(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科植物の特定のS座位型のSレセプターキナーゼ遺伝子を雌しべにおいて発現するようにアブラナ科植物に導入し、これによりその植物の雌しべに導入したSレセプターキナーゼ遺伝子と同一のS座位型の性質を付与することによって、同一のS座位型の花粉が当該雌しべ柱頭上では花粉管を伸長することができないようにすることを特徴とする特定のS座位型を示すアブラナ科植物の作出方法。
【請求項２】
アブラナ科植物が、ブラシカ属に属する植物であることを特徴とする請求項１記載のアブラナ科植物の作出方法。
【請求項３】
Sレセプターキナーゼ遺伝子の植物への導入を、アグロバクテリウム菌を用いて行うことを特徴とする請求項１又は２記載のアブラナ科植物の作出方法。
【請求項４】
Sレセプターキナーゼ遺伝子の植物への導入を、Sレセプターキナーゼ遺伝子と雌しべに特異的に機能するプロモーターとを含むベクターを用いて行うことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のアブラナ科植物の作出方法。
【請求項５】
雌しべに特異的に機能するプロモーターが、S糖タンパク質遺伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項４記載のアブラナ科植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定のＳ座位型のＳレセプターキナーゼ（以下、「ＳＲＫ」という）遺伝子を雌しべにおいて発現するように植物に導入することにより特定のＳ座位型を示す植物を作出する方法に関する。このようにして作出された植物の雌しべ柱頭上では、導入したＳＲＫ遺伝子のＳ座位型と同一の型の花粉は花粉管を伸長することができないので、特定のＳ座位型の花粉による受精を排除して交配を行うことが可能になる。
【０００２】
【従来の技術】
自家不和合性とは、雌雄両生殖器官が正常にも拘わらず、受粉時に雌しべが自己・非自己の花粉を認識して、自己花粉の発芽及び花粉管の伸長を阻害して、その受精を阻害する機構である。アブラナ科植物の自家不和合性は胞子体型に分類され、Ｓ複対立遺伝子（Ｓ１，Ｓ２，・・・・，Ｓｉ）の一致・不一致により制御されており、Ｓ複対立遺伝子表現型が花粉と雌しべで同じ時に、その花粉管は雌しべ柱頭に侵入できないし、また種子が結実しない（Ｂａｔｅｍａｎ  （１９５５）  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ９：５２−６８）。Ｓ複対立遺伝子は胞子体的に機能するため、Ｓ対立遺伝子がヘテロである個体の雌しべと花粉の表現型は、Ｓ遺伝子間の優性・劣性関係により決定される。例えば、Ｓ１  Ｓ２ヘテロ個体においては、雌しべ側でＳ１とＳ２が共優性を示せば、雌しべ表現型はＳ１  Ｓ２となる。花粉側でＳ２が  Ｓ１に対して劣性を示せば、花粉表現型Ｓ１となる。Ｓ遺伝子間の優性・劣性関係は、雌しべ側では共優性が一般的であり、花粉側では優性・劣性関係が多い（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ８０：２４１−２４７）。
【０００３】
これらの事実から、自家不和合性においては、花粉と雌しべ間の特異性がＳ遺伝子によって認識され、雌しべと同じＳ遺伝子を持つ花粉が特異的に排除されて受精しないことといえる。すなわち、自家不和合性とは言うものの、必ずしも自己・非自己の認識ではなくて、その実体はＳ遺伝子間の認識作用である。したがって、雌しべ側に、あるＳ遺伝子の特異性を持たせれば、それと同じＳ遺伝子を持つ花粉の受精を特異的に排除することができる。
なお、このＳ複対立遺伝子はクラシカルな遺伝子分析によって遺伝子と呼ばれているものであり、以下に述べるように、そこには多数の遺伝子が存在することが明らかとなった。そのため本明細書では、このＳ複対立遺伝子を以下「Ｓ座位」と称する。
【０００４】
雌しべ柱頭に特異的に発現し、Ｓ座位と例外なく行動を共にする、Ｓ糖タンパク質（Ｓ−ｌｏｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；  以下「ＳＬＧ」という）が、免疫学的手法によって明らかにされた（Ｎａｓｒａｌｌａ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  （１９６７）  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ２２：  ５１９−５２７，  Ｈｉｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １００：  ６４９−６９７）。ＳＬＧはそれぞれＳ座位型に対応して異なった等電点を有する糖タンパク質で、開花数日前に発現が始まり、その発現時期は自家不和合性の発現時期と一致していた（Ｎｉｓｈｉｏ  ａｎｄ  Ｈｉｎａｔａ  （１９７７）  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  ４１：  ９３−１００）。このような状況証拠から、ＳＬＧがＳ座位に存在するＳＬＧ遺伝子の産物であり、自家不和合性の認識反応に関連した第１候補とされた。現在までに、数多くのＳＬＧ  ｃＤＮＡクローンとＳＬＧゲノミックＤＮＡクローンが単離され、その塩基配列が決定されている（特開昭６２−１４３６８８号，  Ｈｉｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．，  １４３：  ２５７−２９６）。
