(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるクラスのリポタンパク質の混合物を含有する試料中の特定のクラスのリポタンパク質の濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法であって、
ｉ）各々のクラスのリポタンパク質に結合し、そのように結合する場合、適当な励起下にて蛍光する単一プローブ物質を該試料に添加し、
ｉｉ）  試料に対して時間分解蛍光測定を行ない；次いで、
ｉｉｉ）該時間分解蛍光測定から得られた蛍光減衰データの分析から該決定を行う工程を含むことを特徴とする該方法。
【請求項２】
該リポタンパク質のクラスが、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該試料が、血清または血漿から得られることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該異なるクラスのリポタンパク質の各々につき時間の関数として異なる特徴的蛍光強度の減衰を有するように該プローブ物質を選択することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１記載の方法。
【請求項５】
該プローブ物質が、化学式Ｋ−３７：
【化１】
0003647810.tif 000006
により表されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉｉ）の該決定が、減衰速度を表す時間分解強度減衰パラメーターからなされることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉｉ）の該分析が、減衰時間定数を決定するための時間分解蛍光測定データの多重指数関数分析を含み、該決定が該時間定数の関数としてなされることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
該多重指数関数分析が、振幅を減少させる一連の指数関数として時間分解蛍光減衰を表わし、該時間定数が指数関数の最も重要な時間定数であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉｉ）の該決定が、該試料中に存在する全標的分子タイプの総濃度に対する第１の標的分子タイプの濃度を決定することを含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉｉ）の該決定が、該時間分解減衰測定データおよび試料中に存在する全てのクラスのリポタンパク質を含む総リポタンパク質濃度の別々の測定値の組合せから第１の標的分子タイプの濃度を決定することを含むことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１記載の方法。
【請求項１１】
総リポタンパク質濃度の該別々の測定値が生化学的に得られることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、多数の異なるリポタンパク質クラスを含む試料 中の特定のクラスのリポタンパク質の濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法に関する。
【０００２】
特に、専らではないが、本発明は、蛋白質混合物中の特定のリポタンパク質の同一性を決定するための、および血漿または血清のごとき蛋白質混合物中の異なるクラスのリポタンパク質を区別するためのアッセイに関する。
【０００３】
