(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のカテコールアミンを分離カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーで分離して分析するに当たり、試料をイオン交換カラム及びほう酸カラムを用いて前処理した後前記分離カラムに供することを特徴とするカテコールアミン分析方法。
【請求項２】
ほう酸カラムがシリカ系又はポリマー系の基材にボロン酸を固定化したゲルを充填したカラムであることを特徴とする請求項１の分析方法。
【請求項３】
イオン交換カラムがシリカ系又はポリマー系の基材にスルホン基又はカルボキシル基を導入したゲルを充填したカラムであることを特徴とする請求項１の分析方法。
【請求項４】
分離カラムが逆相カラム又はイオン交換カラムであることを特徴とする請求項１の分析方法。
【請求項５】
逆相カラムがシリカ系又はポリマー系の基材にオクタデシル基、オクチル基又はフェニル基を導入したゲルを充填したカラムであることを特徴とする請求項４の分析方法。
【請求項６】
イオン交換カラムがシリカ系又はポリマー系の基材にスルホン基又はカルボキシル基を導入したゲルを充填したカラムであることを特徴とする請求項４の分析方法。
【請求項７】
分離カラムで分離されたカテコールアミン含有画分に１、２−ジフェニルエチレンジアミンを添加してカテコールアミンを蛍光誘導体とし、当該蛍光誘導体を検出することを特徴とする請求項１の分析方法。
【請求項８】
少なくともイオン交換カラム及びほう酸カラムとからなる前処理カラムと分離カラムとを含む、カテコールアミン分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高血圧症や神経系疾患の診断に利用されている、試料中のカテコールアミンの分析方法及びそのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体液等の試料中のカテコールアミン量の分析は、その量が微量であるため、分離カラムで分離されたカテコールアミン含有画分に１、２−ジフェニルエチレンジアミンを添加してカテコールアミンを蛍光誘導体する等して検出感度を高めた種々の高速液体クロマトグラフ法で行われている。特に近年では、夾雑物を除去する目的等でカラムスイッチングを利用する高速液体クロマトグラフ法が多く使われている（例えば、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３年，３０巻，１３５〜１４１頁、臨床検査機器・試薬，１９８８年，第ＸＩ−４号，６３５〜６４１頁等）。即ち、高速液体クロマトグラフにおいて、カラムスイッチングを利用して逆相系カラム及びカチオン交換カラムの２本のカラムで前処理を行った後、分離カラムとしてカチオン交換カラム又は逆相系カラムでカテコールアミン成分を分離して分析する。
【０００３】
この方法によれば、血中の重要なカテコールアミンの一成分である微量のドーパミンも１、２−ジフェニルエチレンジアミンと高感度の蛍光誘導体を生成するため蛍光検出により測定が可能となる。また、尿中のカテコールアミンを高速液体クロマトグラフにおいて測定する際には試料を複雑なアルミナ処理に供定する必要があったが、この方法によればカラムスイッチングにより自動に夾雑物質を除くことも可能である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
１、２−ジフェニルエチレンジアミンを蛍光誘導体試薬として用いる高速液体クロマトグラフ法に限らず、従来の前処理カラムを用いる分析方法では、被験者が薬物投与を受けている場合等、試料中に投与された薬物が混入し、この結果、測定の際に夾雑ピークが現れ、カテコールアミン分析に影響を及ぼし正確な測定が行えない場合がある（例えば、臨床検査機器・試薬，１９８８年，第ＸＩ−４号，６３５〜６４１頁、日本臨床検査自動化学会第２７回大会予行集，１９９５年，２０巻，４４６頁）。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来から使用されている１、２−ジフェニルエチレンジアミンを蛍光誘導体試薬として用いて試料中のカテコールアミンを高速液体クロマトグラフ法で分析する方法において、前述のような薬物混入の影響を排除することを目的として鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち本発明は、試料中のカテコールアミンを分離カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーで分離して分析するに当たり、試料をイオン交換カラム及びほう酸カラムを用いて前処理した後前記分離カラムに供することを特徴とするカテコールアミン分析方法及びこの分析に使用するための、少なくともイオン交換カラム及びほう酸カラムとからなる前処理カラムと分離カラムとを含む、カテコールアミン分析装置である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
