(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一受容体と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体との両方が固着した固相体であって、該複合体が第一受容体を介して固着している固相体と、第一リガンドおよび第二リガンドを含む検体とを接触させ、第一受容体と第一リガンドとの複合体の形成および第二受容体と第二リガンドとの複合体の形成をそれぞれ検出することにより検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法。
【請求項２】
第一受容体が固着した固相体および第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体と、第一リガンドおよび第二リガンドを含む検体とを接触させ、第一受容体と第一リガンドとの複合体の形成および第二受容体と第二リガンドとの複合体の形成をそれぞれ検出することにより検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法。
【請求項３】
第一受容体と第一リガンドとの複合体の形成を第一標識物質で標識された第一受容体で検出し、第二受容体と第二リガンドとの複合体の形成を第二標識物質で標識された第二受容体で検出することを特徴とする、請求項１または２記載の測定法。
【請求項４】
第一リガンドおよび第二リガンドがそれぞれ異なるグリコサミノグリカンであり、第一受容体および第二受容体がそれらを特異的に結合しうるタンパク質である、請求項１または２記載の測定法。
【請求項５】
第一受容体が抗体であり、第二受容体がグリコサミノグリカン結合性タンパク質である、請求項４記載の測定法。
【請求項６】
第一リガンドがケラタン硫酸であり、第二リガンドがヒアルロン酸であり、第一受容体が抗ケラタン硫酸抗体であり、第二受容体がヒアルロン酸結合性タンパク質である、請求項５記載の測定法。
【請求項７】
第一受容体と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体との両方が固着した固相体であって、該複合体は第一受容体を介して固着している固相体。
【請求項８】
第一リガンドおよび第二リガンドがそれぞれ異なるグリコサミノグリカンであり、第一受容体が、第一リガンドであるグリコサミノグリカンを特異的に結合しうるタンパク質であり、第二受容体が、第二リガンドであるグリコサミノグリカンを特異的に結合しうるタンパク質である、請求項７記載の固相体。
【請求項９】
請求項７記載の固相体と、第一標識物質で標識された第一受容体および第二標識物質で標識された第二受容体からなる、検体中の第一リガンドおよび第二リガンドの測定用キット。
【請求項１０】
第一受容体が固着した固相体、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体、第一標識物質で標識された第一受容体および第二標識物質で標識された第二受容体からなる、検体中の第一リガンドおよび第二リガンドの測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２種のリガンドの測定法、それに用いられる固相およびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、多種のリガンドを同時に測定する多項目同時イムノアッセイとしては、ビーズを使用した酵素免疫測定（ＥＩＡ）において、２種類の抗体を、ビーズおよび試験管の内壁にそれぞれコートして、ビーズおよび試験管に結合した２種類のリガンドを別々に測定する方法（特公昭５９−２３４６号）、２種以上の抗体をそれぞれ直接固相に固着させた固相体を用いてサンドイッチ法によって試料中の多種の抗原を測定する方法（特開平４−２３２４６５号）が知られている。
【０００３】
また、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識された多種の抗体をすべて抗ＦＩＴＣ抗体を介して固着させた固相体を用いて、サンドイッチ法によって試料中の抗原の総量を測定する方法が知られている。この測定法においては、多種の抗体の固相への結合量を高めることを目的として、抗ＦＩＴＣ抗体を介して抗体を固相に固着させている（特開平２−２２８５６１号）。
【０００４】
さて、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸は、軟骨の構成成分の一つであるプロテオグリカン集合体を構成するグリコサミノグリカンであり、生体内では、プロテオグリカンの構成成分およびプロテオグリカンと結合可能な成分として重要な役割を果たしている。この２成分は、互いに密接な関係にある。したがって、変形性関節症や慢性関節リウマチなどの関節疾患における軟骨代謝を示す生体内情報として、あるいは臨床面での応用のために、この２成分の濃度を同時に測定することが要望されている。
【０００５】
