(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスプロセスを改変する化合物を同定する方法であって、
アポトーシス細胞抽出物を、１つまたはそれ以上の化合物で処置する工程、および
該アポトーシス細胞抽出物における該アポトーシスプロセスを改変する化合物を選択する工程を包含し、
ここで、該アポトーシス細胞抽出物は、細胞質ゾル抽出物とクロマチンとを含む、方法。
【請求項２】
前記アポトーシスプロセスは、増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アポトーシスプロセスは、阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アポトーシス細胞抽出物を調製する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、NIH助成金CA-47956により一部資金を供与された。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
発明の背景
アポトーシス(apoptosis)は、正常な生理学的過程として多くの組織に発生するある種の細胞死を記述するのに用いられる用語である。さらに、「プログラムされた細胞死」ともいわれるこの形態の細胞の終息は、細胞自殺について本来的に備わっている遺伝的プログラムの細胞内での活性化を含み、これによって細胞は必然的に自己消化する。次いで、これら死細胞の残骸は、炎症を起こしたり瘢痕を残したりすることもなく、さらに周辺の食細胞によって痕跡もほとんど残さずに取り除かれる。従って、アポトーシスは、例えば、心筋梗塞または脳卒中の状況下での酸素喪失によって引き起こされる細胞死とは著しく対照的であり、そこでは、細胞がエネルギー供給を失って破裂し、そしてその内容物を細胞外の環境に流出する。
細胞が体内で代謝回転される正常な生理学的過程の他に、身体から不必要な細胞を除去するために、細胞性刺激、ホルモン性刺激、または他の刺激によりアポトーシスが誘導されて起こり得る。例えば、免疫系の細胞溶解性Ｔ-細胞による腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の殺傷は、標的認識後にアポトーシスを介して起こる。アポトーシスはまた、正常妊娠非存在下での各月経周期を伴う雌性生殖組織内のホルモン刺激の欠乏を介して起こる。さらに、多くの研究により、アポトーシスは、様々な臨床的に重要な領域において細胞死の原因であることが示されている。例えば、癌の処置に現在使用されている本質的に全ての化学療法薬、ならびに多くの場合におけるＸ線照射療法は、アポトーシスを誘導する細胞内経路を活性化することによって悪性細胞を最終的に殺傷する。
正常な細胞現象におけるアポトーシスの効果とは異なり、異常な調節を受けた場合、アポトーシスによる細胞の死により、様々な疾患状態および病的状態が誘導され得る。例えば、アルツハイマー痴呆症およびパーキンソン病などの疾患において起こるニューロンの死では、アポトーシスの多くの際立った特徴が示される。自己免疫疾患では免疫細胞が正常細胞を不適切に攻撃するが、これは一部に、アポトーシスの機能不全が起こるためである。さらに、ウイルス感染によって引き起こされる細胞死は、AIDSの原因であるヒト免疫不全ウイルス(HIV)によって誘導されるＴ-細胞死を含む、多くの場合のアポトーシスにより起こる。アポトーシスの誘導を引き起こすウイルスがあるのに対して、他のウイルスは、アポトーシスをブロックする遺伝子産物の発現によりこの過程を阻害するウイルスもある。単純ヘルペスウイルスは、その特徴的永続性または「潜伏性」ウイルス感染のためにアポトーシスの防止が必要とされるこうした阻害の具体例である。
上記の疾患状態の全てを含む、不適切なアポトーシス細胞死を起こす多くの疾患状態を処置するために、従来の化学療法を用いて努力がなされてきたが、今までのところ、効果的な処置法のための進展は極わずかである。さらに、他の非従来的アプローチもまた特定の増強で試みられた。例えば、胎児神経組織移植法を用いて、ヒトにおいてパーキンソン病が処置されている。このような神経組織移植片の広範な試験ならびに遺伝子工学的に操作された線維芽細胞の試験が、パーキンソン病およびアルツハイマー病の動物モデルにおいて検討されている。後者の場合では、レシピエント神経細胞の生存を延長するために、線維芽細胞は、神経成長因子(NGF)などの神経栄養性因子、またはドーパミンの前駆体などの神経伝達物質を分泌するように改変された。これらの処置法の全般的な難点としては、移植組織上では最初から少数の移植細胞しか生存しないこと、あるいは遺伝子工学的に操作された線維芽細胞の場合では、最初に生存する細胞でもその多くはインビトロで長期間は生存し続けることができないことのいずれかである。
前述のように、癌の化学療法は、アポトーシス経路を最終的に活性化する様々な細胞内標的に作用する。癌は、米国における死亡の主要原因の第２位である。米国人の３人に１人は、一生の間に何らかの形で本疾患を発症し、そして悪性疾患の直接的結果として、主に現在入手可能な化学療法薬が充分でないこと、または悪性細胞がこのような処置に対して自然耐性となることから、大多数の人々が死亡する。
悪性疾患についての詳細の多くは充分に理解されていないが、種々の癌の基礎の大半は解明されている。例えば、多くの遺伝子の非調節の発現が癌遺伝子の形質転換を引き起こすことが現在知られている。これらの遺伝子は、異常に発現された場合に形質転換能があることから、総称して癌遺伝子と呼ばれている。このような癌遺伝子の典型的な例としては、Src、Herb-2(NEU)およびBCR/ABLなどのプロテインキナーゼ、Ki-RAS、Ha-RAS、およびN-RASなどのGTPアーゼ、ならびにFos、Jun、およびMycなどの転写因子が挙げられる。これらの癌遺伝子および他の癌遺伝子は、神経芽腫(N-myc)、バーキットリンパ種(c-myc)、直結腸癌(Ki-RAS)、慢性骨髄性白血病(BCR/ABL)、乳癌(Herb-2/NEU)、および肺癌(L-myc)などの癌の悪性表現型における主な原因であることが充分に報告されている。関連する癌に対する治療的処置を提供するために、いくつものこれらの癌遺伝子を標的とするための試みがなされてきた。しかし、化学療法に関した上記の問題のため、このような試みの全ては、かなり多くの場合、僅かな利益しかもたらさないことが明らかにされている。
異常な発現または非調節の発現により増殖の増大を引き起こす癌遺伝子があるのに対して、過剰発現により細胞の生存の延長を引き起こす少なくとも１つの「癌遺伝子」が存在する。この癌遺伝子はBcl-2と呼ばれており、そしてこの癌遺伝子が新生物細胞の拡張に寄与しているリンパ腫(リンパ節の癌である)でのこの癌遺伝子の不適切な活性化のため、最初に発見された。米国だけで毎年認められるおよそ50,000人のリンパ腫および白血病の新しい患者、薬剤耐性の前立腺癌の本質的に全ての患者(米国で毎年150,000患者)、鼻咽腔癌の80%、乳癌の約70%(米国で毎年およそ100,000患者)、および現在までに検査されている直結腸癌の全ての患者(米国で毎年110,000の新しい患者)において、高レベルのBcl-2タンパク質が生じていることが実証されている。
この癌遺伝子の最初の発見以来、Bcl-2はまた、身体の多くの組織において正常に発現され、そこで長命細胞の生存を維持する生理学的役割を担っていることが示されている。生存がBcl-2により調節されている細胞のタイプには、免疫化の間に形成される「記憶(memory)」リンパ球、脳内ならびに特に筋肉および器官の機能を制御する末梢神経内の多くのタイプのニューロン、骨髄細胞、皮膚、および胃腸管の内側に存在する吸収細胞となる幹細胞がある。
前記考察から、人類に影響を与えている疾患の多くについては、最初10年から15年の間に効果的な処置法に対して大きな進展が見られないのは明白である。しかし、これ程多様に疾患およびその処置方法があるものの、これらの特徴を明確にし、もしくは化学療法を無効にしていた一つの共通のメカニズムが明らかにされてきた。この共通のメカニズムがプログラムされた細胞死の誘導、もしくは阻害のいずれかである。
従って、広い範囲の疾患および病的状態を一般に処置するためには、そして容易に入手可能な薬剤を用いて臨床における処置の増強を可能にするためには、アポトーシスの過程を制御する必要がある。本発明は、この必要性を満足させるものであり、そして関連する利点をも提供している。
発明の要旨
本発明は、アポトーシス細胞死を生じる疾患または病的状態を処置する方法を提供する。この方法は、上記疾患または病的状態により影響される細胞中のBcl-2の活性を増大する工程を包含する。従って、本発明は、アポトーシス細胞死に至る疾患または病変により影響される細胞中のBcl-2活性を増大するために使用され得る薬剤を提供する。アポトーシス細胞死を生じる疾患または病的状態は、例えば、神経変性疾患、癌およびウイルス感染細胞を包含し得る。
また、疾患または病的状態の処置のために移植細胞のインビボ生存を延長する方法が提供される。この方法は、細胞集団中のBcl-2の活性を増加する工程、および増加したBcl-2活性を有する細胞集団を被験体に移植する工程を包含する。従って、本発明は、被験体に移植され得る細胞中のBcl-2活性を増大するために使用され得る薬剤を提供する。疾患または病的状態は、例えば、神経変性疾患、癌またはウイルス感染細胞を包含する。悪性またはウイルス感染細胞の治療に対する感受性を増強する方法が提供され、この方法は、悪性またはウイルス感染細胞中のBcl-2活性を減少させる工程を包含する。従って、本発明はまた、治療に対する細胞の感受性を増強するために、悪性またはウイルス感染細胞中のBcl-2活性を減少するために使用され得る薬剤を提供する。アポトーシス細胞死を改変する化合物を同定する方法、およびモノクローナル抗体産生を増強する方法がまた、本明細書で開示される発明により、および導入遺伝子(transgene)としてBcl-2を発現するトランスジェニックマウスを使用することにより提供される。
【図面の簡単な説明】
図１．標準の組換えDNA技術を用いて構築される組換えBcl-2レトロウイルスベクター。
Ａ．完全長Bcl-2タンパク質(「bcl-2α」)またはより短いBcl-2の阻害形態「bcl-2β」をコードするクローン化ヒトＤＮＡ配列を、pBC140中の唯一のXhoI部位に順方向および逆(AS；アンチセンス)方向の両方で挿入した。Bcl-2発現は、サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサー(CMV；塗りつぶした棒)により行われる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(Neor)遺伝子発現は、最も左のモロニーウイルス長末端反復(LTR；白塗りの棒)により行われ、そして抗生物質G418を用いて優性選択マーカーとして用いられる。選択された制限部位が示されている。
Ｂ．完全長Bcl-2タンパク質をコードするヒトBcl-2 cDNAを、pZip-NEO中の唯一のBamHI部位中にクローン化した。選択された制限部位は以下のように示されている：X、XhoI；Xb、XbaI；B、BamHI。Bcl-2発現は、最も左のモロニーウイルスLTRにより行われる。ネオマイシン耐性遺伝子の発現は、スプライシング事象により媒介される(示さず)。
図２．Bcl-2および変異Bcl-2(59 Pro -> Ser)タンパク質は、哺乳動物細胞をより高い細胞密度に生育させる。
Ａ．トリパンブルー排除により測定された細胞生存率(３回測定の平均±標準偏差)。W.T.、野生型Bcl-2；P59S、変異Bcl-2；Neo、コントロール。
Ｂ．3H-チミジンで８時間パルス標識した細胞の液体シンチレーションカウントにより測定されたDNA合成。Kcpm=キロカウント/分(３回測定の平均±標準偏差)。
図３．Bcl-2は、シンドビスウイルス感染により誘導される、前立腺癌細胞株、AT-3の死をブロックする。トリパンブルー排除により測定されたときの細胞生存率(３回測定の平均±標準偏差)。pZIP-BCL2またはpZIP-NEOは図１．Ｂ．に記載される。AT-3-NEOコントロール細胞(丸印)；AT-3-BCL2細胞(四角印)。ウイルス感染細胞(黒塗りシンボル)；ウイルス非存在下で培養された細胞(白抜きシンボル)。
図４．Bcl-2によるグルタミン酸誘導死からのPC12細胞の保護。MTT色素減少アッセイにより測定されたときの細胞生存率(３回測定の平均±標準偏差)。
図５．Bcl-2の相同体は、Il-3の非存在下で生育する32D-3細胞の生存を種々の時間について延長する。トリパンブルー排除により測定されたときの細胞生存率(３回測定の平均±標準偏差)。
