(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
0003700854.tif 000014
式中、Ｘは
【化２】
0003700854.tif 000015
であり、
Ｒ１はハロゲンによって置換されているベンゾフラニル、またはハロゲンによって置換されているスチリルであり、
Ｒ２は炭素数１〜６のアルキルまたはハロアルキル、１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシ、ハロアルキルもしくはハロアルコキシまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいヘテロ環基、１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシもしくはハロアルキルまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいアリール基であり、
Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＳＯ２−である、
で表される化合物または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有し、ＴＧＦβ１の増加または星細胞の活性化によって誘導される線維化を抑制する、線維化抑制剤。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒ１が２−（４−クロロフェニル）エテニルであり、Ｘが
【化３】
0003700854.tif 000016
である、請求項１に記載の線維化抑制剤。
【請求項３】
式Ｉにおいて、Ｙが−Ｏ−である、請求項１または２に記載の線維化抑制剤。
【請求項４】
式Ｉにおいて、Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有するヘテロ環基である、請求項１〜３のいずれかに記載の線維化抑制剤。  
【請求項５】
式Ｉにおいて、Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有する含窒素ヘテロ環基である、請求項１〜４のいずれかに記載の線維化抑制剤。
【請求項６】
式Ｉにおいて、Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有するピリミジニル基である、請求項１〜５のいずれかに記載の線維化抑制剤。
【請求項７】
肝線維化抑制活性および／または膵線維化抑制活性および／または肺線維化抑制活性を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の線維化抑制剤。
【請求項８】
式Ｉで表わされる化合物が、式ＩＩ
【化４】
0003700854.tif 000017
で表される化合物（２Ｅ）−３−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｓ）−２−オキソ−２−｛［２−オキソ−２−（４−｛［６−（トリフルオロメチル）−４−ピリミジニル］オキシ｝−１−ピペリジニル）エチル］アミノ｝−１−（２−ピリジルメチル）エチル］−２−プロペンアミドである、請求項１〜７のいずれかに記載の線維化抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の線維化抑制剤の、肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬の製造における使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載の線維化抑制剤を含む、肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬。  
【請求項１１】
錠剤、ピル、被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、ジュース、溶液、懸濁液およびドロップから選択される経口投与形態を有する、請求項１０に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な線維化抑制剤およびそれらを含む肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本ではＢ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎に罹患する患者が多く、厚生労働省の試算では慢性肝炎患者数は約１５０万人、肝硬変約３０万人以上と推定されている。肝硬変へと進行した患者は肝機能が低下して肝不全へと移行し死に至り、その場合の救命手段は現在の医療レベルでは肝臓移植以外に治療手段はない。すなわち、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎などの様々な原因による慢性的な肝障害によって肝線維化が引き起こされるが、現状では肝障害を引き起こす原因を取り除くことが肝線維化を阻止する第一の治療法である。それゆえ、効果的な線維化を抑制する薬剤などの治療法の開発は現在の肝臓病学にとって極めて重要な研究テーマである。
【０００３】
最近の分子生物学的研究の発展により、肝線維化に対する細胞、分子レベルでの理解が劇的に深まってきており、活性化肝星細胞とそれに関与するサイトカインが肝線維化の主役をなすことが明らかになりつつある。また、現在の研究では、肝線維化に対する治療法として活性化肝星細胞増殖を抑え、細胞外マトリックスの産生を抑えることを目標として、いくつかの実験モデルにおいて遺伝子療法や薬剤によるコラーゲン産生抑制などによって効果的に線維化を抑えてはいるが、実際にヒトに対し効果的でかつ安全な治療法は未だ確立されていない。
【０００４】
これらウイルス性肝炎に対する予防・対策は徐々に進んでおり、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン療法で劇的にな著効を示す症例が一部の患者で見られたり、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン治療で線維化の改善が見られたとする報告がある（非特許文献１および２）。しかしながら、それら以外には肝細胞壊死を抑制することによって二次的に線維化を抑制する以外に有効な方法は未だ見いだされていないのが現状である。
【０００５】
したがって、現時点での臨床の場においては、肝線維化が進んで肝硬変・肝不全へと進行して不幸な転帰をとる症例は減少してはいない。しかも肝硬変へ進行した患者の多くは肝癌が発症し、肝線維化は肝癌発症の大きな要因となっており、日本では肝癌での死亡率は年々上昇している。このように肝線維化抑制は肝硬変・肝不全への進行抑制、肝癌発症予防となり、これが実用化されれば国民に大きな利益をもたらすため、今や肝線維化研究は肝臓病学の中心的研究テーマとなっている。
【０００６】
最近の肝線維化に関する研究の進歩により、肝線維化に対する細胞、分子レベルでの理解が劇的に深まってきており、活性化肝星細胞とそれに関与するサイトカインが肝線維化の主役をなすことが分かってきており、特に肝線維化の病態にはＴＧＦβ１が中心的な役割を担っていることが明らかになってきている（非特許文献３）。すなわち肝細胞障害・炎症が持続することでＴＧＦβ１の放出が増加すると、肝星細胞の筋線維芽細胞様細胞への活性化と増殖を促し、細胞外マトリックスの産生を促進するとともに、細胞外マトリックスの分解系酵素の合成を抑制し、線維組織の蓄積をもたらすようになる。
【０００７】
ゆえに、肝線維化に対する治療法は活性化肝星細胞増殖を抑え、細胞外マトリックスの産生を抑えることを目標としている。現在まで実験レベルではあるが肝線維化抑制法として注目されているのは大きく分けて、遺伝子療法および線維化治療薬である。
遺伝子治療においてはＴＧＦβ１の産生抑制を目的として、ＴＧＦβ１発現抑制効果がある肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を遺伝子導入によって発現させることで、肝線維化を抑制できた報告がある（非特許文献４および５、特許文献１）。また、変異型ＴＧＦβ受容体を遺伝子導入してＴＧＦβ１の作用を生体内で特異的に抑制することで肝線維化を抑制できたと報告されている（非特許文献６）。
【０００８】
また、線維化治療薬としては前述したインターフェロンαが肝組織でのＴＧＦβ１の発現が抑制され、肝線維化の改善が得られることが臨床例で報告されている（非特許文献１）。実験的にはラット肝線維化モデルでコラーゲン線維産生抑制剤であるプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤（ＨＯＥ０７７）が肝線維化を抑制した報告がある（非特許文献７）。また、抗ＴＧＦβ１抗体（特許文献２）、ε−アミノカプロン酸（特許文献３）および抗ヒートショックプロテイン抗体（特許文献４）による肝線維化抑制の報告もある。
【０００９】
さらに、最近の報告として、フリーラジカルスカベンジャーであるFlavonoid quercetin（非特許文献８）、ビタミンＥ（非特許文献９）、ポリフェノール類（非特許文献１０）、抗アルドステロン剤であるcanrenone（非特許文献１１）、ハーブの１種であるCordyceps sinensis（非特許文献１２）およびＬ−システイン（非特許文献１３）が肝線維化を抑制した報告がある。
このように肝線維化を抑制することは実験的に幾つかの報告があるが、いずれも実用化には至っていないのが現状である。とくに、有効な線維化治療薬の発見により、経口投与などのコンプライアンスの高い治療法の開発が、発症例の多いこの種の疾病においてはとくに希求されている。
【００１０】
一方、一酸化窒素（ＮＯ）は血管内皮細胞由来血管弛緩因子の本体として見いだされ、循環器の生理的調節作用以外にも種々の臓器において多彩な働きがあることが明らかとなってきており、肝臓においても肝硬変、肝虚血再灌流障害などの病態でＮＯが関わっていることが示唆されている（特許文献５および６ならびに非特許文献１４〜１７）。肝虚血再灌流障害においては従来より本発明者らは誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤を投与することで肝虚血再灌流障害が顕著に抑制されることを実験的に検討して報告してきた（非特許文献１８〜２０）。
【００１１】
他方において、肝硬変においては前記誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）が発現が増強していること、肝硬変患者におけるHyperdynamic circulation状態は肝硬変に伴うエンドトキシン血症が誘導型ＮＯ合成酵素を発現させて大量の誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯを産生し、この血管拡張作用によってHyperdynamic circulationが起こることなどが報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、これらの報告はいずれも肝硬変の血行動態などの病態に関するものであり、ＴＧＦβ１産生および肝線維化と誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯの関連に関する研究成果の報告例はない。すなわち、誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯと肝線維化およびＴＧＦβ１産生との因果関係は未だ明らかでない。
【００１２】
特許文献５および６には、ｉＮＯＳの活性を阻害する物質が記載されている。しかしながら、誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯの発生を抑制することによって、ＴＧＦβ１産生および／または肝線維化の抑制に至った例はない。
なお、本願発明において用いられる化合物および薬学的に許容されるその塩は、ｉＮＯＳの活性を阻害する物質として特許文献６に記載されている。しかし、同文献では、かかる化合物のＴＧＦβ１産生および肝線維化抑制等に対する薬理作用については、前述の通り何ら具体的に開示されていない。
【００１３】
いずれにしても、肝硬変は肝線維化によって発症し、かかる発症にはＴＧＦβ１の発現が関わっていることは明らかにされてはいるものの、肝線維化を抑制するための有効な薬剤および肝硬変の進行を抑制するための有効な薬剤は未だ見いだされていない。
また、膵臓にも肝臓と同様に星細胞があり、ＴＧＦβが線維化に関係していること、および肝線維化と同じ機序による膵線維化によって慢性膵炎が発症する可能性があることが報告されている（非特許文献２１〜２９）。しかしながら、膵線維化を抑制するための有効な薬剤および慢性膵炎の進行を抑制するための有効な薬剤も未だ見いだされていないのが現状である。
さらに、肺高血圧症に伴って線維化が生じることも知られているが、かかる線維化を抑制するための有効な薬剤も未だ見いだされていない。
【００１４】
【特許文献１】特表平５−５０３０７６号公報
【特許文献２】特開平９−１９４３６０号公報
【特許文献３】特開平４−１８０２８号公報
【特許文献４】特開平７−６１９３６号公報
【特許文献５】特開平９−２３５２７６号公報
【特許文献６】国際公開第02/0255541号パンフレット
【００１５】
【非特許文献１】Bataller, M.D. et al., "Hepatic Stellate Cells as a Target for the Treatment of Liver Fibrosis", Seminars in Liver Disease, U.S.A. 2001年11月3日, vol. 21, 437- 451.
【非特許文献２】Ulloa, L et al., "Inhibition of transforming growth factor-β/SMAD signalling by the interferon-γ/STAT pathway", U.K., 1999年2月25日, Vol. 397, 710- 713.
【非特許文献３】上野ら、「肝線維化形成の機序」、肝胆膵、日本国、２００２年５月、第４４巻第５号、第５６７−５７４頁。
【非特許文献４】Ueki, T. et al., "Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats", Nature Medicine, Nature America Inc., U.S.A. 1999年2月, Vol. 5, No. 2, 226-230.
【非特許文献５】飯室ら、「肝線維化に対するＨＧＦの作用機序」、肝胆膵、日本国、２００２年５月、第４４巻第５号、第６２５−６３１頁。
【非特許文献６】Qi Z. et al., "Blockade of type β transforming growth factor signaling prevents liver fibrosis and dysfunction in the rat", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, U.S.A., 1999年3月, βVol. 96, 2345- 2349, Medical Sciences.
【００１６】
【非特許文献７】坂井田ら、「線維化の抑制」、肝胆膵、日本国、２００２年５月、第４４巻第５号、第６１３−６１８頁。
【非特許文献８】Pavanto A. et al., "Effects of quercetin on liver damage in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis", [online], 2003年4月, National Library of Medicine, [平成15５年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12741479&dopt=Abstract>
【非特許文献９】Zhan Y. et al., "Effects of vitamin E on the proliferation and collagen synthesis of rat hepatic stellate cells treated with IL-2 or TNF-alpha", [online], 2003年3月, National Library of Medicine, [平成15年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12781063&dopt=Abstract>
【００１７】
【非特許文献１０】Zhong Z. et al., "Polyphenols from Camellia sinensis Attenuate Experimental Cholestasis-Induced Liver Fibrosis in Rats", [online], 2003年6月, National Library of Medicine, [平成15年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12791596&dopt=Abstract>
【非特許文献１１】Caligiuri A. et al., "Antifibrinogenic Effects of Canrenone, an Antialdosteronic Drug, on human Hepatic Stellate Cells", American Gastroenterology, Gasteroenterological Association, U.S.A. 2003年2月, Vol.124, 504-520.
