(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  ウシから採取した再プログラミングされていないドナー体細胞系を準備する工程；
(ii)  卵巣から採取した卵母細胞をin vitroで成熟させる工程；
(iii)  成熟卵母細胞の周囲の卵丘細胞を除去し、該成熟卵母細胞の透明帯の一部を切開して切れ目を作り、そして第１極体を含む細胞質の１０〜１５％を、該切れ目を通して搾り出すことにより除核されたレシピエント卵母細胞を得る工程；
(iv)  除核されたレシピエント卵母細胞に前記ドナー体細胞の全体を注入することによりレシピエント卵母細胞に核を移植し、次いで電気融合し、電気融合した細胞を活性化させることにより胚を得る工程；
(v)  胚をin vitroで後活性化し、培養する工程；ならびに
(vi) 培養した胚を代理ウシに移植してクローン仔ウシを生産する工程を含んでなる、クローンウシの生産方法。
【請求項２】
工程(i)で準備した体細胞系が、子宮灌流液、子宮内膜、卵管、耳もしくは筋肉から採取された細胞、卵丘細胞または胎児繊維芽細胞を含む、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項３】
体細胞系が、継代培養、血清飢餓培養、または凍結により保存される、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項４】
工程(iii)における卵母細胞の周囲の卵丘細胞が、ヒアルロニダーゼで処理した後、露出(denuding)ピペットを用いて物理的に除去される、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項５】
工程(iii)における卵母細胞の除核が、マイクロマニピュレータで該卵母細胞を切開して卵母細胞に切れ目を形成し；該切れ目が垂直方向を向くように卵母細胞を配置し、該卵母細胞の下方部分をホールディングピペットで固定することにより該細胞が動くのを防止し；カッティングピペットで該卵母細胞の上方部分を圧搾して、第１極体を含む細胞質の10〜15％を該卵母細胞から該切れ目を通して取り除くことによって行われる、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項６】
工程(iv)における核移植が、ドナー細胞を、卵母細胞の透明帯上に形成された切れ目を通してレシピエント除核卵母細胞に注入することにより行われる、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項７】
工程(iv)における電気融合が、０．７５〜２．００ｋＶ／ｃｍのDCパルスを、１秒間隔で２回、それぞれ15μｓ間印加することにより行われる、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項８】
工程(iv)における活性化が、電気融合がCa2+を含む培地中で行われることを条件として、電気融合と同時に生じるものである、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項９】
工程(iv)の活性化が、電気融合がCa2+を含まない培地中で行われることを条件として、暗所にてイオノマイシン溶液中で行われる、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項１０】
工程(v)における後活性化が、胚をシクロヘキシミド溶液またはＤＭＡＰ(4-ジメチルアミノプリン)溶液中で培養することにより行われる、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項１１】
工程(v)におけるin vitroでの培養が、後活性化された胚をｍＴＡＬＰ培地、ｍＳＯＦ培地またはｍＣＲ２ａａ培地中で培養することにより行われる、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【請求項１２】
工程(v)においてin vitroで培養した胚を、ペニシリン-ストレプトマイシン、CaCl2、グルコース、MgCl2、Na-ピルビン酸およびリン酸緩衝生理食塩水を含む凍結培地中で凍結し、後に使用するまで保存する工程をさらに含む、請求項１記載のクローンウシの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、クローンウシの生産方法に関する。より具体的には、本発明は、卵母細胞の体外成熟およびそれに続く除核、核移植、胚の電気融合および活性化、該胚の後活性化およびin vitro培養、ならびに該胚の代理ウシへの移植によって体細胞由来のクローンウシを生産する方法に関する。また、上記の方法により生産された胚およびクローンウシにも関する。
