(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、下記［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチド、その活性断片又はその活性誘導体を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程；
［Ａ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
［Ｂ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ又は数個のアミノ酸が付加、欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［Ｃ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［Ｄ］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されている２つのポリヌクレオチドのうち短いものによりコードされ、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［Ｅ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｆ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目のメチオニンから３４番目のアラニンまでのアミノ酸のうち、１番目のメチオニン又は該メチオニンを含む２個以上の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［Ｇ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその３’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされ、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［Ｈ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、３５番目のメチオニン乃至６０９番目のリジンからなるポリペプチド；
［Ｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８２７番目のアデノシンからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｊ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｋ］アミノ末端にメチオニンが付加してなる、［Ｇ］乃至［Ｊ］のいずれか一つに記載のポリペプチド；
［Ｌ］  ２’，５’−オリゴアデニル酸を加水分解する活性が、３’，５’−オリゴアデニル酸を加水分解する活性と同等又はそれ以上であることを特徴とする、［Ａ］乃至［Ｋ］のいずれか一つに記載のポリペプチド。
【請求項２】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、下記［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドが挿入されている発現組換プラスミドＤＮＡで形質転換された哺乳動物由来の宿主細胞を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程。
［ａ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
［ｃ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｄ］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されている２つのポリヌクレオチドのうち短いものであり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｅ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目のメチオニンから３４番目のアラニンまでのアミノ酸のうち、１番目のメチオニン又は該メチオニンを含む２個以上の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｆ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその３’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｇ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、３５番目のメチオニン乃至６０９番目のリジンからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｈ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８２７番目のアデノシンからなるポリヌクレオチド；
［ｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチド；
［ｊ］５’末端にメチオニンコドンが付加してなる、［ｅ］乃至［ｉ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５システムＡ活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドが挿入されている発現組換プラスミドＤＮＡで形質転換された哺乳動物由来の宿主細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該宿主細胞内又は細胞外液における、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの転写量、又は請求項１の［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程。
【請求項４】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該細胞内又は細胞外液における、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの転写量、又は請求項１の［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程。
【請求項５】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム感受性疾治療剤又は予防剤をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、請求項１の下記［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチド、その活性断片又はその活性誘導体を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程。
【請求項６】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は予防剤をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドが挿入されている発現組換プラスミドＤＮＡで形質転換された哺乳動物由来の宿主細胞を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程。
【請求項７】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５システムＡ感受性疾患治療剤又は予防剤をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドが挿入されている発現組換プラスミドＤＮＡで形質転換された哺乳動物由来の宿主細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該宿主細胞内又は細胞外液における、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの転写量、又は請求項１の［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程。
【請求項８】
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は予防剤をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該細胞内又は細胞外液における、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの転写量、又は請求項１の［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程。
【請求項９】
２−５Ａシステム感受性疾患がウイルス感染症又は腫瘍である、請求項５乃至８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
下記の工程［ｉ］及び［ｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化の程度を判定する方法：
［ｉ］被検者若しくは被検哺乳動物、又は健常者若しくは健常な哺乳動物に由来する試料中における、請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの転写量又は請求項１の［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉ］被検者若しくは被検哺乳動物に由来する試料中における該転写量又は該翻訳量が、健常者又は健常な哺乳動物のそれと比較して少ない場合、該被験者又は被検哺乳動物は、２−５Ａシステムが活性化されていると判定する工程。
【請求項１１】
請求項１の［Ａ］乃至［Ｌ］のいずれか一つに記載のポリペプチドを有効成分として含有する２−５Ａシステム不活性化剤。
【請求項１２】
請求項２の［ａ］乃至［ｊ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有する２−５Ａシステム不活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドが挿入された組換プラスミドＤＮＡ、該組換プラスミドＤＮＡで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞の培養物から該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドを単離する工程を含む、該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドの製造方法、該ポリペプチドの活性を調節する物質のスクリーニング方法及び該スクリーニング用キット、該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドの発現を調節する物質のスクリーニング方法及び該スクリーニング用キット、該ポリペプチドと結合する物質のスクリーニング方法及び該スクリーニング用キット、該ポリペプチドの活性を検出する方法及び該検出用キット、該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドの発現を検出する方法及び該検出用キット、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体、その活性断片、そのキメラ抗体、そのヒト型抗体、そのヒト抗体又はその一本鎖抗体を含むことからなる医薬組成物、該ポリペプチドを含むことからなる医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
２’，５’−オリゴアデニル酸（以下、「２−５Ａ」という。）は、２個以上のアデノシンがそれらの２’位と５’位との間でリン酸ジエステル結合し、且つ５’末端のアデノシンの５’位に３リン酸が結合した、オリゴリボヌクレオチドである。２−５Ａは細胞内の調節分子として機能し、２−５ＡによるＲＮＡ分解を介した細胞またはウイルスの増殖制御系は２−５Ａシステムと呼ばれる（非特許文献１）。
【０００３】
２−５Ａシステムは三つの酵素により構成されている。第一に二本鎖ＲＮＡにより活性化される２−５Ａ合成酵素、２−５Ａシンテターゼであり、２−５Ａは２−５ＡシンテターゼによりＡＴＰより合成される。第二に２−５ＡをＡＭＰおよびＡＴＰに分解する酵素である２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ（2',5'-oligoadenylate phosphodiesterase：以下、２’−ＰＤＥ）である。そして、第三に２−５Ａにより活性化される２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＬである。活性化したＲＮａｓｅＬはｍＲＮＡ等の一本鎖ＲＮＡを分解し、その結果タンパク質合成を阻害し、最終的には細胞増殖を阻害する。２−５Ａシステムでは基本的に２−５Ａの存在量が重要であり、２−５Ａの合成・分解のバランスによってＲＮａｓｅＬの活性が調節されていると考えられている。
【０００４】
２−５Ａシステムはインターフェロンによる抗ウイルス活性の発現機構の一つとしてよく研究されている。インターフェロンはサイトカインの一種であり、細胞膜媒介性に２−５Ａシンテターゼを誘導する。ウイルスの多くが感染、増殖の過程で二本鎖ＲＮＡを持ち、２−５Ａシンテターゼは二本鎖ＲＮＡにより活性化されるため、２−５Ａシンテターゼはウイルス感染細胞で優先的に活性化される。活性化された２−５Ａシンテターゼにより、ウイルス感染細胞内の２−５Ａレベルは上昇し、それに伴いＲＮａｓｅＬの活性化がおき、ウイルス感染細胞内のタンパク質合成は阻害され、ウイルス増殖の阻害をもたらすと考えられている。活性化したＲＮａｓｅＬによる直接のウイルスＲＮＡ分解、それによるウイルス増殖阻害も知られている。
【０００５】
インターフェロンは抗ウイルス作用の他に細胞増殖抑制効果、抗腫瘍効果、マクロファージの活性化、ナチュラルキラー細胞の活性増強、免疫応答調節作用、破骨細胞分化の負のフィードバック作用、分化誘導の調節作用など多面的な生物活性を示す多機能分子である（非特許文献２、非特許文献３）。前立腺癌発症家系には、ＲＮａｓｅＬ遺伝子に変異が見られた（非特許文献４）。また、神経成長因子により２−５Ａシンテターゼが誘導されることも示唆されており（非特許文献５）、２−５Ａシステムはインターフェロン以外のサイトカインの機能発現にも関わっている可能性がある。また、インターフェロンは破骨細胞分化の過程で負のフィードバックとして、その分化を抑制していることが示唆されている（非特許文献３）。
【０００６】
２’−ＰＤＥ阻害物質は、生体内又は細胞内の２−５Ａレベルを上昇させることにより、２−５Ａシステム介して抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫活性化作用等を発揮する可能性があるが、現在まで２’−ＰＤＥに関する研究は必ずしも十分ではなかった。２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドは、マウス及びウシよりそれぞれ精製された例が知られている。マウス由来の２種の細胞より精製されたポリペプチドは、いずれも、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上の分子量が３５，０００、ゲル濾過クロマトグラフィーによる見かけの上の分子量が４０，０００であり、２’，５’−オリゴアデニル酸を加水分解する活性が、３’，５’−オルゴアデニル酸を加水分解する活性と同等かそれ以上であり、しかもｔＲＮＡのＣ−Ｃ−Ａ末端を分解する活性を有していた（非特許文献６）。一方、ウシから精製されたポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上の分子量が６５，０００であり、ゲル濾過クロマトグラフィーによる見かけの上の分子量が５６，０００±１１，０００、等電点がｐＨ８．３付近であったが、２’，５’−オリゴアデニル酸を加水分解する活性は、３’，５’−オルゴアデニル酸を加水分解の百分の１程度であり（非特許文献７）、該ポリペプチドが２’−ＰＤＥであるとは言い難い。
【非特許文献１】エム・アール・プレイヤー（M. R. Player)、ピー・エフ・トレンス(P. F. Torrence)共著「ザ  ２−５  エイ  システム：  モジュレーション  オブ  ヴァイラル  アンド  セルゥラー  プロセシィーズ  スルー  アクセラレイション  オブ  アール・エヌ・エイ  デグラデイション(The 2-5A system: modulation of viral and cellular processes through acceleration of RNA degradation)」ファーマコロジー  アンド  セラピューティクス (Pharmacology & therapeutics)、１９９８年に英国にて刊行、第７８巻、ｐ．５５−１１３
【非特許文献２】宮園浩平及び菅村和夫編「バイオ  サイエンス（Bio Science）用語ライブラリー サイトカイン・増殖因子」、１９９８年に日本国にて羊土社より刊行、ｐ．１７８−１８５
【非特許文献３】エイチ・タカヤナギ（H. Takayanagi）他著「ランクル  メインテインス  ボーン  ホメオスタシス  スルー  シィ−フォス−ディペンデント  インダクション  オブ  インターフェロン−ベータ（RANKL maintains bone homeostasis through c-Fos-dependent induction of interferon-β）」ネイチャー(Nature) ２００２年に英国にて刊行、第４１６巻、ｐ．７４４−７４９
【非特許文献４】ジェイ・カープテン（J. Carpten)他著「ジャームライン  ミューテーションズ  イン  ザ  リボヌクレアーゼ  エル  ジーン  イン  ファミリーズ  ショウイング  リンケージ  ウィズ  エイチピーシィー１(Germline mutations in the ribonulease L gene in families showing linkage with HPC1)」ネイチャー  ジネティクス(Nature Genetics)、２００２年にアメリカ合衆国にて刊行、第３０巻、ｐ．１８１−１８４
【非特許文献５】エム・サーマ（M. Saarma）他著「ナーヴ  グロウス  ファクター  インデューセズ  チェインジース  イン  （２’−５’）オリゴ（Ａ）  シンセターゼ  アンド  ２’−フォスフォジエステラーゼ  アクティヴィティーズ  デュアリング  ディフェレンシエイション  オブ  ピーシィー１２ フェオクロモサイトーマ  セルズ(Nerve growth factor induces changes in (2'-5')oligo(A) synthetase and 2'-phosphodiesterase activities during differentiation of PC12 pheochromocytoma cells)」エクスペリメンタル  セル  リサーチ(Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Cell Research)、１９８６年スウェーデンにて刊行、第１６６巻、ｐ．２２９−２３６
【非特許文献６】エイ・シュミット（A. Schmidt）他著「アン  インターフェロン−インデュースト  フォスフォダイエステレース  ディグレイディング  （２’−５’）オリゴアデニレート  アンド  ザ  Ｃ−Ｃ−Ａ  ターミナス  オブ  ｔＲＮＡ（An interferon-induced phosphodiesterase degrading (2'-5') oligoadenylate and the C-C-A terminus of tRNA）」プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイセンス、ユー・エス・エイ（Proceedings of Natioanl Academy of Science, U.S.A）、１９７９年にアメリカ合衆国にて刊行、第７６巻、第１０号、ｐ．４７８８−４７９２
【非特許文献７】ダブリュー・ジー・ハール（W. G. Hearl）著、「ピューリフィケーション  アンド  キャラクタリゼーション  オブ  ア  ２’−フォスフォダイエステレース  フロム  ボヴァイン  スプリーン（Purification and Characterization of a 2'-Phosphodiesterase from Bovine Spleen）」ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、１９８７年にアメリカ合衆国にて刊行、 第２６２巻、第１７号、ｐ．８３７７−８３８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞内又は体内の２’，５’−オリゴアデニル酸（以下、「２−５Ａ」という。）レベルを上昇させることにより、ひいては該細胞内又は体内の２−５Ａシステムを活性化させ得る物質をスクリーニングするのに有用なポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを用いたスクリーニング方法、スクリーニング用キット等を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、２−５Ａシステムを活性化又は増強する物質の探索標的分子について鋭意研究した結果、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ（2',5'-oligoadenylate  phosphodiesterase：以下、「２’−ＰＤＥ」という。）活性を有する新規なポリペプチド及びそれをコードする新規なポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）
下記［ｉ］乃至［ｉｖ］からなる群から選択される一つであるポリヌクレオチド：
［ｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｉｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
［ｉｉｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｉｖ］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されている２つのポリヌクレオチドのうち短いもの、
（２）
下記［ｉ］乃至［ｖｉ］からなる群から選択される一つであるポリヌクレオチド：
［ｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目のメチオニンから３４番目のアラニンまでのアミノ酸のうち、１番目のメチオニン又は該メチオニンを含む２個以上の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｉｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその３’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
［ｉｉｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、３５番目のメチオニン乃至６０９番目のリジンからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｉｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８２７番目のアデノシンからなるポリヌクレオチド；
［ｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチド；
［ｖｉ］５’末端にメチオニンコドンが付加してなる、［ｉ］乃至［ｖ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、
（３）
（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチドが挿入されている組換プラスミドＤＮＡ、
（４）
発現プラスミドＤＮＡであることを特徴とする、（３）記載の組換プラスミドＤＮＡ、
（５）
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡ、
（６）
（３）乃至（５）のいずれか一つに記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞、
（７）
哺乳動物由来の細胞である、（６）記載の宿主細胞、
（８）
ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸脱水素酵素欠損株又はＣＯＳ細胞である、（７）記載の宿主細胞、
（９）
形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）である、（６）記載の宿主細胞、
（１０）
下記の工程［ｉ］及び［ｉｉ］を含むことからなる、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法：
［ｉ］（６）乃至（９）のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養する工程；
［ｉｉ］該培養物から２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドを回収する工程、
（１１）
下記［ｉ］乃至［ｖ］からなる群から選択される一つであるポリペプチド：
［ｉ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
［ｉｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ又は数個のアミノ酸が付加、欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［ｉｉｉ］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチド；
［ｉｖ］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されている２つのポリヌクレオチドのうち短いものによりコードされるポリペプチド；
［ｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（１２）
下記［ｉ］乃至［ｖｉ］からなる群から選択される一つであるポリペプチド：
［ｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目のメチオニンから３４番目のアラニンまでのアミノ酸のうち、１番目のメチオニン又は該メチオニンを含む２個以上の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド；
［ｉｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその５’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［ｉｉｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、３５番目のメチオニン乃至６０９番目のリジンからなるポリペプチド；
［ｉｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８２７番目のアデノシンからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［ｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［ｖｉ］アミノ末端にメチオニンが付加してなる、［ｉ］乃至［ｖ］のいずれか一つに記載のポリペプチド、
（１３）
（１０）記載の方法により得られる、（１１）又は（１２）記載のポリペプチド、
（１４）
２’，５’−オリゴアデニル酸を加水分解する活性が、３’，５’−オリゴアデニル酸を加水分解する活性と同等又はそれ以上であることを特徴とする、（１１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のポリペプチド、
（１５）
（１１）又は（１２）記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（１６）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性阻害物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチド、その活性断片又はその活性誘導体を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程、
（１７）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性阻害物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載の宿主細胞を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程、
（１８）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ発現抑制物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載の宿主細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該宿主細胞内又は細胞外液における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量、又は（１１）乃至（１４）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］
検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程、
（１９）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ発現抑制物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該細胞内又は細胞外液における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量、又は（１１）乃至（１４）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］
検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程。