【０００５】
その後、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａの雌しべ柱頭から、ＳＬＧと相同性の高い細胞外ドメイン、疎水性の膜貫通ドメインとプロテインキナーゼの触媒ドメインを有するプロテインキナーゼがクローニングされ、この遺伝子はＳレセプターキナーゼ（Ｓ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｋｉｎａｓｅ；  以下「ＳＲＫ」という）と呼ばれる。ＳＲＫ遺伝子もＳ座位上に存在している（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８：  ８８１６−８８２０）。ＳＲＫ遺伝子は７つのエクソンから構成されており、その第１エクソンには細胞外ドメインがコードされている。第１イントロンの５’末端にはｉｎ−ｆｒａｍｅで終止コドンが存在し、選択的スプライシングにより生ずる細胞外ドメインからなるタンパク質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＳＲＫ；以下「ｅＳＲＫ」いう）も存在する（Ｇｉｒａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  （１９９５）  ８：  １０１−１０８）。
【０００６】
ＳＬＧ遺伝子とＳＲＫ遺伝子はいずれもＳ座位上にあり、パルスフィールド電気泳動実験からＳＬＧ遺伝子とＳＲＫ遺伝子の物理的距離は８０−３５０ｋｂである（Ｂｏｙｓ  ａｎｄ  Ｎａｓｒａｌｌａｈ  （１９９３）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２３６，  ３６９−３７３，  Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５６：  ２５７−２６４）。Ｓ座位上には未同定の花粉側因子を含め、少なくとも２つ以上の遺伝子が存在し、これら遺伝子は例外なくＳ座位と行動を共にすることから、Ｓ座位に存在するＳＬＧやＳＲＫ等を総称して、Ｓハプロタイプ（Ｓ−ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）とも呼ばれる（Ｎａｓｒａｌｌａｈ  ａｎｄ  Ｎａｓｒａｌｌａｈ  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１３２５−１３３５）。
【０００７】
ＳＬＧ／ＳＲＫの構造と優劣性には、一定の関係がある。Ｂ．  ｏｌｅｒａｃｅａではＳＬＧ６に対するモノクローナル抗体と反応するか否かでＳＬＧはｃｌａｓｓ  Ｉ  とｃｌａｓｓＩＩに分類される（Ｎａｓｒａｌｌａｈ  ａｎｄ  Ｎａｓｒａｌｌａｈ  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１３２５−１３３５）。アミノ酸配列を比較するとｃｌａｓｓ  Ｉ  ＳＬＧ  遺伝子とｃｌａｓｓＩＩ  ＳＬＧ遺伝子の相同性は約７０％であり、ｃｌａｓｓ内の相同性は８０％以上である。花粉側で劣性を示すＳハプロタイプはｃｌａｓｓ  ＩＩ  −タイプのＳＬＧ・ＳＲＫ遺伝子を、花粉側で優性を示すＳハプロタイプはｃｌａｓｓ  Ｉ−タイプのＳＬＧ・ＳＲＫ遺伝子を持つ（Ｔａｎｔｉｋａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：  ６５７−６６６，  Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （１９８８）  １４９：  １５８７−１５９７）。
【０００８】
ＳＬＧとＳＲＫが自家不和合性の雌しべ側認識反応へ直接関与する証拠として、自家和合性突然変異体の解析と遺伝子導入による形質転換体の解析がある。Ｓ座位とは異なるＳｃｆ１座位が変異して、認識作用を失った自家和合性のＢ．  ｒａｐａでは、ＳＬＧ発現量が減少していた。このことから、ＳＬＧ発現量がその認識作用に関係していることが示唆される（Ｎａｓｒａｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２：  ４９７−５０６）。また、自家和合性のＢ．  ｏｌｅｒａｃｅａでは、ＳＲＫの第１及び第２エクソンが欠失しており、ＳＬＧの発現量は正常であるが、ＳＲＫの発現はない。このことは認識反応にＳＲＫの存在の必要性を示唆する（Ｎａｓｒａｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ５：  ３７３−３８４  （１９９４））。
【０００９】
ＳＬＧ遺伝子をＳＬＧ遺伝子のプロモーターにアンチセンス方向につないで自家不和合性アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）に導入した場合、内在のＳＬＧとＳＲＫ遺伝子発現は抑制され、認識反応を失い、自家和合性になった（Ｓｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ．  ７１：  ８１−８３  （１９９５））。ＳＬＧ遺伝子及びＳＲＫ遺伝子を自家不和合性Ｂｒａｓｓｉｃａに導入した場合、コ・サプレッションにより、内在ＳＬＧ・ＳＲＫの遺伝子発現が抑制された結果、雌しべ表現型が変化し、自家和合性になった（Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １１：８０９−８２４，  Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ    １０：  ２０９−２１８）。