【０００２】
発明の背景
従来、動物は、雄と雌の配偶子の受精によって生まれるものと認識されてきたが、人間は同一の外観と遺伝形質を有するクローン動物を生産するために絶えず努力してきた。
【０００３】
受精卵(zygote)のクローン化は、マウスにおいて１細胞期の受精卵の前核を置換することによりクローン化子孫(offspring)を生産することに成功（McGrathおよびSolter, Science, 220:1300-1302, 1983参照）するまでの３０年間、両生類にのみ可能であると考えられていた。しかしながら、このようなクローン動物の生産の初成功にもかかわらず、成熟卵母細胞および２細胞期以後の受精卵割球を用いたクローンマウスの生産は再プログラミング(reprogramming)が低下するなどのいくつかの問題を有するため、産業用動物における同様の成功の報告はかなり遅かった(Wakayamaら, Nature, 394:369-374, 1998参照）。
【０００４】
核移植の技術によるクローン産業用動物の生産に関し、８〜１６細胞期の受精卵をドナー細胞として用いることによりヒツジの子孫を産生したことがまず報告された(Wiladsen, Nature, 320:63-65, 1986)。それ以来、あらゆる細胞に分化し得る全能性を有する受精卵割球のみが、核移植によってクローン化されると考えられてきた。しかしながら、鋭意研究が重ねられた結果、体細胞由来の核を導入することによりクローンヒツジが初めて誕生し(Wilmutら, Nature, 385:810-813, 1997)、従来の発生学的理論に修正が加えられ、クローンウシ(Wellsら, Reprod. Fertil. and Develop., 10:369-378, 1998)およびクローンブタの生産の成功例が次々と報告された。
【０００５】
しかしながら、このような従来の方法は、核移植により生産される胚の収率が比較的低く、その結果、クローン動物の生産率も低くなるという意味で満足度が低いということが判明した。
【０００６】
かかる状況のもとで、核移植によって産生される胚の収率という点で改善された体細胞由来の胚を産生する方法を探索し、開発するための強力な理由が存在するのである。
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、卵母細胞の操作時間を短縮し、ドナー細胞を除核卵母細胞に移植する際の核移植率および活性化率を増進させることを通し、核移植により産生される胚の収率を向上させ得ること、そしてそれによって体細胞由来のクローンウシを効率的に生産し得ることを見出した。
【０００８】
したがって、本発明の主な目的は、体細胞の核移植の技術によりクローンウシを生産する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記方法により生産されたクローンウシ胚を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、前記方法により生産された体細胞由来のクローンウシを提供することである。
【００１１】
本発明の上述した目的および特徴ならびにその他の目的および特徴は、下記の詳細な説明および添付図面からさらに明確になるであろう。
【００１２】
図面の簡単な説明
(図面の簡単な説明については下記参照）
発明の説明
本発明のクローンウシの生産方法は、ウシから採取したドナー体細胞系を準備する工程；卵巣から採取した卵母細胞をin vitroで成熟させる工程；成熟卵母細胞の周囲の卵丘細胞を除去し、成熟卵母細胞の透明帯の一部を切開し、そして第１極体を含む細胞質の一部を搾り出して除核されたレシピエント卵母細胞を得る工程；除核された卵母細胞に前記ドナー細胞を注入することによりレシピエント卵母細胞に核を移植し、次いで電気融合し、電気融合した細胞を活性化させることにより胚を得る工程；胚をin vitroで後活性化し、培養する工程；ならびに培養した胚を代理ウシに移植してクローン仔ウシを生産する工程を含む。
【００１３】
以下、本発明のクローンウシの生産方法をより詳しく説明する。
【００１４】
工程１：ドナー細胞の準備
