(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼのアミノ酸配列の２４３位のシステインまたは２４３と２７９位双方のシステインがＬ−アラニンで置換されてなることを特徴とする、Agrobacterium radiobacter由来のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの安定な変異体。
【請求項２】
２４３および２７９位のシステインアミノ酸残基がアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されてなる、請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体。
【請求項３】
請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードする、ヌクレオチド。
【請求項４】
２４３位のシステインまたは２４３と２７９位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードする、請求項３に記載のヌクレオチド。
【請求項５】
２４３および２７９位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードする、請求項３に記載のヌクレオチド。
【請求項６】
２４３位のシステインまたは２４３と２７９位双方のシステインがＬ−アラニンで置換された、Agrobacterium radiobacter由来のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、発現プラスミド。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が、２４３および２７９位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードしている、請求項６に記載の発現プラスミド。
【請求項８】
Ｄ‐ヒダントイナーゼ酵素をコードする遺伝子であって、プラスミドｐＳＭ６５１（寄託番号ＣＢＳ２０３．９４）に含まれる遺伝子を含んでなる、請求項６または７に記載の発現プラスミド。
【請求項９】
Centraalbureau Voor Schimmelculturesに寄託され、寄託番号ＣＢＳ２０４．９４を受けている、請求項７に記載のプラスミドｐＳＭ６４５。
【請求項１０】
２４３位のシステインまたは２４３と２７９位双方のシステインがＬ−アラニンで置換された、Agrobacterium radiobacter由来のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるプラスミドで形質転換された枯草菌および大腸菌の群から選択される微生物。
【請求項１１】
プラスミドが、２４３および２７９位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
プラスミドがＤ‐ヒダントイナーゼをコードするヌクレオチド配列であって、プラスミドｐＳＭ６５１（寄託番号ＣＢＳ２０３．９４）に含まれる配列を含んでなるものである、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１３】
大腸菌ＳＭＣ３０６  ＣＢＳ２０４．９４である、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１４】
請求項７に記載のプラスミドで形質転換された大腸菌および枯草菌から選択される微生物の培養と、こうして得られた変異体の分離および精製が行われることを特徴とする、請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体の製造方法。
【請求項１５】
プラスミドが、２４３位のシステインまたは２４３と２７９位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
プラスミドが、２４３および２７９位双方のシステインがアミノ酸残基Ｌ‐アラニンで置換されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体をコードするヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｄ‐Ｎ‐カルバミルアミノ酸または５‐置換ヒダントインのラセミ混合物の立体特異性変換によるＤ‐α‐アミノ酸の製造方法であって、変換反応が、請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体および／またはプラスミドｐＳＭ６５１（寄託番号２０３．９４）にコードされてなるＤ‐ヒダントイナーゼおよび請求項１に記載のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体からなる酵素系を生産できる微生物の存在下で行われることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
