(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過照明光学系に設けられ、照明光を透過するためのバンドパスフィルタ、ポラライザー、及び第１のウォラストンプリズムと、
標本より対物レンズ側の観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ、前記ポラライザー、及び前記第１のウォラストンプリズムと組み合わせて観察するための第２のウォラストンプリズムと、
前記標本より前記対物レンズ側の前記観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ、前記ポラライザー、及び前記第１のウォラストンプリズムと組み合わせて観察するためのダイクロイックミラーであり、前記バンドパスフィルタ、前記ポラライザー、及び前記第１のウォラストンプリズムを透過した波長の光を透過または反射するダイクロイックミラーと、
前記観察光学系の光路中に前記ダイクロイックミラーを介して接続された落射蛍光照明光学系と、を備えた落射蛍光顕微鏡において、
前記ダイクロイックミラーには、分光透過率特性が、前記バンドパスフィルタのピーク波長領域よりも短い波長領域で立ち下がるＳ偏光と、前記バンドパスフィルタのピーク波長領域よりも長い波長領域で立ち下がるＰ偏光となる光学手段が形成され、
前記バンドパスフィルタは、前記落射蛍光照明光学系により励起された前記標本の蛍光像のピーク波長よりも長い波長領域をピーク波長とする分光透過率特性を有し、前記Ｐ偏光と前記Ｓ偏光の立ち下がり領域の間の波長領域の波長の光を透過し、
前記落射蛍光照明光学系による前記標本の蛍光像と、前記バンドパスフィルタの透過波長領域で、かつ、前記蛍光像よりも長波長の波長領域における、前記ポラライザー及び前記第１のウォラストンプリズムと前記第２のウォラストンプリズム及び前記光学手段とによる微分干渉像と、を同時に観察することを特徴とする落射蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記光学手段は、前記ダイクロイックミラーの少なくとも１面に形成された光学膜であることを特徴とする請求項１に記載の落射蛍光顕微鏡。
【請求項３】
透過照明光学系に設けられ、照明光を透過するためのバンドパスフィルタ及びホフマンモジュレーションコントラスト観察用のスリットと、
標本より対物レンズ側の観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記スリットと組み合わせて観察するためのホフマンモジュレーションコントラスト観察用のモジュレーターと、
前記標本より前記対物レンズ側の前記観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記スリットと組み合わせて観察するためのダイクロイックミラーであり、前記バンドパスフィルタ及び前記スリットを透過した波長の光を透過または反射するダイクロイックミラーと、
前記観察光学系の光路中に前記ダイクロイックミラーを介して接続された落射蛍光照明光学系と、を備えた落射蛍光顕微鏡において、
前記モジュレーターは、前記標本からの蛍光波長を透過すると共に、暗黒部と灰色部を有し、前記暗黒部と前記灰色部の各々の透過率が０近傍になる波長の間の波長領域に前記バンドパスフィルタのピーク波長領域が位置し、
前記バンドパスフィルタは、前記落射蛍光照明光学系により励起された前記標本の蛍光像のピーク波長よりも長い波長領域をピーク波長とする分光透過率特性を有し、前記モジュレーターの前記暗黒部と前記灰色部の各々の透過率が０近傍になる波長の間の波長領域の波長の光を透過し、
前記落射蛍光照明光学系による前記標本の蛍光像と、前記バンドパスフィルタの透過波長領域で、かつ、前記蛍光像よりも長波長の波長領域における、前記スリット及び前記モジュレーターによる瞳変調像と、を同時に観察することを特徴とする落射蛍光顕微鏡。
【請求項４】
透過照明光学系に設けられ、照明光を透過するためのバンドパスフィルタ及び位相差用スリットと、
標本より対物レンズ側の観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記位相差用スリットと組み合わせて観察するための位相差用モジュレーターと、
前記標本より前記対物レンズ側の前記観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記位相差用スリットと組み合わせて観察するためのダイクロイックミラーであり、前記バンドパスフィルタ及び前記位相差用スリットを透過した波長の光を透過または反射するダイクロイックミラーと、
前記観察光学系の光路中に前記ダイクロイックミラーを介して接続された落射蛍光照明光学系と、を備えた落射蛍光顕微鏡において、
前記位相差用モジュレーターは、前記標本からの蛍光波長を透過すると共に、前記蛍光波長よりも長い波長側に、透過率が低下した低透過率波長帯域を有し、
前記バンドパスフィルタは、前記落射蛍光照明光学系により励起された前記標本の蛍光像のピーク波長よりも長い波長領域をピーク波長とする分光透過率特性を有し、前記位相差用モジュレーターの前記低透過率波長帯域の波長の光を透過し、
