(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソラフェン生合成に関係するそれらの機能の故に、「ソラフェン遺伝子集団（クラスター）」の構成要素として示される右側および左側にある隣接DNA領域を包含するソラフェンの生合成に直接的または間接的に関連し、およびゲノム遺伝子バンク内のハイブリダイゼーションプローブとしてストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000017
のグラナチシン遺伝子クラスターのgra I領域からの4.6KbBamH I断片を用いて同定され得るDNA領域を含むソランギウム・セルロスムのゲノムのDNA断片であって、前記DNA断片が、配列番号:1（SEQ  ID  NO:1）に記載されているヌクレオチド配列を含むDNA断片。
【請求項２】
前記DNA断片が、ソランギウム・セルロスムのゲノムからの1.8KbSal I DNA領域を含み、前記1.8KbSal I DNA領域が、配列番号:1に記載されているヌクレオチド配列を含む請求項１に記載のDNA断片。
【請求項３】
前記DNA断片が、ソランギウム・セルロスムのゲノムからの約6.5KbのPvu I DNA領域を含み、前記約6.5KbのPvu I DNA領域は、ソランギウム・セルロスムのゲノムからの1.8KbSal I DNA領域を含む請求項１に記載のDNA断片。
【請求項４】
前記DNA断片が、ストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000018
のグラナチシン遺伝子クラスター〔（オープン・リーディング・フレーム）ORF1−４〕のgra I領域からの4.6KbBamH I断片と相同性を有し、そしてそれ故に、ソラフェン産生生物のゲノム遺伝子バンク内のハイブリダイゼーションプローブとしてこの4.6Kb断片またはこの断片の一部分の使用により見出され得る配列部分を含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載のDNA断片。
【請求項５】
前記DNA断片が、ゲノムDNAのみからなる請求項１ないし４のいずれか１項に記載のDNA断片。
【請求項６】
粘液細菌ゲノムのDNA断片であって、前記DNA断片が、ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関与し、そして前記DNA断片が、２×SSC、１×デンハルト、0.5％SDS、50μg/ml変性サケ精子DNA中65℃でハイブリダイズし、そしてその後、２×SSC、0.1％SDS中55℃で20分間、２回洗浄し、次いで0.2×SSC、0.1％SDS中室温で20分間洗浄することにより配列番号:1のDNA断片にハイブリッド形成でき、そして前記DNA断片が、ソランギウム／ポリアンギウム群からの粘液細菌のゲノムのDNA断片である、粘液細菌ゲノムのDNA断片。
【請求項７】
粘液細菌ゲノムのDNA断片であって、前記DNA断片が、ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関与し、そして前記DNA断片が、２×SSC、１×デンハルト、0.5％SDS、50μg/ml変性サケ精子DNA中65℃でハイブリダイズし、そしてその後、２×SSC、0.1％SDS中55℃で20分間、２回洗浄し、次いで0.2×SSC、0.1％SDS中室温で20分間洗浄することにより配列番号:1のDNA断片にハイブリッド形成でき、そして前記DNA断片が、ソランギウム・セルロスムのゲノムのDNA断片である、粘液細菌ゲノムのDNA断片。
【請求項８】
粘液細菌ゲノムのDNA断片であって、前記DNA断片が、ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関与し、そして前記DNA断片が、配列番号:1のDNA断片にハイブリッド形成でき、そして前記DNA断片が、ソランギウム・セルロスムのゲノムからの1.8KbSal I DNA断片を含む、粘液細菌ゲノムのDNA断片。
【請求項９】
粘液細菌ゲノムのDNA断片であって、前記DNA断片が、ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関与し、そして前記DNA断片が、配列番号:1のDNA断片にハイブリッド形成でき、そして前記DNA断片が、ソランギウム・セルロスムのゲノムからの約6.5KbのPvu I断片を含む、粘液細菌ゲノムのDNA断片
【請求項１０】
配列番号:1に記載されているヌクレオチド配列を有するDNA断片。
【請求項１１】
請求項１ないし10のいずれか１項に記載のDNA断片の１つを含んでいる組換えDNA分子。
【請求項１２】
請求項１ないし10のいずれか１項に記載のDNA断片の１つを含んでいるベクター。
【請求項１３】
形質転換ベクターである請求項12に記載のベクター。
【請求項１４】
発現ベクターである請求項12に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項12ないし14のいずれか１項に記載のベクターを含んでいる宿主生物。
【請求項１６】
以下の手段：
（ａ）単一のクローン上に配置された細菌ゲノムの全体を実質的に含む、粘液細菌の群からのソラフェン産生生物の代表的な遺伝子ライブラリーの構築；
（ｂ）ソラフェン生合成に関係するそれらの機能の為に、「ソラフェン遺伝子クラスター」の構成要素として示される右側および左側にある隣接DNA領域を包含するソラフェン生合成に直接的または間接的に関連する遺伝子クラスターの少なくとも一部とハイブリッド形成する、請求項２ないし４のいずれか１項に記載のDNA断片をプローブ分子として用いた前記クローンのスクリーニング；
（ｃ）DNAプローブとハイブリダイゼーション信号を示すこれらクローンの選択；および
（ｄ）ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関連する少なくとも１つの遺伝子を含む前記クローンからのDNA断片の単離、
から実質的になる、ソランギウム・セルロスムのゲノム内のソラフェン生合成に関係し、そしてソラフェン生合成に直接的または間接的に関与する遺伝子クラスターから得ることができるDNA断片の同定、単離およびクローニングの為の方法。
【請求項１７】
以下の手段：
（ａ）単一のクローン上に配置された細菌ゲノムの全体を実質的に含む、粘液細菌の群からのソラフェン産生生物の代表的な遺伝子ライブラリーの構築；
（ｂ）ソラフェン生合成に関係するそれらの機能の為に、「ソラフェン遺伝子クラスター」の構築要素として示される右側および左側にある隣接DNA領域を包含するソラフェン生合成に直接的または間接的に関連する遺伝子クラスターの少なくとも一部とハイブリッド形成する、請求項８ないし10のいずれか１項に記載のDNA断片をプローブ分子として用いた前記クローンのスクリーニング；
（ｃ）DNAプローブとハイブリダイゼーション信号を示すこれらクローンの選択；および
（ｄ）ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関連する少なくとも１つの遺伝子を含む前記クローンからのDNA断片の単離、
から実質的になる、ソランギウム・セルロスムのゲノム内のソラフェン生合成に関係し、そしてソラフェン生合成に直接的または間接的に関与する遺伝子クラスターから得ることができるDNA断片の同定、単離およびクローニングの為の方法。
【請求項１８】
以下の手段：
（ａ）単一のクローン上に配置された細菌ゲノムの全体を実質的に含む粘液細菌の群からのソラフェン産生生物の代表的な遺伝子ライブラリーの構築；
（ｂ）「ソラフェン遺伝子クラスター」内のそれぞれ右側および左側に位置する隣接DNA領域の一部と少なくとも重複する、請求項１に記載の予め単離されたDNA断片の１つまたはその選択された一部をプローブ分子として用い前記クローンとのハイブリダイゼーション；
（ｃ）DNAプローブと強いハイブリダイゼーション信号を示すこれらクローンの選択；
（ｄ）（ｃ）に従って選択されたクローンからの重複DNA領域を含むこれら断片の単離、および重複領域を最も越えて突出する断片の単離；
（ｅ）（ｄ）に従って単離されたDNA断片の「ソラフェン遺伝子クラスター」内で機能するその能力の試験；
（ｆ）ソラフェン生合成の範囲内で（ｄ）に従って単離されたDNA断片の機能を検出することが可能であるならば、ソラフェン生合成における機能が特定の新たに単離されたDNA断片について機能試験の範囲内でもはや検出し得ず、その結果、遺伝子クラスターの端部に到達されるまで、（ｄ）に従って単離されたDNA断片またはその選択された一部、特に前記断片の左側または右側フランキング領域からのものが、ここでDNAプローブとして作用する、工程（ａ）ないし（ｅ）による方法の反復；および
（ｇ）適当である場合、これまで選択されなかったその他の方向に工程（ａ）ないし（ｆ）による方法の実施、
からなる、開始または出発領域にフランキングする「ソラフェン遺伝子クラスター」の構築に関与する全てのこれらDNA配列の同定および単離の為の方法。
【請求項１９】
前記ソラフェン産生生物が、ソランギウム／ポリアンギウム群からの粘液細菌である請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記ソラフェン産生生物が、ソランギウム・セルロスムである請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子ライブラリーが、ゲノム遺伝子ライブラリーである請求項18記載の方法。
【請求項２２】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、請求項２ないし４のいずれか１項に記載のDNA断片である請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
前記ハイブリダイゼーションプローブが請求項８ないし10のいずれか１項に記載のDNA断片である請求項18に記載の方法。
【請求項２４】
前記DNA断片の右側および左側に位置するフランキング領域に由来する配列部分が、ハイブリダイゼーションプローブとして使用される請求項18に記載の方法。
【請求項２５】
適当な断片が、工程（ｄ）においてハイブリダイゼーション分析により同定される請求項18に記載の方法。
【請求項２６】
ソラフェン生合成における（ｄ）に従って単離されるDNA断片の機能が、遺伝子破壊試験の範囲内で検出される請求項18に記載の方法。
【請求項２７】
請求項16ないし18のいずれか１項に記載の方法におけるプローブ分子としての請求項８ないし10のいずれか１項に記載のDNA断片を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換えDNA技術の分野、特に粘液細菌（ミクソバクテリア,myxobacteria）、好ましくはソランギウム／ポリアンギウム（Sorangium/Polyangium）群への、細菌ゲノム内の個々の遺伝子そしてまた全体の遺伝子集団（クラスター）の位置決定、同定およびクローニングのための上記技術の適用に関するものである。
ソランギウム／ポリアンギウム群の粘液細菌は土壌、死滅した植物体または動物の糞中に頻繁に検出される非常に特殊化した生物である。この群の微生物の特徴は、特に、唯一の炭素源としてセルロースまたはセルロース含有減成物を利用できる能力である。この群のもう１つの特徴は非常に活性な二次代謝物質を産生する能力である。
例えば植物微生物殺傷性化合物を合成できるこの群からの非常に多くの菌株が今では記載されている。これに関して特に重要なのは、その構造的特性が例えばEP0358606に詳細に記載されている、いわゆるソラフェン（soraphen）である。ソラフェンは静細胞性および植物病原性微生物、特に植物病原菌に対して有用な殺生物性スペクトルを有する巨大環状化合物である。これらの化合物は非常に有利な治療的、浸透的（全体的）、そして特に予防的特性を有し、それ故に哺乳動物の治療および多くの栽培植物の保護のための使用に極めて適している。
抗生物質性および静細胞性作用を有する非常に活性な化合物を合成できる粘液細菌の群のその他の代表的なものも知られている［Reichenbach等（1988）］。これらの化合物の薬学的可能性および植物保護のためのそれらに由来する重要性により、適当な場合に該化合物に特異的に影響を及ぼし得る可能性を提供するためにその合成の遺伝子的基礎を理解することに大きな興味がある。
このことは、ソラフェン生合成の場合のように、天然産生株がより広範囲の活性アッセイに対する物質、いうまでもなく市販製品の要求を十分に満足し得ない不適当な量でのみ興味深い二次的代謝産物を非常に稀に提供するだけなので、特に望ましい。
さらに、上記の株は多くの場合において問題があり、そして取扱いが困難であり、そのために工業的規模、例えば発酵操作における使用に不適当であることが証明されている。
それ故に、粘液細菌の個々の興味深い代表種における二次代謝産生物の遺伝子的基礎を解明することは、合成操作において直接または間接に介在する多大な可能性を切り開くので、特に望ましいであろう。従って、例えば、標的化突然変異またはその他の遺伝子コピーの挿入により産生株の産生性の増加を試みることが考えられるであろう。別の考えられる手段は、二次代謝産物生合成に関係する完全な遺伝子集団またはそれらの選択された部分の、産生目的のために最適化され、そして次に工業的規模で代謝産物産生に使用され得る宿主株中への可能な移入に関する。
しかしながら、このための必須条件は、例えば全体のプラスミドを含む新規遺伝子もしくは遺伝子断片またはその他のDNA配列の粘液細菌のゲノム内への標的化混入による、組換えDNA技術を用いたこれらの生物の直接、そして好ましくは標的化操作を可能にする方法の提供である。
粘液細菌の群のいくつかの代表種は既にこの方向での研究の対象となっている。これに関連した特別な興味は主としてミクソコッカス・キサントゥス（Myxococcus xanthus）に向けられていたが、これはいまでは詳しく研究され、そして種々の遺伝子移入方法が既に記載されている粘液細菌である。このために、例えば大腸菌ファージP1が、最初はミクソコッカス・キサントゥス染色体中にトランスポゾンTn5の挿入のための研究に［Kaiser（1984）;Kuner and Kaiser（1981）］、そしてその後にミクソコッカス・キサントゥス中にクローン化された遺伝子を最初の大腸菌宿主に戻し移入するための研究に［O'Conner and Zusman（1983）;Shimkets等（1983）］、非常に集中的に使用されてきた。
遺伝子移入のもう１つの方法は非常に広い宿主範囲を有するプラスミドRP4の使用に基づいている。Breton等（1985）はこのプラスミドが大腸菌からミクソコッカス・キサントゥス中に接合を介して移入され得、そして染色体中に安定に組み込まれ得ることを示すことができた。これらの性質に基づいて、Breton等（1986）やBreton and Guespin−Michel（1987）はミクソコッカス・キサントゥスの染色体中に外来遺伝子を組み込むことができた。Jaoua等（1987;1989）による研究は観察された組み込みが高い確率を有し、いわゆる部位特異的組換えに基づいていることを明らかにした。従って、後者は、ミクソコッカス・キサントゥスの染色体内の狭い空間的制限を有する特定の部位に制限されているが、これはRP4プラスミド上の１つ以上のいわゆるホットスポットにより仲介される。このタイプの形質転換系は、構造的制限のために、適応性において非常に限定され、そしてそれ故に本発明の範囲での使用には不適当である。
