(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の培養工程において、ＦＴ−ＩＲ法を用い、培養物中の解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度および非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度を測定し、これらの測定値から、培養物のｐＨ値および／または培養物中の乳酸濃度を算出することを特徴とする、乳酸菌の培養管理方法。
【請求項２】
請求項１記載の乳酸菌の培養管理方法において、さらに、基質としてのグルコースまたは乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度を測定し、これらの測定値から、グルコース濃度または乳糖濃度を算出することを特徴とする、請求項１記載の乳酸菌の培養管理方法。
【請求項３】
該赤外吸収の強度の測定を、ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法を用い、インライン上で行うことを特徴とする、請求項１または２記載の乳酸菌の培養管理方法。
【請求項４】
該解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度が、約１５７５cm-1における赤外吸収の強度であり、該非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度が、約１７２５cm-1における赤外吸収の強度である、請求項１、２または３記載の乳酸菌の培養管理方法。
【請求項５】
該グルコースのアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度が、約１０８０cm-1または約１０３５cm-1における赤外吸収の強度であり、該乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度が、約１０７５cm-1または１０４２cm-1における赤外吸収の強度である、請求項２または３記載の乳酸菌の培養管理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳酸菌を利用した各種製品を製造するに際して、その培養工程における乳酸菌の培養状態を管理する方法に関するものであり、さらに詳しくは、本発明は、特にＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法を利用した、乳酸菌の培養工程の管理方法、特に基質としてのグルコースまたは乳糖の濃度、乳酸菌の培養生成物としての乳酸濃度、および発酵液の酸度、ｐＨ値を指標として、乳酸菌の培養状態の監視および制御を簡便かつ迅速にすることを可能とする新しい乳酸菌の培養管理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、発酵乳などの乳酸菌を利用した各種製品の製造にあたり、その培養工程の管理においては、基質としての糖の濃度、発酵の進行に伴い生成してくる生成物としての乳酸の濃度、および発酵液の酸度やｐＨなどの数値の変化などを指標として、発酵の管理、即ち、発酵の進行状況や、発酵終了のタイミングを図ることが行われる。これらの数値を得るために、従来は、発酵工程において、適宜の段階で発酵液を一旦サンプリングし、次いで、それぞれの項目について、例えば、中和滴定法などを利用して、常法に従い、分析定量を行うことが通常であった。しかし、このような方法によると、それぞれの指標値を測定するのに、滴定の誤差が大きいという問題があり、また、かなりの時間や人手を要するので、簡便かつ迅速な形で培養工程の管理を行うことができなかった。
【０００３】
さらに、最近になって、より信頼性の高い簡便なオンライン測定法の可能性について検討した例も見かけられるが、それらは、あくまで特定の製品の発酵過程のオンライン測定の基礎的知識を得るためのものであって、あくまで基礎的検討段階の域を出るものではなく、これまで、そのような測定法により乳酸菌の培養工程の管理が可能かどうかについて実際に検討された例は報告されておらず、当業界において、より信頼性の高い簡便な測定法を利用した新しい乳酸菌の培養工程の管理方法を開発することが強く望まれている状況となっていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の如く、従来、発酵乳などの培養工程において、乳酸菌の培養状態を管理する指標としての、糖の濃度、乳酸の濃度、酸度、ｐＨ値を迅速・簡便かつ正確に測定する方法の開発、特にインライン的に測定する方法の開発、およびそれに基づく乳酸菌の培養管理方法の開発が、望まれていた。
【０００５】
