(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェロセン、フェロセン誘導体、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、キノンおよびキノン誘導体からなる群から選択されるメディエータが酵素の側鎖、又は本体及び側鎖に共有結合を介して導入された導電性酵素と、導電成分と、ビヒクルとを含んでなる、酵素電極用組成物。
【請求項２】
ビヒクルが、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ブチルセロソルブ、ブチルセロソルブアセテート又はベンゼンである請求項１記載の酵素電極用組成物。
【請求項３】
酵素がオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼである、請求項２記載の酵素電極用組成物。
【請求項４】
オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−またはＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコリンオキシダーゼからなる群から選択される、請求項３記載の酵素電極用組成物。
【請求項５】
デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項３記載の酵素電極用組成物。
【請求項６】
メディエータが下記式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して酵素の側鎖に導入されてなる、請求項２記載の酵素電極用組成物。
【化１】
0003717529.tif 000011
（ここで、ｎは１〜７の整数を表す。）
【請求項７】
酵素がグルコースオキシダーゼであり、メディエータがフェロセンまたはフェロセン誘導体であり、該メディエータが酵素本体に、そして請求項６で定義された式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して酵素の側鎖に導入されてなるものである、請求項６記載の酵素電極用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の酵素電極用組成物を基材に担持させてなる、酵素固定化電極。
【請求項９】
フェロセン、フェロセン誘導体、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、キノンおよびキノン誘導体からなる群から選択されるメディエータが酵素の側鎖、又は本体及び側鎖に共有結合を介して導入された導電性酵素。
【請求項１０】
酵素がオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼである、請求項９記載の導電性酵素。
【請求項１１】
オキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−またはＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコリンオキシダーゼからなる群から選択される、請求項１０記載の導電性酵素。
【請求項１２】
デヒドロゲナーゼが、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１０記載の導電性酵素。
【請求項１３】
メディエータが下記式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して酵素の側鎖に導入されてなる、請求項９記載の導電性酵素。
【化２】
0003717529.tif 000012
（ここで、ｎは１〜７の整数を表す。）
【請求項１４】
酵素がグルコースオキシダーゼであり、メディエータがフェロセンまたはフェロセン誘導体であり、該メディエータが請求項１３で定義された式（Ｉ）で表されるスペーサーを介して酵素の側鎖に導入されてなる、請求項９記載の導電性酵素。
【請求項１５】
請求項１４記載の導電性酵素の製造法であって、グルコースオキシダーゼを酸化剤で酸化し、グルコースオキシダーゼの糖鎖にアルデヒド基を形成し、該グルコースオキシダーゼと、次の式（II）：
【化３】
0003717529.tif 000013
（ここで、ｎは１〜７の整数を表す。）
で表されるジヒドラジド化合物とを反応させ、そして、フェロセンカルボン酸を反応させることを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生体試料中に含まれる特定成分を迅速かつ容易に定量することができる酵素センサーに関し、さらに詳しくは導電性酵素、それを用いた酵素固定化電極並びにその電極の製造のための酵素電極用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素の高い基質特異性を利用して種々の物質の存在量を測定する酵素センサーが知られており、例えばグルコースの定量分析に有用なセンサーが実用化されている。
現在実用化されている酵素センサーは、例えば酸化酵素を利用した場合、生成する過酸化水素、水素イオンまたは消費された酸素量を、過酸化水素電極、水素イオン電極または酸素電極によって電気化学的に検出することにより被測定物質を定量している。
【０００３】
このような酵素センサーは、被測定物質に対して高い基質特異性を有する酵素を基材に固定化し、試料中の被測定物質と酵素を接触させて、酵素の作用によって生じる物質を、例えば電気化学的に検出し、定量している。例えば、酸化酵素センサーは、酸化酵素を膜中に固定化し、その酵素膜を隔膜酸素電極上に装着して構成されている。基質である被測定物質が固定化された酵素の作用によって酸化されると、酵素膜に密着されている酸素電極の電流値が変化し、その値から基質の濃度が測定できるのである。
