(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者のTSC２遺伝子に突然変異又は欠失があるかを決定するためのin vitro スクリーニング方法であって、前記対象者由来の生物学的試料中の下記に示す TSC２DNA又は対応のTSC２RNAの存在を検査する及び／又はその特性を評価することを含んで成る方法。
【化１】
0003704145.tif 000013
【化２】
0003704145.tif 000014
【化３】
0003704145.tif 000015
【化４】
0003704145.tif 000016
【化５】
0003704145.tif 000017
【化６】
0003704145.tif 000018
【請求項２】
前記 TSC２DNA 又はTSC２RNAが突然変異しているか又は欠失しているかを検査及び／又は評価することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スクリーニングが、前記TSC２DNA 又は前記TSC２RNA に対応するcDNAのフラグメントを増幅するために、前記試料に核酸増幅過程を適用することを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法を実施するための診断キットであって、請求項１項規定するTSC２DNA又は対応のTSC２RNAを増幅するための核酸プライマーを含んで成るキット。
【請求項５】
対象者が TSC２関連疾病キャリヤーであるか又は TSC２関連疾病を有する患者であるかを決定するための方法を実施するための診断キットであって、請求項１に規定するTSC２DNA又は対応のTSC２RNAにハイブリダイズすることのできる核酸プローブを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は結節硬化症２(TSC２）関連疾病を有する患者における TSC２遺伝子、その突然変異体、 TSC２遺伝子をコードするタンパク質、並びに診断及び治療におけるその利用に関する。
発明の背景
以降に陳述する文献は全て本詳細な説明の最終に列挙し、そしてその内容全体を引用することで本明細書に組入れる。
【０００２】
結節硬化症(TSC）は母斑症に属する常染色体優性疾病(van der Hoeve, 1993) であり、そして数多くの組織及び器官における通常過誤腫と呼ばれる広範囲にわたる増殖進行を特徴とする。特に脳、目、皮膚、腎臓、心臓、肺及び骨格における予測し得ないこれらの損傷分布は、多種多様な症候、症状及び合併症をもたらす(Gomez, 1988) 。ほとんどは神経学又は皮膚学的発現の結果として診断されるが、腎臓病は現在までに報告されている数多くのTSC の死において、最大の死因であることが見い出されている（死亡者の11／40）。出血、高血圧及び最終ステージの腎臓病（ESRD）を含む腎臓合併症は腎臓における嚢胞及び過誤腫増殖（血管筋脂肪腫）の発達に結びつく。血管筋脂肪腫はおそらく腫瘍又は増殖抑制遺伝子として機能するTSC 遺伝子に関する共存する不活化性の構成及び体細胞突然変異に基づいて生ずるものであり(Greenら（1994）及びGreen ら（印刷中））。従って、診断される症例の頻度は 5,800分の１ほどの高さでありうる真の有病率より低い値を示しうる(Osborneら、1991）。TSC の病因はあまりよくわかっておらず、そして主要の基礎的な欠陥を確立する研究は原因遺伝子の位置のクローニングを焦点としている。
【０００３】
連結研究は、明らかに区別できない表現型をもたらす染色体９(Fryerら、1987）及び16(Kandtら、1992）上の疾病決定遺伝子の伴う遺伝子座木均一性を確立した(Sampsonら、1989ａと1992，Hainesら、1991ａとｂ，Janssen ら、1991, Povey ら、1991, Northrupら、1992）。全てでないにしてもたいていの冒された多世代家系において、この疾病はこれらの遺伝子座の一方又は他方の遺伝子に原因している(Kwiatkowskiら、1993）。ゲノムデーターベース命名協会（Genome Database Nomenclature Committee）は最近、染色体９及び16上の遺伝子座をそれぞれ TSC１及び TSC２と称することに同意した。TSC 家系における減数分裂組換現象の分析は、 TSC１及び TSC２の位置を末端小粒(telomeric) 染色体バンド９ｑ34.3及び16ｐ13.3における小さな領域にまで絞った。16ｐ13.3においての候補領域はマーカーMS205.2(Ｄ16Ｓ309)と16AC2.25（Ｄ16Ｓ291)との間に広がり、(Kwiatkowskiら、1993）、推定1.5 メガの塩基数のDNA を示している。
16Ｐにおいてのアレルについてのヘテロ接合能の損失がTSC 患者由来の過誤腫において観察され(Green and Yates, 1993；Smith ら、1993）、TSC 表現型を細胞レベルでもたらすのに第２の体細胞性突然変異が必要でありうることを示唆する。この観察は、その他の母斑症、神経線維症１型（NF１）（Legiusら、1993）及び２型（NF２）(Trofatterら、1993）、並びにフォン・ヒッペル−リンド−(von Hippel-Lindau）病(VHL) (Latifら、1993）の原因となる遺伝子の共通の特徴である腫瘍抑制因子として働く染色体16と一致する。Knudson(1971) により提唱されているツーヒットメカニズム(two-hit mechanism) がTSC に適用されるなら、不活化性構成突然変異が予測されるであろう。TSC10 染色体16α−サラセミア／精神遅退症候群(ATR−16）及び前記候補領域の末梢部に及んでいる16ｐ末端欠失を有する個体において認められている（Wilkieら、1990）。従って、本発明の発明者は前記候補領域の基端部の欠失について調べた。
【０００４】
TSC の60％程度は新しい突然変異を示し(Sampsonら、1989ｂ）、そして本発明者はその一部が大きな欠失となっていることがあると推理した。パルス電場ゲル電気泳動（PFGE）により検出可能であるかかる欠失は、NF１，NF２及びVHL において実証されているように、遺伝子の同定を大いに助長するであろう(Viskochilら、1990；Trofatter ら、1993；Latif ら、1993）。本発明者は、候補領域の基端部における30と75kbとの間の５つのTSC 関連構成性間隙欠失をこの度同定した。これらは120kb セグメントへと地図化され、それより本発明者はいくつかの遺伝子を同定し、その１つは欠失全てにより破綻されていた突然変異分析及び発現研究は、我々が TSC２と呼んでいるこの遺伝子が染色体16結節硬化症決定遺伝子であることの強力な裏付けとなる。
発明の概要
従って、一の観点において、本発明は単離された、精製された、又は組換の核酸配列であって：
（ａ）TSC 遺伝子又はその相補鎖、
（ｂ）上記（ａ）において規定する分子の実体部分に対して実質的に相同性の、又はそれにハイブリダイズできる配列、
