(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)内で分泌シグナルとして機能し得るポリペプチドであって、かつ、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から３１±６番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチドのカルボキシ末端側に１〜５個のアミノ酸残基を導入してカルボキシ末端を[-Lys-Lys-Arg]なる配列としたポリペプチド、をコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の１番目から３１±３番目までのポリペプチドのカルボキシ末端側に１〜５個のアミノ酸残基を導入してカルボキシ末端を[-Lys-Lys-Arg]なる配列としたポリペプチド、をコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子。
【請求項３】
配列番号２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子。
【請求項４】
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)内で異種蛋白質を発現しうる発現ベクターを構築するためのマルチクローニングベクターであって、異種蛋白質構造遺伝子導入部位の上流部に導入される異種蛋白質構造遺伝子に直接連結しうる請求項１、２または３に記載の分泌シグナル遺伝子を有するマルチクローニングベクター。
【請求項５】
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)内で発現しうる発現ベクターであって、分泌シグナルと異種蛋白質がアミノ末端側からこの順で連結した蛋白質の構造遺伝子を有し、しかも該分泌シグナルの遺伝子が請求項１、２または３に記載の分泌シグナル遺伝子である発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターを保持するシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる形質転換体。
【請求項７】
分泌シグナルと異種蛋白質がアミノ末端側からこの順で連結した蛋白質の構造遺伝子であってしかも該分泌シグナルの遺伝子が請求項１、２または３に記載の分泌シグナル遺伝子である該構造遺伝子を有する組み換えＤＮＡを保持するシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる形質転換体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養し、培養液中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明は分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe、以下S.pombeという)の接合に関与する接合フェロモン（Ｐ−ファクター）の前駆体の分泌シグナルに由来するポリペプチド、をコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子に関する。さらに本発明は、その分泌シグナル遺伝子と異種蛋白質構造遺伝子を有する発現ベクター、およびS.pombe等にてこの異種蛋白質構造遺伝子産物を効率よく分泌生産させることに関する。
［背景技術］
従来、遺伝子組み換え技術を用いた異種蛋白質の生産は、大腸菌(Escherichia coli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)および枯草菌(Bacillus)属等の微生物、あるいは動物細胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いて盛んに行われてきた。様々な生物由来の蛋白質が生産の対象と考えられ、すでに多くのものがこれらの生物を用いて工業的に生産され、医薬品等に用いられている。
しかし原核生物を用いる方法では必ずしも全ての蛋白質について有効であるわけではなく、真核生物由来の蛋白質の複雑な翻訳後修飾あるいは天然体と同じ立体構造を再現することは必ずしも容易ではない。また大腸菌には特有のエンドトキシンが存在し、最終製品の夾雑物になる可能性がある。一方、動物細胞、植物細胞ないし昆虫細胞を用いる方法は、扱いが微生物より難しく、培養にコストがかかり、かつ生産効率も悪い。このため異種蛋白質、特に真核生物由来の蛋白質を生産するためには、微生物であり、かつ真核生物である酵母が最も良いと考えられる。培養方法も確立しており、エンドトキシンも含まない。そこでこれまでに種種の酵母を宿主とした発現ベクターが開発されてきた(Romanos,M.A.etal,Yeast 8,423-488,1992)。
種々の酵母類の中でもS.pombeは出芽酵母サッカロミセス・セレビジエをはじめとする他の酵母に比べ様々な性質、たとえば細胞周期や染色体の構造、ＲＮＡスプライシングなどが高等動物により類似しているといわれ、生産されてくる蛋白質のアセチル化、リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾も動物細胞でのそれにかなり近いと考えられている(Russell,P.R.and Nurse,P.,Cell 45,781-782,1986;Kaufer,N.F.et al,Nature 318,78-80,1985;Chappell,T.G.and Warren,G.,J.Cell.Biol.109,2693-2702,1989)。このため、異種蛋白質を発現させる宿主としてS.pombeを用いることによって、動物細胞の場合と同様の、より天然体に近い遺伝子産物が得られることが期待される。培養方法も酵母類で共通の点が多く、他の酵母で知られている知見を容易に応用できる。したがって微生物学の方法と組み替えＤＮＡ技術を用いて、S.pombeを用いた異種蛋白質生産法を用いることが有利であるのは明らかである。
しかし、S.pombeを用いた遺伝子組み換えに関する研究は、大腸菌や出芽酵母にくらべて遅れており、特に遺伝子発現に関する研究は少ない（特開昭６１−１８１３９７号公報、特開平２−２８３２８８号公報、特開平４−６３５９６号公報等参照）。この原因は強力なプロモーターを持ち、菌体内に安定に存在し、かつ遺伝子を導入するのに最適かつ簡便な発現プラスミドの開発が遅れていたためである。最近になって、動物細胞ウイルス由来のプロモーター領域をもつ、非常に発現能の高い分裂酵母用ベクターが開発されたため、ようやくS.pombeを用いての異種蛋白質の大量生産への道が開かれた（本発明者らの発明にかかわる特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報参照）。この技術を用いることにより、多くの細胞内蛋白質は容易に生産できるようになり、その有用性は高い。
従来、分泌性の真核生物（宿主以外）由来蛋白質については、その蛋白質が本来持つシグナル配列では酵母によって認識されにくいため、生産物が宿主細胞から培地中に分泌されず、良い結果を得にくかった。また精製の際には、その細胞を破壊した後不活性化しないように、種々の混在する細胞成分から目的の蛋白質を精製しなければならなかった。異種蛋白質を分泌生産させることは、これに比べて精製が容易であるという点で、望ましい方法であるばかりでなく、分泌生産される蛋白質は宿主細胞の分泌経路に入るため、適当な処理、たとえばジスルフィド結合の形成や糖鎖の形成がなされ、天然の蛋白質と同じあるいは非常に近い立体構造を形成できるという利点がある。
