(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マレイン酸及び／又は無水マレイン酸をイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下異性化させる反応、及び、前記異性化反応物の少なくとも一部及びアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下水溶媒中で反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを生成させる反応、を順次又は同時に実施してＬ−アスパラギン酸を製造する方法において、少なくとも異性化反応における水溶液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して実施することを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法。
【請求項２】
前記水溶液中の溶存酸素濃度を反応に不活性なガスと接触させることにより調節することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液中の溶存酸素濃度を亜硫酸塩を添加することにより調節することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも異性化反応の水溶液中の溶存酸素濃度を０．５ｐｐｍ以下に維持して実施することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法に関するものである。詳しくは、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸を原料とし、酵素作用によりＬ−アスパラギン酸を製造するための工業的に有利なプロセスに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アスパラギン酸は医薬、食品添加物として需要が増加している。また、新たな用途開発も検討されているが、現在のところ製造コストが高く経済的に優れた工業的プロセスは確立されていない。
Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、フマル酸とアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下、酵素反応により得る方法が知られている。
【０００３】
また、マレイン酸とアンモニアをイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下異性化しフマル酸を得た後、上記と同様な酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を得る方法も知られている。［Ｙ．Ｔａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３０，Ｎｏ．４，３４５〜３５０（１９６６）］
しかしながら、従来法は、酵素反応後のＬ−アスパラギン酸アンモニウムを硫酸又は塩酸により酸析するため、経済的価値の低い無機酸アンモニウム塩を大量に副生し、結果的にＬ−アスパラギン酸の製造コストを高めることとなっていた。
【０００４】
この欠点を改良する方法として、酵素反応後のＬ−アスパラギン酸アンモニウムをマレイン酸又は無水マレイン酸により酸析し、Ｌ−アスパラギン酸結晶を回収した後のマレイン酸アンモニウムを含む母液を原料として利用する方法が提案されている（米国特許第４５６０６５３号明細書、特開平８−３３４９１号公報）。これらの方法は、原料として大量に入手が容易で、しかも安価な無水マレイン酸を用いるので、工業的に非常に望ましい方法となり得る。
【０００５】
しかしながら、上記提案の方法は、マレイン酸アンモニウムの異性化反応に、従来より知られている化学反応又は酵素反応を適応させたものであるので、工業的に安定した連続操作を継続的に行ない、Ｌ−アスパラギン酸を安価にかつ効率的に製造することは未だ困難であった。
【０００６】
特に、酵素反応を用いるケースでは、マレイン酸をフマル酸に異性化する反応とフマル酸をアスパラギン酸に変換する二つの反応を多段にあるいは同時に実施することが必要となり、この場合にイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の酵素作用を工業的に満足のいく長時間の連続運転を継続的に維持すると、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物の酵素活性が低下する問題のあることが判明した。
【０００７】
