(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるグリセロールキナーゼ蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の１から１４９４で表される塩基配列である請求項第１項記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを保持し、かつグリセロールキナーゼ生産能を有することを特徴とする遺伝子組換え微生物。
【請求項４】
遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６７）である請求項第３項記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項５】
配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるグリセロールキナーゼ蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを保持し、かつグリセロールキナーゼ生産能を有することを特徴とする遺伝子組換え微生物を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、次いで培養物から該グリセロールキナーゼを採取することを特徴とする該グリセロールキナーゼの製造法。
【請求項６】
遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６７）である請求項第５項記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持する熱安定性の良好なグリセロールキナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ、以下ＧＫと略す）蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子と、その形質転換微生物、およびこれを用いてなる遺伝子組換え酵素ＧＫの製造法並びに遺伝子組換え酵素ＧＫに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＧＫはＡＴＰ存在下、グリセロールの３位の水酸基をリン酸基に置換し、グリセロール三リン酸とＡＤＰを生成する反応を触媒する酵素である（Ｅ．Ｃ．２．７．１．３０）。
従来、公知のＧＫとしては、ストレプトマイセス・キャナス（特開昭５８−５２６３２号公報）、セルロモナス・エスピー（特開昭６０−１６２３３号公報）、バチルス・ステアロサーモフィラス（特開昭６０−４９４７８号公報）、アルスロバクター・エスピー（特開昭６２−６２１５１号公報）、アセトバクター・キシリウム（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２７，７４７（１９７６））、エシェリヒア・コリ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２，１０３０（１９６７））、ラット肝（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１１，９５１（１９５４））、ニューロスポラ・クラッサ（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１６９，２１（１９７５））などにより生産されているものが知られており、臨床診断の分野で使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、近年の臨床診断用酵素の傾向として、溶媒に溶解した状態で保存できるものが望まれており、このため安定性の高い酵素が必要となっていたが、上記に挙げたＧＫはいずれもこの要求を満たすものではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、静岡県田方郡大仁町の畑土壌から単離したフラボバクテリウム・メニンゴセプティクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＧＫ−５４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８）が７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とする高い熱安定性を有するＧＫを生産していることを発見し、常温においても高い酵素安定性を有することを確認した。また、このフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株よりＧＫを分離・精製し、その構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリペプチドの一次構造の決定、及び該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を決定した。
【０００５】
また、該ＧＫ遺伝子を任意のベクターに導入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形質転換体とし、該形質転換体を培養して、ＧＫ遺伝子情報を発現させ、該培養物からＧＫを確認し、優れた工業的生産方法を確立し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたもので、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫ蛋白質をコードするＤＮＡ、配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とするＤＮＡ、ＤＮＡが配列表１の塩基配列の１から１４９４で表される塩基配列であるＤＮＡ、エシェリヒア・コリに属する微生物であって、宿主にとって外来性である配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から実質的になるＧＫ蛋白をコードするＤＮＡを保持し、かつＧＫ生産能を有することを特徴とする実質的に純粋な微生物、配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から実質的になるＧＫ蛋白をコードするＤＮＡを保持し、かつ当該ＤＮＡの発現によるＧＫ生産能を有することを特徴とする実質的に純粋な微生物を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、次いで培養物からＧＫを採取することを特徴とするＧＫの製造法、アミノ酸配列が実質的に配列表１の１から４９８で表されるアミノ酸配列からなり、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の酵素活性を保持することを特徴とするグリセロールキナーゼ蛋白質である。
【０００７】
本発明の配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるＧＫ蛋白のアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表記されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側はアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合であってもよく、Ｎ末端側であるＭｅｔの上流にはさらに一個または複数のアミノ酸残基を有してもよく、そのアミノ酸残基としては開始コドンまたはシグナルペプチドが挙げられ、またＣ末端側のＧｌｕの下流には、さらに一個以上のアミノ酸残基を有してもよい。
【０００８】
さらに、本発明のＧＫを構成するアミノ酸配列は、配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列表１のアミノ酸配列の１から４９８のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものの均等物も含まれる。
【０００９】
本発明の配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであればよい。
【００１０】
