(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、
開口絞りと、
前記被検物体からの光束を集光して像を形成する対物レンズと、
前記対物レンズ内の前記開口絞りと共役な位置に設けられている位相変換部とを有する位相差観察装置において、
前記位相変換部は、前記開口絞りの開口部と所定倍率で相似な形状を有する第１透過率変調部と、
前記第１透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている第２透過率変調部と、
さらに前記第２透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている無変調部とを有し、
前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部の透過率よりも大きいことを特徴とする位相差観察装置。
【請求項２】
前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部側の透過率が低く、前記無変調部側の透過率が高くなるように、段階的に大きくなることを特徴とする請求項１に記載の位相差観察装置。
【請求項３】
少なくとも前記第２透過率変調部は、輪帯形状であることを特徴とする請求項１または２に記載の位相差観察装置。
【請求項４】
前記第１透過率変調部の透過率ＴＡ（％）は、
ＴＡ＜３０
の条件を満足することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の位相差観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、位相差観察装置、特に生物標本などの無色透明な物体を染色すること無しに観察できる位相差顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
位相差顕微鏡は、被検物体を照明系の開口位置に配した絞りによって制限された照明光で照明し、対物レンズ内に開口絞りと共役位置に位相を変換する位相膜を配して、被検物体（位相物体）によって生じる位相差を光の強弱であるコントラストに変えている。これにより、被検物体の位相差を像の明暗として可視化して観察することができる。この位相差顕微鏡は、１９３５年にＦ．Ｚｅｒｎｉｋｅにより発明され、原理に関しては、例えば応用光学１（培風館、１９９０、鶴田匡夫、Ｐ．２５６−２５９位相差法）、又はＦｕｎｄａｍｅｎｔａ１ｓ  ｏｆＯｐｔｉｃｓ（４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−ｈｉｌｌ，１９８１，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．６０２−６０４  Ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）に記載されている。
【０００３】
図６（ａ）に示した位相差顕微鏡の構成図を用いて原理を簡単に説明する。不図示の光源からの波長λの照明光が、図下方から輪帯状の開口部を有するリング絞りＡＰを透過する。絞りＡＰは、コンデンサレンズＧｌの前側焦点位置Ｆに配置されており、被検物体Ｏを照明する光束を図６（ｂ）に示すように輪帯状に制限する。照明された被検物体Ｏを透過した光は、対物レンズＧ２，Ｇ３によって像面Ｉに集光され像が形成される。ここで、対物レンズＧ２の後ろ側焦点位置Ｆ’には位相絞りＰｈ’が設けられている。リング絞りＡＰと位相絞りＰｈ’とは共役な関係となっている。そして、位相絞りＰｈ’は、リング絞りＡＰの開口部と共役な形状で透過光に位相差λ／４を与える位相板ＰＰを有している。また、位相絞りＰｈ’は、位相板ＰＰと同じ形状であり、透過光量を弱めるための変調膜も有している。
【０００４】
