(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化酵素を反応させてビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬であって、酸化酵素とともに尿素を含有することを特徴とするビリルビン測定用試薬。
【請求項２】
酸化酵素がビリルビンオキシダーゼである請求項１記載の直接型ビリルビン測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、生体液中の直接型ビリルビンの測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンはテトラピロール類に属する黄色色素であって、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁中にもっとも多く存在することが知られている。また、生体液中のビリルビンは直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとに大別される。
溶血性貧血、溶血性黄疸などの病態では間接型ビリルビン量が増大し、閉塞性黄疸などの病態では直接型ビリルビン量が増大することから、これらビリルビンの分別定量は臨床診断などにおいて重要な位置を占めている。実際、従来より臨床検査などで測定されるビリルビンは総ビリルビンと直接型ビリルビンであり、直接型ビリルビンの正確な定量は臨床検査などにおいては不可欠になっている。
【０００３】
直接型ビリルビン、総ビリルビンを定量しうるものとしては、ジアゾ試薬を用いる方法、高速液体クロマトグラフィーを利用する方法、ビリルビンオキシダーゼなどの酸化酵素を利用する方法などが挙げられる。
このうちジアゾ試薬を用いる方法については、使用するジアゾ化反応促進剤の種類と、生成するアゾビリルビンの定量方法の違いにより、種々のものが報告されている。例えば、代表的なものとしては、マロイおよびエヴェリン(Malloy & Evelyn) による試薬〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry) 、第１１９巻、第４８１頁（１９３７年）〕などがある。
【０００４】
高速液体クロマトグラフィーによって分画定量する方法には、逆相ＨＰＬＣカラムを使用して各種ビリルビンをリン酸緩衝液およびイソプロパノールのグラジエントによって溶出、分析するラウフ(Lauff) らの方法〔ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(Journal of Chromatography) 、第２２６巻、第３９１頁（１９８１年）〕などがある。
【０００５】
酸化酵素を利用する方法は、酸化酵素を作用させることによってビリルビンを酸化し、ビリルビン自体のもつ４５０ｎｍ付近の黄色を消失させ、反応前後の吸光度変化量よりビリルビンを測定するものである。この場合、反応条件を種々変えることにより、直接型ビリルビンのみを特異的に酸化させることができる。この方法において使用される試薬としては、例えばビリルビンオキシダーゼを用いる試薬〔クリニカル・ケミストリー(Clinical Chemistry)、第２０巻、第７８３頁（１９７４年）〕、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどの酸化酵素を用いる試薬（特公昭６２−３３８８０号公報）がある。さらに、ｐＨ、緩衝液、界面活性剤の選定によって、直接型ビリルビンのみにビリルビンオキシダーゼが働く条件を設定した直接型ビリルビンの測定用試薬も提案されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のジアゾ試薬を用いる方法は、低値域の再現性が悪く、共存物質の影響が認められ、また試薬自体が不安定であり保存に適さないという問題がある。
高速液体クロマトグラフィーによって分画定量する方法は、高価で特殊な装置を使用すること、分析時間が長いこと、一度に多数検体を処理できないなどの問題がある。
【０００７】