ヒアルロン酸の測定法としては、固相に固着させたヒアルロン酸結合性タンパク質と、標識物質で標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質とで、ヒアルロン酸を挟んだ複合体の標識物質を検出することによってヒアルロン酸を測定する方法（特開昭６４−４６９号）、標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質を固相に結合させたヒアルロン酸と検体ヒアルロン酸とに競合的に結合させて複合体を形成させてヒアルロン酸を測定する方法（特開昭６３−１５０６６９号）、ヒアルロン酸結合領域を含む軟骨プロテオグリカンと検体中のヒアルロン酸とを反応させた後、該ヒアルロン酸と結合しなかった該プロテオグリカンを、ヒアルロン酸を固着したプレートに添加して、プレートに固着した該プロテオグリカンを測定することからなる、阻害法によるヒアルロン酸の測定法（特開昭６４−２９７６７号）、および軟骨プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物を固相化して、サンドイッチ法によりヒアルロン酸を測定する方法（特開平４−２６２７９７号）が知られている。
【０００６】
また、ケラタン硫酸の測定法としては、抗ケラタン硫酸抗体であるモノクローナル抗体を固着させた固相に、ケラタン硫酸を含む検体と、標識物質で標識されたケラタン硫酸とを添加し、これらを競合的に該抗体に結合させ、該抗体と標識物質で標識されたケラタン硫酸との結合体の標識物質を検出することによって、検体中のケラタン硫酸を測定する方法（特開昭６０−２２４０６５号、Clinica. Chimica. Acta, 195 (1990) p17-26)、および抗ケラタン硫酸抗体のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法（WO 90/07120 号）が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようする課題】
しかしながら、
１）固相に直接固着させた多種の抗体に多種の抗原を結合させる従来法では、同時に多種の抗体を直接固相に固着させる必要がある。しかし、タンパク質と、固相との吸着は、pHがそのタンパク質のpI値である場合に最高となるため、２種類以上の抗体タンパク質をそれぞれ最適の条件で、固相に固着させることは困難であり、そのため測定感度が低い、または測定結果が一致しないなどの問題があった。
【０００８】
２）従来の、ＦＩＴＣで標識された多種の抗体をすべて抗ＦＩＴＣ抗体を介して固着させた固相体を用いて、サンドイッチ法によって試料中の抗原の総量を測定する方法においては、多種の抗体すべてをＦＩＴＣ標識しなければならず煩雑であった。またそればかりでなく、多種のＦＩＴＣ標識抗体のpIもそれぞれ異なるため、多種のＦＩＴＣ標識抗体をそれぞれの最適な条件で固着させることは困難であった。
【０００９】
また、グリコサミノグリカンであるヒアルロン酸およびケラタン硫酸を、ヒアルロン酸結合性タンパク質および抗ケラタン硫酸抗体を用いて測定する従来の方法では、一検体について一度に１種のグリコサミノグリカンしか測定できないため、微量検体については１種のグリコサミノグリカンしか測定できないという問題や、検体量がたとえ十分であっても、検体中の多種のグリコサミノグリカンを測定するためには、それぞれのグリコサミノグリカンを別の測定系で測定しなければならず、煩雑であるという問題があった。
そこで、同一検体中の２種のリガンドを、同時に感度よく簡便に測定することができ、測定結果の安定した測定法が望まれていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１）第一受容体と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体との両方が固着した固相体であって、該複合体が第一受容体を介して固着している固相体と、第一リガンドおよび第二リガンドを含む検体とを接触させ、第一受容体と第一リガンドとの複合体の形成および第二受容体と第二リガンドとの複合体の形成をそれぞれ検出することにより検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法；
２）第一受容体が固着した固相体および第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体と、第一リガンドおよび第二リガンドを含む検体とを接触させ、第一受容体と第一リガンドとの複合体の形成および第二受容体と第二リガンドとの複合体の形成をそれぞれ検出することにより検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法；
【００１１】
３）第一受容体と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体との両方が固着した固相体であって、該複合体は第一受容体を介して固着している固相体；４）該固相体と、第一標識物質で標識された第一受容体および第二標識物質で標識された第二受容体からなる、検体中の第一リガンドおよび第二リガンドの測定用キット；
および
５）第一受容体が固着した固相体、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体、第一標識物質で標識された第一受容体および第二標識物質で標識された第二受容体からなる、検体中の第一リガンドおよび第二リガンドの測定用キットに関する。
【００１２】
なお、本明細書において、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体の−は、共有結合、または水素結合、静電気的相互作用による結合、ファン・デル・ワールス力による結合、疎水結合などの非共有結合を意味する。
【００１３】
本発明を以下にさらに詳しく説明する。
