(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水に可溶なタンパク質の骨誘導性混合物であって、
（ａ）骨を粉砕、洗浄すると共に、浮選によって軟組織を除去する工程を含む工程と、
（ｂ）酸を用いて、前記粉砕され洗浄された骨粒子を脱無機化する工程と、
（ｃ）低温でグアニジンを用い、洗浄、粉砕、脱無機化された骨粒子からタンパク質を抽出し、前記タンパク質の低下を防止して第１の溶液を得る工程と、
（ｄ）100kDの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた第１の接線流限外ろ過を含む限外ろ過プロセスに前記第１の溶液をかけ、ろ液を保持させるとともに、10kDの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いる第２の接線流限外ろ過に前記ろ液をかけ、保持物を保持する工程と、
（ｅ）10kDの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた限外ろ過工程に引き続くことにより、前記保持物において前記グアニジンに代えて尿素を置換する一方、保持物において失われたグアニジンを構成尿素で置き換えて尿素抽出溶液を得る工程と、
（ｆ）0.135M未満のNaCl濃度を得るために前記尿素抽出溶液にNaClを添加し、第４級アミン基を有する陽性のアニオン交換樹脂に前記尿素抽出溶液を装填する工程と、
（ｇ）0.23M〜0.27MのNaCl濃度を有する第１の溶離剤で前記陽性のアニオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、アニオン交換された分取溶出液を得る工程と、
（ｈ）前記アニオン交換された分取溶出液のpHをpH4.8に調節する工程と、
（ｉ）0.23M〜0.27MのNaCl濃度を得るために前記アニオン交換分取溶出液にNaClを添加し、スルホン酸基を有する陰性のカチオン交換樹脂に前記アニオン交換分取溶出液を装填する工程と、
（ｊ）0.6M〜1.5MのNaCl濃度を有する第２の溶離剤で前記陰性のカチオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、カチオン交換された分取溶出液を得る工程と、
（ｋ）前記カチオン交換分取溶出液を透析して、低分子量種を除去する工程と、
（ｌ）前記カチオン交換分取液からのタンパク質を含む第２の溶液を、炭化水素修飾されたシリカ充填物質を含む逆相HPLCカラムに装填する工程と、
（ｍ）pH2未満のpHと、33容量％から37容量％までに増大する可変アセトニトリル濃度と、0.05容量％〜0.15容量％のトリフルオロ酢酸濃度とを有する第３の溶離剤で、前記HPLCカラムからタンパク質を溶離する工程と、
を含む方法によって製造され、
得られたタンパク質の骨誘導性混合物が20.7〜26.1モルパーセントの酸性アミノ酸、11.3〜15.7モルパーセントのヒドロキシアミノ酸、37.6〜42.4モルパーセントの脂肪族アミノ酸、5.8〜7.9モルパーセントの芳香族アミノ酸、及び、13.3〜19.9モルパーセントの塩基性アミノ酸からなるアミノ酸組成物を含み、
該タンパク質の骨誘導性混合物を所定の基質に、該タンパク質の骨誘導性混合物：基質が1:600の割合となるように加え、該タンパク質の骨誘導性混合物を含む基質を21日間ラットに皮下埋植した時、少なくとも３の組織学的等級を達成するタンパク質の骨誘導性混合物。
【請求項２】
水に可溶なタンパク質の骨誘導性混合物であって、
（ａ）100kDの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた第１の限外ろ過工程からなる限外ろ過に、脱無機化された骨抽出物を含有する溶液をかけ、ろ液を保持させるとともに、10kDの公称分子量分画を有する限外ろ過膜を用いた第２の限外ろ過工程に前記ろ液をかけるとともに該保持物を保持する工程と、
（ｂ）pH8.5のpHを有する前記保持物を、第４級アミン基を有するアニオン交換樹脂に装填し、前記溶液が0.135M未満のNaCl濃度を有することとなる工程と、
（ｃ）0.23M〜0.27MのNaCl濃度を有する溶離剤で前記アニオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、アニオン交換された分取溶出液を得る工程と、
（ｄ）前記アニオン交換された分取溶出液のpHをpH4.8に調節する工程と、
（ｅ）スルホン酸基を有するカチオン交換樹脂に、0.23M〜0.27MのNaCl濃度を有する前記アニオン交換分取溶出液を装填する工程と、
（ｆ）0.6M〜1.5MのNaCl濃度を有する溶離剤で前記カチオン交換樹脂からタンパク質を溶離し、カチオン交換された分取溶出液を得る工程と、
（ｇ）前記カチオン交換分取溶出液を透析して、低分子量種を除去する工程と、
（ｈ）前記カチオン交換分取液からのタンパク質を、炭化水素修飾されたシリカ充填物質を備える逆相HPLCカラムに装填する工程と、
（ｉ）pH2未満のpHと、33容量％〜37容量％のアセトニトリル濃度と、0.1容量％〜0.15容量％のトリフルオロ酢酸濃度とを有する溶離剤で、前記HPLCカラムからタンパク質を溶離する工程と、
を含む方法によって製造され、
得られたタンパク質の骨誘導性混合物が20.7〜26.1モルパーセントの酸性アミノ酸、11.3〜15.7モルパーセントのヒドロキシアミノ酸、37.6〜42.4モルパーセントの脂肪族アミノ酸、5.8〜7.9モルパーセントの芳香族アミノ酸、及び、13.3〜19.9モルパーセントの塩基性アミノ酸からなるアミノ酸組成物を含み、
該タンパク質の骨誘導性混合物を所定の基質に、該タンパク質の骨誘導性混合物：基質が1:600の割合となるように加え、該タンパク質の骨誘導性混合物を含む基質を21日間ラットに皮下埋植した時、少なくとも３の組織学的等級を達成するタンパク質の骨誘導性混合物。
【請求項３】
