(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵黄リン脂質にホスホリパーゼＡ2を作用させて該卵黄リン脂質を加水分解し、該加水分解反応により遊離したアラキドン酸含有脂肪酸を抽出し、得られるアラキドン酸含有脂肪酸にグリセリンを添加し次いでリパーゼを作用させてグリセリドを合成し、得られるグリセリドに再度リパーゼを作用させて該グリセリドを加水分解することによりアラキドン酸含有グリセリドを濃縮精製することを特徴とするアラキドン酸高濃度含有グリセリドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、酵素反応を用いたアラキドン酸高濃度含有グリセリドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高度不飽和脂肪酸の一種であるアラキドン酸は、炭素を20個、二重結合を４個有するω−６系列に属する脂肪酸である。
アラキドン酸は生体内でプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン等の局所ホルモンの前駆体として極めて重要な生理活性物質であり、乳幼児向け食品、健康補助食品、医薬品等に幅広く利用可能な物質として期待されている。
【０００３】
これまでに知られているところのアラキドン酸を含む油脂（グリセリド）としては、モルティエラ（Mortierella)属糸状菌によって生産される油脂が報告されている（新免芳史，月刊フードケミカル，12月号，53−61，1990）。そして、前記モルティエラ属糸状菌によって生産される油脂は、アラキドン酸を25％含有するトリグリセリドを主成分としておりアラキドン酸含有量が高く、アラキドン酸の供給源としてふさわしいものである。
【０００４】
しかし、かかる油脂は微生物によって生産されることから、特殊栄養食品として取り扱われる乳児用調製粉乳等に前記油脂を添加するためには、添加の認可を受けなければならない。このため厳格な審査を経なければならず、実際に使用するまでにはかなりの困難があると予想される。
【０００５】
従って、乳児用調製粉乳等にアラキドン酸含有油脂を添加するには、天然物由来のものが好ましい。天然物由来でアラキドン酸含量の高い油脂としては、アワビ、トコブシ等の貝類の可食部中に含まれる油脂が知られている（それぞれ、脂肪酸組成でアラキドン酸が10％程度含まれる）。
【０００６】
しかし、アワビ、トコブシ等を大量に確保することは困難であり、従って現在では、天然物由来であってアラキドン酸含量の高い油脂を容易に確保することは困難である。
そこで、入手が容易な天然物からアラキドン酸含量の高い油脂を得る方法の開発が望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然物である卵黄を原料にしてアラキドン酸を高濃度含有するグリセリドを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、リン脂質、特に鶏卵の卵黄レシチン中に約３％のアラキドン酸が含まれていることに着目し、これを原料としてホスホリパーゼ及びリパーゼを用いることにより、アラキドン酸を高濃度に含有するグリセリドを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、卵黄リン脂質にホスホリパーゼＡ2を作用させて該卵黄リン脂質を加水分解し、該加水分解反応により遊離したアラキドン酸含有脂肪酸を抽出し、得られるアラキドン酸含有脂肪酸にグリセリンを添加し次いでリパーゼを作用させてグリセリドを合成し、得られるグリセリドに再度リパーゼを作用させて該グリセリドを加水分解することによりアラキドン酸含有グリセリドを濃縮精製することを特徴とするアラキドン酸高濃度含有グリセリドの製造方法である。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）原料
本発明に用いる原料としては、例えば、市販の鶏卵、業務用加塩卵黄、卵黄レシチン及びその濃縮物等の卵黄が挙げられる。そして、これらの卵黄から抽出した卵黄レシチンを、アラキドン酸含有グリセリド製造のための原料とすることができる。
【００１１】
（２）卵黄レシチンの加水分解及び遊離脂肪酸の回収
抽出した卵黄レシチンにホスホリパーゼＡ2 を作用させて、β−位の構成脂肪酸を加水分解し、遊離脂肪酸とリゾリン脂質を得る。
卵黄レシチンの加水分解は、レシチン１部（重量部，以下同じ）に対して0.001〜1.0部の水、及びホスホリパーゼＡ2 を添加して反応させることにより行う。
【００１２】
ここで、α−位にアラキドン酸はほとんど含まれておらず、β−位がその主要な存在位置である。ホスホリパーゼＡ2 はβ−位のみを特異的に加水分解する酵素であり、該酵素によってアラキドン酸が遊離脂肪酸画分に２倍に濃縮されて得られる。ここで、酵素は活性の高いものが望ましく、具体的には、ブタ膵臓由来のホスホリパーゼＡ2、蛇毒由来のホスホリパーゼＡ2等が挙げられる。
【００１３】
また、添加する水としては、例えば、緩衝液、蒸留水、イオン交換水、井戸水、水道水等が挙げられ、また、そのｐＨは４〜10、好ましくは６〜８が適している。このｐＨを調節するために緩衝液を用いると更に効果的である。
反応温度は20〜80℃、好ましくは35〜70℃で行うのが良く、攪拌しても、基質に水を分散させた後静置状態で反応させてもよい。
