(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0003717081.tif 000030
〔式中、Ｒ1は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19
−アルキニルカルボニル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルまたは式II
【化２】
0003717081.tif 000031
の基であり；
Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、ハロゲン、アジドまたはＮＨ2で
あり；
Ｂはヌクレオチド化学において慣用の塩基であり；
ａはオキシまたはメチレンであり；
ｎは１〜１００の整数であり；
Ｗはオキソ、チオキソまたはセレノキソであり；
Ｖはオキシ、チオまたはイミノであり；
Ｙはオキシ、チオ、イミノまたはメチレンであり；
Ｙ′はオキシ、チオ、イミノ、(ＣＨ2)mまたはＶ(ＣＨ2)m（ここでｍは１〜１８の整数である）であり；
Ｘはヒドロキシルまたはメルカプトであり；
Ｕはヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式III
(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ11        （III）
の基（ここでＲ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、−(ＣＨ2)c−〔ＮＨ(ＣＨ2)c〕d−ＮＲ12Ｒ12（ここでｃ
は２〜６の整数であり、ｄは０〜６の整数であり、そしてＲ12はそれぞれ互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルである）であり、Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、あるいはＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ4はＲ3およびこれらを担持する窒素原子と一緒になって５〜６員の複素環式環（これはさらにＯ、Ｓ、Ｎからなる群より選択されたヘテロ原子を含有することができる）を形成し、ｐは１〜１００の整数であり、ｑは０〜２２の整数であり、そしてＲ11は水素または以下からなる群より選択される官能基：ヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ13、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ12また
はハロゲン（ここでＲ12はＣ1〜Ｃ4−アルキルであり、そしてＲ13はＣ1〜Ｃ6−アルキルである）である）であり；
Ｚ＝Ｚ′はメルカプト、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、（Ｃ6〜Ｃ14
）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルコキシ（ここでアリールはヘテロアリールを包含し、そしてアリールは場合によってはカルボキシル、アミノ、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、ヒドロキシル、ハロゲンおよびシアノからなる群より選択された１、２または３個の同一のまたは異なった基により置換される）または式IIIの基
であり；
曲線状の中括弧はＲ2およびその隣りのホスホリル残基が２′−および３′−位に、ま
たは反対に３′−およびおよび２′−位に位置することができることを示し、各ヌクレオチドはＤ−またはＬ−配置で存在することができ、そして塩基Ｂはα−またはβ−位に位置することができる。但し、Ｚがメルカプト、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルまたはエトキシであ
る場合、基Ｘ、Ｙ、Ｙ′、ＶおよびＷのうち少なくとも１つはヒドロキシル、チオ、オキシまたはオキソではなく、あるいはＲ1は水素ではない〕のオリゴヌクレオチド類似体またはその生理学的に許容しうる塩。
【請求項２】
塩基Ｂがβ−位に位置し、ヌクレオチドがＤ−配置で存在し、Ｒ2が２′−位に位置し、そしてａがオキシである請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項３】
Ｒ1が水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたは式IIの基であり；Ｒ2が水素、ヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ18−アルコキシであり；ｎが１０〜４０の整数であり；ｍが１〜６の整数であり；Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3（ここでＲ3はＣ1〜Ｃ8−アルキルまたはメトキシエチルである）である請求項１または２記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項４】
Ｖ、ＹおよびＹ′がオキシである請求項１〜３の何れかの項記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項５】
Ｗがオキソである請求項１〜４の何れかの項記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項６】
Ｕがヒドロキシルである請求項１〜５の何れかの項記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項７】
Ｒ1が水素である請求項１〜５の何れかの項記載のオリゴヌクレオチド類似体。
【請求項８】
ａ）  ３′(２′)−末端のリン(Ｖ)グループおよび遊離の５′−ヒドロキシルもしくはメルカプト基を有するヌクレオチド単位を３′−位にリン（III）もしくはリン（Ｖ）グループを有するもう１つのヌクレオチド単位またはその活性化誘導体と反応させ、あるいは
ｂ）  工程(ａ)の手法でヌクレオチド単位の代わりにヌクレオチドフラグメントを用いてオリゴヌクレオチド類似体を構成し、
そして(ａ)または(ｂ)により得られたオリゴヌクレオチド中に他の官能基を保護するために一時的に導入した保護基を除去し、場合によってはこのようにして得られた式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体をその生理学的に許容しうる塩に変換することからなる請求項１記載の式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体の製造法。
【請求項９】
請求項１〜７の何れかの項記載のオリゴヌクレオチド類似体からなる核酸を検出するためのプローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は有用な物理的、生物学的および薬理学的特性を有する新規なオリゴヌクレオチド類似体、並びにこれらの製造法に関する。これらの用途は遺伝子発現の阻害剤（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボチーム、センスオリゴヌクレオチドおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド）、核酸を検出するためのプローブおよび分子生物学的における補助剤としてのこれらの使用に関する。オリゴヌクレオチドは遺伝子発現の阻害剤としてますます多く使用されている〔G. ZonのPharmaceutical Research 5，539（1988年)；J.S. CohenのTopics in Molecular and Structural Biology 12（1989年）、Macmillan出版; C. HeleneおよびJ.J. ToulmeのBiochimica et Biophysica Acta 1049, 99（1990年）; E. UhlmannおよびA. PeymanのChemical Reviews 90, 543（1990年）〕。アンチセンスオリゴヌクレオチドはその塩基配列が阻害されるｍＲＮＡに対して相補的である核酸フラグメントである。この標的のｍＲＮＡは細胞、ウイルスまたは他の病原体から由来するものでありうる。好適な細胞状の標的塩基配列は例えばレセプター、酵素、免疫調節剤、イオンチャンネルまたは腫瘍遺伝子のものである。アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するウイルスの複製の阻害は例えばＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＨＳＶ−１および−２（単純ヘルペスウイルスＩ型およびII型）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、並びにインフルエンザウイルスについて開示されている。ここでは、ウイルスの核酸に相補的なオリゴヌクレオチドが使用されている。対比して、センスオリゴヌクレオチドの配列はこれらのオリゴヌクレオチドが例えば核酸結合タンパク質または核酸プロセッシング酵素を結合(“捕獲")し、それによりこれらの生物学的活性を阻害するように構成されている（Helene, 1990年）。ここで例として挙げることのできるウイルスの標的は逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼおよび転移活性剤（transactivator）タンパク質である。トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは一般にこれらの標的としてＤＮＡを有し、そしてこれに結合した後、ＤＮＡは三重のヘリックス構造を形成する。一般に、ｍＲＮＡのプロセッシング（スプライシングなど）およびそのタンパク質への翻訳はアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻害されるが、他方トリプレックス形成オリゴヌクレオチドはＤＮＡの転写または複製を阻害する（Heleneら、1990年；UhlmannおよびPeyman，1990年）。しかしながら、最初のハイブリット形成で一重鎖核酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドと結合することもまた可能であり、次に第２のハイブリット形成でトリプレックス形成オリゴヌクレオチドと三重構造を形成する二重鎖の形成を伴なう。この場合、２つの別々のオリゴヌクレオチドまたは１つのオリゴヌクレオチド中にアンチセンスおよび三重結合部分を含ませることができる。いわゆるリボチームはこれらのリボヌクレアーゼ活性の結果として標的ＲＮＡを分解〔J.J. RossiおよびN. SarverのTIBTECH 8, 179（1990年）〕し、さらに合成オリゴヌクレオチドの用途を示す。
【０００２】
好適に標識された核酸フラグメントはＤＮＡ診断研究において検出される核酸への特異的ハイブリッド形成のためのいわゆるＤＮＡプローブとして使用される。ここで、好ましくは放射性ではない標識化を用いて新しい二重鎖の特異的形成が引き続く。このようにして、遺伝子疾患、悪性疾患およびウイルスまたは他の病原体により生じた疾患を検出することができる。
【０００３】
このような用途の大部分に適した、天然由来の形態のオリゴヌクレオチドは殆んど、または全くない。これらは特定の要件について適当であるように化学的に修飾されなければならない。例えばウイルスの複製の阻害のために、オリゴヌクレオチドを生物学的系において使用する場合、これらは次の前提条件を満たす必要がある：
１．これらはインビボ条件下、すなわち細胞内だけでなく血清中でも十分高い程度の安定性を有しなければならない。
２．これらは細胞および核膜を通過することができなければならない。
３．これらは阻害効果を発揮するために生理学的条件下、塩基特異的方法でこれらの標的の核酸に結合しなければならない。
【０００４】
これらの前提条件はＤＮＡプローブについて不可欠ではないが、しかしこれらのオリゴヌクレオチドは例えばケイ光、化学ルミネセンス、比色定量または特異染色による検出を可能にする方法で誘導化されなければならない〔BeckおよびKoesterのAnal. Chem. 62, 2258（1990年）〕。
【０００５】
オリゴヌクレオチドの化学変化は通常リン酸エステル主鎖、リボース単位またはヌクレオチド塩基を適当な方法で変化させることにより起こる(Cohen, 1989年; UhlmannおよびPeyman, 1990年）。しばしば使用される別法は５′−ヒドロキシル基を適当なリン酸化試薬と反応させるこしによるオリゴヌクレオチド５′−抱合体の製造である。５′−末端のみが修飾されたオリゴヌクレオチドはこれらが血清中で分解されるという欠点を有する。一方、すべてのヌクレオチド間のホスフェート基が変化された場合、オリゴヌクレオチドの特性はしばしば徹底的に変化される。例えば、水性溶媒中におけるメチルホスホネートオリゴヌクレオチドの溶解性は減少し、そしてこれらのハイブリッド形成能力もまたそうである。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは非特異的効果を有し、そのため例えばホモオリゴマーもまたウイルスに対して活性である。
【０００６】
したがって、本発明の目的は特異的活性、増大した血清安定性および良好な溶解性を有するオリゴヌクレオチド類似体を製造することである。
本発明は式Ｉ
【化３】
0003717081.tif 000002
〔式中、Ｒ1は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ2〜Ｃ18−アルケニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキニル、Ｃ2〜Ｃ18−アルキルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルケニルカルボニル、Ｃ3〜Ｃ19−アルキニルカルボニル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルまたは式II
