(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする塩基配列を含むDNA。
（ａ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグルカンエリシターレセプター活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号１中の239〜442番のアミノ酸配列を含み、グルカンエリシターレセプター活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列表の配列番号２に示す塩基配列またはその縮重異性体の塩基配列を含む、請求項１記載のDNA。
【請求項３】
受託番号BP−4699の大腸菌株DH5α  EKB633中のプラスミドpER23−１に組み込まれた、グルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAである、請求項１または２記載のDNA。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のDNAが導入された植物細胞または植物。
【請求項６】
カビ耐性である、請求項５記載の植物細胞または植物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、グリカンエリシターレセプターおよびそれをコードするDNA、該DNAを含むベクター、並びに、該DNAが導入された植物細胞に関し、さらに詳細には、ダイズ根の原形質膜画分に由来する、グルカンエリシターレセプター（ER）およびそれをコードするDNA、該DNAを含むベクター、並びに、該DNAが導入された植物細胞に関するものである。
背景技術
植物は、病原菌に感染すると、ファイトアレキシンと呼ばれる抗菌性物質を新たに合成してこれを蓄積するという抵抗反応を示すことが知られている［M.Yoshikawa（1987）Nature 257:546〕。このような植物の抵抗性反応を誘導する物質が植物疫病菌から見いだされ［N.T.Keen（1975）Science 187:74］、これらの物質はエリシターと総称されている。植物の病原菌による感染から、ファイトアレキシン合成および蓄積までの生化学的過程は以下のように考えられている。まず、病原菌の菌糸が植物細胞に侵入すると、植物細胞中に存在するグルカナーゼが働いて病原菌の細胞壁表面の多糖を切断してエリシターを遊離させる。このエリシターが植物細胞に存在するレセプターと結合すると、シグナル伝達の役目をするセカンドメッセンジャーが生成され、このシグナル伝達物質が植物細胞の核内に入ってファイトアレキシン合成系酵素をコードする遺伝子転写を活性化し、ファイトアレキシン合成系酵素を誘導する。それと同時にファイトアレキシン分解系が抑制され、効率よくファイトアレキシンが蓄積する。
ダイズの場合、ダイズの抵抗性に大切な役割を果たすファイトアレキシンはグリセオリンと呼ばれ、その構造も決定されている［M.Yoshikawa et al.（1978）Physiol.Plant.Pathol.12:73］。また、エリシターはグルコースから作られている多糖で、β−1,6結合及びβ−1,3結合したグルカンであることが報告されている［J.K.Sharp et al.（1984）J.Biol.Chem.259:11321,M.Yoshikawa（1990）植物細胞工学1.2:695］。ダイズの病原糸状菌の一種である疫病菌（Phytophythora megasperma f.sp.glycinea）由来のグルカンエリシターに対する特異的なレセプター（ER）は抗菌性物質であるグリセオリンの合成、蓄積に重要な役割を果たしているタンパク質であると考えられるが、このエリシターに特異的なERに関しては、その精製法が示されているのみであって［E.G.Cosio et al.（1990）FEBS 264:235,E.G.Cosio et al.（1992）Eur.J.Biochem.204:1115,T.Frey et al.（1993）Phytochemistry 32:543］、そのアミノ酸配列は未だに解明されておらず、いわんや、ERをコードする遺伝子については全く知られていない。
従って、本発明は、グルカンエリシターレセプターを提供することを目的とする。
本発明は、グルカンエリシターレセプターをコードするDNAを提供することも目的とする。
また、本発明は、グルカンエリシターレセプターをコードするDNAを含むベクターを提供することも目的とする。
さらに、本発明は、グルカンエリシターレセプターをコードするDNAが導入された植物細胞を提供することも目的とする。
発明の開示
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意努力した結果、ダイズ根由来のERの精製およびダイズcDNAライブラリーからのER遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、実質的に配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するグルカンエリシターレセプターを提供する。また、本発明は、実質的に配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAまたはその断片を提供する。さらに、本発明は、プラスミドpER23−１に組み込まれ、グルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAまたはその断片を提供する。さらにまた、本発明は、グルカンエリシターレセプターをコードするDNAを含むベクターおよびグルカンエリシターレセプターをコードするDNAが導入された植物細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、各カラム処理を行った画分のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンの写真である。
第２図は、プラスミドpER23−１およびpER23−２の構成を示す。
第３図は、プラスミドpKV1−ER23の構築の概略図である。
第４図は、ダイズ培養細胞にエリシターを添加すると細胞内Ca2+濃度が一過的に上昇することを示す。
第５図は、形質転換タバコ培養細胞にエリシターを添加すると細胞内Ca2+濃度が一過的に上昇することを示す。
第６図は、大腸菌で発現した、ERの全長及び部分長のエリシター結合活性を示す。
第７図は、エリシター結合ドメインの抗体によってエリシターとダイズ子葉膜画分中のエリシター結合タンパクとの結合が阻害されることを示す。
第８図は、エリシター結合ドメインの抗体によってエリシターが誘導するダイズ子葉のファイトアレキシン蓄積反応が阻害されることを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明のグルカンエリシターレセプターは、植物疫病菌、特にPhytophthora由来のグルカンエリシターのレセプターとしての機能、即ち、植物疫病菌、特にPhytophthora属の微生物が細胞内に侵入した際に疫病菌の細胞壁の一部が植物細胞質中のβ−1,3−グルカナーゼによって切り出されて作られるグルカンエリシターと結合し、植物細胞内のファイトアレキシン含量を増大させることをミクロソーム及び核に指示する機能を持つタンパク質である。本発明のグルカンエリシターレセプターは、実質的に配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有する。「実質的に配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列に加えて、グルカンエリシターレセプターの機能を有している限りにおいて、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列に幾つかのアミノ酸の欠失、置換、付加などがあってもよいことを意味するものである。
本発明のグルカンエリシターレセプターは、例えば、Cosioら［E.J.B.（1992）204:1115］の方法を一部変更した方法により得られる。即ち、ダイズ、好ましくは、品種グリーンホーマーの根、葉、茎等をホモゲナイズし、得られたスラリーから膜画分を回収し、これをイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、更にエリシターをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィーにより精製することにより得られる。この際用いるエリシターとしては、グリーンホーマーに対して不親和性（病原菌に対して耐性）を示すという点から、Phytophthora megasperma f.sp.glycineaレース１（ATCC34566）由来のものが好ましい。
上記のようにして得られたグルカンエリシターレセプターのアミノ酸配列は以下のようにして決定することができる。まず、精製したERをPVDF膜（ミリポア社製）にエレクトロブロッティングにより転写し、これをリジルエンドペプチダーゼ（AP−Ｉ）にて消化する。断片化されたペプチドをPVDF膜上から回収し、これらを逆相HPLC（μ−Bondasphere 5μC8）にて分画した後、それぞれのピーク画分について、気相プロテインシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）で分析する。
