(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大規模発酵槽中での培地中におけるグラム陰性細菌細胞培養の溶存酸素濃度の突然の変化の発生を判定する方法であって、
（ａ）細胞培地全域の溶存酸素濃度が発酵中均質でないように構成された小規模発酵槽において、設定供給速度で導入される炭素／エネルギー源の存在下で細胞の培養を行い；
（ｂ）細胞増殖の間に溶存酸素濃度をゼロ又はゼロ近くまで至らしめる量の細胞量が産生された後に、炭素／エネルギー源の供給速度を増大させ、
（ｃ）炭素／エネルギー源の供給速度を増大させた後に、溶存酸素濃度対時間の傾きに非直線性が生じるかどうか、又は溶存酸素濃度に変動が誘発されるかどうかを決定することを含み、（ｉ）溶存酸素濃度対時間のグラフにおいて緩やかな傾きが急な傾きへ変化するか、又は（ｉｉ）溶存酸素濃度の変動が、炭素／エネルギー源の供給速度の増加によって生じるかの何れかの場合に、溶存酸素濃度の突然の変化の発生が判定される方法。
【請求項２】
炭素／エネルギー源が糖である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖がグルコースである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
発酵槽が１０リットル容量を有する請求項１ないし３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
発酵槽がその頂部に炭素／エネルギー源を導入するための注入口を有する請求項１ないし４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
発酵槽が２組のインペラを有する請求項１ないし５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
発酵槽が溶存酸素用プローブとレドックスプローブを有する請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記プローブが発酵槽の最も底部側のインペラに近接して設けられた請求項７に記載の方法。
【請求項９】
発酵槽の中心には、２組のインペラが互いに上下になるように連結された垂直軸が配設され、該インペラは細菌培養物の表面より有意に下方に位置せしめられ、発酵槽の底部には気体注入手段が設けられると共に、細胞培養物の溶存酸素濃度とレドックス電位をそれぞれ測定するために用いられる溶存酸素用プローブとレドックスプローブとが何れも底部のインペラに近接せしめられて発酵槽に接続される一方、発酵槽の頂上部には液体注入手段が配設されてなる請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの製造のための大規模な細菌発酵の際に特に見出される溶存酸素の不安定性の発生を測定する方法に関する。また本発明はかかる方法に直接使用して好適な発酵槽にも関する。
【背景技術】
【０００２】
比較的同質の、生物学的に活性なポリペプチド及びタンパク質の大量生産は、ヒト及び動物の製薬製剤、酵素、及びその他の専門薬品の作製には経済的に重要である。多くのタンパク質の製造に関して、組換えDNA技術は、大量の外来性タンパク質は他の汚染しているタンパク質を持たない細菌及び別の宿主細胞で発現し得るという理由から、選り抜きの方法となっている。生体触媒として機能する細胞又は細胞部分を製造するための組換えDNA技術によるタンパク質の発現もまた重要な用途である。
組換えタンパク質の製造には、タンパク質をエンコードするDNAを有する宿主細胞を導入することと、組換えタンパク質の発現に好都合な条件下でその細胞を成長させることとが関連する。原核生物である大腸菌(E.coli)は、組換えタンパク質を高収量で作製するのに用いることができるため、宿主として有利である。タンパク質をエンコードするDNAの一般的な細菌発現については、数多くの米国特許がある：米国特許第4,565,785号（細胞外又は周辺細胞質の担体タンパク質に関する細菌遺伝子及び非細菌遺伝子から成る組換えDNA分子について）；米国特許第4,673,641号（凝集体を形成するポリペプチドとの外来ポリペプチドの相互作製について）； 米国特許第4,738,921号（trpプロモーター／オペレーターを有する発現ベクター及びIGF-1のようなポリペプチドとのtrp LE融合について）；米国特許第4,795,706号（外来タンパク質に封入する発現制御配列について）；及び米国特許第4,710,473号（IGF-1をエンコードするような特定環状DNAプラスミドについて）。
細菌生物体の電子伝達連鎖(electron transfer chain)は、電子を基質から分子酸素へ伝達することができる。シトクロム(cytochrome)は、電子をフラボタンパク質(flavoprotein)から分子酸素へ電子を連続的に伝達する作用をする電子伝達連鎖上の鉄含有電子伝達タンパク質の1グループである。電子伝達連鎖の末端シトクロムはシトクロムオキシダーゼと呼ばれる。
【０００３】
細菌発酵槽の一部分が低溶存酸素(DO２)濃度になると、細菌はシトクロムdオキシダーゼ複合体を製造するよう誘発される（Fu等、Mol. Gen. Genetics,226: 209-213，1991）。この複合体は、通常用いられるシトクロムoオキシダーゼ複合体よりも酸素に対する親和性は高い（Anraku及びGennis, TIBS, 12: 262-266，1987)。従って、それが存在すると、シトクロムd複合体により細菌が低酸素濃度の条件下で好気的呼吸を続けることが可能となる。
ユビキノンは、活発な好気的成長の間に、細菌に通常使われる電子伝達連鎖の電子伝達媒介物質である。しかし、平衡段階に近づいているとして大雑把に定義される状態では（Neidhardt FC等（編集）Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Vol.1，American Society for Microbiology,Washington,DC, 1987，p.180におけるPoole及びIngledew,"Pathways of Electrons to Oxygen,"）、代わりの電子伝達媒介物質、メナキノンの生成が誘発される。大抵の高細胞密度の発酵では、手順の大部分は、およそ平衡段階にあるかその段階に近づいている状態の細胞を用いて実行される。これは、酸素減損を避けるための炭素／エネルギー源の制限、生成物形成を誘発させるために講じられる処置、又は生成物の存在に起因するものであろう。
【０００４】
シトクロムdオキシダーゼ複合体は、ユビキノンに対するよりもメナキノンに対してより高い親和性を有しており(上記のAnraku及びGennis)、メナキノンがあればその主要な電子伝達媒介物質として、多分、メナキノンを使うであろう。残念ながら、それらの電子伝達媒介物質としてメナキノンを使う生物は、その成長効率が大幅に低下する。ユビキノンを欠いている生物の好気的成長収率は、野生型生物のそれの約30%である（Wallace及びYoung, Biochim. Biophys. Acta, 461: 84-100，1977）。シトクロムdオキシダーゼ又はシトクロムoオキシダーゼのような突然変異した電子伝達媒介物質を有する微生物の例は、次の諸氏によって報告されている：Oden等、Gene, 96:29-36 (1990); Oden及びGennis, J.Bacteriol., 173:6174-6183 (1991); Kelly等、J.Bacteriol., 172:6010-6019 (1990); Iuchi等、J.Bacteriol., 172:6020-6025 (1990); Soberon等、J.Bacteriol., 172:1676-1680 (1990); Poole等、J.Gen.Microbiol., 135:1865-1874 (1989); Fang等、J.Biol.Chem., 264:8026-8032 (1989); James等、FEMS Microbiol. Lett. 58:277-281 (1989); Green等、J.Biol.Chem., 263:13138-13143 (1988); Soberon等、J.Bacteriol., 171:465-472 (1989); Sharma等、Indian J.Microbiol., 27:26-31 (1987);Yang, Arch. Microbiol., 144:228-232 (1989); Matsushita及びKaback, Biochemistry, 25:2321-2327 (1986); Tamura-Lis及びWebster, Arch.Biochem.Biophys., 244:285-291 (1986); Au等、J.Bacteriol., 161: 123-127 (1985); Mclnerney等、Eur.J.Biochem., 141: 447-452 (1984); Lorence等、J.Bacteriol., 157:115-121 (1984); Kranz等、J.Bacteriol., 156:115-121 (1983); Green及びGennis, J.Bacteriol., 154:1269-1275 (1983); Bryan及びKwan, Antimicrob.Agents Chemother.,19: 958-964 (1981); Willison等、FEMS Microbiol. Lett. 10:249-255 (1981);Willison及びHaddock、FEMS Microbiol. Lett. 10:53-57 (1981); Hoffman等、Eur.J.Biochem., 105: 177-185 (1980); Hoffman等、Eur.J.Biochem., 100: 19-27 (1979); Haddock及びSchairer, Eur.J.Biochem., 35: 34-45 (1973); Haltia等、EMBO L., 8:3571-3579 (1989);Dikshit等、Arch.Biochem.Biophys., 293: 241-245 (1992); Lemieux等、J.Biol.Chem., 267:2105-2113 (1992); Minagawa等、J.Biol.Chem., 267:2096-2104 (1992); Dassa等、Mol.Gen.Genet., 229: 341-352 (1991); Williams等、Biochem. J., 276:555-557 (1991); Puustinen等、Biochemistry, 30: 3936-3942 (1991); Denis等、J.Biol.Chem., 265:18095-18097 (1990); Chepuri等、Biochim.Biophys.Acta, 1018: 124-127 (1990); Andersson及びRoth, J.Bacteriol., 171:6734-6739 (1989); Puustinen等、FEBS Lett., 249: 163-167 (1989); Daldal, J.Bacteriol., 170:2388-2391 (1988); Poole及びWilliams, FEBS Lett., 231: 243-246 (1988); Georgiou等、J.Bacteriol., 169:2107-2112 (1987); O'Brian及びMaier, J.Bacteriol., 161: 507-514 (1985); Green等、J.Biol.Chem., 259:7994-7997 (1984); Au等、J.Bacteriol., 157:122-125 (1984); Matsushita等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80: 4889-4993 (1983); Sasarman, Rev.Can.Biol., 31: 317-319 (1972); Van der Oost等、EMBO J.,11: 3209-3217(1992); Deutch, 92nd General Meeting of the American Society for Microbiology, New Orleans. LA, May 26-30, 1992, Abstr.Gen.Meet.Am.Soc.Microbiol.,92:272 (1992); Mogi等、Biophys.J., 61:A284 (1992); Tron及びLemesle-Meunier,Curr.Genet.,18:413-420 (1990); Shioi等、J.Bacteriol.,170:5507-5511 (1988); Oden及びGennis, J.Cell.Biol., 107:624A (1988); Webster及びGeorgiou, Fed.Proc., 44:abstract 678 (1985); Terriere等、Biochem.Biophys.Res.Commun., 111: 830-839 (1983); Green及びGennis, Fed.Proc., 41:abstract 3652 (1982);Tamura-Lis及びWebster, Fed.Proc., 41:abstract 2799 (1982); Green等、 Fed.Proc., 40: 1669 (1981); Willison及びJohn, J.Gen.Microbiol., 115:443-450 (1979);Hashimoto及びHino, J.Sci.Hiroshima Univ.Ser.B Div. 2(Bot), 15: 103-114 (1975)。
【０００５】
細菌を培養するための発酵槽は、通常、酸素を気相から液相（即ち、培地）へ伝達するために、及び、補助的に、発酵タンク全体にわたってDO２を含む培地成分の均一濃度を維持するために撹はんされる。 本願発明は、細菌でのDNA発現を達成するため小規模な培養を実行中、発酵培地は比較的安定なDO２濃度をもっているのに、大規模な細菌発酵中は突然起こる且つ劇的な、本質的に制御不能な培地のDO２濃度の変化に遭遇する恐れがあるという予期せぬ発見に基づいている。これらの事象によって好結果を生み且つ再現性のある大規模発酵の進展が阻まれ、高品質タンパク質又はその他の生成物製造にはそれらが不向きとされてきた。培養をグルコース又は他の炭素／エネルギー源の制限下で成長させる時、炭素／エネルギー源の供給制御は、ほとんどの環境下で適当なDO２濃度を与えるようプログラムできるが；しかし、大型の反応器では、この制御作用は、険しい生物学的事象を打ち消すには十分でないことが本願発明により見いだされている。
