(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナスカス・ピュウプレウス、モナスカス・ピロウサス、モナスカス・アンカの中から選択された糸状菌を用い、これを穀類に培養して得られた紅麹に水性溶媒を加え、アミラーゼ、プロテアーゼにて酵素処理した後にろ過して得られた酵素分解抽出物より成る細胞賦活剤。
【請求項２】
穀類が米、麦、鳩麦、粟、稗、キビ、トウモロコシの中から選択されたものである請求項１記載の細胞賦活剤。
【請求項３】
米紅麹を酸加水分解したときに遊離するグルコサミン量が２．０〜５．０ｍｇ／ｇである米紅麹を原料とすることを特徴とする請求項１記載の細胞賦活剤。
【請求項４】
モナスカス・ピュウプレウス、モナスカス・ピロウサス、モナスカス・アンカの中から選択された糸状菌を用い、これを穀類に培養して得られた紅麹に水性溶媒を加え、アミラーゼ、プロテアーゼにて酵素処理した後にろ過して得られた酵素分解抽出物を配合して成る皮膚外用剤。
【請求項５】
米紅麹を酸加水分解したときに遊離するグルコサミン量が２．０〜５．０ｍｇ／ｇである米紅麹の酵素分解抽出物を５〜２０重量％配合して成る請求項４記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
皮膚外用剤が液状、乳液状、ゲル状、クリーム状、ペースト状、固体状、粉体状、シート状の何れかである請求項４記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、紅麹を原料とする細胞賦活剤、並びにこれを用いた皮膚外用剤（スキンケア製剤）の提供に関する。
【０００２】
【従来の技術】
紅麹は、モナスカス属の糸状菌を種菌とする紅色の麹で、その歴史は古く、中国では唐代の徐堅の著書「初学記」に紅麹から醸造酒を作ったことが記されている。元時代の呉端の「日用本草」には当時既に紅麹が民間で製造されていたことを示す記述がある。明の時代になると、宋応星がその著書「天工開物」のなかに紅麹の製造方法を記している。清朝初期の李時珍の著書「本草綱目」には現在の純粋培養に近い形の製法が記されており、「消食活血」（消化を助け血行を良くする）の効能を有する漢薬としても利用されてきた。その後台湾にも伝わり、紅酒、老紅酒などの醸造酒や腐乳の原料として、或は、魚や肉や漬物の調味や着色や保存用に用いられてきた。
わが国では、沖縄の伝統食として紅麹が利用され「とうふよう」や赤飯、ムーチ（ちまき）等の着色に現在でも用いられている。また、最近新潟で「赤い酒」として、その色調を活かした日本酒も作られ、販売されている。
近年、薬理的研究も進み、Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓなどの一部の紅麹菌がコレステロール生合成阻害物質モナコリンＫを生産すること（特公昭５９−２５５９９号）、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）を用いた実験で降血圧効果が確認され、その有用物質が水溶性画分に存在するγ−アミノ酪酸、Ｄ−チロシン等であること（特公平３−３１１７０号、特公平５−７５７５８号）等が確認されており、特定保健用食品の素材になり得るとの期待が寄せられ、米紅麹を配合した酢、味噌、醤油、パン等が食品市場に上市されている。
現在、最も一般的な利用は、紅麹色素を食品用天然着色料として用いることである。色素生産能の高い菌をタンク培養し、菌体から色素を抽出する。我が国では年間に６００ｔ程生産されており、その安全性から水産練製品、畜肉製品等に広く用いられている。
