(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
0003727342.tif 000029
［式中、Ｒ1は、
0003727342.tif 000030
であって、Ｒ3は、-NH2、G.アミド、β-Ala.アミド、-KA、R.アミド、またはK.アミドであるか、あるいは
Ｒ1は、Hであって、Ｒ3は、
-SIPPEVKFNKPFVYLIアミド、または
-GLFであり、
Ｒ2は、H、または-(CH2)4-NH2である］
で表される式を有する金属キレート剤に共有結合した標的部分を含む、診断用または治療用の放射性薬剤を製造するのに有用な試薬。
【請求項２】
0003727342.tif 000031
よりなる群から選択される式を有する請求項１記載の試薬。
【請求項３】
式：
0003727342.tif 000032
を有する請求項２記載の試薬。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１記載の試薬と、テクネチウム−９９ｍとを含むシンチグラフィーイメージング剤。
【請求項５】
還元剤存在下にて、請求項１〜３いずれか１記載の試薬とテクネチウム−９９ｍとを反応させる工程を含むシンチグラフィーイメージング剤の製造方法。
【請求項６】
前記還元剤が第一スズイオンであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
所定量の請求項１〜３いずれか１記載の試薬と、該試薬をテクネチウム−９９ｍ、レニウム−１８６またはレニウム−１８８で標識するのに十分な量の還元剤とを含有する密閉バイアルを含む放射性医薬製剤を製造するためのキット。
【請求項８】
請求項１〜３いずれか１記載の試薬と、細胞毒性放射性核種とを含む放射性薬剤。
【請求項９】
前記放射性核種が、レニウム−１８６、レニウム−１８８、スズ−１１７ｍ、銅−６４および銅−６７からなる群から選択されることを特徴とする請求項８記載の剤。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、放射性医薬調製用試薬である物質の組成物、該試薬を用いる放射性医薬の調製方法、かくして調製された放射性医薬、およびかかる放射性医薬を用いるための方法に関する。特に、本発明は、モノアミン、ジアミド、チオール含有（ＭＡＤＡＴ）金属キレート剤である試薬、ならびに該金属キレート基および種々の特異的標的部分との間のコンジュゲートに関する。本発明の１つの態様において、特異的標的部分とコンジュゲートした金属キレート剤からなり、ガンマ線放射用放射性同位体で放射性標識された放射性診断薬を提供するものである。別の態様では、特異的標的部分とコンジュゲートした金属キレート剤からなり、細胞毒性放射性同位体で放射性標識された放射性治療薬を提供するものでもある。本発明の放射性診断薬および放射性治療薬の調製のための本発明の放射性医薬およびアジュバント剤からなるキットを提供するものでもある。本発明の薬物を用いるための放射性診断方法および放射性治療方法を提供するものでもある。
２．従来技術の説明
医師が、非観血的手段を用いて、患者における病的状態の部位を位置確認することができることは、しばしば、臨床学的に好都合である。かかる病的状態としては、肺、心臓、肝臓、腎臓、骨および脳の疾患、ならびに癌、血栓症、肺塞栓症、感染、炎症およびアテローム硬化症が挙げられる。
核医学の分野では、少量の内部投与された放射性標識したトレーサー化合物（放射性トレーサーまたは放射性医薬と称される）の分布を検出することによって、ある種の病的状態が位置確認されるか、または、その程度が評価される。これらの放射性医薬の検出方法は、一般的に、造影または放射性造影方法として知られている。
放射性造影において、放射性標識は、ガンマ線放射用放射性核種であり、放射性トレーサーは、ガンマ線検出用カメラを用いて位置確認される（このプロセスは、しばしば、ガンマシンチグラフィーと称される）。造影部位は、放射性トレーサーが病的部位に局在化するように選択されるか、または、別法としては、該放射性トレーサーがかかる病的部位に特異的には局在化しないように選択されるので、検出可能である。多くの場合、in vivoで病的部位に特異的に局在化する放射性医薬として、放射性標識した特異的結合化合物を用いるのは、特に好都合である。
67Ｇa、99mＴc（Ｔc−９９ｍ）、111Ｉn、123Ｉ、125Ｉおよび169Ｙbを含む種々の放射性核種は、放射性造影に有用であることが知られている。しかしながら、ヒトにおける最適な放射性造影のために多くの因子を考慮しなければならない。検出効率を最大にするために、１００〜２００keＶ範囲でガンマエネルギーを放射する放射性核種が好ましい。患者への吸収放射量を最小にするためには放射性同位体はアルファまたはベータ粒子放射を発するべきではなく、放射性核種の物理的半減期は、造影方法が許す限り短くあるべきである。実験がいつでもおよび何時でも行われるように、臨床部位で常に利用可能な放射性核種の供給源を有するのが好都合である。
Ｔc−９９ｍは、それが有意な粒子放射性放射を有しておらず、約１４０keＶでガンマ線を放射し、６時間の物理的半減期を有しており、モリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍジェネレーターを用いてon-siteで容易に利用可能であるので、好ましいシンチグラフィー造影用放射性核種である。
従来技術で用いられる他の放射性核種は、Ｔc−９９ｍよりもあまり好都合ではない。これは、かかる放射性核種の物理的半減期が長く、その結果、患者への多量の吸収放射量を生じるためである（例えば、インジウム−１１１）。別法としては、かかる代替放射性核種のガンマ線エネルギーは、Ｔc−９９ｍよりも有意に低い（例えば、ヨウ素−１２５）または高く（例えば、ヨウ素−１３１）、これにより、シンチグラフィ造影する質について不適切である。結論として、多くの不都合な放射性核種は、on-siteジェネレーターを用いて生成することができない。
Ｔc−９９ｍは、金属キレート剤または金属キレート部分によって好都合にキレート形成される遷移金属である。Ｔc−９９ｍ結合能を有するキレート部分は、種々の標的分子に共有結合して、かかる標的分子を放射性標識するための手段を提供することができる。これは、Ｔc−９９ｍの最も一般的に利用可能な化学種であるペルテクニタート（ＴcＯ4-）が放射性医薬として有用であるのに非常に充分であるほとんどの標的分子に直接結合することができないためである。Ｔc−９９ｍのかかる放射性標識キレート部分との錯体形成は、典型的には、塩化第一スズなどの還元剤を用いて、ペルテクニタートの化学的還元を必要とする。
Ｔc−９９ｍを錯体形成するためのキレート剤の使用は、従来技術で知られている。
バーン（Ｂyrne）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,４３４,１５１号には、Ｎ2Ｓ2、Ｔc−９９ｍについてのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）、Ｕ.Ｓ.特許第４,４４４,６９０号には、２,３−ビス(メルカプトアセトアミド)プロパノアートに基づく一連のビスアミド、ビスチオールテクネチウム−キレート剤が開示されている。
バーン（Ｂyrne）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,５７１,４３０号には、Ｎ2Ｓ2、Ｔc−９９ｍについてのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
バーン（Ｂyrne）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,５７５,５５６号には、Ｎ2Ｓ2、Ｔc−９９ｍについてのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
ノスコ（Ｎosco）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,９２５,６５０号には、Ｔc−９９ｍキレート錯体が開示されている。
コンド（Ｋondo）ら、欧州特許出願公開第４８３７０４ Ａ１号には、メルカプト−Ｇly−Ｇly−Ｇly部分とのＴc−９９ｍ錯体の製造方法が開示されている。
欧州特許出願第８４１０９８３１.２号（ＥＰ１３５１６０Ａ）には、腎臓機能モニターリング剤としてのビスアミド、ビスチオールＴc−９９ｍリガンドおよびその塩が開示されている。
バーン（Ｂyrne）ら、１９８５、欧州特許出願第８５１０４９５９.３号（ＥＰ１６３１１９Ａ）には、Ｔc−９９ｍ標識した脳造影剤の調製のためのビスアミノ、ビスチオール化合物が開示されている。
欧州特許出願第８６１００３６０.６号（ＥＰ１８８２５６Ａ）には、Ｔc−９９ｍ標識造影剤調製用の、ジチオール、ジアミノ、またはジアミノカルボン酸またはアミン錯体が開示されている。
クング（Ｋung）ら、１９８６、欧州特許出願第８６１０５９２０.２号（ＥＰ２００２１１Ａ）には、小さな中性のＴc−９９ｍ脳造影剤の製造用のビスアミノ、ビスチオール化合物が開示されている。
バーグスタイン（Ｂergstein）ら、１９８８、欧州特許出願第８８１０２２５２.９号（ＥＰ２７９４１７Ａ）には、小さな中性のＴc−９９ｍ造影剤の製造用のビスアミノ、ビスチオール化合物が開示されている。
ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ８９／１２６２５号には、腎機能モニターリグ剤として使用するための、ビスアミド、ビスチオールリガンドの二官能性キレート錯体が開示されている。
デイヴィソン（Ｄavison）ら、１９８１、Ｉnorg.Ｃhem．２０：１６２９−１６３２には、オキソテクネチウムキレート錯体が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）ら、１９８２、Ｊ.Ｎucl.Ｍed．２３：５９２−５９８には、Ｎ,Ｎ'−ビス（メルカプトアセチル）−２,３−ジアミノプロパノアートに基づくＴc−９９ｍキレート剤が開示されている。
バーン（Ｂyrne）ら、１９８３、Ｊ.Ｎucl.Ｍed．２４：Ｐ１２６には、ホモシステイン含有Ｔc−９９ｍキレート剤が開示されている。
ブリソン（Ｂryson）ら、１９８８、Ｉnorg.Ｃhem．２７：２１５４−２１６１には、過剰のリガンドに対して不安定であるテクネチウム−９９の中性錯体が開示されている。
ミスラ（Ｍisra）ら、１９８９、Ｔet.Ｌett．３０：１８８５−１８８８には、放射性標識のためのビスアミンビスチオール化合物が開示されている。
