安定性と本発明の液状製剤中のＡＴ−IIIの安定性とを比較した実験例３の結果を示すグラフである。
１：安定化剤無添加のＡＴ−III乾燥製剤の水溶液の経時安定性。
２：安定化剤として１ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムおよび３ｗ／ｖ％アスパラギン酸ナトリウムを配合したＡＴ−III溶液の経時安定性。
３：安定化剤として１ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムおよび３ｗ／ｖ％酒石酸ナトリウムを配合したＡＴ−III溶液の経時安定性。
４：安定化剤として１ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムおよび３ｗ／ｖ％ＤＬ−リンゴ酸ナトリウムを配合したＡＴ−III溶液の経時安定性。
発明の詳細な説明
（Ｉ）ＡＴ−IIIについて
本発明で使用されるＡＴ−IIIは、ヒト由来のもので医薬として使用できる程度に精製されたものであれば特に制限されるものではなく、例えばヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾された血清などから精製することができる。使用される血液としては、特にＨＢｓ抗原、抗ＨＩＶ抗体に対して陰性であり、ＧＴＰが正常値の２倍以下であるものが好ましい。
血液，血漿からのＡＴ−IIIの精製法としては、例えば特開昭４８−３５０１７号公報（米国特許３８４２０６１号）、特公昭５９−７６９３号公報（米国特許４３４０５８９号）、特開平１−２７５６００号公報（ＥＰ３３９９１９）、ＥＰ５５１０８４に開示の方法等が例示される。
例えば、血漿からクリオプリシピテートを除去した上清の低温エタノール画分IV−１、画分IVまたは画分II＋IIIを、更にヘパリンアフィニティークロマトグラフィーなどの操作を経て精製する方法などが挙げられる。
また、細胞培養法〔例えば、特表昭５７−５００７６８号公報（ＥＰ５３１６５）参照〕、遺伝子工学法〔例えば、特開昭５８−１６２５２９号公報（ＥＰ９０５０５）参照〕などにより調製されるＡＴ−IIIも使用できる。
（II）ＡＴ−IIIの液状製剤
本発明(1)のＡＴ−III液状製剤は、ＡＴ−IIIおよび有機酸もしくはその塩を含有してなる液状製剤であり、好ましくは有機酸が二塩基酸またはクエン酸である液状製剤である。より好ましくは、ＡＴ−III、二塩基酸もしくはその塩、およびクエン酸もしくはその塩を含有してなる液状製剤である。
本発明において有機酸とは、分子内に少なくとも１個、好ましくは１〜３個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する化合物をいう。一塩基酸、二塩基酸、三塩基酸とは、それぞれカルボキシル基を１、２または３個有する化合物をいう。
本発明で使用される有機酸は、脂肪族または芳香族、飽和または不飽和、一塩基酸（モノカルボン酸）、二塩基酸（ジカルボン酸）または三塩基酸（トリカルボン酸）のいずれでもよい。好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは炭素数２〜６のものが挙げられる。一塩基酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などの飽和脂肪族モノカルボン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの一塩基酸のアミノ酸が例示される。二塩基酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などの飽和脂肪族ジカルボン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和脂肪族ジカルボン酸、フタル酸などの芳香族ジカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸などの二塩基酸のアミノ酸、リンゴ酸、酒石酸などの二塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。三塩基酸としては、クエン酸などの三塩基酸のヒドロキシ酸が例示される。好ましくは、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、アスパラギン酸、クエン酸である。
さらに、かかる有機酸は塩の態様をしていてもよい。有機酸の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の有機塩等が例示される。好ましくは、ナトリウム塩である。
本発明で使用される有機酸塩として、より好ましくはリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムである。
有機酸としては、二塩基酸もしくはその塩とクエン酸もしくはその塩とを組合わせて使用することが好ましい。より好ましくは、二塩基酸もしくはその塩とクエン酸塩の組合せである。クエン酸塩としては、例えばクエン酸のナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、クエン酸のマグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩が挙げられる。好ましくは、クエン酸ナトリウムである。
本発明(1)の液状製剤のｐＨは通常ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９であり、より一層好ましくはｐＨ７〜８である。ｐＨ７〜８の製剤は、注射時の疼痛が緩和されるので、注射剤として使用するのに適している。