【０００６】
従って、細菌発酵において新たに観察されたDO２の不安定性の問題を避けるための有効で且つ信頼性のある方法を提供することが、本願発明の目的である。
FDA認可の得られる改良されたGMP処理において高品質のポリペプチドを製造するため、及び／又はより高い収量でポリペプチドを製造するために、細菌発酵、特に大規模細菌発酵の好結果を生み且つ再現性のある進展を達成することは、特に目的とするところである。
さらに、細菌発酵の進行中にDO２の不安定性に関する培養の傾向を決定する方法を提供することも別の目的である。
これらの及びその他の目的は、通常の技術を有する当業者には明かになるであろう。
【非特許文献１】N.S.Lin等,「Production of heterologous proteins from recombinant DNA Escherichia coli in bench fermentors」,  Methods, vol.4, 1992, New York, NY, USA, pp159-168
【非特許文献２】S.C.W.Kwong等,「On-line assessment ofg metabolic activities based on culture redox potential and dissolved oxygen profiles during aerobic fermentation」,  Biotechnology Progress, vol.8, 1992, Columbus, Ohio, USA, pp576-579
【非特許文献３】J.R.Swartz,「Scale up of genetically engineered products」, World Biotech Report, vol.2, 1984, Pinner, UK, pp367-379
【発明の開示】
【０００７】
本願発明は、DO２含量の突然の変化は生物に由来し且つ生物の異なった呼吸経路の切換えに関係があるという予期せぬ発見に基づいている。これらの事象を完全に理解すれば、これらの事象を発酵槽及び／又は発酵プロセスの注意深い設計と操作によって防ぎ得ることが示唆される。
一つの解決策は、液相への最大の酸素送達領域、即ち槽の底部がまたグルコースの最大投入領域であるようにすることである。従って、発酵槽は、その底部にグルコースの投入口を有するように設計される。
他の発酵槽の構成では、グルコースの投入箇所と速度を、槽の種々の領域における酸素使用可能率(oxygen availability)にほぼ一致するよう槽全域に分布させることができる。
培養液の容積が増加すると撹はん機のインペラと液体容積間の幾何学的関係をしばしば顕著に変える流加培養発酵に対して、またより大きな発酵槽、即ち、少なくとも約1000リットルの容量の、好ましくは約1000乃至100,000リットルの容量の発酵槽では、発酵槽の最も効率的な使用を可能にする、本願発明が解決しようとする課題に対する好ましい解決策は、宿主生物を突然変異させてその生物が2つの電子伝達経路の切換えをできないように呼吸経路の1つの主要要素（例えば、シトクロムdオキシダーゼ複合体、シトクロムoオキシダーゼ複合体、メナキノン、又はNADHデヒドロゲナーゼの1つ）を不活性化することである。
【０００８】
特に、本願発明は、ポリペプチドをエンコードする核酸を含んでなる細菌の宿主細胞の発酵から対象のポリペプチドを製造する方法を提供するもので、その方法は、損傷電子伝達連鎖を有する、即ちそれらの呼吸連鎖の1つが不活性化されている細菌宿主細胞を使って発酵を実行することから成る。
他の態様では、本願発明は、大規模発酵槽でのDO２の不安定性に関する細菌細胞培養の性質を決定する方法であって、(a)発酵中細胞培養全体にわたってDO２の濃度が均一にならないよう形成された小規模発酵槽において、設定供給速度で導入される炭素／エネルギー源の存在下で細胞培養を行い、(b)有意の細胞量が生成された後、炭素／エネルギー源の供給速度を増大させ、(c)炭素／エネルギー源の供給速度が増大された後でDO２濃度対時間の勾配に非直線性が生ずるかどうかもしくはDO２濃度の変動が生じるかどうかを測定する方法を提供する。
【０００９】
好ましい実施態様の説明
A.定義
ここで用いられる"対象とするポリペプチド"は、一般的に、約10を越えるアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。ポリペプチドは、細菌の宿主細胞と相同であってよく、又好ましくは、酵母のポリペプチドのような宿主細胞と、又より好ましくは、ほ乳類のポリペプチドと異質であってよい。細菌のポリペプチドの例としては、例えば、アルカリ性ホスファターゼ及びβ-ラクタマーゼがある。ほ乳類のポリペプチドには分子があり、次のものが含まれる：例えば、レニン、ヒトの成長ホルモン、des-N-メチオニル・ヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；シロキシン；リポタンパク質；α1-抗トリプシン；インスリンA鎖；インスリンB鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；ロイティナイジング(leutinizing)ホルモン；グルカゴン；血餅形成因子、例えば、因子VIIIC、因子IX、組織因子、及びフォンビルブランド(von Willebrands)因子；タンパク質Cのような抗血餅形成因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキノーゼ又はヒトの尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子-アルファ及び-ベータ；エンケファリナーゼ；ヒトの血清アルブミンのような血清アルブミン；ムレリアン(mullerian)-阻害物質；レラキシンA鎖；レラキシンB鎖；プロレラキシン；マウスのゴナドトロピン会合タンパク質；β-ラクタマーゼのような微生物タンパク質；DNアーゼ；インヒビン；アクチビン；導管内皮成長因子；ホルモン又は成長因子の受容体；インテグリン；トロンボポエチン；タンパク質A又はD；リウマチ因子；神経親和性因子、例えば、骨誘導神経親和性因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3, -4, -5, 又は-6 (NT-3,NT-4, NT-5, 又はNT-6)、又はNGF-βのような神経成長因子；血小板誘導成長因子(PDGF)；aFGF及びbFGFのような繊維芽細胞成長因子；表皮成長因子(EGF)；TGF-アルファ及びTGF-ベータのような形質転換成長因子(TGF)（含TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4,又はTGF-β5）；インスリン様成長因子-I及び-II(IGF-I及びIGF-II)；インスリン様成長因子結合タンパク質；CDタンパク質、例えば、CD-3, CD-4, CD-8, 及びCD-19；エリトロポエチン；オステオインダクティブ因子；免疫トキシン；骨形質形成タンパク質(BMP)；ソマトトロビン；インターフェロン、例えば、インターフェロン-アルファ、-ベータ、及び-ガンマ；コロニー刺激因子(CSFs)、例えば、M-CSF, GM-CSF, 及びG-CSF；IL-1〜IL-10のようなインターロイキン(ILs)；スーパオキシド・ジスムターゼ；T-細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；例えばAIDS包膜の部分のようなウイルス抗原；伝達タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調整タンパク質；抗体；及び上に掲げたポリペプチトの何れかのフラグメント。
【００１０】
対象とする好ましいポリペプチドは、最小のタンパク質分解で且つ適当に再生された又は活性な物質が最大の状態で細菌細胞中に容易に生成されるようなもので、それらの予期した有用性から糖鎖形成する必要のないものである。そのようなほ乳類のポリペプチドの例には、IGF-I、成長ホルモン、DNアーゼ、レラキシン、成長ホルモン放出因子、インスリン、ウロキナーゼ、免疫トキシン、及び抗原がある。特に好ましいほ乳類ポリペプチドには、IGF-Iと成長ホルモンがある。
ここで用いられる"IGF-I"は、天然配列又は変異型の及び組換えにより生成したウシ、羊、ブタ、ウマ、及び好ましくはヒトを含む任意の種からのインスリン様成長因子を指す。好ましい方法では、IGF-Iはクローン化され、そのDNAは、例えば、1984年12月19日公開のEP 128,733に記載のプロセスで発現される。
ここで用いられる句"炭素／エネルギー源"は、細胞に対する炭素とエネルギーの源を指す。そのような源の例としては、グリセロール、コハク酸、乳酸、及び例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、及びフルクトースのような糖類がある。採用すべき特定炭素／エネルギー源の選択は、主として利用される細菌に依存することになる。E.coli発酵に対する好ましい炭素／エネルギー源は、グルコースである。
【００１１】
ここで用いられる句"電子伝達連鎖"もしくは"呼吸鎖"(respiratory chain)は、細菌の一連の"電子伝達体"(electron carriers)から構成され、電子を基質分子から分子酸素へ伝達できる鎖を指す。従って、それらは、細菌の好気性呼吸経路及び細菌内部の酸素伝達の促進に関係する。これらの電子伝達体には、限定するものではないが、NADH脱水素酵素、ユビキノン及びメナキノンのようなキノン、及びシトクロムoオキシダーゼ複合体又はシトクロムdオキシダーゼ複合体の成分が含まれる。
"損傷された"又は"不活性化"電子伝達連鎖を有する細菌は、その電子伝達連鎖を構成している電子伝達体の全部ではないが少なくとも1つを不活性または無能にするように突然変異させられた細菌を指す。この突然変異は、電子伝達連鎖に該当する遺伝子成分の欠失を経てよく、又はその代わりに、もはや上に定義されたようには機能しないような遺伝子成分のヌクレオチドの変更によってもよい。故に、例えば、もし遺伝子成分がシトクロムo又はｄオキシダーゼなら、その生物は、シトクロムdオキシダーゼの遺伝子産物ではなくシトクロムoオキシダーゼの遺伝子産物を、又はシトクロムoオキシダーゼの遺伝子産物ではなくシトクロムdオキシダーゼの遺伝子産物を生成できる。好ましい細菌生物は、不活性化シトクロムd又はoオキシダーゼ遺伝子を、より好ましくは不活性化シトクロムoオキシダーゼ遺伝子を有し、最も好ましくは後者の遺伝子を欠くものである。
ここで用いる"大規模"発酵は、容積容量、即ち作業容積が少なくとも約1000リットルで、ヘッドスペースとして適当な空間を残している発酵槽での発酵を指す。"小規模"発酵は、一般的に、容積容量が約100リットルを越えない、好ましくは約10リットルを越えない発酵槽での発酵を指す。
【００１２】
B.発明の実施形態
本願発明の目的のため、改変された宿主菌株は、その電子伝達連鎖内部に、好ましくはそのシトクロムoオキシダーゼ又はシトクロムdオキシダーゼ複合体遺伝子内部に、1つ以上のヌクレオチドの突然変異を含有しており、その結果、電子伝達連鎖におけるどれか1つ以上の、但し全部でない、電子伝達体遺伝子が不活性化されている。その菌株は、好ましくは、E.coliの菌株である。そのような菌株変異型は、適切なヌクレオチドの変更を細菌の菌株DNAに誘導することにより適当に作製される。例えば、菌株変異型には、遺伝子がDO２不安定性をもたらす条件下で菌株に1つの好気性呼吸鎖から他へ切り替わらせないだけ十分な、未変性電子伝達連鎖遺伝子の核酸配列の内部のヌクレオチドからの欠失、又はその挿入又は置換がある。そのような遺伝子は、下記の実施例IIIで概説する方法により容易に同定することができる。もし最終の菌株が所望の特性を有してさえいれば、欠失、挿入、及び置換を任意に組合わせて最終的菌株へ到達させることができる。
細菌菌株の変異型の設計に当たり、最適特性は主として突然変異の性質によって左右される。突然変異の部位（又は部位群）は、例えば、(1)先ず、保存的アミノ酸選択物をエンコードするヌクレオチドで、続いて、得られた結果に基づいてより根本的な選択物で置換するか、(2)標的ヌクレオチドを削除するか、又は(3)定められた部位に隣合って同一か又は別種のアミノ酸をエンコードするヌクレオチドを挿入することにより、又は、選択肢1-3の組合わせにより、別々に又は連続して変更してよい。
ヌクレオチド変更の好ましい方法は、電子伝達体遺伝子の領域の又はその内部の配列欠失である。これらの欠失は、特定遺伝子又は欠失される遺伝子に依存して、一般に、少なくとも2ヌクレオチドから約5.8キロ(x 1000)塩基以上の長さになり、典型的には連続している。E.coliのシトクロムoオキシダーゼ遺伝子の長さは、5.8キロ塩基である。Chepuri等、J.Biol.Chem., 265:11185-11192 (1990)。連続した欠失は、通常、偶数の残基群でなされるが、単一又は奇数数の欠失はこの範囲内である。
核酸の配列挿入は、電子伝達体遺伝子内部の一般には約1から5ヌクレオチド、最も好ましくは1〜3の範囲にある単一又は多重ヌクレオチドの配列内(intrasequence)挿入である。挿入は、好ましくは偶数の残基群でなされるが、このことは要件ではない。
【００１３】
ここでの第三グループの変異型菌株は、核酸の置換変異型である。これらの変異型は、未変性細菌分子が取除かれその場所に別の残基が挿入された電子伝達体遺伝子内部に少なくとも1つの核酸を有する。電子伝達体遺伝子生成物の活性の実質的変更は、(a)例えば、シート状又は螺旋形立体配座のような、置換領域の鎖の背骨構造、(b)標的部位での分子のチャージ又は疎水性、又は(c)側鎖の大きさ、を維持する際のそれらの効果が顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生ずる残基は、共通の側鎖特性に基づくグループに分けられる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、cys,met,ala,val,leu,tyr,phe,trp,ile;
(2) 中性親水性：ser,thr;
(3) 酸性：asp,glu;
(4) 塩基性：asn,gln,his,lys,arg;及び
(5) 鎖方位に影響を及ぼす残基：gly,pro.
