(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配偶体型自家不和合性を調節する、花柱組織特異的RNaseの活性の阻害因子を備える配偶体型自家不和合性の調節剤組成物であって、前記花柱組織特異的RNaseの活性の阻害因子は金属イオンが結合された硫酸塩である前記調節剤組成物。
【請求項２】
前記金属イオンが結合された硫酸塩はCuSO4、MgSO4、ZnSO4及びMnSO4からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１に記載の調節剤組成物。
【請求項３】
配偶体型自家不和合性を調節する、花柱組織特異的RNaseの活性の阻害因子を備える調節剤組成物を植物に特定時期に散布することにより処理する工程であって、前記花柱組織特異的RNaseの活性の阻害因子は金属イオンの結合された硫酸塩である前記処理する工程を備える植物の配偶体型自家不和合性制御方法。
【請求項４】
前記金属イオンが結合された硫酸塩はCuSO4、MgSO4、ZnSO4及びMnSO4からなる群から選択された少なくとも一つである請求項３に記載の制御方法。
【請求項５】
CuSO4の適正濃度が１００〜７００ｐｐｍである請求項４に記載の制御方法。
【請求項６】
ZnSO4の適正濃度が１００〜８００ｐｐｍである請求項４に記載の制御方法。
【請求項７】
前記特定時期はつぼみ形成期から満開前である請求項３に記載の制御方法。
【請求項８】
自家不和合性の調節剤組成物を特定時期に散布する方法は展着剤と混合された前記組成物を果実樹に散布することである請求項３に記載の制御方法。
【請求項９】
前記展着剤はヘキサコナゾル(hexaconazole)、シロキサン系(siloxane)、及びアルキルアリルポリエトキシル酸系(alkylarylpolyethoxylate)からなる群から選択される請求項８に記載の制御方法。
【請求項１０】
請求項３の方法を利用して配偶体型自家不和合性が打破されて自己花粉により受粉された植物。
【請求項１１】
前記植物は林檎、梨、コーヒー及びアーモンドを含む果樹類、花卉類、薬用植物、トマト、茄子、タバコ、ジャガイモを含む茄子科野菜からなる群から選択される請求項１０に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は配偶体型自家不和合性（gametophytic self-incompatibility）の調節剤組成物、植物の配偶体型自家不和合性制御方法及び前記制御方法を利用して自家受粉された植物に関するものであり、具体的には、自家不和合性を調節する花柱組織特異的（style-specific）RNaseの活性を阻害する阻害剤として硫酸塩特に、CuSO4及びZnSO4を含む自家不和合性の調節剤組成物と、前記自家不和合性の調節剤組成物を利用する植物の自家不和合性制御方法と、及び前記制御方法を利用して自家不和合性が打破されて自家受粉された植物に関するものである。
【０００１】
（背景技術）
この地球上の半数以上の植物は配偶子型自家不和合性を有している。前記自家不和合性とは自家受粉されない性質を意味する。したがって、このような自家不和合性植物らは遺伝的に異なる花粉によってのみ受粉が可能である。すなわち、このような自家不和合性の性質を有する植物は一つの品種のみ存在する場合に花は咲いても実を結ばれない。
【０００２】
一方、他の品種間の自然的な受粉は蜜蜂及び花虻などの授粉者または風により媒介される。しかし、最近には農薬の過剰使用と急激な産業化にともなう環境汚染等によって授粉者の数が急激に減少しており、授粉者と授粉樹の数が充分であるとしても毎年開花期に発生する低温現象、強風及び降雨などのような気象環境の障害要因により授粉者の活動が難しい場合には安定された結実率を確保することがむずかしい。
【０００３】
さらに、経済性が高い単一品種のみを裁培する農家では授粉樹が不足であるために自然的な結実率がさらに減少するようになる。
したがって、自然結実率だけでは作物の結実安全性と果実の品質向上を図ることが難しいために最近では輸入した花粉を利用して人工受粉を実施したり外国で輸入したオスミアオクニフロンス(Osmia ocrnifrons)などの授粉者を人工で飼育して開花期に放飼する方法を利用している。特に、人工受粉の場合授粉者ではなく、人が直接授粉樹品種の花粉を花柱の柱頭に塗る方法を利用するために多くの労働力と費用が所要されるので、経済的でない。
【０００４】
