(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種蛋白質の前駆体をコードするDNA構成物を含んで成るベクターにより形質転換された酵母細胞を培養することにより前記異種蛋白質を製造する方法において、
（ａ）下記の構造：
シグナルペプチド−リーダーペプチド-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-異種蛋白質
〔ここで、
X1は、Lys又はArgであり；
X2は、Lys又はArgであり、X1及びX2は一緒になって酵母プロセッシング部位を規定し；
X3は、Glu又はAspであり、
X4は、次の構造：（A-B）n（ここで、AはGlu又はAspであり、BはAlaであり、そしてｎは１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり、又は次の構造：（C）m（ここで、CはGlu又はAspであり、そしてｍは１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり；
X5は、ペプチド結合又はGluもしくはAspであり；
X6は、Proであり；そして
X7はLys又はArgである〕
を有するポリペプチドをコードするDNA構成物を含む酵母を培地中で培養して、配列：X3-X4-X5-X6-X7-異種蛋白質を有する前駆体を発現せしめ、そして分泌せしめ；
（ｂ）前記培地から前記前駆体を単離し；そして
（ｃ）塩基性アミノ酸残基に対して特異的な蛋白質分解酵素によるイン−ビトロでの蛋白質分解性開裂によりX3-X4-X5-X6-X7配列を除去する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記のシグナルペプチドが、α−因子シグナルペプチド、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、又は酵母BAR1シグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リーダーペプチドが、天然リーダーペプチド又は合成リーダーペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記天然リーダーペプチドがα−因子リーダーペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異種蛋白質が、インスリン、あるいはネイティブインスリンのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の付加もしくは挿入、欠失、及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つインスリンの生物活性を維持しているインスリンアナログである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記蛋白質分解酵素が、トリプシン、アクロモバクター・リチカス(Achromobacter lyticus)プロテアーゼＩ、エンテロキナーゼ、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びYAP3からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
下記の構造：
シグナルペプチド−リーダーペプチド-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-異種蛋白質
〔ここで、
X1は、Lys又はArgであり；
X2は、Lys又はArgであり、X1及びX2は一緒になって酵母プロセッシング部位を規定し；
X3は、Glu又はAspであり、
X4は、次の構造：（A-B）n（ここで、AはGlu又はAspであり、BはAlaであり、そしてｎは１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり、又は次の構造：（C）m（ここで、CはGlu又はAspであり、そしてｍは１〜５の整数である）を有するアミノ酸の配列であり；
X5は、ペプチド結合又はGluもしくはAspであり；
X6は、Proであり；そして
X7はLys又はArgである〕
を有するポリペプチドをコードするDNA構成物。
【請求項８】
前記のシグナルペプチドが、α−因子シグナルペプチド、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、又は酵母BAR1シグナルペプチドである、請求項７に記載のDNA構成物。
【請求項９】
前記リーダーペプチドが、天然リーダーペプチド又は合成リーダーペプチドである、請求項７又は８に記載のDNA構成物。
【請求項１０】
前記天然リーダーペプチドがα−因子リーダーペプチドである、請求項９に記載のDNA構成物。
【請求項１１】
前記異種蛋白質が、インスリン、あるいはネイティブインスリンのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の付加もしくは挿入、欠失、及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つインスリンの生物活性を維持しているインスリンアナログである、請求項７〜10のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１２】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Argである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１３】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Lysである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１４】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Pro Lysである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１５】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Ala Glu Ala Pro Lysである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１６】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Ala Pro Lysである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１７】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Glu Glu Pro Lysである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１８】
前記X3-X4-X5-X6-X7が、Glu Glu Glu Pro Lysである、請求項７〜11のいずれか１項に記載のDNA構成物。
【請求項１９】
酵母中で複製することが出来、そして請求項７〜18のいずれか１項に記載のDNA構成物を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項２０】
請求項19に記載の発現ベクターにより形質転換された酵母。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、イースト内で発現及び処理されたポリペプチド、該ポリペプチドをコードするDNA配列を含むDNA構成物、該DNAフラグメントを有するベクター並びに該ベクターで形質転換されたイースト細胞、並びにイースト内で異種の蛋白質を産生させる方法に関する。
発明の背景
イースト生物は、細胞内で合成されるが該細胞外の機能を有するいくつかの蛋白質を産生する。このような細胞外蛋白質は分泌蛋白質と呼ばれる。これらの分泌蛋白質は、小胞体（ER）の膜を横切って発現された産物の有効な方向を確実にするプレ配列を含む前駆体又は前駆形態において、細胞内で最初に発現される。通常シグナルペプチドと呼ばれるプレ配列は、トランスロケーションの間に要求される産物から一般に切断される。いったん分泌経路に入ると、蛋白質はゴルジ装置に輸送される。ゴルジから、蛋白質は細胞液胞もしくは細胞膜のような区画に導かれる異なる経路に従い得るか、又はそれは細胞の外に導かれて外の媒体に分泌され得る(Pfeffer, S.R. and Rothman, J.E.Ann.Rev.Biochem. 56 (1987), 829〜852)。
いくつかの試みは、イーストに対して異種の蛋白質のイーストにおける発現及び分泌について示唆している。ヨーロッパ公報第0088632Aは、要求される蛋白質及びシグナルペプチドをコードするDNAを有する発現ベクターでイースト生物を形質転換し、該形質転換された生物の培養物を調製し、そして該培養媒体から蛋白質を回収することによりイーストに対して異種の蛋白質を発現し、処理し、そして分泌する方法を記載する。シグナルペプチドは要求される蛋白質自体のシグナルペプチド、異種のシグナルペプチド又はネイティブ及び異種のシグナルペプチドのハイブリッドであり得る。
イーストに対して異種のシグナルペプチドの使用に対する問題は、異種のシグナルペプチドが有効なトランスロケーション及び／又はシグナルペプチドの後の切断を確実に行わないことであろう。
サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）MFα１（α因子）は、19アミノ酸長のシグナル−又はプレペプチド、次に64アミノ酸長の“リーダー”又はプロペプチドを含み、３つのＮ−結合グリコシル化部位、次に（Lys Arg（Asp／Glu, Ala）2〜3α−因子）4を含む165アミノ酸のプレプロ形態として合成される（Kurjan, J. and Herskowitz, I. Cell 30 (1982), 933〜943）。プレプロMFα１のシグナル−リーダー部分は、Ｓ．セレビシアエ（S. cerivisiae）において異種蛋白質の合成及び分泌を得るのに広く用いられている。