好ましくは、ここにおける菌株の変異型は、E.coli W3110tonAの背景を有しており、そこでは電子伝達体分子の完全遺伝子が削除され、そして最も好ましくは、そこではシトクロムoオキシダーゼ複合体の完全遺伝子が取除かれている。
野生型細菌宿主に導入される変異型遺伝子は、当業者に公知の種々の方法で作製される。これらの方法には、限定するものではないが、もし突然変異誘発が生体内で行われるならトランスポゾン(transposon)突然変異誘発、又は電子伝達体遺伝子の早めに作製された変異型又は非変異型バージョンの例えばオリゴヌクレオチド仲介（又は部位指向）突然変異誘発、アラニン走査突然変異誘発、無作為突然変異誘発、PCR突然変異誘発、又はカセット突然変異誘発による生体外作製が含まれる。
【００１４】
好ましい方法の一つであるトランスポゾン突然変異誘発は、典型的には、例えば、Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)によって説明されているように、P1由来のファージP1kcでの形質導入(trasductions)に関連する。それはまた、例えば、Kleckner等、J. Mol. Biol., 116: 125-159 (1977)によって説明されているように、トランスポゾン遺伝をも包含するかも知れない。
オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発は、随意に他の方法も使ってよいとはいえ、電子伝達体遺伝子の置換、欠失、及び挿入変異型を作製するための好ましい生体外の方法を代表するものである。この技法は、ZollerとSmith, Nucleic Acids Res., 10: 6487 (1982)によって記述されているように当業者に周知である。簡単に言えば、電子伝達体DNAは、所望の突然変異をエンコードするオリゴヌクレオチドをDNA鋳型にハイブリッド形成させることにより変更され、ここでその鋳型は、電子伝達体遺伝子の未変更又は天然のDNA配列を含んでいるプラスミド又はバクテリオファージの一本鎖の形状である。ハイブリッド形成後、鋳型の第二の相補鎖の全体を合成するためにDNAポリメラーゼが使われ、従ってオリゴヌクレオチド・プライマーが編入され、且つ電子伝達体DNAの選択変更が指定されることになる。
一般的に、長さが少なくとも25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適のオリゴヌクレオチドは、突然変異をコード化するヌクレオチド（ヌクレオチド群）のどちら側かで鋳型に完全に相補的である12〜15のヌクレオチドを有するであろう。これによって、オリゴヌクレオチドが一本鎖のDNA鋳型分子と適切にハイブリッド形成するであろう、ことが保証される。オリゴヌクレヲチドは、Crea等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978)よって説明されたような当業者に公知の技法を使って容易に合成される。
DNA鋳型は、バクテリオファージM13ベクターから誘導されるようなベクター（市販のM13mp18及びM13mp19が適合）か、又はViera等、Meth. Enzymol.,153: 3 (1987)が説明しているように一本鎖ファージの複製起点を含んでいるようなベクターによって生成することができる。従って、突然変異が予定されているDNAをこれらのベクターの1つに挿入して一本鎖の鋳型を生成してよい。一本鎖鋳型の作製法は、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 1989)の第4.21-4.41節に記述されている。
【００１５】
あるいは、一本鎖のDNA鋳型は、標準の技法を使って二本鎖プラスミド（又は他の）DNAを変性することにより生成してよい。
突然変異誘発のための好ましい配置である電子伝達体遺伝子の一定のヌクレオチド又は領域を識別する有効な方法は、CunninghamとWells, Science, 244:1081-1085 (1989)によって記述されているように「アナニン走査突然変異誘発」と呼ばれている。ここでは、残基又は標的残基群が識別され（例えば、arg, asp,his, lys, 及びgluのような帯電残基）、そして中性又は負に帯電のアミノ酸（最も好ましくは、アラニンかポリアラニン）によって置き換えられて、アミノ酸と細胞中の又は外部の外界水性環境との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対し機能上の感受性を示すこれらの領域は、さらに又は他の変異型を置換部位に又はそれに対して導入することにより精製される。従って、アミノ酸配列の変種を導入するための部位は前もって決められるが、突然変異の性質は、それ自体予定するには及ばない。例えば、与えられた部位で突然変異の性能を最適化するために、アナニン走査又は無作為突然変異誘発が標的コドン又は領域で行われ、発現された電子伝達体の変異型は所望の活性をもつ最適組合わにふるい分けられる。
未変性のDNA配列の変更に関して、他の方法は、Kunkel等、Methods Enzymol.,154: 367 (1987)によって記述されたようにオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発と無作為突然変異誘発の組合わせである。この方法では、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発は、野生型電子伝達体遺伝子から特定コドンを無作為抽出して可能な全ての残基をエンコードするために用いられる。選ばれたコドンの両側に隣接する相補的配列（約10-15塩基）を有するオリゴヌクレオチドのプールが用いられる。選ばれたコドンは、32コドンで可能な全てのアミノ酸をエンコードするオリゴヌクレオチドのプールをもたらすために、ヌクレオチドNNS（ここでNは任意のヌクレオチド、SはG又はC）で置き換えられる。
この好ましい方法では、一本鎖の複製起点を有するpBR322由来プラスミドは、CJ236のようなE.coli dut-ung-菌株(上記Kunkel等)で一本鎖プラスミドの鋳型として作製される。菌株でのこれらの2つの突然変異は、チミンの代わりに1つ以上のウラシルヌクレオチドを一本鎖DNAに取込む原因となる。無作為オリゴヌクレオチドは、アニールされ、E.coliファージT7 DNAポリメラーゼで満たされ、結合され、W3110のようなE.coliの野生型菌株に変換される。野生型菌株は、約90%の突然変異体を産するよう鋳型として合成突然変異体の鎖を使ってウラシルの取込み違い(misincorporation)を修正する。
【００１６】
突然変異体DNAは、いくつかある方法の1つで生成してよい。もしアミノ酸がポリペプチド鎖に共に密接して配置されるなら、それらは所望のアミノ酸置換の全てをコード化する1つのオリゴヌクレオチドを使って同時に突然変異させてよい。しかし、もしアミノ酸がお互いにある距離をもって（約10を越えるアミノ酸だけ分離して）配置されるなら、所望の変更の全てをエンコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することはさらに困難である。その代わりに、2つの代替法のうちの1つを採用してよい。
最初の方法では、別々のオリゴヌクレオチドが置換されるアミノ酸の各々に対して生成される。その後、そのオリゴヌクレオチドは一本鎖の鋳型DNAに同時にアニールされ、その鋳型から合成されるDNAの第二の鎖によって所望のアミノ酸置換の全てがエンコードされることになる。その代替法は、望みの突然変異体を作り出すために突然変異誘発について2つ以上のラウンドを必要とする。第一ラウンドは、単一の突然変異体に関して記述された通りである：鋳型として野生型DNAを使い、最初の所望アミノ酸の置換（複数置換）をエンコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型についてアニールし、次いでヘテロ二本鎖DNA分子を生成する。突然変異誘発の第二ラウンドは、突然変異誘発の第一ラウンドで生成した突然変異のDNAを鋳型として利用する。このように、この鋳型は、既に1つ以上の突然変異を含んでいる。次いで、所望の追加アミノ酸の置換（複数置換）をエンコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型についてアニールし、得られるDNA鎖は、今度は、突然変異誘発の第一及び第二の両ラウンドからの突然変異をエンコードする。この得られたDNAは、突然変異誘発の第三ラウンド以降で鋳型として用いてよい。
当業者に周知の一つの方法であるPCR突然変異誘発もまた、電子伝達体遺伝子のヌクレオチド変異型を作るのに適している。PCR技術は、一般に、Erlich編集、PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)のR.Higuchi記述の章、p.61-70に説明されている手法に属するものである。
【００１７】
変異型を作製する別法、カセット突然変異誘発は、Well等、Gene, 34: 315(1985)に記載の技術に基づいている。その出発物質は、突然変異する電子伝達体DNAから構成されているプラスミド（又は他のベクター）である。突然変異する電子伝達体DNAのコドン（コドン群）が同定される。同定した突然変異部位（部位群）の各側では特異的制限エンドヌクレアーゼがなければならない。そのような制限部位が何ら存在しないなら、それらを電子伝達体DNAの適当な位置に導入する上述のオリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発方法を使って生成してよい。制限部位をプラスミドに導入した後、そのプラスミドをこれらの部位で切断してそれを線状にする。制限部位間のDNA配列をエンコードしているが但し所望の突然変異（突然変異群）を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準手法を使って合成する。2本の鎖は別々に合成され、その後、標準手法を使って一緒にハイブリッド形成される。この二本鎖オリゴヌクレオチドがカセットと呼ばれるものである。このカセットは、それをプラスミドに直接結合できるよう、線状化プラスミドの末端と和合性のある3'及び5'末端を持つように設計される。このプラスミドは、今や、突然変異した電子伝達体DNAの配列を含んでいる。
突然変異体の核酸もまた、宿主細胞での発現に先立ち、多くの技法の何れかで化学的に合成し組立ててよい。[例えば、Caruthers, 米国特許第4,500,707号；Balland等、Biochimie, 67: 725-736 (1985)；Edge等、Nature, 292: 756-762 (1982)参照]。
一定の欠失と挿入、及び特に置換によって、電子伝達体分子の特性に根本的変化がもたらされるとは考えられない。置換、欠失、又は挿入の正確な効果をそれを行う前に予測することが困難な時は、熟練した当業者は、その効果を日常のスクリーニング検定で評価してよいと判断する。
例えば、DNAの変異型は、典型的に、未変性電子伝達体コード化核酸のトランスポゾン突然変異誘発又は無作為及び／又は部位特定突然変異誘発によって及び電子伝達体変異型遺伝子の細菌宿主染色体へのトランスフェクション又は組込みによって、又は未変性電子伝達体遺伝子を含有する宿主の無作為突然変異誘発によって、作ってよい。その後、核酸変異型を所望の特性についての適当なスクリーニング検定でふるい分けしてよい。例えば、1実施態様では、シトクロムdオキシダーゼ欠失突然変異体菌株は、シトクロムdオキシダーゼ複合体の活性に関して、分離細胞膜の分光分析によって又は実施例IIIに記載されているようなDO２の不安定性の誘発不能性によって、ふるい分けられる。DO２の安定性が高められた突然変異体菌株が選択される。
【００１８】
もし電子伝達体変異型をエンコードする核酸が、最終的に対象とするポリペプチドを産する細菌宿主の外部で生成されるなら、その核酸は、電子伝達体変異型DNAを含んでいるベクターによるトランスフェクションと変換、及び好ましくは、当業者に公知の適当な方法の何れかによる細菌細胞染色体への組込みを含む適切な方法の何れかを使って適切な細菌細胞内に導入される。電子伝達体遺伝子の宿主ゲノムへの組込みの例には、宿主としてE.coli種を使うものがある。この場合、変換のためのベクターに含まれるのは、E.coliゲノムDNAに見られる配列に相補的なDNA配列である。このベクターでのE.coliのトランスフェクションは、ゲノムとの相同的組換え及び電子伝達体変異型遺伝子の染色体への組込みに帰着する。この目的のための宿主は、対応する未変性の電子伝達体遺伝子を欠くか、もしくはその組込みで対応変異型遺伝子によって置換されたその未変性の電子伝達体遺伝子をもっている。
損傷電子伝達連鎖の活性に関して、それらが本願発明における使用に適しているかどうかを決めるためにふるい分けしてよい突然変異の細菌の例には、下記の諸氏によって記述されたようなものがある：上記のOden等；上記のOden及びGennis, J.Bacteriol.；上記のKelly等；上記のLuchi等；上記のSoberon等、(1990)；上記のPoole等；上記のFang等；上記のJames等；上記のGreen等、  J.Biol.Chem., 263；上記のSoberon等、(1989)；上記のSharma等；上記のYang；上記のMatsushita及びKaback；上記のTamura-Lis及びWebster, Arch.Biochem.Biophys.；上記のAu等、J.Bacteriol., 161；上記のMclnerney等；上記のLorence等；上記のKranz等；上記のGreen及びGennis, J.Bacteriol.；上記のBryan及びKwan；上記のWillison等；上記のWillison及びHaddock；上記のHoffman等、(1980)；上記のHoffman等、(1979)；上記のHaddock及びSchairer；上記のHaltia等；上記のDikhit等；上記のLemieux等；上記のMinagawa等；上記のDassa等；上記のWilliams等；上記のPuustinen等、Biochemistry；上記のDenis等；上記のChepuri等、Biochim.Biophys.Acta；上記のAndersson及びRoth；上記のPuustinen等、FEBS Lett.；上記のDaldal；上記のPoole及びWilliams；上記のGeorgiou等；上記のO'Brian及びMaier；上記のGreen等、J.Biol.Chem., 259；上記のAu等、J.Bacteriol.,157；上記のMatsushita等；上記のSasarman；上記のVan der Oost；上記のDeutch；上記のMogi等；上記のTron及びLemesle-Meunier；上記のShioi等；上記のOden及びGennis, J.Cell.Biol.；上記のWebster及びGeorgiou；上記のTerriere等；上記のGreen及びGennis, Fed.Proc.,41:；上記のTamura-Lis及びWebster, Fed.Proc.,41:；上記のGreen等、Fed.Proc.,40:；上記のWillison及びJohn；上記のHashimoto及びHino。
【００１９】
突然変異した電子伝達体遺伝子をもっている細菌細胞は、内在的に対象とするポリペプチドを含んでいてもよい。例えば、アルカリ性ホスファターゼは、E.coliに相同のタンパク質であり、ベクターDNAでの細胞のトランスフェクションをそれ以上行わないで誘導してよい。例えば、IGF-I及び成長ホルモンのような異質のポリペプチドについては、異種の核酸（例えば、cDNA又はゲノムDNA）は、細菌に対する適当なプロモーターの制御下で細菌の培養培地において発現できるよう複製可能なベクターに適切に挿入される。この目的には、多くのベクターが利用でき、適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで変換される特定の宿主細胞によって決まる。各ベクターは、その機能（DNAの増幅又はDNAの発現）及びそれが和合する特定宿主細胞に依存して種々の成分を含んでいる。細菌の変換に関するベクター成分は、一般に、但しこれには限定するものではないが、次のものを1つ以上包含する：シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、及びプロモーター。
一般的に、レプリコン及び宿主細胞と和合性のある種から誘導されるコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターは、細菌の宿主とともに用いられる。そのベクターは、通常、複製部位をもち、並びに変換細胞において表現型選択を提供できる配列を作る。例えば、典型的にはE.coliは、pBR322、E.coli種由来のプラスミドを使って変換される（例えば、Bolivar等、Gene, 2: 95 [1977]参照）。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、従って変換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。そのpBR322プラスミド、もしくは他の微生物のプラスミド又はファージもまた、選択性のマーカー遺伝子の発現に関して微生物により使えるプロモーターを一般的に含むか、又は含むよう改良される。
【００２０】
