(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然コンホメーションの封入体の外因性ポリペプチドを細胞から単離する方法であって、細胞をカオトロピック剤と接触させ、ポリペプチドを細胞から抽出すると共にその溶解度を維持し、その細胞抽出物を、複数の水相を形成する有効量の相形成物質と更に接触させることからなり、前記水相の一が前記ポリペプチドに富み、かつ細胞に由来するバイオマス固体および核酸が涸渇している方法。
【請求項２】
カオトロピック剤および相形成物質と接触する細胞が細胞培養中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
封入体が原核生物培養基由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドが細菌において産生される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
添加が全て発酵容器において起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドを、ポリペプチドに存在する少なくとも１個のジスルフィド結合を還元するに十分な量の還元剤とも接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが約0.1ないし15g/Lの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カオトロピック剤の濃度が約0.1ないし9Mである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カオトロピック剤の濃度が約0.5ないし6Mである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
相形成試薬が添加される前にカオトロピック剤を培養基に添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
カオトロピック剤が尿素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
相を分離することにより該ポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
相のpHを変化させることにより、または相に溶媒、ポリマー、または塩を添加することにより、該ポリペプチドをそれに富む相から単離することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドがIGF−Ｉであり、相のpHを低下させる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが哺乳動物のポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドがIGF−Ｉまたは成長ホルモンである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
相形成物質が、ポリマー−ポリマー、ポリマー−塩、溶媒−塩、またはポリマー−溶媒の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
相形成物質がポリマー−塩の組み合わせである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
塩が硫酸塩、燐酸塩、またはクエン酸塩である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
塩が硫酸塩である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、または多糖類である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
使用されるポリマーの濃度が約５％（w/w）から該ポリマーの溶解度の限界までであり、そして使用される塩の濃度が約３％（w/w）から該塩の溶解度の限界までである、請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
使用されるポリマーの濃度が約５および18％（w/w）の間であり、使用される塩の濃度が約４および15％（w/w）の間である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
形成される水相の数が２である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
上相が該ポリペプチドに富み、且つバイオマス固体および核酸を涸渇している、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
約４ないし７％（w/w）の相形成塩および約12ないし18％（w/w）の相形成ポリマーが添加される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
濃厚になっているポリペプチドを活性コンホメーションに再折り畳みすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
目的とする生物活性な外因性ポリペプチドを細胞から回収する方法であって、細胞をカオトロピック剤と接触させ、非天然コンホメーションとっているポリペプチドを細胞から抽出すると共にその溶解度を維持し、その細胞抽出物を、複数の水相を形成する有効量の相形成物質と更に接触させ、ここで、前記水相の一が前記ポリペプチドに富み、かつ細胞に由来するバイオマス固体および核酸が涸渇しており、前記水相の一を分離することにより該ポリペプチドを回収し、そして、この回収されたポリペプチドを、約５−40％（v/v）のアルコール性または極性非プロトン性溶媒、約0.2ないし3Mのアルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩、約0.1ないし9Mのカオトロピック剤、および約0.01ないし15μＭの銅またはマンガン塩からなり、酸素供給源が導入されているpH7−12の緩衝液中でインキュベートして、該ポリペプチドの再折り畳みがインキュベーション中に起こるようにさせることからなる方法。
【請求項２９】
非天然コンホメーションをとっている目的とする外因性ポリペプチドに富み且つこのポリペプチドが産生された細胞由来のバイオマス固体および核酸が涸渇している相を含み、その水溶液がさらに、複数の水相を形成する有効量の相形成物質および該ポリペプチドの溶解度を維持するに十分な量のカオトロピック剤を含む、多相水溶液。
【請求項３０】
二つの相を含み、ここで上相が該ポリペプチドに富み且つバイオマス固体および核酸を涸渇している、請求項29に記載の溶液。
【請求項３１】
ポリペプチドが成長ホルモンまたはIGF−Ｉである、請求項29に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
この出願は、非天然型のポリペプチドを、それが産生された細胞から単離する方法を目的とする。より詳細には、本発明は、非天然コンホメーションのポリペプチドを、多相水性単離技術を用いて細胞から単離する方法に関するものである。
関連および背景技術の説明
ヘテロローガスな蛋白をコードしているDNAを発現する組み替えDNA技術の使用は、商業的量の蛋白生成物を生産する可能性を開いた。この方法によって、目的生成物をコードしている遺伝子が、宿主細胞、例えば細菌、真菌、酵母、または哺乳動物細胞中に導入され、当該遺伝子がその細胞で発現されるようになるよう、それを培養中で増殖させることができる。このように生産されたポリペプチドは精製され、薬学的および獣医学的用途、そして酵素の場合には食物工業または洗浄剤の用途を包含する数多くの適用のために使用することができる。
組み替え蛋白の生産は、所望の外因性蛋白をコードしているDNAで宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、その細胞を増殖させ、それらを当該組み替え蛋白の産生に好適な条件下に置くことを含む。原核生物の大腸菌は、組み替え蛋白を高い力価で産生させ得るため、宿主として好まれる。細胞外またはペリプラズムの担体蛋白のための細菌遺伝子および非細菌遺伝子を含む組み替えDNA分子に関する米国特許第4565785号；外来ポリペプチドと凝集形成ポリペプチドの同時産生に関する4673641号;trpプロモーター／オペレーターおよびIGF−ＩのようなポリペプチドとのtrpLE融合を有する発現ベクターに関する4738921号；外来蛋白を含めるための発現調節配列に関する4795706号；およびIGF−Ｉをコードしているもののような特異的環状DNAプラスミドに関する4710473号を包含する、組み換えDNAコード化蛋白の一般的な細菌による生産に関する数多くの米国特許が存在する。
幾つかの条件下では、細菌宿主から大量に発現される或る種のヘテロローガスな蛋白は、稠密な凝集体として細胞内に沈殿し、位相差顕微鏡の下で細胞の囲みの中に見える明瞭なスポットとして確認される。この沈殿した蛋白の凝集体は「屈折体」と呼ばれ、細胞の総蛋白のかなりの部分を構成する。ブレムズ等、Biochemistry、24巻7662頁（1985）。これに反して、この蛋白の凝集体は位相差顕微鏡で見えないこともあり、位相差顕微鏡で見えるか否かに拘わらず、「封入体」という語がこの蛋白の凝集体の呼称にしばしば用いられる。
この物体からの蛋白の回収は、細胞内に入っている蛋白を細胞物質およびそこに存在する蛋白からいかにして分離するか、そして封入体蛋白をいかにして生物活性型で回収するか、といったような数多くの問題を提起した。回収された蛋白は、しばしば、それらが活性蛋白とは異なった三次元コンホメーションに折り畳まれているため、専ら生物学的に不活性である。例えば、天然IGF−Ｉに見いだされるものとは異なったジスルフィド結合の対を有する誤って折り畳まれたIGF−Ｉは、有意に低下した生物活性を有する。ラシュドルフ等、Biomedical  and  Environmental  Mass  Spectroscopy、16巻３−８頁（1988）。誤折り畳みは、発酵中にまたは単離操作中のいずれかに細胞内で起こる。正しい、生物活性なコンホメーションに蛋白を再折り畳みする方法は、機能的蛋白の取得にとって必須である。
適正な再折り畳みに加えて、生化学者および細胞生物学者が直面したもう一つの難題は、蛋白および核酸のような可溶性物質と、細胞小器官および細胞全体のような懸濁粒子両者のための、効果的な分離法の開発である。原核生物のブロスの発酵時には、例えば、細胞が崩壊する時に多くの複雑な粒子が生成する。これらの混合物から蛋白を分離する操作は複雑であり、大きさ、形、および化学的組成の異なる粒子が供される。さらに、この粒子は、凝集し、解離し、または時と共にそして物理的または化学的処理と共に一般にその状態を変化させ得る。特に、例えば医薬のためには少なくとも99％でなければならないといったように、生成物の純度レベルが極めて高くなければならない適用に対して、緩和なそして効果的な分画法の大きな必要性がある。
蛋白は、典型的には、１またはそれ以上のクロマトグラフィー法、例えば親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製する。目的とする蛋白を含有する粗製抽出物をクロマトグラフィーカラムに適用する前に、所望生成物を含有する蛋白抽出物を、細胞および細胞断片のような固体から分離せねばならない。これは、カラムに適用される成分は全てゲルマトリックスを通過できなければならないためである。さもないと固体成分はゲル吸着床に詰まり、最終的に液体の流れを完全に停止させてしまうであろう。したがって、工程計画には、固体成分から、そして実用的には粘稠な成分、例えば細胞、細胞断片、および核酸からそれぞれ生成物を分離する精製法が含まれていなければならない。
この目的のために最も普通に用いられる方法は、生成物、宿主細胞の型、および生成物の所在（細胞外、細胞内、細菌のペリプラズム等）にもよるが、遠心分離または精密濾過またはその両者である。混合物には幾つかの異なった成分が存在するため、粒子の異なった性質を利用する異なった方法が必要であり得る。例えば、粒子の大きさおよび密度に従って分離する遠心法は、表面の性質といったような別の性質が分離パラメータを構成する方法によって補完され得る。これらの方法の一つが液−液二相系への分配である。このような方法においては、水を異なったポリマーと混合することにより相系を取得し、その結果、相は、生物学的材料由来の粒子およびマクロ分子と共存し得るようになる。
水性二相分配は、細胞粒子および蛋白の両者のための適用によって1956−1958年に導入された。それ以来これは、植物および動物細胞、微生物、ウイルス、葉緑体、ミトコンドリア、膜小胞、蛋白、および核酸のような異なった材料の宿主に適用されてきた。
二相系による分離の基礎は、相間の物質の選択的分配である。可溶性物質については、分配は主に二つの大容量の相の間で起こり、その分配は、下相に分配された物質の濃度で上相に分配された物質の濃度を除したものとして定義される分配係数によって性格付けられる。理想的には、この分配係数は、合計濃度および相の容積比とは独立している。これは主として、二つの相の性質、分配される物質、および温度の関数である。
この二相系は、二つの相不相容性のポリマー溶液を混合することにより、ポリマー溶液および塩溶液を混合することにより、または塩溶液およびわずかに非極性の溶媒を混合することにより、作成できる。これらの型の系は、蛋白および核酸、細胞粒子、および無傷の細胞といったようなマクロ分子を分離するための水性二相分配法と共に、例えば、アルバートソン、パーティション・オブ・セル・パーティクルズ・アンド・マクロモレキュールズ、第３版（ジョン・ウィレイ・アンド・サンズ：ニューヨーク、1986）；ウォルター等、パーティショニング・イン・アクエアス・トゥー−フェイズ・システムズ：セオリー、メソッズ、ユーシズ、アンド・アプリケーションズ・トゥー・バイオテクノロジー（アカデミック・プレス：ロンドン、1985）；およびクーラ、「抽出工程−酵素の精製への適用（議事録）」第８回国際生命工学シンポジウム（pt.1、612−622）、1988、に記載されている。
蛋白の分離を大規模に取り扱うことのできる幾つかの低コスト二相系が知られている。これらの系は、上相を形成するポリマーとしてポリエチレングリコール（PEG）、下相を形成するポリマーとして粗製デキストラン（例えばクローナー等、Biotechnology  Bioengineering、24巻1015−1045頁［1982］）、濃縮塩溶液（例えばクーラ等、Adv.Biochem.Bioeng.、24巻73−118頁［1982］）、またはヒドロキシプロピル澱粉（ツジャネルド等、Biotechnology  Bioengineering、30巻809−816頁［1987］）を使用する。
様々なPEG誘導体を使用する水性PEGデキストラン系またはPEG−塩系中での粗製インターフェロン溶液の選択的分配により、インターフェロンの精製が達成された。ドイツ国特許DE2943016。
