(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真空包装した豚肉を４℃で１０日〜３０日間貯蔵することからなる豚肉の熟成方法。
【請求項２】
真空包装した豚肉を１５日〜２５日間貯蔵する請求項１記載の豚肉の熟成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は豚肉の熟成方法及び熟成度の測定方法に関する。より詳細には、最も良好な嗜好性を豚肉に付与する熟成方法及び食肉の熟成度を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食肉は屠殺後に「熟成」とよばれる工程を経て生産される。熟成期間中に、死後硬直した筋肉は筋肉内在酵素の作用又は筋漿内カルシウム濃度の上昇作用を受けて軟らかくなると共に風味が向上すると考えられている。
死後硬直した筋肉は時間の経過に伴って硬直が解けるが、８０％の硬直が解けるのは、１℃での貯蔵において、牛で１０日、豚で５日、鶏で０．５日であるといわれており、通常、和牛肉では０℃で２週間以上の熟成が行われ、豚や鶏では４℃以下での流通及び販売の時間が熟成期間に当てられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、食肉の主体をなす骨格筋は熟成により食肉に変換される。熟成は重要な工程であり、熟成が不足すると良好な食感及び風味を有する食肉を得ることはできない。
食肉の熟成方法としては、従来から行われている低温熟成法の外にも、高温熟成法、硬直前高温熟成法、硬直後高温熟成法、電気刺激法などが知られている。牛肉では熟成度を測定する指標として、熟成の進行による軟化と関連させて、剪断力価の減少、筋原線維の小片化率の増加などが報告されている。また、熟成期間中のトロポニンＴの分解産物であ３０ｋＤａ成分の増加、筋漿蛋白質の変化に着目して解糖系酵素であるホスホグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）が減少することが報告されている（日畜会報  ６３，  ８５５−８６０，  １９９２）。
しかし、豚肉では有効な熟成指標は見出されておらず、従来からの経験則に基づいて熟成を行っているのが現状である。前述のように、豚肉の熟成期間は５日間程度が妥当とされているが、これは経験的なものであり、実証されたものではない。例えば、船便でチルド輸送された輸入豚肉が市場に出ており、短期間貯蔵の国産豚肉に比べ軟らかく美味しいと評価されることもある。
【０００４】
このように、豚肉においては、適正な熟成期間について明確な基準が得られていないのが現状である。また、熟成状態を測定するための指標物質が特定されていないことにも問題があり、指標物質に基づく客観的な熟成度測定法が求められている。更に、豚肉に限らず、現在、様々な熟成状態の食肉が市場に流通しており、また多種多量の食肉が輸入されており、熟成日数・状態の不明な輸入肉も多い。そのため、これらの食肉の熟成度を測定できる方法が切望されている。
本発明者等は、これらの問題を解消すべく、豚肉の熟成方法及び豚肉の熟成度の指標物質となり得る物質を研究した結果、低温で長期間熟成すると食感及び風味に優れた豚肉を調製できることが明らかになり、また食肉の熟成度の指標物質を見出すことができた。本発明はかかる知見に基づいてなされたもので、良好な嗜好性を有する豚肉が得られる豚肉の熟成方法及び食肉の熟成度の測定方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、
▲１▼真空包装した豚肉を４℃で１０日〜３０日間貯蔵することからなる豚肉の熟成方法；
▲２▼真空包装した豚肉を１５〜２５日間貯蔵する上記▲１▼記載の豚肉の熟成方法；
▲３▼豚肉の熟成度の測定方法であり、筋原線維中に占める１〜４個のサルコメアで構成される小片の割合を測定することからなる豚肉の熟成度の測定方法；
▲４▼豚肉の熟成度の測定方法であり、豚肉試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に付し、３０ｋＤａ画分を測定することからなる豚肉の熟成度の測定方法；
▲５▼豚肉の熟成度の測定方法であり、豚肉試料中のホスホグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）量を測定することからなる豚肉の熟成度の測定方法；
▲６▼食肉の熟成度の測定方法であり、食肉中のペプチド断片を測定することからなる食肉の熟成度の測定方法；
▲７▼測定対象であるペプチド断片が、下記式（１）、（２）又は（３）で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片である上記▲６▼に記載の食肉の熟成度の測定方法；
0003619891.tif 000002
である。
【０００６】
