(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚丹毒菌エリジペロトリクス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の菌体より抽出される抗原物質群を下記（１）および（２）の工程に付すことによって得られ、ブタのイムノグロブリンを非特異的に吸着する成分を含まずイムノグロブリン中の抗豚丹毒菌抗体のみを特異的に吸着する抗原。
（１）陰イオン交換体に吸着させた後、中性緩衝液と酸性緩衝液に順次接触させて溶出する成分を除去し、続いて未溶出有効成分をアルカリ性水溶液で溶出させる工程。
（２）電気泳動で求めた場合の分子量が６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの成分を分取する工程。
【請求項２】
豚丹毒菌エリジペロトリクス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の菌体より抽出される抗原物質群を下記（１）および（２）の工程に付すことを特徴とする請求項１記載の抗原の製造方法。
（１）陰イオン交換体に吸着させた後、中性緩衝液と酸性緩衝液に順次接触させて溶出する成分を除去し、続いて未溶出有効成分をアルカリ性水溶液で溶出させる工程。
（２）電気泳動で求めた場合の分子量が６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの成分を分取する工程。
【請求項３】
請求項１記載の抗原をマイクロタイタープレートに固定化し、該マイクロタイタープレートを用いて酵素免疫測定法により抗豚丹毒菌抗体を測定する方法。
【請求項４】
抗豚丹毒菌抗体がブタ血清中またはブタ乳中に存在するものである請求項３記載の抗豚丹毒菌抗体を測定する方法。
【請求項５】
請求項１記載の抗原を固定化したマイクロタイタープレートと、ペルオキシダーゼ標識抗豚ＩｇＧ抗体（二次抗体）、発色基質、陰性コントロール血清、陽性コントロール血清、洗浄液、血清希釈液、二次抗体希釈液および反応停止液から構成される抗豚丹毒菌抗体測定のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、豚丹毒菌に対する抗体価を酵素免疫測定法によって検出するための抗原の精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
豚丹毒は  エリジペロトリクス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）を病原菌とし、豚に急性敗血症、蕁麻疹、心内膜炎、および慢性関節炎を引き起こす病気である。さらに人間やその他の動物にも感染する人畜共通感染症である。豚の場合、患畜は敗血症による急死、発熱、食欲廃絶、または歩行困難を呈する。急性敗血症以外の患畜は、抗生物質の投与により治癒するものの、その間の治療費、増体重率の低下、肉質の低下等により市場コストを増大させ、養豚経営に甚大な損害をもたらす。
かかる病気の予防措置として日本国内ではエリジペロトリクス・ルジオパシエの小金井株を用いて作成された生ワクチンが使用され効果をあげている。しかし、該ワクチンの使用はその接種時期が適切でなければ十分な効果が得られず、かえって接種による手間と接種料による生産コストの増大を招く。
【０００３】
母豚に予め豚丹毒生ワクチンを接種しておき、生まれた子豚にその初乳を飲ませることによって受動免疫を与えるのが、一般的なワクチンプログラムである。このようにして得られた抗体を母豚からの移行抗体と呼ぶ。移行抗体が子豚に存在するおよそ３０日令迄は、子豚が豚丹毒に罹る可能性は低い。しかし、移行抗体が消失すると罹患する可能性が急激に高まるので、この時点でワクチンを接種することが望ましい。もし移行抗体が消失していない日令でワクチンを接種すると、移行抗体がワクチンを中和してしまい、ワクチンによる能動免疫が成立しない。すなわちワクチン接種が全くの無駄になる。そこでワクチン接種適期を把握するために豚の血清中に存在する豚丹毒菌に対する抗体価の変動を観察する手法が採られている。
【０００４】
現在日本国内で最も汎用されている抗豚丹毒菌抗体の測定法は生菌凝集法（以下ＷＰ法と略す）である。本方法はエリジペロトリクス・ルジオパシエのうちのマリエンフェルデ（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄｅ）株（以下ＭＦ株という）を用い、該ＭＦ株に２倍ずつ段階希釈した被検血清を加えて凝集を生じた最大希釈倍数で抗体価を表す方法である。しかしながら本方法には幾つかの問題点がある。すなわち、１）強毒株であるＭＦ株を生菌のまま用いるため、測定に当たっては熟練した者が細心の注意のもとに行わなければならない。
