(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とを温度１５〜４２℃で接触させることにより、インターロイキン１の産生を誘導することを特徴とするインターロイキン１の産生誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、特定の材料と血液とを接触させることによりインターロイキン１の産生を効果的に誘導し得るインターロイキン１の産生誘導方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
周知のごとく、生体の悪性腫瘍に対する免疫監視機構を担う抗腫瘍性細胞としては、キラー細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞及び、活性化マクロファージ等が重要な役割を果たしている。また、これらの細胞から分泌されるインターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等のサイトカインは、生体の持つ抗腫瘍性に大きく関与している因子である。近年、外科手術、放射線療法、化学療法と併用して、生体の持つ免疫監視機構を賦活することを目的とした免疫療法が、悪性腫瘍の治療法として盛んに行われてきている。このような、免疫療法剤として、例えば、レンチナンやシゾフィランの様な薬剤があるが、癌患者は免疫抑制状態にあり、かかる状態の中で抗腫瘍免疫に関係する上記の細胞や因子を誘導することはなかなか困難である。
【０００３】
このような困難を克服するために、最近、抗腫瘍免疫に関係する上記の細胞や因子を体外で誘導したり、直接体外から投与しようという試みがある。例えば、癌患者からリンパ球と腫瘍細胞とを体外に取りだし、遺伝子組み替えヒト・インターロイキンを加えて培養し、腫瘍を特異的に攻撃するリンパ球（ＬＡＫ細胞）を誘導した後に、癌患者体内に戻して、抗腫瘍効果を発揮する養子免疫療法が行われている。（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｌｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｍｕｕｌ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ａ    Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  １５７    ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｏｒ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｌｏｎｅ．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８８９−８９７，１９８７）。
【０００４】
しかしながら、癌患者から大量のリンパ球を取り出し、無菌的に長期間、インターロイキンの存在下で培養した後に、癌患者に注入するという操作を行うため、非常に手間がかかること並びに、培養に長時間を要すること及び高価なインターロイキンが必要であることなどの多くの問題があった。
【０００５】
また、遺伝子組み替え技術により、抗腫瘍免疫に関係する上記の種々のサイトカインを大量に得ることができるようになり、これらのサイトカインの直接投与（高久史麿  編集、南江堂、サイトカイン療法、１９９２）が行われている。しかしながら、遺伝子組み替え技術により得られたサイトカインは、その蛋白質分子内に糖鎖を持たなかったり、翻訳後修飾を受けていないものであり、本来患者体内で作られるサイトカインと異なっている。そのため、患者に直接投与しても血液中での寿命が短く、本来の効果が発揮できなかったり、様々な副作用が伴うという欠点を有している。
【０００６】
近年、上記欠点を克服するために、癌患者が本来持っている抗腫瘍免疫機能を体外循環システム等を利用して、体外で産生を誘導しようという試みがある。例えば、グラム陰性菌細胞壁由来のリポ多糖（特開昭５９−２１１４５号公報）やレクチン（特開昭６３−３３３３９号公報）の様な生理活性物質を不溶性担体に固定化し、体外に取り出した血液および血液成分と接触させることによって抗腫瘍免疫機能を誘導することが開示されている。しかしながら、これらの生理活性物質は、体内にはいった場合に、強い毒性を示す物質であり、不溶性担体からの脱離の可能性が皆無である保証がない。また、特開平３−２３６７９０号公報、特開平３−２４０４８５号公報には、それぞれグルクロン酸やＮ−アセチルノイラミン酸のような酸性糖を不溶性材料に固定化し、サイトカインを誘導する血液処理剤が開示されている。これらは不溶性担体から脱離しても生体に対する毒性はないが、このようなリガンドであっても、不溶性担体に固定化するための反応を行わねばならず、煩雑な過程が必要である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述した従来技術の諸欠点を解消し、抗腫瘍免疫機能を賦活するサイトカインであるインターロイキン１を、血液からより簡便に、かつより安全に産生誘導し得る方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
血液中の単球や好中球などの白血球は微生物のような異物と反応すると、種々の酵素、メディエーターを放出し、炎症反応を引き起こす。これらの反応は、材料と接触するときにも同様に引き起こされる。これは、材料が異物とみなされて起こるものであるが、この反応は材料の性質によって大きく変わってくる。一方、インターロイキン１は１９４０年代に白血球が産生する発熱物質として古くから知られている物質であるが、種々の生理活性を持ち、炎症反応においても産生される。そこで、本発明者らは、材料の性質を制御することによって、インターロイキン１の白血球からの産生を制御できるのではないかと考え、種々の材料と血液との接触によるインターロイキン１の産生誘導について、鋭意研究をおこなった。その結果、汎用の高分子材料である、ナイロン−６６、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等の材料と血液との接触によって、インターロイキン１は、ほとんど産生誘導されなかったのに比較して、アガロースゲルまたはそれを修飾したアガロース誘導体ゲルと血液との接触によって、インターロイキン１が効率的に誘導されることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によるインターロイキン１の産生誘導方法は、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とを温度１５〜４２℃で接触させることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明で使用されるアガロースは、紅藻類から抽出される天然多糖類である。アガロースはゲル化能を持ち、加熱したアガロース溶液を冷却すると、自然にゲル形成が起こる。それぞれの糖鎖は２本鎖となり、ついで凝集して束になり安定なゲルを形成する。このアガロースゲルのビーズは、血液と接触させると、著しく多くのインターロイキン１の産生を誘導した。
【００１１】