ウシから採取した体細胞系をドナー細胞として準備する。その際、ウシの品種は特に制限されないが、韓国産ウシ(ボス・タウルス・コリアネ(Bos taurus coreane))およびホルスタイン種(Holstein)(ボス・タウルス)のウシが好ましい。ウシから取得した細胞系としては、ウシの子宮灌流液(uterine flushing fluid)、子宮内膜、卵管、耳もしくは筋肉から分離された細胞、卵丘細胞または胎児繊維芽細胞が挙げられ、これらは従来公知の方法に多少の改良を加えた方法を用いることにより調製される(Mather & Barnes, Methods in Cell Biology, Vol.57, Animal Cell Culture Methods, Academic Press, 1998参照）。
【００１５】
例えば、1%のペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco、ペニシリン10000U/ml、ストレプトマイシン10mg/ml)を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を子宮灌流液に加えた後、遠心分離することにより細胞を回収する。回収した細胞を、非必須アミノ酸、10%ウシ胎児血清（FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給したDMEM（ダルベッコ修飾イーグル培地）中で３９℃、５％CO2の条件下で培養する。
【００１６】
子宮内膜または卵管から採取した子宮上皮細胞を、上記ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、上記と同様の条件下で培養する。
【００１７】
卵丘細胞については、卵丘-卵母細胞複合体をヒアルロニダーゼ溶液で処理して卵母細胞の周囲の卵丘細胞を分離する。卵丘細胞は39℃、５％CO2の条件下で30〜60分間トリプシン処理し、その後上記と同様の様式で培養する。
【００１８】
耳繊維芽細胞およびウシ繊維芽細胞は、軟骨組織に沿った皮膚の内側ならびに胎児の体幹および四肢から採取した組織を無菌的に洗浄し、細かく切り刻んだ後、39℃、５％CO2の条件下でトリプシンおよびコラゲナーゼII型で処理することにより得られる。これらの細胞も、上記のドナー体細胞系と同様に培養する。
【００１９】
体細胞系は、継代培養、血清飢餓培養または凍結により保存される。ドナー細胞系の継代培養は、トリプシン処理後、一定の間隔をおいて古い培地を新しい培地に交換することにより行われる。血清飢餓培養は、０．５％ＦＢＳを補給したＤＭＥＭを用いて、Wilmutらの方法により行われる(Wilmutら, Nature, 385:810-813, 1997)。この細胞系は、後の工程でドナー細胞として用いられる。
【００２０】
工程２：レシピエント卵母細胞の準備
卵巣から採取した未成熟卵母細胞をin vitroで成熟させる。未成熟卵母細胞は、10mMのHEPES(N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸))を含む洗浄用TCM199培地中で卵巣から選別され、エストラジオール、FSH(卵胞刺激ホルモン)およびFBSを補給したTCM199培地(Na-ピルビン酸、ペニシリン-ストレプトマイシンを含む)中で、39℃、５％CO2の条件下にて16〜22時間培養することにより成熟させる。
【００２１】
工程３：レシピエント卵母細胞の除核
成熟レシピエント卵母細胞の周囲の卵丘細胞を除去し、卵母細胞の透明帯の一部を切開した後、第１極体を含む細胞質の一部を卵母細胞から除去することにより除核卵母細胞を得る。まず、成熟卵母細胞の周囲の卵丘細胞は、ヒアルロニダーゼを含む洗浄用TCM199培地中で露出(denuding)ピペットにて物理的に除去される。次いで、露出した卵母細胞を洗浄用TCM199培地で洗浄し、サイトカラシンB溶液に移す。露出卵母細胞を除核するため、露出卵母細胞の透明帯の一部にカッティングピペットを突き刺して切れ目を形成し、第１極体を含む細胞質10〜15%を卵母細胞から該切れ目を通して搾り出す。除核した卵母細胞をTCM199培地中で洗浄し、インキュベートする。前記のサイトカラシンB溶液は、DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解したサイトカラシンBをTCM199培地で希釈することにより調製される。
【００２２】
工程４：ドナー細胞とレシピエント卵母細胞の電気融合および電気融合した細胞の活性化