【化４】
0003717081.tif 000003
の基であり；
Ｒ2は水素、ヒドロキシル、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、ハロゲン、アジドまたはＮＨ2であり；
Ｂはヌクレオチド化学において慣用の塩基例えばアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンのような天然の塩基、またはプリン、２,６−ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ4Ｎ4−エタノシトシン、Ｎ6Ｎ6−エタノ−２,６−ジアミノプリン、プソイドイソシトシンのような非天然の塩基であり；
ａはオキシまたはメチレンであり；
ｎは１〜１００好ましくは１０〜４０の整数であり；
Ｗはオキソ、チオキソまたはセレノキソであり；
Ｖはオキシ、チオまたはイミノであり；
Ｙはオキシ、チオ、イミノまたはメチレンであり；
Ｙ′はオキシ、チオ、イミノ、(ＣＨ2)mまたはＶ(ＣＨ2)m（ここでｍは１〜１８好ましくは１〜６の整数である）であり；
Ｘはヒドロキシルまたはメルカプトであり；
Ｕはヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ6−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−アリール−(Ｃ1〜Ｃ8)−アルキル、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4または式III
(ＯＣＨ2ＣＨ2)pＯ(ＣＨ2)qＣＨ2Ｒ11        （III）
の基（ここでＲ3はＣ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−アリール−(Ｃ1〜Ｃ8)−アルキル、−(ＣＨ2)C−〔ＮＨ(ＣＨ2)c〕d−ＮＲ12Ｒ12（ここでｃは２〜６の整数であり、ｄは０〜６の整数であり、そしてＲ12はそれぞれ互いに独立して水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキル好ましくはメトキシエチルである）であり、Ｒ4はＣ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、特に好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリ
ールまたは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキルであり、あるいはＮＲ3Ｒ4の場合、Ｒ4はＲ3およびこれらを担持する窒素原子と一緒になって５〜６員の複素環式環（これはさらにＯ、Ｓ、Ｎからなる群より選択されたヘテロ原子を含有することができる）を形成し、ｐは１〜１００好ましくは３〜２０、特に好ましくは３〜８の整数であり、ｑは０〜２２好ましくは０〜１５の整数であり、そしてＲ11は水素または官能基例えばヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ13、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＲ12またはハロゲン（ここでＲ12はＣ1〜Ｃ4−アルキル、好ましくはメチルである）であり；
Ｚ＝Ｚ′はヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ1〜Ｃ22−アルコキシ好ましくはＣ6〜Ｃ18−アルコキシ、−Ｏ−(ＣＨ2)b−ＮＲ12Ｒ13（ここでｂは１〜６の整数であり、そしてＲ13はＣ1〜Ｃ6−アルキルであり、またはＲ12およびＲ13はこれらを担持する窒素原子と一緒になって３〜６員の環を形成する）、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル好ましくはＣ1〜Ｃ8−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル好ましくは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキル、（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルコキシ好ましくは（Ｃ6〜Ｃ10）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコキシ（ここでアリールはヘテロアリールを包含し、そしてアリールは場合によってはカルボキシル、アミノ、ニトロ、Ｃ1〜Ｃ4−アルキルアミノ、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、ヒドロキシル、ハロゲンおよびシアノからなる群より選択された１、２または３個の同一のまたは異なった基により置換される）、Ｃ1〜Ｃ18−アルキルメルカプト、ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4、式IIIの基または細胞内吸収を有利にする、もしくはＤＮＡプローブ用標識として作用する、あるいはオリゴヌクレオチド類似体の標的の核酸へのハイブリッド形成の間に結合、架橋または開裂を伴なって後者を攻撃する基であり；
曲線状の中括弧はＲ2およびその隣りのホスホリル残基が２′−および３′−位に、または反対に３′−および２′−位に位置することができることを示し、各ヌクレオチドはＤ−またはＬ−配置で存在することができ、そして塩基Ｂはα−またはβ−位に位置することができる。但し、Ｚがヒドロキシル、メルカプト、メチルまたはエトキシである場合、基Ｘ、Ｙ、Ｙ′、ＶおよびＷのうち少なくとも１つはヒドロキシル、オキシまたはオキソではなく、あるいはＲ1は水素ではない〕のオリゴヌクレオチド類似体またはこれらの生理学的に許容しうる塩に関する。
【０００７】
塩基Ｂがβ−位に位置し、ヌクレオチドがＤ−配置で存在し、Ｒ2が２′−位に位置し、そしてａがオキシである式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体またはこれらの生理学的に許容しうる塩が好ましい。
【０００８】
Ｒ1が水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、特にメチルまたは式IIの基であり；Ｒ2が水素またはヒドロキシル、特に水素であり；ｎが１０〜４０、特に１２〜３０の整数であり；ｍが１〜６の整数、特に１であり；Ｕがヒドロキシル、メルカプト、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、ＮＲ3Ｒ4またはＮＨＲ3、特にヒドロキシルまたはＣ1〜Ｃ6−アルキル（ここでＲ3はＣ1〜Ｃ8−アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ4−アルキルまたはメトキシエチルである）であり、そしてＢ、Ｗ、Ｖ、Ｙ、Ｙ′、ＸおよびＺは上記の意味を有する式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体が特に好ましい。
【０００９】
Ｖ、Ｙ′およびＹがオキシである式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体が特に好ましい。さらに、Ｖ、Ｙ、Ｙ′およびＷがオキシまたはオキソである式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体がとりわけ好ましい。
【００１０】
Ｖ、Ｙ、Ｙ′、ＷおよびＵがオキシ、オキソまたはヒドロキシルである式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体が非常に好ましい。
さらに、Ｒ1が水素である式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体が好ましい。
【００１１】
Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ′およびＹがオキシ、オキソまたはヒドロキシルであり、そしてＲ1が水素である式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体が特に好ましい。
Ｒ2、Ｂ、ａ、Ｗ、Ｖ、Ｙ、Ｕ、Ｒ3、Ｒ4、ｐ、ｑおよびＺのような繰り返して生じる残基は互いに独立して同一のまたは異なった意味を有する。すなわち例えばそれぞれのＶは他のものとは独立してオキシ、チオまたはイミノである。
【００１２】
ハロゲンは好ましくはフッ素、塩素または臭素である。
ヘテロアリールは環系に１個または２個のＮ原子および／または１個のＳもしくはＯ原子を含有する単環式または二環式の（Ｃ3〜Ｃ9）−ヘテロ芳香族の基を意味するものと理解される。
【００１３】
細胞内吸収を有利にする基の例は各種の親油性基例えば−Ｏ−(ＣＨ2)xＣＨ3（ここでｘは６〜１８の整数である）、−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ2)m−ＣＨ3（ここでｎおよびｍは互いに独立して６〜１２の整数である）、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)4−(ＣＨ2)9−ＣＨ3、−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−(ＣＨ2)13−ＣＨ3および−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)7−(ＣＨ2)15−ＣＨ3、またはステロイド残基例えばコレステリル、そして天然の担体系を利用する抱合体例えば胆汁酸、葉酸、２−（Ｎ−アルキル、Ｎ−アルコキシ）−アミノアントラキノン、並びにオリゴヌクレオチドのレセプター媒介エンドサイド−シスをもたらすマンノースとその対応するレセプターのペプチドとの抱合体例えばＥＧＦ（上皮成長因子）、ブラジキニンおよびＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）である。
【００１４】
標識グループは例えばダンシル（＝Ｎ−ジメチル−１−アミノナフチル−５−スルホニル）誘導体、フルオレセイン誘導体もしくはクマリン誘導体のケイ光グループまたは例えばアクリジン誘導体の化学ルミネセンスグループ、並びにＥＬＩＳＡによって検出可能なジゴキシゲニン系、ビオチン／アビジン系によって検出可能なビオチングループ、または検出可能なリポーターグループを用いて引き続いての誘導化を可能にする官能基を有するリンカーアーム例えばアクリジニウム活性エステルと反応して化学ルミネセンスプローブを形成するアミノアルキルリンカーアームを意味するものと理解される。典型的な標識グループは下記に示されるものである：
【化５】
0003717081.tif 000004
【００１５】
【化６】
0003717081.tif 000005
【００１６】
核酸に結合し、または挿入し、そして／または開裂し、または架橋するオリゴヌクレオチド類似体には例えばアクリジン、プソラレン（psoralen）、フェナントリジン、ナフトキノン、ダウノマイシンまたはクロロエチルアミノアリール抱合体が含まれる。典型的な挿入用および架橋用残基は下記に示されるものである：
【００１７】
【化７】
0003717081.tif 000006
【００１８】
【化８】
0003717081.tif 000007
【００１９】
ＮＲ3Ｒ4基（式中、Ｒ3およびＲ4はこれらを担持する窒素原子と一緒になって、追加的に別のヘテロ原子を含む５〜６員の複素環式環を形成する）の例として、モルホリニルおよびイミダゾリジニル基を挙げることができる。
【００２０】
本発明はα−およびβ−Ｄ−またはＬ−リボフラノシド、α−およびβ−Ｄ−またはＬ−デオキシリボフラノシド、並びに対応する炭素環式の５員環類似体に限定されないが、他の糖成分例えば環が伸張した、および環が収縮した糖、非環状の糖誘導体または他のタイプの適当な糖誘導体から構成されるオリゴヌクレオチド類似体もまた可能である。さらに、本発明は式Ｉで例を挙げられるホスフェート基の誘導体に限定されず、公知のデホスホ誘導体にもまた関する。
【００２１】
生物的オリゴヌクレオチドの合成において、式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体の製造は場合によっては自動合成装置を用いて、溶液中または好ましくは固体相上で行なわれる。
【００２２】
しかしながら、３′−末端にホスフェートまたはホスフェートエステル基を有するオリゴヌクレオチドの固体相合成はCaruthersの標準的なホスホラミジット（Phosphoramidite）化学〔M.D. MatteucciおよびM.H CaruthersのJ. Am. Chem. Soc., 103, 3185（1981年）〕では最初のヌクレオチド単位が３′−ヒドロキシル基を介して固体支持体に結合されるため不可能であり、そしてこの理由により３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドがいつもこれらの合成から得られる。固相法に基づく種々の方法が開示されているが、これらの方法はすべて労力を要し、そしてしばしばホスフェートエステルまたはアルキルホスホネートのような誘導体を製造するためには使用することができない〔R. EritjaらのTetrahedron Lett. 32, 1511（1991年）; P. KumarらのTetrahedron Lett. 32, 967（1991年）; W.T. MarkiewiczおよびT.K. Wyrzykiewiczのリン、硫黄およびケイ素51／52，374（1990年）; E. FelderらのTetrahedron Lett. 25, 3967（1984年）; R. LohrmannおよびJ. RuthのDMA 3，122（1984年）〕。
