(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中の抗−Ro/SS−Ａまたは抗−La/SS−Ｂ自己抗体を検出する方法であって、
（ａ）該生物試料を、Ro/SS−ＡまたはLa/SS−Ｂ自己抗原をコードしている核酸からなる組み換え発現カセットで安定にトランスフェクションされている哺乳動物細胞株からの細胞に接触させること、
ここで、該自己抗体は該Ro/SS−ＡまたはLa/SS−Ｂ自己抗原と反応し、該トランスフェクションされている細胞株は該Ro/SS−ＡまたはLa/SS−Ｂ自己抗原を発現する
（ｂ）自己抗原−自己抗体複合体を形成するために該生物試料を該細胞とインキュベイトすること、および
（ｃ）該自己抗原−自己抗体複合体を検出すること
以上のステップからなることを特徴とする検出方法
【請求項２】
該自己抗体は全身性疱瘡エリテマトーデスまたはシェーグレン症候群と関連している請求項１に記載の検出方法
【請求項３】
該自己抗原はRo/SS−Ａ抗原である請求項２に記載の検出方法
【請求項４】
該Ro/SS−Ａ抗原は60kd Ro/SS−Ａである請求項３に記載の検出方法
【請求項５】
該Ro/SS−Ａ抗原は52kd Ro/SS−Ａである請求項３に記載の検出方法
【請求項６】
該自己抗原はLa/SS−Ｂ抗原である請求項２に記載の検出方法
【請求項７】
該細胞株はヒト細胞株である請求項１に記載の検出方法
【請求項８】
該ヒト細胞株はHEp−２に由来する請求項７に記載の検出方法
【請求項９】
該ヒト細胞株はHEp/Ro 60である請求項７に記載の検出方法
【請求項１０】
該ヒト細胞株はHEp/Ro 52である請求項７に記載の検出方法
【請求項１１】
ステップ（ｃ）の該自己抗原−自己抗体複合体は蛍光免疫法によって検出される請求項１〜請求項10に記載の検出方法
【請求項１２】
該組み換え発現カセットは更にヒトサイトメガロウィルス即時早期プロモーターを含む請求項１〜請求項11に記載の検出方法
【請求項１３】
該トランスフェクションされた細胞株は該自己抗原を過剰発現する請求項１〜請求項12に記載の検出方法
【請求項１４】
ヒトRo/SS−Ａ自己抗原をコードしている核酸からなる組み換え発現カセットで安定にトランスフェクションされている細胞株であって、該トランスフェクションされた細胞株は該自己抗原を過剰発現することを特徴とするHEp−２細胞株
【請求項１５】
該細胞株はHEp/Ro 60である請求項14に記載の細胞株
【請求項１６】
該細胞株はHEp/Ro 52である請求項14に記載の細胞株
【請求項１７】
該組み換え発現カセットは更にヒトサイトメガロウィルス即時早期プロモーターを含む請求項14〜請求項16に記載の細胞株
【請求項１８】
抗−Ro/SS−Ａまたは抗−La/SS−Ｂ自己抗体を生物標本中において検出するためのキットであって、
（ａ）Ro/SS−ＡまたはLa/SS−Ｂ自己抗原をコードしている核酸からなる組み換え発現カセットによって安定にトランスフェクションされたヒト細胞株、および
（ｂ）特異的にRo/SS−ＡまたはLa/SS−Ｂ自己抗原に結合するラベルされた結合試薬、ここで、該自己抗体は該自己抗原と反応し、該トランスフェクションされた細胞株は該自己抗原を過剰発現する
からなることを特徴とする検出キット
【請求項１９】
該Ro/SS−Ａ抗原は60kd Ro/SS−Ａである請求項18に記載の検出キット
【請求項２０】
該Ro/SS−Ａ抗原は52kd Ro/SS−Ａである請求項18に記載の検出キット
【請求項２１】
該ヒト細胞株はHEp−２に由来する請求項18〜請求項20に記載の検出キット
【請求項２２】
該ヒト細胞株はHEp/Ro 60である請求項21に記載の検出キット
【請求項２３】
該ヒト細胞株はHEp/Ro 52である請求項21に記載の検出キット
【発明の詳細な説明】
〔発明の分野〕
本発明は自己免疫疾病に関連する自己抗体の検知のための改良されたインビトロの免疫検定法に関するものである。更に詳しく述べれば、本発明は自己免疫抗原を発現する核酸によって安定に形質転換された細胞株を使用する免疫検定法に関するものである。
〔発明の背景〕
自己免疫疾病は患者自身の組織の抗原と反応する抗体の生産によって特徴づけられるこれらの免疫システム不全である。30以上の自己免疫疾病が現在知られている。これらはリューマチ様関節炎、多発性硬化症、および全身性エリテマトーデス（SLE）等の世間の関心を集めている多くの疾病を含んでいる。特異自己抗体の生産はある種の自己免疫疾病に関連する。免疫機構と自己抗体の記述としては、本願の参考として編入されているSchwartz,R.S.,他、In Fundamental Immunology,第２版、Paul,W.E.,編集、Raven Press,New York（1989）pp.819−866を参照されたい。
自己免疫疾病は臓器特異疾病および全身性疾病の部類に入れることが出来る。臓器特異自己免疫疾病は例えば甲状腺のような単一器官、または例えば神経筋システムのような生理的システムに作用するものである。臓器特異疾病に含まれる自己抗原は臓器に対して一次抗原特異性を有しそして疾病の病理学において明らかにされるであろう。例えば、チログロブリンに対する自己抗体は甲状腺炎中に観察されそして疾病の病理学中に包含されるものと思われる。全身性自己免疫疾病は多発性生理的システムに作用する。全身性自己免疫疾病に含まれる自己抗体は一般的に細胞の核の中に見出される抗原のグループを含んでいるもっといろいろな所に存在Ｆる自己抗原と反応する。自己抗原の後半のグループはDNA、ヒストン、およびリボヌクレオプロテインの多くのものを含んでいる（Schwartz,R.S.等の前記書物を参照）。
抗体の検知および測定は自己免疫疾病の多くのものの診断や監視に用いられる。例えば、該自己抗原と反応する自己抗体は、一般に抗核抗体（ANA）テストにおける臨床的研究室において測定される。該ANAテストは核自己抗原のためのソースとして細胞株または組織部分を使用するものである。
該ANAテストにおいて、核蛍光は核抗体の存在を示す。更に、観察される蛍光のパターンは特異核抗原と反応する自己抗体の存在と関連させることが出来る。
該ANAテストは核抗原に対する自己抗体を検知するために汎く用いられ、そしていくらかの全身的自己免疫疾病の診断に有用である。しかしながら、診断有用性が限られたものである該ANAテストには問題が伴う。特に所望の核自己抗原のすべてを充分多量に有する細胞株または組織源を見つけることが困難である。ある種の核自己抗原は通常ANAテストを行うために使用される細胞株および組織源においてほんの低いレベルで生産されるに過ぎない。
このような該自己抗原の例はRo/SS−Ａである。Ro/SS−Ａに対する抗体はSLE、新生児の全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群およびその他のリューマチ疾病に関連する。抗Ro/SS−Ａ自己抗体の測定はこれらの疾病の診断において重要である。それ故に、Ro/SS−Ａをハイレベルで発現する細胞株かまたは正常には低含有量で存在する他の自己抗原が必要とされる。例えばRo/SS−Ａのような核自己抗原に対して、もし他の自己核抗原も発現する細胞株がRo/SS−Ａを過剰発現するために変性することが出来、そして改良されたANAテストのために使用することが出来るようにされたならば、それは特に有用なものとなるであろう。
〔発明の概要〕
本発明は例えばリューマチ疾病の検知のために生物試料中の自己抗体を検知する方法を提供するものである。該方法は自己抗体と反応する自己抗原をコードしている核酸からなる組み換え発現カセットによって安定にトランスフェクションした細胞株に生物試料を接触させること、該生物試料を該細胞株とインキュベートして自己抗原−自己抗体複合体を形成すること、そして該自己抗原−自己抗体複合体を代表的には蛍光免疫法によって検知することからなる。
該自己抗体は例えば全身性エリトマト−デス、新生児全身性エリトマトーデス、またはシェーグレン症候群のような全身性自己免疫疾病に関連する。模範的な抗原はRo/SS−Ａ（60kdおよび52kd型の両方）またはLa/SS−Ｂである。
更にまた本発明では自己抗原をコードしている核酸からなる組み換え発現カセットで安定にトランスフェクションされた細胞株を提供する。
該トランスフェクションされた細胞株は通常例えばHEp/Ro60またはHEp/Ro52のようなヒト細胞株である。該組み換え発現カセットにおいて使用される望ましいプロモーターはヒトサイトメガロウイルス即時早期プロモーターである。該トランスフェクションされた細胞株は望ましくは検定の感度を改良するために自己抗原を過剰発現する。
本発明は更に上記自己抗原をコードしている核酸からなる組み換え発現カセットで安定にトランスフェクションされた細胞株からなる生物標本中の自己抗体を検知するためのキットを提供するものである。
〔定義〕