ドナー細胞をレシピエント卵母細胞に移植した後、電気融合し、電気融合した細胞を活性化する。ドナー細胞をレシピエント卵母細胞に注入する前に、除核した卵母細胞をTCM199培地で洗浄し、PHA-P(フィトヘマグルチニン)溶液に移す。次いで、PHA-P溶液中で卵母細胞の透明帯上に形成した切れ目にドナー細胞を注入することにより、除核卵母細胞にドナー細胞を移植する。
【００２３】
電気融合は、Electro Cell Manipulator(BTX ECM2001)で行う。洗浄用TCM199溶液を補給したマンニトール溶液中で再構築した胚を、２つの電極を有するチャンバー(両サイドに電極１つ)に入れる。胚をそのドナー細胞が陽極に面するようにチャンバー内に配置する前に、チャンバーをマンニトール溶液で満たす。０．７５ｋＶ／ｃｍ〜２．００ｋＶ／ｃｍのDCパルスを1秒間隔で2回、それぞれ15μs印加することにより胚を電気融合させた後、電気融合した胚をマンニトール溶液および洗浄用TCM199培地で洗浄し、サイトカラシンB溶液中でインキュベートし、活性化する。電気融合および活性化は、電気融合がCa2+を含むマンニトール培地中で行われる場合、同時に生じる。さもなければ、活性化は電気融合後に行われる。電気融合がCa2+を含まないマンニトール培地中で行われる場合、活性化工程は胚を暗所にてイオノマイシン溶液中でインキュベートすることにより行われる。次いで、胚をFBSまたはBSAを含む洗浄用TCM199培地で洗浄することによりイオノマイシンを胚から除去する。前記のイオノマイシン溶液は、DMSOに溶解したイオノマイシンをBSAを含む洗浄用TCM１９９培地で希釈することにより調製される。
【００２４】
工程５：胚の後活性化およびin vitro培養
胚をin vitroで後活性化し、培養する。FBSまたはBSAを含む洗浄用TCM199培地中でインキュベートした活性化胚を、シクロヘキシミド溶液またはDAMP(4-ジメチルアミノプリン)溶液中でインキュベートすることにより後活性化し、5%のCO2の条件下、または5%CO2、7%O2および88%N2の混合条件下にてin vitroで培養する。前記のシクロヘキシミド溶液またはDAMP溶液は、in vitro培養用の培地に、それぞれエタノールまたはDAMPに溶解したシクロヘキシミドを加えることにより調製される。in vitro培養のための培地としては、mTALP(表1参照)、mSOF(表2参照)およびmCR2aa(表3参照)培地が挙げられ、それらは全てNaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、Na-乳酸、グルコース、フェノールレッド、BSA、カナマイシン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸およびL-グルタミンを含む。
【００２５】
場合によって、前記のin vitroで培養された胚は凍結保存され、必要な際にこれを解凍して使用することができる。胚を凍結する場合、まず胚をFBSを含むPBSで洗浄し、ペニシリン-ストレプトマイシン、CaCl2、グルコース、MgCl2、Na-ピルビン酸およびPBSを含む凍結培地に入れる。次いで、凍結培地中の胚を緩慢凍結に付し、その後液体N2中で急速凍結する。凍結胚を液体N2から取り出して解凍する場合、凍結胚を約5秒間空気中に置き、次いで温水で解凍する。解凍した胚から凍結培地を除去するために、グリセロールを高濃度含む培地〜低濃度含む培地中に連続的に入れる。
【００２６】
【表１】
表１：mTALP培地
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【表２】
表２：mSOF培地
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【表３】
表３：mCR2aa培地
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工程６：クローンウシの生産
in vitroで培養した胚を代理ウシに移植する。その際、FBSを含むPBS中の胚を代理ウシの子宮に移植する。
【００２７】
