(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
OP−１ポリペプチドを有効成分として含み、肝臓組織又はCNS（中枢神経）組織と接触させて肝臓組織又はCNS組織の機能を再生するための組成物。
【請求項２】
以下を含む非骨格組織の機能を再生するための組成物。
（ａ）単離された肝臓組織又はCNS（中枢神経）組織
（ｂ）OP−１ポリペプチドであって、該ポリペプチドは前記非骨格組織の機能を再生するものである
【請求項３】
単離された、非骨格組織である肝臓組織又はCNS組織の機能を再生するための方法であって、前記組織をOP−１と接触させるステップを含み、それによって該非骨格組織に対する機能を再生する方法。
【請求項４】
分化した非ヒト哺乳動物の、非骨格組織である肝臓組織又はCNS組織から選ばれる機能を再生するための方法であって、前記組織をOP−１と接触させるステップを含み、それによって該非骨格組織に対する機能を再生する方法。
【請求項５】
単離された、非骨格組織である肝臓組織又はCNS組織の状態を評価する方法であって、前記組織におけるOP−１の濃度を求めることを含み、前記検出濃度の変化は前記組織の状態を示しているものである、組織の状態を評価する方法。
【請求項６】
単離された、非骨格組織である肝臓組織又はCNS組織の成長を誘導する方法であって、前記組織が刺激されて成長するのに十分な濃度および時間で、前記組織をOP−１に接触させることを含む、組織の成長を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景技術
この発明は、哺乳動物の体内で組織の形態形成を誘導する形態形成タンパク質、これらのタンパク質を同定する方法およびこれらのタンパク質を天然のソースから得る方法またはこれらのタンパク質の遺伝暗号を組み込んだ組換えDNAを発現させることによりこれらのタンパク質を生産する方法、組織特異性のある非細胞マトリックスの作成、組織の安定状態の維持，修復および再生を促進する方法、およびこれらのタンパク質を用いて始原細胞集団を増大させる方法に関する。
細胞の分化は、形態形成の中心的な特徴であり、胚に始まり、生物が生きている間ずっと、成体の組織の修復および再生メカニズムのなかでさまざまな程度に続く。成体の組織における形態形成の程度は組織によって異なり、とりわけその組織の細胞の代謝回転の程度に関係する。この点にもとづいて、組織は三つの大きなカテゴリーに分類される：（１）細胞分裂が無くかつ初期の発生段階で形成された細胞の大部分が成体が生きている間ずっと生き続ける、神経や骨格筋のような停止細胞集団を含む組織、（２）一般的にはほとんど細胞分裂はしないが、適当な刺激に反応して細胞が分裂し同じ分化型の娘細胞を産み出す、肝臓のような、条件により再生する集団を含む組織、（３）成体における速くかつ継続的な代謝回転を特徴とする、血液，精巣，重層扁平上皮を含む、一生の間再生する細胞集団を含む組織。このような組織では、最終分化細胞は比較的短かい寿命を持ち、幹細胞または始原細胞として知られる異なる亜集団の細胞の増殖によって取って代られる。
これらの細胞の分化のための刺激を制御する細胞および分子事象は、盛んに研究が行われている分野である。医学分野では、細胞の分化および組織の形態形成を制御する因子（因子類）の発見は、病気にかかったまたは損傷した哺乳動物の組織や器官を修復または再生する医術の能力を大いに発展させるものと期待される。特に役に立つ分野には、再建外科や、関節炎、肺気種、骨粗しょう症、心筋症、肝硬変、変形神経症などの組織変形疾患の治療が含まれる。
近年、細胞分化に役割を果たすと見られる多数の異なる因子が単離された。これらの因子群のうちのいくつかは、ドロソフィラ（ショウジョウバエ）に確認されているNOTCH遺伝子およびゼノプス（アフリカツメガエル）に確認されているそれと同類のXOTCH遺伝子のような遺伝子転写活性化因子、それにケノラブディティス  エレガンスに確認されている複数の転写活性化因子である。
造血系は、その継続的に再生する細胞集団のために集中的な研究が行われている分野である。細胞の再生に関与している可能性のあるこの系で確認されている因子には、インターロイキン３（IL−３）、エリトロポエチン、CSF類（GM−CSF,G−CSF,M−CSFその他）および多数の幹細胞成長因子がある。
細胞の分化に役割を果たすと考えられているその他のタンパク質類には、インシュリン様成長因子（IGF）ファミリのメンバであるタンパク質類、ヘパリンに結合する成長因子ファミリのメンバであるタンパク質群（例えば、FGF−酸性およびアルカリ性の線維芽細胞成長因子およびECDGF−胎児性癌腫派生の成長因子）や、いくつかの形質転換がん遺伝子（hstおよびint−２、例えば、Heath他（1988）、J.CellSci.Suppl.10:256−256参照）がある。細胞性粘菌で確認されているDIF（分化誘導因子）は、その生体内に予め持っている細胞の分化を方向づけるもう１つの生体調節タンパク質である。
TGF−βスーパーファミリのタンパク質と構造的に似ているタンパク質群も、種々の発生事象に関与すると確認されている。例えば、TGF−βやインヒビン／アクチビン  グループのポリペプチドは、細胞の成長および分化を制御する働きをするらしい。MIS（ミュラー管抑抑性物質）は、哺乳動物の雄胎児の発生中にミュラー管の退行を引き起こす。また、ドロソフィ（ショウジョウバエ）のdecapentaplegic複合体の遺伝子産物であるDPPは、正しい背−腹の分化に必要なものである。同様に、Vg−１はゼノプスの中胚葉の誘導に関与し、またVgr−１は発生しつつあるマウスの異なる組織中に確認されている。
多くの情報を明らかにするもう一つのソースは、骨の形態形成の分野である。骨のモデルシステムの開発と研究は、骨の分化の発達の段階が、間充細胞のケモタキシス（走化）、これらの始原細胞の増殖、これらの細胞の軟骨芽細胞への分化、軟骨の石灰化、血管の侵入、骨の形成、再成形、そして最後に骨髄の分化から成ることを確認した（Reddi（1981）Collagen  Rel.Res.1:209−206）。マトリックスと一緒に入られたとき哺乳動物の体内で軟骨内の骨成形を誘導する能力のあるタンパク質は、現在多数の異なる哺乳動物の種において確認されており、またこれらのタンパク質を遺伝暗号化している遺伝子も確認されている（例えば、米国特許No.4,968,590および米国特許No.5,011,691、Ozkaynak他，（1990）EMBO  Ｊ  9:2085−2093およびOzkaynak他，（1991）Biochem.Biophys.Res.Commn.179:116−123、および1992年２月21日出願のUSSN07/841,646参照）。これらのタンパク質は、相互にアミノ酸配列の相同性が高く、TGF−βスーパーファミリのタンパク質の多数のメンバと構造が類似しており、適当に修飾されたマトリックスとー諸に哺乳動物に入られたとき軟骨内骨形成および／または軟骨形成を誘導することが示されている。他の組織に、同じような複数発生段階の形態形成を誘導することができるタンパク質は、まだ確認されていない。
本発明の一つの目的は、骨または軟骨とは異なる哺乳動物のいろいろな組織に、複数の発達段階をたどる形態形成を誘導することができる形態形成タンパク質類（”モルフォゲン類”）およびこれらのタンパク質類を同定する方法を提供することである。この形態形成活性は、始原細胞の増殖および分化を誘導する能力と、成体の組織の形態に至る一連の事象を通じて分化した表現型を支援し維持する能力を含む。もう一つの目的は、これらのタンパク質を遺伝暗号化している遺伝子、および組換えDNA技術を用いて天然のソースまたは生合成ソースのどちらからでもこれらのタンパク質を発現させ単離する方法を提供することである。さらにもう１つの目的は、これらのタンパク質と組み合わせて使用できる組織特異性のある非細胞マトリックスを提供することである。その他の目的には、哺乳動物内で始原細胞集団を増大させる方法、生体内または試験管内で始原細胞を刺激して分化させそれらの細胞の分化した表現型を維持する方法、生体内で組織特異の成長を誘導する方法、および生体内の病気にかかったまたは損傷した組織を取り替える方法を提供することが含まれる。本発明のこれらのおよびその他の目的と特徴は、以下の説明、図および請求項から明らかになるであろう。
発明の要旨
本発明は、哺乳動物内で複数の発達段階をたどる組織形態形成を誘導することができる形態形成タンパク質類（”モルフォゲン類”）を提供する。特に、これらのタンパク質は、未分化の始原細胞の増殖を誘導することができ、そして適当な環境条件のもとで組織特異的にこれらの刺激された始原細胞の分化を誘導することができる。さらに、このモルフォゲン類は、これらの分化した細胞の成長と維持を支援することができる。これらの形態形成活性は、この発生のタンパク質類が、形態形成を許容する環境において、複数の発達段階をたどる組織の形態形成を開始させかつ持続させること、すなわち組織特異的に幹細胞を刺激して増殖させ分化させて、新しい組織の形成で完結する一連の事象を誘導することを可能にする。これらの形態形成活性はまた、本発明のタンパク質類が、先にそれらの分化の道筋から外れるように誘導された細胞の”再分化”を刺激することも可能にする。適当な環境条件のもとでは、これらのモルフォゲン類が、分化した細胞の”脱分化”を刺激することができるかも知れないことが期待される（下記参照）。
本発明の１面において、本発明のタンパク質類および組成物は、哺乳動物内の病気にかかったまたは損傷した組織を取り替えるのに、とりわけ損傷した組織が正常な組織や器官の機能を妨げるときに、役に立つ。したがって、本発明のタンパク質類が、例えば、肺気腫の結果傷んだ肺の組織、硬変した腎臓や肝臓の組織、心筋症および／または動脈血栓あるいは心臓塞栓による発作によって生じる得る心臓や血管の傷んだ組織、潰瘍性搾孔またはその修復で傷んだ胃の組織、物理的な負傷またはアルツハイマー病や多発性硬化症や発作などの変性病で傷んだ神経組織、病気や物理的な負傷の結果生じることがある象牙質の組織、などの損傷した組織の修復に役立つことが期待される。本発明のタンパク質類が組織に特異な局所に与えられたとき、またはそれらの発現が組織に特異な局所において刺激されたとき、複数の発達段階をたどる組織形態形成が誘導される。その細胞内でモルフォゲンの発現を刺激することができるタンパク質類または因子との接触により刺激された細胞を、組織の局所に与えてもよい。これらの場合には、そこに存在する組織が必要なマトリックスの条件を提供する。すなわち、形態形成が可能な環境において細胞を増殖させかつ分化させるための好適な培養基台を提供し、さらに発生しつつある組織の組織特異性を指示するために必要な信号類を提供する。あるいまた、本発明のタンパク質類または刺激された細胞を、調整されたマトリックスと組み合わせて、生体内の局所にデバイスとして移植してもよい。この調整されたマトリックスは、生体適合性があり、好ましくは体内分解性があり、後述された特徴を持つ、適正に修飾された、組織特異性のある非細胞マトリックスでなければならない。
多くの場合、組織の機能の喪失は、最初のまたは繰り返し受けた損傷に反応して形成されるはん痕組織が原因となって生じる。はん痕組織の形成の程度は、一般的には、損傷した組織の再生特性および損傷の程度と種類によって異なる。したがって、別の面において、本発明は、新たに損傷した組織の局所にモルフォゲン類またはモルフォゲンで刺激された細胞をつけることにより、はん痕組織の形成を防止するかまたは殆んど完全に抑制するために使用できるかもしれないモルフォゲン類も含む（下記参照）。
本発明のモルフォゲン類はまた、哺乳動物において始原細胞または幹細胞の集団を増大または再生させるためにも使用できるであろう。例えば、始原細胞を個人の骨髄から単離し、体外でそれらの細胞を誘導して増殖させるのに十分な時間とモルフォゲン濃度で刺激してから、骨髄に戻すことができる。適しているかもしれない他の始原細胞のソースには、培養された細胞の系統から取られ、培養中に刺激され、それから体内に入れられる、生体適合性のある細胞が含まれる。あるいはまた、モルフォゲン類を、全身に投与するか、または埋め込み、注入、その他の方法により個人の体内で始原細胞集団に与えて、その始原細胞集団の分裂促進活性を誘導することもできるであろう。例えば、対象とする始原細胞集団においてモルフォゲンの発現を刺激することができる因子を、例えば全身投与により、体内でその細胞郡に与えて、分裂促進活性を誘発することができるであろう。同様に、本発明のモルフォゲン類により、例えば、個人の血液を潅流して対象とする細胞を抽出し、これらの細胞を体外で刺激し、刺激された細胞を血液中に戻すことによって、造血幹細胞の数を増加させることができるであろう。個人の始原細胞の数を増大させることができるこの能力は、再生可能な細胞の消滅または数の減少から起きる異常にたいする現在の治療方法を著じるしく強力にするであろうと期待される。２つの特に重要な応用は、血液疾患の治療と、低下したまたは失われた免疫機能の治療である。その増殖を利用できるかもしれない他の細胞集団は、皮膚組織の再生に使えるかもしれない表皮の幹細胞や、例えば潰瘍の治療に使えるかもしれない胃腸内壁の幹細胞である。
本発明のさらにもう１つの面において、本発明のモルフォゲン類はまた、既存の分化した細胞がそれらの表現型を発現し続けるように誘導することにより、分化細胞の成長と維持を支援するためにも使用できる。この活性は、骨粗しょう症において起こるように細胞が老化または静止することによって機能の喪失が引き起こされる組織の疾病の治療において、特に役に立つことが期待される。これらの細胞を刺激してそれらの表現型を発現させそれによって機能障害の影響を顕著に逆転させ続けるためには、治療されるべき細胞に対する直接のこのタンパク質の塗布または全身注入によるその投与が使用できるかもしれない（下記参照）。あるいはまた体内でモルフォゲンの発現を刺激できる因子を投与してもよい。さらに、この発明のモルフォゲン類はまた、遺伝子治療の計画において、静止した細胞の成長を刺激しそれによってこれらの細胞の外来のDNAを取り込む能力を潜在的に高めるためにも使用できるであろう。
本発明のさらにもう１つの面において、本発明のモルフォゲン類はまた、潰瘍形成中に起こり得るようにそれらの分化の道筋から外れてしまった細胞の”再分化”を誘導するためにも使用できるであろう。本発明のタンパク質類のこの活性は、新生物（腫瘍）の成長を遅くするかまたは実質的に禁止するための治療に特に役に立つであろうと期待されている。この方法はまた、またこれらの細胞の脱分化および再分化を誘導することも期待される。上述したように、これらのタンパク質類は細胞に直接にまたは全身投与により与えてもよい。また体内でモルフォゲンの発現を刺激することができる因子を与えてもよい。
最後に、内在生のモルフォゲンのレベルの変化は、組織の機能不全を検出するための方法の一部として監視できるであろう。具体的には、内在生のモルフォゲンレベルの変化は、組織あるいは器官の静止状態の変化を反映すると考えられる。組織の静止状態は、モルフォゲン自体のレベルの変化を検出することによって監視できるであろう。例えば、組織のサンプルを一定時間間隔で採取し、その組織中に存在するモルフォゲンの濃度を、この分野に習熟した人々に知られている標準的なタンパク質検知手段によって検出することができる。一例として、対象とするモルフォゲンと特異的に相互作用し得る結合タンパク質、例えば抗モルフォゲン抗体が、標準的な免疫検定において、モルフォゲンを検出するために使用できる。それによって検出されたモルフォゲンのレベルを比較すすることが可能になり、検出レベルの変化が組織の状態を示す。内在生のモルフォゲンのレベルの変化はまた、モルフォゲン類に対する体の自然の抗体力価の変化を検出することによっても監視できる（下記参照）。
本発明の形態形成タンパク質類および組成物は、各種の天然に存在するソースから単離することもできるし、従来の組換えDNA技術を使って生合成により作ることもできる。同様に、マトリックス類は、器官特異の組織から誘導することもできるし、後述するように合成によって調整することもできる。
これらの発展のかぎは、天然に存在する骨原性タンパク質の発見と特徴の決定、および続くそれらの注目すべき作用の観察であった。これらのタンパク質類は、もともと骨から単離され、適正に修飾されたマトリックスとともに哺乳動物の体内に入れられたとき、血管形成、石灰化、および骨髄の分化を含む骨形成の全発達段階を誘導することができる。この多段階発達を誘導することができる天然のタンパク質類と、これらのタンパク質を遺伝暗号化しているDNA配列群は、複数の異なる種において単離され、特徴が決定されている（例えば、ヒトおよびマウスOP−１、OP−２、およびCBMP−2.