イーストに対して異種のシグナル／リーダーペプチドの使用は、例えば米国特許第4,546,082号、ヨーロッパ公報0116201A, 0123294A, 0123544A, 0163529A、及び0123289A並びにヨーロッパ特許0100561Bから知られている。
EP 0123289Aにおいて、Ｓ．セレビシアエα因子前駆体の利用が記載される一方、EP 100561はサッカロマイセス・セレビシアエPH05シグナルの利用を記載し、PCT公報WO 95／02059は外来蛋白質の分泌のためのYAP3シグナルペプチドの利用を記載する。
米国特許4,546,082並びにヨーロッパ公報0016201A, 0123294A, 0123544A、及び0163529Aは、サッカロマイセス・セレビシアエからのα−因子シグナル−リーダー（MFα１又はMFα２）がイーストにおける発現される異種蛋白質の分泌過程において利用される方法を記載する。Ｓ．セレビシアエMFα１シグナル／リーダー配列をコードするDNA配列を、要求される蛋白質のための遺伝子の５′末端に融合することによる該要求される蛋白質の分泌及び処理が示される。
EP 206,783はＳ．セレビシアエからのポリペプチドの分泌のためのシステムを開示する。これにより、α−因子リーダー配列は、α−因子処理部位Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Alaを通して異種のポリペプチドにそれ自体融合されたリーダーペプチドを残すようにネイティブのリーダー配列上に存在する４つのα−因子ペプチドを除去するように端を切り取られている。この構造物は（50アミノ酸未満の）より小さなペプチドの効果的な処理を導くことが示される。より大きなポリペプチドの分泌及び処理のために、ネイティブのα−因子リーダー配列は、リーダーペプチドとポリペプチドとの間の１又は２のα−因子ペプチドを残すように端が切り取られている。
いくつかの分泌蛋白質は、２つの保存性塩基性アミノ酸のカルボキシ末端においてペプチド結合を切断することができる蛋白質分解処理システムに露出されるような経路をとる。この酵素活性はKEX2遺伝子によりコードされたＳ．セレビシアエにおいてである（Julius, D.A. et al., Cell 37 (1984b), 1075）。KEX2プロテアーゼによる産物の処理は活性型Ｓ．セレビシアエ交配因子α１（MFα１又はα−因子）の分泌に必要とされるが、活性型Ｓ．セレビシアエ交配因子ａの分泌には関連しない。
分泌される予定のポリペプチドの分泌及び正確な処理は、先に与えられた引用に示されるように構築されたベクターで形質転換されたイースト生物を培養するいくつかの場合に得られる。しかしながら多くの場合、分泌のレベルが極めて低いか又は分泌がなく、あるいは蛋白質分解処理は不正確もしくは不完全であり得る。PCT WO 90／10075に記載されるように、これはそれを蛋白質分解切断にアクセス不能又はほとんどアクセス不可能にするような、リーダーペプチドのＣ末端と異種蛋白質のＮ末端との間に存在する処理部位の不十分な露出にある程度起因すると信じられている。
WO 90／10075は、リーダーペプチドのＣ末端及び／又はリーダーペプチドに融合された異種ポリペプチドのＮ末端における処理部位近くに特定の修飾を与えることにより得られた異種ポリペプチドの改良された処理を有するイースト発現システムを記載する。これにより、未修飾のリーダーペプチド−異種ポリペプチド構造物で得られるより高い正確に処理された蛋白質の収率を得ることが可能である。
発明の概要
本発明は、培養培地からの精製の前の自然発生するイーストプロテアーゼ又は培養培地からの産物の精製の間もしくはその後の試験管内蛋白質分解のいずれかにより切断され得る伸長物として設計された異種ポリペプチドのＮ末端の改良を記載する。
本発明は、次の構造：
シグナルペプチド−リーダーペプチド−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−異種蛋白質
〔ここでＸ1はLys又はArgであり；
Ｘ2はLys又はArgであり、Ｘ1及びＸ2は共にイースト処理部位を規定し；
Ｘ3はGlu又はAspであり；
Ｘ4は次の構造：
（Ａ−Ｂ）n
（ここで、ＡはGlu又はAspであり、
ＢはAla, Val, Leu又はProであり、そして
ｎは０又は１〜５の整数であり、ｎ≧２の場合、Ａ及びＢの各々は他のＡ及びＢと同じもしくは異なる）
を有するアミノ酸の配列であり、又は
Ｘ4は次の構造：
（Ｃ）m
（ここで、ＣはGlu又はAspであり、
ｍは０又は１〜５の整数である）
を有するアミノ酸の配列であり；
Ｘ5はペプチド結合又は同じもしくは異なり得る１以上のアミノ酸であり；
Ｘ6はペプチド結合又はPro, Asp, Thr, Glu, Ala及びGlyからなる群から選択されるアミノ酸残基であり；
Ｘ7はLys又はArgである〕
を有するポリペプチドをコードするDNA構成物に関する。
本文脈において、“シグナルペプチド”という言葉は天然において支配的に疎水性であり、イーストにおいて発現される細胞外蛋白質の前駆体形態におけるＮ末端配列として供するプレ配列を意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は異種蛋白質が小胞体に入るように分泌されるのを許容することである。シグナルペプチドはこの目的の過程において通常切断される。シグナルペプチドは蛋白質を産生するイースト生物に対して異種又は同種であり得るが、シグナルペプチドのより効果的な切断は問題のイースト生物に対して同種である場合に得られうる。
“リーダーペプチド”という表現は、その機能が異種蛋白質が小胞体からゴルジ装置、更には媒体内への分泌のための分泌ベシクルに向かって分泌されること（即ち細胞壁を横切って又は少くとも細胞膜を通しての細胞の細胞周辺腔への発現された蛋白質又はポリペプチドの輸送）を許容する支配的に親水性のペプチドを示すと理解される。
“異種蛋白質”という表現は、天然において宿主イースト生物により産生されない蛋白質又はポリペプチドを示すと意図される。
Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7は共に、異種ポリペプチドのＮ末端における伸長部を形成する。この伸長部は発酵産出量を増加させるばかりでなく、Ｘ3の存在のためにジペプチジルアミノペプチダーゼ(DPAP A)処理に対して保護され、結果としてポリペプチドの同種Ｎ末端となる。伸長部は、培養培地からの異種蛋白質産物の精製前に、例えばイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）のようなDPAP以外の自然発生性イーストプロテアーゼにより切断されるであろうように作製され得る。あるいは伸長部は、Ｎ末端伸長異種蛋白質産物が、次の例えばトリプシン、アクロモバクター・リチカスプロテアーゼＩ又はエンテロキナーゼによる試験管内成熟のために培養培地から精製され得るように発酵の間に蛋白質分解切断に対して耐性があるように作製され得る。
更に他の態様において、本発明は、異種蛋白質の発現及び分泌を得るために適切な培地内で形質転換されたイースト株を培養し、その後培地から蛋白質を単離することを含むイーストにおいて異種蛋白質を産生するための方法に関する。
発明の詳細な記載
ペプチド構造（Ａ−Ｂ）nにおいて、ｎは好ましくは２〜４、更に好ましくは３である。
本発明に従う好ましいポリペプチドにおいて、Ｘ3はGluであり得、ＡはGluであり得、ＢはAlaであり得、Ｘ5はペプチド結合もしくはGlu、又はGlu Pro Lys Alaであり得、又はＸ6はProもしくはペプチド結合であり得る。
可能なＮ末端伸長部Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7の例は、
Glu Glu Ala Glu Ala Glu (Pro/Ala)(Glu/Lys)
(Ala/Glu/Lys/Thr) Arg Ala Pro Arg,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Pro Lys Ala (Thr/Pro) Arg,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Arg,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Pro Lys,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Arg,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala (Asp/Ala/Gly/Glu) Lys,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala (Pro/Leu/Ile/Thr) Lys,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg,
Glu Glu Ala Glu Ala Glu (Glu/Asp/Gly/Ala) Lys,
Glu Glu Ala Glu Ala Pro Lys,
Glu Glu Ala Pro Lys,
Asp Asp Ala Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg,
Glu Glu Glu Glu Pro Lys,
Glu Glu Glu Pro Lys,
Asp Asp Asp Asp Asp Lys、及び
Glu Glu Pro Lys
である。
本発明のポリペプチドのシグナルペプチド配列は、細胞の分泌経路への発現されたポリペプチドの有効な方向づけを確実にするいずれのシグナルペプチドでもあり得る。シグナルペプチドは、天然のシグナルペプチドもしくはその機能的一部分、又は合成ペプチドであり得る。適切なシグナルペプチドはα−因子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、修飾カルボキシペプチダーゼシグナルペプチドもしくはイーストBAR1シグナルペプチド並びにイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチドであることが見い出されている。マウス唾液アミラーゼシグナル配列は
