(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）化学変性サポニンまたはその分画が少なくとも１種のQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2を包含し、および、サポニンまたはその分画の化学変性が、
（１）QA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基のメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基への還元；または、
（２）QA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部の対応するグリコシド断片を生じる加水分解；または、
（３）（１）および（２）の組み合わせ；
から成る粗製クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる化学変性サポニンまたはその分画、
（ｂ）薬学的活性物質；および随意に、
（ｃ）薬剤的に許容されるキャリアー
を包含する、薬学的活性物質の動物の粘膜を通る摂取を増大させるための薬剤組成物。
【請求項２】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−17である請求項１の薬剤組成物。
【請求項３】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−18である請求項１の薬剤組成物。
【請求項４】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21である請求項１の薬剤組成物。
【請求項５】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21−V1である請求項１の薬剤組成物。
【請求項６】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21−V2である請求項１の薬剤組成物。
【請求項７】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−17である請求項１の薬剤組成物。
【請求項８】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−18である請求項１の薬剤組成物。
【請求項９】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−21である請求項１の薬剤組成物。
【請求項１０】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−21−V1である請求項１の薬剤組成物。
【請求項１１】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−21−V2である請求項１の薬剤組成物。
【請求項１２】
メチレンアミノ基が−CH2−Ｎ（Ｒ）−R'［式中、Ｒは水素であり、R'は水素、C1-8アルキル、C2〜C12アルキルアミノアルキル、アリル、アラルキル、C3〜C8シクロアルキル、アリールおよび式：
0003684370.tif 000009
（式中、Ｒ″は水素、C1-4アルキル、またはフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、C1-4アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾリルまたはカルバミル置換C1-4アルキル；またはＲとＲ″が共にピロリジルまたはピペリジニル環を形成する）を有する基からなる群から選ばれる］である請求項７〜11のいずれか１項の薬剤組成物。
【請求項１３】
（ａ）化学変性サポニンまたはその分画が少なくとも１種のQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2を包含し、および、サポニンまたはその分画の化学変性がQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部の対応するグリコシド断片を与える加水分解；単独または、メチレンアルコールまたはメチレンアミノ基へのQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基の還元との組み合わせ；から成る、粗製クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる化学変性サポニンまたはその分画、
（ｂ）薬学的活性物質；および随意に、
（ｃ）薬剤的に許容されるキャリアー
を含む薬学的活性物質の動物の粘膜を通る摂取を増大させるための薬剤組成物。
【請求項１４】
サポニンまたはその分画のアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されている請求項13の薬剤組成物。
【請求項１５】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−18−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項１６】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項１７】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21−V1−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項１８】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21−V2−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項１９】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−18−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項２０】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−21−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項２１】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−21−V1−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項２２】
サポニンまたはその分画が、アルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているQA−21−V2−Ｈである請求項13の薬剤組成物。
【請求項２３】
メチレンアミノ基が−CH2−Ｎ（Ｒ）−R'［式中、Ｒは水素であり、R'は水素、C1-8アルキル、C2〜C12アルキルアミノアルキル、アリル、アラルキル、C3〜C8シクロアルキル、アリールおよび式：
0003684370.tif 000010
（式中、Ｒ″は水素、C1-4アルキル、またはフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、C1-4アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾリルまたはカルバミル置換C1-4アルキル；またはＲとＲ″が共にピロリジルまたはピペリジニル環を形成する）を有する基からなる群から選ばれる］である請求項19〜22のいずれか１項の薬剤組成物。