（ｃ）上記の（ａ）又は（ｂ）において規定する分子のフラグメント、を含んで成る配列を提供する。
【０００５】
詳しくは、図３のヌクレオチド配列の全体又は一部に対応する配列、又は相補性の配列、又はこれらの配列のいずれかにハイブリダイズする配列を有するDNA 分子を提供する。
【０００６】
別の観点において、本発明は以下を特徴とする精製DNA 分子を提供する：
（ｉ）末端小粒染色体バンド16ｐ13.3の中に存在する、
（ii）TSC 患者において突然変異している、
（iii ）マーカー GGG１と16AC２との間にある。
【０００７】
この配列は好ましくはコスミド ZDS−５及びLADS−４の中に含まれている。このDNA はゲノムであってよいが、好ましくはcDNAである。
【０００８】
本明細書に記載の TSC２遺伝子はヒト染色体16の上において見い出され、そして本明細書に記載の家系研究の結果は、この TSC２遺伝子がTSC の予防又は抑制において機能する TSC２タンパク質又はツベリン(tuberin) と呼ばれているタンパク質をコードするという所見の基礎を成す。従って、 TSC２遺伝子は図３に示すDNA 配列及びその全ての機能的均等物を含む。この遺伝子は更に TSC２コード配列の発現をコントロールするようなプロヒーター、エンハンガー及びターミネーター領域を含む調節領域を含む。その他のDNA 配列、例えば最終産物である TSC２RNA 転写体からスプライシングされるイントロンも含まれる。研究はヒト遺伝子に関連して実施されているが、より下等な動物において存在している対応の遺伝的及び機能的配列も包括される。
【０００９】
従って、本発明は図３に係る配列を有する TSC２遺伝子又はその相補鎖を更に提供する。詳しくは、これは図３の配列を有する TSC２遺伝子又はその相補鎖を提供し、この遺伝子又はその鎖は一部のTSC 患者において（より詳しくはTSC 患者において）変更している。
【００１０】
本発明は更に突然変異 TSC２遺伝子を含んで成る核酸配列、特に図３に係る配列であって：
（ａ）〔WS−13〕約32kbが欠失しており、CW13及びCW９が隣接する；
（ｂ）〔WS−９〕約46kbが欠失しており、SM９及びCW12の中に破断点を有する；
（ｃ）〔WS−211 〕約75kbが欠失しており、CW９とCW15との間の末梢側に、及びCW23とCW21との間の基端部側に破断点を有する；
（ｄ）〔WS97〕 BFS２とSM９との間の末梢側にて、及びCW20内の末端部側にて約75kbが欠失している；
（ｅ）〔WS−53〕末梢側でCW23と隣りのJH１との間で約35kbが欠失しており、そして基端部側で TCS２の0.6kb が欠失しており、その欠失はSH６とJH13との間で基端部側にある；
（ｆ）〔WS212 〕図８に示す通り、SM９−CW９の末梢側と TSC２３′UTR の基端部側で約75kbが欠失している；
（ｇ）〔WS−215 〕図８に示す通り、CW20とCW10−CW36との間で約160kb が欠失している；
（ｈ）〔WS−227 〕図８に示す通り、CW20とJH11との間で約50kbが欠失している；
（ｉ）〔WS−219 〕図８に示す通り、JH１とJH６との間で約27kbが欠失している；及び
（ｊ）〔WS−250 〕図８に示す通り、CW20において約160kb が欠失している；
配列から選ばれるものを提供する。
【００１１】
本発明は更に、図３のヌクレオチド配列の全体もしくは一部、又は相補性配列、又は上記の配列のいづれかにハイブリダイズする配列に対応する配列を有する精製RNA 分子に及ぶ。
【００１２】
別の観点において、本発明は上記の配列を有する核酸プローブを提供する。詳しくは、本発明は先の請求項のいづれか１項記載の DNA又は RNA分子の少なくとも一部にハイブリダイズする精製核酸プローブに及ぶ。好ましくは、このプローブは放射圧ラベル、例えば32ｐラベルをの如くのラベルを含む。
【００１３】
別の観点において、本発明は図３のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質、又はこのタンパク質と相同性の特性を有するもしくはこのタンパク質と共通の少なくとも一種の機能性ドメインもしくは活性部位を有するタンパク質ポリペプチドをコードする精製DNA 又はRNA を提供する。
【００１４】
上記のDNA 分子は、図３のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はこのタンパク質と共通の少なくとも一種の機能性ドメインもしくは活性部位を有するタンパク質もしくはポリペプチドを発現するための組換クローニングベクターの中に組込んでよい。
【００１５】
別の観点において、本発明は上記の配列によりコードされるポリペプチド、又は図３のアミノ酸配列に係るアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は前記タンパク質と相同性の特性を有するタンパク質もしくはポリペプチド、又は前記タンパク質と共通の少なくとも一種の機能性ドメインもしくは活性部位を有するタンパク質もしくはポリペプチドを提供する。詳しくは、 TSC２タンパク質又はその突然変異体もしくは変異体を構成する単離された、精製された又は組換のポリペプチド、又は上記の配列によりコードされるポリペプチド又は TSC２タンパク質と実質的に同一の活性を有するその変異体を提供する。
【００１６】
本発明はまた個体が結節硬化症に冒されているかどうかを決定するインビトロ方法を提供し、この方法は図３のアミノ酸配列を有する TSC２タンパク質又はポリペプチドの存在及び／又は量を決定するために個体由来の試料を検定する工程を含んで成る。
【００１７】
更に、又は別に、試料は図３のアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドをコードするmRNAの存在及び／もしくは量を決定するため、又は図３のタンパク質もしくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のフラグメントのフラグメント長を決定するため、又は図３のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくは相同性の特性を有するタンパク質をコードするDNA における不活化性突然変異を検出するために、検定することができる。
【００１８】
本発明に係る方法は、 TSC２関連疾病を有する又はその素因を有すると推定される患者におけるかかる疾病を検査することを含んで成んでよく、この方法は患者から採取した試料中の TSC２DNA, TSC２mRNA及び／又は TSC２タンパク質の存在を検査する及び／又は特徴を評価することを含んで成る。かかる方法は TSC２DNA が欠失しているか、存在しないか、突然変異しているか、異常か、又は正常な TSC２タンパク質を発現しないかを検査及び／又は評価することを含んで成りうる、かかる方法を実施するための一の方法は：
Ａ．患者から生物学的な組織又は生検を採取する；
Ｂ．試料中の TSC２DNA, TSC２mRNA及び／又は TSC２タンパク質の存在を検査及び／又は特徴を評価して、第１セットの結果を得る；