0003730255.tif 000002
Nature 289, 1981, pp.643〜646により記載される。カルボキシペプチダーゼシグナル配列はL.A.Valls et al., Cell 48 , 1987, pp.887〜897により記載される。BAR1シグナルペプチドはPCT公報WO 87／02670に開示される。イーストアスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチドはPCT公報95／02059に記載される。
本発明のポリペプチドのリーダーペプチド配列は小胞体を通して更に分泌経路に沿って発現されたポリペプチドを方向づける機能を有するいずれかのリーダーペプチドであり得る。この目的に適した可能なリーダー配列は、α−因子リーダー又はその機能的アナログのようなイースト又は他の生物から得られる天然のリーダーペプチドである。リーダーペプチドは合成ペプチド、例えばPCT公報WO 89／02463又はWO 92／11378に開示される合成リーダーペプチドの１つでもあり得る。
本発明の方法により製造されたＮ末端伸長異種蛋白質はイースト内で有利に産生され得るいずれかの蛋白質であり得る。これらの蛋白質の例は、アプロチニン、組織因子経路インヒビターもしくは他のプロテアーゼインヒビター、並びにインスリンもしくはインスリン前駆体、インスリンアナログ、インスリン様成長因子ＩもしくはII、ヒトもしくはウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクティベーター、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（GLP-1）、因子VII、因子VIII、因子ＸIII、血小板由来成長因子、酵素、又はこれらの蛋白質のいずれかの機能的アナログである。本文脈において“機能的アナログ”という言葉は、ネイティブ蛋白質（これはネイティブ蛋白質の生物学的活性のレベルよりむしろ天然に関するとして理解されると意図される）として同様に機能するポリペプチドを示すことを意味する。このポリペプチドはネイティブ蛋白質と構造的に類似し得、ネイティブ蛋白質のＣ及びＮ末端のいずれかもしくは両方への１以上のアミノ酸の付加、ネイティブアミノ酸の１もしくはいくつかの異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、ネイティブ蛋白質のいずれかもしくは両方の端又はアミノ酸配列の１以上の部位における１以上のアミノ酸の欠失、又はネイティブアミノ酸の１以上の部位における１以上のアミノ酸の挿入によりネイティブ蛋白質から誘導され得る。このような修飾は先に記載のいくつかの蛋白質において公知である。
適切なインスリン前駆体及びインスリンアナログの例は、（例えばEP 163529に記載されるような）B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)、（例えばPCT公報95／00550に記載されるような）B(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A(1-21)、（PCT公報95／07931に記載されるような）B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)、及びB(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)である。
本発明のポリペプチドをコードする本発明のDNA構成物は確立された標準的方法、例えばS.L.Beaucage and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters  22, 1981, pp.1859〜1869により記載されるホスホアミジト法又はMatthes et al., EMBO Journal 3, 1984, pp.801〜805により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジト法に従うと、オリゴヌクレオチドが、例えば自動DNAシンセサイザー、精製、二本鎖化、結合して合成DNA構成物を形成する。DNA構成物を調製する現在の好ましい方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されるようなポリメラーゼ鎖反応（PCR）による。
本発明のDNA構成物は、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、例えば標準的な技術（例えばSambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, 1989）に従う合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより本発明のポリペプチドの全部又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによるゲノム又はcDNA源のものでもあり得る。この場合、シグナル及びリーダーペプチドをコードするゲノム又はcDNA配列は異種蛋白質をコードするゲノム又はcDNA配列に結合され得、その後DNA配列は、例えば公知の手順に従って同種組換え体のための要求されるアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより、ポリペプチドのアミノ酸配列Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7に相当する部位において修飾され得る。
最後に、DNA構成物は、標準的技術に従う、（適切には）合成、ゲノムもしくはcDNA源のフラグメントのアリーリングにより調製される混合された合成及びゲノム、混合された合成及びcDNA又は混合されたゲノム及びcDNA源、全DNA構成物の種々の部分に相当するフラグメントのものであり得る。これにより、異種蛋白質をコードするDNA配列はゲノム又はcDNA源のものであり得、一方シグナル及びリーダーペプチドをコードする配列並びにＮ末端伸長部Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7をコードする配列は合成的に調製され得ることが認識され得る。
更なる態様において、本発明はイースト内で複製することができ、先に定義されるポリペプチドをコードするDNA構成物を有する組換え発現ベクターに関する。組換え発現ベクターは、イースト生物内で複製することができるいずれかのベクターであり得る。このベクターにおいて、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は適切なプロモーター配列に作用的に接続されるべきである。プロモーターは、イースト内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であり得、イーストに対して同種又は異種のいずれかである蛋白質をコードする遺伝子から得られうる。プロモーターは好ましくは、イーストに対して同種である蛋白質をコードする遺伝子から得られる。適切なプロモーターの例は、サッカロマイセス・セレビシアエMα１, TPI, ADH又はPGKプロモーターである。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列も適切なターミネーター、例えばTPIターミネーターに作用的に接続され得る（例えばT.Alber and G.Kawasaki, J.Mol.Appl.Genet. 1 , 1982, pp.419〜434）。
本発明の組換え発現ベクターは、該ベクターがイースト内で複製することを可能にするDNA配列を更に含む。このような配列の例はイーストプラスミド２μ複製遺伝子REP1-3及び複製の源である。ベクターは、選択可能マーカー、例えばP.R.Russell, Gene 40 , 1985, pp.125〜130に記載されるようなスキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子も含み得る。
本発明のポリペプチド、プロモーター及びターミネーター各々をコードするDNAを結合するために、並びにそれらをイースト複製のために必要な情報を含む適切なイーストベクター内に挿入するために用いられる方法は、当業者に公知である（例えばSambrook et al., 前掲）。最初に本発明のポリペプチドをコードする全DNA配列を含むDNA構成物を調製し、次に適切な発現ベクター内にこのフラグメントを挿入すること、又は（シグナル、リーダー又は異種蛋白質のような）個々の要素についての遺伝情報を含むDNAフラグメントを連続的に挿入し、次に結合することのいずれかにより、ベクターが作製され得ることが理解されよう。
本発明の方法に用いられるイースト生物は、培養によって大量の問題の異種蛋白質又はポリペプチドを産生するいずれかの適切なイースト生物であり得る。適切なイースト生物の例は、イースト種サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、又はサッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）であり得る。イースト細胞の形質転換は、例えばそれ自体周知の様式におけるプロトプラスト形成後の形質転換により行われ得る。細胞を培養するのに用いられる培地はイースト生物を増殖させるのに適したいずれかの慣用的培地であり得る。その重大な割合が正確に処理された形態において培地内に存在するであろう分泌された異種蛋白質は、遠心又はろ過により培地からイースト細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムの手段によりその上清もしくはろ過物の蛋白質の構成物を沈殿させ、次に種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等により精製することを含む慣用の方法により培地から回収され得る。
培養培地への分泌の後、蛋白質は配列Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7を除去するための種々の方法が行われ得る。