「抗体」は抗原上の特異的エピトープと結合することが出来る免疫グロブリン分子をいう。抗体は多クローン性混合物または単クローン性である。抗体は天然ソースまたは組み換えソースから誘導された免疫グロブリンを損なわずそして損なわれない免疫グロブリンの部分を免疫反応することが出来る。抗体は代表的には免疫グロブリンのテトラマーである。該抗体は例えば単一鎖のみならずFv、Fab、およびＦ（ab）２を含む種々の形状で存在する（例えばHuston,他、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879−5883（1988）およびBird,他、Science 242:423−426（1988）が参考としてここに編入される）。（一般的には参考としてここに編入されているHood,他、Immunology,Benjamin,N.Y.,第２版（1984）およびHunkapillerとHood,Nature,323:15−16（1986）を参照されたい）。
「エピトープ」なる言葉は抗体の結合部位を指す。エピトープは塩基配列によって定義されるけれども、また一つの抗体が第２の抗体の同じ位置への結合を結合またはブロックする能力によって機能的に定義される。これは型通りのコンペティティブ免疫検定法によって達成されそしてエピトープマッピングと呼ばれている。
ここに使用される「自己抗体」なる言葉は、個体または動物から得られた抗体を指し、該抗体は同じ個体または動物からの正常な細胞抗原と反応する。自己抗体の生産は一般的に自己免疫疾病に関連する。自己免疫およびヒト自己免疫疾病における自己抗体の生産はSchwarz,R.S.等の前記文献中に詳細に検討されている。
ここに使用される「自己抗原」という言葉は、ここに自己抗体と反応する正常な個体中に存在する抗原を指す。自己抗原の例はチログロフリンのような臓器特異性抗原、DNA、ヒストン、およびリボヌクレオプロテイン粒子のようないたる所に存在する細胞抗原の両方を含む。既知の自己抗原と自己免疫疾病におけるそれらの役割の記述はSchwarz,R.S.等の前述文献中に載せられている。
ここに使用される「核自己抗原」なる言葉は、細胞の核中に存在する自己抗原を指す。核自己抗原と反応する自己抗体は一般的に例えばSLEおよびシェーグレン症候群のような全身的自己免疫疾病に関連する。核自己抗原はDNA、ヒストンおよび多数のリボヌクレオプロテインを含む（Schwartz,R.S.等の前述の文献を参照されたい）。
「Ro/SS−Ａ抗原」または「Ro/SS−Ａ自己抗原」なる言葉は特殊核自己抗原を指す。Ro/SS−Ａ抗原は小さいRNA分子、両方とも核内に見出されるY1−Y5、およびサイトプラズムに関連する60kdプロテインである。また関連する52kdプロテインが存在する。52kd Ro/SS−Ａプロテインに対する自己抗体は60kd Ro/SS−Ａプロテインに対する自己抗体と密接に関連する。上記の言葉は60kdプロテインと52kdプロテインの双方およびこれらのプロテインを含むリボヌクレオプロテイン複合体を指す。「60kd Ro/SS−Ａ抗原」「60kd Ro/SS−Ａ自己抗原」または「60kd Ro/SS−Ａプロテイン」なる言葉は明確に60kdプロテインまたはこのプロテインを含むリボヌクレオプロテイン複合体を指す。「52kd Ro/SS−Ａ抗原」、「52kd Ro/SS−Ａ自己抗原」、または「52kd Ro/SS−Ａプロテイン」なる言葉は52kdプロテインまたはこのプロテインを含むリボヌクレオプロテイン複合体を指す。該Ro/SS−Ａ抗原に対する自己抗体はSLEとシェーグレン症候群の双方に関連している。Ro/SS−Ａ抗原の構造とその自己免疫疾病との関連については、参考としてここにすべて編入されているItoh,K.,他、（1991）J.Clin.Invest.87:177−186,Chan,E.K.他、，（1991）J.Clin.Invest.87:68−76、およびHarley,J.B.他、（1992）Rheumatic Disease Clinics of N.America 18:337−358を参照されたい。
「La抗原」、「La自己抗原」または「La/SS−Ｂ抗原」なる言葉は核内において発現されそしてRNA/DNAハイブリッドのATP依存接触が可能であるRNAポリメラーゼIII転写終結因子を含む核自己抗原を指す。La抗原の構造と機能の詳細な記述に関してはGottlieb,E.他、（1989）EMBO J.8:841−850およびGottlieb,E.他、EMBO J.,8:851−861をここに参考として編入されているので参照されたい。「Laプロテイン」または「La分子」なる言葉は上記RNAポリメラーゼIII転写終結因子を指す。該Laプロテインは細胞5sRNAおよびtRNAの前躯体、7sRNA、および該Ro/SS−Ａ自己抗原に関連する小さいチトプラズマRNAを包含する種々の小さいRNAに関連する。La自己抗原に対する自己抗体はシェーグレン症候群とSLEの双方に関連する。
ここに使用される「生物試料」は生きている生物または死んでいる生物から得られる如何なる試料のことである。生物試料の例は体液および組織標本を含む。
ここに使用される「核酸」はDNAまたはRNAの両方を指す。「核酸の塩基配列」または「ポリヌクレオチドの塩基配列」は5'から3'末端から読まれるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの単一または二重連鎖ポリマーを云う。それは自己複製するプラスミド、DNAまたはRNA、および非官能性DNAまたはRNAの伝染性ポリマーの双方を含む。
「核酸プローブ」はDNAまたはRNAフラグメントであろう。DNAフラグメントは例えばプラスミドDNAの酵素分解またはPCRの使用によって調整されるか、あるいはBeaucageとCarruthers,Tetrahedron Lett.22:1859−1862（1981）に記載されているホスホラミドン法またはMatteucci等、J.Am.Chem.Soc.,103:3185（1981）によるトリエステル法のいづれかによっても合成される。上記文献は両方ともにここに参考として取り入れられている。
ここに使用されている「過剰発現する」または「過剰発現」なる言葉は、自然に起こるよりも大量のプロテイン発現を指す。例えばトランスフェクションされた細胞株はもしそれがトランスフェクションされていない親細胞株において発現されるよりも大量のプロテインを発現するならば、特定のプロテインを過剰発現したと言われる。これは細胞株が特定のプロテイン分子を発現することが出来る核酸によってトランスフェクションされる場合に一般的に起こることである。例えば実施例１−３に記述されるのであるが、HEp−２細胞株の60kd Ro/SS−Ａ抗原を発現するcDNAによるトランスフェクションは親HEp−２細胞において見出されるよりもはるかに大量の60kd Ro/SS−Ａ抗原の発現を結果として生ずる。
トランスフェクションされた細胞株によって発現された自己抗原を参照すると実施例２および３に記述されるように間接蛍光免疫検定法において、過剰発現はトランスフェクションされていない親細胞株とトランスフェクションされている細胞株の双方に対して一連の抗血清の力価を測定することによって測定される。過剰発現は実施例２の実験の筋書きに従って行われる時、親細胞株よりも少なくとも８倍多い力価を得るトランスフェクションされた細胞株において発現される自己抗原の量を云う。更に望ましくは、少なくとも16倍の力価の増加が得られ、更に望ましくは、少なくとも32倍の力価の増加が得られ、更に望ましくは、少なくとも64倍の力価の増加が得られ、更に望ましくは少なくとも128倍またはそれ以上の力価の増加が得られる。
Ro/SS−Ａ自己抗原の過剰発現を測定するための一連の自己抗血清の力価の増加の測定を説明するための表１参照のこと。
「組換え発現カセット」なる言葉は、発現ベクトルへの連結に適したプロモーター（構成的または誘導的）に実施可能に結合した組換えDNAフラグメントを指す。該組換えフラグメントは一般的にプロテインとまたはプロテインのフラグメントをコードする。例えば、組換えを発現カセットは特定の自己抗原プロテインをコードしているDNAまたはcDNA分子を含んでいるであろう。
「細胞培養物」と云う言葉は細胞がオリジナルの植物または動物の外部で成育し得る状態を維持せしめる多細胞植物または動物から誘導された成長する細胞を封じ込んだものを指す。「細胞株」なる言葉は細胞培養物において培養された細胞の株を指す。該言葉は不死の細胞株および最初の（不死でない）細胞株の双方を含む。
「ヒト細胞株」なる言葉はヒト組織から誘導されそしてヒト細胞から構成される細胞株を指す。「HEp/Ro60」なる言葉は60kd Ro/SS−Ａ抗原をコードしている核酸によって安定にトランスフェクションされているHEp−２細胞株を指す。HEp/Ro52」なる言葉は52kd Ro/SS−Ａ抗原をコードしている核酸で安定にトランスフェクションされているHEp−２細胞株を指す。
【図面の簡単な説明】
〔図１〕
