(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有する細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢ。
［１］細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ
（１）性状    ：無色針状結晶
（２）元素組成：Ｃ16Ｈ22Ｏ8 （高分解能マススペクトルによる）
（３）融点    ：１４１〜１４０℃（クロロホルム）
（４）比旋光度［α］D 23＋８４．１°（ｃ＝０．５９，ＭｅＯＨ）
（５）分子量  ：３４２（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マススペクトルによる）
（６）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、２０７（ｌｏｇ  ε＝４．２１）ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外線吸収スペクトルは、１７１３、３４２８ｃｍ-1に吸収帯を有する
（８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルムに可溶、水に難溶
（９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ−アニスアルデヒドに陽性
（１０） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した 1Ｈ−シフト（Ｊ値）は、６．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．５，３．３）、６．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．５，３．３）、６．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．５，１．８）、６．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．５，１．５）、４．９７（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６）、４．２５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）、４．８６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６）、４．１３（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）、５．３８（１Ｈ，ｍ）、２．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．３，４．３）、１．３３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３）、１．４５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６）、１．３７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６）、３．１５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）、２．８５（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）
（１１）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した13Ｃ−シフトは、１７０．２（ｓ）、１６５．８（ｓ）、１６４．７（ｓ）、１４６．２（ｄ）、１４５．２（ｄ）、１２２．７（ｄ）、１２２．２（ｄ）、７４．８（ｄ）、７４．７（ｄ）、７３．９（ｄ）、７３．０（ｄ）、６７．７（ｄ）、４０．９（ｔ）、１９．６（ｑ）、１７．９（ｑ）、１７．８（ｑ）、−ＯＨ、−ＯＨ
［２］細胞接着阻害剤マクロスフェライドＢ
（１）性状    ：無色板状結晶
（２）元素組成：Ｃ16Ｈ20Ｏ8 （高分解能マススペクトルによる）
（３）融点    ：１４８〜１５０℃（クロロホルム）
（４）比旋光度［α］D 23＋４．１°（ｃ＝０．９８５，ＭｅＯＨ）
（５）分子量  ：３４０（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マススペクトルによる）
（６）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、２１０（ｌｏｇ  ε＝４．１５）ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外線吸収スペクトルは、３４５８、１７４３、１７２６、１７０５ｃｍ-1に吸収帯を有する
（８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルムに可溶、水に難溶
（９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ−アニスアルデヒドに陽性
（１０） 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した 1Ｈ−シフト（Ｊ値）は、６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．８，３．６）、６．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８）、７．０３（１Ｈ，ｄ＜Ｊ＝１５．８）、６．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．８，３．０）、５．０８（２Ｈ，ｍ）、５．０８（２Ｈ，ｍ）、４．３２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）、５．４５（１Ｈ，ｍ）、２．８３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．２，１０．９）、２．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．２，３．０）、１．３６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６）、１．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６）、１．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９）、３．４４（ｂｒ．ｓ）
