(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも作用電極と対極を含む複数の電極を備え、前記電極に電圧を印加して試料中に含まれる発光試薬の電気化学発光を検出するセルにおいて、前記作用電極に凹部を設けたことを特徴とする電気化学発光検出セル。
【請求項２】
少なくとも作用電極と対極を含む複数の電極を備え、前記電極に電圧を印加して試料中に含まれる発光試薬の電気化学発光を検出するセルにおいて、前記作用電極に凹部を設け、凹部以外の表面に絶縁物を設けたことを特徴とする電気化学発光検出セル。
【請求項３】
少なくとも作用電極と対極を含む複数の電極を備え、前記電極に電圧を印加して試料中に含まれる発光試薬の電気化学発光を検出するセルにおいて、磁気ビーズ，磁石及び光検出器を備え、上記発光試薬が抗体に標識されて抗原−抗体反応により磁気ビーズ上に導入され、磁石により上記磁気ビーズを上記作用電極上に形成された凹部に捕捉し、作用電極に電圧を印加することにより発光試薬を発光させ、光検出器により発光量を測定することを特徴とする電気化学発光検出セル。
【請求項４】
請求項１から３に記載の作用電極は、白金，パラジウム，イリジウム，シリコン，金の中から選択し、単独にまたは複数個を組み合わせて製作することを特徴とする電気化学発光検出セル。
【請求項５】
請求項１から３に記載の作用電極の凹部は、シリコンをエッチング加工することにより製作し、凹部以外の表面を二酸化珪素，窒化珪素，酸化タンタル，酸化アルミニウムなどの無機絶縁物で被覆し、溝が形成されたガラス板を接合することにより試料が流れる流路としたことを特徴とする電気化学発光検出セル。
【請求項６】
前記発光試薬はトリス（ビピルジル）ルテニウムまたはその誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の電気化学発光検出セル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は電気化学発光を利用した、例えば血液などの生体液中に含まれる成分の定量分析装置に関し、特にホルモン，ガンマーカー，感染症を診断する免疫分析装置または遺伝子診断装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電気化学発光を利用する免疫分析装置がクリニカル・ケミストリー第３７巻，１９９１年，第１５３４頁から第１５３９頁（Clin. Chem. Ｖol.３７，(1991)ｐｐ１５３４−１５３９）に記載されている。本文献では、発光試薬が抗体を介して固定化された磁気ビーズを磁石により板状の白金電極上に捕捉し、白金電極に電圧を印加することによる電気化学発光を、光電子増倍管により検出している。上記磁気ビーズは直径数ミクロンの高分子を主成分とするもので、一回の測定で多数個のビーズを白金電極上に導入して必要な感度を得ている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記文献において、測定の再現性は電極表面に捕捉されるビーズの再現性により決まる。測定の再現性は、検出下限を決めるパラメータでもあるため、ビーズ捕捉の再現性を向上させることは電気化学発光検出器の高性能化のためには重要である。上記文献では、板状白金電極上への磁気ビーズの捕捉は磁石により行っている。したがって、測定ごとに捕捉されるビーズの個数は必ずしも同じではなく、測定の再現性向上が第１の課題となっている。
【０００４】
また、白金電極上に磁気ビーズを導入するとき、ビーズに固定化されていないフリーな抗体も同時にセル中に導入される。このフリーな抗体が非特異的に白金電極表面に吸着し、発光すると、ノイズの原因となりＳ／Ｎを低下させる。したがって、フリーな抗体（Free 抗体，Ｆ）と、ビーズに固定化された抗体（Bound抗体，Ｂ）を分離するＢ／Ｆ分離過程は重要である。上記文献では試薬の流れによりフリーな抗体を除去しているが、十分には除去できず、非特異吸着に基づく発光の低減が第２の課題となっている。
【０００５】
本発明は上記第１及び第２の課題を解決し、高い再現性とＳ／Ｎを兼ね備えた電気化学発光検出セルを提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記第１の課題は、作用電極に凹部を設け、上記凹部に磁気ビーズを一対一で捕捉し、発光させることで解決する。作用電極に形成される凹部の数は一定であるため、その中に捕捉されるビーズの個数も常に一定に保つことができ、発光の高い再現性を得ることができる。
【０００７】
