(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーシストの胞子形成方法であって、水と、好ましくない微生物の増殖を排除するために充分な量で存在する過酸化水素とを含むオーシストの水性懸濁液を形成する工程と；オーシストに胞子形成させる工程とを含む前記方法。
【請求項２】
該水性懸濁液に通気する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該水性懸濁液を約７２時間までの時間培養する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該水性懸濁液を約４０〜７２時間培養する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
培養中の該水性懸濁液が約２２℃〜約３２℃の温度において飽和レベルの約８０％より大きい溶解酸素レベルを有するように、該水性懸濁液に約４０時間より長い時間にわたって、総ての固体を適当に懸濁させるために充分な撹拌レベルで培養する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該水性懸濁液が約１０４〜約１０６オーシスト／ｍｌの濃度と、約１，０００〜約２０，０００ｍｇ／リットルの初期過酸化水素濃度とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
オーシストがエイメリアオーシストである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
エイメリアオーシストがエイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッチ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘ）及びこれらの組み合わせ由来のオーシストからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
オーシストの精製、回収及び胞子形成方法であって、オーシストを含む第１懸濁液からオーシストを分離する工程と、分離したオーシストに請求項１記載の方法によって胞子形成させる工程とを含む前記方法。
【請求項１０】
オーシストがエイメリアオーシストである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
エイメリアオーシストがエイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッチ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘ）及びこれらの組み合わせ由来のオーシストからなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
オーシストの分離が、塩フロテーション・プロセスによって達成される、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
該塩が硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム又はこれらの混合物を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該塩が硫酸ナトリウムを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該塩が硫酸マグネシウムを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該塩フロテーション・プロセスが、オーシストと塩を含む混合物を調製する工程と；該スラリーを遠心分離して、それから上澄み液を回収する工程と；上澄み液の希釈物を形成し、該希釈物を遠心分離する工程と；該遠心分離済み希釈物から濃縮物を回収する工程とを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
オーシストの分離が、第１懸濁液中の気泡と被のう原生動物との間の接着に影響を及ぼすために充分なｐＨに該第１懸濁液を調節する工程と；懸濁液中の粒子を選択的に被覆するために充分な量の界面活性剤化合物と、安定なフロスを生じるために充分な量の異極性化合物とを加えることによって該ｐＨ調節済み懸濁液をコンディショニングする工程と；該コンディショニング済み懸濁液を少なくとも１個のガスフロテーション・セルに通過させる工程と；該ガスフロテーション・セルから被のう原生動物を回収する工程とを含むガスフロテーション・プロセスによって達成される、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