二相水性ポリマー系は文献中で広範に議論されている。例えば、バスカー等、Macromolecules、20巻1300−1311頁（1987）；バーケンメイアー等、J.Chromatogr.、360巻193−201頁（1986）；バーケンメイアーおよびコパーシュレーガー、J.Biotechnol.、21巻93−108頁（1991）；ブロムキストおよびアルバートソン、J.Chromatogr.、73巻125−133頁（1972）；ブロムキスト等、Acta  Chem.Scand.、29巻838−842頁（1975）；アーランソン−アルバートソン、Biochim.Biophys.Acta、617巻371−382頁（1980）；フォスターおよびヘア、Biol.Reprod.、46巻981−990頁（1992）；グロスマンおよびギップス、Naunyn.Schmiedebergs  Arch.Pharmacol.、282巻439−444頁（1974）；ハットリおよびイワサキ、J.Biochem.（Tokyo）、88巻725−736頁（1980）；ハイネス等、AICHE  Journal−American  Institute  of  Chemical  Engineers、37巻1401−1409頁（1991）；ヨハンソン等、J.Chromatogr.、331巻11−21頁（1985）；ヨハンソン等、J.Chromatogr.、331巻11−21頁（1985）；ケッセルおよびマクエルヒニー、Mol.Pharmacol.、14巻1121−1129頁（1978）；コバルチクおよびバンドゥルスキ、Biochemical  Journal、279巻509−514頁（1991）；クー等、Biotechnol.Bioeng.、33巻1081−1088頁（1989）；クボイ等、Kagaku  Kogaku  Ronbunshu、16巻1053−1059頁（1990）；クボイ等、Kagaku  Kogaku  Ronbunshu、16巻755−762頁（1990）；クボイ等、Kagaku  Kogaku  Ronbunshu、17巻67−74頁（1991）；クボイ等、Kagaku  Kogaku  Ronbunshu、772−779頁（1990）；レモイン等、Physiol.Plant、82巻377−384頁（1991）；リルホッジおよびマリク、Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.、40巻19−71頁（1989）；ルンドバーグ等、Biochemistry、31巻5665−5671頁（1992）；マルシアーニおよびバーダー、Biochim.Biophys.Acta、401巻386−398頁（1975）；マティアソンおよびカウル、「生命工学における回収および精製のための水性二相系の使用」（議事録）、314巻、Separ.Recovery  Purif.:Math.Model.、78−92頁（1986）；メンディエタおよびヨハンソン、Anal.Biochem.、200巻280−285頁（1992）；ニファンテヴァ等、Zh.Anal.Khim.、44巻1368−1373頁（1989）；オブライエン等、Blood、80巻277−285頁（1992）；オールソン等、Nucl.Acids  Res.5巻583−590頁（1978）；オウスおよびコウワン、Enzyme  Microb.Technol.、11巻568−574頁（1989）；プルール等、J.Med.Microbiol.、32巻93−100頁（1990）；サンドストローム等、Plant  Physiol.（Bethesda）、85巻693−698頁（1987）；ササカワおよびウォルター、Biochim.Biophys.Acta、244巻461−465頁（1971）；ワング等、J.Chem.Engineering  of  Japan、25巻134−139頁（1992）；ウィデルおよびサンドクヴィスト、Physiol.Plant、61巻27−34頁（1984）；ザスラヴスキー等、J.Chrom.、439巻267−281頁（1988）；ザスラヴスキー等、J.Chem.Soc.、Faraday  Trans.、87巻141−145頁（1991）;89年11月７日登録の米国特許第4879234号（EP210532に対応）;92年２月20日公開のDD（ドイツ国）298424;92年５月14日公開のWO92/07868;および米国特許第5093254号を参照されたい。ヘジュナエス等、Protein  Engineering、５巻797−806頁（1992）もまた参照されたい。
水性二相抽出／単離系はDD特許第288837号に記載されている。この、組み替え蛋白の選択的濃縮のための工程では、蛋白を含有するホモジネートを、相不相容性ポリマーとしてのPEGおよびポリビニルアルコールからなる水性二相系に懸濁する。次いで相の分離を行い、それにより蛋白は上相に濃縮され、一方殆どのバイオマスは下相に濃縮される。しかしながら、この特許は、非天然蛋白をどのように分配するかを扱っていない。
コール、Biotechniques、11巻18−24頁（1991）は、単離されるDNAを分解し得るヌクレアーゼを失活させるためにカオトロープおよび洗浄剤を二相水性系に添加している。コール、Frontiers  Bioprocess  II、340−351頁（1992）およびグルンフェルト等、Appl.Biochem.Biotechnol.、33巻117−138頁（1992）は、ｔ−PAの再活性化または再活性化混合物からのｔ−PAの精製のために二相系を使用している。ヨハンソンおよびコパーシュレーガー、J.Chrom.、388巻295−305頁（1987）は、尿素がアルカリホスファターゼの親和分配効果を低下させると述べている。マック等、Biochemistry、15巻5754−5761頁（1976）は、水性ポリマー二相系を用いてRNAを精製している。モードギル等、J.Biol.Chem.、262巻5180−5187頁（1987）は、レセプターの分配係数を変化させるのに尿素または熱を用いている。ニワ等、Nippon  Suisan  Gakkaishi−Bulletin  of  the  Jap.Soc.of  Scientific  Fisheries、55巻143−146頁（1989）；タナカ等、J.Chem.Eng.Jpn.、24巻661−664頁（1991）；および91年２月21日公開のWO91/02089は、核酸の抽出について報告している。米国特許第4843155号をも参照されたい。
この分配技術の主たる利点は、この方法が効率がよく、スケールアップが容易であり、連続遠心分離器と共に用いた場合迅速であり、比較的コストが低く、そして生物学的適合性を最大とするための水分含有量が高いことである。これらの使用によりかなりの省力を行うことができるが、蛋白を精製するための水性二相系の工業的適用は現在比較的少ない。
二相分配により粗製抽出物から蛋白を単離せねばならない場合、相の間にその蛋白を最大に分配させることにより、回収が増大する。細胞蛋白の残りの部分に比較して大きなまたは小さな分配係数が、その生成物を精製する手段を提供する。結果としての容量低減と、それでいて高収率を保持する、極端な相の容量比を用いて生成物を単離することもまた可能である。細胞内酵素β−ガラクトシダーゼの場合がそうであるように、分配係数が高い場合、水性二相分配は、細胞粒子および核酸を一工程で除去することに加えて、生成物の精製および濃縮を行うことができるであろう。即ち、生成物をPEGに富む上相に集め、同時に細胞粒子および核酸を塩に富む下相に移動させることが可能である。
濃縮された生成物を高収率で取得する可能性を提供する、極端な分配係数の探索は、幾つかの第二世代の水性二相系の使用につながった。一つの例は、PEGを親和基に共有結合させ、得られたコンジュゲートがPEGに富む相に対する分配を増大させるためのポリマー成分として含まれる、親和分配である。これらの、および類似のアプローチは、水性二相抽出／単離を本質上いかなる生成物についても極めて選択的とすることができる。しかしながら、修飾されたPEGの高コスト、適当な親和基の発見の問題、そして経済的な理由による修飾されたPEGリサイクルの必要性が、この考えを大規模適用に対して魅力のないものとしている。もう一つの考えは、WO92/7868に記載されるように、目的生成物を、大きな分配係数を有する蛋白と、またはトリブトファン残基を含むペプチド配列と融合させることであった。
当分野には、蛋白を再生する必要が無く、そして誘導体化されたポリマーのような高価な成分またはペプチドもしくは他の親和剤と生成物との融合を必要としない、発酵槽中インサイトゥで培地から組み替えポリペプチドを直接単離する方法への需要がある。
故に、非天然ポリペプチドをそれらが他の物質と共に存在するプロスから単離するための方法を提供することが、本発明の一つの目的である。
発酵ブロスのホモジネートからの組み替え蛋白の効率的な抽出を提供することがもう一つの目的である。
封入体の形で組み替え蛋白を含むタンクからの非天然IGF−Ｉのための多相水性単離組成物を提供することが特定の目的である。
これらのおよびその他の目的は、当業者にとって明らかであろう。
発明の要約
したがって本発明は、或る態様において、非天然コンホメーションの目的とする外因性ポリペプチドを細胞から単離する方法であって、細胞を、ポリペプチドを細胞から抽出しその溶解度を維持するに十分な量のカオトロピック剤、および複数の水相（このうち一方は、当該ポリペプチドに富み且つ細胞に由来するバイオマス固体が涸渇している）を形成する相形成物質の有効量と接触させることからなる方法を提供する。
別の態様において本発明は、目的とする生物活性な外因性ポリペプチドを細胞から回収する方法であって、細胞を、最初は非天然コンホメーションをとっているポリペプチドを細胞から抽出しその溶解度を維持するに十分な量のカオトロピック剤、および複数の水相（このうち一方は、当該ポリペプチドに富み且つ細胞に由来するバイオマス固体が涸渇している）を形成する相形成物質の有効量と接触させ、相を分離することにより該ポリペプチドを回収し、そして、この回収されたポリペプチドを、約５−40％（v/v）のアルコール性または極性非プロトン性溶媒、約0.2ないし3Mのアルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩、約0.1ないし9Mのカオトロピック剤、および約0.01ないし15μＭの銅またはマンガン塩からなり、酸素供給源が導入されているpH7−12の緩衝液中でインキュベートして、該ポリペプチドの再折り畳みがインキュベーション中に起こるようにさせることからなる方法を提供する。
さらに別の態様においては、本発明は、非天然コンホメーションをとっている目的とする外因性ポリペプチドに富み且つこのポリペプチドが産生された細胞由来のバイオマス固体が涸渇している相を含み、その水溶液がさらに、相形成物質および該ポリペプチドの溶解度を維持するに十分な量のカオトロピック剤を含む、多相水溶液を提供する。
好ましい態様において、本発明は、発酵容器中の原核生物培養基から、封入体の形の目的とする外因性ポリペプチドを単離する方法であって、該ポリペプチド約0.1ないし15mg/mLの入った発酵容器に、カオトロピック剤約0.5ないし6Mおよび該ポリペプチドを還元するに十分な量の還元剤を添加し；相形成塩約４ないし15％（w/w）および相形成ポリマー約５ないし18％（w/w）を添加して二つの水相を形成させ、それにより一方の相が該ポリペプチドに富み且つ発酵ブロスに由来するバイオマス固体が涸渇するようにさせることからなる方法を提供する。最も好ましくは、相形成塩の濃度が約４−７％（w/w）、そして相形成ポリマーの濃度が約12−18％（w/w）であり、それにより上相がポリペプチドに富み且つ発酵ブロスに由来するバイオマス固体が涸渇する。
本明細書に記載の方法は、原核生物細胞由来の封入体の形であって、それらが封入体から単離された後に再折り畳みされる必要のある、哺乳動物のポリペプチド（元来哺乳動物から誘導されたポリペプチド）に特に適している。この方法は、ポリペプチドを取得するために細胞を収穫し遠心するという伝統的な工程の使用に比較して、折り畳み工程前の非天然ポリペプチドの純度の増加をもたらす。この方法は単に還元剤、カオトロープ、および相形成物質を要するだけであって、方法の総コストに加わる誘導体化されたPEGのような特別な化学物質を必要としない。
インサイトゥ可溶化後の水性多相抽出は、所望の組み替えポリペプチドを、少なくとも遠心による屈折体単離中に得られるものに匹敵するレベルにまで精製する手段を提供する。核酸が水性多相系で固体を含む下相に分配される傾向は、それらの除去の助けとなる。さらに、組み替え蛋白は、単離された軽い相から沈殿し、またはさらなる精製および／またはポリマー除去を達成するため再抽出することができる。
加えて、水性多相系を形成するのに用いられる硫酸ナトリウムおよびエタノールのような或る種の化学物質は、蛋白再折り畳みの亢進物質であることが見いだされている。
【図面の簡単な説明】
図１は、IGF−Ｉをコードしている発現ベクター、即ちpBKIGF−2Bの製造の際の中間体プラスミドpBKIGF−２の製造に用いられるpLBIGFTscを生成する際の中間体プラスミドpLamBIGFを生成するのに使用されるプラスミドp200の制限地図を示す図である。
図２は、MFアルファＩプレプロおよびIGF−Ｉ遺伝子配列を含むp200のEcoR I−EcoR Iフラグメント（1149位から1633位まで）のヌクレオチド配列を示す図である（配列番号１）。
図３は、３個のプラスミドフラグメントおよび一片の合成DNAからのpLamBIGFの組み立てを示す図である（配列番号２および３）。pLamBIGFは、pBKIGF−２の製造に用いられるpLBIGFTscの生成の際の中間体プラスミドである。
図４は、pLamBIGFからの中間体プラスミドpLBIGFTscの組み立てを示す図である。
図５は、pBKIGF−２の製造に用いられる中間体プラスミドpRanTscの組み立てを示す図である。
図６は、pLS32Tsc、pLBIGFTsc、pLS33Tsc、およびpRanTscからのpBKIGF−２の組み立てを示す図である。
図７は、pLBIGFTsc、pBKIGF−２、および一片の合成DNAからの、pBKIGF−2Bの製造に用いられるpBKIGF2Aの組み立てを示す図である（配列番号４および５）。
図８は、pLS33LamB、pRANTES、および一片の合成DNAからの、pBKIGF−2Bの製造に用いられるpLamBRanの組み立てを示す図である（配列番号６および７）。
図９は、pBKIGF−２、pBKIGF−2A、pLamBRan、および一片の合成DNAからの、発現ベクターpBKIGF−2Bの組み立てを示す図である（配列番号８および９）。
図10は、再折り畳み中のIGF−Ｉ物質の発生を示す３つのHPLCクロマトグラムの流れである（左から右へ、誤って折り畳まれたIGF−Ｉ、正しく折り畳まれたIGF−Ｉ、そして還元されたIGF−Ｉ）。これらのクロマトグラムは、折り畳み開始時（下のクロマトグラム）、折り畳み開始の１時間後（中程のクロマトグラム）、そして折り畳み開始の３時間後（上のクロマトグラム）に測定された。
図11は、尿素、DTT、非天然IGF−Ｉ、および細胞付随固体を含有する抽出物全体に塩およびポリマーを添加することにより作成された水性二相系を表す相図である。記号を使用して、二相系（白抜きの丸）、一相系（塗りつぶした丸）、浮遊する固体を伴う二相系（ρ）、および公表されている二節点（Ｘ）を示す。曲線を使用して、二節点（実線）、固体の沈降の限界（破線）、および固体が下相に入ることのできる相比率の限界（点線）を示す。陰を付した領域は、IGF−Ｉおよび細胞付随固体の分離に最適な領域を示している。
図12は、IGF−Ｉ再折り畳みの速度に及ぼす銅濃度の効果を示す図である。痕跡量（十字）、0.013μＭ（白抜きの丸）、0.052μＭ（塗りつぶした丸）、0.13μＭ（白抜きの正方形）、0.52μＭ（星印）、1.3μＭ（白抜きの三角形）、5.2μＭ（塗りつぶした三角形）、および13μＭ（塗りつぶした正方形）の濃度の塩化銅を用いて25℃で再折り畳みを実施した。
好ましい態様の説明
A.定義。
本明細書中使用される「目的とするポリペプチド」とは一般に、約10以上のアミノ酸を有するペプチドおよび蛋白を意味する。このポリペプチドは、それらがヘテロローガスであることを意味する「外因性」、即ち、チャイニーズハムスター卵巣細胞によりもしくは細菌細胞により産生される人間の蛋白、または異なる酵母もしくは細菌もしくは哺乳動物細胞により産生される酵母ポリペプチドのように、利用される宿主細胞にとって外来性である。好ましいのは原核生物細胞で産生される哺乳動物ポリペプチドであり、最も好ましくは細菌細胞中の封入体として、特にペリプラズムから産生される哺乳動物ポリペプチドである。
