(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が流れる試料流路と、該試料流路に設けられる作用電極と、該作用電極に印加する電圧の制御を行なう電圧印加制御手段を具備する電気化学フロースルーセルにおいて、前記電圧印加制御手段は、前記試料流路に導入された前記試料を標識し、標識された前記試料を前記作用電極に捕捉する第１の操作、又は、前記作用電極に捕捉されない成分を前記試料流路から除去する第２の操作において、前記作用電極に電圧を印加する制御を行なうことを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項２】
請求項１に記載の電気化学フロースルーセルにおいて、前記作用電極に印加する電圧が、＋０．３５Ｖから＋０．５５Ｖの範囲にあることを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項３】
請求項１に記載の電気化学フロースルーセルにおいて、＋０．３５Ｖから＋０．５５Ｖの範囲にある電圧を、４秒以下の時間だけ１回、前記作用電極に印加することを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項４】
請求項１に記載の電気化学フロースルーセルにおいて、前記試料が前記試料流路を流れている状態で前記作用電極に電圧を印加することを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項５】
請求項１に記載の電気化学フロースルーセルにおいて、パルス状の電圧が前記作用電極に印加されることを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項６】
請求項１に記載の電気化学フロースルーセルにおいて、＋０．３５Ｖから＋０．５５Ｖの範囲にある電圧を、３００ミリ秒以下のパルス幅で複数回、前記作用電極に印加することを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項７】
請求項６に記載の電気化学フロースルーセルにおいて、前記作用電極に印加する電圧をオンしている時間とオフしている時間の比率が１：１から１：３の範囲にあり、前記作用電極に印加する電圧をオフしている時間とオンしている時間の比率が１：１から１：３の範囲にあることを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項８】
試料が流れる試料流路と、該試料流路に設けられる作用電極と、該作用電極に印加する電圧の制御を行なう電圧印加制御手段を具備する電気化学フロースルーセルにおいて、前記電圧印加制御手段は、前記試料流路に導入された前記試料を標識し、標識された前記試料を前記作用電極に捕捉する第１の操作の期間、前記作用電極に捕捉されない成分を前記試料流路から除去する第２の操作の期間、該第２の操作の終了から前記作用電極に電圧を印加して前記試料を検出する操作の開始までの期間、の何れかの期間において、前記作用電極にパルス状に電圧を印加する制御を行なうことを特徴とする電気化学フロースルーセル。
【請求項９】
試料を試料流路に導入する導入工程と、前記試料を標識し、標識された前記試料を前記作用電極に捕捉する捕捉工程と、前記作用電極に捕捉されない成分を前記試料流路から除去する除去工程と、前記作用電極に電圧を印加して前記試料を検出する検出工程と、前記試料流路を洗浄する洗浄工程と、を順次繰返して前記試料を検出する電気化学フロースルーセルを用いる分析方法であり、前記捕捉工程、又は前記除去工程が、前記作用電極に電圧を印加する工程を含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１０】
試料を試料流路に導入する導入工程と、前記試料を標識し、標識された前記試料を前記作用電極に捕捉する捕捉工程と、前記作用電極に捕捉されない成分を前記試料流路から除去する除去工程と、前記作用電極に電圧を印加して前記試料を検出する検出工程と、前記試料流路を洗浄する洗浄工程と、を順次繰返して前記試料を検出する電気化学フロースルーセルを用いる分析方法であり、前記除去工程の終了から前記検出工程の開始の期間で、前記作用電極にパルス状に電圧を印加する工程を有することを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は電気化学法、又は電気化学発光法により試料溶液中の極微量物質を定量するための電気化学フロースルーセル、特に電気化学発光フロースルーセル、及びこれを用いる分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫分析の分野では、試料中の極微量（１０~14ｍｏｌ・ｄｍ~3以下）の測定対象物の濃度を、発光ラベルを利用し測定する分析法として、蛍光法、化学発光法、及び電気化学発光法があり、広く利用されている。蛍光法では光励起により試料から発する発光を検出し、化学発光法では酸化剤等の触媒の存在下で試料から発する発光を検出し、電気化学発光法では試料に電圧を印加した時に試料から発する発光を検出する。これらの各方法では、ホルモン等の測定対象物に抗原抗体反応により発光試薬を結合して、発光試薬に由来する発光を定量するが、中でも電気化学発光法は原理的に検出感度が高い。電気化学発光法では、測定対象試料に電極を接触させる必要があり、一般にフロースルーセル内に試料を流しながら測定を行なう（本願明細書の以下の記載では、このセルを電気化学発光フロースルーセルと呼ぶ）。