残留微生物を不活化し、残留有機物質を除去するために充分な量でブリーチング剤を胞子形成したオーシスト又は胞子形成するオーシストに加える工程と；該胞子形成したオーシスト又は胞子形成するオーシストをブリーチングする工程とをさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１９】
ブリーチング剤が過酸化水素である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ブリーチングが胞子形成と同時に行われる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
過酸化水素が最初に約２，０００〜約２０，０００ｍｇ／リットルの量で存在する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該ブリーチング剤が約５，０００〜約１０，０００ｐｐｍの量で存在する次亜塩素酸ナトリウム、フリーアベイラブル塩素、空気中に約３％までの量で存在するオゾン、又はこれらの組み合わせである、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
クロス−フロー膜濾過によって該ブリーチング済みオーシストを洗浄して、該残留ブリーチング剤濃度を許容レベルまでに減ずる工程をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
ブリーチングされ、洗浄されたオーシスト懸濁液が約１ｘ１０６〜約２．５ｘ１０６オーシスト／ｍｌの濃度、約２００ミクロン未満の最大固体サイズ及び約０．９％未満の塩含量を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ブリーチングされ、洗浄されたオーシストを濃縮して、無菌濃縮物を得る工程と；１種類以上の種のオーシストの無菌濃縮物を一緒にして、複合濃縮物を得る工程と；複合濃縮物を無菌条件下でパッケージングする工程とをさらに含む、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は一般に、ワクチンの製造に用いるための被のう原生動物(encysted protozoa)の精製、回収及び胞子形成方法に関する。原生動物は、ホストの胃腸管を襲うことが知られている病原菌である。ホストが例えば非常に若いホスト、非常に年取ったホスト及び免疫無防備状態ホストのように、弱い又は抑制された免疫系を有する状況では、感染が致命的でありうる。このような損失は経済的損失にもなりうる。原生動物は環境中に比較的安定なシスト(cyst)形態で存在し、この形態は、原生動物が胞子虫類である場合にはオーシスト(oocyst)とも呼ばれる。ホスト中に摂取されると、被のう原生動物は胃腸管の状態に応じて、ホストを感染させる。
【０００２】
これらの疾患の問題を予防又は軽減するために、ノン−イン−オボ  ワクチン(non-in-ovo vaccines)が開発されている。これらのワクチンは典型的に、疾患を発症させずにホスト中に免疫を発生させるために、ホストを低レベルの原生動物に暴露させる。このようなワクチンは、多くの種のコクシジウムのうちのいずれか１種から生じるトリコクシジウム症に対するワクチン（米国特許第５，０５５，２９２号）、トキソプラズマに対するネコのためのワクチン（米国特許第５，０４５，３１３号）、及びブタと他の反芻動物のためのワクチン（米国特許第４，８０８，４０４号）を包含する。これらのワクチンは胃管栄養によって与えるか又は動物の飲料水若しくは食物に加えなければならないので、これらのワクチンは部分的にのみ有効である。胃管栄養は手によるワクチン導入を必要とするので、胃管栄養は効果的ではない。さらに、多くのひな鳥(chicks)は取り扱いのために死ぬ。ワクチンを食物又は飲料水に加えることも、若いひな鳥は孵化直後には殆ど食べず、そのため疾患制御が遅延するので、効果的ではない。その結果、体重増加はあまり迅速ではなく、市場に出せる体重(market weight)に達するには長時間かかる。
【０００３】
