(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を含有する試料を固相担体と接触させて標的核酸を固相担体上に固定化した後、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼと結合性を有する物質で標識した標的核酸と相補性を有する核酸の一部又は全部からなる核酸プローブで処理し、次いで、固相担体上にペルオキシダーゼ標識二本鎖核酸を形成させ、未反応物を洗浄等により除去してから、水素受容体の存在下に、下記一般式（１）
【化１】
0003652188.tif 000005
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は、前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。）
で表わされるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び下記一般式（２）
【化２】
0003652188.tif 000006
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされる N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又は該化学発光試薬に、下記一般式（３）
【化３】
0003652188.tif 000007
（上記一般式（３）において、Ｒは、炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは、１〜３の整数を表わす。）
で表わされるアミノアルコール化合物を添加してなる化学発光試薬を用いて化学発光反応を行い、該化学発光を測定することにより標的核酸の存在又は存在量を検出することを特徴とする核酸の検定方法。
【請求項２】
N,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用いて水素受容体の存在下に請求項１に記載の方法により核酸を検定する際に、発光促進剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする核酸の検定方法。
【請求項３】
前記N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類が、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１又は請求項２に記載の核酸の検定方法。
【請求項４】
前記 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、 N,N−ジメチルホルムアミド、 N,N−ジメチルアセトアミド及び N−メチル−２−ピロリドンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１ないし請求項３のいずれかの請求項に記載の核酸の検定方法。
【請求項５】
前記フェノール性化合物が、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールから選択される少なくとも１種の化合物である請求項２に記載の核酸の検定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペルオキシダーゼ標識核酸プローブを用いる特定化学発光系によるＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の高感度な検定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
分子生物学の急速な進歩により、医学、生物学の分野においては、近年、特定の塩基配列を有する核酸プローブを用いて特定の細菌類やウィルス等の存在を検出したり、遺伝子異常に起因する種々の疾患を診断したりする遺伝子診断の技術や種々の蛋白質をコードする遺伝子のクローニング及びその塩基配列の決定等が広く行われている。このような生化学的又は医学的な目的で検出又は単離が必要とされている標的核酸の検定方法においては、従来、核酸プローブを放射性アイソトープを用いて標識し、これを標的核酸とハイブリダイズさせた後、その放射能を測定することにより標的核酸を検出するアイソトープ法が一般的に行われている。しかしながら、アイソトープ法は安全性の面から特別な放射能漏れ防止設備を備えたアイソトープ実験室で実験を行わなければならないという問題点を有している。
【０００３】
このような背景から、近年、核酸の非放射性標識法が数多く開発されてきている。このような非放射性標識法としては、例えば、発色物質や蛍光物質を用いて核酸を検出する方法等が挙げられる。これらの方法は、核酸プローブを酵素標識して標的核酸とハイブリダイズさせた後、標識酵素の発色基質や蛍光基質と反応させてその発色や蛍光を検出して標的核酸を検定する方法である。
しかし、これらの非放射性標識法は安全性に関しては改善されているものの、核酸の検出感度に関してはアイソトープ法に対して十分に改善されているとは言いがたいのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑み、優れた検出感度を有し、かつ安全で簡易な操作で標的核酸を検定できる核酸の検定方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション等により固相担体上に形成されたペルオキシダーゼ標識二本鎖核酸に対して、ペルオキシダーゼ酵素の化学発光基質を作用させて標的核酸を検定する際に、化学発光基質としてN,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定アミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用いて、水素受容体として過酸化水素等を用い、そして、更に、発光促進剤として特定のフェノール系化合物を用いる発光系が、化学発光物質にルミノールを用いる発光系に比較して、より高感度にペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００６】
従って、本発明の第一は、
標的核酸を含有する試料を固相担体と接触させて標的核酸を固相担体上に固定化した後、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼと結合性を有する物質で標識した標的核酸の一部又は全部からなる核酸プローブで処理し、次いで、固相担体上にペルオキシダーゼ標識二本鎖核酸を形成させ、未反応物を洗浄等により除去してから、水素受容体の存在下に、下記一般式（１）
【０００７】
【化４】
0003652188.tif 000002
（上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は、前駆体ビスアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。）