【請求項２４】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−17またはサポニンQA−17を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項２５】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−18またはサポニンQA−18を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項２６】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−18−ＨまたはサポニンQA−18−Ｈを含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項２７】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−21またはサポニンQA−21を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項２８】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−21−ＨまたはサポニンQA−21−Ｈを含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項２９】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−21−V1またはサポニンQA−21−V1を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３０】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているサポニンQA−21−V1またはサポニンQA−21−V2を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３１】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−17またはサポニンQA−17を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３２】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−18またはサポニンQA−18を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３３】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−18−ＨまたはサポニンQA−18−Ｈを含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３４】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−21またはサポニンQA−21を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３５】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−21−ＨまたはサポニンQA−21−Ｈを含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３６】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−21−V1またはサポニンQA−21−V1を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３７】
トリテルペンアルデヒド基がメチレンアミノ基に還元されているサポニンQA−21−V2またはサポニンQA−21−V2を含有する粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる分画。
【請求項３８】
メチレンアミノ基が−CH2−Ｎ（Ｒ）−R'［式中、Ｒは水素であり;R'は水素、C1-8アルキル、C2〜C12アルキルアミノアルキル、アリル、アラルキル、C3〜C8シクロアルキル、アリールおよび式：
0003684370.tif 000011
（式中、Ｒ″は水素、C1-4アルキル、またはフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、C1-4アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾリルまたはカルバミル置換C1-4アルキル；またはＲとＲ″が共にピロリジルまたはピペリジニル環を形成する）を有する基からなる群から選ばれる］である請求項31〜37のいずれか１項のサポニン。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は薬化学分野である。特に本発明は、動物の粘膜を通る薬物送達を促進するための変性サポニンの使用に関する。本発明の変性サポニンは、天然サポニンに較べてかなり低減された粘膜に対する刺激性を示す。
発明の背景
ある種の小さいペプチドを鼻の粘膜を通って、嗅ぐことにより、または水溶液から直接吸収することができることは公知である。［ゴードン（Gordon、G.S.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  82:7419−7423（1985年）］。しかしながら吸収効率はかなり低く変動的であり、インシュリン等の治療上重要な分子量のより大きいペプチドはほとんど吸収されない。［ヒライ（Hirai）ら、ダイアベーテス（Diabetes）、27:296−299、（1978年）］。
数多くの研究者たちが、界面活性剤によりポリペプチドの送達を促進することを試みてきた。例えばゴードンら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA  82:7419−7423（1985年）には、疎水性胆汁酸塩によりインシュリンの鼻からの吸収が促進されることを報告している。
ロンゲネッカー（Longenecker、J.P.）ら、J.Pharm.Sci.76:351−355（1987年）には、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウムが薬物、特にインシュリンの鼻からの透過の有効な促進剤であることを開示している。
モリモト（Morimoto、K.）ら、J.Phaem.Pharmacol.37:134−136（1984年）には、インシュリンとカルシトニンの鼻からの吸収がポリアクリル酸ゲルによって促進され得ることを開示している。
またインシュリン−胆汁酸塩エアロゾルの成分としてのインシュリン投与が公開されているモーゼス（Moses、A.C.）、ダィアベット（Diabetes）、32:1040−1047（1983年）、および鼻、直腸、口腔、舌下および筋肉内インシュリン効力と胆汁酸吸収促進剤とを比較したアウングスト（Aungst、B.J.）ら、J.Pharm.Exp.Ther.244:23−27（1988年）参照。
ミタニ（Mitani、Ｙ）ら。Drug  Design  Del.1:65−70（1986年）には界面活性剤（非イオン、陰イオンおよび両性）による、およびよらないβ−インターフェロンの鼻腔内投与が開示されている。界面活性剤を使用しない場合、β−インターフェロンはウサギに吸収されなかった。鼻投与後のインターフェロンの吸収を促進するのにグリココール酸ナトリウムが最も有効であった。しかしながらグリココール酸ナトリウムによるβ−インターフェロンの吸収は、静脈内投与による全吸収の2.2％であった。
鼻組織によるポリペプチドの摂取を促進するために使用された他の界面活性剤にはサポニンが含まれる。サポニンは植物種（400以上）に広く分布し一連の生理活性を示すが、そのあるものは有用でありあるものは有害である。水中で撹拌した場合石鹸状の泡を生じ、そのグループにこの名が与えられるのはこの性質による。一般的にサポニンに帰せられる他の性質には例えば、溶血活性、コレステロール結合性および苦みがある。サポニンの化学および生物学的意義のレビューとしてはプライス（Price、K.R.）ら、CRC  Crit.Rev.Food  Sci.Nutr.26:27（1987年）参照のこと。