本発明の豚肉の熟成方法は、真空包装した豚肉を４℃で１０日〜３０日間貯蔵することからなる。本発明で使用される豚肉は、屠殺後の豚を解体して調製された枝肉又はそれから採取された肉塊が用いられる。
かかる豚肉は、必要に応じ予冷（例えば、０〜２℃で一夜程度）・肉表面の静菌（例えば、清浄水、次亜塩素酸塩溶液等による洗浄など）の後、ガス非透過性の包装材料からなる容器に収納し、常法に準じて真空脱気し、ヒートシールなどの手段により密封することにより、真空包装した豚肉が調製される。
上記のガス非透過性の包装材料としては、実質的にガスを透過させない材料であればいずれの材料でも用いることができるが、好適には高いガス非透過性を有するプラスチックフィルム（シートを含む）が用いられる。かかるプラスチック材料としては、例えば、ポリプロピレンフィルム、高密度ポリエチレンフィルム、ポリエステルフィルム等の単層フィルム；未延伸ポリプロピレン−延伸ポリプロピレンからなるラミネートフィルム等のプラスチックラミネートフィルム；中間層がアルミニウム層であり、外層がプラスチックフィルムからなるラミネートフィルムなどが例示される。
また、硬質材料からなる実質的にガス非透過性の容器に豚肉を収納・密封してもよい。
【０００７】
次いで、真空包装された豚肉は、４℃で１０〜３０日間、好ましくは１５〜２５日間程度貯蔵される。この際、豚肉は真空包装されているので、豚肉の腐敗防止及び水分の飛散を防止することができ、真空度もこの目的を達成できる程度であればよい。
貯蔵期間が１０日間未満であると熟成が不足し、また３０日間、特に３５日間を超えると豚肉が酸味を呈することがあるので好ましくない。
熟成温度は、厳密に４℃である必要はなく、ほぼ４℃であればよく、また多少の温度変動があっても実質的に熟成温度が４℃近傍であればよい。
【０００８】
本発明の熟成方法は上記の工程からなり、この方法で得られた豚肉は後記の官能検査結果等に示されるように、良好な味、香り及びテクスチャーを有することが明らかになった。
なお、本発明の熟成方法は上記の例に限定されるものではなく、適宜変更することができ、例えば、豚肉を包装する際に、脱酸素剤を同時に収納する方法及び／又は不活性ガス（例えば、窒素ガス、アルゴンガス、炭酸ガス等）を封入する方法などにより、豚肉の保存性を向上させてもよい。
【０００９】
本発明者等は豚肉の熟成方法を検討している際に、豚肉の熟成度の指標物質となり得る物質を見出した。即ち、▲１▼筋原線維中に占める１〜４個のサルコメアで構成される小片の割合；▲２▼豚肉試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した際の３０ｋＤａ画分；及び▲３▼ＧＡＰＤＨ含量が豚肉熟成度の指標物質となり得ることが判明し、また筋肉蛋白質の分解産物であるペプチド断片、特に前記式（１）、（２）又は（３）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド断片が食肉熟成度の指標物質となり得ることが明らかになった。本発明の測定法は、これらの物質を測定することによる熟成度の測定方法である。
【００１０】
本発明の第１の測定法は、筋原線維中に占める１〜４個のサルコメアで構成される小片の割合を測定することからなる。
食肉の主体である骨格筋は筋線維で構成されており、筋線維は複数の筋原線維の束からなる。筋原線維は、ミオシン分子の集合である多数のＡフィラメントとアクチン分子の集合からなる多数のＩフィラメントとが交互に配列したものである。Ｉフィラメントは円盤状のＺ線で保持されている。Ｚ線−Ｚ線間の１単位はサルコメアと称される。貯蔵日数が進むにつれＺ線部分は脆弱化するので、軽いホモジナイズ操作により、筋原線維はＺ線部分で切断された断片に分かれて小片化する。本発明者等は、軽いホモジナイズ操作を行って調製した試料について、筋原線維中に占める１〜４個のサルコメアで構成される小片の割合を測定した。そして、この割合と官能検査の結果とを対比すると、当該割合が豚肉の熟成度と相関し、特に筋原線維の小片化率は豚肉の硬さを反映しており、熟成度の指標となり得ることを見出した。本測定方法は、この指標を用いて熟成度を測定するものである。
【００１１】
本測定方法をより具体的に説明すると、まず、熟成期間中の豚肉試料を適当量採取して挽肉とする。次いで、挽肉に適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）を加え、ホモジナイズし、遠心分離した後、上清を除去する。沈殿物を緩衝液で適宜洗浄した後、沈殿物を緩衝液に懸濁させることにより、筋原線維懸濁液が得られる。この懸濁液の適当量をスライドグラスに落し、位相差顕微鏡下で観察又は写真撮影する。そして、全筋原線維数及び１〜４個のサルコメアで構成される筋原線維数を測定し、全筋原線維数に対する１〜４個のサルコメアで構成される筋原線維数の割合（％で表したこの値を、便宜上、ＭＦＩという）を計算する。