【０００４】
また、基質と酵素との反応を電極で容易に検出可能なようにメディエータをセンサー系に存在させることも行われている。例えば、人工メディエータを電極表面に薄膜状に塗布し、さらにその上を半透明膜で被膜する方法が提案されている（ＥＰ−７８６３６８１）。また、難水溶性のメディエータを電極中に含有させたり（Agric. Biol. Chem., 52, 1557(1988)）、水溶性のメディエータを電極に予め含有させた後、その電極表面にイオン性高分子と酵素とからなる組成物の薄膜を設けることで、電解液中にメディエータが溶出しないようにする方法（Agric. Biol. Chem., 52, 3187(1988)）などが提案されている。さらに酵素とフェロセンをパラフィンなどに混ぜてペースト状にしたものを電極に擦り込む方法が提案されている（Talania, Vol.38, No.1, 107-110(1991)）。
【０００５】
しかしながら、従来の酵素センサーに用いられる電極、とりわけメディエータを存在させた酵素電極の調製は一般に繁雑である。従って、安定して精度を得るためには、その製造過程において電極の品質管理に細心の注意が払われなければならなかった。また、従来の酵素センサーは電極としての寿命が十分でないとの問題点も指摘されていた。さらに、メディエータが電極から漏出することがあると、生体内での計測ができない。従って、メディエータを存在させる場合、その安定化も酵素センサー開発の重要な課題とされていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、調製が容易でかつ安定した性能が得られる酵素センサーとして用いられる酵素固定化電極を提供することを目的としている。
また本発明は、その酵素固定化電極に用いられる導電性酵素およびその製造のための酵素電極用組成物を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明による酵素電極用組成物は、導電性酵素と、導電成分と、ビヒクルとを含んでなるもの、である。
また、本発明による酵素固定化電極は、前記酵素電極用組成物を基材に担持させてなるもの、である。
【０００８】
さらに、本発明による導電性酵素は、酵素の側鎖および酵素本体にメディエータが共有結合を介して担持されてなるもの、である。
本発明による酵素電極用組成物をスクリーン印刷などの手法によって絶縁性基材に担持させると、電極を構成することができる。従って、本発明による酵素電極用組成物を用いれば簡便な方法によって、安定した性能の酵素センサー用電極を製造することができる。また、本発明による組成物は、スクリーン印刷という種々のパターンの電極を容易に製造することができる手法を利用できる点でも有利である。また、本発明による酵素電極用組成物を用いて得られた電極中ではメディエータが酵素に固定されているため、被検試料中へのメディエータの漏出がなく安定した性能の電極を得ることができる点でも優れる。
【０００９】
酵素電極用組成物
本発明による酵素電極用組成物は、被測定物質に基質特異性を有しかつ導電性を有する酵素を含んでなる。
ここで「導電性酵素」とは、その酵素がその系に存在する基質たる被測定物質の量に依存してその導電性を変化させる酵素を意味する。本発明において、導電性酵素とは、酵素それ自体が導電性を有するものに加え、各種メディエータで修飾された結果導電性が付与された酵素であってもよい。
【００１０】
ここで、メディエータで修飾された結果導電性を付与された酵素とは、次のようなものを意味する。一般に酵素の活性サイトは酵素たる蛋白質の内部に存在するため、その酵素の作用の結果生じる電子の受け渡しを外部から、例えば電極を通じて観察することは一般には難しい。酸化酵素の場合、その電子の受け渡しを、消費される酵素または発生した水素イオンもしくは過酸化水素の量を介して観察することも可能であるが、それらの量を系中で安定化させることが困難な場合も多い。従って、系中に存在する基質量を正確に反映する指標とはなりにくい。しかし、この活性サイトと電極との間の電子の動きを（例えばそれ自体が酸化または還元されて）媒介するメディエータを存在させると、活性サイトで生じる電子の動きを電極で安定して高い精度で観察することができる。よって、本発明においてメディエータで修飾された酵素とは、上記のような役割を担うメディエータで修飾され、その結果導電性を付与されたものを意味するものとする。
【００１１】
本発明において好ましい導電性酵素としては、このメディエータで修飾された酵素が挙げられる。この修飾酵素の態様としては、（１）酵素の側鎖（例えば、糖鎖、アルキル鎖、主鎖より枝分れしたペプチド鎖など）にメディエーターを共有結合を介して結合させたもの、（２）酵素の本体にメディエーターを共有結合を介して結合させたもの、さらに（３）酵素本体及び酵素の側鎖にメディエーターを共有結合を介して結合させたもの、の三態様が挙げられる。これらの態様において、メディエーターと酵素とは適当なスペーサーを介して結合していても良い。
【００１２】
本発明において、酵素は被測定物質との関係で適宜選択されてよく、またメディエータは上記役割を担うものであれば特に限定されない。
