(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドイッチェ・ザムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ・イン・ブルンスウィック（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Brunswick）に、番号ＤＳＭ９９９１およびＤＭＳ９９９２の下に寄託された菌株を含むシュードノカルヂア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属のアミコラトプシス  エスピー.（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）の一菌株。
【請求項２】
アミコラトプシス  エスピー．ＤＳＭ９９９１もしくはＤＭＳ９９９２の微生物の存在下で、フェルラ酸からバニリンを製造する方法。
【請求項３】
（a）請求項２記載の方法によりフェルラ酸からバニリンを製造する工程、そして
(b)工程(a)で製造されたバニリンを芳香剤調製のために使用する工程を含むことを特徴とする芳香剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェルラ酸からバニリンを製造するための発酵的方法およびこの方法に適切な微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バニリンは、食品および飲料工業において多量に使用される重要な芳香物質である。今日まで、それは、場合によってはまた、オイゲノールまたはイソオイゲノールの酸化をへる化学的経路によって、主として亜硫酸廃液のリグニンから調製されてきた。しかしながら、この方法で得られるバニリンは、それが、食品法の意味においては天然物ではなく、したがって、また、天然芳香物質として表示してはならないという不利益をもっている。
【０００３】
これまで、天然芳香物質バニリンは、バニラ豆の抽出によってのみ得ることができた；しかしながら、この方法で得られる天然バニリンは、非常に高価である。天然芳香物質は、化学的には、植物または動物起源の出発材料から、適切な物理的処理（蒸留および溶剤抽出を含む）によるか、酵素的または微生物的処理によって得られる芳香性を有する物質として定義され、それだけで使用されるか、または慣用の食品加工法（乾燥、焙焼、発酵を含む）によって人間の消費のために調製される。
【０００４】
種々の微生物および酵素を用いる天然バニリン調製のための種々の他の方法が、その間に公表されているが、今日までは非常に低収量か低濃度であるが故に、市場にはいかなる製品をももたらしていない；欧州特許出願公開第４０５  １９７号、同第４５３  ３６８号および同第５４２  ３４８号、ＵＳ−ＰＳ５  １２８  ２５３、特開昭６３−２６７  ２６８号（２５．１０．１９８８）および同昭６３−２６７  ２８４号（２５．１０．１９８８）、参照。
【０００５】
科学文献では、フェルラ酸の分解におけるバニリンの生成が、非常に様々の生物において中間体として記述されているが、一般に、濃度に関するデータは与えられていない；Ｓ．Ｔｏｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓ−Ｆｅｒｕｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ”  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９  （１９７０），  ３３７−３４３；  Ｊ．Ｂ．  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｃｉｎｎａｍｉｃ，  ｐ−Ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｎｄ  Ｆｅｒｕｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｔｏｎｉｉ”  ｉｎ  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２９  （１９８３），  １２５３−１２５７；  Ｇ．  Ｏｅｔｕｅｋ，  ”Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｕｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”  ｉｎ  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６３  （１９８５），  ５０１−５０６；  Ｓ．  Ｎａｚａｒｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｒｕｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｖｉａ  ４−Ｖｉｎｙｌｇｕａｉａｃｏｌ  ｂｙ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  （Ｍａｒｔ．）  Ｓａｃｃ．”  ｉｎ  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２  （１９８６）  ４９４−４９７；  Ｍ．  Ｒａｈｏｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｆｅｒｕｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｂｙ  Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉｉ  ａｎｄ  Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｐａｌｍａｒｕｍ”  ｉｎ  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５５  （１９８９），  ２３９１−２３９８  、参照。