Ｘ6がPro, Thr, Ser, Gly、又はAspである場合、伸長部は発酵の間、異種蛋白質に安定して付着され、DPAPのようなイーストプロテアーゼの蛋白質分解活性に対して異種構造の蛋白質のＮ末端を保護する。異種蛋白質におけるＮ末端伸長部の存在は、蛋白質の化学的処理の間異種蛋白質のＮ末端アミノ基の保護として作用し得る。即ち、それはBOC又は類似した保護基の置換物として作用し得る。このような場合、アミノ酸配列Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7は、末端伸長部がＸ7で切断されるように塩基性アミノ酸（例えばLys又はArg）に特異的である蛋白質分解酵素の手段により、回収された異種蛋白質から除去され得る。このような蛋白質分解酵素の例は、トリプシン、アクロモバクター・リチカス（Achromobacter lyticus）プロテアーゼＩ、エンテロキナーゼ、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ、及びサッカロマイセス・セレビシアエのイーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）である。
YAP3はサッカロマイセス・セレビシアエにおいて種々のプロホルモン及び異種蛋白質の発現に適用することを特徴とする（Niamh, X.C. et al., FEBS Letters, 332 , p.273〜276, 1993 ; Bourbonnais, Y. et al., EMBO Journal, 12, p.285〜294, 1993 ; Egel-Mitani, M. et al., YEAST,  ６, P.127〜137, 1990）。
YAP3はサッカロマイセス・セレビシアエの大規模発酵の間に現れる。pHがpH３〜約pH６である場合にそれが活性化される。YAP3の出現は産生のための培地の最小タイプを用いて最も促進される。このような培地において、細胞はグルコース及び／又は窒素が、奪われるが、増殖条件を限定する他の条件が用いられ得る。YAP3プロテアーゼは切断部位に隣接する規定されたモチーフを必要とする。このようなモチーフは、Ｘ7のすぐ上流のアミノ酸がAla又はGluである場合にＮ末端伸長部に存在する（しかしＸ6がPro, Thr, Ser, Gly又はAspの場合、存在しない）。
これにより、Ｘ6がペプチド結合（及びＸ7の上流のアミノ酸がAla又はGlu）である場合、伸長部は最も好ましくはイースト細胞からのその分泌の後に、発酵の間、異種蛋白質から切断され得る−イースト細胞又は増殖培地内においてその基質（リシン又はアルギニンの後のペプチド結合）に作用するYAP3に依存する方法。イースト細胞の内側の、それに付着された、又はそれから出たYAP3は、非伸長産物が増殖培地から精製され得るようにその伸長部が選択的に切断され得る。Ｘ6がAlaもしくはGlu又はペプチド結合である（並びにＸ7の上流のアミノ酸がAlaもしくはGluである）アミノ酸配列Ｘ3−Ｘ7は、イースト細胞にストレスをかけそれらを培地内にYAP3を放出させることによりアミノ酸配列Ｘ3−Ｘ7が切断されることに関連する方法により培地中の異種蛋白質から除去され得る。
イースト細胞にかけられるストレスは、培養培地のpHを6.0未満、好ましくは５未満に減少させる、又はグルコース及び／又は窒素をイースト細胞から奪うことを含み得る。
異種蛋白質を製造するための本発明の方法において、イースト細胞は、細胞の培養により遺伝子が発現され、結果として生ずるプロテアーゼの産物が異種蛋白質からＸ3−Ｘ7のより完全な切断を確実にするように、塩基性アミノ酸残基に特異的であるプロテアーゼをコードする１以上の遺伝子で更に形質転換され得る。
好ましい実施形態において、YAP3をコードする１以上の付加的遺伝子が、細胞の培養により遺伝子が過剰発現され、結果として生ずるYAP3の過剰産物が異種ポリペプチドからのＸ3−Ｘ7のより完全な切断を確実にするように、イースト細胞を形質転換するのに用いられ得る。
本文脈において、イーストアスパラギン酸プロテアーゼ３（YAP3）は、ネイティブYAP3酵素、並びにそのＣ末端が細胞からのYAP3蛋白質の効果的な放出を確実にするために改良されている、もしくは蛋白質分解活性を保持するいずれかの改良が行われているネイティブ酵素から誘導される酵素を含む。
あるいは、プロテアーゼはＡ．リチカス（A. lyticus）プロテアーゼＩ．エンテロキナーゼ又はトリプシンであり得る。
本発明は請求される本発明の範囲を限定することを意図したいずれの手段でもない以下の実施例において更に詳細に記載される。
本発明は次の図面の参照と共に記載される。
図１  Ｎ末端に伸長したポリペプチドを発現する遺伝子を含むプラスミドの作製のための一般的スキームを示す。
図１において以下の記号が用いられる：
１：Ｓ．セレビシアエからのTPI遺伝子プロモーター配列を示す。
２：シグナル／リーダーペプチドをコードする領域を示す（例えばＳ．セレビシアエのα因子遺伝子からのもの）。
３：異種ポリペプチドをコードする領域を示す。
３* ：Ｎ末端伸長異種ポリペプチドをコードする領域を示す。
４：Ｓ．セレビシアエのTPI遺伝子ターミネータ配列を示す。
Ｐ１：Ｎ末端伸長部を決定する合成オリゴヌクレオチドPCRプライマーを示す。
Ｐ２：領域３の増幅のための万能PCRプライマーを示す。
POT ：Ｓ．ポンベからのTPI遺伝子を示す。
２μOri:Ｓ．セレビシアエ内のDNA複製の源を含むＳ．セレビシアエ２μプラスミドからの配列を示す。
ApR ：大腸菌におけるアンピシリン耐性遺伝子及びDNA複製の源を含むpBR322／pUC13からの配列。
図２：位置82におけるLeu及び位置83におけるAspが各々Met及びAlaにより置換されているα−因子シグナル／リーダーペプチドを作り上げる85残基にＮ末端に融合されたインスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)をコードするpJB59におけるDNA配列を示す。
図３：合成シグナル／リーダー配列“YAP3／S1PAVA”にＮ末端に融合されたGLP-17-36AlaをコードするpAK623のDNA配列。
図４：位置82におけるLeu及び位置83におけるAspが各々Met及びAlaにより置換されているα−因子シグナル／リーダーペプチドを形成する85残基にＮ末端に融合されたBchain(1-29)-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)をコードするpKV142のDNA配列。
図５：合成シグナル／リーダー配列“YAP3／LA19”にＮ末端に融合されたBchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)をコードするpAK679のDNA配列。
図６：Ｎ末端伸長部を有する又は有さないインスリン前駆体Bchain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を含む培養物上清のHPLCクロマトグラムを示す。
図７：10％ Tricine-SDS-PAGEゲル上でサイズにより分離された図４に従う産物を示す。
図８：pJB64と比較したpJB176におけるHPLCデータから得られた収率によるYAP3同時発現の存在の効果を示す。
実施例
プラスミド及びDNA
全ての発現プラスミドは、Ｓ．セレビシアエにおけるプラスミド選択及び安定化の目的のためにスキゾサッカロマイセス・ポンベトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子（POT）を含むことを特徴とするWO EP 171 142に記載されるものに類似したC-POTタイプ（図１参照）のものである。このプラスミドはＳ．セレビシアエトリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター（図１の領域１）及びターミネーター（図１の領域４）を更に含む。これらの配列は、シグナル／リーダー／産物をコードするEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントの配列（図１の領域２及び３）を除く全配列である（WO 90／100075に記載される）プラスミドpKFN1003における対応する配列と同一である。異なる異種蛋白質を発現させるために、pKFN1003のEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントは関心のシグナル／リーダー／産物をコードするEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントにより単純に置換される。このようなEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントは、標準的技術（例えばSambrook et al., 1989前掲）に従う合成オリゴヌクレオチド及びPCRを用いて合成され得る。
図１は、Ｎ末端に伸長したポリペプチドを発現する遺伝子を含むプラスミドの作製に用いられる一般的スキームを示す。このスキームは以下のステップを含む。
−  C-POTプラスミドベクターのサンプルを制限ヌクレアーゼEco R Ｖ及びXba Ｉで消化し、最も大きなDNAフラグメントを標準的分子技術（Sambrook J, Fritsch EL and Maniatis T, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
−  （先に記載のプラスミドと同じ又は異なり得る）C-POTプラスミドの他のサンプルを制限ヌクレアーゼEco R Ｖ及びNco Ｉで消化し、領域１及び２を含むフラグメントを単離する。