本発明(1)の製剤は、ｐＨ６〜１０において安定なＡＴ−III液状製剤であり、就中ｐＨ７〜８においてさえも長期保存に安定であることを特徴とするAT−III液状製剤である。
ｐＨの調整は通常の方法で行うことができ、例えば調整剤として水酸化物または適当な緩衝液などを用いて行ってもよい。水酸化物としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が例示される。緩衝液としてはリン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液、トリス緩衝液等が例示される。
本発明(1)のＡＴ−III液状製剤は、ＡＴ−IIIを通常１〜１０００単位／ｍｌ、好ましくは１〜２００単位／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００単位／ｍｌの割合で含有するものである。本明細書においてＡＴ−III １単位とは、正常人血漿１ｍｌ中に含まれるＡＴ−III量に相当するＡＴ−IIIの量をいう。
液状製剤に配合される有機酸もしくはその塩の濃度は、それら総量として、通常０．１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは１〜５ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜３ｗ／ｖ％である。有機酸として、二塩基酸もしくはその塩、およびクエン酸もしくはその塩を配合する場合、二塩基酸もしくはその塩の濃度は、好ましくは１〜５ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜３ｗ／ｖ％であり、クエン酸もしくはその塩の濃度は、好ましくは０．５〜５ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜３ｗ／ｖ％である。
本発明(2)のＡＴ−III液状製剤は、ＡＴ−IIIおよび糖硫酸エステルを含有し、ｐＨが７〜１０であることを特徴とする。
糖硫酸エステルとしては、ヘパリン、デキストラン硫酸等が例示され、好ましくはヘパリンである。
本発明(2)のＡＴ−III液状製剤は、ＡＴ−III １〜１０００単位／ml、好ましくは１０〜１００単位／mlおよびヘパリン１〜１０００単位／ml、好ましくは10〜１００単位／mlを含有する。両者の組成比としてはＡＴ−III １単位当たりヘパリン０．１〜１００単位、好ましくは１〜５単位が例示される。
本発明(2)の液状製剤のｐＨとしては、７〜１０、好ましくは８〜１０が例示される。ｐＨ８〜１０の製剤は、ＡＴ−IIIの溶液中での保存安定性に優れる点で好ましい。ｐＨの調整は通常の方法で行うことができ、例えば上記発明(1)の製剤と同様に水酸化物または緩衝液を用いて行なうことができる。
本発明(2)の製剤には、さらに安定化剤として上記発明(1)の製剤で使用する有機酸またはその塩を配合してもよい。有機酸またはその塩の配合量は上記発明(1)の製剤の説明を参照すればよい。
本発明(3)のＡＴ−III液状製剤はｐＨが９〜１０であることを特徴とする。好ましくはｐＨ９．３〜９．８である。
ｐＨの調整は通常の方法で行うことができ、例えば上記発明(1)の製剤と同様に水酸化物または緩衝液を用いて行うことができる。
本発明(3)のＡＴ−III液状製剤は、ＡＴ−IIIを通常１〜１０００単位／ｍｌ、好ましくは１〜２００単位／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００単位／ｍｌの割合で含有するものである。
本発明(3)の液状製剤は、安定化剤の存在なくしても、長期保存において安定な製剤であるが、さらに安定化剤として上記発明(1)の製剤で使用する有機酸またはその塩（例えばクエン酸、クエン酸塩、アミノ酸）を配合してもよい。有機酸またはその塩の配合量は上記発明(1)の製剤の説明を参照すればよい。
本発明(4)の液状製剤は、ＡＴ−IIIおよび界面活性剤を含有することを特徴とする。界面活性剤の添加により、保存中の不溶性異物の発生を防止することができる。
界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤が好ましく、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば商品名：トウィーン）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（例えば商品名：プルロニック）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば商品名：トリトン）等が例示される。これらの界面活性剤の分子量は２，０００〜２０，０００が好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの脂肪酸としては、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸等の炭素数12〜18の脂肪酸が挙げられる。
好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を使用する。
本発明(4)のＡＴ−III液状製剤は、ＡＴ−IIIを通常１〜１０００単位／ｍｌ、好ましくは１〜２００単位／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００単位／ｍｌの割合で含有する。界面活性剤の濃度は通常０．０１〜１ｗ／ｖ％、好ましくは0.01〜０．１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％である。
