(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化タンパク質または糖化ペプチドから、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させる酵素であって、前記酵素が次に示す理化学性質を有していることを特徴とする、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の菌体由来である酵素。
ａ）３０〜６０℃の温度範囲において、１００％の酵素活性を示す。
ｂ）至適温度が４０〜５０℃の温度範囲にある。
ｃ）分子量が４０，０００〜５０，０００である。
【請求項２】
糖化タンパク質または糖化ペプチドから、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させる酵素であって、前記酵素が次に示す理化学性質を有し、シュードモナス アルカリゲネスKDK1001（Pseudomonas alcaligenes KDK1001）（FERM P−17133）由来であることを特徴とする酵素。
ａ）３０〜６０℃の温度範囲において、１００％の酵素活性を示す。
ｂ）分子量が４０，０００〜５０，０００である。
【請求項３】
コリネバクテリウム属の菌体が、コリネバクテリウム ウレオリティカム KDK1002（Corynebacterium ureolyticum KDK1002）(FERM P−17135）である請求項１記載の酵素。
【請求項４】
遊離される糖化アミノ酸が、α−アミノ基が糖化されたバリンである請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項５】
糖化タンパク質または糖化ペプチドを酵素で分解した後、この分解物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより、前記糖化タンパク質または糖化ペプチドの量を測定する方法であって、前記酵素として請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素を使用する測定方法。
【請求項６】
測定対象物である糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求項５記載の測定方法。
【請求項７】
プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびこれとの反応により酸化される基質を備える糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定キットであり、前記プロテアーゼが、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素を含む測定キット。
【請求項８】
コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の菌体であって、コリネバクテリウム属の菌体が、コリネバクテリウム ウレオリティカム KDK1002（Corynebacterium ureolyticum KDK1002）(FERM P−17135)である請求項１記載の酵素を産生する菌体。
【請求項９】
シュードモナス属（Pseudomonas）の菌体であって、シュードモナス属の菌体が、シュードモナス アルカリゲネスKDK1001（Pseudomonas alcaligenes KDK1001）（FERM P−17133）である請求項２記載の酵素を産生する菌体。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規酵素に関する。
背景技術
プロテアーゼは、様々な産業分野において利用されている。例えば、糖尿病の診断および治療等における重要な指標である血清中の糖化アルブミン等の糖化タンパク質を測定する際にも、前記プロテアーゼが使用されている。
このプロテアーゼを利用した糖化タンパク質の測定方法は、例えば、以下に示すようにして行うことができる。例えば、糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、この分解物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）とを反応させ、生成する過酸化水素量または消費される酸素量を測定することにより、前記糖化タンパク質の量を知ることができる。前記プロテアーゼとしては、特開平５−１９２１９３号公報、特開平７−２８９２５３号公報等に開示されているものが使用されている。
このように、糖化タンパク質を予めプロテアーゼで処理するのは、前記ＦＡＯＤ等は、糖化アミノ酸や糖化ペプチドに作用し易く、糖化タンパク質自身には作用し難いからである。特に、糖化ヘモグロビン（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、その糖化部分がβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基であるため、この部分にＦＡＯＤが作用しやすいように、ＨｂＡ１ｃを処理できるプロテアーゼが求められていた。
発明の開示
そこで、本発明の目的は、糖化タンパク質や糖化ペプチド等に対してＦＡＯＤが作用しやすいように、前記糖化タンパク質等を処理できる新規酵素の提供である。
本発明者らは、まず、各種ＦＡＯＤの中でも、糖がα−アミノ基に結合した糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸等に作用するＦＡＯＤについて、その作用機構を検討した。その結果、前記ＦＡＯＤは、例えば、α−アミノ基に糖が結合した糖化アミノ酸には良く作用するが、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドには作用しがたいことがわかった。そこで、本発明者らは、この知見に基づいて、自然界の様々な菌を分離培養し、それらが産生する酵素を検討した結果、糖がα−アミノ基（Ｎ末端アミノ基）に結合した糖化タンパク質または糖化ペプチドから、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸（α−Glycated  Amino  acid：以下、「α−ＧＡ」という）を遊離する新規酵素を産生する菌を分離することに成功し、本発明に至った。本発明の新規酵素（α−Glycated  Amino  acid  Releasing  Enzyme：以下、「α−ＧＡＲＥ」という）によれば、例えば、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドからα−ＧＡを遊離できるため、α−ＧＡに良く作用する前記ＦＡＯＤを用いたＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等で実用化することができる。また、ＨｂＡ１ｃの測定の他に、他の糖化タンパク質の測定等の様々な分野で使用することもできる。なお、本発明のα−ＧＡＲＥは、α−ＧＡを遊離させる触媒機能のほかに、他の触媒機能、例えば、他のペプチド結合を切断する機能等を備えていても良い。本発明者らが分離した新菌体としては、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属等の菌体がある。なお、本発明のα−ＧＡＲＥは、これらの菌体由来に制限されない。
本発明のα−ＧＡＲＥにおいて、遊離される糖化アミノ酸は、そのα−アミノ基が糖化されていれば特に制限されないが、前述のように、ＨｂＡ１ｃはＮ末端バリン残基が糖化されていることから、前記遊離されるα−ＧＡは、糖化バリン（以下、「α−ＧＶ」という）であることが好ましい。
本発明のα−ＧＡＲＥとしては、例えば、以下に示す、二種類のα−ＧＡＲＥがある。
