(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）  配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）  配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
（ｃ）    配列表の配列番号１の７６位から５２５位の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）    配列表の配列番号１の７６位から５２５位の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）  配列表の配列番号２で示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）  配列表の配列番号２で示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含む組換え体分子。
【請求項５】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む組換え体細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え体細胞を培養し、その培養物から豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を採取することを特徴とする、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を産生する方法。
【請求項８】
請求項３に記載の豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を認識する抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体である請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項３に記載の豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を含む、回虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、寄生虫の感染防御に関わる蛋白質、それをコードするＤＮＡ及びそれらの使用に関する。具体的には、Ａｓｃａｒｉｓ及びＴｏｚｏｃａｒａ属を含むＡｓｃａｒｉｄ線虫の感染防御抗原蛋白質、該感染防御蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する組換え体細胞、寄生虫の感染防御抗原に対する抗体及び寄生虫の感染を防御するワクチンに関する。本発明により、Ａｓｃａｒｉｓ及びＴｏｘｏｃａｒａ属の回虫感染防御を目的とした化合物の合成、あるいは人および動物における回虫感染から守るためのワクチン開発や治療薬の開発に応用できる。
【０００２】
【従来の技術】
人類や家畜生産に甚大な被害をもたらしてきた感染症は、ワクチンの普及によってその多くは制圧されてきた。しかし、ワクチンが開発途上にある寄生虫感染症は、依然として世界各地に分布している。とりわけ、熱帯・亜熱帯地域では寄生虫の蔓延に加え衛生状態の不備から寄生虫による人への健康被害、家畜生産への被害は莫大な額にのぼる。また、先進諸国でも最近は寄生虫による新興、再興の人畜共通感染の脅威が大きな社会問題になりつつある。寄生虫病防除の中心は化学療法剤などの薬剤利用に深く依存している。しかしながら、薬剤の連続使用によるいわゆる薬剤耐性がいずれの薬剤に対しても確立され、殺虫効果の消失するものも少なくない。さらに、薬剤の使用には常に人あるいは動物への副作用を考えなくてはならず、同時に、食と環境の安全性を脅かす薬物残留問題があり、消費者から敬遠される傾向にある。そのうえ、薬剤の使用には有効性や適用範囲に加えて、膨大な開発コストの面からも限界が生じつつあり、２１世紀における寄生虫による人および家畜生産の被害を薬剤使用によって防ぐことは非常に難しい状況にある。
【０００３】
人や家畜、愛玩動物の小腸に寄生する回虫（ＡｓｃａｒｉｓやＴｏｘｏｃａｒａ属）は、熱帯・亜熱帯地域に限らず先進諸国を含め世界的に分布する寄生虫である。一般に、寄生線虫は固有宿主が限定されているが、回虫に関しては本来の固有宿主ではない非固有宿主への感染が顕著に見られる寄生虫である。そのため、豚を固有宿主とする豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）  や犬回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ）の人への感染例が多数報告され、人畜共通感染症としても重要視されている（松山ら，  日本呼吸器学会誌  ３６：２０８−２１２（１９９８），Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３４７：１７６６−１７６７  （１９９６））。また、マウス等の実験動物でも感染が成立し、豚の代替宿主として豚回虫−マウス感染系は広く免疫学的試験等に利用されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８０：  ２１９−２２４．  （１９９０））。
【０００４】
寄生虫感染でもウイルスや細菌感染症に見られるような宿主の再感染防御能の獲得が知られており、古くから実験室段階で実証されている  （Ｍａｉｚｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １７１：１２５−１４７．  （１９９９））  。こうした背景から寄生虫ワクチンとして実用化に至った寄生虫はＰｏｙｎｔｅｒによって開発された牛肺虫である（Ｐｏｙｎｔｅｒ，  Ｄ．，  Ａｄｖ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，  １：１７９−２１２．（１９６３））。しかし、感染幼虫を放射線照射によって製造された寄生虫ワクチンには常に人為感染の副作用があり、また、生ワクチンであるため投与の煩雑さで敬遠されるに至った。豚回虫感染においても、虫体抽出物あるいは放射線照射した感染ステージである第３期幼虫（Ｌ３）で防御免疫が誘導されることは、豚、ウサギ、マウスで明らかにされている（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｅｔ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  １７：  ３１９−３２６．  （１９８５），    Ｓｔａｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ３６：２４５−２５７（１９９０））。なかでも、豚回虫幼虫ステージの抽出抗原や表層抗原を免疫した動物では、顕著な感染阻止が認められことから、幼虫抗原には防御免疫を誘導する分子が含まれていることが示唆されてきている（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ４２：１６１−１６９  （１９９４））。