（２０）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチド、その活性断片又はその活性誘導体を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程、
（２１）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載の宿主細胞を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程；
［ｉｉｉ］検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下のそれと比較して小さい場合、該検体を陽性と判定する工程、
（２２）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載の宿主細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該宿主細胞内又は細胞外液における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量、又は（１１）乃至（１４）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］
検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程、
（２３）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該細胞内又は細胞外液における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量、又は（１１）乃至（１４）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉｉ］
検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下のそれと比較して少ない場合、該検体を陽性と判定する工程。
（２４）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載の宿主細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該宿主細胞内又は細胞外液における２’，５’−オリゴアデニル酸の量又はリボヌクレアーゼＬ（ribonuclease  L：以下、ＲＮａｓｅＬ））によるＲＮＡの分解量を測定する工程；
［ｉｉｉ］
検体存在下における２’，５’−オリゴアデニル酸の量又はＲＮａｓｅＬによるＲＮＡの分解量が、検体非存在下のそれと比較して多い場合、該検体を陽性と判定する工程、
（２５）
下記の工程［ｉ］乃至［ｉｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法：
［ｉ］検体存在下又は非存在下において、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞を保温する工程；
［ｉｉ］該宿主細胞内又は細胞外液における２’，５’−オリゴアデニル酸の量又はリボヌクレアーゼＬ（ribonuclease  L：以下、ＲＮａｓｅＬ））によるＲＮＡの分解量を測定する工程；
［ｉｉｉ］
検体存在下における２’，５’−オリゴアデニル酸の量又はＲＮａｓｅＬによるＲＮＡの分解量が、検体非存在下のそれと比較して多い場合、該検体を陽性と判定する工程、
（２６）
工程［ｉ］において、インターフェロン存在下及び／又は非存在下で、宿主細胞又は細胞を保温することを特徴とする、（１７）乃至（１９）および（２１）乃至（２５）のいずれか一つに記載の方法、
（２７）
下記［ａ］乃至［ｄ］の少なくとも一つを含む、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性阻害物質のスクリーニング用キット、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ発現抑制物質のスクリーニング用キット、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ結合物質のスクリーニング用キット又は２−５Ａシステム活性化物質のスクリーニング用キット：
［ａ］（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチド又はその断片；
［ｂ］［ａ］記載のポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列又はそれに完全に相補的なヌクレオチド配列の一部を有し、且つ［ａ］記載のポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖と会合する、少なくとも１０の塩基を含むオリゴヌクレオチド；
［ｃ］（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体又はその活性断片：
［ｄ］［ａ］記載のポリヌクレオチド又はその断片、［ｂ］記載のオリゴヌクレオチド、及び［ｃ］記載の抗体若しくはその活性断片からなる群より選択される一つが、直接又はスペーサーを介して固定化されている不溶性担体、
（２８）
インターフェロンを含むことを特徴とする、（２７）に記載のキット、
（２９）
下記の工程［ｉ］及び［ｉｉ］を含むことからなり、被検試料に含まれる（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドが有する２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼの活性を検出する方法：
［ｉ］該検体を、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むヌクレオチド基質と接触させる工程；
［ｉｉ］該ヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定する工程、
（３０）
被検試料における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量又は（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程を含むことからなる、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼの発現を検出する方法、
（３１）
下記の工程［ｉ］及び［ｉｉ］を含むことからなる、２−５Ａシステム活性化の程度を判定する方法：
［ｉ］被検者若しくは被検哺乳動物、又は健常者若しくは健常な哺乳動物に由来する試料中における、（１）、（２）若しくは（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量又は（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を測定する工程；
［ｉｉ］被検者若しくは被検哺乳動物に由来する試料中における該転写量又は該翻訳量が、健常者又は健常な哺乳動物のそれと比較して少ない場合、該被験者又は被検哺乳動物は、２−５Ａシステムが活性化されていると判定する工程、
（３２）
下記［ａ］乃至［ｄ］の少なくとも一つを含む、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性の検出用キット、２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼの発現検出用キット又は２−５Ａシステム活性化の程度を判定するためのキット：
［ａ］（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチド又はその断片；
［ｂ］［ａ］記載のポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列又はそれに完全に相補的なヌクレオチド配列の一部を有し、且つ［ａ］記載のポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖と会合する、少なくとも１０の塩基を含むオリゴヌクレオチド；
［ｃ］（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体又はその活性断片又；
［ｄ］［ａ］記載のポリヌクレオチド又はその断片、［ｂ］記載のオリゴヌクレオチド、及び［ｃ］記載の抗体又はその活性断片からなる群より選択される一つが、直接又はスペーサーを介して固定化されている不溶性担体、
（３３）
インターフェロンを含むことを特徴とする、（３２）に記載のキット、
（３４）
（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその活性断片、
（３５）
（３４）記載の抗体又はその活性断片を含むことからなる医薬組成物、
（３６）
（３４）記載の抗体又はその活性断片を含むことからなる２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ阻害剤、
（３７）
（３４）記載の抗体又はその活性断片を有効成分として含有する２−５Ａシステム活性化剤、
（３８）
（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドを含むことからなる医薬組成物、
（３９）
（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドを有効成分として含有する２−５Ａシステム不活性化剤、
（４０）
（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを含むことからなる医薬組成物、
（４１）
（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有する２−５Ａシステム不活性化剤、
（４２）
インターフェロンを含むことを特徴とする、（３５）、（３８）又は（４０）に記載の医薬組成物、
（４３）
（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写を抑制する、下記［ｉ］又は［ｉｉ］記載のヌクレオチド：
［ｉ］配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド中に存在する、連続する少なくとも１０のヌクレオチド：
［ｉｉ］配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド中に存在する、連続する少なくとも１０のヌクレオチドと完全に相補的なヌクレオチド、
（４４）
（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを不活性化する、下記［ｉ］および［ｉｉ］が会合してなるスモール・インターフィアリングＲＮＡ：
［ｉ］配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド中に存在する、連続する１０乃至３０のヌクレオチド：
［ｉｉ］配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド中に存在する、連続する１０乃至３０のヌクレオチドと完全に相補的なヌクレオチド、
（４５）
細胞における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量を低下させるか、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を低下させるか、又は該ポリペプチドが有する２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を阻害することにより、該細胞に含まれる２’，５’−ホスホアデニル酸の量を増加せしめる方法、
（４６）
細胞における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量を低下させるか、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を低下させるか、又は該ポリペプチドが有する２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を阻害することにより、該細胞に含まれるリボヌクレアーゼＬ（ribonuclease  L）を活性化せしめる方法、
（４７）
細胞における、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量を低下させるか、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を低下させるか、又は該ポリペプチドが有する２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を阻害することにより、該細胞に含まれる２−５Ａシステムを活性化せしめる方法、
（４８）
細胞へ、下記［ｉ］乃至［ｉｉｉ］のいずれか一つを導入することを特徴とする、（４５）乃至（４７）いずれか一つに記載の方法：
［ｉ］（３４）記載の抗体又はその活性断片；
［ｉｉ］（４３）記載のヌクレオチド；
［ｉｉｉ］（４４）記載のスモール・インターフィアリングＲＮＡ、
（４９）
（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドの転写量を低下させるか、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のポリペプチドの翻訳量を低下させるか、若しくは該ポリペプチドが有する２’，５’−オリゴアデニル酸ホスホジエステラーゼ活性を阻害する前、後又同時にインターフェロンを投与することを特徴とする、（４５）乃至（４８）のいずれか一つに記載の方法、及び、
（５０）
細胞に含まれるゲノムＤＮＡにおいて、（１）、（２）又は（１５）記載のポリヌクレオチドを一部若しくは全部欠失させるか、あるいは該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが有する２’，５’−ホスホジエステラーゼ活性が一部又は全部失われるよう該ポリヌクレオチドを変異させることを特徴とする、（４５）乃至（４７）のいずれか一つに記載の方法、
等に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の提供するポリペプチドは２’−ＰＤＥ活性を有しており、該ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドは、２’−ＰＤＥ活性阻害物質、２’−ＰＤＥ発現抑制物質、２’−ＰＤＥ結合物質若しくは２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は予防剤のスクリーニング、２’−ＰＤＥ活性若しくは発現の検出等に好適に使用することができる。それらのスクリーニングにより得られる物質は２−５Ａシステム感受性疾患の治療又は予防に、それらの検出方法は２−５Ａ感受性疾患等の判定にそれぞれ有用である。また、本発明の提供する抗体は、本発明のポリペプチドの免疫学的な検出、あるいは２−５Ａシステム感受性疾患等の治療又は予防に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、「ポリペプチド」とは、２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドを意味する。そのようなペプチドとしては、次の［Ｐ１］乃至［Ｐ８］等を例示することができ、好適には［Ｐ１］乃至［Ｐ６］のいずれか一つに記載のポリペプチドであり、より好適には［Ｐ１］、［Ｐ４］、［Ｐ５］又は［Ｐ６］記載のポリペプチドである：
［Ｐ１］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
［Ｐ２］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ又は数個（２つ以上１０個以下）のアミノ酸が付加、欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチド；
［Ｐ３］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と８０％以上、好適には９０％以上、より好適には９５％以上同一なアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチド。
［Ｐ４］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されているポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｐ５］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｐ６］前記［Ｐ１］乃至［Ｐ５］のいずれか一つに記載のポリペプチドの断片であり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有する断片。本発明においては、該断片を、活性断片と呼ぶ；
［Ｐ７］前記［Ｐ１］乃至［Ｐ６］のいずれか一つに記載のポリペプチド又はその断片を２つ以上含み、且つそれらが直接又はスペーサー等を介して間接的に互いに結合しており、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドホモ２量体若しくは３量体以上の多量体、又は同ヘテロ２量体若しくは３量体以上の多量体。本発明においては、それらをポリペプチドの「多量体」と呼ぶ。；
［Ｐ８］前記［Ｐ１］乃至［Ｐ７］のいずれか一つに記載のポリペプチド、その断片又はその多量体に、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリマー、デキストラン硫酸等の多糖、単糖、免疫グロブリンのＦｃ領域、ヒスチジン・オリゴ体等のタグ（ｔａｇ）が化学的又は非化学的に付加したポリペプチド。本発明においては、それらを、ポリペプチドの「活性誘導体」と呼ぶ。
［Ｐ６］のより具体的な例としては、、次の［Ｐ６ｉ］乃至［Ｐ６ｖ］からなる群から選択される一つであるポリペプチドを挙げることができる：
［Ｐ６ｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目のメチオニンから３４番目のアラニンまでのアミノ酸のうち、１番目のメチオニン又は該メチオニンを含む２個以上の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド；
［Ｐ６ｉｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその３’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｐ６ｉｉｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、３５番目のメチオニン乃至６０９番目のリジンからなるポリペプチド；
［Ｐ６ｉｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８２７番目のアデノシンからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
［Ｐ６ｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【００１２】
本発明においては、［Ｐ６ｉ］乃至［Ｐ６ｖ］のいずれか一つに記載のポリペプチドを「短鎖型２’−ＰＤＥ」と呼び、［Ｐ６ｉｉｉ］乃至［Ｐ６ｖ］のいずれか一つに記載のポリペプチドを特に「短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）」と呼ぶ。また、本発明の「２’−ＰＤＥ」は、短鎖型２’−ＰＤＥおよび短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）もその意味に包含する。
【００１３】
本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその断片であり、ゲノムＤＮＡ断片、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、該ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素（reverse transcriptase、以下ＲＴ）により合成される相補的ＤＮＡ（complementary DNA：以下、ｃＤＮＡ）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のいずれでもよく、二本鎖にはＤＮＡ−ＤＮＡ会合体、ＤＮＡ−ＲＮＡ会合体及びＲＮＡ−ＲＮＡ会合体が含まれる。本発明においては、二本鎖ポリヌクレオチドの一方をセンス鎖と呼ぶ場合、他方すなわち該センス鎖が有するヌクレオチド配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことからなる一本鎖ポリヌクレオチドをアンチセンス鎖と呼ぶ。そのような本発明のポリヌクレオチドとしては、次の［Ｎ１］乃至［Ｎ１０］を例示することができ、好適には［Ｎ１］、［Ｎ４］乃至［Ｎ６］および［Ｎ１０］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドである：
［Ｎ１］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ２］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ又は数個（２つ以上１０個以下）のアミノ酸が付加、欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ３］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好適には９０％以上、より好適には９５％以上同一なアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ４］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されているポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ５］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
［Ｎ６］形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）が保持する組換プラスミドＤＮＡの２箇所の制限酵素ＥｃｏＲ１認識部位の間に挿入されているポリヌクレオチド；
［Ｎ７］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列と７０％以上、好適には８０％以上、より好適には９０％以上同一なヌクレオチド配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ８］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において１つ又は２つ以上２０以下のヌクレオチドが付加、欠失、置換もしくは挿入されたヌクレオチド配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ９］前記［Ｎ５］又は［Ｎ６］に記載のポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。本発明において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）、５％  デンハート（Denhardt）溶液及び０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」という）を含むプレハイブリダイゼーション溶液中における、５５℃、４時間以上の保温によりハイブリダイズすること、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb  Hybridization  Solution（クローンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７乃至１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１乃至２倍濃度のＳＳＣ溶液を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件若しくはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう；
［Ｎ１０］前記［Ｎ１］乃至［Ｎ９］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの断片であり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードする断片。本発明においては、該断片を活性断片とよぶ。
［Ｎ１０］のより具体的な例としては、次の［Ｎ１０ｉ］乃至［Ｎ１０ｖ］のいずれか一つに記載の単離されたポリヌクレオチドを挙げることができる：
［Ｎ１０ｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１番目のメチオニンから３４番目のアラニンまでのアミノ酸のうち、１番目のメチオニン又は該メチオニンを含む２個以上３４個以下の連続するアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ１０ｉｉ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその３’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
［Ｎ１０ｉｉｉ］配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、３５番目のメチオニン乃至６０９番目のリジンからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［Ｎ１０ｉｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８２７番目のアデノシンからなるポリヌクレオチド；
［Ｎ１０ｖ］配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチド。
【００１４】
［Ｎ１０ｉ］乃至［Ｎ１０ｖ］のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドは本発明の短鎖型２’−ＰＤＥをコードし、このうち［Ｎ１０ｉｉｉ］乃至［Ｎ１０ｖ」のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドは特に短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）をコードする。
本発明において、「抗体」とは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその活性断片であり、好適には本発明のポリペプチドと特異的に結合し、且つ本発明のポリペプチドが有する２’−ＰＤＥ活性を中和する抗体（以下、中和抗体）又はその活性断片であり、より好適には本発明のより好適なポリペプチドと特異的に結合し、且つ該ポリペプチドの中和抗体又はその活性断片であり、より一層好適には本発明の最適なポリペプチドと特異的に結合し、且つ該ポリペプチドの中和抗体又はその活性断片である。また、本発明の抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、それらのうちいずれかの活性断片等を挙げることができる。なお、本発明の抗体が由来する動物、及び、本発明の抗体を作成する際に使用される免疫源の由来する動物は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であれば、それぞれ特に限定されない。
【００１５】
本発明において、「断片」とは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は抗体の断片を意味する。また、「活性断片」とは、本発明のポリペプチドの断片であり且つ２’−ＰＤＥ活性を有するもの、本発明のポリヌクレオチドの断片であり且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするもの、又は本発明の抗体の断片であり且つ本発明のポリペプチドと特異的に結合し得るものであり、それらも本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は抗体にそれぞれ包含される。
【００１６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換プラスミドＤＮＡ、抗体及びそれらの断片は、それぞれ単離されたものであることが好ましい。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、天然型及び組換型のいずれでもよい。天然型のポリペプチドは、組織、臓器又は細胞から、２’−ＰＤＥ活性を指標として抽出、精製及び／又は単離され得る。天然型のポリペプチドの分離源としては、２’−ＰＤＥを発現している限りにおいて特に限定はないが、例えば、肝臓等を挙げることができる。そのような分離源から本発明のポリペプチドを抽出、精製及び／又は単離する手段としては、細胞分画、塩溶、塩析、透析、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動等を例示することができ、それらの手段を適宜組み合わせることが可能である。
【００１８】
組換型のポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、次いで該ポリヌクレオチドを適当な発現プラスミドＤＮＡへ挿入し、次いで得られた組換発現プラスミドＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、次いで該宿主細胞を培養することにより、その培養物より、２’−ＰＤＥ活性又はアフィニティ・タグを指標として抽出、精製及び／又は単離され得る。本発明は、そのような、組換型ポリペプチドの製造方法をも提供する。また、該製造方法により得られるポリペプチドも、本発明のポリペプチドに包含される。
【００１９】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列と８０％以上、好適には９０％以上、より好適には９５％以上同一なアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有する単離されたポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド又はその断片をプローブとして、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来するｃＤＮＡライブラリーより発現クローニングすることにより、組換型のポリペプチドとして得ることができる。