60kd Ro/SS−Ａプロテインは間接蛍光免疫HEp/Ro60（Ａ）によってトランスフェクションされていない細胞においてよりも60kd Ro/SS−ＡトランスフェクションされているHEp−２細胞の核においてより容易に検知され、そしてHEp−２（Ｂ）はMab2G10によって着色される。HEp/Ro60（Ｃ）とHEp−２（Ｄ）は抗60kd Ro/SS−Ａ参照血清（CDC7）によって着色される（原倍率×400）。
〔図２〕
トランスフェクションされているRo/SS−A cDNAを示す免疫ブロットは60kdプロテインとして発現されている。細胞溶解物はニトロセルロース膜に移され、60kd Ro/SS−Ａ特殊MAb（2G10）によってプローブされた。反応性は125IプロテインＡおよびオートラジオグラフィを使用して検知された。
〔図３〕
HEp/Roを使用したIFAのELISA検定法による比較、蛍光免疫およびELISA検定法は実施例４に記述されるようにして行われた。
〔図４〕
HEp−２（Ａ）およびHEp/Ro52（Ｂ）の抗52kd Ro血清による蛍光免疫着色、蛍光免疫検定法は実施例６に記述されるようにして行われた。
〔図５〕
トランスフェクションされたRo/SS−Ａは52kdプロテインとして発現されることを示す免疫ブロット、細胞溶解物は10％SDS−PAGE上に流されそしてニトロセルロース膜に移され、更に52kd Ro/SS−Ａに対して自己抗血清特質によってプローブされた。反応性は増強された化学ルミネッセンスとフルオログラフィーを使用して検知された。
〔図６〕
遺伝子構成．（Ａ）ヒトゲノームLa遺伝子の再構成。4.4,4.6および6.8kbのEcoR Iフラグメントは二つのλファージクローン、λLa20.2から単離され、プラスミドpGEM−7Zf中にサブクローンされた。該遺伝子の構成の間、ポリリンカー配列の40塩基対がイントロン（Ｐ）中に導入された。エクソンの大体の位置は中実縦棒で示される。（Ｂ）発現ベクターpEE6/HCMVIGS中のヒトLacDNAクローン。制限エンドヌクレアーゼ位置は次に示される。B,BamH I;E,EcoR I;K,Kpul,Xb,Xba I;Xh,Xhol.
〔図７〕
トランスフェクションされたネズミフィブトブラスト中に発現されているヒトLaの核局在化，ヒトゲノームLa構成によってトランスフェクションされたネズミフィブトブラスト株LTA−５の間接蛍光免疫着色（上右枠）およびヒトLaに対して特異的なmAbAlでトランスフェクションされていないヒトLaに対して特異的なLAT−５（上左枠）、および正常ヒト血清（下左枠）または抗Laと抗60kd Ro活性（下右枠）を含んでいるヒト自己抗血清は内因性マウスLa発現を証明する（倍率400）。
〔図８〕
ネズミフィブロブラスト中のヒトLa発現。ヒトゲノーム（LTA−La gl−g3）およびヒトcDNA（LTA−La cl）La遺伝子でトランスフェクションされたLTA−５細胞中のウエスタンブロット分析。溶解物はニトロセルロース膜に移されそしてネズミLa上でヒトLa−特異性mAb,Al（抗ヒトLa）と交差反応する親自己抗血清（抗La血清）によってプローブされた。
〔実施例の説明〕
本発明は自己免疫疾病に関連する自己抗体の検知のための改良されたインビトロ免疫検定法に関するものである。これらの免疫検定は種々な自己抗原を発現する核酸によってトランスフェクションされた細胞株を利用する。方法は自己抗原をコードしている単離された核酸による細胞株のトランスフェクションのためにここに説明される。方法はまたトランスフェクションされた細胞株を利用する種々の免疫検定法手順による自己抗体の検知のためにも説明される。
A.自己抗体をコードしている核酸の単離
特定の自己抗原を発現するためのトランスフェクションされた細胞株を作り出すために、最初に該自己抗原をコードしているDNAまたはcDNA分子を単離することが必要である。該自己抗原をコードしているDNAはそれから適当な発現ベクターの中に取り入れられそして細胞株により該自己抗原の発現を誘導するために該細胞株の中にトランスフェクションされる。
上記したように、異なる自己免疫疾病に関連して種々な異なる自己抗体が存在する。このような自己免疫疾病はシェーグレン症候群，硬皮症，多発性筋炎，皮膚筋炎，全身性エリテマトーデス，若年性リューマチ関節炎，硬直脊椎炎，筋無力症グラヴィス（アセチルコリンリセプターに対する抗体），水泡性天疱瘡（上皮真皮接合での基底膜に対する抗体），天疱瘡（ムコポリサッカライドプロテイン複合体または細胞内セメント物質に対する抗体），糸球体腎炎（糸球体基底膜に対する抗体），グッドパスチュア症候群，自己免疫性溶血性貧血（赤血球に対する抗体），ハシモト病（チロイドに対する抗体），悪性貧血（内因子に対する抗体），突発性血小板減少性紫斑病（血小板に対する抗体），グレーブ病およびアディソン病（チログロブリンに対する抗体）など。
例えば抗チログロブリン；抗チロトロピンリセプター，抗チロイドミクロゾーム，パーオキシダーゼ，抗島細胞（64kdプロテイン），抗インスリン，抗インスリンリセプター，抗ミトコンドリア（70kdプロテイン），抗アセチルコリンリセプター（αサブユニット），抗因子VIII,抗IgG,（Fc部分），抗Ｃ−１インヒビター，抗基底膜，抗細胞内セメント物質，抗ミエリン塩基性プロテイン，抗細胞骨格プロテイン（例えばビメンチン，ドウブリン），抗ミエリングリコプロテイン，抗Ｉ（赤血球膜糖脂質），抗DNA,抗リボヌクレオプロテイン，抗燐脂質（カルジオリピン）等の種々の自己免疫疾病に関連する種々の自己抗体が同定されている。
自己抗体に対する結合特異性は該，細胞質，細胞膜，プラズマプロテイン，ホルモン，酵素，そしてリセプター中に存在する抗原を含む。自己抗原は例えば非常に多くの種類のプロテイン，核酸，燐脂質，リポプロテイン，糖およびステロイドを含む。体中いたる所に存在する自己抗原は、DNA,ヒストン，リボヌクレプロテイン，粒子，リボゾームホスホプロテイン，ミトコンドリアプロテイン，カルジオリピン、およびアクチン，ビメレチン，トウブリンおよびケラチンを含む種々な細胞骨格プロテインを含む。臓器物質自己抗原は例えばペプチド，インスリン，アセチルコリン，およびチロトロピンリセプターのようなホルモン，臓器β細胞，チログロブリン，赤血球抗原および血小板や抗原を含む。ある場合には、自己抗体が識別する分子決定因子は知られていない。しかしながら多数の自己抗原をコードしているcDNAが現在例えば細胞質ATPアーゼ/dATPアーゼ,LA抗原,60kd核プロテインNH2末端,Ro/SS−A,68kd核ポリペプチド,UIRNP,75kd核酸仁プロテイン,RM−Scl,核トポイソメラーゼI,Scl−70,tRNA,アラニル−tRNAシンセターゼ、PL−12,上皮細胞カドヘリン，ミトコンドリアアセチルトランスファラーゼ，ミトコンドリアチトクローム450dbl,β−細胞グルタミン酸デカ−ボキシラーゼ，チロイドパーオキシダーゼ，および刷子縁gp330を含んでクローン化されている。自己免疫疾病に関連する自己抗体および自己抗原のより詳細な検討はSchwartz,R.S.等の記述の文献を参照のこと。
自己抗原をコードしているDNA塩基配列の単離には種々な方法がある。例えば、発現ベクター中へのポリペプチドをコードしているサブクローン化核酸，ラベル化プローブ,DNAハイブリッド化，細胞のトランスフェクション等のこれらポリペプチドをコードしている遺伝子の核酸操作の手法は一般にSambrook他、Molecular Cloning−A Laboratory Manual（第二版）,Vol.1−3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989に記述されており、該文献はここに参考として取入れられている。このマニュアルは「Sambrook等」として状態参照される。
専門家は自己抗原をコードしているDNAやcDNA分子の単離の種々な方法に関して、知識を有する。手短に述べれば、ある自己抗原をコードしている核酸塩基配列はゲノームまたはcDNAライブラリーをプローブすることによって単離されることが出来る。ゲノームまたはcDNAライブラリーはSambrook等において記述されるように一般的に備えられている。
ゲノームまたはcDNAライブラリーをプローブするためには種々の方法がある。核酸プローブは、特に自己抗原プロテインをコードしている核酸に対して利用出来るDNA塩基配列情報がある場合にはしばしば使用される。例えば、該DNAは該DNA中の塩基配列に対して特異的であるラベル化オリゴヌクレオチドプローブを使用してゲノームまたはcDNAライブラリーから単離される。自己抗原をコードしているDNA塩基配列を含んでいるゲノームDNAまたはcDNAの制限エンドヌクレアーゼによる分解は、これらのプロテインをコードしている該DNAを単離するために使用され得る。種々の自己抗原をコードしているDNA塩基配列が知られている（Schwarz,R.S.等前述の文献参照）。これらの場合には制限エンドヌクレアーゼのパネルは所望の領域でのDNAの切断を与えるために組立てられ得る。制限エンドヌクレアーゼによる分解の後、自己抗原をコードしているDNAは、例えばサザーンブロットによる核酸プローブとハイブリダイズする能力によって固定され、これをDNA領域は専門家にはよく知られている標準方法によって単離される。Sambrook等の文献参照。