本発明の液状製剤の浸透圧は、ヒトおよび動物の生理的条件と同じかもしくはそれに近いことが好ましい。
本発明の液状製剤には、本発明の目的に反しない限りＡＴ−III以外の薬効成分を配合することができる。
また本発明の液状液剤には、本発明の目的に反しない限り、通常液状製剤に用いられる添加剤、例えば等張化剤（ソルビトール、マンニトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グルコース、塩化ナトリウム等）、防腐殺菌剤（塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキセノール、クロルクレゾール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノール等）、キレート剤（エデト酸ナトリウム、縮合リン酸ナトリウム等）、粘稠剤（ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム等）等を通常使用される添加量で配合することが出来る。
本発明の液状製剤には、さらに補助安定化剤として糖を添加してもよい。本発明で使用される糖としては、例えば単糖類、二糖類、糖アルコール、アミノ糖等が挙げられる。単糖類としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、イノシトール等が、二糖類としてはサッカロース、ラクトース、マルトース等が、また糖アルコールとしてはマンニトール、ソルビトール、キシリトール等が例示される。またアミノ糖としては、グルコサミンおよびアミノ糖誘導体であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどが例示される。
好ましくは、サッカロース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、マルトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンニトールである。
糖を配合する場合、その濃度は通常０．１〜４０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは５〜１０ｗ／ｖ％である。
本発明(1)〜(3)の液状製剤には、補助安定化剤として界面活性剤をさらに添加してもよい。界面活性剤の添加により、保存中の不溶製異物の発生を防止することができる。界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤が好ましく、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば商品名：トウィーン）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（例えば商品名：プルロニック）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば商品名：トリトン）等が例示される。これらの界面活性剤の分子量は２，０００〜２０，０００が好ましい。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの脂肪酸としては、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸等の炭素数１２〜１８の脂肪酸が挙げられる。
界面活性剤を配合する場合、その濃度は通常０．０１〜１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０１〜０．１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０２〜０．０５ｗ／ｖ％である。
また、本発明の液状製剤には、さらにその他の安定化剤を配合することもできる。例えば、無機塩、アルブミン、アプロチニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはその塩などが挙げられる。
無機塩としては特に限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム等が例示される。
本発明の液状製剤としては、ＡＴ−IIIが他の成分と共に水中に溶解された態様であれば特に制限されるものではなく、例えば注射剤、点滴剤などの態様のものが例示される。溶解させる水としては、例えば注射用蒸留水、滅菌精製水等が例示される。
本発明の液状製剤は、液剤の種類に応じ、自体既知の手段を用いて調製することができる。また所望により加熱処理、除菌濾過などの処理を施すことができる。
このようにして調製された本発明液状製剤は、通常４℃〜室温において長期保存が可能である。通常１０℃以下で少なくとも２年間、室温で少なくとも６カ月間の保存が可能である。好ましくは１０℃以下での保存である。
本発明のＡＴ−III液状製剤は、通常２５℃で少なくとも６カ月間、より好ましくは４℃で少なくとも３年間保存した後でも、製剤調製時におけるＡＴ−III活性の少なくとも８０％、好ましくは９０％以上保持する。
本発明の液状製剤は、先天性ＡＴ−III欠乏に起因する血栓形成傾向およびＡＴ−III低下を伴う汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療に有用である。
本剤の投与方法は、従来のＡＴ−III注射剤もしくは点滴剤の処方に準じることができ、例えば、本発明液状製剤を緩徐に静注もしくは点滴静注する方法が挙げられる。