本発明のERは、カビに対する耐病性の機構解明やカビ耐性を誘導するエリシターの誘導体の開発に、また、ERに対する抗体を調製するための抗原として有用である。
本発明はグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAおよびその断片を包含する。本発明のDNAは、3'−側末端に接して少なくとも１個の停止コドン（例えばTAG）を持つことが好ましい。
具体的には、本発明は、実質的に配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAまたはその断片を含む。なお、「グルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNA」とは、縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、同一のポリペプチドをコードすることのできるDNAを意味する。たとえば配列番号２の塩基配列を有するDNAに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン例えばAsnに対応するコドン（AAC）が、これと縮重関係にあるコドン例えばAATに変わったものを縮重異性体と呼ぶこととする。このような縮重異性体の一例としては、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むDNAを挙げることができる。
また、別の見地からすると、本発明は、プラスミドpER23−１に組み込まれ、グルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAまたはその断片を含む。プラスミドpER23−１を導入した大腸菌DH5αEKB633は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成６年６月15日付けで寄託され、その微生物受託番号はFERM BP−4699である。
本発明のグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAの断片とは、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものである。
本発明のグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAまたはその断片は、所望により、5'−側上流に翻訳フレームと合わせて翻訳開始のメチオニンをコードするATG配列、その5'−側上流および3'−側下流に非翻訳領域として適当な長さの他のDNAが結合してもよい。
本発明のグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAまたはその断片の代表的存在形態は、プラスミドまたはファージDNAの中に構成員の一部としてこのDNAまたはその断片が挿入された形態、並びに、プラスミドまたはファージあるいはゲノムDNAの中にこのDNAまたはその断片が挿入された形で微生物（特に細菌）またはファージ粒子あるいは植物の中に存在する形態である。ここでいう細菌としては、大腸菌やアグロバクテリウムを挙げることができる。
グルカンエリシターレセプターをコードするDNAまたはその断片が植物中で安定に発現しうるように、本発明のDNAまたはその断片に、プロモーター、翻訳開始コドンをコードするDNA（ATG）およびターミネーターを、適宜組み合わせて付加してもよい。上記のプロモーターとしては、リブロース−1,5−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Fluhrら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83:2358）、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Langridgeら、Plant Cell Rep.（1985）4:355）、カリフラワーモザイクウィルス19S−RNAを生じるプロモーター（Guilleyら、Cell（1982）30:763）、カリフラワーモザイクウィルス35S−RNAを生じるプロモーター（Odellら、Nature（1985）313:810）などを用いることができる。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Depickerら、J.Mol.Appl.Gen.（1982）1:561）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Gielenら、EMBO J.（1984）3:835）を用いることができる。
上記のようなグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAを取得する一つの方法としては、核酸合成の方法に従ってそのDNAの少なくとも一部を化学合成し、これをプローブとして使用して、適当なcDNAライブラリーから、慣用されている方法、例えば、免疫学的方法あるいはハイブリダイゼーション法により取得する方法を挙げることができる。上記の方法に用いる幾つかのプラスミド類、様々な制限酵素やT4DNAリガーゼ、その他の酵素類としては市販のものを使用してよい。また、DNAのクローニング、各プラスミドの構築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのDNA等の回収は文献記載の方法［Molecular Cloning,J.Sambrook et al.,CSH Laboratory（1989）,Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,John Wiley ＆ Sons（1987）他］に準じて行なうことができる。
具体的には、以下のようにして本発明のグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAを取得することができる。まず、グルカンエリシターレセプター中の２種類のアミノ酸部分配列を選択し、これらのアミノ酸配列のＣ末端側をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーと前記アミノ酸配列のＮ末端側をコードすると考えられるあらゆる塩基の組み合わせのプライマーとを作成し、これらをミックスプライマーとして用い、適当なダイズcDNAライブラリーのDNAを鋳型としてPCR反応を行う。その後、PCR反応生成物の中から、増幅が予想される特定の長さの２つの増幅断片（前記の２種類のアミノ酸部分配列をコードするDNAに相当する）を取り出し、これらの塩基配列を決定する。決定された塩基配列を基に、上記の２つのアミノ酸部分配列のうち、グルカンエリシターレセプター中でＣ末端側に位置するアミノ酸部分配列のＣ末端側をコードする塩基配列を有するプライマーと、グルカンエリシターレセプター中でＮ末端側に位置するアミノ酸部分配列のＮ末端側をコードする塩基配列を有するプライマーとを合成する。これらの２種のプライマーを用いて、前記のダイズcDNAライブラリーのDNAを鋳型としてPCR反応を行う。得られた増幅断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、前記のダイズcDNAライブラリーからグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAを取得する。
上記のようにして得られるグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAの塩基配列の決定は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、マキサム−ギルバート法（Maxam−Gilbert,Methods Enzymol.,65:499,1980）やM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法（J,Messing,et al.,Gene,19:269,1982）等により行うことができる。
グルカンエリシターに関する種々の研究から、グルカンエリシターレセプターが植物におけるカビ耐性に重要な役割を担っていることが示唆されているから、本発明のグルカンエリシターレセプターをコードするDNAまたはその断片を公知の方法に従ってグルカンエリシターレセプターを持たない植物細胞、特に高等植物細胞に導入して発現させれば、カビ耐性を植物に付与することができるものと思われる。また、一般に植物に感染可能なカビはサプレッサーをもち、従来、植物自身がもつカビに対する抵抗性を抑制する能力を獲得しているという説が提唱されている。しかし、これらの場合でも、ERが機能するように本発明のグルカンエリシターレセプターをコードするDNAまたはその断片を導入し発現させることや、これらのDNAに改変を加えたり、その発現量を調節することにより、カビにより耐性効果のある植物を新たに育種できる可能性を開くことが期待される。さらに、本発明のDNAまたはその断片をカビ抵抗性を示すグルカナーゼなどカビに対する抵抗性を高める遺伝子や形質と共に植物細胞、特に高等植物に導入し発現させれば、グルカナーゼ等を導入した場合よりもさらに強いカビ抵抗性を植物に付与することができるものと思われる。
