(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の酵素学的性質を有するプロテアーゼ。
（１）作用
分子量約１３万の熱変性コラーゲン及び分子量約３０万の未変性可溶化コラーゲンを分子量約７万と分子量約４万のペプチドに分解する限定分解活性を示すが、コラゲナーゼ基質であるＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの合成基質に対してはわずかに分解活性を示し、ＤＮＰ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの合成基質に対しては、分解活性を示さない。
（２）至適pH
pH５．５〜７
（３）至適温度
３７〜４０℃
（４）分子量
２３，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
（５）酵素阻害
ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインにより活性阻害を受けるが、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ヨードアセトアミドによる活性阻害は少ない。
【請求項２】
オウレオバクテリウム エスピー（Aureobacterium sp.）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉと命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６８６７として寄託された微生物。
【請求項３】
請求項２記載の微生物を培養し、その培養物から請求項１記載のプロテアーゼを採取することを特徴とする請求項１記載のプロテアーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱変性コラーゲン（ゼラチン）及び未変性可溶化コラーゲンに対し限定分解活性を示す新規なプロテアーゼ、これを生産する微生物及びこのプロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
熱変性コラーゲンたるゼラチンは、ゲル化剤、起泡剤、増粘剤等として食品、化粧品等に広く用いられ、また、医薬のカプセルとしても用いられている。一方、コラーゲンは、エラスチンとともに動物の結合組織を構成する繊維状タンパク質であり、食品、化粧品、医薬品、塗料、プラスチック材料等の用途がある。
【０００３】
ゼラチンやコラーゲンは、分子量が通常１０万〜３０万程度であり、通常の消化ゼラチンや消化コラーゲンは分子量が１万以下である。
【０００４】
しかしながら、上記の如き多種多様な用途を考慮すると、所望の性質、例えば、低抗原性、易溶解性、低ゲル化強度、易フィルム形成性、易包接性等をもつものが要求され、このため分子量が上記以外のものが求められる。
【０００５】
従来、ゼラチンやコラーゲンを分解し、より低分子量のものとするには、プロテアーゼやコラゲナーゼが用いられ、これら酵素は、アクロモバクター  イオファーガス（Achromo-bactor iophagus）やクロストリジューム  ヒストリチカム（Clostridium histolyticum）を培養することにより得られることが知られている。
【０００６】
しかしながら、これらの微生物は病原性が確認されており、かつ嫌気的条件下で培養しなければならない等の問題点があり、これらの微生物から大量の酵素を得るためには、煩雑な操作が必要であった。また、これら微生物から得られる酵素は、ゼラチンやコラーゲンを最小単位（分子量数１００〜数１０００）まで分解してしまい、適度の分子量を持つゼラチンやコラーゲンの分解物を得ることができないものであった。
【０００７】
また、小腸由来のコラゲナーゼも知られているが、このものは高価であり、かつ、これを得るためには、煩雑な操作が必要で、多量に調整する事は困難であるため、これを用いることは工業的に有利な方法とは言い難いものであった。更にこのコラゲナーゼは、コラーゲンを分子量数１００〜数１０００に分解してしまうものであった。
【０００８】
従って、本発明の目的は、適度な分子量のゼラチンやコラーゲンの分解物を製造するための酵素、この酵素を産生する微生物及び当該酵素の製造法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情において、本発明者は、ゼラチン及びコラーゲンを適度な分子量のペプチドに分解する酵素を自然界に求め鋭意探索した結果、分子量約１３万のゼラチン及びコラーゲンを分子量約７万と約４万のペプチドに分解する酵素を産生する微生物を土壌中に見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、次の酵素学的性質を有するプロテアーゼ、これを産生する微生物、この微生物を利用した当該プロテアーゼの製造法を提供するものである。
【００１１】
（１）作用
分子量約１３万の熱変性コラーゲン及び分子量約３０万の未変性可溶化コラーゲンを分子量約７万と分子量約４万のペプチドに分解する限定分解活性を示すが、コラゲナーゼ基質であるＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの合成基質に対してはわずかに分解活性を示し、ＤＮＰ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの合成基質に対しては、分解活性を示さない。また、アゾコール及びカゼインに対して分解活性を示す。なお、ここでＤＮＰはジニトロフェニル基を示し、ＤはＡｒｇがＤ体であることを示す。
（２）至適pH
pH５．５〜７
（３）至適温度
３７〜４０℃
（４）分子量
２３，０００±２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）
（５）酵素阻害
ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインにより活性阻害を受けるが、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ヨードアセトアミドによる活性阻害は少ない。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のプロテアーゼは、例えばオウレオバクテリウム（Aureobacterium）属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。
【００１３】
斯かるオウレオバクテリウム属に属する本発明プロテアーゼ生産菌としては、上記の本発明プロテアーゼを生産するものである限り特に制限されないが、例えば次の菌学的性質を示すＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉ株が挙げられる。
【００１４】
（１）形態
細胞の大きさ            ０．４〜０．６×０．６〜３μｍ
細胞の形                短桿〜桿菌
細胞の多形性            あり
運動性の有無            なし
べん毛の有無            なし
グラム染色性            陽性
【００１５】
（２）各培地における生育状況
肉汁寒天平板培養        コロニー円形、光沢あり、黄色、半球状
肉汁寒天斜面培養        画像状に生育、光沢黄色コロニー
肉汁液体培地            均一に濁る
肉汁ゼラチン培地        液化
リトマス・ミルク        ピンクに変色、２層分離
【００１６】
（３）生理学的性質
硝酸塩の還元            −
ＶＰテスト              −
インドールの生成        −
ＩＰＡ反応              −
硫化水素の生成          −
色素の生成              −
ウレアーゼ              −
（クリステンゼン培地）  −
オキシダーゼ            −
生育の範囲
温度                  ２０〜３５℃（至適温度２８℃）
pH                    ５．５〜１０．０（至適pH７．０付近）
酵素に対する態度          好気的
ＯＦテスト                酸化
ガスの生成
（クリグラー培地）        −
アシルアミダーゼ          −
ＤＮａｓｅ                ＋
耐塩性                    ＮａＣｌ  １０％未満
運動性                    −
【００１７】
糖から酸の生成
グルコース    嫌気的    −
好気的    ＋
マルトース              ＋
キシロース              −
マンニトール            −
乳糖分解                  −
デカルボキシラーゼ反応
リジン                  −
オルニチン              ＋
アルギニン加水分解試験    −
クエン酸の利用            −（生育せず）
【００１８】
炭素源の資化
Ｄ−グルコース          ＋
Ｌ−アラビノース        −
Ｄ−キシロース          −
Ｄ−ガラクトース        ＋
Ｄ−フルクトース        ＋
Ｄ−マンニトール        −
Ｄ−ソルビトール        −
Ｄ−ラムノース          −
Ｄ−ソルボース          −
Ｌ−アルギニン          −
Ｌ−オルニチン          −
Ｌ−スレオニン          −
Ｄ−バリン              −
酢酸                    −
尿酸                    ±
マロン酸                −
コハク酸                ＋
クエン酸                −
マレイン酸              −
フマール酸              −
グルコン酸              −
イタコン酸              −
グリセリン              ＋
コール酸                −
【００１９】
（４）細胞壁構成成分
Ｄ−オルニチン、Ｌ−アラニン、グリシンを含む
（５）キノン分析
ユビキノンを認めず、ＭＫ−９  ２．７％、ＭＫ−１０  ８．２％、ＭＫ−１１  ３０．５％、ＭＫ−１２  ５４．５％含有する。
（６）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
６７．１mol％
【００２０】
以上の菌学的諸性質を、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）の記載に照らして検討すると、本菌株は桿菌、グラム陽性であり、細胞壁構成成分、キノン分析、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量等の結果より、オウレオバクテリウム・エスピー（Aureobacterium sp.）に属する事が確認された。しかしながら、本菌株は公知の菌株とは異なるので、オウレオバクテリウム・エスピー（Aureobacterium sp.）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１５３２６として寄託した。
【００２１】
本菌株を用いて、目的とするプロテアーゼを得るためには、当該菌体を培地に接種し、常法に従って培養し、得られた培養物から該プロテアーゼを採取すればよい。
【００２２】
ここで使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該菌体が生育可能なものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。