脂質、コレステロールおよびトリグリセリドの担体であるリポタンパク質は、血漿または血清の主成分中にある（簡潔には、後記では、「血漿」なる用語を用いるが、「血漿」への引用は、血漿または血清への引用として解釈されるべきである）。血漿中に見出されたリポタンパク質は、３つの主要クラス：高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）に分類される。血漿中リポタンパク質濃度とアテローム性動脈硬化症（すなわち、心血管疾患発生）の危険性との間に強い関連性があることはよく知られている。また、異なるクラスのリポタンパク質が各々、アテローム性動脈硬化症において異なる役割を果たすことも知られている。例えば、ＨＤＬは抗アテローム発生物質とみなされるが、ＬＤＬは高度のアテローム発生物質である（そのコレステロールはアテローム性動脈硬化症発生と緊密に関連して運搬する）ことが知られている。ＶＬＤＬは、わずかにアテローム発生物質であり、女性においてより重要であると考えられている。
【０００４】
血漿は様々な蛋白質の複合混合物であり、分離し、次いで異なるクラスのリポタンパク質の濃度を直接的に測定する方法は知られているが、かかる方法は複雑でかつ高価である。従って、臨床検査室において広く用いられるリポタンパク質アッセイの通常の方法は間接的方法であり、ここに、重要なＬＤＬ濃度は、
Fridedewaldの式：
（ＣＨ−ＬＤＬ）＝ＣＨ−（ＣＨ−ＨＤＬ）−ＴＧ／５
［式中、ＣＨは総コレステロール濃度、（ＣＨ−ＬＤＬ）はコレステロールＬＤＬ濃度であり、（ＣＨ−ＨＤＬ）はＨＤＬ濃度であって、ＴＧは（遊離グリセロールを含めた）トリグリセリド濃度である］
を用いて、総コレステロール濃度、トリグリセリド濃度およびＨＤＬ濃度の測定値から計算される。
【０００５】
ＨＤＬ、ＣＨおよびＴＧ濃度は、ＬＤＬ濃度の計算前に測定しなければならず、ＨＤＬ、ＣＨおよびＴＧ濃度の測定におけるいずれの誤差もＬＤＬ濃度の計算において形成されると認められるであろう。加えて、ＴＧ濃度の通常の測定は、トリグリセリドおよび遊離グリセロールの濃度間を区別せず、それは変動し、ＬＤＬ濃度の計算にさらなる誤差を誘導し得る。かくして、ＬＤＬ濃度の計算は、特に高トリグリセリドレベルにて非常に大きくなり得る誤差を含む。かかる誤差は、例えば、広範囲に用いられる（ダイエット、薬剤等のごとき）ＬＤＬ低下処置の進行をモニタリングすることにおける特別な問題であり、ここに、トリグリセリドレベルは劇的に変化し得るが、ＬＤＬ濃度における（典型的には、数パーセントのオーダーの）比較的小さな減少を正確にモニターすることが必要である。
【０００６】
前記の通常のアッセイ手法のさらなる欠点は、総ＣＨおよびＴＧアッセイが全血漿試料に行う簡単な手法を含むが、ＨＤＬ濃度の測定は、予備的分離プロセスを必要とし、ここに、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ成分は（ＬＤＬ＋ＶＬＤＬを凝固させ、それらを遠心によって除去することによって）除去される。
【０００７】
前記の方法のさらにさらなる欠点は、それがＶＬＤＬ濃度の測定を提供せず、従って、例えば、酵素学的に推定された血漿中トリグリセリドおよび遊離グリセロール含量に基づきＶＬＤＬ濃度を計算することによりいくらかの異なる方法またはプロセスから決定しなければならないことである。
【０００８】
主としてＬＤＬ＋ＶＬＤＬの合計である血漿の総リポタンパク質濃度をアッセイするための別法の方法は、２つのロシア特許第ＳＵ１４５７３８６号および第ＳＵ１４７６３８４号に開示されている。これらは、蛍光プローブとして、特定の有機発光団、４−ジメチルアミノ−４’−ジフルオロメチル−スルホニル−ベンジリデン−アセトフェノン（ＤＭＳＢＡ）の使用に関する。Ｋ−３７と識別される該プローブの式は、後記に与えられる：
【０００９】
【化１】
0003647810.tif 000002
【００１０】
該プローブＫ−３７は、水中にて発光しないが、血漿のごとき蛋白質水溶液中では高度に発光する。特に、蛍光強度は、血漿のリポタンパク質含量に高度に依存し、かくして、Ｋ−３７をプローブとして用いて、リポタンパク質濃度と、存在できる他の蛋白質の濃度を区別できる。
【００１１】