さらに、本発明の範囲内で行われた研究の途上で、ここで議論されている従来公知のミクソコッカス系がソランギウム／ポリアンギウム群の細菌に適用できないことが明らかになった。これらの生物はそれらの染色体上の部位特異的組換えに必要である特定の構造要素を欠いているように考えられる。さらに、例えばトランスポゾンTn5を使用した際に安定な転位が上記生物のいずれに対しても起きないことが見出された。
係属しているEP−A92810128.6およびJaoua等（1992）は粘液細菌群、特にソランギウム／ポリアンギウム群の代表種の直接および標的化遺伝子操作操作を組換えDNA技術を用いて可能にする形質転換系を初めて開示し、それにより二次代謝産物の生合成、特にソラフェン生合成に直接的または間接的に関与する少なくとも１種の遺伝子または遺伝子の一部を含むDNA断片の本発明の範囲内に開示された同定および単離のための必要条件を提供している。
従って、本発明の範囲内で達成されるべき目的は主として、粘液細菌、そしてこの場合に好ましくはソランギウム／ポリアンギウム群の粘液細菌における二次代謝産物の合成、特にソラフェンの合成に直接的または間接的に関与するDNA領域を含み、そしてそれらの関与遺伝子または一部の少なくとも１種、特に二次代謝産物合成に関与する全体のDNA配列を含むDNA断片の提供に関する。
例えば放線菌に関する初期の研究により相当以前から、二次代謝産物生合成の個々の段階に直接的または間接的に関連する遺伝子がそれまで知られている事例の多くの場合において細菌の染色体上に遺伝子集団の形態で組織されていることは既に知られていた。これに対し、プラスミド結合遺伝子の関連は稀な事例においてのみ検出可能であった。
多くの操作は遺伝子産物が抗生物質生合成に間接的または直接的に関連する遺伝子を単離するために今日まで提案されてきた。これらの中には、例えば、野生型DNAから得られる断片を用いて、特定の突然変異のために所望の抗生物質をもはや合成し得ない欠損突然変異体の合成能力を回復することが試験されるいわゆる相補性方法がある〔例えばMalpartida and Hopwood,1984参照〕。
ポリケチド抗生物質の生合成に関連する遺伝子を見出すための別の方法はWO87/03907に記載されている。これは、該当する微生物のゲノムDNAから予め調製されたゲノム遺伝子バンクをスクリーニングするためのDNAハイブリダイゼーションプローブとして公知ポリケチド抗生物質の生合成に関連する遺伝子の少なくとも一部を含むDNA断片の使用を必要とする。
そのような遺伝子集団の同定および単離のための基本的技術は従って公知であるけれども、今日までほとんど研究されていない新たな生物群に対するそれらの適用は、包含される評価不可能性のために概して問題である。このことは、本発明の場合のように、ゲノムの構造的組織化について利用できる情報が何らなく、それ故に、二次代謝産物生合成に関与する遺伝子集団を探究して、必要なゲノム分析のために適当な出発点を見つけることが最初に必要である場合に特に当てはまる。これはおそらく、何故に二次代謝産物合成の遺伝子構造に関する比較的適度な情報が今日まで数種の研究された生物群に集中し、それ続いてその他の生物、例えば粘液細菌について何ら知られないのかという理由である。
二次代謝産物の生合成に直接的または間接的に関連するDNA領域であって、そして該領域の周囲の遺伝子集団の同定および単離のための出発点として使用されるDNA領域を粘液細菌ゲノム内に位置決定し、そして続いて後者を単離およびクローニングすることが、EP−A92810128.6およびJaoua等（1992）に記載の方法を用いて本発明の範囲内で初めて今可能になった。上記領域はこれに関連して特に、ソランギウム・セルロスム（S.cellulosum）のゲノム内のソラフェン生合成に関係し、そしてソラフェンの生合成に明らかに関連する遺伝子集団から得ることができものである。
従って、本発明は主として、ソランギウム・セルロスムのゲノム内のソラフェン生合成に関係する遺伝子集団から好ましくは得ることができ、そしてソラフェン生合成に関連するそれらの機能のために、「ソラフェン遺伝子集団（soraphen gene cluster）」の構成要素として示される右側および左側にある隣接DNA領域を包含するソラフェンの生合成に直接的または間接的に関連し、そして予め単離されたDNA断片を用いて同定され得るDNA領域を含むDNA断片に関する。
本発明の範囲内で好ましいのは、後記の方法によりソランギウム・セルロスムの「ソラフェン遺伝子集団」から得ることができるDNA領域を含むDNA断片である。
特に好ましいDNA断片は、ソランギウム・セルロスムゲノムから本発明に係る方法により得ることができ、そして配列番号:1に示されたヌクレオチド部分配列からなる1.8KbDNA領域、ならびにこの配列の周辺にあり、そして存在する相同性の故に、構造的または機能的な同等物と見なされ得、そのために上記配列とハイブリッド形成し得る全てのその他のDNA配列を含む。
同様に特に好ましいDNA断片はソランギウム・セルロスムゲノムから本発明に係る方法により得ることができ、そして図１に示された制限パターンを有する6.5KbDNA領域からなり、そして上で詳細に特徴づけした1.8Kb領域をさらに含むものである。
全くゲノムDNAのみからなるDNA断片はとりわけ好ましい。
ソランギウム・セルロスムゲノムから本発明に係る方法により得ることができる1.8KbDNA領域の配列番号:1に示されたヌクレオチド部分配列に相同性を有し、それ故に、ゲノム遺伝子バンク内のハイブリダイゼーションプローブとしてこの領域またはその一部を使用することにより見出され得る配列部分を含むDNA断片が本発明に同様に包含される。
同様に好ましいDNA断片はストレプトマイセス・ビオラセオルベル（Streptomyces violaceoruber）
0003613614.tif 000002
のグラナチシン遺伝子集団〔ORF1−４〕のgra I領域からの4.6Kb BamH I断片と相同性を有し、そしてそれ故にソラフェン産生生物のゲノム遺伝子バンク内にハイブリダイゼーションプローブとして上記4.6Kb断片または該断片の一部の使用により見出され得る配列部分を含むものである。
本発明のもう一つの面は、例えば、出発または開始領域を側部に有し、そしてソラフェン生合成に関係する遺伝子集団の完全な同定を最終的に導く、近接領域を見出すためのプローブとして次に再び使用され得る近接重複DNA領域を見出すためのプローブとして、生合成に直接的または間接的に関連する遺伝子の１種またはそれらの一部のソラフェン生合成に関係する遺伝子集団の一部を含むDNA断片の使用に関する。
本発明はさらに、上記のようにして得ることができ、そして所望するならば連結されて単一断片が得られるDNA領域に関し、該単一断片は上記の全ての遺伝子と遺伝子集団の形態にある最初に同定された開始領域をソランギウムゲノム内の側部にあるその他のDNA配列とからなり、そしてそれらの全体としてソラフェン生合成に関係する。
好ましいプローブ分子はソランギウム・セルロスムゲノムから本発明に係る方法により得ることができる1.8KbDNA領域を含み、そして配列番号:1に示されたヌクレオチド部分配列、特にそれらの選択された一部を含むDNA断片である。特に好ましい配列部分は上記1.8Kb領域のそれぞれ右側および左側に位置するフランキング領域から得られるものである。
プローブ分子としての使用に同様に好ましいのは、ソランギウム・セルロスムゲノムから本発明に係る方法により得ることができる6.5KbDNA領域を含み、そして図１に示された制限パターンを有し、そしてさらに上で詳細に特徴づけた1.8Kb領域、特にそれらの選択された一部を包含する6.5Kb断片である。特に好ましい配列部分は上記1.8Kb領域のそれぞれ右側および左側に位置するフランキング領域から得ることができるものである。
本発明はさらに、本発明に係るDNA断片の１種を含む組換えDNA分子、それらから誘導されるプラスミドおよびベクターに関する。同様に、上記プラスミドDNAまたはベクターDNAで形質転換された宿主生物、植物宿主等が包含される。
さらに、本発明は、ソランギウム・セルロスムのゲノム内のソラフェン生合成に関係し、そしてソラフェン生合成に直接的または間接的に関連する少なくとも１つの遺伝子または遺伝子の一部または別のDNA配列からなる、遺伝子集団から好ましくは得ることができるDNA領域を含むDNA断片の同定、単離およびクローニングのための方法に関し、そしてその方法は実質的に以下の手段からなる：
（ａ）単一のクローン上に分散した細菌ゲノムの全体を実質的に含む粘液細菌の群からのソラフェン産生生物の代表的な遺伝子ライブラリィの構築；
（ｂ）ソラフェン生合成に関係する遺伝子集団の一部と少なくともハイブリッド形成する特定のDNAプローブを用いた上記クローンのスクリーニング；
（ｃ）DNAプローブとハイブリダイゼーション信号を示すクローンの選択；および
（ｄ）ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関連する少なくとも１種の遺伝子または遺伝子の一部または別のDNA配列からなるDNA領域を含む、上記クローンからのDNA断片の単離。
本発明はさらに、開始または出発領域を側部に有する「ソラフェン遺伝子集団」の構築に関連する全てのDNA配列の同定および単離のための方法に関し、該方法は
（ａ）単一のクローン上に分散した細菌ゲノムの全体を実質的に含む粘液細菌の群からのソラフェン産生生物の代表的な遺伝子ライブラリィの構築；
（ｂ）「ソラフェン遺伝子集団」内のそれぞれ右側および左側に位置する近接DNA領域の一部と少なくとも重複する、予め単離されたDNA断片またはその選択された一部の１種をプローブ分子として用いる上記クローンのハイブリダイゼーション；
（ｃ）DNAプローブと強いハイブリダイゼーション信号を示すクローンの選択；
（ｄ）（ｃ）に従って選択されたクローンからの重複DNA領域を含む断片の単離、および重複領域を最も越えて突出する断片の単離；
（ｅ）（ｄ）に従って単離されたDNA断片の「ソラフェン遺伝子集団」内で機能する能力の試験；
（ｆ）ソラフェン生合成の範囲内で（ｄ）に従って単離されたDNA断片の機能を検出することが可能であるならば、工程（ａ）ないし（ｅ）による方法の反復、ただし、（ｄ）に従って単離されたDNA断片またはその選択された一部、特に該断片の左側または右側フランキング領域からのものは、ソラフェン生合成における機能が特定の新たに単離されたDNA断片に対する機能試験の範囲内でもはや検出し得ず、その結果、遺伝子集団の端部に到達されるまで、DNAプローブとして機能する；および
（ｇ）適当であるならば、これまで選択されなかったその他の方向に工程（ａ）ないし（ｆ）による方法の実施、からなる。
本発明の範囲内に含まれるものと意図されることの解釈および理解を容易にするために、保護範囲を確立するのに必要な用語のいくつかが以下に詳しく定義されている。すなわち、詳細な説明はそれらが本発明の範囲内で有すると意図される意味として与えられている。
DNA断片：コードおよび非コード部分の両方を含み得、そしていずれも天然供給源から直接得られるか、または組換えもしくは合成技術またはそれらの組合せにより製造され得るDNAの一部。
コードDNA配列：遺伝コードの規則に従って個々のヌクレオチド構成成分からなり、そして構造的情報を含み、そして転写および翻訳が起こった後に、相当するポリペプチドの製造を生じるDNA配列。
遺伝子：ゲノム内に位置し、そして上記コードDNA配列の他に、発現、すなわちコード部分の転写および翻訳の制御に関係するその他の主として制御DNA配列を含む規定された領域。
実質的に相同：この用語は、存在する相同性の故に、構造的および／または機能的同等物として見なされなければならないDNAおよひアミノ酸配列に主として関連する。一般的に最低であるべきである関連配列間の構造的および／または機能的相違は非常に異なる原因を有し得る。従って、例えばこれらは、天然に生じるか、または人工的に誘導される突然変異からなっていても、または、初期の配列と比較された観察されるべき相違は、例えば化学合成の範囲内で導入され得る特定の修飾に基づいている。
例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはタンパク質配列が酵素活性、免疫学的反応性の領域または遺伝子制御のヌクレオチド配列の場合において初期の配列と同一の特性を実質的に有する場合に、機能的相違は最低であると見なされ得る。
構造的相違は異なる配列間に顕著な重複または類似性がありさえすれば最低と見なされ得、また後者は少なくとも同様の物理的特性を有する。後者は例えば電気泳動移動度、クロマトグラフィー類似性、沈降係数、分光光度特性等を包含する。ヌクレオチド配列の場合、一致の度合いは少なくとも60％、好ましくは75％、そして特に好ましくは90％以上であるべきである。アミノ酸配列の場合、相当する値は少なくとも70％、好ましくは80％、そして特に好ましくは90％である。99％の一致度がとりわけ好ましい。
異種起源の遺伝子またはDNA：特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿入される種以外の種に由来するDNA配列；該DNA配列は外来遺伝子または外来DNAもしくは外因性DNAとも記載される。
同種起源の遺伝子またはDNA：特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿入される種と同一種に由来するDNA配列。このDNAは内因性DNAとも記載される。
DNA相同性:2またはそれ以上のDNA配列間の一致の度合い。
合成遺伝子またはDNA：特定の生成物をコードするか、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段により製造されるDNA配列。
プロモーター：宿主細胞内であらゆる所望の相同または非相同DNA遺伝子配列の転写を確実に行わせるDNA発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのようなプロモーターと操作可能に結合されており、そして後者は宿主細胞内で活性である。
終結配列：転写工程の終了をシグナルで伝える転写単位の末端のDNA配列。
過産生プロモーター（OPP）：このOPPで形質転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察されるよりも明らかに高い程度まで（RNAの形態またはポリペプチドの量で測定される）、操作可能に結合された機能遺伝子配列の宿主細胞内での発現を引起し得るプロモーター。
3'/5'非翻訳領域:mRNAに転写されるけれどもポリペプチドに翻訳されないコード領域の上流／下流に位置するDNA部分。この領域は、調節配列、例えばリボソーム結合部位（5'）を含む。
DNA発現ベクター：適当な宿主細胞内に挿入されたDNAの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクローニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオファージ。
DNAトランスファーベクター：適当な宿主細胞内への遺伝物質の挿入を可能にするトランスファー（移送）ビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオファージベクター。
相同組換え：相同DNA分子間のDNA断片の相互交換。