ワクチンを製造するためには、充分に精製された被のう原生動物が得られなければならない。現在の分離及び回収方法は、腐食性で、危険な有害物質を用いる。これらの物質を相殺するためには、例えば、低い生成物収率を生じる、これらの物質を除去するための広範囲な洗浄操作のような手段を行わなければならない。被のう原生動物を得るための典型的な方法は、例えば、感染した動物の腸又は糞便のような、被のう原生動物ソースを得ることを包含する。被のう原生動物から腸物質又は糞便物質を分離する必要があり、フロテーション方法が用いられる。重液(heavy media)が塩化ナトリウム（米国特許第４，８６３，７３１号）又はスクロース（米国特許第５，０６８，１０４号）である場合には、重液フロテーション(heavy media flotation)又は沈降プロセスが用いられている。重液は水性混合物として用いられる。残念ながら、重液の水性混合物の使用は不利な効果を有しうる。例えば、塩化ナトリウムの水性混合物はひどい装置腐食をもたらす可能性がある。
【０００４】
被のう原生動物が伝染性になりうる前に、分離したオーシストを軽度な酸化によって胞子形成させなければならない。軽度な酸化は懸濁液を振とう台(shaking table)上に置くか又はオーシストの懸濁液に通して空気をバブリング(bubbling)させるかのいずれかによって達成される。胞子形成中の好ましくない微生物増殖を抑制するために、重クロム酸カリウムが通常用いられる。しかし、重クロム酸カリウムは危険な物質である。その使用は取り扱い及び廃棄問題を生じる。その除去は結果として収量減少と費用増加を生じる。
【０００５】
残留有機物質と望ましくない微生物とを除去するために、次亜塩素酸ナトリウムを用いる最終ブリーチング工程が用いられる。ブリーチングされた被のう原生動物は残留ブリーチング剤濃度を許容レベルまで減じるために洗浄されなければならない。一連の希釈とオーシスト回収操作によって洗浄が達成されて、ブリーチング剤レベルが減じられ、オーシスト濃縮物が得られる。最終的な被のう原生動物濃縮物は無菌条件下でワクチンに加工される。各ワクチンはできるだけ最大の保護度を与えるために多重種の原生動物を包含しうる。
【０００６】
より効果的なワクチン接種方法(vaccination method)の必要性が存在する。このようなワクチン接種方法は、免疫応答を発生させて、免疫を樹立する(build immunity)ために充分な、但し急性症状を惹起するほどではない低いレベルで投与される生ワクチンを用いる。例えば、トリコクシジウム症に対してのイン−オボ  ワクチン(in-ovo vaccine)は処置時間を短縮することができ、より均一な投与を可能にする。この方法はクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）及びギアルディア・ラムブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）を含めた原生動物に対する保護のためのヒトワクチンを集めて、生産するためにも用いることができる。この方法は非腐食性濃厚媒質フロテーション・プロセス又は、塩の必要性を完全に除去するガスフロテーション・プロセスを用いる。この改良方法は例えば重クロム酸カリウムのような危険な殺生物剤を用いない。このような代替え殺生物剤又はオキシダントはブリーチング剤としての役割りも果たすことができ、プロセスにおけるもう１つの工程ともう１つの危険な化合物とを排除する。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、被のう原生動物の精製及び回収方法であって、被のう原生動物を含む懸濁液から、塩が例えば硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム若しくはこれらの混合物である塩フロテーション・プロセス、又はガスフロテーション・プロセスによって被のう原生動物を分離することを含む前記方法に関する。
【０００８】
１実施態様では、被のう原生動物の分離方法が塩フロテーションによって達成され、塩が硫酸ナトリウムである。この実施態様では、方法は被のう原生動物とを硫酸ナトリウムとを含む混合物を調製する工程と；該スラリーを遠心分離し、それから上澄み液を回収する工程と；該上澄み液の希釈物を形成し、該希釈物を遠心分離する工程と；遠心分離した希釈物から濃縮物を回収する工程とを包含する。この実施態様は、該混合物を非常に強度な均質化によってホモジナイズする工程をさらに包含することもできる。該混合物中に、硫酸ナトリウムは約３〜約３０重量％の量で存在する。さらに、希釈物の比重は被のう原生動物の比重よりも小さくなりうる。該濃縮物は約１ｘ１０4〜１．５ｘ１０6被のう原生動物／ｍｌを含む。
【０００９】
