(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
図３により規定されたＶＣＡＭ１を発現する白血球及び内皮細胞の付着を、それらを含むシステムにおいて阻止する方法であって、ＶＬＡ−４と結合する抗体をシステム中へ導入するステップからなる阻止方法に使用される阻止剤。
【請求項２】
ＶＬＡ−４と結合する抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の阻止剤。
【請求項３】
抗体がＶＬＡ−４のα４サブユニットと結合する請求項１又は２に記載の阻止剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、炎症の際の内皮細胞に対する白血球の付着に関与する分子、およびこれらを発現に際しコードするＤＮＡ配列に関するものである。より詳細には本発明は、ＥＬＡＭ１並びに血管細胞付着分子１および１ｂ（ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ）を包含する内皮細胞付着分子（ＥＬＡＭ）に関するものである。さらに本発明は、内皮細胞に対する白血球付着に関与する白血球の表面における分子（ＭＩＬＡ）に関するものである。これらはＣＤＸ、すなわちＥＬＡＭ１付着経路に関与する分子、並びにＶＬＡ４、すなわちＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのリガンドを包含する。さらに本発明は、これら付着分子を認識する抗体、並びにこれら抗体と付着分子のためのリガンドもしくはリセプタとの両者を認識する抗−イディオタイプ抗体に関するものである。さらに本発明は、この種の付着分子のためのｍＲＮＡに対し相補的なアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ分子に関し、さらにこの種の分子のためのｍＲＮＡを認識するリボチームに関する。さらに本発明は、たとえば内皮細胞に対する白血球付着を検出し或いは阻止するための診断剤および治療剤を開発する際の上記分子、ＤＮＡ配列、抗体、抗−イディオタイプ抗体、アンチセンス分子およびリボチームの使用方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
炎症は、感染もしくは外傷に対する血管組織の反応である。臨床上、これは４種類の徴候を伴う：すなわち発赤、発熱、疼痛および浮腫。その経過は急性もしくは慢性のいずれかである。
【０００３】
細胞レベルにて、炎症は血管の内皮壁に対する白血球の付着および周囲組織中へのその浸潤を伴う［ハーラン、1985］。急性炎症は多形核白血球（ＰＭＮ）の付着および浸潤を特徴とする［ハーラン、1987並びにマレヒおよびガリン、1987］。組織内のＰＭＮ蓄積は炎症刺戟の2.5 〜4 時間後にそのピークに達し、約28時間で止まる［ベビラッカおよびギンブロン、1987］。これに対し、慢性炎症は他の白血球、特に単核細胞およびリンパ球の付着および、浸潤を特徴とする。
【０００４】
一般的な炎症において、浸潤性白血球は侵入生物もしくは死滅細胞を食菌すると共に、組織修復および免疫反応に役割を演ずる。しかしながら病理学的炎症においては、浸潤性白血球が重大かつしばしば致命的な損傷をもたらしうる。関節リウマチ症およびアテローム性硬化症が慢性炎症病の例であり、単核白血球が組織に浸潤して損傷をもたらす［フーおよびソコロフ、1985並びにロス、1986］。多器官不全症候群、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）および虚血性再灌流障害は急性炎症であって、浸潤性ＰＭＮが損傷をもたらす［ハーラン、1987並びにマレヒおよびガリン、1987］。たとえば重症火傷に伴うショックを受けた後に生じうる多器官不全症候群においては、ＰＭＮ媒介の損傷が外傷を悪化させる。ＡＲＤＳにおいては、ＰＭＮが肺に液体を充満させて犠牲者を溺死させることがある。血液の供給が遮断された組織に突然に血液が灌流された際に生ずる虚血性再灌流障害（たとえば心臓発作または脚部再結合の後）において、ＰＭＮ付着は重大な組織損傷をもたらす［ハーラン、1987］。
【０００５】
白血球浸潤が多くの炎症関連病理学の原因であり、かつ白血球付着が浸潤の第１過程であることを認識して、最近研究者は内皮細胞表面に結合する白血球のメカニズムに注意を集中している。研究が示したところでは、結合はリセプタおよびリガンドとして作用する内皮細胞と白血球との両者における細胞表面分子により媒介される［ハーラン等、1987；ダナ等、1986；およびベビラッカ等、1987ａ］。
【０００６】
炎症の経過に際し、或る種の炎症剤は白血球に対し作用して、これらを内皮に対し高付着性にする。公知の炎症剤はロイコトリエン−Ｂ４（ＬＴＢ４）、相補因子５ａ（Ｃ５ａ）およびホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）を包含する。これらの薬剤は、ＬｅｕＣＡＭと呼ばれる１群の蛋白を活性化させる。ＬｅｕＣＡＭはＣＤ１１およびＣＤ１８蛋白の二量体である。ＬｅｕＣＡＭの１種、すなわちＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ１とも呼ばれる）は、ＩＣＡＭ１（細胞間付着分子１）とも呼ばれる内皮細胞上のリセプタに結合する［ハーラン、1985およびダナ等、1986］。研究者等が示したところでは、ＬｅｕＣＡＭに対するモノクローナル抗体（Ｍｏａｂｓ）はインビトロおよびインビボの両者にて内皮に対するＰＭＮ付着を阻止する［アルフォルス、1987；ベダー等、1988；およびトッド、1989］。
【０００７】
他の炎症剤は内皮細胞に直接作用して、実質的に白血球付着を開始させる。これらの薬剤はサイトキン類、すなわちインタロイキン−１（ＩＬ−１）、リンパ性毒素（ＬＴ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、並びに細菌内生毒素、リポ多糖類（ＬＰＳ）を包含する。たとえばＩＬ−１は、ヒト内皮細胞の単層に対するＰＭＮ、単核細胞および関連細胞ラインＨＬ−60（ＰＭＮ状）およびＵ937 （単核細胞状）の付着を刺戟することが示されている。作用は時間依存性であると共に蛋白合成依存性である［ベビラッカ等、1987ａ；ベビラッカ等、1987ｂ；およびベビラッカ等、1985］。
【０００８】
現在の証拠が示すように、これらの薬剤は内皮細胞表面に対するＥＬＡＭ（内皮細胞−白血球付着分子）と呼ばれる１群の分子を誘発させる。現在まで研究者は２種のこれら分子、すなわち細胞間付着分子１（ＩＣＡＭ１）および内皮細胞−血球付着分子１（ＥＬＡＭ１）を同定している［シモンス等、1988；スタウントン等、1988；およびベビラッカ等、1987b]。ＩＣＡＭ１は多くの細胞型で見出だされ、さらに血管内皮上でのその発現は炎症性サイトキン、すなわちインタロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）およびγインタフェロン（ＩＦＮ−γ）によりインビトロおよびインビボの両者にて強力に増大される［ポバー等、1986；ダスチンおよびスプリンガー、1988；並びにコトランおよびポバー、1988］。
【０００９】
ＥＬＡＭ１は最初に検出され、かつサイトキン処理されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するＰＭＮ付着を部分的に阻止するモノクローナル抗体（Ｍｏａｂ）を特徴とする。ＥＬＡＭ１は、炎症性サイトキンＩＬ−１もしくはＴＮＦに反応するがＩＦＮ−γには反応せずにＨＵＶＥＣにより急速に合成される116 ｋＤの細胞表面グリコ蛋白である［ベビラッカ等、1987b]。ＩＣＡＭ１とは異なり、ＥＬＡＭ１は内皮においてのみ発現されると思われ、その発現は継続したサイトキンの存在下においてさえ一時的である。ＩＣＡＭ１と同様に、ＥＬＡＭ１もインビボにて炎症部位に存在する。免疫組織学の研究は、これが急性炎症部位には存在するが慢性炎症部位には存在せず、非炎症血管壁にも存在しないことを示している［コトラン等、1986、並びにコトランおよびポバー、1988］。したがって、ＥＬＡＭ１はインビボにおける炎症血管壁に対するＰＭＮ付着の主たる媒体であると思われる。重要なことに、細胞表面におけるＥＬＡＭ１の存在は急性炎症の自然経過を辿り、刺戟の数時間後に出現すると共に１日以内に徐々に消失する［ベビラッカ等、1987ｂ］。
【００１０】
間接的証拠は、他のＥＬＡＭが存在することを示唆する。炎症剤はインビトロにて内皮に対するＰＭＮ、単核細胞およびリンパ球の結合を誘発するが、ＥＬＡＭ１に対するＭｏａｂｓはＰＭＮおよび関連細胞の結合のみを阻止する［ベビラッカおよびギンブロン、1987］。さらに、インビボにおける炎症部位でのリンパ球および単核細胞の最大蓄積は、ＥＬＡＭ１発現が基礎レベルまで復帰した際に約24時間にて生ずる。この情報に基づき研究者は、これらリンパ球および単核細胞の結合を媒介する他のＥＬＡＭの存在を想定した［ベビラッカ等、1987ｂ］。以下詳細に説明するように、本発明者等はさらに２種のＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂと称するＥＬＡＭを特性化すると共にクローン化し、これらは内皮細胞に対するリンパ球の結合を媒介する。したがって、ＥＬＡＭは１群の分子と見なすことができる。
【００１１】
多くの証拠が示すように、ＥＬＡＭは腫瘍侵蝕、転移およびウィルス感染を包含する細胞−細胞認識を含む広範囲の病理学的状態にて重要な役割を演ずる［ハーラン、1985；ワリスおよびハーラン、1986；ベビラッカ等、1987ａ；並びにコトランおよびポバー、1988］。
【００１２】
ＥＬＡＭを発現する細胞に対する白血球の付着は、白血球上にＥＬＡＭリガンドが存在することを示唆する。この種の分子の１種はＩＣＡＭ１リガンド、すなわちリンパ球機能に関連した抗原１（ＬＦＡ１）である。ＬＦＡ１は、β２インテグリンもしくはＣＤ１１／１８属として知られた３種のヘテロダイマー分子の１種である［ダスチン等、1986；ロスライン等、1986；並びにマーリンおよびスプリンガー、1987］。最近の研究が示すところでは、ＩＣＡＭ１／ＬＦＡ１経路はインビトロにて内皮細胞に対するリンパ球および多形核白血球（ＰＭＮ）の両者の付着に役割を演ずる［ダスチンおよびスプリンガー、1988；スミス等、1989］。本明細書では、ＥＬＡＭ１リガンドであると証明しうる、内皮細胞に対する白血球付着に関与する分子（ＭＩＬＡ）の分離につき説明する。ＣＤＸと称する分子は約150 ｋＤの蛋白であって、ＨＬ−60細胞から分離された。ＣＤＸを認識するモノクローナル抗体は、ＥＬＡＭ１−発現性細胞に対するＰＭＮおよびＨＬ−60細胞の結合を阻止する。さらに、ＣＤＸはＥＬＡＭ１に付着することが知られた種類の白血球細胞に存在し、ＥＬＡＭ１に付着しない種類の白血球細胞およびその他の細胞には存在しない。したがってＣＤＸは或る種の白血球で発現される分子であって、ＥＬＡＭ１−媒介の白血球−内皮細胞付着において重要な役割を演ずる。さらに、ＣＤＸをコードするｃＤＮＡの分離および配列決定についても説明する。
【００１３】
さらに、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂリガンド、すなわちＶＬＡ４の同定についても説明する［ヘルマーおよびタカダ、ＥＰ330 506 号］。ＶＬＡ４のα4 およびβ1 サブ単位に特異性の抗体は、ＶＣＡＭ１に対するＶＬＡ４−発現性細胞の結合を完全に排除する。
【００１４】
血管壁に対する白血球付着は炎症における第１過程であるため、この過程を防止することに向けられる治療は病理学的炎症の処置に関し魅力的である。臨床医は或る程度の成功を以て白血球媒介付着の阻止に基づく治療につき既に試験している。この種の対策の１つは、ＰＭＮ付着を阻止するための白血球細胞表面複合体（ＣＤ１１／ＣＤ１８）に対するＭｏａｂｓ結合を含む（アルフォルス等、1987；ベダー等、1988；およびトッド等、1989）。
【００１５】
内皮細胞媒介の結合、並びにＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ（ＥＬＡＭリガンドを含む）に基づく白血球付着を防止するための代案治療は特に一層有望であると思われる。ＥＬＡＭ系は２つの理由から特に魅力的である：第１に、内皮細胞におけるＥＬＡＭ発現は構成的でなく誘発されるので、ＥＬＡＭは炎症の部位に集中すると共に数が制限される。このことは付着阻止剤が局部的にのみ作用すればよく、したがって構成的に発現される分子に向けられた阻止剤よりも少なくい投与量にて効果的であることを意味する。第２に、ＥＬＡＭ結合は種々異なる種類の白血球に対し選択的である。たとえばＥＬＡＭ１はＰＭＮを結合するのに対し、ＶＣＡＭ１はリンパ球を結合する。したがって、これらの治療は所定の種類の白血球に対し特異性であると共に、他の種類の白血球の循環もしくは移動に影響を与えない。さらに上記の理由から、この種の治療は安価かつ毒性が低いと判明した。
【００１６】
ＥＬＡＭに基づく治療に対する対策は、常態結合した動物蛋白を含まない高度精製型におけるＥＬＡＭおよびＭＩＬＡの両者を出発物質として必要とする。さらに、これら分子を生産する方法も必要とされる。これらおよびその他の必要性は、特定付着分子を発現に際しコードするＤＮＡ配列を分離すると共に、その生産のための組換ＤＮＡ分子および発現ビークルを作成することにより、本明細書中に説明するように解決される。
【００１７】
【発明の要点】
本発明の主たる目的は炎症を検討し、診断し、予防しかつ処置するための新規な手段を提供することにある。より詳細には本発明の目的は、内皮細胞に対する白血球結合に関与する分子を提供すると共に、白血球の内皮細胞結合を阻止するのに自体有用である他の分子を分離することにある。
【００１８】
本発明は、内皮細胞−白血球付着分子（ＥＬＡＭ）を発現に際しコードするＤＮＡ配列、ＥＬＡＭのためのゲノムＤＮＡ配列（ＥＬＡＭ発現制御配列を包含する）、これらＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子、これらＤＮＡ分子により形質転換された単細胞宿主、ＥＬＡＭの産生方法、並びに常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＥＬＡＭ蛋白を提供する。さらに本発明は、ＥＬＡＭに対し反応性の抗体調製物をも提供する。
【００１９】
さらに本発明は、内皮細胞に対する白血球付着に関与した分子（ＭＩＬＡ）を発現に際しコードするＤＮＡ配列をも提供する。ＭＩＬＡは、ＥＬＡＭに直接結合する白血球表面分子、すなわちＥＬＡＭリガンドを包含する。ＥＬＡＭリガンドを認識するモノクローナル抗体は、ＥＬＡＭ／ＥＬＡＭリガンド結合を直接に阻止することができる。さらにＭＩＬＡは、付着に間接的に関与する白血球表面分子、たとえばモノクローナル抗体のような第３の分子と相互作用することによりＥＬＡＭ／ＥＬＡＭリガンド結合を阻止する分子を包含する。この種の分子は、たとえばＥＬＡＭに対する親和性を低下させるようＥＬＡＭリガンドの表面構成を変化することにより作用することができる。さらに本発明は、ＭＩＬＡ  ＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ分子、およびこれらにより形質転換された単細胞宿主をも提供する。さらに常態結合した動物蛋白を実質的に含まないＭＩＬＡ蛋白、ＭＩＬＡの生産方法、並びにＭＩＬＡ（特にＣＤＸ）を認識するモノクローナル抗体をも提供する。特に本発明は、さらにＣＤＸをコードするＤＮＡ配列を持った組換ＤＮＡ分子を提供し、さらにこれらにより形質転換された単細胞宿主を提供する。
【００２０】
さらに本発明はＥＬＡＭ、ＥＬＡＭリガンドを包含するＭＩＬＡ、またはこれら分子の１部をリセプタもしくはリガンドを阻止するため使用することを含む内皮細胞に対するＰＭＮ結合の阻止方法をも提供する。さらに、ＥＬＡＭ発現を阻止するためのアンチセンス核酸およびリボチームの使用にも関する。さらに本発明は、ＥＬＡＭのそのリガンドに対する結合を阻止する能力につき分子をスクリーニングすることによる結合阻止剤の同定方法にも関する。さらに本発明は、ＥＬＡＭおよびそのリガンドの同定方法をも提供する。この種の１つの方法は、ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドを認識する抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を使用する。
【００２１】
【発明の説明】
以下の詳細な説明には次の定義を用いる：
発現制御配列：他のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御かつ調整するＤＮＡ配列。
【００２２】
作用結合：発現制御配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御かつ調整する際に前記ＤＮＡ配列が発現制御配列に作用結合する。「作用結合」という用語は、発現すべきＤＮＡ配列の前側に適当な出発信号（たとえばＡＴＧ）を有し、かつ正確な読枠を維持して発現制御配列の制御下におけるＤＮＡ配列の発現とＤＮＡ配列によりコードされた所望生産物の産生とを可能にすることを含む。組換ＤＮＡ分子中に挿入することを所望する遺伝子が適当に出発信号を持たなければ、この種の出発信号を遺伝子の前側に挿入することができる。
【００２３】
抗体：免疫グロブリン分子またはその機能的断片、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）2 もしくはｄＡｂ。抗体調製物は、この調製物における個々の免疫グロブリン分子の少なくとも１部が抗原を認識する際（すなわち、これに結合する際）、特定抗原に対し反応性である。抗体調製物は、抗原に対する調製物における個々の免疫グロブリン分子の結合が慣用の方法により検出しえない場合、抗原に対し非反応性である。
【００２４】
標準ハイブリッド化条件：ハイブリッド化と洗浄との両者につき５ｘＳＳＣおよび65℃に実質的に等しい塩および温度の条件。
【００２５】
ＤＮＡ配列：本発明のＤＮＡ配列は、組換ＤＮＡ技術を用いて作成され或いは分離されたＤＮＡ配列を意味する。これらはｃＤＮＡ配列、その天然ゲノムから分離されたＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。請求の範囲に用いる用語は、天然に存在する場合にも天然ＤＮＡ配列を包含することを意図しない。
【００２６】
ＥＬＡＭ：内皮細胞に対する白血球の付着を媒介する、内皮細胞の表面で発現される分子。
【００２７】
ＭＩＬＡ：内皮細胞に対するＥＬＡＭ−媒介結合に関与する、白血球の表面で発現される分子。これはＥＬＡＭリガンド、すなわちＥＬＡＭに直接結合する分子を包含する。
【００２８】
以下に説明するように、本発明者等はｃＤＮＡをＥＬＡＭｍＲＮＡから分離すると共に配列決定し、ＥＬＡＭ分子を適当な宿主にて発現させ、ＭＩＬＡをコードするｃＤＮＡを分離すると共に配列決定し、さらにＭＩＬＡ用のＤＮＡ配列を分離しかつ発現させた。
【００２９】