例えば、米国特許No.4,968,590およびNo.5,011,691;1992年２月21日出願の米国特許出願No.841,646;Sampath他（1990）J.Bio.Chem.265:13198−13205;Ozkaynak他（1990）EMBO  Ｊ  9:2085−2093およびOzkaynak他（1991）Biochem.Biophys.Res.Commn.179:116−123参照）。これらのタンパク質類の成熟型は、特に成熟タンパク質のＣ−未端領域において、実質的なアミノ酸配列の相同性がある。特にこれらのタンパク質類は、この領域に、保存された６または７システインの骨格を持つ（例えば、Ｃ−末端のこれらのシステイン残基の直線配列は、他の明らかに必要なアミノ酸類に加えて、異なるタンパク質類に不可欠に保存されている（下記の表２参照））。
通常は骨や骨の形成に関係しないが、骨原性のタンパク質類のＣ−末端と殆んど完全なアミノ酸配列の相同性があり、６システインまたは７システインの保存骨格を含むポリペプチド鎖もまた、哺乳動物において骨を誘導することができることが確認されている。これらのポリペプチド鎖のなかには、ドロソフィラおよびゼノプスで確認されているアミノ酸配列群がある（例えば、DPPおよびVgl:例えば、米国特許No.5,011,691および下記の表２参照）。さらに、これらの配列の相同性からの外挿（補外）にもとづいて設計された、６または７システインの保存骨格を含む、非天然の生合成による構造は、適当なマトリックスとともに移植されたとき、哺乳動物類において軟骨内の骨形成を誘導することが示されている（米国特許No.5,011,691および下記の表３参照）。
現在では、実質的に相同なアミノ酸配列と６または７システインの保存骨格を共通に持つこのタンパク質の”ファミリ”は、骨および軟骨に加えて、多種の他の器官や組織に対しても組織特異な形態形成を誘導することができる真のモルフォゲン類であることが発見されている。このタンパク質類は、明らかに表面レセプターに結合するかまたは他の方法で始原細胞と接触し相互作用して、形態形成を許容する環境においてそれらの細胞に素因を与えるかまたは刺激して増殖させ分化させる。これらのモルフォゲン類は、自然に発生する組織によって必要とされる血管形成、結合組織の形成および神経の侵入などを含む，器官特異な新しい組織の形成で完結する複数の発生段階をたどる細胞および分子事象を、誘導することができる。
細胞の分化の仕方、例えばそれらが骨を作る骨芽細胞、造血細胞、または肝細胞のどれに分化するかは、それらの局所的な環境に依ることも発見されている（下記参照）。したがって、増殖し分化しつつある細胞は、その上に固着するための適した基台を必要とすることに加えて、それらの組織特異性を方向づけるための適正な信号類をも必要とする。これらの信号類は、細胞の表面の標識の形を取ってもよい。
このモルフォゲン類（またはこれらのモルフォゲン類によって刺激された始原細胞郡）が組織に特異な局所に与えられたとき（例えば、全身注入によるかまたは組織の特異な局所への埋め込めまたは注入によるか、さらには体内でモルフォゲンの発現を刺激することができる因子を投与することによる）、その局所の既存の組織は、病気にかかっていたり損傷したりしていても、適したマトリックスとして働く能力を持つ。あるいはまた、その損傷した組織がこうむっている傷みの程度がひどいときに必要であるかもしれないように、刺激された始原細胞群またはモルフォゲンとー諸に調整したマトリックスを外部から与えることもできる。このマトリックスは、生体適合性があり、移動する始原細胞群の侵入、分化および増殖を許容する大きさを持つ適切に修飾された非細胞マトリックスであって、さらに形態形成を許容する環境を提供することができなければならない（下記参照）。このマトリックスは組織特異性がありかつ体内分解可能であることが好ましい。
調整マトリックスは、脱水された器官特異の組織から、例えばその組織を溶剤で処理してその組織からほとんど非構成要素を除去することにより作成できる。あるいはまた、このマトリックスは、生体適合性があり、好ましくは生体内で生物分解可能なコラーゲンのような構造高分子を、適当な組織特異性のある細胞付着因子と共に用いて、合成により調整することもできる。現在好ましい構造高分子は、組織特異なコラーゲンを要素として含む。現在好ましい細胞付着因子には、グリコスアミノグリカン類およびプロテオグリカン類などがある。このマトリックスはさらに、その哺乳動物の体内から移動する始原細胞群の侵入、増殖および分化を促進するように、表面の細孔や微小なくぼみの数を増加させるために、一つまたは複数の薬品で処理してもよい。
この発明において役に立つタンパク質類には、OP−1,OP−2,CBMP2タンパク質のような当初骨原性のタンパク質類として確認されたタンパク質類や、DPP（ドロソフィラ由来）,Vgl（ゼノプス由来）,Vgr−１（マウス由来、表２およびSeq.ID  No.5−14参照）などのアミノ酸配列が類似したタンパク質、および近年確認されたGDF−１タンパク質（Seq.ID  No.14）がある。このファミリのメンバ−−TGF−βスーパーファミリのタンパク質を含む−−は、それらのＣ−末端領域に、実質的に相同なアミノ酸配列を共通に持っている。下記の表１は、現在までに確認されている多数のモルフォゲン類を、この明細書で使用している名前と配列識別番号と共に示す。
表  １
OP−１  OP−１タンパク質を遺伝暗号化しているDNA配列の１部分または全体から発現される形態形成にたいして活性なタンパク質のグループを全体的に指し、その対立性変異および種間変異、例えば、ヒトのOP−１（"hOP−1"Seq.ID  No.5、成熟タンパク質のアミノ酸配列）またはマウスのOP−１（"mOP−1"Seq.ID  No.6、成熟タンパク質のアミノ酸配列）も含む。７システインの保存骨格は、Seq.ID  No.5および６の残基38から139によって構成されている。このタンパク質類の全長を暗号化しているcDNA配列およびアミノ酸は、Seq.ID  No.16および17（hOP1）およびSeq.ID  No.18および19（mOP1）で与えられる。成熟タンパク質類は、残基293−431（hOP1）および292−430（mOP1）によって構成される。このタンパク質類の、切断されると成熟した形態形成活性なタンパク質を生じる"pro"領域は、実質的に、アミノ酸残基30−292（hOP1）およびアミノ酸残基30−291（mOP1）によって構成されている。
OP−２  OP−２タンパク質を遺伝暗号化しているDNA配列の１部分または全体から発現される活性なタンパク質のグループを全体的に指し、その対立変異および種間変異、例えば、ヒトのOP−２（"hOP−2"Seq.ID  No.7、成熟タンパク質のアミノ酸配列）またはマウスのOP−２（"mOP−2"Seq.ID  No.8、成熟タンパク質のアミノ酸配列）も含む。７システインの保存骨格は、Seq.ID  No.7および８の残基38から139によって構成されている。このタンパク質類の全長を暗号化しているcDNA配列およびアミノ酸は、Seq.ID  No.20および21（hOP2）およびSeq.ID  No.22および23（mOP2）に示されている。成熟タンパク質類は、実質的にアミノ酸残基264−402（hOP2）および261−399（mOP2）によって構成されている。このタンパク質類のの、切断されると成熟した形態形成活性なタンパク質を生じる"pro"領域は、実質的に、アミノ酸残基18−263（hOP2）およびアミノ酸残基18−260（mOP1）によって構成されている。
CBMP2  CBMP2タンパク質類をコード化しているDNA配列から発現された形態形成活性なタンパク質のグループを全体的に指し、その対立変異および種間変異、例えば、ヒトのCBMP2A（"CBMP2A（fx）”、Seq.ID  No.9）またはヒトのCBMP2B  DNA（"CBMP2B（fx）”、Seq.ID  No.10）も含む。
DPP（fx）  ドロソフィラのDPP遺伝子によってコード化されており、７システインの保存骨格（Seq.ID  No.11）を構成するタンパク質配列群を指す。
Vgl（fx）  ゼノプスのVgl遺伝子でコード化されており、７システインの保存骨格（Seq.ID  No.12）を構成するタンパク質配列群を指す。
Vgl−１（fx）  ネズミのVgl−１遺伝子でコード化されており、７システインの保存骨格（Seq.ID  No.13）を構成するタンパク質配列群を指す。
GDF−１（fx）  ヒトのGDF−１遺伝子でコード化されており、７システインの保存骨格（Seq.ID  No.14）を構成するタンパク質配列群を指す。
OP−２タンパク質類は、このファミリの他のタンパク質類に共通して存在する保存されたシステイン骨格に加えて、この領域にもう１つのシステイン残基を持つ（例えば、Seq.ID  No.7および８の残基41を参照）。GDF−１タンパク質は、保存骨格の中に、４つのアミノ酸からなる挿入部を持つ（Seq.ID  No.14の残基44−47）。しかしこの挿入部は、折りたたまった構造の中のシステインの関係には影響を及ぼさないように見える。さらに、CBMP2タンパク質類には、システイン骨格中の１つのアミノ酸残基が欠けている。
これらのモルフォゲン類は、還元されたときは不活性であるが、酸化された同一２量体のときおよび本発明の他のモルフォゲン類と組み合わせて酸化されたときは活性である。すなわち、ここに説明しているように、本発明のモルフォゲンは、一対のポリペプチド鎖からなる２量体のタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は、少なくとも、Seq.ID  No.5のアミノ酸残基43−139によって構成されるＣ−末端の６システイン骨格−−これらのシステインの機能的に同等な配列（例えば、配列中のシステインの直線配列は変えるが、折りたたまった構造中でのシステインの関係は変えないようなアミノ酸の付加や欠落があるもの）を含む−−を持つ。そのため、これらのポリペプチド鎖が折りたたまったとき、このポリペプチド鎖の対からなる二量体タンパク質類は、ここで説明されているようなモルフォゲンの働きをすることができる特有の鎖内または鎖間のジスルフィド結合を含む、特有の３次元構造をとる。具体的には、このタンパク質は、形態形成を許容する環境において、次のような生物学的作用：始原細胞の増殖を刺激すること、始原細胞の分化を刺激すること、分化した細胞の増殖を刺激すること、および分化した細胞の成長と維持を支援すること、さらにはこれらの細胞の再分化も含む、のすべてが可能である。さらに本発明のモルフォゲン類は、適当な環境条件のもとで、分化した細胞の脱分化を誘導できるであろうことも期待される。
１つの好ましい面においては、本発明のモルフォゲン類は、各Xaaが20の天然のＬ−異性体のα−アミノ酸類の１つまたはそれらの１つの誘導体を指す、包括的に表示した２種類のアミノ酸配列：一般配列１（Seq.ID  No.1）または一般配列２（Seq.ID  No.2）の１つ含む。一般配列１は、６システインの保存骨格を含み、一般配列２は６システインの保存骨格に加えてOP−２で確認されている追加のシステインを含む（Seq.ID  No.2の残基36参照）。もう１つの好ましい面においては、これらの配列はさらに、それらのＮ−末端に次の追加の配列を含む。
0003627985.tif 000002
上記の一般配列のうちの好ましいアミノ酸配列には、一般配列３（Seq.ID  No.3）および一般配列４（Seq.ID  No.4）が含まれる。これらの一般配列は、現在までに確認されているこのモルフォゲンファミリの多数の好ましいメンバの間に共通する相同性（表２参照）と、それらのメンバの間のアミノ酸配列の変異を収容している。一般配列３と４は、表２に示されておりまたSeq.ID  No.5−14で決められているタンパク質の複合アミノ酸配列である。これらの一般配列３と４は、表２の配列郡が共通に持つアミノ酸配列の同一部と、その配列内の変更可能な位置にたいして選択し得る残基の両方を示している。これらの一般配列は、一般配列３の位置41または一般配列の位置46に、分子間または分子内のジスルフィド結合が可能な特有のシステイン骨格を提供しながら、もう１つのシステインを含むことができること、およびこのタンパク質の三次構造に影響を及ぼす幾つかの重要なアミノ酸群を含んでいることに注目されたい。
0003627985.tif 000003
0003627985.tif 000004
ただし、Xaaは次のように決められた１または複数の指定されたアミノ酸から独立に選ばれる。"res."は”残基”を示す。
Xaa res.4＝（Ser,AspまたはGlu）；
Xaa res.6＝（Arg,Gln,SerまたはLys）；
Xaa res.7＝（AspまたはGlu）；
Xaa res.8＝（LeuまたはVal）；
Xaa res.11＝（Gln,Leu,Asp,HisまたはAsn）；
Xaa res.12＝（Asp,ArgまたはAsn）；
Xaa res.14＝（IleまたはVal）；
Xaa res.15＝（IleまたはVal）；
Xaa res.18＝（Glu,Gln,Leu,Lys,ProまたはArg）；
Xaa res.20＝（TyrまたはPhe）；
Xaa res.21＝（Ala,Ser,Asp,Met,His,LeuまたはGln）；
Xaa res.23＝（Tyr,AsnまたはPhe）；
Xaa res.26＝（Glu,His,Tyr,AspまたはGln）；
Xaa res.28＝（Glu,Lys,AspまたはGln）；
Xaa res.30＝（Ala,Ser,ProまたはGln）；
Xaa res.31＝（Phe,LeuまたはTyr）；
Xaa res.33＝（LeuまたはVal）；
Xaa res.34＝（Asn,Asp,AlaまたはThr）；
Xaa res.35＝（Ser,Asp,Glu,LeuまたはAla）；
Xaa res.36＝（Tyr,Cys,His,SerまたはIle）；
Xaa res.37＝（Met,Phe,GlyまたはLeu）；
Xaa res.38＝（AsnまたはSer）；
Xaa res.39＝（Ala,SerまたはGly）；
Xaa res.40＝（Thr,LeuまたはSer）；
Xaa res.44＝（IleまたはVal）；
Xaa res.45＝（ValまたはLeu）；
Xaa res.46＝（GlnまたはArg）；
Xaa res.47＝（Thr,AlaまたはSer）；
Xaa res.49＝（ValまたはMet）；
Xaa res.50＝（HisまたはAsn）；
Xaa res.51＝（Phe,Leu,Asn,Ser,AlaまたはVal）；
Xaa res.52＝（Ile,Met,Asn,AlaまたはVal）；
Xaa res.53＝（Asn,Lys,AlaまたはGlu）；
Xaa res.54＝（ProまたはSer）；
Xaa res.55＝（Glu,Asp,AsnまたはGly）；
Xaa res.56＝（Thr,Ala,Val,Lys,Asp,Tyr,SerまたはAla）；
Xaa res.57＝（Val,AlaまたはIle）；
Xaa res.58＝（ProまたはAsp）；
Xaa res.59＝（LysまたはLeu）；
Xaa res.60＝（ProまたはAla）；
Xaa res.63＝（AlaまたはVal）；
Xaa res.65＝（ThrまたはAla）；
Xaa res.66＝（Glu,Lys,ArgまたはGlu）；
Xaa res.67＝（Leu,MetまたはVal）；
Xaa res.68＝（Asn,SerまたはAsp）；
Xaa res.69＝（Ala,ProまたはSer）；
