(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、該ポリペプチドは：
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列から成るか；又は
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して一個又は数個のアミノ酸の欠失、挿入、置換又は付加を有するアミノ酸配列から成り且つ好酸球エオタキシンレセプター活性を示す；
前記ポリペプチド。
【請求項２】
ヒト好酸球エオタキシンレセプターであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
ヒト好酸球エオタキシンレセプターをコードすることを特徴とする請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
ＤＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列を更に含むことを特徴とする請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列番号４で示されるヌクレオチド配列を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
プラスミド、修飾ウイルス、酵母人工染色体、バクテリオファージ及びコスミド、又はトランスポゾン要素からなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
核酸が、ヒト好酸球エオタキシンレセプターをコードすることを特徴とする請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
核酸がヒト好酸球エオタキシンレセプターをコードすることを特徴とする請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞系由来であることを特徴とする請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
好酸球エオタキシンレセプターと結合する化合物の存在の測定方法であって、
（ａ）好酸球エオタキシンレセプターが発現されるような条件下、請求項３に記載の核酸を細胞に導入すること；
（ｂ）前記細胞と、好酸球エオタキシンレセプターと結合する可能性のある化合物とを接触させること；及び
（ｃ）前記化合物が好酸球エオタキシンレセプターに結合するかどうかを測定すること；
を特徴とする該方法。
【請求項１６】
好酸球エオタキシンレセプターがヒト好酸球エオタキシンレセプターであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸が、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）の結果を、好酸球エオタキシンレセプターの既知のリガンドを用いて得られた結果と比較することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
好酸球エオタキシンレセプターの既知のリガンドがエオタキシンであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
好酸球エオタキシンレセプターの既知のリガンドがＲＡＮＴＥＳであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
好酸球エオタキシンレセプターの既知のリガンドがＭＣＰ−３であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
好酸球エオタキシンレセプターが、天然にはヒト好酸球エオタキシンレセプターを発現しない宿主細胞で発現されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞がＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞系由来であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、好酸球エオタキシンレセプター（“ＣＣ ＣＫＲ３”）、特にヒト好酸球エオタキシンレセプター、及びこのレセプターをコードする核酸に関する。本発明は更に、好酸球エオタキシンレセプターに結合する化合物のスクリーニングと同定に使用できるアッセイに関する。このような化合物は、アレルギー性鼻炎、皮膚炎、結膜炎、及び特に気管支喘息を含むアトピー性疾患の治療と予防に有用であろう。
発明の背景
好酸球は、アレルギー性鼻炎、皮膚炎、結膜炎、及び特に気管支喘息を含む種々のアトピー性疾患で顕著な役割をもつ（総説として、Gleich,G.J．ら，Eosinophils．J.I.Gallin，I.M.Goldstein，R.Snyderman，Eds.，Inflammation:Basic Principles and Clinical Correlates（Raven Press,Ltd.，New York，1992）及びSeminario,M.C.ら，（1994）Current Opinion in Immunology 6,860-864を参照されたい）。プロセスにおける重要な事象は関与部位での好酸球の蓄積である。Ｃ５ａ、ＬＴＢ４及びＰＡＦを含む幾つかのの古典的化学誘引物質は好酸球を誘引することが知られているが（Gleich,G.J.ら，Eosinophils.J.I.Gallin，et al．Eds.，Inflammation:Basic Principles and Clinical Correlates(Raven Press,Ltd.，New York，1992）、これらのメディエーターは差異がなく、好酸球を含む種々の白血球に作用し、好酸球の選択的蓄積の原因ではありそうもない。対照的に、８−１０ｋＤａタンパク質のフミリーのケモカインは、標的とする白血球のサブタイプに、より制限があり、アトピー性疾患や喘息において好酸球を集める可能性のある候補物質である（Baggiolini,M.，Dewald,B．and Moser,B．（1994）Advances in Immunology 55,97-179）。好酸球は、幾つかのβ−ケモカイン、特にエオタキシンとＲＮＡＴＥＳによって、アレルギー性炎症部位に集められるという証拠があがりつつあるが、これらの作用を媒介するレセプターはまだ同定されていない。
ケモカインは４個の保存されたシステインを含み、第１のシステインペアの配置に基づき２つのサブファミリーに分けられる（Baggiolini,M.，Dewald,B．and Moser,B．（1994）Advances in Immunology 55,97-179）。ＩＬ−８、ＭＧＳＡ、ＮＡＰ−２及びＩＰ−１０を含むα−ケモカインファミリーでは、これらの２個のシステインは単一アミノ酸で分離されるが、ＲＡＮＴＥＳ（“発現、分泌された活性化Ｔ上で制御された”）、ＭＣＰ−１（単球送化性タンパク質）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α（“マクロファージ炎症性タンパク質”）、ＭＩＰ−１β及びエオタキシンを含むβ−ケモカインファミリーでは、これらの２個のシステインは隣接している。この構造的分類には機能との連関がある。α−ケモカインは主として好中球に作用し、β−ケモカインは主として単球、リンパ球、好塩基球及び好酸球に作用する（Baggiolini,M.，Dewald,B．and Moser,B．（1994）Advances in Immunology 55,97-179）。特に、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３及びＭＩＰ−１αは、好酸球をインビトロで活性化することが示され（Dahinden,C.A.ら，（1994）Journal of Experimental Medicine 179,751-756；Ebisawa,M.ら，（1994）Journal of Immunology 153,2153-2160；Weber,M.ら，（1995）Journal of Immunology 154,4166-4172）、ＲＡＮＴＥＳはインビボで好酸球を選択的に誘引することが示された（Meurer,R.ら（1993）Journal of Experimental Medicine 178,1913-1921；Beck,L.ら（1995）FASEB Journal 9,A804）。同様に、最初にモルモット（Griffiths-Johnson,D.A.ら（1993）Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications 197,1167-1172；Jose,P.J.ら（1994）Journal of Experimental Medicine 179,881-887）及びマウス（Rothenbergら（1995）Proceedings of the National Academy of Sciences 92,8960-8964）で報告されたβ−ケモカインファミリーの新メンバーであるエオタキシンも、インビトロとインビボの両方で好酸球の強力な誘引物質であり活性化物質である。更に、エオタキシンは、アレルギー性気道炎症のモルモットモデルでの抗原チャレンジの間に産生される（Joseら（1995）J.Exp.Med.,179,881-887；Rothenbergら（1995）J.Exp.Med.,181,1211-1216）。モルモットのエオタキシンのクローニングが開示された（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／０７９８５；1995年3月23日）。ヒト好酸球化学誘引物質エオタキシンのクローニングは最近報告され（Ponathら,J.Clin.Invest.（1996）97（3）604-612）、エオタキシンは、アレルギー性炎症の機構で非常に重要な物質であることが示唆された（Baggioliniら，J.Clin.Invest．（1996）97（3）587）。