ここで対象とするポリペプチドをエンコードするDNAは、直接的にのみならず、別のポリペプチド、好ましくは成熟ポリペプチドのN-末端に特異的開裂部位を有するシグナル配列か又は他のポリペプチドとの融合として発現してもよい。一般的に、シグナル配列はベクターの1成分であってよく、もしくはベクターに挿入されるポリペプチドDNAの1部分であってもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって識別され且つ処理される（即ち、シグナル・ペプチターゼで開裂される）ものでなければならない。未変性のポリペプチドシグナル配列を識別且つ処理しない細菌の宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、又は熱安定エンテロトキシンIIリーダーから構成される群から選択される細菌のシグナル配列によって置換される。
発現及びクローニングベクターとも1つ以上の選択宿主細胞でベクターの複製を可能にする核酸配列を包含する。一般的に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主染色体DNAからベクターが独立して複製できるようにする配列であり、複製起点又は自律的複製配列を包含する。そのような配列は、種々の細菌についてよく知られている。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適している。発現及びクローニングベクターもまた、一般に選択遺伝子を含み、選択可能マーカーとも呼ばれる。この遺伝子は、選択培養培地で成長する変換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をエンコードする。選択遺伝子を含有するベクターで変換されない宿主細胞は、培養培地では生存し続けないであろう。典型的選択遺伝子は、(a)抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与え、(b)栄養要求性の欠失を相補し、又は(c)複合媒体、例えば、バチルスに関するD-アラニン・ラセミ化酵素をエンコードする遺伝子からは利用できない重要栄養素を供給するタンパク質をコード化する。選択機構の一例では、宿主細胞の成長を阻止する薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく変換されるような細胞は、薬物耐性を与えるタンパク質を作りだし、従って選択状態を存続する。
【００２１】
異種ポリペプチドを生成する発現ベクターはまた、宿主細菌生体によって識別され、対象とするポリペプチドをエンコードする核酸に取り扱いできるように結合されるプロモーターを含む。細菌宿主とともに用いるのに適しているプロモーターには、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系(Chang等、Nature,275:615 [1978]; Goeddel等、Nature, 281:544 [1979])、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel, Nucleic Acids Res.,8: 4057 [1980]及びEP 36,776)及びtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター(deBoer等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80: 21-25 [1983])がある。しかし、他の既知細菌プロモーターも適している。それらのヌクレオチド配列は既に公になっており、それによって熟練した研究者がリンカー又はアダプターを使って対象とするポリペプチド(Sienbenlist等,Cell, 20:269[1980])をエンコードするDNAに取り扱いできるようにそれらを結合させて任意の所要制限部位を供給することが可能となる。細菌系に使われるプロモーターもまた、一般には、対象とするポリペプチドをエンコードするDNAに取り扱いできるように結合されたシャイン・ダルガルノ(Shine-Dalgarno [S.D.])配列を含んでいる。プロモーターは、制限酵素の消化分解により細菌源DNAから取り除き、所望のDNAを含んでいるベクターに挿入してよい。
上記成分の1つ以上を含んでいる適当なベクターの構成には、標準の連鎖反応技術を用いる。分離したプラスミド又はDNA断片を開裂し、要求に適合させ、そして所要プラスミドを作るのに要する形に再結合させる。
【００２２】
構成されたプラスミドの正しい配列を確認する分析では、連鎖反応混合物を用いてE.coli K12菌株294 (ATCC 31,446)又は他の菌株を変換し、うまく行った形質転換細胞を適当なアンピシリン又はテトラサイクリン耐性で選択する。形質転換細胞からのプラスミドを準備し、制限エンドヌクレアーゼの消化分解で分析し、及び／又はSanger等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74: 5463-5467 (1977)またはMessing等、Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981)の方法により又はMaxam等、Methods in Enzymology, 65: 499 (1980)の方法により配列決定する。
対象とするポリペプチドをエンコードするベクターを発現するために使われる細菌の宿主細胞は、電子伝達連鎖を仲介する取扱い可能な電子伝達体成分を少なくとも1つ含み、その結果、細胞の呼吸経路が全体的に損耗されないようなものである。ここでの方法では、この目的に利用される適当な菌株は、典型的には、その未変性電子伝達体の1つ、但し全部ではない、が不活性になるように突然変異するものである。好ましくは、この不活性化は、普通に宿主細胞に存在する未変性電子伝達体遺伝子に相同である変異型電子伝達体遺伝子で未変性電子伝達体遺伝子を置き換えることによって達成される。
古細菌(archaebacteria)と真正細菌(eubacteria)の両方を含む全ての細菌は、一般に、少なくとも2つの末端オキシダーゼ（上記のAnrakuとGennis）を有しており、従って強制嫌気性生物を除く全てのものは、培養でのDO２の不安定性に潜在的に感じ易い。この目的に向く適当な細菌には、好気性及び通性嫌気性細菌、古細菌と真正細菌のどちらか、特に真正細菌、そして最も好ましくは、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)がある。有用な細菌の例としては、大腸菌(Escherichia)、腸内細菌、アゾトバクター(Azotobacter)、Erwinia、バチルス属(Bacillus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、シゲラ属(Shigella)、リゾビア属(Rhizobia)、Vitreoscilla、及びParacoccusがある。適当なE.coliの宿主には、E.coli W3110 (ATCC 27,325), E.coli 294 (ATCC 31,446), E.coli B,及びE.coli X1776 (ATCC 31,537)がある。これらの例は、制限するためのものではなく説明のために挙げられたものである。上述の細菌の何れかの突然変異細胞も用いてよい。勿論、細菌の細胞におけるレプリコンの複製化を考慮にいれて適当な細菌を選択することが必要である。例えば、E.coli、セラチア、又はサルモネラ種は、pBR322、pBR325、pACYA177、又はpKN410のような公知のプラスミドがレプリコンを供給するのに用いられる時は宿主として適当に用いてよい。 
【００２３】
E.coli菌株W3110は、組換えDNAの生成物発酵に共通の宿主菌株という理由から、特に好ましい親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。例えば、菌株W3110は、タンパク質をエンコードする遺伝子の遺伝的突然変異を発効するよう改良してよく、そのような宿主の例では、完全な遺伝子型tonA△を有するE.coli W3110菌株1A2；完全な遺伝子型tonA△ptr3を有するE.coli W3110菌株9E4；完全な遺伝子型tonA△ptr3phoA△E15△(argF-lac)169ompT△degP41kanｒを有するE.coli W3110菌株27C7(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型tonA△ptr3phoA△E15△(argF-lac)169ompT△degP41kanｒrbs7△ilvGを有するE.coli W3110菌株37D6；非カナマイシン耐性 degP 欠失突然変異を有する菌株37D6であるE.coli W3110菌株40B4；及び米国特許第4,946,783号（1990年8月7日発行）にて開示された突然変異ペリプラズム・プロテアーゼを有するE.coli菌株がある。宿主細胞は、本願発明の上記発現ベクターで変換され、用いるプロモーターに適するように改良された在来の栄養培地で培養される。変換は、DNAが染色体外成分としてか染色体成分により複製できるようDNAを生体に導入することを意味する。用いる宿主細胞に依存して、前述の細胞に適する標準技術を使って変換が実行される。上記のSambrook等の1.82節に記載されているように、塩化カルシウムを採用するカルシウム処理は、一般に、実質上の細胞障壁を含んでいる細菌細胞に対して用いられる。別の変換法は、Chung及びMiller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988)に説明されているように、ポリエチレン・グリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法は、エレクトロポレーション（電気さく孔法）と呼ばれる技術を用いたものである。
本願発明の対象とするポリペプチドを生成するのに用いられる細菌の細胞は、例えば、上記のSambrook等において一般的に説明されているように、プロモーターを構成上又は人為的に導入できる適当な培地で培養される。適当な培地の例は、下記実施例の項で示す。
炭素、窒素、及び無機リン酸塩源のほかの必要な補足物はどれも、単独で又は別の補足物との混合物として又は複合窒素源のような培養基として導入される適切な濃度で含まれてよい。
【００２４】
もしポリペプチドがアルカリ性ホスファターゼなら、栄養培地の炭素、窒素、及びリン酸塩源の構成は、好ましくは、ポリペプチドの集中的集積段階の間は、培地のグルコースの含量は約0%、ホスファターゼの含量は約0.5 mMより多く且つ約5 mMより少なく、そして窒素の濃度は約30μg/mlを越えない。グルコースの供給は、好ましくは遷移段階中に実施する。発酵培養基は、好ましくは強く混合させ、発酵は、好ましくは約25-40℃で、より好ましくは約37℃で実施する。
遺伝子発現は、例えば、mRNAの転写を定量化する在来のノーザンブロット法により試料で直接測定してよい。Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77: 5201-5205 (1980)。種々の標識を用いてよく、最も一般的には放射性同位元素、特に３２Pが使われる。しかし、ポリヌクレオチドへ導入するのにビオチンで修飾されたヌクレオチドを使うような他の技術も用いてよい。その時、ビオチンは、アビジン又は抗体に対する結合部位として作用し、それは多種類の標識、例えば、放射性核種、蛍光体、酵素、又はそれに類するもので標識してよい。
対象とするポリペプチドは、好ましくは、分泌ポリペプチドとしてペリプラズム又は培養培地から回収するが、分泌シグナルを出さないで直接発現される時は、宿主細胞の溶菌液（ライゼート）から回収してもよい。あるいは、細胞又はその一部分を生物触媒として又は実質的精製をともなわない他の作用に関して用いてよい。
しばしば望まれるのは、対象とするポリペプチドを組換え細胞のタンパク質又はポリペプチドから精製して対象とするポリペプチドについて実質的に相同である調合を得ることである。第一段階として、培養培地又はライゼートを遠心分離して微粒子の細胞くずを取除く。その後もし必要なら、膜及び可溶タンパク質画分を分離してよい。次いで、そのポリペプチドが膜結合物か、可溶性であるか、又は凝集形で存在しているかどうかによって、ポリペプチドを可溶タンパク質画分からと培養ライゼートの膜画分から精製してよい。その後で、適切な精製手順として模範となっている次の手順で、ポリペプチドを可溶化し、必要なら折りたたみ、そして汚染可溶物のタンパク質及びポリペプチドから精製する：免疫親和性又はイオン交換カラムでの分別；エタノール沈澱法；逆相HPLC；シリカでの又はDEAEのような陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；等電点クロマトグラフィー；SDS-PAGE；硫化アンモニウム沈澱法；及び例えば、Sephadex G-75を使うゲル濾過。
【００２５】
本願発明の別の実施態様では、特別に構成した発酵装置を用いて、大規模細菌発酵の進行中におけるDO２の不安定性に関して与えられた細菌細胞培養の性質を測定する。この監視方法は小規模発酵槽を利用する。その発酵槽は、細胞培養全域のDO２濃度が発酵中は均一にならないよう構成される。この非均一性は、種々の手段で達成してよい。1つの好ましい手段は、発酵槽の頂上部に炭素／エネルギー源の導入口を設けることによる。他の構成は、発酵槽に、その上部での混合が不十分になるように、通常用いられている3基のインペラを2基だけ装着するようにする。好ましくは、炭素／エネルギー源の導入口及び2基のインペラをともに発酵槽の装備の特色とすることである。他の好ましい特徴は、発酵槽がDO２用プローブだけでなくレドックス（酸化還元）電位測定用のレドックスプローブを備えていることである。これらのプローブは、好ましくは発酵槽の最底部のインペラに最も近接させて取付ける。
この方法を用いた最も好ましい具体例は、10-リットル発酵槽であり、その線図を図1に示す。この図中、容器1は、2基のインペラ、即ち、底部3及び頂上部5インペラが、好ましくはRushton方式のインペラが装備され、通常150-1000rpmで駆動する垂直シャフト7に取付けられる。2基のインペラは、発酵培地の表面9より有意に下方に（即ち、少なくとも全培養容積の1/4下方に）配置する。ガス導入口11、好ましくはリング状空気散布器または回転する空気散布器が、空気を発酵槽の底部に、好ましくは標準で1分当たり約10リットルで導入するのに用いられる。
【００２６】
好ましくは底部インペラ3に近接して容器の壁に取り付けられたDO２プローブ13は、容器の底部にある発酵培地中に溶存した（従って生物体へ到達できる）酸素の濃度を測定するものである。その信号は、好ましくは監視・制御コンピュータへ伝送され、そこで（グルコースのような）細菌に対する炭素／エネルギー源の発酵槽への供給速度が調整される。タンクにはまた、好ましくは底部インペラ3に近接してDO２プローブと同レベルでタンクの壁に取り付けられたレドックスプローブ15も装着される。このレドックスプローブは、レドックス電位の出力を中継する信号を通して培地のレドックス電位を測定する。この構成では、炭素／エネルギー源は、配管のような液体導入口17を通して容器の頂上部に供給される。容器頂上部への供給系は図示されていないが、これは肉汁のpHを制御するために要求に応じてNH４OHを添加するのに使用される。また図示されていないが、容器頂上部への別の供給系があり、これは複合栄養培地を徐々に供給するのに用いる。
大規模発酵槽におけるDO２の不安定性に関して細菌細胞培養の性質を測定する方法は、発酵培地中に発現される所要のDNAを含んでいる細菌を上述の容器で培養することを含む。この初期培養段階中、グルコースのような細菌に対する炭素／エネルギー源が、予め決められた供給速度で発酵培地中に供給される。図1では、この供給は発酵槽の頂上導入口17を通して行われるだろう。空気は発酵槽の底部に供給する。図1では、空気は底部導入口11を通して発酵培地中に供給される。発酵培地のレドックス電位及びDO２濃度は、その各プローブ13及び15により発酵中モニタされる。
【００２７】
有意の細胞量が蓄積されると、即ち、培養が反応器の酸素移送速度を越える十分な酸素吸収能、即ち、乾燥重量で細胞リットル当たり約10-50グラム、を有する時、炭素／エネルギー源の供給速度を増加させてDO２をそのコントロール設定点からより低い値に降下させる。この供給速度の増加は、好ましくは、DO２が徐々に低下するようほんの僅かの増加にする。DO２降下の顕著な非直線性（即ち、DO２対時間のグラフでゆるやかな勾配から早い勾配への変化）及び／又は実験的に決められた比較的高い臨界グルコース供給速度でのDO２の変動を誘導する能力によって、DO２の不安定性をもたらす培養の性質が示される。
次の実施例は、限定するためではなく説明のために提供するものである。
【実施例】
【００２８】
緒言
生物は、メナキノン及びシトクロムdオキシダーゼ複合体が存在するように前もって誘導されている時、低濃度の酸素を、但し非能率的にではあるが、取出す能力を有することがここで見いだされた。十分な酸素が存在すると、この非能率的経路が機能しないようである。
細胞成長の化学量論的検討によって、酸素についての非能率的なメナキノンで助長された利用の結果が明らかにされる。E.coliのC、H、O、N組成は、ほぼC４．１８H７．３６N１O２．０３である。その時、好気的成長を記述する式は次のように書くことができる：
aC６H１６O６ + bO２ + cNH３ = dC４．１８H７．３６N１O２．０３ + eCO２ + fH２O.
