(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒活性を有する、切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７）であって、ヒトＣＹＰ７に存在する膜アンカー領域を欠いている、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７。
【請求項２】
前記膜アンカー領域がヒトＣＹＰ７のアミノ酸１〜２４からなるものである、請求項１に記載の触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７。
【請求項３】
切断されたヒトＣＹＰ７が、レダクターゼおよびＮＡＤＰＨの存在下においてコレステロールの７α−位の初期ヒドロキシル化を触媒し、７α−ヒドロキシコレステロールを生成することができるものである、請求項１または２に記載の触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７。
【請求項４】
切断されたヒトＣＹＰ７が、切断されたラットＣＹＰ７の比活性の少なくとも１０％の比活性を有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の切断されたヒトＣＹＰ７をコードする、ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７をコードするＤＮＡを含んでなる、発現ベクター。
【請求項７】
リボソーム結合部位の上流であってその近傍に配置された転写エンハンサー配列と、ｐＵＣ１２の複製起点とを更に含んでなる、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
大腸菌ＴＯＰＰ３−ｐＪＬ／Ｈ７α１．５（ＡＴＣＣ  ６９４０１）に存在する、発現ベクターｐＪＬ／Ｈ７α１．５。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の発現ベクターを含んでなる、大腸菌ＴＯＰＰ３宿主細胞。
【請求項１０】
発現ベクターｐＪＬ／Ｈ７α１．５（ＡＴＣＣ  ６９４０１）を含んでなる、大腸菌ＴＯＰＰ宿主細胞。
【請求項１１】
触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の製造法であって、
（１）  請求項９または１０記載の宿主細胞を適切な培地で培養し、
（２）  適切な触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の発現を誘導し、
（３）  発現された触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を単離する
工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
切断されていないヒトＣＹＰ７の発現に対し影響を与える化合物のスクリーニング法であって、
(a)   触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を産生することができる条件下に請求項９または１０に記載の宿主細胞を置き、
(b)   前記宿主細胞をこの化合物と接触させ、
(c)   前記宿主細胞によって発現される触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の量を検出する
工程を含んでなる、スクリーニング法。
【請求項１３】
切断されていないヒトＣＹＰ７の酵素活性に対し影響を与える化合物のスクリーニング法であって、
(a)   請求項１〜４のいずれか一項記載の触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を、化合物と接触させ、
(b)   触媒活性を有する、切断されたヒトＣＹＰ７の触媒活性を測定する
工程を含んでなる、スクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
血清コレステロールが高くなると、心臓発作、アテローム性動脈硬化症および循環器障害の危険性が高くなるのが普通である。また、胆石、アテローム性動脈硬化症、高脂質血症およびある種の脂質貯蔵疾患等の様々な疾患がコレステロール異化作用の異常によって引き起こされる。
【０００２】
体内でのコレステロール代謝の主要経路は、コレステロールおよび胆汁酸の消化管への分泌によるものである。胆汁は遊離のコレステロールと胆汁酸を含んでいる。コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７）という酵素は、コレステロールを胆汁酸の合成に付し、肝臓での胆汁酸合成の最初の律速段階を触媒する。具体的には、ＣＹＰ７はレダクターゼおよびＮＡＤＰＨなどの還元剤の存在下で、コレステロールの７α−位の初期ヒドロキシル化を触媒することにより、７α−ヒドロキシコレステロールを形成する。従って、胆汁酸合成が亢進されると、この酵素は肝臓の貯蔵コレステロールを消費し、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込みを増加させ、血清コレステロール濃度を低下させるという肝臓中で重要な役割を果す。
【０００３】
胆汁酸は脂溶性ビタミン、ステロールおよび生体異物の可溶化に重要な生理学的薬剤である。胆汁酸は専ら肝臓で合成されて腸管へ分泌され、そこで修飾されて、二次的胆汁酸となる。ほとんどの胆汁酸は回腸で再吸収され、門脈を通って肝細胞へと再循環する。