で表わされるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び下記一般式（２）
【０００８】
【化５】
0003652188.tif 000003
（上記一般式（２）において、Ｒ1 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされる N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又は該化学発光試薬に、下記一般式（３）
【０００９】
【化６】
0003652188.tif 000004
（上記一般式（３）において、Ｒは、炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは、１〜３の整数を表わす。）
で表わされるアミノアルコール化合物を添加してなる化学発光試薬を用いて化学発光反応を行い、該化学発光を測定することにより標的核酸の存在又は存在量を検出することを特徴とする核酸の検定方法に関するものである。
【００１０】
また、本発明の第二は、
N,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする化学発光試薬又はN,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする化学発光試薬を用いて水素受容体の存在下に請求項１に記載の方法により核酸を検定する際に、発光促進剤としてフェノール性化合物を用いることを特徴とする核酸の検定方法に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の核酸の検定方法において使用される標的核酸を固定化する固相担体としては、核酸を物理的又は化学的に結合できる固体物質であればその材質、形状は任意であるが、例えば、イオン交換樹脂（ポリスチレン、フェノール樹脂、エポキシポリアミン等にイオン交換基を導入したもの）、イオン交換セルロース（セルロースにスルホン酸基、カルボキシル基、アミノ基等を導入したもの）、ゲル濾過クロマトグラフィー用充填剤（デキストラン、アリルデキストラン等を架橋化したもの、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニル、多孔性ガラス、ポリ酢酸ビニル、シリカゲル、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等）、逆相クロマトグラフィー用充填剤（アルキル鎖の化学結合したシリカゲル等）、ガラス粒子、ガラス粉末、セルロース、ポリスチレン、ラテックス粒子、ニトロセルロースメンブラン、ナイロンメンブラン、ガラスフィルター等、及びこれらに標的核酸に相補的な核酸を吸着、結合又は包括させたもの等を挙げることができる。
【００１２】
本発明の核酸の検定方法において使用される標的核酸を含有する試料は任意であるが、細胞、血液、生検組織及び毛根等の生体試料を緩衝液中などにおいて界面活性剤等の蛋白変性剤及びキレート剤等の核酸分解酵素阻害剤で処理するか、グアニジンイソチオシアネート等の蛋白変性・酵素阻害剤で処理し、必要に応じてプロテアーゼの添加や超音波処理によって細胞を破壊して核酸を細胞から分離した溶液等を用いるか、標的核酸をプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅させた溶液等を用いることも出来る。
【００１３】
本発明の核酸の検定方法に用いられるペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼと結合性を有する物質で標識した核酸プローブとしては、ペルオキシダーゼを結合試薬を介して直接に核酸に結合させた標識核酸プローブやビオチン標識核酸にアビジン化ペルオキシダーゼを反応させた核酸プローブ又はジゴキシゲニン等の抗原で標識した核酸にペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を反応させた核酸プローブ等が挙げられる。このように核酸にペルオキシダーゼや抗原類を結合させる結合剤としては、グルタルアルデヒドやビスエポキシ化合物等のような蛋白質の有するアミノ基と核酸塩基に含まれるアミノ基とを結合させる同一官能基を有する結合剤、及び核酸塩基に含まれるアミノ基と蛋白質に含まれ及び／又は導入されたチオール基等のアミノ基以外の官能基を有する異官能性結合剤等を用いることも出来る。このような異官能性結合剤としては、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等を用いることが出来る。核酸の標識方法としては、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド等の核酸鎖に結合剤を用いて直接にペルオキシダーゼや抗原類等の蛋白質やビオチンを結合させる方法、或いはペルオキシダーゼや抗原類等の蛋白質やビオチンを結合させた核酸単量体単位を標的核酸に特異的な核酸に結合させる方法等を用いることが出来る。
【００１４】
本発明の核酸の検定方法に用いられる化学発光試薬は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分とする混合物又はN,N'−ジ置換-9,9'-ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体、 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物を主成分とする混合物である。
【００１５】
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体は、一般式（１）で表される化合物である。一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、各々、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は、炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基は、炭素数６〜２０のものが好ましく、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１６】
一般式（１）において、Ｒ3,Ｒ4,Ｒ5 及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１０のものを挙げることができる。例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロキシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
【００１７】
また、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の対イオンから電子が移動した残基である酸ラジカルを示す。対イオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン等のハロゲンイオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、カルボン酸イオン等を挙げることができる。これらの対イオンのなかで、特に硝酸イオンが好ましい。
