(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジベレリン０．１〜５．０ｍｇ／ｌ及び活性炭１〜１５ｇ／ｌを添加した植物組織培養用ゲランガム固体培地にて多芽体を培養することを特徴とする、植物の多芽体における水浸状組織の発生を抑制し、かつ、改善する方法。
【請求項２】
培養される植物組織が、ユーカリ属に属する植物の組織である、請求項１に記載の植物の多芽体における水浸状組織の発生を抑制し、かつ、改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、農業、林業等に適用可能な、組織培養による植物体の大量生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物組織を培養容器内で栄養繁殖、あるいは増殖させて大量のクローン苗を作成する組織培養技術は、栄養繁殖性の花卉、作物のみならず、優良形質を備えた植物個体を大量増殖させる方法として近年盛んに用いられている。そして、こうした方法によるクローン苗の生産は、草本植物においては既に実生産の段階に達しており、生産品の均一化や高収量化等、大きな効果をもたらしている。
【０００３】
しかし、組織培養においては、培養している植物組織の細胞が水分を含んでガラス様を呈する、いわゆる水浸状の形態を取ることがある。こうした水浸状組織においては、培養物の増殖やシュートの伸長、さらにはシュートからの発根が阻害されるため、組織培養による大量増殖を行なう際にはしばしば問題となっていた。
【０００４】
現在のところ、こうした水浸状組織の発生を抑制するためには、植物組織の培養において、培地を固化するための固化剤として寒天を用いるのが効果的であることが知られている。もっとも、この方法によっても、水浸状組織の発生を完全に防止することはできず、また、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させることはできなかった。
【０００５】
一方、ジベレリンは植物組織の強力な生長促進ホルモンとして知られているが、これを上記寒天培地に添加して多芽体を培養しても生長促進効果を見出すことはできない。却って、その生長を阻害する場合すらある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物の多芽体において水浸状組織の発生を抑制し、かつ、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させ、しかも、ジベレリンによる植物組織の強力な生長促進作用を利用した、多芽体の培養を経て行う植物の効率的な大量増殖方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ジベレリンと活性炭を添加したゲランガム固体培地にて多芽体を培養することにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、ジベレリン０．１〜５．０ｍｇ／ｌ及び活性炭１〜１５ｇ／ｌを添加した植物組織培養用ゲランガム固体培地にて多芽体を培養することを特徴とする、植物の多芽体における水浸状組織の発生を抑制し、かつ、改善する方法であり、しかも、組織培養による植物の効率的な大量増殖を可能とする方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、植物の多芽体に適用される。対象となる多芽体は、既にその一部又は全部が水浸状組織となったものであっても構わない。健康な多芽体の培養に適用した場合、本発明は水浸状組織の発生を抑制し、また、既に水浸状組織を発生させた多芽体に適用した場合、本発明はその水浸状組織を健康な組織へと回復させるからである。
【００１１】
本発明において、上記多芽体を培養する培地にはジベレリン０．１〜５．０ｍｇ／ｌ及び活性炭１〜１５ｇ／ｌを添加する。ジベレリン添加量０．１ｍｇ／ｌ未満の場合は、本発明によってもその生長促進効果を発揮させることができず、一方、これが５．０ｍｇ／ｌを超える場合には、カルスの形成・増殖には有利であるが、多芽体においては伸長を抑制する傾向が強く観察されるようになるからである。また、活性炭添加量が１ｇ／ｌ未満の場合は、本発明の水浸状組織の発生抑制及び改善効果、ジベレリンによる多芽体の生長促進効果を発揮することができず、一方、これが１５ｇ／ｌを超える場合には、培養している多芽体の組織が粉状のカルスを形成しやすくなる。
【００１２】
かかる培地を固化するための固化剤としては、ゲランガムを用いる。その添加量は、植物の組織培養に通常用いる量、即ち、２〜３ｇ／ｌ程度であればよい。液体培地やゲランガム以外の固化剤（寒天等）を用いた培地では、本発明の効果は達成できない。
【００１３】
本発明の目的は、上記培地を用いて、多芽体を培養することにより達成される。これ以外の条件は、培養する植物の種類、あるいは目的に応じて、既に公知の所定の条件に適宜設定してやればよい。
【００１４】
