(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒド基を有する溶媒不溶性担体と、一般式（Ｉ）：
0003613585.tif 000019
（式中、Ｘは−Ｓ−または−Ｏ−、R1およびR2は同じかまたは異なり、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、R3は水素原子または一般式（Ｉ）に示されるチッ素原子に隣接する原子が不飽和結合を持たない置換基、R4およびR5は任意の置換基であるが、１化合物中にHX−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）またはHX−Ｃ−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）の部分構造骨格を１つしか持たない）または一般式（II）：
0003613585.tif 000020
（式中、Ｘは−Ｓ−または−Ｏ−、R1、R2およびR6は同じかまたは異なり、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、R3は水素原子または一般式（II）に示されるチッ素原子に隣接する原子が不飽和結合を持たない置換基、R4、R5およびR7は任意の置換基であるが、１化合物中にHX−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）またはHX−Ｃ−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）の部分構造骨格を１つしか持たない）
で示される化合物とを反応させることを特徴とする前記化合物の前記担体への固定化方法。
【請求項２】
前記溶媒不溶性担体が有するアルデヒド基の密度をＡ（μmol/g）、固定化反応系中のアルデヒド基量をａ（μmol）および固定化反応系中の前記一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物量をｂ（μmol）としたとき、
０＜b/a≦100
および
1/1000≦Ａ≦10000
を満たす固定化反応条件を用いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の固定化方法。
【請求項３】
前記溶媒不溶性担体として、アルデヒド基を有さない溶媒不溶性担体にエポキシ基を導入し、該エポキシ基をアンモニアまたはアミンにより開環し、さらに酸化反応によりアルデヒド基を生成させてえられた溶媒不溶性担体を用いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の固定化方法。
【請求項４】
前記化合物の固定化後、処理温度をｔ（℃）および処理時間をｈ（時間）としたとき、
ｔ≧−10×ｈ＋120（250≧ｔ≧20）
を満たす処理を行なうことを特徴とする請求の範囲第１項記載の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はアルデヒド基を有する溶媒不溶性担体にリガンドまたはリガンドが結合している化合物を固定化する方法に関する。
背景技術
担体にリガンドを固定化する方法は、固定化酵素の研究などで数多く研究されており、産業的にも吸着体の製造などに利用されている。代表的なものとして、（１）臭化シアン活性化法によりイミドカルボネートを生成させ、続いてリガンドのアミノ基と反応させる方法、（２）酸アジド誘導体法として知られている方法で、担体上のカルボキシル基をエステル化、ヒドラジド化し、続いてアジド基に変換し、リガンドのアミノ基で置換する方法、（３）ジアゾ法として知られている方法で、担体上にジアゾニウム塩を生成させ、リガンドのアミノ基と反応させる方法、（４）縮合試薬法として知られている方法で、担体上のアミノ基またはカルボキシル基とリガンドのカルボキシル基またはアミノ基とを縮合試薬で縮合する方法、（５）アルキル化法として知られている方法で、担体上に臭化アセチル基または4,6−ジクロロ−ｓ−トリアジニル基を導入し、リガンドのアミノ基と反応させる方法、（６）担体架橋法として知られている方法で、担体上のアミノ基とリガンドのアミノ基とをグルタルアルデヒドで架橋、還元する方法などがあげられる（田中渥夫、川本卓男、現代化学、24〜30頁、1992年７月）。アルデヒド基を有する溶媒不溶性担体にリガンドを固定化する方法は前記（６）の方法を基本としたもので、アミノ基を有するリガンドを反応させ、シッフ塩基を生成させ、続いて還元反応を行なう手法がとられている（還元的アミノ化）。
前記固定化する方法（１）〜（６）の概略を化学反応式によりつぎに示す。なお、以下の化学反応式において、Ｚは担体、Ｅは酵素を表わしている。
0003613585.tif 000002
0003613585.tif 000003
0003613585.tif 000004
0003613585.tif 000005
0003613585.tif 000006
0003613585.tif 000007
しかし、これらの方法は、下記のような欠点を有している。
（ａ）  固定化に用いようとしている官能基がリガンド中に複数存在すると、固定化ポイントが複数存在することになり、特定の位置の官能基で固定化することは極めて困難である。さらにリガンド中に存在する官能基の量が多いと、リガンド中の多点に結合が生じる可能性が高くなり好ましくない。また、多点で結合することを回避するために、前記官能基の量を少なくすると反応収率が低くなる。これらに該当する方法としては、前記（１）、（２）、（３）、（４）、（５）および（６）の方法があげられる。