グルカンエリシターレセプターをコードするDNAまたはその断片を植物細胞に導入するためのベクターは、グルカンエリシターレセプターが植物体中で安定に発現しうるように構成されればよい。具体的には、グルカンエリシターレセプターをコードするDNAまたはその断片に、プロモーター、翻訳開始コドンをコードするDNA（ATG）およびターミネーターなどが適宜組み合わされて付加されてもよい。上記のプロモーターとしては、リブロース−1,5−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Fluhrら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83:2358）、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Langridgeら、Plant Cell Rep.（1985）4:355）、カリフラワーモザイクウィルス19S−RNAを生じるプロモーター（Guilleyら、Cell（1982）30:763）、カリフラワーモザイクウィルス35S−RNAを生じるプロモーター（Odellら、Nature（1985）313:810）などを用いることができる。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Depickerら、J.Mol.Appl.Gen.（1982）1:561）、オクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター（Gielenら、EMBO J.（1984）3:835）を用いることができる。
植物細胞への遺伝子導入方法としては、通常公知の方法、例えば「“Plant genetic transformation and gene expression;a laboratory manual",J.Draper,et al.eds.,Blackwell Scientific Publications,1988」記載の方法を用いて行うことができる。その例としては、生物的方法であるウィルスを用いる方法、アグロバクテリウムを用いる方法など、物理・化学的方法であるエレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕ダイズ根由来のERの精製
１）ERの結合活性測定法
エリシター（平均分子量10,000）とチラミン（東京化成工業社製）の複合体をJong−Joo Cheong［The Plant Cell（1991）3:127］らの方法に従い合成した。次に、エリシターとチラミンの複合体をクロラミンＴを用いてヨードラベルした。
アッセイ用緩衝液500μｌ（50mM Tris−HCl pH7.4、0.1M Saccharose、5mM MgCl2、1mM PMSF、5mM EDTA）中にサンプル（タンパク量500μｇ以下）を懸濁し、０℃で２時間インキュベートした後、7.0nMヨードラベル化エリシターチラミン複合体（70Ci/mmol、モル数の計算はエリシターの分子量を10,000と仮定して行った、以下同様）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ワットマンGF/B（0.3％ポリエチレンイミン水溶液で１時間以上処理した）で反応溶液を濾過した後、5mlの氷冷緩衝液（10mM Tris−HCl pH7.0,1M NaCl,10mM MgCl2）で３回洗浄し、膜上に残った放射活性をガンマーカウンターでカウントした（カウントＡ）。非特異的結合による影響を除くため、同じサンプルに17μＭのエリシターを加えアッセイ用緩衝液に懸濁した後、０℃で２時間インキュベートし、上記と同様の操作を行ない、得られたカウントを上記のカウントＡから差し引きすることにより、ERの特異的結合によるカウント（Δcpm）を求めた。得られたカウント数（Δcpm）と、実験に用いた全カウント数の商を求め、次いで実験に用いた全エリシター量との積を求めることでエリシター結合蛋白量（mol数）を計算した。
ERの精製は、本測定法を用いて行った。
２）ダイズ根由来のERの精製
ダイズ（グリーンホーマー）種子（タカヤマシード社製）を１週間バーミキュライトで栽培した後、15日間水耕栽培を行ない、根を湿重約40Kg収穫した。収穫した根は精製に使用するまで−80℃で凍結保存した。湿重2Kgの根に対して1.25Lの氷冷懸濁緩衝液（25mM Tris−HCl pH7.0,30mM MgCl2,2mM Dithiothreitol,2.5mMメタ重亜硫酸カリウム,1mM PMSF）を加え、ワーリングブレンダーで２分間ホモゲナイズした。
得られたスラリーをミラクロス（カルビオケム社製）で濾過し、濾液を9,000rpm、４℃で15分間遠心した。上清を37,000rpm、４℃で、20分間超遠心し、沈殿を氷冷緩衝液160ml（25mM Tris−HCl pH7.4,0.1Mシュークロース,5mM MgCl2,1mM PMSF,5mM EDTA）に懸濁して膜画分を得た。ERを膜画分より可溶化するため、終濃度0.25％となるよう両イオン性界面活性剤ZW3−12（ベーリンガー社製）を加え、８℃で30分間攪拌した。可溶化されたERを回収するため、37,000rpm、４℃で20分間超遠心を行ない、上清を回収した（可溶性画分）。可溶性画分165mlを緩衝液（50mM,Tris−HCl pH8.0,0.2％ZW3−12,4℃）2Lで４回透析した後、サンプル中よりプロテアーゼを除きERを安定化するため、プロトラップ（宝酒造社製）5mlを加え、８℃で、30分間ゆっくり攪拌した。その後、遠心（2,800rpm,4℃,2分間）し、上清を回収した。得られた上清160mlを、限外濾過膜YM−10（アミコン社製）を用いて、約50mlに濃縮した後、Ａ緩衝液（50mM Tris−HCl pH8.0,0.1Mシュークロース,5mM MgCl2,1mM PMSF,5mM EDTA,0.2％ZW3−12,4℃）に透析した。
次いで、Ｑ−セファロースHP 26/10（ファルマシア社製）にアプライし、０から1M NaClのリニアグラジエントを行なってERを溶出した（Ｑ−Sepharose活性画分）。ERはNaCl濃度0.45M付近に溶出された。Ｑ−Sepharose活性画分をＡ緩衝液で３倍に希釈した後、MonoQ10/10（ファルマシア社製）にアプライし、０から1M NaClのリニアグラジエントを行なってER画分8mlを溶出した（MonoQ活性画分）。ERはNaCl濃度0.25M付近に溶出された。
最後に、エリシターをリガンドとしたアフィニティーゲルによりERを精製すべく以下の操作を行なった。まず、エリシターはN.T.Keen［Plant Physiol.（1983）71:460,Plant Physiol.（1983）71:466］らの方法を一部変更し、以下のようにして調製した。疫病菌（Phytophthora megasperma f.sp.glycinea）レース１（ATCC34566）の細胞壁をザイモリアーゼ100T（キリンビール社製）で処理しエリシターを遊離させた後、CM−セルロースにザイモリアーゼ100Tを吸着させ、得られた素通り画分をゲル濾過Ｇ−75（ファルマシア社製）にて精製して平均分子量１万の画分を回収した。回収画分のグリセオリンを誘導するエリシター活性をM.Yoshikawa［Nature（1978）257:546］の方法にしたがって測定したところ、８μｇのエリシターをダイズの子葉に与えると、24時間後に約550μｇのグリセオリンが誘導された。
ゲル担体に対する非特異的吸着を除くため、MonoQ活性画分を集め、約33mgのマルトース結合ガラスゲル（ベッド体積約100μｌ）と８℃で１時間攪拌し、ゲルを遠心（1,000rpm,4℃,2分間）で沈殿させ、上清を回収した（マルトース結合ガラスゲル素通り画分）。なお、マルトース結合ガラスゲルは、A.M.Jeffrey et al.［Biochem.Biophys.Res.Commun.（1975）62:608］らの方法に従って以下のようにして作製した。マルトース120mgとGlass,Aminopropyl（シグマ社製）6gを36mlのH2Oに懸濁し、室温で一晩攪拌した。これにエタノール36mlを加え、その直後、72mlのエタノールに864mgの硼水素化ナトリウムを溶解したものを加え、２分間ソニケートし、５時間室温で攪拌した。288mlのH2Oを加えて氷冷し、酢酸でpH5.6に調製した。結合しなかったマルトースを除くため、ゲルを約1.81のH2Oで洗浄した。洗浄液中に含まれるマルトースをアンスロン試薬を用い、J.H.Roe［J.Biol.Chem.（1955）212:335］の方法に従って定量し、洗浄液中に含まれるマルトースの量から、ゲルに結合したマルトース量を推定した。その結果、6gのGlass Aminopropylに対して60mgのマルトースが結合したことがわかった。
マルトース結合ガラスゲル素通り画分8mlに、約17mgのエリシター結合ガラスゲル（ベッド体積約50μｌ）を加え、８℃で一晩ゆっくり攪拌した。遠心（1,000rpm,4℃、２分間）で、ゲルを回収し、２ベッド体積のＡ緩衝液で２回洗浄した。４ベッド体積の0.1％SDSで３回洗浄し、ゲルに結合したERを回収した（エリシター結合ガラスゲル溶出画分）。なお、エリシター結合ガラスゲルは、A.M.Jeffrey et al.［Biochem.Biophys.Res.Commun.（1975）62:608］らの方法に従って以下のようにして作製した。エリシター37mgとGlass Aminopropyl 490mgを6mlのH2Oに懸濁し、室温で一晩攪拌した。これにエタノールを6ml加え、その直後、12mlのエタノールに144mgの硼水素化ナトリウムを溶解したものを加え、２分間ソニケートし、５時間室温で攪拌した。48mlのH2Oを加え、氷冷し、酢酸でpH5.6に調製した。結合しなかったエリシターをアンスロン試薬を用いて定量し、洗浄液中に含まれるエリシターの量から、ゲル結合したエリシター量を推定した。その結果、490mgのGlass Aminopropylに対して、34mgのエリシターが結合したことがわかった。
