(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量基準でペプトン 0.5 - 2.5%、塩化ナトリウム 0.1 -
０．７％、グリシン 1.0 - 5.0%、肉エキス 0.01 - 0.8%、ラクトース 0.5 - 2.0%、フェノールレッド 0.003 - 0.008%、硫酸ポリミキシン B  50 単位/ml 及び寒天1.3 - 2.0% を含有し、卵黄濃度が 5 - 7% であることを特徴とする、セレウス 菌分離用培地。
【請求項２】
重量基準でペプトン 2.0%、塩化ナトリウム 0.5%、グリシン1.0%、肉エキス 0.5%、ラクトース 1.0%、フェノールレッド 0.005%、硫酸ポリ ミキシン B  50 単位/ml 及び寒天 2.0% を含有し、卵黄濃度が 5% であること を特徴とする、請求項 1 に記載のセレウス菌分離用培地。
【請求項３】
重量基準でペプトン 0.5 - 2.5%、塩化ナトリウム 0.1 -0.7%、グリシン 1.0 - 5.0%、酵母エキス 0.01 - 0.8%、ラクトース 0.5 -2.0%、フェノールレッド 0.003 - 0.008%、ポリミキシン B  50 単位/ml 及び寒天 1.3 - 2.0% を含有し、卵黄濃度が 5 - 7% であることを特徴とする、セレウス菌分離用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はセレウス菌 (Bacillus cereus) 分離用培地に係り、香辛料を含む広 義の食品、環境及び臨床材料からのセレウス菌の分離を行なう場合に使用され
る。
【０００２】
【従来の技術】
セレウス菌はグラム陽性有芽胞桿菌であり、土壌細菌の一種であって自然界に汎く分布している。従って土壌と関わりの深い食品、殊に穀類、豆類、香辛料等を汚染し、又水を汚染するので、この細菌による汚染範囲はスパゲッティー、焼きそば等の麺類、米飯類、グラタン、ピザ類、魚介類、食肉及び食肉製品、澱粉等の原料素材、菓子類、脱脂粉乳、豆腐、ソース類、香辛料等の広義の食品、一般環境、臨床材料等の多岐にわたる。
尚、この細菌は蛋白質や多糖類等の高分子物質に対して高い分解能を有し、食品を腐敗・変敗させる雑菌と考えられてきたが、下痢を主徴とし或いは悪心・嘔吐を主徴とする食中毒症状を起こさせることが判明し、昭和 57 年に厚生省が食中毒菌と認定するに至っている。
このセレウス菌は農作物をはじめ、一般食品内では芽胞型として存在し、好条件が与えられると旺盛に増殖する細菌であり、集団食中毒の原因ともなるので、この細菌の検出は衛生学的品質管理上極めて重要である。
【０００３】
従来から国内で行われているセレウス菌の検査には、分離用培地として NGKG 培地又は PBCW 培地が使用されてきた [神保等「東京衛研年報」29 - 1、第 158- 162 頁 (1978 年) 及び寺山等「食衛誌」第 19 巻第 1 号第 98 - 104 頁(1978 年)]。
これらの培地の組成は下記の表 1 に示される通りである。
【０００４】
【表１】
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【０００５】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】
セレウス菌以外の Bacillus 属細菌には、例えば B. subtilis、B. licheniformis 等が存在するが、上記の PBCW 培地はこれらの細菌に対する 抑制性が弱い点に課題があり、一方 NGKG 培地は選択性においては優れているが、卵黄反応の確認が比較的困難である点に課題がある。
従って、本発明の目的はセレウス菌以外のバチルス属細菌を抑制し、環境細菌である大腸菌 (Escherichia coli)、黄色ブドウ球菌 (Streptococcus aureus)、緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) からも鑑別でき且つ卵黄反応の確認が容易である、セレウス菌分離用培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】
本発明者等はセレウス菌の分離に関して従来の NGKG 培地及び PBCW 培地を用いて検討を行い、その問題点を解明し、セレウス菌を特異的に鑑別する培地について鋭意検討を重ねた結果、PBCW 培地を基本とし、これにグリシンを 1 重量% 以上添加すれば B. subtilis 等のセレウス菌以外の Batillus 属細菌を抑制し 得ること並びに卵黄濃度を PBCW 培地と同一の 5% に設定すれば、卵黄濃度が2% の NGKG 培地と異なり卵黄反応の確認が容易となることを見い出して本発明 を完成するに至った。
