(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物中のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）活性を検出する方法であって、
（ａ）前記組成物を、Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２またはＭｅｔ−［Ｘａａ１−Ｐｒｏ］ｎにより示される配列からなるペプチドと、前記配列の前記Ｎ末端メチオニンがＭＡＰによって前記ペプチドから切断されて切断型ペプチドが生成しうる条件下で混合すること（ただし、Ｘａａ１はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＶａｌであり、Ｘａａ２はＰｒｏまたはＡｌａであり、ｎは１、２もしくは３であり、前記ペプチドは前記Ｎ末端メチオニンが前記ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されるＣ末端検出部分を含有する）、
（ｂ）前記（ａ）で生成した切断型ペプチドを前記第２ペプチダーゼと反応させて前記検出部分を放出させること、
（ｃ）放出された検出部分を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記（ａ）および（ｂ）が１つの水性反応混合物中で行われる請求項１の方法。
【請求項３】
前記検出部分がｐ−ニトロアニリドである請求項１の方法。
【請求項４】
前記第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶであり、前記ペプチドがＭｅｔ−Ｘａａ１−Ｐｒｏ（Ｘａａ１はＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含む請求項１の方法。
【請求項５】
前記ペプチドがＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである請求項４の方法。
【請求項６】
ある物質があるメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を阻害するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記物質を、Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２またはＭｅｔ−［Ｘａａ１−Ｐｒｏ］ｎにより示される配列からなるペプチドと、前記配列の前記Ｎ末端メチオニンがＭＡＰによって前記ペプチドから切断されて切断型ペプチドが生成しうる条件下で混合すること（ただし、Ｘａａ１はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＶａｌであり、Ｘａａ２はＰｒｏまたはＡｌａであり、ｎは１、２もしくは３であり、前記ペプチドは前記Ｎ末端メチオニンが前記ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されるＣ末端検出部分を含有する）、
（ｂ）前記（ａ）で生成した切断型ペプチドを前記第２ペプチダーゼと反応させて前記検出部分を放出させること、
（ｃ）放出された検出部分を検出すること、
を含む方法。
【請求項７】
前記検出工程が放出された検出部分の量を定量することを含む請求項６の方法。
【請求項８】
前記（ａ）および（ｂ）がどちらも１つの水性反応混合物中で行われる請求項６の方法。
【請求項９】
前記第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶであり、前記ペプチドがＭｅｔ−Ｘａａ１−Ｐｒｏ（Ｘａａ１はＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含む、請求項６の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ末端検出部分がｐ−ニトロアニリドを含む請求項６の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドがＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである請求項６の方法。
【請求項１２】
前記ＭＡＰが２型ＭＡＰである請求項１の方法。
【請求項１３】
前記ＭＡＰがヒトＭＡＰである請求項１２の方法。
【請求項１４】
（ａ）Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２またはＭｅｔ−［Ｘａａ１−Ｐｒｏ］ｎにより示される配列（ただし、Ｘａａ１はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＶａｌであり、Ｘａａ２はＰｒｏまたはＡｌａであり、ｎは１、２もしくは３である）と、前記Ｎ末端メチオニンが当該ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されうるＣ末端検出部分からなるペプチド、および
（ｂ）前記第２ペプチダーゼ
を含み、請求項２の反応混合物としての使用に適する反応混合物。
【請求項１５】
前記第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶであり、前記ペプチドがＭｅｔ−Ｘａａ１−Ｐｒｏ（Ｘａａ１はＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含む請求項１４の反応混合物。
【請求項１６】
前記ペプチドがＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏｐ−ニトロアニリドである請求項１５の反応混合物。
【請求項１７】
さらにＭＡＰを含む請求項１４の反応混合物。
【請求項１８】
前記ＭＡＰが２型ＭＡＰである請求項１７の反応混合物。
【請求項１９】
請求項２の方法を実施するためのキットであって、前記第２ペプチダーゼ、前記ペプチド、および前記方法を実施するための説明書を含むキット。
【請求項２０】
前記第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶであり、前記ペプチドがＭｅｔ−Ｘａａ１−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（Ｘａａ１はＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）である請求項１９のキット。