本発明による組換ＤＮＡ分子の発現は、宿主細胞による得られたポリペプチドの翻訳後の改変を包含する。たとえば哺乳動物細胞において、発現は特にポリペプチドのグリコシル化、リピド化もしくはホスホリル化、或いは「成熟」蛋白を産生するための信号配列の切断を包含する。したがって、ここで用いるＥＬＡＭおよびＭＩＬＡという用語は、全長ポリペプチドおよびその改変物もしくは誘導体、たとえばこの種のポリペプチド、成熟蛋白、信号ペプチドを保持するポリペリチド、匹敵した生物活性を有する切断ポリペプチドなどのグリコシル化物を包含する。
【００３０】
ＥＬＡＭは、炎症時にのみ内皮細胞の表面で発現される。この現象を利用してＥＬＡＭ  ｃＤＮＡを分離した。本発明のｃＤＮＡ分離物ＥＬＡＭ１によりコードされたポリペプチドをＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂと命名した。この分離に関与する第１工程は、ＥＬＡＭ分子を種々異なって発現する細胞の選択である。ヒトの臍静脈内皮細胞を選択した。何故なら、これらは炎症性サイトキシンＩＬ−１βにより誘発された際にＥＬＡＭを産生するからである。しかしながら実際には、このサイトキン、この細胞型、または特にヒト細胞のみに限定されない。他の哺乳動物細胞、たとえばヒヒ内皮細胞もＥＬＡＭを産生することが知られている［コトランおよびポバー、1988］。
【００３１】
次の工程は、ＥＬＡＭを発現する細胞（この場合にはＩＬ−１β−誘発ＨＵＶＥＣ）からｍＲＮＡを分離すると共にそれらからｃＤＮＡ保存物を作成することである。ｍＲＮＡを分離しかつそれからｃＤＮＡを作成するには、多くの方法が知られている［たとえばグブラーおよびホフマン、1983、並びにマニアチス等、1982参照］。
【００３２】
次いで、ｃＤＮＡを適当なベクターに挿入した。ブライアン・シードにより記載されたように真核性発現ベクターｐＣＤＭ８を選択した［シード、1987］。このプラスミドはイ−・コリにおける高コピー数と、真核性プロモータと、たとえばＣＯＳ７細胞のような一時的発現系における高レベルの発現とを含む幾つかの利点を有する。しかしながら、他の数種のベクター系も可能である［たとえばケート等、1986参照］。
【００３３】
ｃＤＮＡ保存物を作成した後、次の工程はそれからＥＬＡＭ  ｃＤＮＡ配列を持ったクローンを分離することであった。種々異なって発現されたｍＲＮＡにつきｃＤＮＡを分離するには現在多くの方法がある。これらはたとえば（１）標識されたｃＤＮＡによる＋／−スクリーニング；（２）抜取ｃＤＮＡ保存物の作成；および（３）抜取ｃＤＮＡプローブによるスクリーニング［デービス、1986；サージェント、1987；デービス等、1985、ヘドリック等、1984；およびヅギド等、1988］。第３の技術、すなわち抜取ｃＤＮＡプローブによるスクリーニングを選択すると共に、ＥＬＡＭ配列を豊富化させたｃＤＮＡサブ保存物を作成した。
【００３４】
以下、一層詳細に説明するように、サイトキン誘発細胞により産生されるが未誘発細胞では産生されないｍＲＮＡを豊富化させた抜取ｃＤＮＡプローブを作成した。次いで、当業界で周知された技術を用いて、抜取ｃＤＮＡプローブにより、サイトキン誘発ｃＤＮＡ保存物を試験した。これにより、ＥＬＡＭ配列を豊富化したサブ保存物を形成するクローンを分離することができた。
【００３５】
この時点で、２つの技術を用いてＥＬＡＭ配列に関するｃＤＮＡを持ったクローンを同定した。第１方法においては、適する真核性発現系にてＥＬＡＭ活性を発現するクローンを試験した。λＧＴ１１でクローン化されるｃＤＮＡによってコードされた融合蛋白の抗体スクリーニングを含む各種の直接的発現技術を用いることができ［ヤングおよびデービス、1983；ヤングおよびデービス、1984］；またはクローン化されたｃＤＮＡ、或いはＳＰ６／Ｔ７プロモータを有するプラスミドもしくはファージＤＮＡからのｍＲＮＡを注射した後に卵母細胞調節媒体の活性分析を用いることができる。或いは、各種のプロモータ、選択素子および複製素子を有するプラスミド、ファージおよびコスミドベクターにて保存物を作成することもできる。動物細胞を、一時的もしくは安定な発現のため保存物でトランスフェクトすることができる。トランスフェクションは各種の方法で行なうことができる。一時的な発現につき、研究者はスフェロプラスト融合、ＤＥＡＥデキストランおよびエレクトロポレーションを用いている。安定な発現については、燐酸カルシウム、スフェロプラスト融合およびエレクトロポレーションを用いている。本発明者等は、スフェロプラスト融合によりトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞、すなわち一時的な発現系を用いた［アルッフォおよびシード、1987］。
【００３６】
最近まで、直接発現によるクローン化分子の同定は鋭敏な分析を必要とし、リンホキンのみに制限されていた。しかしながら、抗体「パニング」技術［ウィソッキおよびサトウ、1978］による或いはＦＡＣＳでの機能分子の同定［ヤマサキ等、1988］による効率的な一時的発現ベクターにおける一本鎖細胞−表面分子のｃＤＮＡクローン化［たとえばシードおよびアルッフォ、1987並びにシード、1987参照］は、直接的発現により同定しうるクローン化分子の範囲を拡大した。本発明者等は、クローン化分子につきリガンドを発現する適当な細胞種類を用いてこの分子を同定するという付着分析を用いることにより技術を拡大した。
【００３７】
ヒト好中球状細胞ラインＨＬ−60［ベビラッカ等、1985］またはヒトＢ−リンパ球状細胞ラインＲＡＭＯＣ［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ1596、ヒト・バ−キット・リンパ腫］のいずれかを結合するトランスフェクト細胞の能力を試験することにより、ＥＬＡＭ発現を検出した。これにつき以下詳細に説明する。トランスフェクト細胞はヒト細胞でないため、ヒトＥＬＡＭポリペプチドを産生するものは実質的に精製された形態であって、常態結合した動物蛋白を実質的に含まない。この分析にて陽性の試験結果を得た細胞を釣り上げ、プラスミドＤＮＡを回収し、さらにそれらから挿入物を分離した。これら挿入物は、ＥＬＡＭ１（ＨＬ−60細胞に対する付着により選択）およびＶＣＡＭ１（ＲＡＭＯＳ細胞に対する付着により選択）をコードするＤＮＡ配列を有した。
【００３８】
第２の方法においては、誘発されたｍＲＮＡ（未誘発のｍＲＮＡでない）の４ｋｂバンドに対しノーザン・ブロットでハイブリッド化した豊富化サブ保存物からｃＤＮＡ挿入物を同定した。これら挿入物の２種は、ＥＬＡＭ１に関するＤＮＡ配列を有した。サブ保存物からの他の挿入物は、異なる誘発ｍＲＮＡをコードする。
【００３９】
ＩＬ−１β−誘発ＨＵＶＥＣ  ｃＤＮＡ保存物をＶＣＡＭ１  ｃＤＮＡ配列から誘導されたランダム処理のオレゴヌクレオチドＰ32標識プローブで試験することにより、他のＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ１ｂに関するｃＤＮＡを分離した。ＶＣＡＭ１ｂはＶＣＡＭ１より大である。
【００４０】
これら３種の方法により同定されたクローンを用いて、ＥＬＡＭ１並びにＶＣＡＭ１および１ｂにつきｃＤＮＡの配列を決定した。遺伝子コードの縮退に基づき、これら配列の多くのヌクレオチドを変化させると共に図１、図３および図４に示したＤＮＡ配列によりコードされるものと同一のアミノ酸配列を発現に際しコードするＤＮＡ配列を保持し得ることに注目すべきである。さらに、ＥＬＡＭｃＤＮＡ配列の断片に関するＤＮＡ配列（すなわちＥＬＡＭ  ｃＤＮＡ配列に対し実質的に相同であって、それ自身でＥＬＡＭポリペプチドをコードするＤＮＡ配列）は標準ハイブリッド化条件下で上記ＥＬＡＭ  ｃＤＮＡ配列にハイブリッド化する。
【００４１】
上記ＤＮＡ配列からＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列を推定した。蛋白処理技術の現状に鑑み、当業者はこれらアミノ酸配列における合理的な改変、挿入および欠失を行なって、ここに開示した分子と実質的に同じ生物学的もしくは免疫学的活性を有する各種の分子を明らかに得ることができる。
【００４２】
さらにＥＬＡＭ１並びにＶＣＡＭ１および１ｂ遺伝子につき、転写プロモータを含むゲノムＤＮＡ配列を分離した。ヒトゲノム保存物をＥＬＡＭ１またはＶＣＡＭ１  ＤＮＡ配列のコード化領域から誘導されたＰ32標識プローブでスクリーニングした。これにより、ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１の両遺伝子の５′未転写および未翻訳領域の部分を有するクローンを得た。
【００４３】
ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１転写プロモータは多数の用途を有する。第１に、これらはサイトキン（たとえばＴＮＦもしくはＩＬ−１）および細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）または内皮細胞にてＥＬＡＭの発現を誘発することが知られた他の薬剤によって誘発しうるベクターを作成するのに有用である。この種のベクターはたとえば遺伝子転移分析に有用であり、たとえばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどのリポータ遺伝子の転写を開始させるよう、誘発性プロモータを位置せしめる。次いで、この作成物を一時的に或いは安定的に適当な哺乳動物細胞ラインに導入する。誘発の有力な阻止剤もしくは刺激剤を、次いで上記誘発剤のいずれか或いは全てによる誘発に対する作用を測定して分析することができる。
【００４４】
さらに、ＢＢ１１と称するＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを分離した。後記実施例Ｖにその生産につき説明する。
【００４５】
ＶＣＡＭ１は、内皮細胞に結合するＴおよびＢ細胞に関与する。レクチン刺激もしくは特定抗原により活性化されたＴ細胞は、インビトロにてＨＵＶＥＣに結合する。この結合は部分的にＩＣＡＭ／ＬＦＡ１経路によって媒介される。何故なら、ＣＤ１８における阻止性エピトープ（ＬＦＡ１の共通β連鎖）に結合するモノクローナル抗体がＴ細胞結合を部分的に阻止するからである。さらに、抗−ＣＤ１８および抗−ＶＣＡＭ１モノクローナル抗体は結合を完全に阻止することも判明した。ＣＤ１８が欠損した人間は炎症部位に対するリンパ球の正常な修復を示すと共に、活性化されたＴ細胞はリンパ系を介して循環しない（すなわち、これらは炎症部位以外には血流から流出しない）という観察と組合わせて、これはＶＣＡＭ１がインビボにおける活性化Ｔ細胞移動に対し重要であることを意味する。すなわち、ＶＣＡＭ１は全活性化Ｔ細胞を炎症部位に集中させるよう作用する。活性化Ｔ細胞の存在が多くの炎症および自己免疫病の特徴であるため、これはＶＣＡＭ１の不適切な発現がこの種の病気の基本的な病理化学的特徴であることを意味する。したがって、ＶＣＡＭ１経路は活性化Ｔ細胞修復が関与する病気（たとえば関節炎、狼瘡、多発性硬化症など）に対する重要な介入点を与える。したがって、ＶＣＡＭ１結合経路を阻止することにより内皮に対するＴ細胞結合を阻止するための治療処置につき開示する。これは、本明細書中に記載するいずれかの手段により行なうことができる。
【００４６】
ＶＣＡＭ１のＤＮＡ配列は分子がＥＬＡＭ１に対し構造類似性を持たず、免疫クロブリン超遺伝子群の一員であることを示す。免疫グロブリン超遺伝子群のうち３種は細胞−細胞付着分子であると確認される。これらはＮＣＡＭ、ＣＥＡおよびＩＣＡＭ１である。ＮＣＡＭはそれ自身で他の細胞の表面にて結合し（ホモタイプ付着）、かくして同種類の細胞間の付着を促進する。ＣＥＡの機能は最近まで未知であったが、付着分子として機能することにより結腸腫瘍細胞およびＣＥＡに関するｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のホモタイプ凝集を媒介することが見出された［ベンチモル等、1989］。ＩＣＡＭ１は白血球表面蛋白ＬＦＡ１のリガンドであって、白血球−白血球付着および白血球−内皮細胞付着の両者を媒介する［スタウントン等、1988］。ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１は或る程度の機能的類似性を有し、たとえば両者はサイトキンで処理した後に内皮細胞内で誘発され、さらに両者はリンパ球と関連細胞ラインとの付着を媒介する。ＩＣＡＭ１のリガンド（すなわちＬＦＡ−１）は充分特性化されている。ＶＣＡＭ１のリガンドはＶＬＡ４として同定されている（後記参照）。ＩＣＡＭ１は、インビボにおける炎症部位までのリンパ球の移動だけでなく免疫反応に関する多くのリンパ球機能にも役割を演ずると思われる。さらに、ＩＣＡＭ１は多くのリノウィルスのためのリセプタとなることも最近示された。他のウィルス（たとえばポリオ、ＨＩＶ）のリセプタもＩｇ上科のメンバーである［ホワイトおよびリットマン、1989］。たとえば、ＶＣＡＭ１は免疫調節およびウィルス感染の両者において重要な役割を演ずる。
【００４７】
ＣＥＡとＩＣＡＭ１との両者は腫瘍細胞で発現される。ＣＥＡは、結腸癌のための診断標識として永年にわたり使用されている。最近の診断技術は放射線免疫結合体の使用を含み、抗−ＣＥＡ抗体を放射性標識に結合させると共に患者中に導入する。この方法により、臨床医は３mm程度に小さい腫瘍を同定することができる［ゴールデンベルク、1989］。
【００４８】
研究者等は、さらに放射線免疫治療および免疫毒素治療を開発している。放射線免疫治療は放射線免疫結合体の使用を含み、たとえばＩ125 、Ｙ90、Ｒｅ186 などの核種を特定の表面抗原を認識する抗体に結合させる。免疫毒素は、たとえばシュードモナス外生毒素などの細胞毒素と結合した抗体である。注射に際し、これらの結合した抗体は、抗原を発現する細胞に対し毒性剤を指向させる。本発明によれば、放射性標識、核種および細胞毒素をＶＣＡＭ１および１ｂ或いはこれらを認識する抗体と結合させて、ＶＣＡＭ１リガンド（たとえばＶＬＡ４）もしくはＶＣＡＭ１を発現する細胞を標的とすることができる。
【００４９】
新規なＥＬＡＭの発見、またはたとえば腫瘍細胞のような他の細胞で発現されるＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡの将来の発見も、新規なＴＩＬ治療を可能にする。たとえばＥＬＡＭを表面上で発現する腫瘍が見出だされた場合、この腫瘍を生検して浸潤リンパ球を除去することができる。たとえばレトロウィルス発現ベクターにおけるＴＮＦのような殺腫瘍剤のための遺伝子を用いて、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）をトランスフェクトし、次いでこれをＩＬ−２で拡充させる。トランスフェクトされたＴＩＬを患者中に注射すれば、ＴＩＬは初期の腫瘍に特異的に指向すると共に腫瘍中に移動して、ここで殺腫瘍遺伝子生産物が局部作用のため放出される［トーマスおよびシコラ、1989参照］。ＥＬＡＭは全て或る種の白血球を結合することにより浸潤を媒介するので、浸潤白血球を分離し、特定の所望遺伝子生産物の発現につきトランスフェクトし、増量させ、かつ患者に再導入するという改変ＴＩＬ治療も考えられる。
【００５０】
代案のＴＩＬ治療は、或る種の細胞型（特に或る種の癌細胞）がＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡを発現するという事実を利用する。たとえば、結腸癌はＣＤＸを発現するのに対し、黒色腫はＶＬＡ４を発現することが知られている。
【００５１】
ここに開示するＤＮＡ配列を用いて、白血球をトランスフェクトすることにより表面ＥＬＡＭもしくはＭＩＬＡを発現させて白血球の細胞融解活性を向上させ、対応リガンドを発現する標的細胞に対し結合を向上させるよう、治療を設計することができる。白血球型の細胞融解活性がより強い細胞−細胞付着の関数として増大する場合、この種の方法は白血球が標的細胞を破壊する能力を向上させる。たとえば、結腸癌または黒色腫の場合、白血球（好ましくは既に標的癌細胞に対し親和性を持った浸潤性白血球）をＥＬＡＭ１の遺伝子（結腸癌の場合）またはＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂの遺伝子（黒色腫の場合）を含む発現ベクターでトランスフェクトすることができる。この種の白血球を患者中に導入すれば、それぞれ癌細胞もしくは黒色腫細胞に留まり得る白血球の群が得られる。これら白血球は、腫瘍細胞に付着して所望の細胞融解作用を発生する向上した能力を有する。
【００５２】
ＨＵＶＥＣをＴＮＦおよびＩＦＮ−γと一緒に培養すれば、ＶＣＡＭ１発現がＴＮＦ単独での培養よりも約100 ％増大することが判明した。活性化Ｔ細胞はＩＦＮ−γを分泌し、したがって積極的なフィードバック系を介し炎症部位に対するそれ自身の補充を促進することができる。ＶＣＡＭはＴ細胞結合を生ぜしめ、Ｔ細胞はさらにＩＦＮ−γ分泌を介しＶＣＡＭ生産をさらに刺戟する。したがって、このフィードバックメカニズムの阻害を含むＶＣＡＭ依存性病理学につき新たな処置を考案した。この処置はたとえばＩＬ−１、ＴＮＦもしくはＩＦＮ−γのようなサイトキンをたとえばモノクローナル抗体で阻止して、サイトキン刺戟されたＶＣＡＭの生産を阻止することからなっている。
【００５３】
さらにＥＬＡＭ１−媒介付着に関与し、事実恐らく極く最近の本発明者等の証拠が示すように、ＥＬＡＭ１リガンドに関与するＭＩＬＡ、ＣＤＸを分離した。分離は第１工程としてＣＤＸ分子に対するモノクローナル抗体の生産を含んだ。マウスに対し、ＥＬＡＭ１に結合することが知られた全ＨＬ−60細胞、すなわちＰＭＮ−関連細胞ラインで免疫化した。或いは、ＰＭＮ自身および本発明が示すＵ937 細胞を包含するＥＬＡＭ１に結合する細胞ラインで免疫化することもできる。さらに、他のＥＬＡＭに対する付着に関与するＭＩＬＡを分離するため、適するＥＬＡＭに結合する任意の細胞ラインで免疫化することもできる。たとえばＶＣＡＭ１を分離する際、これら２種の細胞ライン、すなわちＢ−リンパ球状細胞ライン（ＲＡＭＯＳ）およびＴ−リンパ球状細胞ライン（ＪＵＲＫＡＴ）を同定した。
【００５４】
免疫化されたマウスからの免疫血清が付着分析にてＨＵＶＥＣに対するＨＬ−60細胞の結合を阻止したことを知った後、当業界で周知された方法にて脾細胞からハイブリドーマを作成した［ゴジング、1983］。次いで、ＣＤＸに対するモノクローナル抗体（Ｍｏａｂｓ）を産生するハイブリドーマを、付着分析にて誘発ＨＵＶＥＣに対するＨＬ−60細胞の結合を阻止する能力につき試験することにより同定した。これらハイブリドーマの数種を用いて、モノクローナル抗体を含有する腹水液を作成した。
【００５５】
さらに、ヒューゼ等（1989）の技術を用いて、これら抗原を認識するモノクローナルＦａｂ断片を生ぜしめこともできる（さらにスケラおよびプリュックスン、1988参照）。或いは、ワード等（1989）により記載されたように、単一ドメインの抗体を産生させることもできる。
【００５６】