１）本発明で使用される第一受容体とは、第一リガンドを特異的に結合しうる分子である。例えば第一リガンドに対する特異的な親和性によって結合しうる分子などが挙げられる。
第一リガンドと第一受容体との組合せとしては、抗原と抗体との組合せのほかに、糖とレクチン、多糖と多糖結合性タンパク質、アゴニストとアゴニストの受容体との組合せなどを挙げることができる。
【００１４】
抗原と抗体との組合わせとしては、例えばグリコサミノグリカンと抗グリコサミノグリカン抗体との組合せなどが挙げられ、さらに詳しくは、例えばケラタン硫酸と抗ケラタン硫酸抗体、コンドロイチン硫酸と抗コンドロイチン硫酸抗体、ヘパラン硫酸と抗ヘパラン硫酸抗体などが挙げられる。
【００１５】
抗ケラタン硫酸抗体、抗コンドロイチン硫酸抗体および抗ヘパラン硫酸抗体は既知の方法でケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸またはヘパラン硫酸を含む、プロテオグリカンなどを各々抗原として免疫し、既知の方法でこれらの抗原に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を産生させることによって得ることができる（抗ケラタン硫酸抗体については、J. Biol. Chem. 258 (1983) p8848-8854, 抗コンドロイチン硫酸抗体については、J. Biol. Chem., 262 (1987) p4146-4152,  抗ヘパラン硫酸抗体については、J. Immunol., 137, (1986) p3900-3908 を参照）。
【００１６】
また市販品を使用することもできる。市販品としては、抗−ケラタン硫酸（商品名）（クローン名：５−Ｄ−４、生化学工業（株）製造、販売）、抗−コンドロイチン硫酸（タイプ−Ｄ）（商品名）（クローン名：ＭＯ−２２５、生化学工業（株）製造、販売）、抗−ヘパラン硫酸（商品名）（クローン名：ＨｅｐＳＳ−１、生化学工業（株）製造、販売）などが挙げられる。
【００１７】
２）本発明の第二受容体とは、第二リガンドを特異的に結合しうる分子である。
第二リガンドと第二受容体との組み合わせとしては、抗原と抗体の組み合わせのほかに、糖とレクチン、多糖と多糖結合性タンパク質（例えば、グリコサミノグリカンとグリコサミノグリカン結合性タンパク質など）、アゴニストとアゴニストの受容体との組合せなどを挙げることができる。
【００１８】
３）本発明に使用される固相体材料としては、マイクロプレートのウエル、チューブ、膜、ビーズ、ゲルなどが挙げられる。またこれらを組合せて使用してもよい。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ポリアロマー、ポリエチレン、ナイロン、ガラス、アガロースなどが挙げられる。
【００１９】
４）本発明で使用される、第一受容体と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体との両方が固着した固相体であって、該複合体が第一受容体を介して固着している固相体、および第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体は、例えば固相体と第一受容体とを接触させて、固相に第一受容体を固着させた後、さらに第一リガンドが結合した第二受容体と接触させて、固相に固着された第一受容体と、第二受容体に結合している第一リガンドとを特異的な親和性によって結合させることで、第一受容体を介して第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体を固相に固着させることによって製造することができる。また得られた固相体をさらに第一受容体と接触させることによって該第一リガンドのうち該固相体に固着した第一受容体と結合していない部分をブロッキングすることが好ましい。
【００２０】
固相体に第一受容体を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法など固定化酵素の調製法として一般的な方法（「固定化酵素」、1975年発行、（株）講談社、第９〜７５頁参照）を応用して行うことができる。特に物理的吸着法は簡便な点で好ましい。なお、第一受容体が固着されていない固相体表面を血清アルブミン、ゼラチンなどによってブロッキングすることが好ましい。
【００２１】
また、第一受容体と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体との両方が固着した上記の固相体の場合、固相体に固着された第一受容体のうちの一部分は、第一リガンドが結合した第二受容体と、結合していない状態で残しておかなければならない。即ち第一受容体が抗体である場合、一部分の抗体の抗原結合部位は飽和させないようにしなければならない。このため固相体と接触させる第一受容体および第一リガンドが結合した第二受容体の量は、予め検討して決定しておくことが必要であるが、これは当業者であれば容易に決定されうる。
【００２２】
本発明で使用される固相体の好ましい態様の１つは、第一リガンドおよび第二リガンドがそれぞれ異なるグリコサミノグリカンであり、第一受容体が第一リガンドであるグリコサミノグリカンを特異的に結合しうるタンパク質であり、第二受容体が第二リガンドであるグリコサミノグリカンを特異的に結合しうるタンパク質である固相体である。さらに詳しくは、第一受容体がグリコサミノグリカンに対する抗体であり、第二受容体がグリコサミノグリカン結合性タンパク質である固相体が挙げられる。
【００２３】
