(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端部分をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントであるペプチド及び／又はアミノ酸を分離する方法であって、下記の各工程：
（１）Ｎ末端部分がブロックされたタンパク質をリジルエンドぺプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼＢで処理してペプチド及び／又はアミノ酸の混合物を調製する工程、
（２）前記ペプチド及び／又はアミノ酸中の遊離の１級アミノ基、ピロリジン核のＮＨ基、又はモノアルキル化アミノ基を有するペプチド及び／又はアミノ酸にビオチン又はその反応性誘導体を結合させて結合体を形成させる工程、
（３）工程（２）で生じた結合体をアビジン又はその反応性誘導体を有する担体に結合させて混合物から分離する工程、
を含有することを特徴とするＮ末端部分をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントであるペプチド及び／又はアミノ酸の分離方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法を用いてＮ末端部分をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントであるペプチド及び／又はアミノ酸を分離するためのキットであって、リジルエンドぺプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼＢと、ビオチン又はその反応性誘導体と、並びにアビジン又はその反応性誘導体を含有することを特徴とする分離用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はペプチド又はアミノ酸の簡便、高感度な分離方法に関し、特に詳細には、Ｎ末端をブロックされたタンパク質由来のＮ末端部分フラグメントの効率良い分離方法に関する。
本発明はまた、この様な分離方法のための分離用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
大多数のタンパク質は、生合成の途上、Ｎ末端において種々のプロセッシングを受け、アシル化、アルキル化等により、Ｎ末端がブロックされる。これらのタンパク質（以下Ｎ末端をブロックされたタンパク質と称する）にはエドマン法を原理とするプロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析を適用することができない。これらのタンパク質の分析方法としては、質量分析装置を用いる方法〔フェブス  レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）  第１２８巻、第３７頁（１９８１）〕、ＨＰＬＣとアシルアミノ酸遊離酵素を用いる方法（酵素法）〔ジャーナル
オブ  バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）  、第９２巻、第６０７頁（１９８２）〕、本発明者らによる、アシルアミノ酸遊離酵素を用いたＮ−α−アシル化タンパク質のＮ末端アミノ酸配列分析方法（特開昭６０−３０５２５３号）、Ｎ−α−アシルアミノ酸のカルボキシル基に疎水基を導入する方法（特開平４−７２５５９号）が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これらの方法においては、Ｎ末端をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントを分離するために、化学的又は酵素的に該タンパク質を切断してフラグメント化し、該フラグメント化されたタンパク質の混合物からＮ末端部分フラグメントを分離する工程が含まれている。
しかし、いずれの方法においても、操作が煩雑であること、また多量の分析試料を必要とすること、目的とするＮ末端部分フラグメントの分離が不十分であるなどの問題点を有していた。また、アシルアミノ酸遊離酵素を用いる方法においては、該方法が適用できるのはＮ末端がホルミル、アセチル、プロピルの低級アシル基でブロックされているタンパク質に限られている。
本発明の目的は、Ｎ末端をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントの簡便な分離方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、Ｎ末端部分をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントであるペプチド及び／又はアミノ酸を分離する方法であって、下記の各工程：
（１）Ｎ末端部分がブロックされたタンパク質をリジルエンドぺプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼＢで処理してペプチド及び／又はアミノ酸の混合物を調製する工程、