【非特許文献１２】Liu Y. et al., "Inhibitive effects of cordyceps sinensis on experomental hepatic fibrosis and its possible mechanism", World Journal of Gastroenterology, The WJG Press, China, 2003年3月15日, Vol. 9, No. 3, 529-533.
【非特許文献１３】Horie T. et al., "L-Cysteine administration prevents liver fibrosis by suppressing hepatic stellate cell proliferation and activation", Biochemical and Biophysical Research Communications, Elsevier Science, U.S.A., 2003年3月15日, Vol. 305, 94-100.
【非特許文献１４】Arkenau H. et al., "Elevated nitric oxide levels in patients with chronic liver disease and correlate with disease stage and parameters of hyperdynamic circulation", [online], 2002年11月, National Library of Medicine, [平成15年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=127436367&dopt=Abstract>
【００１８】
【非特許文献１５】Sanz-Cameno P. et al., "Enhanced intrahepatic inducible nitric oxide synthase expression and nitrotyrosine accumulation in primary biliary cirrhosis and autoimmune hepatitis", [online], 2002年12月, National Library of Medicine, [平成15年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12445411&dopt=Abstract>
【非特許文献１６】McNaughton L. et al., "Distribution of nitric oxide synthase in normal and cirrhotic human liver", [online], 2002年12月13日, National Library of Medicine, [平成15年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12482944&dopt=Abstract>
【非特許文献１７】Hassan MI. et al., "Evaluation of nitric oxide (NO) levels in hepatitis C virus (HCV) infection: relationship to schistosomiasis and liver cirrhosis among Egyptian patients", [online], 2002年, National Library of Medicine, [平成15年6月13日検索]、インターネット<URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12515909&dopt=Abstract>
【非特許文献１８】Meguro M, Katsuramaki T, Kimura H, Isobe M, Nagayama M, Kukita K, Nui A, Hirata L.，"Apotosis and necrosis after warm ischemia-reperfusion injury of the pig liver and their inhibition by ONO-1714", Transplantation 75: 703-710, 2003
【非特許文献１９】Meguro M, Katsuramaki T, Nagayama,M  KimuraH,   Isobe M, KimuraY, Matsuno T,  Nui A,  Hirata H., "A novel inhibitor of inducible nitric oxid synthase (ONO-1714) prevents critical warm ischemia-reperfusion injury in the pig liver",  Transplantation  73: 1439-1446, 2002
【非特許文献２０】Isobe M, Katsuramaki T, Kimura H, Nagayama M, Matsuno T., "Beneficial effects of inducible nitric oxide synthase inhibitor on  reperfusion injury in the pig liver", Transplantation 68: 803-813, 1999
【非特許文献２１】Kuno A et al., "Angiotensin-converting enzyme inhibitor attenuates pancreatic inflammation and fibrosis in male Wistar Bonn/Kobori rats", Gastroenterology. 2003 Apr;124(4):1010-9.
【非特許文献２２】Tashiro M et al., "Oleic acid-induced pancreatitis alters expression of transforming growth factor-beta1 and extracellular matrix components in rats", Pancreas. 2003 Mar;26(2):197-204.
【非特許文献２３】Phillips PA et al., "Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover", Gut. 2003 Feb;52(2):275-82.
【非特許文献２４】Shinjia T et al., "Establishment of a novel collagenase perfusion method to isolate rat pancreatic stellate cells and investigation of their gene expression of TGF-beta1, type I collagen, and CTGF in primary culture or freshly isolated cells", Acta Med Okayama. 2002 Aug;56(4):211-8.
【非特許文献２５】Shek FW et al., "Expression of transforming growth factor-beta 1 by pancreatic stellate cells and its implications for matrix secretion and turnover in chronic pancreatitis", Am J Pathol. 2002 May;160(5):1787-98.,
【非特許文献２６】Yoshikawa H et al., "Role of TGF-beta1 in the development of pancreatic fibrosis in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty rats", Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002 Mar;282(3):G549-58.
【非特許文献２７】Schuppan D et al., "Fibrosis of liver, pancreas and intestine: common mechanisms and clear targets?", Acta Gastroenterol Belg., Germany, 2000 Oct-Dec;63(4):366-70.
【非特許文献２８】Su SB et al., "Expression of transforming growth factor-beta in spontaneous chronic pancreatitis in the WBN/Kob rat"Dig Dis Sci. 2000 Jan;45(1):151-9.
【非特許文献２９】Apte MV et al., "Pancreatic stellate cells are activated by proinflammatory cytokines: implications for pancreatic fibrogenesis", J Gut. 1999 Apr;44(4):534-41.
【非特許文献３０】Criado M et al., "Role of prostanoids and nitric oxide inhibition in rats with experimental hepatic fibrosis" J. Physiol. Biochem., 2000 Sep;56(3):181-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明の課題は、線維化抑制活性を有する化合物または薬学的に許容されるその塩およびそれらを有効成分として含む線維化抑制剤、かかる抑制剤を含む肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬、さらにこれらを用いた肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題を解決すべく、またｉＮＯＳ阻害剤と肝線維化との関連に着目し鋭意研究を重ねる中で、驚くべきことに、ある特定の構造を有するｉＮＯＳ阻害剤によって線維化が劇的に抑制され、さらに肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行も抑制されるという知見を見いだし、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、式Ｉ
【化１】
0003700854.tif 000002
式中、Ｘは
【化２】
0003700854.tif 000003
であり、
Ｒ１はハロゲンによって置換されているベンゾフラニル、またはハロゲンによって置換されているスチリルであり、
Ｒ２は炭素数１〜６のアルキルまたはハロアルキル、１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシ、ハロアルキルもしくはハロアルコキシまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいヘテロ環基、１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシもしくはハロアルキルまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいアリール基であり、
Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＳＯ２−である、
で表される化合物または薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有し、ＴＧＦβ１の増加または星細胞の活性化によって誘導される線維化を抑制する、線維化抑制剤に関する。
【００２２】
また、本発明は、式Ｉにおいて、Ｒ１が２−（４−クロロフェニル）エテニルであり、Ｘが
【化３】
0003700854.tif 000004
である、前記線維化抑制剤に関する。
さらに、本発明は、式Ｉにおいて、Ｙが−Ｏ−である、前記線維化抑制剤に関する。
また、本発明は、式Ｉにおいて、Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有するヘテロ環基である、前記線維化抑制剤に関する。  
さらに、本発明は、式Ｉにおいて、Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有する含窒素ヘテロ環基である、前記線維化抑制剤に関する。
また、本発明は、式Ｉにおいて、Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有するピリミジニル基である、前記線維化抑制剤に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、肝線維化抑制活性および／または膵線維化抑制活性および／または肺線維化抑制活性を有する、を有する、前記線維化抑制剤に関する。
また、本発明は、式Ｉで表わされる化合物が、式ＩＩ
【化４】
0003700854.tif 000005
で表される化合物（２Ｅ）−３−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｓ）−２−オキソ−２−｛［２−オキソ−２−（４−｛［６−（トリフルオロメチル）−４−ピリミジニル］オキシ｝−１−ピペリジニル）エチル］アミノ｝−１−（２−ピリジルメチル）エチル］−２−プロペンアミドである、前記線維化抑制剤に関する。
また、さらに本発明は、前記線維化抑制剤の、肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬の製造における使用に関する。
さらにまた、本発明は、前記線維化抑制剤を含む、肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬に関する。  
そして、本発明は、錠剤、ピル、被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、ジュース、溶液、懸濁液およびドロップから選択される経口投与形態を有する、前記医薬に関する。
【００２４】
本発明の線維化抑制剤の有効成分である化合物および薬学的に許容されるその塩は、直接的にもしくは誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯ産生を低下させるという新規な作用機作によって、線維化を抑制する。また、前記化合物およびその塩は、線維化を抑制することによって肝繊維化および／または膵線維化および／または肺線維化をも抑制し、肝硬変と同様な機序によって発症する慢性膵炎、および／または肺高血圧症進行を抑制するという、格別な効果を奏するものである。
【００２５】
一酸化窒素（ＮＯ）は血管内皮細胞由来血管弛緩因子の本体として見いだされ、循環器の生理的調節作用以外にも種々の臓器において多彩な働きがあることが明らかとなっている。ＮＯを産生する酵素は生体の恒常性維持に寄与する構成型ＮＯ合成酵素と種々の侵襲によって誘導される誘導型ＮＯ合成酵素に大別することができ、一般的に構成型ＮＯ合成酵素由来ＮＯは細胞保護的に作用し、誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯは細胞障害的に作用すると考えられている。誘導型ＮＯ酵素から産生されるＮＯは構成型ＮＯ合成酵素が産生するＮＯに比して約１０００倍と言われており、誘導型ＮＯ合成酵素から産生される大量の誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯは活性酸素などと結合して極めて毒性の強い物質となり、種々の組織で障害作用を発揮する。
【００２６】
本発明者らも従来より肝虚血再灌流障害モデルでＮＯに関して検討しており、虚血再灌流後に誘導型ＮＯ合成酵素がKuppfer細胞、白血球などの炎症細胞に発現し、そこから産生された誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯが活性酸素と結びついて極めて毒性が強いperoxinitriteを生成し、再灌流後に肝細胞障害を惹起すること、誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤投与によってこの再灌流障害が著明に抑制されることを豚肝温阻血再灌流実験、豚肝移植実験において証明してきた。臓器虚血再灌流以外にも、敗血症、手術などの種々の侵襲によってマクロファージ、白血球などの炎症細胞に誘導型ＮＯ合成酵素が誘導され、それから産生される大量の誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯが組織障害性に働くことが報告されている。
【００２７】
一方、肝臓においては肝虚血再灌流障害以外でも肝硬変患者で発生するhyperdynamic circulation状態においてＮＯが関与することが報告されている。すなわち、肝硬変患者におけるHyperdynamic circulation状態は肝硬変に伴うエンドトキシン血症がKupffer細胞などに誘導型ＮＯ合成酵素を発現させ、これによって生成される大量の誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯが血管拡張作用などを起こしhyperdynamic circulationが起こるとされている。しかしながら、肝線維化における誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯの関与については全く検討されていない。
一方、肝線維化における構成型ＮＯ合成酵素阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥの関与を実験的に検討した報告はなされている（非特許文献３０）。しかし、該実験において得られた結果は、Ｌ−ＮＡＭＥによって肝線維化が促進されることを示すものであった。すなわち、Ｌ−ＮＡＭＥの作用は本願発明の組成物の作用とは全く異なるものである。しかも、構成型ＮＯ合成酵素由来ＮＯは、前記のとおり細胞保護的に作用するものであり、またその産生量は誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯの１／１０００に過ぎない。したがって、仮にかかる構成型ＮＯ合成酵素を阻害することによって肝線維化を実験的に抑制し得たとしても、その効果に比して副作用が生じるリスクの方がはるかに大きいため、構成型ＮＯ合成酵素阻害剤を臨床に用いることは極めて困難である。
