(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌由来の核酸の全部又は一部の塩基配列を含むプローブが支持体に固定されたポリヌクレオチドアレイの製造方法であって、C源付与培養条件、C源欠乏培養条件、マルトース培養条件、アルカリ性培養条件、固体培養条件、高温培養条件、固体低温培養条件及び胞子発芽培養条件の各培養条件で培養された糸状菌からそれぞれ作製されるcDNAライブラリーから独立cDNAクローンを取得し、取得した独立cDNAクローンのcDNA配列の領域全体若しくはその断片からなる100種以上10万種の核酸をプローブとして１つの支持体に固定することを含む、前記製造方法。
【請求項２】
プローブとして固定する前記核酸が、ゲノムDNA、cDNA、RNA又はオリゴヌクレオチドDNAである、請求項１記載のポリヌクレオチドアレイの製造方法。
【請求項３】
糸状菌がアスペルギルス・オリゼである請求項１又は２記載のポリヌクレオチドアレイの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法によって製造される、糸状菌由来の核酸の全部又は一部の塩基配列を含むプローブが支持体に固定されたポリヌクレオチドアレイ。
【請求項５】
以下の(a)〜(c)からなる群から選択される少なくとも１つのための、請求項４記載のポリヌクレオチドアレイ：
(a) 糸状菌近縁種又はその変異体の同定及び／又は識別、
(b) 糸状菌における有用物質又は有害物質のスクリーニング、及び
(c) 糸状菌における目的遺伝子の発現最適化。
【請求項６】
糸状菌由来のポリヌクレオチドを標識した後、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドアレイにプローブとして固定化された核酸とハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーション産物からシグナルを検出することを特徴とする糸状菌の遺伝子発現の検出方法。
【請求項７】
糸状菌が、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、 アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス及びアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される少なくとも１種である請求項６記載の検出方法。
【請求項８】
糸状菌が、ポリヌクレオチドアレイにプローブとして固定された核酸の由来する糸状菌とは異なる種の糸状菌である、請求項６又は７に記載の検出方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の検出方法により得られた検出結果を指標として、糸状菌近縁種又はその変異体を同定及び/又は識別する方法。
【請求項１０】
スクリーニングの対象となる有用物質又は有害物質候補サンプルを糸状菌のうち少なくとも１種と共存させたのち、当該糸状菌から核酸を単離及び標識し、標識された核酸を、請求項４に記載のポリヌクレオチドアレイに固定化されたプローブとハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーション産物からシグナルを検出し、得られる検出結果を指標として有用及び/又は有害物質をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
異なる培養条件で培養した糸状菌から核酸をそれぞれ単離及び標識し、標識された核酸を、請求項４に記載のポリヌクレオチドアレイに固定されたプローブとハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーション産物からシグナルを検出し、得られる検出結果を指標として前記糸状菌の目的遺伝子の発現を最適化する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、糸状菌由来の核酸の全部又は一部の塩基配列を含むプローブが基盤に固定された糸状菌ポリヌクレオチドアレイ、及び該ポリヌクレオチドアレイを用いた遺伝子発現の検出方法に関する。本発明のポリヌクレオチドアレイは、糸状菌の遺伝子発現を定量的にモニターするデバイスである。具体的には、本発明のポリヌクレオチドアレイは糸状菌（例えば麹カビ）の発現遺伝子であるcDNAを１種類又は多種類スポットしたものであり、対象とするカビより抽出した遺伝子をラベル化してアレイ上でのハイブリダイゼーションを行うことにより、遺伝子発現頻度を解析するデバイスである。
背景技術
糸状菌にはアスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ムコール属等のカビが存在し、発酵産業や、ヒトおよび穀物感染などに関わっていることから、重要なカビと考えられている。アスペルギルス（Aspergillus）に属するカビには、発酵産業において利用されている種の他に、ヒト感染症又は穀物感染症などの疾患又は病害に主体的に関わっている種も存在する。従って、発酵生産の高効率化・最適化を迅速に達成するためには、生育状態、物質生産等に関与する有用遺伝子の網羅的発現解析が必要である。ヒト感染症カビの同定や抗カビ剤の開発を行うためにも、ヒト感染に関わる遺伝子の網羅的発現解析が必要である。穀物感染カビにおいては、その防疫の観点から、感染カビの同定および、抗カビ剤の開発のために、穀物感染に関わる遺伝子の網羅的発現解析、あるいは毒素生産に関わる遺伝子の網羅的発現解析が必要とされている。
従来より、特に発酵工業、医療、農業において重要なAspergillus属カビの多種類の遺伝子発現を、同時にしかも直接的にモニターする方法は存在していなかった。従って、遺伝子発現の機能自体又は発現物質（麹菌から生産される有用な酵素等のタンパク質や抗生物質などの有用二次代産物）は、目視や芳香などを用いた専門技術者（職人・品質管理技術者・医師など）による観測、生産物中の有機酸やエステルなどの成分の分析などに基づいた観測、感染部位からの分離菌の培養による識別、毒素などの代謝産物の分離測定などによりモニターされており、これまでの経験に基づいて生育の状態や発酵機能の発現、病態との関連、穀物汚染との関連を推定してきた。しかし、これらの従来の観測法により得られたデータは客観的であるとはいえず、また直接的に観測できないため数値化が難しい場合が殆どであり、自動化や省力化が困難な場合が多々存在した。さらに、代謝産物を同定する場合において、クロマト法による分離定量法によれば客観性を確保し、しかも数値化が可能である。しかしながら、分析手法が煩雑であるのみならず、少数の物質を同定できるにとどまるなど、困難さがある。
発明の開示
本発明は、糸状菌の遺伝子が支持体に固定されたポリヌクレオチドアレイ、及び該ポリヌクレオチドアレイを用いた遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、糸状菌から単離されたポリヌクレオチドを基盤に固定化することにより、糸状菌の検出に有用なポリヌクレオチドアレイを作製し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)糸状菌由来の核酸の全部又は一部の塩基配列を含むプローブが支持体に固定されたポリヌクレオチドアレイ。
上記核酸としては、Ｃ源付与培養条件、Ｃ源欠乏培養条件、マルトース培養条件、アルカリ性培養条件、固体培養条件、高温培養条件、固体低温培養条件及び胞子発芽培養条件からなる群から選ばれる少なくとも１つの条件で培養された糸状菌由来のcDNAライブラリーから作製されたcDNA領域を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。また、上記核酸はゲノムDNA、cDNA、RNA又はオリゴヌクレオチドDNAでもよい。