まず、一つめのα−ＧＡＲＥ（以下、「α−ＧＡＲＥ−１」という）は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の菌体由来であり、特に好ましくは、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（Corynebacterium ureolyticum  KDK1002）由来である。このコリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（Corynebacterium ureolyticum  KDK1002）は、本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省・工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（日本国〒３０５−００４６茨城県つくば市東１丁目１−３）に受託番号FERM  P−17135（寄託日：平成１１年１月１１日）で寄託されている。本菌体の菌学的特性は、下記に示すとおりである。
（形態的特性）
本菌体の形状は、その大きさが０．８×１．２μｍの桿菌であり、非運動性である。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、そのコロニー形態は低い凸状の円形であり、前記コロニーの色はクリーム色である。
（生理学的性質）
0003668801.tif 000002
つぎに、二つ目のα−ＧＡＲＥ（以下、「α−ＧＡＲＥ−２」という）は、シュードモナス属（Pseudomonas）の菌体由来であり、特に好ましくは、シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（Pseudomonas alcaligenes  KDK1001）由来である。前記シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（Pseudomonas alcaligenes  KDK1001）も本発明者らが土壌中より新規に単離した菌体であり、通商産業省・工業技術院生命工学工業技術研究所（NIBH）（日本国〒305−0046茨城県つくば市東1丁目1−3）に受託番号FERM  P−17133（寄託日：平成11年1月11日）で寄託されている。本菌体の菌学的特性は下記に示すとおりである。
（形態的特性）
本菌体の形状は、その大きさが０．３×１．０〜１．５μｍの桿菌であり、極毛により運動性を有する。
（培養的性質）
本菌体を常法の寒天培地に生育させた場合、そのコロニー形態は低い凸状の円形であり、表面は滑らかである。前記コロニーの色は半透明から淡黄色に変化する。マックコンケイ（Mac  Conkey：以下、同じ）培地で生育は認められるが、良好とは言い難い。また、培養温度４０℃では生育しない。
（生理学的性質）
0003668801.tif 000003
つぎに、本発明の糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定方法は、糖化タンパク質または糖化ペプチドを酵素で分解した後、この分解物とＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することにより、前記糖化タンパク質または糖化ペプチドを測定する方法であって、前記酵素として本発明の新規酵素（α−ＧＡＲＥ）を使用することを特徴とする。本発明の測定方法において使用するα−ＧＡＲＥは、測定する糖化タンパク質や糖化ペプチドの種類、それらの濃度等により適宜決定されるが、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、前記α−ＧＡＲＥがより作用しやすいように、予め、糖化タンパク質等を別の酵素（例えば、プロテアーゼ等）で分解させてもよい。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応の測定は、前記酸化還元反応によって生じる過酸化水素量の測定または消費される酸素量の測定であることが好ましく、前記過酸化水素量を測定する場合、ペルオキシダーゼと酸化により発色する基質（以下、「発色性基質」という）とを用いた測定であることが好ましい。なお、前記過酸化水素量は、前記ペルオキシダーゼ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法等により測定することもできる。
前記発色性基質としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（例えば、商品名ＤＡ−６４：和光純薬社製等）、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合わせた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、アフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。これらの発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシルメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
本発明の測定方法において、前述のように、血球中のＨｂＡ１ｃを測定することは糖尿病の診断に有用であることから、測定対象試料は、血球であることが好ましい。しかし、糖化タンパク質は、例えば、前記血球以外の血液成分（全血、血漿、血清等）、尿や髄液等の生体試料、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食料等にも含まれるため、測定対象試料は前記血球には限定されない。また、測定対象物も、前記ＨｂＡ１ｃには制限されず、この他にも、ゼラチン、カゼイン等の糖化タンパク質や糖化ペプチド等があげられる。
つぎに、本発明の糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定キットは、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼとの反応により酸化される基質を備える測定キットであり、前記プロテアーゼが本発明のα−ＧＡＲＥを含むことを特徴とする。この測定キットによれば、本発明の測定方法を迅速かつ簡便に行うことができる。なお、前述と同様に、前記α−ＧＡＲＥは一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
本発明の測定キットにおいて、前記酸化される基質としては、前述のような発色性基質が好ましく、測定対象物および測定対象試料も前述と同様である。
つぎに、本発明のα−ＧＡＲＥの製造方法は、本発明の新菌体を培養する工程を含む方法である。これにより、本発明のα−ＧＡＲＥを容易に製造することができる。
本発明のα−ＧＡＲＥの製造方法は、さらに、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す精製工程を含むことが好ましい。
（ａ）  培養液から菌体を除去して、上清を調製する工程。
（ｂ）  前記上清中のタンパク質をエタノール沈殿する工程。
（ｃ）  前記タンパク質をクロマトグラフィーにより分離する工程。
前記精製工程は特に制限されず、その他の精製工程を組合わせてもよい。また、例えば、（ａ）工程だけでもよいし、２以上の工程を行ってもく、さらに同じ工程を繰り返し行ってもよい。
前述のような菌体培養によって得られる本発明のα−ＧＡＲＥは、培養液中に含有された状態でも、精製された状態であってもよく、糖化タンパク質等からα−ＧＡを遊離させる限り、その精製度に拘わらず使用できる。しかし、精製すれば、培養液中のα−ＧＡＲＥ以外の成分が除去されるため、前記α−ＧＡＲＥの比活性が向上する。これにより、実際に使用する際に、その使用量が少量でよく、取り扱いが簡便になる。また、各種反応に用いる場合に、α−ＧＡＲＥ以外の成分による影響も回避できる。
