(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦに結合可能な抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片はＴＮＦへ結合すると、前記ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性が促進され、前記ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行および受容体結合活性が阻害され、一方で前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性は影響されず、
ＴＮＦへの前記抗体又はその断片の結合は、残基１２−２２、３６−４５、９６−１０５、そして１３２−１５７のトポグラフイック領域によって定義されるＴＮＦのエピトープが、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げること特徴とする抗体又はその断片。
【請求項２】
ヒトＴＮＦに結合可能な抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片はＴＮＦへ結合すると、前記ＴＮＦの細胞毒性および受容体結合活性が阻害され、一方で前記ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性は影響されず、
ＴＮＦへの前記抗体又はその断片の結合は、残基１２−２２、３６−４５、９６−１０５、そして１３２−１５７のトポグラフイック領域によって定義されるＴＮＦのエピトープが、自然発生的な生物学的活性リガンドに結合することを妨げること特徴とする抗体又はその断片。
【請求項３】
残基１２−２２、３６−４５、９６−１０５、そして１３２−１５７のトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合することを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項記載の抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片は、抗体、Ｆ（ａｂ）断片、単一ドメイン抗体（dAbs）再構成抗体、一本鎖抗体からなる群から選択されることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項５】
請求項４記載の抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片はモノクローナル抗体またはそのＦ（ａｂ）断片であることを特徴とする抗体又はその断片。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項記載の抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片は、ＭＡｂ２５（ＥＣＡＣＣ  ８９１２１４０１）であることを特徴とする抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ヒト腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）に結合するリガンドであって、この結合によってＴＮＦの生物学的活性が修飾されるものに関する。ここでいう修飾は、すでに明らかにされているような、ＴＮＦアルファに結合してＴＮＦアルファの活性すべてを阻害する抗体によるものとは異なるものである。新規の発見は、ＴＮＦアルファの異なる活性を選択的に阻害したり、促進したりするものである。また、本発明は、ＴＮＦに結合する分子を含む組成物と、ＴＮＦに対して活性を示す分子およびＴＮＦを用いた治療方法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）は、活性マクロファージによって産生されるもので、バシラス・カルメッテグエリン（Bacillus Calmette-Guerin）またはコリネバクテリリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）によってプレセンシタイズされ、エンドトキシン（ＬＰＳ）によってチャレンジされた実験動物の血清中において最初に発見された。ＴＮＦの計画的な（systematic）投与によって、出血性の壊死が、マウスの移植可能な腫瘍に見出されることがあった。一方、インビトロ系ではＴＮＦは腫瘍細胞系に対して細胞溶解性または細胞増殖抑制性効果を示す。
【０００３】
宿主保護効果に加えて、ＴＮＦは敗血症、悪液質、そして脳マラリア（cerebral malaria）の原因となる因子とみなされてきた。ＴＮＦに対する多クローン性ウサギ血清によるマウスの受動免疫は、感染に先立ってされた場合、中毒ショックのイニシエート剤であるＬＰＳエンドトキシンの致死効果からマウスを守ることが示されている。
【０００４】
ＴＮＦをコードする遺伝子はクローン化されており、潜在的なガン治療剤としてこのモノカインの有用性を調査することを可能にしている。
【０００５】
一方、ステージ１臨床治験における癌患者へのＴＮＦ点滴によって腫瘍が退行するが、一方で血小板減少症、リンパ球減少症、肝毒性、腎臓障害、そして高血圧症などのような副作用が報告されている。ＴＮＦの臨床での使用に伴うこれらの顕著な副作用は、数多くの知られているＴＮＦの効果から予測されるものであり、そのいくつかは第１表に挙げられている。
【０００６】
第１表
ＴＮＦの生物学的活性
抗腫瘍活性
抗ウイルス活性
抗寄生虫活性
機能
腫瘍細胞に対する細胞毒性作用
（腫瘍起因性）血管形成作用
発熱原活性
リポタンパク質リパーゼ阻害化
好中球活性化
破骨細胞活性
内皮細胞、単球、そして腫瘍細胞プロコアグラント活性の誘導
内皮細胞上の表面抗原誘導
ＩＬ-６誘導
ｃ-ｍｙｃおよびｃ-ｆｏｓの誘導
EGF受容体の誘導
ＩＬ-１の誘導
ＴＮＦ合成の誘導
ＧＭ-ＣＳＦ合成の誘導
プロスタグランジンおよびコラゲナーゼ合成増加
急性相タンパク質Ｃ３の誘導
【０００７】
とくに重要な点は、内皮および抹消血単球のＴＮＦ活性化の結果として起こる凝固活性化にある。播種性血管内凝固は中毒ショック（toxic shock）に関連しており、また胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、子宮癌、メラノーマ、急性白血病、骨髄腫、骨髄増殖性症候群、そして骨髄芽性白血症などを含む多くの癌に関連している。腫瘍退行活性には影響がないが、凝固活性化のような好ましくない効果が除去またはマスクされるようなＴＮＦ活性の修飾は、明らかにより一層癌治療に有益なものとなるが、一方でＴＮＦ活性の完全な廃止が中毒ショックの完全治癒に求められる。
【０００８】
部位特異性抗体（多クローンおよびモノクローン）の利用によるホルモン活性の分離によってホルモン活性を強めることができる（Aston 1989, Mol. Immunol. 26, 435）。今日、３次元構造が既知のＴＮＦ分子の特定領域に対する機能または抗原性を同定する試みがほとんどなされていない。そのような領域に対する機能の同定は、治療目的に合ったモノクローン抗体および他のリガンドの開発を可能とする。アミノ酸１から１５に対するポリクローン性抗体は、ＴＮＦによるHeLa  R19細胞受容体結合を阻害することが報告されている（Socher et al., 1987, PNAS 84, 8829）。一方で、ＴＮＦ上の未決定の構造的エピトープを認識するモノクローン抗体がインビトロ系でＴＮＦの細胞毒性活性を阻害することが報告されている（Bringman and Aggarwal, 1987,Hybridoma 6, 489）。しかし、これらの抗体が他のＴＮＦ活性に対してどのような効果を示すかは明らかではない。
【０００９】
本発明者は、ヒトＴＮＦに対して活性を示す一連のモノクローン抗体群を作った。そして、ＴＮＦの抗腫瘍効果（インビトロおよびインビボ系）と、ＴＮＦ受容体結合と、凝固の活性化（インビトロおよびインビボ系）に関しての影響について特徴づけ、そしてそれらのトポグラフィックな特異性を定義した。このようなアプローチによって、本発明者はＴＮＦアルファの異なるトポグラフィック領域が、異なる活性に関係していることを発見した。したがって、本発明者は、ＴＮＦアルファ活性を選択的に高めるか阻害するリガンドまたは抗体の同定を可能とし、それによってＴＮＦアルファを含む改善された治療薬や治療方法を提供する。
【００１０】
本発明の第一の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるもので、このリガンドがＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの下記生物学的活性が阻害される。
１．腫瘍退行
２．内皮プロコアギュラントの誘導
３．腫瘍フイブリン沈着の誘導
４．細胞毒性
５．受容体結合
【００１１】
本発明の全ての態様における好ましい実施形態では、リガンドは抗体、Ｆ（ａｂ）断片、再構成抗体（ＣＤＲ移植ヒト化抗体（grafted humanised antibodies））単一ドメイン抗体（dAbs）、単一鎖抗体、血清結合タンパク質、受容体、そして天然の阻害剤から選択される。また、リガンドは合成されたタンパク質またはぺプチドであって前記断片のひとつと類似している。しかし、好ましくは、リガンドはモノクローン抗体またはそのＦ（ａｂ）断片である。