【０００５】
遺伝子組換え技術は、他の感染症と同様に寄生虫ワクチン開発に向け有効な手段となっている。現在、各国で感染防御抗原あるいは寄生虫に特有な変態関連酵素等をコードする遺伝子クローニングが精力的に進められ、安全なワクチン蛋白質の製造が試みられてきている（Ｂｌａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １６：５−６．  （２０００））  。しかし、ワクチン候補分子を製造しても、感染の成立する宿主が限定されてしまうため、マウス等の実験小動物を用いた有効性評価が難しく、組換え技術によって製造された寄生虫感染を防ぐいわゆる感染防御抗原の評価が大きな障害となり、現状では単一分子あるいは複数の分子を組み合わせた組換え抗原によるワクチンの実用化に至っていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、寄生虫の駆除及び寄生虫感染から家畜及び人を守るための化合物の合成を提供し、様々な人畜共通の寄生虫感染症の防除法を提供するものである。具体的には、Ａｓｃａｒｉｓ及びＴｏｚｏｃａｒａ属回虫の感染防御抗原蛋白質、該感染防御抗原蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する組換え体細胞、寄生虫の感染防御抗原に対する抗体及び寄生虫の感染を防御するワクチンを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、豚回虫感染幼虫から、新規な１６ｋＤａの抗原をコードするＤＮＡを単離し、該ＤＮＡがコードする抗原がマウスにおいて回虫感染を防御することを見出し、該抗原が回虫感染防御抗原であることを突き止め本発明を完成するに至った。本発明は寄生虫における感染防御抗原をコードする遺伝子（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍＬ２Ｒ３７遺伝子）、該感染防御抗原蛋白質及び該感染防御抗原蛋白質コード領域を蛋白質発現ベクターに挿入し、精製した組換え感染防御抗原蛋白質の作製に関連する。また、本発明は感染防御抗原に対する抗体、及び抗体の作製方法に関連する。さらに、本発明は該感染防御蛋白質をワクチンとして用いた、回虫感染防御能の誘導に関連する。
【０００８】
即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）  以下の（ａ）又は（ｂ）に示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）  配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）  配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
（２）  以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
（ｃ）    配列表の配列番号１の７６位から５２５位の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）    配列表の配列番号１の７６位から５２５位の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（３）  以下の（ａ）又は（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）  配列表の配列番号２で示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質のアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｂ）  配列表の配列番号２で示す豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質。
（４）  （１）または（２）のＤＮＡを含む組換え体分子。
（５）  （１）または（２）のＤＮＡを含むベクター。
（６）  （５）のベクターを含む組換え体細胞。
（７）  （６）の組換え体細胞を培養し、その培養物から豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を採取することを特徴とする、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を産生する方法。
（８）  （３）の豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を認識する抗体。
（９）  モノクローナル抗体である（８）の抗体。
（１０）  （３）の豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質を含む、回虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチン。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明におけるｃＤＮＡライブラリーの作製、遺伝子のクローニング、スクリーニングおよび塩基配列の決定等の分子生物学、寄生虫学、免疫学並びに生化学的な技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８９）：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｃ（１９８８）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；獣医臨床寄生虫学編集委員会編（１９９８）、獣医臨床寄生虫学、文英堂、等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って行えばよい。また、ＤＮＡ解析は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）（コダック社）およびＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェアー開発社）等のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００１１】
本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列を有する豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードする総てのＤＮＡを含む。また、配列表の配列番号２で示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質をコードする総てのＤＮＡも含む。ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質とは、下に記載のとおりである。