【００１８】
N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の具体例としては、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジエチル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩、N,N'−ジ−ｍ−クロロフェニル−9,9'−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙げられる。勿論これらに限定されるものではないが、特に、N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１９】
本発明の検定方法に用いられる化学発光試薬の成分の一つである N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、一般式（２）で表わされる。一般式（２）において、Ｒ1 は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される。該アリール基はアルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 は、メチル基及びエチル基からなる群より選択される。Ｒ3 は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される。該アリール基は、アルキル基、ハロゲン基、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等からなる群より選択される基で置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。 N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、 N,N−ジメチルホルムアミド、 N,N−ジメチルアセトアミド、 N,N−ジメチルアクリルアミド、N,N −ジメチルプロピオンアミド、N,N −ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
【００２０】
本発明の検定方法に用いられる化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコール化合物は、一般式（３）で表わされる化合物である。一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わす。また、ｍは１〜３の整数である。アミノアルコール化合物の具体例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２１】
本発明の核酸の検定方法に用いられる化学発光試薬は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体及び特定の N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つであるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成分である N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在により自然光等により容易に電荷移動錯体に転化する現象が認められる。また、この N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカルの安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸からなるN,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分として作用している。また、本発明の化学発光試薬へ特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる化学発光試薬において、このアミノアルコール化合物の添加は、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光反応を実現することが可能になる。このアミノアルコール化合物の添加効果については必ずしもはっきりはしていないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時における溶存酸素との反応を阻止してブランクを高める要因を排除することにより、ブランクの少ない安定した高感度測定を可能にしているものと考えられる。
【００２２】
本発明の核酸の検定方法に用いられる化学発光試薬の製造方法は任意であるが、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類を等モル以上の N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合して自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移動錯体の生成は光により触媒されているので、光照射下に反応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられる。
【００２３】
また、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体と N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合比は、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合が好ましい。
【００２４】
更に、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体と N,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合物からなる化学発光試薬に安定剤として特定のアミノアルコール化合物を添加することにより発光性能の安定した化学発光系が得られる。アミノアルコールは、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反応時及び／又は反応後に添加することができるが、電荷移動反応後に添加するのが好ましい。その添加量としては、N,N'−ジ置換−9,9'−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モル、好ましくは１〜２千倍モルの量で用いることができる。
【００２５】