Xaa res.70＝（Ile,ThrまたはVal）；
Xaa res.71＝（SerまたはAla）；
Xaa res.72＝（ValまたはMet）；
Xaa res.74＝（TyrまたはPhe）；
Xaa res.75＝（Phe,TyeまたはLeu）；
Xaa res.76＝（AspまたはAsn）；
Xaa res.77＝（Asp,Glu,AsnまたはSer）；
Xaa res.78＝（Ser,Gln,AsnまたはTyr）；
Xaa res.79＝（Ser,Asn,AspまたはGlu）；
Xaa res.80＝（Asn,ThrまたはLys）；
Xaa res.82＝（IleまたはVal）；
Xaa res.84＝（LysまたはArg）；
Xaa res.85＝（Lys,Asn,GlnまたはHis）；
Xaa res.86＝（TyrまたはHis）；
Xaa res.87＝（Arg,GlnまたはGlu）；
Xaa res.88＝（Asn,GluまたはAsp）；
Xaa res.90＝（Val,ThrまたはAla）；
Xaa res.92＝（Arg,Lys,Val,AspまたはGlu）；
Xaa res.93＝（Ala,GlyまたはGlu）；
および Xaa res.97＝（HisまたはArg）
また一般配列４は、
0003627985.tif 000005
0003627985.tif 000006
ただし、Xaaは次のように決められた１または複数の指定されたアミノ酸から独立に選ばれる。"res."は”残基”を示す。
Xaa res.2＝（LysまたはArg）；
Xaa res.3＝（LysまたはArg）；
Xaa res.4＝（HisまたはArg）；
Xaa res.5＝（Glu,Ser,His,Gly,ArgまたはPro）；
Xaa res.9＝（Ser,AspまたはGlu）；
Xaa res.11＝（Arg,Gln,SerまたはLys）；
Xaa res.12＝（AspまたはGlu）；
Xaa res.13＝（LeuまたはVal）；
Xaa res.16＝（Gln,Leu,Asp,HisまたはAsn）；
Xaa res.17＝（Asp,ArgまたはAsn）；
Xaa res.19＝（IleまたはVal）；
Xaa res.20＝（IleまたはVal）；
Xaa res.23＝（Glu,Gln,Leu,Lys,ProまたはArg）；
Xaa res.25＝（TyrまたはPhe）；
Xaa res.26＝（Ala,Ser,Asp,Met,His,LeuまたはGln）；
Xaa res.28＝（Tyr,AsnまたはPhe）；
Xaa res.31＝（Glu,His,Tys,AspまたはGlu）；
Xaa res.33＝Glu,Lys,AspまたはGln）；
Xaa res.35＝（Ala,SerまたはPro）；
Xaa res.36＝（Phe,LeuまたはTyr）；
Xaa res.38＝（LeuまたはVal）；
Xaa res.39＝（Asn,Asp,AlaまたはThr）；
Xaa res.40＝（Ser,Asp,Glu,LeuまたはAla）；
Xaa res.41＝（Tyr,Cys,His,SerまたはIle）；
Xaa res.42＝（Met,Phe,GlyまたはLeu）；
Xaa res.44＝（Ala,SerまたはGly）；
Xaa res.45＝（Thr,LeuまたはSer）；
Xaa res.49＝（IleまたはVal）；
Xaa res.50＝（ValまたはLeu）；
Xaa res.51＝（GlnまたはArg）；
Xaa res.52＝（Thr,AlaまたはSer）；
Xaa res.54＝（ValまたはMet）；
Xaa res.55＝（HisまたはAsn）；
Xaa res.56＝（Phe,Leu,Asn,Ser,AlaまたはVal）；
Xaa res.57＝（Ile,Met,Asn,AlaまたはVal）；
Xaa res.58＝（Asn,Lys,AlaまたはGlu）；
Xaa res.59＝（ProまたはSer）；
Xaa res.60＝（Glu,AspまたはGly）；
Xaa res.61＝（Thr,Ala,Val,Lys,Asp,Tyr,SerまたはAla）；
Xaa res.62＝（Val,AlaまたはIle）；
Xaa res.63＝（ProまたはAsp）；
Xaa res.64＝（LysまたはLeu）；
Xaa res.65＝（ProまたはAla）；
Xaa res.68＝（AlaまたはVal）；
Xaa res.70＝（ThrまたはAla）；
Xaa res.71＝（Gln,Lys,ArgまたはGlu）；
Xaa res.72＝（Leu,MetまたはVal）；
Xaa res.73＝（Asn,SerまたはAsp）；
Xaa res.74＝（Ala,ProまたはSer）；
Xaa res.75＝（Ile,ThrまたはVal）；
Xaa res.76＝（SerまたはAla）；
Xaa res.77＝（ValまたはMet）；
Xaa res.79＝（TyrまたはPhe）；
Xaa res.80＝（Phe,TyrまたはLeu）；
Xaa res.81＝（AspまたはAsn）；
Xaa res.82＝（Asp,Glu,AsnまたはSer）；
Xaa res.83＝（Ser,Gln,AsnまたはTyr）；
Xaa res.84＝（Ser,Asn,AspまたはGlu）；
Xaa res.85＝（Asn,ThrまたはLys）；
Xaa res.87＝（IleまたはVal）；
Xaa res.89＝（LysまたはArg）；
Xaa res.90＝（Lys,Asn,GlnまたはHis）；
Xaa res.91＝（TyrまたはHis）；
Xaa res.92＝（Arg,GlnまたはGlu）；
Xaa res.93＝（Asn,GluまたはAsp）；
Xaa res.95＝（Val,ThrまたはAla）；
Xaa res.97＝（Arg,Lys,Val,AspまたはGlu）；
Xaa res.98＝（Ala,GlyまたはGlu）；
およびXaa res.102＝（HisまたはArg）．
本発明においてモルフォゲンとして使用するのに特に有効な配列群は、少なくとも６または７システインの保存骨格を含むＣ−末端領域、例えばVgl,Vgr−１、DPP、OP−１、OP−２、CBMP−2A、CBMP−2BおよびGDF−１のＣ−末端の96−102のアミノ酸残基（下記の表２およびSeq.ID  No.5−14参照）、を含むものである。さらに一般配列から設計された生合成による構造、例えばCOP−１、３−５、７、16（下記の表３参照）もまた有効である。他の配列群は、Ｃ−末端にCBMP3およびインヒビン／アクチビン  タンパク質（例えば米国特許No.4,968,590および5,011,691参照）を含む。したがって、他の有効な配列群は、上記の配列群のどれかと、少なくとも70％のアミノ酸配列の相同性、好ましくは80％の相同性があるものである。これらの配列には、対立異形および種異形および突然変異形、生合成によるムテイン類、およびこの形態形成タンパク質のファミリの新しいメンバなどが含まれることが期待される。この類縁のタンパク質のファミリのなかでは、形態形成活性を示し、かつ好ましい配列からのアミノ酸の変化が保存的な変化を含むタンパク質類、例えば、Dayoff他によって、Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure、vol.5、Suppl.3、pp.345−362（M.O.Dayoff編、Nat'l  BioMed.Research  Fdn.,Washington,D.C.1979）に説明されているようなタンパク質が、特に注目される。
本発明におけるモルフォゲンとして有効な、現在最も好ましいタンパク質配列群には、hOP1の６システインの保存骨格を構成するアミノ酸の配列（例えば、Seq.ID  No.5の残基43−139）と60％より大きい、好ましくは65％より大きい同一性を持つタンパク質配列が含まれる、これらの最も好ましい配列群には、OP1およびOP2タンパク質の対立変異および種間変異も含まれる。
本発明はこのように、天然に存在するソースから単離されたものであるか、組換えDNA技術によって作られたものであるかによらず、上記したポリペプチド鎖のどれかを含むタンパク質類を提供する。またこれらのタンパク質類の対立変異および種間変異、天然に発生するまたは生合成された変異形、および端が切り取られたまたは合着した多数の構造も含む。欠落または付加による変異形−−保存されたＣ−末端のシステイン骨格を変えるかもしれない変異形も、その変化が折りたたまった構造中のこれらのシステインの関係を乱して機能を失わせるものでなければ含まれる−−もまた、活性があると考えられる（下記参照）。したがって、このような活性のある形は、ここに開示された明細に記述された構造に同等のものであると見なされる。これらのタンパク質類には、異なるグリコシル化パターンを持つ形、異なるＮ−末端を持つ形、アミノ酸配列が相同な領域を持つ類縁タンパク質のファミリ、および天然のタンパク質類またはホスト細胞内で組換えDNAの発現によって作られた生合成タンパク質類の端が切り取られたまたは変異した形であって活性なものが含まれる。
この形態形成タンパク質類は、完全なまたは端が切り取られたcDNAから、または原核または真核のホスト細胞内で合成DNAから発現させ、精製し、切断し、再び折りたたまらせ、二量体重合させることにより、形態形成にたいして活性な構造を形成させることもできる。現在好まれているホスト細胞群には、大腸菌またはCHO,COS,BSC細胞のような哺乳動物の細胞が含まれる。
したがって、この開示を参考にして、熟練した遺伝子工学技術者は、cDNAからまたは適宜なアミノ酸配列を暗号化している多数の異なる種のゲノムライブラリから遺伝子を単離するか、またはオリゴヌクレオチド類からDNAを構成して、それらの原核および真核の両方を含むいろいろな種類のホスト細胞内で発現させて、ヒトを含む多種の哺乳動物の体内で組織特異な細胞の分化および組織の形態形成を誘導することができる活性なタンパク質類を大量に生産することができる。
本発明はしたがってさらに、本発明の形態形成タンパク質類を用いて組織特異な形態形成を誘導するこれらの方法、および本発明のモルフォゲン類を含む薬品および治療薬も包含する。本発明はさらに、組織の成長を誘導するための処置、始原細胞の増殖を誘導するための処置、新生物の成長を抑制するための処置、および分化した細胞の表現型細胞発現を促進するための処置を含む、いろいろな医療処置のための医薬の製造にこれらのモルフォゲンを使用することも含む。
【図面の簡単な説明】
本発明それ自体、および本発明の前述した目的やその他の目的および特徴は、添付の図面とー諸に読むとき、以下の説明図からより良く理解されるであろう。
図１は、成熟マウスのいろいろな組織におけるVgr−１特異な転写体を同定するNothern  Blot法による顕微鏡写真である。
図２は、２週齢のマウス群から用意されたいろいろなマウスの組織（パネルＡ）および５週齢のマウス群から用意されたいろいろなマウスの組織（パネルＢ）におけるmOP−１特異なmRNAの発現を確認するNothern  Blot法による顕微鏡写真である。
図３は、（１）17日胎児群および（２）出生後３日のマウス群におけるEF−Tu（Ａ、対照）、mOP−１（B,D）、およびVgr−１（Ｃ）のmRNAの発現を確認するNothern  Blot法による顕微鏡写真である。
図4Aおよび4Bは、大脳皮質（Ａ）および脊髄（Ｂ）内のOP−１の存在を（免疫蛍光染色によって）示す顕微鏡写真である。
図5Aおよび5Bは、未分化のNG108細胞（5A）を誘導して神経の形態の分化（5B）をおこさせることができるモルフォゲン（OP−１）の能力を示す顕微鏡写真である。
図6A−6Dは、ヒトの胎児の癌腫細胞の再分化にたいするモルフォゲン（OP−１）の効果を示す顕微鏡写真である。
図７は、部分的に肝臓を切除したラット群にたいする食塩加リン酸緩衝液（PBS、動物１）またはモルフォゲン（OP−１、動物２）の効果を示す顕微鏡写真である。
図8A−8Cは、象牙質の再生にたいする無治療（8A）、キャリヤーマトリックス治療（8B）およびモルフォゲン治療（OP−１、8C）の効果を示す顕微鏡写真である。
発明の開示
哺乳動物の骨からの粗タンパク質抽出物の中に存在する骨形成（骨を誘導する）タンパク質の単離を可能にする精製手順が、最初に開発された（PCT  US  89/01453および米国特許4,968,590参照）。この方法の開発は、新鮮な子ウシの骨が入手可能であることと結びついて、実質的に純粋なウシの骨形成タンパク質（BOP）の単離を可能にした。BOPはその基本事項が調べられ。次にネコ、ウサギ、ラットにおいて軟骨そして最終的に軟骨内の骨の成長を誘導する能力があることが示され、研究された。さらに、それ以前には異成分から成る骨抽出物の中の未知の１つまたは複数のタンパク質によるものと考えられていた骨の形成の全発達段階を誘導できることが示された。さらにこの用量に依存しかつ非常に特異性のある活性は、このタンパク質がグリコシル化されているかいないかによらず存在した（米国特許No.4,968,958、1988年８月４日出願およびSampath他（1990）J.Biol.Chem.265:pp.13198−13205参照）。ウシの材料から得られた配列のデータは、異なる種から得られた骨形成タンパク質類を遺伝暗号化している遺伝子群を単離するために使用されたプローブのデザインに示唆を与えた。ヒトおよびネズミの骨成形性タンパク質の同等物は、すでに確認され基本項目が調べられた（例えば、米国特許No.5,011,691、Ozkaynak他（1990）EMBO  J9:2085−2093、およびOzkaynak他（1991）Biochem.Biophys.Res.Commn.179:116−123、およびUSSN841,646、1992年２月21日出願を参照。それらの開示は、参照によりここの組み入れられている。）
ウシの材料から得られた配列データはまた、骨形成に役割を果していることが知られていなかったこの分野において既知の多数のタンパク質との大きな相同性を示唆した。これらのタンパク質類を用いた骨形成の実験は、これらのタンパク質類を適当なマトリックスとー諸に哺乳動物に入れたとき、軟骨および軟骨内の骨の形成が誘導されることを示した（例えば、米国特許No.5,011,691参照）。これらのタンパク質類のうちの１つは、背−腹の分化に役割を果たすことがしられておりかつ成虫芽の正しい形態形成に必要とされるドロソフィラのタンパク質DPPである。他の２つのタンパク質は、ゼノプスおよびマウスにおいて確認された類似の配列（それぞれVglおよびVgr−１）であり、胚形成期の成長と分化の制御に役割を果たすと考えられている。DPPおよびVgr−１（またはVgr−１に類似物質）の転写体は、いろいろな組織（胚、新生児および成体、Lyons他（1989）PNAS  86:4554−4558、および下記参照）で確認されているが、母系遺伝しかつ空間的に植物内胚葉に限定されているVglの転写体は、原腸胚形成後は劇的に減少する。
これらの相同性から、マトリックスとー諸に入れられたとき哺乳動物内で骨の形態形成を誘導するために必要な活性な配列を含む、包括的な共通の配列が導き出口された。この一般配列は、少なくとも、保存された６システインの骨格（一般配列１、Seq.ID  No.1）、または任意の７システイン骨格（一般配列２、Seq.ID  No.2）を持つ。この７システイン骨格は、一般配列１で決められる６システインの保存骨格と、残基36の位置のもう１つのシステインを含み、OP2タンパク質類において確認されている付加的なシステイン残基を収容する。一般配列の中の各"Xaa"は、その位置に、天然の20のＬ−異性体のα−アミノ酸の１つまたはその１つの誘導体を入れてもよいことを示す。もっと長いやはり有効な一般配列は、さらに、それらのＮ−末端に次の配列を含む。