【００１２】
さらに、本発明のＤＮＡは、配列番号１の７６位から５２５位までの塩基配列からなるＤＮＡ（豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードするＤＮＡ、すなわちＡｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍＬ２Ｒ３７遺伝子）または配列番号１に示す全塩基配列からなるＤＮＡを含む。さらに、これらのＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる総てのＤＮＡも含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードするＤＮＡ配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
【００１３】
また、本発明の蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するもの又は、その類似蛋白質すなわち配列番号２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同等の性質を有し、アミノ酸配列中、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものであり、豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の相同性を有するのが望ましい。ここで、実質的に同質の性質とは、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質の生物学的活性を有することを意味し、生物学的活性を有するとは豚回虫感染防御能を有することを意味する。
【００１４】
本発明の豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードするｃＤＮＡは、以下のような方法で得ることができる。
【００１５】
Ａｓｃａｒｉｓ属またはＴｏｘｏｃａｒａ属回虫の成虫は、回虫感染豚より得ることができる。成虫から未成熟卵を得て、Ｄｏｕｖｒｅｓ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎ，  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，  ６９：５４９−５５８  （１９８３）らの方法によって感染ステージである第３期幼虫（Ｌ３）を含む成熟卵に発育させ、ｃＤＮＡのライブラリーの作成のために供することができる。
【００１６】
回虫Ｌ３より、通常行われる方法または市販のｍＲＮＡ単離キットを用いて、ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ）を精製する。例えば、回虫Ｌ３を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂ等を担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、又はバッチ法によりｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを得ることができる。
【００１７】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡを合成し、適当なベクターに組み込んで、該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法でベクターに組込むことができる。例えば、得られたｃＤＮＡを、適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法などがある。この際、後述のベクター、宿主細胞を用いてｃＤＮＡライブラリーを得ることが出来る。
【００１８】
このようにして得られたクローン化ＤＮＡライブラリーから、目的のＤＮＡを選択する。選択方法として、イムノスクリーニング法、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等の方法を用いることができる。例えば、得られたクローン群を、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質により蛋白質を発現させ、これをナイロン膜若しくはセルロース膜に転写し、目的蛋白質に対する抗体または該抗体を含む血清を用いて免疫学的に対応するクローンを選択することができる。
このようにして調製したクローンから目的ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１９】
塩基配列の決定は、例えば、マキサム・ギルバート法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．  ａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ，  Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７４，５６０，１９７７）又はジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９，３０９，１９８１）等により行うことができる。これらの原理を応用した塩基配列自動解析装置を用いて配列を決定することもできる。
【００２０】
得られた目的ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の遺伝子増幅法により増幅することができる。ＰＣＲは、例えば、蛋白質核酸酵素「ＰＣＲ法最前線―基礎技術から応用まで―」第４巻、第５号、１９９６年４月号増刊、共立出版に記載されている技術により行うことができる。目的のＤＮＡをクローン化又は増幅した後、目的ＤＮＡを回収し、これを入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、さらに適当な宿主細胞に形質転換し、適当な培地中で培養、発現させ、目的蛋白質を回収、精製することができる。
【００２１】
この際のベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモータを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００２２】
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば細菌性のものではｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等がある。
【００２３】