つぎに、以上のような精製工程により精製されたα−ＧＡＲＥについて、そのアミノ酸配列の決定および遺伝子配列の決定を行い、本発明のα−ＧＡＲＥをコードする遺伝子を調製することが好ましい。なお、この遺伝子は、前記α−ＧＡＲＥが発現するために必要である遺伝子には限定されず、例えば、プローブやプライマーとして使用するＤＮＡ断片やＲＮＡ等、また、α−ＧＡＲＥの遺伝子配列をもとに作製した化学合成の断片等も含む。このような遺伝子を用いて、例えば、組換え体等を作製し、これによりα−ＧＡＲＥを製造してもよい。本発明のα−ＧＡＲＥの遺伝子は、例えば、以下に示すようにして得ることができる。
まず、本発明のα−ＧＡＲＥを、例えば、後述する精製工程等により精製して、エドマン分解等の常法によりアミノ酸配列の決定を行ない、これをもとにその遺伝子配列を推測する。そして、これに基づいて常法の化学合成等によりＤＮＡ断片やＲＮＡ断片等を作製し、これをプライマーやプローブ等として使用して、本発明の新規菌体からα−ＧＡＲＥをコードする遺伝子をクローニングすれば、本発明の遺伝子が得られる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の一実施例において、コリネバクテリウム属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したクロマトグラムである。
図２は、前記一実施例において、コリネバクテリウム属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したその他のクロマトグラムである。
図３は、本発明のその他の実施例において、シュードモナス属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＴＬＣにより分析したクロマトグラムである。
図４は、本発明のさらにその他の実施例において、コリネバクテリウム属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＬＣ−ＭＳ分析したトータルイオンクロマトグラムである。
図５は、前記実施例において、コリネバクテリウム属の菌体の培養液上清を用いて、糖化ペプチドを分解し、その分解物をＬＣ−ＭＳ分析したＭＳスペクトラムである。
図６は、本発明のさらにその他の実施例において、コリネバクテリウム属の菌体由来のα−ＧＡＲＥ量と吸光度との関係を表すグラフである。
図７は、本発明のさらにその他の実施例において、シュードモナス属の菌体由来のα−ＧＡＲＥ量と吸光度との関係を表すグラフである。
図８は、本発明のさらにその他の実施例において、コリネバクテリウム属の菌体由来のα−ＧＡＲＥの熱安定性を表すグラフである。
図９は、本発明のさらにその他の実施例において、シュードモナス属の菌体由来のα−ＧＡＲＥの熱安定性を表すグラフである。
図１０は、本発明のさらにその他の実施例において、コリネバクテリウム属の菌体由来のα−ＧＡＲＥの至適温度を表すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のα−ＧＡＲＥを産生する菌体のスクリーニングは、例えば、以下に示すように、土壌中の菌体を分離培養し、その培養液を用いて糖化ペプチドの分解反応を行い、得られる分解物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析することによって行うことができる。なお、以下のスクリーニング方法は、α−ＧＡＲＥ産生菌を分離するために、本発明者らが詳細な検討を重ねた結果、見出したものである。このスクリーニング方法の確立によって、本発明のα−ＧＡＲＥ産生菌の分離が成功したといっても過言ではない。
（１）培養方法
以下に示す栄養液体培地を、予め、オートクレーブにより、１２１℃で２０分間滅菌する。そして、土壌サンプルを滅菌水に懸濁し、これを前記滅菌済みの栄養液体培地に添加して、３０℃で４８時間振とう培養（１１１ｒｐｍ）を行う。得られた培養液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）して、その上清を回収する。
（栄養液体培地）
麦芽エキス（商品名Malt  extract：DIFCO社製）  ２．０ｇ
Ｄ−グルコース（ナカライテスク社製）          ２．０ｇ
ペプトン（商品名Becto  peptone：DIFCO社製）   ０．１ｇ
蒸留水                                        １００ｍｌ
（２）糖化ペプチドの分解反応
（糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸の製造方法）
そのアミノ酸配列が、ＨｂＡ１ｃβ鎖におけるＮ末端側アミノ酸配列と同様であるα−アミノ基糖化ペプチドおよびα−フルクトシルバリン（以下、「ＦＶ」という）を、以下のペプチドおよびバリンと、グルコースとを用いて、常法により作製する。
（ペプチド）
Val−His（ペプチド研究所社製：以下、これの糖化物を「Ｆ２Ｐ」という）
Val−His−Leu（ペプチド研究所社製：以下、これの糖化物を「Ｆ３Ｐ」という）
Val−His−Leu−Thr（バイオリンク社製：以下、これの糖化物を「Ｆ４Ｐ」という）
Val−His−Leu−Thr−Pro（ＳＩＧＭＡ社製：以下、これの糖化物を「Ｆ５Ｐ」という）
Val−His−Leu−Thr−Pro−Glu−Glu−Lys−Ser（バイオリンク社製：以下、これの糖化物を「Ｆ９Ｐ」という）
（Ｌ−アミノ酸）
Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＨｉｓ（和光純薬工業社製）
（分解方法）
予め、前記各糖化ペプチドを０．０１Ｍの濃度になるように蒸留水に溶解し、糖化ペプチド溶液をそれぞれ調製する。そして、前記各糖化ペプチド溶液５０μｌと前記培養液上清１００μｌとをそれぞれ混合し、３７℃で一晩反応させた後、これらの反応液を凍結乾燥する。
（３）ＴＬＣ分析
前記糖化ペプチドの分解物をＴＬＣにより分析し、α−ＧＡＲＥ活性の有無を確認する。なお、使用する試薬および方法を以下に示す。
（薄層プレート）
商品名Pre-Coated  TLC  plate  SILICA  GEL  60（メルク社製）
（検出試薬）
ニンヒドリン（フナコシ社製）を０．５体積％の濃度になるように、７５体積％エタノールで溶解する。
（展開溶媒）
ブタノール（ナカライテスク社製）、酢酸（ナカライテスク社製）および蒸留水を、２：１：１の体積割合になるように混合する。
（分析方法）
予め、展開距離が８ｃｍになるように前記薄層プレートを準備し、前記プレート下端から１ｃｍの位置をサンプルスポットの原線とする。そして、ＴＬＣ分析の直前に、前記凍結乾燥した各反応液を５０体積％エタノール１５μｌにそれぞれ溶解し、これらをシリンジ（容量２５μｌ）により前記原線上にスポットする。なお、コントロールとして、前記ＦＶおよび各種アミノ酸も同様にスポットする。そして、前記展開溶媒で予め飽和された展開槽にこのプレートをいれ、前記原線から約８ｃｍの距離まで前記展開溶媒を上昇させる。なお、前記展開溶媒は、前記プレートがその下端から約０．５ｃｍまで浸かるように入れておく。
前記展開後、ドラフト内で完全に風乾させた前記プレートに前記検出試薬（ニンヒドリン溶液）を噴霧してから、予め熱しておいたホットスターラー（１００℃）により加熱して発色試験を行う。その結果、コントロールのＦＶと同じ移動度を示すサンプルがα−ＧＡＲＥ活性陽性であり、その培養液の菌体がα−ＧＡＲＥ産生菌体である。
前記ＴＬＣ分析は、前述のようなニンヒドリン検出には限定されず、例えば、この他にもフルオレスカミン、エチレンジアミン硫酸塩等の試薬を用いた蛍光検出法も採用できる。
また、前記コントロールとしては、例えば、基質である糖化タンパク質または糖化ペプチドのα−ＧＡを使用することが好ましい。
このようなスクリーニング方法により、発明者らが単離した新菌体としては、例えば、前記コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（Corynebacterium ureolyticum  KDK1002）（FERM  P−17135）およびシュードモナス  アルカリゲネスKDK1001（Pseudomonas alcaligenes  KDK1001）（FERM  P−17133）等がある。