２）測定感度が低いので、移行抗体が消失したか否かを正確に判定しにくい。
３）目視による判定なので測定者毎に主観が入りやすい。
４）被検血清によっては非特異的凝集あるいは非特異的凝集阻害を起こすものがあり、真の抗体価を反映した結果が得られないことがある。
５）予めＭＦ株を１８〜２０時間予備培養してから本試験にとりかかる必要があり、更に測定を開始してから判定までに１８〜２０時間かかる。すなわち検査の必要性が生じてから結果を得るまでに少なくとも２日はかかる。
【０００５】
以上のような問題点があることから、近年では酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡ法という）を原理とした抗豚丹毒菌抗体の測定法が研究されている（日本獣医学雑誌，４３，８１５〜８１９，（１９９０），日本獣医学雑誌，４３，７４３〜７４７，（１９９０））。
【０００６】
ＥＬＩＳＡ法の概略は以下の通りである。固相であるマイクロタイタープレートに抗原を固定化しておき、このマイクロタイタープレートのウェルに被検血清を一定量加えて抗原抗体反応を生じさせる。一定時間インキュベーションした後、余剰の抗体を洗浄除去後、二次抗体例えばウサギで作成した豚のイムノグロブリンＧに反応する抗体にペルオキシダーゼ等の酵素を標識したものをこのウェルに加える。被検血清中に抗原に対する抗体が存在すれば該抗体は固相表面の抗原と結合し、固相上に残っているので、二次抗体は該抗体と結合する。一定時間インキュベーションした後、余剰の二次抗体を洗浄除去する。最後に二次抗体に標識してある酵素に対する基質及び発色剤を加えて発色させる。一般に、該抗体の量に対数比例して発色強度が増大する。
【０００７】
ＥＬＩＳＡ法の特長は、
１）迅速でかつ高感度に抗体価を測定できる。
２）血清中の妨害因子の影響を受け難い。
３）結果の判定がプレートリーダー等の光学機器によるものなので客観的である。
４）生菌を一切用いないので安全である。
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法の場合にも幾つかの問題点がある。従来、固相に固定化する抗原は、菌体を超音波破砕して得た上清や、菌体から界面活性剤やＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）等で抽出して得た混合物の画分、あるいは陰イオン交換体による精製（通常、中性〜酸性緩衝液によるグラジエント溶出で２８０ｎｍの紫外部吸収を示す成分を分取する）や、ＳＤＳ電気泳動による精製により電気泳動によって分子量６４ｋＤａ〜６６ｋＤａを有する抗原を得ていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
これら従来の方法によって得られる抗原にはブタのイムノグロブリン中の抗豚丹毒菌抗体を特異的に吸着する性質を有するものが含まれるが、このものは、非特異的な吸着を起こす成分も含んでいるので、個体によって吸着力が大きく異なる。このことが従来法である生菌凝集法との相関を著しく低下させる要因となっていた。豚丹毒菌に共通に存在し、かつ他の菌種との交差反応がない抗原でかつブタのイムノグロブリンを非特異的に吸着する成分を含まずイムノグロブリン中の抗豚丹毒菌抗体のみを特異的に吸着する抗原を得る必要がある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これまでに研究された豚丹毒菌のＥＬＩＳＡ用抗原で電気泳動法により求めた分子量６４〜６６ｋＤａの抗原中にブタのイムノグロブリンを非特異的に吸着する成分が存在することを見いだし、該成分の除去法を鋭意研究した。その結果、通常の陰イオン交換クロマトグラフィーでは溶出されない成分にブタのイムノグロブリン中の抗豚丹毒菌抗体のみを特異的に吸着する成分が含まれていることに着目し、本発明を完成した。すなわち、本発明は下記の構成を有する。
【００１０】
１．豚丹毒菌エリジペロトリクス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の菌体より抽出される抗原物質群を下記（１）および（２）の工程に付すことによって得られ、ブタのイムノグロブリンを非特異的に吸着する成分を含まずイムノグロブリン中の抗豚丹毒菌抗体のみを特異的に吸着する抗原。
（１）陰イオン交換体に吸着させた後、中性緩衝液と酸性緩衝液に順次接触させて溶出する成分を除去し、続いて未溶出有効成分をアルカリ性水溶液で溶出させる工程。
（２）電気泳動で求めた場合の分子量が６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの成分を分取する工程。
【００１１】