通常、本発明製剤は１日１，０００〜３，０００単位（又２０〜６０単位／kg）の割合で投与されるが、かかる投与量は年齢、体重、症状などにより適宜増減してもよい。
なお、産科的、外科的ＤＩＣなどで緊急処置として本剤を使用する場合は、１日１回４０〜６０単位／ｋｇを投与することが好ましい。
発明の効果
ＡＴ−IIIと安定化剤（有機酸もしくはその塩、糖硫酸エステルまたは界面活性剤）を配合してなる本発明のＡＴ−III液状製剤によれば、加熱処理時および長期保存時におけるＡＴ−III活性の低下、重合化を防止することができる。
また本発明によれば、従来製剤ではＡＴ−IIIの活性維持が困難であったｐＨ７〜８においてさえも、長期にわたり液状のままでＡＴ−IIIを安定に維持することができる。
さらにｐＨ９〜１０の範囲にある本発明のＡＴ−III液状製剤によれば、安定化剤の存在なくしても加熱処理時および長期保存時におけるＡＴ−III活性の低下、重合化を防止することができる。
本発明の製剤は、長期保存においてもＡＴ−IIIを安定に保持する液状製剤である。このため、本発明の液状製剤はそのまま商品（注射剤など）として提供することができる。従って、使用に際して用時溶解することなく、そのまま注射剤等として患者に投与することができるため、投与時の操作が簡略化でき臨床使用上有用である。また製造工程において、凍結乾燥工程を省くことができるため、製造の効率化、および経済化を図ることができる。
実施例
次に、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでない。
実施例１
ＡＴ−III ５００単位、リンゴ酸ナトリウム２５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５０ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例２
ＡＴ−III ５００単位、酒石酸ナトリウム２５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム50ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例３
ＡＴ−III ５００単位、アスパラギン酸ナトリウム２５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５０ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例４
ＡＴ−III ５００単位、アスパラギン酸ナトリウム２５０ｍｇを注射用水５mlに溶解し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例５
ＡＴ−III ５００単位、リンゴ酸ナトリウム２５０ｍｇ、ソルビトール１５０ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解し、ｐＨを８．０に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例６
ＡＴ−III ５００単位、リンゴ酸ナトリウム２５０ｍｇ、ソルビトール２５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５０ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解し、ｐＨを７．０に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例７
ＡＴ−III（乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）５００単位およびヘパリン１０００単位を適量の注射用水に溶解して全量を２０ｍｌとした。pHを８に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例８
ＡＴ−III ５００単位、塩化ナトリウム５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５２mg、マンニトール２００ｍｇおよびヘパリン５００単位を注射用水２０ｍｌに溶解し、ｐＨを８に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例９
ＡＴ−III（乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）５００単位を注射用蒸留水２０ｍｌに溶解して、ｐＨを９に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１０
ＡＴ−III（乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）５００単位を注射用蒸留水２０ｍｌに溶解して、ｐＨを１０に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１１
ＡＴ−III（乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）５００単位、サッカロース２００ｍｇを注射用水１００ｍｌに溶解して、ｐＨを９．３に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１２
ＡＴ−III（乾燥製剤、商品名ノイアート、ミドリ十字社製）５００単位、マンニトール５０ｍｇ、クエン酸ナトリウム５０ｍｇを注射用水１０ｍｌに溶解して、ｐＨを９．８に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１３