【０００４】
胆汁が肝臓中へフィードバックされることによりコレステロール７α−ヒドロキシラーゼが阻害され、従って胆汁酸合成の全般的速度が阻害されることが知られている。それ故、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼは、肝臓における胆汁酸合成の制御機構を解明するための重要な研究課題となってきた。
【０００５】
胆汁隔離剤（sequestrant ）、コレスチラミンまたは胆汁フィステルによって引き起こされるような胆汁酸の再吸収が中断されると、肝臓における胆汁酸合成の速度およびコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ活性が大きくなることが知られている。近年、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡの精製およびクローニングが成功することにより、分子レベルでのこの酵素の制御に関する知識が蓄積されてきた。肝臓におけるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ活性は、主として胆汁酸、コレステロール、ホルモン、日周リズムおよび他の因子によって遺伝子転写レベルで調節される。しかしながら、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ遺伝子発現の制御の根底にある分子機構は未だ決定されていない。
【０００６】
ヒトＣＹＰ７の構造および機能、および胆汁酸、コレステロールおよびホルモンなどの因子によるその制御を理解するには、ヒトＣＹＰ７酵素を精製することが重要である。しかしながら、ＣＹＰ７酵素はヒト肝臓には極めて低濃度でしか含まれておらず、精製された機能を保持する酵素を、ヒト肝臓から十分な量で単離することは実現されていない。
【０００７】
ヒトＣＹＰ７をコードするｃＤＮＡ分子は決定されているが、ヒトＣＹＰ７の組換え発現は今日まで行われていない（Karam and Chiang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 185: 588 (1992) ）。最近、触媒活性を有する切断されたラットコレステロール７α−ヒドロキシラーゼをE. coli で発現させる方法が開示された（Li and Chiang, J. Biol. Chem., 266 (29): 19186 (1991) ）。この文献では、E. coli が内膜を欠いているので、この細菌での膜結合した疎水性タンパク質の発現は困難であることが示された。ＰＣＲにより、ラットコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ酵素のＮ−末端の２３アミノ酸残基を欠いている、切断された酵素をコードする改質ｃＤＮＡが作られた。生成するタンパク質は、主として細菌の細胞質ゾルで発現された。精製された組換え酵素を、再構築した系でコレステロールを、ヒドロキシル化する能力について測定したところ、活性であり、コレステロールに対するＫｍおよびＶmax はラットミクロソーム（切断されていない）酵素の値と同様であった。
【０００８】
ラットおよびヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの間には配列同一性が高いが、ラットコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの発現に以前用いたものと同じ方法に従い、同じ発現ベクター（ｐＫＫ２３３−２）を用いてヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼをE. coli で発現させることはできなかった。従って、触媒活性を有する組換えヒトＣＹＰ７酵素が望まれている。組換え発現された切断されたヒトＣＹＰ７を用いて、ヒトＣＹＰ７の触媒活性を刺激しまたは抑制する薬剤を検出することができるであろう。更に、このような組換えタンパク質を用いて抗−ＣＹＰ７抗体を製造することができ、この抗体は、例えばヒトＣＹＰ７を産生する培養物に接触させられた化合物に反応して、ヒトＣＹＰ７の産生が刺激されまたは抑制されたヒトＣＹＰ７の産生をスクリーニングするのに有用である。
【０００９】
【発明の概要】
本発明の態様によれば、触媒活性を有する切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７）が提供される。有利なことには、組換えにより比較的高回収量で産生させることができるこの切断されたヒトＣＹＰ７は、Li and Chiang, J. Biol. Chem., 266 (29): 19186 (1991) に従って製造された切断されたラット酵素の比活性の少なくとも実質的な部分比活性を有する。
【００１０】
本発明のもう一つの態様によれば、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７であって、ヒトＣＹＰ７に含まれる膜アンカー領域を欠いているものが提供される。膜アンカー領域のアミノ酸１〜２４が欠けているのが有利である。
【００１１】
他の態様によれば、本発明による触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７タンパク質の類似体が提供される。
【００１２】