上記のように現状その利用は、ほとんど全てが食品としての内用であるが、外用についても研究が行われており、例えば、メークアップ化粧料への配合（特開昭６０−１４９５１２号）、皮膚洗浄料への配合（特開昭６４−９０１０９号）、紅麹色素の抽出法と化粧品への配合（特開平３−２５４６８６号）、紫外線吸収物質の抽出（特開平４−２３８８０号）、紅麹のキトサナーゼを利用した皮膚外用剤（特開平４−２１０６１５号）、メラニン生成抑制物質の抽出（特開平６−６５０３８号）、安定化したモナスカス色素の化粧品への配合（特開平６−２３４９３５号）等が例示される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
かかる点、本発明者らは紅麹の長期にわたる使用実績と、近年の健康食品としての使用実態より、内用では充分安全であることに着目し、外用である化粧品原料としての可能性をいろいろ検討してきた。
その結果、紅麹の酵素分解抽出物に動物細胞増殖能（細胞賦活作用）や保湿作用を有することを究明し、肌荒れの改善や小じわ等の皮膚老化の防止を目的とした細胞賦活作用を有する化粧品原料、並びに、これを配合した新規な皮膚外用剤を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
しかるに本発明は、紅麹の酵素分解抽出物より成る細胞賦活剤。紅麹がモナスカス属に属する糸状菌を穀類に培養して得られたものであることを特徴とする細胞賦活剤。モナスカス属に属する糸状菌がモナスカス・ピュウプレウス，モナスカス・ピロウサス，モナスカス・アンカの中から選択されたものであることを特徴とする細胞賦活剤。穀類が米、麦、鳩麦、粟、稗、キビ、トウモロコシの中から選択されたものであることを特徴とする細胞賦活剤。分解酵素としてアミラーゼ、プロテアーゼを用いたことを特徴とする細胞賦活剤。グルコサミンが２．０〜５．０ｍｇ／ｇ含まれる米紅麹を原料とすることを特徴とする細胞賦活剤。紅麹の酵素分解抽出物を配合して成る皮膚外用剤。グルコサミンが２．０〜５．０ｍｇ／ｇ含まれる米紅麹の酵素分解抽出物を５〜２０重量％配合して成る皮膚外用剤。皮膚外用剤が液状、乳液状、ゲル状、クリーム状、ペースト状、固体状、粉体状、シート状の何れかである皮膚外用剤に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態１】
＜分解酵素の作用について＞
精白米を一晩水に浸漬した後３０分間水切りし、２００ｇずつフラスコにわけて入れて１２１℃で２０分間熱処理して滅菌し、３０℃まで冷却した後、紅麹菌（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ；ＩＦＯ  ４５２０）を植菌し、３０℃で７日間好気的に静置培養した。このようにして得た含水米紅麹を６０℃で３時間通風乾燥して乾燥米紅麹とした。（粒状紅麹）一方、かかる粒状紅麹をサンプルミル（協立理工（株）製）で粉砕して粉状とした。（粉状紅麹）
かかる粒状、粉状の紅麹各１００ｇにそれぞれ９００ｇの精製水を加え、１０００ｇ（１０％濃度）の紅麹水懸濁液を得、１００℃で２０分間加熱した後５０℃まで冷却し、表１に示す条件による酵素処理を行った。なお、酵素は以下の各実施形態を含め、グルクザイムＮＬ４．２（天野製薬（株）製：アミラーゼ）、プロテアーゼＡ「アマノ」（天野製薬（株）製：プロテアーゼ）、リパーゼＡ「アマノ」（天野製薬（株）製：リパーゼ）、卵白リゾチーム（キューピー（株）製：リゾチーム）を用いた。
酵素処理は２４時間振とうさせながら行ない、その後９０〜９５℃の範囲に温度管理して５分間熱処理して酵素を失活させ、室温まで冷却した後規格Ｎｏ．２のろ紙にてろ過し、その抽出液を酵素分解抽出物とした。
これのｐＨ，Ｂｒｉｘを測定した結果を表１に示す。尚、ｐＨはｐＨメーターＦ１２（堀場製作所製）、Ｂｒｉｘはアタゴ糖度計（アタゴ（株）製）によって測定し、以下の各実施形態のデータ測定も全てこれによって行った。
【０００６】
【表１】
0003678475.tif 000002
【０００７】