他の実施態様では、被のう原生動物の分離がガスフロテーション・プロセスによって達成される。このガスフロテーション・プロセスは、該懸濁液中の気泡と被のう原生動物との間の接着に影響を及ぼすために充分なｐＨに該懸濁液を調節する工程と；懸濁液中の粒子を選択的に被覆するために充分な量の界面活性剤化合物と、安定なフロス(froth)を生じるために充分な量の異極性化合物とを加えることによって該ｐＨ調節済み懸濁液をコンディショニングする工程と；該コンディショニング済み懸濁液を少なくとも１個のガスフロテーション・セルに通過させる工程と；該ガスフロテーション・セルから被のう原生動物を回収する工程とを包含する。適当なガスは空気を包含する。ガスが空気であるときに、ｐＨを約２．５〜約３．５に調節することができる。該界面活性剤化合物は長鎖アルキル水素スルフェートのナトリウム塩、第４級アンモニウム化合物、脂肪アンモニウムアセテートと２−エチルヘキサノールとのブレンド、エステル／アミド化合物、アルキルオキシポリエチレンオキシエタノール、又はこれらの混合物を包含する。該異極性化合物はアミルアルコール、ブチルアルコール、テルピノール、クレゾール、又はこれらの混合物を包含する。ガスフロテーション・セルの適当なガス流量は、ガス約０．２５〜約１．１量／懸濁液量／分の範囲である。好ましい実施態様では、ガスフロテーション・セルは少なくとも２個の連続ガスフロテーション・ユニットを含み、これらのユニットは異なるガス流量を有しうる。
【００１０】
本発明はまた、オーシストの胞子形成方法であって、水と、好ましくない微生物の増殖を排除するために充分な量で存在する過酸化水素とを含むオーシストの水性懸濁液を形成する工程と；該水性懸濁液に通気して、オーシストに胞子形成させる工程とを含む前記方法にも関する。エアレーション(aeration)中の該水性懸濁液が約２２℃〜約３２℃の温度において飽和レベルの約８０％より大きい溶解酸素レベルを有し、総ての固体を適当に懸濁させるために充分な撹拌レベルを有しうるような条件下で、該水性懸濁液に約４０時間より長い時間にわたって通気することができる。この実施態様では、水性懸濁液は約１０4〜約１０6オーシスト／ｍｌのオーシスト濃度と、約１，０００〜約２０，０００ｍｇ／リットルの過酸化水素濃度とを包含することができる。
【００１１】
他の実施態様では、本発明は、オーシストの精製、回収及び胞子形成方法であって、オーシストを含む第１懸濁液からオーシストを分離する工程と、分離したオーシストに本発明の方法によって胞子形成させる工程とを含む前記方法を包含する。適当なオーシストは、エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッチ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘ）及びこれらの組み合わせである。１実施態様では、オーシストの分離が、オーシストと硫酸ナトリウムとを含む混合物を調製する工程と；該スラリーを遠心分離して、それから上澄み液を回収する工程と；上澄み液の希釈物を形成し、該希釈物を遠心分離する工程と；該遠心分離済み希釈物から濃縮物を回収する工程とを含む硫酸ナトリウム・フロテーションによって達成される。
【００１２】
他の実施態様では、オーシストの分離が、第１懸濁液中の気泡と被のう原生動物との間の接着に影響を及ぼすために充分なｐＨに該第１懸濁液を調節する工程と；懸濁液中の粒子を選択的に被覆するために充分な量の界面活性剤化合物と、安定なフロスを生じるために充分な量の異極性化合物とを加えることによって該ｐＨ調節済み懸濁液をコンディショニングする工程と；該コンディショニング済み懸濁液を少なくとも１個のガスフロテーション・セルに通過させる工程と；該ガスフロテーション・セルから被のう原生動物を回収する工程とを包含するガスフロテーション・プロセスによって達成される。この実施態様はさらに、残留微生物を不活化し、残留有機物質を除去するために充分な量でブリーチング剤を胞子形成したオーシストに加える工程と；該胞子形成したオーシストをブリーチングする工程とをさらに包含しうる。他の実施態様では、ブリーチングが胞子形成と同時に行われ、ブリーチング剤が過酸化水素である。さらに他の実施態様では、該ブリーチング剤は約５，０００〜約１０，０００ｐｐｍの量で存在する次亜塩素酸ナトリウム、フリーアベイラブル塩素(free available chlorine)、空気中に約３％までの量で存在するオゾン、又はこれらの組み合わせである。
【００１３】