0003627985.tif 000007
この包括的な共通の配列から設計され生合成された構造も、軟骨および／または軟骨内の骨形成を誘導することが示されている（例えば、米国特許No.5,011,691に記載されており、かつ下記の表３に示したCOP−１、COCOP−３、COP−４、COP−５、COP−７およびCOP−16）。下記の表２は、モルフォゲンとして確認されている天然のタンパク質類の活性領域のアミノ酸配列を比較している。このようなタンパク質には、ヒトOP−１（hOP−1,Seq.ID  No.5および16−17）、マウスOP−１（mOP−1,Seq.ID  No.6および18−19）、ヒトおよびマウスOP−２（Seq.ID  No.7,8および20−22）、CBMP2A（Seq.ID  No.9）、CBMP2B（Seq.ID  No.10）、DPP（ドロソフィラ由来,Seq.ID  No.11）、Vgl（ゼノプス由来,Seq.ID  No.12）、Vgr−１（マウス由来,Seq.ID  No.13）およびGDF−１（Seq.ID  No.14）が含まれる。この表の中の３つのドットは、その位置のアミノ酸が、hOP−１のアミノ酸と同じであることを示している。３つのダッシュは、その位置にはアミノ酸が存在しないことを示しており、相同性を明らかにする目的で入れてある。例えば、CBMP−2AおよびCBMP−2Bの残基60の位置のアミノ酸は欠落している。もちろん、これらの２つのアミノ酸配列は、この領域ににおいて、Asn−Ser（残基58、59）の次に、CBMP−2AはLysおよびIleを含み、CBMP−2BはSerおよびIleを含む。
0003627985.tif 000008
0003627985.tif 000009
0003627985.tif 000010
0003627985.tif 000011
0003627985.tif 000012
0003627985.tif 000013
下記の表３は、COP1,3,4,5,7,16と各づけた６つの類似の生合成された構造のアミノ酸配列のデータの比較を示す。これらの配列はまた、米国特許No.5,011,691にも記載されている。表２におけるのと同じように、ドットはその位置にCOP−１のアミノ酸と同じアミノ酸があることを示し、ダッシュはCOP−１のアミノ酸がその位置では欠落していることを示す。
0003627985.tif 000014
0003627985.tif 000015
0003627985.tif 000016
0003627985.tif 000017
前述のアミノ酸配列の比較から明らかなように、モルフォゲン活性を保持しながら、これらの一般配列の内部でかなりのアミノ酸の変更が可能である。例えば、表２に図示されているGDF−１タンパク質の配列は、同図に示されているhOP1の配列と、約50％のアミノ酸しか同じでないが、GDF−１の配列は、hOP1配列と、70％よりも大きいアミノ酸配列の相同性を持つ。ここで、相同性は、Atlas  of  protein  Sequence  and  Structure;vol.5、Suppl.3、pp.345−362（M.O.Dayoff,ed.,Nat'l  Bio  Med.Res.Fd'n.,Washington,D.C.1979）においてDayoff他によって定義されているように、その配列内で許容される保存的なアミノ酸の変更であると定義する。
これらの配列によって示されるタンパク質のファミリーはまた、骨および軟骨以外の組織においても、組織特異な多段階発生を開始させ維持することができることが発見されている。ここに開示したような未分化の始原細胞と組み合わせたとき、モルフォゲン類と名づけたこれらのタンパク質類は、その始原細胞の増殖と分化を誘導することができる。これらの細胞の分化を方向づける適当な組織特異な信号が存在し、かつ形態形成を許容する環境において、これらのモルフォゲン類は、胚の発生期に起こる多段階の細胞および分子事象を再現して、機能組織を生じさせることができる。
これらの発展のかぎは、哺乳動物の組織のモデルシステム、すなわち軟骨内の骨形成にたいするモデルシステムの創出と、骨の組織の形態形成のために重要な多段階の事象の研究であった。このシステムを使った研究は、骨を誘導するモルフォゲン類だけでなく、組織を誘導するモルフォゲン類とそれらの活性の発見を可能にした。骨のモデルシステムを開発するために使われた方法は、現在ではこの分野においてよく知られているが、本発明のタンパク質類と組み合わせると、他の組織、例えば肝臓のためのモデルシステムを作り出すために使用できる（下記参照）。
軟骨内の骨形成のモデルシステムを使って、組織の形態形成にたいしては、形態形成する材料が置かれる局所的な環境が重要であることも発見されている。ここでの使用では、”局所環境”は、組織の構造マトリックスとその組織をとりまく環境を含むと解釈される。例えば、モルフォゲンにより刺激された細胞は、それらの増殖のために適当な固着基台を必要とするだけでなく、それらの分化の組織特異性を指示するための信号類を必要とする。これらの信号は異なる組織にたいしては異なっており、細胞の表面の標識も含まれる。さらに、新しい組織の血管形成は、血管形成を支持する局所環境を必要とする。例として骨のモデルシステムを使うことにより、標準的な試験条件下では、骨誘導性のモルフォゲン類を組織の特異性を指定するマトリックスが存在しない、バラバラの間充織に入れると、非常に高濃度のタンパク質を入れないかぎり、普通には軟骨内骨成形はおこらない。対照的に、比較的低濃度のモルフォゲンを適正に修飾された骨由来のマトリックスとー諸に入れると、完全に機能する軟骨内骨が形成される（例えば、Sampath他（1981）PNAS  78:7599−7603および米国特許No.4,975,526参照）。さらに、組織特異なコラーゲンのような構造ポリマーと、組織特異なグリコシルアミノグリカンのような組織特異の細胞付着因子群とから構成された合成マトリックスは、軟骨内の骨形成を可能にするであろう（例えば、PCT公報  US91/03603、1991年12月12日発行（WO91/18558）−−参照によりここに組み入れられている参照）。最後に、モルフォゲンと骨または軟骨にたいして特異性のある適当なマトリックス（例えば、タイプＩ軟骨を含むもの）を一緒にバラバラの間充織に移植すると、軟骨および軟骨内骨形成がおこり、骨髄および血管システムまで形成される。しかしながら、同じ組成を血管を含まない環境、例えば試験管内の培養細胞群や軟骨に特異な部位に置くと、組織の発達は軟骨の形成から先へは続かない（下記参照）。同様に、タイプ２のコラーゲンから構成される軟骨特異なマトリックスを含むモルフォゲン組成物は、生体内で非軟骨組織（例えば、ヒアリン）の形成を誘導することが期待される。しかしながら、この組成物を血管を支持している環境例えばバラバラの間充織に置くと、この組成物は、増殖しつつある始原細胞群を誘導して軟骨細胞および造骨細胞へ分化させ、最終的には骨を形成させることができる。
また組織の形態形成は、形態形成を許容する環境を必要とすることも発見されている。明らかに、一生の間再生を続ける細胞集団から構成されていない、完全に機能している健康な組織では、継続的な組織の成長を阻止する信号類が存在するはずである。したがって、細胞の成長や分化を制御する、フィードバック制御機構のような、制御機構が存在するにちがいないと考えられている。実際、TGF−βおよびMISは、両方とも、適当な濃度で存在するとき、細胞の成長を阻止することができることが知られている。さらに、骨のモデルシステムを使って、脱灰しさらにグアニジン抽出して実質的に完全に非コラーゲン  タンパク質類を除去した骨由来のキャリヤ（マトリックス）を含む骨形成デバイスは、骨誘導性のモルフォゲンと一緒に移植すると、軟骨内骨形成を許すことを示すことができる。しかしながら、骨由来のキャリヤを脱灰せず、例えば低濃度の塩の中で洗浄するだけにすると、軟骨内の骨形成の誘導は抑制される。このことは、そのキャリヤの中に、１つまたは複数の抑制因子があることを示唆している。
これらの発展のもう１つのかぎは、発達しつつある組織および成体組織におけるこれらのモルフォゲン類の広範な分布の決定であった。例えば、DPPは胚胎および発達しつつあるドロソフィラの組織で発現されている。Vglの転写体は、ゼノプスの胚胎の組織の中に確認されている。Vgr−１の転写体は、胚胎および発達しつつある脳、肺、肝臓、腎臓および頭蓋冠（皮膚骨）の組織を含むネズミのいろいろな組織で確認されている。近年、Vgr−１転写体は、成長したネズミの肺、腎臓、心臓および脳でも確認され、特に肺の中に多いことが確認された（下記参照）。
OP−１およびCBMP2タンパク質は、最初は骨モルフォゲン類として確認されたものであり、組織から作成されたcDNAライブラリの中のOP−１およびCBMP2に特異な配列を同定することにより確認されたところによれば、マウスおよびヒトの胎盤、海馬、頭蓋冠および骨肉腫の組織中に確認されている（Ozkaynakら他（1990）EMBO  J9:2085−2093およびOzkaynak他（1991）Biochem.Biophys.Res.Commn.179:116−123参照）。さらに、OP−１タンパク質は、Western  Blot分析および免疫位置決定法により確認されたところによれば、腎臓、肝臓、心臓、副腎組織、脳を含む各種の胚胎期および発達期の組織に中に存在する（下記参照）。OP−１特異の転写体もまた、胚胎期および発達期の組織の両方で、そして腎臓、膀胱および脳において最も多く、確認されている（下記参照）。OP−１はまた、胚形成期に、中葉胚を誘導する因子として存在することも確認されている（下記参照）。さらにOP−１は、付随筋細胞群の中でそれらと関係し、また成長したネズミの軟骨内骨の損傷の後に骨髄中の多能幹細胞と関係することが示されたが、このことは組織の修復ならびに再生におけるOP−１の形態形成上の役割を示している。さらに近年確認されたタンパク質GDF−１（表２参照）は、神経組織の中で確認された（Lee,（1991）PNAS  884250−4254）。
例
モルフォゲンの同定と単離
本発明において役に立つタンパク質類のなかには、当初骨誘導タンパク質として確認されたタンパク質がある。例えばOP−１、OP−２、CBMP  タンパク質や、アミノ酸配列が類似するDPP（ドロソフィラ由来）、Vgl（ゼノプス由来）、Vgr−１（マウス由来、表２および配列リスト参照）のようなタンパク質である。このファミリのメンバ−−構造的に類似するタンパク質のTGF−βスーパーファミリのいくつかのメンバーを含む−−は、それらのＣ−末端領域に実質的なアミノ酸配列の相同性がある。OP−２タンパク質類は、このファミリの他のタンパク質類と共通の保存システイン骨格に加えて、この領域に１つの余分のシステイン残基（配列表No.7および８の位置41）を持つ。これらのタンパク質類は、還元されたときは不活性であるが、酸化された同一２量体種群のとき、および他のモルフォゲン類と組み合わせて酸化されたときは活性である。
したがって、本発明のモルフォゲン類は、各Xaaが20の天然のＬ−異性体のα−アミノ酸類の１つまたはそれらの１つの誘導体を指す、包括的に表示した２種類のアミノ酸配列：一般配列１または一般配列２（Seq.ID  No.1および２）のどちらかによって記述される。このタンパク質のファミリに入る特に有効な配列群には、Vgl、Vgr−１、DPP、OP−１、OP−２、CBMP−2A、CBMP−2B、GDF−１の96−102のＣ末端残基と、それらの完全な成熟アミノ酸配列群がある。さらに、これらの一般的配列から設計された生合成構造、例えば、COP−１、COP−３−５、COP−７およびCOP−16などもまた有効である（例えば、米国特許No.5,011,691参照）。
現在までにモルフォゲン類として使用できることが確認されている配列から編集された好ましいアミノ酸配列を示す一般配列は、一般配列３（Seq.ID  No.3）および一般配列４（Seq.ID  No.4）によって記述される。これらの一般配列群は、分子間または分子内のジスルフィド結合が形成可能な７または８システインの骨格を持つこと、およびそれらのタンパク質類の三次構造に影響を及す幾つかの重要なアミノ酸類を含んでいることに注目されたい。天然に存在するタンパク質類の異なるＮ−末端群は、これらのタンパク質類の組織特異な、または他の重要な調節活性を与えていることも考えられている。
前述のアミノ酸およびDNA配列に関する情報、当業界の技術水準、および米国特許Nos.4,968,590および5,011,691、PCT出願US89/01469、公開1989年10月19日（WO89/09788）、およびOzkaynak他（1990）EMBO  J9:2085−2093およびOzkaynak他（1991）Biochem.Biophys.Res.Commn.179:116−123−−開示内容は参照によってここに組み入れられている−−が与えられているので、少なくとも本発明の１つのモルフォゲンの活性領域、その多様な類似構造（対立変異や、遺伝子工学により作られた変異形を含有する変異異種も含む）、さらには融合タンパク質類、成熟タンパク質類の端が切り取られたもの、欠落や付加による変異形、およびそれらに類似な構造、などを暗号化する多様なDNAが構成できる。さらに、DNAのハイブリッド化のためのプローブ類は、これらのタンパク質類のどれかを暗号化している遺伝子の断片−−これらにタンパク質の活性領域またはpro領域を暗号化している配列を含むもの（下記参照）−−から構成することもできるし、一般配列から新規に設計することもできる。これらのプローブは、異なるゲノムおよびcDNAライブラリをスクリーニングして、更なる組織からさらに別の形態形成タンパク質を同定するために使用できる。
このようなDNAは、この分野に習熟した者によって、ゲノムおよびcDNAの単離、合成オリゴヌクレオチドからの合成DNAの構成、カセット突然変異誘発技術などを含むよく知られたDNA操作技術を使って、作ることができる。Biosearchの8600型DNA合成器により15−100merのオリゴヌクレオチドを合成し、トリス−ホウ酸塩−EDTA緩衝液中でポリアクリルアミド  ゲル電気泳動（PAGE）により精製する。この後、DNAはゲルから電気的に溶離される。オーバーラップしたオリゴマーは、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化して、PAGEによっても精製し得るより大きなブロックに結合する。
次に適正に同定されたクローンからのDNAが単離され、サブクローン化され（好ましくは発現ベクターの中に）、そして配列決定される。対象とする配列群を含んだプラスミド群は、次に、モルフォゲンを発現させるためおよびさらに性質を調べるために、適当なホスト細胞に移入される。ホスト細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。なぜなら、前者はタンパク質をグリコシル化する能力がないので、そのタンパク質の形態形成活性を損なわないからである。便利な宿主細胞群としては、大腸菌、サッカロミセス、昆虫／バクロウイルス細胞システム、ミエローマ細胞、および多数の他の哺乳動物の細胞がある。このベクターはさらに、転写プロモーター、終止配列、エンハンサー（増強構造）、好ましいリボソーム結合部位配列、好ましいmRNAリーダー配列、タンパク質の分泌のための信号配列などを含む，組換えタンパク質の正しい発現を促進するためのいろいろ配列を含むことができる。
