(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表されるグルコース誘導体。
【化１】
0003704173.tif 000018
（式中、ｎは１〜４の整数を表し、Ｉは非放射性ヨウ素原子または放射性ヨウ素原子を表す。）
【請求項２】
放射性ヨウ素原子がＩ−１２３、Ｉ−１２５またはＩ−１３１である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式IIで表される請求項１ないし２記載の化合物の前駆体。
【化２】
0003704173.tif 000019
（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なグルコース誘導体、詳しくは動物細胞の糖代謝および糖輸送系の研究や診断、特に細胞膜に存在するグルコーストランスポーターの研究に有用な新規な化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動物細胞のグルコース輸送は細胞膜表面に存在する特異的な輸送蛋白質（グルコーストランスポーター）により調節されている。この糖輸送系には促通拡散系とＮａ+ 依存能動輸送系があり、Ｄ体のピラノースを輸送基質とした促通拡散系においては阻害剤としてサイトカラシンＢが知られている。
【０００３】
これら、糖代謝や糖輸送系を研究することは動物細胞の特性を分子レベルで明らかにすることにつながり、その意義は大きい。例えば、癌細胞においては糖代謝が異常に亢進することが知られており、この癌化に伴う糖輸送の増加は主として細胞膜のグルコーストランスポーターの数の増加に基づくこと等が示唆されている。しかし、糖輸送活性に対するこれらグルコーストランスポーターの寄与等については依然不明な点が多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞における糖代謝や糖輸送系の解明に有益な情報を提供し得る新規な化合物を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、グルコースの２位の水酸基にビニル基を介してヨウ素を結合させた新規な化合物であって、すなわち、式Ｉで表されるグルコース誘導体
【化３】
0003704173.tif 000002
（式中、ｎは１〜４の整数を表し、Ｉは非放射性ヨウ素原子または放射性ヨウ素原子を表す。）であって、本グルコース誘導体が動物細胞の糖代謝や糖輸送系の研究や診断、特にグルコーストランスポーターの研究に有用であることを見出した。また、式IIで表される化合物が本グルコース誘導体の前駆体として有用であることを見出した。
【化４】
0003704173.tif 000003
（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）
【０００６】
本グルコース誘導体は in vitro の実験結果からグルコーストランスポーターに特異的かつ不可逆的に結合し、グルコースの細胞内への流入を阻害し、その結合部位はこれまでに阻害剤として知られているサイトカラシンＢとは異なり、これとは競合しない。また、ヘキソキナーゼによりリン酸化されることはなく、グルコース、フルクトース、マンノース等のようにヘキソキナーゼの基質となることはない。さらに、in vitroの実験のみならず in vivoの実験においても、本グルコース誘導体が体内において非常に安定であることが判明した。
【０００７】
上記のように本グルコース誘導体はグルコーストランスポーターに特異的かつ不可逆的に結合し、グルコースの細胞内への流入を阻害するため、促通拡散型グルコーストランスポーターの特異的阻害剤として、糖代謝の機構の研究や糖輸送系の研究等種々の研究に有用である。また、本グルコース誘導体中のヨウ素を放射性ヨウ素にすることによって、 in vivoおよびin vitroにおいて生体内の糖輸送能および組織内での糖利用能の量的測定を可能にすることもでき、また、脳、心臓、腫瘍等の臓器の体内イメージング剤として利用することも考えられる。
【０００８】