Ａ．ヒト(HU)およびニワトリ(CH)Bcl-2タンパク質は細胞生存を延長する(NEO=コントロール；Bcl-2なし)。
Ｂ．ヒトBcl-2およびエプスタインバールウイルスBcl-2相同体、BHRF-1、は細胞生存を延長する。(HYG＝コントロール；ハイグロマイシンＢ)。
図６．Bcl-2は、Raf-1と相乗的に作用し、成長因子剥奪の条件下で細胞生存を延長する。Bcl-2タンパク質、単独(白丸)；活性化Raf-1タンパク質、単独(四角)；Bcl-2＋Raf-1タンパク質(黒丸)；Bcl-2タンパク質もRaf-1タンパク質もなし(三角)。
Ａ．トリパンブルー排除により測定されたときの細胞生存率(３回測定の平均±標準偏差)。
Ｂ．3Hチミジン取り込みにより測定されたときのDNA合成。データは、インターロイキン-3(Il-3)の非存在下で培養された細胞について得られた結果を、Il-3の存在下で培養された細胞について得られた値で除することにより規格化した(３回測定の平均±標準偏差)。
Ｃ．フローサイトメトリーにより測定されたときのヨウ化プロピジウム染色生存細胞の相対DNA含量。細胞を、Il-3の存在下(パネルａおよびｃ)または非存在下(パネルｂおよびｄ)で３日間生育させた。32D-BCL2細胞(パネルａおよびｂ)；32D-BCL2/RAF細胞(パネルｃおよびｄ)。(FL＝蛍光強度)。
図７．Bcl-2タンパク質の優性ネガティブ形態、Bcl-2βは、細胞死を促進する。トリパンブルー排除により測定されたときの細胞生存率。データは、コントロール細胞(NEO)に対して規格化した(４回測定の平均±標準偏差)。
図８．Sf9細胞抽出物のウェスタンブロット。レーン１−３は、組換えBcl-2バキュロウイルス感染細胞由来のタンパク質を、それぞれ、5.0、1.0または0.2μg含む；レーン４、t(14;18)含有ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株由来の100μgタンパク質；レーン５、組換えLckバキュロウイルス感染細胞由来の10μgタンパク質(ネガティブコントロール)；レーン６、非感染細胞由来の10μgタンパク質。
図９．Bcl-2機能を評価する無細胞アッセイ。
Ａ．核を、コントロールSf9細胞(上部パネル)またはBcl-2を発現するSf9細胞(下部パネル)から調製されたSf9昆虫細胞溶解産物を含む無細胞抽質物中でインキュベートした。Hoechst 33258 DNA染色を用いて可視化した核(DNA)；SV40 T抗原の核局在化シグナルに対応する合成ペプチドに結合したテトラメチルローダミン標識BSA(TRITC-HSA-NLS)；位相差顕微鏡像(PHASE CONTRAST)。
Ｂ．Bcl-2の存在下または非存在下、120分または160分間インキュベートされた、インタクトで輸送能力のある核の定量。
図１０．Bcl-2タンパク質は、無細胞アポトーシスアッセイにおける核分解の抑制に直接関係する。
図１１は、神経細胞におけるBcl-2タンパク質の発現は、ヘルペスウイルス誘導細胞死から神経細胞を保護することを示す。PC12神経細胞を、コントロール(NEO)またはbcl-2のいずれかを含むレトロウイルスで感染した。安定に感染した細胞を、単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)に曝し、そして生存細胞の相対数を、HSV-1への暴露後種々の時間で測定した。黒塗りシンボルは、HSV-1感染の非存在下での生存を示す；白抜きのシンボルはHSV-1感染の存在下での生存を示す。
図１２は、PC12神経細胞およびB50細胞が、bcl-2発現ベクター(BCL-2)を用いたこれらの細胞のトランスフェクション後、Bcl-2タンパク質を発現したことを示す。コントロール細胞は、ネオマイシン遺伝子のみを含むベクター(NEO)でトランスフェクトした。26キロダルトン(kDa)のBcl-2タンパク質(p26-Bcl-2)が示され、場合によっては50kDaのミトコンドリア膜タンパク質F1-β-ATPアーゼ(p50 F1β)も示される。後者はいくつかの実験では、等量のタンパク質がゲル上にロードされ、そしてニトロセルロースフィルターに移されたことを確認するために使用した。t(14;18)転座を含むリンパ腫細胞であるスコット細胞(Scott)中、およびZIP-BCL-2ウイルスで感染した白血病細胞株である、697-BCL-2細胞(697 B)中で発現したBcl-2タンパク質の移動がまた示されている。
図１３は、種々の濃度のグルタミン酸の存在下、24時間のインキュベーション後の、コントロール(黒塗りシンボル)またはBcl-2(白抜きシンボル)を発現するPC12神経細胞、IMR-5細胞およびB50細胞の生存の百分率を示す。結果の有意水準が示されている。
発明の詳細な説明
本発明は、疾患および病的状態の処置を増大するための一般的かつ有効な方法に関する。この方法は、癌、神経変性疾病、ウイルス感染、自己免疫疾患の処置に、そしてまた移植組織および細胞の改変に適用可能な方法に関する。改変された組織および細胞は、例えば、神経性疾病、および糖尿病(インスリン)および血友病(凝固因子)などのホルモンおよびタンパク質不足により引き起こされる疾患の処置において使用され得る。本明細書で記載される方法はまた、疾患および病的状態の処置および予防のための新規薬剤の開発を可能にする。加えて、本発明の方法はさらに、基礎および応用科学の本質的にすべての専門分野における使用のための優れた研究用および診断用の薬剤ならびに組成物の生産に適用可能である。本発明は、例えば、アポトーシス細胞死を起こす疾患および病変により影響される細胞においてBcl-2の活性を増大するために使用され得る薬剤、ならびに治療に対する上記細胞の感受性を増強するために悪性またはウイルス感染細胞においてBcl-2活性を減少させるために使用され得る薬剤を提供する。
本発明は、Bcl-2が、アポトーシスとして知られるプログラムされた細胞死のプロセスを妨げるためにBcl-2の活性を利用する。多くの多様な疾患に共通な生理学的メカニズムを標的にすることは、特定の疾患のそれぞれに対する異なる薬剤の特殊化した開発が必要でないという点で効率的でありそしてコスト的に有効である。代わりに、アポトーシスの異常調節により、病的状態を明らかに示す本質的にすべての疾患の処置に対する少数の処置化合物または処置方法が開発され得る。多くの場合、そのような化合物は組換え核酸であり得、その投与は遺伝子治療の形態による。従って、アポトーシスの促進または障害のいずれかを行う薬剤が本発明の方法において使用され、疾患で誘導されるアポトーシス細胞死を遅らせ、または従来の化学療法剤による腫瘍細胞殺傷を選択的に増強しならびにこれら薬剤の毒性から正常な非腫瘍性細胞を保護する。
１つの実施態様では、遺伝子導入技術または「遺伝子治療」が、Bcl-2組換えDNA分子およびウイルスベクターを作成するために使用され、アポトーシス細胞死を起こす疾患または病的状態に影響される細胞のインビボ生存を促進する。Bcl-2組換えDNA分子およびウイルスベクターがまた、移植に先だって細胞を遺伝的に改変するために使用され得、それらのインビボ生存時間を延長し、そして適用可能な場合、同時にタンパク質欠乏を正す。標的細胞を不死化しまたは標的細胞の生存率を延長するためのBcl-2の使用は、それが細胞分化をブロックせず、そしてその他の癌遺伝子に比べ、一次細胞または樹立細胞のいずれにおいて発現される場合にも非腫瘍原性である点で有利である。そのような治療の特定の実施例は、Bcl-2発現を、特定の型のニューロンに導く組換えウイルスの生産、およびそのようなウイルスをアルツハイマー病またはパーキンソン病を有する患者に、脳または脊髄液中への直接注入による投与；パーキンソン病の処置のためのBcl-2を発現する胎児ニューロン前駆体細胞の頭蓋内移植；移植後のインビボ生存を延長するためのヒトBcl-2発現細胞のインビトロ大量増殖、およびウイルス感染により誘導される細胞死の予防のための特定の細胞型にBcl-2発現を導くための組換えベクターの使用を包含する。移植における使用のためのBcl-2発現細胞は、遺伝的に改変され得、例えば、脊髄損傷の整復(setting)における好中球因子、パーキンソン病の処置のためのドーパミン、末期病状の癌患者における痛み制御のためのエンケファリン、血友病患者用の凝固因子、糖尿病患者用のインスリン産生膵島細胞などの種々のホルモンおよびペプチドを分泌する。
別の実施態様では、Bcl-2遺伝子導入技術は、ヒト抗体産生性Ｂ細胞を「不死化する」ために使用され、そしてそれによってヒトモノクローナル抗体の開発を促進する。Bcl-2の生存促進機能はまた、モノクローナル抗体産生増強用のＢ細胞の単離用にBcl-2トランスジェニックマウスを作成するために利用される。そのようなモノクローナル抗体は、診断および治療目的に有用である。
さらに別の実施態様では、忠実にアポトーシス細胞死の特徴を再現する無細胞系が記載される。この系は、アポトーシスプロセスを改変する化合物のスクリーニングに有用である。アポトーシスの促進または阻害のいずれかを行う選択された化合物は、神経変性疾患、癌およびウイルス感染細胞を含む、種々の疾患の治療的処置のために使用され得る。
Bcl-2遺伝子は、最初、ヒトにおけるリンパ腫に関係することで発見された。この遺伝子は、現在、リンパ球、造血細胞、線維芽細胞およびニューロンのような種々の細胞型において、高レベルで発現される場合、培養中の細胞生存を延長することが示されている。Bcl-2は、細胞遺伝子の中でユニークな、26キロダルトン(kDa)のタンパク質である。それは、細胞内膜中へのその翻訳後挿入を引き起こす17疎水性アミノ酸の伸長部(stretch)をそのカルボキシ末端近くに含む。遺伝子導入研究は、Bcl-2がプログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスを阻害することにより細胞生存を促進することを示した。
アポトーシスは、例えば、X線照射、細胞毒性薬剤、フリーラジカルおよび熱への暴露により、細胞において活性にトリガーされ、または、種々の組織においてプログラムされた細胞死を常に抑制する、重要なペプチド成長因子、ステロイドホルモン、リンホカインまたはニューロトロフィンの除去によりひき起こされ得る。これらプロセスの多くは、多くの疾患状態に含まれる末端事象であり、またはそれによって治療処置がそれらの結果をもたらす最終事象である。従って、特異的にアポトーシスを標的にしそして改変することは、広範な疾患および病的状態のための一般的治療を提供し得る。しかし、アポトーシスについてはBcl-2非依存性経路が存在することに注意すべきである。従って、本明細書で報告されるBcl-2の新規使用は、以前に公開されていない状況を構築し、その状況下で、Bcl-2遺伝子導入がプログラム化された細胞死に対する保護を奏することが最初に示されている。
Bcl-2は、通常、種々の型の細胞で発現されるが、特に、特定の型のニューロン、長期生存「記憶」リンパ球のような長期生存期間を示す細胞型、または基底上皮細胞および骨髄中の造血始原細胞のような増殖性の自己更新能力を有する細胞のいずれかで発現される。Bcl-2は、組織特異的な様式で発現され、そして細胞寿命の調節に寄与する構造的に類似する遺伝子の全ファミリーのプロトタイプを示すようである。
本明細書で使用される用語「アポトーシス」または「アポトーシス細胞死」とは、プログラム化された細胞死として知られる生理学的プロセスをいう。アポトーシスは、例えば、虚血または壊死の結果として起こる他の形態の細胞死とは異なる。何故なら、アポトーシスは、新たなRNAおよびタンパク質合成を代表的には必要とする、活性でかつATPを必要とする細胞死の形態であるからである。アポトーシスの顕著な特徴は、内因性のエンドヌクレアーゼの活性化であり、エンドヌクレアーゼは最初にゲノムDNAをその最も接近可能な部位、即ち、ヌクレオソーム間で切断し、ヌクレオソーム相互の距離の整数倍を示すDNAバンドの梯子(ladder)を生成する。このDNA分解は、原形質膜完全性の損失前のアポトーシスプロセスの初期に起こる。アポトーシス細胞はまた、収縮サイズを有し、そしてこのプロセスは、通常、細胞外空間中に細胞質内容物の漏れを起こさないので、炎症を伴わない。アポトーシスに伴い、細胞内容物の大部分は自己消化される。インビボ細胞溶解は決して起こらない。何故なら、アポトーシス細胞は、通常、原形質膜透過性が損失する前に、マクロファージおよび関連細胞により貪食されるからである。その結果、炎症反応または引き続く瘢痕(scarring)がない。アポトーシス細胞のその他の形態学的特徴は、核の断片化、小胞体(vesicular body)の発達、「アポトーシス体」および原形質膜泡状化を含み、すべてがインタクトなミトコンドリアおよびリソソームの環境である。天然のプログラムされた事象としてのアポトーシス細胞死の特定の例は、例えば、胎児発達中の余分のニューロンの損失、および胸腺学習(thymic education)の間の潜在的な自己反応性Ｔ細胞の破壊を含む。