突然変異体，変種：自然に、または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での処理その他を用いて人工的に作出され、そして本発明に必須の特徴および特性を依然有する微生物誘導体、外因性DNAでの形質転換により本発明に必須の特徴および特性を獲得した出発菌株の誘導体。
本発明に係るDNA断片を単離するために、必要な二次代謝産物、特にソラフェンを合成する該当する生物株からゲノム遺伝子バンクがまず作られる。
ゲノムDNAは種々の方法で宿主生物から、例えば公知方法を用いて核画分からの抽出および抽出されたDNAの精製により得ることができる。
代表的遺伝子バンクの形成に必要であるクローン化されるべきゲノムDNAのクローニングベクターに挿入するのに適当な大きさまでの断片化は、機械的切断または好ましくは適当な制限酵素での切断により行われ得る。これに関連して、互いに重複するDNA断片を導くゲノムDNAの部分切断が本発明の範囲内で特に好ましい。
ゲノムおよび／またはcDNA遺伝子ライブラリィ創生のために一般的に既に使用されている適当なクローニングベクターは例えば、ファージベクター例えばλシャロンファージ、または細菌ベクター例えば大腸菌プラスミドpBR322を包含する。その他の適当なクローニングベクターは当業者に公知である。
ゲノム遺伝子バンクの形成に特に適しているのは、プラスミドのDNAと、ラムダファージのゲノムからのパッケージングに必須である構成成分、いわゆる「cos」部位からの両方の部分を含むいわゆるコスミドベクターである。コスミドは、プラスミド部分に由来する選択の範囲内で必要とされる１またはそれ以上のマーカー、ならびに細菌宿主内の自律的複製に必須のDNA領域を有する。コスミドは一般的に非常に小さい分子であり、相当する大きなDNA断片をクローニングする能力をそれらに供与する。これは本発明の範囲内での使用に特に適している。
コスミドから誘導されるベクター変種、例えば、変化する量の「全DNA」を有し、それ故に大きさの相違をクローン化されるべきDNAで相殺することができるカロミドがゲノム遺伝子バンクを形成するために同様に適している。
必要な遺伝子または遺伝子断片を含む適当なクローンは次いでスクリーニングプログラムの範囲内で、例えば適当なプローブ分子〔DNAプローブ〕を用いてこのようにして形成された遺伝子ライブラリィから見つけだされ、そして続いて単離され得る。種々の方法、例えば分画コロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションが適当なクローンを見つけだすために利用可能である。発現遺伝子バンクが使用される場合、特定の翻訳産物の同定に基づいた免疫学的検出方法をさらに使用することが可能である。
存在する相同性のために、同定されるべき必要な遺伝子または遺伝子の集団内の相当する配列領域とハイブリッド形成し得る同一または構造的に関連する遺伝子から既に前もって単離されたDNA断片を例えばプローブ分子として使用することが可能である。本発明の範囲内でプローブ分子として使用するのに好ましいのは、公知のポリケチド抗生物質の合成に部分的に作用する遺伝子または別のDNA配列から得ることができるDNA断片である。特に好ましいプローブ分子はストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000003
のグラナチシン遺伝子集団〔ORF1−４〕のgra I領域からの4.6Kb BamH I断片である（Sherman D等,1989）。
「ソラフェン遺伝子集団」内の出発点を見出すために使用され、そして比較的弱いハイブリダイゼーション信号のみを示すストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000004
のgra I領域からのプローブの代わりに、本発明の範囲内で単離された断片の一部、例えば、存在する相同性の故に、その他のソラフェン産生ソランギウム株と明瞭な結果を導きもする1.8Kb Sal I断片の一部をプローブ分子として使用することも今ではもちろん可能である。
単離されるべき遺伝子のアミノ酸配列または該配列の少なくとも一部が一旦判明したら、この配列情報に基づいて適当な相当するDNA配列を設計することが別な態様において可能である。知られているように、遺伝コードは縮重しているので、同一アミノ酸に対する異なるコドンを使用することがほとんどの場合において可能である。この結果、わずかな例外を除いて、一般的にアミノ酸配列はその一連の互いに類似するオリゴヌクレオチドによりコード化され得る。しかしながら、これに関連して、この一連のオリゴヌクレオチドの一種のみが探究される遺伝子内の相当する配列と実際に一致することは留意されるべきである。最初から可能なオリゴヌクレオチドの数を限定するために、例えば、特定のコドンが高いグアノシンおよびシトシン含量を持つ原核細胞において使用される頻度を考慮する、コドンの使用に対するBibb M等（1984）により確立された規則に頼ることも可能である。
この情報に基づいて、プローブ分子をゲノムDNAと上記方法の一つにおいてハイブリダイゼーションさせることによる、適当なクローンの同定および単離のためのプローブ分子として使用され得るオリゴヌクレオチド分子を設計することも可能である。
所望の遺伝子または所望の遺伝子の一部の検出を促進するために、上記のDNAプローブ分子の１種が適当な容易に検出可能な群で標識され得る。本発明の範囲内で、検出可能な群は特に容易に同定可能な物理的または化学的特性を有するあらゆる物質として理解されるべきである。
そのような物質は特にイムノアッセイの分野で既に広く使用されており、そしてそれらの大部分は本発明において使用され得る。酵素的に活性な群、例えば酵素、酵素基質、補酵素および酵素阻害剤、および蛍光剤および発色剤、発色団および放射性同位元素、例えば3H,35S,32P,125Iおよび14Cがこの点で特別な記載がなされ得る。これらの標識の容易な検出性は、一方で固有の物理的特性（例えば蛍光標識、発色団、放射性同位元素）、そして他方でそれらの反応および結合特性（例えば酵素、基質、補酵素、阻害剤）に基づいている。
DNAハイブリダイゼーションに関する一般的方法は、例えばManiatis T等（1982）およびHaymes BT等（1985）に記載されている。
プローブ分子とハイブリダイゼーションし得、そして上記の検出方法の一つにより同定され得る上記遺伝子ライブラリィ内のそれらのクローンは、コード配列の範囲および性質を詳細にさらに決定するために次に分析され得る。
クローン化遺伝子を同定するための別の方法は発現ベクターから構築される遺伝子ライブラリィの創生に基づいている。このことは、上記方法と同様に、所望の遺伝子産物を発現し得るゲノムDNAがまず単離され、そして次に適当な発現ベクター内にクローン化されることを含む。そのようにして創生された遺伝子ライブラリィは次いで適当な手段、例えば相補性試験を用いてスクリーニングされ得、そして所望の遺伝子または少なくともその一部を含むクローンが選択され得る。
従って、上記方法を用いて特定の遺伝子産物をコードする遺伝子を単離ことが可能である。
その他の特徴づけのために、上記のように精製および単離されたDNA配列を制限分析および配列分析に供する。
単離された断片はそれらの制限切断部位に基づいた制限分析の範囲内で、適当な制限酵素、例えばBgl II,Sph IおよびSma Iで完全消化されることにより特徴づけられる。該制限酵素はここでは単独または相互に組み合わせて使用され得る。得られる断片の大きさはアガロースゲル上での分画後にサイズ標準との比較により決定され得る。
配列分析のために、予め単離されたDNA断片を最初に適当な制限酵素により断片に切断し、そして次に適当なクローニングベクター、例えばM13ベクターmp18およびmp19内にクローン化する。一般に配列決定は5'→3'方向に行われ、好ましくはサンガーのジデオキシヌクレオチド鎖停止法［Sanger等（1977）］またはマキサムおよびギルバートの方法［Maxam and Gilbert,1980］が用いて行われる。配列決定におけるエラーを防止するために、同時に２本のDNA鎖の配列を決定することが有利である。実験の手間を減らすのに助けとなり、そのためにそれの使用が本発明の範囲内で好ましい標準化配列決定キットが今では入手可能である。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列の分析は適当な市販のコンピュータソフトウエア（例えばウイスコンシン大学のGCGソフトウエア）を用いて行われる。
種々の変法はソラフェン生合成の範囲内でのその機能に関してクローン化DNA断片の分析に利用できる。
従って、例えば、二次代謝産物生合成における遺伝子または遺伝子断片の原則的な関連を確立するだけでなく、さらに前記DNA断片が関連する合成段階を特定する欠損突然変異体を用いる相補性実験の範囲内での可能性がある。
分析の別な形態において、証明は正確に反対の意味において起こる。粘液細菌ゲノム上の相当する部分と相同性を有するDNA部分を含むプラスミドの移入は粘液細菌の染色体DNA中への上記相同DNA部分の相同組換えを介した相同部位への組み込みを生じる。相同DNA部分がこの場合のように、無傷の遺伝子集団内の領域であるならば、プラスミドの組み込みはいわゆる遺伝子分断による上記集団の不活性化およびそれに次ぐ二次代謝産物産生の停止を生じる。
上記の検出方法を実施する基本はEP−A92810128.6およびJaoua等（1992）に記載されている。同種もしくは異種起源の外来DNAまたは同種および異種起源の遺伝物質の組合せが、粘液細菌細胞内に挿入され、そしてその場所で相同組換えを介して存在する相同性に基づいて正確に規定される部位に特異的に、上記粘液細菌の染色体内に、それがゲノム内の相当する部分と十分な相同性を持つ限り組み込まれることが初めて可能になった。
現時点の知識の水準によれば、少なくとも100Bp、好ましくは1000Bpからなる相同領域が必要な組換え結果を引き起こすのに十分であると考えられる。
しかしながら、0.3ないし4Kb、好ましくは１ないし3Kbに及ぶ相同領域が好ましい。
相同組換えを介する組み込みに十分である粘液細菌染色体との相同性を有する適当なプラスミドの製造方法は、好ましくは、予め単離されたコスミドDNAを消化し、そして適当な大きさの断片を単離し、続いて適当なプラスミドにクローン化するサブクローニング工程からなる。
同種DNA断片ならびに同種および異種由来のDNA断片の適当なクローニングベクターへの結合は例えばManiatis等,1982に記載されるような標準法を用いて行われる。
これは通常、最初に適当な制限酵素で切断された、ベクターと組み込まれるべきDNA配列を必要とする。適当な制限酵素は、例えばブラント末端を有する断片を生じるもの、例えばSma I、Hpa IおよびEcoR V、または粘着端を形成する酵素、例えばEcoR I、Sac I、BamH I、Sal I、Pvu I等である。
互いに相補的である、ブラント末端を有する断片および粘着端を有する断片のどちらも、適当なDNAリガーゼにより再び結合され、単一の連続的DNA分子が形成される。
突出する粘着端を有するDNA断片を大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片と処理して、適当な相補的ヌクレオチドで空隙を充填することによりブラント末端を製造することもできる。
他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて所望のDNA配列および切断されたベクター分子の端部に相補的ホモポリマー尾部を添加するか、または制限切断部位を有する合成オリゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加し、そして次に適当な酵素で切断することにより、粘着端を人工的に製造することもできる。
上記の構築物の製造および複製のために、全ての慣用クローニングベクター、例えば宿主細胞に適合する種に由来する複製および調節配列を必ず有するプラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターを使用することも原理的に可能である。
通常クローニングベクターは形質転換された宿主細胞において表現型の選択特徴、特に抗生物質に対する耐性を導く特定の遺伝子の他に複製開始点を有する。形質転換されたベクターは宿主細胞への形質転換の後にこれらの表現型マーカーに基づいて選択され得る。
本発明の範囲内で使用され得る選択可能な表現型マーカーは、本発明の対象に制限を与えるものではないが、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシン、G418、カナマイシン、ネオマイシンおよびブレオマイシンに対する耐性を含む。特定のアミノ酸に対する原栄養株はその他の選択マーカーとして例えば機能し得る。
本発明の範囲内では主として大腸菌プラスミド、例えば本発明の範囲内で使用されるプラスミドpSUP2021が好ましい。
本発明の範囲内の上記クローニングのために適当な宿主細胞は主として原核生物であり、細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（A.tumefaciens）、大腸菌（E.coli）、エス．・チフィムリウム（S.typhimurium）およびセルラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、さらにシュードモナド、放線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体を含む。
大腸菌宿主、例えば大腸菌HB101株が特に好ましい。
大腸菌HB101株の感応細胞はこれに関連して大腸菌の形質転換に慣用の方法を用いて製造される（“General recombinant DNA techniques"参照）。
形質転換および次の適当な培地上での単離により生成するコロニーは、選択培地上に平板培養することによる分画スクリーニングに供される。引続き、その中にクローン化されてDNA断片を有するプラスミドを含むコロニーから適当なプラスミドDNAを単離することが可能である。
異なる大きさの組換えプラスミドはこのようにして得られる。制限分析の後に、適当な大きさのプラスミドは、該プラスミドDNAの粘液細菌細胞への次の挿入のために選択されることが可能である。このDNA移入はさらに、直接または好ましくは接合移入の範囲内で仲介宿主（供与細胞）を介して起こり得る。
供与細胞から粘液細菌受容体への接合移入は本発明の範囲内で好ましい。
さらに、移入されるべきDNAをまず最初に慣用のクローニングベクター中で上記したようにクローン化し、次に供与細胞として作用する適当な仲介宿主中に形質転換することは本発明の接合移入の範囲内で可能である。しかしながら、仲介宿主を介する迂回経路はDNAのクローニングのため、および接合の範囲内の供与細胞としての使用のための両方に適当である宿主株を用いることにより回避され得る。
供与細胞として本発明の範囲内で使用され得る仲介宿主は実質的に、大腸菌、シュードモナド、放線菌、サルモネラおよび粘液細菌自体からなる群から選択される原核細胞である。
供与細胞から受容細胞へのプラスミドDNAの接合移入のための必要条件はトランスファー機能（tra）および移動機能（mob）の存在である。さらに、移動機能は少なくともトランスファー開始点（oriT）を含み、そして移入されるべきプラスミド上に位置されていなければならない。一方、トランスファー機能（tra）はプラスミドもしくはヘルパープラスミド上に位置されているか、または供与細胞の染色体中に組み込まれて存在していてもよい。