変換反応がＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体および／またはＤ‐ヒダントイナーゼおよびＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体からなる酵素系を生産できる微生物から単離された上記変異体および／または上記酵素系の存在下で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体および／またはその変異体を含んだ酵素系が不溶性固体支持体上に固定されてなる、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、野生型酵素の場合と比較して改善された酵素安定性を有するＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体、それらの製造手段および方法、およびＤ‐α‐アミノ酸の製造についてのそれらの使用に関する。
【０００２】
背景技術
酵素の工業的使用が限定されるのは、一般的にそれらの高い製造および精製コストのためだけではなく、知られているように、一連の因子、例えば熱変性、酸化現象と疎水性および／または共有タイプの結合に起因する凝集に基づくそれらの不安定性のためでもある。
【０００３】
したがって、酵素の不安定性の原因を突き止めることが、酵素方法を改善してそれをもっと有用なものにする解決策を見つける上で最も重要である。他方、(i) この不安定性の原因と、(ii)酵素の活性を変えずに不安定性を解消または減少する上で可能な方策とを正確に示すことはしばしば困難性を伴う。
【０００４】
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼは、Ｄ‐Ｎ‐カルバミル‐α‐アミノ酸を立体特異性加水分解により、対応Ｄ‐α‐アミノ酸に変換することができる酵素である。これらの光学活性化合物は、薬理活性物質（例えば、Ｄ‐フェニルグリシンおよびＤ‐パラヒドロキシフェニルグリシンは、ペニシリン類およびセファロスポリン類の合成に用いられる）、農薬（殺虫剤フルバニレート合成用のＤ‐バリン）または甘味料（Ｄ‐アラニン）の合成に重要な中間体である。
【０００５】
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼは、それが用いられる工業的方法の収率およびコストをかなり悪化させる不安定化現象もうけやすい。
【０００６】
【発明の概要】
上記技術の欠点を克服することが本発明の目的である。
特に、本発明によると、野生型Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼのシステイン２４３、２５０、および２７９のうち少くとも一つの異なるアミノ酸残基による置換により、この酵素を安定化させることができて、Ｄ‐α‐アミノ酸の製造収率を改善することが見出された。
これによれば、本発明の第一の態様は、２４３、２５０、および２７９位におけるシステインアミノ酸残基のうち少くとも一つが天然アミノ酸の群から選択される異なるアミノ酸残基で置換されてなることを特徴とする、改善された酵素安定性を有したＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体に関する。
改善された安定性を有するＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの少くとも１つの変異体をコードするヌクレオチド配列が、本発明のもう１つの対象である。
本発明は上記配列を含んでなる複製性発現ベクターにも関する。
本発明のもう１つの対象は、上記ベクターで形質転換された微生物に関する。
適切な条件下で形質転換微生物を培養し、こうして得られた変異体を分離することからなる、改善された安定性を有するＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの少くとも一つの変異体の製造方法が、本発明のもう１つの態様である。
本発明は、Ｄ‐α‐アミノ酸の製造方法における、上記形質転換微生物または上記微生物から得られたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体の用途にも関する。
【０００７】
【発明の具体的説明】
本発明の他の目的は、下記記載および例から明らかである。
特に、本発明によるＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体は、野生型酵素のアミノ酸配列の２４３、２５０、または２７９位におけるシステイン残基（Ｃｙｓ）のうち少くとも１つがＬ‐アラニン、Ｌ‐セリン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐アルギニン、Ｌ‐アスパラギン酸、Ｌ‐グルタミン酸、Ｌ‐アスパラギン、Ｌ‐グルタミン、Ｌ‐ヒスチジン、Ｌ‐グリシン、Ｌ‐ロイシン、Ｌ‐イソロイシン、Ｌ‐バリン、Ｌ‐チロシン、Ｌ‐トレオニン、Ｌ‐トリプトファン、Ｌ‐フェニルアラニン、Ｌ‐メチオニン、またはＬ‐プロリンから選択される異なる残基で置換されていることを特徴とする。
【０００８】
本発明のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体は：
ａ）Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼをコードする遺伝子の特定部位に一以上の変異を導入し、
