(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物ＴＩＥリガンドホモログポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするか、または、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ内皮細胞の増殖阻害能および／またはアポトーシス誘導能を有するポリペプチドをコードする、
単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１で示される核酸配列中のコード領域を含む請求項１に記載された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子で形質転換した、組換え宿主細胞。
【請求項５】
原核生物細胞である、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
単離された哺乳動物ＴＩＥリガンドホモログポリペプチドであって、該ポリペプチドが、
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるか、または、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ内皮細胞の増殖阻害能および／またはアポトーシス誘導能を有する、
単離された哺乳動物ＴＩＥリガンドホモログポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のＴＩＥリガンドと特異的に結合する、抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基およびヒトフレームワーク（ＦＲ）残基を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
標識されている、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項７に記載のポリペプチドをキャリアとともに含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項８に記載の抗体をキャリアとともに含む、医薬組成物。
【請求項１４】
細胞傷害性薬剤または化学療法剤の二次抗体をさらに含む請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
さらなる治療剤または細胞障害性薬剤に融合された、請求項７に記載のポリペプチドまたは請求項８に記載の抗体を含む、結合体。
【請求項１６】
前記さらなる治療剤が、トキシン、異なるＴＩＥリガンド、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーである、請求項１５に記載の結合体。
【請求項１７】
血管新生をモニタリングし、血管新生の存在を画像化するための診断用組成物であって、検出可能に標識された請求項７に記載のＴＩＥリガンドホモログポリペプチド、またはアゴニストである請求項８に記載の抗体を含有する、組成物。
【請求項１８】
血管形成を阻害する請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
内皮細胞増殖を阻害する請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
内皮細胞のアポトーシスを誘導する請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍増殖を阻害する請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規ＴＩＥリガンドホモログをコードする単離された核酸分子、このような核酸分子によってコードされるＴＩＥリガンドホモログタンパク質、ならびにこのような核酸およびタンパク質分子を製造および使用するための方法および手段、ならびに開示されたＴＩＥリガンドホモログを結合する抗体に関する。
【０００２】
（背景技術）
略号「ＴＩＥ」または「ｔｉｅ」は頭字語であり、これらは、「チロシンキナーゼ含有ＩｇおよびＥＧＦ相同性ドメイン」を表し、そして血管内皮細胞および初期造血細胞でほぼ排他的に発現され、そしてＥＧＦ様ドメイン、および「免疫グロブリン（ＩＧ）様」折り畳みと一般にいわれる鎖内ジスルフィド結合によって安定化される細胞外折り畳みユニットの存在によって特徴づけられる、レセプターチロシンキナーゼの新しいファミリーを示すために新しく作り出された。ヒト白血病細胞からのチロシンキナーゼホモログｃＤＮＡフラグメント（ｔｉｅ）は、Ｐａｒｔａｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７，８９１３−８９１７（１９９０）に記載された。このヒト「ｔｉｅ」レセプターのｍＲＮＡは、すべてのヒト胎児およびマウス胚組織で検出されており、そして心臓および血管内皮細胞に局在することが報告されている。Ｋｏｒｈｏｎｅｎら，Ｂｌｏｏｄ  ８０，２５４８−２５５５（１９９２）；ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ  ９３／１４１２４号（１９９３年７月２２日公開）。「ｔｉｅ−１」といわれるヒトｔｉｅのラットホモログは、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８，１６３１−１６３７（１９９３）によって同定された。「ｔｉｅ−２」と命名されたもう１つのｔｉｅレセプターは、もともとラットで同定されたが（Ｄｕｍｏｎｔら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８，１２９３−１３０１（１９９３））、「ｏｒｋ」といわれる、ｔｉｅ−２のヒトホモログは、米国特許第５，４４７，８６０号（Ｚｉｅｇｌｅｒ）に記載された。ｔｉｅ−２のマウスホモログは、もともと「ｔｅｋ」と称された。脳毛細管ｃＤＮＡライブラリーからのマウスｔｉｅ−２レセプターのクローニングは、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ  ９５／１３３８７号（１９９５年５月１８日公開）に開示される。ＴＩＥレセプターは、新脈管形成に積極的に関与すると考えられ、そしてその上造血においても役割を果たし得る。
【０００３】
ヒトＴＩＥ−２リガンドの発現クローニングは、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ  ９６／１１２６９号（１９９６年４月１８日公開）および米国特許第５，５２１，０７３号（１９９６年５月２８日公開）に記載されている。「ｈｔｉｅ−２リガンド１」または「ｈＴＬ１」と命名されたＴＩＥ−２リガンドをコードするλｇｔ１０と命名されたベクターは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２８で寄託されている。「ｈｔｉｅ−２  ２」または「ｈＴＬ２」と命名されたもう１つのＴＩＥ−２リガンドをコードするプラスミドは、ＡＴＣＣ受託番号７５９２８で入手可能である。この第２のリガンドは、ＴＡＩ−２レセプターのアンタゴニストとして記載されている。ＴＩＥ−２レセプターについての分泌されたヒトおよびマウスリガンドの同定は、Ｄａｖｉｓら，Ｃｅｌｌ  ８７，１１６１−１１６９（１９９６）によって報告されている。新脈管形成および造血中の可能性のある作用におけるその役割を反映するために、「アンジオポエチン−１」と命名したヒトリガンドは、ＷＯ  ９６／１１２６９において「ｈｔｉｅ−２  １」または「ｈＴＬ−１」と種々に命名されたリガンドと同じリガンドである。アンジオポエチン−１は、後で脈管形成役割を果たし、そしてＶＥＧＦの役割とは異なることが記載されている（Ｓｕｒｉら，Ｃｅｌｌ  ８７，１１７１−１１８０（１９９６））。ＴＩＥ−２は、腫瘍増殖に必要な病理的な脈管形成中に明らかにアップレギュレートされるので（Ｋａｉｐａｉｎｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，６５７１−６５７７（１９９４））、アンジオポエチン−１は、腫瘍脈管構造を特異的に標的するためにさらに有用であることが示唆されている（Ｄａｖｉｓら，前出）。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、血管系に強力な効果を有する新規ヒトＴＩＥリガンドホモログに関する。本発明はまた、このようなリガンドホモログまたはその機能的誘導体をコードする単離された核酸分子、およびこのような核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、新規ＴＩＥリガンドホモログまたはその機能的誘導体を産生するためにこのような核酸で形質転換された宿主細胞に関する。新規リガンドホモログは、公知または以後に発見された、ＴＩＥレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。他の治療剤または診断剤のそれぞれのＴＩＥレセプターを発現する細胞への送達を含む、その治療または診断用途もまた、本発明の範囲内である。
【０００５】
本発明はさらに、本明細書中のＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合するアゴニストまたはアンタゴニスト抗体、およびこのような抗体の診断または治療用途を提供する。
【０００６】
別の局面では、本発明は、この新規リガンドホモログまたは抗体を含む組成物に関する。
【０００７】
さらなる局面では、本発明は、本発明の新規ＴＩＥリガンドホモログと他の治療剤または細胞傷害性薬剤との結合体、およびこのような結合体を含む組成物に関する。ＴＩＥ−２レセプターは、腫瘍増殖に必要である病理的な脈管形成中にアップレギュレートされることが報告されており、そして他のＴＩＥレセプターは同様の特徴を有し得る。従って、本発明のＴＩＥリガンドホモログの細胞傷害性または他の抗腫瘍薬剤への結合体は、腫瘍血管系を特異的に標的することにおいて有用であり得る。
【０００８】
なお別の局面では、本発明は、ＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定するための方法に関し、これは、このようなＴＩＥリガンドホモログのＴＩＥレセプターへの結合を可能にする条件下で、本発明の検出可能に標識したＴＩＥリガンドホモログと細胞とを接触させる工程、およびこのような結合が実際に生じたかどうかを決定する工程を包含する。
【０００９】
異なる局面では、本発明は、ＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する少なくとも１つの抗体と生物学的試料を接触させる工程、および形成したＴＩＥリガンドホモログ−抗体複合体の量を測定する工程によって、生物学的試料中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの量を測定するための方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、対応するＴＩＥレセプターに結合するために本発明のネイティブなまたは改変体ＴＩＥリガンドホモログと競合する能力に基づいて、ＴＩＥレセプターのポリペプチドまたは低分子アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、創傷治癒、炎症、またはヒト患者の腫瘍において新脈管形成の存在を画像化するための方法に関し、これは、本発明の検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログまたはアゴニスト抗体を投与する工程、および新脈管形成を検出する工程を包含する。
【００１２】
別の局面では、本発明は、薬学的に受容可能なビヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量を投与する工程による、患者において新生血管形成を促進または阻害する方法に関する。好ましい実施態様では、本発明は、創傷治癒の促進のための方法に関する。別の実施態様では、本発明は、虚血性心臓または肢において側副血管新生を誘導するためのような、脈管形成プロセスを促進するための方法に関する。さらに好ましい実施態様では、本発明は、腫瘍増殖を阻害するための方法に関する。
【００１３】
なお別の局面では、本発明は、患者における骨発生および／または成熟および／または増殖を促進する方法に関し、薬学的に受容可能なビヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００１４】
さらなる局面では、本発明は、筋肉増殖および発達を促進する方法に関し、これは、薬学的に受容可能なビヒクル中の本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量を必要な患者に投与する工程を包含する。
【００１５】
なお別の局面において、本発明は、本発明のＴＩＥリガンドホモログの有効量を投与する工程による、内非細胞増殖を阻害および／または内非細胞のアポトーシスを誘導する方法に関する。さらに、本発明は、炎症を阻害する方法に関し、この方法は、本発明のＴＩＥホモログのアゴニスト（例えば、本明細書中のＴＩＥリガンドホモログに対する抗体(例えば、アゴニスト抗ＮＬ−６抗体））の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【００１６】
本発明のＴＩＥリガンドホモログは、単独で、あるいは互いにおよび／またはＶＥＧＦファミリーのメンバーを含む他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて、投与され得る。組み合わせ治療は、新生血管形成、ならびに筋肉および／または骨の増殖、発達または分化を促進または阻害するための新しいアプローチ、あるいは不要な内非細胞増殖に関連する条件の処置（例えば、腫瘍処置）に導き得る。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．リガンドホモログおよびそれをコードする核酸分子）
本発明のＴＩＥリガンドホモログは、ＮＬ２（配列番号２）、ＮＬ３（配列番号４）、およびＦＬＳ１３９（続いて「ＮＬ６」と改名した；配列番号６）と命名したネイティブなヒトリガンドホモログ、ならびに、サルのような高等哺乳動物；マウス、ラットハムスターのような齧歯類；ブタ；ウマ；ウシを含む（しかしこれらに限定されない）、他の非ヒト哺乳動物種におけるそのホモログ、天然に存在する対立遺伝子およびスプライス改変体、ならびに、ネイティブなＴＬ−１またはＴＬ−２リガンドとは異なる限り、このようなネイティブな分子のアミノ酸配列改変体のような、生物学的に活性な（機能的）誘導体を含む。本明細書中に開示されるネイティブＮＬ２は、ｈＴＬ−１（ＴＩＥ２Ｌ１）と２７％アミノ酸配列同一性およびｈＴＬ２（ＴＩＥ２Ｌ２）と約２４％アミノ酸配列同一性を有する。本明細書中に開示されるネイティブＮＬ３のアミノ酸配列は、ｈＴＬ−１のアミノ酸配列と約３０％同一およびｈＴＬ−２のアミノ酸配と約２９％列同一性である。本明細書中に開示される天然のＦＬＳ１３９（ＮＬ６）とｈＴＬ−１およびｈＴＬ−２との間のアミノ酸配列同一性は、約２１％である。本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログは、そのネイティブな環境に関連する他のタンパク質を実質的に含まない。この定義は、本発明のＴＩＥリガンドホモログが得られる方法によっていかなるようにも限定されず、そしてその他の点で定義内のすべてのリガンドホモログを含み、天然供給源から精製されるか、組換えＤＮＡ技法から得られるか、合成されるか、またはこれらおよび／もしくは他の技術の任意の組み合わせによって調製されるいずれかである。本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、本発明の全長のネイティブなヒトＴＩＥリガンドホモログと、または本発明のネイティブなヒトＴＩＥリガンドホモログのフィブリノーゲン様ドメインと、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、最も好ましくは少なくとも約９９％配列同一性を有する。このようなアミノ酸配列改変体は、好ましくは、ネイティブなＴＩＥリガンドホモログの定性的生物学的活性を提示または阻害する。
【００１８】
用語「フィブリノーゲンドメイン」または「フィブリノーゲン様ドメイン」は、公知のｈＴＬ−１アミノ酸配列における約２７８位〜約４９８位のアミノ酸；公知のｈＴＬ−２アミノ酸配列における約２７６位〜約４９６位のアミノ酸；ＮＬ２のアミノ酸配列における約１８０位〜約４０６位のアミノ酸；ＮＬ３のアミノ酸配列における約７７位〜約２８８位のアミノ酸；およびＦＬＳ１３９のアミノ酸配列における約２３８位〜約４６０位のアミノ酸；ならびに他のＴＩＥリガンドホモログにおけるホモログドメインをいうために使用される。ＮＬ２のフィブリノーゲン様ドメインは、ｈＴＬ−１（ＴＩＥ２Ｌ１）およびｈＴＬ−２（ＴＩＥ２Ｌ２）のフィブリノーゲン様ドメインと約３７〜３８％同一である。ＮＬ３フィブリノーゲン様ドメインは、ｈＴＬ−１およびｈＴＬ−２のフィブリノーゲン様ドメインと約３７％同一であり、一方、ＦＬＳ１３９フィブリノーゲン様ドメインは、ｈＴＬ−１およびｈＴＬ−２のフィブリノーゲン様ドメインと約３２〜３３％同一である。
【００１９】
用語「核酸分子」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝コードの縮重の結果として、所定のＴＩＥホモログをコードする多数のヌクレオチド配列が産生され得ることが理解される。本発明は、すべての可能なコドン選択に基づいて、本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードする、ヌクレオチド配列のあらゆる可能な改変体を特に意図する。本明細書中におけるＴＩＥリガンドホモログをコードする核酸分子は、好ましくは、ストリンジェント条件下で天然に存在するＴＩＥリガンドホモログ遺伝子にハイブリダイズし得るが、実質的に異なるコドン利用を有する、ＴＩＥリガンドホモログをコードするヌクレオチド配列を産生するために有利であり得る。例えば、コドンは、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に従って、ポリペプチドの発現が特定の原核生物または真核生物宿主細胞で起こる割合を増加させるように選択され得る。さらに、改良された特性（例えば、半減期）を有するＲＮＡ転写物は、所定のＴＩＥリガンドホモログをコードするヌクレオチド配列の適切な選択によって産生され得る。
【００２０】
「配列同一性」は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のバージョン１．６、またはこのソフトウエアの任意のアップデート版もしくは等価物に組み込まれる、多配列アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法（ＨｉｇｇｉｎｓらＣｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５，１５１−１５３（１９８９）およびＨｉｇｇｉｎｓら，Ｇｅｎｅ  ７３，２３７−２４４（１９８８））に従って比較されるべき２つの配列を整列することによって決定される。
【００２１】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存的な経験的計算である。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖が融解温度以下の環境に存在する場合に変性したＤＮＡが再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用され得る相対温度が高い。結果として、より高い相対温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があるが、より低い温度ではそうではないことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００２２】
本明細書で定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のための低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ホルムアルドのような変性剤、例えば、４２℃にて、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ  ６．５での５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、をハイブリダイゼーション中に用いる；または（３）４２℃にて５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミド中で４２℃にて洗浄し、次いで５５℃にてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄する、条件によって同定され得る。
【００２３】
「中程度のストリンジェント条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載のように同定され得、そして上記よりもストリンジェントでない洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にての一晩インキュベート、次いで約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することである。当業者は、プローブ長などのような適切な因子に必要なように、温度、イオン強度などをどのように調節するかを認識する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「タグ化されたエピトープ」とは、「タグポリペプチド」に融合したＴＩＥリガンドホモログポリペプチドを含むキメラポリペプチドをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するために十分な残基を有するが、融合されるポリペプチドの活性を妨害しないように十分に短い。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、かなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６アミノ酸残基、および通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
【００２５】
本発明のＴＩＥリガンドホモログに関して、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性な」とは、分子が公知または本明細書中以降に発見されるＴＩＥリガンドのネイティブなレセプター（以降「ＴＩＥレセプター」という）、例えば、ネイティブなＴＩＥ−２レセプターに特異的に結合しそしてそれによってシグナルを出す能力、あるいはシグナル伝達に関与するネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２）の能力をブロックする能力をいう。従って、本発明の（ネイティブなおよび改変体）ＴＩＥリガンドは、ネイティブなＴＩＥ（例えば、ＴＩＥ−２）レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明のＴＩＥリガンドの好ましい生物学的活性は、新生血管形成を誘導または阻害する能力を含む。新生血管形成を誘導する能力は、生物学的状態および疾患（例えば、創傷治癒、虚血、および糖尿病）の処置に有用であり、ここでは、新生血管形成が望ましい。他方で、新生血管形成を阻害またはブロックする能力は、例えば、腫瘍増殖を予防または減弱することに有用であり得る。別の好ましい生物学的活性は、筋肉増殖または発達に影響を及ぼす能力である。さらに好ましい生物学的活性は、骨発生、成熟、または増殖に影響を与える能力である。なお別の好ましい生物学的活性は、内皮細胞増殖を阻害および／またはアポトーシスを誘導する能力である。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害または抑制するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、およびＲｅ186）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素またはそのフラグメントのようなトキシンを含むことを意図する。
【００２７】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、シトキシン、タキソイド類、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、およびドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ，Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｒｎａｃｅ）、トキソテレ、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラミシン類（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン、および他の関連のナイトロジェンマスタードが挙げられる。この定義には、タモキシフェンおよびオナプリストンのような腫瘍においてホルモン作用を調節または阻害するように作用するホルモン性薬剤もまた含まれる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「増殖阻害薬剤」とは、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞、特に本明細書で同定された遺伝子のいずれかを過剰発現するガン細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。したがって、増殖阻害薬剤は、Ｓ期においてこのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を顕著に減少させるものである。増殖阻害薬剤の例には、Ｇ１期阻止およびＭ期阻止を誘導する薬剤のような、細胞周期進行（Ｓ期以外の期間で）をブロックする薬剤が挙げられる。古典的Ｍ期ブロッカーには、ビンカス（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキソール、ならびに、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポＩＩインヒビターが挙げられる。Ｇ１期を阻止する薬剤はまた、Ｓ期阻止にも及び、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクトレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤である。さらなる情報が、Ｍｕｒａｋａｍｉら（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  １９９５）による「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」という題の、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編，Ｃｈａｐｔｅｒ  １、特に１３頁で見られ得る。
【００２９】
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学物質名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リソキシ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセネジオンである。
【００３０】
用語「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとしてもう１つの細胞で作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管阻害因子；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＦＧ−βのような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書で使用される場合。用語サイトカインには、天然供給源からまたは組換え細胞培養物からのタンパク質およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が挙げられる。
【００３１】
「血管内皮増殖因子」／「血管透過因子」（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）は、低酸素症によって刺激されそして腫瘍脈管形成に必要とされることが最近示された、内皮細胞特異的マイトジェンである（Ｓｅｎｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  ４６：５６２９−５６３２（１９８６）；Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ｓｃｈｗｅｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８４３−８４５（１９９２）；Ｐｌａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：８４５−８４８（１９９２））。これは、合成されそして種々の腫瘍および正常細胞によって分泌される３４〜４３ｋＤａ（約４５ｋＤａにて優勢な種を有する）ダイマーのジスルフィド結合した糖タンパク質である。さらに、色素上皮細胞および周皮細胞のような培養したヒト網膜細胞は、低酸素症に応答してＶＥＧＦを分泌しそしてＶＥＧＦ遺伝子発現を増加させることが証明された（Ａｄａｍｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３：６３１−６３８（１９９３）；Ｐｌｏｕｅｔら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：９００（１９９２）；Ａｄａｍｉｓら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：１４４０（１９９３）；Ａｉｅｌｌｏら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：１８６８（１９９４）；Ｓｉｍｏｒｒｅ−ｐｉｎａｔｅｌら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５：３３９３−３４００（１９９４））。逆に、正常組織におけるＶＥＧＦは比較的低い。したがって、ＶＥＧＦは、新生血管形成に関連する多くの病理学的状態およびプロセスにおいて主要な役割を果たすようである。したがって、上記の種々の状態によって影響を受ける組織におけるＶＥＧＦ発現の調節は、低酸素症に関連する処置または予防的治療に重要であり得る。
【００３２】