上記の条件に合致し、それ故に本発明の範囲内で好ましいプラスミドは実質的に不適合群P,Q,T,N,WおよびCol Iである。Ｐ群プラスミドの原型はプラスミドRP4である。本発明の範囲内で特に好ましいのは、mob機能（RP4mob）の成分としてトランスファー開始点（oriT）を有するプラスミドRP4からの1.9Kb断片を含むプラスミドpSUP2021である。mob機能（RP4mob）を有するその他のプラスミド、例えばpSUP101、pSUP301、pSUP401、pSUP201、pSUP202、pSUP203またはpSUP205およびそれから誘導される誘導体［Simom等（1988）］は同様に本発明に係る方法の範囲内で使用され得る。
受容粘液細菌が供与株との保温の前で接合移入の間に短時間の熱処理に晒される場合に有利であることが明らかとなった。35℃ないし60℃、好ましくは42℃ないし55℃、特に48℃ないし52℃の温度で１ないし120分、好ましくは５ないし20分の受容細胞の予備保温が好ましい。
染色体DNAに混入されたプラスミドRP4のトランスファー遺伝子（tra）を含む大腸菌供与株が本発明の好ましい実施態様において使用される。RP4のトランスファー機能（tra）を有するヘルパープラスミドpME305を含む大腸菌供与W3101株（pME305）が本発明の範囲内で好ましい。
方法技術にとって特に興味深く、そして本発明の範囲内で特に好ましいのは、組み込まれたDNA配列を有するベクターのクローニングのためと、接合移入の範囲内で供与細胞として使用するための両方に適当である細菌株である。制限陰性であり、そのために挿入された外来DNAを分解しない細菌株も同様に特に好ましい。上記の両方の条件を大腸菌ED8767株（pUZ8）は理想的に満たしているが、その他の適当な細菌株の代表としてここで記載するにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
上記した供与細胞から受容粘液細菌への接合遺伝子移入の他に、粘液細菌に遺伝物質を挿入するためのその他の適当な遺伝子移入方法を使用することももちろん可能である。ここでは、粘液細菌細胞が高い電場強度に短時間晒されるエレクトロポレーション［Kuspa and Kaiser（1989）］を介する遺伝子移入が主として記載され得る。原核細胞のエレクトロポレーションのための一般的でおおまかな条件はUS−P4910140に記載されている。
ソラフェンの生合成に直接的または間接的に関連し、そしてソラフェン生合成の遺伝子集団から上記のようにして得られる得るDNA領域を含む本発明に係るDNA断片はまた、それと近接するか、または重複するその他のDNA領域の上記遺伝子集団からの同定および単離のための出発クローンとして使用され得る。
これは、例えば、予め単離したDNA断片または特に互いに重複するDNA領域を有するDNA断片からなる遺伝子ライブラリィ内の5'および3'に位置するフランキング配列を用いていわゆる染色体ウォーキングを行うことにより達成され得る。染色体ウォーキングに関する操作は例えばSmith CL等（1987）およびWahl GL（1987）による文献から当業者に公知である。
染色体ウォーキングの必須条件は、遺伝子ライブラリィ内の最大長さの粘着性および相互重複性DNA断片を有するクローンの存在、および分析されるべき領域の周囲、または好ましくは該領域内に位置する断片からなる適当な出発クローンの存在である。出発クローンの正確な位置が不明ならば、ウォーキングは両方向に同様に行われるのが好ましい。
実際のウォーキング工程は出発クローンが同定および単離されたら、それを、出発クローンとの重複領域を有する近接クローンを検出するために上記のハイブリダイゼーション反応の一つにおいてプローブとして用いて始まる。重複領域をはるかに越えて突出する断片を同定するハイブリダイゼーション分析によりさらに可能である。断片が次に第２のウォーキング段階のための開始クローンとして使用され、そしてこの場合において、同じ方向に第２のクローンと重複する断片が同定される。このようにして、染色体に沿って前進を続けることにより、大きいDNA範囲に及び重複DNAクローンのコレクションが得られる。これらは次に、適当である場合に１またはその他のいくつかのサブクローニング段階の後に、行われ、公知方法により互いに連結されて、ソラフェン生合成に必須な一部または好ましくは全部を含む断片が得られる。
非常に大きく扱い難い完全断片の代わりに、重複フランキング領域を有するクローンを同定するためのハイブリダイゼーション反応のために、左側または右側フランキング領域由来であり、かつサブクローニング段階により得ることができる部分断片が使用されることが好ましい。該部分断片のより小さい大きさのために、ハイブリダイゼーション反応により、より少数の陽性ハイブリダイゼーション信号が生じ、その結果、完全断片を用いる場合に比べ、分析作業は明らかに容易である。全体のゲノムにわたって分散され、ウォーキング段階の標的化配列を大きく妨害するであろう反復配列の比較的大きな部分の存在を排除するために、部分断片を詳細に特徴づけることはさらに有利である。
ソラフェン生合成に関係する遺伝子集団は非常に大きい遺伝子領域に及ぶので、いわゆるラージステップウォーキングまたはコスミドウォーキングを行うことが本発明の範囲内で有利である。これらの場合において、非常に大きいDNA断片のクローニングを可能にするコスミドベクターを用いることにより、単一のウォーキング工程により45Kbまでの非常に大きいDNA領域をカバーすることが可能である。
本発明の特定の態様において、ソランギウム・セルロスムのコスミド遺伝子バンクを構築するために、100Kbのオーダーの大きさにある完全DNAが単離され、引続き適当な制限エンドヌクレアーゼにより消化される。
これに関連して、最大の相違を有する制限レベルで行われるように個々の消化が互いに別々に行われるSau3Aでの３回部分消化が好ましい。
消化されたDNAは、依然として存在するエンドヌクレアーゼを除去するために慣用の方法で引き続いて抽出され、そして沈澱され、最後に濃縮される。生成する断片濃厚物は次に例えば密度勾配遠心分離により個々の断片の大きさに従って分画される。このようにして得られる画分は透析の後、アガロースゲル上で分析され得る。適当な大きさの断片を含む画分は集められ、そしてさらに処理するために濃縮される。本発明の範囲内で特に適当であるのは、30Kbないし45Kb、好ましくは40Kbないし45Kbの大きさの断片である。
上記の断片化と同時に、またはその後に、適当なコスミドベクター、例えばpHC79［Hohn and Collins,1980］は適当な制限酵素、例えば引き続くリガーゼ反応のためのBamH Iで完全に消化される。
それらの大きさに従って分画されたソランギウム・セルロスム断片へのコスミドDNAの連結はT4DNAリガーゼを用いて行われる得る。このようにして得られる連結混合物は十分な保温時間の後、λファージ中に、方法の経済的理由のために、好ましくは、現在種々の業者、例えばSTRATAGENまたはPROMEGA等から入手され得る市販のパッケージングキットの１種を用いてパッケージングされる。
得られたファージ粒子は次に適当な宿主株を感染させるのに使用される。recA-大腸菌株、例えば大腸菌HB101が好ましい。感染されたクローンの選択およびプラスミドDNAの単離は一般的な公知方法により行われ得る。
ソラフェン生合成に一部関与するDNA断片に対する遺伝子バンクのスクリーニングは「ソラフェン遺伝子集団」内の相当する領域と十分な相同性を有するDNA領域を含むと考えられる特定のハイブリダイゼーションプローブを用いて行われる。
上記ハイブリダイゼーションプローブの製造に使用され得る出発物質はpUC18のBamH I部位にクローン化されたストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000005
のgra I領域〔グラナチシン遺伝子集団ORF1−４〕の4.6Kb BamH I断片を含むプラスミドpIJ5200［Sherman D等,1989］である。
プラスミドベクターに由来し、かつ4.6Kbからの遺伝子バンク分析に悪影響を及ぼし得る妨害DNA配列を除去するために、上記断片はストレプトマイセスベクター中に好ましくはクローン化され、そして後者は感応性ストレプトマイセス株中で形質転換される。
選択および制限分析の後に、プラスミドDNA中にクローン化された4.6Kb断片を含む適当なクローンは選択され、そしてプラスミド単離のために培養される。プラスミドDNAは公知方法、例えばCsClグラジエント法を用いて単離され、そして4.6Kb断片はプラスミドDNAのBamH Iでの完全消化の後に除去される。
このようにして単離された4.6Kb断片はｄ−CTP32を用いたニックトランスレーションを行うことにより放射標識される。この場合にも、方法の経済性のために、例えばベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジーズ社により販売されている市販のニックトランスレーションキットを用いることが有利である。
「ソラフェン遺伝子集団」内の出発点を見出すために使用され、そしてストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000006
のgra I領域に由来し、そして比較的弱いハイブリダイゼーション信号のみを示すプローブの代わりに、本発明の範囲内で単離された断片の一部、例えば、存在する相同性の故に、その他のソラフェン産生ソランギウム株と明瞭な結果を導きもする1.8Kb Sal I断片をプローブ分子として使用することも今ではもちろん可能である。
放射標識されたプローブを用いた遺伝子バンクのスクリーニングは好ましくはハイブリダイゼーション分析の範囲内で起こる。ハイブリダイゼーション分析は例えばManiatis等［326−328頁；（1982）］に記載されたコロニーハイブリダイゼーションの形態で行われ得る。
最も強いハイブリダイゼーション信号を示すクローンが選択され、そして適当な培地〔例えばLB培地〕で培養され、そして次にプラスミドDNAを単離するために使用される［Maniatis等（1982）;368および369頁の記載に準拠］。
単離されたプラスミドは次いで適当な制限酵素、例えばSal Iで消化され、そしてこのようにして得られた断片はアガロースゲル上で分画される。得られた断片を次にサザーンキャピラリィブロッティングの範囲内で行われ得るサザーンハイブリダイゼーションに供する。オートラジオグラフで1.8Kbに強いバンドを示すコスミドクローン〔p98/1〕が次の作業のために選択される。コスミドクローンをまず適当な培地中でプラスミドDNAの増幅のために培養する。プラスミドDNAが単離された後、適当な制限酵素〔例えばSal I〕で完全に消化し、そしてこのようにして得られる断片をアガロースゲル上での電気泳動により分画する。所望の1.8KbDNA断片は次に電気溶離によりアガロースゲルから取り出され得る。
このようにして得られる1.8Kb断片は引続き細菌プラスミド中でリガーゼ反応においてクローン化される。大腸菌プラスミドpBR322は本発明の範囲内で好ましい。
得られる連結DNAは次に、大腸菌のrecA-株の能力を有する細胞、好ましくは例えば大腸菌HB101株の細胞中にクローン化され［Maniatis等,1982;250および251頁］、そして選択培地に移される。
適当なコロニーは得られる形質転換されたコロニーの分画スクリーニングにより見出され得、そしてそれらのプラスミドDNAは単離され得る［Maniatis等（1982）;368および369頁の記載に準拠］。単離されたプラスミドDNAは次に適当な制限酵素、例えばSal Iで切断され、次にその挿入された断片の大きさに対してアガロースゲル電気泳動により、好ましくは以前に選択されたコスミド〔p98/1〕を比較標準として用いることにより分析される。
所望の大きさのその他の断片を含むプラスミド〔p108/III 2〕は上記の方法でゲルから単離され得る。以前に選択されたコスミド〔p98/1〕の1.8Kb断片に対するこのその他の断片の同定は、サザントランスファーおよびストレプトマイセス・ビオラセオルベルからの4.6KbDNAプローブとのハイブリッド形成により確認され得る。
前もって単離された1.8KbDNA断片の機能分析は遺伝子分断実験の範囲内で行われ得る。
これは最初に、コスミドDNA〔p98/1〕が適当な制限酵素を用いて完全に消化され、そして生成された断片が分画されていることを必要とし、例えばPvu Iを使用した場合、約10,6.5,4.2および4Kbの大きさを有する断片を得ることができる。所望の大きさの断片は次いで、接合移入のために必要な機能を有する適当なベクター中にクローン化され得る。mob機能（RP4mob）および該mob機能の成分としてトランスファー開始点（oriT）を有するプラスミドRP4からの断片を含むプラスミドpSUP2021が好ましい。能力を持った（感応性になった）宿主細胞（好ましくは大腸菌HB101株）の形質転換の後、陽性クローン、すなわちそのプラスミドDNAが所望の大きさの断片を含むクローンを同定および選択することはその時には非常に簡単である。
このようにして得られるプラスミドはソランギウム・セルロスム中への接合移入のために使用され得る。このために好ましく使用される供与株は、染色体DNA中に組み込まれたプラスミドRP4の転位遺伝子（tra）を含む大腸菌株である。RP4の転位機能（tra）を保持するヘルパープラスミドpME305を含む大腸菌供与株W3101（pME305）が本発明の範囲内で好ましい。
組み込まれたDNA配列を有するベクターのクローニングのため、および接合移入の範囲内で供与細胞として使用するための宿主として適当である細菌株は方法論的技術のために特に興味深く、そしてそれ故に本発明の範囲内でとりわけ好ましい。制限陰性であり、従って挿入された外来DNAを分解しない細菌株が同様に特に好ましい。大腸菌ED8767（pUZ8）株により理想的な様式で上記の条件の両方が見たされ、それ故に該菌株の使用は本発明の範囲内で特に好ましい。
アンピシリン耐性遺伝子を持たないヘルパープラスミドpUZ8が使用される場合、接合移入が意図される大腸菌供与株ED8767における直接クローニングが今では可能であるので、大腸菌仲介宿主HB101におけるクローニング工程を省略することができる。
プラスミドpUZ8は、広い宿主範囲を有し、そしてDatta等（1971）により記載されているプラスミドRP4の誘導体である。最初のプラスミドRP4との相違は、その両方が欠失されているアンピシリン耐性遺伝子および挿入要素IS21に実質的に関し、そして水銀イオンに対する耐性を付与する別の遺伝子の組み込みに関連する〔Jaoua等（1987）参照〕。
プラスミドDNAはそれ故に今では大腸菌ED8767株中に直接形質転換され得る。このために、大腸菌ED8767株の感応細胞は大腸菌の形質転換に慣用の方法を用いて製造される（“General recombinant DNA techniques"参照）。
形質転換および続く適当な選択培地上の培養後に得られるコロニーはアンピシリン含有〔60μg/ml〕および無アンピシリン培地上での並行プレーティングにより分画スクリーニングに供される。ソランギウムDNA断片の組み込みのためにアンピシリン耐性を失ったそれらのコロニーを続いて単離することが次に可能である。このようにして得られる培養体は次にソランギウム・セルロスム中への組換えプラスミドの接合移入のための供与細胞として直接使用され得る。
