(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示される新規なニューロプシン。
【請求項２】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号２の塩基配列で示される新規なＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は請求項３記載の新規なＤＮＡを含有する組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、該培養物から請求項１記載のニューロプシンを採取することを特徴とするニューロプシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳の海馬に特異的に発現されている新規なニューロプシン、そのニューロプシンのアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、その組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体、及びニューロプシンの製造法に関するものである。ここで、ニューロプシンとは、神経系末梢組織の細胞の増殖、情報伝達、さらには脳の機能、即ち記憶、学習などに関する研究に貢献すると考えられる新規なタンパク質であり、また、脳疾患治療薬や、このニューロプシンのポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬などへの利用が期待できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ニューロンの分化、生存維持に関わる因子として、神経成長因子（ＮＧＦ）や脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）やニューロトロピン−３（ＮＴ−３）等が報告され、ＮＧＦファミリーと呼ぶべき相同性の高い一群の神経栄養因子がある。それらはそれぞれに特異的なニューロン群に対し、その分化、生存維持の機能を分担していると考えられている。一方、組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ）が脳の一部組織に局存性があり神経突起伸展作用を有するという報告もある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、いずれも発現部位が広範囲であり、又必ずしも神経細胞特異的ではない。中には神経活動に関連しているものもあるが、脳の特異的な機能、即ち記憶、学習といった高度な脳の機能などに特徴づけられる部位と必ずしも結びついていないのが現実である。
【０００４】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、記憶の中枢として考えられている脳の海馬に特異的に発現し、脳の機能（即ち記憶や学習機構等）の解明や脳疾患治療薬の開発が期待されるＤＮＡ（遺伝子）の単離と、そのタンパク質即ちニューロプシンの発現を行い、この有用なニューロプシンの大量供給の道をひらくことを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＮＧＦ−γのセリンプロテアーゼドメインに特異的に保存されている２カ所の領域即ちヒスチジン及びセリン残基領域のｃＤＮＡに基づいて２つのＰＣＲ−プライマーを合成し、マウスの海馬から調製したｍＲＮＡより、ＲＴ−ＰＣＲを行い、新規な塩基配列を有するＤＮＡ断片を得た。さらに、このＤＮＡ断片をプローブにして、上記ｍＲＮＡより作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして新規な塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見い出した。さらに、該ｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターによって形質転換された形質転換体を得、該形質転換体を培養して得られる上清にセリンプロテアーゼ活性を有することを見い出し、これをニューロプシンと名付けた。
【０００６】
即ち、本発明の第１は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示される新規なニューロプシンである。また、本発明の第２は、前記新規なニューロプシンをコードする新規なＤＮＡであり、本発明の第３は、配列表の配列番号２の塩基配列で示される新規なＤＮＡである。更に、本発明の第４は、前記ＤＮＡを含有する組換え発現ベクターである。更にまた、本発明の第５は、前記組替え発現ベクターで形質転換された形質転換体であり、本発明の第６は、前記形質転換体を培養し、該培養物から前記新規なニューロプシンを採取するニューロプシンの製造法である。
【０００７】
本発明の新規なニューロプシンをコードするＤＮＡ、組換え発現ベクター、及び形質転換体は、例えば以下のようにして調製される。