従来多く用いられている１、２−ジフェニルエチレンジアミンを蛍光誘導体試薬として用いる高速液体クロマトグラフィーでは、カラムスイッチングを利用して逆相カラム及びカチオン交換カラムの２本の前処理カラムで前処理を行った後、カチオン交換カラム又は逆相カラムでカテコールアミン成分を分離する。しかし、本発明においては、このカラムスイッチング法又はその他の方法によりカチオン交換カラム及びほう酸カラムの２本の前処理カラムで前処理を行った後、逆相カラム又はイオン交換カラムでカテコールアミン成分を分離する。
【０００８】
２本の前処理カラム、即ちカチオン交換カラム及びほう酸カラムは、前処理を行うに際し、いずれのカラムを先としても良い。即ち、例えば試料をカチオン交換カラム、ほう酸カラムの順に供しても良いし、この逆に供しても良い。
【０００９】
前処理に用いるカチオン交換カラムは、例えばシリカ系又はポリマー系のゲルに交換基としてスルホン基、カルボキシル基等を導入したゲルを充填したカラムを使用することが例示できる。一方前処理に用いるほう酸カラムは、シリカ系又はポリマー系のゲルに交換基としてほう酸、フェニルボロン酸等のホウ素化合物を交換基として導入したゲルを充填したカラムを使用することが例示できる。
【００１０】
以上に例示した様な前処理カラムに供された試料中のカテコールアミンは、最終的に分離カラムで分離される。分離カラムとしては試料中のカテコールアミンを分画し得るものであれば制限はないが、特に逆相カラム又はカチオン交換カラムが好ましい。例えば逆相カラムとしてはシリカ系又はポリマー系のゲルに交換基としてオクタデシル基、オクチル基又はフェニル基等を導入したゲルを充填したカラムが、カチオン交換カラムとしてはシリカ系又はポリマー系のゲルに交換基としてスルホン基、カルボキシル基等を導入したゲルを充填したカラムがそれぞれ例示できる。
【００１１】
通常、異なるカラムに試料を供する際に使用する溶離液は当該カラムの種類及び使用目的により組成を変更させるのが普通である。少なくとも２種類のカラムを使用する本発明においても、分離カラムではカテコールアミンの分離能を向上するためにリン酸緩衝液等の緩衝液でｐＨを３〜６のものを用することが好ましい。一方前処理カラムでは、カチオン交換カラムにおいてはカテコールアミン画分以外の疎水性物質をトラップ（吸着）しないようにリン酸緩衝液やクエン酸緩衝液等の緩衝液にエタノールやアセトニトリル等の有機溶媒を添加した溶液が、ほう酸カラムではカテコールアミン画分をトラップできるようにｐＨが８以上でリン酸ナトリウムや硝酸ナトリウム等の塩を２００ｍＭ以上含んだ溶液が好ましい。
【００１２】
本発明は、前記したように従来の分析方法と比較して夾雑物質をより効果的に排除するためになされたものであり、最終的に分画されたカテコールアミンの量をいかにして測定するかについて特に制限されるものではない。例えば薬物投与を受けている被験者からの尿や血漿等の生体試料について本発明を適用することにより、試料中に投与された薬物が混入していたとしてもその影響を排除し、カテコールアミン画分を取得すること、即ち正確なカテコールアミン分析が可能となる。従って、取得されたカテコールアミン画分については、例えば電気化学検出器による測定等の通常の分析操作を行えば、試料中のカテコールアミンを測定することが可能である。例えば分離カラムで分離されたカテコールアミン画分に対し、１、２−ジフェニルエチレンジアミン等を添加・反応させて蛍光誘導体を生成させ、蛍光検出を実施する方法は、その容易性、感度の高さ等の観点から特に好ましい。このように蛍光誘導体を生成させるには、同様に特に好ましい方法として、エチレンジアミンと反応させる方法や１、２−ジフェニルエチレンジアミン又はエチレンジアミンと反応させて蛍光誘導体を生成させた後、過シュウ酸エステル化学発光反応を利用して発光検出器により測定する方法等を例示できる。
【００１３】