用語「アゴニスト」は、ネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２）によってシグナルを出す能力を有するならば、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログ、ならびにこのようなネイティブなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために使用される。言い換えると、用語「アゴニスト」は、ＴＩＥレセプターの生物学的役割の状況において定義され、およびネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的役割に関して定義されず、これは、上述のように、ＴＩＥレセプター生物学的機能のアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。好ましいアゴニストは、上記に列挙したＴＩＥホモログの好ましい生物学的活性を保有し、そして血管形成のプロモーター、骨形成成熟または増殖に役割を果たす分子、ならびに筋肉増殖および／または発達のプロモーターを含む。
【００３３】
用語「アンタゴニスト」は、ネイティブなＴＩＥレセプター（例えば、ＴＩＥ−２）の生物学的機能を阻害する能力を有するならば、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのペプチドおよび非ペプチドアナログを、ならびにこのようなネイティブなＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する抗体をいうために使用される。また、用語「アンタゴニスト」は、ＴＩＥレセプターの生物学的役割に関して定義され、およびネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的役割に関して定義されず、これは、ＴＩＥレセプター生物学的機能のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであり得る。好ましいアンタゴニストは、血管形成、あるいは病理学的骨格または筋肉の発達または成長のインヒビターである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」とは、悪性または良性の、ならびにすべての前ガン性およびガン性の細胞および組織のいずれかの、全ての新形成細胞成長および増殖をいう。
【００３５】
用語「ガン」および「ガン性」とは、代表的には調節されない細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳動物における生物学的症状をいうかまたは記載する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このようなガンのより特定な例には、乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、扁平上皮ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃腸ガン、膵臓ガン、神経膠芽腫、子宮頚ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、悪性肝ガン（ｈｅｐａｔｏｍａ）、結直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝ガン腫、ならびに種々のタイプの頭部および頚部ガンが挙げられる。
【００３６】
「処置」は、発生を抑制することまたは障害の病理を変更することを意図して行われる介入である。したがって、「処置」とは、治療処置および予防または防止尺度の両方をいう。処置を必要とするものには、既に障害を有するものならびに障害が予防されるべきものが挙げられる。腫瘍（例えば、ガン）処置では、治療薬剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少し得るか、または腫瘍細胞が他の治療薬剤による処置、例えば、放射線照射および／または化学療法をより受けやすくし得る。
【００３７】
ガンの「病理」は、患者の安寧に欠陥を生じさせるすべての現象を含む。これには、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常レベルでの放出、炎症または免疫学的応答の抑制または悪化などが挙げられが、これらに限定されない。
【００３８】
処置の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および飼育動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園、競技、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
１つ以上のさらなる治療薬剤「と組み合わせた」投与は、同時（共同して作用する（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））および任意の順での連続投与を含む。
【００４０】
用語「機能的誘導体」は、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログの生物学的に活性なアミノ酸配列改変体、ならびに、有機誘導体化薬剤との反応によって得られた誘導体、翻訳後修飾、非タンパク質性ポリマーを有する誘導体、およびイムノアドヘシンを含む共有改変を定義するために使用される。
【００４１】
本明細書に記載される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、用語「単離された」とは、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然の環境の夾雑成分は、代表的には、ポリペプチドについての診断または治療用途を妨害し、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る物質である。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターの使用によるＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。単離されたポリペプチドは、インサイチュで、組換え細胞内にポリペプチドを含む。なぜなら、ＴＩＥリガンドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４２】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源中に普通に会合する少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定および分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然で見いだされる形態または配置以外である。単離された核酸分子は、したがって、天然細胞に存在するので、核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞とは異なる染色体位置にある場合、本発明のＴＩＥリガンドを普通に発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれる。
【００４３】
用語「アミノ酸配列改変体」とは、ネイティブなアミノ酸配列と比較してそのアミノ酸配列にいくつかの差を有する分子をいう。
【００４４】
置換改変体は、除去されるネイティブな配列で少なくとも１つのアミノ酸残基および同じ位置で代わりに挿入される異なるアミノ酸を有するものである。置換は、分子中の１つのみのアミノ酸が置換される場合、単一であり得、あるいは、２つ以上のアミノ酸が同じ分子で置換される場合は、複数であり得る。
【００４５】
挿入改変体は、ネイティブな配列において特定の位置でアミノ酸に直接隣接して挿入される１つ以上のアミノ酸を有する改変体である。アミノ酸に直接隣接するとは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。
【００４６】
欠失改変体は、ネイティブなアミノ酸配列に除去される１つ以上のアミノ酸を有する改変体である。通常、欠失改変体は、分子の特定の領域で欠失した１または２アミノ酸を有する。欠失改変体には、Ｃ−および／またはＮ−末端欠失（短縮）を有するもの、ならびに１つ以上のアミノ酸の内部欠失を有する改変体が挙げられる。本発明の好ましい欠失改変体は、本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのフィブリノーゲン様ドメインの外側の欠失を含む。
【００４７】
本発明のアミノ酸配列改変体は、最適の特徴を有する分子を産生するために、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失の種々の組み合わせを含み得る。
【００４８】
アミノ酸は、化学組成およびその側鎖の特性に従って分類され得る。これらは、２つの群、荷電的および非荷電的に広く分類される。これらの群のそれぞれは、アミノ酸をより正確に分類するために下位集団に分割される。
Ｉ．荷電アミノ酸
酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン
ＩＩ．非荷電アミノ酸
親水性残基：セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン
脂肪族残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン
芳香族残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
保存的置換は、１つの群内のメンバーを同じ群内のもう１つのメンバーと交換することを含むが、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーをもう１つに交換することを伴う。非保存的置換によって得られる改変体は、得られた改変体の生物学的特性／機能の顕著な変化を生じることが予測される。
【００４９】
アミノ酸配列欠失は、一般に、約１〜３０残基、より好ましくは約１〜１０残基の範囲であり、そして代表的には隣接する。欠失は、ネイティブなＴＩＥレセプターとの相互作用に直接関連しない領域に導入され得る。欠失は、好ましくは、本発明のＴＩＥリガンドホモログのＣ末端のフィブリノーゲン様領域の外側で行われる。
【００５０】
アミノ酸挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。配列内挿入（すなわち、ＴＩＥリガンドホモログアミノ酸配列内の挿入）は、一般に、約１〜１０残基、より好ましくは１〜５残基、より好ましくは１〜３残基の範囲であり得る。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＩＥリガンドホモログ、細菌組換え細胞培養物中のその直接発現の人工産物、および組換え宿主細胞からの成熟ＴＩＥリガンドホモログの分泌を容易にするための異種Ｎ末端シグナル配列のＴＩＥリガンドホモログ分子のＮ末端への融合物が挙げられる。このようなシグナル配列は、一般に、目的の宿主細胞種から得られ、したがってそれに相同である。適切な配列には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについてはＳＴＩＩまたはＩｐｐ、酵母についてはα因子、および哺乳動物細胞についてはヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルが挙げられる。
【００５１】
ネイティブなＴＩＥリガンド分子の他の挿入改変体には、免疫原性ポリペプチド、例えば、β−ラクタマーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐ遺伝子座によってコードされる酵素のような細菌ポリペプチド、または酵母タンパク質への、ＴＩＥリガンドホモログ分子のＮ末端またはＣ末端の融合物、ならびに、１９８９年４月６日に公開されたＷＯ  ８９／０２９２２に記載のように、免疫グロブリン領域（好ましくは、免疫グロブリン定常領域）、アルブミン、またはフェリチンのような長い半減期を有するタンパク質とのＣ末端融合物が挙げられる。
【００５２】
改変体ＴＩＥリガンドホモログの特徴を予め予測することがしばしば困難であるので、いくつかのスクリーニングが最適な改変体を選択するために必要とされることが理解される。
【００５３】
本発明のネイティブなＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、ネイティブなまたは改変体ＴＩＥリガンドホモログのＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって、当該技術分野で公知の方法によって調製される。アミノ酸配列改変体の構築における２つの主な変数がある：変異部位の位置および変異の性質。ＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡ配列の操作を必要としない、天然に存在する対立遺伝子を除いて、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体は、好ましくは、天然に存在しない対立遺伝子またはアミノ酸配列改変体のいずれかを実現するために、ＤＮＡを変異することによって構築される。
【００５４】
変異の１つの群は、ＴＩＥレセプター、例えば、ＴＩＥ−１もしくはＴＩＥ−２、またはまだ発見されていないレセプターとの相互作用に関連すると同定された、本発明のＴＩＥリガンドホモログのドメイン内で生成される。
【００５５】
あるいはまたはさらに、アミノ酸の変更は、実現されるべき目的に依存して、種々の種からのＴＩＥリガンドホモログにおいて異なる部位、または高度に保存された領域に作成され得る。
【００５６】
このような位置での部位は、代表的には、例えば、（１）最初に保存的選択で、次いで実現した結果に依存してより根本的選択で置換すること、（２）標的残基を欠失すること、または（３）位置した部位に隣接する同じまたは異なるクラスの残基を挿入すること、または選択肢１〜３の組み合わせによって連続して改変される。
【００５７】
１つの有用な技術は、「アラニンスキャンニング」と呼ばれる（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，１０８１−１０８５［１９８９］）。ここで、残基または標的残基の群は、アラニンまたはポリアラニンによって同定されそして置換される。次いで、アラニン置換に対する機能的感受性を証明するドメインは、アラニン置換の部位でまたは部位に対してさらにまたは他の置換基を導入することによって精錬される。
【００５８】
所望の変異を同定した後、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体をコードする遺伝子は、例えば、上記のように化学合成によって得られ得る。
【００５９】
より好ましくは、ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体をコードするＤＮＡは、より初期に調製されたリガンドの改変体または非改変型をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によって調製される。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに横切った欠失連結部の両側で安定な二重鎖を形成するために十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供するために、隣接ヌクレオチドの十分な数の使用によってリガンド改変体の産生を可能にする。代表的には、約２０〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の連結部の両側での約５〜１０残基が変更される。一般に、部位特異的変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、Ｅｄｅｌｍａｎら，ＤＮＡ  ２，１８３（１９８３）のような刊行物に例示される。理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、代表的には、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発に有用な代表的なベクターには、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇら，Ｔｈｉｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ａ．Ｗａｌｔｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８１）に開示されるように、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これおよび他のファージベクターは市販されており、そしてその使用は、当業者に周知である。Ｍ１３由来ベクターを使用するＤＮＡフラグメントにおける部位特異的変異を指示するオリゴデオキシリボヌクレオチドの構築のための多才なおよび有効な手順は、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００［１９８２］によって公開された。また、一本鎖ファージ複製起点を含むプラスミドベクター（Ｖｅｉｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，３［１９８７］）は、一本鎖ＤＮＡを得るために用いられ得る。あるいは、ヌクレオチド置換は、インビトロで適切なＤＮＡフラグメントを合成することによって、および当該技術分野で公知のＰＣＲ手順によって増幅することによって導入される。
【００６０】
一般に、本願の部位特異的変異誘発は、関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを最初に得ることによって行われる。所望に変異された配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、Ｃｒｅａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５，５７６５（１９７８）の方法によって、一般に合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖タンパク質配列含有ベクターとアニールし、そしてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合化酵素を受けさせて、変異含有鎖の合成を完了させる。したがって、ヘテロ二重鎖は、１つの鎖が元の非変異配列をコードし、そして第２鎖が所望の変異を有する場合に形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、ＪＰ１０１細胞のような適切な宿主細胞を形質転換するために使用され、そして変異した配列アライメントを有する組換えベクターを含むクローンが選択される。その後、変異した領域は除去され、そしてタンパク質産生に適切な発現ベクター中に配置され得る。
【００６１】
ＰＣＲ技術はまた、ＴＩＥリガンドのアミノ酸配列改変体を生成することに使用され得る。少量のテンプレートＤＮＡがＰＣＲにおける開始物質として使用される場合、テンプレートＤＮＡにおいて対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーは、プライマーがテンプレートと異なる位置のみでテンプレート配列とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡフラグメントを生成するために使用され得る。プラスミドＤＮＡへの変異の導入のために、プライマーの１つは、変異の位置を重複しそして変異を含むように設計され；他のプライマーの配列は、プラスミドの反対鎖の配列のストレッチと同一でなければならないが、この配列は、プラスミドＤＮＡに沿ってどこにでも位置し得る。しかし、第２プライマーの配列が、第１の配列から２００ヌクレオチド内に位置しそのため末端でプライマーに結合したＤＮＡの全体の増幅した領域が容易に配列決定され得ることが好ましい。まさに記載したもののようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅は、プライマーによって特定される変異の位置で異なるＤＮＡフラグメントの集団を生じ、そしておそらく他の位置では、テンプレートとしてコピーすることは、幾分誤る傾向がある。
【００６２】
物質を産生するためのテンプレートの比が非常に低いならば、大多数の産物ＤＮＡフラグメントは、所望の変異を組み込む。この産物物質は、標準的ＤＮＡ技術を使用してＰＣＲテンプレートとして用いたプラスミド中の対応する領域を置換するために使用される。別々の位置での変異は、変異体第２プライマーを使用するかまたは異なる変異体プライマーでの第２ＰＣＲを行うことのいずれか、および３つ（またはそれ以上）の部分的ライゲーションにおいてベクターフラグメントに２つの得られるＰＣＲフラグメントを同時にライゲートすることによって、同時に導入され得る。
【００６３】
ＰＣＲ変異誘発の特定の例では、テンプレートプラスミドＤＮＡ（１μｇ）は、増幅されるべき領域の外側でプラスミドＤＮＡ中に独特の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによる切断によって直線化される。この物質のうち、１００ｎｇを、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸を含みそしてＧｅｎｅＡｍｐ（商標）キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴおよびＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡより入手）、および２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマーに含まれるＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ混合物に、５０μｌの最終容量まで添加する。反応混合物を、３５μｌ鉱油で重層する。反応物を、１００℃にて５分間変性し、氷上に簡単に置き、次いでＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴおよびＥｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡから購入した１μｌ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｌ）を、鉱油層の下に添加する。次いで、反応混合物を、以下のようにプログラムされたＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓから購入した）に差し込む：
２分、５５℃、
３０秒、７２℃、次いで以下の１９サイクル：
３０秒、９４℃、
３０秒、５５℃、および
３０秒、７２℃。
【００６４】
プログラムの最後に、反応バイアルを、サーマルサイクラーから取り出しそして水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０ｖｏｌ）で抽出し、そしてエタノール沈殿し、そしてＤＮＡを標準的手順によって回収する。この物質は、その後、ベクターへの挿入のために適切な処置にかける。
【００６５】
改変体を調製するためのもう１つの方法である、カセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら，［Ｇｅｎｅ  ３４，３１５（１９８５）］に記載の技術に基づく。開始物質は、変異されるべきＴＩＥリガンドホモログＤＮＡを含むプラスミド（またはベクター）である。変異されるべきＴＩＥリガンドホモログ内のコドンが同定される。同定された変異部位の各側における独特の制限エンドヌクレアーゼがなければならない。このような制限部位が存在しないならば、これらは、ＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡにおいて適切な位置に導入するための上記のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使用して生成され得る。制限部位がプラスミドに導入された後、プラスミドを、直線にするためにこれらの部位で切断する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的手順を使用して合成する。２つの鎖を別々に合成し、次いで標準的技術を使用してともにハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットという。このカセットを、プラスミドに直接連結され得るように、直線にしたプラスミドの末端と適合可能である３’および５’末端を有するように設計する。このプラスミドは、今や、変異したＴＩＥリガンドホモログＤＮＡ配列を含む。
【００６６】
さらに、いわゆるファージミド提示方法は、ネイティブか、または改変体ＴＩＥリガンドホモログのアミノ酸配列改変体を作成することに有用であり得る。この方法は、（ａ）変異させるべきレセプターをコードする第１の遺伝子、第１および第２の遺伝子が異種である天然または野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第２の遺伝子、および融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を形成する第１および第２の遺伝子に作動可能に連結される転写調節エレメントを含む、複製可能な発現ベクターを構築する工程；（ｂ）関連のプラスミドのファミリーを形成する第１の遺伝子内の１つ以上の選択された位置でベクターを変異する工程；（ｃ）プラスミドで適切な宿主細胞を形質転換する工程；（ｄ）ファージコートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで、形質転換された宿主細胞を感染させる工程；（ｅ）プラスミドの少なくとも一部を含む組換えファージミド粒子を形成するために適切でありそして宿主を形質転換し得る条件下で、形質転換し感染した宿主細胞を培養する工程であって、この条件が、ほんの少量のファージミド粒子が粒子の表面上に融合タンパク質の１つより多くのコピーを提示するように調節される、工程；（ｆ）ファージミド粒子の少なくとも一部が抗原に結合するように、適切な抗原とファージミド粒子とを接触させる工程；および（ｇ）結合するファージミド粒子を結合しないものと分離する工程、を包含する。工程（ｄ）〜（ｇ）は、１回以上繰り返され得る。好ましくは、この方法において、プラスミドは、転写調節エレメントの堅い制御下にあり、そして培養条件は、粒子の表面上に融合タンパク質の１つより多くのコピーを提示するファージミド粒子の量または数が、約１％以下であるように調節される。また、好ましくは、融合タンパク質の１つより多くのコピーを提示するファージミド粒子の量は、融合タンパク質の単一コピーを提示するファージミド粒子の量の１０％以下である。最も好ましくは、この量は２０％以下である。代表的には、この方法では、発現ベクターは、ポリペプチドの各サブユニットをコードするＤＮＡに融合した分泌シグナル配列をさらに含み、そして転写調節エレメントは、プロモーター系である。好ましいプロモーター系は、ｌａｃ  Ｚ、λPL、ｔａｃ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファターゼプロモーター、ならびにその組み合わせから選択される。また、通常は、この方法は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、およびＰｈｉ  Ｘ  １７４から選択されるヘルパーファージを用いる。好ましいヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７であり、そして好ましいコートタンパク質は、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＥ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ欠失株である。
【００６７】
上記および類似の変異誘発技術のさらなる詳細は、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１のような、一般的教科書で見いだされる。
【００６８】
「イムノアドヘシン」は、適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列に連結したレセプター配列から伝統的に構築されるキメラである（イムノアドヘシン）。このような構造は、当該技術分野で周知である。文献で報告されたイムノアドヘシンには、Ｔ細胞レセプター*［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４、２９３６−２９４０（１９８７）］；ＣＤ４*［Ｃａｐｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７，５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９，６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９，３４７−３５３（１９９０）；Ｂｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，６６７−６７０（１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）［Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０，２２２１−２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，１６４−１６７（１９９１）］；ＣＤ４４*［Ａｒｕｆｆｏら，Ｃｅｌｌ  ６１，１３０３−１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８*およびＢ７*［Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３，７２１−７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４*［Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１−５６９（１９９１）］；ＣＤ２２*「Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，Ｃｅｌｌ  ６６，１１３３−１１４４（１９９１）］；ＴＮＦレセプター［Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，２８８３−２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，１４８３−１４８９（１９９１）］；ＮＰレセプター［Ｂｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３０６０−２３０６７（１９９１）］；ＩｇＥレセプターα鎖*［ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５，ａｂｓｔｒ．１４４８（１９９１）］；ＨＧＦレセプター［Ｍａｒｋ，Ｍ．Ｒ．ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，投稿中］の融合物が挙げられ、ここでアステリスク（*）は、レセプターが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【００６９】
