(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるロイシンアミノペプチダーゼの製造法であって、アスペルギルス・ソーヤ（ＴＦＬＷ２２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３４８）を培地に培養し、培養物からロイシンアミノペプチダーゼを採取することを含む方法。
【請求項２】
アスペルギルス・ソーヤ（ＴＦＬＷ２２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３４８）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びロイシンアミノペプチダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ロイシンアミノペプチダーゼは、タンパク質の部分加水分解物に作用して、アミノ末端のペプタイド結合を分解する加水分解酵素であって、調味料等の食品の製造において重要な役割を果たしている。中でも、糸状菌由来のものは調味料生産に適した反応性を示すことから、その重要性は大きい。
しかしながら、従来、糸状菌由来のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の構造については全く未知であり、また、該遺伝子の単離すらされていないのが実状である。
このロイシンアミノペプチダーゼは、調味料等の食品の製造等に用いることができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子による形質転換体を取得するとともに、該形質転換体を培養することによるロイシンアミノペプチダーゼの製造法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を単離することに成功し、更に、該遺伝子による形質転換体を作成し、形質転換体によりロイシンアミノペプチダーゼを効率良く製造する方法を確立し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の(ａ)または(ｂ)のタンパク質をコードするロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子である。
(ａ)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(ｂ)アミノ酸配列(ａ)において1もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
【０００５】
更に、本発明は、以下の(ａ)または(ｂ)のＤＮＡからなるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子。
(ａ)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
(ｂ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
更に本発明は、前記のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする組み換え体ＤＮＡである。
更に、本発明は、前記のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡにより形質転換された形質転換体である。
更に、本発明は、前記の組み換え体ＤＮＡにより形質転換された形質転換体である。
更に、本発明は、前記の形質転換体を培地に培養し、培養物からロイシンアミノペプチダーゼを採取することを特徴とするロイシンアミノペプチダーゼの製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定は、例えば、以下の3種の方法で行なうことができる。
［測定法１］ロイシル−グリシル−グリシン（Leu-Gly-Gly）を基質として用いる測定法
この方法は、酵素液中に遊離のアミノ酸が多量に存在するとバックグラウンド値が高くなり、不正確になるので、その場合には透析や、セントリコン(アミコン社製)等のスピンカラムによりアミノ酸を除去した酵素液を使用する必要がある。
【０００７】
先ず、以下の各溶液を調製する。
A液：1.05mM Leu-Gly-Gly溶液(25mM HEPES, pH8.0)…反応時の基質濃度1mM
B液：0.4%(W/V) トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）水溶液
C液：5%(W/V) Na2B4O7・10H2O水溶液
D液：100mM CuSO4水溶液
E液：1検体当たり250 μlのB液、975 μlのC液と25μl のD液を混合する
【０００８】
（用時調製）
次いで、1検体あたり2本の微量遠沈管に夫々25μl の酵素溶液を入れる。一方の遠沈管を盲検用として、100℃で5分間煮沸し、酵素を失活させる。夫々の遠沈管に30℃のA液を475 μl加え、撹拌した後30℃で10〜60分間酵素反応を行なう。100℃で5分間煮沸して反応を止め、37℃のE液を625 μl加えて撹拌し、37℃で25分間保温後、420nmの吸光度を測定する。1分間に1μmolのLeu-Gly-Glyを遊離する活性を１単位とすると、活性は、次の式で表される。