【請求項２１】
さらにＭＡＰを含む請求項１９のキット。
【請求項２２】
前記ペプチドがＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドであり、前記ＭＡＰが２型ＭＡＰである請求項２１のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は全米科学財団助成金番号ＭＣＢ９５１２６５５の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して酵素活性および酵素阻害剤のアッセイに関する。より具体的には、本発明はメチオニンアミノペプチダーゼおよびメチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤を検出するためのアッセイに関する。
【０００３】
（関連技術の説明）
どの生細胞でも、タンパク質合成は、新生タンパク質のＮ末端アミノ酸としてメチオニンを指定するＡＵＧコドンで開始される。原核生物でも真核生物でも、このＮ末端メチオニンは末端から２番目のアミノ酸残基が小さい非荷電残基（例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＶａｌ）であればメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）（ＥＣ３．４．１１．１８）によって除去されるだろう。ただしＮ末端の３アミノ酸がＭｅｔ−Ｔｈｒ−ＰｒｏまたはＭｅｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏである場合はＭＡＰによるメチオニン切断活性は低下する（Ｍｏｅｒｓｃｈｅｌｌら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１９６３８−１９６４３；Ｔｓｕｎａｓａｗａら，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，５３８２−５３９１）。ある種のタンパク質にとって、Ｎ末端メチオニンの除去は、ｉｎ  ｖｉｖｏで正常に機能するために不可欠である。例えば開始メチオニンの除去は、様々なシグナル伝達タンパク質、癌細胞、タンパク質ターゲティング部分および酵素の正常な機能にとって不可欠なＮ−ミリストイル化などの後続のＮ末端修飾にしばしば必要とされる（Ｇｏｒｄｏｎら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，８６４７−８６５０；Ｄｕｒｏｎｉｏら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，７９６−８００）。
【０００４】
メチオニンアミノペプチダーゼは、大腸菌および他のいくつかの真正細菌、酵母、ラットならびに様々な古細菌を含むいくつかの生物から単離され、クローン化されている。現在発見されているＭＡＰは構造および配列類似性に基づいて１型ＭＡＰおよび２型ＭＡＰの２タイプに分類されている。真正細菌は１型、古細菌は２型、そして真核生物は両タイプのＭＡＰを有している。真核生物の場合、いずれか一タイプのヌル突然変異体は、生育は遅いものの生存可能であるが、両ＭＡＰタイプのヌル突然変異体は生存不能である（ＬｉおよびＣｈａｎｇ，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，１２３５７−１２３６１；ＬｉおよびＣｈａｎｇ，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２７，１５２−１５９；Ｂｒａｄｓｈａｗら，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１，２８５−２８６）。同様に、細菌ＭＡＰ１遺伝子のノックアウトも致死性である（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら，１９８７，Ｈ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，７５１−７５７）。このように、ＭＡＰ活性は原核細胞および真核細胞の正常な機能に不可欠である。
【０００５】
タンパク質の開始メチオニンを切断する役割だけでなく、ＭＡＰは他の細胞機能にも影響を及ぼす。例えば、ヒト２型ＭＡＰはタンパク質合成を調節する真核生物開始因子２としての役割も果たす（米国特許第５，８８５，８２０号）。また、フマギリン型血管新生阻害剤の作用様式は２型ＭＡＰの不可逆的阻害であることから（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，４６１−４７１；Ｌｉｕら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１３２４−１３２７；Ｌｏｗｔｈｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１２１５３−１２１５７；Ｓｉｎら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，６０９９−６１０３）、２型ＭＡＰは血管新生に不可欠な役割を果たしていることが示唆される。
【０００６】
ＭＡＰは原核生物機能および真核生物機能にきわめて重要な役割を果たすので、抗生物質としてまたは腫瘍における血管新生を抑制する化学療法剤として役立つかもしれないこれら酵素の阻害剤を新たに発見することに興味が持たれている。しかし、現在のＭＡＰ活性モニター法はこの課題を果たすには不適当である。