(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡを含むポリヌクレオチドワクチンであり、プラスミドベクターおよび該ＤＮＡプラスミドベクター中に存在する少なくとも１つの転写調節因子に操作可能に結合したヒト感染株由来のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする１以上のヌクレオチド配列を含み、該インフルエンザウイルスタンパク質がヘマグルチニンのＨ１ベースのサブタイプ以外のヘマグルチニンまたはノイラミダーゼであり、該ポリヌクレオチドワクチンを哺乳類に投与した場合に該哺乳類がインフルエンザウイルス関連疾患から防御されることを特徴とする前記ワクチン。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルスタンパク質がヘマグルチニンのＨ１ベースのサブタイプ以外のヘマグルチニンである請求項１に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスタンパク質がノイラミダーゼである請求項１に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項４】
前記組換えＤＮＡがＡ型およびＢ型ヒトインフルエンザウイルス由来の２以上の前記ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項５】
前記組換えＤＮＡが少なくとも２種類以上のヒトインフルエンザウイルス由来の２以上のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列がＨ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２またはＢ株のヒトインフルエンザウイルス由来である請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項７】
前記ＤＮＡプラスミドベクターがラウス肉腫ウイルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）のプロモーターを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項８】
前記ＤＮＡプラスミドベクターがサイトメガロウイルスプロモーターを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項９】
前記プラスミドベクターがＶ１Ｊｎｓである請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項１０】
前記プラスミドベクターが配列番号１０のＶ１Ｊである請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項１１】
前記プラスミドベクターが配列番号１８のＶ１Ｊ−ｎｅｏである請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項１２】
前記プラスミドベクターが配列番号４５のＶ１Ｒである請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項１３】
ａ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＰＡ−ＨＡ（この５’末端が配列番号２６であり、３’末端が配列番号２７である）；
ｂ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＧＡ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３）、構築物サイズ６．５６ Ｋｂ（この５’末端が配列番号４６であり、３’末端が配列番号４７である）；
ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０）、構築物サイズ６．６１ Ｋｂ（この５’末端が配列番号５０であり、３’末端が配列番号５１である）；
から成る群より選択される１以上のＤＮＡプラスミドを含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチン。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドワクチンの有効量を含む、インフルエンザウイルス感染に対して哺乳類を防御するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規の医薬製品、即ち脊椎動物生体組織中に直接導入した場合にヒトインフルエンザウイルスを特異的に認識する免疫反応の生成を誘発する核酸の製造及び使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インフルエンザはＡ又はＢ型インフルエンザウイルスによる気道の感染により引き起こされる急性発熱性疾患である。インフルエンザの大発生は殆ど毎年、周期的流行病又は汎性流行病を伴って全世界で起こる。インフルエンザは重篤な全身性症状、入院を要する重症疾患（例えばウイルス性肺炎）、及び二次細菌性肺炎のような合併症を引き起こし得る。最近の米国での流行の年で＞１０，０００（４０，０００まで）以上の死亡者を出しているが、非流行年の１年当たりの死亡は５，０００〜１０，０００名であると考えられる。インフルエンザ関連の罹患及び死亡を防止するための最良の方法はワクチン接種である。最新の認可ワクチンは卵中で増殖させ、次いで不活性化した３種類のウイルス株（Ａ株２種及びＢ株１種）を含むウイルスから得られる。３種類のワクチン：即ち全ウイルス、サブビリオン及び精製表面抗原が利用できる。全ウイルスワクチンでは発熱性反応が増大するため、小児に用いられるのは後者の２種のみである。９歳以下の小児は２段階の免疫化を要するが、一方成人は１回の注射だけでよい。しかしながら、老齢患者ではワクチン接種後の抗体力価が４か月又はそれ以前に防御レベル未満にまで減少した例があったことにより、“初秋にワクチン接種を受けた患者は冬又は初春に二次投与すると有効である”ことが示唆されている（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒ  ３２：８９−９０，Ｓｅｐｔ．１７，１９９３参照）。最近のウイルス株で臨床的に流行するものを予測し、新規の有毒株は来たるべきインフルエンザシーズンに優勢であると予期されるものに基づき、これらのワクチンを毎年再処方する。ワクチン再接種は毎年行なうよう推奨されている。
【０００３】
Ａ．認可ワクチンの限界：
１）特にＡ型インフルエンザでは抗原変異が生じ、以前のワクチン（又は以前の感染）により生じている抗体では中和されないウイルスを生じる。表面糖タンパク質（ヘマグルチニン［ＨＡ］及びニューラミニダーゼ）をコードする遺伝子の点突然変異（抗原連続変異）により及び再類別（抗原不連続変異）により新規の株が生じ、一方内部タンパク質は連続変異株及び不連続変異株内でも高度に保存される。免疫化は、細胞媒介免疫を基礎にした“異種”群間共通免疫ではなく、“同種”株特異性抗体媒介免疫を引き出すに過ぎない。
【０００４】
２）インフルエンザウイルスの優勢流行株が、ある年からその翌年にかけて有意に不連続変異又は連続変異しない場合でも、抗体力価が低減するため免疫化は毎年実施しなければならない。血球凝集阻止（ＨＩ）及び中和の抗体は数か月〜数年存続し、その後次第に低減することが幾人かにより報告されているけれども、Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓは、大きな連続変異又は不連続変異が認められなかった場合でも年に１度の免疫化を推奨する理由として、ワクチン接種後その年内に抗体力価が低減すると言及している（ＨＩ抗体は赤血球を凝集するインフルエンザウイルスの能力を阻害する。中和抗体と同じく、それはＨＡ抗原に主として対応する。血球凝集阻止試験は中和検定より容易に且つ低経費で実施し得るので、異なる株に対して反応するインフルエンザのある株に対して生じる抗体の能力を評価する手段としてしばしば用いられる）。上記のように、ある程度危険な状態にある老齢患者は、上記防御抗体力価の有効期間が短いために１シーズンに２回ワクチン接種すべきであると、上記Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒは示唆している。
【０００５】
３）ワクチンの有効性は満足なものではない。次シーズンのワクチンの開発は、来たるべき流行株を予測すること（アジアにおける監視サンプリングによる）に依っており、これは不正確で、ワクチン用に用いる株と実際に野外で流行するものとのとが余り適合しないということが起こり得る。さらに１９９２〜１９９３年のインフルエンザシーズン中に起きたように、新規のＨ３Ｎ２株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２）がインフルエンザシーズンの後期になってから臨床的に明らかになった。これは、抗原不連続変異のために昔のＨ３Ｎ２株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９）により誘発された抗体が、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２と交叉反応性が不十分となったためで、１９９３〜１９９４年ワクチンの組成の変更を促した。しかしながら、現在では認可ワクチンの製造及び調剤に時間を要するために、既存のワクチンによる防御が不十分であることが判明し、且つ新規流行中のＨ３Ｎ２株の被害が増大しているにもかかわらず、１９９２〜１９９３年シーズン中には新規のワクチン株は導入できなかった。
【０００６】
ワクチンと流行株とがよく適合した場合でも、認可ワクチンは健康な小児及び青年の約７０％、虚弱老齢者の３０〜４０％の疾患を予防するに過ぎない。したがって、ワクチン株が流行株に対応する場合にワクチンの効能を示すためには他の判定基準を用いる。これらの判定基準としては、重症疾患及び二次合併症の予防が挙げられるが、これらは入院防止（自宅生活年配者に関しては７０％、老人ホーム生活年配者に関しては５０〜６０％）及び死亡防止（老人ホーム居住者に関しては８０％）に反映される。老人ホームでの感染の蔓延を低減するための集団免疫は、免疫化のもう一つの利点であると考えられる。
【０００７】
Ｂ．理想的な普遍的インフルエンザワクチンの特性（本発明の目的）：
１）群共通（異種）防御の生成
普遍的ワクチンとは、例えばＨ３Ｎ２サブタイプ内の、そしてできればサブタイプ間でも、例えばＨ１Ｎ１からＨ３Ｎ２までの異なる株に対して防御し得るものである。これは内部保存ウイルスタンパク質からの抗原を認識する細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の媒介に依存するものと思われるが、しかし膜結合タンパク質の保存部分に対して向けられる中和抗体もある役割を演じると考えられる。
【０００８】
２）抗体反応の幅の増大
ＣＴＬは疾病からの回復にある役割を演じると考えられるため、もっぱらＣＴＬ反応を基礎にしたワクチンは疾病の持続期間を短縮する（疾病を無症状にさせる点までの場合を含む）ことが予期されるが、しかし疾病を完全に防止はしないと思われる。卵中での継代による現在のインフルエンザワクチンの製造方法は、ＨＡ抗原性を変えたウイルス亜集団が選択され得ることが実験的に示されている。その結果、ワクチンにより引き出された抗体が優勢な流行株に対して完全には有効でないために、ワクチン効力が減殺される可能性がある。したがって現在のワクチンと比較して反応の幅を改良した抗体の産生が望まれる。１９９２〜９３年のインフルエンザシーズンは、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を用いたワクチンがやはり毒性の大きい新規のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２株に対して十分に交叉反応を示さず、防御力の低い抗体を生成するという、現行のワクチンの限界の優れた事例を提供した。両株はＨ３Ｎ２、即ち同一サブタイプのものでありながら、アミノ酸配列に関しては、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２株はＨＡ１領域における点突然変異が僅かに１１（位置１３３、１３５、１４５、１５６、１５７、１８６、１９０、１９１、１９３、２２６及び２６２）で、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株とは異なっていた。現在の製造方法が交差反応性の欠如に影響を及ぼすか否かは分からないが、しかし抗体反応の幅の改良が望ましいことは明らかである。
【０００９】
３）抗体反応の持続時間の増大
インフルエンザ感染の罹患率及び死亡率に関して最も危険性の高い群の１つ（年配者）は、防御抗体力価が年１度の免疫化では急速に低減して有効でない群でもあるため、改良ワクチンはより長く存続する抗体の防御力価を生成する必要がある。
【００１０】
Ｃ．ワクチンとしてのポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド構築物、即ちタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドの筋肉内接種は、筋肉細胞でタンパク質をその場で生成させることが示されている。ウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドを用いることにより、抗体及びＣＴＬ反応をともに生じて、それぞれ同種又は交差株防御をその後の誘発の際の同種及び異種防御に提供する。これらの種類の免疫反応は各々、既存のワクチン法を上回ると思われる利点を提供する。抗体を生成するためにＰＮＶを使用すると、抗体反応の持続時間の増大と、並びにウイルスの臨床的流行株の正確な配列並びに元のタンパク質（組換え体タンパク質に対して）の適正な翻訳後修飾及び配座とを有し得る抗原の供給が生じ得る。この方法によるＣＴＬ反応の発生により、病原となる可能性のある生ベクター又は弱毒ウイルスを使用せずに、交差株防御の実現が可能となる。
【００１１】
Ｄ．背景のさらなる説明：
したがって、インフルエンザのようなウイルス（中和抗体が生成される対象の）に対するワクチンの開発のための主な課題は、単離物間又は株間のウイルスエンベロープタンパク質の多様性である。マウス及びヒト双方における細胞毒性Ｔリンパ球は保存内部ウイルスタンパク質由来のエピトープを認識でき［Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２，１７８５（１９８５）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，Ｃｅｌｌ  ４４，９５９（１９８６）；Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７，７１９（１９８６）；Ｊ．Ｂａｓｔｉｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５，１５０８（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＨ．Ｂｏｄｍｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，６０１（１９８９）］、ウイルスに対する免疫反応に重要であると考えられる［Ｙ．Ｌ．Ｌｉｎ及びＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４，２２５（１９８１）：Ｉ．Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，６８（１９７４）；Ｋ．Ｌ．Ｙａｐ及びＧ．Ｌ．Ａｄａ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３，２３８（１９７８）；Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９，１３（１９８３）；Ｐ．Ｍ．Ｔａｌｏｒ及びＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８，４１７（１９８６）］ので、異なるウイルス株に対する異種防御を提供し得るＣＴＬワクチンの開発に尽力が注がれた。
【００１２】
ＣＤ８＋ＣＴＬキルウイルス感染細胞は、それらのＴ細胞受容体がウイルスペプチドを認識する場合、ＭＨＣクラスＩ分子と会合した［Ｒ．Ｍ．Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ及びＰ．Ｃ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，同誌１４１，１４２７（１９７５）；Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５３，６０５（１９９１）］。これらのペプチドは、ウイルス内のタンパク質の位置又は機能にかかわらず、内生的合成ウイルスタンパク質由来のものである。したがって、保存ウイルスタンパク質からエピトープを認識することにより、ＣＴＬは交差株防御を提供し得る。ＣＴＬ認識に関してＭＨＣクラスＩと会合し得るペプチドは細胞質又は小胞体の中に又はそれを通過して存在するタンパク質から生じる［Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ及びＪ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，１０７２（１９８９）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，４４３（１９８９）；Ｊ．Ｇ．Ｎｕｃｈｔｅｒｎら，同誌３３９，２２３（１９８９）］。したがって、エンドソーム性処理経路に入る外生タンパク質は（ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原の場合と同様に）概して、ＣＤ８＋ＣＴＬ反応を生じるに際して有効でない。
【００１３】
ＣＴＬ反応を生じるための研究の殆どが、細胞内でタンパク質抗原を産生するための複製ベクターを用いる［Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋら、同誌３１１，５７８（１９８４）；Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ及びＪ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，１５３（１９９０）；Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４５６（１９９１）；Ａ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ及びＲ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４７９（１９９１）；Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，５３（１９９２）；Ｃ．Ｓ．Ｈａｈｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９，２６７９（１９９２）］か、又は細胞質ゾル中へのペプチドの導入に集中した［Ｆ．Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅ及びＭ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９，６０３（１９８９）；Ｋ．Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，５６１（１９８９）；Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，同誌３４４，８７３（１９９０）；Ｄ．Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３３３６（１９９２）；Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎら，同誌１４８，２３５７（１９９２）］。これらのアプローチはともに、ワクチンとしての有用性をそこなうような限界を有する。レトロウイルスベクターは融合タンパク質として発現され得るポリペプチドの大きさ及び構造が限られているが、一方複製する組換え体ウイルスの能力は保持しており［Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１（１９９２）］、その後の免疫化のためのワクチンのようなベクターの有効性は、ベクターそれ自体に対する免疫反応により弱体化され得る［Ｅ．Ｌ．Ｃｏｏｎｅｙら，Ｌａｎｃｅｔ  ３３７，５６７（１９９１）］。さらに、ウイルスベクター及び修飾病原体は、ヒトでのその使用を妨げ得る固有の危険性を有する［Ｒ．Ｒ．Ｒｅｄｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，６７３（１９８７）；Ｌ．Ｍａｓｃｏｌａら，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９，１５６９（１９８９）］。さらに、示されるペプチドエピトープの選択は、個々のＭＨＣ抗原の構造に依っており、したがってペプチドワクチンは異系交配集団におけるＭＨＣハプロタイプの多様性のために限定された有効性を有する。
【００１４】
Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．とＲｅｓｈｅｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ  ８３，９５５１−９５５５，（１９８６）］は、マウスに腹腔内、静脈内又は筋肉内投与された、ＣａＣｌ２沈降したＤＮＡが発現されることを示した。マウスにＤＮＡ発現ベクターを筋注（ｉ．ｍ．）すると、筋肉細胞のＤＮＡ取り込み及びＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現が生じることが立証された［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，８１５（１９９１）］。プラスミドはエピソーム的に保持され、複製しないことが示された。その後、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋並びにラットの心筋に筋注後に持続性発現が観察された［Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］。治療薬として核酸を用いる技術は、ＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日）に報告されているが、この場合、裸ポリヌクレオチドを用いて脊椎動物にワクチン接種した。