−  製造元の説明に従うGene Amp PCR試薬キット（Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA）並びに関心の異種ポリペプチドをコードする（先に記載のプラスミドと同じ又は異なり得る）テンプレート上の合成オリゴヌクレオチドプライマーＰ１及びＰ２を用いてポリメラーゼ鎖反応（PCR）を行う。Ｐ１を、それがKEX2処理部位をコードする配列の前の制限ヌクレアーゼNco Ｉ（５′CCATGG３′）のための認識部位、Ｎ末端伸長部及び関心の異種蛋白質のもとのＮ末端をコードする配列と同一の10〜15ヌクレオチドを含むように設計する。Ｐ２（例えば５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′）は、それが領域３並びにSambrook et al., 前掲に記載される標準的技術を用いるＰ１でのPCRにおける制限ヌクレアーゼXba Ｉ（５′−TCTAGA−３′）のためのフラクキング認識部位を増幅するように設計する。
−  PCR産物は制限ヌクレアーゼNco Ｉ及びXba Ｉで消化し、消化されたフラグメントを単離する。
−  単離されたフラグメントを（Sambrook et al, 前掲に記載される）標準的条件下でのT4 DNA連結により共に連結する。
−  連結混合物を、コンピテント大腸菌細胞apr-を形質転換するのに用いられ、Sambrook et al., 前掲に従ってアンピシリン耐性のために選択される。
−  プラスミドを、（Sambrook et al., 前掲に記載される）標準的分子技術を用いて結果として生ずる大腸菌クローンから単離する。
−  Ｎ末端伸長ポリペプチドをコードするDNA配列を確かめる（又は決定する）ため、及びそれが領域２のシグナル／リーダーペプチドをコードするDNA配列と一緒のフレーム内であることを確実にするために、製造元の説明に従って酵素鎖ターミネーション（Sequenase, United States Biochemicals）を用いてDNAシークエンシングを行う。
−  このプラスミドを、以下に詳細に記載されるように、イースト株MT663を形質転換するのに用い、グルコース上での増殖のために選択する：
イースト形質転換：Ｓ．セレビシアエ株MT663(E2-7B XE11-36a／α, Δtpi／Δtpi, pep4-3／pep4-3)（このイースト株MT663はWO 92／11378の出願に関連してドイチエ・サムルング・ウオン・マイクロオルガニズメン・ウント・ツエルクルトゥレンに寄託され、寄託番号DSM 6278が与えられている）をYPGaL（１％バクトイーストエキス、２％ベクトペプトン、２％グルコース、１％ラクテート）上で0.6の600nmにおけるO.D.となるまで増殖させた。
培養物100mlを遠心により集収し、10mlの水で洗浄し、再び遠心して1.2Ｍソルビトール、25mM Na2EDTA pH＝8.0及び6.7mg／mlジチオトレイトールを含む溶液10ml中に懸濁した。この懸濁液を30℃で15分間インキュベートし、遠心して、この細胞を1.2Ｍソルビトール、10mM Na2EDTA、0.1Ｍクエン酸ナトリウム、pH＝5.8、及び２mg Novozym▲Ｒ▼ 234を含む溶液10ml中に再懸濁した。この懸濁液を30℃で30分間、インキュベートし、遠心により細胞を収集し、1.2Ｍソルビトール10ml、及びCAS（1.2Ｍソルビトール、10mM CaCl2、10mM Tris HCl（Tris＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）pH＝7.5））10mlで洗浄し、CAS ２mlで再懸濁した。形質転換のために、CAS−再懸濁細胞１mlをプラスミドDNA約0.1μｇと混合し、室温に15分間放置した。（20％ポリエチレングリコール4000、10mM CaCl2、10mM Tris HCl、pH＝7.5）１mlを加えてこの混合物を更に30分、室温に放置した。この混合物を遠心してこのペレットをSOS（1.2Ｍソルビトール、33％ｖ／ｖ YPD、6.7mM CaCl2）0.1ml中に再懸濁して30℃で２時間、インキュベートした。その後、この懸濁液を遠心して、このペレットを1.2Ｍソルビトール0.5ml中に再懸濁した。その後、52℃における上面寒天（1.2Ｍソルビトール＋2.5％寒天を含むSherman et al., Methods in Yeast Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory (1982)のSC培地）６mlを加え、この懸濁液を同じ寒天硬化されたソルビトール含有培地を含むプレートの上面に注いだ。
実施例１
pJB108及びpJB109の作製
プラスミドpJB59は、Eco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントが位置82におけるLeu及び位置83におけるAspが各々Met及びAlaにより置換されているα−因子プレプロシグナルペプチドの85残基に相当するシグナル／リーダー配列にＮ末端に融合されたインスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)をコードするpKFN1003の誘導体である（図２）。EcoRＩ−XbaＩフラグメントは、製造元の説明に従ってアプライドバイオシステムズDNAシンセサイザー（Perkin Elmer DNA Thermal Cycler）において合成される。
Ｎ末端に伸長したインスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。
0003730255.tif 000003
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載の一般的スキームに従うプラスミドpJB59。PCR及びクローニングにより、インスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)をコードするDNA配列が、Ｎ末端伸長部Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys（ここで、XaaはPro(pJB108 ; CCAによりコードされるPro)又はThr(pJB109 ; ACAによりコードされるThr)のいずれかである）をコードするDNA配列の後にある構成物を生ずる。
実施例２
pJB44, pJB107、及びpJB126の作製
インスリン前駆体Bchain(1-27)-Aps-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)の更にＮ末端に伸長したものを発現するように設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により作製した。
0003730255.tif 000004
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び実施例１に記載されるプラスミドpJB59。結果として生ずるプラスミドpJB44, pJB107及びpJB126を単離した。これらのプラスミドは、Ｎ末端伸長部Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Xaa-Lys（ここでXaaはGlu（pJB44 ; GAAによりコードされるGlu）、Asp(pJB126 ; GACによりコードされるAsp)又はGly(pJB107 ; GGCによりコードされるGly)のいずれかである）の後のインスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)をコードする。
実施例３
pJB64及びpJB110の作製
Ｎ末端に伸長したインスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段より得た。
0003730255.tif 000005
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び実施例１に記載のプラスミドpJB59。結果として生ずるプラスミドpJB64及びpJB110について単離した。これらのプラスミドは、Ｎ末端伸長部Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Xaa-Lys（ここでXaaはGlu（pJB110 ; GAAによりコードされるGlu)又はAla（pJB64 ; GCAによりコードされるAla)のいずれかである）の後のインスリン前駆体Bchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)のＮ末端伸長部をコードする。
実施例４
pAK663の作製
プラスミドpAK623は、Eco R Ｉ−XbaＩが合成シグナルリーダー配列YAP3／S1PAVAにＮ末端に融合されたGLP-17-36AlaをコードしているpKNF1003の誘導体である。
EcoRＩ−XbaＩフラグメントを製造元の説明に従ってApplied Biosystems DNAシンセサイザーにおいて合成した。
Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Argの形態におけるＮ末端伸長部を有するGLP-17-36ALAを発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。
0003730255.tif 000006
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載される方法に従うプラスミドpAK623は結果としてプラスミドpAK663となる。
実施例５
Ｎ末端伸長産物の発現及び伸長部の除去
先に記載されるC-POTプラスミド（pJB59, pJB108, pJB109, pJB44, pJB126, pJB107, pJB64及びpJB110）で形質転換されたイースト株MT663をYPD（１％イーストエキス、２％ペプトン及び２％グルコース）寒天プレート上で増殖させた。単一コロニーを用いてYPDブイヨンpH＝6.0中の５ml液体培養を開始し30℃で72時間振とうした。Snel, Damgaard and Mollerup, Chromatographia 24, 1987, pp.329〜332により記載される方法により、産物の収率を培養上清上で直接測定した。
伸長していない形態（pJB59）と比較したＮ末端に伸長したBchain(1-27)-Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を発現するイースト株の結果を次に示す。
0003730255.tif 000007