哺乳動物ポリペプチドの例には、例えばレニン、ヒト成長ホルモンを包含する成長ホルモン；牛成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポ蛋白；α１−抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；因子VIIIC、因子IX、組織因子、およびフォンビルブラント因子のような凝固因子；プロテインＣのような抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）のようなプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミュレリアン阻害物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン付随ペプチド；β−ラクタマーゼのような微生物蛋白;DNアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；ホルモンまたは成長因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡまたはD;リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（NT−３、NT−４、NT−５、またはNT−６）、またはNGF−βのような神経成長因子；血小板由来成長因子（PDGF）;FGFおよびbFGFのような線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（EGF）;TGF−αおよびTGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４、またはTGF−β５を包含するTGF−βのようなトランスフォーミング成長因子（TGF）；インシュリン様成長因子ＩおよびII（IGF−ＩおよびIGF−II）；デス（１−３）−IGF−Ｉ（脳TGF−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合蛋白;CD−３、CD−４、CD−８、およびCD−19のようなCD蛋白；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態形成蛋白（BMP）；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；コロニー刺激因子（CSF）、例えばＭ−CSF、GM−CSF、およびＧ−CSF;インターロイキン（IL）、例えばIL−１ないしIL−10;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞レセプター；表面膜蛋白；腐敗加速因子；例えばAIDSエンベロープの一部のようなウイルス抗原；輸送蛋白；ホーミングレセプター；アドレシン；調節蛋白；抗体；および上記ポリペプチドのいずれかのフラグメントが包含される。
目的とする好ましい外因性ポリペプチドは、最低限の蛋白分解を用いて原核生物細胞で容易に産生され、意図されるそれらの用途のためのグルコシル化を必要としないポリペプチドである。このような哺乳動物ポリペプチドの例には、IGF−Ｉ、IGF−II、脳IGF−Ｉ、成長ホルモン、リラキシン鎖、成長ホルモン放出因子、インシュリン鎖またはプロインシュリン、ウロキナーゼ、免疫毒素、NGF、NT−５、および抗原が包含される。特に好ましい哺乳動物ポリペプチドは、IGF−Ｉ、脳IGF−Ｉ、成長ホルモン、ならびにNT−５を包含するNGF、NT−３、NT−４、NT−５、およびNT−６のようなニューロトロフィンを包含し、最も好ましい哺乳動物ポリペプチドはIGF−Ｉである。
本明細書中使用される「IGF−Ｉ」とは、天然配列または変異型および組み替えにより産生された、牛、羊、豚、馬、そして好ましくは人間を含む任意の種由来のインシュリン様成長因子Ｉを意味する。IGF−Ｉを産生する一つの方法が、1984年12月19日公開のEP128733に記載されている。
本明細書中使用される「封入体」または「屈折体」という語は、全ての細胞構成成分を包含する総細胞蛋白の有意な部分を構成する、目的とする凝集したポリペプチドの稠密な細胞内塊体を意味する。常にではないが幾つかの場合においては、これらポリペプチドの凝集体は、1000倍という低い倍率の位相差顕微鏡の下で、細胞の囲みの内部に見える明るい点として認識することができる。
本明細書中使用される「非天然コンホメーションの」という語は、天然構造ではない二次、三次、および／または四次構造が推定されるポリペプチドを表現している。このポリペプチドは、カオトロピック剤および相形成物質との接触工程の前であれまたは最中もしくは後であれ、本明細書に特許請求される方法の任意の時点で係るコンホメーションであり得る。この非天然コンホメーションのポリペプチドは、可溶性であるが不活性型であるか、または非天然膜蛋白であるか、または不溶性であってジスルフィド結合が誤って対合しているもしくは形成されていない生物学的に不活性なコンホメーションであり得る。この不溶性ポリペプチドは、好ましくは屈折体に入っているが、そうでなければならない訳ではなく、即ち、これは位相差顕微鏡で見えても見えなくてもよい。
本明細書中使用される「誤って折り畳まれた」ポリペプチドという語は、屈折体の内部に入っている沈殿したまたは凝集したポリペプチドを意味する。非天然ポリペプチドは、誤って折り畳まれたポリペプチドから取得でき、正しく折り畳まれたおよび誤って折り畳まれたものを包含する。
本明細書中使用される「細胞」という語は、任意の細胞を意味し；目的のポリペプチドが回収される細胞は、それらの状態がいかなるものであろうと、カオトロピック剤および相形成試薬で処理することができる。例えば、本発明は、細胞培養内の細胞（それらが増殖するタンクに関わりなく、細胞が分離されていないブロス全体）、および、ホモジナイズまたは遠心を受けた細胞を包含する。「細胞培養」という句は、哺乳動物細胞培養のみならず、原核生物および酵母細胞を包含する任意の細胞の培養を意味する。
「配座異性体」という語は、分子内ジスルフィド結合のみが異なるポリペプチドを意味する。例えば、IGF−Ｉは70アミノ酸長であり、分子内ジスルフィド結合を形成する６個のシステイン残基を有する。正しい、活性なIGF−Ｉ配座異性体は、アミノ酸残基C6−C48、C47−C52、およびC18−C61の間にジスルフィド結合を有する。別の主なポリペプチドは、アミノ酸残基C6−C47、C48−C52、およびC18−C61の間にジスルフィド結合を有する生物活性のより低い配座異性体である。
本明細書中使用される「発酵容器」という語は、目的のポリペプチドを産生させるよう原核生物宿主の培養を行うタンクまたはその他の装置を意味する。発酵ブロスまたは培地は、その細胞のために使用される培養基である。
本明細書中使用される「カオトロピック剤」とは、水溶液中の適当な濃度において、ポリペプチドの表面での変化によってその空間的立体配置またはコンホメーションを変化させ、その結果該ポリペプチドを水性媒質に可溶とすることのできる化合物を意味する。この変化は、例えば水和の状態、溶媒環境、または溶媒−表面相互作用を変えることによって起こり得る。カオトロピック剤の濃度はその強さおよび有効性に直接影響するであろう。強力に変性させるカオトロピック溶液は高い濃度でカオトロピック剤を含有し、それは溶液中に存在するポリペプチドを溶液状態で効果的に開伸させる。この開伸は、比較的広範囲ではあるが可逆的である。中等度に変性させるカオトロピック溶液は、溶液中十分な濃度において、いかにゆがめられたコンホメーションがその溶液に可溶性の中間体からそのポリペプチドに想定されようとも、そこから、内因性またはホモローガスな生理的条件下でそのポリペプチドが活性型で作用する場合にとる空間的コンホメーションへとそのポリペプチドの部分的折り畳みをさせるカオトロピック剤を含有する。カオトロピック剤の例は、塩酸グアニジン、尿素、および水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような水酸化物を包含する。カオトロピック剤は、塩基と尿素または塩酸グアニジンの混合物といったようなこれらの試薬の組み合わせを包含する。
本明細書中使用される「還元剤」とは、水溶液中の適当な濃度で、分子内または分子間ジスルフィド結合を化学的に妨害するようスルフヒドリル基を維持する化合物を意味する。好適な還元剤の代表例には、ジチオトレイトール（DTT）、ジチオエリスリトール（DTE）、β−メルカプトエタノール（BME）、システイン、システアミン、チオグリコラート、グルタチオン、および水素化硼素ナトリウムが包含される。
本明細書中使用される「相形成物質」または「相形成試薬」とは、水性溶液に添加される時、多相を形成するよう働く分子を意味する。「水性」溶液とは、その溶液の大部分（即ち、約50％より大）が水で構成されている溶液である。したがって、例えば、約60％の水を含有する40％エタノールは相形成物質のための好適な溶媒である。相形成物質の例は、ポリマーポリマーの組み合わせ、溶媒−塩の組み合わせ、ポリマー−塩の組み合わせ、およびポリマー−溶媒の組み合わせを包含する。本明細書中、最も好ましいものは、ポリマー−塩の組み合わせである。
本明細書中使用される「バイオマス固体および核酸」とは、ポリペプチドが産生される細胞または細胞培養からもたらされる（または起源とする）粒子（溶解していない）固体、および核酸（DNA、RNA）を意味する。これは、可溶化および液体抽出構成成分添加物以外の全ての供給源を包含するであろう。係る固体は、例えば、細胞、細胞断片、培地成分、細胞膜および小胞、ならびに可溶性蛋白でない、細胞にとって内因性の蛋白または細胞のその他の不溶性成分を包含する。本発明方法の実施の際、バイオマス固体および核酸は、ポリペプチドとは反対の相に見いだされる。
本明細書中使用される、相に対して適用される「多」という語は、１以上の相、好ましくは２ないし４の相、そして最も好ましくは二つの相を意味する。「ポリペプチドに富みバイオマス固体が涸渇している」相とは、そのポリペプチドが１より大きい分配係数を有し、バイオマス固体が１より小さい分配係数を有する相（ここで分配係数は、注目している相に関するものである）を意味する。例えば、もし下相が生成物に富むならば、分配係数は、下相における濃度を上相における濃度で除したものである。
本明細書中使用される「オスモライト」とは、緩衝化された溶液に浸透圧を与える、または水和もしくは表面張力を作用させる物質を意味する。例には、ヤンシー等、Science、217巻1214−1222頁（1982）およびシェイン、Bio/Technology、８巻308−315頁（1990）により詳細に記載されるように、グリセロール、エリスリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マンニシドマンニトール、グリコシルグリセロール、グルコース、フルクトース、シュクロース、トレハロース、およびイソフルオロシドのようなポリオール類および糖類；デキストラン、レバン、およびポリエチレングリコールのようなポリマー；ならびにグリシン、アラニン、β−アラニン、プロリン、タウリン、ベタイン、オクトピン、グルタマート、サルコシン、ｙ−アミノ酪酸、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（TMAO）のような幾つかのアミノ酸およびその誘導体が包含される。
本明細書中使用される「緩衝液」とは、その酸−塩基共役成分の作用によりpHの変化に抵抗する緩衝化された溶液を意味する。
本明細書中使用される「溶媒」とは、アルコール類および極性非プロトン性溶媒を意味する。アルコール類とは、アルコールに対して一般的に用いられる用語の意義を意味しており、１ないし10個の炭素原子を有するアルコール類、より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、またはｔ−ブタノール、ならびにグリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリエチレングリコール、そして最も好ましくはエタノールまたはイソプロパノールを包含する。このようなアルコール類は水溶液に添加される場合、溶液の極性を低下させることによりその溶液の疎水性を増大させる溶媒である。極性非プロトン性溶媒は、アルコールの代わりに、またはアルコールに添加して使用できる、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、Ｎ−メチルピロリドン（NMP）、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、アセトニトリル等のような分子である。
本明細書中使用される句「アルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩」とは、アルカリ土類もしくはアルカリ金属元素由来の陽イオンまたはアンモニウム陽イオンを有し、且つ無機または有機（炭化水素を基礎とする）陰イオンを有する塩を意味する。係る塩の例には、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、燐酸ナトリウム、燐酸カルシウム、燐酸アンモニウム、燐酸マグネシウム、燐酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等が包含される。本明細書中好ましい塩は塩化物または硫酸塩である。本明細書中最も好ましい塩は塩化ナトリウムである。
本明細書中使用される句「銅またはマンガン塩」とは、システイン残基の酸化の推進を担う、有機陰イオンを包含する任意の陰イオンを伴う銅またはマンガンの塩を意味する。好適な陰イオンは硫酸塩および塩化物を包含し、塩化銅が特に好ましい。この銅またはマンガンは、外から添加することができ、または発酵の残留物であってよく、またはその他の方法で目的とするポリペプチドを含有する溶液に既に存在していてもよい。
B.発明を実施する様式。
本発明は、発酵ブロスに入っているポリペプチドおよび非ポリペプチドを含有する複雑な生物学的混合物から外因性ポリペプチドを単離するための新規な手段および方法に関するものである。これは、試薬を、非天然コンホメーションの当該ポリペプチドを含有する細胞、好ましくは細胞培養と接触させることを含み、その結果水性抽出／単離が起こり得るようにするものである。好ましくは本発明は、組み替えによりポリペプチドが産生された後、発酵容器に試薬を直接添加し、それにより該ポリペプチドを取得するための収穫、ホモジナイズ、および遠心という余分の工程を回避することを包含する。残った粒子はゴーリンホモジナイゼーションおよび再懸濁、濾過、またはそれらの組み合わせにより除去することができるが、本明細書に記載の発明は、組み替えポリペプチドを残りの粒子から精製するために多相抽出系を利用する。
とりわけ本発明は、細胞のペリプラズムに屈折体を形成する原核生物細胞、例えば大腸菌を包含する細菌中で非天然の哺乳動物ポリペプチドを組み替えにより生成させるのに好ましい。この系においては、１またはそれ以上の変性剤（カオトロピック剤）、例えば尿素、塩酸グアニジン、および／または塩基、ならびに還元剤、例えばジチオトレイトールまたはシステインをポリペプチド含有培地に加え、次いで相形成物質をこのブロスに加える。この第二の群の試薬がブロスに添加されると、多相が形成され、それにより一方の相はポリペプチドに富み、且つバイオマス固体および核酸を涸渇させる。好ましくはこの系は２ないし４の相、より好ましくは二つの相を有し、一方がポリペプチドに富み、他方はバイオマス固体および核酸に富む。好ましくは、所望のポリペプチドは上相に分配され、その結果、上相はポリペプチドに富みバイオマス固体および核酸を涸渇させる。
所望のポリペプチドをコードしているDNAを発現するのに好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等な真核生物細胞である。この目的にとって好適な原核生物は、始原細菌およびユーバクテリアのような細菌を包含する。好ましい細菌はグラム陰性またはグラム陽性生物のようなユーバクテリア、例えば腸内細菌、例えばエシェリチア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・ティフィムリウム、セラティア、例えばセラティア・マイセスキャンス、およびシゲラ；バシリ、例えばB.サブティリスおよびB.リチェニフォルミス（例えば1989年４月12日公開のDD266710に開示されるB.リチェニフォルミス41P）；シュードモナス、例えばP.アエルギノーサ、ストレプトミセス；アゾトバクター；リゾビア；ヴィトレオシラ；およびパラコッカスである。好ましい大腸菌宿主には、E.coli  W3110（ATCC27325）、E.coli  294（ATCC31446）、E.coli  Ｂ、およびE.coli  X1776（ATCC31537）が包含される。これらの例は限定的ではなく例示的なものである。
上に述べた任意の細菌の突然変異細胞もまた使用することができる。無論、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択する必要がある。例えば、大腸菌、セラティア、またはサルモネラ種は、pBR322、pBR325、pACYA177、またはpKN410といった周知のプラスミドを使用してレプリコンを供給する時、宿主として好適に使用することができる。