【００１０】
以上の事実から、アブラナ科植物の自家不和合性における雌しべ側の認識物質がＳＬＧとＳＲＫの複合体であり、この両者が花粉からの情報を識別していると考えるのが定説であった。しかしこれらの結果はＳＬＧ／ＳＲＫ両者の重要性を示すのであり、両者の内どちらが特異性決定に主導的な役割を果たすかに付いては、確かな証拠がなかった。また、ＳＬＧ及びＳＲＫ遺伝子の導入実験も重ねられているが、遺伝子受容植物の雌しべに新規のＳ座位特性の表現型を付与するには至っていない。
【００１１】
一方、ハクサイ、カブ、ツケナ、キャベツ、ブロッコリー、ダイコンなどのアブラナ科野菜においては、この自家不和合性の認識作用を利用して、雌しべと同じＳ座位遺伝子型を持つ花粉の受精を排除して、強制的に雑種を作製して、一代雑種品種（Ｆ１品種）が育成されている。したがって、遺伝子操作によって、特定のＳ座位関連遺伝子を導入すれば、その認識作用によって、特定のＳ座位型の花粉の受精を特異的に排除できると期待される。しかし、このＳ座位には上記のように、ＳＬＧとＳＲＫが存在し、どの遺伝子を導入すればＳ座位の認識機能を付与できるかが明らかでなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
品種改良においては、一代雑種品種（Ｆ１）育成に見られるように、特定の遺伝的性質を持つ花粉の受精を排除することが望まれる。本発明は、アブラナ科野菜の育種において、自家不和合性の認識反応を利用して、特定のＳ座位型を持つ花粉の受精を選択的に排除できる手段を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、遺伝子供与植物（Ｂ．  ｒａｐａ）から単離したＳＲＫｃＤＮＡをＳＬＧプロモーターにつなげた遺伝子導入ベクターをアグロバクテリウム法により、遺伝子供与植物とは異なるＳ座位型を示す遺伝子受容植物（Ｂ．  ｒａｐａ）へ導入し、該遺伝子を雌しべで発現させることにより、遺伝子受容植物の雌しべに遺伝子供与植物と同一のＳ座位型の性質を付与することに成功し、これによって、本発明を完成した。
即ち、本発明は、特定のＳ座位型のＳＲＫ遺伝子を雌しべにおいて発現するように植物に導入し、これによりその植物の雌しべに導入したＳＲＫ遺伝子と同一のＳ座位型の性質を付与することを特徴とする特定のＳ座位型を示す植物の作出方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の特定のＳ座位型を示す植物の作出方法は、特定のＳ座位型のＳＲＫ遺伝子を雌しべにおいて発現するように植物に導入し、これによりその植物の雌しべに導入したＳレセプターキナーゼ遺伝子と同一のＳ座位型の性質を付与することを特徴とするものである。
ＳＲＫ遺伝子は、アブラナ科植物由来のものであれば特に限定されないが、ブラシカ属に属する植物由来のものが好ましい。具体的には、ハクサイ、カブ、ツケナ（Ｂ．ｒａｐａ）、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）由来のＳＲＫ遺伝子などを使用することができる。
また、レセプターキナーゼ遺伝子のＳ座位型は、特に限定されず、作出しようとする植物に応じて決めればよい。以下に各型のＳＲＫ遺伝子の入手先を示す。
【００１５】
0003619704.tif 000002
【００１６】
遺伝子を導入する植物は、アブラナ科植物のものであれば特に限定されないが、ブラシカ属に属する植物が好ましい。具体的には、ハクサイ、カブ、ツケナ（Ｂ．ｒａｐａ）、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、クロガラシ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）などを例示することができる。
遺伝子源となる植物（供与植物）と遺伝子導入の対象となる植物（受容植物）とは、同一の種類の植物であることが好ましいが、必ずしもそれに限定されるわけではない。供与植物のＳ座位型と受容植物のＳ座位型は、同一のｃｌａｓｓに属するものであることが好ましい。例えば、ｃｌａｓｓＩに属するＳＲＫ２８を導入する場合、受容植物の雌しべのＳ座位型は、ｃｌａｓｓＩＩに属するＳ６０よりもｃｌａｓｓＩに属するＳ５２の方が好ましい。
【００１７】
ＳＲＫ遺伝子の導入方法は、ＳＲＫ遺伝子を雌しべにおいて発現させることができる方法であれば特に限定されないが、アグロバクテリウム菌を用いた導入方法を使用するのが好ましい。
ＳＲＫ遺伝子の導入は、ＳＲＫ遺伝子と適当なプロモーターなどを含むベクターを用いて行うが、この際使用するプロモーターとしては、雌しべに特異的に機能するプロモーターを使用するのが好ましい。このようなプロモーターとしては、ＳＬＧ遺伝子のプロモーター、ＳＬＲ１（Ｓ−ｌｏｃｕｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １）のプロモーター（Ｔｒｉｃｋ  （１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：２０３−２０５）、ＳＴＩＧ１（Ｓｔｉｇｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ）のプロモーター（Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）  ＥＭＢＯ  １３：２９７６−２９８４）などを挙げることができる。