【０００３】
特公平７−６９１２号には、フロースルーセルの壁面の外部に磁石を配置し、測定対象物（ホルモン、腫瘍マーカー、薬物、酵素、サイトカイン、核酸等）を抗原抗体結合により磁性ビーズに保持し、磁性ビーズを磁石により作用電極の面に保持して、作用電極の面に保持されない成分でありノイズの原因となる成分を、水流の力で洗い流して測定精度を向上させることの記載がある。作用電極の面に保持された成分（結合成分（Ｂｉｎｄ；Ｂ））と、作用電極の面に保持されない成分（フリー成分（Ｆｒｅｅ；Ｆ））との分離は、Ｂ／Ｆ分離と呼ばれている。
【０００４】
電気化学法、電気化学発光法では、例えば、結合成分は抗原抗体反応により測定対象物と発光試薬が結合した成分であり、フリー成分は測定対象物（生体関連物質である抗原、抗体、酵素、ＤＮＡ等）と結合していない発光試薬であり、発光試薬に由来する発光の量から測定対象物の定量を行なうので、測定対象物と結合していない発光試薬に由来する発光は、ノイズとなり正確な測定の妨げとなる。従って、測定対象物の金属等の固体表面への非特異吸着量の低減はノイズ低減につながる。
【０００５】
特開平８−２７１５２２号公報には、電気泳動の技術を用いて測定対象物を帯電さ、ノズルや反応容器等の固体表面に、帯電された電荷と逆極性の電荷を与え、電気的反発力により固体表面の洗浄を行なう記載があり、更に、数秒毎に極性を反転させて電圧を印加して、非特異吸着物質を洗浄するとの記載があるが、印加した電圧が何ボルトかの記載はない。
【０００６】
電極に流れる電流値の変化量に基づいて、測定対象物を測定するアンペロメトリー法がある。特表平８−５０５４７６号公報（国際公開番号ＷＯ９４／２０８４１号）には、導電性であり電気的に活性なポリマを含む電極を用いるパルスアンペロメトリー法において、約＋２ＶＤから約−２ＶＤへと変化する交流電流を電極に印加して、高感度化を行なうことの記載がある。
【０００７】
特公平７−９５０３４号には、作用電極に可変性の電圧を印加してセルのクリーニング、及びコンデショニングを行ない、コンデショニングの終了時点で、可変性の電圧を予め定められた操作前電位に到達させ、この操作前電位を測定開始まで保持して作用電極に印加しておき、コンデショニング流体を試料流体に置き換え、次いで作用電極に印加する電位を変化させることにより、精確なＥＣＬ（電気化学ルミネセンス）測定を行ない、ＥＣＬ現象の敏感な検出を行なうことの記載がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術の電気化学発光フロースルーセルでは、極微量の測定対象物に高確率で発光試薬を結合させるために、測定対象物の量に対して過剰量の発光試薬を加えるので、測定対象物と結合していない発光試薬（フリー成分）が溶液中に多く存在し、Ｂ／Ｆ分離が十分でない時にはフリーの発光試薬に由来するノイズ信号によりＳ／Ｎが低下するという問題があった。特に、測定対象物を、極微量の、ホルモン、腫瘍マーカー、薬物、酵素、サイトカイン、核酸等とする時には、上記のノイズ信号のレベルを、測定対象に由来する信号成分の１００万分の１から５００万分の１のレベルまで低減する必要がある。このレベルまでのノイズ信号の低下は、特公平７−６９１２号に記載された水流の力だけでも可能であるが、Ｐｔ等で構成される作用電極の表面にフリー成分が吸着する非特異吸着と呼ばれる現象があり、水流の力だけではＢ／Ｆ分離に長時間を要し、測定対象物の測定に長測定を要するという問題があった。また、アンペロメトリー法により測定対象物を測定する時に用いる電気化学フロースルーセルにおいても、作用電極、又は対向電極の表面に非特異吸着するフリー成分が、本来計測すべき電流値を乱すという問題がある。
【０００９】
本発明の目的は、上記従来技術における問題を解決して、Ｂ／Ｆ分離を短時間に効率良く行ない、フリー成分に由来するノイズ信号を減少させＳ／Ｎ、検出感度を向上させて、スループットの高い電気化学フロースルーセルを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の電気化学フロースルーセルは、試料が流れる試料流路と、試料流路に設けられる作用電極と、作用電極に印加する電圧の制御を行なう電圧印加制御手段を具備する電気化学フロースルーセルにおいて、（１）電圧印加制御手段は、試料流路に導入された試料標識し、標識された試料を作用電極に捕捉する第１の操作、又は、作用電極に捕捉されない成分を試料流路から除去する第２の操作（Ｂ／Ｆ分離）において、作用電極に電圧を印加する制御を行なう、（２）電圧印加制御手段は、試料流路に導入された試料標識し、標識された試料を作用電極に捕捉する第１の操作の期間、作用電極に捕捉されない成分を試料流路から除去する第２の操作の期間、第２の操作の終了から作用電極に電圧を印加して試料を検出する操作の開始までの期間、の何れかの期間において、作用電極にパルス状に電圧を印加する制御を行なう、ことに特徴がある。