もう一つの態様は、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７またはその一部、および切断されたヒトＣＹＰ７の外に構造タンパク質を含んでなる融合タンパク質である。構造タンパク質は、特定の宿主系で容易に発現することができ、切断されたヒトＣＹＰ７の産生を構造タンパク質の産生が増加することによって増加させることができるようにするのが有利である。
【００１３】
他の態様によれば、前記の触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７タンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
【００１４】
本発明の他の態様によれば、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の組換え発現に有用な発現ベクターおよび宿主細胞が提供される。
【００１５】
更に他の態様によれば、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の製造法であって、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を産生することができる条件下で本発明による宿主細胞を培養する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１６】
もう一つの態様によれば、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７のエピトープを特異的に認識する抗体が提供される。
【００１７】
もう一つの態様によれば、切断されていないヒトＣＹＰ７の発現に対する化合物の効果をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、(a) 触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を産生することができる条件下に本発明による宿主細胞を置き、(b) この宿主細胞を化合物と接触させ、(c) この宿主細胞によって発現される触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の検出する、工程を含んでなる。
【００１８】
もう一つの態様によれば、切断されていないヒトＣＹＰ７の酵素活性に対する化合物の効果をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、(a) 触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を化合物と接触させ、(b) 触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の触媒活性を測定する、工程を含んでなる。
【００１９】
本発明の他の態様および利点は、一部は下記に記載され、一部は説明から明らかになるであり、また本発明の実施によって知ることができる。
【００２０】
【発明の具体的説明】
意外なことには、E. coli ＴＯＰＰ３株の特徴を有する菌株と、発現ベクターｐＪＬの特徴を有するベクターとを用いることにより、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７を組換え発現させることができることが見出された。切断されたヒトＣＹＰ７酵素の発現させる特性を有する菌株または発現ベクターは他に見出されていない。特に、「E. coli ＴＯＰＰ３−ｐＪＬ／Ｈ７α１．５」は発現ベクターｐＪＬ／Ｈ７α１．５  ＤＮＡを含んでなり、細菌の細胞質ゾルで比較的多量に発現される切断されたヒトＣＹＰ７  ｃＤＮＡをコードする。
従って、本発明の一つの態様は、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７タンパク質である。本明細書で用いられる「切断された」とは、ヒトＣＹＰ７の完全な膜アンカー領域の一部、総てまたは実質的に総てが欠失していることを意味する。ヒトＣＹＰ７の膜アンカー領域を含むアミノ酸１〜２４の総てまたは実質的な部分が欠失しているのが好ましい。第２表には、本発明による触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７のアミノ酸配列が示されている。
【００２１】
「触媒活性を有する」とは、ＣＹＰ７タンパク質が、レダクターゼおよびＮＡＤＰＨなどの還元剤の存在下で、コレステロールの７α−位で初期のヒドロキシル化を触媒することにより、７α−ヒドロキシコレステロールを生成させることができることを意味する。触媒活性は、ＫＭおよびＶmax などのいくつかの周知のパラメーターを用いた既知の分析法により測定することができる。有利には、触媒活性を比活性として測定し、前記の触媒活性を有する切断されたラットＣＹＰ７の比活性と比較することができる。切断されたヒトＣＹＰ７および切断されたラットＣＹＰ７の比活性を、同一条件下で同時に行った分析で測定するのが最も好ましい。または、活性の分析法間の変動を、分析条件の差によって観察することもできる。
【００２２】
本発明は、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の類似体も包含する。本発明によれば、「類似体」という用語は、切断されたヒトＣＹＰ７の酵素活性を失わないわずかなアミノ酸の置換または欠失を有するタンパク質を包含する。この類似体は、Li and Chiang, J. Biol. Chem., 266: 19186 (1991)の方法によって産生された切断されたラットＣＹＰ７の比活性の少なくとも約十パーセント（１０％）の比活性を有するのが好ましい。