例えば、ジベレリン及び活性炭を添加する多芽体培養用培地としては、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）やガンボーグのＢ５等、植物の組織培養用培地として一般的に良く知られた基本培地、あるいはこれを改変・希釈したものを用いることができる。また、かかる培地に、ジベレリン及び活性炭の他、更に、植物ホルモンとしてサイトカイニン類やオーキシン類を単独又は組合せて添加してもよく、また、炭素源としてショ糖５〜５０ｇ／ｌを添加して用いてもよい。ここで用いることができるサイトカイニン類やオーキシン類の種類も特に限定されるものではないが、サイトカイニン類としてはカイネチンやベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）が、オーキシン類としてはナフタレン酢酸やインドール酪酸等が入手も容易であり使いやすい。ユーカリ属の植物より得られた多芽体に本発明を適用する場合について述べると、ＭＳ培地又はこのＭＳ培地の硝酸アンモニウム成分と硝酸カリウム成分とを半減させた改変ＭＳ培地を基本培地として、これに植物ホルモンとしてＢＡＰ０．０２〜１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０〜５０ｇ／ｌ、そして前記所定量のジベレリン及び活性炭を加え、ゲランガムで固化させた培地を用いてこの多芽体を組織培養することにより、本発明の効果を達成することができる。
【００１５】
【作用】
本発明において、活性炭は培地中の水分及びジベレリンを一旦吸着して保持し、培養期間の経過に伴い減少するこれらの量に応じて、これらを徐々に培地中に再放出する役割を果たすと考えられる。
【００１６】
もっとも、従来から、樹木の組織培養において、培地中に放出されるポリフェノール類等の有害物質を除去するため、培養に用いる寒天培地に活性炭を添加することは試みられていた。しかし、このような活性炭の添加は、むしろ培養物の著しい生長阻害を引起し、これは、活性炭が、培地中の有害物質のみならず、培養する植物にとって必要な成分をも吸着してしまうためであると考えられていた。
【００１７】
これに対し、本発明者らは、ゲランガム固体培地に所定量のジベレリンと活性炭とを加えて多芽体の培養を行うことにより、水浸状組織の発生を抑制し、また、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させるばかりではなく、多芽体の極めて良好な生長が観察されることを見出した。これは驚くべき効果であり、その理由はわからない。比較例６にて示すように、寒天培地を用いて多芽体の培養を行なった場合には、活性炭による生長阻害を補うため、活性炭を添加したこの寒天培地に単にジベレリンを添加しても、生長阻害による影響は回復せず、却って、培養物である多芽体の枯死を招くからである。
【００１８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００１９】
［実施例１］
ユーカリプタス・シトリオドーラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ（以下、Ｅ．シトリオドーラと略す。））５年生個体の当年生枝より特開平８−２２８６２１に示す方法で得られた多芽体について、ジベレリンを０．２、０．４、０．６、０．８、１．０又は３．０ｍｇ／ｌ、活性炭を５ｇ／ｌ添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、ゲランガム２．５ｇ／ｌ）にて、２４℃で１ヶ月間、１６時間日長で組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表１に示す。
【００２０】
［比較例１］
ジベレリン、活性炭を添加しないＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、ゲランガム２．５ｇ／ｌ）を用いた他は、実施例１と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表１に示す。
【００２１】
［比較例２］
活性炭を添加せず、ジベレリンのみ０．６ｍｇ／ｌを添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、ゲランガム２．５ｇ／ｌ）を用いた他は、実施例１と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表１に示す。
【００２２】
［比較例３］
ジベレリンを添加せず、活性炭のみ５ｇ／ｌを添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、ゲランガム２．５ｇ／ｌ）を用いた他は、実施例１と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
表１．多芽体の生長及び水浸状組織の発生抑制に対する本発明の効果
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【００２４】
なお、表１中、多芽の伸長量とは、多芽体から発生した各々の芽の伸長量の平均値を示したものである。また、水浸状組織の存在率は、水浸状組織が観察された多芽体の数を分子、培養に供した多芽体の数を分母として表した。
【００２５】
この表１より明らかなように、組織培養用ゲランガム固体培地への活性炭の添加によって、培養物である多芽体からの水浸状組織の発生は、全ての供試試料において抑制された。また、ジベレリン及び活性炭を添加した培地にて培養した多芽体は、これらを添加しないで培養を行った多芽体と比べ２倍以上、ジベレリンのみを添加して培養を行った多芽体と比べても１．５倍以上の多芽の伸長を示した。
【００２６】
なお、培地中へのジベレリン添加による生長促進の効果は、活性炭を併用した場合、添加量０．２ｇ／ｌで十分に達成され、それ以上添加量を増加させても、この効果に殆ど変化は観察されなかった。
