(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スぺクチノマイシン25μg/ml〜200μg/mlおよびカルベニシリン50μg/mlの一方または両方、並びにナリジキシン酸1μg/ml〜30μg/mlを含有する、トリクロロエチレン分解菌MO7株（FERM BP-5624）を選択的に増殖せしめるための選択培地。
【請求項２】
シクロヘキシミド50μg/ml〜200μg/mlをさらに含有する請求項１に記載の選択培地。
【請求項３】
グルコース500μg/ml〜50mg/mlおよび酵母エキス0.5μg/ml〜10mg/mlの一方または両方をさらに含有する、請求項１または２に記載の選択培地。
【請求項４】
50μg/ml〜5mg/mlのフェノールをさらに含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の選択培地。
【請求項５】
スペクチノマイシン25μg/ml〜200μg/mlおよびカルベニシリン50μg/ml〜200μg/mlの一方または両方、ナリジキシン酸1μg/ml〜30μg/ml、並びにリファンピシン25μg/ml〜200μg/mlを含有する、トリクロロエチレン分解菌MO7株（FERM BP-5624）のリファンピシリン耐性変異株を選択的に増殖せしめるための選択培地。
【請求項６】
シクロヘキシミド50μg/ml〜200μg/mlをさらに含有する請求項５に記載の選択培地。
【請求項７】
グルコース500μg/ml〜50mg/ml、酵母エキス0.5μg/ml〜10mg/mlの一方または両方をさらに含有する、請求項５または６に記載の選択培地。
【請求項８】
50μg/ml〜５mg／mlのフェノールを含有する請求項５〜７のいずれか１項に記載の選択培地。
【請求項９】
請求項１〜４に記載の選択培地を用いてトリクロロエチレン分解菌MO7株（FERM BP-5624）を特異的に増殖せしめることにより当該菌株を特異的に検出する方法。
【請求項１０】
請求項５〜８に記載の選択培地を用いてトリクロロエチレン分解菌MO7株（FERM BP-5624）のリファンピシン耐性変異株を特異的に増殖せしめることにより、当該変異株を特異的に検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は特定の微生物の計数方法およびトリクロロエチレン分解菌ＭＯ７株を特異的に検出するための選択培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌の微生物処理により土壌汚染の回復を行うバイオメディエーション技術の開発や管理にあたっては、特定の微生物の土壌中での動態を正確に把握する必要がある。従来の細菌の検出、計数方法には、
（１）平板プレート法：培養液を希釈し、適当な寒天培地に塗布し、出現するコロニーを計数する方法；
（２）ＭＰＮ（ｍｏｓｔ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）法：培養液を希釈し、液体培養後、陽性と陰性の本数より統計学的に計数する方法；
【０００３】
（３）特異的ＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法：平板プレートに出現したコロニーについて、特異的ＤＮＡと相補遺伝子を持つコロニーをハイブリダイゼーションにより計数する方法；
（４）特異的ＤＮＡを用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｃｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法：試料から抽出されたＤＮＡについて、特異的ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲを行ない、特異的ＤＮＡを持つ生物を検出する方法；
（５）特異的抗体を用いる方法：特異的な蛋白から、それに特異的な抗体を調製し、試料に対して蛍光抗体法などにより検出する方法；
等が知られている。
【０００４】
（１）及び（２）の方法は古くから行われており、簡便ではあるが、菌特異的な選択培地が必要であり、培養できない菌には適用できない。また、その菌株識別の厳密性にも問題があった。
一方、（５）の方法は、実際には菌特異的なタンパクが得られにくく、あまり行なわれていない。（３）及び（４）の方法は、近年盛んに行われている。特異的ＤＮＡとして１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列を用いた方法が、特によく用いられている。しかしこの方法は、導入菌と系統分類学的に類縁の菌が土着菌として存在する場合には、区別が難しく使用できないケースもあると思われる。
また、土壌中の微生物の動態を正確に把握するためには、目的とする特定の微生物についての特別の工夫が必要である。