サポニン溶液が鼻の膜を通るポリペプチドの送達を促進するのに使用されている。例えばピリオン（Pillion、Ｄ）ら、Invest.Opthal.Vis.Sci.32:3021−27（1991年）には、Gypsophilla由来の未精製サポニンを１％溶液として含む目薬中のインシュリンの投与は、ラットにおけるＤ−グルコース血中レベルの迅速かつ再現性のある減少をもたらすことが報告されている。サポニンを含まないインシュリン目薬には効果がなかった。日本抄録JP第62126135号（1987年）には、ステロイドまたはテルペン構造を有するサポニンを使用する成長ホルモン放出因子の鼻腔投与が開示されている。またサポニン［シグマ・ケミカル社（Sigma  Chemical  Company）製］を含有する目薬の成分としての投与によるインシュリンの全身送達が開示されるチュー（Chiou、G.C.Y.）ら、J.Pharm.Sci.78:815−８（1989年）；およびチューら、J.Ocul.Pharm.5:81−91（1989年）参照のこと。またチューら、ダイアベット・ケア（Diabetes  Care）11:750−51（1988年）（サポニンのきげんは開示されていない）参照のこと。またサポニン［サポニンを和光純薬工業（Wako  Pure  Chemical  Ind.、Ltd、Osaka）から入手したという以外は起源が開示されていない］を含む溶液によるラットにおけるインシュリンの鼻腔投与が開示されるヒライ（Hirai、S.）ら、Int.J.Pharm.、9:173−84（1981年）およびヒライら、Int.J.Pharm.、9:165−72（1989年）参照のこと。
界面活性剤は粘膜を通る薬物の摂取を促進するのにおおいに有望であるが、主な欠点はそれらが刺激性であることである。従って界面活性剤を含む薬剤組成物の長期使用は不可能と思われる。しかしながら急性治療では、粘膜がそれ自身を容易に修復するので局所効果はより重要でない。鼻腔膜透過性を増進するために促進剤を使用する場合、長期毒性効果はより重要である。ポリオキシエチレン−９−ラウリルエステル等のある種の界面活性剤による粘膜の慢性侵食は、炎症、過形成（ハイパープラシア、Hyperplasia）、化生（メタプラシア、mataplasia）および正常な鼻の機能の劣化を伴うことがある。リー（Lee、W.A.）およびロンゲネッカー、BioPharm.、30−37（1988年）参照。
文献報告は生体塩が粘膜構造を破壊する［マーチン（Martin、G.P.）およびマリオット（Marriot、C.）、J.Pharm.Pharmacol.、31:754（1981年）］、膜からのリン脂質およびタンパク質放出を加速する［ホワイトモア（Whitmore、D.A.）ら、J.Pharm.Pharmacol.、31:277（1979年）］および腸粘膜を損傷する［キムラ（Kimura、T.）ら、J.Nut.Sci.Vitaminol.、（1982年）］ことを示している。慢性侵食はまた、鼻腔循環を空気中のバクテリアおよび関連毒物に暴露する［リーおよびロンゲネッカー、Biopharm.30−37（1988年）］。従って、刺激を起こさずに粘膜を通る薬物送達を促進する新しい界面活性剤の開発を引き続き行う必要がある。
発明の要旨
本発明は薬学的活性物質の粘膜を通る摂取を促進するための薬剤組成物に関し、以下を包含する；
（ａ）粗クイラヤ・サポナリア（Quillaja Saponaria）抽出物から得られる化学変性サポニンまたはその分画であって、QA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されていてもよいQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；またはQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部が加水分解によって除去され対応するグリコシド断片を生じるQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；またはQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されていてよく、かつQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部が加水分解により除去され対応するグリコシド断片を生じるQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；
（ｂ）薬学的活性物質；および随意に
（ｃ）薬剤的に許容されるキャリアー。
本発明はまた粘膜を通る薬学的活性物質の摂取を促進する方法であって、前記粘膜を薬剤組成物と接触させることを包含する方法に関し、この薬剤組成物は以下の成分を包含する；
（ａ）粗クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる化学変性サポニンまたはその分画において、QA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されていてもよいQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；またはQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部が加水分解によって除去され対応するグリコシド断片を生じるQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；またはQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されていてもよく、かつQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部が加水分解により除去され対応するグリコシド断片を生じるQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；
（ｂ）薬学的活性物質；および随意に
（ｃ）薬剤的に許容されるキャリアー。
図面の説明
図１はQA−17、QA−18およびQA−21の構造的関係を表す。
図2AはPBS（○）、QA−21（●）およびアルデヒド基がメチレンアルコールに還元されているQA−21（▲）の溶血活性を示すグラフを表す。図2BはQA−18−Ｈ（○）、QA−21H（●）、QA−７（□）およびQA−21（▲）の溶血活性を示すグラフを表す。
図3Aは20μｌの生理食塩水の眼球投与後のラットの血液グルコースレベルを示すグラフを表す。図3Bは0.5％の市販粗ギプソフィラ・サポニン（シグマケミカル社）＋0.4％の豚インシュリンを20μｌ眼球投与後の血液グルコースレベルを示すグラフを表す。図3Cは0.5％の粗クイラヤ・サポニン（水抽出液から超濾過で精製）＋0.5％の豚インシュリンを20μｌ眼球投与後の血液グルコースレベルを示すグラフを表す。
図４は0.1％QA−21−Ｈ（インシュリンなし）の眼球投与の、ラットの血液グルコースレベルに対する効果を示す。
図５は0.025％QA−21−Ｈおよび0.4％正規豚インシュリン20μｌの眼球投与の、３匹のラットの血液グルコースレベルの平均に対する結果を表す。
図６は0.05％QA−21−Ｈおよび0.4％正規豚インシュリン20μｌの眼球投与の、３匹の雄ラットの血液グルコースレベルの平均に対する結果を示すグラフである。
図７は0.1％QA−21−Ｈおよび0.4％正規豚インシュリン20μｌの眼球投与の、３匹の雄ラットの血液グルコースレベルの平均に対する結果を示すグラフである。
図８は第一のラット（■）に対する0.01％QA−21−Ｈおよび0.4％正規豚インシュリン10μl/眼球；第二のラット（◆）に対する0.01％純QA−21−Ｈおよび0.4％正規豚インシュリン10μl/眼球；および第三のラット（ｘ）に対する0.01％QA−21−Ｈおよび0.4％正規豚インシュリン20μl/眼球の眼球投与の血液低下効果を示すグラフである。