リガンド−免疫グロブリンキメラもまた公知であり、そして例えば、米国特許第５，３０４，６４０号（Ｌ−セレクチンリガンドについて）；同第５，３１６，９２１号および同第５，３２８，８３７号（ＨＧＦ改変体について）に開示される。これらのキメラは、レセプター−免疫グロブリンキメラの構築と類似の方法で作成され得る。
【００７０】
本発明のＴＩＥリガンドホモログの共有改変は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、ＴＩＥリガンドの標的されたアミノ酸残基を、選択された側面または末端残基と反応し得る有機誘導体化薬剤と反応させることによって、あるいは選択された宿主細胞で機能する翻訳後改変のメカニズムを利用することによって伝統的に導入される。得られる共有誘導体は、生物学的活性に、イムノアッセイに、または組換え体のイムノアフィニティー精製のための抗ＴＩＥリガンド抗体の調製に、重要な残基を同定することに関するプログラムで有用である。例えば、ニンヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性の完全不活化は、少なくとも１つのアルギニル残基またはリジル残基がその活性に重要であり、その後選択された条件下で改変された個々の残基が、改変したアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントの単離によって同定されることを示唆する。このような改変は、当業者の範囲内であり、そして過度の実験を行うことなく行われる。
【００７１】
システニル残基は、最も普通には、クロロ酢酸またはクロロアセタミドのようなα−ハロ酢酸塩（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド，３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【００７２】
ヒスチジル残基は、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるので、ｐＨ  ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は、好ましくは、ｐＨ  ６．０にて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【００７３】
リジニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤の誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリコキシレートとのトランスアミナーゼ触媒した反応物が挙げられる。
【００７４】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来の試薬、その中でもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫaのために、反応がアルカリ条件で行われることが必要とされる。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
【００７５】
チロシル残基の特定の改変は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することにおいて、特定の目的で行われ得る。最も普通には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイでの使用のために標識されたタンパク質を調製するために125Ｉまたは131Ｉを使用してヨード化される。
【００７６】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に改変される。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【００７７】
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内にはいる。
【００７８】
他の改変には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、トレオニル、またはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。分子は、さらに、米国特許４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２；または４，１７９，３３７に記載の方法で、非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに共有結合され得る。
【００７９】
二官能性薬剤での誘導体化は、ＴＩＥリガンドのポリペプチドとの分子内凝集を調製するために、ならびにアッセイまたはアフィニティー精製での使用のために水不溶性支持体マトリクスまたは表面にＴＩＥリガンドポリペプチドを架橋するために、有用である。さらに、鎖間架橋の研究は、コンホメーション構造における直接情報を提供する。普通に使用される架橋剤には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性イミドエステル、および二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成し得る光活性化可能中間体を得る。あるいは、臭化シアン活性化した炭化水素のような反応性水不溶性マトリクスならびに米国特許第３，９５９，６４２号；第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；第４，０５５，６３５号；および第４，３３０，４４０号に記載の系反応性基質が、タンパク質固定化および架橋に用いられる。
【００８０】
ある翻訳後修飾は、発現したポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内にはいる。
【００８１】
他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン、トレオニン、またはチロシン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３）］が挙げられる。
【００８２】
他の誘導体は、非タンパク質性ポリマーに共有結合した本発明の新規ペプチドを含む。非タンパク質性ポリマーは、通常は、親水性合成ポリマー、すなわち、天然で他には見いだされないポリマーである。しかし、天然に存在し、そして組換えまたはインビトロ方法によって産生されるポリマーは、天然から単離されるポリマーと同様に、有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲にはいる。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールのようなポリビニルアルキレンエーテルは、特に有用である。
【００８３】
ＴＩＥリガンドホモログは、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；または第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのような種々の非タンパク質性ポリマーに連結され得る。まさに本発明のイムノアドヘシンのような、これらの改変体は、対応するネイティブなＴＩＥリガンドホモログよりも長い半減期を有することが予測される。
【００８４】
ＴＩＥリガンドホモログは、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合化によって調製されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル）に、あるいはマクロエマルジョンに捕らえられ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示される。
【００８５】
用語「ネイティブなＴＩＥレセプター」は、公知であるか、本明細書中以後に開示されているヒト、他の高等霊長類（例えば、サル）、ならびに齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）を含むが、これらに限定されない任意の動物種のＴＩＥレセプターをいうために本明細書で使用される。この定義は、詳細には、例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９５／１３３８７号（１９９５年５月１８日公開）に開示されるＴＩＥ−２レセプター、およびＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ  ９３／１４１２４号（１９９３年７月２２日公開）で「ＴＩＥ」という内皮細胞レセプターチロシンキナーゼを含み、そして好ましくはＴＩＥ−２である。
【００８６】
（Ｂ．抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体）
本発明は、ＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する、アゴニストおよびアンタゴニスト抗体をカバーする。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、そして限定することなく、成熟抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦVなど）、単鎖抗体、および種々の鎖の組み合わせを含む。
【００８７】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして具体的には本発明のＴＩＥリガンドを特異的に結合する単一モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ならびに多エピトープ特異性を有する抗体組成物をカバーする。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少ない量で存在し得る潜在的な天然に存在する変異を除いては、同一である。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一抗原性部位に対して指向される。さらに、代表的には種々の決定基（エピトープ）に対して指向される種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは逆に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。
【００８９】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、起源の種または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスの指定にかかわりなく、定常ドメインを伴う、抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体の可変（超可変を含む）ドメインをスプライシングすることによって産生されるハイブリッドおよび組換え抗体（例えば、「ヒト化」抗体）、または重鎖を伴う軽鎖、またはもう１つの種からの鎖を伴う１つの種からの鎖、または異種タンパク質を伴う融合物、ならびに所望の生物学的活性を示す限り抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ）が挙げられる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと。
【００９０】
したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載のような組換えＤＮＡ方法によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載の技術を使用して生成されるファージライブラリーから単離され得る。
【００９１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、このレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換される。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに精錬および最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、このドメインにおいてＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部（代表的にはヒト免疫グロブリンのもの）の一部を含む。
【００９２】
本発明のＴＩＥリガンドホモログに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＴＩＥリガンドおよびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物で惹起される。ＴＩＥリガンドまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに対して、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここでＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）を用いて、結合体化することが有用であり得る。
【００９３】
動物は、１ｍｇまたは１μｇの結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を３容量のフロイント完全アジュバントと合わせること、および複数の部位で皮内に溶液を注射することによって、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫される。１カ月後、その動物に、複数の部位での皮下注射によってフロイント完全アジュバント中の元の量の１／５〜１／１０の結合体を用いてブーストする。７〜１４日後、動物から採血し、そしてその血清を抗ＴＩＥリガンド抗体力価についてアッセイする。動物に、その力価がプラトーになるまでブーストする。好ましくは、動物を、同じＴＩＥリガンドの結合体であるが異なるタンパク質におよび／または異なる架橋試薬を介して結合体化された結合体でブーストする。結合体はまた、タンパク質融合体として組換え細胞培養物中で作製され得る。また、ミョウバンのような凝集剤が、免疫応答を増強するために使用される。
【００９４】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少ない量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いては、同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、異なる抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。
【００９５】
例えば、本発明の抗ＴＩＥリガンドホモログモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法［Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号］によって作製され得る。
【００９６】
ハイブリドーマ方法では、マウス、またはハムスターのような他の適切な宿主動物が、本明細書中上記のように免疫されて、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生または産生し得るリンパ球を誘起する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用してミエローマ細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）］。
【００９７】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する、好ましくは１つ以上の物質を含む、適切な培養培地中に播種し、そして増殖する。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマについての培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる。
【００９８】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高いレベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である細胞である。これらのうち、好ましいミエローマ細胞株は、ｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するようなマウスミエローマ株、ならびにアメリカンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞である。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）］。
【００９９】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、ＴＩＥリガンドホモログに対して指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降剤あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイにより決定される。
【０１００】
このモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【０１０１】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ、そして標準的方法によって増殖され得る。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。この目的に適切な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍のようにインビボで増殖され得る。
【０１０２】
このサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離される。
【０１０３】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、そして配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞を、このようなＤＮＡの好ましい供給源として用いる。一旦単離すると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、このベクターは、次いでそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインでコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され得る。このように、本明細書における抗ＴＩＥリガンドモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１０４】
代表的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換されて、本発明のＴＩＥリガンドに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を生成する。
【０１０５】
キメラまたはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含む化学反応を含む、合成タンパク質化学で公知の方法を使用してインビトロで調製され得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築され得る。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１０６】
診断適用のために、本発明の抗体は、代表的には、検出可能部分を用いて標識される。この検出可能部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能シグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、この検出可能部分は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉのような放射性同位元素、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合物；ビオチン；例えば、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、または3Ｈのような放射性同位元素標識、あるいは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。
【０１０７】
抗体を検出可能部分に別々に結合するための当該技術分野で公知の任意の方法が用いられ得、これには、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載の方法が挙げられる。
【０１０８】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイ方法で用いられ得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。
【０１０９】
競合結合アッセイは、標識された標準（ＴＩＥリガンドホモログまたはその免疫学的反応性部分であり得る）が、限定された量の抗体との結合についてテスト試料分析物（ＴＩＥリガンド）と競合する能力に依存する。テスト試料中のＴＩＥリガンドホモログの量は、抗体に結合するようになる標準の量に反比例する。結合するようになる標準の量を決定することを容易にするために、抗体は、一般に、競合前または後に不溶化され、そのため抗体に結合される標準および分析物は、結合しないままの標準および分析物から簡便に分離され得る。
【０１１０】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を含み、それぞれは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイでは、テスト試料分析物は、固体支持体上に固定されている第一の抗体によって結合され、その後第二の抗体がその分析物に結合し、したがって不溶性３部分複合体を形成する。ＤａｖｉｄおよびＧｒｅｅｎｅ，米国特許第４，３７６，１１０号。この第二の抗体は、それ自体が検出可能部分で標識され得るか（直接的サンドイッチアッセイ）、または検出可能部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能部分は酵素である。
【０１１１】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基といわれ、これは代表的には、「移入」可変ドメインから採用される。ヒト化は、本質的に、ヒト抗体の対応する配列で齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を置換することによる、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って行われ得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ，前出）、ここで、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１１２】
抗体が、抗原についての高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながらヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方法にしたがって、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。モデル中の三次元免疫グロブリンは、一般に利用可能であり、そして当業者は熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンホメーション構造を例示および提示するコンピュータプログラムは、利用可能である。これらの提示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基が、標的抗原に対する増加した親和性のような所望の抗体特性が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列から選択され、そして組み合わせられ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに、直接的およびほとんど実質的に関与する。
【０１１３】
あるいは、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが、今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ領域（ＪH）遺伝子のホモ接合欠損が、内因性抗体産生の完全阻害を生じることが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジの際のヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，２５５−２５８（１９９３）を参照のこと。
【０１１４】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル、好ましくはヒトまたはヒト化、抗体である。本発明の場合では、結合特異性の１つは、特定のＴＩＥリガンドに対してであり、他方は、任意の他の抗原に対してであり、そして好ましくはもう１つのリガンドに対してである。例えば、２つの異なるＴＩＥリガンドホモログを特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明の範囲内である。
【０１１５】
二重特異性抗体を作成する方法は、当該技術分野で公知である。
【０１１６】
伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム類別のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１つのみが正しい二重特異性構造を有する、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生する。アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常行われる、正しい分子の精製は、むしろ煩わしく、そして産物収量は低い。類似の手順が、ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ  ９３／０８８２９号（１９９３年５月１３日に公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  １０，３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１１７】
異なるおよびより好ましいアプローチよれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジの少なくとも一部、および免疫グロブリン重鎮の第２および第３の定常領域（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。これは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不同の比が最適収量を提供する場合の実施態様では、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節することに、非常に柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比での発現が、高い収量を得る場合、または比が特に重要ではない場合、１つの発現ベクター中に、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入することが可能である。このアプローチの好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、１つのアームにおける第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおける（第２の結合特性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するので、この非対称構造が、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから、所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることを見いだした。
【０１１８】
二重特異性抗体を生成することのさらに詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１，２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１１９】
用語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小抗体フラグメントをいい、このフラグメントは同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶL）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む（ＶH−ＶL）。短すぎて同じ鎖における２つのドメイン間の対形成ができないリンカーを使用することによって、このドメインは、もう１つの鎖の相補ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より十分に記載される。
【０１２０】
「単離された」抗体は、単離されたポリペプチドについて本明細書中上記で提供される定義と同様に定義される。詳細には、「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、抗体についての診断または治療使用を妨害する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。好ましい実施態様では、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって決定される場合９５％重量を越える抗体、および最も好ましくは９９％重量を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体は、組換え細胞内でのインサイチュでの抗体を含む。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「標識」とは、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接的または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成物をいう。この標識は、それ自体によって検出可能であり得るか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素的標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学変更を触媒し得る。