大腸菌菌株W3110は、組み替えDNA産物の発酵のための一般的な宿主菌株であるため、好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最少量の蛋白分解酵素を分泌すべきである。例えば、菌株W3110は、蛋白をコードしている遺伝子に遺伝的突然変異を施すよう修飾することができ、係る宿主の例はE.coli  W3110菌株27C7を包含する。27C7の完全な遺伝子型は、tonA△  ptr3  phoA△E15  △（argF−lac）169  ompT△  degP41Kanrである。菌株27C7は、1991年10月30日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC番号55244として寄託された。別法として、1990年８月７日登録の米国特許第4946783号に開示される突然変異体ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌の菌株を使用することもできる。別法として、インビトロクローニング法、例えばPCRまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応も好適である。例えば、菌株W3110は、宿主にとって内因性の蛋白をコードしている遺伝子に遺伝的突然変異を施すよう修飾することができ、係る宿主の例は、完全な遺伝型tonA△を有するE.coli  W3110菌株1A2;完全な遺伝型tonA△ptr3を有するE.coli  W3110菌株9E4;完全な遺伝型tonA△  ptr3  phoA△E15  △（argF−lac）169  ompT△  degP41kanrを有するE.coli  W3110菌株27C7（ATCC55244）；完全な遺伝型tonA△  ptr3  phoA△E15  △（argF−lac）169  ompT△  degP41Kanrrbs7△  ilvGを有するE.coli  W3110菌株37D6;非カナマイシン耐性degP除去突然変異を有する菌株37D6であるE.coli  W3110菌株40B4;および1990年８月７日登録の米国特許第4946783号に開示される、突然変異体ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌菌株である。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物もまた、ポリペプチドをコードしているベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。下等真核宿主微生物の中でサッカロミセス・セレヴィシアエ、またはパン酵母が最も普通に用いられる。しかしながら、シゾサッカロミセス・ポンベ［ビーチおよびナース、Nature、290巻140頁（1981）;1985年５月２日公開のEP139383］；クルイヴェロミセス宿主（米国4943529;フリア等、上記）、例えばK.ラクティス［MW98−8C、CBS683、CBS4574;ローヴェンコート等、J.Bacteriol.、737（1983）］、K.フラギリス（ATCC12424）、K.ブルガリクス（ATCC16045）、K.ウィッケラミイ（ATCC24178）、K.ワルティイ（ATCC56500）、K.ドゥロソフィラルム（ATCC36906;ヴァン・デン・バーグ等、上記）、K.サーモトレランス、およびK.マルキシアヌス；ヤロウィア［EP402226］；ピチア・パストリス［EP183070;スリークリシュナ等、J.Basic  Microbiol.、28巻265−278頁（1988）］；カンディダ；トリコデルマ・リーシア［EP244234］；ニューロスポラ・クラッサ［ケイス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76巻5259−5263頁（1979）］；シュワニオミセス、例えばシュワニオミセス・オクシデンタリス［1990年10月31日公開のEP394538］；および糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラディウム［1991年１月10日公開のWO91/00357］、およびアスペルギルス宿主、例えばA.ニデュランス［バランス等、Biochem.Biophys.Res.Commun.、112巻284−289頁（1983）；ティルバーン等、Gene、26巻205−221頁（1983）；イェルトン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81巻1470−1474頁（1984）］およびA.ニゲル［ケリーおよびハイネス、EMBO  J.、４巻475−479頁（1985）］のようなその他の幾つかの属、種、および株が一般に入手でき、本発明において有用である。
所望のポリペプチドをコードしているDNAの発現のために適当な宿主細胞は、多細胞生物からも誘導することができる。このような宿主細胞は、複雑な工程処理およびクリコシル化作用が可能である。原則として、脊椎動物由来または無脊椎動物由来の如何に関わらず、任意の高等真核生物細胞培養が適当である。無脊椎動物の細胞の例には植物および昆虫細胞が包含される。数多くのバキュロウイルス菌株および変異体ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（毛虫）、アエデス・アエジプティ（蛾）、アエデス・アルボピクトゥス（蛾）、ドゥロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリのような宿主からの対応する許容し得る昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、ルッコウ等、Bio/Technology、６巻47−55頁（1988）；ミラー等、Genetic  Engineering、J.K.セットロー等編、８巻（プレナム・パブリッシング、1986）、277−279頁；およびマエダ等、Nature、315巻592−594頁（1985）を参照されたい。トランスフェクション用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカNPVのＬ−１変異体およびボンビクス・モリNPVのBm−５株が一般に入手可能であり、このようなウイルスは本発明に従う、特にスボドブテラ・フルギベルダ細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして、使用することができる。
綿、トウモロコシ、馬鈴薯、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、所望のポリペプチドをコードしているDNAを含むよう前もって操作しておいて細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの或る菌株と共に、植物細胞をインキュベートすることによってトランスフェクトする。A.トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、所望のポリペプチドをコードしているDNAは植物細胞宿主に移り、その結果これはトランスフェクトされ、適当な条件下で所望のポリペプチドをコードしているDNAを発現するようになる。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞に適合し得る調節およびシグナル配列が利用できる。デピッカー等、J.Mol.Appl.Gen.、１巻561頁（1982）。さらに、Ｔ−DNA780遺伝子の上流領域から分離されたDNAセグメントは、組み替えDNAを含む植物組織における植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増強することができる。1989年６月21日公開のEP321196。
有用な哺乳動物宿主セルラインの例は、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1ライン（COS−７、ATCC  CRL1651）；ヒト胚腎臓ライン（293または懸濁培養中での増殖用にサブクローニングされた293細胞、グラハム等、J.Gen.Virol.、36巻59頁［1977］）；乳児ハムスター腎細胞（BHK、ATCC  CCL10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−DHFR（CHO、ウアラウプおよびチェイシン、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77巻4216頁［1980］）；マウスセルトリ細胞（TM4、マザー、Biol.Reprod.、23巻243−251頁［1980］）；サル腎細胞（CV1  ATCC  CCL70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC  CRL−1587）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC  CCL2）；イヌ腎細胞（MDCK、ATCC  CCL34）；バッファローラット肝細胞（BRL3A、ATCC  CRL1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC  CCL75）；ヒト肝細胞（HepG2、HB8065）；マウス乳房腫瘍（MMT  060562、ATCC  CCL51）;TRI細胞（マザー等、Annals  N.Y.Acad.Sci.、383巻44−68頁［1982］）;MRC5細胞;FS4細胞；およびヒト肝癌ライン（HepG2）である。
宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは上記の本発明に係る発現またはクローニングベクターで形質転換し、そして、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望配列をコードしている遺伝子の増幅に適した修飾を施した常套的栄養培地で培養する。
トランスフェクションとは、実際に何らかのコーディング配列が発現されるか否かに拘わらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。数多くのトランスフェクション法、例えばCaPO4および電気穿孔が当業者に知られている。トランスフェクションの成功は一般に、このベクターの作用の何らかの徴候が宿主細胞内に現れた時に認識される。
形質転換とは、DNAを生物中に導入し、その結果このDNAが染色体外要素としてまたは染色体の要素によって複製可能となることを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、形質転換は係る細胞にとって適当な標準技術を用いて行われる。サムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル［ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1989］の1.82項に記載の塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、または電気穿孔が、一般に、原核生物または実質的な細胞壁障壁を持つその他の細胞に使用される。シャウ等、Gene、23巻315頁（1983）および1989年６月29日公開のWO89/05859に記載のように、アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、或る種の植物細胞の形質転換に使用される。加えて、植物は、1991年１月10日公開のWO91/00358に記載のように超音波処理を用いて形質転換することができる。
このような細胞壁の無い哺乳動物細胞のためには、グラハムおよびヴァン・デル・エプ、Virology、52巻456−457頁（1978）の燐酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的側面は、アクセルにより1983年８月16日登録の米国特許4399216に記載されている。酵母の形質転換は、ヴァン・ソリンゲン等、J.Bact.、130巻946頁（1977）およびシャオ等、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、76巻3829頁（1979）の方法に従って典型的に実施される。しかしながら、例えば核マイクロインジェクション、電気穿孔、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン類、例えばポリブレン、ポリオルニチン等による、DNAを細胞中に導入するその他の方法もまた使用できる。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技術については、キオウン等、Methods  in  Enzymology（1989）、キオウン等、Methods  in  Enzymology（1990）、185巻527−537頁、およびマンスア等、Nature、336巻348−352頁（1988）を参照されたい。
本発明に係る方法に従って目的ポリペプチドを産生するために原核生物細胞を使用する場合は、例えばサムブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、NY、1989）に一般的に記載されるように、プロモーターが構成的にまたは人工的に誘導され得る適当な培地でそれらを培養する。適当な培地の例は下記の実施例の項に示す。
炭素、窒素、および無機燐酸源以外の必要な補足物もまた、単独でまた複合窒素源のような別の補足物または培地との混合物として導入される適当な濃度で加えることができる。培地のpHは、主に宿主生物に応じて約５−９の任意のpHとすることができる。
哺乳動物宿主細胞を用いて本発明に係るポリペプチドを産生する場合、それらは様々な培地で培養できる。ハムのF10（シグマ）、最少必須培地（［MEM］、シグマ）、RPMI−1640（シグマ）、およびダルベッコの改良イーグル培地（［DMEM］、シグマ）のような市販品が入手できる培地が、宿主細胞の培養に好適である。さらに、ハムおよびワレス、Meth.Enz.、58巻44頁（1979）、バーネスおよびサトー、Anal.Biochem.、102巻255頁（1980）、米国4767704;4657866;4927762;または4560655;WO90/03430;WO87/00195;米国特許Re.30985;または米国5122469に記載の培地のうち任意のものを、この宿主細胞のための培養基として使用することができる。これらの培地のうち任意のものに、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩）、緩衝剤（例えばHEPES）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（商標）薬）、微量元素（最終濃度が通常マイクロモルの範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補足することができる。当業者に知られるその他の必要な補足物があればそれも適当な濃度で加えることができる。温度、pH等のような培養条件は、発現のために選択されたその宿主細胞について従来用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、インビトロ哺乳動物細胞培養の生産性を最大とするための原則、プロトコル、および実用技術は、ママリアン・セル・バイオテクノロジー：ア・プラクティカル・アプローチ、M.バトラー編（オクスフォード大学のIRLプレス、オクスフォード、1991）に見いだすことができる。
上の方法は、ポリペプチドが細胞内であるかまたはペリプラズム空間にあるかに拘わらず使用することができる。ポリペプチドの単離のために本明細書に示す好ましい条件は、特にペリプラズム空間に位置する封入体に対するものである。
発酵が完了した後、細胞培養を１またはそれ以上のカオトロピック剤、所望により還元剤、そして相形成試薬と接触させ、その結果多相が形成され、そのうち一つの相が目的とするポリペプチドに富む。ポリペプチドを細胞から抽出しブロス中でのその溶解度を維持するために、相形成試薬が添加される前にカオトロープおよび還元剤を添加するのが好ましい。さらに、目的とするポリペプチドはいずれの相から抽出されても（そしていずれの相において濃厚であっても）よいが、好ましくはこれは最も上の相から回収される。
最も好ましくは、カオトロピック剤および所望による還元剤は、ポリペプチドの単離の前に発酵容器中の発酵ブロスに直接添加され、その結果、試薬は細胞に浸透し、そしてポリペプチドが可溶化し周囲の培地に拡散する。そのポリペプチドが少なくとも１個のスルフヒドリル基を含んでいるならば、還元剤を添加する。