図9Aはクイラヤ・サポナリア樹皮抽出物の逆相HPLC分析を表す。図9Bはアルカリ加水分解後のクイラヤ・サポナリア樹皮抽出物の逆相HPLC分析を表す。
図10Aはアルカリ加水分解後にQA−18から得られた精製QA−18−Ｈの逆相HPLC分析を表す。図10Bはアルカリ加水分解後にQA−21から得られた精製QA−21−Ｈの逆相HPLC分析を表す。
図11はQA−21（○）、グリシンによる還元アミノ化によりトリテルペンアルデヒド位で変性されたQA−21（●）、エチレンジアミンによる還元アミノ化によりトリテルペンアルデヒド位で変性されたQA−21（□）、およびエチルアミンによる還元アミノ化によりトリテルペン位で編成されたQA−21（△）のアジュバント活性を示すグラフを表す。
図12はQA−21（○）、および対応するメチレンアルコールへの還元によりトリテルペン位で変性されたQA−21（●）のアジュバント活性を示すグラフを表す。
好ましい実施態様の説明
本発明は粘膜を通る薬学的活性物質の送達を増進するための薬剤組成物の成分として使用する場合、サポニンによって引き起こされる刺激が、クイラヤ・サポナリア・モリナ（Molina）樹皮中に存在しこの原料から精製できるアジュバント化合物であるQA−17、QA−18およびQA−21のアルデヒド基を変性することにより軽減されるという発見に関する。
本発明は動物に投与した場合、実質的にアジュバント活性または刺激性を有さないが、薬物輸送に対し充分な溶菌効果を保持する変性サポニンを使用する。このような変性サポニンはいくつかの方法で得られる。最初の方法では精製QA−17、QA−18、QA−21、それらの混合物、またはクイラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られQA−17、QA−18およびQA−21を含有するる精製分画のアルデヒド基がナトリウムまたはリチウムボロハイドライド等の穏和な還元剤で還元され、アルコールが得られる。方法Ｉ参照。別法ではQA−17、QA−18、QA−21、それらの混合物、またはクイラヤ・サポナリア・モリナ樹皮から得られQA−17、QA−18およびQA−21を含有するる精製分画のアルデヒドに一級アミンと還元剤による還元アミノ化を行い、QA−17、QA−18および／またはQA−21の関連するアミノ誘導体が得られる。方法II参照。
還元的アルキル化工程に使用できる一級アミンの例には、それに限定されるものではないがメチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、２−メチル−２−アミノエチルアミン、３−メチル−３−アミノプロピルアミン、４−メチル−４−アミノブチルアミン、５−メチルアミノペンチルアミン、６−メチルアミノヘキシルアミン、３−メチルアミノ−２−メチルプロピルアミン、２−エチルアミノエチルアミン、３−エチルアミノプロピルアミン、４−エチルアミノブチルアミン、５−エチルアミノペンチルアミン、６−エチルアミノヘキシルアミン、３−プロピルアミノプロピルアミン、４−プロピルアミノブチルアミン、５−プロピルアミノペンチルアミン、６−プロピルアミノヘキシルアミン、２−（N,N'−ジメチルアミノ）エチルアミン、３−ジメチルアミノプロピルアミン、４−ジメチルアミノブチルアミン、５−ジメチルアミノペンチルアミン、６−ジメチルアミノヘキシルアミン、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピルアミン、２−（N,N'−ジエチルアミノ）エチルアミン、３−ジエチルアミノプロピルアミン、４−ジエチルアミノブチルアミン、５−ジエチルアミノペンチルアミン、６−ジエチルアミノヘキシルアミン、３−ジプロピルアミノプロピルアミン、４−ジプロピルアミノブチルアミン、５−ジプロピルアミノペンチルアミン、６−ジプロピルアミノヘキシルアミン、５−ジエチルアミンペンタン−２−アミン、およびグリシン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、セリン、イソロイシン、スレオニン、バリン、プロリン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン酸、トリプトファン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはシステイン等のアミノ酸が含まれる。
0003684370.tif 000002
0003684370.tif 000003
好ましくはそのエステル側鎖はアジュバント活性を減少させるために加水分解されている、クイラヤ  サポナリア由来のサポニンの精製分画が用いられる。方法III参照。この加水分解の生成物であるQA−18−ＨとQA−21−Ｈは粘膜を通る薬物の摂取を促進する。この様な加水分解は精製サポニンから行うことができるか、あるいはその後の変性サポニンの精製を伴う粗混合物で行うことができる。図10は精製されたQA−18およびQA−21それぞれから得られたQA−18−ＨおよびQA−21−Ｈの逆相HPLC分析を示す。図９はQA−18−ＨとQA−21−Ｈが優勢な生成物であり、クイラヤ  saponnaria樹皮からの粗抽出物のアルカリ加水分解後に容易に精製できることを示している。
0003684370.tif 000004
好ましくはQA−18−ＨとQA−21−Ｈは炎症反応と残存アジュバント効果を低減するためにさらに変性される。方法IVに示される様にQA−18−ＨとQA−21−Ｈのアルデヒド基はナトリウムまたはリチウムボロハイドライドで還元され、対応するメチルアルコールを与える。また、アルデヒド基に一級アミンとナトリウムまたはリチウムボロハイドライドで還元的アミノ化が行われ、対応する二級アミンを与える。方法IV参照。
0003684370.tif 000005
従って本発明は薬学的活性物質の粘膜を通る摂取を促進するための薬剤組成物に関し、以下を包含する；
（ａ）粗製クイラヤ・サポナリア抽出物から得られる化学変性サポニンまたはその分画において、QA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されていてもよいQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；またはQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部が加水分解によって除去され対応するグリコシド断片を生じるQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；またはQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2のトリテルペンアルデヒド基がメチレンアルコールまたはメチレンアミノ基に還元されていてもよく、かつQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の脂肪酸アラビノース部または脂肪酸アラビノース−ラムノース部が加水分解により除去され対応するグリコシド断片を生じるQA−17、QA−18、QA−21、QA−21−V1およびQA−21−V2の少なくとも１種を包含する化学変性サポニンまたはその分画；
（ｂ）薬学的活性物質；および随意に
（ｃ）薬剤的に許容されるキャリアー。
アミノ基は式：−Ｎ（Ｒ）−R'［式中、Ｒは水素;R'は水素、C1-8アルキル、C2−C12アルキルアミノアルキル、アリール、アラルキル、C3−C8シクロアルキル、アリールおよび式：
0003684370.tif 000006
（式中R''は水素、C1-4アルキルまたはフェニル、ヒドロキシフェニル、インドリル、メルカプト、C1-4アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、グアニジノ、イミダゾリルまたはカルバミル置換C1-4アルキルであるか；またはＲおよびR''は共にピロリジニルまたはピペリジニル環を形成する）
を有する基を表わす］を有する。