ＣＤＸに対する本発明のモノクローナル抗体は次の特徴を有する：第１に、これらはＥＬＡＭ１を発現する細胞に対するＨＬ−60細胞もしくはＰＭＮの結合を阻止する。第２に、これら抗体は特異的な細胞結合パターンを示し、すなわちこれらはＥＬＡＭ１に結合する細胞を認識するが、ＥＬＡＭ１に結合しない細胞は認識しない。第３に、これらはヒト細胞ラインに関し他の細胞−表面分子（たとえば抗−ＬＦＡ−１、抗−ＬＦＡ−３、抗−ＣＤ４４、抗−ＩＣＡＭ、抗−ＣＤ４および抗−Ｌｅｕ８）に対する抗体のパターンとは異なる認識パターンを有する。
【００５７】
これらＭｏａｂｓを用いてＣＤＸを分離した。ＨＬ−60表面蛋白および好中球（ヒト血液から分離）からの表面蛋白をクルチンガーにより記載された方法［クルチンガー等、1981］の変法より沃素で放射能標識し、或いはＳ35−メチオニンで代謝的に標識した。膜蛋白を可溶化させると共に、これらを蛋白Ａセファロース（ＡＲＸ）に対しμ鎖−特異性ウサギ抗−マウスＩｇＧを介し結合された抗−ＣＤＸモノクローナル抗体（α−ＣＤＸ  Ｍｏａｂｓ）と共に培養し、次いで抗体結合した蛋白を分離した。この蛋白は、約150 ｋＤの単一の核酸バンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に出現する。しばしば、90ｋＤ蛋白バンドがＨＬ−60細胞からの結合蛋白および常に好中球からの蛋白に観察された。この90ｋＤバンドはＣＤＸ分解生成物を示すと思われる。さらに、しばしば一層高い分子量のバンド（すなわち約150 ｋＤ）も観察された。これらは非特異性バンドである。分離した150 ｋＤ蛋白をＮ−グリカナーゼで処理した場合、分子量が約70ｋＤまで低下した。150 ｋＤバンドをＮ−グリカナーゼおよびＯ−グリカナーゼで処理した場合、分子量はさらに約45ｋＤまで減少した。これは極めて重度にグリコシル化した蛋白の蛋白コアを示すと思われる。この蛋白は、常態結合した動物蛋白を実質的に含まない分離ＣＤＸである。
【００５８】
さらに当業界で知られた技術を用いて、ＣＤＸを発現に際しコードするＤＮＡ配列を分離した。幾つかの実際的技術は、クローン化ＤＮＡを発現するための発現系を使用する。上記したように、各種の真核性発現系を用いることができる。ＣＤＸを発現する細胞ラインＨＬ−60のｍＲＮＡからｃＤＮＡ保存物を作成した。この保存物を上記したような抜取技術によりＣＤＸを発現しない細胞ライン（この場合はヘラ細胞）でＣＤＸ  ＤＮＡ配列につき豊富化させた。細胞ラインＣＯＳ  ７を抜取保存物でトランスフェクトすると共に約2100種のクローンを得、これらからＣＤＸを発現する細胞を多数の方法で検査した。
【００５９】
トランスフェクト細胞をα−ＣＤＸ  Ｍｏａｂｓと共に培養し、かつこれらを抗−マウスＩｇＧもしくはＩｇＭで被覆されたプレートに塗抹し、プレートに結合する細胞はＣＤＸを発現する細胞である。このようにして、ＣＤＸをコードする２．１ｋｂのＤＮＡ挿入体を同定し、配列決定用ベクターにサブクローン化させ、これをｐＳＱ２１９と称する。
【００６０】
ＣＤＸ（または他のＭＩＬＡ）を分離する他の方法は、蛍光性抗体標識を用いる。この方法においては、ＣＤＸ発現性細胞をα−ＣＤＸ  Ｍｏａｂｓと共に培養し、次いでＭｏａｂｓをたとえば蛍光標識された抗−マウス抗体で標識する。蛍光性抗体を結合する細胞を、次いで蛍光活性化細胞分類器（ＦＡＣＳ）で分類した。分類された細胞からのＤＮＡを用いて、たとえばイー・コリのような細菌宿主を形質転換させた。次いで、得られたコロニーからのＤＮＡを用いてＣＯＳ７細胞をトランスフェクトし、この手順を単一のＣＤＸ−発現性クローンが確認されるまで反復することができる。
【００６１】
第３の方法は、上記したようにトランスフェクトされた細胞を組換可溶性ＥＬＡＭ１（ｒｓＥＬＡＭ１）で被覆されたプレート上に塗沫することである。実施例ＶIIIにおいてはプレートをｒｓＥＬＡＭ１で被覆する方法を説明する。これらプレートに結合する細胞は、ＣＤＸを発現するものである。同様に、他の可溶性ＥＬＡＭを用いて、その付着経路に関与するリガンドもしくはＭＩＬＡを発現する細胞を分離することができる。
【００６２】
さらに、発現保存物をイー・コリで作成することもできる。たとえば、λＺＡＰ（登録商標）（ストラタジーン）／ＨＬ−60保存物を作成すると共にこれを用いて、イー・コリで挿入ＤＮＡを発現させることができる。塗沫した後、プラークをたとえば放射能標識されたα−ＣＤＸモノクローナル抗体で直接にスクリーニングすることができる［ヤングおよびデービス、1983、並びにヤングおよびデービス、1984］。モノクローナル抗体が結合するプラークを釣り上げて、ＤＮＡ挿入物をこれらから分離することができる。
【００６３】
抗体認識に基づかずにＥＬＡＭリガンドを同定すべく使用する他の方法は、ＣＯＳ７細胞を適当な保存物（抜取ることができる）でトランスフェクトし、次いでこれらをＥＬＡＭ発現性細胞（たとえば誘発ＨＵＶＥＣ、ＥＬＡＭ−発現性ＣＯＳ７細胞、またはＥＬＡＭ−発現性ＣＨＯ細胞）に直接載せることである。この場合も、適切なクローンを分離するよう充分に保存物を豊富化するには、複数回の処理が必要である。
【００６４】
ＣＤＸ（または他のＭＩＬＡ）をコードするＤＮＡ配列を分離するための他の技術は、オリゴヌクレオチドプローブによるｃＤＮＡ保存物のスクリーニングを含む。たとえばＣＤＸに対する固定化抗体または固定化ＥＬＡＭ１を用いる親和性クロマトグラフィーにより充分量のＣＤＸ蛋白を精製すれば、部分アミノ酸配列を決定して、ＣＤＸ遺伝子の少なくとも１部に対応するオリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。次いで、これらプローブを用いてｃＤＮＡ保存物をスクリーニングすることができる。或いは、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、ＣＤＸ（ＭＩＬＡ）遺伝子用の保存物をスクリーニングする際に使用すべき長いプローブを生ぜしめることができる。
【００６５】
ＣＤＸのためのコード化配列を含むｃＤＮＡ挿入物を分離した後、ＣＤＸがＥＬＡＭ１用のリガンド（または少なくとも１種のリガンド）であるという証拠をさらに蓄積した。ＣＤＸ挿入物でトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１で被覆されたビーズに付着した。この相互作用は陽イオン依存性であって、ＢＢ１１（すなわちＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体と共に事前培養して阻止された。さらに、ＣＤＸ挿入物でトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は、蛍光標識されたα−ＣＤＸ  Ｍｏａｂｓと共に培養した後にＦＡＣＳ上で陽性分析を示した。さらにＣＤＸトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は、α−ＣＤＸ被覆されたセファロースビーズによりロゼットを形成する［シードおよびアルッフォ、1987］。さらに、約120 ｋＤの蛋白を沃素化すると共に、ＡＲＸビーズ（すなわち蛋白Ａセファロースに対しμ連鎖−特異性ウサギ抗−マウスＩｇＧを介し結合したα−ＣＤＸ）を用いてＣＤＸ  ＣＯＳ７細胞から免疫沈殿させることができる。
【００６６】
重質炭水化物成分が天然産ＣＤＸと明らかに結合することに鑑み、さらにシアリダーゼによるＨＬ−60細胞（ＣＤＸ−発現性）の処理がＥＬＡＭ１に対する結合のロスをもたらすことも明らかに観察した。これは、たとえばＣＤＸ糖におけるシアル酸成分がＥＬＡＭ１結合に直接関与するという直接作用である。或いは、これはたとえばシアル酸成分の開裂がＣＤＸの電荷における急激な変化をもたらして、ＥＬＡＭ１に対する結合を阻止しうるという間接的効果でもある。
【００６７】
さらに、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂに関するリガンドを同定した。これはインテグリンＶＬＡ４である［ヘムラー、1988；ヘムラー等、1987ａ；およびヘムラー等、1987b]。インテグリンは細胞−細胞外マトリックスおよびα，β−ヘテロダイマー構造を示す細胞−細胞付着リセプタの１群である［ハイネス、1987；マルカントニオおよびハイネス、1988］。研究者等は、β−サブ単位によって分類される３種のサブ群のインテグリンを確認した。ＶＬＡ（極後期の抗原）蛋白はβ1 サブ群に属し、これらの多くは細胞−細胞外マトリックス付着に対し特異的である［ハイネス、1987およびルオスラーチ、1988］。ＶＬＡ４はリンパ性細胞（たとえばＢおよびＴ細胞）、並びに骨髄性細胞にて比較的高レベルで発現されるが、他の細胞では検出困難である［ヘムラー等、上記］。細胞外マトリックスに対するＢおよびＴ細胞の結合は、ＶＬＡ４およびそのリガンド、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）によって媒介される［ウェイナー等、1989］。ＶＬＡ４がＶＣＡＭ１のためのリガンドであるという知見は、これが活性化内皮細胞に対するＢおよびＴリンバ球の１つの結合経路を規定するので重要である。したがって、下記する方法におけるリガンドおよびリセプタとしてのＶＬＡ４並びにＶＣＡＭ１および１ｂの使用につき説明する。
【００６８】
本発明では、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ  ＤＮＡ配列および分子に関する幾つかの用途が考えられる。第１に、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡを用いて、これら分子に対し反応性のモノクローナル抗体調製物を作成することができる。次いで、Ｍｏａｂｓを治療剤として使用することにより、内皮細胞に対する白血球結合を阻止することができる。
【００６９】
第２に、可溶型ＥＬＡＭ、可溶性ＥＬＡＭリガンドまたはそのいずれかの断片を結合阻止剤として使用することができる。ＥＬＡＭペプチドは白血球上のＥＬＡＭリガンドに結合し、ＥＬＡＭリガンドは内皮細胞上のＥＬＡＭに結合する。両方法は、内皮細胞に対する白血球結合を阻止する。組換可溶性ＥＬＡＭ（ｒｓＥＬＡＭ）またはｒｓＥＬＡＭリガンドを作成するため、好ましくは経膜領域を除去するよう分子をコードするＤＮＡを変化させる。かくして、可溶性分子のためのＤＮＡは、恐らく細胞質ドメインに付着した細胞外ドメインの全部または１部を含む。この対策は、可溶性ＣＤ４、すなわちＡＩＤＳウィルスに結合するＴ細胞における表面蛋白を用いて既に証明されている［フィッシャー等、1988］。この対策はさらに抗体治療の問題を回避する。何故なら、用いるポリペプチドが免疫反応を殆んど誘発しないからである。
【００７０】
可溶性組換分子につき研究者等が遭遇した１つの問題は、短いインビボの血漿半減期である［カポン等、1989］。この種の分子は系から急速に除去されるので、治療効果を得るには大投与量もしくは頻繁な注射が必要である。したがって、研究者等は可溶性分子の半減期を増大させる方法を探求した。有力な解決策は、可溶性分子を血流中における長い半減期を持つことが知られた他の分子に結合させることである。その長い半減期により、免疫グロブリン分子は有力な候補となる。カポン等（1989）は、組換ＤＮＡ技術を用いた免疫グロブリン分子に対する可溶性ＣＤ４の結合を記載している。この対策においては、免疫グロブリン分子の可変領域の代りに可溶性蛋白を用いて蛋白／免疫グロブリン融合蛋白を形成させる。
【００７１】
ｒｓＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は、ｒｓＥＬＡＭ単独よりも長い血漿半減期を有することが予想される。この種の融合蛋白は好ましくは組換作成物で製造され、その際可溶性分子をコードするＤＮＡ配列を免疫グロブリン分子の一定ドメインをコード化するＤＮＡ配列に融合させる。次いで、組換ＤＮＡを適当な宿主細胞、好ましくは動物細胞で発現させて、融合蛋白を産生させる。
【００７２】
ＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は他の利点を有すると思われる。免疫グロブリン分子は一般に二価であるため（すなわち、これらは２個の結合部位を有するため）、ＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白は２個のＥＬＡＭを有し、したがって２個のＥＬＡＭリガンド結合部位を有する。したがって、これらはＥＬＡＭリガンドを示す細胞に対し大きい親和性もしくは親和力を有すると思われる。
【００７３】
第３に、ＥＬＡＭに結合する分子（たとえば抗−ＥＬＡＭ抗体または標識、たとえばリガンドもしくはその断片）を用いて、炎症を検出することができる。これは、たとえば蛍光性もしくは放射能により分子を検出可能にし、これを患者に投与すると共に人体のどこにそれが蓄積したかを決定する。このようにして、炎症の種類を確認することもできる。たとえば、ＥＬＡＭ１に対する結合は慢性炎症でなく急性炎症を示す。
【００７４】
第４に、ＥＬＡＭが炭水化物成分または他の翻訳後の改変を介しリガンドに結合すれば、ＥＬＡＭを用いてこれが結合したＥＬＡＭリガンドにおける炭水化物を確認することもできる。
【００７５】
第５に、ＥＬＡＭおよびＭＩＬＡを系の１部として用いることにより、付着阻止剤のための小分子をスクリーニングすることができる。たとえば、小分子をＣＤＸとＥＬＡＭ１との間の相互作用を阻止する能力につき試験するような分析系を作成することができる。この方法で同定された小分子阻止剤は、抗炎症剤の候補となる。
【００７６】
第６に、これら分子を用いて、ＥＬＡＭに対する白血球結合を阻止するような内生蛋白を確認することもできる。研究者は、この種の１つの分子、すなわち内皮から結合ＰＭＮを脱着させる際に関与する白血球付着阻止剤（ＬＡＩ）を一時的に確認した［ホイーラー等、1988］。
【００７７】
第７に、ＶＣＡＭ／ＩＣＡＭ融合蛋白を生ぜしめることができる。両蛋白は数種の構造ドメインで構成されることが知られている［シモンス等、1988］。各蛋白の各種ドメインをコードするＤＮＡ配列を、たとえばＥＬＡＭ／免疫グロブリン融合蛋白の作成につき説明した遺伝子融合技術を用いて融合させる。選択されるドメインは、それぞれＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂリガンドおよびＩＣＡＭ１リガンドを結合する能力を持ったものである。ＶＬＡ４およびＬＦＡ１（公知のリガンド）を結合するドメインが好適である。これらＤＮＡ配列の発現に際し産生されるポリペプチドは、リガンドを有する細胞がＶＣＡＭ１もしくはＶＣＡＭ１ｂまたはＩＣＡＭ１もしくはその両者のいずれかに付着するのを阻止するため有用である。
【００７８】
最後に、ＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリガンドＤＮＡ配列を用いて、ＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドの発現を翻訳レベルで介入する核酸分子を生成させることができる。この手段は、特定ｍＲＮＡの翻訳をこのｍＲＮＡをアンチセンス核酸で遮蔽し或いはこれをリボチームで切断することにより阻止するためのアンチセンス核酸およびリボチームを利用する。これらの方法は炎症状態を処置する際に有用である。
【００７９】
アンチセンス核酸は、特定ｍＲＮＡ分子の少なくとも１部に対し相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である［ワイントラウブ、1990；マルクス−セクラ、1988］。細胞において、これらは前記ｍＲＮＡにハイブリッド化して二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖形態でｍＲＮＡを翻訳しない。したがって、アンチセンス核酸はｍＲＮＡから蛋白への発現を妨げる。約15個のヌクレオチドのオリゴマーおよびＡＵＧ開始コドンにハイブリッド化する分子は特に効果的である。何故なら、これらは合成が容易であると共に、これらをＥＬＡＭ生産性細胞に導入する際に大分子よりも少ない問題しか提起しないからである。アンチセンス法を用いて、インビトロにおける多くの遺伝子の発現を阻止した［マルクス−セクラ、1988；ハンバー等、1988］。
【００８０】
リボチームは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと若干類似した方法で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を備えたＲＮＡ分子である。リボチームは、或る種のｍＲＮＡがそれ自身のイントロンを切除する能力を有するという観察から見出された。これらＲＮＡのヌクレオチド配列を改変することにより、研究者等はＲＮＡ分子内の特定ヌクレオチド配列を認識して切断する分子を処理することができた［セッチ、1988］。これらは配列特異性であるため、特定配列を持ったｍＲＮＡのみが失活される。
【００８１】
研究者等は２種類のリボチーム、すなわちテトラヒメナ（Tetrahymena ）−型および「ハンマーヘッド」−型を同定した［ハーゼルホッフおよびゲルラッハ、1988］。テトラヒメナ−型リボチームは４−塩基の配列を認識する一方、「ハンマーヘッド」−型は11〜18−塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、標的ｍＲＮＡ種類においてのみ生ずる傾向が大となる。したがって、ハンマーヘッド型リボチームは、特定ｍＲＮＡ種類を失活させるのにテトラヒメナ型リボチームより好ましく、18−塩基認識配列はより短い認識配列よりも好適である。
【００８２】
ここに説明したＤＮＡ配列は、したがってＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ、ＣＤＸおよびＶＬＡ４のためのｍＲＮＡに対するアンチセンス分子を作成し、これらを切断するリボチームを作成するのに用いることができる。
【００８３】
アンチセンス分子およびリボチームは、付着分子の発現を妨げる細胞分子中に導入することにより、炎症を処置する方法に使用することができる。ＥＬＡＭは炎症の症状発生の間に内皮細胞で誘発され、さらに治療剤が静脈内注射により容易に血管内皮細胞に供給され得るので、内皮細胞はこの種の治療に魅力的な標的であり、ただしアンチセンス分子もしくはリボチームは適切な細胞に効果的に供給され得るものとする。
【００８４】
研究者等は、これら分子を標的細胞に供給すべく使用しうる２つの手段を示唆している。第１は、抗−ＥＬＡＭアンチセンス核酸またはＥＬＡＭ−特異性リボチームをｍＲＮＡ分子として発現するベクターにより標的細胞をトランスフェクトすることである［ハンバー等、上記］。この手段はインビトロにて細胞ラインで処理する際に極めて有用であるが、インビボでは効果的でないと思われる。インビボ供給につき一層有望である第２の手段は、リポソームに抗−ＥＬＡＭアンチセンス分子、ＥＬＡＭ−特異性リボチーム、またはこれらを発現するベクターを充填することである。これらリポソームは、リポソームを炎症部位に指向させる抗−ＥＬＡＭモノクローナル抗体を含有することもできる。この供給形態は、マイナスフィードバック系を与える。何故なら、細胞上のＥＬＡＭの出現はこの細胞を抑制の標的にするからである。さらにアンチセンス成分またはリボチーム成分の浸透が成功すれば、ＥＬＡＭ産生を停止させることにより標的としての細胞を除去する。