バーン（Ｂyrne）ら、１９９０、Ｉnorg.Ｃhem．２９：２９４８−２９５１には、キレート剤が中性Ｔc−９９ｍ錯体を形成する、２つのアミド基、チオール基および置換ピリジン基を含有するキレート剤が開示されている。
テイラー（Ｔaylor）ら、１９９０、Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３１：８８５（Ａbst.）には、脳造影のための中性Ｔc−９９ｍ錯体が開示されている。
放射性同位体で標識した標的分子は、診断および治療目的のために放射性医薬として用いられた。放射性同位体で標的分子を標識するために多くの方法が研究された。シンチグラム造影のためのテクネチウムの同位体および治療目的のためのレニウムおよびスズの同位体が特に重要である。このため、標的分子を標識するために研究したキレート基の多くの例があった。
フナットウィッチ（Ｈnatowich）、Ｕ.Ｓ.特許第４,６６８,５０３号には、Ｔc−９９ｍタンパク放射性標識が開示されている。
トールマン（Ｔolman）、Ｕ.Ｓ.特許第４,７３２,６８４号には、標的分子および金属結合タンパク、メタロチオネインのフラグメントのコンジュゲーションが開示されている。
イージ（Ｅge）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,８３２,９４０号には、局在したＴ−リンパ球を造影するための放射性標識ペプチドが開示されている。
ニコロッティ（Ｎicolotti）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,８６１,８６９号には、抗体などの生物学的分子とコンジュゲートを形成する際に有用な二官能性カップリング剤が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,９６５,３９２号には、タンパクを標識するための種々のＳ−保護メルカプトアセチルグリシルグリシンをベースとしたキレート剤が開示されている。
モーガン（Ｍorgan）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,９８６,９７９号には、炎症部位の造影方法が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）ら、Ｕ.Ｓ.特許第５,０９１,５１４号には、タンパクを標識するための種々のＳ−保護メルカプトアセチルグリシルグリシンをベースとしたキレート剤が開示されている。
グスタヴソン（Ｇustavson）ら、Ｕ.Ｓ.特許第５,１１２,９５３号には、タンパクを放射性標識するためのＴc−９９ｍキレート剤が開示されている。
カシナ（Ｋasina）ら、Ｕ.Ｓ.特許第５,１７５,２５７号には、標的分子およびＴc−９９ｍキレート基の種々の組合せが開示されている。
ディーン（Ｄean）ら、Ｕ.Ｓ.特許第５,１８０,８１６号には、二官能性キレート剤を介するタンパクのＴc−９９ｍによる放射性標識方法が開示されている。
フラナガン（Ｆlanagan）ら、Ｕ.Ｓ.特許第５,２４８,７６４号には、放射性標識キレート部分および心房性ナトリウム排泄増加性因子誘導ペプチドの間のコンジュゲートが開示されている。
リーノ（Ｒeno）およびボッティーノ（Ｂottino）、欧州特許出願８７３００４２６.１号（ＥＰ２３７１５０Ａ）には、抗体をＴc−９９ｍにより放射性標識することが開示されている。
ランビィ（Ｒanby）ら、１９８８、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２２７６には、放射性標識化合物をフィブリンに共有結合させることからなる動物におけるフィブリン沈着物の検出方法が開示されている。
ディーン（Ｄean）ら、国際特許出願、公開ＷＯ８９／１２６２５には、タンパクのＴc−９９ｍ標識のための二官能性カップリング剤が開示されている。
シェマーカー（Ｓchoemaker）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９０／０６３２３には、金属結合領域からなるキメラタンパクが開示されている。
モーガン（Ｍorgan）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９０／１０４６３には、炎症部位を造影するための方法が開示されている。
フラナガン（Ｆlanagan）ら、欧州特許出願第９０３０６４２８.５号（ＥＰ４０３２４３Ａ）には、１組の有機キレート分子を介する合成ペプチドフラグメントのＴc−９９ｍ標識化が開示されている。
グスタフソン（Ｇustavson）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９１／０９８７６には、タンパクを放射性標識するためのＴc−９９ｍキレート剤が開示されている。
ロッドウエル（Ｒodwell）ら、１９９１、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３１１６には、「分子認識単位」の「エフェクタードメイン」とのコンジュゲートが開示されている。
コックス（Ｃox）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４５５９には、２つのシステイン残基を含有する放射性標識ソマトスタチン誘導体が開示されている。
ローデス（Ｒhodes）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９３／１２８１９には、金属イオン結合ドメインからなるペプチドが開示されている。
ライル（Ｌyle）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９３／１５７７０には、Ｔc−９９ｍキレート剤およびＴc−９９ｍで標識したペプチドが開示されている。
コフリ（Ｃoughlin）ら、国際特許出願、公開ＷＯ９３／２１１５１には、標的分子を放射性標識するためのチオ尿素基からなる二官能性キレート剤が開示されている。
ナイト（Ｋnight）ら、１９９０、３７th Ａnnual Ｍeeting of the Ｓociety of Ｎuclear Ｍedicine，アブストラクト＃２０９には、Ｔc−９９ｍ標識ペプチドを用いる血栓造影が開示されている。
バビッチ（Ｂabich）ら、１９９３、Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３４：１９６４−１９７４には、ヒドラジノニコチンアミド誘導体からなるＴc−９９ｍ標識ペプチドが開示されている。
標的分子を放射性標識するために用いるキレート基のクラスのよく研究されたメンバーとしては、Ｎ2Ｓ2キレート剤としても知られているジアミンジチオール（ＤＡＤＳ）、およびＮ3Ｓキレート剤としても知られているメルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ3）が挙げられる。これらのキレート基のタイプの両方は、テクネチウムで安定なキレート剤を形成し、方法は、これらのキレート剤を標的分子に結合させるために開発された。
バーン（Ｂyne）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,４３４,１５１号には、Ｎ2Ｓ2、Ｔc−９９ｍのためのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
フリッツバーグ（Ｆrizberg）、Ｕ.Ｓ.特許第４,４４４,６９０号には、２,３−ビス(メルカプトアセトアド)プロパノエートをベースとするビスアミド、ビスチオール化テクネチウム−キレート剤が開示されている。
バーン（Ｂyne）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,５７１,４３０号には、Ｎ2Ｓ2、Ｔc−９９ｍのためのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
バーン（Ｂyne）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,５７５,５５６号には、Ｎ2Ｓ2、Ｔc−９９ｍのためのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
ノスコ（Ｎosco）ら、Ｕ.Ｓ.特許第４,９２５,６５０号には、Ｔc−９９ｍキレート錯体が開示されている。
コンド（Ｋondo）ら、欧州特許出願、公開第４８３７０４Ａ１号には、メルカプト−Ｇly−Ｇly−Ｇly部分とのＴc−９９ｍ錯体の製造方法が開示されている。
欧州特許出願８４１０９８３１.２号（ＥＰ１３５１６０Ａ）には、腎機能モニターリング剤としてビスアミド−ビスチオールＴc−９９ｍレガンドおよびその塩が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）、欧州特許出願第８５３０４２５５.４号（ＥＰ１７３４２４Ａ）には、テクネチウムのＮ／Ｓ錯体が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）ら、欧州特許出願第８８１０４７５５/９号（ＥＰ２８４０７１Ａ）には、Ｎ／Ｓキレート剤が開示されている。
ディヴィソン（Ｄavison）ら、１９８１、Ｉnorg.Ｃhem．２０：１６２９−１６３２には、オキソテクネチウムキレート錯体が開示されている。
フリッツバーグ（Ｆritzberg）ら、１９８２、Ｊ.Ｎucl.Ｍed．２３：５９２−５９８には、Ｎ,Ｎ'−ビス(メルカプトアセチル)−２,３−ジアミノプロパノアートをベースとするテクネチウムキレート剤が開示されている。
バーン（Ｂyrne）ら、１９８３、Ｊ.Ｎucl.Ｍed．２４：Ｐ１２６には、Ｎ2Ｓ2型、Ｔc−９９ｍのためのキレート剤を含有するホモシステインが開示されている。
一般に、これらの方法は、キレートを溶液中１００℃で短時間（１５分）加熱して、安定なキレートを生成することが必要である（例えば、フリッツバーグ（Ｆritzberg）ら、１９８６、欧州特許出願第８５３０４２２５５.４号を参照）。ペプチドおよび炭水化物などの多くの標的分子は、加熱に対して不安定であり、分解および不活性な副産物を生じるので、標識方法を、これらの慣用的な苛酷な標識条件を回避する適度な（例えば、室温）条件下で行うのが必要であり、患者投与の前に病院で迅速に完了させることができる。多くの患者が、彼らの状態の急性特性のために、迅速に診断情報を必要とするので、臨床装置における迅速な標識化は、特に、重要である。
標的分子を標識するために開発されたキレート化合物の別のクラスは、ビスアミンビスチオール（ＢＡＴと称する）である。
バイドー（Ｂaidoo）ら、Ｕ.Ｓ.特許第５,１９６.５１５号にはおよび第５,０９５,１１１号には、ビスアミドビスチオール錯体が開示されている。