表においてＢｒｉｘの値が大きいことは、抽出効率が大きいこどを示し、これによると酵素処理をしないもの、即ち、粉状の紅麹を５０℃で２４時間、酵素を加えず振とう処理したもの（試験区Ｎｏ．１）と酵素処理したもの（例えば、試験区Ｎｏ．６）は酵素処理による差が顕著である。
使用酵素については、紅麹の澱粉質、蛋白質を分解する酵素、即ち、アミラーゼ、プロテアーゼ併用の効果が大きく、脂肪分に作用するリパーゼ、溶菌酵素であるリゾチームは添加による効果が少ない。更に、処理温度は例えば、糸状菌細胞壁溶解酵素（キチナーゼ）の併用を考慮し、これの至適温度である３７℃と、アミラーゼ、プロテアーゼの至適温度である５０℃の比較を行ったが、５０℃による処理の方が好ましい結果となった。また、紅麹の性状においては、粉状であっても粒状であっても大差がないが、抽出の際のろ過速度が速く、処理しやすいことから粒状であることが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態２】
＜培養日数と細胞増殖能について＞
精白米を一晩水に浸漬した後３０分間水切りし、１２１℃で２０分間熱処理して滅菌し、３０℃まで冷却した後紅麹菌（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  Ｐｉｌｏｓｕｓ；ＩＦＯ  ４５２０）を植菌し、６区に分けて３０℃で２〜６日間好気的に棚式培養した。このようにして得た含水米紅麹を６０℃で３時間通風乾爆して乾燥米紅麹とした。尚、培養日数０のものは菌の接種直後のものである。
かかる紅麹各１００ｇにそれぞれ９００ｇの精製水を加え、１０００ｇ（１０％濃度）の紅麹水懸濁液を得、１００℃で２０分間加熱した後５０℃まで冷却した後アミラーゼを１．０ｇ，プロテアーゼを０．５ｇ加え、５０℃で２４時間振とうさせながら酵素処理を行ない、その後９０〜９５℃の範囲に温度管理して５分間熱処理して酵素を失活させ、室温まで冷却した後規格Ｎｏ．２のろ紙にてろ過し、次いでろ液に粉末活性炭（和光純薬（株）製）を２０ｇ加え、活性炭処理した後、規格Ｎｏ．５ｃのろ紙にてろ過してそのろ液を酵素分解抽出物とした。これについてのｐＨ，Ｂｒｉｘ、グルコサミン量、細胞増殖率を測定した結果を表２に示した。
【０００９】
【表２】
0003678475.tif 000003
【００１０】
表におけるグルコサミン量は麹を酸加水分解し、遊離したグルコサミンをＢｌｉｘ法に従い比色定量した。また、細胞増殖率は以下の試験法によって求めた。即ち、細胞は、３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ  ａｉｂｉｎｏ  ｍｏｕｓｃ線維芽細胞を、また、試験用の培地はダルベッコ変イーグル培地＋１％牛胎児血清を用い、直径６０ｍｍのシャーレに２．０×１０５個播種する。試験区では細胞を播種した培地に酵素分解抽出物を所定の濃度、即ち、細胞培養液に対し、５，１０，２０，４０重量％添加し、試料無添加をコントロールとした。また、細胞を播種しない培地のみのものをブランクとした。更に、ダルベッコ変イーグル培地＋２．５％牛胎児血清の培地を用い、同様に細胞を播種したものの細胞増殖率を陽性対照（陽性コントロール）とした。これらをＣＯ２インキュベータ内（３７℃，５％ＣＯ２）で４日間培養した後、細胞を０．１Ｎ−ＮａＯＨで溶解し、全蛋白質量をＬｏｗｒｙ法に従い比色定量した。
増殖率は各々の吸光度から数１の式によってコントロールの増殖率を１．００とした比で求め、最大増殖比１．１０以上を示すものを増殖能ありと判定した。
尚、以下の実施の形態では全てこれに準じて測定し、判定した。
この結果によると、培養日数が３〜５日目、グルコサミンが２．０〜５．０ｍｇ／ｇ、添加量が５〜２０重量％、とりわけ１０〜１５重量％のものが好ましい結果となった。
【００１１】
【数１】
0003678475.tif 000004
【００１２】