好酸球は幾つかのβ−ケモカインによって誘引されるが、そのうち最も強力なものは、エオタキシン（Griffiths-Johnson,D.A.ら（1993）Biochemical and Biophysical Research Communications 197,1167-1172；Jose,P.J.ら（1994）Journal of Experimental Medicine 179,881-887；Rothenbergら（1995）Proceedings of the National Academy of Sciences 92,8960-8964）及びＲＡＮＴＥＳ（Dahinden,C.A.ら（1994）Journal of Experimental Medicine 179,751-756；Ebisawa,M.ら（1994）Journal of Immunology 153,2153-2160；Weber,M.ら（1995）Journal of Immunolgy 154,4166-4172；Meurer,R.ら（1993）Journal of Experimental Medicine 178,1913-1921；Beck.L.ら（1995）FASEB Journal 9,A804）である。幾つかのヒトβ−ケモカインレセプターが詳細にキャラクタライズされたが、観察された反応を説明する適切な選択性をどれもが有していなかった。
好酸球に対するβ−ケモカインの作用の解明は、好酸球生物学の理解に大きく寄与したが、これらの効果を媒介する細胞表面レセプターに関する情報は希薄なままである。更に、初代好酸球へのいずれのβ−ケモカインでもその結合研究を記載する報告はない。公知のβ−ケモカインレセプターはＧタンパク質共役レセプタースーパーファミリーのメンバーである。これらのレセプターのうち２種、単球で見出されたＣＣ ＣＫＲ１（１２，１３）とＣＣ ＣＫＲ２（ＭＣＰ−１Ｒ）（Charo,I.F.ら（1994）Proceeding of the National Academy of Sciences 91,2752-2756；Myers,S,J.ら（1995）Journal of Biological Chemistry 270,5786-5792；Franci,C.ら（1995）Journal of Immunology 154,6511-6517）は広範に研究され、異なるケモカインに対する選択性が明確にされた。しかし、これらのレセプターのどれも、好酸球に対するβ−ケモカインの効果を媒介するのに要求される必要なリガンドの選択性又は適切な発現パターンを有しない。例えば、ＣＣ ＣＫＲ１はＲＡＮＴＥＳと高親和性で結合するが、エオタキシンとは弱くしか結合しないし、ＣＣ ＣＫＲ２に対するエオタキシンの効果は研究されなかったが、このレセプターはＲＡＮＴＥＳに対する親和性を有しない（Myers,S.J.ら（1995）Journal of Biological Chemistry 270,5786-5792）。
アレルギー性炎症におけるケモカインの役割についての総説がkita,Hら，J.Exp.Med．183,2421-2426（1996年6月）によって報告されている。特に、この総説は、レセプターＣＫＲ−３がアレルギー性炎症の過程で果たす役割を考察している。ヒト好酸球エオタキシンレセプターのクローニング、発現及びキャラクタリゼーションがDaugherty,B.J.ら，J.Exp.Med．183,2349-2354（1996年5月）によって報告された。この報告は、ケモカインレセプターＣＣ ＣＫＲ３のクローニングと機能性発現及びそのキャラクタリゼーションを開示している。
報告によれば、ヒト好酸球レセプターのクローニングと発現が、Combadiere,C.ら，J.Biological Chem．270（27）16491-16494（1995年7月14日）により行われた。しかし、次いでそれが撤回され（J.Biological Chem．270,30235（1995））、そこで、かれらは、実際にクローニングされ、発現されたレセプターはＣＣ ＣＫＲ３ではなく、別のＣＣ ケモカインレセプターＣＣ ＣＫＲ５であることを確認した。次いで、このレセプターは、Kitaura,M.ら，J.Biological Chem．271（13）7725-7730（1996年3月29日）によってキャラクタライズされた。
ヒトエオタキシンレセプターは、Ponath,P.D.ら，J.Exp.Med.183,2437-2448（1996年6月）とGerard,C.J.ら，ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２３７１（1996年7月25日）によって報告された。しかし、この刊行物で開示された配列には、レセプターの位置＃２７６でセリンよりむしろスレオニンであるというアサインメントでのエラーがある。更に、レセプターの機能性は十分には示されなかった。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）と命名されたレトロウイルスは、免疫系の進行的破壊（後天性免疫不全症候群；ＡＩＤＳ）及び中枢と末梢神経系の変性を含む複雑な疾患の病原体である。このウイルスは以前にはＬＡＶ、ＨＴＬＶ−III、又はＡＲＶと言われていた。ＨＩＶ−１が標的細胞に侵入するために、細胞表面ＣＤ−４と更なる宿主細胞補因子が必要である。形質転換されたＴ細胞での増殖に適したウイルスの感染に必要な補因子としてフシンが同定されたが、フシン（fusin）は、インビボでのＨＩＶのキー病原株であると考えられているマクロファージ向性ウイルスの侵入を促進しない。最近、標的細胞への効率的な侵入のために、ヒト免疫不全ウイルスは、ケモカインレセプターＣＣＲ−５とＣＸＣＲ−４、及びプライマリーレセプターＣＤ４を必要とすることが認識された（Levy,N.Engl.J.Med.，335（20），1528-1530（1996年11月14日）。ＨＩＶ−１の一次マクロファージ向性株のエンベローブ糖タンパク質によって媒介される侵入のための主要な補因子は、β−ケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βのレセプターであるＣＣＲ５である（Dengら，Nature 381,661-666（1996））。ＨＩＶは、そのエンベロープタンパク質ｇｐ１２０の一領域を介し細胞上のＣＤ４分子に結合する。ＨＩＶのｇｐ１２０のＣＤ−４結合部位が細胞表面のＣＤ４分子と相互作用し、ＣＤ−４結合部位と、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ−４のような別の細胞表面レセプターとを結合させるコンホメーション変化がＣＤ−４結合部位に起ると考えられている。これにより、ウイルスエンベロープが細胞表面により接近し、ウイルスエンベロープ上のｇｐ４１と細胞表面の融合ドメインの間の相互作用が起り、細胞膜と融合し、ウイルスコアが細胞に侵入することを可能とする。β−ケモカインリガンドはＨＩＶが細胞と融合することを妨げることが示された（Dragicら，Nature 381,667-673（1996））。更に、ｇｐ１２０と可溶性ＣＤ４の複合体がＣＣＲ−５と特異的に相互作用し、天然ＣＣＲ−５リガンドであるＭＩＰ−１αとＭＩＰ−１βの結合を阻害することが示された（Wuら，Nature 384,179-183（1996）;Trkolaら，Nature 384,184-187（1996））。