さらに、本発明のＧＫを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、配列表１のアミノ酸配列の１から４９８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列表１のアミノ酸配列の１から４９８中の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したものの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１１】
上記ＤＮＡの好適な例として、配列表１の塩基配列の１から１４９４で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。さらに、好ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始コドン又はシグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げることができる。３’末端たるＧＡＡの下流側には、アミノ酸をコードするコドンを１個以上有するか、又は翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、更に、その３’末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの３’末端側に翻訳終止コドンを有することが好ましい。
【００１２】
７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫ蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、ＧＫ遺伝子の供与体である、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫを生産する微生物よりＤＮＡを分離精製した後、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮＡと、同じく切断してリニヤーにした発現ベクターとを、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡプラスミドを宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、ＧＫの活性発現もしくはＤＮＡプローブを指標としてスクリーニングを行い、ＧＫ遺伝子を含有する組換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えＤＮＡプラスミドからＧＫ遺伝子であるＤＮＡを取得することにより得られる。
【００１３】
ＤＮＡの供与体である微生物としては、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫを生産する微生物であれば、なんら限定されるものではないが、好ましくはフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株が挙げられる。
【００１４】
フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株の菌学的性状は以下の通りである。
生育の特徴
普通寒天平板培地
線上に良好に生育する。表面は滑らかであり、縁は丸い。黄色〜オレンジ色を呈する。不透明。光沢あり。
普通寒天斜面培地
線上に良好に生育する。表面は滑らかであり、縁は丸い。黄色〜オレンジ色を呈する。不透明。光沢あり。
【００１５】
液体培地
生育良好で一様に生育する。
リトマスミルク培地およびＢＣＰ培地
リトマスを還元しないが、液化および凝固が観察された。
ＤＮＡのＧＣｍｏｌ％
３５．７±１．０％（ＨＰＬＣ）
主たるイソプレノイドキノン
ＭＫ−６
【００１６】
形態の特徴
単独で端の丸いまっすぐな長桿菌で、大きさは０．４〜０．７×１．８〜２．５μｍ。運動性はない。芽胞非形成。
0003668272.tif 000002
【００１７】
0003668272.tif 000003
【００１８】
ゼラチン分解                                            ＋
デンプン分解                                            −
カゼイン分解                                            ＋
エスクリン分解                                          ＋
セルロース分解                                          −
チロシン分解                                            −
アルギニン分解                                          −
Ｔｗｅｅｎ８０分解                                      −
カタラーゼ産生                                          ＋
【００１９】
オキシダーゼ産生                                        ＋
ホスファターゼ産生                                      ＋
ウレアーゼ産生（ＳＳＲ）                                −
ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ．）                          −
インドール産生                                          −
硫化水素産生（ＴＳＩ）                                  −
ＤＮａｓｅ産生                                          ＋
アセトイン産生                                          −
ＭＲテスト                                              −
ＬＶ反応テスト                                          −
硝酸塩還元テスト                                        −
亜硝酸塩還元テスト                                      ＋
【００２０】
シモンズ培地での利用性
クエン酸塩                                            −
リンゴ酸塩                                            −
マレイン酸塩                                          −
マロン酸塩                                            −
プロピオン酸塩                                        −
グルコン酸塩                                          −
コハク酸塩                                            −
【００２１】
クリステンゼン培地での利用性
クエン酸塩                                          （＋）
リンゴ酸塩                                            −
マレイン酸塩                                          −
マロン酸塩                                            −
プロピオン酸塩                                        ＋
グルコン酸塩                                          −
コハク酸塩                                            −
【００２２】
グルコースよりガス産生                                  −
糖より酸の産生
アドニトール                                          −
Ｌ（＋）−アラビノース                                −