ロシア特許第ＳＵ１４５７３８６号は、Ｋ−３７を合成する方法を記載し、ロシア特許第ＳＵ１４７６３８４号は、（標準試料の測定された蛍光および既知濃度に参照して）血漿試料およびＫ−３７の混合物の定常状態蛍光の測定値から合わせた総ＣＨおよびＴＧ含量を計算する方法を記載している。アッセイされるべき血液試料は、緩衝液（ｐＨ７.４、１０ｍＮトリスＨＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有）を用いて希釈し、次いで、遠心して、赤血球および他の形成された成分を除去する。次いで、少量（１０μｌ）のＫ−３７の１ｍＮ標準溶液を１ｍｌの上澄み溶液に添加し、得られた蛍光強度を、各々、４４０ｎｍおよび５５０ｎｍの励起波長および観察波長にて、蛍光分光光度計を用いて測定する。式は、アッセイされるべき試料の測定された蛍光、および既知希釈の既知のＣＨおよびＴＧ濃度で、血漿の標準試料中のＫ−３７の測定された蛍光からＣＨおよびＴＧの全濃度を計算するために開示されている。５０倍ないし５００倍希釈にてアッセイされるべき多数の異なる希釈の試料についてのプロセスの繰返しについての結果は、ＣＨおよびＴＧの総濃度の測定が、血液希釈に大きく独立することを確立する。
【００１２】
かくして、蛍光プローブとしてのＫ−３７の使用は、非常に少ない血漿試料だけが必要とされるので、非常に敏感なアッセイ手法を提供し、それは、タンパク質成分の分離を必要とせずに行うために比較的簡単である。次いで、このように測定されたＣＨおよびＴＧの濃度は、計算された結果を正常値と比較することによって高脂血症の直接的な指標として用いることができる。
【００１３】
前記方法の１つの欠点は、それが異なる分類のリポタンパク質間を区別せず、かくして、例えば、それを用いてＬＤＬ濃度における小さな変化をモニターできないことである。
【００１４】
前記の欠点を除去または緩和することが本発明の目的である。
【００１５】
本発明により、少なくとも２つの異なるクラスのリポタンパク質の混合物を含有する試料中の特定のクラスのリポタンパク質の濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法であって、
ｉ） 各々のクラスのリポタンパク質に結合し、そのように結合する場合、適当な励起下にて蛍光するプローブ物質を該試料に添加し、
ｉｉ）試料に対して時間分解蛍光測定を行ない；次いで、
ｉｉｉ）該時間分解蛍光測定から得られた蛍光減衰データの分析から該決定を行う工程を含むことを特徴とする該方法が提供される。
【００１６】
本発明は、リポタンパク質クラスの範囲の各々のものに結合する単一プローブが蛍光減衰寿命に参照して、該試料溶液中に存在するある特定のクラスのリポタンパク質の濃度（または相対的濃度）に対して情報を与えることができるという認識に基づいている。
【００１７】
好ましくは、 各々のクラスのリポタンパク質につき時間の関数として異なる特徴的蛍光強度の減衰を有するように該プローブ物質を選択する。
【００１８】
本発明は、例えば、典型的には、電子時間窓を開けさせて、サブナノ秒およびナノ秒時間スケールでの時間における２点間の蛍光寿命事象を受容する時間ゲート（time-gated）測定系から区別されるごとき真の蛍光寿命測定を含む。時間ゲート測定方法それ自体は、寿命を直接的には測定しない。本発明に用いることができる公知の蛍光寿命測定方法の例は、パルス一致（pulse coincidence）、位相推移（phase shift）または位相変調の方法（後者の２つは、いずれも単一または複数の周波励起による）である。
【００１９】
時間分解蛍光測定から得られたデータの分析は、多数の方法にて行うことができた。好ましい方法は、減衰時間を表すパラメーターを同定することであり、それは、うまく、該時間分解蛍光測定データに関して行われた多重指数関数分析（multi-exponential analysis）の結果として誘導された指数時間定数であり得る。
【００２２】