また、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムの晶析に当たり、大量のマレイン酸を添加しないとＬ−アスパラギン酸結晶の回収率を高めることができず、晶析工程で添加するマレイン酸の量が、晶析すべきＬ−アスパラギン酸の量を超える条件となっている。そのため、晶析後のマレイン酸アンモニウムを含む母液を反応系にリサイクル使用すると、次第に、系内のＬ−アスパラギン酸濃度が上昇する問題が生じ、連続運転が困難となる場合が生じ効率的な工業的製法とは言い難かった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸を原料とし、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物により水溶媒中でこれを異性化し、次いでアスパルターゼ又はこれを産生する微生物、及びアンモニアの存在下、水溶媒中で酵素反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを得て、酵素反応後のＬ−アスパラギン酸アンモニウムをマレイン酸及び／又は無水マレイン酸により酸析し、Ｌ−アスパラギン酸結晶を回収した後のマレイン酸アンモニウムを含む母液を異性化反応工程にリサイクルするＬ−アスパラギン酸の製造方法において、バランスのとれた安定した連続操作が可能なＬ−アスパラギン酸の製造プロセスを提供し、かつ、酵素反応におけるイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の酵素作用を低下することなく継続的に維持する新規な方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は上記実情に鑑み鋭意検討した結果、酵素反応を効率的に行うためには、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物を用い、マレイン酸を異性化するに際し、水溶媒中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して反応することにより、イソメラーゼの活性の低下を抑制し安定的に酵素反応を進行させることが可能なことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸をイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下異性化させる反応、及び、前記異性化反応物の少なくとも一部及びアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下水溶媒中で反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを生成させる反応、を順次又は同時に実施してＬ−アスパラギン酸を製造する方法において、少なくとも異性化反応における水溶液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して実施することを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方法に存する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
（工程▲１▼）
本発明では、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸をイソメラーゼ又はこれを産生する微生物の存在下、異性化させたのち、異性化反応物の少なくとも一部及びアンモニアをアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下、水溶媒中で反応させてＬ−アスパラギン酸アンモニウムを生成させる。反応は、マレイン酸アンモニウムをフマル酸アンモニウムに異性化した後、これを酵素としてアスパルターゼ又はこれを産生する微生物の存在下、反応処理してアスパラギン酸アンモニウムを生成させる二段反応法、又は、マレイン酸アンモニウムの異性化とアスパラギン酸アンモニウムの生成とを同時に行なう一段反応法のいずれでもよい。
【００１２】
マレイン酸アンモニウムをフマル酸アンモニウムに異性化する反応及びフマル酸アンモニウムをアスパラギン酸アンモニウムに変換する反応は公知であり、本発明はこれらの反応自体は公知法に準じて実施することができる。
【００１３】
本発明に用いられるマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物としては、本活性を有する微生物であれば特に限定されるものではないが、アルカリゲネス属、シュードモナス属、キサントモナス属、バチルス属に属する微生物が好適に用いられる。特にアルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＩＦＯ  １２６６９、同ＩＦＯ  １３１１１、同ＩＡＭ  １４７３、アルカリゲネス  ユウトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、シュウドモナス  フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ  ２３７２８、キサントモナス  マルトモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｕｔｏｍｏｎａｓｕ）ＡＴＣＣ  １３２７０、バチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＭＩ−１０１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８０１）、バチルス  ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＭＩ−１０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８０３）等が好適に用いられる。さらに、上記、遺伝子を組換えた遺伝子改変微生物を用いても何等差し支えない。