（ｂ）  競争する副反応が多く、反応収率が低い。これらに該当する方法としては、前記（２）、（３）、（４）および（５）の方法があげられる。
すなわち、これらの方法は、リガンドの特定の位置で溶媒不溶性担体に固定化するにはかなりの制限を受けることになる。とりわけ、リガンドとしてペプチドまたはタンパク質を用いるばあい、側鎖にアミノ基を持つことが多いため（すなわち１分子中に複数のアミノ基が存在することになり）特定のアミノ基での固定化は不可能である。
一方、水溶液中でアルデヒド化合物とアミノエタンチオール（HSCH2CH2NH2）の誘導体とを酸または塩基触媒下に反応させると、チアゾリジン骨格を形成することが有機合成化学の反応として古くから知られている（スモルカ  アイアール（Schomolka IR）、ジャーナル  オブ  ジ  アメリカン  ケミカル  ソサイアティ（J.Amer.Chem.Soc.）、79、4716頁（1957））。また、近年、この古典的な反応をペプチド同士の結合に応用することが検討され、最近、効率よく結合できることが報告されている（シー  エフ  リウ、ジェイ  ピー  タム（C.F.Liu,J.P.Tam）、プロシーデイングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミイ  オブ  サイエンシス  オブ  ジ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、91、6584頁（1994）、シー  ラオおよびジェイ  ピー  タム（C.Rao and J.P.Tam）、ジャーナル  オブ  ジ  アメリカン  ケミカル  ソサイアティ（J.Am.Chem.Soc.）、116、6975頁（1994））。
この方法は、２種のペプチドのうち、一方のペプチドのＣ末端にアルデヒド基を導入し、他方のペプチド（Ｎ末端システイン）を反応させるもので、両反応物が水に溶解した水溶液の状態で反応させるものである。すなわち、このような反応は均一溶液でのみ知られた反応といえる。
一般に固相と液相の反応は極めて進行しにくく、たとえばアミノ基を持つ親水性の化合物Ｍ（たとえばペプチド、アミノ酸、タンパク質またはそれらの誘導体）の末端のアミノ基（−NH2）とカルボキシル基を持つ親水性の化合物Ｎ（たとえばペプチド、アミノ酸、タンパク質またはそれらの誘導体）の末端のカルボキシル基（−COOH）とをDCC（ジシクロヘキシルカルボジイミド（Dicyclohexylcarbodiimide））により脱水縮合するばあい、水溶液中ではDCCが水に不溶（固相）であるため、化合物Ｎのカルボキシル基との反応が進行せず、脱水縮合は起こらないことは周知の事実である。つまり、シー  エフ  リウ（C.F.Liu）ら、シー  ラオ（C.Rao）らにより報告された前記反応も固相と液相の反応へ適用することは極めて困難と思われる。事実、未だかつて前記反応を固相−液相の２相反応へ応用した例はない。
吸着体は、分析、分離、精製、除去を目的として実験用、工業用、治療用、診断用などの分野で広く用いられている。その吸着体の基本的な構成は、担体と呼ばれる展開溶媒に不溶性の固体およびリガンドと呼ばれる対象物質に親和性の高い化合物から成り立っている。
現在、溶媒不溶性担体にリガンドを固定化する方法として、リガンドの特定の位置で特異的に、かつ反応効率よく、しかも安定な結合を形成して固定化する方法は強く求められているにもかかわらず、現状では皆無といえる。本発明者らはその難易度の高さと強い要求を熟知したうえでこの課題に取り組んだ。
すなわち、本発明の目的は、リガンドまたはリガンドが結合している化合物が特定の位置で溶媒不溶性担体と特異的に効率よく反応し、安定な結合を形成して、該担体にリガンドまたはリガンドが結合している化合物を固定化する方法を提供することにある。
発明の開示
本発明は、アルデヒド基を有する溶媒不溶性担体と、一般式（Ｉ）：
0003613585.tif 000008
（式中、Ｘは−Ｓ−または−Ｏ−、R1およびR2は同じかまたは異なり、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、R3は水素原子または一般式（Ｉ）に示されるチッ素原子に隣接する原子が不飽和結合を持たない置換基、R4およびR5は任意の置換基であるが、１化合物中にHX−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）またはHX−Ｃ−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）の部分構造骨格を１つしか持たない）または一般式（II）：
0003613585.tif 000009
（式中、Ｘは−Ｓ−または−Ｏ−、R1、R2およびR6は同じかまたは異なり、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、R3は水素原子または一般式（II）に示されるチッ素原子に隣接する原子が不飽和結合を持たない置換基、R4、R5およびR7は任意の置換基であるが、１化合物中にHX−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）またはHX−Ｃ−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）の部分構造骨格を１つしか持たない）
で示される化合物とを反応させることを特徴とする前記化合物の前記担体への固定化方法（請求の範囲第１項）、前記溶媒不溶性担体が有するアルデヒド基の密度をＡ（μmol/g）、固定化反応系中のアルデヒド基量をａ（μmol）および固定化反応系中の前記一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物量をｂ（μmol）としたとき、