【００２３】
したがって、本発明はａ）  ３′（２′）−末端のリン（Ｖ）グループおよび遊離の５′−ヒドロキシルもしくはメメカプト基を有するヌクレオチド単位を３′−位にリン（III）もしくはリン（Ｖ）グループを有するもう１つのヌクレオチド単位またはその活性化誘導体と反応させ、あるいは
ｂ）  オリゴヌクレオチド類似体を同様にしてフラグメントを用いて構成し、そして（ａ）または（ｂ）により得られたオリゴヌクレオチド中に他の官能基を保護するために一時的に導入された保護基を除去し、場合によってはこのようにして得られた式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体をその生理学的に許容しうる塩に変換することからなる式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体の製造法に関する。
【００２４】
固相合成のための出発物質として使用されるのは式IV
Ｄ−Ｘ′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x−ＣＨ2ＣＨ2−Ａ−Ｔ      (IV)
〔式中、Ａはリンカーアーム例えばジカルボン酸、ジオール、アルキルアミン、ジカルボン酸モノアルキルアミド、酸アミドまたは式
【化９】
0003717081.tif 000008
（ここで、Ｒは水素または場合によっては−ＣＮによって置換されたＣ1〜Ｃ6−アルキル、好ましくはメチルもしくは２−シアノエチルである）のホスフェートの残基であり；Ｔは例えばＣＰＧ（制御多孔ガラス）、シリカゲルまたは有機樹脂例えばポリスチレン（ＰＳ）もしくはＰＳおよびポリエチレングリコール（ＰＯＥ）（側鎖がヒドロキシル、アミノ、ハロゲンまたはＣＯＯＨのような官能基によって修飾される）のグラフトコポリマーのような材料の固体支持体であり；ＤはリンカーアームＡおよびＸ′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x−ＣＨ2ＣＨ2−基を開裂することなく除去できる保護基(Bioorg. Chem. 14, 274〜325(1986年)を参照）、例えば４−メトキシテトラヒドロピラニルおよびジメトキシリチル、好ましくはジメトキシリチルであり；ｘは０、１または２の整数であり；そしてＸ′はオキシまたはチオである〕の固体支持体である。
【００２５】
固体支持体Ｔをイオウ含有基と化学結合（中でもアミド、エステル）により連結するリンカーアームＡ〔DamkaらのNucleic Acids Res. 18, 3813(1990年)〕は好ましくはコハク酸残基（Ｏ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ(Ｏ)−）、シュウ酸残基（Ｏ−Ｃ(Ｏ)−Ｃ(Ｏ)−）、アルキルアミン好ましくはＬＣＡＡ（長鎖アルキルアミン）、またはポリエチレングリコールである。コハク酸残基が特に好ましい。特定の場合、例えばアンモニアでの長期の処理に耐えられない置換基と組み合わせる場合、オキサリルリンカーのようなより不安定なリンカーが有利である。式IVａ〜ｃの固体支持体の製造は実施例１に記載する。
【００２６】
【表１】
0003717081.tif 000009
【００２７】
固相合成はホスフェートトリエステル法、Ｈ−ホスホネート法またはホスホラミジット(phosphoramidite)法、好ましくはホスホラミジット法〔E. SonveauxのBioorg. Chem. 14, 274(1986年)に従って行うことができる。通常、保護基Ｄが最初に式IVの支持体から、好ましくは酸例えば塩化メチレン中におけるトリクロロ酢酸によって除去される。ホスホラミジット法の場合、このようにして得られた式IV′
ＨＸ′−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x−ＣＨ2ＣＨ2−Ａ−Ｔ    （IV′）
（式中、ｘ、Ｘ′、ＡおよびＴは上記の意味を有する）の支持体はテトラゾールのような弱酸の存在下で式Ｖ
【化１０】
0003717081.tif 000010
〔式中、Ｒは緩やかな条件下で除去することのできる保護基例えば４−メトキシテトラヒドロピラニルまたはジメトキシリチルであり；Ｒ2′は水素、Ｃ1〜Ｃ18−アルコキシ、ハロゲンまたは保護されたヒドロキシルもしくはアミノ基であり；Ｒ5およびＲ6は互いに独立してＣ1〜Ｃ12−アルキルであり、またはこれらの残基は一緒になって５〜６員環を形成し；Ｙ″はオキシ、チオまたは(ＣＨ2)mであり；そしてａ、ｍ、ＶおよびＺは上記の意味を有する〕のヌクレオシドホスホラミジットと縮合される。
【００２８】
次に、このようにして得られた支持体はそれ自体公知の方法でヨウ素水（Ｗ＝Ｏ）、ＴＥＴＤ（テトラエチルチウラムジスルフィド）もしくは元素状イオウ（Ｗ＝Ｓ）、またはセレン（Ｗ＝Ｓｅ）を用いて酸化され式VII
【化１１】
0003717081.tif 000011
（式中、Ｒ、Ｖ、Ｂ′、Ｒ2′、Ｚ、Ｘ′、Ｗ、Ｙ″、ＡおよびＴは上記の意味を有する）の誘導化された支持体を生成する。好ましくは、式VIIａ
【化１２】
0003717081.tif 000012
の支持体が製造される。
【００２９】
式Ｖのホスホラミジットは例えば式VI
【化１３】
0003717081.tif 000013
（式中、Ｒ7およびＲ8はＲ5およびＲ6と同一であり、そしてａ、Ｒ、Ｖ、Ｂ′、Ｒ2′、Ｙ″、Ｒ5およびＲ6は上記の意味を有する）のビスアミジット(bisamidite)から、Ｚがアルコキシまたはアルキルメルカプトならばテトラゾール触媒を用いて、その対応するアルコールまたはチオアルコールと反応（実施例２、方法Ａ）させることにより得られる〔J. E. MaruggらのTetrahedron Lett. 27, 2271(1986年)〕。好ましいビスアミジットは式VIａ
【化１４】
0003717081.tif 000014
で表されるものである。
【００３０】
このようにして、式VIIIａ〜ｍのアミジットは製造された、例えば次式
【化１５】
0003717081.tif 000015
〔式中、Ｒ5およびＲ6は上記の意味を有し；Ｚはａ）Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3、ｂ）Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、ｃ）Ｏ−ｎ−Ｃ6Ｈ13、ｄ）Ｏ−ｎ−Ｃ18Ｈ37、
【化１６】
0003717081.tif 000016
ｇ）〜ｋ）式III(Ｒ″＝Ｈ）の残基（ここで、それぞれ、ｇ）ｐ＝３、ｑ＝０、ｈ）ｐ＝４、ｑ＝９、ｉ）ｐ＝５、ｑ＝４、ｋ）ｐ＝８、ｑ＝１３、ｐ）ＣＨ3、
【化１７】
0003717081.tif 000017
である）であり；そしてＢ′はａ）、ｃ）およびｄ）の場合Ｃｙｔi-Buであり、ｂ）およびｐ）の場合Ｔｈｙであり、ｅ）〜ｋ）およびｍ）の場合ＣｙｔBzである〕で表されるものである。
【００３１】
支持体に負荷する(loading)ための別法は式IX
Ｚ″−ＰＲ9Ｒ10        (IX)
〔式中、Ｒ9およびＲ10は互いに独立してＣｌ、−ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ7Ｒ8またはＺ″（ここでＺ″はＺである。但し、ヒドロキシル、メルカプトおよびＳｅＨは保護された誘導体、例えばＯ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＮ、Ｏ−ＣＨ3、Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、Ｘ′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｘ′−Ｄまたは
【化１８】
0003717081.tif 000018
好ましくはＸ′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ(Ｏ)x′−ＣＨ2ＣＨ2−Ｘ′−ＤＭＴｒ（ここでｘ′は０または１の整数である）、特にＯ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＤＭＴｒとして存在しなければならない）であり、そしてＲ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｘ′、ＤＭＴｒおよびＤは上記の意味を有する〕のホスフィチル化試薬(Phosphitylation reagent)を式Ｘ
【化１９】
0003717081.tif 000019
（式中、Ｙ′′′はオキシまたはチオであり、そしてＶ、Ｂ′およびＲは上記の意味を有する）の遊離の３′(２′)−基を有するヌクレオシドと反応させ、次いで、このようにして得られた化合物を縮合剤例えばテトラゾール（Ｒ9，Ｒ10＝ＮＲ5Ｒ6またはＮＲ7Ｒ8の場合）またはジイソプロピルアミン（Ｒ9，Ｒ10＝Ｃｌの場合）の存在下で式IV′の支持体上に縮合させることである：これはしばしばより迅速な方法となる（実施例３、方法Ｂ）。引き続くヨウ素水、イオウまたはセレンを用いての酸化により式VIIａの化合物が得られる。次いで、公知の方法により保護基Ｒを除去し、オリゴヌクレオチド合成を継続させることができる。合成の最後に、このようにして得られた支持体の結合したオリゴヌクレオチド類似体から保護基が公知の方法で除去され、そして本発明の式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体は次に支持体と開裂される。
【００３２】
合成が式Ｖの単位で最後のサイクルを完了する場合、５′−ヒドロキシル基および３′−末端にリン含有抱合部分を有する式Ｉ（Ｒ′＝Ｈ）のオリゴヌクレオチド類似体が得られる。一方、最後の縮合段階で例えば式IX（式中、Ｒ9はＺ″である）のリン酸化試薬を用いた場合、合成の結果として３′−および５′−末端の両方にホスフェート含有置換基を有する式Ｉ（Ｒ′＝式II）のオリゴヌクレオチド類似体が得られる。
【００３３】
３′−末端にホスホラミデート(Phosphoramidate)基を有するオリゴヌクレオチドの製造は例えばJaegerらのBiochemistry, 27, 7237(1988年)に記載されているようにヨウ素／Ｈ2ＮＲ3またはＨＮＲ3Ｒ4（ここでＲ3およびＲ4は上記の意味を有する）を用いて酸化が行われるならばテトラゾールの存在下で式IV′（ｘ＝０）の支持体を式Ｖ（Ｚ＝Ｏ−ＣＨ3）のモノマーメトキシホスホラミジットと反応させることにより可能である。
【００３４】
特定の場合（Ｚ＝ＮＨＲ3、ＮＲ3Ｒ4、Ｏ、ＳまたはＳｅ）、Ｚ基の導入はまたＨ−ホスホネート法により行うこととができ、先ず式(XI)
【化２０】
0003717081.tif 000020
（式中、Ｒ、Ｖ、ａ、Ｂ′、Ｙ′、Ｘ′およびＷは上記の意味を有する）のヌクレオシドＨ−ホスホネートを縮合剤例えば塩化ピバロイルまたはアダマントイルおよび塩基例えばピリジンの存在下で式IV′の支持体と反応させる。次に、生成した式VII′
【化２１】
0003717081.tif 000021
のＨ−ホスホネートジエステルを酸化的ホスホラミド化〔Oxidative phosphoramidation；B. FroehlerのTetrahedron Lett. 27, 5575(1986年)〕またはヨウ素水イオウもしくはセレンを用いての酸化に付される。このようにして、３′−末端にコレステリル基を有するオリゴヌクレオチドが、例えばVII′（ｘ＝０）を出発物質として四塩化炭素の存在下でコレステリルオキシカルボニル−アミノアルキルアミンを用いて製造することができる。例えば、２−メトキシエチルアミンを用いての酸化的アミド化により３′−Ｏ−（２′−メトキシエチル）−ホスホラミデート残基を有するオリゴヌクレオチドが得られる。次の連鎖構成はホスホラミジット、Ｈ−ホスホネートまたはトリエステル法に従って公知の方法で行われる。
【００３５】
式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体の製造はまたトリエステル法を用いて可能であり、式IV′の支持体のヒドロキシル基を縮合剤の存在下で式XII
【化２２】
0003717081.tif 000022
（式中、Ｒ、Ｖ、ａ、Ｂ′、Ｒ2、Ｙ′、Ｚ、ＷおよびＸ′は上記の意味を有する）の保護されたホスフェートジエステルと反応させる。好ましい縮合剤は求核触媒例えばイミダゾール、トリアゾール、テトラゾールまたはこれらの置換誘導体例えばＮ−メチルイミダゾール、３−ニトロトリアゾールもしくは５−（ｐ−ニトロフェニル）−テトラゾールの存在下における塩化アリールスルホニル例えば塩化メシチレンスルホニル、塩化２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルまたは塩化８−キノリンスルホニルである。特に好ましい縮合剤はピリジン−Ｎ−オキシドまたはキノリン−Ｎ−オキシドの４−置換誘導体〔EfimovらのNucleic Acids Research 13, 3651(1985年)〕である。Ｈ−ホスホネートおよびホスホラミジット法と比較して、トリエステル法は追加の酸化段階が必要でないという点で有利である。
【００３６】
オリゴヌクレオチド合成が式IV′のチオ（ｘ＝０）またはスルフィニル（ｘ＝１）支持体を用いて行われる場合、これらの基は塩基好ましくはアンモニアでの開裂を容易なものとするためにそれ自体公知の方法〔FunakoshiらのProc. Natl. Acad. Sci. 88, 6982(1991年)〕で最後にスルホニル基に酸化される。合成が完了すると困難なく除去できなければならないため、塩基Ｂ′のアミノ保護基およびリンカーアームＡの構成の性質はそれぞれ置換基Ｚの性質に依存する。例えば、オリゴヌクレオチド３′−ホスフェートイソプロピルエステル（Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）を製造する際、Ｂ＝ＡｄｅおよびＣｙｔの場合ベンゾイル（Ｂｚ）保護基を、そしてＢ＝Ｇｕａの場合、イソブチリル（ｉ−Ｂｕ）保護基を用いることができる。一方、オリゴヌクレオチド３′−メチルホスホネートエステル（Ｚ＝ＣＨ3）またはエチルエステル（Ｚ＝Ｏ−Ｃ2Ｈ5）を合成するために、Ｂ＝ＡｄｅおよびＧｕａ、そしてＢ＝Ｃｙｔの場合、それぞれより不安定なフェノキシアセチル（ＰＡＣ）およびイソブチリル保護基が使用される。