しかし、これまでは分裂酵母内で有効に機能するシグナル配列はほとんど報告がなく(Tokunaga,M.et al.,Yeast 9,379-387,1993;Broker,M.et al.,B.B.A.908,203-213,1987)、分泌型の発現ベクターの開発はなされていないに等しい。一方、本発明者らは、S.pombeそれ自身が細胞外に分泌する蛋白質の一つで、接合に関与する接合フェロモンであるＰ−ファクターについて検討し、その前駆体がS.pombe内の種々の酵素によってプロセッシングされてＰ−ファクターとなり培地中に分泌される事実、およびＰ−ファクター前駆体のアミノ酸配列やその遺伝子を見いだしている（Imai,Y.and Yamamoto,M.,Gene & Dev.8,328-338;特開平６−３２７４８１号公報参照）。このＰ−ファクター前駆体のアミノ酸配列を後記配列表の配列番号１に示す。
［発明の開示］
本発明者は、上記Ｐ−ファクターに着目しその分泌性を利用して分泌型の発現ベクターを開発することを検討した。従来はその前駆体のどの領域が分泌シグナルとして有効に機能しているかについては不明であったが、さらなる検討の結果分泌シグナルとして有効に機能している部分の一つとして、Ｐ−ファクター前駆体のアミノ末端側から約６０番目までのポリアミノ酸部分であることを見いだした。さらに、Ｐ−ファクター前駆体の分泌シグナルを詳しく検討した結果、分泌シグナルのうちでシグナルペプチダーゼによって切断されるプレ配列と小胞体やゴルジ装置内でのプロテアーゼでプロセッシングを受けて切断されるプロ配列の存在を解明することができた。従って、Ｐ−ファクター前駆体の分泌シグナルはアミノ末端側から約６０番目より短い配列である場合もある。
本発明は、S.pombe内で分泌シグナルとして機能し得るポリペプチドをコードする遺伝子である。このポリペプチドは、Ｐ−ファクター前駆体の分泌シグナルに類似のポリペプチドである。以下このS.pombe内で分泌シグナルとして機能し得るポリペプチドを単に分泌シグナルという。
本発明はこの分泌シグナルをコードする遺伝子（以下分泌シグナル遺伝子という）、その分泌シグナル遺伝子を有するマルチクローニングベクター、その分泌シグナル遺伝子と異種蛋白質構造遺伝子を有する発現ベクター、その分泌シグナル遺伝子を有する組み換えＤＮＡまたは上記発現ベクターを保持する真核細胞宿主からなる形質転換体、およびその形質転換体を用いた異種蛋白質の製造方法にかかわる下記発明である。
S.pombe内で分泌シグナルとして機能し得るポリペプチドであって、かつ、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から３１±６番目までのアミノ酸配列から成るポリペプチドのカルボキシ末端側に１〜５個のアミノ酸残基を導入してカルボキシ末端を[-Lys-Lys-Arg]なる配列としたポリペプチド、をコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子。
配列番号１のアミノ酸配列の１番目から３１±３番目までのポリペプチドのカルボキシ末端側に１〜５個のアミノ酸残基を導入してカルボキシ末端を[-Lys-Lys-Arg]なる配列としたポリペプチド、をコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子。
配列番号２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる分泌シグナル遺伝子。
S.pombe内で異種蛋白質を発現しうる発現ベクターを構築するためのマルチクローニングベクターであって、異種蛋白質構造遺伝子導入部位の上流部に導入される異種蛋白質構造遺伝子に直接連結しうる上記分泌シグナル遺伝子を有するマルチクローニングベクター。
S.pombe内で発現しうる発現ベクターであって、分泌シグナルと異種蛋白質がアミノ末端側からこの順で連結した蛋白質の構造遺伝子を有し、しかも該分泌シグナルの遺伝子が上記分泌シグナル遺伝子である発現ベクター。
上記発現ベクターを保持するS.pombeからなる形質転換体。
分泌シグナルと異種蛋白質がアミノ末端側からこの順で連結した蛋白質の構造遺伝子であってしかも該分泌シグナルの遺伝子が上記分泌シグナル遺伝子である該構造遺伝子を有する組み換えＤＮＡを保持するS.pombeからなる形質転換体。
上記形質転換体を培養し、培養液中に異種蛋白質を生成蓄積させ、これを採取することを特徴とする異種蛋白質の製造方法。
本発明の分泌シグナル遺伝子を有する形質転換体内では分泌シグナルを有する異種蛋白質がまず産生され、引き続きその蛋白質が細胞内で切断されて分泌シグナル部分が切断除去され、その後プロセッシングされた蛋白質が細胞から分泌される。これにより目的とする蛋白質を培地から分離回収することができることより、効率よくかつ容易に目的蛋白質の製造を行うことができる。
本発明者の検討によれば、例に示される最も長い分泌シグナルは５７番目までのポリペプチド部分である。しかし、このポリペプチド部分を含みさらに長いポリペプチド部分であってもよい（例１では５９番目までのポリペプチドを用いた）。その場合、切断された場所より下流のポリペプチド部分〜アミノ酸残基（以下付加部分という）が結合した異種蛋白質が分泌されることとなる。
しかし、通常付加部分が長い場合、目的とする異種蛋白質として不都合である場合が多い。したがって、付加部分はないかまたは短いものであることが好ましい。より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の５９番目以下までのアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列）である。また例の結果を見ると、５９番目までのアミノ酸配列を分泌シグナルとした場合、分泌される異種蛋白質は分泌シグナルの５８番目と５９番目のアミノ酸残基をそのアミノ末端に有している。したがって、この場合は分泌シグナルとしては配列番号１（配列番号２でも同じ）の１番目から５７番目までのポリペプチドがより適切であると予想される。
上記部分の切断は、５５〜５７番目の［-Lys-Lys-Arg］なる配列の後で起っている。したがって、この配列が切断の何らかのシグナルとなっていると予想される。
さらに、より短い配列を利用するために分泌シグナルを詳しく検討した結果、アミノ末端から２２番目までがプレ配列で、２３番目（または２５番目）から３１番目までがプロ配列であることが解明された。プレ配列のすぐ後でもプロ配列のすぐ後でも目的蛋白質を連結せしめて分泌させることが可能であるため、アミノ末端側から約６０番目より短いこれらの配列も分泌シグナルとして有効である。一方、理論的な予想（von Heijne,G."A new method for predicting signal sequence cleavage sites",Nucleic Acids Research,14,4683-4690(1986)）によれば、２２番目までよりもさらに短い分泌シグナルの末端として、１６番目の[-Ala]や１８番目の[-Pro]が考えられる。従って、１番目から１６番目までの配列のポリペプチドや１番目から１８番目までの配列のポリペプチドもまた分泌シグナルとして機能する可能性が予想される。