また、糸状菌としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属又はムコール属に属する微生物が挙げられる。本発明の態様において、アスペルギルス属に属する微生物としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ノミウス、アスペルギルス・フミガタス及びアスペルギルス・ニジュランスからなる群から選択される少なくとも１種であり、好ましくはアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・パラシティクス、アスペルギルス・フラバス及びアスペルギルス・ノミウスからなる群から選択される少なくとも１種であり、さらに好ましくはアスペルギルス・オリゼである。
本発明のポリヌクレオチドアレイに使用される支持体としては、例えばセルロースポリマー、ナイロンポリマー、ガラス、非多孔質材料又は多孔質材料が挙げられる。
(2)検出の目的ポリヌクレオチドを標識した後、上記(1)のポリヌクレオチドアレイに固定化されたプローブとハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーション産物からシグナルを検出することを特徴とする目的ポリヌクレオチドの検出方法。
上記検出方法において、検出の目的ポリヌクレオチドは、糸状菌由来のものであり、ポリヌクレオチドの標識は、蛍光標識、放射線標識、電子標識又は多段修飾標識により行われる。検出の目的ポリヌクレオチドは、例えばゲノムDNA、cDNA、RNA又はオリゴヌクレオチドDNAである。糸状菌としては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属又はムコール属に属する微生物のうち少なくとも１種である。アスペルギルス属に属する微生物は、(1)に例示したものと同様である。
本発明の検出方法において、ポリヌクレオチドアレイに固定化するプローブの種類は、20〜10万種類である。
(3)上記(2)に示す検出方法により得られた検出結果を指標として、糸状菌近縁種又はその変異体を同定及び/又は識別する方法。
(4)スクリーニングの対象となる有用物質又は有害物質候補サンプルを糸状菌のうち少なくとも１種と共存させたのち、当該糸状菌から核酸を単離及び標識し、標識された核酸を、前記(1)のポリヌクレオチドアレイに固定化されたプローブとハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーション産物からシグナルを検出し、得られる検出結果を指標として有用及び/又は有害物質をスクリーニングする方法。
上記有用物質又は有害物質としては薬物が挙げられる。
(5)異なる培養条件で培養した糸状菌から核酸をそれぞれ単離及び標識し、標識された核酸を、前記(1)のポリヌクレオチドアレイに固定されたプローブとハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーション産物からシグナルを検出し、得られる検出結果を指標として前記糸状菌の目的遺伝子の発現を最適化する方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．総論
本発明は、糸状菌、特に麹菌の多数の遺伝子の塩基配列を利用して、上記の問題を解決しようとするものである。即ち、本発明による塩基配列を有する多数のハイブリダイゼーションプローブを用意し、より具体的には支持体である固相基盤上にプローブとして核酸を整列固定化させ、糸状菌由来のDNA量及び遺伝子の発現量を測定することにより、糸状菌の生育状態及び菌の発酵機能の発現を直接的かつ正確に測定することが可能となる。さらに、近縁菌種を対象とする解析においては、例えばアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）のヒト感染時の遺伝子発現、穀物感染カビであるアスペルギルス・フラバス（A.flavus）、アスペルギルス・パラスティカス（A.parasiticus）などの穀物感染時の遺伝子発現、あるいは毒素を含む代謝産物の生産に関わる遺伝子発現を正確に測定することも可能となる。アスペルギルス・ニガー（A.niger）などの発酵生産株などの遺伝子発現モニターにも使用することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドアレイに固定化されたポリヌクレオチドは、種々の代表的な発酵生産や生育条件において発現する遺伝子の塩基配列のほとんど全てが網羅されたものであり、このポリヌクレオチドアレイは糸状菌遺伝子を検出するのに有効であると考えられる。これにより、従来は極めて困難であった自動化及び省力化が達成されるばかりでなく、発酵生産の信頼性の向上及び標準化が達成される。これにより、大幅な生産コストの削減が可能となる。
２．ポリヌクレオチドアレイ
(1)固定用ポリヌクレオチドの調製
本発明において、ポリヌクレオチドアレイとは、支持体である基盤上にポリヌクレオチドである核酸がプローブとして固定化されたものをいう。
ポリヌクレオチドアレイは、ポリヌクレオチドを溶媒に溶解してポリヌクレオチド溶液を調製し、調製されたポリヌクレオチド溶液を基盤の表面に固定することにより作製することができる。例えば、基盤表面にポリヌクレオチド液分注針の先端面を当接してポリヌクレオチド溶液を配置した後、固定する。あるいは基盤表面上に直接合成して作製することもできる。
使用するポリヌクレオチドは、糸状菌由来のものを使用できる。糸状菌としては、例えばアスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ムコール属に属する微生物（カビ）が例示される。当該微生物の種類は特に限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。
(i)アスペルギルス属
産業用種：アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、黒麹であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）
これらの産業用種は、医薬品、化成品、酵素又は食品の生産に利用されている。
ヒト感染種：アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）
穀物感染種：アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・パラシティクス（Aspergillus parasiticus）、アスペルギルス・ノミウス（Aspergillus nomius）
実験モデル生物種：アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）
(ii)ペニシリウム属
産業用種：ペニシリン生産菌であるペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・ノタータム（Penicillium notatum）、水虫治療薬グリセオフルビン生産菌のペニシリウム・グルセオフルブム（Penicillium griseofulvum）、チーズ生産に利用されているペニシリウム・ロクフォルチ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・カマンベルチ（Penicillium camemberti）
穀物および果実汚染種：ペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・イスランヂカム（Penicillium islandicum）、ペニシリウム・エクスパンサム（Penicillium expansum）
(iii)フザリウム属
産業用種：微生物タンパク質（マイコプロテイン）用のフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）