好ましい修飾酵素の具体例としては、メディエータで修飾されたオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼが挙げられる。ここでオキシダーゼの好ましい例としては、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−またはＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコリンオキシダーゼからなる群から選択されるものが挙げられる。また、デヒドロゲナーゼの好ましい例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるものが挙げられる。さらに、メディエータの好ましい例としては、フェロセン、フェロセン誘導体、ｐ−ベンゾキノン、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルファート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）などが挙げられる。特にフェロセンまたはその誘導体が好ましい。好ましいフェロセン誘導体としては、例えば１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセン酢酸、ヒドロキシエチルフェロセン、１，１’−ビス（ヒドロキシメチル）フェロセン、フェロセンモノカルボン酸、フェロセン１，１’−ジカルボン酸、クロロフェロセン、メチルトリメチルアミノフェロセンなどが挙げられる。
【００１３】
酵素とメディエータの組み合わせとしては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）とフェロセンまたはフェロセン誘導体との組み合わせ、あるいはフルクトースデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）とフェロセンまたはフェロセン誘導体との組合せが挙げられる。
より具体的にはＧＯＤは次の反応：
【００１４】
【化４】
0003717529.tif 000002
【００１５】
を触媒し、ＧＯＤとフェロセンの組み合わせは、電子を次のように運ぶ。
【００１６】
【化５】
0003717529.tif 000003
【００１７】
（式中、ＦＡＤはフラビンアデニンジヌクレオチドである）
また、ＦＤＨは、次の反応：
【００１８】
【化６】
0003717529.tif 000004
【００１９】
を触媒し、ＦＤＨとフェロセンの組み合わせは、電子を次のように運ぶ。
【００２０】
【化７】
0003717529.tif 000005
【００２１】
メディエータのフェロセンは過酸化水素と比較して低い電極電位でも測定可能であり、過酸化水素と類似した電位で還元される多くの物質（例えば、アスコルビン酸など）からの影響を受けることがない。
オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼへのメディエータの導入は、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼの酵素本体（例えば、リジン残基のアミノ基）および／または側鎖（例えば、糖鎖、アルキル鎖、主鎖より枝分れしたペプチド鎖など）に行われてよい。
【００２２】
さらにこの導入は適当なスペーサーを介して行われてもよい。特に、側鎖へのメディエータの導入はスペーサーを介して行われるのが好ましい。スペーサーとしては、イソプレン、ブタジエン、アセチレン、およびこれらの誘導体並びに各々のコポリマー等が挙げられるが、スペーサーの好ましい具体例としては、下記の式（Ｉ）で表されるスペーサーが挙げられる。
【００２３】
【化８】
0003717529.tif 000006
【００２４】
（ここで、ｎは１〜７の整数を表す）
好ましい修飾酵素の具体例としては、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼの酵素本体にリジン残基のアミノ基にフェロセンカルボン酸を酸アミド結合によって導入し、および／または、酵素の糖鎖を修飾して形成したアルデヒド基を利用して上記式（Ｉ）で表されるスペーサーを介してフェロセンカルボン酸を導入したものが挙げられる。
【００２５】
最も好ましくは、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼの酵素本体および糖鎖の両方に上記のようにフェロセンが導入されたものが挙げられる。この酵素本体および糖鎖にメディエータが導入された修飾酵素は新規であり、後記する酵素固定化電極において特に好ましい特性を有することから、本発明の一態様を構成する。
【００２６】
酵素に導入されるメディエータ量は特に限定されないが、酵素１分子に対するメディエータ分子の比が１：５０程度であるのが好ましく、特に酵素がオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼであり、メディエータがフェロセンである場合、その比は１：５〜２０程度が好ましく、より好ましくは１：１０〜１５程度である。
【００２７】
図１は、酵素の本体および／または側鎖にメディエータが導入された状態の模式図である。図中、（Ａ）は酵素の側鎖にメディエーターを共有結合させたモデル、（Ｂ）は酵素本体及び酵素の側鎖にメディエーターを共有結合させたモデル、（Ｃ）は酵素本体のみにメディエーターを共有結合させたモデルを表す。
本発明による酵素電極用組成物は、酵素に加え更に導電成分を含有する。この導電成分の好ましい具体例としては、カーボンパウダー、金、銀などの金属粉、ポリイオンコンプレックスまたは導電性ポリマーなどが挙げられる。
【００２８】
また、本発明による組成物は、後記する方法で基材に担持されることで電極とされる。従って、本発明による組成物は、酵素および導電性成分の他に、その基材への適用法に適した成分が添加されて組成物とされる。具体的には、適当なビヒクルに、導電性酵素および導電成分を分散させて組成物とされる。ビヒクルは有機系溶剤が好ましく、具体例としてはエタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、ペンタノール、ヘキサノール、ブチルセロソルブ、ブチルセロソルブアセテートまたはベンゼンなどが挙げられる。