０＜b/a≦100
および
1/1000≦Ａ≦10000
を満たす固定化反応条件を用いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の固定化方法（請求の範囲第２項）、前記溶媒不溶性担体として、アルデヒド基を有さない溶媒不溶性担体にエポキシ基を導入し、該エポキシ基をアンモニアまたはアミンにより開環し、さらに酸化反応によりアルデヒド基を生成させてえられた溶媒不溶性担体を用いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の固定化方法（請求の範囲第３項）、前記化合物の固定化後、処理温度をｔ（℃）および処理時間をｈ（時間）としたとき、
ｔ≧−10×ｈ＋120（250≧ｔ≧20）
を満たす処理を行なうことを特徴とする請求の範囲第１項記載の固定化方法（請求の範囲第４項）
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明では、アルデヒド基を有する溶媒不溶性担体とSHまたはOHおよびアミノ基（NH）を有する前記一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物とを反応させるばあい、該担体のアルデヒド基と該化合物のSHまたはOHおよびアミノ基とが特異的に反応して、安定な結合を形成することが利用され、リガンドが固定化される。
本発明における溶媒不溶性担体とは、反応時、使用時に用いる溶媒に溶解しない担体のことであり、溶媒の具体例としては、たとえば水、アルコール、DMSO、DMF、NMP（Ｎ−メチルピロリドン）、ジオキサン、アセトン、THF（テトラハイドロフラン）などがあげられる。
また、水に酢酸、酢酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、食塩、KClなどを加えて緩衝液にして使用してもよい。これらの溶媒は単独溶媒であってもよく、２種以上混合した溶媒であってもよい。
溶媒として水または水を含む水系溶媒を用いるばあいの溶媒不溶性担体、すなわち水不溶性担体の具体例としては、たとえばガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレンなどの合成高分子からの水不溶性担体や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、キトサンなどの多糖類などからなる有機担体、さらにはこれらの組合せによりえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。これらの担体はそれぞれ単独で用いてもよく、任意の２種以上を併用してもよい。これらの中では親水性担体が非特異吸着が比較的少なく、リガンドによる吸着選択性が良好であるため好ましい。
前記親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水との接触角が60度以下の担体をいう。このような親水性担体としては、たとえば結晶性セルロース、架橋セルロース、キトサン、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸グラフトポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフトポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
これらの親水性担体の中でもOH基が存在する担体は非特異吸着が少ない点ですぐれており、中でも結晶性セルロース、架橋セルロースからなる多孔質ゲルは、（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填したばあい、液体を高流速で流しても圧密化したり目詰まりしたりしないので、高流速で流すことが可能となり、また細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくく、（２）ゲルが結晶性セルロース、架橋セルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうるOH基が多数存在し、非特異吸着も少ない、（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量がえられるなどのすぐれた点を有しており、本発明に用いるもっとも適した担体のひとつであるが、これらのみに限定されるものではない。
本発明に用いるアルデヒド基を有する溶媒不溶性担体は、溶媒不溶性担体にアルデヒド基を導入することによりえてもよい。溶媒不溶性担体へのアルデヒド基の導入方法としては、今までに種々検討されており、どのような導入方法であっても本発明に用いることができるが、一例としてセルロースを原料とした担体へのアルデヒド基の導入方法について述べる。
もっとも簡単にアルデヒド基を導入するには、（ｉ）セルロース担体に過ヨウ素酸ナトリウムを反応させてグルコース環の酸化的開裂によりアルデヒド基を導入する方法、（ii）セルロース担体の有する水酸基にエピクロルヒドリンを反応させてエポキシ基を導入し、導入したエポキシ基をアミン（たとえばNH3、エチレンジアミンなど）と反応させてアミノ基を導入し、導入したアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させて還元的アミノ化によりアルデヒド基を導入する方法などがあげられる。本発明者らは、（ｉ）、（ii）の方法を改良した（iii）の方法として、（ii）の方法でのアミノ基導入後、過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化剤をアミノ基の量の１〜５当量反応させる方法を開発し、以下の理由から好んで用いている。