【００１４】
培養した各菌体は、予め、リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄した後用いることも出来る。洗浄用のリン酸緩衝液の濃度は０．０５Ｍ〜０．２Ｍ程度が好適に用いられる。菌体はそのまま使用することができるし、必要により、該菌体を超音波破砕等で処理をした菌体破砕物や該破砕物を遠心分離した無細胞抽出液、該無細胞抽出液を硫安分画法、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム等で精製した部分精製酵素、または該菌体や菌体破砕物をアクリルアミドモノマー、アルギン酸等の担体を用いて固定化した固定化物を用いることもできる。菌体を用いる場合、予め菌体を凍結したり、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２重量％添加した液中で、１５〜４０℃の温度で、１０〜１２０分菌体を処理することにより菌体の透過性を高めてから使用する事もできる。
【００１５】
本発明では、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理物をマレイン酸を含有する水溶液中で酵素反応させるに際し、マレイン酸を含有する水溶液中の溶存酸素濃度（以下、ＤＯと略記することがある）を４ｐｐｍ以下、好ましくは１ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０．５ｐｐｍ以下に維持して反応させることに特徴を有する。
【００１６】
溶存酸素濃度が高いと、異性化反応を長時間実施すると酵素イソメラーゼの活性が低下し、異性化反応を安定的に継続することが困難となり、イソメラーゼ又はこれを産生する微生物を反応終了後に回収する等により、繰り返しバッチ運転を実施したり、長時間の連続運転を実施することは難しくなる。
【００１７】
本発明において前記水溶液中の酸素濃度を調節する方法としては、通常、前記水溶液中に不活性なガスを流通させる方法、又は、脱酸素剤である亜硫酸塩を前記水溶液に添加する方法などが挙げられる。これらの処理は反応に供する原料水溶液を対象として通常実施されるが、反応系にて実施してもよい。
【００１８】
本発明に用いる反応に不活性なガスとは、酸素を含むガスでなければ特に限定されるものではない。Ａｒ、Ｈｅのようないわゆる希ガス、窒素ガス、炭酸ガス等から選択されるガスでよく、一種のガスか、２種以上のガスを組み合わせてもよい。これらのガスにより処理する方法としては、例えば、マレイン酸水溶液中に上記ガスを連続的又は間歇的に吹き込みながら攪拌する方法が一般的である。また、処理後は引き続きマレイン酸含有水溶液槽内を前記ガスでシールしておくことが好ましい。
【００１９】
本発明に用いる亜硫酸塩とは、亜硫酸の塩であれば良く、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸カルシウム等の無機亜硫酸塩が好ましいが、マレイン酸イソメラーゼ活性を阻害することが知られる水銀、銅との塩は用いられない。亜硫酸塩を添加する場合の濃度としては、１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは１０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍが用いられる。亜硫酸塩の添加位置としては、特に限定されるものではなく、どの工程でも、またどの工程の間へでも構わない。数カ所に分割して添加してもよい。
【００２０】
本発明において、フマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸アンモニウムに変換するには、アスパルターゼあるいはアスパルターゼを産生する微生物の存在下に実施されるが、この方法は公知の方法により行なうことが出来る。アスパルターゼを産生する微生物としては、フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を生成しうる能力を有する微生物であれば特に制限がなく、例えば、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、バチルス属等の微生物が挙げられる。具体的には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ  ６８７２、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ  １１３０３、同ＡＴＣＣ  ２７３２５等を例示することが出来る。