好適な還元剤の例は、ジチオトレイトール（DTT）、β−メルカプトエタノール（BME）、システイン、チオグリコラート、および水素化硼素ナトリウムを包含する。緩衝剤中に存在すべき還元剤の量は、主に還元剤およびカオトロピック剤の型、使用する緩衝剤の型およびpH、ならびに緩衝剤中のポリペプチドの型および濃度に依存するであろう。還元剤の有効量は、分子間ジスルフィド仲介凝集を排除するに十分な量である。例えば、１−4M尿素を含有するpH7.5−10.5の緩衝化された溶液中のIGF−I0.5−6mg/mLについては、DTT濃度は約１−20mMであり、そしてシステインの濃度は約10−50mMである。好ましい還元剤は約２−10mMのDTTまたは約30−50mMのシステインである。
本発明の実施に好適なカオトロピック剤は、例えば尿素およびグアニジンの塩またはチオシアナート、より好ましくは尿素、塩酸グアニジン、またはチオシアン酸ナトリウムを包含する。緩衝剤中に存在すべき必要なカオトロピック剤の量は、例えばそのカオトロピック剤の型および存在するポリペプチドに依存する。発酵ブロスに添加すべきカオトロピック剤の量は、そのポリペプチドを細胞から抽出し、ブロス中でのその溶解度を維持するに十分高いものとなろう。ポリペプチドが上相から抽出される場合は、相形成物質の添加後に、固体が底に沈まず上相に上がる点まで密度が増大しないよう、カオトロピック剤の量が十分少なくなくてはならない。一般に、カオトロピック剤の濃度は約0.1ないし9M、好ましくは約0.5−9M、より好ましくは約0.5ないし6M、そして最も好ましくは約0.5−3Mである。また、好ましくはカオトロピック剤は相形成試薬が添加される前に培養に添加される。本発明において好ましいカオトロピック剤は、約1.5−2.5M、より好ましくは約2Mの尿素、または約0.5−3Mの塩酸グアニジンである。最も好ましくは、カオトロピック剤は尿素である。
カオトロープおよび還元剤が添加される水溶液中のポリペプチドの濃度は、そのポリペプチドが最大収率で回収される濃度でなければならない。使用される正確な量は、例えばポリペプチドの型ならびに水溶液中の他の成分、特に還元剤、カオトロピック剤、相形成物質の濃度および型、ならびにpHに依存するであろう。ポリペプチド一般について、好ましいポリペプチドの濃度は約0.1ないし15mg/mLである。IGF−Ｉの好ましい濃度（変性されたまたは非天然のIGF−Ｉの最大収率をもたらす）は、mL当たり0.5−6mg、より好ましくは1.5−5mg/mLの範囲である。
本明細書中使用される相形成物質の型は、処理される発酵ブロス中のポリペプチドおよび成分の型を包含する多くの因子に依存する。該物質は、ポリペプチドが沈殿せず、一方の相が他方の相より疎水性であり、その結果ポリペプチドはより疎水性の相に位置し、バイオマス固体および核酸は疎水性の低い相に沈降するよう、選択せねばならない。
相形成物質は、ポリマーの組み合わせ（ポリマー−ポリマー）、ポリマー−塩の組み合わせ、溶媒−塩、およびポリマー−溶媒の組み合わせを包含する、物質の組み合わせであってよい。好適なポリマーは、親水性の高いポリマーおよび親水性の低いポリマーの両者であり、即ち、当分野で知られる任意の相形成ポリマーである。例には、PEG4000、PEG6000およびPEG8000といった種々の分子量のPEGを包含するポリエチレングリコールまたはその誘導体、例えばグルンフェルド等、上記、に記載されるPEGの誘導体、約36000ないし360000という好ましい分子量範囲のポリビニルピロリドン（PVP）、デキストラン（例えばデキストラン70および500）、デキストリン、およびマルトデキストリン（約600および5000の間という好ましい分子量）のような澱粉、シュクロース、およびフィコール−400（商標）ポリマー（シュクロースおよびエピクロロヒドリンのコポリマー）が包含される。本発明において好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、またはデキストランのような多糖類である。本発明において最も好ましいポリマーは、異なった分子量のPEGまたはPEG−ポリプロピレングリコールの組み合わせもしくはコポリマーである。
好適な有機溶媒の例には、エチレングリコール、グリセロール、ジメチルスルホキシド、ポリビニルアルコール、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、ならびにメタノール、エタノール、および２−プロパノールのようなアルコール類が包含される。このような溶媒は、水溶液に添加される時、その溶液の疎水性を増すような溶媒である。
塩は無機または有機とすることができ、好ましくは当該ポリペプチドを沈殿させるような働きをしない。遷移元素を含む塩はポリペプチドを沈殿させる傾向があるため、好ましくない。水性多相系を形成させる可能性を有する陰イオンが選択される。例には、硫酸アンモニウム、燐酸二塩基ナトリウム、硫酸ナトリウム、燐酸アンモニウム、クエン酸カリウム、燐酸マグネシウム、燐酸ナトリウム、燐酸カルシウム、燐酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マンガン、燐酸マンガン等が包含される。水性二相系の形成に有用な塩の型は、ザスラヴスキー等、J.Chrom.、上記、に、より詳細に評価されている。本発明において好ましい塩は硫酸塩、燐酸塩、またはクエン酸塩であり、且つアルカリまたはアルカリ土類金属である。硫酸塩およびクエン酸塩がより好ましく、硫酸塩が最も好ましく、何故なら硫酸塩にはpHの制限が少ないからである。本発明において最も好ましい塩は硫酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムである。
満足できる多相系を得るために目的ポリペプチドに添加される相形成物質の量は、当分野において知られている。ポリペプチドに添加される相形成物質の量は、例えば、もし発酵ブロス中に既に存在するカオトロピック剤および還元剤があればその量、細胞培養基の性質、発酵に用いられる細胞の型、処理されるポリペプチドの型、ポリペプチドが下相または上相のいずれから回収されるか、そして添加される相形成物質の型のような因子に依存する。使用されるポリマーの一般的な濃度は、約５％（w/w）から該ポリマーの溶解度の限界までであり、使用される塩の濃度は、約３％（w/w）からその塩の溶解度の限界までであり、必要な相−容量比の大きさに依存する。相−容量比はバイオマス固体を収容するに十分でなければならない。有効な相形成物質の型および量は、相図によって、そして最終的な結果、即ち目的ポリペプチドの純度および収量を評価することによって決定することができる。相形成物質がポリマー−塩の組み合わせである場合、好ましくは、添加される塩の濃度は約４−15％（w/w）であり、ポリマーの濃度は５−18％（w/w）であって、その結果、所望のポリペプチドは、バイオマス固体および核酸が存在する相とは反対の相にあるであろう。
所望の系が、ポリペプチドが上相に分配されバイオマス固体および核酸が下相にある系である場合、相形成物質の濃度には或る適切な領域がある。可溶化を維持するため大量のカオトロピック剤を添加すればする程大量の相形成物質が必要となる。しかしながらこれら全ての試薬の濃度を高くすると溶液の密度が増すであろう。高い密度は、バイオマス固体の沈降をより難しくさせるであろう。過度に高い密度は、バイオマス固体を表面に浮遊させるであろう。よって、カオトロピック剤および相形成物質の濃度は、完全に可溶化したポリペプチドを維持するに十分高くなければならず、しかしながらバイオマス固体を反対の（下の）相に沈降させるに十分低くなければならない。
ポリペプチドを上相に回収しようとする場合、典型的には、例えば塩、ポリマー、およびポリペプチドの型に応じて、塩濃度は約４−７％（w/w）であり、ポリマー濃度は約12−18％（w/w）となるであろう。エタノールのような有機溶媒が相形成物質として添加される場合、これは、例えばポリペプチドおよびアルコールの型に応じて、好ましくは溶液の約10ないし30％（容量／容量）の濃度で添加され、もし他の相形成物質が存在するならば、好ましくは約20％（v/v）の濃度である。
細胞培養を様々な試薬と接触させる正確な条件は、例えば緩衝剤のpH、相形成試薬の型、ならびにポリペプチドおよびカオトロピック剤および還元剤の型および濃度に依存するであろう。反応温度は一般に約20−40℃、より好ましくは室温である。接触工程は一般に少なくとも約30分間、好ましくは、副反応が起こるか否かに応じて約30分間ないし12時間、より好ましくは約30分間ないし８時間、そして最も好ましくは約30分間ないし1.5時間である。
ポリペプチドが開伸されているならば、その開伸の程度は、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを包含する非天然ポリペプチドのクロマトグラフィーによって好適に測定される。非天然物質に相当するピーク面積の増加は、どれだけの非天然ポリペプチドが存在するかを示す。
いったん多相系が確立されると、一方の相はポリペプチドに富み、且つバイオマス固体および核酸からなる破壊された粒子および細胞が涸渇することになろう。二相系においては、好ましくは上相がポリペプチドに富み、それに対して下相が破壊された粒子および細胞に富む。ポリペプチドは相の分離により容易に回収することができる。この回収工程は、上相を傾瀉することにより、下相を排水することにより、または遠心により、達成できる。次にこのポリペプチドを、ポリペプチドが沈殿するように相のpHを変えることにより、または適当な溶媒を添加することにより、それが含まれている相から単離し、すると沈殿したポリペプチドは、遠心もしくは濾過により、またはスラリーとして好適に回収される。別法としてこのポリペプチドは、適当なポリマー、塩、または溶媒の添加により再抽出することによって、ポリマー含有相から回収することもできる。IGF−Ｉの場合、このポリペプチドは、IGF−Ｉが沈殿するようpHを低下させることによりポリマー相から単離され、その結果IGF−Ｉの収率は約97％にもまたはそれ以上になる。
多相系の液相から取得されると、またはより後の精製段階において、該ポリペプチドは、適切に活性コンホメーションへと再折り畳みされる。利用できる一つの好適な再折り畳み法は以下に述べるようなものである。
本明細書に記載の多相抽出系によりポリペプチドを可溶化し抽出した後、これを、溶媒、カオトロピック剤、塩、および最少量の銅またはマンガン塩を含有する緩衝液中に入れまたはこれにより希釈する。意外にもこの緩衝液は、いかなる型の宿主由来のポリペプチドの再折り畳み収率をも増加させる。この緩衝液は、主としてポリペプチドおよび還元剤の型に応じて約７ないし12のpH、好ましくは約８ないし11、より好ましくはpH8.5ないし11、そして最も好ましくは8.5ないし10.5である。
この緩衝液の一つの重要な成分は、アルコール性または極性非プロトン性溶媒であって、例えばポリペプチドおよび溶媒の型、ならびにカオトロピック剤の濃度に応じて、溶液の約５−40％（v/v）、好ましくは10ないし30％（容量／容量）の濃度である。これは最も好ましくは約20％（v/v）の濃度である。
この緩衝液にとって重要な第二の成分は、アルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩であって、これは主としてカオトロープ濃度、溶媒濃度、およびアルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩および使用されるポリペプチドの型に応じて約0.2ないし3M、好ましくは0.2ないし2Mの濃度で存在する。例えば、陽イオンがナトリウム、カリウム、またはアンモニウムであるならば、濃度は約0.5ないし3Mであるが、陽イオンがマグネシウムならば濃度は約0.2ないし1Mである。
この緩衝液の第三の重要な成分は、有効量のカオトロピック剤である。係るカオトロープの量は、主としてアルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩の濃度、溶媒の濃度、使用される個々のアルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩の型、使用される個々のカオトロピック剤の型、およびポリペプチドの型、ならびに緩衝液のpHに依存するが、一般に約0.1ないし9M、好ましくは約0.5ないし6M、そして最も好ましくは約1.5ないし4Mの範囲であろう。個々のカオトロープについては、好ましくは約0.1ないし2Mの塩酸グアニジン、および好ましくは約１−3M、より好ましくは約１−2.5M、そして最も好ましくは約2Mの尿素が利用される。
緩衝液の第四の重要な成分は、酸化および結果としての再折り畳みが起こるような銅およびマンガン塩から選ばれる遷移金属塩の有効量である。銅またはマンガン塩の量は、主として、使用される遷移金属およびポリペプチドの型および存在する酸素のレベルに依存する。酸素の添加速度または酸素レベルが低いほど、使用され得る銅またはマンガン塩の量は多くなる。銅またはマンガン塩の濃度は典型的には約0.01ないし15μＭ、好ましくは約0.01ないし10μＭ、より好ましくは約0.01ないし５μＭ、そしてさらに好ましくは約0.01ないし0.5μＭである。上記の好ましい範囲はとりわけIGF−Ｉにとって好ましい。この濃度が約15μＭを超えて増大すると、正しく折り畳まれたポリペプチドの収率は突然劇的に低下する。最も好ましくは、銅またはマンガン塩の濃度は約0.5μＭである。遷移金属塩は、例えばこれが発酵中に残っているならば、外からこれを添加することなく緩衝液中に既に存在していることがあり、又はこれを緩衝液に添加してもよく、またはその両方であってもよい。
緩衝液は、第一の緩衝化溶液について上に列挙したもののいずれかとすることができ、pH8.5−11のCAPSO、グリシン、およびCAPSが、特に約20mMの濃度で好ましく、最も好ましくはCAPSOおよびグリシンである。ポリペプチドは、再折り畳み緩衝液で、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも約10倍に希釈することができる。別法として、ポリペプチドを再折り畳み緩衝液に対して透析することもできる。再折り畳みは典型的には約０−45℃、好ましくは約20−40℃、より好ましくは約23−37℃、さらに好ましくは約25−37℃、そして最も好ましくは約25℃で少なくとも約１時間実施する。好ましい温度は塩、溶媒、およびカオトロピック剤のレベルによる明らかな影響を受けないが、シュクロースおよびグリセロールの存在により影響を受けることがあり、この場合温度は約20℃より高く保つべきである。溶液には所望により還元剤およびオスモライトをも含有させる。
還元剤は、可溶化工程について上に記載されたものから、示された濃度範囲で適当に選択する。その濃度は、特にアルカリ土類、アルカリ金属、またはアンモニウム塩、ポリペプチド、および溶媒の濃度に依存するであろう。好ましくは、還元剤の濃度は約0.5ないし8mM、より好ましくは約１−5mM、さらに好ましくは約0.5−2mMである。好ましい還元剤はDTTおよびシステインである。
所望によるオスモライトは好ましくはシュクロース（約0.25−1Mの濃度）またはグリセロール（約１−4Mの濃度）である。より好ましくは、シュクロースの濃度は約1Mであり、グリセロールの濃度は約4Mである。
折り畳み緩衝液中のポリペプチドの初期濃度は、HPLC、RIA、またはバイオアッセイにより測定される、回収された誤って折り畳まれた配座異性体に対する正しく折り畳まれたものの比が、最大となるような濃度である。正確な濃度は、例えば使用されるポリペプチドの型に依存するであろう。ポリペプチドの好ましい濃度（正しく折り畳まれた配座異性体の最大収率をもたらす）は約0.1ないし15mg/mL、より好ましくは約0.1ないし6mg/mL、そして最も好ましくは約0.2ないし5mg/mLである。
さらに、空気または気体酸素のような酸素供給源を緩衝液中に飛沫同伴またはその他のやり方で導入し、銅またはマンガン塩と共に酸化を起こさせる。酸素は、ポリペプチドまたはその他の任意の試薬が緩衝液に添加される前を含む任意の時点で緩衝液中に存在することができる。
導入される酸素供給源の量は、例えば、利用する容器の型、ポリペプチドの型および濃度、酸素供給源の型、銅またはマンガン塩の型および量、ならびにもし存在するならばその還元剤の型および量、ならびに存在するカオトロピック剤の型および量、ならびに緩衝液のpHに依存するであろう。一般に、酸素供給源は、攪拌機を用いて受動的手段により導入されるであろう（例えば、流体容積に対する空気の空間の比が2:1である、頭隙中の空気として）。別法として、酸素供給源はスパージャーを介して通気することにより導入することもできる。酸素の導入速度は、好ましくは約１時間ないし12時間、より好ましくは約１ないし６時間、そして最も好ましくは約１ないし３時間で折り畳みが完成に至るに十分でなければならない。酸素モルの添加は還元体濃度およびポリペプチド濃度に比例するが、銅またはマグネシウム塩濃度に反比例する。酸化の速度は酸素の添加速度ではなく触媒のレベルにより制限を受ける。大きな容量の折り畳みになる程大きな分散速度が必要となる。