【０００７】
従って、本発明によるセレウス属分離用培地は、重量基準でペプトン 0.5 -2.5%、塩化ナトリウム 0.1 - 0.7%、グリシン 1.0 - 5.0%、肉エキス 0.01 -0.8%、ラクトース 0.5 - 2.0%、フェノールレッド 0.003 - 0.008%、硫酸ポリミキシン B 50 単位/ml 及び寒天 1.3 - 2.0% を含有し、卵黄濃度が 5 - 7% であることを特徴としている。
【０００８】
具体的には、重量基準でペプトンが 2.0%、塩化ナトリウムが 0.5%、グリシンが 1.0%、肉エキスが 0.5%、ラクトースが 1.0%、フェノールレッドが 0.005%、硫酸ポリミキシン B が 50 単位/ml 及び寒天が 2.0% であり、卵黄濃 度が 5% であることができる。尚、肉エキスは酵母エキスに代替することができる。
【０００９】
【実施例等】
次に、製造例、参考試験例及び試験例に関連して本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
製造例
下記の表 2 に示される原材料及び量割合で本発明による培地 (以下「PBCWG培地」と称する) を調製した。
【表２】
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【００１０】
参考試験例 1
既知の PBCW 培地及び NGKG 培地を用い、11 種類のセレウス菌について、そ の発育性を検討した。即ち、トリプトソーヤブイヨンを用い、36℃ にて 24 時 間培養した菌液を 10-5 - 10-7 に稀釈し、その 0.1ml を各培地に滴下した後に、コンラージ棒で塗抹し (1ml 当り 10-6 - 10-8 稀釈)、発育性と卵黄反応を調べた。
結果は下記の表 3 に示される通りであり、発育性に大差はなかったが、卵黄 反応に関しては、NGKG 培地の場合に判定が若干困難であった。
【表３】
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【００１１】
参考試験例 2
ＮＧＫＧ  培地 (卵黄不含の場合の pH は 6.8 ± 0.1 であるが、卵黄液を添加す ると pH は低下する傾向がある) における卵黄液濃度と pH 変化による卵黄反応について検討した。即ち、トリプトソーヤブイヨンを用い、36℃ にて 24 時間 培養した菌液を 10-6 に稀釈し、その 0.1ml を各培地に滴下した後に、コンラ ージ棒で塗抹して (1ml 当り 10-7 稀釈) 調べた。
結果は下記の表 4 に示される通りであり、卵黄液濃度を 5% に設定し、卵黄 液添加後の pH が 6.8 程度となるように pH 調整を行うことにより卵黄反応が より明確になることが判明した。
【表４】
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【００１２】
参考試験例 3
PBCW 培地を対象とし、セレウス菌分離の選択性を高めるために、グリシンの 添加効果に関する検討を行った。即ち、PBCW 培地にグリシンを 0 - 3% 添加し た培地を調製し、参考試験例 2 と同様の方法で評価した。
結果は下記の表 5 に示される通りであり、グリシンを 1% 又はそれ以上添加 することにより、セレウスの発育に影響を及ぼすことなしに、多くの食品から分離される B. subtilis の発育を抑制し得ることが判明した。
【表５】
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【００１３】
参考試験例 4
PBCW 培地と NGKG 培地を対象とし、製造上問題となる滅菌条件の相違による pH と色差の変化について検討した。滅菌条件は 121℃ で 15 分、30 分又は 60分或いは 132℃ で 15 分又は 30 分に設定した。
結果は下記の表 6 に示される通りであり、殺菌条件が 121℃ で 60 分及び
132℃ で 30 分の場合に PBCW 培地では pH が若干低下する傾向が認められた
が、両培地共に色差への影響は殆ど認められなかった。
【表６】
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【００１４】
参考試験例 5
滅菌条件の異なる PBCW 培地及び NGKG 培地を対象とし、細菌の発育性を検討した。
結果は下記の表 7 に示される通りであり、NGKG 培地においては滅菌条件を
121℃、30 分又はそれ以上に設定すると P. aeruginosa に対する抑制性の激減 することが判明した。
【表７】