【００１１】
また、本発明の電気化学フロースルーセルを用いる分析方法は、試料を試料流路に導入する導入工程と、試料を標識し、標識された試料を作用電極に捕捉する捕捉工程と、作用電極に捕捉されない成分を試料流路から除去する除去工程（Ｂ／Ｆ分離工程）と、作用電極に電圧を印加して試料を検出する検出工程と、試料流路を洗浄する洗浄工程と、を順次繰返して試料を検出する電気化学フロースルーセルを用いる分析方法であり、（ａ）捕捉工程、又は除去工程が、作用電極に電圧を印加する工程を含むこと、（ｂ）除去工程の終了から検出工程の開始の期間で、作用電極にパルス状に電圧を印加する工程を有すること、に特徴がある。
【００１２】
上記特徴により本発明では、Ｂ／Ｆ分離を短時間に効率良く行ない、フリー成分に由来するノイズ信号を減少させＳ／Ｎ、検出感度を向上させて、スループットの高い電気化学フロースルーセル及びこれを用いる分析方法が可能となる。
【００１３】
本発明では、０．４秒以下のパルス幅の電圧を作用電極に複数回印加した時に、Ｓ／Ｎ、検出感度の向上の効果が認められ、パルス幅を数秒にした時には明確な効果が認められず、本発明による効果は、特開平８−２７１５２２公報に記載の現象とは異なる現象に基づくと考えられる。
【００１４】
また、本発明は、試料の測定に先立ち、電圧印加制御手段による上記の（１）、（２）の制御により、作用電極に電圧を印加することにより、作用電極の電極の汚染を減少させ、更に、測定対象物の検出感度の増大を図ることを同時に実現する点で、特公平７−９５０３４号に記載の技術と異なる。
【００１５】
なお、電気化学法や電気化学発光法では、分析対象物と標識試薬とを結合させた後と、分析対象物の検出の前との間で、数ボルト程度の電圧を作用電極に印加すると、標識試薬の活性が阻害されるので、作用電極に印加する電圧は、標識試薬の活性を阻害しない条件とする必要がある。電気化学発光法では、標識試薬として、トリス（２、２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）錯体（又は、錯イオン）（図１０（Ａ）を参照。以下、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体と略記する。）、トリス（２、２’−ビピリジル）オスミウム（ＩＩ）錯体（又は、錯イオン）（図１０（Ｂ）を参照。以下、Ｏｓ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体と略記する。）等が用いられるが、例えば、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体の標準電極電位は１．２９Ｖであるので、分析対象物と標識試薬とを結合させた後と、分析対象物の検出の前との間で、１．２９Ｖ以上の電圧を作用電極に印加すると、標識試薬の活性を失うので、作用電極に印加する電圧は１．２９Ｖよりも低い値とする。
【００１６】
本発明では、分析対象物の検出以前で作用電極に、１Ｖ以下の電圧、又は、数百ｍＶ以下のパルス状の電圧を印加するので、分析対象物と結合した標識試薬が活性を失うことがない。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、図を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１８】
図１は、本発明の実施例の電気化学発光フロースルーセルの構成を表わす一部断面を含む図である。本発明の電気化学発光フロースルーセルを用いて、電気化学発光法により、ホルモン、腫瘍マーカー、薬物、酵素、サイトカイン、核酸等の試料を定量できる。電気化学発光フロースルーセル１に試料を流しながら作用電極２に試料を接触させ測定を行なう。試料の検出時には、作用電極２と作用電極２に対向する対向電極３との間に、電気化学発光分析に用いる標識物質の標準電極電位以上の電位を付加する。作用電極２と対向電極３に印加する電圧の基準とする参照電極４を備えるのが望ましい。作用電極２、対向電極３、及び参照電極４は、ポテンシオスタット・電源回路及び電圧印加制御系１０により制御される。以下の説明において作用電極２に印加される電圧は、参照電極４により測定される溶液の電位（溶液電位）を基準（０ボルト）とした時の値で示す。フロースルーセル１を構成する材料は、透明窓９としてガラス、アクリル、ポリメタクリル酸メチル等の光透過性物質を用い、その他の不透明な部分にはプラスチック等の高分子化合物、Ａｌ、ステンレス等の金属、セラミックを使用できる。作用電極２、対向電極３は、Ａｌ、Ａｇ等からなり、耐腐食性の高いＰｔを使用するのが好ましい。本発明の電気化学フロースルーセルを使用して電気化学法を実行する時は、作用電極２に電流計や抵抗計を接続する。
【００１９】