インビトロでＨＩＶのコレセプターとして働かない変異ＣＣＲ−５レセプターに関しホモ接合であるヒトは、ＨＩＶ感染に異常に抵抗性であるようであり、この遺伝的変異体の存在によって免疫低下していない（Nature,382,722-725（1996））。ＣＣＲ−５が無いと、ＨＩＶ−１感染から防御されるようである（Nature，382,668-669（1996））。他のケモカインレセプターは、ＨＩＶ−１の幾つかの株によって使用できうるか、又は伝染の非性的経路に好まれうる。現在まで研究された大部分のＨＩＶ単離株はＣＣＲ−５又はフシンを用いるけれども、両方並びに関連したＣＣＲ−２Ｂ及びＣＣＲ−３をコレセプターとして使用できるものもある（Nature Medicine 2（11）,1240-1243（1996））。ケモカインレセプターがＨＩＶの細胞への侵入の決定的コレセプターであるという結論が、Science Magazineによって“1996年度のブレークスルー”と言われた（Science 274,1987-1991（1996年12月20日）。
好酸球エオタキシンレセプターの作用を調節する経口活性剤の使用は、アレルギー性鼻炎、皮膚炎、結膜炎、及び特に気管支喘息を含むアトピー性疾患の治療と予防における重大な進歩であろう。更に、正常のケモカインレセプターを有するヒトにおける好酸球エオタキシンレセプターを遮断できる薬剤は、健康人における感染を防止し、感染した患者におけるウイルス進行を遅延又は停止させるはずである。
新規である好酸球エオタキシンレセプターファミリーを解析し、その正常の生理的役割を理解するために、好酸球エオタキシンレセプターの分子構造を知ることも望ましいであろう。これにより、リガンド−レセプター結合に際し起るインビボプロセスをより良く理解できよう。更に、アトピー性疾患の治療と予防のための新規薬剤を同定できるアッセイ系の必須成分としてクローニングされた好酸球エオタキシンレセプターを用いることも望ましいであろう。
発明の概要
本発明は好酸球エオタキシンレセプターである新規レセプターに関する。このレセプターはヒトβ−ケモカインレセプターであり、“ＣＣ ＣＫＲ３”と命名されていた。本発明の一面は、レセプターに付随するタンパク質を含有しないヒト好酸球エオタキシンレセプターに関する。本発明の更なる面は、単離又は精製されたヒト好酸球エオタキシンレセプターである。
本発明のもう一つの面は、実質的に同一の核酸配列によってコードされるが、スプライシングにおける変化を受けたか、又は他のＲＮＡプロセシング由来修飾もしくは変異誘発によって誘導された変化を受けて、発現タンパク質は相同であるが、天然型とは異なるアミノ酸配列を有する好酸球エオタキシンレセプターである。これらの変異型は、ヒト及び動物生理において、又はインビトロの細胞ベースアッセイで異なる、及び／又は付加的機能を有しうる。
本発明は更に、β−ケモカインレセプターであり、初代好酸球からクローニングされ、ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞で発現された好酸球エオタキシンレセプターを提供する。このレセプターは強力な好酸球誘引物質である、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３と高親和性で結合する。更に、エオタキシン及びＲＡＮＴＥＳ、並びに程度は小さいがＭＣＰ−３はＣＣＣＫＲ３を発現している細胞においてＣａ2+流動を誘導する。初代好酸球の結合性との関連により、ＣＣ ＣＫＲ３は、好酸球に対するβ−ケモカインの効果を媒介する主要な内因性レセプターであるという決定的証拠が得られる。
本発明は更に、好酸球エオタキシンレセプターである新規レセプターを用いるアッセイに関する。このレセプターはヒトβ−ケモカインレセプターであり、“ＣＣ ＣＫＲ３”と命名されていた。本発明の一面は、レセプターに付随するタンパク質を含まないヒト好酸球エオタキシンレセプターを用いるアッセイに関する。本発明の更なる面は、単離又は精製されたヒト好酸球エオタキシンレセプターを用いるアッセイに関する。更に、本発明は、好酸球エオタキシンレセプターがＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞系で発現されているアッセイを提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｇタンパク質共役レセプターであり、ヒト好酸球からクローニングされ、ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞で安定に発現されたときに、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３と高親和性で結合する好酸球エオタキシンレセプター“ＣＣ ＣＫＲ３”に関する。125Ｉ−ヒトエオタキシンに対する競合結合研究で、３種のβ−ケモカインに関し、それぞれＫｄ値０．１、２．７、１ｎＭが得られる。ＣＣ ＣＫＲ３は低親和性であるがＭＣＰ−１とも結合するが、ＭＩＰ−１α又はＭＩＰ−１βとは結合しない。該レセプターを発現しているクローンでＣａ2+流動を刺激する能力で測定すると、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、及び程度はより小さいがＭＣＰ−３はＣＣ ＣＫＲ３を活性化するが、他のケモカインは活性化しない。初代好酸球における競合結合研究で、ＣＣ ＣＫＲ３で測定した結合親和性とは区別できない、異なるケモカインのための結合親和性が分る。ＣＣ ＣＫＲ３は好酸球で顕著に発現するので、ＣＣ ＣＫＲ３は好酸球エオタキシンレセプターであると結論される。好酸球はまた、ＭＩＰ−１αの効果の原因であるようである第２のケモカインレセプターＣＣ ＣＫＲ１をずっと低いレベルで発現する。
好酸球エオタキシンレセプターは、細胞膜にレセプターを固定する１個以上のドメイン及び少なくとも１個のリガンド結合ドメインを含む種々の機能性ドメインを含有するタンパク質である。多くのレセプタータンパク質に関し、多くのアミノ酸を修飾すること、特にリガンド結合ドメインに見出されないが、元のレセプターの生物活性の少なくとも一部を依然として保持するアミノ酸を修飾することが可能である。本発明によれば、好酸球エオタキシンレセプターのある一部は、β−ケモカインによる活性化に必須ではないことが示唆される。それ故、本発明は特に、欠失、短縮、又は変異部分を有する、修飾されてはいるが機能的に等価な好酸球エオタキシンレセプターを包含する。本発明はまた特に、他のドメインで修飾及び／又は欠失を含むが、機能性活性を損失していない、修飾はされてはいるが機能的に等価な好酸球エオタキシンレセプターをも包含する。
更に、第２メッセンジャーエフェクター系と相互作用するドメインのような他の機能性ドメインを、結合特異性及び／又は選択性を変えることによって修飾することも可能である。このような機能的に等価な変異レセプターも本発明の範囲内である。
本発明の更なる面は、ヒト又は他の種からの好酸球エオタキシンレセプター又は機能性等価物をコードする核酸である。これらの核酸は結合している核酸を含まないこともできるし、又は単離もしくは精製されうる。大部分のクローニング目的のために、ｃＤＮＡは好適な核酸であるが、本発明は特に他の型のＤＮＡ及び好酸球エオタキシンレセプター又は機能性等価物をコードするＲＮＡをも包含する。
本発明の更なる別の面は、好酸球エオタキシンレセプター又は機能性等価物をコードする核酸を含有するベクターに関する。これらのベクターはＤＮＡ又はＲＮＡからなりうる。大部分のクローニング目的のために、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的ベクターは、好酸球エオタキシンレセプターをコードできるプラスミド、修飾ウイルス、バクテリオファージとコスミド、酵母人工染色体及び他の型のエピソームＤＮＡもしくは組込みＤＮＡを包含する。特定の遺伝子の転移又は他の用途のために適切なベクターを決定することは十分に当業者の技術の範囲内である。
本発明の更なる面は、好酸球エオタキシンレセプター又は機能性等価物をコードする遺伝子で形質転換された宿主細胞である。宿主細胞は細胞膜に好酸球エオタキシンレセプターを天然に発現しうるし、又は発現しえない。形質転換されると、宿主細胞は細胞膜に好酸球エオタキシンレセプター又は機能性等価物を発現できることが好ましい。宿主細胞に依存して、発現を最適化するために特定のコドンを使用するように、ＤＮＡを改変することが望ましいかもしれない。このような改変は当業界公知であり、これらの核酸も本発明の範囲内に含まれる。
本発明のレセプターは、好酸球から分離されたＲＮＡからクローニングされた。ＣＣＣＫＲ１とＣＣＣＫＲ２の両方から設計したプライマーによる縮重ＰＣＲを用い、クローンをＡＭＬＡ１４．３Ｄ１０細胞系での発現によってスクリーニングした。クローニングは幾つかの点で困難であった。第１に、本発明前に、生化学的特徴とこれらのレセプターによって使用される細胞内シグナル伝達／エフェクター経路について利用できる情報はほとんど無く、スクリーニング方法は不確かなものとなった。第２に、このレセプターは、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３ののような、レセプターをクローニングするために通常使用される細胞系で発現され、及び／又は機能的に共役することはできなかった。標準的細胞系を用いて失敗を繰返した後、一般に知られていない好酸球様細胞系ＡＭＬ１４．３Ｄ１０を試み、本発明で記載されるレセプターの発現に適切であることが知見された。