対象とする遺伝子を暗号化したDNA配列はまた、抑止配列であるかもしれない配列を除去するため、あるいは望ましくない二次および三次構造の形成を最小にするように操作される。この組換えモルフォゲンもまた融合タンパク質として発現される。翻訳後、タンパク質は細胞自体から精製するか、培養液から回収される。生物学的な活性なすべてのタンパク質の形は、ジスルフィドボンドによって結合されているか、または他の方法で会合した二量体種群を含む。これらは一つまたはそれ以上のいろいろな組換えポリペプチド鎖を、適当な原核細胞内または試験管内で、個々のサブユニット群を発現させた後に、リホールディングおよび酸化させて作られる。大腸菌および多数の異なる哺乳動物細胞の中で組換えDNAから発現されたモルフォゲン類に関する詳細な記述は、PCT公報US90/05903、1991年５月２日（WO91/05802）公開および米国特許願No.841,646、1992年２月21日出願−−この開示内容は参照によりここに組み入れられている−−に開示されている。
また別のやり方として、形態形成ポリペプチド鎖を、この分野において通常の技術者にもよく知られている従来のペプチド合成技術を用いて、化学的に合成することも可能である。例えば、Biosearchの固体相ペプチド合成器で、標準の操作手順を用いて、完全なタンパク質あるいは部分的なタンパク質を合成することができる。完成した鎖はつぎに保護をはずされ、HPLC（高圧液体クロマトグラフィ）によって精製される。もしそのタンパク質が部分的に合成されたものであるときは、それらの部分を、標準的な手法を用いてペプチド結合させて、完全なタンパク質を形成することができる。一般的には、モルフォゲン類の作り方は従来の方法でよく、これは本発明の一部分を構成するものではない。
モルフォゲンの分布
本発明のモルフォゲン類の、生物の全生命期間を通じての一般的な機能は、全く異なる各種の哺乳動物の組織における発現から証明できる。モルフォゲン類の組織分布の決定もまた、与えられた組織で発現される異なるモルフォゲン類を同定したり、新しい、類似したモルフォゲン類を同定するのにも利用できる。このタンパク質類（あるいはそのmRNA転写体群）は、標準的な手法または発現が少ない組織においてはそれを僅かに修正した方法を使って、異なった組織中において簡単に確認できる。例えば、タンパク質分布は、標準のWestern  Blot分析法または免疫蛍光技術と、対象とするモルフォゲンまたはモルフォゲン類に特異な抗体群を用いて、決定することができる。同じように、モルフォゲン転写体の分布は、標準のNorthernハイブリッド化プロトコルおよび転写体に特異なプローブ類を用いて決定できる。
特異的に１つの転写体とのハイブリッド化が可能で、対象とする転写体を他の類似する転写体から区別できるものであれば、どようなプローブでも使用できる。本発明のモルフォゲン類は、それらの活性なＣ−端末領域に高い相同性があるので、特定のモルフォゲン転写体の組織分布は、不成熟タンパク質のpro領域および／または成熟タンパク質のＮ−末端領域にたいして特異的なプローブを使用すると、最もよく決定できるであろう。その使用できる配列は、停止コドンに隣接しかつそれに続く3'非暗号領域である。配列中のこれらの部分は、本発明のモルフォゲン類の間で大幅に異なり、したがって各タンパク質に特有のものである。例えば、特に有効なVgr−１特異のプローブ配列は、Pvu II−Sac Iフラグメント、すなわち翻訳されないpro領域の１部分と成熟配列のＮ−末端の両方を暗号化している265bpのフラグメントである（cDNA配列の記述は、Lyons他（1989）PNAS  86:4554−4558参照）。同様に、特に有効なmOP−１特異のプローブ配列群は、BstXl−Bgl Iフラグメント、すなわちmOP−１のpro領域のほぼ2/3を含む0.68kbの配列;Stu I−Stu Iフラグメントすなわち７システイン領域のすぐ上流の0.2kbの配列；およびEar1−Pst1フラグメント、すなわち3'非翻訳配列の１部分を含む0.3kbのフラグメントである（Seq.ID  No.18参照、この配列では、pro領域は本質的に残基30−291で規定されている）。例えばhOP1（Seq.ID  No.16）またはヒトまたはマウスのOP2（Seq.ID  No.20および22）に対しても、同様のアプローチが使用できる。
これらのモルフォゲン特異なプローブ類−−合成されたものでも、クローン化された配列から得られたものでもよい−−を使うと、この分野の普通の技術を持つ人々によく知られている標準的な方法によって、哺乳動物の組織中のモルフォゲン転写体を確認できる。簡単に説明すると、成長したネズミのいろいろな組織（例えば、肝臓、腎臓、精巣、心臓、脳、胸腺および胃）から、標準的な方法、例えばChomczyaski他の方法（（1987）Anal.Biohem.162:156−159）で、下記のようにして、全RNAを用意する。オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィ（例えば、Pharmacia LKB Biotechnology社のタイプ７）を使って、ポリ（Ａ）＋RNAを用意する。各組織からのポリ（Ａ）＋RNA（通常15μｇ）を、１％のアガロース／フォルムアルデヒドゲル上で分別し、Nytran膜（Schleicher ＆ Schuell）の上に移す。移した後、そのメンブレンを80℃で焼き、紫外光線（通常1mW/cm2で30秒間）のもとでRNAを架橋させる。ハイブリッド化の前に、適当なプローブ（例えば、Pvu II−Sac I  Vgr−１フラグメント）を加熱して変性させる。ハイブリッド化は、ローラーボトル装置内でほぼ１回転／分で回転するルーサイト製のシリンダの中で、40％フォルムアルデヒド、５×Denhardts、５×SSPEおよび0.1％SDSからなるハイブリッド化ミックスを使って、37℃で約15時間行う。このハイブリッド化の後、非特異性のものは、0.1×SSPE、0.1％SDS中で50℃でフィルタ洗浄して除かれる。成熟配列の異なるＮ末端にたいして特異性のあるVgr−１プローブを使って行ったNorthern  Blots分析は、Vgr−１のメッセージが約3.5kbであることを示す。
図１は、Vgr−１特異のプローブを用いて、成長したネズミのいろいろな組織を、Northern  Blot分析で調べた結果を表す顕微鏡写真である：レーン３−10はそれぞれ肝臓、腎臓、精巣、心臓、脳、胸腺および胃を示している。レーン１と12はサイズスタンダードであり、レーン２と11はブランクである。テストした組織の中で、Vgr−１が最も多く発現されていたのは成人の肺であり、少なかったのは成人の腎臓、心臓および脳であった。これらの結果はVgr−１およびVgr−１様転写体をいくつかの成熟マウス組織で確認した以前の研究成果、（Lyonsら、（1989）PNAS  86:4554−4558）、ならびに、いろいろなヒトcDNAライブラリ類の中でOP−１およびCBMP2を確認した研究成果（例えば、胎盤、海馬、頭蓋冠、および骨肉腫組織、Ozkaynakら、（1990）EMBO9:2085−2093参照）を確認し発展させるものである。
同じプローブ探査方法を使って、図２および３に示すように、mOP−１転写体も多くのネズミ組織の芽萌およびいろいろな成長組織の中で確認されている。プローブ探査方法の詳細はOzkaynakら、（1991）Biockem.Biophys.Res.Commn.179:116−123に開示されており、ここにレファレンスとして収録されている。図２に示されているNorthern Blotsは、生後13日のマウス（パネルＡ）または５週令のマウス（パネルＢ）の成長中の脳、脾臓、肺、腎臓（および副腎）、心臓、および肝臓からのRNAをプローブ探査したものを示している。このOP−１特異のプローブは上記の3'非翻訳配列群を含んだもの（0.34kb  Earl−Pst Iフラグメント）であった。RNA回収のための対照として、EF−Tu（翻訳伸長因子）mRNA発現も測定された（EF−Tu発現はほとんどの組織で比較的均一と思われる）。
矢じり形は、種々の組織で観察されるOP−１特異のメッセージ群を示している。図２で明らかなように、OP−１発現は、脾臓、肺、腎臓および副腎組織で大幅に異なるが、これらのEF−Tu  mRNAレベルは一定である。心臓、脳、および肝臓で、一様に低いEF−Tu  mRNAレベルが観察された。顕微鏡写真に明らかに見られるように、最も高いレベルのOP−１  mRNAは腎臓および副腎、ついで脳に現れる。反対に、心臓および肝臓からは検知できる信号はなかった。膀胱組織に対して行われた追加の分析は示されていないが、OP−1 mRNA発現は高く、腎臓／副腎組織で検知されたレベルに近かった。Northern  Blots分析によれば、GDF−１、OP−１  mRNA発現は異なった組織においても同じようにbicistonicであることも示されている。異なった組織において、４つの転写体:4kb、2.4kb、2.2kb、および1.8kbの転写体が確認され、OP−１特異のプローブ類を用いて、遺伝子のpro部分とＮ−末端配列群をクロスプローブ探査した結果、これらの転写体はOP−１特異のものであることが示された。
図３のOP−１およびVgr−１の並列比較によって、これらのプローブ類が異なる組織中のモルフォゲンVgr−１とOP−１転写体を区別することがわかり、また異なる組織中のOP−１の複数の転写を浮かび上がらせることが示されている。具体的には、図３はOP−１（パネルＢおよびＤ）、Vgr−１（パネルＣ）、およびEF−Tu（パネルＡ）（対照）胎性17日（レーン１）および生後３日（レーン２）のマウスのmRNAの発現を比較したものである。OP−１特異（パネルＢおよびＤ）、Vgr−１特異（パネルＣ）、およびEF−Tu特異（パネルＡ）のラベルつきDNAプローブによる連続ハイブリッド化には同じフィルタが使われた。パネルA:EF−Tu特異のプローブ（対照）は0.4kbのHind III−Sac Iフラグメント（タンパク質を暗号する領域の一部）であり、使われたSac Iサイトはベクターに属する；パネルB:OP−１特異のプローブは0.68kbのBstX I−Bgl Iフラグメントでpro部分配列群を含むもの；パネルD:OP−１特異のプローブは0.34kbのEar I−Pst Iフラグメントで3'非翻訳配列を含むもの；パネルC:Vgr−１特異のプローブは0.26kbのPvu II−Sac Iフラグメントで上記のVgr−１の分析で使われたものである。
1.8−2.5kbのOP−１  mRNAは、生後３日のマウスでは胎性17日のものに比べて約２倍高く発現するが、これは多分骨および／または腎臓の成長の様相を反映しているものであろう。さらに、脳で認められた４つのメッセージ群では、2.2kbの転写が最も多く現れたが、肺と脾臓では1.8kbのメッセージが支配的であった。５週令マウスの腎臓および副腎組織を注意深く分離した結果、2.2kb転写群は腎臓組織から出るが、4kb  mRNAは副腎により多いことが判明した（図２参照）。
同様に、同じ一般的なプローブ探査方法を使用して、BMP3およびCBMP2B転写群が肺組織に大量にあることが最近確認された。
胎性組織中のモルフォゲン分布は、５ないし６日令のマウス胎児群ならびにモルフォゲン特異の抗血清と組み合わせた標準的な免疫蛍光分析手法を用いることによって決定することができる。例えば、ウサギの抗OP−１抗血清は、当業界で広く知られている多くの標準抗体プロトコル類のいずれかを使用すれば簡単に得ることができる。次にこの抗体に標準的な手法を用いて蛍光ラベルをつける。次に、５ないし６日令のマウス胎児を薄い切片に切り分け、ラベル付けされた抗体で各種の成長組織群を再び標準的な手法に従って探査する。こうした手法を使って、成長中の脳および心臓の中にOP−１タンパク質が検出された。
この方法は修復中の成人組織群の中のモルフォゲン類を確認するのにも使用できるであろう。例えば、ウサギの長骨例えば大腿骨に骨折部分を作る。２ないし３日、骨折が治るように放置しておく。その後、そのウサギを屠殺し、骨折部分を細かく切り分け、モルフォゲン、例えばOP−１、の存在を確認するため探査する。この探査には標準の免疫位置分析方法を利用し、蛍光ラベルを付けたウサギ抗OP−１抗血清を使用する。この手法によって、付随筋細胞群中のOP−１ならびに、筋肉、軟骨、および軟骨内骨の成長のための始原細胞群を確認する。さらに、OP−１は骨髄中に潜在する多能性幹細胞群でも確認され、それが組織の修復および再生における形態形成の役割を果たしていることが示された。
OP−１タンパク質はラットの脳の中でも、標準の免疫蛍光着色手法を用いて確認された。具体的には、成熟ラット脳（２−３月令）および脊髄を凍結し、切片に細分した。ウサギで養成し、標準的の方法によってOP−１アフィニティカラム上で精製した抗−OP−１を、これらの切片群に特定の結合をさせるために標準的な条件下で加えた。次に、OP−１抗体が組織の切片に結合しているのを視覚できるように、蛍光ラベルを付したヤギの抗−ウサギIgGを使用した。
図4Aおよび4Bに見られるように、免疫蛍光着色によってOP−１が成熟ラットの中枢神経系（CNS）に存在することがわかる。同様の、より広範な着色が脳（4A）および脊髄（4B）の両方に認められる。OP−１は主として灰白質の細胞外マトリックスに局在し、ニューロン細胞体群を除くすべてのエリアに存在する。白質部分では、着色は星状神経膠細胞群に限られている。同様の着色パターンは新生ラット（10日令）の脳の切片中にも認められる。
細胞の分化
本発明のモルフォゲン類の細胞分化能力は、若い間充織細胞群をモルフォゲンの存在下で培養し、培養した細胞群をトルイジンブルーで着色し、その細胞を組織学的に研究することによって確定することができる。例えば、下顎骨に成長することになっているラットの間充織細胞群を、ステージ11で、上にかぶさっている上皮細胞から切り離し標準的な組織培養条件で試験管で培養すると、分化は継続しない。しかしながら同じ細胞群をあと１日、上にかぶさっている内胚葉に接触したままにしておくと、この時にはステージ12の細胞群になっているが、これらの細胞群は試験管内でも軟骨細胞群を形づくるように分化を続ける。さらに造骨細胞群への分化、そして最終的に、下顎骨に分化するためには適当な局所環境、例えば血管形成の環境、が必要である。
モルフォゲン、例えばOP−１、の存在下で試験管内で培養されたステージ11の間充織細胞群は、試験管内で軟骨細胞群を形づくるように分化をし続けることがすでに発見されている。これらのステージ11細胞群はまた、もし上を覆っている内胚葉細胞群から取り出された細胞産生物群とともに試験管内で培養されれば、試験管内で分化をし続ける。そのうえ、OP−１は、内胚葉細胞群で調整された媒体の中に、Western  Blot法または免疫蛍光法のいずれかで確認することができる。この実験は、異なるモルフォゲン類の細胞分化能力を評価したり、異なる成長組織群内でのそれらの分布を調べるために、その他のモルフォゲン類ならびに異なる間充織細胞群を使って行うことができる。
モルフォゲン誘導の細胞分化のもう一つの例として、神経細胞群の分化に対するOP−１の効果が培養でテストされた。具体的には、NG108−15の神経芽腫×神経膠腫ハイブリッドクローン化細胞系統に対するOP−１の効果の評価が行われた。この細胞系統は培養中、線維芽細胞的な形態形成を示した。この細胞系統は、0.5mMのブチレート、１％のDMSOまたは500mMのフォルスコリンを使い化学的に分化の誘導が可能で、培養された一次神経のほとんどすべての重要な神経特性の発現が誘導される。しかしながら、これらの細胞の化学的誘導は細胞分裂の終止も同時に誘導する。