フロースルーセル１は、測定対象物を含む溶液を導入する試料流入口５と、排出する試料流出口６を持つ。本発明が、従来技術の磁性ビーズを用いたＢ／Ｆ分離の性能をどの程度向上させるかを測定するために、磁性ビーズを作用電極２に保持する磁石７を設置した。磁石７は本発明では必須ではないが、磁性ビーズを用いたＢ／Ｆ分離を利用する時には必須となる。標識物質からの発光を検知する光検出器８を作用電極２近傍に設けた。光検出器８は、電気化学発光法を用いる時は必須であるが、作用電極２の電流や電位をトレースする電気化学法では必須ではない。標識物質からの発光は、対向電極３側の透明窓９を透過し光検出器８で検出される。
【００２０】
以下の実施例では、標識試薬であるＲｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体と、磁性ビーズとを、免疫分析で用いられるサンドイッチ法により、ホルモン等の測定対象物に結合させて、電気化学発光法により測定対象物定量する場合を例にとる。Ｂ／Ｆ分離は、フロースルーセル１内の作用電極の背面に磁石を設けて、磁性ビーズを磁石により保持しながら水流の力により行なう。作用電極の表面で生じるＲｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体に由来する発光は、フォトマル、フォトダイオード、ＣＣＤ等の光検出器８により検出する。Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体からの発光を得るために、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体の標準電極電位（１．２９Ｖ）以上の電圧を作用電極に印加する（この標準電極電位以上の電圧印加のことを、以下の説明では、「検出信号を得るために必要な電圧印加」と呼ぶ）。
【００２１】
本発明では、検出信号を得るために必要な電圧印加に先立ち、測定対象物を含む溶液がフロースルーセル１を流れている状態、即ち、作用電極２の表面に水流が存在する状態で、作用電極２に電圧をパルス状に印加する。本発明では、パルス状の電圧の印加により、フリー成分の作用電極の表面への非特異吸着によるノイズを減少させ、かつ結合成分の検出感度の増大を図るという二つの条件を同時に満足する、電圧と印加時間との組み合わせを提示する。なお、作用電極に印加する電圧のオンオフのパターンは、矩形、三角波、三角関数の何れかを使用するが、矩形、三角波、三角関数の何れかの重ね合わせで得るパターンでも良い。
【００２２】
本発明の構成では、試料流路１１の壁面の外部に磁石７を配置し、磁性ビーズを用い、Ｂ／Ｆ分離を行なって測定精度を向上させる。磁石７は、電磁石、又は永久磁石である。磁石の磁力によってフロースルーセル１の作用電極２上に捕捉されている磁性ビーズは、分析終了後、電磁石への通電を遮断して、又は永久磁石を機械的にフロースルーセルより遠ざけて磁力を弱め、フロースルーセルから排出される。
【００２３】
図２は、従来技術の電気化学発光測定において電圧を作用電極に印加する手順の一例を示す図である。従来技術では、フリー成分を分離するＢ／Ｆ分離の操作の過程では、作用電極には電圧を印加せず（Ｅ0＝０Ｖ）、Ｂ／Ｆ分離の終了後、検出信号を得るために必要な電圧（Ｅ2（Ｖ））印加を作用電極に行なう（発光検出の過程）。発光検出の過程が終了した後、次の測定に備えて作用電極の表面を洗浄する洗浄過程では、例えば、Ｅ3（Ｖ）の電圧を作用電極に印加する。従来技術、及び本発明では、少なくともＢ／Ｆ分離、発光検出、洗浄の３つの過程を含むサイクルを繰り返し連続測定を行なっている。
【００２４】
以下の実施例１から実施例５では、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧の条件、水流速度の条件を変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。実施例１から実施例４では、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体で標識された磁性ビーズを磁石によりＰｔ作用電極の表面に捕捉し、電気化学発光法により測定対象物を検出する時、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧の条件、及び水流速度の条件を変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。
【００２５】
実施例１から実施例４における実験（Ａ１）から（Ａ４）では、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体で標識したビオチンタンパク質（０．１３３マイクログラム／マイクロリットル）と、ストレプトアビジンで表面をコートした磁性ビーズとを常温で１時間インキュベートする。磁性ビーズと結合したＲｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体が結合成分、磁性ビーズと結合していないＲｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体がフリー成分に相当する。磁石で磁性ビーズをＰｔ作用電極上に捕捉した後、電気化学発光法でＲｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体に由来する発光量を測定した。これら実験（Ａ１）から（Ａ４）の実験では、結合成分とフリー成分の両方に由来する発光が検出される。