この方法はさらに、クロス−フロー膜濾過(cross-flow membrane filtration)によって該ブリーチング済みオーシストを洗浄して、残留ブリーチング剤濃度を許容レベルまでに減ずる工程をさらに包含しうる。さらに他の実施態様では、ブリーチング剤は、残留微生物の増殖を抑制するために充分な濃度で洗浄後に存在する次亜塩素酸ナトリウムであり、ブリーチングされ、洗浄されたオーシスト懸濁液が約１ｘ１０6〜約２．５ｘ１０6オーシスト／ｍｌの濃度、約２００ミクロン未満の最大固体サイズ及び、シスト又はオーシストの生存能力と伝染性(infectivity)とに影響を及ぼさないほど充分に低く、好ましくは約３％未満、より好ましくは約０．９％未満の量で存在する硫酸ナトリウムを有する。この方法はさらに、ブリーチングされ、洗浄されたオーシストを濃縮して、無菌濃縮物を得る工程と；１種類以上の種のオーシストの無菌濃縮物を一緒にして、複合濃縮物を得る工程と；複合濃縮物を無菌条件下でパッケージングする工程とをさらに包含しうる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ワクチンに用いられる、シスト又は胞子形成したオーシストの濃縮物の製造に関する。詳しくは、この方法は、コクシジウム症に対するイン−オボ  ワクチンの生産に用いられる、胞子形成したトリコクシジウム・オーシストの濃縮物の製造に関する。適当な、許容されるワクチンの生産は、複数の単位プロセスから成る多重工程処理プロセスを必要とする。図１Ａと図１Ｂに示すように、ワクチン生産プロセスは、被のう原生動物の懸濁液を用意する工程と、該懸濁液をホモジナイズする工程と、塩フロテーション若しくはガスフロテーションのいずれかによって該懸濁液から被のう原生動物を分離する工程と、必要な場合に被のう原生動物に胞子形成させる工程と、胞子形成した被のう原生動物をブリーチングする工程と、ブリーチングした生成物を洗浄する工程と、被のう原生動物を濃縮する工程と、多重被のう原生動物からの濃縮物を一緒にする工程と、無菌充填して、ワクチンを生産する工程を包含しうる。これらの工程は以下でさらに詳細に説明する。
【００１５】
シスト及びオーシストを包含する被のう原生動物は、精製懸濁液、腸裏層(intestinal linings)及び糞便懸濁液を含めた、種々なソースから得ることができる。被のう原生動物が糞便から得られる場合には特に、懸濁液又はスラリーはかなりの量の好ましくない懸濁固体を包含しうる。例えば、懸濁液は約１重量％から約２０重量％までの固体又は糞便を包含しうる。好ましくは、懸濁液は、塩フロテーションを用いる場合は約５〜約２０重量％の固体を包含し、ガスフロテーションを用いる場合は約１重量％の固体を包含する。懸濁液中の会合有機物質(associated organics)からシストを遊離させるために、懸濁液を均質化工程にさらすことができる。均質化の強度に依存して、懸濁液を約０分間より長く約５分間までの時間、好ましくは１分間にわたってホモジナイズすることができる。均質化はシスト及びオーシストを遊離させるために充分に強度で、但しそれらの分解を防止するほど穏やかであるべきである。
【００１６】
被のう原生動物はこの第１懸濁液から、好ましくは少なくとも約７０％の被のう原生動物回収率と少なくとも約８０％固体排除(rejection)を達成するほどに、分離する必要がある。典型的に、これは約１ｘ１０4〜約１．５ｘ１０6被のう原生動物／ｍｌの被のう原生動物濃度を生じる。分離は塩フロテーション・プロセス又はガスフロテーション・プロセスのいずれかによって達成することができる。
【００１７】
塩フロテーション・プロセスを用いる場合には、未精製被のう原生動物と塩との混合物が調製される。適当な塩溶液は、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛の塩化物、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩及び酢酸塩を含めた水溶性塩の濃厚溶液を包含する。適当な高水素結合有機物(highly hydrogen-bonded organics)は尿素と、グアニジエン(guanidiene)の塩を包含する。好ましくは、塩は硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、及びこれらの混合物を包含する。より好ましくは、塩は硫酸ナトリウムである。これらの塩はプロセス装置に対して有意に低腐食性であるという利益を生じる。塩は、被のう原生動物の比重と混合物の比重との間に差を生じるために充分な量で加えられる。好ましくは、被のう原生動物の比重は混合物の比重よりも小さい。塩は約３〜約３０重量％、好ましくは約１４〜約２０重量％、より好ましくは約２０重量％の量で存在する。
【００１８】