クング（Ｋung）ら、欧州出願第８６１０５９２０.２号（ＥＰ２００２１１Ａ）には、ビスアミドビスチオールリガンドおよびそれらのテクネチウム−９９ｍ錯体が開示されている。
ミスラ（Ｍisra）ら、１９８９、Ｔet.Ｌett．３０：１８８５−１８８８には、放射性標識のためのビスアミドビスチオール化合物が開示されている。
バイドー（Ｂaidoo）ら、１９９０、Ｂioconjugate Ｃhem．１：１３２−１３７には、ビスアミドビスチオールを用いる生物分子の標識方法が開示されている。
これらの化合物は、それらを室温でテクネチウムで標識することができるので、標的分子に結合した場合に有用である。かかる適度な標識条件は、化学的に感受性の高い標的分子を最小の化学的ストレスに暴露して、あまり分解を生じず、より化学的に純粋な放射性標識標的化合物を生じる。しかしながら、ＢＡＴキレートは、いくつかの欠点も有する。ＢＡＴキレート剤の１つの欠点は、これらのキレートが本質的に非常に脂質親和性であることである。この性質は、これらの化合物を過剰に末梢血液中に保有させることができ、これは、有用な診断イメージを得ることができる前にバックグラウンド放射能を減少させるためにイメージング剤を末梢血液から除去しなければならないので、効率的なシンチグラフィーを妨害する。この欠点は、ＢＡＴキレート剤含有シンチグラフィイメージング剤が商業的に実行可能な生成物であるかを決定するために十分に重要なだけである。
ＢＡＴキレート剤の別の欠点は、かかるキレートを標的分子に共有結合させるための化学を研究することが困難であるということである。ＢＴＡキレート剤の標的分子への好結果の共有結合が達成されたが、典型的には、高価な中間体の生成を生じ、最終放射性医薬生成物を製造するための高価な方法であることが最終的に証明された。
ペプチドを放射性標識するためのキレート化剤の使用、およびペプチドをＴc−９９ｍで標識化するための方法は、従来技術で知られており、同時係属中のＵ.Ｓ.特許出願第０７／６５３,０１２号、第０７／８０７,０６２号、第０７／８７１,２８２号、第０７／８８６,７６２号、第０７／８９３,９８１号、第０７／９５５,４６６号、第０８／０１９,８６４号、第０８／０７３,５７７号、第０８／２１０,８２２号、第０８／２３６,４０２号および第０８／２４１,６２５号に開示されており、血栓を造影するためのシンチグラフィイメージング剤として有用な放射性標識したペプチドは、従来技術で知られており、同時係属中のＵ.Ｓ.特許出願第０７／８８６,７５２号、第０７／８９３,９８１号および第０８／０４４,８２５号ならびに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／００７５７（ＷＯ９２／１３５７２）、ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０７１６（ＷＯ９３／１０７４７）、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２３２０（ＷＯ９３／１７７１９）、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３６８７（ＷＯ９３／２１９６２）、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７９４（ＷＯ９３／２３０８５）、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０５３７２（ＷＯ９３／２５２４４）、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６０２９（ＷＯ９４／００４８９）、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９３８７（ＷＯ９４／０７９１８）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１８９４（ＷＯ９４／１９０２４）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３８７８（ＷＯ９４／２３７５８）およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５８９５（ＷＯ９４／２８９４２）に開示されている（出典明示により本明細書の一部とする）。
不安定な生物学的標的分子の化学的および物理的分解を回避するために、適度な化学的条件下で容易に放射性標識することができる診断および治療目的のための放射性医薬が必要である。合成が容易であり、適度に脂質親和性であり、標的分子に結合することができ、次いで、室温で迅速にＴc−９９ｍで標識することができる安価なキレートグループがなお必要とされている。
発明の概要
本発明は、診断用および治療用の放射性医薬剤を製造するのに有用な試薬を提供する。特に、本発明は、モノアミン／ジアミド／チオール含有（ＭＡＤＡＴ）金属キレート剤である試薬を提供する。本発明は、モノアミド／ビスアミド／モノチオールキレート剤、ならびに、かかる金属キレート剤と、テクネチウム−９９ｍ、レニウム−１８６、レニウム−１８８、スズ−１１７ｍ、銅−６４および銅−６７などの同位元素との錯体も提供する。該金属キレート基と様々な特異的標的部分とのコンジュゲートも提供される。かかるコンジュゲートは、特異的標的分子に共有結合した本発明の金属キレート基からなる。かかる放射標識コンジュゲートは、本発明によって提供される放射線診断剤および放射線治療剤を含有する。
本発明は、放射性医薬剤、および、かかる放射性医薬剤を製造するための試薬を提供する。かかる試薬は、
（ｉ）式：
0003727342.tif 000002
で示される基、および
（ii）式：
0003727342.tif 000003
で示される基
［式中、ｎ、ｍおよびｐは、各々、独立して０または１である整数；各Ｒ'は、独立して、Ｈ、低級アルキル、Ｃ2−Ｃ4ヒドロキシアルキル、またはＣ2−Ｃ4アルコキシアルキル、および各Ｒは、独立して、ＨまたはＲ''（ここで、Ｒ''は、置換または非置換の低級アルキルまたはフェニルであるが、チオール基を含有しない）、およびＲまたはＲ'の一方は、Ｌ（ここで、Ｌは金属キレート剤を標的部分に連結する二価の連結部分であり、一方のＲ'がＬのとき、ＮＲ'2はアミン）である］
からなる群から選択される金属キレート剤に共有結合した標的部分からなる。
好ましい具体例では、Ｌは、Ｃ1−Ｃ6直鎖、分枝鎖または環式のアルキル基、カルボン酸エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、エーテル、チオエーテル、アミン、アルケン、アルキン、１,２−、１,３−もしくは１,４−結合の、所望により置換されていてもよい、ベンゼン環、あるいは、アミノ酸または２〜約１０個のアミノ酸からなるペプチド、あるいは、それらの組合せである。
好ましい具体例では、Ｒ''は、Ｃ1-Ｃ6直鎖、分枝鎖または環式のアルキル基；−ＣqＯＣr−、−ＣqＮＨＣr−または−ＣqＳＣr−基（ここで、ｑおよびｒは整数であり、各々独立して１〜５；ただし、ｑ＋ｒの和は６以下である）；（Ｃ1−Ｃ6）アルキル−Ｘ（ここで、Ｘはヒドロキシル基、置換アミン、グアニジン、アミジン、置換チオール基、またはカルボン酸、エステル、ホスフェート、またはスルフェート基）；フェニル基、または、ハロゲン、ヒドロキシル、置換アミン、グアニジン、アミジン、置換チオール、エーテル、ホスフェート、またはスルフェート基で置換されたフェニル基；インドール基；１〜３個の窒素、酸素もしくは硫黄原子またはそれらの組合せを含有するＣ1−Ｃ6ヘテロ環式基である。
本発明の好ましい金属キレート剤としては、式：
0003727342.tif 000004
［式中、Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、Ｃ2−Ｃ4ヒドロキシアルキル、またはＣ2−Ｃ4アルコキシアルキル；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、独立して、Ｈ、置換または非置換の低級アルキルまたはフェニルであるが、チオール基を含有しない；Ｒ7およびＲ8は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、低級ヒドロキシアルキルまたは低級アルコキシアルキル；Ｌは二価の連結基；およびＺは標的部分である］
で示されるキレート剤が挙げられる。
本発明の別の好ましい金属キレート剤としては、式：
0003727342.tif 000005
［式中、Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、Ｃ2−Ｃ4ヒドロキシアルキル、またはＣ2−Ｃ4アルコキシアルキル；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5およびＲ6は、独立して、Ｈ、置換または非置換の低級アルキルまたはフェニルであるが、チオール基を含有せず、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6の１つは、Ｚ−Ｌ−ＨＮ（ＣＨ2）n−（ここで、Ｌは二価の連結基、Ｚは標的部分、およびｎは１〜６の整数）；Ｒ7およびＲ8は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、低級ヒドロキシアルキルまたは低級アルコキシアルキル；およびＸは、アミノ基、置換アミノ基または−ＮＲ1−Ｙ（ここで、Ｙは、アミノ酸、アミノ酸アミド、または２〜１０個のアミノ酸からなるペプチド）である］
で示されるキレート剤が挙げられる。
本発明のより好ましい金属キレート剤としては、式：
0003727342.tif 000006
［式中、Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、Ｈ、低級アルキル、低級ヒドロキシアルキル、または低級アルケニルアルキル；Ｒ3およびＲ4は、独立して、Ｈ、置換または非置換の低級アルキルまたはフェニルであるが、チオール基を含有しない；ｎは１〜６の整数；Ｌは二価の連結基；およびＺは標的部分である］
で示されるキレート剤が挙げられる。
別のさらに好ましい金属キレート剤としては、式：
0003727342.tif 000007
［式中、Ｌは二価の連結基およびＺは標的部分である］
で示されるキレート剤が挙げられる。
本発明の最も好ましい金属キレート剤としては、以下の式：