現在のＭＡＰ活性モニター法には、ニンヒドリン比色法（Ｄｏｉら，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，１７３−１８４）、アミノ酸オキシダーゼ処理に続くペルオキシダーゼ反応およびｏ−ジアニシジン発色（ＣａｒｔｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，４５３−４５９）、イオン交換クロマトグラフィーに続いてニンヒドリン（Ｍｏｏｒｅら，１９５８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０，１１８５−１１９０）、フルオレサミン（Ｓｔｅｉｎら，１９７３，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５５，２０２−２１２）またはｏ−フタルアルデヒド／β−メルカプトエタノール（Ｒｏｔｈ，１９７１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４３，８８０−８８２）でポストカラム誘導体化を行うことによるアミノ酸分析、アミノ酸のプレカラム誘導体化に続く逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（ＣｏｈｅｎおよびＳｔｒｙｄｏｍ，１９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４，１−１６；Ｚｕｏら，１９９４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２，５１４−５１６）、ならびに基質ペプチドと生成物の逆相ＨＰＬＣによる分離および分離された各化合物のオンラインＵＶ検出（Ｌａｒｒａｂｅｅら，１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，１９４−１９８；Ｗａｌｋｅｒら，１９９９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９，１５７−１６３）などがある。これらの方法は定量的アッセイに十分な感度または精度を持たないか、ハイスループットスクリーニングに十分な迅速性を持たない。したがって、ハイスループットＭＡＰ分析を必要とする作業、例えばＭＡＰ阻害剤のスクリーニングに使用できるほど十分に迅速かつ定量的なＭＡＰ活性の新しいアッセイが必要とされている。
【０００７】
（発明の概要）
そこで本発明者らは、迅速かつ定量的で自動化に適した新規ＭＡＰアッセイの発明を成し遂げた。本アッセイでは第２のペプチダーゼを使用し、かつＭＡＰによって切断されうるＮ末端メチオニンと、前記Ｎ末端メチオニンが当該ペプチドから切断された場合にのみ前記第２ペプチダーゼによって当該ペプチドから放出されうるＣ末端検出部分とを含むペプチドを使用する。
【０００８】
例えば本発明の一実施形態は、組成物中のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）活性を検出する方法を対象とする。これらの方法では、（ａ）前記組成物を、Ｎ末端メチオニンを含むペプチドと、前記Ｎ末端メチオニンがＭＡＰによって前記ペプチドから切断されて切断型ペプチドが生成しうる条件下で混合し（ただし、前記ペプチドは前記Ｎ末端メチオニンが前記ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されるＣ末端検出部分を含有する）、（ｂ）（ａ）で生成した切断型ペプチドを前記第２ペプチダーゼと反応させて前記検出部分を放出させ、（ｃ）放出された検出部分を検出する。好ましい第２ペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶである。ジペプチジルペプチダーゼＩＶを使用する場合、好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ＸａａはＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含み、最も好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである。
【０００９】
また本発明は、ある物質があるＭＡＰを阻害するかどうかを決定する方法も対象とする。この方法では、（ａ）前記物質、前記ＭＡＰ、およびＮ末端メチオニンを含むペプチドを、前記Ｎ末端メチオニンが前記ＭＡＰによって前記ペプチドから切断されて切断型ペプチドが生成しうる条件下で混合し（ただし、前記ペプチドは前記Ｎ末端メチオニンが前記ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されるＣ末端検出部分を含有する）、（ｂ）（ａ）で生成した切断型ペプチドを前記第２ペプチダーゼと反応させて前記検出部分を放出させ、（ｃ）放出された検出部分を検出する。先に記載した方法の場合と同様に、好ましい第２ペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶであり、好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである。この方法では、ＭＡＰ阻害剤をより正確に検出するために、検出部分の量を定量することも好ましい。
【００１０】
もう１つの実施形態として本発明は、上記の方法での使用に適した反応混合物を対象とする。この反応混合物は、（ａ）メチオニンアミノペプチダーゼによって切断されうるＮ末端メチオニンと、前記Ｎ末端メチオニンが当該ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されうるＣ末端検出部分とを含むペプチド、および（ｂ）前記第２ペプチダーゼを含む。この混合物はＭＡＰを含んでもよい。
【００１１】
さらなる一実施形態として本発明は、上記の方法を実施するためのキットであって、上記の方法で説明した第２ペプチダーゼおよびペプチド、ならびに上記方法を実施するための説明書を含むキットを対象とする。本キットはＭＡＰも含むことが好ましい。
【００１２】
また本発明は上記の実施形態で説明したペプチドも対象とする。
【００１３】
したがって、本発明によって達成されるいくつかの利点の一部として、ＭＡＰ活性およびＭＡＰ阻害剤活性を迅速に検出および定量するための方法および試薬の提供を挙げることができる。これらの方法は今までに達成されたことがない速さ、定量精度および自動実行の可能性を併せ持つので、ＭＡＰおよびＭＡＰ阻害剤活性の迅速なスクリーニングと定量に、既知の方法よりも適している。
【００１４】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は迅速かつ定量的なＭＡＰアッセイを対象とする。これらのアッセイでは第２のペプチダーゼとペプチドとを使用する。前記ペプチドはＭＡＰによって切断されうるＮ末端Ｍｅｔと、前記Ｎ末端Ｍｅｔが前記ペプチドから切断された場合にのみ前記第２ペプチダーゼによって前記ペプチドから放出されうるＣ末端検出部分とを含む。検出部分はペプチドに共有結合されている場合には検出できないが、ペプチドから放出されると検出可能になる。