ＡＴ−III ５００単位、クエン酸ナトリウム２５０ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解して、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１４
ＡＴ−III ５００単位、クエン酸ナトリウム２５０ｍｇ、サッカロース５００ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解して、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１５
ＡＴ−III ５００単位、クエン酸ナトリウム２５０ｍｇ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ６８）２ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解して、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
実施例１６
ＡＴ−III ５００単位、リンゴ酸ナトリウム１５０ｍｇ、クエン酸１５０ｍｇ、サッカロース２５０ｍｇ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ６８）０．５ｍｇを注射用水５ｍｌに溶解して、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤とした。
以下の実験例において、本発明のＡＴ−III液状製剤中のＡＴ−IIIの安定性を調べた。
なお、ＡＴ−IIIの安定性は、残存するＡＴ−III活性および／またはＡＴ−IIIの重合化の割合から評価した。なお、以下に述べるように、ＡＴ−III活性はＡＴ−III活性測定キット（テストチームＡＴ−III・２キット：第一化学薬品製）を用いて測定し、ＡＴ−IIIの重合化の割合はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析によって測定した。
（１）ＡＴ−III活性の測定
検体希釈液５０μｌ〔２．４Ｕ／ｍｌヘパリン，４０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液，０．１４Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．４）中〕をチューブに採り、ヒトトロンビン溶液〔０．９％塩化ナトリウム、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．０５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）6000中、１Ｕ／ｍｌトロンビン含有）１００μｌを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした後、合成基質液（Ｓ−２２３８：ＨＤ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩）１００μｌを加え、さらに３７℃で５分間インキュベートした。発色後、クエン酸溶液を１ｍｌ加えて反応を停止させ、分光光度計で波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。測定検体と同時に正常ヒト血漿（１Ｕ  ＡＴ−III／ｍｌ）を測定し、その検量線から検体のＡＴ−III含量を測定した。
（２）ＨＰＬＣ分析
Ｇ３，０００ＳＷXLカラム（東ソー社製）を０．３Ｍ  ＮａＣｌ加０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した後、流速０．７ｍｌ／分で測定を行った。
実験例１
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III力価：８０．４Ｕ／ｍｌ、０．５％クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、８．０、８．５または９．０）に５ｗ／ｖ％アスパラギン酸ナトリウムおよび１ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムを配合して、ｐＨ7.5〜９．０で５５℃で３０分間加熱処理を行い、ＡＴ−III活性の残存率を測定した。結果を表１に示す。表中コントロールは加熱処理前の試料をさし、そのＡＴ−III活性（力価）７０．２Ｕ／ｍｌを１００％として各試料中のＡＴ−III活性の残存率を求めた。
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ｐＨ７．５〜９でＡＴ−III活性は９９．９％以上の残存率を示し、いずれも安定であった。
実験例２
各種安定化剤（アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ＤＬ−リンゴ酸ナトリウム）を３ｗ／ｖ％もしくは５ｗ／ｖ％配合するＡＴ−III溶液（ＡＴ−III力価：８０．４Ｕ／ｍｌ、ｐＨ７．５）を調製し、それぞれについて５５℃、１〜１０時間加熱におけるＡＴ−IIIの安定性を経時的に測定して、比較検討を行った。結果を表２に示す。
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実験例３