前記落射蛍光照明光学系による前記標本の蛍光像と、前記バンドパスフィルタの透過波長領域で、かつ、前記蛍光像よりも長波長の波長領域における、前記位相差用スリット及び前記位相差用モジュレーターによる位相差像と、を同時に観察することを特徴とする落射蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学、生物学などの分野において、細胞や組織などの状態を観察する際に利用される落射蛍光顕微鏡に係わり、特に細胞や組織の輪郭を微分干渉観察法または変調コントラスト（ホフマンモジュレーションコントラスト）顕微鏡等による瞳変調検鏡法で観察しながら、同時に落射蛍光観察法により物質等の位置を検出する落射蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（第１の従来の技術）
一般に蛍光顕微鏡は、医学および生物学をはじめ、その他の分野においても、生物組織や細胞上で蛍光標識を施した蛋白や遺伝子等を検出する目的で広く用いられている。特に近年では、微分干渉観察法により細胞や組織の輪郭を検出しながら、同時に落射蛍光観察法により蛍光標識を施した蛋白や遺伝子を検出し、それらが細胞や組織のどこに位置するのかを調べることが可能になりつつある。
【０００３】
しかしながら、微分干渉観察と落射蛍光観察を同時に行なう場合、観察光学系の中にアナライザ（偏光板）を設ける必要があり、このアナライザを透過することによる光量損失が大きくなる。特に蛍光像は微弱な光であるため問題になる。したがって、必要な蛍光を得るために強力な励起光を標本に照射する必要がある。しかしこの場合、蛍光褪色が早くなるばかりか、生きた標本の場合には標本に対するダメージも大きくなるという欠点がある。
【０００４】
以上のような問題を解決するために、“ＯＰＴＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＦＯＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ”（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｖｉｄｅｏ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｈｅｌｄ  ｉｎ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｊｕｎｅ  ４−７，１９８９：Ａ  ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ，ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮ出版：Ｂｒｉａｎ  Ｈｅｒｍａｎ，Ｋｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ著）の５１３ページ〜５２２ページには、ダイクロイックミラーの偏光と波長に依存する透過率特性を利用した、微分干渉観察と落射蛍光観察の同時観察が可能な顕微鏡の構成が開示されている。この構成によれば、ダイクロイックミラーはある特定の波長領域にのみアナライザ（偏光板）の機能を有することになる。そして、前記特定の波長より長波長の領域では透過率が高いので、その波長領域の蛍光像は暗くならず、高い効率で微分干渉観察と落射蛍光観察を同時に行なうことが可能になる。
【０００５】
（第２の従来の技術）
近年では、変調コントラスト顕微鏡等を用いた瞳変調検鏡法により細胞や組織の状態を検出しながら、同時に落射蛍光観察法により蛍光標識を施した蛋白や遺伝子を検出し、それらが細胞や組織のどこに位置するのか、さらにはその動態を調べることが可能になりつつある。
【０００６】
図１２の（ａ）は、特開昭５１−１２８５４８号公報に開示されている、一般の顕微鏡にモジュレーションコントラスト観察のための要素を付加した構成を示す図である。図１２の（ａ）に示すように、対物レンズ１０３の射出瞳面にモジュレーター１０２が配置されている。このモジュレーター１０２は、図１２の（ｂ）に示すように透過率が３段階に異なる領域を有するフィルターである。このフィルターにおいて、１０８は光をほとんど通さない暗黒部分（Ｄ）、１０９は透過率が約１５％の灰色部分（Ｇ）、さらに１１０は光を全部通す領域であり明るい部分（Ｂ）になっている。
【０００７】
また、コンデンサー１０５の前側焦点面には、スリット１０６が配置されている。このスリット１０６の片側に付加されているＰ1 とその下に配置されているＰ2 は各々偏光板であり、偏光板Ｐ2 を回転させることにより、スリット１０６を透過する光量を制御できる。また、モジュレーター１０２の置かれている対物レンズ１０３の射出瞳面と、スリット１０６の置かれているコンデンサー１０５の前側焦点面は、互いに共役関係にあるので、スリット１０６の像はモジュレーター１０２の面に形成される。
【０００８】
そして、位相差顕微鏡のリングスリットをフェーズプレートのリングに合わせる調整と同様に、オペレータが事前に望遠鏡を用いて対物レンズ１０３の射出瞳面のモジュレーター１０２を見ながら、スリット像をモジュレーター１０２の上記灰色部分（Ｇ）１０９に合わせておく。また、モジュレーター１０２とスリット１０６は、偏斜照明系の如く偏芯した位置関係で配置されている。
【０００９】
図１３は、透明な位相物体を透過した光がモジュレーターを介することにより、コントラストのついた像を形成する過程を示す図である。この原理は、Ｒ．ＨｏｆｆｍａｎとＬ．Ｇｒｏｓｓにより、１９７５年に発表されたものである。なお図１３では、説明の都合上スリット１１７とモジュレーター１１２を光軸ａの中心に配置させている。