ｂ）工程ａ）で得られた変異誘発させた遺伝子をクローニングベクターにクローニングし、
ｃ）工程ｂ）で得られた組換えベクターで宿主株を形質転換し、
ｄ）工程ｃ）で形質転換された宿主株を適切な培地で培養し、そして
ｅ）こうして得られたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体を分離および精製する
ことからなる方法で製造される。
【０００９】
遺伝子の既定部位における変異の導入は、インビトロで公知変異誘発技術の１つを用いて実施できる。ＤＮＡ配列上にある特定の既定部位で修正を行う様々な技術の中では、一本鎖の合成オリゴヌクレオチドを用いる技術が最も広く用いられている。
【００１０】
特に、Zoller,M.J.and Smith,M.,(1982),Nucl.Acid.Res.,10,6487-6500に記載された方法の修正法が用いられ、その方法では：
１）Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼまたはこの一部（標的配列）の遺伝子をＭ１３タイプバクテリオファージまたはそれに由来するプラスミド中に導入して、変異遺伝子の合成用の鋳型として有用な一本鎖でそれを作り、
２）変異を決定する内部部分を除いて変異誘発される配列に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、
３）合成オリゴヌクレオチドを鋳型にアニーリングさせ（これは第二修飾鎖の合成用のプライマーとして作用する）、
４）インビトロで１回の重合および結合により二本鎖の環状構造（１本のフィラメントは親であり、他方は望ましい変異を含んでいる）を再構成し、
５）親フィラメントを除去し、インビトロで１回の重合および結合により二本鎖の環状構造（双方のフィラメントが望ましい変異を含んでいる）を再構成し、
６）変異および野生型クローンの集団を得ることによりコンピテント(competento)化された宿主細胞を形質転換するために二本鎖形を用い、
７）変異クローンを選択する。
【００１１】
変異誘発されるＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの遺伝子に関して、これは微生物、例えばPseudomonas 、Hansenula 、Agrobacterium 、Aerobacter、Aeromonas 、Bacillus、Moraxella 、Brevibacterium、Flavobacterium、Serratia、Micrococcus 、Arthrobactor、またはParacoccusから単離することができる。これら微生物の具体例としてはBacillus macroides ATCC 12905 、Aerobacter cloacae IAM 1221 、Agrobacterium sp.IP I-671 、Agrobacterium radiobacter NRRLB 11291 、Pseudomonas sp.FERM BP 1900 が挙げられる。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、Agrobacterium radiobacter NRRLB 11291 に由来するＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼ遺伝子が変異誘発された。
Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡの断片が制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 切断によりプラスミドｐＳＭ６５１（ＣＢＳ２０３．９４）から単離され、電気泳動ゲルによる精製後、それが同制限酵素で切断された後のバクテリオファージＭ１３ｍｐ８に公知技術を用いて結合された。
【００１３】
得られたリガーゼ混合物はDagert,M.and Ehrlich(1979),Gene,6:23に記載されたようにコンピテント化されたEscherichia coli７１／１８（大腸菌）の細胞を形質転換するために用いられ、形質転換株が多数の陽性組換えプラークを得るために適した培地上で選択された。
【００１４】
陽性プラークの１つから一本鎖を作った後、これは望ましい変異を導入するための鋳型として用いられた。特に、下記合成オリゴヌクレオチドがＣｙｓ→Ａｌａ置換を２４３、２５０、および２７９位に導入するために用いられた：
（１）5´ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  Ｃ3´
（２）5´ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＧＣＣ3´
（３）5´ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ3´
【００１５】
オリゴヌクレオチドの合成は市販装置、例えばオリゴ１０００ＤＮＡシンセサイザー(Beckman) を用いて、公知方法で実施できる。
【００１６】
次いで、第二修飾フィラメントの合成用のプライマーとして作用する合成オリゴヌクレオチドへの一本鎖のカップリングが行われる。
【００１７】