本発明は、血清または血漿のごとき蛋白質混合物中に存在する特定のクラスのリポタンパク質の濃度を決定するのに特に適当である。この場合には、プローブ物質は、好ましくは、前記のＫ−３７である。
【００２３】
本発明の操作の例は、今や、添付図面を参照して記載され、ここに：
図１は、後記の実施例２に関して引用されたプロットであり；および
図２および３は、後記の実施例３に関して引用されたプロットである。
【００２４】
前記のごとく、本発明は、リポタンパク質の脂質に結合し、適当な放射波長にて励起される場合に蛍光する蛍光プローブ（Ｋ−３７）を用いる時間分解蛍光測定に基づいている。時間分解蛍光測定の基本原理はよく知られており、特定の波長にて（または特定の範囲の波長にわたって）周期的な短いパルスの放射で試料を発光させ、次いで、各パルスに続く時間にわたって蛍光強度における減衰を測定することを含む。後記の実験において、シンクロトロン源を用いて、試料を励起し、次いで、単一光子計数法を用いて、時間減衰データを誘導した。Munro I. H., （１９８０）、「蛍光寿命測定法用および時間分解分光法用の変調された源としてのシンクロトロン放射」；Synchrotron Radiation Research 編, Winick H, Doniachs, Plenum Press New Yorkの第８章；Munro I. H., Schwenter N（１９８３）「シンクロトロン放射を用いる時間分解分光法に関して」Nuclear Instruments and Methods, ２０８, ８１９；およびO'Connor, D. V. Philips  , D（１９８４） Time-Correlated Single-Photon-Counting、Academic Press. London。しかしながら、蛍光寿命の測定に適当ないずれの手法も用いることができると理解されるであろう。
【００２５】
単一成分溶液中のリポタンパク質の区別およびリポタンパク質タイプの同定は、12TH NATIONAL SYNHROTRON RADIATION CONFERENCE, NOVOSIBIRSK, RUSSIA, 14-18 JULY 1988, VOL. 448, no. 1-2, - July 1998 (1998-07) pages 471-477, XP004206579 Nuclear Instruments & Methods in Physics Research, Section A (Accelerators, Spectometers, Detectors and Associated Equipment), 21 June 2000, Elsevier, Netherlands ISSN:0168-9002に開示されている。本発明の理解を助けるために、この文書の教示の適応例を今や記載するであろう。
【００２６】
ヒト血清リポ蛋白質のＶＬＤＬおよびＬＤＬはよく確立された慣用的な方法を用いて、超遠心分離のプロセスによって供与体血清から得た。次いで、各試料の各々の水溶液を調製し、各リポタンパク質は、ｐＨ７.３の０.１４Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍトリス−ＨＣｌ中のｌｇ／Ｌの濃度を有する。次いで、プローブＫ−３７を各試料溶液に攪拌下にて、ゆっくり添加した。
【００２７】
次いで、各試料を４４０ｍｎの励起波長にて、Daresbury Laboratry（Daresbury, Warrington, Cheshire, England）のシンクロトロン源を用いて、本発明に従って時間分解蛍光測定に付した。次いで、単光子計数法を用いて、５５０ｎｍの検出波長に対してエネルギーにおいて等価な光子の時間分解減衰データを集めた。次いで、該結果の多重指数分析を非線形最小二乗法を用いて行ない、時間定数を減少させる一連の指数関数、すなわち：
【００２８】
【数１】
0003647810.tif 000003
【００２９】
［式中、Ａ１、Ａ２・・・Ａｎは振幅であって、τ１、τ２・・・τｎは例示的減衰時間定数である］として強度減衰の時間依存性を表した。