【０００５】
【関連技術】
本発明者らは、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）を効率よく分解する微生物として新属新種細菌ＭＯ７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２４）を分離し、この株を用いて土壌中のＴＣＥの分解除去等に関し特定の検討を行ってきた。土壌中にこの当株を添加して土壌中のＴＣＥ等の汚染物を除去するバイオメディエーションにおいては、この微生物の土壌中での動態を把握する必要があり、その例として、例えば土壌中からＤＮＡを抽出し、それをＭＯ７株特異的プローブにより検出するか、あるいはＭＯ７株に特異的なプライマーにより特定の遺伝子、例えば１６ＳｒＤＮＡ等を検出する方法が考えられる。しかしながら、この方法によっては、死菌のＤＮＡをも検出されるため、生きた状態の目的微生物数のみを測定することができない。また、これらの手法は特異性が優れているという特長を持つものの定量的評価が難しいという欠点がある。
【０００６】
他方、生きた微生物を検出するには被験試料を選択培地中で培養することにより、目的の微生物と土着菌とを分別培融させる方法が考えられる。この方法は、土壌試料中の土着菌が比較的少い場合には適当であるが、完全な選択性を持つ培地を作成するのは困難であり、このため、出現したコロニーのなかには必然的に土着菌が混入している可能性が高く、目的とするＭＯ７株のみを検出するのに困難を伴う。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は上記のごとき従来技術の欠点を有さず、簡便で且つ対象とする特定微生物を非常に高い特異性をもって計数する方法、および土壌中特定の標的株ＭＯ７株の微生物数を測定するための、ＭＯ７株の選択培地を提供しようとするのである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果（１）の平板プレート法と（４）の特異的ＤＮＡを用いたＰＣＲ法の併用により、比較的簡便に、且つ極めて高い特異性をもって特定微生物を検出又は計数できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明は、特定微生物の計数方法において、
（１）対象とする微生物を含有すると予想される試料を、該対象微生物を選択的に増殖せしめる固体平板培地下に添加してインキュベートすることにより、該対象微生物を含むコロニーを形成せしめ；そして
（２）前記コロニーから複数のコロニーを無作為に選択し、前記対象微生物に固有の対象遺伝子を増幅することができるプライマーを用いて、前記選択されたコロニー中の対象遺伝子をＰＣＲ法により増幅し、ＰＣＲに供したコロニー数に対する増幅が生じたコロニーの比率を求める；
ことを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
さらに、基本培地に、種々の抗生物質等を添加することにより、ＭＯ７株と土着株とを区別することができる。このための基本培地としては、Ｍ９培地（Ｎａ３  ＨＰＯ４  ・７Ｈ２  Ｏ  １２．８ｇ／ｌ，ＫＨ２  ＰＯ４    ３ｇ／ｌ，ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ，ＮＨ４  Ｃｌ  １ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ４    ０．２５ｇ／ｌ，ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．００１５ｇ）、ＮＭＳ培地（ＭｇＳＯ４  ・７Ｈ３  Ｏ  １ｇ，ＣａＳＯ４  ・２Ｈ３  Ｏ  ０．２ｇ，ＫＮＯ３    ０．２３ｇ，（ＮＨ４  ）２  ＳＯ４  ０．６５ｇ，ＫＨ２  ＰＯ４    ０．２７２ｇ，Ｎａ３  ＨＰＯ４  ・１２Ｈ３  Ｏ  ０．７２７ｇ）等の無機培地、ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ製Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ  ２５ｇ／ｌ）、１／３ＬＢ培地、ＮＢ培地（栄研化学製Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ  １８ｇ／ｌ）等の有機培地を用いることができるが、ＮＭＳ培地及び１／３ＬＢ培地が特に好ましい。