【００２６】
実施例１から実施例４における実験（Ｂ１）から（Ｂ４）では、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体で標識したビオチンタンパク質（０．１３３μｇ／μｌ（マイクロリットル））を１８０μｌ採取して、Ｐｔ作用電極に非特異吸着するビオチンタンパク質の量を、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体に由来する発光量を測定した（ビオチンタンパク質は磁性ビーズと結合していないので、フリー成分のみに由来する発光が検出される）。
【００２７】
なお、実施例１から実施例５における実験（Ａ１）から（Ａ５）で検出された発光強度をＬA、実験（Ｂ１）から（Ｂ５）で検出された発光強度をＬBとすると、（ＬA−ＬB）／ＬBがＳ／Ｎ（信号対雑音比）に相当する。但し、ＬA≫ＬBなので（数１）が成立する。
【００２８】
【数１】
（ＬA−ＬB）／ＬB≒ＬA／ＬB                                  …（数１）
図５から図９ではＬA／ＬBをＳ／Ｎとして示し、Ｂ／Ｆ分離中に電圧を印加しなかった時のＳ／Ｎを１．０としている。
【００２９】
（実施例１）
実施例１では、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧を変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。
【００３０】
図３は、実施例１において、電圧を作用電極に印加する手順の一例を示す図であり、発光を検出する以前に１回の電圧印加を行ない、図２に示す従来技術の電圧印加の手順に比較して、Ｓ／Ｎを向上させる電圧印加の手順を示す。
【００３１】
実験（Ａ１）：Ｂ／Ｆ分離時に、４秒間一定電圧を、Ｐｔ作用電極に印加した。
【００３２】
実験（Ｂ１）：Ｂ／Ｆ分離時にＰｔ作用電極に印加する電圧の条件は実験（Ａ１）と同じである。
【００３３】
図５は、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧とＳ／Ｎの関係を示す図である。図５に示すように、＋０．３５Ｖから約＋０．５５Ｖの範囲の電圧をＢ／Ｆ分離中に印加する時、Ｓ／Ｎの向上が認められた。即ち、図３において、Ｅ0＝０Ｖ、Ｅ1＝０．３５Ｖ〜０．５５Ｖ、ｔ1＝４秒の時に感度の向上が見られた。
【００３４】
（実施例２）
実施例２では、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧を０．４８Ｖとして、電圧の印加時間を変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。
【００３５】
実験（Ａ２）：Ｂ／Ｆ分離時に、１、２、４、８、１２、１６秒間、一定電圧０．４８Ｖを、Ｐｔ作用電極に印加した。Ｐｔ作用電極への電圧印加はＢ／Ｆ分離の操作の過程の最後の部分で、水流速度が１３０μｌ（マイクロリットル）／秒）の状態で行なった。
【００３６】
実験（Ｂ２）：Ｂ／Ｆ分離時にＰｔ作用電極に印加する電圧条件、及び水流速度の条件は、実験（Ａ２）と同じである。
【００３７】
図６は、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧が一定の時の、電圧の印加時間とＳ／Ｎの関係を示す図である。図６に示すように、Ｂ／Ｆ分離中の４秒以下の間の０．４８Ｖの電圧の印加により、有意なＳ／Ｎの向上が認められた。即ち、図３において、Ｅ0＝０Ｖ、Ｅ1＝０．４８Ｖ、ｔ1≦４秒、かつＥ1の印加時の水流速度＞０の時（溶液が流れている状態）に、Ｓ／Ｎの向上が見られ、特に、ｔ1＝２秒の時に最もＳ／Ｎの向上が見られた。
【００３８】
（実施例３）
実施例３では、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に０．４Ｖの電圧を複数回オンオフして印加し、印加する電圧パルスのパルス幅を１００ミリ秒から４００ミリ秒まで変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。
【００３９】
図４は、実施例３において、電圧を作用電極に印加する手順の一例を示す図であり、発光を検出する以前に複数回電圧を作用電極に印加して、図２に示す従来技術の電圧印加の手順に比較して、Ｓ／Ｎを向上させる電圧印加の手順を示す。
【００４０】
実験（Ａ３）：Ｂ／Ｆ分離時に、４秒間、＋０．４Ｖの電圧を、作用電極に対しオンオフし、印加するパルス状の電圧のパルス幅を、１００、２００、３００、４００ミリ秒とした。例えば、１００ミリ秒のパルス幅の時は、＋０．４Ｖを１００ミリ秒印加し、次の１００ミリ秒は電圧を０Ｖとし、４秒間繰り返した。パルス状の電圧の印加は水流速度が１３０μｌ／秒の状態で行なった。