【００１８】
なお、胞子体型自家不和合性のアブラナ科植物のＳ座位は２つのＳＲＫ遺伝子しか持てないが、本発明により、雌しべで機能する３つ以上のＳ座位遺伝子を持つ植物体の作出が可能になる。
本発明の方法により、特定のＳ座位型を持つ花粉の受精を選択的に排除できる植物を作出できる。これにより、例えば、アブラナ科野菜における一代雑種品種（Ｆ１品種）採種における獲得種子量の増加を計ることができる。Ｆ１採種圃場では、Ｓ座位遺伝子の異なる両親系統が栽植される。この場合には、花粉親系統の花数を増やす必要があるが、実際には種子親花粉によって受精・結実するために、花数が限られ、多くならない。花粉親系統に種子親系統花粉による受精を選択的に排除する能力を付加することによって、花粉親系統の開花期間を延長することができ、少数の花粉親を用いて、優良Ｆ１種子の獲得量を増加させることができる。また、本発明の方法は、Ｆ１採種において、自家不和合性が弱い系統を花粉親として用いる場合に特に有効である。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
［実施例１］  Ｓレセプターキナーゼ（ＳＲＫ）遺伝子導入ベクターの設計と構築
小国カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）のＳ２８ホモ系統から単離されたＳＲＫ２８ｃＤＮＡ（Ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）はプラスミドベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｏｔＩサイトにクローニングされている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ．  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５：  １２２１−１２２９、ＳＲＫ２８ｃＤＮＡは東北大学農学部遺伝育種学研究室より入手できる）。このｃＤＮＡは５’翻訳領域が４ｂｐ（ＡＴＧＡ）不足している。ＳＲＫ２８ｃＤＮＡの３’末端に存在するＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイト（ｐＣＲＩＩのマルチクローニングサイト）にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＮｏｓターミネーター（Ｎｏｐａｌｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ）を挿入した。次に、ＳＬＧ２８ゲノミックＤＮＡ（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３７：  ８６６−８６９）からプロモーター領域と翻訳領域を含むＡｐａＩ／ＳａｃＩ断片（２．３ｋｂ）を切り出し、ＳＲＫ２８ｃＤＮＡの５’上流域につないで、ｐＳＬＧｐｒｏＳＲＫ２８を構築した。ＳＲＫ２８ｃＤＮＡとＳＬＧ２８ゲノミックＤＮＡの５’翻訳領域塩基配列は９６９ｂｐまで完全に一致しており、ＳａｃＩサイトはＳＲＫ２８ｃＤＮＡとＳＬＧ２８ゲノミックＤＮＡの翻訳開始点から１６８ｂｐ下流に存在する。ＳＬＧ２８ゲノミックＤＮＡは東北大学農学部遺伝育種学研究室より入手できる。ｐＳＬＧｐｒｏＳＲＫ２８からＳＬＧ２８プロモーター、ＳＲＫ２８ｃＤＮＡ、Ｎｏｓターミネーターを含むＨｉｎｄＩＩＩ断片を切り出し、アグロバクテリウムのバイナリーベクターであるｐＳＬＪ４９１（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：２８５−２９７）に挿入し、遺伝子導入ベクターｐＳＬＪＳＲＫ２８を構築した（図１）。
【００２０】
［実施例２］アグロバクテリウムの形質転換
植物へ遺伝子を導入する手法は、植物病原菌のアグロバクテリウムを用いたバイナリーベクター法によった。アグロバクテリウム株はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａ１３６株／ｐＣＩＢ５４２  （Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６８：  １２９１−１３０１）を用いた。遺伝子導入法として凍結融解法を採用し（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＩＩ  ｐｐ  Ｂ／１０−Ｂ／１２）、５０  ｍｇ／Ｌ  カマナマイシン（Ｋｍ）を含むＹＥＢ培地でｐＳＬＪＳＲＫ２８を含むＡ１３６株を選抜した。
【００２１】
［実施例３］  遺伝子受容植物の育成
遺伝子受容植物として、コマツナ（Ｂ．  ｒａｐａ）の品種「おそめ（タキイ種苗（株）））」を購入し、栽植して自殖種子を得、その中からＳ６０ホモ系統選抜して、これを用いた。おそめのＳ座位遺伝子型はＳ５２Ｓ６０ヘテロであり、花粉側でＳ５２はＳ６０に対して優性を示し、雌しべ側では共優性であった。ＳＬＧ特異的ｐｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲ法により（Ｎｉｓｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９２：  ３８８−３９４）、ＳＬＧ５２とＳＬＧ６０遺伝子をクローニングし、ＳＬＧ５２はＣｌａｓｓ  Ｉ  に属し、ＳＬＧ６０はＣｌａｓｓ  ＩＩに属することを確かめた。したがって、本実施例では、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｓ座位ホモ遺伝子型の植物が受容体となっている。
