(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニルピリジンおよび２−ビニルピリジンからなる群より選ばれる少なくとも一種の窒素含有塩基性ビニルモノマーを２〜６０重量％およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８重量％含有するモノマーを重合して得られた共重合ポリマーよりなることを特徴とする核酸吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、温度応答性の核酸吸着剤に関する。さらに詳しくは、酵素製造時の酵素の精製工程における核酸の除去や核酸の抽出などに使用することができる核酸を吸着分離可能な温度応答性核酸吸着剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、酵素反応が洗浄剤、繊維、食品、種々の産業分野および診断薬のような医療分野にて利用されるようになっており、酵素を低コストで高活性を維持したまま回収する精製方法の開発が望まれている。目的とする酵素の抽出・精製は、まず酵素を生産させた細菌を破壊して無細胞化した後、酵素タンパクとしての変性を防ぐため、温度、ｐＨ、イオン強度、基質や補助因子の共存などに留意しつつ、また微生物の汚染も避けながら実施する必要がある。酵素の精製は存在する他の物質から酵素タンパクを分離する一連の分画法であるが、一般には除核酸、安定性による分画、溶解度による分画、分別吸着、カラムクロマトグラフィーによる分画、電気泳動による分画、密度勾配超遠心法による分画、二相分離法などによる分画法がある。
【０００３】
酵素の精製においては、通常核酸が酵素と親和性を有し、複合体を形成しやすいため除核酸の工程が不可欠である。この除核酸を効率的に行なうことは、さらに他の精製方法を行う場合においても非常に重要である。従来、除核酸の方法としては、主に塩基性水溶性ポリマーなどからなる核酸吸着剤に核酸を吸着させる方法が使用されてきた。
【０００４】
この塩基性水溶性ポリマーとしては、具体的にはポリエチレンイミンやポリアミノアルキルメタクリレート類、アミノアクリルメタクリレートとアクリルアミドの共重合体、ポリビニルイミダゾリンのようなカチオン性ポリマーが知られているが、核酸の吸着後の状態がハイドロゲルのような状態であるため酵素と核酸の分離が困難であり、遠心分離を十分おこなっても酵素の回収率は低かった。また、核酸吸着剤の分子量が高いため、酵素が核酸吸着剤のハイドロゲル状ポリマーに物理的に沈澱物として取り込まれる割合が高いことも収率の低い原因となっている。
【０００５】
さらに、除核酸の方法としては、硫酸プロタミンまたは硫酸ストレプトマイシンなどの除核酸剤と核酸を結合させた後、沈澱させて分離する結合沈澱法が知られているが、いずれも沈澱が不十分なため、多量の除核酸剤を必要とし、コストが高くなるという問題があった。
また、その他の除核酸の方法として、水性２相分配法、硫酸アンモニウム分画、ｐＨ処理、熱処理などにより粗分画抽出液にすることもできるが、いずれも精製度合いの低いものしか得ることができず、さらに各種クロマトグラフィー処理工程が必須で、各工程での酵素濃縮、脱塩なども必要となり、最終的にコストが高くなる問題があった。
【０００６】
一方、近年生体試料から核酸の抽出操作が工業的に広くに行われている。例えば遺伝子工学やＤＮＡプローブの作製においては、目的とするタンパク質を生産する細胞からｍＲＮＡやＤＮＡを抽出する操作が、またＤＮＡプローブを用いて例えばウィルスＤＮＡ（ＲＮＡ）を検出する臨床診断においては、生体試料から検出されるべきＤＮＡ（ＲＮＡ）を抽出する操作が行われる。従来、核酸の抽出は、苛性試薬添加後、フェノールなどで抽出操作を数回繰り返し、実施後エタノール沈澱を行なう方法が知られているが、危険な溶剤を使用し、また操作も繁雑で時間がかかり、また、得られる核酸の収率も低いという問題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来の技術的課題を背景になされたもので、酵素活性を維持しつつ、効率的に核酸を選択的に吸着でき、危険な溶剤を使用することなく、しかも簡便なプロセスで目的とする核酸を抽出することができる吸着剤を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的は、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニルピリジンおよび２−ビニルピリジンからなる群より選ばれる少なくとも一種の窒素含有塩基性ビニルモノマーを２〜６０重量％およびＮ−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８重量％含有するモノマーを重合して得られた共重合ポリマーよりなることを特徴とする核酸吸着剤によって達成される。
【０００９】
本発明の核酸吸着剤は、酵素を吸着せず、核酸のリン酸基部分に選択的に吸着し、且つ温度の変化により溶解状態から不溶化し析出するという特性を有している。この析出する状態としては、凝集融着状態であり、核酸が大きな塊状となるため酵素と核酸の分離操作も容易であり、しかも分離効率も高い。
