(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする抗リウマチ剤。
【請求項２】
脂質がホスファチジルエタノールアミンであり、グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸である請求項１記載の抗リウマチ剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、脂質結合グリコサミノグリカンを有効成分とする抗リウマチ剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（以下、ＲＡという）は、関節炎を主病変とする慢性多発性炎症疾患であり、その血清及び関節液には、免疫グロブリンＩｇＧと反応する自己抗体であるリウマトイド因子（以下、ＲＦという）が検出される。ＲＦの存在から、その病態には免疫異常が関与していると考えられているが、その病因は未だ不明である。ＲＡの病態変化としては、便宜的におおよそ３期に分けて考えられている（Zvaifler NJ., Adv. Immunol., 16, 265-336, (1973)) 。第１期は、未知の病原因子、すなわち抗原が関節滑膜に到達して滑膜炎症が開始される初期相である。第２期では、滑膜炎症を引き金として慢性炎症が大きく展開する。すなわち、滑膜表層下の微小血管新生、滑膜下組織の浮腫、滑膜表層細胞の増殖、肥厚および多層化などが現れ、小血管周囲ではリンパ濾胞様のリンパ球浸潤とその周辺の形質細胞浸潤がみられる。そして第３期では、炎症滑膜が細長い絨毛突起（パンヌス）となって関節腔内に突出し、軟骨破壊・骨破壊、そしてついに関節強直へと進行していく。この第３期の軟骨破壊・骨破壊は、臨床上著しい機能障害を残し、リウマチ患者の日常生活を著しく障害するので、初期の滑膜炎の防止と共に最も重要な時期である。軟骨破壊には、リウマチ関節液中に多量に放出されているプロテアーゼなどの消化酵素による、関節表面からのプロテオグリカンの直接分解作用と、滑膜組織のパンヌスによりその関節軟骨との接合部での細胞組織の破壊の機序があり、リウマチ患者の軟骨表層部ではプロテオグリカンの減少が見られる。リウマチ患者では、特異的にフィブロネクチン様物質を含んだ免疫複合体の関節軟骨表層への被覆がおこり、これが更にパンヌスを進行させているといわれている。特にフィブロネクチンは、活動性のリウマチ滑膜できわめて多量に産生されており、これは間葉系細胞の伸展因子であることから、パンヌスの伸展に積極的に関与していると考えられている（Shiozawa S., Scand. J. Rheu., Suppl. 74, 56-72, 1988) 。
【０００３】
上述のようにＲＡの原因は現在なお不明であり、その確実な治療法も未だ確立されていない。特にパンヌスの伸展抑制に効果のある薬剤は皆無である。また現在治療に使われている薬剤は、その効果が不十分であることはもとより、それらによる重篤な副作用が併発する問題もある。したがって、前記ＲＡの諸症状を改善する薬剤の開発が望まれている。
【０００４】
動物モデルとして、大腸菌Ｏ：１４株加熱死菌で感作誘導したウサギの関節炎は、極めてリウマチに類似した症状を呈する点が特徴的である（Aoki S., et al., Arthritis and Rheumatism, 28, 522-528, 1985, および Aoki,S., 中部リウマチ(Chubu Rheum. Assoc.), 21, 1-13, 1990 ）。すなわち、滑膜表層細胞の多層化、表層細胞下の浮腫、リンパ濾胞を伴う小円形浸潤、フィブリノイド沈着およびパンヌス形成などの関節病理所見に加え、血清中にＩｇＧと反応する自己抗体、ＲＦ様物質が検出される点で、ＲＡの動物モデルとして優れている。
【０００５】
なお、関節炎を早期に時期をそろえて確実に発生させるために、大腸菌Ｏ：１４株加熱死菌を数ヶ月感作後、膝関節腔内に直接大腸菌死菌を投与して関節炎を起こさせる抗原誘導関節炎でも、同様なＲＡ様の症状を呈する。
【０００６】
一方本発明者らは、先にグリコサミノグリカンと脂質とが共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンを合成し、細胞接着阻害作用及び癌転移抑制作用を有することを見い出している（特開平４−８０２０１号、特開平４−８０２０２号、特開平４−８２８３６号、生化学，62(7), 880, 1990、生化学，63(8), 948, 1991）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述の通り、優れた治療効果を有し、毒性等の副作用のない抗リウマチ剤が求められていた。
【０００８】
本発明の目的は、上記ＲＡの諸症状を改善するための抗リウマチ剤として新しい物質を提供することである。特に、軟骨破壊を引き起こすパンヌスの伸展を抑制する効果を有し、滑膜の炎症反応をやわらげる効果を有するとともに、毒性および副作用のない抗リウマチ剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分とする抗リウマチ剤である。
【００１０】
上記脂質結合グリコサミノグリカンはグリコサミノグリカンと脂質とが共有結合した構造のものであればよいが、好ましい構造は、グリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧという）の還元末端のピラノース環を特異的に開環させ、化学的処理により形成されたカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基もしくは１級アミノ基と、脂質の官能基が共有結合した構造である。