【００２９】
さらに本発明による組成物には、適当な添加剤が添加されていてよい。例えば、ｐＨ緩衝剤（例えば、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝剤）、バインダ用レジン（例えば、ポリビニルブチラール樹脂）、界面活性剤（例えば、ノニオン系界面活性剤）または担体（フィラー）（例えば、結晶性セルロース）などが挙げられる。
【００３０】
本発明による組成物中の酵素の濃度は０．１〜１０％が好ましく、より好ましくは０．６％である。酵素の濃度を変化させることによりセンサーの応答特性を任意に決定することができる。また、導電成分の濃度は５〜５０％が好ましく、３０％が特に好ましい。
本発明による組成物はこれらの成分を適当な混合手段、例えば、アジテーター、ホモミクサー、三本ロールなどで混合して製造することができる。
【００３１】
酵素固定化電極の製造およびその用途
本発明による酵素電極用組成物は、それを基材に担持させることによって酵素固定化電極とすることができる。すなわち、組成物を基材に適用して、そのビヒクル成分を蒸発させて除くことによって、組成物を基材に担持させる。組成物の基材への適用方法は特に限定されないが、印刷技術に応用することができる。例えば、スクリーン印刷法、ローラーコーティング法、ディスペンサー法などの手法によって、組成物を基材に適用することができる。スクリーン印刷は、種々のパターンを比較的容易に印刷できる方法であることから特に好ましいといえる。
【００３２】
こうして得られた酵素固定化電極は、その基質の存在量を測定するためのセンサー用電極として利用することができる。酵素固定化電極は、固定化された酵素を介して検体試料中の基質の存在量に依存してその導電性を変化させる。従って、その導電性の変化を基質の濃度が既知の系で予め標準化しておき、その結果に基づいて基質濃度が未知の試料の基質濃度を測定することができる。具体的には、本発明によって得られた酵素固定化電極と、対向電極と、参照電極を用いた系によって、基質濃度と酵素固定化電極の導電率の変化とを測定すればよい。
【００３３】
図２は、センサー用電極の好ましい態様を示したものである。図２（ａ）は、基材１の上にスクリーン印刷の手法によって酵素電極用組成物を適用して、酵素固定化電極２を形成して得られた一極系電極であり、図２（ｂ）はその斜視図である。また、図２（ｃ）は、基材１の上に同様にスクリーン印刷の手法によって酵素電極用組成物を適用して酵素固定化電極２を形成し、さらに導電性酵素を含まない以外は酵素電極用組成物と同一の組成の組成物を同様の手法で適用して形成した対向電極３を同一の基材１上に設けた二極系電極であり、図２（ｄ）はその斜視図である。図２（ｃ）および（ｄ）の態様の場合、基材は絶縁性の物質であることが必要である。
【００３４】
さらにそれらのセンサー用電極を備えたセンサーの模式図は図３（Ａ）および（Ｂ）に示される通りである。電極５は本体部４と分離可能であり、電極５は使い捨て型とすることができる。
導電性酵素の製造
それ自体が導電性を有しない酵素の場合、メディエータを導入することにより導電性酵素とすることが出来る。酵素へのメディエータの導入は、上記したように酵素本体および側鎖のいずれに行ってもよく、またその導入は酵素本体または側鎖に存在する官能基（この官能基は酵素を酸化または還元して、もしくは酵素に存在する官能基と置換反応させることによって形成されたものであってもよい）と、メディエータに存在する官能基（この官能基もメディエータを酸化または還元して、もしくは酵素に存在する官能基と置換反応させることによって形成されたものであってもよい）とを反応させることによって行うことができる。
【００３５】
さらにメディエータのスペーサーを介しての導入も、そのスペーサーが有する官能基を利用して行うことができる。
酵素がオキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼである場合の反応の具体例を以下に示す。
（１）酵素の側鎖へのメディエーターの導入
まず、オキシダーゼまたはデヒドロゲナーゼの糖鎖を、酵素の性質を変化させないような溶媒（例えばリン酸緩衝液）中において、適当な酸化剤（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）で酸化し、糖鎖にアルデヒド基を形成する。次いでスペーサーとして次の式(II)：
【００３６】
【化９】
0003717529.tif 000007
【００３７】
で表されるジヒドラジドを、そのアルデヒド基に導入する。この反応物とメディエーターとしてのフェロセンカルボン酸とを適当な還元剤（例えば、シアノボロハイドライドナトリウム）または縮合剤（例えば、カルボジイミド）の存在下で反応させる。
（２）酵素の本体および側鎖へのメディエーターの導入（Ａ法）
まず前記（１）と同様の方法で酵素の側鎖にメディエーターを導入する。ついで酵素を変性剤（例えば、尿素）で処理してタンパク質内部を露出させ、Y.DeganiとA.Heller (J.Physical Chemistry,91,1285-1289(1987))によるカルボジイミド法に類似の方法で、フェロセンカルボン酸を酵素の本体と側鎖とに導入する。
【００３８】
（３）酵素の本体および側鎖へのメディエーターの導入（Ｂ法）
まず前記（１）と同様の方法で酵素の側鎖を酸化し、側鎖にアルデヒド基を形成する。次いで変性剤および縮合剤の存在下で前記式(II)で表されるジヒトラジドを酵素の側鎖に導入する。更に、変性されて側鎖にスペーサーが導入された酵素と、フェロセンカルボン酸と反応させる。
【００３９】
（４）酵素の本体へのメディエーターの導入