次に、混合物を遠心分離し、上澄み液と濃縮物とを回収する。混合物の状態に依存して、被のう原生動物を上澄み液又は濃縮物のいずれかに含めることができる。混合物を約３０００〜約１５，０００ｇ、好ましくは１２，０００ｇにおいて、被のう原生動物を充分に分離するために必要な時間にわたって、典型的には約１０分間まで遠心分離する。２０％硫酸ナトリウム溶液では、被のう原生動物は上澄み液中に含まれるので；上澄み液を回収して、濃縮物又はペレットを廃棄物に向ける。図２に示すように、２０％の硫酸ナトリウム濃度は上澄み液（生成物）中に高濃度の被のう原生動物（この場合には、オーシスト）を与え、ペレット（廃棄物）中にごく少量の被のう原生動物を与える。回収した上澄み液に水を添加して、希釈物を形成する。被のう原生動物の比重が希釈物の比重よりも大きいように、上澄み液を充分に希釈する。それ故、被のう原生動物は希釈物中で沈降する傾向がある。２０％の硫酸ナトリウム濃度に関して、希釈物重量の、上澄み液重量に対する比率は約４〜約８である。
【００１９】
次に、残留塩濃度が約１０重量％未満、好ましくは約１重量％未満であり、生じるシスト濃度が約１０4〜１０6シスト／ｍｌであって、約８０〜約９５％の回収率を表すように、希釈物を第１遠心分離におけると同様な遠心分離条件下で再度遠心分離する。固体デブリ(debris)排除率は好ましくは約９０〜約９９％である。この実施態様では、被のう原生動物は濃縮物から回収され、上澄み液は廃棄物に向けられる。
【００２０】
他の実施態様では、被のう原生動物の分離がガスフロテーション・プロセスによって達成される。好ましくは、ガスは空気であるが、酸素及び窒素を包含する任意のガスを用いることができる。ガスフロテーションを用いる場合には、懸濁液のｐＨを、被のう原生動物の表面化学の変更によって懸濁液中の気泡と被のう原生動物との接着に影響を及ぼすために充分なｐＨに調節する。このｐＨは典型的に約２〜約９、好ましくは約２．５〜３．５、より好ましくは約３のｐＨに調節される。
【００２１】
ｐＨ調節済み懸濁液をさらに、時にはコレクター化合物(collector compound)と呼ばれる界面活性剤化合物と、時にはフロサー化合物(frother compound)と呼ばれる異極性化合物とを添加することによってコンディショニングする。選択的洗剤、湿潤剤又は乳化剤とも呼ばれる界面活性剤化合物を、フロートさせるべき粒子上に薄い被膜を形成し、これらの粒子を疎水性にするが、他の粒子は被覆しないことによって、選択された固体と気泡との間の接触を促進するために充分な量で加える。それ故、界面活性剤化合物の選択によって、フロートさせるべき粒子を決定することができる。それ故、被のう原生動物を、被のう原生動物がフロートされるガスフロテーション・プロセスにおいて又は除去されるべき固体がフロートされる逆フロテーション・プロセスにおいて回収することができる。適当な界面活性剤は長鎖アルキル水素スルフェートのナトリウム塩、第４級アンモニウム化合物、脂肪アンモニウムアセテートと２−エチルヘキサノールとのブレンド、エステル／アミド化合物、アルキルオキシポリエチレンオキシエタノール、又はこれらの混合物を包含する。好ましくは、界面活性剤化合物はラウリル硫酸ナトリウムである。界面活性剤は、フロートされる粒子を被覆するために充分な量で存在すべきである。界面活性剤はコンディショニング済み懸濁液中に約０．５〜２  ｌｂ／トン固体、好ましくは０．５  ｌｂ／トン固体の量で存在する。或いは、界面活性剤化合物は、中性ｐＨが得られるまで塩酸によって酸性化されている約０．５  ｌｂドデシルアミン／トン固体、又は約０．５  ｌｂオレイン酸カリウム塩／トン固体でありうる。
【００２２】
異極性化合物は、それらが水の表面張力を変化させ、安定なフロスを生じることができるために、選択される。典型的に、これらの異極性化合物は１つの極性基に結合した１つ以上の炭化水素基を含有し、該炭化水素ラジカルは５又は６個以上の炭素原子を有する。適当な異極性化合物はアミルアルコール、ブチルアルコール、テルピノール、クレゾール及びこれらの混合物を包含する。好ましくは、異極性化合物はメチルイソブチルカルビノール（ＭＩＢＣ）であり、これはメチルアミルアルコールとも呼ばれ、最も正確には４−メチルペンタノール−２と呼ばれる。異極性化合物は安定なフロスを生じるために充分な量で存在する。好ましくは、異極性化合物は約２．０  ｌｂ／トン固体までの量、より好ましくは約０．５〜２．０  ｌｂ／トン固体、最も好ましくは約０．５  ｌｂ／トン固体の量で存在する。
【００２３】