【０１２２】
「固相」とは、本発明の抗体が付着し得る非水性マトリクスを意味する。本明細書において含まれる固相の例は、ガラス（例えば、制御された孔ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから部分的または全体が形成されるものを含む。ある実施態様では、状況に依存して、その固相は、アッセイプレートのウェルを含み得；他では、固相は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載のような別々の粒子の不連続固相を含む。
【０１２３】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば、本明細書で開示される抗ＥｒｂＢ２抗体、および必要に応じて、化学療法剤）の送達に有用である、種々のタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置に類似の、二層形成で一般に配置される。
【０１２４】
抗体「アゴニスト」および「アンタゴニスト」は、上で定義されるとおりである。
【０１２５】
ヘテロ結合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞を標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＰＣＴ出願公開公報第ＷＯ  ９１／００３６０号および第ＷＯ  ９２／２００３７３号；ＥＰ  ０３０８９）提案されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、そして多くの架橋技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【０１２６】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶHおよびＶLドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶHおよびＶLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このことはｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【０１２７】
（Ｃ．ＴＩＥリガンドホモログのクローニングおよび発現）
本発明の文脈では、表現「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、交換可能に使用され、そしてすべてのこのような名称は子孫を含む。すべての子孫が、故意のまたは偶然の変異のため、ＤＮＡ含量が正確に同一であり得ないことも理解される。最初の形質転換された細胞についてスクリーニングした場合に、同じ機能または生物学的特性を有する変異体子孫が、含まれる。
【０１２８】
用語「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」とは、一片の外来ＤＮＡを挿入され得る、通常二本鎖の、一片のＤＮＡをいう。外来ＤＮＡは、異種ＤＮＡと定義され、これは、宿主細胞中に天然に見いだされないＤＮＡである。このベクターは、適切な宿主細胞に外来または異種ＤＮＡを輸送するために使用される。一旦宿主細胞にはいると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡから独立して複製し得、そしてベクターおよびその挿入された（外来）ＤＮＡのいくつかのコピーが生成され得る。さらに、このベクターは、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳することを可能にするのに必要なエレメントを含む。したがって、外来ＤＮＡによってコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。
【０１２９】
発現およびクローニングベクターは、当該技術分野で周知であり、そして１つ以上の選択された宿主細胞中でベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。適切なベクターの選択は、１）ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現に使用されるべきかどうか、２）ベクターに挿入されるべきＤＮＡのサイズ、および３）ベクターで形質転換されるべき宿主細胞、に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの発現、ＤＮＡの増幅）および適合可能である宿主細胞に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般に、１つ以上の以下のものを含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０１３０】
（（ｉ）シグナル配列成分）
一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されるＴＩＥリガンド分子の一部であり得る。シグナル配列が異種であるならば、宿主細胞によって認識およびプロセシング（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断）されるように選択されるべきである。
【０１３１】
原核生物宿主細胞に適切な異種シグナル配列は、好ましくは、α−アミラーゼ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＣ、ｏｍｐＥ、ｏｍｐＦ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩのリーダーのような、原核生物シグナル配列である。酵母分泌については、例えば、酵母インベルターゼ、アミラーゼ、α因子、または酸性ホスファターゼのリーダーが使用され得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列が最も適切である。列挙したシグナル配列は、例示のためのみであり、そしていかなるようにも本発明の範囲を限定しない。
【０１３２】
（（ｉｉ）複製起点成分）
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方とも、１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能にした核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体から独立して複製することを可能にする配列であり、そして複製起点または自律複製する配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスにとって周知である。周知のプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適切であり、酵母についての２μプラスミド起点および種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。複製起点は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（ＳＶ４０起点は、代表的には、単に初期プロモーターを含むので、使用され得る）。ほとんどの発現ベクターは、「シャトル」ベクターであり、すなわち、これらは、少なくとも１つのクラスの生物で複製し得るが、発現のために他の生物にトランスフェクトされ得る。例えば、ベクターはＥ．ｃｏｌｉにクローニングされ、次いで同じベクターが、たとえ宿主細胞染色体から独立して複製し得ないとしても、発現のために酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。
【０１３３】
ＤＮＡはまた、宿主ゲノムへの挿入によってクローニングされる。これは、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓゲノムＤＮＡで見いだされる配列に相補的であるＤＮＡ配列をベクターに含むことによって、宿主としてＢａｃｉｌｌｕｓ種を使用して、容易に達成される。このベクターでのＢａｃｉｌｌｕｓのトランスフェクションは、ゲノムとの相同組換えおよび所望の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡの挿入を生じる。しかし、制限酵素切断が、コードされたポリペプチド分子を切り出すために必要とされるので、ゲノムＤＮＡの回収は、外因性の複製されたベクターの回収よりも複雑である。
【０１３４】
（（ｉｉｉ）選択遺伝子成分）
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称する、選択遺伝子を含むべきである。これは、このベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在は、そのベクターを欠失する宿主細胞が、形質転換した宿主よりも増殖または再生で全く有利点を得ないことを確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性の欠損を相補するか、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給する（例えば、バチルス属についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。
【０１３５】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子でうまく形質転換される細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を発現し、したがって選択レジメを生存する。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン［Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７（１９８２）］、ミコフェノール酸［Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９，１４２２（１９８０）］、またはハイグロマイシン［Ｓｕｄｇｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．５，４１０−４１３（１９８５）］を使用する。上記の３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、あるいはハイグロマイシンに対する耐性を与えるために真核生物制御下で細菌遺伝子を用いる。
【０１３６】
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの他の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、所望の核酸を取り込むためにコンピテントであった細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞の形質転換体は、形質転換体のみが、そのマーカーを取り込んでいることによって生存するために独特に適合される選択圧下に、配置される。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度がうまく変化する条件下で形質転換体を培養することによって課され、それによって、選択遺伝子および所望のポリペプチドをコードするＤＮＡの両方の増幅を導く。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生について非常に需要がある遺伝子が、染色体内で協調して組換え細胞のうまくいった生成を繰り返すプロセスである。所望のポリペプチドの増加した量は、増幅したＤＮＡから合成される。
【０１３７】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞は、ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを含まない培養培地中で、すべての形質転換体を培養することによって、最初に同定される。この場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠失するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７、４２１６（１９８０）に記載のように調製および増殖される。特に有用なＤＨＦＲは、ＭＴＸ（ＥＰ  １１７，０６０）に非常に耐性である、変異ＤＨＦＲである。この選択薬剤は、内因性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず、他の適切な任意の宿主、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１  ＣＨＯ−Ｋ１を用いて使用され得る。次いで、ＤＨＦＲおよび所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、それぞれ、ＤＨＦＲを不活化する薬剤（メトトレキサート、またはＭＴＸ）への曝露によって増幅される。細胞が、常により多量のＭＴＸ濃度の連続したラウンドにおいて増殖し得る細胞についてのみ選択することによって、より多くのＤＨＦＲを必要とする（そして結果としてすべての外因性ＤＮＡを増幅する）ことを確実にする。あるいは、所望のポリペプチド、野生型ＤＨＦＲ、およびｎｅｏ遺伝子のようなもう１つの選択可能マーカーをコードする遺伝子で同時形質転換した宿主は、Ｇ４１８のような選択可能マーカーについての選択薬剤を使用して同定され得、次いで内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主中でメトトレキサートを使用して選択および増幅され得る（米国特許第４，９６５，１９９号も参照のこと）。
【０１３８】
酵母における使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，１９７９，Ｇｅｎｅ  ７：１４１；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒら，１９８０，Ｇｅｎｅ  １０：１５７）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力のない酵母の変異体株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６、またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，１９７７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２）についての選択マーカーを提供する。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による、形質転換体を検出するために効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって相補される。
【０１３９】
（（ｉｖ）プロモーター成分）
発現ベクターは、クローニングベクターとは異なって、宿主生物によって認識されそして所望のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含むべきである。プロモーターは、その制御下で核酸の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンから上流に位置する非翻訳配列である。これらは、代表的には、２つのクラス、誘導性および構成性に分かれる。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変化、例えば、栄養の存在または不在あるいは温度変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。この時、種々の可能性のある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素切断によって起源の遺伝子から取り出され、次いで発現されるべきポリペプチドについての開始コドンの５’への挿入によって、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。これは、ＴＩＥリガンドについてのゲノムプロモーターが使用可能ではないことをいうのではない。しかし、異種プロモーターは、一般に、天然のままのＴＩＥリガンドプロモーターと比較した場合、発現したＴＩＥリガンドホモログのより大きい転写および高い収量を生じる。
【０１４０】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターには、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）および欧州特許出願公開公報第３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（Ｈ．ｄｅ  Ｂｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それによって、当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを使用してＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡに作動可能に連結することを可能にする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら，Ｃｅｌｌ  ２０：２６９（１９８０））。細菌系での使用のためのプロモーターはまた、ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１４１】
酵母宿主との使用に適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））または他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）（Ｈｅｓｓら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９７８）；およびＨｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））のプロモーターが挙げられる。
【０１４２】
増殖条件によって制御される転写のさらなる有利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に応答する酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら，ＥＰ  ７３，６５７Ａに記載される。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０１４３】
プロモーター配列は、真核生物について公知である。実際には、すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見いだされるもう１つの配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここでＸは任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端にはコード配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。これらの配列のすべては、哺乳動物発現ベクターに適切に挿入される。
【０１４４】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＴＩＥリガンド転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２型）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスのようなウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから、ならびにこのようなプロモーターが宿主細胞系と適合可能であるならば、ＴＩＥリガンド配列に通常付随するプロモーターから、得られるプロモーターによって制御され得る。
【０１４５】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点もまた含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる［Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３（１９７８）、ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９，１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐａｖｌａｋｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８，７３９８−７４０２（１９８１）］。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる［Ｇｒｅｅｎａｗａｙら，Ｇｅｎｅ  １８，３５５−３６０（１９８２）］。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用する哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示される。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。サル細胞中でヒト免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡを発現することにおいては、Ｇｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，５０３−５０８（１９８２）；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下で、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡを発現することにおいてはＲｅｙｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７，５９８−６０１（１９８２）；培養したマウス細胞およびウサギ細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現においてはＣａｎａａｎｉおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９，５１６６−５１７０（１９８２）；ならびにプロモーターとしてラウス肉腫ウイルス長末端反復を使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現においてはＧｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９，６７７７−６７８１（１９８２）も参照のこと。
【０１４６】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明のＴＩＥリガンドホモログをコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加する。エンハンサーは、その転写を増加させるためにプロモーターで作用する、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、転写ユニットに対して５’［Ｌａｉｍｉｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８，９９３（１９８１）］および３’［Ｌａｓｋｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．３，１１０８（１９８３）］、イントロン内［Ｂａｎｅｒｊｉら，Ｃｅｌｌ  ３３，７２９（１９８３）］ならびにコード配列自体内［Ｏｓｂｏｒｎｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．４，１２９３（１９８４）］に見いだされており、比較的配向性および位置非依存性である。多くのエンハンサー配列は、現在は、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）由来で公知である。しかし、代表的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後ろ側におけるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側におけるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエレメントを増強することにおいてはＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７，１７−１８（１９８２）も参照のこと。エンハンサーは、ＴＩＥリガンドＤＮＡの５’または３’の位置でベクターにスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。
【０１４７】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、ＴＩＥリガンドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。
【０１４８】
上記の成分、所望のコード配列および制御配列の１つ以上を含む適切なベクターの構築は、標準的ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生成することが所望される形態に再ライゲートされる。
【０１４９】
構築したプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のために、ライゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からのプラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、および／またはＭｅｓｓｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９，３０９（１９８１）の方法によってか、またはＭａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５，４９９（１９８０）の方法によって配列決定される。
【０１５０】
ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞に効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコードされる高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性の系は、クローンＤＮＡによってコードされるポリペプチドの便利な陽性同定、ならびに所望の生物学的または生理学的特性についてのこのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、ＴＩＥリガンドのアナログおよび改変体を同定する目的のために、本発明で特に有用である。
【０１５１】
組換え脊椎動物細胞培養物におけるＴＩＥポリペプチドの合成への適合に適切な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｔｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９３，６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１，４０−４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら；ＥＰ  １１７，０６０およびＥＰ  １１７，０５８に記載される。ＴＩＥリガンドポリペプチドの哺乳動物細胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ  ３０７，２４７）、その他に、ｓｐ６転写開始部位、次いでＸｈｏ／ＮｏｔＩＩ  ｃＤＮＡクローニング部位の前にＳｆｉＩ制限酵素部位を有するｐＲＫ５Ｄ、およびＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体のｐＲＫ５Ｂのような、ｐＲＫ５の誘導体である；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，１２７８−１２８０（１９９１）を参照のこと。
【０１５２】
（ｖｉｉ）ベクターの構築および分析
１つ以上の上記の成分を含む適切なベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、切断され、適合させられ、そして必要とされるプラスミドを生成することが所望される形態に再ライゲートされる。
【０１５３】
構築したプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析のために、ライゲーション混合物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）を形質転換するために使用され、そして成功した形質転換体は、適切であるアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からのプラスミドは、調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、および／またはＭｅｓｓｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９，３０９（１９８１）の方法によってか、またはＭａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５，４９９（１９８０）の方法によって配列決定される。
【０１５４】
（ｖｉｉｉ）一過性発現ベクター
ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現を提供する発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一般に、一過性発現は、宿主細胞で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含み、そのため、宿主細胞は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に、発現ベクターによってコードされる高いレベルの所望のポリペプチドを合成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出，１６．１７−１６．２２頁。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、所望の生物学的特性または生理学的特性についてのこのようなポリペプチドの便利なポジティブスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、必要な生物学的活性を有する天然のＴＩＥリガンドホモログのアナログおよび改変体を同定する目的のために、本発明で特に有用である。
【０１５５】
（ｉｘ）適切な例示的脊椎動物細胞ベクター