前記アミノ酸の総モル量に基づいて、20.7〜26.1モルパーセントのASP（＋ASN）及びGLU（＋GLN）、11.3〜15.7モルパーセントのSER及びTHR、37.6〜42.4モルパーセントのALA,GLY,PRO,MET,VAL,ILE及びLEU、5.8〜7.9モルパーセントのTYR及びPHE、並びに、13.3〜19.9モルパーセントのHIS,ARG及びLYSからなるアミノ酸組成物を、加水分解の際に備えてなる請求項１または２に記載のタンパク質の骨誘導性混合物。
【請求項４】
11.14モルパーセントのAsp、12.25モルパーセントのGlu、9.48モルパーセントのSer、8.50モルパーセントのGly、2.28モルパーセントのHis、7.19モルパーセントのArg、4.03モルパーセントのThr、8.05モルパーセントのAla、7.16モルパーセントのPro、3.63モルパーセントのTyr、3.79モルパーセントのVal、1.73モルパーセントのMet、2.75モルパーセントのIle、8.00モルパーセントのLeu、3.21モルパーセントのPhe、及び7.11モルパーセントのLysからなるアミノ酸を含む請求項１または２に記載のタンパク質の骨誘導性混合物。
【請求項５】
前記限外ろ過工程によって得られた溶液をアニオン交換樹脂に装填する工程に先だって、前記溶液のpHをpH8〜pH9に調整することを含む請求項１に記載のタンパク質の骨誘導性混合物。
【請求項６】
前記第１の溶液、前記アニオン交換分取溶出液及び前記カチオン交換分取溶出液の各々は、溶出中のタンパク質を保持するに十分な量の尿素を備えてなる請求項１に記載のタンパク質の骨誘導性混合物。
【請求項７】
前記タンパク質の骨誘導性混合物は、骨形成の誘導に適した担体に沈積され皮下埋植された際に３マイクログラムで骨誘導活性を示す請求項１に記載のタンパク質の骨誘導性混合物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般に、骨の成長を誘導または促進することに有用なタンパク質（即ち、骨誘導性タンパク質）ならびに、無機質除去した骨の抽出物からそのようなタンパク質を精製するために用いる方法に関する。より具体的には、本発明は、骨誘導タンパク質を精製するために好ましくは組み合わせて使用される限外ろ過法、アニオン交換法、カチオン交換法および逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法に関する。
発明の背景
骨は多くのタンパク質を含み、そのいくつかは骨の成長を誘導または促進する。組換えDNA技術または自然に発生するタンパク質の精製によって特定の骨誘導性タンパク質を製造することに多大な研究が当てられてきた。このようなタンパク質およびそれらを得るための多様な方法は、数多くの特許の主題である。しかし、有用な骨誘導性タンパク質の経済的で大規模な工業的量産に対しては、ほとんど研究がなされていない。
カリフォルニア州パロアルトのコラーゲン（Collagen）社は、骨誘導性タンパク質に関する多数の特許の譲受人である。1984年２月28日に発行されたセイディンらによる米国特許第4,434,094号は、カチオン交換クロマトグラフィーを利用して、骨形成因子を部分的に精製し、30キロドルトン（kD）未満の分子量を有する非繊維状のタンパク質を無機質除去した骨抽出物から単離する方法を示している。部分的に精製された10〜30kDの骨誘導因子と、無機質除去した骨からの抽出、ゲルろ過および、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を含むことができる、カルボキシメチルセルロースカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーをはじめとする精製法とが、1986年12月９日に発行されたセイディンらによる米国特許第4,627,982号に記載されている。
また、セイディンらによる、コラーゲン社に譲渡された1988年９月27日に発行の米国特許第4,774,228号は、骨の中に見られる２種の26kDタンパク質を記載している。これらのタンパク質は、TGB−β検定で活性を有するものであり、セイディンの'094号特許に教示された方法に似てはいるが、逆相HPLCまたは酢酸−尿素ゲル電気泳動を含み、精製されたタンパク質が軟骨形成活性（骨形成に関連するといわれている）を示すところの方法によって精製される。1989年９月５日に発行されたナタンらによる米国特許第4,863,732号は、骨形成因子、例えばセイディンの'982号特許に記載のものをアテロペプチドコラーゲンと合わせ、共沈によってさらに精製したものの注入性溶液に関する。他の特許、例えば1988年12月６日に発行されたワルラスらによる米国特許第4,789,663号および1989年１月３日に発行されたピッツェらによる第4,795,467号は、アテロペプチドコラーゲン物質の混合物に関する。
マーシャルR.ユリストは、骨誘導剤の分野の多数の特許に名をあげた発明者である。1981年10月13日に発行された、ユリストによる米国特許第4,294,753号は、骨形態発生タンパク質（BMP）を得るための方法であって、無機質除去した骨を中性塩で処理して骨コラーゲンをゼラチンに変換し、BMPを可溶化剤で抽出し、次いで透析によって可溶性化剤および塩を除去してBMPを沈殿させることによる方法を記載している。溶液からのタンパク質の沈殿は選択性が高くないことが認められている。1,000〜100,000の範囲の分子量を有するBMPが、1984年６月19日に発行されたユリストによる米国特許第4,455,256号の主題である。1986年10月28日に発行されたユリストによる米国特許第4,619,989号は、ヒトおよびウシ科動物のBMP組成物および因子をさらに精製、単離するための、追加的な透析および共沈の段階を含む改良された方法を開示している。1988年８月２日に発行されたユリストによる米国特許第4,761,471号は、前述の方法によって得られる、活性の17.5kD（ヒト）または18.5kD（ウシ科動物）BMP因子ならびに約14、22、24および34kDの分子量を有する、骨形成を促進はするが誘導はしないBMP関連タンパク質を含有する実質的に純粋なBMP組成物を含む生成物に関している。