【００１５】
方法の成功のためには免疫化が筋注である必要はない。即ち、Ｔａｎｇ等［Ｎａｔｕｒｅ，３５６，１５２−１５４（１９９２）］は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆した金ミクロ入射粒子をマウスの皮膚に導入するとマウスにおいて抗−ＢＧＨ抗体が産生されることを開示した。Ｆｕｒｔｈ等［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０５，３６５−３６８（１９９２）］は、生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織をトランスフェクトするためにジェットインジェクターを用い得ることを示した。核酸を導入するための種々の方法に関し、近年Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．，［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２７５−１２８１（１９８９）］の総説がある。Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐａｐｅｒｓ  Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  １９９２  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｎｅｗ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆ  ＡＩＤＳ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｐ９２も参照して頂きたいが、この場合、鳥類インフルエンザＤＮＡの鶏へのｉｍ、ｉｐ及びｉｖ投与は致命的影響に対する防御を提供したと記載されている。しかしながら、どの鳥類インフルエンザウイルス遺伝子を用いたかの開示はなかった。さらに、交差株防御の誘発については何も触れずに、Ｈ７特異性免疫反応のみが記載されている。
【００１６】
したがって、本発明はタンパク質の発現を誘発するために生組織中に核酸を導入するための任意の公知の方法を意図する。本発明は、ウイルス特異性ＣＴＬを生成するための抗原処理経路にウイルスタンパク質を導入する方法を提供する。したがって、ウイルス性病原体に対する所望の予防的免疫反応を引き出し得る特異的治療薬の必要性は、本発明のインフルエンザウイルスにより満たされた。本治療アプローチにおいて特に重要なことは、抗原遺伝子を得た株と比べ異種であるウイルス株の感染をさえ防止し得るＴ細胞免疫反応を誘発する能力である。したがって、本発明は、ヒトインフルエンザウイルス核タンパク質（ＮＰ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ニューラミニダーゼ（ＮＭ）、マトリックス（Ｍ）、非構造（ＮＳ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１及びＰＢ２＝塩基性ポリメラーゼ１及び２；ＰＡ＝酸性ポリメラーゼ）のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物、又は特異的ＣＴＬを生成する物質をコードする任意の他のインフルエンザ遺伝子を提供する。
【００１７】
インフルエンザウイルスは、複数のＲＮＡセグメントから成るリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムを有する。各ＲＮＡは少なくとも１つの遺伝子物質をコードする。ＮＰ遺伝子物質はＲＮＡと結合して、ウイルスＲＮＡを感染細胞の核中にトランスロケートする。配列は、５０年の期間を見ても、アミノ酸配列中に僅か約７％の変化率で保存されている。Ｐ遺伝子物質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ）は新規のウイルスＲＮＡの合成に関与する。これらの遺伝子は、ＮＰ遺伝子よりさらに高度に保存されている。ＨＡは主要ウイルスエンベロープ遺伝子物質である。それはＮＰほど高度には保存されていない。それは細胞受容体を結合し、したがって新規のインフルエンザ感染をもたらす。主要な中和抗体反応はこの遺伝子物質に対して向けられる。大部分の細胞毒性Ｔリンパ球反応もこのタンパク質に対して向けられる。ヒトインフルエンザウイルスに対する現行のワクチンは、３種類の株のインフルエンザウイルス又はそれらのＨＡタンパク質を有している。しかしながら、株が違うとＨＡのタンパク質配列が変異するので、ワクチンは絶えず流行している病原株に合わせて作られねばならない。しかしながら、ＨＡは、適正に存在する場合には、ＣＴＬの生成のためのいくつかの保存要素を有している。ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子物質は生理機能が十分に判明していないが、しかし防御ＣＴＬ反応の生成に有意であると思われる。最後に、ＨＡにおけるよりもわずかに多く保存されたＭ１及びＭ２遺伝子物質は、主要ＣＴＬ反応を誘発する。Ｍ１タンパク質は非常に豊富に存在するウイルス遺伝子物質である。
【００１８】
その後のウイルス感染に対するＤＮＡワクチン接種の防御効力は、１つ又はそれ以上の上記のウイルスタンパク質をコードする非複製プラスミドＤＮＡを用いた免疫化により実証される。これは、感染性物質の関与がなく、ウイルス粒子を集める必要がなく、そして決定因子選択が可能であるために有益である。さらに、核タンパク質及びいくつかの他のウイルス遺伝子物質の配列がインフルエンザの種々の株内に保存されているため、クローン化遺伝子が得られた株と同種の又は異種のインフルエンザウイルスの有毒株によるその後の感染に対する防御が可能となる。
【００１９】
本発明の要約
注射又は他の方法により動物組織中に直接導入する場合に発現され得る本発明のＤＮＡ構築物は、新規の予防製剤である。それらは、株特異性である一般の抗体に対比して、異なる株のウイルスと反応するウイルス抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘発する。このようなＣＴＬのｉｎ  ｖｉｖｏ生成は通常、ウイルス感染の場合と同様に、抗原の内生的発現を要する。直接ペプチド供給の制約を伴わず又はウイルスベクターを使用せずに、免疫系に関与するウイルス抗原を生成するために、ヒトインフルエンザウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡをＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭筋に注入したが、これによりインフルエンザウイルス特異性ＣＴＬが生成され、ウイルス肺力価の低下、体重損失の阻止、及び生存率の増大で測定されたように、インフルエンザウイルスの異種株を用いたその後の感染試験の防御がなされた。ヘマグルチニンに対する抗力価中和抗体及び核タンパク質に対する抗体がアカゲザルで生成され、鼻腔ウイルス力価の低下がフェレットの同種及び異種誘発試験後に観察された。
【００２０】
本発明に関連する主要な観察を以下に挙げる：
１）効力の実証
ＮＰ遺伝子の供給源株とは異なるインフルエンザの株を用いて試験したマウスにおける生存率の増大、ウイルス肺力価の低下、及び体重損失の阻止で測定されるように、核タンパク質（ＮＰ）ＤＮＡを用いた免疫化後に異種防御が認められる。この場合、２つの株の表面タンパク質はまったく異なっており（Ｈ１Ｎ１対Ｈ３Ｎ２）、試験株は初期株後３４年目に生じたものである。ＮＰ  ＤＮＡ及びマトリックス（Ｍ１）ＤＮＡを別々に、一緒に、又はＨＡ  ＤＮＡと組合せてフェレットを免疫化すると、連続変異株（臨床的単離物）を用いた試験に対する防御（鼻腔ウイルス脱落低減）が示された。特にＤＮＡカクテル（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９タンパク質をコードするＮＰ及びＭ１  ＤＮＡ、及びＢｅｉｊｉｎｇ／８９又はＨａｗａｉｉ／９１  ＨＡをコードするＨＡ  ＤＮＡ）による防御は、フェレットにおける連続変異株（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）に対しては、認可ワクチン（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９含有）によってもたらされるものより大きかった。Ｈａｗａｉｉ／９１からのＨＡ  ＤＮＡを含有するカクテルは、Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＨＡ  ＤＮＡを含有するカクテルよりもわずかに効力が高いと思われた。Ｈａｗａｉｉ／９１に関するＨＡ  ＤＮＡを含むカクテルを用いて観察された防御は同種ＨＡ  ＤＮＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を用いて観察された防御と同等だったが、一方Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９に関するＨＡ  ＤＮＡを有するカクテルは同種防御とは異なっていたが、しかしそれは依然として認可物質よりも有意に効力が良好であった。ＨＩ抗体は、マウス、フェレット、アカゲザル及びアフリカミドリザルを含めたすべての試験種で産生された。
【００２１】
２）持続性
リポーター遺伝子をコードするＤＮＡを用いた試験において、ＤＮＡ及びタンパク質発現の存在は少なくとも１．５年間存続した（マウスで試験した最長時間；Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２）。したがって、インフルエンザ遺伝子物質も持続的に発現されるならば、その結果生じる免疫反応も持続しているはずである。インフルエンザＤＮＡ注入により生成される抗体及びＣＴＬ（Ｙａｎｋａｕｃｋａｓら，ＤＮＡ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９３）、並びに同種防御免疫（ＭＲＬデータ）は、マウスでは１年に亘って存続することが示されている。抗体は、アカゲザルでは今までのところ少なくとも１年間存続することが示されている。ＣＴＬ反応及び異質防御の持続時間（生存率増大）は、６か月まで存続する（これまでの試験最長時間）。異種防御度のわずかな低減が生じたが、防御は増強可能である。
【００２２】
３）用量範囲。
【００２３】
アカゲザルで投与試験を実施した結果、ＨＡ  ＤＮＡ  １００μｇを２回投与すると、今までのところ１年ＨＩ抗体の良好な力価が存続することが示された。マウスにおける防御の発生（異種試験後の生存率増大）は、６μｇ（３回投与）という低い用量で、そして２００μｇの１回注入で観察されたが、しかし概して注射回数を増大すると（３回まで）防御程度が改良された。霊長類試験からは、３つのＨＡｓ並びにＮＰ及びＭ１（後者はＨ３Ｎ２  Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９遺伝子をコードする）をコードするＤＮＡ  １０〜１００μｇを２回注射すると、認可ワクチンにより生成されるものとほぼ同じＨＩ抗体力価を生じた。試験したすべての動物がインフルエンザには未感染であったが、一方で標的臨床集団（老齢個体）はすべてインフルエンザを経験しているということを思い起こすことは重要である（９才以下の小児に認可ワクチンを２回注射したことを思い出していただきたい）。
【００２４】
本発明の詳しい説明
本発明は、哺乳類及びヒトのような脊椎動物を含めた動物に直接導入する場合に、動物内でのコード化タンパク質の発現を誘発する核酸製剤を提供する。タンパク質が病的症状の場合を除いて通常はその動物には生じないもの、例えばインフルエンザウイルスと会合したタンパク質、例えばインフルエンザ核タンパク質、ニューラミニダーゼ、ヘマグルチニン、ポリメラーゼ、マトリックス又は非構造タンパク質である（しかしこれらに限定されない）場合、動物の免疫系が活性化されて防御反応を起こす。これらの外生タンパク質は動物自身の組織により生成されるため、発現タンパク質は主な組織適合性複合体ＭＨＣにより処理され、提示される。この認識は、関連する生物体による実際の感染時に起きるものと類似する。結果は、本開示に示すように、有毒感染に対して防御する免疫反応の誘発である。
【００２５】
本発明は、同様の機序（上記の“発明の背景”参照）により注射、吸入又は押印によって動物組織中にｉｎ  ｖｉｖｏに導入した場合に、ヒトインフルエンザウイルス遺伝子物質の発現が起きる核酸を提供する。したがって、例えば本発明のＤＮＡ構築物をマウスの筋肉中に注射すると、コード化遺伝子物質の発現が誘発される。フェレット及びアカゲザルでも同様である。有毒インフルエンザウイルスを用いたその後の試験においては、等しく対照動物を殺す用量を用いても、ポリヌクレオチドワクチンを注射した動物は罹患率及び死亡率が非常に低下する。したがって、本発明は、インフルエンザウイルス感染を防止するためのヒトに有用なワクチンを開示する。
【００２６】
インフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物が動物における防御免疫反応を引き出すことを、我々は示す。下記でさらに詳しく述べるように、動物における免疫反応としては、マウスにおける抗体及びＣＴＬ産生、フェレット及び霊長類における抗体産生、並びにマウス及びフェレットにおけるインフルエンザの同種の連続変異及び不連続変異株を用いたウイルス誘発試験に対する防御が挙げられる。ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを用いた免疫化のおそらくは最もめざましい結果は、別のサブタイプのウイルスに対する防御を付与する能力であった。これは、ＣＴＬ誘発成分のワクチンへの付加は、シーズン半ばに発生したり又はワクチン株が翌年のために毎年選択された際には予想できなかった新変種の出現による衝撃を軽減するのに役立つことを示唆する。ＨＡ、ＮＰ及びＭ１遺伝子をコードするｃＤＮＡベクターによる免疫化が、認可ワクチンの場合よりもフェレットにおけるウイルスの連続変異株に対してより有効に防御し得た、ということは重要である。これは、ＰＮＶにおける内部遺伝子をコードする構築物の使用の妥当性を意味する。
【００２７】
ある態様において、連続変異及び不連続変異抗原に対する群共通防御を提供するために、本ワクチン生成物質は、例えばＡ／Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｔｅｘａｓ／９１）、Ａ／Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）及びＢ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０）ウイルスに代表された３つの流行の臨床株からのＨＡをコードする別々のＤＮＡプラスミド、並びにＡ（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９；Ｈ３Ｎ２）及びＢ株の両方からの内部保存タンパク質ＮＰ及びＭ１（マトリックス）をコードするＤＮＡ構築物から成る。ＨＡ  ＤＮＡは、ＨＡを生成し、その結果ＨＡに対する中和抗体を生じることにより機能する。これはタイプ特異性であって、あるものは現行認可タンパク質ベースのワクチンに比して連続変異株に対する防御の幅を増大した。ＮＰ及びＭ１構築物はＣＴＬ生成を促し、これが交差株防御を提供して、ウイルス負荷を低減し、疾病からの回復を促進する。ＤＮＡ構築物（筋細胞におけるエピソーム性非複製非一体化形態での）の予測持続性は、現行ワクチンに比して防御の持続時間を増大することが予期される。
【００２８】
現行認可ワクチンよりも有益であると考えられる点を以下に挙げる：ＣＴＬ反応による防御幅の増大±抗体幅の増大、及び防御継続時間の増大。ＰＮＶアプローチは、新規のＤＮＡ構築物は臨床的野外単離物からもっと直接的に作り得るため、現行認可ワクチンのようにリアソータントを作製し、選択しそして増殖する必要がない。
【００２９】
本発明のある態様では、Ａ／ＰＲ／８／３４株から得られたヒトインフルエンザウイルス核タンパク質ＮＰ配列を発現ベクター中でクローン化する。ベクターはＲＮＡポリメラーゼ転写のためのプロモーター、及びＮＰコード配列の末尾に転写ターミネーターを含有する。ある好ましい態様においては、プロモーターは、強力な転写プロモーターであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）である。さらに好ましいプロモーターは、イントロンＡ配列を有するサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）である。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長ホルモンターミネーターである。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨターミネーターの組合せが特に好ましい。さらに、製剤の調製を容易にするために、抗生物質耐性マーカーも発現ベクター中に含まれるのが好ましい。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は任意の他の製薬上許容可能な抗生物質耐性マーカーを用い得る。本発明の好ましい態様において、抗生物質耐性遺伝子はネオマイシン耐性のための遺伝子物質をコードする。さらに、原核生物において発酵による製剤を高効率で達成するためには、ベクターが複製原点を含有し、高複写数を有すると有益である。多数市販されている原核性クローニングベクターは、いずれもこれらの利益を提供する。本発明の好ましい態様においては、これらの機能性は、ｐＵＣとして公知の市販ベクターにより提供される。非必須ＤＮＡ配列は除去するのが望ましい。したがって、ｐＵＣのｌａｃＺ及びｌａｃＩコード配列は、本発明のある態様においては除去される。
【００３０】
ある態様では、発現ベクターｐｎＲＳＶを用いるが、この場合ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）をプロモーターとして用いる。別の態様では、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨ転写ターミネーターをその中でクローン化したＶ１、即ち突然変異化ｐＢＲ３２２ベクターを用いる。Ｖ１−ＮＰ構築物を用いてマウスを免疫化し、異種感染を防御するＣＴＬを誘発した。本発明の特に好ましい態様において、Ｖ１の要素を組合せてＶ１Ｊと命名する発現ベクターを生成した。Ｖ１Ｊ中で、インフルエンザウイルス遺伝子、例えばＡ／ＰＲ／８／３４  ＮＰ、ＰＢ１、ＮＳ１、ＨＡ、ＰＢ２又はＭ１遺伝子をクローン化する。さらに別の態様において、アンピシリン耐性遺伝子をＶ１Ｊから除去し、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換えて、Ｖ１Ｊ−ｎｅｏ（配列番号１８、図７）を形成し、この中で、本発明に従って用いるために多数の異なるインフルエンザウイルス遺伝子をクローン化した。さらに別の態様では、ベクターはＶ１Ｊｎｓであって、これは、それまでになかったＳｆｉＩ制限部位をＶ１Ｊ−ｎｅｏの２１１４位に一つだけあるＫｐｎＩ部位に組み込んだ以外は、Ｖ１Ｊと同様である。ヒトゲノムＤＮＡにおけるＳｆｉＩ部位の頻度は非常に低い（約１部位／１００，０００塩基）。したがって、抽出ゲノムＤＮＡをＳｆｉＩ消化するだけで、このベクターにより宿主ＤＮＡとの発現ベクター一体化を注意深く監視し得る。さらなる改良において、ベクターはＶ１Ｒである。このベクターにおいては、できるだけ非必須ＤＮＡをベクターから“切り取って”高度に詰まったベクターを生成した。このベクターはＶ１Ｊｎｓの誘導体であって、図３６（配列番号４５）に示す。このベクターによって、望ましくない配列がコードされることなく大きな挿入物を使用できるし、特異的インフルエンザウイルス遺伝子をコードする構築物が周囲組織に導入される場合の細胞による取り込みを最適化できる。図３６では、切り取られたＶ１Ｊｎｅｏ（図７）の部分をギャップで、挿入配列は太字で示すが、Ｖ１Ｊｎｅｏの塩基番号は変えていない。前述のベクター修飾及び開発手順は当業者に公知の方法により達成し得る。記載した特定の生成物質は、慣用的方法により得られたが、適用される特定の目的には特に有用であった。
【００３１】
本発明のある態様はＡ／ＰＲ／８／３４株からのインフルエンザＮＰ遺伝子を組み入れるのであるが、さらに好ましい態様は最近のインフルエンザウイルス単離物からのＮＰ遺伝子、ＨＡ遺伝子、ＮＡ遺伝子、ＰＢ遺伝子、Ｍ遺伝子又はＮＳ遺伝子を組み入れる。これは、ウイルス遺伝子のＤＮＡコピーを調製し、次いで個々の遺伝子をサブクローニングすることにより達成される。多数のインフルエンザウイルス株の多数の遺伝子に関する配列が、現在、ＧＥＮＢＡＮＫから公式に入手できる（インフルエンザＡ遺伝子に関しては約５０９の配列）。したがって、ウイルスの近年のＴｅｘａｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ又はＰａｎａｍａ単離物からクローン化され、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌが抗インフルエンザワクチンに望ましいと推奨した株であるこれらの遺伝子が本発明に好ましい（Ｌｅｄｅｒｌｅ，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９３，ｐ１２３２のＦＬＵ−ＩＭＭＵＮＥＲ  インフルエンザウイルスワクチンを参照。Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１，Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９，Ｈ３Ｎ２；及びＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのヘマグルチニンタンパク質を含有する３価の精製インフルエンザ表面抗原ワクチン）。用語を統一するために、ＤＮＡ構築物を記述するために本明細書中では以下の慣例に従った：“ベクター名  −  インフルエンザ株  −  遺伝子”。したがって、Ａ／ＰＲ／８／３４株のＮＰ遺伝子が発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏ中にクローン化される構築物は、本明細書では“Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＰＲ−ＮＰ”と呼ぶ。当然、ウイルス変異の病因株として、製剤中に組み込まれるのに最適な遺伝子は変わり得る。しかしながら、下記に実証するように、異種株に対して防御し得る細胞毒性リンパ球反応が誘発されるため、全ウイルス又はサブユニットポリペプチドベースのワクチンと比較した場合、本発明の新規のワクチンにおいて株変異性は余り重要でない。さらに、製剤は新規の遺伝子を容易に挿入できるため、これは分子生物学の標準的方法で容易になされる調節手段である。