Ｓ２８（遺伝子供与植物）のＳ座位遺伝子型とＳ６０（遺伝子受容植物）−ハプロタイプ間の優劣性関係をあらかじめＳ２８Ｓ６０ヘテロ個体で調べたところ、雌しべ側ではＳ２８とＳ６０は共優性を示し、花粉側ではＳ２８はＳ６０に対して優性を示した。
【００２２】
［実施例４］    Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．の形質転換
実験は高崎らの方法（Ｔａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４７：  １２７−１３４，  特開平９−２５２６７）に改良を加えて行った。Ｓ６０ホモ系統の種子を無菌播種し、播種後６ー７日目の実生から胚軸（５−１０  ｍｍ）を切り出し、タバコのＢＹ−２のフィーダーセルを広げた共存培養培地  （ＭＳ  ｓａｌｔｓ，  １００  ｍｇ／ｌ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ，  １．３  ｍｇ／ｌ  ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ，  ２００  ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，  １ｍｇ／ｌ  ２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ    （２，４−Ｄ），  ３％ｓｕｃｒｏｓｅ，  ０．６％  ｐｈｙｔｏａｇａｒ）に移植し、２４時間，  ２５℃，  暗黒下で前培養を行った。
【００２３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを５０  ｍｇ／ｌ  カナマイシン  （Ｋｍ）と５０  ｍｇ／ｌ  ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  （Ｓｐｅｃ）含むＹＥＢ培地  （Ｇｒｉｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：  ３２８２−３２８６）を用いて、２００  ｒｐｍ，  ２８℃で一晩振盪培養した。ＯＤ６８０＝１．０  （１．２  ×  １０９  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ／  ｍｌ）に達した培養液を２００μＭ  アセトシリンゴンを含む共存培養液体培地で１０倍に希釈し、この液を感染液として使用した。共存培養培地で前培養した胚軸を感染液に３０分間浸漬してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを感染させた。その後、滅菌したペーパータオルの上で余分なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを取り除き、胚軸を共存培養培地に戻した。共存培養後、胚軸を５００  ｍｇ／ｌカルベニシリン  （Ｃｂ）を含むカルス誘導培地  （Ｂ５  ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎｓ，  １  ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ，  ３％  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ０．６％  ｐｈｙｔｏａｇａｒ，  ｐＨ  ５．８）に移植し、７日間培養した。その後、胚軸を１０ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３，  ５００  ｍｇ／ｌ  Ｃｂ，  １０  ｍｇ／ｌ  Ｋｍを含むシュート形成培地  （Ｂ５  ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎｓ，  ３  ｍｇ／ｌ  ＢＡ，  １  ｍｇ／ｌ  Ｚｅａｔｉｎ，  １％  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ０．６％  ｐｈｙｔｏａｇａｒ，  ｐＨ  ５．８）に移植した。１週間後、ＡｇＮＯ３フリーの同じ組成の新しい培地に継代し、その後２週間ごとに継代を続けた。６−８週間後、約２ｃｍに生長した緑色のシュートをカルスから切り離し、５００  ｍｇ／ｌ  Ｃｂと５０  ｍｇ／ｌ  Ｋｍを含むシュート成熟培地  （Ｂ５  ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎｓ，  １％  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ０．６％  ｐｈｙｔｏａｇａｒ，  ｐＨ  ５．８）に移植した。この間、すべてのプレート  （９０ｍｍ  ｘ  ２０ｍｍ）はサージカルテープ  （ＭｉｃｒｏｐｏｒｅＴＭ．，  ３Ｍ社）でシールし、２５℃，  ３０−４０  μＥｍ−２ｓ−１，  １６時間日長下で維持した。３週間後、カナマイシン耐性シュートを２５０  ｍｇ／ｌ  Ｃｂと５０  ｍｇ／ｌ  Ｋｍを含む発根培地  （Ｂ５  ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎｓ，  ２  ｍｇ／ｌ  ｉｎｄｏｌ−３−ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  （ＩＢＡ），  １％  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ０．６％  ｐｈｙｔｏａｇａｒ，  ｐＨ  ５．８）の入ったアグリポットに移植した。３−４週間後、発根したカナマイシン耐性幼植物をポットに移した。１ヶ月間の順化後、Ｐ１温室の移し、生育させた。