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−システイン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−イソシステイン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−ホモシステイン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−ペニシラミン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−２−メルカプトエチルアミン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−２−メルカプトプロピルアミン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−２−メルカプト−２−メチルプロピルアミン−、
（アミノ酸）1−（アミノ酸）2−３−メルカプトプロピルアミン−、
［ここで、（アミノ酸）は第一α−またはβ−アミノ酸であるが、チオールを含有せず、該キレート剤は、該キレート剤のカルボキシル末端との共有結合を介して、または、アミノ酸基の一方の側鎖を介して、標的部分または連結基のいずれかに結合する］
で示されるキレート剤が挙げられる。
最も好ましいキレート剤には、（アミノ酸）1がα,ω−またはβ,ω−アミノ酸（ここで、α−またはβ−アミノ基は遊離アミン）であり、該α,ω−またはβ,ω−アミノ酸がωアミノ基を介して共有結合している上記式で示されるキレート剤も含まれる。
他の最も好ましい金属キレート剤としては、
−システイン−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
−イソシステイン−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
−ホモシステイン−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
−ペニシラミン−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
２−メルカプト酢酸−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
２−または３−メルカプトプロピオン酸−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
２−メルカプト−２−メチルプロピオン酸−（アミノ酸）−（α,β−またはβ,γ−ジアミノ酸）；
［ここで、（アミノ酸）は第一α−またはβ−アミノ酸であるが、チオールを含有せず、該キレート剤は、該キレート剤のアミノ末端との共有結合を介して、または、アミノ酸基の一方の側鎖を介して、標的部分または連結基のいずれかに結合する］
からなる群から選択されるものが挙げられる。
特に好ましい金属キレート剤は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−、−（ε−Ｌｙｓ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−、−（δ−Ｏｒｎ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−、−（γ−Ｄａｂ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−、および−（β−Ｄａｐ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−からなる群から選択される。（これらの式中、ε−Ｌｙｓはリシン残基（典型的なα−アミノ基よりむしろε−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成する）；δ−Ｏｒｎはオルニチン残基（典型的なα−アミノ基よりむしろδ−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成する）；γ−Ｄａｂは２,４−ジアミノ酪酸残基（γ−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成する）；およびβ−Ｄａｐは１,３−ジアミノプロピオン酸残基（β−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成する）を表す。）
上述の構造タイプＶを有する、より望ましい金属キレート剤の例は、下記の構造の金属キレート部分を形成するＬys−(ω−ペプチド)−Ｇly−Ｃysアミドである。
0003727342.tif 000008
構造タイプIXを有するキレートリガンドは下記の構造を有するオキソテクネチウム錯体を形成する
0003727342.tif 000009
上述の構造タイプIIを有する金属キレート基を含み、本発明により提供される放射性医薬品を製造するための試薬の例は、下記の金属キレート部分を形成する（標的部分）−Ｃys−Ｇly−α，β−ジアミノプロピオンアミドである。
0003727342.tif 000010
構造タイプXIを有する放射診断薬は、下記の構造を有するオキソテクネチウム錯体を形成する。
0003727342.tif 000011
本発明はまた、標的分子に共有結合していない、放射性医薬品自体として本発明の金属キレート剤の各々を提供する。かかる本発明の具体化物は、適当なアイソトープでラベルされたときに放射診断薬および放射治療薬として有用であり、多くの放射診断的および放射治療的利用、例えば腎臓、肝臓および脳の造影のために本明細書に記載された放射性医薬品としての利用性を有する。
本発明により提供される放射性医薬品は、モノクローナル抗体、ペプチド、レセプター結合分子、接着分子、酵素基質、酵素阻害剤、炭水化物、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび一般的に生体の何らかの構成成分と親和性を有する化学物質、である標的部分を含む。標的部分の例には、免疫グロブリン、ネズミ由来のＦ(ab')2フラグメントあるいはＦabまたはＦab'フラグメント、ヒトまたはキメラヒト−ネズミモノクローナル抗体、ソマトスタチンレセプター結合ペプチド、糖タンパクIIb／IIIa結合ペプチド、動脈硬化性プラーク結合ペプチド、血小板因子４誘導ペプチド、レセプター結合分子、接着分子、酵素基質、酵素阻害剤および炭水化物を含む。
本発明の放射性医薬品および該放射性医薬品を製造するための試薬は、標的部分または金属キレートあるいはその両者が多価連結部分に共有結合して形成され得る。本発明の多価連結部分は、標的部分または金属キレート剤に共有結合し得る、少なくとも２個の同一の連結基を含んでいる。多価連結部分は、各結合部分が連結機能基を含んでいる前駆物質となる試薬から形成される。この機能基は、標的部分また金属キレート剤またはその両者と反応し得るものである。望ましい連結機能基には、第１級また第２級アミン、ヒドロキシ基、カルボン酸基またはマレインイミドなどのチオ−反応基および２−ハロアセチル基がある。望ましい具体例として、多価連結部分には、ビス−サクシンイミド−メチルエーテル(ＢＳＭＥ)、４−(２,２−ジメチルアセチル)安息香酸(ＤＭＡＢ)、トリス(サクシンイミジルエチル)アミン(ＴＳＥＡ)、トリス(アセトアミドエチル)アミン、ビス−アセトアミドメチルエーテル、ビス−アセトアミドエチルエーテル、α,ε−ビス−アセチルリジン、リジンおよび１,８−ビス−アセトアミド−３,６−ジオキサ−オクタンが含まれる。
本発明は、本発明の金属キレート基／標的部分コンジュゲートのＴc−９９m錯体を含む放射診断薬であるシンチグラフィーイメージング剤を提供する。これらの化合物の放射ラベルの方法も提供する。本発明により提供される放射ラベル錯体は、本発明のコンジュゲート試薬とＴc−９９mとを還元剤の存在下に反応せしめることにより形成される。望ましい還元剤には、ジチオナイトイオン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の錯体はまた、本発明のコンジュゲート試薬を、ここで提供されるあらかじめ還元されたＴｃ-９９m錯体とのリガンド交換により、Ｔc−９９mでラベルすることにより形成される。
本発明はまた、本発明のＴc−９９mラベル放射性医薬品を製造するためのキットを提供する。本発明のＴc−９９mラベルコンジュゲート試薬のためのキットは、Ｔc−９９mで試薬をラベルするために、あらかじめ定めた量の本発明のコンジュゲート試薬および充分な量の還元剤を含有する封じられた容器(例えばバイアルまたはシリンジ)を含む。
本発明は、金属キレート剤、金属キレート剤／標的部分コンジュゲート試薬および本発明の放射性医薬品をin vitroで化学合成により製造する方法を提供する。望ましい具体例において、かかる化合物は固相ペプチド合成により合成される。
本発明はまた、本発明の放射診断薬および放射治療薬を使用する方法を提供する。一つの具体例において、本発明のシンチグラフィーイメージング剤として、in vivoガンマ−シンチグラフィーイメージを得ることにより哺乳動物体内でイメージ部位でのＴc−９９mラベル放射性医薬品が提供される。これらの方法には、本発明のＴc−９９mラベル放射診断コンジュゲート試薬の有効な診断量を投与すること、および哺乳動物の体内の部位に局在化したＴｃ-９９mによって放射されるガンマ線を検出することが含まれる。
他の点は、in vivoの病原部位にアイソトープの細胞毒性量を局在化せしめるためのＲe−１８６、Ｒe−１８８、Ｓn−１７７mまたはＣu−６７ラベル放射性医薬品である放射治療剤を提供することにある。これらの方法には、本発明の放射ラベル放射治療コンジュゲート試薬の有効な治療量を投与することおよび該放射性医薬品を適当な病理部位に局在化せしめ、その部位での細胞毒性により治療効果を発揮せしめることを含む。
本発明の特に望ましい具体例は、下記する、ある望ましい具体例のより詳細な記述および請求の範囲から明らかになるであろう。
好ましい実施態様の詳細な記載
本発明は、モノアミン、ジアミド、チオール含有（ＭＡＤＡＴ）金属キレート剤及びかかるキレート剤のテクネチウムー９９ｍ、レニウムー１８６、レニウムー１８８、錫ー１１７、銅ー６４及び銅ー６７を含むラジオアイソトープとの複合体を提供する。本発明は、また、本発明の金属キレート剤と診断的及び治療的適用に適したラジオアイソトープとの複合体である、放射性診断剤や放射性治療剤のような放射性医薬品を提供する。更に、本発明により、当該金属キレート剤の製造法、当該金属キレート剤をラジオアイソトープと複合化する方法及び当該金属キレート剤を放射性医薬品として使用する方法が提供される。