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討をした結果、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンに比較的耐性を有するのに対して、多くの土着菌は耐性を有しないことを見出した。従って、本発明は、スペクチノマイシン２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ及びカルベニシリン５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの一方又は両方を含有する、ＭＯ７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２４）用選択培地を提供する。
【００１２】
本発明者らはさらに、ナリジキシン酸は土着菌に対して単独では抗菌作用を示さないが、スペクチノマイシン及びカルベニシリンと併用した場合、それらの相剰作用により土着菌が抑制されることを見出した。従って、本発明は、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの一方又は両方にかえて、１μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌのナリジキシン酸を含有する選択培地を提供する。
【００１３】
本発明者らはさらに、シクロヘキシミドが、ＭＯ７株の増殖を阻害しないのに対して、土着の糸状菌に対して強い抗菌作用を有することを見出した。従って本発明は、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び／又は５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、並びに５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有するＭＯ７株用選択培地を提供する。本発明はさらに、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び／又は５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌのナリジキシン酸、並びに５０〜２００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有するＭＯ７株用選択培地を提供する。
【００１４】
よって種々の選択培地においても放線菌の増殖を完全に阻害することができず、放線菌による小形のコロニーとＭＯ７株のコロニーとが識別しにくいという問題点が存在した。本発明者らは、この点を解決すべく種々検討した結果、培地にグルコース又は酵母エキスを添加すると、ＭＯ７株のコロニーの生育を促進しつつ、放線菌のコロニーは大きく成長し、放線菌の特徴である気菌糸の生長を促進できるためＭＯ７株のコロニーと放線菌のコロニーとの間の識別が容易になることを見出した。従って本発明は、上記種々の選択培地に、さらに５００μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのグルコース及び／又は０．５μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの酵母エキスを加えた選択培地を提供する。
【００１５】
なお、Ｍ０７株はフェノール資化性を有するため、上記のいずれのＭＯ７選択培地においても、唯一の炭素源としてフェノール５０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ好ましくは５００μｇ／ｍｌを含有する培地を用いるのが好ましい。このような培地を使用することにより、土着の微生物はその増殖が抑制されるからである。
リファンピシンは土着菌に対して極めて強力な抗菌力を有すが、同時にＭＯ７株に対しても抗菌力を有するので、ＭＯ７株用の選択培地に作用することができない。このため、本発明者らは、ＭＯ７株のリファンピシン耐性（ＭＯ７Ｒと称する）突然変異株を作出することを試み、これに成功した。
【００１６】
すなわち、ＭＯ７株を、リファンピシン２５〜２００μｇ／ｍｌを含有する寒天培地上で培養し、次にこの寒天培地上にコロニーを形成した株を、リファンピシン２５〜２００μｇ／ｍｌを含有する液体培地中で集積培養した。次にこの集積培養において増殖した細胞を上記の寒天培地上で培養し、これを５〜１０代継代した。上記の操作によって作出した培養液をリファンピシン添加寒天培地上に塗沫すればリファンピシン耐性コロニーが確実に生じ、その１個を液体培地に接種すれば、確実に増殖した。従って、本発明変異株は、極めて再現性よく、確実にリファンピシン添加培地によって計数することができる。
【００１７】
こうして、３４株のリファンピシン耐性株を得、これらの内ＭＯ７Ｒ２，ＭＯ７Ｒ１９，ＭＯ７Ｒ２６及びＭＯ７Ｒ３１の４株を選び、ＴＣＥ分解能を試験した。その結果、いずれも親株であるＭＯ７株に比べて遜色の無いＴＣＥ分解能を有していることが確認された。従って、本発明によれば、５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのリファンピシンに耐性を有し、且つ親株であるＭＯ７株と同等の又はＴＣＥ分解能を有する株を再理性よく得ることができる。