本明細書で使用される用語「Bcl-2」は、リンパ腫においてその不適切な活性化に起因して当初発見されたタンパク質をいう。Bcl-2は、細胞生存を促進することにより、正常な細胞生育および分化を制御する。それは、SDS-PAGEにより測定されたとき、約26kDaの分子量を有し、そしてそのカルボキシ末端近くに、細胞内膜付着において機能する約17のアミノ酸の疎水性伸長部により特徴付けられる。
Bcl-2は、配列番号２に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、そして配列番号１として示される配列と実質的に類似のヌクレオチド配列によりコードされる。用語「Bcl-2」の定義は、上記の機能的特徴または配列相同性を示すことが見いだされたタンパク質メンバーのような、他のBcl-2ファミリーのメンバーを含む。そのようなメンバーは、例えば、ラット、マウス、ニワトリ、ハエ類(flies)および蠕虫類(Worms)のような下等生物からクローン化されたBcl-2の相同体を含む。
Bcl-2ファミリーメンバーの特定の例は、エプスタインバールウイルス中のBHRF-1遺伝子によりコードされるタンパク質である。BHRF-1遺伝子は、Bcl-2と約22%の配列同一性および約45%の配列類似性を示し、細胞生存を促進することにおいてBcl-2と機能的に等価である(例えば、図５参照)。
Bcl-2の生物学的機能を破壊することなくこのタンパク質の限定改変を行うことが可能であり、そして活性をもたらすためには完全一次構造の部分のみが要求され得ることが理解されている。例えば、Bcl-2の活性を破壊しないようなBcl-2タンパク質またはヌクレオチド配列の微少な改変は、Bcl-2の定義内に含まれる。さらに、完全タンパク質の少なくとも一つの機能を保持するBcl-2のフラグメントも本定義に含まれる。一次アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の種々の改変によって、配列番号１および２に記載の配列と比較して実質的に同等もしくは増強された機能を有するタンパク質をもたらし得ることが理解されている。これらの改変は、部位特異的突然変異などによる意図的なものであっても、またはBcl-2産生をするものである宿主の変異などによる偶発的なものであってもよい。これら改変は全て、Bcl-2の生物学的機能が保持されている限り含まれる。さらに、他のタンパク質、炭水化物、または脂質などの種々の分子をBcl-2に付加し得る。このような改変は、Bcl-2の定義内に含まれる。
本発明は、アポトーシス細胞死をもたらす疾患または病的状態を処置する方法を提供する。本方法は、疾患または病的状態による影響を受けた細胞内のBcl-2の活性を増加することを包含する。疾患または病的状態には、例えば神経変性疾患、癌、およびウイルス感染細胞が含まれ得る。
アルツハイマー病は最も多い神経変性疾患であり、400万人の米国人が発症していると推測されており、家族および社会的に及ぼす大きな経済的負担が指摘されている。どのような処置も、この疾患の進行を停止し得ず、遅延すらし得ない。アミロイドβタンパク質(ABP)は、本疾患の原因となり得る要因として同定されている。ABP、またはこのタンパク質由来の特異的ペプチドフラグメントを、培養したニューロンおよび神経細胞株に添加すると細胞死がもたらされる。遺伝子導入によるこれら培養細胞でのBcl-2の発現は、ABPによる神経細胞の殺傷を減少し得る。これらの結果は、アポトーシスがアルツハイマー病における神経細胞死に寄与することを示す。
パーキンソン病は、黒質の着色ドーパミン作用性ニューロンの喪失によって特徴付けられる、進行性および最終的に致死性の神経変性疾患である。パーキンソン病の徴候は、しばしばドーパミンの中間前駆体であるL-DOPAの投与によって、初め処置され得る。しかし、おそらく本薬物の代謝によりCNSへの有効送達が妨げられることから、しばしばL-DOPA処置の効果減退が起こる。ニューロン由来の神経栄養因子の撤回によりアポトーシスに一致する機構による細胞死がもたらされることから、プログラムされた細胞死はまた、この神経変性疾患に重要な役割を果すことが示唆されている。さらに、パーキンソン病患者の脳内に炎症細胞または瘢痕形成が認められないことから、線条体ニューロンの死は、例えば、壊死と相対するアポトーシスにより発生し得ることが示される。
神経変性疾患に加えて、アポトーシスは、脳卒中および筋萎縮性側索硬化症(ALS；"ロウ ゲーリッヒ病")などの状態から発生するグルタミン酸誘導性神経毒性より細胞死をもたらすことが示されている。グルタミン酸誘導性毒性は、急性損傷時の脳内の瀕死のニューロンから、グルタミン酸が放出される時に生じる。瀕死のニューロンより放出されたグルタミン酸は順次、周辺の正常ニューロン上のグルタミン酸に対する特異性レセプターに結合し、アポトーシス細胞死をもたらす複雑な一連の生化学的現象を起こすシグナルを引き起こす。
上記および下記の疾患および病的状態などの疾患および病的状態は、この疾患および病的状態による影響を受けた細胞内のBcl-2の活性を増加させることにより処置され得る。これらの影響を受けた細胞内のBcl-2活性を増加すると、これら細胞のアポトーシス性の死を阻害し、従って、疾患または病的状態の進行を減少もしくは妨害する。
Bcl-2の活性は、例えばBcl-2合成速度の増加、またはBcl-2分解速度の減少、またはアポトーシスプロセスを制御するその他のタンパク質に相互作用するBcl-2の能力を調節することを含む種々の手段によって増加し得る。Bcl-2の合成速度を増加すると、タンパク質蓄積の上昇がもたらされ、およびそれによって細胞内のBcl-2活性が増加する。
合成速度の上昇は、例えば、Bcl-2をコードする核酸を発現するために組換え発現ベクターおよび遺伝子導入技術を用いることによって達成され得る。このような方法は当該分野では周知であり、組換えウイルスベクターに関しては下記に記載されている。適切な標的細胞と適合性である他のベクターでも同目的を達成し得、従って本明細書中に記載の方法での組換えウイルスベクターに対して代用し得る。例えば、全身性または組織特異性プロモーターを有する組換えアデノウイルスを使用して、Bcl-2 cDNAを発現させ、Bcl-2発現構築物を、脳の黒質(パーキンソン病の影響を受けた領域)中のニューロンなどの非分裂細胞を含む種々のタイプの組織および細胞中に分配し得る(La Salleら、Science 259: 988-990 (1993)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)。
あるいは、組換えアデノ関連ウイルスが本目的に使用され得、組換えウイルスが、中枢および末梢神経系のニューロンなどの一様に静止期の非増殖細胞のクロマチン内に安定に組み込まれ得るという利点をさらに伴う(Lebkowskiら、Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)。レセプター介在DNA送達のアプローチも、架橋分子によるDNAとの非共有結合で複合体化した組織特異性のリガンドまたは抗体を用いて、組織特異的方法で、Bcl-2発現プラスミドを細胞中に送達するために使用され得る(Curielら、Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); WuおよびWu、J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)、両者とも本明細書中に参考として援用されている)。DNA(種々のタイプの哺乳動物発現プラスミド)または陽イオンリポソーム内に封入したDNAの直接注入もまた、非分裂細胞および分裂細胞へのインビボの安定な遺伝子導入のために使用され得る(Ulmerら、Science 259:1745-1748 (1993)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)。さらに、粒子ボンバー法(particle bombardment method)によるDNA導入が、DNAを種々の組織中に導入するために使用され得る(Williamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)。
さらに、Bcl-2をコードする組換え発現ベクターはまた、疾患または病的状態の治療処置に有用な、付加的な非Bcl-2をコードする核酸を含有し得る。例えば、Bcl-2をコードするベクターは、パーキンソン病処置時に、例えば細胞生存の増強(Bcl-2)および細胞機能の増強(ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ)のために遺伝子を同時に提供するという考案により、ドーパミン合成中に使用される酵素をコードするように構築され得る。その他の例としては、Bcl-2と、アルツハイマー病で一般に失われるコリン作用性ニューロンの生存を保持するための神経成長因子の分泌を促すように操作した組換えDNA配列との併用(Rosenbergら、Science 242:1575-1578 (1988)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)、Bcl-2と、糖尿病処置のためのインシュリンとの併用、またはBcl-2と、難治性疼痛の処置のためのエンケファリンとの併用がある。その他の非Bcl-2をコードする核酸もまたベクター内に含まれるかどうかについては、疾患および治療の必要性に依存する。当業者は、このような必要性を決定し得る。
ウイルスは特殊化された感染性因子であって、多くの場合宿主の防御メカニズムを逃れるように進化している。一般にウイルスは、特異性細胞タイプにおいて感染し、そして増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、この本来の特異性を利用して、順次予め決定された細胞タイプを特異的に標的とし、そしてこれによってウイルスゲノム内に操作された組換え遺伝子を感染細胞に導入する。本発明の方法で使用するベクターは、標的となる望ましい細胞タイプに依存する。例えば、神経変性疾患を、本疾患により影響を受けた神経細胞のBcl-2活性を増加させることにより処置しようとする場合、神経細胞系統の細胞に特異的なベクターが使用され得る。このようなウイルスベクターには、例えば単純ヘルペスウイルスベースのベクター(Battlemanら、J. Neurosci. 13:941-951 (1993)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)が含まれる。同様に、造血系の疾患または病的状態を処置しようとする場合、血液細胞およびその前駆体、好ましくは特異的タイプの造血細胞に対して特異的なウイルスベクターを使用すべきである。このようなウイルスベクターには、例えばHIVベースのベクター(Carrollら、J. Cell. Biochem. 17E:241 (1993)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)が含まれる。
さらに、このようなベクターは、レセプター仲介事象によって標的特異性を改変または変化させるように、特定のレセプターまたはリガンドでさらに改変され得る。これらの改変手順は、例えば、組換えDNA技術または合成化学手順を用いて実施され得る。ウイルスベクターおよびそれらの特異性の特定の例としては、例えば、神経細胞系統に対して単純ヘルペスウイルス、Ｔリンパ球に対してHIV、肝細胞に対して肝炎ウイルス、および肺組織および他の組織に対してアデノウイルスが挙げられる。ウイルス感染が組織特異性となり得ない場合には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーの使用により所望のタイプの細胞のみに特異的なウイルス遺伝子を発現させることが可能であり得る(Daiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895 (1992)、この内容は本明細書中に参考として援用されている)。
インビボ標的および治療手順に通常用いられるウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはDNAベースのベクター(DNA-based vector)である。レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するかまたは感染の最初の１ラウンドのみを受けるように構築され得る。前者の場合、ウイルスのゲノムは、新規なウイルスタンパク質およびRNAを合成するために必要な遺伝子、調節配列、およびパッケージングシグナルすべてを維持するように改変される。しかし、これらのウイルスの癌性形質転換特性は破壊される。一旦ウイルスタンパク質が合成されると、宿主細胞はRNAを、さらなる感染ラウンドを受け得る新規なウイルス粒子中にパッケージングする。ウイルスゲノムはまた所望の組換え遺伝子をコードしそして発現するように遺伝子工学的に操作される。