本発明における吸着とは、物理的結合および化学的結合の両方を含むものである。
【００１０】
以下本発明の核酸吸着剤（以下、単に「吸着剤」と略すことがある）について詳細に説明する。
本発明において吸着剤を形成する共重合ポリマーの製造に使用することのできる、窒素含有塩基性ビニルモノマーは、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、４−ビニルピリジンおよび２−ビニルピリジンからなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーである。これらは１種または２種以上で用いられる。
【００１１】
窒素含有塩基性ビニルモノマーの使用量としては、全モノマーの２〜６０重量％、好ましくは５〜４０重量％である。窒素含有塩基性ビニルモノマーが２重量％より少ない場合、核酸を吸着する能力が不足する問題があり、また６０重量％を越える場合では、いかなる温度でも共重合ポリマーが水に不溶化しなくなるため、核酸を試料から分離することができなくなる。
【００１２】
また、本発明の吸着剤を形成する共重合ポリマーは、温度に対する応答性を付与するためには、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを４０〜９８重量％共重合する必要がある。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが４０重量％より少ないと、温度応答性がなくなり、核酸を分離することができなくなり、さらに、９８重量％を越えると、核酸を吸着する能力が不足するようになる。
また、その他温度応答性を低下させない範囲で、親水性、疎水性などの他のビニルモノマーを使用することができる。その他のビニルモノマーとしては、例えばアクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物；２−ヒドロキエチルメタクリレート、Ｎ−メチロールアクリルアミド、スチレンスルホン酸ナトリウム、イソプレンスルホン酸ナトリウム、無水マレイン酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどのアミド化合物が挙げられる。これらその他のビニルモノマーの使用量は全モノマーの２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下である。
【００１３】
本発明において共重合ポリマーを得るための重合方法は、好ましくはラジカル重合であり、その形式は溶液重合、乳化重合または懸濁重合いずれでも良いが、最も好ましい方法は溶液重合である。溶液重合において重合溶媒の具体例としては、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、テトラヒドフラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、トルエンなどが挙げられる。また、重合溶媒には、重合中ポリマーが析出しない範囲で水を組み合わせることもできる。
【００１４】
重合開始剤としては、通常のラジカル開始剤が使用でき、アゾイソブチロニトリルのようなアゾ系開始剤、ベンゾイルパーオキサイドなどの有機過酸化物を使用することができる。  重合後、硫酸や塩酸を滴下してｐＨを７以下にコントロールした後、減圧蒸留などの方法により脱溶剤することにより共重合ポリマー水溶液を得ることができる。
本発明で使用する共重合ポリマーの分子量は、通常１０００〜５０万、好ましくは２０００〜２０万である。分子量が１０００未満では沈澱しにくくなり、一方５０万を超えると粘度が高くなりすぎる。
【００１５】
本発明の吸着剤は、水系媒体中において温度の変化により水溶性と不溶性の可逆形態を有する温度応答性のあるポリマーである。本発明の吸着剤の温度応答性は、低温側では溶解しており、高温領域では不溶性となり沈澱するものである。変化する温度は、重合時使用する窒素含有塩基性ビニルモノマーの種類と量、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの量、その他のビニルモノマーの種類と量によってコントロールすることができる。温度の調整により形成された沈澱は、遠心分離操作により沈降させることができ上清と沈降ポリマーと分離することができる。具体的には２０℃以下では吸着剤の８０重量％以上が水系媒体に溶解しており、５０℃以上では吸着剤の８０重量％以上が水系媒体に不溶化する温度応答性ポリマーが好ましい。２０℃以下でポリマーが溶解しない場合は、ポリマーが溶解した状態で核酸を吸着することができず、一方５０℃以上で析出しない場合は、核酸を吸着して後分離することができなくなるという問題がある。
【００１６】
本発明の吸着剤を用いて除核酸することにより酵素を精製するための試料、および核酸抽出するための試料としては、微生物や組織、細胞、血液などの生体組織が例示できる。これらの試料について、含有されるタンパク質や核酸が吸着剤と接触できない状態、すなわち、試料が細胞壁や細胞膜を有しているか塊状になっている場合などには、必要に応じて例えばホモジナイズ処理あるいは超音波処理を実施すると良い。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