上記のようにして得られた、本発明のＭＯ７株のリファンピシン耐性株は、リファンピシンを含有する培地上で選択的に検出することができる。従って本発明は、リファンピシン２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌを含有するＭＯ７リファンピシン耐性株（ＭＯ７Ｒ）用選択培地を提供する。
【００１８】
本発明によれば、リファンピシンのほかに、親株（ＭＯ７株）の選択培地に使用した抗生物質を併用することにより、ＭＯ７Ｒ株の選択性をさらに向上させることができる。従って本発明は、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのリファンピシン、並びに２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの一方又は両方を含有するＭＯ７Ｒ選択培地を提供する。
本発明はさらに、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのリファンピシン及び７．５μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌのナリジキシンを含有するＭＯ７Ｒ選択培地を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのリファンピシン、２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの一方又は両方、並びに７．５μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌのナリジキシン酸を含有するＭＯ７Ｒ選択培地を提供する。
本発明はさらに、上記種々のＭＯ７Ｒ選択培地にさらに５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添加したＭＯ７Ｒ選択培地を提供する。
【００２０】
ＭＯ７株の選択培地と同様、上記の種々のＭＯ７Ｒ選択培地においても、グルコース又は酵母エキスを添加することにより、ＭＯ７Ｒ株のコロニーと放線菌のコロニーとの識別を容易にすることができる。従って本発明はさらに、上記の種々のＭＯ７Ｒ選択培地に、５００μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのグルコース又は０．５μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの酵母エキスをさらに添加したＭＯ７Ｒ選択培地を提供する。
【００２１】
なお、ＭＯ７Ｒ株に親株ＭＯ７株と同様にフェノール資化性を有するため、上記いずれのＭＯ７Ｒ選択培地においても、唯一の炭素源としてフェノール３００ｐｐｍ  〜１，０００ｐｐｍ  、好ましくは約５００ｐｐｍ  を含有する培地を用いるのが好ましい。このような培地を使用することにより、土着の微生物の幾らかはその増殖が抑制されるからである。
本発明はさらに、上記の種々のＭＯ７株選択培地又はＭＯ７Ｒ株選択培地を用いて、これらの菌を選択又は濃縮する方法を提供する。
【００２２】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１． ＭＯ７株の各種抗生物質に対する特性
微生物としてＭＯ７株を使用し、土壌として次の表１に示すＨＯ土壌を使用した。
【００２３】
【表１】
0003613656.tif 000002
【００２４】
ＮＭＳ培地に５００ｐｐｍ  のフェノールおよび５ｐｐｍ  の酵母エキスを添加し、さらに表２に記載した１１種類の抗生物質を表中に記載した濃度で添加した培地を用意し、ＭＯ７株の自然抗生物質耐性を調べた。ＭＯ７株の菌体を水に懸濁し、前記培地を用いた希釈平板法によって耐性細胞の出現頻度を測定することによってＭＯ７株の自然抗生物質耐性を調べた。
ｅｘｐ．１とｅｘｐ．２の２回に分けて行った実験の結果を表３に示した。この結果から、ＭＯ７株はスペクチノマイシン、カルベニシリン、ナリジキシン酸に対して自然抗生物質耐性を有していることが明らかになった。
【００２５】
【表２】
0003613656.tif 000003
【００２６】
【表３】
0003613656.tif 000004
【００２７】
次にこの３種の抗生物質に加えて、土着菌抑制能力が高いと予想されるリファンピシン、糸状菌の抑制効果が期待されるシクロヘキシミドの計５種の抗生物質について、（１）ＭＯ７株の生育に影響を与えない（少ない）濃度範囲、（２）土着菌抑制効果のある濃度範囲、の２点を調べる実験を行った。土着菌抑制効果は、調製した各種抗生物質添加培地に生育しうる土着菌数を指標とした。土着菌数の計数方法は以下の通り。土壌試料を１００倍量の０．８５％ＮａＣｌ溶液（滅菌済み）に懸濁した。ヤマト製振とう抽出機ＳＡ３１によって最大速度で振とう抽出を２分間行った。室温に２分静置後、得られた土壌中抽出液の上清を常法の希釈平板法による計数に用いた。