【００１５】
Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリドなどのペプチド類似体はロイシンアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１）などのアミノペプチダーゼの基質として働くことが知られている。ｐ−ニトロアニリドをＬｅｕに結合すると、４０５ｎｍにおける光の吸収は、アミノ酸から放出された場合と比べてはるかに少なくなる。したがって、Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリドをロイシンアミノペプチダーゼで切断してロイシン＋ｐ−ニトロアニリドを生成させると、それに付随してＡ４０５の定量的増加が起こる。しかしＭＡＰはＭｅｔ−ｐ−ニトロアニリドを切断してｐ−ニトロアニリドを放出することができない。
【００１６】
他の酵素がｐ−ニトロアニリド、または他の同様の検出部分に結合された短いペプチドを基質として利用することによりｐ−ニトロアニリドを放出できることも知られている。注目に値する一例は、Ｘａａ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（Ｘａａは任意のアミノ酸）を切断してｐ−ニトロアニリドを放出するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＥＣ３．４．１４．５）（白血球分化抗原ＣＤ２６とも呼ばれる）である（例えば図１の反応Ｂ）。またジペプチジルペプチダーゼＩＶは、検出部分の放出速度は低下するものの、末端から２番目のアミノ酸として（Ｐｒｏの代わりに）Ａｌａおよびヒドロキシプロリンを利用することもできる（Ｉｋｅｈａｒａら，１９９４，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４，２１５−２２７）。また最近になって、ジペプチジルペプチダーゼＩＶはＮ末端Ｔｙｒ−Ｇｌｙを基質として利用できることも見いだされた（Ｐｒｏｏｓｔら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３９８８−３９９３）。
【００１７】
１型または２型ＭＡＰをＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶと混合すると、前記ペプチドからｐ−ニトロアニリドが放出されるのに対して、ＭＡＰを含めなかった場合はｐ−ニトロアニリドが放出されないことを、ここに見いだした（図２）。すなわち、ＭＡＰはトリペプチドを基質として利用することによって、例えば図１の反応Ａを媒介してＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを生成することができ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶは生成したＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを基質とすることによってｐ−ニトロアニリドを放出することができる。
【００１８】
用語「放出」をペプチド上の検出部分に関して本明細書で使用する場合、この用語は、検出部分とペプチドの間の共有結合が、一般に酵素作用によって破壊されたことを意味する。
【００１９】
したがって本発明は、そのいくつかの実施形態において、組成物中のＭＡＰ活性を検出する方法を提供する。これらの方法では、（ａ）前記組成物を、Ｎ末端メチオニンを含むペプチドと、前記Ｎ末端メチオニンが切断されうる条件下で混合する（ただし、前記ペプチドは前記Ｎ末端メチオニンが切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されうるＣ末端検出部分も含有する）。組成物との反応によって生成した切断型ペプチドを前記第２ペプチダーゼと反応させて前記検出部分を放出させ、次に、放出された検出部分を検出する。
【００２０】
第２ペプチダーゼは、前記ペプチドのＮ末端メチオニンが除去された場合に前記検出部分を前記ペプチドから放出させることができなければならない。加えて第２ペプチダーゼは、Ｎ末端Ｍｅｔが存在する場合には、前記検出部分を前記ペプチドから放出させることができてはならない。また、ＭＡＰは一定のアミノ酸（例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＶａｌ）が当該ペプチドの末端から２番目の位置に存在する場合にのみＮ末端Ｍｅｔをペプチドから切断することができるので、第２ペプチダーゼによって切断されうるペプチド−検出部分はＮ末端位置にこれらのアミノ酸のうちの１つを持たなければならない。第２ペプチダーゼは、例えばＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを基質として利用することによりｐ−ニトロアニリドを放出することができるジペプチジルペプチダーゼＩＶであることが好ましい。このジペプチジルペプチダーゼＩＶ基質のＮ末端アミノ酸は、末端から２番目のアミノ酸としてＭＡＰに許容されるＧｌｙであることに注目されたい。したがって、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドはＭＡＰによって切断されて、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ基質であるＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−アニリドを放出できるが、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドそのものはジペプチジルペプチダーゼＩＶ基質ではない。それゆえジペプチジルペプチダーゼＩＶはこの方法に適した第２ペプチダーゼである。他のペプチダーゼ、例えばＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−検出部分を基質として利用することができるトリアミノペプチダーゼ（Ａｏｙａｇｉら，１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０，４３５）や、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−検出部分を基質として利用することができるカテプシンＣ（Ｊａｄｏｔら，１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１９，９６５；ＤｏｕｇｈｔｙおよびＧｒｕｅｎｓｔｅｉｎ，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６４，７７２）なども、第２ペプチダーゼとして役立つだろう。