Ｃ．この第１セットの結果を、前記疾病を有するものと予測されていない個体に関して同一又は類似の方法論を利用して得られた第２セットの結果と対比させる：
ことを含んで成り、そしてもしこの第１と第２セットの結果が、 TSC２DNA が欠失している、存在していない、異常である、突然変異している又は TSC２タンパク質を発現しないとの点で相異するなら、それはその患者の前記疾病の存在、素因又はそれを発症する傾向を示唆している。
【００１９】
本発明に係る特定の方法は、患者から、 TSC２DNA であると主張されている TSC２遺伝子座由来の TSC２DNA 又はDNA の試料を抽出し、その試料をインビトロで培養し、そしてその結果としてのタンパク質を分析し、そしてその結果としてのタンパク質を十分に確立されたタンパク質トランケーション試験に従って正常な TSC２タン
パク質と対比させることを含んで成る。
【００２０】
感度のあまりよくない試験には、RT PCR（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）を利用するRNA 分析及びゲノム DNAの検査が含まれる。
【００２１】
他方、この方法の工程Ｃは、次の工程により代替される：
Ｃ．第１セットの結果を、少なくとも１種の前記疾病を有することのわかっている個体において同一又は類似の方法論を利用して得られた第２セットの結果と対比させる；そしてもしこの第１セットと第２セットの結果が実質的に同一であるなら、このことはその患者における TSC２DNA が欠失している、突然変異している、又は正常な TSC２タンパク質を発現しないことを示唆している。
【００２２】
本発明は更に TSC２遺伝子の中に突然変異を有するものと推定される対象体における突然変異を特性決定する方法を提供し、この方法は：
Ａ．対象体の TSC２遺伝子中の各エクソンを増幅させる；
Ｂ．増幅させたエクソンの相補鎖を変性させる；
Ｃ．変性分離した相補鎖を希釈して、各一本鎖DNA 分子が二次構造コンホメーションを帯びるようにする；
Ｄ．このDNA 分子を非変性条件下で電気泳動にかける；
Ｅ．前記一本鎖分子の電気泳動パターンを、正常又は TSC２ヘテロ接合ゲノタイプのいづれかを有するコントロール個体に由来する同じ増幅させたエクソンを含む一本鎖分子の電気泳動パターンと対比させる；そして
Ｆ．コントロール個体のDNA から提供したパターンと異なる電気泳動パターンを有する任意の増幅生成物を配列決定する；
ことを含んで成る。
【００２３】
本発明は更に上記の方法を実施するための診断キットにも及び、これは上記のDNA 又はRNA 配列のフラグメントを増幅するための核酸プライマーを含んで成る。
【００２４】
別のキットの態様では、EcoRI フラグメントを供するように試料を消化するための１又は複数種の物質と、前述のDNA プローブとを組合せていてよい。
【００２５】
更に、キットは上記のDNA 又はRNA 分子にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを含みうる。
【００２６】
本明細書に記載のタンパク質（ツベリン）は結節硬化症(TSC) の如くの TSC２関連疾病に冒された又は冒され易い患者を処置するのに利用してよい。即ち、このタンパク質又はこのタンパク質と相同性の機能を有するポリペプチド又ハイブリドタンパク質を患者に投与して TSC２関連疾病の影響を軽減又は回避することができうる。
【００２７】
以降に記載の通り、 TSC２及びツベリンタンパク質は TSCを有する又は有さない患者における癌の発症の予防に関与するものと信じられている。従って、本発明は更に腫瘍の発症を抑制するもしくは無秩序な細胞分裂を阻止する、又は TSC２関連腫瘍を処置する方法を提供し、この方法は機能性 TSC２遺伝子を患者の所望の細胞に供与して、例えばその中でツベリンを発現させることによるか、又はその中にツベリンもしくはツベリン機能性擬似体（例えば相同な機能を有するハイブリドタンパク質）を、細胞増殖調節もしくは腫瘍抑制作用の如くの所望の作用を得るに足りる量で供与することによる。
【００２８】
本発明は上記の特徴の任意の創作的な組合せ、又は下記の説明に及ぶ。
【００２９】
図１は染色体16ｐの末端領域の地図であり、そしてMS205.2(Ｄ16Ｓ309)と16AC2.5(Ｄ16Ｓ291)との間の連結分析により決定された TSC２候補領域を示す。 ATR−16患者BOにおいて見い出せる末端欠失のサイズを示す（上部）（Harrisら、1990；Harrisら、1991；Germino ら、1992；Rackら、1993；Wilkieら、1990； Germinoら、1993及びKwiatkowski ら、1993よりまとめた）。下に広がっているのは、基端部の TSC２候補領域の詳細な地図であり、ClaI（Ｃ）部位、２種類の体細胞ハイブリドＮ−OH１及びＰ−MWH2A の破断点、並びに存在且つ選定した新たなDNA プローブの位置を示している。近隣 (contig) 内のコスミドの位置を地図の下に示す：１，JC１；２，JC11；３，CC１；４，CC１−２；５，CBFS１；６，CW９Ｄ；７，LADS４；８，CW12I ；９，JH１Ｋ；10,  ZDS５；11，SMII。
【００３０】
図２において、染色体16のTSC 領域、酵素BssHII，Ｂ；MluI, Ｍ；NotI, Ｎ；NruI, Ｒ； SacII, Ｓのゲノム部位及び EcoRI（Ｅ）部位の部分地図の詳細な地図を示す。空白の枠はゲノムプローグのサイズ及び位置を示す（詳細な実験手順を参照のこと）。べた塗りの枠は転写体のサイズを示し、そして染色体上のその方向は矢印で示している。各遺伝子のゲノムの大きさはかっこで示す。３Ａ３の完全な基部の大きさは未知である。 TSC２遺伝子を含んで成るcDNAクローンを下に拡大して示している。TSC 関連欠失のサイズ及び位置は地図の上方に示し、破線は不確定な領域を示す。WS−13欠失は32kbであり、そしてCW13及びCW９が隣接する。７kbのEcoRI 破断フラグメントがこれら２つのプローブを伴って見い出せる（図３Ｃ）。WS−９は46kbの欠失であり、SM９及びCW12の中に破断点を有する。これらのプローブを伴って８kbのEcoRI 破断フラグメントが見い出せる。WS−211 欠失は〜75kbであり、そして破断点はCW９とCW15との間で末梢側に、及びCW23とCW21との間にある。WS−97の末梢破断点は BFS２とSM９との間、且つCW20内の基端部側にあり、約75kbの領域が欠失している。このWS−53欠失は〜35kbであり、そして末梢破断点はCW23内のJH１に対して基端部側にある。 TSC２の基端部の 0.6kbが欠失している。WS−53の基端部破断点の正確な位置はわかっていない。
【００３１】