まず、あるタンパク（ヒスチジン及びセリン残基領域）の保存されたドメイン（例えば、ＮＧＦ−γのセリンプロテアーゼドメイン）に対するＰＣＲプライマーを合成し、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子をクローニングする方法を利用することにより、ｃＤＮＡをクローニングする。尚、ｃＤＮＡをクローニングする他の方法については、後述する。
【０００８】
クローニングされたｃＤＮＡは、ニューロプシンの全アミノ酸配列或いは部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有している。全アミノ酸配列をコードする塩基配列が得られていなければクローニングを繰り返すか、或いは新たにプライマーエクステンション法（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ・オブ・サイエンス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA］第７６巻、７３１頁（１９７９年））を用いて、ｃＤＮＡを合成して、ｃＤＮＡライブラリーを調製して、上記ｃＤＮＡをプローブとして、不足のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをクローニングする。
【０００９】
得られたニューロプシンをコードするｃＤＮＡは、その塩基配列の決定や発現ベクターの構築に用いる。塩基配列の決定方法としてはジデオキシ法（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ・オブ・サイエンス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA］第７４巻、５４６３頁（１９７７年））、マキサム−ギルバート法（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ・オブ・サイエンス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA］第７４巻、５６０頁（１９７７年））を利用することができる。
【００１０】
得られたニューロプシンをコードするｃＤＮＡは必要に応じて、適切な制限酵素、リガーゼなどの修飾酵素、合成ＤＮＡ断片などを用いて、全コーディング領域を含有するｃＤＮＡをつくり、適切な発現ベクターに組み換える。使用する発現ベクターとしては、利用する宿主内で複製、増殖し、転写、翻訳されるものであればよく、宿主として大腸菌、酵母菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌を宿主とする場合は、pUC18,pBR322, λgt11などが例示され、酵母菌を宿主とする場合は、pRB15（ATCC37062）等が例示される。また、昆虫細胞を宿主とする場合は、例えばＳＦ２１細胞の場合には、バキュロウイルス由来ベクター（ pVL1392）等が挙げられる。さらに、哺乳動物細胞を宿主とする場合は、ＣＯＳ細胞であればＣＤＭ８等が、マウスＣ１２７細胞であればウシバピローマウイルスＤＮＡ由来のベクターが、ＣＨＯ細胞であればＳＶ４０由来のベクターが例示される。尚、必要に応じて、ニューロプシンｃＤＮＡ配列の前後に、プロモーター配列、ＳＤ配列、翻訳開始コドン、翻訳停止コドン、ポリＡ付加シグナル配列やターミネーション配列を連結し、発現ベクターを構築してもよい。また、発現ベクターは、宿主に組み込まれた後に組換え体を選択するためのマーカー遺伝子を保持していてもよい。このマーカー遺伝子としては、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン等の耐性遺伝子やジハイドロ葉酸還元遺伝子等が例示される。
【００１１】
構築された発現ベクターを宿主細胞株に形質転換し、形質転換体をスクリーニングする。必要に応じて、得られた形質転換体をニューロプシンの生産性及びその安定性等を目安に選別を行ってもよい。得られたニューロプシンを発現する形質転換体を適切な培地及び培養条件で培養し、得られた形質転換体より抽出、精製を行うことにより、目的であるニューロプシンを得る。精製法としては、前に示した精製方法（例えば、クロマトグラフィー手法、塩析法、溶媒抽出法、限外濾過濃縮法、遠心分離法、電気泳動法など）を用いることができる。
【００１２】
尚、上記ｃＤＮＡをクローニングする他の方法として、マウスの脳などから分離精製されたニューロプシンを用いる方法がある。この方法を以下に簡単に説明する。
まず、本発明のニューロプシンを、マウスの脳などから分離精製する。これらの組織からの精製方法としては一般に広く用いられるクロマトグラフィー手法や塩析法、溶媒抽出法、限外濾過濃縮法、遠心分離法、電気泳動法を用いることができる。クロマトグラフィーの手法としてはＳ−セファロース、ＣＭ−セファロースなどの陽イオン交換クロマトグラフィー、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファロースなどの陰イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ヘパリンセファロース及び抗体やＤＮＡや色素をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどがあげられ、これらを組み合わせて用いることができる。