【００１０】
以下、透明な位相分布をもった試料１１５が、図１３に示すようなプリズムの形状を成しているものとする。スリット１１７を出てコンデンサー１１６で平行になった光線が、下側からこのプリズムに入射すると、図中左側の傾斜部分を通過する光線は入射光線より左側に、また右側の傾斜部分を通過する光線は入射光線より右側に各々曲がる。また、前記プリズムの下面と上面が平行部分である中央を通過する光線は、曲がらずにそのまま直進する。
【００１１】
これらの光線は、対物レンズ１１３を通過後、モジュレーター１１２に入射し、図中左側の光はモジュレーター１１２の暗黒部（Ｄ）１２１を通り強度が弱められて暗い光となり、対物レンズ１１３の結像位置１２４に達し中間像をつくる。また、中央部を通ったものはモジュレーター１１２の灰色部（Ｇ）１２２を通り、少し強度が減った光として中間像をつくる。そして右側の光は、モジュレーター１１２の明るい部分（Ｂ）１２３を通り、明るさを弱められることなく中間像をつくる。このようにして、透明なプリズム状の位相分布をもった試料１１５の像は、傾きや厚さの変化に応じて暗黒の差がついた、目に見える像１１１に形成される。以上がホフマンモジュレーションコントラスト観察の原理である。
【００１２】
次に、前述した変調コントラスト顕微鏡に落射蛍光顕微鏡を組合せた従来の複合検鏡顕微鏡について説明する。
図１４は、従来の複合検鏡顕微鏡の構成を示す図である。透過光源１３１から発せられた光はミラー１３４により折り返され、上記スリット１０６と同様のスリット１３６を通り、コンデンサー１３７により試料１３８に導かれる。試料１３８を透過した光は対物レンズ１３９により集められ、上記モジュレーター１０２，１１２と同様のモジュレーター１４０を通る。そして落射蛍光用のダイクロイックミラー１４１および吸収フィルター１４２を透過し、結像レンズ１４３により結像され、接眼レンズ１４５に導かれる。以上が、変調コントラスト法による照明および観察光路である。
【００１３】
またこれと同時に、以下の落射蛍光用光路が形成される。落射光源１４６から発せられた光は、コレクターレンズ１４７等を介して励起フィルター１５１に導かれる。励起フィルター１５１を通過した励過光は、ダイクロイックミラー１４１で反射され、モジュレーター１４０、対物レンズ１３９を通り、試料１３８に照射される。
【００１４】
試料１３８から発光した蛍光は、上述した変調コントラスト法による像と同様に対物レンズ１３９により集められ、モジュレーター１４０を通る。そしてダイクロイックミラー１４１および吸収フィルター１４２を透過し、結像レンズ１４３により結像された後接眼レンズ１４５に導かれる。
【００１５】
上記のように形成された二つの光路、すなわち変調コントラスト法による光路と落射蛍光用光路を同時に用いることで、変調コントラスト法と落射蛍光観察法による二つの像が接眼レンズ１４５において同時に重なり、観察可能になる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
（第１の従来の技術の問題点）
上述したような第１の従来の技術によれば、高い効率で微分干渉観察と落射蛍光観察を同時に行なえるようになった。しかし、バンドパスフィルターを介した微分干渉観察用の波長領域を、ダイクロイックミラーや吸収フィルターで透過させる構成を成している。そのため、励起波長と蛍光波長とが近い蛍光色素の場合、上述したような構成であると励起光が観察光学系に混入しやすくなる。このため、蛍光像のコントラストすなわちバックグラウンドと蛍光の強度比が著しく低下してしまう、という欠点がある。
【００１７】
（第２の従来の技術の問題点）
一方、上述したような第２の従来の技術によれば、変調コントラスト顕微鏡に落射蛍光顕微鏡を組み合わせ、細胞や組織の状態を検出しながら蛍光標識を施した蛋白や遺伝子等を検出し、その所在や動態を調べることができる。
【００１８】
しかし、観察光学系中にモジュレーター等の光学部材が介存しているため、特に落射蛍光観察においては蛍光像の明るさが致命的に低下してしまう。また、変調コントラスト顕微鏡等の瞳変調検鏡法で観察される細胞や組織は、一般に白色の背景色を有しているので、同時に観察される蛍光が同系色であると細胞や組織の像と蛍光像とを分離することが困難である、という欠点がある。
【００１９】
本発明の目的は、下記の落射蛍光顕微鏡を提供することにある。
(a) 簡易な構成により、効率の高い微分干渉観察と落射蛍光観察の同時観察を可能にするとともに、コントラストの高い蛍光像を得ることができる落射蛍光顕微鏡。
(b) 効率の高い（明るい蛍光像が得られる）瞳変調検鏡法と落射蛍光観察の複合検鏡を可能にするとともに、瞳変調検鏡法による像と落射蛍光像の分離能を高くできる落射蛍光顕微鏡。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決し目的を達成するために、本発明の落射蛍光顕微鏡は以下の如く構成されている。
