(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０。
【請求項２】
Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントイン及び／又はＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸からＬ−α−アミノ酸を製造する方法において、この変換を微生物ＤＳＭ７３２９及び／又はＤＳＭ７３３０を用いて及び／又はこれらの微生物が生産したカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼを用いて行うことを特徴とするＬ−α−アミノ酸の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、Ｄ−又はＬ−又はＤ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントイン又はＤ−又はＬ−又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸を相応するエナンチオマー純粋なＬ−α−アミノ酸に変換する能力を高い特異的活性で有する新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｎ−５−モノ置換ヒダントインのエナンチオマー純粋なＬ−α−アミノ酸への発酵による、もしくは酵素による変換のための多くの方法が文献中に記載されているか、又は特許申請されている（Ｓｙｌｄａｔｋ，Ｃ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｒ．、Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｍ．、Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．著、ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  Ｌ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ  ＦＲＯＭ  Ｄ，Ｌ−５−ＭＯＮＯＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ  ＨＹＤＡＮＴＯＩＮＳ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｅｓ（Ｒｏｚｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．及び  Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．，編集）、Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ社，Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、１９９２、第１２９〜１７６頁参照）。
【０００３】
フラボバクター種(Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．)ＡＪ−３９１２からの精製されたヒダントイナーゼでの５−アリールアルキルヒダントイン、例えば５−ベンジルヒダントインの加水分解に関する反応機構は文献に記載されている（ヨコゼキ，Ｋ．、サノ，Ｋ．、エグチ，Ｃ．、イワガミ，Ｈ．及びミスギ，Ｋ．(１９８６）：ＯＰＴＩＭＡＬ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  Ｌ−ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ  ＦＲＯＭ  ＴＨＥ  ＣＯＲＲＥＳＰＯＮＤＩＮＧ  ５−ＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ  ＨＹＤＡＮＴＯＩＮＳ、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第５１巻、第７２９〜７３６頁及びヨコゼキ，Ｋ．、ヒロセ，Ｙ．及びクボタ，Ｋ．（１９８６）：ＭＥＣＨＡＮＩＳＭ  ＯＦ  ＡＳＹＭＭＥＴＲＩＣ  ＰＲＯＤＵＫＴＩＯＮ  ＯＦ  Ｌ−ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ  ＦＲＯＭ  ＴＨＥ  ＣＯＲＲＥＳＰＯＮＤＩＮＧ  ＨＹＤＡＮＴＯＩＮＳ  ＢＹ  ＦＬＡＶＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ  ＳＰ．、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第５１巻、第７３７〜７４６頁参照）。この際、往復反応の相対速度が調べられ、かつＤ−５−ベンジルヒダントインのＮ−カルバモイル−Ｄ−フェニルアラニンへの往反応がＬ−５−ベンジルヒダントインのＮ−カルバモイル−Ｌ−フェニルアラニンへの加水分解より明らかにゆっくりと進むことが示された。ここでは、Ｄ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントインは痕跡程度にしかＮ−カルバモイル−Ｌ−メチオニンに変換することはできなかったために、５−アルキルヒダントインのエナンチオマー選択加水分解の機構に関しては全く何も供述していない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は簡単に培養することができ、かつ比較的大量に、もしくは比較的高速でＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントイン及び／又はＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸からＬ−α−アミノ酸を製造することのできる酵素を製造する新規微生物を提供することである。