本発明で使用されるアガロース誘導体としては、アガロースに２，３−ジブロモプロパノールを強アルカリ条件下で作用させて架橋させ強度を高めた架橋型アガロースや、それにジエチルアミノエチル基等のイオン交換基をエーテル結合させたもの、４級アミン等で修飾したものなどが挙げられる。このアガロース誘導体からなるゲルのビーズは、血液と接触させると、著しく多くのインターロイキン１の産生を誘導した。
【００１２】
本発明において、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とを接触させる方法については、血液と上記材料とが十分に接触され得る限り、任意の方法を用いることができる。例えば、繊維状の上記材料をカラムに充填し、該カラムに血液を循環させる方法や、粒径５０μｍ〜５ｍｍのビーズ状の上記材料をカラムに充填し、血液を循環させる方法を用いることができる。さらに、血液中に種々の形状の上記材料を浮遊させることにより、血液と上記材料を接触させてもよい。
【００１３】
上記材料と血液とを接触させる際の温度は、１５℃〜４２℃の範囲であり、好ましくは、３０℃〜４０℃の範囲である。接触温度が１５℃よりも低い場合、４２℃よりも高い場合には、インターロイキン１の産生誘導は低下する。
【００１４】
本発明では、上記材料と血液とを接触させることにより、上記材料と細胞との相互作用により、インターロイキン１の産生誘導が行われる。このインターロイキン１産生細胞とは、抹消血中の細胞に限らず、リンパ管、リンパ節または脾臓等から得られる細胞も含まれる。血液中には、インターロイキン１を産生するこれらの細胞が多く含まれている。血液中のこれらの細胞が、上記材料と作用し、インターロイキン１が産生誘導されるが、直接作用せずとも、上記材料と血液中の何らかの因子とが作用して誘導された別の因子を介して上記細胞により、インターロイキン１の産生が誘導されてもよい。
【００１５】
本発明では、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料が、血液と接触されてインターロイキン１の産生誘導が行われるため、癌患者等の血液からインターロイキン１を産生誘導することができるため、本発明は癌などの治療に好適に用いることができる。また、本発明の方法によってインターロイキン１が産生誘導された血液を癌患者に戻すことにより、癌患者内因性のインターロイキン１を患者に与えることができるため、患者の体内において優れた抗腫瘍効果を発揮させることができる。
【００１６】
本発明を用いた癌治療法について以下に例示する。癌患者の血液を血液回路等を用いて連続的に体外に導き、繊維状またはビーズ状の上記インターロイキン１誘導材料を充填したカラム部にて、好ましくは体温付近の温度にて血液を上記材料と接触させ、血液内にインターロイキン１を産生誘導する。しかる後、この癌患者内因性のインターロイキン１を多量に含む血液および血液成分を癌患者体内に連続的に返血する。上記治療方法に用いられる装置としては、市販の体外循環システム等の上記操作過程を可能にする装置であれば任意のものを用いることができる。
【００１７】
また、本発明を用いた別の癌治療法としては、あらかじめ癌患者の血液を採血し、上記材料を内部に含有する血液バッグ内で上記材料と癌患者血液とを接触させ、インターロイキン１を産生誘導し、遠心分離等の手段を用いて血漿等を分離後、患者に投与する方法が挙げられる。また、上記方法によって得た癌患者内因性のインターロイキン１を多量に含む癌患者自身の血漿等を冷凍保存し、しかる後に、必要に応じて患者に投与することも可能である。
【００１８】
また、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料を用いて簡便にインターロイキン１を誘導することができるため、その誘導活性を測定することにより、患者のインターロイキン１産生能力を調べることが可能である。即ち、患者の病態を反映する免疫学的パラメーターとして、このインターロイキン１産生能を利用することが可能である。
【００１９】
また、本発明によれば血液から内因性の天然型インターロイキン１を含有する血清または血漿を簡便に入手することが可能となり、これらの血清または血漿は、天然型インターロイキン１を得るための原材料として種々の用途に利用できる。
【００２０】
【作用】
本発明では、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料が血液と接触されるため、血液中のインターロイキン１を産生する細胞と該材料との相互作用が促進されることにより、あるいは上記材料と何らかの因子とが相互作用し、それによって誘導された別の因子により、インターロイキン１の産生が効率よく誘導され得る。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明を詳細に説明する。
まず、下記の実施例１〜６及び比較例１〜６に記載する方法にて、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料、および各種比較材料を作製し、次いで得られた材料を用いて、インターロイキン１の産生誘導実験を行った。
【００２２】
実施例１
アガロース（ナカライ化学社製、電気泳動用特製試薬  ＧＰ−３６）を５重量％濃度で蒸留水に溶解させ、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理を行った。この溶液を６０℃に保温しておき、冷蒸留水中にマイクロシリンジを用いて滴下して、アガロースゲルビーズ（粒径５ｍｍ）を作製した。
このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  社製）に充填した。充填量はアガロースビーズ２０個とした。
【００２３】
実施例２
約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社製）の懸濁液３ｍｌを１５ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（岩城硝子社製）に入れた。これを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄みを吸引して捨てた。この洗浄操作を３回行い、一晩４℃にて放置した。
このゲル担体５００μｌ（かさ体積）を実施例１と同様に、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  社製）に充填した。
【００２４】
実施例３
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂの代わりに、約６重量％濃度の架橋型アガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２５】
実施例４
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂの代わりに、約６重量％濃度の、架橋型アガロースにジエチルアミノエチル基をエーテル結合で導入したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２６】
実施例５
