(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血単核球細胞とヒトウイルムス腫瘍細胞株HFWTとを混合培養する工程を含む、ヒトナチュラルキラー細胞の増殖方法。
【請求項２】
ヒト個体より分離した末梢血単核球細胞を用いて、該ヒト個体自身のナチュラルキラー細胞を増殖させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト個体が腫瘍患者である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
あらかじめ増殖能を失わせたヒトウイルムス腫瘍細胞株HFWTを用いる請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
インターロイキン-2の存在下で培養を行う請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法によるヒトナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項７】
腫瘍患者より分離した末梢血単核球細胞を用いた請求項１に記載の方法により該腫瘍患者自身のナチュラルキラー細胞を増殖させる工程を含む、該腫瘍患者のための腫瘍治療剤の製造方法。
【請求項８】
ヒトナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の測定方法であって、ヒトウイルムス腫瘍細胞株HFWTとヒトナチュラルキラー細胞とを混合培養し、培養後に生存した標的細胞を染色する工程を含む方法。
【請求項９】
染色にクリスタルバイオレットを用いる請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの免疫系細胞の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物体内にあるナチュラルキラー細胞（以下、本明細書において「ＮＫ細胞」と略す場合がある。）は、免疫反応の一翼を担うリンパ球系の細胞である。この細胞には様々な機能があるが、特に腫瘍細胞を殺す強い活性があることから、体内では腫瘍化した、あるいは腫瘍化しつつある異常な細胞を取り除く免疫監視機構の重要メンバーであると考えられている。従って、この細胞を腫瘍治療に有効利用しようという研究は古くから行われていた。
【０００３】
例えば、リンホカインの一種であるインターロイキン−２（以下、本明細書においてインターロイキンを「ＩＬ」と略す場合がある）を大量に培養液に添加し、末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣ）を培養すると、ヒトの場合には１週間前後でいわゆるリンホカイン活性化キラーリンパ球（以下、本名所において「ＬＡＫ細胞」と略す場合がある）が増殖してくるが、この中にはＮＫ細胞が多く含まれていることはよく知られている。ＬＡＫ細胞は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらの研究（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１３，  ｐｐ．１４８５−１４９２，  １９８５）以来、腫瘍の養子免疫療法に広く使用されている。また、ＬＡＫ細胞は感染症にも有効であることが知られており、抗生物質では治しにくい感染症対策として注目されている。しかしながら、ＬＡＫ細胞を大量に増殖させるために２週間以上長期間培養すると、ＮＫ細胞の細胞傷害活性が大幅に下がる場合が多いので、ＬＡＫ細胞培養によるＮＫ細胞の取得は得策ではない。
【０００４】
ＮＫ細胞の表面上にはＮＫ活性阻害受容体（以下、本明細書において「ＮＫＩＲ」と呼ぶ場合がある）があり、これに結合する分子があるとＮＫ細胞の細胞傷害活性は阻害される（Ｇｕｍｐｅｒｚ，  Ｊ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐａｒｈａｍ，  Ｐ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７８，  ｐｐ．２４５−２４８，  １９９５）。一般に、正常細胞の表面には主要組織適合性抗原クラスＩ（以下、本明細書において「ＭＨＣ−Ｉ」と呼ぶ場合がある）分子が発現されていて自己と非自己の識別に重要な役割をはたしているが、ＭＨＣ−Ｉ分子群のなかにはＮＫＩＲに結合するものがあるため、通常、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を測定するときはヒト慢性白血病細胞株Ｋ５６２を標的にして活性を測定する。これは、Ｋ５６２細胞がＭＨＣ−Ｉ分子をほとんど発現していないためである。しかも、Ｋ５６２細胞を殺すときには、ＮＫ細胞はさらに活性化され増殖することが知られている。