植物感染種：フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）
(iv)トリコデルマ属
産業用種：セルラーゼ生産菌であるトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）
(iv)ムコール属
産業用種：凝乳酵素生産菌のムコール・プシルス（Mucor pusillus）、ムコール・ミーヘイ（Mucor miehei）
(v)リゾープス属
産業用種：グルコアミラーゼ生産菌のリゾープス・デレマー（Rhizopus delemar）、リゾープス・ニグリカンス（Rhizopus nigricans）、リゾープス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、テンペ生産菌のリゾープス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）
(vi)モナスカス属
産業用種：モナスカス・アンカ（Monascus anka）、モナスカス・ルーバー（Monascus ruber）、モナスカス・プルプレウス（Monascus purpureus）
これらの菌は、紅酒や豆腐の製造、赤色色素の生産、あるいはコレステロール血症治療薬の生産に用いられている。
ポリヌクレオチド（核酸）の種類はDNA（デオキシリボ核酸）、RNA（リボ核酸）等が挙げられ、染色体DNA由来のDNA断片、RNA（mRNAなど）、cDNA、オリゴヌクレオチドのいずれでもよい。なお、オリゴヌクレオチドとは、上記染色体DNA断片、mRNA、cDNAの全部又は一部を化学的な処理を施したもの、あるいは上記核酸配列に基づいて化学合成したものをいう。例えば、PCR増幅産物、制限酵素切断処理DNA等が挙げられる。
また、特定の遺伝子の一部を含むDNA断片、転写レベルの異常が見られるmRNA、又は該mRNAに由来するcDNAでもよい。核酸は溶媒に溶解し、核酸含有溶液（ポリヌクレオチド溶液という）を調製する。
さらに、核酸は、各種培養条件で糸状菌を培養し、培養後の糸状菌から調製することが可能である。培養条件としては、Ｃ源付与培養条件、Ｃ源欠乏培養条件、マルトース培養条件、アルカリ性培養条件、固体培養条件、高温培養条件、固体低温培養条件及び胞子発芽培養条件があり、これらの条件の１つを用いて又は組み合わせて培養することができる。
Ｃ源付与培養条件とは、炭素源を含む培地で培養したときの培養条件を意味し、例えばYPD培地（1% yeast extract, 2% Bacto-pepton, 0.04% adenine sulfate, 2% glucose）における0℃、22時間の震盪培養（180rpm）を指す。
Ｃ源欠乏培養条件とは、炭素源を含まない培地で培養したときの培養条件を意味する。例えば、YPD培地（1% yeast extract, 2% Bacto-pepton, 0.04% adenine sulfate, 2% glucose）で30℃、22時間培養し、菌体をろ過によって集菌し蒸留水で洗浄した後、この菌体を、glucoseなどの炭素源を含まない（Czapek-Dox）CD培地（Nakajima K et al. Curr Genet. 2000 May;37(5):322-7など）に移してさらに８時間培養するものを指す。
マルトース培養条件とは、マルトースを含む培地で培養したときの培養条件を意味する。例えば、ACM培地（2% Malt extract, 0.1% Bacto-pepton, 2% Glucose）で37℃、24時間振とう培養し（180rpm）、菌体を濾過集菌して天然培地（1% Bacto-pepton, 0.5%  KH2PO4, 0.1%  NANO3, 0.05% MgSO4・7H2O）で洗浄した後、この菌体を2% Maltoseを含む天然培地で37℃、4時間更に振とう培養するものを指す。
アルカリ性培養条件とは、pHが7〜11の範囲で培養したときの培養条件を意味する。例えば、pH10に調製したCD(Czapek-Dox)寒天培地上に滅菌したセロファンを置き、A.oryzaeRIB40株の分生子を植菌し、30℃で3日間培養する。
固体培養条件とは、小麦ふすま5gに、分生子5×106個を水４mlに懸濁して添加し（106個/g-ふすま）、これを30℃で27時間静置培養するものを指す。
高温培養条件とは、温度が30〜42℃の範囲で培養したときの培養条件を意味する。例えば、上記YPD培地にて、37℃，24時間振とう培養するものを指す。
固体低温培養条件とは、麸、米または醤油麹用の穀類を含む組成の培地で、30〜15℃の範囲で培養したときの培養条件を意味する。例えば、脱脂加工大豆10ｇに15mlの水を加えて吸水させ、焙炒割砕小麦10gを加えて攪拌する。これを500ml容三角フラスコに入れてバイオシリコ栓をして30分間オートクレーブ処理し、冷却後Aspergillus oryzae RIB40を1×105個胞子/gになるように接種する。接種後30℃（気相式）で34時間、その後25℃で3時間製麹する。
胞子発芽培養条件とは、胞子を発芽させた菌体を含む培地で培養したときの培養条件を意味する。例えば、分生子を、PD（ポテトデキストロース寒天）平板で28℃８日間培養し、取得する。発芽菌体は、分生子をSP液体培地（3.5% 可溶性デンプン、2% ポリペプトン、0.5% KH2PO4、0.5% 、MgSO4・7H2O）で30℃、12時間培養して得る。
用いるポリヌクレオチドの種類又は個数は、20個（種）以上であればいくらでも構わないが、20〜10万個（種）、望ましくは100個（種）以上10万個（種）の範囲である。ポリヌクレオチド自体の長さは、プローブとして機能し得る長さであれば任意に設定することができる。例えば、10〜50,000塩基、好ましくは10〜2000塩基、さらに好ましくは10〜1000塩基である。
(2)ポリヌクレオチド溶液の支持体への配置
ポリヌクレオチドアレイ用支持体表面に対して多数のポリヌクレオチド溶液を配置する。支持体はセルロース膜（セルロースポリマー）、ナイロン膜（ナイロンポリマー）などの膜、ガラス支持体、さらに非多孔質支持体又は多孔質支持体等を使用することができる。非多孔質支持体材料又は多孔質支持体材料にはプラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等）が含まれる。本発明においては、低コストで高密度化が容易かつ平面特性に優れる点でガラス支持体が好ましく、具体的には日本レーザ電子株式会社製のスライドガラス（DNA Microarray Kit専用スライドグラス）を使用することができる。支持体の表面は、陽電荷処理される。陽電荷処理としては支持体の表面をポリ-L-リシン又はアミノプロピルトリエトキシシラン等でアミノ化処理して陽電荷化させる。次に、支持体表面にポリヌクレオチド溶液を配置する。ポリヌクレオチドの支持体表面への固定化はこれに限られるものではなく、例えばアミノ化されたポリヌクレオチドと共有結合可能な表面特性を有する支持体との組み合わせもある。具体的にはSurrmodics社の3D-Linkがあげられる。配置装置は市販のもの、例えばGTMAS Stamp（日本レーザ電子社製）を用いることができる。この装置は、支持体表面に対し、分注ヘッドをX-Y-Z軸方向へ移動制御して分注ヘッドにおける各分注針の先端面を約0.5〜１秒間当接させ、多種類のポリヌクレオチド溶液をマトリクス状に配置することができる。この配置作業において、分注ヘッドはX-Y軸方向に対し、各スポットの相互間隔が約100〜200μｍになるように移動制御される。但し、配置の方法はこれに限られるものではない。
支持体は平面のものに限られるものではなく、ビーズ状の支持体でも構わない。その場合、ビーズ毎に異なるポリヌクレオチド種が保持される。
(3)ポリヌクレオチドの固定