【００１３】
マウスの脳などから分離精製されたニューロプシンを、トリプシンやリジルエンドペプチダーゼなどによる限定分解により消化し、逆相高速液体クロマトグラフィーによりペプチドを分離分取する。得られたペプチドは、プロティンシークエンサーを用いて、そのアミノ酸配列を決定する。
【００１４】
得られたアミノ酸配列を基に、ニューロプシンをコードする遺伝子をクローニングするためのオリゴヌクレオチドを合成する。
ニューロプシンをコードする遺伝子をクローニングするため、ニューロプシンを発現している細胞や組織からｍＲＮＡを抽出精製する。抽出方法としては広く用いられているグアニジンチオシアネート法を用いることができる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを用いｃＤＮＡを合成し、プラスミドやファージＤＮＡに組み込みｃＤＮＡライブラリーを調製する。
【００１５】
ここで、ｃＤＮＡ合成法としては、オカヤマ−バーグ（Okayama-Berg）法（モレキュラー・セル・バイオロジー［Mol.Cell Bio.］第２巻、 １６１頁（１９８２年））あるいはグブラー（Gubler）らの方法（ジーン［Gene］第２５巻、２６３頁（１９８３年））などが利用できる。またｃＤＮＡを組み込むプラスミドやファージＤＮＡとしては、pBR322,pUC8,pBS,λgt10,λgt11 などが利用できる。得られた組換えベクターで大腸菌などを形質転換したり、ファージタンパクにパッケージしてｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。
【００１６】
ｃＤＮＡライブラリーからのニューロプシンをコードするｃＤＮＡのクローニングは、前述の合成オリゴヌクレオチドをＰ32にて標識した後、プローブとして用いてクローニングする。例えば、コロニーハイブリダイゼーション法（ジーン［Gene］第１０巻、６３頁（１９８０年））、プラークハイブリダイゼーション法（サイエンス［Science］第１９６巻、１８０頁（１９７７年））を用いるこ とができる。又、ニューロプシンにたいする抗体があれば、その抗体を用いるクローニング方法も有効である。
【００１７】
以上の方法によりクローニングされたｃＤＮＡは、前述の通り、発現ベクターの構築に用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（ニューロプシンをコードする遺伝子のクローニングと塩基配列決定）
（１−１）ＲＴ−ＰＣＲ
ＮＧＦ−γのセリンプロテアーゼドメイン中に保存されているアミノ酸残基Ｈｉｓ65とＳｅｒ213 の領域に対応する、下記表１に示すような２種類のＰＣＲプライマーを合成した。
【００１９】
【表１】
0003684431.tif 000002
【００２０】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（５週齢、雄）の海馬よりFast Track mRNA抽出キット（Invitrogen社（製） ）によりｍＲＮＡを抽出し、２μg のｍＲＮＡを使ってランダムプライマー法により逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。引き続き Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社（製））により、上記ＰＣＲプライマーを使いＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４℃で２分の熱処理の後、９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で３分のサーマルサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で１０分の条件で行った。ＰＣＲ産物は、その後アガロース電気泳動により分析し、約０．４ｋｂ−０．５ｋｂのサイズのバンドを確認したので、ゲルより切り出し、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはその後Klenow酵素により平滑末端にし、あらかじめ HindIII/Xholで切ったpBluescript II KS +（Stratagene社）を同様の方法で平滑末端にしたものにつないだ。このＤＮＡサンプルは引き続き、ＤＨ５αに形質転換した。
【００２１】
このようにして得られたクローンをＢ４１と名付け、その全塩基配列をジデオキシ法により決定した。その結果を配列表の配列番号３に示す。Ｂ４１はホモロジー検索の結果、ヌクレオチドレベルでＮＧＦ−γと３２％、ＥＧＦ−ＢＰと４０％、ｔＰＡと４７％、ＮＧＦ−αと５０％のホモロジーがある新規なセリンプロテアーゼであることが推定された。以後、Ｂ４１クローンは完全長のｃＤＮＡを得るためのプローブとした。
（１−２）ｃＤＮＡライブラリーの作製とスクリーニング