すなわち、（ii）および（iii）の方法のばあい、（ｉ）の方法に比べてリガンドの固定化反応が側鎖アミノ基でも固定化されるという副反応がおこらない点ですぐれている。また、（iii）の方法のばあい、（ii）の方法に比べて反応条件が穏やかで短時間で簡便に行なえる点ですぐれている。（iii）の方法の特徴は、末端官能基である
0003613585.tif 000010
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数が任意、通常炭素数１〜４のアルキル基（具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、アミノエチル基（−CH2CH2−NH2）など）を表わす、反応操作、反応性の点から好ましいＲは水素原子である）
に対して酸化反応を行ない、アルデヒド基に導くところにある。この反応は定量的、かつ５分間程度という短時間で完結する反応である。
（iii）の方法の概略を化学反応式によりつぎに示しておく。
0003613585.tif 000011
本発明において、溶媒不溶性担体に導入したアルデヒド基と反応させる化合物としては、一般式（Ｉ）：
0003613585.tif 000012
（式中、Ｘは−Ｓ−または−Ｏ−、R1およびR2は同じかまたは異なり、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、R3は水素原子または一般式（Ｉ）に示されるチッ素原子に隣接する、すなわち前記チッ素原子に結合する原子が不飽和結合を持たない置換基、R4およびR5は任意の置換基であるが、１化合物中にHX−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）またはHX−Ｃ−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）の部分構造骨格を１つしか持たない）または一般式（II）：
0003613585.tif 000013
（式中、Ｘは−Ｓ−または−Ｏ−、R1、R2およびR6は同じかまたは異なり、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基、R3は水素原子または一般式（II）に示されるチッ素原子に隣接する原子が不飽和結合を持たない置換基、R4、R5およびR7は任意の置換基であるが、１化合物中にHX−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）またはHX−Ｃ−Ｃ−Ｃ−NHR3（式中、ＸおよびR3は前記と同じ）の部分構造骨格を１つしか持たない）
で示される化合物として知られている特定骨格を有する化合物であればよく、一般式（Ｉ）または一般式（II）のXHおよびアミノ基が反応点となり、位置特異的に担体上のアルデヒド基と反応して固定化させることができる。
一般式（Ｉ）および一般式（II）におけるＸは−Ｓ−、−Ｏ−であるが、Ｘがこれらの基のばあい、固定化反応の反応性および結合の安定性の点から好ましい。
一般式（Ｉ）または一般式（II）中のR1、R2、R6は、前述のごとく、いずれも水素原子または炭素数１〜４のアルキル基（具体的には前記Ｒのばあいと同様にメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、iso−プロピル基、iso−ブチル基など）であるが、反応時の立体障害性の点からR1は水素原子、メチル基、R2は水素原子、メチル基、R6は水素原子、メチル基であるのが好ましい。
Ｎ末端がシステイン、スレオニンまたはセリンであるペプチドまたはタンパク質は前記特定骨格を有する。
Ｎ末端がシステイン、スレオニンまたはセリンである１本鎖のペプチドまたはタンパク質において、Ｎ末端以外にシステイン、スレオニンまたはセリンを含んでいてもそれらは前記特定骨格をとらず、Ｎ末端のアミノ酸残基のみが担体上のアルデヒド基と反応する。
もっとも端的な例としてポリリジンのＮ末端だけをシステイン、スレオニンまたはセリンにしたばあい、従来の技術で述べた（１）〜（６）の方法ではＮ末端での固定化は不可能であるが、担体にアルデヒド基を導入した本発明の方法を用いるとＮ末端での固定化が可能となる。
もちろん、リガンドとして用いる化合物がペプチドまたはタンパク質のばあいにも、前記特定骨格を別途導入し、位置特異性を与えることも可能である。ペプチド、タンパク質以外のリガンドについてもこの方法は有効であり、側鎖にアミノ基、チオール基、水酸基など求核性の官能性を持つ化合物の固定化にとくに有効である。
その理由は側鎖にアミノ基、チオール基、水酸基など求核性の官能基を持つ化合物を固定化するばあい、通常よく知られている固定化法、すなわちエポキシ活性化担体、CNBr活性化担体などへの反応による固定化では（リガンドの）特定位置で固定化することが困難である（末端官能基で固定化しようとしても側鎖官能基でも固定化されるため）。これに対して本発明の固定化法では側鎖に前記官能基を含んでいても側鎖での固定化はされず、リガンドの向きをそろえることができる。
本発明における前記担体と一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物との反応の例をつぎに示しておく。
0003613585.tif 000014
0003613585.tif 000015
本明細書におけるリガンドという語は、対象物質に高い親和性を有し、担体に固定化することにより吸着体として利用できるという意味で使用している。