【００２１】
異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成させる反応の原料水溶液濃度は、通常、後述する工程▲３▼から回収されるマレイン酸モノアンモニウム水溶液の濃度により決定される。本発明においては、工程▲１▼における原料水溶液の濃度は、通常、マレイン酸モノアンモニウム換算で、４５〜７００ｇ／ｌ、好ましくは９０〜４５０ｇ／ｌである。
【００２２】
本発明における工程▲１▼の異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成させる反応は、アンモニア以外のアルカリ剤を併用したｐＨ調整下で実施することもできる。この際の前記反応系内のｐＨはそれぞれ通常、７．５〜１０が好ましく、両反応を同時に同一反応槽で実施しても差し支えない。同時に行なう場合には、各々の性質を持つ菌を併用し、両反応に適した条件を選定して行なうことができる。また、両方の性質を有するものであれば併用の必要は必ずしもない。
【００２３】
アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど特に限定されるものではないが、Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応の原料であるアンモニアを使用することが、本発明においては好ましく、異性化反応に対しても何ら悪影響を与えない。アンモニアを単独で使用する場合アンモニアの使用量は原料マレイン酸モノアンモニウムに対して、１．０５〜２．０モル倍であり、好ましくは１．１〜１．６モル倍である。また、上記アルカリ剤をアンモニアと併する場合は、前記反応系内のｐＨ範囲になる量に、アンモニア及びアルカリ剤の量が調節される。
【００２４】
異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成させる反応の温度は、酵素反応が効率的に行なわれる温度が選定され、通常１０〜８０℃、好ましくは５０〜６０℃である。
【００２５】
酵素反応の反応操作としては、限定されるものではないが、バッチ操作に比べて連続操作がより好ましい。通常、反応方式として菌体を固定化した充填層に原料水溶液を通液する方法、又は、菌体自体又は固定化した菌体を懸濁した反応器中に原料水溶液を供給する一方、反応液を抜き出し、これを分離膜や遠心分離機を用いて菌体を分離し反応器に戻す方法が挙げられる。
【００２６】
Ｌ−アスパラギン酸を生成させる反応で得られる反応液はＬ−アスパラギン酸アンモニウムを主体として含むが、このアンモニウム塩はモノアンモニウム塩とジアンモニウム塩の混合物である。ジアンモニウム塩の割合は通常、１０〜６０％モルである。また、この反応液中には未反応のフマル酸アンモニウム及びマレイン酸アンモニウムを含む場合もあるが、この含有量は５ｇ／ｌ以下、好ましくは２ｇ／ｌ以下、特に１ｇ／ｌ以下に制御することが望ましい。
【００２７】
工程▲１▼の酵素反応した反応液は、常法により菌体を分離した後、次工程に送られる。通常、分離膜や遠心分離機を用いて菌体を分離する。
【００２８】
（工程▲２▼）
上記工程▲１▼で得られた溶液にマレイン酸及び／又は無水マレイン酸を添加して、Ｌ−アスパラギン酸を晶析させる。添加するマレイン酸、無水マレイン酸は、粉末でも、溶融液でも、水溶液でも、またスラリーであってもよい。この二種類の酸を任意の比で混合することも何ら制限をうけるものでない。
【００２９】
工程▲２▼で添加されるマレイン酸及び／又は無水マレイン酸の量は、（マレイン酸＋無水マレイン酸）／Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムのモル比が、０．５〜１．４、好ましくは０．６〜１．３となる様に添加される。このモル比が小さすぎると、晶析回収でのＬ−アスパラギン酸の回収率が充分でなく、リサイクル系内のアスパラギン酸濃度が高くなり、また大きすぎると、添加したマレイン酸および無水マレイン酸が効率的に晶析に利用されない。
【００３０】
晶析温度は通常、０〜９０℃、好ましくは、１０〜８０℃である。あまり低温の場合、得られる結晶が細かくなりすぎ、固液分離操作が面倒となる上、リンス効率も悪化する。すなわち、固液分離で得られる湿ケーキの母液保持量（含水液量）が多くなり、さらに充分なリンス効果が得られないため、結晶純度が低下するか、リンス量を増やしてＬ−アスパラギン酸の回収率を低下させるかの状況になる。一方、あまり高温では、Ｌ−アスパラギン酸の回収率が低いばかりか、マレイン酸の熱劣化が生ずる恐れがあり、好ましくない。
【００３１】
また晶析工程の処理時間は通常０．５〜５時間程度である。
晶析は通常、攪拌槽タイプの晶析槽を用いて実施される。マレイン酸及び／又は無水マレイン酸の添加位置は晶析槽又はこれに通じる工程▲１▼からの移送配管中のいずれでもよい。また、晶析は、工程▲１▼で得られた溶液、又は必要により後述する工程▲４▼で得られた溶液の脱アンモニア後の水溶液と、マレイン酸及び／又は無水マレイン酸とを連続的に供給する一方で、生成スラリーを連続的に抜き出す連続式が望ましいが、一部、間歇的操作もしくは回分式で行なってもよい。