酵素量はリン脂質１ｇ当たり２〜2000Ｕ、好ましくは20〜200Ｕが適しており、反応時間は酵素量、反応温度によって適宜変えることができ、通常0.5〜50時間である。
上記加水分解方法によれば、リン脂質の脱アシル化が円滑に進行し、遊離の脂肪酸（アラキドン酸が濃縮されている）及びリゾリン脂質が効率良く得られる。
【００１４】
アラキドン酸が濃縮された遊離の脂肪酸については、反応生成物中の水分１重量部に対して、8.5〜80重量部のアセトンを添加して、アセトン可溶部分から分離回収することによって得られる。
得られた脂肪酸については、塩酸飽和メタノールでメチルエステル化し、ガスクロマトグラフィーに掛けることによりその組成を分析することができる。
なお、リゾリン脂質の生成量は、加水分解前に存在するレシチンが加水分解後リゾレシチンに変換した割合の重量％を変換率として表す。この変換率は、イヤトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ法）で分析することが可能である。
【００１５】
（３）グリセリドの合成及びその回収
本発明においては、グリセリドの合成は、リパーゼの逆反応を利用することによって、上記脂肪酸とグリセリンとの縮合反応により合成できる。
本発明のグリセリドの合成は、脂肪酸１部に対して0.05〜10部のグリセリン、０〜１部の水及びリパーゼを添加して反応させる方法により行う。
添加する酵素としては、キャンディダ(Candida) 属等の酵母由来のリパーゼ、シュウドモナス（Pseudomonas)属等の細菌由来のリパーゼ、ジオトリカム(Geotrichum)属、リゾプス(Rhizopus)属、リゾムコール（Rhizomucor) 属等の糸状菌由来のリパーゼが好ましい。
【００１６】
また、添加水としては、前記と同様であり、そのｐＨは３〜９、好ましくは４〜８が適しており、このｐＨを調節するために緩衝液を用いると更に効果的である。
反応温度は20〜80℃、好ましくは25〜45℃で行うのが良く、攪拌しながら反応させるのが好ましい。
酵素量は脂肪酸１ｇ当たり100〜30,000Ｕが適しており、反応時間は酵素量、反応温度によって適宜変えることができ、通常0.5〜120時間である。
上述のグリセリド合成方法によれば、脂肪酸とグリセリンの縮合反応が円滑に進行し、トリグリセリドを主成分とするアラキドン酸含有グリセリドを効率よく得ることができる。
【００１７】
アラキドン酸含有グリセリドについては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリで未反応の脂肪酸を石鹸にした後、ヘキサンで抽出することによって分離回収できる。
また、グリセリドの脂肪酸組成については、ナトリウムメチラート法によりメチルエステル化してガスクロマトグラフィーにより分析することができる。
なお、グリセリドの組成については、イヤトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ法）によって分析することができる。
【００１８】
（４）グリセリドの加水分解
本発明では上記（３）で得られたグリセリドを再度リパーゼを用いて加水分解処理することにより、グリセリド中にアラキドン酸をさらに濃縮精製することができる。
本発明のグリセリド画分へのアラキドン酸の濃縮方法は、上記（３）で得られたグリセリド１部に対して、0.01〜10部の水及びリパーゼを添加して反応させるものである。
【００１９】
添加する酵素は前記と同様であり、キャンディダ(Candida) 属等の酵母由来のリパーゼ、シュウドモナス（Pseudomonas)属等の細菌由来のリパーゼ、ジオトリカム(Geotrichum)属、リゾプス(Rhizopus)属、リゾムコール（Rhizomucor) 属等の糸状菌由来のリパーゼが好ましい。
また、添加水についても前記と同様であり、そのｐＨは３〜９、好ましくは４〜８が適しており、このｐＨを調節するために緩衝液を用いると更に効果的である。
【００２０】
反応温度は20〜80℃、好ましくは25〜45℃で行うのが良く、攪拌しながら反応させるのが好ましい。
酵素量は脂肪酸１ｇ当たり50〜1,500 Ｕが適しており、反応時間は酵素量、反応温度によって適宜変えることができ、通常0.5 〜72時間である。
上述のグリセリドの濃縮法によれば、加水分解反応が円滑に進行し、トリグリセリドが主成分となったアラキドン酸含有油脂を効率よく濃縮精製することができる。
【００２１】
得られたアラキドン酸含有グリセリドについては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリで未反応の脂肪酸を石鹸にした後、ヘキサンで抽出することによって分離回収できる
また、グリセリドの脂肪酸組成については、ナトリウムメチラート法によりメチルエステル化してガスクロマトグラフィーにより分析することができる。
グリセリドの組成については、イヤトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ法）によって分析することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
〔実施例１〕
【００２３】
（１）リン脂質の加水分解
市販卵黄レシチン（和光純薬（株）製）400ｇ（リン脂質16.7％，トリグリセリド81.0％，脂肪酸2.3％）にホスホリパーゼＡ2 酵素液1.5ml(ノボノルディスクバイオインダストリー（株）社製、レシターゼ（Lecitase) 10L 、10,000 U/ml)を混合し、これらをスターラーで攪拌して酵素液を分散させた後、この混合物を50℃の恒温槽中に入れて再度スターラーで攪拌しながら反応させた。
