(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質抗原をラテックスからなる不溶性担体に担持させる抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法であって、
前記脂質抗原は、カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなり、
前記脂質抗原を前記不溶性担体に担持させる工程において、脂質抗原が不溶性担体１０μｇに対してカルジオリピンは０．０１〜１．０μｇ、レシチンはカルジオリピンの３〜１５倍量、コレステロールはカルジオリピンの１〜５倍量の割合で配合されてなり、反応温度が３０〜５５℃であり、反応時間が１〜１０時間である
ことを特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法。
【請求項２】
不溶性担体は、ポリスチレン又はスチレン−スチレンスルホン酸共重合体からなるラテックスである請求項１記載の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法により得られることを特徴とする抗リン脂質抗体測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂質抗原を用いる免疫学的診断試薬に関する。特に、梅毒の検査に用いる免疫学的診断試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  Ｐａｌｌｉｄｕｍ）が生体に感染すると、該病原体に対する抗体とともに、リン脂質と反応性を持つワッセルマン抗体が産生される。
従来の梅毒の検査法は、梅毒菌体に対する抗体を検出するために、梅毒菌体から抽出した抗原そのものを用いる方法と、ワッセルマン抗体を検出するために、カルジオリピンを含む脂質類を抗原として用いる方法との２つに大別される。
【０００３】
現在、脂質抗原を用いる方法としては、ＶＤＲＬ法、緒方法、ＲＰＲ（Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｒｅａｇｉｎ）法、ガラス板法等があるが、定性スクリーニングには、ＲＰＲ法、ガラス板法が主に行われている。
このような脂質抗原を用いる検査法は、梅毒以外の疾患においても陽性反応を呈する欠点を有しているが、ワッセルマン抗体は梅毒の感染状態をよく反映する利点を有している。これを利用して梅毒治療経過を追うこと等にも応用されている。
【０００４】
上記ＲＰＲ法は、カルジオリピン及びレシチンを含む脂質をカオリン又は炭素末に吸着させたものを、白色プレート上で検体と混合し、カオリン又は炭素末の凝集の有無を判定する方法である。
上記ガラス板法は、ガラス板上において、カルジオリピン、レシチン及びコレステリンを含む脂質抗原液を検体と混合し、コレステリン結晶の凝集の有無を判定する方法である。
【０００５】
上記２つの方法は用手法であるので、大量の検体を検査する場合には適していない。また、ＲＰＲ法の場合には、炭素末の凝集を目視で判定を行い、ガラス板法の場合には、コレステリン結晶の生成を顕微鏡下で観察し判定を行うので、判定には熟練を要する。よって判定者によっては判定結果が異なることも起こり得る等の欠点を有していた。
【０００６】
特開平４−２０４２５７号公報には、カルジオリピンを含む脂質抗原ミセルを作成し、これを室温で不溶性担体であるマイクロタイタープレートに吸着させる測定試薬の製造方法が開示されている。この測定試薬による抗リン脂質抗体検出法は、凝集の程度を吸光度で測定するので、陰陽の判定は客観的に行うことができるが、マイクロタイタープレートへの試薬の分注や検体の分注が手作業となり、操作が煩雑である等の問題があった。
【０００７】
特開平５−３１２８０８号公報には、担体に固相化された脂質抗原と検体中に含まれる目的抗体との抗原抗体反応を行い、ついで、磁界の存在下で、脂質抗原に結合した目的抗体とこの目的抗体に対する抗体で感作した磁性粒子との抗原抗体反応を行って担体上にパターンを形成させることにより、抗リン脂質抗体の検出を行い、梅毒の検査を行う場合には、１〜５０重量％のカルジオリピンを含有する脂質抗原を用いる検出法が開示されているが、磁力をかける装置等が必要であり汎用性に乏しい欠点があった。
上述のように、一般的な生化学自動分析機に適用することが可能な抗リン脂質抗体測定試薬はこれまでなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、迅速、簡便に大量の検体を測定することができ、かつ、客観性が高い梅毒の検出法に用いることができる抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法及び試薬を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１記載の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法は、脂質抗原をラテックスからなる不溶性担体に担持させる抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法であって、前記脂質抗原は、カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなり、前記脂質抗原を前記不溶性担体に担持させる工程において、脂質抗原が不溶性担体１０μｇに対してカルジオリピンは０．０１〜１．０μｇ、レシチンはカルジオリピンの３〜１５倍量、コレステロールはカルジオリピンの１〜５倍量の割合で配合されてなり、反応温度が３０〜５５℃であり、反応時間が１〜１０時間であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項２記載の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法は、不溶性担体は、ポリスチレン又はスチレン−スチレンスルホン酸共重合体からなるラテックスである請求項１記載の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法である。
【００１１】
本発明の請求項３記載の抗リン脂質抗体測定試薬は、請求項１又は２記載の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法により得られることを特徴とする。
以下に本発明の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法を詳述する。
【００１２】
本発明においては、脂質抗原を不溶性担体に担持させる。