活性(単位/ml)＝(ΔOD×0.125×1000)÷(25×T)
［ただし、ΔODは、試料のODから盲検のOD値を引いたもの、Tは、反応時間（分）］
【０００９】
［測定法２］L-ロイシン-p-ニトロアニリド(Leu-pNA)を基質として用いる測定法
先ず、以下の各溶液を調製する。
A液：0.1mmolのLeu-pNAを5mlのエタノールに溶解させる。ここに、10mlの500mMトリスバッファー(pH8.5)と85mlの蒸留水を加え、100mlの1mM Leu-pNA溶液とする。
B液：0.1規定塩酸
次いで、30μl の酵素溶液を入れた微量遠沈管及び盲検用の空の微量遠沈管に300 μlのA液を加え、撹拌した後、30℃で10〜60分間酵素反応を行なう。900 μl のB液を加え、撹拌し、酵素反応を停止させる。盲検用の遠沈管に30μl の酵素溶液を加え、撹拌する。400nmの吸光度を測定する。1分間に1μmolのLeu-pNAを遊離する活性を１単位とすると、活性は、次の式で表される。
活性(単位/ml)＝(ΔOD×0.69×1000)÷(30×T)
［ただし、ΔODは、試料のODから盲検のOD値を引いたもの、Tは、反応時間（分）］
【００１０】
［測定法３］多数の菌株のロイシンアミノペプチダーゼ産生能を検定するための簡便な活性測定法
試薬は、［測定法２］のA液及びB液を使用する。
糸状菌、例えば、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子約1000個を含む滅菌蒸留水または0.01%(W/V)Tween-20水溶液10μl を(盲検として、胞子を含まないものについても同時に行なう)、大豆粉寒天培地［3%(W/V)加熱・加圧膨化処理した脱脂大豆粉末、1%(W/V) KH2PO4、1.5%寒天末、pH6.0］上に置いた厚手・8mmφのペーパーディスク(東洋濾紙社製)に滴下し、30℃で胞子を形成し出すまで（麹菌の場合48時間程度）培養する。菌体の付着したペーパーディスクを直径10mm以上の試験管に移し、30℃のA液600 μlを加え、激しく撹拌した後30℃で7〜30分間程度酵素反応を行なう。B液を600 μl加え、激しく撹拌し、400nmにおける吸光度を測定する。盲検値の吸光度を引いたものを任意単位の活性とした。ただし、この方法は、結果のばらつきが大きいので、1つの菌株につき3試験以上を並行して行なうことが望ましい。また、比較したいもの同士は同時に測定する必要がある。糸状菌以外の生物を用いる場合には、細胞数・培地組成・培養時間を適宜変更することにより同様にして測定することができる。
【００１１】
本発明の遺伝子のドナーとしては、例えば、アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM BP-6349)等が挙げられる。
次いで、上記微生物を通常の糸状菌の培養方法( 以下、特開昭48-35094号公報記載の方法と言う) で培養し、ロイシンアミノペプチダーゼを精製することにより、ロイシンアミノペプチダーゼを得ることができる。
得られたロイシンアミノペプチダーゼを、変性条件下でリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製)処理し、断片化する。上記断片を、例えば、POROS R2/Hプレパックドカラム（ベーリンガー・マンハイム社製）等を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分取し、数種の断片ペプタイドについてアミノ酸配列を、例えば、ABI470Aプロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いて決定する。
【００１２】
上記アミノ酸配列をもとに、PCRプライマーを作成する。この際、コドンの縮重を考慮した混合プライマーを用いる。また、4種の塩基全てが縮重している個所については、イノシンを使用することができる。作成されたプライマーを用いて、遺伝子のドナー、例えば、アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM BP-6349)の染色体DNAを鋳型としたPCRを行なう。アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM BP-6349)の染色体DNAは、例えば、ジョアン・ティルバーン(Joan Tilburn)等：ジーン(Gene)、26、205-221(1983)の方法で得ることができる。PCRは、例えば、Robocycler Gradient(ストラタ・ジーン社製)を用いてアニーリング温度を検討する。PCRには、例えば、Ex Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製)を用いる。増幅されたDNA断片を、ベクターDNA、例えば、pGEM-T Easyプラスミド(プロメガ社製)等に組み込み、組み換え体プラスミドを得る。該プラスミド中の挿入DNAの塩基配列を、例えば、Model4200 DNAシーケンサー(LI-COR社製) 等を用いて決定し、PCRのプライマー設計に用いたペプタイドのアミノ酸配列を正しくコードする塩基配列を両端に有するものを選択する。
