(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロカワ（Ｂｏｌｅｔｏｐｓｉｓ  ｌｅｕｃｏｍｅｌａｓ）のレクチンであって、以下の特徴を有するクロカワ由来のレクチン：（ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１５，０００であり、（ｂ）Ｎ−末端アミノ酸のアミノ基がブロックされており、（ｃ）臭化シアン分解によりＮ−末端からのアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−であるペプチドが得られ、（ｄ）約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でウサギ赤血球を凝集させる活性を有し、（ｅ）Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース担体に結合活性をもつ。
【請求項２】
得られるレクチンがヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞およびマウス肺癌ＬＬ２細胞の増殖を抑制し、アポトーシス誘導活性を示す請求項１のレクチン。
【請求項３】
クロカワを緩衝液で抽出し、その抽出液を硫酸アンモニウム沈澱およびＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて、請求項１のレクチンを吸着、分離および分画することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載されるクロカワ由来のレクチンの分離精製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野〕
本発明は、新規なクロカワレクチンタンパク質およびその分離精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レクチンは糖鎖を認識するタンパク質であり、その製造は産業的意義が高く、多くの特許がある。次にその数例を挙げる。
特開平０９−０５９２９８アロエ葉皮由来のレクチン活性蛋白質は、アロエレクチンに関するものである。
特開平０８−１１９９９４キクイモ由来のレクチンおよびその精製法は、マンノース／グルコース親和性レクチンの精製およびマルトースをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーによる分離精製法に関するものである。
特表  ２０００−５０５６４３レクチン様性質を有する化合物およびその生物学的応用は、レクチン様性質を有するポリペプチドを解読することが可能なヌクレオチド配列、同様のザルコレクチン型ポリペプチド、並びに、それらの治療での使用に関するものである。
特表平  １０−５０４２８７ヤドリギからイソレクチンを単離する方法は、ヤドリギからラクトシルセファロース上でクロマトグラフィーを行い、ＭＬＩ型イソレクチンを単離する方法に関するものである。
再表    ９５／０１８１４９  新規レクチンおよびその製造方法は、キリンザイ属に属する海藻から新規レクチンを分離精製して、大量に取得することに関するものである。
以上のように、材料や方法には色々のものがあり、まだまだ未開発の有用なレクチンが存在すると考えられ、それらのレクチン、特に食品由来のレクチンの開発と適切な製造方法が未開発のまま残されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
レクチンには多くの種類があり、糖鎖結合特異性、血液型特異性、抗癌作用などを利用した細胞分離試薬、臨床検査試薬、臨床治療薬などの開発が進められている。さらに多様な目的に合うよう対応するために新たな特徴をもつレクチンの開発が求められる。とくに食品由来のレクチンは、その安全性が高い可能性があるために、有利な応用が期待される。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本研究の目的は、食用キノコであるクロカワから緩衝液抽出により、レクチンに関する研究を行い、従来知られていない新規なレクチンの製造法を提供することにある。
本発明者らは上記の目的を解決するため鋭意研究を行い、Ｎ，Ｎ’−ジキトビオースをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにより、効率的にレクチンを分離精製できることを見い出した。すなわち、クロカワを緩衝液で抽出し、その抽出液を硫酸アンモニウム沈澱およびＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて、レクチンを吸着、分離および分画することにより、新規のクロカワ由来のレクチンを得る。
【０００５】
得られるクロカワ由来のレクチンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１５，０００であり、Ｎ−末端アミノ酸のアミノ基がブロックされており、臭化シアン分解によりＮ−末端からのアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−であるペプチドが得られ、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でウサギ赤血球を凝集させる活性を有し、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース担体に結合活性をもつ。クロカワレクチンは文献未記載の新規レクチンであり、まだ糖鎖結合特異性は明らかではないが、一般の単糖や二糖ではその赤血球凝集活性が阻害されないため、特徴ある糖鎖結合特異性があるものと考えられる。
【０００６】
さらに、本発明者らはクロカワレクチンが培養ヒト癌細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導して死滅させることを見い出した。すなわち、得られるクロカワ由来のレクチンは、ヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞およびマウス肺癌ＬＬ２細胞の増殖を抑制し、アポトーシス誘導活性を示すレクチンである。