支持体表面に配置された多数のポリヌクレオチド溶液を乾燥した後、約50〜120mJの紫外光を照射してポリヌクレオチドを固定化する。その後、支持体表面におけるポリヌクレオチドの非配置領域をブロッキング処理する。ブロッキング処理は、所定量の無水こはく酸、N-メチルピロシノン及びほう酸ナトリウム溶液を含むブロッキング液中に、ポリヌクレオチドが固定された支持体全体を浸漬して行なう。具体的には日本レーザ電子社製のブロッキング溶液（Microarray Kit A2、A3,A4の混合溶液）を用いることができる。ブロッキング溶液から取り出した支持体を95〜99℃の熱水に浸漬して放置し、エタノールに浸漬した後に、支持体表面を風乾させる。
３．遺伝子の検出
(1)解析対象糸状菌
検出の対象となるtotal RNAおよびmRNAは糸状菌の菌糸ならびに胞子から調製することができる。糸状菌の種類は前記と同様、麹菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、黒麹Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii、Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus parasiticus、Aspergillus nomius、Aspergillus nidulansが挙げられる。遺伝子は、上記糸状菌のうち少なくとも１種から調製される。目的遺伝子の調製は公知の任意の方法（例えば液体窒素で細胞を凍結し粉砕後、RNase阻害剤存在下でトータルRNAを抽出する）を採用することができるが（Nakajima K et al. Curr Genet. 2000 May;37(5):322-7など）、日本ジーン社製のISOGENなど市販のトータルRNA抽出キットを使用してもよい。トータルRNAよりのmRNAの精製はプロメガ社製のMESSAGE MAKERなどに代表されるoligo(dT)が固定化された樹脂やビーズなどを利用して行うことができる。
(2)遺伝子の標識
本発明の方法においては、容易に検出結果が得られるように、検出の対象となるポリヌクレオチドを標識する。標識は、蛍光標識、放射線標識、電子標識又はは多段修飾標識が挙げられる。
蛍光標識とは、解析対象とするポリヌクレオチド（ターゲット）に酵素的又は化学的に蛍光物質を導入する標識法であり、標識物質としてはROX, TET, FAM, IRD, cyanine(Cy3, Cy5, Cy3.5),ALEX,等が挙げられる。例えばCy3は緑色に、Cy5は赤色に発色するため、２種類の検出対象を区別したいときに便利である。なお市販の標識キット、宝酒造社製Label IT non-RI Labeling等を使用することも可能である。
放射線標識とは、解析対象とする核酸に放射性核酸や放射性官能基を導入する標識法であり、標識物質としては32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125Iを含むdNTPや核酸に導入可能な反応性官能基を含む物質が挙げられる。市販の標識キット、例えばアマシャム・ファルマシア社製のランダムプライマーラベリングキットや末端ラベル化キット等を使用することも可能である。
電子標識とは、プローブとターゲットがハイブリダイズした二本鎖ポリヌクレオチドに反応性のある電荷のある物質を加えることで、二本鎖が形成された部位を電気化学的検出法により検出する方法である。そのような物質としては電荷のあるインターカレーターがあげられる。
多段修飾標識とは、蛍光標識又は放射線標識が一段階の反応ではなく、二段階以上の反応による標識を意味する。一般に一段階修飾では標識化合物がターゲットのポリヌクレオチドに取り込まれ難い場合がある。そこで、一段階目の反応として標識化合物と反応性があり、かつ、ターゲットに取り込まれやすい物質を導入しておき、第２段階目以降で標識化合物を先行して取り込ませた標識化合物と反応性のある物質とを反応させることで標識効率を上げる。市販の標識キットClontech社製Atlas Glass Fluorescent Labeling Kit、NEN社製Micromax TSA Labeling Kit等を使用することも可能である。
(3)プローブと検出目的遺伝子とのハイブリダイゼーション
プローブ（支持体上に固定化されたポリヌクレオチド）とターゲット（目的遺伝子含有液）とを反応させて、ハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーションの条件は、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件に設定する。例えば、高い相同性（相同性が60％以上、好ましくは80％以上）を有するDNAがハイブリダイズする条件を設定する。具体的には、ナトリウム濃度が100〜900mM（2〜20×SSC、好ましくは4〜10ＸSSC）、好ましくは150〜900mMであり、温度が37〜68℃、好ましくは42〜68℃である。
(4)検出
ハイブリダイゼーション後、所定の検出器を用いて標識物質のシグナルを測定（検出）する。蛍光標識の場合は蛍光イメージ解析装置、放射線標識の場合はオートラジオグラフィーあるいは放射線イメージアナライザー、電子標識の場合は電気化学検出装置、多段修飾標識の場合は標識物の種類に応じて対応した装置を用いてシグナルを測定することができる。
４．糸状菌近縁種又はその変異体の同定及び/又は識別
本発明においては、上記検出結果に基づいて糸状菌近縁種又はその変異体を同定及び/又は識別することができる。
近縁種とは、DNAの相同性が40％以上、望ましくは50％以上、さらに望ましくは70％以上のものを指す。
変異体とは、同種菌（DNAの相同性がほぼ100％）であって、限定数（1個〜数個）の塩基に塩基の欠失、付加、置換があるものを指す。または限定数（１個〜数個）の遺伝子の欠失でも構わない。あるいはゲノム上に新たに限定数（１個〜数個）の遺伝子を付加したものもある。
２種の菌株においてラベル化したゲノムDNAのポリヌクレオチドアレイへの競合ハイブリダイゼーションが認められるものを近縁種とし、オリゴDNAなどを利用して、一塩基の変化をもハイブリダイゼーションの変化として検出できるように設計したポリヌクレオチドアレイにおいては、ハイブリダイゼーションの有無により変異を同定することができる。
５．有用物質または有害物質のスクリーニング、有用（有害）物質産生条件の解析
本発明においては、上記検出結果に基づいて有用物質をスクリーニングすることができる。有用物質としては、薬物、酵素、蛋白物質が挙げられる。有害物質としては変異源性物質、発がん物質、環境ホルモン、重金属等が挙げられる。
薬物をスクリーニングするには、ポリヌクレオチドアレイのプローブを提供するAspergillus属カビに、スクリーニング候補となる有用物質又は有害物質を与えて共存培養した菌体、及び有用物質又は有害物質を与えずに培養した菌体から各々mRNAを調製し、蛍光標識を行って、ポリヌクレオチドアレイで遺伝子発現応答解析を行う。その際、発現応答のあった遺伝子を選択して解析することにより、薬物の有する作用機作を推定したり、有用薬物合成のためのリード化合物選択の判断基準とすることが可能である。
また、本発明においては、酵素遺伝子のみならず転写制御因子も含めた発現応答解析から、有用物質生産条件の最適化が可能となる。一方、毒素などの有害物質の産生抑制にもポリヌクレオチドアレイ解析は有効である。すなわち毒素生産関連遺伝子（転写制御因子の遺伝子も含む）をポリヌクレオチドアレイ上に固定化しておいた場合は、それらの発現を抑制する培養条件の探索や、発現抑制物質のスクリーニングを行うことも可能である。以下、検出結果の各種利用についてそれぞれ説明する。
(1)発現応答のあった遺伝子の解析手法の概要：
検出装置で測定した結果、ある条件で発現応答があった遺伝子について、そのシグナル強度を解析用ソフト（例えばArrayProやScanAlyzeなど）を用いて定量化して、遺伝子発現量を求める。この際には対照となるコントロール遺伝子の発現量を基準にして標準化して定量値とする。多数の遺伝子の発現情報データの解析には専用の解析ソフト（例えばGeneSpringやGeneMathsなど）を用いて統計解析を行うことにより、遺伝子の発現制御ネットワークの解明や代謝経路図にマッピングされた遺伝子の発現パターンなどが明らかにできる。
