(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の抗原に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集させるに当たり、不溶性担体として平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの範囲にあり、かつ、平均粒径の異なる２種以上の担体を用い、これら不溶性担体に各モノクローナル抗体をそれぞれ担持させることを特徴とする高感度免疫測定法。
【請求項２】
不溶性担体がラテックス粒子であることを特徴とする請求項１記載の測定法。
【請求項３】
平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの範囲にある２種以上の不溶性担体を、最小粒子種の平均粒径に対する他の粒子種の平均粒径の比が３〜６の範囲になるように組み合わせて使用することを特徴とする請求項１又は２記載の測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の抗原に対するモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で該抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集反応させる高感度免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病院、検査センター等においては、省力化、コスト削減、多量検体処理等の要請から、臨床検査等の諸検査の自動化、および測定時間の短縮化が図られてきた。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定性ないし定量する凝集法が知られている（特公昭５８−１１５７５号公報参照）。
【０００３】
この凝集法は、被検試料中における抗原性物質を測定するに当たり、該被検試料と、該抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させた不溶性担体とを反応させ、不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量するものである。この場合、上記抗体としては、通常、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が適宜選択される。モノクローナル抗体は抗原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、該抗原性物質は多価抗原である場合でも特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、上記抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合は、その抗原は、特定のモノクローナル抗体に対応するエピトープに関しては、一価抗原となる可能性が高くなる。測定の対象とする抗原物質が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された１種類のモノクローナル抗体と被検試料中の該抗原性物質とが反応もしくは結合しても、通常、凝集は起こらない。このため、凝集の起こり易さという観点から、通常、ポリクローナル抗体が多用されている。
【０００４】
しかしながら、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較してみれば、抗原に対する特異性の点では、モノクローナル抗体の方が断然優れている。また、ポリクローナル抗体は動物の個体差や採血の時期により異なるため、常に同じ品質のものを得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での該抗体の量および活性損失も大きい。これに対し、モノクローナル抗体は品質の一定した抗体を大量生産するのに向いている。
【０００５】
このような点を考慮して、特定の抗原に対する異なる２種または３種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、該抗原と反応させて、不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量する方法が提案されている（特公平３−４０３４１号公報参照）。
【０００６】
また、近年、免疫診断では尿、血清、血漿等に含まれる微量物質、たとえば癌マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）や、カルテイノエンブリオイックアンテイジエン（ＣＥＡ）などは１ｎｇ／ｍｌといった低濃度まで定量することが望まれている。このような物質を測定するために、平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合することによって低濃度から高濃度までの広範囲濃度の抗原又は抗体の測定を可能にする方法も提案されている（特開昭６３−６５３６９号公報参照）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、すべてのモノクローナル抗体を同一平均粒径の不溶性担体に担持させる方法では、不溶性担体による立体的障害のために、抗体と測定しようとする抗原物質との間の抗原抗体反応およびそれに続く凝集反応が阻害される可能性がある。すなわち、抗原性物質が、１種類のモノクローナル抗体と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体とに同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じるわけであるが、すべてのモノクローナル抗体が不溶性担体に担持されていると、２種のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に互いに近接した部位にある場合、不溶性担体間の立体的障害によって、異なる２種または３種のモノクローナル抗体が１つの抗原物質に対し同時に結合することが阻害される場合がある。また、この２種あるいは３種のモノクローナル抗体の間で抗原と抗原との親和定数が大きく乖離している場合も上記と同様に該親和定数の高いモノクローナル抗体が優先的に抗原と結合し、他のモノクローナル抗体との結合およびそれに続く凝集を阻害する場合がある。これらの理由により、モノクローナル抗体を同一平均粒径の不溶性担体に担持させる方法では、抗原性物質を正確に定量できない可能性がある。
【０００８】
特開昭６３−６５３６９号公報は、上述したように、低濃度の抗原物質の検出を実現するために、平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合する方法を開示しているが、この方法で用いられている抗体はポリクローナル抗体であり、かつこの公報記載の発明は抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させることを企図したものである。従って低濃度での反応量は増大するが、同時にバックグラウンドおよび抗原物質以外の物質に由来する非特異凝集が多いという欠点がある。
【０００９】
本発明の目的は、上記のごとき実情に鑑み、不溶性担体の立体的障害による凝集阻害がなく、非特異凝集を惹起することなく、抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させることができ、その結果、抗原性物質を正確に定量できる高感度免疫測定法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明による高感度免疫測定法は、特定の抗原に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集させるに当たり、不溶性担体として平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの範囲にあり、かつ、平均粒径の異なる２種以上の担体を用い、これら不溶性担体に各モノクローナル抗体をそれぞれ担持させることを特徴とする方法である。
【００１１】
本発明により検出するのに適した抗原性物質は、生体試料中に含まれる生理活性物質で、かつ該抗原性物質に対応するモノクローナル抗体の作成ないし入手が可能である限り特に限定されないが、一価の抗原でかつ１種類のモノクローナル抗体では検出不可能なものが特に望ましい。また、抗原性物質を検出する試験項目としては、臨床検査上重要な項目であり、かつ従来の凝集法では検出感度が不足であるとされていた項目が特に有用である。
【００１２】
例えば、癌検診のスクリーニングにおいて測定される、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９などの１ｎｇ／ｍｌまで検出感度が要求される項目などである。
【００１３】
本発明で使用するモノクローナル抗体は特定の抗原に対する異なる２種以上（例えば２種または３種、好ましくは２種）のモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、またそれらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して産生、取得することができる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」岩崎辰夫ら著、講談社）。