1989年10月31日に発行されたワングらによる米国特許第4,877,864号は、組換え遺伝子技術によって製造することができる、特定のペプチド配列を特徴とする約28kD〜30kDのヒトおよびウシ科動物の骨誘導性因子を開示している。
1989年２月14日に発行されたセンによる米国特許第4,804,744号は、約22〜24kDの分子量を有する主要な骨形成性タンパク質（P3）を示している。この特許はまた、P3なしでは非骨形成性であるタンパク質P2およびP4を示し、さらには、無機質除去した骨組織からP3を単離するための、抽出、透析、ゲルろ過およびHPLCの段階を含む方法を示している。
明らかに、骨誘導的活性の高いタンパク質の混合物を得ることが望ましいであろう。そのようなタンパク質を効率的にかつ効果的に工業的規模で製造することができるならば、有益であろう。また、そのようなタンパク質を、その製造を最大限にしながらもその劣化を最小限にするような方法で製造することができるならば、有益であろう。また、処理条件の小さな変動を許容しうる方法において比較的周知のユニット操作を利用してそのようなタンパク質を製造することができるならば、有益であろう。また、所望の混合物を得るために、まず個々の特定のタンパク質を得て、それらを混合し直すことなしに、タンパク質の混合物を直接的に製造することができるならば、有益であろう。
発明の概要
本発明は、好ましくはウシ科動物の骨からの精製によって骨誘導性因子を得るための方法と、その結果として得られる生成物とを包含する。
骨誘導的活性のタンパク質を精製する方法の一実施態様は、好ましくは約pH8〜約pH9のpHを有し、好ましくは約1,900μmhos（1.9×10-3S）未満の導電率を有する無機質除去した骨抽出物溶液に対してアニオン交換クロマトグラフィーを実施することからなる。好ましくは約10,260μmhos（1.026×10-2S）〜約11,200μmhos（1.120×10-2S）の導電率を有する溶離剤により、アニオン交換樹脂からタンパク質を溶離させる。溶離したタンパク質の溶液を、好ましくは、約pH4.4〜約pH5.0のpHおよび好ましくは約17,900μmhos（1.79×10-2S）〜19,200μmhos（1.92×10-2S）の導電率に調節し、カチオン交換樹脂に装填する。タンパク質は、好ましくは約39,100μmhos（3.91×10-2S）〜約82,700μmhos（8.27×10-2S）の導電率を有する溶離剤により、カチオン交換樹脂から溶離される。82,700μmhosを超える導電率値をうまく利用することもできるが、より高い値をもってすると、HPLCの前の透析により長い時間を要するであろう。カチオン交換樹脂から溶離させたタンパク質を逆相HPLCカラムに装填する。好ましくは約33容量％〜37容量％の範囲の上昇するアセトニトリル濃度勾配を有する溶離剤により、HPLCカラムからタンパク質を溶離させて、高められた骨誘導的活性を有する精製されたタンパク質混合物を得る。
本発明のさらなる実施態様においては、アニオン交換樹脂は強陽性であり、第四アミン官能基を有するものである。本発明のもう一つの実施態様においては、カチオン交換樹脂は強陰性であり、スルホン酸官能基を有するものである。本発明はまた、炭化水素で改質されたシリカ、好ましくはVYDACTM（分離群（The Separation Group））C18カラムであるHPLC充填材の使用を含む。
本発明はまた、上述の方法によって得られる骨誘導性因子を含む。骨誘導性因子の一実施態様においては、この因子は、図１に示すドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）分布を示す多数のタンパク質の混合物である。本発明のもう一つの実施態様は、好ましいアミノ酸組成、すなわち酸性アミノ酸［ASP（＋ASN）およびGLU（＋GLN）］約23.4モル％；ヒドロキシアミノ酸（SER＋THR）約13.5モル％；脂肪族アミノ酸（ALA、GLY、PRO、MET、VAL、ILEおよびLEU）約40.0モル％；芳香族アミノ酸（TYRおよびPHE）約6.8モル％ならびに塩基性アミノ酸（HIS、ARGおよびLYS）約16.6モル％を有するタンパク質の混合物である。TRP、CYSおよびCYSは測定せず、モル％の計算には入れていない。
本発明の好ましい実施態様によると、無機質除去した骨粒子を、グアニジン塩基塩を用いるタンパク質抽出に付す。抽出物溶液をろ過し、二段階限外ろ過法に付す。第一の限外ろ過段階においては、好ましくは、100kDの公称分子量分画（MWCO）を有する限外ろ過膜を使用する。残留液を捨て、ろ液を、好ましくは約10kDの公称MWCOを有する限外ろ過膜を使用する第二の限外ろ過段階に付す。次に、残留液を透析ろ過に付してグアニジンに代えて尿素を用いる。次に、タンパク質含有尿素溶液を、連続イオン交換クロマトグラフィー、すなわち、まずアニオン交換クロマトグラフィー、続いてカチオン交換クロマトグラフィーに付す。上述した方法においては、骨誘導的活性のタンパク質を溶液中に保持することが有利である。好ましくは、上記の方法によって製造した骨誘導性タンパク質を次にHPLCに付す。
本発明の利点は、工業的量産規模に容易に拡大することができる方法が得られるということである。さらなる利点は、精製段階の間、タンパク質が溶液中に保持されるということである。もう一つの利点は、製造過程の間、タンパク質がほとんど劣化を示さないということである。もう一つの利点は、所望により、得られたタンパク質混合物を、別々の方法によって製造されたタンパク質と混合し直すことなしに、直接的に使用しうるということである。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の方法によって得られる骨誘導的活性のタンパク質混合物のSDS−PAGEを還元および未還元の両形態で示すものである。