【００８５】
本発明の他の特徴は、ここに説明したＥＬＡＭおよびＭＩＬＡ  ＤＮＡ配列の発現である。当業界で周知されているように、ＤＮＡ配列は、これらを適切な発現ベクターにて発現制御配列に作用結合させると共にこの発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換させることにより発現させることができる。
【００８６】
発現制御配列に対する本発明のＤＮＡ配列の作用結合は、勿論、既にＤＮＡ配列の１部でなくてもＤＮＡ配列の上流における正確な読枠に開始コドンＡＴＧを与える。
【００８７】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるには、広範な種類の宿主／発現ベクター組合せを用いることができる。たとえば、有用な発現ベクターは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列の断片で構成することができる。適するベクターはＳＶ４０および公知の細菌プラスミドの誘導体、たとえばイー・コリプラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＰ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体、たとえばＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、たとえば多数のファージλの誘導体、たとえばＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３およびフィラメント状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、たとえば２μプラスミドもしくはその誘導体；真核性細胞に有用なベクター、たとえば昆虫もしくは哺乳動物細胞に有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクター、たとえばファージＤＮＡもしくは他の発現制御配列を用いるよう改変されたプラスミドなどを包含する。
【００８８】
広範な種類の発現制御配列（作用結合されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列）をこれらベクターで用いて、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。この種の有用な発現制御配列は、たとえばＳＶ４０もしくはアデノウィルスの早期および後期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばＰｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモータ、並びに原核性もしくは真核性細胞またはそのウィルスの遺伝子の発現を制御することが知られた他の配列、並びにその種々の組合せを包含する。
【００８９】
本発明のＤＮＡ配列を発現するには、広範な種類の単細胞宿主細胞も有用である。これらの宿主は周知の真核性および原核性宿主、たとえばイー・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌類（たとえば酵母）の菌株、並びに動物細胞、たとえばＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（たとえばＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０）、並びに組織培養における昆虫細胞（たとえばＳｆ９）、ヒト細胞および植物細胞を包含する。
【００９０】
必ずしも全てのベクター、発現制御配列および宿主が本発明のＤＮＡ配列を同等に充分発現するよう機能するとは限らないことが了解されよう。さらに、必ずしも全ての宿主が同じ発現系により同等に機能するとき限らない。しかしながら当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、所望の発現を達成するよう無駄な実験なしに適切なベクター、発現制御配列および宿主を選択することができる。たとえば、ベクターを選択する際、ベクターが宿主中で機能せねばならないので、この宿主を考慮せねばならない。ベクターのコピー数、このコピー数を制御する能力、およびベクターによりコードされる任意の他の蛋白（たとえば抗生物質マーカー）の発現も考慮される。
【００９１】
発現制御配列を選択する際は、各種の因子が一般に考慮される。これらは、たとえば系の相対強度、その制御性および発現すべき特定のＤＮＡ配列もしくは遺伝子との適合性を包含し、特に有力な二次構造を考慮せねばならない。適する単細胞宿主は、たとえば選択されたベクターに対する相容性、分泌特性、蛋白を正確に折重ねる能力、およびその発酵要求性、並びに発現すべきＤＮＡ配列によりコードされる生産物の主宿に対する毒性、さらに発現生産物の精製容易さを考慮して選択される。
【００９２】
これらおよび他の因子を考慮して、当業者は発酵または大規模の動物培養に際し本発明のＤＮＡ配列を発現する各種のベクター／発現制御配列／宿主の組合せを作成することができる。
【００９３】
ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１および１ｂ、ＣＤＸおよびＶＬＡ４に対する抗体の存在は、他のＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリガンドに関する他の分離方法を可能にする。この方法は、イディオタイプとして知られた抗体特性を利用する。各抗体は、抗原に対し特異性の独特な領域を有する。この領域をイディオタイプと称する。抗体自身は抗原決定子を有し、抗体のイディオタイプはその分子に独特な抗原決定子である。抗体で生物を免疫化することにより、イディオタイプを認識する抗体を含め、これらを認識する「抗−抗体」を生ぜしめることができる。他の抗体のイディオタイプを認識する抗体を抗−イジィオタイプ抗体と称する。或る種の抗−イディオタイプ抗体は、抗体が認識する初期抗原の形状に類似すると共に、抗原の「内部イメージ」を有すると言われる［ケネディー、1986］。抗原がリガンドである場合、或る種の抗−イディオタイプはそのリガンドリセプタに結合することができる。研究者等は、インシュリン、アンギオテンシンII、アデノシンＩ、β−アドレナリンおよびラット脳ニコチンのためのリセプタ並びに麻酔性リセプタに結合する抗−イディオタイプを包含するこれら数種を同定した［カールソンおよびグラッド、1989］。
【００９４】
この現象を利用して、抗−イディオタイプ抗体を用いることにより他のＥＬＡＭおよびＥＬＡＭリガンドを分離することができる。抗−イディオタイプを用いて、初期抗原に結合する分子をスクリーニングすることができる。たとえば、この技術を用いて他のＥＬＡＭリガンドを同定することができる。
【００９５】
同様なドメイン構造を有する関連ＥＬＡＭが存在することを突き止めた（すなわちＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ）。遺伝子組換の結果、１個もしくはそれ以上のドメインを有する数種の付着分子を細胞表面上に存在させることができる。任意の共有ドメインを認識する抗−イディオタイプ抗体は、ビオアッセイにより同定されないＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンドを免疫化学的に分離するのに有用であり、これは構造でなく蛋白の機能に依存する。
【００９６】
本発明を一層良好に理解しうるよう、以下に実施例を示す。これら実施例は例示の目的であって、決して本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００９７】
【実施例】
実施例Ｉ
ＥＬＡＭ配列について富化したｃＤＮＡサブライブラリの調製
次のようにして、ＥＬＡＭ配列について富化したｃＤＮＡサブライブラリを調製した：
臍帯からヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を単離し、この細胞を予備培養で生育させ、ギムブロン（１９７６）に記載されたようにこれらを継代した。ライブラリ作成のため、４〜５継代のＨＵＶＥＣｓを使用した。細胞を誘導してＥＬＡＭｓについてのｍＲＮＡを生産するため、群集モノレイヤを３７℃で２．５時間、組換えヒトＩＬ−１β（１０単位／ｍｌ）を用いてインキュベートした。これらの細胞からｍＲＮＡを単離し、当業界で周知の技術を使用してこれをｃＤＮＡに逆転写させた（グブラーとホフマン、１９８３）。標準的手順を使用し、次の配列を有するＮｏｔＩ−ＢｓｔＸＩリンカ／アダプタに二本鎖ｃＤＮＡを連結した：
５′GCG GCC GCT TTA GAG CAC A ３′
３′CGC CGG CGA AAT CTC       ５′
その後、ブリアン・シードの手順により、ベックマン（登録商標）ＳＷ６０ローター中で３時間５０，０００ｒｐｍで２２℃にて、４．２ｍｌ５〜２０％酢酸カリウムグラジエント、２ｍＭＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌエチジウムブロミドによりｃＤＮＡを大きさにより選択した（同様にマニアティスら、１９８２、第２７８頁参照）。５００塩基対より大きいｃＤＮＡ断片をプールした。その後ベクタ、ｐＣＤＭ８（ブリアン・シードより贈呈）を調製した。このプラスミドをＢｓｔＸＩにより消化した。４００塩基対の近接断片を除去するため、この混合物を前記したように酢酸カリウムグラジエントにより遠心し、大きな断片を単離した。アガロースゲル電気泳動によりこの断片を更に精製した後、このｃＤＮＡをベクタと連結した。このようにして、誘導ＨＵＶＥＣｓ中で発現されるｍＲＮＡについてのＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ分子を創製した。これらのプラスミドを使用してイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３を形質転換した。この結果、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡについてのｃＤＮＡライブラリからなる７×１０6 組換えクローンのコレクションを得た。
【００９８】
このｃＤＮＡライブラリからＥＬＡＭｃＤＮＡ配列について富化したサブライブラリを調製するため、最初にＥＬＡＭ配列富化減算プローブを調製した。前記したように、ＩＬ−１βにより誘導したＨＵＶＥＣｓからｃＤＮＡを調製し、これを32Ｐによりラベルした（デービス、１９８６）。その後、誘導されなかったＨＵＶＥＣｓからｍＲＮＡを単離した。未誘導ｃＤＮＡ配列を誘導配列から減算するため、ｍＲＮＡとｃＤＮＡとをハイブリダイズさせ、デービス（１９８６）により記載されたようにして、ｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮＡを単離した。単離したｃＤＮＡを他のラウンドの減算に供し、富化のレベルを増加させた。結局、ＥＬＡＭ配列について富化された減算プローブの３つのバッチを調製した。
【００９９】
ノーザンブロットによりプローブの精製のレベルを試験した（レーラーら、１９７７）。誘導および未誘導ＨＵＶＥＣｓに由来するポリＡ＋ｍＲＮＡの平行レーンによりゲルを走らせ、これをジーン・スクリーン（登録商標）（ニュー・イングランド・ヌクレア）にブロットした。ハイブリダイゼーションおよび続くオートラジオグラフィにより、プローブは誘導レーン中で４ｋｂのバンドに強固に結合したが、未誘導レーンではバックグラウンドを越えた結合はしないことが明らかとなった。場合により、誘導レーン中の他のメッセージより弱いハイブリダイゼーションバンドを認めた。
【０１００】
減算プローブを使用し、ＩＬ−１β誘導配列について富化されたイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３中でｃＤＮＡライブラリを作成した。ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリの百万のクローンをプレートアウトすることにより開始した。１２．５μｇ／ｍｌアンピシリンおよび７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天上で、ジーン・スクリーン・プラス（登録商標）フィルタ（ニュー・イングランド・ヌクレア）上に百万のコロニーをプレートし、これらを３７℃で１２時間生育させた。それぞれのマスターから２つのレプリカフィルタ（リフト）を作成した。１２．５μｇ／ｍｌアンピシリンおよび７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ寒天上でこれらを４時間生育させ、２５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上でこれらを１６時間増幅した。製造業者の仕様書に従ってフィルタを溶解し、その後これらをプラーク・スクリーン（登録商標）緩衝液（０．０５Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．２％フィコール−４００、０．２％ＢＳＡ）中で予備ハイブリダイズした。１０％硫酸デキストランおよび１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ並びに約１×１０7 ｃｐｍの減算ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃＤＮＡを含有する５０ｍｌのプラーク・スクリーン（登録商標）緩衝液中で、フィルタを６５℃で４０時間ハイブリダイズさせた。その後、６５℃にてプラーク・スクリーン（登録商標）緩衝液で２回、２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで２回、そして１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで２回フィルタを洗浄した。その後このフィルタを５日間フィルムに露呈した。
【０１０１】
オートラジオグラフを用いてマスターフィルタをアニールし、滅菌した楊枝を用いてコロニーをフィルタから掻き取ることによりプローブにハイブリダイズするコロニーを選択した。それぞれの掻き取り物を９６穴マイクロタイタプレートの１つの穴に入れ、７．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび１２．５μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢブロスで満たした。接種後、マイクロタイタプレートを３７℃で一夜インキュベートした。細胞が成育したならば、それぞれの穴に対し、最終濃度２０％でグリセリンを添加し、プレートを−７０℃で保存した。このようにして、マスターライブラリフィルタから８６４のＥＬＡＭ配列について富化したｃＤＮＡサブライブラリからなるコロニーを単離した。プレートする密度のため、富化したサブライブラリの全てのコロニーが純粋ではないことを銘記する。
【０１０２】
富化したｃＤＮＡサブライブラリを用いて並列に２つのセットの手順を行った。
実施例II
ＥＬＡＭ１を発現するクローンの単離
第１の手順で、富化したサブライブラリからＥＬＡＭ１を発現するクローンを単離した。このサブライブラリを選択して、高レベルの過渡的発現についてコンピテントなセルライン、アフリカミドリザルのセルラインＣＯＳ７に感染させた。この細胞をプレートし、スフェロプラスト融合（サンドリ−ゴールディンら、１９８１）によりサブライブラリを感染させた。感染後４８時間に、ＨＬ−６０細胞（炎症剤により刺激された内皮細胞に結合することが知られたセルライン）に結合する能力により、ＥＬＡＭ１の発現についてＣＯＳ７セルラインをアッセイした。
【０１０３】
次のようにしてアッセイを行った：ブリーナンとパリッシュ法（ブリーナンとパリッシュ、１９８４）により、カルボキシフルオロセイン二酢酸を用いてＨＬ−６０細胞をラベルした。すなわち、ＨＬ−６０細胞を１×１０7 細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳに再懸濁し、アセトン中の１０ｍｇ／ｍｌの保存溶液から０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度でカルボキシフルオロセイン二酢酸を添加した。室温で１５分間ラベルしたＨＬ−６０細胞と共にＣＯＳ７細胞をインキュベートした。ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより細胞を３〜４回洗浄した。蛍光顕微鏡により付着性ＨＬ−６０細胞の群集についてペトリ皿を検査した。ＨＬ−６０細胞の群集を有する細胞プレートの領域を取り上げ、０．６％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８中で溶解させた後、ヒルト（ヒルト、１９６７）の方法によりプラスミドを遊離させた。これらのプールしたプラスミドを使用してイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３を形質転換した。これらの形質転換体からコロニーを生育させ、ＣＯＳ７細胞を用い、続いてＨＬ−６０付着についてのアッセイを用いて第２回のスフェロプラスト融合を行った。付着について陽性であった細胞の中から１つを選択し、これからプラスミドを単離した。このプラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６を含有する培養物を選定した。このプラスミドを、ブタペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、６１１ピー・ハモンド・フェリー・アールディ、リンチカム、Ｍｄ、２１０９０（米国）に対し、１９８９年４月２０日に寄託した。これは次のように同定される：
ＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３受託番号ＩＶＩ−１０２０４。
【０１０４】
実施例III
ＥＬＡＭ１配列についてのｃＤＮＡ挿入物の単離
第２の手順で、ＩＬ−１β誘導ｃＤＮＡ配列についてのｃＤＮＡ挿入物を単離した。富化したライブラリの８６４のコロニーから２４を無作為に選択し、マニアティスのアルカリ性ミニ調製手順を使用してこれらからプラスミドを単離した（マニアティス、１９８２）。ＸｈｏＩまたはＮｏｔＩによりプラスミドを消化し、１％アガロースゲル上で断片を単離した。３ｋｂを越える大きさの挿入物を有する２つのプラスミドをこのゲルから同定し、これらの挿入物を単離し、32Ｐによりこれらをラベルした（フェインバーグとボーゲルスタイン、１９８３および１９８４参照）。
【０１０５】