【００３０】
前記の数学的分析は、ＶＬＤＬ溶液につきτ１＝３.１ナノ秒およびＬＤＬ溶液につきτ１＝４.１ナノ秒を明らかとする。これらの数値計算における誤差は、０.２ナノ秒のオーダーにすぎないが、２つの数値間の差は明確に大きい。従って、ＬＤＬまたはＶＬＤＬのいずれかを含有するいずれの特定の単一成分溶液についてのτ１の測定値も、リポタンパク質が存在することを明らかとするであろう。換言すれば、Ｋ−３７プローブを用いる本発明による時間分解蛍光測定法の実行は、ＶＬＤＬおよびＬＤＬを区別し、τ１の測定値は、各々の溶液中のＶＬＤＬまたはＬＤＬの同定用のパラメーターとして推定できる。
【００３１】
本実施例は、リポタンパク質の時間分解蛍光減衰がリポタンパク質の密度に高度に依存することを示す。ＬＤＬおよびＶＬＤＬ溶液だけを用いたが、本実施例は、ＨＤＬのごとき他のリポタンパク質のクラスで繰返して、それらの特定の特徴的減衰時間定数を確立できる。
【００３２】
本発明の実施例１：リポタンパク質混合物（血清）中のＶＬＤＬ画分の決定。
異なるリポタンパク質がＫ−３７を用いて測定されるごとき異なる蛍光減衰時間定数を有するならば、本実施例は、リポタンパク質混合物の時間分解蛍光減衰の測定を用いて、その混合物中に存在する異なるリポタンパク質の相対的濃度に関する直接的な情報を与える方法を示す。
【００３３】
１０個の血清試料をコレステロール（ＣＨ）およびトリグリセリド（ＴＧ）含量における広範囲の変動を有するように選択された異なる供与体から得て、次いで、脂質濃度の決定を臨床自動分析器における日常的な酵素分析を用いて各試料の一部分に行った。かかる手法は慣用的である。これは、各試料の３つの数値、すなわち、総ＣＨ濃度、総ＴＧ濃度、ＨＤＬコレステロール（ＣＨ−ＨＤＬ）濃度を与えた。生化学的に測定された数値を後記の表１に与える。
【００３４】
【表１】
0003647810.tif 000004
【００３５】
該ＣＨおよびＴＧのレベルは、各々、６２３ｍｇ／ｄＬおよび８６７ｍｇ／ｄＬの非常に高値まで全試料にわたって非常に広範囲に変動することが、表１から分かるであろう。さらに、ＣＨ：ＴＧ比は、０.２３−対−４.０、すなわち、１７倍変動する。これらの変動の範囲には、典型的なヨーロッパ人集団において見出されると期待できる数値の９８％を超えて含まれる。
【００３６】
次いで、時間分解減衰測定を、実施例１に関連して前記のごとく、該試料を調製して、蛍光測定を行い、各試料に行った。減衰時間τ１の測定値を以下の表２に与える。
【００３７】
【表２】
0003647810.tif 000005
【００３８】、
ヒト血清中トリグリセリドが主としてＶＬＤＬから生じ、総ＣＨが全てのリポタンパク質から生じ、ＶＬＤＬコレステロール濃度がＶＬＤＬトリグリセリド濃度の約０.２であることはよく知られているので、ＶＬＤＬ：総リポタンパク質濃度の比は以下の式によって表すことができる：
(ＣＨ−ＶＬＤＬ+総ＴＧ)/(総ＣＨ+総ＴＧ)=１.２(総ＴＧ)/(総ＣＨ+総ＴＧ)
【００３９】
生化学的に決定されたデータへの参照により測定された減衰時間の分析は、混合物のτ１がその混合物内に存在するリポタンパク質の相対的濃度に密接に関連することを確立する。該試料の総リポタンパク質濃度のＶＬＤＬ画分と、測定された時間定数τ１との間の密接な相関性は、以下の蛍光パラメーターＦ１：
Ｆ１＝２.０−（６.２／τ１）
を用いて示すことができる。
（表２に与えられた測定値τ１から計算された）蛍光パラメーターＦ１に対する（前記のごときおよび表１の生化学的に誘導されたデータを用いて計算された）ＶＬＤＬ画分のプロットを図１として示す。これは、その２つの間に非常に強固な線形相関が存在することを示す。線形相関係数は、ｒ＝−０.９８である（すなわち、１に非常に近い）。
【００４０】
かくして、前記の確立されたτ１およびＶＬＤＬ画分の間の相関性を知れば、いずれの血清試料の総コレステロール含量のＶＬＤＬ画分も、単一測定、すなわち、時間定数τ１に基づいて本発明を用いて誘導できる。血清コレステロール成分の他の測定および先の分離は必要とされない。