以上の各精製ステップにおけるタンパク質量及びER量を第１表に示す。
0003625830.tif 000002
上記のMonoQ活性画分、マルトース結合ガラスゲル素通り画分およびエリシター結合ガラスゲル溶出画分（各10μｌ）を電気泳動用グラジエントゲル、SDS−PAGEプレート10/20（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動し、銀染色（第一化学薬品社製）により染色した。これらの電気泳動のパターンを第１図に示す。第１図中のレーン１はMonoQ活性画分、レーン２はマルトース結合ガラスゲル素通り画分、レーン３はエリシター結合ガラスゲル溶出画分を示す。第１図が示すように、ERのバンドは、分子量約70,000付近に検出された。
分子量約70,000に検出されたタンパク質がエリシター結合活性を持つことは、フォトアフィニティー試薬、SASD（ピアス社製）とエリシターの複合体をヨードラベル化したものを用いて、分子量約70,000のタンパク質がヨードラベル化されたこと、および、膜画分のSDS−PAGEをPVDF膜へウエスタンブロッティングし、PVDF膜をERの結合能活性測定に用いたのと同じヨードラベル化エリシターとインキュベートしたところ、分子量約70,000のタンパク質がヨードラベル化されたことより示された。
上述の方法により、湿重約40kgの根から約４μｇのERが精製された。
３）ERの断片化ペプチドの分析
ERをプロテアーゼ消化によってペプチド断片化して、岩松の方法［岩松明彦、生化学、（1991）63:139、A.Iwamatsu,Electorophoresis（1992）13:142］によって断片化ペプチドのアミノ酸配列を決定した。上述の方法で精製したERの溶液をセントリコン−30（アミコン社製）で約100μｌに濃縮し、10−20％ポリアクリルアミドSDS電気泳動を行なった後、各バンドをPVDF膜（ミリポア社製）へエレクトロブロッティング装置（Sartrius社製）により転写した。転写されたPVDF膜を0.1％Ponceau S（シグマ社製）/1％酢酸で染色し、分子量約70,000のメインバンドを切り取り、0.5mM NaOHで脱色した。これを還元Ｓ−カルボキシメチル化し、リジルエンドペプチダーゼ（AP−Ｉ）を酵素：基質（mol:mol）比で1:100になるよう加え、30℃で16時間反応させた。生成した断片化ペプチドを溶媒A 98％を溶媒B 2％で平衡化したμ−Bondasphere 5μC8−300Å（2.1x150mm,Waters）カラムにアプライし、溶媒Ｂに関し２−50％のリニアグラジエントで30分間、流速0.25ml/分で溶出した（溶媒A:0.05％TFA水溶液、溶媒B:2−プロパノール：アセトニトリル＝7:3（v/v）中の0.02％TFA）。溶出されたペプチドを214nmにおける吸収で検出し、それぞれのピーク画分をマニュアルで集めた。得られたそれぞれのピーク画分は、気相プロテインシークエンサー（Applied Biosystems Model 470A）を用いて分析した。すべての得られたピーク画分を分析した結果、以下の断片化ペプチドアミノ酸配列が明確に決定された。
0003625830.tif 000003
〔実施例２〕  ダイズERのクローニング
１）ダイズmRNAの取得
ダイズ（グリーンホーマー）種子（タカヤマシード社製）を１週間バーミキュライトで栽培した後、15日間水耕栽培を行ない、根を湿重約40Kg収穫した。その一部を液体窒素により凍結し使用するまで−80℃で保存した。石田（細胞工学実験操作入門  講談社サイエンティフィク）らの方法に従い全RNAの取得を行なった。凍結保存した根（湿重28.5g）に液体窒素を加えながら乳鉢で粉末状にした。この粉末に、65℃に保温したGTC溶液35.6mlを加えワーリングブレンダーで攪拌し、得られた懸濁液を6,000rpm、15分間、室温で遠心し上清40mlを回収した。セシウムクッション液をあらかじめ入れた遠心管に得られた上清を静かに重層し、35,000rpm、20時間、25℃で遠心した。得られた沈殿に9mlのTE/0.2％SDSを加えて溶解した。２回フェノール／クロロホルム抽出を行なった後、エタノール沈殿で4.37mgの全RNAを回収した。
上記で得られた全RNA2.2mgをオリゴテックス−dT30（日本ロッシュ社製）を用いてマニュアルに従い精製し、68μｇのpoly（Ａ）＋RNAを精製した。
２）ダイズcDNAライブラリーの作成
５μｇのpoly（Ａ）＋RNAをcDNA合成キット（ファルマシア社製）を用いて、マニュアルに従い、cDNAを合成した。合成したcDNA断片はラムダファージベクターλgt10（ストラタジーン社製）にT4リガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結した。さらにDNA混合溶液を用いて、ファージ粒子にギガパック（ストラタジーン社製）を用いてパッケージングし、約150万pfuのダイズのcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーを増幅して1.6 x 1011pfu/ml、160mlのダイズcDNAライブラリーを得た。
cDNAライブラリーの全DNAは以下の様に調整した。500μｌのファージ液（1.6 x 1011pfu/ml）を等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）を加えて30秒間振とうした後、遠心分離により水層を回収した。クロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）により再抽出した後、水層に５μｌの3M酢酸ナトリウムpH5.4溶液と125μｌのエタノールを加えて遠心し、沈殿を回収した。この沈殿を70％エタノール溶液で洗浄後、１μg/ml RNaseA（シグマ社製）を含む10mMトリス塩酸pH8溶液に溶解し、これをPCR法の鋳型として使用した。
３）ダイズERのcDNA断片のPCR法による増幅とクローニング
実施例１で得られた断片化ペプチドのアミノ酸配列（＃５と＃６）を基にミックスプライマーとして、
0003625830.tif 000004
（R:A/G、Y:C/T、W:A/T、H:A/C/T、N:A/G/T/C）
の４種類のオリゴデオキシヌクレオチド（プライマーU5;プライマーU7;プライマーU10;プライマーU12）を自動核酸合成機（アプライドバイオシステム社モデル394）を用いて合成した。
0.5μｇのcDNAライブラリー中の全DNAを79μｌの蒸留水に溶解し、10μｌの10xPCRバッファー（宝酒造社製Taq DNAポリメラーゼに添付）、８μｌの2.5mM dNTPにプライマーU5とU7もしくはU10とU12をそれぞれ100pmolずつ及び0.5μｌのTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を加え最終量100μｌとし、以下のようにPCR反応を行なった。反応装置はパーキンエルマー社製ジーンアンプPCRシステム9600を用いた。反応は、１）変性94℃;30秒、２）再生47℃;30秒、３）伸長72℃;1分の操作を50回繰り返して行った。反応後、反応液の15μｌを15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動に供した上記ゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウム溶液で10分間染色し、UV下で観察して、それぞれ増幅が予想される40bpと47bpの特異的増幅断片を示すバンドを切り出した。同ゲル断片をプラスチック棒で粉砕後、溶出バッファー（0.5M酢酸アンモニウム、10mM酢酸マグネシウム、1mM EDTA、0.1％ SDS）で１晩溶出し、DNAを含む溶液を回収した。
回収したDNA断片をプラスミドpT7Blue（Ｒ）にpT7Blue T−Vector Kit（ノバゲン社製）を用いてクローニングし、得られたプラスミドｐ＃５−1,2、ｐ＃６−1,2,3,4,5,6,7,8,9を蛍光プライマー・サイクル・シークエンス・キット（アプライドバイオシステム社製）と蛍光自動DNAシーケンサー（アプライドバイオシステム社モデル373A）を用いてDNAの配列を決定した。その結果、得られた増幅DNA断片のプライマー以外の部分は、＃５および６の断片化ペプチドのアミノ酸配列をコードしていた。
上記DNA配列決定の結果を基にして、ミックスプライマーとして
0003625830.tif 000005
（ＹおよびＲは上記のとおり、M:A/C）
とする２種類のオリゴデオキシヌクレオチド（プライマーU18;プライマーU19）を自動核酸合成機を用いて合成した。