【０００５】
最近、Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒのグループは、細胞表面にほとんどＭＨＣ−Ｉを発現していないヒトＢ細胞株７２１．２２１に放射線を照射して分裂能を失わせた状態とし、これをＰＢＭＣとともに５〜６日間混合培養し、そこからＮＫ細胞を精製してさらに培養を続けてＮＫ細胞を大量に得る方法を開発した。この方法でメラノーマ患者から得られたＮＫ細胞は、ＭＨＣ−Ｉを発現していない患者自己メラノーマ細胞を殺せることが示されている（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９４，  ｐｐ．１３１４０−１３１４５，  １９９７）。もっとも、この方法はＮＫ細胞を増殖させるのには簡便であるものの、ＮＫ細胞の標的細胞として使用した７２１．２２１細胞株は、Ｋ５６２細胞と同様に実際上はわずかながらＭＨＣ−Ｉの発現があることから（Ｈａｙ，  Ｒ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、Ｋ５６２細胞に比して特に効率よくＮＫ細胞を増殖させるわけではない。
【０００６】
一方、ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性測定としては、Ｋ５６２細胞を標的細胞としてこれにあらかじめ放射性のＣｒ−５１を無機塩として取り込ませておき、Ｋ５６２細胞が死んだときに細胞外に遊離するＣｒ−５１の量を放射線測定器で測定する方法が標準的に使われている。この方法は、標的細胞に対して殺す側の細胞（すなわちエフェクター細胞）を大量に加えても、Ｃｒ−５１が殺される側のＫ５６２細胞からのみ遊離するため、高感度で特異性が高い方法である。しかしながら、放射性物質を扱うため危険であるという逃れられない欠点がある。
【０００７】
これに対して、本発明者らは、細胞傷害性Ｔリンパ球（以下、本明細書において「ＣＴＬ」と呼ぶ場合がある）の活性測定法として、付着性細胞を標的細胞として用いるクリスタルバイオレット染色法（以下、本明細書において「ＣＶ法」と呼ぶ場合がある）を提案している（Ｌｉｕ，  Ｓ．  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １，  ｐｐ．２６７−２７１，  １９９５）。この方法は、標的細胞をエフェクター細胞と混合培養した後、細胞を相互に分離し、生き残った標的細胞をクリスタルバイオレットで染色して比色法で定量するため、放射性物質を必要とせず極めて安全である。
【０００８】
しかしながら、Ｋ５６２細胞が浮遊性細胞であるため、同じく浮遊性細胞であるエフェクター細胞と一旦混合した後では、標的細胞のみを分離することは非常に困難であり、ヒトＮＫ細胞の活性測定にはＣＶ法は適用できないという問題がある。Ｋ５６２細胞と同様にヒトＮＫ細胞に高感受性で、しかも付着性の標的細胞が利用できればＣＶ法が適用できるが、そのような報告はこれまでにない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来から知られている方法よりも効率のよいＮＫ細胞増殖法を提供することにある。より具体的には、従来の方法に比べて２倍以上の効率でＰＢＭＣからＮＫ細胞を選択的に増殖させることができ、しかも高い細胞傷害活性を保った状態のＮＫ細胞を得るための方法を提供することが本発明の課題である。また、上記の特徴を有する方法により生産されたヒトＮＫ細胞、及び従来の方法よりも安全性の高いヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性測定法を提供することも本発明の課題である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＮＫ細胞の標的細胞となる細胞群のなかで、ＭＨＣ−Ｉ分子の発現誘導剤であるインターフェロンガンマ（以下、本明細書において「ＩＦＮｇ」と呼ぶ場合がある）を細胞培養中に添加してもＭＨＣ−Ｉ分子を増加発現することのない細胞株を多数のヒト培養細胞株群からスクリーニングし、そのような細胞株中である特定の細胞株を用いた場合には、Ｋ５６２細胞株に比べて非常に高いＮＫ細胞増殖効果を達成できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、末梢血単核球細胞とヒトウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴとを混合培養する工程を含む、ヒトナチュラルキラー細胞の増殖方法を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、ヒト個体、好ましくは腫瘍患者より分離した末梢血単核球細胞を用いて、該個体自身のナチュラルキラー細胞を増殖させる上記方法；予め増殖能を失わせたヒトウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴを用いる上記方法；及びインターロイキン−２の存在下で培養を行う上記方法が提供される。