天然果樹類、花卉類、薬用植物及び茄子科野菜らは生殖組織である雌蕊から花柱組織特異的RNaseが分泌される。一方、前記RNaseの場合各品種ごとに遺伝形質が異なるRNaseが花柱組織に存在する。そのメカニズムは以下の通りである。自己花粉が雌蕊の花柱組織から子房に向けて伸張する時、花柱組織特異的RNaseが分泌され、自己花粉のrRNAだけが選択的に分解される(McClure等、Nature、1991)。このメカニズムにより花粉管伸張は雌蕊の一定の位置である１／３地点で破壊され、花粉管が子房まで伸張できず、その結果、自己花粉による受精がなされない。
【０００５】
一方、現在の研究によれば花柱組織で分泌されるRNaseは自己または非自己花粉に非選択的に入るが、前記RNaseに特異的に反応する自己花粉内で抑制因子（inhibitor）または受容体（receptor）と結合される。このような作用は選択的に自己花粉のrRNAのみを分解する信号伝達過程に関連して結局自己花粉である場合には花粉管が子房に到達する前に破壊されて受精がなされないものとして推測されている。
【０００６】
これとは別に、授粉者または風により媒介された異なる遺伝形質を有する授粉樹に由来した非自己花粉は花粉管を正常に伸張させる。このような現象は現在までの研究による仮説によって説明されている。その仮説は以下の通りである。異なる形質の花粉に存在する雌蕊（花柱）組織で分泌されるRNaseを受け入れる受容体の構造が自己形質のものと一致されないので、以後の信号伝達過程が進まない。その結果、非自己花粉のrRNAはRNaseの攻撃を受けなくなることにより花粉管の伸張が正常に誘導されて受粉が可能になる。
【０００７】
しかし、まだ花粉側の抑制因子や受容体分子に対しては世界各国の研究陣らにより活発な研究が進行されているが明確な糸口は見つかっておらず、顕微鏡上の免疫学的な方法の観察により、花柱組織で分泌されるRNaseが花粉管の伸張組織内部でも発見されるという報告があるだけである。
【０００８】
一方、林檎、梨、コーヒー及びアーモンドなどの果樹類、一部花卉類、一部薬用植物、野生種のトマト、茄子、タバコ、ジャガイモなどのような茄子科野菜らの自家不和合性は雌蕊（花柱組織）特異的でありながら遺伝子特異的RNaseに調節されると報告されている(Chung Il-Kyung等、Plant Molecular Biology、26:757-762、1994と、Chung Il-Kyung等、韓国育種学会紙29(1):41-46、1997と、Chung Il-Kyung等、Journal of Plant Physiology、154:63-70、1999)。
【０００９】
これと関連して本願発明者は自家不和合性を調節する野生種トマトから分離された花柱組織特異的RNaseを1992年に報告した（Chung Il-Kyung等、Bioscience Biotechnology Biochemistry、57(7):1172-1176、1993と、日本特許出願第1262865号）。また、本願発明者はトマト及び麦門冬のような植物の自家不和合性に関与する遺伝子を同定した(Chung Il-Kyung等、Plant Molecular Biology、26:757-762、1994と、Chung Il-Kyung等、Plant Cell Physiology、36(8):1621-1627、1995と、日本特許第７−１８７５５７号）。
【００１０】
前記のような自家不和合性植物の問題を解決するために、本発明者等は花柱組織特異的RNaseの活性を阻害する阻害剤を同定し、前記阻害剤を利用して自家不和合性を調節する自家不和合性制御方法及び自家受粉された植物を提供し、果樹類などの植物が自己花粉により水分または果物の結実がなされるように操作して良質の果実を確保することができるだけでなく経済的にも優秀な営農法を提示した。
【００１１】
（発明の開示）
本発明の目的は配偶体型自家不和合性を調節する花柱組織特異的RNaseを阻害する抑制因子を含む配偶体型自家不和合性の調節剤組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は前記調節剤組成物を用いて、配偶体型自家不和合性を調節する方法を提供することにある。
また、本発明の目的は配偶体型自家不和合性の破壊された自家受粉された植物を提供することにある。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は配偶体型自家不和合性を調節する花柱組織特異的RNaseの活性を阻害する抑制因子を含む配偶体型自家不和合性の調節剤組成物を提供する。