【００３２】
核タンパク質の配列はインフルエンザの種々の株に保存されるため、核タンパク質に関する遺伝子をクローニングした株に対して異種であるインフルエンザＡの有毒株によるその後の誘発に対しても、防御が達成される。インフルエンザＡの多数の株からのＮＰの比較は、二次構造に有意差を示さず［Ｍ．Ｇａｍｍｅｌｉｎら，Ｖｉｒｏｌ．１７０，７１，１９８９］、アミノ酸配列の変化も非常に少なかった［Ｏ．Ｔ．Ｇｏｒｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，３７０４，１９９１］。約５０年の間に、ヒト株におけるＮＰは０．６６アミノ酸変化／年の割合で進化したに過ぎない。さらに、Ａ／ＨＫ／６８−特異性ＣＴＬがＡ／ＰＲ／８／３４  ＮＰの配列に由来する合成ペプチド  ＮＰ（１４７−１５５）で刺激された標的細胞を認識するという我々の結果は、このＨ−２Ｋｄ  −制限ＣＴＬエピトープが３４年間機能的に無傷のままであったことを示している（図２参照）。遺伝子がウイルス表面抗原、例えばヘマグルチニン又はニューラミニダーゼをさえコードする場合、相当の中和体液性（抗体）免疫反応が非常に重要な細胞毒性リンパ球反応に加えて生じ得るということにも留意すべきである。
【００３３】
インフルエンザＡの保存内部タンパク質をコードするＤＮＡ発現ベクターを筋注すると、その後のウイルス誘発に対し有意の防御免疫が生じる。特に、ＮＰ特異性抗体及び一次ＣＴＬが生成された。ＮＰ  ＤＮＡ免疫化は、対照と比較した場合、ウイルス肺力価の低下、体重損失の阻止及び生存率の増大を引き起こした。防御免疫反応は、ウイルス感染との戦いにおいてＮＰ抗体単独の作用の欠如によって実証される（実施例４参照）ように、ＮＰ−特異性抗体により媒介されず、したがってＮＰ特異性細胞免疫によるものと考えられた。さらに、ＮＰに対して向けられる相当量の一次ＣＴＬを生じた。防御は、ＤＮＡをクローニングした株とは異種のインフルエンザＡの有毒株に対してであった。さらに、誘発株がＡ／ＰＲ／８／３４株後３０年以上経ったものだが、これは、変異性エンベロープタンパク質は抗原性不連続変異及び連続変異したにもかかわらず、保存タンパク質に対して向けられる免疫反応が有効であることを示す。インフルエンザウイルス遺伝子物質は各々ある程度の保存を示すため、そしてＣＴＬは細胞内発現及びＭＨＣプロセッシングに対する反応で生成され得るため、他のインフルエンザウイルス遺伝子はＮＰに関してなされたのと同様の反応を生じることが予測される。免疫原性エピトープの同定方法は、当業者には十分公知である［例えば、Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１６５７−１６６７，１９９２；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：５７５−５８３，１９９１；Ｃａｌｉｎ−Ｌａｕｒｅｎｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：９７４−９７８，１９９３参照］。したがって、発現ベクターにおけるクローン化し配列決定した結合物によって示される（下記参照）ように、多数のこれらの遺伝子が、これらの構築物が利用可能形態の予防薬であるようクローン化された。
【００３４】
したがって、本発明は免疫原としてインフルエンザウイルスタンパク質をコードする発現ベクターを提供する。本発明は、自己複製剤又はアジュバントを必要としない交差株防御免疫を誘発する手段を提供する。さらに、ＤＮＡを用いた免疫化は、多数の他の利点を提供する。先ず、ワクチン接種のためのこのアプローチは、ＣＤ８＋ＣＴＬ反応が病理生理学的工程に重要であるため、腫瘍並びに感染剤に適用できる［Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３５９（１９８８）］。したがって、形質転換工程に決定的なタンパク質に対する免疫反応を引き出すことは、癌防御又は免疫療法の有効な手段である。第二に、ウイルスタンパク質（ＮＰ及びヘマグルチニン）及びヒト成長ホルモンＤＮＡの注入後の発現タンパク質に対する高力価抗体の形成［例えば、Ｄ．Ｃ．Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２，１９９２参照］は、これが、別々に又は保存抗原を標的にした細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンと組合せて、抗体由来のワクチンを製造する平易で且つ非常に有効な手段であることを示す。
【００３５】
ＤＮＡ構築物の生成及び精製が容易であることは、伝統的タンパク質精製によく比べ、組合せワクチンの生成がしやすいという利点がある。したがって、例えばＮＰ、ＨＡ、Ｍ１、ＰＢ１、ＮＳ１又は他のインフルエンザウイルス遺伝子をコードする多面的構築物を調製、混合、同時投与し得る。最後に、タンパク質発現がＤＮＡ注入後に保持されるため［Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｏｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］、Ｂ−及びＴ細胞記憶の持続性が増強され［Ｄ．Ｇｒａｙ及びＰ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，９６９（１９９１）；Ｓ．Ｏｅｈｅｎら，同誌１７６，１２７３（１９９２）］、それにより永続性体液性及び細胞媒介性免疫が生み出される。
【００３６】
現行認可インフルエンザワクチンの限界により、感染防止及び病状軽減のためのさらに有効な手段の開発の必要性が強調されている。古いワクチンは防御の限界を示し、２〜３の選択ウイルス株に対してのみ有効であって、その効力は短期間で衰える。したがって、現在のワクチンは、有効性維持のためには毎年接種用に再処方せねばならない。内部タンパク質に対する改良ＣＴＬ反応の生成は、現在の認可ワクチンではできない有意の長期交差反応性免疫を提供するものと思われる。
【００３７】
インフルエンザ抗原に対して向けられる宿主免疫反応の検出により、マウス、フェレット及び非ヒト霊長類におけるＰＮＶ構築物からのタンパク質発現を、我々は実証した。マウスにインフルエンザＮＰをコードするＤＮＡを注射すると、ＤＮＡ構築物に含まれるものとは異なるインフルエンザサブタイプ（不連続変異株）による誘発後に、対照動物と比較して、生存率の増大、ウイルス肺力価の低下及び体重損失減少をもたらした。ＮＰ  ＤＮＡを接種したフェレットにおける不連続変異株での誘発後のウイルス脱落低減も我々は観察した。これらの結果は、インフルエンザ株における主要不連続変異に対する防御がＮＰをコードする遺伝子を含むＤＮＡワクチンにより増強されたことを示す。ＨＡ  ＤＮＡを注射し、その後連続変異ウイルス株で実験動物を誘発すると、ウイルス脱落のさらなる実質的低減が引き起こされた。内部タンパク質ＤＮＡを付加すると、ＨＡ  ＤＮＡ単独注入後に観察された高程度の防御が多少増大した。
【００３８】
インフルエンザＤＮＡに対する免疫反応を、注射後６か月間マウスで追跡調査した結果、抗体、ＣＴＬ活性及びｉｎ  ｖｉｖｏ防御の持続が認められた。ＤＮＡを反復注入すると、異なるサブタイプのインフルエンザ株による２５週目の誘発後の生存率がさらに増大し、防御的細胞媒介免疫を高める能力を示した。抗体持続性も、アフリカミドリザルにおいてＨＡ  ＤＮＡを２回注射後少なくとも１年間実証され、ＨＡ  ＤＮＡを１回注射後は少なくとも１か月間存続した。
【００３９】
これらの動物実験の結果は、直接ＤＮＡ注入がインフルエンザ感染及び疾病に対するヒトの防御のための方法改良を提供することを示す。留意すべきは、ＤＮＡ注入による実験的防御が未感染マウス及びフェレットのワクチン接種により達成されたことである。ＤＮＡを接種した成人は、過去にインフルエンザに曝されたことがある。これらの人々は、ＤＮＡ構築物による免疫化により、おそらくは持続時間の増大したさらに実質的な免疫反応を示す。
【００４０】
使用濃度を最適にするために、免疫原性に関して用量範囲を比較する。小哺乳類実験では、１μｇという少量のＮＰＤＮＡが抗体及びＣＴＬ反応を誘発した。アカゲザルの免疫化は、１００及び１０００μｇの用量のＨＡ  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／０８／３４）を用いて２匹中２匹とも抗体反応をもたらしたが、一方、１０μｇ  １回注射には２匹のうち１匹が反応した。別々の実験において、未使用アフリカミドリザルに３種類のウイルスサブタイプからのＨＡをコードする５つの異なるＤＮＡ構築物並びにインフルエンザＡウイルスからのＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡの混合物を注射した。各群とも３匹のサルのうち３匹が５つの構築物の各々を１０μｇ又は１００μｇ含有するワクチンに反応した。これらの所見に基づいて、１０、５０、１００及び２００μｇのＤＮＡの投与がヒトでは有効であると予測される。
【００４１】
認可不活化ワクチンによる感染防止は、ＨＡに対して向けられる血清及び粘膜抗体レベルと相関するが、内部インフルエンザタンパク質に対する抗体反応とは相関しない。したがって、ＨＡはインフルエンザＤＮＡワクチンの開発に含まれねばならない。しかしながら、ＮＰに対する免疫反応はＨＡに対する抗体反応を増強し、インフルエンザ内部タンパク質はインフルエンザの抗原的に別種の株と交差反応性のＣＴＬ反応を提供する。上記のように、注射に内部タンパク質並びにＨＡをコードするＤＮＡ構築物が含まれる場合の免疫原性及び防御の改良を動物実験は示している。内部タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含入すると、ヒトにおけるＤＮＡワクチンの効力が増強されると思われる。投与レベルはこれらの成分の相互作用に依っていると考えられるため、標準的手段により当業者はＨＡ、ＮＰ及びＭ１  ＤＮＡ構築物の混合物を製造するためにワクチン中のＤＮＡの量を決定し得る。これらの各成分に対する宿主反応は、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）力価、及びＨＡ成分に対する中和、並びにＭ１及びＮＰエピトープに対するＣＴＬ反応を比較して、別々に測定し得る。結果を、ＨＡのみを発現する構築物を注射後の抗体反応と比較する。これらの試験によりＨＡ及び内部タンパク質をコードするＤＮＡを含有するワクチンに対する反応増強の可能性を評価できる。
【００４２】
ヒトでの有効性を、同一のウイルス株並びに異なるサブタイプのインフルエンザ株に対するワクチン効力を示すよう、インフルエンザＤＮＡワクチンを接種し、その後鼻腔内誘発を施された有志で明らかにした。ワクチンの組成、用量及び投与計画は前記試験を基礎にする。臨床的効力は、感染率、疾病状況及び疾病持続期間で示す。防御と相関する代用マーカーを調べるために、これらの臨床所見を、宿主免疫反応及びウイルス脱落の実験室評価と比較する。
【００４３】
ＤＮＡ構築物を調製及び精製するための分子生物学の標準技法により、本発明のＤＮＡ治療薬の調製が可能である。したがって分子生物学の標準技法は本発明の生成物質の製造のために十分である一方、本明細書に開示した特定の構築物は意外にも、標準不活化全ウイルス又はサブユニットタンパク質ワクチンによってはこれまで得られなかった交差株防御を生じる、新規の治療薬を提供する。
【００４４】
ワクチン受容者に導入される発現可能なＤＮＡの量は、ＤＮＡ構築物中に用いる転写及び翻訳プロモーターの強度に、そして発現化遺伝子物質の免疫原性に依っている。概して、約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇの免疫的又は予防的有効量を筋組織に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を通しての押印、及び他の投与方法、例えば腹腔内、静脈内、又は吸入投与を意図してもよい。ブースターワクチン接種が提供されることも意図し得る。
【００４５】
ＤＮＡは裸で、即ちいずれのタンパク質、アジュバント又は受容者免疫系に影響を及ぼす他の薬剤とも会合していないこともある。この場合、ＤＮＡが生理的に許容可能な溶液、限定はしないが例えば滅菌食塩水又は滅菌緩衝食塩水中に存在することが望ましい。あるいは、ＤＮＡは、ＤＮＡ−リポソーム混合物として、リポソーム、例えばレシチンリポソーム又は当業界で公知の他のリポソームと会合し得る（例えばＷＯ９３／２４６４０参照）か、あるいはＤＮＡは免疫反応を増強するために当業界で公知のアジュバント、例えばタンパク質又は他の担体（これらに限定されない）と会合し得る。ＤＮＡの細胞取り込みを助ける薬剤、例えばカルシウムイオン、ウイルスタンパク質及び他のトランスフェクション促進剤（これらに限定されない）を用いるのも有益である。これらの薬剤は一般に、トランスフェクション促進剤及び製薬上許容可能な担体と呼ばれる。本明細書で用いる場合、遺伝子という用語は、独立のポリペプチドをコードする核酸のセグメントを指す。製剤及びワクチンという用語は、免疫反応の誘発に有用な組成物を示すために同じ意味で用いる。構築物及びプラスミドという用語は、同じ意味で用いる。ベクターという用語は、本発明の方法に用いるために遺伝子がその中にクローン化されるＤＮＡを示すために用いる。
【００４６】
したがって、本発明のある態様は、ヒトを含めた哺乳類のような脊椎動物における免疫反応をｉｎ  ｖｉｖｏで誘発するためのインフルエンザウイルス遺伝子の使用方法であって、以下の：
ａ）遺伝子を単離し；
ｂ）生組織中に導入される場合に遺伝子の転写開始及びその後の翻訳を指図する制御配列と操作可能的に遺伝子が結合するように遺伝子を調節配列と結合させ；
ｃ）遺伝子を生組織中に導入し；そして
ｄ）任意に付加的インフルエンザ遺伝子で増強する
ことを包含する方法である。
【００４７】
本発明の好ましい態様は、インフルエンザウイルスの異種株に対する防御方法である。これは、保存インフルエンザウイルスエピトープをコードする免疫的有効量の核酸を投与することにより達成される。例えば、核タンパク質に関する全インフルエンザ遺伝子はこの機能を提供するので、これらの遺伝子内の保存エピトープをコードする他のインフルエンザ遺伝子及びその部分に関するコード配列も同様に交差株防御を提供するとみられる。
【００４８】
本発明の別の態様では、ＤＮＡワクチンはヒトインフルエンザウイルス核タンパク質、ヘマグルチニン、マトリックス、非構造、又はポリメラーゼ遺伝子物質をコードする。この態様の特定の実施例を以下に示すが、この場合ヒトインフルエンザウイルス遺伝子は、ヒトインフルエンザウイルス単離物  Ａ／ＰＲ／８／３４の核タンパク質、塩基性ポリメラーゼ１、非構造タンパク質１、ヘマグルチニン、マトリックス１、塩基性ポリメラーゼ２、ヒトインフルエンザウイルス単離物  Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９の核タンパク質、ヒトインフルエンザウイルス単離物  Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１のヘマグルチニン遺伝子、又はヒトインフルエンザウイルス単離物  Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４６／９０のヘマグルチニン遺伝子をコードする。
【００４９】
本発明の特定の態様において、ＤＮＡ構築物はインフルエンザウイルス遺伝子をコードするが、この場合、ＤＮＡ構築物を動物生体組織中に導入すると発現して、そのコード化インフルエンザ遺伝子発現物質に対する免疫反応を生じ得る。このようなＤＮＡ構築物の例を以下に示す：
ａ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲ−ＮＰ；
ｂ）Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ；
ｃ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＰ（これの５′末端が配列番号１２である）；
ｄ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ１（これの５′末端が配列番号１３である）；
ｅ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＳ（これの５′末端が配列番号１４である）；
ｆ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ（これの５′末端が配列番号１５である）；
ｇ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ２（これの５′末端が配列番号１６である）；
ｈ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−Ｍ１（これの５′末端が配列番号１７である）；
ｉ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＢＪ−ＮＰ（これの５′末端が配列番号２０でありそしてこれの３′末端が配列番号２１である）；
ｊ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＴＸ−ＮＰ（これの５′末端が配列番号２４でありそしてこれの３′末端が配列番号２５である）；
ｋ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＰＡ−ＨＡ（これの５′末端が配列番号２６でありそしてこれの３′末端が配列番号２７である）；
ｌ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＧＡ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３），構築物サイズ６．５６Ｋｂ（これの５′末端が配列番号４６でありそしてこれの３′末端が配列番号４７である）；
ｍ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＴＸ−ＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１），構築物サイズ６．５６Ｋｂ（これの５′末端が配列番号４８でありそしてこれの３′末端が配列番号４９である）；
ｎ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０），構築物サイズ６．６１Ｋｂ（これの５′末端が配列番号５０でありそしてこれの３′末端が配列番号５１である）；
ｏ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９），構築物サイズ６．４２Ｋｂ（これの５′末端が配列番号５２でありそしてこれの３′末端が配列番号５３である）；
ｐ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９），構築物サイズ５．６２Ｋｂ（これの５′末端が配列番号５４でありそしてこれの３′末端が配列番号５５である）；
ｑ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０），構築物サイズ６．５４Ｋｂ（これの５′末端が配列番号５６でありそしてこれの３′末端が配列番号５７である）；
ｒ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０），構築物サイズ５．６１Ｋｂ（これの５′末端が配列番号５８でありそしてこれの３′末端が配列番号５９である）。
【００５０】
【実施例】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はこれら実施例の個別条件に限定されるものではない。
【００５１】
実施例１
ヒトインフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築物の調製：
ｉ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲＮＰ：Ａ／ＰＲ／８／３４遺伝子をｐＡＰＲ−５０１［Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇら，Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１９８３）］から１５６５塩基対ＥｃｏＲＩ断片（ｐＲＳＶ−ＢＬのクレノウ充填及びホスファターゼ処理ＸｂａＩ部位中にクレノウ充填及びクローン化した）として単離した。ｐＲＳＶ−ＢＬを、先ずｐＢＬ−ＣＡＴ３［Ｂ．Ｌｕｃｋｏｗ及びＧ．Ｓｃｈｕｔｚ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，５４９０（１９８７）］ベクターをＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化してＣＡＴコード配列を除去し、クレノウ充填及び自己結紮して構築した。ＲＳＶプロモーター断片をＮｄｅＩ及びＡｓｐ７１８断片としてｐＲｓｈｇｒｎｘ［Ｖ．Ｇｉｇｕｅｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３０，６２４（１９８７）］（クレノウ充填して上記で生じた中間ベクター（ＣＡＴ配列を欠くｐＢＬ−ＣＡＴ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化した）から単離した。
【００５２】