【００１１】
該脂質結合ＧＡＧの特に好ましい態様は、ＧＡＧを還元反応及び限定酸化反応（部分酸化反応）に付すことにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環させるとともに、ＧＡＧの還元末端にホルミル基を形成させ、次いで該ホルミル基と脂質の１級アミノ基とでシッフ塩基を形成させ、次いで該シッフ塩基を還元することによって得られる脂質結合ＧＡＧ、あるいはＧＡＧを酸化反応に付すことにより還元末端のピラノース環を特異的に開環させるとともに、ＧＡＧの還元末端にカルボキシル基を形成させ、次いでラクトン形成反応に付すことによってＧＡＧの還元末端をラクトン構造とし、次いで該ラクトンと脂質の１級アミノ基とを反応させることによって得られる脂質結合ＧＡＧである。
【００１２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の抗リウマチ剤の有効成分である脂質結合ＧＡＧは公知物質である。例えば特開平４−８０２０１号公報又は特開平４−８０２０２号に記載された化合物が例示されるが、本発明はこれに限定されず、ＧＡＧと脂質とが共有結合した脂質結合ＧＡＧであれば本発明薬剤の有効成分として使用できる。
【００１３】
特に脂質結合ＧＡＧは、ＧＡＧのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基、水酸基もしくは１級アミノ基、又はＧＡＧに別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基もしくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）、エステル結合又はアミノアルキル結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）によって共有結合したものが好ましい。とりわけ、以下の▲１▼〜▲３▼の結合によって得られたものが好ましい。
【００１４】
なお、上記結合に関与するアミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、水酸基は、ＧＡＧ又は脂質に元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって形成されたもの、あるいは上記官能基を末端に有するスペーサー化合物を、予めＧＡＧ又は脂質と反応させることによって別途導入されたもののいずれであってもよい。
【００１５】
▲１▼  ＧＡＧの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたＧＡＧのカルボキシル基（ラクトンを含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）、
▲２▼  ＧＡＧのウロン酸部分のカルボキシル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）、又は
▲３▼  ＧＡＧの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたＧＡＧのホルミル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還元して形成されたアミノアルキル結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）。
脂質結合ＧＡＧとその原料化合物との関係を模式的に示すと次の通りである。
【００１６】
【化１】
0003714683.tif 000002
【００１７】
【化２】
0003714683.tif 000003
【００１８】
【化３】
0003714683.tif 000004
【００１９】
本発明で用いる脂質結合ＧＡＧは、その塩であることができ、好ましくはナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属塩；トリアルキルアミンのようなアミン塩；ピリジンのような有機塩基との塩であることができる。
【００２０】
原料のＧＡＧは、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどのいずれも使用することができ、具体的にはヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｋ）、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸等が例示される。これらのＧＡＧは通常使用される塩（例えばナトリウム塩）であってもよい。
【００２１】
原料の脂質は、動物、植物、微生物等の天然物由来又は化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することができ、特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質；モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましい。とりわけ、１級アミノ基を有するリン脂質が好ましい。なお、脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度は特に限定されないが、例えばパルミトイル（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノイル）が例示される。また、これら脂質は通常使用される塩であってもよい。
【００２２】