【００２３】
当業者であれば、第２表におけるアミノ酸配列を有し触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７の類似体を容易に構築することができることが容易に理解されるであろう。この類似体は、例えば遺伝子コードの縮重を利用しまたは非必須アミノ酸のアミノ酸置換および／または付加、または欠失を生じる点突然変異を行うことによって調製することができる。アミノ酸の置換は、周知の原理によればわずかなものであるのが、有利である。
【００２４】
例えば、類似体は、有利には、少なくとも約８５％、更に有利には少なくとも約９０％のアミノ酸配列類似性を有するタンパク質であって、切断されたラットＣＹＰ７の酵素活性と実質的に同じ酵素活性を有するものを包含する。好ましくは、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７またはその類似体は、同一条件下で同時に行った分析により測定された触媒活性を有する切断されたラットＣＹＰ７の比活性の、少なくとも約１０％、有利には少なくとも約２５％、更に有利には少なくとも約５０％、更に有利には少なくとも約７５％、更に有利には少なくとも約９０％を有する。
【００２５】
本発明は更に、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７またはその一部、および切断されたヒトＣＹＰ７の外に構造タンパク質を含んでなる融合タンパク質も包含する。構造タンパク質は、特定の宿主系で容易に発現することができるのが好ましい。この構造タンパク質は、宿主によって比較的多量に産生されるタンパク質であるのが好ましい。この方法では、切断されたヒトＣＹＰ７の産生は、構造タンパク質の産生を増加することによって増加させることができる。従って、Ｈ７α１．５などの切断されたｈＣＹＰ７遺伝子の外に、少なくとも１個の追加の構造タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターが提供される。追加のタンパク質は、例えばファクターIXのようにE. coli で高水準で発現するタンパク質から選択するのが好ましい（Nagai et al., Meth. Enzym., 153: 461 (1987) を参照されたい）。
【００２６】
本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載されているタンパク質をコードするＤＮＡである。当業者であれば、多くの様々ＤＮＡが同一のタンパク質をコードすることができ、好ましいコドンを様々な発現系に対して通常用いることができることが理解されるであろう。これらのＤＮＡは総て本発明に含まれるものである。また、この態様には、ストリンジェントな条件下で、好ましくは極めてストリンジェントな条件下で触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列が含まれる。本発明によれば、「ストリンジェントな条件」という用語は、６２〜６６℃で４×ＳＳＣ（ＮａＣｌ−クエン酸緩衝液）の塩濃度を含むハイブリダイゼーション条件を意味し、「極めてストリンジェントな条件」とは、６８℃で０．１×ＳＳＣの塩濃度を含むハイブリダイゼーション条件を意味する。
【００２７】
本発明の更にもう一つの態様によれば、触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７タンパク質を組換えにより製造する方法が提供される。一つの方法は、タンパク質を産生することができる条件下で、タンパク質またはその類似体をコードする遺伝子を含む宿主細胞、有利にはE. coli ＴＯＰＰ３（ＡＴＣＣ  ６９４０１）を培養することからなる。この方法は、好ましくはタンパク質を回収する工程を更に含んでなる。以下に説明するように、多量のポリペプチドを得るのが有利である。当業者であれば、本発明の組換えタンパク質を調製することができる様々な方法を理解するであろう。
【００２８】
Li and Chiang, J. Biol. Chem., 266: 19188 (1991)によって産生されたラットＣＹＰ７の対応する量と比較すると、本発明により発現した切断されたヒトＣＹＰ７の濃度は、実質的に増加しており、すなわち収量が４倍にまで増加した。本発明によれば、E. coli 培養物１リットルで少なくとも３０ｎｍｏｌ、更に有利には５０ｎｍｏｌ／リットルのヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを発現させる方法が提供される。この著しく改良された収率は、ｃＤＮＡをｐＪＬ発現ベクター中でサブクローニングしてｐＪＬ／Ｒ７α１．５を形成し、これで次にE. coli ＴＯＰＰ３株を形質転換することによって得ることができる。ｐＪＬ発現ベクターは、(i) リボソーム結合部位の上流でその近傍に置かれた転写エンハンサー配列、および(ii)ｐＵＣ１２の複製起点を有することを特徴とする。
【００２９】
本発明のもう一つの態様は、切断されたＣＹＰ７をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、具体的には転写エンハンサー領域（Ｔ．Ｅ．）を更に含む発現ベクターであって、特に前記のＴ．Ｅ．がリボソーム結合領域の上流でかつその近傍に位置するものである。好ましくは、このベクターはｐＵＣ１２の複製起点またはインサートされた遺伝子の高値のコピー数の発現に関与することが知られている何んらかの他の源も有する。典型的には、Ｔ．Ｅ．およびリボソーム結合領域は、切断されたＣＹＰ７  ｃＤＮＡに作動可能に結合している。本発明の有利な態様は、切断されたＣＹＰ７をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＪＬ／Ｈ７α１．５およびトランスフェクションしたE. coli ＴＯＰＰ３（ＡＴＣＣ  ６９４０１）を宿主細胞として含んでいる。