【００１４】
細胞融合の一態様によれば、ある特定の完全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシなどの動物に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するといった手法を用いて投与し、該動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免疫マウスの該抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞および／または末梢血細胞などの細胞を採取し、該細胞と自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に有しない適当な株化細胞、例えばマウス骨髄腫（ミエローマ）株化細胞とを、それ自体公知の手法により細胞融合処理する。
【００１５】
モノクローナル抗体を得るためのミエローマ細胞と抗体産生細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意の組み合わせでよい。
【００１６】
使用されるミエローマ細胞は特に限定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞体を使用することができる。好ましい株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなものである。通常用いられるものは、８−アザグアニジン抵抗性の株化細胞で、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない性質を有している。さらに使用する株化細胞は「非分泌型」のものであることが好ましい。例えばマウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ3 ／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ1 （Ｐ3 Ｕ1 ）、Ｐ3 ／Ｘ６３−Ａｇ８・６・５・３、Ｐ3 ／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・３などが好適に用いられる。
【００１７】
該細胞融合処理は、例えば、通常イーグル最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地中で上記免疫マウスの脾細胞１×１０8 〜５×１０8 個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１×１０7 〜５×１０7 個とを、混合して行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましく、他の融合促進剤、例えば、ポリビニルアルコール、ウイルスなども使用することができる。ＰＥＧの使用濃度は好ましくは約３０〜５０％である。
【００１８】
上述のようにして得ることのできる融合細胞含有系から融合細胞を、それ自体公知の手法を利用して、選別処理、抗体活性スクリーニング処理およびクローニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能を持つ融合細胞株を取得することができる。
【００１９】
上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプレートに１０5 〜１０6 個／ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地（例えばＨＡＴ培地）を加え、以後選択培地交換を行いながら、５％ＣＯ2 培養器（３７℃）で培養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので試験管内（in vitro）培養では長期間生育できない。したがって培養後１０〜１４日ぐらいから生育してくる細胞はすべて融合細胞である。
【００２０】
上述のようにして得ることのできる融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理およびクローニング処理は、例えば以下のようにして常法により行うことができる。
【００２１】
融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索することができる。すなわち、 125Ｉ、 131Ｉなどのラジオアイソトープあるいは酵素などで標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在および結合能を検索することができる。
【００２２】
目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には２種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【００２３】
上述のようにして得ることのできるモノクローナル抗体産生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得するには、該モノクローナル抗体産生細胞株を、例えば適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に該細胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法など、それ自体公知の手法を利用することができる。
【００２４】
上記前者の方法によれば、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培養液で培養し、その培養上清液を硫安分画や、抗原を結合させたセファロース４Ｂなどのアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することにより目的とするモノクローナル抗体を採取することができる。
【００２５】
また、上記後者の方法によれば、例えば、同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、融合細胞を腹腔内投与することにより生体内（in vivo ）で融合細胞を大量に増殖させる。その結果、形成される腹水には高濃度のモノクローナル抗体が含まれている。この腹水から硫安分画および必要に応じて前記アフィニティークロマトグラフィーなどにより、目的とするモノクローナル抗体を取得することができる。
【００２６】
上述のようにして取得できるようなモノクローナル抗体は市販品として入手することも可能であり、本発明方法に利用できる。
【００２７】
本発明で使用する不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応および凝集阻止反応において一般的に用いられている微粒子の担体を使用することができる。
【００２８】
このような不溶性担体としては、工業的に大量生産可能な有機系微粒子が好ましいが、これに限定されるものではない。工業的に大量生産可能な有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステルなどのビニル系モノマーの単独重合体および／または共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体などのブタジエン系共重合体などの微粒子、および官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基、またはカルボアミノ基（−ＣＯＮＨ2 ）、水酸基、アルデヒド基などを有し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられる。抗体の吸着性に優れており、かつ生物学的活性を長期間安定に保持できるなどの理由から、特にポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００２９】
そのほか、動物の赤血球や細菌の細胞などの生物学的粒子、ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末など非生物学的粒子が挙げられる。
【００３０】
本発明で使用する不溶性担体の平均粒径は、不溶性担体上の抗体と、測定対象となる抗原物質の抗原抗体反応により惹起される凝集反応の結果生じた凝集塊が肉眼または光学的に検出できるに充分な大きさを呈するものであればよい。特に、平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの範囲にある２種以上の不溶性担体（好ましくはラテックス粒子）を、最小粒子種（２種以上の不溶性担体のうち最も平均粒径の小さいもの）の平均粒径に対する他の粒子種（２種以上の不溶性担体のうち上記最小粒子種以外の１または２以上のもの）の平均粒径の比が３〜６の範囲になるように組み合わせて使用することが好ましい。
【００３１】
２種の不溶性担体を混合する際、その容量の比は１：１０〜１０：１の範囲で、測定対象物質の必要な検出下限に合わせて適宜選択される。３種以上の不溶性担体を混合する際にも上記と同様に混合比を決定すればよい。
【００３２】