セロビオース                                          −
ズルシトール                                          −
メソ−エリスリトール                                  −
フルクトース                                          ＋
Ｄ−フコース                                          ＋
Ｄ−ガラクトース                                      −
Ｄ−グルコース                                        ＋
グリセロール                                          ＋
イノシトール                                          −
イヌリン                                              −
ラクトース                                            ＋
マルトース                                            ＋
マンニトール                                          ＋
マンノース                                            ＋
メレジトース                                          −
メリビオース                                          ＋
ラフィノース                                          −
Ｌ（＋）−ラムノース                                  −
Ｄ−リボース                                          −
サリシン                                              −
Ｌ−ソルボース                                        −
ソルビトール                                          −
スターチ                                              ＋
サッカロース                                          −
トレハロース                                          ＋
Ｄ−キシロース                                        −
エタノール（３％）                                    ＋
【００２３】
色素の産生                            フルオレッセンを産生
ＰＨＢの蓄積                                            −
無機窒素源の利用
硝酸塩                                                −
アンモニウム塩                                        ＋
【００２４】
なお、本菌株の同定に当たって、同定実験は医学細菌同定の手引（第２版）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（３巻）に準じて行い、実験結果を医学細菌同定の手引（第２版）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．２、Ｖｏｌ．３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｒｉｏｌｏｇｙに対比して同定を行った。
【００２５】
その結果、本菌株の主性状はグラム陰性の桿菌で非運動性であり、カタラーゼ、オキシダーゼ、フォスファターゼ陽性で、グルコースを酸化的に分解し、酸を産生し、ＧＣｍｏｌ１％は３５．７±１．０％、キノンタイプはＭＫ−６、芽胞非形成であり、これらの主性状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．２、Ｖｏｌ．３に対比した結果、フラボバクテリウム属に属する微生物と判明した。
【００２６】
そこで、フラボバクテリウム属の中から本菌株と似た４菌株（フラボバクテリウム・ブレブ；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、フラボバクテリウム・グレウム；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ、フラボバクテリウム・インドロゲネス；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ、フラボバクテリウム・メニンゴセプティクム；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）を選び本菌株と比較し、本菌株はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムに属すると判断し、さらにフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＩＦＯ−１２５３５株（タイプカルチャー）とのＤＮＡ相同性が判断基準である７０％以上であるとこと合わせて、本菌株をフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株と同定命名したものである。
【００２７】
なお、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学技術研究所にフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ  ＧＫ−５４）として寄託されている。寄託日は平成６年１１月２日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８である。
【００２８】
まず本発明における７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫ蛋白質をコードするＤＮＡを得るためには、具体的には以下のように行えばよいが、その操作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
【００２９】
７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫを生産する微生物に由来するＤＮＡ（ｔｏｔａｌＤＮＡと略称する）を採取するには、例えば７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫを生産する微生物を培養し、得られる培養菌液から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌させることによってＧＫ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（特開昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組み合わせで行ってもよい。
【００３０】
この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
ｔｏｔａｌＤＮＡを分離する菌株としては、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするＧＫを生産する微生物ならなんでもよいが、好ましくはフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株を使用すればよい。
【００３１】
分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断する方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、ＳａｌI 、ＢｇｌII、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのII形制限酵素が適している。