（１）本発明の落射蛍光顕微鏡は、透過照明光学系に設けられ、照明光を透過するためのバンドパスフィルタ、ポラライザー、及び第１のウォラストンプリズムと、標本より対物レンズ側の観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ、前記ポラライザー、及び前記第１のウォラストンプリズムと組み合わせて観察するための第２のウォラストンプリズムと、前記標本より前記対物レンズ側の前記観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ、前記ポラライザー、及び前記第１のウォラストンプリズムと組み合わせて観察するためのダイクロイックミラーであり、前記バンドパスフィルタ、前記ポラライザー、及び前記第１のウォラストンプリズムを透過した波長の光を透過または反射するダイクロイックミラーと、前記観察光学系の光路中に前記ダイクロイックミラーを介して接続された落射蛍光照明光学系と、を備えた落射蛍光顕微鏡において、前記ダイクロイックミラーには、分光透過率特性が、前記バンドパスフィルタのピーク波長領域よりも短い波長領域で立ち下がるＳ偏光と、前記バンドパスフィルタのピーク波長領域よりも長い波長領域で立ち下がるＰ偏光となる光学手段が形成され、前記バンドパスフィルタは、前記落射蛍光照明光学系により励起された前記標本の蛍光像のピーク波長よりも長い波長領域をピーク波長とする分光透過率特性を有し、前記Ｐ偏光と前記Ｓ偏光の立ち下がり領域の間の波長領域の波長の光を透過し、前記落射蛍光照明光学系による前記標本の蛍光像と、前記バンドパスフィルタの透過波長領域で、かつ、前記蛍光像よりも長波長の波長領域における、前記ポラライザー及び前記第１のウォラストンプリズムと前記第２のウォラストンプリズム及び前記光学手段とによる微分干渉像と、を同時に観察するよう構成されている。
（２）本発明の落射蛍光顕微鏡は上記（１）に記載の顕微鏡であって、かつ前記光学手段は、前記ダイクロイックミラーの少なくとも１面に形成された光学膜である。
（３）本発明の落射蛍光顕微鏡は、透過照明光学系に設けられ、照明光を透過するためのバンドパスフィルタ及びホフマンモジュレーションコントラスト観察用のスリットと、標本より対物レンズ側の観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記スリットと組み合わせて観察するためのホフマンモジュレーションコントラスト観察用のモジュレーターと、前記標本より前記対物レンズ側の前記観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記スリットと組み合わせて観察するためのダイクロイックミラーであり、前記バンドパスフィルタ及び前記スリットを透過した波長の光を透過または反射するダイクロイックミラーと、前記観察光学系の光路中に前記ダイクロイックミラーを介して接続された落射蛍光照明光学系と、を備えた落射蛍光顕微鏡において、前記モジュレーターは、前記標本からの蛍光波長を透過すると共に、暗黒部と灰色部を有し、前記暗黒部と前記灰色部の各々の透過率が０近傍になる波長の間の波長領域に前記バンドパスフィルタのピーク波長領域が位置し、前記バンドパスフィルタは、前記落射蛍光照明光学系により励起された前記標本の蛍光像のピーク波長よりも長い波長領域をピーク波長とする分光透過率特性を有し、前記モジュレーターの前記暗黒部と前記灰色部の各々の透過率が０近傍になる波長の間の波長領域の波長の光を透過し、前記落射蛍光照明光学系による前記標本の蛍光像と、前記バンドパスフィルタの透過波長領域で、かつ、前記蛍光像よりも長波長の波長領域における、前記スリット及び前記モジュレーターによる瞳変調像と、を同時に観察する。
（４）本発明の落射蛍光顕微鏡は、透過照明光学系に設けられ、照明光を透過するためのバンドパスフィルタ及び位相差用スリットと、標本より対物レンズ側の観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記位相差用スリットと組み合わせて観察するための位相差用モジュレーターと、前記標本より前記対物レンズ側の前記観察光学系に設けられ、前記バンドパスフィルタ及び前記位相差用スリットと組み合わせて観察するためのダイクロイックミラーであり、前記バンドパスフィルタ及び前記位相差用スリットを透過した波長の光を透過または反射するダイクロイックミラーと、前記観察光学系の光路中に前記ダイクロイックミラーを介して接続された落射蛍光照明光学系と、を備えた落射蛍光顕微鏡において、前記位相差用モジュレーターは、前記標本からの蛍光波長を透過すると共に、前記蛍光波長よりも長い波長側に、透過率が低下した低透過率波長帯域を有し、前記バンドパスフィルタは、前記落射蛍光照明光学系により励起された前記標本の蛍光像のピーク波長よりも長い波長領域をピーク波長とする分光透過率特性を有し、前記位相差用モジュレーターの前記低透過率波長帯域の波長の光を透過し、前記落射蛍光照明光学系による前記標本の蛍光像と、前記バンドパスフィルタの透過波長領域で、かつ、前記蛍光像よりも長波長の波長領域における、前記位相差用スリット及び前記位相差用モジュレーターによる位相差像と、を同時に観察する。
【００２１】
上記手段を講じた結果、それぞれ次のような作用が生じる。
（１）本発明の落射蛍光顕微鏡によれば、透過照明光学系に設けられ透過光を変調するための第１の光学的変調部材は、蛍光波長よりも長波長側に透過率のピークを有し、観察光学系に設けられる第２の光学的変調部材は、前記第１の光学的変調部材を透過した波長のみを選択的に変調するようにしたので、蛍光波長領域は効率良く前記第２の光学的変調部材を透過でき、蛍光像は暗くならない。よって、非常に高効率な同時観察が可能になる。また、励起光が蛍光像に混入せずコントラストの高い蛍光像が得られる。本発明は、特に励起波長と蛍光波長が近い蛍光色素を使用する観察に有効に活用できる。