本発明者らは、上記方法に基づいて、韓国産ウシ(ボス・タウルス・コリアネ(Bos taurus coreanae))とホスルタイン種の耳細胞をそれぞれ核ドナーとして用いることにより、ボス・タウルス・コリアネ胚／TcEarとSNU2(ウシNT胚)を生産した。これらの２つの胚は、それぞれ、1999年12月31日と2000年3月10日に、国際寄託機関KCTC(Korean Collection for Type Cultures; KRIBB #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, 大韓民国)に寄託し、受託番号KCTC 0719BPおよびKCTC 0753BPを得ている。本発明者らは、これらの胚を代理ウシに移植することにより正常なクローン子孫を得た。
【００２８】
以下、実施例を通して本発明をさらに具体的に説明する。但し、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
実施例１：ドナー細胞およびレシピエン卵母細胞の準備
ドナー細胞を調製するために、韓国産ウシ(ボス・タウルス・コリアネ)の耳皮膚の内側に沿った組織を採取し、PBS(リン酸緩衝生理食塩水、Gibco BRL、Life Technologies、USA)で洗浄し、細かく刻んで100メッシュサイズにした。次いで、かかる組織を、0.25%のトリプシン、1mMのEDTAおよび1mg/mlのコラゲナーゼII型を含むPBS中で、39℃、5%CO2の条件下にて1時間インキュベートした。組織を酵素で消化した後、1,500rpmで2分間遠心分離し、10%FBS、1%NEAA(非必須アミノ酸)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給したDMEM(ダルベッコ修飾イーグル培地、Gibco BRL、Life Technologies、USA)中に懸濁した。懸濁液を細胞培養用の皿に移し、39℃、5%CO2の条件下にてインキュベートして体細胞系を得た。その後、細胞を0.25％トリプシンおよび1mM EDTAを含む溶液中でトリプシン処理し、細胞数を２×104細胞/mlに調節し、細胞をエッペンドルフ管に分取した。
【００３０】
図１は、核ドナー用に単一細胞として分離された体細胞を示す図である。
【００３１】
一方、レシピエント卵母細胞について、18G針を有する10ml注射器を用いて韓国産ウシの卵巣から直径約2〜6mmの卵胞を吸い出した。次いで、その卵胞液を、低部にグリッド(線間の距離は1cm)が描かれた100mm皿に移し、均一な細胞質を有し、周りに十分な数の卵丘細胞層が付着した卵母細胞を選別した。選別した卵母細胞を35mmの皿中で2mlの洗浄用TCM199培地(表４参照)にて3回洗浄し、次いでTCM199培地(表５参照)にて1回洗浄した。最後に、この卵母細胞を0.1%エストラジオール溶液(表６参照)、2.5%卵胞刺激ホルモン溶液(表７参照)および10%FBSを含むTCM199培地中で培養し、レシピエント卵母細胞を得た。
【００３２】
【表４】
表４：洗浄用TCM199培地
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【表５】
表５：TCM199培地
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【表６】
表６：エストラジオール溶液
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【表７】
表７：卵胞刺激ホルモン溶液
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実施例２：体細胞の核移植
実施例１で調製したレシピエント卵母細胞を、洗浄用ＴＣＭ１９９培地で１回洗浄し、洗浄用ＴＣＭ１９９培地1mlとヒアルロニダーゼ原液(洗浄用TCM培地中10mg/ml)111μlを混合することで調製した0.1％ヒアルロニダーゼ(Sigme Chemical Co., U.S.A)溶液中に移した。卵丘細胞を0.1%ヒアルロニダーゼの存在下で卵母細胞から除去した後、露出した卵母細胞を洗浄用TCM199培地中で3回洗浄し、インキュベートした。次いで、10%FBSを含む洗浄用TCM199培地1mlとサイトカラシン原液(DMSO中7.5mg/ml)1μlとを混合することにより調製したサイトカラシンB(Sigma Chemical Co., U.S.A)溶液に卵母細胞を移し、各卵母細胞の透明帯をマイクロマニピュレータを用いて切開して切れ目を形成した。この切れ目を通して細胞質の10〜15％を卵母細胞から搾り出して除核卵母細胞を得ることができる。除核工程は、より具体的には下記のとおりである：作業皿をマイクロマニピュレータプレート上に置き、該マイクロマニピュレータの左アームにホールディングピペットを、右アームにカッティングピペットを取り付けた。