かくして得られたＭＦＩを、官能検査結果等と対比すると、ＭＦＩが７０以上、好ましくは８０以上になると熟成が完了し、良好な味、香り、テクスチャーを有する豚肉となっていることが判明した。即ち、本熟成度の測定法によれば、上記の方法でＭＦＩを測定し、その値が７０以上、好ましくは８０以上になっていれば熟成が完了したと判断することができる。
【００１２】
本発明における第２の熟成度の測定方法は、豚肉試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付し、３０ｋＤａ画分を測定することからなる。
豚肉を貯蔵し、熟成が進行すると、筋原線維蛋白質は蛋白分解酵素の作用を受けて蛋白質サブユニット又は更に低分子の物質に変換されるが、本発明者等は豚肉試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した際に、熟成が進行するとトロポニンＴ由来と考えられる３０ｋＤａ画分が現われ、これが熟成度の指標になり得ることを見出した。本測定方法は、この指標を用いて熟成度を測定するものである。
【００１３】
本測定法をより具体的に説明すると、まず、熟成期間中の豚肉試料を適当量採取して挽肉とする。次いで、挽肉に適当なイオン強度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）を加え、ホモジナイズし、遠心分離した後、沈渣をＳＤＳ存在下で加熱処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、３０ｋＤａ画分を測定することにより行われる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは常法に準じて行えばよく、泳動後の染色はクマシーブリリアントブルー等の慣用の染色剤を用いて行えばよい。
【００１４】
染色された３０ｋＤａ画分の測定は、デンシトメーターで各バンドの濃度を測定し、３０ｋＤａ画分の濃度（Ａ・ｍｍ）の全蛋白質量（ｍｇ／ｍｌ）に対する割合（便宜上、３０ｋＤａ成分指数という）又はアクチンに対する割合（便宜上、対アクチン比という）を測定するのが簡便である。
かくして得られた３０ｋＤａ成分指数及び対アクチン比を、官能検査結果等と対比すると、３０ｋＤａ成分指数が８０以上、好ましくは１００以上、対アクチン比が０．０３以上、好ましくは０．０５以上になると熟成が完了し、良好な味、香り、テクスチャーを有する豚肉となっていることが判明した。即ち、本熟成度の測定法によれば、上記の方法で３０ｋＤａ成分指数及び／又は対アクチン比を測定し、その値が上記の数値以上になっていれば熟成が完了したと判断することができる。
【００１５】
本発明における第３の熟成度の測定方法は、豚肉試料中のＧＡＰＤＨ含量を測定することからなる。
豚肉を貯蔵し、熟成が進行すると、筋漿蛋白質の中には蛋白分解酵素の作用を受けて低分子の物質に変換されるものがある。本発明者等は豚肉試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した際に、熟成が進行するとＧＡＰＤＨ画分が減少し、これが熟成度の指標となり得ることを見出した。本測定法は、この指標を用いて熟成度を測定するものである。
本測定法をより具体的に説明すると、まず、熟成期間中の豚肉試料を適当量採取して挽肉とする。次いで、挽肉に適当なイオン強度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液等）を加え、ホモジナイズし、遠心分離した後、上清を分離し、２−メルカプトエタノール等の還元剤及びＳＤＳの存在下で加熱処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＧＡＰＤＨ画分（３６ｋＤａ画分）を測定することにより行われる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは常法に準じて行えばよく、泳動後の染色はクマシーブリリアントブルー等の慣用の染色剤を用いて行えばよい。
【００１６】
染色されたＧＡＰＤＨ画分の測定は、デンシトメーターで各バンドの濃度を測定し、ＧＡＰＤＨ画分の濃度（Ａ・ｍｍ）の全蛋白質量（ｍｇ／ｍｌ）に対する割合（便宜上、ＧＡＰＤＨ指数という）又はミオグロビンに対する割合（便宜上、対ミオグロビン比という）を測定するのが簡便である。
かくして得られたＧＡＰＤＨ指数及び対ミオグロビン比を、前記の官能検査結果等と対比すると、ＧＡＰＤＨ指数が１０００以下、好ましくは５００以下、対ミオグロビン比が４以下、好ましくは２以下になると熟成が完了し、良好な味、香り、テクスチャーを有する豚肉となっていることが判明した。即ち、本熟成度の測定法によれば、上記の方法でＧＡＰＤＨ指数及び／又は対ミオグロビン比を測定し、その値が上記の数値以下になっていれば熟成が完了したと判断することができる。