図３において、推定タンパク質をDNA 配列の下に示し (SEQID No：２においても示す）、ここで翻訳は長いオープンリーディングフレームの最初のフレーム内のメチオニンにおいて始まると仮定している。網目状の灰色の棒線はGAP 関連ドメインを示す（アミノ酸1593−1631) 。二重下線は考えられる膜スパニング領域を示す。点線はアミノ酸81で始まる潜在性のロイシンジッパーを示す。ｒ ｒはアミノ酸76〜84及び99〜107 にある反復モチーフHAVE／LALW／LKAを示す。可能なＮ−連結グリコシル化部位（Ｑ）はアミノ酸1037,1205, 1499及び1628において表示している。cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼ (上向矢印）（Glass ３，1986），プロテインキナーゼＣ（右向矢印）（Woodgettら、1986）又はカゼインキナーゼス（下向矢印) (Pinna, 1990) により潜在的にリン酸化されるセリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）残基、並びに可能なチロシン（Ｙ）キナーゼリン酸化部位（＃）(Patschinskyら、1982）を示す。塩基5425及び5429（下線）にある２つの潜在的なポリアデニル化をシグナル並びにポリアデニル化切断部位を表示する（＾）。切断は表示の塩基のすぐ前後で起きる。
【００３２】
図４において、同一のアミノ酸を枠で囲った。星印は、ツベリンと少なくとも一種のGAP タンパク質とで共有されている同一の又は交換可能なアミノ酸を表示する。交換可能なアミノ酸はDayhoff らの基準を利用して同定した（1978) 。人類のツベリンmRNA配列についてのGenBank 受諾番号はＸ75621 である。
【００３３】
図５において、ゲノムプローブ（CW26, CW12, CW18）及びcDNAプローブ（Ｅ0.5,  Ｅ1.6,  Ｅ0.7,  Ｅ2.5)はベタ塗り棒により表し、そして遺伝子に影響を及ぼす５つの小さな欠失（網目状棒）の位置を示す。エクソンのEcoRI 部位と遺伝子の５′及び３′末端とを対角線によりゲノム地図に結んだ。
【００３４】
図６は以下のものを示す：
（ａ）クローンCW21（WS−９，WS−13, WS−97）及びJH１（WS−53）でプローブしたTSC 患者及びコントロール由来の Mlu１−消化DNA のPFGE。これは正常な個体（Ｎ）における〜120kb のフラグメント及びその患者における追加のより小さいフラグメントを検出する。CW21は患者WS−53において欠失しており、従って異常な〜90kbフラグメントを認識しない。WS−97欠失は末梢MluI部位を含む〜75kbを除去し、〜74kbのジャンクションフラグメントを生み出す（図２参照）。
【００３５】
（ｂ）欠失の末梢端（CW９及びCW15）にある、及び基部端（CW23及びCW21）にある破断点に隣接するプローブとハイブリダイズさせた正常コントロール（Ｎ）及びWS−211(211)のNruI−消化DNA のPFGE。正常の〜150kb フラグメントと同様に、同じ〜80kbの破断フラグメント（矢印で示す）が見い出され、欠失の外側に２つのマーカーがある（CW９及びCW21）。CW15は完全に欠失しており（破断フラグメントなし）、一方CW23はほとんどが欠失しており、ただし弱い〜80kbフラグメントがWS−211 トラックの中に見い出せうる。
（ｃ）慣用のゲル上で、分離させ、そして欠失に隣接するプローブ（CW９及びCW13）とハイブリダイズさせた正常コントロール（Ｎ）及びWS−13（13）由来の EcoRI−消化DNA(図２参照のこと）。同じ７kb破断フラグメント（矢印で示す）が両マーカーで見い出され、これらのプローブにより見い出せるEcoRI フラグメント内において終了する32kb欠失と一致する。
【００３６】
図７は以上のものを示す：
（ａ）症例5773及び1737におけるサザンブロット分析。患者（Ｐ）由来のHindIII −及び−BamHI −消化DNA 並びに無関係のコントロール（Ｎ）をcDNAプローブＥ0.7 とハイブリダイズさせた。このプローブは〜14kb及び2.5kb の隣接のHindIII フラグメント並びに〜14kbの単一BamHI フラグメントを検出する。症例5773において, BamHI フラグメント内の〜１kbの欠失はHindIII 部位を除去し、〜16kbのジャンクションフラグメントを生み出す。症例1737における〜４kbの欠失は〜10kbの新規のHindIII 及びBamHI フラグメントを生み出す。隣りのフラグメントは正常である。
【００３７】
（ｂ）症例WS−11におけるdenovo（新規）欠失のサザンブロット分析。患者（11）、父親（Ｆ）及び母親（Ｍ）由来のEcoRI 消化DNA をプローブＥ0.7,  CW12, Ｅ1.6 及びCW18とハイブリダイズさせた。Ｅ0.7 はWS−11及び両親における正常な18kbのフラグメント並びにWS−11のみにおける追加の17kbフラグメントを検出した。CW12はWS−11及び両親における正常な４kbフラグメント、並びにWS−11のみにおける追加の17kbのフラグメントを検出し、17kbのフラグメントＥ1.6 がジャクションフラグメントの形成において欠失するEcoRI 部位に広がっていることを示し、従って４kb及び18kbの双方の正常なフラグメント並びに17kbのジャンクションフラグメントを検出する。CW18は突然変異染色体上で欠失しており、従ってジャンクションフラグメントを検出できない。HindIII ジャンクションフラグメント及び新規の小さなBamHI フラグメントもサザン分析により見い出され、そして様々な数のタンデム反復形多現象を認識するプローブを生物学的血統を確認するために利用した（データは示さない）。
【００３８】
（ｃ）正常なコトロール（Ｎ）及び遺伝子ゲノム欠失を有するTSC 患者WS−11（11）由来の１ｇのリンパ球mRNAを含むノーザンブロットにハイブリダイズさせた TSC２ cDNA クローン２Ａ６（〔６号〕参照のこと）。正常のものより〜１kb小さい追加の転写体（矢印で示す）がWS−11において見い出せる。
【００３９】
図８は酵素MluI（Ｍ），ClaI（Ｃ），PvuL（Ｐ）及びNruI（Ｒ）についてのゲノム部位を示す。欠失をスクリーニングするために用いた単独のコピープローブ及びコスミドの位置を〜400kb のゲノムDNA を示している線分の下に示している。約45kbの TSC２遺伝子のゲノム分布及び PKD１遺伝子の既知の範囲を上に表示する。網目状の領域は〜50kbの領域を表わし、それは染色体16ｐ上のより基端部で二本鎖となっている。
図面の詳細な説明
TSC 候補領域における欠失
TSC 候補領域に及んでいる16Ｐ (wilkieら、1990) において構成欠失を有する ATR−16患者（Bo）（図１）をTSC 徴候について特別に再評価したが（臨床評価、腎起音波及び頭蓋CTイメージング）、ネガティブな結果が得られた。本発明はTSC 関連欠失についての研究を候補領域の一層基端部に焦点を当てることを決意した。その領域のほとんどは約340kb のClaI制限フラグメントに広がる(Germinoら、1992, Harrisら、1990）。パルス電場ゲル電気泳動（PFGE）を利用し、SM６を有する 255人の無関係のTSC 患者においてこのフラグメントを検定し、コスミドSMIIから単独のコピープローブを単離した（図１）。患者は全員Gomez により規定された具体的な診断基準（1988）に合格した。構成間隙欠失と一致する異常な小型のフラグメントが５症例において観察された。これらの変化はTSC 遺伝子に関与する傾向があるため、本発明者は欠失を含む更なる領域を特性決定することを決意した。