（２）前記ペプチド及び／又はアミノ酸中の遊離の１級アミノ基、ピロリジン核のＮＨ基、又はモノアルキル化アミノ基を有するペプチド及び／又はアミノ酸にビオチン又はその反応性誘導体を結合させて結合体を形成させる工程、
（３）工程（２）で生じた結合体をアビジン又はその反応性誘導体を有する担体に結合させて混合物から分離する工程、
を含有することを特徴とするＮ末端部分をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントであるペプチド及び／又はアミノ酸の分離方法に関する。
また、本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法を用いてＮ末端部分をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントであるペプチド及び／又はアミノ酸を分離するためのキットであって、リジルエンドぺプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼＢと、ビオチン又はその反応性誘導体と、並びにアビジン又はその反応性誘導体を含有することを特徴とする分離用キットに関する。
【０００５】
以下、本明細書において、「ペプチド及び／又はアミノ酸」を、「Ｐ／Ａ」と略記し、「遊離の１級アミノ基、ピロリジン核のＮＨ基、又はモノアルキル化アミノ基」を、総称する場合に「窒素含有基」と略記し、前記「混合物」を、「Ｐ／Ａ混合物」と略記する。
【０００６】
本発明において遊離の１級アミノ基とは、例えばペプチドのＮ末端の遊離の１級アミノ基、アミノ酸の遊離のα−アミノ基やリジンの側鎖の１級アミノ基やオルニチンの側鎖の１級アミノ基等のビオチン又はその反応性誘導体と反応しうる１級アミノ基を示し、アルギニンのグアニジノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、トリプトファンのインドール基、アスパラギン又はグルタミン側鎖の酸アミド等は含まれない。
また本発明においてピロリジン核のＮＨ基を有するＰ／Ａとは、プロリン又はオキシプロリンを含むＰ／Ａを示す。
また本発明においてモノアルキル化アミノ基とは、Ｎ−α−モノメチルアミノ基等の、ビオチン又はその反応性誘導体と反応しうるモノアルキル化アミノ基を示す。
【０００７】
本発明において用いられるビオチン又はその反応性誘導体としては、上記の窒素含有基と反応性を有する物であればよく、Ｎ−ヒドロキシスクシニルイミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）、スルホスクシニルイミドビオチン（スルホ−ＮＨＳ−ビオチン）等を用いることができる。
【０００８】
Ｎ末端部分をブロックされたタンパク質の解析において、Ｎ末端部分をブロックされたタンパク質に適当な処理を行うことにより、Ｎ末端部分フラグメントを窒素含有基を有さないＰ／Ａとして、またＮ末端以外の部分由来のフラグメントを窒素含有基を有するＰ／Ａとして含むこれらのフラグメントの混合物として調製し、試料として用いることができる。ビオチン又はその反応性誘導体を、この試料中の窒素含有基を有するＰ／Ａに結合させて結合体を形成させ、生じた結合体をアビジン又はその反応性誘導体を有する担体に結合させて試料から分離することにより、Ｎ末端以外の部分由来のフラグメントを試料から分離することができる。Ｎ末端部分フラグメントは、ビオチン又はその反応性誘導体に結合しない画分から簡便に分離することができる。
【０００９】
以下、本発明を用いるＮ末端をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントの分離の例を具体的に説明する。
【００１０】
（１）試料の調製
Ｎ末端をブロックされたタンパク質を含む試料としては、例えば、天然の微生物や動物由来の、若しくは遺伝子組換えにより生産されたタンパク質を用いることができる。
【００１１】
（ａ）リジルエンドペプチダーゼを用いる方法
例えば、Ｎ末端をブロックされたタンパク質を、リジン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に切断するリジルエンドペプチダーゼであるアクロモバクタープロテアーゼＩ（以下ＡＰＩと称する）で消化し、種々の長さのフラグメントの混合物を得る。次いで、例えばカルボキシペプチダーゼＢを作用させ、それぞれのフラグメント（但し、Ｃ末端に由来するフラグメントを除く）のＣ末端のリジン残基を遊離させる。
この場合、試料中には少なくとも遊離のリジン残基と目的とするＮ末端をブロックされたタンパク質由来のリジンを含まないＮ末端部分フラグメント及びそれ以外の部分のリジンを含まないフラグメントが含まれている。
Ｎ末端部分フラグメントは目的とするタンパク質中のリジン残基の位置により種々の長さとなりうるが、例えば、目的とする、Ｎ末端をブロックされたタンパク質のＮ末端から２番めのアミノ酸がリジンである場合には、Ｎ末端のアミノ酸由来の、α−アミノ基をブロックされたアミノ酸となる。
【００１２】
（ｂ）化学修飾による方法