組換え脊椎動物細胞培養物におけるＴＩＥリガンド（天然のタンパク質の機能的誘導体を含む）の合成への適合に適切な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９３，６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１，４０−４６（１９７９）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら；ＥＰ  １１７，０６０およびＥＰ  １１７，０５８に記載される。ＴＩＥリガンドの哺乳動物細胞培養物発現に特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ  ３０７，２４７）またはｐＳＶ１６Ｂ（ＰＣＴ公開公報第ＷＯ  ９１／０８２９１号）である。
【０１５６】
本発明のベクターをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはバチルス属が挙げられる。好ましいクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種またはＳｅｒｒａｔｉａ  Ｍａｒｃｅｓａｎｓのような他のグラム陰性またはグラム陽性原核生物が適切である。
【０１５７】
原核生物の他に、糸状真菌または酵母のような真核生物微生物は、本発明のベクターに適切な宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般のパン酵母は、下等真核生物宿主微生物のうちで最も一般に使用される。しかし、多くの他の属、種、および株は一般に利用可能であり、そして本発明で有用であり、例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ［ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０，１４０（１９８１）］、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ［Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３７（１９８３）］；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ［Ｃａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６，５２５９−５２６３（１９７９）］；およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ［Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２，２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ  ２６，２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１，１４７０−１４７４（１９８４）］およびＡ．ｎｉｇｅｒ［ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．４，４７５−４７９（１９８５）］のようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主である。
【０１５８】
適切な宿主細胞はまた、多細胞生物に由来し得る。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を行い得る。原則として、脊椎動物または無脊椎動物のいずれかからの、任意の高等真核生物培養物は作動可能であるが、ヒトのような哺乳動物からの細胞が好ましい。無脊椎動物の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および改変体およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ宿主細胞のような宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，４７−５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら、（編）  第８巻（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６），２７７−２７９頁；およびＭａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５，５９２−５９４（１９８５）を参照のこと。種々のこのようなウイルス株は、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体は、公に利用可能であり、そしてこのようなウイルスは、本発明による本発明のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。
【０１５９】
一般に、植物細胞は、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの特定の株（ＴＩＥリガンドＤＮＡを含むように既に操作されている）とのインキュベーションによってトランスフェクトされる。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの植物細胞培養物のインキュベーション中、ＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡは、トランスフェクトされるように植物細胞宿主に移入され、そして適切な条件下で、ＴＩＥリガンドＤＮＡを発現する。さらに、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と適合可能な調節およびシグナル配列は、利用可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１，５６１（１９８２）。さらに、Ｔ−ＤＮＡ  ７８０遺伝子の上流領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織において植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増加し得る。１９８９年６月２１日に公開されたＥＰ  ３２１，１９６を参照のこと。
【０１６０】
しかし、脊椎動物細胞が最も興味深く、そして培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の増殖はそれ自体周知である。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）を参照のこと。有用な哺乳宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓細胞株［２９３細胞または、懸濁培養物中の増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６，５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞９ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７，４２１６（１９８０）］；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３，２４３−２５１（１９８０）］；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部ガン腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞［Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３，４４０６８（１９８２）］；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝ガン細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎臓２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【０１６１】
本発明の目的に特に好ましい宿主細胞は、本発明のＴＩＥリガンドホモログを産生する脊椎動物細胞である。
【０１６２】
宿主細胞は、トランスフェクトされ、そして好ましくは上記の発現またはクローニングベクターで形質転換され、そしてプロモーターを誘導するかまたは増幅した遺伝子を含む形質転換体を選択するために適切であるように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０１６３】
本発明のＴＩＥリガンドホモログを産生するために使用される原核生物細胞は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、（前出）に記載のように適切な培地中で培養される。
【０１６４】
哺乳動物細胞は、種々の培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞を培養するために適切である。さらに、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８，４４（１９７９）；ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２，２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；または同第４，５６０，６５５号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５、または米国特許再発行３０，９８５に記載の培地のいずれかが、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれかは、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンTM薬物）、微量元素（μモル範囲での最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源が必要な場合に補充され得る。任意の他の必要な補充物はまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、適切には、場合によっては、クローニングまたは発現のために選択される宿主とともにこれまで使用された条件であり、そして当業者には明らかである。
【０１６５】
本開示でいわれる宿主細胞は、インビトロ細胞培養物中の細胞ならびに宿主動物または植物内にある細胞を含む。
【０１６６】
本発明のＴＩＥリガンドホモログが、相同組換えによって、または特定のＴＩＥリガンドをコードするＤＮＡを既に含む細胞に導入された制御エレメントを利用する組換え産生方法で、産生され得ることが、さらに想到される。
【０１６７】
遺伝子増幅および／または発現は、例えば、本発明で提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを使用して便利なサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７，５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、試料中で直接的に測定され得る。種々の標識が用いられ得、最も一般には、放射性同位体、特に32Ｐである。しかし、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン改変化ヌクレオチドを使用するような、他の技術も用いられ得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するための部位として作用し、これは放射性同位元素、蛍光体、酵素などのような広範な標識で標識され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特異的二重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。抗体は、次に、標識され得、そしてアッセイは、二重鎖が表面に結合される場合に行われ得、そのため表面上での二重鎖の形成の際に、その二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。
【０１６８】
あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するための、組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養物または体液のアッセイのような、免疫学的方法によって測定され得る。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料は、代表的には、脱水および固定、次いで遺伝子産物に特異的な標識された抗体との結合反応によって調製され、ここで、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識などのような標識は、通常、可視で検出可能である。本発明での使用に適切な特に感度の高い染色技術は、Ｈｓｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．７５，７３４−７３８（１９８０）に記載される。
【０１６９】
試料液体の免疫組織化学的染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の動物で調製され得る。都合よく、その抗体は、本発明の天然のＴＩＥリガンドポリペプチドに対して、または以下にさらに記載されるような本発明で提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、調製され得る。
【０１７０】
ＴＩＥリガンドホモログは、封入体の形態で宿主細胞中で産生され得るか、あるいはペリプラズム空間または培養培地中に分泌され得、そして、代表的には、宿主細胞溶解物から回収される。組換えリガンドホモログは、安定なタンパク質のその後の形成を考慮して、任意の技術によって精製され得る。
【０１７１】
ＴＩＥリガンドホモログがヒト起源の細胞以外の組換え細胞で発現される場合、ヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかし、リガンドについて実質的に均質である調製物を得るために組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＴＩＥリガンドホモログを精製することが必要である。第１の工程としては、培養培地または溶解物を遠心分離して、粒子状の細胞破砕片を除去する。次いで、膜および可溶性タンパク質画分を分離する。次いで、ＴＩＥリガンドホモログは、可溶性タンパク質画分から精製され得る。以下の手順は、適切な精製手順の例である：イムノアフィニティーまたはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過；およびＩｇＧのような夾雑物を除去するためのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム。
【０１７２】
残基が欠失、挿入、および／または置換されているＴＩＥリガンドホモログの機能的誘導体は、変更によって生じた特性の任意の実質的変化を考慮して、天然のリガンドと同じ様式で回収される。例えば、ＴＩＥリガンドホモログと、もう１つのタンパク質またはポリペプチド、例えば、細菌またはウイルス抗原との融合物は、精製を容易にし；抗原に対する抗体を含むイムノアフィニティーカラムは、融合物を吸着するために使用され得る。ウサギポリクローナル抗ＴＩＥリガンドホモログカラムのようなイムノアフィニティーカラムは、少なくとも１つの残っている免疫エピトープに結合することによってＴＩＥリガンドホモログ改変体を吸着するために用いられ得る。フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼインヒビターはまた、精製中のタンパク質分解を阻害するために有用であり得、そして抗生物質は、偶然の夾雑物の増殖を防ぐために含まれ得る。本発明のＴＩＥリガンドホモログは、ＴＩＥレセプター、例えば、ＴＩＥ−２に結合する能力に基づいて、アフィニティークロマトグラフィーによって便利に精製される。
【０１７３】
当業者は、天然のＴＩＥリガンドホモログに適切な精製方法が、改変を必要とし得ること、そしてこのことが組換え細胞培養物中での発現の際に天然のＴＩＥリガンドホモログまたはその改変体の特徴の変化を説明することを理解する。
【０１７４】
（Ｄ．ＴＩＥリガンドホモログ、核酸分子、および抗体の使用）
本発明のＴＩＥリガンドホモログは、細胞培養物においてＴＩＥレセプターを発現する細胞の生存および／または増殖および／または分化を促進することに有用であることが予測される。
【０１７５】
ＴＩＥリガンドホモログは、天然のＴＩＥレセプターを発現する細胞を同定するためにさらに使用され得る。この目的ために、検出可能に標識されたリガンドを、そのレセプター（ＴＩＥレセプター）への結合を可能にする条件下で標的細胞と接触させ、そして結合はモニターされる。
【０１７６】
本発明のＴＩＥリガンドホモログはまた、例えば、本発明のＴＩＥリガンドホモログを発現する細胞をテスト分子に曝露すること、そして直接的検出によってまたは二次的生物学的効果に基づいてのいずれかで、テスト分子のＴＩＥレセプターへの特異的結合を検出することによって、ＴＩＥリガンドホモログの生物学的活性を提示する分子を同定するために使用され得る。このアプローチは、ＴＩＥリガンドファミリーの新しいメンバーを同定するために、あるいはペプチドまたは非ペプチド小分子ライブラリーをスクリーニングするために特に適切である。
【０１７７】
本明細書中で開示されたＴＩＥホモログリガンドはまた、骨発生、成熟、もしくは成長に、または筋肉増殖または発育に重要な役割を果たし、および／あるいは血管新生を促進または阻害する、天然のＴＩＥレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するように設計されたスクリーニングアッセイで有用である。例えば、ＴＩＥレセプターのアンタゴニストは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー技術（ＢＩＡｃｏｒｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｍｉｄｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用することによって；または本発明の生物学的に活性なＴＩＥリガンドホモログによって引き起こされる生物学的応答をブロックする能力をモニターすることによって、測定されるように、天然のＴＩＥレセプターへの本発明のＴＩＥリガンドホモログの結合をブロックする能力に基づいて同定され得る。モニターされ得る生物学的応答には、例えば、ＴＩＥレセプターまたはＴＩＥシグナル伝達経路の下流の成分のリン酸化、あるいは、ＴＩＥレセプターを発現する細胞の生存、増殖、または分化が挙げられる。ＴＩＥレセプターを発現するようにか、またはＴＩＥレセプターおよび本発明のＴＩＥリガンドホモログを同時発現するように操作された、ＴＩＥレセプターを正常に発現しない細胞を利用する細胞ベースのアッセイは、使用に特に便利である。
【０１７８】
特定の実施態様では、天然のＴＩＥレセプターの小分子アゴニストおよびアンタゴニストは、ＴＩＥリガンド／ＴＩＥレセプター相互作用を妨害する能力に基づいて、同定され得る。ＴＩＥレセプターへのテスト分子の特異的結合を測定するために多くの方法があり、これには、ＴＩＥレセプターを発現するインタクトな細胞の表面に結合したか、細胞溶解物中のＴＩＥレセプターに架橋したか、またはインビトロでＴＩＥレセプターに結合した、テスト分子の量を検出または測定することが含まれるがこれに限定されない。
【０１７９】
検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログには、例えば、放射活性物質、例えば、125Ｉ、蛍光物質、酵素活性を有する物質（好ましくは、比色検出に適切な）、酵素のための基質（好ましくは、比色検出に適切な）、または（検出可能に標識された）抗体分子によって認識され得る物質に共有または非共有結合したＴＩＥリガンドホモログが挙げられる。
【０１８０】
本発明のアッセイは、１９９６年４月１８日に公開された、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９６／１１２６９に記載されるものと類似の方法で行われ得る。
【０１８１】
本発明のＴＩＥリガンドホモログはまた、イムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）の形態で必要に応じて使用されるＴＩＥレセプターを精製するために有用であり、ＴＩＥリガンドまたはそのＴＩＥレセプター結合部分は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域に融合される。
【０１８２】
さらに、本発明の新規のＴＩＥリガンドホモログは、新血管形成を促進するために使用され得、そして腫瘍増殖を阻害するために有用であり得る。
【０１８３】
更なる潜在的な治療用途としては、筋肉および骨発達、成熟、または増殖の調整が挙げられる。
【０１８４】
本発明の核酸分子は、細胞または組織切片においてＴＩＥリガンドホモログの発現を検出することに有用である。細胞または組織切片は、ハイブリダイズ条件下で本発明のＴＩＥリガンドをコードする検出可能に標識された核酸分子と接触され得、そして核酸分子にハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を決定し、それによってＴＩＥリガンドの発現を検出する。
【０１８５】
本発明の抗体は、例えば、生物学的試料においてＴＩＥリガンドの量を測定するためにイムノアッセイで使用され得る。生物学的試料は、本発明のＴＩＥリガンドを特異的に結合する抗体または抗体混合物と接触され、そしてテスト試料に存在するリガンドと形成された複合体の量が測定される。
【０１８６】
本発明のＴＩＥリガンドホモログに対する抗体は、さらに、対応するＴＩＥレセプターを発現する細胞に対する、細胞傷害性分子、例えば、放射性同位元素またはトキシン、あるいは治療薬剤の送達に有用であり得る。治療薬剤は、例えば、ＴＩＥ−２リガンドを含む他のＴＩＥリガンド、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバー、公知の抗腫瘍薬剤、および筋肉増殖または発育、あるいは骨発生、成熟、または増殖に関連することが公知の薬剤であり得る。
【０１８７】
抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体はまた、ＴＩＥ（例えば、ＴＩＥ−２）レセプターの発現に関連する疾患状態を検出するために、診断薬剤として適切である。したがって、検出可能に標識されたＴＩＥリガンドホモログおよびＴＩＥレセプターの抗体アゴニストは、血管新生の存在をイメージングするために使用され得る。
【０１８８】
抗ＴＩＥリガンドホモログ抗体特異的抗ＮＬ６抗体もまた、抗炎症性薬剤としての有用性を見出す。
【０１８９】
治療用途については、本発明のＴＩＥリガンドホモログまたは抗ＴＩＥリガンド抗体は、全身または局所適用に適切な、薬理学的に受容可能なビヒクルとの混合物中に活性成分を含む治療組成物として処方される。本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥した処方物または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する活性成分を、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤と混合することによって、貯蔵のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９０】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合化、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕らえられ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｅｉｎｃｅｓ，前出に開示される。
【０１９１】
インビボ投与に使用されるべき処方物は、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に、滅菌濾過メンブランを通す濾過によって容易に行われる。
【０１９２】
本発明の治療組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。
【０１９３】
投与の経路は、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路による注射または注入、局所投与、または持続放出システムによる、公知の方法に従う。
【０１９４】
持続放出調製物の適切な例には、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルでの、半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許３，７７３，９１９、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」２２（１）：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，「Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．」１５：１６７−２７７およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニル酢酸（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら，同上）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８Ａ）が挙げられる。持続放出組成物はまた、リポソームを含む。本発明の範囲内の分子を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：ＤＥ  ３，２１８，１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９８５，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ」８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇら，１９８０，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ」７７：４０３０−４０３４；ＥＰ  ５２３２２Ａ；ＥＰ  ３６６７６Ａ；ＥＰ  ８８０４６Ａ；ＥＰ  １４３９４９Ａ；ＥＰ  １４２６４１Ａ；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許４，４８５，０４５および４，５４４，５４５；およびＥＰ  １０２，３２４Ａ。もともと、リポソームは、脂質含量が約３０ｍｏｌ．％を越えるコレステロールである小さい（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、選択された割合は、最適なＮＴ−４治療に対して調節される。
【０１９５】
治療的に用いられるべき本発明の分子の有効量は、例えば、治療対象、投与経路、および患者の症状に依存する。したがって、投与量を滴定し、そして最適な治療効果を得るために必要とされる投与経路を改変することが、治療医師には必要である。代表的な１日の用量は、上記の要素に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。代表的には、臨床医は、必要とされる生物学的効果を提供する投与量に達するまで、本発明の分子を投与する。この治療の進捗は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
【０１９６】
この治療の到達点が腫瘍の予防または処置である場合、本発明における化合物は、他の治療と組み合わせられ得る。例えば、このような抗腫瘍剤で処置される患者は放射線療法もまた受け得る。あるいは、またはさらに、化学療法剤が患者に投与され得る。このような化学療法剤についての調製および投薬のスケジュールが、製造者の指導書に従って、または熟練した開業医により経験的に決定されたように使用され得る。このような化学療法についての調製および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ編、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）において記載される。化学療法剤は、抗腫瘍剤の投与に先行し得るかまたは続き得、またはそれらと共に同時に授与され得る。
【０１９７】
抗原に関連する他の腫瘍に対する抗体（例えば、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体）を投与することもまた所望され得る。あるいは、またはさらに、本明細書に開示される同じかまたは２つ以上の異なる抗原に結合する２つ以上の抗体が患者に同時投与され得る。時々、１つ以上のサイトカインを患者に投与することもまた有益であり得る。好ましい実施態様では、本発明の抗腫瘍化合物が、さらなる増殖阻害剤とともに同時投与される。
【０１９８】
疾患の予防または処置のために、例えば、本発明の抗体のような抗腫瘍剤の適切な用量は、上記で定義されるような処置されるべき疾患の型、疾患の重篤度および経過、薬剤が予防的な目的または治療的な目的のために投与されるか否か、先行治療、患者の臨床的経歴および薬剤への応答、ならびに主治医の裁量に依存する。この薬剤は、１回または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１９９】
本発明のさらなる詳細が、以下の制限されない実施例から明らかである。
【０２００】
（実施例１）
（ＦＬＳ１３９リガンドの同定）
ＦＬＳ１３９を、本明細書中に参考として援用される「説明書マニュアル：ｃＤＮＡ合成およびλクローニングのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｌａｍｂｄａ  Ｓｙｓｔｅｍ」、カタログ番号１９６４３−０１４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡに記載のプロトコルに従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ＵＳＡから得たヒト胎児肝臓ｍＲＮＡ、カタログ番号６４０１８−１から調製したｃＤＮＡライブラリーにおいて同定した。他に言及されない限り、全試薬もまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。全手順は、以下の工程に要約され得る：（１）第１鎖合成；（２）第２鎖合成；（３）アダプター添加；（４）酵素消化；（５）ｃＤＮＡのゲル単離；（６）ベクターへの連結；および（７）形質転換。
【０２０１】
（第１鎖合成：）