【００２１】
条件を調節しなくても両方のペプチダーゼ反応が起こりうるように、第２ペプチダーゼはＭＡＰと同じ条件（例えば１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．３５）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、０．１〜０．５ｍＭ  Ｃｏ２＋［緩衝液Ｈ］［Ｚｕｏら（前掲）］、３０〜３５℃）で活性であることが好ましい。そのような第２ペプチダーゼを利用すれば、組成物、ペプチドおよび第２ペプチダーゼを同時にインキュベートして１工程でアッセイを行うことができるだろう。
【００２２】
上述のように、本アッセイで使用されるペプチドはＭＡＰによって切断されうるＮ末端メチオニンを持っていなければならない。すなわち本アッセイで使用されるペプチドは、ＭＡＰによるＮ末端メチオニンの切断を許すアミノ酸（例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＶａｌ）を末端から２番目の位置に持たなければならない。またこのペプチドは、Ｎ末端メチオニンが存在しない場合にのみ第２ペプチダーゼによってペプチドから切断されうるＣ末端検出部分も持っていなければならない。したがって、そのような切断が可能な配列でなければならない。第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶである場合、許容できるペプチドにはＭｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−検出部分（Ｘａａ１はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＶａｌ、好ましくはＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒ、最も好ましくはＧｌｙであり、Ｘａａ２はＰｒｏ、ＨｙｐまたはＡｌａ、最も好ましくはＰｒｏである）が含まれる。したがってジペプチジルペプチダーゼＩＶにとって最も好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−検出部分である。しかし活性なＭＡＰが存在する場合には検出部分の放出が起こりＭＡＰが存在しない場合には検出部分の放出が起こらないペプチドであれば、いかなるペプチドでもこれらの方法に役立ちうる。例えばジペプチジルペプチダーゼＩＶによって切断可能なペプチドの複合体、例えばＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−検出部分またはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−検出部分を使用してもよい。なぜならジペプチジルペプチダーゼＩＶは（ＭＡＰによるＮ末端Ｍｅｔ切断後に）各ジペプチドを順次切断して検出部分を放出することができるからである。本発明のペプチドは当技術分野で知られる任意の方法によって製造することができる。
【００２３】
これらの方法では、ＭＡＰおよび第２ペプチダーゼと共同して検出部分を放出または活性化する（ただしＭＡＰなしでは検出部分を放出または活性化しない）第３の酵素を使用することもできる。この方式では、第３酵素に適合するようにペプチドを設計する。例えば第２ペプチダーゼと第３酵素をジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびカテプシンＣとし、ペプチドをＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−検出部分またはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−検出部分として、第２ペプチダーゼと第３酵素を順次作用させることができる。もう一つの選択肢として、第３酵素は検出部分に作用して検出可能なシグナルを生成するものであってもよい。この場合、検出部分は第３酵素の基質、例えば第３酵素であるルシフェラーゼに対してルシフェリンなどである。
【００２４】
検出部分がペプチドから放出されて検出可能なシグナルを生成する能力を持つ限り、検出部分の選択によって本発明が狭く限定されることはない。検出部分は、後続の工程によって、例えばクロマトグラフィー、遠心分離または電気泳動的分離によって、または（上述の）酵素反応によって検出できる部分であることができる。この点に関して、（１）第２ペプチダーゼによってペプチドから放出された時に当該酵素の活性が増加し、かつ（２）当該酵素の作用後に検出することが可能な基質に対して、当該酵素が活性を持っているのであれば、検出部分自体が酵素であってもよい。検出部分は、例えば肉眼、測光法または蛍光手段などによって容易に検出できるものであることが好ましい。このような部分の具体例として、放出されると蛍光を発するクレシルバイオレット（Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎら，１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２，７１−７７）；放出されるとやはり蛍光を発する７−アミノ−３−トリフルオロメチルクマリン（Ｌｏｊｄａ，１９９６，Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ９８，２１５−２１８）；放出されるとやはり蛍光を発する４−メトキシ−２−ナフチルアミン（Ｓｃｈａｒｐｅら，１９８８，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３４，２２９９−２３０１）または２−ナフチルアミン（Ｉｋｅｈａｒａら（前掲））；放出されるとテトラゾリウム塩と反応して水不溶性で濃色のホルマザンを形成する１−ヒドロキシ−４−ナフチルアミド（本法のいくつかの固相形式に有用）；放出されると６００ｎｍに吸収極大を持つ化合物２，６−ジブロモフェノール−インド−ｐ−キシレノールを形成する３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド（Ｓｈｉｂｕｙａ−Ｓａｒｕｔａら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９，１１３−１１８）；および放出されると４１５ｎｍに吸収極大を持つｐ−ニトロアニリド（同上）などがあるが、これらに限るわけではない。