ポリメラーゼ鎖反応もまた自己抗原をコードしているDNAを調製するために用いられることが出来る、ポリメラーゼ鎖反応手法（PCR）はmRNA,cDNAあるいはゲノームライブラリーまたはcDNAライブラリーから直接生ずる自己抗原ポリペプチドの核酸塩基配列を増幅するために使用される。自己抗原をコードしているDNAを増幅するために適当なプライマーおよびプローブはDNA塩基配列の分析から生ずる。簡単に云えば、増幅されるべきで領域の２つの3'境界と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。ポリメラーゼ鎖反応はそれから２つのプライマーを用いて行われる。PCRプロトコール:A Guide to Methods and Applications（Innis,M.,GeHand,D.,Sninsky,J.とWhite.T.編集）,Academic Press,San Diego（1990）参照。プライマーは自己抗原プロテインの全長をコードしている全体の領域を増幅するために、または所望の小さいDNAセグメントを増幅するために選ばれることが出来る。
プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは最初Beaucage,S.L.とCarruthers,M.H.,1981,Tetrahedron Letts.,22（20）:1859−1862によって記述された固相ホスホラミドントリエステル法により、Needham−VanDevanter,D.R.他、1984,Nucleic Acids Res.,12:6159−6168に記述されるように自動操作合成装置を用いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、Pearson,J.D.とRegnier,F.E.,1983,J.Chrom.,255:137−149において記述されるように生アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換HPLCのいづれかによる。該合成オリゴヌクレオチドの塩基配列はMaxam,A.M.とGilbert,1980,W.,Grossman,L.とMoldave,D.編集、Academic Press,New York,Methods in Enzymology,65:499−560の化学的分解法を用いて確認することが出来る。
発現されたプロテインに対するプローブまたは検定法を使用する種々な発現クローニング法もまた自己抗原をコードしている核酸を単離するために使用することが出来るであろう。例えば、cDNA個数が領域をコードしているcDNAの転写と翻訳を与えるためにデザインされたベクター中に結合され得る。所望のcDNAクローンはそれから所望のプロテインを確認する抗体または抗血清による免疫的スクリーニングによって同定されるであろう。発現クローニングを用いる種々な免疫的スクリーニング方が専門家には知られている。Sambrook等の文献参照。免疫的スクリーニング法はスクリーニングにおいて使用する自己免疫、自己血清、または特異的抗体の有効性の故に、自己抗原をコードしている核酸を単離するために特に有用である。専門家にはよく知られている他の方法もまた自己抗原をコードしている核酸の単離に使用することが出来る。指定されたプロテイン分子をコードしているDNAの単離のための他の手法の記述は、Sambrook等を参照。
B.細胞株の中に自己抗原を発現する単離された核酸のトランスフェクション
細胞培養中の自己抗原をコードしている核酸の発現は、遺伝子またはcDNAをプロモーター（内在するかまたは誘導される）に使用できるように結合すること、および発現ベクター中へ取り入れることによって行なわれる。
該ベクターは所望の細胞株において複製または組み込みに適している。構成において用いられる特定のプロモーターは本発明では非常に重要なものではなく、いかなる強いプロモーターも本発明における使用に適した安定なトランスフェクタントを生産するために使用することが出来る。該プロモーターの例は、ヒトチロメガロウイルスから誘導されたプロモーター、メタロチオニンプロモーター、SV−40早期プロモーター、SV−40後期プロモーター、ネズミ乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現のために有効と思われるその他のプロモーターを含む。典型的な発現ベクターは転写および翻訳ターミネーター、開始塩基配列、および自己抗原をコードしているDNAの発現の調節に有用なプロモーターを含む。該ベクターはまた少なくとも一つの独立したターミネーター塩基配列、真核生物および原核生物の両方に存在するプラスミドの複製を行なう塩基配列すなわちシャトルベクター、そして原核または真核システムの両方のための選択マーカーを含む一般的な発現カセットからなる。該ベクターは望ましくは例えばアンピシリンまたはネオマイシンのような抗生物質に対する授与抵抗のような形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるためのマーカーを含む。
自己免疫抗原をコードしている単離されたDNAまたはcDNA分子は細胞培養物の形質転換に使用するための種々な発現ベクターに結合させることが出来る。発現ベクターと結合方法の記述はSambrook等の前述文献を参照。自己抗原をコードしているDNA塩基配列の転写と翻訳を開始するための遺伝子塩基配列は選択された宿主細胞に適合するように選択される。ウイルスやプラスミドから導入される数多くのクローニングベクターが使用されるであろう。哺乳動物細胞における使用のために適当な発現ベクターの説明は実施例１、４および８に記述される。
望ましくは哺乳動物細胞株はトランスフェクションのための宿主細胞として使用される。種々な異なった細胞株が異なった自己抗原によるトランスフェクションにとって望ましい。容易に利用できる細胞株のリストは細胞株およびヒブリドーマのATCCカタログ第７版（1992）、ATCC,Rockville,Maryland,USA中に記述されており、該文献はここに参照とし取り入れられる。例えば、ANAテストに使用するために適しているHEp−２のようなヒト細胞株は、該自己抗原をコードしているDNAによるトランスフェクションのために望ましい宿主細胞である。これらのトランスフェクションされている細胞株は、改良されたANAテストまたはANAテストを相補なうテストの開発に有用であろう。例えば、実施例１−３に記述されるHEp/Ro60トランスフェクション細胞株は、それが60kd Ro/SS−Ａ抗原の増強されたレベルを発現するためにANAテストのための改良された細胞株として有用であろう。この細胞株はRo/SS−Ａ自己抗原をより鋭敏に検知することが出来る改良されたAMAテストにおいて有用であろう。それに代えて、この細胞株または60kd Ro/SS−Ａ抗原を発現するDNAによってトランスフェクションされた他の細胞株はRo/SS−Ａ自己抗体に対するより明確なテストの開発に有用であろう。
宿主細胞は種々の手段により形質転換のためのコンピテントまたは付与されたコンピテントである。動物細胞中にDNAを導入するためには幾らかの良く知られた方法がある。これらは燐酸カルシウム沈殿法、DNAを含むバクテリアプロトプラストによる受容細胞の融合、DNAを含むリポゾームによる受容細胞の処理、DEAEデキストラン、電気穿孔および細胞中への直接DNAのマイクロ注射等を含む、形質転換方法の詳細な説明は、Sambrook等を参照のこと。
形質転換された細胞は良く知られた手法によって培養される。Biochemical Methods in Cell Culture and Virology,Kuchler,R.J.,Dowden,HatchinsonおよびRoss,Inc（1977）を参照のこと。専門家にとっては公知の様々な免疫検定法フォーマットが、自己抗原を発現または過剰発現するトランスフェクションされた細胞株を選択するために使用されるであろう。自己抗原をコードしている核酸によるトランスフェクションによって選択された自己抗原を発現または過剰発現する細胞株はそれから免疫検定法の開発のために使用されるであろう。
C.自己抗体の測定のための免疫検定法