0.5μｇのcDNAライブラリーの全DNAを79μｌの蒸留水に溶解し、10μｌの10xPCRバッファー、８μｌの2.5mM dNTPにプライマーU18とU19をそれぞれ100pmolずつ及び0.5μｌのTaq DNAポリメラーゼを加え最終量100μｌとし、PCR反応を行なった。反応は、１）変性94℃;30秒、２）再生52℃;30秒、３）伸長72℃;1分の操作を40回繰り返して行った。反応液の15μｌを１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
電気泳動に供した上記ゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウム溶液で15分間染色し、UV下で観察して、特異的に増幅が観察できた約540bpの増幅断片のバンドを切り出した。同ゲル断片はジーンクリーンII（バイオ101社製）によって処理し、DNAを含む溶液を回収した。
回収したDNA断片をプラスミドpT7Blue（Ｒ）にpT7Blue T−Vector Kitを用いてクローニングし、得られたプラスミドｐ＃５−＃６のDNAの配列を蛍光シークエンサーにて決定した。得られた増幅DNA断片は、539bpからなり、＃５および６の断片化ペプチドのアミノ酸配列をコードしており、増幅した部分には＃７の断片化ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列が存在することがわかった。
４）ハイブリダイゼーションによるライブラリーのスクリーニングとクローニング
ERのcDNA断片がクローニングされているプラスミドｐ＃５−＃６の、制限酵素BamH IおよびPst Iによって切り出されるDNA断片（約540bp）を回収し、プローブとして用いた。回収されたDNA断片をメガプライムDNA標識システム（アマシャム社製）を用い、マニュアルに従って［α−32P］dCTPにてラベル化し、反応液をハイブリダイゼーションの実験に供した。
ファージライブラリーを大腸菌C600 hfl（インビトロジェン社製）に感染させ、10mg/mlのMgCl2を含むＬ培地を入れた直径約15cmのシャーレにまいて総数約100万個のプラークを形成させた後、ナイロンメンブレン（Hybond−N;アマシャム社製）にブロッティングした。32P−dCTPで標識したエリシター受容体cDNA断片をこのメンブレンと反応させ、オートラジオグラフィーによって検出した陽性ファージを再度同様にスクリーニングすることにより、シグナル強度の異なる約30個のファージクローンを得た。この中から挿入DNA断片の最も長いクローンλER23を選択した。
ハイブリダイゼーション実験より単離したポジティブなクローンλER23のファージ液からラムダソーブ（プロメガ社製）を用いてλファージDNAを精製した。５μｇのDNAに10μｌの10xEcoR I切断バッファー制限酵素EcoR I10Uを加え、全量を100μｌとし37℃で一晩反応させた。反応液を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、約2.3kbのバンドを切り出し、ジーンクリーンII（バイオ101社製）によって処理し、DNAを含む溶液を回収した。一方、0.02μｇのベクターpBluescript II KS−（ストラタジーン社製）を制限酵素EcoR Iで切断した。
両DNA溶液を混合し、２μｌの10xリガーゼバッファーと0.2μｌのT4DNAリガーゼ（宝酒造製）を加え、全量20μｌとして16℃で４時間反応させ、この反応混合溶液を用いて大腸菌DH5α（ギブコBRL社製）を形質転換した。50μg/mlアンピシリン、40μg/mlIPTG、40μg/mlX−galを含むＬ培地25mlで２％寒天平板培地を作成した。同培地に形質転換した大腸菌をまき、37℃１晩生育させた。生育した菌のうち、白色のコロニーを示す菌を選び、3mlの50μg/mlのアンピシリンを含むＬ培地で37℃で８時間培養した。これらの菌からアルカリ法にてプラスミドを回収し、制限酵素にて正しい断片がクローニングされたクローンであるかどうかを調べ、ベクターに対する方向を異にするプラスミドpER23−１とpER23−２（5225bp）を得た。プラスミドpER23−１およびpER23−２の構成を第２図に示す。
５）ERをコードするクローンのDNA塩基配列の決定
ERのcDNAがクローニングされているプラスミドpER23−１とpER23−２を適当な制限酵素を用いるか、塩基配列の決定した部分から適当なプライマーを合成し用いるか、前者プラスミドは制限酵素Kpn IとXho Iで、後者プラスミドは制限酵素Kpn IとCla Iで切断後、キロシークエンス用ディリーションキット（宝酒造製）を用いて、ほぼ200−300bpごとに欠失したプラスミドを作成するかを行ない、これらを用いて蛍光シークエンサーで両方向のDNA塩基配列を決定した。そのDNA塩基配列を配列表の配列番号２に示す。その結果、そのDNA断片中にはアミノ酸シークエンサーで決定されたＮ−末端からの配列（＃１の断片化ペプチド）に対応する塩基配列を先頭に2001bpからなるORFが存在し、667残基のアミノ酸がコードされていると推定された。このアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。得られたDNA塩基配列から推定されるアミノ酸配列は先に決定したダイズERのアミノ酸配列と一致した。
さらに、核酸およびアミノ酸配列の解析ソフト（マックベクター：コダック社製）と核酸およびアミノ酸配列のデータベース（Entrez:NCBI社製）を用いて相同性の高いアミノ酸配列の検索を行なったところ、現在まで知られている配列と強い相同性を示すものは確認できなかった。従って、前記のERは全く今まで知られていなかった新規のタンパク質であることが明らかとなった。
〔実施例３〕  ダイズERのタバコ植物での発現
１）植物体発現プラスミドpKV1−ER23の構築
まず、第３図に示すように、カリフラワー・モザイクウィルスの35Sプロモーターを含むプラスミドpCaP35J［J.Yamaya et al.（1988）Mol.Gen.Genet.211:520］を基にして、本実施例で用いる植物体発現ベクターpKV1を以下のように作製した。まず、pCaP35Jの35Sプロモーターの上流域にある多クローニング部位を欠失する目的で制限酵素BamH Iで完全消化した後、Pvu IIで部分消化後、クレノウ断片（宝酒造社製）処理を施し平滑化した後、ライゲーション反応を行ない環状化した。これを大腸菌DH5αに形質転換した。得られたクローンの中から目的のプラスミドを得た。さらに35Sプロモーターの下流域に多クローニング部位を挿入する目的で制限酵素Pst Iで消化後、クレノウ断片処理を施し平滑化した。さらにHind IIIで消化して、自動核酸合成機を用いて合成した下記に示す合成リンカー用DNAをアニーリングした後、ライゲーションで組み込み、大腸菌DH5αに形質転換した。得られたクローンの中から目的のプラスミドpCaP35Y（2837bp）を得た。
0003625830.tif 000006
上記のpCaP35Yにノパリン合成酵素のターミネーターを導入する目的で、pBI121（クローンテック社製）の断片（Sac I−EcoR I断片を分離しクレノウ断片で平滑化したもの）をプラスミドpCaP35Yの35Sプロモーターの下流のHind III部位をやはり平滑化したものとライゲーションで組み込み、大腸菌DH5αに形質転換した。得られたクローンの中から目的のプラスミドを得た。このプラスミドにカナマイシン耐性カセットを導入する目的で、このプラスミドをPvu IIで消化して、pLGVneo1103［R.Hain et al.（1985）Mol.Gen.Genet.199:161］の断片（オクトピン合成酵素ターミネーター下流に存在するPvu II部位で切断後、Bal31（宝酒造製）処理を施し、欠失を生じさせた。さらにノパリン合成酵素プロモーターの上流はEcoR I部位で切断後、両端を平滑化したもので約1620bpになる断片）をライゲーション反応で連結し、これを大腸菌DH5αに形質転換した。得られたクローンの中から目的のプラスミドである植物発現用ベクターpKV1（4828bp）を得た。
作成したpKV1を単一制限酵素であるBamH IとSal Iで消化し、ER遺伝子を含む断片（pEB23−１のBamH I−Sal I断片、約2.3kbp）をライゲーションで組み込み、これを大腸菌DH5αに形質転換した。得られたクローンの中から目的のER発現用プラスミドpKV1−ER23（約7.1Kbp）を得た。
２）ERのタバコ培養細胞での一過的発現