この式を使えば、消費されるグルコースのモル当たりの使用酸素のモルは、下表に示すように成長率(growth yield)の関数として推定してよい：
成長率                      O２モル／グルコース・モル
(g細胞／gグルコース)
0.4                            3.1
0.1                            5.3
0.0                            6.0
もしシトクロムdオキシダーゼ複合体及びメナキノンを発現したE.coliの培養がDO２濃度の低い領域に遭遇すると、酸素に対するその親和性が比較的低いシトクロムoオキシダーゼ系は、もはや好気的呼吸を維持することができない。従って、シトクロムdオキシダーゼ仲介の呼吸経路を使わなければならない。この非能率的呼吸経路への切替えによって、ATP供給が減り、成長率がより低くなる。結果として、供給されるグルコースのモル当たりの使用酸素が増加することになる。容器はすでに低DO２濃度の局部的領域を認める状態にあるので、グルコースの供給が一定である限り、酸素消費の増加により、低DO２濃度の領域が拡大されることになる。このためにより多くの細胞が非能率経路に移され、そして局所的且つ全体的酸素要求がさらに増えることになる。
【００２９】
このように、タンク全体にわたってより高い呼吸速度の方への及び低DO２濃度の方への迅速な自己伝播変移の傾向がある。この連鎖は、不十分な呼吸に伴うより高い酸素利用率を支えるのに十分な残留酸素伝達容量が（DO２濃度が低下すると酸素推進力を増加させるように）存在する場合のみに停止するであろう。酸素を伝達するために発酵槽の最大容量を十分に利用するのが望ましい故、正常動作下で利用できるどんな余剰容量も多分十分でなく、全容器におけるDO２濃度はゼロに至るであろう。
本願発明は、この自己伝播変移の結果として効能を失するという動作傾向を克服するために必要な手段を採用している。
開示データは、容器の底部及び頂上部の両DO２レベルに追従するため大型発酵槽を改良して得た。その時、大型発酵槽におけるDO２の不安定性を再現するために改良10-L発酵槽が用いられた。シトクロムオキシターゼ複合体における突然変異は、DO２の不安定性の生物学的起源として呼吸経路間の切換えを確実にするために用いた。突然変異した宿主も、異種組換えタンパク質を作り出すそれらの適合性について評価した。驚いたことには、シトクロムoオキシターゼの突然変異体は、シトクロムdオキシターゼの突然変異体より優れており、未改良10-L発酵槽における突然変異していない同質遺伝子的(isogenic)比較宿主と比べて等価量の生成物を産した。
【００３０】
実施例I
1000-L発酵槽におけるDO２不安定性問題の検証
i. 宿主細胞菌株27C7の構築
本実施例で説明する発酵において組換えヒトIGF-1を作るのに用いた宿主は、27C7と命名された、E.coli W3110の誘導体であった。27C7の完全な遺伝子型はtonA△ptr3phoA△E15△(argF-lac)169ompT△degP41kanｒである。菌株27C7の誘導は、図2に図解されており、下記に説明する。菌株27C7は、ATCCにATCC  No. 55,244として1991年10月30日寄託。
菌株27C7は、P1由来のファージP1kc （J.Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)）、及びトランスポゾン遺伝子 [Kleckner等、J.Mol.Biol., 116: 125-159 (1977)]での形質導入関連の技術を利用する数段階で構築した。用いた出発宿主は、F-λ-のK12菌株であるE.coli K12 W3110であった[F.C.Niedhardt等、編集、Escherichiacoli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Vol. 2,American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1987)におけるBachmann, Bact.Rev.,36: 525-557 (1972); Bachman, "Derivatives and Genotypes ofSome Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12," p.1190-1219]。
先ず、tonA遺伝子 (fhuA) [F.C.Niedhardt等、編集、Escherichiacoli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Vol. 2,American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1987)におけるKadner等、J.Bact.,143: 256-264 (1980), Bechmann, Microbiol.Rev.,47: 180-230 (1983), Bachman, "Linkage Map of Escherichia coli K-12," 第7版, p. 807-876]を、tonA遺伝子への挿入及びその後のTn10トランスポゾンの不正確除去によってW3110から欠失した。この構築法は、図3(B)及び4に図解。
【００３１】
本処理の第一段階で、E.coli W3110は、λ::Tn10で形質導入され、E.coli W3110のTn10 hopプールを生成した[上記Kleckner等、J.Mol.Biol.,]。
E.coli W3110のTn10 hopプールは、37℃のL肉汁で約1 x 10９/mlの細胞密度まで成長させた。全体で0.5mlの培養を遠心分離し、そのペレットを7.0 x 10９pfuを含有する0.2mlのλphi80溶菌液で再懸濁した。ファージを37℃で30分間吸収させた。次いで、その懸濁液は、テトラサイクリン(15μg/ml)を補ったEMBプレート上に塗って広げた。37℃で一晩保温した後、コロニーは、3mlのL肉汁でプールし、37℃で一晩成長させ、2回洗浄し、L肉汁で再懸濁した。バクテリオファージ P1kc溶菌液は、この培養に関して作った[上記のMiller, J.H., Experiments in Molecular Biology, p.304]。
E.coli AT982 (no. 4546, E.coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.)は、このP1kc溶菌液でテトラサイクリン耐性に形質導入した。導入体は、テトラサイクリン(15μg/ml)と40μg/mlのジアミノピメリン酸(jap)を補ったL肉汁プレート上で選択した。得られた導入体は、テトラサイクリン耐性及びdap遺伝子
(dap+, tetＲ)の再生成に関してふるい分けした。次いで、遺伝子型 dap+, tetＲを有する導入体をλphi80耐性に関して試験した。
P1kc溶菌液は、次いで、dap+, tetＲ, λphi80耐性のいくつかの菌株に関して作製した。溶菌液は、E.coli W3110をテトラサイクリン耐性に形質導入するために使用した。導入体は、λphi80耐性に関してふるい分けし、選択した。
テトラサイクリン感受性の分離集団は、W3110 tonA::Tn10-λphi80R導入体から選択した。[MaloyとNunn, J.Bacteriol., 145: 1110 (1981)]。これらの分離集団は、単一コロニーの精製後λphi80耐性及びテトラサイクリン感受性に関して調査した。
【００３２】
DNAは、テトラサイクリン-感受性λphi80-耐性のいくつかの突然変異体から分離し、Sstllで消化分解した。Sst-ll-消化分解DNAは、Tn10が削除されているかどうかを決めるプローブとして放射能で標識され且つSstll-消化分解のλ::Tn10 DNAを使用するサザンブロット(Southern blot)法で特性を明らかにした[Davis等、Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980)]。テトラサイクリン感受性分離集団の1つは、λ::Tn10からのDNAと親のW3110 tonA::Tn10λphi80Rとのハイブリッド形成と比べて2つのTn10ハイブリッド形成帯を失ったことが示された。第三のハイブリッド形成帯は、Tn10の不正確除去に起因する欠失が生じていたことを示す変更移動度を有していた。
不正確なTn10除去に関する菌株からの外部膜作製の標本のSDS-ゲル電気泳動で、tonAでエンコードされたタンパク質であると想定される帯は、tonA遺伝子でエンコードされた野生型タンパク質と比べて変更された電気泳動移動度を有する、ことが明かとなった。得られたタンパク質は、λphi80ファージ受容体タンパク質として機能しなかった。やはりTn10の不正確削除を受けた第二の独立菌株は、SDSゲルでtonAによってエンコードされたタンパク質は何ら示さなかった。
これらの菌株のどちらもテトラサイクリン耐性又はλphi80感受性への復帰を示さず、このことは、tonA遺伝子の部分的又は完全な欠失と共にTn10トランスポゾンの全部又は部分の不正確除去があることを示している。従って、tonA遺伝子(MW 78,000)でエンコードされたタンパク質は、外部膜から削除し、W3110 tonA菌株をいくつかのバクテリオファージに対して耐性を持たせた。この得られた菌株（1A2と命名）はバクテリオファージT1及びφ80に対して耐性がある。
ptr3遺伝子[Cheng等、J.Bacteriol., 140: 125-130 (1979)]は、次のように菌株1A2に導入した。先ず、thyA8突然変異体をトリメトプリム(trimethoprim)耐性に関して選択することにより1A2で分離し菌株9E1を形成した。次いで、argA81::tn10遺伝子座を（B.Bachman, E.coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.から得た）ファージP1kcでの形質導入により9D9から9E1に輸送して9E3を形成した。ptr3遺伝子座は、thyA8とargA81との間にある。ptr3突然変異体[9D7, J.Bact.,140: 125 (1979)]で成長させたP1ファージでの形質導入は、thyAと8argA81::Tn10の野生型座への変換と同時にptr3突然変異を導入することに帰着した。この菌株（9E4）は、ペリプラズム・プロテアーゼIIIを欠いている。ptr3突然変異は9E4に含まれるという結論は、得られた菌株における強力に改善されたIGF-Iの蓄積によって支持されるものである。
【００３３】
次いで、さらに2つの欠失突然変異、phoA△E15 [Sarthy等、J.Bacteriol.,145: 288-292 (1981)]及び△(argF-lac)169 [SchweizerとBoos, Mol.Gen.Genet., 192: 293-294 (1983)]、は、Purdue大学Barry Wanner教授から得た、6D3に含まれた、プロリン生合成遺伝子proC::Tn5に挿入されたカナマイシン-耐性トランスポゾンへの遺伝子結合によって、9E4へ同時に転移した。
トランスポゾンは、1A2でP1形質導入後、グルコース最少の寒天平板上でプロトン放出(pro+)分離集団に関して選択することにより削除した。phoA突然変異の導入によりアルカリ性ホスファターゼの発現が除去され、0.2mMリン酸塩と20mg/lの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸を有するグルコース最少寒天平板上で白色コロニーを形成する導入体として識別された。同様に、△(argF-lac)169突然変異は、酵素β-ガラクトシダーゼ（lac-表現型の一つ）の損失の原因となり、MacConkey-1%ラクトース寒天平板上で白色コロニーを形成する細胞に帰着する。得られた菌株は、27A7と命名された。
ompT欠失 [Earhart等、FEBS Microbiol.Lett., 6: 277-280 91979)]をP1の同時形質導入(cotransduction)により27A7に導入した。このompT欠失は、コリシンBとDに対する付加タンパク質についてコードする隣接のent遺伝子クラスターにまで及ぶ、ということは注意すべきである。先ず、purE遺伝子における結合Tn10の挿入異変は、慣用の形質導入技術を使ってompT欠失の次へ挿入された[中間体 3E9 (Wisconsin大学Dr.Carol Grosから入手可能なものと類似の菌株), 16B2, 25C9 (J.Bacter., 153: 1104-1106 (1983)),及び25D3]。次いで、purE::Tn10を27A7に形質導入した。最後に、この菌株をプリンプロトトロフィーに形質導入してトランスポゾンを削除した。ompT△の遺伝子型の維持は、得られた菌株でのコリシンBの耐性によって確認した（27C6と命名）。この菌株は外部膜のプロテアーゼVIIを欠いている。
【００３４】
最後に、ペリプラズムプロテアーゼの突然変異、degP41kanｒ [Strauch等、J.Bacteriol., 171:2689-2696 (1989); Harvard Medical School]を標準技術によって菌株27C6に形質導入した。この突然変異は、生体外で、degP遺伝子の区（セクション）をカナマイシン遺伝子と置き換えることにより構成した。これはトランスポゾンではないが，カナマイシン耐性を用いて欠失の選択を認める。
この最終菌株、27C7、は、次の特性を有する：ファージ耐性があり、3つのプロテアーゼを欠き、ラクトースで成長せず、且つ培地で、rhIGF-Iの生成を誘導するのと同一の条件で、ホスファターゼの消耗に基づくアルカリ性ホスファターゼを生成しない。
ii. IGF-1発現プラスミドpLS32Tscの説明／構築
菌株27C7を形質変換するのに使用される分泌プラスミドpLS32Tscは、IGF-1遺伝子を含んでいる。E.coliにおいてIGF-1遺伝子を発現するために要する転写・翻訳配列は、アルカリ性ホスファターゼプロモーターとtrpシャイン・ダルガルノ配列によって与えられる。λtｏ転写終結区は、IGF-1の終止コドンに隣合って置かれる。シトプラズムからのタンパク質の分泌は、lamBシグナル配列又はその代わりとしてSTIIシグナル配列によって指図される。rhIGF-Iの大半は、細胞のペリプラズム空間で見られる。プラスミドpLS32Tscは、形質転換した宿主に対してテトラサイクリン耐性を与える。
【００３５】
プラスミドpLS32Tscは、中間体としてプラスミドpLS32, pAPlamB, pLS32lamB,及びpLS33Tscを使って数段階で構築した。
段階1: pLS32
プラスミドpLS32は、熱安定性エンテロトキシンII (STII)シグナル配列のそれに対するIFG-1の融合で生じ、図5に示すように4つのDNA断片を一緒に結合することにより作製した。これらの始まりは、組織因子遺伝子を含有するNsλ-BamHIの小断片が取り除かれているベクターpTF2A12 [Paborsky等、Biochemistry, 28: 8072-8077 (1989)]であった。STIIシグナル配列は、Picken等、Infectg.Immun., 42: 269-275 (1983)によって説明されている。
第二の断片は、成熟IGF-1の最初の18アミノ酸をエンコードする55-bp合成二重らせんであった。この二重らせんは、次の配列を持つ：
5'-GGTCCCGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAGTTTGTTTGCG-3'
3'-ACGTCCAGGGCTTTGAGACACGCCACGACTTGACCAACTGCGAGACGTCAAACAAACGCCACTG-5'
(それぞれ、SEQ. ID NOS.1及び2)
連結反応の第三の片は、IGF-1の残りのアミノ酸 19-70をエンコードするpK1ZZIGF-1からの154-bp BstEII-HindIII断片であった。pK1ZZIGF-1は、カナマイシン-耐性プラスミドであって、合成IGF-1遺伝子に対する界面Asn-Glyをエンコードし、さらに高コピー数を与えるF領域を含んでいる2つのコドンを使って融合された、IgGsと分泌タンパク質を結合するタンパク質Aからの2つの共通Z領域に付着した、タンパク質Aのシグナルに付着したタンパク質Aプロモーターに付着したlacプロモータを含んでいる。このプラスミドは、EP Pub.No.230,869（1987年8月5日発行）の図6で示され、そこで説明されたpZZ-IGF-1と類似しており、そこではアンピシリン遺伝子はカナマイシン遺伝子で置き換えられる。