さらに検討したところ、２２番目（または２４番目）までのプレ配列や３１番目までのプロ配列の切断効率より、アミノ末端側から約６０番目までのポリアミノ酸部分、特に５７番目のアルギニンのカルボキシ末端での切断効率の方が高いことが判明した。従って、短い配列を分泌シグナルとして用いる場合、これらプレ配列またはプロ配列の直後に５５番目から５７番目に相当する［-Lys-Lys-Arg］なる配列を結合させると切断がより容易となり、効率の良い分泌が期待される。実際３１番目の［-Lys-］の直後に［-Lys-Arg］を結合させたものは効率のよい分泌生産がなされることがわかった。
以上のことより、Ｐ−ファクター前駆体における切断部位は２２番目（または２４番目）の後ろ、３１番目の後ろ、および５７番目の後ろであり、１番目からこれらの位置までのポリペプチドがS.pombe内で分泌シグナルとして機能していると考えられ、さらにこれより長い配列あるいは短い配列もまたS.pombe内で分泌シグナルとして機能うると予想される。
本発明における分泌シグナルは、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から３１±６番目まで（好ましくは３１±３番目まで）のアミノ酸配列からなるポリペプチドのカルボキシ末端側に１〜５個のアミノ酸残基を導入してカルボキシ末端を[-Lys-Lys-Arg]なる配列としたポリペプチドである。
本発明の分泌シグナル遺伝子は上記分泌シグナルをコードする遺伝子である。この分泌シグナル遺伝子は前記特開平６−３２７４８１号公報記載のＰ−ファクター前駆体遺伝子の上流部分に相当するもの、およびその改変体である。この遺伝子はS.pombe染色体から採取することができ、また合成することもできる。また、分泌シグナル遺伝子は上記公報記載の配列に限定されるものではなく、上記アミノ酸配列に対応する他の遺伝子配列であってもよい。
目的とする異種蛋白質はその構造遺伝子を組み込んだ発現系で発現される。発現系としては、異種蛋白質構造遺伝子を有する発現ベクターで形質転換した真核細胞が好ましい。真核細胞としては特にS.pombeが好ましい。発現系において異種蛋白質構造遺伝子の先端に上記した分泌シグナル遺伝子を結合することにより、分泌シグナルと異種蛋白質が結合した蛋白質が産生され、その後細胞内でプロセッシングされて、異種蛋白質が細胞外へ分泌される。
本発明のマルチクローニングベクターは、真核細胞宿主内で異種蛋白質を発現しうる下記発現ベクターを構築するためのマルチクローニングベクターである。このマルチクローニングベクターに異種蛋白質構造遺伝子を導入することによって下記発現ベクターを構築することができるものである。ただし、下記発現ベクターは以下にいう分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子を用いて構築することができるものであり、下記発現ベクターはこの本発明マルチクローニングベクターを用いて構築されたものに限定されない。
本発明のマルチクローニングベクターは、異種蛋白質構造遺伝子導入部位の上流部に導入される異種蛋白質構造遺伝子に直接連結しうる上記分泌シグナル遺伝子を有する。これに異種蛋白質構造遺伝子を導入して発現ベクターとすると分泌シグナル遺伝子と異種蛋白質構造遺伝子が連結し、その発現により分泌シグナルと異種蛋白質が連結した蛋白質が産生される。
本発明の発現ベクターは前記分泌シグナル遺伝子と異種蛋白質構造遺伝子が連結した遺伝子（以下分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子という）を有し、真核細胞宿主内においてその遺伝子の発現が可能である発現ベクターである。この発現ベクターは分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子を用いて種々の方法で構築することができる。たとえば、上記本発明マルチクローニングベクター以外のマルチクローニングベクターのマルチクローニングサイトに分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子を導入して構築することができる。また、マルチクローニングベクターを用いることなく構築することもできる。
本発明の発現ベクターとしては、前記特開平５−１５３８０号公報記載の構造を有する発現ベクターが好ましい。また、この発現ベクターに関連した前記特願平６−２４１５８１号明細書記載のマルチクローニングベクターやそれを用いた発現ベクターの構築法を用い手本発明発現ベクターを構築することが好ましい。しかし、本発明の発現ベクターとしては上記公報記載の発現ベクター以外のものであってもよく、その発現ベクターは染色体組み込み型のものであってもよく、核外でコピー数を増やし安定に存在するものであってもよい。以下、特開平５−１５３８０号公報記載の構造を有する本発明発現ベクターについて説明するが、本発明発現ベクターはこれに限定されない。
本発明の発現ベクターは、導入された分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子の発現を制御するプロモーター領域を含む。このプロモーターはこの下流に導入された前記分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子の発現を支配する。このプロモーターは真核細胞内において機能しうるもので、かつ導入された分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子の転写を促進するものである。具体的にはS.pombe細胞内において機能しうるプロモーターが好ましい。
上記プロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス遺伝子プロモーター、ヒトコリオニックゴナドロピンα遺伝子プロモーター等がある。特に動物細胞ウィルス由来のプロモーターなどの転写を強力に促進するもの（R.Toyama et al.,FEBS Lett,268,217-221(1990).）であることが好ましい。このような好ましいプロモーターとしては、動物細胞ウィルス由来のプロモーター、特にヒトサイトメガロウイルス遺伝子のプロモーターがある。
本発明の発現ベクターは、さらに必要により、抗生物質耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、その他の種々の遺伝子を有していてもよい。また、大腸菌などの原核細胞内で機能しうるプロモーターや薬剤耐性遺伝子等を組み込んでシャトルベクターとすることもできる。
発現ベクターが細胞内で発現するためには複製開始点を有することが必要である。しかし、上記本発明の発現ベクターは必ずしも複製開始点を有している必要はない。複製開始点は発現ベクター構築後に導入することができる。また、複製開始点を有しない発現ベクターを細胞内に入れ込んだ後細胞内でその発現ベクターに自動的に複製開始点を導入することができる。これらの複製開始点導入手段は公知である。たとえば酵母内で機能しうる複製開始点を有するベクター（以下酵母ベクターという）を本発明の発現ベクターに組み込むことができる（特開平５−１５３８０号公報参照）。また、本発明の発現ベクターと酵母ベクターを１つの細胞内に入れ込み、細胞内で自動的に両者を融合させることができる。このような複製開始点導入手段を採用することができることより、本発明の発現ベクターは複製開始点を有していてもよく、有していなくてもよい。ただし、いかなる場合でも細胞内で発現ベクターの発現が起こるためには、最終的にはベクターに複製開始点が必要である。