前記（２）に準じて行うことができる。すなわち、酵素を変性剤で処理してタンパク質内部を露出させ、ついでカルボジイミド法に類似の方法で、フェロセンカルボン酸を酵素本体に導入する。
【００４０】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下では次の略号を使用する。ＧＯＤ：グルコースオキシダーゼ、ＦＤＨ：フルクトースデヒドロゲナーゼ、ＨＥＰＥＳ：Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸。
【００４１】
実施例１  ＧＯＤ側鎖へのフェロセンの導入（その１）
（ａ）  ＧＯＤ（シグマ社製、TypeII、EC1.1.3.4.,Aspergillus niger、
１００mg) を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝液（１ml）に溶かし、予め前記と同様の緩衝液に溶かしておいた２０mM過ヨウ素酸ナトリウムと混合し、４℃で１時間放置した。続いてエチレングリコール（１００μｌ）を加えて酸化反応を停止させた。その後、更に４℃で３０分放置してから、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応混合物を４８時間以上かけて透析した。
【００４２】
（ｂ）  アジピルジヒドラジド（１００mg乾燥粉末）を上記の透析の済んだ溶液に溶かし、その溶液を室温下、暗所にて一晩放置した。この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら透析し、未反応のアジピルジヒドラジドを除いた。
（ｃ）  フェロセンカルボキシアルデヒド（濃度１mg／ml、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液２ml）を前記（ｂ）で得たＧＯＤヒドラジド溶液（２ml）に混合し、４℃暗所にて一晩反応させた。シアノボロハイドライドナトリウムを１０mMの最終濃度になるように混合し、１時間反応させた。次いでpH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応混合物を透析して、過剰のフェロセンカルボキシアルデヒドを除き側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００４３】
実施例２  ＧＯＤ側鎖へのフェロセンの導入（その２）
（ａ）  ＧＯＤ（シグマ社製、TypeII、EC1.1.3.4.,Aspergillus niger、５００mg) を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝液（５ml）に溶かし、泡立てないように４℃でよく攪拌した。予め前記と同様の緩衝液に溶かしておいた２０mM過ヨウ素酸ナトリウムを加え、４℃で１時間放置した。続いて反応を停止させるためにエチレングリコール（５００μｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応混合物を４８時間以上かけて透析した。
【００４４】
（ｂ）  アジピルジヒドラジド（５００mg乾燥粉末）を上記の透析の済んだ溶液に溶かし、その溶液を４℃で、一晩暗所で攪拌した。この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら４８時間以上透析し、未反応のアジピルジヒドラジドを除いた。
（ｃ）  あらかじめ１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５００mg）およびフェロセンカルボン酸（４５０mg）を０．１５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ml）に溶かしておき、pH７．３に調整した。このフェロセン溶液に、先の透析が完了した酵素溶液を混合し、途中２〜３回pHが７．３であることを確認しつつ４℃暗所にて一晩攪拌した。この酵素液について、リン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回以上交換しながら４８時間以上かけて再び透析を行なった。続いて未反応のフェロセンカルボン酸および他の低分子成分を除き、側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００４５】
実施例３  ＧＯＤ本体および側鎖へのフェロセンの導入（その１）
Y.DeganiとA.Heller(J.Physical Chemistry,91,1285-1289(1987)) による手法を参考にした。すなわち、フェロセンカルボン酸と酵素自身の遊離アミノ基とをカルボジイミド法にて反応させることにより、ＧＯＤ本体にフェロセンを結合させた。
【００４６】
（ａ）  実施例１（ａ）と同様にして過ヨウ素酸ナトリウムでＧＯＤの側鎖を酸化した。
（ｂ）  実施例１（ｂ）と同様にしてアジピルジヒドラジドを酸化したＧＯＤに反応させた。
（ｃ）  尿素（８１０mg）、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド；１００mg）およびフェロセンカルボン酸（８０mg）をpH７．３、０．１５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（４ml）中でソニケーションし、pH７．２〜７．３に再び合わせた。このpHでフェロセンカルボン酸を飽和させた。前記（ｂ）で得たＧＯＤヒドラジト溶液（２ml）を加え、必要に応じてpHを確認し、調整し、反応物を０℃下暗所にて一晩放置した。過剰量の試薬は、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応物を透析して、本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００４７】