上記の海馬から得られた２μg のｍＲＮＡよりTime Saver cDNA合成キット（Pharmacia社（製））でｃＤＮＡ合成を行い、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを両端に付け、λgt10ファージベクターにつないで、Gigapack II packaging extract（Stratagene 社（製））を用いてパッケージした。約２×１０7 のライブラリーができた。
【００２２】
約４×１０5 プラークを Hybond-N+（Amersham社（製））のメンブレンフィルターに写し、以下のようにプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。すなわちハイブリダイゼーションの条件は５×ＳＳＰＥ、２×Denhardt液、０．１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミドに２５０μg/mlの変性サケ精巣ＤＮＡを加え、４２℃で６時間のプレハイブリダイゼーションを行った。その後、ランダムプライマー法により32ＰｄＣＴＰ（Amersham社（製））でラベルしたＢ４１プローブを加え、引き続き同じ条件で１８時間ハイブリダイゼーションを行った。その後フィルターを６５℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む液で数回洗い、風乾後、オートラジオグラフィーでポジティブクローンを選別した。その結果、６個のポジティブクローンが得られた。各プレートライセートよりファージを精製して、さらにファージＤＮＡを抽出し、インサートをサイトにサブクローニングし、制限酵素マッピング、塩基配列決定に供した。
（１−３）  ニューロプシン遺伝子
制限酵素マッピングの結果（図１参照、図１にて、ＢはＢａｍＨＩ、ＸはＸｂａＩ、ＲはＲｓａＩ、ＰはＰｓｔＩである）、得られた６個のクローン（ＮＰ５、ＮＰ１、ＮＰ３、ＮＰ４、ＮＰ６、ＮＰ８）はそれぞれオーバーラップすることがわかり、このうちＮＰ５が一番長く、約１．３ｋｂのインサートを含むことがわかった。他は約０．８ｋｂであったので、ＮＰ５についてさらに解析し、全塩基配列を決定した。その結果、配列表の配列番号２に示すように、全長は１３３３ｂｐで、７８０ｂｐからなるオープンリーディングフレームが判明した。翻訳開始コドンはｎｔ４８７−４８９（ＡＴＧ）、又終始コドンはｎｔ１２６７−１２６９（ＴＧＡ）と推定される。即ち、４８６ｂｐからなる５’非コーディング領域と６４ｂｐからなる３’非コーディング領域（終始コドンとポリＡを含む）に挟まれた７８０ｂｐからなるコーディング領域を含むことがわかった。これはアミノ酸残基２６０個からなり、その配列から推定される分子量は約２万６千ダルトンと判明した。このタンパク質をニューロプシンと命名した。
【００２３】
配列表の配列番号１には、塩基配列から演繹されるニューロプシンのアミノ酸の一次構造を示す。ニューロプシンはアミノ酸配列レベルでのホモロジー検索の結果、ＥＧＦ−ＢＰと約４３％、ＮＧＦ−γと４１％、ＮＧＦ−αと３９％、トリプシン３８％、ｔＰＡと１８％のホモロジーがあることがわかり、セリンプロテアーゼの一種と推定された。このことはＨｉｓ73 、Ａｓｐ120、Ｓｅｒ212 とセリンプロテアーゼに特徴的なアミノ酸が含まれていることからも推定される。さらにアミノ酸１１０−１１２に、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｒと糖鎖結合部位を含み糖タンパク質であることも推定される。
［実施例２］
（ニューロプシン遺伝子の組換え発現とその活性）
単離したｃＤＮＡがセリンプロテアーゼ活性を有するニューロプシンを発現していることを確認するために、バキュロウイルスベクターにこのｃＤＮＡをつないで昆虫細胞での発現を試みた。形質転換及び発現は、バキュロゴールドスターターキット（PharMingen社（製））を使い、昆虫細胞用ベクターｐＶＬ１３９２のポリヘドリンプロモーターの下流にあるＮｏｔＩサイトに、ニューロプシンのコーディング領域を含むクローンＮＰ３の８６６ｂｐからなるＮｏｔＩ断片をつないだ。このようにして構築した発現ベクターｐＶＬ１３９２／ＮＰ３を図２に示す。
【００２４】
形質転換は以下のように行った。すなわち、１０％ＦＣＳを含むＴＮＭ−ＦＨ培地４ｍｌ培養したＳＦ２１細胞２×１０6／２５ｃｍ2を１５分間室温に立て、新しい培地と交換した。一方、直鎖状にしたウイルスＤＮＡ ０．５μg／μ１とｐＶＬ１３９２／ＮＰ３とを混ぜ、室温に置き５分後に１ｍｌの形質転換バッファーＢ（前出のバキュロゴールドスターターキットの一部）をこれに加え、ＤＮＡをよく混ぜ、ＤＮＡ混液とした。さらに、ＳＦ２１細胞の培地を１ｍｌの形質転換バッファーＡ（前出のバキュロゴールドスターターキットの一部）と交換して、上述のように調製した１ｍｌのＤＮＡ混液をゆっくりと適下して加えた。そして、２７℃で４時間インキュベートした後、ＳＦ２１細胞を新しいＴＮＭ−ＦＨ培地で一度洗い、３ｍｌのＴＮＭ−ＦＨ培地を加えた。形質転換後３日目に、培地中のウイルスは１０7 Ｐｆｕ／ｍｌとなった。
【００２５】