本グルコース誘導体の製造方法は、まず、1-O-メチル 4,6-O- ベンジリデン- α-D- グルコピラノシドをジメチルホルムアミド(DMF) 、テトラヒドロフラン(THF) 、ジオキサン、アセトニトリル等の溶媒中において、式III
【化５】
0003704173.tif 000004
（式中、ｎは１〜４の整数を表し、Ｘはハロゲン原子，あるいはスルホネート等の脱離基を表す。）で表される低級アルキニル化合物を反応させ、式IV
【化６】
0003704173.tif 000005
（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）で表されるモノ低級アルキニル体を得る。
【０００９】
次に、トリ-n- ブチルチンハイドライドを加え還流し、トリブチルチン化を行う。得られた式II
【化７】
0003704173.tif 000006
（式中、ｎは１〜４の整数を表す。）で表されるトリブチルチン体はシリカゲルカラム、薄層クロマトグラフィー(TLC) 、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の常套手段によって精製される。
上記トリブチルチン体は、本発明における放射性ヨウ素標識グルコース誘導体の製造に極めて有用な前駆体である。
【００１０】
次に、トリブチルチン体をテトラヒドロフラン(THF) 、ジメチルホルムアミド(DMF) 、ジオキサン、アセトニトリル等の溶媒中において、非放射性ヨウ素塩または放射性ヨウ素塩と反応させ、保護基を脱離させ、精製して目的物である式Ｉ
【化８】
0003704173.tif 000007
（式中、ｎは１〜４の整数を表し、Ｉは非放射性ヨウ素原子または放射性ヨウ素原子を表す。）で表されるグルコース誘導体を得る。
【００１１】
ここで、放射性ヨウ素とはＩ-123、Ｉ-125、Ｉ-131、Ｉ-132等で、イメージング用としてはＩ-123が好ましい。放射性ヨウ素塩としては上記放射性ヨウ素の塩を意味し、その化学形はＩ- イオンの形であればよく、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化リチウムのようなアルカリ金属塩が好適である。また、式中、ｎは１であることが望ましい。
【００１２】
本グルコース誘導体の製造にあたっては、例えばpHを調整するための酸、塩基、適当な緩衝剤、安定化剤、等張剤、あるいは保存剤を適宜使用してよく、また、シリカゲルカラムやＴＬＣ、ＨＰＬＣ等により適宜精製されることは言うまでもない。
【００１３】
上記のようにして得られた本グルコース誘導体を、動物血液および血液成分を用いて in vitro 試験に供した結果、
・血漿中のタンパク質にはほとんど結合しない。
・血液中で分解されない。
・赤血球に対して、経時的に結合する。
・不可逆的結合である。
・グルコーストランスポーターの特異的阻害剤となる。
・阻害力はサイトカラシンＢと同程度である。
・サイトカラシンＢとは結合部位が異なり、競合しない。
・細胞内へは取り込まれない。
等が判明し、これらの特徴を利用した研究用あるいは診断用試薬として有用であることが明らかとなった。
【００１４】
また、本グルコース誘導体の放射性ヨウ素標識体を体内イメージング剤として使用する時には、静脈注射した後、経時的にシンチグラムをとるか、プローブ法で放射能を測定するか、あるいはＳＰＥＣＴを用いて断層像を得て本グルコース誘導体の臓器器官および組織への取り込みを測定することができ、このとき、本グルコース誘導体は投与直後から脳や肝臓等のグルコース代謝のさかんな組織に放射能の集積がみられ、その後速やかに腎臓を経て尿中に排泄される。
また、本グルコース誘導体は体内においても極めて安定で、遊離したヨウ素にみられる甲状腺への集積はほとんどみられない。
【００１５】
本放射性体内イメージング剤を被検者に投与する時の放射能量は一般に 1〜10mCi 、特に 2〜6mCiが使用されるが、目的とするイメージングを実施するのに充分な情報が得られ、かつ被検者の放射線被曝を可能な限り低くする放射能量であることが望ましい。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例をあげて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００１７】