【００３０】
転写エンハンサー領域（Ｔ．Ｅ．）を含む発現ベクター、特に前記Ｔ．Ｅ．が好ましくはｐＵＣ１２の複製起点を有するリボソーム結合領域の上流でかつ近傍に位置しているものを用いる、切断されたＣＹＰ７タンパク質の製造法も本発明に包含される。この方法は、ヒトまたはラット以外の種源を有する切断されたＣＹＰ７タンパク質を製造するのに用いることができる。例えば（ヒト遺伝子インサートのない）発現ベクターとE. coli ＴＯＰＰ３宿主細胞とを用いて作成された、切断されたＣＹＰ７のハムスター、ハツカネズミおよび他の種は、本発明に包含される。特に、本発明によれば、ＣＹＰ７の所望な種のＣＹＰ７ゲノムインサートを含むｐＪＬ発現ベクターでトランスフェクションしたE. coli ＴＯＰＰ３を用いて、他の種の切断されたＣＹＰ７を産生する。
【００３１】
E. coli ＴＯＰＰ３−ｐＪＬ／Ｈ７α１．５は、ＡＴＣＣ６９４０１の受託番号で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、ＡＴＣＣ、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド  ２０８５２、米国に１９９３年８月２５日に寄託されている。
【００３２】
本発明には、切断されたヒトＣＹＰ７に特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体またはそれらの結合性フラグメント、すなわち触媒活性を有する切断されたヒトＣＹＰ７のエピトープを特異的に認識するもの、が包含される。これらの抗体の調製法も、本発明に包含されるものとする（下記の実施例４を参照されたい）。また、抗−切断ＣＹＰ７抗体を、ＣＹＰ７酵素発現を抑制または刺激する化合物の能力をスクリーニングする方法に用いることもできる（実施例４を参照されたい）。例えば、本発明による抗体または切断されていないヒトＣＹＰ７に対する抗体を用いて、切断されたヒトＣＹＰ７の発現を分析検出する。従って、ＣＹＰ７を増強する薬剤をスクリーニングするため、薬剤が発現を調節するのに十分な期間、薬剤をＴＯＰＰ３−ｐＪＬ／Ｈα１．５の培養物に加えた後、発現した切断されたヒトＣＹＰ７をウェスターンブロットで前記抗体のいずれかを用いて検出することができる。タンパク質含量の増加を薬剤に接触させなかった細胞のコントロール酵素発現のレベルと比較して、ヒトＣＹＰ７の発現を刺激する薬剤を検出する。このような分析の結果は、場合によっては、米国出願番号第０８／１３５，４８８号明細書に記載されているイン・ビボでのトランスフェクション動物の分析で確認できる。
【００３３】
本発明によって得られた切断されたＣＹＰ７を、切断されていないＣＹＰ７活性のインディケーターとしてスクリーニング分析において用いることもできる。化合物が酵素発現のレベルまたはその活性を増加させまたは減少させるかどうかを決めるために、化合物をスクリーニングすることができる。化合物は単独で試験することも、または生理学的化合物または薬剤の存在下で試験することができる（実施例３および４を参照されたい）。得られた情報を用いて有用な薬剤としての可能性があるもの、特に胆汁酸合成およびコレステロール代謝に欠陥を有する患者を治療することができる薬剤についてスクリーニングすることができる。
【００３４】
本発明による化合物のスクリーニング法は、下記のようにして行うことができる。ヒト肝臓でＣＹＰ７酵素活性に対する化合物の効果を評価するため、この化合物を様々な投与量で酵素分析法で試験する。このような方法は、E. coli ＴＯＰＰ３−ｐＪＬ／Ｈ７α１．５から精製された切断されたＣＹＰ７で行うのが好ましい。酵素活性の検出法は、本明細書の実施例３に記載されたとおりである。ＣＹＰ７酵素レベルに対する化合物の効果を、例えば実施例４に記載のウェスターンブロット分析法でＣＹＰ７特異抗体を用いて決定する。
下記の実施例は単に本発明を説明するものであり、特許請求の範囲に記載の発明を制限するものと考えるべきではない。
【００３５】
実施例１ E. coli での切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの産生および発現
２種類のプライマーを設計して、完全な長さのヒトクローニングＰＨＣ７Ｆを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応によって切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡを生成させた（Karam and Chiang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 185: 588-95 (1992)）。５′−プライマーの配列は、５′ＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣＧＧＧＴ−３であり、配列Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ（２５）−Ａｒｇ（２６）−Ａｒｇ（２７）−Ｇｌｕ（２８）等を有するＮ−末端をコードした。３′−プライマーの配列は、ＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＡＧ−３′であり、コード領域の３′−末端近くの１５９９〜１６１２のｃＤＮＡ配列に相補性であった。生成したｃＤＮＡを配列決定して、ヒト配列（第１表）を確かめた。このｃＤＮＡを、ｐＪＬプラスミドのＮｃｏＩ部位（ＧＣＣＡＴＧ）に連結させた。次に、組換え構築物ｐＪＬ／Ｈ７α１．５（第１図）を一連の細菌株に形質転換した。