非感染性ウイルスベクターの場合、ヘルパーウイルスゲノムは通常、RNAをウイルス粒子中に包膜するのに必要であるウイルスパッケージングシグナルを破壊するように変異されるが、所望の１つまたは複数の遺伝子を含有する共導入(co-introduced)組換えウイルスをパッケージングするのに必要な構造遺伝子を保持する。このようなシグナルがなければ、形成される粒子はいずれもゲノムを含有せず、従って続く感染ラウンドを通じて進行し得ない。
このようなウイルスベクターを構築および使用する方法は、当該分野で公知であり、そして、例えばMillerおよびRosman, Biotechniques 7:980-990 (1992)(この内容は本明細書中に参考として援用されている)に概評されている。ベクターの特定のタイプは意図される目的に依存する。実際のベクターはまた、当該分野内で公知でありそして容易に入手可能であるか、または当業者により構築され得る。
Bcl-2をコードするウイルスベクターは、発現を得るためにいくつかの経路で投与され得、従って疾患または病的状態による影響を受けた細胞においてBcl-2の活性を増大させ得る。例えばウイルスベクターが用いられる場合、この手順はそれらの標的特異性を利用し得、そしてこのベクターは疾患部位に局所的に投与されなくてもよい。しかし、局所投与は、より迅速でより有効な処置を提供し得る。投与はまた、被験体への静脈内注射または皮下注射により行われ得る。脊椎液へのウイルスベクターの注入もまた、特に神経変性疾患の場合における投与の形態として用いら得る。注入後、ウイルスベクターは、それらが感染に対して適切な標的特異性で宿主細胞を認識するまで循環する。
Bcl-2をコードするベクターの投与の別の形態は、直接接種により疾患または病的状態の部位に局所的に行われ得る。希釈効果がなく、従って大部分の標的細胞においてBcl-2発現を達成するためにより少量の用量しか必要としないので、局所投与が有利である。さらに、接種領域において全ての細胞に感染するベクターが用いられ得るので、局所接種は、他の投与形態で必要とされる標的要求性(targeting requirement)を軽減する。発現が接種領域内の特定のサブセットの細胞のみにおいて望ましい場合、所望のサブセットに特異的なプロモーターおよび発現エレメントがこの目標を達成するために用いられ得る。このような非標的ベクターは、例えば、ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミドなどであり得る。リポソームのようなトランスフェクション媒体(vehicle)が、上記の非ウイルスベクターを接種領域内のレシピエント細胞に導入するために用いられ得る。このようなトランスフェクション媒体は、当業者に公知である。
本発明の方法で用いられるBcl-2をコードする核酸は当該分野で公知であり、そして配列番号１として記載される。このBcl-2ヌクレオチド配列はまた、遺伝子座同定(locus identification)「HUMBCL2A」下で受託番号M13994としてGenbankから入手可能である。本明細書に記載されるヌクレオチド配列(配列番号１)または上記データベースから入手可能なヌクレオチド配列が、当業者が開示された方法で用いるためのBcl-2 cDNAを得るのに必要な配列の全てである。さらに、Bcl-2 cDNAがTsujimotoおよびCroce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5214-5218 (1986)(この内容は本明細書中に参考として援用されている)において公開されているので、これもまた当業者に容易に入手可能である。
本明細書中に記載のBcl-2配列(配列番号１)を用いて、当業者は、従来のライブラリースクリーニング法を用いてBcl-2をクローニングし得る。スクリーニングに有用なオリゴヌクレオチドプローブは、ホスホルアミダイト化学法のような当該分野において公知の方法を用いて合成され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような他の方法もまた、Bcl-2をコードする核酸を迅速および効率的にクローニングするのに用いられ得る。PCRを用いて、約6,000塩基対長までのDNAセグメントが１個の遺伝子コピーから増幅され得る。
簡単に説明すると、PCRは、変性DNA試料を、相補鎖のDNAポリメラーゼ依存性合成に導く２つのオリゴヌクレオチドプライマーとインキュベートすることを包含する。複数サイクルの合成が行われ、ここでは各サイクルにより標的配列の量が約２倍になる。各サイクルは、DNA鎖の変性、プライマーのアニーリング、および新規DNA鎖の合成が可能になる温度を変化させることにより制御され得る。熱安定性DNAポリメラーゼを用いることにより、各サイクルごとに新たな酵素を添加する必要がなくなり、そして完全に自動化されたDNA増幅が可能になる。25回の増幅サイクルにより標的配列の量が約106倍に増加する。PCR技術は、米国特許第4,683,195号、第4,800,159号、第4,754,065号、および第4,683,202号の主題である(これらの内容は、本明細書中に参考として援用されている)。
本発明はまた、Bcl-2活性を増大させることによる、アポトーシス細胞死を生じる疾患または病的状態を処置する方法を提供する。ここでこの疾患または病的状態はウイルス感染により媒介される。神経性疾患および病的状態の処置に対する上記方法はまた、種々の他の疾患状態(例えば、ウイルス感染細胞)にも適用され得る。多くのウイルス感染(例えばHIV)はアポトーシスによる細胞死に達する。
アポトーシスは、ウイルス感染細胞においてBcl-2をコードする核酸またはそれらの機能的等価物を発現させることにより、妨害または遅延され得る(例えば、図３を参照のこと)。Bcl-2レベルの上昇は、感染ウイルスにより誘導されるプログラムされた細胞死を阻害し、そして感染細胞の生存延長を生じる。感染細胞を適切に標的するBcl-2含有ウイルスベクターが、感染細胞においてBcl-2活性を特異的に導入し、そして増大させるのに用いられ得る。このようなベクターはまた、ウイルス感染細胞を処置するために有用である非Bcl-2をコードする核酸を含み得る。
本発明は、疾患または病的状態の処置のための移植細胞のインビボ生存を延長する方法を提供する。この方法は、細胞集団においてBcl-2の活性を増大させる工程、および増大したBcl-2活性を有する細胞集団を被験体に移植する工程を包含する。疾患または病的状態は、例えば、神経変性疾患、癌、およびウイルス感染細胞を包含し得る。
例えば、遺伝的に改変された、タンパク質、ホルモン、または神経伝達物質を分泌する細胞の移植が、上記疾患、ならびに多くの慢性、代謝性、および遺伝子の疾患(例えば糖尿病および血友病)を処置するのに用いられ得る。本明細書中に記載の方法を利用することにより、このような疾患細胞のインビボ生存が、Bcl-2遺伝子導入により改善され得る。Bcl-2を用いて細胞が処置する利点は、Bcl-2はほとんどの細胞において発癌性でなく、従ってインビボでの正常な生育制御メカニズムに応答性である細胞を「不死化」するのに用いられ得る。
細胞移植は、現在、特定の疾患、とりわけパーキンソン病、の処置について調べられている。例えば、パーキンソン病の動物モデルにおける可能な治療法は、遺伝的に改変された線維芽細胞の細胞移植を包含する。これにより、L-DOPAが黒質付近で産生される。これらの実験の結果は勇気づけられるもの(encouraging)であるが、移植細胞の生存時間は限定され、従って状態の一時的で、かつわずかな改善を生じるのみである。
ドーパミン性ニューロンの前駆体を含む胎児脳細胞の移植もまた、パーキンソン病の可能な処置として試験されている。この疾患の動物モデルおよび患者において、胎児脳細胞移植は、運動異常の一時的低減を生じる。さらに、移植された胎児ドーパミン性ニューロンが周囲の宿主ニューロンとシナプスを形成するようである。しかし、胎児脳細胞の移植は、例えば、移植ニューロン前駆体の限定される生存時間のために再度限定される。
パーキンソン病の特定の場合において、Bcl-2の活性の増大による介入は、胎児および成熟ドーパミン性ニューロン、それらの前駆体、およびドーパミン分泌線維芽細胞のインビトロおよびインビボ生存を改善し得、従ってこの疾患のより有効な処置を提供し得る。同様に、本質的にはいずれの移植される細胞型のインビボ生存改善は、この疾患の処置を改善する。例えば、神経細胞またはそれらの前駆体は、Bcl-2を用いて細胞のインビボ生存を増強することによる、他の神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病およびグルタミン酸誘導神経細胞死)の処置のために用いられ得る。
神経細胞以外の細胞型の特定の例は、肝不全の処置のための肝細胞、インスリン依存性糖尿病の処置のためのβ細胞、および火傷の処置のための皮膚細胞を包含する。さらに、Bcl-2発現は、美容処置のために移植細胞の生存を増強するのに用いられ得る。このような美容目的の１つの例は、脱毛(禿頭症の医学用語)の処置である。さらに、ウイルスベクターは、毛嚢の細胞にBcl-2発現を標的する方法を使用して用いられ得るか、またはBcl-2導入媒体が頭皮に局部的に適用され得て、脱毛に対する新規な遺伝的処置を生じる。
特定の疾患の処置のために移植される細胞は、Bcl-2の活性を増大させるようにインビトロで遺伝的に改変され得る。このような方法は、当該分野において公知であり、そしてBcl-2発現が最初にインビトロで達成されることを除いて上記と本質的に同じである。Bcl-2発現ベクターは、組換えDNA技術を用いて構築され得、そして例えば、ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミドなどを利用し得る(例えば、図１を参照のこと)。このようなベクターはまた、１つまたはそれ以上の非Bcl-2ヌクレオチド配列をコードし得、移植されると細胞の治療的機能を促進する。
Bcl-2をコードするベクターは、当業者に公知のトランスフェクション法を用いてレシピエント細胞に導入される。このような方法は、例えば、ウイルスベクターを用いる感染、リポフェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバー、およびトランスフェクションを包含する。これらの方法の詳細な手順は、Sambrookら, Molecular Colning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)および本明細書中に引用された文献(これらの内容は、本明細書中に参考として援用されている)中に見出され得る。
トランスフェクション後、増加したレベルのBcl-2活性を有する細胞が、移植処置における使用のために選択される。スクリーニング手順は、Bcl-2活性が増大する方法に依存する。例えば、活性増大がBcl-2タンパク質レベルの上昇により達成される場合、蓄積されたBcl-2タンパク質レベルを測定する定量アッセイが用いられ得る。このようなアッセイは、例えば、イムノブロット分析、免疫沈降、およびELISAを包含する。このような方法は、当業者に公知であり、そしてAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1989)またはHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)に見出される。これらは両者とも、本明細書中に参考として援用されている。本明細書中に記載され、あるいは当該分野で公知であるようなアポトーシスDNA分解または核崩壊の阻害のような機能的アッセイもまた、利用され得る(実施例VIIを参照のこと)。
移植細胞のインビボ生存の延長のためのBcl-2の使用と同様に、続く移植のための培養における哺乳動物細胞の増殖、あるいはタンパク質、代謝産物、または他の臨床的に有用な因子の工業的規模の生産のための細胞の増殖は、Bcl-2による生存増強により有益になり得る。これらのタイプの手順を悩ます限定には、多くの細胞型が固体表面への接着に依存していることがある。さらに、多くの型の細胞は、それらが必要とする成長因子が不足する場合または毒性副産物が高密度で生育した細胞の培養物中に蓄積する場合、アポトーシスにより死に至る。このような問題は、培養細胞内のBcl-2のレベルを増大させることにより克服され得る。