有効成分である脂質結合ＧＡＧの製造法は特に限定されず、公知の合成法（例えば、特開平４−８０２０１号、特開平４−８０２０２号参照）を採用することができる。代表的な合成法について以下に説明する。
【００２３】
還元末端限定酸化法
この方法は、ＧＡＧの還元末端の糖残基であるキシロース残基、ガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、該ＧＡＧの還元末端にホルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）を形成させて、ＧＡＧと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２４】
ＧＡＧの還元末端の糖残基の還元は、ＧＡＧに対して５〜５０当量程度、好ましくは２５〜３０当量の還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩など）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
【００２５】
上記還元後、限定酸化を行ってＧＡＧの還元末端に特異的にホルミル基を有するアルデヒド化合物を合成する。該酸化反応は、上記還元後のＧＡＧに対して１〜１０当量、好ましくは３〜６当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩など）を用い、通常０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で行うことができる。
【００２６】
得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質など）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に、上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、通常１５〜６０℃の温度で反応させることができる。この反応時又は反応終了後に適当な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩など）を作用させてシッフ塩基を還元することができる。
【００２７】
なお、本反応方法で脂質結合ＧＡＧを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２官能性のスペーサー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジアミン；リジン等のアミノ酸）と上記アルデヒド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（−ＣＨ2 ＮＨ−）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物の他方の官能基（例えば、アミノ基）と反応し得る官能基（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシルグリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよい。
【００２８】
還元末端ラクトン化法
この方法は、ＧＡＧの還元末端の糖残基であるキシロース残基、ガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させて該ＧＡＧの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応に付すことによって該ＧＡＧの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成させることによって、ＧＡＧと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２９】
ＧＡＧの還元末端の糖残基の酸化は、ＧＡＧに対して２〜２０当量程度、好ましくは５〜１５当量の酸化剤（ヨウ素、臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン酸塩緩衝液等）中、通常０〜４０℃、好ましくは１５〜２０℃で行うことができる。
【００３０】
上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウエックス５０（商品名；ダウ・ケミカル社製）、アンバーライトＩＲ−１２０（商品名；オルガノ（株）製）及び／又は酸（塩酸、硫酸等の無機酸；酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処理することによって、ＧＡＧの還元末端が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を合成することができる。
【００３１】
得られたラクトン化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃の温度で反応させればよい。
【００３２】
なお、還元末端限定酸化法の場合と同様に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２官能性のスペーサー化合物と上記ラクトン化合物とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させてもよい。
【００３３】
その他の方法
上記以外の方法としては、例えばＧＡＧのウロン酸部分のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基とを反応させて、酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成させる方法が挙げられる。