本発明で使用される第一リガンドが結合した第二受容体を得る方法としては、公知の方法で第一リガンドと第二受容体とを物理的に結合させるかまたは化学的に結合させる方法や、第一リガンドが結合している第二受容体を天然物などから得る方法などが挙げられる。
第一リガンドが結合している第二受容体としては、第二受容体が多糖結合性タンパク質、さらに詳しくはグリコサミノグリカン結合性タンパク質の場合、例えば、ケラタン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質、コンドロイチン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質、ヘパラン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質などが挙げられる。
【００２４】
ケラタン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質としては、軟骨由来プロテオグリカン（例えばアグリカン（ＰＧ−Ｈ））、コンドロザルコーマ由来プロテオグリカンおよびケラタン硫酸が結合しておりヒアルロン酸結合性領域を含むこれらのタンパク質の一部または融合タンパク質などが挙げられる。また、これらのタンパク質にはコンドロイチン硫酸が結合されている場合があるが、このコンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸分解酵素（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣなど）を作用させるなどの方法で予め除いておくことが好ましい。
【００２５】
ケラタン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質は、公知の方法（特開平４−２６２７９７号、Adv. Drug Dev. Rev. (1991) p257-264 、Biochem. Biophys. Acta. (1979) p281-289 など）で得ることができる。
【００２６】
また市販品を使用することもできる。市販品としては、プロテオグリカンモノマー（ウシ鼻軟骨またはラット軟骨種）（商品名、ＩＣＮバイオメディカル社製造、生化学工業（株）販売）などが挙げられる。この市販品を使用する場合は、コンドロイチン硫酸分解酵素（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣなど）を作用させるなどの方法でコンドロイチン硫酸を予め除いておくことが好ましい。
【００２７】
コンドロイチン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質としては、軟骨由来プロテオグリカン（例えばアグリカン（ＰＧ−Ｈ）など）、ＰＧ−Ｍ（バーシカン）、ニューロカン、コンドロザルコーマ由来プロテオグリカン、コンドロイチン硫酸が結合したＣＤ４４およびコンドロイチン硫酸が結合しており、ヒアルロン酸結合性領域を含むこれらのタンパク質の一部または融合タンパク質などが挙げられる。これらのタンパク質にはケラタン硫酸やヘパラン硫酸が結合されている場合があるが、このケラタン硫酸やヘパラン硫酸は、ケラタン硫酸分解酵素（例えばケラタナーゼ、ケラタナーゼIIなど）やヘパラン硫酸分解酵素（ヘパリチナーゼ、ヘパリナーゼなど）を作用させるなどの方法で予め除いておくことが好ましい。
【００２８】
コンドロイチン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質は、公知の方法で得ることができる（Adv. Drug Dev. Rev. (1991) p257-264, Glycobiology, 2 (1992) p93-97、細胞工学別冊・ハンドブックシリーズ「接着分子ハンドブック」、秀潤社刊、第298-3076頁、1994年発行）。例えば、アグリカンは、ウシ、ブタ、シカまたはヒトなどの軟骨から、４〜６M 塩酸グアニジンで軟骨成分を可溶化して、抽出し、次いでプロテオグリカンが会合する条件下（例えば０．５M 塩酸グアニジン溶液中）で沈降平衡遠心を行って高密度（約１．６g/ml以上）の画分を得、この画分についてプロテオグリカンが会合しない条件下（例えば４〜６M 塩酸グアニジン溶液中）で沈降平衡遠心を行って高密度（約１．５g/ml以上）画分を得、これを透析してアグリカンを得ることができる。
【００２９】
また市販品を使用することもできる。市販品としては、プロテオグリカンモノマー（ウシ鼻軟骨またはラット軟骨種）（商品名、ＩＣＮバイオメディカル社製造、生化学工業（株）販売）などが挙げられる。この市販品を使用する場合は、ケラタン硫酸分解酵素（例えばケラタナーゼ、ケラタナーゼIIなど）を作用させるなどの方法でケラタン硫酸を予め除いておくことが好ましい。
【００３０】
ヘパラン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質としては、ヘパラン硫酸が結合したＣＤ４４およびヘパラン硫酸が結合しておりヒアルロン酸結合性領域を含むこれらのタンパク質の一部または融合タンパク質などが挙げられる。これらのタンパク質にはコンドロイチン硫酸が結合されている場合があるが、このコンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸分解酵素（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣなど）を作用させるなどの方法で予め除いておくことが好ましい。