【００２０】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ又は数個（２つ以上１０個以下）のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含むことからなり、且つ２’−ＰＤＥ活性を有する単離されたポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドを、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いて末端から削る方法（高浪満ら編、続生化学実験講座１  遺伝子研究法ＩＩ  組換えＤＮＡ技術、１９８６年に東京化学同人より刊行、ｐ．３３５−３５４）、カセット変異法（村松正実ら編、新生化学実験講座２  核酸ＩＩＩ  組換えＤＮＡ技術、１９９２年に東京化学同人より刊行、ｐ．２４２−２５１）、変異プライマーを用いたＰＣＲ法、部位特異的変異誘発法等により変異が導入されたポリヌクレオチドを取得し、次いで得られたポリヌクレオチドにコードされているポリペプチドを発現させることにより、組換型のポリペプチドとして取得することができる。ちなみに、天然型のインターロイキン２（以下、ＩＬ−２）のアミノ酸配列上に存在するシステインがセリンに置換されたものは、天然型のＩＬ−２と同等の生物活性を保持する（Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433）。
【００２１】
本発明のポリペプチドの活性断片は、該ポリペプチドをそのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から除去すること等により得られる。具体的には、例えば、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドを、エキソヌクレアーゼＢａｌ３１（BAL31 Nuclease）等を用いて本発明のポリヌクレオチドを末端から削る方法（前述）等に基づいてポリペプチドを短鎖化し、２’−ＰＤＥ活性を保持していることを確認することにより得ることができる。
【００２２】
そのような本発明のポリペプチドの活性断片には、短鎖型２’−ＰＤＥが包含される。組換型の短鎖型２’−ＰＤＥは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において、１番目のアデノシンから１０２番目のグアノシンまでのヌクレオチドのうち、１番目のアデノシン及びその３’側に隣接する２つのヌクレオチド（５’末端３量体）又は５’末端３量体を含み３ｎ（ｎは１以上３３以下の整数）個の連続するヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをプラスミドＤＮＡに挿入し、次いで得られた組換プラスミドＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養物した後、該培養物から短鎖型２’−ＰＤＥを回収することにより、調製することができる。
【００２３】
それらの短鎖型２’−ＰＤＥのアミノ末端には、必要に応じ（例えば、宿主細胞における発現を目的として）、メチオニンを付加せしめることができる。組換プラスミドＤＮＡの挿入配列の５’末端にメチオニンコドンを付加せしめれば、アミノ末端にメチオニンを有する所望の短鎖型ポリペプチドを調製することが可能となる。また、短鎖型２’−ＰＤＥのアミノ末端には、必要に応じ、シグナルペプチドを付加せしめることができる。それにより、所望の短鎖型ポリペプチドを分泌タンパク質として調製することが可能となる上、遺伝子組換により付加された前述のアミノ末端メチオニンを含まない成熟体タンパク質を調製することができる。分泌タンパク質とする場合、酵素の失活に注意することがの好ましい。
【００２４】
さらに、組換型の短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）は、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち、１０３番目のアデノシン乃至１８３０番目のグアノシンからなるポリヌクレオチドをプラスミドＤＮＡに挿入し、次いで得られた組換プラスミドＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養物した後、該培養物から短鎖型２’−ＰＤＥを回収することにより、調製することができる。また、組換型の短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列全長からなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの５’末端より０個以上乃至１０２個以下のヌクレオチドを削除せしめたものをプラスミドＤＮＡに挿入し、次いで得られた組換プラスミドＤＮＡで宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞株２９３細胞）を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養物した後、該培養物から所望の短鎖型２’−ＰＤＥを回収することにより、調製することができる。組換型の短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）の調製に使用されるポリヌクレオチドでは、１０３乃至１０５番目のメチオニンコドン（ＡＴＧ）より５’末端側であり且つ該メチオニンコドンと同じ読み枠には、他のメチオニンコドンが含まれないことが好ましい。なお、短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）は、前記のメチオニン又はシグナルペプチドの付加なしに宿主細胞において発現させることが可能である。
【００２５】
本発明のポリペプチドの多量体は、当業者に周知の方法に従って取得することができる（ＷＯ９８／４９３０５号：ＷＯ２００１／１８２０３号）。
【００２６】
また、本発明のポリペプチドの活性誘導体も、当業者に周知の方法に従って取得することができる（ＵＳ４１７９３３７号：ＥＰ０４０１３８４号：Ｍａｌｉｋら、Exp.Hematol., 20, p1028-1035(1992)：ＷＯ２０００／２４４１６号）。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、組織、臓器又は細胞、あるいは該動物に由来する細胞株等から、常法に従い、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、次いでゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド等をプローブとしてクローニングすることができる。また、発現クローニングは、本発明の抗体又はその活性断片をプローブとして用いるか、あるいは２’−ＰＤＥ活性を指標とすることにより行うことができる。そのようにして得られたクローンが発現するｍＲＮＡ、対応のｃＤＮＡ、又は該クローンのゲノムＤＮＡは、それぞれ本発明のポリヌクレオチドを含有する。
【００２８】
本発明のｃＤＮＡは、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として、常法に従って合成されたｃＤＮＡライブラリーよりクローニングすることができる。全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの起源としては、ヒトが好適である。
【００２９】
全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの抽出法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法等なども例示することができ、好適な方法として酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等を挙げることができる。
【００３０】
哺乳動物等の真核生物に由来する細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られており、この特徴を利用してビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブに全ＲＮＡ中に含まれるｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し、次いで洗浄した後、ｍＲＮＡを溶出することによりｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させ、次いで該吸着画分を溶出することによってもｍＲＮＡを得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをより高度に精製することも可能である。
【００３１】
このようにして得られたｍＲＮＡが本発明のポリペプチドをコードするものであることは、該ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの活性を検出するか、あるいは該ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて免疫学的に検出することにより確認できる。例えば、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入すれば、該ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドを翻訳産物として得ることができる（Gardon, j. B. et al. (1972) Nature 233, 177-182)。また、ウサギ網状赤血球系、コムギ胚芽系等の無細胞翻訳系によっても同様に翻訳産物を得ることができる（Schleif, R. F. and Wensink, P. C. (1981): " Practical Methods in Molecular Biology " , Springer-Verlag, NY.)。
【００３２】
そのようなｍＲＮＡを鋳型として、レトロウイルス由来の逆転写酵素（reverse transcriptase：以下、ＲＴ）を用いて第一鎖の相補的ＤＮＡ（complementary DNA：以下、ｃＤＮＡ）を合成した後、該第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いて第二鎖ｃＤＮＡを合成することができる。そのようなｃＤＮＡは、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Efstratiadis, A. et al. (1976) Cell 7, 279-288)、ランド法（Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251-2266)、オー・ユーン・ユー法（Yoo, O. J. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049-1053）、オカヤマ−バーグ法（Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161-170)等により製造することができるが、好適な方法はオカヤマ−バーグ法である。
【００３３】
得られたｃＤＮＡをプラスミドＤＮＡベクターあるいはラムダファージベクターへ挿入し、次いでそれらのベクターを宿主細胞へ導入することにより、所望のｃＤＮＡを保有する細胞を得ることができる。ラムダファージベクターを用いる場合、該ｃＤＮＡをラムダファージベクターへ挿入し自己複製させることにより該ｃＤＮＡを保有する組換えファージを安定に維持し、増殖させることができる。例えば、ラムダファージλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）を用いる場合、宿主大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株やＪＭ１０９株にプラークを作らせ、それらのプラークの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside（Ｘ−ｇａｌ））代謝による発色の有無から組換え体を選別することができる。組換えファージから、２’−ＰＤＥ活性を有する所望のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを有するクローンを選別する方法としては、以下の［Ｉ］乃至［ＩＶ］に記載の方法を例示することができる。また、ｃＤＮＡ以外の所望のポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ等）も、下記［Ｉ］乃至［ＩＶ］記載のいずれか一つに方法により選抜することができる。
［Ｉ］合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法
所望のＤＮＡによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列の全部又は一部が知られている（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、該ポリペプチドのいずれの部分でもよい。）、該アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、これを３２Ｐ、３５Ｓ等の放射性同位元素あるいはビオチン等で標識したものをプローブとして、組換えファージＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性クローンを選択する。該オリゴヌクレオチドを合成するに際しては、コドンに縮重のあるアミノ酸に対しては、使用頻度の高いコドンを用いても、または考えられるコドンを組み合わせて複数個のヌクレオチド配列を合成してもよく、また後者の場合、イノシンを含有させることにより多重度を軽減することもできる。
［ＩＩ］ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用いる方法
所望のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの有するアミノ酸配列の全部又は一部が知られている場合、センス鎖の５’−末端側の一部のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、及びアンチセンス鎖の３’−末端側の一部のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、次いでそれらをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という。Saiki, R. K. et al. (1988) Science 239, 487-491参照）を行い、所望のｃＤＮＡの断片を増幅する。その際、鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する哺乳動物由来の細胞より抽出された全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応にて合成されたｃＤＮＡ、又は該哺乳動物のゲノムＤＮＡ等を用いることができる。調製されたＤＮＡ断片を、３２Ｐ、３５Ｓ等の放射性同位元素あるいはビオチン等で標識し、これをプローブとして用いてプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等により目的のクローンを選択する。
［ＩＩＩ］他の動物細胞株において２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドを産生させる方法：
前述のようにして得られたｃＤＮＡを発現ベクターに挿入したプラスミド（自己複製可能で、転写プロモーター領域を含むプラスミド、もしくは動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれも使用できる）で動物細胞宿主を形質転換し、それらｃＤＮＡがコードするポリペプチドを産生させ、その培養上清または細胞抽出物中の２’−ＰＤＥ活性を測定するか、本発明の抗体又はその活性断片、それに対する二次抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することにより、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含有する株を選択する。なお、哺乳動物由来の細胞宿主としては、ＣＯＳやＣＨＯ等、汎用される細胞株が使用され得るが、外来遺伝子産物としての本発明のポリペプチドの検出を容易にするためには、該宿主細胞自体は一定の培養条件下において本発明のポリペプチドの発現が検出されないことが好ましい。
［ＩＶ］セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーションの系を用いる方法：
形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルターなどにブロットし、本発明のポリペプチドの産生能を有する組織または細胞から抽出したｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収したｍＲＮＡを、タンパク質翻訳系（例えば、アフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや、コムギ胚芽などの無細胞系）でポリペプチドへ翻訳させ、該ポリペプチドが有する２’−ＰＤＥ活性を測定するか、又は本発明の抗体又はその活性断片を用いて所望のクローンを選択することができる。
【００３４】
以上このようにして選択されたクローンの培養物より、当業者に周知の方法に従って所望のポリヌクレオチドを精製し、単離することができる。例えば、該培養物よりプラスミドＤＮＡベクター又はラムダファージベクターを単離し、次いで制限酵素等のエンドヌクレア−ぜを用いて該ベクターより所望のポリヌクレオチドを切り出すことができる（Maniatis, T. et al. (1982) : " Molecular Cloning A Laboratory Mannual " Cold Spring Harbor Laboratory, NY）。
【００３５】
ゲノムＤＮＡライブラリーは、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の臓器、組織、細胞、体液、該動物由来の細胞株を物理的に破砕し、次いで核内ＤＮＡを抽出、精製し、次いでそれらを適宜断片化したのち、ベクターへ挿入し、次いで得られた組換ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得られる。
【００３６】
試料の物理的な破砕は、ポリトロン・ホモジナイザー等を用いたホモジナイズ等により行うことができる。破砕された試料に含まれる核内ＤＮＡの抽出は、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ：以下、「ＳＤＳ」という。）等の界面活性剤を用いて行なうことができる。抽出されたゲノムＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出を行なうことにより除タンパクされ、エタノール沈澱を行なうことにより沈澱として回収することができる。
【００３７】
得られたゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で限定分解させ、断片化する。限定分解に使用される制限酵素としては、通常入手可能な制限酵素であれば特に限定されないが、例えば、Ｓａｕ３ＡＩ等を挙げることができる。断片化されたＤＮＡをゲル電気泳動に供し、適当なサイズのゲノムＤＮＡを含むゲルからＤＮＡを回収する。ＤＮＡ断片のサイズには特に限定はないが、好適には２０ｋｂ以上である。
【００３８】
ゲノムＤＮＡライブラリー作製用のベクターとしては、該ベクターで形質転換された宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等が挙げられ、好適にはコスミドベクターである。また、これらのベクターは発現ベクターであってもよい。さらに、該ベクターは、該ベクターで形質転換された宿主細胞に表現形質（表現型；Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の選択性を付与する塩基配列を有していることが好ましい。該ベクターは、クローニング及び機能発現の双方に適用できるものであることが好ましく、複数種の宿主細胞を形質転換することが可能なベクター、すなわちシャトルベクターを用いることが好ましい。該シャトルベクターは、少なくとも１つの宿主細胞種において複製されるのに必要な塩基配列を有する。本発明において、便宜上、これらのベクターは「プラスミドＤＮＡ」の意味に包含されるものとする。
【００３９】
また、宿主細胞が大腸菌の場合、組換プラスミドＤＮＡの導入はｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングにより行われることがある。本発明において、「形質転換」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングによる外来ＤＮＡの導入も意味し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングにより外来ＤＮＡを導入された宿主細胞も形質転換宿主細胞の意味に包含される。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列は、例えば、マキサム―ギルバートの化学修飾法（Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980) : "Methods in Enzymology" 65, 499-559）、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Messing, J. and Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276）等などにより決定することができる。また、放射性同位元素の代わりに蛍光色素を用いた市販の自動ＤＮＡ配列解析装置（例えば、パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシステムズ社製モデル３７３Ａ）を好適に使用することができる。
【００４１】
なお、本発明のより好適なポリヌクレオチドが挿入された組換プラスミドＤＮＡを保持する形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２は、平成１４年８月６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２が付与された。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドが挿入された組換プラスミドＤＮＡも本発明に含まれる。本発明の組換プラスミドＤＮＡは、宿主細胞の形質転換を可能にする要素、すなわち、該宿主細胞と適合し得る生物種由来のレプリコン（複製起点）および転写プロモータ（以下、プロモータ）を含有するものであれば特に限定されるものではなく、好適には、形質転換された宿主細胞を選択するのに有用な表現形質（表現型）付与し得る要素を含有する。より好適な組換プラスミドＤＮＡは、組換発現プラスミドＤＮＡである。すなわち、本発明のポリヌクレオチドが挿入された組換発現プラスミドＤＮＡで、大腸菌等の原核宿主細胞またはＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸脱水素酵素欠損株、ＣＯＳ細胞等の真核生物由来の宿主細胞を形質転換することにより、該形質転換宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。発現に使用されるプラスミドＤＮＡには、適当なプロモーター、発現に必須な要素等が含まれていることが好ましい。また、形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）に保持されている組換プラスミドＤＮＡも本発明の宿主細胞に包含される。
【００４３】
本発明の組換プラスミドＤＮＡで形質転換された宿主細胞も本発明に包含される。そのような宿主細胞のうち、原核生物の宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）株、枯草菌（Bacillus subtilis）株などを挙げることができ、好適には、組換プラスミドＤＮＡの有するレプリコンが由来する生物種と適合し得る生物種由来の宿主細胞である。大腸菌株としてはＫ１２株等を、枯草菌株としては２０７−２５株等をそれぞれ挙げることができる。また、形質転換大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２）も本発明に包含される。
【００４４】
大腸菌を宿主細胞とする場合のプラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系のプラスミドＤＮＡをそれぞれ例示することができるが、それらに限定されるものではなく、当業者が入手可能な各種菌株及びプラスミドＤＮＡがそれぞれ使用され得る。また、大腸菌を宿主細胞とする場合のプラスミドＤＮＡに含有されるプロモータとしては、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等を例示することができる。枯草菌を宿主細胞とする場合のプラスミドＤＮＡに含有されるプロモータとしては、ｐＴＵＢ２２８（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）等を挙げることができる。
【００４５】
また、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に、直接又はスペーサーを介して間接的に接続することにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞の外に分泌させることが可能になる。例えば、枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡが本発明のポリヌクレオチドに連結している組換発現プラスミドＤＮＡで枯草菌を形質転換すれば、該形質転換枯草菌体外に所望のポリペプチドが分泌される。
【００４６】
真核生物の宿主細胞には、哺乳動物等の脊椎動物、昆虫等の節足動物又は植物に由来する細胞、あるいは酵母等が含まれ、哺乳動物由来の細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等を例示することができる。本発明のＣＯＳ細胞には、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞等が含まれる。
【００４７】
脊椎動物細胞を宿主細胞とする場合の組換発現プラスミドＤＮＡには、通常、本発明のポリヌクレオチドの５’−上流に位置するプロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列等が含有されており、必要に応じ複製起点を有していてもよい。そのようなプラスミドＤＮＡとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等を挙げることができるが、それに限定されるものではない。
【００４８】
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合、組換発現プラスミドＤＮＡとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、プロモーター、転写終結シグナル、ＲＮＡスプライス部位等を具えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）等によりＣＯＳ細胞へトランスフェクションすることができる。なお、本発明においては、トランスフェクションも形質転換の意味に包含される。
【００４９】
宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合、組換発現プラスミドＤＮＡと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Sambrook, J. et al. (1989) : "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341）などを共トランスフェクションし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に発現しているクローンを得ることができる。
【００５０】
昆虫由来の宿主細胞としては、鱗翅類ヤガ科の種（Spodoptera frugiperda）の卵巣細胞由来の株化細胞（Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１等）、同じく、鱗翅類ヤガ科の種（Trichoplusia ni）の卵細胞由来のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396）等を例示することができ、発現プラスミドＤＮＡとしては、オートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３の如きバキュロウイルストランスファーベクター、バキュロウイルスのＰ１０やバキュロウイルスの塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクター等を例示することができる（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137-159)。また、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７アミラーゼ等のシグナルペプチドをコードするＤＮＡが本発明のポリヌクレオチドに連結している発現プラスミドＤＮＡで昆虫細胞を形質転換すれば、該昆虫細胞外に所望のポリペプチドが分泌される（Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174)。
【００５１】
酵母としては、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）の如きサッカロミセス（Saccharomyces）属の種、石油酵母（Pichia pastoris）等を例示することができる。酵母の発現プラスミドＤＮＡは、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025）あるいは酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5）等のプロモータが含まれている。また、所望のポリペプチドを細胞外へ分泌させる場合、シグナルペプチドおよび宿主細胞の保有する内在性プロテアーゼあるいは当業者に周知のプロテアーゼ認識部位が本発明のポリペプチドのアミノ末端側に付加させることが好ましい。石油酵母を宿主細胞とする場合、例えば、所望のポリペプチドのアミノ末端側に酵母αファクターのシグナルペプチドおよび石油酵母由来ＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位を付加させることにより、該ポリペプチドを石油酵母外へ分泌させることができる（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125-131)。