望ましい変異を得た後、一方のフィラメントが親で、他方が望ましい変異を起こした標的配列の環状二本鎖構造が、インビトロで１回の重合および結合により再構成された。
【００１８】
親フィラメントはヘキソヌクレアーゼで除去され、その後環状二本鎖構造が再重合および結合により再構成される。この構造において、双方のフィラメントは変異を含んでいる。
【００１９】
上記反応混合物は、大腸菌ＴＧ１のコンピテント細胞を形質転換して、組換えバクテリオファージプラークを得るために用いた。各変異誘発実験から得られる陽性組換えプラークのゲノムに含まれたカルバミラーゼ遺伝子は、Sanger et al.(PNAS(1977),74:5463) により記載された方法に基づき、市販キット SequenaseＲ（ＵＳＢ）を用いて配列決定した。
【００２０】
本発明の変異体の活性および安定性の特徴を確かめるために、上記のように変異誘発された遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌細胞が、適切な培地中３７℃で１６時間培養された。次いで細胞溶解物から得られたタンパク質抽出物が、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムを含有したポリアクリルアミドゲル上の電気泳動）および光学密度計測分析により分析された。結果は、変異体が互いに匹敵して、野生型酵素の発現レベルに類似した量で発現されることを示した。
【００２１】
Weatherburn,M.W.,(1967),(Anal.Chem.,39:971) に記載されたように生抽出物で行われた活性試験では、すべての変異体について野生型酵素の場合に匹敵する活性を示した。
【００２２】
異なる時間に室温（２０〜２５℃）で行われた安定性研究では、試験された変異体について野生型Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの場合よりも高い安定性を示した（例９および図１）。
【００２３】
事実、８８８時間後に野生型酵素はその活性を完全に喪失したが、二重変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａの場合は６３％の残留活性が観察され、１８９６時間後に３２％であった。
【００２４】
加えて、Ｄ‐Ｎ‐カルバミル‐パラヒドロキシフェニルグリシンを同量の変異酵素Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａおよび野生型酵素と接触させることにより行われた研究では、同反応時間で、変異酵素がＤ‐パラヒドロキシフェニルグリシンの製造収率で改善を示すことを示した（例１０および図２）。
【００２５】
本発明によれば、上記のように変異誘発された遺伝子は、宿主株でその発現を調節する配列のコントロール下にその遺伝子を正確に配置することにより、クローニングベクター中に導入できる。
【００２６】
目的に適したベクターは、市場または公的な貯蔵センターで入手しうるプラスミド、バクテリオファージ、およびコスミドから選択することができる。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、変異誘発されたカルバミラーゼ遺伝子はＤ‐ヒダントイナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んだプラスミド例えばｐＳＭ６５１（ＣＢＳ２０３．９４）中にクローニングされる。
【００２８】
特に、ヒダントイナーゼおよび野生型カルバミラーゼ遺伝子（ヒダントイナーゼ‐カルバミラーゼオペロン）をベクターｐＳＭ６７１（ＣＢＳ２０５．９４）中に挿入することで得られた上記プラスミドは、それが大腸菌および／または枯草菌中でコントロール下におかれた遺伝子の発現をかなり効率的にインダクターなしで指示できる合成プロモーターを含んでいることで特徴付けられる。
【００２９】
同様の変異誘発された遺伝子による野生型Ｄ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼをコードする遺伝子の置換から、Ｄ‐ヒダントイナーゼ酵素およびＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体からなる酵素系を発現できる組換えプラスミドを組立てる。
【００３０】
変異誘発されたＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼ遺伝子または変異誘発されたヒダントイナーゼ‐カルバミラーゼオペロンを含む組換えプラスミドは枯草菌および／または大腸菌の群から選択される宿主微生物中に導入することができる。
【００３１】
次いで、これらの微生物は炭素および窒素の同化源と、異なるカチオン、アニオンおよび、場合により微量のビタミン、例えばビオチンまたはチアミン、あるいはアミノ酸を含有した水性培地中、好気的条件下で培養される。
【００３２】
同化性炭素源には炭水化物、例えばグルコース、加水分解アミド、糖蜜、スクロースまたは他の慣用的な炭素源がある。
【００３３】
窒素源の例は、例えば無機アンモニウム塩、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムと、尿素または有機もしくは無機窒素含有物質、例えばペプトン、酵母または肉エキスから選択することができる。