PFGE欠失及びゲノムクローニングの地図化
コスミド歩行を既に規定されている遺伝子座JCII及びＮ54から始めた(Germinoら、1990； Himmelbauerら、1991）。基端部方向の歩行はTSC 関連欠失の領域にわたって200kb 広がる一連の重複クローンを確立し、一方末梢方向の歩行は16ｐの一層基端側の配列に相同性の二本鎖領域により妨げられた(Germinoら、1992）。長いレンジの制限地図にゲノム及びクローニングしたDNA （それは Germinoら（1992）により作られたものとサイズにおいて一致するが、NruI及びMluIについての追加の部位が同定されている）において構築した。 SacII及びBssHI 部位の地図化はメチル化されていない CpG島の位置決めを可能にした（図２）。この領域をEcoRI 及びその他の制限酵素で正確に地図化し、そして数多くのフラグメントをサブクローニングした（詳細は図２及び実検手順）。
【００４０】
５つのTSC 欠失のサイズ及び位置は、MluIおよびNruI消化 DNAを分析することによりより一層正確に決定した。連続ハイブリダイゼーションは欠失破断点に隣接するか又はそれを含むフラグメントの同定を可能にする。適切な材料が入手できたら、欠失にすぐ隣接するプローブによりEcoRI, BamHI及び／又はHindIII 消化物における破断フラグメントを同定し、転移(rearrangement) の状態を確認した。TSC 欠失のそれぞれの正確な位置を図２にまとめた。32kb及び46kbにおいて推測される２つの欠失、並びに少なくとも70kbの２つは末梢側に位置し、そして互いと高度に重複していた。約35kbの５番目の欠失はより基端側に位置し、そして少なくとも３つの末梢端側の欠失と重複していなかった（図２）。これらの欠失はそれぞれ染色体16TSC 遺伝子の一部を含むようであるため、その全体に広がっている候補遺伝子を調べた。
パルス電場欠失を担持する領域における遺伝子
TSC 関連欠失の領域に広がるコスミドに由来するサブクローニングしたプローブ及びフラグメントを、ヒト胎児脳及びヒト腎臓cDNAライブラリーをスクリーニングするために用いた。標的領域に至る陽性クローンの地図化は誘導16染色体（この領域に隣接する破断点、即ち、末梢例のＮ−OH１および基端部側のＰ−MWH2A(図１）を有する）を含む体細胞ハイブリド及び陽性コントロールとしてのこの領域を含む放射線ハイブリドHy145.19のパネルに対するハイブリダイゼーションにより確認した。様々なヒト細胞系に由来するRNA を利用するノーザンブロット分析は、クローンが４種の明らかに無関係な遺伝子に由来することを示唆した。コスミド、ゲノム及びハイブリド DNAの消化物へのcDNAクローンのハイブリダイゼーションは遺伝子のゲノム分布を示す。配列分析は各遺伝子のポリＡテールを同定し、そしてその転写方向を確立した。
【００４１】
1.7kb の転写体（cDNAクローンOCTS２Ｃ及びRCTS２）を有するOCTS２と呼ぶ遺伝子及び１kb転写体（cDNAクローンOCTS3C）を有するOCTS３と呼ぶ第２遺伝子は４つの異なる欠失内全体に広がっていたが、しかし患者WS−53における基端部欠失までは及んでいなかった（図２）。15kbの転写体が２種のcDNAクローン３Ａ３及びAH４により認識され、そして３Ａ３と称する。これはWS−53欠失内に部分的に広がっていた。末梢クローンAH４がポリＡテールを含んでいるため、この遺伝子は動原体から末端小粒へと転写され、そして末端欠失に向って広がらない（図２）。
【００４２】
cDNAクローン２Ａ６及び4.9 は〜5.5kb の転写体を検出し、そしてコスミド ZDS５由来の18kbのEcoRI フラグメントを利用して同定した（CW23及びCW21においてサブクローニングした領域に対応) 。同じサイズの転写体がCW26、即ち４種の末梢欠失内に位置する CpG島に広がるゲノムにより検出される。従ってこの遺伝子を TSC２と命名し、そして詳細に特性決定した。
TSC２発現
ノーザンブロット分析は、 TSC２が、脳、腎臓、皮膚、肝臓、副腎、結腸及び白血球に由来する細胞系を含む試験した全ての細胞系において見い出される5.5kb の転写体と共に幅広く発現されることを示唆した。発現は、肝臓、腎臓及び心臓を含む試験した全ての組織、並びにリンパ球、繊維芽細胞及び胆管表皮細胞においても見い出せた。繊維芽細胞における TSC２発現の高レベルは、正常コントロール及びTSC 患者由来の繊維芽細胞における転写レベルの対比を可能にする。TSC が染色体16ｐ13.3マーカーと一緒に分離するが、突然変異が同定されなかった一の家族において、冒されている者は明確に低下したレベルの TSC２転写体を示した。隣接遺伝子由来の転写体不変の発現レベルを示した。
【００４３】
TSC 患者における TSC２に影響を及ぼす非重複PGFE欠失と TSC２転写体の低下発現との組合せは、この欠失が、遠隔遺伝子にとっての調節因子ではなく、構成TSC 決定遺伝子を不活化することを強く示唆した。 TSC２が実際にTSC 決定遺伝子であるかを確証するため、我々は  立の遺伝子内突然変異を調べた。
TSC２に影響を及ぼす遺伝子内突然変異
260人の無関係のTSC 患者由来のDNA 試料を、ハイブリダイゼーションプローブとしてcDNAサブクローンを用い、 TSC２内の確証的な転移（Confirmatory rearrangements)についてのスクリーニングした。試験した患者全員がGomez(1988）の具体的な診断基準に合格し、そしてPFGEにより予め研究されたものの多くを含んでいた。PFGE異常が発見された症例の他に、更に５人の患者において多重制限酵素により異常なバンドが認められた。ゲノムクローンとハブリダイゼーションプローブとしての小さなcDNAフラグメントの組合せを利用するサザン分析は、これらの変化が小さな欠失を示していることを実証した。各欠失セグメントの位置を EcoRI, HindIII 及びBamHI 部位のゲノム地図に相対させて確認した（図５）。患者WS−210において発見された最も５′例の欠失は全体が遺伝子内になく、なぜならそれはOCTS３遺伝子も含んでいたからである。欠失は５〜６kb広がり、そして TSC２コード配列を含むゲノムプローブCW26を除去する。４種のその他の欠失は全て TSC２内に全体的に入っていることが見い出された。患者5773における約１kbの欠失はイントロンのHindIII 部位を除去することが示された。この場合、突然変異は冒された両親においても検出された。更なる２つの症例 (WS−80及び1737）においては、それぞれ約３kb及び５kbの欠失が同定された。これらの症例の両親は冒されてはいないと考えられたが、分析にかけることができず、その変化がde nove 突然変異を示していることを確認することができなかった。一方、患者WS−11の共に臨床学的に冒されていない両親は分析にかけることができ、そして〜５kbの欠失（これはPFGE上では発現されなかった) がde nove 突然変異を示すことを示した。この欠失はイントロンのHindIII 部位及び上流イントロンのEcoRI 部位を除去した。これらの部位にわたって広がり、且つ TSC２転写体を検出するゲノムプローブCW18は欠失しているものと示された。この患者から調製した白血球ポリＡRNA はノーザン分析で〜4.5kb の異常な TSC２転写体を示した。これらの発見は TSC２が染色体16の結節硬化症決定遺伝子であることを確認した。