【００１２】
本発明の第二の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであって、ＴＮＦへのリガンドの結合によって、残基１-１８、５８-６５、１１５-１２５、そして１３８-１４９からなるトポグラフイック領域、または残基１-１８、１０８-１２８からなるトポグラフイック領域、または残基５６-７９、１１０-１２７、そして１３５-１５５からなるトポグラフイック領域が実質的に、自然発生的な生物学的活性リガンドに対する結合から遮るようにして、リガンドがＴＮＦに結合することによって、ＴＮＦによる内皮プロコアギュラント誘導、腫瘍退行、腫瘍フイブリン沈着誘導、細胞毒性、そして受容体結合の活性を阻害することを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の第三の発明は、主として残基１-２０からなるトポグラフィック領域と、残基５６-７７からなるトポグラフイック領域と、残基１０８-１２７からなるトポグラフイック領域と、そして残基１３８-１４９からなるトポグラフイック領域からなる群から選択される少なくとも２つの領域において、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものである。
【００１４】
本発明の第三の発明にもとづく好適な実施態様では、リガンドはトポグラフイック領域１-１８、５８-６５、１１５-１２５、そして１３８-１４９においてヒトＴＮＦと結合する。このような配列からなる領域をトポグラフイックにして第２３図に示した。
【００１５】
本発明の第三の発明にもとづくより好適な実施態様では、リガンドはトポグラフイック領域１-１８および１０８-１２８においてヒトＴＮＦと結合する。このような配列からなる領域をトポグラフイックにして第２４図に示した。
【００１６】
本発明の第二の発明にもとづくより好適な実施態様では、リガンドはトポグラフイック領域５６-７９、１１０-１２７、そして１３６-１５５においてヒトＴＮＦと結合する。このような配列からなる領域をトポグラフイックにして
第２５図に示した。
【００１７】
本発明の第一、第二および第三の発明にもとづく特に好適な実施態様では、リガンドは、ＭＡｂ１、ＭＡｂ４７、そしてＭＡｂ５４と命名されたモノクローン抗体からなる群から選択されるモノクローン抗体である。ＭＡｂ１、ＭＡｂ４７、そしてＭＡｂ５４を産生するハイブリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ寄託された。ＭＡｂ１は、１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０１である。ＭＡｂ５４は、１９８９年８月３１日に寄託され、その登録番号は８９０８３１０３である。ＭＡｂ４７は、１９８９年１２月１４日に寄託され、その登録番号は８９１２１４０２である。
【００１８】
本発明の第四の発明は、本発明の第一、第二または第三の発明にもとづくリガンドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものであって、ＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とする。
【００１９】
本発明の第五の発明は、本発明の第一、第二または第三の発明にもとづくリガンドもしくは本発明の第四の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与することからなる中毒ショック治療方法からなるものである。
【００２０】
本発明の第六の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであって、このリガンドはＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性を阻害し、内皮細胞上の受容体へのＴＮＦ結合を阻害し、そしてＴＮＦによる腫瘍フイブリン沈着誘導および腫瘍退行活性を促進させるが、一方で細胞毒性は影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性については影響を受けないかあるいは促進されることを特徴としている。
【００２１】
本発明の第七の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドに関するものであって、このリガンドはＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性を阻害し、内皮細胞上の受容体へのＴＮＦ結合を阻害し、そしてＴＮＦによる腫瘍フイブリン沈着誘導および腫瘍退行活性を促進させ、ＴＮＦの細胞毒性及び受容体結合活性は影響されず、ＴＮＦへのこのリガンドの結合は、残基１-３０、１１７-１２８、そして１４１-１５３からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが自然発生的な生物学的活性リガンドへの結合を遮られることを特徴とする。
【００２２】
本発明の第八の発明は、残基１-３０、１１７-１２８、そして１４１-１５３からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなる。
【００２３】
この第八の発明の好適な実施態様では、リガンドは残基１-２６、１１７-１２８、そして１４１-１５３のトポグラフィック領域においてヒトＴＮＦへ結合する。そのような配列からなる領域は、トポグラフイックに第２６図に示した。
【００２４】
本発明の第六、第七および第八の発明にもとづく好適な実施態様では、リガンドは、ＭＡｂ３２と命名されたモノクローン抗体である。ＭＡｂ３２を産生するハイブリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０２である。
【００２５】
本発明の第九の発明は、本発明の第六、第七または第八の発明にもとづくリガンドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成物は、そのＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とする。投与されたサイトカインの活性を修飾するためにモノクローン抗体（MAb）とともにＴＮＦを投与することを開示した文献はいままでのところない。
【００２６】
本発明の第十の発明は、本発明の第六、第七または第八の発明にもとづくリガンド、又は本発明の第九の発明における組成物のどちらか一方を投与することを含むもので、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する腫瘍処置方法からなるものである。
【００２７】
本発明の第十一の発明は、ヒトＴＮＦの残基１-１８へ結合するリガンド（ペプチド３０１）からなるものである。
【００２８】
本発明の第十二の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであって、このリガンドはＴＮＦへ結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性を阻害し、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着誘導および腫瘍退行を促進させるが、ＴＮＦの細胞毒性は影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響されないかあるいは促進され、リガンドのＴＮＦへの結合は、残基１ー１８からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的活性リガンドへの結合を遮られることを特徴とするものである。
【００２９】
本発明の第十三の発明は、本発明の第１１または第１２の発明にもとづくリガンドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものである。この組成物は、そのＴＮＦに対してリガンドが結合していることを特徴とするものである。
【００３０】
本発明の第十四の発明は、本発明の第十一または第十二の発明にもとづくリガンド、又は本発明の第十三の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与することを含む、ＴＮＦによって腫瘍の増殖を阻害する腫瘍処置方法からなるものである。
【００３１】
本発明の第十五の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであって、このリガンドはＴＮＦへ結合すると、ＴＮＦの細胞毒性および腫瘍退行活性は影響されず、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導、及び腫瘍フイブリン沈着誘導の活性を阻害するが、ＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響されないことを特徴とするものである。
【００３２】