上記脂質抗原は、カルジオリピン、レシチン及びコレステロールからなり、不溶性担体１０μｇに対してカルジオリピンは０．０１〜１．０μｇ、好ましくは０．１〜０．８μｇ、レシチンはカルジオリピンの３〜１５倍量、好ましくは５〜１２倍量、コレステロールはカルジオリピンの１〜５倍量、好ましくは１〜４倍量の割合で配合されてなる。カルジオリピン量が０．０１μｇ未満となると、測定に十分な感度が得られず、１．０μｇを超えると非特異凝集が起こり沈殿が生じてしまうため上記範囲に限定される。レシチン量がカルジオリピンの３倍量未満であると、測定に必要な抗原性を持った脂質抗原が形成されず、カルジオリピンの１５倍量を超えると非特異凝集が起こり沈殿が生じてしまうため上記範囲に限定される。コレステロールは試薬測定系の感度を向上させるために添加されており、カルジオリピンの５倍量を超えると非特異凝集が起こり沈殿が生じてしまうため上記範囲に限定される。
【００１３】
本発明においては、脂質抗原を不溶性担体に担持させる工程における反応温度が３０〜５５℃である。３０℃未満であると、充分な感度を持つ測定試薬を作成することができず、５５℃を超えると、ラテックスがその安定性を保つことができず測定試薬を作成することができないので、上記範囲に限定される。より好ましくは、３５℃〜５０℃である。
【００１４】
本発明において、脂質抗原を不溶性担体に担持させる工程は、脂質抗原を不溶性担体と混合し物理化学的吸着を行う工程、及び、ブロッキング剤によりブロッキングを行い、脂質抗原担持不溶性担体を安定化させる工程からなる。
本発明においては、上記２つの工程のうち少なくとも上記物理化学的吸着を行う工程が、上記反応温度とされていることが必要である。
【００１５】
本発明において、脂質抗原を不溶性担体に担持させる工程の反応時間は、上記物理化学的吸着を行う工程と上記ブロッキングにより安定化させる工程（以下、この２つの工程をまとめて「感作工程」という）の２つの工程を併せて１〜１０時間に限定される。詳細には物理化学的吸着工程が０．５時間以上、安定化工程が０．５時間以上であることが好ましい。また、特に安定化工程を長時間にすることが望ましい。感作工程が１時間未満であると、物理化学的吸着又は安定化させるのに十分ではなくなり、１０時間を超えると不溶性担体粒子がその安定性を保つことができにくくなる（特に、反応温度が４５℃を超える場合）ので、上記時間に限定される。
【００１６】
上記不溶性担体としては、合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックスに限定される。
上記合成高分子としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。なかでも、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体が好ましい。
本発明において、上記ラテックスの粒径は０．１〜１．０μｍが好ましく、より好ましくは、０．１〜０．５μｍである。
【００１７】
上記ブロッキング剤としては特に限定されず、例えば、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン等のアルブミン；ヒト、ウシ、羊、ヤギ、ウサギ、マウス等の動物の血清等が挙げられる。
【００１８】
本発明によって作成された試薬は、適当な検体希釈液で希釈することによって使用することもできる。
上記検体希釈液としては、ｐＨ５．０〜９．０の緩衝液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。
【００１９】
上記検体希釈液には、測定感度の向上、及び、抗原抗体反応の促進のために、種々の増感剤を添加することができる。
上記増感剤としては、例えば、特開平２−１７３５６７号公報に記載されているメチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類；特開平５−１８０８３８号公報に記載されているプルラン及びポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００２０】
上記検体希釈液には、検体中に存在する他の物質により起こる非特異反応を抑制するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵性アルブミン等を添加することもできる。
【００２１】
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬は、本発明の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法により得られる。
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬は、凝集の程度を光学的に測定する一般の生化学自動分析機に適用させることができる。
【００２２】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
（１）脂質抗原液の作成
カルジオリピンのエタノール溶液（５ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）２ｍｌ、精製レシチン（ナカライテスク社製）のエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌ及びコレステロール（ナカライテスク社製）のエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを混合し、脂質抗原液を得た。
【００２４】
（２）脂質抗原感作ラテックス試薬の作成
ポリスチレンラテックス（平均粒径０．４μｍ、１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１００μｌを予め３７℃で攪拌しながらあたためておいた。これに先に作成した脂質抗原液２５０μｌを添加し、そのまま３７℃で２時間攪拌した。次に１％ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を含むリン酸塩緩衝食塩水（以下「ＰＢＳ」という）２ｍｌを添加し、更に１時間３７℃で攪拌した（感作工程は合計３時間となる）。１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を除き、沈殿したラテックスを再び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ３ｍｌに懸濁した。この操作を３回繰り返しラテックスを洗浄し、最後に１％ＢＳＡ、１０ｍＭＥＤＴＡ・４Ｎａ、５００ｍＭ塩化コリンを含むＰＢＳ４ｍｌに懸濁した。このようにして脂質抗原感作ラテックス試薬を得た。
【００２５】
（３）感度の測定
上記（２）で得た脂質抗原感作ラテックス試薬と検体希釈液（メディエースＴＰＬＡ（積水化学工業社製）に添付されているもの）を使用し、日立７１７０型生化学自動分析機を用いて測定を行った。測定波長は７００ｎｍ、１検体測定につき脂質抗原感作ラテックス試薬は３０μｌ、検体希釈液は２１０μｌ、検体は２０μｌ使用した。測定にはＲＰＲ法による測定値（ＲＰＲ値）が８、４、２、１、０．５及び０である検体を用い、各検体の吸光度変化量を測定し、図１、図２、図３にその結果を示した。