【００１４】
本発明者は自家不和合性と関連した花柱組織特異的RNaseの阻害剤を発見して自然界に存在する植物の自家不和合性を制御することによって自己花粉による受精を誘発しようとした。
【００１５】
まず、本発明者は富士林檎の生殖組織である花柱組織から自家不和合性を誘発するのに決定的な役割をするRNaseを単離し、精製した（表２参照）。また、富士林檎の根、葉、幹、花びら及び萼からRNaseを単離して花柱組織から単離されたRNaseと共に電気泳動した。その後、RNase活性染色をすることで花柱組織から単離されたRNaseが花柱組織特異的RNaseであることを確認した（図１参照）。合わせて、林檎品種による花柱組織特異的RNaseの差を調べるために、紅ロ、紅玉、富士、国光及びスガル（Sgaroo）の花柱組織からRNaseを分離・精製した後、RNase活性染色と銀染色を行った。その結果、林檎の種ごとに花柱組織特異的RNaseの種類が異なることを確認した（図２参照）。
【００１６】
前記富士林檎の花柱組織特異的RNaseが自家不和合性を調節することを確認するために、人工的に花粉から花粉管の伸張を誘導することができる花粉管伸張培地（Willi Jahnen等、Plant Cell、(1):501-510、1989年5月と、Harris等、Plant Physiology、189:360-367、1989）に前記花柱組織特異的RNaseを添加して富士林檎の花粉管の伸張様相を観察した（図３参照）。
【００１７】
その結果花柱組織特異的RNaseが花粉管伸張を抑制することによって自家不和合性を調節することを確認することができた。
本発明者は本発明で提示する独創的の実験方法を利用して前記花粉管伸張培地に富士林檎の花柱組織特異的RNaseといろいろな化学物質を添加して富士林檎の花粉管の伸張様相を観察した（図４及び図５参照）。その結果、自己花粉の花粉管伸張を抑制するRNase活性が硫酸塩により効果的に阻害されることによって花粉管が正常に伸張された。この結果から金属イオンの結合した硫酸塩が前記RNase活性を阻害する阻害剤であることが確認された。このように前記硫酸塩は自家不和合性の調節剤組成物として作用して自家不和合性の調節剤組成物で使用され、硫酸塩のうちCuSO4、MgSO4、ZnSO4及びMnSO4が望ましく、特に、CuSO4及びZnSO4がさらに望ましい。
【００１８】
また、本発明は前記自家不和合性の調節剤組成物を利用して植物の自家不和合性制御方法を提供する。
前記花粉管伸張培地を利用した実験結果に基づき、本発明者は本発明の自家不和合性の調節剤組成物による自家不和合性の阻害効果を実際の栽培条件で生育する自家不和合性作物である野生種トマト及び富士林檎を対象に実験した。
【００１９】
まず、本発明の自家不和合性の調節剤組成物を処理する時期を決定するために、野生種トマトには開花７日前から満開２日後まで１ｍＭのCuSO4及びZnSO4を処理し、富士林檎には開花５日前から満開２日後まで１ｍＭのCuSO4及びZnSO4を処理して自家受粉率を調べた。その結果、野生種トマトは開花初期である開花７日前から開花４日前まで本発明の自家不和合性の調節剤組成物を処理した時に、７０％以上の結実率であった。富士林檎も開花初期である開花５日前から開花３日前まで本発明の自家不和合性調節剤組成物を処理した時に、７０％以上の結実率であった。したがって、花柱組織特異的RNaseの活性を阻害する物質を含む自家不和合性の調節剤組成物を特定時期に散布する方法として植物の配偶体型の自家不和合性を制御することができ、前記自家不和合性の調節剤組成物を処理する時期は植物生育の特定時期であるつぼみ形成期から満開前である開花初期が望ましい。
【００２０】
また、本発明の自家不和合性の調節剤組成物の適当な処理濃度を調べるために野生種トマト及び富士林檎にCuSO4及びZnSO4を０または１５００ｐｐｍで開花初期に処理して薬害有無及び結実率を調べた（図６及び図７参照）。実際の果実樹裁培時に本発明の自家不和合性の調節剤組成物を展着剤と混合して処理することによって自家不和合性の調節剤組成物の吸収効率を増加させることができるために、前記CuSO4及びZnSO4を展着剤と混合して一定時期すなわち、開花初期に果実樹に散布する方法で処理した。
【００２１】