【００２４】
［実施例５］  形質転換体の確認
上記実施例４で得られたカナマイシン耐性植物の葉からＣＴＡＢ法  （Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  （１９８０）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ８：  ４３２１−４３２５）により、全ＤＮＡを抽出した。全ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、ジオキシゲニンでラベルしたＳＲＫ２８ｃＤＮＡ−Ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  （ＳＲＫ２８−ＫＤ）断片をプローブとしてサザンブロット解析を行った。ＳＲＫ２８−ＫＤを挿入してあるプラスミドは東北大学農学部遺伝育種学研究室から入手できる。ラベリング、ハイブリダイゼーション、洗浄、検出は、ＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）のマニュアルに従い行った。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、０．１ｘＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳで６５℃，  ２０分間を行い、これを２回行った。その結果、５個体にＳＲＫ２８導入遺伝子の存在を確認した。また、ＸｂａＩで切断し導入遺伝子のコピー数を推定したところ、これら形質転換体には１−４コピー導入されていた（図２）。
【００２５】
［実施例６］  交配実験による形質転換体の自家不和合性表現型の解析
得られた形質転換体における受粉時の花粉管行動を交配実験により調査した。花を花梗から摘み取り、寒天に挿し、所定の花粉と受粉後一晩放置した。翌日、雌ずいを１Ｎ  ＮａＯＨで６０℃，１時間半処理し、その後塩基性アニリンブルー液  （０．１Ｍ  Ｋ３ＰＯ４，  ０．１％アニリンブルー）に１時間浸漬し染色した。５０％無蛍光グリセリンをスライドグラスにたらし、カバーグラスで雌しべを押しつぶした後、蛍光顕微鏡で花粉管の行動を観察した。
【００２６】
得られた形質転換体の自家受粉はすべて不和合であった。形質転換体とＳ２８ホモ系統（遺伝子供与植物）間の正逆交配を行った結果、Ｎｏ．  ５の個体はＳ２８ホモ系統の花粉の雌しべ柱頭への侵入を抑制し、他の形質転換体は花粉管が侵入した（抑制しなかった）。一方、すべての形質転換体の花粉はＳ２８ホモ系統の雌しべに対して侵入した。また、形質転換体とＳ６０ホモ系統（遺伝子受容体植物）間の正逆交配の結果は、いずれも花粉管の侵入を抑制した。以上の結果から、Ｎｏ．  ５の個体の雌しべ表現型はＳ６０からＳ２８Ｓ６０に変化し、花粉表現型はＳ６０のままであることが明らかになった（表１）。
【００２７】
【表１】
0003619704.tif 000003
【００２８】
次に雌しべ表現型の変化がＳ２８特異的であるか否かを、形質転換体とＣｌａｓｓ  Ｉに属するＳ２４，  Ｓ４３，  Ｓ４５，  Ｓ５２ホモ系統及びＣｌａｓｓＩＩに属するＳ２９，  Ｓ４４ホモ系統間の正逆交配により調査した。Ｎｏ．  ５の個体とこれら６つＳテスターラインの正逆交配の結果はいずれにおいても花粉管の侵入が見られ、Ｎｏ．  ５の個体の雌しべ表現型の変化はＳ２８特異的であった。すなわち、ＳＲＫ２８遺伝子の導入によって、受容植物の雌しべにＳ２８特異性を付与できた。
【００２９】
［実施例７］  形質転換体におけるＳＲＫ２８遺伝子の発現解析
形質転換体、Ｓ６０ホモ系統及びＳ２８ホモ系統の開花２日前の雌しべからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＭｉｃｒｏ−Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて抽出した。ノーザンブロット解析はＷａｔａｎａｂｅらの方法  （Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３５：  １２２１−１２２９）に従い行った。プローブとしてジゴキシゲニンで標識したＳＲＫ２８−ＫＤ，  ＳＬＧ２８ｃＤＮＡ，  ＳＬＧ６０−ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ及びβＡＴＰａｓｅを用いた。プローブに用いたＤＮＡは東北大学農学部遺伝育種研究室と（株）採種実用技術研究所から入手できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、０．１ｘＳＳＣ，  ０．１％  ＳＤＳで６５℃，  ２０分間を行い、これを２回行った。ＳＲＫ２８−ＫＤをプローブしたノーザンブロット解析の結果、形質転換体の中では雌しべ表現型がＳ２８Ｓ６０に変化したＮｏ．５の個体においてのみＳＲＫ２８導入遺伝子の発現が確認された。一方、他の形質転換体ではＳＲＫ２８導入遺伝子の発現は認められなかった。ＳＬＧ２８ｃＤＮＡをプローブしたノーザンブロット解析の結果、ＳＬＧ２８様遺伝子の発現はどの形質転換体にも認められなかった。また、すべての形質転換体の内在ＳＬＧ６０及びＳＲＫ６０遺伝子の発現は正常であった（図３）。