【００３４】
上記反応に際し、縮合剤〔例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等〕を用いて酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成させるか、あるいはウロン酸部分のカルボキシル基を、上記縮合剤の存在下、活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等）と反応させて活性エステルとした後、脂質と反応させて酸アミド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成させることができる。
【００３５】
なお、上記反応において、ＧＡＧのウロン酸部分を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエチルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）とし、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
【００３６】
代表的化合物
本発明の有効成分である脂質結合ＧＡＧの好適な化合物を以下に例示する。
（１）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸
【００３７】
【化４】
0003714683.tif 000005
【００３８】
原料
ＧＡＧ：ヒアルロン酸（鶏冠由来、分子量  １万）
脂質：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
合成法
還元末端ラクトン化法［特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（２）−１）参照］
【００３９】
（２）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸
【００４０】
【化５】
0003714683.tif 000006
【００４１】
原料
ＧＡＧ：コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量  ３万）
脂質：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
合成法
還元末端ラクトン化法［特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（２）−２）参照］
【００４２】
（３）ステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸
【００４３】
【化６】
0003714683.tif 000007
【００４４】
原料
ＧＡＧ：コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量  ３万）
脂質：ステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン
合成法
還元末端ラクトン化法［特開平４−８０２０１号公報、実施例１−（３）参照］
【００４５】
（４）モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステル結合コンドロイチン硫酸
【００４６】
【化７】
0003714683.tif 000008
【００４７】
原料
ＧＡＧ：コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来、分子量  ３万）
脂質：モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステル
合成法
還元末端限定酸化（アルデヒド化）ＧＡＧにエチレンジアミンを反応させた後、上記脂質と反応させる（還元末端アミン法）［特開平４−８０２０１号公報、実施例２−（３）参照］
【００４８】
（５）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸
【００４９】
【化８】
0003714683.tif 000009
【００５０】
原料
ＧＡＧ：ヒアルロン酸（鶏冠由来、分子量  １万）
脂質：ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン
合成法
還元末端限定酸化法［特開平４−８０２０２号公報、実施例１−（２）−１）参照］
【００５１】
抗リウマチ剤
本発明の抗リウマチ剤は、血清及び関節液にＲＦが検出される慢性多発性炎症疾患、特にＲＡを治療又は予防するためのヒトを含む哺乳動物の医薬品として使用される。
すなわち、本発明の抗リウマチ剤は、脂質結合ＧＡＧを経口的あるいは非経口的投与（静脈内、筋肉内、関節内、皮下など組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与等）のための医薬品として、液体製剤、固体製剤、半固体製剤など任意の剤形に製剤化したもので、任意の投与ルートで患者に投与される。
該製剤は、脂質結合ＧＡＧに通常薬学的に許容される製剤補助剤を加えることにより常法に従って製造される。さらに公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
【００５２】