図２は、実施例に用いる「Ｘ線評点」を得るために用いられるＸ線基準を示すものである。
発明の詳細な説明
本発明によれば、骨誘導性因子を骨から精製する方法が与えられ、かつ、骨誘導性因子が得られる。
本発明の一実施態様においては、骨誘導タンパク質を精製する方法は、限外ろ過段階と、アニオン交換クロマトグラフィー段階と、カチオン交換クロマトグラフィー段階とを含む。本発明の他の実施態様はHPLC精製段階を含む。
本発明のもう一つの側面は、骨誘導性タンパク質混合物である。一実施態様においては、この混合物は数種類のタンパク質を含むものである。これを、還元および未還元状態の骨誘導性因子のSDS−PAGEを示す図１に示す。本発明のもう一つの実施態様はまた、アミノ酸組成、すなわちASP（＋ASN）およびGLU（＋GLN）約20.7〜約26.1（好ましくは約23.4）モル％;SERおよびTHR約11.3〜約15.7（好ましくは約13.5）モル％;ALA、GLY、PRO、VAL、MET、ILEおよびLEU約37.6〜約42.4（好ましくは約40.0）モル％;TYRおよびPHE約5.8〜約7.9（好ましくは約6.8）モル％ならびにHIS、ARGおよびLYS約13.3〜約19.9（好ましくは約16.6）モル％を有する骨誘導的活性のタンパク質混合物を含む。さらなる実施態様は、説明した精製法の各実施態様から得られる骨誘導性因子を含む。
ここに使用する「骨誘導性因子」とは、組織学的評価による決定では、骨芽細胞、破骨細胞および骨状基質を伴う骨の新たな形成を示す、骨誘導的に活性である１種またはそれ以上のタンパク質を含む組成物をいう。例えば、骨誘導的活性は、試験すべき物質を付着させるところの支持体を使用する試験によって実証することができる。付着物質を有する支持体を試験動物に皮下埋植する。この埋植片を後で取り出し、骨芽細胞、破骨細胞および骨状基質を含む骨形成の存在について顕微鏡で調べる。
本発明に好ましい出発原料は、タンパク質抽出に備えて骨を粉砕、洗浄および無機質除去によって前処理し、骨タンパク質を抽出し、抽出したタンパク質を多数の精製段階によって濃縮することを含むことが好ましい多段階手順によって得られる。本方法の出発原料の好ましい源は、哺乳類の骨である。その入手の簡便性および低廉さのため、通常はウシ科動物の骨を使用する。しかし、他の哺乳類の骨を適宜に使用して本発明を実施することもできる。骨は、当該技術において公知である慣例的な手段、例えば粉砕および洗浄により、骨タンパク質の抽出に備えて前処理する。通常、骨を粉砕して連続的により微細な粒子にし、洗剤溶液に浸漬して骨以外の物質を除去する。好ましくは、骨を、4mm未満、好ましくは約1mm〜約4mmの大きさの粒子に粉砕し、粉砕の合間に洗剤溶液に浸漬し、浮選タンク中ですすいで軟組織を除去する。
次に、洗浄した粉砕骨を酸で無機質除去する。骨を適当な酸に浸漬し、これを好ましくは室温で撹拌してもよい。酸浸漬溶液のpHは、通常pH1.3以下に維持する。希釈HCl溶液（例えば約0.6M〜約1.2M）が骨の無機質除去に効果的であることがわかった。あるいはまた、他の適当な酸、例えばギ酸を使用することもできる。無機質除去の間の過剰な発泡を防ぐために、オクチルアルコールまたは他の脱泡剤が有用である。
骨は、ほぼ完全に無機質除去されるまで、十分な時間酸に浸漬しておく。Ｘ線分析を利用して、無機質除去の程度を評価してもよい。あるいはまた、経験によって標準的な手法を開発して、無機質除去に要する時間を決定することもできる。通常は、少なくとも７時間を要する。次に、無機質除去した骨をすすいで酸を除去する。通常、骨は、一夜またはすすぎ排液のpHがpH4以上に達するまで水ですすぐ。当業者であれば理解することができるように、代わりの洗浄および無機質除去方法を使用してもよい。
タンパク質は、タンパク質変性剤、例えばグアニジウムイオンおよび／または尿素を使用して、無機質除去した骨から抽出する。好ましくは、抽出は、20℃未満、より好ましくは15℃未満の温度で実施する。他の適当な変性剤を同様に使用しうることが注目されよう。グアニジン塩酸塩はイオンであり、タンパク質を溶液中に保持するための可溶化剤としても機能するため、好ましい変性剤である。
任意には、抽出の間にカオトロープを加えて、抽出したタンパク質の溶解性を改善することができる。適当なカオトロープには、塩化カルシウム（CaCl2）、塩化マグネシウム（MgCl2）および塩化セシウム（CeCl2）がある。
タンパク質は、当該技術において、通常使用される手段により、無機質除去した骨から抽出することができる。例えば、フィルタプレス中、タンパク質変性剤を無機質除去した骨の中に汲み入れて、回収される変性剤中にタンパク質を抽出することができる。適当な低温を提供するために、変性剤を無機質除去した骨の中に汲み込むとき、それを初めに低い温度、好ましくは約０℃〜約４℃に冷却することができる。変性剤の温度は、抽出過程の間に上昇させることができる。
普通、実質的にすべての非コラーゲン質の骨タンパク質が無機質除去した骨から除去されるまで抽出を続ける。通常の抽出は約48時間を要する。好ましくは、抽出溶液を中性pH付近に維持する。
変性剤溶液中に抽出したタンパク質を、一連の精製段階によって分離する。第一の限外ろ過法が、所定の望みの範囲の分子量を有する望みのタンパク質を選択して、さらなる処理に備える。好ましくは、第一段階として、100kDの公称分子量分画（MWCO）を有する限外ろ過膜、例えば、「セントラセット（Centrasette）」（フィルトン社）の商品名のもとで販売されているプレート＆フレーム型接線流ろ過ユニットを使用する。ろ過は、好ましくは、加圧下に、通常は約50psiのろ過圧で実施する。タンパク質濃度は抽出の完結性によって変化する。
第一の限外ろ過段階に続き、好ましくはさらに低い分子量のタンパク質を除く10kDの公称分子量分画の膜を介する第二の限外ろ過段階によってろ液を濃縮する。第二の限外ろ過は、所望の範囲内の分子量を有するタンパク質混合物（「ろ過したタンパク質濃縮物」）とともに、残留液を生じさせる。