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂの代わりに、約４重量％濃度の、架橋型アガロースにエーテル結合を介してフェニル基を導入したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２７】
実施例６
実施例２において、約２重量％濃度のアガロースよりなる、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂの代わりに、約６重量％濃度の、架橋型アガロースに４級アミンをＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社製）を用いたことの他は、実施例２と同様に操作した。
【００２８】
比較例１
注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  社製）。
比較例２
ナイロン６６のビーズ（粒径２．５ｍｍ）を射出成形により作製した。これらをメタノールで洗浄後乾燥した。
このビーズを注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で洗浄後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用ポリプロピレンチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  社製）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。
【００２９】
比較例３
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリスチレンを使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
比較例４
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリメチルメタクリレートを使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
比較例５
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリエチレンテレフタレートを使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
比較例６
比較例２におけるナイロン６６のかわりに、ポリテトラフルオロエチレンプロピレン共重合体を使用したことの他は、比較例２と同様に操作した。
【００３０】
インターロイキン１の産生誘導試験
実施例１〜６及び比較例１〜６で得られた材料を用いて、インターロイキン１の産生誘導実験を行った。
インターロイキン１の産生誘導実験とその測定方法は以下のように行った。
（１）ビーズによるインターロイキン１産生誘導実験
各ゲルビーズを充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、３７℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。しかる後、血液を回収し、以下の方法で血漿中のインターロイキン１の濃度を測定した。
【００３１】
（２）血漿中インターロイキン１濃度測定方法
インターロイキン１産生誘導試験後の血液を遠心分離して血漿を採取し、血漿中のインターロイキン１−βの濃度をインターロイキン１−βモノクローナル抗体を用いて、免疫酵素抗体法（Ｍａｄｇｅｎｉｘ社製、商品名；ＩＬ１−β−ＥＡＳＩＡＲ  ）にて測定した。この測定方法の検出限界濃度は１０ｐｇ／ｍｌであった。
【００３２】
また、採血直後の血液を遠心分離して血漿を採取して、血漿中のインターロイキン１−βの濃度を同様にして測定した。採血直後の血液の血漿中インターロイキン１−β濃度は何れも検出限界以下であった。
インターロイキン１の産生誘導実験の結果を表１に示す。
なお、表１および後述の表２において、ＩＬ１−βは、インターロイキン１−βを示す。
【００３３】
【表１】
0003620863.tif 000002
【００３４】
実施例７
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、１５℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
実施例８
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、３０℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
実施例９
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、４０℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
実施例１０
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、４２℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
【００３５】
比較例７
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、１０℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
比較例８
実施例２と同様に調製したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂゲル担体を充填したポリプロピレンチューブにヘパリン採血した健常人新鮮血１．６ｍ１を加えて回転円盤に取り付けて、４５℃にて２時間、回転数２６ｒｐｍで転倒混和した。
【００３６】
インターロイキン１の産生量の測定
実施例７〜１０及び比較例７、８のインターロイキン１の産生誘導実験で得られた血液を回収し、前述の方法と同様にして血漿中のインターロイキン１の濃度を測定した。
結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
0003620863.tif 000003
【００３８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料と血液とが接触されるため、インターロイキン１の産生が効果的に誘導される。従って、癌患者の血液を用いることにより、癌患者由来の内因性インターロイキン１を患者に与えることが出来、新規な癌治療方法を提供することが可能となる。
【００３９】
また、アガロースゲルまたはアガロース誘導体ゲルからなる材料を用いて簡便にインターロイキン１を誘導することができるため、その誘導活性を測定することにより、患者のインターロイキン１産生能力を調べることが可能であるから、患者の病態を反映する免疫学的パラメーターとして、このインターロイキン１産生能を利用することが可能である。
【００４０】
また、本発明によれば血液から内因性の天然型インターロイキン１を含有する血清または血漿を簡便に入手することが可能となり、これらの血清または血漿は、天然型インターロイキン１を得るための原材料として種々の用途に利用できる。
【００４１】
また、本発明では、従来の生理活性物質固定化材料のように、固定化された生理活性物質等の脱離が発生しないため、安全性の点においても優れており、かつ特定の固定化リガンドも必要ないため効率的である。