また、上記第２の課題は作用電極上の凹部以外の表面を絶縁物で被覆することにより解決する。試料溶液中のフリーな抗体は非特異的に吸着するが、絶縁物上に吸着した抗体の発光試薬は、電子の授受ができないため酸化還元反応を行うことができず、したがって発光することができない。したがってノイズの発生源を最小限に抑えることができるため高いＳ／Ｎを実現することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
図１に免疫分析装置で使用されるビーズの概念図を示す。ポリスチレンなどの高分子ビーズ１の表面にビオチン−アビジン２により抗体３を結合させる(ａ)。次に血液などの生体試料を導入し、その中に含まれる抗原４と抗体３を特異的に反応させる（ｂ）。次にルテニウム錯体化合物などの発光試薬５を標識した抗体を反応させ、ビーズ表面に抗体−抗原−抗体のサンドイッチ構造を形成する(ｃ)。この状態で検出セルに導入される。磁気ビーズを用いるときは、磁性体の粉末を高分子中に分散させて製作する。
【０００９】
図２は従来の検出セルにおける発光測定の概念を示したものである。上記のサンドイッチ構造が形成されたビーズ６を白金などの作用電極７上に捕捉し、ビーズを電極上で静止させる。この状態で作用電極と対電極に電圧を印加して、発光試薬を酸化還元反応させて発光させる。発光試薬が発光するためには作用電極と電子の授受が必要であり、ビーズに固定化された発光試薬の内、作用電極近傍の発光試薬のみが発光に関与する。
【００１０】
図３は本発明の第１の実施例である。導電性電極板８に複数個の凹部９を形成した（ａ）。凹部は機械加工の他、フォトリソグラフィー技術とエッチング技術を組み合わせて形成することができる。凹部の大きさは、使用するビーズの大きさに合わせて設計する。凹部の開口部は使用するビーズの直径よりやや大きめに設定することが望ましい。
【００１１】
（ａ）図のａａ′の線で切断したときの断面図を（ｂ）図に示す。本実施例では導電性材料を加工して凹部を形成するので、凹部の底面及び側面が電極となる。一旦捕捉したビーズは次の測定には完全に除去される必要があるため、ビーズが除去されやすい構造であることが望ましい。例えば（ｂ）図に示すように、開口部の面積より底面１０の面積を小さくし、逆台形にした断面形状を有する凹部とすれば、ビーズ除去を効率的に行うことができる。
【００１２】
（ｃ）図にビーズ６が捕捉された状態を示す。前述したように、発光試薬が発光するためには作用電極と電子の授受が必要であり、ビーズに固定化された発光試薬の内、作用電極近傍の発光試薬のみが発光に関与する。図２に示した従来の平板状作用電極ではビーズとの接点は１箇所のみであり、この接点で電気化学発光が起こる。一方、本発明の凹部付き作用電極ではビーズと接触する点は少なくても凹部の側面の４箇所、凹部構造を最適化すれば底面１０とも接触可能であるため５箇所の接点をビーズと共有することになる。
【００１３】
従って、各接点で電気化学発光が起こるため、高いＳ／Ｎの測定が可能となる。上記導電性電極の材料としては、白金，パラジウム，イリジウム，シリコン，金の中から選択し、単独にまたは複数個を組み合わせて製作することができる。白金，パラジウム，イリジウム，金を材料とするときは、凹部の底面を正方形とし、底面と側面とのなす角度を１３５度とすることが望ましい。シリコンを材料とするときは（１００）面を用いる必要があり、正方形のマスクを形成して水酸化カリウム水溶液中で約９０度の温度でエッチングすると、凹部の底面と側面のなす角度は約１２５度になる。金属及びシリコンのいずれを用いる場合でも、凹部の底面積を最適化することによりビーズと凹部の接点を５個とすることができ高いＳ／Ｎを得ることができる。
【００１４】
ビーズの大きさは通常１μｍから１０μｍの範囲であり、好ましくは約３μｍである。ビーズ材料としては、比重，表面修飾のし易さのためポリスチレンを用い、磁場に対する感度を付与するために、フェライトなどの磁性微粒子をポリスチレン中に分散させる。直径３μｍのビーズ及び上記金属の電極を用いる場合、凹部の底面の正方形の一辺の長さを１.２４μｍ とし、凹部の深さを少なくとも０.４５μｍ 以上とすることにより、ビーズと凹部の接点を５個とすることができ最大のＳ／Ｎが得られる。一方、直径３μｍのビーズ及びシリコンの電極を用いる場合、凹部の底面の正方形の一辺の長さを１.５６μｍ とし、凹部の深さを少なくとも０.６４μｍ 以上とすることにより、ビーズと凹部の接点を５個とすることができ最大のＳ／Ｎが得られる。
【００１５】
ビーズを除去する時の効率を高めるため、凹部の深さはビーズの直径よりは小さい方が好ましい。凹部の深さをビーズの直径と同じ３μｍとした場合、金属電極表面における凹部開口部の正方形の一辺の長さは７.２４μｍ 、シリコンの場合７.５６μｍとなる。凹部と隣の凹部との間隔を、金属電極の場合２.７６μｍ、シリコン電極の場合２.４４μｍ とし、発光させる部分の面積を５mm×５mmとすると、２５００００個のビーズを電極凹部に捕捉することができる。なお、電極の厚さは０.１から１mmの範囲であり、０.５mmが好ましい。