【００２６】
実施例２
実施例１の（２）における感作温度を５０℃としたこと以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図１にその結果を示した。
【００２７】
実施例３
実施例１の（１）において、カルジオリピンのエタノール溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、精製レシチンのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１５ｍｌ及びコレステロールのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを混合し、脂質抗原液としたこと以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図２にその結果を示した。
【００２８】
実施例４
実施例１の（１）において、カルジオリピンのエタノール溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、精製レシチンのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ及びコレステロールのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを混合し、脂質抗原液としたこと以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図２にその結果を示した。
【００２９】
実施例５
実施例１の（２）脂質抗原感作ラテックス試薬の作成において、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２ｍｌを添加し、更に３時間３７℃で攪拌する（感作工程は合計５時間となる）以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図３にその結果を示した。
【００３０】
実施例６
実施例１の（２）脂質抗原感作ラテックス試薬の作成において、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２ｍｌを添加し、更に６時間３７℃で攪拌する（感作工程は合計８時間となる）以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図３にその結果を示した。
【００３１】
実施例７
実施例１の（２）脂質抗原感作ラテックス試薬の作成において、脂質抗原液２５０μｌを添加し、そのまま３７℃で０．５時間攪拌した。次に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２ｍｌを添加し、更に０．５時間３７℃で攪拌する（感作工程は合計１時間となる）以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図３にその結果を示した。
【００３２】
比較例１
実施例１の（２）における感作温度を２５℃としたこと以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図１にその結果を示した。
【００３３】
比較例２
実施例１の（１）において、カルジオリピンのエタノール溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、精製レシチンのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ及びコレステロールのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを混合し、脂質抗原液としたこと以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図２にその結果を示した。
【００３４】
比較例３
実施例１の（１）において、カルジオリピンのエタノール溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、精製レシチンのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２０ｍｌ及びコレステロールのエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを混合し、脂質抗原液としたこと以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図２にその結果を示した。
【００３５】
比較例４
実施例１の（２）脂質抗原感作ラテックス試薬の作成において、脂質抗原液２５０μｌを添加し、そのまま３７℃で０．２５時間攪拌した。次に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２ｍｌを添加し、更に０．２５時間３７℃で攪拌する（感作工程は合計０．５時間となる）以外は実施例１と同様に試薬を作成し、感度を測定した。図３にその結果を示した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の抗リン脂質抗体測定試薬の製造方法により、迅速、簡便に大量の検体を測定することができ、かつ、客観性が高い梅毒の検出法に用いることができる抗リン脂質抗体測定試薬を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における脂質抗原感作ラテックス試薬の感度を示すグラフである。横軸は、ＲＰＲ値を表し、縦軸は、吸光度変化量（Δａｂｓ×１００００）を表す。白ぬりの□は、実施例１の測定値であり、黒ぬりの△は、実施例２の測定値であり、白ぬりの○は、比較例１の測定値である。
【図２】実施例における脂質抗原感作ラテックス試薬の感度を示すグラフである。横軸は、ＲＰＲ値を表し、縦軸は、吸光度変化量（Δａｂｓ×１００００）を表す。白ぬりの□は、実施例１の測定値であり、黒ぬりの□は、実施例３の測定値であり、×は、実施例４の測定値であり、白ぬりの○は、比較例２の測定値であり、黒ぬりの△は、比較例３の測定値である。
【図３】実施例における脂質抗原感作ラテックス試薬の感度を示すグラフである。横軸は、ＲＰＲ値を表し、縦軸は、吸光度変化量（Δａｂｓ×１００００）を表す。白ぬりの□は、実施例１の測定値であり、黒ぬりの□は、実施例５の測定値であり、白ぬりの△は、実施例６の測定値であり、白ぬりの○は、実施例７の測定値であり、黒ぬりの△は、比較例４の測定値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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