最後の断片は、プラスミドpLS8からの291-bp HindIII-BamHI断片であった。この最後の断片は、単純にpBR322テトラサイクリン遺伝子の開始に対するコーディング配列であり [Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 43: 77-90 (1978)]、そこではHindIIIの制限部位がメチオニン開始コドンの即上流で処理された。
得られるプラスミド、pLS32、は、効率よく発現し、培地にrhIGF-1を分泌する。次の2つの構成段階は、STIIシグナル配列をlamBシグナル配列で置き換え生成物収量を改善するために実施された。
【００３６】
段階2: pAPlamB
プラスミドpAPlamBは、図6に示すように、2つのDNA断片を一緒に結合することにより構成し、APプロモーター及びtrpシャイン・ダルガルノ配列の下流でlamBシグナルコーディング配列の配置で生ずる。連結反応に含まれたのは、Xbal-Bg/II小断片が取り除かれているベクターpRA1であった。このプラスミドは、phGH1の誘導体であり[Chang等、Gene, 55: 189-196 (1987)]、その後者のプラスミドは、APプロモーター、そのSTIIシグナル、及びhGHをエンコードするDNAを含んでいる。pRA1は、それがhGHよりはむしろレラキシンA鎖（その配列は米国特許第4,758,516に記載）をエンコードするDNAを含んでおり、且つプロモーターとリボソーム結合部位の下流に好都合なBg/II制限部位を含んでいるということでphGH1とは異なっている。連結反応の第二の片は、次の配列を有する80-bpの合成DNA二重らせんであり、それは、ClementとHofnung, Cell, 27: 507-514 (1981)によって説明された、lamBシグナル配列をエンコードする：
5'-CTAGAATTATGATGATTACTCTGCGCAAACTTCCTCTGGCGGTTGCCGTCGCAGCGGGCGTAATGTCTGCTCAGGCCATGGCCA-3'
3'-TTAATACTACTAATGAGACGCGTTTGAAGGAGACCGCCAACGGCAGCGTCGCCCGCATTACAGACGAGTCCGGTACCGGTCTAG-5'
(それぞれ、SEQ. ID NOS.3及び4)
段階3: pLS32lamB
プラスミドpLS32lamBは、lamBシグナル配列のIGF-1コーディング領域に対する融合で生じ、図7に示すように、3つのDNA断片の連結反応で構成した。これらの始まりは、XbaI-BstEIIの小断片が取り除かれているベクターpLS32であった。第二は、lamBシグナル配列をエンコードするpAPlamBからの75-bp Xbal-Eaelであった。第三は、成熟IGF-1の最初の18アミノ酸をエンコードする55-bpの合成DNA二重らせんであり、次の配列を持つ：
5'-GGCCGGTCCCGAAACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAGATTTGTTTGCG-3'
3'-CCAGGGCTTTGAGACACGCCACGACTTGACCAACTGCGAGACGTCAAACAAACGCCACTG-5'
(それぞれ、SEQ. ID NOS.5及び6)
【００３７】
次の段階は、転写ターミネーターをプラスミドに導入する。これらのプラスミドの変化は、生成物の収量改善に帰着。
段階4: pLS33lamB
プラスミドpLS33lamBは、pLS32Tsc生成における中間体であり、図8に示すように、3つのDNA断片を共に連結することにより構成した。これらの始まりは、XbaI-BstEIIの小断片が取り除かれているベクターpLS32であった。第二は、lamBシグナル配列をエンコードするpAPlamBからの75-bp Xbal-Eaelであった。第三は、次の配列を有する46-bpの合成DNA二重らせんであった：
5'-GGCCACTCTGTGCGGTGCTGAACTGGTTGACGCTCTGCAGTTTGTTTGCG-3'
3'-TGAGACACGCCACGACTTGACCAACTGCGAGACGTCAAACAAACGCCACTG-5'
(それぞれ、SEQ. ID NOS.7及び8)
上記の配列は、成熟IGF-1のアミノ酸4-18をエンコードする。
段階5: pLS33Tsc
プラスミドpLS33Tscは、IGF-1コーディング配列の即下流にλtｏ転写ターミネーターを配置することで生ずる。このプラスミドを構成するのに、3つのDNA断片を図9に示すように一緒に連結した。第一片は、XbaI-BamHIの小断片が取り除かれているベクターpLS18であった。pLS18は、hGHよりはむしろ（1990年7月12日発行のWO 90/07572に開示されているような）ヒトのDNアーゼをエンコードするDNAを含んでいるphGH1の誘導体[上記のChang等]である。phGH1は、同一の断片を作るのに用いることができた。連結反応の第二の部分は、HindIII制限部位がDNAポリマラーゼI(Klenow)で処理することにより平滑化されているpLS33lamBからの288-bpのXbal-HindIIIであった。連結反応の第三の部分は、プラスミドpdH108-4からの412-bp Stul-BamHI断片であった。この断片は、λtｏ転写ターミネーター[ScholtissekとGrosse, Nuc.Acids Res., 15: 3185 (1987)]とpBR322[上記Sutcliffe]の塩基対2-375とを含んでおり、ここで塩基対2-375は、転写ターミネーターの下流にあるか又は3'である。この断片のターミネーター領域の配列は次の通り：
5'-CCTAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGTTAA-3'
3'-GGATTGCGAGCCAACGGCGGCCCGCAAAAAATAACAATT-5'
(それぞれ、SEQ. ID NOS.9及び10)
【００３８】
段階6: pLS32Tsc
最終プラスミドpLS32Tscは、図10に示すように、2つのDNA断片を共に連結することにより構築した。これらの始まりは、EcoRI-BstEIIの小断片が取り除かれているベクターpLS33Tscであった。第二は、APプロモーター、trpシャイン・ダルガルノ、及びIGF-1の最初の18アミノ酸に融合したlamBシグナル配列に対するコーディング配列を含んでいるpLS32lamBからの550-bp EcoRI-BstEIIであった。得られたプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼの消化分解によって分析した。全プロモーター及びコーディング配列は、DNAの配列決定によって、図11に示されるヌクレオチド配列(SEQ. ID NO.11)とlamBとIGF-1のタンパク質融合のアミノ酸配列とを有していることが確証された。
【００３９】
iii. 発酵及び回収処理
A. 形質転換
能力E.coli 27C7細胞は、標準の形質転換の手法を使ってpLS32Tscで形質転換した。形質転換細胞(transformant)は、20 mg/Lのテトラサイクリンを含んでいるLBプレート上で選択・精製した。この培地は次の組成を有する：10 g/Lバクト-トリプトン(Bacto-Tryptone)、5 g/L酵母抽出物、10 g/L塩化ナトリウム、及び20 mg/Lテトラサイクリン-HCl。
形質転換したコロニーの1つは、20 mg/Lのテトラサイクリンを含んでいる無菌のLB肉汁を接種するのに用いた。フラスコの培養は、550nmの光学密度が約1.0に到達するまで35-39℃で保温した。無菌のDMSOを培養に添加し、DMSOの最終濃度を10% (v/v)とした。1-2 mLのアリコートを無菌ガラスびん中に分散し、-60℃以下の低温で保管した。
B. 発酵の接種材料
10-L発酵槽の接種材料は、先ず、テトラサイクリン含有の約500 mlの無菌LB培地が入っている2-リットル振とうフラスコを上述の新たに解凍した1-2 mlの培養ガラスびんを用いて接種することにより作成した。このフラスコを35-39℃で8時間保温し、実施例D節で記述する生産培地の入った10-リットル発酵槽へ移した。10-リットル発酵槽の接種材料（源）は35-39℃で約5-8時間50-200rpmで保温（即ち、25 OD(光学密度)まで成長）した。次いで、その接種源を図12の1000-L発酵容器へ移した。
【００４０】
C. 発酵装置
図12は、1000-L規模での細菌由来の組換え生成物製造用発酵システムの概略図を示す。容器は、全容積が約1500-Lで、公称実用容積が（ヘッドスペースを含めて）1000-Lである。容器には、通常150-300rpmで動作するトップドライブ式の垂直シャフトに取り付けた3基のRushton方式のインペラを装備。リング状の空気散布器を、標準で分当たり約1000リットルの空気を発酵槽の底部へ導入するのに用いる。容器壁の底部インペラ近くに取り付けたDO２プローブによって、液体に溶解した（従って生物体に到達できる）酸素の濃度が測定される。その信号は監視・制御用コンピュータへ送られ、そこで発酵槽へのグルコースの供給率が調整される。
この構成では、グルコース供給ラインの滅菌を簡略化できるようグルコースは容器の頂上部へ供給される。図面に示していないが、容器頂上部への供給ラインは、肉汁のpHを制御するため要求に応じてNH４OHを添加するのに使用する。また図示されていないが、容器頂上部への別の供給ラインがあり、これは複合栄養素を徐々に供給するのに用いてよい。
【００４１】
D. 発酵処理
1000-L容器には、開始時に、下記から構成される600-800リットルの発酵培地が包含されている：  
原料                                  量／リットル
グルコース＊                           250-350 g
硫酸アンモニウム                       2-6 g
水酸化アンモニウム                     pH 7.1〜7.5に調節する量
リン酸ナトリウム、一塩基二水化物       1-2 g
リン酸カルシウム、二塩基               2-3 g
クエン酸ナトリウム、二水化物           0.5-1.5 g
塩化カルシウム                         1-2 g
25% Pluronic Polyol L61                当初0.2 ml及び発泡制御に要する量
硫酸マグネシウム、七水化物             1-3 g
テトラサイクリン HCl                   5-20 mg
酵母抽出物＊＊                         5-15 g
NZアミンAS＊＊                         5-20 g
イソロイシン                           0-10 g
塩化第二鉄、七水化物                   10-30 mg
硫酸亜鉛、七水化物                     2-5 mg
塩化コバルト、六水化物                 2-5 mg
モリブデン酸ナトリウム、二水化物       2-5 mg
硫酸銅、五水化物                       2-5 mg
ホウ酸                                 0.5-2 mg
硫酸マンガン、一塩基                   1-3 mg
＊  最初に1-5 g/Lのグルコースを培養に添加した。残りは発酵過程全体にわたって培養に供給した。
＊＊酵母抽出物とNZアミンASは、最初に添加してよく及び／又は発酵全体を通して供給してよい。
【００４２】
発酵処理は、35-39℃-pH 7.1-7.5で実施した。撹はん速度は、150-300 rpmに設定し、通気速度は、分当り培養容積当り空気容積0.7-1.5に設定した。培地内のリン酸を欠失した後にIGF-1の生成が発生した。
コンピュータ・アルゴリズムは、DO２プローブの読みの増分を用い、グルコースの初期添加量が欠失され、次いで生体をその最大成長速度に近い成長速度に維持するためにDO２の読みが空気飽和の30%まで降下してしまうまで50%-グルコース溶液が供給されたのは何時かを検出した。その後、コンピュータで標準の比例・積分(PI)制御アルゴリズムを使ってグルコースの供給を調節し、DO２の読みを30%に維持した。
約12時間の保温後、初期添加のリン酸を削除した。細胞合成に少な目のグルコースが使われており、従ってより低いグルコース供給速度で酸素移送速度と一致する酸素消費が行われるので、コンピュータでグルコース供給速度を減らして30%のDO２を維持した。
【００４３】
iv. 結果
図13は、IGF-1を生成する本実施例の1000-L発酵に対し時間の関数としてグルコースのポンプ速度（図13(A)）とDO２の読み（13(B)）を示すものである。12時間で、コンピュータは30%のDO２で制御しているが、すぐ後でリン酸が欠失し、グルコース供給速度が、制御アルゴリズムの作用で落ち始めた。しかし、図から分かるように、この移送によって、コンピュータが制御できなかったDO２濃度の激しい変動が誘発された。グルコース供給速度が減じた後でさえ、不安定状態が続いた。約16時間で、グルコース供給速度を手動制御下におき一定の供給速度を維持した。DO２濃度はほぼ一定のまま保持され、極めて徐々に減少して約28%に到達した。この点で、DO２濃度に急峻な降下があった。
全時間にわたって調べると、DO２の記録に共通パターンがあるように見えた。このことは図14により詳細に示されており、1分間隔で記録したDO２の読みとグルコース供給速度を示している。一定のグルコース供給速度であっても、DO２濃度は、約25%まで徐々に降下した後劇的に落ち込んでいる。2分以内で、DO２濃度は、25%からゼロに落ちた。
発酵槽及びその支援装置は、そうした観察の原因となる誤動作について検査した。何も見つからなかった。
【００４４】
実施例II
DO２の不安定性を検討するための2つのDO２プローブの使用と代替供給配置
図15は、DO２の不安定性をさらに検討するために改良した1000-L発酵槽の概略図である。DO２プローブは、それがリン酸欠失時に丁度発酵培地に浸漬されるよう容器の頂上部近くに取り付けた。グルコースの供給ラインは、グルコースの入口点が発酵中に発酵槽の頂上から底部まで変えられるよう改造した。
発酵は、DO２の急峻な落下を防ぐためDO２が40%で制御されたこと以外は実施例Iに説明したように実施した。グルコースは容器の頂上部に供給した。リン酸欠失後、グルコース供給速度をその新たな疑似定常状態の値になるようにし、グルコース供給速度を再度手動制御下においた。DO２の不安定性の再現誘導性(reproducible inducibility)についてテストするため、グルコース供給速度を次いで小さい増分で徐々に増やして行き、DO２プローブの読みがゼロに落ちるまで続けた。その後、グルコース供給速度を減らして明確な制御可能DO２レベルを回復した。
グルコース添加点がグルコース供給増加に対するDO２応答に影響を及ぼしたかどうかを決めるために、第二段階の実験を行った。グルコース供給点をタンクの底へ切り替え、DO２制御を40%に再設定した。グルコース供給速度を再度増分で徐々に増やしていってDO２をゼロに到達させた。グルコース供給速度を再度減らしてDO２レベルを回復させた。この全行程をその後繰り返した。
図16は、一連の繰返しサイクルから得た結果を示す。最初の一組のサイクルから得た結果は類似しており、DO２不安定性の再現誘導性を示唆している。先ず、グルコースを発酵槽の頂上部へ供給して、DO２を（底部のDO２プローブによって）40%設定点での制御下においた。次いでグルコース供給速度を手動制御下におき、供給速度を8%だけ上げた。
【００４５】
均一の反応器において、この一連の事象から酸素吸収率の8%増加が導き出されるが、それはまた必要酸素を気相から液相に移送する酸素の8%増加を必要とする。1バールの超過圧力が発酵槽に加えられ、液体の静水頭が推定でさらに0.2バールの圧力を作用させるので、簡単な計算から、酸素濃度の推進力8%増は、40%から約26%へのDO２濃度の低下によって得られるであろうことが示唆される。