電気穿孔法によるERのタバコ培養細胞での一過的発現は渡辺らの方法［Y.Watanabe（1987）FEBS 219:65］を一部改変して行なった。上記で作成したプラスミドpKV1−ER23のDNAはアルカリ法によって精製した。一過的発現のためのタバコ培養細胞の取得は平井らの植物細胞育種入門（学会出版センター1982）に従って行った。タバコ（品種ブライトイエロー：東京大学内宮博文教授より分与）の種子を１％次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌したのち発芽させ、発芽直後のタバコ幼組織をタバコ培養用寒天培地（ムラシゲとスクーグ培地：フローララボラトリー社製に2ppm 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、３％蔗糖と0.8％寒天）に植え込み、３週間でカルスを誘導した。約1gのカルス塊を50mlのタバコ培養用培地（ムラシゲとスクーグ培地：フローララボラトリー社製に2ppm 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、３％蔗糖）に懸濁し培養細胞を作製した。これらのタバコ培養細胞を植え継ぎで対数増殖期にした後、遠心分離器（600rpm,3分間）で回収し、１％セルラーゼ・オノヅカ（ヤクルト社製）、１％ドリセラーゼ（協和発酵社製）、0.1％ペクトリアーゼ（盛進製薬社製）、0.4M D−マンニトール（和光純薬社製）HClでpH5.7に調製したものに懸濁し、30℃90分間反応しプロトプラストを作成した。遠心を３回繰り返すことにより、４℃の0.4M D−マンニトールで洗い酵素液を取り除いた。電気穿孔法の一回の操作は1 x 106の細胞を0.8mlの電気穿孔用溶液（70mM KCl,5mM MES,0.3Mマンニトール）に懸濁し、10μｇのpKV1−ER23のDNAと混ぜ、電気穿孔用キュベット（バイオラッド社製、電極間0.4cm）に入れ、ジーンパルサー（バイオラッド社製）を用い、125μＦ、300Vで処理を行なった。処理後、パスツールピペットで回収した溶液を氷上で30分放置した後30℃で５分反応させ、遠心分離によりプロトプラスト培地（ムラシゲとスクーグ培地：フローララボラトリー社製に0.2ppm 2,4−Ｄ、１％蔗糖、0.4Mマンニトールを添加しpH5.7に調製）に再懸濁した。細胞をその後、暗所25℃で一晩静置培養した後、遠心（8,000rpm,3分間）で回収し、60μｌの懸濁緩衝液（25mM Tris−HCl pH7.0,30mM MgCl2,2mM Dithiothreitol,2.5mMメタ重亜硫酸カリウム,1mM PMSF）を加え３分間ボルテックスで攪拌した。得られた標品はエリシター結合実験を行なうまで−80℃で保存した。
対照として、pKV1−ER23のDNAの代わりにpKV1のDNAをタバコ細胞に導入した他は上記の操作を繰り返した。
３）ERのタバコ培養細胞での定常的発現
定常的にER遺伝子を保持する形質転換タバコ培養細胞は以下のようにして一過的発現のタバコ培養細胞から選別した。
前述した一過的発現のタバコ培養細胞の作成で得られたプロトプラストを１％アガロースを含んだプロトプラスト培地（ムラシゲとスクーグ培地：フローララボラトリー社製に0.2ppm 2,4−Ｄ、１％蔗糖、0.4Mマンニトールを添加しpH5.7に調製）に懸濁し、アガロースが固化する前にシャーレにスポイトで懸濁液を滴下して、プロトプラストをビーズ状の固形培地に固定した。アガロースが固まった後、シャーレにアガロースを含まないプロトプラスト培地を加えプロトプラストを固定したアガロース培地を液体培地で浸した。暗所で一週間培養した後に終濃度100μg/mlのカナマイシンを加え、さらに培養を継続し、増殖してきたコロニーを選別して得られた形質転換体をカナマイシンを含む液体培地に移し培養した。
定常的にpKV1−ER23を保持する形質転換タバコ培養細胞が２クローン（I 1,I 6）、対照として、定常的にpKV1を保持するタバコ培養細胞が２クローン（C 2−1,C 2−４）それぞれ得られた。
４）エリシター結合実験
ERの結合活性は以下のようにして測定した。エリシターとチラミン（東京化成工業社製）の複合体をJong−Joo Cheong［The Plant Cell（1991）3:127］らの方法に従い合成した。次に、エリシターとチラミンの複合体をクロラミンＴを用いてヨードラベルした。500μｌのアッセイ用緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.4,0.1M Saccharose,5mM MgCl2,1mM PMSF,5mM EDTA）中に、得られた標品（タンパク量500μｇ以下）を懸濁し、０℃で２時間インキュベートした後、100nMヨードラベル化エリシターチラミン複合体（70Ci/mmol）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ワットマンGF/B（0.3％ポリエチレンイミン水溶液で１時間以上処理した）で反応溶液を濾過した後、5mlの氷冷緩衝液（10mM Tris−HCl pH7.0,1M NaCl,10mM MgCl2）で３回洗浄し、膜上に残った放射活性をガンマーカウンターでカウントした（カウントＡ）。非特異的結合による影響を除くため、同じサンプルに17μＭのエリシターを加えアッセイ用緩衝液に懸濁した後、０℃で２時間インキュベートし、上記と同様の操作を行ない、得られた放射活性のカウントを上記のカウントＡから差し引きすることにより、ERの特異的結合によるカウント（Δcpm）を求めた。得られたカウント数（Δcpm）と、実験に用いた全カウント数の商を求め、次いで実験に用いた全エリシター量との積を求めることでエリシター結合蛋白量（mol数）を計算した。
その結果、対照としてpKV1のDNAを導入したタバコ細胞ではエリシターとの特異的な結合が観察されなかったが、pKV1−ER23のDNAを導入したタバコ細胞ではエリシターとの特異的な結合が観察された（第２表）。よって、上記のようにして得られた遺伝子はエリシター結合活性を持つタンパクをコードすることが明らかになった。
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５）グルカンエリシターの添加による、形質転換タバコ培養細胞の細胞内Ca2+濃度の一過的上昇
植物はエリシターをそれに対する特異的な受容体で認識し、ファイトアレキシンの蓄積を促進したり過敏感反応を誘導したりしてカビの侵入を防いでいる。これら抵抗性反応の初期にカルシウムイオンが細胞内に流入することが重要であるとの報告がいくつかの植物においてすでになされており［U.Conrath et al.（1991）FEBS LETTERS 279:141,M.N.Zook et al.（1987）Plant Physiol.84:520,F.Kurosaki et al.（1987）Phytochemistry 26:1919,C.L.Preisig and R.A.Moreau（1994）Phytochemistry 36:857］、我々がERを取得する材料に用いたダイズにおいてもカルシウムイオンが細胞内に流入することが引き金となってファイトアレキシンの蓄積が促進される事を示唆する報告がなされている［M.R.Stab and J.Ebel（1987）Archi.Biochem.Biophys.257:416］。そこで、ERをもたないタバコ培養細胞に受容体を導入発現させた形質転換タバコ培養細胞を作成し、グルカンエリシター添加によって細胞内カルシウムイオン濃度が変化するようになればその変化が引き金となってダイズ以外の植物（タバコ）でもグルカンエリシターによって抵抗性反応が誘導され、グルカンを細胞壁成分の一つとする幅広い種類のカビに対して抵抗性を示すようになることが期待される。
そこで、形質転換タバコ培養細胞の細胞内Ca2+濃度のエリシター添加による影響を調べた。
ここでタバコ培養細胞は、カナマイシン選抜で得られた形質転換タバコ培養細胞（I6）及びプラスミドのみ導入したタバコ培養細胞（C2−４）を用いた。
培養細胞の細胞内Ca2+濃度はCa2+測定用蛍光キレーター（Fura−２）のアセトキシメチル誘導体（Fura−2 AM）を用いて以下のように測定した。
形質転換タバコ培養細胞約2mlを取り（10分間静置で細胞体積約250μｌに当たる）、600rpm、30secで細胞を集め上清を捨てた。2mlのタバコ培養用培地を加え、軽く攪拌した後遠心（600rpm,30sec）し、上清を除き、再度同様の操作を繰り返し培養細胞を洗浄した。洗浄した培養細胞に培地2mlを加え、均一になるよう懸濁し、培地に懸濁した培養細胞1mlを取り、1mlの培地と４μｌの1mM Fura−2 AM（終濃度２μＭ、同仁化学社製）を加え、30分間室温暗所で時々攪拌しながらインキュベートした。その後、遠心操作（600rpm,30sec）により2mlの培地で２回細胞を洗浄し、細胞内に取り込まれなかったFura−2 AMを取り除いた。洗浄した培養細胞に2mlの培地を加え、培養細胞を均一に懸濁して培養細胞2mlを蛍光測定用セルに移した。細胞内に取り込まれたFura−2 AMは細胞内エステラーゼにより加水分解を受けてFura−２に変化する。このFura−２が細胞内Ca2+と結合することによって生ずる蛍光を励起波長335nm、蛍光波長505nmで、培養細胞が沈殿しないようにスターラーで攪拌しながら、測定した。50μｌのグルカンエリシター（1mg/ml）ないしは脱イオン水を培養細胞に添加して蛍光強度を経時的に測定し、細胞内Ca2+濃度の変化を調べた。対照実験としてプラスミドのみを導入したタバコ培養細胞についても上記と同様の操作で細胞内Ca2+濃度の変化を調べた。また更に、別の対照実験としてダイズ培養細胞についても上記と同様の操作（但し、培養細胞の洗浄にダイズ細胞用の培地を使用した）を行なった。