また、表３には、表２の試験区Ｎｏ．４の抽出物の特性を示したが、活性炭処理により、抽出物の脱臭、脱色がはかられ、また成分、不純物等においても皮膚外用剤成分として適するとの結果を得た。
【００１３】
【表３】
0003678475.tif 000005
【００１４】
【発明の実施の形態３】
＜糸状菌について＞
精白米を一晩水に浸漬した後３０分間水切りし、２００ｇずつフラスコにわけて入れて１２１℃で２０分間熱処理して滅菌し、３０℃まで冷却した後、それぞれ以下の７種の糸状菌を接種した。
0003678475.tif 000006
0003678475.tif 000007
これをフラスコ培養において好ましい培養日数、即ち、Ｍｏｎａｓｃｕｓ属の糸状菌については７日間、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の糸状菌については４日間好気的に静置培養した。このようにして得た含水米紅麹を６０℃で３時間通風乾燥して乾燥米麹とした。
かかる米麹各１００ｇにそれぞれ９００ｇの精製水を加え、１０００ｇ（１０％濃度）の懸濁液を得、１００℃で２０分間加熱した後５０℃まで冷却した後アミラーゼを１．０ｇ，プロテアーゼを０．５ｇ加え、５０℃で２４時間振とうさせながら酵素処理を行ない、その後９０〜９５℃の範囲に温度管理して５分間熱処理して酵素を失活させ、室温まで冷却した後規格Ｎｏ．２のろ紙にてろ過し、次いでろ液に粉末活性炭（和光純薬（株）製）を２０ｇ加え、活性炭処理した後、規格Ｎｏ．５ｃのろ紙にてろ過してそのろ液を酵素分解抽出物とした。
これについてのｐＨ，Ｂｒｉｘ、グルコサミン量、細胞増殖率を測定した結果を表４に示した。
【００１５】
【表４】
0003678475.tif 000008
【００１６】
この結果においてはモナスカス属に属する、具体的にはモナスカス・ピュウプレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｕｒｐｒｅｕｓ）、モナスカス・ピロウサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ）、モナスカス・アンカ（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ａｎｋａ）が優れる。
【００１７】
【発明の実施の形態４】
＜培地について＞
下記の９種類の穀類各２００ｇを培地とし、これを一晩水に浸漬した後３０分間水切りし、１２１℃で２０分間熱処理して滅菌し、３０℃まで冷却した後、フラスコに入れ、紅麹菌（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ；ＩＦＯ  ４５２０）を植菌し、６もしくは７日間好気的に培養した。
0003678475.tif 000009
このようにして得た未失活の含水紅麹を６０℃で３時間通風乾燥して乾燥紅麹とした。
かかる紅麹各１００ｇにそれぞれ９００ｇの精製水を加え、１０００ｇ（１０％濃度）の紅麹水懸濁液を得、１００℃で２０分間加熱した後５０℃まで冷却した後アミラーゼを１．０ｇ，プロテアーゼを０．５ｇ加え、５０℃で２４時間振とうさせながら酵素処理を行ない、その後９０〜９５℃の範囲に温度管理して５分間熱処理して酵素を失活させ、室温まで冷却した後規格Ｎｏ．２のろ紙にてろ過し、次いでろ液に粉末活性炭（和光純薬（株）製）を２０ｇ加え、活性炭処理した後、規格Ｎｏ．５ｃのろ紙にてろ過してそのろ液を酵素分解抽出物とした。これについてのｐＨ，Ｂｒｉｘ、グルコサミン量、細胞増殖率を測定した結果を表５に示した。
【００１８】
【表５】
0003678475.tif 000010
【００１９】
以上の結果は、大豆、小豆等の豆類は培地として適さないことを表している。
【００２０】
【発明の実施の形態５】
＜皮膚外用剤としての処方例１＞  エモリエントクリーム
0003678475.tif 000011