（２）本発明の落射蛍光顕微鏡によれば、前記透過照明光学系及び前記観察光学系は微分干渉観察法に基づく光学系であるので、蛍光像と微分干渉観察による像との成す色の差を明瞭に観察でき、非常に高効率な微分干渉観察と落射蛍光の同時観察が可能になる。
（３）本発明の落射蛍光顕微鏡によれば、前記透過照明光学系及び前記観察光学系は瞳変調検鏡法に基づく光学系であるので、蛍光像と瞳変調検鏡法による像との成す色の差を明瞭に観察でき、非常に高効率な瞳変調検鏡と落射蛍光の同時観察が可能になる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図である。図１に示す顕微鏡は、微分干渉観察法と落射蛍光観察法を同時に行なえるものである。
【００２３】
まず、図１における微分干渉観察に係る部分について説明する。図１において１は透過用光源であり、この透過用光源１から発せられた光はバンドパスフィルター２で特定波長のみが透過し、ポラライザー３に入射する。なお、バンドパスフィルター２の分光透過率特性については後述する。
【００２４】
そしてポラライザー３から出射した直線偏光は、ウォラストンプリズム（複屈折素子）４を通過することで互いに直交する方向に振動する二つの直線偏光に分かれる。これらはコンデンサーレンズ５で集光し、標本６上を横ずれ（シャー）して進む。これら二つの光線は対物レンズ７を透過し、第２のウォラストンプリズム８と後述するダイクロイックミラー１２のアナライザー機能により干渉する。それら二つの波面による干渉像は、標本６の位相変化を微分したものが、明暗または色のコントラストの差として結像レンズ９を介して観察される。
【００２５】
次に、図１における落射蛍光観察に係る部分について説明する。図１において１０は超高圧水銀灯等の励起光源であり、この励起光源１０から発せられた発光波長のうち、標本６を励起するのに必要な波長のみが励起フィルター１１を透過する。励起フィルター１１を透過した波長はダイクロイックミラー１２で選択的に反射する。なお、ダイクロイックミラー１２には後述するような分光透過率特性を有するコーティングを施してあり、特定される波長領域より長い波長を透過するものである。そして、ダイクロイックミラー１２で反射した励起光は、ウォラストンプリズム８を通り対物レンズ７により標本６へ照射される。
【００２６】
これにより標本６の蛍光色素に染色されている部分が励起され、励起光より長い波長の蛍光を発し、その発した蛍光が対物レンズ７により集められる。そしてウォラストンプリズム８を介してダイクロイックミラー１２を透過する。ダイクロイックミラー１２を透過した蛍光は、特定される波長領域より長い波長の蛍光像のみを透過する吸収フィルター１３を透過した後、結像レンズ結像レンズ９に導かれ、観察される。
【００２７】
図２は、上記した励起フィルター１１、ダイクロイックミラー１２、吸収フィルター１３およびバンドパスフィルター２の分光透過率特性を示す図である。なお、励起フィルター１１と吸収フィルター１３の分光透過率特性は、従来の落射蛍光顕微鏡と同様一般的なものである。そして、ダイクロイックミラー１２には、励起光を反射し蛍光を透過する分光透過率Ｔが立上がる波長領域ＴU においては、偏光に関せず分光透過率Ｔが急激に上昇し、分光透過率Ｔが立下がる波長領域ＴD においては、Ｐ偏光の方がＳ偏光よりも長波長側で立下がるようなコーティングが施してある。
【００２８】
ここで図２に示すように、バンドパスフィルター２の分光透過率特性のピークをダイクロイックミラー１２のＰ偏光とＳ偏光の立下がり領域の間に設定すると、この波長領域においてダイクロイックミラー１２のＰ偏光は透過し、Ｓ偏光は透過しない。すなわち、この波長領域で微分干渉観察を行なうよう透過照明系にバンドパスフィルター２を配置することにより、ダイクロイックミラー１２が偏光板としての機能を有することになり、このダイクロイックミラー１２を前述の微分干渉観察のためのアナライザーとして用いることができる。一方、蛍光波長領域Ｄは、効率良くダイクロイックミラー１２および吸収フィルター１３を透過できるので、蛍光像は暗くならない。よって、非常に高効率な微分干渉と落射蛍光の同時観察が可能になる。
【００２９】
またさらに、ダイクロイックミラー１２の立上がり波長領域ＴU と吸収フィルター１３の立上がり波長領域では、偏光依存性がなくシャープな透過率の立上がりを成しているので、励起光がダイクロイックミラー１２や吸収フィルター１３で完全に遮断され蛍光像に混入せず、コントラストの高い蛍光像が得られる。これは、特に励起波長と蛍光波長が近い蛍光色素を使用する観察に有効である。
【００３０】
（第２の実施の形態）
図３の（ａ）および（ｂ）は、本発明の第２の実施の形態に係るダイクロイックミラー１２の分光透過率特性を示す図である。本第２の実施の形態では、ダイクロイックミラー１２の裏面（透過用光源１および励起光源１０側）、表面（結像レンズ９側）にそれぞれ図３の（ａ），（ｂ）に示すような分光透過率特性を有するコーティングを施す。そしてこれらの組合せにより、図２に示したような分光透過率特性を成すようにしている。これにより、上記第１の実施の形態に示したものと比べて、コーティングに係る設計が簡易に行なえるという利点が生じる。
【００３１】
（第３の実施の形態）