複製開始点として、大腸菌ベクターに対して、例えばＣｏｌｉＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母ベクターに対して、例えば２μｍＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものを用いることができる。また、プロモーターとしてアデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター等を用いることができる。
【００２４】
選択マーカーとして、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等を、哺乳類細胞には、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を挙げることができる。
【００２５】
ＤＮＡのベクターへの導入は、任意の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にＤＮＡを挿入することができる。本発明のＤＮＡおよび調節配列を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に本発明の豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原を発現、産生させることができる。
【００２６】
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等が挙げられる。
【００２７】
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポーレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００２８】
得られたリコンビナント蛋白質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がＧＳＴ等との融合蛋白質として発現される場合は、目的蛋白質と融合している蛋白質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグとの融合蛋白質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有する蛋白質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる、またＧＳＴとの融合蛋白質として発現させた場合、ＧＳＴはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。
【００２９】
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原に対する抗体は、以下のようにして調製することができる。
【００３０】
該１６ｋＤａ抗原を抗原として、当業者に良く知られた方法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ、ヤギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し、十分に免疫した後、動物から採血し、血清分離し、抗回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原抗体を作製することができる。この際、適当なアジュバントを使用することもできる。モノクローナル抗体も公知の方法により作製し得る。例えば、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原で免疫したマウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマの培養上清又は該ハイブリドーマを腹腔内に投与したマウスの腹水から調製することができる。免疫抗原として用いる豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原は、豚回虫から抽出した天然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメントや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。ペプチドフラグメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でも良い。融合蛋白質は、配列番号１に示す塩基配列の一部を他の蛋白質をコードする遺伝子と連結させて、発現ベクターに組み込んで発現させて製造することもできるし、ポリペプチドフラグメントを適当なキャリア蛋白質と化学結合により結合させた上で使用することもできる。得られた抗体の反応性は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロッティング等の当業者によく知られた方法により測定することができる。
【００３１】
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原を、回虫感染防止のためのワクチンとして用いることができる。
ワクチンとして用いる豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質は、豚回虫から抽出した天然蛋白質、組換え蛋白質でもよいし、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも良いし、該蛋白質の部分構造を有するペプチドフラグメントや他の蛋白質との融合蛋白質でも良い。フラグメントの場合、フラグメントが回虫の感染を防御する抗体（中和抗体）が認識するエピトープ（中和エピトープ）を含んでいることが必要である。ペプチドフラグメントは該蛋白質を適当な蛋白質分解酵素で分解した断片も用い得るし、配列番号１に示す塩基配列の一部を発現ベクターに組み込んで発現させた産物でも良い。
【００３２】
ワクチンは、１種又は数種のアジュバント、例えばフロイントの完全若しくは不完全アジュバント、コレラトキシン、易熱性大腸菌毒素、水酸化アルミニウム、カリウムミョウバン、サポニン若しくはその誘導体、ムラミルジペプチド、鉱物油または植物油、ＮＡＧＯ、ノバソームまたは非イオン性ブロック共重合体、ＤＥＡＥデキストラン等を含むことができる。また、医薬上許容される担体を含んでいてもよい。医薬上許容される担体は、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を及ぼさない（すなわち、少なくとも、該動物にワクチン接種しない場合に病気により認められる影響より著しい悪影響を及ぼさない）化合物であると理解される。医薬上許容される担体は、例えば、無菌水または無菌生理塩溶液であることが可能である。より複雑な形態の場合には、該担体は例えばバッファーであることが可能である。
【００３３】