実際の移入のために、定常期にあるソランギウム・セルロスム細胞を、匹敵し得る比率の細胞からなる大腸菌供与細胞の後期対数期にある培養体と混合する。
この場合、大腸菌との接合の前に水浴中での短時間の熱処理にソランギウム受容細胞を暴露することが有用であることが証明されている。ソランギウム・セルロスムSJ3株との最良の移入結果は50℃の温度で10分間の熱処理で達成され得る。１−５×10-5の移入頻度が上記条件で達成され得るが、これは従来の熱処理なしの方法に比較して10倍の増加に相当する。
種々の選択段階が行われた後、所望のプラスミドDNAを含むソランギウム・セルロスムの接合完了体（トランス接合体）を得ることができる。ソランギウムに対するプラスミドDNAの移入の形質転換頻度は受容株に基づいて平均１−３×10-6である。
ソランギウム・セルロスム内の相当する部分と相同であるDNA部分を含むプラスミドの移入により、上記DNA部分がソランギウム・セルロスム染色体DNA中に相同部位で相同組換えを介して組み込まれる。相同領域が遺伝子集団内の部分、例えばソラフェン生合成に関するものであるならば、プラスミド組み込みはいわゆる遺伝子分断により上記集団の不活性化をもたらす。従って、この方法はソランギウム・セルロスムにおけるクローン化DNA断片の機能の分析を可能にする。
コスミドp98/1のPvu I断片の機能を試験するために、十分に成長した接合完了体コロニーが移入され、そして選択剤としてカナマイシンフレオマイシンおよびストレプトマイシンを含有する選択培地上で培養される。
１またはそれ以上の中間培養段階は、細菌により放出されたソラフェンを結合する吸着剤、例えばポリマー吸着性樹脂を含む培地に移して行われる。
数日間の培養の後、吸着剤が除去され、そして吸着したソラフェンが、例えば適当な溶媒、例としてイソプロパノールとの震盪により抽出される。ソラフェンの定量分析はHPLC法により、好ましくは波長210nmでUV検出器を用いて行われ得る。
上記6.5Kb断片のその他の特徴づけのために、該断片は制限分析に供され、続いて上記6.5Kb断片に含まれる1.8Kb断片が配列決定される。
制限切断部位に基づいて6.5KbのPvu I断片を特徴つけるために、該断片は適当な制限酵素、例えば単独でまたは互いに組み合わせて使用されるBgl II,Sph IおよびSma Iで完全に消化される。生成する断片の大きさはサイズ標準との比較によりアガロースゲル上での分画後に決定され得る。
6.5KbのPvu I断片のBgl IIでの消化により、4.3Kbおよび2.3Kbの大きさの２種の断片が得られ、そしてSph Iでの消化により2.8Kb、1.5Kb、0.7Kbの大きさの４種の断片が得られる。２種の酵素〔Bgl IIおよびSph I〕の組合せにより、1.6Kb、1.5Kb、1.5Kb、1.2Kb、0.7Kbの大きさの５種の断片を生じる。Sma Iでの消化により、2.9Kb、2.0Kbおよび1.6Kbの大きさを有する３種の断片が得られる。
この場合において、用いられる測定方法により、断片の実際の大きさは表記の値から＋／−10％程度異なる。コスミドp98/1の6.5Kb断片上のBgl II,Sph IおよびSma I切断部位の位置は図１に示されるように見出された断片の大きさに基づいて確立され得る。
前に特徴づけられた6.5Kb断片に含まれる1.8Kb断片の引き続く配列決定を準備するために、それはまずプラスミド〔p108/III2〕から単離され、そして次に適当なベクター中にクローン化される。
クローンpSN105/7の6.5Pvu I断片に含まれる1.8Kb Sal I断片とプラスミドp108/1112中にクローン化された1.8Kb断片との同一性はハイブリダイゼーション実験に基づいて示され得る。
本発明の範囲内で好ましいのは、M13mp18またはM13mp19ベクターであり、その各々は例えばGIBCO−BRL（スイス国バーゼル）から販売されてい入手され得る。ベクター内へのクローニングおよび引き続く適当な大腸菌宿主のトランスフェクションがManiatis等（1989）［4.35−4.38頁］により記載された方法により行われ得る。
このようにして得られた組換えファージプラーク（無色）はManiatis等［4.25頁；（1989）］により記載されたように単離され、適当な大腸菌宿主中で複製され得る。正確な大きさの挿入断片に対する組換えファージの分析は同様にゲル電気泳動を用いる公知方法により行われ得る〔Maniatis等［4.39−4.40頁；（1989）］。所望の挿入物を有するファージからの大量の一本鎖DNAは次に単離される〔Maniatis等［4.29−4.30頁；（1989）］。
DNA配列決定は好ましくは市販の配列決定キットを用いて行われ得る。本発明の範囲内で好ましいのは、Sanger（1977）のジデオキシ法により操作するPHARMACIAからのT7配列決定キットである。これは、予め単離された一本鎖DNAを鋳型として使用することを含む。全ての配列決定操作はキット内に収納されているユニバーサルプライマーおよび放射性標識のために使用される35SdATP（アマルシャム）を用いてファルマシアT7配列決定キットの指示書（1991指示書,No.xy−010−00−08）に従って行われる。このようにして得られる試料は次に変性ポリアクリルアミドゲル（６％）上での電気泳動により分画され、そしてＸ線フィルム〔コダックＸ−OmatS〕でのオートラジオグラフィーにより試験される。操作の詳細は以下の実施例およびManiatis等［13.45−13.58頁；（1989）］の指示に見出され得る。
このようにして得られるDNA配列情報に基づいて、その他内部に位置される1.8Kb Sal I断片の領域を配列決定するためのプライマーとして次に使用され得るオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。
限定されない実施態様
一般的な組換えDNA技術
本発明において用いられる組換えDNA技術の多くは当業者にとって一般的なものであるので、通常用いられる技術に関してここで簡潔に記載しておく。別に特記したことを除いて、これらの全ての操作は文献Maniatis等（1982）に記載されている。
A.  制限エンドヌクレアーゼでの切断
反応バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオラブス（New England Biolabs）およびドイツ国マンハイムのベーリンガー（Bohringer）により推奨される緩衝溶液中に約50ないし500μg/mlのDNAを含む。制限エンドヌクレアーゼ２ないし５単位をDNA1μｇにつき添加し、そして反応混合物を上記の会社により推奨される温度で１ないし３時間保温する。65℃で10分間加熱するか、またはフェノールでの抽出により反応を終結させ、エタノールでDNAを沈澱させる。この方法は文献Maniatis等（1982）の第104ないし106頁にも記載されている。
B.  ブラント末端を製造するためのDNAのポリメラーゼでの処理
DNA断片50ないし500μg/mlを、製造会社主にマサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオラブスおよびドイツ国マンハイムのベーリンガーにより推奨される緩衝液中の反応混合物に添加する。反応混合物は全４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を0.2mMの濃度で含有する。反応は15℃で30分間行われ、次いで65℃で10分間加熱することにより終結される。5'突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばEcoR IおよびBamH Iで切断することにより得られる断片のためには、DNAポリメラーゼの大断片またはクレノウ断片が使用される。3'突出末端を製造するエンドヌクレアーゼ例えばPst IIおよびSac Iにより製造される断片のためには、T4DNAポリメラーゼが使用される。これらの２つの酵素の使用は文献Maniatis等（1982）の第113ないし121頁に記載されている。
C.  アガロースゲル電気泳動およびゲルからのDNA断片の精製
アガロースゲル電気泳動を文献Maniatis等（1982）の第150ないし163頁に記載のように水平型装置で行う。使用される緩衝液はその中に記載されているトリス−アセテート緩衝液である。DNA断片は、電気泳動の間にゲルに存在するか、または電気泳動の後に添加されるいずれかの0.5μg/ml臭化エチジウムを用いて染色される。DNAを長波長の紫外線の照射により可視化する。
断片をゲルから分離する場合には、使用されるアガロースは低いゲル化温度のものであり、これはミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）から入手できる。電気泳動後、望ましい断片を削り取り、プラスチック管内に入れ、65℃で約15分間加熱し、次いでフェノールで３回抽出し、そしてエタノールで２回沈澱させる。この操作は文献Maniatis等（1982）の第170頁の記載とはわずかに異なっている。変法として、DNAはジェネクリーン・キット（Geneclean kit）［米国カリフォルニア州ラ・ジョラのバイオ101社（Bio 101 Inc.）］を用いてアガロースから単離され得る。
D.  DNA断片からの5'末端ホスフェートの除去
プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減少させる（文献Maniatis等（1982）の第13頁に記載されている）。正しい制限エンドヌクレアーゼでのDNAの切断の後、マンハイムのベーリンガー−マンハイム（Boehringer−Mannheim）から得られる子ウシ消化管のアルカリホスファターゼ１単位を添加する。DNAを37℃で１時間保温し、次にフェノールで２回抽出し、そしてエタノールで沈澱させる。
E.  DNA断片の連結
相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、各々の断片約100ngは、ニュー・イングランド・バイオラブスからのT4DNAリガーゼ約0.2単位をこの会社により推奨される緩衝液中に含有する20ないし40μｌの反応混合物中で保温される。保温は15℃で１ないし20時間行われる。ブラント末端を有するDNA断片が結合される場合、それらはT4DNAリガーゼの量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に保温される。
F.  DNAの大腸菌内への形質転換
大腸菌HB101株、W3101株およびED8767株がほとんどの実験において使用される。文献Maniatis等（1982）の第250ないし251頁に記載されているように、塩化カルシウム法を用いてDNAが大腸菌内に導入される。
G.  プラスミドのための大腸菌のスクリーニング
形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーは迅速プラスミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験される。２種の慣用の方法は、文献Maniatis等（1982）の第366ないし369頁に記載されている。
H.  プラスミドDNAの大規模な単離
大腸菌からプラスミドを大規模に単離する方法は文献Maniatis等（1982）の第88ないし94頁に記載されている。
図面
図１〔Fig.1〕はコスミドp98/1の6.4（6.5）Kb Pvu I断片の制限地図を示す。横棒は1.8Kb Sal I断片を示し、そして該横棒の斜線領域は配列決定されたSal I−Bgl IIIサブフラグメント（二次断片）を表す。
図２〔Fig.2〕はコスミドp98/1の40Kb挿入物の制限地図を示す。横棒は遺伝子分断により分析された４つのPvu I断片の位置を示す。これらのPvu I断片の外側のその他のPvu I部位は示されていない。
実施例１  ソランギウム・セルロスムからの「ソラフェン遺伝子集団」に由来する断片のクローニング
1.1 ソランギウム・セルロスムからコスミド遺伝子バンクの構築
1.1.1  高分子量ゲノムDNAの単離
ソランギウム・セルロスムの高分子量〔約100Kb〕ゲノム完全DNAがそれ自体公知の方法を用いてM15株から単離される。
このことは特に、最初にソランギウム・セルロスム細胞がG51b培地〔培地および緩衝液の項参照〕200ml中28℃の温度で180rpmの連続揺動を行いながら10日間培養されることを含む。細胞は次に10000rpmでの遠心分離により除去され〔ソルバールSA600ロータ；デュポン・インストルメンツ〕、そしてリゾチーム〔ベーリンガー・マンハイム，ドイツ国マンハイム〕が最終濃度5mg/mlに添加されたSTE緩衝液〔培地および緩衝液の項参照〕36ml中に再懸濁する。この混合物を37℃で30分間保温する。次に、溶菌緩衝液〔培地および緩衝液の項参照〕16mlを添加し、そしてこの新たな混合物を55℃でさらに１時間保温する。
このようにして得られる細胞溶菌液にCsClを最終濃度1g/mlまで加え、そしてこの混合物を次に10000rpmで10分間遠心分離し〔ソルバールGSAロータ；デュポン・インストルメンツ，米国コネチカット州ニュートン〕、粒子成分を除去する。溶菌液をさらに45000rpmで18時間、20℃の温度で遠心分離する〔ベックマンVTi50ロータ；ベックマンインストルメンツ社，米国パロアルト〕。
次にゲノムDNAは容易に見える非常に粘性の画分から、例えば16ゲージの注射針を用いてプラスチック遠心管に単に穿孔し、そして内容物を流出させることにより単離され得る。高分子DNAを含む高粘性画分が集められ、そして次に一緒にされる。
このDNA含有画分は引続き、TE緩衝液〔培地および緩衝液の項参照〕に対して十分に透析され、そしてDNAはエタノール沈澱により濃縮される。沈澱を遠心分離し、そしてペレットをTE緩衝液2ml中に再懸濁し、そしてさらに処理を行うまで−40℃で貯蔵する。
1.1.2  高分子量DNAの部分消化
前に単離したDNAを適当な制限酵素により次に消化する。ここで異なる制限レベルを達成するために、DNAをこれも製造会社により推奨される緩衝液中のSau3A〔プロメガ，米国ウイスコンシン州メジソン〕で３回独立に部分消化に供する。使用されるDNAの量は各々の場合において100μｇであり、そして酵素濃度は0.04,0.02または0.01単位／μgDNAである。保温時間は37℃で30分間である。酵素活性はNa2EDTAを最終濃度50mMまで添加することにより停止される。この反応混合物をフェノール：クロロホルム〔50:50〕で２回、そしてクロロホルムで１回抽出し、次いでエタノール沈澱を行う。部分的に消化されたDNAをTE緩衝液中に再懸濁し、そして全ての試料を集め、そして1mg/mlの濃度に調整する。
このようにして予備処理されたDNAを65℃で５分間加熱し、そして10％ないし40％強度ショ糖密度勾配〔1M  NaCl,20mMトリス（pH8.0）,5mM  EDTA中に５％刻みの10％−40％ショ糖〕上での遠心分離〔ベックマンSW−28ロータ;25000rpm（82700×ｇ）,20℃,16−18時間〕により大きさに従って分画する。勾配は0.5ml毎に分取され、そして30μｌのオーダーの試料が全ての第２の部分から取り出され、透析され、そして0.4％アガロースゲル上でサイズ標準と共に分析される。
1.1.3  ゲノム遺伝子バンクの構築
コスミドベクターpHC79［Hohn B and Collins J,1980］をBamH Iで完全消化し、フェノール：クロロホルム〔50:50〕で抽出し、そして次にエタノールで沈澱させ、濃縮する。
