(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚より得られる試料中の微生物を培地中で培養し、培養終了後に得られる培養上清のセラミダーゼ活性を正常値と比較測定することを特徴とするアトピー性皮膚炎の検出方法。
【請求項２】
皮膚より得られる試料が、皮膚表面から得られた試料であることを特徴とする請求項１記載のアトピー性皮膚炎の検出方法。
【請求項３】
セラミダーゼ活性用基質を含有することを特徴とする請求項１記載のアトピー性皮膚炎の検出方法に用いるためのキット。
【請求項４】
セラミダーゼ活性用基質が、標識を有し、又は有しないセラミドであることを特徴とする請求項３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アトピー性皮膚炎の簡便な検出方法、及び当該検出方法に用いるためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、アトピー性皮膚炎の診断は、本症に特異的な検査方法がこれまで報告されていないために、主に皮疹の性状や分布等の臨床的症状から肉眼的あるいは問診により行われており、臨床検査の結果においては参考項目としてしか利用されていない。例えば、臨床検査として血清ＩｇＥ値の測定が行われ、ＩｇＥ値が高値であることがアトピー性皮膚炎の診断材料とされている。しかしながら、ＩｇＥ値の上昇を示す疾患は、アトピー性皮膚炎以外に、気管支喘息、アレルギー性鼻炎等のアレルギー疾患、寄生虫疾患、肝炎、肝硬変、原発性肝がん等の肝疾患、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患等が存在する。したがって、ＩｇＥ値が高値であることが必ずしもアトピー性皮膚炎とは結びつかず、また逆に、血清ＩｇＥ値が全く正常であるアトピー性皮膚炎患者もかなりの割合で存在することが報告されている。
他の臨床検査として、抹消血好酸球数の測定、ＲＡＳＴ法（抗原特異的ＩｇＥ定量）、乱切り法（スクラッチテスト）、単刺法（プリックテスト）や貼布試験（パッチテスト）等のアレルゲンの検索試験等が行われるが、いずれもアトピー性皮膚炎に特異的なものではない。
上述した臨床検査は、すべてアトピー性皮膚炎のアレルギー性疾患としての側面に基づくものである。しかしアトピー性皮膚炎はアレルギー的側面だけでなく非アレルギー的側面も重要であると考えられている。
非アレルギー的側面とは、皮膚の機能障害であり、アトピー性皮膚炎患者の皮膚において、外界と生体を隔てるバリアとしての皮膚の機能低下が見られる。
セラミドは角層に存在する角質細胞間脂質の約５０％を占め、皮膚を乾燥から保護し、バリア機能において重要な働きを担っていると考えられている。これまでアトピー性皮膚炎患者の皮膚においてセラミドの減少が見られ、皮膚の易乾燥性とバリア機能の低下の原因である可能性が示唆されている。
このセラミドは、セラミダーゼ（アシルスフィンゴシンデアシラーゼ：ＥＣ３．５．１．２３）によってスフィンゴシン塩基と脂肪酸に加水分解される。
セラミダーゼの増加は、セラミドの減少を引き起こす可能性があり、アトピー性皮膚炎の増悪に関与することが考えられる。更に、セラミダーゼによるセラミドの加水分解物であるスフィンゴシンは皮膚細胞の増殖を抑制し、分化誘導を活性化することが知られている。
【０００３】
また、アトピー性皮膚炎患者の皮膚において、バリア機能の低下と共に微生物の菌数が増加することが報告されている。このとき様々な微生物の菌数の増加が報告されており、特に黄色ブドウ球菌や真菌マラセチアが増加することが報告されている。しかしながら、これらの微生物は皮膚における常在菌であり、菌数の増加以外で健常者と患者の間における菌の性質の違いは明らかされていない。また、主要な微生物である黄色ブドウ球菌や真菌マラセチア以外の菌についてはアトピー性皮膚炎の患者との関係は全く示されていない。これら微生物的観点からのアトピー性皮膚炎の検査方法はこれまで存在しなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、非アレルギー的観点、すなわち微生物観点及び皮膚障害の観点に基づく検査方法が得られれば、肉眼的あるいは問診及びアレルギー的観点に基づく検査方法によるアトピー性皮膚炎の診断を補完する検出方法として、あるいはアトピー性皮膚炎の１次スクリーニングとして非常に有用である。
したがって、本発明の目的は、皮膚より得られる試料中の簡易なアトピー性皮膚炎の検出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はアトピー性皮膚炎の検出方法に関する発明であって、皮膚より得られる試料中の微生物を培地中で培養し、培養終了後に得られる培養上清のセラミダーゼ活性を正常値と比較測定することを特徴とする。
本発明の第２の発明は、上記第１の発明のアトピー性皮膚炎の検出方法に用いるためのキットに関する発明であって、セラミダーゼ活性用基質を含有することを特徴とする。