本発明は更に、好酸球エオタキシンレセプターである新規レセプターを用いるアッセイに関する。このレセプターはヒトβ−ケモカインレセプターであり、“ＣＣ ＣＫＲ３”と命名されていた。本発明の一面は、レセプターに付随するタンパク質を含まないヒト好酸球エオタキシンレセプターを用いるアッセイに関する。本発明の更なる面は、単離又は精製されたヒト好酸球エオタキシンレセプターを用いるアッセイに関する。更に、本発明は、好酸球エオタキシンレセプターがＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞で発現されているアッセイに関する。
本発明の特定の実施態様は、好酸球エオタキシンレセプターに結合する化合物の存在の測定用アッセイに関する。即ち、本発明は、好酸球エオタキシンレセプターに結合する化合物の存在の測定方法であって、
（ａ）好酸球エオタキシンレセプターが発現するような条件下、好酸球エオタキシンレセプターをコードする核酸を細胞に導入すること；
（ｂ）探知（detector）分子又は探知分子をコードする核酸を細胞内に導入すること（探知分子は直接的又は間接的に、好酸球エオタキシン−リガンド結合事象に応答性であること）；
（ｃ）該細胞と、好酸球エオタキシンレセプターと結合する可能性のある化合物とを接触させること；及び
（ｄ）探知分子を監視することにより、該化合物が好酸球エオタキシンレセプターに結合するかどうかを測定すること；
を特徴とする該方法も包含する。
本発明の別の好適実施態様では、好酸球エオタキシンレセプターと結合する可能性のある化合物の結合を、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３の結合又は影響と比較する。
本発明の更なる実施態様は、公知のリガンドの好酸球エオタキシンレセプターとの結合に拮抗する化合物の存在の測定用アッセイに関する。即ち、本発明は、好酸球エオタキシンレセプターと拮抗する化合物の存在の測定方法であって、
（ａ）好酸球エオタキシンレセプターが発現するような条件下、好酸球エオタキシンレセプターをコードする核酸を細胞に導入すること；
（ｂ）探知分子又は探知分子をコードする核酸を細胞内に導入すること（探知分子は直接的又は間接的に、好酸球エオタキシン−リガンド拮抗事象に応答性であること）；
（ｃ）該細胞と、好酸球エオタキシンレセプターと拮抗する可能性のある化合物とを接触させること；
（ｄ）該細胞と、好酸球エオタキシンレセプターの公知のリガンドである化合物とを接触させること；
（ｅ）探知分子を監視することにより、化合物が公知リガンドの好酸球エオタキシンレセプターへの作用と拮抗するかどうかを測定すること；
を特徴とする該方法を更に包含する。
本発明の好適実施態様では、好酸球エオタキシンレセプターはＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞で発現される。
本発明の別の好適実施態様では、好酸球エオタキシンレセプターの公知のリガンドは、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３である。
本発明の一面は、好酸球エオタキシンレセプターと結合するリガンド、特に好酸球に対するケモカインの作用のアンタゴニストを検出するために使用できる感受性で、丈夫で、信頼性があり、高スループットのスクリーニングアッセイの開発である。
特に、このようなアッセイの典型的プロトコルは次のようである。アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２，０．５ｗ％ＢＳＡ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＣａＣｌ2，１００μＭ ＰＭＳＦ，並びに１０μｇ／ｍＬホスホラミドン，ロイペプチン，アプロチニン，及びキモスタチン）、試験化合物（又は等量の溶媒）、２０ｐＭ  125Ｉ−ヒトエオタキシン（２０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）、２５ｎｇ非標識ヒトエオタキシン（非特異的結合ウエルのみ）、及びエオタキシンレセプター発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞又は好酸球を順次、９６ウエル、丸底のポリスチレンプレートに最終容量２５０μＬまで加える。次いで、アッセイプレートを混合し、３１℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション後、Packard Filtermate196セルハーベスターを用いて、０．３３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で処理したPackard９６ウエルＧＦ／Ｃ Unifiterプレート上にアッセイプレートの内用物を回収する。ウエルとフィルターを、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．０２％ＮａＮ3含有５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２ ２００μＬで洗浄する。濾過後、ＧＦ／Ｃプレートを乾燥し、密閉する。次いで、Packarad Microscint-0 scintillantを各ウエルに加え、Packard Topcount（液体125Ｉ設定）で２分間カウントする。
本明細書記載のアッセイを用いて検出されるリガンドは、好酸球エオタキシンレセプターの活性の修飾によって益する疾患の治療と予防、例えばアレルギー性鼻炎、皮膚炎、結膜炎及び特に気管支喘息を含むアトピー性疾患の治療と予防に使用できる。
本発明の更なる面は、問題のアッセイを用いて同定される新規リガンドに関する。
好酸球エオタキシンレセプター及びフラグメントは免疫原生である。即ち、本発明のもう一つの面は、好酸球エオタキシンレセプター又は好酸球エオタキシンレセプターフラグメントに結合できる抗体及び抗体フラグメントである。これらの抗体はモノクローナル抗体でありえ、ハイブリドーマ技術か組換え法を用いて産生されうる。それらは、アッセイ系の一部として、又は細胞内に存在する好酸球エオタキシンレセプターの機能を推定するために使用できる。
本発明の更なる面は、好酸球エオタキシンレセプターヌクレオチドに結合でき、レセプター機能又は発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明の更なる面は、細胞における好酸球エオタキシンレセプターの量の増加方法であって、細胞に好酸球エオタキシンレセプターをコードする核酸を導入し、好酸球エオタキシンレセプターを発現させることを特徴とする該方法である。
明細書と請求の範囲で使用する場合、以下の定義が適用される：
リガンド--本発明の好酸球エオタキシンレセプターに結合する任意の分子。これらのリガンドは、アゴニスト活性、部分的アゴニスト活性、部分的アンタゴニスト活性、又はアンタゴニスト活性を有しうる。
レセプターに付随するタンパク質を含まない--レセプタータンパク質は、他の膜レセプタータンパク質との混合液又は溶液中にない。
結合している核酸を含まない--核酸は、生物の染色体で天然では共有結合しているＤＮＡと共有結合していない。
単離されたレセプター--タンパク質はいずれの他のタンパク質との混合液又は溶液中にない。
単離された核酸--核酸はいずれの他の核酸との混合液又は溶液中にない。
機能性等価物--オールターナティブスプライシング、欠失、変異又は付加によって、天然の好酸球エオタキシンレセプターと正確な同一アミノ酸配列を有しないが、天然のレセプターの生物活性の少なくとも１％、好ましくは１０％、及びより好ましくは２５％を保持するレセプター。このような誘導体は、天然の好酸球エオタキシンレセプターと有意の相同性を有し、好酸球エオタキシンレセプターから得られたＤＮＡ配列とストリンジェンシィの減少したハイブリダイゼーションによって検出されることができる。機能性等価物をコードする核酸は、天然のレセプター核酸とはヌクレオチドレベルで少なくとも約５０％の相同性を有する。
精製されたレセプター--レセプターは少なくとも９５％純粋である。
精製された核酸--核酸は少なくとも９５％純粋である。
アミノ酸残基の一文字略語は以下のとおりである：Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；Ｙ，Ｔｙｒ。
好酸球ケモカインレセプターのオーファンクローニング