本発明のワクチンは、通常の能動免疫法で投与することができ、注射により投与する全身性ワクチンでも、注射によらず経口投与等により投与する粘膜誘導型ワクチンでもあり得る。すなわち、予防的に有効な量（すなわち、回虫による攻撃に対して動物において免疫を誘導する抗原を発現しうる免疫化抗原）にて、剤形に適合した方法による単回または反復投与により投与することができる。ワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的または鼻腔内に投与することができる。また、本発明のワクチンは、同じおよび／または他の寄生虫の他の抗原成分と有効に混合することが可能である。
【００３４】
ワクチンの投与量、投与回数は対象動物により変わり得るが、例えば本発明の豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ抗原を数十μｇ含むワクチンを１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することにより動物に防御免疫を誘導し得る。
【００３５】
さらに、本発明は分離した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原に対するインヒビターに関する。分離した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質に対するインヒビターに関する言葉は、天然物あるいは核酸技術もしくは化学合成から得られたものも含まれる。
【００３６】
また、本発明は、それら蛋白質、核酸、抗体、動物の治療を目的とした治療的化合物としてのインヒビター等、ならびにその応用も含まれる。
本発明の豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質及び核酸は、寄生虫ワクチンあるいは抗寄生虫剤の新規ターゲットに利用することもできる。
【００３７】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
実施例１  本発明における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原塩基配列の分離及び決定
豚回虫Ａ．  ｓｕｕｍ  の成虫は、茨城県食肉処理場下妻支所にてＡ．  ｓｕｕｍ感染豚より採取した。成虫から得た未成熟卵はＤｏｕｖｒｅｓ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎ，  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，  ６９：５４９−５５８．  （１９８３）らの方法によって感染ステージのＬ３を含む成熟卵に発育させ、以下の操作に供した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原をコードする遺伝子は、イムノスクリーニングによるＡ．  ｓｕｕｍ  Ｌ３  ｃＤＮＡライブラリーから単離した。使用したｃＤＮＡライブラリーは、λＺａｐＩＩ  ベクター（ストラータジーン社）を用いてメーカーの推奨する方法により作製した。使用した血清は、Ａ．  ｓｕｕｍ  Ｌ３を４回感染させたウサギの血清であった（Ｋａｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １２１：６７１−６７７．  （２０００））。
使用したファージはＥ．Ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  に感染させ、シャーレ（直径１５０ｍｍ）に５×１０４になるよう調製し、３７℃で４時間培養した。プラーク出現後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を浸漬させたニトロセルロース膜で培地の表層を覆い、さらに３時間培養した。培養シャーレから取り除いたニトロセルロース膜は、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ  添加Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、さらに５％添加ＴＢＳＴに室温１時間ブロッキングした。ニトロセルロース膜は、１：２００に希釈したＡ．  ｓｕｕｍ  Ｌ３感染ウサギ血清と３時間室温で反応させ、ＴＢＳＴで十分洗浄した後アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ山羊血清と１時間反応させ、陽性ファージを５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  （ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を用いて検出した。検出したクローンは、さらに上記スクリーニングを繰り返し、陽性クローンを単離した。単離したファージはＥｘＡｓｓｉｓｔ（商標）ヘルパーファージとＥ．Ｃｏｌｉ  ＳＯＬＲ（商標）を用いてメーカーの推奨する方法に従いＤＮＡのインビボーイクサイションを行った。
【００３９】
アルカリ溶菌法により調製した組換え体プラスミドＤＮＡ（Ｌ２Ｒ３７）はＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅ及びＦｏｒｗａｒｄプライマー（アプライドバイオシステム社）を用い、Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（アプライドバイオシステム社テクニカルマニュアル）によりメーカーの推奨する方法に従い反応させ、反応産物をＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３７０Ａ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３０、アプライドバイオシステム社）を用いて解析し塩基配列を決定した。Ｌ２Ｒ３７は、６１５塩基で構成され、５’には非翻訳領域に続き７６位にＡＴＧの開始コドン５２６位に終止コドンがそれぞれ認められ、さらにその下流には真核生物に存在するポリアデニレーションが確認された。塩基配列から推定される蛋白質は１５０残基のアミノ酸から構成され、その内Ｎ末領域には１８残基の真核生物シグナル配列が確認された。全アミノ酸の推定分子量は１６，４２４Ｄａで等電点は５．２３であったのに対して、シグナル配列を除いた虫体内での予想される成熟蛋白質の分子量は、１４，４２０Ｄａ、等電点は４．９１であった。配列表の配列番号１に該ＤＮＡの塩基配列を示した。コーディング領域は、７６位から５２５位であった。配列表の配列番号２にアミノ酸配列を示した。アミノ酸データベースとの相同性検索から、本発明で示す推定アミノ酸構造は、人象皮症の病原体であるフィラリアの抗原分子あるいは土壌線虫のひとつであるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓｅの遺伝子産物とそれぞれ約５０％の類似性を示した。しかしながら、現在のＧｅｎＢａｎｋ（商標）データーベース上で人及びマウス等の哺乳動物で確認されている蛋白質との間で類似性を示した蛋白質は確認されなかった。このことから分離された遺伝子がコードする蛋白質は、線虫特有のものであることが示唆された。