【００２８】
使用した抗生物質濃度はスペクチノマイシン２５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、ナリジキシン酸７．５μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、カルベニシリン５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、リファンピシン５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、及びシクロヘキシミド２５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであった。
寒天プレートに生育したコロニーの計数は、３０℃で１週間程度培養した後に実施した。
【００２９】
ＨＯ土壌由来の土着菌には、菌糸を作る糸状菌や放線菌の類が多く存在していた。開発した選択培地では、ＭＯ７株をＨＯ土壌に導入・検出する際には、（１）糸状菌菌糸にＭＯ７株のコロニーが埋もれる、（２）放線菌と思われるコロニーと区別が付きにくい、といった問題が生じた。そこで、最終的に目視でＭＯ７株とそれ以外（土着菌）を区別できるようにするため、次のように定義して計数したものをＨＯ土壌由来の土着菌として選択培地の開発を進めた（計数方法は適宜選択した）。
【００３０】
１．糸状菌および放線菌の類を含む全細菌を全て計数。
２．糸状菌（直径４〜５ミリ以上の菌糸状のコロニーを形成、図１）を除いたものを計数。
３．糸状菌（直径４〜５ミリ以上の菌糸状のコロニーを形成、図１）と放線菌と思われるコロニー（明確な気菌糸を有するコロニー、図１）を除いたものを計数（放線菌か否か識別困難な場合は、除かずに計数）。
【００３１】
ＭＯ７株は、図２及び図３に示したように、スペクチノマイシン（〜２００μｇ／ｍｌ）、ナリジキシン酸（〜３０μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（〜１００μｇ／ｍｌ）、シクロヘキシミド（〜１００μｇ／ｍｌ）には耐性を有していた。（抗生物質を加えた場合では、加えない場合に比べてＭＯ７株が１／１０程度に減少する傾向が見られたが、自然耐性能に比較して抗生物質濃度が高すぎることが原因と考えられたため、ここでは問題視しなかった。）またＭＯ７株は、リファンピシンには全く耐性を有していなかった。
【００３２】
一方、ＨＯ土壌由来の土着菌は図２に示したように、スペクチノマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加することで、添加しない場合に比べて１／１０強に抑えることができた。また、リファンピシンを添加することで、土着菌を１／１００程度に抑えることが判った。ナリジキシン酸を添加（〜３０μｇ／ｍｌ）することによる土着菌の抑制効果はほとんどなかった。
リファンピシンに対してＭＯ７株は耐性を有していなかったが、抗生物質の土着菌の抑制効果は高かった。
【００３３】
実施例２． 放線菌対策
ＭＯ７株の検出に関して、放線菌等（抗生物質による生育抑制効果が少ない）が多いＨＯ土壌に導入した場合には、抗生物質を添加してＭＯ７株を選択的に生育させることが困難であった。放線菌を抑制することを期待して検討したリファンに対しては、ＭＯ７株が耐性を有していなかった。そこで放線菌を抗生物質で抑制するのとは逆に、放線菌特有の気菌糸の生育を促進させて目視で識別するため、寒天培地（ＮＭＳ培地中に５００ｐｐｍ  フェノール、５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシン、７．５μｇ／ｍｌナリジキシン酸及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを添加したもの）中の栄養を増した場合（０．５％のグルコースあるいは１０００ｐｐｍ  の酵母エキスを添加）について検討した。
【００３４】
結果は図４に示したように、０．５％のグルコースを添加した場合は、加えない場合と同様の土着菌数を維持しつつ、気菌糸の生育を促進させた放線菌を目視で識別することが容易になった（図５）。
【００３５】
実施例３． 糸状菌対策