β−ケモカインレセプター、ＣＣ ＣＫＲ１（Neote,K.ら（1993）Cell 72,415-425）及びＭＣＰ−１Ｒ（Charo,I.F.ら（1994）Proceeding of the National Academy of Sciences 91,2752-2756）の膜貫通へリックスII（ＴＭII）とVII（ＴＭVII）内でクラスターとなっているアミノ酸残基から開発されたオリゴヌクレオチドプライマーを、好酸球から分離された全ＲＮＡ上で使用して行ったＲＴ／ＰＣＲにより、約７００塩基（Ｇタンパク質共役レセプターのために期待されるサイズと一致したサイズ）のＤＮＡフラグメントが得られた。幾つかのＴＭII〜ＴＭVIIクローンの解析により、核酸レベルでヒトＣＣ ＣＫＲ１と７６％相同性である新規配列を得た。３′末端と５′末端のクローニングの完成により、長さで３５５残基のタンパク質のための配列が得られ、それは、最も近い相同性であるＣＣ ＣＫＲ１と６３％同一であり、ＣＣ ＣＫＲ２Ｂと５１％同一であった。
ヒト好酸球エオタキシンレセプターＣＣ ＣＫＲ３のアミノ酸配列を下に示す（配列番号１）：
0003689118.tif 000002
ヌクレオチド３５８７で始まり、ヌクレオチド４６５１で終るヒト好酸球エオタキシンレセプターＣＣ ＣＫＲ３をコードするｃＤＮＡの配列を下に示す（配列番号２）：
0003689118.tif 000003
又はその縮重変異体。
ヒト好酸球エオタキシンレセプターをコードする５′ゲノム隣接配列は更に、下に示すヌクレオチド１で始まりヌクレオチド３５８６で終る領域を含む（配列番号３）：
0003689118.tif 000004
0003689118.tif 000005
0003689118.tif 000006
又はその縮重変異体。
ヒト好酸球エオタキシンレセプターをコードするｃＤＮＡの配列は更に、下記のヌクレオチド４６５２で始まり、ヌクレオチド５０９９で終るターミネーター領域を含む（配列番号４）：
0003689118.tif 000007
又はその縮重変異体。
当業者が理解するように、特別のアミノ酸に翻訳されるコドンのセットに多量の冗長性がある。それ故、本発明はまた、ＤＮＡ配列によって翻訳されるアミノ酸配列に変化がないように、コドンが別のコドンで置き換えられている別の塩基配列も包含する。本明細書の目的のために、１個以上のこのような置き換えられたコドンを有する配列は、縮重変異体と定義する。ロイシンの代わりにバリン、リシンの代わりにアルギニン、及びグルタミンの代わりにアスパラギンのような、当業者が機能に影響しないと期待する変異（個々のアミノ酸の交換）も包含される。
ＣＣ ＣＫＲ３のアミノ酸は、ＣＣ ＣＫＲ１（Neote,K.ら（1993）Cell 72,415-425）、ＣＣ ＣＫＲ２Ｂ（Charo,I.F.ら（1994）Proceeding of the National Academy of Sciences 91,2752-2756）、ＣＣ ＣＫＲ４（Power,C.A.ら（1995）Journal of Biological Chemistry 270,19495-19500)及びＶ２８（Raport,C.J.ら（1995）Gene 163,295-299）とある程度の配列相同性を共有する。ＣＣ ＣＫＲ３と命名されたこのタンパク質の配列は、位置１０７でアスパラギンの代わりにリシンを含むことを除いて、Combadiereら（Combadiere,C.ら1995）Journal of Biological Chemistry 270,16491-16494）によって以前に報告されたものと同一である。ゲノムクローニングによって、位置１０７にリシンを含む問題の配列が確認された。残基１０７のコドンの第３位でＧのＴへの置換が原因の配列の相違は、遺伝的多形性を表しているともいえる。しかし、このことはとてもありそうにもない。何故ならば、最近報告された好塩基球β−ケモカインレセプター（Power,C.A.ら（1995）Journal of Biological Chemistry 270,19495-19500）、ＣＣ ＣＫＲ１（Neote,K.ら（1993）Cell 72,415-425）、ＭＣＰ−１Ｒ（Charo,I.F.ら（1994）Proceeding of the National Academy of Science 91,2752-2756）、ＩＬ−８ＲＡとＩＬ−８ＲＢ（Holmes,W.E.ら（1991）Sciences253,1278-1280;Murphy,P.M.ら（1991）Science 253,1280-1283）、３種のマウスβ−ケモカインレセプター（Post,T.W.ら（1995）Journal of Immunology 155,5299-5305;Gao,J.L.ら（1995）Journal of Biological Chemistry 270,17494-17501）、及び３種のヒトケモカイン様レセプター（Loetscher,M.ら（1994）Journal of Biological Chemistry 269,232-237；Raport,C.J.ら（1995）Gene  163,295-299；Combadiere,C.ら（1995）DNA and Cell Biology 14,673-680；Federsppiel,B.ら（1993）Genomics 16,707-712）を含む現在まで分析された全てのα−及びβ−ケモカインレセプターはその位置にリシンを含むからである。ＣＣ ＣＫＲ３の異常な特徴は、第２細胞外ループ中のＴＭIVの先の陰性荷電のアミノ酸のクラスター（ＥＴＥＥＬＦＥＥＴ）である。
ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞でのヒトＣＣ ＣＫＲ３の発現
ＣＣ ＣＫＲ３をコードする完全長ｃＤＮＡを単離し、発現ベクターｐＢＪ／ＮＥＯにクローニングしたとき、ｐＢＪ／ＮＥＯ／ＣＣＣＫＲ３と命名した得られたプラスミドをＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞系にトランスフェクトした。
ＣＣ ＣＫＲ３でトランスフェクトされたＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞系を、American Type Culture Collection,Rockville,MarylandにＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１２０７９として1996年4月5日に限定寄託した。
安定なクローンがネオマイシン耐性として選択され、幾つかを更なる解析のために選択した。レセプタータンパク質の発現を証明するために、ＣＣ ＣＫＲ３の予測Ｃ末端由来のペプチドに対し産生された抗血清を用いて、ウエスタンブロットを行った。約４５−５５ｋｄに移動する免疫反応性バンドが初代好酸球と３．１６クローンに存在し、ＣＣ ＣＫＲ３はこれらの細胞で実際に発現されることを示す。好中球に存在する免疫反応性バンドは無く、抗血清は実際に好酸球特異的タンパク質を同定していることを示した。免疫反応性の非特異的パターンが非トランスフェクトＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞で検出され、更にこのパターンはクローン３．４９でも同一であり、このネオマイシン耐性クローンはＣＣ ＣＫＲ３の非発現体であることを示した。研究した２７個のネオマイシン耐性クローンのうち、１９個はＣＣ ＣＫＲ３を発現しなかった。その他の８個は、ウエスタン分析と、エオタキシンとＲＡＮＴＥＸがＣａ2+流動を誘導する能力の両方で判定して、レセプターを発現した。非発現クローンは、次の実験で陰性対照として用いた。
ＡＭＬ１４／ＣＣＣＫＲ３．１６無傷細胞のＣＣ ＣＫＲ３への結合
３個の異なるＣＣ ＣＫＲ３発現クローンを用いた予備実験で、それらのクローンが125Ｉ−エオタキシンと結合することが示されたので、この標識リガンドを用いる競合研究を行い、レセプターの結合性をキャラクタライズした。表１に示すように、非標識ヒトエオタキシンはＫｄが０．１ｎＭで競合した。マウスエオタキシンでの結果も本質的に同一であった、スキャチャード解析は、エオタキシンは単一親和性で結合すること及び異なるクローンが２〜４×１０5レセプター／細胞を発現したことを示した。エオタキシンと結合する能力はＣＣ ＣＫＲ３のためである。というのは、３．４９のような免疫反応陰性クローンも、非トランスフェクト細胞も全く特異的結合を示さなかったからである。ＣＣ ＣＫＲ３はエオタキシンの高親和性レセプターであるのは明瞭である。好酸球化学誘引物質であると知られている２種の他のβ−ケモカイン、ＲＡＮＴＥＳとＭＣＰ−３による交差競合研究は、それらもまた、ＣＣ ＣＫＲ３に対するかなりの親和性を有し、ｋｄは約３ｎＭであることを示した（表１参照）。対照的に、ＭＣＰ−１はずっと低い親和性で競合し（Ｋｄ＝６０ｎＭ）、ＭＩＰ−１αとＭＩＰ−１βは全く競合しなかった（表１参照）。同様に、α−ケモカインＩＬ−８はエオタキシン結合を阻害しなかった。
競合研究を、125Ｉ−ＭＣＰ−３に対しても行った。再び、ヒトとマウスエオタキシンは、ｋｄが０．２ｎＭと０．３ｎＭで強く競合した（表１）。ＲＡＮＴＥＳとＭＣＰ−３もｋｄが０．５ｎＭと０．７ｎＭで高親和性を示したが、その値はエオタキシンに対し観察されたものより約４倍低かった。エオタキシンを用いる研究におけるように、ＭＣＰ−１は弱く競合し（Ｋｄ＝１６ｎＭ）、ＭＩＰ−１αとＭＩＰ−１βは全く競合しなかった。即ち、小さな定量的差異にも関わらず、レセプターの全体のリガンド選択性は、エオタキシン又はＭＣＰ−３どちらにせよそれらに対する競合を測定すると、同一であり、力価の順序、エオタキシン＞ＭＣＰ−３＝ＲＡＮＴＥＳ＞＞ＭＣＰ−１は同一である。