また、アジピルジヒドラジド（ｎ＝４）に代えてスクシニルヒドラジド（ｎ＝２）を用いた以外は同様の方法で調製することによって、スペーサーがスクシニルヒドラジドである導電性酵素を得た。
比較例１
実施例３のアジピルジヒドラジド（ｎ＝４）に代えてオキサリルヒドラジド（ｎ＝０）およびセバシルヒドラジド（ｎ＝８）をスペーサーとして用いて導電性酵素の調製を試みた。しかしスペーサーがＧＯＤリン酸緩衝液に溶解しなかったため導電性酵素を調製することができなかった。
【００４８】
実施例４  ＧＯＤ本体および側鎖へのフェロセンの導入（その２）
酵素の酸化された側鎖のアルデヒド基（−ＣＨＯ）と、酵素本体の遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）との両方にアジピルジヒドラジドを反応させた。そしてフェロセンアルデヒドをヒドラジドと反応させた。
（ａ）  実施例１（ａ）と同様にして過ヨウ素酸ナトリウムでＧＯＤ側鎖の一部を酸化した。
【００４９】
（ｂ）  ０．５Ｍアジピルジヒドラジド（pH５に調製：２ml）、塩化ナトリウム（９mg）、前記（ａ）で得た酸化ＧＯＤ溶液（２ml）、１Ｍ水溶性カルボジイミド（１ml）および３Ｍ尿素を混合し、pHを５に調整した。室温下暗所にて４時間放置して反応を進めた。３０分おきにpHを５に調整した。４時間後、反応液をpH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応液を透析した。
【００５０】
（ｃ）  前記（ｂ）で得たＧＯＤヒドラジド溶液（２．５ml）を０．４mg／mlフェロセンカルボキシアルデヒド（２．５ml）と混合し、４℃暗所にて４時間反応させた。最終濃度が０．１mMになるようにシアノボロハイドライドナトリウムを加え、次いでpH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応液を透析して、本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００５１】
実施例５  ＧＯＤ本体および側鎖へのフェロセンの導入（その３）
（ａ）  ＧＯＤ（５００mg）を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝液（５ml）に溶かし、泡立てないように４℃でよく攪拌した。予め前記と同様の緩衝液に溶かしておいた２０mM過ヨウ素酸ナトリウムを加え、４℃で１時間放置した。続いて反応を停止させるためにエチレングリコール（５００μｌ）を加え、４℃で３０分間攪拌した。この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応混合物を４８時間以上かけて透析した。
【００５２】
（ｂ）  アジピルジヒドラジド（５００mg乾燥粉末）を上記の透析の済んだ溶液に溶かし、その溶液を４℃で、一晩暗所で攪拌した。この溶液を、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら４８時間以上透析し、未反応のアジピルジヒドラジドを除いた。
（ｃ）  尿素（４０５０mg）、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５００mg）およびフェロセンカルボン酸（４５０mg）を０．１５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ml）に溶かし、pH７．３に調整した。このフェロセン溶液に、先の透析が完了した溶液を混合し、途中２〜３回pHを確認しつつ４℃暗所にて一晩攪拌した。この酵素液について、リン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回以上交換しながら４８時間以上かけて再び透析を行なった。続いて未反応のフェロセンカルボン酸および他の低分子成分を除き、本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００５３】
実施例６  ＧＯＤ本体へのフェロセンの導入（その１）
ＧＯＤ（１００mg）を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝液（１ml）に溶かし、４℃でよく攪拌した。
尿素（８１０mg）、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド；１００mg）およびフェロセンカルボン酸（８０mg）をpH７．３、０．１５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（４ml）中でソニケーションし、pH７．２〜７．３に再び合わせた。このpHでフェロセンカルボン酸を飽和させた。前記ＧＯＤ溶液を加え、必要に応じてpHを確認し、調整し、反応物を０℃下暗所にて一晩放置した。過剰量の試薬は、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応物を透析して、本体にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００５４】
実施例７  ＧＯＤ本体へのフェロセンの導入（その２）
ＧＯＤ（５００mg）を０．１Ｍ、pH６．０のリン酸緩衝液（５ml）に溶かし、４℃でよく攪拌した。