発現ベクターに抗生物質耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を組み込むことはクローニングのためやマーカーとして用いるために通常必須である。また、ロイシン要求性細胞の要求性を解除する遺伝子（ＬＥＵ２遺伝子など）やウラシル要求性細胞の要求性を解除する遺伝子（ＵＲＡ３遺伝子など）を組み込むことも少なくない。本発明のベクターにおいてもこれら抗生物質耐性遺伝子等とその転写を促進するプロモーター（以下第２のプロモーターという）を有していることが好ましい。この第２のプロモーターは、前記分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子の転写を促進するプロモーターに比較してそれよりも転写促進活性の低いものであることが好ましい。しかもこの第２のプロモーターとしては、動物細胞ウィルス由来のプロモーター、特にＳＶ４０初期プロモーターが好ましい。この第２のプロモーターに支配される抗生物質耐性遺伝子としては、通常のものであってよいが、特に本発明においてはネオマイシン耐性遺伝子が好ましい。
本発明においては、抗生物質耐性遺伝子を有する発現ベクターを使用することによって分泌シグナル遺伝子−異種蛋白質発現量を増大させることが可能となる。このためには第２のプロモーターは前記分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子を支配するプロモーターよりも転写促進活性が低い必要がある。たとえば上記のようなＳＶ４０初期プロモーターとそれによって支配されるネオマイシン耐性遺伝子とを有する発現ベクターを保持するS.pombeを培養する場合を例にとって説明する。このS.pombe形質転換体をＧ４１８（ネオマイシン）含有培地で培養すると、培地中のＧ４１８濃度に依存して菌体内で発現ベクターのコピー数が増す。したがって、Ｇ４１８濃度を高くすることにより菌体内で発現ベクターのコピー数を多くすることができ、その結果分泌シグナル遺伝子−異種蛋白質発現量を増大させることができる。この際、第２のプロモーターの活性が分泌シグナル−異種蛋白質遺伝子を支配するプロモーターよりも高活性であると、発現ベクターのコピー数が少なくても充分なネオマイシン耐性蛋白質（酵素）が生産されるために発現ベクターのコピー数を増やす必要がなくなり、目的とする分泌シグナル遺伝子−異種蛋白質発現量を増大させることができない。
異種蛋白質構造遺伝子に由来する異種蛋白質としては、特に限定されないが、高等動物由来の生理活性を持つ蛋白質が望ましい。さらにたとえば本来動物細胞にて分泌生産されているものであって大腸菌では製造困難であるような糖蛋白質や、ジスルフィド結合が多く複雑な立体構造を持つ蛋白質などが特に好ましい。たとえばヒト血清アルブミンやインターロイキン−６などがある。
本発明のマルチクローニングベクターおよび発現ベクターを構築するための一般的手法は公知であり、たとえば文献「J.Sambrook et al.,"Molecular Cloning 2nd ed.",Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989).」に記載されている。本発明のマルチクローニングベクターおよび発現ベクターはこの一般的手法を用い前記した方法で構築できる。発現ベクターの宿主として本発明で用いるS.pombeの菌株としては、たとえばATCC 38399(leu1-32h-)またはATCC 38436(ura4-294h-)等が挙げられ、これらは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から入手できる。
発現ベクターを用いてS.pombeを形質転換する方法は公知であり、たとえば酢酸リチウム法（K.Okazaki et al.,Nucleic Acids Res.,18,6485-6489(1990).）等によって、S.pombeの形質転換体が得られる。形質転換体を培養するための培地は公知であり、ＹＰＤ培地等の栄養培地あるいはＭＭ培地等の最少培地（M.D.Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics",Cold Spring Harbor Labolatory Press(1990).）など、あるいはそれにさらにグルコースやカザミノ酸などを添加した培地等を用いうる。形質転換体の培養は、通常１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で、８〜１６８時間、好ましくは４８〜９６時間行う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて撹拌や通気を加えてもよい。
培養物中に産生した蛋白質の単離・精製法としては、公知の、塩析または容媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。
単離・精製した蛋白質の確認方法としては、公知の、ウエスタンブロッティング法または、活性測定法等が挙げられる。また精製された蛋白質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることができる。
【図面の簡単な説明】
発明を実施するための最良の形態の項に関連して提出する図面は以下の通りである。
図１は例１で構築した発現ベクターpSL26mの構成図である。図２および図３は例２、５、８、１１、および１４におけるヒトインターロイキン−６やその変異体の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図とウエスタンブロット観察図である。また、図４は例４で構築した発現ベクターpSL2P06a'c1の構成図、図５は例７で構築した発現ベクターpSL2P16a'c1の構成図、図６は例１０で構成した発現ベクターpSL2P26a'c1の構成図、図７は例１３で構築した発現ベクターpSL2P36a'c1の構成図、および図８は例１６で構築した発現ベクターpSL2P3M1の構成図でもある。
［発明を実施するための最良の形態］
次に本発明を実施例をもって具体的に説明するが、実施例は具体的認識を得るために挙げたものであり、本発明を限定するものではない。なお、参考例１、２に実施例で使用した酵母の形質転換法と酵母の培養方法を示す。
［参考例１：酵母の形質転換法］
宿主としてロイシン要求性株、S.pombe leu1-32h-(ATCC38399)を用いた。この宿主細胞を最少培地にて(0.5〜1)×107細胞数／mlになるまで生育させ、集菌洗菌後1×109細胞数／mlとなるように、0.1Ｍ酢酸リチウム（pH５）で懸濁し、30℃で60分間インキュベートした。その後、酵母ベクターpAL7(ars,stb,LEU)(Nucleic Acid Research 18,6485-6489)をPstIで切断したもの１μgと実施例の発現ベクター２μgを上記懸濁液100μlに加え、さらに50％（W/V）のPEG4000（分子量4000のポリエチレングリコール）を290μl加えてよく撹拌した後、30℃で60分間、43℃で15分間インキュベートし、室温で10分間放置した。遠心によりPEG4000を除去した後、適当量の培養液に懸濁し、最少培地にまいた。形質転換効率は105／μg(pAL7)以上であった。
上記によって得られた形質転換体を適当数取り、各形質転換体を300μlの水に懸濁し、その内の３μlをＧ４１８（25μg／ml）を含んだＹＥＡ培地（イーストエキストラクト５ｇ、グルコース３０ｇ、アガー２０ｇ／１リットル）にまき３日後生じたコロニーを取り使用した。
［参考例２：酵母の培養方法］