ＣＣ ＣＫＲ３はＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞と機能的に結合している
ＡＭＬ１４．３Ｄ１０系で発現されたときに、ヒトＣＣ ＣＫＲ３は機能的に結合しているかどうかを決定するために、種々のβ−ケモカインに応答性の細胞内Ｃａ2+レベルを測定した。１００ｎＭエオタキシンとＲＡＮＴＥＳの両方がレセプター発現細胞でＣａ2+流動を誘導した。驚くべきことに、ＭＣＰ−３は、反応を誘導するのに１μＭが必要であり、その反応は、エオタキシン又はＲＡＮＴＥＳで観察されたものより小さかった。１μＭという高濃度でＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１又はＩＬ−８の添加で反応は全く起らなかった。エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３に対する反応はＣＣ ＣＫＲ３の特異的発現のためである。何故ならば、これらのメディエーターのどれも、非トランスフェクト細胞又はクローン３．４９で流動を誘導しなかったからである。Combadiereらによる予備的機能性キャラクタリーゼーションは、本発明とは大きく異なり、かれらは、レセプターを発現していると推定される細胞に全く特異的結合を証明することができなかった。現在ではこのような機能に関するデータは撤回されている（Combadiere,C.ら（1995）Journal of Biological Chemistry 270,30235）。
初代好酸球の結合性
種々のβ−ケモカインに対するＣＣ ＣＫＲ３の選択性は、好酸球化学誘引物質としてのこれらのリガンドの有効性を反映し、ＣＣ ＣＫＲ３はケモカイン誘導好酸球走化性の主要メディエーターであることを示唆する。更なる薬理的証拠を提供するために、結合研究を初代好酸球に対し行った。125Ｉ−エオタキシンに対し競合で測定すると、非標識ヒトエオタキシンはＫｄ＝０．１ｎＭであり、その値は、クローン化ＣＣ ＣＫＲ３で得られた値と同一であった（表１参照）。スキャチャード解析は、単一結合親和性と４×１０5部位／細胞を示した。結合部位数は、研究で用いた３供与体で２倍未満だけしか異ならなかった。ＲＡＮＴＥＳとＭＣＰ−３に対する親和性もＣＣ ＣＫＲ３で測定したものと同一であり、ＣＣ ＣＫＲ３に関し、ＭＩＰ−１αもＭＩＰ−１βも放射性標識エオタキシンと競合できなかった（表１参照）。同様に、好酸球上で125Ｉ−ＭＣＰ−３に対する競合で得られたＫｄは、クローン化ＣＣ ＣＫＲ３に対し測定したものと実際に区別できない（表１参照）。観察と測定の全てと、ＣＣ ＣＫＲ３の発現を示すウエスタンブロットと考え合わると、ＣＣ ＣＫＲ３は好酸球エオタキシンレセプターであり、好酸球に対する大部分のβ−ケモカインの効果を媒介する大なる原因であるようであることを証明する。
好酸球系ＡＭＬ１４．３Ｄ１０で安定に発現されたＣＣ ＣＫＲ３は、高親和性で、力価の等級順序はエオタキシン＞ＲＡＮＴＥＳ＝ＭＣＰ−３で、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＣＰ−３と結合する。ＭＣＰ−１はずっと低い親和性でしか結合せず、ＭＩＰ−１αとＭＩＰ−１βは全く結合できなかった。ＣＣ ＣＫＲ３の選択性は初代好酸球の結合活性の大部分を反映する。実際、125Ｉ−エオタキシンに対する競合で測定すると、これらのβ−ケモカインの全てに関する好酸球の結合親和性は、クローン化ＣＣ ＣＫＲ３で得られたものと区別できない。更に、ＣＣ ＣＫＲ３は好酸球からクローニングされ、ウエスタンブロティングで示されるように、これらの細胞で大きく発現された。異なるケモカインがＣＣ ＣＫＲ３を活性化する能力は、結合データと一致する。何故ならば、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、程度はより小さいがＭＣＰ−３は全て、レセプターを発現するクローンでＣａ2+流動を刺激するが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βは、１μＭという高濃度でさえ、刺激しないからである。即ち、その性質、発現に基づくと、ＣＣ ＣＫＲ３は好酸球エオタキシンレセプターである。
0003689118.tif 000008
記載したヨウ素化リガンドに対する競合結合実験を以下のように、及び本明細書記載のように行った。
ＣＣ ＣＫＲ３発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞と初代好酸球へのβ−ケモカインの平衡結合は、固定濃度の125Ｉ−ヒトエオタキシン又は125Ｉ−ＭＣＰ−３のどちらかに対して競合する非標識ヒトエオタキシン、マウスエオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３又はＭＣＰ−１の濃度を増加させて試験した。また、ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βの１００ｎＭ濃度による競合も試験した。実験は、ＣＣ ＣＫＲ３発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞又は好酸球で行った。全ての値は３連測定の平均である。典型的には、４０００〜６０００ｃｐｍのヨウ素化リガンドが、１５を超えるＳ／Ｎ比で、競合物質の非存在下、結合した。ヒト及びマウスエオタキシンはそれぞれヒト及びマウスケモカインである。“Ｎ．Ｂ．”は競合が観察されなかったということを示す。全ての結果は、括弧内に示した実験数の平均である。
本発明の思想と範囲から逸脱することが無くして、本発明の物と方法に関し種々の変化と修飾がなされることができる。本明細書記載の種々の実施態様と実施例は本発明を例示するために記載され、本発明の範囲又は思想を限定するものと理解されるべきではない。
実施例１
ｍＲＮＡ分離とｃＤＮＡクローニング
ＴＲＩｚｏｌ試薬（BRL）を用いて精製した好酸球から全ＲＮＡを分離し、ヒトＣＣ ＣＫＲ１とＭＣＰ−１ＲＢ ｃＤＮＡ配列（Neote,K.ら（1993）Cell 72,415-425;Charo,I.F.ら（1994）Proceeding of the National Academy of Sciences 91,2752-2756）から設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ／ＰＣＲ反応で用いた（Daugherty,B.L.ら（1991）Nucleic Acids Research 19,2471-2476）。ＰＣＲで用いたプライマーは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）IIとVIIでコードされたコンセンサス配列に対応した：
５′−ＰＣＲプライマー（ＴＭII）（配列番号５）
５′−ＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴ（Ｃ，Ｔ）ＴＣＴＧＡ（Ｃ，Ｔ）ＣＴＧＣ−３′
３′−ＲＴ／ＰＣＲプライマー（ＴＭVII）（配列番号６）
５′−ＧＡＡＣ（Ｃ，Ｔ）ＴＣＴＣ（Ｃ，Ａ）ＣＣＡＡＣＧＡＡＧＧＣ。
得られた約７００塩基対のＰＣＲ産物をプラスミドｐＮｏＴＡ（Five Prime,Three Prime,Inc）にサブクローンし、Sequenase（USB）を用いて配列決定した。ＣＣ ＣＫＲ３をコードする残りの５′と３′配列を、以下のプライマー配列（５′−ＲＡＣＥ）（配列番号７）：
５′−ＴＣＴＣＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧ−３′
（３′−ＲＡＣＥ）（配列番号８）：
５′−ＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＡＴＣＣ−３′
を用いて、５′−ＲＡＣＥキットと３′−ＲＡＣＥキット（Clontch）の両方を使用してｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）によってクローニングした。
得られたＰＣＲ産物（５′−ＲＡＣＥ，約４５０塩基対；３′−ＲＡＣＥ，約７００塩基対）をｐＣＲII（Invitrogen）にサブクローンし、配列決定した。開始ＡＴＧコドンを含むｃＤＮＡの５′末端と終止コドンＴＡＧを含む３′末端を同定して、好酸球全ＲＮＡから、ＣＣ ＣＫＲ３の発現のための完全コード領域を再増幅するために、ＰＣＲプライマーの新規セットを設計した。ＲＴ／ＰＣＲのために使用したプライマー配列は、
５′−ＰＣＲプライマー（配列番号９）：
５′−ＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＴＡＣＡＧ−３′；
３′−ＲＴ／ＰＣＲプライマー（配列番号１０）：