ＮｏｔＩプライマー−アダプター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．，２μｌ、０．５μｇ／μｌ）を滅菌１．５ｍｌ微量遠心管に添加し、これにポリＡ＋ｍＲＮＡ（７μｌ、５μｇ）を添加した。反応管を、７０℃まで、５分間、またはｍＲＮＡの２次構造を変性するのに十分な時間で加熱した。次いで、反応物を氷上で冷却し、そして５×第１鎖緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．，４μｌ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（２μｌ）、および１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．，１μｌ）を添加し、次いで、３７℃まで２分間加熱して、温度を平衡化させた。次いで、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．，５μｌ）を添加し、反応管を十分に混合し、そして３７℃で１時間インキュベートし、そして氷上に置くことにより終結させた。反応物の最終濃度は、以下の通りであった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；７５ｍＭ  ＫＣｌ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ  ＤＴＴ；５００μＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；５０μｇ／ｍｌ  ＮｏｔＩプライマー−アダプター；５μｇ（２５０μｇ／ｍｌ）ｍＲＮＡ；５０，０００Ｕ／ｍｌ  ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）逆転写酵素。
【０２０２】
（第２鎖合成：）
氷上の間に、以下の試薬を、第１鎖合成からの反応管に添加し、反応物を十分に混合し、そして温度を１６℃より上にさせないように注意して、１６℃で２時間反応させた：蒸留水（９３μｌ）；５×第２鎖緩衝液（３０μｌ）；ｄＮＴＰ混合物（３μｌ）；１０Ｕ／μｌ  Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）；１０Ｕ／μｌ  Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（４μｌ）；２Ｕ／μｌ  Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（１μｌ）。１０Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（２μｌ）を添加し、そして反応物を、もう５分間１６℃でインキュベートし続けた。反応物の最終濃度は、以下の通りであった：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１００ｍＭ  ＫＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；０．１５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋；２５０μＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；１．２ｍＭ  ＤＴＴ；６５Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡリガーゼ；２５０Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡポリメラーゼＩ；１３Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＨ。反応を、氷上に置くことおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（１０μｌ）の添加により止め、次いで、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、１５０μｌ）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして５Ｍ  ＮａＣｌ（１５μｌ）および無水エタノール（−２０℃、４００μｌ）に希釈し、そして１４，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を、得られたＤＮＡペレットから注意深く除去し、ペレットを、７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。上清を再度除去し、そしてペレットをスピードバックで乾燥した。
【０２０３】
（アダプター添加）
以下の試薬を、上記の第２鎖合成からのｃＤＮＡペレットに添加し、そして反応物を穏やかに混合し、そして１６℃で１６時間インキュベートした：蒸留水（２５μｌ）；５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（１０μｌ）；ＳａｌＩアダプター（１０μｌ）；Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（５μｌ）。反応物の最終組成は、以下であった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１ｍＭ  ＡＴＰ；５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００；１ｍＭ  ＤＴＴ；２００μｇ／ｍｌ  ＳａｌＩアダプター；１００Ｕ／ｍｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ。反応物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、５０μｌ）により抽出し、水相を取り出し、収集し、そして５Ｍ  ＮａＣｌ（８μｌ）および無水エタノール（−２０℃、２５０μｌ）に希釈した。次いで、これを１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を除去し、そしてペレットを０．５ｍｌの７０％エタノールに再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。続いて、上清を除去し、そして得られたペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして次の手順へ続けた。
【０２０４】
（酵素消化：）
以下の試薬を、前段落からのＳａｌＩアダプターを用いて調製したｃＤＮＡに添加し、そして混合物を３７℃で２時間インキュベートした：ＤＥＰＣ処理水（４１μｌ）；ＮｏｔＩ制限緩衝液（ＲＥＡＣＴ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．，５μｌ）、ＮｏｔＩ（４μｌ）。この反応物の最終組成は、以下であった：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１，２００Ｕ／ｍｌ  ＮｏｔＩ。
【０２０５】
（ｃＤＮＡのゲル単離：）
ｃＤＮＡを、５％アクリルアミドゲルでのアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画し、そして分子量マーカーとの比較により決定される、１ｋｂより長いいずれのフラグメントもゲルから切り出した。次いで、ｃＤＮＡを、ゲルから０．１×ＴＢＥ緩衝液（２００μｌ）に電気溶出させ、そしてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、２００μｌ）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして１４，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清をＤＮＡペレットから除去し、これを７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。上清を再度捨て、ペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして蒸留水（１５μｌ）に再懸濁した。
【０２０６】
（ｃＤＮＡのｐＲＫ５ベクターへの連結：）
以下の試薬を共に添加し、そして１６℃で１６時間インキュベートした：５×Ｔ４リガーゼ緩衝液（３μｌ）；ｐＲＫ５、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩで消化したベクター、０．５μｇ、１μｌ）；前段落から調製したｃＤＮＡ（５μｌ）、および蒸留水（６μｌ）。続いて、さらなる蒸留水（７０μｌ）および１０ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ（０．１μｌ）を添加し、そして全反応物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）により抽出した。水相を取り出し、収集し、そして５Ｍ  ＮａＣｌ（１０μｌ）および無水エタノール（−２０℃、２５０μｌ）に希釈した。次いで、これを、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、デカントし、そしてペレットを７０％エタノール（０．５ｍｌ）に再懸濁し、そして１４，０００×ｇで２分間、再度遠心分離した。次いで、ＤＮＡペレットをスピードバックにおいて乾燥し、そして後の手順における使用のために蒸留水（３μｌ）に溶出した。
【０２０７】
（ライブラリー連結物の細菌への形質転換：）
前で調製した連結ｃＤＮＡ／ｐＲＫ５ベクターＤＮＡを氷上で冷却し、これにエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ．，２０μｌ）を添加した。次いで、細菌ベクター混合物を、製造者の推奨どおりにエレクトロポレーションした。続いて、ＳＯＣ培地（１ｍｌ）を添加し、そして混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、形質転換体を、２０個の標準的な、１５０ｍｍ  アンピシリン含有ＬＢプレートに配置し、そして１６時間（３７℃）インキュベートして、コロニーを増殖させた。次いで、陽性コロニーをそぎ落とし、そしてＤＮＡを、標準的なＣｓＣｌ勾配プロトコルを用いて細菌ペレットから単離した。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、２．３．１。
【０２０８】
（ＦＬＳ１３９の同定）
ＦＬＳ１３９は、当該分野で既知の任意の標準的な方法（Ｋｌｅｉｎ  Ｒ．Ｄ．ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３，７１０８−７１１３、およびＪａｃｏｂｓ（１９９６年７月１６日に発行された米国特許第５，５６３，６３７号）により報告された方法を含む）により、ヒト胎児肝臓ライブラリーにおいて同定され得る。Ｋｌｅｉｎら、およびＪａｃｏｂｓによれば、新規の分泌および膜結合哺乳動物タンパク質をコードするｃＤＮＡは、それらの分泌リーダー配列を、リポーター系として酵母インベルターゼ遺伝子を用いて検出することにより同定される。この酵素インベルターゼは、スクロースからグルコースおよびフルクトースへの分解、ならびにラフィノースからスクロースおよびメリビオースへの分解を触媒する。分泌形態のインベルターゼは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によるスクロース資化に必要とされ、その結果、分泌型インベルターゼを生成し得ない酵母細胞は、唯一の炭素源およびエネルギー源としてスクロースを含む培地上で十分に増殖しない。Ｋｌｅｉｎ  Ｒ．Ｄ．、前出、およびＪａｃｏｂｓ、前出の両方は、哺乳動物シグナル配列が、機能的に、酵母インベルターゼのネイティブシグナル配列の代わりになるという既知の能力を利用する。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーを、非分泌型酵母インベルターゼをコードするＤＮＡに連結し、連結されたＤＮＡを単離し、そしてインベルターゼ遺伝子を含まない酵母細胞に形質転換する。哺乳動物シグナル配列に連結した非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子を含む組換え体を、炭素源としてスクロースのみまたはラフィノースのみを含む培地上で増殖するそれらの能力に基づいて同定する。次いで、同定された哺乳動物シグナル配列を使用して、第２の完全長ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、対応する分泌型タンパク質をコードする完全長クローンを単離する。例えば、クローニングは、発現クローニングによって、または当該分野で既知の任意のほかの技術によって行われ得る。
【０２０９】
ＦＬ１３９の同定のために使用されたプライマーは、以下の通りである：
ＯＬＩ１１４：ＣＣＡＣＧＴＴＧＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡ  配列番号１３
ＯＬＩ１１５：ＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧ  配列番号１４
ＯＬＩ１１６：ＴＣＧＴＣＴＡＡＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣ  配列番号１５。
【０２１０】
ＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列を図６（配列番号５）に示すが、一方、そのアミノ酸配列を図７（配列番号６）に示す。図１に例示するように、ＦＬＳ１３９は、２つの既知のヒトＴＩＥ−２レセプターリガンド（ｈ−ＴＩＥ２Ｌ１およびｈ−ＴＩＥ２Ｌ２）と高度の配列相同性を示す、フィブリノーゲン様ドメインを含む。従って、ＦＬＳ１３９は、ＴＩＥリガンドファミリーの新規メンバーとして同定された。
【０２１１】
ＦＬＳ１３９クローンは、ブタペスト条約により、１９９７年９月１８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に寄託し、そして寄託番号ＡＴＣＣ  ２０９２８１を与えられている。
【０２１２】
（実施例２）
（ＮＬ２およびＮＬ３の同定）
ＮＬ２およびＮＬ３は、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴを使用してＧｅｎＢａｎｋデーターベースをスクリーニングすることによった（Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０（１９９６））。ＮＬ２配列は、既知のＥＳＴ配列、Ｔ０８２２３、ＡＡ１２２０６１およびＭ６２２９０との相同性を示す。同様に、ＮＬ３は、既知のＥＳＴ配列、Ｔ５７２８０およびＴ５０７１９との相同性を示す。完全長配列として同定され、またはＴＩＥレセプターと結合したリガンドとして記載されている既知のＥＳＴ配列はない。
【０２１３】
これらの同定の後、ＮＬ２およびＮＬ３を製造者の指示に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）、カタログ＃６５２８−１から購入したｍＲＮＡから調製したヒト胎児肺ライブラリーからクローニングした。このライブラリーを以下の合成オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした：
ＮＬ２に関して：
ＮＬ２，５−１  ＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣ  配列番号７
ＮＬ２，３−１  ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧ  配列番号８
ＮＬ２，３−４  ＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡ  配列番号９
ＮＬ３に関して：
ＮＬ３，５−１  ＴＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧ  配列番号１０
ＮＬ３，３−１  ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣ  配列番号１１
ＮＬ３，３−２  ＴＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡ  配列番号１２。これらは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて見出されたＥＳＴに基づく。ｃＤＮＡ配列は、それらの全体での配列であった。
【０２１４】
ＮＬ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２（配列番号１）および図３（配列番号２）にそれぞれ示す。ＮＬ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４（配列番号３）および図５（配列番号４）にそれぞれ示す。
【０２１５】
ＮＬ−２のクローン（ＮＬ−２−ＤＮＡ２２７８０−１０７８）をブダペスト条約により、１９９７年９月１８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２に寄託し、そして寄託番号ＡＴＣＣ  ２０９２８４を与えられている。
【０２１６】
ＮＬ３のクローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２）に、１９９７年９月１８日に、ブタペスト条約の下に寄託し、そして受託番号ＡＴＣＣ２０９２８３を割り当てられた。
【０２１７】
（実施例３）
（ノーザンブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーション結果）
ヒト組織におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３  ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析によって試験した。ヒトｍＲＮＡブロットを全長ｃＤＮＡに基づいた32Ｐ−標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズした；このプローブをｃＤＮＡインサートを消化し、精製することによって生成した。ヒト胎児ＲＮＡブロットＭＴＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびヒト成体ＲＮＡブロットＭＴＮ−ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＤＮＡプローブとインキュベートした。ブロットをハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＰＥ；２Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  溶液；１００ｍｇ／ｍＬ  変性剪断サケ精子ＤＮＡ；５０％  ホルムアミド；２％  ＳＤＳ）中で４２℃、６０時間プローブとインキュベートした。このプローブは、数回、２×ＳＳＣ；０．０５％  ＳＤＳで１時間、室温で洗浄し、次いで５０℃で０．１×ＳＳＣ；０．１％  ＳＤＳにおいて３０分間洗浄した。このブロットは、ホスホルイメージャー分析（Ｆｕｊｉ）によって一晩の曝露後、発色させた。
【０２１８】
図８および９に示したように、ＮＬ２およびＮＬ３  ｍＲＮＡ転写物を検出した。
【０２１９】
ＮＬ３の組織発現パターンをまた、ＰＣＲ−生成した33Ｐ−標識化リボプローブを使用する最適化されたプロトコールを使用して、インサイチューハイブリダイゼーション（細胞ＲＮＡに対するハイブリダイゼーションを観察して）によって決定した。（ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ、Ｃｅｌｌ  Ｖｉｓｉｏｎ  １：１６９−１７６（１９９４））。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト胎児および成体組織を切り出し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）で１５分間、３７℃でタンパク質除去した。そして、さらにＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ（１９９４）によって記載されるようにインサイチューハイブリダイゼーションについてさらに処理した。[33−Ｐ]ＵＴＰ−標識化アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、そして５５℃で一晩、ハイブリダイズした。このスライドをＫｏｄａｋ  ＮＴＢ２  核トラックエマルジョンに浸漬し、４週間曝露した。
【０２２０】
（33Ｐ−リボプローブ合成）
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の33Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢＦ  １００２，ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピードバック乾燥した。乾燥33Ｐ−ＵＴＰを含む各々のチューブに、以下の成分を添加した：
２．０μｌ  ５×転写緩衝液
１．０μｌ  ＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌ  ＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ：各１０ｍＭ  ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＡＴＰ＋１０μｌ  Ｈ2Ｏ）
１．０μｌ  ＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌ  Ｒｎａｓｉｎ
１．０μｌ  ＤＮＡ鋳型（１μｇ）
１．０μｌ  Ｈ2Ｏ
１．０μｌ  ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物については通常、Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ）
チューブを３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１  ＤＮａｓｅを添加し、次いで、３７℃で１５分間インキュベートを行った。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を添加し、そして混合物をＤＥ８１紙の上にピペットで移した。残っている溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットにロードし、そしてプログラム１０（６分）を用いてスピンをかけた。濾過ユニットを、２番目の管の上に逆さまにし、そしてプログラム２（３分）を用いてスピンをかけた。最後の回収スピンの後、１００μｌのＴＥを添加した。１μｌの最終産物をＤＥ８１紙の上にピペットで移し、そして６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ  ＩＩでカウントした。
【０２２１】
プローブをＴＢＥ／尿素ゲルにおいて流した。１〜３μｌのプローブまたは５μｌのＲＮＡ  Ｍｒｋ  ＩＩＩを、３μｌのローディング緩衝液に添加した。９５℃ヒートブロック上で３分間の加熱後、ゲルを直ぐに氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシュし、サンプルをロードし、そして１８０〜２５０ボルトで４５分間流した。ゲルをサランラップでくるみ、そして−７０℃フリーザーで、１時間〜一晩、増感スクリーンと共にＸＡＲフィルムに曝露した。
【０２２２】
（33Ｐハイブリダイゼーション）
（凍結切片の前処理）  スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレー上に置き、そして室温で５分間解凍した。トレーを５５℃のインキュベーターに５分間入れて、曇りを減少させた。スライドを、換気装置（ｆｕｍｅ  ｈｏｏｄ）内で、氷上で、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、そして０．５×ＳＳＣで、室温で５分間洗浄した（２５ｍｌ  ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍｌ  ＳＱ  Ｈ2Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中で３７℃１０分のタンパク質除去（予め温めたＲＮａｓｅを含まないＲＮＡｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌストック）の後、切片を、０．５×ＳＳＣで、室温で１０分間洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中で各々２分間脱水した。
【０２２３】
（パラフィン包埋切片の前処理）  スライドを脱パラフィンし、ＳＱ  Ｈ2Ｏ中に置き、そして２×ＳＳＣで、室温で２回各時５分間リンスした。この切片を、ヒト胚−２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＲＮａｓｅを含まないＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ；３７℃、１５分）、またはホルマリン組織−８×プロテイナーゼＫ（ＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１００μｌ；３７℃、３０分）中でタンパク質除去した。その後の０．５×ＳＳＣでのリンスおよび脱水を、上記のように行った。
【０２２４】
（プレハイブリダイゼーション）  スライドを、Ｂｏｘ緩衝液（４×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド）に浸した濾紙が並んだプラスチックの箱の中に置いた。組織を、５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｇ  デキストラン硫酸＋６ｍｌ  ＳＱ  Ｈ2Ｏ）で覆い、ボルテックスし、そして蓋を緩めてマイクロ波で２分間加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０×ＳＳＣ、および９ｍｌのＳＱ  Ｈ2Ｏを添加し、組織を十分にボルテックスし、そして４２℃で１〜４時間インキュベートした。
【０２２５】
（ハイブリダイゼーション）  スライド１枚あたり１．０×１０6ｃｐｍのプローブおよび１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を、９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、そしてスライドあたり４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を添加した。ボルテックスした後、５０μｌの33Ｐ混合物を、スライド上の５０μｌのプレハイブリダイゼーションに添加した。スライドを、５５℃で一晩インキュベートした。
【０２２６】
（洗浄）  洗浄を、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温で、２×１０分で行い（４００ｍｌ  ２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌ  ０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）、それに続いてＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（ＲＮａｓｅ緩衝液２５０ｍｌ中、１０ｍｇ／ｍｌの５００μｌ＝２０μｇ／ｍｌ）。スライドを、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡを用いて室温、２×１０分で洗浄した。ストリンジェンシーな洗浄条件は以下の通りであった：５５℃で２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖf＝４Ｌ）。
【０２２７】
（オリゴ：）
Ｃ−１４１Ｆ−ＮＬ３ｐ１：４８マー  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  （配列番号１６）
Ｃ−１４１Ｇ−ＮＬ３ｐ２：４７マー  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  （配列番号１７）。
【０２２８】
検査された成体組織は以下のものである：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質、海馬、小脳、陰茎、目、膀胱、胃、胃ガン、結腸、結腸ガンおよび軟骨肉腫、アセトアミノフェン誘導肝臓損傷および肝硬変。検査された胎児組織は、以下のものである：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大脈管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、目、脊髄、体壁、骨盤および下肢。発現は、正常組織または胎児組織のいずれからも観察されなかった。発現は、急性（アセトアミノフェン誘導）および慢性肝臓障害（肝硬変および直腸結腸ガン転移に隣接した）において肝臓洞様毛細血管細胞（おそらく内皮の）で検出された。これらの結果は、ＮＬ３が肝臓の再生の調節において役割を果たし得ることを示す。
【０２２９】
ＮＬ１の発現をまた成体および胎児組織の同様の配列で検査したが、発現は、上に示した状態下では観察されなかった。
【０２３０】
（実施例４）
（Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現）
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける本発明のＴＩＥリガンドホモログの非グリコシル化形態の調製を例示する。ＮＬ２、ＮＬ３、またはＦＬＳ１３９リガンドをコードするＤＮＡ配列（それぞれ、配列番号１、３、および５）を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含むべきである。種々の発現ベクターが使用され得る。ベクターは、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子、複製起点、プロモーター、およびリボザイム結合部位をコードする。適切なベクターの例は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ  ２：９５（１９７７）を参照のこと）である。ベクターを制限酵素で消化し、そして脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターに連結する。
【０２３１】
次いで、連結混合物を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載の方法を用いて、選択したＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレート上で増殖するそれらの能力により同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析により確認し得る。
【０２３２】