【００１２】
例えば、腫瘍患者の末梢血より分離した末梢血単核球細胞を本発明の方法に従ってヒトウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴとともに培養することにより、患者本人のＮＫ細胞を高い細胞傷害活性を保ったまま大量に増殖させることができる。また、これらの方法によって製造されたヒトナチュラルキラー細胞、及び腫瘍患者より分離した末梢血単核球細胞を用いて上記方法により増殖させた該腫瘍患者自身のナチュラルキラー細胞を含む、該腫瘍患者のための腫瘍治療剤が本発明により提供される。
【００１３】
別の観点からは、ヒトナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の測定方法であって、ヒトウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴとヒトナチュラルキラー細胞とを混合培養し、培養後に生存した標的細胞を染色する工程を含む方法が提供され、この方法の好ましい態様によれば、染色にクリスタルバイオレットを用いる上記方法が提供される。これらの方法によれば、放射性物質を使用せずに、ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を正確かつ簡便に測定できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ヒトＮＫ細胞を増殖させるにあたり、ヒトのウイルムス腫瘍細胞株  ＨＦＷＴを標的細胞としてヒトＰＢＭＣと混合培養することを特徴としている。本発明の方法によれば、ＰＢＭＣ中のＮＫ細胞を選択的に増殖させることが可能である。ヒトのウイルムス腫瘍細胞株  ＨＦＷＴは理化学研究所（日本国埼玉県和光市広沢２番１号）の細胞開発銀行（日本国つくば市高野台三丁目１番１号）に細胞番号ＲＣＢ０６６５として保存されており、申請により入手することが可能である。
【００１５】
本発明の方法において、培養方法は特に限定されないが、通常は、下記の方法に従って培養を行うことができる。通常の動物細胞培養用培地に血清又は血漿とリンパ球の増殖を支持する増殖因子とを添加し、ヒト末梢血より分離したＰＢＭＣを加え、この培養物をＨＦＷＴ細胞に添加して培養する。培地に添加する血清又は血漿の種類は特に限定されず、市販の各種動物由来のものを用いることができるが、ヒト由来であって血液型がＡＢ型のものが好ましく、ＰＢＭＣを採取した本人由来のものがさらに好ましい。濃度は１ないし３０容量％程度でよい。また、無血清状態でリンパ球の増殖を支持できる培地を用いることもできる。
【００１６】
増殖因子としてはインターロイキン−２（ＩＬ−２）が最も好ましいが、ＰＢＭＣからリンパ球を増殖させるようなサイトカインの組み合わせや、リンパ球増殖を刺激するレクチン類、あるいはＰＢＭＣを採取した対象者とは異なるヒト個体から採取したＰＢＭＣで増殖能力を失わせる処理をほどこしたものを増殖因子の代わりに用いてもよい。増殖能を失わせる方法は特に限定されないが、放射線照射やマイトマイシンＣ処理など、当業者に知られている方法を用いることができる。添加するＩＬ−２の濃度は１０〜２，０００  国際単位／ｍｌが好ましい。
【００１７】
ＰＢＭＣとＨＦＷＴ細胞との比は特に限定されないが、１０：１程度とすることが好ましい。標的であるＨＦＷＴ細胞は付着性細胞であるため、一般的には、これらが付着している状態のまま、増殖能を失わせる処理を施して使用することが好ましい。もっとも、上記細胞を物理的に付着状態から引き剥がす等、浮遊状態にして用いることもできる。また、ＮＫ細胞が活性化して盛んに増殖している状態では、標的細胞であるＨＦＷＴ細胞はＮＫ細胞により速やかに殺されてしまうため、このような状態で標的細胞を用いるときは、その増殖能をあらかじめ失わせておく必要は必ずしもない。ＰＢＭＣの培養期間は特に限定されないが、好ましくは５日間以上である。ＮＫ細胞は高い活性を維持した状態のまま増殖するが、自然にＮＫ細胞が増殖能を失うまでの間は培養を継続可能である。