脂質結合ＧＡＧは、多くは水溶性であり、容易に液体製剤を調製することができる。特に、抗リウマチ剤としての効果を十分に発揮させるために、注射剤として関節腔内に投与することが好ましい。注射剤等の液体製剤を製造するには、脂質結合ＧＡＧを必要に応じてpH調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウム、ブドウ糖など）とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下に凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、脂質結合ＧＡＧに、乳化剤（レシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）を加えて水中で乳化させ、注射用乳剤とすることもできる。
【００５３】
また、脂質結合ＧＡＧと賦形剤（乳糖、デンプン、結晶セルロースなど）、結合剤（白糖、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）などの製剤補助剤を用いて、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の経口投与用の固形製剤、あるいは脂質結合ＧＡＧに甘味剤（白糖、ソルビトールなど）、水、精油、エタノールなどを加えてシロップ剤などの経口投与用の液状製剤とすることもできる。
【００５４】
さらに脂質結合ＧＡＧを、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィンなどに加えて軟膏剤とするか、粘着剤（ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体など）と練合したのち、ポリエチレンなどの不織布に展延してテープ剤とすることもできる。
【００５５】
上記製剤中の脂質結合ＧＡＧの含有量は、剤形、投与方法、投与回数等によって変動するが、通常、注射剤の場合は０．１〜１０重量％程度、経口投与用製剤の場合は１〜８０重量％程度、外用剤の場合は０．１〜１０重量％程度である。
【００５６】
脂質結合ＧＡＧの投与量は、患者の年齢、症状、体重、投与方法によって異なり、一概には特定できないが、組織内投与（注射）の場合は１回量１〜１０００mgを１日もしくは数日に１回投与することが好ましい。特に関節腔内に投与する場合は、各部位の関節腔の大きさに応じて投与量を適宜調節する必要があり、例えば膝関節の場合、成人に対して１回量０．１〜１０mlの液量で、脂質結合ＧＡＧとして０．１〜１００mg程度を１日〜数週間に１回投与することが好ましい。また、経口投与の場合は１日量１００〜２０００mg程度を１回又は数回に分けて投与すればよい。
【００５７】
本発明の脂質結合ＧＡＧは低毒性の化合物であり、医薬としての安全性は極めて高い。脂質結合ＧＡＧの急性毒性を以下の方法で調べた。
【００５８】
４週齢の Sic-ddy  系雌雄マウスを１週間予備飼育後、雄 23 〜30g 、雌20〜25g の体重になった時点で、参考例で調製したホスファチジルエタノールアミン結合コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＰＥ）又はホスファチジルエタノールアミン結合ヒアルロン酸（ＨＡ−ＰＥ）を、各々５％の濃度になるように局方生理食塩水に溶解し、腹腔内に投与した。雌雄それぞれ１群１０匹を用いて、ＬＤ50を算出した。その結果、いずれの化合物もＬＤ50値は 2000 mg／kg  以上であり、医薬としての安全性は問題ない。
【００５９】
【実施例】
以下に本発明の脂質結合ＧＡＧの合成例を示す参考例、薬理作用等の生物学的作用を示す試験例、製剤例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例示には限定されない。
【００６０】
参考例１：還元末端ラクトン化法によるリン脂質結合ＧＡＧの合成
（１）還元末端酸化ＧＡＧの合成
ヒアルロン酸（鶏冠由来，分子量  約１０, ０００，ＨＡ１）５００mgを水１０mlに溶解し、０. １M ヨウ素のメタノール溶液５mlを加え、室温で６時間反応させた。その後、反応液に０. １N 水酸化カリウム水溶液約５mlを加えて遊離のヨウ素の色を消失させた。この溶液に酢酸カリウム飽和エタノールを加え、生じた沈澱を濾取し、十分にエタノールで洗浄し、減圧乾燥して還元末端酸化ヒアルロン酸（カリウム塩）４２３mgを得た。
【００６１】
次いで還元末端酸化ヒアルロン酸４００mgを水１０mlに溶解し、強酸性陽イオン交換樹脂（Dowex 50(H+ 型) ）カラム５０mlを１時間で通過させ、還元末端ラクトンヒアルロン酸３９０mgを含む水溶液を得た。
【００６２】
この水溶液にトリ−ｎ−ブチルアミンを添加して中和し、凍結乾燥して還元末端ラクトンヒアルロン酸トリ−ｎ−ブチルアミン塩４００mgを得た。
【００６３】
また、コンドロイチン（鯨軟骨由来のコンドロイチン硫酸を脱硫酸したもの；分子量  約１５, ０００，ＣＨ）、コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来；分子量  約１０, ０００，ＣＳ（Ｓ１）；分子量  約３０, ０００，ＣＳ（Ｓ３）；分子量約６０, ０００，ＣＳ（Ｓ６））、デルマタン硫酸（豚皮由来；分子量  約１５, ０００，ＤＳ）、ヘパリン（豚小腸由来；分子量  約１５, ０００，Ｈｅｐ）及びヘパラン硫酸（牛腎由来；分子量  約１５, ０００，ＨＳ）を、それぞれ原料として使用し、上記の方法に準じて原料ＧＡＧに対応する還元末端ラクトン化合物を得た。その結果を表１に示す。
【００６４】
【表１】
0003714683.tif 000010
【００６５】
（２）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ＧＡＧの合成