本発明の第十六の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドからなるものであって、このリガンドは、ＴＮＦへ結合すると、ＴＮＦの細胞毒性および腫瘍退行の活性は影響されないが、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導およひ腫瘍フイブリン沈着誘導の活性は阻害され、さらにＴＮＦの腫瘍受容体結合活性は影響されず、。リガンドのＴＮＦへの結合は、残基２２-４０，４９-９７、１１０-１２７、そして１３６-１５３からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的活性リガンドにへ結合するのを妨げることを特徴とする。
【００３３】
本発明の第十七の発明は、残基２２-４０，４９-９７、１１０-１２７、そして１３６-１５３からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦへ結合するリガンドからなるものである。そのような配列からなる領域は、トポグラフイックに第２７図に示した。
【００３４】
本発明の第十七の発明の好適な実施態様では、残基２２-４０，４９-９６、１１０-１２７、そして１３６-１５３からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦへ結合するリガンドからなるものである。この領域はＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する
【００３５】
本発明の第十五、第十六および第十七の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ４２と命名たモノクローン抗体である。このＭＡｂ４２を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０４である。
【００３６】
本発明の第十八の発明は、本発明の第十五、第十六または第十七の発明にもとづくリガンドと組み合わさってＴＮＦを含む組成物からなるものであって、ＴＮＦに対してリガンドが結合することを特徴とするものである。
【００３７】
本発明の第十九の発明は、本発明の第十五、第十六または第十七の発明にもとづくリガンド、又は本発明の第十八の発明にもとづく組成物のどちらか一方を投与することを含むもので、ＴＮＦの作用によって腫瘍の増殖を阻害する腫瘍処置方法からなるものである。
【００３８】
本発明の第二十の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性には影響を与えないが、細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性を阻害することを特徴とするものである。
【００３９】
本発明の第二十一の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性には影響を与えないが、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性を阻害し、このリガンドのＴＮＦへの結合は、残基１２-２２，３６-４５、９６-１０５、そして１３２-１５７からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドによって遮る事を特徴とするものである。
【００４０】
本発明の第二十二の発明は、残基１２-２２，３６-４５、９６-１０５、そして１３２-１５７からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦへ結合するリガンドからなるものである。この領域はＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する。そしてトポグラフイックに第２８図に示した。
【００４１】
本発明の第二十、第二十一および第二十二の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ２５と指定しれたモノクローン抗体である。このＭＡｂ２５を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ１９８９年１２月１４日に寄託され、その登録番号は８９１２４０１である。
【００４２】
本発明の第二十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものであって、このリガンドはＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント誘導、そしてＴＮＦの受容体結合活性を阻害することを特徴とするものである。
【００４３】
本発明の第二十四の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性を促進させ、一方で、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント誘導、そして受容体結合活性を阻害し、このＴＮＦへのリガンドの結合は、残基１-２０および７６-９０からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドへ結合するのを遮ぎる事を特徴とするものである。
【００４４】
本発明の第二十五の発明は、残基１-２０および７６-９０からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものである。これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する。そしてトポグラフイックに第２９図に示した。
【００４５】
本発明の第二十五の発明の好適な実施態様では、リガンドは残基１-２８および７６-９０からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結合する。
【００４６】
本発明の第二十三、第二十四および第二十五の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ２１と命名されたモノクローン抗体である。このＭＡｂ２１を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ１９９０年１月２５日に寄託され、その登録番号は９００１２４３２である。
【００４７】
本発明の第２６の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性には影響が及ばず、しかしＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント誘導活性、そして受容体結合活性が阻害されることを特徴とするものである。
【００４８】
本発明の第２７の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着活性には影響せず、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、内皮プロコアギュラント誘導、そして受容体結合活性が阻害され、このＴＮＦへのリガンドの結合は、残基２２-４０、６９-９７、１０５-１２８、そして１３５-１５５からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドへ結合するのを遮ぎるものである事を特徴とする。
【００４９】
本発明の第二十八の発明は、残基２２-４０、６９-９７、１０５-１２８、そして１３５-１５５からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものである。これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する。そしてトポグラフイックに第３０図に示した。
【００５０】
本発明の第二十六、第二十七および第二十八の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ５３と命名されたモノクローン抗体である。このＭＡｂ５３を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ１９９０年１月２５日に寄託され、その登録番号は９００１２４３３である。
【００５１】
本発明の第二十九の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着、内皮プロコアギュラント誘導、細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性は影響されない事を特徴とするものである。
【００５２】
本発明の第三十の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの腫瘍フイブリン沈着、内皮プロコアギュラント誘導、細胞毒性、腫瘍退行、そして受容体結合活性は影響されず、このＴＮＦへのリガンドの結合は、残基２２-３１および１４６-１５７からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが、実質的に自然発生的な生物学的リガンドへ結合することを遮ぎるものである事を特徴とする。
【００５３】