本実験において、NG108−15細胞は、ポリ−Ｌ−リシンでコートされた６穴プレート群で継代培養された。それぞれの穴には40−50,000個の細胞群が2.5mlの化学的に規定された培養液の中に入っている。３日目に0.025％のトリフルオロ酢酸を含む60％エタノール中に入れた2.5μｌのOP−１をそれぞれの穴に加えた。０、１、10、40および100ng/mlのOP−１濃度でテストが行われた。培養液は毎日OP−１の新しいアリコートに取り替えられた。40および100ng/mlのOP−１濃度のものは４日後に、OP−１がNG108−15細胞群の分化を誘導した。図５はそこで起こった形態形成変化を示す。OP−１は細胞群の凝集および環状化ならびに神経突起の形成（プロセス）を誘導した。図５（純NG108−15細胞）と図5Bを比較すると、OP1処理された細胞群の効果がわかる。このようにして、OP−１は細胞群が神経細胞形態形成へ分化してゆくのを誘導することができる。いくつかの神経突起群はシナプス型の結合部へと接合してゆく。この効果は１−100ng/ml濃度のTGF−B1で培養された細胞群では見られなかった。
OP−１の神経防御効果は、NG108−15細胞群に対する化学的分化用薬剤類との比較で示された。50,000個の細胞群が６穴プレート上で培養され、ブチレート、DMSO、フォルスコリンまたはOP−１で４日間処理された。細胞数のカウントによって、化学薬剤類を含んだ培養液の中では、分化が細胞分裂の終止を伴うことが示された。対照的に、OP−１で分化が誘導された細胞群は、H3チミジンの摂取で確認されるとおり、分裂を続けた。このデータはOP−１が、分化の後培養中の細胞群の安定性を維持する能力のあることを示唆するものである。
さらに関連するもう一つの例として、本発明のモルフォゲン類の、変換細胞群の”再分化”を誘導する能力についても評価が行われた。具体的には、OP−１のヒトEC細胞群（胎生癌細胞群、NTERA−Z CL.D 1）に対する効果をここに開示した。外部からの刺激がない状態で、これらの細胞群は未分化の幹細胞群として維持され、無血清培養液（SMF）の中で成長が誘導された。モルフォゲン処理がなされない場合、これらの細胞群は勢いよく増殖し、固定源は無関係であった。モルフォゲン処理の効果は図6A−Ｄに示されている。図6Aおよび6Bは、SMF中における４日間の成長を示すもので、OP−１が存在した場合（25ng/ml、6A）またはモルフォゲンが存在しない場合（6B）である。図6Cおよび6Dは、５日間の成長を示すもので、10ng/mlのOP−１が存在した場合（6C）とモルフォゲンが存在しない場合（6D）である。図6Cおよび6Dは図6Aおよび5Bに対し、10倍および20倍の拡大率である。OP−１の存在下では、EC細胞は偏平細胞群に成長し、固定源依存性となるのがよくわかる。さらに、成長率は約10分の１に減少する。最後に、それらの細胞群の分化は誘導された。
表現型の維持
本発明のモルフォゲン類はまた細胞の分化された表現型を維持するのにも使われる。この形態形成能力は特に、静止または老衰細胞群の中で、表現型の継続的な発現を誘導するのに有用である。
モルフォゲンの表現型維持能力は簡単に評価することができる。試験管の中で、標準培養条件下で多段階の過程を経過した後、多くの分化された細胞群が静止または老衰する。しかしもし、これらの細胞群が本発明のモルフォゲンの１つと一緒に試験管の中で培養されると、その細胞群は多段階の過程中、彼らの表現型の発現を維持するように誘導される。たとえば、培養された造骨細胞群のアルカリ性ホスファターゼ（燐酸酵素）の活動は、培養された骨肉腫細胞群や頭蓋冠細胞群と同じように、試験管の中では多段階の過程を経た後は大幅に減少する。しかしながら、もしそれらの細胞群がモルフォゲン（たとえばOP−１）の存在下で培養されると、アルカリ性ホスファターゼの活動性は長期間にわたって維持される。同じように、筋細胞群の表現型発現もまたこれらモルフォゲンの存在によって維持される。この実験は、異なったオリジンの細胞群に対する異なったモルフォゲン類の表現型維持能力を評価するために、その他のモルフォゲン類および異なった細胞群を用いて実施することができる。
表現型維持能力はまた生体でも、骨粗しょう症のためのラットモデル、すなわち1991年８月30日出願のUSSN752,857、審査中、に開示されているもので、ここにレファレンスとして収録、を使用して評価することができる。そこで開示されているように、Long  Evansラット群を、発情ホルモンの産生減少で骨粗しょう症の状態にするため、卵巣摘出を行う。卵巣摘出の８日後、ラット群に全身的に燐酸緩衝生理食塩水（PBS）またはOP−１（21μｇまたは20μｇ）を22日間与える。しかる後ラット群を屠殺し、血清アルカリ性ホスファターゼのレベル、血清カルシュームレベル、血清骨カルシンレベルを、標準的な方法で測定する。OP−１を１または20μｇ与えたラット群では３倍高いレベルの骨カルシウムが認められた。アルカリ性ホスファターゼレベルもまた増加しているのが認められた。けい骨骨幹における組織形態計量分析でOP−１は、エストロジェンレベルの低下による骨質量損を減らせることが判明した。
細胞にたいする刺激
本発明のモルフォゲン類が始原細胞群の増殖を刺激する能力もまた簡単に試験管内で評価することができる。有用な純幹細胞群としては、多分骨髄またはへそ帯血液から標準的な方法で単離される多能性幹細胞群、（たとえば、Faradjiら、（1988）Vox  Sang.55（３）:133−138またはBroxmeyerら、（1989）PNAS  86（10）:3828−3832参照）、ならびに血液から得られる純幹細胞群がある。あるいは、胎生細胞群（たとえば、培養された中胚葉細胞系統からの）も有用である。
始原細胞群を得るもう一つの方法ならびにモルフォゲン類の細胞増殖を刺激する能力を測定する方法は、始原細胞群を生体ソースから捕まえることである。たとえば、移入始原細胞群が流入できるような生体適合性のあるマトリックス材料を、生体中のあるサイトに始原細胞群の流入を許すぐらい長時間移植する。たとえば、骨由来のグアニジン抽出のマトリックスを、たとえばSampathら（（1983）PNAS80:6591−6595）、または米国特許No.4,975,526に開示されている方法で作り、ラットの皮下部位に、基本的にはSampathらの方法（同上）に従って移植する。３日後移植物を取り除くと、マトリックスと一緒にあった始原細胞群は拡散され、培養される。
次に、どのようにして得た始原細胞群も、想定されるモルフォゲンとともに、当業界の普通の技術者にも公知の標準的な細胞培養条件で、試験管培養をする。外部からの刺激がない状態では、その始原細胞群は増殖しないか、あるいはその培養液の中で最低限の増殖をする。しかしながら、もしその細胞がOP−１のようなモルフォゲンの存在下で培養されると、増殖するように刺激される。細胞の成長は視覚的に確認するか、または公知の標準的な方法を用いて分光光度法で測定することができる。
始原細胞集団の増殖
始原細胞群は、生体内または生体外で、増殖するように刺激することができる。これらの細胞群は、個体的にモルフォゲンを含んだ滅菌処方品を注射もしくは他の方法で与えることによって、生体内で刺激することができる。たとえば、個体の造血性の多能性幹細胞群数は、個体の骨髄に適当な濃度のモルフォゲンを注射か何かで与えることによって、増殖するように刺激することができる。
増加させたい始原細胞個体群にモルフォゲンを、滅菌状態下で、細胞群の増殖を刺激するのに十分な濃度と時間接触させることによって、始原細胞群を生体外で刺激することができる。一般的には、約10分間から約24時間の期間で充分である。この後、刺激されたこれら細胞群を個体に、たとえば、適当な生体の遺伝子座に、注入する。生体適合性のある適当な始原細胞群は、公知の方法もしくはここに述べた方法のいずれかで得ることができる。
損傷したまたは病気にかかった組織の再生
本発明のモルフォゲン類は、ほ乳動物の疾病もしくは損傷した組織の再生に用いることができる。再生しようとする組織は、好ましくは鑑定評価し、必要に応じて、過度のえ死性もしくは干渉しそうなはん痕組織を外科的、化学的、切除あるいはその他医学的に公知の方法で除去する。
しかる後、モルフォゲンを無菌で生体適合性のある組成物の一部として、直接組織遺伝子座に外科的移植法もしくは注射により与える。あるいは、モルフォゲン刺激を受けた始原細胞群を含む無菌の生体適合性のある組成物を組織の遺伝子座に与える。その遺伝子座に存在する組織は、病んでいたり損傷していても、始原細胞群の増殖および組織特異の分化をさせるための適当なマトリックスとなり得る。さらに、損傷したもしくは病んでいる組織の遺伝子座は、特に外科的手段でさらに傷められたものであっても、形態形成を許容する環境を与える。組織によっては、モルフォゲンを全身的に与えれば十分なこともある。
状態によっては、特に組織の損傷が広範な場合、その組織が細胞の流入および増殖に十分なマトリックスを提供できないことがある。このような場合には、モルフォゲンもしくはモルフォゲン刺激をした始原細胞群を、下記のいずれかの方法で作られた生体適合性のある適当な調整マトリックスとともに、組織の遺伝子座に与える必要がある。このマトリックスは、組織特異性で生体内で生物分解性があり、かつ70−850μｍ、最も好ましくは150−420μｍ、の範囲の大きさの粒子群で構成されているものが望ましい。
本発明のモルフォゲン類はまた、ケガのあとのはん痕組織の生成を防止もしくは実質的に生成させないようにするためにも使うことができる。もしモルフォゲンが新たに傷ついた組織の遺伝子座に与えられると、移入線維芽細胞の未分化の接合組織への集結を防止しながら、その遺伝子座に組織の形態形成を誘導することができる。このモルフォゲンは、ケガの後５時間以内に、無菌の医薬品処方としてその遺伝子座に注射によって与えることが望ましい。異なる組織に対するモルフォゲン類の再生能力を示す、いくつかの発明を限定しない事例をつぎに紹介する。本発明のプロテイン類は軟骨および軟骨内骨成形を誘導する能力があることを以前に示した（たとえば、米国特許No.5,011,691）。
一つの例として、部分的な肝切除後のかなり傷ついた肝臓組織のプロテイン誘導の形態形成が開示されている。この一般的なプロトコルの変型はその他の異なる組織群におけるモルフォゲン活性をテストするのにも使用できる。この一般的な方法には、組織の中の基本的に再生しない部分を切除すること、モルフォゲンを好ましくは溶解性の医薬品処方として、切除した組織の遺伝子座に与えること、キズをふさぎ、そのサイトを後日調べること、が含まれる。骨や肝臓のようなものは、胎児の段階以後は、キズついたあと再生する能力を潜在的に有している。
モルフォゲン、（たとえば、成熟形の精製組み換えヒトOP−１）を0.1％のトリフルオロ酢酸（または同等の酸）を含む50％エタノール（または同等の溶剤）に溶解させた（1mg/ml）。OP−1/溶剤−酸の貯蔵溶液１部を、滅菌したPBS（燐酸緩衝生理食塩水）に0.2％のラット血清アルブミンを溶解させたもの９部で希釈して、注射可能なOP−１溶液が作られた。
成長しつつあるラット群または成熟したラット群を、ケタミンを使って麻酔させた。２つの肝臓葉（右および左）を切除し（各葉の約1/3）、それぞれの切断端に沿った複数のサイトにOP−１を局所的に注射した。注入したOP−１の量は、100μｇを100のPBS/RSA（燐酸緩衝生理食塩水／ラット血清アルブミン）注射緩衝液に入れたものであった。プラシーボサンプル類にはOP−１を入れない注射緩衝液を使用した。それぞれのグループには５匹ずつのラット群を使用した。傷をふさぎ、ラット群は通常の餌を食べられるように、また水道水を飲めるようにした。
12日後、それらのラット群を屠殺し、肝臓の再生を目視観察した。図７の顕微鏡写真は、肝臓再生に関するOP−１の劇的な効果を示している。OP−１注入グループは完全な肝臓組織再生を示し、肝臓の中に切り傷跡はなんら残っていなかった（動物２）。対照的に、PBSだけを注射したコントロールグループではごく僅かの再生だけが認められた（動物１）。さらに、このグループのサンプルには切開した跡が残っていた。
もう一つ別の例として、本発明モルフォゲン類の象牙質形成を誘導する能力も評価された。今日、歯科医療の分野においては歯髄組織のキズに対する予期せざる反応が治療上の根本的な問題である。
他の下等な非霊長類ほ乳動物類をベースとしたモデルよりも、猿がヒトの歯科生理学により近い指標になると思われることから、シノモルグス猿が霊長類のモデルとして選ばれた。
標準的な歯の外科的手順によって、サンプルの歯の髄のすぐ上のエナメル質および象牙質を（ドリリングによって）取り除き、歯髄の小さな面積（たとえば、2mm）を外科的に露出させ、歯冠側の髄組織を部分的に切断して、止血を誘導しながら、髄の処理、穴の仮封および充填を標準的な手順で行った。
使われた髄処理は：キャリヤマトリックスにOP−１を分散させたもの；キャリヤマトリックスだけで無処理のもの。１匹12本の歯（それぞれの処理に４本ずつ）を用意し、２匹の猿を使用。４週間後に、歯を抜き取り象牙質の生成状況を分析するために組織学的に処理、および／または象牙質の無機質化を分析するためにすりつぶした。図８はモルフォゲンの骨様象牙質修復の劇的な効果を示している。図8Aは対照処理（PBS）の顕微鏡写真で、修復はほとんど無いか全く見られなかった。図8Bはキャリヤだけの場合の顕微鏡写真で、最少の修復を示している。対照的に、モルフォゲン処理のもの（図8C）はかなりの修復を示した。図８の結果は、外科手術的に露出された健康な歯髄群に対し、確かにOP−１−CM（OP−１にキャリヤマトリックスを加えたもの）が修復的ないしは骨様象牙質ブリッジの形成を誘導したことを示している。対照的に、キャリヤマトリックスだけで処理したもの、または処理しなかったものは、修復象牙質の形成はなかった。
もう一つの例として、中枢神経系（CNS）の修復に対するモルフォゲン誘導の再生効果をラットの脳窄刺モデルを使って評価することができる。要約すれば、雄のLong  Evansラット群に麻酔をかけ、頭部手術の準備をする。頭蓋冠を標準的な外科手術手順で露出し、0.035Kのワイヤを使ってそれぞれの脳葉の中心に向かって穴を、ちょうど頭蓋冠を突き通すようにあける。モルフォゲン（OP−１、25μｌ）またはPBSのいずれかを含んだ25μｌの溶液を、ハミルトンシリンジを使ってそれぞれの穴に入れる。溶液は表面から約3mmの深さまで、つまり下にある皮膚、脳梁および海馬の中まで入れる。そのあと皮膚を縫合し、動物を回復させる。
手術の３日後、ラット群は断頭により屠殺し、それらの脳をセクションに切り分けた。はん痕組織形成の程度を定性的に測定するために、グリア原線維酸性プロテインに対する免疫蛍光着色法で評価した。グリア原線維酸性プロテインは神経膠はん痕に関するマーカープロテインである。切り分けたセクション群について、OP−１の存在を確認するために抗−OP−１抗体でプローブ探査もした。モルフォゲンで処理した動物検体群の切片中のグリア原線維酸性プロテインのレベルが低いことは、モルフォゲンが神経膠はん痕形成を抑止する能力を証明するものであり、それによって神経の再生を刺激することになる。
モルフォゲンの活性の調節
本発明のモルフォゲン類に対する抗体群は健康なヒトの血清で確認されている。さらに、モルフォゲン類（たとえば、OP−１）を含んだ移植用デバイス類が、抗−モルフォゲン抗体（たとえば、抗−OP−１抗体）の増加を誘導するために、すでに発見されている。これらの抗体群は、生体内におけるモルフォゲン活動力に対する生体規制の一部分を構成するものと考えられる。抗体群の存在ならびにそれらのレベルの変動は簡単にモニターすることができ、それらは組織の均衡ならびに組織の生存度をモニターするための有用な方法を提供してくれることになる（たとえば、病理学的な状態の確認）。たとえば、標準の放射免疫定量法あるいはELISA法で血清中の内因性抗−モルフォゲン抗体を検知し定量することができる。抗−モルフォゲン抗体類を検知できる抗体群あるいはその他の拘束性プロテイン類は標準的な方法により得ることができる。