（１１）13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で測定した13Ｃ−シフトは、１９６．２（ｓ）、１７０．４（ｓ）、１６５．２（ｓ）、１６４．３（ｓ）、１４４．５（ｄ）、１３２．６（ｄ）、１３２．１（ｄ）、１２２．４（ｄ）、７６．５（ｄ）、７５．７（ｄ）、７４．６（ｄ）、６７．７（ｄ）、４０．６（ｔ）、１９．７（ｑ）、１７．８（ｑ）、１６．０（ｑ）、−ＯＨ
【請求項２】
ミクロスフェロプシス属に属する請求項１に記載のマクロスフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養物中にマクロスフェライドＡ及びＢを蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライドＡ及びＢを採取することを特徴とする新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢの製造法。
【請求項３】
ミクロスフェロプシス属に属し、請求項１に記載のマクロスフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物が、ミクロスフェロプシス  エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＦＯ−５０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７７６）である請求項２記載の製造法。
【請求項４】
ミクロスフェロプシス属に属し、請求項１に記載のマクロスフェライドＡ及びＢを生産する能力を有するミクロスフェロプシス  エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＦＯ−５０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７７６）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄成白血病（ＨＬ−６０）細胞の接着に関与する接着因子を阻害する新規な細胞間接着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢ並びにそれらの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌治療の方法は、主として外科療法、放射線療法、化学療法に大別される。今日におけるこれらの方法の技術の向上あるいは新たな制癌剤の開発により、癌の治療率は５０％程にも達している。胃癌や子宮癌などは集団検診や定期検診等も整備されてきており、死亡率は減少している一方、最近、食生活や生活習慣の変化あるいは高齢化により、肺癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌などが増加しているのが現状であるが、これらに対する有効な化学療法剤は未だ満足すべきものはなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このように、癌の治療率が５０％を越えた現在、患者のクオリティ・オブ・ライフ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ；以下、ＱＯＬと呼称する）の重要性が注目されている。しかしながら、制癌剤は癌細胞に対して直接殺細胞作用を示す事を指標に開発されているため、効力が強い反面、副作用も強力である。そこで、治療は勿論のこと、術後の再発や予後不良を防止するため、従来とは異なる新たな作用機序を持った化学療法剤の開発が強く望まれていた。
【０００４】
癌細胞の血管内皮細胞への接着は癌転移において重要な役割を担っていると考えられており、接着阻害は癌転移阻害剤として期待されている。Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｋ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１８０１１〜１８０１８（１９８９）。
【０００５】
従って、本発明は細胞接着阻害という新たな作用機序を有する新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢを提供するものであり、更に、本発明は分生子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス属に属するマクロスフェライドＡ及びＢを生産する能力を有する微生物を培地に培養して培養物中にマクロスフェライドＡ及びＢを蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライドＡ及びＢを採取することを特徴とする新規な細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ及びＢの製造法である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新規な生理活性物質の探索を目的として種々の土壌から菌株を分離し、その生産する代謝産物について種々の検索を続けた結果、新たに静岡県伊豆町で採取された土壌から分離した菌株ＦＯ−５０５０の培養物中に、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄性白血病（ＨＬ−６０）細胞の接着を阻害する物質が産生されることを見出した。
【０００７】