本発明の第三十一の発明は、残基２２-３１および１４６-１５７からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものである。これらの領域は、ＴＮＦアルファの３Ｄ構造に近似する。そしてトポグラフイックに第３１図に示した。
【００５４】
本発明の第二十九、第三十および第三十一の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ３７と命名されたモノクローン抗体である。このＭＡｂ５３を産生するハイリドーマからなる細胞系統の試料は、英国（Porton Down, Salisbury, Wilthshire SP4 OJG, United Kingdom）にあるヨーロピアンコレクションオブアニマルセルカルチャーズ（European Collection of Animal Cell Cultures; ECACC）、ワクチン開発製造研究所（Vaccine Research and Production Laboratory）、公衆衛生ラボラトリーサービス（Pubic Health Laboratory Service）、応用微生物学研究センター（Centre for Applied Microbiology and Research）へ１９８９年８月３日に寄託され、その登録番号は８９０８０３０３である。
【００５５】
本発明の第三十二の発明は、ヒトＴＮＦに結合するリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性は影響されず、一方で、細胞毒性、腫瘍退行、腫瘍フイブリン沈着、そしてＴＮＦの受容体結合活性を阻害することを特徴とする。
【００５６】
本発明の第三十三の発明は、ヒトＴＮＦに結合可能なリガンドであって、このリガンドはＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導は影響されず、一方、ＴＮＦの細胞毒性、腫瘍退行、腫瘍フイブリン沈着、そして受容体結合活性は阻害され、このＴＮＦへのリガンドの結合は、残基２２-４０および４９-９８からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが実質的に自然発生的な生物学的リガンドへ結合するのを遮ぎる物であることを特徴とする。
【００５７】
本発明の第三十四の発明は、残基２２-４０からなるトポグラフイック領域、残基４９-９８からなるトポグラフイック領域、そして残基６９-９７からなる
トポグラフイック領域からなる群から選択される少なくともひとつの領域においてヒトＴＮＦに結合するリガンドからなるものである。
【００５８】
本発明の第三十四の発明の好適な実施態様では、リガンドは残基４９-９８からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合する。この領域は、トポグラフイックに第３２図に示した。
【００５９】
本発明の第三十四の発明のより好適な実施態様では、リガンドは残基２２-４０および７０-８７からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦと結合する。この領域は、ＴＮＦの３Ｄ構造に近似し、トポグラフイックに第３２図に示されている。
【００６０】
本発明の第三十二、第三十三および第三十四の発明の好適な実施態様では、リガンドはＭＡｂ１１またはＭＡｂ１２と命名されたモノクローン抗体である。
【００６１】
本発明の第三十五の発明は、ヒトＴＮＦに結合することが可能なリガンドであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導活性を阻害する事を特徴とする。
【００６２】
本発明の第三十六の発明は、ヒトＴＮＦに結合することが可能なリガンドからなるものであって、ＴＮＦに結合すると、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント誘導を阻害し、ＴＮＦへのリガンドの結合は、残基１０８-１２８からなるトポグラフイック領域によって規定されるＴＮＦのエピトープが、実質的に自然発生的な生物学的リガンドへ結合するのを遮ぎるものである事を特徴とする。
【００６３】
本発明の第三十七の発明は、残基１０８-１２８からなるトポグラフイック領域においてヒトＴＮＦへ結合するリガンドからなる。
【００６４】
本発明の第三十五、第三十六および第三十七の発明の好適な実施態様では、リガンドは、ＭＡｂ１、ＭＡｂ３２、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５３そしてＭＡｂ５４と命名されたモノクローナル抗体からなる群から選択されるリガンドである。
【００６５】
ここで述べられているＴＮＦの生物学的活性は、「腫瘍退行」、「内皮プロコアギュラント」「腫瘍フイブリン沈着誘導」、「細胞毒性」、そして「受容体結合」という用語の意味は下記の方法によって決定される。
【００６６】
「単一ドメイン抗体」という用語は、ワードらの文献（Nature 341, 544-546, 1989）に開示されたような抗体断片を意味するように使用される。
本発明をより一層明らかにするために、好ましい態様を下記の実施例と添付された図面をもとにして記載する。
【００６７】
動物および腫瘍細胞系統
すべての実験において用いられたマウスは、ＣＳＩＲＯ動物施設から入手した生後１０-１２週間の雌でＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスである。ＭｅｔｈＡ固形腫瘍およびＭｅｔｈＡ腹水腫瘍の細胞株は、オルド博士（Dr. Lloyd J. Old, Sloan Kettering Cancer Centre）に提供して頂いた。また、ＷＥＨＩ-１６４繊維肉腫系統は、チャウドリ博士（Dr. Geeta Chauhdri, John Curtin School of Medical Research, Autralian National University）に提供して頂いた。
【００６８】
ハイブリドーマの融合と産生
完全フロイトアジュバント中の１０μｇのヒト組換え体ＴＮＦをマウスの腹腔内に注入してマウスを免疫した。その一ヶ月後に、完全フロイントアジュバントに中の１０μｇのＴＮＦを投与した。六週間後および融合四日前に、ＰＢＳ中の１０μｇのＴＮＦでマウスをブーストした。免疫されたマウスから得た脾臓細胞をラスジェンとアンダーウッドの方法（Rathjen & Underwood, Mol. Immunol. 23, 441. 1986）にもとづいてミエローマｓｐ２／０と融合させた。ラジオイムノアッセイによって抗ＴＮＦ抗体を産生することが判明した細胞系統をマウス腹腔マクロファージからなる支持細胞層（feeder layer）上で限界希釈によりサブクローン化した。さらに、抗体のサブクラスは、ＥＬＩＳＡ（Misotest, Commonwealth Serum Laboratories）によって決定した。
【００６９】
ラジオイムノアッセイ
標準的な方法によってラクトぺルオキシダーゼを用いてＴＮＦをヨウ素化した。ハイブリドーマの培地の上清（５０μｌ）を125Ｉ-ＴＮＦ（20,000 cpm/50ul）とともに一晩、４℃でインキュベートとした。そして、１００μｌのＳａｃ-Ｃｅｌ（ロバ抗マウス／ラット免疫グロブリン被覆セルロース，Wellcome Diagnositics）を添加し、さらに室温（２０℃）で２０分間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、１ｍｌのＰＢＳを添加し、そして試験管を２，５００ｒｐｍで５分間遠心した。この遠心後、上清をデカントして、沈澱物の放射活性を測定した。
【００７０】
抗体-抗体拮抗アッセイ
モノクローン抗体間の特性比較を行なうために、固定化抗原（ＬＡＣＴ）または抗体（ＰＡＣＴ）のどちらか一方を用いて拮抗アッセイを行なった（Aston & Ivanyi, 1985, Pharmac. Therapeut. 27, 403）。
【００７１】
ＰＡＣＴ
１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）によって非特異的結合部位をブロックするのに先立って、フレキシブルなマイクロタイタートレーを、モノクローン抗体（マウス腹水から得られた硫酸ナトリウム沈澱グロブリンを100μｇ／mlで含む重炭酸ナトリウム緩衝液、0.05M、pH9.6）で一晩、４℃で静置してコートした。固定された抗体への125Ｉ-ＴＮＦの結合は、種々の濃度の二次抗ＴＮＦモノクローン抗体存在下で決定した。抗体およびＴＮＦは同時に添加され、そしてＰＢＳ（４回）による洗浄に先立って２４時間インキュベートされた。そして、ウエルの結合放射活性を測定した。１００％結合は、異種のモノクローン抗体の非存在下で決定され、一方１００％拮抗は、過剰な同種のモノクローン抗体存在下で決定された。すべての希釈はＢＳＡ／ＰＢＳにて行なった。
【００７２】
ＬＡＣＴ
プロテインＡで精製済み、且つ放射能で標識したモノクローン抗体の、ＴＮＦ被覆マイクロタイターウエルへの結合は、種々の濃度の二次モノクローン抗体存在下で決定した。マイクロタイタープレートは前記のようにしてＴＮＦ（５０μｇ／ｍｌ）がコートされている。125Ｉ-モノクローン抗体（３０，０００ｃｐｍ）を添加して２４時間保つ前に、拮抗する抗体（５０μｌ）をプレート上で４時間、４℃でプレインキュベートした。ウエルに結合した放射能の測定は、ＰＢＳでウエルを４回洗った後に行なった。１００％結合は、拮抗する抗体の非存在下で決定され、一方１００％拮抗は、過剰の未標識モノクローン抗体存在下で決定された。