本発明の核酸の検定方法に用いられる化学発光試薬は、ｐＨ４．５〜１３、好ましくはｐＨ５〜８の範囲において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。その際に、発光反応はｐＨが酸性側においてその発光時間が長くなる傾向が認められる。
また、この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤を存在させることによって増強させることができる。
【００２６】
従って、本発明の第二は、ペルオキシダーゼ標識核酸プローブによる標的核酸の検定を化学発光試薬を用いて行う際に、発光促進剤としてフェノール性化合物を使用することができる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
【００２７】
本発明の核酸の具体的な検定方法としては、特に限定されるものではないが、標的核酸を含有する試料溶液をニトロセルロースメンブラン等の薄膜上にスポットして固定化させ、ブロッキング剤でブロッキング処理した後、標識核酸プローブ溶液を添加してハイブリダイゼーション反応させ、未反応物を洗浄で除去してから、化学発光試薬溶液を添加して化学発光させる方法が一般的である。該化学発光の観察は、黙視、ＣＣＤカメラ等による画像の取り込み及びその画像の印刷、感光紙による感光等で行なうことが可能であり、一般的には光に感光するオートラジオグラフィー用フィルム等を用いて発光を記録することにより行なわれる。
本発明の核酸の検定方法は、ドットブロッティングの他にサザンブロッティング、ノーザンブロッティング等の分析方法に好適に用いることが出来る。
【００２８】
本発明の核酸の検定方法に用いられる化学発光試薬の濃度は、１０-8〜１Ｍ、好ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲であり、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が望ましい。また、発光促進剤の使用量は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度は１０-6〜１Ｍであり、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲が望ましい。また、化学発光反応に用いる過酸化水素の量は化学発光試薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量としては化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が望ましい。また、用いられるペルオキシダーゼとしては、特に限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましい。
【００２９】
核酸の検定に用いる化学発光反応用の緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００３０】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例等に限定されるものではない。
尚、参考例及び実施例中の％は重量％を意味する。
【００３１】
〔参考例１〕
N,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びN,N-ジメチルアセトアミドを含む化学発光試薬の調製
ルシゲニン 1.5 mg を試験管に採り、これにN,N-ジメチルアセトアミド１mlを加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で 250 Wのコピーランプを７時間照射することによりN,N'−ジメチル−9,9'−ビスアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体及びN,N-ジメチルアセトアミドを含有する反応混合物を得た。尚、電荷移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計を用いる方法で測定して確認した。次いで、この溶液に500 μｌのトリエタノールアミンを添加することにより化学発光試薬を得た。
【００３２】
〔参考例２〕
ペルオキシダーゼ標識化オリゴヌクレオチドプローブの調製
市販の大腸菌由来ＤＮＡ断片を10mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（pH7.4)に1.0 μg ／mlの濃度で溶解した溶液１mlに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の10μg ／mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液 0.1 ml を添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液（pH 6.O）でゲル濾過を行ない、マレイミド化ＤＮＡ断片と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００３３】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0 mg／mlのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10 mg／mlの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液（pH 4.5）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷冷下に約10倍に濃縮した。次に、これに 0.1M ジチオスレイトールを含有する 0.1M 酢酸緩衝生理食塩水（pH 4.5）１mlを添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
【００３４】
次に、マレイミド化ＤＮＡ断片とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に１mlに濃縮し、4 ℃で一昼夜放置した後、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（pH 7.4）１mlを添加することによりペルオキシダーゼ標識化オリゴヌクレオチドプローブ溶液を得た。
【００３５】
〔実施例１〕