以上の実験から、Ｎｏ．  ５の個体では、ＳＲＫ２８遺伝子が１コピー導入され、雌しべで発現していることが示された。その結果、Ｓ２８花粉に対し不和合となり、雌しべ表現型がＳ６０からＳ２８Ｓ６０に変化したと判断された。
【００３０】
［実施例８］  自殖次代及び他殖当代におけるＳＲＫ２８導入遺伝子の確認
Ｎｏ．  ５の個体を蕾受粉して自殖種子（Ｔ１）を得ると共に、Ｓ５２及びＳ６０ホモ系統にＮｏ．  ５の個体の花粉を受粉してＳ５２ｘＮｏ．５とＳ６０ｘＮｏ．５の種子を得た。自殖及び他殖植物の葉から抽出したをゲノミックＤＮＡを鋳型に、ＳＲＫ２８導入遺伝子に特異的なプライマーＰＫ２８（５’−ＣＣＴＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧ−３’）とＰＫ４（５’−ＣＡＡＴＣＣＣＡＡＡＡＴＣＣＧＡＧＡＴＣＴ−３’，  Ｎｉｓｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９５：３３５−３４２）を用いたＰＣＲ法によりＳＲＫ２８遺伝子の存在の有無を確認した。なお、プライマーＰＫ２８はＳＲＫ２８遺伝子の膜貫通ドメインの配列に従い、ＰＫ４はＳＲＫ２８遺伝子の第４エクソンの配列に従って合成した。ＰＣＲ反応は９４℃  １ｍｉｎ，  ５５℃  ２ｍｉｎ，  ７２℃  ３ｍｉｎを３０サイクル行い、更に７２℃  ５ｍｉｎの反応を行った。ＳＲＫ２８導入遺伝子をもつ個体では、期待通りに６４８ｂｐのバンドが増幅された。
【００３１】
上記のプライマー組合せで、Ｓ５２ｘＮｏ．５の個体ではわずかにＳＲＫ５２遺伝子の増幅も認められたので、Ｓ５２ｘＮｏ．５個体についてはＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（Ｎｉｓｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９２：  ３８８−３９４）により、ＳＲＫ２８遺伝子の存在の有無を確認した。Ｓ２８−Ｎ（５’−ＡＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡ−３’）とＯｃｋＢ（５’−ＣＣＴＣＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧ−３’）を用い、上記条件下でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物をＭｂｏＩで消化した後、５％アクリルアミドで電気泳動し、銀染色法によりバンド多型を検出した。ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果、ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つ個体と持たない個体は、自殖次代では１６個体と４個体に分離し、一遺伝子を仮定したときの分離比３：１と良く適合した。Ｓ６０ｘＮｏ．５では６個体と５個体に分離し、Ｓ５２ｘＮｏ．５では６個体と５個体ずつ分離した。この結果も単遺伝子の分離に期待される１：１の分離比に適合する。すなはち、導入したＳＲＫ遺伝子は通常の遺伝子と同様な遺伝子行動をしていることが分かった。
【００３２】
［実施例９］  自殖次代及び他殖当代における自家不和合性表現型
上記実施例６の方法に従い、自殖次代、Ｓ６０ｘＮｏ．５及びＳ５２ｘＮｏ．５における花粉管行動を交配実験により調査した。自殖次代では、ＳＲＫ２８導入遺伝子をもつ１６個体の雌しべはＳ２８花粉とＳ６０花粉の花粉管侵入を特異的に抑制した。これら個体の花粉はＳ２８雌しべ上では花粉管を侵入させ、Ｓ６０雌しべに対して花粉管が侵入できなかった。一方、ＳＲＫ２８導入遺伝子をもたない４個体の雌しべと花粉はＳ２８の花粉と雌しべに対して、それぞれ花粉管を侵入させ、Ｓ６０の花粉と雌しべに対しては花粉管を侵入できなかった。また、Ｓ６０ｘＮｏ．５のＳＲＫ２８導入遺伝子をもつ６個体と持たない個体５個体でも同様の結果が得られた。
【００３３】
Ｓ５２ｘＮｏ．５では、ＳＲＫ２８導入遺伝子をもつ６個体の雌しべはＳ２８，  Ｓ５２及びＳ６０の花粉管侵入を特異的に抑制した。これら個体の花粉はＳ２８及びＳ６０の雌しべに対していずれも花粉管を侵入させ、Ｓ５２雌しべに対しては花粉管の侵入が出来なかった。一方、ＳＲＫ２８導入遺伝子をもたない５個体の雌しべはＳ２８の花粉と雌しべに対して花粉管侵入に抑制はなく、Ｓ５２及びＳ６０の花粉に対しては花粉管侵入を抑制した（表２）。
【００３４】
【表２】
0003619704.tif 000004
【００３５】
［実施例１０］  自殖次代及び交雑植物におけるＳＲＫ２８導入遺伝子の発現