【００７３】
ＷＥＨＩ-１６４細胞毒性試験
組換えＴＮＦ活性のバイオアッセイをエスペヴィックとニッセンマイヤーの方法（Espevik & Nissen-Meyer, J. Immunol. Methods 95, 99. 1986）にもとづいて実施した。ＴＮＦ活性に対するモノクローン抗体の効果は、ＡＢＴ９０にある細胞培養へモノクローン抗体を添加することによって決定した。
【００７４】
腫瘍退行実験
モノクローン抗体によるＴＮＦ誘導性腫瘍退行の変化を３種類の腫瘍モデルを用いて実施した。すなわち、３種類の腫瘍モデルは、皮下腫瘍ＷＥＨＩ-１６４、ＭｅｔｈＡサルコーマ、そして腹水ＭｅｔｈＡ腫瘍である。皮下腫瘍は、約５Ｘ１０5細胞を注射することによって誘導された。これによって約１４日後に１０-１５ｍｍの腫瘍が形成された。マウスの腹腔に、ヒト組換えＴＮＦ（１０μｇ）と、モノクローン抗体（２００μｌ腹水グロブリン）とを４日間つづけて注射した。対照群は、ＰＢＳのみ、あるいはＴＮＦと牛ウシ成長ホルモンに対するモノクローン抗体とを注射した。それぞれの実験の開始時には、固形腫瘍の場合にはカリパスで腫瘍サイズを、そして腹水症マウスの場合には体重を測定した。これらの測定は実験中、日々実施された。
【００７５】
ラジオレセプターアッセイ
コンフルエントに増殖したＷＥＨＩ-１６４細胞を培地から回収し、１％ＢＳＡ含有ハンク平衡塩溶液（Hank's balanced salt solution, HBSS, Gibco）で１回洗浄した。１００μｌの未標識ＴＮＦ（1-10,000ng/試験管）またはモノクローン抗体（10倍希釈液シリーズ、腹水グロブリンで１対１０ないし１対１００，０００）を５０μｌの125Ｉ-ＴＮＦ（50,000cpm）へ添加した。その後、ＷＥＩ-１６４細胞を添加した（2 X 106細胞を含む200μｌ）。この混合物を振とうウオーターバスで３７℃、３時間インキュベーションした。このインキュベーションの終了時に、１ｍｌのＨＢＳＳを添加し、そして細胞を16,000rpm、３０秒の遠心処理した。上清を捨てて、細胞沈澱物に結合した125Ｉ-ＴＮＦを測定した。すべての希釈は、１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳで行なった。
【００７６】
内皮細胞でのＴＮＦによるプロコアギュラント誘導
ウシ大動脈内皮細胞（継代１０）を、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で10%ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、そして２-メルカプトエタノールを含むRPMI-1640中で増殖させた。ＴＮＦによるプロコアギュラント誘導活性のために、細胞をトリプシン処理し、そして２４穴（ウエル）コスタートレイに播種した（Bevilacqua et al., PNAS 83, 4533, 1986によるプロトコール）。ＨＢＳＳで、コンフルエントな細胞単層を洗浄した後にＴＮＦ（0-500単位／培養）と、モノクローン抗体（希釈は、腹水グロブリン１：２５０に）とを添加した。４時間後、細胞を回収して凍結し、ソニケーション処理した。全体の細胞プロコアギュラント活性を、３７℃で正常なドナー血小板・血漿欠乏（normal donor platelet-poor plasma）のリカルシフイケーション（recalcification）時間によって決定した。100μｌのクエン酸処理済 (citrated)血小板欠乏血漿を、100μｌの塩化カルシウム（30mM）と100μｌの細胞ライセートに添加し、クロット（血ぺい）形成時間を記録した。いくつかの実験では、腫瘍細胞培養の上清をＴＮＦおよび（または）モノクローン抗体（最終濃度２対１）によって処理された内皮細胞に添加した。
【００７７】
ＴＮＦおよびモノクローン抗体によって処理されたマウスへの125Ｉフイブリノーゲンの取り込み
インビボ系でのフイブリン形成に対するモノクローン抗体とＴＮＦとの効果について試験するために、BALB/cマウスの皮下にWEHI-164細胞（105細胞／動物）を注射した。７-１４日後、腫瘍の直径が約１cmに達した時点で、動物の腹腔内に、ＴＮＦ（10ug/動物）および125Ｉ-ヒトフイブリノーゲン（7.5ug/動物、122μCi/mg，Amersham）を、単独で、あるいはヒトＴＮＦに対するモノクローン抗体（200μｌ／動物腹水グロブリン）とともに注射した。ウシ成長ホルモンに対するモノクローン抗体は、対照用のモノクローン抗体として用いられた。ＴＮＦの注入２時間後、マウスの組織への125Ｉ-フイブリノーゲンの取り込みを、組織片を除去して試料とし、その重量を測定し、そしてガンマカウンターで試料の放射能を測定した。
【００７８】
ヒトＴＮＦと反応する１３種類のモノクローン抗体が単離された。これらのモノクローン抗体は、それぞれＭＡｂ１、ＭＡｂ１１、ＭＡｂ１２、ＭＡｂ２０、ＭＡｂ２１、ＭＡｂ２５、ＭＡｂ３１、ＭＡｂ３２、ＭＡｂ３７、ＭＡｂ４２、ＭＡｂ４７、ＭＡｂ５３、そしてＭＡｂ５４と定められた。ヒトＴＮＦ生物活性に対するこれらのモノクローン抗体の効果を第２表に示した。
【００７９】
第２表から明らかなように、いくつかのモノクローン抗体は、ヒトＴＮＦにより、凝固活性及び抗腫瘍活性を阻害したが（ＭＡｂ１、４７および５４）、すべての抗腫瘍活性を阻害するすべての抗体が、インビボおよびインビトロで凝固活性を阻害したわけではない（ＭＡｂ１１、１２、２５および５３）。実際、腫瘍退行を阻害するＭＡｂ２１はインビボで凝固活性化を促進させた。
【００８０】
【表１】
0003717466.tif 000002
【００８１】
ＴＮＦ上のエピトープを分かち合うための拮抗的結合についてのテストで示されたＭＡｂ１、４７および５４は、ＴＮＦの完全中和に必要とされる高いＴＮＦレベルである中毒ショックおよび他の細菌、ウイルスおよび寄生虫感染の状態を治癒する上で要求される特徴を備えている。ＭＡｂ３２のような他のモノクローン抗体は、癌治療の際にＴＮＦと一緒に投与されることが好ましい。なぜなら、腫瘍退行を阻害しないが、凝固を阻害するからである。このような治療方法は、ＴＮＦによる凝集活性を促すような癌治療に用いられる細胞毒性剤（cytotoxic drugs）と組み合わせる場合に特に指摘される（例えば、ビンブラスチン、アシクロビル（acyclovir）、ＩＦＮアルファ、ＩＬ-２、アクチノマイシンＤ、ＡＺＴ、ラジオセラピイ、アドリアミシン、マイトマイシンＣ、シトシンアラビノシド、ドウノルビシン（dounorubicin）、シス・プラチン、ビンクリスチン、５-フルオロウラシル、ブレオマイシン（Watanabe N et al. 1988. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 10 117-127）、またはＴＮＦレベルが低い段階の疾患（例えば免疫不全症候群）および癌、例えばカポジサルコーマ、ノンホジキンズリンホーマおよびスクアマウスセルカルシノーマ（squamous cell carcinoma）に関連した免疫不全症候群を有する患者）。
【００８２】
モノクローン抗体ＭＡｂ１は、以下の特徴を有することがわかった。
１．ヒト組換え体ＴＮＦアルファと結合する。しかし、ヒトリンパ毒（ＴＮＦベータ）またはヒトインターフェロンとは結合しない。同様にＭＡｂ１は、組換え体マウスＴＮＦ（第１図）と交差反応しない。
２．ＭＡｂ１は免疫グロブリン型がＩｇＧ１、Ｋである。親和性は約４，４Ｘ１０-9モル／リットルである（第２図）。
３．ＭＡｂは、培養中のWEHI-164マウスフイブロサルコーマ細胞上の組換え体ヒトＴＮＦの細胞毒性効果を中和する。インビトロ系で１μｇのＭＡｂ１は、約１５６．２５単位のＴＮＦを中和する（第３図）。
４．ＭＡｂ１は、インビボ系で下記のマウス腫瘍モデル：WEHI-164皮下ソリッド腫瘍（subcutaneous solid tumour）、Meth A 皮下ソリッド腫瘍、そしてMeth A腹水症腫瘍（ascites tumour）においてＴＮＦの腫瘍退行活性を中和する（第４図、第５図および第９図）。
５．ＭＡｂ１は、マラリア病原虫に感染したマウスにおいて、ヒトＴＮＦによって引き起こされる大脳損傷を抑える。
６．ラジオリセプターアッセイにおいて、ＭＡｂ１は、 WEHI-164上にある受容体（レセプター）へのＴＮＦの結合を抑える（第３表）。
７．ＭＡｂ１は、ウシ大動脈内皮培養細胞上のプロコアギュラント誘導活性（組織因子）を阻害する（第６図）。
８．ＭＡｂ１は、ＴＮＦ処理されたマウスの腫瘍への125Ｉフイブリノーゲン取り込みを減少させる（第７図）。
９．ＭＡｂ１は、125Ｉ-ＴＮＦの結合に対して拮抗する。したがって下記のモノクローン抗体：２１、２５、３２、４７、５４、そして３７と、オーバラッピングしたエピトープを分かち合う。
１０．ＭＡｂ１は、下記のモノクローン抗体：１１、１２、４２、５３、３１、そして２０と、125Ｉ-ＴＮＦの結合に対して拮抗しない（第８図）。
【００８３】
【表２】
0003717466.tif 000003
【００８４】