更に、Ｌ−α−アミノ酸の相応する製法並びにカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の獲得法、及びカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の微生物又は細胞中への挿入法も課題である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この課題は微生物ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０で解決する。これらの微生物は１９９２年１１月１７日にドイツ微生物保存機関（ＤＳＭ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｕｍｅｎ  ｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １Ｂ、Ｄ−３３００  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託した。相当する寄託書を添付する。
【０００６】
新規に単離し、ドイツ微生物保存機関に寄託した微生物はアルトロバクター種の新規な種類である。
【０００７】
Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントイン及び／又はＤ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸から酵素によるＬ−α−アミノ酸の製法は、変換を微生物ＤＳＭ７３２９及び／又はＤＳＭ７３３０を用いてかつ／又はこれらの微生物の生産する酵素を用いて行う。
【０００８】
この方法を微生物自体を用いて行う場合、この方法はこれらの微生物が自体でこの基質を使用しないように、有利に静止又は死滅微生物を用いて行う。
【０００９】
この方法をこれらの微生物が生産した酵素を用いて行う場合、この方法を微生物の原汁（例えばフレンチプレス又はガラスビーズミルを用いて得られる）、粗抽出液を用いて又は多少でも精製した微生物の酵素を用いて行うことができる。
【００１０】
本発明は微生物ＤＳＭ７３２９及び／又はＤＳＭ７３３０を、
これらの微生物の突然変異種または変体の培養、
又はカルバモイラーゼ又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の獲得、
又は微生物又は細胞中へのカルバモイラーゼ又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の挿入、
又はＬ−α−アミノ酸の製造、
への使用にも関する。
【００１１】
これらの微生物の突然変異種又は変体の培養は例えば自然に起きる突然変異の選択により行うことができる。その他の可能性は、例えば化学物質及び／又は放射線及び／又はＵＶ−光の作用による突然変異である。
【００１２】
これらの微生物からの１種又はそれ以上の遺伝子の獲得は、例えば酵素に関する遺伝子の配列分析又は微生物中への挿入のために用いられ、この際この遺伝子を挿入する微生物の選択により前記方法に重要な酵素を多量に生産する微生物を得ることができる。場合によってはこの遺伝子を動物の、又は植物の細胞に組み込むこともできる。遺伝子の組込は微生物学的に常用の方法で、例えばベクターを用いて行う。
【００１３】
記載した新規微生物は一連の酵素を、この細胞塊が前記方法にとって非常に高い活性を有するような量で製造する。従来、この方法のために高い活性を有する菌株は全く知られていない。
【００１４】
前記のＬ−α−アミノ酸の製法は本発明の微生物もしくはそれらの酵素で実質的に立体特異的に進み、この際種々の５−置換ヒダントインを変換することができる。あとで示す反応工程（反応工程１）により相応するアミノ酸が得られる。本発明において、ヒダントイン中の基はアルキル基であってよく、分枝、環状であってよく、１種又はそれ以上のヘテロ原子によって置換されていてよく、芳香族であっても、ヘテロ芳香族であってもよい、等々。困難であるのは、５−メチルヒダントイン、５，５−ジ置換ヒダントイン、複数置換されたフェニルヒダントイン、例えば５−３´−メチル−４´−アミノメチルフェニルヒダントイン、ヒダントインに直接嵩高い基を有する、例えば５−ｔ−ブチルヒダントイン並びにヒダントインに隣接して荷電した置換基を有する残基を有する、例えば５−β−カルボキシエチルヒダントイン、５−γ−アミノプロピルヒダントイン、５−δ−アミノブチルヒダントインである。これに対して多くの化合物、例えば置換基、イソプロピル、Ｎ−プロピル、Ｎ−ブチル、メチルチオエチル、イソブチル、インドリルメチル、シクロヘキシルメチル、ベンジル、ナフチルメチル、フェニルで５−置換されたヒダントインは変換することができ、この際、非常に多種の置換基が可能である、例えばベンジルに、ｐ−フルオル、ｐ−クロル、ｐ−アミノ、ｐ−メトキシ、ｐ−カルボキシ。こうしてヒダントインもしくはＮ−カルバモイルアミノ酸中の５−置換基は基本的には全く制限されない、それというのも可能な置換基が多いこと及び置換基もしくはアミノ酸残基の官能化の可能性が多いことから基本的に全ての典型的な５−置換ヒダントイン又は相応するＮ−カルバモイルアミノ酸を基質として考慮することができる。
【００１５】