被検物体Ｏを透過する際に、物体で回折された光束は、直接光Ｌ１と±１次の回折光Ｌ２とに分かれて位相絞りＰｈ’を通過する。直接光Ｌ１と回折光Ｌ２とが位相絞りＰｈ’を透過する際に、直接光Ｌ１の通過する部分に位相板ＰＰを設け、例えば直接光Ｌ１の位相がλ／４進むように構成されている。位相がλ／４進んだ直接光Ｌｌは、位相がλ／４遅れた回折光Ｌ２と像面Ｉの位置で干渉して弱め合う。これに対して、位相物体が無い部分では回折光が生じないため、直接光Ｌｌの明るさの背景となる。これにより、物体Ｏの位相差を、像の明暗として観察できる。また、±１次の回折光Ｌ２の振幅は、ベッセル関数を用いてＪ1（Ｂ）で表される。そして、位相差量に応じて変化する回折光の強度｛Ｊ1（Ｂ）｝2に合わせて、位相板ＰＰに、透過光量を弱めるニュートラルデンシティ膜などの透過率変調膜が施されている。透過率変調膜により直接光Ｌ１の振幅と回折光Ｌ２の振幅を等しくした場合に、背景光に対し位相物体が最もコントラスト良く観察することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術の位相差顕微鏡では、被検物体の位相差が小さい場合は、直接光Ｌ２の透過率を低くして位相差量の検出感度を高くした、いわゆる高コントラストタイプが用いられている。この時の位相板ＰＰ上の変調膜の透過率は１０％〜２５％程度である。高コントラストタイプの位相差顕微鏡の場合、微小な位相差量の物体を検出することができる反面、位相差量が大きい物体を観察すると直接光と回折光の振幅量が逆転して、コントラストの反転した像が形成されてしまう。このため、物体像の周囲に、位相差又は構造に応じた隈取り状の光の滲みが生ずる。この現象はハロー（ｈａ１ｏ）と呼ばれる。ハローが生じると良好な観察が妨げられるばかりか、さらに被検物体の構造を誤認して観察するおそれがあり問題である。
【０００６】
一方、位相差量の大きい被検物体を観察する際は、ハローが生じにくいように直接光Ｌ１の透過率を高くした低コントラストタイプの位相差顕微鏡が用いられている。この時の位相膜ＰＰ上の透過率変調膜の透過率は２５％〜５０％程度であることが望ましい。低コントラストタイプの顕微鏡の場合は、ハローが生じにくい代わりに、微小な位相差量の物体を観察した場合に、観察像のコントラストが低くなってしまい、良好な像の検出が困難になるという問題がある。
【０００７】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、被検物体が有する位相差量に関らず、常に良好なコントラストの観察像を得ることができる位相差観察装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、請求項１記載の発明では、光源と、
前記光源からの光束を被検物体に照射するための照明光学系と、
開口絞りと、
前記被検物体からの光束を集光して像を形成する対物レンズと、
前記対物レンズ内の前記開口絞りと共役な位置に設けられている位相変換部とを有する位相差観察装置において、
前記位相変換部は、前記開口絞りの開口部と所定倍率で相似な形状を有する第１透過率変調部と、
前記第１透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている第２透過率変調部と、
さらに前記第２透過率変調部の周囲を取り囲むように設けられている無変調部とを有し、
前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部の透過率よりも大きいことを特徴とする。
【０００９】
また、請求項２記載の発明では、前記第２透過率変調部の透過率は、前記第１透過率変調部側の透過率が低く、前記無変調部側の透過率が高くなるように、段階的に大きくなることを特徴とする。
【００１０】
また、請求項３記載の発明では、少なくとも前記第２透過率変調部は、輪帯形状であることを特徴とする。
【００１１】
また、請求項４記載の発明では、前記第１透過率変調部の透過率ＴＡ（％）は、
ＴＡ＜３０
の条件を満足することを特徴とする。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて、本発明の実施の形態について説明する。
（第１実施形態）
図１（ａ）は、本発明の第１実施形態にかかる位相差顕微鏡の概略構成を示す図である。図１（ａ）の構成において、前述した従来技術のものと同じ構成部分については同一の符号を用いている。
【００１５】
光源ＬＳからの波長λの照明光が、図下方からリング状の開口部を有するリング絞りＡＰを透過する。絞りＡＰは、コンデンサレンズＧｌの前側焦点位置Ｆに配置されており、開口絞りとして被検物体Ｏを照明する光束を図１（ｂ）に示すように輪帯状に制限する。照明された被検物体Ｏを透過した光は、対物レンズＧ２，Ｇ３によって像面Ｉに集光され像が形成される。ここで、対物レンズＧ２の後ろ側焦点位置Ｆ’には位相絞りＰｈが設けられている。位相絞りＰｈとリング絞りＡＰとは共役な関係となっている。また、位相絞りＰｈは、リング絞りＡＰの開口部と相似な形状であり、かつ透過光に位相差λ／４を与える位相板ＰＰを有している。