特定のプロテインと反応する自己抗体は種々な免疫検定法によって測定されることが出来る。免疫学的方法または免疫検定法の論評については、Basic and Clinical Immunology第７版（D.StitesおよびA.Terr版）1991参照。更に特定の自己抗原を発現するトランスフェクションされた細胞株を使用する本発明の免疫検定法は、幾らかの形態において行われることが出来る。これら免疫検定法の形態はEnzyme Immunoassay,E.T.Maggio編集、CRC Press,Boca Raton,Florida（1980）；“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays",P.Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and molecular biology,Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam（1985）；およびHarlowとLane,Antibodies,A Laboratory Manual,前述の文献の中に広範囲にわたって論評されており、これら文献はここに参照として取入れられている。
自己抗体を測定する免疫検定法は競合的にまたは非競合的結合検定法のどちらでも良い。
競合的結合検定法においては資料分析物は固体表面に結合されている捕獲試薬中の特定の結合位置に対してラベルされている分析物と競合する。望ましくは、該捕獲試薬は自己抗原を過剰発現するトランスフェクションされた細胞株である。競合結合検定法のためのラベルされた分析物は、例えば自己抗原と結合に際して競合するラベル化抗体である。トランスフェクションされている細胞株に結合されているラベル化分析物の濃度は、試料中に存在する遊離分析物の量に反比例する。
非競合的検定法は試料分析物が二個の分析物特定結合試薬の間に結合する典型的なサンドイッチ検定法である。該結合試薬の一つは捕獲試薬として使用され固体表面に結合される。第２の結合試薬はラベルされ視覚または装置的手段によって得られる複合体を測定または検知するために使用される。
数多くの捕獲試薬とラベル化結合試薬との組合わせが使用され得る。望ましくは、自己抗原を過剰発現するトランスフェクションされた細胞株は捕獲試薬として使用され、ヒト抗体の一定領域に特異的なラベルされている抗ヒト抗体はラベル化結合試薬として使用されることが出来る。ヒト免疫グロブリン一定領域（例えばγまたはμ）に特異的な山羊，羊，およびその他の非ヒト抗体はこの分離においては良く知られている。
例えばプロテインＡまたプロテインＧのようなヒト免疫グロブリン一定領域に特異的に結合することが出来る他のプロテインもラベルされた結合試薬として使用されるであろう。これらのプロテインはストレプトコッカバクテリアの細胞壁の正常構成物である。これらは種々の種からの免疫グロブリンの一定領域と強い非免疫的反応性を有する。一般的にはKronval等、J.Immunol.III,1401−1406（1973）およびAkerstrom等、J.Immunol.,135;2589−2542（1985）参照。上記免疫検定法はすべて、免疫検定物の成分の一つが固体支持体と結合する固相分離法を使用している。上記検定法フォーマットにおいて、固体支持は望ましくは例えば顕微鏡スライドやマイクロ力価プレートのような適当な固体支持体に付着されているトランスフェクションされた細胞株である。
上記免疫検定法フォーマットはラベルされている分析化合物を使用する。該ラベルは種々な形状をとることが出来る。該ラベルは良く知られている方法によって所望の分析化合物に直接または間接的に結合されるであろう。
広範囲なラベルが使用される。化学物は幾らかの方法の位置の一つによってラベルされるであろう。従来は3H,125I,35S,14C,または32Pを含む放射性ラベルが使用されていた。非放射性ラベルはラベル化抗体，蛍光支持体，化学発光剤，酵素およびラベル化リガンドに対する特異的な結合対メンバーとして提供される抗体と結合するリガンドを含む。ラベルの選択は要求される精度、化合物との結合の容易性、要求される安定性および使用する装置に依存する。
非放射性ラベルは間接手段によって結合されるであろう。一般的に、例えばビオチンのようなリガンド分子は分子に共有的に結合される。リガンドはそれから本来的に測定可能あるいは例えば測定可能な酵素，蛍光化合物，または化学発光化合物のような信号システムに共有的に結合されている例えばストレプタビヂンのような抗リガンド分子とに結合する。多数のリガンドと抗リガンドとが使用出来る。例えばビオチン，チロキシンおよびコルチソールのようにリガンドが自然の抗リガンドを有する場合にはラベルされ自然に生ずる抗リガンドと共に使用されることが出来る。それに代えて、ハプテンンまたは抗原化合物が抗体と組合わせて使用することが出来る。
分子はまた例えば酵素や蛍光支持体と結合する場合のように信号発信化合物と直接結合せしめることが出来る。ラベルとして興味ある酵素は、主としてハイドロラーゼ、特にホスファターゼ，エステラーゼおよびグリコシダーゼ，またはオキサイドリダクターゼ、特にパーオキシダーゼであろう。蛍光化合物はフルオレセインおよびその誘導体．ローダミンおよびその誘導体、ダンシル，ウンベリフェロン等を含む。化学発光試薬はルシフェリンおよびたとえばルミノールのような２、３ジハイドロフタラジンジオンを含む。使用される種々なラベリングまたは信号生成システムの論評については、ここに参照として取り入れられるUS特許第4,391,904号を参照のこと。
ラベル化化合物は種々な手段によって検知されることが出来る。ラベル化化合物の検知のための手段は、使用されるラベルのタイプとそして免疫検定法のフォーマットに依存する。例えば、間接蛍光免疫検定法においては蛍光顕微鏡が使用れる。このタイプの検定法においては、トランスフェクションされている細胞株は、顕微鏡スライドに付着されそして自己抗体は細胞株において発現される自己抗原に結合される。自己抗原に結合出来る蛍光ラベルされた結合試薬は、それから蛍光顕微鏡の下で結合された自己抗体を見えるようにするために使用される。間接蛍光免疫フォーマットにおける免疫検定法の実際的説明については実施例２および３を参照のこと。ここに使用される「免疫蛍光法」なる言葉は直接及び間接蛍光免疫法の両方を指す。直接蛍光免疫法においては、抗原と反応する初期抗体が蛍光支持体によってラベルされる。
ラベル化化合物または例えば酵素ラベルが蛍光酵素方法において用いられる時、光顕微鏡によって検出することが出来る。このタイプの検定法では、トランスフェクションされている細胞株が顕微鏡スライドに付着されることが出来、そして細胞株において発現される自己抗原に結合される酵素ラベル化結合試薬はそれから固定化細胞に結合されている自己抗体に結合される。それに続く基質とクロモゲン化合物とのインキュベーションは、光顕微鏡によって見えるようにすることが出来るクロモゲンの生産を惹起こす。例えば、結合試薬はヒト免疫グロブリンを結合することが出来るホースラディッシュパーオキシダーゼラベル化非ヒト抗体とすることが出来る。例えば過酸化水素４−クロロナットールとによるホースラディッシュパーオキシダーゼのインキュベーションは、光顕微鏡によってみることが出来るようにする不溶性クロモゲンの生産を惹起こす。光顕微鏡が望ましいものである一方、このような免疫酵素法によって生ずるクロオモゲンもまた光顕微鏡法に加えて他の光学的方法によって測定されることが出来る。
本発明はまた自己抗原を発現または過剰発現するトランスフェクションされている細胞株，容器，そしてテストを行なうための支持物質からなる自己抗体の存在を検知するための診断上のキットを含有する。
特に定義されないけれどもここに用いられるすべての技術的科学的術語は、本発明が属している分野における専門家によって通常に理解されると同様な意味を有する。ここに記載されている方法および材料と同様ないかなる方法および材料が本発明の実際または試験において使用されることが出来るけれども、望ましい方法と材料とがここに記載される。以下に述べられるすべての刊行物はここに参照として取り入れられる。特に記述されないけれども、ここに使用されまたは使用しようと考慮される技術はこの分野の専門家によって良く知られている標準方法論である。材料、方法および実施例は単に説明であり、限定ではない。
〔実施例〕
実施例1:HEp−２のヒト60kd Ro/SS−Ａ抗原をコードしているcDNAによるトランスフェクション
ａ）遺伝子のクローニングおよび構成
60kd Ro/SS−Ａ分子をコードしているう全長cDNAは、ポリメラーゼ鎖反応によって誘導される300塩基対5'cDNAプローブによるスクリーニングによってヒトＴ細胞株（Hutt−78）cDNAライブラリーからクローン化された。該cDNAは塩基配列を測定されそしてDeutcher等（1988）Proc.Natl,Acad,Sci,USA 85:9479−9483によって記述されたものと同一のものであることが見出された。トランスフェクションのために、該cDNAはヒトチトメガロウィルス即時早期プロモーター（II CMV）（Thomsen等（1984）Proc.Natl.Acad.Sci,USA 81:659−663に記述されている）とポリアデニル化塩基配列の調節下において哺乳動物発現ベクター中にクローン化される。この発現ベクターはpRc/CMV（インビトロゲン，サンジエゴ,CA）に基づく。