好ましい検出部分はｐ−ニトロアニリドである。なぜならｐ−ニトロアニリドは、例えばジペプチジルペプチダーゼアッセイ（例：ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−アニリドなどを用いるアッセイ）で、検出部分として広く使用されているからである。ｐ−ニトロアニリドの検出にはいくつかの異なる検出方法が使用されている（Ｉｋｅｈａｒａ（前掲））。例えばこの化合物は、３８５ｎｍなどの波長で測光法的にまたは分光法的に、直接視覚化または測定することができる。より感度の高いｐ−ニトロアニリド検出法では、ジアゾ化およびＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンとのカップリングにより、５４８ｎｍで測定できる生成物を生成させる（同上）。
【００２５】
本発明は様々なアッセイ形式を包含する。例えば本アッセイは、まず（ＭＡＰを含んでいるかもしれない）組成物をペプチドと混合して、存在するＭＡＰにＮ末端メチオニンを前記ペプチドから切断させた後、第２ペプチダーゼを加えて検出部分を放出させるという二工程法で実施することができる。この形式は、第２ペプチダーゼがその活性に異なる要件（例えば異なる至適ｐＨまたは至適温度）を有しており、第２ペプチダーゼを添加する前に条件を変化させることができる場合に有用だろう。しかしアッセイは、組成物、ペプチドおよび第２ペプチダーゼを同時に混合しインキュベートして検出部分を遊離させるという１工程で実施されることが好ましい。
【００２６】
本方法は完全に水溶液中で（例えばチューブまたはマイクロタイターウェル中で）実施するか、または部分的にもしくは完全に固相で実施することができる。例えばビーズ、チューブ、またはウェルにペプチダーゼを吸着または共有結合し、他の成分が溶解状態である場合や、アッセイ全体をニトロセルロース膜などの固相で行い、検出部分がペプチドからの放出により不溶性の検出可能な生成物を生じる場合などに、固相を使用することができる。このような固相形式は、組織中に存在するＭＡＰを局在化するための組織化学的用途にも使用することができる。これらの用途では、ペプチドをジペプチジルペプチダーゼＩＶと共に組織に適用する。ＭＡＰ「シグナル」が組織中のＭＡＰ位置から移動しないように、検出部分はペプチドから放出された時に不溶性になることが好ましい。
【００２７】
これらの方法は定性的にも定量的にも使用することができる。例えば本方法は、放出された検出部分を単に視覚化することにより、ＭＡＰの生産または精製をモニターするために、定性的に使用することができる。本方法は、検出部分を定量し、その値を既知ＭＡＰ活性の対照と比較することにより、上記の生産または精製を定量的にモニターするために、または組織もしくは液体飼料中のＭＡＰ活性を定量的に測定するために使用することもできる。
【００２８】
本発明はもう一つの実施形態として、ある物質があるＭＡＰを阻害するかどうかを決定する方法を提供する。これらの方法は、一定量のＭＡＰを使用し、ＭＡＰをペプチドと混合する前に前記物質を加える点を除いて、ＭＡＰ活性に関する上記の方法と同様に実施される。したがって本方法では、前記物質、前記ＭＡＰ、およびＮ末端メチオニンを含むペプチドを、前記Ｎ末端メチオニンが前記ＭＡＰにより前記ペプチドから切断されて切断型ペプチドを生成しうる条件下で混合し（ただし、前記ペプチドは前記Ｎ末端メチオニンが前記ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されるＣ末端検出部分を含有する）、生成した切断型ペプチドを前記第２ペプチダーゼと反応させて前記検出部分を放出させ、放出された検出部分を検出する。当該物質がＭＡＰを阻害する場合は、当該物質がＭＡＰを阻害しない場合よりも、ペプチドから放出される検出部分が少ない（または検出部分がペプチドから放出されない）ことになる。したがって、放出された検出部分の量が、阻害剤がない場合に放出される量よりも少ないかどうかを決定することができるように、非阻害剤対照を使用することが好ましい。また、ＭＡＰではなく第２ペプチダーゼが阻害されている可能性を排除するための対照を使用することも好ましい。例えば第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶである場合、そのような対照はＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドの代わりにペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを使用することだろう。
【００２９】
この阻害剤検出法では、任意の供給源に由来するＭＡＰまたは第２ペプチダーゼを使用することができる。しかし、一部の既知ＭＡＰ阻害剤は一部の形態のＭＡＰしか阻害しない（例えばフマギリンは２型ＭＡＰを阻害するが１型ＭＡＰは阻害しない）ので、このアッセイ用に選択されたＭＡＰは、阻害することを望むＭＡＰと類似するか同じであるべきである。
【００３０】
ＭＡＰおよび第２ペプチダーゼは純粋な形であるか、または不純品の他の成分がＭＡＰ−ペプチドまたはＭＡＰ−第２ペプチダーゼ反応を妨害しないという条件の下に不純な形、例えば細胞溶解液であることができる。一変形として、ＭＡＰおよび第２ペプチダーゼをトランスジェニック細胞（当技術分野公知の方法で製造したもの）で製造し、そこにペプチドおよび阻害剤を添加することもできる。
【００３１】