【００３２】
ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。
【００３３】
また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ  Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、シュードモナス属を宿主とする場合にはＲＳＦ１０１０、酵母とくにサッカロミセス・セルビシエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用できる。
【００３４】
この様なベクターを、ｔｏｔａｌＤＮＡの切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したプラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  Ｃ６００などが利用できる。
【００３５】
宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよい。
宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無についての選択は、上記方法により組換えＤＮＡを移入した宿主微生物により作成した遺伝子ライブラリーから、３２Ｐや蛍光体などでラベルした、ＧＫの部分アミノ酸配列を基に設計し、予め合成したＧＫのＤＮＡプローブで、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなどを行うことによりポジティブ株を選択し、この株を目的の形質転換体とすればよい。形質転換体からのＧＫ遺伝子を含むＤＮＡの分離は、常法に従って行えばよい。
【００３６】
上述の方法によって得られたＧＫ遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０）で解読すればよく、またＧＫを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定できる。
この様にして一度選択された組み換えＤＮＡは、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００３７】
また、更に、該組み換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してＧＫを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００３８】
かくして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地に培養されることによりＧＫを産生し得るが、宿主微生物によってはＧＫ遺伝子を移入するだけではＧＫ生産性を有しない場合がありうる。このような場合、得られたＧＫ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７）による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離し、該宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流にＧＫ遺伝子を結合したＤＮＡを組み込んだプラスミドにより、新たな形質転換体を作成し、ＧＫを産生させればよい。
【００３９】
例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、ＧＫ遺伝子を接続する遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが例示され、これらのプロモーターの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コドンＡＴＧやＧＴＧを有するＧＫ構造遺伝子を接続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくのごとくして作成されたプラスミドで大腸菌を形質転換すればよい。
【００４０】
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、程度が例示される。
【００４１】
また、本発明のＧＫは公知の遺伝子操作手段により、７０℃１０分の熱処理で８０％の活性を有する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このようなムテインのＤＮＡは、本発明のＧＫ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、かくして取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質を有するＧＫムテインＤＮＡについては最終的にはこのムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて組み換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させることによって、ＧＫムテインの製造が可能である。
【００４２】
ＧＫ遺伝子を含み、ＧＫを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とし、その内部にＧＫ遺伝子を含有するプラスミドｐｃＧＫＺ１（その制限酵素地図を図１に示した）を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６７）が挙げられる。
【００４３】
形質転換微生物により該ＧＫを製造するに当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して菌体内又は培養液中に該ＧＫを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該ＧＫの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該ＧＫを得ることができる。
【００４４】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
【００４５】
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４６】
培養温度は微生物が発育し、ＧＫを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、ＧＫが最高終了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＧＫを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。
【００４７】
培養物中のＧＫは、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、ＧＫが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりＧＫ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＫが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は界面活性剤を添加してＧＫを可溶化し水溶液として分離採取する。
【００４８】
この様にして得られたＧＫ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去することができる。
【００４９】
また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により精製し、これらの手段を用いて得られるＧＫ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製されたＧＫが得られる。
【００５０】