【００１８】
本発明により提供されるヒトナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の測定方法は、ヒトウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴとヒトナチュラルキラー細胞とを混合培養し、培養後に生存した標的細胞を染色することを特徴としている。この方法は、一般的には公知の方法（Ｌｉｕ，  Ｓ．  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １，  ｐｐ．２６７−２７１，  １９９５）に準じて、エフェクター細胞をＮＫ細胞とし、標的細胞をＨＦＷＴ細胞として行うことができる。染色にはクリスタルバイオレットを用いることが好ましい。ＨＦＷＴ細胞が付着性培養細胞であることから、本発明の方法によれば、放射性物質を使用することなく、正確かつ簡便にヒトＮＫ細胞の活性を測定できる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。以下の実施例で用いた細胞株は、理化学研究所細胞開発銀行に保存されているヒト腫瘍細胞株２０９株をスクリーニングし、このうち慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（細胞番号ＲＣＢ００２７）、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ（細胞番号ＲＣＢ０６６５）、メラノーマ細胞株ＨＭＶ−ＩＩ（細胞番号ＲＣＢ０７７７）がＭＨＣ−Ｉ分子をほとんど発現していないこと（ただし後２者はＫ５６２細胞と同程度のわずかなＭＨＣ−Ｉの発現が確認されている）、これらの細胞では培養内で２４時間ＩＦＮｇ添加処理をしてもＭＨＣ−Ｉ発現が増強されることは全くないことを、当業者に周知のフローサイトメトリー法で確認した上で用いた。
【００２０】
Ｋ５６２細胞には多数のバリアントが存在することが知られており、原株（Ｌｏｚｚｉｏ，  Ｃ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｌｏｚｚｉｏ，  Ｂ．  Ｂ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ４５，  ｐｐ．３２１−３３４，  １９７５）はＩＦＮｇ処理によりＭＨＣ−Ｉの発現が誘導されるとされている。しかし、本実施例で用いているＫ５６２細胞株は原株から変異しており、ＩＦＮｇ処理によってもＭＨＣ−Ｉの発現が極めて低い状態のまま変化することはない。また、Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞は、病理診断でｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａとされた脳腫瘍組織から、理化学研究所細胞開発銀行において継代培養されたものであり、これは通常の培養下で常時強くＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩを発現している細胞である。この細胞は、ＭＨＣ−Ｉをほとんど発現していない細胞株との比較対照として用いた。
【００２１】
例１：健常人のＮＫ細胞の選択的培養
ＨＦＷＴ細胞を標的細胞にした場合、健常人のＰＢＭＣからＮＫ細胞が選択的に増殖してくるか否かを検討した。
＜方法＞
１．標的細胞の培養
１×１０５個の標的細胞を２４ウエルプレートの各ウエルに播種した。標的細胞としてはＨｉｇａｓｈｉｎｏ、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、ＨＭＶ−ＩＩを用い、培地としては、１０％牛胎児血清添加Ｈａｍ  Ｆ１２培地を用いた。これらの細胞を一夜培養した後、５０  ＧｙのＸ線を照射し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄後、標的細胞として供した。
２．ＰＢＭＣの調製
健常者の末梢血３０  ｍｌからＰＢＭＣを当業者に周知の方法（Ｋａｗａｉ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３５，  ｐｐ．２２５−２２９，  １９９２）に従って分離した。なお、このときに採取される血漿はＰＢＳ（−）にて２倍に希釈されているが、それを以下の培養で使用した。使用濃度は２倍希釈状態で容量比で１０％（すなわち、血漿としては５％）である。
【００２２】
３．ＰＢＭＣの培養