その結果処理されたCuSO4及びZnSO4の一定濃度で野生種トマトと富士林檎で薬害なしに自家受粉された果実及び植物体を得ることができた。これから本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤組成物が種に関係なくその効果を表すことが分かり、開花初期に処理するCuSO4の望ましい濃度は１００〜７００ｐｐｍであり、ZnSO4の望ましい濃度は１００〜８００ｐｐｍである。また、本発明の自家不和合性阻害剤組成物を製造社別の推奨使用量の展着剤と混合して果実樹に散布することによって薬害なしに非常に高い受粉率を確保することができた。前記展着剤としてはヘキサコナゾル(hexaconazole)系、シロキサン(siloxane)系及びアルキルアリルポリエトキシル酸(alkylarylpolyethoxylate)系展着剤が高い結実率を得るのに望ましい。
【００２２】
本発明の自家不和合性阻害剤組成物の望ましい適正濃度を表１に表した。
【００２３】
【表１】
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前記表１の花柱組織特異的RNaseの阻害剤としてCuSO4を有効成分として利用する場合１００ｐｐｍ以下で使用される場合RNase活性を適切に阻害させられないために７０％以上の安定された結実率を確保することが難しくて反面に、７００ｐｐｍ以上で使用される場合薬害の被害を誘発することがあり得るために経済的に適合でない。また、花柱組織特異的RNaseの阻害剤としてZnSO4を有効成分として利用する場合も１００ｐｐｍ以下ではRNase活性を適切に阻害させられなくて７０％以上の安定された結実率を確保することが難しい反面に、８００ｐｐｍ以上の高農図を使用する場合薬害の被害を負われる恐れがあり経済的に適合でない。
【００２４】
合わせて、本発明は前記制御方法を利用して自家不和合性が打破されて自家受粉された植物を提供する。
上記の結果のように本発明の自家不和合性の調節剤組成物を利用して自家不和合性が打破されて自家受粉された植物を得ることができる。本発明の自家不和合性制御方法を利用することができる植物の例としては実施例で使用した富士林檎及び野生種トマト以外に林檎、梨、コーヒー及びアーモンドなどの果樹類または花卉類、薬用植物、トマト、茄子、タバコ、ジャガイモなどのような茄子科野菜がある。
【００２５】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明がこれに限定されるものではない。
【００２６】
＜実施例１＞自家不和合性の調節タンパク質である花柱組織特異的RNaseの分離・精製
＜１−１＞富士林檎の各組織からRNaseの分離・精製
富士林檎の花柱、根、葉、幹、花びら及び萼組織からRNaseを分離するために次のような実験を遂行した。
【００２７】
富士林檎花柱組織１ｇに１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１％［Ｗ／Ｖ］ポリビニルピロジン(polyvinyl pyrrodine)を含有する緩衝溶液を添加して乳鉢で破砕して総タンパク質を抽出した。抽出した総タンパク質を４０％硫酸アンモニウムで濃縮させた後半透過性膜（制限範囲：分子量１２０００Ｄａ以下）を利用して５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝溶液中で透析した。その結果RNase活性が強い分画を得たし、この時RNaseの総活性度は２９５０００ユニットであった。
【００２８】
前記RNase活性が強い分画でBio-gel  P-60樹脂（バイオ−ラド社、Ｅｎｇｌａｎｇ）で充填されたコラムを利用したゲルろ過クロマトグラフィを遂行した（Harris等、Plant Physiology、89:360-367、1989と、Anuradha Singh等、Plant Physiology、96:61-68、1991と、Shihshie等、Plant Cell、6:1021-1028、1994）。前記RNase活性が強い分画を５００μｌずつ１．５ｃｍ／時の速度で４℃で前記コラムに吸着させた後、同一な条件で０．５Ｍ塩化ナトリウムと５０ｍＭ燐酸ナトリウムを含有する緩衝溶液で溶離させた。前記ゲルろ過クロマトグラフィの結果、分子量２３〜２５ｋＤａである花柱組織で特異的に発現される１２８２０００ユニットのRNaseを回収した。
【００２９】
また、富士林檎の根、葉、幹、花びら及び萼組織から前記と同一の方法で各々２０〜３０ｋＤａのRNaseを分離・精製した。
＜１−２＞富士林檎の各組織から分離・精製したRNaseの活性染色