【０００６】
本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の皮膚に存在する微生物について、種々研究を行っていたところ、アトピー性皮膚炎患者の皮膚に存在する微生物は、正常人の皮膚に存在する微生物よりセラミダーゼ生産能が高いことを明らかにし、更に、そのセラミダーゼ活性がアトピー性皮膚炎の指標として使用できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
【発明の実施の態様】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明において、皮膚より得られる試料とは、特に限定されないが、被検者の皮膚の落屑や、皮膚を綿棒やガーゼ等で拭ったもの、あるいは皮膚を洗浄した液等が挙げられる。
本発明において、皮膚より得られる試料の採取方法は、特に限定されないが、例えば、被検者の皮膚からの落屑をそのまま採取する方法、被検者の皮膚を綿棒やガーゼ等で拭う方法及び適当な大きさの円筒を皮膚面に密着させ、その中に生理食塩水、リン酸緩衝液等の洗浄液を入れ皮膚面を洗浄することによりその洗浄液を採取する方法等が挙げられる。
【０００８】
皮膚より得られた試料中のセラミダーゼ活性を測定する方法は、感度よくセラミダーゼ活性を測定することができれば、特に限定されるものではないが、セラミダーゼ活性の測定感度を上げるために、該試料中の微生物を適当な培地で培養する。培養する場合、培地は皮膚より得られた試料中の微生物が増殖でき、かつ、セラミダーゼが生産されやすくする組成であればよく、例えば炭素源及び窒素源として、グリセロール、グルコース、スクロース、糖蜜、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、硝酸アンモニウム等が適当である。その他、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質及び金属塩を加えてもよい。また、培地中にスフィンゴミエリン、セラミドなどの脂質あるいはタウロデオキシコール酸塩等の界面活性剤を０．００１〜１％の範囲内で添加し、セラミダーゼの生産性を高めることにより検出感度を上げることができる。
また、これら微生物の培養条件は、特に限定されないが、２５〜３７℃で１〜７日間培養することが好ましい。この培養により、微生物の増殖と同時にセラミダーゼの生産が起こり、培養終了後、遠心分離等で培養上清を得、この培養上清を試料とすることにより、下記の測定方法を用い、セラミダーゼ活性を測定することが可能である。
【０００９】
本発明において、セラミダーゼ活性測定用基質は、セラミダーゼの活性を測定することが可能な、標識を有し、又は有しない基質であれば、特に限定されないが、例えば、標識を有し、又は有しないセラミドが挙げられる。
本発明において、セラミダーゼの活性測定法は、特に限定されないが、例えば、簡易で測定することが可能である、標識を有しないセラミドを基質とする方法や、標識セラミドを基質とする方法が挙げられる。
【００１０】
標識セラミドとしては、セラミドの脂肪酸部分やスフィンゴシン部分に、発色団を形成する物質、蛍光物質、ビオチン、放射性同位元素等を導入して、標識セラミドを作製することが可能である。例えば、本発明者らが、平成９年７月１７日に特許出願した整理番号１−９７０７０５−１の「スフィンゴ脂質及びスフィンゴ脂質誘導体の製造方法」の明細書中に記載の方法や、アナリティカル  バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第２４７巻、第１号、第５２〜５７頁（１９９７）に記載の方法で作製した標識セラミドが挙げられる。
標識を有しないセラミドを基質とする場合、セラミドを試料と共に保温後、セラミドの分解を薄層クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーにより、セラミドの減少あるいは分解産物である遊離脂肪酸あるいはスフィンゴシンを定量することによりセラミダーゼ活性を測定することができる。
標識セラミドを基質とする場合、標識セラミドを試料と共に保温後、各種クロマトグラフィーにより基質と分解産物を分離し、脂肪酸が標識されている場合は、標識セラミドの減少及び／又は分解産物である遊離標識脂肪酸を定量することによりセラミダーゼ活性を測定することができる。また、スフィンゴシンが標識されている場合は、標識セラミドの減少及び／又は標識スフィンゴシンを定量することによりセラミダーゼ活性を測定することができる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１２】
実施例１
正常者２５例、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部２０例、アトピー性皮膚炎患者の非皮疹部２４例、尋常性乾せん患者の皮疹部８例について、それぞれの皮膚表面の微生物についてセラミダーゼの活性測定を行った。