〔実施例１〕   1-O- メチル 4,6-O- ベンジリデン-2- トリ-n- ブチルチンプロペニル-D- グルコピラノシドの合成
1-O-メチル 4,6-O- ベンジリデン- α-D- グルコピラノシド 13gに乾燥DMF 460ml を入れ、撹拌下溶解させ、NaH 2gを加え撹拌する。これに DMF 70ml で希釈したプロパギルブロマイド 5.5g を滴下させ反応させる。反応液は飽和塩化ナトリウム液とした後、クロロホルムで抽出し、式V
【化９】
0003704173.tif 000008
で表される上記構造のモノプロパギル体を得た。収量 15.5g。
【００１８】
次に、モノプロパギル体 3.68gに対して乾燥エタノール 57ml とトリ-n- ブチルチンハイドライド 10gを加え還流する。反応液は溶媒を減圧留去し、ヘキサン液とする。ヘキサン液はシリカゲルカラムに適用し精製し (溶出液  ベンゼン- アセトン 20:1)、式VI
【化１０】
0003704173.tif 000009
で表される目的物（1-O-メチル 4,6-O- ベンジリデン-2- トリ-n- ブチルチンプロペニル-D- グルコピラノシド）を得た。収率は約60% であった。
【００１９】
〔実施例２〕  1-O-メチル 4,6-O- ベンジリデン-2- トリ-n- ブチルチンプロペニル-D- グルコピラノシドの分析
実施例１で得た試料につき、ベンゼン：アセトン＝20：１を展開溶媒としてシリカゲル薄層板を用いた薄層クロマトグラフィー法で分析するとき、1-O-メチル 4,6-O- ベンジリデン-2- トリ-n- ブチルチンプロペニル-D- グルコピラノシドは Rf 約0.6 に展開され、他にスポットはほとんど認められなかった。呈色は硫酸を用いて行った。
【００２０】
〔実施例３〕  2-O-ヨウ化プロペニル D- グルコピラノースの合成
実施例１で得たトリ-n- ブチルチンプロペニル体 4g を THF 29ml に溶かし、同じくTHF に溶かしたヨウ素 1.9g を滴下し、式VII
【化１１】
0003704173.tif 000010
で表される上記構造のヨウ化プロペニル体を得た。ヨウ化プロペニル体は溶媒を減圧留去し、酢酸エチル-n- ヘキサンで再結晶し精製する。収率は83% 。
【００２１】
次に、ヨウ化プロペニル体 500mgに対して無水酢酸 8mlを加え硫酸存在下で16時間撹拌し、1,3,4,6-テトラアセチル-2- ヨウ化プロペニル-D- グルコピラノシドを得た。精製は反応液を飽和塩化ナトリウム液とした後、クロロホルムで抽出して行った。収率 66%。
【００２２】
上記方法で得たテトラアセチル体を、 pH9の乾燥メタノール／ナトリウムメトキシド液に溶解し、約 2時間撹拌し、式VIII
【化１２】
0003704173.tif 000011
で表される2-O-ヨウ化プロペニル-D- グルコピラノース (以下、ＩＶＧと略す）を得た。精製は陽イオン交換樹脂を用いて行った。
【００２３】
〔実施例４〕  2-O-ヨウ化プロペニル -D-グルコピラノース(IVG) の分析
実施例３で得られたＩＶＧをエタノールを展開溶媒とし、シリカゲル薄層板を用いた薄層クロマトグラフィー法により分析するとき、実施例３で得たＩＶＧのRf値は約0.8 であった。また同一試料の元素分析の結果を下記の表に示す。
【表１】
0003704173.tif 000012
【００２４】
当該試料の重水素化メタノールを溶媒として測定したNMR スペクトルの化学シフトと、その帰属を以下に示す。
【表２】
0003704173.tif 000013
【化１３】
0003704173.tif 000014
【００２５】
〔実施例５〕  ＩＶＧの急性毒性
ウサギ(2kg) にIVG, 120μg を投与したところ、特に異常な所見は得られなかった。
【００２６】
〔実施例６〕  ＩＶＧ(I-123) の合成