【００４１】
実験（Ｂ３）：Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に電圧を印加する条件、及び水流速度の条件は実験（Ａ３）と同様である。
【００４２】
図７は、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧パルスのパルス幅とＳ／Ｎの関係を示す図である。図７に示すように、Ｂ／Ｆ分離中に作用電極に４秒間、＋０．４Ｖの電圧をオンオフして印加し、パルス状の電圧のパルス幅時間を１００ミリ秒から３００ミリ秒として、Ｓ／Ｎの向上が認められた。
【００４３】
（実施例４）
実施例４では、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に０．４Ｖの電圧を複数回オンオフして印加し、印加する電圧パルスのオン時間とオフ時間の比率を変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。
【００４４】
実験（Ａ４）：Ｂ／Ｆ分離時に、１８秒間、＋０．４Ｖの電圧を、作用電極にオンオフして印加し、印加するパルス状の電圧のオン時間−オフ時間をそれぞれ、１００ミリ秒−３００ミリ秒、２００ミリ秒−１００ミリ秒、２００ミリ秒−２００ミリ秒、２００ミリ秒−３００ミリ秒、３００ミリ秒−１００ミリ秒とした。例えば、１００ミリ秒−３００ミリ秒の時は、＋０．４Ｖを１００ミリ秒印加し、次の３００ミリ秒は電圧を０Ｖとし、１８秒間繰り返した。パルス状の電圧の印加は水流速度が１３０μｌ／秒の状態で行なった。
【００４５】
実験（Ｂ４）：Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧条件、及び水流速度の条件は実験（Ａ４）と同じである。
【００４６】
図８は、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧パルスのオン時間とオフ時間の比率とＳ／Ｎの関係を示す図である。図８に示すように、Ｂ／Ｆ分離中に、作用電極に１８秒間、＋０．４Ｖの電圧をオンオフして印加し、パルス状の電圧のオン時間を１００ミリ秒から３００ミリ秒、パルス状の電圧のオフ時間を１００ミリ秒から３００ミリ秒として、Ｓ／Ｎの向上が認められた。
【００４７】
実施例３と実施例４から、Ｅ0＝０Ｖ、Ｅ1＝０．４Ｖ、τa又はτb≦３００ミリ秒の時に、感度の向上が見られた。特に、Ｅ0＝０Ｖ、Ｅ1＝０．４Ｖ、τa＝τb＝２００ミリ秒とした時に最もＳ／Ｎの向上が見られた。また、実施例１、実施例３、実施例４から類推すると、Ｅ0＝０Ｖ、Ｅ1＝０．３５Ｖ〜０．５５Ｖ、τa又はτb≦３００ミリ秒の時にも感度の向上が期待でき、このＳ／Ｎの向上も、後述する実施例５で明かとなる、τaとτbの期間での水流速度が大きい方がＳ／Ｎの向上が大きいという事実から、（τaとτbの期間での水流速度）＞０の時に顕著になると期待できる。
【００４８】
（実施例５）
Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体で標識された甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）抗体とＴＳＨとを抗原抗体結合で結合させて磁性ビーズに結合し、磁石によりＰｔ作用電極の表面に捕捉し、電気化学発光法によりＴＳＨを検出する時、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に０．４Ｖの電圧を２００ミリ秒オン２００ミリ秒オフして印加し、Ｂ／Ｆ分離時の溶液の流速を変化させ、Ｓ／Ｎの変化を調べた。
【００４９】
実験（Ａ５）：ビオチンタンパク質と結合したＴＳＨ抗体（Ａｎｔｉ−ＴＳＨマウスモノクロナール抗体２．０ｍｇ／ｌ（リットル）、リン酸緩衝液１００ｍｍｏｌ／ｌ）、ストレプトアビジンで表面をコートした磁性ビーズ（０．７２ｍｇ／ｍｌ）、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体で標識したＴＳＨ抗体（Ａｎｔｉ−ＴＳＨマウス／ヒトモノクロナール抗体１．２ｍｇ／ｌ、リン酸緩衝液１００ｍｍｏｌ／ｌ）と、ＴＳＨ標準試料Ａ（ＴＳＨ濃度１．５９μＵ（マイクロユニット）／ｍｌ（マイクロリットル））を常温で数分間インキュベートする。その後、インキュベートされた溶液をフロースルーセルに導入し、磁石で磁性ビーズをＰｔ作用電極上に捕捉した後、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体に由来する発光量を電気化学発光法で測定した。Ｂ／Ｆ分離時、＋０．４Ｖの電圧を作用電極にオンオフしてパルス状に印加し、印加された電圧パルスのパルス幅を２００ミリ秒とし、流速は１３５μｌ／秒、又は２７０μｌ／秒とした。実験（Ａ５）では、結合成分とフリー成分の両方に由来する発光が検出される。
【００５０】