形質転換したS.pombe(leu1-32h-)株を、１wt％カザミノ酸、２wt％グルコースを含む５mlのＭＭ培地（Alfa et al."Experiments with Fission Yeast"Cold Spring Harbor Laboratory Press 1993）にてＧ４１８(25μg/ml)存在下で32℃、１晩培養後その培養液から５×107cellsの菌体をとり、Ｇ４１８（200μg/ml）、１wt％カザミノ酸、および２wt％グルコースを含む50mlのＭＭ培地に添加した後、32℃で48時間培養した。その後培養後遠心し培養液を集めた。
［例１］
ヒトインターロイキン−６分泌ベクターの作製
市販のベクターpUC19（ベーリンガー社販売）にヒトインターロイキン−６ｃＤＮＡ全長を導入してなるプラスミドpAG9-8-1（特開平７−２２４０９７号公報参照）をテンプレートとして、配列番号３および配列番号４に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって成熟体インターロイキン−６のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含む領域を増幅した。制限酵素EcoRI（宝酒造（株）販売）およびHindIII（宝酒造（株）販売）による二重消化で末端処理をし、アガロースゲル電気泳動によって、約６００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰ（旭硝子（株）販売）を用いたガラスビーズ法で精製し、挿入遺伝子断片とした。
S.pombeのmap2遺伝子全長を含むプラスミドpADMP2（特開平６−３２７４８１号公報参照）をテンプレートとして、配列番号５および配列番号６に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によってＰ−ファクター分泌シグナル配列を含む領域を増幅した。制限酵素BspHI（ニュー・イングランド・バイオラボ社販売）およびEcoRIによる二重消化で末端処理をし、アクリルアミドゲル電気泳動により約２００塩基対に相当するバンドを切出し、ゲルから溶出して挿入シグナル断片とした。
特開平５−１５３８０号公報記載のベクターpcD4Bを用いて構成したS.pombe用発現ベクターpTL2M（特開平７−１６３３７３号公報参照）を、制限酵素AFlIII（ニュー・イングランド・バイオラボ社販売）およびHindIIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動によって、約５０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。
これら３本の断片を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）販売）を用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５株（東洋紡（株）販売）を形質転換した後、正しく構築されたプラスミドをもつ大腸菌をスクリーニングした。得られた発現ベクターpSL26mの構成図を図１に示す。アルカリ−ＳＤＳ法によってpSL26mを大量調製し、制限酵素地図の作製および部分塩基配列決定によって、目的の配列を持ったプラスミドであることを確認した。また、塩基配列より予想されるヒトインターロイキン−６のアミノ酸配列は、配列番号７に示す１８５残基のものであった。さらに、分泌シグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号２に示す５９残基のものであった。
［例２］
ヒトインターロイキン−６の分泌生産
例１で作製した分泌ベクターによって参考例１に従って酵母を形質転換、参考例２に従って培養した後、培養液５０mlをアミコン社製メンブレンフィルターを用いて２００倍程度に濃縮した。濃縮したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、クマシーブリリアントブルーで染色して解析した。その結果であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図を図２に示す。図２におけるレーン１はS.pombe/pSL2M（コントロール）の培養上清を、レーン２はS.pombe/pSL26mの培養上清を示す。
図２のように分子量５万以上のところに数本のバンドが観察されたが、低分子量の領域には主として２１Ｋ付近に１本、このバンドよりやや分子量の小さいところにもう一本バンドが観察された。
また、上記培養上清をウエスタンブロッティングにより解析した結果を図３に示す。図３におけるレーン１はS.pombe/pSL2M（コントロール）の培養上清を、レーン２はS.pombe/pSL26mの培養上清を示す。図３に示されているレーン２の２１Ｋのバンドおよびそれよりやや小さい分子量のバンドがヒトインターロイキン−６であることが確認された。分子量の小さいバンドは分解物と考えられる。
［例３］
分泌蛋白質のアミノ末端配列決定
例２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて得られた２１Ｋのバンドを切り取りプロテインシークエンサー（”シマズＰＳＱ−１”）にてアミノ末端より解析した結果、Glu-Phe-Met-Pro-Val-Pro-Pro-であることがわかり、分泌シグナルのLysとGluの間で正確にプロセッシングされて培地中に分泌されていることがわかった。またわずかに存在する分子量の小さい方のバンドについても同様の検討を行ったところ、Asp-Val-Ala-Ala-Pro-His-でありＮ末端から９番目のLysと10番目のAspの間の結合が過剰切断されていることがわかった。
［例４］
分泌シグナルを用いたインターロイキン−６変異体分泌ベクターの作製
ヒトインターロイキン−６の変異体のｃＤＮＡを含むプラスミドpTL26a'c1（特開平７−２２４０９７号公報参照）をテンプレートとして、配列番号８および配列番号９に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、インターロイキン−６変異体のＯＲＦを含む領域を増幅した。無限酵素EcoRIおよびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約６００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入遺伝子断片とした。
S.pombeのＰ−ファククター分泌シグナル配列のｃＤＮＡを含むプラスミドpSL26m（例１）を、制限酵素EcoRIおよびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約５０００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。
これら２本の断片を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製によって、図４に示す正しく構築された分泌ベクターpSL2P06a'C1を保持する大腸菌をスクリーニングした。アルカリ−ＳＤＳ法によってpSL2P06a'C1を大量調製し、インターロイキン−６変異体ＯＲＦおよびＰ−ファクター分泌シグナル配列に対応する部分の塩基配列決定を行った。その結果、塩基配列より予測されるインターロイキン−６変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０に示す１６２残基のものであった。また、分泌シグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号２に示す５９残基のものであり、これを分泌シグナル”Ｐ０”配列と命名した。