上記のそれぞれの被検者の皮膚を滅菌した綿棒で拭い、その綿棒を培地（０．５％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．０５％スフィンゴミエリン、０．００５％セラミド、０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウム）０．５ｍｌに入れ、３０℃、５日間静置培養を行った。培養終了後、遠心分離し、培養上清を試料とし、以下の方法で、それぞれのセラミダーゼ活性測定を行った。
培養液１０μｌと１００ｐｍｏｌのＣ１６−14Ｃ−セラミド［アナリティカルバイオケミストリー、第２４７巻、第１号、第５２〜５７頁（１９９７）］、０．５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０μｌを３７℃、６時間反応した後、１００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１）を加え反応を止めた。
得られた反応液は乾固した後、クロロホルム／メタノール（２：１）１０μｌに溶解し試料とした。
各試料は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：２５％アンモニア水＝９０：２０：０．５）で分離後、ＢＡＳ１０００イメージングアナライザー（富士フィルム社製）を用い、遊離した14Ｃ脂肪酸及び残存Ｃ１６−14Ｃ−セラミドを定量し、分解率を算出しセラミダーゼ活性とした。この結果を図１に示す。すなわち、図１は、被検者の皮膚より得られた試料中の微生物のセラミダーゼ活性を被検者別にプロットした図であり、縦軸にＣ１６−14Ｃ−セラミドの分解率（％）を示し、横軸に被検者を示す。図中、各症例における横太線は、各症例の測定値の平均値、横細線は、各症例の測定値の９５％信頼区間を示す。
図１に示すように、健常者と、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部、アトピー性皮膚炎患者の非皮疹部、尋常性乾せん患者の皮疹部において皮膚表面に存在する微生物の生産するセラミダーゼ活性値の分布に違いが見られた。すなわちアトピー性皮膚炎とは異なる皮膚炎である乾せん皮疹部においては皮膚表面に存在する微生物の生産するセラミダーゼ活性値が正常者と同等のレベルであるが、アトピー性皮膚炎においては皮疹部、非皮疹部を問わず正常者よりセラミダーゼ活性値が高いことが見出された。
【００１３】
実施例２  キットの配合例
滅菌した綿棒、皮膚より得られる試料中の微生物の培養用培地、セラミダーゼ活性測定用基質含有反応用緩衝液をセットにして、アトピー性皮膚炎検出用キット（２０回分）を表１に示すように構築した。なお、皮膚より得られる試料中の微生物の培養用培地として０．５％ペプトン、０．１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．０５％スフィンゴミエリン、０．００５％セラミド、０．０５％タウロデオキシコール酸ナトリウムを含む培地、セラミダーゼ活性測定用基質含有反応用緩衝液（表１中、反応用緩衝液と略す）として、Ｃ１６−14Ｃ−セラミド、０．５％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した。
【００１４】
【表１】
表      １
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綿棒                                  ２０本
培地                                  １０ｍｌ
反応用緩衝液                        ２００μｌ
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【００１５】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明により、皮膚より得られる試料中、詳しくは皮膚より得られる試料中に生存する微生物の生産するセラミダーゼ活性値が、アトピー性皮膚炎のマーカーとなることが見出され、アトピー性皮膚炎の簡易な検出が可能となった。
本発明は、アレルギー的観点からのこれまでの検出法とは異なる観点からの検出方法であり、アレルギー的観点に基づく検出方法では他のアレルギー症との区別がつきにくかったり、検出されない場合、あるいは肉眼的に他の皮膚症と区別のつきにくい場合に有用であり、またアトピー性皮膚炎の１次スクリーニングとしても、本発明の検出方法は有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により測定した皮膚表面の菌の生産するセラミダーゼ活性を症例別に示す図である。
【図１】
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