ヨーロッパ特許第０１５９８６６Ｂ１号明細書には、相応する５−アリールアルキルヒダントイン及び／又は相応するＮ−カルバモイルアミノ酸からＬ−α−アミノ酸を形成することのできるアルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．ＤＫ−２００のバクテリアが記載されている。ここでは単にＬ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−チロシンの合成のみ記載されている。特異的酵素活性又は酵素的機構に関しては全く記載されていない。アルトロバクター  ｓｐ．ＤＫ−２００は明らかに新規微生物アルトロバクター  ｓｐ．ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０とは異なる：アルトロバクター  ｓｐ．ＤＫ−２００はデンプンを加水分解することができない、このことはアルトロバクター属の中の種を同定するための決定的な生理学的特徴である。更に、この菌株はウレアーゼ活性を全く示さず、脱窒素に関してはこの菌株はプラスとしてグループ分けされている。更に、菌株アルトロバクターＤＫ−２００の成長は３３．２℃を越える温度ではもはや観察されない。更に、第１表から明らかなように炭素源としての乳糖の利用並びに糖からの酸の形成（Ｌ−アラビノースはマイナス、グリセリンはプラス）のような生理学的特徴に差がある。
【００１６】
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西独特許第３７１２５３９Ｃ２号明細書中には、非病原性で、かつ好気性のコリネフォルム（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｅ）バクテリアに属する３種の微生物、ＤＷ３（ＤＳＭ３７４５）、ＣＷ４（ＤＳＭ３７４６）及びＣＷ５（ＤＳＭ３７４７）が記載されている。これらの微生物は相応する５−アリールアルキルヒダントイン及びＮ−カルバモイル−α−アミノ酸から相応する芳香族Ｌ−α−アミノ酸を遊離する能力を有する。更に、この明細書はＤ−、Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントインをＤ−Ｎ−カルバモイルメチオニンを介してＬ−メチオニンに変換することを記載している。この変換に関しては使用した有機体に関する特異的な生産性に関する記載はない。Ｄ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸のＬ−アミノ酸への変換はＮ−カルバモイル中間化合物の面にラセマーゼが存在することに起因する（西独特許第３７１２５３９号明細書、第２頁、第４２〜４４行）。菌株ＤＳＭ３７４７に関する最新の刊行物中には相応するＤ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントインからＬ−アミノ酸の獲得の際にＤ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸の関与に関して記載されていない（Ｓｙｌｄａｔｋ，Ｃ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｒ．、Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｍ．、Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．、ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  Ｌ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ  ＦＲＯＭ  Ｄ，Ｌ−５−ＭＯＮＯＳＵＢＳＴＩＴＵＴＥＤ  ＨＩＤＡＮＴＯＩＮＳ：Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｅｓ（Ｒｏｚｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．出版）Ｈａｎｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、１９９２、第１２９〜１７６頁参照）。両方の微生物ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０に対して西独特許第３７１１５３９号明細書に記載された微生物ＤＳＭ３７４５〜ＤＳＭ３７４７の差異は生理学的な面において明らかである。このことは第２表の記載から明らかである。
【００１７】
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５−アルキルヒダントイン又は相応するＮ−カルバモイルアミノ酸から出発して、脂肪族Ｌ−α−アミノ酸を製造するための一連の方法が公知である。
【００１８】
西独特許第３７０２３８４Ａ１号明細書（米国特許第５０７１７５２号明細書）中には相応する５−置換ヒダントインからＬ−アミノ酸、例えばＬ−ロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−システインの微生物ノカルディア種（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｅｃ．）ＤＳＭ３３０６を用いる形成が記載されている。しかしながら特異的な活性に関しても記載されていないし、ヒダントイン加水分解に関する機構も提案されていない。
【００１９】
特開昭５５−２９６７８号公報によればコリネバクター  セペドニクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｍ）をＬ−またはＤ，Ｌ−Ｎ−
カルバモイルメチオニンに作用させ、その際基質混合物中に含有するＬ−Ｎ−カルバモイルメチオニンがＬ−メチオニンに変換される。しかしながら、この方法によればＬ−エナンチオマー基質のみがＬ−メチオニンに変換され、Ｄ−Ｎ−カルバモイルメチオニンは変換されない。同様にして特公昭６５−２９６７８号公報には微生物の酵素を用いてＤ，Ｌ−Ｎ−カルバモイルメチオニンからＬ−メチオニンを形成する方法が記載されている。この反応の後、未反応のＤ−Ｎ−カルバモイルメチオニンからＬ−メチオニンの分離が必要である。
【００２０】
アルトロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）を用いてＤ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントインからのＬ−メチオニンの形成が記載されており（Ｇｕｉｖａｒｃｈ，Ｍ．、Ｇｉｌｌｏｎｎｉｅｒ，Ｃ．及びＢｒｕｎｉｅ，Ｊ．−Ｃ．（１９８０）：ＯＢＴＥＮＴＩＯＮ  Ｄ´ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＥＳ  ＯＰＴＩＱＵＥＭＥＮＴ  ＡＣＴＩＦＳＡ  Ｌ´ＡＩＤＥ  Ｄ´ＨＹＤＡＮＴＯＩＮＡＳＥＳ、Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒ．Ｎｏ．１−２，９１−９５）、この際Ｄ−及びＬ−Ｎ−カルバモイルメチオニン中間工程でラセミ化が生じる。この反応工程は新規ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０では起きない。
【００２１】
特公平４−３９３１６号明細書には２種の新規のアルトロバクター種（Ａｒｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃ．）ＤＰ−Ｂ−１００１及びＤＰ−Ｂ−１００２が記載されており、これらは５−置換ヒダントインから、及びＮ−カルバモイルアミノ酸から、これらがＤ−、Ｌ−、Ｄ，Ｌ−型で存在するか又は混合物として存在するかに依存せずに、相応するＬ−アミノ酸を形成する。反応機構に関しては全く記載されていない。しかしながら、これらの新規微生物は主にその生理学的特徴において微生物ＤＳＭ７３２９およびＤＳＭ７３３０に対して異なっている。このことは第３表から明らかである。更に、Ｄ−Ｎ−カルバモイルメチオニンのＬ−メチオニンへの変換の比活性において、第４表に記載するように明らかな差異がある。
【００２２】
0003717535.tif 000004
0003717535.tif 000005
全ての細胞の比活性の計算を次の式により行う：
0003717535.tif 000006
第４表：
特公平４−３９３１６により、日本の菌株ＤＰ−Ｂ−１００１はＤ−Ｎ−カルバモイルメチオニンに関する次の比活性を提供する。
【００２３】
0003717535.tif 000007
同じ条件下に、菌株ＤＳＭ７３３０はＤ−Ｎ−カルバモイルメチオニンに関する次の比活性を提供する：
0003717535.tif 000008
すなわち、前記特公平、例１に記載された条件下のＤ−ＣＭに関する比活性の上昇は（ｇ／ｇ  ＢＦＭ×ｈ）に関してファクター３．３である。
【００２４】
他の緩衝液（０．１Ｍ  Ｎａ−炭酸塩−緩衝液、ｐＨ：８．５）及び２倍の基質投与の使用下に次の比活性が得られる：
0003717535.tif 000009
すなわち、ファクター  ６．５への更なる上昇が得られた。
【００２５】
条件の変更下に（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ：８．０、３０℃、通気及びその他の添加物なしに）次の比活性が得られた：
0003717535.tif 000010
すなわち、更にファクター１２への上昇！
ＢＭＦ：湿ったバクテリア塊；
Ｄ−ＣＭ：Ｄ−Ｎ−カルバモイルメチオニン
本発明で２種の新規アルトロバクター種ＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０の単離が行われた、これらは公知技術に対して明らかに高められた生産性を示し、主に脂肪族Ｌ−アミノ酸、例えばＬ−メチオニンを５−モノ置換ヒダントインのＤ−、及び／又はＬ−、及び／又はＤ，Ｌ−型及び／又は相応するＮ−カルバモイルアミノ酸及び／又はこれら両方の物質群からなる混合物から、反応工程１に示された新しく解明された反応機構により製造する。“アルキル”はここでは単に前記基質スペクトルに関する例として挙げられている。見出された速度に関しては矢印の太さで示す。
【００２６】
【化１】
0003717535.tif 000011
【００２７】
【実施例】
次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
【００２８】
例１：  微生物の単離
唯一の窒素源としてＤ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントインを含有する次の組成：
ＫＨ2ＰＯ4                                  １．０      ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                                  １．８１６  ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ０．１２３  ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                          ０．０１７  ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                          ０．００６  ｇ／ｌ
グルコース                                  ５．０      ｇ／ｌ
Ｄ，Ｌ−メチルチオエチルヒダントイン        １．０      ｇ／ｌ
痕跡成分溶液                                １０        ｍｌ／ｌ
ｐＨ：７．０
の合成培地各５０ｍｌを、
〔この際、痕跡成分溶液は次の組成を有する；