本発明の分析方法は、例えば使用する前処理及び分離カラムを調製しておき、手作業で試料を順次供することによっても実施できるが、実施例に示したようにカラムスイッチング法を利用することが操作の容易性や操作に要する時間を短縮できるという観点で特に好ましい。
【００１４】
本発明のカテコールアミン分析装置は、前述の前処理カラム及び分離カラムを含むことを特徴とし、好ましくは、市販のサンプラー等で構成される前処理カラム及び分離カラムへの試料導入手段とを更に備え、例えば前述のごとき蛍光誘導体を生成させる方法を実施するのであれば、更に蛍光誘導体化試薬導入手段、蛍光誘導体化試薬と試料を反応させるための反応部及びカテコールアミンの蛍光誘導体の蛍光強度を検出するための蛍光検出手段とを有する装置である。
【００１５】
図１に例示した装置は、蛍光誘導体を生成させる方法に用いる、カラムスイッチング法を採用した特に好ましい本発明の装置の一例である。この装置では、前処理のための溶液１、２、カテコールアミン成分を分離するための溶離液３、蛍光誘導体化のための反応液４、５、溶液を切り換える３方電磁弁６、７、溶液または反応液を送液するポンプ８〜１１を含む。
【００１６】
試料１３はオートサンプラー部シリンジポンプ１５によりインジェクションバルブ１６を経てサンプルループ１２に導入される。導入された試料はポンプ８により前処理カラム１７に導入され、前処理カラムに吸着されない親水性物質は切り換えバルブ１８を経て廃棄させる。カテコールアミン成分は切り換えバルブ１を経て前処理カラム１９に導入される。前処理カラム１９に吸着されないアニオン性物質は切り換えバルブ２０を経て廃棄させる。カテコールアミン成分は切り換えバルブ２０を経て分離カラム２１に導入され分離される。分離されたカテコールアミン成分はポンプ１０、１１で送液される反応液４、５と混合され反応オーブン２２に導かれ蛍光誘導体化される。蛍光誘導体化されたカテコールアミン成分は蛍光検出器２３で検出される。
【００１７】
本例においては、２本の前処理カラムの位置を逆にすることが可能である。また、溶液及び反応液流量、反応オーブンの温度、切り換えバルブ及び３方電磁弁の制御、検出ピークの定量等をマイクロコンピュータにより自動制御することにより、自動的に信頼性の高い分析結果を得ることも可能である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
図１に示した構成の装置を用いてカテコールアミンの分析を行った。ポンプ  （８〜９）の流速はそれぞれ１．３、１．０、０．４、０．４ｍｌ／分に設定した。前処理カラム１７、１９及び分離カラム２１としては市販のカラム（それぞれＴＳＫｇｅｌＳＰ−５ＰＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１１．５ｃｍ）、ＴＳＫｇｅｌＢｏｒａｔｅ−３ＰＷ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３．５ｃｍ）、ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔｍ（６．０ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５ｃｍ）（全て東ソー（株）製）を使用した。
【００２０】
溶液１は１０ｍＭのリン酸ナトリウム、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、３５０ｍＭの硝酸ナトリウム及び５％のエタノールを含むｐＨ８．８の溶液を、溶液２はアセトニトリルを含む市販の溶液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用溶離液Ｂ、東ソー（株）製）を、溶液３は１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸及び１５０ｍＭの硝酸ナトリウムを含むｐＨ４．０の溶液を使用した。
【００２１】
反応液４及び５としては、１、２−ジフェニルエチレンジアミンを含む市販のカテコールアミン分析用の反応試薬（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用反応試薬Ｄ、東ソー（株）製）を５０％エタノール溶液で調製した溶液及びフェリシアン化カリウムを含む市販の反応液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用反応液Ｅ、東ソー（株）製）を使用した。
【００２２】