(2)薬物の有する作用機序を推定するための基準：
薬物を与えた条件で遺伝子発現量に変化の生じた遺伝子群を解析ソフトを用いて代謝経路図にマッピングする。その結果、発現量に変化を示した遺伝子がある同系列の代謝経路に多くマッピングされれば、薬物はその代謝経路に特異的に作用することが推定できる。
Aspergillus属カビに特異的な遺伝子が発現応答した場合、その応答遺伝子が必須遺伝子であって、スクリーニング候補物質によって負に（場合によっては正に）制御された場合には、抗真菌剤のスクリーニング情報を提供する。
(3)リード化合物選択の判断基準：
リード化合物の候補を用いた培養条件で発現応答に変化が生じた遺伝子群の代謝経路図にマッピングすることにより、これまで知られていなかった経路に作用することが推定される化合物をリード化合物としてスクリーニングすることが可能である。
(4)薬効強度の判断
発現応答の強度や時系列解析から薬効強度の判断にも用いることが可能である。例えば、ある薬物を用いて発現応答を調べたときに、作用する遺伝子の発現レベルが大きく変動する場合は、使用した薬効はきわめて強いと判断することができる。
(5)有害物質であると判断するための基準：
本解析手法は有用薬物ばかりでなく、毒物などの有害物質のスクリーニングにも用いることが可能である。すなわち、哺乳類などにも保存されている細胞必須の遺伝子のAspergillus属カビ中の相同遺伝子を固定化したポリヌクレオチドアレイでは、その発現を阻害するような物質のスクリーニングも薬物のスクリーニングと同様に可能であり、それらは哺乳類などの毒物スクリーニング系となる。
例えば、ある物質を与えた場合に大きく発現応答が変動する遺伝子群がDNAの修復関連遺伝子やuvsやradなどである場合は、その物質は変異原性を有する有害物質であると判断できる。
(6)二次代謝産物のスクリーニング
Aspergillus属カビ自身が生産する未知の有用酵素や有用（有害）二次代謝産物をスクリーニングするには、まず、酵素の誘導や有用（有害）二次代謝物質生産が認められる培養条件と認められない培養条件での遺伝子発現差を解析する。応答のあった遺伝子を、マッピングした代謝経路図を指標としてしぼり込む。その過程で、有用酵素そのものの遺伝子、あるいは有用酵素又は有用（有害）二次代謝産物の生産を制御する遺伝子を特定することが可能である。
例えば、美白用化粧品に利用されるコウジ酸が生産される培養条件でのみ発現が認められる、または抑えられる遺伝子がDNA結合タンパク質をコードする遺伝子の場合は、このDNA結合タンパク質遺伝子は、コウジ酸の生産を制御する重要な遺伝子であると判断され、産業上有用な二次代謝産物の生産制御遺伝子としてスクリーニングされる。
(7)目的遺伝子の発現の最適化
またAspergillus属カビ（糸状菌）による有用物質の発酵生産に関しては、種々の培養条件と対照となる培養条件でのポリヌクレオチドアレイを用いた遺伝子発現解析により、糸状菌の目的遺伝子の発現を最適化することができる。
糸状菌を、前述のいずれかの培養条件（Ｃ源付与培養条件、Ｃ源欠乏培養条件、マルトース培養条件、アルカリ性培養条件、固体培養条件、高温培養条件、固体低温培養条件又は胞子発芽培養条件）で培養し、どの培養条件で培養したときに特定の遺伝子の発現が促進し、どの培養条件で培養したときにその遺伝子の発現が抑制されたのかを調べておくと、目的遺伝子を発現させるために最適となるような培養条件を選択することが可能である。
ここで、「最適化」とは、ある物質の生産に関与する１つ又は複数の遺伝子の発現を人為的に制御して最大又は最小収量を達成させる培養条件を設定することを意味する。例えば、醤油麹製造において、醤油固体培養のいくつかの条件の間でハイブリダイゼーションを行って、その結果生じるプロテアーゼやペプチダーゼ遺伝子の発現シグナルがもっとも高くなるような条件を見出した場合は、醤油製造に重要な酵素遺伝子の発現は最大化として最適化されている。また不要な遺伝子の場合には、培養条件の比較からポリヌクレオチドアレイにおける目的遺伝子の発現シグナルが最小になる条件を見出すことが最小化と言える。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のポリヌクレオチドアレイの模式図である。
図２は、本発明のポリヌクレオチドアレイの模式図である。
図３は、本発明のポリヌクレオチドアレイの模式図である。
図４は、本発明のポリヌクレオチドアレイにおいてA. oryzaeの遺伝子（Ｃ源付与栄養培養cDNAクローン）の発現強度を検出した結果を示す画像の写真である。
図５は、本発明のポリヌクレオチドアレイにおいてA. oryzaeの遺伝子（Ｃ源欠乏栄養培養cDNAクローン）の発現強度を検出した結果を示す画像の写真である。
図６は、本発明のポリヌクレオチドアレイにおいてA. nigerの遺伝子（Ｃ源欠乏栄養培養cDNAクローン）の発現強度を検出した結果を示す画像の写真である。
図７は、ポリヌクレオチドアレイの概要を示す図である。
図８Ａは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の１〜４番）。
図８Ｂは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の５〜８番）。
図８Ｃは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の９〜12番）。
図８Ｄは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の13〜16番）。
図８Ｅは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の17〜20番）。
図８Ｆは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の21〜24番）。
図８Ｇは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の25〜28番）。
図８Ｈは、ポリヌクレオチドアレイに搭載したクローンを示す図である（図７に示すブロック配列の29〜32番）。
図９は、Aspergillus oryzaeの遺伝子発現結果を示す写真である。緑色はＣ源付与培養したときに得られた遺伝子（Cy3標識）、赤色はＣ源欠乏培養したときに得られた遺伝子（Cy5標識）を示す。
図10は、Aspergillus oryzaeの解糖系酵素遺伝子について、DNAポリヌクレオチドアレイによる遺伝子発現の検出結果とノーザン解析結果との比較を示す写真である。
図11は、Aspergillus nigerの生育と遺伝子発現結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例1〕  ポリヌクレオチドアレイ作製用Aspergillus属カビDNAの調製
本実施例においては、Aspergillus属カビとして、麹菌Aspergillus oryzaeを例としてポリヌクレオチドアレイ用にDNAを調製した。国税庁醸造研究所より分与されたAspergillus oryzae RIB40株より以下に記載の方法でcDNAライブラリーを作製し、複数の異なるライブラリー由来のcDNAを単離して、ポリヌクレオチドアレイ固定化用DNAとした。
1.  グルコースを含むポリペプトン液体培地（Ｃ源付与培養条件）を用いて培養した約50ｇの麹菌菌体より全RNAを抽出し、オリゴdTを固定化した樹脂又はビーズを用いてmRNAを抽出した。このmRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとしてcDNAを合成した。続いて、RNaseHによるヘテロ二重鎖のRNA鎖の部分消化およびDNAポリメラーゼでのDNA鎖伸長反応を利用して、二重鎖のcDNAを合成した。このcDNAにEcoR Iアダプターを連結し、pBluescript SK II+などの大腸菌プラスミドベクターに連結して大腸菌に形質転換した。適宜希釈した後、寒天培地に一様に塗布することによって、寒天培地上に多数の独立した数百から数千個以上の多数のコロニーを形成させることによりライブラリーとした。