実施例１で得た1-O-メチル 4,6- ベンジリデン-2- トリ-n- ブチルチンプロペニル-D- グルコピラノシド(compound 1)約1mg を150 μl のTHF に溶解し、これに放射性NaI(I-123), compound 1と同モルの非放射性NaI(担体NaI)を含む0.08N NaOH溶液120 μl および5%酢酸ナトリウム／酢酸溶液 300μl を加える。さらに、過酸化水素／酢酸(2:1) 溶液 300μl を加え、室温下 1時間反応させる。反応後クロロホルムで抽出し、得られたクロロホルム層を減圧留去する。残渣に無水酢酸 500μl と濃硫酸 5μl を加え、室温下 2時間反応させる。反応液は中和した後、クロロホルムで抽出し、同様にクロロホルム層を減圧留去する。この残渣にメタノール／ナトリウムメトキシド液(pH10)適量を加え、室温下で反応させ目的とするＩＶＧ(I-123) を得た。収率は約50% 。
上記化合物をシリカゲル薄層板およびベンゼン／アセトン／エタノール（４：４：１）を展開溶媒として用いた薄層クロマトグラフィー法により分析するとき、放射化学的純度は 80%であった。
【００２７】
〔実施例７〕  ＩＶＧ(I-125) の合成
実施例６に記述した方法で、NaI(I-123)に代わり、NaI(I-125)を用いて合成した。収率は約50%,放射化学的純度は約90% であった。
【００２８】
〔実施例８〕  ＩＶＧ(I-125) のマウスにおける体内動態 (in vivo 実験)
ＩＶＧ(I-125) の生理食塩溶液 2μCiを ddY系雄マウスに尾静脈内投与し、ＩＶＧ(I-125) の体内動態を調べた。結果から明らかなように、ＩＶＧ(I-125) は投与後全身に分布し、その後速やかに腎臓を経て尿中に排泄された。排泄量は投与後 3時間で 70%以上に達した。尿中に排泄された放射性成分の主要なものは未変化のＩＶＧ(I-125) であった。また、単位組織重量当りの集積率で評価すると、脳や肝臓等のグルコース代謝のさかんな組織に集積する傾向が示唆された。体内における安定性は、甲状腺への集積が軽微であることから、安定であることが示唆された。
【表３】
0003704173.tif 000015
【表４】
0003704173.tif 000016
【００２９】
〔実施例９〕  ＩＶＧ(I-123) のウサギを用いたイメージング(in vivo実験)
ＩＶＧ(I-123) の生理食塩溶液1mCiを日本白色系ウサギ(JW)に頸動脈内投与し、経時的なシンチグラムを撮像した。脳に関心領域を設定し、図１に示される時間−放射能曲線を得て分析したところ、曲線は 2相性を示し、第一相, 第二相の消失速度Ｔ1/2 はそれぞれ 2.7分, 43.1分であった。ＩＶＧの投与直後から脳は明瞭に描出され、投与56分後においても明らかな放射能の集積が認められた。その他の臓器への放射能の集積は認められず、実施例７で得た結果と同様に速やかな尿中排泄が認められた。
【００３０】
〔実施例１０〕  動物での尿中代謝産物の検討
ＩＶＧの主な排泄経路は腎臓→尿であることから、マウス，ラット，ウサギにおけるＩＶＧ(I-123) ，ＩＶＧ(I-125) の尿中放射能成分の分析を行った。その結果、尿中放射能成分はその放射能のほとんどが未変化体のＩＶＧ(I-123) およびＩＶＧ(I-125) であった。
【００３１】
〔実施例１１〕  SDラットの血漿中でのＩＶＧ(I-123) のタンパク質結合性(in vitro 実験)
NCA-IVG(I-123;無担体のIVG)の生理食塩溶液をSDラットに頸動脈内投与し、投与後 2分のラット血液から遠心分離した血漿をゲル濾過し、血漿中のタンパク質にIVG(I-123)  が結合しているかを検討した。ゲル濾過画分のオートウェルによる計測結果を図２に示す。ラット血漿中の放射活性の溶出パターンとコントロールとして非放射性のIVG (IVG担体) をゲル濾過した溶出放射活性パターンが同一であることから、ラット血漿中のIVG(I-123)は遊離の状態で存在しタンパク質にはほとんど結合しないと判断された。
【００３２】
〔実施例１２〕ＩＶＧ(I-125) のJWウサギの血漿中での代謝(in vitro 実験)