次いで、ホールディングピペットとカッティングピペットをそれぞれ9時と3時の方向に配置し、ピペットコントローラを真ん中に配置することにより全方向に自由に動くように調節した。これらの２つのピペットを、作業皿に触れないようにさらに調節し、それらの先端を微小滴の中で上下に動かして該微小滴の真ん中に配置した。次いで、洗浄用マウスピペット(内径200μmより大)を用いて卵母細胞を洗浄用TCM199培地からサイトカラシンB溶液に移した。まず、マイクロマニピュレータの粗動つまみと微調節つまみを用いて卵母細胞に焦点を合わせた後、二つのピペットを上下に動かすことにより焦点をさらに調整した。卵母細胞をその第１極体が12時の方向をむくように配置し、ホールディングピペットを卵母細胞の9時の方向に密着させて配置し、流圧をかけることにより卵母細胞を固定した。図２は、ホールディングピペットおよびカッティングピペットを用いて卵母細胞の透明帯を切開するプロセスを示す図である。図２に示したように、卵母細胞の細胞質を損傷させないように特別な注意を払いながらカッティングピペット（２）を１時の方向から11時の方向に貫通させた。その後、ホールディングピペット（１）に流圧をかけて卵母細胞（３）を分離させ、第１極体の上部に接する透明帯を貫通しているカッティングピペットにホールディングピペットを接触させ、二つのピペットを摩擦させることにより透明帯の一部を切開した。上部に形成された卵母細胞の切れ目を除核とドナー細胞注入に用いた。図３は、卵母細胞から第１極体および核を取り除く除核プロセスを示す図である。図３に示されているように、卵母細胞（３）をその切れ目が垂直方向を向くように配置し、その下方部分をホールディングピペット（１）で固定して動かないようにし、カッティングピペット（２）を用いてその上方部分を軽く押すことで除核された卵母細胞を得た。除核卵母細胞を洗浄用ＴＣＭ１９９培地で３回洗浄し、ＴＣＭ１９９培地中でインキュベートした。
【００３３】
その後、あらかじめ準備しておいたドナー細胞を、マイクロマニピュレータを用いて除核卵母細胞に移植した。まず、400μlの洗浄用TCM199溶液と100μlのPHA-P(フィトヘムアグルチニン)原液(洗浄用TCM199溶液中0.5mg/ml)を混合して調製したPHA-P溶液を用いることにより、作業皿の真ん中に4μlの注入微小滴を形成させた。その後、ドナー細胞用の２つの微小滴を、前記皿上の注入微小滴の上下に1%FBSを含むPBSを用いて形成させた。これらの微小滴を鉱油で広げた後、その作業皿をマイクロマニピュレータプレート上に置いた。
【００３４】
マイクロマニピュレータ上に取り付けたカッティングピペットを注入用ピペットに交換した。除核卵母細胞を洗浄用ＴＣＭ１９９培地で３回洗浄し、注入微小滴に移した。ドナー細胞を注入用ピペットに吸い上げ、注入微小滴に移した。図４は、除核卵母細胞に体細胞を移植するプロセスを示す図である。図４に示されているように、除核卵母細胞をその切れ目が1時の方向をむくように配置し、ホールディングピペットで固定し、注入用ピペットと流圧を用いてドナー細胞を切れ目から注入することにより再構築された胚を得た。この胚を洗浄用ＴＣＭ１９９培地中で３回洗浄し、インキュベートした。
【００３５】
実施例３：電気融合および活性化
再構築した胚をElectro Cell Manipulator(ECM2001、BTX、USA)を用いて電気融合に付した後、活性化した。0.28Mのマンニトール、0.5mMのHEPES(pH7.2)、0.1mMのMgSO4および0.05％のBSAを含むマニトール溶液１５μｌを洗浄用マウスピペットで再構築した胚を含む洗浄用ＴＣＭ１９９培地に加えて、１分間インキュベートした。その後、胚を、洗浄用マウスピペットを用いて洗浄用ＴＣＭ１９９溶液を補給したマンニトール溶液中で1分間インキュベートし、最後にマンニトール溶液に移した。Electro Cell Manipulatorのチャンバー(3.2mmチャンバーNo.453)を、洗浄用TCM199培地を補給したマンニトール溶液で満たし、次いで胚をそのドナー細胞部が陽極に面するようにチャンバー内に入れた。0.75〜2.00kV/cmのDCパルスを1秒間隔で2回それぞれ15μs間印加することにより胚を電気融合し、マンニトール溶液経由で洗浄用TCM199倍値中に移し、3回洗浄した。
【００３６】