本発明のα−ＧＡＲＥの検出および活性測定に使用できる基質としては、前述の糖化ペプチド等には制限されず、例えば、Ｎ末端のα−アミノ基が糖化されている糖化タンパク質および糖化ペプチド等があげられる。このような基質を用いる場合、例えば、遊離されたα−ＧＡに対して、後述するＦＡＯＤを用いた酸化還元反応（例えば、発色反応等）を行うことにより、α−ＧＡＲＥを検出・測定することができる。
前記糖化タンパク質としては、例えば、ＨｂＡ１ｃ、糖化グロビン等があげられる。このような糖化タンパク質は、例えば、天然のものでもよいし、糖とタンパク質とのアマドリ転位反応により合成したものでもよい。前記糖化グロビンは、例えば、ＨＰＬＣ等を用いて精製したＨｂＡ１ｃを、テールの方法（Teale,F.W.J,Biochem,Biophys,Acta,35,543,1959）によりグロビン化することによって調製できる。合成により各種タンパク質を糖化する場合、使用する糖は特に制限されず、例えば、グルコース等のアルドースや、ケトース等があげられる。
前記糖化ペプチドは、例えば、前述のような糖化タンパク質をプロテアーゼ分解することにより調製したり、糖と合成ペプチドとのアマドリ転位により合成できる。糖化ペプチドの長さは、特に制限されないが、例えば、アミノ酸残基数２〜２０の範囲であり、好ましくは２〜８の範囲である。
糖とのアマドリ転位反応を行う前記ペプチドは、例えば、天然のものでもよいし合成ペプチドでもよい。また、そのアミノ酸組成は特に制限されないが、アルギニンやリジンを含まないペプチドであることが好ましい。このようなペプチドを糖化すれば、ペプチドのα−アミノ基のみが糖化された糖化ペプチドを調製できるため、この糖化ペプチドを用いることによってα−ＧＡＲＥ活性のみを検出できる。
具体的に、α−ＧＡＲＥをＨｂＡ１ｃ測定に利用することを目的とする場合、前記糖化ペプチドは、例えば、ＨｂＡ１ｃβ鎖におけるＮ末端側アミノ酸配列と同様の糖化ペプチドであることが好ましく、例えば、前記「糖化ペプチドの分解反応」において記載したＮ末端Ｖａｌのα−アミノ基が糖化された糖化ペプチド糖があげられる。また、例えば、ＨｂＡ１ｃをトリプシンで分解すれば、Ｎ末端バリンのα−アミノ基が糖化されているアミノ酸残基数８個の糖化ペプチドを得ることができる。
また、α−ＧＡＲＥの基質として、Ｎ末端のα−アミノ基が糖化されている糖化ペプチド等を用いる場合、遊離されたα−ＧＡを検出してもよいが、α−ＧＡ遊離後の残存ペプチドの検出により、α−ＧＡＲＥを検出・測定することもできる。
このような糖化ペプチドは、特に制限されないが、例えば、ＦＶ−Ｌｅｕ（以下、「ＦＶＬ」）、ＦＶ−Ｇｌｎ（以下、「ＦＶＱ」）、ＦＶ−Ａｌａ（以下、「ＦＶＡ」）、ＦＶ−Ａｓｎ（以下、「ＦＶＮ」）等のジペプチドがあげられる。これらは、α−ＧＡＲＥによりＦＶが遊離し、同時にＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ａｓｎがそれぞれ生成される。この生成されたＬｅｕをロイシンデヒドロゲナーゼ、Ｇｌｎをグルタメートデヒドロゲナーゼ、Ａｌａをアラニンアミントランスフェラーゼとαケトグルタル酸とラクテートデヒドロゲナーゼ、Ａｓｎをアスパラギンアミノトランスフェラーゼとαケトグルタル酸とマレートデヒドロゲナーゼ等とそれぞれ反応させ、ＮＡＤＨ生成またはＮＡＤ生成を吸光度測定（波長３４０ｎｍ）することによって検出できる。
また、糖化トリペプチドとしては、例えば、ＦＶ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（以下、「ＦＶＬＳ」）等があげられる。ＦＶＬＳは、α−ＧＡＲＥによりＦＶが遊離し、同時にＬｅｕ−Ｓｅｒが生成される。これを例えば、アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、プロテナーゼＫ等の加水分解酵素で分解し、これにより生成したロイシンを前述と同様にして測定することができる。なお、前記ペプチドの長さは、特に制限されない。
さらに、α−ＧＡＲＥの基質として、アミノ酸と検出基とを含み、前記アミノ酸のα−アミノ基が糖化され、かつ、前記検出基が前記アミノ酸のα−カルボキシル基にアミド結合またはエステル結合し、前記検出基が、結合状態では検出不可能であり、遊離すると検出可能となる基質を用いることもできる。
α−ＧＡＲＥは、前記基質と反応させれば、α−ＧＡと前記検出基とのアミド結合またはエステル結合を切断して、α−ＧＡと検出基とを遊離する。この切断によって遊離した前記検出基は、例えば、発色・発光するため、これによりα−ＧＡＲＥを検出・測定できる。
前記検出基は、特に制限されないが、例えば、前述のように、発色や蛍光により検出できるものが好ましい。前記発色により検出できる検出基としては、パラニトロアニリド（以下、「ｐ−ＮＡ」という）、パラニトロフェノール、インドール、β−ナフチルアミド、４−メトキシ−β−ナフチルアミド（４ＭβＮＡ）等があげられ、前記蛍光により検出できる検出基としては、例えば、４−メチル−クマリル−７−アミド等があげられる。具体的に、ｐ−ＮＡやパラニトロフェノールは、例えば、波長４０５〜４１０ｎｍ付近の吸光度を分光光度計等により測定すればよく、４−メチル−クマリル−７−アミドは、波長３８０ｎｍで励起して波長４６０ｎｍで測定すればよい。
なお、前記検出基とα−カルボキシル基との結合が、アミド結合であってもエステル結合であっても、α−ＧＡＲＥがα−ＧＡを遊離できるのは、α−ＧＡＲＥがα−アミノ基の糖化部分を認識してα−ＧＡを遊離させるためと推測される。
このようにα−カルボキシル基に検出基を結合させたα−ＧＡＲＥの基質は、例えば、市販の検出基が結合したアミノ酸と糖とを用いて常法により調製できる。
つぎに、本発明のα−ＧＡＲＥは、例えば、前述の培養方法に準じた方法により、本発明のα−ＧＡＲＥ産生菌体を培養することによって製造できる。コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）を使用する場合、その培養条件は、例えば、培養温度２０〜３７℃の範囲、培養時間１８〜７２時間の範囲、培地のｐＨ７．０〜８．０の範囲である。シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）を使用する場合、その条件は、例えば、培養温度２０〜４０℃の範囲、培養時間１８〜７２時間の範囲、培地のｐＨ５．０〜１０．０の範囲である。
また、前記培養液に含有されるα−ＧＡＲＥを、常法により分離精製することによって、α−ＧＡＲＥの酵素標品を得ることができる。α−ＧＡＲＥの精製は、例えば、既知の方法である、硫安等による塩析法、等電点沈殿法、エタノール沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等の組み合わせにより行うことができる。以下に、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥの精製方法の一例を示す。
まず、前記培養液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）して菌体を除去し、上清を得る。前記上清に５０体積％になるように冷エタノールを添加して充分に攪拌し、４℃で約２０分間放置した後、この溶液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）する。得られた上清に、８５体積％になるように、再度、冷エタノールを添加して攪拌した後、前述と同様にして、放置、遠心分離を行い沈殿を回収する。そして、この沈殿を精製水に溶解する。
この溶液を商品名ポロスＨＱ／Ｍ（ピーイーバイオシステムズ社製）カラムに供し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により非吸着画分を溶出して回収する。そして、この非吸着画分を商品名バイオスケールＣＨＴ−Ｉ（バイオラド社製）カラムに供し、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）により非吸着画分を溶出して回収することによって、部分精製された本発明のα−ＧＡＲＥ酵素溶液を得ることができる。なお、本発明のその他の新菌体由来のα−ＧＡＲＥも同様にして精製できる。