35Kbないし45Kbのオーダーの大きさを有するDNA断片を含むSau3A部分消化ソランギウム・セルロスムDNAのこれらの画分が集められ、そしてエタノール沈澱により濃縮する。
次に、製造会社の指示に従って行われる仔ウシの胃からのアルカリホスファターゼ〔プロメガ〕と処理される。
大きさに従って分画されたソランギウム・セルロスムDNAへのコスミドDNAの連結はT4DNAリガーゼを用いて行われる。これは、２種のDNA出発物質がおよそ等モル量〔ソランギウム・セルロスムDNA約６μｇおよびベクターDNA約１μｇ〕で一緒に混合され、次に65℃で15分間の熱処理および再び新たなエタノール沈澱により行われる。完全DNAの最終濃度は全容量10μｌ中にDNA500μg/mlないしDNA800μg/mlである。この反応混合物を最初室温で数時間保温し、次に15℃で10ないし14時間さらに保温する。
連結混合物１ないし２μｌを次いで、例えば米国カリフォルニア州ラ・ジョラにあるSTRATAGENE社または米国ウイスコンシン州マジソンにあるPROMEGAから入手され得る市販の試験管内パッケージングキットを用いてラムダファージ中にパッケージングする。得られるファージ粒子は適当なrecA-大腸菌株〔例えば大腸菌HB101株〕の細菌の感染のために使用される。このための特定の操作は以下のとおりである：
（ａ）細菌を0.4％マルトースおよび10mM  MgSO4を補足したルリアブロス培地〔10g/lバクトトリプトン;5g/l酵母抽出物;5g/lNaCl〕中で一晩培養物として先ず培養し；
（ｂ）培養物を同じ培地に希釈し、そして光学濃度〔OD600〕0.5〔中間対数期〕に達するまで〔約２時間〕増殖させ；
（ｃ）大腸菌培養液0.2mlを滅菌エッペンドルフチューブ中に移し、「バッケージされた」ファージ粒子50μｌを添加し、そして完全混合物を十分に混合し；
（ｄ）37℃で15分間保温した後、ルリアブロス溶液1mlを添加し、そして保温をさらに１時間続け；
（ｅ）トランスフェクションされたクローンを選択するために、一部0.1mlを50mg/lアンピシリンを補足したルリアブロスアガー上にプレーティングし；そして
（ｆ）プラスミドDNAを公知方法により選択後のコロニーから単離する。
ファージ物質の力価は全体で約50000ファージ粒子/mlを示す。
1.2 ストレプトマイセス・ビオラセロウベル（S.violacerouber）
0003613614.tif 000007
からの放射標識されたDNAプローブの調製
pUC18〔GIBCO  BRL,スイス国バーゼルから入手可能〕のBamH I切断部位にクローン化されたストレプトマイセス・ビオラセオルベル
0003613614.tif 000008
のgra I領域〔グラナチシン遺伝子集団ORF1−４〕の4.6Kb BamH I断片を含むプラスミドpIJ5200［Sherman等,1989］がDNAプローブを調製するための出発材料として使用される。
相当するpBR322またはpUC18配列と相同性を有するDNA配列がないDNA断片を得るために、4.6Kb BamH I断片をまず放線菌ベクターpIJ486［Ward等,1986］内にクローン化する。このために、プラスミドpIJ5200［Sherman等,1989］約３μｇをBamH Iで完全に消化し、そして得られる断片をアガロースゲル電気泳動によりそれぞれ分離する。
所望の4.6Kb断片を次に電気泳動によりアガロースから取りだす。このために、まず、滅菌メスでアガロースゲルからアガーストリップを約2mmないし3mm幅に切断し、そして透析チューブ〔例えばBRLから入手できる直径1/4インチの調整透析チューブ〕に入れる。アガロースブロックを含有する透析チューブを次に電流が透析チューブの長軸に対し直角に２時間流れるように、水平アガロース電気泳動チャンバー内100ミリアンペアの電流で１×TAE緩衝液〔トリス酢酸塩0.04M;EDTA0.002M〕中にて処理する。45秒間の電流の逆転後、透析チューブを開き、そして内容物〔緩衝液およびアガロースブロック〕を5mlシリンジを用いてガラス繊維フィルター〔ホワットマンGF/C;ホワットマン・サイエンティフィック社，英国ケント〕にゆっくり通す。フィルターを次にTAE緩衝液〔１×〕200μｌで洗浄し、そしてtRNA〔例えばドイツのベーリンガー・マンハイムから入手できるパン酵母由来の転移RNA〕を濾過された試料に最終濃度５μl/mlまで添加する。DNA試料を次にフェノール／クロロホルムで抽出し［Maniatis等,1982,458頁］、そしてエタノールで沈澱させる［Maniatis等,1982,461頁］。得られた沈澱物をTE緩衝液30μｌないし40μｌ中に採取する。
このようにして得られた断片約0.5μｇをBamH Iで予め切断したpIJ486［Ward等,1986］ベクターDNA約0.1μｇと混合し、エタノールで沈澱させ［Maniatis等,1982,461頁］、そして反応緩衝液〔製造会社により規定されている〕20μｌ中のT4DNAリガーゼ〔ドイツのベーリンガー・マンハイムから入手可能〕と約15℃で一晩連結させる。この連結混合物２−５μｌをストレプトマイセス・ピロスス（Streptomyces pilosus）M1/5株［Schupp等,1988］内でHopwood等，（1985）に記載のプロトプラスト法により形質転換させる。R2YEアガー［Hopwood等,1988］上に250μg/mlチオストレプトン［Schupp等,1985参照］を含有する軟質栄養アガー（ディフコ）4mlを注ぎ、18時間の保温（28℃）の後に形質転換体を選択する。28℃で７日間の保温後、コロニーをプラスミドDNAの単離のために選択する。DNA単離はBirnboim and Doly（1979）の方法をわずかに修正して〔Schupp等,1988に準拠〕行われる。単離されたプラスミドDNAは次いでBamH Iで消化され、そして消化および未消化両方のDNAがゲル電気泳動を用いて分析される。
4.6Kbの追加のBamH I断片を有していたコロニーが148G培地［Schupp等,1986］500ml中で培養され、そしてプラスミドDNAがCsCl勾配法［Hopwood等,1985］を用いて単離される。上記の方法で得られ、そしてストレプトマイセス・ビオラセオルベルの4.6Kb BamH I断片を有するプラスミドはp82/11およびp82/21と命名される。
4.6KbDNA断片の放射標識のために、プラスミドp82/21約1ugをBamH Iで完全に切断し、そしてこのようにして得られる断片をアガロースゲル電気泳動により互いに分離する。4.6Kb断片を電気泳動によりアガロースから次に単離する（上記参照）。このようにして単離される4.6Kb BamH I断片約0.2μｇをニックトランスレーション［Rigby DWJ等,1977］による放射標識のために用いる。ニックトランスレーションはスイス国バーゼルにあるGIBCO  BRL（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジーズ社）から市販されて利用可能であるニックトランスレーションシステムを用いて、製造会社の指示に従いｄ−CTP32P80ZμCiの標識をして行われる。標識された4.6Kb断片はセファデックスＧ−50含有の登録商標ニック・カラム（nick column）〔ファルマシア・バイオシステムズ，スイス国デュッセルドルフ〕に通すことにより非組込みヌクレオチドから分離され得る。
1.3 ストレプトマイセス・ビオラセオルベルからのDNAプローブを用いるソランギウム・セルロスムのコスミド遺伝子バンク内の個々のクローンのハイブリダイゼーション
アンピシリン〔60μg/ml〕を補足したLBアガーを有するペトリ皿上にプレーティングした後、試験管内でパッケージングされたラムダファージ〔実施例1.1に準拠〕100μｌを大腸菌HB101株の細菌に感染させることにより、多数のアンピシリン耐性コロニー（1300以上〕を得ることができる。これらのコロニーは以下の方法〔ハイボンドフィルターのためのアマルシャムの指示〕でナイロンフィルター上でコロニーハイブリダイゼーションにより試験され得る。
ナイロンフィルター〔アマルシャム・トランスファー・メンブラン・ハイボンド−N;アマルシャム・インターナショナル，英国アマルシャム〕をコロニー上に載せ、そして１分後（コロニーを上方にして）、滅菌濾紙〔ホワットマンNo.3〕上に載せる。コロニーのインプリント（レプリカ）を作成するために、第２の濾紙を第１の濾紙上に載せ、次にLBアガープレート〔アンピシリン60μg/mlを補足〕上に載せ、そしてコロニーが直径約1mmを有するまで保温する。第１の濾紙を次にコロニーを上方にして変性溶液〔1.5M  NaCl;0.5M  NaOH〕を含浸した５層のホワットマンNo.3濾紙上に載せる。７分間の作用の後、濾紙を、中和溶液〔1.5M  NaCl;0.5M  トリスHCl（pH7.2）;0.001M  EDTA〕を同じ時間含浸した新たな濾紙上に同様にして載せる。この溶液には３分間作用させ、中和溶液での処理をもう１回繰り返す。
濾紙を２×SSC〔0.3M  NaCl;0.03Mクエン酸ナトリウム）中に短時間浸漬し［Maniatis等,1982］、そして乾燥のためにホワットマンNo.3濾紙に載せ（コロニー上方）、そして風乾させる。DNAを固定するために、濾紙をサランフィルム〔ダウ・ケミカル・カンパニー〕に包み、そして紫外線（313nm）をUVトランスイルミネーター〔CAMAGレプロスター，スイス国ムッテンツ，カマーク〕により５分間照射する（コロニー下方）。
次に、予備ハイブリダイゼーションのために、濾紙を以下の組成の緩衝液と共に65℃で90分間保温する:2×SSC［Maniatis等,1982］＋１×デンハルト（Denhard）［Maniatis等,1982］＋0.5％SDS＋50μg/mlサケ精子DNA〔DNAナトリウム塩,III型，サーモン・テスツ由来；シグマ・ケミカル社，米国セントルイス〕（100℃で10分間の加熱により変性）。ハイブリダイゼーションのために、プラスミドpCT82/21〔実施例1.2参照〕からのニックトランスレーションにより標識された、前もって100℃で10分間の加熱により変性されている4.6KbDNA断片約２×105cpm/mlが添加される。
実際のハイブリダイゼーションは次に65℃、24時間行われる。
ハイブリダイゼーション後、フィルターをまず２×SSC中室温で15分間、次に２×SSC中60℃で15分間、さらに２×SSC＋0.1％SDS中60℃で30分間、そして最後に0.5×SSC中60℃で15分間洗浄する。次のオートラジオグラフィーはＸ線フィルム〔例えばフジRX（医療用Ｘ線フィルム）を用いて24時間行われる。
1.4 プラスミド単離およびサザンハイブリダイゼーションによるコスミド含有コロニーの分析
上記の方法により得られ、そしてコロニーハイブリダイゼーションにおいて強い信号を示すコスミドクローンをアガープレートからLB培地2ml中に移し、そして37℃で一晩保温する。これらの培養体の一部1mlを次にプラスミドDNAの単離のために使用する［Maniatis等,1982;368−369頁の記載に準拠］。
単離されたプラスミドを次にSal Iで消化し、そしてこのようにして得られる断片を0.8％トリス酢酸塩アガロースゲル〔１×TAE〕中1.2ボルト/cmで15時間分画する。ゲルを次に変性溶液〔1.5M  NaCl;0.5M  NaOH〕中で２×15分間、そして中和溶液〔1.5M  NaCl;0.5M  トリスHCl;1mM  EDTA  Na2（pH7.2）〕中２×15分間、室温でゆっくり揺動しながら処理する。次いでDNAをサザンキャピラリィブロッティング［Maniatis等,1982;383−386頁］により10倍濃度のSSC緩衝液を用いてニトロセルロース膜〔0.45μニトロセルロース；バイオ−ラド・ラボラトリーズ，米国リッチモンド〕に移し、そして該膜に真空下80℃で２時間固定する。
次のハイブリダイゼーションのために、フィルターをまず予備ハイブリダイゼーションのために以下の組成の緩衝液と共に65℃で120分間保温する:2×SSC［Maniatis等,1982］＋１×デンハルト［Maniatis等,1982］＋0.5％SDS＋50μg/mlサケ精子DNA（100℃で10分間の加熱により変性）。実際のハイブリダイゼーションのために、プラスミドp82/21〔実施例1.2参照〕からのニックトランスレーションにより標識された、前もって100℃で10分間の加熱により変性されている4.6KbDNA断片約８×106cpm/mlが添加される。ハイブリダイゼーションは次に65℃、36時間行われる。
ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×SSC＋0.1％SDS中55℃で20分間（２回）、そして0.2×SSC＋0.1％SDS中同温にて20分間洗浄する。次のオートラジオグラフィーはＸ線フィルム〔例えばフジRX（医療用Ｘ線フィルム）により48時間行われる。
オートラジオグラフにおいて1.8Kbの強いバンドを示すコスミド〔p98/1〕が次の作業のために選択される。
1.5 コスミドp98/1からの1.8Kb Sal I断片の大腸菌ベクターpBR322中へのサブクローニング
より大量のコスミドp98/1を調製するために、相当する大腸菌HB101/p98/1株〔実施例1.1参照〕20ml培養液をLB培地中で調製し、そして一晩保温する。ここで、この培養液〔15ml〕からコスミドp98/1のより大量のDNAを単離することが可能である［Maniatis等，（1982）;368−369頁参照］。
コスミドp98/1約３μｇをSal Iで完全に消化し、そしてこのようにして得られる断片を0.8％トリス酢酸塩アガロースゲル〔１×TAE〕上、1.2ボルト/cmで15時間の電気泳動により分画する。所望の1.8KbDNA断片を次に実施例1.2に記載の方法と同様にして電気溶離によりアガロースから取り出す。
このようにして得られる1.8Kb Sal I断片の試料30μｌを、予めSal Iで切断したプラスミドpBR322約0.05μｇと混合し、そしてエタノールで沈澱させ［Maniatis等,1982,461頁］、そして反応緩衝液〔製造会社により特定されている〕20μｌ中のT4DNAリガーゼ〔ドイツのベーリンガー・マンハイムから入手可能〕と約15℃で一晩連結させる。
引続き、得られた連結DNA〔５μｌ〕を、Maniatis等,1982,［250−251頁］に記載されるように受容性にされた大腸菌HB101株の細胞中でクローン化させ、そして50μg/mlアンピシリンを補足したLBアガー上にプレーティングする。
テトラサイクリン感受性コロニーが、50μg/mlアンピシリンまたは50μg/mlアンピリシンと20μg/mlテトラサイクリンを有するLBアガー上に得られる形質転換されたコロニーの分画スクリーニングにより見出され得、そしてそれらのプラスミドDNAは単離され得る［Maniatis等，（1982）;368−369頁の記載に準拠］。単離されたプラスミドDNAを次にSal Iで切断し、そして挿入断片の大きさのためのアガロースゲル電気泳動により、対照として同様に注入されたコスミドp98/1を用いて分析される。
所望の大きさの追加の断片を含むプラスミド〔p102/III2〕は上記の方法でゲルから単離され得る。追加の断片がコスミドp98/1からの1.8Kb Sal I断片であるということは、次に、サザントランスファー〔実施例1.4の記載に準拠〕およびストレプトマイセス・ビオラセオルベルからの4.6Kb BamH I DNAプローブとのハイブリダイゼーションで確認され得る。