また本発明は、標的部分に連結させたモノアミン、ジアミド、チオール含有キレート剤、すなわち哺乳類の身体の部位に結合し又は蓄積することが出来る放射性医薬品を製造するための試薬を提供することが出来る。本発明のこの点での具体的態様としては、金属キレート剤と標的部分が共有結合により直接化学的に結合する場合がある。他の具体的態様として、金属キレート剤と標的部分がリンカーを介して連結する場合があり、リンカーとしては例えばアミノ酸やペプチドがある。本発明にかかる金属キレート剤／標的部分コンジュゲートのラジオアイソトープ、例えばテクネチウムー９９ｍ、レニウムー１８６、レニウムー１８８、錫ー１１７ｍ、銅ー６４及び銅ー６７との複合体も又、提供される。本発明は、本発明にかかる金属キレート剤／標的部分コンジュゲートと診断的及び治療的適用に適したラジオアイソトープとの複合体である、放射性診断剤や放射性治療剤のような放射性医薬品を提供する。更に、本発明により、当該コンジュゲートの製造法、当該コンジュゲートをラジオアイソトープと複合化する方法及び当該結合体を放射性医薬品として使用する方法が提供される。本発明の放射性診断剤や放射性治療剤を含む放射性医薬品を提供する。
本発明はまた、本発明の金属キレート剤／標的分子結合体をラジオアイソトープとの複合体を含む、放射性医薬品を提供する。この点における具体的態様としては、哺乳類の体内の標的部位を画像化するためのシンチグラフ画像化剤を含む、放射性診断剤があり、その場合の放射性薬剤はＴｃ−９９Ｍの金属キレートを含む。他の具体的態様として、レニウムー１８６、レニウムー１８８、錫ー１１７ｍ、銅ー６４及び銅−６７のようなラジオアイソトープの細胞毒性量を哺乳類の体内の病態部位に指向させる為の放射性治療剤が提供される。
本発明によって提供されるシンチグラフ画像化剤のような放射性診断剤において、Ｔｃ−９９ｍによる標識は、このアイソトープの核的かつ放射的性質がそれを理想的シンチグラフ画像化剤とするが故に、有利である。このアイソトープは、単一フォトンエネルギー１４０ｋｅＶ、放射能半減期約６時間であって、99Ｍｏ−99mＴｃ発生器から容易に得ることが出来る。
本発明の目的において、「標的部分（targeting moiety）」なる用語は、哺乳類体内の標的部位に結合するか、蓄積する化合物、すなわち周囲組織に比べてより大きな度合で標的部位に局在する化合物を意味する。これは本発明の放射性診断法において有利であり、その理由はこのような標的部分を含むシンチグラフ画像化剤が投与後哺乳類体内に拡散して、インビボ標的の可視性画像を与えるからである。また、これは本発明の放射性治療法において有利であり、その理由は放射性細胞毒性剤がインビボの非特異的全身性毒性の付随的低減化と共に病態的部位に局在するからである。
本発明によって、モノクローナル抗体、ペプチド、リセプター結合分子、接着性分子、酵素基質、酵素阻害剤、炭水化物、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび一般に生物生体の成分に対して親和性を有する化学的存在である標的部分を含む、放射性薬剤およびその調製用試剤が提供される。標的部分の具体例としては、イムノグロブリン、ネズミ、ヒトまたはキメラヒト−ネズミモノクローナル抗体から誘導されたＦ(ab')2断片またはＦabもしくはＦab'断片、cyclo(N-CH3)-Phe-Tyr-(p-Trp)-Lys-Val-Hcy-のようなソマトスタチンリセプター結合ペプチド、CH2CO(D-Tyr)-Amp-Gly-Asp-Cys-Lys-Gly-Cys-GlyアミドのようなグリコプロテインIIb／IIIa結合性ペプチド、Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Gly-Ala-Lysアミドのようなアテローム性動脈硬化症プラーク結合性ペプチド、Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Serのような血小板因子４誘導ペプチド、スピロペリドールやハロペリドールのようなリセプター結合分子、アシアリルLewis2、２−ニトロイミダゾールのような酵素基質、ヒルジンやD-Phe-Pro-Argクロロメチルケトンのような酵素阻害剤、β−グルカンのような炭水化物などが含まれる。
本発明の試剤の一例として標的部分を含むβ−グルカンがある。本発明の目的において、「β−グルカン」なる用語は、１,３−および１,６−結合β−Ｄ−グルコース残基を有するオリゴサッカライドであって、β−グルカン分子が約２,０００キロダルトン以下の分子量を有するものを言う。本発明にかかるβ−グルカン含有試剤の好ましい一例は次式を有するものである：β−グルカン−（−NNHCO(CH2)2CO）(ε-K)GCYアミド。
標的分子がペプチドである本発明の態様において、本発明の各ペプチド例はアミノ酸配列を有する。ここに使用された「アミノ酸」なる用語は、Ｌ−およびＤ−第１α−およびβ−アミノ酸であって、天然、修飾、置換、改変等を受けたものも含まれる。本発明の標的分子を含むペプチドには、次式のペプチドが包含されるが、これらに限定されるものではない：
0003727342.tif 000012
0003727342.tif 000013
0003727342.tif 000014
（アミノ酸の単文字略号は、G.Zubay,Biochemistry(2d.ed.),1988(MacMillen Publishing:New York)p.33に見いだすことが出来る；他の略号は、次のとおりである：Acm、アセトアミドメチル（acetamidomethyl）；Mob、４−メトキシベンジル（4-methoxybenzyl）；Abu、アミノ酪酸（aminobutyric acid）；FDはＤ−フェニルアラニン（Ｄ-phenylalanine）；WD、Ｄ−トリプトファン(Ｄ-tryptophan)；YD、Ｄ−チロシン（Ｄ-tyrosine）；Aca、６−アミノヘキサン酸（6-aminohexanoic acid）；Amp、４−アミジノフェニルアラニン（4-amidinophenylalanine）；Acp、Ｓ−（３−アミノプロピル）システイン（S-(3-aminopropyl)cysteine；Hcy、ホモシステイン（homocysteine）；Nal、２−ナフチルアラニン（2-naphthylalanine）；Cpa、４−クロロフェニルアラニン（4-chloropheylalanine）；KD）、Ｄ−リジン（D-lysine）；DD、Ｄ−アスパルテート（D-aspartate）；NalD、Ｄ−２−ナフチルアラニン（D-2-naphthylalanine）；ＤＴＰＡ、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（diethylenetriaminepentaacetic acid）；Trc、トリカルバリル酸（tricarballylic acid）；Trc-imide、トリカルバリルイミド（tricarballylic imide）およびHca、ヘキサカルボキシシクロヘキサン（hexacarboxycyclohexane）。（．．．）2Ｋはリジンの二つのアミノ基に対する共有結合を表す。Ｈcy（．．．）はホモシステインの側鎖硫黄原子に対する共有結合を表す。（Ｎ-ＣＨ3）ＦはＮ−α−メチルフェニルアラニンを表す。基間の下線は環状スルフィドを表す（たとえばCH2COＹDＲＧＤＣにおけるＣＨ2ＣＯ基とシステイン（Ｃ）の間におけるが如し）。アミノ酸の間の下線は環状ジスルフィド結合を表す（たとえばＣＮＰＲＧＤＣにおけるシステイン（Ｃ）の間におけるが如し）。下線配列の前の「cyclo」なる語はＮ−末端とＣ−末端の環状配列を表す。下つきの記号ＸDはアミノ酸がＤ−配位にあることを表す。全ての他の下つきの記号はアミノ酸側鎖保護基に関するものである。ε−Ｋは典型的なα−アミノ基ではなく、ε−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成しているリジン残基を表す。δ−Ｏrnは典型的なα−アミノ基ではなく、δ−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成しているオルニチン残基を表す。γ−Ｄabはγ−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成している２，４−ジアミノ酪酸残基を表す。β−Ｄapはβ−アミノ基が隣接アミノ酸のカルボキシル基に共有結合してペプチド結合を形成している１,３−ジアミノプロピオン酸を表す。
本発明により提供される放射性医薬の調製用試薬のこのリストは例示的なものであって、限定または排除を意図するものではなく、当業者であれば、本明細書に開示したペプチドまたはその相当物の組合せを含む試薬が本発明のいずれのキレート化基とも共有結合すること、および本明細書に開示した種々の標的基および金属キレート剤も本発明の範囲内に含まれることは当業者であれば理解するであろう。
ある種の具体例において、金属キレート剤および標的部分は多価連結部分を介して結合している。多価連結部分は本発明の標的部分、金属キレート剤またはその両方に共有結合している。本発明に提供される多価連結部分は、標的部分または金属キレート剤に共有結合し得る少なくとも２個のリンカー官能基よりなる。かかる官能基には、限定するものではないが、一級アミンおよび二級アミン、ヒドロキシル基カルボン酸基およびチオール反応性基が含まれる。多価連結部分は、好ましくは、標的部分または金属キレート剤に共有結合され得る少なくとも３個の官能基よりなる。好ましい多価連結部分には、リジン、ホモリジン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸のごときアミノ酸；直鎖状および環状のアミンおよびポリアミン；ポリカルボン酸；ならびにジ-およびトリマレイミドのごとき活性化チオールが含まれる。また好ましいのは、多価連結部分が、共有結合して分岐多価連結部分を形成する複数の多価連結部分よりなる具体例である。特に好ましい多価連結部分には、ビススクシンイミジルメチルエーテル、４-（２,２-ジメチルアセチル）安息香酸、トリス(スクシンイミジルエチル)アミン、４-(Ｏ-ＣＨ2ＣＯ-Ｇly-Ｇly-Ｃys.アミド)アセトフェノン、ビス-スクシンイミドヘキサン、トリス(アセトアミド-エチル)アミン、トリス(アセトアミドメチル)エーテル、ビス(アセトアミドエチル)エーテル、α,ε-ビスアセチルリジン、および１,８-ビス-アセトアミド-３,６-ジオキサ-オクタンが含まれる。
本発明のペプチド標的基は、イン・ビトロ(in vitro)で化学的に合成し得る。本発明のペプチド標的部分は、一般的に、ペプチドシンセサイザー上で有利に合成し得る。本発明のペプチド標的部分は合成し得、そこでは、イン・ビトロ(in vitro)合成の間に、当業者によく知られた技術を用いて、キレート基が特異的-結合ペプチドに共有結合される。ペプチド合成の間のキレート基の導入は、それが特異的-結合ペプチドおよび錯化基の間の共有結合の正確な位置が両方とも知られる試薬を提供し、特異的結合ペプチドの特異的な結合親和性のいずれの不安定要因をも回避または最小限化するように試薬をデザインし得るため、特に有利である。