マトリックスの調整
本発明のモルフォゲン類は、生体適合性のある、好ましくは生体中で体内分解性のある適当に修飾されたマトリックス中に分散されて外科的に移植される。マトリックスは、中にモルフォゲンを分散させるためと始原細胞群の移入、分化および増殖をさせるための構造を与えるためである。マトリックスはまた、基本的に成長抑止信号類を含まないもので、分化する細胞群に組織特異性を方向付けるための信号類を与え、同時に形態形成を許容する環境を与えられるものでなければならない。
これらの特性を備えたものでなければ、そのマトリックスは形態形成用組成物の部分としては適当なものではないことになる。骨成形用デバイス類（調整したマトリックス内にモルフォゲン類を分散したもの）に関する最近の研究において、ポリ酪酸およびまたはポリグリコール酸バイオポリマー類、セラミックス類（トリ−カルシウム−フォスフェートの一つ）、またはヒドロキシアパタイトなどから作られたマトリックス類は、それ自体、ラット類に新たな軟骨内骨成形を誘導する適当な環境を与えることができないものであることが判明した。さらに、市場で入手できる高度に精製された再構成されたコラーゲン類または天然物から作られた種特異のコラーゲン類（たとえば、ラットの尾の腱からの）で構成されたマトリックス類もまた骨原性プロテインとともに移植したとき骨成形を誘導することができなかった。これらのマトリックス類は明らかに、モルフォゲンに刺激され分化する始原細胞群の組織特異性の方向付けを助ける、特定の構造関連特性が欠如している。
調整されたマトリックスは、想定される手術で望まれるような形に作られたり、手術の最中に医者や技師によって必用な形に作ることができる。このようにこの材料は、組織を修復したり、新たにその成長を誘導するために、局所的、皮下、腹膜組織内、あるいは筋肉内の移植用に使用される。このマトリックスは生体内で生物分解性があるもの、つまり体に徐々に吸収されかつ新しい組織成長に、移植した形ないしはそれに近い形で、置きかえられるものが望ましい。
本発明に有用なマトリックス類の作り方および使用方法の詳細を次に説明する。
組織から作るマトリックス類
適切な生体適合性、生体内分解性のある無細胞性マトリックス類は天然の組織から作ることができる。組織の細胞性の非構造性成分を実質的に抽出するために、その組織を適当な薬剤類で処理する。この薬剤類は、その組織に関与している成長抑止成分も同時に抽出できるものでなければならない。こうしてできたものは、多孔性、無細胞性の、非構造性成分が実質的に取り除かれた、マトリックス類である。
このマトリックスはさらに薬剤類で処理し、マトリックスの孔および表面の微細なくぼみの数を増やすような修飾をすることができる。当業界の熟練技術者であれば、種々の組織の非構造成分の抽出に最適の薬剤類を選択する方法を知っている。たとえば、肝臓や肺のような柔らかい組織類であれば、薄く切り分け、組織の細胞性構造を破壊し非構造性成分群を抽出するために、たとえば100％エタノールのような無極性の溶剤にさらす。次に、この材料を乾燥し粉末に砕き、非付着性の多孔性粒子群を得る。コラーゲンが主成分であるような軟骨や象牙質のような構造性組織の場合は、基本的にはSampathらの方法（（1983）PNAS80:6591−6595）に準拠して、脱塩し、グアニジンで抽出をする。たとえば、粉末化され脱塩された象牙質は、５溶の4Mグアニジン−塩酸、50mMTris−塩酸を使用して、pH7.0、４℃で16時間抽出する。次にこの懸濁液をろ過する。残った不溶解分を回収し、マトリックスを作るために使用する。この材料はほとんどコラーゲン状のものである。これは形態形成能力に欠けるものである。このマトリックス粒子群をさらにコラーゲンの原線維修正薬剤で処理し、望ましくないと考えられる成分群をマトリックスから抽出すると同時にマトリックス材料の表面構造を変える。有用な薬剤類は酸類、有機溶剤類または加熱した水溶性溶媒である。これらのマトリックス処理の詳細は、米国特許No.4,975,526およびPCT広報US90/00912、1990年９月７日発行（WO90/10018）に開示されている。
現在最も好ましいとされている薬剤は、マトリックスの粒子表面積および多孔度を増加させるための、水のような加熱した水溶性の原線維修正溶媒である。現在最も好まれている水溶性溶媒はpH約4.5以下、たとえば、加熱前のコラーゲンが”膨潤”するのを助けることができるようなpH2−pH4の範囲、のものである。0.1％の酢酸、pH約3,が現在最も好まれている。0.1Mの酢酸も使用可能である。
種々の量の脱脂、脱塩、グアニジン抽出された骨コラーゲンを、水ジャケット付きのガラスフラスコ中のコンスタントに撹はんしながら、水溶性溶媒（1gマトリックス/30ml水溶液溶媒）の中で、加熱し、所定時間一定温度に保つ。処理時間としては１時間程度が好ましいが、0.5から２時間の間であればよい。採用する温度は37℃から65℃の範囲で一定に保つ。現在好まれている加熱処理温度は約45℃から60℃の範囲内である。
この熱処理の後、そのマトリックスは濾過、洗浄、凍結乾燥され、移植用に使われる。酸性の水溶性溶媒が使われたときは、そのマトリックスは洗浄、凍結乾燥の前に中和される。現在好まれいてる中和用の緩衝液は、pH7.0の200mM燐酸ナトリウム緩衝液である。マトリックスを中和するため、マトリックスは熱処理の後まず冷却され、酸性水溶性溶媒（たとえば、0.1％酢酸）が除去され、中和緩衝液に置き換えられ、約30分間そのマトリックスを振動する。そして中和緩衝液を除去し、マトリックスを洗浄し、凍結乾燥する。
その他の有用な原線維修正処理としては、酸処理（たとえば、トリフルオロ酢酸および弗化水素）、ならびにジクロロメタン、アセトニトリル、イソプロパノール、クロロフォルムなどの溶剤ならびに特定の酸／溶剤の組み合わせによる溶剤処理がある。
原線維修正薬剤に接触させた後、処理されたそのマトリックスから残っている抽出成分群を除去するために、下記の手順に従って、洗浄する：
1.マトリックス調整品をTBS（Tris緩衝生理食塩水）中に懸垂し、４℃で２時間撹はんする；またはpH7.0の6M尿素、50mMTris−塩酸、500mM塩化ナトリウム溶液（UTBS）または水の中で、30分間（pHを中和するのに必要とされる充分な時間）室温（RT）で撹拌し、
2.遠心分離および、洗浄ステップをくりかえし、
3.遠心分離し、上澄み液を捨て、残留物を水洗し、凍結乾燥する。
合成の組織特異性マトリックス類
上述の天然物からの組織特異性マトリックスに加えて、有用な組織特異性マトリックスを合成によって、もし適正に修飾されるならば、作ることもできる。これらの多孔性で生体適合性があり、生体中の体内分解性を備えた合成マトリックス類が、PCT広報US91/03603、発行1991年12月12日（WO91/18558）に開示されており、ここにレファレンスとして収録した。要約すれば、そのマトリックスは、生体適合性、体内分解性のあるコラーゲンならびに、組織特異性の細胞付着用因子群としての組織特異性のグリコサミノグリカン類の適当なものとの、多孔性架橋構造性ポリマーを含んだものである。不溶性コラーゲン、酸に可溶のコラーゲン、中性または塩基性水溶液に可溶のコラーゲン、市場で入手可能なコラーゲン類などを含めて、いろいろなソースからのコラーゲンがこれらの合成マトリックス類として使うのに適当であろう。
グリコサミノグリカン類（GAGs）またはムコ多糖類は動物起源のヘキソースアミンを含んだ多糖類で、組織特異の分布を有しており、したがってモルフォゲンに刺激された分化細胞群の組織特異性の決定を助けるために使うことができる。GAGsとの反応性はまたコラーゲンにもう一つ別の重要な特性、すなわち、動物宿主からの免疫反応（異物に対する反応）を誘発させない能力、を与えることになる。
化学的には、GAGsは、グリコシド結合し、幾らか規則的にヘキソウロン酸またはヘキソース部分のどちらかと入れ替わっているヘキソースアミン類から構成されている（例えば、DodgsonらCarbohydrate Metabolism and its Disorders（編集Dickensら）vol.1、Academic Press（1968）参照）。有用なGAGsには、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリンサルフェート、コンドロイチン６−サルフェート、コンドロイチン４−サルフェート、デルマタンサルフェート、およびケラチンサルフェートがある。その他のGAGsもここに述べたマトリックスを作るのに適しており、当業界の熟練者はその他の適当なGAGsを知っているか、あるいは通常の実験操作を使うだけでそれらを確認することができる。ムコ多糖類のさらに詳細な記述は、Aspinall、Polysaccharides、PergamonPress、Oxford（1970）を参照されたい。たとえば、米国特許出願No.529,852に開示されているように、コンドロイチン６−サルフェートは軟骨内骨成形が要求されるところに使用できる。一方、ヘパリンサルフェートは肺組織の修復用のマトリックス類を作るのに使用できる。
コラーゲンは、水溶性の酸性溶液、好ましくは希釈された酢酸の中で、GAGと反応させることができる。コラーゲンの水性分散液にGAGを滴下すると、GAGに被覆され、絡まったコラーゲン線維の共沈物ができる。この絡まった線維のかたまりをホモジナイズと、微細な線維群の均一な分散液とし、ついで、ろ過および乾燥する。
コラーゲン−GAG組成物の不溶解性はこれらの材料を共有架橋結合させることによって望ましいレベルまで上げることができ、これはまたこれらの材料の再吸収に対する抵抗性を上げることにも役立つ。一般的には、脱水サーマルプロセスによる架橋が好まれるが、コラーゲンの架橋に適する共有架橋方法であれば、いずれの方法もこれらの複合材料の架橋にも適する。
乾燥したとき、架橋された粒子は基本的に球状であり、直径約500μｍである。走査電子顕微鏡によれば、表面の孔は約20μｍで、内部の孔は約40μｍである。内部は線維状およびシート様両方の構造物群からなっており、細胞付着用の表面を提供している。空隙部は内部でつながっており、細胞群が粒子の内部のどこにでもアクセスできるようになっている。この材料の空隙容積はほぼ99.5％であり、ミクロキャリヤのグラム単位あたりの潜在的な細胞の質量、これは成長してゆくものであるが、という観点からは、極めて効率的な材料となっている。
ここに述べてきたモルフォゲン類は、下記のいずれかの方法を使って、適切に修飾された組織特異のマトリックスと組み合わせ、そしてその中に分散させて使用することができる：
1.エタノールによる沈降
グアニジン−塩酸に溶解させたモルフォゲン中にマトリックスを加える。サンプルははげしく撹はんし、低温でインキュベートする。サンプルはその後さらに渦巻撹はんされる。この混合物に冷純エタノールを加え、撹はん、インキュベートする。遠心分離（高速のミクロ遠心分離）の後、上澄み液を捨てる。マトリックスは冷濃縮エタノールにより水の中で洗浄し、そのあと凍結乾燥する。
2.アセトニトリル３弗化酢酸による凍結乾燥
この手順において、アセトニトリル３弗化酢酸にモルフォゲンを入れた溶液（ACN/TFA）をキャリヤ物質に加える。激しくサンプルを何度も攪はんし、そのあと凍結乾燥する。
3.緩衝生理食塩水凍結乾燥
生理食塩水に入れたモルフォゲン調整物もまたマトリックスとともにはげしく攪はんし、形態形成的に活性な物質を得るために凍結乾燥する。
生物学的評価
本発明のモルフォゲン類および形態形成用組成物の、生体内における形態形成の有用性を評価するための種々の方法を次に示す。これらのプロテイン類および組成物類は、数多くの公知の方法のいずれかに従って、ほ乳動物に注射もしくは外科的に移植される。たとえば、外科的移植の生物学的評価は基本的にはSampathらの方法（1983）PNAS80:6591−6595に準拠して行う。
組織学的評価
生体内における形態形成の程度を調べるためには、特に組織の修復の手順においては、組織学的な切り分け（セクショニング）および着色が好ましい。切りとられた移植物はBounis溶液中に固定され、パラフィンに埋め込まれ、６−８μｍのセクション群に切り分けられる。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン／エオシンによる着色によって新しい組織の最終的な発達が明確に示される。移植物が新しく誘導された組織を含んでいるかどうか認定するためには通常12日間の移植で十分であるる
移植が成功する場合、誘導組織の発達ステージを通して、コントロールされた進展を示すため、起こっている組織特異の事象群を確認し追跡することができる。たとえば、軟骨内骨成形に含まれるステージは：（１）１日目に白血球；（２）２日目および３日目に間充織細胞の移入および増殖；（３）５日目および６日目に軟骨細胞の出現；（４）７日目に軟骨マトリックスの生成；（５）８日目に軟骨の石灰化；（６）９日目および10日目に血管の侵入、造骨細胞群の出現、および新しい骨の生成；（７）12日目から18日目にかけて造骨細胞および骨のリモデリングがあらわれ、移植したマトリックスが溶ける；（８）21日目に小骨の中で造血性の骨髄分化、が含まれる。
生物学的標識類
組織学的評価に加えて、生物学的標識類も組織の形態形成のマーカーとして使うことができる。有用なマーカーとしては、組織特異の酵素類があり、移植物を均質化した後、それらの活動を評価分析（たとえば、分光光度計測定によって）する。これらの評価分析は、移植物を動物から取り除いた後に、迅速に定量ならびに組織形成の推定をするのに有用である。たとえば、アルカリ性ホスファターゼの活動を骨形成におけるマーカーの一つとして利用することができる。
全身的に与えられたモルフォゲン類はタグをつけた（たとえば、放射線でラベルをつけて）モルフォゲン類を使って追跡し、新しい組織の中でのそれらの局在を確認したり、および／または循環系統からそれらが消失するのを、標準の脈拍追跡標識プロトコールを利用してモニターする。このモルフォゲンはまた、組織特異の分子タグと一緒に与えることもでき、その取り込みをモニターしたり、与えられたモルフォゲン濃度との相関性をみることができる。一つの例として、雌のラット群の卵巣除去は、結果として骨のアルカリ性ホスファターゼの低下を招き、それらのラット群を骨粗しょう症に向かわせた。もしこれらのラット群に今度はモルフォゲン、たとえばOP−１を与えると、カルシウム（Ca2＋）の全身的濃度の低下がみられ、これらは与えられたモルフォゲンの存在と相関し、アルカリ性ホスファターゼ活性の増加との対応がみられる。
本発明の精神または基本的な特性から逸脱せずに本発明を別の特定の形で実施することが可能である。本発明の実施例はしたがって、すべての点において説明のためのものであり、本発明を制限するものではない。発明の範囲は前述の説明にではなく、付帯の請求項に示されており、したがって、あらゆる変更で請求項の意味および同等の範囲に入るものはすべて、それらの請求項の範躊に入るものとみなす。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）特許出願人：コーヘン，チャールズ  エム．クベラサンパス，
サンガベルパン，ロイ  エッチ．エル．オッパーマン，
ハーマン  リューガー，デイビッド  シー．
（ii）発明の名称：タンパク質によって誘導される形態形成
（iii）配列の数:23
（iv）連絡先：
（Ａ）所：テスタ，ハーウィツ  ＆  チボールト
（Ｂ）街:53  ステート  ストリート