【００３７】
多くの抱合体は、式Ｖのモノマー単位に組込まれる前に適当な方法で保護されなければならない追加の官能基を有する。例えば、フルオレセインのカルボキシル基はアルキルエステルとして保護されなければならない。プソラレンでは、アミド基はＮ−Ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）−保護化合物として存在しうる。ヒドロキシル基はアシル化またはシリル化（ｔ−ブチルジメチルシリル）による副反応によって保護することができる。アミノ基はまたトリフルオロアセチル−保護形態で存在しうる。例外的な場合、抱合体は非常に不安定なため、オリゴヌクレオチド合成の間に保護基の除去の条件下で分解されうる。このような場合、式Ｖのモノマーに官能基例えばＺ＝ＨＮ−(ＣＨ2)x−ＮＨ−Ｆｍｏｃ（ここでｘは２〜１２、好ましくは４〜６の整数である）を有するリンカーアームを１個だけ組込むことが好都合である。オリゴヌクレオチド中への組込みおよび好ましくはアンモニアを用いての保護基の除去後、遊離のアミノ基は活性エステルに結合されうる。例えば塩基不安定なアクリジニウムエステルはこのようにして製造された。
【００３８】
合成したオリゴヌクレオチド誘導体の特性決定は電気スプレーイオン化質量分析法により行われる〔StultsおよびMastersのRapid Commun. Mass. Spectr. 5, 350(1991年)〕。
【００３９】
本発明の式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体を血清中における、および公知のエキソヌクレアーゼに対する安定性について試験した。
【００４０】
驚くべきことに、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、すべての式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体は血清ヌクレアーゼに対する非常に増大した安定性を有し、他方これらのハイブリッド形成作用はほんのわずかしか影響されないことを見い出した。
【００４１】
非修飾オリゴヌクレオチドはウシ胎児血清中、約２時間の半減期を有するが、すべての式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体は約１６時間、十分安定である。さらに、式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体はＲ′が水素でないものだけが脾臓ホスホジエステラーゼに対して抵抗性があるが、ヘビ毒ホスホジエステラーゼに対して安定である。非修飾オリゴヌクレオチドはヘビ毒ホスホジエステラーゼにより３′−末端から、そして脾臓ホスホジエステラーゼにより５′−末端からエキソ核酸分解的に分解される。
【００４２】
相補性一重鎖ヌクレオチド配列では、式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体はワトソン−クリック型塩基対による二重鎖ハイブリッドを形成し、他方これらはフーグスティーン型塩基対による二重鎖核酸を有する三重らせん構造を形成する。このようにして、核酸の生物学的機能の調整または抑圧、例えば細胞遺伝子および腫瘍遺伝子の発現もしくはウィルスのゲノムの機能の抑圧は本発明のオリゴヌクレオチド類似体を用いることにより可能である。従って、式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体はウィルス感染もしくは癌の治療または予防のための医薬として使用することができる。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチドの活性はＨＳＶ−１ウィルス複製の阻害に基づいて測定した。例として、次の式ＩのオリゴヌクレオチドがＨＳＶ−１に対して活性であることがわかった：
0003717081.tif 000023
【００４４】
これらの天然形態、すなわち３′−誘導化のない形態において、所定の配列はおそらく血清中で急速な分解に付されるか、または不十分な細胞浸透を有するため、細胞培養においてＨＳＶ−１に対して不活性である。一方、式Ｉの３′−誘導化オリゴヌクレオチドはＨＳＶ−１複製を様々の程度まで阻害する。適当な化学的誘導化を伴うが抗ウィルス活性を持たないコントロール配列として役にたつものを下記に示す：
0003717081.tif 000024
【００４５】
３′−末端がプソラレンで修飾された式Ｉのオリゴヌクレオチド（実施例４Ｓ）はＨＳＶ−２のＩＥ4/5領域を認識し、そしてＨＳＶ−２の複製を阻害する。プソラレン抱合体の抗ウィルス活性はUV光で照射することにより有意に増大されうる。１６０,０００塩基を有するＨＳＶ−1/2ゲノムは自然に、ウィルス複製を阻害するための種々の効果を有する数多くの別の標的配列を提供する。ヌクレオチド配列を変えることにより、治療原理を他の何れかのウィルス、細菌または他の病原体に適用することができる。他の病原体に適用するための唯一の前提条件は、これらの病原体の生活環のために不可欠な遺伝子が公知であるということである。これらの遺伝子の配列はいわゆる遺伝子データベース中に非常に多様に蓄えられる。これはその機能が抑圧されうる腫瘍遺伝子および他の細胞遺伝子の場合についてもそうである。他の細胞遺伝子の例は酵素、レセプター、イオンチャンネル、免疫調節剤、成長因子および他の調節タンパク質を符号化するものである。腫瘍遺伝子の例はａｂｌ、ｎｅｕ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒａｓ、ｆｏｓ、ｍｏｓ、ｅｒｂＢ、ｅｔｓ、ｊｕｎ、ｐ５３、ｓｒｃおよびｒｅｌである。
【００４６】
アンチセンスおよびトリプレックス形成オリゴヌクレオチド配列は例えば、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ〔L. SheffieldのExp. Cell Res. 192, 307(1991年)〕、ストリキニン感受性グリシンレセプター〔AkagiらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8103(1989年)〕、クロライドチャンネル〔SorscherらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7759(1991年)〕、インターロイキン−６〔LevyらのJ. Clin. Invest. 88, 696(1991年)〕、塩基性繊維芽細胞成長因子〔BeckerらのEMBO J. 8, 3685(1989年)〕およびｃ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子〔PostelらのProc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8227(1991年)〕の阻害剤として知られている。他の標的分子の配列の次のさらなる例は、本発明のオリゴヌクレオチドの幅広い応用性を説明するためのものである。
【００４７】
ａ）  ＨＩＶ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド：
5′ACA CCC AAT TCT GAA AAT GG 3′（スプライス部位）
5′AGG TCC CTG TTC GGG CGC CA 3′（プライマー結合部位）
ｂ）  ＥＧＦレセプター（上皮成長因子レセプター）
5′GGG ACT CCG GCG CAG CGC 3′   （５′未翻訳）
5′GGC AAA CTT TCT TTT CCT CC 3′（アミノ末端）
ｃ）  ｐ５３腫瘍サプレッサー
5′GGG AAG GAG GAG GAT GAG G 3′      （５′非符号化）
5′GGC AGT CAT CCA GCT TCG GAG 3′（翻訳開始）
ｄ）  ｃ−ｆｏｓ腫瘍遺伝子
5′CCC GAG AAC ATC ATG GTC GAA G 3′（翻訳開始）
5′GGG GAA AGC CCG GCA AGG GG 3′   （５′非符号化）
ｅ）  ＥＬＡＭ−１（内皮白血球癒着分子）
5′ACT GCT GCC TCT TGT CTC AGG 3′  (５′−非符号化）
5′CAA TCA ATG ACT TCA AGA GTT C 3′（翻訳開始）
ｆ）  ＩＣＡＭ−１（細胞内癒着分子）
5′CTC CCC CAC CAC TTC CCC TC 3′（３′−未翻訳）
5′GCT GGG AGC CAT AGC GAG G 3′ （翻訳開始）
ｇ）  ＢＣＲ−ＡＢＬ（フィラデルフィア染色体転座）
5′GCT GAA GGG CTT CTT CCT TAT TG 3′（ＢＣＲ−ＡＢＬ中断点）
【００４８】
文献公知の３′−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチド誘導体と比較して、式Ｉのオリゴヌクレオチド類似体からなるＤＮＡプローブは一方で増大したヌクレアーゼ安定性の利点を提供し、そして他方ではオリゴヌクレオチドの両方の末端で同一のまたは異なった標識分子の受容を可能にする。異なった標識グループを１個のオリゴヌクレオチド内で選択的に活性化することができる（二重標識化）ということは有利である。一方の末端に標識をつけ、そして他方の末端に付加的な官能基を導入（例えば親和性標識）するために二官能性誘導化もまた用いることができる。この目的のために、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンを認識するビオチンをオリゴヌクレオチドの３′−末端に組込むことができるが、他方アルキルアミノリンカーを介してアクリジニウムエステル化学ルミネセンス標識を５′−末端に付けることができる。
【００４９】
その上、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の浸透作用は多くの場合、非修飾オリゴヌクレオチドよりも有利であり、特に親油性基が導入された場合はそうである。オリゴヌクレオチドの増大した安定性およびこれらの改良された細胞浸透は、非修飾オリゴヌクレオチドと比較してより高い生物学的活性を有する形態において現れる。
【００５０】
前述した本発明のオリゴヌクレオチド類似体の診断上、予防上および治療上の用途は単なる代表例であって、したがってこれらの類似体の使用はこれらに限定されない。その上、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は例えばバイオテクノロジーおよび分子生物学における補助剤として使用されうる。
【００５１】
さらに、本発明は場合によっては生理学的に許容しうる補助剤および／または賦形剤および／または他の公知の活性物質とともに、有効量の１種以上の式Ｉの化合物またはこれらの生理学的に許容しうる塩を含有する製剤、並びに活性物質が賦形剤そしておそらくはさらに補助剤、添加剤または他の活性物質とともに適当な形態に変換されることからなるこれらの製剤の製造法に関する。投与は好ましくは静脈内的に、局所的に、または鼻内的に行われる。
【００５２】
【実施例】
実施例１  式IVの支持体の製造
ａ）  アミノプロピル−ＣＰＧをビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルのスクシネートと反応させることによる式IVａの支持体の製造
４.５６ｇのビス−（２−ヒドロキシエチル）スルホンのジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）モノエーテル（１０ミリモル）を２回無水ピリジン中に入れて濃縮することにより乾燥し、２５mlの無水ピリジンに溶解し、１.７８ｇ（１４ミリモル）のＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）および１.４ｇの無水コハク酸（１４ミリモル）を加え、そしてこの混合物を室温で３時間撹拌した。反応が完了した後、混合物を濃縮し、残留物を３回トルエン中に入れて濃縮してピリジンを除去し、次いで２２０mlの塩化メチレン中に入れた。有機相を１０％強度クエン酸（１１０ml）および３回１１０mlの水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして濃縮した。得られた固体残留物を真空乾燥した（５.６４ｇ）。１.６７ｇ（３ミリモル）のこのスクシネートを２回無水ピリジン中に入れて濃縮し、０.６５mlの無水ピリジンおよび６mlのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の混合物中に溶解した。２.１mlの無水ＴＨＦ中における４２０mg（３ミリモル）のｐ−ニトロフェノールおよび６８７mgのＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド、３.３ミリモル）の溶液を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。反応が完了した後、遠心分離により沈殿したジシクロヘキシル尿素を除去した。沈殿物を１mlの無水エーテル中に懸濁し、再び遠心分離した。１.５ｇのアミノプロピル−ＣＰＧ支持体（Fluka社製、５００Å、１００μモル／ｇのアミノ基）を１.８mlの無水ＤＭＦおよび３５０μｌのトリエチルアミンの混合物中に懸濁し、沈殿物からデカンテーションしたニトロフェニルスクシネートエステルの合一した溶液を加え、そして混合物を室温で１６時間振とうした。固体支持体を分離し、３mlのキャッピング試薬（無水酢酸／２,６−ルチジン／ＤＭＡＰ；それぞれＴＨＦ中０.２５Ｍ）と一緒に室温で１時間振とうして反応性基をブロックした。次に、誘導化されたＣＰＧ支持体を吸引濾過し、メタノール、ＴＨＦ、塩化メチレンおよびエーテルで洗浄し、そして４０℃で真空乾燥した。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVａの支持体の荷重（loading）は３８μモル／ｇであった。