【０００６】
また、報告された菌株のあるものは、菌株収集機関に寄託されてなく、それ故、他の研究者には評価できない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
容易に利用できる出発材料からの天然バニリンの新規な実用的製造方法に関する研究において、驚くべきことに、これが、放線菌群からのある種の細菌を用いて、天然フェルラ酸の転化により、良好な収量および濃度において経済的に得られることがここに発見された。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、ドイッチェ・ザムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ・イン・ブルンスウィック（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  ｉｎ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）に、番号ＤＳＭ９９９１およびＤＭＳ９９９２の下に寄託された菌株を含むシュードノカルヂア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属の新規なアミコラトプシス  エスピー．（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）に関する。
【０００９】
化学分類学的研究の結果を基に、両分離株は、アミコラトプシス属（シュードノカルヂアシー（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）科）に指定された。同定は、次の５つの特性に基づいた：
１．ペプチドグリカンの特徴的なアミノ酸：メソ−ジアミノピメリン酸；
２．全細胞加水分解物からの特徴的な糖：アラビノースおよびガラクトース；
３．ミコール酸：なし；
４．メナキノン：ＭＫ−９（Ｈ４）；
５．脂肪酸パターン：イソ／アンテイソ−  ＋  １０−メチル−分枝飽和および不飽和脂肪酸、プラス２−ヒドロキシ脂肪酸。この脂肪酸パターンは，ア
ミコラトプシス属を代表する特徴である。
【００１０】
また、ＤＳＭ９９９１およびＤＳＭ９９９２は、アミコラトプシス属を代表する典型的外観−ベージュないし黄色の基底菌糸、そしてまたある種の培地では、細かい白色気菌糸−を示すので、アミコラトプシス属へのＤＳＭ９９９１およびＤＳＭ９９９２の指定は、形態学によってもさらに支持される。
【００１１】
主成分分析による登録されたＤＳＭ脂肪酸データベースとこの２菌株の脂肪酸パターンの比較は、２菌株についてアミコラトプシス・メヂテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）への指定をもたらした。しかしながら、類似指数は、両者の場合非常に低い（０．０３７および０．００６）ので、特定の種の指定はできない。
【００１２】
さらに、１６ＳｒＲＮＡの分析、および特徴的な部分配列とアミコラトプシス種菌株の登録された１６ＳｒＲＮＡデータベースとの比較は、脂肪酸分析の結果を支持した。また１６ＳｒＲＮＡ配列の場合には、既知のアミコラトプシス種菌株との高い相同性は、立証できなかった。２つの分離株のパターンに差異が見られなかった脂肪酸の結果とは反対に、１６ＳｒＲＮＡ配列を用いることによって、ＤＳＭ９９９１およびＤＳＭ９９９２を区別することは可能であった。１６ＳｒＲＮＡ配列における大きな差異（類似度９９．６％）を基に、ＤＳＭ９９９１およびＤＳＭ９９９２は、互いに独立したこれまで記述されてないアミコラトプシス種の菌株であると推定できる。
【００１３】
さらに、本発明は、新規なアミコラトプシス種またはそれらの酵素、あるいは前記アミコラトプシス種由来の遺伝物質（遺伝物質は、この反応に活性をもつ酵素の構造遺伝子および調節遺伝子をコードしている）をもつ微生物の存在下で、フェルラ酸からのバニリンの製造方法に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、このように調製されたバニリンの芳香剤調製のための使用に関する。
【００１５】
出発材料として好適な天然フェルラ酸は、なかんずく、天然オイゲノールからシュードモナス  エスピー．ＤＳＭ７０６２またはＤＳＭ７０６３を用いる転化によって得ることができる（ドイツ特許出願第４  ２２７  ０７６号）。
【００１６】
微生物は、微生物培養の常用法で常用の培養基において培養できる。基質は、培養の開始時、増殖の間または増殖完了後に、すべて一度でも、または比較的長期にわたって分散されても添加できる。フェルラ酸の量は、有利には、培養液中の化合物濃度が、８０ｇ／ｌ、好ましくは１５ｇ／ｌを超えないような量である。反応経過は、培養液中の出発材料および生産物を、高圧液体クロマトグラフィーにより定量することによって追跡できる。最適量のバニリンが生成された後、これが、抽出、蒸留またはクロマトグラフィーのような既知の物理的方法によって、培養液から単離される。かくして得られる粗生産物は、さらなる段階によって精製できる。
【００１７】
本発明の微生物は、合成、半合成または複合培養基において培養できる。これらの培養基は、炭素源、窒素源、無機塩、および場合により微量元素とビタミンを含む。
【００１８】
使用できる炭素源は、例えば、グルコースのような糖類、グリセロールまたはマニトールのような糖アルコール類、クエン酸のような有機酸、あるいは麦芽エキス、酵母エキスまたはカゼイン加水分解物のような複合混合物である。