［例５］
分泌シグナルＰ０配列を用いたヒトインターロイキン−６変異体の分泌生産
例４で作製した分泌ベクターを用いて参考例１に従って酵母を形質転換し、参考例２に従って培養した後、培養液５０mlをアミコン社製メンブレンフィルターを用いて２００倍程度に濃縮した。濃縮したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、クマシーブリリアントブルーで染色して解析した。その結果であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図を図２に示す。図２におけるレーン３はS.pombe/pSL2P06a'C1の培養上清を示す。
図３のように分子量５万以上のところに数本のバンドが観察されたが、低分子量の領域には主として１８Ｋ付近に１本のみバンドが観察された。
また、上記培養上清をウエスタンブロッティングにより解析した結果を図３に示す。図３におけるレーン３はS.pombe/pSL2P06a'C1の培養上清を示す。図３に示されているレーン３の１８Ｋのバンドがヒトインターロイキン−６変異体（IL-6a'C1）であることが確認された。
［例６］
分泌蛋白質のアミノ末端配列決定
例５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて得られた１８Ｋのバンドを切り取り常法に従ってプロテインシークエンサーにてアミノ末端より解析した結果、Glu-Phe-Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Ser-Ser-Gluであることがわかり、インターロイキン−６のＮ末端から９番目と１０番目のLys-Aspの領域が欠除した変異体であるIL-6a'C1が分泌シグナルのLysとGluの間で正確にプロセッシングされて培地中に分泌されていることがわかった。従って、例３での過剰切断は分泌のために必要なことではなく、特別な配列が分子中に存在しなければＮ末端のそろった１種類のみの蛋白質が分泌されることがわかった。
［例７］
分泌シグナルＰ１配列を用いたインターロイキン−６変異体分泌ベクターの作製
ヒトインターロイキン−６−変異体のｃＤＮＡを含むプラスミドpSL2P06a'C1（実施例４）をテンプレートとして、配列番号１１および配列番号１２に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、インターロイキン−６変異体のＯＲＦを含む領域を増幅した。制限酵素HaeII（宝酒造（株）販売）およびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入遺伝子断片とした。
S.pombeのＰ−ファクター分泌シグナル配列のｃＤＮＡを含むプラスミドpSL2P06a'C1（例４）をテンプレートとして、配列番号１３および配列番号１４に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、Ｐ−ファクター分泌シグナル配列を含む領域を増幅した。制限酵素SpeI（宝酒造（株）販売）およびHaeIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約７００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入シグナル断片とした。
S.pombe用発現ベクターpTL2M（特開平３７−１６３３７３号公報参照）を、制限酵素SpeIおよびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。
これら３本の断片を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製によって、図５に示す正しく構築された分泌ベクターpSL2P16a'C1を保持する大腸菌をスクリーニングした。
アルカリ−ＳＤＳ法によってpSL2P16a'C1を大量調製し、インターロイキン−６変異体ＯＲＦおよびＰ−ファクター分泌シグナル配列に対応する部分の塩基配列決定を行った。その結果、塩基配列より予測されるインターロイキン−６変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５に示す１６３残基。また、分泌シグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号１６に示す３０残基のものであり、これを分泌シグナル”Ｐ１”配列と命名した。
［例８］
分泌シグナルＰ１配列を用いたヒトインターロイキン−６変異体の分泌生産
例７で作製した分泌ベクターによって参考例１に従って酵母を形質転換、参考例２に従って培養した後、培養液５０mlをアミコン社製メンブレンフィルターを用いて２００倍程度に濃縮した。濃縮したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、クマシーブリリアントブルーで染色して解析した。その結果であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図を図２に示す。図２におけるレーン４はS.pombe/pSL2P16a'C1の培養上清を示す。
図２のように分子量５万以上のところに数本のバンドが観察されたが、低分子量の領域には主として１９Ｋ付近に２本のバンドが観察された。
また。上記培養上清をウエスタンブロッティングにより解析した結果を図３に示す。図３におけるレーン４はS.pombe/pSL2P16a'C1の培養上清を示す。図３に示されているレーン４の１９Ｋ付近の２本のバンドがヒトインターロイキン−６変異体IL-6a'C1由来であることが確認された。
［例９］
分泌蛋白質のアミノ末端配列決定
例５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて得られた１９Ｋ付近の２本のバンドを常法により切り取りそれぞれプロテインシークエンサーにてアミノ末端より解析した結果、上方のバンドはAsp-Pro-Gy-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Proであることがわかり、下方のバンドはGly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Proであった。したがって分泌シグナルＰ１のＮ末端から２２番目のAlaと２３番目のAspの間が切断され、さらに２残基Ｃ末端側のProとGlyの間でも切断されて分泌された。２カ所の切断サイトが見いだされた。シグナルペプチダーゼでの切断が２カ所である可能性が高い。
［例１０］
分泌シグナルＰ２配列を用いたインターロイキン−６変異体分泌ベクターの作製
ヒトインターロイキン−６変異体のｃＤＮＡを含むプラスミドpSL2P06a'C1（例４）をテンプレートとして、配列番号１７および配列番号１８に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、インターロイキン−６変異体のＯＲＦを含む領域を増幅した。制限酵素HaeIIおよびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入遺伝子断片とした。