実施例６
生体内のＮ末端伸長部の除去
プラスミドpJB59, pJB64, pJB44及びpJB108で形質転換されたイースト株の培養物から得られた培養上清（上述参照）をHPLCクロマトグラフィー（図４ａ）により測定し、平行サンプルを10％ Tricine-SDS-PAGEゲルにかけた（図５、レーン１, ２, ３及び４）。HPLCクロマトグラムから、プラスミドpJB44（クロマトグラム３）及びpJB64（クロマトグラム２）を有するイーストからの培養物上清がＮ末端伸長及び非伸長Bchain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-A(1-21)を含んでおり、一方pJB108を有するイースト（クロマトグラム４）からの培養物上清はＮ末端に伸長した形態のみを含んでいる。pJB64の場合、前駆体の約50％が非伸長形態において見い出され（図５レーン２参照）、一方この形態のみがpJB44のマイナー部分を示す。
これらの結果は、伸長部がGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys（pJB64）又はGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys（pJB44）のいずれかである場合の生体内で選択的にＮ末端伸長部を切断するイーストの能力、並びにGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys（pJB108）の形態におけるＮ末端伸長部を切断するイーストの能力の欠如を示す。伸長部を切断する原因である蛋白質分解活性は、イースト細胞のトランスゴルジシステムにおける膜結合YAP3のような分泌経路における酵素と関連し得る。
実施例７
試験管内でのＮ末端伸長部の除去
先に記載される培養物を、YAP3を過剰発現するイースト株ME783（Egel-Mitani et al. 1990）から単離された部分精製YAP3酵素又はアクロバクター・リチカスプロテアーゼＩのいずれかでの蛋白質分解切断のための基質として用いた。
YAP3アッセイを次のように行った：
YAP3酵素４μｌ
無細胞増殖培地800μｌ
サンプルを0.1Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液pH4.0中で37℃で15時間、インキュベートした。
アクロバクター・リチカスプロテアーゼＩアッセイを次のように行った：
Ａ．リチカスプロテアーゼＩ  10μｇ
無細胞増殖培地１ml
サンプルを0.1Ｍトリス緩衝液、pH8.75中で37℃で１時間、インキュベートした。
図４ｂ及び４ｃはYAP3及びＡ．リチカスプロテアーゼＩ消化から各々得られたHPLCクロマトグラフィーにより測定された結果を示す。平行サンプルを10％ Tricine-SDS-PAGEにかけた（図５レーン５−12）。
図４ｂのクロマトグラムから、Ｎ末端伸長部がGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys（pJB64）又はGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Lys（pJB44）の形態である場合にYAP3酵素はＮ末端伸長部を選択的に切断することができるが、Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Pro-Lys（pJB108）ではそうでないことが明らかになる（図５レーン６, ７及び８も参照）。この結果はYAP3又はYAP様酵素が生体内に見られるＮ末端伸長部の部分的切断を引きおこすことを明らかに示す（例えば実施例６）。
図４ｃのクロマトグラムから、全ての場合におけるＡ．リチカスプロテアーゼＩへの消化が同じ産物、即ち前駆体におけるＢ及びＡ鎖の間に見い出されるものを含むBchain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)において見い出される全てのLys残基の後の蛋白質分解切断の最後の結果であるBchain(1-27)-Asp-Lys-（ジスルフィド結合により接続）-Achain(1-21)を生ずることが明らかになる。
（非伸長Bchain(1-27)Asp-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を発現する）pJB59で形質転換されたイーストからの培養物上清の消化の場合、他の消化においては現れない産物が見られる。この産物、Arg-Bchain(1-27)-Asp-Lys-（ジスルフィド結合により接続）-Achain(1-21)は増殖培地中の分泌されたリーダー−前駆体のＡ．リチカスプロテアーゼＩ切断が生ずる。Ａ．リチカスプロテアーゼＩは、イースト細胞の分泌経路におけるKEX2切断を避けた産物の二塩基KEX2部位におけるLys及びArg残基の間を切断する。
実施例８
YAP3を過剰発現することによるＮ末端伸長の除去
Egel-Mitani et al. (Yeast  ６ (1990) pp.127〜137)によりクローンされたYAP3遺伝子を次のようにGlu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Bchain(1-27)-Pro-Lys-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)（実施例３参照）をコードするC-POTプラスミドpJB64内に挿入した。
YAP3遺伝子を含む2.5kb Sal Ｉ／Sac ＩフラグメントをプラスミドpME768(Egel-Mitani et al. Yeast  ６ (1990) pp.127〜137)から単離し、プラスミドpIC19R(March et al. Gene 32 (1984) pp.481〜485)のSal Ｉ及びSacＩ部位内に挿入した。結果として生ずるpME834とされたプラスミドから、YAP3遺伝子を含む2.5kb Sal Ｉ／Xho Ｉフラグメントを単離してpJB64のPOT及びApRの間にある唯一のSal Ｉ内に挿入した。１つの結果として生じたプラスミドをpJB176とした。
イースト株MT663にpJB176を形質転換し、実施例５に記載されるように分析した。
図８に示される収率に基づきHPLCデータから見られ得るように、pJB176内のYAP3遺伝子の存在は、pJB64のイースト形質転換体と比較して、対応するイースト形質転換体の培養物上清における非伸長Bchain(1-27)-Pro-Lys-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)のより高い割合を明らかに引きおこす。
この結果は、YAP3により引きおこされる蛋白質分解のレベルを操作することにより、Ｎ末端伸長部を生体内で選択的に切断する増強された能力を有するイースト株を作る能力を示す。
実施例９
pKV143の作製
プラスミドpKV142は、Eco R Ｉ−XbaＩフラグメントが位置82におけるLeu及び位置83におけるAspが各々Met及びAlaにより置換されているα−因子プレプロシグナルペプチドの85残基に相当するシグナル／リーダー配列にＮ末端に配合されたインスリン前駆体Bchain(1-29)-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)をコードしているpKFN1003の誘導体である（図４）。
Asp-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Ala-Asp-Pro-Argの形態におけるＮ末端伸長部を有するBchain(1-29)-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。
0003730255.tif 000008
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載される一般的スキームに従うプラスミドpKV142。
実施例10
pKV102の作製
Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Argの形態におけるＮ末端伸長部を有するBchain(1-29)-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を次の配列を有するＰ１−プライマーの手段により得た。
0003730255.tif 000009
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及び先に記載の一般的スキームに従うプラスミドpKV142。
実施例11
Ｎ末端に伸長したBchain(1-29)-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)の発現
イースト株MT663をC-POTプラスミドpKV142, pKV143及びpKV102で形質転換し、実施例５に記載のように分析した。
非伸長形態と比較したＮ末端に伸長したBchain(1-29)-Ala-Ala-Arg-Achain(1-21)を発現するイースト株の結果を以下に示す。
0003730255.tif 000010
実施例12
pIM69及びpIM70の作製及び発現
プラスミドpAK679はEco R Ｉ−Xba Ｉフラグメントが合成シグナル／リーダー配列YAP3／LA19にＮ末端に融合されたインスリン前駆体Bchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)をコードしているpKFN1003の誘導体である（図５）。
Ｎ末端に伸長したインスリン前駆体Bchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を発現するよう設計されたプラスミド構成物を、２つの連続的PCR反応を含む方法により得た。次の配列を有するプライマーの手段により最初のPCR反応を行った。
0003730255.tif 000011
Ｐ２−プライマー：５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′及びプラスミドpAK679。
第２のPCR反応をＰ１−プライマーの手段により行った。