加えて、金属キレート剤は、例えば、リジンのε-アミノ基のようなアミノ酸の側鎖を含む基に共有結合し、例えば、αＮ(Ｆmoc)-Ｌys-εＮ-(Ｇly-Ｇly-Ｃys-)を提供し得、それはペプチド鎖のいずれの位置にも導入し得る。この配列は、特に有利である。なぜならば、それは標的結合ペプチドの導入の簡便な様式を提供するからせある。本発明は、実質的にいずれかのペプチド標的部分へのこれらのキレート剤の導入を提供し、Ｔｃ-９９ｍ錯体基に共有結合した放射性同位体標識ペプチドを生じる。
本発明の金属キレート剤または金属キレート剤／標的部分コンジュゲートでの放射性テクネチウムの錯体の形成においては、還元剤存在下にて、テクネチウム錯体、好ましくはＴｃ-９９ｍ過テクネチウム酸の塩をキレート剤またはコンジュゲートと反応させ；好ましい具体例において、該還元剤は、第一スズイオンの塩、最も好ましくは塩化第一スズである。Ｔｃ-９９ｍ-標識金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートである本発明のシンチグラフィー・イメージング剤は、所定量の試薬およびＴｃ-９９ｍで試薬を標識するに十分量の還元剤を含有する密封バイアルを含むキットから簡便かつ有利に提供される。別法として、本発明のシンチグラフィー・イメージング剤は、本発明の金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートと、予め形成したテクネチウムのラービル錯体および移動リガンドとして知られる他の化合物とを反応させることによって形成し得る。このプロセスは、リガンド交換として知られ、当業者によく知られている。ラービル錯体は、例えば、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコネート、グルコヘプトネートまたはマンニトールのごとき移動リガンドを用いて形成し得る。本発明で有用なＴｃ-９９ｍ過テクネチウム酸塩の中には、ナトリウム塩またはアンモニウム塩のごときアルカリ金属塩、または低級アルキルアンモニウム塩が含まれる。本発明の試薬とＴｃ-９９ｍ過テクネチウム酸塩または予め形成したＴｃ-９９ｍラービル錯体との反応は、室温にて水性媒質中で行い得る。本発明により提供されるテクネチウム-９９ｍ標識シンチグラフィー・イメージング剤は、以下の実施例２に記載する反応条件下で調製し得る。
放射性標識金属キレート剤および金属キレート剤/標的部分コンジュゲートは、放射性医薬剤として使用するのに適量の放射活性を有して提供される。約０.０１ミリキュリー(ｍＣｉ)〜１００ｍＣｉ/ｍＬの濃度の放射活性を含有する溶液中で放射性錯体を形成するのが一般的に好ましい。
本発明のＴｃ-９９ｍ-標識金属キレート剤および金属キレート剤/標的部分コンジュゲートであるシンチグラフィー・イメージング剤は、ガン、例えば、胃腸系腫瘍、メラノーマ、小細胞ガンおよび他のＡＰＵドーマ、髄質チロイドガンおよび下垂体腫瘍、髄膜腫および星状細胞腫のごとき脳腫瘍、ならびに前立腺、乳房、小腸および卵巣の腫瘍のごとき数多くのタイプの疾患の診断に有用である。また、本発明のシンチグラフィー・イメージング剤は、感染症、血栓、肺塞栓、炎症、アルツハイマー病およびアテローム硬化症、ならびに肺、心臓、肝臓、腎臓、骨および脳の疾患の部位をイメージするのにも有用である。
本発明によれば、Ｔｃ-９９ｍ標識シンチグラフィー・イメージング剤は、単一ユニット注射用量で投与する。本発明のシンチグラフィー・イメージング剤は、生理食塩水のごとき従来の静脈注射用媒質、または血漿媒質中で静脈内投与し得る。また、かかる媒質は、例えば、浸透圧調整用の医薬上許容される塩、緩衝剤、保存料などのごとき従来の医薬調整剤も含有し得る。好ましい媒質の中では、通常、生理食塩水および血漿である。一般的に、投与すべき単位用量は約０.０１ｍＣｉ〜約１００ｍＣｉ、好ましくは１ｍＣｉ〜２０ｍＣｉの放射能を有する。単位投与量で注射すべき溶液は、約０.０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。有利には、該用量は静脈内投与し得るが、他の経路、例えば、静脈内を用いることもできる。投与後に、目的の領域のイメージングは数分で起こり得る。しかしながら、所望により、イメージングは、患者に注射後数時間またはより長い時間起こすこともできる。極端な例において、十分量の投与用量は、約０.１時間以内にイメージングすべき空間に蓄積し、シンチフォトを採ることができる。診断目的のシンチグラフィー・イメージングのいずれの従来法も、本発明により利用し得る。
また、本発明は、哺乳動物体内の病理学的状態を治療するための、本発明のＲｅ−１８６、Ｒｅ−１８８またはＳｎ-１１７ｍ標識金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートである放射性治療剤も提供する。スズ錯体は、単純に、本発明の金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートを放射性スズ塩と反応させることによって調製する。レニウム錯体は、前記および以下の実施例２に記載するようにテクネチウム-９９ｍ錯体と実質的に同一の方法で調製する。特に、レニウム錯体は、キレートリガンド存在下で過レニウム酸塩の反応によるか、またはオキソテトラボロモレネートのごとき予め還元したレニウムと本発明の金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートの反応によるかのいずれかによって作製する。治療目的には、レニウム-１８６、レニウム-１８８、またはＳｎ-１１７ｍ錯体を約０.０１〜約１００ｍＣｉ、好ましくは１〜２０ｍＣｉの用量で提供する。
これらの化合物を作製し、標識する方法を以下の実施例にさらに十分に説明する。これらの実施例は、前記方法および有利な結果のある種の態様を説明しているものである。これらの実施例は例示的に示すものであって、限定するものではない。
実施例１
固相ペプチド合成
固相ペプチド合成(ＳＰＰＳ)は、Ａpplied Ｂiosystems Ｍodel 431Aペプチドシンセサイザーを用い、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆmoc)アミノ-末端保護を用い、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは２-(１Ｈ-ベンゾ-トリアゾール-１-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート/ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＢＴＵ/ＨＯＢＴ)でカップリングし、カルボキシ末端酸にはｐ-ヒドロキシメチルフェノキシ-メチルポリスチレン(ＨＭＰ)またはＳasrinTM樹脂を、またはカルボキシ-末端アミドにはＲinkアミド樹脂を用いて、０.２５ミリモル(mmole)スケールで行った。
ホモシステイン(Ｈcy)は、Ｌ-ホモシステインラクトンのアルカリ加水分解によるか、または液体アンモニア中の金属ナトリウムを用いたホモシステインの還元によって調製した。Ｆmoc.Ｈcy(Ｓ-trityl)およびＦmoc.Ｐen(Ｓ-trityl)は、Ａthertonら(1989,Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓynthesis,IRL Press社：Ｏxford)により記載されているごとく、トリフルオロ酢酸中のトリフェニルメタノールでのトリチル化につづくＦmoc誘導体化によって、適当な前駆体アミノ酸から調製した。チロシンの４-ピペリジニルブチルエーテル誘導体
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は、Ｆmoc-チロシン-(4-Ｂoc-ピペリジンブチルエーテル)で出発するＳＰＰＳによって調製した。Ｆmoc-Ｓ-(３-Ｂoc-アミノプロピル)システインは、メタノールを含むナトリウムメトキシド中のＬ-システインおよびＢoc-アミノプロピルブロミドにつづく、ｐＨ１０でのＯ-９-フルオレニルメチル-Ｏ'-Ｎ-スクシンイミジルカーボネート(ＦmocＯsu)での処理から調製した。４-アミジノフェニルアラニン(Ａmp)は、出典明示して本明細書の一部とみなす共同出願かつ同時係属出願であるＰＣＴ/ＵＳ９４/０３８７８号に記載のごとく調製した。
適当には、ＳＰＰＳの間にカップリングすべき差異母の残基としての適当な２-ハロ酢酸を用いることによってか、またはＮＭＰ中の２-ハロ酢酸/ジイソプロピルカルボジイミド/Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルもしくはＮＭＰ中の無水２-ハロ-酢酸/ジイソプロピルエチルアミンのいずれかで、樹脂に結合するペプチドのＮ-末端遊離アミノ基を処理することによってかのいずれかで、２-ハロアセチル基を導入した。
適当には、リン酸または重炭酸緩衝液中の０.１-１.０ｍｇ/ｍＬ溶液、または０.５-１.０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する希水酸化アンモニウム(ｐＨ８)を撹拌し、つづいて酢酸で酸性化し、凍結乾燥しＨＰＬＣ精製することによって２-ハロアセチル化ペプチドを環化した。
適当には、チオール-含有ペプチドをクロロアセチル含有、チオール-保護Ｔｃ-９９ｍ錯体形成基と、ｐＨ１０、室温にて０.５-４時間反応させ、つづいて、酢酸酸性化し、溶液を蒸発させて対応するペプチド-スルフィド付加物を得た。脱保護および精製は、記載のごとくルーチンに行い、キレート剤-ペプチドコンジュゲートを得た。
ＳasrinTM樹脂-結合ペプチドは、ジクロロメタン中の１％ＴＦＡ溶液を用いて切断して保護ペプチドを得た。適当には、アミノ酸側鎖が保護されている発生ペプチド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて、保護ペプチド前駆体をアミノ-末端遊離アミンおよびカルボキシ-末端遊離酸の反応によってアミノ-およびカルボキシ-末端の間で環化した。