【００３６】
第１表
ヒトＣＹＰ７のｃＤＮＡ配列。ＡＴＧ開始コドンは２９〜３１位に位置しており、ＴＧＡ停止コドンは１４７５〜１４３７７位に位置している。
【表１】
0003717958.tif 000002
【００３７】
ｐＪＬ／Ｈ７α１．５を有するE. coli のＴＯＰＰ３株は、第２表に示されるアミノ酸配列を有する切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼを極めて多量に発現することができることが判った。
【００３８】
第２表
切断されたヒトＣＹＰ７アミノ酸配列（分子量：５５２８１；長さ：４８２アミノ酸）。
【表２】
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【表３】
0003717958.tif 000004
【００３９】
ｐＪＬ／Ｈ７α１．５を有する細菌を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む「テリフィック(terrific)」ブロスで６時間培養した。ＩＰＴＧ  １ｍＭを加えて、３０℃でタンパク質の産生を１５〜１８時間誘導させた。培養物に２ｍＭのδ−アミノレブリン酸を加えたところ、発現レベルが１００％まで増加した。培養物１リットル当たり、ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ約２０ｎｍｏｌが発現した。
【００４０】
実施例２ 細菌で発現したヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの精製
切断されたヒトＣＹＰ７をコードする組換えベクターを有する細菌の培養は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むテリフィックブロス８リットルにＴＯＰＰ３−ｐＪＬ／Ｈ７α１．５の６時間培養物を摂取することによって行った。この培養物を、Ｏ．Ｄ．600 が約０．４〜約０．６になるまで３７℃で生育させたところ、これは約３時間で起こった。ＩＰＴＧを加えて最終濃度を１ｍＭとし、インキュベーションを３０℃で１５〜１８時間行った。
【００４１】
誘導の後、培養物を５，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離により回収した。次に、細胞を、緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、０．５％コール酸ナトリウム、２０％グリセロール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）１／１００容量に再懸濁した。次に、細胞を緩衝液Ａ中でリゾチーム２００μｇ／ｍｌを用いて溶解させた。総溶解生成物を１００，０００×ｇで４℃で１時間遠心分離した後、上清を回収した。ペレットを同じ緩衝液に十分に再懸濁させ、再度遠心分離した。上清を合わせて、ＤＮアーゼＩを１００単位加えた後氷上で一晩保管した。次に、透明な溶解生成物をOctylamino Sepharose 4B カラム（２．６×１５ｃｍ）に適用した。このカラムを、同じ緩衝液で洗浄し、溶出させた。溶出した画分を緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、０．２％コール酸ナトリウム、０．２％Emulgen 911 、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））に対して透析し、ヒドロキシアパタイトカラム（２．４×７ｃｍ）に適用し、同じ緩衝液で平衡にした。次いで、このカラムを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液２００ｍｌで洗浄した後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液１５０ｍｌで洗浄し、次に１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液３００ｍｌで溶出した。これらの３種類の緩衝液は、２０％グリセロール、０．３％コール酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ  ＰＭＳＦも含んでいた。精製した試料を０．２％Emulgen 911 に加え、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４、２０％グリセロール、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦおよび０．２％Emulgen 911 （緩衝液Ｃ）に対して透析した。次に、試料を緩衝液Ｃで平衡にした第二のヒドロキシアパタイトカラム（０．５×３．０ｃｍ）に適用し、３６０ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝液Ｃで溶出した。この段階では、ヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。