また、動物実験においても担がん動物に延命効果をもたらすことも見い出しており、現在は定かではないが、食用により抗癌効果も期待され、クロカワを機能性食品として位置付けることができる可能性がある。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本研究に使用される食用キノコであるクロカワ（Ｂｏｌｅｔｏｐｓｉｓ  ｌｅｕｃｏｍｅｌａｓ）は山梨県の山林中より採取することができる。
クロカワレクチンの好ましい分離精製法としては、クロカワをトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジナイザーを用いて粉砕し、抽出物を得る。硫安分画法により７０％沈殿物を分離し、溶解後の画分をＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース−セファロースを用いるアフィニティーカラムにかけ、トリス緩衝液で十分洗浄後、Ｎ−アセチルグルコサミン含有溶媒にて溶出し、クロカワレクチンを得る。
かくして得られるクロカワレクチンはウサギ赤血球を凝集させる活性を有する。
【０００８】
本発明によって作られたクロカワレクチンはヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞の増殖を抑制し、Ｕ９３７細胞アポトーシス誘導活性を有することから、抗癌作用があると考えられる。また、マウス肺癌細胞の増殖を抑制し、実際にマウスを用いた動物実験で、癌細胞を移植した担癌動物に腹腔内投与より、延命効果をもたらす。
【０００９】
【実施例】
以下に示す実施例は限定的な意味を持つものではなく、実例にすぎない。
山梨県山林中より採取したクロカワの子実体１００ｇに１００ｍｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ホモジナイズし、１３，０００×ｇで１０分遠心分離後、上清に７０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、１時間放置後、遠心分離して沈澱を集めた。この沈澱に５０ｍｌのトリス塩酸緩衝液を加えて溶解し、透析後、遠心上清をゲルベッド２ｍｌのＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース固定化セファロース４Ｂカラムにかけ、トリス塩酸緩衝液で十分洗浄後、２５０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミンで溶出し、結合タンパク質７ｍｇを得た。
本タンパク質は、図１のように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、分子量１５，０００の位置に泳動し、メルカプトエタノールの存在の有無にかかわらず、図２のように、同一分子量を示すことから、サブユニットがＳ−Ｓ結合で結合したタンパク質ではないことが明らかになった。
【００１０】
本タンパク質はその分離方法から糖鎖を認識するレクチンのひとつであると考えられたので、赤血球凝集反応を調べた結果、図３のように、本タンパク質は５０ｎｇ／ｍｌという極めて低い濃度で赤血球凝集活性を示した。従って、本タンパク質はレクチンの１種であることが確認された。なお、この赤血球凝集反応は各２５０ｍＭのＮ−アセチルグルコサミン、メチルα−マンノシド、グルコース、マンノース、ラクトース、スクロースでは阻害されなかった。
【００１１】
本クロカワレクチンのアミノ酸配列の決定を試みたが、そのままではアミノ酸配列に関する結果が得られなかったので、Ｎ−末端アミノ酸残基がブロックされていると考えられた。そこで、メチオニン残基のカルボキシル側で特異的に切断する臭化シアン処理を行い、この方法で得られたペプチドの分析から、本クロカワレクチンにはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−の配列が存在することが明らかになった。アミノ酸配列データベースのコンピューター検索の結果、同一配列をもつタンパク質は報告されておらず、本クロカワレクチンは新規のタンパク質であると決定された。
【００１２】
次に、癌細胞に対する効果を調べるために、本クロカワレクチンを２×１０４個のヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞の培養液に加え、２４時間培養後、アラマ−ブルーを加えて細胞増殖をクロカワレクチンを加えていないコントロールと比較したところ、図４のように、クロカワレクチンは濃度依存的にＵ９３７細胞の増殖を抑制した。
【００１３】
クロカワレクチンで処理した細胞をヘキスト３３３４２で染色した場合に、図５のように、アポトーシスに特徴的なクロマチン凝縮が観察された。さらに、クロカワレクチンで処理した細胞からＤＮＡを抽出してアガロースゲル電気泳動で分離後、サイバーグリーンで染色した結果、図６のように、クロカワレクチンは濃度依存的にアポトーシスに特徴的なＤＮＡラダー形成を誘導した。従って、本クロカワレクチンはＵ９３７細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することが明らかになった。
【００１４】
マウス癌細胞に対する効果を調べるために、本クロカワレクチンを２×１０４個のマウス肺癌ＬＬ２細胞の培養液に加え、２４時間培養後、トリパンプルーを加えて生細胞数を計測し、細胞増殖をクロカワレクチンを加えていないコントロールと比較したところ、図７のように、クロカワレクチンは濃度依存的にＬＬ２細胞の増殖を抑制した。
【００１５】
