(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼの酵素活性を、化学発光基質、反応増感剤及び酸化剤を用いる化学発光により測定する試薬であって、これらを化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH９〜１３に調製された試薬（１）と酸化剤を含有するpH４〜８に調製された試薬（２）して保存してなること、化学発光基質がルミノール類であること、反応増感剤がフェノール誘導体であること、及び酸化剤が過酸化水素、過硼素酸塩又は過酸化尿素であることを特徴とする化学発光測定試薬。
【請求項２】
化学発光基質がルミノール又はイソルミノールである請求項１記載の化学発光測定試薬。
【請求項３】
酸化剤が過酸化水素である請求項１又は２記載の化学発光測定試薬。
【請求項４】
反応増感剤が４−[４′−(２′−メチル)チアゾリル]フェノール、４−(４′−チアゾリル)フェノール、４−[４′−(２′−(３′−ピリジル))チアゾール]フェノール、４−(２′−チエニル)フェノール、４−[２′−(４′−メチル)チアゾリル]フェノール、フェノチアジン−Ｎ−プロピルスルフォネート又はフェノールインドフェノールである請求項１〜３のいずれかに記載の化学発光測定試薬。
【請求項５】
ペルオキシダーゼが標識された西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載の化学発光測定試薬。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の化学発光測定試薬を用いることを特徴とする化学発光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ペルオキシダーゼの酵素活性を、増感剤の存在下での化学発光により測定する化学発光測定試薬及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、放射性同位元素を用いる測定方法に変わって、化学発光を用いる方法が普及し始めている。化学発光を用いる方法では、測定対象物質の増減に応じて変化する標識物質として、化学発光基質または酵素を使用する方法がある。しかし、発光の持続性に起因する測定装置の汎用性や測定精度の点で、酵素を標識する方法が優れた方法である。標識する酵素にも種々あるがペルオキシダーゼが多く利用されており、ペルオキシダーゼを標識物質とする系において、ルミノールなどの化学発光基質と酸化剤の存在下で生じる化学発光を測定する方法が主に用いられている。この反応を増感剤を用いて増感する方法が感度の良い方法として知られており、種々の増感剤が開発されている（Methods in Enzymology,Vol.133,p.331-353,1986、特開平２−２９１２９９号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２号公報、特表平１−５０３７３０号公報等）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
試薬の構成として、上記特開昭５９−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２号公報等には、ペルオキシダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の４つを別々の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反応を開始させることが記載される。さらに具体的には、使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始させることが記載されている。また、上記特開平２−２９１２９９号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使用の約２時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加えて混合した混合液を、反応系に添加することが記載されている。
一般に、これらの化学発光反応を利用する測定方法が適用される分析対象物質は超微量であることが多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに高感度でかつ安定な測定ができる、保存安定性の高い試薬の開発が望まれている。
本発明はこれらの課題を解決するものであり、特に保存安定性に優れた簡便で精度の良い化学発光測定試薬及び測定方法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、ペルオキシダーゼの酵素活性を、化学発光基質、反応増感剤及び酸化剤を用いる化学発光により測定する試薬であって、これらを化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH９〜１３に調製された試薬▲１▼と酸化剤を含有するpH４〜８に調製された試薬▲２▼として保存してなる化学発光測定試薬並びにこの試薬を用いることを特徴とする化学発光測定方法に関する。
【０００５】