１ウエルあたり２  ｍｌの血漿添加ＲＨＡＭα培地（Ｋａｗａｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３５，  ｐｐ．２２５−２２９，  １９９２）に懸濁した１×１０６個のＰＢＭＣを標的細胞上に播種した。また、培地中にＩＬ−１（終濃度１６７国際単位／ｍｌ、以下同様に終濃度を示す）、ＩＬ−２（６７国際単位／ｍｌ）、ＩＬ−４（６７国際単位／ｍｌ）、ＩＬ−６（１３４国際単位／ｍｌ）を添加した。これを３７℃の炭酸ガスインキュベーターで培養した。
４．フローサイトメトリー
当業者に周知の方法で、培養された浮遊細胞群をそれぞれの細胞表面抗原に特異的に結合する単クローン抗体で蛍光染色し、ＦＡＣＳ（ベクトンデイッキンソン社製）で解析した。ここで使用した単クローン抗体のうち、抗ＣＤ３抗体はＴ細胞を識別するために使用、抗ＣＤ５６抗体はＮＫ細胞を識別するために使用した。
【００２３】
５．細胞数の計測
細胞数はタタイ式血球計算盤を使用して計測した。
６．細胞傷害活性の測定
既報の方法（Ｌｉｕ，  Ｓ．  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １，  ｐｐ．２６７−２７１，  １９９５）に従って、ＣＶ法により培養リンパ球の細胞傷害活性を測定した。本実施例では、生きている標的細胞にリンパ球を添加する直前の標的細胞の染色後の吸光度を１００％とした。このため、２４時間インキュベーション後では、対照となる標的細胞のみのウエル（エフェクター細胞と標的細胞の比（以下、Ｅ／Ｔ比）が０のウエル）では標的細胞が増殖しているために細胞傷害活性が１００％を越えているが、これは本実験において標的細胞自体は健全であったことを示している。
【００２４】
＜結果＞
健常者１（４０才、女）のＰＢＭＣを用いて得た結果を表１の実験１及び実験２、並びに図１に示し、健常者２（２７才、男）から得た結果を表１の実験３及び図２に示す。
【００２５】
【表１】
0003619853.tif 000002
【００２６】
本実施例で用いた４種のＩＬの組み合わせは、ＭＨＣ−Ｉ分子と抗原ペプチドを同時に認識して殺す性質のあるＣＴＬを誘導培養するために適するものである（Ｌｉｕ，  Ｓ．  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ３９，  ｐｐ．２７９−２８５，  １９９４）。健常人のＰＢＭＣは通常８〜２５％のＮＫ細胞を含むが、表１に示したように、ＣＤ３＋ＣＤ５６−で表されるＴ細胞はＨｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を標的細胞とした場合には９６％に達するものの、ＣＤ３−ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞は、健常者１のＰＢＭＣを用いた実験１ではほとんどなくなり、実験２でも５．４％となっている。一方、ＭＨＣ−Ｉ分子がほとんど表面にないＨＦＷＴ細胞を標的細胞とした場合は、逆にＴ細胞の割合が大幅に低下し、ＮＫ細胞の割合が５４．６％にまで上昇した。この割合は、同じようにＭＨＣ−Ｉ分子がほとんど表面にないＫ５６２細胞を標的細胞とした場合の結果（１７．６％）に比べても明らかに高い。実験２でもこれらの傾向は変わらず、ＮＫ細胞の割合はＨＦＷＴ細胞を標的細胞とした場合には７５．９％に達し、同じようにＭＨＣ−Ｉ分子がほとんど表面にないＨＭＶ−ＩＩ細胞を標的細胞とした場合（１８．９％）に比べても明らかに高い。
【００２７】
健常者２の末梢血からＰＢＭＣを調製した直後では、ＣＤ３＋ＣＤ５６−のＴ細胞は５５．４％、ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞は１３．２％であった。表１の実験３に示したように、培養１３日後には、Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を標的にした場合は９５．１％がＴ細胞で占められ、ＮＫ細胞はほとんどなくなり、逆にＨＦＷＴ細胞を標的にした場合はＮＫ細胞が６４．６％にまで増加した。しかも、図１に示すように、健常者１のＰＢＭＣ由来の細胞増殖は、Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞とＨＦＷＴ細胞を標的とした方が、ＨＭＶ−ＩＩ細胞を標的にした場合や標的細胞がない場合に比べて明らかに高い。健常者２の場合（図２）は、Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を標的とした場合よりもＨＦＷＴ細胞を標的とした場合の方がさらに効率よくＰＢＭＣ由来細胞が増殖した。