ＨＯ土壌から導入したＭＯ７株を抽出し希釈平板法によって検出する場合には、糸状菌菌糸が寒天プレート上に大きく拡がって、ＭＯ７株のコロニーを計数することが困難であるという問題があった。ＭＯ７株についてのシクロヘキシミドの耐性を確認したところ（図３）、〜１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド濃度まではＭＯ７株の生育に影響は無いことが判った。糸状菌はシクロヘキシミドによって抑制可能なので、培地（ＮＭＳ培地に、５ｐｐｍ  酵母エキス及び５００ｐｐｍ  フェノールを添加したもの）にシクロヘキシミドを加えることでＨＯ土壌中の糸状菌の生育を抑制することができた。
【００３６】
実施例４． 抗生物質の相乗効果
抗生物質スペクチノマイシン、ナリジキシン酸、カルベニシリンに対してＭＯ７株は耐性を有するを示した。ここでは、それらを３種の抗生物質を同時に加えて、より効果的な土着菌の抑制効果を狙った（ナリジキシン酸はＨＯ土壌の土着菌を抑制しなかったが、ＭＯ７株は耐性を有しており、別の土壌（ＨＯ土壌以外）では抑制効果がみられる可能性があるので使用した）。
【００３７】
結果は図６に示した。ＮＭＳ培地に５ｐｐｍ  酵母エキス、５００ｐｐｍ  フェノール、１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び０．５％グルコースを添加した基礎培地上でのＭＯ７株のコロニー数は、抗生物質の濃度が高くなるにつれ徐々に減少した。ＨＯ土壌由来の土着菌の計数結果（明確にＬ糸状菌および放線菌と思われるコロニーを除いて計数した場合実施例１における３の定義））から、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌ・ナリジキシン酸３．７５μｇ／ｍｌ・カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを添加した場合が、ＭＯ７株の生育阻害の少なさと土着菌の抑制効果のバランスの上で最適であると判断される。
【００３８】
ＨＯ土壌由来の土着菌は、糸状菌だけを除いて計数した場合（実施例１における２の定義）についても図６に示した。その場合、上記（実施例１における３の定義の計数結果）に比べて菌数は１桁程度上昇した。つまり、ＨＯ土壌の土着菌数は、計数方法によって１桁程度差がでる可能性があることを示している。一方、計数方法として糸状菌だけを区別することは容易なため、計測者間でのばらつきは少ないと考えられる（図９）。
【００３９】
実施例５． ＭＯ７株からのリファンピシン耐性株の作製
耐性菌の任意基礎培地としての無機塩（ＮＭＳ）培地又は１／３ＬＢ培地にリファンピシン５０μｇ／ｍｌを添加した寒天培地に、ＭＯ７株の菌体懸濁液をコンラージ棒で塗沫又は、ニードルでスプレーディングした。３０℃にて２日間培養した後、発生したコロニーを上記の組成を有する液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間１２０ｒｐｍ  で振とう培養した。次に、この培養液を上記の団体培地上に塗沫及びスプレーディングし、操作を繰り返して継代培養した。
これにより、リファンピシン耐性株（以下、ＭＯ７Ｒ株と呼ぶ）が３４株得られた。この中で特に生育の良かったＭＯ７Ｒ２，ＭＯ７Ｒ１９，ＭＯ７Ｒ２６，ＭＯ７Ｒ３１の４株を選び、継代を繰り返した。
【００４０】
ＴＣＥ分解能の確認
上記のＭＯ７Ｒ株について、休止菌体法によってＴＣＥ分解能力をＧＣ分析し、ＭＯ７株（親株）（野生株）との比較を行った。すなわち、ＮＹＧ培地（ＮＭＳ培地に酵母エキス５００ｐｐｍ  、グルコース１ｍＭ）で前々培養した菌体を、フェノール（５００ｐｐｍ  ）、酵母エキス（５００ｐｐｍ  ）を含むＮＭＳ培地で前培養し、集菌後フェノールを添加せずに、ＴＣＥ（３０ｐｐｍ  ）を添加したＮＭＳ培地にＯＤ６００  が０．１になるように再懸濁し、この際の２４時間後のＴＣＥ分解量をヘッドスペース法で測定した。各株とも３検体ずつ供試した。ＭＯ７Ｒ２６株の１検体を除き、前培養にはリファンピシンを添加せずに培養を行った。
【００４１】
ＧＣ分析の結果を図７に示す。同時、３検体の平均と標準備差を示す。この結果、親株と比較してＴＣＥ分解能力には遜色無いことが確認された。ＭＯ７株の野生株に比較して、ＭＯ７Ｒ株は有意に分解能力が優れていた。この原因は（１）変異によて分解能力が高まった、（２）リファンピシンで馴養されたことにより細胞のサイズが小さくなり、ＯＤ０．１あたりの菌体数が高まった、等の原因が考えられる。前培養時のリファンピシン添加の有無は、分解能力に影響を与えなかった。
【００４２】
抗生物質耐性の確認
得られた耐性菌株をリファンピシン（２５〜２００μｇ／ｍｌ）を含む培地に植菌し、耐性を持つ濃度を確認した。
【００４３】
土壌系での計数試験
実験のモデル土壌として用いている草地土壌（ＨＯ土壌）に、得られた突然変異体（ＭＯ７Ｒ２６株）を添加し、リファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）およびシクロヘキシミド（１００μｇ／ｍｌ）を含む１／３ＬＢ培地を用いて、希釈平板法による計数を試みた。