例えば、Bcl-2のレベルの増大により、足場依存性細胞が固体表面に付着せずに生存および生育し得る。Bcl-2過剰発現もまた、低レベルまたは正常レベルのBcl-2を発現する細胞に比較して、細胞をより高い密度で生育させ得る。さらに、新規な形態のBcl-2タンパク質であるBcl2/P59Sは、高密度生育を可能とし、そして組織培養培地における成長および生存因子の枯渇により細胞死を防ぐことにおいて、野生型タンパク質より実質的に活性である(図２)。Bcl-2のこれらの全ての特性は、培養における細胞の大量増殖のために利用され得る。
本発明はまた、免疫細胞のBcl-2活性を増大させることによる、疾患または病的状態の処置のために、移植細胞のインビボ生存を延長させる方法を提供する。免疫系は、感染性生物体から身体を防御し、そして癌細胞のような異常細胞の出現に対して身体を継続的にモニターする種々の細胞型からなる。いくつかの免疫細胞は、他の細胞型、特に腫瘍細胞およびウイルス感染細胞に結合し、そして殺傷する能力を有する。キラー細胞応答の１つの結果は、標的細胞の死の他に、キラー細胞それ自身でのアポトーシスの活性化である。この自己誘導自殺の生理学的役割は、免疫応答を制御するためのネガティブフィードバックメカニズムであり得る。しかし、この免疫細胞の死の調節メカニズムは、免疫応答が悪性細胞またはウイルス感染細胞を有効に除去するのに充分な期間および強度を有することを妨害する。腫瘍特異的およびウイルス特異的免疫細胞もまた、インビボで充分な量の成長因子(例えば、インターロイキン−２(Il-2))を欠くために死滅し得る。このプロセスは、Bcl-2遺伝子導入により阻止または妨害され得る。従って、Bcl-2発現の増大による免疫細胞の生存増大は、癌およびウイルス感染症のより有効な処置となり得る。
免疫細胞のアポトーシス死は、これらの細胞またはその前駆体を単離し、そして上昇レベルのBcl-2を発現させるようにそれらを改変することにより阻害され得る。これらの細胞を改変する方法は、本質的に上記のような方法である。Bcl-2発現細胞を癌またはウイルス感染症を有する疑いのある被験体に移植することにより、その状態に対する、より長く活性な免疫応答が確実になる。体外処置の代替として、組織特異的な遺伝子導入および発現の技術が、インビボでのキラー細胞におけるBcl-2遺伝子発現を特異的に増大させるのに用いられ得る。
Bcl-2の細胞生存機能を増大するか、または免疫細胞のキラー活性を増強する他の非Bcl-2遺伝子は、Bcl-2と組み合わせて細胞に導入され得る。免疫細胞のエフェクター活性を増強する第２の遺伝子を導入する特定の例は、Lckタンパク質チロシンキナーゼの共発現である。例えば、アミノ酸505位の調節チロシン残基をフェニルアラニン(Y505F)に変異させることにより構成的に過剰発現させると、Lckは、IL-2の非存在下でＴ細胞エフェクター機能をY505F発現細胞に付与する。IL-2要求性を除くことが臨床的に有利である。なぜならIL-2のような免疫刺激剤での処置による副作用が回避され得るからである。Lck以外のタンパク質をコードする核酸が、免疫細胞のエフェクター機能を増強するように共発現され得る。このような核酸は、例えば、Lyn、Hck、Fyn、Yes、Atk、Fgr、およびBlkを包含する。
Raf-1はセリン−トレオニンタンパク質キナーゼをコードするが、これは、Bcl-2の作用を増強するために、Bcl-2と共に投与され得る非Bcl-2遺伝子の例である(例えば実施例Ｖおよび図６を参照のこと)。構成性非誘導性キナーゼ活性を有するRaf-1キナーゼの変異型をコードするDNA配列での細胞の感染は、アポトーシス細胞死をブロックすることにより、細胞生存を延長するBcl-2と相乗的に作用する(例えば図６.Ａを参照のこと)。従って、Bcl-2の機能を増大させるか、または他の所望の機能を増強する非Bcl-2遺伝子の共発現は、ウイルス感染および悪性細胞生育を防止するかまたは制限する手段を提供する。
本発明はまた、悪性またはウイルス感染細胞におけるBcl-2の活性を低下させることによる、悪性またはウイルス感染細胞の治療に対する感受性を増強するための方法を提供する。活性低下は、Bcl-2またはBcl-2と相互作用する他のタンパク質と結合複合体を形成し得(ここで結合Bcl-2は不活性である)、従って、Bcl-2の正常機能を阻害し得る、別の形態のBcl-2を発現させることにより達成され得る。
多くのタイプの悪性細胞が、高い内因性レベルのBcl-2のために処置に対して耐性または抗療性となる。これらの高レベルのBcl-2を有する悪性細胞は、前立腺癌、結腸直腸癌、および鼻咽頭癌、ならびにリンパ腫、白血病、および神経芽腫を包含する。同様に、ウイルス感染細胞は、内因性のBcl-2発現のために本来耐性であり得る。Bcl-2活性を増大させるための既に記載した方法とは対照的に、このような疾患は、反対のアプローチ(すなわちBcl-2活性の阻害)を利用することにより、有効に処置され得る。Bcl-2機能の抑制は、単独または従来の治療法と組み合わせて用いられて、化学療法薬および放射線照射による殺傷することに対する悪性またはウイルス感染細胞の耐性を低下させる、より有効な手段を提供し得る。
Bcl-2発現は、例えば、別の形態のBcl-2タンパク質であるBcl-2βを産生する標的および／または発現ベクターにより、阻害され得る。正常Bcl-2遺伝子と共に発現されると、Bcl-2βは、Bcl-2が通常相互作用する細胞性タンパク質に結合し、そして、おそらく競合メカニズムによりBcl-2機能を妨害する。変異形態の遺伝子産物の共発現により野生型機能を阻害することは、優性ネガティブ変異として当該分野で公知である(図７；Kolchら, Nature 349:426-428 (1991)もまた参照のこと。この内容は、本明細書中に参考として援用されている)。
Bcl-2βは、代替スプライシングメカニズムにより生じ、正常Bcl-2タンパク質で見出されるアミノ酸の疎水性伸長部が欠失している。この疎水性領域は、Bcl-2の膜挿入およびアポトーシスのブロッカーとしての機能に必要である。異変Bcl-2の他の例は、239アミノ酸のBcl-2タンパク質の85位から219位のアミノ酸領域内に欠失を含むように遺伝子工学的に操作されたタンパク質である。Bcl-2機能が優性ネガティブ変異により顕著に低下させられた悪性細胞では、広範な化学療法薬(例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、Ara-C、およびデキサメタゾン)により殺傷することに対する感受性の増強が観察され得る。
悪性またはウイルス感染細胞の治療に対する感受性を増強するためにBcl-2活性を阻害することに加え、疾患状態の進行に関わる他の非Bcl-2遺伝子産物が阻害されて、処置有効性を増大させ得る。例えば、高レベルのRaf-1キナーゼ活性は腫瘍の放射線耐性と関連している。Raf-1キナーゼ活性の増大または低下を生じる遺伝子導入操作により、腫瘍細胞の化学療法薬による殺傷に対する感受性をそれぞれ増大または低下させ得る。さらに、増大したBcl-2活性の存在下でのRaf-1活性の上昇は、Raf-1およびBcl-2と干渉するように設計された試薬の組み合わせ使用が、腫瘍細胞を従来の化学療法薬および放射線照射に対してより感受性にするように相乗的に作用し得ることを示す(実施例Ｖを参照のこと)。
遺伝子治療および遺伝子導入のアプローチに対する代替として、Bcl-2の活性を変化させる化学化合物が用いられ得る。これらの適用に対して、疾患または病的状態の処置についての上記と同じ理論的解釈が適用され得るが、但し、Bcl-2活性を変化させる特異的化合物が、組換え法の代わりに置き換えられるという点を除く。従って、Bcl-2遺伝子導入を用いる上述の全ての療法は、Bcl-2特異的化合物の使用に対して等しく適用可能である。
新規なBcl-2特異的化合物が、例えば、示性設計または無作為薬剤スクリーニング法により得られ得る。必要とされるのは、活性化合物を正確に同定する方法のみである。活性化合物は、Bcl-2活性を増大させる化合物およびその活性を低下させる化合物の両方を包含する。従って、活性の測定法は、所望の結果に依存する。
本発明は、アポトーシスのプロセスを変化させる化合物を同定する方法を提供する(実施例VIIを参照のこと)。この方法は、アポトーシス細胞の抽出物を１つまたはそれ以上の化合物で処置する工程、およびこの細胞抽出物中においてアポトーシスプロセスを変化させる化合物を選択する工程を包含する。従って、この方法により、活性なBcl-2特異的化合物の同定が可能になる。この方法は、アポトーシスプロセスを忠実に再現する無細胞抽出物からなる。簡単に説明すると、アフリカツメガエル卵抽出物を、精子クロマチンと混合し、このクロマチンを核膜に囲まれた核に集合させる。これらの無細胞核は、経時的に自発的にまたは特定の薬剤の存在下で誘導的に変性を受ける。核変性プロセスは、アポトーシスによる細胞死において生じるプロセスを暗示する。Bcl-2タンパク質を抽出物に添加することにより、核破壊が妨害される(例えば、図９を参照のこと)。活性なBcl-2特異的化合物は、無細胞抽出物中でBcl-2に代えてこの化合物を置換することにより同定され得る。無細胞抽出物法の利点は、それが、例えば、放射性標識または蛍光標識ペプチドの核への輸送をモニターすることにより自動化され得ることである；この輸送プロセスは、核破壊により妨害され得る。
本発明はまた、ハイブリドーマ前駆細胞においてBcl-2の活性を増大させることにより、この前駆細胞のインビトロ生存を延長させることによるモノクローナル抗体産生を増強する方法を提供する。上記方法と同様に、Bcl-2は、例えば、抗体産生細胞の生存を増強し得る。このような生存増強は、より多数の融合に成功した物の生成を可能にすることにより、モノクローナル抗体産生の効率を増大させる。
ミエローマ融合パートナーおよび抗体産生Ｂ細胞のような前駆ハイブリドーマ細胞は、本明細書中に記載の方法を用いて、Bcl-2の発現を高めるように改変され得る。Bcl-2発現ベクターは、開示された方法を用いて、インビトロでミエローマ細胞に導入され得る。抗体産生Ｂ細胞は免疫動物から単離されるので、これらの細胞においてBcl-2発現を増大させることは、Bcl-2をコードする導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物を免疫することにより達成され得る。このような免疫動物の脾臓から採取したＢ細胞は、正常動物由来のＢ細胞に比較して増強された生存特徴を有する。さらに、ヒトbcl-2遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を用いて調製されたハイブリドーマは、正常マウスから得られたＢ細胞より高い頻度で抗原ポジティブクローンを産生し、それにより、所望のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株を得る可能性を増大させた。従って、本発明はまた、導入遺伝子としてBcl-2を発現するトランスジェニックマウスを提供する。このようなマウスのＢリンパ球は、より効率的なモノクローナル抗体産生を得るために有用である。さらに、Bcl-2活性の増大はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトＢ細胞を不死化するのに用いられ得る。
以下の実施例は、本発明を説明することを意図されており、限定することを意図しない。
実施例Ｉ
この実施例は、Bcl-2の発現によって培地中で生存32D-3細胞の数を増加させ、そして細胞が、この細胞株が通常観察されるよりも長く生存できるようにすることを示す。
32D-3細胞を、G418抗生物質耐性遺伝子と野性型または変異型のいずれかのヒトBcl-2DNA配列とを含有する発現プラスミドによって安定にトランスフェクトした。変異Bcl-2配列は、アミノ酸位置59のプロリンがセリンに置換された変異Bcl-2タンパク質(BCL2/P59S)をコードする。このアミノ酸置換の結果、高レベルのBCL2/P59Sが構成的に発現される。
細胞をG418耐性で選択した後、細胞をプレートし、そしてこれらの生存率を測定した。図２Ａに示すように、コントロール細胞(Neo)の生存数は、約４日〜５日で最大に達し、それから減少した。野性型Bcl-2タンパク質(W.T.)を発現する生存細胞の数もまた、約４日〜５日で最大に達したが、生存細胞の数は試験期間中減少しなかった。対照的に、変異Bcl-2タンパク質(P59S)を発現する生存細胞の数は、６日間増加しコントロール細胞および野性型Bcl-2タンパク質を発現する細胞の約２倍のレベルまで達した。図２Ｂに示すように、生存細胞の数は、種々の集団の細胞におけるDNA合成のレベルと相互に関連がある。
これらの結果は、Bcl-2が培地中で生存細胞の数を増加させ、そして細胞が通常の期間より長く生存できるようにすることを示す。