ｉｉ）Ｖ１−ＮＰ：ｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ［Ｙ．Ｗｈａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．６１，１７９６（１９８７）］から発現ベクターＶ１を構築した。ベクターをＥｃｏＲＩで切断し、自己結紮してＡＫＩ及びＤＨＦＲ遺伝子を除去した。このベクターはＣＭＶプロモーター中にイントロンＡを含有しないので、それを内部にＳａｃＩ部位を欠くＰＣＲ断片として加えた［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，３９７９（１９９１）の配列番号による１８５５に］。ＰＣＲ反応のために用いた鋳型は、ｐＣＭＶｉｎｔＢＬを生成するよう、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサー／プロモーター及びイントロンＡを含むｐＣＭＶ６ａ１２０［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，同誌を参照］からのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ断片を、ｐＢＬ３のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位に結紮して作ったｐＣＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであった。ＲＳＶ−Ｌｕｘ［Ｊ．Ｒ．ｄｅ  Ｗｅｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７，７２５，１９８７］からの１８８１塩基対ルシフェラーゼ遺伝子断片（クレノウ充填したＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ）を、クレノウ充填しホスファターゼ処理したｐＣＭＶｉｎｔＢＬのＳａ１Ｉ部位中にクローン化した。
【００５３】
イントロンＡを結びつけるプライマーを以下に示す：
５′プライマー（配列番号５）：
５′−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧ  ＣＴＣＧＴＴＴＡＧ−３′．
３′プライマー（配列番号６）：
５′−ＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡ  ＣＴＧＣＡＧ−３′．
ＳａｃＩ部位を除去するのに用いたプライマーを以下に示す：
センスプライマー（配列番号７）：
５′−ＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＣ−３′
及びアンチセンスプライマー（配列番号８）：
５′−ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣ−３′
ＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、同一酵素で切断済のベクターに挿入した。インフルエンザＡ（Ａ／ＰＲ／８／３４）からのＮＰ遺伝子をｐＡＰＲ５０１［Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇら，Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１９８３）］から１５６５塩基対のＥｃｏＲＩ断片として切り離し、盲端化した。それを盲端化ＢｇｌＩＩ部位でＶ１に挿入して、Ｖ１−ＮＰを作製した。大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ中でプラスミドを増殖させて、アルカリ性溶解法により精製した［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］。ＣｓＣｌバンド化ＤＮＡをエタノール沈降させ、注射用に０．９％食塩水中に２ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。
【００５４】
実施例２
ヒトインフルエンザウイルス細胞毒性Ｔリンパ球に関する検定：
細胞毒性Ｔリンパ球を、ＤＮＡで免疫化した、又はＡ／ＨＫ／６８の感染から回復したマウスから生成した。対照培養は、対照ＤＮＡを注射したマウス並びに非注射マウスから得た。単一細胞懸濁液を調製し、塩化アンモニウムを用いて溶血させて赤血球を除去し、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び２ｍＭ  １−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で脾細胞を培養した。同数の自系照射刺激体細胞をＨ−２Ｋｄ  制限ペプチドエピトープ  ＮＰ１４７−１５５（Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  ＡｒｇＡｌａ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  （配列番号９））を用いて１０μＭで６０分間パルスするか、又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）で感染させ、１０Ｕ／ｍｌの組換え体ヒトＩＬ−２（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を加えて、培養を５％ＣＯ２  及び１００％相対湿度で３７℃で７日間保持した。選択実験では、ｒｈＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びＣｏｎＡ（２μｇ／ｍｌ）を自系刺激体細胞の代わりに加えた。細胞毒性Ｔ細胞エフェクター活性を、細胞１０６個当たり６０μＣｉの５１Ｃｒを用いて３時間標識化し、上記の様にＮＰ１４７−１５５でパルス化した、又はインフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３（Ｈ３Ｎ２）に感染させたＰ８１５細胞を用いて測定した。対照標的（ペプチド又はウイルスを用いずにＰ８１５で標識化）は溶解しなかった。標的を丸底９６ウエルプレート中に１×１０４細胞／ウエルで平板培養し、３通りで４時間インキュベートした。上清（３０μｌ）を各ウエルから取り出してＢｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で計数した。６Ｍ  ＨＣｌの付加により放出される最大計数及びＣＴＬを用いずに放出される自発的計数を各標的標本に関して調べた。特異的溶解率（％）は以下のように算出した：［（実験値−自然発生値）／（最大値−自然発生値）］×１００。
【００５５】
実施例３
ＮＰ特異性ＣＴＬ及び抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ生成：
ＢＡＬＢ／ｃマウスの両足の四頭筋に、ラウス肉腫ウイルス又はサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動されるＡ／ＰＲ／８／３４核タンパク質をコードするプラスミドｃＤＮＡを注射した。
【００５６】
使用した発現ベクターを以下に示す：
ｉ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲＮＰ（実施例１参照）：
ｉｉ）Ｖ１−ＮＰ（実施例１参照）。
【００５７】
用いた動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣから入手した雌ＢＡＬＢ／ｃ  マウスであった。マウスは生後４〜５週齢で入手し、最初に５〜６週齢でＤＮＡを注射した。別記しない限り、ＤＮＡの注射は両足の四頭筋に投与し、各足はＤＮＡ  １００μｇを含有する滅菌食塩水  ５０μｌを摂取した。マウスには３週間の間隔で１、２又は３回の摂取を施した。陰性対照動物には注射しないか又は挿入ＮＰ遺伝子を欠いた適切なブランクベクターを注射した。
【００５８】
選択動物の筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡの存在又は非存在をＰＣＲで分析した（図１）。プラスミドＤＮＡ（ＮＰ又はルシフェラーゼＤＮＡ）は、試験した注射筋肉４８例中４４例で検出された。ルシフェラーゼＤＮＡ注射マウスでは、当業界で公知の方法によって筋抽出物中に回収されたルシフェラーゼ活性により、タンパク質発現を実証した［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１４６５（１９９０）：Ｇ．Ａｓｃａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，８１５（１９９１）；Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］。
【００５９】
ＮＰ  ＤＮＡの注射後の筋肉中のＮＰ発現は、ウエスタンブロット分析に関する検出限界を下回った（＜１ｎｇ）が、しかしＮＰ特異性抗体の産生によって示された（図２参照）。ＮＰ特異性ＣＴＬ生成の分析のために、免疫化後１〜４週目に脾臓を取り出し、脾細胞を組換え体ヒトＩＬ−２＋インフルエンザＡ（Ａ／ＰＲ／８／３４）に感染させるか又はＨ−２Ｋｄ制限核タンパク質ペプチドエピトープ（ＮＰ残基１４７−１５５。Ｏ．Ｋ．Ｒｏｔｚｓｃｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ３４８，２５２（１９９０）参照）でパルス化した自系脾細胞で再刺激した。ウイルス感染又はエピトープパルス化同系細胞で再刺激した脾細胞は、核タンパク質エピトープパルス化標的細胞を殺すことができる（図３Ａ）。これは、ＮＰＤＮＡの筋注が、特異的ＣＴＬ反応の誘発のためにＩ種のＭＨＣと会合した適切なＮＰ由来ペプチドを生成したことを示す。これらのＣＴＬはウイルスに感染した標的細胞（図３Ｂ）を、又はＨ−２Ｋｄ制限核タンパク質ペプチドエピトープ及びウイルス感染標的細胞でパルス化した標的細胞を認識又は溶解できる。このことはそれらの特異性並びに感染細胞中に自然に生じるエピトープを検出するそれらの能力の表われである。
【００６０】
ＮＰ  ＤＮＡワクチンの免疫原性のさらに厳密な測定は、一次ＣＴＬ反応の評価であった。ＮＰ  ＤＮＡ注入マウスから採取した脾細胞をＣｏｎ  Ａ及びＩＬ−２に曝して活性化したが、しかし適切な標的を殺すそれらの能力を試験する前の抗原発現細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激は実施しなかった。ＮＰ  ＤＮＡで免疫化したマウスからの脾細胞は、抗原特異性再刺激を行なわずにＣｏｎ  Ａ及びＩＬ−２でｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化した場合、エピトープパルス化及びウイルス感染標的細胞をともに溶解した（図３Ｃ及びＤ）。再刺激化及び活性化脾細胞の両方のこの溶解活性は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）後３４年目に生じた有毒マウス適合Ｈ３Ｎ２株であるインフルエンザＡ／ＨＫ／６８で予め感染させたマウスから得た同様に処理した脾細胞よりも優れている。したがって、ＮＰ  ＤＮＡの注入は、核タンパク質エピトープに特異的な、そして天然に処理された抗原を同定し得る（即ちウイルス感染細胞を殺し得る）ＣＴＬを生成した。ＮＰ  ＣＴＬも、ヒトＨＬＡ−Ａ２を発現するＣ３Ｈ及びＢ６トランスジェニックマウスで生成された。
【００６１】
ＮＰ  ＣＴＬは、１用量１μｇという少ないＮＰ  ＤＮＡ（試験した最低用量）を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓でも検出されている（表３−ＩＶ）。
【００６２】
表  ３−ＩＶ
ＮＰ  ＤＮＡ１回注射後のマウスにおけるＣＴＬ反応
【００６３】
【表１】
0003608642.tif 000002
【００６４】
表３−ＩＶ：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週）にＡ／ＰＲ／３４  ＮＰ  ＤＮＡ（Ｖ１ＪＮＰ）又は対照ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ）を指定用量で１回注射した。比較のために、マウスをインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／３４に感染させた。ＣＴＬを８週目に得て、ＮＰペプチドパルス化同系脾細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激し、５０：１のエフェクター：標的比でＮＰペプチドパルス化Ｐ８１５細胞に対して検定した。データは代表的な個々のマウスに関して特異的溶解度（％）で表した。
【００６５】
追加実験は、１μｇのＮＰ  ＤＮＡを１用量投与したマウスが少なくとも４．５か月（試験終了時）ＮＰ  ＣＴＬを保持したことを示した。ＤＮＡ注入後のＣＴＬ反応の大きさは、インフルエンザ感染マウスに匹敵した。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原再刺激後のＣＴＬの分析は厳密には定量的でないことに留意すべきである。したがって、マウスにおけるＮＰ特異的ＣＴＬのレベルをより定量的に評価するために、限定希釈検定を我々は目下開発中である。１００μｇのＮＰ  ＤＮＡを３用量注入されたマウスにおいて、ＣＴＬ反応は免疫化後少なくとも６か月検出された（図１９）。したがって、インフルエンザＰＮＶは、保存インフルエンザ抗原に向けられる長期的ＣＴＬ反応を生成する可能性を有する。
【００６６】
マウスにＮＰ  ＤＮＡを注射すると、高力価抗ＮＰ  ＩｇＧ抗体の産生が生じた（図２）。マウスにおける高力価ＩｇＧ抗体の生成は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の助けを要すると考えられる（Ｐ．Ｖｉｅｉｒａ及びＫ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，４８７（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，３０７１（１９９０））。これはｉｎ  ｓｉｔｕでプラスミドから発現されたＮＰがＩ種及びＩＩ種のＭＨＣの両方を提示するようにプロセッシングされたことを示す。
【００６７】
実施例４
有毒性ヒトインフルエンザウイルスによる誘発におけるマウスの防御：
インフルエンザに対する防御免疫におけるＮＰ抗体の役割を、２つのアプローチで示す：先ず、ウイルス肺力価を受動輸送実験で測定した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後１０週齢以上）に、ＮＰ  ＤＮＡ  ２００μｇを３回注射したマウスからプールした血清（ＰＢＳ  ２．０ｍｌで希釈）０．５ｍｌを腹腔内注射した。対照マウスには等容量のプールした正常マウス血清か又はＡ／ＨＫ／６８による感染から回復したマウスからのプール血清をこれも２．０ｍｌのＰＢＳに希釈して注射した。Ａ／ＨＫ／６８免疫血清の用量は、抗ＮＰ抗体のＥＬＩＳＡ力価がＮＰ  ＤＮＡ注射マウスからのプール血清と等しくなるように調整した。血清注射後２時間目に１０４ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いて盲検的に麻酔せずにマウスに誘発し、３日後、等量の血清をさらに注射した。注射後６及び７日目にマウスを屠殺し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌでのウイルス肺力価をＭｏｒａｎ［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，３２１，１９９１］の記載と同様にして測定した。
【００６８】
未使用マウスに、ＮＰ  ＤＮＡを注射したマウスから得た抗ＮＰ抗血清を注入し、次いでＡ／ＨＫ／６８を用いて誘発した。ウイルス誘発はＡ／ＨＫ／６８のマウス適合株を用いて実施し、その後マウスでｉｎ  ｖｉｖｏ継代を維持させた（Ｄｒ．Ｉ．Ｍｂａｗｕｉｋｅ私信）。使用したウイルス種子ストックは感染マウスからの肺のホモジネートであって、ＭＤＣＫ細胞では５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を有した。ウイルス肺力価測定及び体重損失試験のために、非麻酔マウスの鼻孔に１０４ＴＣＩＤ５０を含有する２０μｌを鼻腔内点滴注入してウイルス誘発した。この方法はウイルスの肺感染を徐々に引き起こすが、ＢＡＬＢ／ｃマウスには致命的でない［Ｙｅｔｔｅｒ，Ｒ．Ａ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９，６５４，１９８０］。生存実験では、ケタミン及びキシラジンによる全身麻酔下でマウスの鼻孔に１０２．５ＴＣＩＤ５０を含有する２０μｌを点滴注入してウイルス誘発した。この用量で麻酔マウスを感染させると急速な肺感染が生じ、非免疫化マウスの９０〜１００％が死亡した［Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｕｌｍａｎ及びＥ．Ｄ．Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１８，２５７，１９６３；Ｇ．Ｈ．Ｓｃｏｔｔ及びＲ．Ｊ．Ｓｙｄｉｓｋｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４，６９６，１９７６；Ｒ．Ａ．Ｙｅｔｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９，６５４，１９８０］。ウイルス肺力価は、Ｍｏｒａｎ等（上掲）の記載と同様に９６ウエルプレート中のＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手）における順次滴定により測定した。
【００６９】
抗ＮＰ抗血清（６．３±０．２；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）を投与したマウスにおいては、正常血清（６．１±０．３；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）を投与した対照マウスと比較して、ウイルス肺力価の低下は認められなかった。陽性対照として、Ａ／ＨＫ／６８に感染させたマウスから血清を収集し、４匹の未使用マウスに受動輸送させた。Ａ／ＨＫ／６８による誘発後、ウイルス感染はそれらの肺では検出されなかったが、これは全ウイルスに対するこの血清が同種ウイルスを用いた誘発を完全に防御したことを示す。第二に、筋注により未使用マウスを精製ＮＰ（５μｇ／足。６週間に３回）で免疫化した。これらのマウスは高力価ＮＰ特異性抗体を生成したが、しかしＮＰ特異性ＣＴＬは生成できず、致死用量のウイルスを防御できなかった。したがって、全ウイルスに対する抗体の中和作用と違って、流行中の抗ＮＰＩｇＧはマウスに対して防御免疫を付与しなかった。
【００７０】
ＮＰ  ＤＮＡ注射のｉｎ  ｖｉｖｏ防御効力を評価して、細胞媒介免疫反応が機能的に有意であるか否かを調べた。免疫反応の有効性の直接測定法の１つは、最初にＮＰ  ＤＮＡで免疫化したマウスが異種株のインフルエンザ（Ａ／ＨＫ／６８；Ｈ３Ｎ２）による漸進的亜致命的肺感染を消散する能力であった。ウイルス誘発は上記と同様に実施した。ＮＰ  ＤＮＡで免疫化したマウスは、免疫化されなかった（４．１±０．３；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）、又はブランクベクターで免疫化された（４．５±０．０；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）対照マウスの場合に比べ、７日目の大きさが３等級低い（１．０±１．０；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）誘発後ウイルス肺力価を有した。実際、４匹の免疫化マウスのうち３匹がその肺に検出不可能なレベルのウイルスを有したに過ぎなかったが、一方この時点でウイルスが除去された対照はなかった。この実験及び別の６つの実験で観察されたウイルス肺力価の顕著な差異は、免疫反応がウイルスの清掃を促すことを意味する。ブランクベクター対照に防御作用が欠けていることは、ＤＮＡそれ自体は免疫反応に関与しないことを示す。さらに、ウイルスの誘発株Ａ／ＨＫ／６８（有毒性マウス適合Ｈ３Ｎ２株）はＮＰ遺伝子をクローン化した株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）とは異種であるため、免疫は明らかに異型であった。
【００７１】
ウイルス誘発性罹患の尺度として、ＮＰ  ＤＮＡで免疫化後にインフルエンザＡ／ＨＫ／６８で亜致命的に感染させたマウスにおいて体重損失を監視した（図４）。非注射マウス又はブランクベクターを注射したマウスを対照として用いた。ＮＰ  ＤＮＡで免疫化したマウスは対照マウスに比して体重損失が少なく、インフルエンザＡ感染後により迅速に試験前の体重に戻った。
【００７２】
全身麻酔マウスをインフルエンザＡで鼻腔内感染させると、肺での急速な広範囲のウイルス複製が生じ、感染を制御できない場合には６〜８日で死亡した（Ｒ．Ａ．Ｙｅｔｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９，６５４（１９８０））。この方法で誘発したマウスの生存率は急性肺感染の重症度を制限するそれらの能力を反映する。インフルエンザの２つの異なる株Ａ／ＨＫ／６８（図５参照）及びＡ／ＰＲ／８／３４を用いた誘発に生き残るマウスの能力を調べた。ＮＰ  ＤＮＡで予め免疫化したマウスは９０％の生存率を示したが、これに比してブランクベクター注射対照では０％、非注射対照動物では２０％であった（図５）。このような１４の試験全体で、ＮＰ  ＤＮＡで免疫化したマウスは対照よりも少なくとも５０％多い生存率を示した。したがって、３４年後に生じた異なる株のウイルスにより引き起こされる回復及び疾病低減を有効に促すＮＰ  ＤＮＡ誘発性免疫反応の能力は、細胞毒性Ｔリンパ球反応の生成のために保存タンパク質を標的とすべきだとする論理的根拠を支持する。
【００７３】
実施例５
インフルエンザウイルス単離物からの遺伝子の単離：
古くから多数のインフルエンザウイルス株がＡＴＣＣに寄託されている（Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ＆  Ａｎｔｉｓｅｒａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ  ＆Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ第六版の１９９０年カタログにはインフルエンザＡ株２０種及びインフルエンザＢ株１４種が列挙されている）。
【００７４】
Ａ．ウイルス株及び精製：