【００５３】
ｂ）  TentaGelR（Rapp社の登録商標名）をビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルのスクシネートと反応させることによる式IVｂの支持体の製造
１００mgのアミノ形態のTentaGel樹脂、２５０μモル／ｇのアミノ基を有するＰＳ／ＰＯＥコポリマーを３６０μｌのＤＭＦおよび７０μｌのトリエチルアミンの混合物中に懸濁し、４００μモルのｐ−ニトロフェニルスクシネートエステル（製造：実施例１ａ参照）を加え、そして混合物を室温で１６時間乾燥した。次に、実施例１ａ）に記載したように後処理した。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVｂのTentaGel樹脂の荷重は９８μモル／ｇであった。
【００５４】
ｃ）  TentaGel（ヒドロキシ形態）を式IX（Ｚ″＝ＤＭＴｒ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−；Ｒ9＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2；Ｒ10＝Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）のホスフィチル化試薬と反応させることによる支持体IVｃの製造
５００μモル／ｇのヒドロキシル基を有する５０mgのヒドロキシ形態のTentaGel樹脂を２５当量のテトラゾールの存在下、１０当量の式IX（Ｚ″＝ＤＭＴｒ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−；Ｒ9＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2；Ｒ10＝Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）のホスフィチル化試薬とアセトニトリル中、２２℃で反応させた。ヨウ素水（ＴＨＦ／水／ピリジン中における１.３ｇのヨウ素；７０：２０：５＝ｖ：ｖ：ｖ）で酸化した後、実施例１ａ）に記載したように後処理を行った。ジメトキシトリチル含有成分を有する式IVｃの支持体の荷重は２４７μモル／ｇであった。
【００５５】
実施例２  式VIIIの保護されたヌクレオシド３′−ホスホラミジットの製造
ａ）  VIIIａ(Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｚ＝Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
２ミリモルの式VI（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のヌクレオシド３′−ホスホロビスアミジットを２回２０mlの無水アセトニトリル中に入れて濃縮して、そして２０mlの無水アセトニトリル中に溶解した。次に、５mlの無水アセトニトリル中における２.４ミリモルのエタノールおよび１.２ミリモルの昇華したテトラゾールの溶液を１５分間にわたって滴加した。撹拌をさらに２.５時間継続した後、混合物を７５mlの塩化メチレンで希釈し、そして有機相を５０mlの５％強度重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。水性溶液を２回５０mlの塩化メチレンで洗浄し、合一した有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮した。残留物を塩化メチレン／ｎ−ヘプタン／トリエチルアミン（４５：４５：１０；ｖ：ｖ：ｖ）を用いるシリカゲル上におけるカラムクロマトグラフィーにより精製した。０.７ｇの所望のジアステレオマー物質が、薄層クロマトグラフィーにより精製した化合物（31Ｐ−ＮＭＲ σ＝１４６.７、１４７.５ppm）として得られた。痕跡量のその相当するビス−エチルホスフィットが副生成物（31Ｐ−ＮＭＲ σ＝１３９.３ppm）として単離された。
【００５６】
ｂ）  VIIIｂ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
１０mlの無水塩化メチレン中におけるテトラゾール（０.５ミリモル）の存在下、式IX（Ｚ″＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｒ9＝Ｒ10＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2；４ミリモル）のビスアミジットを用いる式Ｘ（Ｂ′＝Ｔｈｙ（β−位）；Ｒ＝ＤＭＴｒ、Ｖ＝Ｏ、ａ＝Ｏ、Ｙ″＝Ｏ；２ミリモル）の５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンのホスフィチル化により製造を行った。混合物を実施例２ａ）のようにして後処理した（31Ｐ−ＮＭＲ σ＝１４５.０４ppm、１４５.６６ppm）。
【００５７】
ｃ）  VIIIｃ（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｚ＝Ｏ−ｎ−Ｃ6Ｈ13、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ(Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のｎ−ヘキサノールとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.１ppm、１４８.５ppm）。
【００５８】
ｄ）  VIIIｄ（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｚ＝Ｏ−ｎ−Ｃ18Ｈ37、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のｎ−オクタデカノールとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４７.２ppm、１４７.９ppm）。
【００５９】
ｅ）  VIIIｅ(Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝３−ピリジルプロパン−３−オキシ、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｒ2′＝Ｈ）のビスアミジットから、テトラゾール触媒の存在下、１当量の３−ピリジン（プロパン−３−オール）との反応により製造した。
この場合、カラムクロマトグラフィーにより２つのジアステレオマーを分離することができた（31Ｐ−ＮＭＲ ジアステレオマー１：１４７.７ppm、ジアステレオマー２：１４８.２ppm）。
【００６０】
ｆ）  VIIIｆ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のｐ−ニトロフェニルエタン−２−オールとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.１ppm、１４８.６ppm）。
【００６１】
ｇ）  VIIIｇ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝−(ＯＣＨ2ＣＨ2)3ＯＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のトリエチレングリコールモノメチルエーテルとの反応により製造した(31Ｐ−ＮＭＲ １４８.５ppm、１４８.９ppm）。
【００６２】
ｈ）  VIIIｈ(Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝−(ＯＣＨ2ＣＨ2)4Ｏ(ＣＨ2)9ＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のテトラエチレングリコールモノデシルエーテルとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.４ppm、１４８.８ppm）。
【００６３】
ｉ）  VIIIｉ(Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝−(ＯＣＨ2ＣＨ2)5Ｏ(ＣＨ2)4ＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のペンタエチレングリコールモノペンチルエーテルとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.４ppm、１４８.９ppm）。
【００６４】
ｋ）  VIIIｋ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝−(ＯＣＨ2ＣＨ2)8Ｏ(ＣＨ2)13ＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量のオクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテルとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４８.４ppm、１４８.８ppm）。
【００６５】
ｌ）  VIIIｐ(Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝ＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンから触媒としてテトラゾールの代りに２当量のジイソプロピルエチルアミンを用いて、式IX（Ｚ″＝ＣＨ3、Ｒ9＝Ｃｌ、Ｒ10＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2）の試薬でのホスフィチル化により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １２０.６ppm、１２１.０ppm）。
【００６６】
ｍ）  VIIIｍ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝アクリジン−９−（ブチル−４−オキシ）−、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）の製造
実施例２ａ）と同様の方法で、式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｒ7＝Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからテトラゾール触媒の存在下、１当量の９−（４−ヒドロキシブチル）アクリジンとの反応により製造した（31Ｐ−ＮＭＲ １４６.７ppm、１４７.４ppm）。
【００６７】
実施例３  式VIIの支持体の結合したヌクレオチドの製造
ａ）  方法Ａ：式VIIIｂのヌクレオシド３′−ホスホラミジットを結合することによる式VIIａ−１の支持体の製造
それに０.２μモルのビスヒドロキシエチルスルホンジメトキシトリチルエーテルが結合された実施例１ａ）で得られた７.５mgの支持体を３％強度のトリクロロ酢酸で処理し、これによりＤＭＴｒ保護基を除去し、アセトニトリルで洗浄し、次いでアセトニトリル中、テトラゾール（１０μモル）の存在下で２μモルの式VIIIｂ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のヌクレオシド３′−ホスホラミジットと反応させた。反応時間は２.５分である。次に、ヨウ素での酸化（Ｗ＝Ｏの場合；ＴＨＦ／水／ピリジン中における１.３ｇのヨウ素；７０：２０：５＝ｖ：ｖ：ｖ）を行った。
【００６８】
ｂ）  方法Ｂ：式IXのホスフィチル化試薬を介しての反応による式VIIａ−２の支持体の製造
式IX（Ｚ″＝ｎ−オクチル、Ｒ9＝Ｒ10＝Ｃｌ；１当量）のホスフィチル化試薬を無水アセトニトリルまたは塩化メチレン中、１.２当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下、式Ｘのヌクレオシド（１当量の５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン、Ｂ′＝β−位、Ｙ′′′＝Ｏ）と−７８℃で反応させて相当するヌクレオシド−３′−Ｏ−ｎ−オクチルホスホンモノクロライドを生成した。保護基Ｄ＝ＤＭＴｒを除去するために、式IVａの支持体を方法Ａのようにして処理し、次いでアセトニトリルで洗浄し、ＤＩＰＥＡの存在下、その場で製造した過剰のヌクレオシド−３′−Ｏ−ｎ−オクチルホスホンモノクロライドと反応させた。ヨウ素水で酸化した後、式VIIａ−２の支持体の結合したヌクレオチドが得られた。これは次のオリゴヌクレオチド合成に利用できる。
【００６９】
実施例４  式Ｉのオリゴヌクレオチド（それぞれの場合において、モノマーはβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドである）の製造
ａ）  式Ｉａ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ、Ｂ＝Ｔｈｙ、ｎ＝９）のオリゴヌクレオチドの製造
ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ−(Ｏ−ｉ−Ｃ３Ｈ７)
実施例３ａ）で得られた０.２μモルの支持体VIIａ−１（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）を次の試薬を用いて順番に処理した：
１．無水アセトニトリル