また、本発明の新規菌体の培養に使用する培地は、前記栄養液体培地には制限されず、この他に、例えば、以下に示すヘモグロビン（Ｈｂ）培地を使用することもできる。なお、Ｈｂ溶液は、例えば、以下に示す方法により調製できる。
（Ｈｂ培地：ｐＨ６．０）
Ｈｂ培地                          ０．２重量％
Ｋ2ＨＰＯ4                         ０．２重量％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                ０．０２重量％
微量金属塩溶液                    １．０重量％
微量ビタミン類溶液                ０．２重量％
（Ｈｂ溶液）
新鮮血液を遠心分離（２，０００Ｇ、１０分間、室温）して赤血球を回収し、これに等量（体積）の蒸留水を添加して溶血させる。この溶血液を遠心分離（２，０００Ｇ、１５分間、室温）し、赤血球膜等を除去した溶液をＨｂ溶液とする。
（微量金属塩溶液）
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ              ２００ｍｇ
Ｈ3ＢＯ3                          ５０ｍｇ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ                ２０ｍｇ
ＫＩ                              ５０ｍｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              １００ｍｇ
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ              ２００ｍｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ２００ｍｇ
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ             ５０ｍｇ
残分                              水（全量  ５００ｍｌ）
（微量ビタミン類溶液）
Ｃａ−パントテン酸                ４０ｍｇ
イノシトール                      ２０ｍｇ
ナイアシン                        ４０ｍｇ
ρ−アミノ安息香酸                ２０ｍｇ
ピリドキシン塩酸塩                ４０ｍｇ
チアミン塩酸塩                    ４０ｍｇ
ビオチン                            ０．２ｍｇ
ビタミンＢ12                        ０．０５ｍｇ
残分                            水（全量１００ｍｌ）
つぎに、本発明の糖化タンパク質または糖化ペプチドの測定方法について、血球を試料とし、前記血球中の糖化タンパク質（例えば、ＨｂＡ１ｃ）を、α−ＧＡＲＥおよびＦＡＯＤを用いて測定する例をあげて説明する。
まず、全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離し、これを溶血させる。この溶血方法は特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等のポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル類、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０等のポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類、商品名Ｂｒｉｊ３５等のポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル類等が使用できる。前記界面活性剤による処理条件は、例えば、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、５秒〜１分程度攪拌すればよい。
つぎに、前記溶血試料に対し、本発明のα−ＧＡＲＥによる酵素処理を行う。これにより、前記溶血試料中の糖化タンパク質からα−ＧＡを遊離させる。前記α−ＧＡＲＥによる酵素処理は、例えば、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するα−ＧＡＲＥの種類（例えば、由来等の違い）や、糖化タンパク質や糖化ペプチドの種類およびそれらの濃度等により適宜決定される。
例えば、測定対象物がＨｂＡ１ｃであり、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来のα−ＧＡＲＥを使用する場合、その処理条件は、例えば、反応液中のα−ＧＡＲＥ濃度０．０１Ｕ〜１ＫＵ／リットル、温度１５〜６０℃、反応時間３分〜６時間、ｐＨ５．０〜１０．０の範囲である。また、好ましくは、それぞれ、温度３０〜３７℃、反応時間５〜６０分、ｐＨ６〜８の範囲である。この場合、前記緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液（ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等）等が使用できる。なお、本発明のその他の新菌体由来のα−ＧＡＲＥも同様にして使用できる。
つぎに、前記α−ＧＡＲＥ処理によって得られた分解物（α−ＧＡ）をＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤが触媒する、α−ＧＡの分解反応を、下記式（１）に示す。
（式１）
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2  ＋  Ｈ2Ｏ  ＋  Ｏ2
→  Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ  ＋  ＮＨ2−Ｒ2  ＋  Ｈ2Ｏ2
前記式（１）に示すように、前記α−ＧＡＲＥ処理による分解物（α−ＧＡ  ：  Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2）をＦＡＯＤ処理することにより、糖（Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ）、アミノ酸（ＮＨ2−Ｒ2）および過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が生成する。
前記式（１）において、Ｒ1は、糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前が糖のケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）はグルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、  −[ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ  で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
また、前記式（１）において、Ｒ2は、α−アミノ基が糖化されているアミノ酸残基であり、下記式（２）で示すことができる。下記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示す。
（式２）
−ＣＨＲ3−ＣＯ−ＯＨ