その後これらの挿入物を用いてノーザンブロットを前記したようにして行った。両者の挿入物は、誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡレーン中で４ｋｂのバンドにハイブリダイズしたが、未誘導ＨＵＶＥＣｍＲＮＡレーンにはハイブリダイズしなかった。また、この挿入物は、ＥＬＡＭ１発現プラスミドＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６（前記）に交叉ハイブリダイズした。これらの挿入物を、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼにより処理したＮｏｔＩ消化ｐＮＮ１１に挿入した。制限消化および新しい合成断片による置換により、市販のプラスミドｐＵＣ８（ファルマシアＰＬバイオケミカルス）から合成ポリリンカを除去することにより、配列決定プラスミドｐＮＮ１１を作成した。複製開始点を与えアンピシリン耐性を与えるｐＵＣプラスミドに共通の２．５ｋｂ骨格はそのまま残した。ｐＮＮ１１の新しい合成部分を図２に示す。これらの新しい構成物をそれぞれｐＳＱ１４８およびｐＳＱ１４９と呼ぶ。
【０１０６】
実施例IV
ＥＬＡＭ１のＤＮＡ配列
プラスミドｐＳＱ１４８およびｐＳＱ１４９の挿入物の全ＤＮＡ配列、およびＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６の挿入物の５′末端の配列の６２４ヌクレオチドを決定した。マキサム−ギルバート法（マキサムとギルバート、１９８０）を使用した。これらの配列は顕著な重複を有するため、ＥＬＡＭｃＤＮＡの複合配列、３８６３ヌクレオチドの配列を得た。この配列は、５′非翻訳領域の１４０ヌクレオチド、６１０アミノ酸をコードする１８３０ヌクレオチド、並びに３′非翻訳領域の１８９３ヌクレオチド（翻訳停止コドンおよびポリアデニル化シグナルを含む）よりなる。推論されたアミノ酸配列から誘導された成熟蛋白質をＥＬＡＭ１とし、コード領域をＥＬＡＭ１ＤＮＡ配列とした。ＥＬＡＭ１のｃＤＮＡ配列を図１に示す。
【０１０７】
ジーンバンク・データベース（解放５８、１９８８年１２月）の検索により、ＥＬＡＭ１のＤＮＡ配列は、公知のＤＮＡ配列とは顕著な相同性を有さないことが明らかになった。
【０１０８】
このｃＤＮＡ配列を使用してＥＬＡＭ１アミノ酸配列を推論した。これも図１に示す。この配列の解析により、次の特性が明らかになった。この蛋白質は、シグナル配列に特徴的な疎水性Ｎ−末端配列を有する（フォン・ヘイジン、１９８６）。蛋白質配列決定では、シグナル開裂部位および成熟Ｎ−末端は決定しなかったが、フォン・ヘイジンによれば、成熟Ｎ−末端アミノ酸はトリプトファン、図１のヌクレオチド番号２０４であると考えられる。ポリペプチドの外部ドメインは、シグナル配列を含む約５５４アミノ酸であり、この後に２４アミノ酸の疎水性膜横断領域が続く。この蛋白質は、３２アミノ酸の短い、荷電したサイトプラズム尾部を有する。この蛋白質はシステインに富み、１１の可能なＮ−グリコシル化部位を含むことを銘記する。
【０１０９】
ＥＬＡＭ１のアミノ酸配列とＭＢＲＦおよびＮＥＷ蛋白質データベースの他の蛋白質とを比較し、相補的Ｃ２前駆体、β−２糖蛋白質Ｉ、Ｃ４ｂ結合蛋白質、相補的因子Ｂ、相補的因子Ｈ、ドロソフィラのノッチ蛋白質、ＩｇＥレセプタヘパチックレクチン、並びに凝集因子ＩＸおよびＸ前駆体を含む幾つかの蛋白質との相同性を認めた。よって、前記した蛋白質との相同性に基き、ＥＬＡＭ１を少なくとも３つのドメインに分割することができる：（１）レクチン様ドメイン（図１のヌクレオチド２０４〜５６３）、（２）ＥＧＦ様ドメイン（ヌクレオチド５６４〜６６８）、並びに（３）リピート当り６のシステイン残基を含有する５９〜６３アミノ酸のコンセンサスシステインリピート単位（ヌクレオチド６６９〜１７９３）。それぞれのリピート中の他の変化しないアミノ酸は、プロリン、グリシン並びにトリプトファンである。
【０１１０】
実施例Ｖ
ＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体
ＥＬＡＭ１を認識するモノクローナル抗体を作成するため、実施例Ｘ（後記）で行ったものと主として同様にしてハイブリドーマを調製した。ただし、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０細胞付着を遮断する能力について抗血清を試験することにより抗ＥＬＡＭ１抗体を生産するマウスを同定した。
【０１１１】
幾つかのアッセイを使用し、これらの抗ＥＬＡＭ１モノクローナルを生産するものにつきこの様式で産生したハイブリドーマを検索した。第１に、ＥＬＡＭ１を安定に発現するセルラインに結合する能力を有する抗体について、培養上澄を試験した。このセルラインは、ＥＬＡＭ１動物細胞発現ベクタ、ｐＢＧ３４１ｊｏｄ．ＥＬＡＭにより感染したＣＨＯ−ＤＨＦＲ- のラインとした。ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列をｐＣＤＭ８クローン６からｐＢＧ３４１．ｊｏｄのＮｏｔＩ部位（実施例ＶIII、後記に記載）に導入することによりこのプラスミドを創製した。ＥＬＡＭ１発現ＣＨＯ−ＤＨＦＲ- 誘導セルラインは、ＨＬ−６０細胞に対する付着アッセイを使用して検出した。
【０１１２】
第２に、サイトカイン誘導ＨＵＶＥＣｓに結合する能力（コントロールには結合しない）についてハイブリドーマ培養上澄を検索した。
【０１１３】
第３に、サイトカイン誘導ＨＵＶＥＣモノレイヤに対するＨＬ−６０細胞付着を阻害するこれらの能力につきこれらを試験した。
【０１１４】
３つの全てのアッセイで陽性の結果を与えた１つのハイブリドーマクローン、ＢＢ１１を同定した。ＢＢ１１免疫沈殿蛋白質は、ＥＬＡＭ１発現ＨＵＶＥＣｓおよびＣＯＳ細胞に由来する約１１０ｋＤおよび９６ｋＤの分子量を有し、ＥＬＡＭ１の種々のグリコシル化形態を示す（ベビラッカら、１９８９）。またこれは、ＥＬＡＭ１発現ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞に対するＨＬ−６０細胞の付着を完全に遮断した。これはＩｇＧ2bクラスのイムノグロブリンを生産した。ブタペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、６１１ピー・ハモンド・フェリー・アールディ、リンチカム、Ｍｄ、２１０９０（米国）に対し、１９８９年１２月１３日に寄託した。これは次のように同定される：
モノクローナル抗体ＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６
受託番号ＩＶＩ−１０２２０。
【０１１５】
実施例VI
ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂを発現するクローンの単離
更に、リンパ球およびリンパ球様セルラインに結合する２つの異なるＥＬＡＭｓの特徴を調べクローン化した。第１の工程として、４、２４、または４８時間、ＩＬ−１βまたはＴＮＦにより誘導したＨＵＶＥＣｓに対し、ＲＡＭＯＳ、Ｂ−リンパ球様ライン、ＪＵＲＫＡＴ、Ｔ−リンパ球様ラインの結合経路の特徴を調べた。ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ結合の両者は、ＩＬ−１βまたはＴＮＦによる誘発の４時間後に最大となり、結合は２４時間、誘発後４８時間維持されることを認めた。ＲＡＭＯＳ結合は温度感受性であり、室温では進行するが４℃では進行しなかった。ＪＵＲＫＡＴ結合は４℃で減少したが、完全には除去されなかったため、ＪＵＲＫＡＴは、温度感受性および温度非感受性の両者の成分を示した。ＪＵＲＫＡＴ細胞により免疫したマウス由来の抗血清は、ＨＵＶＥＣｓに対するＪＵＲＫＡＴおよびＲＡＭＯＳ細胞の両者の結合を阻害し、ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴがＭＩＬＡを共有することを示した。誘発後４〜４８時間で、ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴの両者は、ＥＬＡＭ１を発現するＣＯＳまたはＣＨＯ細胞に結合せず、ＨＵＶＥＣｓ上の少なくとも１つの他の誘導性ＥＬＡＭの存在を示した。
【０１１６】
ＨＵＶＥＣｓに結合するＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴに含まれるＥＬＡＭｓを発現するクローンを単離するため、実施例II、前記に記載した方法により、先に記載したＥＬＡＭ富化ＨＵＶＥＣｃＤＮＡサブライブラリを検索した。サブライブラリ感染ＣＯＳ７細胞と共に、カルボキシフルオレセイン二酢酸ラベルしたＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ細胞をインキュベートした。結合細胞の群集を有する細胞プレートの領域を取り出して溶解し、プラスミドを得、イー・コリに形質転換し、先に記載したようにＣＯＳ７細胞中で再アッセイした。再アッセイで陽性であった形質転換体に由来する個々の細菌コロニーからプラスミドを単離した。これらのプラスミドをＣＯＳ７細胞に個々に感染させ、ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴへの付着についての試験で陽性のプラスミドを同定した。このプラスミドからｃＤＮＡ挿入物を摘出し、放射能ラベルし、レーラ（１９７９）の手順に従ってノーザンブロットのプローブとして使用した。このプローブは、長さ約３．４ｋｂのＲＮＡ分子種にハイブリダイズした。このＲＮＡは、未誘導ＨＵＶＥＣＲＮＡにおいては検出できず、ＩＬ−１βによる処理の５、１０、３０または６０分後にかろうじて検出することができたが、ＩＬ−１βによる処理の２、２４、４８並びに７２時間後には十分に存在した。
【０１１７】
プラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１を作成した。このプラスミドを、ブタペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年５月２４日に寄託した。これは次のように同定される：
ＡＭｐＣＤＭ８クローン４１／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３
受託番号ＩＶＩ−１０２０６。
【０１１８】
また、他のＶＣＡＭからｃＤＮＡを単離した。
ＡＭｐＣＤＭ８クローン４１からラベルしたＶＣＡＭ１コード挿入物を用いてＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリ（実施例Ｉ）を検索した。これらのクローンの１つである１Ｅ１１を配列決定した。ＸｂａＩによる制限マッピングによる分析により、クローン４１挿入物より長い幾つかのクローンを認めた。これらの１つのクローンである１Ｅ１１を配列決定した。これを、ブタペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年１２月７日に寄託した。これは次のように同定される：
ＶＣＡＭ１Ｂクローン１Ｅ１１ｐＣＤＭ８／イー・コリＭＣ１０６１ｐ３
受託番号ＩＶＩ−１０２１６。
【０１１９】
また、他のＥＬＡＭｓについてのＤＮＡ配列を単離した。ＩＬ−１β誘発後４８時間に渡りＨＵＶＥＣｓからｍＲＮＡを集めた。ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１および１ｂについてｃＤＮＡ配列を単離するのに使用したものと同様にしてＥＬＡＭｃＤＮＡ配列を単離し得る。
【０１２０】
また、ＴＮＦ、ＬＴ、ＬＰＳ、インターフェロンのような他の炎症剤、またはこの種の薬剤の組合せを用いて誘発することにより他のＥＬＡＭｓを同定し得る。
【０１２１】
実施例VII
ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのＤＮＡ配列
マキサムとギルバート（１９８０）の方法により、プラスミドＡＭｐＣＤＭ８クローン４１の挿入物の全ＤＮＡ配列を決定した。この配列は、１０６ヌクレオチドの５′非翻訳領域、１９４１ヌクレオチドをコードする６４７アミノ酸、並びに翻訳停止コドンを含む７６４ヌクレオチドの３′非翻訳領域よりなる。このｃＤＮＡ配列から誘導した蛋白質をＶＣＡＭ１とし、コード配列をＶＣＡＭ１ＤＮＡ配列とした。図３にＶＣＡＭ１のｃＤＮＡ配列を示す。ＶＣＡＭ１の推定されるアミノ酸配列を同様に図３に示す。
【０１２２】
また、マキサムとギルバート（１９８０）の方法により、プラスミドＶＣＡＭ１ｂｐＣＤＭ８１Ｅ１１の挿入物のＤＮＡ配列を決定した。この配列は、９９ヌクレオチドの５´非翻訳領域、２２１７ヌクレオチドをコードする７３９アミノ酸、並びに翻訳停止コドンを含む７６４ヌクレオチドの３′非翻訳領域よりなる。ｃＤＮＡ配列から誘導された成熟蛋白質をＶＣＡＭ１ｂとし、コード配列をＶＣＡＭ１ｂＤＮＡ配列とした。ｃＤＮＡ配列および推定されたＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列を図４に示した。
【０１２３】
ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのＤＮＡおよびアミノ酸配列の比較により、１つの有意な差以外は、これらは実質的に同一であることが明らかとなった。すなわち、ＶＣＡＭ１ｂは、コード領域の中間付近に２７６ヌクレオチドの挿入を含む。これらのヌクレオチドは、ＶＣＡＭ１ドメイン３の末端とＶＣＡＭ１ドメイン４の開始部との間に位置する８４アミノ酸の余分なドメインを形成する９２の付加的なアミノ酸をコードする。ＶＣＡＭ１ドメイン３Ｂとしたこのドメインの意義を以下に論ずる。
【０１２４】
配列の解析により次の特性が明らかとなった：ＶＣＡＭ１ポリペプチドは、シグナル配列（フォン・ヘイジン、１９８６）を特徴とする疎水性Ｎ−末端配列を有する。蛋白質配列決定では、シグナル開裂部位および成熟Ｎ−末端を決定しなかったが、ヘイジンにより、成熟蛋白質のＮ−末端アミノ酸は、図３のヌクレオチド番号１７９のフェニルアラニンと推定される。このポリペプチドの細胞外ドメインは、シグナル配列を含む約６０６アミノ酸であり、その後に２２アミノ酸の疎水性膜横断領域が続く。この蛋白質は、１９アミノ酸からなる短い荷電したサイトプラズム尾部を有する。この蛋白質は、６の可能なＮ−グリコシル化部位を含有することを銘記する。
【０１２５】
同様に、成熟ＶＣＡＭ１ｂ蛋白質のＮ−末端アミノ酸はフェニルアラニンの筈であり、これは図４のヌクレオチド番号１７２である。このポリペプチドの細胞外ドメインはＶＣＡＭ１より長く、シグナル配列を含む約６９８アミノ酸であり、この後に２２アミノ酸の疎水性膜横断領域が続く。この蛋白質は、１９アミノ酸の短い荷電したサイトプラズム尾部を有する。この蛋白質は７の可能なＮ−グルコシル化部位を含有することを銘記する。
【０１２６】
ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのアミノ酸配列とＮＢＲＦおよびＮＥＷ蛋白質データベース中の他の蛋白質とを比較することにより、非特異的交叉反応抗原（ＮＣＡ）、胆汁糖蛋白質１（ＢＧ１）、神経細胞付着分子（ＮＣＡＭ）、発癌胚抗原（ＣＥＡ）、免疫グロブリンα鎖一定領域、Ｔ細胞レセプタ（ＴＣＲ）αおよびβ鎖変動領域、並びにミエリン関連糖蛋白質（ＭＡＧ）を含む幾つかの蛋白質との顕著な相同性が明らかとなった。より少ない相同性が、ミオシン軽鎖キナーゼ、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、アデノウイルスＥ１Ａ２８Ｋ蛋白質、シウドウリジン合成酵素、並びにキシルロキナーゼについて認められる。ＶＣＡＭ１および１ｂ並びにＶＣＡＭ１および１ｂＤＮＡ配列は、先に記載したＥＬＡＭ１（前記）と全く相同性を示さず、これとは異なるものである。
【０１２７】
重要なことは、ＮＣＡ、ＢＧ１、ＮＣＡＭ、ＣＥＡ、ＭＡＧ並びにＴＣＲが免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であることである（ウイリアムスとバークレイ、１９８８、フンカピラーとフッド、１９８９）。このファミリーの構成員は、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子の基本構造単位、Ｉｇ相同単位に対して相同な１以上の領域の存在により特定される（フンカピラーとフッド、１９８９）。これらの単位は、長さ約７０〜１１０残基の一次アミノ酸配列を特徴とし、５０〜７０残基に及ぶ実質的に変動しないジスルフィド架橋を有し、「抗体の折り畳み」と呼ばれる三次構造を確立する際に包含される幾つかの他の比較的保存された残基を有する。これらの単位は、更に３つの群に分割することができる。すなわち、Ｖ、Ｃ１およびＣ２（ウイリアムスとバークレイ、１９８８）、またはＶ、ＣおよびＨ（フンカピラーとフッド、１９８９）であり、内部システイン離間、β鎖の数、並びに保存残基の種類を含む種々の基準に基く。これらの基準を推論されたＶＣＡＭ１の一次配列に適用すると、この配列を６のＩｇ単位に分割することができ、これをドメイン１〜６とすると、その全てはＣ２またはＨサブセットとなり、それぞれ約１００アミノ酸の長さである。図３に示すように、６のドメインの変動しないジスルフィド架橋は、システイン４７および９５（ドメイン１）、１３７および１９５（ドメイン２）、２４６および２９１（ドメイン３）、３３３および３９１（ドメイン４）、４４２および４８７（ドメイン５）並びに５３１および５７６（ドメイン６）の間に存在する。
【０１２８】
前記したように、ＶＣＡＭ１ｂは７のドメインを有する。付加的なドメインをドメイン３Ｂとした。このドメインは、図４のヌクレオチド１０２７で開始しヌクレオチド１３０５で終了するＶＣＡＭ１ｂの付加的な２７６ヌクレオチドに含まれる。ドメイン１〜３に及ぶＤＮＡ配列は、ドメイン３Ｂ〜５に及ぶＤＮＡ配列に対し７２％相同である。ポリペプチドレベルでは、それぞれドメイン１および３Ｂ、２および４、並びに３および５の間に顕著な相同性がある。図５および図６に、ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのドメイン構造を示す。
【０１２９】
ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂのｍＲＮＡは２つの機構により生成し得る。これらは同一の遺伝子生成物の交互にスプライスされた形態を与えることができるか、別のＶＣＡＭ対立遺伝子の生成物たり得る。これらの可能性の区別に供すべく、サイトカイン誘発後の異なる時点で、３つの個体からのＶＣＡＭ１およびｍＲＮＡを試験した。３つの異なる個体に由来する臍帯からＨＵＶＥＣｓを調製し、緒のサンプルを＃１、＃２、並びに＃３とラベルした。それぞれの調製物を４つの別のフラスコに分け、ＴＮＦによる０（未処理）、２．５、２４並びに４８時間の処理に供した。ＶＣＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂｍＲＮＡの相対量は、ノーザンブロットおよびそれぞれの形態について特異的な合成オリゴヌクレオチドによるプローブによって決定した。ＶＣＡＭ１ｂは、３つの臍帯調製物の全てにおいて、明らかに主要な存在するｍＲＮＡであった。ＶＣＡＭ１は緒＃１および＃３に存在し、２．５時間の誘発時点で最も優勢であったが、緒＃３ＶＣＡＭ１も２４および４８時間において存在した。緒＃２細胞は殆どまたは全くＶＣＡＭ１ｍＲＮＡを有さなかったが、ＶＣＡＭ１ｂｍＲＮＡの量は、緒＃１および＃３に由来するＨＵＶＥＣｓ中のものと対比し得た。これらの２つの生成物が生成する機構はなお不明であるが、交互にスプライスされる可能性がある。２つのｍＲＮＡは、スプライス部位の可能性のある点において１つのドメインの欠損以外は同一であるためである。そのドメイン間の位置（フンカピラーとフッド、１９８９）およびスプライス部位に典型的なジヌクレオチドＡＧの存在（ブレサナクとチャンボン、１９８１）により判断したものである。更に、交互スプライシングは、ＶＣＡＭ１が明らかに最も関連するＩｇ遺伝子スーパーファミリーの他の構成員に共通である（フンカピラーとフッド、１９８９）。