2.  上記と同様にして、グルコースを含むポリペプトン液体培地以外に、マルトースを含むポリペプトン液体培地（マルトース培養条件）、炭素源を全く含まない液体培地（Ｃ源欠乏培養条件）、アルカリ性液体培地（アルカリ性培養条件）、ふすまなどの固体培地（固体培養条件）の各培養条件により麹菌を培養し、培養菌からライブラリーを作製した。また、グルコースを含むポリペプトン液体培地については、通常の30℃での培養の他に35〜45℃、好ましくは37℃での培養条件（高温培養条件）によるライブラリーを作製し、大豆と小麦の混合物固体培地については、30℃で麹菌体増殖後、温度を20〜25℃好ましくは25℃まで下げて培養した条件（固体低温培養条件）からのライブラリーを作製した。さらに、胞子発芽直後における菌糸体形成以前の菌体（胞子発芽培養条件）についてもライブラリーを作製した。
3.  上記各ライブラリー由来の多数のコロニーについて、それぞれ独立した液体培地で一昼夜培養し、大腸菌菌体よりプラスミドDNAを抽出・精製した。このプラスミドを鋳型とし、M13ユニバーサルおよびリバースプライマーなどの、ベクタークローニング部位の近傍に位置するプライマーを用いて、プラスミドに挿入された麹菌由来DNA断片を増幅した。なお、該DNA断片は、菌体を熱処理した後、直接鋳型として用いて増幅した。
増幅反応は、添付PCRバッファー、0.25μＭ PCRプライマー、250μＭ dNTP、鋳型プラスミド約10ng、TaqDNAポリメラーゼ1.25Uを含む反応組成液を用い、94℃1分の変性１サイクルに続き、94℃で１分の変性、68℃で２分のアニーリング及び伸長反応のシャトルPCRを30サイクル行った。
4.  上記各ライブラリーより調製したcDNA断片を用い、それぞれ独立に固体支持体に固定化した。Ｃ源付与培養菌体cDNAクローンより86クローンを選択してアレイを作製した（図1、4）。またＣ源欠乏培養cDNAクローンより86クローンを選択し、アレイを作製した（図2、5）。さらにＣ源欠乏培養菌体由来のcDNAクローン82個を選択して、A. niger用のアレイを作製した（図3、6）。
〔実施例2〕  Aspergillus属カビポリヌクレオチドアレイの作製
本実施例においては、Aspergillus属カビの例として実施例１で調製したポリヌクレオチド液を用い、cDNAをプローブの例としてポリヌクレオチドアレイの作製法を以下に記す。
1.  ポリヌクレオチドを溶媒に溶解し、ポリヌクレオチド溶液を調製した。ポリヌクレオチドは、日本レーザ電子社製のスポットバッファー（DNA Microarray KitA1溶液）を用いて溶解した。本実施例においては実施例１で作製したAspegillus oryzae麹カビcDNAを、0.1〜1μg/μlの濃度になるように、望ましくは0.5μg/μlになるようにスポットバッファーを調製し、以下に記載の方法で支持体にスポットを行った。本実施例においては、実施例１で作製したcDNAライブラリーの単離クローンをスポットに用い、必要に応じて、クローンの塩基配列を決定して遺伝子機能の推定を行った。
2.  支持体表面に対して分注針の先端を当接して多数のポリヌクレオチド溶液をスポッティングした。具体的には、日本レーザ電子株式会社製のスライドガラス（DNA  Microarray  Kit専用スライドグラス）を使用した。支持体の表面は、ポリ-L-リシンまたはアミノプロピルトリエトキシシラン等で表面処理して陽電荷化させた。
3.  支持体表面にポリヌクレオチド溶液をスポッティングした。スポッティング装置にはGTMAS Stamp（日本レーザ電子社製）を用いた。
4.  ポリヌクレオチドが固定された支持体表面に対し、UVクロスリンカー（Hoefer社製UVC500）を使用して約50〜120mJの紫外光を照射してポリヌクレオチドを固定化した。その後、1〜1.5wt/vol％無水コハク酸、90vol/vol％ N-メチルピロシノン及び10vol/vol％ 0.2Mホウ酸ナトリウムを含む溶液（pH:8.0）でpH５〜６に調整されたブロッキング液中に、ポリヌクレオチドが固定された支持体全体を約15分間浸漬した。具体的には、日本レーザ電子社製のブロッキング溶液（Microarray  Kit  A2、A3,A4の混合溶液）を用いた。ブロック溶液から取り出した支持体を95〜99℃の熱水に浸漬して約60秒間、放置した。その後、支持体をエタノールに浸漬した後に、支持体表面を風乾させ、ポリヌクレオチドアレイを作製した。
〔実施例3〕Aspergillus属カビポリヌクレオチドアレイによる遺伝子発現の検出(1)
Aspergillus oryzaeおよびAspergillus nigerの遺伝子発現のポリヌクレオチドアレイによる検出を例に示す。
1.Aspergillus属糸状菌の培養
マルツ寒天培地（麦芽エキス2%、ペプトン0.1%、グルコース2%、寒天1.5%）に保存してあるカビのコロニーから胞子懸濁液（1×107個 / ml）を調製した。1Lの三角フラスコにYPD培地（酵母エキス2%、バクトペプトン4%、グルコース4%）200mlを調製し、上記胞子懸濁液を1ml（1×107個）接種して、30℃、22時間ロータリーシェーカーにて100rpmで振盪培養を行った。その後100mlの菌体はＣ源付与供与菌体として、集菌・洗浄・脱水してRNAの抽出まで-80℃で保存した。残りの100mlの菌体は無菌的に集菌・洗浄・脱水後、全量を最小培地（NaNO30.3%、KCl 0.2%、KH2PO40.1%を水道水で調製しMg,Feを供給したもの）100mlの入った500ml三角フラスコに移し、さらに30℃、８時間、ロータリシェーカー（100rpm）にて培養を行った。Ｃ源欠乏培養菌体を集菌・洗浄・脱水してRNA抽出まで-80℃にて保存した。
2.トータルRNAの抽出
１において調製した凍結カビ菌体約1.5g（湿重）を液体窒素の入った乳鉢中で十分に破砕し、破砕菌体を5mlのISOGEN（日本ジーン社製）の分注された15mlのファルコンチューブ（ファルコン社製）に入れて、よく混合した。室温５分放置後、1mlのクロロホルムを加えてよく混合し、室温で３分放置後、7,500xgで4℃、15分遠心分離を行った。上層（水相）を回収し、2.5mlのイソプロパノールの入った15mlのファルコンチューブに移して、混合した後、室温で10分放置した。7,500xg、4℃で10分遠心しRNAを沈殿として回収した。上清のイソプロパノールを除いた後、沈殿に5mlの70%エタノールを入れて軽く懸濁した後、再度7,500xg、4℃、5分遠心し、RNAを沈殿として回収し風乾した。RNAはTE又はRNaseフリー水（DEPC処理水）100〜500μlに溶解し、トータルRNA溶液とした。トータルRNA溶液をTE又はTNaseフリー水で10〜500倍に希釈し、260nm及び280nmの吸光度を測定した。OD260/OD280の値が1.8〜2.0範囲の高純度RNAを以下の実験に使用した。トータルRNA溶液は使用するまで-80℃で保存した。なお、上記操作において器具・試薬は全てRNAaseフリーのものを使用した。詳細はISOGENに添付のマニュアルを参考にした。
3.mRNAの精製
トータルRNAからmRNAの調製はプロメガ社製MESSAGE MAKERを使用し、方法は添付のマニュアルに従った。2において調製したトータルRNAを以下の操作を行ってmRNAを精製した。
(1)サンプル準備
1)2mgのトータルRNAを15mlのファルコンチューブにとり、RNaseフリー水で3.6mlにメスアップする（終濃度0.55mg/mlとする）
2)65℃、５分間インキュベート後、氷上で急冷する