【００５２】
本発明の形質転換宿主細胞は常法に従って培養することができ、該培養物より本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを回収することができる。形質転換宿主細胞の培養に用いられる培地は、宿主細胞の種類等に応じて慣用されるものを適宜選択することができる。ＣＯＳ細胞の培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭ）等を例示することができる。それらの培地には、必要に応じ、ウシ胎児等に由来する血清あるいは血清成分等が含まれていてもよい。
【００５３】
前記培養物中の存在する本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドは、それらの物理化学的あるいは生化学的な性質を利用した、当業者に周知の分画手段により精製、単離することができる。そのような分画手段としては、遠心分離、塩溶、塩析、透析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、電気泳動等をあげることができ、それらの手段を実施するに際しては高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography：以下、ＨＰＬＣ）等を利用することができる。予め所望のポリペプチド又はポリヌクレオチドにタグ（ｔａｇ）を付加させておけば、該タグを利用することにより容易に該ポリペプチド又はポリヌクレオチドを精製し、単離することができる。例えば、予め本発明のポリヌクレオチドのセンス鎖の５’−末端にヒスチジンのオリゴマーをコードするポリヌクレオチドを付加させておけば、Ｎ末端にヒスチジンのオリゴマーが付加したポリペプチドを発現させることができ、ニッケル等の金属キレート・アフィニティ・クロマトグラフィーにより、タグが付加した所望のポリペプチドを効率よく精製することができる。
【００５４】
以上のような本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの製造方法、並びに、該方法により製造されるポリペプチド又はポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【００５５】
また、本発明のポリヌクレオチドは、ホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al. (1984) Nature 310, 105-111）の如き方法により化学的に合成することが可能である。同様に、本発明のポリペプチドは、固相合成法等により、化学的に合成することができる。
【００５６】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に基づいて推定され得る。また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドの全部又は一部のアミノ酸配列（以下、検索配列式）に基づいて、ＥＳＴを含む公知のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列をコンピュータ上（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ：イン・シリコ）で解析することにより、連続しているかあるいは１つ以上のイントロンにより分断されたオープン・リーディング・フレームによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列として決定され得る。同時に、本発明のポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、すなわち本発明のポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列も決定され得る。検索配列式は、具体的なアミノ酸配列か、又はそのようなアミノ酸配列を有するペプチドを試料として取得されたスペクトルデータである。そのようなスペクトルは、アミノ酸配列を予測するのに有用であれば特に限定されないが、好適には。質量分析スペクトルである。質量スペクトルデータを、Ｍａｓｃｏｔ（マトリックス・サイエンス社製：Electrophoresis, 20(18), p3551-3567(1999)）、ＭＳ−Ｔａｇ（カリフォルニア大学サンフランシスコ校製）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅａｒｃｈ（European Molecular Biology Laboratory製）、ＳＥＱＵＥＳＴ（ThermoFinnigan社製）等のソフトウェアに供することにより、データベース等における検索を行うことができる（磯辺俊明および高橋信弘編、ポストゲノム時代の実験講座２  プロテオーム解析法、実験医学別冊、羊土社より２０００年に刊行）。
【００５７】
質量分析に供されるポリペプチドは、精製又は部分精製されていることが好ましい。部分精製されている場合には、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した後、２’−ＰＤＥ活性に対応するバンドを特定し、次いで該バンドを含むゲル断片を切り出すことにより、所望のポリペプチドを単離することができる。
【００５８】
ポリペプチドを質量分析に供するに際しては、予め該ポリペプチドをプロテアーゼにより消化しておき、次いで得られるペプチド断片をカラムクロマトグラフィーにて分画し、該カラムから溶出されるペプチド断片を順じ質量分析に供することが可能である。そのような質量分析には、Ｑ−ＴＯＦ２（マイクロマス社製）の如きタンデム質量分析装置が好適に使用され得る。
【００５９】
イン・シリコで決定されたヌクレオチド配列に基づいて、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、それを発現させることにより本発明のポリペプチドを取得することができる。
【００６０】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにおける、本発明のポリペプチド中のアミノ酸に対応するコドンは、当該アミノ酸をコードする範囲において何ら限定されるものではないが、例えば、宿主細胞のコドン使用頻度を考慮に入れて選択され得る。（Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 143-174）。そのようなコドンの改変は、当業者に周知の方法、例えば、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチド・プライマーを利用した、部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis／Mark, D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666）などに従って行うことができる。
【００６１】
配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列と７０％以上、好適には８０％以上、より好適には９０％以上同一なヌクレオチド配列を含むことからなり且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、予めランダムプライマー法（Anal. Biochem., 132: 6-13 (1983)）あるいはニックトランスレーション法（Maniatis, T. et al. (1982) in " Molecular Cloning A Laboratory Mannual " Cold Spring Harbor Laboratory, NY.）により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ等で標識された配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるヌクレオチド又はその断片をプローブとして、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来するｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーより発現クローニングすることにより、組換ポリヌクレオチドとして得ることができる。（Maniatis, T. et al.、前述）
配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列において１つ又は２つ以上２０以下のヌクレオチドが付加、欠失、置換もしくは挿入されたヌクレオチド配列を含むことからなり且つ２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドをエキソヌクレアーゼＢａｌ３１等を用いてその末端から削る方法（前述）、カセット変異法（前述）、部位特異的変異誘発法、変異プライマーを用いたＰＣＲ法等に従って得ることができる。なお、一般に、遺伝子は多型（polymorphism）を示す（Nishi, T. et al. (1985) J. Biochem. 97, 153-159等参照）。本発明はそのような天然に存在する多型にかかるポリヌクレオチドのうち、２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも包含する。
【００６２】
本発明の提供するモノクローナル抗体は、通常、下記の工程［ａ］乃至［ｇ］を経て取得され得るが、それに限定されるものではない：
［ａ］免疫源である本発明のポリペプチドを精製、部分精製又は単離する工程；
［ｂ］前記免疫源で動物を免疫し、適当な時期に該動物より脾臓を摘出し、次いで抗体産生細胞を調製する工程；
［ｃ］骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）を調製する工程；、
［ｄ］抗体産生細胞及びミエローマを細胞融合する工程；
［ｅ］所望の抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程；
［ｆ］該ハイブリドーマ群からの単一細胞を得る工程（クローニング）；
［ｇ］単一細胞により生産されるモノクローナル抗体が本発明のポリペプチドと特異的に結合することを確認する工程。
免疫源は、フロインドの完全アジュバント、同不完全アジュバント、カリミョウバン等の助剤と混合された後、動物の免疫に供される。免疫される動物としては、特に限定されないが、マウス及びウサギが好適である。
【００６３】
免疫源の投与方法としては、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射等を例示することができ、好適には皮下注射及び腹腔内注射である。
【００６４】
免疫源の投与は、１回、又は適当な間隔で（好ましくは１週間から５週間間隔）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清における免疫源に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった時期に該動物より脾臓を摘出することが好ましい。マウスに免疫する場合、最後に免疫源を投与してから３乃至５日が経過した後、脾臓を摘出し、次いで抗体産生細胞を得ることが好ましい。
【００６５】
抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下、ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（以下、ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応等を挙げることができ、好適にはＲＩＡ法及びＥＬＩＳＡ法である。
【００６６】
ＥＬＩＳＡ法の場合、免疫源が固定化された不溶性担体をウシ血清アルブミン等でブロッキングし、次いで段階希釈した試料を一次抗体として接触させ、次いで酵素標識された二次抗体を接触させ、次いで該酵素の基質を添加し、基質の分解による蛍光発色、吸光度の変化等を測定することにより、抗体価が算出される。
【００６７】
ミエローマとしては、マウス由来の株化細胞が一般的であり、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）（Yelton, D.E. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7(1978)）、Ｐ３／ＮＳ１ ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（Kohler, G. et al. European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)）、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270 (1978)）、Ｐ３Ｘ６Ａｇ８．６５３（Kearney, J. F. et al. J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Horibata, K. and Harris, A. W. Nature, 256, 495-497 (1975)）等を例示することができる。該細胞は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、およびウシ胎児血清を加えた培地に、８−アザグアニンを加えた培地）、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium ；以下、ＩＭＤＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium；以下、ＤＭＥＭ）で継代培養するが、あるいは細胞融合の３乃至４日前に、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）のような正常培地で継代培養する。
【００６８】
抗体産生細胞は、形質細胞又はその前駆細胞であるリンパ球であり、それらは免疫された動物個体のいずれの部位からも採取することができるが、一般には脾臓、リンパ節、末梢血、又はこれらを適宜組み合わせたものから採取され、好適には脾臓より採取される。
【００６９】
脾臓細胞の如き抗体産生細胞とミエローマを細胞融合させる方法には、ポリエチレングリコールを用いるのが一般的である、例えば、脾臓細胞及びミエローマとを無血清培地又はリン酸緩衝生理食塩液（以下、ＰＢＳ）で洗浄し、次いで脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１乃至１０：１となるように混合した後、遠心分離する；上清を除去し、沈澱をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００乃至４０００）を含む無血清培地を滴下する；１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下、ＨＡＴ）液およびマウスインターロイキン−２（以下、ＩＬ−２）を含む正常培地（以下、ＨＡＴ培地）中に懸濁して培養用プレートの各ウェルに分注し、５％  炭酸ガス存在下、３７℃にて２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【００７０】
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株の場合、細胞融合しなかったミエローマ細胞及びミエローマ細胞どうしが融合した細胞は、ＨＡＴ培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、及び体産生細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）該培地中で生存可能であり、更に抗体産生細胞どうしの融合細胞は次第に増殖能を失う。従って、融合細胞をＨＡＴ培地中で培養し続ければ、所望のハイブリドーマが選抜される。
【００７１】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地をアミノプテリンを除いた培地で置換し、次いで培養上清の一部を採取してその抗体価を測定する。次いで本発明の抗体を生産することが確認されたハイブリドーマを、別のプレートに移し、限界希釈法、軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する方法（ソータクローン）等により単一細胞を得る（クローニング）。クローニング操作を２乃至４回繰返し、抗体価が安定しているものを、所望のハイブリドーマとして選択する。
【００７２】
以上のようにして得られる本発明のハイブリドーマは、正常培地により培養され得る。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。そのような培養上清又は腹水から、当業者に周知の分画手段を用いて、本発明の抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の精製には、ＭＡｂＴｒａｐキット（アマシャム・バイオサイエンス社製）の如き市販のキットを好適に利用することができる。
【００７３】
かくして得られるモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する。
【００７４】
モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定には、オクテルロニー（Ouchterlony）法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等が適用され、市販のキット（例．マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することができる。
【００７５】
本発明のモノクローナル抗体は、その結合特異性を利用した、本発明のポリペプチドの免疫学的な検出、本発明のポリペプチドのアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製等の目的に供することができる。
【００７６】
本発明において、「キメラ抗体」とは、その可変領域がヒト以外の動物の免疫グロブリン由来であり且つその定常領域がヒト免疫グロブリン由来であることを特徴とする、組換型モノクローナル抗体を意味する。好適なキメラ抗体は、その可変領域がマウス免疫グロブリン由来であり且つその定常領域がヒト免疫グロブリン由来であることを特徴とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体である。定常領域が由来するヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のアイソタイプを例示することができ、好適にはＩｇＧ及びＩｇＭである。そのようなキメラ抗体を製造する方法としては、ヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより該抗体をコードするＤＮＡを単離し、次いで該ＤＮＡより活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）及びＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）を単離し、ＶＨ遺伝子の下流にヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡ由来のＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、ＶＬ遺伝子の下流にＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）をそれぞれ機能発現が可能なように適宜連結し、次いで同一又は別個の発現ベクターへ挿入し、得られた組換発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換宿主細胞の培養物より単離精製する方法（特公平３−７３２８０号公報等参照）を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。
【００７７】
本発明において、「ヒト型抗体（humanized antibody via CDR-grafting）」とは、可変領域内の相補性決定領域（Complementarity-determining region：以下、ＣＤＲ）の一部又は全部がヒト以外の動物のモノクローナル抗体由来であり、且つその可変領域内のＣＤＲ以外の領域すなわち枠組領域（Framework region：以下、ＦＲ）の大部分又は全部がヒトイムノグロブリン由来であり、且つその定常領域がヒトイムノグロブリン由来であることを特徴とする、組換型モノクローナル抗体を意味する。好適なヒト型抗体は、ＣＤＲの一部又は全部がマウスモノクローナル抗体由来であり、且つＦＲがヒトイムノグロブリン由来であり、且つその定常領域がヒトイムノグロブリン由来であることを特徴とする、ヒト型モノクローナル抗体である。
【００７８】
本発明において、ＣＤＲとは、抗体の可変領域中に存在する、抗原と相補的に直接結合する部位である領域を意味する。
【００７９】
定常領域が由来するヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のアイソタイプを例示することができ、好適にはＩｇＧ及びＩｇＭである。そのようなヒト型モノクローナル抗体の製造方法としては、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子及びそれに対応する少なくとも１つマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を、ヒト免疫グロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子及び前マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子をそれぞれ単離し、次いでマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子とヒトＨ鎖遺伝子を、マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子とヒトＬ鎖遺伝子をそれぞれ機能発現が可能なように適宜連結し、次いで同一又は別個の組換えベクターへ挿入し、得られた組換発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換宿主細胞の培養物より単離精製する方法（特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等参照）等を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。
【００８０】
本発明において、「ヒト抗体」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域及びＨ鎖の定常領域並びにＬ鎖の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する免疫グロブリンを意味する。そのようなヒト抗体の製造方法としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子をヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物をヒト抗原で免疫感作することにより、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として取得する方法（ＷＯ９４／２５５８５号公報、特表平６−５００２３３号公報等参照）等を例示することができるが、その方法に限定されるものではない。
【００８１】
本発明において、「抗体の断片」とは、本発明における抗体の一部を意味し、好適には本発明のモノクローナル抗体の一部を意味する。抗体の断片には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓｃＦｖ等が含まれる。「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、免疫グロブリン又はモノクローナル抗体を、ペプシンやパパイン等のタンパク質分解酵素又はペプチド分解酵素で処理することにより、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後が切断されて生じる抗体断片を意味する。
【００８２】
本発明において、「抗体産生細胞」とは、本発明の抗体、好適には本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片を産生する細胞を意味する。好適には、２’−ＰＤＥ活性を有するヒト由来のポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞、該Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合して得られるハイブリドーマ、該モノクローナル抗体産生Ｂ細胞又は該ハイブリドーマから単離される該モノクローナル抗体のＨ鎖をコードする遺伝子及び／又はＬ鎖をコードする遺伝子を保持する宿主細胞、キメラ抗体を産生し得る宿主細胞、ヒト型抗体を産生し得る宿主細胞、ヒト抗体を産生し得る宿主細胞、一本鎖抗体を生産し得る宿主細胞等であり、それぞれ前述の方法により作製することができる。
【００８３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを導入された宿主動物を提供する。そのような宿主動物は、ヒト又はヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されるものではない。宿主動物へポリヌクレオチドを導入する方法としては、イン・ビボ法又はエクス・ビボ法（実験医学増刊、１２巻、１５号、１９９４年刊行）、トランスジェニック動物作製法（Brigid Hoganら著、山内一也ら訳、マウス胚の操作マニュアル、１９９７年に近代出版より刊行：八木健編、ジーンターゲティングの最新技術−効率よく確実なマウスの遺伝子組換えとクローン作製法、２０００年に羊土社より刊行：勝木元也編、野村達次監修、発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方、１９８７年に講談社より刊行）等を例示することができる。
【００８４】
前述の通り、本発明の提供するポリペプチドは、２’−ＰＤＥ活性を有する。本発明において、２’−ＰＤＥ活性とは、２’，５’−ホスホジエステル結合を部分構造として含有するオリゴリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドにおける該２’，５’−ホスホジエステル結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。本発明において、２’−ＰＤＥ活性は、「本発明のポリペプチドの活性」、「本発明のポリペプチドの酵素活性」、「２’−ＰＤＥの活性」、「２’−ＰＤＥの酵素活性」、あるいは単に「活性」とのみ記載される場合がある。
【００８５】
本発明においては、「２’，５’−ホスホジエステル結合を部分構造として含有するオリゴリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチド」を「ヌクレオチド基質」と呼ぶ。好適なヌクレオチド基質は、アデニリル（２’−５’）アデノシンを部分構造として含むオリゴリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドである。より好適なヌクレオチド基質は２’，５’−オリゴアデニル酸であり、アデニリル（２’−５’）アデノシン、アデニリル（２’−５’）アデニリル（２’−５’）アデノシン等を例示することができる。本発明のより一層好適なヌクレオチド基質は、５’末端に１、２、３又は４個以上１０個以下のリン酸エステルが直鎖状に結合した２’，５’−オリゴアデニル酸である。そのような、５’末端にリン酸エステルが結合したものも、２’，５’−オリゴアデニル酸の意味に包含される。また、該ヌクレオチド基質には、２’−ＰＤＥ活性の測定に必須かあるいは有用な標識物質、化合物、ペプチド又はヌクレオチドが付加していていもよい。本発明においてはそのような付加体をヌクレオチド基質の意味に包含する。
【００８６】
なお、アデニリル（３’−５’）アデノシン、アデニリル（３’−５’）アデニリル（３’−５’）アデノシン等、２つのアデノシンが一方の３’位と他方の５’位との間でホスホジエステル結合しているオリゴアデニル酸は、本発明において３’，５’−オリゴアデニル酸と呼ばれる。
【００８７】
本発明のポリペプチドが２’，５’−オルゴアデニル酸を加水分解する活性は、該ポリペプチドが３’，５’−オルゴアデニル酸を加水分解する活性と同等又はそれ以上である。具体的には、２’，５’−オルゴアデニル酸を加水分解する活性は、３’，５’−オルゴアデニル酸を加水分解する活性の０．１倍以上であり、好適には０．５倍以上であり、より好適には１倍以上である。
【００８８】
２’−ＰＤＥ活性の検出又は測定に供される本発明のポリペプチドは、特に限定されるものではなく、該ポリペプチドの粗画分、部分精製画分、精製標品、該ポリペプチドを発現している細胞、本発明の宿主細胞等でもよい。粗画分には、本発明のポリペプチドを内在性に発現している動物、該動物に由来する細胞と組織、本発明のポリヌクレオチドが導入されたヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来する組織や細胞の抽出物、破砕物、ホモジネート、本発明のポリヌクレオチドが直接導入された細胞の抽出物、破砕物、ホモジネート等が含まれる。部分精製画分は、粗画分を各種クロマトグラフィー等に供して部分精製することにより得られる。精製標品は、部分精製画分を更に各種クロマトグラフィー等に供することにより均一な画分として得ることができる。そのような各種クロマトグラフィー等については、本発明の他の箇所において詳細に記載されている。ポリペプチドを発現している細胞には、本発明のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞、本発明のポリヌクレオチドが導入されたヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来する細胞等が含まれる。
【００８９】