JWウサギ血液から遠心分離により血漿と赤血球を調製し、ＩＶＧ(I-125) を加えて37℃で 3時間インキュベートした。インキュベートした後、赤血球サスペンジョンは遠心分離により赤血球（RBC)とその上清(RBC sup.)とに分離した。血漿とRBC sup.は MeOH 沈澱法によりタンパク質を除き、RBC は MeOH により溶血と抽出 (効率 98%) を同時に行い TLC分析用サンプルとした。展開後、バイオイメージアナライザー (BAS-2000) により放射能を分析した。なお、コントロールとしてＩＶＧ(I-125) のみを37℃で 3時間インキュベートしたものを用いた。結果は赤血球，赤血球上清，血漿のすべての TLCラジオクロマトグラムがコントロールと一致し、 in vitro においてもＩＶＧは分解されないと判断した。
【００３３】
〔実施例１３〕  ＩＶＧのSDラット赤血球膜表面への結合(in vitro 実験)
【００３４】
13-1. タイムコース
SDラット血液より遠心分離により赤血球を調製し、約１×109 個／ml PBS (pH 7.4) の赤血球サスペンジョンとした。この赤血球液はプレインキュベートした後、NCA-IVG(I-123)を加え37℃でインキュベートし、各時間点で取り込み反応を停止させた。反応停止後、遠心により上清と赤血球に分離しオートウェルにより放射能を計測した。
結果を図３に示す。縦軸は赤血球中の放射活性を系全体の放射活性で割った値で表した。この結果、ＩＶＧは経時的に赤血球に取り込まれ、約20分のインキュベーションで取り込み量は最大となった。また、４℃インキュベーションの条件においても検討したが、この場合経時的な取り込みの増大は観察されなかった。
【００３５】
13-2. 濃度依存性の検討
タイムコースの実験法に準じ、NCA-IVG(I-125)に IVG担体を加えることでＩＶＧの濃度を調整し、各濃度下におけるＩＶＧのSDラット赤血球への取り込みを計測した。
図４に示したように、IVG 濃度１mMまでその取り込み量は直線的に増大した。この濃度範囲ではＩＶＧ濃度に比例して取り込み量は増大すると判断された。縦軸は１μM ＩＶＧでの赤血球中への取り込み量を１として他のＩＶＧ濃度の場合を相対的に示した。
【００３６】
13-3. 阻害剤の影響
阻害実験はタイムコースの実験方法と同様の方法で、NCA-IVG(I-125)を添加する直前に阻害剤を終濃度１mMとなるように加えてインキュベートした。
図５の縦軸はコントロール（阻害剤の非存在下）を100%とした相対値で示した。結果から明らかなようにＩＶＧの取り込みは１mMのこれらの阻害剤では阻害されないと判断された。
【００３７】
13-4. 赤血球内に取り込まれたＩＶＧのwash out
JWウサギの赤血球サスペンジョンを用いてＩＶＧを取り込ませた後に上清を除いた赤血球を調製した。この赤血球について PBS(pH 7.4)を用いて 4℃で洗浄したが、放射活性の wash out は観察されなかった。したがって赤血球内へのＩＶＧの取り込みは不可逆的なものであると考えられた。
【００３８】
〔比較例〕  D-グルコースのSDラット赤血球への取り込みに及ぼすＩＶＧの阻害効果(in vitro 実験)
14-1. タイムコース
実験方法はＩＶＧの取り込み実験に準じ、放射性核種標識グルコースは14C-グルコースを用いた。インキュベーション温度は37℃と 4℃の 2条件でインキュベーションした後、赤血球のみを調製して、その後溶血し一部を固形シンチレーターにアプライして液体シンチレーションカウンターにより放射活性を計測した。表５に 600秒までのタイムコースを 4℃と37℃の条件について示す。その結果から 4℃と37℃のどちらでも経時的なグルコースの取り込みが観察されたが、37℃の方が同時間点での取り込み量が大きく、 600秒までの範囲で直線性を有してした。37℃のインキュベーションは、より長時間点のタイムコースを検討したので、その結果を図６に示す。図６からグルコースの取り込みは45分までの範囲では直線性を有していることが明らかとなった。
【表５】
0003704173.tif 000017