前記ＦＡＯＤは、前記反応を触媒するものであれば、特に制限されず、例えば、さらに他の触媒機能を有してもよい。このＦＡＯＤ処理は、前記α−ＧＡＲＥによる酵素処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。前記緩衝液は特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
前記ＦＡＯＤの処理条件は、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度０．１〜１０ＫＵ／リットル、温度１５〜５０℃、反応時間１〜６０分、ｐＨ６〜９の範囲であり、好ましくは、それぞれ、ＦＡＯＤ濃度０．５〜２ＫＵ／リットル、温度３０〜３７℃、反応時間５〜２０分、ｐＨ７〜８の範囲である。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理で生じた過酸化水素を、前記ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を用いて、酸化還元反応を利用して測定する。
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、反応液中の過酸化水素濃度等により適宜決定される。例えば、反応液中のＰＯＤ濃度１０Ｕ〜４００ＫＵ／リットル、反応温度１５〜４０℃、反応時間０．１〜５分、ｐＨ５〜１０であり、より好ましくは、ＰＯＤ濃度５０Ｕ〜２０ＫＵ／リットル、反応温度３０〜３７℃、反応時間０．１〜１分、ｐＨ５〜８である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡＯＤ処理と同様の緩衝液等が使用できる。
前記基質として前記発色性基質を用いた場合は、その発色（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の濃度を測定でき、これから試料中の糖化タンパク質濃度を知ることができる。
この測定において、各処理工程は前述のように別々に行ってもよいが、場合によりいくつかの工程を同時に行ってもよいし、全てを同時に行ってもよい。例えば、試料にα−ＧＡＲＥとＦＡＯＤとを同時に添加して反応させることにより、α−ＧＡＲＥ処理と工程とＦＡＯＤ処理工程とを同時に行うことができる。また、α−ＧＡＲＥ分解物に、ＦＡＯＤとＰＯＤと発色性基質とを同時に添加して反応させることにより、ＦＡＯＤ処理工程とＰＯＤを用いた発色工程とを同時に行うこともできる。この他に、前記界面活性剤による溶血処理工程と、α−ＧＡＲＥ処理工程とを同時に行うことも可能である。
（実施例）
（実施例１）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥを産生する新菌体の培養液上清と、α−ＧＡを有する糖化ペプチドとを反応させて、前記糖化ペプチドからα−ＧＡを遊離させた例である。なお、特に示さない限り、前記スクリーニング方法と同様にして、菌の培養、糖化ペプチドの分解およびＴＬＣ分析を行った。
まず、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）を、前記栄養液体培地２００ｍｌに植菌して、３０℃で４８時間振とう培養を行った。得られた培養液を、遠心分離して菌体を除去し、その上清を粗酵素液とした。
前記粗酵素液１００μｌと前記各０．０１Ｍ糖化ペプチド（Ｆ２Ｐ、Ｆ３Ｐ、Ｆ５Ｐ）溶液５０μｌとをそれぞれ混合し、３７℃で一晩反応させた後、これらの反応液をＴＬＣにより分析した。このＴＬＣ分析の結果を図１および図２に示す。図１において、レーンＮｏ．１はコントロール（ＦＶ）、レーンＮｏ．２はコントロール（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ）、レーンＮｏ．３はＦ２Ｐ分解物、レーンＮｏ．４はＦ３Ｐ分解物であり、図２において、レーンＮｏ．１はＦ２Ｐ分解物、レーンＮｏ．２はＦ５Ｐ分解物である。また、同図中において矢印が示すスポットの移動度を、下記表１に示す。
（実施例２）
シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）を前記栄養液体培地に植菌し、前記実施例１と同様にして、菌の培養、糖化ペプチドの分解およびＴＬＣ分析を行った。このＴＬＣ分析の結果を図３に示す。同図中において、レーンＮｏ．１はコントロール（ＦＶ）、レーンＮｏ．２はコントロール（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ）、レーンＮｏ．３はＦ２Ｐ分解物、レーンＮｏ．４はＦ３Ｐ分解物である。また、同図中において矢印が示すスポットの移動度を、下記表１に併せて示す。
0003668801.tif 000004
図１、図２および図３ならびに前記表１に示すように、前記各粗酵素液により処理した糖化ペプチド分解物において、コントロールＦＶと同じ移動度でスポットが確認できた（矢印で示すスポット）。また、実施例２におけるＦ５Ｐ分解物も、ＦＶと同じ移動度でスポットが確認できた（移動度０．４６：図示せず）。以上のことから、本発明のα−ＧＡＲＥにより、糖化ペプチドからα−ＧＡが遊離することがわかった。さらに、前記分解物のスポットが、Ｖａｌの移動度とは異なることから、α−ＧＡＲＥにより遊離されたＦＶから糖が乖離されていないこともわかった。また、図１、図２および図３に示すように、Ｆ２Ｐ分解物では、ＦＶとＨｉｓのスポットが見られた。Ｆ３Ｐ分解物およびＦ５Ｐ分解物において、ＦＶ以外の分解物（ジペプチドおよびテトラペプチド）のスポットが見られないのは、このＴＬＣの方法では検出されにくいためと推測できる。
（実施例３）
この実施例は、本発明の新規菌体由来の粗酵素により糖化ペプチドを処理し、α−ＧＡ（ＦＶ）の遊離を確認した例である。
コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）を、前述のＨｂ培地（ｐＨ６．０）で２８℃、５日間培養した。そして、培養液を遠心分離（１２，０００Ｇ、１５分間、４℃）し、得られた上清を粗酵素液とした。
前記粗酵素液と０．０１Ｍ  Ｆ４Ｐ溶液５０μｌとを混合し、３７℃で一晩反応させた。この反応液を、限外ろ過膜（分画分子量５ｋＤａ：ミリポア社製）に供してタンパク質等の高分子量物質を除去し、得られた溶液を凍結乾燥した。
前記各凍結乾燥品を下記溶離液Ａ２０μｌに溶解し、この溶液を下記条件で逆相クロマトグラフィーに供し、分析開始から１５秒ごと（２５０μｌ／１フラクション）に分画した。また、コントロールとしてＦＶを同条件で溶出させ、その溶出時間も確認した。
（逆相クロマトグラフィー）
0003668801.tif 000005
そして、前記逆相クロマトグラフィーにより得られた各分離フラクションについて、以下に示す方法によりＦＶの検出を行った。
（ＦＶの検出方法）
各分離フラクション溶液２０μｌに過酸化水素水溶液２０μｌ添加した後、下記酸化還元反応液Ａ  ６０μｌを添加して３７℃で反応させた。そして、生化学自動分析装置：商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製、以下同じ）を用いて、前記反応液の主波長６９４ｎｍおよび副波長８８４ｎｍにおける吸光度を測定した。
（酸化還元反応液Ａの組成）
0003668801.tif 000006
この結果、逆相クロマトグラフィーにおける溶出時間５〜６分の分離フラクションにおいて、発色が確認された。この溶出時間は、コントロールＦＶの溶出時間と同様であり、Ｆ４Ｐの分解物にＦＶが存在することが示唆された。
つぎに、発色が確認された分離フラクションについて、以下に示す条件により液相クロマトグラフィー（ＬＣ）／マススペクトル（ＭＳ）分析を行った。この結果を、図４および図５に示す。図４は、トータルイオンクロマトグラムであり、図５は、溶出時間１．８４分における溶出物のＭＳスペクトラムである。
（ＬＣ条件）
0003668801.tif 000007
（ＭＳ条件）
0003668801.tif 000008
この結果、図４および図５に示すように、３つのピークが検出された。詳しくは、溶出時間１．８４分に、ＦＶを示す質量数２８０のピークと、質量数２６１のＦＶの擬分子ピークが検出された。大部分が質量数２８０のピークであり、これはＦＶを示すピークであることから、Ｆ４Ｐが分解されてＦＶが生成されていることが確認できた。