典型的なC1−C8アルキル基にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、ペンチルおよびヘキシル基が含まれる。
典型的なC3−C8シクロアルキル基にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル基が含まれる。
典型的なアリル基にはフェニル、ナフチル、フェナンスリル、アンスラシル、およびフルオレニル基が含まれる。
典型的なアラルキル基には例えばフェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、フェニルペンチルおよびフェニルヘキシル基等の上記アリール基の１種で置換されたC1−C8アルキル基と、その分枝同族体が含まれる。
典型的なC2−C12アルキルアミノ基には２−メチルアミノエチル、３−メチルアミノプロピル、４−メチルアミノブチル、５−メチルアミノペンチル、６−メチルアミノヘキシル、３−メチルアミノ−２−メチルプロピル、２−エチルアミノエチル、３−エチルアミノプロピル、４−エチルアミノブチル、５−エチルアミノペンチル、６−エチルアミノヘキシル、３−プロピルアミノプロピル、４−プロピルアミノブチル、５−プロピルアミノペンチル、６−プロピルアミノヘキシル、２−（N,N'−ジメチルアミノ）エチル、３−ジメチルアミノプロピル、４−ジメチルアミノブチル、５−ジメチルアミノペンチル、６−ジメチルアミノヘキシル、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル、２−（N,N'−ジエチルアミノ）エチル、３−ジエチルアミノプロピル、４−ジエチルアミノブチル、５−ジエチルアミノペンチル、６−ジエチルアミノヘキシル、３−ジプロピルアミノプロピル、４−ジプロピルアミノブチル、５−ジプロピルアミノペンチル、６−ジプロピルアミノヘキシル、５−ジエチルアミンペンタン−２−イル等が含まれる。
その内容が完全に本明細書の一部をなす米国特許第５、057、540号によれば、サポニンは南米産樹木であるクイラヤ  サポナリア  モリナの樹皮の水抽出液から精製される。サポニン活性を有する少なくとも22ピークが分離可能である。優勢な精製クイラヤサポニンはQA−７、QA−17、QA−18およびQA−21である。これらのサポニンは高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）および低圧シリカクロマトグラフィーで精製されている。QA−21は疎水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）を用いてさらに精製され、異なった化合物であるQA−21−V1およびQA−21−V2に分離される。従って「QA−21」は、40mM酢酸のメタノール／水（58/42、v/v）溶液を用い、バイダック（Vydac）C4（粒子寸法５μｍ、孔径330Å、4.6mmID×25cml）の逆相HPLC上で単一ピークとして現れる成分QA−21−V1とQA−21−V2の混合物を表す。その成分分画は、さらに精製された成分で行われた実験を記述する場合、特にQA−21−V1およびQA−21−V2と呼ばれる。
クイラヤ  サポナリア  モリナ樹皮由来のサポニンを精製するために、クイラヤ  サポナリア  モリナ樹皮の水抽出物を水に対し透析する。透析抽出物を凍結乾燥で乾燥、メタノールで抽出し、メタノール可溶抽出物をシリカゲルクロマトグラフィー上および逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）でさらに精製する。それぞれのサポニンは逆相HPLCで分離される。少なくとも22本のピーク（QA−１〜QA−22と指定される）が分離できる。それぞれのピークは逆相薄層クロマトグラフィー上で単一ピークのみを示す炭化水素に対応する。それぞれの成分がバイダックC4HPLCカラムで以下のように同定された：
ピーク 保持時間（分） ピーク 保持時間（分）
QA−１  溶媒先端        QA−12  21.2
QA−２  4.6             QA−13  22.6
QA−３  5.6             QA−14  24.0
QA−４  6.4             QA−15  25.6
QA−５  7.2             QA−16  28.6
QA−６  9.2             QA−17  35.2
QA−７  9.6             QA−18  38.2
QA−８  10.6            QA−19  43.6
QA−９  13.0            QA−20  47.6
QA−10  17.2            QA−21  51.6
QA−11  19.0            QA−22  61.0
実質的に純粋なQA−17サポニンは以下のように性格づけされる：アジュバント活性を有する；乾燥重量あたり約29％の炭化水素を（アントロンで分析）含む;205−210nmにUV吸収極大を有する；粒子径５μｍ、孔径330Å、4.6mmID×25cmLを有するバイダックC4カラム上、流速1ml/min、40mM酢酸のメタノール−水（58:42;v/v）の溶液中でRP−HPLCにかけたときの保持時間約35分;40mM酢酸中の粒子径５μｍ、孔径330Å、10mmID×25cmLを有するバイダックC4カラムから50〜80％メタノールグラディエント溶離で63−64％メタノールで溶出；水中で0.06％（w/v）および０リン酸緩衝生理食塩水中で0.03％の限界ミセル濃度を有する;25μg/mlでヒツジ赤血球の溶血を引き起こす；およびモノサッカライド残基末端ラムノース、末端キシロース、２−フコース、３−キシロース、３、４−ラムノース、２、３−グルクロン酸、末端グルコース、２−アラビノース、末端ガラクトースおよびアピオース（結合は決定されず）を含有する。
実質的に純粋なQA−18サポニンは以下のように性格づけされる：免疫アジュバント活性を有する；乾燥重量あたり約25−26％の炭化水素を（アントロンで分析）含む;205−210nmにUV吸収極大を有する；粒子径５μｍ、孔径330Å、4.6mmID×25cmLを有するバイダックC4カラム上、流速1ml/min、40mM酢酸のメタノール−水（58:42;v/v）の溶液でRP−HPLCにかけたときの保持時間約38分;40mM酢酸中の粒子径５μｍ、孔径330Å、10mmID×25cmLを有するバイダックC4カラムから50〜80％メタノールグラディエント溶離で64−65％メタノールで溶出；水中で0.04％（w/v）およびリン酸緩衝生理食塩水中で0.02％（w/v）の限界ミセル濃度を有する;25μg/ml以上でヒツジ赤血球の溶血を引き起こす；およびモノサッカライド残基末端アラビノース、末端アピオース、末端キシロース、末端グルコース、末端ガラクトース、２−フコース、３−キシロース、3,4−ラムノースおよび2,3−グルクロン酸を含有する。
実質的に純粋なQA−21サポニンは以下のように性格づけされる：免疫アジュバント活性を有する；乾燥重量あたり約22％の炭化水素を（アントロンで分析）含む;205−210nmにUV吸収極大を有する；粒子径５μｍ、孔径330Å、4.6mmID×25cmLを有するバイダックC4カラム上で、流速1ml/min、40mM酢酸のメタノール−水（58:42;v/v）溶液でRP−HPLCにかけたときの保持時間約51分；粒子径５μｍ、孔径330Å、10mmID×25cmLを有するバイダックC4カラムから40mM酢酸の50〜80％メタノールグラディエント溶離で69−70％メタノールで溶出；水中で約0.03％（w/v）およびリン酸緩衝生理食塩水中で0.02％の限界ミセル濃度を有する;25μg/ml以上でヒツジ赤血球の溶血を引き起こす。成分分画である実質的に純粋なQA−21−V1およびQA−21−V2サポニンはFAB−MSにより同じ分子量と同一のスペクトルを有する。それらはQA−21−V1が末端アピオースを有するのに対しQA−21−V2ではキシロースである（従って２個の末端キシロースを有しアピロースを有さない）点で異なるのみである。二つの成分はさらにモノサッカライド末端アラビノース、末端アピオース、末端キシロース、４−ラムノース、末端ガラクトース、２−フコース、３−キシロース、および2,3−グルクロン酸を含有する。