すなわち、誘導型ＮＯ合成酵素を阻害することによる肝線維化阻害について検討した報告もこれまで全くなされていない。
【００２８】
なお、本発明において、ある物質が「線維化抑制活性を有する」とは、当該物質が肝細胞、膵細胞または肺細胞等の臓器細胞に投与された場合に、当該物質非投与の場合と比較して、前記投与された肝細胞、膵細胞または肺細胞における繊維化がそれぞれ抑制されることを意味する。
本発明において、ある物質が「ＴＧＦβ１産生抑制活性を有する」とは、当該物質が組織、器官または生体に投与された場合に、当該物質非投与の場合と比較して、前記投与された組織、器官または生体におけるＴＧＦβ１産生が抑制されることを意味する。
また、本発明において、ある物質が「肝硬変および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制する活性を有する」とは、当該物質が肝炎もしくは肝硬変の兆候を示している対象および／または慢性膵炎の兆候を示している対象および／または肺高血圧症の兆候を示している対象に投与された場合に、当該物質非投与の場合と比較して、前記投与された対象における肝硬変への移行もしくは肝硬変の進行および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行がそれぞれ抑制されることを意味する。
【００２９】
また、本発明における「薬学的に許容される塩」とは、ある物質の塩が対象に投与された場合に、当該塩が当該物質から所望される薬効を発揮する場合の前記塩を意味する。  
本発明における「肝炎もしくは肝硬変の兆候を示している対象、慢性膵炎の兆候を示している対象または肺高血圧症の兆候を示している対象」には、肝炎もしくは肝硬変、慢性膵炎または肺高血圧症に罹患しているヒトおよび動物がそれぞれ包含される。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、肝臓および／または膵臓および／または肺における線維化を抑制することができる。また、本発明によれば、従来不可能であった肝炎から肝硬変の進行の抑制および／または慢性膵炎の進行の抑制および／または肺高血圧症の進行の抑制が、薬剤の経口投与などの投与によって、重篤な副作用を伴うことなく可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の線維化抑制剤の有効成分である式Ｉの化合物には、各鏡像異性体およびラセミ体が包含される。また、該式Ｉの化合物において、Ｘは
【化５】
0003700854.tif 000006
または
0003700854.tif 000007
である。これらのうち、
【化６】
0003700854.tif 000008
は、高い線維化抑制効果を与えるため好ましい。
Ｒ１はハロゲンによって置換されているベンゾフラニル、またはハロゲンによって置換されているスチリルである。これらのうち、２−（４−クロロフェニル）エテニルは、高い線維化抑制効果を与えるため好ましい。したがって、Ｘが
【化７】
0003700854.tif 000009
であり、Ｒ１２が下記式で表される２−（４−クロロフェニル）エテニルである本願発明の抑制剤は、とくに好ましい。
【化８】
0003700854.tif 000010
【００３２】
Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−または−ＳＯ２−であある。これらのうち、Ｙが−Ｏ−であるものは、高い線維化抑制効果を与えるため好ましい。
また、本発明の線維化抑制剤の有効成分である化合物Ｉおよび薬学的に許容されるその塩において、Ｒ２は
（１）炭素数１〜６のアルキルまたはハロアルキル、
（２）１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシ、ハロアルキルもしくはハロアルコキシまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいヘテロ環基、または
（３）１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシもしくはハロアルキルまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいアリール基、
である。
【００３３】
前記Ｒ２に包含されるヘテロ環基のうち、１個または２個以上の、炭素数１〜６のアルキル、アルコキシ、ハロアルキルもしくはハロアルコキシまたはハロゲンによって任意に置換されていてもよいヘテロ環基は好ましい。
前記ヘテロ環基のうち、ピリジル、ピラジニル、チアゾリル、ピリダジニルおよびピリミジニルならびに１個または２個以上の炭素数１〜６のアルキル、ハロアルキルもしくはハロアルコキシまたはハロゲンからなる群から選択される置換基を有する前記ヘテロ環基は好ましく、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニルおよびピリミジニルの含窒素ヘテロ環基はさらに好ましい。
さらに、前記置換または無置換のヘテロ環基のうち、１個または２個以上の置換基を有するヘテロ環基は好ましく、１個または２個以上の置換基を有する含窒素ヘテロ環基はさらに好ましい。Ｒ２が１個または２個以上の置換基を有するピリミジニルであるものはとくに好ましい。
【００３４】
前記ヘテロ環基の前記置換基としては、炭素数１〜６のハロアルキルもしくはハロアルコキシまたはハロゲンが好ましく、前記ハロアルキルはとくに好ましい。さらに好ましい前記置換基はトリフルオロメチル基である。
Ｒ２は、最も好ましくは、６−（トリフルオロメチル）−４−ピリミジニルである。
したがって、最も好ましい−Ｙ−Ｒ２は、下記式で表される−Ｏ−６−（トリフルオロメチル）−４−ピリミジニルである。
【００３５】
【化９】
0003700854.tif 000011
【００３６】
本願発明の線維化抑制剤のうち、とくに肝繊維化抑制活性を有するものは、肝炎から肝硬変の進行および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行をより効果的に抑制することができるため好ましい。
すなわち、線維化抑制剤は、肝硬変の進行および／または慢性膵炎の進行および／または肺高血圧症の進行の抑制に用いることができる。
【００３７】
とくに、式Ｉの化合物が（２Ｅ）−３−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｓ）−２−オキソ−２−｛［２−オキソ−２−（４−｛［６−（トリフルオロメチル）−４−ピリミジニル］オキシ｝−１−ピペリジニル）エチル］アミノ｝−１−（２−ピリジルメチル）エチル］−２−プロペンアミドまたはその塩である線維化抑制剤によれば、肝硬変の進行および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を極めて効果的に抑制することができる。
したがって、本願発明の線維化抑制剤の最も好ましい有効成分は、下記式ＩＩの化合物である。
【化１０】
0003700854.tif 000012
【００３８】
式Ｉの化合物のうち、塩基に分類されるものは、例えば、エタノールなどの不活性溶媒中における等量の塩基および酸との反応と、引き続く蒸発により、酸を用いて対応する酸付加塩に変換することができる。この反応に好適な酸は、とくに、薬学的に許容し得る塩を提供するものである。したがって、酸付加塩として無機酸、例えば硫酸、硝酸、塩酸または臭化水素酸などのハロゲン化水素酸、オルトリン酸などのリン酸、または、スルファミン酸、さらにまた有機酸、特に脂肪族の、脂環式の、芳香族脂環式の、芳香族のまたは多環式の単塩基または多塩基カルボン酸、スルホン酸または硫酸、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタン−またはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンモノ−およびジスルホン酸、およびラウリルスルホン酸、との塩が挙げられる。
【００３９】
一方、式Ｉの化合物のうち、酸に分類されるものは、塩基を用いて、例えばエタノ−ルなどの不活性溶媒中での当量の酸と塩基の反応と、その後の留去によって関連する酸付加塩へ変換できる。この反応に適した塩基は、特に、生理学的に許容し得る塩を与えるものである。
したがって、式Iの化合物の酸は、塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウム）を用いて、対応する金属塩、とくにアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、または対応するアンモニウム塩に変換できる。
この反応にはとくに有機塩基が好適であり、例えば、エタノールアミンなどの生理学的に許容し得る塩を与える有機塩基が好適である。
【００４０】
本発明の線維化抑制剤を含む医薬によれば、有効成分を効果的に送達することができるため、肝炎から肝硬変の進行および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を極めて効果的に抑制することができる。
【００４１】
本発明の肝硬変の進行および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬は、有効成分として前記化合物または薬学的に許容されるその塩を含む線維化抑制剤を含む医薬である。これらの医薬は、ヒト医薬または獣医薬として効果的に用いることができる。本発明の医薬を製剤化する場合に好適な賦形剤は、経腸（例えば経口）、非経口または局所投与に好適で、前記化合物と反応しない有機または無機物質、例えば水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、乳糖またはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはワセリンである。
【００４２】
経口投与に好適なのは、特に錠剤、ピル、被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、ジュース、溶液、懸濁液またはドロップであり、直腸投与に好適なのは坐剤であり、非経口投与に好適なのは、溶液、好ましくはオイルベースのまたは水性の溶液、さらにまた懸濁液、エマルションまたは移植片であり、そして局所適用に好適なのは、軟膏、クリームまたはパウダーであり、またはパッチで経皮的になされるものである。
【００４３】
本発明の医薬の投与形態としては、本発明の線維化抑制剤が経口投与において活性を発現すること、および投与の簡便さの観点から経口投与が好ましい。かかる経口投与は対象自身によって極めて簡便に行えるため、通院の手間が省けるなどのコンプライアンスの向上の観点からも好適である。
【００４４】
本発明による線維化抑制剤の有効成分である式Ｉの化合物およびその塩は、凍結乾燥してもよく、精製した凍結乾燥物を、例えば、注射製剤の製造に使用してもよい。示された前記製剤は、滅菌してもよく、および／または、潤滑剤、保存剤、安定剤などの助剤、および／または、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変更するための塩、緩衝物質、着色剤および風味剤、および／または、多数のさらなる活性成分、例えば１種または２種以上のビタミンを含んでもよい。
エアロゾル又はスプレーの形態での投与のための好適な製剤は、例えば、薬学的に許容し得る溶媒中の式Ｉで表される活性成分の溶液、懸濁液またはエマルジョンである。
【００４５】
一般的に、本発明の線維化抑制剤は、好ましくは用量単位あたり、有効成分の量として１〜５００ｍｇ、特に好ましくは５〜１００ｍｇの用量で投与される。日量は、体重１ｋｇあたり約０．０１〜１００ｍｇであり、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．１〜８０ｍｇであり、特に好ましくは体重１ｋｇあたり約１〜７０ｍｇである。しかしながら、各患者への具体的な用量は、広範な因子、例えば、用いられる具体的な化合物の有効性、年齢、体重、健康の一般状態、性別、食餌、投与の時間および方法、排泄率、医薬の組合せおよび治療が適用される特定の疾患の重篤度に左右される。経口投与が好ましい。
【００４６】
したがって、本発明はさらにまた、本発明の線維化抑制剤の、肝硬変の進行および／または慢性膵炎および／または肺高血圧症の進行を抑制するための医薬の製造、特に非化学的方法によるものへの使用に関する。この場合、これらの線維化抑制剤の有効成分である化合物およびその塩は、少なくとも１種の固形、液状および／または半液状賦形剤または助剤と共に、そして、所望ならば１種または２種以上のさらなる活性成分との組合せで好適な用量形態に変換することができる。
【００４７】
本発明の線維化抑制剤の有効成分である化合物および薬学的に許容されるその塩は、以下に示すように、典型的には対応するカルボン酸およびカルボキシラートとの反応によって以下のように得られる。
【００４８】
中間体１  ベンジル({(2S)-2-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-3-(2-ピリジル)プロパノイル} アミノ)アセタート
(2S)-2-[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]-3-(2-ピリジル)プロピオン酸(55.0g)、グリシンベンジルエステルトシラート(69.7g)およびジフェニルホスホリルアジド(46.7ml)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(550ml)に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(75.6ml)を４℃において滴下添加した。混合物を室温に温め、３時間攪拌した。生成した混合物を氷冷炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(700ml)に注入した。混合物をエチルアセタート(全量1.3L)を用いて２回抽出し、水、塩化アンモニウム飽和水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液(300ml x 2)およびブライン(40ml)によって洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、濃縮して前記目的化合物を淡褐色結晶として得た(77.4g)。
ESI-MS: 414.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.48(dd,J=5,2Hz,1H),7.82(br,1H),7.60(td,J=8,2Hz,1H),7.40-7.29(m,5H),7.21(d,J=8Hz,1H),7.14(dd,J=8,5Hz,1H),6.33(br,1H),5.15(s,2H),4.62(br,1H),4.04(d,J=6Hz,2H),3.36-3.18(m,2H),1.43(s,9H).
【００４９】
中間体2  ベンジル{[(2S)-2 アミノ-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}アセタートジヒドロクロリド
ベンジル({(2S)-2-[(tert-ブトキシカルボニル)-アミノ]-3-(2-ピリジル)プロパノイル} アミノ)アセタート（73.8g）のエチルアセタート溶液(150ml)に、４Ｎ塩化水素のエチルアセタート溶液(669ml)を10℃において30分間にわたり滴下添加した。混合物を室温に温め、３時間攪拌した。混合物をエチルアセタート(300ml)によって希釈した。生成した沈殿をろ過によって回収し、エチルアセタート(700ml)によって洗浄し、真空化にて乾燥し前記目的化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6）δ9.31(t,J=6Hz,1H),8.83(d,J=5Hz,1H),8.70(br,3H),8.40(t,J=8Hz,1H),7.96(d,J=8Hz,1H),7.87(t,J=5Hz,1H),7.41-7.30(m,5H),5.14(s,2H),4.53(br,1H),4.05(dd,J=18,6Hz,1H),3.99(dd,J=18,6Hz,1H),3.64(dd,J=15,5Hz,1H),3.54(dd,J=15,8Hz,1H).
【００５０】
中間体3  ベンジル{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]-アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}アセタート
4-クロロケイ皮酸(49.2g)のジクロロメタン溶液(400ml)に、オキサリルクロリド(30.5ml)および１滴のN,N-ジメチルホルムアミドを添加し、混合物を室温下にて６時間攪拌した。混合物を蒸留して乾燥せしめ、酸塩化物残渣をジクロロメタン(900ml)に溶解した。この溶液にベンジル{[(2S)-2-アミノ-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}アセタート ジヒドロクロリド(104g)を１０℃にて添加し、トリエチルアミン(116ml)を40分間にわたって添加した。混合物を室温まで温め、２時間攪拌した。反応混合物を蒸留して乾燥せしめ、残渣を水(500ml x 5)およびテトラヒドロフラン-n-ヘキサン(1: 2,500ml x 10)を用いて洗浄し、真空化にて乾燥して前記目的化合物を白色固体として得た(115g)。
ESI-MS: 478.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.51(dd,J=5,2Hz,1H),8.27(t,J=5Hz,1H),7.83(d,J=6Hz,1H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.57(d,J=16Hz,1H),7.44(d,J=9Hz,2H),7.39-7.28(m,8H),7.19(dd,J=8,5Hz,1H),6.47(d,J=16Hz,1H),5.14(s,2H),4.98(app q,J=6Hz,1H),.4.07(d,J=5Hz,2H),3.36(dd,J=15,5Hz,1H),3.26(dd,J=15,6Hz,1H).