上記１〜９の成分を混合して約８０℃で加熱溶解し、これに約８０℃に加熱した１０及び１２を加えて均一な混合液とし、次いで１１を加えた後、攪拌しながら約３０℃まで冷却し、クリームとした。表中のＥ．Ｏ．は以下の処方例を含めエチレンオキサイドの付加モル数を意味する。
尚、紅麹抽出物は、表２における試験区Ｎｏ．４のものを用いた。
【００２１】
＜皮膚外用剤としての処方例２＞  ミルクローション
0003678475.tif 000012
0003678475.tif 000013
上記１〜４の成分を混合し、約８０℃に加熱溶解し、これに約８０℃に加熱した５〜７及び１０の成分を加えて均一な混合液とした。次いで８及び９を加えた後、攪拌しながら約３０℃まで冷却し、ミルクローションとした。
尚、紅麹抽出物は、表２における試験区Ｎｏ．４のものを用いた。
【００２２】
＜皮膚外用剤としての処方例３＞  化粧水
0003678475.tif 000014
１〜７を混合し、均一に溶解して化粧水とした。
尚、紅麹抽出物は、表２における試験区Ｎｏ．４のものを用いた。
【００２３】
＜皮膚外用剤としての処方例４＞  パック
0003678475.tif 000015
0003678475.tif 000016
１〜９を混合して練り合わせ、均一なペーストにしてパックとした。
尚、紅麹抽出物は、表２における試験区Ｎｏ．４のものを用いた。
【００２４】
＜評価テスト＞
前記皮膚外用剤としての処方例３に示した化粧水を用いて３０名（２５〜５５才）の女性を対象に３０日間の使用テストを行い、使用感と安全性、及び、有用性についてのアンケート回答を得た。その結果を表６〜表８に示す。
【００２５】
【表６】
0003678475.tif 000017
【００２６】
【表７】
0003678475.tif 000018
【００２７】
【表８】
0003678475.tif 000019
【００２８】
尚、表６には使用感と安全性について、表７、表８には有用性について設問に対する回答として集計した。
かかるモニターテストによれば、この化粧水は、刺激が全くない安全な製品で、使用感も良く、また、肌表面の改善効果と小じわ改善効果（老化防止効果）に優れたものであることがわかった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明による抽出物には、優れた動物細胞増殖作用があり、老化予防効果を期待する皮膚外用剤に応用することができる。
その具体的な利用方法としては、化粧品への応用が挙げられ、それらの製剤の形態については、特に制約されることなく、液状、乳液状、ゲル状、クリーム状、ペースト状等様々な形態の製品に用いることが可能である。これらの製剤の処方中に配合して用いることにより、加齢に伴ない衰えていく皮膚の新陳代謝を活性化して、小じわを始めとした皮膚の老化を予防する効果が期待できると共に、肌の潤いを保ち、しっとりと滑らかな使用感が得られる。
また、本紅麹抽出物の水分を除去したり、包接などの技術的な配慮を施すことにより、固体あるいは粉体にすることも可能であり、このような処理をしたものを用いれば、固体状、粉体状、シート状などの形態の製品に用いることが可能である。
即ち、本発明は特に穀類を培養基質としてモナスカス属に属する微生物を培養し、これの酵素分解抽出物に見出した新たな機能をもとに皮膚外用剤への応用開発をしたもので、細胞賦活作用を有する化粧品原料として、また、かかる有用性のみならず、使用感においても優れ、かつ、皮膚への局所適用に対する安全性も高いことから、これを配合した新規な皮膚外用剤を提供するものである。
尚、紅麹の製麹に際しては、培養法による効果の差が顕著でないため、必要量によってフラスコ培養、棚式培養、通風式培養等、任意の方式を選択すればよく、培養された紅麹は、乾燥して失活させても未失活の湿菌体であっても効果に差がないため、輸送、取扱い上便利な乾燥状態とするのが好ましい。