【００４４】
この時、（１）ＭＯ７株の培養液、（２）ＨＯ土壌抽出液、（３）ＨＯ土壌にＭＯ７株の培養液を１００μｌ添加したもの、の３条件で供試した。尚、本実験では培地にフェノールは添加していない。
６日間培養後に計数を行った。結果を図８に示した。ＨＯ土壌の土着耐性菌数は８．２×１０５  ｃｆｕ  ／ｇ  ｓｏｉｌ  であった。糸状菌は完全に抑制できなかったが、計数には全く支障の無いレベルであった。
【００４５】
この結果は、無機塩培地を基本とした場合にＨＯ土壌の土着耐性菌数（リファンピシン耐性菌）は検出限界以下であった事と比較すると興味深い。その代わりに１０日間以上の培養期間を必要としていた無機塩培地ベースの際に比較して、短い期間で計数を行う事が可能である。ＭＯ７株をＨＯ土壌に導入した際の菌数の計数値は１．２×１０８  ｃｆｕ  ／ｇ  ｓｏｉｌ  であった。この際に導入したＭＯ７株の菌数は、１．２×１０９  ｃｆｕ  ／ｍｌの培養液を土壌１０ｇに１ｍｌ添加したので１．２×１０８  ｃｆｕ  ／ｇ  ｓｏｉｌ  であると推定され、実測値と完全に一致した。
このように、ＭＯ７Ｒ株とリファンピシン添加ＬＢ培地を用いることにより、簡便かつ信頼性の高い計数が可能であることが証明された。
【００４６】
実施例６． ＭＯ７Ｒ株用のリファンピシン添加培地の土着菌抑制効果
ＭＯ７Ｒ株用のリファンピシン添加培地の土着菌抑制効果を調べるために、ＮＹＰ培地（ＮＭＳ培地に酵母エキス５ｐｐｍ  、フェノール５００ｐｐｍ  を添加）またはＮＹＰＧ培地（ＮＹＰ培地に０．５％グルコースを添加）にリファンピシンとその他の抗生物質を添加し、ＨＯ土壌中の土着菌数の抑制効果を調べた。結果を図９（グラフ右半分）に示した。リファンピシンとシクロヘキシミドを無機塩培地に添加することにより、土着菌数を１０３ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ  以下にまで抑制可能であった。無機塩培地では生育速度が遅いので、１／３ＬＢ培地を基本とした場合を比較したところ、土着菌数は１０５  〜１０６ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ  であるものの、５日程度で計数が可能であり、実用上有用であった。
【００４７】
実施例７． 選択培地による計数値の妥当性評価および培地の選択性評価
ＨＯ土壌にｃｕｆ  値既知のＭＯ７Ｒ株の菌体液の１０倍希釈系列をそれぞれ１／１０量添加し、この土壌中の菌数をリファンピシン５０μｇ／ｍｌ、シクロヘキシミド１００μｇ／ｍｌを含む１／３ＬＢを用いた計数した。土着菌数に添加したＭＯ７株数（ｃｆｕ  値に希釈数を乗じて算出）を加えたものを理論値として算出し、実測値との比較を行った。さらに、計数に用いた平板上のコロニーを任意に１００個ずつ釣菌し、Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ法によって判別を行った。尚、ＭＯ７株添加量の少ない試料で、計数に用いた平板上にコロニーが１００個存在しない場合は、可能な限りのコロニーを用いた。
【００４８】
このＰＣＲの結果から、陽性（増幅産物が得られる）である比率（陽性コロニー数／供試コロニー数）を計数値に乗じて、ＭＯ７株数を厳密に推定する方法を検討した。ＰＣＲの標的遺伝子はＩＳＲ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｓｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎ；１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー配列）とし、これを標的としたプライマーセット（α２−−ω２；平成９年７月３０日「新規微生物の特異的検出用核酸配列」として出願）を用いた。平板から釣菌したコロニーを１０μｌの滅菌水に懸濁し、その１μｌを用いて１００μｌの系で反応を行った。プライマーを各６０ｐｍｏｌ、またＴａｋａｒａ製Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。サーマルサイクラーはＴａｋａｒａ製サーマルサイクラーＭＰを用いた。
【００４９】