これらの方法は、ＭＡＰ阻害剤を定性的または定量的にスクリーニングするために使用することができる。例えば、求めている阻害剤を使った処理とそのような阻害剤を使用しない処理または対照とで、放出された検出部分の相違が視覚的に容易に確認することができる場合、本方法は、ある物質が強力なＭＡＰ阻害剤であるかどうかを評価するために定性的に使用することができる。また本方法は、放出された検出部分を定量し、その値を既知量の阻害剤を含む対照と比較することにより、ある物質の相対的阻害活性を定量的に評価するために、または例えば組織もしくは液体試料中の阻害剤の量を定量するために使用することもできる。例えば血管新生を防ぐためにフミギリン（ｆｕｍｉｇｉｌｌｉｎ）で処置した癌患者の組織中の同ＭＡＰ阻害剤の量を、これらの方法でモニターすることができる。
【００３２】
これらの阻害剤検出法は、ＭＡＰおよび第２ペプチダーゼおよび／または第３酵素（第３酵素を使用する場合）の阻害剤活性に関して、化合物を同時にスクリーニングするために使用することもできる。この方式では、阻害剤をＭＡＰ、第２ペプチダーゼ、および所望により第３酵素と共に加える。次に検出部分の放出を阻害する物質をすべて第２ペプチダーゼおよび／または第３酵素の阻害について評価する。例えばＭＡＰ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、カテプシンＣおよびペプチドＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを使って、ある物質の阻害活性を試験することができる。当該物質がこれらの酵素のどれについても阻害的でない場合は、ｐ−ニトロアニリドが放出されるだろう。しかし、放出されるｐ−ニトロアニリドの量が減少する場合は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリド（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ基質）またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（カテプシンＣ基質）を使用して、当該物質を試験することができる。当該阻害剤がＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを使用した場合にはｐ−ニトロアニリドの放出を許さず、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを使用した場合には放出を許すのであれば、当該阻害剤はジペプチジルペプチダーゼＩＶに特異的であり、結果が逆であれば、当該阻害剤はカテプシンＣに特異的である。
【００３３】
本発明は、さらなる実施形態として、ＭＡＰを検出する方法またはＭＡＰ、第２ペプチダーゼまたは第３酵素の阻害剤を検出する方法に役立つ反応混合物を提供する。本反応混合物は、（ａ）ＭＡＰによって切断されうるＮ末端メチオニンと、前記Ｎ末端メチオニンが当該ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されうるＣ末端検出部分とを含むペプチドおよび（ｂ）前記第２ペプチダーゼの混合物を含む。また、この実施形態の反応混合物は、ｐＨおよびイオン強度などの因子がＭＡＰおよび第２ペプチダーゼの活性に適していなければならないという点で、上記ＭＡＰ検出法の反応混合物としての使用に適していなければならない。この反応混合物中の好ましい第２ペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶである。第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶである場合、好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ＸａａはＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含み、最も好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである。これらの反応混合物はＭＡＰを含んでもよい。これはＭＡＰ阻害剤を検出する方法に役立つ。
【００３４】
本発明は、さらなる実施形態として、ＭＡＰを検出する方法またはＭＡＰ、第２ペプチダーゼまたは第３酵素の阻害剤を検出する方法の実施に役立つキットを提供する。本キットは、（ａ）ＭＡＰによって切断されうるＮ末端メチオニンと、前記Ｎ末端メチオニンが当該ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されうるＣ末端検出部分とを含むペプチド、（ｂ）前記第２ペプチダーゼ、および（ｃ）前記方法を実施するための説明書を含む。これらのキット中の好ましい第２ペプチダーゼはジペプチジルペプチダーゼＩＶである。第２ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼＩＶである場合、好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ＸａａはＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含み、最も好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである。これらのキットは好ましくはＭＡＰも含む。これはＭＡＰ阻害剤を検出する方法に役立ち、またはＭＡＰを検出する方法における対照の一成分として役立つ。これらのキットの各成分は個別の容器に入れることができ、または一部の成分もしくは全ての成分を混合してもよい。
【００３５】
本発明は、さらなる実施形態として、メチオニンアミノペプチダーゼによって切断されうるＮ末端メチオニンと、前記Ｎ末端メチオニンが当該ペプチドから切断された場合にのみ第２のペプチダーゼによって放出されうるＣ末端検出部分とを含むペプチドを提供する。これらの実施形態の場合、好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（ＸａａはＡｌａ、Ｃｙｓ、ＧｌｙまたはＳｅｒである）を含み、最も好ましいペプチドはＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドである。
【００３６】
（産業上の利用）
本発明の方法および組成物は、迅速かつ定量的なＭＡＰまたはＭＡＰ阻害剤の検出、新しいＭＡＰまたはＭＡＰ阻害剤の単離、精製もしくは定量、または試料中のＭＡＰ活性の決定または定量に有用である。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態を以下の実施例に説明する。本願特許請求の範囲に包含される他の実施形態は、本明細書を検討しまたは本明細書に開示する発明を実施すれば、当業者には明らかになるだろう。本明細書は実施例を含めて単なる具体例に過ぎないとみなされ、本発明の範囲と精神は特許請求の範囲によって示されるものとする。