図４は、本発明の第３の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図である。図４に示す顕微鏡は、瞳変調検鏡法であるホフマンモジュレーションコントラスト観察法と落射蛍光観察法とを同時に行なえるものである。
【００３２】
まず、図４におけるホフマンモジュレーションコントラスト観察に係る部分について説明する。図４において２１は透過用光源であり、この透過用光源２１は例えばハロゲンランプからなる。透過用光源２１から発光した照明光はコレクタレンズ２２により進められ、視野絞り２３を介し折り返しミラー２４により反射される。そして窓レンズ２５を通りバンドパスフィルター２６で特定波長のみ透過し、コンデンサーレンズ２８の前側焦点面位置にあるスリット２７に入射する。なお、バンドパスフィルター２６の分光透過率特性については後述する。
【００３３】
スリット２７を出た光は、コンデンサーレンズ２８により集光して標本２９を照明する。標本２９を透過した光は対物レンズ３０により集められ、対物レンズ３０の射出瞳面にある三つの異なる波長特性（後述する）を有するモジュレーター３１を透過する。そして、ダイクロイックミラー３２および吸収フィルター３３を透過した後、結像レンズ３４およびプリズム３５を介して接眼レンズ３６に導かれ、上記第２の従来の技術に述べた原理に基づいた像が観察される。
【００３４】
次に、図４における落射蛍光観察に係る部分について説明する。図４において３７は超高圧水銀灯等の励起光源であり、この励起光源３７から発せされた光はコレクターレンズ３８により集められ、開口絞り３９、視野絞り４０および投影レンズ４１を介して励起フィルター４２に導かれる。そして励起フィルター４２で、標本２９を励起するのに必要な波長のみを透過する。励起フィルター４２を透過した波長はダイクロイックミラー３２で選択的に反射する。なお、ダイクロイックミラー３２は、特定される波長領域より長い波長を透過するものである。そして、ダイクロイックミラー３２で反射した励起光は、モジュレーター３１を通り対物レンズ３０により標本２９へ照射される。
【００３５】
これにより標本２９の蛍光色素に染色されている部分が励起され、励起光より長い波長の蛍光を発し、その発した蛍光が対物レンズ３０により集められる。そしてモジュレーター３１を介してダイクロイックミラー３２を透過する。ダイクロイックミラー３２を透過した蛍光は、特定される波長領域より長い波長の蛍光像のみを透過する吸収フィルター３３を透過した後、結像レンズ３４およびプリズム３５を介して接眼レンズ３６に導かれ、観察される。
【００３６】
図５は、上記した励起フィルター４２、ダイクロイックミラー３２、吸収フィルター３３、バンドパスフィルター２６およびモジュレーター３１の分光透過率特性を示す図である。なお、励起フィルター４２、ダイクロイックミラー３２および吸収フィルター３３の分光透過率特性は、従来の落射蛍光顕微鏡と同様一般的なものである。
【００３７】
図６は、モジュレーター３１の構成を示す図である。図６に示すようにモジュレーター３１は三つの部分から構成されており、ＡおよびＢで示す部分は図５に示すように透過率Ｔが一定の分光波長から、各々比較的緩やかな傾斜を成して長い波長側へ向かって減少する透過率特性を有している。またＣは、図５には示さないが全ての波長に対し１００％近い透過率を有している。
【００３８】
ここで、バンドパスフィルター２６の分光透過率特性のピークを、図５に示すようにモジュレーター３１におけるＡの透過率とＢの透過率とが０になる間隔付近に設定する。このような波長領域においては、モジュレーター３１のＡはほとんど透過せず、Ｂは数十％の透過率になるが、Ｃは１００％近く透過する。よって、これらＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ図１２の（ｂ）に示したホフマンモジュレーションコントラスト観察に必要なモジュレーターの暗黒部（Ｄ）１０８、灰色部（Ｇ）１０９、明るい部分（Ｂ）１１０に対応することになる。これにより、バンドパスフィルター２６の透過波長領域においては、ホフマンモジュレーションコントラスト観察の効果が得られることになる。
【００３９】
一方、モジュレーター３１は、蛍光観察に必要な波長領域、すなわち図５に示すような励起フィルター４２が１００％の透過率を有する領域と発光する蛍光の波長領域Ｄとにおいて高い透過率を有している。このように、蛍光観察には何ら影響を与えることがないので、蛍光像も暗くなることはない。よって本第３の実施の形態によれば、蛍光観察においても損失のない非常に高効率なホフマンモジュレーションコントラストと落射蛍光の同時観察が可能になる。
【００４０】
（第４の実施の形態）
図７は、本発明の第４の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図である。なお図７において図４と同一な部分には同一符号を付し、説明を省略する。図７に示す顕微鏡は上記第３の実施の形態と同様、ホフマンモジュレーションコントラスト観察法と落射蛍光観察法を同時に行なえるものである。
【００４１】
上記第３の実施の形態では図４に示したように、ホフマンモジュレーションコントラスト観察に必要なスリット２７およびモジュレーター３１は、それぞれコンデンサーレンズ２８の前側焦点面および対物レンズ３０の射出瞳面に配置されるのが一般的である。しかしこの二つ位置は、一般的に複数枚で構成されたレンズ群の間に存在することが多く、スペース的な余裕が少ない。また、スリット２７およびモジュレーター３１を、構成上正確な位置に配置できず、光学性能上問題とならない範囲で光軸方向へずらして配置される場合もある。さらに、モジュレーター３１は対物レンズ３０のレンズ群中のレンズ面にコーティングされている場合もあり、特性を変更する場合は対物レンズごと変更しなければならず、コーティングの技術も困難である。