【００１６】
さらに、位相絞りＰｈは、図１（ｃ）に示すように、ニュートラルデンシティ膜で構成された輪帯状の透過率変調部Ａ１と、その周囲を取り囲むように外周及び内周部分に透過率変調部Ｂ１及び無変調部Ｃ１とを有している。
【００１７】
位相絞りＰｈの構成を図２を用いてさらに詳しく説明する。透過率変調部Ａ１は、リング絞りＡＰの開口部に対して所定倍率の相似形状である。所定倍率として、コンデンサレンズＧ１と対物レンズＧ２との合成倍率、即ち、絞りＡＰがレンズＧ１とＧ２とによりリレーされる倍率であることが望ましい。さらに好ましくは、位相絞りＰｈの位置調整の容易性等を考慮して、リング絞りＡＰの開口部に対応するリレー倍率で定まる幅よりやや広めであることが望ましい。そして、透過率変調部Ａ１の外周及び内周の周囲部分には、透過率変調部Ｂ１が透過率変調部Ａ１を取り囲む様に設けられている。透過率変調部Ｂ１の幅は、透過率変調部Ａ１と同一又は若干広い程度であることが望ましいが、これに限られるものではない。さらに、透過率変調部Ｂ１を取り囲むようにして無変調部Ｃ１が設けられている。透過率変調部Ａ１、Ｂ１はいずれも輪帯形状である。
【００１８】
透過率変調部Ａ１の透過率ＴＡ１は２０％、透過率変調部Ｂ１の透過率ＴＢ１は５０％となるようにニュートラルデンシティ膜などを使用して調整されている。さらに、位相差絞りＰｈの最外周部分及び中心部分付近Ｃ１は、透過率変調を行なっていない、透過率ＴＣ１が１００％の部分である。
【００１９】
次に、本実施形態の位相絞りＰｈを用いた場合の、位相差観察の原理について説明する。物体の構造によって生じる回折光Ｌ２の回折角θは、使用波長をλ、媒質の屈折率をｎ、物体構造の周期をｄとしたとき、次式で表される。
【００２０】
θ＝ｓｉｎ-1（０．６１λ／ｎ・ｄ）
ただし、０≦θ≦π／４である。
【００２１】
一般に、生物標本では、位相差量は物体の構造の大きさにほぼ比例するので、位相差量の大きい物体では、構造も大きい、即ち、上式でｄが大きいという特徴が存在する。このとき、ｎ、λが定数ならばθが小さくなる。
【００２２】
また、回折光Ｌ２と直接光Ｌ１との距離Ｐ（図１参照）は次式で表すことができる。
【００２３】
Ｐ＝ｆ２・ｓｉｎθ
ここで、ｆ２は対物レンズＧ２の焦点距離、θは回折角をそれぞれ表している。
【００２４】
位相差量の大きい物体（構造の大きな物体）を観察する場合は、回折角θは小さくなり、かつ回折光の強度はある程度大きい。このため、直接光Ｌ１と回折光Ｌ２との距離Ｐが小さくなるので、直接光Ｌ１は透過率変調部Ａ１、±１次の回折光Ｌ２は透過率変調部Ｂ１をそれぞれ通過する。したがって、透過率変調部Ａ１の透過率ＴＡ１＝２０％と透過率変調部Ｂ１の透過率ＴＢ１＝５０％との比が、回折光Ｌ２に対する直接光Ｌ１の実質的な透過率変調となるので、低コントラストタイプの構成と同様の効果となる。
【００２５】
さらに、位相差量の小さい物体（構造の小さい物体）を観察する場合は、回折角θは大きくなり、かつ回折光の強度がある程度弱い。このため、直接光Ｌ１は透過率変調部Ａ１、±１次の回折光Ｌ２は無変調部Ｃ１をそれぞれ通過する。したがって、透過率変調部Ａ１の透過率ＴＡ１＝２５％と無変調部Ｃ１の透過率ＴＣ１＝１００％との比が、回折光Ｌ２に対する直接光Ｌ１の実質的な透過率変調となるので、直接光Ｌｌの振幅のみを低下させる高コントラストタイプの構成と同様の効果を得ることができる。
【００２６】
かかる位相絞りＰｈによれば、透過率変調部Ａ１に対してＢ１，Ｃ１と段階的に透過率が変化しているので、物体の構造にかかわらず、直接光Ｌ１と回折光Ｌ２との振幅（光量比）が適度に調整、好ましくは略同一となるように調整されるので、コントラストの良い観察像を得ることができる。
【００２７】
また、透過率ＴＡ１、ＴＢ１は、ＴＡ１＝１５％、ＴＢ１＝４０％等としてもよい。
【００２８】
（第２実施形態）
図３は本発明の第２実施形態にかかる位相差観察装置の位相絞りの構成を示す図である。その他の構成については第１実施形態と同様であるので説明を省略する。図３は位相絞りＰｈをＺ軸（光軸）方向から見た平面図である。位相絞りＰｈは、リング状の透過率変調部Ａ２（透過率ＴＡ２＝２０％）と、透過率変調部Ａ２を中心として対称的に設けられている透過率変調部Ｂ２（透過率ＴＢ２＝５０％）、透過率変調部Ｃ２（透過率ＴＣ２＝８０％）、及び無変調部Ｄ２（透過率ＴＤ２＝１００％）とを有している。図からもわかるように、透過率変調部Ｂ２はＡ２を取り囲むように、同様にＣ２はＢ２を取り囲むように、Ｄ２はＣ２を取り囲むように構成されている。透過率変調部Ａ２〜Ｃ２はいずれも輪帯形状である。