【００３４】
下記カチオンおよびアニオン、即ちカリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸のリン酸、硫酸、塩化物、マンガンおよび硝酸イオンが本発明の目的にとり同等に適している。
【００３５】
発酵は２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度、６〜７．５、好ましくは６．５〜７．０のｐＨにおいて、攪拌下で行われる。
【００３６】
慣用的技術、例えば遠心または濾過で培地から回収された細胞（バイオマス）はＤ‐α‐アミノ酸の製造に用いられ、または細胞がヒダントイナーゼおよび変異カルバミラーゼ酵素を発現するときには、５‐置換ヒダントインのラセミ混合物の製造に用いられる。
【００３７】
一方、Ｄ‐α‐アミノ酸の製造においては、超音波処理またはFrench-Pressによる細胞の破壊から得られた細胞抽出物、慣用的技術を用いて精製または部分精製された双方の酵素、あるいは不溶性支持体に固定された酵素が使用できる。
【００３８】
多数のＤ‐Ｎ‐カルバミルアミノ酸および５位で置換されたヒダントインが本発明の目的に使用できる。５位で可能な置換基は炭素原子数１〜６の直鎖または分岐鎖アルキル基から選択されるが、そのアルキル基はヒドロキシル、カルボキシル、スルフヒドリルもしくはアミノ基またはフェニルもしくはベンジル基で一または多置換でき、更に後者の置換基はオルト、メタおよびパラ位に１以上の置換基を含むことができる。
【００３９】
５‐置換ヒダントインの例としては、Ｄ，Ｌ‐５‐フェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐パラヒドロキシフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐メトキシヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐イソプロピルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐チエニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐パラメトキシフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐パラクロロフェニルヒダントイン、Ｄ，Ｌ‐５‐ベンジルヒダントインが挙げられる。
【００４０】
対応Ｄ‐α‐アミノ酸における出発基質（５‐置換ヒダントインまたはＤ‐Ｎ‐カルバミルアミノ酸）の変換反応は、密封容器中、窒素雰囲気下において、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で行われることが好ましい。
反応培地のｐＨは６〜１０、好ましくは７〜８．５の値内に維持される。このｐＨ調節は、例えば塩基性水溶液、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたはカリウムの水溶液を加えることにより実施できる。
【００４１】
基質の初期濃度は通常２〜３０重量％である。
【００４２】
反応混合液に加えられるバイオマスまたは酵素の量は、酵素に対する基質の具体的親和性に依存している。１／１〜１／５０のバイオマス／基質重量比が通常使用できる。
【００４３】
本発明の方法で製造されたＤ‐α‐アミノ酸は、従来よりの方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはアミノ酸の等電点沈降を用いて反応環境から回収することができる。
【００４４】
本発明はA.radiobacter のＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼの変異体の製造に関するが、他の微生物から得られる相同的酵素の修正にも適用しうることは明らかである。
【００４５】
本発明によれば、プラスミドｐＳＭ６４５は大腸菌ＳＭＣ３０６としてCentraalbureau Voor Schimmelcultures,SK Baarn(Holland)に受託され、そこで寄託番号ＣＢＳ２０４．９４が付された。
【００４６】
【実施例】
下記実験例は本発明を更に説明するが、その範囲を制限するものではない。
例１
バクテリオファージＭ１３ｍｐ８の複製形におけるＤ‐Ｎ‐カルバミラーゼをコードする遺伝子の断片ＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII のクローニング：
プラスミドｐＳＭ６５１  ＣＢＳ２０３．９４（１μｇ）を３７℃で６０分間かけて１単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII (Boehringer)により切断した。
【００４７】
酵素反応を６５℃で１０分間阻止した後、反応混合物を低融点アガロースゲル上に０．８％で置き、５０ボルトで２時間処理した。次いでＤ‐Ｎ‐α‐カルバミラーゼをコードする配列を含んだ９１５塩基対（ｂｐ）のＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII バンドをGelaseTM(Epicentre Technologics)により精製した。