したがって、リガンドの一部として一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物からR4、R5またはR4、R5、R7が除かれた特定骨格を有するばあい、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物全体がリガンドとなる。一方、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物のR4、R5の少なくとも１つまたはR4、R5、R7の少なくとも１つがリガンドとして作用し、他の部分が単に位置特異性を有する固定化のために使用されているばあいには、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物のR4、R5の少なくとも１つまたはR4、R5、R7の少なくとも１つがリガンドとなる。
前記アルデヒド基を有する溶媒不溶性担体と、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物とを反応させる条件としては、溶媒不溶性担体が有するアルデヒド基の密度をＡ（μmol/g）、固定化反応系中のアルデヒド基量をａ（μmol）および固定化反応系中の一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の量をｂ（μmol）としたとき、
０＜b/a≦100および
1/1000≦Ａ≦10000
を満たすＡ、ａおよびｂを固定化反応の条件とするともっとも効率よく一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の固定化を行なうことができる。この条件は本発明者らが見出したものである。
前記b/aが100より大きいばあいには、未反応で回収する一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の量が増加するので経済的でない。より好ましくは、０＜b/a≦10であり、ほとんどのばあい、b/aが小さくなることによる固定化量の減少は認められない。さらに好ましくは、０＜b/a≦３であり、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物が高価なものであり、かつ一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物を高密度に固定化したいばあいなどには好ましい、より経済性の高い反応条件である。驚くべきことには、b/a＝１（すなわち、アルデヒド基量と一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の量とを当量）で反応させても70％以上の固定化収率をうることができる。なお、b/a≧1/1000であることが固定化収率の点から好ましい。
一方、Ａが1/1000より小さいばあいには、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の濃度をいくら増加させても一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の固定化効率はきわめてわるくなり、また、Ａが10000より大きいばあいには、実際に必要な固定化量をはるかにこえる量固定されたり、過剰のアルデヒド基をキャッピング（アルデヒド基を適切な化合物で「封印」し、アルデヒドの活性を消失させる）する必要が生じ、そのキャッピング剤による影響が大きくなり、固定された一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物のリガンドとしての性能が低下するばあいがある。
前記理由により、1/1000≦Ａ≦10000であることが好ましく、1/100≦Ａ≦1000であることがさらに好ましい。
なお、Ａを算出するときの担体重量の測定の仕方は種々存在するが、以下の方法で1/1000≦Ａ≦10000を満たせばよい。すなわち、多孔質ゲルなどのばあい、グラスフィルター上でゲル外の溶媒を吸引除去（サックドライ）し、凍結乾燥などによりゲル内部の水分も完全に除去する方法がある。
一方、溶媒不溶性担体と前記化合物との固定化方法において反応後未反応のリガンドを洗浄などにより除いたのち、20℃で10時間以上または115℃で30分間以上の処理を行なうことにより、安定な結合を形成させることができる。この条件を数式で表わすと、処理温度ｔ［℃］、処理時間ｈ［時間］としたとき、
ｔ≧−10×ｈ＋120（250≧ｔ≧20）
となり、前記の式を満たす処理を行なうと安定な結合のみが残り、不安定な結合のものをきわめて容易に脱離、除去させることができる。この処理は用途によっては必ずしも必要ではないが、吸着体からリガンドが脱離することを避けるばあいには極めて有効な処理である。なお、処理温度ｔの上限は結合の強度の点から250℃程度、好ましくは150℃程度であり、下限は処理時間の点から20℃程度である。
前記のごとき固定化方法の好ましい態様としては、水不溶性担体として非特異吸着が比較的少なく、リガンドによる吸着選択性が良好な親水性担体（とくにセルロース、アガロース、デキストラン、キトサンなどの多糖類からなる担体などが好ましい）にエポキシ基を導入したものに、アンモニアまたはアミンを作用させてエポキシ基を開環させ、隣接する２個の炭素原子にそれぞれ水酸基およびアミノ基を有する基に誘導したのち、酸化反応によりアルデヒド基に変換し、ついで一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物を、1/10≦b/a≦10、１≦Ａ＜500（Ａは水不溶性担体が有するアルデヒド基の密度（μmol/g）、ａは反応系中のアルデヒド基量（μmol）、ｂは反応系中の一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物量（μmol））を満たす条件で反応させる方法があげられる。反応後、80〜130℃で240〜20分間程度の処理を行なうことにより、担体とリガンドとの結合を安定なものにすることができる。