ＭＡｂ３２は、ＩｎＧ２ｂ，Ｋ抗体で、ヒトＴＮＦアルファに対する親和性はスキャッチャード分析よれば、８．７７Ｘ１０-9moles/lである。しかし、このモノクローン抗体は、ヒトＴＮＦベータ（リンパ毒（lymphotoxin））やマウスＴＮＦアルファとは反応しない。
【００８５】
第３図に示したように、ＭＡｂ３２は、インビトロ系でのWEHI-164アッセイの結果によれば、ＴＮＦ細胞毒性を阻害しない。
【００８６】
モノクローン抗体３２は、ＴＮＦ投与量が１０μｇ／日であるBALB/cマウスに皮下経由で移植された、腫瘍であるWEHI-164繊維肉腫に対するＴＮＦ誘導腫瘍退行活性を不安定に抑制する（第１０図および第１１図を見よ）。このような特徴は、ＴＮＦに対して生じたすべての抗体に当てはまるわけではなく（第９図）、受容体を介した腫瘍細胞へのＴＮＦ取込み増大を許すＭＡｂ３２に特異的な結合部位に当てはまる（第８図、第４表）。
【００８７】
【表３】
0003717466.tif 000004
【００８８】
ＴＮＦ投与量が低いときのＭＡｂ３２によるＴＮＦ活性の促進とは、少なくとも１０分の１以下のＴＮＦが、同程度の腫瘍退行を達成するのに必要とされることである（第１１図および第１８図参照）。結果は、１日目(day 1)では２．５μｇおよび１μｇＴＮＦと、２日目（day 2）では５μｇ、２．５μｇと１μｇであった。統計学的違いは、ｔ検定でｐ＜０．０１であった。このようなＴＮＦ活性増大の程度は、またレシピエントの生存率を上げることになる。なぜなら、低濃度のＴＮＦを使用するので毒性効果が生じることはない。第１９図は、ＭＡｂ３２の単一の価からなるＦａｂ断片が、ＭＡｂ３２全体と同様にしてＴＮＦ誘導腫瘍退行を促進させることを示している（下記参照）。
【００８９】
ＭＡｂ３２は、ＴＮＦと培養細胞とをインキュベーションすることによって正常に誘導される内皮細胞の凝固因子（clotting factors）発現を阻害する（第６図）。この応答は、事前に同定されていないＴＮＦ受容体によって媒介されるものであるが、これは、他の細胞で発見された受容体と異なるものである。
【００９０】
逆に言えば、ＭＡｂ３２は、放射性同位元素で標識されたフイブリノーゲンの取り込みによって示されるような腫瘍床内での凝固のインビボ系での活性化を促進させる（第７図）。このことは、単球／マクロファージ・プロコアギュラントの活性化にもとづくものであり、さらにＴＮＦによって誘導される腫瘍退行の機構を明らかにすることを可能とするものであろう。
【００９１】
ＭＡｂ３２を用いた実験で得られた結果を、第２表において他のものと比較した。
【００９２】
内皮細胞に対するＴＮＦの結合を阻害する能力について、ＭＡｂ３２とＭＡｂ４７ともアッセイした。
【００９３】
ウシ大動脈内皮細胞(BAE)（継代１１）を２４穴の培養皿（コーニング社製）に播種した。この培養皿の各ウエルには事前にゲラチン（0.2%）をコートしておいた。また、20%ウシ胎児血清を含むマッコイ５Ａ（修飾）メジウム中でコンフルエントとなるように増殖させた。このメジウムは、ラジオイムノアッセイにおける希釈溶液（未標識ＴＮＦおよびＭＡｂ）としても用いられた。ＢＡＥ細胞を未標識ＴＮＦ（0-100ng）またはＭＡｂ（1/100-1/100,000）に希釈された腹水グロブリン）と、ヨウ素化ＴＮＦ（50,000cpm）との存在下において１時間インキュベートした。この時間が経過した後、メジウムを捨てて、細胞を洗った。その後、細胞を１Ｍの水酸化ナトリウムで溶解した。溶解された細胞を結合放射性ＴＮＦについてを測定し、細胞に特異的に結合した標識ＴＮＦを決定した。
【００９４】
ＭＡｂ３２、ＭＡｂ４７、そして対照のＭＡｂに関するのアッセイで得られた結果は、第１２図に示した。
【００９５】
ＴＮＦおよび抗ＴＮＦモノクローン抗体存在下で培養されたＢＡＥ細胞を用いた凝固（血ぺい形成；クロッテイング）アッセイにおいて得られた結果は、ＢＡＥラジオレセプターアッセイで得られた結果と関係している。すなわち、内皮細胞の表面上への凝固因子誘導を阻害するモノクローン抗体は、またＴＮＦがその受容体へ結合することも阻害する（ＴＮＦ単独の場合と比較して凝固時間が増加する）。これは、ＭＡｂ３２および４７によって示される。
【００９６】
WEHI-164細胞へのＴＮＦ結合を阻害しないＭＡｂ３２は、内皮細胞へのＴＮＦ結合を阻害しない。このような結果は、ＴＮＦ分子上に異なる機能部位が存在していること、またこのような部位が異なる細胞型の異なる受容体サブ集団と相互作用するというよいうな仮説を支持するものとなる。したがって、ＴＮＦの規定された領域に結合するリガンドは、特定の受容体サブタイプへ結合することを限定することによってＴＮＦの生物学的活性を修飾する。
【００９７】
第１２図に示すように、ＭＡｂ４７は、内皮細胞に作用するＴＮＦの特に強力な阻害剤であって、１／１００ないし１／１０，０００希釈での特異的結合の率は、事実上ゼロである。
【００９８】
インビトロ系での、ヒトカルシノーマ細胞上のＭＡｂ３２と複合体を形成するヒトＴＮＦに関する受容体結合実験
ＭＡｂ３２は、ヒトＴＮＦの抗腫瘍活性を促進させることが示されている。この促進効果に隠されているメカニズムには、特定の（腫瘍）受容体サブタイプに対するＴＮＦの結合を制限することが含まれるが、非腫瘍細胞に対するＴＮＦ毒性が続いて減少する他のもの（内皮）は含まれない。このメカニズムは、インビトロ系において、腫瘍細胞によるＴＮＦの取り込みを促進させることは必要ではない。また、ＭＡｂ３２は、ある種のヒトカルシノーマ細胞系上のＴＮＦ受容体に対するヒトＴＮＦの直接的結合を可能とさせる。
【００９９】
材料と方法
下記のヒトカルシノーマ細胞系統を用いて、ＭＡｂ３２存在下におけるＴＮＦによる受容体媒介取り込み促進についてアッセイした。
【０１００】
ヒトカルシノーマ細胞系統：Ｂ１０、ＣａＣｏ、ＨＴ２９、ＳＫＣ０１（これらは結腸カルシノーマ）、５６３７（膀胱カルシノーマ）、ＭＭ４１８Ｅ（メラノーマ）、ＩＧＲ３（メラノーマ）、そして  ＭＣＦ（胸部カルシノーマ）。
【０１０１】
細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシンリン／ストレプトマイシン、そしてＬ-グルタミンを添加したＲＰＭＩ-１６４０（ＭＭ４１８Ｅ）、ＤＭＥＭ（ＣａＣｏおよびＩＧＲ３）またはイスコーブ修飾ＤＭＥＭ（Ｂ１０、ＨＴ２９、ＳＫ０１、Ｓ６３７、ＭＣＦ７）のどれかによって増殖させた。受容体アッセイは、既に知られている内皮細胞に対する方法にもとづいて行なったが、以下の点を変えた。すなわち、ヨウ素化ＴＮＦとのインキュベーション時間を３時間まで延長した。例外として、Ｂ１０の場合はインキュベーション時間を１時間とした。
【０１０２】
結果
メラノーマ細胞系統ＭＭ４１８ＥおよびＩＧＲ３（第１３図および第１４図）、膀胱カルシノーマ５６３７（第１５図）、そして胸部カルシノーマＭＣＦ７（第１６図）によって、ＭＡｂ３２存在下において、ＴＮＦ取り込み促進が観察された。ＭＡｂ３２は、Ｂ１０（第１７図）によって示されるような他の細胞系統においてＴＮＦ受容体相互作用に対してなんら影響を与えなかった。ＭＡｂ４７は、ＷＥＨＩ-１６４細胞および内皮細胞へのＴＮＦ結合を阻害し、またＴＮＦ媒介腫瘍退行を阻害するが、これはＴＮＦ媒介腫瘍退行を、試験したすべての細胞系統において、顕著にＴＮＦ結合を阻害することが観察された（第１３図-第１７図）。
【０１０３】
結論
受容体結合実験によれば、ＴＮＦの抗腫瘍活性を高めるような役割をＭＡｂ３２が有するというような第二の機構が存在することを示す。ＴＮＦの働きを高めるこの第二の経路は、ＭＡｂ３２の存在下での腫瘍全受容体によるＴＮＦの取り込み増加にもとづくものである。
【０１０４】
ＷＥＨＩ-１６４皮下腫瘍を有するマウス（Ｎ＝５動物／群）を用いて、上記方法にもとづいて腫瘍退行を調べた。腫瘍の大きさは、実験継続期間中、毎日測定した。ＭＡｂ３２を用いて得られた結果は、第２２図に示した。その結果によれば、処理完了時点（２日目；  day 2）で、腫瘍領域の平均＋／-ＳＤ％の変化を示した。
対照ＭＡｂ-ＴＮＦ処理群と、ＭＡｂ３２-ＴＮＦ処理群との間に認められる違いは、統計学的に顕著であった（ｔ検定  ｐ＜０．０１レベル）。
【０１０５】
ＭＡｂ３２の一価ＦＡｂ’断片を用いた結果は、第１９図に示されている。
腫瘍の大きさは、実験継続期間中、毎日測定した。処理完了時点（２日目；  day 2）で、腫瘍領域の平均＋／-ＳＤ％の変化を示した。 対照ＭＡｂ-１０Ｆ処理群と、ＭＡｂ３２-ＴＮＦ処理群との間に認められる違いは、統計学的に顕著であった（ｔ検定  ｐ＜０．０１レベル）。
【０１０６】
ＴＮＦ誘導腫瘍退行：抗ペプチド３０１血清の効果
第２０図は、ＴＮＦ＋対照ＭＡｂ（ウシ成長ホルモンに対する抗体）、ＴＮＦ＋ＭＡｂ３２、あるいはＴＮＦ＋抗ぺプチド３０１血清（グロブリン分画）によって３日間処理された腫瘍を有するマウスにおける腫瘍領域の変化率を示すものである。対となっていない（unpaired）ｔ-検定において、対照群は、試験群（ＭＡｂ３２、抗血清３０１）の両方と顕著に異なった。一方、ＭＡｂ３２とペプチド抗血清３０１群とは、互いに顕著な違いが認められなかった。（対照群対ＭＡｂ３２、ｐ＜０．００２；  対照群対抗ペプチド３０１、ｐ＜０．０２５）。したがって、ＭＡｂ３２の特異性を有する部分を含むペプチドを用いて調製した抗血清は、ＴＮＦの腫瘍退行促進も引き起こさせる。
【０１０７】