尿素（４０５０mg）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（５００mg）およびフェロセンカルボン酸（４５０mg）を０．１５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ml）中に溶かし、pHを７．３に調整した。この溶液に前記ＧＯＤ溶液を加え、途中２〜３回pHを確認しつつ、４℃下暗所にて一晩放置した。過剰量の試薬は、pH６．０、０．１Ｍリン酸緩衝液を外液とし、その外液を４回交換しながら反応物を透析して、本体にフェロセンが導入されたＧＯＤを得た。
【００５５】
実施例８  ＦＤＨ側鎖へのフェロセンの導入
ＧＯＤに代えてＦＤＨを用いた以外は、実施例２と同様の方法で調製した。
実施例９  ＦＤＨ本体および側鎖へのフェロセンの導入
ＧＯＤに代えてＦＤＨを用いた以外は、実施例３および実施例４と同様の方法で調製した。
【００５６】
実施例１０  ＦＤＨ本体へのフェロセンの導入
ＧＯＤに代えてＦＤＨを用いた以外は、実施例６と同様の方法で調製した。
実施例１１  導電性酵素の評価（１）
金作用電極（直径１mm）、プラチナ対向電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用いたサイクリックボルタモメトリで、前記実施例で調製した導電性酵素を評価した。使用前に酸化アルミニウム（０．０７５μｍ）で作用電極を研磨した。測定は北斗電子ポテンシオシュタット／ガルバノシュタットモデルＨＡＢ−１５１とグラフテックＷＸ１２００記録計を用いて行なった。
【００５７】
修飾酵素溶液は実施例で得られたものを希釈することなく用いた。過酸化水素の妨害を避けるために、最終濃度で０．１mg／mlのカタラーゼを加えた。最初に、導電性酵素のサイクリックボルタモグラムを基質非存在下で測定した。次に最終濃度で１０mMになるようにグルコースまたはフルクトース溶液を加えてから、同一条件下でサイクリックボルタモグラムを測定した。測定中は酸素の影響を除くため、窒素によるバブリングを充分に行なった。
【００５８】
実施例１、２、３（スペーサーがアジピルジヒドラジド）、５、６および７の導電性酵素についての結果は、それぞれ図４、５、６、７、８および９に示される通りである。これらの図から明らかなように、基質としてグルコースが加えられることにより導電率の上昇が認められた。
なお、実施例２、５および７においては、金電極は直径５mmのものを用い、最終濃度８．２５×１０-2ｍＭになるようグルコース溶液を加えた。
【００５９】
また、フルクトースを基質とした場合も、同様に導電率の上昇が認められた。
実施例１２  導電性酵素の評価（２）
実施例３において調製した２種類の導電性酵素（スペーサーがアジピルジヒドラジド（ｎ＝４）である場合およびスクシニルヒドラジド（ｎ＝２）である場合）を評価した。最終濃度で１．０mg／mlになるようにグルコース溶液を加えた以外は、実施例１１と同様の方法でサイクリックボルタモグラムを測定した。
【００６０】
結果は図１０に示されるとおりである。スペーサーとしてアジピルジヒドラジドを用いた導電性酵素の方が、スクシニルヒドラジドを用いたものよりも高い応答を示した。
実施例１３  導電性酵素の評価（３）
実施例３の導電性酵素（スペーサーがアジピルジヒドラジド）を、グルコースの最終濃度が０、０．０２、０．０６、０．０８mg／mlの時のサイクリックボルタモグラムを測定することによって評価した。
【００６１】
グルコースの濃度を変化させた以外は実施例１１と同様の方法で測定を行った。
結果は図１１に示されるとおりである。導電性酵素が存在する溶液系におけるグルコース濃度と導電率の増加には、正の相関関係が見い出された。
実施例１４  導電性酵素の評価（４）
ＩＣＰ（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)分析によって、実施例２、５および７で調製された導電性酵素について、ＧＯＤ１分子あたり導入されているフェロセンの平均分子数を測定した。結果は、実施例２、５、７の導電性酵素に対してそれぞれ１１．８個、１４．２個、９．２個であった。これらの結果は導電率の増加（図５、７、９）と非常によく相関した。
【００６２】
比較例２
ＧＯＤとメディエータとを単に混在させた系を実施例１１と同様に評価した。すなわち、実施例１１と同一の評価装置で、次のような混合物の導電率の変化を測定した。
ＧＯＤ（未修飾）                    １００mg
フェロセン                              １mg
リン酸緩衝液（pH６．０、０．１Ｍ）    ３０ml
カタラーゼ                              ３mg
グルコース                              １０mM又は０mM
その結果は図１２に示される通りである。この図から明らかなように、ＧＯＤとメディエータであるフェロセンは、単に混在しているだけでは、ＧＯＤの導電率の変化にはほとんど寄与しないといえる。
【００６３】
また、ＧＯＤ（未修飾）、グルコースをそれぞれＦＤＨ（未修飾）、フルクトースに代えて上記比較例と同様に比較したが、応答の極めて低い観測結果であった。
実施例１５  センサー用電極の調製
実施例１〜７で得られた導電性酵素と、次表に示される成分とを混合して、組成物Ａを得た。また、導電性酵素を含まない以外は組成物Ａと同一組成の組成物Ｂも用意した。
【００６４】
0003717529.tif 000008
1)：クエン酸３０ｇ、クエン酸ナトリウム１２０ｇおよびアミルアルコール５０４ｇをボールミルポットに入れ３０時間以上かけてよく混合し、スラリー状にしたものを使用した。
【００６５】
2)：ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦコリドン９０）５０．４ｇ、ポリビニルブチラール（積水化学Ｂｘ−１）９．０ｇおよびアミルアルコール２８２．６ｇをアジテータでよく攪拌した後、一晩以上静置したものを使用した。