精製ＡＴ−III溶液（１．０％クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、ＡＴ−III力価：８５．９Ｕ／ｍｌ）にアスパラギン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ＤＬ−リンゴ酸ナトリウムをそれぞれ３ｗ／ｖ％ずつ配合して、それぞれについて５５℃、１〜１０時間加熱におけるＡＴ−IIIの安定性を経時的に測定して、比較検討を行った。また比較対照として市販のＡＴ−III乾燥製剤の水溶液（0.25％塩化ナトリウム，０．２６％クエン酸ナトリウム，１％マンニトール）について同様にＡＴ−IIIの安定性を調べた。結果を表３および図１に示す。
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ＡＴ−III乾燥製剤の水溶液では、ＡＴ−IIIは５５℃、１時間の加熱で１８％まで失活するのに対して、安定化剤を配合した溶液では、ＡＴ−III活性が約７０〜１００％も残存していた。特に１ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムおよび３ｗ／ｖ％ＤＬ−リンゴ酸ナトリウムを配合した場合は、５５℃、１０時間加熱においてもＡＴ−III活性が８０％以上も残存しており、従来品（乾燥製剤）の水溶液）より約６０倍以上も安定化効果が高まっていた。
実験例４
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III力価：１１３．４Ｕ／ｍｌ）にリンゴ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび各種の糖を配合したものを、ｐＨ７．５に調整して５５℃で１０時間の加熱処理を行い、加熱処理後のＡＴ−III活性の残存率を測定することにより、糖の併用効果を調べた。結果を表４に示す。加熱処理前の試料のＡＴ−III活性（力価）１１３．４Ｕ／ｍｌを１００％として各試料中のＡＴ−III活性の残存率を求めた。
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実験例５
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III力価：８５．９Ｕ／ｍｌ，ｐＨ７．５）に０．５ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムおよび各種安定化剤（アスパラギン酸ナトリウム，グルタミン酸ナトリウム，酒石酸ナトリウム、ＤＬ−リンゴ酸ナトリウム、グリシンまたは酢酸ナトリウム）を添加し、それぞれを５５℃で１〜１０時間加熱処理した。各種安定化剤および０．５ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムのＡＴ−IIIに対する安定化効果をＨＰＬＣ分析を用いて重合物の生成度を測定することによって調べた。結果を表５に示す。
なお、表中の記号は生成した重合物の含量が、◎：重合物２％未満、○：重合物２〜５％、▲：重合物５〜１０％、×：重合物１０％以上であったことを示す。
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安定化剤として二塩基酸とクエン酸とを組合わせて使用した場合、ＡＴ−IIIの重合化が抑制され、高い安定化効果が認められた。
実験例６
ｐＨ７．５のＡＴ−III溶液に安定化剤として３ｗ／ｖ％アスパラギン酸ナトリウム、３ｗ／ｖ％酒石酸ナトリウムまたは３ｗ／ｖ％リンゴ酸ナトリウムを配合した検体を調製して、それぞれ５５℃で１〜１０時間加熱処理した後、ＡＴ−III力価の残存量を調べた。
その結果、安定化剤無添加のＡＴ−III溶液に比して、３ｗ／ｖ％リンゴ酸ナトリウム、３ｗ／ｖ％酒石酸ナトリウム、３ｗ／ｖ％アスパラギン酸ナトリウムの順で高いＡＴ−IIIに対する安定化効果が認められた。
実験例７
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III力価：１２５．１Ｕ，ｐＨ７．５）にリンゴ酸ナトリウムおよび各種安定化剤（グリシン、ソルビトール、クエン酸ナトリウム）を添加した検体（表６参照）を作成して、それぞれ２５℃で６か月間保存した。６か月後、検体中のＡＴ−III活性の残存率を測定した。結果を表６に示す。
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実験例８
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III １００Ｕ／ｍｌ）に３．５ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムを添加し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤を調製した。この製剤を４０℃で１週間、または２５℃で１カ月保存した後、ＡＴ−III活性を測定し、活性残存率を求めた。結果を表７に示す。
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実験例９
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III １００Ｕ／ｍｌ）に表８に記載の安定化剤を添加し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤を調製した。これらの製剤を40℃で１週間保存した後、ＡＴ−III活性を測定し、活性残存率を求めた。結果を表８に示す。
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実験例１０