（１）５００ｍｌガラス製耐圧瓶中で、ジメチルアミノエチルアクリレート２０ｇと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド８０ｇを、メタノール２００ｇに溶解し重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル０.２ｇを加え７０℃で５時間重合した。重合転化率は９８％であった。０.５重量％硫酸水溶液４００ｇ添加した後減圧蒸留によりメタノールおよび残留モノマーを除去して水溶液とした。調整水およびｐＨ調整剤を添加することにより固形分濃度１０重量％、ｐＨ６.３のポリマー水溶液［ポリマー（１）］とした。
得られたポリマー（１）の温度応答性を測定したところ３０℃以下では透明で溶解し、３５℃以上では不溶化により析出した。この変化は可逆的であった。
（２）超音波破砕および遠心分離により得られたＰｓｅｕｄｍｏｎａｓ  ｓｐ.  Ｆ−１２６の無細胞抽出液（０.０１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６.２）にタンパク質１０ｇあたり前記温度応答性ポリマー［ポリマー（１）］１０重量％水溶液１００ｇを２０℃で攪拌しながら滴下しポリマーに核酸を吸着させた。３０分後液温を４０℃に昇温し、温度応答性共重合ポリマーを析出させ、遠心分離により上清を得た。この操作で上清に得られたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼの比活性は変化せず、酵素活性の回収率は８７％であった。
【００１９】
比較例１
実施例１（１）において、モノマーとしてジメチルアミノエチルアクリレート６５ｇおよびＮ−イソプロピルアクリルアミド３５ｇを使用した他は実施例１（１）と同様な操作でポリマー（２）を得た。ポリマー（２）の温度応答性を測定したところ、１０℃から９０℃まで溶解した状態であり温度応答性はなかった。実施例１（２）と同様にして核酸吸着剤としての使用を検討したが、すべての温度で析出しないため、核酸と酵素を分離することはできなかった。
【００２０】
比較例２
実施例１（１）において、モノマーとしてジメチルアミノエチルアクリレート１ｇおよびＮ−イソプロピルアクリルアミドを９９ｇを使用した他は実施例１（１）と同様な操作でポリマー（３）を得た。ポリマー（３）の温度応答性を測定したところ、３１℃以下では透明で３３℃以上では析出するという非常に優れた温度応答性を有していた。しかし、実施例１（２）と同様にして核酸吸着剤として使用したところ、ポリマーの核酸を吸着する能力が不十分なため、核酸と酵素を分離することはできなかった。
【００２１】
実施例２
（１）１Ｌオートクレーブ中で、４−ビニルピリジン４０ｇとＮ−イソプロピルアクリルアミド１６０ｇをエチルアルコール４００ｇに溶解し重合開始剤としてベンゾイルパーオキサイド０.５ｇを加え８０℃で４時間重合した。重合転化率は９５％であった。１重量％硫酸水溶液８００ｇを添加しロータリーエバポレーターでエチルアルコールおよび残留モノマーを除去した後、調製水およびｐＨ調整剤を添加することによりｐＨ５.０、固形分濃度１０重量％のポリマー水溶液［ポリマー（４）］を得た。得られたポリマー（４）の温度応答性を測定したところ２８℃以下で完全に溶解し透明となり、３５℃以上で完全に不溶化し塊状に析出した。
（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ  ＩＦＯ  ３４６０（２Ｋｇ）から超音波破砕により調製した無細胞抽出液（５００ｍＬ）に前記ポリマー（４）の１０重量％水溶液（ｐＨ５.０）を１００ｇ添加して２０℃でポリマーに核酸を吸着した。その後４０℃に昇温してポリマー（４）を析出させ、４０℃に維持したまま遠心分離したところ、糖、脂質などの夾雑物と同時にポリマーが核酸に吸着した状態の沈澱物として核酸を除去できた。この操作で上清に得られたアルギニンラセマーゼの比活性はほとんど変化なく、酵素活性の回収率は８２％で良好であった。
【００２２】
実施例３
（１）５００ｍｌガラス製耐圧瓶中で、ジメチルアミノエチルアクリレート３０ｇと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを、メタノール１５０ｇに溶解し重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル０.５ｇを加え７０℃で１２時間重合した。重合転化率は９５％であった。１重量％硫酸水溶液４００ｇ添加した後減圧蒸留によりメタノールおよび残留モノマーを除去して水溶液とした。調整水およびｐＨ調整剤を添加することにより固形分濃度１０重量％、ｐＨ７.１のポリマー水溶液［ポリマー（５）］とした。
得られたポリマー（５）の温度応答性を測定したところ、４０℃以下では透明で溶解して、４８℃以上では不溶化により析出した。この変化は可逆的であった。