【００３１】
ヘパラン硫酸が結合したヒアルロン酸結合性タンパク質は、公知の方法で得ることができる（Glycobiology, 2 (1992) p93-97 、細胞工学別冊・ハンドブックシリーズ「接着分子ハンドブック」、秀潤社刊、第298-3076頁、1994年発行）。
【００３２】
５）本発明の測定法は、本発明の固相体、または第一受容体が固着した固相体および第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体と、第一リガンドおよび第二リガンドを含む検体とを接触させて、検体中の第一リガンドと第一受容体との複合体の形成と、検体中の第二リガンドと第二受容体との複合体の形成とをそれぞれ検出することにより、検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法である。
【００３３】
本発明の方法により測定される第一リガンドおよび第二リガンドとしては、例えば多糖（例えばグリコサミノグリカンなど）、オリゴ糖、タンパク質、ペプチド、アゴニストなどが挙げられる。さらにリガンドがグリコサミノグリカンの場合を例示するとケラタン硫酸とヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸とヒアルロン酸、ヘパラン硫酸とヒアルロン酸などのような、２種のリガンドの組み合わせが例示される。
【００３４】
本発明の測定法の好ましい態様の１つは、第一リガンドおよび第二リガンドがそれぞれ異なるグリコサミノグリカンであり、第一受容体および第二受容体がそれらを特異的に結合しうるタンパク質である測定法である。さらに詳しくは、第一受容体がグリコサミノグリカンに対する抗体であり、第二受容体がグリコサミノグリカン結合性タンパク質である測定法が挙げられる。
【００３５】
この場合の第一受容体と第二受容体との組合わせとしては、抗ケラタン硫酸抗体とヒアルロン酸結合性タンパク質、抗コンドロイチン硫酸抗体とヒアルロン酸結合性タンパク質、または抗ヘパラン硫酸抗体とヒアルロン酸結合性タンパク質との組合わせなどが挙げられる。これらの場合ケラタン硫酸とヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸とヒアルロン酸またはヘパラン硫酸とヒアルロン酸の測定が可能である。
【００３６】
上記複合体の形成法や検出法は、抗原または抗体を用いる通常のイムノアッセイのほか、糖とレクチン、多糖と多糖結合性タンパク質、アゴニストとアゴニストの受容体などを用いたアフィニティーアッセイなどで用いられる方法を利用することができる。
【００３７】
これらの測定法は、公知の方法（入江  賽編、「続ラジオイムノアッセイ」、講談社、1979年発行；石川栄治ら編、「酵素免疫測定法」第２版、医学書院、1982年発行；「エンザイムイムノアッセイ」東京化学同人、1989年発行、P. Tijssen著、石川栄治監訳；「タンパク質核酸酵素」別冊No.31 、酵素免疫測定法、共立出版（株）発行、1987年、ｐ13-26 、特開平４−２６２７９７号、Anal. Biochem., 149, 555-565(1985)、WO90/07120号、特開昭６０−２２４０６５号など）に準じて実施される。例えば、サンドイッチ法や競合法などが挙げられる。
【００３８】
サンドイッチ法において上記の複合体の形成順序は、いわゆるフォワード、リバース、同時のいずれも可能である（「タンパク質核酸酵素」別冊No.31 、酵素免疫測定法、共立出版（株）発行、1987年、p13-26参照）。サンドイッチ法のさらに具体的な方法としては、例えば、本発明で使用される固相体の第一受容体および第二受容体のそれぞれに、検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを反応させ、ついで第一標識物質で標識された第一受容体および第二標識物質で標識された第二受容体を同時または順次接触させた後、固相と液相とを分離し（ＢＦ分離）、いづれかの相の第一標識物質と第二標識物質を同時または順次検出する方法などが挙げられる。
【００３９】
６）本発明で使用される第一標識物質および第二標識物質としては、試料中の測定成分の量と相関したレベルの、検出可能なシグナルを生成するものであれば特に制限されない。さらには第一標識物質および第二標識物質を同時に検出することが可能な標識物質を組合せて用いることができる。
【００４０】
標識物質としては、酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ユーロピウム、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）など）、放射性同位元素(125Ｉ、 131Ｉ、 3Ｈなど）、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）などが挙げられる。
【００４１】
第一標識物質と第二標識物質との組合わせとして、例えば蛍光物質と酵素との組合わせとしては、蛍光物質としてユーロピウム、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ローダミンまたはテキサスレッドを用い、酵素としてアルカリホスファターゼを用いて、基質にｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いる例などが挙げられる。