２．豚丹毒菌エリジペロトリクス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の菌体より抽出される抗原物質群を下記（１）および（２）の工程に付すことを特徴とする上記第１項に記載の抗原の製造方法。
（１）陰イオン交換体に吸着させた後、中性緩衝液と酸性緩衝液に順次接触させて溶出する成分を除去し、続いて未溶出有効成分をアルカリ性水溶液で溶出させる工程。
（２）電気泳動で求めた場合の分子量が６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの成分を分取する工程。
【００１２】
３．上記第１項に記載の抗原をマイクロタイタープレートに固定化し、該マイクロタイタープレートを用いて酵素免疫測定法により抗豚丹毒菌抗体を測定する方法。
【００１３】
４．抗豚丹毒菌抗体がブタ血清中またはブタ乳中に存在するものである上記第３項に記載の抗豚丹毒菌抗体を測定する方法。
【００１４】
５．上記第１項に記載の抗原を固定化したマイクロタイタープレートと、ペルオキシダーゼ標識抗豚ＩｇＧ抗体（二次抗体）、発色基質、陰性コントロール血清、陽性コントロール血清、洗浄液、血清希釈液、二次抗体希釈液および反応停止液から構成される抗豚丹毒菌抗体測定のためのキット。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、抗原の製造に用いられる豚丹毒菌は、小金井株、ＭＦ株、藤沢株（これらの株は農林省家畜衛生試験場より分与される）、ＡＴＣＣ  Ｅ１−６Ｐ株、ＮＦ−４株のいずれの株でもよい。これらのいずれかの菌を適当な培地に接種し培養する。培地としては、０．１重量％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標），０．３％トリスを含むトリプティケースソイブロス（ｐＨ７．８）等が挙げられるが、これらの菌を培養できるものであれば特に制限は無い。培養条件は、例えば３０〜４５℃で１０〜４０時間振とう培養を行うのが適当である。
【００１６】
培養後、遠心分離等の方法で集菌を行い、次に示す方法、例えば菌体を超音波粉砕を行うか、０．０１Ｍ〜０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で４℃〜１０℃で１５〜２５時間撹拌した後、遠心し、その上清を濾過し、その濾液として抽出液を得る。
上記で得られた抽出液に３０〜７０重量％飽和相当の粉末硫酸アンモニウムを加えて撹拌し、４℃〜１０℃で３０分〜２時間静置する。遠心分離（10000rpm、１０分）する事により沈殿部分を得る。沈殿を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む０．０１Ｍ〜０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）等に懸濁し、同緩衝液で透析したものを菌体抽出液とする。
【００１７】
本発明に係わる製造法は、菌体抽出液を前記工程（１）および（２）に付すことにより達成される。
工程（１）において、陰イオン交換体による処理は、陰イオン交換クロマトグラフィーやバッチ法等が挙げられるが、陰イオン交換クロマトグラフィーが簡便で効率の良い方法である。
また、工程（２）の方法は、電気泳動法が代表的な方法であるが、電気泳動で求めた場合の分子量６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの成分を分取できるのであれば、遠心分離法やゲル濾過法でも構わない。
これらの（１）および（２）の工程は、どちらを先に行っても構わないが、工程（１）として陰イオン交換クロマトグラフィー、工程（２）として電気泳動法を実施する場合、電気泳動法で処理できるキャパシティーを考慮すると、まず量の多い菌体抽出液を陰イオンクロマトグラフィーで処理して不要な成分を除去することにより全体量を少なくし、次いで電気泳動法を行うのが好ましい。
【００１８】
工程（１）において、使用する陰イオン交換体は、ジエチルアミノエチル基を有する陰イオン交換体であれば何でも良い。例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社製）、ＤＥＡＥーセルロファイン（生化学工業（株）製）等がある。陰イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、この陰イオン交換体を担体に用いる。陰イオン交換体は開始緩衝液を用いて適当な大きさのガラスカラムに充填する。開始緩衝液として０．０１Ｍ〜０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）を用い、約２０倍容量の該緩衝液で担体を十分に平衡化する。精製に用いる担体量は抗原を含む抽出液の量によって異なるが、概ね５〜５０ｍｌ程度である。
【００１９】