還元末端ラクトンヒアルロン酸トリ−ｎ−ブチルアミン塩４００mgをジメチルホルムアミド２００mlに溶解し、これにジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン（以下、ＰＥという）２７. ６mgを含むクロロホルム溶液を添加し、７０℃で２時間反応させた。反応後、クロロホルムを溜去し、過剰量の酢酸ナトリウムを加え、次いで酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え、生成した沈澱を濾取した。これを０. ３M 酢酸アンモニウム溶液に溶解し、疎水クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌフェニルトヨパール６５０  Ｍ；東ソー（株）製）４００mlに吸着させ、０. ３M 塩化アンモニウム水溶液で十分に洗浄し、３０％メタノール水溶液で溶出した。素通り画分及び洗浄画分に未反応の原料物質が溶出され、３０％メタノール水溶液溶出画分に目的物が溶出された。３０％メタノール水溶液溶出画分を減圧濃縮し、透析して脱塩し、凍結乾燥してＰＥ結合ヒアルロン酸（ロット番号：６００）３６mgを得た。
ロット番号：６００
ＰＥ含量：６. ４４％
ヒアルロン酸含量：８２. ３７％
【００６６】
ヒアルロン酸以外のＧＡＧについては、上記（１）で得られた還元末端ラクトン化合物とＰＥとを用い、上記の方法に準じて各種のＰＥ結合ＧＡＧを調製した。原料物質の使用量及び目的物質の生成量を表２に、目的物質の分析値を表３にそれぞれ示す。
【００６７】
【表２】
0003714683.tif 000011
【００６８】
【表３】
0003714683.tif 000012
【００６９】
参考例２：還元末端限定酸化法による脂質結合ＧＡＧの合成
（１）還元末端酸化ＧＡＧの合成
ヒアルロン酸（鶏冠由来，分子量  約１０, ０００，ＨＡ１）２０００mgを０. ０５M ホウ酸塩緩衝液（pH８. ３）２００mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム１８２mgを加えて室温で５時間反応させた。酢酸でpH４. ５に調整し、エタノールを加えて生成物を沈澱させ、エタノールで洗浄し、還元末端残基開環ヒアルロン酸１８００mgを得た。
【００７０】
次いで、還元末端残基開環ヒアルロン酸１７００mgを４０mMイミダゾール緩衝液（pH６. ５）２５０mlに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム１３９. ９６mgを加え、０℃で１時間反応させた。反応液にエタノールを加えて生成物を沈澱させ、沈澱をエタノール洗浄し、還元末端限定酸化ヒアルロン酸１６００mgを得た。
【００７１】
また、コンドロイチン硫酸（鮫軟骨由来；分子量  約３０, ０００，ＣＳ（Ｓ３））１０００mgと水素化ホウ素ナトリウム３１. ５０mgを使用し、上記と同様の方法によって還元末端残基開環コンドロイチン硫酸８９７mgを得、次いで還元末端残基開環コンドロイチン硫酸８００mgと過ヨウ素酸ナトリウム２２. ８３mgを用い、上記と同様の方法によって還元末端限定酸化コンドロイチン硫酸７７４mgを得た。
【００７２】
（２）ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ＧＡＧの合成
還元末端限定酸化ヒアルロン酸１０００mgを０. ０５M リン酸緩衝液（pH７. ０）１００mlに溶解し、これにＰＥ  １mg／mlを含むクロロホルム−メタノール（２：１）溶液６９. ２mlを加え、さらにメタノールを加えて均一な溶液とし、５０℃で１時間反応させた。次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム２５mgを加え、５０℃で２時間反応させた。反応液を減圧濃縮し、５倍量の酢酸飽和エタノールを加え、生じた沈澱を濾取した。沈澱を０. ３M 塩化アンモニウム溶液で溶解し、疎水クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌフェニルトヨパール６５０  Ｍ）４００mlに吸着させ、０. ３M 塩化アンモニウム水溶液で十分に洗浄し、３０％メタノール水溶液で溶出した。素通り画分及び洗浄画分に未反応の原料物質が溶出され、３０％メタノール水溶液溶出画分に目的物が溶出された。３０％メタノール水溶液溶出画分を減圧濃縮し、透析して脱塩し、凍結乾燥してＰＥ結合ヒアルロン酸（ロット番号：３００）４０mgを得た。
ロット番号：３００
ＰＥ含量：６. ２１％
ヒアルロン酸含量：６２. １２％
【００７３】
また、上記（１）で合成した還元末端限定酸化コンドロイチン硫酸７００mg、ＰＥ１６. １５mg及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム５. ８９mgを使用し、上記と同様の操作でＰＥ結合コンドロイチン硫酸（ロット番号：３０２−２）２９mgを得た。
ロット番号：３０２−２
ＰＥ含量：２. ２２％
コンドロイチン硫酸含量：６５. ５２％
【００７４】
試験例１：ウサギ関節軟骨組織及び滑膜組織の同時器官培養におけるパンヌス伸展に対する抑制効果（１）
大腸菌Ｏ：１４株死菌を静脈注で７〜８カ月間感作した白色日本ウサギの膝関節に、大腸菌同株死菌を注射して関節炎を惹起させ、その４〜５週後に屠殺・解剖し、膝関節の軟骨組織、及び脂肪組織を含んだ滑膜組織を無菌的に採取し、３〜５mm角に切りそろえ、ハンクス液で洗浄した。
【００７５】