（実施例４）
この実施例は、α−ＧＡＲＥ濃度を変化させて、各濃度におけるα−ＧＡＲＥ活性を確認した例である。
（１）部分精製酵素の調製
コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）およびシュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）を前記実施例３と同様にしてそれぞれ培養した。そして、各培養液から上清を回収して粗酵素液とした。これらの粗酵素液５０ｍｌを、それぞれ分画分子量サイズ５ｋＤａの限外ろ過膜（商品名ウルトラフリーＭＣフィルター：ミリポア社製）を用いて濃縮した後、以下に示す条件のゲルクロマトグラフィーに供して部分精製した。
（ゲルカラムクロマトグラフィー）
0003668801.tif 000009
（２）α−ＧＡＲＥ活性の測定
コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥの基質として下記ＨｂＡ１ｃ消化物溶液を、シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来α−ＧＡＲＥの基質として１０ｍＭ  Ｆ３Ｐ（５０ｍｍｏｌ／リットルリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ８．０）を、それぞれ使用した。前記各基質５０μｌに対して、各部分精製α−ＧＡＲＥを所定量（２５、５０、７５、１００、１２５、１４０μｌ）添加して３７℃で一晩反応させ、この反応溶液２０μｌについて前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、吸光度を測定した。そして、α−ＧＡＲＥ無添加の場合をブランクとし、５分間当たりの吸光度増加量をα−ＧＡＲＥ活性として求めた。この結果を図６および図７に示す。図６は、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥの酵素量と発色量（吸光度）との関係を表すグラフであり、図７は、シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来α−ＧＡＲＥの酵素量と発色量（吸光度）との関係を表すグラフである。
（ＨｂＡ１ｃ消化物溶液）
人の全血を生理食塩水（０．８５重量％ＮａＣｌ）で洗浄し、血球を回収した。この血球に１０倍体積量の精製水を加えて完全に溶血させてから、遠心分離（１０，０００Ｇ、３０分）により血球膜を分離し、溶血液を得た。前記溶血液について、Ｈｂ量で７．５ｍｇづつ、カラムサイズ０．９４ｃｍ×２０ｃｍの商品名Ｐｏｌｙ  ＣＡＴカラム（ポリＬＣ社製）を用いて、ビッセとウィランドの方法（J.Chromatogr,(1988),Vol434,p95-110,Bisse&Wieland）に基づき分離を行い、ＨｂＡ１ｃを回収した。回収したＨｂＡ１ｃ（ヘモグロビン濃度１７ｇ／リットル）２０ｍｌと０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）５ｍｌとを混合し、酢酸でｐＨ３．０に調整した後、ペプシン（シグマ社製）０．３５ｍｇを添加した。この溶液を２８℃で一晩インキュベートした後、限外ろ過膜（商品名ウルトラフリーＭＣフィルター：ミリポア社製）を用いてペプシン等の高分子量物質を除去し、得られた溶液をＨｂＡ１ｃ消化物溶液とした。
図６に示すように、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥは、酵素量約５０〜１００μｌの範囲で酵素量に依存して活性が増加した。図７に示すように、シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来のα−ＧＡＲＥは、酵素量約７０μｌ以上の添加により、活性が直線性を持って増加した。
（実施例５）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥについて熱安定性を確認した例である。
前記実施例４と同様にして、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）α−ＧＡＲＥおよびシュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来α−ＧＡＲＥの部分精製酵素を調製した。予め、前記両部分精製酵素を各温度（３０、３７、５０、６０、７０、８０℃）で１５分間インキュベート、熱処理後の部分精製酵素１００μｌおよび基質５０μｌを混合して、３７℃で一晩反応させた。なお、それぞれのα−ＧＡＲＥに対する前記基質は、前記実施例４と同様のものを使用した。この反応溶液２０μｌについて前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、吸光度を測定した。そして、５分間当たりの吸光度の増加量をα−ＧＡＲＥ活性とし、未処理のα−ＧＡＲＥの活性を１００％とした場合の残存活性（％）を求めた。この結果を図８および図９に示す。図８は、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥの熱安定性を示すグラフであり、図９は、シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来α−ＧＡＲＥの熱安定性を示すグラフである。
図８に示すように、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来のα−ＧＡＲＥは、３０〜６０℃の熱処理によっても１００％の残存活性を示したが、８０℃での熱処理によって、残存活性が５０％に低減した。また、図９に示すように、シュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来のα−ＧＡＲＥも３０〜６０℃の熱処理によっても１００％の残存活性を示したが、７０℃での熱処理によって、残存活性が約６０％に低減した。
（実施例６）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥについて至適温度を確認した例である。
前記実施例４と同様にして、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥの部分精製酵素を調製した。この部分精製酵素１００μｌを、前記実施例５と同様のＨｂＡ１ｃ消化物溶液９０μｌおよびリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１０μｌの混合液に添加し、各温度（１０、３０、３７、５０、６０、７０℃）で一晩反応させた。この反応溶液２０μｌについて、前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、吸光度を測定した。そして、５分間当たりの吸光度の増加量をα−ＧＡＲＥ活性とした。この結果を図１０に示す。図１０は、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来α−ＧＡＲＥの至適温度を示すグラフである。
図１０に示すように、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来のα−ＧＡＲＥの至適温度は、約４０〜５０℃であった。
（実施例７）
この実施例は、本発明のα−ＧＡＲＥの分子量を確認した例である。