ダイズ細胞用の培地組成を以下に記す（NaH2PO4・H2O 75mg/ml,KH2PO4 170mg/ml,KNO3 2,200mg/ml,NH4NO3 600mg/ml,（NH4）2SO4 67mg/ml,MgSO4・7H2O 310mg/ml,CaCl2 2H2O 295mg/ml,FeSO4・7H2O 28mg/ml,EDTA・Na2 37.3mg/ml,KI 0.75mg/ml,MnSO4・4H2O 10.0mg/ml,H3BO3 3.0mg/ml,ZnSO4・7H2O 2mg/ml,Na2MoO4・2H2O 0.25mg/ml,CuSO4・5H2O 0.025mg/ml,CoCl2・6H2O 0.025mg/ml,Inositol 100mg/ml,Nicotinic acid 1.0mg/ml,Pyridoxine・HCl 1.0mg/ml,Thiamine・HCl 10.0mg/ml,Glucose 5g/ml,Sucrose 25g/ml,Xylose 250mg/ml,Sodium pyruvate 5.0mg/ml,Citric acid 10.0mg/ml,Malic acid 10.0mg/ml,Fumaric acid 10.0mg/ml,N−Ｚ−amine 500.0mg/ml,2,4−D 1.0mg/ml,Zeatine riboside 0.1mg/ml,KOHでpH5.7に調製する）。
これらの実験を行なった結果、ダイズ培養細胞ではエリシター添加３分後に約７％蛍光強度が一過的に上昇したが、脱イオン水の添加ではそのような変化は観察されなかった（第４図）。この結果は、本実験法によってERがグルカンエリシターと結合することによって一過的に細胞内にCa2+を流入させる現象を観察できることを示唆しており、ダイズ培養細胞でエリシターによって引き起こされる抵抗性反応にカルシウムイオンが重要な役割を果たしているとの報告を支持している。形質転換タバコ培養細胞ではエリシター添加３分後に約10％蛍光強度が一過的に上昇したが、脱イオン水の添加ではそのような変化は観察されなかった。
また、プラスミドのみを導入したタバコ培養細胞では形質転換タバコ培養細胞で生じたエリシター添加による蛍光強度の変化は観察されなかった（第５図）。
これらの結果はグルカンエリシターに反応性の無かったダイズ以外の植物（タバコ）にダイズ由来のグルカンエリシター受容体を導入発現させるとグルカンエリシターに対する反応性を新たに獲得する事を示している。それぞれの植物におけるシグナル伝達経路に関しては未だ未知の部分が多く残されているが、タバコ以外の植物でも本ERを導入発現させればグルカンエリシターに対する反応性（細胞内Ca2+濃度の一過的な上昇）を獲得し、ひいてはグルカンをその細胞壁成分の一つとする幅広い種類のカビに対して抵抗性を示す植物の育種が可能になると期待される。
〔実施例４〕  ダイズERの大腸菌での発現とエリシター結合ドメインの決定
１）大腸菌でのエリシター結合ドメインの発現
ダイズERの部分断片を大腸菌で発現させるためマルトース結合蛋白（MBP）との融合蛋白の作成をニューイングランドバイオラボ社製のProtein Fusion ＆ Purification Systemを用いて行なった。pER23−１を鋳型に用いてPCRを行ない、様々な長さのDNA断片を取得した。プライマーは、第６図に示すダイズERの全長および断片をコードするDNAの外側に、5'側はBamH I部位を、3'側はSal I部位をあらかじめ付加しておき、プラスミドpMAL−c2（ニューイングランドバイオラボ社製）にクローニングした際にMBPと融合蛋白が産生するようにデザインした。これらプライマーを自動核酸合成機（アプライドバイオシステム社モデル394）を用いて合成した。DNA鎖の増幅には以下のプライマーを用いた。
0003625830.tif 000008
0.01μｇのpER23−1DNAを79μｌの蒸留水に溶解し、10μｌの10xPCRバッファー（宝酒造社製Taq DNAポリメラーゼに添付）、８μｌの2.5mM dNTPにプライマーU5とU7もしくはU10とU12をそれぞれ100pmolずつ及び0.5μｌのTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を加え最終100μｌとし、以下の要領にてPCR反応を行なった。反応装置はパーキンエルマー社製ジーンアンプPCRシステム9600を用いた。反応条件は１）94℃;30秒、２）55℃;30秒、３）72℃;1分で１）２）３）を30回繰り返した。反応後、15μｌを制限酵素BamH IとSal Iで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
電気泳動に供した上記ゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウム溶液で15分間染色し、UV下で観察して、想定される特異的に増幅が観察できた断片を切り出した。同ゲル断片はジーンクリーンII（バイオ101社製）によって処理し、DNAを含む溶液を回収した。回収したDNA断片をプラスミドpMAL−c2のBamH I−Sal I部位にクローニングし大腸菌DH5αに導入した。
２）大腸菌からの可溶化蛋白画分の調製
それぞれのプラスミドを導入した大腸菌を１晩、発現培地（10g/lトリプトン；ギブコ社製、5g/l酵母抽出物；ギブコ社製、5g/l NaCl、2g/lブドウ糖、100μg/mlアンピシリン）で前培養した培養液0.4mlを40mlの発現培地に添加し、OD600＝0.55になるまで37℃で振盪培養した。最終濃度0.3mMになるようにイソプロピルチオガラクトサイドを加えさらに４時間振盪培養を継続し、発現の誘導を行なった。大腸菌を遠心分離で回収後、洗浄バッファー（20mM Tris−HCl,pH7.4,200mM NaCl,1mM EDTA）で菌体を洗浄し、超音波処理（15秒ずつ２分間）で細胞を破砕し、終濃度0.25％ ZW3−12添加後30分間４℃でインキュベート後、遠心分離（10,000rpm,5min）より上清を回収し、大腸菌可溶化蛋白画分を得た。融合蛋白が発現していることは、抗マルトース結合蛋白抗体（ニューイングランドバイオラボ社製）を用いたイムノブロット法により確認した。
３）エリシター結合実験
エリシターとの結合活性は以下のようにして測定した。エリシターとチラミン（東京化成工業社製）の複合体をJong−Joo Cheong［The Plant Cell（1991）3:127］らの方法に従い合成した。次に、エリシターとチラミンの複合体をクロラミンＴを用いてヨードラベルした。500μｌのアッセイ用緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.4,0.1M Saccharose,5mM MgCl2,1mM PMSF,5mM EDTA）中に、得られた標品（タンパク量800μｇ以下）で懸濁し、０℃で２時間インキュベートした後、100nMヨードラベル化エリシターチラミン複合体（70Ci/mmol）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ワットマンGF/B（0.3ポリエチレンイミン水溶液で１時間以上処理した）で反応溶液を濾過した後、5mlの氷冷緩衝液（10mM Tris−HCl pH7.0,1M NaCl,10mM MgCl2）で３回洗浄し、膜上に残った放射活性をガンマーカウンターでカウントした（カウントＡ）。非特異的結合による影響を除くため、同じサンプルに17μＭのエリシターを加えアッセイ用緩衝液に懸濁した後、０℃で２時間インキュベートし、上記と同様の操作を行ない、得られた放射活性のカウントを上記のカウントＡから差し引きすることにより、ERの特異的結合によるカウント（Δcpm）を求めた。得られたカウント数（Δcpm）と、実験に用いた全カウント数の商を求め、次いで実験に用いた全エリシター量との積を求めることでエリシター結合蛋白量（mol数）を計算した。
ERのDNAを導入した大腸菌でもエリシターとの特異的な結合が観察された（第６図）。よって、上記のようにして得られた遺伝子はエリシター結合活性を持つタンパクをコードすることが再確認できたとともに、配列番号１中の239から442のアミノ酸配列中にエリシター結合ドメインが存在することが明かとなった。
〔実施例５〕  エリシター結合ドメインの抗体によるグルカンエリシターとダイズ子葉膜画分のエリシター結合タンパクとの結合阻害とダイズ子葉のファイトアレキシン蓄積阻害
１）大腸菌でのエリシター結合ドメインの発現
ER由来の大量のエリシター結合ドメインを大腸菌で発現させるためマルトース結合蛋白（MBP）との融合蛋白の作成をニューイングランドバイオラボ社製のProtein Fusion ＆ Purification Systemを用いて行なった。エリシター結合ドメインをコードするDNAを得るためPCRを用いた。以下のプライマーを自動核酸合成機（アプライドバイオシステム社モデル394）を用いて合成し用いた。
0003625830.tif 000009
0.01μｇのpER23−1DNAを79μｌの蒸留水に溶解し、10μｌの10xPCRバッファー（宝酒造社製Taq DNAポリメラーゼに添付）、８μｌの2.5mM dNTPにプライマーU5とU7もしくはU10とU12をそれぞれ100pmolずつ及び0.5μｌのTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を加え最終100μｌとし、以下の要領にてPCR反応を行なった。
反応装置はパーキンエルマー社製ジーンアンプPCRシステム9600を用いた。反応条件は１）94℃;30秒、２）55℃;30秒、３）72℃;1分で１）２）３）を30回繰り返した。反応後、15μｌを制限酵素BamH IとSal Iで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にかけた。
電気泳動に供した上記ゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウム溶液で15分間染色し、UV下で観察して、特異的な増幅が観察できた断片を示すバンドを切り出した。同ゲル断片はジーンクリーンII（バイオ101社製）によって処理し、DNAを含む溶液を回収した。回収したDNA断片をプラスミドpMAL−c2のBamH I−Sal I部位にクローニングし大腸菌DH5αに導入した。