【００１３】
上記DNA断片を標識し、プラーク・ハイブリダイゼーションによりアスペルギルス・ソーヤの染色体断片を含むファージ・ライブラリーから、目的遺伝子を含むクローンを単離する。ファージ・ライブラリーの作成は、例えば、STRATA GENE社のZAP Express Vector Kitを用いて行なうことができる。DNA断片の標識と、ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、DIG DNA標識・検出システム（ベーリンガー・マンハイム社製）等を用いて行なうことができる。
【００１４】
単離されたファージ・クローンから、キットに記載の方法でプラスミドを調製する。プラスミド数種について、各種制限酵素により断片化し、制限酵素地図を作成する。制限酵素地図をもとに、挿入断片の一部ずつを持つサブクローンプラスミドを調製する。サブクローンプラスミドについて、前述の方法で塩基配列を決定する。得られた塩基配列を解析し、配列番号２で示される塩基配列を決定し、次いでこの遺伝子によってコードされるポリペプタイドのアミノ酸配列、即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列を決定することができる。
【００１５】
そして、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数、好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を得るには、公知の多くの方法を用いることができる。例えば、遺伝子に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
これらのDNAは、ロイシンアミノペプチダーゼ活性をもたらすポリペプタイドをコードしている蓋然性が高く、下記のように形質転換し活性を持つものを選択することができる。
【００１６】
本発明のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子と実質的に同一な遺伝子を取得するためには、配列番号２の塩基配列を持つDNA又はその相補鎖、又はそれらの一部を含むプローブによりストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションし、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を持つポリペプタイドをコードするものを選択することができる。ここでいう、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件である。この様な条件は、個々の生物種により若干異なるが、常法によりハイブリダイゼーションと洗いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみで容易に決定することができる。このような条件としては、例えば、後記実施例１の項目６において特異的なシグナルが観察できることから、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V) N-ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行ない、洗いは、0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2 回行なう。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、45℃以上、好ましくは52℃以上、更に好ましくは57℃以上である。このような条件でハイブリダイズするようなＤＮＡはロイシンアミノペプチダーゼ活性を持つペプタイドをコードしている蓋然性が高いが、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を失うような変異を持つものも含まれる。しかし、それらについては、形質転換を行なった後に、本発明者等が開発し前述した測定法３により形質転換体のロイシンアミノペプチダーゼ産生能を測定することにより容易に取り除くことが可能である。
【００１７】
得られたロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を用いて、公知の方法、例えばイー・シエラ(E. Shiela)等：モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス、218、99-104(1989)記載の方法で、例えば、アスペルギルス・ソーヤATCC42251を形質転換する。この方法では、まず、液体培養した菌体を、例えば Novozym 234( ノボ・ノルディスク社) 等の細胞壁分解酵素で処理することにより細胞壁を除去したプロトプラストを得る。続いて、塩化カルシウム及びポリエチレングリコール 4000存在下で、例えばniaD等のマーカー遺伝子を含むDNAと、目的遺伝子を含むDNAを同時に細胞内に導入する。その後、使用したマーカー遺伝子に適した選択培地に希釈して保温することによりプロトプラストの再生を行なうと、マーカー遺伝子及び目的遺伝子が夫々宿主細胞の染色体上に組み込まれた形質転換体を得ることができる。従って、用いるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子は、ベクター上に挿入された組み換え体ＤＮＡであってもよいが、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片等の非組み換え体ＤＮＡであっても宿主細胞の染色体への組み込みが起こるため支障なく形質転換を行なうことができる。更に、得られた形質転換体について、例えば、［測定法３］を用いてロイシンアミノペプチダーゼ生産能の向上したものをスクリーニングすることにより、目的の形質転換体を得ることができる。