【００５１】
中間体4  {[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸
ベンジル{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}-アセタート(10.8,g)のメタノール懸濁液(200ml)に1N水酸化ナトリウム水溶液(22.6ml)を添加し、混合物を室温下にて５時間攪拌した。混合物を真空下にて濃縮し、残渣をクエン酸水溶液(10%,100ml)によって処理した。生成した白色沈殿をろ過によって回収し、テトラヒドロフラン-ヘキサン(1: 1,150ml)を用いて洗浄し、真空化にて乾燥し前記目的化合物を白色固体として得た(8.25g)。
ESI-MS: 388.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,DMSO-d612.6)δ(br,1H),8.50-8.36(m,3H),7.68(td,J=8,2Hz,1H),7.56(d,J=9Hz,2H),7.47(d,J=9Hz,2H),7.34(d,J=16Hz,1H),7.30(d,J=8Hz,1H),7.20(dd,J=8,5Hz,1%),6.68(d,J=16Hz,1H),4.96-4.86(m,1H),3.78(dd,J=18,6Hz,1H),3.74(dd,J=18,6Hz,1H),3.24(dd,J=14,5Hz,1H),2.99(dd,J=14,10Hz,1H).
【００５２】
中間体5  ベンジル{[(2S)-2-{[(5-クロロ-1-ベンゾフラン-2-イル)カルボニル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}アセタート
ベンジル{[(2S)-2-アミノ-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}アセタートジヒドロクロリドおよび5-クロロ-1-ベンゾフラン-2-カルボン酸から、中間体3と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 492.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.70-8.49(m,3H),7.71-7.62(m,2H),7.52-7.18(m,10H),5.16(s,2H),5.11-5.02(m,1H),4.19-4.03(m,2H),3.44(dd,J=15,4Hz,1H),3.35(dd,J=15,7Hz,1H).
【００５３】
中間体6  {[(2S)-2-{[(5-クロロ-1-ベンゾフラン-2-イル)カルボニル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸
ベンジル 1-[(2S)-2-{[(5-クロロ-1-ベンゾフラン-2-イル)カルボニル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]-アミノ}アセタートから、中間体4と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 402.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.6(br,1H),9.00(d,J=8Hz,1H),8.49(dd,J=5,2Hz,1H),8.46(t,J=6Hz,1H),7.88(d,J=2Hz,1H),7.72(d,J=9Hz,1H),7.67(td,J=8,2Hz,1H),7.53(d,J=lHz,1H),7.48(dd,J=9,2Hz,1H),7.33(d,J=8Hz,1H),7.20(dd,J=8,5Hz,1H),5.04-4.94(m,1H),3.80(dd,J=18,6Hz,1H),3.74(dd,J=18,6Hz,1H),3.32(dd,J=14,4Hz,1H),3.22(dd,J=14,10Hz,1H).
【００５４】
中間体7  tert-ブチル4-(1,3-チアゾール-2-イルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート
水酸化ナトリウム(約60% 油懸濁液、5.67g)のジメトキシエタンスラリー(40ml)に、tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラート(23.9g)のジメトキシエタン溶液(60ml)を30分間にわたり添加し、混合物をさらに１時間攪拌した。混合物に2−ブロモチアゾール(15.0g)を添加し、この混合物を４時間還流した。
冷却した後、生成した淡褐色の懸濁液をエーテル(300ml)によって希釈し、混合物をセライトパッドを通して濾過した。濾物をブラインを用いて洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、真空下にて濃縮した。油残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
(溶出液：15%エチルアセタートのn-ヘキサン溶液)によって精製し前記目的化合物を黄色油として得た(22.1g)。
ESI-MS:285.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.11(d,J=4Hz,1H),6.67(d,J=4Hz,1H),5.13(septet,J=4Hz,1H),3.73(ddd,J=14,7,4Hz,2H),3.32(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.08-1.96(m,2H),1.88-1.74(m,2H),1.47(s,9H).
【００５５】
参考例1 
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(1,3チアゾール-2-イルオキシ)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)-エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-(1,3-チアゾール-2-イルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート(2.93g)のエチルアセタート溶液(12ml)に４Ｎ塩化水素のエチルアセタート溶液(15ml)を１０℃にて滴下添加した.。混合物を室温下にて１時間攪拌し、さらに混合物を真空下にて濃縮し、乾燥した。黄色固体残渣をN,N-ジメチルホルムアミド(40ml)中の{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸(4.0g)、1-ヒドロキシベンゾニトリル(1.53g)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(2.17g)の氷冷混合物に添加した。混合物にN,N-ジイソプロピルエチルアミン(3.9ml)を滴下添加した。混合物を室温下にて２時間攪拌し、生成した混合物を炭酸水素ナトリウム氷冷飽和水溶液(200ml)に注入した。混合物をエチルアセタート(全量400ml)にて３回抽出し、塩化アンモニウム飽和水溶液(100ml),水(70ml x 3)およびブライン(20ml)によって洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ(溶出液：1%メタノールのクロロホルム溶液)によって精製し、エチルアセタート中にて再結晶せしめて前記目的化合物を淡黄色固体として得た(4.57g)。
ESI-MS: 554.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.55(dd,J=5,2Hz,1H),8.04-7.97(m,1H),7.96-7.88(m,1H),7.63(td,J=8,2Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=9Hz,2H),7.34(d,J=9Hz,2H),7.25(d,J=8Hz,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),7.10(d,J=4Hz,1H),6.68(d,J=4Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.25-5.15(br m,1H),5.06-4.99(m,1H),4.03(d,J=4Hz,2H),3.83-3.52(m,3H),3.43(dd,J=15,5Hz,1H),3.37-3.31(m,1H),3.26(dd,J=15,6Hz,1H),2.08-1.81(m,4H).
【００５６】
中間体８  tert-ブチル4-(2-ピラジニルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート
水酸化ナトリウム(約60%油懸濁液、114mg)のジメチルスルホキシドスラリー(5ml)にtert-ブチル-4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラート(576mg)を滴下添加した。相当量の泡状物が生成し、溶液 は淡橙色に変化した。この溶液に、クロロピラジン(377mg)を添加し、混合物を室温下にて１２時間攪拌した。生成した混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液およびエチルアセタートによって分配した。有機層を水およびブラインを用いて洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、真空下にて濃縮した。残渣固体をエチルアセタートおよびn-ヘキサンの混合物によって粉砕し、前記目的化合物を白色結晶として得た(472mg)。
ESI-MS: 280.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.20(d,J=lHz,1H),8.10(d,J=3Hz,1H),8.05(dd,J=3,lHz,1H),5.20(septet,J=4Hz,1H),3.84-3.72(m,2H),3.30(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.05-1.93(m,2H),1.81-1.68(m,2H),1.48(s,9H).
【００５７】
参考例3
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(2 ピラジニルオキシ)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)-エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-(2-ピラジニルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 549.4(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.22-8.20(m,1H),8.13(d,J=3Hz,1H),8.05(dd,J=3,lHz,1H),8.03-7.88(m,2H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.27(d,J=8Hz,1H),7.19(dd,J=8,5Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.33-5.22(m,1H),5.07-4.99(m,1H),4.05(appd,J=4Hz,2H),3.92-3.78(m,1H),3.68-3.52(m,2H),3.48-3.22(m,3H),2.07-1.92(m,2H),1.88-1.78(m,2H).
【００５８】
中間体９  tert-ブチル4-(4-ピリジルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび4-クロロピリジンヒドロクロリドから、中間体８と同様の方法によってから上記化合物を得た。
ESI-MS: 279.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.42(d,J=6Hz,2H),6.80(d,J=6Hz,2H),4.58(septet,J=4Hz,1H),3.69(ddd,J=14,8,4Hz,2H),3.37(ddd,J=l4/8s4Hz,2H),2.01-1.88(m,2H),1.84-1.69(m,2H),1.47(s,9H).
【００５９】
参考例5 
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(4-ピリジルオキシ)-1-ピペリジニル]エチル]アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-(4-ピリジルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 548.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.55(dd,J=5,2Hz,1H),8.43(dd,J=5,2Hz,2H),8.04-7.86(m,2H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.26(d,J=8Hz,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.79(dd,J=5,2Hz,2H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.06-4.98(m,1H),4.70-4.62(m,1H),4.12-3.96(m,2H),3.84-3.22(m,6H),1.98-1.79(m,4H).
【００６０】
中間体10   tert-ブチル4-(3-ピリジルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート 
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび3-フルオロピリジンから中間体８と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 279.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ 8.33-8.30(m,1H),8.22(dd,J=4,3Hz,1H),7.23-7.20(m,2H),4.51(septet,J=4Hz,1H),3.71(ddd,J=14,7,4Hz,2H),3.35(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.00-1.88(m,2H),1.83-1.70(m,2H),1.47(s,9H).
【００６１】
参考例7 
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(3-ピリジルオキシ)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-(3-ピリジルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 548.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.33-8.30(m,1H),8.24(dd,J=4,lHz,1H),8.06-7.87(m,2H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.29-7.16(m,5H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.06-4.99(m,1H),4.634.57(m,1H),4.13-3.97(m,2H),3.81-3.23(m,6H),1.99-1.81(m,.4H).
【００６２】
中間体11  tert-ブチル4-[(6-メトキシ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジン-カルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび2-クロロ-6-メトキシピリジンから、中間体8 と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 309.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.49(t,J=8Hz,1H),6.29(d,J=8Hz,2H),5.17(septet,J=4Hz,1H),3.88(s,3H),3.81-3.70(m,2H),3.31(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.04-1.92(m,2H),1.82-1.67(m,2H),1.47(s,9H).
【００６３】
参考例9
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-メトキシ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-[(6-メトキシ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 578.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCI3)δ 8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.04-7.86(m,2H),7.63(td,J=8,2Hz,K1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.53-7.42(m,3H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.26(d,J=8Hz,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),6.29(d,J=8Hz,2H),5.32-5.20(m,1H),5.06-4.98(m,1H),4.03(app d,J=4Hz,2H),3.86(s,3H),3.82-3.21(m,6H),2.02-1.74(m,4H).
【００６４】
中間体12  tert-ブチル3-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジン-カルボキシラート
tert-ブチル3-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび2,5-ジクロロピリジンから、中間体8と同様の方法によって上記化合物を得た。 
ESI-MS: 313.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.07(d,J=3Hz,1H),7.52(dd,J=9,3Hz,1H),6.66(d,J=9Hz,1H),4.99(br s,1H),3.90-3.10(br m,4H),2.10-1.70(br m,3H),1.60-1.50(m,1H),1.34(br s,9H).
【００６５】
参考例11
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{3-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル3-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび1 [(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 582.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.58-8.51(m,1H),8.10-7.81(m,3H),7.66-7.41(m,5H),7.34(d,J=8Hz,2H),7.25(d,J=8Hz,1H),7.20-7.14(m,1H),6.69-6.60(m,1H),6.53-6.44(m,1H),5.10-4.96(m,2H),4.16-3.80(m,2H),3.77-3.20(m,6H),2.10-1.50(m,4H).
【００６６】
中間体13  tert-ブチル4-(2-ピリジルオキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート
2-ヒドロキシピリジン(2.0g),、tert-ブチル4ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラート(5.3g)およびトリフェニルホスフィン(8.3g)のテトラヒドロフラン溶液(63ml)に、ジエチルアゾジカルボキシラート(5.5g)を８℃にて緩やかに添加し、混合物を室温下にて４時間攪拌した。反応混合物を真空下にて濃縮し、上記目的化合物の粗組成物を得、それをシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.16-8.10(m,1H),7.60-7.52(m,1H),6.88-6.81(m,1H),6.71(d,J=8Hz,1H),5.27-5.17(m,1H),3.85-3.70(m,2H),3.35-3.23(m,2H),2.05-1.90(m,2H),1.80-1.65(m,2H),1.47(s,9H).
【００６７】
中間体14  tert-ブチル4-[(6-メチル-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジン-カルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび2-ヒドロキシ-6-メチルピリジンから、中間体13と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.44(dd,J=8,8Hz,1H),6.68(d,J=8Hz,1H),6.49(d,J=8Hz,1H),5.26-5.16(m,1H),3.82-3.68(m,2H),3.353.24(m,2H),2.42(s,3H),2.02-1.90(m,2H),1.79-1.64(m,2H),1.47(s,9H).