前記実施例３と同様にして、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）およびシュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）を培養し、その上清を回収して粗酵素液とした。そして、これらの粗酵素液を、それぞれ、前記実施例４と同じ条件のゲルクロマトグラフィーに供して、分離をおこなった。そして、各フラクション１５０μｌを、基質５０μｌおよび５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）の混合液に添加し、３７℃で一晩反応させた。それぞれのα−ＧＡＲＥに対する前記基質は、前記実施例４と同様のものを使用した。この反応溶液２０μｌについて前記実施例３と同様にしてＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行い、吸光度を測定した。そして、５分間当たりの吸光度の増加量をα−ＧＡＲＥ活性とした。なお、分子量マーカーとして商品名ＭＷマーカー（ＨＰＬＣ）（オリエンタル酵母社製）を使用した。
この結果、両粗酵素液とも、分子量約４０，０００〜５０，０００に相当するフラクションにα−ＧＡＲＥ活性が見られたことから、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）α−ＧＡＲＥおよびシュードモナス  アルカリゲネス  KDK1001（FERM  P−17133）由来α−ＧＡＲＥの分子量は、それぞれ約４０，０００〜５０，０００と推測される。
（実施例８および比較例１）
この実施例は、実施例１および実施例２と同じα−ＧＡＲＥ粗酵素液により糖化ペプチドを処理し、その処理物に対してＦＡＯＤ等を用いた酸化還元反応を行うことにより、前記粗酵素液のα−ＧＡＲＥ活性を測定した例である。使用した試薬、その組成および方法を以下に示す。
（５０ｍＭ、糖化ペプチド溶液）
前記Ｆ２Ｐを、５０ｍＭの濃度になるように蒸留水に溶解した。
（緩衝液Ａ）
８０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
（酸化還元反応液Ｂの組成）
商品名ＤＡ６４                        ０．１ｍｍｏｌ／リットル
ＰＯＤ                                      ５０ＫＵ／リットル
ＦＡＯＤ（キッコーマン社製）                １０ＫＵ／リットル
緩衝液Ａ                                ８０ｍｍｏｌ／リットル
前記実施例１および実施例２と同様にして調製した粗酵素液４９０μｌと前記糖化ペプチド溶液１０μｌとを混合し、３０℃で一晩反応させて前記糖化ペプチドの分解を行った。この分解液２５μｌに前記緩衝液Ａ５５μｌを添加した後、前記酸化還元反応液Ｂ２０μｌを混合して反応を開始し、主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおけるこの反応液の吸光度を生化学自動分析装置：商品名ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社製）を用いて測定した。そして、予め、標準物質としてＦＶを用いてＦＡＯＤによる反応を行い作成した検量線と、前記吸光度とから、α−ＧＡＲＥの活性を求めた。この結果を、下記表２に示す。なお、トリプシン（シグマ社製）、パパイン（シグマ社製）およびアミノペプチダーゼ（シグマ社製）を１ｇ／リットルの濃度になるように精製水に溶解したものを、それぞれ酵素液として用いた以外は、前述と同様にしてα−ＧＡＲＥ活性の測定を行ったものを比較例１とした。
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前記表２に示すように、前記二種類の新菌体由来の粗酵素液を用いた場合、α−ＧＡＲＥ活性が確認されたが、トリプシン、パパインおよびアミノペプチダーゼをそれぞれ用いた比較例１では、α−ＧＡＲＥ活性は検出できなかった。
（実施例９）
この実施例は、コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来のα−ＧＡＲＥ酵素溶液により糖化グロビンを処理し、その処理物を、ＦＡＯＤを用いた酸化還元反応を行うことにより、α−ＧＡＲＥ活性を測定した例である。使用した試薬、その組成および方法を以下に示す。
（α−ＧＡＲＥ酵素溶液の調製方法）
コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）を、前記栄養液体培地２００ｍｌに植菌して、３０℃で４８時間振とう培養を行い、得られた培養液から遠心分離により菌体を除去し、その上清を回収した。そして、この上清を、前述と同様にして、商品名ポロスＨＱ／Ｍ（ピーイーバイオシステムズ社製）カラムおよび商品名バイオスケールＣＨＴ−Ｉ（バイオラド社製）カラムに供し、α−ＧＡＲＥの部分精製を行い、得られた活性画分をα−ＧＡＲＥ酵素溶液とした。
（糖化グロビンの調製方法）
ヒト血球より、前述のテールの方法に従いグロビンを精製した。そして、このグロビンに対し、グルコースを１０重量％の濃度になるように添加して、４０℃で一週間放置することにより糖化グロビンを調製した。
予め、前記糖化グロビンを、蒸留水に２ｇ／リットルの濃度になるように溶解して、糖化グロビン溶液を調製した。そして、前記α−ＧＡＲＥ酵素溶液１００μｌ、前記糖化グロビン溶液５０μｌおよび１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３５０μｌを混合し、３７℃で３時間反応させて糖化グロビンの分解を行った。この分解液を用いて、前記実施例８と同様にしてα−ＧＡＲＥの活性を求めた。なお、前記ＦＡＯＤ（キッコーマン社製）は、α−ＧＡに特異的に作用するため、前記コリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来のα−ＧＡＲＥが、α−ＧＡ以外に、例えば、ε−アミノ基が糖化されたアミノ酸残基等を遊離させていても、α−ＧＡＲＥ活性のみを測定することができる。その結果、α−ＧＡＲＥ活性は２．１Ｕ／リットルであった。
（実施例１０）
この実施例は、基質としてＦＶ−ｐＮＡを用いてα−ＧＡＲＥ活性を測定した例である。
実施例１と同様にしてコリネバクテリウム  ウレオリティカム  KDK1002（FERM  P−17135）由来の粗酵素液を調製した。前記粗酵素液４００μｌおよび下記反応試薬Ｃ１００μｌを混合して３７℃で反応させ、α−ＧＡＲＥにより遊離されるｐＮＡの発色を波長４１０ｎｍにおける吸光度変化として測定した。そして、１分間当たりの吸光度変化をα−ＧＡＲＥ活性として求めた。この結果を下記表３に示す。
（ＦＶ−ｐＮＡの調製）
Ｖａｌ−ｐＮＡ（シグマ社製）とグルコースとから、常法によりＦＶ−ｐＮＡを調製した。
（反応試薬Ｃ）
ＦＶ−ｐＮＡ                                      １ｍｌ
５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）    ２０ｍｌ
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前記表３に示すように、本発明のα−ＧＡＲＥ活性は、アミノ酸のα位アミノ基が糖化され、かつ、α位カルボキシル基にアミド結合により検出基が結合しているアミノ酸基質により、測定することもできる。
このように、本発明のα−ＧＡＲＥによれば、α−ＧＡが遊離し、ＦＡＯＤが作用しやすくなるため、糖化タンパク質や糖化ペプチドの測定を精度良く行うことができる。
産業上の利用可能性
このように本発明の新規酵素であるα−ＧＡＲＥは、糖化タンパク質等から、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸残基を遊離させることができる。したがって、例えば、前記α−ＧＡＲＥを、ＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質等の測定方法に使用すれば、糖尿病診断の指標となるＨｂＡ１ｃの測定を正確かつ簡便に行うことができるため、ＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等において実用化することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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