このようにして得られた形質転換体を、例えば、特開昭48-35094号公報の方法で培養し、ロイシンアミノペプチダーゼを精製することにより、ロイシンアミノペプチダーゼを効率良く製造することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明する。
（実施例１）ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
１．酵素の精製
前記方法により麹菌アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM BP-6349)の培養、ロイシンアミノペプチダーゼの精製を行ない精製酵素３mgを得た。
２．部分アミノ酸配列の決定
ABI470Aプロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いて精製酵素30ngを試料としてN末端のアミノ酸配列としてGly Arg Ala Leu Val Ser Pro Asp Glu Phe Proを得た。しかしながら、本酵素は、ペプタイド結合をN末端から遊離させる活性を有するため、自己消化によりN末端が一部削られたものが混入することを避けがたく、これ以上の配列は得られなかった。
【００１９】
そこで、リシルエンドペプチダーゼにより本酵素を断片化し、内部アミノ酸配列を決定することとした。この際にも、断片ペプタイドのN末端が残存する本酵素の活性により削り込まれる問題が生じた。そこで、下記のような、本酵素を失活させ、かつ、リシルエンドペプチダーゼが働きうる条件を見い出し、断片化を行なった。先ず、精製酵素1mgを1%(W/V) SDS、5mM EDTAを含む50mMトリス緩衝液(pH9.0)0.5ml中で37℃、1.5時間処理することにより失活させた。ここに0.1mg/mlのリシルエンドペプチダーゼ(和光純薬工業社製)を15μl 添加し、37℃で14時間反応させ、更に、上記リシルエンドペプチダーゼ5 μlを添加して37℃で2時間反応させた。このようにして得られた断片ペプタイドを含む溶液に1Mリン酸カリ緩衝液(pH7.5)55 μlを加え、氷上に30分間放置したのち、15,000×g 20分間の遠心分離することによりSDSを除去した。断片ペプタイド溶液から、カラムガードHV13mm（ミリポア社製）を用いて固形分を除去した。このようにして調製した断片ペプタイド溶液100 μlに終濃度0.1%のトリフルオロ酢酸（以下、TFAと略称する。）を加え、POROS R2/Hプレパックドカラム（ベーリンガー・マンハイム社製）により0.1% TFAを含む超純水〜47.5%アセトニトリル水溶液の勾配で逆相クロマトグラフィー分離した。この際、220nmにおける吸光度を指標に、ペプタイドのピークを夫々分取した。分取した各ピークのペプタイド溶液を真空遠心濃縮器により蒸発乾固し、20μl の20mMリン酸緩衝液(pH8.0)に再溶解した。これらのペプタイド数種についてABI470Aプロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いてアミノ酸配列の決定を行なった。その結果、ピーク5がXaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Pro Ser Val Glu Gly Lys(Xaaは、別のペプタイドの混入により決定できなかった配列）、ピーク6がGln Pro Gln Val His Leu Trp…、ピーク11がAsn Ala Val Arg Phe Leu Phe Trp Thr Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Ser His Leu…となった。
【００２０】
３．PCRによるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の一部の取得
前項で明らかになった部分アミノ酸配列を用いてPCRプライマーの設計を行なった。