エチレンジアミンテトラ酢酸塩（Ｎａ+）     ５００ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                        ２００ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                        １０  ｍｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ                        ３    ｍｇ／ｌ
Ｈ3ＢＯ3                                  ３０  ｍｇ／ｌ
ＣｏＣｌ2・４Ｈ2Ｏ                        １    ｍｇ／ｌ
ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                        １    ｍｇ／ｌ
ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ                        １    ｍｇ／ｌ
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ                     ３    ｍｇ／ｌ、〕
種々異なる場所の土壌試料１ｇと共にじゃま板を有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で、３０℃、ｐＨ：７．０及び１００ｒ．ｐ．ｍで回転振盪装置（Ｂｒａｕｎ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）上で４日間恒温保持する。引き続き、これらの懸濁液各１ｍｌを新たに滅菌した前記培養液中に接種し、改めて３０℃、ｐＨ７及び１００ｒ．ｐ．ｍで回転振盪装置上で4日間恒温保持する。培養工程を１０回行なった後にそれぞれ懸濁培養液を複合培地に基づく寒天培地上に希釈列により塗布し、３０℃で恒温保持し、３日後に単独のコロニーが成長する様にする。個々の単独のコロニーを公知法で純粋培養にする。
【００２９】
個々の微生物菌株に関する複合培地の組成は次のとおりである：
グルコース                  １０．０ｇ／ｌ
工業用酵母抽出液            ０．５ｇ／ｌ
クエン酸                    ０．５ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ          ０．１ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ          ０．０５ｇ／ｌ
ＫＨ2ＰＯ4                  １．０ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                  １．８１６ｇ／ｌ
痕跡成分溶液                １０．０ｍｌ／ｌ
寒天                        ２０．０ｇ／ｌ
ｐＨ：７．０
Ｄ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントインからＬ−α−アミノ酸を獲得するための酵素活性に関する検査のためにこのようにして得られた純粋培養をサブマーズ培養（Ｓｕｂｍｅｒｓｋｕｌｔｕｒｅ）中で次のように培養した：
じゃま板を有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で、滅菌栄養培地Ｉ  １００ｍｌを新規にえられた純粋な培養の洗出液で接種し、かつ３０℃、ｐＨ：７．０及び１００ｒ．ｐ．ｍで回転振盪装置上で２４時間恒温保持する。このようにして得られた懸濁培養から、じゃま板を有する２０００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の滅菌栄養培地ＩＩ  ５００ｍｌを予培養１０ｍｌで接種する。新たに、培養を３０℃、ｐＨ７．２及び１００ｒ．ｐ．ｍで回転振盪装置上で３６時間行なう。その後細胞を遠心分離し、０．９％のＮａＣｌ溶液で２回洗浄する。このようにして得られた湿った細胞塊は、すぐに酵素活性を試験することも、又は−１８℃で数週間の間、中間的に貯蔵することもできる。
【００３０】
栄養培地  Ｉは次の組成を有する：
グルコース                                            １０．０ｇ／ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4                                        ６．５０ｇ／ｌ
クエン酸                                              ０．３２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                    ０．２０ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                                    ０．０２ｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ                                    ０．０２ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                    ０．０２ｇ／ｌ
ＫＨ2ＰＯ4                                            ４．５４ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                                            ７．６１ｇ／ｌ
栄養培地ＩＩは次の組成を有する：