臨床検査の現場においては、主として血清中の直接型ビリルビンおよび総ビリルビンを定量している。しかし、血清を血餅から分離するためには多大な時間を要し、また、ビリルビンは光や金属イオン等により容易に分解されるなど、比較的不安定な物質である。従って、血液凝固阻止剤を添加し、血球と速やかかに分離した血漿を試料として、直接型ビリルビンおよび総ビリルビンを測定する方がより正確であり望ましい。しかしながら、ビリルビンに酸化酵素を作用させてビリルビンの変化を光学的に測定する各種のビリルビン測定法では、測定試薬と血漿検体とを混合したのちにビリルビンの変化とは無関係に吸光度が上昇し、各種ビリルビン測定値に誤差を生じるという問題があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明の発明者は、以上の通りの事情に鑑みて、酸化酵素を利用したビリルビン測定用試薬におけるこれらの問題点を解決するための検討を進めた結果、酸化酵素を利用してビリルビンを測定する試薬において、尿素を共存させることにより、ビリルビン含有血漿検体中のビリルビンを精度良く測定できることを見い出し、この発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、この発明は、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化酵素を反応させてビリルビンの変化を光学的に測定するための試薬であって、酸化酵素とともに尿素を含有することを特徴とするビリルビン測定用試薬を提供する。
この発明のビリルビン測定用試薬は、尿素、アルブミン、界面活性剤等を含む緩衝液（第１試薬）と、ビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵素、アルブミン、界面活性剤等を含む試薬（第２試薬）とからなる２種類の試薬からなる形態のものでもよく、あるいはまた、これらを混合した形態からなるものでもよい。
【００１０】
尿素の濃度は０．５Ｍ〜５Ｍ、好ましくは１Ｍ〜３Ｍである。尿素の濃度が前記範囲の下限未満であると、測定試薬と血漿検体とを混合したのちの、ビリルビンの変化とは無関係な吸光度の上昇を回避することができず、好ましくない。
その他の試薬類、例えば緩衝剤や界面活性剤、防腐剤等は、公知の化学的酸化法やビリルビンオキシダーゼ法等において使用される例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、フタル酸等の緩衝剤、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル等の非イオン性界面活性剤、パラベン等の防腐剤から必要に応じて適宜選択して用いることができ、それらの使用濃度や測定試液のｐＨ等も公知の方法において採用されている測定試液のそれに準じて適宜設定することができる。例えば緩衝剤の濃度は２０ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、界面活性剤の濃度は0.001 ％〜１％、好ましくは0.01％〜0.5 ％、また防腐剤の濃度は0.01％〜１％、好ましくは0.02％〜0.5 ％である。もちろん市販の酵素法によるビリルビン測定用試薬を用いてもよい。
【００１１】
たとえば以上のようにして得られたこの発明の試薬を用いてビリルビンを測定するための方法は、具体的には以下の通りである。
まず、尿素を含む緩衝液を第１試薬とし、これにビリルビンを含む検体（血漿検体）を混合し、この溶液の特定波長（４３０〜４６０ｎｍ付近）の吸光度を測定する（吸光度１）。これにビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵素を含む第２試薬を添加して２５〜４０℃で、３〜１５分間ビリルビンの酸化反応を行った後、特定波長付近の吸光度を再度測定する（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に液量補正値等を乗ずるなどしたのち、上記の特定波長における吸光度変化量（Ａ）を求める。次に、既知濃度のビリルビンを含む標準物質を同様に測定し、吸光度変化量（Ｂ）を求める。この吸光度変化量（Ｂ）から作成した検量線に上記の吸光度変化量（Ａ）を当てはめることによって試料中の直接型ビリルビン量を測定することができる。
【００１２】
自動分析装置を用いないその他の測定方法として、使用時にその都度用いる試薬を調製し、通常の分光光度計を用いて一回ごと測定を行う場合には、第１試薬と試料とを混合した溶液の吸光度を吸光度１とし、第１試薬と第２試薬とを予め混合したものと試料とを反応させた結果得られる溶液の吸光度を吸光度２として、上記と同様の操作を行うことによっても、同様に試料中の直接型ビリルビン濃度を測定することができる。
【００１３】
【作用】
以上の通りのこの発明の試薬においては、ビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵素とともに、尿素を共存させているため、測定試薬と血漿検体とを混合したのちに、ビリルビンの変化とは無関係に吸光度が上昇する現象が認められず、ビリルビン含有血漿検体中のビリルビンを精度良く測定することが可能となる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。なお、以下の例における吸光度の測定は、日立７０７０型自動分析装置を用いて行った。