限界希釈法により多核体を形成しないウイルスを選び、組換えウイルスとした。組換えウイルスストックは、ＳＦ２１細胞を１０％ＦＣＳを含むＴＮＭ−ＦＨ培地で培養することにより調製した。組み換えニューロプシンを得るために１０7 ／ｍｌのＳＦ２１細胞にｐＶＬ１３９２／ＮＰ３細胞あたり２０Ｐｆｕで１時間感染させた。感染後細胞は一度ＴＮＭ−ＦＨ培地（−ＦＣＳ）で洗い、１０％ＦＣＳを含む同培地に１０8 細胞／ｍｌの細胞数で懸濁した。さらに５００ｍｌスピナーフラスコに移して、２７℃で培養した。４８時間後遠心により細胞を除き、洗浄の後シュークロース、塩酸マグネシウムにベンザミンを加えたトリス緩衝液に懸濁し、細胞を破砕した。遠心の後、上清にTriton X-100と５Ｍ  ＮａＣｌを加え、超音波にて可溶化し定法通りゲル濾過、イオン交換、及び抗体カラムによるアフィニティークロマトグラフィーを経て精製した。
【００２６】
セリンプロテアーゼ活性の確認は、各種合成発色基質を用いて、以下の反応系で確認した。即ち、
反応液中に  ニューロプシン                    １０μｌ
５０ｍＭ反応用バッファー        ４７０μｌ
２０ｍＭ合成発色基質              ２０μｌ
を順に加え、３７℃、３０分で反応させ、発色にｐＮＡ（フェニルニトロアニリド）を用いた場合は４０５ｎｍ、ＭＣＡを用いた場合は３０７ｎｍの波長を測定した。なお、用いるバッファーにはｐＨの至適範囲があるため、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５ではリン酸バッファー、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０ではトリスバッファー、ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０では炭酸バッファーを用いて測定した。
【００２７】
図３は合成発色基質Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（第一化学薬品株式会社製）を用いてニューロプシンの酵素活性の至適ｐＨを示したグラフである。横軸はｐＨを、縦軸は酵素が切断した基質（ｐＮＡ）の濃度を示しており、ｐＨ７〜ｐＨ８付近で強い活性が見られた。尚、合成発色基質Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（第一化学薬品株式会社製）を用いても同様の活性が確認された。
【００２８】
表２は様々な合成発色基質を用いてニューロプシンの基質特異性を調べたものである。反応用バッファーは５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．０）を用いた。トリプシンタイプの酵素基質には反応が見られたが、キモトリプシンタイプの酵素基質には反応しなかった。
【表２】
0003684431.tif 000003
【００２９】
表３は様々なインヒビターによりニューロプシンの酵素活性がどの程度阻害されるかを示したものである。合成発色基質はＶａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡを、反応用バッファーは５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．０）を用いた。インヒビターの濃度が０Ｍのときの阻害活性を０％として、反応液中のインヒビター濃度とそのときの活性阻害率を示した。この表３から明らかなように、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ａｎｔｉｐａｉｎ等に強い阻害を受けた。
【表３】
0003684431.tif 000004
【００３０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、記憶の中枢として考えられている脳の海馬に特異的に発現する新規なニューロプシンは、神経系の細胞の増殖、情報伝達、さらには脳の機能（記憶や学習機構等）などに関する研究に貢献すると考えられる新規なタンパク質であるため、脳疾患治療薬やこのニューロプシンのポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬などとして利用可能であるという効果が得られる。また、末梢組織（脾臓、胸腺など）に存在するニューロプシンは免疫などの機能に関係すると考えられ、免疫疾患治療薬として利用可能であるという効果が得られる。また、ニューロプシンのアミノ酸配列をコードする新規なＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体を培養し、この培養物からニューロプシンを採取することにより、有用なニューロプシンの大量供給が可能になるという効果が得られる。
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の（１−２）で得られた６個のクローンの制限酵素地図である。
【図２】  昆虫細胞用ニューロプシン発現ベクターの構築図を示す。
【図３】  精製ニューロプシンの合成基質を用いたセリンプロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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