グルコース                                            １５．０ｇ／ｌ
工業用酵母抽出物                                        １．０ｇ／ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4                                       ６．５０ｇ／ｌ
クエン酸                                              ０．６２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                    ０．４０ｇ／ｌ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                                    ０．０４ｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ                                    ０．０４ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                                    ０．０４ｇ／ｌ
ＫＨ2ＰＯ4                                            ３．４０ｇ／ｌ
Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ                                 ４．４２ｇ／ｌ
Ｄ，Ｌ−５−インドリルメチル−Ｎ−３−メチルヒダントイン０．２５ｇ／ｌ
このようにして得られた湿潤細胞塊（ＢＦＭ）の酵素活性を次の反応条件下に比較テストを行なう：
０．２Ｍのトリス／ＨＣｌ−緩衝液  ｐＨ：８．０  ５０ｍｌ中にＤ，Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントイン５０ｍｇ及びＢＭＦ２．５ｇを添加し、２４時間３０℃で恒温保持する。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、透明の上澄をＨＰＬＣ−分析で調べる。特に活性な物として２種の菌株が見出され、これらをドイツ微生物保存機関（ＤＳＭ）にＤＳＭ７３２９及びＤＳＭ７３３０として寄託した。これらの菌株は次に第５表の記載した生理学的及び細菌学的特性を有する。
【００３１】
0003717535.tif 000012
0003717535.tif 000013
0003717535.tif 000014
0003717535.tif 000015
化学的及び／又は物理学的突然変異により、又は連続的な培養における選択によりこれらの微生物から突然変異種又は変体が高められた及び／又はより安定化した酵素活性で富化する。
【００３２】
本発明による微生物でＮ−カルバモイル−α−アミノ酸を介してＬ−α−アミノ酸に、示した反応機構に相応して加水分解することのできるＤ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントイン変換に関する例を第６表に示す、両方の菌株で測定精度の範囲において同じ結果が見出された。
【００３３】
【表１】
0003717535.tif 000016
【００３４】
例２：バイオマスの培養
滅菌栄養培地Ｉ  １００ｍｌを有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコを傾斜培養の菌株ＤＳＭ７３３０の白金輪で接種し、円形振盪装置上１００ｒ．ｐ．ｍ．及び３０℃で培養する。２４時間の恒温保持時間の後、この懸濁培養を第２の予培養のための接種材料として使用する。滅菌栄養培地Ｉ  ５００ｍｌを含有する２０００ｍｌエルレンマイヤ−フラスコ１０コにそれぞれ第１の予培養１０ｍｌで接種し、新たに１００ｒ．ｐ．ｍ．及び３０℃で恒温保持する。恒温保持の後、この予培地ＩＩを接種材料としてバイオ反応器５０  ｌに使用する。この反応器は強化装置を備えており、これに栄養培地ＩＩの組成に相応する栄養培地４５  ｌを挿入し、ｐＨ６．５及び温度１２１℃及び約１バールの加圧で３０分間滅菌する。３０℃に冷却後、１０％のＮａＯＨでｐＨ７．０に調節し、引き続き予培養ＩＩからなる懸濁培養で接種する。培養を３０℃及び回転数４００ｒ．ｐ．ｍ．及び通気速度０．８Ｖ／Ｖ／ｍで行なった。１８時間後、湿潤細胞塊を遠心分離し、引き続き０．９％食塩溶液で２回洗浄する。このようにして得られた湿潤細胞塊はすぐに又は後の反応の時点まで−１８℃で中間貯蔵した後に、酵素反応に使用することができる。湿潤細胞塊１．７２５ｋｇが得られる。
【００３５】
同様にして、菌株ＤＳＭ７３２９を培養すると、この際湿潤細胞塊１．６９ｋｇが得られ、これは乾燥細胞塊０．３４ｋｇに相当する。
【００３６】
例３：
ＤＳＭ７３３０の湿潤細胞塊８３ｇ及びＤ，Ｌ−メチルチオエチルヒダントイン２０ｇ（１１５ｍｍｏｌ）を０．１Ｍソエレンセン（Ｓｏｅｒｅｎｓｅｎ）緩衝液ｐＨ：８．０  １０００ｍｌ中に懸濁させ、２  ｌ撹拌反応器中で３５℃、Ｎ2−通気、及び撹拌下に、２８時間恒温保持する。引き続き、細胞を遠心分離し、上澄を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析する。上澄中に、Ｌ−メチオニン１６．４ｇ（１１０ｍｍｏｌ）が検出された。
【００３７】
収量＝理論値の９５．６％
例４：
ＤＳＭ７３３０の湿潤細胞塊１００ｇ及びＤ−カルバモイルメチオニン１０ｇ（５２ｍｍｏｌ）を０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ：８．０１０００ｍｌ中に３０℃で懸濁させ、かつ通気することなしに２  ｌ撹拌反応器中で撹拌下に９時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にＬ−メチオニン６．６ｇ（４４ｍｍｏｌ）が検出された。