【００３８】
（実施例）
本実施例では、本発明に従ってＭＡＰを定量する方法およびＭＡＰの阻害剤を検出する方法の実施形態を例示する。
【００３９】
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドがＭＡＰの基質であるかどうか、またジペプチジルペプチダーゼの存在がＭＡＰの活性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、Ｚｕｏら（前掲）に記載されているＡｃｃＱ−Ｔａｇアッセイを使用した。表１はこのペプチドが１型ＭＡＰと２型ＭＡＰの両方の基質であることを示している。
【００４０】
【表１】
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１型ＭＡＰと２型ＭＡＰの活性はどちらもジペプチジルペプチダーゼＩＶの添加による影響を受けなかった。
【００４１】
次に、マイクロタイター形式でｐ−ニトロアニリドの放出をモニターすることによりＭＡＰ活性を決定した。９６穴マイクロタイタープレートのウェルに入れた０．１Ｍ  ＫＣｌおよび０．１ｍＭ  Ｃｏ２＋を含む４７μｌの緩衝液Ｈ（１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１０％グリセロール）に、精製した１型ＭＡＰまたは２型ＭＡＰ（０．６μｇ）および／または０．００１単位のジペプチジルペプチダーゼＩＶを加えた。３７℃で５分間インキュベートした後、この混合物に２ｍＭのＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを加えて反応を開始した。放出されたｐ−ニトロアニリドを検出するために４０５ｎｍに設定したマイクロタイタープレートリーダーを使って、反応の進行を記録した。図２に示すように、ＭＡＰ（いずれかのタイプ）がジペプチジルペプチダーゼＩＶと共に存在する場合にのみ、ｐ−ニトロアニリド放出量の有意な増加が起こった。これらの曲線は再現性が高く線形で、相関係数（ｒ２）＞０．９８である。
【００４２】
２型ＭＡＰ阻害剤の検出を目的とする本方法の使用を実証するために、様々な量のフミギリンを各反応に加えた。ＭＡＰ溶液と共に３７℃で１０分間インキュベートした後、２ｍＭのＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを加えて反応を開始し、ｐ−ニトロアニリドの放出を上述のようにマイクロタイタープレートリーダーを使って４０５ｎｍでモニターした。Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを基質として使用することにより、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性に対するフミギリンの影響も調べた。図３に示すように、１型ＭＡＰおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性はどちらも、９００ｎＭフマギリンの存在下でさえ影響を受けなかったが、２型ＭＡＰ活性は５００ｎＭフミギリンによって完全に阻害された。これらの結果はＡｃｃＱ−Ｔａｇ法（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら（前掲））で得られた結果ときわめて類似しており、これが新しいＭＡＰ阻害剤の信頼できる同定法であることを示している。
【００４３】
本明細書で引用した参考文献はすべて参照して本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の説明は単に著者らの主張を要約しようとするものであって、これらの参考文献が先行技術を構成すると認めるわけではない。出願人らは引用文献の正確性および関連性に異議を申し立てる権利を留保する。
【００４４】
上記の説明に照らせば、本発明のいくつかの利点が成し遂げられ、他の利点も達成されることがわかるだろう。
【００４５】
上記の方法および組成物には本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができるので、上記の説明に含まれる事物および添付の図面に示す事物は全て例示であって限定的意味はないと解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に役立つＭＡＰ（Ａ）およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（Ｂ）によって触媒される反応を表す図。
【図２】  ペプチドＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを使用し本発明に従って実施したＭＡＰに関するアッセイ結果を示すグラフであり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶは１型ＭＡＰ（●−●）および２型ＭＡＰ（○−○）の存在下ではｐ−ニトロアニリドを放出できるが、ジペプチジルペプチダーゼＩＶだけ（▽−▽）ではｐ−ニトロアニリドを放出できない。
【図３】  ジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびペプチドＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドを使用し本発明に従って行ったフマギリンによるＭＡＰの阻害に関するアッセイ結果を表すグラフであり、２型ＭＡＰを使用した場合（▽−▽）はｐ−ニトロアニリドの放出がフマギリンによって強く阻害されたが、１型ＭＡＰを使用した場合（○−○）またはジペプチジルペプチダーゼＩＶをＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリドと共に使用した場合（●−●）には、ｐ−ニトロアニリドの放出は阻害されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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