本発明者らは、そのような新しい乳酸菌の培養管理方法を開発することを目標として鋭意研究を進めた結果、ＦＴ−ＩＲ法（フーリエ変換赤外分光法）を用い、発酵液の赤外吸収スペクトルを測定し、培養物中の解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度、非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度、グルコースのアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度、および乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度を測定し、これらの測定値から、培養物中の乳酸濃度、ｐＨ値、グルコース濃度、および乳糖濃度を算出できること、そしてこれらの値を指標として乳酸菌の培養状態の監視および制御を簡便かつ迅速に行うことができることを見出し本発明を完成した。また、ＦＴ−ＩＲ法のなかでも全反射スペクトルを測定する方法である、ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法によれば、インライン的に、各種指標の数値が測定可能であること、そして、それにより乳酸菌の培養管理の自動化を行うことができることを見出した。
【０００６】
本発明は、発酵乳などの乳酸菌を利用した各種製品の製造にあたり、その培養工程を管理する方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、乳酸菌の培養工程において、培養を管理する各種の指標値を迅速・簡便かつ正確に測定するとともに、乳酸菌の培養状態の監視および制御を簡便かつ迅速に行うことが可能な新しい乳酸菌の培養管理方法を提供することを目的とするものである。
さらに、本発明は、上記乳酸菌の培養工程において、上記指標値を、特に、インライン上により測定することにより乳酸菌の培養管理を簡便かつ迅速に自動的に行う方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明は、乳酸菌の培養工程において、ＦＴ−ＩＲ法を用い、培養物中の解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度および非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度を測定し、これらの測定値から、培養物のｐＨ値および／または培養物中の乳酸濃度を算出することを特徴とする、乳酸菌の培養管理方法、である。
【０００８】
また、本発明の他の態様は、上記の乳酸菌の培養管理方法において、さらに、基質としてのグルコースまたは乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度を測定し、これらの測定値から、グルコース濃度または乳糖濃度を算出することを特徴とする、上記の乳酸菌の培養管理方法、である。また、本発明の他の態様は、該赤外吸収の強度の測定を、ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法を用い、インライン上で行うことを特徴とする、上記の乳酸菌の培養管理方法、である。また、本発明の他の態様は、該解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度が、約１５７５cm-1における赤外吸収の強度であり、該非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度が、約１７２５cm-1における赤外吸収の強度である、上記の乳酸菌の培養管理方法、である。さらに、本発明の他の態様は、該グルコースのアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度が、約１０８０cm-1または約１０３５cm-1における赤外吸収の強度であり、該乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度が、約１０７５cm-1または１０４２cm-1における赤外吸収の強度である、上記の乳酸菌の培養管理方法、である。
ここで特定する波数は±１０cm-1程度の幅を含むものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
次に本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明でいう乳酸菌とは、酪農産業で通常利用される、酪農乳酸菌、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属などの乳酸菌が代表的なものとして例示されるが、それ以外にも、本発明の方法で、測定可能な、糖の濃度、乳酸の濃度、ｐＨ値などを指標に同様に培養管理が可能な微生物であれば、当然、同様に利用可能なものとして本発明でいう乳酸菌に含まれるものであり、それらのものとしては、例えば、ビフィドバクテリウム属、ペディオコッカス属、スポロラクトバチルス属などが挙げられる。
また、本発明でいう乳酸菌の培養工程は、代表的には発酵乳などの乳酸菌を利用した各種製品の発酵工程を意味するものであるが、乳酸菌そのものの培養を目的とした培養工程等も含め、乳酸菌を含む発酵・培養工程であれば、その種類を問わず対象とされる。
【００１０】