ＨＭＰまたはＲinkアミド樹脂-結合生成物をルーチンで切断し、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)またはＴＦＡおよび塩化メチレンを含む、所望により水、チオアニソール、エタンジオールおよびトリエチルシランまたはトリイソプロピルシランを１００：５：５：２.５：２の比で含んでいてもよい溶液を用いて、保護側鎖-含有環化ペプチドを室温にて０.５-３時間脱保護した。適当には、トリフェノールメタノール/ＴＦＡ中で生成物をre-Ｓ-トリチル化し、(Ｂoc)2Ｏを用いてペプチドにＮ-Ｂoc基を再導入した。
粗製ペプチドは、Ｗaters Ｄelta-Ｐak C18カラムおよびアセトニトリルで修飾した水中の０.１％ＴＦＡでの勾配溶出を用いた分取用高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)によって精製した。カラム溶出後に、溶出フラクションからアセトニトリルを蒸発させ、ついでこれを凍結乾燥した。かく生成し精製した各生成物の同定は、高速原子衝突質量分析(ＦＡＢＭＳ)または電子スプレー質量分析(ＥＳＭＳ)によって確認した。
実施例２
Ｔｃ-９９ｍで放射線標識する常法
金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートの試料０.１ｍｇを０.１ｍＬの水、または５０：５０エタノール：水、またはリン酸緩衝液(ＰＢＳ)、または５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝５、６または７.４)もしくは水中の１０％(ｗ/ｖ)ヒドロキシプロピルシクロ-デキストリン(ＨＰＣＤ)に溶解した。Ｔｃ-９９ｍグルセプテートは、Ｇlucoscanバイアル(Ｅ.Ｉ.ＤuＰont de Ｎemours，Ｉnc.社,Ｗilmington，ＤＥ)を２００ｍＣｉまでを含有するＴｃ-９９ｍ過テクネチウム酸ナトリウム１.０ｍＬで再現し、室温にて１５分間放置し、ついで金属キレート剤または金属キレート剤/標的部分コンジュゲートに２５μlのＴｃ-９９ｍグルセプテートを添加し、該反応物を放置して室温にて５-３０分間反応を進行させ、ついで０.２μｍフィルターを通して濾過することによって調製した。
Ｔｃ-９９ｍ標識試薬の放射能化学純度は以下の条件を用いたＨＰＬＣによって測定した：５μｍ×４.６ｍｍ×２２０ｍｍの寸法を有するＷaters Ｄelta-Ｐak RP-18分析カラムを、各放射性標識ペプチドで負荷し、ついで１ｍＬ/分の流速でこれ溶出する。グラジエント溶出は、１００％溶媒Ａ(０.１％ＴＦＡ/水)で出発し１００％溶媒Ｂ(０.１％ＴＦＡ/９０％アセトニトリル/水)で終結する線状勾配を用いて１０-２０分間行った。放射性成分は、積算レコーダーにつなげたin-lineラジオメトリック検出器によって検出した。Ｔｃ-９９ｍグルセプテートおよびＴｃ-９９ｍ過テクネチウム酸ナトリウムは、これらの条件下では１および４分の間に溶出されるが、Ｔｃ-９９ｍ標識ペプチドはその時間よりはるかに後に溶出する。
非-放射性レニウム錯体は、本発明の各試薬と、Ｃottonら(1966,Ｉnorg.Ｃhem.5:9-16)によって記載されているごとく調製した約１モル当量のテトラブチルアンモニウムオキソテトラ-ブロモレネート(＋５)とをジメチルホルムアミドまたはアセトニトリル／水中に同時溶解し、０.５-５日間撹拌することによって調製した。該レニウム錯体は、Ｔｃ-９９ｍ標識ペプチドについて前記したごとく逆相ＨＰＬＣによって単離し、ＦＡＢＭＳまたはＥＳＭＳによって特徴付けした。
例えばＲｅ-１８６またはＲｅ-１８８を用いた放射性レニウム錯体は、Ｔｃ-９９ｍ標識と同一のプロトコールを用いて適当な過レネート塩からか、またはペプチドおよび過レネエートの溶液に還元剤を添加するか、または所望によりクエン酸塩のごときリガンド移動剤を用い、該反応物を室温〜１００℃にて５〜６０分間インキュベートすることによって調製した。
以下の表は、本明細書記載の方法を用いて実施例１に従って調製したペプチドの成功したＴｃ-９９ｍ標識を説明している。
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**肩文字は以下の標識条件を意味する：
１＝水中
２＝１０％ＨＰＣＤ中
３＝５０／５０エタノール／水中
４＝０.９％ＮａＣｌ中
５＝ＮａＨＣＯ3でｐＨ９にした水中
***ＨＰＬＣ法（ＲTの後ろの肩文字により示す）
溶媒Ａ＝水中０.１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ＝水中０.１％ＴＦＡ／ＣＨ3ＣＮ
Waters−１カラム＝Waters DeltaPak C18、５μｍ、３９ｍｍ  ｘ  １５０ｍｍ（流速：１.２ｍＬ／分）
Waters−２カラム＝Waters NovaPak Radial Compression C18、４μｍ、８ｍｍ  ｘ  １００ｍｍ（流速：３ｍＬ／分）
Vydacカラム＝Vydac 218TP54 RP-18、５μｍ、４.６ｍｍ  ｘ  ２２０ｍｍ（流速：１ｍＬ／分）
方法１＝Waters−１カラム、１００％溶液Ａ→１０分で１００溶液Ｂ
方法２＝Vydacカラム、１００％溶液Ａ→１０分で１００％溶液Ｂ
方法３＝Waters−２カラム、１００％溶液Ａ→１０分で１００％溶液Ｂ
アミノ酸の１文字略記法は、G.Zubay,Biochemistry(2d.ed),1988(MacMillen Publishing:New York)p33に見いだされる。下線は、結合アミノ酸または誘導体基間のアミドまたはチオール結合の形成を示す。Ａｃｍはアセトアミドメチル；Ｏｒｎはオルニチン；ＦDはＤ−フェニルアラニン；ＹDはＤ−チロアイン；ＷDはＤ−トリプトファン；ＫDはＤ−リジン；ＤDはＤ−アスパラギン酸Ａｍｐは４−アミジノフェニルアラニン；ＡｐｃはＬ−（Ｓ−（３−アミノプロピル）システイン）；Ｈｃｙはホモシステイン；Ｎａｌは２−ナフチルアラニン；ＮａｌDはＤ−２−ナフチルアラニン；ＤＰＴＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸；Ｃｐａは４−クロロフェニルアラニン；Ａｃａは６−アミノヘキサン酸；Ａｂｕはアミノイソ酪酸；Ｔｒｃはトリカルバリリックアシッド；Ｔｒｃ−イミドはトリカルバリリックイミド；Ｈｃａはヘキサカルボキシシクロヘキサンである。(．．．)2Ｋは、リジンの両方のアミノ基への共有結合を示す。Ｈｃｙ(．．．)は、ホモシステインの側鎖硫黄原子への共有結合を示す。（Ｎ−ＣＨ3）ＦはＮ−α−メチル−フェニルアラニンを示す。基（例えば、ＣＨ2ＣＯＹDＲＧＤＣにおけるＣＨ2ＣＯ基とシステイン（Ｃ）との間）間の下線は環状スルイフィドを示す。アミノ酸間の下線（例えば、ＣＮＰＲＧＤＣにおけるシステム（Ｃ））は環状ジスルフィド結合を示す。下線を付した配列の前の用語「シクロ」はＣ−末端に結合したＮ−末端である環状配列を意味する。下付き文字ＸDは、アミノ酸がＤ−配置であることを示し；他のすべての下付き文字はアミノ酸側鎖保護基をいう。
実施例３
血小板凝集阻害アッセイ
実質的にはZucker(1989,Methods in Enzymol.169:117〜133)により記載されたようにして血小板凝集の研究を行った。簡単に説明すると、１マイクロリットル中３０００００個の血小板からなる新鮮ヒト・血小板豊富血漿を用い、推定上の血小板凝集阻害化合物を用いて血小板凝集をアッセイした。アデノシンジホスフェート溶液を添加して最終濃度１０ないし１５マイクロモルとすることにより血小板凝集を誘導し、Bio／Dataアグレゴメーター（Bio/Data Corp.,Horsham,PA）を用いて血小板凝集の程度をモニターした。血小板凝集阻害化合物の濃度を、０.１から５００μｇ／ｍｌまで変化させた。血小板凝集を５０％減じた阻害剤濃度（ＩＣ50と定義）を、血小板凝集の程度に対する阻害剤濃度のプロットから決定した。陽性対照として試験した血小板の各バッチに関してペプチドＲＧＤＳに関する阻害曲線を決定した。
下記ペプチド試薬を上記アッセイにおいて試験した：
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これらの実験結果を表IIに示す（ＲＧＤＳは陽性対照）。
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（表Ｉの説明に記載したように、アミノ酸の１文字略記法は、G.Zubay,Biochemistry(2d.ed),1988(MacMillen Publishing:New York)p33に見いだされる）。
これらの結果は、本発明ペプチド試薬が、インビトロにおいて高アフィニティーで特異的なGPIIb/IIIa受容体に結合することを示す。
実施例４
イヌ・モデルにおけるＴｃ−９９ｍ標識血栓標的ペプチドを用いる深部静脈血栓症のイメージング
雑種犬（２５〜３５ポンド、一晩絶食）を、ケタミンおよびアセプロザミン混合物を筋肉内注射して鎮静化させ、次いで、ペントバルビタールナトリウムを静脈注射して麻酔した。各動物において、１８ゲージの血管カテーテルを右大腿部静脈の遠位の半分に挿入し、５ｍｍまたは８ｍｍのDacronRのからまったステンレス鋼閉塞コイル（Cook Co.,Bloomington IN）を、大腿部のほぼ中央部の大腿部静脈中に入れた。カテーテルを除去し、傷を縫合し、コイルの設置をＸ線で見た。次いで、動物を一晩回復させた。
コイル設置後、各動物を再麻酔し、各前足にセイライン静脈滴注を行い、尿を集めるために膀胱カテーテルを挿入した。低エネルギー全目的コリメーターを装備したガンマカメラの下に動物をうつむけて置き、Ｔｃ−９９ｍに関してフォトピークした。Ｔｃ−９９ｍ標識血栓標的ペプチド［１８５〜３７０ｍＢｑ（５〜１０ｍＣｉ）Ｔｃ−９９ｍ、試薬０.２〜０.４ｍｇ］をそれぞれ、一方の前足の挿入位置において静脈ライン中に注入した。第２のラインを血液の収集のために維持した。
ガンマカメライメージングを注入と同時に開始した。最初の１０分間において動的研究として心臓上の腹側のイメージを得て、次いで、注入後１、２、３および４時間目に静的イメージを得た。注入後約１０〜２０分、次いで、約１、２、３および４時間目に足の上の腹側のイメージを５０００００カウントまたは２０分間得た。膀胱上に配置した鉛シールドを用いて足のイメージを収集した。
最後のイメージを集めた後、ペントバルビタールで各動物を深く麻酔した。ヘパリン処理シリンジを用いて２つの血液試料を収集した後、心臓内または濃縮塊静脈注射により安楽死量の塩化カルシウム飽和溶液を投与した。次いで、血栓を含んでいる大腿部静脈、対側（対照）の足の静脈の同様の部分、血栓に近い部分の血管の部分、およびふとももの筋肉の試料を注意深く切除した。次いで、血栓、コイルおよびコイル状Dacronファイバーを血管から切除した。血栓、セイライン洗浄した血管試料、コイルおよびコイル状DacronRファイバーを分離し、前以て秤量しておいた試験管に各試料を入れた。試料を秤量し、注入量のわかっているフラクションとともに、Ｔｃ−９９ｍチャンネル中のガンマウェルカウンターでカウントした。