【００３８】
収量＝理論値の８４．６％
例５：
ＤＳＭ７３２９の湿潤細胞塊１００ｇ及びＬ−カルバモイルメチオニン１０ｇ（５２ｍｍｏｌ）を０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ：８．０１０００ｍｌ中に３０℃で懸濁させ、かつ通気することなしに２  ｌ撹拌反応器中で撹拌下に３．５時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にＬ−メチオニン７．６８ｇ（５１．５ｍｍｏｌ）が検出された。
【００３９】
収量＝理論値の９９％
例６：
ＤＳＭ７３３０の湿潤細胞塊１００ｇ及びＤ，Ｌ−カルバモイルメチオニン１０ｇ（５２ｍｍｏｌ）を０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ：８．０  １０００ｍｌ中に３０℃で懸濁させ、かつ通気することなしに２  ｌ撹拌反応器中で撹拌下に９時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にＬ−メチオニン７．１６ｇ（４８ｍｍｏｌ）が検出された。
【００４０】
収量＝理論値の９２％
例７：
ＤＳＭ７３３０の湿潤細胞塊１００ｇ及びＤ，Ｌ−カルバモイルメチオニン１０．４ｍｍｏｌ及びＤ，Ｌ−メチルチオエチルヒダントイン４１．６ｍｍｏｌからなる工業用ヒダントイン１０ｇを０．２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ：８．０  １０００ｍｌ中に３０℃で懸濁させ、かつ通気することなしに２  ｌ撹拌反応器中で撹拌下に１５時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にＬ−メチオニン７．０１ｇ（４７ｍｍｏｌ）が検出された。
【００４１】
収量＝理論値の９０．３％
例８：
粗抽出物及び精製酵素溶液の製造
微生物ＤＳＭ７３２９もしくはＤＳＭ７３３０をガラスビーズミル中で約１５分砕壊し、引き続きバイオマスを遠心分離により分離する。上澄は酵素−粗抽出物であり、蛋白質約２１ｇ／ｌを含有する。粗抽出物中に含有されるヒダントイナーゼの単離のためにこれを常法で処理する。ここでの場合、上昇する分割沈殿を、１．７Ｍ硫酸アンモニウムで開始し、引き続き硫酸プロタミン（３ｇ／ｌ）分離、引き続き２．５Ｍ硫酸アンモニウムによる蛋白質の沈殿により行なう。このようにして得られた予精製生産物をカラムクロマトグラフィーにより更に精製するが、この際、順次ブチルセファロース、フェニルセファロース及び２回アニオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ７．８、ｐＨ６．６）を行なう。菌株ＤＳＭ７３２９は第１のアニオン交換クロマトグラフィーの後、蛋白質含量０．１２ｇ／ｌを有し、菌株ＤＳＭ７３３０は第２のアニオン交換クロマトグラフィーの後蛋白質含量０．１ｇ／ｌを有する（Ｂｒｅｄｆｏｒｄによる）。蛋白質純度はゲル電気泳動により決定する。
【００４２】
酵素−粗抽出物（２１ｇ／ｌ）及び精製した酵素溶液（ヒダントイナーゼ０．１ｇ／ｌ）を次の例に使用する。
【００４３】
例９：
Ｄ−メチルチオエチルヒダントイン０．００５７５ｍｍｏｌを酵素１００  ｌと共に０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ８．５  ９００  ｌ中で４２℃で１時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にＤ−カルバモイルメチオニン０．００３５１ｍｍｏｌが測定され、このことは変換率６１ｍｏｌ％に相応する。
【００４４】
例１０：
Ｌ−メチルチオエチルヒダントイン０．００５７５ｍｍｏｌを酵素１００  ｌと共に０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ８．５  ９００  ｌ中で４２℃で１時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にＬ−カルバモイルメチオニン０．０００８６３ｍｍｏｌが測定され、このことは変換率１５ｍｏｌ％に相応する。
【００４５】
例１１：
Ｄ−カルバモイルメチオニン０．００５２１ｍｍｏｌを酵素１００  ｌと共に０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ８．５  ９００  ｌ中で４２℃で１時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にＤ−メチルチオエチルヒダントイン０．０００１６２ｍｍｏｌが測定され、このことは変換率３．１ｍｏｌ％に相応する。
【００４６】
例１２：
Ｌ−カルバモイルメチオニン０．００５２１ｍｍｏｌを酵素１００  ｌと共に０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ８．５  ９００  ｌ中で４２℃で１時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にＬ−メチルチオエチルヒダントイン０．００００５２１ｍｍｏｌが測定され、このことは変換率１．０ｍｏｌ％に相応する。
【００４７】
例１３：
Ｌ−カルバモイルメチオニン０．００５２１ｍｍｏｌを酵素−粗抽出物１００ｌと共に０．１Ｍトリス／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ８．５  ９００  ｌ中で４２℃で０．５時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にＬ−メチオニン０．００５２１ｍｍｏｌが測定された。