【００４０】
実施例２  組換え体蛋白質を発現させるベクター構築のための豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原ｃＤＮＡの分離及び増幅並びに組換え体分子及び組換え体細胞の作出
上記方法で合成したＡ．  ｓｕｕｍ  Ｌ３  ｃＤＮＡセンスプライマー（５’−ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＴ  ＴＧＣ−３’；ＣＴＣＧＡＧはＸｈｏＩサイト；配列番号３）とアンチセンスプライマー（５’−ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ−３’；Ｇ  ＡＡＴ  ＴＣはＥｃｏＲＩ  サイト；配列番号４）を用いたＰＣＲ反応にて増幅した。
【００４１】
ＰＣＲ反応は５０μｌの反応液〔１ｎｇ  Ａ．  ｓｕｕｍＬ３ｃＤＮＡ、１μＭセンス及び１μＭアンチセンスプライマー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（プロメガ社）〕を調製し、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の反応を３５サイクルで実施した。増幅したＰＣＲ産物はゲル電気泳動を行い、増幅したＤＮＡ断片をＤＮＡ精製キット（キアゲン社）を用いて蒸留水中に回収し、回収液を制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで３時間酵素処理した。プラスミド発現ベクターであるｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクター（インビトローゲン社）も挿入断片と同様に制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで３時間酵素処理した。制限酵素処理した挿入断片及びベクターをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社）を用いてメーカーの推奨する方法に従ってＤＮＡ断片を挿入し、大腸菌Ｔｏｐ１０を用いて形質転換を行い、Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き白色のコロニーから豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原コード領域の挿入されたクローンを選択した。
【００４２】
実施例３  大腸菌における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の作出及び、作出した蛋白質の性状
形質転換した大腸菌を３７℃でアンピシリンを含んだＳＯＢ液で培養し、培養後ＳＯＢ液のＯＤ６０００．５に到達した時点で１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養を続けた。経時的に産生される蛋白産生の変化は１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動｛Ｌａｅｍｍｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５（１９７０）｝を実施した後、クマーシー染色で確認した。その結果、約２２ｋＤａ付近に組換え蛋白質の産生が認められ。また、同様に実施した電気泳動のゲルをニトロセルロース膜（アマシャム社）に電気的に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳで１０，０００倍に希釈されたアルカリホスファターゼ標識されたＴ７モノクローナル抗体（ノバーゲン社）と１時間反応させた。ＴＢＳＴで洗浄した後、結合した蛋白質を基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ギブコＢＲＬ社）を用いて可視化した。その結果、このウエスタンブロット解析によって約２２ｋＤａ付近に確認された組換え蛋白質と反応することが認められ、組換え蛋白質に（Ｈｉｓ）６が付加されていることが確認された（図１）。図１でレーン１は、発現前の大腸菌ライセート、レーン２は、発現後の大腸菌ライセート、レーン３は、精製した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ組換え抗原蛋白質を示している。
【００４３】
実施例４  大腸菌からの豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の精製、及び精製した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質に対する抗体作製
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質はメタルキレートクロマトグラフィー（インビトローゲン）を用いてメーカーの推奨するイミダゾール溶出法によって精製した（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ９７：  ６９−７９（１９９８））。溶出された蛋白質はＣｅｎｔｒｉｓａｒｔ  Ｉ  （ザルトリウス社，  ｃｕｔ  ｏｆｆ  １０，０００  ＭＷ）  を用いて濃縮し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  （ピアス社）を用いてリン酸緩衝食塩液中にて透析を行った。この精製した豚回虫感染幼虫抗原組換え体蛋白質は、以下の抗体作製、各種動物の豚回虫免疫血清の反応性、豚回虫感染幼虫を用いた攻撃試験の検討に使用した。
【００４４】
豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質に対するポリクローナル抗体はマウスを用いて以下のように作製した｛Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ９７：  ６９−７９，  （１９９８）｝。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質５０μｇをＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（商標） （シンテックス社）とともに皮下接種し、４週間後再度同量を接種した。再投与２週後に採血を行い、血清を−２０℃に保存した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質を用いたウエスタンブロット解析によって、作製された１６ｋＤａ組換え蛋白質マウス免疫血清は、２２ｋＤａ付近の組換え蛋白質と強く反応することが確認された。
【００４５】
実施例５  精製した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質の各種動物のＡ．ｓｕｕｍ  Ｌ３免疫血清との反応性