【０１３０】
作用的には、ＶＣＡＭ１の２つの形態の差異は最小であると考えられる。両者の形態は、ＣＯＳ７細胞中で過渡的に発現された場合、ＲＡＭＯＳ細胞に結合し、この結合はＭｏａｂ１４Ｂ９により完全に阻害されたことから、同一のエピトープがそれぞれの場合の結合に関与することを示す。更に、このエピトープは、最初の３つのドメイン内に位置することを示したが、これは両者の形態に共通である（実施例VIII、前記参照）。
【０１３１】
実施例VIII
組換え可溶性ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂ
組換え可溶性ＥＬＡＭ１（ｒｓＥＬＡＭ１）を発現するベクタを作成した。このベクタをｐＳＡＢ１０８と呼ぶ。ｐＳＡＢ１０８により発現されるｒｓＥＬＡＭ１は、図１のヌクレオチド１４１〜ヌクレオチド１９７０のＤＮＡ配列によりコードされるＥＬＡＭ１の細胞外ドメインの一部を含有する。
【０１３２】
ｐＳＡＢ１０８を作成するため、第１にｒｓＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ断片を創製した。ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩによりＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６を消化した。これにより、ＥＬＡＭ１をコードするＤＮＡ配列を含む３．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（実施例IIIに記載）により予め処理したＮｏｔＩ消化ｐＮＮ１１にこの断片をサブクローン化した。これをベクタｐＮＮＥＬＡＭ１とした。
【０１３３】
部位特異的変異誘発を使用し、ＥＬＡＭ１の膜横断および細胞内領域を除去した（ペデンとナサンス、１９８２、カルデロンら、１９８２、オーストラら、１９８３）。よって、ｐＮＮＥＬＡＭ１のサンプルをＥｃｏＲＩにより消化し、大きい断片を単離した。ＳｃａＩによりｐＮＮＥＬＡＭ１の他のサンプルを線状化した。その後、配列５′ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＣＣＣを有するオリゴヌクレオチドを合成した。この配列がＥＬＡＭ１アンチセンス配列にハイブリダイズすると、これはヌクレオチド番号１７９０以降のＥＬＡＭ１ＤＮＡ配列に停止コドンおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入する。モリナガら（１９８４）およびチャンら（１９８４）の方法により、これらの３つの断片を使用してヘテロデュープレックスを創製した。クレニュー断片およびＴ４リガーゼを用いて一本鎖ギャップを埋め、混合物を使用してイー・コリＭＣ１０６１を形質転換した。ＢａｍＨＩ部位についてチェックすることにより得られたコロニーを検索し、変異誘発クローンを選択した。結果的に発現に際し、ポリペプチドの膜横断領域は除去され、Ｃ−末端アミノ酸はプロリンである。これをプラスミドｐＳＡＢ１００と呼ぶ。
【０１３４】
その後ＡａｔIIおよびＮｃｏＩによりｐＳＡＢ１００を消化し、５．２ｋｂ断片を単離した。また、ｐＮＮＥＬＡＭ１をこれらの２つの酵素で消化し、１．４ｋｂ断片を単離した。ＮｃｏＩは、ＥＬＡＭ１コード領域の中央付近で、図１のヌクレオチド９２７で切断する。これらの２つのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＳＡＢ１０８とした。このように構成したのは、部位特異的変異誘発により、場合により分子の他の部分に変異が起こり、ｒｓＥＬＡＭ１のコード領域中でのこの種の全ゆる変異を回避せんがためである。ＮｏｔＩによりｐＳＡＢ１０８を消化し、３．８ｋｂ断片を単離した。この断片を、後記するようにして創製したｐＢＧ３４１．ｊｏｄの７８１９ｂｐ断片に連結した。
【０１３５】
まず、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ベセスダ、Ｍｄ（米国）からｐＳＶ２−ＤＨＦＲ、ＡＴＣＣ３７１４６を得た（サブラマニら、１９８１）。これをＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩにより消化し、４４２０ｂｐ断片を単離した。その後、ＡｐａＩオーバーハングを有する合成二本鎖ＤＮＡ配列、ヒトガストリン遺伝子（サトら、１９８６、図４）のヌクレオチド＋１９０〜＋２３３、ＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＩオーバーハングをコードするＤＮＡ配列を作成した。このオリゴヌクレオチドをｐＳＶ２−ＤＨＦＲの４４２０ｂｐ断片に連結し、得られたプラスミドをｐＤＴ４と呼ぶこととした。ＡａｔIIおよびＸｈｏＩによりこのプラスミドを消化し、４３９１ｂｐ断片を単離した。
【０１３６】
その後、ＡａｔIIおよびＳａｌＩによりミュラー阻害物質発現ベクタｐＤ１（ケートら、１９８６）を開裂し、５４６２ｂｐ断片を単離した。この断片をｐＤＴ４の４３９１ｂｐ断片と連結してｐＪＯＤ−１０を作成した。
【０１３７】
ＨｉｎｄIIIおよびＢｓｔＥIIによりｐＪＯＤ−１０を消化し、ミュラー阻害物質をコードしない大断片を単離した。断片末端を平滑末端とし、この末端にＳａｌＩリンカを連結し、ベクタを自己連結させた。これはｐＪＯＤ−ｓを与えた。
【０１３８】
その後ＡａｔＩおよびＮｏｔＩによりｐＪＯＤ−ｓを消化し、６７５０ｂｐ断片を単離した。これを次のようにして創製したｐＢＧ３４１由来の１１００ｂｐＮｏｔＩ断片に連結した。
【０１３９】
ｐＢＧ３１２のＳｍａＩ部位（ケートら、１９８６）をＮｏｔＩ部位で置換することによりｐＢＧ３４１を創製した。ＢｇｌIIによりｐＢＧ３１２を線状化し、クレニューにより埋めることによりこの断片を平滑末端とし、これを自己連結させた。ＢａｍＨＩによりこのプラスミドを線状化し、再度平滑末端とし、これを自己連結させた。ＳｍａＩによりこのプラスミドを線状化し、配列５′ＧＣＧＧＣＧＣを有するＮｏｔＩリンカを末端に連結した。得られたプラスミドをｐＢＧ３４１と呼ぶこととした。
【０１４０】
ＡａｔIIおよびＮｏｔＩによりｐＢＧ３４１を消化し、１１００ｂｐ断片を単離した。この断片をｐＪＯＤ−ｓの６７５０ｂｐ断片に連結した。得られたプラスミドをｐＢＧ３４１．ｊｏｄと呼ぶこととした。このプラスミドは、ＳＶ４０初期およびアデノアイルス主要後期プロモータを含有する。ＮｏｔＩ部位にてプラスミドに挿入された遺伝子は、これらのいずれのプロモータからでも転写される。
【０１４１】
その後、ＮｏｔＩによりｐＢＧ３４１．ｊｏｄを線状化し、線状７８１９ｂｐ断片を単離した。これを、ｒｓＥＬＡＭ１をコードするｐＳＡＢ１０８の３．８ｋｂ断片に連結し、プラスミドｐＳＡＢ１１０を作成した。
【０１４２】
ＡａｔIIにより線状化したプラスミドｐＳＡＢ１１０を用いてエレクトロポーレーションによりＣＨＯ−ＤＨＦＲ- 細胞に感染させた。２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 、並びに６ｍＭデキストロース中で１０7 細胞／ｍｌを使用し、２０μｇプラスミドおよび２００μｇ超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、２７０Ｖおよび９６０μＦＤにて、バイオラド（登録商標）ジーン・パルサーによりエレクトロポーレーションを行った。感染後、選択培地、α- ＭＥＭ（５００ｎＭメトトレキセートおよび１０％透析ＦＣＳを含有する）中で細胞を培養した。コロニーを取り上げ、これらを９６穴クラスタープレートにプレートし、モノクローナル抗体ＢＢ１１を使用してｒｓＥＬＡＭ１発現細胞を検出した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する完全培地中で群集になるまで細胞を生育させた後、細胞がｒｓＥＬＡＭ１を生産する２％ＦＣＳを含有する培地中でこれらを維持した。培地を回収し、３〜４日毎に新鮮な２％血清によりこれを置換した。
【０１４３】
このコンディショニングした培地から少なくとも９５％純度にｒｓＥＬＡＭ１を単離した。これには、培地を濃縮し、プロテインＡセファロースに共有結合した（シュナイダーら、１９８２）Ｍｏａｂ  ＢＢ１１を用いてこれを一夜インキュベートすることが包含される。その後ＰＢＳによりこの樹脂を洗浄し、未結合蛋白質を除去し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７により結合物質を溶出させ、溶出物をリン酸ナトリウムで中和し、これをＰＢＳに対して透析した。ＰＢＳ中でのプロテインＡセファロースによるクロマトグラフィにより、ｒｓＥＬＡＭ１を更に精製した。
【０１４４】
次のアッセイを使用し、ｒｓＥＬＡＭ１を生産したことを示す。直径６ｃｍの細菌用プラスチック（例えばファルコン＃１００７、登録商標）のペトリ皿に、２．５ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ９．５を添加した。これに１０μｇの純粋なｒｓＥＬＡＭ１を添加した。このプレートを室温で６０分間インキュベートし、ｒｓＥＬＡＭ１をプレートに結合させた。その後培地を吸引し、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳによりこれを置換した。この溶液中でプレートを一夜４℃でインキュベートし、プレート上の残留する蛋白質結合部位をブロックした。プレートを室温に加温し、１０％ウシ胎児血清を含有する培地によりこれらを洗浄し、２ｍｌの細胞（２×１０6 ｍｌ-1）を用いて２０分間これらをインキュベートした。培地を吸引し、３ｍｌのそれぞれの培地（１０％血清を有するＲＰＭＩ１６４０）によりプレートを２回洗浄した。その後顕微鏡によりプレートを検定した。
【０１４５】
ＨＬ−６０細胞のようなＥＬＡＭ１に結合する細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１被覆プレートに結合することを認めたが、例えばＢセルラインＲＡＭＯＳのようなＥＬＡＭ１に結合しない細胞はこれらのプレートに結合しないことを認めた。
【０１４６】
更に、特異的Ｍｏａｂ  ＢＢ１１はｒｓＥＬＡＭ１被覆プレートに対するＨＬ−６０細胞の結合を遮断することを認めた。また、これらの結果はまず、ｒｓＥＬＡＭ１が生産され、次にＥＬＡＭ１のように、ｒｓＥＬＡＭ１は白血球に結合する能力を有することを示す。
【０１４７】
また、組換え可溶性ＶＣＡＭ１ｂ（ｒｓＶＣＡＭ１ｂ）を発現するベクタを作成した。このベクタをｐＢＮ１００６と命名した。ｐＢＮ１００６により発現されるｒｓＶＣＡＭ１ｂは、図４に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド１０７〜ヌクレオチド２１９３によりコードされるＶＣＡＭ１ｂの細胞外ドメインの一部を含有する。
【０１４８】
可溶性ＶＣＡＭ１ｂの全長を構成的に発現し得るセルラインを作成するため、まずアデノウイルス主要後期プロモータの下流の独特のＮｏｔＩ部位を有するｐＪＯＤ−ｓからベクタを作成し、発現ベクタへのＮｏｔＩ断片の挿入を図った。プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩ開裂によりｐＪＯＤ−ｓを線状化した。突出する５′末端をマング・ビーン・ヌクレアーゼを使用して平滑末端とし、線状化したＤＮＡ断片を、低融点アガロース（ＬＭＡ）ゲル電気泳動により精製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してＤＮＡ断片を再連結した。その後連結した分子をイー・コリＪＡ２２１（ＡＴＣＣ受託番号３３８７５）に形質転換した。ＮｏｔＩ部位の非存在についてコロニーを検索した。得られたベクタをｐＪＯＤ−ｓデルタＮｏｔ１とした。ｐＪＯＤ−ｓデルタＮｏｔ１をＳａｌＩを使用して線状化し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを使用して５′末端を脱リン酸化した。ＬＭＡゲル電気泳動により線状化したＤＮＡ断片を精製し、ホスホリル化オリゴヌクレオチドＡＣＥ１７５（５′ｐＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ）の存在下に連結した。連結混合物をイー・コリＪＡ２２１に形質転換し、ＮｏｔＩ部位の存在についてコロニーを検索した。合致するプラスミドをｐＭＤＲ９０１と命名した。
【０１４９】
ＡｌｕＩによる消化によりヌクレオチド２１９３でＶＣＡＭ１ｂクローン１Ｅ１１を縮めることにより、可溶性ＶＣＡＭ１ｂを得、これにより膜横断および細胞内部分並びに３′非翻訳領域を除去した。停止コドン−ＮｏｔＩリンカを添加し、挿入物をｐＣＤＭ８に再連結した。ＮｏｔＩによりｐＣＤＭ８から挿入物を切り取り、ＮｏｔＩ部位でｐＭＤＲ９０１に連結した。この構成物をｐＢＮ１００６としたが、これは図４に示すようにアミノ酸１〜６９８を有する可溶性ＶＣＡＭ１ｂの全長をコードする。
【０１５０】
先に記載した材料および方法を使用し、前記したｒｓＥＬＡＭ１およびｒｓＶＣＡＭ１ｂ分子の縮めた形態を発現するプラスミドを同様に作成した。これらの縮めた形態は、ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１ｂの細胞外領域の１以上の特定のドメインのアミノ酸配列からなり、これを使用していずれのドメインが細胞−細胞付着に直接関与するかを検討した。最初の実験では、これらの分子に対する抗体、すなわちそれぞれ抗体ＢＢ１１および４Ｂ９により認識されるＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１および１ｂのドメインを検討した。
【０１５１】
ＣＨ１０１とした可溶性ＥＬＡＭ１構成物を調製した。これはＥＬＡＭ１のレクチン様ドメインからなる。図１を参照すると、ＣＨ１０１は、ヌクレオチド１〜５５７（ＥＬＡＭ１のアミノ酸１〜１３９をコードする）および停止コドンを含むｃＤＮＡ配列の発現生成物であった。ＣＨ１０２とした他の可溶性構成物を調製した。これはレクチン様ドメインおよびＥＬＡＭ１のＥＧＦ様ドメインからなる。図１を参照すると、ＣＨ１０２は、ヌクレオチド１〜６７１（ＥＬＡＭ１のアミノ酸１〜１７７をコードする）および停止コドンを含むｃＤＮＡ配列の発現生成物であった。可溶性ＥＬＡＭ１構成物ＣＨ１０２は、抗ＥＬＡＭ１モノクローナル抗体、ＢＢ１１を免疫沈澱させることが認められた。
【０１５２】
次の可溶性ＶＣＡＭ１および１ｂ構成物を同様に調製した：（Ａ）ドメイン１（アミノ酸１〜１０８をコードする図３のヌクレオチド１〜４３０）、（Ｂ）ドメイン１＋ドメイン２（アミノ酸１〜２１７をコードする図３のヌクレオチド１〜７５７）、（Ｃ）ドメイン１＋ドメイン２＋ドメイン３（アミノ酸１〜３１０をコードする図３のヌクレオチド１〜１０３６）、（Ｄ）ドメイン１＋ドメイン２＋ドメイン３（ＶＣＡＭ１とＶＣＡＭ１ｂｃＤＮＡとのハイブリッド、図４に示すアミノ酸１〜３１７をコードする）、（Ｅ）可溶性ＶＣＡＭ１の全長（図３のヌクレオチド１〜１９２４、アミノ酸１〜６０６をコードする）、並びに（Ｆ）可溶性ＶＣＡＭ１ｂの全長（図４のヌクレオチド１〜２１９３、アミノ酸１〜６９８をコードする）。
【０１５３】
前記したＶＣＡＭ１構成物の内、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ並びにＦ（Ａを除く）は、抗ＶＣＡＭ１抗体４Ｂ９と免疫沈澱する。また、構成物Ｂ、Ｄ、Ｅ並びにＦは、細胞吸着に機能的な蛋白質を生産することが認められた。構成物Ｂ、Ｄ、Ｅ並びにＦによりコードされる蛋白質を含有するコンディショニング培地を濃縮し、固定化４Ｂ９抗体の免疫アフィニティカラムを通し、結合した蛋白質を溶出させ、ｒｓＥＬＡＭ１について記載したように中和した。ｒｓＥＬＡＭ１について記載したように溶出蛋白質をプラスチックに固定化し、ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ細胞の支持体特異的付着を認めた。これらの結果は、ＶＣＡＭ１の最初の２つのドメインは、所定のＶＬＡ４発現ヒトリンパ球セルラインの付着を支持するのに十分であることを示す。
【０１５４】
実施例IX
ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１プロモータの単離
ＥＬＡＭ１およびＶＣＡＭ１遺伝子について染色体クローンを単離し特徴を調べた。ＥＬＡＭ１クローンを次のようにして単離した。
【０１５５】
プローブとして全ＥＬＡＭｐＣＤＭ８クローン６挿入物またはその５´末端から４００塩基対断片を選択した。ランダンム・プライミングによりこれらの分子を32Ｐラベルした。その後、ＥＬＡＭｃＤＮＡプローブを用いてヒト染色体ＥＭＢＬ３ライブラリを検索した。ライブラリから染色体ＥＬＡＭ１クローンを単離して特徴を調べ、これをＥＬ１−０７とした。これは、ＥＬＡＭ１の転写プロモータを含む１５ｋｂの５′フランク配列および遺伝子の５′末端の約１００塩基対のコード領域を含む。現在の知識によれば、誘導についての関連する制御配列は、このファージクローンにより示されるＤＮＡ配列内に含まれることが示唆されている（レオナルドとバルチモア、１９８９）。８４０ｂｐの５′フランク配列および７２０ｂｐのＥＬＡＭ１遺伝子の５´末端を含む領域の配列決定を行った（最初の２つのエクソン、最初のイントロン並びに第２イントロンの一部を含む）。この配列を図７に示す。５′フランク領域は、ＴＡＴＡＡＡおよびＣＡＡＴ配列を含む古典的なプロモータ構造を示す。またこれは、転写の推定開始から約９５塩基対上流の配列ＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣを含む。この配列は、ヒトκ免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子エンハンサに認められるものと同一のＮＦ−κＢ結合配列である。ＮＦ−κＢは、炎症および免疫応答に関連する多数の遺伝子（例えば免疫グロブリン、インターロイキン−２レセプタ、並びにβ−インターフェロン、その他）の転写を刺激することが知られた、または推定された誘導性ＤＮＡ結合蛋白質である。これは、ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１並びにＩＣＡＭ１の生産を刺激することが知られた同一のインデューサであるＴＮＦ、ＩＬ−１並びにＬＰＳにより活性化され得る（レナルドとバルチモア、１９８９、オスボーンら、１９８９）。ＮＦ−κＢＤＮＡ結合活性は、ＩＬ−１およびＴＮＦにより内皮細胞中で刺激されることを示したが、ここでは、内皮および他の種類の細胞中にプロモータ／レセプタ遺伝子構成物を感染させることにより、ＥＬＡＭ１プロモータからの誘導性転写に必要な最少のＤＮＡ配列の特定を行った。