【００３２】
（工程▲３▼）
上記工程▲２▼で得られたスラリーを固液分離し、必要に応じて得られた結晶を水でリンスすることによりＬ−アスパラギン酸結晶を回収する。得られた結晶は、常法により乾燥し純度９９％以上の製品として回収することができる。
【００３３】
固液分離で得られる母液には、マレイン酸モノアンモニウムが含まれ、さらに溶解度分のＬ−アスパラギン酸アンモニウムも含まれている。この母液は上記工程▲１▼にリサイクルされ、工程▲１▼の原料として再使用される。
【００３４】
スラリーの固液分離は、特に限定するものではないが、０〜８０℃の温度範囲、好ましくは、１０〜５０℃で行なう。低温下ではスラリーの粘性が高く取扱いが困難になり、高温下では、Ｌ−アスパラギン酸の溶解度が高くなり、回収率が低下してしまう。必要に応じて行なうリンス操作に用いる水の量は、特に限定するものではないが、湿ケーキに対して５重量倍以下、好ましくは、３重量倍以下で行なう。リンス量が少なすぎるとリンス効果が充分でなく、多すぎるとＬ−アスパラギン酸の回収率が低下する。リンス水の温度についても特に限定されるものではない。
【００３５】
分離操作は、限定されるものではないが、例えばヌッチェ、遠心分離等の常法により行なうことができる。
固液分離で得られる母液は、主にマレイン酸モノアンモニウムが含まれ、ｐＨが３〜６程度の酸性水溶液である。必要に応じて濃縮工程により水を除去し、更にアンモニアを加えて工程▲１▼にリサイクルすることができる。
【００３６】
（工程▲４▼）
本発明の方法においては、工程▲１▼で得た反応液を工程▲２▼の実施の前に蒸留又はストリッピングしてアンモニアの一部を除去することにより、Ｌ−アスパラギン酸アンモニウムを実質的に、Ｌ−アスパラギン酸モノアンモニウム塩とすることができ、さらに有利なプロセスとなる。工程▲４▼を実施した場合に得られるＬ−アスパラギン酸モノアンモニウム塩の割合は、全体のＬ−アスパラギン酸アンモニウム塩に対して９０モル％以上、好ましくは９５モル％以上、更に好ましくは９８モル％以上、である。
【００３７】
この脱アンモニア処理により、工程▲２▼で用いるマレイン酸又は無水マレイン酸の使用量が抑制でき、バランスのとれた一層長期間の連続運転可能な工業的プロセスが実現するのである。
【００３８】
好ましい態様として工程▲４▼を実施する場合のプロセスにおいて、工程▲４▼で得られた液は、工程▲２▼に送られ酸析に供されるが、その場合のマレイン酸及び／又は無水マレイン酸の添加量は、（マレイン酸＋無水マレイン酸）／Ｌ−アスパラギン酸モノアンモニウムのモル比で、０．５〜１．１、好ましくは０．６〜１．０である。このモル比が小さすぎると、晶析回収でのＬ−アスパラギン酸の回収率が充分でなく、リサイクル系内のアスパラギン酸濃度が高くなり効率的でなく、また大きすぎると、添加したマレイン酸および無水マレイン酸が効率的に晶析に利用されない。
【００３９】
工程▲４▼を実施する場合のプロセスにおける工程▲２▼の他の晶析条件については、前記工程▲２▼に記載した方法によればよい。
蒸留操作又はストリッピング操作（以下、アンモニア除去操作ということがある）は、常圧下でも減圧下でもよく、３０〜１００℃の範囲で、好ましくは、４０〜８０℃で行なうことができる。低温下でアンモニア除去操作を行なうには、減圧度を高めなくてはならず操作上の制約が大きくなる。
【００４０】
一方、高温下では、液組成の熱劣化を招くので好ましくない。本発明の方法における全工程のうち、最も高温で処理することにもなり得る本工程の温度条件、特に上限温度については、この観点から上記の様に規定されるべきである。アンモニア蒸留塔の形式は通常の棚段塔又は充填塔が使用できる。
【００４１】
工程▲１▼の酵素反応により得られたＬ−アスパラギン酸アンモニウム水溶液を、上記の方法でアンモニア除去操作することにより、蒸留釜にはＬ−アスパラギン酸に対するアンモニアのモル比が約１．０の、即ち、Ｌ−アスパラギン酸モノアンモニウム、を含む残液を得ることができる。
【００４２】
アンモニア除去操作で蒸気として分離されるのは、アンモニアおよび水のみであり、冷却管等を用いてこの蒸気を液として回収すれば、アンモニア水が得られる。この得られるアンモニア水の濃度は、アンモニア除去操作の温度、圧力および蒸気回収温度等に影響される。
【００４３】
上記操作後の水溶液は工程▲２▼に送り、Ｌ−アスパラギン酸結晶を回収するが、晶析工程に供給する水溶液中のＬ−アスパラギン酸アンモニウム濃度は通常、５０〜８００ｇ／ｌ、好ましくは１００〜５００ｇ／ｌである。この濃度があまり低いと結晶回収率が低くなり、逆にあまり高いと回収スラリーの濃度が高くなりすぎ操作上好ましくない。
【００４４】
工程▲４▼のアンモニア除去操作で蒸気として分離し、冷却管等で回収されたアンモニア水は、上記の工程▲３▼あるいは工程▲１▼に必要に応じて再使用される。この場合の供給温度は、特に限定されないが、それぞれの工程の反応又は操作温度を考慮して５〜８０℃、好ましくは、１０〜５０℃が採用できる。高温下では、アンモニアの蒸気圧が高くなり好ましくない。また、反応温度より低温で供給しても何ら問題ない。