好ましい実施態様においては、その後のイオン交換クロマトグラフィーに備えて、ろ過したタンパク質濃縮物をイオン変性剤溶液から非イオン変性剤溶液、例えば尿素に移す。イオン変性剤、例えばグアニジン塩酸塩は、所望のタンパク質を選択的に結合するイオン交換樹脂の能力を損なうため、その後のイオン交換精製段階に使用するには非イオン変性剤が好ましい。好ましくは、タンパク質変性剤溶液は、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（以下「トリス」という）で緩衝し、約pH8.5のpHに滴定した約2M〜約6Mの尿素溶液である。
イオン変性剤から非イオン変性剤へのタンパク質の移行は、透析ろ過または透析を使用して実施することができる。透析ろ過は、適当な接線流限外ろ過ユニット、例えばセントラセットTM（フィルトン）限外ろ過ユニットを使用して実施する。透析ろ過または透析の使用により、溶液からタンパク質を沈殿させることなしに、ろ過したタンパク質濃縮物を適当な変性剤に移すことができる。この手法は、その後の精製を簡素化し、またはタンパク質を沈殿させるならば生じるおそれのある損失を防ぐため、有利である。この手法を工業的量産規模で使用しうるということもまた有利である。
本発明は、抽出した骨タンパク質の溶液を精製して、骨誘導的活性のタンパク質混合物を生じさせるためのアニオン交換法を含む。アニオン交換法の好ましい実施態様においては、好ましい出発原料を得るための上述した方法を使用して出発原料を前処理する。アニオン交換法は、以下に説明する追加的な精製法とあわせて利用する。
イオン交換クロマトグラフィー、すなわちアニオン交換およびカチオン交換クロマトグラフィーにおいては、特定のイオン交換樹脂を求める特定のタンパク質の親和力は、タンパク質溶液のイオン強度およびpHに依存する。溶液のイオン強度は、その導電率によって測定することができる。あるいはまた、溶液のイオン強度は、特定の対イオン濃度に換算して測定することもできる。ここに使用する「対イオン濃度」とは、イオン交換樹脂上の結合場所を求めてタンパク質と競合する溶液中のイオンのモル濃度をいう。
本発明にしたがって骨タンパク質溶液をアニオン交換カラムに装填する前に、骨タンパク質溶液の導電率を調節して所望のタンパク質を選択的に樹脂に結合させる。本アニオン交換法においては、対イオン濃度の変動により、骨タンパク質溶液の導電率を、約1,900μmhos（1.9×10-3S）未満、より好しくは約1,080μmhos（1.08×10-3S）〜約1,900μmhos（1.9×10-3S）に調節する。好ましい実施態様においては、対イオンはCl-であり、約0.135M未満のNaCl濃度で存在する。
適当な導電率を有する、アニオン交換法によって精製すべき骨タンパク質溶液をアニオン交換カラムに装填する。本アニオン交換法においては、アニオン交換カラムは、強陽性のアニオン交換樹脂を有するものである。強陽性のアニオン交換樹脂を用いる本アニオン交換法は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を精製することに効果的であることがわかった。ここに使用する強陽性のアニオン交換樹脂とは、強陽性の官能基、例えば第四アミン官能基を有する樹脂をいう。第四アミン官能基を有する好ましい樹脂は、「Ｑ−セファロース（Ｑ−Sepharose）」TM（ファルマシア（Pharmacia）社）の商品名のもとで販売されている。しかし、同様に塩基性の官能基を有する他の樹脂もまた適当である。
アニオン交換樹脂への結合の選択性に影響するならなる要因は、アニオン交換カラムに装填される骨タンパク質溶液およびアニオン交換溶離剤のpHである。骨タンパク質溶液および溶離剤のpHは、骨タンパク質溶液からの望みのタンパク質がカラムを通過するときにそれに樹脂を結合させ、タンパク質の所望の溶離を可能にするのに効果的なpHである。一般に、約pH8〜pH9のpHがこの方法に効果的である。好ましくは、タンパク質溶液および溶離剤のpHを約pH8.5に調節する。
アニオン交換カラムを通過する骨タンパク質溶液の線速度は、必要とされる回収パラメータによって決まる。通常、処理を低速で実施して所望のタンパク質のほぼ完全な吸収を可能にして、タンパク質の損失が最小限になるようにする。しかし、線速度はそれより大きくてもよいが、タンパク質損失を支えうることを認識すべきである。
アニオン交換法は、結合したタンパク質の所望の部分を溶離剤によってカラム樹脂から選択的に脱着させることをさらに含む。脱着される結合タンパク質の部分は、溶離剤溶液の導電率によって決まる。タンパク質は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を得るのに十分な導電率を有する溶液により、本発明のアニオン交換カラムから溶離させる。好ましくは、溶離剤は、約10,260μmhos（1.026×10-2S）〜約11,200μmhos（1.120×10-2S）の導電率を有するものである。より高い導電率を用いてもよいが、それは、後の精製段階で除去しなければならないかもしれない。より多量の物質の脱着を招く。
本発明のアニオン交換溶離剤は、通常は、適当な導電率を得るのに適当な塩濃度を有するタンパク質変性剤溶液である。好ましい溶離剤は、塩化ナトリウムを含むトリス塩基で緩衝した6Mの尿素である。塩化ナトリウム（NaCl）は、溶離剤中に適当な導電率を生じさせる対イオン濃度を提供するのに効果的である。好ましい実施態様においては、溶離剤は、約0.10M〜約0.16M、より好ましくは約0.105M〜約0.145Mの対イオン濃度のNaClで前処理する。他の適当な塩を、適当な導電率を提供するのに十分な対イオン濃度で使用してもよい。
本発明は、溶液中の骨誘導タンパク質から骨誘導性因子をさらに精製するための、上述したアニオン交換法および以下に記すHPLC処理と組み合わせて使用することが有利であるカチオン交換クロマトグラフィー法をさらに含む。