なお、上記の例ではＧＡＰＤＨ含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定しているが、他の方法で測定してもよく、例えば、ＧＡＰＤＨ又は前記式（２）で示されるペプチドを抗原として得られた抗体を用いて、慣用の免疫学的測定法によりＧＡＰＤＨ含量を測定してもよい。
【００１７】
本発明における第４の熟成度の測定方法は、食肉中のペプチド断片を測定することからなる食肉の熟成度の測定方法であり、特に好適には前記式（１）、（２）又は（３）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを測定することからなる。
前述のように、筋肉は熟成期間中に酵素の作用を受けて分解し、ペプチド及びアミノ酸に変換されていくが、熟成の進行にともなって生成するペプチド断片が食肉熟成度の指標となり得ることを見出した。本測定方法は、生成した各種ペプチド断片の内の任意のペプチド断片に着目し、このペプチド断片を指標として用いて熟成度を測定するもので、特に好適には前記式（１）、（２）又は（３）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを指標として測定することからなる。
【００１８】
本測定法の一例を、前記式（１）で示される配列からなるペプチド（以下、Ｐ１ペプチドという）又は式（２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、Ｐ２ペプチドという）を測定する例をもって、より具体的に説明する。まず、熟成期間中の豚肉試料を適当量採取して挽肉とする。この挽肉に、０．１％程度の２−メルカプトエタノール溶液を加え、ホモジナイザーでホモジナイズした後、除蛋白剤（例えば、トリクロロ酢酸等）を添加し撹拌する。混合液を冷所で１夜程度放置した後、遠心分離し、上清を分離する。この上清（除蛋白した酸可溶性抽出液）をＨＰＬＣ、免疫学的測定法等の慣用の測定手段に付し、Ｐ１ペプチド又はＰ２ペプチドを測定することにより行うことができる。
【００１９】
上記の例において、ＨＰＬＣによる測定操作は常法に準じて行えばよい。
また、免疫学的測定法を利用する場合には、Ｐ１ペプチド及び／又はＰ２ペプチドに対する抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を調製し、この抗体を利用して慣用の免疫学的測定法（例えば、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法等）に準じて測定を行うことができる。また、測定法としては、例えば、固相担体を用いたサンドイッチ法、競合法、二抗体法などが例示される。これらの免疫学的測定法で使用される抗体は常法により調製することができ、例えば、モノクローナル抗体は、必要に応じてアルブミン等の蛋白質又はポリアミン  マトリックス（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ５４０９−５４１３，  １９８８参照）を結合したＰ１ペプチド又はＰ２ペプチドでラットを免疫した後、当該ラットの脾臓細胞とラットミエローマ細胞とを融合し、得られたハイブリドーマから上記のペプチドを認識する抗体を産生している細胞をスクリーニングし、この抗体産生細胞を培養することにより得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、上記のＰ１ペプチド若しくはＰ２ペプチド又はそれらの複合体をフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｊｕｖａｎｔ）と共に実験動物（例えば、兎、山羊、羊、ラット、マウス等）に投与して免疫し、その血清から常法に準じて得ることができる。
【００２０】
後記実施例に示されるように、Ｐ１ペプチドは生成量が多く、また熟成により著しく増加するので、検出の容易な指標として有用である。一方、Ｐ２ペプチドは、貯蔵２０日まで増加し、３０日以降は減少する傾向を示すペプチドであり、前述のように貯蔵１０〜３０日、好ましくは１５〜２５日程度が最もおいしくなる時期であることから、Ｐ２はおいしい時期を判定することができる指標として利用することができる。
【００２１】
なお、本熟成度の測定法は、筋肉蛋白質の分解生成物であるペプチド断片を測定することからなるので、豚肉に限らず、他の食肉（例えば、牛肉、鶏肉、羊肉、馬肉、山羊肉、兎肉等）の熟成度の測定にも利用することができる。即ち、上記のＰ１ペプチドはトロポニンＴ由来の分解ペプチドであると、またＰ２ペプチドはＧＡＰＤＨ由来の分解ペプチドであると推察される。トロポニンＴ及びＧＡＰＤＨは豚肉に限らず、他の食肉にも含有されている蛋白質であり、例えば、牛肉においては、豚肉と同様に、熟成の進行に伴いＰ２ペプチドが生成し、また、Ｐ１ペプチドに対応するペプチドとして前記式（３）で示されるペプチドが生成する。