【００４２】
第一標識物質および第二標識物質を同時に測定する際の好ましい標識物質の組合せとしては、励起波長が近く、蛍光波長が干渉しない程度に離れている場合の蛍光物質の組合せが挙げられ、例えばＡＭＣＡとユーロピウムキレートとの組み合わせ、ＦＩＴＣと、フィコエリトリンやトリカラーとの組み合わせなどが挙げられ、特にＡＭＣＡとユーロピウムキレート、ＦＩＴＣとトリカラーとの組み合わせが好ましい。
【００４３】
標識物質の標識方法は、標識物質に適した公知の方法（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照など）を用いればよいが、例えばビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法（Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook,p57-63,PIERCE CHEMICAL COMPANY,1994年発行参照）、ＦＩＴＣを使用する場合は特公昭６３−１７８４３号記載の方法などから適宜選択できる。
【００４４】
７）検体としては、例えば血清、血漿、尿、関節液などの体液、細胞または細菌の培養上清などを用いることができる。
【００４５】
８）本発明の測定法においては、上記の本発明の固相体、第一標識物質で標識されているかまたは標識されうる第一受容体、および第二標識物質で標識されているかまたは標識されうる第二受容体からなるキットを用いることができる。
【００４６】
また、第一受容体が固着した固相体、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が第一受容体を介して固着している固相体、第一標識物質で標識されているかまたは標識されうる第一受容体および第二標識物質で標識されているかまたは標識されうる第二受容体からなるキットを用いることもできる。
【００４７】
好ましい、キットとしては、
(1) 第一受容体が抗ケラタン硫酸抗体であり、第二受容体−第一リガンド−第一受容体がヒアルロン酸結合性タンパク質−ケラタン硫酸−抗ケラタン硫酸抗体である上記の固相体、第一標識物質で標識された抗ケラタン硫酸抗体、および第二標識物質で標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質からなるキット、
(2) 第一受容体が抗コンドロイチン硫酸抗体であり、第二受容体−第一リガンド−第一受容体がヒアルロン酸結合性タンパク質−コンドロイチン硫酸−抗コンドロイチン硫酸抗体である上記の固相体、第一標識物質で標識された抗コンドロイチン硫酸抗体、および第二標識物質で標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質からなるキット、
(3) 第一受容体が抗ヘパラン硫酸抗体であり、第二受容体−第一リガンド−第一受容体がヒアルロン酸結合性タンパク質−ヘパラン硫酸−抗ヘパラン硫酸抗体である上記の固相体、第一標識物質で標識された抗ヘパラン硫酸抗体、および第二標識物質で標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質からなるキットなどが挙げられる。
【００４８】
上記の第二標識物質で標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質の原料としてのヒアルロン酸結合性タンパク質としては、軟骨由来プロテオグリカン（例えばアグリカン（ＰＧ−Ｈ）など）、ＰＧ−Ｍ（バーシカン）、ニューロカン、コンドロザルコーマ由来プロテオグリカン、ＣＤ４４およびヒアルロン酸結合性領域を含むこれらのタンパク質の一部または融合タンパク質などが挙げられる。また、これらのタンパク質にはコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸などが結合されている場合があるが、これらはコンドロイチン硫酸分解酵素（例えばコンドロイチナーゼＡＢＣなど）、ケラタン硫酸分解酵素（例えばケラタナーゼ、ケラタナーゼIIなど）またはヘパラン硫酸分解酵素（例えばヘパリチナーゼ、ヘパリナーゼなど）を作用させるなどの方法で予め除いておいてもよい。
【００４９】
検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法を例示する模式図を図１に示す。ここで、第一受容体が固着した固相と、第二受容体−第一リガンド−第一受容体複合体が固着した固相とは、同一固相であっても、異なる固相であってもよい。
【００５０】
【実施例】
実施例で使用する試薬、材料について以下に示す。
１）抗ケラタン硫酸抗体（１／２０／５−Ｄ−４）を含む腹水
プリスタン（シグマ社製）０．５mlをマウス腹腔内へ投与した。プリスタン投与後２週間目に腹腔内に１×１０7 個のハイブリドーマを含む細胞懸濁液０．５mlを投与した。投与後１０日の腹部が肥大した時点で、２０Ｇ針を腹部に刺して腹水を採取した。（単クローン抗体実験マニュアル、富永朔二ら編、1987年発行、講談社を参照）
なお、上記ハイブリドーマは、Catersonらの文献（J. Biol. Chem., 258, (1983) p8848-8854）に記載の方法で作成されたハイブリドーマを培養して得た。
【００５１】
２）緩衝液
（１）緩衝液Ａ：０．０３％ＮａＮ3 を含む０．１５M リン酸緩衝液（pH７．２）