アニオン交換法に関連して上述したように、骨タンパク質溶液の導電率を制御して、カチオン交換樹脂に対するタンパク質の選択的結合をもたらす。骨タンパク質溶液を本発明のカチオン交換カラムに装填する前に、骨タンパク質溶液の導電率を調節して、カチオン交換樹脂をタンパク質の所望の部分に選択的に結合させるのに効果的なものにする。本カチオン交換法においては、骨タンパク質溶液の導電率は、好ましくは約17,900μmhos（1.79×10-2S）〜約19,200μmhos（1.92×10-2S）である。塩化ナトリウムまたは他の適当な塩を使用して、導電率を適当なレベルに調節することができる。好ましい実施態様においては、骨タンパク質溶液の対イオン濃度は、約0.125MのNaCl〜約0.30MのNaCl、より好ましくは約0.23M〜約0.27MのNaClである。
適当な導電率を有する、カチオン交換法によって精製すべき骨タンパク質溶液をカチオン交換カラムに装填する。本カチオン交換法においては、強陰性のカチオン交換樹脂が骨誘導的活性のタンパク質の混合物を精製するのに効果的であることがわかった。ここに使用する強陰性カチオン交換樹脂とは、強陰性の官能基、例えばスルホン酸官能基を有する樹脂をいう。スルホン酸官能基を有する好ましい樹脂は、「Ｓ−セファローズ」TM（ファーマシア社）の商品名のもとで販売されている。しかし、同様に酸性の官能基を有する他の樹脂もまた適当である。
カチオン交換法によって精製すべき骨タンパク質溶液のpHは、所望のタンパク質を樹脂に結合させるのに効果的なpHに調節する。本方法においては、約pH4.4〜約pH5.0のpHを使用することが好ましい。好ましくは、タンパク質溶液のpHを約pH4.8に調節する。
カチオン交換カラムを通過する骨タンパク質溶液の線速度は、上記のアニオン交換と同様に、必要とされる回収パラメータによって決まる。速度は、一般に、タンパク質の損失を最小限にしながら、望みのタンパク質のほぼ完全な吸着を可能にするのに十分なほど低いものである。
カチオン交換法は、結合したタンパク質の所望の部分をカラム樹脂から選択的に脱着させることを含む。タンパク質は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を生じさせるのに適当な導電率を有する溶離剤により、カチオン交換カラムから溶離させる。本カチオン交換法の場合、溶離剤の導電率は、好ましくは39,100μmhos（3.91×10-2S）〜約82,700μmhos（8.27×10-2S）またはそれ以上である。
一般に、本方法の溶離剤は、適当なタンパク質変性剤、例えば尿素と、所望の導電率を達成するのに適当な塩濃度とを有する溶液である。好ましい実施態様においては、溶離剤は、約0.6MのNaCl〜約1.5MのNaCl、より好ましくは約1.3M〜約1.5MのNaClの対イオン濃度によって前処理して適当な導電率を得る。
本発明は、骨誘導活性のタンパク質混合物を得るために上述したアニオンおよびカチオン交換法と合わせて利用してもよい逆相HPLC法をさらに含む。本発明のHPLC精製法においては、骨タンパク質溶液を逆相HPLCカラムに装填する。このカラムはポリマー（すなわちポリスチレン）であってもよいし、シリカベースのものであってもよい。好ましくは、HPLCカラムは炭化水素で改質されたシリカである。好ましくは、シリカ樹脂はC4〜C18炭化水素鎖の添加によって改質されたものであり、より好ましくは、HPLCカラムはVYDACTM（分離群）C18カラムである。
逆相カラムに装填すべき骨タンパク質溶液は、トリフルオロ酢酸または他の適当な溶媒（例えば、ヘプタフルオロ酪酸またはリン酸）の溶液であることができる。好ましくは、トリフルオロ酢酸を約0.05容量％〜約0.15容量％、より好ましくは約0.1容量％の濃度で有するトリフルオロ酢酸溶液を使用する。
骨誘導活性のタンパク質は、所望のタンパク質を得るのに適当な有機溶媒／水の混合物により、HPLCカラムから溶離させる。HPLC法において好ましい溶離剤はアセトニトリル溶液である。好ましい溶離剤は、通常、溶離の間に約30容量％から約40容量％に、より好ましくは約33容量％から約37容量％に変動するアセトニトリル濃度を有する。好ましい実施態様においては、溶離剤中のアセトニトリル濃度は、アセトニトリルの所望の最高濃度に達するまで、毎分約0.30容量％〜約0.40容量％の増分で増加させる。タンパク質は、当該技術において公知の手段により、HPLC法の溶離剤から回収することができる。
本発明のさらなる実施態様は、適当な担体に付着され、皮下埋植されたときに約３マイクログラムで骨誘導的活性を示す、上述したHPLC法からのタンパク質生成物である。本発明の一実施態様においては、骨誘導性因子は、図１に示すゲル分離分布を示す骨誘導的活性のタンパク質混合物である。このゲル分離分布は、SDS−PAGEを使用して実施したものである。第一の列は、既知の分子量の基準についてSDS−PAGEを実施することによって得られた分子量目盛りである。第二の列は、２−メルカプトエタノールで還元された本発明によるタンパク質混合物のSDS−PAGE分布を示す。第三の列は、本発明によるタンパク質の未還元混合物のSDS−PAGE分布を示す。図１に示すSDS−PAGE分布を提供するタンパク質の混合物は高い骨誘導的活性を有することがわかったが、実施例に実証するように、図１に示すものとわずかに異なるSDS−PAGE分布を有するタンパク質の混合物もまた効果的であると推測される。したがって、図１の還元または未還元状態のSDS−PAGE分布において検出されるほぼすべてのタンパク質帯からなる分布を有するタンパク質の混合物は、本発明の範囲にあるとみなされる。
本発明の更に別の実施態様は、加水分解を受けたときに、アミノ酸組成、すなわちASP（＋ASN）およびGLU（＋GLN）約23.4モル％;SERおよびTHR約13.5モル％;ALA、GLY、PRO、MET、VAL、ILEおよびLEU約40.0モル％;TYRおよびPHE約6.8モル％ならびにHIS、ARGおよびLYS約16.6モル％を有する骨誘導的活性のタンパク質混合物を含む。