本発明の試薬を用いる化学発光測定は、増感剤の存在下に、ペルオキシダーゼの触媒作用により化学発光基質及び酸化剤を反応させ、生じた発光を検出・定量する方法であれば特に限定するものではない。ペルオキシダーゼは一般に標識酵素として用いられるが、非標識体のまま用いることもできる。例えば、標識酵素として用いる特異的結合反応として、一抗体免疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッチ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェスタン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用できる。
【０００６】
本発明で用いられるペルオキシダーゼは特に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの各型が知られているが、これらの中ではＣ型がＲＺ値（ヘミンとタンパク質の比を示す）及び酵素活性の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡（株）から市販され入手可能である。
【０００７】
化学発光反応に用いる化学発光基質としては、ルミノール類、ロフイン、ルシゲニンなどがあるが、ルミノール類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール等が挙げられる。中でも、ルミノール又はイソルミノールが安定性や発光効率の点で好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノールは、通常入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いので、再結晶を繰り返し、精製したものを用いるのが好ましい。
【０００８】
化学発光に用いる酸化剤としては、過酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが好ましいものとして挙げられるが、特に過酸化水素が取扱いやすさの点で好ましい。
化学発光反応に用いる増感剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば特に限定するものではないが、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロムフェノール、フェノールインドール、４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール、４−(４′−チアゾリル)フェノール、４−[４′−(２′−(３′−ピリジル))チアゾール]フェノール、４−(２′−チエニル)フェノール、４−[２′−(４′−メチル)チアゾリル]フェノール、フェノチアジン−Ｎ−プロピルスルフォネート又はフェノールインドフェノール等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾール、４−（４−ハイドロキシフェニル）チアゾール等のチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジル）−プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジエチルアニリンなどが好ましいものとして用いられる。中でも好ましいものは、４−[４′−(２′−メチル)チアゾリル]フェノール、４−(４′−チアゾリル)フェノール、４−[４′−(２′−(３′−ピリジル))チアゾール]フェノール、４−(２′−チエニル)フェノール、４−[２′−(４′−メチル)チアゾリル]フェノール、フェノチアジン−Ｎ−プロピルスルフォネート又はフェノールインドフェノールであり、特に好ましいものは、Ｓ／Ｎ比（シグナルとノイズの比）が高い点で４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノールである。
【０００９】
本発明の試薬においては、これらを化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH９〜１３に調製された試薬▲１▼と酸化剤を含有するpH４〜８に調製された試薬▲２▼の２液として保存する。酸化剤を含有する試薬▲２▼はpHが上記範囲より高すぎても低すぎても安定な試薬にならない。また、化学発光基質及び反応増感剤を含有する試薬▲１▼はpHが低すぎると不安定になる。
上記pHとするために、各試薬に用いる緩衝液としては、試薬▲２▼（pH４〜８）にはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましいものとして使用でき、試薬▲１▼（pH９〜１３）にはホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、アンモニウム緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が好ましいものとして用いられる。これらの緩衝液の組み合わせは任意に選択することが出来、それぞれの濃度とpHにより両試薬が混ざった時の最終反応液のpHや塩濃度を調整し最適反応条件にすることができる。
最終反応液の好ましいpHは８〜１０であり、このpHが低すぎると感度が低下しやすく、高すぎるとブランクが高くなりすぎる。
【００１０】
各試薬中の成分濃度は、使用する成分の種類、試薬▲１▼と試薬▲２▼の混合割合等により違ってくるが、最終反応液の濃度が以下に示す範囲に入るようにすれば良い。すなわち最終反応液中の酸化剤（例えば過酸化水素）濃度は０．１〜１０ｍＭの範囲が好ましく、これより少ないと基質不足により感度が低下する傾向にあり、多すぎると酵素活性を阻害し感度が低下する傾向にある。