また、ＧＫの活性測定するには、以下のようにすればよい。即ち、０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．２ｍｌ、５％のグリセロールを０．１ｍｌ、０．１ＭのＡＴＰを０．０２ｍｌ、０．１Ｍの塩化マグネシウムを０．０４ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ（シグマ社製）を０．１ｍｌ、０．３％の４−アミノアンチピリンを０．１ｍｌ、０．２５％のフェノールを０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのグリセロフォスフェイトオキシダーゼ（旭化成社製）を０．２ｍｌ、および蒸留水を０．１４ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．５％のＳＤＳを添加して反応を停止させ、５分以内に層長１ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。
【００５１】
また、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルのグリセロフォスフェイトを生成させる酵素量とし、下記の計算式により算出した。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×２．２７×酵素液の希釈倍率
【００５２】
以上の製造法により得られるＧＫとして例えば下記の諸物性を有するＧＫが例示される。
理化学的性質
（１）酵素作用：基質としてグリセロールを用いた酵素作用を以下に示す。
グリセロール＋ＡＴＰ→グリセロール−３−リン酸＋ＡＤＰ
（２）基質特異性：グリセロールに基質特異性を示す。各種基質に対する特異性は以下の通りである。
【００５３】
グリセロール                        ：１００％
グリセロール−α−モノクロロヒドリン：    ０％
エチレングリコール                  ：    ０％
１，３−プロパンジオール            ：    ０％
１，４−ブタンジオール              ：    ０％
１，２−ブタンジオール              ：    ０％
Ｄ−マンニトール                    ：    ０％
Ｄ−ソルビトール                    ：    ０％
Ｄ−グルコース                      ：    ０％
リビトール                          ：    ０％
【００５４】
（３）Ｋｍ値：３．９×１０-2±０．５×１０-2ｍＭ（グリセロールに対して）、５．３ｘ１０-2±０．５×１０-2ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（４）等電点：４．４±０．５（キャリアー−アンホラインを用いた電気泳動法にて）
（５）分子量：１４５０００±５０００（ＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、５００００±５０００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて）
【００５５】
（６）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めた。ｐＨ４．５〜６．５の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．５の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。その結果、至適ｐＨは７．５〜８であった。
【００５６】
（７）ｐＨ安定性
１００ｍＭ各種緩衝液（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を３７℃、６０分間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、ｐＨ０．５〜４．０は１００ｍＭのクラークアンドルブス緩衝液、ｐＨ３．５〜７．０は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ３〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。
【００５７】
（８）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度を３７℃〜９５℃の範囲で変化させて至適温度を求めた。その結果本酵素の至適温度は８０℃であった。
（９）熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、少なくとも６０℃まで１００％安定で、７０℃、１０分間の処理では８０％以上の残存活性を保持していた。
【００５８】
（１０）金属イオンの影響
各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響について調べた結果、カルシウムイオンによる弱い阻害がみられた。
（１１）Ｎ末端アミノ酸配列
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
【００５９】
（１１）保存安定性
液状化試薬の対応を目的として、０．０５％のアジ化ナトリウム（防腐剤）を含む、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、本発明グリセロールを０．８Ｕ／ｍｌの濃度となるように調製し、３７℃で２日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に残存活性を前記活性測定法で測定した結果、それぞれ、９４％、９１％、８１％、７１％、６０％の活性を保持していた。このことから、本酵素は安定化剤の非存在下、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持していた。
【００６０】
また、本発明ＧＫと従来から知られているＧＫとの性質を比較すると、次の通りである。
（１）分子量
本酵素                              ：１５００００
ストレプトマイセス・キャナス由来    ：  ７２０００
バチラス・ステアロサーモフィラス由来：２３００００
セルロモナス・エスピー由来          ：２３００００
アルスロバクター・エスピー由来      ：  ８２０００
アセトバクター・キシリウム由来      ：  ５００００
エシェリヒア・コリ由来              ：２８００００
ニューロスポラ・クラッサ由来        ：１２００００
【００６１】
（２）グリセロールに対するＫｍ値
本酵素                              ：０．０３９  ｍＭ
ストレプトマイセス・キャナス由来    ：０．０４８  ｍＭ
バチラス・ステアロサーモフィラス由来：０．０４４  ｍＭ
セルロモナス・エスピー由来          ：０．０４４  ｍＭ
アルスロバクター・エスピー由来      ：０．０３５  ｍＭ
アセトバクター・キシリウム由来      ：０．４５    ｍＭ
エシェリヒア・コリ由来              ：０．００１３ｍＭ
ニューロスポラ・クラッサ由来        ：０．０５０  ｍＭ
【００６２】
（３）ＡＴＰに対するＫｍ値
本酵素                              ：０．０５３ｍＭ
ストレプトマイセス・キャナス由来    ：０．２０  ｍＭ
セルロモナス・エスピー由来          ：０．４３  ｍＭ
アルスロバクター・エスピー由来      ：０．０３７ｍＭ
アセトバクター・キシリウム由来      ：０．５０  ｍＭ
エシェリヒア・コリ由来              ：４．０    ｍＭ
ニューロスポラ・クラッサ由来        ：０．２０  ｍＭ
【００６３】
（４）至適ｐＨ
本酵素                              ：７．４
ストレプトマイセス・キャナス由来    ：９．０〜１０．０
セルロモナス・エスピー由来          ：９．８
アルスロバクター・エスピー由来      ：９．５〜１０．０
アセトバクター・キシリウム由来      ：８．４〜９．２
エシェリヒア・コリ由来              ：９．８
ラット肝由来                        ：９．８
ニューロスポラ・クラッサ由来        ：８．０
【００６４】
（５）ｐＨ安定性
本酵素                              ：ｐＨ３．５〜１１．０で安定
ストレプトマイセス・キャナス由来    ：ｐＨ５．５〜１０．０で安定
セルロモナス・エスピー由来          ：ｐＨ５．５〜１０．０で安定
アルスロバクター・エスピー由来      ：ｐＨ５．５〜１０．０で安定