TSC２に関与する更なる欠失
TSC が乳児性多嚢胞腎臓病に関連している６人の患者における TSC２及び PKD１の双方に関与する欠失を同定し、そして特性決定した。WS−53における欠失と同様に、WS−215 及びWS−250 におけるものは、 PKD１の既知の分布を基端部側ではるかに超えて広がり、そしておそらくは全遺伝子を欠失させていた。WS−194 における欠失は既知の PKD１の範囲よりも広く広がっていたが、しかし基端部側ではそれほどでなく、一方WS−219 及びWS-227における基端部側の破断点は PKD１自体の中にあった。欠失の外側に広がるプローグJH８による症例WS−219 のノーザン分析は低下したレベルの PKD１転写体を示したが、しかし異常なサイズの転写体の証拠はなかった（データーは示さない）。患者WS−53, WS−215,  WS−219,  WS−227 及びWS−250 の臨床的に冒された両親由来の試料の分析は、これらの患者における欠失がde novo であることを示した。WS−194の父親は試験できなかった。
【００４４】
更なる症例 (WS−212)において、腎臓超音波は４年の年齢において嚢胞を示さなかったが、しかし全 TSC２遺伝子を除去し、そして PKD１のポリアデニル化シグナルに対して42bp  ５′側に位置するXbal部位を欠失させる欠失が同定された。
TSC２の特性決定
TSC２遺伝子を更に特性決定するため、進化保存を研究し、そして配列分析を行った。様々な動物種に由来するゲノムDNA を含む「動物園（200)−ブロット」は、 TSC２遺伝子が高等脊椎動物全体で保存されていることを示した。霊長類から強力なシグナル得られ、そして低度の相同性を示すシグナルがげっ歯類、有袋類及びは虫類を含むいく種かのその他の脊椎動物から得られた。魚類又は無脊椎動物種からのシグナルは得られなかった。 TSC２転写体を両鎖において完璧に配列決定した。配列は全て少なくとも２つの独立cDNAクローンにおいて確認した。得られるコード配列は5474bp広がっていた（図６）。反復cDNAライブラリー再スクリーニングにかかわらず、５′を更に超えるクローンは同定できなかった。有効な配列はノーザンブロット分析により決定される転写体サイズに似ていた。cDNAはフクレオチド１から5370に至るオープンリーディングフレーム（ORF)を含む。２番目に優れた ORFは 402bp以下であった。ヌクレオチド位置19において、我々はKozak 説に適合するフレーム内開始コドンを発見した（Kozak, 1987)。３′末端において、我々はヌクレオチド5425にて２つの部分的に重複したポリアデニル化シグナル（AATAAATAAA）を認識した。このタブレットの発生は異なり合うポリアデニル化を生じせしめうることがあり、なぜなら我々は４種のcDNAクローンの中に15bpまで異なるポリアデニル化部位を発見したからである。推定タンパク質の全長は1784個のアミノ酸であり、計算した分子量は 198kdである。見かけ上のシグナルペプチド又はシグナルペプダーゼ切断部位はなかった。Eisen bergら(1984)により述べられてる方法を利用し、我々は疎水性ドメインを同定し、その４つは膜スパニング領域を示しうる。推定α−ヘリックス構造において、９個のアミノ酸の反復モチーフにより囲まれた22個のアミノ酸の鎖がロイシンジッパー説に合致した（Landschulzら、1988）。タンパク質レベルでの配列相同性の研究は、 TSC２の推定生成物とGTPase活性化タンパク質 GAP３（又はrap1GAP)との類似領域を示した(Rubinfeldら、1991）。この領域は58個のアミノ酸以上に広がり、そして残基同一性レベルはSander and Schneider (1991）の構造相同性についての基準を合格していた。最初の39個のアミノ酸のうち、14個がネズミGAP 及びヒトGAP と同一であった。17残基のコア鎖は同一又は類似のアミノ酸を含み、１個の誤対合のみあった（図４）。
考察
本発明者は結節硬化症において突然変異した染色体16上の遺伝子を同定するのに位置クローニング手法を利用した。TSC の生物学的及びその他の疾病とのその関係を考慮したいくつかの問題が解決できる。 TSC２遺伝子は、Germino ら（1992) により決定された常染色体優性多嚢胞腎臓病１型(ADPKD１）を引き起こす未同定の PKD１遺伝子についての候補領域内に広がる。多嚢胞腎臓はTSC 及び ADPKD１に共通の特徴であるため(Bernstein and Robbins, 1991）、Kandt ら (1992）により提唱されている病因リンクの可能性を考慮せねばならない。しかしながら、腎性嚢胞症が染色体９−関連TSC 家系において報告され(Nellistら、1993）、それ故その存在は染色体16関連TSC に限定されない。更に、TSC 及び ADPKD１嚢胞は巨視的に似ているが、上皮皮膜TSC 関連嚢胞は通常組織学的に異なると考えられている(Bernsteinら、1974）。これらの観察にもかかわらず、TSC 及び ADPKD１の染色体16関連形態はアレル変更であるとの仮設をたてることができうる。しかしながら、本発明者はこれが本当であるとの証拠を何ら発見していない。本発明者がツベリンと呼んでいる推定タンパク質の配列における可能な機能性モチーフについての研究は注目のいくつかの領域を示唆する。膜定着に関与しうる４つの疎水性ドメイン及び４つ潜在的なグリコシル化部位が最後の推定トランスメンブランドメインの下流に観察された。推定アミノ酸のアミノ末端にあるどの配列もvon Heijneにより規定されたシグナルペプチド構造と一致しなかった。しかしながら、見かけ上のシグナルペプチドのないいくつかのトランスメンブランドメインの存在が、嚢胞繊維芽症関連タンパク質CFTRにおいて認められた(Riordanら、1989) 。我々はまたタンパク質間相互作用に関連する構造であるロインシン残基の周期配列（ロイシンジッパー）を見い出した。同定された配列モチーフの機能的な有意性に至る識見を担うであろうツベリンの細胞局在を決定する実験を進めた。高度に多様性であるTSC 表現型を理由に、患者の近親者の遺伝状態はかなり診断的研究を経た後でさえも不明のままでありうる。（Al−Gazaliら、1989；Fryeo ３，1990）。この状況において、原因的な突然変異の同定は非常に有用であろう。この研究においては比較的少ない数の突然変異しか報告していないが、 TSC２遺伝子配列がわかっている今ではその他の手法、例えばSSCP分析(Oritaら、1989）を適用することができうる。