富士林檎の各組織で発現されるRNaseの組織特異性を調べるために、前記実施例１−１で分離・精製した各組織のRNaseを４℃で１５％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、電気泳動したゲルを０．１ＭTris-HCl（ｐＨ７．４）とから構成された緩衝溶液に入れて酵母のリボソームRNA（米国シグマ社製品）３００μｍ／ｍｌを基質で添加して３７℃で１２０分間酵素反応を遂行した。
【００３０】
図１の活性染色結果から花柱、根、葉、幹、花びら及び萼のRNaseは部位によって分子量の種類が異なることを確認することができ、花柱組織から分離したRNaseは花柱組織特異的RNaseであることを確認することができた。
【００３１】
＜１−３＞林檎品種による花柱組織特異的RNase調査
林檎品種によって花柱組織特異的RNaseの種類が異なるかを調べるために、まず、裁培種である紅ロ、紅玉、富士、国光及びスガルから実施例１−１の方法でRNaseを分離・精製した後、下記の方法でRNaseの活性染色及び銀染色を遂行した。
【００３２】
それぞれの品種で分離・精製したRNaseを実施例１−２と同一な方法でRNaseの活性染色をした。また、前記RNaseを１５％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後銀染色（Giulian G. G.等、Anal. Biochem.、129、1983）をして図２に表した。
【００３３】
その結果林檎品種によって分子量がお互い異なる花柱組織特異的RNaseが存在したし、これから授粉樹と授粉樹から花粉を受け入れる果実樹には遺伝形質特異的RNaseが発現されることを分かった。
【００３４】
＜１−４＞花柱組織特異的RNaseの高純度精製
実施例１−１で分離・精製した富士林檎の花柱組織特異的RNaseを高純度で精製するために、次のような実験を遂行した。前記花柱組織特異的RNaseをセントリコン−１０（ミリポア社）で濃縮させた後モノ−Ｓコラム（Amersham-Pharmacia）とFPLCシステム（バイオ−ラド社）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィを遂行してさらに高い純度に精製した。前記コラムに吸着されたタンパク質を１．０ｍｌ／分の流速で０．５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．０）とから構成された緩衝溶液を利用して溶離させた。
【００３５】
その結果、強い活性を表す２種類のS1 RNase分画とS2 RNase分画が回収された。このような２種類のRNase分画物は裁培種の果実樹種である富士林檎が遺伝型質的に異型接合体で２種類の花柱組織特異的RNaseが存在するためである。前記回収されたRNaseらは分子量及び等電点が各々異なり精製プロフィールを表２に整理した（SはSelf-incompatibilityの略字）。
【００３６】
【表２】
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前記表２に整理したように、酵素総活性はS1 RNaseとS2 RNaseが各々１３６ユニットと１１４ユニットであり、特異的活性はS1 RNaseとS2RNaseが各々８５００ユニットと６０００ユニットであった。精製効率は総タンパク質の抽出液を１００％を基準にして計算した時S1 RNaseとS2 RNaseが各々１０％と１４％であった。これから富士林檎の花柱組織特異的RNaseが高純度で精製されたことを分かる。
【００３７】
＜実施例２＞富士林檎の花柱組織特異的RNaseによる自己花粉の花粉管伸張抑制
前記実施例１−４で精製された花柱組織特異的S1 RNaseが自己花粉の花粉管伸張におよぶ影響を調べるために次のような実験を遂行した。まず、富士林檎雄蕊で作られる自己花粉のみを分離した。分離された花粉を実施例１−４で精製されたS1 RNaseを各々０，２，４，６ユニット（ｍｇ-1ｍｉｎ-1ｍｌ）で添加した花粉管伸張培地で２８℃で２４時間の間暗条件で自己花粉を培養した。前記花粉管伸張培地は２０ｍＭのMes-KOH（ｐＨ６．０）、０．０７％のCa(NO3)2・4H2O、０．０２％のMgSO4・7H2O、０．０１％KNO3、０．０１％H3BO3及び２％スクロースとから構成されており、花粉管を人工的に伸張させる。
【００３８】