底部のDO２の読みは、事実、40%から約25%へ低下し、そこで新たに平衡になることが予想された。しかし、この点で底部のDO２の読みはゼロに落ち込んだ。これは実施例Iで説明された実験についてなされた観察の再現であった。重要なことは、ほとんどの経過を通して、頂上部のDO２プローブの読みは、底部のDO２プローブの読みより20%以上低くかったことである。このことは、発酵肉汁容積全般にわたってのDO２濃度の顕著な不均一性を示している。グルコース供給速度を増やした後約15分間は、頂上部プローブの読みは底部プローブの読みとほぼ同じ率で減少した。底部プローブの読みにおける急峻な降下が誘発されたのは、頂上部プローブの読みがゼロに達した時であった。
【００４６】
グルコースが容器の底部に供給される時、頂上部と底部のプローブの読みの一致は、DO２の不均一性がより少ないことを示唆した。再度、底部のDO２プローブによって制御を40% DO２に設定し、グルコース供給速度を8%だけ上げた。今度は、新規の定常状態がほぼ予想したDO２の読みで達成された。 グルコース供給速度をさらに8%増やすと、DO２の読みは再び減少し、ほぼ予想値で安定した。明らかに安定した動作は、約10% DO２で確立された。最後に、グルコース供給速度をさらに5%増やすと、酸素利用度と酸素推進力の計算から推定されるように、DO２の読みはゼロに落とされた。
これらの結果から、図13に示されたDO２の不安定性は、容器全体に均一な溶存酸素濃度を供給することにより防ぎ得ることが示唆される。この特殊な発酵槽で、発酵槽底部へグルコースを供給することによりDO２の均一性が顕著に改善された。大型の及び／又はより複雑な発酵槽（例えば、冷却コイル付き発酵槽）では、DO２の均一性を達成するのははるかに困難であろう。
結果はまた、（発酵槽の底部でのDO２モニタ中に観察された）DO２の不安定性事象は、発酵肉汁の頂上部での測定可能なDO２濃度の枯渇と同時に起こることを示唆している。これらの結果は、複雑で且つ極めて急速の水力学的現象か全酸素利用率を高めた非常に低いDO２濃度で誘発された突発的生物学的事象のいずれかを示唆するものである。
【００４７】
実施例III
変形した10-L発酵槽でのDO２不安定性の再現
実施例IIの結果は確かに有益であるが、1000-L規模の実験は困難且つ高価である。それ故、ベンチ規模、即ち10-Lの作業容積の発酵槽でDO２の不安定性現象を作り出す方法を開発することが望まれた。
i. 発酵槽
図1は、ここで用いた変形型10-L発酵槽の概略図を示す。通常は、発酵槽は3基のRushton-方式のインペラを使うであろう。この変形した構成では、頂上のインペラを取り除き、発酵槽を比較的高い液体容積で動作させる。これによって混合が不十分な大きい領域が発酵肉汁の頂上部で作られることになる。グルコースは、大規模な構成を模擬し、さらにDO２の不均一性の一因となるよう発酵槽17の頂上部へ供給される。最後に、レドックスプローブ15を通常のポーラログラフ・DO２プローブ13に追加して装着する。これから分かるように、これによってDO２プローブの読みがゼロかその近くになった時の培養に関する情報が提供される。
ii. 宿主生物
用いた宿主生物は、rbs7欠失（リボース無し）を有すること及び復元されたilvG遺伝子座を有すること以外は実施例Iで用いたもの(27C7)と同一であった。両マーカーは、P1の形質導入によって導入した。その生物は37D6と命名されている。
【００４８】
iii. IGF-1発現プラスミド pBKIGF2Bの説明／構築
IGF-1発現プラスミド pBKIGF-2Bにおいて、E.coliのIGF-1遺伝子を発現するために要する転写・翻訳配列は、アルカリ性ホスファターゼプロモーターとtrpシャイン・ダルガルノ配列によって与えられる。λtｏ転写終結区は、IGF-1の終止コドンに隣合って置かれる。シトプラズムからのタンパク質の分泌は、lamBシグナル配列又はその代わりとしてSTIIシグナル配列によって指図される。rhIGF-Iの大半は、細胞のペリプラズム空間で見られる。プラスミドpBKIGF-2Bは、形質転換した宿主に対してテトラサイクリン耐性を与える。
プラスミドpBKIGF-2Bは、中間体としてプラスミドpLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tsc,及びpRanTscを使って数段階で構築した。
段階1: pLS32Tsc
このプラスミドは、実施例Iで説明したようにして構築した。
段階2: pLBIGFTsc
段階a: pLamBIGF
連結反応の最初の部分については、pBR322からEcoRI-PstIベクターの断片を分離した。連結反応の第二の部分については、PstI-NcoIの1244-bp断片をpAPLamBから分離した。連結反応の第三の部分については、最初の5'末端を除いたIGF-1遺伝子を含んでいるHaeII-EcoRIの196-bp断片をプラスミドp200から分離した。p200はpBR322由来のプラスミドであって、5'から3'のオーダで、キレチン(chelatin)プロモーター、MFアルファIプレプロシグナル配列、成熟IGF-1をエンコードするDNA、及び2-ミクロンのターミネーターを有する。それは、細菌に対してColE1の複製起点を及び酵母に対して2-ミクロン起点を含んでいる。p200の制限酵素プラスミドの線図を図17に示す。（位置1149で出発する）EcoRIのMFアルファIプレプロとIGF-1遺伝子を含んでいるp200の（位置1628で出発する）EcoRIまでのヌクレオチド配列 (SEQ.ID NO.13)を図18に与える。また図17の線図にあるHaeII, PstI, BamHI,及びSalIの制限部位は、アンダラインを引いた配列で示す。シグナル配列をIGF-1遺伝子(Ncol〜HaeII)に連結する合成DNA片は、次の配列をもって作製：
5'-CATG GCC GGT CCG GAA ACT CTG TGC GGC GC (SEQ.ID NO.14)
3'-  CGG CCA GGC CTT TGA GAC ACG C (SEQ.ID NO.15)
3つのプラスミド断片と合成DNAを一緒に連結して、図19に示すように、pLamBIGFを作った。
段階b: pLBIGFTsc
Xbal-BamHIのベクター断片を最初の連結断片としてpLS18から分離した。連結の第二部分は、上述のプラスミドpdH108-4からの412-bp StuI-BamHI断片であった。連結の第三部分は、pLamBIGFのEcoRInoの消化分解、次いでDNAポリメラーゼのクレノウフラグメント(Klenow fragment)による処理、その後Xbalの消化分解によって作製した。得られた302-bpの断片を分離した。これらの3つの断片を連結させて図20に示すようなpLBIGFTscを産した。
【００４９】
段階3: pRanTsc
Xbal-BamHIのベクター断片を最初の連結断片としてpLS18から分離した。連結の第二部分は、上述のプラスミドpdH108-4からの412-bp StuI-BamHI断片であった。連結の第三部分は、pRANTESから作製した。pRANTESは、Xbalリンカー断片それに続いてSTIIシグナル、続いてRANTESをエンコードするcDNA [Schall等、J.Immunol., 141: 1018 (1988)によって発表]、続いてBamHIリンカーを含んでいるpBR322-素地のプラスミドである。第三断片は、BamHIによるpRANTESの消化分解、次いでDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントによる処理、その後Xbalの消化分解によって作製した。得られた303-bpの断片を分離した。これらの3つの断片を連結させて図21に示すようなpRanTscを得た。
段階4: pBKIGF-2
図22に示すように、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、lamBシグナル配列、及びIGF-1の初めの15アミノ酸をエンコードするDNAを含んでいるEcoRI-PstIの540-bp断片は、pLS32Tscから削除した。IGF-1のアミノ酸16-38をエンコードするDNAを含んでいるPst-Bsp12861断片(〜70 bp)をpLBIGFTscから削除した。IGF-1のアミノ酸39-70をエンコードするDNA、ラムダ・ターミネーター、及びTcプロモーターを含んでいるBsp12861-HindIII (〜179-bp)断片をpLS33Tscから削除した。最後に、EcoRI-HindIII 〜4331bpベクター断片(pBR322-素地)をpRanTscから削除した。これらの4つの断片を連結してpBKIGF-2を得、これはAPプロモーター、lamBシグナル配列、全IGF-1タンパク質をエンコードするDNA、転写ターミネーター、Tcプロモーター、及びテトラサイクリンとアンピシリン耐性マーカーを含んでいる。
段階5: pBKIGF-2A
pBKIGF-2をPstIとClaIで消化分解し、〜245-bpの断片を分離した。これは、IGF-1のアミノ酸16-70とλTｏターミネーターを含む。pLBIGFTscをNcoIとClaIで消化分解し、ベクター断片を分離した。このベクター断片は、APプロモーター、lamBシグナル、及びTet遺伝子を含む。これらの2つの断片は、NcoIからPstIまでのIGF-1 DNAの5'末端を次のように合成的に誘導したコドンと置き換える合成DNA片と連結した：
5'-CATGGCC GGT CCC GAA ACT CTG TGC GGT GCT GAA CTG GTT GAC GCT CTG CA-3'
3'-  CGG CCA GGG CTT TGA GAC ACG CCA CGA CTT GAC CAA CTG CGA G-5'
(それぞれ、SEQ.ID NOS.16及び17)
得られたプラスミドはpBKIGF-2Aと命名。その構造を図23に示す。
【００５０】
段階6: pLamBRan
このプラスミドは、pLS33LamBをNcoIとBamHIで消化分解して作製し、ベクター断片を分離した。pLS33LamBは、APプロモーター、lamBシグナル、及びIGF-1遺伝子を挿入したpBR322から作ったプラスミドである。BamHIはプラスミドのTc部分で切断し、NcoIはIGF-1遺伝子の5'末端で切断する。第二の断片は、pRANTESをBsaJIとBamHIで消化分解し、得られた〜200-bpの断片を分離して生じた。第三の断片は、RANTES遺伝子をNcoIからBsaJIまでのシグナル配列に連結する合成DNA片であった。この合成DNAは次の配列を持つ：
NcoI         BsaJI
5'-CATGGCCTCCCCATATTC-3'
3'-CGGAGGGGTATAAGGAGC-5'
(それぞれ、SEQ.ID NOS.18及び19)
得られたベクターはpLamBRanと命名。その構築法を図24に示す。
段階7: pBKIGF-2B
このプラスミドの構築法を図25に示す。pLamBRanはNcoIとSphIで消化分解し、ベクター断片をプロモーターとシグナル配列を包含して分離した。pBKIGF-2はDdelとSphIで消化分解し、〜600-bp断片をラムダ転写ターミネーターとTetＲ遺伝子の5'末端を包含して分離した。pBKIGF-2AはNcoIとBsp12861で消化分解し、〜110-bp断片をIGF-1のアミノ酸1-38をエンコードするDNAを包含して分離した。これらの3つの断片を一緒にしてIGF-1のアミノ酸39-70をエンコードする合成DNAと連結し、pBKIGF-2Bを産した。この合成リンカーは次の配列を持つ：
5'-TCGTCGTGCTCCC CAG ACT GGT ATT GTT GAC GAA TGC TGC TTT CGT TCT TGC GAC CTG CGT CGT CTG-3'
(SEQ.ID NO.20)
3'-AGA ACG CTG GAC GCA GCA GAC CTT TAC ATA ACG CGA GGG GAC TTT GGG CGATT TAGACGAATCTTCGAGG-5'
(SEQ.ID NO.21)
【００５１】
iv. 形質転換と発酵
上述の菌株37D6を標準の形質転換技術を使ってpBKIGF-2Bで転換した。次いで、それは、10-L発酵槽を接種するために500-ml LB培地培養を用いた後1000-L発酵槽に対して説明したように発酵を実行した以外は実施例Iに記述したのと同じやり方で成長させた。加えて、鉱物塩は、1000-L発酵で用いた濃度の60%まで減少させた。これにより、1000-L発酵槽に比べ改良型10-L発酵槽ではリン酸塩が約2時間早く枯渇されることになった。
最後に、複合窒素供給は、40 OD (A550)で開始され、初めに発酵槽に充填したアミノ酸とリン酸塩の欠失後、徐々に供給されるアミノ酸とリン酸塩源を与えた。この供給物は、140mlの20%酵母抽出物と混合された290mlの20%NZアミンASから成り、0.4 ml/minの率で供給された。接種添加後の初期出発容積は約8 Lであった。
【００５２】
v. 結論
図26は、変形型10-L発酵槽で実施された実験の結果を示すものである。この図から分かるように、10と11時間の間で、グルコース供給速度（図26(B)）は、30% DO２設定点を維持するコンピュータ制御下で低下しつつあった。このことは、リン酸塩が欠失しつつあり、細胞の大量生産にグルコースはほとんど使われていなかった、ことを暗示するものである。約11.5時間で、グルコース供給速度を手動制御下においた。その後、グルコース供給速度をDO２がゼロに至るまで増分で早めた。
この特殊な実験で、DO２プローブは、実際のDO２濃度がゼロであった時に約5%の読みを生じた。初期のDO２の傾斜曲線の形状(図26(A))はDO２の不安定性を呈していたが、結果は明確ではなかった。それ故、グルコースのポンプ速度(GPR)を落としてDO２を回復させ、その後少しづつ増やした。DO２の別の墜落が約13時間で起こった時、GPRを再度下げて回復させた。この点で、4%未満のGPRの増加により、ゆっくりしたDO２の降下という特性プロフイルが生じ、それに続いて急峻で且つ予想よりはるかに大きいDO２濃度の降下が起こった。
GPRを再び下げて回復させた時、意外な一連の事象が続いて起こった。発酵槽のDO２濃度は、何ら外部からの刺激がないのに再現できるように周期的に変化（サイクル）し始めた。14.2時間でのDO２のサイクルパターンで観測された不規則性は、グルコースの供給を短時間中断したことに起因して起こった。その唯一つの事象以外、発酵の動作パラメータを変更するものは何も起きなかった。分かるように、そのサイクルは大きさが不変で周波数だけが変化し、ますます離れ17.3時間に至ってようやく止まった。さらに2つのほぼ同一の連続したサイクルが、グルコース供給速度を20.25及び22.2時間の時に下げることにより刺激された。
これらの結果は、この改良型10-L発酵槽におけるDO２濃度の劇的不安定性を明示している。サイクルのDO２降下部分の全般的形状は、1000-L発酵槽で観測されたそれと類似している。このことは、10-L反応器はより大きい発酵槽で最初に観測された現象を繰り返していることを物語っている。小さい反応器で観測されたサイクルの速度と規則性は、生物学的起源を示唆するものである。
【００５３】
実施例IV
未形質転換の野生型E.coliによるDO２不安定性の発生
先の実施例では、生物はDO２の不安定時に生成物を形成するよう誘発されていた。宿主生物はまた、比較的ひどく突然変異した。DO２の不安定現象の一般性を検討するため、未形質転換の比較的突然変異をしていない生物を図1に示す改良型10-L発酵槽で試験した。生物はE.coli W3110tonAで、その由来は上述の通りであり、1A2と命名されたものである。この細菌は、鉄の取込みに使用され、そしていくつかのバクテリオファージによる付着部位として使われる細胞表面のタンパク質形成を避けるtonAの遺伝子座における欠陥を除けば、本質的に野生型E.coliである。生物は、実施例IIIに記述したものと同一の条件下で成長させた。
図27は、実施例IIIに記述したものと同じDO２の不安定性誘発プロトコルを適用した結果を説明するものである。この発酵では、DO２プローブは、DO２濃度を過大評価する信号をまた生じた。27-29%の信号はゼロのDO２濃度を表示した。幸いにも、11時間後、この実験はレドックスプローブでもモニタされ、その出力を図27(B)に表示する。両信号は、DO２濃度における反復性の規則的な変動の発生を示している。故に、DO２の不安定性をもたらす現象は、プラスミドの存在、異型生成物の形成、又は生産宿主に用いられたいくつかの突然変異には依存しない。