ｂ）トランスフェクション
HEp−２細胞（ATCC♯LCL23）（Moore,A.F.等（1955）Cancer Res.15:998）は10％仔ウシ胎児血清，非必須アミノ酸，グルタミン，抗生物質および５×10-5M2−メルカプトエタノール（完全RPMI）によって補充されたRPMI中の単層として培養液中に支持された。トランスフェクションは燐酸カルシウム沈澱法によって行われた（Margulies Hy Evans G.A.,Ozato K.,Camirini−Otero R.D.,Tanaka K.,Apella E.,Seidman J.G.,（1983）J.Immunol 130:463−470を参照）。薬品耐性形質転換体の選択を促進するために、選択可能な遺伝子pSV2neo（Southern P.J.およびBerg,P.（1982）J.Mol.Appl.Genet.1:327−341）が60kd Ro/SS−A cDNAを含むベクターによって共トランスフェクションされた。HEp/Ro60を指摘する安定なトランスファクタントは0.41mg/mlのG418（Gibco,Grand Island,NY）を含む完全RPMIにおいて選択される。
実施例2:トランスフェクションされているHEp−２細胞中の60kd Ro/SS−Ａ抗原の発現と細胞内局在化
ａ）蛍光免疫法
細胞株は多重ウェルスライド中で一晩成長せしめられそれから20℃２分間アセトンとメタノール（3:1）混合液中で固定され、それから乾燥された。60kd Ro/SS−Ａプロテインは燐酸バッファー生理食塩水で希釈されたヒト血清または適当なモノクローン抗体（MAb）培養上澄液によって30分間単層のインキュベーションによって検知された。PBS洗滌に続いて、単層はPBS中で1:100希釈液に希釈されたフルオロセインイソチオシアナートラベル化羊抗ヒト免疫グロブリンまたは羊抗マウス免疫グロブリン（Silenus,Australia）によってインキュベートされる。抗60kd Ro/SS−A MAb,2G10はG.J.M.Prujin博士（ニーメゲン大学  オランダ）から寄贈された。抗La/SS−B MAb,A1はE.M.Tan博士の寄贈でありそして前述されている（Chan E.K.L.,Tan,E.M,（1987）J.Exp.Med.166:1627−1640参照）。終点力価が得られ次いで1:100から血清の２倍の連続希釈が行われた。正常ヒト血清は1:100の希釈でスクリーンされた。この研究で用いられた抗Ro/SS−Ａ陽性血清はカウンター蛍光免疫法（CIE）による抗Ro/SS−Ａに対して陽性であり、CIEとIF−ANAにおける他の特異性に対して陰性である。他の血清はRo/SS−A,La/SS−B,nRNP,Sm,Scl−70（CDC,アトランタ）,PCNA,動原体，分裂紡錘体，および20の健康なドナーからの血清に対する照合血清を含んでいた。HEp−２および60kd Ro/SS−ＡトランスフェクトHEp−２細胞（Hep/Ro60）の間接蛍光免疫（IF）染色はHEp−２中の典型的な特有の核斑点およびトランスファクタント中のRo/SS−Ａの劇的な過剰発現を示した。トランスフェクタントにおける発現は強い仁染色により、優勢的に局在化核であった。高強度染色されたこれらの細胞はまた抗Ro/SS−Ａ特異的自己抗血清により検知される弱いチトプラズマ染色をしめす。MAbまたは抗Ro/SS−Ａ特異性による自己抗血清によって固定され非透過性にされた細胞の表面染色は全く観察されなかった（データは示されない）。60kd Ro/SS−Ａの過剰発現のレベルは内因性Ro/SS−Ａの基底レベルから変化する非均一染色限度を与えるクローン化個数を越えて発現の内因性レベルよりも大きい128倍までの力価を与える強い染色まで変化した。最高強度染色によるHEp/Ro60細胞は個数の約10−15％に達した。発現のレベルのこの変化はHCMVプロモーターによる発現の調節によるものと思われ、他のトランスフェクションシステムにおいても観察された。
ｂ）免疫ブロット
全体細胞抽出物はヂチオスレイトールを含むソジウムドデシルスルフェイト（SDS）試料バッファー中２×107/mLの細胞の溶解によって調整された。３分煮沸した後、プロテインは10％ゲル上標準SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって分離された。プロテインはセミドライ転移装置（Novablot.Pharmacia LKB,スウェーデン）を使用してニトロセルロース（アマーシャムUK）に移された。ニトロセルロース繊維は３％低脂肪粉ミルクを含むPBS中１時間ブロックされ、それから洗滌バッファー（PBS,3％粉ミルク、および0.5％ツイーン20）中に希釈された血清中１時間インキュベイトされた。該ニトロセルロース繊維は洗滌バッファーで５回洗滌され、それから信号を増幅するためにウサギ抗マウス免疫グロブリン（Dakoスフェーデン）によってプローブされた。抗体結合は125IプロテインＡ（アマーシャムUK）とオートラジオグラフィーを使用して検知された。予備染色された分子量マーカー（Bio−RadリッチモンドCA）が分子容量を決定するために使用された。
抗Ro/SS−Ａ特異性MAb,2G10でプローブされたHEp/Ro60のウェスタンブロット分析は免疫学的に同一の60kdプロテインの発現のレベルの増大を示した（図２）。過剰発現されたRo/SS−Ａポリペプチドはモノクローンおよびポリクローン抗Ro/SS−Ａ抗体の両方と反応し、そして内因性60kd Ro/SS−Ａと同一の分子量を有する。IF上の分離した核小斑点入りのパターンはRo/SS−Ａ抗原が位置する優勢的核である。面白いことには顕著な仁染色はまた60kd Ro/SS−Ａプロテインは核と仁との間を往復することを暗示するような観察がされた。また真のチトプラズマ局在化を表すことが出来るかまたは固定の間チトプラズマ中への抗原の拡散に帰することが出来る種々のチトプラズマ染色が検知された。過剰発現にも関わらず、Ro/SS−ＡはHEp/Ro60表面膜上には観察されなかった。これはヒトLa/SS−Ｂによってトランスフェクションされたマウス細胞が他に報告されたように過剰発現、紫外線照射および血清損失の条件下で表面La/SS−Ｂを発現しないという意見と一致する（実施例４および５参照）。
実施例3:HEp/Ro60細胞およびHEp−２親細胞上のヒト血清の蛍光免疫法
HEp/Ro60とHEp−２親細胞を使用した蛍光免疫法が実施例２に述べられたようにして行われた。この研究において使用された抗Ro/SS−Ａ陽性血清はカウンター蛍光免疫法（CIE）による抗Ro/SS−Ａに対して陽性であり、CIEおよびIF−ANAによるその他の特異性に対して陰性であった。その他の血清はRo/SS−A,La/SS−B,nRNP,Sm,Scl−70（CDC,アトランタ）、PCNA,動原体，分裂紡錘体，および20の健康なドナーからの血清に対する照合血清を含む。
トランスフェクションされたHEp−２細胞は60kd Ro/SS−ＡをIFによって正確に、感度よく、そして特異的に検知するためにそれらの能力を分析された。CIE上の抗o/SS−Ａに対して陽性である24の血清はHEp−２およびHEp/Ro60細胞に対して1:100で出発して２倍の希釈で力価測定された（表１参照）。20の正常ヒト血清が1:100希釈でHEp−２とHEp/Ro60細胞に対する染色を示さなかった。抗60kd Ro/SS−Ａ血清の終点力価において、ドラマチックな増加は抗60kd Ro/SS−Ａプロテインの感度の良いそして特異的な確認が得られる特徴のある染色パターンによって伴われた。通常行われるIF−ANAによって検知された他の自己抗原の発現は分析された。細胞形態のゆがみ、局在の変化、または発現のレベルの変化は照合血清がSm,Scl−70,PCNA,動原体，分離紡錘体と、そしてMAbがLa/SS−Ｂと照合した場合、HEp/60または親株HEp−２がIFによって染色された時に観察されなかった（データは示されない）。
0003625067.tif 000002
実施例4:抗Ro/SS−Ａ自己抗体の検知のためのトランスフェクションされた細胞株を利用するIFAとELISA法との比較
IFA検定における60kd Ro特異性自己抗体を感度良くそして特異的に測定するためのHEp/Ro60の能力はELISAフォーマットにおける商業的に手に入る組換えRoプロテインと比較された。HEp/Ro60細胞株の生産は実施例１に記述される。蛍光免疫法は実施例１に記述されているように行われた。終点力価は得られ次いで1:100から血清の２倍の連続希釈が行われた。正常ヒト血清は1:100の希釈でスクリーニングされた。