開始緩衝液で平衡化した担体１ｍｌ当たりに抽出液を５ｍｌの割合で加え、担体容積の２０倍の開始緩衝液を流す。次に、中性緩衝液（例えば０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）等）を用いて溶出される成分を除去する。この成分は２８０ｎｍの紫外部吸収を示すので、モニターすることができる。次に酸性緩衝液（例えば１Ｍ酢酸ナトリウム塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）等）を担体容積の５倍程度流す。最後にアルカリ性水溶液（例えば代表的なものとして水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物の水溶液等が挙げられる。濃度は０．１〜１．０Ｍ程度が適当である。）を流す。この溶液で溶出されたピークをフラクションコレクターにて分取する。
集めた画分を０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液に対して４℃〜１０℃で１８時間〜２４時間透析する。透析後、体積を測定してから凍結乾燥し次の工程まで冷暗所望ましくは−８５℃〜−２０℃で保存する。
【００２０】
次に、工程（２）の電気泳動による精製法として、例えば分取用電気泳動装置として市販されているバイオフォレーシス（アトー社製）あるいはプレップセル（バイオラッド社製）等が利用できる。この工程で凍結乾燥粉末を電気泳動でさらに精製する。試料液の調製法は、凍結乾燥粉末に上記で透析後に測定した体積の１／２０容の０．０６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、さらに先の体積の１／４００容の２−メルカプトエタノールを加える。適当なふた付き容器に移し、１００℃の沸騰浴中で３分〜５分、あるいは５６℃で３０分、もしくは３７℃で１８時間〜２４時間加温反応させる。７０重量％グリセロール、０．１重量％ブロモフェノールブルーを含む０．０６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加温反応後の試料液に１／１０容加えて撹拌する。使用時まで冷暗所望ましくは−２０℃〜−８５℃で保存する。
【００２１】
次に分取型の電気泳動ゲルを作成する。基本はＳＤＳ電気泳動法と全く同様である。分離ゲルは５．０容量％〜７．５容量％ポリアクリルアミドゲルが望ましく、濃縮ゲルは３容量％〜５容量％ポリアクリルアミドゲルが望ましい。泳動条件等は市販の分取型電気泳動装置のプロトコルに従えばよい。溶出部をフラクションコレクターで集める。
【００２２】
得られた画分について分析用サイズのＳＤＳ電気泳動を行う。クマジーブリリアントブルー染色により、６４〜６６ｋＤａの分子量の抗原が認められる画分を選び、最終精製抗原（本発明の抗原）とする。
精製された抗原は生理食塩水で透析し、界面活性剤を充分除去することが望ましい。抗原液を凍結乾燥し、白色粉末とするかもしくは生理食塩水溶液として使用時まで冷暗所、望ましくは−２０℃の冷凍庫で保存する。
【００２３】
次にＥＬＩＳＡ法に用いる、抗原が固定化された固相の作製方法をマイクロタイタープレートを例にして述べる。
６４〜６６ｋＤａ抗原の蛋白量を適当な方法で測定する。例えばＢＳＡ（牛血清アルブミン）を標準液としたローリー法が適している。ＢＳＡ換算で１０ｎｇ〜１μｇ／ｍＬの蛋白濃度となるように適当な溶媒に抗原を溶解し、抗原溶液を作製する。溶媒としては０．０５Ｍ〜０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、０．０１Ｍ〜０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ〜０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）等が挙げられるが、中性〜弱アルカリ性の溶媒であればこの限りではない。抗原溶液を１００μＬづつマイクロタイタープレートのウェルに分注する。用いるマイクロタイタープレートは、９６穴式のポリスチレン樹脂製の平底型が望ましい。その後、マイクロタイタープレート（以下プレートという）を４℃〜１０℃で１５時間〜２４時間静置する。
０．０５重量％〜０．１重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で該プレートを洗浄する。洗浄回数は５回程度が望ましい。
【００２４】
次にブロッキング操作を行う。ブロッキング剤としては牛血清アルブミン、オブアルブミン、スキムミルク、ゼラチンまたはカゼインなどの０．１重量％〜１０重量％の生理食塩溶液を用いることが出来る。該プレートに３００μＬずつブロッキング剤を含む溶液を分注し、該プレートを４℃〜１０℃で１５時間〜１８時間静置する。