【００３９】
14-2. 濃度依存性の検討
タイムコースを評価した実験と同様に、14C-グルコースを加える直前に非放射性のグルコースを加えて反応系中のグルコース濃度を調整し、取り込み率を検討した。条件は37℃, 10分間のインキュベーションとした。
図７に結果を示す。反応系中のグルコース濃度が 1〜100 μM までは濃度に比例して赤血球への取り込み量が増大するがそれ以上では飽和してくると考えられた。GLUT 1（グルコーストランスポーターの一種）に対するグルコースのKm値は
1〜 2mMと言われており、本結果は妥当なものと判断された。
【００４０】
14-3. 阻害剤の影響
実験方法は濃度依存性の実験に準じ実施した。
図８にコントロールを100%とした時の各阻害剤存在下での結果を示した。図８から明らかなように、グルコースの取り込み阻害剤としてすでに知られているものは予想される結果を示し、実験系選択の適正さが裏付けられた。
ＩＶＧはグルコースの取り込みを阻害したが、その阻害の程度は促通拡散型グルコーストランスポーターの特異的阻害剤であるサイトカラシンＢと同程度であり、阻害剤として強力な作用であると判断された。
【００４１】
〔実施例１５〕  ＩＶＧによる阻害様式(in vitro 実験)
赤血球サスペンジョンに０〜1000μM のＩＶＧを加え37℃，10分間インキュベーションした後、遠心分離により取り込まれなかったＩＶＧを除いた。ＩＶＧを取り込ませた赤血球は再び赤血球サスペンジョンとして14C-グルコースを加えて37℃で30分間インキュベートした後、赤血球中の放射活性を液体シンチレーションカウンターにより計測した。
結果を図９に示す。図９から明らかなようにグルコース取り込みに対するIVG の50% 阻害濃度は約２５μM であると考えられた。また、このin vitro実験系におて阻害効果が確認されたことにより、ＩＶＧは赤血球膜表面に存在するグルコーストランスポーターに不可逆的に結合し、赤血球内には取り込まれないと考えられた。
【００４２】
【発明の効果】
ＩＶＧはグルコーストランスポーターの膜表面に特異的かつ不可逆的に結合し、赤血球内には取り込まれないという性質を有すると判断され、グルコーストランスポーターの研究に有用な試薬となる。また、サイトカイシンＢとは異なる結合部位を有する特異的阻害剤である。
また、本グルコース誘導体中のヨウ素を放射性ヨウ素にすることによって、in vivo およびin vitroにおいて生体内の糖輸送能および組織内での糖利用能の量的測定を可能にすることもでき、また、脳, 心臓, 腫瘍等の臓器の体内イメージング剤として研究や診断に利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＩＶＧ(I-123) を投与したJWウサギの脳に関心領域を設定した時の時間−放射能曲線。
【図２】  ＩＶＧ(I-123) を投与したラット血漿のカラムクロマトグラフィー。
【図３】  ＩＶＧ(I-123) のラット赤血球への取り込みのタイムコース。
【図４】  ＩＶＧ(I-123) のラット赤血球への取り込みにおける濃度依存性。
【図５】  ＩＶＧ(I-123) のラット赤血球への取り込みに対する各種阻害剤の影響。
【図６】  D-グルコースのラット赤血球への取り込みのタイムコース。
【図７】  D-グルコースのラット赤血球への取り込みにおける濃度依存性。
【図８】  D-グルコースのラット赤血球への取り込みに対する各種阻害剤の影響。
【図９】  D-グルコースのラット赤血球への取り込みに対するＩＶＧの阻害効果。
【図１】
0003704173.tif 000020
【図２】
0003704173.tif 000021
【図３】
0003704173.tif 000022
【図４】
0003704173.tif 000023
【図５】
0003704173.tif 000024
【図６】
0003704173.tif 000025
【図７】
0003704173.tif 000026
【図８】
0003704173.tif 000027
【図９】
0003704173.tif 000028