上記不溶性担体の表面にモノクローナル抗体を感作させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、このような感作手法として不溶性担体表面にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる手法や、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結合法や共有結合法により、モノクローナル抗体を効率的に感作する手法が挙げられる。
【００３３】
抗体を担持させた不溶性担体と、抗原との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応であり、該反応が起こりうる条件であれば、その反応条件は特に限定されないが、反応温度は恒温、特に２５℃〜３７℃の範囲内の恒温であることが好ましい。反応時間についても特に限定されないが、５秒〜１５分が好ましい。
【００３４】
反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であればどのようなものでもよいが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。反応液のｐＨは、好ましくは５．５〜８．５、特に好ましくは６．５〜８．０である。上記反応液に、安定剤として牛血清アルブミン、ショ糖、または感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストランなどの水溶性多糖類、防腐剤としてアジ化ナトリウム、および塩濃度調整のために塩化ナトリウム等の添加剤を適宜溶解させてもよい。
【００３５】
不溶性担体の凝集の程度を測定する方法は、特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、上記結合物の凝集の程度を目視によって判定することも可能である。該凝集を定量的に測定する場合、簡便性及び精度の点からは、例えば光学的に測定することが望ましい。
【００３６】
凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないし平均粒径の変化としてとらえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。
【００３７】
これらのそれぞれの測定法について、速度試験（レートアッセイ；異なる時点で少なくとも２つの測定値を得て、これらの時点間における該測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める）と、終点試験（エンドポイントアッセイ；ある時点（通常は、反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める）が利用可能である。測定の簡便さ、迅速性の点からは、比濁法を用いた速度試験を行うことが望ましい。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００３９】
実施例および比較例で用いた試薬および材料は、下記の通りである。
【００４０】
１）試薬および材料
下記の試薬および材料を用意ないしは調製した。
【００４１】
抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体：
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７、ＩｇＧ−１、ＤＡＫＯ社製、およびClone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１、ＩｇＧ−１、ＤＡＫＯ社製）を用いた。
【００４２】
ラテックス：
平均粒径０．０８７μｍ、０．１２０μｍ、、０．２１０μｍ０．４００μｍ、０．４６４μｍのポリスチレン粒子をそれぞれ含む５種のラテックス（いずれも固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学社製）を用いた。
【００４３】
ラテックス希釈用緩衝液：
５０ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 と５０ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4 をｐＨ７．５０になるように混合し、得られた混合物をラテックス希釈用緩衝液として用いた。
【００４４】
抗体希釈用緩衝液：
上記ラテックス希釈用緩衝液を抗体希釈用緩衝液としても用いた。
【００４５】
ブロッキング用緩衝液：
１００ｍＭ  Ｎａ2 ＨＰＯ4 と１００ｍＭ  ＮａＨ2 ＰＯ4 をｐＨ７．４０になるように混合し、得られた混合物にウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin、Fraction V、Reagent Grade 、Miles Corp. 社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ3 （試薬特級、ナカライテスク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、ブロッキング用緩衝液として用いた。
【００４６】
ＣＥＡ標準品：
ＣＥＡ標準品（ダイナボット社製、ＣＥＡ・リアビーズキット添付品）の０、５、２０、１００、５００ｎｇ／ｍｌをそのまま用いた。
【００４７】
検体希釈用希釈液（Ｒ１液）：
ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６，０００（平均分子量７，５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【００４８】
実施例１
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
平均粒径０．０８７μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス希釈用緩衝液９容を添加してラテックスを希釈し、１．０％ラテックス液とした。抗ＣＥＡ抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７）は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作用の抗体液とした。１．０％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液６００μｌを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、これに抗体液１２００μｌを素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を３．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液を４．０ｍｌ添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を１．８ｍｌ添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行った。これにさらにブロッキング用緩衝液を１．８ｍｌ添加し、固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［１］とした。このようにして調製したＣＥＡ測定用試薬［１］は４℃にて保存した。
【００４９】
また、不溶性担体液として、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ））を用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１、ＩｇＧ−１）をタンパク濃度が１２．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［２］を得、４℃にて保存した。
【００５０】
(2) ＣＥＡ量の測定
ＣＥＡ量の測定は、生化学用自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行った。上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［１］および［２］を等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りである。
【００５１】
検体容量                      ２０μｌ
検体希釈用希釈液（Ｒ１液）    ２１０μｌ
試薬（Ｒ２液）                ３０μｌ
測定波長                    ５７０ｎｍ
測定温度                      ３７℃
【００５２】
測定系に試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）を測定し、この吸光度の差を１０，０００倍したものを吸光度変化量とした。検体として既知濃度のＣＥＡ標準品を用いて測定を行い、検量線を作成した。
【００５３】
比較例１（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［１］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００５４】
比較例２（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００５５】
試験結果