3)5M NaClを360μl添加する（終濃度0.5M NaClとする）
4)Oligo（dT）Cellulose Suspensionびんをよく混合し、3)で得た溶液に2ml添加する
5)このサンプル液をよく混合し、37℃、10分間加温する
6)溶出用RNaseフリー水はあらかじめ、65℃に加温しておく
(2)精製処理
1)サンプル液を直接シリンジに入れ、プランジャーで押し切る
2)ディスポのコップにWash Buffer 1を5ml入れ、シリンジで吸う
3)シリンジ中の液をよく懸濁し後、液を出し切る
4)ディスポのコップにWash Buffer 2を5ml入れ、シリンジで吸う
5)再びシリンジ中の液をよく懸濁し後、液を出し切る
(3)mRNAの溶出処理
1)65℃に加温してある溶出用RNaseフリー水をディスポのコップに2ml入れる
2)シリンジで吸い上げ、よく懸濁し後、15mlのファルコンチューブに液を出する。
3)このシリンジは２回目の精製に利用するためとっておく
(4)精製処理（２回目）
1)溶出したサンプル液を65℃、５分間インキュベート後、氷上で急冷する
2)5M NaClを200μl添加してサンプル液とする（終濃度0.5M NaClとする）
3)１回目の精製に使用したシリンジは添付のWash Buffer 1を吸い出してよく洗う
4)ディスポのコップにサンプル液を入れ、シリンジで吸いよく懸濁する
5)そのシリンジを室温で10分間放置後、液を出し切る
6)上記(3)の2)〜5)と同様に処理する
(5)溶出処理とエタノール沈殿
1)上記(3)の1)〜2)と同様に処理する
2)2,600G、４℃で３分遠心し、混入したOligo（dT）Celluloseを除く
3)終濃度が50μgグリコーゲン/ml、0.75M酢酸アンモニウムとなるように添加する
4)２倍量のエタノール（-20℃）を加え、１晩置く
5)2,600G、４℃で30分遠心し、75%エタノールでリンスする
6)2,600G、４℃で10分遠心後、乾燥し、10〜30μlのTE又はRNaseフリー水に溶解する
4.ターゲットラベリング
上記３で調製したmRNAを用いて蛍光ラベル化したcDNAをポリヌクレオチドアレイ用ターゲットプローブとして調製した。
poly(A)RNA(mRNA)2〜4μgに25mer oligo(dT)primer 9μl（4.5μg、濃度を０．５μg/μlに調整しておく）を加え、さらにTEを加えて全容量を15.4μlにした。70℃で10分変性後、氷上で急冷し、以下の試薬を加え42℃で１時間逆転写反応による蛍光ラベル化を行った。逆転写酵素はGibco社製Superscript II、DTTはSuperscript IIに添付のものを使用した。
５×Superscript buffer       6μl
DTT                          3μl
dNTP（25mMdA,G,C,10mMdT）  0.6μl
Cy3-dUTP（又はCy5-dUTP）     3μl
Superscript II               2μl
さらにSuperscript II 2μlを加え42℃で１時間反応させた後、TE270μlを加えた。Cy3-dUTP及びCy5-dUTPはアマシャム・ファルマシア社製を使用し、Ｃ源付与培養菌体由来mRNA及びＣ源欠乏培養菌体由来mRNAの一方をCy3-dUTPにて、他方をCy5-dUTPにて反応を行った。反応後、Cy3反応液とCy5反応液を混ぜ合わせて、Microcon-30（ミリポア社製）に移し液量が約10μlにまるまで遠心濃縮した（エッペンドルフ型遠心機12,000rpm、約10分）。Microcon-30カップ上部にTE400μlを加え、さらに液量が約10μlにまるまで再度遠心を行った（12,000rpm、約15分）。Microcon-30のカップを取り出し、新しいチューブに逆さにして挿入し、3,000rpmで３分間遠心した。以下の試薬を加え、全量を約30μlとした。
yeast tRNA  1μl（10μg、TEで濃度を25mg/2.5mlに調製）
poly dA     4μl（4μg、TEで濃度を5U/200μlに調製）
20×SSC     0.85μl
1％ SDS     1.5μl
TE          約13μl
約30μlとなったCy3又はCy5で蛍光ラベル化されたcDNAを含むポリヌクレオチドアレイ用ターゲットは、使用するまで遮光して-20℃で保存した。
5.検出
４において蛍光色素によりラベル化されたターゲット溶液を100℃で１分間変性後、室温で30分放置し１本鎖のラベル化cDNAとした。22mm x 22mmのカバーガラスに7.5μlのターゲット溶液をのせて、実施例２で作製した麹菌Aspergillus oryzaeのポリヌクレオチドアレイに気泡が入らないようにかぶせた。湿箱中にスライドグラスを並べ、乾かさないように、65℃で一晩放置してハイブリダイゼーションを行った。2XSSC/0.1%SDS溶液中に少し浸し、カバーグラスを緩やかに振ってはがし、さらに2〜3回溶液中で緩やかに振った。次いで、1XSSC溶液中で２分間振盪した。さらに0.2XSSC溶液中に２分間静置した。乾燥窒素ガスを緩やかにスライド表面にあててスライドを乾燥させた後、日本レーザ電子社製GTMAS Scan IIにて解析を行った。
6.解析結果
1)A.oryzaeＣ源付与培地とＣ源欠乏培地での遺伝子発現解析
実施例１、1.のＣ源付与培養条件で作製したA.oryzaeのcDNAライブラリーより任意に86クローンを選択し、実施例２記載の方法でポリヌクレオチドアレイを作製した（図1、2参照）。また実施例１、2.に記載のＣ源欠乏培養条件より86クローン選択し、同様にポリヌクレオチドアレイを作製した。A.oryzaeＣ源付与菌体由来のcDNAをCy5（赤）により蛍光標識し、Ｃ源欠乏菌体由来のcDNAをCy3（緑）で蛍光標識した。これらの標識cDNAをターゲットとして用いて、ポリヌクレオチドアレイを用いた解析を行った。蛍光強度に特徴を示したクローンについては、そのクローンの塩基配列を決定し、Blastなどを用いたデータベースサーチから遺伝子を推定した。
Ｃ源付与培養条件由来cDNAクローンポリヌクレオチドアレイでは約70%のスポットについてはCy5（赤）由来の蛍光強度がCy3（緑）由来の蛍光強度よりも高く、発現強度の弱いもの、両色素が同程度で観察されるスポットも認められた（図１に示すアレイ配置、図４に示すアレイ画像）。
Cy5蛍光強度の強かったクローンについて、塩基配列の解析を行ったところ、例えば、１行７列のクローン（蛍光強度7894(Cy5)および1452(Cy3)）はSaccaromyces cerevisiae HEM13遺伝子ホモログ（配列番号１）、２行１列（蛍光強度5506(Cy5)及び1117(Cy3)）はAspergillus oryzaeピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（配列番号２）、３行３列（蛍光強度6910(Cy5)及び1351(Cy3)）ではグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナゼー遺伝子（配列番号３）であった。Cy3で蛍光強度の強かった７行３列（蛍光強度3653(Cy5)および8736(Cy3)）はA. nigerの転写制御因子(prf:2305380B)（配列番号４）であった。Cy3及びCy5の両蛍光が同程度の強度を示した６行３列（蛍光強度7451(Cy5）及び5834(Cy3)）はヒストンH3遺伝子（配列番号５）であった。