５′−ＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＡＧＡＧＡＧＴＴＣＣ−３′。
得られた１１０５塩基対のＰＣＲ産物をＨｉｎｄIIIとＮｏｔIで消化し、プラスミドｐＢＪ／ＮＥＯにサブクローンし、ｐＢＪ／ＮＥＯ／ＣＣＣＫＲ３を得た。プラスミドｐＢＪ／ＮＥＯは本質的に次のように製造した。プラスミドｐＤ５／Ｉｇｈ／Ｎｅｏ（Daugherty,B.L.ら（1991）Nucleic Acids Research 19,2471-2476）を制限酵素ＳａｌＩで消化し、E.coli ＤＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメントで充填し、平滑末端を作製し、次いで制限酵素ＮｏｔＩで消化した。プラスミドｐ８９−１１からのＣＭＶＩＥイントロンＡフラグメントをＣｌａＩで消化し、充填し、平滑末端を作製し、次いでＨｉｎｄIIIで消化した。ヒトＣ５ａレセプターｃＤＮＡのＨｉｎｄIII−ＮｏｔＩフラグメントを使用しての３方向連結でこれらのフラグメントを用いた。Ｃ５ａレセプターフラグメントをＨｉｎｄIIIとＮｏｔＩで切出し、オリゴヌクレオチド配列番号９と１０によるＲＴ／ＰＣＲで得られた、ＨｉｎｄIIIとＮｏｔＩによる消化後の１１０５塩基対のエオタキシンレセプターｃＤＮＡで置き換えた。幾つかのクローンを配列決定し、コンセンサス配列を含む一つのクローンを、異系細胞でのＣＣ ＣＫＲ３発現のために選択した。
実施例２
ＡＭＬ１４．３Ｄ１０ヒト好酸球細胞系へのトランスフェクション
ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞（Paul,C.C.ら（1995）Blood 86,3737-3744）を、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５μＭ β−メルカプトエタノール及び２ｍＭ Ｌ−グルタミン（完全培地）で培養した。細胞を密度０．３×１０6／ｍＬで回収し、ＰＢＳで１度洗浄し、ＲＰＭＩに１０7／ｍＬに再懸濁し、プラスミド２５μｇを加えた。Gene Pulser（BioRad）を用い、３００Ｖ、９６０μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞を０℃に１０分間冷却し、次いで１０6／Ｔ７５フラスコで、完全培地に播き、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。１６〜２４時間後、細胞をペレットにし、２ｍｇ／ｍＬ Geneticin（GIBCO）を含む完全培地に再懸濁した。個々の生存クラスターが現われるまで、細胞を選択培地に８〜１０日関維持した。次いで個々の細胞を９６ウエルプレートに移し、増殖させた。ＲＡＮＴＥＳ又はエオタキシンに反応してＣａ2+流動を引起す能力についてＡＭＬ１４／ＣＣＣＫＲ３亜系をアッセイした。次いで、ＣＣ ＣＫＲ３の予測Ｃ末端に対し作製された抗体によるウエスタンブロティングによって陽性亜系を調べた。次いで、両方のセットのアッセイで陽性の細胞系を、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−１などの種々のＣＣケモカインと結合する能力についてキャラクタライズした。
実施例３
好酸球の精製
アレルギー患者と喘息患者のドナーから得たグラニュロフォーレシス調製物から、初代好酸球を分離した（Bach,M.K.ら（1990）Journal of Immunlogical Methods 130,277-281）。白血球を等量のＨＢＳＳと混合し、報告されたようにＬＳＭ（Organon Teknika）に重層した（Rollins,T.E.ら（1988）Journal of Biological Chemistry 263,520-526）。ＮＨ4Ｃｌで赤血球を溶解後、次いで顆粒球を抗ＣＤ１６ミクロビーズで処理し、次にＭＡＣＳ分離（Miltenyl Biotech）（Hansel,T.Tら（1991）Journal of Immunological Methods 145,105-110）を行った。典型的には、好酸球調製物は、LeukoStat染色キット（Fisher）を用いて測定すると＞９９％純粋であった。
実施例４
α−ＣＣ ＣＫＲ３抗血清の作製及びイミュノブロティング
Ｃ末端デカペプチド配列ＴＡＥＰＥＬＳＩＶＦを用い、ポリクローナルウサギ抗血清をＣＣ ＣＫＲ３に対し作製した。ペプチド合成、チログロブリンへのカップリング及び抗血清の産生を行った（Miller,D.K.ら（1993）Journal of Biological Chemistry 268,18062-18069）。細胞全体を煮沸し、Laemiliサンプル緩衝液中で音波処理し（Laemmili,U.K.（1970）Nature 227,680-685）、４−２０％ＳＤＳゲル（Novex）上で電気泳動し、二フッ化ポリビニリデン膜（BioRad）に移し、ＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中５％脂肪非含有乾燥ミルクで４℃で１６時間ブロックした。膜を、ＴＢＳＴ中１：１０００で抗血清と室温で１６時間インキュベートし、次いでＴＢＳＴ中１：４０００でヤギ抗ウサギＨＲＰ（Zymed）と再び室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、膜をＥＣＬウエスタンブロティング試薬（Amersham）で１分間処理し、プラスチックラップで覆い、フィルムに２分間曝した。
実施例５
ケモカイン結合アッセイ
組換えＭＣＰ−３、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、マウスとヒトのエオタキシンを、Peprotech（Princeton,NJ）から得た。125Ｉ−ＭＣＰ−３と125Ｉ−ＭＩＰ−１αをNew England Nuclear（Boston,MA）から得、125Ｉ−ヒトエオタキシンをAmershamから得た。種々の濃度の非標識リガンドの存在下、細胞丸ごと（典型的には、標識エオタキシン、ＭＣＰ−３又はＭＩＰ−１αの実験のために、それぞれ１．５×１０4、１０5、又は１０6）への125Ｉ−標識リガンド（典型的には合計２×１０4ｃｐｍ）の結合を３２℃で行った（Van Riper,G.ら（1993）Journal of Experimental Medicine 177,851-856）。
実施例６
リガンド誘導Ｃａ2+流動
ヒトＣＣ ＣＫＲ３発現ＡＭＬ１４クローン又は精製好酸球を、ＲＰＭＩ １６４０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５％ＦＢＳ中で１．２５μｇ／ｍＬ Ｉｎｄｏ−Ｉ（Molecular Probes,Eugene,OR）と、３７℃で６０分間インキュベートした（Van Riper,G.ら（1993）Journal of Experimental Medicine 177,851-856）。負荷細胞を洗浄し、３７℃でインキュベートし、次いでリガンドを加えた。励起波長３６５ｎｍ及び発光二波長４０５ｎｍと４８８ｎｍによりＦＡＣＳアナライザー（Becton Dickinson & Co.，Mountain View，CA）上でカルシウム流動を測定した。
実施例７
ＣＣ ＣＫＲ３結合アッセイ
アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２，０．５ｗ％ＢＳＡ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭ ＣａＣｌ2，１００μＭ ＰＭＳＦ、並びに１０μｇ／ｍＬホスホラミドン，ロイペプチン、アプロチニン，及びキモスタチン）、試験化合物（又は等量の溶媒）、２０ｐＭ125Ｉ−ヒトエオタキシン（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、２５ｎｇ非標識ヒトエオタキシン（非特異的結合ウエルのみ）、及びエオタキシンレセプター発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞又は好酸球を、９６ウエル、丸底、ポリスチレンプレート最終容量２５０μＬに順次加える。次いでアッセイプレートを混合し、３１℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション後、Packard Filtermate 196セルハーベスターを用い、０．３３％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で処理したPackard 96-well GF/C Unifilter plates上にアッセイプレートの中身を取得する。ウエルとフィルターを、０．５Ｍ ＮａＣｌと０．０２％ＮａＮ3含有５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２  ２００μＬで洗浄する。濾過後、ＧＦ／Ｃプレートを乾燥し、密封する。次いで２５μＬ Packard Microscint-0 scintillantを各ウエルに加え、Packard Topcount（液体125Ｉ設定）で２分間カウントする。