三方電磁弁６及び７、切り換えバルブ１８及び２０の切り換え時間を、それぞれＯＮ２０．０−ＯＦＦ３２．０、ＯＮ３６．０−ＯＦＦ３７．５、ＯＮ０．０−ＯＦＦ３．５、ＯＮ１７．０−ＯＦＦ２６．０分とした。また試料のインジェクションは４７分ごとにした。
【００２３】
既知試料の溶出パターンを得るためにノリエピネフリン（以下ＮＥとする）、エピネフリン（以下Ｅとする）及びドーパミン（ＤＡとする）の３種類がそれぞれ１０ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で含まれる試料を測定したところ、検出時間は２７．１４、２９．９６、３４．４４分となった。この結果を図２に示す。
【００２４】
実際にさまざまな薬物投与を受けている被験者の尿検体４種類について測定操作を実施した。その結果は表１及び図５〜８に実検体１〜４として示す。なお、被験者の尿試料については、文献に記載された方法（臨床検査機器・試薬，１９８８年，第ＸＩ−４号，６３５〜６４１頁）と同様に前処理操作を行い測定を行った。表１中、Ｘは測定不能であることを、＜は検出限界以下であることをそれぞれ示す。
【００２５】
実施例２
図１に示した装置において、前処理カラム１７、１９及び分離カラムとして市販のカラムセット（ＴＳＫ  Ｃａｔｅｃｈｏｌ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｔ  Ｆ、東ソー（株）製）を使用した。溶液１及び２には、それぞれ市販の溶液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用溶離液Ａ及びＢ、東ソー（株）製）を使用し、溶液３としては、市販の溶離液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用溶離液Ｆ、東ソー（株）製）を使用した。反応液４及び５としては、それぞれ市販のカテコールアミン分析用の反応試薬（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用反応試薬Ｄ、東ソー（株）製）を５０％エタノール溶液で調製した溶液、市販の反応液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用反応液Ｅ、東ソー（株）製）を使用した。
【００２６】
三方電磁弁６及び７、切り換えバルブ１８及び２０の切り換え時間をそれぞれＯＮ１１．０−ＯＦＦ１６．０、ＯＮ１９．５−ＯＦＦ２１．０、ＯＮ０．０−ＯＦＦ０．６、ＯＮ５．５−ＯＦＦ１５．０分とした。また試料のインジェクションは２５分ごとにした。既知試料の溶出パターンを得るためにＮＥ、Ｅ及びＤＡの３種類がそれぞれ１ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で含まれた試料を測定したところ、検出時間は１２．９９、１４．４９、２０．０８分となった。この結果を図３に示す。
【００２７】
実際にさまざまな薬物投与を受けている被験者の尿検体４種類について測定操作を実施した。その結果は表１及び図５〜８に実検体１’〜４’として示す。なお、被験者の尿試料については、文献に記載された方法（臨床検査機器・試薬，１９８８年，第ＸＩ−４号，６３５〜６４１頁）と同様に前処理操作を行い測定を行った。
【００２８】
実施例３
図１に示した装置において、前処理カラム１７、１９及び分離カラム２１として市販のカラムセット（ＴＳＫ  Ｃａｔｅｃｈｏｌ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｔ、東ソー（株）製）を使用した。溶液１、２及び３としては、それぞれ市販の溶離液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用溶離液Ａ、Ｂ及びＣ、東ソー（株）製）を使用した。反応液４及び５としては、それぞれ市販のカテコールアミン分析用の反応試薬（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用反応試薬Ｄ、東ソー（株）製）を５０％エタノール溶液で調製した溶液、市販の反応液（カテコールアミン分析装置ＨＬＣ−７２５ＣＡ用反応液Ｅ、東ソー（株）製）を使用した。
【００２９】
三方電磁弁６及び７、切り換えバルブ１８及び２０の切り換え時間を、それぞれＯＮ４．０−ＯＦＦ１８．０、ＯＮ０．０−ＯＦＦ０．０、ＯＮ０．０−ＯＦＦ４．０、ＯＮ９．０−ＯＦＦ１３．０分とした。また試料のインジェクションは２８分ごとにした。既知試料の溶出パターンを得るためにＮＥ、Ｅ及びＤＡの３種類がそれぞれ１ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度で含まれた試料を測定したところ、検出時間は２６．１３、２３．９３、２８．７８分となった。この結果を図３に示す。