【００２４】
反応時間８時間で反応を終了して、リゾリン脂質を分離するためアセトンを添加した。アセトンはレシチン１部に対して９部になるように3.6kg 添加して、十分に攪拌後遠心分離してアセトン層とアセトン不溶部分（リン脂質及びリゾリン脂質含有画分）に分離した。
アセトン不溶部分の分析はイヤトロスキャン法により、原料レシチンのリン脂質中のホスファチジルコリンがリゾホスファチジルコリンに変換した重量％を測定した。
【００２５】
その結果、リゾリン脂質の変換率は33.7％重量％であった。
アセトン可溶部分から脂肪酸を抽出するために、まずエバポレーターでアセトンを完全に留去して油分を得た。
再度１L のｎ−ヘキサンに溶解してから、１L の２Ｎ−水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、脂肪酸画分を水−エタノール層（下層）に移行させた。
【００２６】
分離したヘキサン層（上層）に再度500 mlの２Ｎ−水酸化カリウム／エタノールを加え、脂肪酸の再抽出を行った。
抽出した水−エタノール層を合わせて、１L のｎ−ヘキサンを加えて４Ｎ−塩酸で中和することにより、ヘキサン層に脂肪酸を抽出した。
エバポレーターによりｎ−ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮したところ、6.4 ｇが得られた。この脂肪酸を塩酸−メタノール法によりメチルエステル化してガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸14.4％、ステアリン酸7.2％、オレイン酸38.2％、リノール酸19.6％、アラキドン酸5.7 ％、ドコサヘキサエン酸9.5 ％であった。
【００２７】
（２）グリセリドの合成
（１）で得られた脂肪酸４ｇ、グリセリン４ｇ、水0.8mlからキャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea,名糖産業（株）社製）のリパーゼ3,000 Ｕを添加して、35℃で攪拌（250rpm) しながら70時間反応させてグリセリドを合成した。反応後、反応液に50mlの２Ｎ−水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、水−エタノール層（下層）に移行させて、50mlのｎ−ヘキサンでグリセリドを抽出した。
分離した水−エタノール層に再度25mlのｎ−ヘキサンを加えることによりグリセリドを再抽出した。
【００２８】
エバポレーターによりｎ−ヘキサンを留去して脂肪酸を濃縮したところ、1.9ｇのグリセリドが得られた。
このグリセリド画分をイヤトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ）で分析したところ、トリグリセリド87％、ジグリセリド12％、モノグリセリド１％であった。また、この画分をナトリウムメチラート法によりメチルエステル化してガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸14.9％、ステアリン酸9.5％、オレイン酸35.4％、リノール酸17.2％、アラキドン酸7.9％、ドコサヘキサエン酸7.1％であった。
【００２９】
（３）グリセリドの加水分解
（２）で得られたグリセリド1.5ｇ、水1.5ｇ、キャンディダ・シリンドラシエ（Candida cylindracea,名糖産業（株）社製）のリパーゼ360 Ｕを添加して、35℃で攪拌（500rpm) しながら16時間加水分解を行った。加水分解反応後の反応液は、十分平衡に達していた。
次いで、この反応液からリパーゼを含む水層を除去して加水分解油を得た。
更に、この反応液に50mlの２Ｎ−水酸化カリウム／エタノール溶液を加えて、脂肪酸をカリウム塩にすることにより、水−エタノール層（下層）に移行させて、50mlのｎ−ヘキサンでグリセリドを抽出した。
【００３０】
分離した水−エタノール層に再度25mlのｎ−ヘキサンを加えることによりグリセリドを再抽出した。
エバポレーターによりｎ−ヘキサンを留去して濃縮したところ、0.7 ｇのグリセリドが得られた。
【００３１】
このグリセリド画分をイヤトロスキャン（ＴＬＣ−ＦＩＤ）で分析したところ、トリグリセリド84％、ジグリセリド13％、モノグリセリド３％であった。また、この画分を（２）と同様にしてガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分析した結果、パルミチン酸10.3％、ステアリン酸7.5 ％、オレイン酸26.4％、リノール酸15.2％、アラキドン酸16.5％、ドコサヘキサエン酸15.1％であった。
【００３２】
以上のことから、本発明によりアラキドン酸を高濃度に含有するグリセリドを製造することができる。すなわち、前記のモルティエラ属糸状菌によって生産されるアラキドン酸含有量が25％の油脂には及ばないものの、天然物由来の原料から、アラキドン酸高濃度含有グリセリドを容易にかつ大量に製造することができるものであり、本発明の製造方法は、本発明者らが初めて確立したものである。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、アラキドン酸を高濃度に含有するグリセリドが得られる。