Ｎ末端をブロックされたタンパク質の遊離の１級アミノ基例えばリジン残基のε−アミノ基を特異的に化学修飾しうる試薬を用いて、これらの遊離の１級アミノ基を化学修飾した後、適当なエンド型プロテアーゼ、例えばトリプシン、又はアルギニルエンドペプチダーゼ等を用いて消化を行ってもよい。化学修飾の方法としては、後に述べるフェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）を固定化した担体（ＤＩＴＣ−グラス）、及び上述のビオチン又はその反応性誘導体と反応しない試薬を用いるものであればよく、例えばイソチオシアン酸フェニル化（ＰＩＴＣ化）、スクシニル化等が挙げられる。
この場合、試料中には少なくとも目的とするＮ末端をブロックされたタンパク質由来のＮ末端部分フラグメント及びそれ以外の部分のフラグメントが含まれており、それぞれのフラグメントのＮ末端以外の遊離の１級アミノ基は化学修飾されている。Ｎ末端部分フラグメントはエンド型プロテアーゼの作用位置により種々の長さとなりうるが、例えば、Ｎ末端のアミノ酸由来の、α−アミノ基もブロックされたアミノ酸となっている場合もある。
また方法（ｂ）において、例えばアシルアミノ酸遊離酵素等の、Ｎ末端をブロックされたフラグメントからＮ末端部分のアミノ酸を切り出す作用を持つ酵素を適当なエンド型プロテアーゼによる処理と組合せるか、又は単独で用いて消化を行うと、少なくともＮ末端部分フラグメントとして、Ｎ末端のアミノ酸由来の、α−アミノ基がブロックされたアミノ酸を含む試料を調製することができる。
また、方法（ｂ）において、例えばカルボキシペプチダーゼＰ、又はカルボキシペプチダーゼＹ等の、ペプチドのＣ末端からアミノ酸を順次遊離させる作用を持つ酵素を単独で、又は適当なエンド型プロテアーゼによる処理と組合せて用いて消化を行うと、少なくとも種々の長さのＮ末端部分フラグメントを含む試料を調製することができる。この場合、試料中には、少なくとも各フラグメントのＣ末端側から切り出された遊離のアミノ酸が含まれている。
【００１３】
次いで、ビオチン又はその反応性誘導体による処理工程を行うが、該工程に先立って、（１）で調製した試料に対し、例えばＤＩＴＣ−グラス等の、窒素含有基を有するＰ／Ａと反応しうる担体を用いて窒素含有基を有するＰ／Ａを除去する前処理を行ってもよい。これらの操作により、後の工程で用いるビオチン及びアビジン又はそれぞれの反応性誘導体の量を節約することができ、有利である。
【００１４】
（２）ビオチン又はその反応性誘導体による処理
（１）で得られた試料を、遊離のアミノ基を有さない緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液、（ｐＨ７．５〜９が好ましい）に溶解し、試料中の窒素含有基の合計モル量の１０倍〜２０倍量のビオチン又はその反応性誘導体、例えばＮＨＳ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン等を加えて反応させる。反応は２０℃〜３０℃で行うのが好ましい。
この処理により、試料中の窒素含有基を有するＰ／Ａはビオチン又はその反応性誘導体に結合する。試料中の、Ｎ末端をブロックされたタンパク質由来のＮ末端部分フラグメントは窒素含有基を有さないのでビオチン又はその反応性誘導体には結合しない。
【００１５】
（３）アビジン又はその反応性誘導体を有する担体による処理
（２）で得られた試料をアビジン又はその反応性誘導体を有する担体、例えばイムノピュアイモビライズドアビジンと混合し、非吸着画分を集める。加えるアビジン又はその反応性誘導体の量は、（２）で用いたビオチン又はその反応性誘導体の５〜１０倍量が好ましい。この工程においてはカラムクロマトグラフィーを用いるのが効果的で、カラムクロマトグラフィーの条件としては０．２〜０．５Ｍ程度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いるのが好ましい。非吸着画分より、Ｎ末端をブロックされたタンパク質のＮ末端部分フラグメントを回収し、分離することができる。該フラグメントは直接、質量分析法、例えばＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によるＮ末端ブロック基やアミノ酸配列等の解析に供することができる。
【００１６】
本発明に用いられるビオチン又はその反応誘導体と、アビジン又はその反応誘導体とを試薬として含むキットを構成することができ、このキットを用いて本発明の分離方法を簡便に行うことができる。またキット中に、例えばペプチドをフラグメント化するためのプロテアーゼ、例えばリジルエンドペプチダーゼ、又はカルボキシペプチダーゼＢ等の酵素や、ＤＩＴＣガラスやＰＩＴＣ等の遊離のアミノ基に結合する試薬や、緩衝液、クロマトグラフィー用のカラム等を入れておいてもよい。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００１８】
実施例１
馬心臓シトクロームｃのＮ末端アセチル化ペプチドの単離