該プレートを０．０５重量％〜０．１％重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で洗浄する。
洗浄が終了したプレートを水気を良く切った後、室温中で自然乾燥又は減圧乾燥させる。以上のように抗原を固定化して得られたプレートを乾燥剤が同封されたビニール袋に入れれば、４℃にて長期保存が可能である。
【００２５】
次にＥＬＩＳＡの術式について述べる。
被検血清を５〜２００倍に希釈する。血清を希釈するための溶液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）および１重量％から１０重量％のブロッキング剤を含む生理食塩水が望ましい。同様に、陰性コントロール血清および陽性コントロール血清も希釈する。希釈した被検血清ならびに陰性コントロール血清および陽性コントロール血清を上記作成したプレートのウェルに１００μＬずつ加える。測定は２連以上で行うことが望ましい。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを２０℃〜３７℃で一定時間望ましくは３０分以上静置する。
次に、洗浄液でプレートを洗浄する。洗浄液は０．０５重量％〜１．０重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水が適当である。洗浄回数は３回〜１０回が適当である。
【００２６】
次に、二次抗体を上述のウェルに１００μＬずつ加える。２次抗体は市販のペルオキシダーゼ標識抗ブタＩｇＧ抗体を用いることが出来る。例えばペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ブタＩｇＧ抗体（ベチル社製）、ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ブタＩｇＧ抗体（カペル社製）等が適当である。
二次抗体を希釈液で５０００〜１００００倍に希釈する。希釈用の液は上記血清希釈用の液が望ましい。
二次抗体を加えた後、蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、２０℃〜３７℃で一定時間望ましくは３０分以上静置する。
次に、洗浄液でプレートを洗浄する。洗浄液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水が適当である。洗浄回数は３回〜１０回が適当である。
【００２７】
次に、発色操作を行う。二次抗体の標識酵素がペルオキシダーゼの場合、発色基質は２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン等が適当である。過酸化水素を含むこれらの発色基質溶液を１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせる。
１５分〜４０分間、２０℃〜３７℃で静置後、反応停止液を５０〜１００μＬずつウェルに加えて発色反応を停止させる。反応停止液としては、１Ｍ〜２Ｍ硫酸水溶液、１Ｍ〜４Ｍ塩酸水溶液、１Ｍ〜３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液が挙げられる
直ちにプレートリーダーで発色反応を停止させたプレートの吸光度を測定する。酵素や用いた発色基質により極大吸収が異なるので、最適波長を選択する。例えば酵素がペルオキシダーゼで発色基質が２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸の場合は４０５ｎｍ〜４１５ｎｍ、同じく酵素がペルオキシダーゼで発色基質が３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンの場合は４５０ｎｍが適当である。
得られた吸光度は被検血清中の抗原に対する抗体量に比例対数的に増加する。この結果から抗体価の高低を比較する。
【００２８】
抗原固定化プレート、ならびにこれに付随する、陰性コントロール血清、陽性コントロール血清、洗浄液、二次抗体溶液、血清希釈用液、発色基質および反応停止液はあらかじめ調製して安定な条件下、例えば凍結乾燥あるいは安定剤を添加した溶液状態で４℃〜８℃で保存すれば長期保存および即時使用可能となる。測定用キットは上記の条件で調製した抗原固定化プレート及びこれに付随する二次抗体溶液、血清希釈用液、発色基質、反応停止液をセットしたものからなる。キットは上述と同様の方法で使用する。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１（抗原の部分精製）
豚丹毒菌の培養
豚丹毒菌として小金井株を用いた。培地は以下の組成である。
豚丹毒菌培地（１０００ｍｌ中）