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III １００Ｕ／ｍｌ）に表９に記載の安定化剤を添加し、ｐＨを７．５に調整してＡＴ−III液状製剤を調製した。これらの製剤を４℃または２５℃で１カ月保存した後、ＡＴ−III活性を測定し、活性残存率を求めた。結果を表９に示す。
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実験例１１
ＡＴ−III溶液（ＡＴ−III １１０Ｕ／ｍｌ）に３ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウムおよび３ｗ／ｖ％リンゴ酸ナトリウムを添加し、ｐＨを７．５に調整した。ここにポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名プルロニックＰＦ６８）またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商品名Tween 80、和光純薬社製）０．０１〜０．０４ｗ／ｖ％を添加してＡＴ−III液状製剤を調製した。これらの製剤を１２５ｒｐｍで２５℃、４８時間振とうした後、ＡＴ−III残存活性の測定および不溶性異物について肉眼観察を行った。結果を表１０に示す。表中の記号は、＋＋：不溶性異物が観察された、±：不溶性異物がわずかに観察された、−：不溶性異物が観察されなかったことを示す。
界面活性剤の添加により不溶性異物の発生が抑制された。
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実験例１２
液状製剤へのヘパリンの添加量と安定性の関係を調べた。
ＡＴ−III濃度１０Ｕ／ｍｌと、ヘパリン０〜５００Ｕ／ｍｌ、ｐＨ７〜７．５の条件下で６０℃１０分間の加熱処理を行った。ヘパリン無添加および０．５Ｕ／ｍｌ存在下ではＡＴ−III活性残存率は共に５％程度であったが、５Ｕ／ml、５０Ｕ／ｍｌおよび５００Ｕ／ｍｌ存在下では１８％、４５％および９４％であり、ヘパリン量が多くなるほどＡＴ−IIIの安定化傾向が認められた。
実験例１３
本発明のＡＴ−III液状製剤のｐＨと製剤中のＡＴ−IIIの安定性との関係を調べた。
ｐＨ６、７、８、９および１０に調整したＡＴ−III液状製剤（ＡＴ−III力価：２５単位／ｍｌ）をそれぞれ用意し、各々５０℃で３０分間加熱処理した。その後各ＡＴ−III液状製剤のＡＴ−III活性残存率を調べて、加熱処理に対するＡＴ−IIIの安定性を比較した。
その結果、ｐＨ６のＡＴ−III液状製剤ではＡＴ−IIIは非常に不安定であった。しかし、ｐＨが７、８、９及び１０の液状製剤においては、そのＡＴ−III活性残存率は５２％、７５％、８８％及び９２％とｐＨが９〜１０の範囲で高くなるほどＡＴ−IIIが極めて安定であることが確認された。
実験例１４
実験例１３の方法に準じて、各ｐＨに調整したＡＴ−III液状製剤（AT−III力価：２５単位／ｍｌ）を５５℃で３０分間加熱処理して、その後各ＡＴ−III液状製剤のＡＴ−III活性残存率を調べた。
その結果、ｐＨ６においてＡＴ−IIIは非常に不安定であった。しかし、ｐＨが７、８、９及び１０と高くなるにつれて、ＡＴ−III活性残存率も２４％、45％、６９％、及び８４％と多くなり、ｐＨが９〜１０の範囲でＡＴ−IIIが安定であることが確認された。
参考例
コーンの冷エタノール分画法で得られた画分IV−１のペースト１０ｋｇを生理食塩水１００ｌに懸濁し、硫酸バリウムを５ｗ／ｖ％になるように加え、室温で３０分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸着させて除去した。この上清液をｐＨ６．５に調整し、ポリエチレングリコール＃４，０００を１３ｗ／ｖ％となるように加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチレングリコール＃４，０００を３０ｗ／ｖ％になるように加え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷生理食塩水約２０ｌに溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファロースのカラムに注入し、ＡＴ−IIIをカラムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる部分を回収した。
このＡＴ−IIIの水溶液にクエン酸ナトリウムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐＨ７．８に調整した後、６０℃で１０時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウム（最終濃度３Ｍ）およびクエン酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）を添加し、pH７．５に調整した。一方、３Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したブチル型ポリビニル系担体（ブチルトヨパール６５０、東洋曹達（株）製）にＡＴ−III含有水溶液を接触させたのちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回収した。続いて０．５％クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に対して一夜透析を行い精製ＡＴ−IIIを得た。
【図１】
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