染色体９上の TSC１遺伝子の同定も、TSC における完全な突然変異スペクトル及びDNA ベース診断の実用性が評価される前に達成できる。本発明者は無関係なTSC 患者においてTSC ２遺伝子の異なる部分に影響を及ぼす多数の欠失突然変異を同定した。冒された個体におけるこのパターン及び見い出せる TSC２の  められた発現性は、TSC における構成突然変異が不活化である傾向にあることを示唆する。TSC 関連損傷の斑状病巣の性質及びそれらが示すヘテロ接合能の損失(Green and Yatcs, 1993）はホモ接合のない状態への低下が、細胞増殖の前及び分化が無秩序となる前に必要であることを示唆する。不活化構成及び体細胞突然変異の組合せが網膜芽腫におけるRb遺伝子において (Horowitzら、1989）、そしてより近年、神経繊維肉腫において（Legiusら、1993）明確に示された；それはNF２(Rouleauら、1993）及びVHL (Latifら、1993）においても提唱されている。��って、 TSC２はKnudson の発癌理論(Knudson, 1971）により規定の腫瘍抑制遺伝子としてもふるまうようであろう。これらの所見の見地において、ツベリンが、ｐ21ras と拮抗すると考えられているGTP 結合性タンパク質であるｐ21rap1のGTPase活性を強める GAP３に対して相同性の領域を含むということは興味深い。この相同性領域は GAP３の触媒活性に必要であることで知られている領域内にある(Rubinfeldら、1992）。ツベリンはｐ21rap1、又は細胞の増殖を及び分化のコントロールに関与するその他のGAP タンパク質についてのGAP 活性を有しうる可能性がある。NF１において似たような状況が既に実証されており、それではｐ21rasの正常な調節がrasGAP相同性ニューロフィブロミンに影響を及ぼす突然変異により破綻される (Xuら、1990及びMartinら、1990）。様々な母斑症に関与するタンパク質が同定されるに従い、その機能及び考えられる相互関係が確立されるであろう。
実験手順
パルス電場電気泳動
高分子量DNA を標準の方法(Hermannら、1987) によりマガロースプラグ中で末梢血液から単離し、そして製造者の推奨に従って消化した。ブロックを１％のアガロースゲルのウェルに載せ、そしてBioRad CHEF DRII又は類似の装置及び必要な様々な解像度に適するプログラムを用いて電気泳動を行った。
サガンブロット分析
ゲノムDNA を標準の方法により末梢血液から抽出した。５〜８μｇのDNA を制限酵素で消化し、アガロースゲルで電気泳動し、そして記載の通りにしてナイロンフィルターにブロッティングした (Sambrook３，1989）。プローブをランダム・プライマー法（Feinbergand Vogelstein, 1984）によりラベル化した。反復要素を含むプローブについては、10ngのラベル化DNA を、ハイブリダイゼーションの１〜５hr前に 650Ｃで全容量 200μｌにおいて 0.1〜１mgの変性音波処理全ヒトDNA と予め結合させた。必要な、フィルターを更に 100μｇ／mlの変圧音波処理全ヒトDNA 及びサケ精子DNA とプレハイブリダイズした。フィルターをハイブリダイズし、記載の通りに洗い (Sambrookら、1989）、そして−70℃で塩酸スクリーンを用いてオートラジオグラフィーフィルムに暴露した。
DNA プローブ及び体細胞ハイブリド
この試験において用いたいくつかのプローブは既に述べられている：MS205.2(Ｄ16Ｓ309 ，Royle ら、1992）； GGG１（Ｄ16Ｓ259；Germino ら、1990）；16AC2.5(Ｄ16Ｓ291 ；Thompsonら、1992）及びＮ54（Ｄ16Ｓ139 ；Himmelbauer ら、1991）。いくつかの新しいプローブもこの試験中に単離された：SM６, SMII由来の2.3kb の Sau３Ａフラグメント； BFS２, CC１−２の1.8kb のBssHIIフラグメント；SMa,  CBFS１の７kbのRcoRI フラグメント；CW９，CBFS１の１kbの EcoRI／NotIセグメント；CW15, CW９Ｄの10kdのEcoRI ／NotIフラグメント；CW24及びCW26はCW９Ｄのそれぞれの0.9kb 及び0.4kb の SacII及び SacII／ SacＩフラグメントである；CW13及びCW12はCW９Ｄ由来のそれぞれ2.2kb 及び2.0kb のEcoRI ／NotIフラグメントである；CW18M, CW20 はCW12I 由来のそれぞれ３kb及び16kbの EcoRI／NotIフラグメントである；JH１はCW12I の4.4kb のBamHI フラグメントである；そしてCW23及びCW21はそれぞれJHIKの14kb及び3.5kb のNotI／EcoRI フラグメントである。SM６， BFS２,CW26及びCW21を除く新しいプローブは全て反復配列を含み、そして変性音波処理ヒトDNA(75mg／ml) とハイブリダイズさせ、そして0.05×SSC, 0.2％のSDS の中で65℃で洗った。
【００４５】
体細胞ハイブリドＮ−OH１及び放射線ハイブリドHy145.19を既に述べられている(Germinuら、1990；Himmelbauer ら、1991）。Ｐ−MWH2A ハイブリドは誘導染色体16qter−16ｐ13.3：：７ｑ32−７qterを含み、そしてバランスのとれた転座を有する対象者MWから単離された。Ｐ−MWH2A は、Deisseroth and Hendrick(1979) の方法によりMW由来のリンパ芽球細胞をAPRT欠失マウス赤白血病と融合することにより作った。このハイブリドにおける破断点は16AC2.5 と隣りのClaI部位の間の領域に位置した（図１参照のこと）。
RNA 単離及びノーザンブロット分析
RNA をChomczynski and Sacchi (1987) の酸フェノール法により細胞系及び組織から抽出した。mRNAをビオチニル化オリゴ（dT) プライマー及びストレプトアビジン複合型強磁性粒子(PolyATtract mRNA lsolatim System, Promega）を用い全RNA から単離した。RNAを変性ホルムアルデヒドゲルの中で分け、そして標準の手順によりノーザンブロッティングした。ノーザンブロットのハイブリダイゼーション及び洗浄はサザンについて記載の通りとした。
コスミド歩行
コスミドはいく種かのライブラリーから得た。Los Alamos染色体16特異性ライブラリー(Stallingsら、1990) 並びに全ゲノムコスミドライブラリー412 及びIG328(Integrated Genetics)及び961200(Stratagene)。連続コスミド歩行は各コスミドを地図化し、末端のクローンを単離し、そして必要なら反復配列を抑制する条件を利用してライブラリーを再ハイブリダイズさせることにより行った。コスミド／ゲノムEcoRI 地図を作り、そしてコスミドの位置をハイブリドパネル上での地図化、PFGE及びin situ ハイブリダイゼーションでの蛍光によりチェックした。