トリプティックソイブロス          ３０ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０                      １ｇ
トリスヒドロキシルアミノメタン      ３ｇ
精製水                              残量
以上を混和し、ｐＨを７．８に調整した。
上記培地５Ｌに豚丹毒菌を接種し、３７℃で２０時間振とう培養した。
【００３０】
菌体からの抗原の部分精製
培養後、培養液を１００００×ｇで２０分間遠心し、沈殿部の菌体を集めた。上清部は後記の培養上清からの抗原の部分精製に使用する。沈殿部に生理食塩水を１００ｍｌ加えて懸濁し、再度１００００×ｇで２０分間遠心して沈殿を集めた。
沈殿部に０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を２００ｍｌ加えて、４℃で１８時間ゆっくり攪拌した後、１００００×ｇで２０分間遠心し、上清を得た。上清を０．１Ｍ塩酸でｐＨ８．０に調整して得られた抽出液に対して３０％飽和相当となるよう硫酸アンモニウム粉末を加えて溶解した。４℃で１時間静置後、１００００×ｇで２０分間遠心し、沈殿を集めた。
【００３１】
沈殿部に０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）を加えて緩やかに超音波分散を行い菌体抽出試料液とした。
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）をφ３．２ｃｍ×８ｃｍのベッド容積となるようにガラスカラムに充填し、開始緩衝液の０．０１Ｍトリス塩酸酸緩衝液（ｐＨ９．５）で担体を十分に平衡化した。菌体抽出試料液の４０ｍｌをイオン交換体に乗せ、開始緩衝液を流した。次に、０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）でグラジエント溶出を行った。溶出部は２８０ｎｍの紫外部吸収をモニターしながらフラクションコレクターにて分取した（溶出部Ａ）。次に１Ｍ酢酸ナトリウム塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を流した。カラム出口のｐＨが３．０になった時点から１カラム体積分の同緩衝液を流した。次に０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を流し、溶出部をフラクションコレクターで集めた（溶出部Ｂ）。集めた画分は塩酸あるいは水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０〜ｐＨ８．０となるように調整した。
得られた２つの画分（溶出部Ａと溶出部Ｂ）をそれぞれ０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に対して４℃１８時間透析後、凍結乾燥した。
【００３２】
部分精製抗原の評価
各溶出部の凍結乾燥粉末に０．０６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨを６．８）を５ｍｌ加えて溶解し、２−メルカプトエタノールを０．２５ｍｌ加え、ふた付き試験管に移した。５７℃の沸騰浴中で３０分間加温後、７０重量％グリセロール及び０．１重量％ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を含む０．０６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を０．５ｍｌ加えて電気泳動用の試料液とした。ポリアクリルアミド電気泳動はアトー社製ミニスラブゲル電気泳動装置を用いた。ゲルの作成条件は５容量％濃縮ゲルおよび７．５容量％分離ゲルとし、試料および分子量マーカーを５μｌチャージして２０ｍＡで約９０分間通電した。
泳動後、ウエスタンブロット用メンブランに転写し、１重量％スキムミルク水溶液にメンブランを４℃で２４時間浸漬してブロッキングを行った。
【００３３】
ウエスタンブロット用の血清は、抗豚丹毒菌抗体陽性のブタ血清（１８０日令）、抗豚丹毒菌抗体陰性プライマリーＳＰＦ豚（１８０日令）のブタ血清、および野外の豚丹毒生ワクチン接種後２週間を経た５０日令のブタ血清、同ブタの１５０日令の血清を１重量％スキムミルク、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で２００倍に希釈して用いた。２次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ブタＩｇＧ（カペル社製）を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で１０００倍に希釈して用いた。発色基質は０．００３容量％過酸化水素水を含む４−クロロ−１−ナフトール溶液を用いた。メンブランを希釈した血清溶液に浸漬し、２５℃で１時間反応させ、洗浄液で洗浄後、２次抗体溶液に２５℃３０分間浸漬した。洗浄液で洗浄後、発色基質に浸漬し、３０分後に観察した。