このように、筋肉蛋白質の分解生成物であるペプチド断片を測定することからなる本熟成度の測定法は、広く食肉一般の熟成度の測定方法に利用することができる。
【００２２】
また、本熟成度の測定法は操作が簡便であるという特長を有する。即ち、前述の３０ｋＤａ画分の測定方法では、３０ｋＤａ画分の抽出には適当なイオン強度の溶媒を必要とするが、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド等のペプチド断片は水溶性ペプチドであり、水で抽出することができるので、検体調製操作が簡易である。また、検体が高イオン強度溶液（高塩濃度溶液）であると、塩による測定の妨害を回避するために脱塩工程を必要とすることがあるが、水で抽出して得た検体では脱塩操作を必要としない利点がある。
更に、Ｐ１ペプチド、Ｐ２ペプチド等のペプチド断片は、食肉の保存中に浸出してくる肉汁（ドリップ）にも含有されているのでドリップを測定試料として用いることができ、このドリップを用いれば熟成中の肉を破壊することなく測定試料を調製することができる。
また、最近、食肉はトレイ包装されて小売されることが多く、トレイと肉の間には吸水性ポリマーからなるドリップ吸収紙が汎用されている。このドリップ吸収紙にＰ１ペプチド等を測定ないし検出する機材をインジケーターとして組み込んでおけば、食肉の熟成状態をインジケーターが表示するので、食肉の熟成状態をアッピールしながら食肉を販売することができる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の豚肉の熟成方法によれば、従来の経験的方法と異なり、良好な味、香り及び食感を有する豚肉を確実に得ることができるという効果を奏する。また、本発明の熟成度の測定法によれば、客観的な基準をもって熟成度を測定するので、的確に且つ個人差なく熟成状態を把握することができるという効果を奏する。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、以下の試験に使用した試料及び熟成条件は下記のとおりである。
試料と熟成条件
供試豚としてＬＷＤ（ランドレース×大ヨークシャー×デュロック種）豚を４頭用いた。供試豚は屠殺後、枝肉のまま０〜２℃で一晩冷却し、ロイン部をそれぞれの個体から左右併せて計８本採取した。各ロインを次亜塩素酸ソーダ（有効塩素１０ｐｐｍ）で肉表面を静菌後４分割（肩、肩中、腿中、腿側）し、クライオバックフィルムを用いて真空包装した。このように調製した試料を４℃で熟成の目的で屠殺後２、５、１０、１５、２０、２５、３０日間貯蔵した後、分析時まで−２０℃で凍結保存した。
【００２５】
実施例１
貯蔵して得られた豚熟成肉について、官能検査を行い、長期間の熟成により豚肉の嗜好性の変化を調べた。また、熟成期間中のアミノ酸組成及び硬さの変化を検討した。
▲１▼官能検査
官能検査試料は熟成後試験時まで−２０℃で凍結保存した。凍結状態の官能検査用試料を１２ｍｍ厚にバンドソーで切り、自然解凍後ロース芯を取り出した。官能検査には屠体間及び部位間の差をなくすために、同じ屠体の同じ部位（例、屠体Ａの左右の肩側）のロース芯を用いた。ロース芯を片面１分、裏面１分、もう一回繰り返して計４分間、１８０℃のホットプレートで加熱したものを直ちに官能検査した。検査は訓練したパネラー（９〜１１人）により、味の強さ、香りの強さ、軟らかさ及び嗜好性（総合評価）の４項目による２点比較法で、４回行った。但し、味の強さは香りと味を区別するために鼻栓を用いて行った。
【００２６】
その結果を表１に示す。表１に示されるように、２日目に比べその他の貯蔵期間の豚肉は有意に味、香りが強いことが示された。また、貯蔵２〜３０日目においては、１０、２０、３０日目の味の強さには有意差は認められなかったが、熟成に伴い味、香りが有意に強くなり、さらに有意に軟らかくなる傾向があった。その影響を受け嗜好性が熟成により有意に向上する傾向を示した。貯蔵３０日目までは有意差は認められなかったが、貯蔵３０日目を経過すると豚肉には酸味臭が発生し、保存性の問題などから熟成の限界を示した。このことから熟成初期においては味、香りが弱く硬い豚肉が熟成により味、香りが強くなり軟らかくなり嗜好性が向上することが明らかとなった。官能検査の結果からは、豚肉は長期間の熟成により嗜好性が向上し、４℃で貯蔵した場合、１５〜２５日間程度の熟成が最適であることが明らかとなった。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
▲２▼熟成中の肉のアミノ酸組成変化