現在の１９９２年インフルエンザシーズンワクチンを包含するインフルエンザ株は、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｌＤｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡのＮａｎｃｙ  Ｊ．Ｃｏｘ博士から入手した。これらの株を以下に挙げる：（１）Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９（Ｈ３Ｎ２）；（２）Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；（３）Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０；及び（４）Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３。
【００７５】
これらのウイルスはすべて、９〜１１日齢鶏卵胚中で継代により増殖させ（ＭＤＣＫ細胞中で増殖させたＡ／Ｇｅｏｒｇｉａを除く）（１００〜２００／ウイルス標本）、Ｍａｓｓｉｃｏｔ等（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０１，２４２−２４９（１９８０））が記載した方法の変法により精製した。手短に言えば、ウイルス懸濁液を８０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心分離器。ＧＳ−３ローター）して透明にし、次いでＢｅｃｋｍａｎ  １９型ローターで１８，０００ｒｐｍで２時間遠心分離してペレットとした。ペレット化ウイルスをＳＴＥ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離（Ｈｅｒｍｌｅ  Ｚ３６０Ｋ遠心分離器）して、凝集物を除去した。上清  ２ｍｌを、６０％ショ糖  ２ｍｌとＳＴＥで緩衝した上層の３０％ショ糖  ７ｍｌから成る不連続ショ糖勾配上に層とし、３６，０００ｒｐｍ（ＳＷ−４０ローター，Ｂｅｃｋｍａｎ）で９０分遠心分離した。バンド化ウイルスを界面で収集し、ＳＴＥで１０倍に希釈して、３０，０００ｒｐｍで２時間（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ４５ローター）ペレット化した。次にペレット化ウイルスを−７０℃で凍結した。
【００７６】
Ｂ．ウイルスＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡ合成：
ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９（１９８７））の方法を用い、市販キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてグアニジニウムイソチオシアネート抽出により凍結ウイルスからウイルスＲＮＡを精製した。メーカーの指示に従い、いくつかの修正を加えて、市販ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてウイルスＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。すべてのＡ株遺伝子に関し、ウイルスＲＮＡの３′末端に位置する保存配列と相補的である合成オリゴデオキシリボヌクレオチド  ５′−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ−３′（配列番号３０）を用いて、ｃＤＮＡの一次鎖をプライムした。この配列はすべてのＡ型インフルエンザウイルスＲＮＡに共通であり、したがって任意のＡ株インフルエンザウイルス遺伝子をクローニングしてもよい。ｃＤＮＡの一次及び二次鎖の合成後、フェノール／クロロホルムで反応物を抽出し、キットの指令に従うよりむしろエタノール沈降させた。次にこれらの盲端化ｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化したＶ１Ｊｎｅｏ又はＶ１Ｊｎｓベクターに直接結紮し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで盲端化して、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理した。
【００７７】
特定の全長ウイルス遺伝子をスクリーニングするために、指定ウイルス遺伝子の翻訳開放読み枠の末尾に３′末端を補足するよう意図された合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを我々は用いた。アガロース電気泳動ゲル上での制限マッピング及びサイズ確定により全長遺伝子を示すと思われる標本を、ウイルス遺伝子とＶ１Ｊｎｅｏとの両接合部のジデオキシヌクレオチドシーケンシングにより実証した。これらのウイルスからクローン化した各遺伝子の配列接合部を下記の実施例８に示す。
【００７８】
同様の方法を用いて、ウイルスＲＮＡの各末端に共通の配列を有さぬＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０に関するものを除き、上記のウイルスの各々からｃＤＮＡをクローニングし、オリゴデオキシリボヌクレオチドの混合物を用いて一次鎖ｃＤＮＡ合成をプライムした。これらのプライマーを以下に示す：
（１）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣ−３′（ＰＢ１及びＰＢ２、配列番号３１）；
（２）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡ−３′（ＮＳ及びＨＡ、配列番号１９）；
（３）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＣＡＣ−３′（Ｍ、配列番号２２）；
及び
（４）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡ−３′（ＮＰ、配列番号２３）。
【００７９】
ＰＣＲでクローン化された遺伝子に関しては、盲端ｃＤＮＡ溶液をＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ反応に直接用いた。ＰＣＲによって得た６つのインフルエンザ遺伝子をクローニングするために用いたプライマーを以下に挙げる：
１．Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３からのＨＡ遺伝子
センスプライマー（配列番号３３）
５′ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ３′
アンチセンスプライマー（配列番号３３）
５′ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＡＡＴ  Ｇ  ３′
２．Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１からのＨＡ遺伝子
センスプライマー（配列番号３５）
５′ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＴＧ  ３′
アンチセンスプライマー（配列番号３６）
５′ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＡＧ  ３′
３．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＨＡ遺伝子
センスプライマー（配列番号３７）
５′ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ３′
アンチセンスプライマー（配列番号３８）
５′ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ３′
４．Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９からのＭ１遺伝子
センスプライマー（配列番号３９）
５′ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ３′
アンチセンスプライマー（配列番号４０）
５′ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ３′
５．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＮＰ遺伝子
センスプライマー（配列番号４１）
５′ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ３′
アンチセンスプライマー（配列番号４２）
５′ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ３′
６．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＭ１遺伝子
センスプライマー（配列番号４３）
５′ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ３′
アンチセンスプライマー（配列番号４４）
５′ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＴＡＧ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＡＧＣ  ＴＧ  ３′
生成するのがｃＤＮＡであれＰＣＲであれ、すべてのインフルエンザ遺伝子クローンを遺伝子結紮部位を中心に配列解析し、トランスフェクトＲＤ細胞において遺伝子を発現することにより立証した。発現はイムノブロットにより検出した。
【００８０】
Ａ／Ｈ３Ｎ２株に関するＮＰ及びＭ１構築物（ベクター４及び５）をＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９から作製した。ＮＰ及びＭ１遺伝子には高程度の保存が期待でき、そしてそれらの有効性のために、これらの遺伝子を選択した。
【００８１】
前記の研究から、組合せて生成される７つの発現ベクターの特に好ましい群を以下に挙げる：
１．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３）  ６．５６Ｋｂ
２．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１）      ６．５６Ｋｂ
３．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０）    ６．６１Ｋｂ
４．Ｖ１Ｊｎｓ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９）６．４２Ｋｂ
５．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９）５．６２Ｋｂ
６．Ｖ１Ｊｎｓ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０）    ６．５４Ｋｂ
７．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０）    ５．６１Ｋｂ
発現ベクター中のこれらの遺伝子の接合部に関して関連のある配列を以下に示す。構築物の小部分の配列解析が、正確に遺伝子がクローン化されたことを実証するのに十分だった。同様の公知の遺伝子と比較すれば、指定遺伝子がＮＰ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｍ１遺伝子等であることを実証するのは容易である。例えば、Ａ／Ｔｅｘａｓ  ＨＡ遺伝子配列はＡ／Ｋｉｅｖ／５９／７９のＨＡ遺伝子配列と非常に類似しており、その配列は受け入れ番号Ｍ３８３５３号としてＧＥＮＢＡＮＫで入手可能である。同様に、Ｂ／Ｐａｎａｍａ  ＨＡ配列に関しては、受け入れ番号Ｍ１８３８４号としてＧＥＮＢＡＮＫで入手可能なＢ／Ｅｎｇｌａｎｄ／２２２／８２  ＨＡ配列と非常に類似している。同様の方法で、任意のヒトインフルエンザウイルスからの指定の遺伝子に関するクローン化配列の同一性を実証し得る。下記の各々の場合、全遺伝子が存在することの確認のために、５′配列と３′配列の両方を検討した。各々の場合、下線ＡＴＧはインフルエンザ遺伝子の開始コドンを示し、一方３′部分の下線配列は停止コドンである：
0003608642.tif 000003
0003608642.tif 000004
実施例６
Ｖ１Ｊ発現ベクター（配列番号１０）：
Ｖ１Ｊを作るに際しての我々の目的は、それらを所要の状況により対処するようにわれわれのベクター  Ｖ１からプロモーター及び転写終止要素を除去し、より密なベクターを作製し、そしてプラスミド精製収率を改良することであった。
【００８２】
Ｖ１Ｊは、ベクターＶ１（実施例１参照）及び市販プラスミドであるｐＵＣ１８から得た。Ｖ１をＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ＤＮＡの２つの断片を生成した。ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及び異種遺伝子の発現を制御するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終止要素を含有するこれらの断片の小さい方（配列番号１１）を、アガロース電気泳動ゲルから精製した。次に、別の“盲端”ＤＮＡ断片にそれを結紮しやすくするために、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いてこのＤＮＡ断片の末端を“盲端”にした。
【００８３】
発現ベクターの“骨格”には、ｐＵＣ１８を選択した。それは高収率のプラスミドを生成として知られ、配列及び機能が十分特徴づけられており、サイズは最小である。われわれはＨａｅＩＩ制限酵素を用いた部分消化により、このベクターから全ｌａｃオペロンを除去したが、これはわれわれの目的には不必要であって、プラスミド収率及び異種遺伝子発現に不利益である。残りのプラスミドを、上記と同様にアガロース電気泳動ゲルから精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化して、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、上記のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ要素と結紮した。ｐＵＣ骨格内のプロモーター要素の２つの考え得る配向のいずれかを持つプラスミドを得た。これらのプラスミドの１つは大腸菌中でさらに高収率のＤＮＡを生じ、これをＶ１Ｊ（配列番号１０）と名づけた。このベクターの構造を接合領域の配列解析により確認し、次いでＶ１と比較した場合に、それに匹敵する又はより高い異種遺伝子発現率をしめすことを実証した。
【００８４】
実施例７
発現ベクターＶ１Ｊにおけるインフルエンザウイルス遺伝子構築物：
インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／８／３４株からの遺伝子の多くは、実施例４に記載されているように、Ｖ１ベクターと同様か又はそれより高いレベルでの発現を生じるベクターＶ１Ｊ中にクローン化した。ＰＲ８遺伝子配列は公知であって、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースから入手できる。下記のクローン化遺伝子の各々に関して、クローン化される断片のサイズをサイジングゲルにより点検し、部分配列が比較対象となるＧＥＮＢＡＮＫ受け入れ番号を提示した。ウイルス株から、例えばＡＴＣＣから入手したウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４はＡＴＣＣＶＲ−９５である）からこれらの遺伝子を得る方法に関しては、実施例５を参照して頂きたい。
【００８５】
Ａ．ＰＲ８遺伝子のＶ１Ｊ中でのサブクローニング：
１．ＮＰ遺伝子
ｐＡＰＲ５０１からＮＰ遺伝子をサブクローニングした（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｒｄａ）ｐｐ．１２９−１３８）。ＥｃｏＲＩでｐＡＰＲ５０１を切断することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。クローン化断片は１．６キロ塩基の長さであった。
【００８６】
２．ＮＳ
ｐＡＰＲ８０１からＮＳ遺伝子をサブクローニングした（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。ＥｃｏＲＩでｐＡＰＲ８０１を切断することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。クローン化断片は０．９キロ塩基の長さ（ＮＳ１及びＮＳ２を含む完全ＮＳコード領域）であった。
【００８７】
３．ＨＡ
ｐＪＺ１０２からＨＡ遺伝子をサブクローニングした（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。ＨｉｎｄＩＩＩでｐＪＺ１０２を切断することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。クローン化断片は１．７５キロ塩基の長さであった。
【００８８】
４．ＰＢ１
ｐＧｅｍ１−ＰＢ１からＰＢ１遺伝子をサブクローニングした（ベクターとの遺伝子の５′及び３′接合部を配列解析してそれらの同一性を実証した。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８を参照）。ＨｉｎｄＩＩＩでｐＧｅｍ１−ＰＢ１を切断することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。クローン化断片は２．３キロ塩基の長さであった。
【００８９】
５．ＰＢ２
ｐＧｅｍ１−ＰＢ２からＰＢ２遺伝子をサブクローニングした（ベクターとの遺伝子の５′及び３′接合部を配列解析してそれらの同一性を実証した。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。それを、ＢａｍＨＩでｐＧｅｍ１−ＰＢ２を切断することにより切り出し、断片ゲルを精製した。付着端化断片をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入した。クローン化断片は２．３キロ塩基の長さであった。
【００９０】
６．Ｍ１
プラスミドｐ８９０１  ＭＩＴＥからＰＣＲによりＭ１遺伝子を生成した。このプラスミド中のＭ配列は、“センス”プライマーに関してはオリゴマー５′−ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ−３′（配列番号３）を、“アンチセンス”プライマーに関してはオリゴマー  ５′−ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ−３′（配列番号４）を用いて、ｐＡＰＲ７０１からＰＣＲにより生成した（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ  Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。ＰＣＲ断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩで切断して、ＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に結紮した。クローン化断片は０．７キロ塩基の長さであった。コード化Ｍ１のアミノ末端は上記のように“ＡＴＧ”として“センス”プライマー中にコードされ、一方Ｍ１翻訳停止コドンは、センス方向では停止コドン“ＴＧＡ”である  “ＴＣＡ”コドンの復帰によりコードされる。
【００９１】
Ｂ．インフルエンザ遺伝子−Ｖ１Ｊ発現構築物：
各々の場合に、クローン化遺伝子中での５′プロモーター領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）からの接合配列を示す。これらの配列は、コード配列の配列を生成するプライマー：
ＣＭＶｉｎｔＡプライマー  ５′−ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧ−３′（配列番号２８）
をシーケンシングして作成した。接合が起きる位置を“／”で区分したが、これは配列がここで切れていることを示すものではない。これらの構築物の調製方法を下記のすべての配列の後に要約した。提示した各配列は指定のインフルエンザ遺伝子に関する完全な、利用可能且つ発現可能なＤＮＡ構築物を表す。
【００９２】
各構築物を一時的に培養中のヒト横紋筋肉腫細胞系であるＲＤ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１３６）中でトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間目に細胞を採集し、溶解させて、ウエスタンブロットを実施した（マウスで試験し、ウエスタンブロット実施前に抗ＨＡ特異性抗体を生じ、したがって発現がｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたのでウエスタンブロットを実施する必要がないＶ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ構築物を除く）。ＰＢ１、ＰＢ２及びＮＳタンパク質に特異的な抗体は、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現される精製タンパク質を用いてポリクローナル抗血清を生成したケンブリッジ大学のＳｔｅｐｈｅｎ  Ｉｎｇｌｉｓの提供によるものであった。全Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスを用いてウサギを免疫化して、抗ＮＰポリクローナル抗血清を生成した。抗Ｍ１抗体は、ヤギ抗インフルエンザＡ抗血清として、カタログ番号Ｂ６５２４５ＧでＢｉｏｄｅｓｉｇｎから市販されている。各々の場合、予測サイズのタンパク質が観察されたが、これはコード化インフルエンザタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示すものである。
【００９３】
これらの構築物に対する呼称は慣用的に以下のように示す：“ベクター名−インフルエンザ株−遺伝子”。すべての場合に、クローン化及びシーケンス化Ａ／ＰＲ／８／３４遺伝子配列に関してＧＥＮＢＡＮＫの公知配列との異同を点検した。これらの構築物の各々の生理活性を、上記の実施例２、３及び４と同様に実証した：
ＣＭＶｉｎｔＡ及びＡ／ＰＲ／８／３４からのインフルエンザ遺伝子の５′接合部付近の配列：
0003608642.tif 000005
0003608642.tif 000006
断片接合方法：
１．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＰ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクター）−盲端化ＥｃｏＲＩ（ＮＰ）