また、ここでいう、ＦＴ−ＩＲ（Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、特にＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）−ＦＴ−ＩＲ法とは、試料からの赤外領域の光を光干渉計にいれ、出てくる光の強度を可動鏡の移動距離の関数として測定し、そのフーリエ変換によってスペクトルを得るもので、特にＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法は、一定の波長の光の入射角を変化させたときの全反射光の強度変化を測定する分光法として知られている方法である。
【００１１】
また、本発明でいう、インラインによる方法とは、乳酸菌の培養を行う培養槽に、直接、本発明に係る赤外吸収スペクトル測定装置のプローブ（センサー部分）を装着して測定することを意味するものであり、従来法のように、乳酸菌の培養進行中に、一旦サンプリングを行う工程を採用することなく、培養槽により直接的に測定することをいう。さらに、従来法のように、例えば、乳糖やグルコース等の基質の消費量の測定値から、乳酸濃度を推定するような間接的な方法とは本質的に区別されるものである。
【００１２】
本発明では、前記ＦＴ−ＩＲ法を用いて、発酵管理を目的とする乳酸菌の培養液の赤外吸収スペクトルを測定し、そのうち特定波数の強度と、グルコース濃度、乳糖濃度、乳酸濃度、酸度、ｐＨ値などの値との相関関係について、具体的に調べた。
その結果、グルコース濃度については、グルコースの水溶液を標準液とした試験で、グルコースのアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される１０８０cm-1または１０３５cm-1の吸収強度との間に強い相関関係（相関係数０．９９９）があることが判った（図１、図２参照）。また、乳酸菌の発酵槽に直接、赤外吸収スペクトル測定装置のプローブを装着してインラインで計測した場合も、それぞれの波数で、高い相関関係（相関係数１０８０cm-1で０．９９２、１０３５cm-1で０．９９８）があることが判り、ＩＲ吸収の強度から、グルコース濃度が測定できることが判った（図５参照）。
【００１３】
次に、乳糖濃度については、乳糖の水溶液を標準液として用いた試験で、乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される１０７５cm-1または１０４２cm-1の吸収強度との間に強い相関関係（相関係数０．９９８）があることが判った（図３参照）。また、乳酸菌の発酵槽に直接、赤外吸収スペクトル測定装置のプローブを装着してインラインで計測した場合も、それぞれの波数で、高い相関関係（相関係数１０７５cm-1で０．９９５、１０４２cm-1で０．９９８）があることが判り、ＩＲ吸収の強度から、乳糖濃度が測定できることが判った（図６参照）。
【００１４】
次に、乳酸濃度についても、乳酸の水溶液を標準液として用いた試験では、カルボン酸Ｃ＝Ｏ基に帰属される１７２５cm-1、カルボン酸のＣ−Ｏ基に帰属される１２３７cm-1、また、アルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される１１３２cm-1の吸収強度との間に良好な相関関係があることが判った（図４）が、実際の発酵槽に直接プローブを装着してインライン測定した場合は、いずれの波数の吸収強度との間においても、乳酸濃度との間に線形関係が認められなかった。そこで、この点について種々検討の結果、乳酸の解離率に着目し、解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度および非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度を組み合わせた重回帰式を用いることで、乳酸濃度を算出することができることを見出した。また、さらに簡便な算出方法として、ＡＴＲ測定法において、赤外線の波数の関数である測定試料に対する潜り込みの深さの比率の補正をそれぞれの強度に対して行うことによっても乳酸濃度を求めることができることを見出した。
【００１５】
さらに、乳酸の解離率からHenderson-Hasselbalch式を応用して、酸度、ｐＨ値についても、正確に算出できることを見出した。
即ち、後に記載した実施例１を例として説明すると、電解質の解離率が５０％のときのｐＨをｐＫａとすると、Henderson-Hasselbalch 式
ｐＨ＝ｐＫａ＋ｌｏｇ〔解離濃度〕／〔非解離濃度〕
を変形することにより、解離率（％）は、
解離率＝｛１０(pH-pKa)／（１０(pH-pKa)＋１）｝×１００
であり、乳酸のｐＫａは、３．８６であるから、ｐＨと解離率の関係は、
解離率＝｛１０(pH-3.86) ／（１０(pH-3.86) ＋１）｝×１００
となる。後記する実施例１のロゴサ培地における培養工程において、ｐＨは、６．８〜３．５まで変化したので、解離率は、９９〜３３％まで変化したことになる。
解離型と非解離型の吸収波数を確認するために、ｐＨを２〜７まで変化させた１％乳酸標準液の赤外吸収スペクトルを図７に示した。
【００１６】
夾雑物によるノイズが小さく、相対変化の大きな吸収波数として、解離型は１５７５cm-1、非解離型は１７２５cm-1を選択し、この２波数に潜り込みの補正を組み合わせて乳酸濃度（Ｌ）（ｇ／ｌ）を求める式を導いた（図８）。