【００２７】
［実施例２］
ユーカリプタス・グロブルス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ）５年生個体の当年生枝より特開平８−２２８６２１に示す方法で得られ、水浸状組織を発生した多芽体について、ジベレリンを０．６ｍｇ／ｌ、活性炭を５ｇ／ｌ添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．２ｍｇ／ｌ、ショ糖１５ｇ／ｌ、ゲランガム２．５ｇ／ｌ）にて、実施例１と同様に組織培養を行ない、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表２に示す。
【００２８】
［比較例４］
活性炭を添加せず、ジベレリンのみ０．６ｍｇ／ｌを添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．２ｍｇ／ｌ、ショ糖１５ｇ／ｌ、ゲランガム２．５ｇ／ｌ）を用いた他は、実施例２と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
表２．  多芽体の生長及び水浸状組織の回復に対する本発明の効果
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【００３０】
表２より明らかなように、活性炭を添加したゲランガム固体培地にて組織培養を行なうことによって、多芽体に発生していた水浸状組織は、全ての供試試料において、健康な組織へと回復した。また、この場合も、ジベレリン及び活性炭を添加した培地にて培養した多芽体は、ジベレリンのみを添加して培養を行った多芽体と比べ、１．３倍程度の多芽の伸長を示した。
【００３１】
［実施例３］
ユーカリプタス・ユーロフィラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）×ユーカリプタス・グランディス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）３年生個体の当年生枝より特開平８−２２８６２１に示す方法で得られ、水浸状組織を発生した多芽体について、ジベレリンを０．５ｍｇ／ｌ、活性炭を５、１０、１５ｇ／ｌ添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、ゲランガム２．４ｇ／ｌ）にて、実施例１と同様に組織培養を行ない、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。
３週間培養後の結果を表３に示す。
【００３２】
［比較例５］
活性炭を添加せず、ジベレリンのみ０．５ｍｇ／ｌを添加したＭＳゲランガム固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、ゲランガム２．４ｇ／ｌ）を用いた他は、実施例２と同様にして組織培養を行い、多芽の伸長、水浸状組織の有無を観察した。
３週間培養後の結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
表３．多芽体の水浸状組織回復に対する活性炭の効果
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【００３４】
表３より明らかなように、活性炭を添加したゲランガム固体培地にて組織培養を行なうことによって、多芽体に発生していた水浸状組織は顕著に回復し、その効果は、活性炭添加量１０ｇ／ｌで十分に達成された。
【００３５】
［比較例６］
Ｅ．シトリオドーラ５年生個体の当年生枝より特開平８−２２８６２１に示す方法で得られた多芽体について、ジベレリンを０又は０．５ｍｇ／ｌ、活性炭を０又は５ｇ／ｌ添加したＭＳ寒天固体培地（ＢＡＰ０．１ｍｇ／ｌ、ショ糖１０ｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌ）にて、実施例１と同様に組織培養を行ない、多芽の伸長、水浸状組織の発生を観察した。
１ヶ月間培養後の結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
表４．寒天固体培地を用いた場合の多芽体の成長及び水浸状組織の発生抑制
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【００３７】
表４より明らかなように、活性炭を添加した寒天固体培地にて組織培養を行うことによって、多芽の伸長は著しく阻害され、これは、同じ培地中にジベレリンを添加することによっても回復せず、むしろ、供試試料全てが枯死するという結果となった。また、本比較例においては、ジベレリンのみを添加した培地にて培養を行った多芽体もまた、著しい生長阻害を示し、ジベレリン自体による単なる生長促進効果すらも観察されなかった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により、多芽体の培養においてしばしば問題となっていた、水浸状組織の発生を抑制することができる。
【００３９】
また、本発明においては、一旦発生した水浸状組織を健康な組織へと回復させることもできる。
【００４０】
しかも、本発明によれば、多芽体の生長を著しく促進させることができる。
【００４１】
従って、本発明によれば、多芽体の培養を経て組織培養を行う場合に、植物の効率的な大量増殖が可能となる。