この第二のインキュベーション時に起こる再折り畳みの程度は、該ポリペプチドのRIA力価により、または例えばヴィダックもしくはベイカーＣ−18カラムを用いるHPLC分析により、好適に測定することができ、増大するRIA力価または正しく折り畳まれたポリペプチドのピーク高は、緩衝液中に存在する正しい生物活性なポリペプチド配座異性体の増大する量と直接相関している。インキュベーションを実施して、RIAまたはHPLCにより測定される、正しく折り畳まれたポリペプチド配座異性体の収量および回収された誤って折り畳まれた配座異性体に対する正しく折り畳まれたポリペプチド配座異性体の比を最大とし、そして、物質収支により測定される、多量体の、会合したポリペプチドの収量を最少とする。
ポリペプチドが再折り畳みされた後は、以下の方法が、より高い純度を得るための好適な精製方法の例である：免疫親和またはイオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相HPLC;疎水性相互作用クロマトグラフィー；シリカまたはイオン交換樹脂、例えばＳ−セファロースおよびDEAE上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿；および例えばセファデックスＧ−75を用いるゲル濾過。
本発明は以下の実施例を参照することによりさらに詳細な理解がされるが、これらは本発明の範囲を限定するのではなく本発明の例示を意図するものである。全ての文献および特許の引用は、説明的に引用して本明細書の一部とするものである。
実施例Ｉ
A.  宿主細胞菌株37D6の組み立て。
本実施例に記載される発酵における組み替えヒトIGF−Ｉの産生に使用される宿主は、大腸菌W3110の誘導体であって、37D6と表示された。37D6の完全な遺伝子型は、tonA△  ptr3  phoA△E15  △rbs7  ilvG△（argF−lac）169  ompT△  degP41kanrである。遺伝子型tonA△  ptr3  phoA△E15  △（argF−lac）169  ompT△  degP41kanrを有する37D6の親菌株である菌株27C7の誘導は、1993年６月10日公開のWO93/11240に開示されており、その内容は引用して本明細書の一部とする。菌株27C7は1991年10月30日にATCC番号55244としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された。
菌株37D6は、rbs7の除去（リボース利用なし）および回復したilvG遺伝子座を有する以外は上記27C7と同じである。いずれのマーカーもP1形質導入によって導入することができる。
B.  IGF−Ｉ発現プラスミドpBKIGF2Bの説明／組み立て。
IGF−Ｉ発現プラスミドpBKIGF−2Bにおいて、大腸菌におけるIGF−Ｉ遺伝子の発現に必要な転写および翻訳配列は、アルカリホスファターゼプロモーターおよびtrpシャイン−ダルガルノ配列によって提供される。ラムダto転写ターミネーターは、IGF−Ｉ終止コドンに隣接して位置する。細胞質からの蛋白の分泌は、lamBシグナル配列により、またはこれに代わってSTIIシグナル配列により指令される。rhIGF−Ｉの大部分は細胞のペリプラズム空間に見いだされる。プラスミドpBKIGF−2Bは、形質転換された宿主にテトラサイクリン耐性を付与する。
プラスミドpBKIGF−2Bは、中間体プラスミドとしてpLS32Tsc、pLBIGFTsc、pLS33Tsc、およびpRanTscを使用して、幾つかの工程で組み立てられた。
工程1:pLS32Tsc。
分泌プラスミドpLS32TscはIGF−Ｉ遺伝子を含んでいる。大腸菌におけるIGF−Ｉ遺伝子の発現に必要な転写および翻訳配列は、アルカリホスファターゼプロモーターおよびtrpシャイン−ダルガルノ配列によって提供される。ラムダto転写ターミネーターは、IGF−Ｉ終止コドンに隣接して位置する。細胞質からの蛋白の分泌は、lamBシグナル配列により、またはこれに代わってSTIIシグナル配列により指令される。rhIGF−Ｉの大部分は細胞のペリプラズム空間に見いだされる。プラスミドpLS32Tscは、形質転換された宿主にテトラサイクリン耐性を付与する。
プラスミドpLS32Tscは、中間体プラスミドとしてpLS32、pAPlamB、pLS32lamB、pLS33lamB、およびpLS33Tscを使用して、上記WO93/11240に詳細に開示されるように、幾つかの工程で組み立てられた。
工程2:pLBIGFTsc。
工程a:pLamBIGF。
ライゲーションの第一部分のために、pBR322からのEcoR I−Pst Iベクターフラグメントを分離した。ライゲーションの第二部分のために、Pst I−Nco I1244bpフラグメントをpAPLamBから分離した。ライゲーションの第三部分のために、最初の5'末端以外のIGF−Ｉ遺伝子を含むHae II−EcoR I196bpフラグメントをプラスミドp200から分離した。p200は、5'から3'の順に、chelatinプロモーター、MFアルファＩプレプロシグナル配列、成熟IGF−ＩをコードしているDNA、および２ミクロンターミネーターを有する、pBR322から誘導されるプラスミドである。これは、細菌のためのColE1複製起点および酵母のための２ミクロン起点を含んでいる。p200の制限酵素プラスミド図を図１に供する。MFアルファＩプレプロおよびIGF−Ｉ遺伝子を含む、p200のEcoR I（1149位で始まる）からEcoR I（1628位で始まる）までのフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号１）を図２に提供する。やはり図２中の図にあるHae II、Pst I、BamH I、およびSal I制限部位を、下線を付すことにより配列中に示す。以下の配列：
0003646195.tif 000002
を有する、シグナル配列をIGF−Ｉ遺伝子に（Nco IからHae IIまで）連結する一片の合成DNAを作成した。三つのプラスミドフラグメントおよびこの合成DNAをライゲーションして、図３に示されるpLamBIGFを作成した。
工程b:pLBIGFTsc。
Xba I−BamH Iベクターフラグメントを第一のライゲーションフラグメントとしてpLS18から分離した。ライゲーションの第二の部分は上記のプラスミドpdH108−４からの412bpのStu I−BamH Iフラグメントであった。ライゲーションの第三の部分は、pLamBIGFをEcoR I消化し、その後DNAポリメラーゼクレノウフラグメントにより処理し、その後Xba I消化によって調製した。得られた302bpフラグメントを分離した。これら三つのフラグメントをライゲーションして、図４に示されるpLBIGFTscを生成した。
工程3:pRanTsc。
pLS18からのXba I−BamH Iベクターフラグメントを第一のライゲーションフラグメントとして分離した。ライゲーションの第二の部分は上記のプラスミドpdH108−４からの412bp  Stu I−BamH Iフラグメントであった。ライゲーションの第三の部分はpRANTESから調製した。pRANTESは、Xba Iリンカー、その後STIIシグナル、その後RANTESをコードしているcDNA［シャル等、J.Immunol.、141巻1018頁（1988）により公開されるとおり］、その後BamH Iリンカーを含んでいる、pBR322を基礎とするプラスミドである。第三のフラグメントは、pRANTESをBamH Iにより消化し、その後DNAポリメラーゼクレノウフラグメントにより処理し、その後Xba I消化によって調製した。得られた303bpフラグメントを分離した。これら三つのフラグメントをライゲーションして、図５に示されるpRamTscを生成した。
工程4:pBKIGF−２。
図６に示されるように、アルカリホスファターゼプロモーター、lamBシグナル配列、およびIGF−Ｉの最初の15のアミノ酸をコードしているDNAを含むEcoR I−Pst I  540bpフラグメントをpLS32Tscから切り取った。IGF−Ｉのアミノ酸16−38をコードしているDNAを含むPst−Bsp1286Iフラグメント（〜70bp）をpLBIGFTscから切り取った。IGF−Ｉのアミノ酸39−70をコードしているDNA、ラムダターミネーター、およびTcプロモーターを含むBsp1286I−Hind III（〜179bp）フラグメントをpLS33Tscから切り取った。最後に、EcoR I−Hind III〜4331bpベクターフラグメント（pBR322を基礎とする）をpRanTscから切り取った。これら四つのフラグメントをライゲーションするとpBKIGF−２が得られ、これは、APプロモーター、lamBシグナル配列、IGF−Ｉ蛋白全体をコードしているDNA、転写ターミネーター、Tcプロモーター、ならびにテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性マーカーを含む。
工程5:pBKIGF−2A。
pBKIGF−２をPst IおよびCla Iで消化して〜245bpフラグメントを分離した。これはIGF−Ｉのアミノ酸16−70およびラムダtoターミネーターを含んでいる。pLBIGFTscをNco IおよびCla Iで消化してベクターフラグメントを分離した。このベクターフラグメントは、APプロモーター、lamBシグナル、およびTetr遺伝子を含んでいる。これら二つのフラグメントを、IGF−Ｉ  DNAのNco IからPst Iまでの5'末端を、合成により誘導される以下のようなコドン：
0003646195.tif 000003
に置き換えている一片の合成DNAにライゲーションした。得られたプラスミドをpBKIGF−2Aと名付けた。組み立てを図７に示す。
工程6:pLamBRan。
pLS33LamBをNco IおよびBamH Iで消化することによりこのプラスミドを調製し、ベクターフラグメントを分離した。pLS33LamBはpBR322から作成されるプラスミドであり、この中にAPプロモーター、lamBシグナル、およびIGF−Ｉ遺伝子が挿入されている。BamH IはプラスミドのTc部分を切り、Nco IはIGF−Ｉ遺伝子の5'末端を切る。第二のフラグメントは、pRANTESをBsaJ IおよびBamH Iで消化し得られた〜200bpフラグメントを分離することにより作成した。第三のフラグメントは、RANTES遺伝子をNco IからBsaJ Iまでのシグナル配列に連結するための一片の合成DNAであった。この合成DNAは、配列：
0003646195.tif 000004
を有する。得られたベクターをpLamBRanと名付け、その組み立てを図８に示す。
工程7:pBKIGF−2B。
このプラスミドの組み立てを図９に示す。pLamBRanをNco IおよびSph Iで消化し、プロモーターおよびシグナル配列を含むベクターフラグメントを分離した。pBKIGF−２をDde IおよびSph Iで消化し、ラムダ転写ターミネーターおよびTetR遺伝子の5'末端を含む〜600bpフラグメントを分離した。pBKIGF−2AをNco IおよびBsp1286Iで消化し、IGF−Ｉのアミノ酸１−38をコードしているDNAを含む〜110bpフラグメントを分離した。これら三つのフラグメントをIGF−Ｉのアミノ酸39−70をコードしている合成DNAとライゲーションしてpBKIGF−2Bを得た。この合成リンカーは、配列：
0003646195.tif 000005
0003646195.tif 000006
C.  発酵および回収方法。
i.形質転換。
コンピテントなE.coli  27C7細胞を標準的形質転換技術によりpBKIGF−2Bを用いて形質転換した。形質転換体を選択し、テトラサイクリン20mg/Lを含有するLB平板上で精製した。この培地は以下の組成を有していた：バクト−トリプトン10g/L、酵母抽出液5g/L、塩化ナトリウム10g/L、およびテトラサイクリン−HCl  20mg/L。
ii.発酵イノキュラム。
最初に、テトラサイクリンを含有する滅菌LB培地およそ500mLを入れた２リットルの振盪フラスコに、新たに融解した１−2mLの上記培養バイアルを接種することにより、10L発酵槽のイノキュラムを調製した。このフラスコを35−39℃で８時間インキュベートし、この実施例のＣ項に記載の範囲の生産培地を入れた10リットル発酵槽に移した。この10リットル発酵槽イノキュラムを35−39℃、pH7.1−7.5で６−12時間インキュベートした。攪拌速度は650−1000rpm、通気速度は１分当たり培地の容量当たり0.7−1.5容量の空気に設定した。次いでこのイノキュラムを無菌的に1000L発酵容器に移し、ここにグルコースを底から導入する。
この10Lイノキュラムを500mL振盪フラスコの培養と同様に、指数的成長相の中央まで増殖した（バッチ培養）。グルコースは全て発酵開始時に10L発酵槽に添加した。1000L発酵槽のみにグルコースのフィーデングを採用した。
iii.発酵方法。
1000L容器には最初、以下の組成の発酵培地600−800リットルを入れた：
0003646195.tif 000007
この発酵法は35−39℃、pH7.1−7.5で24−48時間実施した。攪拌速度は200rpm、そして通気速度は１分当たり培地の容量当たり0.7−1.5容量の空気に設定した。IGF−Ｉの産生は、培地の燐酸塩が涸渇した後に起こった。この方法は、およそ18％の充填細胞量および、主としてペリプラズム空間にあり、細胞外の培地では低いレベルであった、3g/L以上のIGF−Ｉを含有する発酵ブロスをもたらした。
D.  インサイトゥ可溶化。
発酵の終点で、温度を除く全ての供給および制御装置を止めた。温度制御は37℃に維持した。分散を止め、発酵槽の背圧を解放した。排水してブロスの容量を1200Lとし、攪拌を200rpmから150rpmに下げた。次に、分散のラインおよび発酵槽の頭隙に、最初は150Lpmの速度で１分間、次いで操作の残りの時間50Lpmで気体窒素を流した。次いで、尿素174kgを含むスラリー220Lを発酵槽中に速やかにポンプで注入し、その後直ちにpHを10.0に調節するに十分なおよび8Lの50％（w/w）水酸化ナトリウムを加えた。次にジチオトレイトール2.9kgを含有する溶液20Lを加え、さらにおよそ3Lの50％水酸化ナトリウムによってpHを10.0に再調節した。このバッチを攪拌しつつ37℃で60分間維持し、その後これを22℃まで冷却し、水性二相抽出のために保持タンクに移した。逆相HPLCによる検定は、IGF−Ｉの最初の力価が3.8g/L、そして可溶化後にIGF−Ｉが細胞から定量的に放出されることを示した。
E.  水性二相液−液抽出。
バッチの温度を22℃に維持し、タンクの頭隙に窒素を流した。1450Lの容量を有する処理済みブロスに、PEG−8000  250kgおよび硫酸ナトリウム90kgを加えた。このバッチをおよそ40分間攪拌した。遠心および試料の分析は、相−容量比（Kv）が2.6で安定化し、IGF−Ｉの分配係数（Kc）が8.5であることを示した。バッチをウェストファリアSB−７分離機を用いて分離すると、およそ1300Lの軽い相および550Lの重い相が得られた。逆相HPLCによる分析は、分離された軽い相が、最初の処理済みブロス1450L中のIGF−Ｉのおよそ88％を含むことを示した。軽い相を窒素下に保持し、重い相は廃棄した。
F.  IGF−Ｉの沈殿化。
2M燐酸およそ36Lを軽い相に加えて22℃でpHを7.0に調節した。このバッチを穏やかに攪拌しながらおよそ８時間維持すると、この時点で逆相HPLCによる検定はおよそ96％のIGF−Ｉが沈殿したことを示した。次にペレットをウェストファリアSB−７清澄器を用いて集めた。ペレットスラリーの質量はおよそ88kgであった。
G.  再折り畳み。