【００４５】
リサイクルするアンモニアを供給する方法は、特に限定するものではないが、工程▲１▼の異性化反応及びＬ−アスパラギン酸を生成する酵素反応の二つの反応に適当に分配しても、またいずれかの反応に一括して供給しても何ら問題にならない。また、異性化反応とＬ−アスパラギン酸を生成する酵素反応を同一反応器内で行なう場合、工程▲３▼で分離された母液に供給してもよい。
【００４６】
（ブリード）
本発明のＬ−アスパラギン酸の製造方法では、リサイクルの工程を含むため不純物や反応副生成物の蓄積を考慮して、必要に応じてブリードを行なうことが可能である。
【００４７】
ブリードする位置としては、特に限定するものではなく各工程後のいずれの位置からブリードしてもよい。また、複数の箇所においてブリードすることも可能である。中でも工程▲１▼で得た釜残水溶液から、即ち、工程▲１▼と工程▲２▼の間、又は工程▲１▼と工程▲４▼の間から、ブリードするのが好ましい。
【００４８】
ブリード量は、通常、釜残水溶液の容量ベースで１〜２０％、好ましくは３〜１７％である。ブリード率が低いとその効果が小さく意味がなく、高ければ主工程と同じ程度の機器容積をブリード系がもつことになり、経済的に不利なプロセスを与える。ブリードする方法は、このブリード率を満足する範囲において連続的であっても、また、間歇的であっても良い。
【００４９】
ブリード液からＬ−アスパラギン酸を結晶として回収するのが好ましく、その方法としては、通常、硫酸又は塩酸等の無機酸を添加して行なうのが好ましい。無機酸の添加量はアスパラギン酸アンモニウムに対して当量以上である。すなわち、Ｌ−アスパラギン酸の等電点２．８になるようにブリード液に無機酸を加えるのが回収率を向上させるために望ましい。
【００５０】
上述のブリード液の処理により、含有されるＬ−アスパラギン酸アンモニウムは損失することなく回収でき、しかも、系内に蓄積する不純物はブリードによりパージされるので好ましい結果を与える。本発明は、工程▲１▼〜▲３▼のメインライン及び好ましくは工程▲４▼の脱アンモニウム工程からのアンモニア回収、また好ましくはブリード液処理工程、の各工程を連結することにより、バランスのとれた安定して連続運転可能な工業的に有利なプロセスを提供することができ、かつ高純度のＬ−アスパラギン酸の製造を可能とするものである。
【００５１】
また、本発明は上記▲１▼〜▲３▼の各工程の処理操作を逐次実施するが、▲１▼〜▲３▼の各工程は回分法でも、連続法でもよい。例えば、全工程を回分法で実施する場合でも、本発明によれば、繰り返し反応を行なっても、各工程とも同一処理量で同一条件にて操作することが可能である。
もちろん、全工程を連続法で実施する場合には、バランスのとれた安定したプロセスとなるのである。
【００５２】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、実施例の記述に限定されるものではない。
尚、Ｌ−アスパラギン酸（以下、ＡＳＰと略記する）、マレイン酸（以下、ＭＡと略記する）およびフマル酸（以下、ＦＡと略記する）の分析は高速液体クロマトグラフィーにより、ＡＳＰ結晶中のアンモニア（以下、ＮＨ3 と略記する）含量の分析はイオンクロマトグラフィーにより定量した。
【００５３】
［参考例］酵素の調整
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性ソーダでｐＨ７．０に調整）の培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、アルカリゲネス  フェカリス  ＩＦＯ  １２６６９菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
【００５４】
また、上記と同様の培地１０００ｍｌを容量３Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
【００５５】
（２）フマル酸よりアスパラギン酸生成能を有する微生物の培養
尿素：４ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：１４ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ：０．５ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ：２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地１００ｍｌを容量５００ｍｌの三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＢ−４１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した。
【００５６】