実施例１および比較例１、２で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表１および図１に示す。
【００５６】
【表１】
0003652029.tif 000002
【００５７】
表１および図１から明らかなように、本発明の方法による実施例１の測定値から作成された検量線は、ＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬による比較例１、２の検量線は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなかった。
【００５８】
これは、実施例１では、２種のモノクローナル抗原を異なる平均粒径の不溶性担体に担持させてなるラテックス試薬を用いたため、比較例で用いた同一平均粒径のものよりもラテックス粒子間の立体障害が解消され、抗原抗体反応およびそれに続く凝集反応が促進されたためと推察される。
【００５９】
以上の結果から、本発明によるＣＥＡ定量法は、従来のラテックス凝集免疫試薬よりも高感度で優れた定量法であることが確認された。
【００６０】
実施例２
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
不溶性担体液として、平均粒径０．１２０μｍおよび０．４００μｍの２種のポリスチレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が４８．３μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したもの、および、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１をタンパク濃度が１４．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものをそれぞれ用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［３］および［４］を得、４℃にて保存した。
【００６１】
(2) ＣＥＡ量の測定
上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［３］および［４］を等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００６２】
比較例３（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［３］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例２と同じ操作を行った。
【００６３】
比較例４（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［４］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例２と同じ操作を行った。
【００６４】
試験結果
実施例２および比較例３、４で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表２および図２に示す。
【００６５】
【表２】
0003652029.tif 000003
【００６６】
表２および図２から明らかなように、本発明の方法による実施例２の測定値から作成された検量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬による比較例３、４の検量線は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなかった。
【００６７】
実施例３
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［１］と、実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［４］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００６８】
実施例４
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］と、実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［３］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００６９】
試験結果
実施例３、４で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表３および図３に示す。
【００７０】
【表３】
0003652029.tif 000004
【００７１】
表３および図３から明らかなように、本発明の方法による実施例３、４の測定値から作成された検量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示した。
【００７２】
実施例５
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
不溶性担体液として、平均粒径０．２１０μｍのポリスチレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が２７．６μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点では実施例１のＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［５］を得、４℃にて保存した。
【００７３】
(2) ＣＥＡ量の測定
上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［５］と、実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００７４】
比較例５（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
不溶性担体液として、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が１２．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［６］を得、４℃にて保存した。
【００７５】
(2) ＣＥＡ量の測定
上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［６］と、実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００７６】
試験結果
実施例５および比較例５で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表４および図３に示す。
【００７７】
【表４】
0003652029.tif 000005
【００７８】
表４および図３から明らかなように、本発明の方法による実施例５の測定値から作成された検量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬による比較例５の検量線は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなかった。
【００７９】
【発明の効果】
本発明による免疫測定法は以上の如く構成されているので、従来のラテックス凝集免疫試薬で見られたような不溶性担体の立体的障害による凝集阻害がなく、かつ非特異凝集を惹起することがなく、抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させることができる。その結果、抗原性物質を正確に定量することができ、低濃度域でも高い検出感度を示すことができる。特に、２種以上のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に互いに近接していたり、または抗原物質の分子量が小さく、同一平均粒径の不溶性担体では凝集反応が生じ難い場合に、より一層その効果が発揮される。したがって、本発明による測定法は、被検試料中の抗原性物質を正確に定量することを可能にし、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度変化量の相関、および比較例１、２に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図２】実施例２に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度変化量の相関、および比較例３、４に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図３】実施例３、４および５に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度変化量の相関、および比較例５に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図１】
0003652029.tif 000006
【図２】
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【図３】
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