0003730255.tif 000012
Ｐ２−プライマー：このPCR反応のためのDNA−テンプレートとして最初のPCR反応のPCR産物を用いる５′−AATTTATTTTACATAACACTAG−３′。
第２のPCR反応のPCR産物を先に記載の一般的スキームに従ってNcoＩ及びXbaＩで切断し、pAK679に連結した。結果として生ずるプラスミド２つについて、各々Glu-Glu-Glu-Pro-Lys （pIM70）及びGlu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys（pIM69）の形態におけるBchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)のＮ末端伸長部をコードすると同定した。
イースト株MT663をC-POTプラスミドpAK579, pIM69及びpIM70で形質転換して実施例５に記載されるように分析した。
pAK579を有するイーストからの非伸長Bchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)の収率が実際にないことが見い出された一方、pIM69及びpIM70を有するイーストが各々大量のGlu-Glu-Glu-Glu-Pro-Lys-Bchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)及びGlu-Glu-Glu-Pro-Lys-Bchain(1-29)-Ala-Ala-Lys-Achain(1-21)を産生することが見い出された。
配列表
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：６アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：サッカロマイセス・セレビシアエ
（xi）配列の記載：配列番号：１：
0003730255.tif 000013
（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：13アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：２：
0003730255.tif 000014
（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：11アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：３：
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（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：10アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：４：
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（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：10アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：５：
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（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：６：
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（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：７：
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（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：８：
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（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：８アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：９：
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（２）配列番号：10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：８アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：10：
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（２）配列番号：11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：７アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：11：
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（２）配列番号：12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：５アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：12：
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（２）配列番号：13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：４アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：13：
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（２）配列番号：14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：22塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：14：
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（２）配列番号：15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：63塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：15：
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（２）配列番号：16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：64塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：16：
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（２）配列番号：17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：61塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：17：
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（２）配列番号：18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：72塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：18：
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（２）配列番号：19の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：19：
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（２）配列番号：20の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：20：
0003730255.tif 000032
（２）配列番号：21の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：21：
0003730255.tif 000033
（２）配列番号：22の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：22：
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（２）配列番号：23の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：23：
0003730255.tif 000035
（２）配列番号：24の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：８アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：24：
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（２）配列番号：25の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：８アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：25：
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（２）配列番号：26の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：９アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：26：