【００６８】
参考例15
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-メチル-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-[(6-メチル-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 562(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.55(d,J=5Hz,1H),8.04-7.85(m,2H),7.63(dd,J=2,16Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.50-7.40(m,3H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.30-7.15(m,2H),6.70(d,J=8Hz,1H),6.55-6.45(m,2H),5.35-5.25(m,1H),5.07-4.98(m,1H),4.07-4.00(m,2H),3.86-3.72(m,1H),3.70-3.52(m,2H),3.48-3.20(m,3H),2.41(s,3H),2.01-1.71(m,4H).
【００６９】
中間体15  tert-ブチル4-[(6-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
ter-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび6-クロロ-2-ヒドロキシピリジンから、中間体13と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.50(dd,J=8,8Hz,1H),6.87(d,J=8Hz,1H),6.61(d,J=8Hz,1H),5.26-5.15(m,1H),3.80-3.68(m,2H),3.353.25(m,2H),2.03-1.90(m,2H),1.78-1.65(m,2H),1.47(s,9H).
【００７０】
参考例17 
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
ter-ブチル4-[(6-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 582(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.56(d,J=5Hz,1H),.8.04-7.87(m,2H),7.69-7.49(m,3H),7.46(d,J=8Hz,2H),7.36(d,J=8Hz,2H),7.30-7.15(m,2H),6.90(d,J=8Hz,1H),6.64(dd,J=2,8Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.35-5.25(m,1H),5.07-4.99(m,1H),4.08-4.00(m,2H),3.90-3.75(m,1H),3.67-3.50(m,2H),3.49-3.20(m,3H),2.06-1.90(m,2H),1.87-1.73(m,2H).
【００７１】
中間体16  tert-ブチル4-{[5-(トリフルオロメチル)-2-ピリジル]オキシ}-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび5-トリフルオロメチル-2-ヒドロキシピリジンから、中間体13と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.40(br s,1H),7.76(dd,J=2,8Hz,1H),6.69(d,J=8Hz,1H),5.33-5.23(m,1H),3.84-3.70(m,2H),3.35-3.23(m,2H),2.05-1.92(m,2H),1.80-1.66(m,2H),1.48(s,9H).
【００７２】
参考例19 
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-{[2-オキソ-2-(4-{[5-(トリフルオロメチル)-2-ピリジル]オキシ}-1-ピペリジニル)エチル]アミノ}-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-{[5-(トリフルオロメチル)-2-ピリジル]オキシ}-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 616(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)b 8.55(d,J=5Hz,1H),8.40(br s,1H),8.04-7.95(m,1H),7.91(d,J=8Hz,1H),7.77(dd,J=2,8Hz,1H),7.63(dd,J=2,16Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.29-7.15(m,2H),6.80(dd,J=2,8Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.41-5.30(m,1H),5.06-4.97(m,1H),4.08-4.00(m,2H),3.92-3.20(m,6H),2.06-1.92(m,2H),1.86-1.71(m,2H).
【００７３】
中間体17  tert-ブチル4-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジン-カルボキシラート
ter-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび5-クロロ-2-ヒドロキシピリジンから、中間体13と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.06(d,J=2Hz,1H),7.51(dd,J=2,8Hz,1H),6.67(d,J=8Hz,1H),5.20-5.10(m,1H),3.83-3.70(m,2H),3.333.20(m,2H),2.02-1.90(m,2H),1.77-1.64(m,2H),1.47(s,9H).
【００７４】
参考例21
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。 
ESI-MS: m/z 582(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.55(d,J=5Hz,1H),8.05(d,J=2Hz,1H),7.98(br s,1H),7.90(d,J=8Hz,1H),7.63(dd,J=2,16Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.52(dd,J=2,8Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.28-7.14(m,2H),6.66(dd,J=2,8Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.27-5.17(m,1H),5.06-4.97(m,1H),4.06-3.98(m,2H),3.90-3.75(m,1H),3.70-3.20(m,5H),2.03-1.70(m,4H).
【００７５】
中間体18  tert-ブチル4-フェノキシ-1-ピペリジンカルボキシラート 
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよびフェノールから、中間体13と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ7.32-7.20(m,2H),6.98-6.80(m,3H),4.50-4.41(m,1H),3.75-3.64(m,2H),3.39-3.27(m,2H),1.99-1.66(m,4H),1.47(s,9H).
【００７６】
参考例23
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-{[2-オキソ-2-(4-フェノキシ-1-ピペリジニル)エチル3アミノ}-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル−4-フェノキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。 
ESI-MS: m/z 547(M1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.55(d,J=5Hz,1H),8.05-7.82(m,2H),7.62(dd,J=2,16Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.12-7.38(m,6H),6.96(dd,J=8,8Hz,1H),6.90(d,J=8Hz,2H),6.49(dd,J=2,16Hz,1H),5.06-4.97(m,1H),4.60-4.50(m,1H),4.06-3.99(m,2H),3.81-3.52(m,3H),3.48-3.20(m,3H),1.90-1.79(m,4H).
【００７７】
中間体19  tert-ブチル4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジン-カルボキシラート(30.0g)、2,2,2-トリフルオロエタノール(149g)およびトリフェニルホスフィン(58.6g)のテトラヒドロフラン溶液(450ml)に、ジエチルアゾジカルボキシラート(38.9g)を ８℃にて.緩やかに添加した。混合物を室温下にて２時間、60℃にて８時間攪拌した。反応混合物を真空下にて濃縮し、上記目的化合物の組成物を得、それをシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ3.90-3.58(m,5H),3.20-3.10(m,2H),1.90-1.78(m,2H),1.65-1.50(m,2H),1.46(s,9H).
【００７８】
参考例25
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(2,2,2-トリフルオロエトキシ)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル-4-(2,2,2トリフルオロエトキシ)-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]-アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 553(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(d,J=5Hz,1H),8.05-7.82(m,2H),7.62(dd,J=2,16Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.34(d,J=8Hz,2H),7.28-7.13(m,2H),6.49(dd,J=2,16Hz,1H),5.05-4.95(m,1H),4.10-3.92(m,2H),3.90-3.63(m,4H),3.60-3.35(m,3H),3.30-3.16(m,2H),1.88-1.56(m,4H).
【００７９】
中間体20  tert-ブチル4-イソプロポキシ-1-ピペリジンカルボキシラート 
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび2-ヨードプロパンから、中間体7と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 3.87-3.73(m,2H),3.75-3.65(m,1H),3.55-3.45(m,1H),3.10-2.47(m,2H),1.85-1.40(m,4H),1.26(s,9H),1.15(d,J=7Hz,6H).
【００８０】
参考例27
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-{[2-(4-イソプロポキシ-1-ピペリジニル)-2-オキソエチル]アミノ}-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]アクリルアミド
tert-ブチル4-イソプロポキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 513(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.55(d,J=5Hz,1H),8.01-7.81(m,2H),7.66-7.55(m,2H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.14-7.27(m,2H),6.49(dd,J=2,16Hz,1H),5.05-4.97(m,1H),4.04-3.96(m,2H),3.90-3.31(m,6H),3.29-3.10(m,2H),1.82-1.45(m,4H),1.14(d,J=7Hz,6H).
【００８１】
中間体21  tert-ブチル4-ブトキシ-1-ピペリジンカルボキシラート 
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび1-ヨードブタンから、中間体7と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ3.82-3.70(m,2H),3.48-3.36(m,3H),3.12-3.00(m,2H),1.87-1.76(m,2H),1.46(s,9H),1.60-1.30(m,4H),0.98-0.80(m,5H).
【００８２】
参考例29
(2E)-N-[(1S)-2-{[2-(4-ブトキシ-1-ピペリジニル)-2-オキソエチル]-アミノ}-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-3-(4-クロロフェニル)アクリルアミド
tert-ブチル4-ブトキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 527(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(d,J=5Hz,1H),8.01-7.82(m,2H),7.62(dd,J=2,16Hz,1H),7.60(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.32-7.14(m,2H),6.49(dd,J=2,16Hz,1H),5.05-4.95(m,1H),4.05-3.95(m,2H),3.84-3.69(m,1H),3.59-3.11(m,8H),1.84-1.70(m,2H),1.44-1.29(m,4H),0.91(t,J=7Hz,3H).
【００８３】
中間体22  tert-ブチル4-[(6-クロロ-2-ピラジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび2,6-ジクロロピラジンから、中間体8と同様の方法によって上記化合物を得た。
SI-MS: 314.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.13(s,1H),8.10(s,1H),5.21(septet,J=4Hz,1H),3.82-3.70(m,2H),3.32(ddd,J=14,9,4Hz,2H),2.05-1.93(m,2H),1.82-1.68(m,2H),1.48(s,9H).
【００８４】
参考例31
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-クロロ-2-ピラジニル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
tert-ブチル4-[(6-クロロ-2-ピラジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 583.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.16(s,1H),8.11(d,J=1.5Hz,1H),8.02(s,1H),7.96-7.89(m,1H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=9Hz,2H),7.35(d,J=9Hz,2H),7.26(d,J=8Hz,1H),7.19(dd,J=8,5Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.33-5.22(m,1H),5.07-4.99(m,1H),4.05(appd,J=4Hz,2H),3.92-3.76(m,1H),3.67-3.51(m,2H),3.48-3.21(m,3H),2.06-1.92(m,2H),1.88-1.73(m,2H).
【００８５】
中間体23  tert-ブチル4-[(6-クロロ-3-ピリダジニル）オキシ]-1ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび3,6-ジクロロピリダジンから、中間体8と同様の方法によって上記化合物を得た。 
ESI-MS: 314.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.38(d,J=9Hz,1H),6.94(d,J=9Hz,1H),5.44(septet,J=4Hz,1H),3.87-3.73(br m,2H),3.26(ddd,J=14,9,4Hz,2H),2.13-2.02(m,2H),1.83-1.67(m,2H),1.48(s,9H).
【００８６】
参考例33
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-クロロ-3ピリダジニル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-[(6-クロロ-3-ピリダジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 583.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.51-8.46(m,2H),8.15-8.08(m,1H),7.82-7.78(m,1H),7.69(td,J=8,2Hz,1H),7.56(d,J=9Hz,2H),7.47(d,J=9Hz,2H),7.39-7.29(m,3H),7.20(dd,J=8,5Hz,1H),6.68(d,J=16Hz,1H),5.43-5.32(m,1H),5.00-4.90(m,1H),4.04-3.97(m,2H),3.95-3.84(m,1H),3.73-3.62(m,1H),3.41-3.22(m,3H),3.07-2.96(m,1H),2.14-1.95(m,2H),1.80-1.53(m,2H).
【００８７】
中間体24  tert-ブチル4-[(6-メトキシ-3-ピリダジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび3-クロロ-6-メトキシピリダジンから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 310.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ6.96-6.88(m,2H),5.31(tt,J=8,4Hz,1H),4.04(s,3H),3.89-3.75(br m,2H),3.22(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.13-2.01(m,2H),1.81-1.66(m,2H),1.47(s,9H).
【００８８】
参考例35
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-メトキシ-3-ピリダジニル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-[(6-メトキシ-3-ピリダジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 579.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.56(dd,J=5,2Hz,1H), 8.06-7.84(m,2H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.26(d,J=8Hz,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.97-6.86(m,2H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.42-5.31(m,1H),5.06-4.98(m,1H),4.06-3.89(m,3H),4.04(s,3H),3.66-3.56(m,1H),3.51-3.36(m,2H),3.35-3.20(m,2H),2.16-2.00(m,2H),1.87-1.72(m,2H).
【００８９】
中間体25  tert-ブチル4-[(3-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
ter-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび2,3-ジクロロピリジンから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 313.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.02(dd,J=5,2Hz,1H),7.63(dd,J=8,2Hz,1H),6.83(dd,J=8,5Hz,1H),5.32(tt,J=8,4Hz,1H); 3.71(ddd,J=14,8,4Hz,2H),3.41(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.02-1.89(m,2H),1.87-1.74(m,2H),1.48(s,9H).
【００９０】
参考例37
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(3-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-[(3-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 582.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.06-7.86(m,3H),7.68-7.57(m,3H),7.46(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.29-7.23(m,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.85(dd,J=8,5Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.44-5.34(m,1H),5.08-4.99(m,1H),4.14-3.95(m,2H),3.85-3.54(m,3H),3.49-3.20(m,3H),2.01-1.80(m,4H).
【００９１】
中間体26 tert-ブチル4-[(6-クロロ-4-ピリミジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
ter-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび4,6-ジクロロピリミジンから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 314.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(s,1H),6.76(s,1H),5.31(tt,J=8,4Hz,1H),3.84-3.70(m,2H),3.29(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.05-1.93(m,2H),1.81-1.66(m,2H),1.47(s,9H).