前記花粉管伸張様相の実験結果を図３に示す。図３に示すように、花柱組織特異的S1 RNaseが添加されなかった対照区（Ａ）と比較した時、花柱組織特異的S1 RNaseを２，４，６ユニットで添加した場合（Ｂ，Ｃ及びＤ）に自己花粉の花粉管伸張が抑制された。この結果から、自家不和合性を誘発する決定的な因子が花柱組織特異的RNaseという事実を確認することができた。
【００３９】
＜実施例３＞花柱組織特異的RNase活性の阻害剤調査
前記実施例１−４で精製された花柱組織特異的S1 RNase及びS2 RNaseにタンパク質分解酵素の阻害剤として作用する化学物質らを添加して前記RNaseの活性変化を調べた。一般的なRNase活性促進剤ら、市販のRNase活性阻害剤及び本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤候補物質を添加してRNase活性を測定した(Singh A.等、Plant Physiology、96:61-68、1991)。そのうち阻害剤の代表的な物質であるタンパク質分解酵素抑制剤であるＥＤＴＡ、RNase活性促進剤であるCaCl2、市販のRNase活性阻害剤として猛毒性物質であるDEPC（シグマ社）、花柱組織特異的RNase阻害剤候補物質であるZnSO4及びCuSO4を各々１ｍＭで添加して測定したRNase活性結果を図４に表した。
【００４０】
その結果、前記花柱組織特異的RNaseの活性は１ｍＭのZnSO4（約２８８ｐｐｍ）と１ｍＭのCuSO4（約２５０ｐｐｍ）を各々添加した時、燐酸緩衝溶液でのRNaseの活性（対照区）１００％と比較して１５％以下で顕著に阻害された。DEPCのような市販中であるRNase活性阻害剤も花柱組織特異的RNaseに対し活性阻害効果が卓越であったが、これらは猛毒性物質であるため農作物には規制されている。これらの結果から、ZnSO4とCuSO4が花柱組織特異的RNaseの活性を効果的に阻害する物質であることが判明された。
【００４１】
＜実施例４＞花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理による自己花粉の花粉管伸張  前記実施例３で花柱組織特異的RNaseの阻害剤として判明されたZnSO4及びCuSO4が自己花粉の花粉管伸張に及ぼす影響を調べるために、次のような実験を遂行した。前記花柱組織特異的S1 RNase１０ユニット(ｍｇ-1ｍｉｎ-1ｍｌ-1）を花粉管伸張培地に添加して１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭのZnSO4と１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭのCuSO4を各々添加して実施例２と同一の方法で花粉管を培養した。
【００４２】
図５の花粉管伸張様相結果から花粉管の伸張を抑制するRNaseの活性が１ｍＭのZnSO4、２ｍＭのZnSO4と１ｍＭのCuSO4添加によって克服されて花粉管が再び伸張するようになることを観察することができた。これからZnSO4及びCuSO4が花柱組織特異的RNase活性の効果的な阻害剤であることが確認された。
【００４３】
＜実施例５＞野生種トマトで花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理時期の決定、結実率及び薬害調査
＜５−１＞花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理時期決定
本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤効果を実際の栽培環境で実験するために、研究用温室（大韓民国慶尚北道慶山市大邱カトリック大学所在）で裁培されている野生種トマトに本発明の花柱組織特異的RNaseを処理した。野生種トマトは自然界で代表的な自家不和合性植物であり遺伝的に単一品種のみを維持させる環境条件を維持しながら実験を遂行した。
【００４４】
本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理時期を決定するために、開花初期（つぼみ形成期〜満開前）、開花中期（満開時）、開花末期（満開１日後〜花期脱落期）に前記阻害剤を処理した。植物の水分が活発になされる時間帯である午前９時〜１１時の間に前記阻害剤ZnSO4は１ｍＭ（約２８８ｐｐｍ）で添加したし、CuSO4は１ｍＭ（約２５０ｐｐｍ）で処理した。結実率を調べて各実験で２５個花期（林檎の雄蕊、雌蕊組織、花びらなどを含んだ生殖組織）に対する４回反復実験の結果を表３に統計値で表した。