【００１９】
適切な窒素源の例は、硝酸塩およびアンモニウム塩のような無機窒素源、そして酵母エキス、大豆粉、綿実粉、カゼイン、カゼイン加水分解物、コムギグルテンおよびコーンスチープリカーのような有機窒素源である。
【００２０】
使用できる無機塩は、例えば、中でもナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛および鉄の硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩およびリン酸塩である。
【００２１】
培養温度は、好ましくは、範囲１０〜５５℃、特に好ましくは、範囲３５〜４５℃である。培地のｐＨは、好ましくは、３〜９、特に、４〜８である。微生物は、適切な振盪装置でも、撹拌機を備えた発酵槽でも培養できる。培養中の管理は、十分な通気を確保しなければならない。微生物は、バッチ法、半連続または連続法でも培養できる。生産物が最大量に到達するまでの培養時間は、培養接種後４〜１２０時間である。使用されるか生成される物質の毒性から微生物を保護するために、培養基に吸着剤、例えば活性炭か、またはＲＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡＤ−２、ＲＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡＤ−７、ＸＡＤ−１６、ＲＬｅｗａｔｉｔＯＣ１０６２か１０６４のような吸着樹脂を添加することのが得策である。
【００２２】
以下の実施例におけるパーセンテージは、各場合、重量である。
【００２３】
【実施例】
実施例１
前培養の調製
バッフル付きの５００ｍｌ三角フラスコに、麦芽エキス１ｇ、グルコース０．４ｇおよび酵母エキス０．４ｇを含み、そして水で１００ｍｌにした培地１００ｍｌを満たし、次いで、１２１℃で２０分間殺菌した。冷却後、フラスコに、アミコラトプシス  エスピー．ＤＳＭ９９９１またはＤＳＭ９９９２の凍結グリセロール培養物２００μｌを接種した。培養は、ロータリー振盪機上で、４５℃、１００ｒｐｍで実施した。２４時間後、この培養物を、生産培地へ接種するために使用した。
【００２４】
実施例２
振盪フラスコにおける生産
側面バッフル付き５００ｍｌ三角フラスコ８個に、各々培地（グルコース４ｇ／ｌ、麦芽エキス１０ｇ／ｌおよび酵母エキス４ｇ／ｌ）１００ｍｌを満たし、次いで、１２１℃で２０分間蒸気殺菌した。
【００２５】
冷却後、フラスコに、各々、実施例１からのアミコラトプシス種ＤＳＭ９９９２の培養物２ｍｌを接種した。培養は、ロータリー振盪機上で、３７℃、１００ｒｐｍで実施した。
【００２６】
滅菌濾過したフェルラ酸３．３％溶液２０ｍｌを、各フラスコに、接種後１６時間に添加し、２４時間後４０ｍｌ、そして４４時間後さらに１０ｍｌを添加した。４７時間後、そのフラスコ培養液を一緒にし、そしてバニリンおよび未反応フェルラ酸の含量を測定した。
【００２７】
ＨＰＬＣ分析によれば、培養液中のバニリン含量は、７３１７ｐｐｍであった。フェルラ酸の１５２６ｐｐｍは、まだ未反応であった。８個のフラスコの培養液の最終重量は、１４２０ｇであった。これは、転化されたフェルラ酸を基に、転化率が理論量の約７２％であることを示す。
【００２８】
実施例３
１０  ｌ発酵槽におけるバニリンの生産
培養基（グルコース４ｇ／ｌ、麦芽エキス１０ｇ／ｌおよび酵母エキス６ｇ／ｌ）５  ｌを、発酵槽中で殺菌し、そして冷却後、実施例１によるＤＳＭ９９９２の種母培養１００ｍｌを接種した。
【００２９】
培養条件は、３７℃、５００ｒｐｍ、通気量５  ｌ／分であった。接種後１２．５時間に、フェルラ酸約３．７％溶液１．６３４ｋｇ（フェルラ酸６０．２ｇ）を添加した。１７．５時間後、さらなるフェルラ酸約３．７％溶液４．３９７ｋｇ（フェルラ酸１６４．７２ｇ）を、１０時間かけてポンプで添加した。
【００３０】
３２時間後、発酵を終了した。バニリン濃度は、１１．５ｇ／ｌであり、未反応のフェルラ酸１ｇ／ｌが、なお存在した。最終容量は、１１．２９  ｌであった。これは、転化されたフェルラ酸を基に、転化率が理論量の７７．８％であることを示す。
【００３１】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
【００３２】
１．  ドイッチェ・ザムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ・イン・ブルンスウィック（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  ｉｎ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）に、番号ＤＳＭ９９９１およびＤＭＳ９９９２の下に寄託された菌株を含むシュードノカルヂア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属のアミコラトプシス  エスピー．（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）。
【００３３】
２．  アミコラトプシス  エスピー．ＤＳＭ９９９１もしくはＤＭＳ９９９２、またはそれらの酵素、あるいはこの反応に活性をもつ酵素の構造および調節遺伝子をコードしている、アミコラトプシス  エスピー．ＤＳＭ９９９１もしくはＤＭＳ９９９２由来の遺伝物質を含む微生物の存在下で、フェルラ酸からバニリンを調製する方法。
【００３４】
３．  使用される出発成分が天然フェルラ酸である、第２項記載の方法。
【００３５】
４．  芳香剤調製のための、第２および３項記載の方法により調製されたバニリンの使用。