【００９２】
参考例39
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(6-クロロ-4-ピリミジニル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-[(6-クロロ-4-ピリミジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 583.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.57-8.56(m,1H),8.55(s,1H),8.05-7.99(m,1H),7.96-7.89(m,1H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=9Hz,2H),7.96-7.89(m,1H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=9Hz,2H),7.35(d,J=9Hz,2H),7.26(d,J=8Hz,1H),7.19(dd,J=8,5Hz,1H),6.76(appd,J=2Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.42-5.32(m,1H),5.07-4.98(m,1H),4.05(d,J=4Hz,2H),3.93-3.77(m,1H),3.65-3.47(m,2H),3.47-3.21(m,3H),2.07-1.91(m,2H),1.87-1.71(m,2H).
【００９３】
中間体27  tert-ブチル4-{[6-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジニル]オキシ}-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび6-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジノールから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 348.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.86(s,1H),7.06(s,1H),5.39(tt,J=8,4Hz,1H),3.85-3.72(m,2H),3.30(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.08-1.95(m,2H),1.84-1.68(m,2H),1.48(s,9H).
【００９４】
参考例41
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-{[2-オキソ-2-(4-{[6-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジニル]オキシ}-1-ピペリジニル)エチル]アミノ}-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
tert-ブチル4-{[6-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジニル]オキシ}-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 617.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.86(s,1H),8.57(dd,J=5,2Hz,1H),8.08-8.01(m,1H),7.98-7.89(m,1H),7.64(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=9Hz,2H),7.35(d,J=9Hz,2H),7.27(d,J=8Hz,1H),7.19(dd,J=8,5Hz,1H),7.07(s,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.51-5.41(m,1H),5.06-4.98(m,1H),4.05(d,J=4Hz,2H),3.96-3.80(m,1H),3.68-3.50(m,2H),3.50-3.21(m,3H),2.10-1.95(m,2H),1.90-1.74(m,2H).
【００９５】
中間体28  tert-ブチル4-{[2-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジニル]オキシ}-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび4-ヒドロキシ-2-(トリフルオロメチル)ピリミジンから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 348.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.56(d,J=6Hz,1H),6.86(d,J=6Hz,1H),5.39(tt,J=8,4Hz,1H),3.83-3.71(m,2H),3.33(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.08-1.96(m,2H),1.84-1.68(m,2H),1.48(s,9H).
【００９６】
中間体29  tert-ブチル4-[(5-クロロ-2-ピラジニル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル−4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび5-クロロ-2-ピラジノールから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。5-クロロ-2-ピラジノール は、J.Org.Chem.29,2491-2492(1964)に記載の方法によって調製した。
ESI-MS: 314.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.07(d,J=lHz,1H),7.99(d,J=lHz,1H),5.14(tt,J=8,4Hz,1H),3.83-3.70(m,2H),3.29(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.03-1.91(m,2H),1.66-1.80(m,2H),1.48(s,9H).
【００９７】
中間体30  2-ブロモ-5-メチル-1,3-チアゾール
2-アミノ-5-メチル-1,3-チアゾール(11.7g)のアセトニトリル(200ml)溶液にtert-ブチル亜硝酸塩(8.33ml)を０℃において滴下添加し、臭化銅(II)(5g)を5分間にわたって添加した。０℃において３時間攪拌した後、混合物を濃縮し、１Ｎ塩酸およびエチルアセタートによって分配した。有機層を、水、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液およびブラインを用いて洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、セライトパッドを通してろ過し、真空下にて濃縮し、前記目的化合物をオイルとして得た(3.24g)
ESI-MS: 177.8(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.25(s,1H),2.44(s,3H).
【００９８】
中間体31  tert-ブチル4-[(5-メチル-1,3-チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび2-ブロモ-5-メチル-1,3-チアゾールから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 299.3(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 6.74(s,1H),5.06(tt,J=8,4Hz,1H),3.78-3.66(m,2H),3.30(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.31(s,3H),2.06-1.95(m,2H),1.85-1.72(m,2H),1.47(s,9H).
【００９９】
参考例45
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(5-メチル-1,3チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-[(5-メチル-1,3-チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 568.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(dd,J=5,2Hz,1H),8.04-7.97(m,1H),7.96-7.87(m,,1H),7.63(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.34(d,J=8Hz,2H),7.25(d,J=8Hz,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.73(app s,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.13(br s,1H),5.06-4.98(m,1H),4.03(app d,J=4Hz,2H),3.83-3.49(m,3H),3.43(dd,J=15,5Hz,1H),3.37-3.20(m,2H),2.31(d,J=lHz,3H),2.05-1.79(m,4H).
【０１００】
中間体32  tert-ブチル4-[(5-クロロ-1,3-チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-[(1,3-チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラート(8.0g)の酢酸溶液(80ml)をN-クロロスクシンイミド(4.5g)に滴下添加した。混合物を60-70℃に温め、５時間攪拌した。生成した混合物を(80g)および水(80ml)の混合物に注入し、エチルアセタートによって抽出した。有機層を真空下にて濃縮し、残渣をエチルアセタートに溶解した。溶液を1N水酸化ナトリウム溶液によって塩基化した。有機層をブラインを用いて洗浄し、無水硫酸マグネシウムによって乾燥し真空下にて濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ(溶出液：9%エチルアセタートのn-ヘキサン溶液)によって精製し、前記目的化合物を得た 白色結晶(5.56g)として得た。
ESI-MS: 319.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 6.93(s,1H),5.11(tt,J=8,4Hz,1H),3.79-3.63(m,2H),3.31(ddd,J=14,8,4Hz,2H),2.07-1.94(m,2H),1.87-1.72(m,2H),1.47(s,9H).
【０１０１】
参考例47
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(5-クロロ-1,3チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
tert-ブチル4-[(5-クロロ-1,3-チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 588.KM+H) 
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.55(dd,J=5,2Hz,1H),8.06-7.98(m,1H),7.95-7.88(m,1H),7.63(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.46(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.25(d,J=8Hz,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.92(s,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.235.13(m,1H),5.05-4.97(m,1H),4.03(app d,J=4Hz,2H),3.83-3.49(m,3H),3.48-3.20(m,3H),2.06-1.78(m,4H).
【０１０２】
中間体33  tert-ブチル(3R)-3-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピロリジンカルボキシラート
tert-ブチル(3R)-3ヒドロキシ-1-ピロリジンカルボキシラートおよび2,5-ジクロロピリジンから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 299.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.08(s,1H),7.53(d,J=9Hz,1H),6.69(d,J=9Hz,1H),5.49(br s,1H),3.71-3.40(m,4H),2.14(br s,2H),1.47(s,9H).
【０１０３】
中間体34  tert-ブチル(3S)-3-[(5-クロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピロリジンカルボキシラート
tert-ブチル(3S)-3ヒドロキシ-1-ピロリジンカルボキシラートおよび5-クロロ-2-ピリジノールから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 299.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.08(s,1H),7.53(d,J=9Hz,1H),6.68(d,J=9Hz,1H),5.48(br s,1H),3.69-3.42(m,4H),2.14(br s,2H),1.46(s,9H).
【０１０４】
中間体35  tert-ブチル(3R)-3-[(6-クロロ-2-ピラジニル）オキシ]-1-ピロリジンカルボキシラート
tert-ブチル(3R)-3ヒドロキシ-1-ピロリジンカルボキシラートおよび2,6-ジクロロピラジンから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.17(s,1H),7.12(s,1H),5.54(br s,1H),3.73-3.43(m,4H),2.26-2.12(m,2H),1.48(s,9H).
【０１０５】
中間体36  tert-ブチル(3R)-3-[(5-メチル-1,3-チアゾール-2-イル）オキシ]-1-ピロリジンカルボキシラート
tert-ブチル(3R)-3ヒドロキシ-1-ピロリジンカルボキシラートおよび2-ブロモ-5-メチル-1,3チアゾールから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 285.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ6.75(s,1H),5.46-5.40(m,1H),3.77-3.38(m,4H),2.31(s,3H),2.40-2.00(m,2H),1.47(s,9H).
【０１０６】
中間体37  tert-ブチル3-{[6-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジニル]oxy}-1-アゼチジンカルボキシラート
tert-ブチル3-ヒドロキシ1-アゼチジンカルボキシラートおよび6-(トリフルオロメチル)-4-ピリミジノールから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 320.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.87(s,1H),7.14(.s,1H),5.44(tt,J=7,4Hz,1H),4.37(dd,J=10,7Hz,2H),4.01(dd,J=10,4Hz,2H),1.45(s,9H).
【０１０７】
中間体38  3,5-ジクロロ-2-(4-ピペリジニルオキシ)ピリジンジヒドロクロリド
tert-ブチル−4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラート(0.5g)、3,5-ジクロロ-2-ピリドン(0.41g)およびトリフェニルホスフィン(0.98g)のテトラヒドロフラン溶液に、ジエチルアゾジカルボキシラート(0.65g)を８℃において緩やかに添加し、混合物を室温下にて４時間攪拌した。反応混合物を真空下にて濃縮し、粗組成物を得た。
粗組成物のメタノール溶液 (5ml)に、４Ｎ塩化水素のエチルアセタート 溶液(6.2ml)を８℃において添加した。混合物を室温下にて１時間攪拌し、真空下にて濃縮した。固体残渣をエチルアセタートによって洗浄し、前記目的化合物を得た(585mg)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.99(d,J=2Hz,1H),7.68(d,J=2Hz,1H),5.45-5.37(m,1H),3.45-3.29(m,4H),2.44-2.13(m,4H).
【０１０８】
参考例59
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(3,5-ジクロロ-2-ピリジル）オキシ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸(0.19g)、3,5-ジクロロ-2-(4-ピペリジニルオキシ)ピリジンジヒドロクロリド(0.16g)、1-ヒドロキシベンゾニトリル(0.084g)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(0.11g)の混合物のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(2.5ml)に、N,Nジイソプロピルエチルアミン(0.27ml)を８℃において滴下添加した。 混合物を室温下にて６時間攪拌し、混合物を氷水に注入しエチルアセタートによって抽出した。有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液およびブラインによって洗浄した。無水硫酸ナトリウムによって乾燥し、および真空下にて濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィによって精製し、前記目的化合物を得た(231mg)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.61-8.53(m,1H),8.07-7.85(m,3H),7.707.57(m,3H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.30-7.15(m,2H),6.51(dd,J=2,15Hz,1H),5.38-5.28(m,1H),5.07-4.98(m,1H),4.13-3.95(m,2H),3.85-3.20(m,6H),2.00-1.79(m,4H).
ESI-MS: m/z 616(M+1)
【０１０９】
中間体39  tert-ブチル4-( [3-(トリフルオロメチル)-2-ピリジルオキシ-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび3-(トリフルオロメチル)-2-ヒドロキシピリジンから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.33-8.24(m,1H),7.90-7.81(m,1H),6.996.90(m,1H),5.48-5.33(m,1H),3.63-3.44(m,4H),1.99-1.77(m,4H),1.47(s,9H).
【０１１０】
参考例61
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-{[2-オキソ-2-(4-{[3(トリフルオロメチル)-2-ピリジル]オキシ}-1-ピペリジニル)エチル]アミノ}-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
tert-ブチル4-{[3-(トリフルオロメチル)-2-ピリジル]オキシ}-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 616(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.59-8.53(m,1H),8.30-8.25(m,1H),8.067.83(m,3H),7.66-7.55(m,2H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.29-7.14(m,2H),7.00-6.93(m,1H),6.50(dd,J=15,3Hz,1H),5.55-5.45(m,1H),5.06-4.98(m,1H),4.14-3.90(m,3H),3.60-3.35(m,4H),3.30-3.20(m,1H),2.00-1.79(m,4H).
【０１１１】
中間体40  4-(4-フルオロフェノキシ)ピペリジン
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラート(2.0g)、4-フルオロフェノール(1.1g)およびトリフェニルホスフィン(3.9g)のテトラヒドロフラン溶液に、ジエチルアゾジカルボキシラート(2.6g)を８℃において緩やかに添加し、混合物を室温下にて４時間攪拌した。反応混合物を真空下にて濃縮し、粗組成物を得た。
粗組成物のエチルアセタート(5ml)およびメタノール(5ml)溶液に、４Ｎ塩化水素のエチルアセタート溶液(25ml)を８℃において添加した。混合物を室温下にて１時間攪拌した。混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液に注入しし、エチルアセタートによって抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、真空下にて濃縮し、前記目的化合物を得た(1.08g)。
【０１１２】
参考例63
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-({2-[4-(4-フルオロフェノキシ)-1-ピペリジニル]-2-オキソエチル} アミノ)-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
4-(4-フルオロフェノキシ)ピペリジンおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-2-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例５９と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 565(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.60-8.53(m,1H),8.07-7.85(2H,m),7.68-7.56(m,2H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.31-7.15(m,2H),7.04-6.93(m,2H),6.90-6.80(m,2H),6.50(dd,J=15,2Hz,1H),5.06-4.97(m,1H),4.50-4.40(m,1H),4.11-3.95(m,2H),3.79-3.20(m,6H),1.94-1.75(m,4H).