ピーク5より、LAP5F: 5’-GA(C/T)TA(C/T)CCI(A/T)(C/G)IGA(C/T)GTIGA(AG)GGIAA G-3’、LAP5R: 5’-TTICC(C/T)TCIAC(A/G)TCI(C/G)(A/T)IGG(A/G)TA(A/G)TC-3’の2種を、ピーク11より、LAP11F: 5’-TT(C/T)TGGACIGCIGA(A/G)GA(A/G)TT(C/T)GG-3’、LAP11R: 5’-CC(A/G)AA(C/T)TC(C/T)TCIGCIGTCCA(A/G)AA-3’の計4種を作成した。なお、Iは、イノシンを表す。ジョアン・ティルバーン(Joan Tilburn)等：ジーン(Gene)、26、205-221(1983)の方法により調製したアスペルギルス・ソーヤ 1-190 FERM BP-6349 のゲノムDNAをテンプレートとして、上記プライマーを組み合わせて、下記のようにPCRを行ない、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の一部を増幅した。サーモサイクラーとしては、RoboCycler Gradient 96(ストラタ・ジーン社製)を、PCR試薬は、ExTaq(宝酒造社製)を用いた。
【００２１】
0.2ml容量のPCR用チューブ(イナ・オプティカ、T-02)に滅菌蒸留水33.75 μl 、10×バッファー(ExTaqに付属のもの)5μl 、プライマーDNAの100pmol/μl 溶液2 μl×2種、ゲノムDNAの0.5ug/μl 溶液3 μl、2.5mM dNTP溶液(宝酒造社製)4μl 及びExTaq DNAポリメラーゼ0.25μl を入れ、混和した後、ミネラルオイル(シグマ社製)20 μlを滴下しRoboCycler Gradient 96にセットした。なお、ゲノムDNAは、予め96℃で3分間変性させた後、氷上で急冷したものを用いた。プライマーは、LAP5F・LAP11R、LAP5R・LAP11Fの2通りで行なった。RoboCycler Gradient 96に、1)95℃30秒、2)95℃30秒、3)36〜56℃30秒、4)72℃2分、2)〜4)を45サイクル、5)72℃5分のプログラムをセットし、反応を実施した。なお、3)については、アニーリングブロックに36〜58℃のグラジエントをかけて、36、40、44、48、52、56℃の各温度の位置にチューブを置いた。反応後、5 μlを0.7%アガロースLO3(宝酒造社製)ゲルで電気泳動し、増幅産物を確認したところ、LAP5F・LAP11Rのプライマーを用いた反応液では約500bpの産物が、LAP5R・LAP11Fのプライマーを用いた反応液では約1200bpの産物が夫々主要なものであった。また、最適なアニーリング温度は、48℃であった。
【００２２】
そこで、これらのアニーリング温度48℃の反応液40μl を2%アガロースゲルで電気泳動し、上記の2つの増幅産物をゲルから回収した。ゲルからのDNAの回収にはQIAquick Gel Extraction kit(キアゲン社製)を用い、25μl の滅菌蒸留水でスピンカラムから溶出させた。これらの2種のDNA断片溶液を7 μlずつ用いて、 pGEM-T Easy Vector System II(プロメガ社製)のマニュアルに従って、夫々、pGEM-T Easyプラスミド(プロメガ社製)に組み込み、大腸菌JM109コンピテントセル(キットに添付のもの)を形質転換した。
【００２３】
これらの形質転換体夫々4株から「モレキュラークローニング第２版」(Molecμlar Cloning Second edition)1.25-1.28 頁、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(1989)の方法に従って組み換え体プラスミドを調製した。これらのプラスミドについて、Thermo Sequenaseサイクルシークエンシングキット(アマシャム社製)・Model4200 DNAシーケンサー(LI-COR社製)を用いて塩基配列の決定を行なった。この結果、500bpの断片を有する組み換え体プラスミド4種のうち、2種の末端の塩基配列がプライマー設計に用いたアミノ酸配列をコードするものであり、また、内部の塩基配列は、上記のアミノ酸配列をもたらす読み枠には終止コドンを含まないものであった。従って、この断片が目的とするロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の一部であることが推測され、このプラスミドをpCRLAと命名した。
【００２４】
４．麹菌ゲノムDNAライブラリーの作成
麹菌アスペルギルス・ソーヤ 1-190FERM BP-6349のゲノムDNAを項目３．と同様の方法により調製し、平均塩基数約10kbpになるようにSau3AIにより限定分解し、10kbp前後のDNAをアガロースゲル電気泳動、QIAquickによって回収し、ZAP Express Predigested Gigapack III Cloning Kit(ストラタ・ジーン社製)を用いてZAP Expressベクターに組み込み、パッケージング、増幅を行ない、ゲノムDNA
のλファージライブラリーを作成した。
【００２５】
５．DNAプローブの作成