【００１６】
図４は本発明の第２の実施例である。形状は図３の実施例と基本的に同じであるが、導電性電極１１を形成する部分を凹部に局在化したものである。本実施例でも凹部の底面及び側面が電極となる。板状材料の凹部以外の部分は絶縁材料  １２で構築してある。導電性電極１１と外部回路との接続はリード線１３により行い、局在化導電性電極に電圧を印加することができる。
【００１７】
本実施例では、ビーズが捕捉される凹部のみに電圧を印加して、発光試薬の酸化還元反応を行わせることができるので、電気化学発光を凹部のみに局在化することができる。試料中に存在するフリーな標識抗体は非特異的にセル内面に吸着するが、絶縁物表面に吸着したフリー標識抗体は電子の授受を行うことができず、発光しない。したがって、非特異吸着に基づくノイズを低減することができ、高いＳ／Ｎの測定が可能となる。
【００１８】
図５は本発明の第３の実施例である。シリコン基板１４を材料とし、試料溶液と接触する表面に酸化膜１５を形成する。酸化膜にはフォトリソグラフィーにより穴があけられており、凹部９が形成されている。本実施例も図４と同様に電気化学発光を凹部のみに局在化し、非特異吸着によるノイズを低減することができるので高Ｓ／Ｎの測定が可能である。
【００１９】
（ａ）図のｂｂ′の線で切った断面形状を（ｂ）図に示す。シリコン基板の結晶面及び異方性エッチング技術を用いることにより、図３及び図４と同様に開口部の面積より底面１０の面積を小さくし、台形を逆にした断面形状を有する凹部を製作することができる。例えば、基板に（１００）面シリコン、エッチング液に水酸化カリウム水溶液、またはエチレンジアミン／パイロカテコール／水、及び方形状に穴開けされた酸化膜マスクを用いることにより図５（ｂ）の形状の凹部を製作することができる。凹部の底面及び側面１６、すなわち作用電極となる部分はシリコンが直接露出しているか、または白金，金，イリジウム，パラジウムなどの金属材料で被覆することが望ましい。シリコン表面に形成する絶縁膜として、酸化膜の他、窒化珪素，酸化タンタル，酸化アルミニウムを使用することができる。
【００２０】
以上のように本実施例はシリコンを材料とし、半導体プロセスにより製作することができるので、特性のそろったセルを安価に製作することができ、使い捨て型セルの用途にも応用可能である。
【００２１】
第２及び第３の実施例に記載した絶縁物は、ガラス，酸化珪素，レジスト、ポリ塩化ビニルなどの高分子を材料とし、第３の実施例のように凹部以外の表面を被覆するか、または第２の実施例のように凹部と凹部の間に埋設する。
【００２２】
図６は本発明の第４の実施例である。図５に示したシリコンを材料とする作用電極１７とガラス基板１８を張り合わせたものである。作用電極と対抗するガラス表面には溝１９が加工されており、張り合わせにより流路を形成することができる。（ｂ）図はガラスに形成される流路の形状を示したものである。作用電極となる凹部アレーの付近２０で流路幅が増大しており、高速で流れてきたビーズが急速に広がり、凹部アレーの中に均一に捕捉される構造となっている。（ｃ）図は（ａ）図のｃｃ′の線で切った断面形状を示したものである。ガラスに形成された流路は、フッ酸などによりエッチングされたものであり、（ｃ）図に示した断面形状の流路１９となる。ガラスとシリコンの張り合わせには陽極接合など、高温（５００度から６００度）中でガラスとシリコンの間に電圧を印加する方法が適している。
【００２３】
本実施例のように、作用電極のみではなく、試料が流れるフローセルまでも一体化することにより、小型で、微量試料でも測定可能な電気化学発光検出セルを提供できる。
【００２４】
図７は本発明の第５の実施例であり、図６に示した実施例のフローセル２１を用いて測定システムを構築したものである。本実施例では表面にアビジンをコーティングした磁気ビーズを用い、この磁気ビーズと、ビオチンを修飾した甲状腺刺激ホルモン抗体，測定対象の甲状腺刺激ホルモン、及び電気化学発光試薬であるトリス（ビピルジル）ルテニウムを固定化した甲状腺刺激ホルモン抗体とを反応させて、磁気ビーズ上に抗体−抗原−抗体のサンドイッチ構造を形成した。上記磁気ビーズ，フリーな抗体及び抗原を含む試料２２，トリプロピルアミンなどの試薬２３、及び洗浄液２４のボトルから、ピペット２５及びポンプ２６により、必要に応じて試料，試薬，洗浄液を上記フローセル中に導入し、磁石２７により磁気ビーズをフローセル中の作用電極の凹部に捕捉する。その状態でトリプロピルアミンを含む試薬２３をしばらく流し続けてノイズの原因となるフリーな抗体を洗い流し、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００２５】