抗Ro抗体の検知のためのELISA検定法。マイクロウェルELISAプレート（Nunk,デンマーク）に、0.03M炭酸ソーダバッファー（pH9.6）中に希釈されたIU/ウェルで組み換え60kd Ro（AMRADオーストラリア）を塗布しそして４℃で一晩インキュベートした。ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、ウェルは1:500に希釈された血清の重複試料と共に37℃、１時間インキュベートされた。結合IgGはアルカリホスファターゼ結合抗ヒトIgG（Sigma,セントルイス,USA）とSigma104ホスファターゼ基質を用いて検知された。60の正常コントロールの平均以上の3SDよりも大きな吸光度（OD 405nm）は陽性と考えられた。
この研究で使用された抗Ro陽性血清はカウンター免疫電気泳動（CIE）による抗Ro自己抗体に対して陽性でそしてCIEおよび蛍光免疫法では他の特異性に対して陰性であった。20の健康なボランティアからの血清は正常コントロール血清として使用された。
CIEでの抗Roに対して陽性の24の血清はHEp−２とHEp/Ro60細胞に対して1:100で出発して２倍希釈で力価測定された。これらの血清はまた1:500の希釈で組み換え60kd ELISAによりスクリーニングされた（図３参照）。
20の正常ヒト血清が1:100希釈で親HEp−２またはHEp/Ro60細胞で染色を示さなかった。HEp/Ro60に対する終点力価におけるドラマチックな増大が示され、そしてこれらトランスフェクタントの60kd Roを検知するための感度における親細胞以上の増大が示された。該組み換え60kd Ro ELISAは、生来の60kd Roプロテインに対する知られた反応性による24血清のうちの13の測定に失敗した。組み換え60kd Ro ELISAによる抗60kd Ro抗体検知の失敗はHEp−２またはHEp/Ro60での蛍光免疫法による低力価に関係しない。
この実施例は組み換え60kd Ro ELISAと比較される60kd Roに対する自己抗体を検知するためにヒト60kd Roでトランスフェクションされたヒト細胞株（HEp/Ro60）の卓越した高感度を示す。この研究の血清はカウンター免疫電気泳動法による生来のRoプロテインを検知するためのこれらの能力について選択された。該トランスフェクションされた60kd Roはプロテインの処理、翻訳後修正、そして折り重ねが生来の構造の官能性プロティンを生産する真核発現システムにおいてインビトロで過剰発現される。組み換えプロティンの生産のために用いられる原核発現システムにおいては、限られた翻訳後修正が起こりそして改められた生来の形態の折り重ねが生ずることは保証されない。自己反応エピトープの分裂に対する60kd Roの感度は、多くの血清が組み換えプロティンには存在しない形態的決定基と反応することを示唆する。
実施例5:ヒト52kd Ro/SS−Ａ抗原をコードしているcDNAによるHEp−２のトランスフェクション
ａ）遺伝子クローニングおよび構成
52kd Ro分子をコードしている全長cDNAはポリメラーゼ鎖反応によって誘導された全長52kd Ro cDNAでスクリーニングすることによって、ヒトＴ細胞株（Hutt−78）cDNAライブラリーからクローン化された。トランスフェクションのために、該cDNAは哺乳類発現ベクター類似体の中でpRc/CMV（インビトロゲン）へクローン化された。プラスミドはヒトサイトメガロウィルス即時早期プロモーター（HCMV）（Thomsen,D.R.等（1984）Proc.Nat.Acad.Sci.,USA81:659−663）と3'ポリアデニル化塩基配列とを含有する。選択可能なマーカーは別なプラスミドに含まれている。
ｂ）トランスフェクション
HEp細胞は10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、グルタミン、抗生物質、および５×10-5M2−メルカプトエタノール（完全RPMI）を補足されているRPMI中で単層として培養基中に維持された。トランスフェクションは実施例１で述べられていると同様な燐酸カルシウム沈澱法によって行われた。薬品耐性形質転換体の選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子pSV2neo（Southern,P.J.およびBerg,P.前述文献）が52kd Ro cDNAを含んでいるベクターによって共トランスフェクションされた。トランスフェクタントはG418（Gibco,Grand Island,NY）を0.4mg/mLで含んでいる完全RPMI中で選択され、そして続いてヒト52kd Roの発現のための分析に先立って限定希釈によってクローン化された。
実施例6:トランスフェクションされたHEp−２細胞中の52kd Ro/SS−Ａ抗原の発現を細胞間局在化
蛍光免疫法が実施例２に述べられたように行われた。52kdプロティンは燐酸バッファー生理的食塩水（PBS）中1:100に希釈されたヒト血清と共に30分間単層のインキュベーションによって検知された。この研究で用いられた抗Ro陽性血清はカウンター免疫電気泳動法（CIE）による抗Roに対して陽性であり、そしてCIEとIF−ANAでの他の特異性に対して陰性であった。免疫プロットは実施例２に記載されたように行われた。
HEp−２と52Kd Roプロティンに対して陽性の自己抗血清でトランスフェクションされたHEp−２（HEp/Ro52）は親細胞株で典型的な核小斑点生成を示し、そしてHEp/Ro52のチトプラズム中の52kd Roプロティンのドラマチックな過剰発現を示した（図４）。間接蛍光免疫法ではチトプラズムと同様にこれらのトランスフェクタントの核における局在化が存在するかどうかは測定困難であるが、パターンは優勢チトプラズマである。
抗52kd Ro抗血清でプローブされたHEp/Ro52のウェスタンブロット分析は、内生52kd Ro分子で共転移して50kdの見掛けの分子容量の単一過剰発現ハンドを示した（図５）。
実施例7:HEp/Ro52細胞でのヒト血清の蛍光免疫測定:ELISA検定法との比較
蛍光免疫法が実施例６に述べられたと同様に行われた。この研究で使用された抗Ro陽性血清はカウンター免疫電気泳動法（CIE）による抗Roに対して陽性であり、そしてCIEおよびIF−ANAでの他の特異性に対して陰性であった。
全長52kd RoはpQEベクターとQIA発現システム（QIAGEN,CA,USA）を使用して6xヒスチジン（6xHis）融合プロティンとして大腸菌中で発現された。組み換えプロティンは、製造者のインストラクションによって8M尿素中の金属キレート親和性クロマトグラフィーによって調製された。マイクロウェルELISAグレート（Nunc,デンマーク）に0.03M炭酸ソーダバッファー（pH9.6）中で希釈された52kd Ro−6xHis融合プロティンまたは組み換え60kd Ro（IU/ウェル）（AMRAD,オーストラリア）が塗布され、そして４℃で一晩インキュベートされた。３％ウシ血清アルブミンブロッキングした後、ウェルは1:500に希釈された血清の複製試料と共にインキュベートされ、PBS/0.05％Tween 20で洗滌され、そして結合されたIgGはアルカリホスファターゼ結合抗ヒトIgG（Sigma,セントルイス、USA）とSigma104ホスファターゼ基質とを用いて検出された。60の正常コントロールの平均値以上で3SDよりも大きい吸光度（OD405nm）は陽性と考えられる。
カウンター免疫電気泳動法（CIE）によるRoに対する陽性の23人の病人の血清は、52kd Roプロティンに対して特異的な抗体の検知のためにIFによって親HEp−２およびHEp/Ro52で分別された。血清はまた52kdおよび60kd Roプロティンに対する反応性のために組換えELISAによって分別された。23血清のうちの17がELISAによる52kd Roに対して陽性であり、これらのうちの13がHEp/Ro52中のトランスフェクションされた52kd Roプロティンに対してチトプラズム染色特異性を与えた（表２）。ELISAによる52kd Roに対して陰性な血清（60kd Ro単一特異性血清および10の正常コントロール血清）はHEp/Ro52でのIFにより52kd Roに対して陰性であった。
抗52および60kd Ro活性を区別する能力は病気少数派によるこれらの自己抗体のより詳細な分類と共同とを可能にする。これらのトランスフェクションされた細胞は52kd Roプロティンに対する自己抗体の存在の証明のための単純診断試薬を提供するであろう。
0003625067.tif 000003
実施例8:cDNAとヒトLa（SS−Ｂ）核自己抗原をコードしているゲノームDNAとによるネズミLTA−５細胞のトランスフェクション
ａ）遺伝子構成