実施例II
この実施例は、前立腺癌細胞のシンドビスウイルス誘発死およびニューロンPC12細胞のヘルペスウイルス誘発死の防止におけるBcl-2の効果を説明する。
ラット前立腺癌細胞株、AT-3を、pZIP-BCL2またはpZIP-NEO(図１参照)によって感染し、次いでシンドビスウイルスの存在下または非存在下で生育させた。シンドビスウイルスの添加後の様々な時間で、細胞を回収し、そして細胞の生存率をトリパンブルー排除を用いて測定した。
図３に示すように、シンドビスウイルス感染によって、３日以内に実質的に全てのAT-3細胞が死ぬ(黒塗り丸)。対照的に、Bcl-2を発現したAT-3細胞は、シンドビスウイルス誘発死から守られ(黒塗り四角)、まるでシンドビスウイルスが存在しなかったように生存した(コントロールと比較、白抜き丸)。これらの結果は、Bcl-2発現がウイルス感染による死から細胞を保護することを示す。
Bcl-2発現はまた、ヘルペスウイルスに曝した後のPC12細胞を死から保護する。PC12細胞を、pZIP-BCL2またはpZIP-NEOで感染し、次いで単純ヘルペスウイルス(HSV-1)に曝した。HSV-1に曝した後、様々な時間で、細胞を回収し、そして細胞の生存率を上記のように測定した。図11に示すように、PC12細胞の生存率は、HSV-1に曝してから５日後、コントロール細胞の生存率の約15％に減少した。対照的に、Bcl-2を発現するPC12細胞は、HSV-1誘発による細胞死から保護され、そしてNeoまたはBcl-2を発現したが、HSV-1に曝されなかったコントロールPC12細胞と実質的に同様に生育した。
実施例III
この実施例は、培養PC12神経細胞におけるグルタミン酸誘発アポトーシスの阻害に対するBcl-2の効果を説明する。
おそらく、ALSを含む神経細胞の生存が危なくなるような脳卒中、および他の症状の間に、脳中の瀕死のニューロンからグルタミン酸が遊離される。ニューロンは、細胞表面グルタミン酸レセプターを含む。このグルタミン酸レセプターは、アポトーシス細胞死に導くには十分に特徴付けられていないシグナルを伝達すると思われる。インビトロの研究によって、グルタミン酸処理の結果、培養皮質ニューロンおよびPC12細胞の死が起こり得ることを示した。誘発されたグルタミン酸誘発細胞死は、アポトーシスから生じるヌクレオソーム間DNA分解(internucleosomal DNA degradation)および超微細構造変化に付随して起こる。Bcl-2発現は、神経細胞をグルタミン酸誘発細胞死から保護する。
ラット褐色細胞腫細胞株、PC12を、pZIP-BCL-2またはpZIP-NEO(図１参照)によって安定にトランスフェクトし、次いで30mMグルタミン酸で24時間処理した。処理後、細胞生存率を、Tadaら、J. Immunol. Meth. 93:157-165(1986)に記載されているように、MTT染色還元アッセイによって評価した。図４に示されるように、Bcl-2発現はPC12細胞をグルタミン酸誘発死から保護した。
さらに、PC12神経細胞、B50細胞(Behlら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 186:944-950(1992)、これは、本明細書に文献として援用する)およびIMR-5細胞を、pZIP-BCL-2またはpZIP-NEO(Hanadaら、Canc. Res. 53:4978-4986(1993);Behlら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 197:949-956(1993)、それぞれ本明細書に文献として援用する)のいずれかで感染した。イムノブロッティングによって、PC12およびB50細胞のBcl-2の発現について調べた。簡単に述べると、細胞溶解産物を、細胞から調製し、そしてBcl-2タンパク質の相対レベルを評価する前に、総タンパク質含有量を標準化した。ヒトBcl-2タンパク質のアミノ酸残基41〜54に対応する合成ペプチドに対してウサギ抗Bcl-2抗血清を作成した(Reedら、Canc. Res. 51:6529-6538(1991)、本明細書に文献として援用する)。
25μgまたは50μgのタンパク質／レーンを、12％ゲル中のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分画し、次いで標準的な方法(例えば、HarlowおよびLane、上記、1988、参照)を用いてニトロセルロースフィルターに移した。ヒトBcl-2タンパク質を、Krajewskiら、Cancer. Res. Canc. Res. 53:4701-4714(1993)(本明細書に文献として援用する)に記載されているように、抗Bcl-2抗血清と、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびジアミノベンゼンを用いるアビジン−ビオチン試薬とを用いて検出した。いくつかの実験において、ミトコンドリア内膜タンパク質、p50-F1-b-ATPアーゼの量を、等量のタンパク質をゲルにかけたことを確認するために測定した(Tanakaら、J. Biol. Chem. 268:10920-10926(1991)参照、本明細書に文献として援用する)。
図12に示されるように、pZIP-NEO(「NEO」)ではなく、pZIP-BCL-2「(BCL-2)」で感染したPC12またはB50細胞でBcl-2タンパク質を発現した。感染したPC12細胞およびB50細胞でのBcl-2発現を比較した結果は、Scott細胞(このScott細胞はリンパ腫細胞でありt(14;18)転移を含む)および697-BCL-2細胞(この697-BCL-2細胞は、ZIP-BCL-2ウイルスで感染された白血性細胞株である)におけるBcl-2発現に匹敵した(MiyashitaおよびReed、Blood 81:151-157(1993)、本明細書に文献として援用する)。
pZIP-BCL-2またはpZIP-NEO感染PC12細胞、B50細胞またはIMR-5細胞を、種々の濃度のグルタミン酸に曝した。5000細胞を、96ウェルプレート中の100μl培地で培養した。次の日、グルタミン酸を100μl培地に添加した。細胞をさらに24時間インキュベートし、次いで回収し、そして細胞生存率をMTTアッセイを用いて評価した。図13に示されるように、生存細胞の相対数の濃度依存性減少が、３つの異なる神経細胞株の各々に起こった。コントロール細胞に対比して、Bcl-2発現細胞は、グルタミン酸による殺傷に対して明らかにより耐性がある。
生存細胞の百分率もまた、20％のパンクレアチンを用いて培地から細胞を回収し得るが、これは細胞をヨウ化プロピジウムを含有する培地に再懸濁し、そして蛍光顕微鏡によりまたは蛍光活性化細胞を選別して測定することによって生存細胞の百分率を比較し得る。細胞のサンプルを固定し、そして電子顕微鏡分析のために包埋して、アポトーシスを示すような超微細構造変化が起こるかどうかを決定する。
DNAの断片化を、定性的ゲル電気泳動アッセイによっておよび定量的生化学方法によって評価する。定性的DNA断片化アッセイを、Sorensonら、J. Natl. Canc. Inst. 82:749(1990)に記載されているゲル電気泳動アッセイを用いて行う。さらに、定量的DNA断片化アッセイを行う。簡単に述べると、１μCi/ml 3H-チミジンを含有する培地に細胞を12時間〜24時間生育させて、代謝的に細胞DNAを放射能標識する。細胞を３回洗浄し、そして約１×106を通常の培養培地に戻す。この細胞を、種々の濃度のグルタミン酸(０〜50mM)の存在下でインキュベートする。４時間〜24時間の後、この細胞を遠心分離によってペレットにし、そして培養上清を回収して、3H-チミジン濃度を液体シンチレーション計測によって測定する(画分１)。
この細胞を５mM Tris(pH 7.4)、10mM EDTA、0.5％TritonX100に再懸濁し、そして13,000×ｇで30分間遠心分離する。得られた低分子量の(断片化された)DNAを含む上清(画分２)およびインタクトな高分子量のDNAを含むペレット(画分３)の放射性活性を測定した。DNA断片化の百分率を、画分１および２における放射性活性の１分あたりのカウント(cpms)を合計し、そして全ての３画分における放射性活性の全cpmsで割ることによって計算した。オリゴヌクレオソーム長フラグメントへのゲノムDNAの分解の始まりは、pZIP-BCL-2感染PC12細胞およびB50細胞において遅延された。これらの結果は、神経細胞におけるアポトーシス細胞死を阻害するBcl-2の役割と一致する。
実施例IV
この実施例は、ウイルスと鳥類のヒトBcl-2の相同体の作用の類似性を説明する。
32D-3細胞を、ハイグロマイン(HYG)またはG418(NEO)抗生物質耐性遺伝子のいずれか、およびヒトBcl-2タンパク質、ニワトリBcl-2タンパク質、またはエプスタイン・バーウイルス（Bcl-2のウイルス相同体）からのBHRF-1タンパク質のいずれかをコードするcDNAを含有する発現プラスミドによって安定にトランスフェクトした。所望のタンパク質または対応するmRNAの生産を、イムノブロットまたはノーザンブロットアッセイによって確認した。トランスフェクションの後、細胞を、成長因子なしで様々な時間について培養し、そして生存細胞の数を測定した。
図５．Ａに示されるように、ニワトリBcl-2相同体は、培地中で細胞生存率を延長させる点においてヒトBcl-2とほとんど同様の効果であった。同様な結果が、ウイルスBHRF-1タンパク質についても観測され得、これはまた、成長因子なしで細胞の生存率を増加させた(図５Ｂ)。細胞増殖の研究は、生存率の増加が、実際には、細胞の生育に起因するのではなかったことを示した。
実施例Ｖ
この実施例は、細胞生存に関係する非Bcl-2タンパク質が、インビトロでの32D-3細胞の生存を長くするために相乗的に作用することを示す。
32D-3細胞を、Bcl-2タンパク質、活性化Raf-1タンパク質、またはBcl-2とRaf-1との両方を産生する発現プラスミドによって安定にトランスフェクトし、次いでアポトーシスを起こす成長因子を排除した条件下で培養した。培地から成長因子を除去した後に様々な時間に、細胞を回収し、そして生存率を測定した。
図６Ａに示されるように、Raf-1のみの発現では、細胞の生存に効果がなかったが、一方Bcl-2のみの発現では、あまり大きくない(modest)効果があった。注目すべきことに、Bcl-2およびRaf-1タンパク質の両方一緒の発現によって、細胞生存が相乗的に延長した。重要なことは、細胞の種々の集団のDNA合成レベルにおいて差異が認められず(図６Ｂ)、Bcl-2およびRaf-1の組み合わせ効果は細胞の生存率を高めるが、例えば、成長因子なしで増殖する能力でないことを示す。
フローサイトメトリーを用いて、成長因子を除いた細胞が増殖しないことを確認した。細胞をIl-3の存在または非存在下で３日間生育させた。インキュベーションの後、細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、そして細胞の相対DNA含有量を測定した。図６Ｃに示されるように、成長因子の存在下で生育したBCL2発現細胞およびBCL2/RAF発現細胞(パネルaおよびc)は、Il-2の非存在下で生育した異なる細胞株が示すように、同様のパターンの蛍光強度を示す(パネルbおよびd)。より高いDNA含有量を有する細胞の数の減少は、Il-3の非存在下で生育した細胞中に存在する非サイクリング(non-cycling)G0/G1相細胞のより多数と一致する(パネルbおよびd)。
実施例VI
この実施例は、32D-3細胞死の促進におけるBcl-2タンパク質の優性ネガティブ形態の効果を説明する。
32D-3細胞を、ネオマイシン耐性を与える遺伝子を単独でまたはBcl-2タンパク質、Bcl-2βの22kDa形態をコードするDNA配列と組み合わせて含有するレトロウイルスベクターによって安定に感染した（図１Ａ）。感染後、細胞を、成長因子なしで１日培養し、そして生存細胞の数を測定した。図７に示されるように、優性ネガティブBcl-2βタンパク質の発現によって、重大な細胞死が生じた。
実施例VII
この実施例は、Bcl-2が無細胞系において核のアポトーシス分解を阻害することを示す。
Bcl-2タンパク質の機能を阻害または高める能力について化合物を容易にスクリーニングするために、Bcl-2の機能を評価する無細胞アッセイを開発した。このアッセイは、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)の卵に由来する細胞抽出物と単離された精子クロマチンとを混合することによってインビトロで自己集合核に利用する。核集合は、通常、約２時間後に、分解し始める。核は、収縮するようであり、そして短時間エンドヌクレアーゼで処理した単離された核と同様な外観を有していた。この現象は、アポトーシスを示すようである。あるいは、単離された肝細胞核を、精子クロマチンと置換し、そして卵抽出物と混合し、同じ現象を生じ得る。