新鮮血栓を秤量し、安楽死直前に血栓および血液中の注入量パーセント値（％ＩＤ）／ｇ得て、血栓／血液および血栓／筋肉比を決定した。コンピューターに蓄えたイメージから、血栓および隣接する筋肉上に描かれた対象領域において測定されたカウント数／ピクセルの分析により、血栓／バックグラウンド比を決定した。
代表的な結果を表IIIに示す。表IIに示す化学構造に対応するペプチドを数により同定する。これらの結果は、これらの代表的なペプチドのそれぞれは、Ｔｃ−９９ｍ標識され、投与され、本明細書記載のごとくイメージ化された場合に、in vivoで効果的なシンチグラフィーイメージング剤として有用であることを示す。
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実施例５
高コレステロールウサギモデルにおけるＴｃ−９９ｍ標識シンチグラフィー用イメージング剤を使用したアテローム硬化症プラークの局在化およびインビボイメージング
両方の性で、２−３kgの体重のニュージーランドホワイト(ＮＺＷ)ウサギを２群に分ける。対照群は、ウサギ餌商品(Ｐurina)を与え、食べさせる６匹のウサギを含む。ＨＣ群は、標準化したコレステロールに富む餌(コレステロール１％ｗ／ｗ濃度に混ぜたウサギ餌)を、７週令から２８週令になるまで食べさせる。全ての動物は水を自由に摂取する。
Ｔｃ−９９ｍ標識アテローム硬化症プラークイメージング剤は、上記のように製造する。約１０００μgのペプチドをＴｃ−９９ｍ  １００−２００mＣｉで標識し、０.５−２mＬ容量で、５−１０mＣｉの単位用量(１２.５−２０.０μg／ウサギ；６−７μg／kg)に調製する。成熟ウサギに、各Ｔｃ−９９ｍ標識イメージング剤を、ゆっくりした塊注入(約０.１mＬ／分)により、側耳静脈内に投与する。シンチフォトを、ピンホールコリメーター(pin-hole collimator)(５mm穴)が接続し、エネルギー窓がＴｃ−９９ｍにセットされ、約５００,０００カウントを蓄積するかまたは所望の時間スキャンできる、ガンマカメラを使用して得る。イメージングの直前に、動物をケタミンとキシラジン(５：１、１mＬ／kg、筋肉内)の混合物で麻酔する。
ガンマカメライメージを心臓の心臓の直ぐ上４０°−４５°(左前傾斜[ＬＡＯ]視野)で得、大動脈弧を描写し、下方大動脈を見る。イメージは注射後１５分および２時間に得る。追加麻酔は、必要に応じて、各イメージ回収前に注射する。
２.５時間(２時間スキャン後)、動物をペントバルビタールナトリウムの静脈投与により殺す。死体解剖において、大動脈を回収し、枝別れ血管を、大動脈弁が無いように、腹の真ん中まで切開する。並行(parallel)ホールコリメターを使用して、大動脈をコーポラ外(ex corpora)にイメージする。対照として、大動脈を長手方向に切開し、スダンIVで染色し、それによりアテローム硬化症プラークが濃赤レンガ色に変わる。脂肪が無い、傷付いて無い大動脈内皮は、対照的にこれらの条件下で正常な、光る白ピンクのままである。したがって、このプロトコールは、本発明のシンチグラフィー用イメージング剤を使用したアテローム硬化症プラークの存在を確認するのに、明らかに使用できる。
実施例６
感染の動物モデルにおけるＴｃ−９９ｍ感染標的剤のシンチグラフィーイメージングおよび生体分布
両方の性の体重２−３kgのニュージーランドホワイト(ＮＺＷ)ウサギに、有効なエシェリキア・コリ株を、左ふくらはぎ静脈内に感染させた。２４時間後、動物をケタミンおよびキシラジンの筋肉内により鎮静化し、次いでＴｃ−９９ｍ標識感染標的剤
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を注射した。次いで、動物をイメージすべきガンマカメラ(ＬＥＡＰ  カロリメーター／Ｔｃ−９９ｍにフォトピーク)の見える範囲内に、仰向けにおいた。動物を注射後１時間にわたりイメージし、次いで、約１時間間隔で、次の３時間イメージした。動物を、イメージを得ない間は正気にさせ、必要に応じて再麻酔した。
最後のイメージングが終了した後、動物をペントバルビタールの致死量を静脈投与して殺し、次いで血液ならびに感染および対照組織を得るために死体解剖した。組織サンプルを秤量し、ガンマ放射カウンターを使用して計数した；標準量である注射投与量は、対照として各サンプルと平行して計数した。これらのデータから、組織サンプルに残っている注射量の組織グラム当たりの割合を測定した。感染組織対非感染筋肉組織のグラム当たり、および感染筋肉組織対血液の注射量の割合を、次いで、各ペプチドについて計算し、本発明の放射標識シンチグラフ用イメージング剤の特異的局在化を証明した。
これらの実験の結果を表IVに示す。これらの結果は、これらの代表的剤が、哺乳類体内の炎症部位を検出するために有用なシンチグラフィーイメージング剤であることを示す。
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実施例７
ＡＲ４２Ｊラット膵臓腫瘍細胞膜に結合する[125Ｉ−Ｔyr11]ソマトスタチン−１４の阻害
本発明の様々なソマトスタチン類似体がインビトロでソマトスタチン受容体に結合する能力を、放射性標識ソマトスタチン類似体のソマトスタチン受容体含有細胞膜への結合のペプチド試薬媒介阻害アッセイにおいて測定した。
ソマトスタチン受容体を発現するラット膵臓腫瘍細胞ラインＡＲ４２Ｊを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および８ｍＭグルタミンを補足したダルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）中、加湿５％ＣＯ2雰囲気中３７℃で培養した。収穫した細胞を冷緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣl、ｐＨ７.４）中で均質化し、次いで、ホモジェネートを３９,０００gで１０分間４℃で遠心分離した。ペレットを１度緩衝液で洗浄し、次いで、氷冷１０ｍＭトリス−ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.４）に再懸濁した。その後、この細胞膜調製物の等量ずつを[125Ｉ−Ｔyr11]ソマトスタチン−１４（アメルシャム、イリノイ州アーリントン）、最終濃度０.５nＭ、７５０,０００cpm／ml、比活性２０００Ci／mmol、および本発明のペプチドまたはペプチド−レニウム錯体（１％ウシ血清アルブミン含有５０mＭＨＥＰＥＳ緩衝液中最終濃度範囲１０-11ないし１０-6Ｍ、ｐＨ７.４、５ｍＭＭgＣl2、０.０２mg／mlバシトラシン、０．０２mg／mlフェニルメチルスルホニルフルオリド、および２００,０００ＩＵトラシロール）のいずれかと共に３０℃で２５分間インキュベートした。
インキュベーション後、膜混合物を濾過マニホルドを用いてポリエチレンイミン洗浄ＧＣ／Ｆフィルター（ホワットマン・リミテッド、イギリス、メッドストーン）により濾過し、フィルターに残った残渣を５ｍＬ冷ＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、フィルターおよびフィルター洗液のサンプルをガンマカウンターでカウントした。非特異的結合を評価するために、アッセイを２００mg非標識化ソマトスタチン−１４の存在下で実質的に上記の通り実施した。データ分析の際、BylundおよびYamamura（1990，Methods in Nuerotransmitter Receptor Analysis,Yamanura等、編，Raven Press:N.Y.）に記載のとおり、阻害定数を得るためにデータのヒルプロットを行った。
下記のペプチドを試験した：
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本発明の試薬を用いるこのアッセイを用いて得られた結果は、下記の通りである：
0003727342.tif 000027
これらの結果は、本発明のペプチド試薬が、インビトロで高親和性を持ってソマトスタチン受容体に結合することを示している。
実施例８
ラットにおけるソマトスタチン受容体(ＳＳＴＲ)−発現腫瘍の位置測定およびインビボイメージング
ラット腫瘍細胞により発現されるソマトスタチン受容体のインビボイメージングを実質的にBakker等（1991,Life Sciences49:1593-1601）に記載のとおりに行った。
凍結収穫腫瘍ブライから解凍したＣＡ２０９４８ラット膵臓腫瘍細胞を０.０５ないし０.１mL／動物の懸濁液で６週齢のルイスラットの右後部腿へ筋肉内移植した。腫瘍を約０.５ないし２gまで増殖させ、収穫し、腫瘍ブライを第２の投薬未経験（naive）のルイスラットに移植するのに使用した。この段階の処理を繰り返して、継代の腫瘍保持動物を作った。インビボ研究に使用された腫瘍保持動物は、通常、第３ないし第５代由来のものであり、０.２ないし２gの腫瘍を有した。
腫瘍におけるラジオトレーサー位置測定の特異性を研究するために、選択した動物に、オクトレオチドの皮下ＳＳＴＲ−遮断用量（４mg／kg）をラジオトレーサー注射の３０分前に与えた。（このプロトコールは111Ｉn−[ＤＴＰＡ]オクトレオチド腫瘍取り込みを４０％まで低減する結果を得たことがBakker等に示されている。）
第３ないし第４代のＣＡ２０９４８腫瘍保持ルイスラットを保定し、本発明の99mＴc−標識化ＳＳＴＲ標的イメージング剤を０.１５−０.２０mＣiの用量（０.２ないし０.４ｍＬ中３ないし８μgペプチドに対応する）で背尾静脈から静脈内注射した。
所定時間で、動物を頸部転位により屠殺し、所定の死体解剖を行った。収穫した組織サンプルの重量を測り、ガンマウェルカウンターで注射用量ずつカウントした。
選択した放射性標識ペプチドの９０分の生体分布結果を表ＶＩに表す。特に、99mＴc−Ｐ８３２、99mＴc−Ｐ８２９、および99mＴc−Ｐ７７３は、非常に高い腫瘍取り込みおよび標的（腫瘍）組織におけるそれらの高度特異的取り込みを示す腫瘍／血液比率を示した。これらの結果は、本発明の代表的なシンチグラフィー用イメージング剤を用いて、ソマトスタチン受容体発現新生物細胞の部位をインビボで位置測定できること、および、そのため、癌の放射性診断剤および放射能療法剤としての効能を有することを示している。
上記開示は、本発明のある特定の実施態様を包含すること、およびこれらに均等な全ての修飾または変更が添付の請求の範囲に記載した本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。
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