実施例４で作製した１６ｋＤａ組換え蛋白質とウサギ、マウス及び豚の豚回虫免疫血清との反応性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法を用いて調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （Ｌａｅｍｍｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５（１９７０））で分離した１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質を定法に従いニトロセルロース膜（アマシャム社）に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳで５００倍に希釈されたウサギ、マウス及び豚の免疫血清と１時間反応させた。ＴＢＳＴで転写膜を洗浄した後、免疫血清と結合した蛋白質を検出するためにアルカリホスファターゼ標識された抗ウサギ、マウス及び豚−ＩｇＧ抗体（カッペル社）と１時間反応させ、結合した蛋白質を基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ギブコＢＲＬ社）を用いて可視化した。その結果、いずれの免疫血清も２２ｋＤａの抗原組換え体蛋白質と陽性反応を示し、１６ｋＤａ組換え蛋白質の抗原性が確認された。
【００４６】
実施例６  イムノブロット法によるネイティブ（天然型）豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の性状及び人回虫及び犬回虫における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原様分子の性状
実施例４で作製したマウス豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質免疫血清を用いて、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （Ｌａｅｍｍｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５（１９７０））で分離した後、定法に従いニトロセルロース膜（アマシャム社）に転写した。転写後、膜を５％スキムミルクで３０分間ブロッキングし、次いで、ＴＢＳで１，０００倍に希釈されたマウス豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え体蛋白質免疫血清と１時間反応させた。ＴＢＳＴで洗浄したのち、免疫血清と結合した蛋白質を検出するために、アルカリホスファターゼ標識された抗マウス−ＩｇＧ抗体（カッペル社）と１時間反応させ、結合した蛋白質を基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ギブコＢＲＬ社）を用いて可視化した。その結果、マウス血清と反応する約１６ｋＤａの単一バンドが確認され、Ａ．ｓｕｕｍＬ３抽出蛋白液中の天然型豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原が同定できた。この成績により本発明の表題に用いた１６ｋＤａは、Ｌ２Ｒ３７がコードする豚回虫の成熟抗原の分子量である。さらに、人回虫抽出蛋白を用いて上記の方法を行ったところ、豚回虫抽出蛋白の場合と同様の１６ｋＤａの大きさに陽性反応が確認された。しかし、犬回虫抽出蛋白には陽性反応は確認されなかった。これらのことから検出された１６ｋＤａ抗原は豚及び人回虫に共通して存在する分子であることが示された（図２）。図２でレーン１は人回虫、レーン２は犬回虫、レーン３は豚回虫、レーン４は豚回虫感染幼虫１６ｋＤａ組換え抗原蛋白質を示している。
【００４７】
実施例７  豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質を免疫したマウスにおけるＡ．ｓｕｕｍＬ３攻撃試験
マウス２０匹を４群（５匹／１群）に分け、それぞれ豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群、アジュバンド対照群、感染耐化群および未処置群を構成した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群のマウスに初回に５０μｇの豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質をフロイトの完全アジュバント（ディフコ社）と共に皮下接種し、その４週間後および６週間後に１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質をフロインドの不完全アジュバントと共に皮下接種し合計３回免疫処置を行った。アジュバンド対照群には、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群で使用したアジュバントを免疫処置日と同一日に皮下接種した。感染耐化群は、Ａ．ｓｕｕｍＬ３を頻回感染させることによって作製した。すなわち、感染ステージであるＬ３を含んだ成熟卵を初回２，０００個経口投与し、その後４週目および６週目に４，０００個投与した。実験群マウスへのＡ．ｓｕｕｍＬ３のチャレンジは最終免疫および経口投与の１週間後に成熟卵５，０００個を経口投与することで行った。感染後、７日目にて安楽死させ肺を取り出しべ−ルマン法により抗生物質を加えたＰＢＳ中に肺組織内の幼虫を遊出させ、顕微鏡下でその幼虫数をカウントした。数値は平均値±標準偏差で示した。感染防御の効果判定は未処置群との幼虫数増減で行った。
【００４８】
未処置群では、２５３．５±４１．５匹、アジュバンド対照群では、２７５．５±１０８．１匹、これらに対して、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質を免疫群では、１２４．８±９５．３匹、であった。また、各群のマウス血清を用いて、イムノブロット法によって豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の特異抗体を測定した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質を免疫群ではいずれのマウス血清も希釈倍率１，６００倍あるいは３，２００倍で強い陽性反応が確認された。未処置群及びアジュバンド対照群ではいずれも陽性反応は確認されなかった。すなわち、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の免疫によって、Ａ．ｓｕｕｍ幼虫回収率が有意に減少し、Ａ．ｓｕｕｍＬ３に対する豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質による防御免疫誘導が確認された。なお、Ａ．ｓｕｕｍＬ３感染マウスにおけるＡ．ｓｕｕｍＬ３チャレンジの防御免疫誘導は、今回設定した感染耐化群のチャレンジ試験において肺からの幼虫回収が０であったことからも立証された。