ＰＣＲ条件は以下の通り、９４℃１分１サイクル、９４℃１分／５０℃１分／７２℃１．５分のサイクルを３０サイクル、７２℃２分、４℃に冷却。反応液をアガロースゲル電気泳動後にエチジウムプロマイド染色し、ＵＶ検出した際の増幅産物の有無で判定した。実験結果を図１０に示した。全ての次数において計数値と理論値は非常によく一致し、本培地による計数の精度が確認された。しかし、１０５ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ  以下では、土着菌の影響で計数ができない検出限界に達していた。Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲによる判別結果によって計数値を補正し、ＭＯ７Ｒ株数を推定した結果は、接種したＭＯ７Ｒ株数と非常によく一致していた。また、選択培地による希釈平板法では計数できなかった１０５ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ  と１０４ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ  においても、定量的な計数が可能であった。
【００５０】
以上の結果から希釈平板法とＤｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲを組み合わせた手法は、定量的且つ厳密な計数に用いることができ、選択培地の選択性の限界を広げる（たとえば１０倍に）ことが可能であることが示された。
【００５１】
【発明の効果】
上記の選択培地によりＭＯ７株の生育には影響を与えずに、平板上に生育する土着菌数を（例えばＨＯ土壌を試料とした際には約１０５  〜１０６  ｃｆｕ  ／ｇ  ｓｏｉｌ  に）抑制することが可能である。従って、約１０３  〜１０４  ｃｆｕ  ／ｇ  ｓｏｉｌ  程度以上のＭＯ７株を選択的に計数する事が可能である。
【００５２】
また本変異株はＭＯ７株（野生株）のもつ特長（汚染物質分解能力）等には遜色がないことを確認済みで、野生株と同様の使用（例えばＢｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ等）が可能である。
また、ＭＯ７Ｒ株と本薬剤添加培地を用いることにより、土壌系に導入したＭＯ７Ｒ株を希釈平板法によって選択的に計数可能なシステムが構築できた。
さらに、希釈平板法とＤｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲ法とを組み合わせた手法により、本選択培地の選択性の評価が可能となり、また、土着菌の生育によって生じた検出限界を１オーダー以上下げる事が可能となった。さらに本手法は目的とする被検出菌レベルが低い場合においても検出することが可能となる。また、本手法は、ＭＯ７株に限らず別の細菌とその選択培地とを用いる場合にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１に平板培養における、細菌、放線菌及び糸状菌のコロニーの形態を示し、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図２】図２は、ＭＯ７株及び土着菌の生育に対する各種抗生物質の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＯ７株及び土着菌の生育に対する各種抗生物質の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＭＯ７株及び土着菌の生育に対する酵母エキス及びグルコースの効果を示すグラフである。
【図５】図５は、放線菌のコロニーの大きさに対するグルコースの効果を示し、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図６】図６は、３種類の抗生物質の相乗効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＴＣＥ分解能についてＭＯ７株とリファンピシリン耐性株ＭＯ７Ｒを比較したグラフである。
【図８】図８は、土壌にＭＯ７Ｒ株を接種した後にその菌数を測定した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、土着菌の生育に対する培地および抗生物質組成の効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、土壌にＭＯ７Ｒ株を接種した後に、その菌数を測定した効果およびＤｉｒｅｃｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲによって計数値を補正し、厳密にはＭＯＲ７株の菌数を推定した結果を示すグラフである。
【図１】
0003613656.tif 000005
【図２】
0003613656.tif 000006
【図３】
0003613656.tif 000007
【図４】
0003613656.tif 000008
【図５】
0003613656.tif 000009
【図６】
0003613656.tif 000010
【図７】
0003613656.tif 000011
【図８】
0003613656.tif 000012
【図９】
0003613656.tif 000013
【図１０】
0003613656.tif 000014