試薬の調製
試薬１：その組成が、フタル酸水素カリウム１００ｍＭ（ｐＨ５．３）、ｐ−トルエンスルホン酸４０ｍＭ、Ｎ−アセチルシステイン２．０ｍＭ、フッ化ナトリウム２．０ｍＭ、人血清アルブミン0.002 ％、ポリエチレングルコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル0.05％となるように調製した。
【００１５】
試薬２：試薬１に尿素（ナカライテスク製）を０．５Ｍ添加して調製した。
試薬３：試薬１に尿素を１Ｍ添加して調製した。
試薬４：試薬１に尿素を３Ｍ添加して調製した。
試薬５：試薬１にビリルビンオキシダーゼ（宝酒造製）を５Ｕ／ｍｌ添加して調製した
実施例１〜６
比較例１〜２
上記の試薬１（０．２８ｍｌ）に試料１（抗凝固剤としてフッ化ナトリウム、ヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡ・２カリウムを用いた血漿検体）０．０１ｍｌを加え、３７℃で５分間加温し、４５０ｎｍ（副波長５４６ｎｍ）でサンプルブランクを最終液量補正して測定した。その後試薬５（０．０７ｍｌ）を加え、３７℃で５分間反応させ、４５０ｎｍ（副波長５４６ｎｍ）の吸光度を測定し、濃度既知のジタウロビリルビン溶液を標準として試料中のビリルビン測定値を求めた。その結果を図１に示した（比較例１）。
【００１６】
また、比較例１における試薬１の代わりに試薬２、３または４を用いて同様に測定値を求めた。結果を比較例１とともに図１に示した（実施例１〜３）。
さらに、試料２（抗凝固剤としてＥＤＴＡ・２カリウムを用いた血漿検体）についても同様にビリルビン測定値を求めた。その結果を図２に示した（比較例２および実施例４〜６）。
【００１７】
以上の結果から、この発明の試薬によれば、測定用試薬と血漿検体とを混合したのちの、ビリルビンの変化とは無関係な吸光度の上昇が回避され、血漿検体中のビリルビンが正確に測定できていることが確認された。
実施例７〜１０
比較例３
実施例２の血漿試料の代わりに以下の試料を用いて、同様に試料中のビリルビン測定値を求めた。患者Ａ、患者Ｂ、患者Ｃより採取した血液（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ）をそれぞれ５等分し、それらの各試料の１画分は抗凝固剤を添加せずに放置して血清を分離し、そのビリルビン測定値を求めた（比較例３）。
【００１８】
残りの４画分には、それぞれ、ヘパリンナトリウム（血液１ｍｌに対して９ＩＵ）、ＥＤＴＡ・２カリウム（血液１ｍｌに対して１．２ｍｇ）、クエン酸ナトリウム（血液１ｍｌに対して３．１３％溶液を０．１１ｍｌ）、フッ化ナトリウム＋ヘパリンナトリウム＋ＥＤＴＡ・２ナトリウム（血液１ｍｌに対して、それぞれ、１．２５ｍｇ、１４．２ＩＵ、３．７ｍｇ）を添加したのちに遠心分離して血漿を得、そのビリルビン測定値を求めた（実施例７〜１０）。
【００１９】
結果は表１に示した通りであり、この発明の測定用試薬によれば、血清検体のビリルビン測定値と血漿検体のビリルビン測定値が一致し、正確に測定できていることが確認された。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
実施例１１
ハイレベルチェック・ＢＩＬ（国際試薬社商品名）溶液を生理食塩水を用いて希釈し、試料を調製した。実施例３の血漿試料の代わりにこの試料を用いて同様に測定値を求めた。測定値と希釈率との関係を図３に示す（実施例１１）。両者の関係はほぼ原点を通る直線となり、尿素の添加は試料中のビリルビン測定に影響を及ぼさないことが確認された。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく述べたように、この発明によれば、血漿検体中のビリルビンを正確に測定することができ、試料採取後短時間でビリルビン濃度を測定することが可能となるため、臨床検査その他において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の試薬（実施例１〜３）および対照（比較例１）による血漿検体（抗凝固剤はＮａＦ、ヘパリン、ＥＤＴＡ）を試料として用いた際の反応の経時的変化を示した図である。
【図２】この発明の試薬（実施例４〜６）および対照（比較例２）による血漿検体（抗凝固剤はＥＤＴＡ）を試料として用いた際の経時的反応変化を示した図である。
【図３】この発明の試薬（実施例１１）によるハイレベルチェック・ＢＩＬ溶液を試料として用いた場合の直接型ビリルビン測定値と試料希釈率の関係を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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