２．ジクロロメタン中における３％トリクロロ酢酸
３．無水アセトニトリル
４．０.１５mlの無水アセトニトリル中における４μモルのβ−シアノエチル５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３′−ホスフィット−ジイソプロピルアミジットおよび２.５μモルのテトラゾール
５．アセトニトリル
６．４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリジンとともにＴＨＦ中における２０％無水酢酸
７．アセトニトリル
８．ヨウ素（ＴＨＦ／水／ピリジン中１.３ｇ；７０：２０：５＝ｖ：ｖ：ｖ）
【００７０】
段階１〜８（以後、一反応サイクルと称する）を８回繰り返してデカチミジレート誘導体を生成した。合成が完了した後、段階１〜３に記載のようにしてジメトキシトリチル基の除去を行った。オリゴヌクレオチドを支持体から開裂し、と同時にアンモニアで１.５時間処理することによりβ−シアノエチル基を除去した。オリゴヌクレオチドはアミノ保護基を全く含まないので、アンモニアを用いてのこれ以上の処理は必要ではない。得られたイソプロピルデカチミジレート３′−ホスフェートの粗生成物はポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣにより精製した。
【００７１】
ｂ）  式Ｉｂ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ−Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）
モノマー中、異なったヌクレオチド塩基を用いる以外は実施例４ａ）と同様の方法で合成を行った。合成段階１〜８において、一般にモノマーはアデニン（Ａｄｅ）、シトシン（Ｃｙｔ）またはグアニン（Ｇｕａ）のアミノ基が適当な保護基で保護されたβ−シアノエチル５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヌクレオシド−３′−ホスフィット−ジアルキルアミドとして使用される。本実施例においては、Ｎ6−ベンゾイル−Ａｄｅ（ＡｄｅBz）、Ｎ4−ベンゾイル−Ｃｙｔ（ＣｙｔBz）およびＮ2−イソブチリル−Ｇｕａ（ＧｕａiBu）を使用した。実施例４ａ）に記載のようにして式VIIａ−１（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）の支持体を出発物質として用い、上記の順序に従ってその相当するモノマー上に縮合して連鎖構成を行った。しかしながら、アミノ保護基を除去するために、さらにアンモニアでの処理（５０℃で１６時間）を行った。
【００７２】
ｃ）  式Ｉｃ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ3）
その製造が方法Ａ（実施例３ａ））に従って式VIIIａのモノマーの助けによって行われる、式VIIａ−３（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ−Ｃ2Ｈ5）の支持体を出発物質として、実施例４ｂ）と同様の方法で合成を行った。しかしながら、塩基−不安定な置換基（ここではＺ＝Ｏ−Ｃ2Ｈ5）を製造するために、合成の最後により容易に開裂されうるより不安定なアミノ保護基Ｎ6−フェノキシアセチル−Ａｄｅ（ＡｄｅPAC）、Ｎ4−イソブチリル−Ｃｙｔ（ＣｙｔiBu）およびＮ2−フェノキシアセチル−Ｇｕａ（ＧｕａPAC）が有利に用いられた。次に、アンモニアでの保護基の除去に５０℃で２時間だけかかった。生成物を５０℃においてアンモニアでさらに６時間処理した場合、約５〜１０％のオリゴヌクレオチド−３′−ホスフェートがエチルホスフェートエステルの開裂の結果としての副生成物として得られた。
【００７３】
ｄ）  式Ｉｄ〔Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｏ−（ＣＨ2)17ＣＨ3、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ；Ｗ＝Ｏ、最後の２個の５′−末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合(Ｗ＝Ｓ、Ｐｓとして示される)を除く〕のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐsＧｐsＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−Ｏ−（ＣＨ2)17ＣＨ3）
その製造が方法Ａ（実施例３ａ））に従って式VIIIｄのモノマーの助けによって行われる、式VIIａ−４（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ−（ＣＨ2)17ＣＨ3）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）に記載のものと同様の方法でより不安定な保護基を用いて合成を行った。末位から２番目のヌクレオチド（Ｇ）および最後のヌクレオチド（Ｃ）を結合した後、ヨウ素水の代りにＴＥＴＤ溶液（アセトニトリル中における０.４Ｍのテトラエチルチウラムジスルフィド）をイオウ酸化のために使用した。保護基をアンモニアで２時間処理することにより除去した。２個の５′−末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３′−Ｏ−ｎ−オクタデシルホスフェートエステル残基を有する式Ｉｄのオリゴヌクレオチドが得られた。
【００７４】
ｅ）  式Ｉｅ〔Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝ＣＨ3、ａ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ；Ｕ＝Ｏ、２個の５′−末端メチルホスホネートヌクレオチド間結合（Ｕ＝ＣＨ3、ＰMeとして示される)を除く〕のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐMeＧｐMeＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐMe）
その製造が方法Ａ（実施例３ａ））に従って式VIIIｐのモノマーの助けによって行われる、式VIIａ−５（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝ＣＨ3）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様の方法で合成を行った。通常のシアノエチルで保護されたモノマー（式VIII、Ｚ＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）の代りに、その相当するメチルホスホンアミジット（式VIII、Ｚ＝ＣＨ3）を最後の２個のヌクレオチド単位（ＧおよびＣ）を結合するために用いた。濃アンモニア（室温で１.５時間）で支持体から開裂し、次いでエチレンジアミン／エタノール／水（５：４：１；ｖ：ｖ：ｖ）で６時間処理して塩基のアミノ基を遊離させた。その結果、２個の５′−末端メチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する式Ｉｅのオリゴヌクレオチド−３′−メチルホスホネートが得られた。
【００７５】
ｆ）  式Ｉｆ(Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝ＣＨ3、Ｘ＝Ｓ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ(s)Me）
実施例１ａ）で得られた式IVａの支持体を出発物質として、式VIII(Ｚ＝ＣＨ3、Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のメチルホスホンアミジットを実施例３ａ）に記載されているように最初の反応サイクルで結合した。酸化はＴＥＴＤを用いて行った。さらなる合成は実施例３ｃ）に記載のようにして行った。実施例３ｅ）と同様の方法で保護基を除去した後、式Ｉｆのオリゴヌクレオチド−３′−メチルホスホノチオエートが得られた。
【００７６】
ｇ）  式Ｉｇ(Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｘ＝Ｓ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ(s)s）
実施例４ｂ）に記載された合成法と同様にして、実施例１ａ）で得られた式IVａの支持体を出発物質として行ったが、しかし最初の縮合段階でメチルホスホンアミジットの代りに式VIII(Ｚ＝２,４−ジクロロチオベンジル；Ｒ5＝Ｒ6＝エチル）のヌクレオシド−３′−ホスホラミジットを使用した。ＴＥＴＤ（アセトニトリル中０.４Ｍ）を用いての酸化により再び第２のＳ原子の導入を行った。ジクロロベンジルチオ基の開裂は公知の方法でチオフェノール／トリエチルアミンを用いて行った。濃アンモニアで保護基を除去した後、式Ｉｇのオリゴヌクレオチド−３′−ホスホロジチオエートが得られた。
【００７７】
ｈ）  式Ｉｈ(Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
【化２３】
0003717081.tif 000025
その製造が方法Ａ（実施例３ａ））に従って式VIIIｆのモノマーの助けによって行われる、式VIIａ−６（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝ｐ−ニトロフェニルエチル−２−オキシ）の支持体を出発物質として、実施例４ｂ）と同様の方法で合成を行った。５５℃において１０時間アンモニアで処理することにより保護基を除去した後、式Ｉｈのオリゴヌクレオチド−３′−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニルエチル）ホスフェートが得られた。
【００７８】
ｉ）  式Ｉｉ(Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝３−ピリジルプロパン−３−オキシ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
【化２４】
0003717081.tif 000026
実施例３ａ）に記載のようにして式VIIIｅのアミジットの助けによって製造した式VIIａ−７（Ｂ′＝ＣｙｔiBu、Ｗ＝Ｏ、
【化２５】
0003717081.tif 000027
の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様にしてオリゴヌクレオチド合成を行った。
【００７９】
ｋ）  式Ｉｋ(Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3ＣＨ3、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴｐＣｐＣｐＴｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＧｐＣｐ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3ＣＨ3）
実施例３ａ）に記載のようにして式VIIIｇのアミジットの助けによって製造した式VIIａ−８（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3ＣＨ3）の支持体を出発物質として、実施例４ｂ）と同様にして上記の配列に相当するオリゴヌクレオチド合成を行った。
【００８０】
ｌ）  式Ｉｌ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)5（ＣＨ2)4ＣＨ3、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)5−（ＣＨ2)4ＣＨ3）
実施例３ａ）に記載のようにして式VIIIｉのアミジットの助けによって製造した式VIIａ−９（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)5（ＣＨ2)4ＣＨ3）の支持体を出発物質として、実施例４ｂ）と同様にしてオリゴヌクレオチド合成を行った。
【００８１】
ｍ）  式Ｉｍ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8（ＣＨ2)13ＣＨ3、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8−（ＣＨ2)13ＣＨ3）
実施例３ａ）に記載のようにして式VIIIｋのアミジットの助けによって製造した式VIIａ−１０（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)8（ＣＨ2)13ＣＨ3）の支持体を出発物質として、実施例４ｂ）と同様にしてオリゴヌクレオチド合成を行った。
【００８２】
ｎ）  式Ｉｎ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−（ＣＨ3）Ｎ（ＣＨ2)2Ｎ（ＣＨ3)2、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−Ｎ(ＣＨ3)(ＣＨ2)2Ｎ−(ＣＨ3)2
実施例１ｃ）で得られた式IVｃの支持体を出発物質として、実施例４ａ）に記載のようにしてオリゴヌクレオチド合成を行った。但し、最初の縮合反応には式VIII（Ｂ′＝Ｃｙｔi-Bz、Ｚ＝ＯＣＨ3、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｎ(ｉ−Ｃ3Ｈ7)）のメトキシホスホラミジットを使用し、そして酸化的アミド化は２回ＴＨＦ／Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−トリメチルエチレンジアミン（２：１；ｖ：ｖ）中における０.１Ｍヨウ素溶液を用いて１５分間行った。オリゴヌクレオチド配列の構成後、塩基に安定なスルフィド支持体をそれ自体公知の方法でＮａＩＯ4を用いて酸化して塩基に不安定なスルホン支持体とした。支持体からの開裂および保護基（ＡｄｅおよびＧｕａの場合はＰＡＣ；Ｃｙｔの場合はｉ−Ｂｕ）の除去は５０℃においてｔ−ブチルアミン／メタノール（１：１、ｖ：ｖ）を用いて１６時間行った。式Ｉｎのオリゴヌクレオチド−３′−トリメチルエチレンジアミン−ホスホラミジットが得られた。