【００４２】
本第４の実施の形態では、図７に示すように瞳投影レンズ５１およびリレーレンズ５２を用いることで、対物レンズ３０の射出瞳面と光学的に共役な位置を観察光路中に作りだすことができる。光学的に共役であるため、モジュレーター３１を投影された瞳位置に配置することでも、ホフマンモジュレーションコントラスト観察を行なうことができる。また、照明側のスリット２７もコンデンサーレンズ２８の前側焦点面と光学的に共役な位置に置き換えることができる。
【００４３】
図７は、前述したように光学的に共役な位置にスリット２７およびモジュレーター３１を置き換えた構成を示している。このような構成であれば、スリット２７およびモジュレーター３１をスペース的に余裕のある位置に配置可能になるので、各々を交換可能な構成を成すことができる。よって、図５に示したようなモジュレーター３１の分光透過率特性を変更したものと交換することで、試料の特性に合わせてバンドパスフィルター２６の透過波長領域に対する透過率を変え、ホフマンモジュレーションコントラスト観察の効果を調整することが可能になる。
【００４４】
また、落射蛍光観察との同時観察に関しては、上記第３の実施の形態と同様、高効率なホフマンモジュレーションコントラストと落射蛍光の同時観察が可能になる。
【００４５】
（第５の実施の形態）
図８は、本発明の第５の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図である。なお、図８において図４と同一な部分には同一符号を付し、説明を省略する。図８に示す顕微鏡は上記第３の実施の形態におけるホフマンモジュレーションコントラスト観察法を瞳変調検鏡法である位相差観察法に置き換えたものであり、位相差観察法と落射蛍光観察法を同時に行なえるものである。よって、基本的な光学的構成等は上記第３の実施の形態と同様であるので、位相差観察のポイントとなるスリット６１およびモジュレーター６２を中心に説明する。
【００４６】
図９の（ａ），（ｂ）は、それぞれ図８において対物レンズ３０の射出瞳面に置かれる位相差用モジュレーター６２と、コンデンサーレンズ２８の前側焦点面に置かれる位相差用スリット６１とを示す図である。図９の（ａ）における９１はモジュレーター６２の位相膜部であり、図９の（ｂ）における９２はスリット６１の開口部である。
【００４７】
なお、位相差観察の原理は公知の通りであるが、以下に簡単に説明する。スリット６１を通過しコンデンサーレンズ２８により試料２９に平面波が入射する。ここで試料２９がなければ、開口部９２の像は対物レンズ３０によりモジュレーター６２の位相膜部９１の中に入るように結像される。試料２９により回折された回折光は、位相膜部９１の外を通り、回折されない０次の回折光のみが位相膜部９１を通過する。なお、試料２９で回折された回折光は０次光に対し位相が遅れるため、位相膜部９１において０次光の位相を１／４λもしくは３／４λ遅らせる。それとともに、強度を落としてやり、回折光と干渉させて像にコントラストを付けて観察する。一般的には、位相膜部９１の透過率は数％から４０％程度であり、落射蛍光観察を同時に行なうと蛍光はかなりの損失を生じてしまう。
【００４８】
図１０は、上記した励起フィルター４２、ダイクロイックミラー３２、吸収フィルター３３、バンドパスフィルター２６およびモジュレーター６２の分光透過率特性を示す図である。図１０に示すようにモジュレーター６２の位相膜部９１は、一定波長より短い波長では高い透過率を持ち、一定波長より長い波長では低い透過率を持つ分光透過率特性を有している。
【００４９】
ここで、バンドパスフィルター２６の分光透過率特性のピークを、図１０に示すようにモジュレーター６２（すなわち位相膜部９１）の透過率が低い部分に設定すると、この波長領域においてバンドパスフィルター２６は低い透過率になり、位相差観察に必要な０次光の強度を落とす機能を持つこととなる。よって、位相を遅らせる機能と合わせることで、バンドパスフィルター２６の透過波長領域においては、位相差観察の効果が得られることになる。
【００５０】
さらに、位相膜部９１の分光透過率特性は蛍光観察に必要な波長領域、すなわち図１０に示すような励起フィルター４２が１００％の透過率を有する領域と発光する蛍光の波長領域Ｄとにおいて高い透過率を有している。そのため、蛍光観察には何ら影響を与えることがないので、蛍光像も暗くなることはない。よって本第５の実施の形態によれば、蛍光観察においても損失のない非常に高効率な位相差と落射蛍光の同時観察が可能になる。
【００５１】
（第６の実施の形態）
図１１は、本発明の第６の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図である。なお、図１１において図８と同一な部分には同一符号を付し、説明を省略する。図１１に示す顕微鏡は上記第５の実施の形態と同様、位相差観察法と落射蛍光観察法を同時に行なえるものである。
【００５２】