【０１５６】
ブダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年１２月７日にクローンＥＬ１−０７を寄託した。これは次のように同定される：
ＥＬ１−０７
受託番号ＩＶＩ−１０２１８。
【０１５７】
ＶＣＡＭ１ｃＤＮＡの５′末端に相同の32Ｐラベルした３０塩基オリゴマープローブを用いて前記ＥＭＢＬ３ヒト染色体ライブラリをプローブすることにより、ＶＣＡＭ１遺伝子を示すＥＭＢＬ３染色体クローンを単離した。このクローンをＶＣ１−１６とし、これをブダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年１２月７日に寄託した。これは次のように同定される：
ＶＣ１−１６
受託番号ＩＶＩ−１０２１７。
【０１５８】
ＶＣＡＭ１遺伝子の約３００ｂｐの５′フランク配列および９００ｂｐの５′末端を含む領域を配列決定した（第１エクソン、第１イントロン、並びに第２エクソンの一部を含む）。この配列を図８に示す。５′フランク配列は、古典的なＴＡＴＡＡＡ配列および２つのＮＦ−κＢコンセンサス配列：転写開始から約−６３〜−５４からのセンス鎖上のＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣ、および約−６９〜−７８からの逆相補鎖上のＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣを有する。この配列は、ＥＬＡＭ１プロモータ配列について提唱したものと類似する検討に使用し得る。
【０１５９】
実施例Ｘ
抗体認識ＣＤＸ
ＣＤＸ、ＥＬＡＭ１媒介付着に関与するＭＩＬＡを単離した。最初の工程として、白血球細胞表面上で抗原を認識し、白血球−内皮細胞結合を妨害するモノクローナル抗体を調製した。これらのモノクローナルが認識する抗原がＥＬＡＭ１媒介付着に関与することを確認するため、ＥＬＡＭ１媒介結合が排他的な細胞−細胞結合経路である系でモノクローナルを試験した。
【０１６０】
１．ＣＤＸに対するモノクローナル抗体の調製および分析
ａ．付着アッセイ
白血球−内皮細胞結合を阻害するＭｏａｂｓを同定するため、内皮細胞−白血球付着を検出する改良したアッセイを開発した。ＨＬ−６０細胞およびＨＵＶＥＣｓを使用してこのアッセイを行った。ＭＩＬＡを発現するいずれかのセルラインを使用し、ＥＬＡＭを発現するいずれかのセルラインを用いて、この種のアッセイを行うことができるのは明らかであろう。４８穴組織培養プレート中で、ＨＵＶＥＣｓを群集に生育させた（８×１０4 細胞／穴）。ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより細胞を１回洗浄し、それぞれの穴に対して１３Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βにより０．５ｍｌのＲＰＭＩ／１％ＦＣＳを添加した（コントロールの穴を除く）。これらの細胞を３７℃で４時間インキュベートした。使用の直前にこれらをＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより１回洗浄した。アッセイに使用したＨＬ−６０細胞を１μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンにより一夜ラベルした。これらの細胞を１回洗浄した後、これらを５×１０6 細胞／ｍｌでＲＰＭＩ／１％ＦＣＳ中に再懸濁した。１００μｌのＨＬ−６０細胞を取り、５０μｌのＭｏａｂ（１μｇ／ｍｌ）を用いて０℃で３０分間これらをインキュベートした。その後それぞれの穴に対して１５０μｌのＨＵＶＥＣｓを添加した。２０℃で１０分間細胞を結合させた後、ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳを用いて穴を穏やかに１回洗浄した。ＲＰＭＩ／１％ＦＣＳにより穴を満たし、プレートを封止し、これらを反転させ、５００×ｇで２分間これらを遠心した。培地を除去し、ＰＢＳ* により更に２回穴を洗浄した（ＰＢＳ* は、Ｃａ++を含有せず、Ｍｇ++を含有しないＰＢＳである）。２００μｌの０．２ＮＮａＯＨ／１％ＳＤＳによりそれぞれの穴中で細胞を可溶化し、４．５ｍｌのシンチラント（レディ・プロテイン、ベックマン）を添加し、シンチレーション・カウンタでカウントすることにより、ＨＵＶＥＣｓに結合したＨＬ−６０細胞の数を測定した。
【０１６１】
ｂ．ハイブリドーマの調製
ＣＤＸに対するモノクローナル抗体を作成するため、次のようにしてハイブリドーマを調製した。全体の生きたＨＬ−６０細胞を用いてＢＡＬＢ  Ｃマウスを注射した。最初に、それぞれのマウスは腹膜内（ＩＰ）にＰＢＳ* 中の２×１０7 細胞を受けた。２〜２４時間後に異なる部位にて腹膜内に完全フレンドアジュバントを注射した。６週間に渡り、２週間毎に２×１０7 細胞ＩＰによりマウスを補助装薬した。融合４日前に、マウスに対し静脈内に５×１０6 細胞、ＩＰにより５×１０6 細胞を注射した。
【０１６２】
前記した付着アッセイによりＩＬ−１β刺激ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０細胞の結合を阻害する能力についてこれらの動物からの免疫血清を試験した。第３回の補助装薬後に免疫血清は試験の結果陽性となり、免疫した動物の脾臓細胞からのハイブリドーマ生産を続けた。当業界で標準的な様式（ゴディング、１９８３参照）で、脾臓細胞とミエローマ細胞との融合を行った。
【０１６３】
前記した付着アッセイを使用し、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＨＬ−６０細胞の結合を阻害するモノクローナル抗体を生産するものについてハイブリドーマを検索した。このようにして、ＣＤＸを認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定した。これらのハイブリドーマの５つを使用して腹水液を生産した。ＳＧＢ3 Ｂ4 としたこれらの１つを、ブダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９８９年４月２５日に寄託した。これは次のように同定される：
ＳＧＢ3 Ｂ4 
受託番号ＩＶＩ−１０２０５。
【０１６４】
ｃ．ＦＡＣＳ分析
いずれの種類の細胞に対してこのモノクローナルが結合するかを同定するため、ＦＡＣＳ分析を行った。これは、２×１０5 細胞を取り、ＰＢＳ* によりこれらを１回洗浄し、その後２５μｌのＲＰＭＩ、１％ＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧ、並びに０．１％アジ化ナトリウム中で０℃にて１０分間インキュベートすることによりＦｃレセプタを遮断することを含む。その後抗体（１μｇ／ｍｌで２５μｌ）を添加し、細胞を０℃で３０分間インキュベートした。２５０×ｇで５分間細胞を遠心し、緩衝液Ａ（ＰＢＳ* 、５％ＦＣＳ、０．１％アザイド）によりこれらを２回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌヒトＩｇＧを含有する２５μｌの緩衝液Ａにこれらを再懸濁した。フルオレセイン共役抗マウスＩｇＧ（緩衝液Ａ中に５μｇ／ｍｌで２５μｌ）（キャペル）を添加し、混合物を０℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心し、これらを緩衝液Ａにより１回洗浄し、これらを２５０μｌの緩衝液Ａに再懸濁した。その後、ベクトン−ディキンソンＦＡＣＳター・セルソーターによりこれらを分析した。
【０１６５】
主としてＨＬ−６０細胞−ＨＵＶＥＣ付着アッセイについて記載したように、ＥＬＡＭ１発現ＣＯＳ細胞により細胞結合の検討を行った。
【０１６６】
２．ハイブリドーマＳＧＢ3 Ｂ4 は、ＣＤＸを認識するモノクローナル抗体を生産することの説明
ＥＬＡＭ１媒介結合に関与するＭＩＬＡ（特にＣＤＸ）について、ハイブリドーマＳＧＢ3 Ｂ4 由来のモノクローナルの特異的認識を示す証拠たる幾つかのラインを開発した。
【０１６７】
第１に、α−ＣＤＸ抗体は、ＣＤＸを発現する細胞のＥＬＡＭ１発現細胞への結合を阻害する筈である。付着アッセイを使用し、これらのモノクローナルが、ＩＬ−１β誘導ＨＵＶＥＣｓおよびＥＬＡＭ１発現ＣＯＳ７細胞に対するＨＬ−６０細胞およびＰＭＮｓの結合を実際に阻害することを示す。６０．３、β2 インテグリン鎖に対するモノクローナル抗体の存在下では、ＥＬＡＭ１発現ＣＯＳ７細胞中で利用されるＨＬ−６０細胞およびＰＭＮｓに対する唯一の結合経路はＥＬＡＭ１自体である。したがって、この系における細胞−細胞付着の抗体阻害は、ＣＤＸを経由するＥＬＡＭ１経路を介する必要がある。
【０１６８】
第２に、α−ＣＤＸモノクローナルは、付着アッセイにおいてＥＬＡＭ１発現細胞に結合するこれらの細胞を認識する筈であるが、このアッセイにおいてＥＬＡＭ１に結合しないこれらの細胞を認識しない筈である。ＦＡＣＳ分析を使用し、このＭｏａｂｓの結合パターンを決定した。これらのモノクローナルは次の種類の細胞に結合した：ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨＴ−２９、ＴＨＰ−１、ＳＷ６２０、ＳＷ９４８、ＳＷ１４１７、単球、エオジン好性細胞、並びにＰＭＮｓ。これらは次の細胞には結合しなかった：ＲＡＪＩ、ＤＡＵＤＩ、ＲＡＭＯＳ、ＨｅＬａ、またはＪＹ。（末梢血液白血球を分画することにより非形質転換細胞を単離した。）これらの結合パターンは、これらの細胞のＥＬＡＭ１発現ＣＯＳ７細胞およびｒｓＥＬＡＭ１被覆プレートに対する結合と正確に平行したものである。
【０１６９】
第３に、α−ＣＤＸモノクローナルは、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ１並びにＣＤ４のような他の白血球細胞表面抗原に対するモノクローナルとは異なる認識パターンを示す筈である。実際、ここで考える他のモノクローナルには、本発明の抗体と同じ細胞認識パターンを示すものはない。
【０１７０】
要は、ハイブリドーマＳＧＢ3 Ｂ4 により、およびここで単離した他のハイブリドーマにより生産されるモノクローナルがＣＤＸを認識することは明らかである。最終的に、これらのモノクローナルを使用してＣＤＸ自体を単離した。
【０１７１】
実施例XI
ＣＤＸの単離
１．ＨＬ−６０細胞表面蛋白質のヨウ素化
ＰＢＳ* により１×１０7 ＨＬ−６０細胞を３回洗浄し、これらを０．５ｍｌＰＢＳ* に再懸濁し、５０μｇの１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコウリル（シグマ・ケミカルス社）により被覆したチューブにこれらを添加した。これに１ｍＣｉ125 Ｉを添加した。この混合物を０℃で３０分間インキュベートした。ラベルした細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを含有するチューブに移し、１０００×ｇで５分間これらを遠心した。その後これらを最初に別の１０ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳにより、次に２ｍｌのＰＢＳ* により洗浄した。（また、35Ｓ−メチオニンまたは35Ｓ−システインを用いて細胞を代謝的にラベルした。）１％ＮＰ４０、２ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＥＤＴＡ、大豆トリプシンインヒビタ（５０ｍｇ／ｍｌ）並びにロイペプチン（１ｍＭ）（シグマ・ケミカルス社）を含有する１．０ｍｌのＰＢＳ* の添加により細胞を溶解した。その後これらを０℃で３０分間インキュベートした。溶解物を１０分間１０，０００×ｇで遠心して粒子物を除去した。１０μｇのウサギ抗マウスＩｇＭ（ジャクソン・イムノ−リサーチ・ラブス）および５０μｌの蛋白質Ａセファロース（ジムド、２ｍｇ蛋白質Ａ／ｍｌ）を用いて、０℃で２時間、ラベルした可溶化膜蛋白質を含有する上澄を予備清澄化した。溶解物を４℃で保存した。
【０１７２】
２．ＣＤＸの免疫沈殿
Ｍｏａｂｓを使用してこれを免疫沈殿させるべく他のラベルした蛋白質からＣＤＸを精製した。次のようにして免疫沈殿を行った。
【０１７３】
１０λのＡＲＸビーズを用いて４℃で２時間予備清澄化した溶解物（５０〜１００μｌ）をインキュベートした。０．７５％ＮＰ４０、０．２％ＤＯＣ、並びに１ｍＭＥＤＴＡを含有する２ｍｌのＰＢＳ* によりセファロースを４回洗浄した。その後、ＡＲＸビーズを非還元性ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した。このサンプルを８５℃で１０分間加熱し、上澄を除去した。これにβ−ＭＥを５％添加し、５分間加熱し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分子を分離した。ゲルを乾燥し、これをオートラジオグラフにかけた。
【０１７４】
ＣＤＸは、約１５０ｋＤの分子量を有する単一の拡散バンドとしてオートラジオグラフ上に現れた。
【０１７５】
実施例XII
ＣＤＸを発現するクローンの単離
実施例Ｉの一般的手順に従い、２つの種類のＣＤＸ発現細胞、ＨＬ−６０細胞およびＵ９３７細胞に由来するｐＣＤＭ８ベクタ中の２つのｃＤＮＡライブラリを調製した。その後、最初に１μグラムのＨＬ−６０ポリＡ＋ｍＲＮＡ由来の32ＰラベルｃＤＮＡプローブを創製することにより富化したＣＤＸｃＤＮＡライブラリを調製し、その後ＨｅＬａ細胞由来の３０μグラムのポリＡ＋ｍＲＮＡ（これはＣＤＸを発現しない）とハイブリダイズすることによりプローブから非ＣＤＸｃＤＮＡ配列を減算した（デービス、１９８６参照）。減算プローブを使用してイー・コリＭＣ１０６１Ｐ３中でＨＬ−６０細胞から富化したサブライブラリを創製し、２２の９６穴プレート中で約２１００クローンを生育させた。Ｖ９３７富化ＣＤＸサブライブラリを同様の様式で調製し、１４００のクローンを得た。
【０１７６】
実施例IIの一般的手順に従い、スフェロプラスト融合によりＣＯＳ７細胞の感染についてコロニーを２２のプールに分割した。シードとアルフォ（１９８７）の方法により、ハイブリドーマＳＧＣ2 Ｅ5 （実施例Ｘで単離）からα−ＣＤＸモノクローナル抗体を選別することによりＣＤＸ発現について感染ＣＯＳ７細胞をアッセイした。アッセイの結果プール＃７は陽性であり、２．１ｋｂｃＤＮＡ挿入物を有する２つのクローンを生成し、これを７．１および７．２とした。
【０１７７】
配列決定ベクタｐＮＮ１１にサブクローン化したＣＤＸｐＣＤＭ８クローン７．２および７．２挿入物の一部から、マキサムとギルバート技術（１９８０）によりＣＤＸのＤＮＡ配列を得た。後者のプラスミドをｐＳＱ２１９とした。得られたＤＮＡ配列を図９に示す。
【０１７８】
ブダペスト条約により、イン・ビトロ・インターナショナル・インコ、６１１Ｐ、ハモンド・フェリーＲｄ、リンチカム、Ｍｄ（米国）に対し、１９９０年４月２６日にプラスミドＣＤＸｐＣＤＭ８クローン７．２を含有する培養物を寄託した。これは次のように同定される：
ＣＤＸｐＣＤＭ８／イー・コリＭＣ１０６１Ｐ３
受託番号ＩＶＩ−１０２４２。
【０１７９】
また、ＣＤＸクローン７．１および７．２をＣＯＳ７細胞に感染させ、ＣＤＸの発現を確認した。感染後４８時間で、これらの細胞は、ＦＡＣＳによるアッセイによりα−ＣＤＸ抗体が結合するその細胞表面で蛋白質を発現した。この細胞表面蛋白質は125Ｉによりラベルすることができ、免疫沈殿した。免疫沈殿したダブレットのみかけの分子量は約１２５ｋＤだった。また、ＣＤＸ発現ＣＯＳ７．２はｒｓＥＬＡＭ１により被覆したセファロースビーズの周囲にロゼットを形成し、このロゼット形成は陽イオン依存性であり、ＢＢ１１（抗ＥＬＡＭ１抗体）により阻害され、更にｐＣＤＭ８単独（挿入されたＣＤＸ遺伝子を有さない）により感染したＣＯＳ細胞は、ｒｓＥＬＡＭ１ビーズにロゼット形成しなかった。また、ＣＯＳ７．２細胞は、ウシ血清アルブミンにより被覆したビーズにロゼット形成しなかった。前記した事実は全てＣＤＸがＥＬＡＭ１についてのリガンドであることを示す。
【０１８０】
ＣＤＸの推論されたアミノ酸配列の一次分析により、４０５アミノ酸部分（図９のヌクレオチド６６〜１２８０）が示された。ＵＷＧＣＧ配列回折ソフトウエアパッケージ（バージョン６．１、１９８９年８月）を使用し、他の蛋白質との相同性につきプログラムＦＡＳＴＡを使用してＮＢＲＦ蛋白質データベース（解放２３、１９８９年１２月）を検索した。また、ＴＦＡＳＴＡを使用して、ゲンバンク（解放６３、１９９０年３月）およびＥＭＢＬ（解放１９、１９８９年５月）を検索した。これらの検索で、ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・タイプ１、デングウイルス、黄熱および他のフラビウイルスを含む所定のウイルスエンベロープ蛋白質に対して相同の短い領域（例えば約２３アミノ酸）を認めた。一般に、公知の蛋白質に対する相同性は低く、ＣＤＸは新規な蛋白質であると結論した。
【０１８１】
実施例XIII
ＶＣＡＭ１のＭＩＬＡｓを認識する抗体
全ＪＵＲＫＡＴ細胞により免疫した３匹のマウスからポリクローナル抗血清を得た。１つのマウス由来の血清は、室温で４時間誘導ＨＵＶＥＣｓに対するＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ結合の両者を完全に阻害した。他の２つのマウス由来の血清はＲＡＭＯＳを完全に阻害したが、同様の条件下でＪＵＲＫＡＴ結合を部分的に阻害するのみであった。これらのデータは、ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴはＭＩＬＡを共有し、ＪＵＲＫＡＴはＲＡＭＯＳにより共有されていない少なくとも１つの他のＭＩＬＡを阻害することを示す。
【０１８２】
リンパ球ＭＩＬＡｓに単するＭｏａｂｓを調製するため、全生存ＲＡＭＯＳおよびＪＵＲＫＡＴ細胞に対してマウスを免疫し、前記実施例VIIIに記載した様式にて、ＪＵＲＫＡＴ免疫マウス由来の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合を行った。ＣＤＸに対するモノクローナル抗体を得るのに成功裡に使用した実施例VIIに記載した方法により、得られたハイブリドーマを検索した。現在まで、ＴＮＦにより２４時間処理したＨＵＶＥＣｓに対するＲＡＭＯＳ付着を阻害する約２６０のハイブリドーマをコンディショニングした培地から検索した。約２５のハイブリドーマが付着の一貫した部分的阻害を示し、現在これらは再検索のためサブクローン化されている。この種の抗体は、リンパ球ＭＩＬＡｓの単離およびクローン化の両者に使用することができる。
【０１８３】
実施例XIV
ＶＬＡ４がＶＣＡＭ１リガンドである証拠
本発明者および協力者は、ＶＬＡ４はＶＣＡＭ１のリガンドであり、ＶＬＡ４はＶＣＡＭ１およびフィブロネクチンに対する別の結合部位を有することを示す幾つかの検討を行った。
【０１８４】