質量17.6kgを有するペレットスラリーのアリコートを、最終濃度を2Mとするに十分な固体尿素を添加し、濃度を10mMとするに十分なジチオトレイトールを添加し、そして50％（w/w）水酸化ナトリウムでpHを10.0に調節することによって溶解した。次にこれを、2M尿素、1M塩化ナトリウム、19％（v/v）エタノール、20mMグリシン、0.5μＭ銅、pH10.5の組成を有する折り畳み緩衝液700Lに添加した。次いでジチオトレイトールの最終濃度を1mMに調節した。22℃で穏やかに混合しながら気体酸素を280mL/分で分散させることにより、折り畳みを実施した。折り畳みの進行を逆相HPLCによって監視した。折り畳みの開始時、中程、そして終わった後に測定された代表的逆相HPLCクロマトグラムを図10に示す。およそ３時間後、酸素の分散の停止と、およそ1.6Lの燐酸試薬でバッチをpH3.5に滴定することによって、折り畳みを終止させた。逆相HPLCによる検定は、折り畳みの収率が50％であることを示した。
実施例II
宿主の組み立て、プラスミドの組み立て、および発酵を、実施例Ｉ、Ａ−Ｃ項に記載のように実施した。DTTを使用する代わりに最終濃度を50mMとするに十分なＬ−システイン（およそ8.8kg）を添加することによりブロスを還元する外は、実施例Ｉ、Ｄ項に記載のようにインサイトゥ可溶化を実施した。可溶化の終わりに、逆相HPLCによる検定は、IGF−Ｉの93％が細胞から放出されていることを示した。
その後の単離は、規模を縮小した実施例Ｉ、Ｅ−Ｇ項に記載の操作により実施した。
実施例III
実施例Ｉ、Ａ−Ｄ項に記載の宿主、プラスミド、発酵、およびインサイトゥ可溶化法を用いて、非天然IGF−Ｉを製造した。
水性二相系を以下の方法を用いて作成した：（１）相形成物質を15mlの目盛り付きポリスチレン培養管に入れた；（２）インサイトゥ可溶化からの全抽出液のうち7mLを加え、内容物を混合し、頭隙に窒素を流した；（３）組成物を室温または37℃のいずれかで、よく混合しながら２時間インキュベートした。ポリマーは保存溶液（50％w/wPEG  Mr3350ポリマー、50％w/wPEG  Mr8000ポリマー、および100％w/wダウ・ポリグリコール15−200（商標）ブランドのポリマー）から加え、一方、塩は乾燥化学物質として加えた。成分を添加して、抽出液全体が1g/mLの密度を有すると想定しながら、予め定められた組成を重量対重量に基づいて達成した。
25℃または37℃のいずれかで約1300g、20分間遠心することにより、相を分離した。上相中のIGF−Ｉの濃度を逆相HPLC分析により測定した。下相中のIGF−Ｉの濃度は物質収支の仮定を用いて算出した。
相形成ポリマーの濃度および型、相形成塩の濃度および型、非相形成塩の濃度および型、ならびに温度を変えて、三つの実験を行った。得られた系は、目視により、列挙される五つの範疇のうちの一つに属すると性格付けられる：（１）一相系、（２）固体が下相に沈降している二相系、（３）若干の固体が下相に浮遊している二相系、（４）固体が上相にも下相にも全体に分配している二相系、および（５）固体が上相に分配している二相系。
図11に示されるプロットは、全抽出液のみ、PEG−8000、およびNa2SO4より成る系についての、この、系の組成および性質の間の関係を図示している。このプロットにおいて、「浮遊する固体を有する二相系」とは、固体が下相に沈降しない全ての二相系を示す。さらにこのプロットは、固体の容量を収容するのにちょうど十分な大きさの下相に固体が沈降している系を描写する限界を示している。固体が下相に沈降し、その下相の容量が固体を収容するに十分であり、且つ相容量比が約１より大である最も好ましい系、陰を付した領域内に入っている。
これら三つの実験はさらに、第Ｉ表に示されるように、相異なる水性二相系を定量的に比較できるようなデータを提供した。誤差を減らし、与えられた変化の影響をより明確にするため、容量比および分配係数のデータを、示されるように幾つかの異なった系について平均した。この分析から得られる結果は幾つかの傾向を示している。ポリマーPEG−8KおよびPEG−4K（それぞれ8000および3350のMr値を有する）は、非天然IGF−Ｉが同じように分配する類似の容量比を有する系を形成する。調査された相系にNaClを含めると、容量比は影響を受けないがIGF−Ｉの分配係数は低下する。ランダムポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールコポリマーダウ・ポリグリコール15−200（商標）ブランドのポリマー（Mr〜2500）の添加は容量比または分配係数を変化させない。PEG−8000およびNa2SO4系に相形成塩クエン酸塩を含めると、二節曲線の位置が変わるが、IGF−Ｉの分配には影響しない。37℃での水性二相抽出の実施は、25℃に比べて容量比および分配係数を低下させる。
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実施例IV
実施例Ｉ、Ａ−Ｄ項に記載の宿主、プラスミド、発酵、およびインサイトゥ可溶化法を用いて非天然IGF−Ｉを製造した。
保存溶液としてではなく乾燥形態でPEG−8000を添加する以外は実施例IIIに記載のようにして水性二相系を作成した。上相および下の液相中のIGF−Ｉの濃度を逆相HPLC分析によって測定した。下の液相は、残留する懸濁した固体を除去するため、分析の前に0.2μｍの濾過に付した。
水性二相系中の非天然IGF−Ｉの分配係数の直接測定結果を第II表に示す。５％（w/w）Na2SO4、14％（w/w）PEG−8000の条件では、分配係数は９ないし10の大きさを有する。塩濃度を１％（w/w）、またはポリマー濃度を２％（w/w）上げると、この大きさが二倍となる。塩およびポリマー濃度を組み合わせて増大させると４倍の増大となり、40近い値となる。この後者の組み合わせは、浮遊する固体のある二相系の形成をもたらす。
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数値は上から下へそれぞれ、IGF−Ｉ分配係数（測定値）、相容量比、および上相中の可溶性の全抽出液IGF−Ｉの質量パーセンテージを示す。
実施例Ｖ
実施例Ｉ、Ａ−Ｅ項に記載の発酵、インサイトゥ可溶化、および水性二相抽出法を用いて、非天然IGF−Ｉを製造した。IGF−Ｉ沈殿のために、軽い相の一部を幾つかのアリコートに分け、次いでこれらを以下の酸のうちの一つを用いておよそpH6に滴定した:2N燐酸、2N酢酸、2N硫酸、2N塩酸、2Nクエン酸、または2N硝酸。次いでこのアリコートをおよそ5000xgで15分間、簡単に遠心し、上清の液体を傾瀉した。逆相HPLCによる検定は、全ての場合において少なくとも93％の出発IGF−Ｉがペレット中に回収されていることを示した。これに続くペレットの蛋白折り畳みを、実施例Ｉ、Ｇ項に記載の方法の規模を小さくして実施した。
実施例VI
実施例Ｉ、Ａ−Ｅ項に記載の発酵、インサイトゥ可溶化、および水性二相抽出法を用いて、非天然IGF−Ｉを製造した。
実施例ＩのＥ項から得た軽い相の試料を幾つかのより小さいアリコートに分け、2M硫酸を用いてこれらのアリコートをpH10、4.5、4.0、3.5、または3.0のいずれかに滴定することにより、酸沈殿化を開始させた。次にこれら五つの保存液をさらに５個のアリコートに分け、それらに、最終濃度３、４、５、６、または７％（重量）を与えるに十分な固体硫酸ナトリウムを加えた。試料を穏やかに混合しながら25℃で２時間インキュベートした。次いで相をおよそ5000xgで20分間遠心した後に分離した。両方の相のIGF−Ｉの濃度を逆相HPLCにより検定した。
pH10の硫酸ナトリウムの全レベルについて、95％以上のIGF−Ｉが上相に残っていた。他の全てのpH（4.5ないし3.0）における全ての試料について、98％以上のIGF−Ｉが下相に回収された。
実施例VII
実施例Ｉ、Ａ−Ｇ項に記載の発酵、インサイトゥ可溶化、水性二相抽出、および中和沈殿法を用いて、非天然IGF−Ｉを製造した。
中和沈殿により得られたIGF−Ｉペレットから、還元されたIGF−Ｉを含有する懸濁液を調製した。この懸濁液を生成させるため、IGF−Ｉを含有する湿潤ペレット30gを、20mMグリシン（pH10.5）、2M尿素、および10mM  DTTを含有する溶液に再懸濁して最終容量を100mLとした。得られた懸濁液のpHを、NaOHおよびHClを必要量添加することによりpH10.5に調節した。この懸濁液の逆相HPLC分析は、これが35mg/mLのIGF−Ｉを含有することを示した。
15mLポリスチレン培養管に以下の保存溶液の適当量を加えることにより、再折り畳み緩衝液を調製した:1Mグリシン（pH10.5）および25μＭ  CuCl2、9M尿素、100％エタノール、1.8M  Na2SO4、20％（v/v）PEG−3350、および20％（v/v）PEG−8000。各管に、グリシンおよびCuCl2を含有する50X緩衝液の保存溶液0.1mLを加えた。他の保存溶液は、最終容量5mLにおいて示された濃度を有するように添加した。再折り畳み緩衝液構成成分の入った各管を最終容量4mLとした。
還元されたIGF−Ｉ懸濁液1mLを前もって作成した再折り畳み緩衝液中に希釈して7mg/mLの始発IGF−Ｉ濃度を与えるようにすることにより、IGF−Ｉの再折り畳みを開始した。管に蓋をし、軌道振盪機上で水平に振盪した。各管には液体5mLおよび空気10mLを入れた。再折り畳みを３時間起こさせ、その後試料を集め、20mMグリシン（pH3）、2M尿素を含有する酸性化された緩衝液中に係数10で希釈し、逆相HPLCにより分析して正しく折り畳まれたIGF−Ｉの含有量を決定した。
この実施例の目的は、再折り畳み中に得られる正しく折り畳まれたIGF−Ｉの収率に及ぼす水性相形成成分の効果を示すことである。研究された個々の相形成成分は、Na2SO4、PEG−3350、PEG−8000、およびエタノールであった。調査された濃度は、分離された水相を係数10ないし15で希釈することにより生成され得る濃度と合致した。
第III表に示される結果は、正しく折り畳まれたIGF−Ｉの収率は、相形成成分エタノールおよびNa2SO4の存在下でIGF−Ｉを再折り畳みすることによって増大することを示している。IGF−Ｉの収率は、相形成成分PEG−3350またはPEG−8000の存在による影響を受けない。
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実施例VIII
実施例Ｉ、Ａ−Ｇ項に記載の発酵、インサイトゥ可溶化、水性二相抽出、および中和沈殿法を用いて、非天然IGF−Ｉを製造した。
中和沈殿により得られたIGF−Ｉペレットから、還元されたIGF−Ｉを含有する懸濁液を調製した。この懸濁液を生成させるため、IGF−Ｉを含有する湿潤ペレット10gを、20mMグリシン（pH10.5）、2M尿素、および10mM  DTTを含有する溶液45mLに再懸濁した。得られた懸濁液のpHを、NaOHを必要量添加することによりpH10.5に調節した。このpH調節された懸濁液の逆相HPLC分析は、これが15mg/mLのIGF−Ｉを含有することを示した。pH調節された懸濁液に、濃縮されたDTT溶液を加えて、DTT最終濃度15mMを得た。得られた還元されたIGF−Ｉ懸濁液は、15mg/mL  IGF−Ｉ、20mMグリシン（pH10.5）、2M尿素、および15mM  DTTを含んでいた。
15mLポリスチレン培養管に適当量の様々な保存溶液および乾燥化学物質を加えることにより、再折り畳み緩衝液を作成した。各管に、1Mグリシン（pH10.5）、および25μＭ  CuCl2を含有する50X緩衝液の保存溶液0.1mLを入れた。最終容量5mLにおいて、指示された濃度を有するよう、他の化学物質の適当量を添加した。エタノールおよびグリセロールは液体として加えた。尿素、NaCl、およびNa2SO4は乾燥形態で加えた。再折り畳みを1mg/mL  IGF−Ｉで行うのか、または4mg/mL  IGF−Ｉで行うのかに応じて、再折り畳み緩衝液成分の入った各管をそれぞれ最終容量4.7または3.7mLとした。
それぞれ１または4mg/mL  IGF−Ｉでの再折り畳みのために、還元されたIGF−Ｉ懸濁液0.3または1.3mLを、前もって作成した再折り畳み緩衝液中に希釈することにより、IGF−Ｉの再折り畳みを開始した。管に蓋をし、軌道振盪機上で水平に振盪した。各管には液体5mLおよび空気10mLを入れた。再折り畳みを８時間起こさせ、その後試料を集め、酸性化し、逆相HPLCにより分析して正しく折り畳まれたIGF−Ｉの含有量を決定した。
再折り畳み緩衝液構成成分の以下の側面を研究した：塩の型および濃度（０、0.5、1.0M  NaCl;または０、0.2、0.6M  Na2SO4）、カオトロープ濃度（１、２、3M尿素）、溶媒濃度（０、10、20％v/vエタノール）、オスモライト濃度（０、20、30％v/vグリセロール）、および始発IGF−Ｉ濃度（１、4mg/mL）。これらの構成成分の選ばれた組み合わせを用いて得られた収率を第IV表に示す。検分したところでは、正しく折り畳まれたIGF−Ｉの最高収率は以下の条件での再折り畳みにより得られた:1mg/mL  IGF−Ｉ、20mMグリシン（pH10.5）、2M尿素、1M  NaCl、20％（v/v）エタノール、および0.5μＭ  CuCl2（試料＃０）。
この実施例に記載される実験を、全ての単一因子および全ての二因子相互作用の重要性を評価するために、正しく折り畳まれたIGF−Ｉ収率データの多因子統計学的解析ができるよう設計した。この統計学的解析からの結果を第Ｖ表およびVI表に示す。これらの結果の検分は、使用された実験条件の下で以下の傾向が明らかとなったことを示す：（１）最良の収率は、低いIGF−Ｉ濃度での再折り畳みによって得られる；（２）約1Mの濃度で塩を含有させることは、特にエタノールの存在下での再折り畳み収率を改善する；（３）NaClはNa2SO4より好ましい塩である；（４）２−3Mの尿素を用いると、より低い尿素濃度と比較してより良い収率が得られるが、この相違はエタノールの存在下では縮小する；（５）溶媒の不在下に比較して20％（v/v）エタノールの存在下では、向上した収率が得られる；そして（６）グリセロールの含有は収率を改善するが、この利点はエタノールの存在下で低減する。
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実施例IX
高度に精製された正しく折り畳まれたIGF−Ｉから、還元されたIGF−Ｉ保存溶液を調製した。1mg/mL  IGF−Ｉ、20mMグリシン（pH10.5）、2mMクエン酸塩、0.1M  NaCl、および2M尿素を含有する溶液を栓付きバイアルに入れ、時々攪拌しながら頭隙に加湿アルゴンガスを約１時間流した。溶液を脱酸素した後、DTTを117mM保存溶液から注射筒を介して加え、最終濃度1.17mMとした。DTT添加の後、この溶液を頭隙にアルゴンを連続して流しながら２時間インキュベートした。
再折り畳み溶液は、20mMグリシン（pH10.5）、0.1M  NaCl、および2M尿素を含有する通常の緩衝液の保存溶液から調製した。この緩衝液の保存溶液をバイアルに分注し、CuCl2、NiCl2、ZnCl2、CoCl2、MnCl2、およびFeCl3を1.3mM保存溶液から別々に加えた。得られた溶液を入れたバイアルに栓をし、この溶液を、加湿アルゴンまたは酸素のいずれかに連続して分散させた。
再折り畳み反応を開始するために、還元されたIGF−Ｉ保存溶液のアリコートを係数10で再折り畳み溶液中に速やかに希釈した。還元されたIGF−Ｉ保存溶液を注射筒を介して移し、再折り畳みを開始させた。対照の再折り畳み反応（遷移金属塩を欠く）および被験再折り畳み反応は同時に実施し、共通の気体供給源を用いた。
18分間の酸化の後に再折り畳み反応から注射筒によって試料を採取し、少量の6N  HClを入れた、隔膜で覆われたマイクロバイアルに速やかに添加した。IGF−Ｉ再折り畳みの程度を、逆相HPLCによる試料の分析によって決定した。
第VII表に示されるように、還元されたIGF−ＩをCuCl2またはMnCl2いずれかの存在下で酸素に暴露すると、還元されたIGF−Ｉの酸化および正しく折り畳まれたIGF−Ｉの形成の両方がもたらされた。CoCl2の存在は還元されたIGF−Ｉの酸化につながったが、正しく折り畳まれたIGF−Ｉの形成はより少なかった。NiCl2およびFeCl3はいずれも、還元されたIGF−Ｉの酸化および正しく折り畳まれたIGF−Ｉの形成がさらに少なかった。ZnCl2に対する応答は微量元素に対する応答と変わらなかった。
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実施例Ｘ
実施例IXに記載のようにして、高度に精製された正しく折り畳まれたIGF−Ｉから、還元されたIGF−Ｉ保存溶液を調製した。
20mMグリシン（pH10.5）、0.1M  NaCl、および2M尿素を含有する一般的緩衝液の保存溶液から、再折り畳み溶液を調製した。この緩衝液の保存溶液をバイアルに分注し、必要に応じてCuCl2を、前もって連続希釈により調製しておいた1.3、0.13、0.013、および0.0013mM保存溶液から添加した。CuCl2を添加した後、バイアルに栓をし、液体に、加湿アルゴンまたは酸素のいずれかを連続的に分散させた。