【００２３】
窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されないが、例えば窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、
炭素源としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、
無機塩類としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。
【００２４】
培地のpHは６〜７程度が好ましく、培養温度は２８〜３０℃で、２０〜４８時間振とう培養することが好ましい。
【００２５】
培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。すなわち、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、硫酸アンモニウム沈澱法、限外濾過膜による濃縮等を用い、カラムクロマトグラフィー等により精製する方法が挙げられる。
【００２６】
このようにして得られるＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉ由来のプロテアーゼは以下に示す酵素学的性質を有する。
【００２７】
（酵素学的性質）
１．基質特異性（表１）
１−１  分解使用基質として、未変性可溶化コラーゲン（Ｍ．Ｗ．３０万、宮城化学工業株式会社）、熱変性コラーゲン（Ｍ．Ｗ．１３万、ゼラチン化基質）（宮城化学工業株式会社製）、豚皮ゼラチン（Ｍ．Ｗ．１３万、宮城化学工業株式会社製）、牛骨ゼラチン（Ｍ．Ｗ．１３万、宮城化学工業株式会社製）を基質とし、各０．１％溶液に１／１０量の酵素液を添加し３７℃での分解活性を、ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％ゲル）の電気泳動法により確認した。
この結果、ゼラチンに強い限定分解活性（分子量約７万と約４万に分解）を示し、コラーゲンにも同様の限定分解活性を示した（図１）。
また、乳製カゼインについても、分解が確認された。これらの事から、基質に対する種特異性はない事が確認された。
【００２８】
１−２  アゾコール試薬での活性測定法として、アゾコール試薬｛アゾコール試薬（CALBIOCHEM）４mg／ml、０．０５％  Ｂｒｉｊ３５、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０mM  ＣａＣｌ2、０．０２％  ＮａＮ3、５０mM  ＭＥＳ        pH５．５｝を調製し、アゾコール試薬１mlに各希釈酵素液１００μｌ（−Ｈ2Ｏブランク）を加え、３７℃３０分反応を行い、（１０分毎に転倒混和）、直ちに遠心分離（１０，０００rpm、２０sec）後、上清について波長５２０nmによる測定を行った。（３０分で吸光度１．００上昇させる酵素量を１単位とする）
この結果、アゾコール試薬に強い色素可溶化作用を示した。
【００２９】
１−３  合成基質でのコラゲナーゼ活性の測定は、合成基質ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−ＡｒｇとＤＮＰ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇの２種を用いて、３０℃３０分反応を行った。反応後、上清について波長３６５nmによる吸光度の測定を行った。
その結果、合成基質ＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−ＡｒｇとＤＮＰ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｄ−Ａｒｇに対し、Ｐｒｏが入った基質はわずかに分解活性を示し、Ｐｒｏが入っていない基質は分解活性を示さない。
【００３０】
【表１】
0003652526.tif 000002
【００３１】
２．反応至適温度
各温度で、アゾコール試薬を用い酵素液と３０分反応させ、波長５２０nmで吸光度の測定を行った。
その結果、至適温度は３７〜４２℃で、４０℃で活性最大値を示した（図２）。
【００３２】
３．温度安定性
各温度で酵素液を１時間放置し、その酵素液について、３７℃３０分でのアゾコール分解活性を測定した。
その結果、−８０℃及び氷冷下では安定で、３０℃１時間で７０％の活性低下、４０℃１時間では１００％活性低下を示した（図３）。
【００３３】
４．至適pH
下記の条件で緩衝液を調製し測定を行った。
緩衝液はpH３．０〜５．０で酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、pH５．０〜９．０はＭＥＳ−ＨＥＰＥＳ−ホウ酸緩衝液をpH０．５刻みで用い、各緩衝液にアゾコール試薬を入れた物を調製し、酵素液を３７℃３０分反応させ、波長５２０nmの吸光度を測定した。
その結果、至適pHはpH５．５〜７．０であった（図４）。
【００３４】
５．pH安定性
上記各緩衝液に酵素液を入れ、緩やかに攪拌しながら１時間氷冷した。その酵素液を用い、３７℃３０分反応させアゾコール分解活性を測定した。
その結果、pH５．５〜９．０で安定であった。（図５）。
【００３５】
６．酵素阻害
下記条件で、阻害剤を調製し測定を行った。
阻害剤としてエチレンジアミン四酢酸、２−メルカプトエタノール、Ｎ−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システイン、ヨードアセトアミドの入ったアゾコール試薬を調製し、酵素液を加え、３７℃３０分反応させアゾコール分解活性を測定した。
その結果、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインで酵素阻害が見られた（表２）。
【００３６】
【表２】