大腸菌Ｋ12株の１白金耳を通常の培養培地10mlに植菌して30℃で８時間種培養した後、培養物を100 mlの上記培地に移植して30℃で一晩培養し、培養物を遠心分離して集菌した。次に、該大腸菌を 9.5mlＴＥ緩衝液（10mM トリス、1mM EDTA)（pH 8）に再懸濁し、10％ＳＤＳ（ドデシルスルホン酸ソーダ）0.5 mlと20mg／mlプロテアーゼＫ50μl を加え、よく混和して37℃で１時間保温して溶菌した。次いで、これをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで数回抽出し、遠心して水層を分離し、水層にイソプロパノールを添加しよく撹拌してＤＮＡを沈殿させ、生成した沈殿を70％エタノールに加え、よく洗浄してから沈殿を遠心分離し、ＴＥ緩衝液に溶解して大腸菌の染色体ＤＮＡ溶液を得た。次に、この溶液のＤＮＡ濃度を分光光度計で測定し、更に、魚類精子ＤＮＡを100 ng／mlの濃度で含有するＴＥ緩衝液溶液で稀釈して稀釈系列を作成した。このＤＮＡ稀釈系列の溶液をニトロセルロース製のメンブラン上にスポットし、各スポットに、それぞれ、0pg、 0.005pg、 0.01pg、 0.05pg、 0.1pg、 0.5pg、 1.0pg、 5.0pg、 10pgの大腸菌染色体ＤＮＡが含まれるようにした。次いで、このメンブランを80℃のオーブン内に30分間入れて、上記大腸菌染色体ＤＮＡをメンブラン上に固定した。次いで、ＢＳＡ２％を含有するＰＢＳ（pH 7.4）からなるブロッキング溶液に30分間浸漬してブロッキング処理を施した。
【００３６】
次いで、このメンブランを50％ホルムアミド、0.65M ＮａＣｌ、 5mM ＥＤＴＡ、0.1％ＳＤＳ等を含有するプレハイブリダイゼーション液中で、42℃、４時間振盪してから、参考例２で調製したペルオキシダーゼ標識化した大腸菌染色体ＤＮＡの部分的配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブ溶液及び魚類精子ＤＮＡ100 ng／mlを加えたプレハイブリダイゼーション液に移して42℃で一晩振盪してハイブリダイゼーション反応させた。ハイブリダイゼーション後、メンブランをハイブリダイゼーション液から取り出して洗浄してからペーパータオル等に挟んで水分を除去した。
【００３７】
次いで、このメンブランを底の浅い長方形の容器に入れ、内部にＣＣＤカメラをセットして遮光した箱状の容器内に設置し、このメンブランを入れた底の浅い長方形の容器内に、参考例１で調製した化学発光試薬を75mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.4）で 500倍に稀釈した稀釈液 920μｌに、10mMｐ−ヨードフェノール溶液80μｌ及び0.0034重量％の過酸化水素水溶液 1.2mlを順次加えて調製した混合液を注入してスポット部位を発光させた。この発光をＣＣＤカメラにより取り込み、ビデオプリンターでプリントアウトすることにより、ニトロセルロースメンブランの上に、ＤＮＡの量が 0.1pg〜10pgのスポットについて発光が確認された。
【００３８】
〔実施例２〕
サザンブロット分析
実施例１で得られた大腸菌の染色体ＤＮＡ１μｇを100 mM塩化マグネシウム、500 mMＮａＣｌ等を含む 100mMトリス−塩酸緩衝液（pH 7.5)2μl に溶解し、制限酵素NotIを３ユニット添加してから精製水を加えて全体量を20μl にして、37℃で３時間反応して分解した後、少量のEDTAを加え、これに50％グリセロール、100 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）、0.4 ％ブロモフェノールブルーを含有する添加緩衝液10μl を加えた後、展開緩衝液に10mMリン酸緩衝液（pH 7.0）を用いて１％アガロースゲル中を1.75Ｖ／cmで、12時間電気泳動した。
【００３９】
次いで、このアガロースゲルを0.2 N ＨＣｌ中に浸して10分間ゆっくりと動かして酸処理してから酸溶液を捨て、ゲルを精製水で数回洗浄した。次に、ゲルを0.5 M ＮａＯＨ、1.5 M ＮａＣｌからなる変性液中に30分間浸して変性処理した後、変性液を捨てて1.5 M ＮａＣｌを含む0.5 M トリス−塩酸緩衝液（pH 7.0）中に30分間浸漬してから、10×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは 0.15 M ＮａＣｌ、0.15M クエン酸ナトリウム）中に10分間浸漬して10×ＳＳＣを含浸した濾紙上に置き、その上にゲルよりやや小さいニトロセルロースメンブランを重ね、更に濾紙を重ねて一番上にガラス板等を置いて圧迫することによりＤＮＡ断片をニトロセルロースメンブランにブロットした。次に、このメンブランをゲルから剥がし取りよく洗浄してから水分を拭き取り、オーブンを用いて80℃で２時間熱処理した。
【００４０】
次いで、このメンブランを50％ホルムアミド、0.65 MＮａＣｌ、5  mM EDTA、0.1 ％ＳＤＳ等を含有するプレハイブリダイゼーション液中で、42℃、４時間振盪してから、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Manheim）社製のＤＮＡラベリングキットによりジゴキシゲニン標識した大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼpolIの部分的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ溶液及び魚類精子ＤＮＡ100 ng／mlを加えたプレハイブリダイゼーション液に移して42℃で一晩振盪してハイブリダイゼーション反応させた。ハイブリダイゼーション後、メンブランをハイブリダイゼーション液から取り出して洗浄してから、ＢＳＡ２％を含有するＰＢＳ（pH 7.4）からなるブロッキング溶液に30分間浸漬してブロッキング処理を施した。次に、このメンブランのＤＮＡ断片をブロットした部分に、市販のペルオキシダーゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を含有するＰＢＳ（pH 7.4）を滴下して37℃で４時間抗原抗体反応させてジゴキシゲニン標識ＤＮＡにペルオキシダーゼを結合させた。次いで、このメンブランを遮光した箱状容器内に入れ、そのＤＮＡ断片をブロットした部分に、参考例１で調製した化学発光試薬を10mMリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（pH 5.5）で 500倍に稀釈した稀釈液 920μｌに10mMｐ−ヨードフェノール溶液 80 μｌ及び0.0034重量％の過酸化水素水溶液 1.2mlを順次加えて調製した混合液を滴下した後、このメンブランの上に透明のラップフィルムで覆い、その上にオートラジオグラフィー用フィルムを重ねて５分間感光させることにより、3.0 kbp 付近に感光スポットが認められ、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼpolI遺伝子を含むＤＮＡ断片の存在が確認された。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の核酸の検定方法は、入手が容易で取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が容易であるルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造できる新規化学発光試薬を用いる化学発光法により試料中のＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸類を高感度に検定することができる。