また、上記と同様の培地１０００ｍｌを容量２Ｌのジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液２０ｍｌと滅菌済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これを３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。本菌体は、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の方法で除いた。すなわち、アスパラギン酸：１００ｇ、アンモニア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりなる組成液に集菌体を懸濁し、４５℃、３時間振とうし、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体を回収した。
【００５７】
［実施例１］酵素反応
（１）予め窒素ガスを３０分吹き込みながら攪拌し、窒素置換した反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉を容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、上記で回収した両菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加し、窒素ガスを０．０２ｖｖｍの速度で供給して槽内を窒素ガスでシールし、反応中、溶存酸素濃度を０．５ｐｐｍ以下に維持した。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１６９ｇ／ｌ得られた。
【００５８】
（２）予め窒素ガスを３０分吹き込みながら攪拌し、窒素置換した反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉を密閉された容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、溶存酸素濃度が安定になったところで上記で回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加した。反応中、溶存酸素濃度はおよそ３ｐｐｍ以下に維持された。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１３６ｇ／ｌ得られた。
【００５９】
（３）反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉に０．２ｇ／ｌの亜硫酸ソーダを加え、密閉された容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、溶存酸素濃度が安定になったところで上記で回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加した。反応中、溶存酸素濃度はおよそ３ｐｐｍ以下に維持された。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１３３ｇ／ｌ得られた。
【００６０】
［比較例１］酵素反応
溶存酸素低下処理を行わなかった反応液〈マレイン酸１５０ｇ、２５％アンモニア水２２０ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〉を容量３Ｌのジャーファーメンターに移し、上記で回収した菌体（イソメラーゼ菌２０ｇ、アスパルターゼ菌１２０ｇ）を添加し、反応中も特に溶存酸素低下処理を行わなかった。反応中、溶存酸素濃度はおよそ７ｐｐｍであった。
３０℃で４８時間反応させたところ、反応液中にＬ−アスパラギン酸は、１０１ｇ／ｌ得られた。
【００６１】
［実施例２］リサイクル操作
（Ａ）実施例１（１）と同様にして得られた酵素反応液を溶存酸素濃度の上昇がないように窒素ガスでシールしたまま、限外ろ過膜（旭化成社製−ＡＣＶ−３０５０）を用い、菌体を除去した。菌体の濃縮液は、窒素ガスシールの容器に移し、４℃で冷蔵保存した。
【００６２】
一方、得られた反応濾液１Ｌを容量２Ｌのナス型フラスコに仕込み、ラボ用エバポレーターを用いて、８０℃、３８０ｍｍＨｇの条件下、アンモニアを蒸留分離した。得られる蒸気の回収を目的に、５０ｗｔ％エチレングリコールの冷却水が０℃で循環する冷却管をとりつけた。１５分後、常圧に戻して、アンモニア除去操作を終了した。
【００６３】
蒸留釜の残液は、ＡＳＰが２０７ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２６．５ｇ／ｌの組成で、８２５ｍｌの容量であった。この残液に蒸留水を加えて、ＡＳＰが２００ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２５．９ｇ／ｌの組成（ＮＨ3 ／ＡＳＰモル比は１．０、すなわち、全てがＡＳＰモノアンモニウム塩）で８５０ｍｌの釜残液を作成した。
冷却管で得られた回収液は、ＮＨ3 が２７ｇ／ｌのアンモニア水１８５ｍｌであった。
【００６４】