前記方法によりリガンドを固定するばあいには、リガンドが特定の位置で溶媒不溶性担体のアルデヒド基と特異的に、かつ反応効率よく、しかも安定に結合したリガンド固定担体を製造することができる。
つぎに、本発明の方法を実施例にもとづいて説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
セルロース系多孔質硬質ゲルであるCKA3（チッソ（株）製）90mlに水を加えて全量を180mlとしたのち、2M水酸化ナトリウム60mlを加えて40℃とした。これにエピクロルヒドリン21mlを加え、40℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ基導入ゲルをえた。
このエポキシ基導入ゲル10gに28％アンモニア水3mlおよび水17mlを加え、撹拌後室温で20時間静置し、充分な量の水で洗浄してアミノ基導入ゲル（10μmol/g）をえた。続いて10μmol/mlメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液25mlを加えて室温で５分間撹拌したのち、充分な量の水で洗浄してアルデヒド基導入ゲル（10μmol/g）をえた。アルデヒド基導入ゲル1gに対しフェニルヒドラジン100μmolを加え総量を5mlとして室温で４時間振とうし、上清のフェニルヒドラジンの吸光度を測定することにより定量した。対照としてアルデヒド基導入前のゲル（CKA3）1gを同様に処理し、上清のフェニルヒドラジンの吸光度を測定した。
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH3.0）にシステインを溶解させ、10μmol/mlとした。この溶液3mlに前記アルデヒド基導入ゲル3gを懸濁させ、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のシステインの濃度を反応前後で測定したところ反応後のシステインは反応前の20％であった。
比較例１
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH3.0）にリジンを溶解し、10μmol/mlとした。この溶液3mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル3gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。リジンの濃度を反応前後で測定したところ、反応後のリジン濃度は反応前と変わらなかった。
実施例２
100mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）にシステインを溶解し、20μmol/mlとした。この溶液100mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル3gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。システインを固定化後、吸着体を1N塩酸中で100℃で10時間加熱し、脱離したシステインを定量した結果、固定化量は9.9μmol/gであった。
定量はpH8.5〜9.0に調整してTNBS（トリニトロベンゼンスルホン酸）の飽和ホウ酸ナトリウム水溶液（１μmol/ml）を加えてアミノ基を測定することにより行なった。
実施例３
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）とＮ−メチルピロリドンを1:1（v/v）で混合し、これにシステインを溶解して10μmol/mlとした。この溶液3mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル1gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のシステインの濃度を反応前後で測定したところ、反応後のシステイン濃度は反応前の67％であった。
実施例４
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）にシステインを溶解し、５μmol/mlとした。この溶液3mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル3gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のシステインの濃度を反応前後で測定したところ、反応後のシステイン濃度は反応前の２％であった。
実施例５
セルロース系多孔質硬質ゲルであるCKA3（チッソ（株）製）90mlをエタノールに浸漬し、水をエタノールに置換し、さらにヘプタンに置換した。このゲル10mlに20％水酸化ナトリウム水溶液4g、ヘプタン12g、Tween20（ICI社製）を一滴加え、40℃で２時間撹拌した。さらにエピクロルヒドリン5gを加え、40℃で撹拌下２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ基導入ゲルをえた。
このエポキシ基導入ゲル10gに28％アンモニア水10mlおよび水10mlを加え、撹拌後室温で20時間静置し、充分な量の水で洗浄してアミノ基導入ゲル（100μmol/g）をえた。続いて40μmol/mlメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液40mlを加えて室温で５分間撹拌したのち、充分な量の水で洗浄してアルデヒド基導入ゲル（100μmol/g）をえた。