アミノ酸分析は熟成後に−２０℃で凍結保存したロイン左側の一部を用いた。試料を自然解凍し、脂肪及び結合組織を除去した後に３ｍｍ径のプレートで挽肉とし、分析時まで−２０℃で凍結保存した。凍結保存した分析用挽肉５ｇに０．１％メルカプトエタノールを２２ｍｌ加え、１分間のホモジナイズを行った。この懸濁液に５０％のトリクロロ酢酸を３ｍｌ加え混合後、一晩冷蔵庫で静置し、遠心分離後濾過した。この上清１ｍｌに１Ｎ−ＮａＯＨを加え、ｐＨ２．３に調製し５ｍｌにメスアップしたものを遊離アミノ酸分析用試料とした。更にこの上清１ｍｌに濃塩酸１ｍｌを加え、ブロックヒーターを用い１１０℃で２４時間加熱した（塩酸加水分解）。加熱後、脱塩酸を行い１０ｍｌにメスアップしたものを加水分解物アミノ酸分析試料とした。試料分析にはベックマン（ＳＹＳＴＥＭ  ６３００Ｅ）のアミノ酸分析計を用いた。ペプチドのアミノ酸組成は、加水分解物アミノ酸量から遊離アミノ酸量を差し引いて算出した。
【００２９】
遊離アミノ酸総量及びペプチド総量の変化を図１に示す。図１に示されるように、遊離アミノ酸総量及びペプチド総量は熟成により増加した。また、個々のアミノ酸についてみても熟成により含有量が増加した。ジペプチドであるＣａｒ及びＡｎｓは呈味の緩衝作用を有することが報告されている。熟成によりこれらの物質の濃度は増加しなかったが、Ｃａｒは肉中にかなりの量が存在しており、旨みの向上になんらかの寄与をしていることが推察された。
以上のように、熟成により遊離アミノ酸類及びペプチドが増加しており、これらの成分は熟成による呈味向上に大きく関与していることが推察された。
【００３０】
▲３▼肉質の硬さ（Ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）の変化
試料を凍結のまま約１５ｍｍ厚にバンドソーでスライスし、クライオバックフィルムを用いて真空包装した。自然解凍後８０℃の恒温水槽で２０分加熱し、直ちに流水で冷却後試料を取り出し、試料表面の水分をふき取りサランラップで包み、冷蔵庫で一晩冷蔵した。翌日、筋繊維と平行に１０×１０×５０ｍｍの大きさにカットし、テンシプレッサー（タケトモ社製、ＴＴＰ−５０Ｂ）で硬さを測定した。一屠体について３０〜４０回測定した。
【００３１】
４℃で貯蔵中の肉の硬さの変化を図２に示した。貯蔵期間に伴い肉の硬さは低下し、熟成により肉の軟化が進んでいることを示していた。特に、貯蔵初期ほど肉の硬さは顕著に低下したが、貯蔵１０日目以降、特に貯蔵１５日目以降は変化が小さかった。このことは表１の官能検査の肉の軟らかさの変化と傾向が一致していた。一方、３５日目以降は熟成過多となるため、更に肉の軟化が進みすぎ美味しさに欠けると考えられた。貯蔵１０日目、より好ましくは貯蔵１５〜３０日間が丁度良い軟らかさとなり、熟成適時と考えられた。
【００３２】
実施例２
筋原繊維の形態観察及び小片化率
筋原繊維は下記の方法により調製した。
脂肪、結合組織を除去した胸最長筋を３ｍｍ径のプレートで挽肉とし、得られた挽肉１ｇ採取し、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＮａＮ３緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ添加し、ポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ社製、ＰＴ１０−３５）を用い、氷冷下で１分間ホモジナイズした（目盛５）。この懸濁液を遠心分離後に上澄みを捨て、更に沈殿部の洗浄を上記緩衝液で２回行い、ガーゼで濾過した。この洗浄した沈殿に同緩衝液１０ｍｌを加え懸濁した。こうして得られた筋原繊維懸濁液１ｍｌに３ｍｌの緩衝液を加え混合した。希釈懸濁液をスライドガラスに１滴落とし、カバーグラスを載せ、油浸用レンズを用いて位相差顕微鏡で１，０００倍で観察し、写真撮影した。
Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．，  ３２，  ４０９−４１３，  １９６７）に従って、撮影した写真中の全筋原繊維数に占める１〜４個のサルコメアからなる筋原繊維数のパーセント（ＭＦＩ）を求めた。
【００３３】
豚肉貯蔵中の筋原繊維の形態変化は図３に示した。筋原繊維は貯蔵日数が進むにつれ、Ｚ線部分で切断された断片に分かれ、サルコメアが４個以下の筋原繊維が数多く見られた。１０日目から２０日目にかけて、小片化した筋原繊維の割合が著しく増加していることが観察された。
次に、貯蔵期間中における筋繊維の小片化率（ＭＦＩ）の変化を図４に示した。筋原繊維の小片化率は、熟成により増加し、特に１０日目から２０日目にかけ大きく増加することが観察された。筋原線維の小片化率の測定は豚肉の硬さを反映していると考えられることから熟成指標として有効であり、前記の官能検査及び硬さの変化などの結果を勘案すると、ＭＦＩが約７０以上でほぼ熟成が完了し、８０以上が最適熟成時期であることが判明した。
【００３４】
実施例３
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる３０ｋＤａ画分の測定