【００２８】
さらに、実験３で得た培養リンパ球群を用いて、細胞傷害試験を行った結果を図３に示す。Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を標的として得た培養リンパ球群は、４種のＩＬを組み合わせて培養したためＣＴＬとなっていることが予想されたが、実際、このリンパ球群は細胞傷害活性測定時に標的細胞とした生きているＨｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を非常によく殺した。Ｅ／Ｔ比が０のとき（すなわち標的細胞のみのとき）、２４時間で標的細胞が１４７％と増殖する条件下でも、Ｅ／Ｔ比が２のときの生残標的細胞は４７．６％となった。Ｅ／Ｔ比が８のときの生残標的細胞はわずか７．５％となった。このときの生残標的細胞の割合は、Ｅ／Ｔ比が低ければ高くなり、明瞭な用量依存関係が認められた。しかし、細胞傷害活性測定時の標的細胞が生ＨＦＷＴ細胞である場合には、Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を標的として得たリンパ球群はＨＦＷＴ細胞を全く殺さず、ここで得た培養リンパ球群が典型的ＣＴＬであることが確認された。
【００２９】
一方、ＨＦＷＴ細胞を標的として得た培養リンパ球群は、生ＨＦＷＴ細胞を非常によく殺した。Ｅ／Ｔ比が２のときの生残標的細胞は１８．５％となった。Ｅ／Ｔ比が８のときの生残標的細胞は−９．２％まで低下した（マイナス値となったのは測定誤差のためである）。このときの生残細胞の割合は、Ｅ／Ｔ比が低ければ高くなり、用量依存関係が認められた。従って、細胞傷害活性測定時に生きているＨＦＷＴ細胞を標的細胞とすることにより、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を正確に測定できる。
【００３０】
また、この培養リンパ球群には１２．４％のＴ細胞が含まれており、生ＨＦＷＴ細胞に比べれば程度は明らかに低くなるものの、生Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ細胞も殺していることから、この中にはＮＫ細胞だけではなく若干のＣＴＬも含まれていると推定される。Ｅ／Ｔ比が２のときの生残標的細胞は６０．５％、Ｅ／Ｔ比が８のときの生残標的細胞は２１．８％となった。従って、これら実験から明らかなように、ＨＦＷＴ細胞を標的とすれば、高い細胞傷害活性を保ったＮＫ細胞をＰＢＭＣから選択的に、かつ効率よく増殖させることができる。
【００３１】
例２：ＮＫ細胞の選択的培養に必要なインターロイキン
例１では増殖能を失わせたＨＦＷＴ細胞を標的細胞として、健常者のＰＢＭＣからＮＫ細胞が選択的に増殖培養できることを示したが、培養に４種類のＩＬを用いていた。この例では、リンパ球にとって最低限必要といわれるＩＬ−２のみを添加した培地を用いて、ＨＦＷＴ細胞を標的細胞としてＮＫ細胞の選択的培養を行った。方法は培地に添加するＩＬの種類を変更したこと以外は全て例１と同じである。ただし、ＩＬ−２のみを添加する場合の濃度は５００国際単位／ｍｌとした。また、フローサイトメトリー法で培養された細胞群を調べる際、ＮＫ細胞を識別するために、抗ＣＤ５６抗体の他に抗ＣＤ１６抗体も使用した。
【００３２】
図４に示すように健常者１、健常者２、健常者３（５６才、男）由来のすべてのＰＢＭＣとも、ＨＦＷＴ細胞を標的細胞として培養した場合に、４種のＩＬ添加でもＩＬ−２のみの添加でも、ほぼ同じように増殖した。図４（Ｃ）に示すように、健常者３由来ＰＢＭＣでは、標的細胞を使用せず、しかもＩＬ−２のみを添加した培養では細胞増殖は大きく遅れた。
【００３３】
健常者１のＰＢＭＣでは、当初８．０％しかなかったＣＤ３−ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は、培養１４日後に標的細胞を追加して再刺激したところ、ＩＬとしてＩＬ−２のみを添加した培養でも、培養１７日後には７７．３％に達した。このような再刺激をしていない健常者２のＰＢＭＣの場合では、培養１３日後には、ＩＬ−２のみを添加した培養でも、ＣＤ３−ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は９０．７％、またＣＤ１６＋で表されるＮＫ細胞の割合は７９．１％、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は７８．２％となった。健常者３でもこのような傾向は変わらず、培養１３日後には、ＩＬ−２のみを添加した培養でも、ＣＤ３−ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は７４．９％、またＣＤ１６＋で表されるＮＫ細胞の割合は７６．５％、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は７５．７％となった。