1.6  プラスミドp108/III2の1.8Kb Sal I断片の0.78Kb Sal I/Bgl II二次断片の配列決定
配列決定のために、1.8Kb Sal I断片をまず実施例1.5に記載されたプラスミドp108/III2から単離する。このために、プラスミドp108/III2約２μｇをSal Iで完全に切断し、そして0.8％トリス酢酸塩アガロースゲル上、1.2ボルト/cmで15時間の電気溶離により分画する。1.8Kb Sal I断片を次に実施例1.5に記載の方法と同様にして電気泳動により単離する。
Sal I断片〔約0.3μｇ〕は次いでベクターM13mp18〔約0.02μｇ〕のSal I切断部位中に直接連結され得る。
これに対する別法として、Sal I断片はまた、Bgl IIでさらに切断され、そして２種のBgl II−Sal I二次断片〔２断片，全体で約0.3μｇ〕の形態でSal IおよびBamH Iで予め切断したベクターM13mp19〔約0.1μｇ〕中に連結されてもよい〔T4DNAでの連結は実施例1.5に記載されるように行われ得る〕。M13mp18およびM13mp19ベクターはGIBCO−BRL（スイス国バーゼル）から市販されて利用可能である。これらのベクター内へのクローニングおよび次の大腸菌JM101細胞のトランスフェクションはManiatis等（1989）〔4.35−4.38頁〕に記載の方法により行われ得る。
各々の場合において、このようにして得られた12の組換えファージプラーク（無色）はManiatis等〔4.25頁；（1989）〕に記載されるように単離され、そして大腸菌JM101中で複製される。正確な大きさの挿入断片に対する組換えファージの分析は同様に、ゲル電気泳動［Maniatis等〔4.39−4.40頁；（1989）〕を用いる公知方法により行われ得る。所望の挿入物を有するファージからの大量の一本鎖DNAが次いで単離される［Maniatis等〔4.29−4.30頁；（1989）〕。
DNA配列決定はSanger（1977）のジデオキシ法によるファマルシアからのT7配列決定キットを用いて行われ得る。このために、予め単離された一本鎖DNAが鋳型として使用される。全ての配列決定操作はキット内に収納されているユニバーサルプライマーおよび放射性標識のために使用される35SdATP（アマルシャム・インターナショナル；英国アマルシャム）を用いてファルマシアT7配列決定キットの指示書（1991指示書,No.xy−010−00−08）に従って行われる。このようにして得られる試料は次に変性ポリアクリルアミドゲル（６％）上での電気泳動により分画され、そしてＸ線フィルム〔コダックＸ−OmatS〕でのオートラジオグラフィーにより試験される。操作の詳細はManiatis等［13.45−13.58頁；（1989）］の指示に見出され得る。
２つのSal I−Bgl II二次断片の中央領域におけるDNA配列を決定するために、上で得られるDNA配列情報に基づいて４種のオリゴヌクレオチドが合成される。
オリゴヌクレオチドOli1およびOli2は5'に位置するSal I/Bgl II二次断片を配列決定するために次の配列決定戦略における配列決定用プライマーとして使用され得る。２種のオリゴヌクレオチドは以下の塩基配列を有する：
−5' TAC TGG TAT CGA AAC CT 3'（151−167）
＝  Oli1（配列番号:2）
−5' GAA GAC GAC GTG GTC TT 3'（642−626）
＝  Oli2（配列番号:3）
0.78Kb Sal I/Bgl II断片に対する配列決定戦略は以下のように模式的に示され得る：
0003613614.tif 000009
2.ソランギウム・セルロスム内へのコスミドp98/1のPvu I断片のサブクローニングおよび接合移入
実施例３に記載される遺伝子分断実験のために使用されるベクターpSUP2021はAmpR遺伝子内の単一Pvu I切断部位を有するので、Pvu I断片は以後サブクローニング工程および接合移入のために対応して使用される。
2.1  プラスミドpSUP2021へのコスミドp98/1のPvu I断片のサブクローニング
コスミドp98/1〔約４μｇ〕をPvu Iで完全に消化し、そして得られた断片を実施例1.5に記載の方法と同様にして0.8％トリス酢酸塩アガロースゲル〔１×TAE緩衝液〕上、1.2ボルト/cmで18時間の電気泳動により分画する（図２）。
十分に分離された断片〔約6.5Kb,約10Kbおよび4Kbと4.2Kbの画分〕が実施例1.5に記載の方法による電気溶離により単離され、そして各々をTE緩衝液40μｌ中に再懸濁する。４種の断片のこのようにして得られる試料の各々35μｌを、前もってPvu Iで切断したプラスミドpSUP2021［Simon R等,1983］約0.05μｇと混合し、そしてエタノールで沈澱させ［Maniatis等,1982,461頁に記載］、そして反応緩衝液20μｌ中のT4DNAリガーゼ〔ドイツ国マンハイムのベーリンガーから入手可能〕と約15℃で一晩連結させる。
Maniatis等（1982）に記載されるように感応性にされた大腸菌HB101細胞は、上記のリガーゼ反応から得られる３種のDNA試料各10μｌで形質転換され［Maniatis等,1982,250−251頁］、そして30μg/mlクロラムフェニコールを有するLBアガー上にプレーティングされる。このようにして形質転換されたコロニーの各々はそのアンピシリン感受性に対して試験される。アンピシリン感受性コロニーは引続き同定され、そしてプラスミドDNAを単離するための出発材料として使用される［Maniatis等，（1982）;368−369頁］。単離されたプラスミドは次にPvu Iで切断され、そしてアガロースゲル電気泳動により分析される。Pvu Iで切断されたコスミドp98/1が比較標準として使用される。所望の断片を含む３種のプラスミドをまとめて同定することもこの方法で可能である。約6.5Kbを含む断片を有するプラスミドはpSN105/7と命名される。約10Kbを含む断片を有するプラスミドはpSN120/10と命名される。4Kbと4.2Kbを含む断片を有するプラスミドはpSN120/43−49およびpSN120/46と命名され、それぞれ４および4.2Kbの大きさの断片を含む。
上記断片の正確な測定により以下のサイズであることが判明している：
0003613614.tif 000010
2.2  ソランギウム・セルロスム内への組換えプラスミドの接合移入
2.2.1  プラスミドpSN105/7,pSN120/10,pSN120/43−49およびpSN120/46の大腸菌内への形質転換
その調製および単離は実施例2.1に既に記載したプラスミドpSN105/7,pSN120/10,pSN120/43−49およびpSN120/46がヘルパープラスミドpUZ8［Hedges RW and Matthew M（1979）］を含む大腸菌ED8767株内に形質転換される。
プラスミドpUZ8は、広い宿主範囲を有し、そしてDatta等（1971）により記載されているプラスミドRP4の誘導体である。最初のプラスミドRP4との相違は、その両方が欠失されているアンピシリン耐性遺伝子および挿入要素IS21に実質的に関し、そして水銀イオンに対する耐性を付与する別の遺伝子の組み込みに関連する〔Jaoua等（1987）参照〕。
形質転換および次のテトラサイクリン〔10μg/ml〕およびクロラムフェニコール〔25μg/ml〕を補足したLBアガー上での24時間保温の後に得られるコロニーはアンピシリン含有〔60μg/ml〕および無アンピシリン培地上での並行プレーティングによる分画スクリーニングに供される。ソランギウムDNA断片の組み込みのためにアンピシリン耐性を失ったそれらのコロニーを続いて単離することが可能である。このようにして得られる培養体は次にソランギウム・セルロスム細胞中への組換えプラスミドの接合移入のための供与細胞として直接使用され得る。
2.2.2  接合移入
実際の移入のために、定常期にあるソランギウム・セルロスムSJ3培養液〔１−４×109細胞/ml〕15mlを、匹敵し得る数の細胞を含む大腸菌ED8767供与細胞の後期対数期にある培養液10mlと混合する。これらは次いで4000rpmで10分間一緒に遠心分離され、そしてG51bまたはG51t培地500μｌ中に再懸濁される。
大腸菌との接合の前に水浴中での短時間の熱処理にソランギウム受容細胞を暴露することが有用であることが証明されている。ソランギウム・セルロスムSJ3株との最良の移入結果は50℃の温度で10分間の熱処理で達成され得る。１−５×10-5の移入頻度が上記条件で達成され得るが、これは従来の熱処理なしの方法に比較して10倍の増加に相当する。
SolE固体培地を有するプレートへ移送し、30℃で２日間保温する。細胞を次に集め、G51bまたはG51t培地1ml中に再懸濁する。細菌懸濁液100μｌを、カナマインシ〔25mg/ml〕の他にフレオマイシン〔20ないし35mg/ml〕およびストレプトマイシン〔300mg/ml〕を選択剤として含有する選択性SolE培地上にプレーティングする。供与株〔大腸菌W3101（pME305）〕の逆選択はストレプトマイシンを用いて行われる。
30℃の温度で10ないし14日の保温期間の後、上記選択性SolE培地上で増殖したコロニーはプラスミドpSN105/7,pSN120/10,pSN120/43−49およびpSN120/46の接合移入により要求されるフレオマイシン耐性を獲得したソランギウム・セルロスムの接合完了体である。これらのフレオマイシン耐性コロニーは、次の分子生物学的研究のために使用され得る。ソランギウムに対するプラスミドDNAの移入の形質転換頻度はSJ3受容株に基づいて平均１−３×10-6である。
3.上で同定された断片の特徴づけ
3.1  コスミドp98.1の6.5Kb Pvu I断片中への1.8Kb Sal I断片の帰属
その調製および単離は実施例2.1に既に記載したプラスミドpSN105/7,pSN120/10,pSN120/43−49およびpSN120/46をSal IおよびPvu Iで完全に消化し、そして断片を実施例1.4におけるように0.8％トリス酢酸塩アガロースゲル上で分画し、サザンキャピラリィブロッティングによりニトロセルロース膜に移す。ハイブリダイゼーションはプローブとしてプラスミドp108/III2の1.8Kb Sal I断片を用いて実施例1.4に記載の条件下で行われ、最後のフィルターの洗浄工程を65℃（0.2×SSC＋0.1％SDS）で行う。
アガロースゲルおよびオートラジオグラフの評価により、クローンpSN105/7がその6.5Kb Pvu I断片中にプラスミドp108/112内にクローン化された1.8Kb断片と同一である1.8Kb Sal I断片を含むことが示される。
3.2  コスミドp98/1の6.5Kb Pvu I断片の制限切断部位による特徴づけ
プラスミドpSN105/7を実施例3.1に記載されるようにPvu Iで消化し、そしてこのようにして得られる２つの断片を0.8％トリス酢酸塩アガロースゲル〔１×TAE〕上で、1.2ボルト/cmで15時間分画する。大きさが6.5KbであるDNA断片を次に実施例1.2に記載の方法と同様にして電気溶離によりゲルから取り出し、そしてTE緩衝液30μｌ中に採取する。
6.5Kb Pvu I断片を制限切断部位により特徴づけるために、得られる6.5KbDNA断片をそれぞれ別個にBgl II、Sph IおよびSma Iで完全に消化し、そして得られる断片の大きさはトリス酢酸塩アガロースゲル〔１×TAE〕上での分画の後、決定される。このために、Hind III切断λDNA（GIBCO−BRL（スイス国バーゼルから入手可能）が同一ゲル上でのDNA断片の大きさの比較のための標準として使用される。個々の断片の相互の位置を明瞭にするために、6.5Kb断片はさらに、各々の場合において上記制限酵素の２種の全ての考えられる組合せで消化される。
Bgl IIでの消化により大きさが4.3Kbおよび2.3Kbの２種の断片が得られ、そしてSph Iでの消化により大きさが2.8Kb、1.5Kb、1.5Kbおよび0.7Kbの４種の断片が得られる。Sma Iでの消化により大きさが2.9Kb、2.0Kbおよび1.6Kbの３種の断片が得られる。この場合において、用いられる測定方法により、断片の実際の大きさは表記の値から＋／−10％程度異なる。コスミドp98/1の6.5Kb断片上のBgl IIおよびSph I切断部位の位置は図１に示されるように見出された断片の大きさに基づいて確立され得る。
4.機能試験
4.1  遺伝子分断後のソランギウム・セルロスムによるソラフェン産生に対するコスミドp98/1のPvu I断片の効果の分析
ソランギウム・セルロスムゲノム内の相当する部分と相同であるDNA部分を含むプラスミドの移入により、相同組換えを介する相同部位での染色体ソランギウム・セルロスムDNA内への上記DNA部分の組込みが行われる。
相同領域が遺伝子集団、例えばソラフェン生合成のための遺伝子集団内にあるならば、プラスミドの組込みはいわゆる遺伝子分断により当該集団の不活性化を導く。この方法は従って、ソランギウム・セルロスムにおけるクローン化DNA断片の機能の分析を可能にする。
コスミドp98/1のPvu I断片の機能を調べるために、十分に増殖した接合完了体コロニー〔実施例2.2.2参照〕が滅菌プラスチックループでマスタープレートから取り出され、そしてカナマインシ〔25mg/ml〕、フレオマイシン〔20−35mg/ml〕およびストレプトマイシン〔300mg/ml〕を選択剤として含有する選択性SolE培地上に縞状に塗布する。８−10日間の保温期間〔30℃〕の後、約１−２×109細胞を滅菌プラスチックループで取りだし、そしてＧ−55培地〔樹脂なし〕2ml中に移す。
30℃および180rpmでの３−４日間の保温の後、各試料1ml〔１×４×109細胞/ml〕をG55培地〔樹脂なし〕10mlを有するエルレンマイヤーフラスコ中に移す。同一条件下でさらに３−４日間の保温の後、別の移入が行われるが〔5ml;1−４×109細胞/ml〕、この場合は吸着剤樹脂、例えば登録商標アンバーライト（AMBERLITE）XAD−1180〔ローム・アンド・ハース・ドイチェランド・ゲーエムベーハー，ドイツ国フランクフルト〕をさらに含有するG55培地中で行われる。産生されたソラフェンの定量は30℃および180rpmで７日間の保温後に行われる。
ソラフェンの評価はHPLC分析により行われる。これは培養液のポリエステルフィルター［Sartorius,B 420−47−Ｎ］を介する吸引濾過をまず含む。フィルターに残留する樹脂を次にイソプロパノール50ml中に再懸濁し、そして30℃および180rpmで１時間抽出する。この懸濁液から1mlが除去され、そしてエッペンドルフ微量遠心管中12000rpmで遠心分離される。上清200μｌをイソプロパノール600μｌで希釈し、そしてその中に含有されるソラフェンの量をHPLCによりUV検出器を用いて測定する。検出波長210nmである。
全体で、pSN105/7プラスミドが組み込まれた35種の接合完了体、pSN120/10プラスミドが組み込まれた14種の接合完了体、pSN120/43−49プラスミドが組み込まれた18種の接合完了体およびpSN120/46プラスミドが組み込まれた８種の接合完了体が上記の方法で試験された。
この場合において、HPLC分析は、全ての接合完了体がもはやソラフェンを産生しないことを示した。これに対し、ソラフェンＡは陽性対照、SJ3受容株および組換えプラスミドpSJB55を有する接合完了体で50−100mg/mlの濃度で検出可能であった。