筋原繊維蛋白質は、実施例２で得られた筋原繊維懸濁液を用いた。筋原繊維懸濁液を２．５％  ＳＤＳ、５％  ２−メルカプトエタノールを含む０．５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、３分間沸騰水中で加熱処理を行った。泳動は分離用ゲル濃度１２％、濃縮ゲル濃度５％を用い、室温、２０ｍＡで１００分行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像からの量的解析はデンシトメーター（島津クロマトスキャナーＣＳ−９０００）で行った。即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを染色した後、ゲルをデンシトメーターのステージに乗せ、５７０ｎｍの透過光により各バンドの濃度を測定した。なお、筋原繊維蛋白質の非蛋白態成分の影響を除き、ばらつきを補正するために、ローリー法により各々の蛋白量を測定した。すなわち、各画分を蒸留水で希釈し、硫酸銅−クエン酸ナトリウム−炭酸ナトリウム−水酸化ナトリウムを含む溶液に溶解し、フェノール試薬を加え７５０ｎｍで吸光度を測定した。標準物質として、牛アルブミンを使用した。
【００３５】
筋原線維蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を図５に示した。貯蔵５日目以降に分子量３０ｋＤａ付近に新しいバンドが２本出現し、貯蔵日数が進むにつれ、このバンドは濃くなる傾向があった。逆に、分子量４０ｋＤａ付近のバンドの中で、トロポニン−Ｔと考えられ３７ｋＤａのバンドは１５日目以降消滅し、分子量マーカー位置から推定して４０ｋＤａのバンドは薄くなる傾向があった。
この新しく出現した３０ｋＤａのバンドをデンシトメーターで測定し、貯蔵中の変化を見た。その３０ｋＤａ画分の変化を筋原線維蛋白総量に対する割合（３０ｋＤａ成分指数）で示したのが図６であり、アクチンに対する割合（対アクチン比）で示したのが図７である。
図６に示されるように、３０ｋＤａ成分指数は、２０日目まで二次曲線的に増加しその後は変化がなかった。前記の官能検査及び硬さの変化などの結果を勘案すると、３０ｋＤａ成分指数が約８０でほぼ熟成が完了し、１００以上が最適熟成時期であることが判明した。
また、図７に示されるように、対アクチン比は１５日目以降急激に上昇した。前記の官能検査及び硬さの変化などの結果を勘案すると、対アクチン比が約０．０３でほぼ熟成が完了し、０．０５以上が最適熟成時期であることが判明した。
【００３６】
実施例４
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＡＰＤＨ画分の測定
筋漿蛋白質測定用検体には、実施例２に記載の筋原線維調製時に得られた遠心分離上清液を用いた。筋漿蛋白質を、２．５％  ＳＤＳ、５％  ２−メルカプトエタノールを含む０．５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解し、３分間煮沸水中で加熱処理を行った。そして、実施例３に記載と同様の条件で電気泳動し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像から量的解析を行った。
筋漿蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を図８に示した。貯蔵１０日目以降、特に貯蔵１５日目以降に約３６ｋＤａ付近のバンドが消失する傾向が観察された。３６ｋＤａのバンドは、ＧＡＰＤＨ（１４４ｋＤａ）のサブユニットであると考えられる。
【００３７】
ＧＡＰＤＨサブユニットのバンドをデンシトメーターで測定し、貯蔵中の変化をみた。そのＧＡＰＤＨサブユニットの変化を筋漿蛋白総量に対する割合（ＧＡＰＤＨ指数）で示したのが図９であり、ミオグロビンに対する割合（対ミオグロビン比）で示したのが図１０である。図９に示されるように、ＧＡＰＤＨ指数は、１５日目まで急激に減少し、その後は殆ど変化しなかった。前記の官能検査及び硬さの変化などの結果を勘案すると、ＧＡＰＤＨ指数が約１０００でほぼ熟成が完了し、５００以下が最適熟成時期であることが判明した。
また、図１０に示されるように、対ミオグロビン比は、１０日目まで急激に減少し、１５日目まで漸減したが、その後は変化しなかった。前記の官能検査及び硬さの変化などの結果を勘案すると、対ミオグロビン比が４でほぼ熟成が完了し、２以下が最適熟成時期であることが判明した。
【００３８】
実施例５
Ｐ１ペプチド及びＰ２ペプチドの測定