上述の方法のいずれかまたは他の方法によって誘導される骨誘導的活性のタンパク質混合物は、多様な配送系を利用して、骨成長が望まれるところの場所に送ることができる。一つの配送系は、骨誘導的活性のタンパク質混合物を付着させたコラーゲン支持体である。本発明の更なる実施態様は、皮膚誘導または腱誘導のコラーゲンを使用する配送系である。
実施例
実施例１
ウシ科動物の皮質骨の断片（47kg）を、25、６および4mm孔径の連続するスクリーンに通して粉砕した。軟組織および脂質の除去を容易にするため、粉砕するごとに、洗剤溶液を含む浮選タンクに入れて骨の粒子を洗浄した。1.2MのHCl溶液60ガロンとともに室温で7.5時間撹拌することにより、粉砕した骨（25.95kg）を無機質除去した。また、発泡を防ぐために、オクタノール40mlを加えた。
トリス塩基でpH7.4に緩衝した4Mのグアニジン塩酸塩約60リットルを用い、無機質除去した骨粒子の充填床の中に溶液を連続的に循環させることにより、骨誘導的活性のタンパク質を抽出した。グアニジンを、抽出の間、まず約４℃に冷却し、この抽出において、49.5時間後に抽出物溶液59リットルを捕集した。
抽出物溶液を、５μｍのカプセルフィルタに通してろ過し、次に、100kDの公称分子量分画（MWCO）を有する25平方フィートのフィルトロンオメガ（Filtron Omega）TM接線流限外ろ過膜を使用して、700mlの容量に濃縮した。残留液を捨て、100kD未満のMWのろ液を、10kDの公称MWCOを有する25平方フィートのフィルトロンオメガTM限外ろ過膜上で、1.1リットルの容量に濃縮した。次に、HClでpH8.5に調節した20mMのトリスおよび6Mの尿素30リットルを使用して、同じ10kDのMWCOの膜で溶液を透析ろ過した。残留液950mlはタンパク質約19.27gを含んでいた。ろ液は廃棄した。
残留液を、HClでpH8.5に調節した20mMのトリスおよび6Mの尿素（導電率＝910μmhos;9.1×10-4S）で平衡化したＱ−セファローズTM（ファーマシア社）アニオン交換カラム（直径25.2cm×16.5cm、床容量＝8.3リットル）に装填した。試料の適用に続き、約２空隙容積分の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。pH8.5に調節した20mMのトリスおよび6Mの尿素（導電率＝10,740μmhos;1.074×10-2S）に0.125MのNaCl約12リットルを適用することにより、骨誘導的活性のタンパク質をカラムから溶離させた。11リットル中約3.94gのタンパク質をカラム溶出液中に回収した。
Ｑ−セファローズTM（ファーマシア社）アニオン交換クロマトグラフィーからの溶出液を氷酢酸でpH4.8に調節し、固形NaClを加えることによって導電率を18,200μmhos（1.82×10-2S）に増大させた。次に、試料を、pH4.5に調節した20mMの酢酸ナトリウムおよび6Mの尿素中の0.25MのNaClで平衡化したＳ−セファローズTM（ファーマシア社）カチオン交換カラム（直径11.3cm×16.5cm、床容量＝1.65リットル）に装填した。試料の適用に続き、約２空隙容積分の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。pH4.5に調節した20mMの酢酸ナトリウムおよび6Mの尿素（導電率＝79,500μmhos;7.95×10-2S）に、1.5MのNaCl約1.7リットルを適用することにより、骨誘導的活性のタンパク質を溶離させた。1.2リットル中約220.8mgのタンパク質をカラム溶出液中に回収した。
低分子量種を除くため、6kDの分子量分画の中空繊維束（スペクトラムインダストリイズ社から入手）を使用して、カチオン交換溶出液を、冷気（４℃）中、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥させた。これを10％（容量比）酢酸に再溶解させ、凍結乾燥させ、10mMのHClに再び溶解させた。1.2および0.45μｍのフィルタに通して連続的にろ過したのち、タンパク質混合物を室温で18〜24時間放置し、凍結乾燥させた。
ここに概説した一連の段階により、骨誘導的活性のタンパク質を溶液中に保持した。どの段階にもプロテアーゼ阻害剤は使用せず、タンパク質の劣化は見られなかった。カチオン交換クロマトグラフィーならびに塩および緩衝液の除去に続き、この手順で単離したタンパク質35μｇを適当な担体および基質と合わせ、ラットに皮下埋植すると、骨形成が再現的に誘発された。
実施例２
Ｓ−セファローズTM（ファーマシア社）カチオン交換クロマトグラフィーからの凍結乾燥試料を、水性0.1容量％トリフルオロ酢酸/30容量％アセトニトリルの混合物6mlに溶解させ、57％Ａ、43％Ｂ（Ａは水中0.1容量％のトリフルオロ酢酸であり、Ｂは水中70容量％のアセトニトリル、0.1容量％のトリフルオロ酢酸である）で平衡化した前処理用VYDAC TM（ザ・セパレーション・グループ社）C18幅広孔HPLCカラムに適用した。浅い勾配の増大するＢを使用しながら、骨誘導的活性のタンパク質を試料の他の成分から分離した。HPLCからの溶出液を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および生体内バイオアッセイ（生物検定）によって特性解析した。47容量％のＢと52容量％のＢとの間（アセトニトリル33容量％〜37容量％）で骨誘導的活性のタンパク質が溶出することがわかった。この範囲の溶媒組成で溶出するタンパク質を凍結乾燥させ、10mMのHClに溶解させた。骨誘導的活性のタンパク質の収量は16.45mgであった。このタンパク質混合物3.5μｇを適当な担体または基質に付着させ、皮下埋植すると、骨形成が誘発された。
実施例３
多数の特徴的なタンパク質の帯が骨誘導的活性のプールの中に存在している。これらは、15重量％SDS−ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動に基づくと、14kD〜68kDの見かけ分子量の範囲にある。２−メルカプトエタノールでの還元の前後のタンパク質の帯状化パターンの例を図１に示す。