２．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ１：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクター）−盲端化ＨｉｎｄＩＩＩ（ＰＢ１）
３．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＳ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクター）−盲端化ＥｃｏＲＩ（ＮＳ１）
４．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクター）−盲端化ＨｉｎｄＩＩＩ（ＨＡ）
５．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ２：付着端化ＢｇｌＩＩ（ベクター）−付着端化ＢａｍＨＩ（ＰＢ２）
６．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−Ｍ１：付着端化ＢｇｌＩＩ（ベクター）−付着端化ＢｇｌＩＩ（Ｍ１）
Ｍ１は、鋳型としてのｐ８９０−Ｍ１ＴＥ及び両端にＢｇｌＩＩ部位を付加し、Ｍ１（ＴＧＡ）に関してＡＴＧの３塩基前で開始して終止コドン後の右で終結するプライマーを用いて、ＰＣＲにより得た。
【００９４】
実施例８
Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター（配列番号１８）：
大規模発酵槽中ではアンピシリンを用い得ないため、Ｖ１Ｊを採取した細菌の抗生物質選択のためにあるａｍｐｒ  遺伝子を除去する必要があった。ＳｓｐＩ及びＥａｍＩ１０５１制限酵素で消化することにより、Ｖ１ＪのｐＵＣ骨格からａｍｐｒ遺伝子を除去した。残りのプラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化して、次いで仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３から得られ、ｐＵＣ４Ｋプラスミド内に含有される市販のｋａｎｒ遺伝子をＰｓｔＩ制限酵素を用いて切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。この断片をＶ１Ｊ骨格と結紮し、いずれかの方向でｋａｎｒ  遺伝子を有するプラスミドを得て、これをＶ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名した。これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、接合領域のＤＮＡ配列解析により確認し、Ｖ１と同様の量のプラスミドを生成することを示した。異種遺伝子物質の発現も、これらのＶ１ＪｎｅｏベクターはＶ１Ｊに匹敵した。我々は取りあえずＶ１Ｊｎｅｏ＃３という呼称を選択したが、以後Ｖ１Ｊｎｅｏ（配列番号１８）と呼ぶ。これは発現構築物としてのＶ１Ｊ中にａｍｐｒ遺伝子と同じ方向にｋａｎｒ遺伝子を含有する。
【００９５】
Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１及びＢ／Ｐａｎａｍａ／４６／９０株の各々からの遺伝子をｃＤＮＡとして、ベクターＶ１Ｊｎｅｏ中でクローン化した。各々の場合、コード配列の配列を規制する５′プロモーター領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）からクローン化遺伝子への接合配列を、プライマー：
ＣＭＶｉｎｔＡ  プライマー  ５′−ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＴＣＣ
ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧ−３′（配列番号２８）
を用いて配列解析した。これはターミネーター／コード配列へ続いており、その接合も示されている。この配列は、非コード化鎖の配列を規制するプライマー：ＢＧＨプライマー  ５′−ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＧ−３′（配列番号２９）を用いて生成した。すべての場合に、これらの又は他のインフルエンザ単離物からのクローン化し配列解析した遺伝子に関しては、ＧＥＮＢＡＮＫからの公知の配列と照合した。接合が起きる位置を“／”で区分したが、ここで配列が切れているわけではない。Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＴＸ−ＨＡ接合の場合、シーケンシングゲルが圧縮され、初期配列を読み取るのは難しかった。したがって、この接合部の最初の８塩基を“Ｎ”とした。これらのヌクレオチドは後に確認し、同定ヌクレオチドが表示されている。各配列に含まれる最初の“ＡＴＧ”はそれぞれのクローン化遺伝子に関する翻訳開始コドンである。表示した各配列は指定のインフルエンザ遺伝子に関する完全な、利用可能且つ発現可能なＤＮＡ構築物を表す。これらの構築物に対する呼称は慣用的に以下のように示す：“ベクター名−インフルエンザ株−遺伝子”。これらの構築物の各々の生理活性を、上記の実施例２、３及び４と同様に実証した。
【００９６】
異なるインフルエンザ株及びタンパク質を用いての、ＣＭＶｉｎｔＡ及びインフルエンザ遺伝子の５′接合部、並びにインフルエンザ遺伝子及びＢＧＨターミネーター発現構築物との３′接合部配列：
0003608642.tif 000007
0003608642.tif 000008
実施例９
インフルエンザ遺伝子の皮内注射：
遺伝子の皮内導入のための手法は筋注の場合と同様で、Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ  ２００μｇを３週間おきに３回注射した。３回目の注射後５５日目にｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定のために脾臓を採取し、ノナペプチド核タンパク質エピトープ１４７−１５５（配列番号９）で再刺激した。標的細胞（Ｐ８１５細胞、マウス肥満細胞腫、ＢＡＬＢ／ｃマウス  Ｈ−２ｄ  と同系のもの）を異種ウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３に感染させて、５：１〜４０：１の範囲のエフェクター：標的比でエフェクターとして脾細胞を用いて特異的溶解を施した。陰性対照には、インフルエンザウイルスに感染していない標的細胞の溶解を測定した。陽性対照には、Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ  １３０μｇを３回注射し、Ａ／ＨＫ／６８による生インフルエンザウイルス感染を生き抜いたマウスから得た脾細胞によるインフルエンザウイルス感染標的細胞の溶解を測定した。
【００９７】
結果：全エフェクター：標的比での皮内注射マウスからの脾細胞を用いて特異的溶解を達成した。非注射マウス又は挿入ＰＲ−ＮＰ遺伝子を含有しないベクターＶ１を注射したマウスから得た脾細胞をエフェクター細胞として用いた場合は、特異的溶解は認められなかった。さらに、皮内供給を用いて達成した特異的溶解は、全エフェクター：標的比で筋注により得た結果に匹敵した。インフルエンザウイルス肺力価も皮内注射又は筋注マウスで測定した。各群５匹のマウスを用い、３×２００μｇの用量で３週間おきに投与し、そして最終投与後３週目に誘発した結果を以下に示す：
0003608642.tif 000009
【００９８】
最後に、マウスの生存率（％）を２８日まで試験した。２８日目に、Ｖ１−ＮＰ−ＰＲを投与したマウスのうち、筋注受容者の８９％、皮内受容者の５０％が生存した。Ｖ１ベクターのものはまったく生存せず、非処理マウスは３０％だけが生存した。この実験は、Ａ／ＰＲ／８／３４株からの核タンパク質をコードするＤＮＡが、それとは異種株のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３からの核タンパク質を認識するＣＴＬ及び異種株Ａ／ＨＫ／６８に対する防御免疫反応を誘発し得たことを実証する。
【００９９】
実施例１０
霊長類におけるポリヌクレオチドワクチン接種
１．アカゲザルにおけるＮＰに対する抗体：アカゲザル（００６  ＮＰ、００９ＮＰ又は対照１０１；０２１）に１ｍｇ／部位のＲＳＶ−ＮＰを１日目に３部位に筋注した。各々１ｍｇのＲＳＶ−ＬＵＸ及びＣＭＶ−ｉｎｔＬＵＸ（リポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ発現に関する構築物）を同時に別々の部位に注射した。１５日目に動物に、以前と同量のＤＮＡと、並びに１ｍｇのｐＤ５−ＣＡＴ（リポーター遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現に関する構築物）を各々の部位に再注射した。リポーター遺伝子を含有する筋肉部位を生検し、リポーター遺伝子活性に関して検定した。最初の注射後３、５、９、１１、１３及び１５週目に血清を採集した。抗ＮＰ抗体に関する陽性標本は１１週目に初めて採集され、さらに陽性標本を１３及び１５週目にも採集した。抗ＮＰ抗体は、ＥＬＩＳＡにより定量した。結果を図９に示す。
【０１００】
２．アカゲザルにおけるヘマグルチニン抑制（ＨＩ）抗体：１日目にサルにＶ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡを筋注した。２匹の動物の各四頭筋に各々１ｍｇ、１００μｇ又は１０μｇのＤＮＡを投与した。注射は各々０．５ｍｌの容量で投与した。１日目の注射の前に動物を採血した。１５日目に全動物にＤＮＡを再注射して、その後２〜４週間おいて血液を採集した。Ａ／ＰＲ／８／３４に対するヘマグルチニン抑制（ＨＩ）力価は、Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ  ＤＮＡの最初の注射後５、９及び１２週目に陽性となった。結果を表１０−Ｉに示す。
【０１０１】
表  １０−Ｉ
Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ  ＤＮＡ投与アカゲザルのＨＩ抗体力価
【０１０２】
【表２】
0003608642.tif 000010
【０１０３】
実施例１１
フェレットにおけるポリヌクレオチドワクチン試験
１．ＨＡ（株特異性中和抗体を誘発し得る表面タンパク質）又は内部タンパク質ＮＰ、ＮＳ１、ＰＢ１、Ｍ（株非依存性である細胞媒介免疫反応を誘発すると考えられる）をコードする遺伝子で免疫化することにより、インフルエンザＡ感染から動物が防御されるか否かを調べるために、フェレットにおけるポリヌクレオチドワクチン接種の試験を開始した。下記のように、われわれのＶ１Ｊ−ベクター中の種々のインフルエンザ遺伝子をコードするＤＮＡを動物に注射した：
表  １１−Ｉ
【０１０４】
【表３】
0003608642.tif 000011
【０１０５】
２．免疫化後２２日目及び４３日目に、免疫化動物から血清を採集し、中和（ヘマグルチニン抑制−ＨＩ）抗体及び核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体に関して、ＥＬＩＳＡにより検定した。ＤＮＡを投与した動物は、対応する遺伝子に対する抗体を発現していた。これらを添付の図１０、１１及び１６に示す。
【０１０６】
３．１２８日目に、選択免疫化動物に１２００ＴＣＩＤ５０のインフルエンザＡ／ＨＫ／６８による誘発を施した。この株は、免疫化するために用いるコード配列の供給源であるＡ／ＰＲ／８／３４株に対して異種であって、したがって防御は細胞媒介株非依存性免疫機序を基礎にした免疫を示す。添付の図１２に示すように、対照と比較した場合のウイルス脱落の統計的に有意の低減は内部タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化した動物に認められ、このことはフェレットにおけるポリヌクレオチド免疫化が免疫反応を引き出し得、このような反応は防御的であることを実証する。
【０１０７】
４．Ａ／ＰＲ／８／３４を用いた同種誘発を同様に実施し、ポリヌクレオチドワクチン接種により誘発される中和抗体の防御効力を同様に実証する。
【０１０８】
実施例１２
Ｖ１Ｊｎｓの取得
組込み研究を可能にするために、ＳｆｉＩ部位をＶ１Ｊｎｅｏに付加した。市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）をベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に付加した。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで線状にし、ゲル精製して、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼにより盲端化し、盲端ＳｆｉＩリンカーに結紮した。制限マッピングによりクローン性単離物を選択し、リンカー部分の配列解析で確認した。新規のベクターをＶ１Ｊｎｓと呼ぶ（図１７）。Ｖ１Ｊｎｓ（ＳｆｉＩを有する）における異種遺伝子の発現は、Ｖ１Ｊｎｅｏ（ＫｐｎＩを有する）における同一遺伝子の発現に匹敵した。
【０１０９】
実施例１３
免疫原性
１．体液性免疫反応
インフルエンザＨＡ、ＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡの注入は、マウス、フェレット又は非ヒト霊長類（アフリカミドリザル及びアカゲザルを含む）において、体液性免疫反応を引き起こした。今日までのところ、インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／３４、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ／Ｔｅｘａｓ／９１、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３株からクローン化したＨＡ遺伝子を含有するＰＮＶは、抗体を生成することが示された。
【０１１０】
ａ）マウス：ＮＰ及びＭ１に対する抗体を、ＤＮＡ注射後のマウスからの血清中でＥＬＩＳＡにより検出した。抗体力価の相当な値（１０４  〜１０６  ）が、１μｇという少ないＮＰ  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を１回投与（試験最小用量）でも生じ、注射後２週間という早さ（試験最短時間）で生じ、注射後少なくとも６か月間は低減しなかった。これらのＮＰ抗体は中和を示さず、防御に関与しなかった。しかしながら、それらはＤＮＡ注射後のｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＰタンパク質発現をもたらす。これに対比して、ＨＡに対する抗体は、インフルエンザウイルスの同種株に対する防御免疫を提供する。Ａ／ＰＲ／３４株からクローン化したＨＡ  ＤＮＡを注入すると、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）検定によりｉｎｖｉｔｒｏで測定されたところによると、中和抗体の産生が起こる。ＨＩ力価≧１２８０は、１００μｇのＨＡ  ＤＮＡを３回投与したマウスの多数で測定され、検出可能な力価は０．１μｇの２回投与といった少量投与動物でも何匹かに観察された。ＨＩ力価とＤＮＡ用量との間、並びにＨＩ力価と注入回数との間に用量−反応関係が認められた（表１３−Ｉ）：
表  １３−Ｉ
マウスにおける体液性免疫反応の発生
【０１１１】
【表４】
0003608642.tif 000012
【０１１２】
表１３−Ｉ：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）にＡ／ＰＲ／３４  ＨＡ  ＤＮＡ（Ｖ１ＪＨＡ）を３週間おきに指定用量で１、２又は３回注射した。陰性対照には、遺伝子挿入物を含有しないベクター（Ｖ１Ｊ）から成る対照ＤＮＡを注射したマウス、及び未使用非注射マウスが含まれた。投与後７週目に血清標本を採集し、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）抗体の存在に関して分析した。データはゲノム平均ＨＩ力価（ｎ＝１０）で表す。
【０１１３】
ａＨＩ力価に対して陽性の試験マウスが一部あった。
【０１１４】
ｂ全マウス。
【０１１５】
試験したすべてのマウスにおいて、ＨＩ抗体の存在は同種誘発モデルにおける防御と相関した。ＨＡ  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を注射したマウスにおけるＨＩ抗体反応は、少なくとも６か月間は事実上変わらぬままであった。ＨＡ抗体は、ＥＬＩＳＡで測定されるように、インフルエンザウイルスのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０及びＡ／Ｔｅｘａｓ／９１株からのＨＡ  ＤＮＡを用いてマウスにおいて生成された。
【０１１６】
ＤＮＡ注入後の老齢マウスにおける低リポーター遺伝子発現を示した文献の報告に基づいて、ＨＡに対する体液性免疫反応に及ぼす年齢の影響を調べた。老齢処女雌マウスが入手できないために、約１０か月齢の引退した繁殖用動物を用いた。引退繁殖用動物及び４〜６週齢処女マウスを、ＨＡに対する抗体を生成するその能力に関して比較した。老齢マウスは、若年マウスより低い力価にもかかわらず、１μｇ（試験最低用量）という低用量でのＨＡ  ＤＮＡ注射後にもＨＡ抗体を生成した（表１３−ＩＩ）。
【０１１７】
表  １３−ＩＩ
体液性免疫反応に及ぼす年齢の影響
【０１１８】
【表５】
0003608642.tif 000013
【０１１９】
表１３−ＩＩ：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢処女及び１０か月齢引退繁殖用動物）にＡ／ＰＲ／３４  ＨＡ  ＤＮＡ（Ｖ１ＪＨＡ）を３週間おきに指定用量で３回注射した。陰性対照には、対照ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ）を注射したマウス、及び未使用非注射マウスが含まれた。比較のために、他のマウスに亜致死量のインフルエンザＡ／ＰＲ／３４を注入した。投与後９週目に血清標本を採集し、ＨＩ力価に関して分析した。データはゲノム平均ＨＩ力価（ｎ＝１５）で表す。
【０１２０】
ａＨＩ力価に対して全試験マウスが陰性だった。
【０１２１】
しかしながら、これはＰＮＶそれ自体の結果ではなく、むしろ生Ａ／ＰＲ／３４ウイルスに感染後に老齢マウスは概して若年マウスよりも低いＨＩ反応を示すという、体液性免疫反応を生成する老齢マウスの能力の低下の結果であった。実際、ＨＩ抗体はＤＮＡ接種老齢マウスにおいてはインフルエンザ感染老齢マウスよりＨＩ抗体の抑制度は低いと思われた。さらに、本試験に用いた引退繁殖用動物は、同一年齢の典型的処女より約５０％重かったが、このことはマウスにおけるカロリー制限餌を用いた他の研究者の研究に基づけば、これらの動物の免疫反応に不利益な作用を及ぼし得た。このそして他の理由により、これらのマウスの免疫反応は代表的なものとはいえない。にもかかわらず、年齢（少なくとも１０か月まで）によっては、１μｇという低用量においてさえ、体液性免疫反応を誘発するポリヌクレオチドワクチン接種の能力が有意に低減したとは思えない。
【０１２２】
ｂ）フェレット：体液性免疫反応は、インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／３４、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３株からのＨＡ  ＤＮＡを注射したフェレットにおいて生じた。Ａ／ＰＲ／３４に対するＨＩ抗体及び他の株からのＨＡに対するＥＬＩＳＡ抗体を適切なＰＮＶにより引き出した。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３  ＨＡ  ＤＮＡを注射したフェレットからの血清は、これらの動物がウイルス誘発から防御されたため、ＨＩ抗体及び中和抗体を有することが判明している。
【０１２３】
ｃ）非ヒト霊長類：（上記実施例１０も参照）。１０、１００及び１０００μｇ／足の用量でＨＡ  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を２回用いてアカゲザルを免疫化した。３２０に及ぶＨＩ力価が、１００又は１０００μｇ用量を投与した動物において測定されたが、２匹の１０μｇ投与サルのうちの１匹はＨＩ力価が８０であった。今までのところ、１３か月まで血清を検定した。ＨＩ力価は６〜１３か月では検出できるほどは低減しなかった（表１３−ＩＩＩ）：
表  １３−ＩＩＩ
アカゲザルにおけるＨＩ抗体の生成
【０１２４】
【表６】
0003608642.tif 000014
【０１２５】
表１３−ＩＩＩ：体重４．３〜８．８ｋｇの大きさのアカゲザル（雌雄）にＡ／ＰＲ／３４  ＨＡ  ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ  ＨＡ）を指定用量で０及び２週目に注入した。血清標本は投与後の指定時間に採取し、ＨＩ力価に関して分析した。データは個々の動物に関するＨＩ力価を表す。
【０１２６】
ＨＡ  ＤＮＡ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９）１００μｇを含有する組合せＰＮＶを注射したアフリカミドリザルにおいて、１回投与後４〜６週目の血清の評価は２９というＧＭＴを示した（８／９感応）。これは、同時点での認可サブビリオンワクチン（ＧＭＴ＝１６，５／６感応）及び認可全ビリオンワクチン（ＧＭＴ＝３６，６／６感応）に対する反応よりも優れている（図１８）。二次免疫化すると顕著な効力増強の起こることが、１０μｇ用量のＨＡ  ＤＮＡ投与動物で観察された（１回投与後のＧＭＴ＝１．９，２回投与後＝１９９）。認可全ビリオンワクチンでは同様の効力増強を示したが、一方サブビリオンワクチンの二次投与では生成したＨＩ力価は一過性に過ぎなかった。今までのところ、同様レベルのＨＩ抗体は、最良認可ワクチン（全ビリオン）と比較して、１０μｇ及び１００μｇ用量のＨＡ  ＤＮＡで免疫化した動物において１８週までに測定されている。これらの結果は、ＰＮＶが、全ビリオンワクチンと少なくとも同様にそしてサブビリオンワクチンを上回って、中和抗体生成に際して有効であることを示す。精製サブユニットワクチンは、マウスにおいて検出可能な免疫原性を示さなかった。したがって、非ヒト霊長類ではそれらを試験しなかった。本試験では、候補ワクチンに似せて、ＰＮＶは、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０及びＡ／Ｔｅｘａｓ／９１からのＨＡ、並びにＡ／ＰＲ／３４からのＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡの５価のカクテルを含有した。ワクチンの他の成分に対する体液性免疫反応の発生に関してこれらの動物をさらにわれわれは調べ、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０  ＨＡ及びＡ／ＰＲ／３４  ＮＰに対する抗体を検出した。別々の実験において、Ａ／Ｔｅｘａｓ／９１に対するＨＩ及び中和抗体はともにＰＣＲクローン化ＨＡ  ＤＮＡの２回投与により誘発した。