背最長筋の挽肉５ｇに０．１％メルカプトエタノールを２２ｍｌ加え、１分間のホモジナイズを行った。この懸濁液に５０％のトリクロロ酢酸を３ｍｌ加え混合後、一晩冷蔵庫で静置し、遠心分離後濾過した。ペプチド分析には、この上清（除蛋白して得られた酸可溶性抽出物）を用いた。ペプチドの分離、分取はＯＤＳカラム（センシューパックＶＰ−３１８、４．６×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで行った。溶出液にはＡ液として０．０９％のＴＦＡを含む蒸留水及びＢ液として０．０８％のＴＦＡを含む８０％のアセトニトリルを使用し、溶出開始時にＡ液１００％ととし、８０分後にＡ液５０％、Ｂ液５０％のグラジェント法でペプチドを溶出した。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃で、試料は分析時には１００μｌ、分取時に５００μｌ注入した。なお、連続して分取した後濃縮したペプチドは、アミノ酸配列をプロテインシークエンサー（アプライドバイオシステム社製、４７７Ａ）で分析し、由来蛋白質を調べるためにホモロジー検索を行った。
【００３９】
ＯＤＳカラムを用いて酸可溶性抽出物をＨＰＬＣで溶出したところ、初めはアミノ酸が溶出され、その後は低分子ペプチドが溶出された。貯蔵期間の違うペプチドの分離を示したクロマト図を図１１に示す。貯蔵期間が長くなるに伴い分離されたペプチドのピークが大きくなる傾向があり、熟成によりオリゴペプチドが増加することから、これらペプチドを熟成度の指標として使用できることが示された。また、前述のように、熟成により味が強くなり美味しくなることが解っており、このデータからも、熟成によりペプチドが増加するために、美味しくなることが示唆された。
【００４０】
図１１における種々のペプチドの内のＰ１及びＰ２ペプチドを有効な熟成指標として選別した。熟成期間中のＰ１及びＰ２ペプチド量の変化を図１２及び図１３にそれぞれ示す。図１２に示されるように、Ｐ１ペプチドは生成量が多く、熟成により著しく増加することから、検出が安易な熟成指標として好適である。また、図１３に示されるように、Ｐ２は熟成２０日目まで増加し、その後やや減少するペプチドであった。前述のように、熟成１５〜２５日目が最も美味しい時期であることが解かっており、Ｐ２ペプチドは美味しい時期が分かる熟成指標として好適であることが判明した。
いずれのペプチドも上記と同じＨＰＬＣで分取・精製し、ペプチドシークエンサーでアミノ酸配列を決定した。その結果、Ｐ１はアミノ酸配列が式（１）で示される１６残基のペプチド（配列番号１）で、トロポニンＴ由来の分解物であることが判明した。また、Ｐ２はアミノ酸配列が式（２）で示される１２残基のペプチド（配列番号２）で、ＧＡＰＤＨ由来の分解物であることが判明した。Ｐ２ペプチドは豚ＧＡＰＤＨとホモロジーが一致した。
【００４１】
また、別途牛肉を４℃の条件下に貯蔵し、前記の方法と実質的に同様にしてＨＰＬＣに付し、Ｐ１ペプチド及びＰ２ペプチドに相当する画分を分取・精製し、ペプチドシークエンサーでアミノ酸配列を決定した。その結果、牛肉においても、Ｐ２ペプチドに相当する画分は、Ｐ２ペプチドと同じアミノ酸配列を有していた。また、Ｐ１ペプチドに相当するペプチドは、前記式（３）に示されるアミノ酸配列（配列番号３）を有することが明らかになった。これらは熟成度の指標として利用できることが示された。
【００４２】
【配列表】
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【００４３】
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【００４４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】熟成期間中の遊離アミノ酸総量及びペプチド総量の変化を示す図である。
【図２】熟成期間中の肉の硬さの変化を示す図である。
【図３】熟成期間中の筋原線維の形態の変化を示す図である。
【図４】熟成期間中のＭＦＩの変化を示す図である。
【図５】熟成期間中の筋原線維蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの変化を示す図である。
【図６】熟成期間中の３０ｋＤａ成分指数の変化を示す図である。
【図７】熟成期間中の対アクチン比の変化を示す図である。
【図８】熟成期間中の筋漿蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの変化を示す図である。
【図９】熟成期間中のＧＡＰＤＨ指数の変化を示す図である。
【図１０】熟成期間中の対ミオグロビン比の変化を示す図である。
【図１１】豚肉試料の酸可溶性抽出物のＨＰＬＣ溶出パターンの変化を示す図である。
【図１２】熟成期間中のＰ１ペプチド量の変化を示す図である。
【図１３】熟成期間中のＰ２ペプチド量の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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