１０％ウシ胎児血清含有のイスコフ変法培地（シグマ社）1 mlを満たした６穴の組織培養用プレート（ファルコン(Falcon) 3046 、内径３５mm；ファルコン社）の中に、フィルター付き培養用プレートインサート（ミリセル(Millicell)-CM、30mm径、ポアサイズ0.4 μm ；ミリポア社）を浸し、そのフィルター上に関節面を上にして上記軟骨組織片を置き、その軟骨片の上に一部重なるように滑膜細胞面を下にして滑膜組織片を置き、３７℃で培養した。
【００７６】
参考例１で合成したＰＥ結合コンドロイチン硫酸（ロット番号：６０２−２；以下、ＣＳ−ＰＥという）を使用し、これをハンクス液に溶解して溶液（100 μg/ml）とし、該溶液で軟骨組織片を、培養前に、３７℃で１時間前処理するか、培地中にＣＳ−ＰＥを100 μg/mlとなるように添加して培養し、その影響を見た。
【００７７】
４日ないし８日培養後、器官培養組織片をそのまま中性ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィン包埋し、軟骨と滑膜の重なる部分が観察できるように垂直に切断し、得られた切片をヘマトキシリン−エオシン（以下、ＨＥという）染色した。顕微鏡で軟骨組織表面に滑膜細胞がパンヌス様に伸展する程度を観察して、非常に強く細胞伸展が起こっているものを＋＋、明らかに伸展がみられるものを＋、若干滑膜由来の細胞が軟骨表面にみられるものを±とし、全く細胞伸展がみられないものを−とした。結果を以下の表４に示す。
【００７８】
【表４】
0003714683.tif 000013
【００７９】
表４から明らかな様に、ＣＳ−ＰＥに軟骨表面への滑膜細胞の伸展（パンヌス）を阻害する効果がみられた。また、培地に添加するよりもあらかじめ軟骨組織に塗布しておいた方（軟骨前処理）が伸展阻害効果は高かった。
【００８０】
試験例２：ウサギ関節軟骨組織及び滑膜組織の同時器官培養におけるパンヌス伸展に対する抑制効果（２）
大腸菌Ｏ：１４株死菌を皮下注で４カ月間感作した白色日本ウサギの膝関節に大腸菌同株死菌を注射して関節炎を惹起させ、その５週後に屠殺・解剖し、膝関節の軟骨組織、及び脂肪組織を含んだ滑膜組織を無菌的に採取し、３〜５mm角に切りそろえ、ハンクス液で洗浄した。その軟骨組織片の一方を、ＰＥ結合コンドロイチン硫酸（ＣＳ−ＰＥ；ロット番号：６０２−２）又は参考例１で合成したＰＥ結合ヒアルロン酸（ロット番号：６００；以下、ＨＡ−ＰＥという）をハンクス液に溶解した溶液（それぞれ100 μg/ml）中に移し、３７℃で１時間前処理した後、再びハンクス液で洗浄した。
【００８１】
１０％ウシ胎児血清含有のイスコフ変法培地（シグマ社）1 mlを満たした６穴の組織培養用プレート（ファルコン(Falcon) 3046 、内径３５mm；ファルコン社）の中に、フィルター付き培養用プレートインサート（ミリセル(Millicell)-CM、30mm径、ポアサイズ0.4 μm ；ミリポア社）を浸し、そのフィルター上に関節面を上にして上記ＣＳ−ＰＥ又はＨＡ−ＰＥで前処理した軟骨組織片と未処理軟骨組織片を並べて置き、その軟骨片の間に一部重なるように滑膜細胞面を下にして滑膜組織片を置き、３７℃で培養した。
【００８２】
４日間培養後、試験例１と同様に、器官培養組織片から得られた切片をＨＥ染色し、パンヌス様滑膜細胞伸展程度を判定した。結果を以下の表５に示す。
【００８３】
【表５】
0003714683.tif 000014
【００８４】
表５から明らかな様に、ＣＳ−ＰＥ前処理軟骨、すなわちＣＳ−ＰＥを塗布した軟骨表面への滑膜細胞の伸展（パンヌス）は抑制された。また、ＨＡ−ＰＥで前処理した軟骨では、ＣＳ−ＰＥほどではないがパンヌスを抑制する効果がみられた。
【００８５】
参考例１及び２で合成した上記２化合物以外の脂質結合ＧＡＧについて、上記と同様にパンヌス様滑膜細胞の伸展阻害効果を調べた。その結果、脂質結合コンドロイチン硫酸（ロット番号：６０２，６０２−３，３０２−２）は、いずれも上記ＣＳ−ＰＥ（ロット番号：６０２−２）と、ほぼ同等の伸展阻害効果を示した。また、他の脂質結合ＧＡＧも、ＣＳ−ＰＥよりは劣るが、ある程度の伸展阻害効果を示した。
【００８６】
試験例３：大腸菌誘導関節炎ウサギに対する脂質結合グリコサミノグリカンの影響
日本白色ウサギ（体重２kg）１８羽を用い、大腸菌加熱死菌 1000 μg の生理食塩水懸濁液 0.5mlに等量のフロイントの不完全アジュバンドを混ぜ、その１mlを１カ月ごとに計４回筋肉内に注射した。最終感作後８日目にそれらウサギの両膝関節に大腸菌加熱死菌懸濁液（1000μg の抗原液 1ml）を惹起注射した。その左膝関節内に、惹起注射直後から１週間ごとに計５回ないし６回、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）1 ml、ＣＳ−ＰＥ（ロット番号：６０２−２；1 mg／ml）1 ml、及びＨＡ−ＰＥ（ロット番号：６００；1 mg／ml）1 mlの３種類をそれぞれ６羽ずつに投与した。右膝関節には惹起注射以外はせずに対照とした。
【００８７】
惹起注射後４週目および６週目の２回に分け、実験動物を解剖し、関節材料を採取した。関節組織はホルマリン固定してパラフィン包埋し、ＨＥ染色切片を作成した。関節各部位から得られた組織標本を顕微鏡観察し、パンヌスの伸展や滑膜炎症に特に注目して病理学的に関節炎の程度を評価をした。
【００８８】
全身所見では、対照のＰＢＳ投与群に比べ、本発明の薬剤投与群では明らかに動物の活動が活発であり、また対照の右膝関節に比較し、薬剤投与した左膝関節の腫れはほとんど見られず、関節炎症状の改善が観察された。
【００８９】
組織標本の所見では、ＰＢＳ投与の対照群は、すべての動物で滑膜が絨毛状に増殖し、滑膜表層部のフィブリン沈着や滑膜表層下組織におけるリンパ濾胞様の小円形細胞浸潤を伴っていた。その滑膜炎組織は、明らかにパンヌスとなって軟骨表面に伸展していた。
【００９０】