【００３０】
実際にさまざまな薬物投与を受けている被験者の尿検体４種類について測定操作を実施した。その結果は表１及び図５〜８に実検体１’’〜４’’として示す。なお、被験者の尿試料については、文献に記載された方法（臨床検査機器・試薬，１９８８年，第ＸＩ−４号，６３５〜６４１頁）と同様に前処理操作を行い測定を行った。
【００３１】
【表１】
0003704594.tif 000002
【００３２】
【発明の効果】
さまざまな薬物の含まれたカテコールアミン試料を測定すると、前処理カラムとして逆相系カラムとカチオン交換カラムを用いる従来の方法では、エピネフリン、ノリエピネフリン及びドーパミン等の分析に影響が生じて正確な測定が困難となり、時には測定不能の事態が生じることもある。
【００３３】
これに対して本発明では、これら薬物の含まれたカテコールアミン試料について、より正確な分析が可能になると同時に、測定不能の事態を減少させることが可能である。
【００３４】
本発明の分析方法は、例えばカラムスイッチング法を使用することにより全自動化することも可能であり、臨床的に重要なカテコールアミン分析を、より迅速かつ正確でしかも自動的に実施することを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で使用した、本発明のカテコールアミン分析計の概要図を示すものである。
【図２】実施例１のカテコールアミン標準試料の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。
【図３】実施例２のカテコールアミン標準試料の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。
【図４】実施例３のカテコールアミン標準試料の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。
【図５】実施例１〜３におけるの実検体１の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。図中、実検体１は実施例１の結果を、実検体１’は実施例２の結果を、実検体３’’は実施例３の結果を示す。
【図６】実施例１〜３におけるの実検体２の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。図中、実検体２は実施例１の結果を、実検体２’は実施例２の結果を、実検体２’’は実施例３の結果を示す。
【図７】実施例１〜３におけるの実検体３の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。図中、実検体３は実施例１の結果を、実検体３’は実施例２の結果を、実検体３’’は実施例３の結果を示す。
【図８】実施例１〜３におけるの実検体４の分析結果のクロマト図である。図中のＮＥ、Ｅ、ＤＡはそれぞれノリエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンを示す。図中、実検体４は実施例１の結果を、実検体４’は実施例２の結果を、実検体４’’は実施例３の結果を示す。
【符号の説明】
１〜３      溶液
４、５      反応液
６、７      ３方電磁弁
８〜１１    ポンプ
１２        サンプルループ
１３        試料
１４        オートサンプラー部３方電磁弁
１５        オートサンプラー部シリンジポンプ
１６        インジェクションバルブ
１７、１９  前処理カラム
１８、２０    切り換えバルブ（実線はＯＦＦを点線はＯＮの状態を示す）
２１        分離カラム
２２        反応オーブン
２３        蛍光検出器
２４        イオン交換水
【図１】
0003704594.tif 000003
【図２】
0003704594.tif 000004
【図３】
0003704594.tif 000005
【図４】
0003704594.tif 000006
【図５】
0003704594.tif 000007
【図６】
0003704594.tif 000008
【図７】
0003704594.tif 000009
【図８】
0003704594.tif 000010