（２）緩衝液Ｂ：０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０および０．０３％ＮａＮ3 を含む０．１５M リン酸緩衝液（pH７．２）
【００５２】
３）牛鼻軟骨由来プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物
プロテオグリカン  モノマー（ウシ鼻軟骨）（ＩＣＮバイオメディカル社製造、生化学工業（株）販売）３．８mgを０．３M 酢酸ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（pH８．０）０．５mlに溶解した。これに、０．０２M トリス塩酸緩衝液（pH８．０）０．１mlに、コンドロイチナーゼＡＢＣ１．０ユニット（プロテアーゼフリー、生化学工業（株）製造、販売）を溶解した液２０μl を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。ついでこれを透析外液を蒸留水として４℃で３日間透析し、牛鼻軟骨由来プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物を含む透析内液を得た。
【００５３】
４）ビオチン化抗ケラタン硫酸抗体の調製
上記１）で調製した抗ケラタン硫酸抗体を含む腹水１mlに０．１M リン酸緩衝液（pH８．０）を加えて４倍容量に希釈後、予め０．１M リン酸緩衝液（pH８．０）で平衡化したプロテインＡセルロファイン（生化学工業（株）製）カラム（ゲル量２．０ml）に負荷した。カラムの２５倍容量の０．１M リン酸緩衝液（pH８．０）で洗浄後、０．１M クエン酸緩衝液（pH３．０）で抗体を溶出した。溶出液は直ちに０．１M トリス塩酸緩衝液（pH９．０）により中和した。この液を０．１M 炭酸ナトリウム（pH８．２）に対して４℃で１日間透析した。透析内液を希釈して抗体濃度１mg/ml の希釈液にした。この希釈液４００μl に、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Biotin-N-Hydroxysuccinimide ester)（ピアス社製）をジメチルスルホキシドに溶解して１mg/ml とした溶液を２４μl 加えて、室温で４時間インキュベートした。この反応液を０．１％ＮａＮ3 を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して４℃で１日間透析し、ビオチン化抗ケラタン硫酸抗体を含む透析内液７５５μg/mlを得た。
【００５４】
５）基質緩衝液
０．０３％ＮａＮ3 と１mM  ＭｇＣｌ2 とを含む１M ジエタノールアミン水溶液（pH９．８）
【００５５】
６）ビオチン化ヒアルロン酸結合性タンパク質の調製
ヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）は、Tengbladらの文献（Biochem. Biophys. Acta 578(1979) p281-289)に記載の方法に準じて調製した。得られたＨＡＢＰ３０mgとヒアルロン酸３０mgを０．０５M リン酸緩衝液５ml（pH７．０）に溶解し、４℃で一晩保存した。０．１M ＮａＨＣＯ3 （pH８．２）を加えて３０mlとした。ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Biotin-N-Hydroxysuccinimide ester)（ピアス社製）３０mgをジメチルスルホキシド１５mlに溶解した液を加え、室温で４時間反応させた。０．０２M リン酸緩衝液pH７．０に対して４℃で２４時間透析した。最終濃度が４M となるようにグアニジン塩酸を加えた。これに４M グアニジン塩酸溶液で平衡化しておいたヒアルロン酸結合球状セルロースを同容量加えて、混合した。これを０．５M 酢酸ナトリウム溶液（pH５．８）に対して透析した。透析内成分をカラムにつめ、０．１M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．８）、１M ＮａＣｌ含有０．１M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．８）、３M ＮａＣｌ含有０．１M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．８）で順次洗浄した。４M グアニジン塩酸溶液でビオチン化ＨＡＢＰを溶出した。これを脱イオン水に対して４℃で１日間透析した。次いで分画分子量１万の限外濾過膜を用いて濃縮し、ビオチン化ＨＡＢＰを得た。
なお、ヒアルロン酸結合球状セルロースは特開平４−２６２７９７号明細書記載の方法で調製した。
【００５６】
実施例１
イムノプレート（商品名：ヌンクイムノプレート、番号：４３９４５４、材質：ポリスチレン、ヌンク社製）の各ウエルに、抗ケラタン硫酸抗体を含む腹水を２緩衝液Ａにより４００倍に希釈した液１００μl づつを添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。プレートの溶液を除き、牛血清アルブミン（エンザイムイムノアッセイ用、バイエル社製）を緩衝液Ａに溶解した１％溶液１５０μl を各ウエルに添加し、３７℃で１時間インキュベートして、ブロッキングを行った。この後、プレートの液を除き、緩衝液Ｂで洗浄した。牛鼻軟骨由来プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡＢＣ処理物をＰＢＳに溶解して０．５μg/mlの濃度にした溶液を各ウエルに１００μl づつ添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。