【００４５】
【表３】
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前記表３の結果で分かるように、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤を花期形成初期（満開４日〜７日前）に処理した時７０％以上の自己花粉による結実率を確保することができた。
【００４６】
＜５−２＞花柱組織特異的RNaseの阻害剤の濃度変化による結実率及び薬害調査
花柱組織特異的RNaseの阻害剤の濃度による結実率及び薬害を調べるために、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤であるZnSO4とCuSO4を濃度別に野生種トマトに満開４日前に処理した。
【００４７】
また、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤の結実調節剤としての効能を極大化させるために、ZnSO4またはCuSO4をヘキサコナゾル系、シロキサン系及びアルキルアリルポリエトキシル系展着剤を製造会社の推奨使用量に従って混合して処理した。
【００４８】
【表４】
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シロキサン系展着剤（商品名：シルエット、大韓民国東部精密化学社）を０．０３３５％で混合した組成物を製造して処理した。その後、表４に示すように自己花粉による結実率を調べた。各実験に２５個花期に対する４回反復実験結果を統計値で表した。
【００４９】
ZnSO4の場合には、１００〜８００ｐｐｍの範囲ですべての花期で受精された時を１００％の標準にすると、７０％以上の自己花粉による結実率が確保された。９００ｐｐｍ以上の濃度では花期が黄変するか、または早期に脱落される薬害が生じた。CuSO4の場合には１００〜７００ｐｐｍの範囲ですべての花期で受精された時を１００％の標準にすると、７０％以上の自己花粉による結実率が確保された。８００ｐｐｍ以上の濃度では薬害が生じた。
【００５０】
＜実施例６＞富士林檎で花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理時期決定及び結実率調査
＜６−１＞花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理時期決定
本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤効果を実際包装で実験するために、研究用温室（大韓民国慶尚北道青松郡所在）で裁培されている富士林檎に本発明の花柱組織特異的RNaseを処理した。富士林檎は自然界で代表的な自家不和合性植物であり遺伝的に単一品種のみを維持させる環境条件を維持しながら実験を遂行した。
【００５１】
本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤処理時期を決定するために、花期初期（つぼみ形成期〜満開前）、花期中期（満開時）、花期末期（満開１日後〜花期脱落期）に前記阻害剤を処理した。前記阻害剤にシロキサン系展着剤（商品名：シルエット、大韓民国東部精密化学社）を０．０３３５％で混合した組成物を製造して前記実施例５−１と同一の条件で実験を実施した後その結果を表５に表した。
【００５２】
【表５】
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前記表５に整理したように富士林檎の花期形成初期（満開３日〜５日前）に展着剤を混合した本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤を処理した結果野生種トマトのように７０％以上の自己花粉による結実率を確保することができた。
【００５３】
＜６−２＞花柱組織特異的RNaseの阻害剤の濃度変化による結実率及び薬害調査
花柱組織特異的RNaseの阻害剤の濃度による結実率及び薬害を調べるために、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤であるZnSO4とCuSO4を濃度別に富士林檎に満開４日前に処理した。
【００５４】