【０１２７】
２．細胞媒介免疫反応
上記実施例３参照。
【０１２８】
３．免疫反応の生成
ａ）体液性免疫：ＤＮＡ注入後に体液性及び細胞媒介免疫反応の発生が起こる現象は、まだ解明されていない。中和抗体（例えばインフルエンザウイルスＨＡに対する）を生成するためには、細胞は形質膜上で抗原を発現するか又はそれを細胞外環境に分泌しなければならない。さらに、トランスフェクト化細胞は、ビリオンの場合のそれと同様の二次、三次及び四次構造を有するＨＡを発現する必要がある。ロゼット検定においては、ＨＡの細胞表面発現は、ＨＡ  ＤＮＡで一時的にトランスフェクト化したＲＤ細胞（横紋筋肉腫；筋原細胞起源）で実証された。赤血球はＨＡトランスフェクト化細胞の表面に凝集し、疑似トランスフェクト化細胞には凝集しなかったが、これはＨＡが表面上で発現されただけでなく、シアル酸含有タンパク質と結合するための適正な形状を有していたことを示す。
【０１２９】
ｂ）細胞媒介免疫：細胞媒介免疫反応（例えば、インフルエンザウイルスＮＰに対する）の発生には、Ｉ種ＭＨＣと会合してそこから得られるペプチドの予防的プロセッシング及び提示を要する。ＤＮＡ注入後に免疫反応を発生させる抗原提示細胞の性質はまだ分かっていない。筋細胞は低レベルのＩ種ＭＨＣしか発現せず、その表面に同時刺激分子を発現するとは考えられない。したがって、筋細胞は一般に、抗原提示細胞ではないと考えられる。しかしながら、数種類の証拠は、筋細胞がＤＮＡ筋注後の免疫反応の発生に関与していることを示唆する。先ず、ｉｎ  ｓｉｔｕでのタンパク質発現を引き起こす裸プラスミドＤＮＡを内在化し得る組織の限定調査は、プラスミドを直接組織中に注入すると多数の細胞型がリポーター遺伝子を発現し得るが、しかし実質的には筋細胞より効力が低いことを示した。筋注後の非筋細胞によるＤＮＡの取り込みの完全分析はまだ報告されていないが、しかし取り込みはさらに低効率であると思われる。第二に、ＤＮＡ筋注後のリポーター遺伝子の発現は、多数の異なる種の骨格筋及び心筋で示された。第三に、ＣＴＬ反応は他の経路（静注及び皮内注射）によってもＤＮＡ注入後に発生し得るが、しかしマウスにおける最良の免疫反応はＤＮＡ筋注後に引き出された。第四に、筋原細胞及び筋細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＴＬに認識され、溶解され、この溶解はＩ種ＭＨＣ発現を向上させるγ−インターフェロンで前処理することにより増強し得る。最後に、安定トランスフェクト化ＮＰ発現筋原細胞を未使用同系マウスに移植すると、防御的細胞媒介免疫反応がｉｎ  ｖｉｖｏで引き起こされる（図２０）。したがって、筋細胞による抗原の発現は、ＤＮＡ注入後に観察される防御的免疫反応を誘発するのに十分である。さらに、非筋細胞によるＤＮＡの取り込み及び発現は、防御免疫の生成を引き起こすのに必要でないかも知れない。ワクチンとしてのポリヌクレオチドの見地から、ＤＮＡ取り込みを筋細胞に限定するのは有益である可能性がある。第一に、筋細胞は最終的に弁別され、分裂しない。これはプラスミドＤＮＡが染色体ＤＮＡと一体化する可能性を低減し、抗原の永続的発現を保持するのに重要であって、これにより長期免疫反応が生じ得る。第二に、筋細胞は、筋原細胞の融合により再生し得る大型多核細胞である。これはＤＮＡ注入がなぜ、ＣＴＬによる細胞溶解的分解の証拠がなくてもおそらくは長期間存続し得るタンパク質発現を引き起こすのかを説明するのに役立つものと思われる。
【０１３０】
実施例１４
防御試験
ヒトインフルエンザ感染のため、広く用いられる二つの動物モデル（マウス及びフェレット）を用いて、インフルエンザ株を種々の組合せで、インフルエンザウイルス抗原をコードするＤＮＡを用いて免疫化すると、死亡及び疾病が防御され、ウイルス負荷が低減した。
【０１３１】
１．異種（異型，群共通）防御は、認可死菌ワクチンによっては有効に達成されないものであるが、動物モデルにおけるＤＮＡワクチン接種により提供された。この防御は、ＮＰ又はＭ１をコードするＤＮＡを実験室動物に注入した場合に示された。これらのＤＮＡを用いたワクチン接種により誘発される交差反応細胞媒介免疫（ＣＭＩ）反応は、防御反応を提供した。
【０１３２】
ａ．マウス：Ａ／ＰＲ／３４からのＮＰをコードするＤＮＡを筋注したＢＡＬＢ／ｃ及びＣ３Ｈマウスは、ＬＤ９０のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ３Ｎ２）（Ｈ３であり、Ｈ１であるＡ／ＰＲ／３４とは異型株）を用いた全気道感染による誘発の場合に、死亡及び疾病を防御した（体重減少で評価）。図２１は、３週間おきにＮＰ  ＤＮＡ（２００μｇ／投与）で３回免疫化し、最終免疫化後３週目に誘発したＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率を示す。図２２は、免疫化マウスにおける誘発後の体重損失の阻止を示すが、これに比して対照マウスは重度の体重損失を示した。図２３は、対照非コードＤＮＡを投与したマウスと比較した場合の、ＮＰ  ＤＮＡにより免疫化したマウスの上気道誘発後７日目の肺におけるウイルス負荷の減少を示す。ＮＰ  ＤＮＡで免疫化したマウスは、対照マウスと比較して、死亡を完全に防御し、体重損失を低減し、肺のウイルス負荷の低下を示した。死亡及び体重損失を防御するのに要するＮＰ  ＤＮＡの量は、ＤＮＡを３回投与する場合は、≦６．２５μｇ／注射であることが判明した（図２４）。ＮＰ  ＤＮＡを用いた免疫化により生じる防御は、免疫化マウスにおいては少なくとも３か月間は事実上変わらずに存続することが判明した。防御は６か月後まで続いたが、最終免疫化後３〜６か月間にわずかに低下した。しかしながら、ＮＰ  ＤＮＡを２５週目の誘発の３週間前である２２週目に１回注射する再接種をすると、完全防御を回復した（図２５）。したがって、ＮＰ  ＤＮＡによるマウスの免疫化は長期存続性で、増強可能な異種防御を生じた。これらの動物を再接種した場合に既往反応を生じる能力は、免疫学的記憶がＮＰ  ＤＮＡ免疫化により生成されたことを示唆する。
【０１３３】
ｂ．フェレット：フェレットは、インフルエンザウイルスの広範囲のヒト単離物で感染しやすいため、ヒトインフルエンザ感染のためのモデルとして一般に用いられる。フェレットにおけるウイルス複製は主に鼻孔及び気管で、そして非常に少程度には肺で生じるが、これに対比してマウスでは肺におけるウイルス負荷が大きい。フェレットにおける感染は、鼻腔洗浄液中にウイルスを滴入することにより最も容易にできる。ヒトから得られた最近の株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９，Ｈ３Ｎ２）からのＮＰ  ＤＮＡ又はＭ１  ＤＮＡを単一で又は組合せて用いて免疫化したフェレットは、野外単離物Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３（Ｈ３Ｎ２）で誘発した場合１〜６日目にウイルス脱落の有意の低減を示した（図２６）。この野外単離物は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９認可ワクチンがＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３によって引き起こされる疾病に対するヒトの防御を殆ど又はまったく提供しない程度に、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９型株からの抗原連続変異を示した。Ａ／ＰＲ／３４の内部タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化したフェレットは、同型株Ａ／ＰＲ／３４で感染後５及び６日目に鼻腔ウイルス脱落の有意の低減を示した（図２７）。ウイルス脱落の低減は初期及び後期時点の両方でＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３誘発後に観察されたが、一方脱落の後期低減はＡ／ＰＲ／３４誘発後に観察された。これは２株間のフェレットに対する毒性の差に依るものと思われる。
【０１３４】
２．同種（同型，型特異性）防御は、ＨＡ  ＤＮＡで免疫化したマウス及びフェレットの両方で容易に実証された。
【０１３５】
ａ．マウス：ＨＡ  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＬＤ９０のＡ／ＰＲ／３４による誘発から完全に防御された。免疫化マウスでは誘発後に死亡（図２８）も体重の５％以上の損失（図２９）も認められなかったが、一方対照の９０〜１００％が死亡しそして重度の体重損失を示した。防御を達成するのに要するＨＡ  ＤＮＡの用量は、１μｇのＨＡ  ＤＮＡを３回注射すれば、完全防御を達成するのに十分であることを示した（図３０）。
【０１３６】
ｂ．フェレット：Ａ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡで免疫化したフェレットは、対照ＤＮＡを投与したフェレットより有意に低いウイルス脱落を同種誘発後１〜６日目に示した（図３１）。同様に、Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３ＨＡ  ＤＮＡで免疫化したフェレットは、同種感染後１日目及び３〜７日目にウイルス脱落の低減を示した（図３２）。ＨＩ抗体は免疫化フェレットのすべてからの血清中の適切な株に対して存在した（上記参照）。したがって、ＨＡ  ＤＮＡによる免疫化は同種防御を生じる。
【０１３７】
３．ワクチン組合せ：ＮＰ及びＭ１  ＤＮＡと組合せて、一層普遍的な防御を提供するＨＡ  ＤＮＡの能力をフェレットで調べた。
【０１３８】
ａ．抗原性連続変異変種に対する防御の幅：Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９及びＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２株間に生じた抗原性連続変異は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有する認可ワクチンで免疫化した多数のヒトがＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２変種により引き起こされる疾病に対して防御されないほどに、広範囲のものであった。北米では、蔓延した疾病が、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２様の野外単離物、例えばＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３により引き起こされた。この北米野外単離物は抗原的にはその型株、即ちＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２と同様であるが、しかし単離の地理的位置、及びそれらが卵ではなく哺乳類細胞培養中で継代されたという継代歴が異なる。しかしながら、ＨＡのアミノ酸配列に関しては、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２様の株はＨＡ１領域の１１の点突然変異（１３３、１３５、１４５、１５６、１５７、１８６、１９０、１９１、１９３、２２６及び２６２位置）だけがＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９様の株と異なる。したがって、ＨＡ  ＤＮＡに誘発される同型免疫反応と、ＮＰ及びＭ１  ＤＮＡにより誘発される交差反応性ＣＭＩ反応とを組合せれば、この抗原性連続変異変種に対し、より大きな防御を提供するのではないかを検討することにした。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有する認可ワクチンによる、あるいはＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９様の野外単離物（Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１）からのＨＡ  ＤＮＡによるフェレットの免疫化は、フェレットにＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３による誘発を施した場合、ウイルス脱落の低減を生じた（図３３）。ＮＰ、Ｍ１及びＨＡ  ＤＮＡを含有する組合せＰＮＶで免疫化したフェレットは、認可物質で、又はＨＡ  ＤＮＡ単独で免疫化したフェレットより有意に低いウイルス脱落を示した（図３４）。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９  ＮＰ及びＭ１ＤＮＡと組合せたＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１ＨＡ  ＤＮＡの場合、生じた防御は同種Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３ＨＡ  ＤＮＡにより提供される最大防御とはさして異ならなかった（図３５）。したがって、ＨＡ、ＮＰ及びＭ１  ＤＮＡを組合せると、認可ワクチンに比して抗原性連続変異変種に対する防御の改良が生じた。
【０１３９】
ｂ．ワクチン抗原の継代歴の影響：組織培養のＭＤＣＫ細胞中で継代させた米国野外単離物（Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１）から得られたＨＡ  ＤＮＡ配列から成るワクチンで免疫化したフェレットは、抗原的連続変異株Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３で誘発した場合、卵継代Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有する認可死菌ウイルスワクチンを投与したフェレットに比べ、低い（２次元分散分析によりｐ＝０．０２１）ウイルス脱落を示した（図３３）。これに対比して、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＨＡ  ＤＮＡを投与したフェレットは、同一ウイルスを含有する認可ワクチンを投与したフェレットとは、有意に異なる（ｐ＝０．０５８）Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３誘発後ウイルス脱落を示した。卵及び哺乳類細胞増殖株はＨＡのＨＡ１領域の２つの点突然変異（１８６及び１９３位置）で異なるが、これはともにＨＩ及び中和抗体の結合に重要であると考えられる領域のＨＡモノマーの先端に近い抗原部位Ｂに位置する。いくつかのヒトインフルエンザ単離物がニワトリＲＢＣと結合する能力は、最初は非常に低いがしかし卵中での連続継代により増大することがある。このことはＨＡの受容体結合領域が鳥細胞における増殖による実質的選択を受け得ることを示唆する。実験室動物におけるＨＡベースのインフルエンザワクチンの効力に及ぼす小配列変異の作用は、このようなワクチンを調製する場合に野生型ウイルスの配列にできるだけ近いものにすることの重要性を強調する。
【０１４０】
ｃ．非ヒト霊長類：非ヒト霊長類は、感染の臨床反応が乏しいために、インフルエンザ誘発モデルとしては一般に用いない。しかしながら、認可死菌ウイルスワクチンとの比較に際して、非ヒト霊長類におけるＰＮＶワクチン組合せの免疫原性をわれわれは調べた。ＨＡ及び内部タンパク質遺伝子を含有する組合せＰＮＶによりもたらされる抗体力価は、ＨＩ抗体力価及び反応の持続時間に関しては認可物質と少なくとも等しかった（上記参照）。ＰＮＶで免疫化したアフリカミドリザルは抗原連続変異性変種に関するＨＡ  ＰＮＶに反応したが、これはＰＮＶに対する型特異性反応が過去に免疫化された被験体に生じ得ることを示す。ＰＮＶで免疫化されたサルはさらに慣用の死菌ウイルスワクチンを用いたその後の免疫化にも反応した。
【０１４１】
４．結論：インフルエンザに対するポリヌクレオチドワクチンは、インフルエンザ感染の実験室動物モデルに有効である。同種防御はＨＡをコードするＤＮＡベクターを用いて、最も有利には現行認可インフルエンザワクチンに用いるＨＡタンパク質により誘発されるのと同様の免疫学的機序により達成し得る。異種防御は、インフルエンザの保存内部タンパク質をコードするＤＮＡを含入することにより、抗原的不連続変異及び連続変異株の両方に対して達成し得る。１回免疫化にこれらのアプローチを組合せると、フェレットモデルにおいては現行認可ワクチンと比較して、抗原性連続変異変種に対する防御の改良が生じた。
【０１４２】
実施例１５
ベクターＶ１Ｒ調製
基礎ワクチンベクターを絶えず最適化しようと、我々はＶ１Ｒと呼ばれるＶ１Ｊｎｓの誘導体を調製した。このベクター構築の目的は、Ｖ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓがもたらす全体的最適化遺伝子発現特性及び高プラスミド収率を依然として保持したまま、最小サイズの、即ち不必要なＤＮＡ配列を含有しないワクチンベクターを生成することであった。文献から並びに経験により、（１）大腸菌の複製原点をなすｐＵＣ骨格内の領域を、プラスミド収率を犠牲にせずに細菌から切り取り得る；（２）カナマイシン開放読み枠後のｋａｎｒ遺伝子の３′領域を、その代わりに細菌ターミネーターを挿入して切り取り得る；そして（３）ＢＧＨの３′側の〜３００塩基対の半分を、その調節機能に影響を及ぼさずに切り取り得る（ＢＧＨエレメント内に現存するＫｐｎｌ制限部位の後）ということを我々は確かめた。
【０１４３】
それぞれＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＧＨターミネーター、複製原点及びカナマイシン耐性遺伝子のＤＮＡの３つのセグメントをＶ１ＪｎｓからＰＣＲを用いて合成し、Ｖ１Ｒを構築した。ＰＣＲオリゴマーを用いて、各々のセグメントに特有の制限酵素を各セグメント末端に付加した：ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨに関してはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎｒ  遺伝子に関してはＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ；そしてｏｒｉｒに関してはＢｃｌＩ及びＳａｌＩ。各々のＰＣＲ−由来ＤＮＡセグメントを方向性をもって結紮させ、各部位をその後除去できるよう、これらの酵素部位を選択した：ＥｃｏＲＶ及びＳｓｐＩは結紮に適合性の盲端ＤＮＡを残し、一方ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩの場合と同様に相補的オーバーハングを残す。ＰＣＲによりこれらのセグメントを得た後、各セグメントを上記の適切な制限酵素で消化し、次いで３つのＤＮＡセグメントをすべて含有する、単一の反応混合物に結紮した。ｏｒｉｒ５′末端は、カナマイシン耐性遺伝子に関する終結情報を提供し得るようにこの領域内に一般に見出されるＴ２  ｒｈｏ非依存性ターミネーター配列を包含するよう意図した。制限酵素消化（＞８酵素）により、並びに結紮接合部のＤＮＡ配列解析により、結紮物質を確認した。Ｖ１Ｒ内でのウイルス遺伝子を用いたＤＮＡプラスミド収率及び異種発現は、Ｖ１Ｊｎｓと同様であると思われる。ベクターサイズの正味低減は、１３４６ｂｐ（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６Ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２Ｋｂ）であった（図３６（配列番号４５）参照）。
【０１４４】
Ｖ１Ｒを合成するために用いたＰＣＲオリゴマー配列を以下に示す（制限酵素部位には下線を施し、配列の後ろのかぎ括弧内にその名称を示した）：
（１）５′−ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＧＧ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＴＡＣ  Ｇ−３′    ［ＳｓｐＩ］（配列番号６０）；
（２）５′−ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ−３′        ［ＸｈｏＩ］（配列番号６１）；（ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨセグメントに関して）
（３）５′−ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＴＣ−３′      ［ＥｃｏＲＶ］（配列番号６２）；
（４）５′−ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  Ｇ  ＴＡＡ  ＴＧＣ  ＴＣＴＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＡＣＣ−３′    ［ＢａｍＨＩ］（配列番号６３）；（カナマイシン耐性遺伝子に関して）
（５）５′−ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＣＧＴ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＧ−３′          ［ＢｃｌＩ］（配列番号６４）；
（６）５′−ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＣ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧＧ−３′      ［ＳａｌＩ］（配列番号３２）          （大腸菌複製原点に関して）