マウスを用いた動物実験において、本クロカワレクチンの腹腔内投与は、マウスルイス肺癌ＬＬ２細胞腹腔内移植マウスに対して延命効果を示した。すなわち、同系マウスＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に１×１０６個のＬＬ２細胞を移植し、コントロール群には生理食塩水を、実験群にはクロカワレクチンを２日おきに投与し、マウスが死亡するまでの日数を計測した。その結果、図８のように、コントロール群７匹が死亡したあとも２匹が生存していたことから、延命効果があると認められた。このように、上記の本レクチンが培養細胞に対してアポトーシスを誘導して増殖を抑制するという結果が動物実験においても確かめられた。
【００１６】
【発明の効果】
以上記述したように、クロカワを緩衝液で抽出し、その抽出液を硫酸アンモニウム沈澱およびＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて、吸着、分離および分画することを特徴とする分離精製法によって、クロカワ由来のレクチンを製造できた。本発明によって製造できたクロカワ由来のレクチンは、（ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が約１５，０００であり、（ｂ）Ｎ−末端アミノ酸のアミノ基がブロックされており、（ｃ）臭化シアン分解によりＮ−末端からのアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−であるペプチドが得られ、（ｄ）約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でウサギ赤血球を凝集させる活性を有し、（ｅ）Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース担体に結合活性をもつ、特徴を有する。
【００１７】
本発明のクロカワ由来のレクチンは、ヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞およびマウス肺癌ＬＬ２細胞の増殖を抑制し、アポトーシス誘導活性を示す。従来、食品から分離されたレクチンで癌細胞にアポトーシスを誘導して癌抑制効果をもつものとして小麦胚レクチンが知られているが、小麦胚レクチンによる赤血球凝集反応はＮ−アセチルグルコサミンで阻害されるのに対し、クロカワレクチンの場合は阻害されないので、両者では糖鎖結合特異性に違いがある。従って、食品由来レクチンのうち、クロカワレクチンは癌細胞アポトーシス誘導活性および新しい糖鎖結合特異性を有する新規のものであると考えられる。以上のことから、抗癌作用に基づく新たな抗癌剤としての開発や糖鎖結合特異性を利用した検査薬の開発など産業への貢献が期待できる。
【００１８】
【図面の簡単な説明】
【図１】  クロカワ抽出物のＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース−固定化セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより分離精製された、分子量約１５，０００（１５ｋＤａ）のクロカワレクチンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン（図中の３）を、マーカータンパク質（図中の１）および分離前のクロカワ抽出物（図中の２）とともに示したものである。
【図２】  クロカワレクチンが還元剤であるメルカプトエタノールの存在の有無にかかわらず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で同じ分子量約１５，０００（１５ｋＤａ）の位置に泳動すること（図中の５と６）を、マーカータンパク質（図中の４）とともに示す図である。
【図３】  Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース−固定化セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーで分離精製したクロカワレクチンがウサギ赤血球を凝集させる（図中の７と８）ことを示す図である。
【図４】  クロカワレクチンが、ヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞の培養液に加えて培養したときに、細胞増殖を抑制することを示す図である。
【図５】  クロカワレクチンをヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞の培養液に加えて培養したとき（図中の右図）に、クロカワレクチンが存在していない場合のコントロール（図中の左図）では見られない、アポートシスに特徴的なクロマチン凝縮が観察されることを示す図である。
【図６】  クロカワレクチンをヒト単球性白血病Ｕ９３７細胞の培養液に加えて培養したときに、クロカワレクチンが存在していない場合のコントロールでは見られない（図中の１１）、アポートシスに特徴的なＤＮＡの断片化（ＤＮＡラダー）が濃度依存的に起こっている（図中の１２、１３、１４）ことを示す図である。
【図７】  クロカワレクチンが、マウス肺癌ＬＬ２細胞の培養液に加えて培養したときに、細胞増殖を抑制することを示す図である。
【図８】  マウス肺癌ＬＬ２細胞を腹腔内移植したマウスに対して、クロカワレクチンを腹腔内投与すると、生理食塩水を投与した群に比べて、死亡日数の延長がみられることを示す図である。
【符号の説明】
１  マーカータンパク質混合物
２  クロカワ粗抽出物
３  分離したクロカワレクチン
４  マーカータンパク質混合物
５  非還元条件下でのクロカワレクチン
６  還元条件下でのクロカワレクチン
７  クロカワレクチン１００ｎｇ／ｍｌによる赤血球凝集
８  クロカワレクチン５０ｎｇ／ｍｌによる赤血球凝集
９  クロカワレクチン２５ｎｇ／ｍｌによる赤血球凝集
１０  コントロール赤血球
１１  クロカワレクチン非処理細胞からのＤＮＡ
１２  ２０μｇ／ｍｌのクロカワレクチンで処理した細胞からのＤＮＡ
１３  １０μｇ／ｍｌのクロカワレクチンで処理した細胞からのＤＮＡ
１４  ５μｇ／ｍｌのクロカワレクチンで処理した細胞からのＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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