【００８３】
ｏ）  式Ｉｏ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−ＨＮ(ＣＨ2)2Ｏ−ＣＨ3、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−ＨＮ(ＣＨ2)2Ｏ−ＣＨ3）
実施例４ｎ）と同様にして行った。ＴＨＦ／２−メトキシ−エチルアミン（２：１；ｖ：ｖ）中における０.１Ｍヨウ素溶液を用いての酸化的アミド化は２回１５分間行った。保護基を除去した後、式Ｉｏのオリゴヌクレオチド−３′−（２−メトキシエチル）−ホスホラミデートが得られた。
【００８４】
ｐ）  式Ｉｐ（Ｒ1＝式II、Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｓ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｚ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ｐsＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐs）
式IVａの支持体を出発物質として、実施例４ｂ）に記載のようにして合成を行った。しかしながら、最初の単位（式VIII；Ｂ′＝ＣｙｔBz；Ｚ＝Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ；Ｒ5＝Ｒ6＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2）を結合した後、酸化はＴＥＴＤを用いて行った。加えた最後の塩基のＤＭＴｒ保護基を除去した後、式IX（Ｒ9＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2、Ｚ″＝Ｒ10＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）のビス−シアノエチルオキシ−ホスホラミジットを用いて遊離の５′−ヒドロキシル基をホスフィチル化し、次いでＴＥＴＤで酸化してチオホスフェートとした。アンモニア処理の間にシアノエチル保護基を除去した。その結果、式Ｉｐのオリゴヌクレオチド−３′,５′−ビス−チオホスフェートが得られた。
【００８５】
ｑ）  式Ｉｑ（Ｒ1＝式II、Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｚ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ｉ−Ｃ2Ｈ7−Ｏ−ｐＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ−Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）
実施例４ｂ）に記載のようにして合成を行った。加えた最後の塩基のＤＭＴｒ保護基を除去した後、式IX（Ｒ9＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2、Ｒ10＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、Ｚ″＝Ｏ−ｉ−Ｃ3Ｈ7）のシアノエチルオキシ−ｉ−プロピルオキシ−ホスホラミジットを用いて遊離の５′−ヒドロキシル基をホスフィチル化し、次いでヨウ素水で酸化した。その結果、式Ｉｑのオリゴヌクレオチド−３′,５′−ビス−イソプロピルホスフェートエステルが得られた。
【００８６】
ｒ）  式Ｉｒ（Ｒ1＝式II、Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝ｎ−Ｃ8Ｈ17、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｚ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣＨ3(ＣＨ2)7−ｐＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐ−(ＣＨ2)7ＣＨ3）
実施例３ｂ）に記載のようにして製造した式VIIａ−２（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝(ＣＨ2)7ＣＨ3）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様にして合成を行った。加えた最後のＤＭＴｒ保護基を除去した後、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）を用いて式IX（Ｚ″＝(ＣＨ2)7ＣＨ3、Ｒ9＝Ｒ10＝Ｃｌ）のｎ−オクチルジクロロホスファンで遊離の５′−ヒドロキシル基をホスフィチル化した。酸化および加水分解後、オリゴヌクレオチドを実施例４ｅ）のようにして支持体から開裂した。式Ｉｒのオリゴヌクレオチド−３′,５′−ビス−（ｎ−オクチルホスホネート）が得られた。
【００８７】
ｓ）  式Ｉｓ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ″＝“プソラレン”、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ−“プソラレン”）
その前に実施例２ａ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）から“プソラレン”−Ｈとの反応〔V. PielesおよびU. EnglischのNucleic Acids Research １７，２８５（１９８９年）〕により得られた式VIII（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｚ＝“プソラレン”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１１（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｚ＝“プソラレン”、Ｗ＝Ｏ）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様にして合成を行った。アンモニアで保護基を除去した後、３′−末端に“プソラレン”ホスフェートエステルが結合された式Ｉｓのオリゴヌクレオチドが得られた。
【００８８】
ｔ）  式Ｉｔ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝“ビオチン”、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ−“ビオチン”）
その前に実施例２ａ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）から“ビオチン”−Ｈとの反応〔R. PonのTetrahedron Lett., ３２，１７１５（１９９１年）〕により得られた式VIII（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｚ＝“ビオチン”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１２（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｚ＝“ビオチン”、Ｗ＝Ｏ）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様にして合成を行った。アンモニアで保護基を除去した後、３′−末端に“ビオチン”ホスフェートエステルが結合された式Ｉｔのオリゴヌクレオチドが得られた。
【００８９】
ｕ）  式Ｉｕ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝“フルオレセイン”、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＧｐＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＣｐＧｐＧｐＣｐＣｐＴｐＧｐＣｐＧｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＣｐＧｐＣｐＧｐ−“フルオレセイン”）
その前に実施例２ａ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）から“フルオレセイン”−Ｈとの反応〔SchnbertらのNucleic Acids Research, １８，３４２７（１９９１年）〕により得られた式VIII（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｚ＝“フルオレセイン”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１３（Ｂ′＝ＧｕａPAC、Ｚ＝“フルオレセイン”、Ｗ＝Ｏ）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様にして合成を行った。
【００９０】
ｖ）  式Ｉｖ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝アクリジン−９−イル−ブタ−４−オキシ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−（アクリジン−９−イル−ブタ−４−オキシ））
その製造が式VIIIｍのモノマーを用いて実施例３ａ）と同様にして行われる式VIIａ−１４（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｗ＝Ｏ、Ｚ＝アクリジン−９−イル−ブタ−４−オキシ）の支持体を出発物質として、実施例４ｂ）に記載のようにしてオリゴヌクレオチド合成を行った。脱保護した後、３′−末端にアクリジン−９−イル−ブタ−４−イルホスフェートエステルを含有する式IVのオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９１】
ｗ）  式Ｉｗ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝ＨＮ(ＣＨ2)3ＮＨ(ＣＨ2)4ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ2、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ｄ（ＣｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐ−ＨＮ(ＣＨ2)3ＮＨ−(ＣＨ2)4ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ2）
実施例４ｎ）と同様にして合成を行い、そして酸化的アミド化はスペルミンを用いて行った。次に、無水酢酸の代りに無水トリフルオロ酢酸を用いてキャッピング反応を行った。保護基を除去した後、３′−末端にスペルミン−ホスホラミデート残基を含有する式Ｉｗのオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９２】
ｘ）  式Ｉｘ（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝アジリジル−Ｎ−エチル−２−オキシ、ａ＝Ｕ＝Ｖ＝Ｗ＝Ｘ＝Ｙ＝Ｙ′＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
【化２６】
0003717081.tif 000028
その前に実施例２ａ）と同様にして式VIａ（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のビスアミジットからＮ−（２−ヒドロキシエチル）アジリジンとの反応により得られた式VIII（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝アジリジル−Ｎ−エチル−２−オキシ、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１５（Ｂ′＝ＣｙｔBz、Ｚ＝アジリジル−Ｎ−エチル−２−オキシ、Ｗ＝Ｏ）の支持体を出発物質として、実施例４ｃ）と同様にして合成を行った。アンモニアで保護基を除去した後、３′−末端にアジリジン−Ｎ−エタ−２−イルホスフェートエステルが結合された式Ｉｘのオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９３】
ｙ−１）  式Ｉｙ−１（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−ファルネシル、ｐｓについてはＷ＝Ｓ）のオリゴヌクレオチドの製造
５′ＣｐＳＣｐＳＧｐＳＧｐＳＡｐＳＡｐＳＡｐＳＡｐＳＣｐＳＡｐＳＴｐＳＣｐＳＧｐＳＣｐＳＧｐＳＧｐＳＴｐＳＴｐＳＧｐＳＴｐＳ-Ｏ-ファルネシル
その前に実施例２ｂ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）からファルネシルとの反応によって製造された式VIII（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−ファルネシル、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１６（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−ファルネシル）の支持体を出発物質として、実施例４ｄ）と同様にして合成を行った。酸化はそれぞれ実施例４ｄ）に記載のようにＴＥＴＤ溶液を用いて行った。アンモニアで保護基を除去した後、３′−末端にファルネシルチオホスフェートエステルが結合された式Ｉｙ−１のアロホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９４】