【００５４】
実施例V
あるシトクロムオキシダーゼが欠失した生物体でのDO２不安定性の欠如
先の実施例は、DO２の不安定性に関する生物学的起源を示唆するものである。この実施例で試験される仮説は、この現象が、一つはシトクロムoオキシダーゼでそしてもう一つはシトクロムdオキシダーゼで仲介された、2つの可能な好気性呼吸鎖間の切り替えに関連があるかどうかである。従って、欠失は、W3110tonA宿主1A2への慣用的なP1の形質導入によって各シトクロムオキシダーゼ遺伝子でなされ、2つの新規生物、E.coli W311OtonA△cyokanｒ及びE.coli W311OtonA△cydkanｒ、を作った。突然変異源は、それぞれ、生物GV102及びGO103であった（Oden等、Gene, 96: 29-36 [1990]）。
生物は実施例IIIで記述したような改良型10-L発酵槽で成長させた。図28は、シトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異体を用いてDO２の不安定性を誘導しようとした試みの結果を表している。時間尺度は、図27で12のDO２サイクルを示すのに要する時間が4時間であったのに比べこの図では12時間である。DO２の不安定性についてのゼロDO２特性への急速な接近は、誘導できなかった。14時間でのゼロDO２への接近及び18.5時間での接近の両方ともゆっくりしておりDO２不安定性のヒントはもたらさなかった。レドックスプローブの出力（図28(B)）も同様の物語を語った。
【００５５】
図29は、シトクロムdオキシダーゼ欠失突然変異体による同じプロトコルに従って得た結果を表す。この実験では、DO２プローブの最低の読みは、約17%であった。これが枯渇したDO２条件に対応したということは、一時的に撹はん速度を落とすことにより13.2時間に確認された。レドックスプローブの出力に応答があったが、DO２の読みがさらに下がることはなかった。この試験もまた、レドックスプローブが使いものにならないことを示している。△cyo突然変異宿主同様、△cyd突然変異宿主を用いるこの実験では、DO２不安定性のヒントは何ら無かった。
これらの結果から、W3110tonA E.coliの生物で観察されるDO２不安定性に2つのシトクロムオキシダーゼが関与していることが確認される。
【００５６】
実施例VI
シトクロムオキシダーゼの1つを欠いている生成生物に対するDO２不安定性の欠如
同じ突然変異が、組換えDNAの生成生物におけるDO２不安定性を防ぐだろうかどうかを決めることは次に望まれることである。実施例IIIに用いられた宿主生物37D6は、3つの新規宿主生物を作るために改良した。
最初の変更では、非カナマイシン耐性のdegP削除突然変異は、宿主生物に形質導入され、さもなければ同質遺伝子であるカナマイシン感受性宿主を作った。この突然変異は、出発プラスミドとしてペリプラズム・プロテアーゼ突然変異、degP41kan、を含んでいるpKS16を使って行い、そこでは2.3-kb PstI-PstI断片は、degPを含んでいる元の8-kb BamHI-BamHI断片からその遺伝子がdegPネガティブになるよう削除された [上記のStrauch等]。pKS16は、Jeffrey H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Habor Laboratories, 1972), Experiment 13 on uv light mutagenesis, page 121に記載されているように（参考としてここに引用）、紫外線突然変異誘発にかけた。突然変異誘発後、カナマイシン耐性を失ったコロニーを選別した。非カナマイシン耐性突然変異について選別したものを慣用の形質導入技術により菌株37D6の染色体へ移し、40B4と命名されたカナマイシン感受性宿主を産した。
【００５７】
次いで、カナマイシンが結合された△cyoと△cydを宿主40B4に形質導入して2つの新規生物、39H8と39H9、を得た。これらの形質転換は、標準の方法によった。菌株39H8は、シトクロムo突然変異を有し且つカナマイシン耐性であることを除けば、40B4と同質遺伝子である。菌株39H9は、シトクロムd突然変異を有し且つカナマイシン耐性であることを除けば、40B4と同質遺伝子である。その後、3つの生物全てをIGF-1生成プラスミドpBKIGF-2Bで形質転換した。
図30は、図1に示した変形型10-リットル発酵槽で形質転換40B4生成宿主を用いてDO２不安定性を試験した結果を示すものである。明らかに、DO２不安定性が観測された。再度、サイクルは劇的で且つ規則的であった。12.5と13.5時間の間で経験した比較的高いDO２の不安定性は、偶然に復帰したコンピュータ制御の結果であった。グルコース供給速度を臨界供給速度で手動制御に戻した時、その不安定性はその規則的パターンを繰り返した。
この実験では、レドックスプローブの出力は特に参考になった。DO２プローブの読みがゼロであった時でさえ、レドックスプローブは培地のレドックス電位に変化があることを表示した。例えば、約17時間では、レドックス電位は回復していなかった。このことは、DO２サイクルが復帰するにはグルコース供給速度を減じなければならない、ことを示唆した。グルコース供給速度を減じた時、サイクルは全く復帰しなかった。この実験では、レドックスプローブの出力を約-50と-100mVの間に維持するのは不可能であった。如何なる理論に限定されるものではないが、中間のレドックス電位を維持するこの不能性は、酸素取込み率の急激なシフトに関係があると思われる。
図31（シトクロムdオキシダーゼ欠失突然変異体 39H9）及び図32（シトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異体 39H8）は、図1に示した変形型10-リットル発酵槽でシトクロムオキシダーゼ欠失突然変異体によりDO２不安定性の誘導を試みた結果を示す。何れの場合もDO２不安定性は生じなかった。図31におけるDO２プロフィルの一つのはっきりした不連続性は、グルコースの供給が短時間中断された結果であった。両突然変異宿主に関して、-50及び-100 mVの間のプローブ出力を生ずるレドックス電位を制御する上で何らはっきりした問題はなかった。従って、未形質転換の野生型宿主に見られるように、シトクロムオキシダーゼの遺伝子の1つを取り除くことにより、DO２の不安定性が止められた。これらの観測は、2つの好気性呼吸経路間での切り替えはDO２の不安定性に関連がある、という仮説と一致するものである。
【００５８】
実施例VII
シトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異体によるIGF-1生成の評価
組換えDNAのタンパク質生産に対するシトクロムオキシダーゼ突然変異宿主の適切性を評価するため、シトクロムoオキシダーゼ突然変異体を調べた。シトクロムoオキシダーゼは、激しい好気性呼吸に通常用いられるもの故、シトクロムdオキシダーゼを欠失した突然変異体菌株はより健康な宿主であろうということが予想された。しかし、これは観察されなかった。それはさらにゆっくりと成長し、シトクロムoオキシダーゼ突然変異体と同じほど長い期間高い呼吸率を維持できなかった。このようにして、シトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異体は、ヒトのIGF-1を発現・蓄積するその能力が評価された。
図33は、未変形型10-L発酵槽で実施されたこと以外は実施例Iで記述したように実行した、pBKIGF-2Bで形質転換したシトクロムoオキシダーゼ突然変異体菌株39H8及びpBKIGF-2Bで形質転換したコントロール菌株40B4の比較発酵に際して観測された、全IGF-1の蓄積と細胞密度を示す。培地塩の最大濃度と同様、3基の全Rushtonインペラが用いられた。実施例IIIで説明した複合窒素の供給は、0.2 ml/minの速度で行った。
最終的細胞密度は、突然変異体に関してはコントロールよりやや低いとはいえ、IGF-1の最終容積収量は通常の10-L発酵槽で同一であった。このことは、組換えタンパク質生成に対するシトクロムoオキシダーゼ宿主の適切性を証明するものである。約1000-、10,000-、又は100,000-リットル容量を有する発酵槽のような大規模発酵槽においては、IGF-1の収量はコントロールと対比して突然変異体において改善され、及び／又はそのプロセスはFDAの要請とより一致するであろうことが期待される。何故なら、発酵進行中、それはDO２濃度の劇的変動を伴わなかったからである。
加えて、シトクロムo又はdオキシダーゼ呼吸経路の他の突然変異もしくはオキシダーゼ経路以外の呼吸経路の突然変異もまた、DO２不安定性を生ずる傾向を有することなく、組換えDNA産物の正常な生産を可能にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】大規模DO２の不安定性を模倣できるよう設計された10-L発酵槽の構成を示すものである。
【図２】27C7と命名されたプロテアーゼ欠失E.coli W3110宿主菌株の由来を示すものである。
【図３】図3(A)と3(B)は、E.coli菌株W3110におけるそれぞれtonAとphoA遺伝子の突然変異のスキームを示すものである。
【図４】tonA遺伝子をW3110から除去するための方法を詳細に示す。
【図５】pLS32Tscを作製する際の中間プラスミドであってIGF-1をエンコードする遺伝子を含有するプラスミドpLS32の構築法を示す。
【図６】pLS32Tscを作製する際及びさらに別の中間プラスミド、PLamBIGF、を作製する際の別の中間プラスミド、pAPlamB、の構築法を示す。
【図７】pLS32Tscを作製する際のさらに別の中間プラスミド、PLS32lamB、の構築法を示す。
【図８】pLS32Tscを作製する際の別の中間プラスミド、PLS33lamB、の構築法を示す。
【図９】pLS32Tscと、下記の例で用いられる別の発現ベクター、即ちpBKIGF-2B、を作製する際の中間プラスミドであるpBKIGF-2とを作製する際の別の中間体、PLS33Tscの構築法を示す。
【図１０】pLS33TscとpLS32lamBからのpLS32Tscの構築法を示す。
【図１１】lamBシグナル配列とプラスミドpLS32TscのIGF-I遺伝子によってエンコードされた発現カセットのヌクレオチド配列とアミノ酸配列（それぞれSEQ.ID NOS.11と12）を示す。
【図１２】DO２不安定性問題が生ずる1000-L発酵槽の概略図である。
【図１３】pLS32Tscで変換された菌株27C7の1000-L発酵中（ここでグルコースの供給速度は手動制御される）のグルコースポンプ速度(g/min.)(図13(A))およびDO２パーセント(図13(B))対時間を示す。
【図１４】pLS32Tscで変換された菌株27C7の1000-L発酵中（ここでグルコースの供給速度は手動制御される）のDO２パーセント(塗りつぶした菱形記号)とグルコースポンプ速度(白抜きの丸記号)対時間を示している。
【図１５】DO２の不安定性を検討するために変形された1000-L発酵槽の概略図である。
【図１６】pLS32Tscで変換された菌株27C7の1000-L発酵中のDO２の不安定性対時間の分析結果を示すもので、頂上部及び底部からのグルコース供給が用いられており、槽低部の%DO２は四角で、槽頂上部の%DO２は丸で、グルコースポンプ速度/3(g/min)は実線で示されている。
【図１７】pBKIGF-2を作製するために用いられるpLBIGFTscの作製時の中間プラスミドであるpLamBIGFを作製するために使われるプラスミドp200の制限地図を示す。
【図１８】MF alpha Iプレプロ及びIGF-1遺伝子配列(SEQ. ID NO.13)を含んでいるp200の(位置1149から1633までの)EcoRI-EcoRIフラグメントのヌクレオチド配列を示す。
【図１９】3つのプラスミド断片と合成DNA片(SEQ.ID NOS. 14と15)からのpLamBIGFの構築法を示すものである。pLamBIGFはpBKIGF-2を作製するために用いられるpLBIGFTscの作製時の中間プラスミドである。
【図２０】pLamBIGFからの中間プラスミドpLBIGFTscの構築法を示す。
【図２１】pBKIGF-2の作製時に用いられる中間プラスミドpRanTscの構築法を示す。
【図２２】pLS32Tsc、pLBIGFTsc、pLS33Tsc、及びpRanTscからのpBKIGF-2の構築法を示す。
【図２３】pLBIGFTsc、pBKIGF-2、及び合成DNA片(SEQ.ID NOS. 16と17)からpBKIGF-2Bを作製するために用いられるpBKIGF-2Aの構築法を示す。
【図２４】pLS33LamB、pRANTES及び合成DNA片(SEQ.ID NOS. 18と19)からpBKIGF-2Bを作製するために用いられるpLamBRanの構築法を示す。
【図２５】pBKIGF-2、pBKIGF-2A、pLamBRan、及び合成DNA片(SEQ.ID NOS. 20と21)からの発現ベクターpBKIGF-2Bの構築法を示す。
【図２６】発現ベクターpBKIGF-2Bで変換された、菌株27C7由来の、37D6と命名された生物による図1に示す改良10-L発酵槽における%DO２（図26(A)）及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図26(B)）対時間を示すものである。
【図２７】1A2と命名された未形質転換宿主W3110tonAによる改良10-L発酵槽における%DO２（図27(A)）、レドックスプローブ(redox probe)出力(mV)（図27(B)）、及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図27(C)）対時間を示すものである。
【図２８】宿主W3110tonAの未形質転換シトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異による改良10-L発酵槽における%DO２（図28(A)）、レドックスプローブ出力(mV)（図28(B)）、及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図28(C)）対時間を示すものである。
【図２９】宿主W3110tonAの未形質転換シトクロムdオキシダーゼ欠失突然変異による改良10-L発酵槽における%DO２（図29(A)）、レドックスプローブ出力(mV)（図29(B)）、及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図29(C)）対時間を示すものである。
【図３０】pBKIGF-2Bで形質転換され、40B4と命名されたカナマイシン-感受性IGF-I生成生物による変形10-L発酵槽における%DO２（図30(A)）、レドックスプローブ出力(mV)（図30(B)）、及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図30(C)）対時間を示すものである。
【図３１】pBKIGF-2Bで形質転換された菌株40B4のシトクロムdオキシダーゼ欠失突然変異による変形10-L発酵槽における%DO２（図31(A)）、レドックスプローブ出力(mV)（図31(B)）、及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図31(C)）対時間を示すものである。
【図３２】pBKIGF-2Bで形質転換された菌株40B4のシトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異による変形10-L発酵槽における%DO２（図32(A)）、レドックスプローブ出力(mV)（図32(B)）、及びグルコースポンプ速度(ml/min)（図32(C)）対時間を示すものである。
【図３３】両方ともpBKIGF-2Bで形質転換された突然変異とコントロールである、菌株40B4のシトクロムoオキシダーゼ欠失突然変異（白抜き四角又は丸）及び同質遺伝子コントロールとしての菌株40B4（塗りつぶした四角又は丸）について成長（A550の細胞密度、丸）と全IGF-I生成/10 (mg/L、四角）を比較して10-L発酵の結果を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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