このことは、ソランギウム・セルロスム染色体DNA内に組み込まれた後、４種の全てのPvu I断片はソラフェン産生を明らかに阻害することを意味する。従って、これらの断片はソラフェン合成に直接的または間接的に関連する遺伝子の一部を含む。
5.「ソラフェン遺伝子集団」の同定
5.1  重複挿入物を有するコスミドクローンの単離
p98/1の挿入断片とで強いハイブリダイゼーション信号を生じるコロニーは1.3に記載した方法に従ってコロニーハイブリダイゼーションにより実施例1.1で製造したコスミド遺伝子バンクから選択される。p98/1の放射標識1.8Kb断片、または好ましくはp98/1のソランギウム部分におけるSal I断片の分散に基づいてp98/1の左側または右側フランキング領域に帰属され得る選択されたSal I断片のいずれかがハイブリダイゼーションプローブとして使用される。
5.2  新規コスミドのp98/1との重複の確認
3'または5'方向にp98/1からの挿入物と重複する断片を同定することがハイブリダイゼーション分析により可能である。これらは単離され、そして次のウォーキング工程のために使用される。
ハイブリダイゼーション分析は以下の特定の工程からなる：
プラスミドDNAが、上記の方法で強い信号を示す〔1.4と比較せよ〕コスミドクローンから実施例1.4に記載の方法により単離される。単離されたプラスミドを次にSal Iで、および並行してPvu Iで消化し、そしてこのようにして得られた断片をアガロースゲル上で分画し、次いでサザンキャピラリィブロッティング［Maniatis等,1982;383−386頁］によりニトロセルロース膜に移す。
新規コスミドクローンの重複のためのプローブとしての1.8Kb Sal I断片またはp98/1の挿入物のフランキング領域からのSal I断片とフィルターとのハイブリダイゼーションにより、確認され、そしてp98/1の挿入物の右側または左側への帰属が可能となる。ここに記載の方法は1.4に記載の方法に従って正確に行われ得る。
プラスミドp98/1および新規コスミドクローン内に見出された共通のSal IおよびPvu I断片の数は、挿入領域における重複の大きさについてのその他の情報を与える。適当であるならば、プラスミドp98/1からの挿入断片のさらに左側または右側にも位置しているソランギウム・セルロスム染色体の領域を有するその他のコスミドを単離することが可能である。このために、上記の方法はプローブとしてのp98/1挿入物に対する「右側」または「左側」コスミドのSal I断片を用いて繰り返される。
5.3  機能分析
上記の方法で同定された近接および重複DNA断片は実施例2.1−2.2.2に記載した「遺伝子分断（破壊）」の範囲内でソラフェン生合成におけるそれらの機能が試験される。新規コスミドでのウォーキング法は、ソラフェン産生に影響を及ぼさず、そして「ソラフェン遺伝子集団」の外側に位置している断片に達するまで続けられる。このようにしてコスミドp98/1からの挿入物を含む完全遺伝子集団の位置決定およびクローン化が可能である。
5.4  制限断片の地図作成
制限酵素地図の作成により、得られる制限断片の配列を確立し、それ故に、完全領域の正確な制限地図を構築することが可能である。これと並行して、個々の断片のDNA配列は実施例1.6に記載の方法により決定される。
寄託
本発明の範囲内の以下の微生物およびプラスミドはブダペスト条約に従って国際寄託機関として認められているドイツ国ブラウンスヴァイクにある「ドイチェ・ザンムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハー」に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関する要求を満たすために寄託された。
0003613614.tif 000011
培地および緩衝液
G51b培地（pH7.4）
グルコース                                 0.2％
デンプン                                   0.5％
〔ジャガイモデンプン,Noredux type;セレスタール・イタリア社（CERESTAR ITALIA S.p.a.），イタリア国ミラノ〕
ペプトン                                   0.2％
〔ディフコ・ラボラトリーズ（DIFCO Laboratories），アメリカ合衆国〕
プロビオンＳ                               0.1％
〔シングル・セル・プロテイン；ヘキスト社，ドイツ国フランクフルト〕
CaCl2×2H2O                               0.05％
MgSO4×7H2O                               0.05％
HEPES〔フルカ〕                           1.2 ％
G51t培地（pH7.4）
グルコース                                 0.2％
デンプン                                   0.5％
〔ジャガイモデンプン,Noredux type;セレスタール・イタリア社，イタリア国ミラノ〕
トリプトン                                 0.2％
〔マルコ（MARCO），アメリカ合衆国ニュージャージー州ハッケンサック〕
プロビオンＳ                               0.1％
〔シングル・セル・プロテイン；ヘキスト社，ドイツ国フランクフルト〕
CaCl2×2H2O                               0.05％
MgSO4×7H2O                               0.05％
HEPES〔フルカ〕                           1.2 ％
G52c培地（pH7.4）
グルコース                                2.0g/l
デンプン                                  8.0g/l
〔ジャガイモデンプン,Noredux type;セレスタール・イタリア社，イタリア国ミラノ〕
脱脂大豆粉                                2.0g/l
〔ムセドラ社（MUCEDOLA S.r.l），イタリア国セッチモ・ミラネッセ〕
イーストエキス                            2.0g/l
〔フォールド・アンド・スプリンガー（FOULD ＆ SPRINGER），フランス国メゾン・アルフォ〕
CaCl2×2H2O                               1.0g/l
MgSO4×7H2O                               1.0g/l
Fe−EDTA〔8g/l貯蔵液〕                    1.0ml
HEPES〔フルカ〕                           2.0g/l
蒸留水                        全体を1000mlとする
pHは殺菌〔120℃で20分〕前にNaOHで7.4に調整される。殺菌後のpH:7.4
培地:G−55    培地50mlを有する200mlフラスコ
デンプン                                  8.0g/l
〔ジャガイモデンプン,Noredux type;セレスタール・イタリア社（CERESTAR ITALIA S.p.a.），イタリア国ミラノ〕
ジャガイモ由来のデキストリン              8.0g/l
〔ブラットマン（Blttmann），スイス国ベーデンビルから供給される〕
グルコース                                2.0g/l
脱脂大豆粉                                2.0g/l
〔ムセドラ社（MUCEDOLA S.r.l），イタリア国セッチモ・ミラネッセ〕
イーストエキス                            2.0g/l
〔フォールド・アンド・スプリンガー（FOULD ＆ SPRINGER），フランス国メゾン・アルフォ〕
DL−アスパラギン酸（C4H7NO7）             1.0g/l
CaCl2×2H2O                               1.0g/l
MgSO4×7H2O                               1.0g/l
HEPES〔フルカNo.54461〕                  12.0g/l
Fe−EDTA〔8g/l貯蔵液〕                    1.0g/l
MZM1（樹脂）                            50.0ml/l
水道水                        全体を1000mlとする
殺菌前のpH:NaOHで7.4に調整
殺菌後のpH:7.4−7.5
接種：十分に増殖した培養液5ml〔約１−４×109細胞/ml〕
SolE培地（pH7.4）
グルコース＊                              0.35％
トリプトン                                0.05％
〔マルコ，アメリカ合衆国ニュージャージー州ハッケンサック〕
MgSO4×7H2O                               0.15％
硫酸アンモニウム＊                        0.05％
CaCl2×2H2O＊                              0.1％
K2HPO4＊                                 0.006％
硫酸ジチオニット＊                        0.01％
Fe−EDTA＊                              0.0008％
HEPES〔フルカ〕                            1.2％
殺菌された定常期のソランギウム・セルロスム培養液上澄み＊                              3.5％（v/v）
寒天                                       1.5％
＊添加は殺菌後に行う
pHは殺菌〔120℃で20分〕前にNaOHで7.4に調整される。
LB培地
トリプトン                               10.0g/l
イーストエキス                            5.0g/l
NaCl                                      5.0g/l
STE緩衝液（pH8.0）
シュークロス                                25％
EDTA  Na2                                    1mM
トリスHCl                                   10mM
PLM緩衝液（pH7.6）
SDS                                         ５％
EDTA  Na2                                  125mM
トリスHCl                                  0.5mM
TER緩衝液
トリスHCl（pH8.0）                          10mM
EDTA  Na2                                    1mM
RNアーゼ                                10μg/ml
連結緩衝液
MgCl2                                       0.1M
トリスHCl（pH7.8）                          0.5M
溶菌緩衝液（pH7.6）
Na−サルコシル                              ５％
Na2−EDTA                                  125mM
トリスHCl                                   0.5M
TE緩衝液
トリスHCl（pH8.0）                          10mM
Na2EDTA                                      1mM
0003613614.tif 000012
0003613614.tif 000013
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：チバ−ガイギー  アクチエンゲゼルシヤフト
（Ｂ）通り：クリベックシュトラーセ  141
（Ｃ）都市：バーゼル
（Ｅ）国  ：スイス
（Ｆ）郵便番号:4002
（Ｇ）電話番号：＋41  61  69  11  11
（Ｈ）ファクシミリ番号：＋41  61  696  79  76
（Ｉ）テレックス番号:962  991
（ii）発明の名称：粘液細菌による二次代謝産物生合成に関連するDNA配列
（iii）配列の数:3
（iv）コンピュータの読み取り可能な形式：
（Ａ）媒体の形式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM  PCコンパチブル
（Ｃ）使用したOS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウエア:PateniIn  Release  ＃1.0,Version  ＃1.25（EPO）
（２）配列番号:1に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:784
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（vi）起源：
（Ａ）生物名：ソランギウム・セルロスム
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名：コスミドクローンp98/1
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..784
（Ｃ）他の情報:/遺伝子産物＝「ソラフェン遺伝子集団」の構成要素
（xi）配列の表示：配列番号:1:
0003613614.tif 000014
（２）配列番号:2に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:17
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..17
（Ｃ）他の情報:/遺伝子産物＝「合成オリゴ」  ／表示＝Oli1
（xi）配列の表示：配列番号:2:
0003613614.tif 000015
（２）配列番号:3に対する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:17
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（ゲノム）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..17
（Ｃ）他の情報:/遺伝子産物＝「合成オリゴ」  ／表示＝Oli2
（xi）配列の表示：配列番号:3:
0003613614.tif 000016
【図１】
0003613614.tif 000019
【図２】
0003613614.tif 000020