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（２）配列番号：27の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：13アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：27：
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（２）配列番号：28の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：８アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：28：
0003730255.tif 000040
（２）配列番号：29の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：５アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：29：
0003730255.tif 000041
（２）配列番号：30の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：660塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：30：
0003730255.tif 000042
（２）配列番号：31の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：138アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：31：
0003730255.tif 000043
（２）配列番号：32の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：516塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iii）アンチセンス：No
（vi）起  源：
（Ａ）生物名：合成
（xi）配列の記載：配列番号：32：
0003730255.tif 000044
（２）配列番号：33の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：93アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号：33：
0003730255.tif 000045
（２）配列番号：34の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：10アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：34：
0003730255.tif 000046
（２）配列番号：35の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：６アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：35：
0003730255.tif 000047
（２）配列番号：36の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：５アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：36：
0003730255.tif 000048
（２）配列番号：37の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：６アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：37：
0003730255.tif 000049
（２）配列番号：38の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：61アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：38：
0003730255.tif 000050
（２）配列番号：39の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：53アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：39：
0003730255.tif 000051
（２）配列番号：40の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：10アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：40：
0003730255.tif 000052
（２）配列番号：41の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：74塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：41：
0003730255.tif 000053
（２）配列番号：42の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：13アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：42：
0003730255.tif 000054
（２）配列番号：43の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：83塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：43：
0003730255.tif 000055
（２）配列番号：44の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：53アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：44：
0003730255.tif 000056
（２）配列番号：45の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：39塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：45：
0003730255.tif 000057
（２）配列番号：46の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：36塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：46：
0003730255.tif 000058
（２）配列番号：47の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：59アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：47：
0003730255.tif 000059
（２）配列番号：48の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：58アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：48：
0003730255.tif 000060
（２）配列番号：49の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：10アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：49：
0003730255.tif 000061
（２）配列番号：50の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：660塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：50：
0003730255.tif 000062
（２）配列番号：51の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：600塩基対
（Ｂ）型    ：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：DNA
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：51：
0003730255.tif 000063
（２）配列番号：52の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長  さ：55アミノ酸
（Ｂ）型    ：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子型：ペプチド
（iii）ヒポセチカル：No
（iv）アンチセンス：No
（ｖ）フラグメント型：中間部
（xi）配列の記載：配列番号：52：
0003730255.tif 000064
【図１】
0003730255.tif 000065
【図２ａ】
0003730255.tif 000066
【図２ｂ】
0003730255.tif 000067
【図３】
0003730255.tif 000068
【図４ａ】
0003730255.tif 000069
【図４ｂ】
0003730255.tif 000070
【図５ａ】
0003730255.tif 000071
【図５ｂ】
0003730255.tif 000072
【図６ａ】
0003730255.tif 000073
【図６ｂ】
0003730255.tif 000074
【図６ｃ】
0003730255.tif 000075
【図７】
0003730255.tif 000076
【図８】
0003730255.tif 000077