第９図に示すように、拮抗（競合）結合実験によって１３種類のモノクローン抗体が２つのメイングループに分類された。すなわち、ＭＡｂ１、２１、４７、５４、３７、３２、そして２５のグループと、ＭＡｂ１１、１２、５３、そして４２のグループである。よって、つぎの実験は、これらのモノクローン抗体によって認識されたヒトＴＮＦ上の領域を同定することである。
【０１０８】
モノクローン抗体により認識される、ヒトＴＮＦ上の領域の同定
１．７ないし１０個のアミノ酸配列程度の長さからなる重なり合ったペプチドは、ゲイセンらの方法（Geysen et al., 1984, PNAS 81, 3998-4002）にもとづいてポリプロピレン・ピン上で合成された。重なり合いはそれぞれ６残基および９残基のもので、ペプチドは全体で全ＴＮＦアミノ酸配列を覆っている。このペプチドは、ＥＬＩＳＡによってＭＡｂとの反応性が調べられた。全ＴＮＦと事前のインキュベーションによってＴＮＦ反応性が吸収されたＭＡｂもまた、ペプチドとの反応性について調べられ、そして負の対照群として作用した。
【０１０９】
２．ＴＮＦの長めのペプチドは、下記の通りに合成された。このペプチドは、下記のプロトコールにもとづいてヒツジから抗血清を調製するのに用いられた。オバルブミンにコンジュゲートされ、完全フロインドアジュバント中に乳濁化されたＴＮＦペプチドによって一次接種されたメリノヒツジ（Merino sheep）に、４週間の間隔で、ペプチド・オボアルブミンでブーストし、ラジオイムノアッセイにより、抗ＴＮＦ抗体の存在をアッセイした。その結果、ペプチド２７５、３０１、３０５、３０６、そして３０７のみが全ＴＮＦと反応する血清から得られた。よって、陽性血清をＭＡｂとの拮抗結合アッセイ（PACTアッセイ）に用いた。
【０１１０】
下記のペプチドが合成された。これらのペプチドは、それぞれのアミノ酸を表わすために従来の３文字コードを用いた。ＴＮＦ配列領域は括弧で示した。
「配列表１」
ペプチド２７５
H-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-OH (111-120)
ペプチド３０１
H-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-OH (1-18)
ペプチド３０２
H-Leu-Arg-Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro-Ser-Glu-Gly-Leu-Tyr-Leu-Ile-OH (43-58)
ペプチド３０４
H-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-Cys-Pro-Ser-Thr-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-OH (63-83)
ペプチド３０５
H-Leu-Ser-Ala-Glu-Ile-Asn-Arg-Pro-Asp-Tyr-Leu-Asp-Phe-Ala-Glu-Ser-Gly-Gln-Val-OH (132-150)
ペプチド３０６
H-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-OH (13-26)
ペプチド３０７
H-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-Gln-Trp-Leu-Asn-Arg-Arg-Ala-Asn-Ala-Leu-Leu-Ala-Asn-Gly-OH (22-40)
ペプチド３０８
H-Gly-Leu-Tyr-Leu-Ile-Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Lys-Gly-Gln-Gly-OH (54-68)
ペプチド３０９
H-His-Val-Leu-Leu-Thr-His-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Lys-Val-Asn-Leu-Leu-COOH (73-94)
ペプチド３２３
H-Thr-Ile-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-OH (79-89)
【０１１１】
これらのペプチドは、下記の一般的なプロトコールにしたがって合成された。
すべてのペプチドは、固相ペプチド合成法であるＦｍｏｃ-ポリアミノ法（Atherton et al., 1978, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 13, 537-539）によって合成された。用いられた固形樹脂は、ペプシン(PepSyn)ＫＡであって、４-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を官能化リンカーとして用いたキエセルグール支持体（Kieselguhr support）上のポリジメチルアクリルアミドゲルである（Atherton et al. 1975, J. Am. Chem. Soc. 97, 6584-6585）。
【０１１２】
カルボキシル末端のアミノ酸は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰメジエーテッド・シンメトリカル・アンヒドリド・エスエリフィケーション（DCC/DMAP-mediated symmetrical-anhydride esterification）によって固体支持体に結合する。
【０１１３】
すべてのＦｍｏｃ基は、ピペリジン／ＤＭＦ洗浄によって除去され、またペプチド結合はペンタフルオロフェニル活性エステルを介して、あるいは直接的にＢＯＰ／ＮＭＭ／ＨＯＢｔ（カストロ試薬）（Fournier et al., 1989. Int. J. Peptide Protein Res., 33, 133-139）によって、第５表に示したあるアミノ酸を除き形成された。
【０１１４】
アミノ酸に対して選ばれる側鎖保護は、合成後に残される、システイン上のＡｃｍを除き、クリービング（cleavage）中に付随的に除去された。
【０１１５】
【表４】
0003717466.tif 000005
【０１１６】
開裂と精製
ペプチド３０１、３０２、３０５ は、９５％ＴＦＡおよび５％チオアニソール（1.5h）によって樹脂からクリービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA水溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１１７】
ペプチド３０３、３０４は、 ９５％ＴＦＡおよび５％フェノール（5ー6 h）によって樹脂からクリービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１１８】
ペプチド３０６、３０８は、 ９５％ＴＦＡおよび５％水（1.5 h）によって樹脂からクリービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１１９】
ペプチド３０９は、 ９５％ＴＦＡおよび５％チオアニソールによって樹脂からクリービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１２０】
ペプチド３０７は、 ９３％ＴＦＡ、３．１％アニソール、２．９７％エチルメチルスルフィド、そして０．９５％エタンジチオールからなる混合物（3 h）によって樹脂からクリービングされ、そして逆相Ｃ４カラム（緩衝液Ａ-0.1% TFA溶液、緩衝液Ｂ-80% ACN 20% A）によって精製された。
【０１２１】
結果
７および１０量体（mers）を用いたモノクローン抗体ＥＬＩＳＡの典型的な結果を第２１図に示す。ヒツジ抗ペプチド血清（第６表参照）を用いたＰＡＣＴの結果とともに、ＴＮＦの下記領域は抗ＴＮＦモノクローン抗体の結合部位を含む。
【０１２２】
ＭＡｂ１      ：  残基  1-18、 58-65、 115-125、138-149
ＭＡｂ１１    ：  残基  49-98
ＭＡｂ１２    ：  残基  22-40、 70-87
ＭＡｂ２１    ：  残基  1-18、 76-90
ＭＡｂ２５    ：  残基  12-22、36-45、96-105、 132-157
ＭＡｂ３２    ：  残基  1-26、 117-128、 141-153
ＭＡｂ３７    ：  残基  22-31、 146-157
ＭＡｂ４２    ：  残基  22-40、 49-96、 110-127、 136-153
ＭＡｂ４７    ：  残基  1-18、 108-128
ＭＡｂ５３    ：  残基  22-40、 69-97、 105-128、 135-155
ＭＡｂ５４    ：  残基  56-79、 110-127、 136-155
【０１２３】
【表５】
0003717466.tif 000006
【０１２４】
結論