電気融合した胚を活性化するために、イオノマイシン(Sigma Chemical Co., USA)溶液(5μMのイオノマイシンおよび1%のBSAを含む洗浄用TCM199培地)中で暗所にて4分間インキュベートした。イオノマイシン原液は、1.34mlのDMSOに1mgのイオノマイシンを溶解することにより調製した。活性化した胚を、１０％FBSを補給した洗浄用TCM199培地を含む３５ｍｍ皿中で５分間インキュベートしてイオノマイシンを胚から取り除いた。
【００３７】
実施例４：電気融合胚の後活性化およびin vitro培養
in vitro培地のｍＴＡＬＰにシクロヘキシミド原液（エタノール中10mg/ml）を最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるまで加えることによりシクロヘキシミド(Sigma Chemical Co., USA)溶液を調製した。前記活性化胚を前記シクロヘキシミド溶液25μl中で４時間、後活性化した。その後、胚を選別し、選別した胚を39℃、5%CO2の条件下で7日間インキュベートした。
【００３８】
本発明者らは、韓国産ウシ(ボス・タウルス・コリアネ)の耳細胞を核ドナーとして用いて、上記実施例１〜４に記載の方法によって胚、ボス・タウルス・コリアネを生産した。この胚は、国際寄託機関KCTC(Korean Collection for Type Cultures; KRIBB#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, 大韓民国)に、1999年12月31日に寄託し、受託番号KCTC 0719BPを得ている。
【００３９】
実施例５：ホルスタイン種の耳細胞を用いた胚の産生
本発明者らは、ホルスタイン種の耳細胞と卵母細胞をそれぞれ核ドナーとレシピエント卵母細胞として用いる以外は、上記実施例１〜４に記載の方法と同様の方法により別の胚ＳＮＵ２（ウシNT胚）を生産した。この胚は、国際寄託機関KCTC(Korean Collection for Type Cultures; KRIBB#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305-333, 大韓民国)に、2000年３月10日に寄託し、受託番号KCTC 0753BPを得ている。
【００４０】
実施例６：胚の凍結および解凍ならびに移植
前記胚を長期保存するため、凍結を行った。まず、凍結培地（参照：表８、表９）を35mm皿に分注し、フリーザーを可動して-5℃に維持した。凍結用に選抜した胚を10％FBS含有PBSで洗浄し、凍結培地中で20分間インキュベートした。次いで0.25mlのフレンチストロー中に該胚を吸い上げて、そのストローの中央に該胚を含む凍結培地を有し、またその両末端に空気の層を有するようにした。そのストローの両端を加熱した鉗子を用いて加熱密封した後、フリーザー中に置いて５分間-5℃で維持し、液体窒素で予冷した鉗子でストローの下端を軽く持ち上げて植氷した。植氷後、該ストローを-0.3℃／minの速度で-30℃まで冷却し、温度が-30℃に達するとそれを１０分間維持した。最後に、該胚を液体窒素のタンク中で保存した。
【００４１】
【表８】
表８：凍結用PBS
0003652308.tif 000009
【表９】
表９：凍結培地
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この凍結胚を解凍するために、20％FBSを添加したPBS含有解凍培地を35mm皿に調製し、さらにグリセロールを添加して、０％、３％、および６％グリセロールを各々含む解凍培地を作製した（参照：表８および１０）。次に、液体窒素から凍結されたストローを取り出し、空気中に５秒間置いた後、30℃の温水が入っている容器（直径20cmを上回るもの）中で解凍した。解凍後、該ストローを両末端の空気層のところで切断し、胚を含む前記培地を回収した。その胚は顕微鏡下で検査した。胚から凍結培地を取り除くために、６％グリセロール含有解凍培地、３％グリセロール含有解凍培地、グリセロールを含まない解凍培地中で、それぞれ５分間ずつ連続的にインキュベートした。
【００４２】
【表１０】
表１０：解凍培地
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解凍した胚を20％FBS含有PBS中に置き、0.25mlストロー中に吸い上げた。そして次に、それを代理ウシの子宮内に移植した。
【００４３】
実施例７：様々な核ドナーを使用した胚の比較