【００４８】
このバンドに相当するＤＮＡ断片（０．０２μｇ）を、同制限酵素で切断した後のベクターＭ１３ｍｐ８（５０ng）に結合させた。リガーゼ反応は６６mMトリスＨＣｌ  ｐＨ７．６、１mMＡＴＰ、１０mMＭｇＣｌ２、１０mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有混合液２０μｌ中Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１Ｕの存在下１６℃で１６時間行った。
【００４９】
次いでリガーゼ混合液の一部（５μｌ）を用いて、５０mMＣａＣｌ２でコンピテント化された大腸菌７１／１８（ＢＲＬ）の細胞を形質転換させた(Dagert,M.and Ehrlich(1979),Gene,6:23)。
【００５０】
次いで形質転換株を４０μg/mlのＸ‐Ｇａｌ（５‐ブロモ‐４‐クロロ‐３‐インドリル‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド）および１２５μg/mlのＩＰＴＧ（イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド）含有のＹＴ寒天（８g/ｌバクトトリプトン(DIFCO) 、５g/ｌＮａＣｌ）のプレート上で選択した。
【００５１】
上記のように操作して、多数の陽性組換えプラーク（白色）を得たが、これは非組換え体（青色）と容易に区別することができた。
【００５２】
ＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII 断片の挿入が正確に行われたかを確認するために、二本鎖バクテリオファージＤＮＡ（複製形またはＲＦ）をいくつかの陽性プラークから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 酵素(Boehringer)で切断した。
【００５３】
部位特定変異誘発段階で鋳型として用いられる一本鎖バクテリオファージＤＮＡ（ＳＳ）を陽性プラークの１つから作ったが、これは正確な挿入を示した。
【００５４】
例２
部位特定変異誘発
望ましい変異を導入するために用いられたオリゴヌクレオチドは、オリゴ１０００ＤＮＡシンセサイザー(Beckman) を用いて、公知方法により合成した。特に、そのオリゴヌクレオチドは下記配列を有している：
（１）5´ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  Ｃ3´変異Ｃｙｓ２４３→Ａｌａを挿入する；
（２）5´ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  3´変異Ｃｙｓ２５０→Ａｌａを挿入する；
（３）5´ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＣＧＡ  ＧＡＴ3´変異Ｃｙｓ２７９→Ａｌａを挿入する。
【００５５】
下線の塩基はシステインのコドンをアラニンのコドンで置換するために用いられる塩基である。
【００５６】
オリゴヌクレオチドは、１００mMトリスＨＣｌ  ｐＨ８、１０mMＭｇＣｌ２、５mMＤＴＴ、１mMＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega) ２Ｕ含有の反応混合液３０μｌ中３７℃で３０分間のインキュベートにより、鎖の５´末端側でリン酸化させた。
【００５７】
次いでリン酸化オリゴヌクレオチドは、製造者の指示に従い操作するため、Zoller and Smith(1983,Methods in Enzymol.,100:468-500)に記載された方法に基づき、系“オリゴヌクレオチド‐特定部位インビトロ変異誘発バージョン２”(Amersham)を用いて、インビトロで３種の変異誘発反応に別々に用いた。
【００５８】
次いで反応混合物は前記のように大腸菌ＴＧ１(Amersham)の細胞を感染させるために用いた。
【００５９】
各変異誘発実験から得られる白色プラークに由来するバクテリオファージＤＮＡは、望ましい変異の存在を確認するために、Sanger et al.(PNAS(1977),74:5463) に記載された方法に基づき"Sequenase 2.0" キット(United States Biochemical) で配列決定した。
【００６０】
例３
プラスミドｐＳＭ６７１における変異体Ｃｙｓ→Ａｌａのサブクローニング
システインからアラニンへの置換を含んだ組換えバクテリオファージの二本鎖ＤＮＡの各々１．０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII(２Ｕ）で切断し、その後同制限酵素で既に切断されたプラスミドｐＳＭ６７１  ＣＢＳ２０５．９４（１μｇ）と結合させた。リガーゼ反応はＴ４  ＤＮＡリガーゼ２Ｕ、バクテリオファージＤＮＡ１５０ngおよびプラスミドＤＮＡ５０ngを含有したリガーゼ緩衝液２０μｌ中１６℃で１６時間行った。
【００６１】
次いで各混合液５μｌを用いて、大腸菌７１／１８（ＢＲＬ）のコンピテント細胞を形質転換させた。
【００６２】