選択したクローンを、液体培養培地（例えば、抗生物質を補充したｌＢブロス）中で一晩増殖し得る。続いて、一晩培養物を使用して、大規模（ｌａｔｅｒ  ｓｃａｌｅ）培養物に接種し得る。次いで、細胞を、所望の光学密度まで増殖させる。誘導物質（例えば、ＩＰＴＧ）を添加し得る。
【０２３３】
さらに数時間細胞を培養した後、細胞を遠心分離によって回収し得る。遠心分離によって得られた細胞ペレットを当該分野で既知の種々の薬剤を使用して可溶化し得、次いで可溶化タンパク質を金属キレートカラムを使用して、タンパク質のタイトな結合を可能にする条件下で精製し得る。
【０２３４】
実際、ＮＬ２を、次の手順を使用して、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態でＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。ＮＬ２をコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを使用して最初に増幅した。このプライマーは、選択した発現ベクターで制限酵素部位に対応する制限酵素部位、ならびに有効および信頼できる翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、ならびにエンテロキナーゼを用いたタンパク質分解除去のために提供する他の有用な配列を含んだ。次いで、ＰＣＲ増幅したポリ−Ｈｉｓタグ化配列を発現ベクターに連結した。これは、株５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ  ｇａｌＥ  ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ）に基づいたＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換するために使用した。形質転換体をまず、３〜５のＯ．Ｄ．６００に達するまで５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢ中で３０℃で振とうして増殖させた。次いで培養物をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．７１ｇクエン酸ナトリウム２水和物、１．０７ｇ  ＫＣｌ、５．３６ｇ  Ｄｉｆｃｏ  酵母抽出物、５．３６ｇの５００ｍｌ水中におけるＳｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｈｙｃａｓｅ  ＳＦ、ならびに１１０ｍＭ  ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび７ｍＭ  ＭｇＳＯ4を混合することにより調製した）中で５０〜１００倍希釈し、そして振とうして３０℃で約２０〜３０時間増殖させた。サンプルを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確かめた。そして大量培養物を遠心分離して細胞をペレットにした。細胞ペレットを精製およびリフォールディングまで凍結した。  ０．５〜１Ｌの発酵からのＥ．ｃｏｌｉペースト（６〜１０ｇ  ペレット）を１０容量（ｗ／ｖ）で７Ｍ  グアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中に再懸濁した。固形亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを加えてそれぞれ０．１Ｍおよび０．０２Ｍの最終濃度とし、そしてこの溶液を４℃で一晩攪拌した。この工程は、亜硫酸化（ｓｕｌｆｉｔｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によってブロックされた全システイン残基を有する変性されたタンパク質を生じる。この溶液を３０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ  超遠心機で４０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を３〜５容量の金属キレートカラムバッファー（６Ｍ  グアニジン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で希釈し、そして０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、透明化した。未定の透明化した抽出物を、金属キレート緩衝液で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムにロードした。このカラムを５０ｍＭイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｕｔｒｏｌ  ｇｒａｄｅ）を含むさらなる緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄した。このタンパク質を２５０ｍＭ  イミダゾールを含む緩衝液で溶出した。所望のタンパク質を含む画分をプールし、そして４℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、このアミノ酸配列に基づいた計算された吸光係数を使用して２８０ｎｍの吸光度によって推定した。
【０２３５】
このタンパク質を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．６、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２．５Ｍ  尿素、５ｍＭ  システイン、２０ｍＭ  グリシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる新鮮に調製されたリフォールディング緩衝液中にサンプルをゆっくりと希釈することによりリフォールドした。リフォールディング容量を最終タンパク質濃度が５０〜１００μｇ／ｍｌであるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２〜３６時間穏やかに攪拌した。リフォールディング反応は、０．４％の最終濃度にＴＦＡを添加することによって停止した。このタンパク質のさらなる精製の前に、この溶液を０．２２ミクロンのフィルターを通してろ過し、そしてアセトニトリルを２〜１０％の最終濃度まで添加した。リフォールドされたタンパク質を０．１％  ＴＦＡの流動緩衝液を使用して、１０〜８０％のアセトニトリルのグラジエントを用いた溶出でＰｏｒｏｓ  Ｒ１／Ｈ逆相カラムにおいてクロマトグラフした。Ａ２８０の吸光度を有するフラクションのアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、そして均質なリフォールドタンパク質を含むフラクションをプールした。一般に、ほとんどのタンパク質の適切にリフォールドされた種は、最も低濃度のアセトニトリルで溶出される。なぜならこれらの種は、最もコンパクトであり、これらの疎水性の内部は、逆相樹脂との相互作用から遮蔽されるからである。凝集した種は、より高いアセトニトリル濃度で通常、溶出される。所望の形態からタンパク質のミスフォールドされた形態を分離することに加えて、逆相工程はまた、サンプルからエンドトキシンを取り除く。
【０２３６】
所望のフォールドされたＮＬ２タンパク質を含む画分をプールし、この溶液に対する窒素の緩やかな流れを使用してアセトニトリルを除いた。タンパク質を透析によってまたは処方緩衝液で平衡化されたＧ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を使用したゲルろ過によって０．１４Ｍ  塩化ナトリウムおよび４％  マニトールを有する２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．８中に処方し、そして滅菌濾過した。
【０２３７】
（実施例５）
（哺乳動物細胞におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現）
本実施例は、哺乳動物細胞における組換え発現による、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３リガンドホモログのグリコシル化形態の調製を例示する。
【０２３８】
ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ  ３０７，２４７を参照のこと）を、発現ベクターとして使用する。必要に応じて、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３  ＤＮＡを、連結方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載）を用いて、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３  ＤＮＡの挿入を可能にする選択した制限酵素で、ｐＲＫ５に連結する。得られたベクターを、それぞれ、ｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、−ＮＬ２およびＮＬ３と呼ぶ。
【０２３９】
１つの実施態様において、選択した宿主細胞は２９３細胞であり得る。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）を、培地（例えば、ウシ胎仔血清、必要に応じて栄養成分および／または抗生物質を補充したＤＭＥＭ）中で組織培養プレートにおいてコンフルエンスまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、−ＮＬ２またはＮＬ３  ＤＮＡを、約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ，３１：５４３（１９８２））と混合し、そして５００μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ  ＣａＣｌ2に溶解する。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＮａＰＯ4を滴下し、そして沈殿物を、２５℃で１０分間形成させる。沈殿物を懸濁し、そして２９３細胞に添加し、そして３７℃で約４時間放置する。培養培地を吸引し、そしてＰＢＳ中２０％のグリセロール２ｍｌを３０秒間添加する。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、そして細胞を約５日間インキュベートする。
【０２４０】
トランスフェクションの約２４時間後、培養培地を除去し、そして培養培地（単独）、または２００μＣｉ／ｍｌ、35Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌ、35Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換する。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を収集し、スピンフィルター上で濃縮し、そして１５％ＳＤＳゲル上にロードする。処理したゲルを乾燥し、そして選択した期間、フィルムに暴露して、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ポリペプチドの存在を明らかにし得る。トランスフェクト細胞を含む培養物は、さらなるインキュベーション（無血清培地中で）を受け得、そして培地を、選択されたバイオアッセイで試験する。
【０２４１】
代替の技術において、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２：７５７５（１９８１）により記載されたデキストラン硫酸法を用いて、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、２９３細胞に一過的に導入し得る。２９３細胞を、スピナーフラスコ中で最大密度まで増殖し、そして７００μｇのｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３  ＤＮＡを添加する。細胞を、最初に、遠心分離によりスピナーフラスコから濃縮し、そしてＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を、２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、そして組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン、および０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再導入する。約４日後、馴化培地を遠心分離し、そして濾過して細胞および破片を除去する。次いで、発現ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を含むサンプルを濃縮し、そして任意の選択した方法（例えば、透析および／またはカラムクロマトグラフィー）により精製し得る。
【０２４２】
別の実施態様においては、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３は、ＣＨＯ細胞において発現され得る。ｐＲＫ５−ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、既知の試薬（例えば、ＣａＰＯ4またはＤＥＡＥ−デキストラン）を用いて、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし得る。上記のように、細胞培養物をインキュベートし、そして培地を、培養培地（単独）または放射性標識（例えば、35Ｓ−メチオニン）を含む培養培地で置換し得る。ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３ポリペプチドの存在を決定した後、培養培地を無血清培地で置換し得る。好ましくは、培養物を約６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を含む培地を濃縮し、そして任意の選択した方法により精製し得る。
【０２４３】
エピトープタグ化ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３もまた、宿主ＣＨＯ細胞において発現され得る。ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングし得る。サブクローン挿入物は、バキュロウイルス発現ベクターに、選択したエピトープタグ（例えば、ポリ−ｈｉｓタグ）とインフレームで融合するようにＰＣＲを受け得る。次いで、ポリ−ｈｉｓタグ化ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３挿入物を、安定クローンの選択のための選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）を含むＳＶ４０駆動ベクターにサブクローニングし得る。最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ４０駆動ベクターで（上記のように）トランスフェクトし得る。標識を上記のように行って、発現を確かめ得る。次いで、発現ポリ−Ｈｉｓタグ化ＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を含む培養培地を濃縮し、そして任意の選択した方法（例えば、Ｎｉ2+キレートアフィニティークロマトグラフィー）により精製し得る。
【０２４４】
グルコシル化形態のＮＬ２、ＮＬ３およびＦＬＳ１３９（ＮＬ６）を実際、ポリＨｉｓタグ化された形態でＣＨＯ細胞中で発現させた。ＰＣＲ増幅の後、ＮＬ２、ＮＬ３またはＮＬ６ＤＮＡをＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ  ３．１６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）に記載されたような標準の技術を使用してＣＨＯ発現ベクター中でサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターを目的のＤＮＡの５’および３’に適合性制限酵素部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトリングを可能にするように構築する。ＣＨＯ細胞におけるＮＬ２、ＮＬ３またはＮＬ６の発現のために使用されるベクターは、Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９（１９９６））に記載されている通りであり、そして目的のｃＤＮＡおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用する。ＤＨＦＲ発現はトランスフェクション後のプラスミドの安定な維持のための選択を可能とする。
【０２４５】
１２μｇのＮＬ２、ＮＬ３またはＮＬ６をコードするプラスミドＤＮＡを市販のトランスフェクション試薬、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）またはＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して約１０００万のＣＨＯ細胞に導入した。この細胞は増殖され、そしてＬｕｃａｓら、前出で記載された。約３×１０-7の細胞を下記のようにさらなる増殖および生成のためにアンプル中に凍結した。
【０２４６】
ＮＬ２、ＮＬ３またはＮＬ６プラスミドＤＮＡを含むアンプルを、水浴に入れることにより解凍し、そしてボルテックスにより混合した。内容物を、１０ｍＬの培地を含む遠心管にピペットで移し、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引し、そして細胞を、１０ｍＬの選択培地（５％  ０．２μｍダイアフィルトレーションしたウシ胎仔血清を含む０．２μｍ濾過ＰＳ２０）に再懸濁した。次いで、細胞を、９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーにアリコートした。１〜２日後、細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、そして３７℃でインキュベートした。さらに２〜３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、および２０００ｍＬスピナーに３×１０5個細胞／ｍＬを接種した。培地を、遠心分離および生成培地中への再懸濁により新鮮な培地と交換した。任意の適切なＣＨＯ培地（例えば、１９９２年６月１６日に発行された、米国特許第５，１２２，４６９号に記載の培地）を、使用し得る。３Ｌ生成スピナーに、１．２×１０6個細胞／ｍＬで接種する。０日目に、細胞数およびｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプリングし、そして濾過空気の散布を開始した。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に変え、そして３０ｍＬの５００ｇ／Ｌ−グルコースおよび０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサンエマルジョン、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６５  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｒａｄｅ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を添加した。生成の間、ｐＨを、約７．２で保持するために必要なように調節した。１０日後、または生存率が７０％未満に下がるまで、遠心分離により細胞培養物を採集し、そして０．２２μｍフィルターに通して濾過した。濾過物を、精製カラムへのローディングまで４℃で貯蔵した。
【０２４７】
このポリＨｉｓタグ化構築物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを、５ｍＭの濃度まで馴化培地に添加した。馴化培地を、流速４〜５ｍｌ／分、４℃で、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  イミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）緩衝液で平衡化した６ｍｌ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムにポンプで注入した。ローディング後、カラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、そしてタンパク質を、０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。続いて、精製タンパク質を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、および４％  マンニトールを含む貯蔵緩衝液（ｐＨ６．８）中に、２５ｍｌ  Ｇ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、そして−８０℃で貯蔵した。
【０２４８】
精製タンパク質の均質性をＳＤＳ  ＰＥＧにより確かめ、そしてＮ末端アミノ酸配列決定をエドマン分解により行った。
【０２４９】
（実施例６）
（酵母におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現）
まず、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の細胞内産生または分泌のために、酵母発現ベクターを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターから構築する。ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３をコードするＤＮＡ、選ばれたシグナルペプチドおよびプロモーターを、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の細胞内発現を指示するために、選ばれたプラスミド中の適当な制限酵素部位に挿入する。分泌に関しては、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の発現のための、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、およびリンカー配列（もし必要なら）と共に、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３をコードするＤＮＡを、選ばれたプラスミドにクローニングし得る。
【０２５０】
次いで、酵母株ＡＢ１１０のような酵母細胞を、上記で述べられたような発現プラスミドで形質転換し、選ばれた発酵培地中で培養し得る。形質転換した酵母の上清を、１０％トリクロロ酢酸を用いた沈澱およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離によって、次にゲルをクマシーブルー染料で染色することによって分析し得る。
【０２５１】
次に、組換えＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３を、遠心分離によって酵母細胞を発酵培地から除去すること、次に選ばれたカートリッジフィルターを用いてその培地を濃縮することによって、単離および精製し得る。ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を含む濃縮液を、選ばれたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて、さらに精製し得る。
【０２５２】
（実施例７）
（バキュロウイルストランスフェクトされた昆虫細胞におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２およびＮＬ３の発現）
次の方法は、バキュロウイルストランスフェクトされた昆虫細胞におけるＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の組換え発現について記載する。
【０２５３】
ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を、バキュロウイルス発現ベクターと、含まれるエピトープタグの上流に融合する。そのようなエピトープタグは、ポリヒスチジンタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような、市販のプラスミド由来のプラスミドを含む、種々のプラスミドを利用し得る。簡単には、ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３、またはＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の所望の部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列のような）を、５’および３’領域に相補的なプライマーを用いてＰＣＲで増幅する。５’プライマーを隣接する（選ばれた）制限酵素部位に組み込むことができる。産生物を次にそれらの選ばれた制限酵素で消化して、発現ベクターにサブクローニングする。
【０２５４】
組換えバキュロウイルスを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて、上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を同時にトランスフェクトすることによって産生する。２８℃で４−５日間インキュベートした後、放出されたウイルスを回収してさらに増幅するために使用する。ウイルス感染およびタンパク質の発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）によって述べられたように、実施する。
【０２５５】
次に、発現したポリヒスチジンタグのついたＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を、例えばＮｉ2+キレートアフィニティークロマトグラフィーによって、次のように精製し得る。Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：１７５−１７９（１９９３）によって記載されるように、組換えウイルスが感染したＳｆ９細胞から抽出物を調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理緩衝液（２５ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）に再懸濁し、氷上で２０秒間、２回超音波処理する。超音波処理したものを遠心分離により透明にし、上清をローディング緩衝液（５０ｍＭリン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターで濾過する。Ｎｉ2+−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を床容積５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄して２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出液を１分あたり０．５ｍＬカラムにロードする。カラムをＡ280のベースラインになるまでローディング緩衝液で洗浄し、その時点から画分の回収を開始する。次に、非特異的に結合したタンパク質を溶出する２番目の洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）でカラムを洗浄する。再びＡ280のベースラインに達した後、２番目の洗浄緩衝液中、０から５００ｍＭまでのイミダゾールの勾配でカラムを展開する。１ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび、銀染色またはアルカリホスファターゼに結合したＮｉ2+−ＮＴＡを用いたウエスタンブロット（Ｑｉａｇｅｎ）によって分析する。溶出されたヒスチジン10タグのついたＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３を含む画分をプールし、ローディング緩衝液に対して透析する。
【０２５６】
あるいは、ＩｇＧタグ（またはＦｃタグ）のついたＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３の精製を、例えばプロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて行い得る。
【０２５７】
ＮＬ２またはＦＬＳ１３９（ＮＬ６）を、バキュロウイルスが感染したＨｉｇｈ５細胞においてポリヒスチジンタグのついた形態で発現させた。発現は実際には０．５Ｌの規模で実施したが、より大きな（例えば、８Ｌ）調製法に簡単に規模を拡大することができる。
【０２５８】
それぞれのコード配列をＰＣＲ増幅後、バキュロウイルス発現ベクター（ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓ．ｃ）にサブクローニングし、ベクターおよびＢａｃｕｌｏｇｏｌｄ（登録商標）バキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をＨｉｇｈ５細胞に、リポフェクチン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、同時にトランスフェクトした。ｐｂ．ＰＨ．Ｈｉｓは、市販のバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を修飾したものであり、ヒスチジン配列を含む改変されたポリリンカー領域を伴う。その細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＨｉｎｋ’ｓ  ＴＮＭ−ＦＨ培地中で増殖した。細胞を、２８℃で５日間インキュベートした。この上清を採取し、次に１０％ＦＢＳを補充したＨｉｎｋ’ｓ  ＴＮＭ−ＦＨ培地中のＳｆ９細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）約１０で感染させることにより、最初のウイルス増幅に使用した。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。この上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおけるＮＬ２およびＮＬ６構築物の発現を、１ｍｌの上清の、２５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）に対するバッチ結合によって決定し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でクマシーブルー染色によって既知の濃度の標準タンパク質と比較した。
【０２５９】
最初のウイルス増幅上清を、ＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＬＣ）中で増殖された、Ｈｉｇｈ５細胞のスピナー培養物（５００ｍｌ）への感染に、約０．１のＭＯＩで使用した。細胞を、２８℃で３日間インキュベートした。この上清を採取し、そして濾過した。必要に応じて、このスピナー培養物での発現が確認されるまで、バッチ結合とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を繰り返した。