（Ｃ）市：ボストン
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:02109
（ｖ）コンピュータで読取り可能な形式：
（Ａ）媒体：フロッピー  ディスク
（Ｂ）コンピュータ:IBM  PC  互換機
（Ｃ）オペレータティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn
レリース  No  1,
バージョンNo  1.25
（vii）先出願データ
（Ａ）出願番号:US  667,274
（Ｂ）出願日:1991年３月11日
（vii）先出願データ
（Ａ）出願番号:US  752,764
（Ｂ）出願日:1991年８月30日
（２）SEQ  ID  No:1に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称：ー般配列１
（Ｄ）その他の情報：各Xaaは天然に存在する20のＬ−異性体α−アミノ酸のうちの１つまたはその１つの誘導体を示す。
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:1
0003627985.tif 000018
（２）SEQ  ID  No:2に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称：ー般配列２
（Ｄ）その他の情報：各Xaaは天然に存在する20のＬ−異性体α−アミノ酸のうちの１つまたはその１つの誘導体を示す。
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:2
0003627985.tif 000019
（２）SEQ  ID  No:3に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称：ー般配列３
（Ｄ）その他の情報：各Xaaは、この明細書中に示したような、１つまたは複数の指定されたアミノ酸のグループから、独立に選択される。
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:3
0003627985.tif 000020
（２）SEQ  ID  No:4に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称：ー般配列４
（Ｄ）その他の情報：各Xaaは、この明細書中に示したような、１つまたは複数の指定されたアミノ酸のグループから、独立に選択される。
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:4
0003627985.tif 000021
（２）SEQ  ID  No:5に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:hOP−１（成熟形）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:5
0003627985.tif 000022
0003627985.tif 000023
（２）SEQ  ID  No:6に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:mOP−１（成熟形）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:6
0003627985.tif 000024
0003627985.tif 000025
（２）SEQ  ID  No:7に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:hOP−２（成熟形）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:7
0003627985.tif 000026
0003627985.tif 000027
（２）SEQ  ID  No:8に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:mOP−２（成熟形）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:8
0003627985.tif 000028
0003627985.tif 000029
（２）SEQ  ID  No:9に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:96アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:CBMP−2A（fx）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:9
0003627985.tif 000030
（２）SEQ  ID  No:10に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:101アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:CBMP−2B（fx）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:10
0003627985.tif 000031
（２）SEQ  ID  No:11に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:DPP（fx）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:11
0003627985.tif 000032
（２）SEQ  ID  No:12に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:Vgl（fx）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:12
0003627985.tif 000033
（２）SEQ  ID  No:13に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）名称:Vgr−１（fx）
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:13
0003627985.tif 000034
（２）SEQ  ID  No:14に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:106アミノ酸
（Ｂ）種類：タンパク質
（Ｃ）鎖数：単鎖
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（vi）起源
（Ａ）生物：ヒト
（Ｆ）組織：脳
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報:/product＝"GDF−１（fx）”
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:14
0003627985.tif 000035
（２）SEQ  ID  No:15に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:5アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖数：単鎖
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：ペプチド
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:15
0003627985.tif 000036
（２）SEQ  ID  No:16に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:1822塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖数：単鎖
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：ヒト
（Ｂ）組織：海馬
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）場所:49..1341
（Ｄ）その他の情報:/standard−name＝"hOP1"
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:16
0003627985.tif 000037
0003627985.tif 000038
0003627985.tif 000039
0003627985.tif 000040
0003627985.tif 000041
（２）SEQ  ID  No:17に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:431アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報:/Product＝"OP1−PP"
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:17
0003627985.tif 000042
0003627985.tif 000043
0003627985.tif 000044
0003627985.tif 000045
（２）SEQ  ID  No:18に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:1873塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖数：単鎖
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：ネズミ科の動物
（Ｂ）組織：胎児
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）場所:104..1393
（Ｄ）その他の情報:/note＝"MOP1（cDNA）”
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:18
0003627985.tif 000046
0003627985.tif 000047
0003627985.tif 000048
0003627985.tif 000049
0003627985.tif 000050
（２）SEQ  ID  No:19に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:430アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報:/product＝"mOP1−PP"
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:19
0003627985.tif 000051
0003627985.tif 000052
0003627985.tif 000053
（２）SEQ  ID  No:20に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:1723塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖数：単鎖
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：ヒト
（Ｂ）組織：海馬
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）場所:490..1696
（Ｄ）その他の情報:/note＝"hOP2（cDNA）”
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:20
0003627985.tif 000054
0003627985.tif 000055
0003627985.tif 000056
0003627985.tif 000057
0003627985.tif 000058
（２）SEQ  ID  No:21に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:402アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ａ）その他の情報:/product＝"hOP2−PP"
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:21
0003627985.tif 000059
0003627985.tif 000060
0003627985.tif 000061
0003627985.tif 000062
（２）SEQ  ID  No:22に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:1926塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖数：単鎖
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類:cDNA
（vi）起源
（Ａ）生物：ネズミ科の動物
（Ｆ）組織：胎児
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）場所:93..1289
（Ｄ）その他の情報:/note＝"mOP2  cDNA"
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:22
0003627985.tif 000063
0003627985.tif 000064
0003627985.tif 000065
0003627985.tif 000066
0003627985.tif 000067
0003627985.tif 000068
（２）SEQ  ID  No:23に関する情報
（ｉ）配列の特性
（Ａ）長さ:399アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｄ）形状：直鎖
（ii）分子の種類：タンパク質
（ix）特徴：
（Ｄ）その他の情報:/product＝"mOP2−PP"
（xi）配列の識別名:SEQ  ID  NO:23
0003627985.tif 000069
0003627985.tif 000070
0003627985.tif 000071
0003627985.tif 000072
【図１】
0003627985.tif 000073
【図２】
0003627985.tif 000074
【図３】
0003627985.tif 000075
【図４Ａ】
0003627985.tif 000076
【図４Ｂ】
0003627985.tif 000077
【図５Ａ】
0003627985.tif 000078
【図５Ｂ】
0003627985.tif 000079
【図６Ａ】
0003627985.tif 000080
【図６Ｃ】
0003627985.tif 000081
【図６Ｂ】
0003627985.tif 000082
【図６Ｄ】
0003627985.tif 000083
【図７】
0003627985.tif 000084
【図８Ａ】
0003627985.tif 000085
【図８Ｂ】
0003627985.tif 000086
【図８Ｃ】
0003627985.tif 000087