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）にシステインを溶解し、５μmol/mlとした。この溶液10mlに前記アルデヒド基導入ゲル1gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のシステインの濃度を反応前後で測定したところ、反応後のシステイン濃度は反応前の２％であった。
実施例６
セルロース系多孔質硬質ゲルであるCKA3（チッソ（株）製）90mlに水を加えて全量を180mlとしたのち、2M水酸化ナトリウム0.6mlを加えて40℃とした。これにエピクロルヒドリン0.2mlを加え、40℃で撹拌下１時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ基導入ゲルをえた。
このエポキシ基導入ゲル50gに28％アンモニア水5mlおよび水95mlを加え、撹拌後室温で20時間静置し、充分な量の水で洗浄してアミノ基導入ゲル（0.1μmol/g）をえた。続いて0.5μmol/mlメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液50mlを加えて室温で５分間撹拌したのち、充分な量の水で洗浄してアルデヒド基導入ゲル（0.1μmol/g）をえた。
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH4.5）にシステインを溶解し、0.1μmol/mlとした。この溶液15mlに前記アルデヒド基導入ゲル30gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のシステインの濃度を反応前後で測定したところ反応後のシステイン濃度は反応前の10％であった。
実施例７
50mM  酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（pH3.0）にペプチド（Ｎ末端よりCys−Thr−Lys−Thr−Phe−Thr−Val−Thr−Glu、分子量＝1029.1）を溶解し、2mg/mlとした。この溶液1.4mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル0.72gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のペプチドの濃度を反応前後で測定したところ、反応後のペプチド濃度は反応前の２％であった。
実施例８
アセトニトリルと水を1:1（v/v）で混合し、これに
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を溶解して１μmol/mlとした。この溶液1.4mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル0.72gを懸濁し、室温で20時間撹拌して吸着体をえた。この化合物の反応液中の濃度を反応前後で測定したところ反応後の濃度は反応前の２％であった。
実施例９
100mM  コハク酸−水酸化ナトリウムバッファー（pH4.0）にペプチド（Ｎ末端よりSer−（Lys）ｎ−Lys分子量＝約10,000）を溶解し、２μmol/mlとした。この溶液1.4mlに実施例１で調製したアルデヒド基導入ゲル0.72gを懸濁し、37℃で40時間撹拌して吸着体をえた。反応液中のペプチドの濃度を反応前後で測定したところ反応後のペプチド濃度は反応前の50％であった。
実施例１〜９および比較例１におけるアルデヒド基量、一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の反応量、これらの比率および一般式（Ｉ）または一般式（II）で示される化合物の担体1g当りの固定化量Ｒを表１に示しておく。
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実施例10
実施例１で調製した吸着体68mgを生理食塩液400μｌに懸濁し、20℃で10時間の処理後、水で液交換を行ない、サックドライし、さらに生理食塩液400μｌに懸濁し、25℃で65時間放置した。上清のシステイン濃度を測定したところ、吸着体から脱離したシステイン量は固定化量に対して１％未満であった。
実施例11
実施例７で調製した吸着体68mgをリン酸バッファー／生理食塩液（PBS）400μｌに懸濁し、密閉容器内で115℃で30分間加温後、生理食塩液で液交換を行ない、サックドライし、さらにPBS400μｌに懸濁し、25℃で65時間放置した。上清のペプチド濃度を測定したところ、吸着体から脱離したペプチド量は固定化量に対して１％未満であった。
実施例12
実施例９で調製した吸着体68mgを水400μｌに懸濁し、50℃で８時間加温後、生理食塩液で液交換を行ない、サックドライし、さらに水400μｌに懸濁し、25℃で65時間放置した。上清のペプチド濃度を測定したところ、吸着体から脱離したペプチド量は固定化量に対して１％未満であった。
実施例10〜12におけるリガンドの脱離率を表２に示しておく。
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産業上の利用可能性
本発明の固定化方法は簡便であり、リガンドまたはリガンドが結合している化合物が特定の位置で溶媒不溶性担体のアルデヒド基と特異的にかつ効率よく反応し、しかも安定な結合を形成しうる固定化方法であり、吸着体の製造などに有用である。