また、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤の果物結実調節剤としての効能を極大化させるために、ZnSO4またはCuSO4にシロキサン系展着剤（商品名：シルエット、大韓民国東部精密化学社）を０．０３３５％で混合した組成物を製造して処理した。
【００５５】
【表６】
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前記表６に整理したようにZnSO4の場合には１００〜８００ｐｐｍの範囲で７０％以上の自己花粉による結実率が確保され、９００ｐｐｍ以上の濃度では花期が黄変するか、または早期に脱落される薬害が生じた。CuSO4の場合には１００〜７００ｐｐｍの範囲で７０％以上の自己花粉による結実率が確保され、８００ｐｐｍ以上の濃度ではやはり薬害が生じた。
【００５６】
それぞれの実験結果は２５個花期に対する４回反復実験結果を統計処理して表した。
前記実施例５及び６の結果から、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤は配偶者体型自家不和合性植物の自家不和合性を種に関係なく打破させることができることが判明された。
【００５７】
（産業上の利用可能性）
前記の結果に示すように、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤である硫酸塩特に、CuSO4及びZnSO4を植物の開花初期（つぼみ形成期〜満開前）に処理することによって自己花粉による受粉及び結実が安定に誘導された。したがって、本発明の花柱組織特異的RNaseの阻害剤を有効成分で含む組成物を自家不和合性植物である林檎、梨、コーヒー、アーモンドなどの果樹類に適正濃度で処理することによって別の授粉樹を裁培しなくても自家受粉された果実及び植物を獲得することができる。また、授粉者の助けがなくても高い結実率を確保することができるために単位面積当たりの生産量を極大化することができる革新的な裁培方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  富士林檎の根、葉、幹、花びら、萼及び花柱から分離され、酵母のリボソームRNAを分解するRNaseの活性染色結果を表し、「→」は花柱組織特異的RNaseの活性を表すバンドであり、列１は根、列２は葉、列３は幹、列４は花びら、列５は蕚、列６は花柱である。
【図２】  裁培種林檎品種の紅ロ、紅玉、富士、国光及びスガルの花柱から分離した総タンパク抽出物の銀染色法結果を表し、「→」は富士林檎遺伝形質特異的RNaseの活性を表すバンドであり、Ｍは標準分子マーカーであり、列１は紅ロ、列２は紅玉、、列３は富士、列４は国光、列５は国光及びスガルである。
【図３】  富士林檎の花粉管伸張が花柱組織特異的RNaseを含む花粉管伸張培地で抑制される結果を表した顕微鏡写真であり、ＡはRNase無添加、Ｂは2ユニットのRNase添加、Ｃは4ユニットのRNase添加、Ｄは6ユニットのRNase添加である。
【図４】  富士林檎の花柱から分離・精製した花柱組織特異的S1及びS2RNase酵素活性を阻害する化学物質の阻害程度を表したグラフである。
【図５】  富士林檎の花粉管が花柱組織特異的RNase及び花柱組織特異的RNaseの阻害剤組成物を含む花粉管伸張培地で伸張される結果を表す顕微鏡写真であり、Ａでは１ｍＭのZnSO4と１０ユニットのRNaseを添加、Ｂでは２ｍＭZnSO4と１０ユニットのRNaseを添加、Ｃでは５ｍＭZnSO4と１０ユニットのRNaseを添加、Ｄでは１ｍＭCuSO4と１０ユニットのRNaseを添加、Ｅでは２ｍＭCuSO4と１０ユニットのRNaseを添加、Ｆでは５ｍＭCuSO4と１０ユニットのRNaseを添加した。
【図６ａ】  本発明の花柱組織特異的RNase阻害剤組成物による処理前の開花初期の野生種トマトを表す写真である。
【図６ｂ】  本発明の花柱組織特異的RNase阻害剤組成物による処理後の自家不和合性が打破されて自己花粉により受精された野生種トマトを表す写真である。
【図７ａ】  本発明の花柱組織特異的RNase阻害剤組成物による処理前の開花初期における富士林檎を表す写真である。
【図７ｂ】  本発明の花柱組織特異的RNase阻害剤組成物による処理後の自家不和合性が打破されて自己花粉により受精された富士林檎を表す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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