アセトバクター・キシリウム由来      ：ｐＨ６．５〜１１．５で安定
エシェリヒア・コリ由来              ：ｐＨ６．０〜  ７．０で安定
ラット肝由来                        ：ｐＨ４．６〜  ５．４で安定
【００６５】
（６）至適温度
本酵素                              ：８０℃
バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃±５℃
セルロモナス・エスピー由来          ：５０℃付近
アルスロバクター・エスピー由来      ：５０℃付近
【００６６】
（７）熱安定性
本酵素：７０℃、１０分間の熱処理で８０％以上活性が残存する。
ストレプトマイセス・キャナス由来：ｐＨ７．５、４５℃、１５分間の処理で、９６％の残存活性を保持する。７０℃の処理では完全に失活する。
バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃、１０分間の熱処理で１０％の残存活性であった。
【００６７】
セルロモナス・エスピー由来：４０℃以下の温度で安定。
アルスロバクター・エスピー由来：ｐＨ７．０、１５分間の処理で４５℃以下の温度で安定。
エシェリヒア・コリ由来：６０℃、４．５分間の熱処理で、活性が半減。
ラット肝由来：６０℃、８０分間の熱処理で１００％の活性を保持する。
【００６８】
【実施例】
以下、本発明の実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した操作は、例えば前出のマニアティスらの方法や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
【００６９】
実施例１
＜フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムからのＤＮＡの抽出＞
１％のグリセロール、３％の肉エキス、０．５％のバクトソイトン（ＤＩＦＣＯ社製）からなる培地（ｐＨ７．０）５００ｍｌに、ＧＫ生産菌であるフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株を植菌し、２８℃で３０時間振盪培養した。
【００７０】
培養液を遠心分離（３，０００Ｇ、４℃、１０分）し、集菌した菌体を２０ｍｌのＴＥＳ（５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１５％Ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁し、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにリゾチーム（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、３７℃で１０分間処理し、細胞壁を破壊した。これに１０％ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）を０．５ｍｌ加え、さらに２１ｍｌのフェノールとクロロホルムの１対１混合液を加え撹拌した後、遠心分離（２５，０００Ｇ、１５分）し、分離した水層を他の容器に移し、４２ｍｌのエタノールを加え析出してくる染色体をガラス棒にからめて取得した。
【００７１】
この染色体を２０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとクロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。
【００７２】
この分離した上層２０ｍｌに３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体を７５％  エタノールで洗い、減圧乾燥した。
以上の操作によりフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株の染色体標品１ｍｇを得た。
【００７３】
実施例２
＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞
フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株より生産された酵素ＧＫを精製し、その部分アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。
判明した部分アミノ酸配列をコードするＧＫ遺伝子の塩基配列を予想した。この配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプローブには無数の形状があるが、本発明ではそのうち、配列表２で表される塩基配列を有するＧＫ１と命名したオリゴヌクレオチドを使用した。
【００７４】
このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベックス社）に合成依託して作成し、完成したオリゴヌクレオチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）および、７４０ｋＢｑ（キロベクレル）の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ  ８．５ｕで３７℃、３０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ３２Ｐを取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。
【００７５】
実施例３
＜ＧＫ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞
実施例１の操作で得られたフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成するため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行った。即ち、フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株の染色体ＤＮＡ（１０μｇ）を各種制限酵素で切断し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１４、４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従ってサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にＤＮＡを移行させた。
【００７６】
このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブレン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションを行い、さらに実施例２で作成したＧＫ１放射性プローブを使用したハイブリダイゼーションを５０℃で１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを５０℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム，１５ｍＭクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム（富士写真フィルム社製  Ｎｅｗ  ＲＸＯ−Ｈ）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
【００７７】
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティブバンドのサイズを観察した。
その結果、ＢｇｌＩＩ切断により約６〜７ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にＧＫ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＢｇｌＩＩで切断した染色体ＤＮＡの６〜７ｋｂフラグメントから遺伝子ライブラリーを作成することとした。
【００７８】
実施例４
＜遺伝子ライブラリーの作成＞