cDNA単離及び特性決定
cDNAについてのスクリーニングは標準のファージプレーティング、フィルターリフト及びクローン精製技術を利用して、ヒト胎児脳(Clonetech, Stratagene) 及びヒト成人腎臓(Clonetech) 由来の市販のライブラリーで実施した。反復配列は上記の通りに抑制させた。 650℃で一夜のハイブリダイゼーションの後、フィルターを記載の通りに洗った(Sambrook, 1989)。陽性クローン全てをpBluescript 又はpUC ベクターのいづれかにサブクローニングし、そしてPharmacia A.L.F.又はABI モデル 373Ａ自動シーケンサーによりその製造者のプロトコールに従って、又はマニュアルで配列決定した。
【００４６】
【表１】
0003704145.tif 000002
【００４７】
【表２】
0003704145.tif 000003
【００４８】
【表３】
0003704145.tif 000004
【００４９】
【表４】
0003704145.tif 000005
【００５０】
【表５】
0003704145.tif 000006
【００５１】
【表６】
0003704145.tif 000007
【００５２】
【表７】
0003704145.tif 000008
【００５３】
【表８】
0003704145.tif 000009
【００５４】
【表９】
0003704145.tif 000010
【００５５】
【表１０】
0003704145.tif 000011
【００５６】
【表１１】
0003704145.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】染色体16pterの物理地図である；
【図２】染色体16のTSC 領域の詳細な地図である；
【図３Ａ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｂ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｃ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｄ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｅ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｆ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｇ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｈ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｉ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｊ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｋ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｌ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｍ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｎ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｏ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｐ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｑ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｒ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｓ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図３Ｔ】TSC２遺伝子のヌクレオチド配列（cDNA) であり、そしてその推定タンパク質も示す（SEQ ID No : １) ；
【図４】ツベリンの推定タンパク質配列（アミノ酸1539−1631）と、ヒト GAP３及びネズミGAP のアミノ末端ドメインとの相同性を示し；そして
【図５】TSC２のゲノム分布を示す制限地図である；
【図６ａ】TSC 個体における欠失のPFGE分析の結果である。
【図６ｂ】TSC 個体における欠失のPFGE分析の結果である。
【図６ｃ】TSC 個体における欠失のPFGE分析の結果である。
【図７ａ】ａ〜ｃは図５の制限地図において示す TSC２に影響を及ぼす５つの小さな欠失の分析の結果である。
【図７ｂ】ａ〜ｃは図５の制限地図において示す TSC２に影響を及ぼす５つの小さな欠失の分析の結果である。
【図７ｃ】ａ〜ｃは図５の制限地図において示す TSC２に影響を及ぼす５つの小さな欠失の分析の結果である。
【図８】染色体16の TSC２及び PKD１領域の地図である。
【図１】
0003704145.tif 000019
【図２】
0003704145.tif 000020
【図３Ａ】
0003704145.tif 000021
【図３Ｂ】
0003704145.tif 000022
【図３Ｃ】
0003704145.tif 000023
【図３Ｄ】
0003704145.tif 000024
【図３Ｅ】
0003704145.tif 000025
【図３Ｆ】
0003704145.tif 000026
【図３Ｇ】
0003704145.tif 000027
【図３Ｈ】
0003704145.tif 000028
【図３Ｉ】
0003704145.tif 000029
【図３Ｊ】
0003704145.tif 000030
【図３Ｋ】
0003704145.tif 000031
【図３Ｌ】
0003704145.tif 000032
【図３Ｍ】
0003704145.tif 000033
【図３Ｎ】
0003704145.tif 000034
【図３Ｏ】
0003704145.tif 000035
【図３Ｐ】
0003704145.tif 000036
【図３Ｑ】
0003704145.tif 000037
【図３Ｒ】
0003704145.tif 000038
【図３Ｓ】
0003704145.tif 000039
【図３Ｔ】
0003704145.tif 000040
【図４】
0003704145.tif 000041
【図５】
0003704145.tif 000042
【図６ａ】
0003704145.tif 000043
【図６ｂ】
0003704145.tif 000044
【図６ｃ】
0003704145.tif 000045
【図７ａ】
0003704145.tif 000046
【図７ｂ】
0003704145.tif 000047
【図７ｃ】
0003704145.tif 000048
【図８】
0003704145.tif 000049