【０１１３】
中間体41  4-[4-(トリフルオロメチル)フェノキシ]ピペリジンヒドロクロリド
tert-ブチル4-ヒドロキシ1-ピペリジンカルボキシラートおよび4-(トリフルオロメチル)フェノールから、中間体３８と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ 7.67(d,J=8Hz,2H),7.19(d,J=8Hz,2H),4.85-4.737(m,1H),3.29-3.00(m,4H),2.20-2.05(m,2H),1.981.78(m,2H).
【０１１４】
参考例65
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-[(2-オキソ-2-{4-[4-(トリフルオロメチル)フェノキシ]-1-ピペリジニル}エチル)アミノ]-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
4-[4-(トリフルオロメチル)フェノキシ]ピペリジンヒドロクロリドおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例５９と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 615(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.60-8.53(m,1H),8.10-7.85(m,2H),7.68-7.51(m,4H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.30-7.15(m,2H),6.95(d,J=8Hz,2H),6.50(dd,J=15,2Hz,1H),5.07-4.97(m,1H),4.68-4.58(m,1H),4.09-3.97(m,2H),3.86-3.20(m,6H),1.99-1.78(m,4H).
【０１１５】
中間体42  tert-ブチル4-(4-クロロフェノキシ)-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-ヒドロキシ-1-ピペリジンカルボキシラートおよび4-クロロフェノールから、中間体１３と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.31-7.14(m,2H),6.74-6.60(m,2H),4.474.36(m,1H),3.75-3.61(m,2H),3.40-3.26(m,2H),1.97-1.84(m,2H),1.80-1.66(m,2H),1.47(s,9H).
【０１１６】
参考例67
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-({2-[4-(4-クロロフェノキシ)-1-ピペリジニル]-2-オキソエチル} アミノ)-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-(4-クロロフェノキシ)-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: m/z 581(M+1)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.60-8.51(m,1H),8.09-7.84(m,2H),7.68-7.55(m,2H),7.4.5(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.30-7.14(m,4H),6.83(d,J=8Hz,2H),6.50(d,J=15Hz,1H),5.05-4.97(m,1H),4.55-4.45(m,1H),4.11-3.94(m,2H),3.80-3.20(m,6H),1.91-1.73(m,4H).
【０１１７】
中間体43  tert-ブチル4-(2-ピリジルチオ)-1-ピペリジンカルボキシラート 
水酸化ナトリウム(約60%油懸濁液、397mg)のジメトキシエタンスラリー(4ml)に、2−ピリジンチオール(1.05g)の ジメトキシエタン溶液(6ml)を０℃において添加し、混合物を室温下にて１時間攪拌した。混合物にtert-ブチル-4-ブロモ-1-ピペリジンカルボキシラート(2.74g)を添加し、混合物を２時間還流した。冷却した後,生成した懸濁液をエーテルによって希釈し、セライトパッドによって濾過した。濾物をブラインを用いて洗浄した、無水硫酸マグネシウムによって乾燥し、真空下にて濃縮した。
残渣をシリカゲルクロマトグラフィ(溶出液：14%エチルアセタートのn-ヘキサン溶液)によって精製し、前記目的化合物を白色固体として得た(2.2g)。
ESI-MS: 295.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.42(dd,J=5,2Hz,1H),7.47(td,J=8,2Hz,1H),7.16(d,J=8Hz,1H),6.99(dd,J=8,5Hz,1H),4.06-3.83(m,3H),3.16-3.02(m,2H),2.12-2.00(m,2H),1.71-1.56(m,2H),1.46(s,9H).
【０１１８】
参考例69
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(2-ピリジルチオ)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
tert-ブチル4-(2-ピリジルチオ)-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-1 [(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}-酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 564.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(dd,J=5,2Hz,1H),8.41(dd,J=5,2Hz,1H),8.02-7.96(m,1H),7.95-7.88(m,1H),7.63(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.52-7.42(m,3H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.28-7.23(m,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),7.15(d,J=8Hz,1H),7.00(dd,J=8,5Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.06-4.97(m,1H),4.26-4.04(m,2H),4.02(appd,J=4Hz,2H),3.70-3.59(m,1H),3.43(dd,J=15,5Hz,1H),3.30-3.10(m,3H),2.19-2.02(m,2H),1.73-1.54(m,2H).
【０１１９】
参考例71
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(2-ピリジルスルホニル)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
2-(4-ピペリジニルスルホニル)ピリジンヒドロクロリドおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]-アミノ}酢酸から、参考例５９と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 596.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.75-8.80(m,1H),8.58-8.52(m,1H),8.127.82(m,4H),7.68-7.55(m,3H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.28-7.15(m,2H),6.54-6.44(m,1H),5.04-4.96(m,1H),4.684.56(m,1H),3.99(appd,J=4Hz,2H),3.88-3.67(m,2H),3.473.35(m,1H),3.29-3.19(m,1H),3.11-2.97(m,1H),2.74-2.61(m,1H),2.12-1.90(m,2H),1.86-1.68(m,2H).
【０１２０】
中間体44  tert-ブチル4-[(5-クロロ-2-ピリジル)チオ]-1-ピペリジンカルボキシラート
tert-ブチル4-メルカプト-1-ピペリジンカルボキシラートおよび2,5-ジクロロピリジンから、中間体７と同様の方法によって上記化合物を得た。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.38(dd,J=2,lHz,1H),7.45(dd,J=8,2Hz,1H),7.10(dd,J=8,lHz,1H),4.01-3.85(m,3H),3.14-3.00(m,2H),2.10-1.98(m,2H),1.70-1.58(m,2H),1.46(s,9H).
【０１２１】
参考例73
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(5-クロロ-2-ピリジル)チオ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル4-[(5-クロロ-2-ピリジル)チオ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)-プロパノイル} アミノ]酢酸から、参考例1と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 598.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.37(d,J=2Hz,1H),8.03-7.97(m,1H),7.95-7.89(m,1H),7.63(td,J=8,2Hz,1H),7.61(d,J=16Hz,1H),7.49-7.42(m,3H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.28-7.23(m,1H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),7.09(d,J=8Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.06-4.97(m,1H),4.27-4.14(m,1H),4.10-3.97(m,3H),3.703.58(m,1H),3.43(dd,J=15,5Hz,1H),3.30-3.07(m,3H),2.17-2.00(m,2H),1.72-1.54(m,2H).
【０１２２】
参考例75
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-オキソ-2-({2-オキソ-2-[4-(4-ピリジルチオ)-1-ピペリジニル]エチル} アミノ)-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
4-(4-ピペリジニルチオ)ピリジンジヒドロクロリドおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]-アミノ}酢酸から、参考例５９と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 564.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3）δ8.56(dd,J=5,2Hz,1H),8.45(d,J=6Hz,2H),8.08-7.88(m,1H),7.65(td,.J=8,2Hz,1H),7.62(d,J=16Hz,1H),7.47(d,J=8Hz,.2H),7.36(d,J=8Hz,2H),7.29-7.24(m,1H),7.20(dd,J=8,5Hz,1H),7.15(d,J=6Hz,1H),6.50(d,J=16Hz,1H),5.064.97(m,1H),4.27-4.13(m,1H),4.03(appd,J=4Hz,2H),3.75-3.52(m,2H),3.49-3.39(m,1H),3.31-3.11(m,3H),2.14-2.01(m, 2H),1.72-1.55(m,2H).
【０１２３】
参考例77
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-t(4クロロフェニル)チオ]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-1-(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド
tert-ブチル−4-[(4-クロロフェニル)チオ]-1-ピペリジンカルボキシラートおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例１と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 597.2(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(dd,J=5,2Hz,1H),8.03-7.85(m,2H),7.63(td,J=8,2Hz,1H),7.60(d,16Hz,1H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.37-7.22(m,7H),7.18(dd,J=8,5Hz,1H),6.49(d,J=16Hz,1H),5.04-4.96(m,1H),4.30-4.16(m,1H),3.99(appd,d=4Hz,2H),3.713.59(m,1H),3.47-3.37(m,1H),3.29-3.16(m,2H),3.15-2.91(m,2H),2.00-1.88(m,2H),1.59-1.42(m,2H).
【０１２４】
参考例79
(2E)-3-(4-クロロフェニル)-N-[(1S)-2-[(2-{4-[(4-クロロフェニル)スルホニル]-1-ピペリジニル}-2-オキソエチル)アミノ]-2-オキソ-{(2-ピリジルメチル)エチル]-2-プロペンアミド 
4-[(4-クロロフェニル)スルホニル]ピペリジンヒドロクロリドおよび{[(2S)-2-{[(2E)-3-(4-クロロフェニル)-2-プロペノイル]アミノ}-3-(2-ピリジル)-プロパノイル]アミノ}酢酸から、参考例５９と同様の方法によって上記化合物を得た。
ESI-MS: 629.1(M+H)
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.57-8.51(m,1H),8.05-7.83(m,2H),7.827.74(m,2H),7.67-7.52(m,4H),7.45(d,J=8Hz,2H),7.35(d,J=8Hz,2H),7.28-7.13(m,2H),6.53-6.43(m,1H),5.03-4.93(m,1H),4.71-4.57(m,1H),3.98(appd,J=4Hz,2H),3.86-3.75(m,1H),3.46-3.34(m,1H),3.29-3.19(m,1H),3.16-2.90(m,2H),2.65-2.50(m,1H),2.15-1.95(m,2H),1.69-1.49(m,2H).