【００２９】
かかる構成によれば、透過率変調部Ａ２に対して、Ｂ２，Ｃ２は第１実施形態よりもさらに細かく段階的に透過率が大きくなっているので、より良好なコントラストの像を観察できる。
【００３０】
（第３実施形態）
図４は本発明の第３実施形態にかかる位相差観察装置の位相絞りの構成を示す図である。装置構成は、絞りＡＰがリング絞りではなく円形開口絞りである点を除いて第１実施形態と同様であるので説明を省略する。図４は位相絞りＰｈをＺ軸（光軸）方向から見た平面図である。位相絞りＰｈは、円形状の透過率変調部Ａ３（透過率ＴＡ３＝２０％）と、透過率変調部Ｂ３（透過率ＴＢ３＝５０％）、透過率変調部Ｃ３（透過率ＴＣ３＝８０％）、及び無変調部Ｄ３（透過率ＴＤ３＝１００％）とを有している。図からもわかるように、絞りＰｈの中心から、透過率変調部Ｂ３はＡ３を取り囲むように、同様にＣ３はＢ３を取り囲むように、Ｄ３はＣ３を取り囲むように構成されている。ここで、透過率変調部Ａ１は円形開口絞りＡＰと相似な円形形状であり、透過率変調部Ｂ３、Ｃ３は輪帯形状である。
【００３１】
（第４実施形態）
図５は本発明の第４実施形態にかかる位相差観察装置の位相絞りの透過率変調部の透過率変化を示す透過率曲線である。その他の構成については第１実施形態と同様であるので説明を省略する。横軸は位相差絞りＰｈが置かれた瞳面での光軸からの距離を最外周を１として規格化した座標、縦軸は透過率（パーセント）をそれぞれ示している。本実施形態の位相絞りの透過率変調部Ｂの透過率は、Ａに対して絞りの中心部から外周方向へ向かって連続的に大きくなっている。
【００３２】
そして、好ましくは、透過率曲線は次式、
ＴＡ＋（１００−ＴＡ）×ｄ／Ｄ＜ＴＢ＜１００
を満足することが望ましい。ここで、ＴＡ（％）は透過率変調部Ａの透過率、ＴＢ（％）は透過率変調部Ｂの透過率、Ｄは透過率変調部Ｂの幅、ｄは透過率変調部Ａからの距離ｄをそれぞれ表している。かかる条件を満足することで、より良好なコントラストで像を観察できる。
【００３３】
また、本発明では、以下の条件式、
ＴＡ＜３０
を満足することが望ましい。ここでＴＡは第１透過率変調部である透過率変調部Ａ１、Ａ２、Ａ３などの透過率を表している。当該条件を満足することで、位相差の小さい被検物体でも良好なコントラストで観察することができる。
【００３４】
また、本発明の位相差観察装置において直接光と回折光との間に位相差を与える場合に、直接光の位相差をλ／４だけ進めるようにして、媒質より屈折率の高い物体が背景より暗く見えるダークコントラスト法、又は直接光の位相差をλ／４だけ遅れるようにして、媒質より屈折率の高い物体が背景より明るく見えるブライトコントラスト法のいずれを用いても良い。
【００３５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の位相観察装置によれば、電気的なコントラスト変調装置を用いることなく、きわめて簡易な構成で、位相差量の大きい構造の物体でもハローの少ない観察ができ、さらに位相差量の小さい構造の物体でも高いコントラストで観察できる。このため、被検物体の位相差量にかかわらず、常に良好なコントラスト像を観察できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態の位相差観察装置の構成を示す図である。
【図２】本発明の第１実施形態の位相差観察装置の位相絞りの構成を示す図である。
【図３】本発明の第２実施形態の位相差観察装置の位相絞りの構成を示す図である。
【図４】本発明の第３実施形態の位相差観察装置の位相絞りの構成を示す図である。
【図５】本発明の第４実施形態の位相差観察装置の位相絞りの透過率変化を示す図である。
【図６】従来の位相差顕微鏡の構成図である。
【符号の説明】
Ａ，Ａ１，Ａ２，Ａ３  第１透過率変調部
Ｂ，Ｂ１，Ｂ２，Ｃ２，Ｂ３，Ｃ３  第２透過率変調部
ＰＰ  位相板
Ｐｈ  位相絞り
ＡＰ  開口絞り
Ｇ１  照明系レンズ
Ｇ２，Ｇ３  対物レンズ
Ｏ  被検物体
Ｉ  観察像（像面）
Ｌ１  直接光
Ｌ２  回折光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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