アルカリ加水分解生成物は以下の様に調製される。QA−18を短時間のアルカリ加水分解処理すると１個の主要炭化水素含有アルカリ加水分解生成物（QA−18−Ｈと命名）を生じた。精製QA−18−ＨはQA−18から調製され、以下の様に単離された。
1mlのQA−18（5mg/ml）を25μｌの1N  NaOHと室温で15分間インキュベートした。反応を100μｌの1N酢酸を加えて停止した。これらの加水分解条件を用いてQA−18は、未加水分解QA−18に対する66.8minに較べて保持時間8.0minを有するピークにおいて溶出し、QA−18−Ｈの親水性増加を示す主要加水分解生成物（QA−18−Ｈ）に完全に転換された。［クロマトグラフィーは55/45のメタノール／水（v/v）中の0.1％トリフルオロ酢酸中、バイダックC4（4.6mmID×25cmL）；流速1ml/min、180分間のグラディエントで64/36メタノール／水（v/v）で溶出］。純粋なQA−18−Ｈ（保持時間8.0min）を含有するピークを次の特性評価のためにプールした。QA−21−Ｈで表されるQA−21の加水分解生成物を同じ方法で調製し精製した。QA−21Hは未加水分解QA−21の80.4minに対して9.3minの保持時間を有した。これらの加水分解生成物はHPLCの保持時間と逆相薄層クロマトグラフィーにより、NH4HCO3中の穏和なアルカリ加水分解を用いるヒグチ（Higuchi）ら、フィトケミストリー（Phytochemistry）、26:229（1987年）、の方法を用いて得られる主要加水分解生成物と同一であることが示された（表５）。さらにこれらの生成物QA−18−ＨおよびQA−21−Ｈは、QA−７、QA−17、QA−18およびQA−21と共に他のサポニンを含有する粗サポニン混合物である「Quil−Ａ」の加水分解からの主要分解生成物であることが示され、これは加水分解生成物QA−21−ＨおよびQA−18−Ｈは上記ヒグチらにより構造決定のために単離されたものと同じ加水分解生成物であることを示している。
0003684370.tif 000007
変性サポニンを包含する本発明の組成物は、多数の薬学的活性物質のいずれかひとつの粘膜を通る摂取を促進するために使用される。好ましくはこの様な薬学的活性物質はポリペプチドであるが、本発明はそれに限定することを意図しない。本発明の変性サポニンを包含する組成物は、その分子量が約200、000未満であるかぎり、どの様な薬学的活性物質の摂取を促進するために使用できる。
本発明の組成物と共に投与されるこの様なポリペプチドの例には、それに限定されるものではないがインシュリン、インシュリン様成長因子、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、レニン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、コルチコトロピン、卵胞刺激ホルモン、絨毛膜生殖線刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体放出ホルモン、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、IgG等の抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）、エンケファリン［スー（Su、K.S.E）ら、J.Pharm.Sci.74:394−98（1985年）］、カルシトニン［マックマーチン（McMartin、Ｃ）およびピータース（Peters、G.）、デリバリー・システム・フォア・ペプチド・ドラッグス（Delivery  System  For  Peptide  Drugs）、デービス（Davis）ら（編集）、pp.249−53、プラヌム・プレス（Planum  Press）ニューヨーク（1986年）］、ソマトスタチン［（マックマーチンおよびピータース、デリバリー・システム・フォア・ペプチド・ドラッグス、デービス、S.S.ら（編集）、pp.255−63、プラヌム・プレス・ニューヨーク（1986年）］、メチオニル成長ホルモン［ムーア（Moore、J.A.）ら、デリバリー・システム・フォア・ペプチド・ドラッグス、デービス、S.S.ら（編集）、pp.317−329、プラヌム・プレス・ニューヨーク（1986年）］、オキシトシン［ヘンドリックス（Hendricks、C.H.）およびポーズ（Pose、S.V.）、J.A.M.A.175:384−387（1961年）］、バソプレシンおよびデスモプレシン［リッチソン（Richson、D.W.）およびロビンソン（Robinson、A.G.）、Ann.Int.Med.103:228−239（1985年）］、黄体ホルモン放出ホルモン［フィンク（Fink、G.）ら、J.Endocr.63:351−360（1974年）］、酢酸ナファレイン［アニック（Anik、S.T.）ら、.Pharm.Sci.73:684−685（1984年）］、セクレチン［オーワキ（Ohwaki、T.）ら、J.Pharm.Sci.、74:5510−552（1985年）］、グルカゴン［ポンテォローリ（Pontiroli、A.E.）ら、Acta  Diabetol  Let.22:102−110（985年）］、ピモロール［カイラ（Kaila、T.）ら、J.Ocular  Pharm.1:79−83（1985年）］、ピモロール［カイラ（Kaila、T.）ら、J.Ocular  Pharm.、1:79−83（1985年）］、チロトロピン放出ホルモン［サンドー（Sandow、J.）およびペトリ（Petri、W.）、Trans  Nas.System.Med.、チェン（Chien、Y.W.）編集、エルゼビア・サイエンス・パブリシャーズ（Elsevier  Science  Publishers  B.B.）、アムステルダム、pp.183−199（1985年）］が含まれる。
さらに本発明の組成物は酵素、すなわちトランスフェラーゼ、ハイドロラーゼ、イソメラーゼ、プロテアーゼ、リガーゼおよびエステラーゼ、フォスファターゼ、グリコシダーゼ、およびペプチダーゼ等のリガーゼおよびオキシドレダクターゼ；ロイペプチン、キモスタチンおよびペプスタチン等の酵素阻害剤、および腫瘍アンギオジェネシス因子等の成長因子の鼻孔膜を通る摂取を促進するために使用される。
他の適当な薬学的活性物質は脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫと共にプロゲステロン、エストロゲンおよびアンドロゲン等の脂溶性ステロイドである。
低および高分子量ペプチドに加えて、薬学的活性物質は抗炎症剤（例えばインドメタシン、フルールビプロフェン、ケトプロフェン、イブプロフェン、フェニルブタゾン）、抗生物質（例えばベータラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、プリリドンカルボン酸、ホスフォマイシン）、抗腫瘍剤（例えばアドリアマイシン、シスプラチン、ブレオマイシン、マイトマイシン、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、アミノ酸（例えばアスコルビン酸、Ｎ−アセチルトリプトファン）、抗カビ剤、プロスタグランディン、ビタミン、ステロイドおよび抗ウイルス剤（AZT、DDI、アシクロビーア、ヨードウリジン、アマンタジンおよびビダラビン）である。
本発明の組成物は結膜、鼻膜、膣、結腸、尿道、膀胱、肺、大腸およびおよび小腸を含む任意の粘膜に応用できる。本発明の組成物はまた、例えばパッチの成分として経皮的に投与される。好ましくは本発明の組成物は目薬の成分として眼に、エアロゾルの成分として鼻に、または固形ウエファーの成分として経口的に投与される。