【００３４】
「図１」の様に、菌体試料液の溶出部Ａは抗豚丹毒菌抗体陰性血清にもかかわらず６４ｋＤａ〜６６ｋＤａおよび５０ｋＤａの抗原に強いバンドが認められＩｇＧの非特異的吸着が強いことを示していた。一方、菌体試料液の溶出部Ｂは抗豚丹毒菌抗体陽性血清では６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの位置に明確に現れるが、抗豚丹毒菌抗体陰性血清では同位置にバンドは認められない。このことから、ＥＬＩＳＡとして使用できる６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの抗原は、菌体試料液から得られた溶出部Ｂに含まれるものに限定された。また、５０ｋＤａ付近および３０ｋＤａ以下の分子量の位置に陰性血清でも現れるバンドがあり、本部分精製抗原の中にはいまだＩｇＧの非特異吸着を起こす物質が含まれていることを示していた。日令で見ると菌体試料液では溶出部Ｄの６４〜６６ｋＤａの位置に濃いバンドが認められるのは抗豚丹毒菌抗体陽性の１５０日令と１８０日令のブタで、５０日令のブタは薄いバンドであった。
【００３５】
実施例２（抗原の再精製）
実施例１で得られた知見から、菌体試料液の溶出部Ｂを電気泳動で精製し、菌体試料液の分子量６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの抗原を分取することにより、ＩｇＧの非特的吸着のない抗原が得られると考えられた。分取用電気泳動装置はアトー社製バイオフォレーシスを用いた。ポリアクリルアミドは５容量％の濃縮ゲルおよび７．５容量％の分離ゲルを用い、連続的に分取し、フラクションコレクターで分画した。得られた画分を実施例１で述べたミニゲルによって検定し、菌体試料液の６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの画分のみを集めた。得られた画分を実施例１と同様にウエスタンブロットを行ったところ、「図２」のように抗豚丹毒菌抗体陽性血清では分子量６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの位置に明確なバンドが認められ、陰性血清では全く認められなかった。
【００３６】
実施例３（ＥＬＩＳＡへの応用）
抗原の固定化
実施例２で得られた精製抗原を生理食塩水に対して透析し、抗原のタンパク量をＢＳＡを標準としたローリー法によって求めた。求めた抗原のタンパク含量は１８０μｇ／ｍｌであった。この値をもとに、０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液にタンパク量として１μｇ／ｍｌとなるように抗原を溶解し、抗原溶液とした。
９６ウェル式マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に該抗原溶液を１００μｌずつ全ウェルに加え、４℃で１８時間静置した。
一方、従来のＥＬＩＳＡ抗原の調製法は次の通りである。実施例１で得られた硫酸アンモニウムによる沈殿画分に２重量％ＳＤＳおよび５容量％の２−メルカプトエタノールを含む０．０６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）を２００ｍｌ加えて懸濁し、１００℃で５分間加熱したものを実施例２と同様に分取用電気泳動で分子量６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの抗原を分取し、前記同様に１μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイタープレートに抗原を固定化した。
以下、本発明による抗原を用いたＥＬＩＳＡを新法とし、従来の方法で得られた抗原を用いたＥＬＩＳＡを旧法と呼ぶ。
【００３７】
洗浄
０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水を各ウェルに３００μｌずつ加えてこぼす操作を５回繰り返して洗浄した。
ブロッキング
１重量％のスキムミルクを含む生理食塩水を全ウェルに３００μｌずつ加え、４℃で１８時間静置した。
洗浄
０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水を各ウェルに３００μｌずつ加えてこぼす操作を５回繰り返して洗浄した。
乾燥
洗浄後、水気を良く切り、室温で２時間減圧乾燥させた。乾燥後、シリカゲルの乾燥剤が入ったビニール袋ににプレートを入れ、４℃の暗所で保存し、抗原固定化プレートとした。