形質転換株は    μg/mlのクロラムフェニコールを含有したＬＢ寒天培地（０．８％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、寒天１８g/ｌ）のプレート上で選択した。
【００６３】
こうして得られた陽性Ｃｍｒクローン（クロラムフェニコール耐性）の１つから単離されたプラスミドＤＮＡを、遺伝子の正確な挿入を確認するために、制限分析により分析した。
【００６４】
こうして得られたプラスミドをｐＳＭ６４１（変異Ｃｙｓ２４３→Ａｌａを有する）、ｐＳＭ６４２（変異Ｃｙｓ２５０→Ａｌａを有する）、ｐＳＭ６４３（変異Ｃｙｓ２７９→Ａｌａを有する）と呼んだ。
【００６５】
例４
大腸菌における変異体の発現
プラスミドｐＳＭ６４１、ｐＳＭ６４２、およびｐＳＭ６４３を保有する大腸菌株を、２０μg/mlのクロラムフェニコールが加えられたＬＢ培地１０mlを含有した各々の５０mlフラスコ中に接種し、攪拌下（２００rpm)３７℃で１６時間インキュベートした。コントロールとして、カルバミラーゼの野生型遺伝子を保有するプラスミドｐＳＭ６３７を含んだ大腸菌７１／１８の株を上記と同様の条件下で培養した。
【００６６】
次いで培養液を１２０００rpm で１分間遠心した（ローターＳＪ１４、Beckman)。こうして得られた細胞を２０mMトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０mMＭｅＯＨ、２０％グリセロールの緩衝液３００μｌに再懸濁し、超音波処理（Soniprep150,平均電圧でＭＳＥ１分間インパルス）により溶解させた。各溶解物２０μｌをＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及び活性試験により分析した。
【００６７】
電気泳動分析では、すべての酵素が互いにおよび野生型酵素の発現レベルに匹敵する量で発現された。
【００６８】
例５
二重Ｃｙｓ→Ａｌａ変異体の組立て
例２で記載された部位特異性変異誘発方法を用いて、二重変異Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２５０ＡｌａおよびＣｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａを含んだ変異体を得た。処置は、導入される変異を含んだ２つのオリゴヌクレオチド（各々、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２５０Ａｌａについてオリゴヌクレオチド１および２、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａについてオリゴヌクレオチド１および３）が同時に加えられた２種の反応混合液を調製することだけであった。インビトロ変異誘発反応後、各混合液は大腸菌ＴＧ１の細胞を形質転換するために用いた。各形質転換から得られる白色プラークの１つから単離されたプラスミドＤＮＡは、システインの正確な置換を確認するために配列決定した。次いで選択された組換えバクテリオファージを二本鎖ＤＮＡの作成のために用いた。
【００６９】
例６
プラスミドｐＳＭ６７１における二重変異体のサブクローニング
例３で記載されたのと同様の操作を用いて、２つの変異を含むカルバミラーゼ遺伝子をプラスミドｐＳＭ６７１  ＣＢＳ２０５．９４でバクテリオファージＤＮＡからサブクローニングした。得られたプラスミドの分析では、カルバミラーゼ遺伝子の正確な挿入を示した。得られたプラスミドはｐＳＭ６４４（二重変異Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２５０Ａｌａを有する）およびｐＳＭ６４５（二重変異Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａを有する）と呼んだ。
プラスミドｐＳＭ６４５を含む大腸菌のクローンは略称ＳＭＣ３０６で示した。
【００７０】
例７
大腸菌における二重変異体の発現
プラスミドｐＳＭ６４４およびｐＳＭ６４５を含んだ大腸菌の細胞を例４に記載されたのと同条件下で培養した。細胞溶解物の電気泳動分析では、変異酵素が野生型酵素の場合に匹敵するレベルで発現されることを示した。
【００７１】
例８
変異体の精製
プラスミドｐＳＭ６４１、ｐＳＭ６４５およびｐＳＭ６３７（コントロール）を各々含んだ大腸菌の株の発酵から得たバイオマスを２５mMトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０、２０％(v/v) グリセロールの緩衝液（緩衝液Ａ）に懸濁し、French-Pressで２回１８０００psi(約１２６０ kg/cm2 ）で溶解させた。
【００７２】
溶解物の遠心（３００００rpm 、４℃、３０分間）後に得られた上澄を緩衝液Ａで平衡化された SepharoseＲＱ  ＦＦ(Pharmacia) カラム（２．６×２０cm）上にのせた。次いでカラムを緩衝液Ａ（カラムの３倍容量）で洗浄し、その後０〜０．４ＭのＮａＣｌ勾配で溶出させた。酵素活性を有する分画を集め、塩化ニッケルで活性化されて緩衝液Ａで平衡化されたFast Flow Chelating SpharoseＲ(Pharmacia) カラム（２．６×２０cm）上にのせた。
【００７３】
緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、それを同緩衝液中０〜０．２Ｍのイミダゾールの勾配で溶出させた。酵素活性を有する分画を集めて、ＹＭ１０膜(Amicon)で限外濾過により濃縮した。次いで濃縮溶液を緩衝液Ａで平衡化させたSuperoseＲ１２ＨＲ１０／３０(Pharmacia) カラム上にのせ、同緩衝液で溶出させた。酵素活性を有する分画をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより１２．５％で分析したところ、分子量約３６０００ドルトンで純度９０％以上のタンパク質の存在を示した。
【００７４】
０．２Ｍ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．０の緩衝液中基質として０．１２Ｍ  Ｄ‐カルバミルパラヒドロキシフェニルグリシンを用いて測定された精製タンパク質の比活性は互いに匹敵し、野生型酵素の場合と類似する値８〜９U/mgであった。
【００７５】
単位という用語は、４０℃で１分間かけて１μモルの基質を形質転換できる酵素の量に関する。
【００７６】
例９
変異体の酵素安定性の分析
例８に記載されたように得られた酵素溶液を０．２μｍのDynaGard（Microgon,Inc.)で無菌条件下濾過した。次いで濾液の一部（０．２ml）をEppendorf 無菌試験管に入れ、室温（２０〜２５℃）で維持した。規則的な時間間隔で、残留酵素活性はｐＨ７．０の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でＤ‐Ｎ‐カルバミルパラヒドロキシフェニルグリシンを基質として用いてＨＰＬＣで形成されたＤ‐パラヒドロキシフェニルグリシンを計量することにより４０℃で調べた。
【００７７】
表１および図１は、ｈｒ（横座標）で表示された時間に対して、野生型カルバミラーゼ（−・−）、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ（−＋−）およびＣｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ（−＊−）の残留活性（縦座標）がパーセンテージで示されている。
【００７８】
【表１】
0003701341.tif 000002
【００７９】
例１０
野生型カルバミラーゼおよび変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ間の生産力の比較
同量（０．０６４単位／ml）の野生型カルバミラーゼおよび変異カルバミラーゼＣｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａを、ｐＨ７．０の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１００ml中にＤ‐Ｎ‐カルバミルパラヒドロキシフェニルグリシン（２５．２mg/ml)を含有した４０℃にサーモスタット調節される２つの装置に導入した。規則的な時間間隔で、生産されたＤ‐パラヒドロキシフェニルグリシンの量をＨＰＬＣにより調べた。得られた結果は図２で示される通りであった。そこでは横座標はｈｒの時間であり、縦座標はμモル／mlとして表示されたアミノ酸の量である。（−・−）は野生型カルバミラーゼを、（−＋−）はカルバミラーゼの変異体をそれぞれ表す。
【００８０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を表す記号：プライマー
配列
GAGCAGCATG GCCCCCTCCT CC                                     22
【００８１】
配列番号：２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を表す記号：プライマー
配列
CGCCACGATG GCCGAATGGC C                                       21
【００８２】
配列番号：３
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列の特徴：
特徴を表す記号：プライマー
配列
GCAGTTCCCG GGCGCGGTCG AGAT                                     24
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による変異体の酸素安定性の分析結果を示す図面である。ここで、野生型カルバミラーゼ（−・−）、変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ（−＋−）およびＣｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ（−＊−）の残留活性（縦座標）がパーセンテージで示されている。
【図２】野生型カルバミラーゼおよび変異体Ｃｙｓ２４３Ａｌａ‐Ｃｙｓ２７９Ａｌａ間の生産力の比較を示す図である。ここで、（−・−）は野生型カルバミラーゼを、（−＋−）はカルバミラーゼの変異体をそれぞれ表す。
【図１】
0003701341.tif 000003
【図２】
0003701341.tif 000004