ｙ−２）  式Ｉｙ−２（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−フィチル、ｐｓ(ｓ)についてはＷ＝Ｕ＝Ｓ）のオリゴヌクレオチドの製造
５′ＣｐＳ(Ｓ)ＣｐＳ(Ｓ)ＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＧＧｐＴｐＴｐＳ(Ｓ)ＧｐＳ(Ｓ)Ｔｐ−Ｏ−フィチル３′
その前に実施例２ｂ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）からフィトールとの反応により得られた式VIII（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−フィチル、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造された式VIIａ−１７（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−フィチル）の支持体を出発物質として、実施例４ｙ−１）と同様にして合成を行った。ヌクレオチド２、３、１９および２０（ヌクレオチドのカウンティングは３′から５′への合成の方向に対応する）は式VIII（Ｚ＝２,４−ジクロロチオベンジル、Ｒ5＝Ｒ6＝Ｃ2Ｈ5）の単位を介して導入した。これらのヌクレオチドの場合、酸化はＴＥＴＤ溶液を用いて行った。他の反応サイクルでは、ヨウ素水を用いて酸化を行った。アンモニアで保護基を除去した後、各場合とも３′−および５′−末端に２個のホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を有し、そして３′−末端にフィチルホスフェートエステルが結合された式Ｉｙ−２のオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９５】
ｙ−３）  式Ｉｙ−３（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝“−Ｏ−コレステロール”、ｐＭｅについてはＵ＝ＣＨ3）のオリゴヌクレオチドの製造
５′ＣｐＭｅＣｐＭｅＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＧｐＧｐＴｐＴｐＭｅＧｐＭｅＴｐ−“Ｏ−コレステロール”
その前に実施例２ｂ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）から“コレステロール”との反応により得られた式VIII（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“コレステロール”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１８（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“コレステロール”）の支持体を出発物質として、実施例４ｙ−１）と同様にして合成を行った。ヌクレオチド２、３、１９および２０は実施例４ｅ）に記載のようにして式VIII（Ｚ＝ＣＨ3）のメチルホスホンアミジットを介して導入した。各場合とも、酸化はヨウ素水を用いて行った。保護基を除去（実施例４ｄ）を参照）した後、各場合とも３′−および５′−末端に２個のメチルホスホネートヌクレオシド間結合を有し、そして３′−末端に“コレステロール”ホスフェートエステルが結合された式Ｉｙ−３のオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９６】
ｙ−４）  式Ｉｙ−４（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−テストステロン、ｐＭｅについてはＵ＝ＣＨ3）のオリゴヌクレオチドの製造
５′ＣｐＭｅＣｐＭｅＧｐＭｅＧｐＭｅＡｐＭｅＡｐＭｅＡｐＡｐＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＣｐＭｅＧｐＭｅＧｐＭｅＴｐＭｅＴｐＭｅＧｐＭｅＴｐ−“テストステロン”
その前に実施例２ｂ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）から“テストステロン”との反応により得られた式VIII（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“テストステロン”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−１９（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“テストステロン”）の支持体を出発物質として、実施例４ｙ−３）と同様にして合成を行った。ヌクレオチド２〜７および１５〜２０は実施例４ｅ）に記載のようにして式VIII（Ｚ＝ＣＨ3）のメチルホスホンアミジットを介して導入した。各場合とも酸化はヨウ素水を用いて行った。保護基を除去した後、各場合とも３′−および５′−末端に６個のメチルホスホネートヌクレオシド間結合を有し、そして３′−末端に“テストステロン”ホスフェートエステルが結合された式Ｉy-4のオリゴヌクレオチドが得られた。
【００９７】
ｙ−５）  式Ｉｙ−５（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−ビタミン−Ａ、ｐＭｅ(Ｓ)についてはＵ＝ＣＨ3およびＷ＝Ｓ、ｐＳについてはＵ＝ＳおよびＷ＝Ｏ）のオリゴヌクレオチドの製造
ＣｐＭｅ(Ｓ)ＣｐＭｅ(Ｓ)ＧｐＭｅ(Ｓ)ＧｐＭｅ(Ｓ)ＡｐＭｅ(Ｓ)ＡｐＭｅ(Ｓ)ＡｐＳＡｐＳＣｐＳＡｐＳＴｐＳＣｐＳＧｐＳＣｐＭｅ(Ｓ)ＧｐＭｅ(Ｓ)ＧｐＭｅ(Ｓ)ＴｐＭｅ(Ｓ)ＴｐＭｅ(Ｓ)ＧｐＭｅ(Ｓ)Ｔｐ−Ｏ−“ビタミンＡ”
その前に実施例２ｂ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）から“ビタミンＡ−アルコール”との反応により得られた式VIII（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“ビタミンＡ”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−２０（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“ビタミンＡ”）の支持体を出発物質として、実施例４ｙ−４）と同様にして合成を行った。ヌクレオチド２〜７および１５〜２０は実施例４ｅ）に記載のようにして式VIII（Ｚ＝ＣＨ3）のメチルホスホラミジットを介して導入した。酸化は実施例４ｄ）に記載のようにしてＴＥＴＤを用いて行った。保護基を除去した後、メチルホスホノチオエートおよび内部に７個のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する式Ｉｙ−５のオリゴヌクレオチドが得られた。このオリゴヌクレオチドの３′−末端にはさらに“ビタミンＡ”ホスフェートエステルが位置する。
【００９８】
ｙ−６）  式Ｉｙ−６（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｏ−ＣＨ3；Ｔの場合Ｒ2＝Ｈ、Ｚ＝−Ｏ−ビタミンＥ）のオリゴヌクレオチドの製造
５′２′−Ｏ−ＣＨ3（ＣｐＣｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＵｐＣｐＧｐＣｐＧｐＧｐＵｐＵｐＧｐ）Ｔｐ−Ｏ−“ビタミンＥ”
その前に実施例２ｂ）と同様にしてビスアミジットVIａ（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｒ5〜Ｒ8＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）からトコフェロールとの反応により得られた式VIII（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“ビタミンＥ”、Ｒ5＝Ｒ6＝ｉ−Ｃ3Ｈ7）のモノマーから実施例３ａ）と同様にして製造した式VIIａ−２１（Ｂ′＝Ｔｈｙ、Ｚ＝Ｏ−“ビタミンＥ”）の支持体を出発物質として、実施例４ｙ−４）と同様にして合成を行った。ヌクレオチド２〜２０は式Ｖ(Ｒ＝ＤＭＴｒ、Ｒ2＝Ｏ−ＣＨ3)の２′−Ｏ−メチルリボヌクレオシド−ホスホラミジットを介して導入した。酸化は実施例４ａ）に記載のようにしてヨウ素水を用いて行った。不安定なフェノキシアセチル保護基を除去した後、３′−末端に“ビタミンＥ”ホスフェートエステルを含有する式Ｉｙ−６の２′−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドが得られた。
【００９９】
実施例５  ヌクレアーゼ安定性試験
１０ナノモルの調査対象のオリゴヌクレオチドをＲＰＭＩ培地および５０mlの２回蒸留した水中における４５０μlの２０％濃度ウシ胎児血清に溶解し、３７℃でインキュベートした。ゲル電気泳動のためのサンプル１０μlおよびＨＰＬＣのためのサンプル２０μlを直ちに、そして１、２、４、７および２４時間後に取り出し、各場合ともそれぞれ５または１０μlのホルムアミドと混合して反応を終了させ、次いで９５℃で５分間加熱した。ゲル電気泳動分析のために、サンプルを１５％ポリアクリルアミドゲル（２％ビス）上に負荷し、次いで約３,０００ボルト時間行った。銀染色法によりバンドを可視化した。ＨＰＬＣ分析のためにサンプルをＧｅｎ−Ｐａｋ Ｆａｘ ＨＰＬＣカラム（Waters／Millipore社製）に注入し、そして緩衝剤Ｂ中における５〜５０％の緩衝剤Ａ〔緩衝剤Ａ：１０ミリＭのリン酸二水素ナトリウム、アセトニトリル／水（１：４＝ｖ：ｖ）中０.１Ｍ ＮａＣｌ、pH６.８；緩衝剤Ｂ：Ａと同じだが、１.５Ｍ ＮａＣｌ〕を用いて１ml／分でクロマトグラフィー処理した。
【０１００】
実施例６  抗ウイルス活性
本発明の化合物の抗ウイルス活性をインビトロ試験で調べた。この目的のために、本発明の化合物を微量滴定用プレート中におけるＨｅＬａおよびＶｅｒｏ細胞の細胞培養物に種々の希釈度で加えた。３時間後、その培養物をヒトの病因となる種々のウイルス（例えば、ヘルペスウイルスのＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、オルトミクソウイルスのインフルエンザＡ２、ピコルナウイルスのライノウイルス２）で感染させた。感染後４８〜７２時間経過してから治療上の効果を細胞変性効果に基づいて、顕微鏡検査により、そしてニュートラルレッドを加えてから光度測定〔Finter呈色試験；N.B. Finterらの「インターフェロン」、North Holland出版社、１９６６年〕することにより測定した。感染した細胞の半分が細胞変性効果を全く示さない最小濃度を最小阻止濃度（ＭＩＣ）とみなした。
【０１０１】
実施例７  ホスフィチル化試薬ＤＭＴｒ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−Ｐ−｛ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ｝｛Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2｝
〔請求項９；Ｘ′＝Ｏ、ｘ′＝０、Ｒ9＝ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、Ｒ10＝Ｎ（ｉ−Ｃ3Ｈ7)2〕の製造
ビス−ヒドロキシエチルスルフィド（３.０５ｇ）を７５mlの無水ピリジンに溶解し、この溶液を０℃まで冷却した。次に、６０mlの無水ピリジンに溶解したジメトキシトリチルクロライド（８.０４ｇ）を撹拌しながら１時間にわたって滴加した。反応混合物を室温で加温した後、これをさらに、１.５時間撹拌した。５mlの水をその溶液に加え、真空濃縮した。残留物を２５０mlの塩化メチレン中に溶解した。この溶液をそれぞれ１２５mlの０.１Ｍリン酸塩緩衝剤（pH７）で３回抽出し、そして有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮した。粗生成物を、酢酸エチル／ｎ−ヘプタン／トリエチルアミン（グラジエント ６：１４：１〜２：２：１、ｖ：ｖ：ｖ）を用いてシリカゲルカラム上でクロマトグラフィー処理した。５.３ｇのビス−ヒドロキシエチルスルフィド−モノ−（ジメトキシトリチル）エーテル ＤＭＴｒ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ（５２％）が得られた。
【０１０２】
１２.５mlの無水アセトニトリル中におけるこのジメトキシトリチル化合物（１.０６ｇ）およびテトラゾール（８８mg）の溶液を無水アセトニトリル（２０ml）中におけるシアノエトキシ−ジ−イソプロピルアミノ−ホスファン（０.７５ｇ）の溶液にゆっくりと（２０分）、滴加した。さらに３時間の反応後、反応溶液を９５mlの塩化メチレンで希釈し、５％強度の炭酸ナトリウム溶液（６５ml）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮した。残留物を酢酸エチル／ｎ−ヘキサン／トリエチルアミン（１１：８：１、ｖ：ｖ：ｖ）を用いるシリカゲルカラム上におけるクロマトグラフィーにより精製した。１.２５ｇ（８０％）の所望のホスフィチル化試薬（31Ｐ−ＮＭＲ：δ１４８ppm〔ｄ〕、９９％の総リン含量）が得られた。
【０１０３】
実施例４に記載の化合物は下記に示す残基を有する：
【化２７】
0003717081.tif 000029