次いで、該培養物からヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト骨髄性白血病（ＨＬ−６０）細胞の接着を阻害する有効物質を分離、精製した結果、後記の理化学的性質を有するマクロスフェライドＡ及びＢ物質は従来全く知られていないことから、この物質をマクロスフェライド類と呼称することにした。更に、後記の理化学的性質を有するマクロスフェライド類は、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属する生産菌を培地に培養して、培養物にマクロスフェライド類を蓄積せしめ、該培養物からマクロスフェライド類を採取する。
【０００８】
本発明のマクロスフェライド類を使用するために使用される菌株としては、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属するが、例えば本発明者らが分離した分生子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス属に属するミクロスフェロプシス  エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＦＯ−５０５０菌株は本発明に最も有効に使用される菌株の一例であって、本菌株の菌学的性状を示すと下記の通りである。
【０００９】
Ｉ．形態的性質
バレイショ・ブドウ糖寒天培地、イーストエキストラクト・ソルブルスターチ寒天培地（ＹｐＳｓ）などで良好に生育し、柄子殻の形成も良好である。バレイショ・ブドウ糖寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると菌糸は透明で隔壁を有しており、柄子殻の形成も良好である。柄子殻は黒色、まれに菌糸に覆われ白色、球状、ときに孔口または頚部が顕著で培地上に半突出する。大きさは２００〜２５０μｍで、成熟後、頂部の孔口から黒い胞子泥をだす。殻壁組織は暗褐色である。分生子は淡褐色、卵形〜楕円形、単泡で大きさは４．５〜５．５μｍ×３．８μｍである。
【００１０】
II．培養性状
各種培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果を表１に示す。なお、各培地において、菌の生育に伴う分泌液および菌核の形成は観察されなかった。
【００１１】
【表１】
0003641013.tif 000002
0003641013.tif 000003
【００１２】
III ．生理的、生態的性状
１）本菌株の最適生育条件はＧＰ液体培地においてｐＨ４〜１０、最適生育温度はＹｐＳｓ寒天培地において１５〜３０℃である。
２）本菌株の生育範囲はＧＰ液体培地においてｐＨ３〜１０、生育温度はＹｐＳｓ寒天培地において７〜３５℃である。
３）好気性、嫌気性の区別：好気性
【００１３】
以上の形態的観察および培養、生理的性状に基づき既知菌株との比較を試みた結果、本菌株は分生子果不完全菌綱、ミクロスフェロプシス（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）属に属する菌株と同定し、ミクロスフェロプシス  エスピー（Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）ＦＯ−５０５０と命名した。なお、本菌株は、ミクロスフェロプシス  エスピー  ＦＯ−５０５０として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成７年２月２０日で、受託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１４７７６である。
【００１４】
本発明の好ましい菌株として、マクロスフェライド類生産菌を説明したが、糸状菌の一般的性状としての菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ミクロスフェロプシス属に属し、マクロスフェライド類を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
【００１５】
また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株も本発明のマクロスフェライド類生産菌として包含される。本発明においては、先ずミクロスフェロプシス属に属するマクロスフェライド類生産菌が、適当な培地に培養される。本菌の培養においては、通常の糸状菌の培養方法が一般に適用される。培地としては微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じ無機塩などを含有させた栄養培地が用いられる。
【００１６】
同化し得る炭素源としては、ブドウ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロース、コーン・スティープ・リカー、グリセリン、有機酸などが単独または組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、例えば市販されているペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、カゼイン、大豆蛋白分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物が単独または組み合わせて用いられる。
【００１７】
更に、必要に応じてナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が添加される。更に、培地には、必要に応じて、本菌の生育やマクロスフェライド類の生産を促進する微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。
【００１８】
培養は通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ましい。培地のｐＨは中性付近で培養を行うのが好ましい。培養温度は２０〜３７℃でも行い得るが、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、液体培養の場合、通常３〜６日培養を行うと、マクロスフェライド類が生成蓄積される。好ましくは培養中のマクロスフェライド類の蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよい。
【００１９】
これらの培養組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。
【００２０】