先に項目３．で推測されたロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の部分塩基配列を元に、プライマー2種（FOW-LAP-A: 5’-AGGGCAAGGTAGCTCTCATCAAGCGTGG-3’、REV-LAP-A: 5’-GAGAAAGCGCACGGCATTCTTGACGGAG-3’）を作成した。LAP5F及びLAP11Rをプライマーとして用い、10ngのpCRLAをテンプレートとして下記のような条件でPCRを行ない、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の一部を増幅した。0.2ml容量のPCR用チューブに滅菌蒸留水34.75 μl、10×バッファー5 μl、プライマーDNAの100pmol/μl 溶液2 μl×2種、ゲノムDNAの5ng/μl 溶液2 μl、2.5mM dNTP溶液4 μl及びExTaq DNAポリメラーゼ0.25μl を入れ、混和した後、ミネラルオイル20μl を滴下しRoboCycler Gradient 96にセットした。なお、ゲノムDNAは、予め96℃で3分間変性させた後、氷上で急冷したものを用いた。RoboCycler Gradient 96に、1)95℃30秒、2)95℃30秒、3)50℃30秒、4)72℃40秒、2)〜4)を45サイクル、5)72℃2分のプログラムをセットし、反応を実施した。反応液を1%アガロースゲルで電気泳動し、約500bpの増幅断片をQIAquick Gel Extraction kit(キアゲン社製)を用いて回収し、50μl のTEバッファー［10mMトリス、1mM EDTA、pH8.0］で溶出した。次に、プライマーとしてFOW-LAP-A及びREV-LAP-Aを用い、上記増幅断片溶液の10倍希釈液をテンプレートとして下記のようにPCRによりジゴキシゲニン(DIG)ラベルされたDNAプローブを作成した。0.2ml容量のPCR用チューブに滅菌蒸留水37.75 μl、10×バッファー5 μl、プライマーDNAの100pmol/μl 溶液1 μl×2種、テンプレートDNA溶液1 μl、PCR DIGミックス10倍濃度(ベーリンガー・マンハイム社製)4μl 及びExTaq DNAポリメラーゼ0.25μl を入れ、混和した後、ミネラルオイル20μl を滴下しRoboCycler Gradient 96にセットした。なお、ゲノムDNAは、予め96℃で3分間変性させた後、氷上で急冷したものを用いた。RoboCycler Gradient 96に、1)95℃30秒、2)95℃30秒、3)62℃30秒、4)72℃40秒、2)〜4)を45サイクル、5)72℃2分のプログラムをセットし、反応を実施した。反応液よりエタノール沈殿によって増幅断片を回収し、50μl のTEバッファーに溶解してDIGラベルプローブdLAP-Aとした。
【００２６】
６．プラーク・ハイブリダイゼーションによるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の検索
項目４．で調製した麹菌ゲノムDNAのλファージライブラリーから項目５．のプローブを用いてプラーク・ハイブリダイゼーションによってロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を検索した。
ライブラリー作成に用いたキットのマニュアルに従い、5枚の寒天培地に１枚あたり約5×103個のプラークを形成させた。これらの寒天培地上のプラークからHyBond-N+ナイロントランスファーメンブレン(アマシャム社製)に、メンブレンの説明書に従ってDNAをトランスファーした。なお、この際、非特異のシグナルを排除するために、1枚の寒天培地につき2枚のメンブレンにトランスファーを行なった。
【００２７】
上記メンブレンについて、項目５．で作成したジゴキシゲニンラベルDNAプローブ、DIGシステム(ベーリンガー・マンハイム社製)を用いて「DIGシステムを用いてハイブリダイゼーションを行なうためのユーザーガイド」37-40頁、ベーリンガー・マンハイム社(1996)に従ってハイブリダイゼーション・検出を行なった。具体的には、ファージライブラリーのDNAが吸着した上記メンブレン10枚に標準プレハイブリダイゼーションバッファー[5×SSC, 1%(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬(ベーリンガー・マンハイム社製), 0.1%(W/V) N-ラウロイルサルコシン, 0.02%(W/V) SDSを加え、穏やかに振盪しながら57℃で1時間放置した。
【００２８】
ここに、項目５．で作成したdLAP-Aプローブを100℃で10分間煮沸した後、氷水で急冷したものを加え、穏やかに振盪しながら57℃で16時間放置して、ハイブリダイズさせた。メンブレンを新しい容器に移し、2×洗浄液[2×SSC, 0.1%(W/V) SDS]で室温で5分ずつ2回洗浄した。続いて、0.1×洗浄液[2×SSC, 0.1%(W/V) SDS]で57℃で15分ずつ2回洗浄した。次いで、メンブレンをバッファー1[0.1Mマレイン酸, 0.15M NaCl, pH7.5]と1分間平衡化し、新しい容器に移してから、バッファー2[バッファー1、1%(W/V) 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬]を加え、室温で30分間穏やかに振盪した。バッファー2を捨て、バッファー2で1万倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を加え、室温で30分間穏やかに振盪した。抗体溶液を捨て、清潔な容器中でバッファー1＋0.3%ツイーン20で15分ずつ2回洗浄した。次いで、メンブレンをバッファー3[0.1Mトリス pH9.5, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2]と2分間平衡化した。