S.pombeＰ−ファクター分泌シグナル配列のｃＤＮＡを含むプラスミドpSL2P06a'C1（例４）をテンプレートとして、配列番号１９および配列番号２０に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、Ｐ−ファクター分泌シグナル配列を含む領域を増幅した。制限酵素SpeIおよびHaeIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約７００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入シグナル断片とした。
S.pombe用発現ベクターpTL2M（特開平７−１６３３７３号公報参照）を、制限酵素SpeIおよびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。
これら３本の断片を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製によって、図６に示す正しく構築された分泌ベクターpSL2P26a'C1を保持する大腸菌をスクリーニングした。
アルカリ−ＳＤＳ法によってpSL2P26a'C1を大量調製し、インターロイキン−６変異体ＯＲＦおよびＰ−ファクター分泌シグナル配列に対応する部分の塩基配列決定を行った。その結果、塩基配列より予測されるインターロイキン−６変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５と同一のものであった。また、分泌シグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号２１に示す３１残基のものであり、これを分泌シグナル”Ｐ２”配列と命名した。
［例１１］
分泌シグナルＰ２配列を用いたヒトインターロイキン−６変異体の分泌生産
例１０で作製した分泌ベクターによって参考例１に従って酵母を形質転換、参考例２に従って培養した後、培養液５０mlをアミコン社製メンブレンフィルターを用いて２００倍程度に濃縮した。濃縮したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、クマシーブリリアントブルーで染色して解析した。その結果であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図を図２に示す。図２におけるレーン５はS.pombe/pSL2P26a'C1の培養上清を示す。
図２のように分子量５万以上のところに数本のバンドが観察されたが、低分子量の領域には主として１９Ｋ付近に２本のバンドおよび１８．５Ｋ付近に１本のバンドが観察された。
また、上記培養上清をウエスタンブロッティングにより解析した結果を図３に示す。図３におけるレーン５はS.pombe/pSL2P26a'C1の培養上清を示す。図３に示されているレーン５の１９Ｋ付近の２本のバンドおよび１８．５Ｋ付近の１本のバンドがヒトインターロイキン−６変異体ILー6a'C1由来であることが確認された。
［例１２］
分泌蛋白質のアミノ末端配列決定
例１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて得られた１９Ｋ付近の２本のバンドを切り取り常法に従ってそれぞれプロテインシークエンサーにてアミノ末端より解析した結果、上方のバンドはAsp-Pro-Gly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Proであることがわかり、下方のバンドはGly-Val-Val-Ser-Val-Ser-Ala-Pro-Val-Proであった。したがって分泌シグナルＰ２のＮ末端から２２番目のAlaと２３番目のAspの間が切断され、さらに２残基Ｃ末端側のProとGlyの間でも切断されて分泌された。２カ所の切断サイトが見いだされた。シグナルペプチダーゼでの切断が２カ所である可能性が高い。さらに１８．５Ｋ付近のバンドをＮ末端より解析した結果Ser-Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Ser-Ser-Gluであることがわかり分泌シグナルＰ２のＮ末端から３１番目のLysと３２番目のSerの間でプロセッシングされて分泌されていることがわかった。
［例１３（実施例）］
分泌シグナルＰ３配列を用いたインターロイキン−６変異体分泌ベクターの作製
ヒトインターロイキン−６−変異体のｃＤＮＡを含むプラスミドpSL2P06a'C1（例４）をテンプレートとして、配列番号２２および配列番号２３に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、インターロイキン−６変異体のＯＲＦを含む領域を増幅した。制限酵素AfIII（ニッポンジーン（株）販売）およびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電位泳動によって約５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−
ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入遺伝子断片とした。
S.pombeのＰ−ファクター分泌シグナル配列を含むプラスミドpSL2P06a'C1（例４）をテンプレートとして、配列番号２４および配列番号２５に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、Ｐ−ファクター分泌シグナル配列を含む領域を増幅した。制限酵素SpeIおよびAfIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約７００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入シグナル断片とした。
S.pombe用発現ベクターpTL2M（特開平７−１６３３７３号公報）を、制限酵素SpeIおよびHindIIIによる二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。
これら３本の断片を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製によって、図７に示す正しく構築された分泌ベクターpSL2P36a'C1を保持する大腸菌をスクリーニングした。
アルカリ−ＳＤＳ法によってpSL2P36a'C1を大量調製し、インターロイキン−６変異体ＯＲＦおよびＰ−ファクター分泌シグナル配列に対応する部分の塩基配列決定を行った。その結果、塩基配列より予測されるインターロイキン−６変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５と同一のものであった。また、分泌シグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号２６に示す３４残基のものであり、これを分泌シグナル”Ｐ３”配列と命名した。
［例１４（実施例）］
分泌シグナルＰ３配列を用いたヒトインターロイキン−６変異体の分泌生産
例１３で作製した分泌ベクターによって参考例１に従って酵母を形質転換、参考例２に従って培養した後、培養液５０mlをアミコン社製メンブレンフィルターを用いて２００倍程度に濃縮した。濃縮したサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、クマシーブリリアントブルーで染色して解析した。その結果であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ観察図を図２に示す。図２におけるレーン６はS.pombe/pSL2P36a'C1の培養上清を示す。