本発明のポリペプチドとヌクレオチド基質を接触させる際の条件は、水溶液中であれば特に限定されないが、ｐＨ条件は通常ｐＨ４乃至１０、好適にはｐＨ５乃至９、より好適にはｐＨ６乃至８であり、温度条件は通常０乃至５０℃、好適には４乃至４０℃、より好適には２０乃至３７℃である。接触時間は通常３０秒間乃至６時間、好適には１乃至６０分間である。
【００９０】
また、本発明のポリペプチドとヌクレオチド基質を接触させる際には、２価の金属イオンを共存させることが好適であり、そのような金属イオンとしては、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
２’−ＰＤＥ活性は、本発明のポリペプチドと前記ヌクレオチド基質を接触させた後の、該ヌクレオチド基質の加水分解の程度として検出又は測定され得る。
【００９２】
ヌクレオチド基質の加水分解の程度は、該ヌクレオチド基質の減少又はその加水分解産物の増加として検出又は測定することができる。発光物質、蛍光物質、発色物質、それらの標識物質が結合し得る物質等を付加せしめたヌクレオチド基質等を使用すれば、分光光学的な手法により直接あるいは二次反応後に該ヌクレオチド基質の減少又は加水分解産物の増加を好適に検出することができる。また、本発明のポリペプチドのヌクレオチド基質又は加水分解産物が有する紫外吸収、それらの誘導体が特定の励起光により発する蛍光、それらの誘導体化反応とカップリングした化学反応により生成する物質に起因する蛍光等を用いることにより、分光光学的な手法により該ヌクレオチド基質の減少又はその加水分解産物の増加を検出又は測定することができる。
【００９３】
より好適な基質であるアデニリル（２’−５’）アデノシンを用いる場合、２’−ＰＤＥによる加水分解産物としてアデノシン及びアデノシン−５’−モノリン酸（adenosine-5'-monophosphate：以下、ＡＭＰ）が生成する。ＡＭＰは当業者に周知の方法により定量することができる。例えば、ＡＭＰデアミネース（AMP  deaminase）を作用させることにより、ＡＭＰをイノシン−５’−一リン酸（inosine-5'-monophosphate：以下、ＩＭＰ）とアンモニアへ分解し、次いで発生したアンモニアを定量することにより、ＡＭＰの増加を検出することができる。アンモニアの定量には、例えば、アンモニア・テスト・キット（和光純薬（株）製）等の市販のキットが好適に使用され得る。
【００９４】
５’−末端にリン酸基を保有しない２’，５’−オリゴアデニル酸を基質として用いる場合、本発明のポリペプチドによる加水分解産物はアデノシン（adenosine）を含む。アデノシンは当業者に周知の方法により定量することができる。例えば、アデノシンにアデノシン・デアミネース（adenosine  deaminase）を作用させた後、イノシン（inosine）とアンモニアへ分解し、次いで発生したアンモニアを定量することにより、アデノシンの増加を検出することができる。また、イノシンにヌクレオチド・ホスホリレース（nucleotide phosphorylase）を作用させることによりヒポキサンチン（hypoxanthine）を得、次いでキサンチン・オキシダーゼ（xanthine oxidase）を作用させてることにより過酸化水素を得れば、生成した過酸化水素にパーオキシデース（peroxidase）及び蛍光基質などを作用させることにより蛍光によりアデノシンの増加を検出することができる。
【００９５】
５’−末端に３つのリン酸基を保有する２’，５’−オリゴアデニル酸を基質として用いる場合、本発明のポリペプチドによる加水分解産物はアデノシンー５’−三リン酸（adenosine-5'-triphosphate：以下、ＡＴＰ）を含む。生成したＡＴＰは当業者に周知の方法により定量することができる。ＡＴＰの定量には、例えばＡＴＰ発光キット（東洋インキ製造（株）製）等の市販のキットを好適に使用され得る。
【００９６】
本発明のポリペプチドにより加水分解された結果、発色、発光、あるいは特定の励起光により蛍光を発するように設計されたヌクレオチド基質を使用すれば、該加水分解産物の増加を検出することができる。そのようなヌクレオチド基質として、例えば、加水分解を受けることにより、蛍光エネルギー移動が起こらなくなり、フルオレセイン（Fluorescein）の蛍光を生じるように設計されたヌクレオチド基質等を挙げることができる。一方、該加水分解されることにより発色、発光、あるいは特定の励起光による蛍光を発しなくなるように設計されたヌクレオチド基質を使用すれば、該ヌクレオチド基質の減少を検出することができる。
【００９７】
放射性物質で標識したヌクレオチド基質を用いることにより、放射線又は液体シンチレーション・カウントの減少又は増加として、該ヌクレオチド基質の減少又はその加水分解産物の増加を検出することができる。質量分析法を用いることにより、質量スペクトルピークの減少又は増加としてヌクレオチド基質の減少又はその加水分解産物の増加を検出することができる。
【００９８】
また、本発明のポリペプチドとヌクレオチド基質を接触させる際又はその後にＲＮａｓｅＬ及びＲＮＡを添加し、該ＲＮＡの分解を指標としてＲＮａｓｅＬの活性化を検出又は測定すれば、２’−ＰＤＥ活性の検出又は測定に代えることができる。同様に、本発明のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞とヌクレオチド基質を接触させる際又はその後にウイルスを添加し、一定時間保温した後に該ウイルスの量又はその増殖を検出又は測定すれば、２’−ＰＤＥ活性の検出又は測定に代えることができる。一方、ヌクレオチド基質と接触させる、本発明のポリヌクレオチドを内在性に保有している細胞が予めＲＮａｓｅＬ、ＲＮＡ又はウイルスを含有する場合、それらを添加せずに、同様の検出又は測定を行うことができる。例えば、２−５Ａシステムが活性化されている細胞、ウイルスに感染している細胞等をヌクレオチド基質と接触させる場合、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮＡ又はウイルスを外から添加する必要はない。
【００９９】
ヌクレオチド基質の減少又はその加水分解産物の増加を検出又は測定するに際しては、必要に応じ、予め被検試料からタンパク質成分を除去しておく。タンパク質成分は、トリクロロ酢酸等の酸を添加することにより生じる不溶化画分を遠心分離、膜濾過等の操作により除去され得る。また、ヌクレオチド基質の減少又はその加水分解産物の増加を検出するに際しては、必要に応じ、該ヌクレオチド基質とその加水分解産物を互いに分離する。ヌクレオチド基質の減少を検出する場合、該ヌクレオチド基質はその加水分解産物から分離されることが好ましい。加水分解産物を検出する場合、少なくとも検出対象の加水分解産物はヌクレオチド基質から分離されることが好ましい。予めヌクレオチド基質に適当なタグ等を付加させておけば、そのような分離を行うのに有用である。一方、高速液体クロマトグラフィー（high  performance  liquid  chromatography：ＨＰＬＣ）等を用いれば、基質とその加水分解産物の分離ならびにそれらの検出を並行して行うことができる。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドの転写量は、当業者に周知のいずれの方法によっても測定することができ、そのような方法として、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はそれを鋳型として作製されたｃＤＮＡライブラリーに対する、本発明のポリヌクレオチド又はその断片をプローブとしたドットブロット、スロットブロット、ノーザンブロット（northern  blotting）等のハイブリダイゼーション法、それらを鋳型として作製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、且つ本発明のポリヌクレオチド又はその断片を増幅させるべく設計されたオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ鎖伸張反応（polymerase  chain  reaction：以下、ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（reverse  transcription  PCR：以下、ＲＴ−ＰＣＲ）、タックマン（Taqman）ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、マイクロアレイ法、遺伝子チップ（genechip）法等を例示することができる。また、前記プローブを用いて組織切片に対するイン・サイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションを行うことにより、組織における本発明のポリヌクレオチドの転写を検出又は測定することができる。
【０１０１】
本発明のポリペプチドの翻訳量は、当業者に周知のいずれの方法によっても測定することができ、そのような方法として、ヒト又はヒト以外の哺乳動物に由来する細胞、組織、体液等の試料又はその分画物に対する、本発明のポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体、その断片若しくはその一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ポリクローナル抗体又は抗血清を用いた、各種免疫アッセイ（immunoassay）やウェスタンブロット（western  blotting）法等を例示することができる。免疫アッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、サンドウィッチＥＩＡ、ＲＩＡ等を例示することができる。また、組織切片を染色することにより、組織における本発明のポリペプチドを検出又は測定することができる。
【０１０２】
本発明は、２’−ＰＤＥ活性調節物質をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、検体非存在下又は存在下において前記２’−ＰＤＥ活性を検出又は測定する工程を含む。具体的には、検体非存在下又は存在下において、本発明のポリペプチド又は本発明の宿主細胞をヌクレオチド基質と接触させ、前述のような方法によりヌクレオチド基質の加水分解の程度を測定し、検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下におけるそれと比較して変化している場合、該検体を２’−ＰＤＥ活性調節物質と判定することができる。一方、検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下におけるそれと比較して小さい場合、該検体を２’−ＰＤＥ活性阻害物質と判定することができる。他方、検体存在下における加水分解の程度が、検体非存在下におけるそれと比較して大きい場合、該検体を２’−ＰＤＥ活性増強物質と判定することができる。なお、当該スクリーニング方法に使用される宿主細胞としては、本発明のポリペプチドを機能的に発現しているものが好適である。
【０１０３】
本発明は、２’−ＰＤＥ発現調節物質をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、検体非存在下又は存在下において本発明のポリヌクレオチドの転写量又は本発明のポリペプチドの翻訳量を測定する工程を含む。具体的には、検体非存在下又は存在下において、本発明の宿主細胞又は本発明のポリヌクレオチドを内在性に保有する細胞を保温し、次いで細胞内又は細胞外液における、本発明のポリヌクレオチドの転写量又は本発明のポリペプチドの翻訳量を測定し、検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下におけるそれと比較して変化している場合、該検体を２’−ＰＤＥ発現調節物質と判定することができる。一方、検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下におけるそれと比較して少ない場合、該検体を２’−ＰＤＥ発現抑制物質と判定することができる。他方、検体存在下における転写量又は翻訳量が、検体非存在下におけるそれと比較して多い場合、該検体を２’−ＰＤＥ発現促進物質と判定することができる。なお、当該スクリーニング方法に使用される宿主細胞としては、本発明のポリヌクレオチドが転写されているものか、又は本発明のポリペプチドが翻訳されているものが好適である。
【０１０４】
本発明のスクリーニング方法において細胞又は宿主細胞を保温する場合、インターフェロンの存在下及び／又は非存在下で保温することができる。それにより、単独で所望の生物活性を発揮する物質、単独では所望の生物活性を発揮しないがインターフェロンの作用を増強する物質、単独で所望の生物活性を発揮し且つインターフェロンの作用を増強する物質、単独では所望の生物活性を発揮しないがインターフェロンの作用を抑制又は阻害する物質、単独で所望の生物活性を発揮し且つインターフェロンの作用を抑制又は阻害する物質等を、それぞれ他と区別しつつ効率よく選抜することが可能となる。
【０１０５】
本発明は、２’−ＰＤＥ結合物質をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、本発明のポリペプチドに対する検体の親和性又は結合性を直接測定するか、あるいは該ポリペプチドとその基質又はリガンドの結合に対する競合的阻害活性を測定することにより行われ得る。当該方法に供される本発明のポリペプチドは、２’−ＰＤＥ活性の検出又は測定に使用されるものと同様である。
【０１０６】
本発明のポリペプチドに対する検体の親和性又は結合性は、２つの物質間の親和性又は結合性の測定に使用されうる当業者に周知の方法であれば特に限定されるものではない。例えば、ＮＭＲ法を用いてケミカルシフト変化の有無を検出するかあるいは質量分析を行うことにより、検体と結合していない遊離のポリペプチドおよび検体と結合しているポリペプチドを区別することができる。
【０１０７】
本発明のポリペプチドとその基質又はリガンドの結合に対する競合的阻害活性は、通常酵素タンパク質とその基質の結合又は受容体タンパク質とそのリガンドの結合に対する競合的阻害を測定する当業者に周知の方法により、測定され得る。そのような方法として、例えば、前述の２’−ＰＤＥ活性の検出又は測定方法を適用することができる。すなわち、２’−ＰＤＥ活性を競合的に阻害する検体は本発明のポリペプチドに対し親和性又は結合性を有するものと見なすことができる。
【０１０８】
そのようにしてスクリーニングされる２’−ＰＤＥ結合物質には、２’−ＰＤＥにより特異的に加水分解されるヌクレオチド、２’−ＰＤＥの内在性又は外来のリガンド、２’−ＰＤＥ活性調節物質等が含まれる。
【０１０９】
本発明の提供するスクリーニング方法に供される検体は、何ら限定されるものではなく、化学合成された化合物、天然試料から分離された化合物、微生物の培養物、その抽出物及びその分画物、動物又は植物に由来する抽出物及びその分画物、それらの混合物等が含まれる。ここでいう「化合物」には、低分子化合物、ペプチド、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、ポリマー等が包含される。該検体は、抽出物などの粗画分、部分精製画分、精製標品等のいずれであってもよい。また、該検体は難溶性又は不溶性の担体に直接又はスペーサー等を介して間接的に固定化されていてもよい。
【０１１０】
本発明は、２’−ＰＤＥ活性を検出する方法を提供する。該方法は、被検試料に含まれる２’−ＰＤＥ活性を測定する工程を含む。
【０１１１】
本発明は、２’−ＰＤＥの発現を検出する方法を提供する。該方法は、被検試料に含まれる本発明のポリヌクレオチドの転写量又は本発明のポリペプチドの翻訳量を測定する工程を含む。
【０１１２】
本発明の提供する検出方法に供される被検試料には、ヒト又はヒト以外の動物に由来する細胞、組織、臓器、体液若しくは糞便、本発明の宿主細胞、本発明の宿主動物に由来する細胞、組織、臓器、体液若しくは糞便、それらのうちいずれかの分画物、該分画物に由来する部分精製画分若しくは精製画分等の試料が含まれる。精製画分としては、精製されたペプチド、ヌクレオチド等を例示することができる。植物や微生物に由来する被検試料もそれに含まれる。
【０１１３】
本発明は、前記スクリーニング方法を実施するに際して使用されるキット、すなわちスクリーニング用キットを提供する。
【０１１４】
本発明の２’−ＰＤＥ活性調節物質のスクリーニング用キットには、本発明のポリペプチド又は本発明の宿主細胞、及び本発明のヌクレオチド基質が含有される。
【０１１５】
本発明の２’−ＰＤＥ発現調節物質のスクリーニング用キットには、下記［ａ］乃至［ｄ］からなる群より選択される少なくとも一つが含有される：
［ａ］ハイブリダイゼーション用プローブとして使用され得る、本発明のポリヌクレオチド又はその断片；
［ｂ］本発明のポリヌクレオチド又はその断片を複製又は増幅する際のプライマーとして使用される、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列又はそれに完全に相補的なヌクレオチド配列の一部を有し、且つ該ポリヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖と会合する、少なくとも１０の塩基を含むオリゴヌクレオチド。ＰＣＲのプライマーとしては、本発明のポリヌクレオチド又はその断片のセンス鎖及びアンチセンス鎖を増幅させるべく設計された２つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい；
［ｃ］本発明のポリペプチドを免疫アッセイ（Immunoassay）により検出する際のプローブとして使用され得る、本発明のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体、その活性断片、そのキメラ抗体、そのヒト型抗体、その完全ヒト抗体又はその一本鎖抗体；
［ｄ］［ａ］記載のポリヌクレオチド又はその断片、［ｂ］記載のオリグヌクレオチド、及び［ｃ］記載の抗体、その活性断片、そのキメラ抗体、そのヒト型抗体、そのヒト抗体又はその一本鎖抗体からなる群から選択される一つが、直接又はスペーサーを介して固定化されている不溶性担体。不溶性担体としては、有機ポリマーやガラスからなるビーズ、プレート、プレート上のウェル等、ＳＰＡビーズ、ＤＮＡチップ用担体、マイクロアレイ用担体等を例示することができる。
そのようなスクリーニング用キットは、［ａ］乃至［ｄ］のいずれかを用いた検出又は測定に必須であるかあるいは有用な物を更に含んでいてもよい。そのような物には、検出又は測定に必須な標識に必要な物質、検出に必要な物質、定量に必要な標準物質、インターフェロン等が包含される。また、［ａ］乃至［ｄ］は、予め標識されてるか、あるいは標識され得るよう予め加工されていてもよい。
【０１１６】
本発明の２’−ＰＤＥ結合物質のスクリーニング用キットには、本発明のポリペプチドが含有され、好適には、本発明のヌクレオチド基質が含まれる。
【０１１７】
以上のような本発明のスクリーニング用キットは、２’−ＰＤＥの活性検出用キット、２’−ＰＤＥの発現検出用キット、又は２’−ＰＤＥへの結合検出用キットとしても本発明に包含される。
【０１１８】
本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、各種疾患や生物学的状態の改善又は改変に有用である。２’−ＰＤＥ活性阻害物質、２’−ＰＤＥ結合物質、２’−ＰＤＥ発現抑制物質等は、２−５Ａシステムの活性化、２−５Ａシステム感受性疾患の治療又は予防に有用である。
【０１１９】
本発明において、「２−５Ａシステム」とは、２’−ＰＤＥ及びその内在性のヌクレオチド基質（２’，５’−オリゴアデニル酸）が直接又は間接に関与する生態防御機構を意味し、「２−５Ａシステム感受性疾患」とは２−５Ａシステムが活性化されることにより症状が軽減若しくは改善され得るかあるいは予防され得る疾患の総称であり、ウイルス感染症、腫瘍等を例示することができる。
【０１２０】
２−５Ａシステム感受性疾患に包含されるウイルス感染症としては、インターフェロン感受性のピコルナウイルス科（Picornaviridae）、オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、アデノウイルス科（Adenoviridae）、パポーバウイルス科（Papovaviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）等による感染症を挙げることができ（エス・ジェイ・フリント(S. J. Flint)ら著プリンセパルズ  オブ  ヴァイロロジィ：  モレキュラー  バイオロジー，パソゲェネシス，アンド  コントロール(Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control)，  米国にてアメリカン  ソサイェティ  フォー  マイクロバイオロジィ(American Society for Microbiology)より１９９９年刊行）、ヒトに対して病原性を示すウイルスとしては、ピコルナウイルス科の一種であるポリオウイルス（poliovirus）やライノウイルス（rhinovirus）；オルソミクソウイルス科の一種であるインフルエンザウイルス（influenza virus）；レトロウイルス科の一種であるヒトＴリンパ好性ウイルス（human T cell leukemia virus）やヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus）；ポックスウイルス科の一種である天然痘ウイルス（smallpox virus）；ヘルペスウイルス科の一種である単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）１、２、水痘・帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス３）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus）やＥＢウイルス（EB(Epstein-Barr) virus）；アデノウイルス科の一種であるヒトアデノウイルス（human adenovirus）１乃至４７；パポーバウイルス科の一種であるヒトパピローマウイルス（human papilloma virus）；パラミクソウイルス科の一種である麻疹ウイルス（measles virus）、ムンプスウイルス（mumps virus）や呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus）；フラビウイルス科の一種であるＣ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus）等を例示することができる（畑中正一  編集、ウイルス学、１９９７年に朝倉書店より刊行）。
【０１２１】
２−５Ａ感受性疾患に包含される腫瘍には、肉腫、癌腫、白血病等が含まれ、より具体的には線維肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫、神経膠腫、肺癌、胃癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、食道癌、舌癌、脳腫瘍、咽頭癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、急性白血病、慢性白血病、リンパ腫、膠芽腫等を例示することができ、好適には多発性骨髄腫、腎癌、前立腺癌、悪性黒色腫、膠芽腫等である（後藤稠編集代表、最新医学大辞典  第二版、１１５ページ、１９９６年に医歯薬出版株式会社より刊行）。
【０１２２】
また、２−５Ａ感受性疾患には、骨粗鬆症、慢性間接リウマチ、各種骨減少症、腎性骨異栄養症、高カルシウム血症、各種腫瘍及びその骨転移等に骨吸収性疾患も包含される。
【０１２３】
一方、２’−ＰＤＥ活性増強物質、２’−ＰＤＥ結合物質、２’−ＰＤＥ発現促進物質は、２−５Ａシステムの不活性化、免疫抑制等に有用である。
【０１２４】
従って、本発明の提供する、２’−ＰＤＥ活性調節物質をスクリーニングする方法、２’−ＰＤＥ発現調節物質をスクリーニングする方法、及び２’−ＰＤＥ結合物質をスクリーニングする方法は、いずれも、２−５Ａシステム調節物質をスクリーニングする方法としても本発明に包含される。このうち、２’−ＰＤＥ活性阻害物質をスクリーニングする方法、及び２’−ＰＤＥ発現抑制物質をスクリーニングする方法は、２−５Ａシステム活性化物質をスクリーニングする方法として好適であり、２’−ＰＤＥ活性増強物質をスクリーニングする方法、及び２’−ＰＤＥ発現促進物質をスクリーニングする方法は、２−５Ａシステム不活性化物質をスクリーニングする方法として好適である。また、２’−ＰＤＥ活性阻害物質をスクリーニングする方法、及び２’−ＰＤＥ発現抑制物質をスクリーニングする方法は、２−５Ａ感受性疾患治療剤又は予防剤をスクリーニングする方法として好適であり、２’−ＰＤＥ活性増強物質をスクリーニングする方法、及び２’−ＰＤＥ発現促進物質をスクリーニングする方法は、免疫抑制剤をスクリーニングする方法として好適である。
【０１２５】
同様に、本発明の提供する、２’−ＰＤＥ活性調節物質のスクリーニング用キット、２’−ＰＤＥ発現調節物質のスクリーニング用キット、及び２’−ＰＤＥ結合物質のスクリーニング用キットは、いずれも、２−５Ａシステム調節物質のスクリーニング用キットとしても本発明に包含される。このうち、２’−ＰＤＥ活性阻害物質のスクリーニング用キット、及び２’−ＰＤＥ発現抑制物質のスクリーニング用キットは、２−５Ａシステム活性化物質のスクリーニング用キットとして好適であり、２’−ＰＤＥ活性増強物質のスクリーニング用キット、及び２’−ＰＤＥ発現促進物質のスクリーニング用キットは、２−５Ａシステム不活性化物質のスクリーニング用キットとして好適である。また、２’−ＰＤＥ活性阻害物質のスクリーニング用キット、及び２’−ＰＤＥ発現抑制物質のスクリーニング用キットは、２−５Ａ感受性疾患治療剤又は予防剤のスクリーニング用キットとして好適であり、２’−ＰＤＥ活性増強物質のスクリーニング用キット、及び２’−ＰＤＥ発現促進物質のスクリーニング用キットは、免疫抑制剤のスクリーニング用キットとして好適である。
【０１２６】
本発明のスクリーニング方法により得られる物質も本発明に包含される。そのような物質には、本発明のポリペプチドと特異的に結合し且つ２’−ＰＤＥ活性を阻害し得る抗体（中和抗体）、その活性断片、そのキメラ抗体、そのヒト型抗体、その完全ヒト抗体、その一本鎖抗体及びその活性誘導体、アンチセンスヌクレオチド、本発明のポリペプチドのリガンド等が包含される。
【０１２７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの一部又は全部と相補的なアンチセンスヌクレオチドを提供する。該アンチセンスヌクレオチドは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド又はそれと完全に相補的なヌクレオチド配列と８０％以上同一なヌクレオチド配列を含むことからるなるポリヌクレオチド中に存在する、連続する少なくとも１０のヌクレオチドであり、且つ本発明のポリヌクレオチドと会合することにより、その転写を抑制又は阻害するヌクレオチドであれば特に限定されない。好適なアンチセンスヌクレオチドには、その３’−末端のヌクレオチドは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド中の対応するヌクレオチドと同一である。より好適なアンチセンスヌクレオチドは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列又はそれと完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことからるポリヌクレオチド中に存在する、連続する少なくとも１０のヌクレオチドである。そのようなアンチセンスヌクレオチドは、２−５Ａシステム活性化剤、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は予防剤、本発明のポリペプチドの機能解析等に有用である。
【０１２８】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの一部又は全部を含むスモール・インターフィアリングＲＮＡ（small interfering RNA：ｓｉＲＮＡ）を提供する。該ｓｉＲＮＡは、通常、互いに相補的な二本鎖ヌクレオチドからなるが、そのうち一方のヌクレオチド鎖は、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチドと完全に相補的なヌクレオチド配列と８０％以上同一なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド中に存在する、連続する少なくとも１０のヌクレオチドからなり、且つ当該本発明のポリヌクレオチドとの会合を介して本発明のポリヌクレオチドを不活性化せしめる。好適なｓｉＲＮＡには、その５’及び／又は３’末端のヌクレオチドは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド中の対応するヌクレオチドと同一である。より好適なｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号１で示されるヌクレオチド配列又はそれと完全に相補的なヌクレオチド配列を含むことからるポリヌクレオチド中に存在する、連続する１０乃至３０のヌクレオチドである。そのようなｓｉＲＮＡは、２−５Ａシステム活性化剤、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は予防剤、本発明のポリペプチドの機能解析等に有用である。
【０１２９】
本発明のスクリーニング方法により得られる物質、本発明の提供するポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、その活性断片、そのキメラ抗体、そのヒト型抗体、そのヒト抗体若しくはその一本鎖抗体、アンチセンスヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ（以下、「本発明の医薬成分」という。）は、医薬組成物としてヒト又はヒト以外の動物に対し、経口又は非経口により安全に投与され得る。本発明のスクリーニングにより得られる物質を含有する医薬組成物も、本発明に含まれる。医薬組成物としての投与形態は、疾患の種類、疾患の程度、症状、年齢、性別、体重等に応じて適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤は経口投与され、注射剤は単独で若しくはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与されるか又は単独で筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与され、貼付剤は経皮投与され、点鼻剤は経鼻投与され、粘膜適用剤は経粘膜投与若しくは口腔内投与され、坐剤は直腸内投与される。これらの製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、着色剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、ゲル化剤、界面活性剤、コーティング剤等、医薬の製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製剤化することができる。そのような医薬組成物に含まれる本発明のスクリーニング方法により得られる物質の量は、特に限定されるものではないが、通常０．１乃至７０重量％であり、好適には１乃至３０重量％である。