【０２６０】
トランスフェクトされた細胞（０．５〜３Ｌ）からの馴化培地を、遠心分離によって採取して細胞を除いて、そして０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。ポリヒスチジンタグのついた構築物については、タンパク質構築物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを馴化培地に５ｍＭの濃度まで加えた。この馴化培地を、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに、４℃、流速４−５ｍｌ／分で注入した。ロード後、このカラムをさらなる平衡化緩衝液で洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールを含む平衡化緩衝液で溶出した。次いで、その高度に精製されたタンパク質を、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌおよび４％マンニトールを含む、ｐＨ６．８の保存緩衝液に、２５ｍｌのＧ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを用いて脱塩し、そして−８０℃で保存した。
【０２６１】
ＮＬ２およびＮＬ６タンパク質の均質性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）電気泳動およびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって実証した。
【０２６２】
（実施例８）
（ＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３に結合する抗体の調製）
この実施例はＦＬＳ１３９、ＮＬ２またはＮＬ３に特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製を説明する。
【０２６３】
モノクローナル抗体の産生技術は当該分野において公知であり、そして例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、前出において記載される。使用され得る免疫原は、本発明の精製されたリガンドホモログ、そのようなリガンドホモログを含む融合タンパク質、および細胞表面に組換えリガンドホモログを発現した細胞を含む。当業者は過度な実験をせずに免疫原を選択し得る。
【０２６４】
Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスを完全フロイントアジュバントに乳化した免疫原で免疫し、そして１〜１００μｇの量を皮下または腹腔内に注射する。あるいは、この免疫原を、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）に乳化し、そして動物の後足肉趾内に注射する。免疫されたマウスに、次に１０から１２日後に選んだアジュバントに乳化した追加の免疫原で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫注射で追加免疫もまたし得る。抗体を検出するＥＬＩＳＡアッセイを試験するために、血清サンプルを定期的にマウスから眼窩後方の採血によって採取し得る。
【０２６５】
適切な抗体力価を検出した後、抗体「陽性」の動物に、所定のリガンドを最終的に静脈内注射し得る。３日から４日後、そのマウスを屠殺し、そして脾臓細胞を回収する。次にこの脾臓細胞を、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ  １５９７より入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選ばれたマウスミエローマ細胞株と融合する（３５％ポリエチレングリコールを用いて）。この融合物は、ハイブリドーマ細胞を産生し、次にこれを、融合していない細胞、ミエローマハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプレートし得る。
【０２６６】
ハイブリドーマ細胞を、抗原に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。本明細書中のＴＩＥリガンドホモログに対する望ましいモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は当業者の技術的範囲内である。
【０２６７】
抗ＴＩＥリガンドホモログモノクローナル抗体を含む腹水を産生するために、陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し得る。あるいは、ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させ得る。腹水中で産生されたモノクローナル抗体の精製を、硫酸アンモニウム沈澱、次にゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成し得る。あるいは、抗体のプロテインＡまたはプロテインＧへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを使用し得る。
【０２６８】
（実施例９）
（ＶＥＧＦ刺激による内皮細胞増殖の阻害）
ウシ副腎皮質毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（初代培養から最大１２〜１４継代）を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、１００μＬあたり５００個の細胞／ウェルの密度で、３ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを追加した低グルコースＤＭＥＭ、１０％仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐｔおよびファンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）中にプレートした。コントロールを同じ方法でプレートしたが、いくつかはＶＥＧＦを含まなかった。ＮＬ８ポリペプチドの試験サンプルを１００μｌ容量で加えて、最終的な容積を２００μＬ容量とした。細胞を３７℃で６〜７日間インキュベートした。この培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。酸性ホスファターゼ反応混合物（１００μＬ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸）を加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、１０μＬの１Ｎ  ＮａＯＨを加えて反応を止めた。マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍの光学密度を測定した。コントロールは細胞なし、細胞単独、細胞＋ＦＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）、細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）＋ＴＧＦ−β（１ｎｇ／ｍｌ）、および細胞＋ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍＬ）＋ＬＩＦ（５ｎｇ／ｍＬ）であった（１ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−βはＶＥＧＦ刺激による細胞増殖を７０−９０％阻害することが知られている）。
【０２６９】
酸性ホスファターゼの活性をＯＤ４０５ｎｍで測定することによって決定する、ＶＥＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）刺激による細胞増殖の阻害の割合を計算することによって、（１）刺激なしの細胞と比較して、および（２）ＶＥＧＦ刺激活性の参照ＴＧＦ−β阻害と比較して、結果を評価した。阻害が３０％以上であれば、結果を陽性と判断する。以下の表１に示す結果は、ＮＬ５、およびおそらく関連ポリペプチドの、ガン治療および特に腫瘍脈管形成を阻害することにおける有用性の指標である。表１に示される数値（相対阻害）を、ＶＥＧＦ刺激増殖のパーセント阻害を、刺激無しの細胞に対する試験したＴＩＥリガンドホモログを計算すること、次いでこのパーセンテージをＶＥＧＦ刺激細胞増殖の７０〜９０％をブロックすることが公知である２ｎｇ／ｍｌでのＴＧＦ−βによって得られたパーセント阻害へと除することによって決定した。
【０２７０】
【表１】
0003668795.tif 000002
（実施例１０）
（内皮細胞のアポトーシス誘導）
ＮＬ２、ＮＬ３およびＮＬ６が内皮細胞にアポトーシスを誘導する能力を、９６ウェル形式で、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した０％血清培地中で、ヒト静脈性臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において試験した（ＨＵＶＥＣ細胞は容易にプレート表面から取り除かれるので、ウェル中のすべてのピペット操作は実施可能な限り穏やかに行わなければならない）。
【０２７１】
培地を吸引し、細胞を１回ＰＢＳで洗浄した。５ｍｌの１×トリプシンをＴ−１７５フラスコ中の細胞に加え、細胞がプレートから離れるまで（約５−１０分）静置した。５ｍｌの増殖培地を加えることにより、トリプシン処理を止めた。細胞を４℃、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離（ｓｐｉｎ）した。培地を吸引し、細胞を１０ｍｌの１０％血清補充培地（Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１×ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐに再懸濁した。
【０２７２】
この細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、ＲＰＮＱ１６０、滅菌、組織培養処理、個別包装）で、１０％血清（ＣＳＧ培養液、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で、総容積１００μｌ、ウェルあたり２×１０4個の細胞密度でプレートした。ＮＬ５およびＮＬ８ポリペプチドを１％、０．３３％、０．１１％の希釈で３組づつ加えた。細胞無しのウェルをブランクとして、細胞のみのウェルをネガティブコントロールとして使用した。ポジティブコントロールとして、５０μｌのスタウロスポリン３倍ストックを１：３に連続的に希釈したものを使用した。ＮＬ５ポリペプチドがアポトーシスを誘導する能力を、アポトーシスを検出するためにカルシウムおよびリン脂質結合タンパク質の１つであるアネキシンＶを用いて決定した。
【０２７３】
０．２ｍｌのアネキシンＶ−ビオチンストック溶液（１００μｇ／ｍｌ）を４．６ｍｌの２×Ｃａ2+結合緩衝液および２．５％ＢＳＡに希釈した（１：２５希釈）。５０μｌの希釈したアネキシンＶ−ビオチン溶液を各ウェルに加え（コントロールを除いて）、最終的な濃度を１．０μｇ／ｍｌとした。35Ｓ−ストレプトアビジンを直接加える前に、サンプルをアネキシン−ビオチンと共に１０−１５分間インキュベートした。35Ｓ−ストレプトアビジンを２×Ｃａ2+結合緩衝液、２．５％ＢＳＡで希釈し、全てのウェルに最終的な濃度が３×１０4ｃｐｍ／ウェルになるように加えた。プレートに封をし、１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して軌道振盪機（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）に２時間置いた。１４５０Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）で分析を行った。
【０２７４】
ＮＬ２、ＮＬ３、およびＮＬ６はこのアッセイで陽性であった。これらの結果は、この分子、および潜在的に関連する分子の、ガン治療における潜在的な有用性をさらに確認する。
【０２７５】
（実施例１１）
（内皮細胞におけるｃ−ｆｏｓの誘導）
増殖培地（５０％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＧＨＴ無し、低グルコース、および５０％ＤＭＥＭ、グリシン無し、ＮａＨＣＯ3有、１％グルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ）中のヒト静脈臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートに、１×１０4細胞／ウェルの細胞密度でプレートした。プレーティングの翌日、その細胞を、増殖培地を除去することおよびその細胞を１００μｌ／ウェルの試験サンプルおよびコントロール（陽性コントロール：増殖培地；陰性コントロール：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％（ｗ／ｖ）マンニトール、ｐＨ６．８）で処置することによって飢餓させた。その細胞を３０分間３７℃で５％ＣＯ2中でインキュベートした。そのサンプルを取り出し、そしてｂＤＮＡキットプロトコル（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ｃａｔ＃６００５−０３７）の第一部にしたがい、ここで、以下に列挙した各大文字で始まる試薬／緩衝液はそのキットから利用可能であった。
【０２７６】
手短には、その試験に必要なＴＭ  Ｌｙｓｉｓ  ＢｕｆｆｅｒおよびＰｒｏｂｅの量を、製造業者によって提供される情報に基づいて計算した。解凍したＰｒｏｂｅの適切な量をＴＭ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに添加した。Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを室温に暖めた。ｂＤＮＡストリップを金属ストリップホルダに設定し、そして１００μｌのＣａｐｔｕｒｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを、必要とされる各ｂＤＮＡウェルに添加し、次いで少なくとも３０分間インキュベートした。その細胞を有する試験プレートをインキュベーターから取り出し、そしてその培地を緩やかにそのバキュームマニホルドを用いて除去した。１００μｌのＰｒｏｂｅを伴うＬｙｓｉｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを、マイクロタイタープレートの各ウェルへ迅速にピペッティングした。次いで、このプレートを５５℃で１５分間インキュベートした。インキュベーターからの取り出しの際、そのプレートをマイクロタイターアダプターヘッドを伴うボルテックスミキサに置き、そして＃２設定で１分間ボルテックスした。８０μｌの溶解物を取り出し、そしてＣａｐｔｕｒｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを含むｂＤＮＡウェルへ添加し、そして上下にピペッティングして混合した。このプレートを５３℃で少なくとも１６時間インキュベートした。
【０２７７】
翌日、ｂＤＮＡキットプロトコルの第二部を行った。詳細には、Ｐｌａｔｅをインキュベーターから取り出し、そしてベンチにおいて１０分間冷却した。必要とされる追加の容量を、製造業者によって提供された情報に基づいて計算した。Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（２０ｆｍ／μｌ）のＡＬ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒへの１：１００希釈を行うことによって調製した。ハイブリダイゼーション混合物を、プレートから取り出し、そしてＷａｓｈ  Ａを用いて２回洗浄した。５０μｌのＡｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに添加し、そしてそのウェルを５３℃で３０分間インキュベートした。次いで、そのプレートをそのインキュベーターから取り出し、そして１０分間放冷した。Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、Ｌａｂｅｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（４０ｐモル／μｌ）のＡＬ  Ｈｙｒｂｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１：１００希釈を行うことによって調製した。１０分間の放冷期間の後、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅを除去し、そしてそのプレートをＷａｓｈ  Ａで２回洗浄した。５０μｌのＬａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  を各ウェルに添加し、そしてそのウェルを５３℃で１５分間インキュベートした。１０分間冷却した後、そのＳｕｂｓｔｒａｔｅを室温まで暖めた。アッセイに必要とされるＳｕｂｓｔｒａｔｅ１ｍｌあたり３μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加する際に、そのプレートを１０分間放冷し、Ｌａｂｅｌ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅを除去し、そしてそのプレートを２回Ｗａｓｈ  Ａで洗浄し、そしてＷａｓｈ  Ｄで３回洗浄した。５０μｌのＥｎｈａｎｃｅｒを伴うＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに添加した。そのプレートを３０分間３７℃でインキュベートし、そしてＲＬＵを適切なルミノメーターで読み取った。
【０２７８】
複製を平均し、そして変動係数を決定した。陰性コントロール（上記のＨＥＰＥＳ緩衝液）の値に対する増加倍数の活性の尺度を、化学発光単位（ＲＬＵ）により示した。陰性コントロールの値に対して少なくとも２倍の値を示したサンプルを陽性とみなした。
【０２７９】
【表２】
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（実施例１２）
（内皮細胞Ｃａ流入アッセイ）
Ｃａ流入は、特定のリガンドの、そのレセプターに対する結合の際の充分に記載された応答である。このＣａ流入アッセイにおいて陽性応答をもたらす試験化合物を、特定のレセプターに結合し、そしてヒト内皮細胞における生物学的シグナル伝達経路を活性化するといい得る。これは、最終的には、例えば、細胞分裂、細胞増殖の阻害、内皮細胞管形成、細胞移動、アポトーシスなどを導き得る。
【０２８０】
増殖培地（５０：５０グリシン無し、１％グルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１０％ＦＢＳ，１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ）中のヒト静脈臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、９６ウェルのＶｉｅｗＰｌａｔｅｓ−９６（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ＃６００５１８２）マイクロタイタープレートに、２×１０4細胞／ウェルでプレートした。この細胞を緩衝液（ＨＢＳＳ＋１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）で３回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌ放置した。ＮＬ６ポリペプチドの試験サンプルを、異なる９６ウェルプレートに、緩衝液中に５×濃縮で調製した。陽性コントロール：５０μＭイオノマイシン（５×）；陰性コントロール：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３２．細胞プレートおよびサンプルプレートを、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置上にかけた。ＦＬＩＰＲ装置は２５μｌの試験サンプルを細胞に添加し、および読み取りを、１分間にわたり１秒ごとに行い、次いで次の３分間にわたり３秒ごとに行った。
【０２８１】
曲線（Δ変化）の最大の上昇に対する基底線の蛍光変化を計算し、そしてその複製を平均した。蛍光が増加する速度を、モニターし、そして１０００を超えるΔ変化を有し、そして６０秒以内に上昇したそのサンプルのみを陽性とみなした。以下の表３には、結果が、陽性コントロールと比較して表現される。
【０２８２】
【表３】
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（実施例１３）
（モルモット皮膚生検評価）
３５０グラム以上の体重の無毛モルモットにケタミン（７５〜８０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で筋肉内で麻酔をかけた。ＮＬ６または馴化培地試験サンプルを、注射部位あたり１００μｌで背中に皮内注射した。動物１匹あたりおよそ１６〜２４の注射部位が存在した。１ｍｌのＥｖａｎｓ青色色素（１％生理学的緩衝化生理食塩水）を心臓内注射した。試験化合物に対する前炎症または皮膚血管透過性応答を、肉眼で、試験材料（ＮＬ６）の投与後１〜６時間で注射部位からもれる青色色素の直径を測定することによってスコア付けした。動物を投与後６時間で屠殺した。各皮膚部位を生検し、そしてホルマリンで固定した。皮膚を組織学的評価のために調製した。各部位を皮膚内への炎症細胞浸潤について評価した。可視の炎症細胞浸潤を有する部位を、陽性とスコア付けした。炎症細胞浸潤物は、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球性であり得る。ＮＬ６を、このアッセイにおいて、潜在的な前炎症物質と同定した。
【０２８３】
（実施例１４）
（内皮の管形成の刺激）
このアッセイは、以下のようにＤａｖｉｓおよびＣａｍａｒｉｌｌｏ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２４：３９−５１（１９９６）で述べられたアッセイまたは、その変形の１つに従う。
【０２８４】
プロトコル：ＨＵＶＥ細胞（継代回数が初代培養から８回未満）を６×１０5個の細胞／ｍｌの密度でＩ型ラットテイルコラーゲンと混合し、最終濃度は２．６ｍｇ／ｍｌ、そして９６ウェルプレート上にウェルあたり５０μｌをプレートした。ゲルを３７℃で１時間凝固させておいて、次いでウェルあたり５０μｌの１％ＦＢＳを追加したＭ１９９培養培地およびＮＬ６ポリペプチドサンプル（各１％、０．１％、０．０１％の希釈で）を、液胞が形成されている間それを染色する１μＭの６−ＦＡＭ−ＦＩＴＣ色素と共に加える。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で４８時間インキュベートし、３．７％ホルマリンを用いて室温で１０分間固定し、ＰＢＳで５回洗浄した。次にＲｈ−ファロイジンを用いて４℃で１晩染色し、次に４μＭのＤＡＰＩで核を染色した。
【０２８５】
（１．アポトーシスアッセイ）
このアッセイは、３次元マトリクス中で、外来性の増殖因子（ＶＥＧＦ、ＰＭＡなしのｂＦＧＦ）存在下で、細胞の生存を促進する因子を同定する。
【０２８６】
１以下の結果が陽性である。０＝アポトーシスなし、１＝２０％未満の細胞がアポトーシスをおこしている、２＝５０％未満の細胞がアポトーシスをおこしている、３＝５０％を超える細胞がアポトーシスをおこしている。この系でアポトーシスを刺激する物質は、アポトーシス因子と予想され、インヒビターはアポトーシスを防止または抑制することが予想れる。
【０２８７】
（２．液胞アッセイ）
このアッセイは、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、内皮の液胞形成および管腔形成を刺激する因子を同定する。
【０２８８】
２以上の結果が陽性である。１＝２０％未満の細胞に液胞が存在する、２＝２０−５０％の細胞に液胞が存在する、３＝５０％を超える細胞に液胞が存在する。このアッセイをピノサイトーシス、イオン輸送、透過性、および結合形成の刺激に関与する因子を同定するために設計する。
【０２８９】
（３．管形成アッセイ）
このアッセイは、３次元マトリクス中で内皮の管形成を刺激する因子を同定する。このアッセイは、３次元マトリクス中で外来性の増殖因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ）存在下で、内皮細胞の管様構造への分化を刺激する因子を同定する。
【０２９０】
２以上の結果が陽性である。１＝細胞は全て丸い、２＝細胞は細長くなっている、３＝細胞はいくらか結合した管を形成している、４＝細胞は複雑な管ネットワークを形成している。このアッセイはトラッキング、走化性、または内皮の形状変化の刺激に関与し得る因子を同定する。
【０２９１】
図１０はＨＵＶＥＣの管形成に対する、ポリヒスチジンに結合した１％希釈のＮＬ６ポリペプチド、および１％希釈の緩衝液コントロール（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．１４Ｍ  ＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ６．８）の効果を示している。ＩｇＧ融合物として試験した、もう１つの新規のＴＩＥリガンドホモログ（ＮＬ１）および２つの公知のＴＩＥリガンドであるＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２と比較した結果もまた図１０に示す。
【０２９２】
（材料の寄託）
前に言及したように、次の材料をアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
【０２９３】
【表４】
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これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）およびその下での規制の規定の下になされた。これは寄託の生存可能な培養物を寄託日から３０年間維持することを保証する。寄託物はブダペスト条約の条項の下で、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣ間の合意を条件として、ＡＴＣＣによって入手可能となり、これは、適切な米国特許が発行された時点、またはあらゆる米国または外国特許出願が公開された時点のどちらが先にきても、寄託物の培養物の子孫を、公衆が永続的に無制限に入手できることを保証する。そして、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに準ずる米国特許商標庁長官の規則（８８６ＯＧ６８３に特に言及している３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４を含む）によって、米国特許商標庁長官によってその権利があると決定されたものがその子孫を入手できることを保証する。
【０２９４】
本願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されている時に死滅または喪失または破壊された場合、通知に基づいて直ちにもう１つの同じものと交換することに同意した。寄託した材料の入手可能性は、あらゆる政府の権威のもとでその特許法に従って授与された権利に違反して本発明を実施する実施許諾とは解釈されるべきではない。
【０２９５】
本明細書は、当業者が発明を実施するのを可能にするのに十分であると判断される。寄託された実施態様は本発明の特定の局面の１つの例示として意図されており、機能的に等価なあらゆる構築物は本発明の範囲内であるので、本発明は寄託された構築物によって範囲が制限されるべきではない。本明細書中の材料の寄託は、明細書がその最良の形態を含む本発明のあらゆる局面の実施を可能にするのに不適当であるという承認を構成しない。また請求の範囲をそれが表す特定の例示に制限するように解釈されるべきではない。実際に、本明細書中に示され記述されたものに加えて、本発明の様々な変形が、前述の記載から当業者に明らかになり、添付される請求の範囲の範囲内に入る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、リガンドホモログＮＬ２、ＮＬ３およびＦＬＳ１３９の、ＴＩＥ２レセプターの２つの公知のリガンドホモログ（ｈ−ＴＩＥ２Ｌ１およびｈ−ＴＩＥ２Ｌ２）ならびに出願番号第０８／９３３，８２１号（１９９７年９月１９日出願）に開示される他のＴＩＥリガンドホモログとの関係の図示である。
【図２】  図２は、ＴＩＥリガンドＮＬ２のヌクレオチド配列である（配列番号１）（ＤＮＡ  ２２７８０）。
【図３】  図３は、ＴＩＥリガンドＮＬ２のアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図４】  図４は、ＴＩＥリガンドＮＬ３のヌクレオチド配列である（配列番号３）（ＤＮＡ  ３３４５７）。
【図５】  図５は、ＴＩＥリガンドＮＬ３のアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図６】  図６は、ＴＩＥリガンドＦＬＳ１３９のヌクレオチド配列である（配列番号５）（ＤＮＡ  １６４５１）。
【図７】  図７は、ＴＩＥリガンドＦＬＳ１３９のアミノ酸配列である（配列番号６）。
【図８】  図８は、種々の組織においてＴＩＥリガンドホモログＮＬ２およびＮＬ３のｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。
【図９】  図９は、種々の組織においてＴＩＥリガンドＮＬ２およびＮＬ３のｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。
【図１０】  図１０は、１％希釈でポリ−ｈｉｓに結合したＮＬ６ポリペプチドの、および１％希釈で緩衝液コントロール（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．１４Ｍ  ＮａＣｌ／４％マンニトール、ｐＨ  ６．８）の、ＨＵＶＥＣチューブ形成における効果を示す。ＩｇＧ融合体としてテストした、別の新規ＴＩＥリガンドホモログ（ＮＬ１）および２つの公知のＴＩＥリガンドＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２との比較結果もまた、図中で示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
0003668795.tif 000024
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
0003668795.tif 000028
【図８】
0003668795.tif 000029
【図９】
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【図１０】
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