図２のように分子量５万以上のところに数本のバンドが観察されたが、低分子量の領域には主として１８Ｋ付近に１本バンドが観察された。
また、上記培養上清をウエスタンブロッティングにより解析した結果を図３に示すレーン６の１８ＫのバンドがIL-6a'c1であることが確認された。
［例１５（実施例）］
分泌蛋白質のアミノ末端配列決定
例１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて得られた２０Ｋのバンドを切り取り常法に従ってプロテインシークエンサーにてＮ末端より解析した結果、Ala-Pro-Val-Pro-Pro-Thr-Ser-Ser-Glu-であることがわかり、Ｐ３シグナル末端のLysとIL-6a'C1のＮ末端Alaとの間で正確にプロセッシングされて培地中に分泌されていることがわかった。
［例１６（実施例）］
S.pombe汎用分泌ベクターの作製
S.pombe用発現ベクターpTL2M（特開平７−１６３３７３号公報参照）をテンプレートとして、配列番号２７および配列番号２８に示すオリゴＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって、ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）配列を含む領域を増幅した。制限酵素AflIIIおよびBglII（宝酒造（株）販売）による二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって約３００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、挿入ＭＣＳ断片とした。
ヒトインターロイキン−６変異体分泌ベクターpSL2P36a'C1（例１３）を、制限酵素AflIIおよびBamHI（宝酒造（株）販売）による二重消化で末端を処理し、アガロースゲル電気泳動によって、約４５００塩基対に相当するバンドを切出し、ＤＮＡ−ＰＲＥＰを用いたガラスビーズ法で精製し、ベクター断片とした。
これら２本の断片を、ＤＮＡライゲーションキットを用いて、ライゲーションした。大腸菌ＤＨ５株を形質転換した後、制限酵素地図の作製によって、図８に示す正しく構築された分泌ベクターpSL2P3M1を保持する大腸菌をスクリーニングした。
アルカリ−ＳＤＳ法によって、pSL2P3M1を大量調製し、ＭＣＳ配列およびＰ−ファクター分泌シグナル配列に対応する部分の塩基配列決定を行った。その結果、ＭＣＳの塩基配列は配列番号２９に示す７５塩基対のものであった。塩基配列より予測される分泌シグナル配列のアミノ酸配列は、配列番号２６と同一のものであった。
［配列表］
配列番号：１
配列の長さ：２０１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
0003730256.tif 000002
配列番号：２
配列の長さ：５９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003730256.tif 000003
配列番号：３
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000004
配列番号：４
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000005
配列番号：５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000006
配列番号：６
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000007
配列番号：７
配列の長さ：１８５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003730256.tif 000008
配列番号：８
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000009
配列番号：９
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000010
配列番号：１０
配列の長さ：１６２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
配列
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配列番号：１１
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000012
配列番号：１２
配列の長さ：１０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000013
配列番号：１３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000014
配列番号：１４
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000015
配列番号：１５
配列の長さ：１６３
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
0003730256.tif 000016
配列番号：１６
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号：１７
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
0003730256.tif 000018
配列番号：１８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：１９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２０
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２１
配列の長さ：３２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号：２２
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２５
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２６
配列の長さ：３４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
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配列番号：２７
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２８
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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配列番号：２９
配列の長さ：７５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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