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【００１５】
参考試験例 6
種々の温度条件で滅菌した普通寒天培地を対象として硫酸ポリミキシン B に よる細菌発育の抑制効果について検討した。
結果は下記の表 8 に示される通りであり、硫酸ポリミキシン B を添加しない場合には何れの培地においても供試菌株は増殖した。尚、ポリミキシン B を添 加後に滅菌処理した培地 (前添加) において、E. coli は何れの滅菌条件でも発育しなかったが、P. aeruginosa に関しては滅菌条件が 121℃、30 分又はそれ 以上の培地において生育し、参考試験例 5 と同様な傾向を示した。但し、予め 滅菌処理した培地に硫酸ポリミキシン B を添加した (後添加) 場合には、P.aeruginosa の発育も抑制された。
【表８】
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【００１６】
試験例 1 及び比較試験例 1
セレウス菌 (B. cereus, ATCC 19637) と他の細菌との混合菌液を使用し、PBCW 培地、NGKG 培地、5-NGKG 培地 (NGKG 培地の卵黄液濃度を 5% に且つ pH を 6.8 ± 0.1 に設定したもの) 及び製造例による PBCWG 培地を対象としてセ レウスに対する選択性及び鑑別性を検討した。即ち、トリプトソーヤブイヨンを用い、36℃ にて 24 時間培養した菌液を稀釈し、セレウス菌については 10-6
に稀釈し、他の細菌については 10-1 - 10-8 に稀釈し、各稀釈液を 1ml 宛採取し、殺菌済み試験管に入れ混合したものを 0.1ml 宛各平板培地に接種し、コン ラージ 棒で塗抹して調べた。
結果は下記の表 9 に示されている通りであり、セレウス菌以外の菌種に対し て抑制性が弱かったのは PBCW 培地であり、他の 3 種類の培地はほぼ同等の抑 制力を示し、セレウス菌に対する鑑別性が良好であり且つ選択性に優れていたのは 5-NGKG 培地と PBCWG 培地であり、NGKG 培地における卵黄反応は弱いことが判明した。
【表９】
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【００１７】
試験例 2 及び比較試験例 2
試験例 1 及び比較試験例 1 に示されている結果から、従来の NGKG 培地及びPBCW 培地よりも 5-NGKG 培地及び PBCWG 培地の方がセレウス菌の選択培地として明らかに優れているものと考えられたが、5-NGKG 培地と PBCWG 培地との間で何れが優れているかを決定するのは困難である。従って、両培地を大量に調製して (100 リットル)、安定性に関する検討を行った。
両培地の組成及び配合量は下記の表 10 に示される通りであった。
【表１０】
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【００１８】
上記の両培地は硫酸ポリメキシン B 及び卵黄液以外の原材料を混合し、121℃において 15 分間処理して滅菌した後に、濾過滅菌した硫酸ポリメキシン B 及 び卵黄液を添加し、次いで pH 調整を行うことにより調製された。
5 ケ 月間にわたる経時試験を実施した処、両培地の物理化学的性状は、5-NGKG培地において pH 及び色差の変化が大きかったが、PBCWG 培地の場合には下記の表 11 に示される通り、顕著な変化は認められなかった。
尚、細菌の培養試験を実施した処、5-NGKG 培地の場合にはセレウス菌以外の 細菌に対する抑制性が経時的に低下し、卵黄反応も減弱する傾向が認められた
が、PBCWG 培地の場合には、下記の表 12 及び 13 に示される通りであり、そのような傾向は認められなかった。
従って、これらの安定性試験の結果として PBCWG 培地が改良 NGKG 培地であ る 5-NGKG 培地よりもセレウス選択培地として優れていることが判明した。
【表１１】
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【００１９】
【表１２】
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【００２０】
【表１３】
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【００２１】
【発明の効果】
本発明による培地は、従来の NGKG 培地や PBCW 培地と比較する場合に、セレウス菌の選択性、卵黄反応の確認容易性及び保存安定性において優れている。従って、本発明による培地を使用すれば、何時でも容易にセレウス菌を分離検出することができる。