【００４９】
実施例８    経鼻免疫による豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の感染防御能
実施例７において、実験室内で汎用されている免疫方法によって作製された豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫マウスにＡ．ｓｕｕｍＬ３感染に対する防御免疫誘導が確認された。そこで、さらにワクチン投与による動物への侵襲負担の軽減及び投与の省力化を図るため、鼻腔投与による豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の防御免疫誘導能について検討した。アジュバントにはコレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ、Ｃ−９９０３、シグマ社）を用いた。
【００５０】
マウス１５匹を３群（５匹／１群）に分け、それぞれ豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢ免疫群、ＣＴＢ免疫対照群、および未処置群を構成した。豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢ免疫群のマウスには初回、５０μｇの豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質と２５μｇＣＴＢの混和液を鼻腔内にマイクロキャピラリーラウンドチップを用いて投与し、その４週間後および６週間後に同様に投与し合計３回の免疫処置を行った。ＣＴＢ免疫対照群には、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質免疫群で使用したＣＴＢを免疫処置日と同一日に鼻腔投与した。
実験群マウスへのＡ．ｓｕｕｍＬ３のチャレンジは最終免疫および経口投与の１週間後に成熟卵５，０００個を経口投与することで行った。感染後、７日目に安楽死させ肺を取り出し、ベ−ルマン法により抗生物質を加えたＰＢＳ中に肺組織内の幼虫を遊出させ、顕微鏡下でその幼虫数をカウントした。回収した幼虫数は平均値±標準偏差で示した。感染防御の効果判定は未処置群との幼虫数増減で行った。また、各群のマウス血清を用いて、ＥＬＩＳＡによる豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質に対する特異抗体を測定した。すなわち、０．１Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．６を用いて２μｇ／ｍｌに調整した豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白をポリスチレン性マイクロプレート（ＡＥ１６４０，住友ベークライト社）の各ウエルをコートした。プレートは４℃で１６時間放置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。各ウエルは１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）加ＰＢＳで３７℃１時間ブロックした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、系列希釈した血清を添加し３７℃度で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで５回洗浄しウエルに１：１０，０００に調整したホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（ベッチル社）を加え３７℃で１時間反応させた。反応後プレートはＰＢＳＴで５回洗浄し、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）基質溶液（ＡＢＴＳ，ＫＰＬ）を添加し３７℃で発色させた。反応の停止は１％ＳＤＳ添加によって行った。発色の測定はマイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡＦＬＵＯＲ、和光）を用いてＡ４０５で測定した。抗体価は最高希釈倍率のｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｌｏｇ２  ｔｉｔｅｒで示した。その結果、未処置群では、１７３．４±４９．６匹。ＣＴＢ免疫対照群では、２００．８±５２．８匹であった。これらに対して、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢの免疫群では、７６．４±２５．６匹であった。その結果、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質＋ＣＴＢの免疫群では、１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質に対する特異ＩｇＧ抗体価１９．０±０．７０が確認された。未処置群及びＣＴＢ免疫対照群ではいずれも抗体価は＜６であった。すなわち、豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質の経鼻による粘膜免疫によって、Ａ．ｓｕｕｍ幼虫回収率が有意に減少し、Ａ．ｓｕｕｍＬ３感染に対する豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原組換え蛋白質による防御免疫誘導が確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、  豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、該ＤＮＡを含むベクター及び組換え体細胞、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）感染幼虫の１６ｋＤａ抗原蛋白質、該抗原を認識する抗体並びに該抗原を含む豚回虫感染防御のための全身性及び粘膜誘導型ワクチンが提供され、寄生虫の駆除及び寄生虫感染から家畜及び人を守るための化合物の合成及び様々な人畜共通の寄生虫感染症の防除が可能になる。
【００５２】
【配列表】
0003613577.tif 000002
0003613577.tif 000003
0003613577.tif 000004
0003613577.tif 000005
0003613577.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】イムノブロット法による人回虫における豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ関連抗原ならびにネイティブ型豚回虫感染幼虫の１６ｋＤａ抗原の結果を示す図である。
【図１】
0003613577.tif 000007
【図２】
0003613577.tif 000008