【００３４】
これら健常者２および３から得たほとんどＮＫ細胞となったリンパ球群の細胞傷害活性を見た結果を図５に示す。このときの生標的細胞はＨＦＷＴである。健常者２の場合も健常者３の場合も、十分に活性が強いＮＫ細胞が得られており、ＨＦＷＴ細胞を標的としてＰＢＭＣからＮＫ細胞を選択的に培養する際に添加するＩＬはＩＬ−２のみでよく、高い細胞傷害活性を保ったまま、選択的に効率よく増殖させることができる。
【００３５】
例３：腫瘍患者ＰＢＭＣからの選択的なＮＫ細胞の増殖培養
例１及び例２では健常者のＰＢＭＣを用いたが、この例では腫瘍患者のＰＢＭＣを用いてＮＫ細胞の選択的増殖培養が可能であるか否かを検討した。試験は例１に従って行い、ただし、ＰＢＭＣ培養時の標的細胞としてはＨＦＷＴ細胞又はＫ５６２細胞を用い、ＩＬとしてはＩＬ−２のみを添加し、濃度は５００国際単位／ｍｌとした。また、フローサイトメトリー法で培養された細胞群を調べる際、ＮＫ細胞を識別するために抗ＣＤ５６抗体の他に抗ＣＤ１６抗体も追加して使用した。患者（５１才、男）はｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａと診断された脳腫瘍患者で、例１及び例２で使用しているＨｉｇａｓｈｉｎｏ細胞を採取した本人である。
【００３６】
図６に結果を示す。ＰＢＭＣ由来のリンパ球の増殖は、標的細胞としてはＫ５６２細胞よりもＨＦＷＴ細胞の方がよかった。１×１０６個から出発して、累積増殖リンパ球数の最高値が、Ｋ５６２細胞を標的とした場合では３．０５×１０７個であるのに対し、ＨＦＷＴ細胞を標的とした場合では１５．６×１０７個に達した。また、ＰＢＭＣ由来細胞群の構成を表２に示した。
【００３７】
【表２】
0003619853.tif 000003
【００３８】
Ｋ５６２細胞を標的として増殖培養した場合、及びＨＦＷＴ細胞を標的として増殖培養した場合のいずれでも、ＣＤ３−ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は８２％前後、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋で表されるＮＫ細胞の割合は５３％前後とほとんど同じであった。得られたリンパ球群の細胞傷害活性は、生ＨＦＷＴ細胞を標的として測定した結果、Ｋ５６２細胞とＨＦＷＴ細胞のどちらを標的細胞として増殖培養したリンパ球群でも、非常に強力であった（図７）。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、従来の方法よりも一層効率的なヒトＮＫ細胞の増殖培養が可能になり、大量のＮＫ細胞が容易に得られる。腫瘍患者ＰＢＭＣを材料として本発明により得られたＮＫ細胞は、その患者本人の体内に拒絶反応等の問題なく戻すことができるため、腫瘍治療や感染症治療に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法により、健常者１（４０才、女）のＰＢＭＣを用いてＮＫ細胞の選択的培養を行った結果を示した図である。
【図２】本発明の方法により、健常者２（２７才、男）のＰＢＭＣを用いてＮＫ細胞の選択的培養を行った結果を示した図である。
【図３】例１の実験３で得た培養リンパ球群を用いて、細胞傷害試験を行った結果を示した図である。
【図４】ＮＫ細胞の選択的培養におけるインターロイキン添加の効果を示した図である。図中、ＩＬｓは培養に４種類のインターロイキンを用いた場合の結果を示し、ＩＬ−２はインターロイキン−２のみを添加した場合の結果を示す。
【図５】ＮＫ細胞の選択的培養におけるインターロイキン添加の効果として、健常者２及び３から得たＮＫ細胞を含むリンパ球群の細胞傷害活性を示した図である
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【図６】腫瘍患者のＰＢＭＣを用いて本発明の方法により選択的にＮＫ細胞を増殖培養した結果を示した図である。
【図７】腫瘍患者のＰＢＭＣを用い、Ｋ５６２細胞又はＨＦＷＴ細胞を標的として増殖培養した場合について細胞傷害試験を行った結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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