組成物ＡおよびＢをスクリーン印刷の手法を用いて基板に適用し、図２に示される一極系電極および二極系電極の二種類の電極を調製した。具体的には、スクリーンとしてテトロン、１２０メッシュ、１５０μｍ（膜厚）の版（株式会社ミノグループ）を、基版としてポリスチレンを用意し、特開昭６１−２８４６６１号の記載に準じてスクリーン印刷を行なった。印刷後、直ちに送風乾燥（室温、５分）し、次いで基板を幅３ｍｍ、長さ３０ｍｍ、厚さ１００μｍに断裁した。
【００６６】
実施例１６  電極の評価（１）
実施例１５で調製した一極系電極を金作用電極に代え、また実施例１５で調製した二極系電極を金作用電極および対向電極に代えた以外は、実施例１１と同様にして電極の評価を行った。なお、測定は接点を取り出さない側から電極を約２０ｍｍだけ試料に浸して行った。
【００６７】
導電性酵素として実施例３および実施例９で得られたものを含んだ組成物からそれぞれ得た電極の評価結果は、次の表２および表３にそれぞれに示される通りである。なお、表中の電流値は、電位差が＋４５０ｍＶの時の作用電極と対向電極との間に流れる電流である。
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実施例１７  電極の評価（２）
実施例２、５および７で得られた導電性酵素と、表４に示される成分とを混合して組成物Ｃを得た。また、修飾していないＧＯＤおよびフェロセンカルボン酸を用いた以外は組成物Ｃと同一組成の組成物Ｄも用意した。
【００６８】
0003717529.tif 000010
組成物Ｃを、スクリーンとして５mm角のパターンを用い、基板としてポリイミドフィルムを用いた以外は実施例１５と同様にしてスクリーン印刷を用い、図１３（ａ）に示されるような計１２個の電極を一つの基板上に作成した。その基板から図１３（ｂ）に示すような一個の電極を切り出した。この電極を用いて電位差を＋７００ｍＶとした以外は、実施例１６とほぼ同様にして、導電性酵素として実施例２、５および７で得られたものを含んだそれぞれの組成物から製造した電極の、グルコース濃度と電流値との関係を評価した。結果は、図１４に示される通りである。
【００６９】
比較例３
組成物Ｃの代わりに組成物Ｄを用いたこと、またスクリーンとして７mm角のパターンを用いたこと以外は、実施例１７と同様の方法で電極を作成した。この組成物Ｄから製造した電極のグルコース濃度と電流値との関係を、導電性酵素として実施例５で得られたものを含んだ組成物Ｃから製造した電極のそれと比較した。結果は、図１５に示されるとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素の本体および／または側鎖にメディエータが導入された状態の模式図である。
【図２】本発明によるセンサー用電極の好ましい態様を示す。図２（ａ）は基材１の上に酵素固定化電極２を形成して得られた一極系電極であり、図２（ｂ）はその斜視図である。また、図２（ｃ）は酵素固定化電極２を形成し、さらに導電性酵素を含まない以外は酵素電極用組成物と同一の組成の組成物を同様の手法で適用して形成した対向電極３を同一の基材１上に設けた二極系電極であり、図２（ｄ）はその斜視図である。
【図３】本発明によるセンサー用電極を備えたセンサーの模式図である。
【図４】実施例１で得られた側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図５】実施例２で得られた側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図６】実施例４で得られた本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図７】実施例５で得られた本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図８】実施例６で得られた本体にフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図９】実施例７で得られた本体にフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図１０】スペーサーの炭素数がｎ＝２またはｎ＝４である場合の、実施例３で得られた本体および側鎖のフェロセンが導入されたＧＯＤのサイクリックボルタモグラムである。
【図１１】実施例３で得られた本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤの、グルコース濃度を変化させた時の、サイクリックボルタモグラムである。
【図１２】ＧＯＤとメディエータとを単に混在させた系のサイクリックボルタモグラムである。
【図１３】実施例１７で製造した電極の模式図であり、（ａ）は一つの基板上に１２個の電極がスクリーン印刷により作られた電極群を示す。（ａ）において１０はポリイミドフィルムを表し、１１は電極組成物から得られた電極部であり、１２は銅はくを表わす。（ｂ）は、（ａ）の電極群から切り離して得られた１つの電極の図である。
【図１４】●は側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤ、■は本体および側鎖にフェロセンが導入されたＧＯＤ、□は本体にフェロセンが導入されたＧＯＤがそれぞれ固定された電極における、グルコース濃度と電流値の関係を表すグラフである。
【図１５】□は実施例５で得られた導電性酵素、▲は等量のＧＯＤとフェロセンとの混合物がそれぞれ固定された電極における、グルコース濃度と電流値の関係を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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