実施例７の方法に従い、自殖次代とＳ６０ｘ  Ｎｏ．  ５の雌しべからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により、ＳＲＫ２８導入遺伝子の発現を調査した。ＳＲＫ２８−ＫＤをプローブとして用いた結果、ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つ個体ではいずれもＳＲＫ２８導入遺伝子の発現が確認されたが、持たない個体ではＳＲＫ２８導入遺伝子の発現は認められなかった。ＳＬＧ２８ｃＤＮＡをプローブしたノーザンブロット解析の結果、ＳＬＧ２８様遺伝子の発現はどの形質転換体にも認められず、また、すべての形質転換体の内在ＳＬＧ６０及びＳＲＫ６０遺伝子の発現は正常であった（図４）。
【００３６】
以上の結果から、ＳＲＫ２８導入遺伝子をもつ個体の雌しべのｍＲＮＡに関する表現型は、それぞれの遺伝子型と一致し、また、花粉管の行動も導入ＳＲＫ２８および内在Ｓ座位遺伝子から推定される特性と一致した。
【００３７】
［実施例１１］  交配次代のＳ２８花粉に対する種子稔性
Ｓ６０ｘ  Ｎｏ．  ５及びＳ５２ｘ  Ｎｏ．  ５の各個体の当日開花した雌しべにＳ２８花粉を受粉した場合の結莢率及び種子稔性について調査した。Ｎｏ．  ５個体には、ＳＲＫ２８遺伝子が１コピー導入されていた。よって、Ｓ６０ｘ  Ｎｏ．  ５及びＳ５２ｘ  Ｎｏ．  ５の各個体中、ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つ個体は導入遺伝子を１コピーで持つものと考えられる。ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つＳ６０  ｘ  Ｎｏ．  ５の結莢率は５２．３％で、種子稔性は２．３であった。一方、ＳＲＫ２８導入遺伝子を持たないＳ６０ｘ  Ｎｏ．  ５の結莢率は１００％で、種子稔性は１０．９であり、Ｓ６０にＳ２８花粉を受粉した場合の結莢率及び種子稔性とほぼ等しかった（表３）。
【００３８】
【表３】
0003619704.tif 000005
【００３９】
ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つＳ５２ｘ  Ｎｏ．  ５の個体は結莢率は９．６％で、種子稔性は０．２３であった。一方、ＳＲＫ２８導入遺伝子を持たないＳ６０ｘ  Ｎｏ．  ５の結莢率は１００％で、種子稔性は１５．９であり、Ｓ５２Ｓ６０にＳ２８花粉を受粉した場合の結莢率及び種子稔性とほぼ等しかった（表３）。ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つＳ５２ｘ  Ｎｏ．  ５個体がＳＲＫ２８導入遺伝子を持つＳ６０ｘ  Ｎｏ．  ５の個体に比べ、結莢率、種子稔性が低かった。これは、ＳＲＫ２８導入遺伝子はＣｌａｓｓ  Ｉに属し、Ｃｌａｓｓ  ＩＩであるＳ６０のバックグランドよりも  Ｃｌａｓｓ  ＩであるＳ５２のバックグランドで効率よく機能したためと考えられた。
一方、ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つＳ６０ｘ  Ｎｏ．  ５及びＳ５２ｘ  Ｎｏ．  ５の個体の花粉をＳ２８雌しべに受粉した場合の結莢率及び種子稔性は、Ｓ６０及びＳ５２Ｓ６０花粉をＳ２８雌しべに受粉した場合の結莢率及び種子稔性とほぼ等しかった（表４）。
【００４０】
【表４】
0003619704.tif 000006
【００４１】
本実施例によって、ＳＲＫ遺伝子導入植物の雌しべはそれに相応するＳ座位特異性を持つ花粉の花粉管侵入を抑制し、受精を妨げ、結実できないことが明らかである。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の方法により、特定のＳ座位型を持つ花粉の受精を選択的に排除できる植物を作出できる。これにより、効率的なＦ１採種が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＲＫ遺伝子導入ベクターの設計と構築の概要を示す図である。
【図２】サザンハイブリダイゼーションによりＳＲＫ２８導入遺伝子の存在を示す写真である。
Ａ：  ＨｉｎｄＩＩＩで切断
Ｂ：  ＸｂａＩで切断
レーン６０：  非形質転換体（Ｓ６０）      レーン１−５：形質転換体
【図３】ノーザンハイブリダイゼーションによるＳＲＫ２８導入遺伝子の発現を示す写真である。
レーン６０：  非形質転換体（Ｓ６０）、レーン２８：  遺伝子供与体（Ｓ２８）、レーン１−５：形質転換体、レーン２８には１μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、他のレーンには２μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  をロードしている。用いたプローブの種類を右側に示す。
【図４】ノーザンハイブリダイゼーションによる自殖次代のＳＲＫ２８導入遺伝子の発現を示す写真である。
レーン６０：  非形質転換体（Ｓ６０）、レーン２８：  遺伝子供与体（Ｓ２８）、レーン２８６０：  Ｓ２８Ｓ６０、レーン１−５：  ＳＲＫ２８導入遺伝子を持つ個体、レーン６−９：  ＳＲＫ２８導入遺伝子を持たない個体、レーン２８には１μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、他のレーンには２μｇ  ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  をロードしている。用いたプローブの種類を右側に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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