核に対するBcl-2タンパク質の効果を試験するために、Bcl-2または無関係のタンパク質、例えばβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)もしくはLckキナーゼ(Reedら、Anal. Biochem. 205:70-76(1992)参照)のいずれかをコードする組換えバキュロウイルスで感染したSf9昆虫細胞から溶解産物を調製した。Bcl-2が昆虫細胞溶解産物で発現したことを確認するために、Sf9昆虫細胞を、組換えBcl-2バキュロウイルスまたは組換えLckバキュロウイルスベクターで感染した。感染した細胞を３日間インキュベートして遺伝子生産物を発現させ、次いで溶解産物を得そしてSDS-PAGE電気泳動によって分画した。電気泳動の後、タンパク質を膜に移し、そしてヒトBcl-2の推定アミノ酸配列の一部分に対応する合成ペプチドに対して惹起された抗血清でプローブした。図８に示すように、Bcl-2タンパク質はBcl-2バキュロウイルスベクターで感染されたSf9細胞で発現された(レーン１および２)が、非感染細胞(レーン６)またはLckキナーゼを発現するバキュロウイルスで感染された細胞(レーン５)では発現しなかった。Bcl-2タンパク質は、総抽出タンパク質の約５〜10％を含んでいた。
Sf9細胞溶解産物を、Xenopus抽出物に1:90希釈でまたは最終タンパク質濃度が10μg/mlとなるまで添加した(NewmeyerおよびWilson、Meth. Cell Biol. 36:607-634(1991)参照、本明細書に文献として援用する)。コントロールSf9溶解産物を入れている抽出液において、クロマチン凝縮が約２時間後に始まった(図９Ａ、上方パネル、および図９Ｂ)。Hoechst 33258DNA染料で明るく染色される丸い、高度の凝縮体が形成され、そして核の一般収縮および抽出物周囲に浮いている小片の凝縮クロマチンが見られた(図示せず)。さらに約40分のインキュベーションの後、核は完全に分解し(図９Ｂ)、そしてヘキスト蛍光の広く分散された繊維状のバックグランドが、多くの小さな球形または不規則に形成されたクロマチンの集合体にそって残されていた(図示せず)。
対照的に、Bcl-2含有溶解産物を添加した場合、核はこの種の分解から保護された(図９Ａ、下方パネル、および図９Ｂ)。核のかなりの部分は完全なままであり、そして蛍光基質の核輸送における機能は完全であった。この基質は、SV40 Ｔ抗原(TRITC-HSA-NLS)の核局在シグナルに対応する合成ペプチドと結合したテトラメチルローダミン標識BSAであった。図９Ａに示されるように、上方パネルは、２つの核を含み、これらの１つのみが完全であり、そして蛍光輸送基質を蓄積する。下方パネル(Bcl-2存在)は、代表的な完全な核を示し、この核は輸送基質を蓄積しそしてかなり成長し、核膜と核膜小胞との融合によって新しい膜を獲得することを示す。DNA(図９Ａ、左パネル)は、Bcl-2処理された抽出物の核の一部に濃縮された。このDNA局在は、精子クロマチン体の元の細長い形状とおよそ対応し、そして通常の羽毛のような(feathery)、すなわち標準的な、非アポトーシスアフリカツメガエル卵抽出物中で集合した精子核の形態に特徴的な脱凝縮(decondense)の外観を有する。
代表的な実験で観察される、完全な、輸送能力を有する核の定量によって、２時間のインキュベーション後、輸送能力によって測定した場合、Bcl-2処理された抽出物中の核の約50％は完全である(標準的な、非アポトーシス抽出物において完全な核の百分率は50％〜90％の範囲にある)のに対し、コントロール核はわずか８％〜10％しか完全でなかったことが明らかにされた（図９Ｂ）。上述のように、40分後には完全な核はコントロール抽出物中に残ってなかった。しかし、Bcl-2を含有する抽出物中の核の42％は、２時間40分のインキュベーションの後でも完全なままであった。従って、Bcl-2含有溶解産物は、これらの抽出物中の核を分解から保護する。
核分解の抑制がBcl-2タンパク質の存在に起因することを示すために、免疫沈降反応を行った。２つの異なる昆虫細胞溶解産物を、Xenopus無細胞アポトーシスアッセイに添加する前に、抗Bcl-2特異的抗体または無関係の抗体とプレインキュベートした。図10に示すように、抗Bcl-2抗体とインキュベートした溶解産物は核分解を抑制する能力を失い、他方、無関係の抗体を用いたインキュベーションは、溶解産物が分解を抑制する能力には影響がなかった。抗Bcl-2抗体と溶解産物との免疫沈降後、Bcl-2タンパク質の減少を、ウエスタンブロット分析によって確認した(図示せず)。
追加の結果は、Bcl-2の作用が核輸送の効率の変化を介して媒介されていないことを示す。これらの同じサンプルにおける核輸送活性の測定の結果、Bcl-2含有溶解産物の添加後１時間に核によって輸送される蛍光輸送基質の量の大きな変化がなかったことを示した。
無細胞系における核の分解がBcl-2によってブロックされ得る経路によって媒介されるという開示の結果のように、この系は、例えば合理的な設計またはランダムな合成によって生じた化合物のアポトーシスを変える能力について検討するのに用いられ得る。所望の活性を示す化合物は、種々の疾患および病的状態を処置するために選択され、使用され得る。
実施例VIII
この実施例は、Bcl-2発現ベクターが、障害された脳に移植されたときに、L-DOPAを分泌する遺伝工学的に操作された線維芽細胞のインビボでの生存を延長するために用いられ得ることを示す。遺伝的に改変された筋芽細胞、神経内分泌または他の細胞タイプを移植する場合にも同様のアプローチが用いられ得る。さらに、ベクターを直接注射する必要はないが、脳の所望の領域に移植し得る生物学的適合性の「カプセル」に取り込ませ得る。
Bcl-2遺伝子導入が、頭蓋内に移植されL-DOPAを分泌するように遺伝工学的に操作された、線維芽細胞の生存を延長するために用いられる。不死のラット線維芽細胞株(208F)またはチロシンヒドロキシラーゼをコードする組換えレトロウイルスで安定に感染された一次ラット皮膚線維芽細胞を、ラット脳の神経脱落した線条体に移植した。これらの移植細胞は、それぞれ２週間および10週間で行動的症状を減少する。２、３週間後の208F細胞の治療効果がなかったことは、生存移植細胞が失われた結果であった。このパーキンソン病の動物モデルにおいて、治療的アプローチは、動物の脳で線維芽細胞が長期間生存できなかったことによってうまくいかなかった。Bcl-2の発現は、この問題を回避しそして脳の線条体に移植されたときに遺伝工学的に操作された線維芽細胞の頭蓋内の生存を延長し得る。
Bcl-2およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を共発現する線維芽細胞を創出するためにBcl-2レトロウイルスを用いて予めTHを発現するウイルスで安定に感染させた樹立および一次ラット線維芽細胞を感染する。Bcl-2/THポジティブ細胞を選択し、そして定位的にパーキンソン病を有する被験体の脳に導入する。
ヒトの患者にこれらの注入を行う方法は、例えば、Freedら、New Engl. J. Med. 327:1549-1555(1992)およびFreedら、Arch. Neurol. 47:505-512(1990)に記載されている。簡単に述べると、手術の前に、尾状核(caudate)および被殻をCTスキャニングで視覚化する。移植を、局部麻酔の下で覚醒および鎮静した患者について楕円頭蓋切除(elliptical craniectomy)(3.5×1.5cm)によって実行する。患者の頭部を定位固定フレームにマウントし、そしてCTスキャンを用いて、注入座標を決定する。６〜９の針経路(needle pass)を脳の各側に作り、そして針をゆっくり抜くとき、1.5〜３μlの細胞懸濁液が被殻、尾状核、または両方の10mmトラックに沿って堆積される。
有効性を試験または手順を最適化するために使用され得る動物モデルには、線条体ニューロンの6-ヒドロキシドーパミン障害を受けたラットが使用される。例えば、このような脳に移植されたBcl-2発現線維芽細胞のインビボ寿命と、コントロールウイルスで感染された線維芽細胞の寿命とを比較する。このようにして、特定のBcl-2発現細胞株に必要な細胞の適切な数を決定し得る。
実験は、ラットモデルを用いて実行され得る。この場合、移植を、麻酔をかけた動物の頭部を定位固定のフレームにマウントし、そしてPaxinosおよびWatson、The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press、1982)に記載されるように以下の座標を用いて線条体中の２つの部位に10μlの細胞懸濁液を注入することによって行う:AP=0.3mm;ML=2.0mm;DV=4.5mm、およびAP=1.5mm;ML=2.0mm、DV=4.5mm。Fisherら、Neuron 6:371-380(1991)(本明細書に文献として援用する)に記載されているように、各部位で2.5μlの細胞を与え、次いで注射器を１mmを上げ、そして別の2.5μlを１μl／分の速度で投与する。注射器をさらに２分間その場において、細胞を拡散させる。
安定に感染するTHポジティブ線維芽細胞に用いられるレトロウイルスベクターは、Bcl-2cDNAおよび大腸菌のlacZ遺伝子の両方を発現する。LacZはβ-galをコードし、このβ-galは、比色アッセイによって容易にモニターされる。このベクターの顕著な特徴には、モロニー肉腫ウイルス5'-LTRに続いて、Bcl-2遺伝子、内部リボソーム開始部位、lacZ、および3'モロニー白血病ウイルスLTRを含む。このレトロウイルス構築物は、一般のpBAGベクターよりも有意に高い力価のウイルス生産を生じる(AustinおよびCepko、Development 110:713-732(1990)参照のこと、本明細書に文献として援用する)。
ウイルスベクターを生産するために、上記のプラスミドを、標準リン酸カルシウム沈澱法によってPE501、エコトロピックパッケージ細胞株(より一般的に用いられるPsi-2細胞よりもより少ない発生率の自発的な組換え現象を有する)にトランスフェクトする。本明細書中で使用される用語「エコトロピック(ecotrophic)」は、用語「アンホトロピック(amphotrophic)」(これは全ての種由来の細胞を感染するウイルスをいう)に対して限定された宿主範囲(すなわち、齧歯類細胞のみに感染)をウイルスベクターが有することを意味する。一時的に生産されたウイルスを用いて、Millerら、Som. Cell Mol. Gen. 12:175-182(1986)(本明細書に文献として援用する)の方法によってアンホトロピック細胞株PA317を安定に感染する。
ウイルス組み込みを可能にするために培養の２継代後に、安定に感染された細胞を、生存細胞に用いられ得る蛍光β-gal基質を用いて３ラウンドの蛍光活性化細胞選別(FACS)によって濃縮する(Nolanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2603-2607(1988)、本明細書に文献として援用する)。選別された細胞を低密度で培養に接種あるいは限定希釈でマイクロタイタープレートにプレートする。個々のクローンをランダムに回収し、培養で繁殖し、そしてヒトBcl-2タンパク質に特異的な抗体を用いてイムノブロットアッセイにより測定されるように、Bcl-2タンパク質生産の相対レベルに基づいてウイルス発現を最初にスクリーニングする。
見込みのあるクローン由来の培養上清をNIH3T3細胞の感染によって力価検定し、そして単層培養における青い細胞の細胞増殖巣をスコアーする。このスクリーニング手順は、インサイチュで細胞を固定化する工程およびβ-galに対する比色性基質で染色する工程を含むプロトコルを使用する(LimおよびChae、Biotechniques 7:576-579(1989)、本明細書に文献として援用する)。次いで、最高のウイルス生産を示すクローンを、DNAブロットで分析して、組み込まれたプロウイルスの組み込みを確認し、そして標準的な方法(例えば、Mannら、Cell 33:153-159(1983)参照、本明細書に文献として援用する)によって汚染しているヘルパーウイルスを試験する。