ウエルを緩衝液Ｂで洗浄した後、抗ケラタン硫酸抗体を含む腹水を緩衝液Ａで８００倍に希釈した液１００μl づつを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ウエルを緩衝液Ｂで洗浄した後、緩衝液Ａを希釈溶媒として、表１の各濃度のケラタン硫酸（牛鼻軟骨由来、平均分子量５，０００）およびヒアルロン酸（平均分子量８４．４万）を含む標準サンプル１００μl を各ウエルに添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
ウエルを緩衝液Ｂで洗浄した後、上記ビオチン化抗ケラタン硫酸抗体を緩衝液Ａで１，０００倍に希釈した液１００μl づつをウエルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ウエルを緩衝液Ｂで洗浄した後、ストレプトアビジン結合ユーロピウム（商品名Euro Flow STM Tracer、サイバーフロー社製）を、添付マニュアルに従って緩衝液Ａで５１倍に希釈した液１００μl づつを各ウエルに添加し、３７℃で３０分間、プレートシェイカーで振とうしながらインキュベートした。
このプレートから液を除去後、自然乾燥し、蛍光用イムノプレートリーダーで励起波長３３７nm、蛍光波長６１５nmにてケラタン硫酸を測定した。
【００５９】
次いでプレートを緩衝液Ｂで洗浄した後、ビオチン化ＨＡＢＰを緩衝液Ａに溶解して３５０ng/ml の濃度にした溶液１００μl づつを各ウエルに添加し、３７℃で１．５時間インキュベートした。
ウエルを緩衝液Ｂで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（シグマ社製）を緩衝液Ａで１，０００倍に希釈した液１００μl づつを各ウエルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
ウエルを緩衝液Ｂで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ社製）を基質緩衝液に溶解した１mg/ml 溶液１００μl づつを各ウエルに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。吸光度用イムノプレートリーダーで波長４０５nm（対照波長６３０nm）の吸光度を測定した。
ケラタン硫酸の濃度に対して測定された蛍光強度をプロットすることによりケラタン硫酸の検量線を作成し、ヒアルロン酸の濃度に対して測定された吸光度をプロットすることによりヒアルロン酸の検量線を作成した。結果を図２に示す。
【００６０】
この結果により、ケラタン硫酸とヒアルロン酸は、同時に感度よく簡便に測定することができ、１検体から２種のリガンドを測定することが可能であることが示された。
【００６１】
実施例２
実施例１と同様に表２の濃度のケラタン硫酸とヒアルロン酸を含むサンプルを調製した。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
これらのサンプルについて、プレートのウエルに添加するビオチン化ＨＡＢＰ濃度を１，７５０ng/ml に代えた点の他は実施例１と同様にケラタン硫酸およびヒアルロン酸を測定し、ケラタン硫酸の濃度と蛍光強度、ヒアルロン酸濃度と吸光度についてプロットした。結果を図３に示す。
この結果により、ケラタン硫酸とヒアルロン酸は、感度よく測定可能であり、それぞれ互いに影響し合わない検量線を与えることから、本発明の方法では、１検体で２種のリガンドを測定することが可能であることが示された。
【００６４】
【発明の効果】
本発明で使用される固相体では、固相体上に直接固相化されているのは、第一受容体のみであり、固相化のための最適条件を第一受容体に基づいて選択することができる。また、第一リガンドが結合された第二受容体を適当な濃度で用いることによって、煩雑な操作を必要とせずに、特異的に、第二受容体を必要な濃度で第一リガンド−第一受容体を介して同じ固相体上に固着化させることができる。そのため第一受容体および第二受容体の安定した固着化ができるので、同一検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを高感度にまた同時に測定することができる。
【００６５】
さらに、２種のリガンドを同時に測定することができるため、検体量が少なくてすむ、操作が簡便である、時間を短縮できる、使用するプレートなどの資材の消費量が少なくてすむなどの利点がある。
【００６６】
さらに、本発明の方法によれば、２種類のグリコサミノグリカンを同時に感度よく測定することでグリコサミノグリカンに関連する複数の疾患（例えば、変形性関節症、慢性関節リウマチなどの軟骨の異常を伴う疾患；角膜組織異常を伴う疾患；リウマチなどの炎症；癌；肝疾患；モルキオ症、ハーラー症などのムコ多糖症など）の一次スクリーニングを簡便に行える。
【図面の簡単な説明】
【図１】検体中の第一リガンドおよび第二リガンドを測定する方法を示す模式図。
【図２】ケラタン硫酸とヒアルロン酸の検量線。
【図３】ケラタン硫酸とヒアルロン酸の測定例。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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