次いで、適当な大きさに切ったハイブリダイゼーションバッグ中にメンブレンを1枚ずつ置き、100倍希釈したCDP-Star溶液(ベーリンガー・マンハイム社製)を0.4mlずつ滴下し、全体に均一に行き渡らせた後、余分な溶液を除去し、シーラーで密閉した。これらのメンブレンを37℃で10分間放置した後、富士直接撮影用フィルムRX-U(富士写真フィルム社製)に1〜10分間密着した後、フィルムを現像した。同一の寒天培地上のプラークからトランスファーした2枚のメンブレンで同じ位置に認められたシグナルが5個所あり、これらをA〜Eの陽性クローンとした。寒天培地上のこれらのシグナルに対応する位置から、軟寒天部分直径5mmを微量遠沈管に取り、500 μlのSMバッファー[10mM NaCl, 0.2%(W/V) MgSO4・7H20, 50mMトリスpH7.5, 0.01%ゼラチン]、クロロホルム20μl を加え、4℃で1晩放置した。寒天培地上で、これらのファージを1枚あたり約100個になるように調節してプラークを形成させた。これらのプラークを上記の方法でメンブレンにトランスファーし、dLAP-Aプローブでハイブリダイゼーションを行なった。Aのシグナルの位置から得たファージ液を用いたものでは、多数の強いシグナルが観察された。Bではシグナルは観察されず、C, D, Eでは数個のシグナルが観察された。そこで、A, C, D, Eの４つのシグナルについて、上記のようにプラークを回収し、再度プラーク・ハイブリダイゼーションを行なったところ、A, Dは全てのプラークが陽性であったので、夫々単一のプラークを回収した。
これらのファージクローンについて、キットの説明書に従い、in vitro excisionを行い、夫々プラスミドpLZA及びpLZDとして回収した。
【００２９】
７．ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の解析
前項で得られた２つのプラスミドについて解析を行なった。先ず、これらのプラスミドをテンプレートとして、PCRを行なった。プライマーとして、FOW-LAP-A, REV-LAP-A, ベクター上のクローニングサイトの両側のプライマー、F: 5’-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’, R: 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’を次のような組み合わせで用いた。
a) FOW-LAP-A, F
b) REV-LAP-A, F
c) FOW-LAP-A, R
d) REV-LAP-A, R
【００３０】
PCRの条件は、72℃での伸長反応を8分間にした以外はdLAP-Aを調製したときと同様である。PCR産物をアガロースゲル電気泳動したところ、pLZAをテンプレートとしたものではa)で約2.1kbpのバンドが、d)で約4.1kbpのバンドが観察され、pLZDをテンプレートとしたものではd)で約2kbpのバンドが観察された。
次いで、常法によりこれらのプラスミドを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動し、大まかな制限酵素地図を作成し、PCRの結果と合わせて、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子のおおよその位置を推定した(図１)。その結果、pLZA及びpLZDは、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を含む同一のDNA 断片を含むことが推測された。
【００３１】
そこで、pLZA上のDNA断片を適宜サブクローニングし、項目３．と同様の方法で塩基配列の決定を行なった。また、この方法で決定できなかった配列については、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(パーキンエルマー社製)、Moel373Aシークエンサー(パーキンエルマー社製)を用いて決定した。塩基配列は、配列番号2の通りであった。この塩基配列において、塩基番号67-171については、その両端の配列と、精製ロイシンアミノペプチダーゼのN末端配列から、イントロンであることが判った。配列番号2の塩基番号1-66, 172-1640を結合した配列から翻訳されるポリペプタイドのアミノ酸配列と、精製ロイシンアミノペプチダーゼのＮ末端配列からマチュアーなロイシンアミノペプチダーゼのアミノ酸配列を決定し、配列番号１とした。
配列番号１のアミノ酸配列は、N末端に、精製したロイシアミノペプチダーゼのN末端配列を、内部に項目２．で決定したロイシンアミノペプチダーゼの内部配列全てを含むことからマチュアーなロイシンアミノペプチダーゼのアミノ酸配列であり、pLZAはロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子が組み込まれたベクターDNAであると結論できる。
【００３２】
（実施例２）ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子による形質転換体の取得