各モノクローン抗体によって認識される領域のマッピングによって、グループＩ（ＭＡｂ１，２１，４７，５４，３７，３２，そして２５）のモノクローン抗体は、ＭＡｂ３７と５４とを除き、残基１-１８の領域においてＴＮＦと結合する。一方、グループＩＩ（ＭＡｂ１１，１２，５３，そして４２）は、ＴＮＦ３次元構造のいわゆるパリンドローム・ループを取り囲む残基７０-９６の領域においてＴＮＦと結合する。内皮細胞プロコアギュラント誘導活性を阻害するモノクローン抗体（ＭＡｂ１，３２，４２，４７，５４，そして５３）はずべて、ＴＮＦ３次元構造のループ構造をふたたび取り囲む残基１０８-１２８の領域においてＴＮＦと結合し、またこの領域は内皮細胞上にはあるが、腫瘍細胞上にはないＴＮＦ受容体に作用する。インビボ系でＴＮＦの腫瘍退行と抗ウイルス活性とを促進させるＭＡｂ３２は、残基１-２６，１１７-１２８，そして１４１-１５３と関係したループ領域のすべてに結合する唯一の抗体である。したがって、これらの領域の結合は、正常細胞に対する毒性の低減が生じ始めるのと同様に、ＴＮＦ生物学的活性の促進にとって重要なものとなる。
【０１２５】
第２表から明らかなように、ＭＡｂ１、４７、そして５４はＴＮＦの生物学的活性に対して同一の効果を示す。上記に示した結果から、これら３種類のモノクローン抗体は、ＴＮＦ分子の類似領域へ結合する。したがって、主に残基１-２０の領域、残基５６-７７の領域、残基１０８-１２８の領域、そして残基１３８-１４９の領域からなる群から選択される少なくとも２つの領域においてＴＮＦに結合するリガンドは、ＭＡｂ１、４７および５４と同様にしてＴＮＦの生物学的活性に対する効果を示す。同様に、主に残基１-２０および７６-９０からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体２１と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に残基２２-４０および６９-９７からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体１２と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に残基１-３０、１１７-１２８、そして１４１-１５３からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体３２と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に残基２２-４０、４９-９７、１１０-１２７、そして１３６-１５３からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体４２と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に２２-３１および１４６-１５７からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体３７と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。主に２２-４０、６９-９７、１０５-１２８、そして１３５-１５５からなる領域においてＴＮＦと結合するリガンドは、モノクローン抗体５３と同様に、ＴＮＦの生物学的活性に対して効果を示す。
【０１２６】
本発明者は、以下のことをはっきりと示した。すなわち、ＴＮＦの生物学的活性は、ＴＮＦへのリガンドの結合によって変更されてしまう。また、生物学的活性への効果はリガンドの特異性の関数である。例えば、残基１-２６、１１７-１２８、１４１-１５３からなる領域においてＴＮＦへのＭＡｂ３２の結合は、ＴＮＦの内皮プロコアギュラント活性の誘導を引き起こし、また内皮細胞上の受容体に対するＴＮＦの結合は阻害された状態となり、ＴＮＦによる腫瘍退行活性および腫瘍フイブリン沈着活性は促進された状態となる。細胞毒性については何等影響されず、またＴＮＦの腫瘍受容体活性は影響されないか、あるいは促進される。ＴＮＦの生物学的活性に対するこのような効果は、ＭＡｂ３２によって認識されるＴＮＦのエピトープが自然発生的な生物学的活性リガンドへの結合を妨害することによって起こる。したがって、ＭＡｂ３２によって作られた同様の効果もまた、ＴＮＦの領域に結合するリガンドによって作られ、ＭＡｂ３２によって認識されたエピトープは、自然発生的な生物学的に活性なリガンドへの結合から阻害される。この結合の妨害は、立体障害または他の機構によるものであろう。
【０１２７】
したがって、本願に開示された種々のモノクローン抗体によって認識されるエピトープの、自然発生的生物学的活性リガンドへの結合阻害は、本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  第１図は、ＴＮＦに対するＭＡｂ１の滴定検定の結果を示すものである。
【図２】  第２図は、ＴＮＦ  ＭＡｂ１スキャッチャードプロットと、親和性の測定とを示すものである。
【図３】  第３図は、ＷＥＨＩ-１６４細胞におけるＴＮＦ毒性に対する抗ＴＮＦモノクローン抗体１および３２の効果を示すものである。
【図４】  第４図は、ＴＮＦに誘導された、Ｍｅｔｈ  Ａ  固形（solid）腫瘍の退行に対するＭＡｂ１の効果を示すものである。
【図５】  第５図は、ＴＮＦに誘導されたＭｅｔｈ  Ａ  腹水腫瘍の退行に対するＭＡｂ１および２５の効果を示すものである。
【図６】  第６図は、ＴＮＦによる内皮細胞プロコアギュラント活性の誘導に対する抗ＴＮＦモノクローン抗体の効果を示すものである。
【図７】  第７図は、腫瘍を有するマウスの腫瘍部への、標識されたフイブリノーゲンの取り込み、及び抗ＴＮＦモノクローン抗体の効果を示すものである。
【図８】  第８図は、ＴＮＦのエピトープを概略的に説明するための図である。
【図９】  第９図は、ＷＥＨＩ-１６４腫瘍のＴＮＦ誘導性退行に対する抗ＴＮＦモノクローン抗体の効果を示すものである。
【図１０】  第１０図は、２つの実験におけるＭＡｂ３２によるＴＮＦ退行活性の促進を示すものである。
【図１１】  第１１図は、１日目および２日目のＭＡｂ３２投与量応答によるＴＮＦ誘導性腫瘍退行の促進を示すものである。
【図１２】  第１２図は、ウシ大動脈内皮細胞上の受容体に対する、放射性標識ＴＮＦの結合を示すものである。
【図１３】  第１３図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記のものとメラノーマ細胞系統ＭＭ４１８Ｅ上で複合体を形成して用いられた。
【図１４】  第１４図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記のものとメラノーマ細胞系統ＩＧＲ３上で複合体を形成して用いられた。
【図１５】  第１５図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記のものと膀胱カルシノーマ細胞系統５６３７上で複合体を形成して用いられた。
【図１６】  第１６図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記のものと胸部カルシノーマ細胞系統ＭＣＦ７上で複合体を形成して用いられた。
【図１７】  第１７図は、ＴＮＦの受容体結合アッセイを示すもので、このＴＮＦは、下記のものと結腸カルシノーマ細胞（colon carcinoma cell）系統Ｂ１０上で複合体を形成して用いられた。
【図１８】  第１８図は、下記の抗体によるインビボ系（in vivo）でのＴＮＦ媒介腫瘍退行効果を示すものである。
【図１９】  第１９図は、対照モノクローン抗体、ＭＡｂ３２、そしてＭＡｂ３２の一価ＦＡｂ’断片によるインビボ系でのＴＮＦ媒介腫瘍退行効果を示すものである。
【図２０】  第２０図は、下記抗体によるＴＮＦ誘導腫瘍退行の効果を示すものである。
【図２１】  第２１図は、アミノ酸長が１０個のオーバーラップペプチドとＭＡｂ３２との反応性を示すものである。
【図２２】  第２２図は、ＴＮＦ分子の三次元（３Ｄ）構造を模式的に示すものである。
【図２３】  第２３図は、残基１-２０、５６-７７、１０８-１２７、そして１３８-１４９からなる領域をトポグラフイック（立体的）に示したものである。
【図２４】  第２４図は、残基１-１８および１０８-１２８からなる領域を立体的に示したものである。
【図２５】  第２５図は、残基５６-７９、１１０-１２７および１３６-１５５からなる領域を立体的に示したものである。
【図２６】  第２６図は、残基１-２６、１１７-１２８および１４１-１５３からなる領域を立体的に示したものである。
【図２７】  第２７図は、残基２２-４０、４９-９７、１１０-１２７、そして１３６-１５３からなる領域を立体的に示したものである。
【図２８】  第２８図は、残基１２-２２、３６-４５、９６-１０５、そして１３２-１５７からなる領域を立体的に示したものである。
【図２９】  第２９図は、残基１-２０および７６-９０からなる領域を立体的に示したものである。
【図３０】  第３０図は、残基２２-４０、６９-９７、１０５-１２８、そして１３５-１５５からなる領域を立体的に示したものである。
【図３１】  第３１図は、残基２２-３１および１４６-１５７からなる領域を立体的に示したものである。
【図３２】  第３２図は、残基４９-９８からなる領域を立体的に示したものである。
【図３３】  第３３図は、残基２２-４０および７０-８７からなる領域を立体的に示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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