【００４２】
実施例３ 精製したヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの特性決定
切断した酵素を組換え細菌から精製した。精製法は、Li and Chiang, J. Biol. Chem., 266 (29): 19186 (1991) に記載されている。ＣＹＰ７の活性を、化合物の存在または非存在下の両方で、Chiang, Meth. Enzym., 206: 483 (1991) 二記載の方法と同様にして測定する。
【００４３】
精製した切断された酵素は、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびリン脂質（精製したＣＹＰ７酵素（０．１ｎｍｏｌｅ）、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼ２単位、Ｌ−ジラウロイル−グリセリル−３−ホスホリルコリン４０μｇ／ｍｌ、１００μＭコレステロール／１０μｌの４５％Molecusol 、０．０１５％ＣＨＡＰＳ（３−（（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミニオ）−１−プロパンスルホネート）、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１％Emulgen 911 ）の存在下でのコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ活性の再構築で活性を有していた。Molecusol を様々な濃度で添加したところ、活性は３倍まで増加した。反応は１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを添加することによって開始し、３７℃で２０分間行った。反応は０．８％コール酸ナトリウムを加えて停止した。生成物にコレステロールオキシダーゼ１単位を加えて酸化し、３７℃で１０分間インキュベーションした。反応混合物を、石油エーテルそれぞれ６ｍｌで３回抽出し、合わせた抽出物をアセトニトリル：メタノール（７０：３０、ｖ／ｖ）１００μｌに溶解させ、前記したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム上で分析した。Chiang, Meth. in Enzymol.,
206: 483-91 (1991) 。
【００４４】
コレステロールについてのＫｍおよびＶmax を、切断された細菌で発現したラットＣＹＰ７酵素と比較して決定した（第２図）。切断されたヒト酵素に対するＫｍは５．８５μＭであり、Ｖmax は０．１３ｎｍｏｌ／分であり、これは切断された細菌で発現したラット酵素およびラットの肝ミクロソームから単離された完全な酵素の値と同じであった。従って、単離され、切断されたヒトＣＹＰ７酵素は、切断されたラットのＣＹＰ７酵素と同様な速度論特性を有する。
【００４５】
実施例４ ヒト肝臓における切断されていないＣＹＰ７酵素を抑制または刺激する能力についての化合物のスクリーニング法
Ａ．  精製したヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼに対する抗体の調製前記のように、精製して切断されたヒトＣＹＰ７に対して生じた抗体を用いる分析系を用いて、ヒト肝臓での切断されていないＣＹＰ７酵素活性を抑制または刺激する化合物の能力をスクリーニングする。切断されたヒトＣＹＰ７に対する抗体は、下記のようにして製造することができる。
精製した切断されたＣＹＰ７酵素１ｍｇを、等容量のフロイントのアジュバントおよび熱で滅菌したマイクロバクテリア５ｍｇ／ｍｌと混合した。乳化した抗原混合物をニュージーランド白ウサギの背中の複数の部位に皮内注射により注入した。６週間後、精製したヒト酵素０．５ｍｇを不完全アジュバントと混合し、同じウサギに対するブースター注射に用いた。６週間後、血液試料を耳静脈から採取し、オクタロニー二重拡散法およびChiang, et al., J. Biol. Chem., 265, 3889-3897 (1990) が以前に報告した免疫ブロット法により抗体の存在を試験した。
ウェスターンブロット分析には、精製したヒトＣＹＰ７酵素１μｇを７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に載せ、分離したポリペプチドを以前に報告された改質法によってImmobilon P 膜に電気泳動により移した Chiang et al., 上記文献 (1990) 。希釈した抗血清を膜と反応させた後、第二の抗体であるアルカリ性ホスファターゼで包合された抗ウサギＩｇＧと反応させ、次いで以前に報告された方法により、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＤＣＩＰ）で染色した。
【００４６】
Ｂ．  精製したヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼに対する抗体を用いる分析法