再折り畳み反応を開始するため、還元されたIGF−Ｉ保存溶液のアリコートを再折り畳み溶液中に係数10で速やかに希釈した。還元されたIGF−Ｉ保存溶液を注射筒を介して移し、再折り畳みを開始させた。対照の再折り畳み反応（CuCl2を欠く）および被験折り畳み反応は同時に実施し、共通の気体供給源を用いた。
予め定められた間隔で再折り畳み反応から注射筒によって試料を採取し、少量の6N  HClの入った、隔膜で覆われたマイクロバイアルに速やかに添加した。この処理は試料のpHをpH3に下げ、再折り畳み反応を効果的に停止させる。試料を集め、再折り畳み開始後以下の時点で反応停止させた:0、２、４、６、10、20、40、60、100、および200分。時間に伴うIGF−Ｉ再折り畳みの程度を、逆相HPLCによる時間経過に伴う試料の分析によって決定した。
以下のCuCl2の濃度を調べた：痕跡量、0.013μＭ、0.052μＭ、0.13μＭ、0.52μＭ、1.3μＭ、5.2μＭ、および13μＭ  CuCl2。これらのCuCl2濃度における好気的酸化触媒反応中の正しく折り畳まれたIGF−Ｉの発生のプロットを図12に示す。
結果は、好気的酸化触媒反応中は、低いCuCl2濃度（約0.05μＭおよぴ15μＭの間、好ましくは0.05および0.5μＭの間）は、より高い濃度（約15μＭより高い）よりも高収率の正しく折り畳まれたポリペプチドを提供し、そして、微量元素触媒作用よりも迅速且つ再現性のある酸化速度を提供することを示している。
図12に示される結果は、アルコール性または極性非プロトン性溶媒を欠く溶液中でIGF−Ｉを再折り畳みすることによって得られた。さらなる実験は、再折り畳み緩衝液にアルコールが含まれることは、CuCl2濃度に対するIGF−Ｉ再折り畳み速度および収率の依存性に影響を及ぼさず、また、他の遷移金属の濃度に対する依存性に影響を及ぼすとは予想されないことを示した。実験はさらに、1.3μＭ  CuCl2を含有する再折り畳み溶液中にEDTA（CuCl2に対して1:1のモル比）またはｏ−フェナントロリン（CuCl2に対して3:1のモル比）が含まれることは、CuCl2により触媒される好気的IGF−Ｉ酸化の速度に影響を及ぼさないことを示した。
実施例XI
発酵。
hGHの発現および分泌のために用いられる発現プラスミドphGH4Rの組み立ては、チャング等、Gene、55巻189−196頁（1987）に詳説される。
大腸菌菌株40G3はE.coli  W3110の誘導体である。40G3の完全な遺伝子型は、tonA△  phoA△E15  △（argF−lac）169  deoC  △ompT  degP41（△PstI−kanr）ilvG2096R  phn（EcoB）である。菌株40G3は、遺伝子型tonA△  phoA△E15  △（argF−lac）169deoCを有するE.coli  W3110菌株16C9から誘導することができる。ompT除去はpurE遺伝子における連鎖したTn10挿入とのP1同時形質導入によって導入した。この菌株をプリンプロトトロフィーに形質導入してトランスポゾンを除去した。カナマイシン耐性について選択することにより、degP41  （△Pst I−kanr）突然変異を導入した。P1形質導入を用いてイソロイシン／バリン栄養要求性突然変異体をプロトトロフィーと修復することにより、ilvG2096R遺伝子を導入した。最後に、E.coli  phn遺伝子のP1形質導入によって、phn（EcoB）オペロンを宿主に導入した。
コンピテントなE.coli  40G3細胞を標準的形質転換技術によってphGH4Rで形質転換した。形質転換体を、20mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB平板上で選択し精製した。この培地は以下の組成を有していた:10g/Lバクト−トリプトン、5g/L酵母抽出液、10g/L塩化ナトリウム、および20mg/Lテトラサイクリン−HCl。
まず、5mg/Lテトラサイクリンを含有するおよそ500mLの滅菌LB培地を入れた２リットル振盪フラスコに、新たに融解した保存培養0.5mLを接種することにより、10L発酵槽イノキュラムを調製した。このフラスコを35−39℃で８時間インキュベートし、下記の範囲の生産培地を入れた10リットル発酵槽に移した。
0003646195.tif 000016
10リットルの培養を35−39℃、pH7.2−7.4で42−48時間増殖させた。攪拌速度は650−1000rpm、そして通気速度は１分当たり培地の容量当たり0.7−1.5容量の空気に設定した。
この10L培養は、発酵中絶えずグルコースを供給しながら増殖させた。hGHの産生は、培地中の燐酸塩が涸渇した後に起こった。
ヒト成長ホルモンの可溶化および水性抽出。
2Lの瓶に入れた発酵ブロス1Lに、尿素240g、1Mグリシン（pH10）20mL、および1Mジチオトレイトール（DTT）10mLを加えることにより、上の発酵ブロスからのhGHを可溶化した。得られた混合物のpHを1N  NaOHの添加によりpH10に調節した。インキュベーションの間この混合物は、水中のモーターで駆動する回転翼で絶えず攪拌し、頭隙に窒素を流した。２時間のインキュベーションの後、アリコートを採取し、遠心して、固体を沈降させ、上清をhGH含有量について検定した。逆相HPLC分析は、総hGHの31％が遠心上清にあることを示した。
次に、可溶化混合物にPEG−8000  308gおよびNa2SO4103gを加えることにより、hGHを抽出した。得られた相系を、連続攪拌および窒素通気をしながらさらに１時間インキュベートした。この相系の遠心したアリコート14.5mLを検分すると、これが透明な軽い相11.2mLおよび固体を含む重い相3.3mLを含むことがわかった。インキュベーションの後、この相系を２個の1L遠心瓶に分け、遠心して相を分離した。分離した相を傾瀉すると1.2Lの透明な軽い相が得られた。逆相HPLC分析は、この軽い相が、可溶化上清に含まれるhGHの82％を含むことを示した。
pH4に調節することにより、分離された軽い相からhGHを沈殿させた。沈殿懸濁液の一つのアリコートを、蓋付きの15mLの管に入れ、遠心により透明にした。遠心後、透明な上清を新しい管に傾瀉し、ペレットを2.5mLの6Mグアニジン−HCl、50mMトリス−HCl（pH9）、0.1M  DTTに再懸濁した。逆相HPLC分析は、再懸濁されたペレットは最初軽い相に含まれていたhGHの92％を含み、上清は１％未満を含むことを示した。
ヒト成長ホルモンの再折り畳み。
上に記載の可溶化および水性抽出法を用いて非天然hGHを含む軽い相を調製した。15mLのポリスチレン培養管に以下の乾燥化学物質の適量を加えることにより、再折り畳み緩衝液を調製した：尿素、グアニジン−HCl、NaCl、Na2SO4、および試薬級エタノール。各管に、1Mトリス−HCl（pH8）、25μＭ  CuCl2または1Mグリシン（pH10）、25μＭ  CuCl2のいずれかを含有する50X緩衝液保存溶液0.1mLを入れた。他の化学物質は、最終容量5mLにおいて指示された濃度を有するように加えた。再折り畳み緩衝液成分の入ったそれぞれの管を精製水で最終容量4.5mLとした。
還元されたhGHを含有する軽い相0.5mLを、約0.05mg/mLの始発hGH濃度を与えるよう、前もって調製された再折り畳み緩衝液中に希釈することにより、hGH再折り畳みを開始した。管に蓋をし、軌道振盪機上で水平に振盪した。各管には液体5mLおよび空気10mLを入れた。再折り畳みを12時間起こさせ、その後試料を集め、50mM酢酸（pH3）、50mM  NaClを含有する酸性化された緩衝液中に係数２で希釈し、逆相HPLCにより分析して正しく折り畳まれたhGHの含有量を決定した。
この実験の目的は、再折り畳み中に得られる正しく折り畳まれたhGHの収率に及ぼす再折り畳み緩衝液構成成分の効果を示すことである。再折り畳み緩衝液構成成分の以下の側面を研究した：塩の型および濃度（0.2M  Na2SO4、0.5M  NaCl）、カオトロープの型および濃度（0.5、4M尿素；または0.5、2Mグアニジン−HCl）、溶媒濃度（０、10％［v/v］エタノール）、および緩衝液の型およびpH（トリスHCl  pH8、グリシンpH10）。これらの構成成分の選ばれた組み合わせを用いて得られた収率を第VIII表に示す。検分したところでは、正しく折り畳まれたhGHの最高収率は以下の条件での再折り畳みにより得られた:20mMグリシン（pH10）、0.5Mグアニジン、0.5M  NaCl、10％（v/v）エタノール、および0.5μＭ  CuCl2（試料＃５）。
0003646195.tif 000017
この実施例に記載される実験を、全ての単一因子の重要性を評価するために、正しく折り畳まれたhGH収率データの多因子統計学的解析ができるよう設計した。この統計学的解析からの結果を第IX表に示す。
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上の結果は、組み替えhGHは、アルカリ性発酵ブロスにカオトロープおよび還元体を添加することにより、可溶化された細胞から分泌され得ることを示している（平均して約30％の収率）。可溶化剤の添加前に細胞を溶菌するならば、可溶化に際してより高い収率を得ることができる（約50％の収率の改善）。可溶化中のその他の小さな相違には、尿素よりグアニジンを用いた場合の収率が高い事（約10％の収率の改善）、そして、低いカオトロープ濃度より中等度のカオトロープ濃度を用いた場合の収率が高い事（2Mではなく4Mを使用することによる約20％の収率の改善）が包含される。
バイオマスからの非天然hGHの分離中の水性抽出法は、バイオマスからの非天然IGF−Ｉの分離中の水性抽出法と事実上等しく挙動した。唯一の注目すべき違いは、抽出中、より高いカオトロープ濃度が多少好ましいという事を包含している（2Mではなく4Mの尿素を使用することによる約５％の収率の改善）。抽出中、より高いカオトロープ濃度を含むことは、所望の非天然ポリペプチドが軽い相に多く、バイオマス固体が重い相に沈降する二相系の生成に必要なポリマーおよび塩の濃度に有意な影響を及ぼさなかった。同様に、可溶化前の細胞の機械的溶菌は水性抽出の挙動に影響しなかった。
ひとまとめに考えると、これらの相違は一般に、より大きな蛋白hGHは、より小さな蛋白IGF−Ｉよりも、可溶化のために、より強い変性を行うカオトロピック条件を好み、そして透過性を上げた細胞からの分泌が、より容易でないという事を示している。
結論として、hGHについて上に記載された結果は、この特許請求された方法が、IGF−Ｉと同様非天然hGHの分離にも適用し得ることを明白に示すものである。IGF−ＩおよびhGHはそれらの性質の多くが有意に異なっていることから、実質上異なった蛋白である。詳細には、これらは異なったアミノ酸配列、異なった分子量、異なった数およびパターンのジスルフィド結合、ならびに異なった等電点を有している。これらの相違にも拘わらず、IGF−ＩおよびhGHは、本発明に係る方法によるバイオマス固体からの抽出的分離中には、極めて類似の挙動を示す。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：
（Ａ）ジェネンテク，インコーポレイテッド
ビルダー，スチュアート
ハート，ロジャー
レスター，フィリップ
オーゲズ，ジョン
レイフスナイダー，デイビッド
（ii）発明の名称：ポリペプチドの水性多相単離
（iii）配列の数:9
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：ジェネンテク，インコーポレイテッド
（Ｂ）通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバード460番
（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ZIP:94080
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型:5.25インチ,360Kbフロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM  PC適合
（Ｃ）オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウエア:patin（ジェネンテク）
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号:08/110663
（Ｂ）出願日:1993年８月20日
（viii）弁護士／代理人情報：
（Ａ）氏名：ハサック，ジャネット・イー
（Ｂ）登録番号:28,616
（Ｃ）参照／整理番号:828P1PCT
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号:415/225−1896
（Ｂ）ファックス番号:415/952−9881
（Ｃ）テレックス:910/371−7168
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:485塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号1:
0003646195.tif 000019
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号2:
0003646195.tif 000020
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号3:
0003646195.tif 000021
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:51塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号4:
0003646195.tif 000022
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:43塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号5:
0003646195.tif 000023
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号6:
0003646195.tif 000024
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:18塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号7:
0003646195.tif 000025
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:67塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号8:
0003646195.tif 000026
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（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:70塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号9:
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【図１】
0003646195.tif 000029
【図２】
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【図３】
0003646195.tif 000031
【図４】
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【図５】
0003646195.tif 000033
【図６】
0003646195.tif 000034
【図７】
0003646195.tif 000035
【図８】
0003646195.tif 000036
【図９】
0003646195.tif 000037
【図１０】
0003646195.tif 000038
【図１１】
0003646195.tif 000039
【図１２】
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