さらに本発明の組成物は適当な支持放出組成物中に調合される。例えば変性サポニンと薬物を、サポニンと薬物を長期間にわたって放出するシリコーンエラストマーと組み合わせることができる。シリコーンエラストマーはまた、アルブミンを包含してもよい。米国特許第４、985、253号明細書の内容を本発明の一部とする。シリコーンエラストマーからの薬物の放出速度は、シリコーンエラストマー中に水溶性または脂溶性混合剤または共通溶剤（例えばポリエチレングリコール400、ポリソルベート80、アルギン酸ナトリウム、Ｌ−アラニン、塩化ナトリウム、ポリジメチルシロキサン）を加えて制御することができる。放出速度を加速する目的で任意の他の添加剤もまたシリコーンエラストマー中に加えることができる。
さらに薬学的活性物質とサポニンはポリラクチドおよび／またはポリグリコリドコポリマー、セルロースポリマー（メチル−、メチルヒドロキシエチル−、ヒドロキシプロピル−、ヒドロキシエチル−、ナトリウムカルボキシエチルセルロース）、ポリアクリル酸、ポリメチルメタクリレート、架橋ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、アガロース、またはジビニルアゾベンゼン架橋スチレンとヒドロキシエチルメタクリレートを包含する制御放出組成物に配合される。また薬学的活性物質とサポニンはDEAE−デキストランマイクロスフェア、澱粉マイクロスフェア、またはアルブミンマイクロスフェアの成分として調合される。
サポニンと薬学的活性物質が支持放出組成物中に調合される場合、薬剤物質の内容物は投与される投与量、および放出速度によって適当に制御される。組成物がマトリックス型調合物に成形される場合、薬剤物質は通常５〜40重量％であり、より好ましくは15重量％を越えない、例えば９重量％以下である。ペプチドホルモンを投与する場合、その含有量は約６〜10重量％未満でなければならない。使用する場合、アルブミンは50重量％未満で、好ましくは約20〜30重量％で存在する。シリコーンエラストマーは50重量％以上の量で、好ましくは70〜90重量％の量で含まれる。
支持放出組成物は成分を任意の順番で混合して調製される。アルブミンを添加する場合、薬物とアルブミンが最初に、好ましくは固形で混ぜ合わされる。また薬剤物質とアルブミンの水溶液を混ぜ合わせ、得られた混合物が固形混合物をつくるために凍結乾燥される。この混合物を次いでエラストマー基剤と、随意には可塑剤（例えばジメチルポリシロキサン）と均一に分散し、そこに硬化剤を加え得られた混合物を撹拌する。混合物を次いで適当な鋳型に満たし、室温で硬化して成形組成物を得る。別法では薬剤物質を含まないコア材料を、薬剤物質、随意にはアルブミンを含有するシリコーンエラストマーを包含する組成物で被覆し、成形組成物を製造する。この様なコア材料は任意の非毒性材料を包含する。好ましくはこの様なコア材料は弾性ポリマーである。
本発明の支持放出組成物は体腔中で粘膜と有効に接触するに適した任意の形状を有する。例えば薬学的活性物質が舌下投与される場合、支持放出組成物はウエファーの形である。薬学的活性物質が膣から投与される場合、支持放出組成物はリング状の形態である。眼から投与する場合、支持放出組成物は薄い眼移植物の形状である。
本発明の組成物はまたサポディラ（sapodilla）のラテックスからのガムを包含するチュウインガムの成分として調合される。好ましくはチュウインガム組成物はまた甘味剤、（砂糖、アスパルテーム等）および薬学的活性物質に伴う不快な味をマスクする芳香剤（スパーミント、ウインターグリーンまたはペパーミント油等）を包含する。
眼または鼻から投与する場合、本発明の組成物は薬剤として許容される緩衝系によりpH3.0〜8.0の間、最も好ましくpH5.0〜5.4に緩衝された水溶液中に調合される。pHを好ましい範囲に維持する事ができる任意の薬剤として許容される緩衝系が本発明の実施に使用される。典型的な緩衝液は例えば酢酸緩衝液、ホスフェート緩衝液、シュウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液等である。緩衝液の濃度は0.005〜0.1モルの範囲、最も好ましくは約0.02モルである。
本発明の組成物が眼球投与される場合、組成物はデキストロースとグルタチオンと共にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩素および炭酸イオンを含む溶液を包含する。例えば米国特許第４、550、002号、第４、443、432号参照。また眼用液は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸を含む水溶液を包含する。水酸化ナトリウムがpH値を約7.25にするために含まれてもよく、硫酸マグネシウムも含まれてもよい。英国特許出願GB第２、064、320号参照。また眼に投与した場合苦痛を与えない潅注液を開示する米国特許第４、938、970号参照。この特許によれば電解液はpH6.85〜8.0に緩衝された２〜10meq/LのK+、0meq/LのCa++、1meq/LのMg++および110〜150meq/LのNa+を包含する。
保存剤、組織の浸透圧値を保つ塩類、または既知の鼻または眼用調合化学により指示される他の添加剤もこれらの調合物に添加してよい。
「動物」という用語は、本発明の組成物から利益を受ける全ての動物を意図する。これらの動物のうちの第一はヒトであるが、本発明はそれに限定することを意図せず、本発明の有利な効果を得る任意で全ての動物を処置することが本発明の意図する範囲である。
鼻からの投与の目的では、本発明の組成物は好ましくは内容物を鼻粘膜に施すことを可能にする手段、例えば鼻アプリケータ装置を備えた容器中に入れる。適した施法は公知であり、液体組成物を鼻粘膜にドロップまたはスプレー形状で投与するために用いられるものが含まれる。ポリペプチドの投与量はできるかぎり性格に制御されなければならないので、投与量が正確な制御をしやすいスプレーアプリケーターの使用が一般に好ましい。適した投与器には例えば噴霧器、例えばポップ噴霧器およびエアロゾルディスペンサーが含まれる。後者の場合、アプリケーターは鼻用アプリケータで使用するに適した噴射媒体と共に本発明による組成物を含有する。噴霧器は適当なスプレーアダプターを備えていて、内容組成物を鼻粘膜へ送達できる。この様な器具は公知である。
容器、例えば鼻用アプリケーターまたはドロップボトルは一回の鼻または眼からの投与、または数日または数週間にわたる数回の連続投与に充分な組成物を含む。
以下の実施例は説明のためであり、本発明の方法および組成物を制約するものではない。他の適当な変法、および病院治療で通常経験するいろいろな条件およびパラメーターの採用、および等業者に公知のものは本発明の精神と範囲内である。
実施例１  還元的アルキル化を介したグリシンとエチレンジアミンのQA−21トリテルペンアルデヒドへの結合
グリシンをQA−21トリテルペンアルデヒドと反応させるため、20mgのQA−21を0.8mlの50％メタノール、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0に溶解した。グリシンの0.5ml溶液水溶液を調製した。全量で0.1mlのグリシンをQA−21溶液に添加した。ナトリウムシアノボロハイドライドの0.1Mメタノール溶液を調製した（5ml中32mg）。全量で0.1mlのナトリウムシアノボロハイドライドの溶液をQA−21溶液に添加した。ナトリウムシアノボロハイドライドの添加は2.5、21、25および46時間に繰り返された。反応混合物を逆相HPLCで精製した。31.3分の新しいピークを採集した。新規化合物をFAB−MSで確認した。
エチレンジアミンをQA−21トリテルペンアルデヒドと反応させるため、6mgのQA−21を1mlの50％メタノール、20mMトリエチルアミンホスフェート、pH6に溶解した。全量で0.15mlの0.1Mエチレンジアミン水溶液を加え、次いで50mMのナトリウムシアノボロハイドライドのメタノール溶液0.06mlを添加した。シアノボロハイドライドの残りの一定量を45分および16時間に添加した。反応精製物を30−60％のＢ法による逆相HPLCで精製した。19.6分の新しいピークを採集した。この物質を凍結乾燥した。得られたピークを逆相薄層クロマトグラフィーで分析したところニンヒドリンと反応することが分かり、これはQA−21に遊離アミノ基が付加されたことを示している。