２）大腸菌で発現した融合蛋白の精製と抗体の作成
プラスミドを導入した大腸菌を１晩、発現培地（10g/lトリプトン；ギブコ社製、5g/l酵母抽出物；ギブコ社製、5g/l NaCl、2g/lブドウ糖、100μg/mlアンピシリン）で前培養した培養液150mlを1.51の発現培地に添加し、OD600＝0.55になるまで37℃で坂口フラスコにて振盪培養した。最終濃度0.3mMになるようにイソプロピルチオガラクトサイドを加えさらに４時間振盪培養を継続し、発現の誘導を行なった。大腸菌を遠心分離で回収後、洗浄バッファー（20mM Tris−HCl,pH7.4,200mM NaCl,1mM EDTA）で菌体を洗浄し、超音波処理（15秒ずつ２分間）で細胞を破砕した。遠心によって得られた可溶化蛋白画分からMBP融合蛋白をアミロースレジンで精製、さらにファクターXaでMBPとエリシター結合ドメインを切断後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製蛋白（エリシター結合ドメイン）を得た。精製蛋白はE.HarlowとD.Lane［Antibody（1988）コールドスプリングハーバー社、pp.53−137］の方法に従い、マウス腹腔に２回免疫感作を行なった。力価が上昇したことをELISA法で確認した後、腹水を取得し、50％飽和硫安沈殿、プロテインＡセファロース（ファルマシア社製）で処理（0.1Mリン酸ナトリウムpH8.0で抗体を結合し、0.1Mクエン酸pH3.5で溶出した。）して抗体の精製を行なった。イムノブロット法では、得られた抗体は、ダイズにおいてはER蛋白のみを認識することが確認された。
３）ダイズ子葉膜画分の調製
ダイズ子葉膜画分の調製は以下のように行なった。
土壌栽培（９日間）したダイズ子葉（湿重、36g）を収穫し、47mlの氷冷バッファー（25mM Tris−HCl pH7.0,30mM MgCl2,2mM dithiothreitol.2.5mM sodium metabisulfite,1mM PMSF）に懸濁した。子葉膜画分の調製法はダイズ根の膜画分調製法に従った。得られた子葉膜画分を1mlの氷冷バッファー（10mM Tris−HCl pH7.4,0.1M sucrose,5mM MgCl2,1mM PMSF,5mM EDTA）に懸濁し−80℃で保存した。
４）ダイズ子葉膜画分のエリシター結合タンパクとグルカンエリシターの結合反応の阻害活性測定
エリシターとの結合活性は以下のようにして測定した。エリシターとチラミン（東京化成工業社製）の複合体をJong−Joo Cheong［The Plant Cell（1991）3:127］らの方法に従い合成した。次に、エリシターとチラミンの複合体をクロラミンＴを用いてヨードラベルした。500μｌのアッセイ用緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.4,0.1M Saccharose,5mM MgCl2,1mM PMSF,5mM EDTA）中に、ダイズ子葉膜画分（100μl,820μｇ）を懸濁し、０℃で２時間インキュベートした後、714ng（143nM）のヨードラベル化エリシターチラミン複合体（70Ci/mmol）を加え、４℃で２時間インキュベートした。ワットマンGF/B（0.3％ポリエチレンイミン水溶液で１時間以上処理した）で反応溶液を濾過した後、5mlの氷冷緩衝液（10mM Tris−HCl pH7.0,1M NaCl,10mM MgCl2）で３回洗浄し、膜上に残った放射活性をガンマーカウンターでカウントした（カウントＡ）。非特異的結合による影響を除くため、同じサンプルに約100倍量（75μg,15μＭ）のコールドエリシターを加えアッセイ用緩衝液に懸濁した後、０℃で２時間インキュベートし、上記と同様の操作を行ない、得られた放射活性のカウントを上記のカウントＡから差し引きすることにより得られた、ERの特異的結合によるカウント（Δcpm）を100％として、コールドエリシターの代わりにそれぞれ3.6、7.1、10.8、14.4、28.8μｇの精製抗体を加えインキュベートして得られた結合カウント数をカウントＡから差し引いて得られる値を求め、コールドエリシターで得られたカウント数との比較をパーセントで表した（第７図）。28.8μｇの抗体で51％程エリシターの結合が阻害された。この結果によって、エリシター結合ドメインの抗体が確かにエリシターとエリシター結合タンパクとの結合を阻害しうることが確認できた。
５）エリシター結合ドメインの抗体によるファイトアレキシン蓄積阻害
ダイズ子葉を用いたグルカンエリシターによるファイトアレキシン蓄積量の測定はM.G.Hahnらの［（1992）Molecular Plant Pathology Volume II A Practical Approach,IRL Press pp.117−120］方法にしたがった。
エリシター結合ドメインに対する精製抗体それぞれ（０、１、２、３、４、10、20μg/25μl/子葉１枚）及び対照として酵母由来のdsRNAaseであるpac Iに対する精製抗体それぞれ（４、10、20μg/25μl/子葉１枚）をダイズ子葉に加え、１時間インキュベートした後、グルカンエリシター（200ng/25μl/子葉１枚）を更にダイズ子葉に加え20時間インキュベートしてグルカンエリシターによるファイトアレキシン蓄積が抗体によって阻害されるかを調べた。エリシター単独で蓄積されるファイトアレキシン量を100％として、抗体を添加した後エリシターを添加することによって誘導蓄積されるファイトアレキシン量をパーセントで表した（第８図）。ダイズ子葉１枚当たり20.0μｇのエリシター結合ドメインに対する抗体を加えた場合、約53％ファイトアレキシンの蓄積量が減少したが、対照のpac I抗体ではダイズ子葉１枚当たり20.0μｇを加えてもファイトアレキシンの蓄積量はほとんど変化しなかった。これらの結果から、取得された遺伝子は単なるエリシター結合蛋白ではなく、ダイズの抵抗性反応を引き起こすERをコードしていることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、グルカンエリシターレセプター、それをコードするDNAおよびその断片、該DNAおよびその断片を含むベクター、並びに、該DNAおよびその断片が導入された植物細胞が提供された。
本発明のERは、カビに対する耐病性の機構解明やカビ耐性を誘導するエリシターの誘導体の開発に、また、ERに対する抗体を調製するための抗原として有用である。
また、本発明のグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNAおよびその断片は、カビ耐性植物の育種技術の確立のための材料として有用である。すなわち、本発明のDNAまたはその断片を、種々の植物に導入し発現させれば、その植物のカビに対する抵抗性を高めることが出来る。
さらに、本発明のグルカンエリシターレセプターに対する抗体や、本発明のグルカンエリシターレセプターをコードする塩基配列を含むDNA、その変異体及びこれらのDNAに対するアンチセンスDNAは、ERのエリシター結合部位やシグナル伝達の研究に用いることができる。
さらにまた、ERのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列の情報はERに対するエリシターの結合部位やERの関与するシグナル伝達に関する研究に利用することができる。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:667
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003625830.tif 000010
0003625830.tif 000011
0003625830.tif 000012
配列番号:2
配列の長さ:2004
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：ダイズ（Glycine max L.）
株名：グリーンホーマー
配列
0003625830.tif 000013
0003625830.tif 000014
0003625830.tif 000015
0003625830.tif 000016
0003625830.tif 000017
0003625830.tif 000018
配列番号:3
配列の長さ:54
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003625830.tif 000019
配列番号:4
配列の長さ:58
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列
0003625830.tif 000020
【図１】
0003625830.tif 000021
【図６】
0003625830.tif 000022
【図２】
0003625830.tif 000023
【図３】
0003625830.tif 000024
【図４】
0003625830.tif 000025
【図５】
0003625830.tif 000026
【図７】
0003625830.tif 000027
【図８】
0003625830.tif 000028