【０１２５】
なお、他の参考例を製造する方法は、その全体が参考資料として本明細書に組み込まれる特許文献６に記載されている。
【実施例１】
【０１２６】
方  法
１  肝硬変モデル
体重２００ｇのラットにチオアセトアミド（ＴＡＡ）を２００ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回腹腔内投与し、１２週間投与することによって肝硬変を作成した。
２  ＮＯ合成酵素阻害剤および投与方法
誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤である式ＩＩの化合物（藤沢薬品工業より供与。以後ＦＲと略記）を３２ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回、連日経口投与した。なお、前記式ＩＩの化合物は、ポリエチレングリコールに溶解せしめた溶液の形態にて投与した。
３  実験群
実験群は３群設定した。
・ＴＡＡ単独群：ＴＡＡのみ投与（ｎ＝７）、・ＴＡＡ＋ＦＲ投与群：ＴＡＡとＦＲを投与（ｎ＝８）、・ＦＲ単独投与群：ＦＲのみ投与（ｎ＝５）。
４  サンプル
１２週目に犠牲死させ、肝重量、脾重量を測定した。肝組織の一部を凍結切片とホルマリン固定で保存した。同時に血液を採取し血清を分離して−８０℃で保存した。
【０１２７】
５  測定項目
・  組織学的検討
ＨＥ染色、Azan-Mallory染色
・  免疫組織学的検討
ｉＮＯＳ染色、ＴＧＦβ１染色
・  血液・生化学検査
血算として赤血球数、白血球数、血小板数を測定した。生化学検査としてＡＳＴ，  ＡＳＴ    Ｔ．Ｂｉｌを測定した。凝固系因子としてフィブリノーゲン、ＰＴ−ＩＮＲを測定した。
・  ＮＯｘ測定
ＮＯ産生量推定のために血清ＮＯｘを従来の方法（Greiss法）に準じて測定した。
・  ヒアルロン酸
肝線維化と類洞障害を示す指標としてヒアルロン酸値（ＨＡ）を測定した。
・  ＴＧＦβ測定
肝線維化に関与するサイトカインとしてＴＧＦβを測定した。  
測定値は平均値±標準偏差で表し、統計学的処理については一元配置分散分析、ｔ検定を用いＰ＜０．０５をもって有意とした。  
【０１２８】
結果
１  肝形態所見
犠牲死時の腹腔内所見ではＦＲ投与群では全例、形態的に正常肝であったが、ＴＡＡ群では全例肝硬変となって肝萎縮を認め、腹水の貯留と脾腫も認めた。一方、ＴＡＡ＋ＦＲ群では肝線維化は認めるもののＴＡＡ群に比して線維化は軽度で肝萎縮程度も僅かであり、腹水、脾腫は認めなかった（図１）。
組織学的検討では線維化、炎症細胞浸潤はＴＡＡ群では全てのラットで＋＋であったが、ＴＡＡ＋ＦＲ群ではいずれもＴＡＡ群に比較して軽度で＋程度であった（表１）。
【０１２９】
【表１】
0003700854.tif 000013
【０１３０】
２  肝重量、脾重量
肝重量を体重に対する比（肝重量／体重）で示すとＴＡＡ群では２．４±０．６％、ＴＡＡ＋ＦＲ群では３．５±０．５％、ＦＲ群では３．３±０．３％で、ＴＡＡ群は有意な肝萎縮を示した（図２）。同じく脾重量を体重に対する比（脾重量／体重）で示すとＴＡＡ群では０．４２±０．０８％、ＴＡＡ＋ＦＲ群では０．２８±０．０３％、ＦＲ群では０．１８±０．０１％で、ＴＡＡ群は有意に脾が腫大していた（図３）。
【０１３１】
２  Azan-Mallory染色
肝線維化の程度をAzan-Mallory染色にて検討した（図４）。ＴＡＡ群は肝硬変に進展しているため著明な線維成分の増生を認めたが、ＴＡＡ＋ＦＲ群では線維化が抑制されていた。線維化の程度を面積比率で割り出すと、ＴＡＡ群は２５．４５％であったが、ＴＡＡ＋ＦＲ群では９．６０％と有意に線維化の程度が低かった。
【０１３２】
３  血液・生化学検査
赤血球数はＦＲ群で７８７．６±３９．４×１０６／μｌ、ＴＡＡ＋ＦＲ群７７９．５±６８．８×１０６／μｌ、ＴＡＡ群６５６．４±５１．８×１０６／μｌで、ＴＡＡ＋ＦＲ群はＴＡＡ群に比較して有意に高かった。白血球数はＦＲ群で５３４０±７２６／μｌ、ＴＡＡ＋ＦＲ群１２５００±１４６４μｌ、ＴＡＡ群１２４５７±４１２５μｌで、ＴＡＡ＋ＦＲ群とＴＡＡ群では差はなかった（図５）。血小板数はＦＲ群で８８．１±５．７×１０４／μｌ、ＴＡＡ＋ＦＲ群８１．７±１１．８×１０４／μｌ、ＴＡＡ群５０．８±１４．１×１０４／μｌでＴＡＡ＋ＦＲ群はＴＡＡ群に比較して有意に高かった（図５）。
【０１３３】
生化学検査ではＡＳＴ、ＡＬＴはＦＲ群で１５２．０±２６．５  ＩＵ／Ｌ、３４±３．５  ＩＵ／Ｌ、ＴＡＡ＋ＦＲ群３１５．７±３３．４  ＩＵ／Ｌ、９８．２±１３．４  ＩＵ／Ｌ、ＴＡＡ群３５０．４±２９．４  ＩＵ／Ｌ、１０４．６  ±２０．５ＩＵ／Ｌで、ＴＡＡ＋ＦＲ群とＴＡＡ群では差はなかった（図６）。Ｔ．ＢｉｌはＦＲ群で０．１０±０，１３ｍｇ／ｍｌ、ＴＡＡ＋ＦＲ群で０．３５±０．１４ｍｇ／ｍｌ、ＴＡＡ群で０．６７±０．１３ｍｇ／ｍｌとＴＡＡ＋ＦＲ群はＴＡＡ群に比較して有意に低かった（図６）。
【０１３４】
凝固系因子としてフィブリノーゲンはＦＲ群で２８０．８±１５．１ｍｇ／ｍｌ、ＴＡＡ＋ＦＲ群で２０１．７±２９．４ｍｇ／ｍｌ、ＴＡＡ群で１７５．４±３７．８ｍｇ／ｍｌでＴＡＡ＋ＦＲ群で高い傾向にあったが有意差はなかった（図７）。ＰＴ−ＩＮＲはＦＲ群で１．８３±０．１１、ＴＡＡ＋ＦＲ群で２．８１±０．６９、ＴＡＡ群で２．９８±０．４６とＴＡＡ＋ＦＲ群はＴＡＡ群より有意に低かった（図７）。
【０１３５】
４  血清ＮＯｘ値
血清ＮＯｘはＦＲ群で６９．４±１９．４、ＴＡＡ＋ＦＲ群で７２．２±１３．１、ＴＡＡ群で９２．３±６７．０と３群間で有意差はなかった（図８）。
【０１３６】
５  ヒアルロン酸値
ヒアルロン酸値はＦＲ群で３６．４±４．３、ＴＡＡ＋ＦＲ群で１１０．０±３１．６、ＴＡＡ群で２９４．８±１５０．０と３群間でＴＡＡ＋ＦＲ群ではＴＡＡ群に比較して有意に減少していた（図９）。
【０１３７】
６  ＴＧＦβ１
ＴＧＦβ１はＦＲ群で５６．４±５２．６、ＴＡＡ＋ＦＲ群で８７．７±２０．９、ＴＡＡ群で１１０．０±７．４でＴＡＡ群はＦＲ群より有意に高値であった。ＴＡＡ群とＴＡＡ＋ＦＲ群では、ＴＡＡ＋ＦＲ群が低い傾向にあった（図１０）。すなわち、前記式ＩＩの化合物は、ＴＧＦβ１産生抑制活性を有することが推察された。
【０１３８】
７  ｉＮＯＳ免疫組織学的検討
ＴＡＡ群でｉＮＯＳ発現を免疫染色で認めたが、ＴＡＡ＋ＦＲ群ではｉＮＯＳ発現が減弱していた（図１１）。
【０１３９】
８  ＴＧＦβ１免疫組織学的検討
ＴＡＡ群では線維化を起こしている部位にＴＧＦβ１が強く染色されていたが、ＴＡＡ＋ＦＲ群では減弱していた（図１２）。
【０１４０】
（まとめ）
本発明者らは肝虚血再灌流障害において誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤による再灌流障害抑制を研究している過程で、侵襲が加わった状態では誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤が極めて有用な治療手段となることを認識してきた。そこで、この誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤の新たな可能性・発展性を追求するために、従来よりＮＯの関連については全く検討されていない肝線維化において、ＮＯとくに誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯが肝線維化に関与しているのかを検討した。
【０１４１】
本発明において、本発明者らは藤沢薬品が見いだした経口投与可能な誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤（式ＩＩの化合物）を用いて、主として当該化合物によってＴＧＦβ１産生および肝線維化を抑制できるか否かをラット肝硬変モデルを用いて検討した。誘導型ＮＯ合成酵素はモノマーであるときは非活性型であり、活性化するためにはダイマーとならなければならないが、式ＩＩの化合物は誘導型ＮＯ合成酵素のダイマー化を抑制することで酵素活性を阻害する薬剤である。
【０１４２】
ラット肝硬変を作成するに当たってはＴＡＡを週に２回、腹腔内投与することで作成した。本モデルは投与８週目で慢性肝炎となり、１２週目で完全に肝硬変となる。肝萎縮、脾腫、腹水を認め、組織学的には炎症細胞浸潤、強い繊維化を認め、ヒトの肝硬変に組織学的にかなり近いモデルと考えられている。本モデルにおいて式ＩＩの化合物を１日２回連日経口投与させたところ、式ＩＩの化合物の投与によって肝線維化が抑制されるという画期的な成果をえることができた。すなわち、式ＩＩの化合物の投与によって肝硬変への進展が抑制され、腹水・脾腫は認めず、肝線維化率も２５％から９．６％に軽減していた。また、血小板数低下、Ｔ．Ｂｉｌの上昇などの肝硬変における血液・生化学的検査異常値の改善も認めた。また、肝類洞障害指標であるヒアルロン酸値の上昇も著明に抑制されていた。以上の結果から、誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤は肝繊維化を抑制するという新たな事実が判明した。
【０１４３】
前述したように、肝線維化の病態にはＴＧＦβ１を中心的な役割を担っていることが明らかになっている。すなわち肝炎などの炎症が持続することでＴＧＦβ１の放出が増加すると、細胞外マトリックスの産生が促進されるとともに、細胞外マトリックスの分解系酵素の合成を抑制し、線維組織の蓄積をもたらすようになる。今回、本発明者らはＴＧＦβ１の発現を免疫染色法にて検討したところ、ＴＡＡ群では線維化部分に一致してＴＧＦβ１が著明に染色されていたが、ＴＡＡ＋ＦＲ投与群では染色性が減弱していた。また、血清ＴＧＦβ１は両群で有意差はないもののＴＡＡ＋ＦＲ投与群で低い傾向にあった。このようにＦＲは何らかの機序でＴＧＦβ１産生を抑制し、それによって星細胞からのコラーゲン産生を抑制している可能性が考えられる。
【０１４４】
ＴＡＡによる慢性的な炎症が誘導型ＮＯ合成酵素を誘導し、そこから産生されるＮＯがＴＧＦβ１の産生を促しているのかもしれない。確かに免疫組織染色学的検討では誘導型ＮＯ合成酵素はＴＡＡ投与群では著明な発現が見られたが、ＴＡＡ＋ＦＲ投与群では減弱していた。しかしながら、本発明者らは血清ＮＯｘを測定したがＦＲ群、ＴＡＡ群、ＴＡＡ＋ＦＲ投与群で差を認めなかった。一般的に肝硬変では誘導型ＮＯ合成酵素が発現するが、これは随伴するエンドトキシン血症などによって誘導される二次的な結果との報告もある。一方、侵襲によって発現する誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯはＴＮＦα、インターフェロンγなどのサイトカイン産生を新たに誘導するので、誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯが慢性的に微量にＴＧＦβ１産生させていることも考えられる。
【０１４５】
本実験で使用した式ＩＩの化合物および他の関連化合物は慢性的かつ持続的に誘導型ＮＯ合成酵素由来ＮＯ産生を低下させることでＴＧＦβ１の産生を低下させ、結果的に肝線維化を抑制することも考えられる。
一方、式ＩＩの化合物および他の関連化合物は誘導型ＮＯ合成酵素阻害とは全く無関係に直接的にＴＧＦβ１産生抑制に、もしくはコラーゲン産生抑制として働いている可能性も考えられる。
【０１４６】
仮に式ＩＩの化合物および他の関連化合物がＢ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎患者などの患者において臨床応用され肝硬変への移行が抑制されれば、肝硬変による肝不全症例の激減や、肝不全例に対する肝移植例の減少などが期待され、患者並びに医療財政におけるメリットは計り知れないものがある。また、Ｃ型慢性肝炎患者は肝硬変へと進展する過程で高率に肝癌が発生するが、肝硬変進展が抑制されることで肝癌発生も抑制されれば、肝癌発症予防という極めて重要な効果も期待される。そうような効果が臨床的に確認されれば、肝癌によって生命の危険をさらされる患者にとって福音といえる。
【０１４７】
さらに現時点における肝線維化抑制が臨床的に可能と考えられているのはインターフェロンαのみであるが、この薬剤は経口剤ではないので患者は通院しなくてはならず、発熱、血小板減少、自殺企図などの精神症状などの副作用も有する。一方、今回用いた誘導型ＮＯ合成酵素阻害剤であるＦＲは経口剤としての投与が可能であるため、通院回数が少なくてすみ患者への負担は軽減される。このような観点からも本薬剤が仮に臨床応用されれば極めて有用な薬剤となる。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明の線維化抑制による肝線維化抑制効果および／または膵線維化抑制効果および／または肺線維化抑制効果を有する組成物および治療法は、肝線維化抑制研究、膵線維化抑制研究および肺線維化抑制研究において、従来にない独創的なものである。したがって、本発明は、医薬産業などの関連産業の発展に寄与するところ極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】各処理群マウスの肝臓および脾臓を示す写真図である。
【図２】各処理群マウスの肝重量を示すグラフである。
【図３】各処理群マウスの脾重量を示すグラフである。
【図４】各処理群マウスの肝線維化の程度をAzan-Mallory染色して示す写真図である。
【図５】各処理群マウスの赤血球数、白血球数および血小板数を示す図である。
【図６】各処理群マウスの生化学検査結果を示す図である。
【図７】各処理群マウスの凝固因子量を示す図である。
【図８】各処理群マウスの血清ＮＯｘ値を示す図である。
【図９】各処理群マウスのヒアルロン酸値を示す図である。
【図１０】各処理群マウスのＴＧＦβ１産生の程度を示す図である。
【図１１】ｉＮＯＳ免疫組織学的検討結果を示す写真図である。
【図１２】ＴＧＦβ１免疫組織学的検討結果を示す写真図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003700854.tif 000025
【図９】
0003700854.tif 000026
【図１０】
0003700854.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
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