ＣＳ−ＰＥ投与群では、左右膝関節の同一部位で比較できたものが６例中２例あり、対照の右膝関節にはリンパ濾胞様の小円形細胞浸潤を伴った滑膜絨毛の増生があり、この炎症性肉芽組織はパンヌスとして軟骨表層に向かって伸展しているのが見られた。同一個体同一部位で、ＣＳ−ＰＥ注射の左膝関節を比較すると、その２例とも関節軟骨へのパンヌスの伸展が抑制されているのが観察された。
【００９１】
ＨＡ−ＰＥ投与群では、パンヌス抑制作用はＣＳ−ＰＥ投与群ほどははっきりと見られなかったが、滑膜炎症部位において対照の右膝関節滑膜に表層部のフィブリン沈着と表層下のリンパ球の濾胞様集合があり、強い炎症像を呈しているのに対し、ＨＡ−ＰＥ注射の左関節滑膜ではその炎症反応が比較的弱くみられた。このような抗炎症作用は６例中３例に観察された。
【００９２】
以上の結果から本発明の脂質結合ＧＡＧはリウマチ様関節炎症状を改善する効果を有することが明らかである。
【００９３】
試験例４：脂質結合ＧＡＧのウサギ関節軟骨組織内での残存性
正常な日本白ウサギ（体重２. ７〜３. ０kg）と、約６カ月間不完全アジュバンドとともに大腸菌死菌を皮下投与し続けた日本白ウサギの両膝関節に、直接大腸菌死菌を注射して１週間後に関節炎症状を呈した日本白ウサギ（体重２. ７〜３. ０kg）を実験動物として使用した。
【００９４】
フルオレスアミンで蛍光標識したコンドロイチン硫酸（以下、Ｆ−ＣＳという）及び同様に蛍光標識したＣＳ−ＰＥ（以下、Ｆ−ＣＳ−ＰＥという）をＰＢＳにそれぞれ溶解（1 mg／ml,10 mg／ml）し、滅菌濾過した。これら被検液を上記の正常ウサギおよび大腸菌感作ウサギの膝関節に、それぞれ 1ml／関節ずつ注射した。1 mg投与群と、10mg投与群（正常ウサギは10mg投与群のみ）に分け、左膝関節にはＦ−ＣＳを、右膝関節にはＦ−ＣＳ−ＰＥを投与した。試験物質投与１日後、ウサギを屠殺・解剖し、膝関節組織及びコントロールとして肘関節組織を分離した。採取した関節組織は、脂肪組織を含む滑膜組織、半月板、十字靱帯、骨端軟骨及び関節液である。
【００９５】
各組織を凍結乾燥した後、プロナーゼ（科研製薬（株））で処理して抽出し、得られた抽出液の蛍光強度から、各組織に付着した蛍光標識誘導体の量を算出した。正常ウサギの結果を図１に、関節炎ウサギの結果を図２に示した。
【００９６】
正常ウサギでは、関節液中の残存量はＦ−ＣＳ−ＰＥの方が多かったが、有意な差ではなかった。Ｆ−ＣＳ−ＰＥの関節軟骨への移行量は、Ｆ−ＣＳとの間に有意差は認められなかった。しかし、半月板、十字靱帯及び滑膜へのＦ−ＣＳ−ＰＥの移行量はＦ−ＣＳに比べ有意に多く、特に滑膜組織についてはＦ−ＣＳの３０倍のＦ−ＣＳ−ＰＥが検出された。滑膜組織は脂肪組織を多く含むので、おそらく脂肪組織中にＦ−ＣＳ−ＰＥが蓄積されたものと思われる。
【００９７】
関節炎ウサギ関節組織の結果は、関節液、関節（骨端）軟骨、半月板、滑膜共に、Ｆ−ＣＳに比べＦ−ＣＳ−ＰＥが数倍から約２０倍高濃度に取り込まれていた。また、添加容量（1 mg,10 mg）に応じて残存量も増加した。正常のウサギとの大きな違いは、関節炎ウサギでは全体に取り込み量が増大しており、特に軟骨組織に対してのＦ−ＣＳ−ＰＥの残存性が、炎症関節組織で大きいことである。この結果は、関節炎軟骨表面にフィブロネクチン様物質や免疫複合体が被覆されることと関連するものと考えられる。
【００９８】
製剤例：関節注射用液剤
無菌的に調製したＣＳ−ＰＥ（ロット番号：６０２−２）及びＨＡ−ＰＥ（ロット番号：６００）のそれぞれ４５mgを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に室温で溶解して４５mlとした。これを無菌濾過（ポアサイズ０. ２２μm のメンブレンフィルター使用）し、２. ５mlずつ分注後封入し、１アンプルあたり２. ５mgの上記有効成分をそれぞれ含有する関節注射用液剤を調製した。
【００９９】
【発明の効果】
リウマチ症では、炎症性滑膜細胞の軟骨組織表層への浸潤、すなわちパンヌスが重要な病態である。上述のように、本発明の脂質結合ＧＡＧが炎症性の軟骨表面や滑膜組織に固相化されることによって、伸展してくる炎症性滑膜細胞の関節軟骨組織への接着が阻害されることにより、パンヌスが防止されることが、本発明の薬剤の作用機作として考えられる。従来このような作用機作に基づく抗リウマチ剤は知られておらず、本発明の薬剤は全く新しいタイプの抗リウマチ剤である。
【０１００】
また、脂質結合ＧＡＧには、滑膜組織の炎症症状を改善する作用、すなわち滑膜細胞の異常増殖、フィブリン沈着、リンパ球の濾胞様集合の状態等を弱める作用もあることが見出され、上記パンヌス抑制作用と相まって抗リウマチ剤としてより優れた効果が期待できる。
【０１０１】
本発明薬剤の有効成分である脂質結合ＧＡＧは、元来毒性の極めて低い化合物であるが、炎症部位への局所投与で特に効果を発揮する本発明薬剤は、他の臓器への副作用はほとんどないものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光標識したコンドロイチン硫酸（Ｆ−ＣＳ）又は蛍光標識したＣＳ−ＰＥ（Ｆ−ＣＳ−ＰＥ）を投与した、正常な日本白ウサギの各組織におけるＦ−ＣＳ又はＦ−ＣＳ−ＰＥの残存量を示す。
【図２】蛍光標識したコンドロイチン硫酸（Ｆ−ＣＳ）又は蛍光標識したＣＳ−ＰＥ（Ｆ−ＣＳ−ＰＥ）を投与した、大腸菌誘導関節炎日本白ウサギの各組織におけるＦ−ＣＳ又はＦ−ＣＳ−ＰＥの残存量を示す。
【図１】
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【図２】
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