このようにして得られた培養物中に蓄積された活性物質は培養濾液または培養菌体中に含まれている。培養濾液を必要に応じて濾過補助剤、例えばセライト、ハイフロースーパーセル等を加えて濾過するか、または遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、培養濾液と菌体との有機溶媒抽出物を濃縮したものの混合物からマクロスフェライド類を採取するのが有利である。
【００２１】
また、培養濾液及び菌体を分離しないで、そのまま非親水性有機溶媒により抽出することができる。また、マクロスフェライド類の含有量が培養濾液と菌体のどちらかに極端に多いときはその多い方から抽出してもよい。培養菌体からマクロスフェライド類を分離精製するためには、通常、培養ろ液と菌体の有機溶媒抽出物を濃縮した物の混合物またはそれぞれを非浸水性溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホルムで抽出することにより、マクロスフェライド類が有機溶媒に転溶される。
【００２２】
このようにして得られた有機溶媒層は、必要に応じ種々の脱水剤、たとえば無水硫酸ナトリウム、ビーズゲルなどを加えて脱水された後、減圧下で有機溶媒が留去される。この濃縮操作においてマクロスフェライド類は安定な物質であるが、通常加熱温度を５０℃以下となるように行うのが好ましい。残渣にヘキサン、石油エーテルなどの有機溶媒を加えてマクロスフェライド類を沈澱させることができる。
【００２３】
得られた沈澱物は数回ヘキサンなどで洗浄後、吸引濾過または遠心分離によりマクロスフェライド類の粗製物を採取することができる。この粗製物をさらに精製するためには、マクロスフェライド類と混雑物との溶解度の差や混じり合わない二液相関の分配の差や各種吸着担体に対する吸着力の差を利用した多くの手段が可能であるが、特にクロマトグラフィーはマクロスフェライド類の精製に有効な方法である。
【００２４】
マクロスフェライド類の精製に有効なクロマトグラフィーとしては、シリカゲル、アルミナ、活性炭セルロース、ヒドロキシアパタイトＨＰ−２０などの吸着樹脂などによる吸着クロマトグラフィー、シラン化シリカゲル、オクタデシルシラン化シリカゲルなどを用いる逆相分配クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、トヨパール（商品名、東ソー社製）などを用いる分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２５】
マクロスフェライド類は、これらのクロマトグラフィーや電気泳動、向流分配、限外濾過などの手段を、単独あるいは任意の順序にて組み合わせまたは反復して用いることにより、分離精製することができる。例えば上記の粗製物を少量のクロロホルムに溶かし、シリカゲルに吸着させ、クロロホルム−アセトン系混合溶液を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、その活性画分を減圧濃縮後、少量のメタノールに溶かし、これをメタノールで分子ふるいにもとずくゲル濾過クロマトグラフィーを行うことによりマクロスフェライドを分離精製することができる。
【００２６】
次に、本発明マクロスフェライド類の理化学的性質について以下に述べる。
〔１〕細胞接着阻害剤マクロスフェライドＡ
（１）性状：無色針状結晶
（２）元素組成：Ｃ16Ｈ22Ｏ8 （高分解能マススペクトルによる）
（３）融点：１４１〜１４２℃（クロロホルム）
（４）比旋光度：〔α〕D 23＋８４．１゜（ｃ＝０．５９，ＭｅＯＨ）
（５）分子量：３４２（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マススペクトルによる）
【００２７】
（６）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、２０７（ｌｏｇ  ε＝４．２１）ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外線吸収スペクトルは図２に示すとおりであり、１７１３，３４２８ｃｍ-1に吸収帯を有する
（８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルムに可溶、水に難溶
【００２８】
（９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ−アニスアルデヒドに陽性
（１０）核磁気共鳴スペクトル：日本電子ＥＸ−２７０ＮＭＲスペクトロメータを用いて測定した 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、２７０ＭＨｚ）および13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、６７．８ＭＨｚ）はそれぞれ図３及び図４に示すとおりである。また、水素および炭素の化学シフトは下記表２に示す通りである。
【００２９】
【表２】
0003641013.tif 000004
【００３０】
〔２〕細胞接着阻害剤マクロスフェライドＢ
（１）性状：無色板状結晶
（２）元素組成：Ｃ16Ｈ20Ｏ8 （高分解能マススペクトルによる）
（３）融点：１４８〜１５０゜（クロロホルム）
（４）比旋光度：〔α〕D 23＋４．１゜（ｃ＝０．９８５，ＭｅＯＨ）
（５）分子量：３４０（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マススペクトルによる）
【００３１】
（６）紫外線吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図５に示すとおりであり、２１０（ｌｏｇ  ε＝４．１５）ｎｍ付近に特徴的な吸収極大を示す
（７）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した赤外線吸収スペクトルは図６に示すとおりであり、３４５８，１７４３，１７２６，１７０５ｃｍ-1に吸収帯を有する
【００３２】
（８）溶剤に対する溶解性：アセトン、酢酸エチル、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルムに可溶、水に難溶
（９）呈色反応：硫酸、リンモリブデン酸、ヨウ素、Ｐ−アニスアルデヒドに陽性