ヒトゲノームLaをコードしているプラスミド、pLa15.8（図6A）は４段階型、２つのシャロン3Aλファージクローン、λLa2.1およびλLa26.2（Chamers,J.C.等、J.Biol,Chem.263:18045−18051参照、J.Keene博士から寄贈された）において組み立てられた。該ファージからの4.6kbおよび6.8kbのEcoR IフラグメントはクローニングベクターpGEM−7Z（Promega,Madison,WI,USA）の中へサブクローニングされた。4.4kbサブクローンの3'EcoR I位置は部分EcoR I酵素分解とDNA末端のクロノウ修復によって削除された。4.6kb EcoR Iフラグメントはそれから4.4kbサブクローンの5'EcoR I位置の中へ正確な配向でクローニングされた。このより大きなフラグメント（9.0kb）はXba Iポリリンカー制限位置の最初の酵素分解、次いでクレノウ修復およびCla I酵素分解によって切除された。この9.0kbフラグメントはそれから6.8kbサブクローンのクレノウ修復Bam III位置およびCla I酵素分解されたポリリンカー位置の中へ一方向的にクローニングされた。ベクターpGEM7−Zfの中に含まれている最終のゲノームクローン（pLa15.8））は4.4kbと6.8kbのEcoR Iフラグメント間に誘導されるポリリンカー塩基配列の40塩基対を含む。
プラスミド,pCTLa（図6B）はヒトチトメガロウィルス即時早期プロモーターのコントロール下にヒトLa cDNAをコードする。この組立てのために、5'非コード塩基配列の90塩基対を欠いているヒトLa cDNAはまず全長La cDNAクローンのポリメラーゼ鎖反応生成物からクローニングされた（McNeilage,L.J.等（1990）J.Immunol.145:3829−3835参照のこと）La cDNAの1097ヌクレオチドを含むKpn I/EcoR Iはそれから原cDNAクローンから相当するフラグメントで置換えられた。再構成されたcDNAの残りは置換体を誘導するポリメラーゼ鎖反応がないことを確認するために塩基配列された。得られた全長La cDNAを含むクレノウ修復されたBamH I/EcoR Iフラグメントは、Xba I,発現ベクターpEE6/ECMV/GS（Celltech UK）のクレノウ修復されたクローニング位置の中へサブクローニングされる。
ｂ）トランスフェクション
LTA−５細胞は10％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、グルタミン、抗生物質、および５×10-5M2−メルカプトエタノール（完全DMEM）を補給されたダルベッコの修正イーグル媒体（DMEM）中で単層として培養基中に維持された。トランスフェクションは、実施例１に記載されたと同様に行われた。薬品耐性形質転換体の選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子pSV2nco（Southern,P.J.,およびBerg,P,（1982）J.Mol,Appl.Genet,1:327−341）は再構成されたヒトLaゲノーム遺伝子（pLa15.8）またはcDNA構成（pCTLa）のいづれかによって共トランスフェクションされた。トランスフェクタントはG418（Gibco,Grand Island,NY,USA）を0.2mg/mLで含む完全DMEM中で選択され、そして続いてヒトLaの発現のための分析に先立って制限希釈によってクローンングされた。
実施例9:トランスフェクションされたネズミフィブロブラスト中のヒトLa抗原の局在化および発現
ａ）蛍光免疫法
細胞株は多重ウェルスライド中で一晩成長され、それからアセトンとメタノール（3:1）混合液中で−20℃、２時間固定され、それから空気乾燥された。Laプロティンは、燐酸バッファロー生理的食塩水中1:100に希釈されたヒト血清またはモノクローン抗体（mAb）腹水液たはウシmAb培養物上澄液により30分間単層のインキュベーションによって測定された。PBS,洗滌に続いて、該単層はフルオロセインイソチオシアナートラベルされた羊［Ｆ（ab）２］抗ヒト免疫グロブリンまたは羊［Ｆ（ab）２］抗マウス免疫グロブリン（Silenus,オーストラリア）の1:100希釈液でインキュベイションされた。モノクローン抗体A1,A2およびA3はE.M.Tan博士から寄贈され、SW1,SW3およびSW5はO.Williams博士からの寄贈であり、先に記述されている（Chan,E.K.L等（1987）J.Exp.Med.166:1627−1640およびSmith,P.R.,他（1985）J.Immunol.Med.77:63−76参照）。抗La活性を有するヒト血清は一次シェーグレン症候群の病人から採取され、そしてまた60kda Ro抗原に対する活性を含む。抗60kda Ro活性を有し、しかし抗La特異性を欠く血清は全身性エリテマトーデスの病人から採取した。
選択可能なマーカー遺伝子は、cDNAまたはゲノームヒトLa構成のいづれかで共トランスフェクションされ、ヒトLaのこれらの型を独立して発現する安定な薬品耐性トランスフェクタントを形成した。選択媒体中での培養に続いて、トランスフェクションされたネズミフィブロブラストは、制限希釈によってクローニングされ、ヒトLaプロティンの局在化を測定するために間接蛍光免疫法によって分析された。mAb A1を含み、特異的抗ヒトLaモノクローン抗体で染色され浸透出来るようにされたトランスフェクタントは粗い核小斑点と微細な核粒とを優先的に示す。弱い拡散チトプラズマ染色はまた観察された。La分散のこのパターンはネズミLa抗原と交差反応する病人の自己抗体で染色された内生ネズミLaのそれからは区別が出来なかった。ヒトLa cDNAトランスフェクタントとヒトLaゲノームDNAトランスフェクタントは同一の蛍光免疫パターンを示した（図７参照）。
抗ヒトLa特異性mAbsまたは病人の抗La自己抗血清を使用して顕微鏡的にまたは流動細胞計測法による間接蛍光免疫法によって試験された場合、トランスフェクションされていないLTA−５細胞またはいかなるヒトLaトランスフェクタントの細胞表面におけるヒトLaプロティンの検知可能な発現はみられなかった。ヒトLaまたは内生マウスLaの表面発現は、他の細胞タイプにおける内生La抗原の表面発現を誘導するために報告された条件下にこれらヒトLaトランスフェクタントの処理の後でも、示されることは出来なかった。トランスフェクタントUVB照射量（0.1,10,100および500mJ/em2）の広い範囲にわたって曝露され、そして1,4または20時間の培養の後表面ヒトLaの発現に対して流動細胞計測法によって分析された。10％コンカナバリンＡ刺激Ｔ−細胞上澄液（Baboonian,C等（1989）Clin.Exp.Immunol.78:454−459）の添加による同調からの解放が後に続く血清剥奪（0.5％FCS）の条件における48時間の培養は、流動細胞計測法におり測定されるようにヒトまたはネズミLaの表面発現の誘導を引き起こさない。ネズミフィブロブラストは表面Laの発現のために必要な要求のすべてを有しておらず、しかしこれらのデータはLaの相対的過剰発現よりもむしろ組織特異性または病気特異性因子が他のものによって観察される表面発現を明らかにすることを示唆している。
ｂ）免疫ブロット
免疫ブロットは実施例２に記載されると同様に行われた。より明確には、ヒトゲノーム（LTA La g1−g3）とヒトcDNA（LTA−LA C1）La遺伝子でトランスフェクションされたLTA−５細胞中のLa発現のウェスタンブロット分析が行われた。溶解物はニトロセルロース膜に移されそしてネズミLaおよびヒトLa特異性mAb,A1（抗ヒトLa）と交差反応する親自己抗血清（抗La血清）でプローブされた。反応性はパーオキシダーゼ結合第２抗体を用いて進められそして化学発光フルオログラフィーによって増強された。
ウェスタンブロット分析は、ヒトLaがヒト細胞中で発現されるLa共転移するので、該ヒトLaはトランスフェクションされたネズミ細胞中の正確な見掛けの分子容量の内にあり、そしてより低い見掛けの分子容量で移動する内生ネズミLa抗原からの電気泳動転移において明らかに区別されることが出来る。トランスフェクションされたネズミフィブロブラスト中に発現されるヒトLa抗原は、ヒト自己抗血清およびヒトLaプロティンに対して特異的な抗La mAbsと反応した。ゲノームおよびcDNA構成物から発現したヒトLaプロティンは殆どのクローン分離物中において見掛け分子容量は同一であった（例えばクローンg3およびg1）。しかしながら、ゲノームヒトLa遺伝子生産物を発現するある種のトランスフェクタントクローン（例えばクローンg1およびg2）においては、より高い分子量プロティンバンドからウエスタンブロット分析において検出された。ヒトLaのより高分子型はいくらかのヒトLa−特異性mAbs,A1,SW1およびSW3によって検知され、そして病人抗La抗血清によってはもっと小さい範囲となる（図８参照）。
ここに記述されている実施例や実施の形態は説明の目的のためのみであってこの分野の専門家によって容易に予想される種々な改変、変更は本出願の精神と付記される請求の範囲の内に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図６Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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