当該顕微鏡は第４の実施の形態に示したように、対物レンズ３０の射出瞳面と光学的に共役な位置を、瞳投影レンズ５１およびリレーレンズ５２の働きで観察光路中に作りだすことができる。光学的に共役であるため、位相差用モジュレーター６２を投影された瞳位置に配置することでも、位相差観察を行なう事ができる。
【００５３】
一般的に、ホフマンモジュレーションコントラスト観察と同様、位相差用モジュレーター６２も対物レンズ３０のレンズ群の中にあるため、モジュレーター６２を変更しようとすると対物レンズ３０ごとに交換することになる。しかしながら、特に位相差観察においては、位相膜部９１の透過率と位相の遅れ量はコントラストの付き方により複数の組み合わせを持っているため、その数だけ対物レンズが必要になっている。
【００５４】
よって本第６の実施の形態のように、投影された瞳位置にモジュレーター６２を置き交換可能とし、図１０に示したバンドパスフィルター２６の透過波長領域における位相膜部９１の透過率を変更したもの、または位相膜部９１の位相の遅らせ幅を変更したものとモジュレーター６２とを交換することで、位相差における複数のコントラストの違いを一本の対物レンズ３０で観察することができる。また、照明側の位相差用スリット６１も、コンデンサーレンズ２８の前側焦点面と光学的に共役な位置に置き変えることで、余裕のあるスペースで容易に交換可能とすることができる。
【００５５】
さらに、落射蛍光との同時観察においては、図１０に示した分光透過率特性を保ったままモジュレーター６２を交換できるので、高効率を保ち位相差と落射蛍光の同時観察における位相差のコントラスト手法の変更が行なえる。
なお、本発明は上記各実施の形態に限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、下記の落射蛍光顕微鏡を提供できる。
(a) 簡易な構成により、効率の高い微分干渉観察と落射蛍光観察の同時観察を可能にするとともに、コントラストの高い蛍光像を得ることができる落射蛍光顕微鏡。
(b) 効率の高い（明るい蛍光像が得られる）瞳変調検鏡法と落射蛍光観察の複合検鏡を可能にするとともに、瞳変調検鏡法による像と落射蛍光像の分離能を高くできる落射蛍光顕微鏡。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルターおよびバンドパスフィルターの分光透過率特性を示す図。
【図３】本発明の第２の実施の形態に係る、ダイクロイックミラーの分光透過率特性を示す図であり、（ａ）はダイクロイックミラーの裏面、（ｂ）は表面に係る図。
【図４】本発明の第３の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図。
【図５】本発明の第３の実施の形態に係る、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルター、バンドパスフィルターおよびモジュレーターの分光透過率特性を示す図。
【図６】本発明の第３の実施の形態に係る、モジュレーターの構成を示す図。
【図７】本発明の第４の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図。
【図８】本発明の第５の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図。
【図９】本発明の第５の実施の形態に係る図であり、（ａ）は位相差用モジュレーター、（ｂ）は位相差用スリットを示す図。
【図１０】本発明の第５の実施の形態に係る、励起フィルター、ダイクロイックミラー、吸収フィルター、バンドパスフィルターおよびモジュレーターの分光透過率特性を示す図。
【図１１】本発明の第６の実施の形態に係る落射蛍光顕微鏡の構成を示す図。
【図１２】従来例に係る図であり、（ａ）は一般の顕微鏡にモジュレーションコントラスト法のための要素を付加した構成を示す図、（ｂ）は透過率が３段階に異なる領域を有するフィルタを示す図。
【図１３】従来例に係る図であり、透明な位相物体を透過した光がモジュレーターを介することにより、コントラストのついた像を形成する過程を示す図。
【図１４】従来の複合検鏡顕微鏡の構成を示す図。
【符号の説明】
１…透過用光源、２…バンドパスフィルター、３…ポラライザー、４…ウォラストンプリズム、５…コンデンサーレンズ、６…標本、７…対物レンズ、８…ウォラストンプリズム、９…結像レンズ、１０…励起光源、１１…励起フィルター、１２…ダイクロイックミラー、１３…吸収フィルター、２１…透過用光源、２２…コレクタレンズ、２３…視野絞り、２４…折り返しミラー、２５…窓レンズ、２６…バンドパスフィルター、２７…スリット、２８…コンデンサーレンズ、２９…標本、３０…対物レンズ、３１…モジュレーター、３２…ダイクロイックミラー、３３…吸収フィルター、３４…結像レンズ、３５…プリズム、３６…接眼レンズ、１０１…接眼レンズ、１０２…モジュレーター、１０３…対物レンズ、１０４…試料、１０５…コンデンサー、１０６…スリット、１０８…暗黒部分（Ｄ）、１０９…灰色部分（Ｇ）、１１０…明るい部分（Ｂ）、１１１…像、１１２…モジュレーター、１１３…対物レンズ、１１４…コンデンサー、１１５…試料、１１６…コンデンサー、１１７…スリット、１２１…暗黒部（Ｄ）、１２２…灰色部（Ｇ）、１２３…明るい部（Ｂ）、１２４…結像位置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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