【００３８】
新法と生菌凝集法との相関および旧法と生菌凝集法との相関３０日令、５０日令、６５日令、１５０日令 ３００日令の肥育豚および母豚について５個所の農場からランダムに血清を採取した野外血清８３検体および抗豚丹毒菌抗体陰性ＳＰＦ豚血清３３検体を新法、旧法並びに生菌凝集法に供した。
新法および旧法の術式血清希釈用液による血清の希釈１重量％のスキムミルクを含む生理食塩水を血清希釈用液とした。これの９９５μｌに血清を５μｌ加えて供試サンプルとした。
【００３９】
コントロール血清抗豚丹毒菌抗体陽性血清として、生菌凝集法で１６倍を示す血清を陽性コントロール血清とした。また、抗豚丹毒菌抗体陰性血清を陰性コントロール血清とし、それぞれ血清希釈用液で上述の如く希釈した。
二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗ブタＩｇＧウサギ抗体（カペル社製）を、血清希釈用液で２０００倍に希釈して二次抗体用液とした。
発色基質５５ｍＭ−３，３’，５，５’テトラメチルベンチジンのメタノール溶液を作成し、使用時まで４℃の暗所に保存した。
【００４０】
供試サンプルおよび、希釈済みの標準血清を抗原固定化プレートに、１００μｌずつ、４ウェルずつ加えた。フィルムでふたをして３７℃で１時間静置した。０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水でこのプレートを５回洗浄した。最後に水気を良く切り、上述の二次抗体を全ウェルに１００μｌずつ加えた後、フィルムでふたをして３７℃で３０分間静置した。
その後、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で５回このプレートを洗浄した。最後にプレートの水気を良く切り、０．５Ｍ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に発色基質を１／１００容、及び０．３容量％過酸化水素水を１／１００容加えて混和したものをプレートの全ウェルに１００μｌずつ加えた。
２Ｍ−硫酸を全ウェルに１００μｌずつ加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（バイオラッド社製モデル３５５０）で測定した。
【００４１】
以下の式で試験サンプルの値を求めた。
0003689989.tif 000002
【００４２】
生菌凝集法の術式
豚丹毒菌Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄｅ株を実施例１で述べた培地で３７℃２０時間培養した。被検血清は５６℃で３０分間非働化した。９６穴式Ｕ底マイクロタイタープレートに該培地を５０μｌずつ加え、被検血清を端のウェルに５０μｌ加えて１００μｌとした後、隣のウェルに５０μｌ加える。次々に隣のウェルに移すことにより２倍ずつの段階希釈を行う。前記で培養した菌液を該培地で１００倍希釈し、全ウェルに５０μｌずつ加える。被検血清は４倍希釈から始まって８倍、１６倍、３２倍、６４倍．．．２０４８倍希釈まで設定した。３７℃で２０時間静置した後、凝集像を観察し、凝集が認められた最大の希釈倍数を生菌凝集価として表した。
【００４３】
結果を「図３」および「図４」に示した。旧法は生菌凝集価との相関係数が０．４８であったのに対し、新法では０．８１まで向上した。特に旧法では生菌凝集価が低いにもかかわらず、ＥＬＩＳＡの値が高い検体がしばしば認められたが新法では殆どなかった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の抗原は、豚丹毒菌の菌体より抽出される抗原物質群である分子量６４ｋＤａ〜６６ｋＤａの抗原のうち、ブタのイムノグロブリンを非特異的に吸着する抗原を含まないので、本抗原を用いるとＥＬＩＳＡと生菌凝集の相関が高くなり、高感度で特異性が高く、しかも簡便で迅速に抗体価を測定できる。さらに測定に際して使用する試薬類を全て揃えてキットとすることにより、試薬の調製ミスがなくなる上、誰でも簡便でしかも最適な測定条件で行えるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の各溶出部のウエスタンブロット像を模式化したもの。
【図２】実施例２の完全精製抗原のウエスタンブロット像を模式化したもの。
【図３】実施例３の旧法と生菌凝集法との相関を示したグラフ。
【図４】実施例３の新法と生菌凝集法との相関を示したグラフ。
【図１】
0003689989.tif 000003
【図２】
0003689989.tif 000004
【図３】
0003689989.tif 000005
【図４】
0003689989.tif 000006