実験（Ｂ５）：実験（Ａ５）において、ＴＳＨ標準試料Ａ（ＴＳＨ濃度１．５９μＵ／ｍｌ）の代わりに、ＴＳＨ標準試料Ｂ（ＴＳＨ濃度０μＵ／ｍｌ）を使用し、その他の条件は実験（Ａ５）と同様である。実験（Ｂ５）では、ＴＳＨ標準試料Ｂの濃度が０なので、検出される発光強度は理想的には０である。しかし、実際には、ＴＳＨ抗体のＰｔ作用電極への非特異吸着量、即ち、フリー成分に起因する発光が検出される。
【００５１】
図９は、Ｂ／Ｆ分離時の溶液の水流速度と、Ｓ／Ｎ、測定限界の関係を示す図である。ＴＳＨ標準試料Ｂの測定値の標準偏差より測定限界を求めた。測定限界は値が低い程、高感度であることを意味する。図９では、Ｂ／Ｆ分離中に作用電極に電圧を印加しなかった時の測定限界を１．０としている。図９に示すように、Ｂ／Ｆ分離中に、作用電極において複数回、＋０．４Ｖの電圧を２００ミリ秒オン、２００ミリ秒オフしてＳ／Ｎの向上、及び検出限界を下げる効果が認められた。また、Ｂ／Ｆ分離時の水流速度が大きい方が、効果が大きかった。
【００５２】
なお、実施例５と同じ実験を、作用電極に印加する電圧を０．５Ｖに変更して行なった（作用電極に印加する電圧を０．５Ｖにして、２００ミリ秒オン、２００ミリ秒オフとした）時、同様な感度向上の効果が認められたが、作用電極に印加する電圧が０．４Ｖの時と比較して、感度向上の程度は小さかった。
【００５３】
また、実施例２から実施例５では、フリー成分が作用電極の表面から有意に脱離するには、水流速度＞０の下で、作用電極に電圧を印加することが必須であった。従って、本発明では電気的反発力等の電気的作用のみでは、フリー成分と作用電極との間の吸着力を弱めるが、作用電極の表面からフリー成分を効率よく脱離させるには、水流速度＞０の条件が必要である。
【００５４】
なお、図２、図３、図４において、（イ）Ｂ／Ｆ分離の工程と、（ロ）発光を検出する工程との間に、（イ）、（ロ）何れの工程にも属さない区間Ａを設けているが、区間Ａでは、例えば、磁性ビーズを永久磁石を用いて作用電極に捕捉した後に、光検出器に及ぼす永久磁石の影響を防止するために、永久磁石を機械的にフロースルーセルから遠ざける操作を行なう。永久磁石の代わりに電磁石を用いる場合は電気的に電磁石の磁力を制御できるので、区間Ａは省略可能である。
【００５５】
Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体を用いる発光の検出では、作用電極にプラスの電圧を付与するので、作用電極はプラスに帯電し、フリー成分は作用電極に吸着する。フリー成分は電気的には点電荷ではなく、ダイポールと考えられ電気的なモーメントを持つ。０．３Ｖから０．６Ｖ程度の電圧の印加で電極の表面に吸着している分子の吸着構造が変化することが報告されており（Ｔ．Ｙａｍａｄａ、Ｎ．Ｂａｔｉｎａ、Ｋ．Ｉｔａｙａ：Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ３３５、ｐ２０４（１９９５）、Ｔ．Ｙａｍａｄａ、Ｎ．Ｂａｔｉｎａ、Ｋ．Ｉｔａｙａ：Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ９９、ｐ８８１７（１９９５）を参照）、本発明の効果にも、作用電極の表面での分子の回転等に起因する吸着構造の変化が関与している可能性がある。即ち、作用電極に印加する電圧と印加時間に応じて、作用電極の表面で分子の回転がおこると考えられ、この分子の回転によりフリー成分と電極との間の吸着力が弱まると予測される。
【００５６】
実施例１に示したように、作用電極に＋０．３５Ｖから＋０．６Ｖ程度の電圧を印加してＳ／Ｎの向上が見られた。より詳細には、フリー成分の発光は有意に増大しなかったが、結合成分に由来する発光強度が増大したためＳ／Ｎが向上した。このＳ／Ｎ向上の効果は、作用電極への電圧の印加により作用電極の近傍に存在する分子の作用電極の面に対する角度が変化して分子配向が揃うことに起因すると考えられる。事実、４−（４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（Ｄ２８９の＋１価）呼ばれる、１４デバイのダイポールモーメントを持つ分子では、０．３Ｖ以上の電圧の印加で、電極の面に対して４０度以上も回転する（Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＨｅとＺｈｉ  Ｘｕ：Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、１０１、２１０１−２１０４（１９９７）を参照）。更に、上記の各実施例で用いたＲｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体の再配向エネルギーＬs（溶液内での分子の配向が変わる時に出入りするエネルギー）は０．５８５Ｖであり、この再配向エネルギーＬsは、上記の各実施例で作用電極に印加した電圧とほぼ等しい。なお、再配向エネルギーＬsは、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体の半径ａを６．８オングストローム、水の屈折率ｎを１．３３、水の比誘電率Ｄを７８．５として、以下の（数２）より算出した。