最初に、ＶＬＡ４のサブユニットに対するモノクローナル抗体は、活性化ＨＵＶＥＣｓおよびＶＣＡＭ１により感染したＣＯＳ細胞に対するＶＬＡ４発現細胞の付着を阻害することを示した。ＶＬＡ４は、サブユニットβ1 およびα4 から構成される（ヘムラー、１９８８）。β1 に対するＢ１Ｅ１１としたモノクローナル抗体、およびヤギ抗β1 ヘテロ抗血清は、活性化ＨＵＶＥＣｓおよび感染ＣＯＳ細胞に対するＲＡＭＯＳ細胞の付着を完全に阻害することを認めた。対照の抗体は付着を阻害しなかった。更に、ＨＰ２／１としたα4 サブユニットに対するモノクローナル抗体は、同様にこれらの細胞に対するＲＡＭＯＳの付着を遮断した。同様に、これらの抗体は、ＶＬＡ４発現Ｔリンパ芽球セルラインＨＰＢ−ＡＬＬの付着を阻害した。
【０１８５】
次に、本来ＶＬＡ４を発現しない細胞をα4 により感染することにより、これらをＶＣＡＭ１発現細胞に結合させることが可能なことを示す。２つのセットのＫ−５６２赤白血病細胞を感染させた。１つのセットは、α4 をコードするｃＤＮＡを用いて感染させた（タカダら、１９８９）。他は、ＶＬＡ４の一部ではないα2 を用いて感染させた（タカダとヘムラー、１９８９）。α4 により感染したＫ−５６２細胞は、かくしてＶＣＡＭ１感染ＣＯＳ細胞またはＴＮＦ活性化ＨＵＶＥＣｓのモノレイヤに結合することが可能となったが、親Ｋ−５６２細胞およびＫ−５６２α2 感染細胞は可能ではなかったことを示した。更に、α4 またはβ1 に対するモノクローナル抗体は、これらのＶＣＡＭ１発現細胞に対するα4 感染Ｋ−５６２細胞（これは通常はβ1 サブユニットを発現する）の付着を排除した。
【０１８６】
最近の検討により、ＶＬＡ４は、ＦＮＣＳ−１部位を介してヒトプラズマフィブロネクチン（ＦＮ）に対する細胞付着を媒介することが示された（ワイナーら、１９８９）。ＶＣＡＭ１に対するＶＬＡ４結合部位は、ＦＮに対するその結合部位とは異なることを示した。最初に、ＲＡＭＯＳ細胞またはα4 感染Ｋ−６５２細胞とＦＮ−４０（可溶性ＦＮ断片）との予備インキュベーションにより、ＦＮ−４０とのその結合が阻害されるが、ＶＣＡＭ１感染ＣＯＳ細胞またはＴＮＦα活性化ＨＵＶＥＣｓとでは阻害されないことを認めた。次に、ＶＬＡ４、ＨＰ１／３に対するモノクローナルは、感染ＣＯＳ細胞または活性化ＨＵＶＥＣｓに対するこれらの細胞の結合を阻害するが、ＦＮ−４０に対しては阻害しないことを認めた。
【０１８７】
実施例XV
阻害剤検索
合成有機化学物質、天然発酵生成物、ペプチド等のような可能な阻害剤を検索する３つの基本的な付着アッセイにおいて、ＥＬＡＭｓおよびそのリガンドを使用することができる。
【０１８８】
１．細胞−細胞付着アッセイ
第１のアッセイにより、細胞−細胞付着を阻害する分子の能力を試験し得る。このアッセイは、９６穴マイクロタイタプレート中で行うことができる。最初に、例えば実施例Ｖに記載したように、ＥＬＡＭを安定に発現するセルラインを創製する。その後、これらの細胞をプレートアウトし、ＨＬ−６０細胞を添加する。阻害剤は、ＥＬＡＭ発現細胞に対するＨＬ−６０結合を阻害するその能力により同定する。ＥＬＡＭリガンドに対するモノクローナル抗体を検索する際に記載したのと全く同様にアッセイを行い得る。
【０１８９】
２．細胞付着蛋白質アッセイ
第２のアッセイにより、ＥＬＡＭ自体に対する細胞結合を阻害する低分子の能力を試験し得る。９６穴マイクロタイタプレートで行うｒｓＥＬＡＭ１によるこの種のアッセイを開発した。細菌性プラスチックからなるこれらのプレート（例えば、リンブロ／タイタテック＃７６−２３２−０５、登録商標）を、５０μｌの１５ｍＭ炭酸ナトリウム／３５ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．２中の穴当り０．５μｇのｒｓＥＬＡＭ１により、４℃で一夜インキュベートする。その後１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳによりこのプレートを室温で１時間ブロックし、その後例えば穴当り５０μｌのＨＬ−６０細胞、２×１０6 ／ｍｌを使用し、実施例VIIIに記載したようにして付着アッセイを行う。これらの条件下で、ＨＬ−６０細胞はｒｓＥＬＡＭ１に良好に結合し、検索に便利なマイクロアッセイを提供する。プレートに対するＨＬ−６０結合を阻害するその能力により阻害剤を同定し得る。その他、プローブとしてＥＬＡＭを安定に発現するセルラインを使用し、このアッセイにおいてＥＬＡＭリガンドを使用することができる。
【０１９０】
この範疇の他のアッセイは、それぞれＥＬＡＭリガンドまたはＥＬＡＭを安定に発現する細胞のモノレイヤに対する可溶性ＥＬＡＭまたはＥＬＡＭリガンドの結合を検定するものである。この可溶性分子は、レポーター群（例えば、放射能、蛍光プローブ、酵素等）によりラベルし得る。
【０１９１】
３．付着蛋白質−付着蛋白質アッセイ
このアッセイは、ＥＬＡＭのそのリガンドに対する結合を阻害する低分子の能力を検定するものである。可溶性形態の２つの分子、例えば可溶性ＥＬＡＭを９６穴マイクロタイタプレートの穴に固定化し、この対の他の構成員、例えばレポーター群によりラベルしたＥＬＡＭリガンドの結合により付着を測定する。
【０１９２】
これらの３つのアッセイのいずれにおいても、付着を阻害するその能力によって阻害剤を検出する。
【０１９３】
実施例XVI
ＶＣＡＭ１／免疫グロブリン構成物
発現に際してｒｓＶＣＡＭ１／免疫グロブリン融合蛋白質を生産するＤＮＡ配列を調製した。このＤＮＡ配列は、５′から３′に、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３およびＩｇＧ1 重鎖遺伝子の一定領域を含む。
【０１９４】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により、図３のヌクレオチド１０３５を介してＶＣＡＭ１ドメイン１〜３を含有するＤＮＡ断片を生産した（サンブロックら、１９８９）。３′−５′プライマは、配列５′ＧＡ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧを有する。これは図３のヌクレオチド１００〜１１４に相補的であり、ＶＣＡＭ１開始コドンおよびＸｈｏＩおよびＮｏｔＩについての認識部位を含有する。５′−３′プライマは、配列５′ＣＴ  ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＣＡＣを有する。これはドメイン３の末端で図３のヌクレオチド１０１６〜１０３５に相補的であり、ＮｈｅＩ認識部位を含有する。これらのプライマを使用し、ＡＭｐｃＤＭ８クローン４１のＶＣＡＭ１コード領域を含有するプラスミドから断片を増幅した。このプロセスの生成物は、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３をコードするＤＮＡ配列であった。ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩによりこのＤＮＡ断片を消化し、次のようにして作成したｐＡＢ５３にこれを挿入した。
【０１９５】
ＳａｌＩによりｐＪＯＤ−ｓ（実施例ＶIII）を消化し、ヒトｒｓＣＤ４をコードするｃＤＮＡ配列を挿入した。このプラスミドをｐＪＯＤ−ｒｓＴ４と呼ぶこととした。ＰｖｕIIおよびＳｐｈＩによりｐＪＯＤ−ｒｓＴ４を部分消化し、ＤＨＦＲｃＤＮＡの転写を調節するＳＶ４０プロモータ中の２つのＳＶ４０エンハンサリピートを含む断片を欠損させた。プラスミドを再連結し、これをｐＪＯＤ−ｒｓＴ４デルタＥとした。その後、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩによりｐＪＯＤ−ｒｓＴ４デルタＥを消化し、２つのＤＮＡ断片を挿入した。最初に５′ｍＲＮＡスプライス部位を含むＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIIIリンカ、次にＩｇＧ重鎖遺伝子の一定領域をコードするＤＮＡ断片である。これらの断片を次のようにして得た。
【０１９６】
次の配列を有するＮｈｅＩ−ＨｉｎｄIIIリンカを合成した：
0003684228.tif 000002
【０１９７】
ＩｇＧ重鎖遺伝子のＤＮＡ配列はエリソンら（１９８２）に記載されている。ＥＭＢＬ３ヒト染色体ライブラリ（実施例ＶIII）からオリゴヌクレオチドプローブを使用してこの遺伝子の断片を単離した。ＨｉｎｄIIIおよびＮｏｔＩによりこの断片を消化し、一定の重ドメインおよび随伴するイントロンを含む断片を単離した。
【０１９８】
これらの２つの断片をｐＪＯＤｒｓＴ４デルタＥに連結し、得られたプラスミドをｐＡＢ５３と呼ぶこととした。ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩによりｐＡＢ５３を消化し、ｒｓＴ４コード領域を欠損させた。この場所に、ＶＣＡＭ１ドメイン１〜３をコードするＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ断片を挿入した。このプラスミドをＶＣＡＭ１−ＩｇＧ1 と呼ぶこととした。
【０１９９】
ｒｓＶＣＡＭ１／ＩｇＧ融合蛋白質を、このプラスミドを使用して発現させた。安定した発現のため、このプラスミドをＣＨＯ細胞に感染させた。この遺伝子の転写後、ｍＲＮＡをスプライスしてイントロンを除去し、翻訳の際に、細胞はｒｓＶＣＡＭ−ＩｇＧ融合蛋白質を生産した。
【０２００】
実施例XVII
アンチセンス核酸による阻害ＶＣＡＭ１発現
ここで、ＶＣＡＭ１に対するアンチセンス核酸および誘導されたＨＵＶＥＣｓにおけるＶＣＡＭ１発現を阻害するその能力を試験する方法を記載する。アンチセンス核酸についての有効な核酸配列は、ｍＲＮＡのコード領域、更に詳しくは開始コドンＡＵＧ、またはスプライス部位に相補的なものである（マルクス−セクラ、１９８８）。また、約１５ヌクレオチドのオリゴマが最も好適である。よって、ＶＣＡＭ１に対する最も有効なアンチセンス核酸は、ＤＮＡ配列５′ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧを有するオリゴマである。これは、図３のヌクレオチド９４〜１０８に結合し得る（アンチセンス開始コドン）。このＤＮＡ配列は、例えば自動ＤＮＡ合成装置によって合成される。
【０２０１】
このアンチセンス核酸のＶＣＡＭ１発現を阻害する能力は次のようにして試験する。細胞生育に使用する血清を６０℃で３０分間熱失活させてヌクレアーゼを失活させる以外は、実施例Ｖと同様にしてＨＵＶＥＣｓを群集に生育させる。４〜４８時間、１０μＭ〜１００μＭの濃度で、最も好ましくは細胞生存性に影響を与えない最も高い濃度で、オリゴマを用いて細胞を予備インキュベートする。これらの範囲は、有効な阻害のために必要である（マルクス−セクラ、１９８８、ベッカーら、１９８９）。その後、ＨＵＶＥＣｓを１０ｎｇ／ｍｌＴＮＦにより処理してＶＣＡＭ１を誘導する。約４時間後、細胞の表面上のＶＣＡＭ１の存在を付着アッセイにより試験する。
【０２０２】
実施例XVIII
ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡを認識するハンマーヘッドリボザイム
次のようにしてハセルホフとゲーラー（１９８８）の規則に従い、ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡを認識するハンマーヘッド型リボザイムをを調製する。最初に、標的ｍＲＮＡ上の開裂部位を同定する。ハンマーヘッドリボザイムは、配列５′ＧＵＸ（Ｘはいずれかのヌクレオチドである）の後を開裂する。ＶＣＡＭ１ｍＲＮＡのコード領域中のこの配列の最初の例は、６番目のコドン、５′ＡＵＧ  ＣＣＵ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＧＵＣ  ＧＵＧ  ＡＵＣ  ＣＵＵである。適切な認識配列には、開裂部位の側面に位置する５′および３′領域の約６のヌクレオチドが包含される。開裂部位を含む１８塩基の認識配列は、５′ＡＡＧ  ＡＵＧ  ＧＵＣ  ＣＵＧ  ＡＵＣ  ＣＵＵである。
【０２０３】
その後、認識配列および触媒「ハンマーヘッド」の配列を含むリボザイムについてＲＮＡ配列を設計する。この種の配列は、５′ＡＡＧ  ＧＡＵ  ＣＡＣ［ＣＵＧＡＵＧＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡ］ＡＣ  ＣＡＵ  ＣＵＵである。括弧内の配列は、触媒「ハンマーヘッド」および５′および３′フランク配列を生成し、認識部位に相補的で、これに結合する。同様の方法で、より短い認識配列またはＶＣＡＭ１ｍＲＮＡの他の開裂部位についてのものまたは他のＥＬＡＭまたはＥＬＡＭリガンドｍＲＮＡについてのものを設計し得る。
【０２０４】
実施例XIX
ＥＬＡＭ１リガンドを認識する抗イディオタイプ抗体
ＨＬ−６０細胞上のＥＬＡＭ１のリガンドに結合する抗ＥＬＡＭ１抗体に対する抗イディオタイプ抗体を調製した。完全フレンドアジュバント中で１：１に乳化した蛋白質Ａ精製ＣＤＢ．ＢＢ１１．ＢＣ６モノクローナル（実施例Ｖ）によりウサギを免疫した。免疫後２６日に、ウサギを採血し、ＦＡＣＳを使用して特異的抗体について抗血清を分析した。ＨＬ−６０細胞（ＥＬＡＭ１のリガンドを発現する）またはＲＡＭＯＳ細胞（発現しない）を用いて抗体調製物をインキュベートした。この抗体調製物は、ＨＬ−６０細胞に特異的に結合したが、ＲＡＭＯＳ細胞には結合しないことを認め、これはＥＬＡＭ１リガンドを認識する抗体を含有することが示された。対照抗血清は、いずれのセルラインとも反応しなかった。
【０２０５】
実施例XX
新規なＥＬＡＭの証拠
誘導されたＨＵＶＥＣｓに対するＵ９３７細胞（これは単球様である）の結合は、ＥＬＡＭ１、ＶＣＡＭ１、および／またはＩＣＡＭ１に至る特定のＭｏａｂｓ経路によっては遮断されない。しかしながら、Ｕ９３７結合は、ＣＤ２９、β1 インテグリン・サブユニットに対するモノクローナル抗体によって遮断される。このことから、β1 インテグリンを介して白血球と相互作用するＨＵＶＥＣｓ上の新たな付着分子の存在が推定される。この新たな分子はＶＣＡＭ１に類似する時間経過により誘導され、誘導後４８時間最大レベルを維持する。２．５時間ＩＬ−１誘導ＨＵＶＥＣ減算サブライブラリについて先に記載した方法を使用し、４８時間ＴＮＦ処理ＨＵＶＥＣｓから減算ライブラリを作成した。先に記載した直接発現手順を使用し、新たな分子のクローン化を試みているところである。
【０２０６】
この発明の多数の態様をここに記載したが、当業者であれば本発明の手順を改変して、この発明の方法および組成物を利用する他の態様を提供し得ることは明らかである。したがって、この発明の範囲はここに添付する請求の範囲により特定され、例として示した特定の態様によらないことが銘記されよう。
【０２０７】
【表１】
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【０２０８】
【表２】
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【０２０９】
【表３】
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【０２１０】
【表４】
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【０２１１】
【表５】
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【０２１２】
【表６】
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【０２１３】
【表７】
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【０２１４】
【表８】
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【０２１５】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＥＬＡＭ  ｐＣＤＭ８クローン６、ｐＳＱ１４８およびｐＳＱ１４９のＤＮＡ配列から誘導された複合ＥＬＡＭ１  ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは1〜3863の番号を有する。本明細書の全体にわたり、この図のコード化ＤＮＡ配列をＥＬＡＭ１のためのＤＮＡ配列と称する。さらに、この図に示したアミノ酸配列からなる分子をＥＬＡＭ１と称する。
【図１Ｂ】図１Ａの分図である。
【図１Ｃ】図１Ａの分図である。
【図１Ｄ】図１Ａの分図である。
【図１Ｅ】図１Ａの分図である。
【図２】ｐＮＮ１１の合成ポリリンカーのＤＮＡ配列を示す。
【図３Ａ】ＡＭ  ｐＣＤＭ８クローン４１から誘導されたＶＣＡＭ１をコードするｃＤＮＡの配列およびＶＣＡＭ１の推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは1〜2811の番号を有する。本明細書において、この図のコード化ＤＮＡ配列をＶＣＡＭ１のためのＤＮＡ配列と称する。さらに、この図に示したアミノ酸配列からなる分子をＶＣＡＭ１と称する。
【図３Ｂ】図３Ａの分図である。
【図３Ｃ】図３Ａの分図である。
【図３Ｄ】図３Ａの分図である。
【図４Ａ】ＶＣＡＭ１ｂ  ｐＣＤＭ８クローン１Ｅ１１から誘導されたＶＣＡＭ１ｂをコードするｃＤＮＡの配列およびＶＣＡＭ１ｂの推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは1〜3080の数で示す。本明細書において、この図のコード化ＤＮＡ配列をＶＣＡＭ１ｂのためのＤＮＡ配列と称する。さらに、この図に示したアミノ酸配列からなる分子をＶＣＡＭ１ｂと称する。
【図４Ｂ】図４Ａの分図である。
【図４Ｃ】図４Ａの分図である。
【図４Ｄ】図４Ａの分図である。
【図５】ＶＣＡＭ１のドメイン構造を示し、アミノ酸はウィスコンシン大学のジェネティックス・コンピュータ・グループにより使用される一文字コードによって示される［デブロー等、1984］。
【図６】ＶＣＡＭ１ｂのドメイン構造を示し、アミノ酸はウィスコンシン大学のジェネティックス・コンピュータ・グループにより使用される一文字コードによって示される［デブロー等、1984］。
【図７】クローンＥＬ１−０７から誘導されたＥＬＡＭ１の５′未翻訳および未転写領域における部分のＤＮＡ配列を示す。
【図８】クローンＶＣ１−１６から誘導されたＶＣＡＭ１の５′未翻訳および未転写領域における部分のＤＮＡ配列を示す。
【図９Ａ】ｐＳＱ２１９およびＣＤＸ  ｐＣＤＭ８クローン７．２から誘導されたＣＤＸをコードするｃＤＮＡの配列および推定アミノ酸配列を示し、ヌクレオチドは1 〜2175の番号を有する。本明細書において、この図のコード化ＤＮＡ配列をＣＤＸ用のＤＮＡ配列と称する。さらに、この図に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドをＣＤＸと称する。
【図９Ｂ】図９Ａの分図である。
【図９Ｃ】図９Ａの分図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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