【００３３】
（１０）核磁気共鳴スペクトル：日本電子ＥＸ−２７０ＮＭＲスペクトロメータを用いて測定した 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、２７０ＭＨｚ）および13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム溶液中、６７．８ＭＨｚ）はそれぞれ図７及び図８に示すとおりである。また、水素および炭素の化学シフトは下記表３に示す通りである。
【００３４】
【表３】
0003641013.tif 000005
【００３５】
ヒト血管内皮細胞を用いた細胞接着阻害能の評価
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対するヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）の結合能を指標として細胞接着阻害活性を試験した。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヘパリン１００Ｕ／ｍl 、ＥＣＧＦ５０μｇ／ｍl を含むＭＣＤＢ１０７培地に懸濁したＨＵＶＥＣを２×１０4 個を９６穴のマイクロプレートの各穴に播き、ＣＯ2 インキュベータ内で３７℃で２４時間培養する。
【００３６】
次いで１０ｎｇの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を添加してＨＵＶＥＣを刺激した。５時間後に検体ならびに蛍光標識ＨＬ−６０を加え、３０分間インキュベートした。非接着細胞を除去した後、各穴の蛍光強度を測定することにより細胞接着率を算出した、その結果は表４に示した通りである。
【００３７】
【表４】
0003641013.tif 000006
【００３８】
【発明の効果】
以上のとおり、本発明によるマクロスフェライドＡ及びＢは、細胞接着が深く関与すると考えられる疾患、例えば癌転移、あるいは関節炎などの慢性炎症や喘息、アレルギー疾患等に対しての効果が期待される。
【００３９】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
試験管（φ２×２０ｃｍ）にグルコース２．０％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、ポリペプトン０．５％、リン酸二水素カリウム０．１％、寒天０．１％（ｐＨ５．６〜５．８）、１０ｍl を滅菌し、これに酵母エキス０．４％、可溶性デンプン１．５％、リン酸−水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、寒天２．０％（ｐＨ６．０）を含む寒天斜面培地上に２７℃、６日間培養したミクロスフェロプシス  エスピー  ＦＯ−５０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４７７６）の斜面培養から一白金耳を接種し、２７℃で７２時間振とう培養して種母を得た。
【００４０】
次に、５００ｍl 容三角フラスコに可溶性デンプン３．０％、グリセロール１．０％、キナコ２．０％、乾燥酵母０．３％、塩化カリウム０．３％、炭酸カルシウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、リン酸二水素カリウム０．０５％を含む液体生産培地（ｐＨ６．５）１００ｍl （２０本）を仕込み滅菌した後、上記の方法で得られた種母１．０ｍl を上記三角フラスコに無菌的に移植し、毎分２２０回転するローターリシェーカーにより２７℃で１２０時間振とう培養を行った。
【００４１】
得られた培養液を液体画分と菌体画分とに分け、液体画分については、酢酸エチルを加えて充分攪拌した後、分液操作により酢酸エチル抽出画分を得た。菌体画分については、これにメタノールを加え、充分攪拌した後、得られたメタノール画分を減圧濃縮してメタノールを留去後、酢酸エチルにより抽出した。液体および菌体の両画分より得た酢酸エチル画分を合わせ、減圧濃縮操作により酢酸エチル抽出画分３７９．４ｍｇを得た。
【００４２】
この酢酸エチル抽出画分を薄層シリカゲル（２０×２０ｃｍ、厚さ０．５ｍｍ、メルク社製）二枚に吸着せしめ、クロロホルム−メタノール混合溶媒（９：１）で展開した。Ｒｆ値が０．５付近で、紫外線ランプ（２５４，３６６ｎｍ）照射下で橙黄色の蛍光を示すバンドを分画し、クロロホルム−メタノール混合溶媒（１：１）で溶出した。得られた溶出画分を減圧濃縮してマクロスフェライド類を含む１８．３ｍｇの粗物質Ｉを得た。
【００４３】
この粗物質Ｉを少量のメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（センシューパック・ペガシル、φ２０×２５０ｍｍ）にかけ、４０％アセトニトリル溶液を移動相として活性画分を分取することによりマクロスフェライドＡの純品１０．２ｍｇ及びマクロスフェライドＢの純品５．２ｍｇをそれぞれ得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】マクロスフェライドＡの紫外線吸収スペクトルである。
【図２】マクロスフェライドＡの赤外線吸収スペクトルである。
【図３】マクロスフェライドＡの 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】マクロスフェライドＡの13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルである。
【図５】マクロスフェライドＢの紫外線吸収スペクトルである。
【図６】マクロスフェライドＢの赤外線吸収スペクトルである。
【図７】マクロスフェライドＢの 1Ｈ−核磁気共鳴スペクトルである。
【図８】マクロスフェライドＢの13Ｃ−核磁気共鳴スペクトルである。
【図１】
0003641013.tif 000007
【図２】
0003641013.tif 000008
【図３】
0003641013.tif 000009
【図４】
0003641013.tif 000010
【図５】
0003641013.tif 000011
【図６】
0003641013.tif 000012
【図７】
0003641013.tif 000013
【図８】
0003641013.tif 000014