実施例１の操作で得られたフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株の染色体ＤＮＡ１０μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、常法に従い約６〜７ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＢｇｌIIで切断しアルカリフォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ１１８  １μｇと、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）で連結させた。
【００７９】
次いでこれを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリ  ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）（Ｆ- ，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄＲ１７（ｒｋ- ，ｍｋ+ ），ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，λ- （Ｔ．ｍａｎｉａｔｉｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８２），５０４−５０６））をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ・１０ｇ／ｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、約１９，５００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。
【００８０】
実施例５
＜ＧＫ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞
実施例４により得た遺伝子ライブラリーを、ナイロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリカし、このフィルターに添付のマニュアルに従って菌体のＤＮＡを固定した。
このフィルターを添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションおよび、実施例２で調製したＧＫ１プローブを使用したハイブリダイゼーションを行った。
【００８１】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンを実施例３に示した５０℃の洗浄液で１０分洗った後メンブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレンをＸ線フィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。
オートラジオグラフィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニーを４個確認した。
【００８２】
実施例６
＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例５で選ばれたポジティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。その結果、４つのコロニーより抽出されたプラスミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、このプラスミドのうちの１つをｐｃＧＫＺ１と命名し、該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＤＨ１をエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６７）と命名した。本プラスミドｐｃＧＫＺ１の構造を図１に示した。
【００８３】
実施例７
＜ＧＫ遺伝子塩基配列の決定＞
実施例６で得られたプラスミドｐｃＧＫＺ１より、ＧＫをコードする部分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。決定した塩基配列およびそのコードするアミノ酸配列は配列表１に示した。
【００８４】
実施例８
＜ｐｃＧＫＺ１保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有した３．７％  ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地１．５ｍｌで３７℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌを遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２００μｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。同様に、ＧＫ遺伝子を含まないクローニングベクターｐＵＣ１１８により形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＵＣ１１８の抽出液も調製した。さらに両抽出液について、耐熱性ＧＫの活性のみを検定するために６５℃で３０分熱処理した。
【００８５】
実施例９
＜細胞抽出液中のＧＫ酵素活性の確認＞
実施例８で調製したエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１、およびエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＵＣ１１８の細胞抽出液中のＧＫ酵素活性を、以下のＧＫ酵素活性測定法によって測定した。
【００８６】
０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．２ｍｌ、５％のグリセロールを０．１ｍｌ、０．１ＭのＡＴＰを０．０２ｍｌ、０．１Ｍの塩化マグネシウムを０．０４ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ（シグマ社製）を０．１ｍｌ、０．３％の４−アミノアンチピリンを０．１ｍｌ、０．２５％のフェノールを０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのグリセロフォスフェイトオキシダーゼ（旭化成社製）を０．２ｍｌ、および蒸留水を０．１４ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．５％のＳＤＳを添加して反応を停止させ、５分以内に層長１ｃｍセルを用いて波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。
【００８７】
また、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルのグリセロフォスフェイトを生成させる酵素量とし、下記の計算式により算出した。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×２．２７×酵素液の希釈倍率
【００８８】
上記の方法により活性を測定した結果、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１では、培養液１ｍｌあたり０．２４ユニットの活性が検出され、エシェリヒア・コリＤＨ１・ｐＵＣ１１８には活性は検出されなかった。これによりエシェリヒア・コリＤＨ１・ｐｃＧＫＺ１でのＧＫの活性発現が確認された。
このようにして得られたＧＫの理化学的性質は前記した通りである。
【００８９】
【発明の効果】
ＧＫの部分アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドを使用して、ＧＫ生産菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからＧＫ遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＧＫ遺伝子を分離したもので、該ＧＫ遺伝子を利用して、高効率なＧＫの生産が可能になった。
【００９０】
【配列表】
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【００９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐｃＧＫＺ１の制限酵素地図を示す。
【図１】
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