【０１３０】
本発明の医薬成分の投与量は、症状、年齢、体重、投与形態、剤形等に依存するが、例えば、通常成人に対する１日当たりの投与量の上限が１０乃至１０００ｍｇ、下限が０．００１乃至０．１ｍｇである。該物質の投与回数は、投与形態、剤形等に依存するが、数日に１回、１日１回、又は１日数回である。
【０１３１】
また、本発明の医薬成分を有効成分として含有する２−５Ａシステム活性化剤、２−５Ａシステム感受性疾患の予防剤又は治療剤、２−５Ａシステムを活性化するための本発明の医薬成分の使用、２−５Ａシステム感受性疾患を予防又は治療するための本発明の医薬成分の使用、２−５Ａシステム活性化剤を製造するための本発明の医薬成分の使用、２−５Ａシステム感受性疾患を治療剤又は予防剤を製造するための本発明の医薬成分の使用、本発明の医薬成分を投与することからなる２−５Ａシステム活性化方法、本発明の医薬成分を投与することからなる２−５Ａ感受性疾患の治療方法等も本発明に包含される。
【０１３２】
さらに、本発明の医薬成分を医薬組成物としてヒト又はヒト以外の哺乳動物に投与するに際しては他の医薬と併用してもよく、そのような他の医薬としてインターフェロン（interferon）、インターフェロンの産生促進物質、インターフェロンの活性促進物質、その他の抗ウイルス剤、その他の抗腫瘍剤等を例示することができ、インターフェロンとしてはヒト・インターフェロンα、同β、同γ等が好適である。
【０１３３】
本発明は、２’，５’−オリゴアデニル酸の量を増加せしめる方法、ＲＮａｓｅＬを活性化せしめる方法、及び２−５Ａシステムを活性化せしめる方法を提供する。具体的には、本発明のスクリーニングにより得られた物質、本発明の抗体、本発明のアンチセンスヌクレオチド等を用いて、ヒト又はヒト以外の哺乳動物、該動物に由来する細胞、組織又は体液における２’−ＰＤＥ活性を阻害するか、本発明のヌクレオチドの転写量又は本発明のポリペプチドの翻訳量を低下させることにより、該動物、細胞、組織又は体液における２’，５’−オリゴアデニル酸の量を増加せしめ、それによりＲＮａｓｅＬを活性化せしめ、ひいては２−５Ａシステムを活性化せしめる。
【０１３４】
また、該動物、細胞、組織又は体液に含まれるゲノムＤＮＡにおいて、本発明のポリヌクレオチドを一部又は全部欠失させるか、あるいは該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが有する２’−ＰＤＥ活性が一部又は全部失われるよう該ポリヌクレオチドを変異させることによっても、結果的に２’，５’−オリゴアデニル酸の量を増加せしめることが可能である。ゲノムＤＮＡに変異を導入するに際しては、部位特異的変異誘発法（site-directed mutagenesis）等、当業者に周知の方法が好適し使用され得る（Martin J. T. and Ismail K., Gene Knockout Protocols, Humana Press, U.S.A.(2001)：相沢慎一著、ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、１９９５年に羊土社より刊行：Brigid Hoganら著、山内一也ら訳、マウス胚の操作マニュアル、１９９７年に近代出版より刊行：八木健編、ジーンターゲティングの最新技術−効率よく確実なマウスの遺伝子組換えとクローン作製法、２０００年に羊土社より刊行）。
【０１３５】
なお、それらの方法は、２−５Ａシステム活性化方法又は２−５Ａシステム感受性疾患の治療方法などとしても有用である。
【０１３６】
前述の通り、本発明のポリペプチドは、２’，５’−ホスホジエステル結合を部分構造として含むヌクレオチドを特異的に加水分解し得る。その活性を利用して、従来製造困難であったヌクレオチド又はその誘導体を生成することができる。
【０１３７】
本発明は、２−５Ａシステム活性化の程度を判定する方法を提供する。該方法は、被検試料における本発明のポリヌクレオチドの転写量、本発明のポリペプチドの翻訳量、２’−ＰＤＥ活性などを測定する工程を含む。例えば、被検者若しくは被検哺乳動物に由来する被検試料、又は健常者若しくは健常な哺乳動物に由来する試料（対照試料）における該転写量又は該翻訳量を測定し、被検試料における該転写量又は該翻訳量が、対照試料におけるそれと比較して少ない場合、該被験者又は被検哺乳動物においては２−５Ａシステムが活性化されていると判定する。同様に、被検者若しくは被検哺乳動物に由来する被検試料、又は健常者若しくは健常な哺乳動物に由来する試料（対照試料）における２’−ＰＤＥ活性を測定し、被検試料における２’−ＰＤＥ活性が、対照試料におけるそれと比較して低い場合、該被験者又は被検哺乳動物においては２−５Ａシステムが活性化されていると判定する。反対に、被検試料における該転写量又は該翻訳量が、対照試料におけるそれと比較して多い場合、該被験者又は被検哺乳動物においては２−５Ａシステムが不活性化されていると判定する。同様に、被検試料における２’−ＰＤＥ活性が対照試料におけるそれと比較して高い場合、該被験者又は被検哺乳動物においては２−５Ａシステムが不活性化されていると判定する。
【０１３８】
本発明においては、対照試料と比較して、被検試料体における本発明のポリヌクレオチドの転写量が少ない場合、本発明のポリペプチドの翻訳量が少ない場合、２’−ＰＤＥ活性が低い場合、２’，５’−オリゴアデニル酸の量が多い場合、ＲＮａｓｅＬによるＲＮＡの分解量が多い場合、タンパク質合成量が少ない場合、又は細胞増殖速度が低い場合、２−５Ａシステムが活性化されているという。反対に、対照試料と比較して、被検試料体における本発明のポリヌクレオチドの転写量が多い場合、本発明のポリペプチドの翻訳量が多い場合、２’−ＰＤＥ活性が高い場合、２’，５’−オリゴアデニル酸の量が少ない場合、ＲＮａｓｅＬによるＲＮＡの分解量が少ない場合、タンパク質合成量が多い場合、又は細胞増殖速度が高い場合、２−５Ａシステムが不活性化されているという。
【０１３９】
２−５Ａシステムは、ウイルス感染症、腫瘍等の２−５Ａシステム感受性疾患への罹患により内在性に活性化又は不活性化され得る。よって、２−５Ａシステム活性化の程度を判定する方法は、２−５Ａシステム感受性疾患に罹患する危険を判定する方法としても本発明に包含される。該方法においては、被験者又は被検哺乳動物において２−５Ａシステムが活性化されている場合、該被験者又は被検哺乳動物は２−５Ａシステム感受性疾患に罹患する危険が低いと判定する。反対に、被験者又は被検哺乳動物において２−５Ａシステムが不活性化されている場合、該被験者又は被検哺乳動物は２−５Ａシステム感受性疾患に罹患する危険が高いと判定する。
【０１４０】
また、被検者又は被検哺乳動物へ本発明の医薬成分を投与する前後に、それぞれ２−５Ａシステムの活性化の程度を測定し、投与前と比較して投与後において２−５Ａシステムの活性化の程度が高い場合、その医薬成分が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム活性化効果又は２−５Ａシステム感受性疾患治療若しくは予防効果は高いと判定され得る。反対に、投与前と比較して投与後において２−５Ａシステムの活性化の程度が低いか同程度の場合、その医薬成分が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム活性化効果又は２−５Ａシステム感受性疾患治療若しくは予防効果は低いと判定され得る。本発明には、２−５Ａシステム活性化剤、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は同予防剤などの有効性を判定する方法も包含される。
【０１４１】
一方、被検者又は被検哺乳動物へ本発明の医薬成分を投与する前後に、それぞれ２−５Ａシステムの活性化の程度を測定し、投与前と比較して投与後において２−５Ａシステムの活性化の程度が高いか同程度の場合、その医薬成分が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム不活性化効果又は免疫抑制効果は低いと判定され得る。反対に、投与前と比較して投与後において２−５Ａシステムの活性化の程度が低い場合、その医薬成分が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム不活性化効果又は免疫抑制効果は高いと判定され得る。本発明には、２−５Ａシステム不活性化剤、免疫抑制剤などの有効性を判定する方法も包含される。
【０１４２】
さらに、健常者又は健常な哺乳動物と比較して、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が多い場合、本発明のポリペプチドの翻訳量が多い場合、又は２’−ＰＤＥ活性が高い場合、本発明の２’−ＰＤＥ活性阻害物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム活性化効果又は２−５Ａシステム感受性疾患治療若しくは予防効果は高いと予測され得る。反対に、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が少ない場合、本発明のポリペプチドの翻訳量が少ない場合、又は２’−ＰＤＥ活性が低い場合、本発明の２’−ＰＤＥ活性阻害物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム活性化効果又は２−５Ａシステム感受性疾患治療若しくは予防効果は低いと予測され得る。
【０１４３】
一方、健常者又は健常な哺乳動物と比較して、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が多い場合、又は本発明のポリペプチドの翻訳量が多い場合、本発明の２’−ＰＤＥ発現抑制物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム活性化効果又は２−５Ａシステム感受性疾患治療若しくは予防効果は高いと予測され得る。反対に、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が少ない場合、又は本発明のポリペプチドの翻訳量が少ない場合、本発明の２’−ＰＤＥ発現抑制物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム活性化効果又は２−５Ａシステム感受性疾患治療若しくは予防効果は低いと予測され得る。
【０１４４】
そのような、２−５Ａシステム活性化剤、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は同予防剤などの効果を予測する方法も本発明に包含される。
【０１４５】
また、健常者又は健常な哺乳動物と比較して、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が多い場合、本発明のポリペプチドの翻訳量が多い場合、又は２’−ＰＤＥ活性が高い場合、本発明の２’−ＰＤＥ活性増強物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム不活性化効果又は免疫抑制効果は高いと予測され得る。反対に、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が少ない場合、本発明のポリペプチドの翻訳量が少ない場合、又は２’−ＰＤＥ活性が低い場合、本発明の２’−ＰＤＥ活性増強物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム不活性化効果又は免疫抑制効果は低いと予測され得る。
【０１４６】
一方、健常者又は健常な哺乳動物と比較して、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が少ない場合、又は本発明のポリペプチドの翻訳量が少ない場合、本発明の２’−ＰＤＥ発現促進物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム不活性化効果又は免疫抑制効果は高いと予測され得る。反対に、被検者又は被検哺乳動物における本発明のポリヌクレオチドの転写量が多い場合、又は本発明のポリペプチドの翻訳量が多い場合、本発明の２’−ＰＤＥ発現促進物質が該被検者又は被検哺乳動物に対して発揮し得る２−５Ａシステム不活性化効果又は免疫抑制効果は低いと予測され得る。
【０１４７】
そのような、２−５Ａシステム不活性化剤、免疫抑制剤などの効果を予測する方法も本発明に包含される。
【０１４８】
本発明の判定方法又は予測方法における被験者又は被検哺乳動物は、対照の健常者又は健常哺乳動物と同種である限りにおいて何ら限定されないが、性別、年齢、週齢、病歴等について健常者又は健常哺乳動物と同じであることが好ましい。
【０１４９】
本発明の検出方法、判定方法又は予測方法を実施するに際しては、本発明の提供するスクリーニング用キットが好適に使用され得る。すなわち、本発明のスクリーニング用キットは、２’−ＰＤＥの活性検出用キット、２’−ＰＤＥの発現検出用キット、２−５Ａシステムの活性化程度判定用キット、２−５Ａシステム感受性疾患に罹患する危険を判定するためのキット、２−５Ａシステム活性化剤、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は同予防剤の有効性判定用キット、２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は同予防剤の効果予測用キット、２−５Ａシステム不活性化剤又は免疫抑制剤の有効性判定用キット、免疫抑制剤の効果予測用キット等としても、本発明に包含される。
【０１５０】
また、本発明の判定方法及び予測方法は、それぞれ２−５Ａシステム感受性疾患等の診断方法としても有用であり、そのような診断方法も本発明に包含される。同様に、本発明のスクリーニング用キットは、本発明の診断用キットとしても、本発明に包含される。
【実施例】
【０１５１】
以下の実施例及び試験例において本発明をより詳細且つ具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
実施例１．ウシ肝臓からの２’−ＰＤＥの部分精製
本実施例の操作は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と該ゲルの染色を除き、全て４℃にて行った。
【０１５２】
ウシ肝臓２００ｇを細断したものに緩衝液１［組成：１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ］７００ｍｌを加え、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製）を用いてホモゲナイズした後、１５０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収して更に１０００００×ｇで６０分間遠心分離に供した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和度３０％となるよう添加し、２０分間攪拌した後、１５０００×ｇで２０分間遠心分離した。その遠心上清に硫酸アンモニウムを飽和度５０％になるよう更に添加し、１２時間攪拌した後、９０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
【０１５３】
該沈殿にプロテアーゼ阻害剤であるコンプリート（Roche Diagnostics社製）を４粒含有する緩衝液２［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ］を２００ｍｌ加えて溶解せしめ、１０Ｌの緩衝液２に対して３時間、その後１０Ｌの緩衝液３［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ］に対して１２時間、排除限界分子量７０００の透析膜（ピアス社製）を用いて透析を行った。得られた透析内液を２８０００×ｇで１５分間遠心し、その遠心上清を孔径０．２μｍのメッシュを用いてろ過し沈殿を除いた。
【０１５４】
得られた透析内液を、予め緩衝液３で平衡化した疎水性相互作用カラム（ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ（Ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）：アマシャム・バイオサイエンス社製、すなわち旧アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）に添加した。２５０ｍｌの緩衝液３で該カラムを洗浄した後、５０ｍｌの緩衝液３及び５０ｍｌの緩衝液２による直線的濃度勾配とその後の１００ｍｌの緩衝液２を用いて、該カラム吸着成分を溶出させた。各溶出画分につき２’−ＰＤＥ活性を検出した。排除限界分子量７０００の透析膜を用いて、活性画分９０ｍｌを２Ｌの緩衝液４［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％（重量／容積）ＣＨＡＰＳ］に対して１２時間透析した。
【０１５５】
得られた透析内液を、予め緩衝液４で平衡化した色素結合アフィニティカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰ  ５ｍｌ：アマシャム・バイオサイエンス社製製）に添加した。５０ｍｌの緩衝液４で該カラムを洗浄した後、１２．５ｍｌの緩衝液４及び１２．５ｍｌ緩衝液５［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％（重量／容積）  ＣＨＡＰＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ］による直線的濃度勾配とその後の７５ｍｌの緩衝液５を用いて、該カラム吸着成分を溶出させた。各溶出画分について２’−ＰＤＥ活性を検出した。排除限界分子量７０００の透析膜を用いて、活性画分２０ｍｌを１Ｌの緩衝液４に対して１２時間透析した。
【０１５６】
得られた透析内液を、予め緩衝液４で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  １ｍｌ：アマシャム・バイオサイエンス社製）に添加した。１０ｍｌの緩衝液４で該カラムを洗浄した後、１００ｍｌの緩衝液４及び１００ｍｌの緩衝液５を用いて直線的濃度勾配を作成し、該カラム吸着成分を溶出させた。各溶出画分について２’−ＰＤＥ活性を測定した。排除限界分子量７０００の透析膜を用いて、活性画分２ｍｌを１Ｌの緩衝液４に対して１２時間透析した。
【０１５７】
得られた透析内液を、予め緩衝液４で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＰＣ  １．６／５：アマシャム・バイオサイエンス社製）に添加した。４ｍｌの緩衝液４で該カラムを洗浄した後、１６ｍｌの緩衝液４及び１６ｍｌの緩衝液５を用いて直線的濃度勾配を作成し、該カラム吸着成分を溶出させた。各溶出画分について２’−ＰＤＥ活性を検出した。活性画分又はその周辺の画分を、還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％ゲルを使用）により分離し、蛍光（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ：モレキュラー・プローブ社製）染色した結果、約６５ｋＤａに相当する位置に２’−ＰＤＥ活性と相関するバンドが検出された（図１）。
【０１５８】
２’−ＰＤＥ活性ピーク画分のうち５０μｌを、予め緩衝液６［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．０５％（重量／容積）  ＣＨＡＰＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で平衡化したゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＰＣ  ３．２／３０：アマシャム・バイオサイエンス社製）により分画した。各溶出画分について２’−ＰＤＥ活性を検出した。活性画分とその周辺画分を、還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％ゲルを使用）により分離し、蛍光染色した結果、約６５ｋＤａに相当する位置に２’−ＰＤＥ活性と相関するバンドが検出された（図２）。
実施例２．２’−ＰＤＥ活性の検出
検体１０μｌに、１．５ｍＭ  アデニリル（２’−５’）アデノシン（生化学工業（株）社製）を含む４０μｌの緩衝液７［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン］を添加し、３７℃にて６０分間保温した後、１０μｌの３．５μｇ／ｍｌ  アデノシンデアミナーゼ（ウシ脾臓由来：Sigma社製）を含む緩衝液８［組成：０．５Ｍ  コハク酸（ｐＨ６．０）、２．５Ｍ  ＮａＣｌ］を添加して、３７℃で更に２０分間保温した。次いでアンモニアテストキット（和光純薬工業（株）製）に含まれる除タンパク液６０μｌを添加して混和した後、室温にて７００×ｇで１５分間遠心分離した、上清５０μｌを回収し、該キットに含まれるＡ液５０μｌ、Ｂ液２５μｌ、Ｃ液５０μｌを順次添加して混和し、３７℃にて２０分間保温した後、波長λ６３０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた測定値から、アデニリル（２’−５’）アデノシンを含有しない緩衝液７を用いて行った反応の測定値を差し引いた。なお、本実施例記載の検出条件下において、１ｍＭのアデノシンを生成する２’−ＰＤＥ活性を１単位（ｕｎｉｔ：以下、Ｕ）／ｍｌとした。
実施例３．ヒト２’−ＰＤＥをコードするｃＤＮＡのクローニング
１）  ヒト２’−ＰＤＥ部分配列の決定
実施例１において検出された、非還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルゲル電気泳動上の約６５ｋＤａの、２’−ＰＤＥ活性に相関するバンド（図１又は図２）を該ゲルより切出し、得られたゲル片に１００μｌの緩衝液９［組成：５０％（容量／容量）  アセトニトリル、５０％（容量／容量）  ２０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）］を加え、３０℃にて３０分間振盪しつつゲルを脱色した。該脱色操作は２回行った。脱色された該ゲル片を２００μｌのアセトニトリルに添加し、２０℃にて１分間振盪しつつ脱水し、回収された乾燥ゲル片に５０μｌの１０ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液１０［組成：２０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）］を加え、５０℃にて３０分間振盪しゲル内のタンパク質を還元した。次いで、ゲル片に１００μｌの５５ｍＭ  ヨードアセトアミドを含む緩衝液１０を加え、２０℃にて遮光下２０分間振盪しつつゲル内のタンパク質をアルキル化した。次いで、該ゲル片に２００μｌのアセトニトリルを加え２０℃にて１分間振盪しつつ脱水し、回収された乾燥ゲル片に２００μｌの緩衝液１０を加え、２０℃にて１５分間振盪しつつゲル片を洗浄した。得られたゲル片に２００μｌのアセトニトリルを加え２０℃にて１分間振盪しつつ脱水し、その後遠心エバポレータ−（東京理科機械（株）社製）にて完全に乾燥させた。該乾燥ゲル片に１０μｌの１０ｎｇ／μｌ  トリプシン（プロメガ社製  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ  シークエンシンググレード）を加え、３７℃にて１２時間ゲル内蛋白質の消化反応を行った。生成した消化ペプチドは２０μｌの緩衝液１１［組成：０．０５％（容量／容量）  ギ酸、９９．９５％  蒸留水］で１回、２０μｌの緩衝液１２［組成：０．０５％（容量／容量）  ギ酸、９９．９５％  アセトニトリル］で２回、２０℃にて５分間振盪することにより抽出した。回収された抽出液を遠心エバポレータ−を用いて２０μｌまで濃縮した。
【０１５９】
該抽出液を、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置に供した。
【０１６０】
液体クロマトグラフィーシステム（ウォーターズ社製：ＣａｐＬＣ）を用い、スプリッターにより２５０ｎｌ／ｍｉｎの流速で運用した。逆相樹脂（イナートシル２μｍ：ジーエルサイエンス社製）を、エレクトロスプレーニードル（Ｐｉｃｏｔｉｐ：ニュー・オブジェクティブ社製、内径７５μｍ、先端径５μｍ、長さ５ｃｍ）に充填したものを、カラムとして用いた。質量分析装置としては、マイクロマス社製Ｑ−ＴＯＦ２を用いた。
【０１６１】
前記抽出液のうち５μｌを、緩衝液１１で予め平衡化した前記カラムに供与した。３μｌの緩衝液１１で該カラムを洗浄した後、緩衝液１１＝１００％から緩衝液１１：緩衝液１２＝３０％：７０％（容量／容量）まで直線的に変化するよう、流速２５０ｎｌ／ｍｉｎにて１５分間を要する濃度勾配を作成し、該カラム吸着性分を溶出させ、タンデム質量分析装置に直接導入した。得られた質量スペクトルデータはデータベース検索ソフトウェア（Ｍａｓｃｏｔ：マトリックス・サイエンス社製）により解析した。データベースとして米国ＮＣＢＩにより編纂されたｎｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ）データベースを用いた。その結果、２’−ＰＤＥ活性と相関する図１上の約６５ｋＤのバンド及び２’−ＰＤＥ活性と相関する図２上の約６５ｋＤのバンドのいずれの場合も、前駆体イオンとしてモノアイソトピック質量がｍ／ｚ  ６４１．８２、６５３．３４及び６９１．８８のＭＳ／ＭＳスペクトル（図３参照）等が、共通のヒトの公知アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセション番号  ＢＡＢ８５０７９．１）にヒットした。それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＢＡＢ８５０７９．１の予想トリプシン消化断片に対し良好に帰属された（図３参照）。前駆体イオンとしてモノアイソトピック質量がｍ／ｚ  ６４１．８２のＭＳ／ＭＳスペクトルは配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列に（図３ａ）、６５３．３４のそれは配列表の配列番号４で示されるアミノ酸に（図３ｂ）、６９１．８８のそれは配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列に（図３ｃ）、それぞれ対応していた。これらの結果より、得られた該ヒト配列（前記、ＢＡＢ８５０７９．１）は、ヒト２’−ＰＤＥ活性を有するポリペプチドの全長又は断片のアミノ酸配列であるものと推測された。
２）ヒト２’−ＰＤＥをコードするヌクレオチド配列の決定
得られた該ヒト２’−ＰＤＥ又はその断片のアミノ酸配列（前記、ＢＡＢ８５０７９．１）に対応するヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセション番号  ＡＫ０７４４２３．１）を用いて、以下に述べるようなイン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）ＥＳＴウォーキングを行った。
【０１６２】
ＡＫ０７４４２３．１を質問式とし、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴ検索（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１、  フィルターオプション：ＯＦＦ）を行った結果、オーバーラップ３５８塩基、同一性１００％のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセション番号  ＢＭ８９４１９７．１）がヒットした。
【０１６３】
同様に、該ヌクレオチド配列（前記、ＢＭ８９４１９７．１）を質問式とし、前述のＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴ検索（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１、  フィルターオプション：ＯＦＦ）を行った結果、オーバーラップ２３８塩基、同一性１００％のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセション番号  Ｈ０６０１９．１）がヒットした。
【０１６４】
更に、該ヌクレオチド配列（前記、Ｈ０６０１９．１）を質問式とし、前述のＥＳＴデータベースに対しＢＬＡＳＴ検索（ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１、  フィルターオプション：ＯＦＦ）を行った結果、オーバーラップ２２９塩基、同一性９９％のヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセション番号  Ｈ４２１１２．１）がヒットした。
【０１６５】
このようにして得られた４つのヌクレオチド配列（前記、ＡＫ０７４４２３．１、ＢＭ８９４１９７．１、Ｈ０６０１９．１、及びＨ４２１１２．１）をＰＨＲＡＰ（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．９６０７３１）を用いてアセンブリング（assembling）したところ、配列表の配列番号１０で示される、全長１９３９ｂｐのヌクレオチド配列を得た。該ヌクレオチド配列中のヌクレオチド番号第７２乃至１９０１番（配列表の配列番号１）は、メチオニンで始まり終始コドンに至る全６０９残基のアミノ酸からなる、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするオープン・リーディング・フレーム（以下「ＯＲＦ」という）と推測された。得られたＯＲＦは、アセンブリングに使用されたいずれのヌクレオチド配列よりも長かった。
３）逆転写反応及びＰＣＲによるヒト２’−ＰＤＥのｃＤＮＡクローニング
上記２）に示した配列表の配列番号１のヌクレオチド配列を有する、ヒト２’−ＰＤＥのｃＤＮＡを、逆転写反応（reverse transcription：以下、ＲＴ）およびＰＣＲ反応を組み合わせて、ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡよりクローニングした。
【０１６６】