Ｌ＝（０．５２４×Ａ１７２５＋０．４７６×Ａ１５７５）／０．０００４５
この式を用いることにより乳酸濃度を算出できることが明らかとなった。表１に赤外吸収スペクトルから求めたグルコース濃度、乳酸濃度、ｐＨと、酵素法およびｐＨ電極で測定した値とを示した。インライン測定した赤外吸収スペクトルからグルコース濃度、乳酸濃度等を高い精度で算出できた。
解離型乳酸としては１５７５cm-1以外にも、１４５７、１４１６、１３６２、１３１５、１０４５等の吸収も利用可能であり、非解離型乳酸としては１７２５cm-1以外にも、１２３７、１１３１等の吸収が利用可能である。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【実施例】
次に、本発明について、実施例をあげてさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉをロゴサ培地（Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１１０，２５８−２６７，１９６２）で、３７℃で、静置培養した。代表的状態変数としてグルコース濃度、乳酸濃度、菌体濃度を選択した。赤外スペクトルは、赤外分光光度計ＦＴ−１Ｒ  ＦＴＳ−６５Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｄｉｇｉｌａｂ）、およびＦＴ−１ＲプローブＡＴＲ  Ｍｏｄｅｌ  ＤＰＲ−２１０（Ｓ）（ラボラトリーオートメーションシステムズ）を組み合わせて１９００〜９００cm-1の範囲で赤外吸収スペクトルの連続自動インライン計測を行った。データ蓄積および解析は、コンピュータ（ＩＢＭ−ＰＣ）を用いて検討した。赤外吸収スペクトルと対比させる目的で、グルコースおよび乳酸は酵素法で定量した。その結果、先に述べた様に、本発明の方法により、グルコース濃度、乳酸濃度、酸度、ｐＨ値を精度よく測定することができた。
【００１９】
実施例２
ロゴサ培地をミルク培地にかえて、乳酸菌発酵乳の代表的状態変数である滴定酸度と高い相関を示す乳酸の赤外分光法による測定を実施例１と同様にして検討した。その結果、乳酸濃度（Ｌ）（ｇ／ｌ）は、１７２５および１５７５cm-1における赤外吸光度（Ａ１７２５、Ａ１５７５）から以下の式で算出できることが明らかとなった（図９）。
Ｌ＝（０．５２４×Ａ１７２５＋０．４７６×Ａ１５７５）／０．００４１
粘性、付着性が高いミルク培地においても、赤外吸収スペクトル測定装置のプローブを発酵タンクに直接装着したインライン計測方法で、代表的状態変数を定量できた。したがって、従来、滴定酸度で培養プロセスを監視および制御していた乳酸菌飲料、発酵乳などの系において本発明の方法が極めて有効であることが明らかとなった。
【００２０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は、乳酸菌の培養工程において、ＦＴ−ＩＲ法を用いて、培養物中の解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度、非解離型乳酸に帰属される赤外吸収の強度、グルコースのアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度および／または乳糖のアルコール性Ｃ−Ｏ基に帰属される赤外吸収の強度をそれぞれ直接に測定し、これらの測定値から、培養物中のｐＨ値および／または培養物中の乳酸濃度を算出し、さらに、グルコース濃度または乳糖濃度を算出することを特徴とする、乳酸菌の培養管理方法、であり、本発明により、発酵乳などの乳酸菌を利用した製品の製造にあたり、その培養工程の管理に必要な各種の指標値を迅速・簡便かつ正確に測定することが可能となり、それによって、培養工程における乳酸菌の培養状態の監視および制御を簡便かつ迅速に行うことができる。また、ＡＴＲ−ＦＴ−ＩＲ法を用いることにより、上記各種の指標値をインライン上で行うことが可能となり、乳酸菌の培養工程の管理を自動化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】水の吸収を差し引いたグルコース標準液の赤外吸収スペクトルを示す。
【図２】吸光度とグルコース濃度との関係を示す。
【図３】吸光度と乳糖濃度との関係を示す。
【図４】吸光度と乳酸濃度との関係を示す。
【図５】実施例１におけるグルコース濃度と吸光度との関係を示す。
【図６】実施例２における乳糖濃度と吸光度との関係を示す。
【図７】水の吸収を差し引いたｐＨ２〜７の１％乳酸溶液の赤外吸収スペクトルを示す。
【図８】ロゴサ培地における乳酸濃度と解離型および非解離型の乳酸の培養０時間を差し引いた赤外吸光度との関係を示す。
【図９】ミルク培地における乳酸濃度と解離型および非解離型の乳酸の培養０時間を差し引いた赤外吸光度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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