その後、流れを停止し、ポテンシオスタット２８により作用電極に１.４Ｖ の電圧を印加し、発光量を光電子増倍管２９で検出する。発光検出時間は１.５ 秒から２秒である。光電子増倍管の信号はフォトンカウンター３０を介してコンピュータ３１に入力され、バックグランド信号の除去，発光信号の積分，濃度への換算などの演算処理が行われる。一方、ポテンシオスタット２８もコンピュータに接続されており、電圧印加のタイミングなどが制御される。
【００２６】
発光量測定後、作用電極に３Ｖの電圧を印加して電極表面で水の電気分解を行わせ、気泡を発生させることにより作用電極表面からビーズを除去し、廃液ボトル３２に保管する。ポテンシオスタットによる電圧印加は流路中に設置されている作用電極，対極及び参照電極３３により行った。この３電極方式による測定は、作用電極の電位を正確に制御することができるため、再現性がよい。本実施例の構成によれば、多数の試料を連続的に順次測定することができ、高いスループットの測定システムを提供することができる。
【００２７】
図８は本発明の第６の実施例である。図３に示した第１の実施例において凹部の底面及び開口部の形状を長方形としたものである。凹部の底面及び側面は白金，パラジウム，イリジウム，金またはシリコンで形成されており、作用電極となる。（ａ）は全体図、（ｂ）は（ａ）図のｄｄ′の線で切った断面図、（ｃ）は（ａ）図のｅｅ′の線で切った断面図である。
【００２８】
凹部底面の長方形の短辺の長さは第１の実施例で記載した長さと同様であり、長辺の長さは発光させる部分全域に及び、本実施例では５mmである。本実施例では磁気ビーズは凹部の中に一列に捕捉される。長辺の長さが決まっているので凹部中に捕捉されるビーズの数は一定となり、再現性の良い測定を行うことができる。凹部中に捕捉されたビーズの多くは凹部底面及び長辺の側面の計３箇所で作用電極と接点を持ち、その接点から発光する。したがって、第１の実施例に比べると発光量は少なくなるが、図２に示した従来の電極形状に比べると高いＳ／Ｎが得られる。
【００２９】
なお、凹部の端に捕捉されるビーズは作用電極と４個の接点を有するが、その数は全体の０.４％ にすぎないため、発光量に及ぼす影響は小さい。一方、洗浄時の効率を高めるために、本実施例は凹部の長辺を試料の流れに対して平行に、したがって短辺を直角になるように設置することが好ましい。この構成では、本実施例は第１の実施例より洗浄効率が高く、迅速，高スループット測定に適している。なお、本実施例を第２，第３及び第４の実施例に適用できることは言うまでもない。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば作用電極上に捕捉するビーズの個数を一定に制御することができるため、再現性の良い測定を行うことができる。また、凹部中におけるビーズと電極との接点の数を増やすことができるため、従来に比べて発光量を増大させることができる。さらに、凹部以外の作用電極表面には絶縁物が形成されているため、非特異吸着に基づく発光を小さく抑えることができるのでノイズを低減することができる。したがって、本発明は再現性がよく、高Ｓ／Ｎであり、従って検出下限の低い高感度な測定システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体固定化ビーズの説明図。
【図２】従来の電気化学発光測定の概念図。
【図３】本発明の第１の実施例である作用電極の構造を示す斜視および部分断面図。
【図４】本発明の第２の実施例の作用電極の構造を示す部分断面図。
【図５】本発明の第３の実施例の作用電極の構造を示す斜視および部分断面図。
【図６】本発明の第４の実施例のフローセルの構造を示す斜視図および平面図および正面図。
【図７】本発明の第５の実施例の測定システムの構成を示すブロック図。
【図８】本発明の第６の実施例の作用電極の構造を示す斜視および部分断面図。
【符号の説明】
１…ビーズ、２…ビオチン−アビジン、３…抗体、４…抗原、５…標識試薬、６…抗体固定化ビーズ、７…白金電極、８…導電性電極、９…凹部、１０…底面、１１…導電性電極、１２…絶縁物、１３…リード線、１４…シリコン、１５…酸化膜、１６…側面、１７…凹部付き作用電極、１８…ガラス板、１９…溝、  ２０…幅広流路、２１…フローセル、２２…試料、２３…試薬、２４…洗浄液、２５…ピペット、２６…ポンプ、２７…磁石、２８…ポテンシオスタット、２９…光電子増倍管、３０…フォトンカウンター、３１…コンピュータ、３２…廃液ボトル、３３…参照電極。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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