Bcl-2/THポジティブ線維芽細胞を得るために、上記で生産されたBcl-2/β-galベクターを、THポジティブ齧歯類線維芽細胞に安定に感染する。感染細胞をフローサイトメトリーによって濃縮し、そしてラットの6-ヒドロキシドーパミン障害脳に移植する。アポモルフィンまたはアンフェタミン誘発旋回のような症状を毎週評価することによって処置をモニターする。動物を様々な時間で屠殺して、適切な比色基質β-galの使用により青色染色された組織切片の組織化学的分析によって、生存細胞の相対数を測定する。
移植手順を最適化するための上記のβ-gal依存性選択ストラテージに対する別のアプローチは、Bcl-2/β-galベクターの代わりに他のレトロウイルスベクターを用いることである。これらの他のベクターは、例えば、ハイグロマイシン(hygromycin)耐性遺伝子のような適切なマーカーを含む(Gakenら、Biotechniques 13:32-33(1992)、本明細書に文献として援用する)。このようにして、Bcl-2 cDNAをG418耐性、TH-発現線維芽細胞に導入し、そして安定に感染された細胞をハイグロマイシン中の生育について選択する。比色マーカー遺伝子が利用できない場合、ラットの脳中で線維芽細胞を生産するBcl-2タンパク質の存在を、例えば、抗Bcl-2抗体(この抗体はタンパク質の外因性形態に対して特異的であり、そしてホルマリン-またはBouin試薬で固定され、パラフィンで包埋された組織を免疫染色するために有用である)を用いる免疫組織化学的方法によって評価される。
実施例IX
この実施例は、移植胎児ドーパミン作動性ニューロンのインビボ生存を延長するためのBcl-2発現ベクターの使用を示す。
Bcl-2遺伝子導入を、胎児ニューロン組織から回収したドーパミン作動性ニューロンのインビトロ生存を延長するために用いる。不死化TH発現ニューロン前駆体を、不死化癌遺伝子としてv-mycレトロウイルスを用いて構築した。13日齢のラット胎児の中脳曲領域からの胎児細胞を用いた。なぜなら、黒質にあり、そしてその後、線条体を神経支配する神経細胞が、妊娠12日〜14日のあたりでこの領域を通って移動すると考えられているからである(MarchlardおよびPoirier、Neuroscience 9:373-381(1983)、本明細書に文献として援用する)。
細胞をv-mycウイルスで感染し、そして培養に置いた。感染後12日までに、全ての未感染コントロール細胞が死んだが、v-mycウイルスに曝した細胞の約半分は生存した。G418中での選別後、細胞をクローン化し、そして６ヶ月にわたり少なくとも20継代について培養で増殖させた。３つのクローンを詳細な特徴付けのためにランダムに選択し、そしてMF13/H11と称するそれらのうちの１つが、THを含むことを見出した。
免疫組織化学的研究によって示されたように、MF13/H11細胞は、代表的な神経細胞抗原(例えば150kDaおよび200kDaのニューロフィラメントタンパク質、ニューロン特異的接着タンパク質、コンタクチン(contactin))、および神経冠のマーカーである、ガングリオシドGD2を発現した。この細胞は、グリア細胞および星状細胞マーカーGFAPおよびプロテオグリカンNG2を発現しなかった。この細胞は、血清を供給された場合、高密度状態で、分割を続けるが、しかし血清を取り去ると萎縮し死んだ。MF13/H11は、現在までに記載された、最初の不死化ドーパミン作動性ニューロン前駆体クローンである。
v-mycまたは前駆体神経細胞の不死化のためのSV40ラージＴ抗原の温度感受性バージョン、および続いて起こるこれらの細胞のインビボでの分化を用いるいくつかの報告された成功があるが、分化する能力を保持する不死化クローンは、通則というよりむしろ例外である。上記のTH-発現MF13/H11細胞は、例えば、レチノイン酸(retinoic acid)および他の活性な神経細胞分化の薬理学的誘発物質で刺激した場合、インビトロで分化する能力をほとんど示さない。しかし、v-mycとは異なり、Bcl-2は、細胞の増殖および分化する能力に影響を与えることなく、細胞を不死化する能力を有する。
胎児神経細胞のインビトロ生存を延長するために、Bcl-2が代わりに用いられることを除いて上記と同様の手順が、v-mycを有するこれらの細胞の不死化に用られる。エコトロピック(PE501)およびアンホトロピック細胞株(PA317)の両方を、任意の差別を避け得ることを保証するために用いる。
簡単に述べると、ポリ-L-リジンまたはポリ-L-オルニチンでコートされた組織培養皿で１〜２日間胎児前駆体神経細胞を培養することによって感染を行う。このような条件は、グリア細胞を除去し、そして前駆体神経細胞の付着を助ける。高力価(＞106コロニー形成ユニット／ml)のウイルス含有上清を、PA317またはPE501細胞の新鮮培養から収集し、そして10μg/ml〜20μg/mlポリブレン(polybrene)と共に３時間〜４時間または４μg/mlポリブレンと共に16時間〜24時間、胎児細胞培養に添加する。次いで、ウイルス含有培地を除去し、そして適切な選択剤(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはピュロマイシン耐性遺伝子がそれぞれ、組換えbcl-2レトロウイルスに含まれるか否かに依存してG418、ハイグロマイシン、またはピュロマイシン)を添加する前に１〜２日間より長く胎児細胞を培養する。これら抗生物質を含有する培地における継続培養は、実験の目的に依存して、たかだか１日間だけまたは数ヶ月間であり得る。
いくつかの場合では、抗生物質による選択は行われない。この場合には、Bcl-2感染細胞の選択を、本質的に、Bcl-2の生存促進機能を用いて行う。非感染中脳細胞は代表的には２週間以内に死ぬため、Bcl-2ウイルス感染培養のみが、生存可能な増殖細胞を含む。あるいは、β-gal活性、Bcl-2 RNA、またはタンパク質分析が、Bcl-2発現前駆体神経細胞をスクリーニングするために用いられ得る。線維芽細胞について本質的に上記のようにBcl-2の安定な形質転換体を増殖させそして移植する。
実施例Ｘ
この実施例は、Bcl-2を発現するトランスジェニックマウスの生産について記載する。
Bcl-2トランスジェニックマウスの生産のために使用するDNA構築物を以下のように構築した。ヒトBcl-2 3'非翻訳領域の部分、t(14;18)ブレイクポイント(breakpoint)、重鎖結合領域遺伝子セグメント、およびIGHエンハンサー領域を含有する4.3kbフラグメント(λ1032-5/SH)を、SstIおよびHindIIIを用いて切断することによってλファージクローンλ1032-5(Tsujimotoら、Science 229:1390-1393(1985)、本明細書に文献として援用する)から切り出した。切り出した配列を、DNAポリメラーゼ(Klenowフラグメント)およびT4ポリメラーゼを用いて平滑末端にし、pSKII(Stratagene、La Jolla、CA)のHincII部位にサブクローニングした。２つのプロモーターおよび最初の２つのエクソンおよびBcl-2の第２番目のイントロンの一部を含有する6.9kbフラグメント(p18-21H/BH)を、HindIII消化およびBamHI部分消化によってp18-21Hから切り出し、そして上記のpSKII／Ｅμプラスミドにサブクローニングした(Tsujimotoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1329-1331(1987)、本明細書に文献として援用する)。最後に、Bcl-2の、第２番目のイントロンの一部、第３番目のエキソン、3'非翻訳領域、およびポリアデニル化部位を含む4.4kbのHindIIIフラグメント(p18-4/H)をp18-4から単離し、上記の5' Bcl-2とEμフラグメントとの間に位置するHindIII部位にサブクローニングした。マイクロインジェクションのために、13kb DNAフラグメントを、最後のプラスミドからBssHII切断により単離し、ゲル精製し、そして改変TE緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1mM EDTA)に対して透析した。
上記の構築体の約250〜500コピーを、当該分野で公知の標準方法によりF1(SWR/J×SJL/J)受精卵の雄性前核中に注入することによって、トランスジェニックマウスを生産した。t(14;18)主要ブレイクポイント領域に特異的なプライマーを用いて尾部溶解産物(tail lysate)のPCR分析によって、導入遺伝子の組み込みを最初にスクリーニングした。各トランスジェニック株のF1子孫から単離された肝臓DNAのDNAブロット分析によって結果を確認した。全てのもどし交配は、SWR/Jマウスと行った。Reedら、前出、(1991)に記載されているように、ヒトBcl-2たんぱく質に特異的な抗体を用いる２段階の免疫沈降／イムノブロットアッセイによって、Bcl-2タンパク質の相対レベルを測定した。
実施例XI
この実施例は、ヒトBcl-2タンパク質を発現するbcl-2トランスジェニックB6マウスから得られたＢリンパ球が、野生型マウスから得られるＢリンパ球を用いて形成されるハイブリドーマと比較すると、有意により高い頻度のポジティブクローンを有してハイブリドーマを形成したことを説明する。
免疫グロブリン重鎖エンハンサーの制御下でbcl-2ミニ遺伝子(minigene)を発現するトランスジェニックB6マウスを、上記のように生成する(Siegelら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:7003-7007(1992);Katsumataら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:11376-11380(1992)、それぞれ本明細書に文献として援用する)。高レベルのヒトBcl-2タンパク質は、これらトランスジェニックマウスのＢリンパ球で発現され、そしてこれらの細胞における高レベルのBcl-2発現と関連して、抗原刺激後のＢ細胞の生存が延長される。
トランスジェニックBcl-2 B6マウスおよびB6非トランスジェニック同腹子またはBalb/cマウスを、１日および14日目にミョウバン中の100μgの細菌性β-ガラクトシダーゼ(β-gal)を腹腔内注入することによって免疫化した。脾臓を取り出す前３日間(第２回目の免疫化注入の後、通常、約２週間)、PBS中の100μg β-galを用いてマウスをブーストした。この脾臓細胞を、96ウェルプレート中に２×105細胞／ウェルで接種し、ポリエチレングリコールを用いてP3/NSI-Ag4-1(ATCC TIB 18)骨髄腫細胞と4:1の比で融合させ、そしてハイブリドーマをHAT含有培地(HarlowおよびLane、前出、1988)で選択した。ポジティブのハイブリドーマを、プラスチックプレートに吸着させたβ-galを用いてELISAにより同定した。固定化物に結合したポジティブのモノクローナルマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体(Cappel/Worthington)を用いて同定した。
表に示すように、ヒトBcl-2を発現するトランスジェニックB6マウスから得られたＢ細胞は、１細胞あたりの基準で、トランスジェニックマウスの通常の同腹子からまたは通常のBalb/cマウスから得られたＢ細胞よりも、約３〜４倍多くポジティブのハイブリドーマを生産した。さらに、ハイブリドーマによって発現される免疫グロブリンアイソタイプの分析によって、大多数がIgGアイソタイプであったことが明らかになり、Bcl-2発現Ｂリンパ球でクラススイッチが起こることが示された。これらの結果は、ヒトbcl-2遺伝子を発現するトランスジェニックマウスからのＢリンパ球が、ポジティブのハイブリドーマの数を増加させるために有用であることを示す。
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本発明を、開示した実施態様に関連して記載しているが、種々の改変が本発明の思想から逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきである。それゆえに、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ（ａ）】
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【図６Ｃ（ｂ）】
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【図６Ｃ（ｃ）】
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【図６Ｃ（ｄ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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