【０１４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲによる筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡの検出を示す電気泳動の写真である。ＲＳＶ−ＮＰ  ＤＮＡ又はブランクベクター（１００μｇ／足）をＢＡＬＢ／ｃマウスの両四頭筋に３週間間隔で３回注射し、その後マウスをインフルエンザに感染させた。最終注射後４週間目に筋肉を摘出し、直ちに液体窒素中で凍結させた。次にそれらをＭＩＫＲＯＤＩＳＭＥＭＢＲＡＴＯＲＴＭ（Ｂ．ＢｒａｕｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入れた溶解緩衝液（２５ｍＭ  トリス−Ｈ３ＰＯ４，ｐＨ８、２ｍＭ  トランス−１：２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、２ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で粉砕し、高分子ＤＮＡをフェノール／クロロホルム及びエタノール沈降により抽出した。４０サイクルＰＣＲ反応（ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ  ＧＥＮＥＡＭＰＴＭキットでの操作支持どおりとした）を実施して筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡの存在を検出した。ＣＭＶプロモーターからの挿入ＮＰ遺伝子の５′部分の殆どに及ぶ７７２塩基対のＰＣＲ生成物質（矢印を参照）を、プロモーター領域でプライムした１８塩基長センスオリゴヌクレオチド（ＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧ，  配列番号１）及び挿入ＮＰ配列の５′部分の２３塩基長オリゴヌクレオチドアンチセンスプライマー（ＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＡＴＴＣ，配列番号２）から生成した。この７７２ｂｐ物質は、選択ＮＰ  ＤＮＡ注入筋肉標本において臭化物染色アガロースゲル上で観察されるが、ブランクベクター対照（６００Ｌ）では認められない。上記の各レーンの名称は、マウス同定番号及び右又は左足を示す。
【図２】ＮＰ  ＤＮＡ注射マウスにおけるＮＰ抗体の産生。マウスの各足にＶ１−ＮＰＤＮＡ  １００μｇを０、３及び６週間目に注射し、０、２、５及び８週目に血液を採取した。血清中の抗ＮＰ  ＩｇＧの存在を、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトしておいた昆虫細胞から精製したＮＰを用いて、ＥＬＩＳＡ（Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，３０７１（１９９０））により検定した。結果は、最初のＮＰ  ＤＮＡ注射後の時間に対する平均ｌｏｇ１０ＥＬＩＳＡ力価±ＳＥＭ（ｎ＝１０）としてプロットした。ブランクベクターで免疫化したマウスは検出可能なＮＰ抗体を生じなかった。
【図３】ＤＮＡで免疫化したマウスから得られたＣＴＬに関して４時間５１Ｃｒ放出検定で測定した特異的溶解（％）。マウスを４００μｇのＶ１−ＮＰ  ＤＮＡ（黒丸）又はブランクベクター（黒四角）で免疫化して、３〜４週間後に屠殺した。陰性対照ＣＴＬは、未使用マウス（白三角）、そして陽性対照は４週間前にＡ／ＨＫ／６８で感染させておいたマウス（黒三角）から得た。グラフは代表的な個々のマウスからのデータを示す。少なくとも８匹の個体を各組の条件に関して調べた。Ａ図：ＮＰ１４７−１５５パルス化自系脾細胞で再刺激し、ＮＰ１４７−１５５パルス化Ｐ８１５細胞に対して検定した脾細胞。Ｂ図：ＮＰ１４７−１５５パルス化自系脾細胞で再刺激し、ＣＴＬ付加前に６時間インフルエンザＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３（Ｈ３Ｎ２）で感染させたＰ８１５標的に対して検定した脾細胞。Ｃ図：付加的抗原を用いずにＣｏｎ  Ａ及びＩＬ−２で再刺激し、ＮＰ１４７−１５５でパルス化したＰ８１５細胞に対して検定した脾細胞。Ｄ図：マウスに１回の注射につき２００μｇのＶ１−ＮＰ  ＤＮＡ又はブランクベクターを３週間置きに３回注射した。最終免疫化後４週目に脾臓を取り出して、脾細胞をＩＬ−２及びＣｏｎ  Ａと７日間培養し、ＣＴＬをＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３で感染させたＰ８１５標的細胞に対して検定した。
【図４】１０４ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いた非麻酔下鼻腔内誘発後のＤＮＡ免疫化マウスにおける体重損失（グラム）及び回復。Ｖ１−ＮＰ  ＤＮＡ又はブランクベクターを用いて３週間置きに３回マウスを免疫化するか、あるいは注射せずに、最終免疫化後３週目に誘発した。誘発時点でそして４日目から毎日、ＮＰＤＮＡ注射マウス（黒丸）、ブランクベクター対照（白三角）及び非注射対照（白丸）に関し、各群マウス１０匹の重量を調べた。ここに、平均体重±ＳＥＭを示す。ＮＰ  ＤＮＡ注射マウスは、ｔ−検定によると、８〜１３日目にブランクベクター注射（ｐ≦０．００５）及び非注射マウス（ｐ≦０．０１）より有意に低い体重損失を示した。２つの対照間に有意差は認められなかった（ｔ−検定ではｐ＝０．８）。
【図５】１０２．５ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いた非麻酔下鼻腔内誘発後のＤＮＡ免疫化マウスの生存率。Ｖ１−ＮＰ  ＤＮＡ（黒丸）又はブランクベクター（白丸）で３週間置きに３回免疫化したマウス、及び非注射対照（白三角）を最終免疫化後３週間目に誘発した。生存率（％）は、９匹又は１０匹のマウス群に関して示す。ＮＰ  ＤＮＡ注射マウスの生存率は、対照より有意に大きかった（χ２乗分析でｐ＝０．０００４）が、一方ブランクベクター注射マウスと非注射マウスとの間に有意差は認められなかった（χ２乗分析でｐ＝０．１７）。
【図６】発現ベクターＶ１Ｊ，配列番号１０の配列。
【図７】発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏ，配列番号１８の配列。
【図８】ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨプロモーター−ターミネーター配列，配列番号１１の配列。
【図９】サル抗−ＮＰ抗体。
【図１０】フェレット赤血球凝集抑制。点線は最小防御抗体力価を示し、貫通横線付き丸で平均値を示す。
【図１１】ＤＮＡ免疫化後のフェレットにおけるＩｇＧ抗ＮＰ抗体。
【図１２】ＤＮＡ免疫化をした場合としない場合のフェレットにおけるインフルエンザウイルス脱落。
【図１３】ｐＲＳＶ−ＰＲ−ＮＰ及びＶ１−ＮＰベクターの図解。ＮＰは挿入されたコーディング領域を示す。
【図１４】インフルエンザタンパク質及び株の図解。
【図１５】細胞内での注入ＤＮＡプロセッシングの図式。
【図１６】ＨＡ及び内部タンパク質遺伝子による免疫化によって誘発されるインフルエンザＡ／ＲＰ／８／３４に対するフェレットの耐性。
【図１７】Ｖ１Ｊｎｓベクターの図解。
【図１８】アフリカミドリザルにＨＡ  ＤＮＡ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９，Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０，Ａ／Ｔｅｘａｓ／９１）、ＮＰ  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）及びＭ１  ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）から成るＤＮＡのカクテルを注射した。各成分は、１０μｇ（黒四角）又は１００μｇ（黒丸）を６週間の間隔をおいて（矢印参照）２回投与した。比較のために、他の動物に完全ヒト用量（４５μｇタンパク質当量；１５μｇ／ＨＡ）で、認可サブビリオン（白四角）及び全ビリオン（白丸）ワクチンを別の動物に注射した。血清標本を２週間毎に１８週間収集し、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９  ＨＡに対するＨＩ力価に関して分析した。データは幾何平均ＨＩ力価±ＳＥＭ（この場合ｎ＝３）として表す。
【図１９】雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）にＡ／ＰＲ／３４  ＮＰ  ＤＮＡ（２００μｇ）を３週間おきに３回注射した。陰性対照としては、対照ＤＮＡ（２００μｇ）、組換え体ＮＰタンパク質（１０μｇ）を注射したマウス、及び未使用非注射マウス（模擬）が含まれた。比較のために、インフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／６８（インフルエンザ）に感染させたマウスも試験した。ＣＴＬは投与後６か月のものから得られ、ウイルス感染同系脾細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激して、１０：１のエフェクター：標的比でＮＰペプチドパルス化Ｐ８１５細胞に対して試験した。データは％特異的溶解±ｓｄ（ｎ＝３）で示す。
【図２０】Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに正常Ｃ２Ｃ１２筋原細胞（１×１０７細胞）、組換え体ＮＰタンパク質（２μｇ）又はＮＰトランスフェクト化筋原細胞（１×１０７細胞）を注射した。この量のＮＰタンパク質（２μｇ）は抗体反応を生じるのに十分であり、移植ＮＰトランスフェクト化筋原細胞中に存在するＮＰの量の約１００倍と等価であった。ＣＴＬは処置後６週目のこれらのマウスから調製し、インフルエンザウイルス感染同系脾細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激した。陽性対照として、ＣＴＬをインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／６８に感染させておいたマウスから調製した。未処置（黒）、インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３−感染（斜線）及びＮＰトランスフェクト筋原細胞（点描）を２５：１のエフェクター：標的比で標的細胞として用いた。データは％特異的溶解±ｓｄ（ｎ＝３）で示す。
【図２１】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おきに３回ＮＰ  ＤＮＡ  ２００μｇを筋注して免疫化した。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した（全気道誘発）。生存マウス（１０匹／群）の比率を誘発後の時間に対してプロットした。
【図２２】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おきに３回ＮＰ  ＤＮＡ  １００μｇを筋注して免疫化した。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した（全気道誘発）。マウスを毎日計量し、各生存マウスに関して初期体重との比率を算出した。初期体重との平均パーセントを±ＳＥＭ対誘発後の時間でプロットした。
【図２３】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おきに３回ＮＰ  ＤＮＡ  ２００μｇを筋注して免疫化した。非麻酔下での２０００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した（上部気道誘発）。誘発後７日目にマウスを安楽死させて、肺を摘出し、ホモジェナイズして、ＭＤＣＫ細胞に関する順次測定によりウイルス力価を測定した。
【図２４】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おきに３回ＮＰ  ＤＮＡ  ６．２５、２５、１００又は２００μｇを筋注して免疫化した。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した（全気道誘発）。生存マウス（１０匹／群）の比率を誘発後の時間に対してプロットした。
【図２５】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おきに３回、２００μｇのＮＰ  ＤＮＡ、対照ＤＮＡ又は模擬物質を筋注して免疫化した。次に麻酔下で３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いてＤＮＡの３回注射後６、１２及び２５週目にマウスに誘発した。選択マウスでは２２週目にＮＰ  ＤＮＡ  ２００μｇで再免疫化し、次いで２５週目に誘発した（“追加免疫”）。平均体重は、各群に関する初期全体重の百分率として示す。図示した対照体重は６、１２及び２５週誘発からの全対照群、対照ＤＮＡを摂取した又は模擬物質を注射した６群の合計の体重の平均である。各群は最初は各々１０匹の動物を含有した。死亡したマウスは次の重量分析から除外した。
【図２６】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰをコードするＤＮＡ  １ｍｇ、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＭ１をコードするＤＮＡ  １ｍｇ、又は両ＤＮＡを併合したもの  １ｍｇを用いて、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。３〜５日目のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較した。ＮＰ  ＤＮＡ、Ｍ１  ＤＮＡ又はＮＰ＋Ｍ１  ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は対照フェレットの脱落よりも有意に低かった（それぞれｐ＜０．０００１、０．００１６及び＜０．０００１）。ＮＰ（データは示されていない）、Ｍ１又はＮＰ＋Ｍ１投与フェレットの脱落は、認可ワクチン投与フェレットの場合の脱落と有意に異ならなかった（それぞれｐ＝０．１０４、０．５３３及び０．１４５）。１ｍｇの免疫化用量は、任意に選択した。用量範囲試験は非ヒト霊長類で実施した。
【図２７】雄２２〜２５週齢フェレット８匹の各群を対照ＤＮＡ、食塩水又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４タンパク質をコードするＤＮＡを筋注して０、２１及び１２１日目に免疫化し、１４８日目に２００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与して誘発した。免疫化動物はＮＰ  ＤＮＡ  １ｍｇ又はＮＰ、ＮＳ１、ＰＢ１、ＰＢ２及びＭ１  ＤＮＡを併合したもの  ２ｍｇ（各構成分  ４００μｇ）を摂取した。対照は食塩水  ０．５ｍｌ／足又は対照ＤＮＡ  １ｍｇを摂取した。解析の都合上、食塩水及び対照ＤＮＡを摂取した群を併合し（対照）、ＮＰ  ＤＮＡを単独で又は他の内部タンパク質遺伝子と組合せて摂取した群（内部）と比較した。グラフは、３ｍｌの容量の鼻腔洗浄液の５０μｌ当たりのＴＣＩＤ５０での鼻腔洗浄感染性力価を示す。未希釈洗浄液（試験最低希釈）は原鼻腔浸出物の１：１０希釈物であると仮定して、陽性未希釈標本は１  ｌｏｇの値を割り当てた。１  ｌｏｇより大きい力価は３回の反復実験の中からＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ内挿法に基づいて割り当てて、５０％感染性終点を得た。未希釈を試験した場合に陰性であった標本には、０  ｌｏｇの値を割り当てた。グラフに示したｐの値を、２平均に関するＴ−検定により指定日に免疫化フェレット対対照に関してコンピューター処理する。全曲線に関するｐの値を２次元分散分析によりコンピューター処理すると、ＮＰ対対照は＜０．０００１、併合ＤＮＡ対対照は＜０．００１となった。
【図２８】ＤＮＡで免疫化し、次いでインフルエンザウイルスで誘発したマウスの生存率。マウスに、２００μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回筋注した。最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、誘発後の生存率（％）対時間としてプロットした（ｎ＝９又は１０匹／群）。
【図２９】ＤＮＡで免疫化し、次いでインフルエンザウイルスで誘発したマウスの体重損失。マウスに、２００μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回筋注した。最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、各群に関して平均を出した各個体の初期体重の％対時間としてプロットした（死亡動物は平均から除外した）。
【図３０】ＤＮＡで免疫化し、次いでインフルエンザウイルスで誘発したマウスの生存率。マウスに、１、１０又は１００μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回筋注した。最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、誘発後の生存率（％）対時間としてプロットした（ｎ＝９又は１０匹／群）。
【図３１】雄２２〜２５週齢フェレット８匹の各群を対照ＤＮＡ、食塩水又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４タンパク質をコードするＤＮＡを筋注して０、２１及び１２１日目に免疫化し、１４８日目に２００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与して誘発した。免疫化動物はＨＡ  ＤＮＡ  １ｍｇ又はＨＡ、ＮＰ、ＮＳ１、ＰＢ１、ＰＢ２及びＭ１  ＤＮＡを併合したもの２ｍｇ（各構成分  ３３０μｇ）を摂取した。対照は食塩水  ０．５ｍｌ／足又は対照ＤＮＡ  １ｍｇを摂取した。解析の都合上、食塩水及び対照ＤＮＡを摂取した群を併合し（対照）、ＨＡ  ＤＮＡを単独で又は他の内部タンパク質遺伝子と組合せて摂取した群（ＨＡ，ＨＡ＋内部）と比較した。グラフは、３ｍｌの容量の鼻腔洗浄液の５０μｌ当たりのＴＣＩＤ５０での鼻腔洗浄感染性力価を示す。未希釈洗浄液（試験最低希釈）は原鼻腔浸出物の１：１０希釈物であると仮定して、陽性未希釈標本に１  ｌｏｇの値を割り当てた。１  ｌｏｇより大きい力価は３回の反復実験の中からＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ内挿法に基づいて割り当てて、５０％感染性終点を得た。未希釈を試験した場合に陰性であった標本には、０  ｌｏｇの値を割り当てた。全曲線に関するｐの値を２次元分散分析によりコンピューター処理すると、ＨＡ対対照は＜０．０００１、併合ＤＮＡ対対照は＜０．０００１となった。
【図３２】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／Ｇｅｏｇｉａ／９３からのＨＡをコードするＤＮＡ  １ｍｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較した。ＨＡ  ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は対照フェレットの脱落よりも有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。
【図３３】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９（データは示されていない）からのＨＡをコードするＤＮＡ  １ｍｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較し、著しく低い（ｐ＜０．０００１）ことを認めた。Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１  ＨＡ  ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は認可物質投与フェレットの脱落よりも有意に低かった（Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１  ＨＡ  ＤＮＡに関してはｐ＝０．０２１；１〜６日目についての２次元分散分析）。一方、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９  ＨＡ  ＤＮＡ投与フェレットの場合の脱落（データは示されていない）は認可物質投与フェレットにおける脱落と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０５８；１〜６日目についての２次元分散分析）。
【図３４】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１（図１３参照）からのＨＡをコードするＤＮＡ  １ｍｇを用いて、又はＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１からのＨＡ並びにＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡ各々３３０μｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較した。ＨＡ＋ＮＰ＋Ｍ１  ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は認可ワクチン（ｐ＜０．０００１）又はＨＡ  ＤＮＡ単独（ｐ＝０．００５３）投与フェレットの脱落よりも有意に低かった。
【図３５】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／Ｇｅｏｇｉａ／９３からのＨＡをコードするＤＮＡ  １ｍｇを用いて、又はＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１からのＨＡ、並びにＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡ  各々３３０μｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較した。ＨＡ＋ＮＰ＋Ｍ１  ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は同種ＨＡ  ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０６４）。
【図３６】発現ベクターＶ１Ｒ，配列番号４５の配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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