【００５７】
【数２】
Ｌs（ｅＶ）＝７．２０（１／ｎ2−１／Ｄ）／ａ                  …（数２）
電気化学発光の発光強度は、作用電極と発光試薬との間での電子伝達速度に依存すると考えられる。この電子伝達速度は分子の配向が揃った時により早くなると考えら、作用電極の面からより遠方まで、電子が移動しやすくなると考えられる。フリー成分の多くは作用電極の表面に付着していて、作用電極との距離が短いので、より遠方まで電子が到達するようになっても影響は少ない。しかし、結合成分は直径数μｍの磁性ビーズ上に固定化されているので、一般に作用電極の表面からの距離は、結合成分の方が大きい。従って、電子が作用電極から遠方まで到達する時に、結合成分に由来する発光量が増大する度合いが大となると考えられる。分子配向の程度はフリー成分の電気的モーメントと作用電極の性質に依存すると考えられる。
【００５８】
作用電極への電圧の印加により、作用電極と発光試薬との間での電子伝達速度が上昇し、電子の到達距離が増大するため、作用電極の「電気化学的活性」が上昇すると考えられる。但し、上記のＧｒｅｇｏｒｙとＺｈｉの論文では、印加電圧の絶対値を上昇すると、最終的に分子は電極の面に対し殆ど垂直の配向となる。電圧の絶対値を更に上昇しても配向の向きは変わらない。電気化学発光の強度が、分子の配向だけで説明できるとすると、作用電極に印加する電圧の絶対値を上昇すれば良いことになるが、それだけでは、実施例１のように作用電極に印加する電圧が約＋０．６Ｖを越えると結合成分による発光強度が減少する（図５）理由を説明できない。分子配向以外の、本発明による効果を説明する理由として、電気化学発光反応において、Ｒｕ（ｂｐｙ）3（ＩＩ）錯体を励起状態にするために添加している補助剤（ＴＰＡ、トリプロピルアミン）が、作用電極に印加する電圧がある特定の電圧を越える時、作用電極上で反応し局所的に分解消費されてしまい、電気化学発光が阻害されると考えられる。
【００５９】
また、作用電極にマイナスの電圧を印加した時にもフリー成分に由来する発光強度は減少するが、結合成分に由来する発光強度も減少することが確認されたが、この発光強度の減少は、分子の配向する方向が、作用電極にプラスの電圧を印加した時と反対となることに関連があると考えられる。
【００６０】
【発明の効果】
測定対象物を含む溶液を作用電極に接触させて測定対象物を検出する電気化学検出法に使用する電気化学フロースルーセルにおいて、測定対象物による電極の汚染を減少させ、かつ測定のＳ／Ｎを向上させるという二つの条件を同時に満足する、作用電極に印加する電圧と印加時間との組合せを用いて、より高感度な測定が可能となる。また、検出感度を従来技術の電気化学フロースルーセルと同程度にすると、Ｂ／Ｆ分離の時間が短縮されスループットが向上できる。従来技術の電気化学フロースルーセルに新たな制御機構を設ける必要がなくコストを不要として上記の効果を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例の電気化学発光フロースルーセルの構成を表わす一部断面を含む図。
【図２】従来技術の電気化学発光測定において電圧を作用電極に印加する手順の一例を示す図。
【図３】本発明の実施例において、電圧を作用電極に印加する手順の一例を示す図。
【図４】本発明の実施例において、電圧を作用電極に印加する手順の一例を示す図。
【図５】本発明の実施例１において、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧とＳ／Ｎの関係を示す図。
【図６】本発明の実施例２において、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧が一定の時の、電圧の印加時間とＳ／Ｎの関係を示す図。
【図７】本発明の実施例３において、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧パルスのパルス幅とＳ／Ｎの関係を示す図。
【図８】本発明の実施例４において、Ｂ／Ｆ分離時に作用電極に印加する電圧パルスのオン時間とオフ時間の比率とＳ／Ｎの関係を示す図。
【図９】本発明の実施例５において、Ｂ／Ｆ分離時の溶液の水流速度と、Ｓ／Ｎ、測定限界の関係を示す図。
【図１０】従来技術の電気化学発光法において使用される、トリス（２、２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）錯体、トリス（２、２’−ビピリジル）オスミウム（ＩＩ）錯体の構造を示す図。
【符号の説明】
１…電気化学発光フロースルーセル、２…作用電極、３…対向電極、４…参照電極、５…試料流入口、６…試料流出口、７…磁石、８…光検出器（フォトマル、フォトダイオード等）、９…透明窓、１０…ポテンシオスタット・電源回路及び電圧印加制御系、１１…試料流路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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