（Ｂ）上記（Ａ）で得られたＡＳＰモノアンモニウム水溶液  ８５０ｍｌを容量１０００ｍｌのジャケット付きセパラブルフラスコ内でジャケットに温水を流すことで６０℃に保温し、攪拌しながらＭＡ１１９ｇ（ＭＡ／ＡＳＰモル比は０．８０）を添加し、晶析した。ＭＡの添加後、攪拌を続けながら３０分間６０℃で保温した後、１時間かけ、２０℃まで冷却し、さらに３０分間保温した。
【００６５】
（Ｃ）得られたスラリーは、ヌッチェで固液分離し、さらに蒸留水  ４００ｇでリンスし、減圧下、約６０℃で乾燥したところ、１３８．５ｇの白色固体を得た。
得られた固体は、ＡＳＰが９９．３重量％で、ＭＡアンモニウム  ０．６重量％、ＦＡアンモニウム  ０．１重量％を含んでいた。ＡＳＰの回収率は、８０．９％であった。一方、固液分離で得られた母液は、ＡＳＰ  ２７．１ｇ／ｌ、ＭＡ  ９８．６ｇ／ｌ、ＮＨ3   １８．６ｇ／ｌの組成であり、ｐＨは約４．５、容量１．２Ｌであった。なお、ここで得られたＭＡアンモニウムはそのＮＨ3 バランスから見て実質的全てがモノアンモニウム塩であった。
【００６６】
（Ｄ）上記（Ｃ）で得られた母液  １．２Ｌは、８０℃、減圧（３００〜４００ｍｍＨｇ）下、水を飛ばし濃縮した。得られた濃縮液に２５％アンモニア水、上記（Ａ）で回収したアンモニア水１８５ｍｌ、および蒸留水を添加して、ｐＨ９．０、容量約１Ｌの液を作成したところ、ＡＳＰ  ３２．９ｇ／ｌ、ＦＡ  ０．９ｇ／ｌ、ＭＡ  １１９．６ｇ／ｌ、ＮＨ3   ４４．６ｇ／ｌの組成であった。
【００６７】
（Ｅ）上記（Ｄ）で得られた反応液を、上記（Ａ）で冷蔵保存した菌体を用い、実施例１（１）と同様に３０℃、４８時間酵素反応したところ、得られた酵素反応液はＡＳＰ  １６８ｇ／ｌ、ＦＡ  １．１ｇ／ｌ、ＭＡ  ０．７ｇ／ｌ、ＮＨ3   ２７．５ｇ／ｌ、ＮＨ3 ／ＡＳＰモル比は１．２７、ｐＨは９であった。
【００６８】
（Ｆ）さらに上記（Ｂ）〜（Ｅ）と同様の操作を条件を変えずに３回繰り返した。結果を第１表に示す。
【００６９】
【表１】
0003704812.tif 000002
【００７０】
［比較例２］リサイクル操作
（Ａ）比較例１と同様に酵素反応を行い、７２時間後に反応が終了したことを確認した。反応中、溶存酸素濃度はおよそ７ｐｐｍを維持していた。酵素反応液は、限外ろ過膜（旭化成社製−ＡＣＶ−３０５０）を用い、菌体を除去し、菌体の濃縮液は、容器に移し、４℃で冷蔵保存した。
【００７１】
一方、得られた反応濾液１Ｌを容量２Ｌのナス型フラスコに仕込み、ラボ用エバポレーターを用いて、８０℃、３８０ｍｍＨｇの条件下、アンモニアを蒸留分離した。得られる蒸気の回収を目的に、５０ｗｔ％エチレングリコールの冷却水が０℃で循環する冷却管をとりつけた。１５分後、常圧に戻して、アンモニア除去操作を終了した。
【００７２】
蒸留釜の残液は、ＡＳＰが２０５ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２６．３ｇ／ｌの組成で、８２０ｍｌの容量であった。この残液に蒸留水を加えて、ＡＳＰが２００ｇ／ｌ、ＮＨ3 が２５．９ｇ／ｌの組成（ＮＨ3 ／ＡＳＰモル比は１．０、すなわち、全てがＡＳＰモノアンモニウム塩）で８５０ｍｌの釜残液を作成した。
冷却管で得られた回収液は、ＮＨ3 が２７ｇ／ｌのアンモニア水１８５ｍｌであった。
【００７３】
（Ｂ）上記（Ａ）で得られたＡＳＰモノアンモニウム水溶液  ８５０ｍｌを容量１０００ｍｌのジャケット付きセパラブルフラスコ内でジャケットに温水を流すことで６０℃に保温し、攪拌しながらＭＡ１１９ｇ（ＭＡ／ＡＳＰモル比は０．８０）を添加し、晶析した。ＭＡの添加後、攪拌を続けながら３０分間６０℃で保温した後、１時間かけ、２０℃まで冷却し、さらに３０分間保温した。
【００７４】
（Ｃ）得られたスラリーは、ヌッチェで固液分離し、さらに蒸留水  ４００ｇでリンスし、減圧下、約６０℃で乾燥したところ、１３８．５ｇの白色固体を得た。
得られた固体は、ＡＳＰが９９．３重量％で、ＭＡアンモニウム  ０．６重量％、ＦＡアンモニウム  ０．１重量％を含んでいた。ＡＳＰの回収率は、８０．９％であった。一方、固液分離で得られた母液は、ＡＳＰ  ２７．１ｇ／ｌ、ＭＡ  ９８．６ｇ／ｌ、ＮＨ3   １８．６ｇ／ｌの組成であり、ｐＨは約４．５、容量１．２Ｌであった。なお、ここで得られたＭＡアンモニウムはそのＮＨ3 バランスから見て実質的全てがモノアンモニウム塩であった。
【００７５】
（Ｄ）上記（Ｃ）で得られた母液  １．２Ｌは、８０℃、減圧（３００〜４００ｍｍＨｇ）下、水を飛ばし濃縮した。得られた濃縮液に２５％アンモニア水、上記（Ａ）で回収したアンモニア水１８５ｍｌ、および蒸留水を添加して、ｐＨ９．０、容量約１Ｌの液を作成したところ、ＡＳＰ  ３２．９ｇ／ｌ、ＦＡ  ０．９ｇ／ｌ、ＭＡ  １１９．６ｇ／ｌ、ＮＨ3   ４４．６ｇ／ｌの組成であった。
【００７６】
（Ｅ）上記（Ｄ）で得られた反応液を、上記（Ａ）で冷蔵保存した菌体を用い、比較例１と同様に３０℃、７２時間酵素反応したところ、得られた酵素反応液には、ＡＳＰが１０１ｇ／ｌ（反応回収率５９％）含まれていたが、それ以上反応が進行しなかった。
【００７７】
【発明の効果】
本発明によれば、異性化反応における水溶液中の溶存酸素量を特定量以下に低減させることにより、長期間安定した反応を行なうことができる。