１ｎｍｏｌ馬心臓シトクロームｃ（ジグマ社製）を５０ｍＭ  Ｎ−エチルモルホリン緩衝液（ｐＨ  ８．５）中にてリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）により、６時間酵素消化を行った。続いて、同緩衝液中で、カルボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガー社製）を用いて３７℃で２時間酵素消化を行った。消化物を濃縮乾固した後、１０％メタノールを含む５０ｍＭ  Ｎ−エチルモルホリン緩衝液（ｐＨ  １０）に溶解し、５７０ｎｍｏｌ  ＤＩＴＣを固定化したガラスビーズ３．８ｍｇを添加し、４０℃、２時間かくはんした。反応上清を回収し、濃縮乾固し、乾固物を５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．８）に溶解し、５０ｎｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシニルイミドビオチン（ピアス社製）を溶解したジメチルスルホキシドを添加し、遊離のα−アミノ基を有するペプチドと反応させた。反応溶液を、あらかじめ２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．５）で平衡化しておいたイムノピュアイモビライズドアビジンを有するカラムに添加し、非吸着画分を回収した。非吸着画分をＯＤＳカラム（コスモシール５Ｃ１８−ＡＲパックドカラム、ナカライテスク社製）を有するＨＰＬＣに供試し、０．１％  ＴＦＡ中、０〜６０％のアセトニトリルの濃度勾配溶出（流速  ０．５ｍｌ／分）によりピークを示す画分を分取した。検出は２１５ｎｍの紫外吸収で行った。図１にその結果を示す。すなわち図１は、馬心臓由来シトクロームｃのＮ末端アセチル化ペプチドを含むアビジン固定化アガロース非吸着画分をＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣにより分析した結果を示すクロマトグラムであり、縦軸は吸光度（２１５ｎｍ）、横軸は保持時間（分）を示す、矢印は、Ｎ末端部分ペプチドのピークを示す。分取した画分を質量分析、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供し、Ｎ末端がアセチル化されたペプチドであることを確認し、アミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００１９】
実施例２
鶏卵々白由来リボフラビン結合タンパク質のＮ末端ピログルタミル化ペプチドの単離
１ｎｍｏｌ鶏卵々白由来  リボフラビン結合タンパク質〔ジャーナル  オブ
バイオケミストリー、第９５巻、第１６３３〜１６４４頁（１９８４）〕を実施例１と同様の条件でリジルエンドペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＢにより酵素消化した。消化物を濃縮乾固した後、１０％メタノールを含む５０ｍＭ
Ｎ−エチルモルホリン緩衝液に溶解し、４５０ｎｍｏｌ  ＤＩＴＣを固定化したガラスビーズ３．０ｍｇを添加し、４０℃、２時間かくはんした。反応上清を回収し、濃縮乾固し、乾固物を５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．８）に溶解し、５０ｎｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシニルイミドビオチンと実施例１と同様の条件で反応させた。反応溶液を実施例１と同様の条件で、イムノピュアイモビライズドアビジンを有するカラムに添加し、非吸着画分を回収した。非吸着画分を実施例１と同様の条件でＨＰＬＣに添加し、ピーク画分を分取した。図２にその結果を示す。すなわち、図２は、鶏卵々白由来リボフラビン結合タンパク質のＮ末端ピログルタミル化ペプチドを含むアビジン固定化アガロース非吸着画分をＯＤＳカラムを有するＨＰＬＣにより分析した結果を示すクロマトグラムであり、縦軸は吸光度（２１５ｎｍ）、横軸は保持時間（分）、矢印はＮ末端部分のペプチドのピークを示す。分取した画分を質量分析、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供し、Ｎ末端がピログルタミル化されたペプチドであり、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有することを確認した。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、Ｐ／Ａ混合物の簡便かつ迅速な分離方法が提供される。
【００２１】
【配列表】
【００２２】
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【００２３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】馬心臓由来シトクロームｃのＮ末端アセチル化ペプチドの分析結果を示す図である。
【図２】鶏卵々白由来リボフラビン結合タンパク質の分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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