また、Ｃ源欠乏培養条件由来cDNAクローンポリヌクレオチドアレイにおいては、50%のスポットについてはCy3の蛍光強度がCy5の強度を上回って測定され、その他のスポットは発現強度が弱いか、２種の色素の蛍光強度が同程度に観察された（図２に示すアレイ配置、図５に示すアレイ画像）。Cy3発現強度の強かった、５行１列のクローン（蛍光強度1862(Cy5)及び4321(Cy3)）はエノラーゼ遺伝子（配列番号６）、６行７列（蛍光強度1117(Cy5)および3267(Cy3)）はアルドラーゼ遺伝子（配列番号７）であった。Cy5蛍光の強かった３行６列（蛍光強度4953(Cy5)及び1951(Cy3)）は熱ショックタンパク質遺伝子（配列番号８）と推定された。Cy3及びCy5の両蛍光が同程度な４行６列目（蛍光強度4381(Cy5)及び3953(Cy3)）は細胞質性セリンプロテアーゼ遺伝子（配列番号９）であると推定された。
2)A.nigerＣ源付与培地とＣ源欠乏培地での遺伝子発現解析
1)と同様に、A.oyzaeのＣ源欠乏培養条件から選択したクローンを82個スポットしたポリヌクレオチドアレイを作製した（図３に示すアレイ配置、図６に示すアレイ画像）。米国Fungal Genetic Stock Centerより分与を受けたAspergillus niger FGSC A798株を用いて、Ｃ源付与菌体由来のcDNAをCy3により、Ｃ源欠乏菌体由来のcDNAをCy5で蛍光標識したものをターゲットとして用いて、ポリヌクレオチドアレイを用いた解析を行った。蛍光強度に特徴を示したクローンについては、そのクローンの塩基配列を決定し、Blastなどを用いたデータベースサーチから遺伝子を推定した。ただし、A.niger由来蛍光標識cDNAをターゲットとするハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションの温度は、アレイ上に配置されるクローン種に依存するため、37〜68℃の間のいずれかに設定することが必要である。本例では53℃で行った。
その結果、Cy3で蛍光強度が強かった１行２列目（蛍光強度3017(Cy3)及び1153(Cy5)）、及び１行10列目（蛍光強度3203(Cy3)及び1050(Cy5)）のクローンは、その塩基配列解析の結果、各々Aspergillus nidulansのβ-1,3-グルカナーゼ遺伝子ホモログ（配列番号10）、sconB遺伝子ホモログ（配列番号11）であった。またCy5で蛍光強度の強かった４行４列（蛍光強度1543(Cy3)及び4751(Cy5)）、４行５列（蛍光強度1123(Cy3)及び4213(Cy5)）、６行６列（蛍光強度917(Cy3)及び2981(Cy5)）は、Aspergillus nidulansのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ホモログ（配列番号12）、酵母翻訳因子SU1遺伝子ホモログ（配列番号13）、Aspergilus oryzaeホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（配列番号14）であった。
以上の検出結果より、A.oryzae cDNAポリヌクレオチドアレイを用いて、異種糸状菌A.nigerの遺伝子発現の応答を捉えることが可能であることが示された。
〔実施例４〕Aspergillus属カビポリヌクレオチドアレイによる遺伝子発現の検出(2)
実施例１の各種培地由来のcDNAライブラリーより、各種独立クローンを2170個を選択し、各クローンを重複してスポットした同ポリヌクレオチドアレイを作製した（2000クローンアレイ）。図７（パネルＡ）に本実施例で使用したポリヌクレオチドアレイの模式図を、図８Ａ〜Ｈには搭載クローンリスト（library Accession No.で表示）を示した。図8A〜Ｈは、図７Ａのブロック配列の１番から32番の区画に収められた遺伝子のクローンを示しており、図8A〜Ｈに示す１〜32番は、図7Aのブロック配列の番号と対応する。図７パネルＢは、図７Ａの各区画の拡大図であり、列が12又は10スポット、行が12(3,5,6)スポットである。行の「（3,5,6)」は、第11列及び第12列のスポットが、３スポット（10〜12行、例えば図8Bの５番）、５スポット（8〜12行、例えば図8Dの15番）、又は６スポット（７〜12行、例えば図8Bの７番））であることを意味する。また、図８に示す各クローンは、それぞれ２列ずつスポットされている。例えば、図8Aの１番の区画において、「JZ1823」のクローンがスポットされている位置は、図7Bの１行１列及び１行２列である。
以下、2000クローンアレイを用いて、Aspergillus oryzae、Aspergillus nigerの遺伝子発現解析を行った。
１）A.oryzaeのＣ源付与培地とＣ源欠乏培地での遺伝子
A.oryzaeのＣ源付与菌体由来のcDNAをCy3により蛍光標識し、Ｃ源欠乏菌体由来のcDNAをCy5で蛍光標識した。これらの標識cDNAをターゲットとして用いて、2000クローンアレイを用いた解析を行った。その結果を図９に示した。図９は、図7Aのブロック配列のフローステッド面が紙面の下になるように表示してある。従って、ブロック配列の１番の区画は図９の左上に、４番の区画は図９の右上となる位置関係である。
解析結果の特徴的な例を挙げると、Ｃ源欠乏状態で特異的に発現した遺伝子はアルドラーゼ遺伝子であり、他の解糖系遺伝子のほとんどがＣ源付与状態で発現していた。図10にはノーザン解析とポリヌクレオチドアレイ解析の比較を代謝マップに投影して示した。図10において、枠内の物質は解糖系において作用する酵素名であり、枠の右側に記載のMIX番号は、クラスタリングによってグループ化された独立ESTクローンを表す。それぞれの酵素をコードする遺伝子のポリヌクレオチドアレイの結果とノーザン解析の結果とは良く一致していた。
２）A.nigerＣ源付与培地における生育時間と遺伝子発現
米国Fungal Genetic Stock Centerより分与を受けたAspergillus niger FGSCA798株を、Ｃ源付与培地で16時間又は26時間培養した。16培養した菌体由来のmRNAより調整したcDNAをCy3により標識し、26時間培養した菌体由来のcDNAをCy5で蛍光標識した。これらの標識cDNAをターゲットとして用いて、2000クローンアレイを用いた解析を行った。蛍光強度に特徴を示したクローンについては、そのクローンの塩基配列を決定し、Blastなどを用いたデータベースサーチから遺伝子を推定した。ただし、A. niger由来蛍光標識cDNAをターゲットとするハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションの温度は、アレイ上に配置されるクローン種に依存するため、37〜68℃の間のいずれかに設定することが必要である。本実施例では、53℃で行った。ハイブリダイゼーションの例を図11に示す。16時間培養ではZn輸送タンパク質、αキシロシダーゼ（Zn protein, alpha-xylosidase）が特異的に発現し、26時間では、α-アミラーゼ、グルタメート-アンモニアリガーゼが特異的に発現していた。
以上の検出結果より、本ポリヌクレオチドアレイは搭載遺伝子数を増した場合においても、A. oryzaeのみならずA. nigerなどの異種糸状菌の遺伝子発現検定に有効に利用できることが示された。
本明細書は、本願の優先権の基礎であるPCT出願PCT/JP01/02823号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明により、糸状菌由来のポリヌクレオチドが固定されたポリヌクレオチドアレイ及び遺伝子の検出方法が提供される。本発明のポリヌクレオチドアレイにより、従来は極めて困難であった糸状菌の多数のポリヌクレオチド種の同時網羅的ハイブリダイゼーション解析が実現される。これにより遺伝子発現解析、近縁種、変異体などの精密な同定あるいは識別の自動化及び省力化が達成される。またこの系は、発酵性産の高度最適化に活用可能で、さらには有用（有害）物質のスクリーニング系をも提供するなど、従来にない産業需要の高い非常にすぐれたデバイスである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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