ヒト肝臓由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Human liver poly(A)+RNA：BD Biosciences Clontech社製）２μｇ、及びｃＤＮＡ第１鎖合成用プライマ−であるｐ（ｄＴ）１５（Roche Diagnostics社製）１μｇを混和し、蒸留水（DNase and RNase free water：Sigma社製）を添加して終容積１５μｌとした後、７０℃にて１０分間保温した。保温後、氷上にて急冷し、５分間静置した。次いで、５×第１鎖合成用緩衝液（5x first strand buffer）５μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ（以上、SUPERSCRIPT II（Invitrogen社製）に添付）２．５μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（各２５ｍＭのデオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ、デオキシＴＴＰ ） （以上、Invitrogen社製）１μｌ、４０Ｕ／μｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（RNase inhibitor：ＴＯＹＯＢＯ社製）０．５μｌ 、及び２００Ｕ／μｌ  逆転写酵素（SUPERSCRIPT II RNase H−  Reverse Transcriptase：Invitrogen社製）１μｌを加え、終容積２５μｌとし、４２℃にて９０分、７０℃にて１０分間保温した後、蒸留水（DNase and RNase free water：Sigma社製）を添加して終容積５０μｌとした。得られた溶液をｃＤＮＡ第１鎖として以下の実験に供した。
【０１６７】
ＰＣＲ用オリゴヌクレオチド・プライマー１（5'-CTCCTCAGCTCCACCTGACAGTAGG-3'：配列表の配列番号６）及び同プライマー２（5'-TACTTCCTTTTCAGACTTCAATTCC-3'：配列表の配列番号７）は、配列表の配列番号１のヌクレオチド配列に基づいて設計され、β−シアノエチルアミダイト固相合成法により合成された（Sigma・ジェノシス社により委託製造された）。
【０１６８】
ＰＣＲ反応は、市販のキット（KOD-plus DNA Polymerase：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、該キットに添付されたプロトコールに従って行った。すなわち、先に得られたｃＤＮＡ第１鎖溶液０．５μｌに、前記のＰＣＲ用オリゴヌクレオチド・プライマー１及び２をそれぞれ終濃度０．３μＭ、濃縮された緩衝液（10xPCR buffer for KOD-plus）１０μｌ、終濃度０．２ｍＭのデオキシＡＴＰ、終濃度０．２ｍＭのデオキシＣＴＰ、終濃度０．２ｍＭのデオキシＧＴＰ、終濃度０．２ｍＭのデオキシＴＴＰ、終濃度１ｍＭの硫酸マグネシウム、及びＤＮＡポリメラーゼ（KOD-plus DNA polymerase）２Ｕ（以上、前記KOD-plus DNA Polymeraseに添付）を添加し、終容積を１００μｌとした。次いで、ＰＣＲ用保温装置（GeneAmp PCR System 9700：Applied Biosystems社製）により、９４℃にて５分間加熱し、次いで９４℃にて１５秒間、６５℃にて３０秒間、６８℃にて４分間の順からなる温度サイクルを４０回繰り返し、次いで７２℃にて１０分間保温してから４℃に保存した。反応物の一部を１．２％のアガロースゲルで電気泳動した後、染色液（SYBR Gold nucleic acid gel stain：Molecular Probes社製）を用いて該ゲルを染色した結果、所望のｃＤＮＡ（１９３９ｂｐ）が特異的に増幅されていることが確認された。
【０１６９】
増幅されたｃＤＮＡを、市販のキット（QIAquick PCR Purification Kit：ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、該キットに添付されたプロトコールに従って前記ＰＣＲ反応物より精製した。次いで、市販のキット（Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit：Invitrogen社製） を用い、該キットに添付されたプロトコールに従って、該ｃＤＮＡを市販のプラスミドＤＮＡ（pCR-Blunt II-TOPO Vector：前記キットに添付）へクローニングした。得られた組換プラスミドＤＮＡで、コンピテント大腸菌（ＴＯＰ１０：Invitrogen社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。次いで、カナマイシン耐性の形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む液体ＬＢ培地１．２ｍｌへ接種した後で３７℃にて１晩培養し、市販の装置（Bio Robot 9600：ＱＩＡＧＥＮ社製）及び市販のキット（QIAprep 96 turbo Miniprep Kit：ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、該キットに添付されたプロトコールに従って、得られた培養液より組換えプラスミドＤＮＡを回収した。
【０１７０】
該組換プラスミドＤＮＡに挿入されたＤＮＡのヌクレオチド配列を、市販のキット（BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0：Applied Biosystems社製）を用い、該キットに添付されたプロトコールに従って、ダイデオキシ法により決定した。シーケンス反応には、市販の装置（GeneAmp PCR System 9700：Applied Biosystems社製）を適用した。シーケンス反応物を、市販のＤＮＡ分析装置（ABI PRISM 3700 DNA Analyzer：Applied Biosystems社製）に供することによりヌクレオチド配列解析を行い、配列表の配列番号１に示される核酸配列を有するＤＮＡが、得られた組換プラスミドＤＮＡ上に挿入されていることが確認された。
【０１７１】
配列表の配列番号１のヌクレオチド配列及び該ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列表の配列番号２）は、それぞれ連続した１つのオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列及びそれによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列としては、公知のポリヌクレオチド配列又は公知のポリペプチド配列のいずれにも、５０％以上の同一性を示さなかった。また、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの、該アミノ酸配列に基づき市販のソフトウェア（GENETYX-SV/RC Version 5.1.1：株式会社ゼネティックス製）を用いて計算された分子量は６７３３８．８９８５であり、等電点は６．０４である。
【０１７２】
なお、上記ｃＤＮＡが挿入された組換プラスミドＤＮＡ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２を保持する形質転換大腸菌は、  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２  ＳＡＮＫ  ７１００２として、平成１４年８月６日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４２が付与された。
【０１７３】
また、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２を制限酵素ＥｃｏＲ１で消化することにより、ヒト２’−ＰＤＥをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。
実施例４．組換型ヒト２’−ＰＤＥの発現
１）組換発現プラスミドＤＮＡの構築
哺乳動物細胞発現系を利用して、実施例３において得られたｃＤＮＡがコードするポリペプチドを発現させるため、組換発現プラスミドＤＮＡを構築した。すなわち、ＥＦ１−αプロモーターの下流に、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列（配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列）の３’−末端にリンカーが接続しており、更に該リンカーの３’−末端に、所望のポリペプチドをアフィニティー・クロマトグラフィー及び／又はウェスタンブロッティングに供する際有用なＶ５エピトープ並びにヒスチジン６量体をコードするヌクレオチド配列が接続されているように、組換発現プラスミドＤＮＡを設計した（図４）。
【０１７４】
組換発現プラスミドＤＮＡを作製するためのオリゴヌクレオチド・プライマー３（5'-tattatgtggaggctcccaggc-3'：配列表の配列番号８）及び４（5'- tttccattttaaatcacatacaagtgc-3'：配列表の配列番号９）は、
β−シアノエチルアミダイト固相合成法により合成された（Sigma・ジェノシス社製）。
【０１７５】
実施例３において得られた、組換プラスミドＤＮＡ  ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２を鋳型として、市販のキット（ＬＡ  ｔａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ：宝酒造（株）製）を用い、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００（パーキンエルマー・ジャパン・アプライドバイオシステムズ社製）によりＰＣＲ反応を行った。すなわち１４０ｎｇのｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯ−Ｆ６−２／２２、０．２μＭ  ＫＵＢＯＦ１、０．２μＭ  ＫＵＢＯＲ１、２．５ｍＭ  デオキシＡＴＰ、２．５ｍＭ  デオキシＣＴＰ、２．５ｍＭ  デオキシＧＴＰ、２．５ｍＭ  デオキシＴＴＰ、及び２×ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕを含む５０μｌの反応液を調製した。この反応液を９４℃にて１分間加熱した後、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて２分間の順からなる温度サイクルを３０回繰り返し、次いで７２℃にて１０分間保温した。得られた反応液を０．７５％アガロースゲル電気泳動に供した結果、所望のｃＤＮＡ（１８３１ｂｐ）が特異的に増幅されていることが確認された。
【０１７６】
市販のキット（ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ＰＣＲ産物をプラスミドＤＮＡ  ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。すなわち、ＰＣＲ反応液０．５μＬ、ＳａｌｔＳｏｌ（キットに添付）１．０μＬ、ＴＯＰＯベクター（前記キットに添付）１．０μＬを１本のトレフチューブに分注し、純水を加えて終容量５μＬとし、室温にて１５分間保温した。次いで、化学的形質転換法により、大腸菌ＴＯＰ１０株（キットに添付）へ導入した。得られた形質転換大腸菌のコロニー群より、プラスミドＤＮＡ上に挿入ＤＮＡが含まれるようなクローンを、コロニーＰＣＲにより選抜した。次いで、選抜された１０のクローンに対応するコロニーをレプリカプレートより１．５ｍＬの２×ＴＹ培地へ接種し、３７℃、１２０ｒｐｍにて一晩振とう培養した。培養後、市販のキット（ＷｉｚａｒｄＰｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて１０のクローンよりそれぞれプラスミドＤＮＡを抽出した。各プラスミドＤＮＡ上の挿入ＤＮＡについてヌクレオチド配列を決定することにより、所望のＤＮＡが挿入されたプラスミドＤＮＡを保持しているクローンを選抜し、該クローンが保持している組換発現プラスミドＤＮＡをｐＥＦ６／ＫＵＢＯ＃００２／１１−１と命名した。
２）ＣＯＳ−１細胞におけるヒト２’−ＰＤＥの発現
市販の試薬（ＦｕＧＥＮＥ６：Roche Diagnostics社製、すなわち旧Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用い、１）で得られた組換発現プラスミドＤＮＡ：ｐＥＦ６／ＫＵＢＯ＃００２／１１−１を、リポソーム法によりサル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−１細胞（American Type Culture Collection No. CRL-1650 ）へ導入した。
【０１７７】
予め、ＣＯＳ−１細胞を、１０％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ：Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉａ（以下、Ｄ−ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）が含まれる細胞培養用フラスコ（培養面積２２５ｃｍ２ ：住友ベークライト（株）社製）中において、５％炭酸ガス下、３７℃にてセミ・コンフルエントになるまで培養した。得られた培養物より培地を除去した後、３ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Sigma社製）を添加し、３７℃にて３分間保温処理することによりＣＯＳ−１細胞を該フラスコから遊離させた。遊離した細胞を、８００ｒｐｍ、４分間の遠心分離により回収し、リン酸緩衝液［組成：０．０２％  塩化カリウム、０．０２％  リン酸２水素カリウム、０．８％  塩化ナトリウム、１．１５％  リン酸水素２ナトリウム：以下、ＰＢＳ（−）：日水製薬（株）社製］へ懸濁した。得られた懸濁液中の細胞数をカウントした後、細胞培養用シャーレ９０φ（培養面積５７ｃｍ２：住友ベークライト社）へ、１×１０６ 細胞数／シャーレとなるよう１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭを用いて希釈しつつ分注し、５％炭酸ガス下、３７℃にて２４時間培養した。
【０１７８】
市販のキット（ＷｉｚａｒｄＰｌｕｓ  Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて調製したｐＥＦ６／ＫＵＢＯ＃００２／１１−１  ２０μｇ、及びＦｕＧＥＮＥ６（前記、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）３０μｌを混和し、次いでＣＯＳ−１細胞に添加することにより、形質転換を行った。陰性対象として、ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺによるＣＯＳ−１細胞の形質転換を、前述の条件において行った。
【０１７９】
形質転換されたＣＯＳ−１細胞を、５％炭酸ガス下、３７℃にて７２時間培養した後、シャーレより培地を抜き取り、５ｍｌのＰＢＳ（−）で２回細胞を洗浄した。その後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート：ロッシュ・ダイアグノスティクス社製）及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む哺乳類細胞の細胞可溶化試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ：Sigma社製）１ｍｌを添加し、２５℃にて５分間保温し細胞を可溶化した。この可溶化液を別のチューブに集め、シャーレを１ｍｌのＰＢＳ（−）で一度洗い、これを可溶化液にあわせた。この可溶化液を８００ｒｐｍ、４分間遠心分離し、この遠心上清を細胞可溶化物とした。
３）組換型ヒト２’−ＰＤＥの酵素活性
２）で得られた組換タンパク質を含む細胞可溶化物の２’−ＰＤＥ活性を、実施例２に記載の方法により検出した。その結果、ｐＥＦ６／ＫＵＢＯ＃００２／１１−１で形質転換されたＣＯＳ−１細胞可溶化物中に、２’−ＰＤＥ活性が検出された。一方、陰性対象であるｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺで形質転換されたＣＯＳ−１細胞可溶化物中、及び、形質転換されていないＣＯＳ−１細胞可溶化物中には、２’−ＰＤＥ活性が検出されなかった（図５上パネル）。
４）組換型ヒト２’−ＰＤＥの基質特異性（その１）
３）に記載されたヒト２’−ＰＤＥの酵素活性検出方法におけるアデニリル（２’−５’）アデノシン（生化学工業（株）社製）をアデニリル（３’−５’）アデノシン（生化学工業（株）社製）で置き換えた上で、２）で得られた組換タンパク質を含む細胞可溶化物の有する加水分解活性を、実施例２に記載の方法により検出した。その結果、ｐＥＦ６／ＫＵＢＯ＃００２／１１−１で形質転換されたＣＯＳ−１細胞可溶化物中に、アデニリル（３’−５’）アデノシンを加水分解せしめる活性が検出され、該活性は３）で検出された２’−ＰＤＥ活性と同等であった。一方、陰性対象であるｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺで形質転換されたＣＯＳ−１細胞可溶化物中、及び、形質転換されていないＣＯＳ−１細胞可溶化物中にも、弱いながらアデニリル（３’−５’）アデノシンを加水分解せしめる活性が検出された（図５下パネル）。該活性は、ＣＯＳ−１細胞が内在性に保有するヌクレアーゼ（nuclease）に拠るものと考えられた。
【０１８０】
以上のように、ｐＥＦ６／ＫＵＢＯ＃００２／１１−１に挿入されたＤＮＡに依存したアデニリル（２’−５’）アデノシンの加水分解活性は、該ＤＮＡに依存したアデニリル（３’−５’）アデノシンの加水分解活性と同等又はそれ以上であり、本発明の実施例において単離され機能が確認されたポリペプチドは２’，５’−オルゴアデニル酸選択的な２’−ＰＤＥであることが確認された。
実施例５．ヒト２’−ＰＤＥの発現プロファイル
配列表の配列番号１と部分的に重複するヌクレオチド配列を有するＥＳＴプローブ（Affymetrix  GeneChip HG−U133 probe 231839_at：アフィメトリックス社製）について、ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社製のデータベース（GeneExpressR Software System ver. 1.4.1.0）から発現プロファイル解析を行なった。
【０１８１】
該データベースにおける肝臓サンプル６０例、及び肝細胞サンプル１９例について転写量を比較したところ、肝細胞サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＝７．３４−５：図６上パネル）、同様に、皮膚サンプル５８例及びメラノサイト・サンプル７例について転写量を比較したところ、メラノサイト・サンプルにおいて有意に高く転写されていた（Ｐ値＝１．７０−３：図６下パネル）。
実施例６．組換型ヒト２’−ＰＤＥの基質特異性（その２）
２）部分精製標品の調製
組換型ヒト２’−ＰＤＥは実施例４の１）で得られた組換発現プラスミドＤＮＡ  ｐＥＦ／ＫＵＢＯ＃２／１１−１およびＣＯＳ−１細胞を用い、実施例４の２）に記載の方法を２５倍スケールアップし、細胞可溶化物を得た。
【０１８２】
細胞可溶化物中のヒト２’−ＰＤＥのカルボキシル末端にはヒスチジン６量体が連結されているので、それを利用して以下に示すとおり部分精製した。以下の精製は全て４℃にて行った。すなわち、５０ｍｌの細胞可溶化物を、５００ｍｌの緩衝液１３［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール（imidazole）、０．０５％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］に対して３時間透析したのち外液を捨て、５００ｍｌの緩衝液１３に対して１５時間透析した。次いで、金属キレートカラム（HiTrap Metal Chelating HP 1ml：アマシャム・バイオサイエンス社製）へ０．６ｍｌの０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４を添加することによりニッケルカラムを調製し、緩衝液３で平衡化した。このカラムへ透析内液を添加し、１０ｍｌの緩衝液１３で洗浄した後、１０ｍｌの緩衝液１３および等容の緩衝液１４［２５０ｍＭ  イミダゾール（imidazole）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］による直線的濃度勾配を作製することにより該カラム吸着画分を溶出した。溶出液中の２’−ＰＤＥ活性を実施例２に記載の方法により測定した。活性画分に等容のグリセロールを加え、部分精製２’−ＰＤＥ酵素溶液として−２０℃にて保存した。
２）基質特異性の解析
部分精製２’−ＰＤＥ酵素溶液を、緩衝液７を用いて５倍希釈し、得られた酵素希釈溶液３μｌに１５０μＭの基質を含む３０μｌの緩衝液７を添加し、３７℃にて６０分間保温した。基質は、アデニリル（２’−５’）アデノシン、アデニリル（３’−５’）アデノシン、アデニリル（２’−５）アデニリル（２’−５’）アデノシン、アデニリル（３’−５’）アデニリル（３’−５’）アデノシン、５’−モノリン酸化アデニリル（２’−５’）アデニリル（２’−５’）アデノシン、および、５’−モノリン酸化アデニリル（３’−５’）アデニリル（３’−５’）アデノシンからなる群から選択した。反応後、６７μｌのメタノールを添加し酵素を失活させ、反応液を遠心エバポレーターで乾固し、得られた乾個物に１００μｌの緩衝液１５［組成：５０ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（triethylamine Acetate：ｐＨ７．０］を加えて再溶解させた。得られた溶液のうち１０μｌを、予め緩衝液１５で平衡化した逆相カラム（Ｘｔｅｒｒａ、ＲＰ１８、３．５μｍ：直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ：ウォーターズ社製）に供した。カラムクロマトグラフィーは、流速１ｍｌ／分、４０℃にて行い、波長２６０ｎｍでモニターした。緩衝液１５：緩衝液１６［５０ｍＭ  酢酸トリエチルアミン（triethylamine Acetate：ｐＨ７．０）、２５％（容積／容積）アセトニトリル］＝９９：１の混合溶媒で該カラムを洗浄した後、緩衝液１５：緩衝液１６＝９９：１から緩衝液１５：緩衝液１６＝２：３に至る直線的濃度勾配を２０分間かけて作製し、吸着画分を溶出させた。各基質の標準品を用いて、ピーク面積から基質量を求める換算式を作成した。換算式に基づいて、酵素希釈溶液を添加した場合の基質ピーク面積から基質の減少量を算出し、これを酵素反応生成物量とした。
【０１８３】
その結果をグラフとして図７Ａに示す。また、アデニリル（２’−５’）アデノシンを基質とした場合の酵素反応生成物量を１とした場合の、各基質に対する相対切断効率を図７Ｂに示す。その結果、アデニリル（３’−５’）アデニリル（３’−５’）アデノシンに対する切断効率として得られた値「１．１」は、ジョンストン（Johnston.,M.I.）らが得た値「１６３」とは著しく異なっていた。このように、本発明の提供するヒト２’−ＰＤＥは、ジョンストンらにより精製された２’−ＰＤＥとは、分子量について類似するものの、基質特異性の点で大きく異なることが確認された。
製造例１．Ａ−７４５２８化合物の調製
１）生産菌の培養
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．（ストレプトマイセス・エスピー）  ＳＡＮＫ  ６１１９６株（平成１３年３月３０日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３２を付与された：特開２００３−２３８５５２号公報参照）を、１２１℃、３０分間滅菌した前培養培地８０ｍｌを入れた５００ｍｌ容の三角フラスコヘ、スラントより８ｍｍ角分を接種して細かく砕き、２８℃にて５日間、ロータリー振とう培養機を用いて回転半径７ｃｍ、２１０ｒｐｍの条件下で培養した。得られた培養液を、前培養培地５００ｍｌを含む２Ｌ容三角フラスコ４本に３％ずつ接種し、２８℃にて１日間、回転半径７ｃｍ、２１０ｒｐｍ振とう条件で培養した。得られた培養液を、１２１℃、２０分間間滅菌した本培養培地６０Ｌを含む１００Ｌ容タンク培養器に３％接種し、２８℃にて６日間、通気量１ｖｖｍ、回転数５５乃至１００ｒｐｍ、溶存酸素量３乃至５ｐｐｍの条件下で培養した。
前培養培地の組成：
グルコース                      ５０ ｇ
大豆粉                          １０ ｇ
エルリッヒ肉エキス（極東）      ４ ｇ
ポリペプトン（日本製薬）        ４ ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）    １ ｇ
ＣａＣＯ３                      ５ ｇ
ＮａＣｌ                        ２．５ ｇ
消泡剤＊                        ０．０５ ｍｌ
水道水                          １０００ ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――
＊ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（日本油脂（株）製）
滅菌前にｐＨを７．２に調整した。
本培養培地の組成
グルコース                      ８０ ｇ
ファーマメディア                ２０ ｇ
エルリッヒ肉エキス（極東）      ４ ｇ
ポリペプトン（日本製薬）        １５ ｇ
イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）    ２ ｇ
ＣａＣＯ３                      ５ ｇ
ＮａＣｌ                        ２．５ ｇ
消泡剤＊                        ０．１ ｍｌ
水道水                          １０００ ｍｌ
―――――――――――――――――――――――――――――――
＊ニッサン・ディスフォームＣＢ−４４２（日本油脂（株）製）
ｐＨは無調整。
２）Ａ−７４５２８化合物の単離
１）で得られた培養液９０Ｌに、アセトン９０Ｌを加えて抽出した後、セライト（珪藻土セライト５４５）を濾過助剤として３％量添加し、フィルタープレスにより濾過した。得られたアセトン抽出液１９０ＬのｐＨを３に調整した後、酢酸エチル９０Ｌで分配した。分配の結果得られた上層（有機層）１３０Ｌを飽和食塩水７０Ｌ、水７０Ｌで順次洗浄した後、減圧濃縮し、析出した不溶物を濾紙及びロートを用いて濾過し、回収された濾液を減圧濃縮に供することにより酢酸エチルを留去し、オイル状物質８６．０ｇを得た。
【０１８４】
上述のオイル状物質をアセトニトリル５００ｍｌへ溶解し、コスモシル（Cosmosil）１４０  Ｃ１８オープンカラム （容積３８Ｌ） に付し、２０％アセトニトリル水７６Ｌで洗浄した後、３０％アセトニトリル水 １１４Ｌ、３５％アセトニトリル水 １１４Ｌ、４０％アセトニトリル水１１４Ｌで順次溶出した。３５％アセトニトリル水及び４０％アセトニトリル水による溶出画分を混合して減圧濃縮に供した後、ｐＨを３．５に調整して酢酸エチル１００Ｌで分配した。得られた有機層（上層）１３０Ｌを飽和食塩水７０Ｌ 、水７０Ｌで順次洗浄した後減圧濃縮に供し、析出した不溶物を濾紙及びロートを用いて濾別した。得られた濾液中の酢酸エチルを減圧濃縮により留去し、オイル状物質１０．０ｇを得た。このオイル状物質をメタノール１００ｍｌへ溶解したもの５０ｍｌを３５％アセトニトリル−０．２％トリエチルアミン・リン酸水（ｐＨ３．５）で平衡化したＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｋ  ＯＤＳ（直径１００×５００ｍｍ：ワイエムシィ（株）製）に付し、平衡化に用いた上記溶媒を用い、流速２００ｍｌ／分で展開した。溶出画分の波長λ３５０ｎｍの吸収を検出し、保持時間９４乃至９５分に溶出される画分を分取した。残りの５０ｍｌについても同様にＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを行った。得られた画分を合併し減圧濃縮することにより懸濁液５０ｍｌを得、これを酢酸エチル５００ｍｌで分配した。得られた有機層（上層）を乾固し油状物１００ｍｇを得た。
３）Ａ−７４５２８化合物の理化学的性質の測定および構造の決定
Ａ−７４５２８化合物は、下記の物理化学的性状を有していた（特開２００３−２３８５５２号公報参照）。
３−１）性  状：淡黄色粉末
３−２）溶解性：メタノール、ジメチルスルフォキシドに可溶
３−３）分子式：Ｃ３０Ｈ２４Ｏ１１
３−４）分子量：５６０（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ法による観測値：m/z 561.1405 (M+H)+、計算値：561.1397）
３−５）紫外線吸収スペクトル：λmax（メタノール中：単位ｎｍ）288（ε  19000）、354（ε  15400）
３−６）赤外吸収スペクトル：νmax（ＫＢｒ法：単位ｃｍ−１）3187、1694、1674、1603
３−７）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（重ジメチルスルフォキシド中：単位ｐｐｍ：内部標準のテトラメチルシランを０ｐｐｍとする）： 14.80 (1H, s), 12.71 (1H, s), 11.73 (1H, s), 11.56 (1H, s), 10.90 (1H, s) , 10.82 (1H, s), 6.40 (1H, s), 6.22 (1H, s), 6.20 (1H,s), 5.98 (1H, s), 5.18 (1H, s), 4.23 (1H, s) , 3.87 (1H, d, J = 3.2 Hz), 3.50 (1H, d, J = 3.4 Hz), 2.98 (1H, ABq, J = 14.7 Hz), 2.94 (1H, m), 2.82 (1H, q, J = 7.5 Hz), 2.65 (1H, ABq, J = 14.7 Hz), 2.49 (1H, dd, J = 19.1, 6.1 Hz), 2.33 (1H, dd , J = 19.1, 12.0 Hz), 1.34 (3H, d, J = 7.5 Hz).
３−８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：（重ジメチルスルフォキシド中：単位ｐｐｍ：内部標準のテトラメチルシランを０ｐｐｍとする）： 198.5 (s), 189.2 (s), 178.1 (s), 169.9 (s), 164.7 (s), 164.5 (s), 163.9 (s), 163.5 (s), 163.1 (s), 161.7 (s), 141.0 (s), 139.0 (s), 118.8 (s), 113.6 (d), 108.7 (s), 107.2 (s), 106.3 (s), 104.1 (d), 101.8 (d), 100.7 (d), 89.0 (d), 71.8 (d), 53.3 (d), 42.0 (s), 42.0 (t), 34.8 (d), 32.9 (d), 31.4 (d), 29.0 (t), 20.7 (q).