（２）ヒト白血球の癌細胞であるＫ５６２細胞を１％牛胎児血清を含むＰＲＭ１−１６４０培地で培養した。培養懸濁液１ｍＬあたり５０万の細胞となった時点で１ｍＬの懸濁液をサンプリングチューブにとり、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈澱に細胞を回収した。
細胞に対し１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.２を添加した後、超音波処理により、無細胞化した後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い上清を得た。この上清にポリマー（５）の１０％水溶液を、１００μＬ添加し３０分間攪拌後ｐＨ８の緩衝液を１０ｍＬ添加し、５０℃に昇温することにより核酸を吸着した状態で沈澱させ、５０℃に維持したまま遠心分離により上清と分離した。沈澱に５℃のｐＨ７.２の緩衝液１ｍｌを添加することにより核酸溶液を得た。以上のように抽出された核酸について制限酵素を作用させた結果、これらの酵素による反応は阻害されることはなかった。
【００２３】
実施例４
実施例３で得たＫ５６２細胞溶解液を、それぞれ０.５ｍＬ、３本の２ｍＬ遠心チューブに取り、ｐＨ５の１０ｍＭリン酸緩衝液で２ｍＬまで希釈した。この希釈液の中に、エイズウイルスＤＮＡを組み込んで培養したヒト白血球（ＮＹ１０株）から取ったＨＩＶ−１ＤＮＡを、チューブ１、２、３に、０分子、１０分子、５０分子をそれぞれ加えた。ボルテックス後、各チューブに実施例３で使用したポリマー（５）の固形分濃度１０重量％ポリマー水溶液を２μＬ添加し、室温で５分間回転攪拌した（１０ｒｐｍ）。次いで、５０℃に昇温してポリマーを析出させた後、５０℃に維持したまま、３０００ｒｐｍで３分間遠心した。上澄みをアスピレーターで吸引して除去し、得られた沈澱をｐＨ７の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でリンスした後、２５μＬのポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応溶液を加えて、ＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応液の組成は下記のとおりであった。
0003689897.tif 000002
プライマー  ＳＫ１４５Ａの配列は、
【００２４】
５’ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ  ３’
【００２５】
プライマー  ＳＫ４５１Ａの配列は、
【００２６】
５’ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ  ３’
【００２７】
であって、これらのアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成器３８１Ａ型を用いて、メーカーマニュアルに従って合成し、ＨＰＬＣにより精製品を得た。
なお、ＰＣＲ反応はＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＣＥＴＵＳ社製のサーマルサイクラー  モデルＪＰ２０００を用いて、次のプログラムで増幅反応を行った。
９４℃  ０.５分
５５℃  １.０分
７２℃  １.５分
３０サイクル
７２℃  ７分
【００２８】
上記１回目のＰＣＲ法による増幅反応の生成物を５μＬ取り、同様なプログラムでＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の反応を行った。その時のＰＣＲ法の反応液の組成はプライマーＳＫ１４５の代わりにＳＫ１４５（タカラ製）、ＳＫ４５１Ａの代わりにＳＫ４５１を使用した以外は同様に行った。
ＰＣＲ法およびＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の反応増幅産物を２重量％のアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  １６００、和光純薬製）を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液、ｐＨ８.２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動し、エチジウムブロマイド染色後に紫外線（２５４ｎｍ）照射下で検出した。その結果を下記表１にまとめて示す。この結果より、本発明の吸着剤を用いることによりＤＮＡのみ回収することができるため、ＰＣＲ法に利用できることがわかった。
【００２９】
【表１】
0003689897.tif 000003
【００３０】
【発明の効果】
本発明の核酸吸着剤を使用すると、酵素反応液の温度を変化させるという簡単な操作で核酸を容易に回収できるので、酵素の精製が容易に可能となり、目的とする酵素を効率良く回収できるとともに、酵素の活性が高いため酵素精製方法が著しく簡略化される効果がある。また本発明の核酸吸着剤の使用により、核酸を抽出するにあたり危険な溶剤を使用することなく、簡便なプロセスで短時間に目的とする核酸を抽出できる効果がある。