実施例２  QA−21トリテルペンアルデヒドのメチレンアルコールへの還元
QA−21  12mgの4ml水溶液を8mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液と混合し最終QA−21濃度を1mg/mlとした。0.01M  NaOH中で1Mのナトリウムボロハイドライドの貯蔵溶液を調製した。全量で0.580mlのナトリウムボロハイドライドをQA−21に少しづつ増やしながら添加した（約50μｌの増加）。ナトリウムボロハイドライドの最終濃度は0.05Mであった。この反応混合液を室温で１時間インキュベートした。1mlの1N酢酸で反応を停止した。ナトリウムボロハイドライドを除去するため、QA−21をC18に吸着した。4mlの反応混合物をC18を含むカートリッジに通した。カートリッジを次いで5mlの水で２回洗浄した。次いでQA−21をC18から5mlのメタノールで溶出した。この方法を残りの8mlの反応混合液に繰り返した。メタノールをN2気流中で蒸発させた。還元QA−21を次いで39％アセトニトリル/0.15％トリフルオロ酢酸に溶解し、残存未還元QA−21を除去するためHPLCで精製した［バイダックC4、粒径５μｍ、3ml/minの流速で60分で25−40％Ｂのグラディエント（溶液Ａ−0.15％TFA水溶液、溶液Ｂ−0.15％TFAのアセトニトリル溶液）］。還元QA−21は保持時間46.8分に溶離した（未還元QA−21に対する保持時間48.1分に比較）。還元QA−21に対応するピークを貯蔵し、水で1/2に希釈し上記C18カートリッジ上に収集した。最終精製物を凍結乾燥し免疫化の研究に使用した。
実施例３  変性QA−21サポニンのアジュバント活性
上記の通り調製された変性QA−21サポニンをアジュバント活性につき試験した。C57  b1/6マウス（グループあたり５匹）を生理食塩水中の25μｇのオボアルブミンと10−50μｇのQA−21またはその誘導体の１種で皮下注射により免疫した。ブースター免疫化を14日目に行った。抗体反応（全IgG）を酵素免疫分析により二回目の免疫化後に測定した。トリテルペンアルデヒド位で還元的アルキル化により調製した２種の誘導体は試験した投与量でアジュバント活性を維持していなかった（図11）。トリテルペンアルデヒドがアルコールに還元された変性QA−21は若干のアジュバント活性を維持していたが、QA−21よりも高い最少有効投与量であった（図12）。二回のブースター免疫化が２週間置きに行われた同様な実験の結果を表６にまとめる。
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実施例３  変性サポニンの溶血活性
溶血試験は膜透過性を測定することにより、薬学的活性物質の粘膜を通る摂取を促進する界面活性剤の能力の大ざっぱな目安である。簡単に言うと、変性サポニンの希釈液をリン酸緩衝生理食塩水中1:2希釈で丸底マイクロタイタープレート上、連続した列に作成する。アルセバー液［Alsevers  solution、ウィタッカー（Whittaker）］中の10μｌの正常ヒツジ血液を各ウエルに加え撹拌した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで未溶血細胞を沈降させるためプレートをソルバール（Sorvall）RT6000中で遠心した。溶血のないことはウエルの底の未溶血細胞のペレットの存在で測定された。溶血活性はヒツジ赤血球からのヘモグロビンの放出の増加により測定された（赤血球上澄液の562または570nmでの吸光度で測定）。
図２に示される様に、QA−21はきわめて低い濃度で膜透過性をかなり増加させる。還元QA−21もまた膜透過性を増加させるが、QA−21に較べてより低いレベルおよびより高い濃度でである。
実施例４  変性サポニンで促進される眼からのインシュリン投与
プロトコール：
雄スプラグ−ドーレー（Sprague−Dawley）ラットをキシラジン−ケタミンで麻酔し、30分後（時間０）に0.4％インシュリン（100U/ml）プラスまたはマイナス生理食塩水と以下のサポニンのうちの１種とからなる目薬を投与した：ギプソフィラ（Gypsophilla）より抽出されたシグマ粗サポニン（シグマケミカル社、セントルイス、Mo.）；クイラヤ由来粗サポニン;QA−21由来QA−21−Ｈ精製サポニン加水分解誘導体。典型的には20μｌの目薬をひとつの眼に送達したが、時には両方の眼に20μｌを送達した。血液Ｄ−グルコースレベルをアキュチェック（AccuCheck）IIグルコメーターを用いて測定した。データは目薬投与の前後の様々な時間の血液グルコースレベルを表す。それぞれの一本の線は、示されていなければ一匹の実験動物から得られたデータを表す。
結果：
図3Aに示す様に、対照として、ラットの眼に生理食塩水を投与した場合、血液グルコースレベルに変化はほとんどなかった。しかし0.5％のシグマギプソフィラ・サポニンを0.4％の正規豚インシュリンと共に投与した場合、有意の低血糖効果が観察された。図3B参照。0.5％の粗クイラヤ・サポニン（未変性）を正規豚インシュリンと共投与した場合、血清グルコースレベルにより少ない有意の減少が観察された。図3C参照。
図４は0.1％の純粋なサポニンの対照溶液（インシュリンなし）の眼からの投与の、３匹のラットにおける血液グルコースレベルへの効果を示す。グラフからみられる様に、インシュリンの無い場合は何等の有意な低血糖効果は観察されなかった。
図５は20μｌの0.025％QA−21−Ｈと0.4％の正規豚インシュリン投与時の、３匹のラットに対する血液グルコースレベルへの結果を示す。グラフからみられる様に有意の低血糖効果が観察された。
図６は0.05％QA−21−Ｈと0.4％の正規豚インシュリン投与時の、３匹のラットに対する血液グルコースレベルへの結果を示す。グラフからみられる様に有意の低血糖効果が観察された。
図７は0.1％QA−21−Ｈと0.4％の正規豚インシュリン投与の、３匹のラットに対する血液グルコースレベルへの結果を示すグラフを表す。グラフからみられる様に有意の低血糖効果が観察された。
図８は最初のラットに対する0.01％QA−21−Ｈと0.4％正規豚インシュリン10μl/眼；第二のラットに対する0.01％QA−21−Ｈと0.4％正規豚インシュリンの10μl/眼；第三のラットに対する0.01％QA−21−Ｈと0.4％の正規豚インシュリンの20μl/眼投与の血液低下効果を示すグラフを表す。それらの結果は、0.01％QA−21−Ｈでもインシュリンのある程度の限界輸送が観測されたことを示している。
これらの実験から以下の結論が導かれる。
1.インシュリン吸収につき試験された全てのサポニンの効果は、60分後に観察される最大低血糖作用を伴う迅速な開始を示した。
2.シグマサポニンに較べて、ケンブリッジクイラヤサポニンは目薬からのインシュリンの全身性吸収を刺激するにはより有効でなかったが、ケンブリッジQA−21−Ｈは有意により有効であった。
3.サポニンの濃度が減少するにつれて眼の刺激は減少した;0.1％精製QA−21−Ｈは眼の刺激をもたらしたが、0.05％および0.025％QA−21−Ｈは、次第により少ない刺激を起こした；しかしながら二つのより低い非刺激的投与量は輸送を誘導するのに有効であり、これはこの製品が刺激がない輸送に有効で有り得ることを示唆している。部分精製（粗）クイラヤサポニンもまた、輸送を誘導するに最低限有効である投与量である0.5％で眼の刺激をもたらしたが、これはこの粗製品が刺激なしに有効に使用できないことを示している。
以上の説明から当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、過度の実験を行わずに多様な用途と条件に適応するための様々な変化と変法を行うことができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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