３−９）高速液体クロマトグラフィー
保持時間：６．８分
カラム  ：ＰＥＧＡＳＩＬ−ＯＤＳ
（センシュー科学（株）製 ：直径４．６ｃｍ×長さ１５０ｍｍ）
溶    媒：３５％アセトニトリル−０．２トリエチルアミン・リン酸水（ｐＨ３．５）
流    速：１．５ｍｌ／分
検    出：ＵＶ  ２１０ｎｍ。
【０１８５】
また、該化合物の構造式は、下記の通り決定された。
【０１８６】
【化１】
0003678734.tif 000002
実施例７．２’−ＰＤＥ阻害剤の有する抗ウイルス作用
１）Ａ−７４５２８化合物による組換型ヒト２’−ＰＤＥ活性の阻害。
【０１８７】
製造例１において得られた部分精製ヒト２’−ＰＤＥ酵素溶液１０μｌに、０．７５ｍＭののアデニリル（２’−５’）アデノシンを基質として含む８０μｌの緩衝液７、ならびにジメチルスルフォキシドに溶解させたＡ−７４５２８化合物溶液１０μｌを添加し、３７℃にて６０分間保温した後、２００μｌのメタノールを添加することにより酵素を失活させた。０．４５μｍのフィルターにより不溶物を除去した後得られた試料１０μｌを、予め緩衝液１７［５０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐｈ５．０）、５％（容積／容積）アセトニトリル］で平衡化した逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２、５μｍ：直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ：ＧＬサイエンス社製）に供した。液体クロマトグラフィーは流速１ｍｌ／分、４０℃にて行い、溶出液を波長２６０ｎｍでモニターした。溶出はアイソクラティック溶出にて行った。基質の標準品を用いて、ピーク面積から基質量を求める換算式を作成した。換算式に基づいて、酵素希釈溶液を添加した場合の基質ピーク面積から基質の減少量を算出し、これを酵素反応生成物量とした。図８Ａに示す通り、Ａ−７４５２８化合物は、組換型ヒト２’−ＰＤＥを濃度依存性に阻害し、その５０％阻害濃度は３４μｇ／ｍｌであった。
２）Ａ−７４５２８化合物の抗ウイルス活性
１×１０５個細胞のＨｅＬａ細胞を、１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＭＥＭ（Minimum Essential Medium）を分注した２４穴プレート（コラーゲンタイプＩコート：旭テクノグラス社製）中で、５％炭酸ガス存在下３７℃にてセミ・コンフルエントになるまで培養した。培地を除去した後、３００単位のインターフェロン−α（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び２．５％のＦＣＳを含む２５０μｌのＭＥＭ、または、インターフェロン−αを含まない、２．５％ＦＣＳを含む２５０μｌのＭＥＭで、細胞を更に２４時間培養した。培地を、Ａ−７４５２８化合物および２．５％ＦＣＳを含む２５０μｌの新鮮なＭＥＭに交換した直後、ワクシニアウイルスＷＲ株（Vaccinia  virus  WR  strain）をｍｏｉ＝０．００１となるよう感染させた。感染から２時間が経過した時点で、培養液中のＡ−７４５２８化合物の濃度がウイルス感染前のそれと等しくなるよう、Ａ−７４５２８化合物および２．５％ＦＣＳを含むＭＥＭを添加した。更に２２時間培養した後、培地を除去し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５００μｌのエタノールを添加して２５ ℃にて１０分間保温することにより細胞を固定化した。
【０１８８】
ウイルス感染細胞は、パーオキシダーゼ・アンチパーオキシダーゼ（ＰＡＰ）染色法（Okuno, Y., Tanaka, K., Baba, K., Maeda, A., Kunita, N. and Ueda, S. (1990) J. Clin. Microbiol. 28, 1308-1313）を若干改変させることにより検出した。すなわち、細胞を、５００倍希釈したウサギ抗ワクシニアウイルス抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ社製）で２５℃、１時間処理した後、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、１０００倍希釈したヤギ抗ウサギイムノグロブリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）および１０００倍希釈したパーオキシダーゼ−アンチパーオキシダーゼ複合体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）で、それぞれ同様に細胞を処理した。次いで、Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｅｔｅｍ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製）を用いてパーオキシダーゼ（Peroxidase）を反応させ、可視化されたプラークを数えた。
【０１８９】
図８Ｂに示す通り、Ａ−７４５２８化合物は、単独で濃度依存性のウイルス複製抑制作用を示し、且つ、インターフェロン−αと共存させることによりインターフェロン−αのウイルス複製抑制作用を増強した。
実施例８．２’−ＰＤＥ特異的ｓｉＲＮＡの抗ウイルス作用
本発明の２’−ＰＤＥに特異的なスモール・インターフィアリングＲＮＡ（small interfering RNA ：ｓｉＲＮＡ）が、当該酵素遺伝子の発現を抑制し且つ抗ウイルス作用を示すか否かを調べた。ヒト２’−ＰＤＥ特異的なｓｉＲＮＡとしては配列表の配列番号１１および１２で示されるもの（5'-GUACAAGGUGGAGCGCAACdTdT-3'および5'-GUUGCGCUCCACCUUGUACdTdT-3）を、対照のｓｉＲＮＡとしては配列表の配列番号１３および１４で示されるもの（5'-GGUGCUCUCAGAGCUCUUCdTdG-3'および5'-GAAGAGCUCUGAGAGCACCdTdG-3'）を、それぞれ用いた。ＨｅＬａ細胞を用いた抗ワクシニアウイルス試験は実施例７に準じて行った。
【０１９０】
１×１０５個細胞のＨｅＬａ細胞を、１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＭＥＭを分注した２４穴プレート（コラーゲンタイプＩコート：旭テクノグラス社製）中で、５％炭酸ガス存在下３７℃にて２４時間培養した。培地を、１０％のＦＣＳを含む新鮮なＭＥＭで交換した後、２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡおよび１μｌのリポフェクタミン２０００（Lipofectamine  2000：インビトロジェン社製）２０００を含むｏｐｔｉ−ＭＥＭ（血清使用量低減培地：インビトロジェン社製）１００μｌを培地に添加し、２４時間培養することによりｓｉＲＮＡを細胞へ導入した。培地を除去した後、３００単位のインターフェロン−α（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び２．５％のＦＣＳを含む２５０μｌのＭＥＭ、または、インターフェロン−αを含まない、２．５％ＦＣＳを含む２５０μｌのＭＥＭで、細胞を更に２４時間培養した。培地を２．５％ＦＣＳを含む２５０μｌの新鮮なＭＥＭに交換した後、ワクシニアウイルスＷＲ株（Waccinia  virus  WR  strain）をｍｏｉ＝０．００１となるよう感染させた。感染から２時間が経過した時点で、２．５％ＦＣＳを含む２５０μｌのＭＥＭを添加し、更に２２時間培養した後、培地を除去し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで５００μｌのエタノールを添加して２５ ℃にて１０分間保温することにより細胞を固定化した。ウイルス感染細胞を、実施例７の２）に記載の方法に準じて検出した。
【０１９１】
図９に示す通り、本発明のヒト２’−ＰＤＥ特異的ｓｉＲＮＡは、単独でウイルスの複製を抑制し、且つ、インターフェロン−αと共存させることによりインターフェロン−αのウイルス複製抑制作用を増強する傾向を示した。
実施例９．２−５Ａシステムの不活性化によるインターフェロンの抗腫瘍活性の減弱
１）ヒト前立腺ガン細胞株ＰＣ−３を宿主とする、ヒト２’−ＰＤＥ安定発現株の取得
ＰＣ−３細胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０（インビトロジェン社製）を用い、４％炭酸ガス存在下３７℃にて培養した。ヒト２’−ＰＤＥのカルボキシル末端にＶ５エピトープ及びヒスチジン６量体を付加させるよう、ヒト２’−ＰＤＥのｃＤＮＡに適宜ヌクレオチドを加え、ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１（インビトロジェン社製）へ挿入した。得られた発現プラスミドをリポフェクタミン（Lipofectamine plus：インビトロジェン社製）を用いてＰＣ−３細胞ヘ導入した。宿主のＰＣ−３細胞はブラストサイジン（blasticidin）感受性であるが、遺伝子が導入されたＰＣ−３細胞はブラストサイジン抵抗性を獲得する。そこで、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを培地中に含有せしめることにより、安定発現株を選択した。単離された安定発現株は、組換えヒト２’−ＰＤＥ修飾体（２’−ＰＤＥ−Ｖ５−Ｈｉｓ）タンパク質の発現は、抗Ｖ５エピトープ抗体を用いたウエスタンブロッティング解析により確認した。
【０１９２】
図１０Ａに示す通り、２’−ＰＤＥ安定発現株として、高発現株＃６および低発現株＃１０が得られた。
２）２’−ＰＤＥの過剰発現による２−５Ａシステムの不活化
３．０×１０３個の、２’−ＰＤＥ安定発現株＃６、＃１０および遺伝子が導入されていない宿主ＰＣ−３細胞を、それぞれ、１０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、９６穴プレートに播種した。細胞を、インターフェロン−α（コスモバイオ社製）、インターフェロン−γ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、又は、ｄｓＲＮＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）の存在下で３日間培養し、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（Ａｌａｍｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて細胞の生存率を測定した。
【０１９３】
図１０ＢおよびＣに示す通り、インターフェロン−αおよびインターフェロン−γは濃度依存性にＰＣ−３細胞の生存を抑制した。これに対して、２’−ＰＤＥ安定発現株ではインターフェロンの増殖抑制活性が減弱した。また、図１０Ｄに示す通り、ｄｓＲＮＡはインターフェロンより協力にＰＣ−３細胞の生存を抑制した。これに対して、２’−ＰＤＥ安定発現株ではｄｓＲＮＡの細胞増殖抑制活性が大きく源弱した。
実施例１０．短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）
１）短鎖型２’−ＰＤＥの調製
まず、実施例４に記載の方法に準じ、配列表の配列番号１に記載のヌクレオチド配列が挿入された組換え発現プラスミドを、ヒト胎児腎細胞株２９３細胞に導入し、組換型の短鎖型ヒト２’−ＰＤＥ（３５−６０９）（以下、単に「短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）」という）を安定に発現している株を取得した。
【０１９４】
次いで、短鎖型ヒト２’−ＰＤＥ安定発現細胞の培養物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート：ロッシュ・アプライド・サイエンス社製）及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む細胞可溶化試薬（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ：Ｓｉｇｍａ社製）を用い、該試薬に添付されたプロトコールに従って可溶化した。得られた細胞可溶化液を粗画分とし、以下に記載の方法により短鎖型ヒト２’−ＰＤＥを精製した。精製操作は４℃にて行い、粗画分は使用時まで−８０℃にて保存した。２’−ＰＤＥ活性は実施例２に記載の方法により検出した。
【０１９５】
１２０ｍｌの細胞可溶化液を解凍した後、７，５００×ｇにて２０分間遠心分離し、不溶物を除去した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和度が５０％となるように添加して３時間攪拌した後、７，５００×ｇにて２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
【０１９６】
該沈殿に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート：ロッシュ・アプライド・サイエンス社製）を１粒含有する緩衝液２（実施例１参照）を５０ｍｌ加えて再溶解せしめ、
これを排除限界分子量７，０００の透析膜（ピアス社製）に入れ、２Ｌの緩衝液２に対して３時間、外液を新たな２Ｌの緩衝液２に交換して更に１２時間透析を行った。
【０１９７】
得られた透析内液を、予め緩衝液２で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ６ｍｌ：アマシャム・バイオサイエンス社製）に添加した。９０ｍｌの緩衝液２で該カラムを洗浄した後、緩衝液２から緩衝液２：緩衝液３＝３：１（容積／容積）に至る直線的濃度勾配を、流速６ｍｌ／分にて５０分間かけて作製し、該カラム吸着画分を溶出させた。活性画分２０ｍｌを、排除限界分子量７，０００の透析膜を用いて、５００ｍｌの緩衝液３に対して１２時間透析した。
【０１９８】
得られた透析内液を、予め緩衝液３で平衡化した、疎水性相互作用カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ（ｌｏｗ  ｓｕｂ）１ｍｌ：アマシャム・バイオサイエンス社製）を２本直列に接続したものに添加した。３０ｍｌの緩衝液３で該カラムを洗浄した後、緩衝液３から緩衝液２（容積／容積）に至る直線的濃度勾配を、流速１ｍｌ／分にて１０分間かけて作製し、次いで４０ｍｌの緩衝液２を同じ流速で添加することにより、該カラム吸着画分を溶出させた。活性画分１２ｍｌを、排除限界分子量７，０００の透析膜を用い、５００ｍｌの緩衝液４に対して１２時間透析した。
【０１９９】
得られた透析内液を、予め緩衝液４で平衡化した、色素結合アフィニティカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｂｌｕｅ  ＨＰ  １ｍｌ：アマシャム・バイオサイエンス社製）を２本直列に接続したものに添加した。２５ｍｌの緩衝液４で該カラムを洗浄した後、緩衝液４から緩衝液４：緩衝液１８［組成：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％（重量／容積）ＣＨＡＰＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ］＝１：１（容積／容積）に至る直線的濃度勾配を、流速１ｍｌ／分にて５分間かけて作製し、次いで緩衝液４：緩衝液１８＝１：１から緩衝液１８に至る直線的濃度勾配を、同じ流速にて５分間かけて作製し、次いで２５ｍｌの緩衝液１８を同じ流速にて添加することにより、該カラム吸着画分を溶出させた。活性画分６ｍｌを、排除限界分子量７，０００の透析膜を用いて、１Ｌの緩衝液４に対して１２時間透析した。
【０２００】
得られた透析内液を、予め緩衝液４で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｍｉｎｉ  Ｑ  ＰＣ  ３．２／３：アマシャム・バイオサイエンス社製）へ添加した。２ｍｌの緩衝液４で該カラムを洗浄した後、緩衝液４から緩衝液４：緩衝液５＝１７：３（容積／容積）に至る直線的濃度勾配を、流速２４０μｌ／分にて４０分間かけて作製し、該カラム吸着画分を溶出させた。最も高い２’−ＰＤＥ活性を示した画分を、還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％ゲルを使用）により分離し、蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ蛍光：モレキュラー・プローブ社製）を用いて染色した。染色された各バンドを、実施例３の１）に記載の方法により、ゲル内消化した上、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置に供した。当該質量分析操作は、実施例３の１）に準じて行った。但し、液体クロマトグラフィーシステムにはＲｅｎＣｏｎシステム（ナノソリューションズ社製）を用い、流速はスプリッターなしで１００ｎｌ／分とし、カラムとして、内径１５０ｍｍのフューズドシリカをＬａｓｅｒ  ｐｕｌｌｅｒ（Ｓｈｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）により加工し、そこに逆相樹脂（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＦ−ＨＧ−３：野村化学社製）を充填したものを用いた。その結果、図１１に示す通り、約６６ｋＤａに相当するバンド中にヒト２’−ＰＤＥの部分配列が検出された。
２）短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）のアミノ末端解析
まず、実施例１０の１）において部分精製された短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）タンパク質の一部を還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ポリヴィニリデン・フルオライド（polyvinylidene fluoride）膜にブロットした後、エドマン分解法によるアミノ末端解析に供したが、タンパク質として十分量を供しているにもかかわらずシグナルは得られず、短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）のアミノ末端はブロックされていることが示唆された。
【０２０１】
次いで、部分精製された短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）タンパク質の一部を還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（１０−２０％グラディエントゲルを使用）により分離し、亜鉛（Ｚｎ  ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ：バイオ・ラッド社製）を用いて染色した。
【０２０２】
染色後、短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）に相当するバンドを、実施例３の１）に記載の方法に準じてゲル内消化した。但し、脱色は、ゲル片に１００μｌの緩衝液１９［組成：２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９．２ｍＭ  グリシン（ｐＨ８，３）］を加え２５℃に５分間振盪する操作を２回繰り返すこｔｐにより行い、消化酵素として、各２０μＬのトリプシン（５ｎｇ／μｌ：プロメガ社製）、リシルエンドペプチダーゼ（５ｎｇ／μｌ：和光純薬社製）、キモトリプシン（５ｎｇ／μｌ：ロッシュ・アプライド・サイエンス社製）又はエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃ（１０ｎｇ／μｌ：ロッシュ・アプライド・サイエンス社製）を用い、トリプシンおよびリシルエンドペプチダーゼは３７℃にて、キモトリプシンおよびエンドプロテナーゼＧｌｕ−Ｃは２５℃にてそれぞれ保温した。
【０２０３】
生成した消化ペプチド抽出液を、実施例１０の１）に記載の方法により、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置に供した。酵素消化により得られた４種の質量スペクトルデータを結合させ、データベース検索ソフトウェア（Ｍａｓｃｏｔ：マトリックス・サイエンス社製）を用いて、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対してマップした（図１２Ａ）。その結果、アミノ末端から数えて３５残基目のメチオニンがアセチル化を受けたペプチドが見出され、該ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルは良好に帰属された（図１２Ｂ）。以上の結果より、短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）のアミノ末端は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列中、アミノ末端より３５残基目のメチオニンであることが確認された。
３）短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）の等電点
実施例１０の１）において部分精製された短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）タンパク質の一部を、等容のＩＥＦサンプル緩衝液（ｐＨ３−１０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合し、次いでｐＨ３−１０の等電点電気泳動用ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添加し、１００Ｖ−１時間、２００Ｖ−１時間、および５００Ｖ−３０分の条件下で室温にて電気泳動を行なった。泳動後のゲルを、蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ：モレキュラー・プローブ社製）で染色した。その結果、等電点ｐＩ６．０付近に主要なバンドが観察され、当該バンドを切り出し、実施例１０の２）に記載の方法によりでゲル内消化し、次いで実施例１０の１）に記載の方法による液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置に供した。その結果、図１３に示す通り、ｐＩ６．０付近に相当するバンドからヒト２’−ＰＤＥが検出された。アミノ酸配列より算出された全長ヒト２’−ＰＤＥ（１−６０９）および短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）が有する等電点の理論値はそれぞれｐＩ６．０およびｐＩ５．９であり、短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）の実験値（ｐＩ６．０）とともに、ジョンストンらにより精製されたウシ由来酵素の等電点（ｐＩ８．３）とは大きく相違していた。
【産業上の利用可能性】
【０２０４】
本発明の提供するポリペプチドは２’−ＰＤＥ活性を有しており、該ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドは、２’−ＰＤＥ活性阻害物質、２’−ＰＤＥ発現抑制物質、２’−ＰＤＥ結合物質若しくは２−５Ａシステム感受性疾患治療剤又は予防剤のスクリーニング、２’−ＰＤＥ活性若しくは発現の検出等に好適に使用することができる。それらのスクリーニングにより得られる物質は２−５Ａシステム感受性疾患の治療又は予防に、それらの検出方法は２−５Ａ感受性疾患等の判定にそれぞれ有用である。また、本発明の提供する抗体は、本発明のポリペプチドの免疫学的な検出、あるいは２−５Ａシステム感受性疾患等の治療又は予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】（上パネル）実施例１に記載の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより得られた画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図。（下パネル）実施例１に記載の陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより得られた画分について２’−ＰＤＥ活性を検出した結果を示す図。
【図２】（上パネル）実施例１に記載のゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得られた画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図。（下パネル）実施例１に記載のゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得られた画分について２’−ＰＤＥ活性を検出した結果を示す図。
【図３ａ】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルより切り出した約６５ｋＤａのバンドを消化することにより得られたペプチドのうち、実施例３に記載の液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析において溶出した、モノアイソトピック質量６４１．８２を前駆体イオンとするタンデム質量分析スペクトル。
【図３ｂ】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルより切り出した約６５ｋＤａのバンドを消化することにより得られたペプチドのうち、実施例３に記載の液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析において溶出した、モノアイソトピック質量６５３．３４を前駆体イオンとするタンデム質量分析スペクトル。
【図３ｃ】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルより切り出した約６５ｋＤａのバンドを消化することにより得られたペプチドのうち、実施例３に記載の液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析において溶出した、モノアイソトピック質量６９１．８８を前駆体イオンとするタンデム質量分析スペクトル。
【図４】ヒト２’−ＰＤＥの機能発現に適用され得る組換プラスミドＤＮＡの構築方法を示す図。
【図５】（上パネル：Ａ）アデニリル（２’−５’）アデノシンを基質としたときの、組換ヒト２’−ＰＤＥの活性を示す図。ヒト２’−ＰＤＥをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞（pEF6/KUBO#002/11-1）抽出物により、アデニリル（２’−５’）アデノシンは加水分解された。陰性対照のＤＮＡが導入された宿主細胞（pEF6/V5-His-TOPO/LacZ）抽出物及び外来ＤＮＡが導入されていない宿主細胞（-DNA）抽出物では、アデニリル（２’−５’）アデノシンは加水分解されなかった。（下パネル：Ｂ）アデニリル（３’−５’）アデノシンを基質としたときの、組換ヒト２’−ＰＤＥの活性を示す図。ヒト２’−ＰＤＥをコードするＤＮＡが導入された宿主細胞（pEF6/KUBO#002/11-1）抽出物により、アデニリル（３’−５’）アデノシンは加水分解された。また、陰性対照のＤＮＡが導入された宿主細胞（pEF6/V5-His-TOPO/LacZ）抽出物及び外来ＤＮＡが導入されていない宿主細胞（-DNA）抽出物により、アデニリル（３’−５’）アデノシンが若干加水分解された。
【図６】（上パネル：Ａ）ヒト２’−ＰＤＥの相対的な転写量を示す図。肝細胞において高く転写されていた。（下パネル：Ｂ）ヒト２’−ＰＤＥの相対的な転写量を示す図。メラノサイトにおいて高く転写されていた。
【図７】（上パネル：Ａ）（２’−５’）および（３’−５）オリゴアデニル酸を用いて、ヒト２’−ＰＤＥの加水分解活性を比較した結果を示す図。白抜きカラムは（２’−５’）オリゴアデニル酸を、黒塗りカラムは（３’−５）オリゴアデニル酸を、それぞれ示す。（下パネル：Ｂ）種々のオリゴアデニル酸に対する基質選択性を、公知酵素と比較した図。「A2'pA」はアデニリル（２’−５’）アデノシンを、「A3'pA」はアデニリル（３’−５’）アデノシンを、「A2'pA2'pA」はアデニリル（２’−５’）アデニリル（２’−５’）アデノシンを、「A3'pA3'pA」はアデニリル（３’−５’）アデニリル（３’−５’）アデノシンを、「pA2'pA2'pA」は５’−ホスホアデニリル（２’−５’）アデニリル（２’−５’）アデノシンを、「pA3'pA3'pA」は５’−ホスホアデニリル（３’−５’）アデニリル（３’−５’）アデノシンをそれぞれ示す。１酵素活性はA2'pAを基質とした場合を１として算出した相対値。２文献値（Schmidt, A., et al., Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  76,  p4788-4792(1979)）。３文献値（Johnston, M.I., et al., J.  Biol.  Chem.,  262,  p8377-8382(1986)）
【図８】（上パネル：Ａ）Ａ−７４５２８が濃度依存性にヒト２’−ＰＤＥを阻害することを示す図。（下パネル：Ｂ）インターフェロン（ＩＦＮ）存在下又は非存在下における、種々の濃度のＡ−７４５２８によるウイルス複製抑制活性を示す図。Ａ−７４５２８の濃度は、黒塗りカラムが０μｇ／ｍｌ、白抜きカラムが２５μｇ／ｍｌ、ドットカラムが５０μｇ／ｍｌ、斜線カラムが１００μｇ／ｍｌである。
【図９】インターフェロン（ＩＦＮ）存在下又は非存在下における、ヒト２’−ＰＤＥ特異的ｓｉＲＮＡ（2'-PDE  specific  siRNA)）および対照ｓｉＲＮＡ（control  siRNA）によるウイルス複製抑制活性を示す図。白抜きカラムはｓｉＲＮＡ未添加、黒塗りカラムは２’−ＰＤＥ特異的ｓｉＲＮＡ添加、ドットカラムは対照ｓｉＲＮＡ添加をそれぞれ示す。
【図１０】（上パネル：Ａ）ヒト２’−ＰＤＥ安定発現株の取得を示す図。＃６株は高発現株、＃１０は低発現株。（中央左パネル：Ｂ）インターフェロン−α（INF-α）は濃度依存性にＰＣ−３細胞（◆）の増殖を抑制したが、２’−ＰＤＥを発現している＃６株（■）および＃１０株（□）では当該抑制効果が減弱しており、当該減弱の程度は２’−ＰＤＥの発現の高さと相関していたことを示す図。（中央右パネル：Ｃ）インターフェロン−γ（INF-γ）は濃度依存性にＰＣ−３細胞（◆）の増殖を抑制したが、２’−ＰＤＥを発現している＃６株（■）および＃１０株（□）では当該抑制効果が減弱しており、当該減弱の程度は２’−ＰＤＥの発現の高さと相関していたことを示す図。（下パネル：Ｄ）ｄｓＲＮＡは濃度依存性にＰＣ−３細胞（◆）の増殖を抑制したが、２’−ＰＤＥを発現している＃６株（■）および＃１０株（□）では当該抑制効果が減弱しており、当該減弱の程度は２’−ＰＤＥの発現の高さと相関していたことを示す図。
【図１１】部分精製された短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図。約６６ｋＤのバンドが短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）と対応していた。
【図１２】（上パネル：Ａ）短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）に相当するバンドを酵素消化させるにより得られた４種の質量スペクトルデータを結合させ、データベース検索ソフトウェア（Ｍａｓｃｏｔ：マトリックス・サイエンス社製）を用いて、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対してマップした図。（下パネル：Ｂ）短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）に相当するバンドを酵素消化させるにより得られたペプチドのうち、モノアイソトピック質量４５１．７５を前駆体イオンとするタンデム質量分析スペクトルを示す図。配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列中の、３５番目のメチオニンをアミノ末端とし且つアミノ末端がアセチル化されたオリゴペプチドが、ＭＳ／ＭＳスペクトルに良好に帰属された。
【図１３】短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）の等電点電気泳動の結果を示す図。ｐＩ６．０のバンドが短鎖型２’−ＰＤＥ（３５−６０９）と対応していた。
【配列表フリーテキスト】
【０２０６】
配列番号６：ヒト２’−ＰＤＥをコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマー１
配列番号７：ヒト２’−ＰＤＥをコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチド・プライマー２
配列番号８：ヒト２’−ＰＤＥの機能発現に適用され得る組換プラスミドＤＮＡを構築するためのオリゴヌクレオチド・プライマー３  
配列番号９：ヒト２’−ＰＤＥの機能発現に適用され得る組換プラスミドＤＮＡを構築するためのオリゴヌクレオチド・プライマー４  
配列番号１１：ヒト２’−ＰＤＥをコードするｍＲＮＡを不活性化するためのｓｉＲＮＡ１
配列番号１２：ヒト２’−ＰＤＥをコードするｍＲＮＡを不活性化するためのｓｉＲＮＡ２
配列番号１３：対照実験用のｓｉＲＮＡ３
配列番号１４：対照実験用のｓｉＲＮＡ４
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
0003678734.tif 000005
【図３ｂ】
0003678734.tif 000006
【図３ｃ】
0003678734.tif 000007
【図４】
0003678734.tif 000008
【図５】
0003678734.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0003678734.tif 000014
【図１１】
0003678734.tif 000015
【図１２】
0003678734.tif 000016
【図１３】
0003678734.tif 000017
【配列表】
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