実施例８
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）アッセイ
エオタキシンレセプター（ＣＣＣＫＲ３）発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞を試験化合物とインキュベートし、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−３で刺激し、ペレットにし、１ｍＬ溶解緩衝液（１％Nonidet P-40，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１０ｍＭヨードアセトアミド，４６ｍＭ ｂ−グリセロホスフェート、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬロイペプチン，１μｇ／ｍＬキモスタチン，１μｇ／ｍＬアンチパイン，１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ，及び１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）中で溶解する。次いで、溶解液を非結合プロテインＡ Affi-Gelビーズで１時間、前もって清澄化する。次いで、プロテインＡ Affi-Gelビーズ（BioRad）に結合したｐ８５ポリクローナル抗血清（１μＬ／ｍＬ溶解液；Upatate Biologics，New York，NY）で、４℃で２時間免疫沈殿を行う。免疫沈殿物を洗浄し、脂質混合液、０．１ｍｇ／ｍＬ PtdIns１００μＬ，及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０と１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液に音波処理で分散した０．１ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリンを用いてインビトロ脂質キナーゼアッセイにかける。反応を、２０μＬキナーゼ緩衝液中１００ｍＭ ＡＴＰと２０μＣｉ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加して開始させる。次いで、１５分後反応を終らせ、ホスホイノシチド脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分離し、ヨウ素蒸気オートラジオグラフィーに曝して可視化する。
実施例９
走化性アッセイ
エオタキシンレセプター発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞を、１５０×ｇ、１５分間の遠心によって分離し（van Riper,G.ら（1994）J.Immunol．152,4055-4061）、洗浄し、１ｍＭ ＣａＣｌ2と１ｍＭ ＭｇＣｌ2含有ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）（走化性緩衝液）中で１０7細胞／ｍＬに再懸濁する。次いで、走化性実験をTranswell皿（6.5mm，Costar，Cambridge，MA）中で行う。下部チャンバーは走化性緩衝液０．６ｍＬを含み、５ｍｍ孔Nucleoporeポリカーボネート膜（Nucleopore Corporation，Pleasanton，CA）によって、１０6細胞を含む上部チャンバーから隔てられている。３７℃で１５分間のプレインキュベーション後、試験化合物、及びエオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−３を最終濃度３００ｎＭまで下部チャンバーに加える。３７℃で２時間後、上部チャンバーを取外し、下部チャンバーに移動した細胞をCoulter Counter（Coulter Electronics，Hialeah，FL）で数える。
実施例１０
リガンド依存イノシトールリン酸放出アッセイ
エオタキシンレセプター発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞を、報告されたように（Wu,D.ら（1993）Science 261,101-103）、［3Ｈ］イノシトール（１０μＣｉ／ｍＬ）で２４時間標識する。次いで、試験化合物、及び種々の濃度のエオタキシン、ＭＣＰ−３又はＲＡＮＴＥＳを３０分間細胞に加える。細胞を１０％過塩素酸中で溶解し、２Ｎ ＫＯＨで中和し、遠心する。上清を、ＡＧ１−Ｘ８アニオン交換樹脂０．５ｍＬを含むカラムに移し、６ｍＬホウ砂緩衝液で洗浄し、０．３ｍＬギ酸（０．１Ｍ）で溶出する。溶出したサンプルをシンチレーションカクテルと混合し、カウントする。
実施例１１
酸性化速度アッセイ
エオタキシンレセプター発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞に１６時間血清飢餓を行う。ついで、細胞を、低融点アガロースと３：１（ｖ／ｖ）比で混合する。細胞／アガロース混合物の１０μＬ滴を、滅菌Capsule Cup（Molecular Devices）に、細胞密度約２００，０００細胞／カップでピペットで入れる。約５分後、細胞／アガロース滴はゲルになり、それを、２枚の３μｍ孔ポリカーボネート膜の間に流動培地を用いて集める。組立てられた小皿カップをセンサーチャンバーに入れ、次いで１ｍＬ流動培地を含むCytosensor Microphysiometer（Molecular Devices）上に置く。チャンバーを、流速１００μＬ／分で、３７℃で１時間平衡化させる。種々の濃度のエオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３及び試験化合物を８分間曝して、実験を開始し、細胞が非刺激レベルに戻るまで、ベースライン上の酸性化速度を培地中で測定する（McConnell,H.M.ら（1992）Science 257,1906-1912）。
実施例１２
アクチン重合アッセイ
エオタキシンレセプター発現ＡＭＬ１４．３Ｄ１０細胞を、濃度４×１０6／ｍＬにＡＰＡ緩衝液（ＨＢＳＳ；２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ；０．２％ＢＳＡ，ｐＨ７．２）中に希釈する。試験化合物、及びエオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ又はＭＣＰ−３を１μＬ、９６ウエルプレートに加え、３７℃でインキュベートする。細胞１００ｍＬをプレートに加え、２０秒インキュベートし、それにＡＰＡカクテル（８％ホルムアルデヒド２ｍＬ；０．３３μＭローダミン−ファロイジン４６０μＬ；２００μｇ／ｍＬリゾレシチン１．８５ｍｇ；ＨＢＳＳ７．２５ｍＬ）１００ｍＬを加える。次いで、プレートを２０００ＲＰＭで５分間遠心し、清澄化し、次いでＨＢＳＳ１００μＬを全てのウエルに加え、Fluoroskan II蛍光測定器で読む。
本発明を記載し、そのある特定の実施態様に関し説明したが、当業者ならば、方法とプロトコルの種々の改変、変更、修飾、置換、欠失又は付加が、本発明の思想と範囲から逸脱することなしになされうることを理解しよう。例えば、本明細書で記載の特定の実験方法以外の方法が、上記本発明のタンパク質及びＤＮＡの配列における縮重と変異の結果として適用できうる。同様に、観察されたキャラクタリゼーションデータは、用いた特定のアッセイ又はキャラクタリゼーション法により、及びそれに依存して僅かに変わりうるし、結果におけるこのような予期される変異又は差異が、本発明の目的と実施により考えられる。それ故、本発明は以下の請求の範囲で規定され、このような請求の範囲は、妥当な限り広く解釈されるものとする。
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：355
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
0003689118.tif 000009
配列番号：2
配列の長さ：1065
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
0003689118.tif 000010
配列番号：3
配列の長さ：3586
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
0003689118.tif 000011
0003689118.tif 000012
0003689118.tif 000013
配列番号：4
配列の長さ：448
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
配列
0003689118.tif 000014