異なる核ドナーを使用して作製した胚の間の差異を比較するために、実施例４および実施例５でそれぞれ作製したボス・タウルス・コリアネ胚／TcEar(KCTC 0719BP)およびSNU2(KCTC 0753BP)を、代理ウシに移植し、以下の項について比較した：電気融合した卵母細胞の数、電気融合率(％)、分割率(％)、桑実胚／胚盤胞発育比率(％)、移植胚の数、および生まれた子の数(％)（参照：表１１）。桑実胚／胚盤胞発育比率(％)は、核移植により作製された全胚に対する、in vitro培養により移植直前の段階まで発生した胚の比率を示す。
【００４４】
【表１１】
表１１：胚の比較
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表１１に示すように、核ドナーとしての韓国産ウシとホルスタイン種の耳細胞の間には、この２つの事例を胚の作製および培養の項目において比較した場合、有意な差異が無かった。この結果は、本発明のクローンウシの生産方法を、全く特異性無しにその他の品種のウシにも適用できることを示している。核ドナーとしての広範な利用だけでなく、本発明の桑実胚／胚盤胞発育比率(％)および出産率が従来技術の場合よりもはるかに高いために、本発明の方法は再構築胚の産生量を有意に改善することができる（参照：Gotoら, Anim. Sci. Journal, 70:243-245, 1999、Zakhartchenkoら, J. Reprod. Fertil., 115:325-331, 1999、Hillら, Biol. Reprod., 62:1135-1140, 2000、Kubotaら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:990-995, 2000）。
【００４５】
実施例８：韓国産ウシの子宮細胞を核ドナーとして用いた胚の作製
ドナー細胞を韓国産ウシの子宮から単離したこと以外は、実施例１〜４に記載したものと同じ方法を用いて、胚を作製した。
【００４６】
実施例９：様々なドナー組織を使用した胚の比較
異なるドナー組織を使用して作製した胚の間の差異を比較するため、実施例４および８においてそれぞれ作製した胚を実施例６に記載の方法により代理ウシに移植し、実施例７と同じように調べた（参照：表１２）。
【００４７】
【表１２】
表１２：核ドナーの供給源に応じた胚の発生率
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表１２に示すように、ドナー細胞としての異なる組織の間には、この２つの事例を胚の作製および培養の項目において比較した場合に有意な差異が無かった。この結果は、特定の体細胞ではなく多くの細胞型に、本発明のクローンウシの生産方法を適用できることを示している。
【００４８】
上記に明白に例示しまた説明した通り、本発明は、in vitroでの卵母細胞の成熟、ドナー体細胞および除核卵母細胞の調製、核移植、電気融合、および続く活性化、後活性化およびin vitro培養、ならびに代理ウシへの胚の移植の各工程を含んでなる、クローンウシの生産方法を提供する。本発明のクローンウシの生産方法に従い、高度に改良された核移植技術によって得られた再構築胚を使用することによって体細胞由来のクローンウシを効率の良い方法で生産することができ、それにより医療産業および家畜産業において医薬品および臓器の大量生産が可能になり、またその他の多くの関連分野における広範な利用が促進される。
【００４９】
当業者には、本明細書に示したものおよび記載したもの以外にも、本発明の様々な改変が上記記載から明らかであろう。それらの改変もまた、本明細書の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００５０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ドナー体細胞の写真である。
【図２】  図２は、ホールディングピペットとカッティングピペットでレシピエント卵母細胞の透明帯を切開する過程を示す写真である。
【図３】  図３は、レシピエント卵母細胞の第１極体と核を取り除く除核過程を示す写真である。
【図４】  図４は、ホールディングピペットと注入用ピペットで、除核された卵母細胞に体細胞を移植する過程を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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