0003652526.tif 000003
【００３７】
７．分子量
分子量は、ポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動で測定を行った。
すなわち、ポリアクリルアミドゲル１５／２５％（第一化学薬品（株））、使用分子量マーカーとして、タンパク質分子量マーカー「第一」III（第一化学薬品（株））を使用し、ＳＤＳ及び還元剤入りサンプル処理とサンプルを１：１に混合し、９０℃５分加熱処理を行ったものを用いた。電気泳動は、電気泳動操作法に準拠し、染色法は銀染色法に準拠した（第一化学薬品（株））。
染色後、分子量マーカー及びタンパクの移動度から分子量を２３，０００±２，０００と決定した（図６）。
【００３８】
８．金属イオンの影響
金属イオンとしてカルシウムイオン（ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、コバルトイオンＣｏ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・４Ｈ2Ｏ、マンガンイオン（ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ）、マグネシウムイオン（ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）をアゾコール試薬に添加し、３７℃３０分反応させアゾコール分解活性を測定した。
その結果、カルシウムイオンと、コバルトイオンに活性促進効果が確認され、マンガンイオンと、マグネシウムイオンに活性阻害効果が確認された（表３）。
【００３９】
【表３】
0003652526.tif 000004
【００４０】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは、分子量約１３万〜３０万のゼラチン及びコラーゲンを分子量約７万と４万のペプチド分解することができ、この分解物は、例えば抗原性の低さ、易溶解性、低ゲル化強度、易フィルム形成性、易包接性等の特徴を生かし、新たな用途が期待できる。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１
宮城県仙台市の土壌試料０．１〜０．２ｇを改良スタイナー基礎培地（０．５Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4−ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（pH６．８）８０ml／ｌ、Ｈｕｎｔｅｒ無機塩溶液２０ml／ｌ、酵母エキス０．１ｇ／ｌ、０．３％ゼラチン及びコラーゲン溶液３００ml／ｌ）からなる培地懸濁し、３０℃で振盪培養を行った。
この、培養上清液を電気泳動によりゼラチン及びコラーゲンを、限定分解する菌株の存在を確認した土壌試料培養液を、適当な増殖用平板培地に蒔きコロニー形成を行った。
再度、このコロニーについてゼラチン及びコラーゲン入りの培地で培養を行い、限定分解活性を確認し、本菌株、オウレオバクテリウム・エスピー（Aureobacterium sp.）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉを分離することができた。
【００４３】
実施例２
本分離菌株オウレオバクテリウム・エスピー（Aureobacterium sp.）ＭＩＭ−ＣＧ−９５３５−Ｉを、増殖培地（表４）で好気的に２８℃、１６〜２４時間培養した。培養後遠心分離により菌体を分離した培養液に、硫酸アンモニウムを加えて５５％飽和沈澱画分を遠心分離にて集めた。
この沈澱を、２０mM  Ｔｒｉｓ塩酸（pH７．５）、８mM塩化カルシウム、０．１Ｍ硫酸アンモニウム緩衝液に溶解し、同緩衝液０．８Ｍ硫酸アンモニウム濃度に調製後遠心分離を行い上清を得た。
この溶液をブチルトヨパール（Butyl-TOYOPEARL）「東ソー株式会社」カラムにかけ、硫酸アンモニウム０．８Ｍ〜０．１Ｍリニアグラジェントにて溶出を行い、溶出される活性タンパク画分をアゾコール試薬及び電気泳動にて確認を行った。
更に、活性画分を硫酸アンモニウム７０％飽和で沈澱画分を集め、２０mM  Ｔｒｉｓ塩酸（pH７．５）、８mM塩化カルシウム緩衝液で透析を行い、スーパーＱトヨパール（Super Q TOYOPEARL）「東ソー株式会社」カラムにかけ、塩化ナトリウム０〜０．３Ｍ  リニアグラジェントにて溶出した。活性タンパク画分を、アゾコール及び電気泳動にて確認を行った（表５）。
この、得られた活性タンパクを限外濾過膜Ｍ．Ｗ．１万膜にて濃縮を行い、１０mM  ＭＥＳ（pH５．５）、１５０mM塩化ナトリウム、５mM塩化カルシウム緩衝液で透析を行い精製標品とした。
この得られた酵素は、ポリアクリルアミドゲル（１５〜２５％ゲル）の電気泳動法で、単一バンドとして確認された（図６）。
【００４４】
【表４】
0003652526.tif 000005
【００４５】
【表５】
0003652526.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプロテアーゼにより分解されたゼラチンの電気泳動を示す図である。
【図２】本発明のプロテアーゼの温度と分解率を示す図である。
【図３】本発明のプロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図４】本発明のプロテアーゼのpHと分解率を示す図である。
【図５】本発明のプロテアーゼのpH安定性を示す図である。
【図６】本発明のプロテアーゼの分子量を示す電気泳動図である。
【図１】
0003652526.tif 000007
【図２】
0003652526.tif 000008
【図３】
0003652526.tif 000009
【図４】
0003652526.tif 000010
【図５】
0003652526.tif 000011
【図６】
0003652526.tif 000012