前記の特異抗体をスクリーニング分析で用いて、切断されたＣＹＰ７に対する対応する効果の分析によりヒト肝臓でのＣＹＰ７の発現に対する特定の化合物の抑制または刺激効果を測定することができる。直前に記載したウェスターンブロット分析における発現した切断酵素の量を定量するため、１〜１０μｇの各種濃度の精製した切断されたＣＹＰ７酵素を、実験的に処理した細胞由来のヒトＣＹＰ７酵素を含むレーンに対して７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での隣接レーンで分析する。切断されたＣＹＰ７酵素の刺激は、ウェスターンブロット上でコントロールに対して暗いバンドによって検出される。化合物がＣＹＰ７酵素発現および／または活性を刺激すれば、このような化合物または薬剤を用いてヒトのコレステロールを減少させることができる。化合物または薬剤がＣＹＰ７の酵素発現および／または活性を抑制すれば、このような化合物はヒトの血清コレステロール濃度を増加させる可能性があるので、慎重に使用すべきである。各種の改良および変更を本発明の組成物および方法に行うことができることは、当業者には明らかであろう。特に、切断されたヒトＣＹＰ７またはその類似体を用いる各種のスクリーニング法が包含される。従って、本発明は、特許請求の範囲内にあるという条件で改質および変更等を包含するものである。
【００４７】
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：ヒト
直接の起源
クローン：ＰＨＣ７Ｆ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｅｘｏｎ
存在位置：１..２７
他の情報：切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
配列
【表４】
0003717958.tif 000005
【００４８】
配列番号：２
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源：
生物名：ヒト
直接の起源
クローン：ＰＨＣ７Ｆ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１..６
他の情報：切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
配列
【表５】
0003717958.tif 000006
【００４９】
配列番号：３
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：ヒト
直接の起源
クローン：ＰＨＣ７Ｆ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｅｘｏｎ
存在位置：１..２３
他の情報：切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
配列
【表６】
0003717958.tif 000007
【００５０】
配列番号：４
配列の長さ：１５２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic ＤＮＡ
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＹＥＳ
起源：
生物名：ヒト
直接の起源
クローン：ＰＨＣ７Ｆ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｅｘｏｎ
存在位置：１..１５２４
他の情報：切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
配列
【表７】
0003717958.tif 000008
【００５１】
配列番号：５
配列の長さ：４８２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
ハイポセティカル配列：ＮＯ
アンチセンス：ＮＯ
起源：
生物名：ヒト
直接の起源
クローン：ＰＨＣ７Ｆ
配列の特徴
特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ
存在位置：１..４８２
他の情報：切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ
配列
【表８】
0003717958.tif 000009
【表９】
0003717958.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】切断されたヒトコレステロール７α−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡに対する組換え発現ベクター構築体を示した図である。ＰＣＲで精製したｃＤＮＡ、Ｈ７α１．５を、実施例１に記載したのと同様に、ＮｃｏＩで消化した発現ベクターｐＪＬにインサートして作成した。
略号は下記の通りである。
Ｔ．Ｅ．：転写エンハンサー、Ｒ．Ｂ．Ｓ：リボソーム結合部位、ＸｂａＩおよびＮｃｏＩ：制限酵素部位、Ｍ：メチオニン、Ａ：アラニン、Ｒ［２５］：アルギニン・完全な長さのタンパク質の残基２５、Ｇ：グルタミン、Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子、ＯｒｉＰＵＣ１２：ＰＵＣ１２の複製起点、ｐｔａｃ：ｔａｃプロモーター。
【図２】  E. coli での切断されたヒトおよび切断されたラットコレステロール７α−ヒドロキシラーゼの活性のラインウィーバー−バークプロットと示した図である。切断されたＣＹＰ７活性は、前記のように様々な濃度のコレステロールで、実施例３に記載されている再構築分析法を用いて測定した。線を引くのに直線回帰を用いた。
【図１】
0003717958.tif 000011
【図２】
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