先ず、イー・シエラ(E. Shiela)等：モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス、218、99-104(1989)記載の方法で、宿主として使用するアスペルギルス・ソーヤATCC42251から、niaD欠損株を取得した。
ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子が組み込まれたベクターDNAであるpLZAプラスミド、マーカーとして使用するniaD遺伝子が組み込まれたpSTA14プラスミド(イー・シエラ等、前出)をQIAGEN Plasmid Maxi Kit(キアゲン社製)を用いて大量調製した。
【００３３】
これらのプラスミドを用いて、先に得たアスペルギルス・ソーヤATCC42251 のniaD欠損変異株をイー・シエラ等(前出)記載の方法で形質転換し、最少培地上に25個の形質転換体コロニーを得た。
得られた形質転換体について、前述の［測定法３］によりロイシンアミノペプチダーゼ産生能の検定を行なった。その結果、ロイシンアミノペプチダーゼ産生能が宿主株と同程度、少し向上したもの、大きく向上したものを選択し、夫々、TFLW14、TFLW5及び、TFLW22と命名した。
なお、得られたアスペルギルス・ソーヤ(TFLW22)は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-6348として寄託されている。
【００３４】
宿主株及び上記形質転換体3株について、ゲノムDNAを項目４．で述べた方法で調製し、制限酵素SalIで切断し、常法によりHyBond-N+ナイロントランスファーメンブレン(アマシャム社製)にブロッティングした。このメンブレンをdLAP-Aをプローブとして、実施例１の項目６．に記載の方法でハイブリダイゼーションし、検出した。その結果、これらの株におけるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子のコピー数は、宿主株で1、TFLW14で1、TFLW5で2-3、TFLW22でおよそ10以上であることが判った。
【００３５】
（実施例３）形質転換体によるロイシンアミノペプチダーゼの製造
小麦ふすま2.78g及び蒸留水2.22mlを混合し、150ml容量の三角フラスコに入れ、121℃で50分間オートクレーブ処理し、室温まで放冷後、宿主株及び前項の3種の形質転換体の胞子106個を夫々接種した。30℃で24時間放置した後、三角フラスコを激しく振盪して内容物を小さい粒子に砕き、30℃で更に48時間放置して菌体を生育させた。そこへ、蒸留水25mlを加えて、激しく撹拌し、室温で3時間放置して酵素を抽出することにより酵素液を得た。
【００３６】
アミノペプチダーゼの活性を測定するためにこの酵素液から遊離アミノ酸及び低分子ペプタイドを除去した。具体的には、セントリコン-10(アミコン社製) に酵素液2mlを入れ、3000×gで遠心分離し、液量が0.5mlになったら1.5mlの25mM HEPES緩衝液pH7.0を加え、更に、3000×gで遠心分離することを3回繰り返した。回収した酵素液を25mM HEPES緩衝液(pH7.0)で2mlに容量を調整した。
こうして得られた酵素液試料について、Leu-Gly-Glyを基質としたロイシンアミノペプチダーゼ活性測定を行なった(表１)。Leu-Gly-Gly活性は、宿主株の活性を1とすると、TFLW14が約1.0、TFLW5が約2.1、TFLW22が約4.9であった。つまり、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むベクターによって形質転換された形質転換体であるTFLW22を生育させることにより、宿主株に比べて効率良くロイシンアミノペプチダーゼを製造することが出来た。
【００３７】
【表１】
0003727780.tif 000002
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、本発明ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の組み込まれた組み換え体DNAを含む、例えば、微生物を培地に培養することにより、ロイシンアミノペプチダーゼを効率良く得ることができる。また、上記遺伝子は、蛋白質工学用試料として用いることができ、本発明は、産業上極めて有用なものである。
【００３９】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：481
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列：
0003727780.tif 000003
0003727780.tif 000004
0003727780.tif 000005
【００４０】
配列番号：2
配列の長さ：1640
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)１-190
株名：FERM BP-6349
配列：
0003727780.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNA断片の制限酵素地図を示す図。
【図１】
0003727780.tif 000007