化学発光基質（例えばルミノール）の最終反応液中の濃度は０．１〜１００ｍＭの範囲が好ましく、この範囲を外れると感度が低下する傾向にある。
反応増感剤の濃度は、使用する物質、測定するペルオキシダーゼの濃度範囲等で最適濃度が違ってくるので、特に制限されるものではない。例えばｐ−ヨードフェノールの場合は０．０１〜１０ｍＭの範囲が好ましく、４−〔４′−（２′−メチル）チアゾリル〕フェノールの場合は０．００１〜１０ｍＭの範囲で使用するのが好ましい。各反応増感剤の濃度がこの範囲を外れると増感効果が低下する傾向にある。
【００１１】
本発明に用いる、化学発光基質及び反応増感剤を含有するpH９〜１３に調製された試薬▲１▼と酸化剤を含有するpH４〜８に調製された試薬とは、測定されるペルオキシダーゼが入った反応容器に、測定時に同時に又は順次に分注することにより混合しても良いし、測定前に両液を混合し１液にして測定時に反応容器に分注してもよい。なお、予め混合し１液にした場合は発光液の感度が徐々に低下し、通常室温で数日しか使用できないので混合後早めに使用するのが好ましい。
本発明に用いる酸化剤を含有するpH４〜８の範囲に調製された試薬には測定精度を向上させるため、さらに蛋白成分や界面活性剤等を含有してもよい。
【００１２】
本発明の試薬を用いることのできる測定対象物は、ペルオキダーゼを直接測定すること又は標識酵素として用いて測定することにより、測定できるものであれば特に制限されるものではない。例えば、酵素免疫測定法に用いることにより、pg／mlオーダーまでの高感度測定が可能となるので、例えば成長ホルモン（ＧＨ）、エンドセリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、遊離サイロキシン４（ＦＴ４）などのペプチドホルモンやサイトカインなどの微量生体成分等の測定試薬として適用できる。
【００１３】
実施例１  試薬の安定性に及ぼすpHの影響
ストリップ型黒色マイクロウェル（ＮＵＮＣ社製）にペルオキシダーゼ溶液  （西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼＣ型をＰＢＳ溶液に溶解、濃度１００pg／ml）を５μｌ入れる。次に１ｍＭ過酸化水素を含有する発光液Ａ（１０ｍＭりん酸緩衝液又はほう酸緩衝液でpH９から３までの水溶液を調製）１００μｌと０．１６ｍＭ ４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール及び１０ｍＭ ルミノールを含有する発光液Ｂ（pH９〜１３、１００ｍＭほう酸緩衝液で対応する発光液Ａと混合したとき最終pHが９となるように調製）１００μｌを分注する。撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)社製、MLR-100)を用いて、５分後の化学発光量を測定した。
ここで、発光液Ａ及び発光液Ｂの両試薬を３７℃に保管した苛酷試験により、保存安定性を評価した結果を図１に示した。これから分かるように、発光液ＡのpHが４〜８の範囲にあるとき（このとき発光液ＢはpHが９〜１３にある）安定なことがわかった。
【００１４】
実施例２  酵素免疫測定法への応用
本化学発光測定試薬の酵素免疫測定法への応用として血清中の成長ホルモン  （ＧＨ）の測定を検討した。
抗ＧＨモノクローナル抗体を感作したストリップ型黒色マイクロウェル（ＮＵＮＣ社製）に血清２５μｌとビオチン化抗ＧＨヒツジ抗体溶液１００μｌを分注し、６０分間室温で攪拌しながらインキュベーションした。０．０５％（ｖ／ｖ）ツィーン２０含有ＰＢＳで４回洗浄した後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ溶液を１００μｌ分注し、１０分間室温で攪拌しながらインキュベーションした。０．０５％（ｖ／ｖ）ツィーン２０含有ＰＢＳで４回洗浄した後、実施例１と同様の発光液Ａ（pH７）とＢ（pH１０）を１００μｌずつ分注した。撹拌混合し、化学発光測定装置(コロナ電気(株)製、MLR-100)を用いて、５分後の化学発光量を測定した。
血清の代わりにＧＨの濃度既知標準血清を用いて検量線を求めたところ図２に示すように良好な検量線が得られた。３種の同一検体を繰り返し１０回測定し、同時再現性を求めた結果、表１のように良好な同時再現性が得られた。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【発明の効果】
本発明の化学発光測定試薬は、特に保存安定性に優れ、また簡便で精度の良い測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例における種々のpHの発光液Ａ及び発光液Ｂの両試薬を３７℃に保管した苛酷試験により保存安定性を評価したグラフである。なお、１ルミカウントの発光量は１．２×１０-16Ｗである。
【図２】本発明の実施例におけるＧＨ定量用の検量線を示すグラフである。なお、１ルミカウントの発光量は１．２×１０-16Ｗである。
【図１】
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【図２】
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