実施例４
分取用HPLCからの骨誘導活性プールからのアリコット（部分標本）を、6MのHCl蒸気中、110℃で20時間、アルゴン雰囲気下で加水分解した。加水分解した試料をフェニルイソチオシアネートで誘導体化して、PTC−アミノ酸誘導体を形成し、また、システムゴールド（System Gold）ソフトウェアを備えたベックマン338勾配システムを使用する逆相HPLCによって分析した。３回のアミノ酸分析を平均して、表1.に示す組成を立証した。
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実施例５  （精製された骨誘導性因子および部分的に精製された骨誘導性因子の骨誘導的活性の評価）
十分な量の精製されたタイプＩ原線維状ウシ科動物腱コラーゲンを酢酸の１容量％水溶液に加えて４重量％分散液を調製した。室温で一夜放置したのち、粘性の分散液を、直径8mm×厚さ3mmのマルチキャビティー型デルリンTM（デュポン社）成型ディスクの中に配置した。コラーゲン分散液の型を−50℃で凍結させ、約18時間凍結乾燥させて、１個6.0±1mgの重さのコラーゲンスポンジのディスクを製造した。骨誘導的活性の生体内生物学的評価の際に、これらのディスクを、骨誘導性因子を加えるための支持体として利用した。
（精製された骨誘導性因子）
１×10-2Mの塩酸溶液に、十分な量の精製された骨誘導性因子を加えて、HClの1mlあたりタンパク質35、100および350μｇを含む試験溶液を調製した。上記３種の試験の100μｌアリコットを各試験用量について４個のコラーゲンスポンジディスクに加えた。溶液をコラーゲンスポンジディスクの中に30分間浸漬させて、そこでディスクを−50℃で凍結させ、約18時間凍結乾燥させた。これらの精製された骨誘導性因子含有コラーゲンスポンジディスクを、レッディによって記載された方法（その全体を本明細書に引用例として含める、ウイリアム・ペック編集、ボーン・アンド・ミネラルリサーチ（Bone ＆ Mineral Research）第３巻第２章、レッディ.A.H.,「局所的および系統的要因による骨分化の規則」（エルセビア・パブリッシャーズB.V.,1985））に似たやり方で、以下に説明するように、４匹のラットに皮下埋植した。
体重約50〜100gの雌のロングエバンスラットの腹側胸郭区域の皮膚に小さな（約6mm）の切開を施した。鈍い切開により、皮膚の下にポケット状部を設けた。精製された骨誘導的活性のタンパク質を含む、すでに調製したコラーゲンスポンジディスクのうちの１個をこのポケット状部に挿入し、切開をテブデック（Tevdek）IITM（エチコン社）５−０縫合糸で閉じた。他二つの精製された骨誘導的活性のタンパク質用量グループ試料の一つづつを各動物に同様に埋植した。埋植されるコラーゲンスポンジディスクは、互いに最低1cmの距離を離した。21日後、ラットを二酸化炭素で窒息死させ、試験物質を取り出した。外植の際、組織試料を秤量し、70％エタノール中に定着させた。定着させてから少なくとも４時間を経たのち、外植組織を、マイクロ−Ｒ型Ｘ線キャビネットを使用するＸ線に付した（20keV X線、ポラロイドタイプ53フィルム、暴露時間20秒）。重合したメタクリル酸グリコールを使用し、外植組織試料を埋め込み（その全体を本明細書に引用例として含める、ブロック、M.H.、L.トレンナー、P.レッグおよびM.カーの「メタクリル酸グリコール埋込技術」、ラボラトリーメディシン,13（５）:1982年pp.290−298を参照）、４μの厚さに切断し、トルイジンブルーＯまたは硝酸銀、続いてヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、骨形成および石灰化した組織の増殖について組織学的に評価した。軟骨内の骨形成（外植片の質量測定、Ｘ線評価および組織学的評価によって判断する）を容易に実証することができた。結果を以下の表2.にまとめる。
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（部分的に精製された骨誘導性因子）
これらの同じ手法を利用して、部分的に精製された骨誘導性因子物質を評価した。カチオン交換クロマトグラフィーののち、HPLC精製の前に得られたタンパク質試料を、１×10-2の塩酸に、HCl1mlあたり350、100および3,500μｇの濃度で溶解させた。上記３種の試験溶液の100μｌアリコットを、実施される各試験について４個のコラーゲンスポンジディスクに加えた。溶液をコラーゲンスポンジディスクの中に30分間浸漬させた。次に、ディスクを−50℃で凍結させ、約18時間凍結乾燥させた。部分的に精製された骨誘導性因子を含むこれらのディスクをラットに皮下埋植した。21日後、組織を外植し、上述の手法によって評価した。結果を以下の表3.にまとめる。
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表2.と表3.とを比較することによって理解されうるように、精製された骨誘導性因子は、部分的に精製された骨誘導性因子よりも低い用量で、より大きな骨誘導性的活性を提供する。この理由のため、精製された骨誘導性因子が好ましい。
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本発明の種々の実施態様を詳細に説明してきたが、これらの実施態様の変形および応用が当業者にとって可能であることは明らかである。例えば、骨誘導性因子は、種々の用途、例えば歯周疾患の治療および顔面の修復ならびに他の骨および関節の障害の治療に使用することができる。しかし、このような変形および応用は、以下の請求の範囲に述べる本発明の真髄および範囲に該当するということを明確に理解しなければならない。
【図２】
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【図１】
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