【００４１】
前記の実施例が、τ１およびＶＬＤＬ画分の間の関係を確立するが、同様の関係は、ＶＤＬおよびＨＤＬを含めた他のリポタンパク質のτ１および画分濃度の間で確立できる。
【００４２】
本発明の実施例２：血清中のＬＤＬ濃度の決定：
総リポタンパク質濃度に対するいずれの特定のクラスのリポタンパク質の画分濃度も、（前記の実施例２によって確立されたごとき）τ１から見出すことができるので、絶対濃度は、総ＣＨ＋ＴＧ濃度の別々の測定から計算できることに続く。
【００４３】
本明細書の導入部分に言及されるごとく、血清中のＬＤＬ濃度を正確に測定できることは非常に重要である。本実施例は、本発明を用いて、ＬＤＬ濃度の測定を非常に単純化できる方法を説明する。
【００４４】
表１の生化学的データおよび表２の関連した時間減衰測定を用いて、図２は、後記の蛍光パラメーターＦ２：
Ｆ２＝（ＣＨ＋ＴＧ）×［１.８−（５.６／τ１）］
に対するＬＤＬコレステロール（ＣＨ−ＬＤＬ）のプロットである。
【００４５】
図２は、蛍光パラメーターＦ２（かくして、τ１）およびＬＤＬ濃度との間に、用いられた試料によって示された非常に広範囲の濃度にわたり非常に密接な相関性が存在することを示す。線形相関係数は、ｒ＝０.９６である。かくして、本発明は、血清中のＬＤＬ濃度を決定する方法を提供し、わずか２つの測定値、すなわち、τ１、およびよく知られ相対的に単純な臨床的手法を用いて容易に得ることができる総ＣＨ＋ＴＧを必要とする。従って、本発明によるＬＤＬ決定は、先行技術のものより、行うのに非常に単純でかつ直接的である。
【００４６】
パラメーターＦ２およびＶＤＬ濃度間の相関性は、パラメーターＦ２の計算における生化学的に誘導されたデータ、すなわち、ＣＨ＋ＴＧの使用に起因し得ないことに注目すべきであろう。数値ＣＨ＋ＴＧは、事実、他方に対して一方をプロットする図３に示されるごときＣＨ−ＬＤＬ濃度と何ら相関性を有しない。図３の場合において、線形相関係数は、ゼロに非常に接近している（ｒ＝０.０６）。
【００４７】
本方法から得られた結果は、有意な確率的誤差（random error）を示さない。さらに、いずれの小さな誤差も特性において系統的であり、試料が取られた特定の患者等に依存し、従って、その小さな誤差は、その患者に対する全てのテストにおいて存在し、かくして、例えば、経時的なＬＤＬレベルにおける小さな変化を正確にモニターする能力に対して効果を有さないであろうと推定できる。
【００４８】
本明細書の導入部分に言及されたごとく、Ｋ−３７の蛍光強度は、血清の希釈の程度に依存しないようであり、かくして、本発明は大きな感度を有し、患者等から採取されるべきほんの少量の試料を必要とする。加えて、得られた結果は一貫し、長期の治療サイクルにわたる変化を測定するのに特に重要である再現性がある。
【００４９】
時間分解蛍光データの獲得は単一工程操作であり、血清中リポタンパク質の先の分離を必要としないことが認められるであろう。加えて、蛍光寿命結果は、プローブＫ−３７の添加の１分間以内に得ることができる。
【００５０】
本発明を行い、血清および血漿以外の蛋白質混合物のリポタンパク質含量を同定できることが認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例２に関して引用されたプロットであり、蛍光パラメーターＦ１とＶＬＤＬ画分との非常に強固な線形相関を示す。
【図２】  図２は、実施例３に関して引用されたプロットであり、蛍光パラメーターＦ２とＬＤＬ濃度との相関性を示す。
【図３】  図３は、実施例３に関して引用されたプロットであり、ＣＨ＋ＴＧ濃度とＣＨ−ＬＤＬ濃度とが相関性を有しないことを示す。
【図１】
0003647810.tif 000007
【図２】
0003647810.tif 000008
【図３】
0003647810.tif 000009