コンディショニング済み懸濁液をガスフロテーション・セルに通過させ、被のう原生動物を回収する。選択したｐＨ，界面活性剤化合物及び異極性化合物に依存して、被のう原生動物はフロートされうるか又は懸濁液中に保持されうる。好ましくは、被のう原生動物はフロートされる。ガスフロテーション・プロセスは、約２０〜１００％、好ましくは約８５％の被のう原生動物を回収し、約２０〜９０％、典型的に７０％の固体デブリを排除するために充分な時間にわたって、充分な空気流量で行われる。ガスフロテーション・プロセスは約３分間から約１０分間を超えるまでの時間、好ましくは約１０分間にわたって行われる。空気フロテーション・セル中のガス流量はガス約０．２５〜約１．１量／溶液量／分（“ｖｖｍ”）、好ましくは約０．２５〜約０．８３ｖｖｍ、より好ましくは約０．２５〜約０．７５ｖｖｍである。ガスフロテーション・セルは複数個の連続フロテーション・ユニットを含有しうる。好ましくは、ガスフロテーション・セルは少なくとも２個の連続フロテーション・ユニットを包含する。好ましくは、フロテーション・ユニットはガスフロテーション・カラムである。連続フロテーション・ユニットにおけるガス流量は同一であることも、異なることも可能である。好ましくは、ガス流は異なり、例えば３２インチ高さ、２インチ直径カラムでは約０．４７ｖｖｍであり、６０インチ高さ、２インチ直径カラムでは約０．２７ｖｖｍである。
【００２４】
被のう原生動物がオーシスト又は被のう胞子虫類(encysted sporozoa)であるときに、オーシストは胞子形成している。図３に示すように、胞子形成はオーシストの回収後できる限り早く起こるべきであり、好ましくは、オーシストは回収後３日間以内に胞子形成するべきである。オーシストとオキシダント又は殺生物剤との水性懸濁液を調製し、オーシストに胞子形成させるために充分な時間にわたって、該水性懸濁液に通気する。オーシストを分離するために塩フロテーション・プロセスを用いた場合には、胞子形成中の塩濃度は約１０重量％未満、好ましくは約２重量％未満、より好ましくは約１重量％未満であるべきである。好ましくは、胞子形成中のシスト濃度は約１０4〜約１０6オーシスト／ｍｌ、より好ましくは、約１０5オーシスト／ｍｌである。オーシストは、精製シスト濃縮物の回収後約１〜２４時間以内に、胞子形成するべきである。水性懸濁液のｐＨは約５．０〜７．０、好ましくは約５．２〜６．８であるべきである。１実施態様における水性懸濁液の温度は約２０〜約３３℃、好ましくは約２２〜約３２℃、より好ましくは約２５〜約２９℃、最も好ましくは約２５℃である。１実施態様における通気速度は約０．１〜約１０ｖｖｍ、好ましくは約０．１〜約２．０ｖｖｍである。全体として、撹拌レベルは、胞子形成中に総ての固体を完全に懸濁させるために充分であるが、オーシストを破壊するほどではないレベルであるべきである。これはエアレーション、振とう、撹拌及びこれらの組み合わせによって発生しうる。例えば、撹拌を用いる場合には、撹拌は懸濁液の固体を懸濁状態に維持するために充分であるが、シスト又はオーシストを破壊するほどではない撹拌であるべきである。６インチ直径容器中の適当な撹拌は約１２１〜２０４ｒｐｍ、好ましくは約１９７〜２００ｒｐｍ、より好ましくは約２００ｒｐｍにおいて生じうる。溶解酸素含量は、オーシストに胞子形成させるために充分なレベル、好ましくは一定温度における飽和濃度の約８０％に維持されるべきである。胞子形成のための時間は約７２時間まで、好ましくは約４０〜約７２時間、より好ましくは約４８〜約５０時間でありうる。
【００２５】
オキシダントは、水性懸濁液中の好ましくない微生物増殖を不活化するために充分な量で加えられる。適当なオキシダント、又は殺生物剤は過酸化水素、オゾン、重クロム酸カリウム、塩素及びこれらの組み合わせを包含する。１実施態様では、オキシダントは重クロム酸カリウムであり、約２．５ｖ／ｗ％の量で存在する。好ましい実施態様では、オキシダントは、約１，０００〜約２０，０００ｍｇ／リットル、好ましくは約５，０００ｍｇ／リットルの量で存在する過酸化水素である。過酸化水素は容易で、費用のかからない取り扱いという利益を与え、このプロセスからの危険な廃棄副生成物の発生は緩和される。
【００２６】
エアレーションは、シェーカー台(shaker table)上での振とう又は胞子形成タンク（例えば、発酵タンク）中での空気スパージング(air sparging)によって達成することができる。好ましくは、エアレーションは空気スパージングタンク中で達成される、この理由は、空気の質量移動が大きく、そのために胞子形成のための時間及び装置の必要なサイズを減少させるからである。
【００２７】
胞子形成後に、必要な場合には、オーシストを洗浄して、残留オキシダント濃度を許容レベルにまで減ずることができる。過酸化水素はこの工程の必要性を排除するという利益を与える。洗浄は連続的洗浄によって達成されることができ、好ましくは、洗浄は膜濾過によって、より好ましくは透析濾過(diafiltration)によって達成される。膜濾過の場合には、膜の孔度は、膜を通しての溶質の通過を可能にするが、膜の片側から他方の側へのオーシストの通過を制限するように選択される。１実施態様では、洗浄は水によって、約３０ｐｓｉまで、好ましくは約２０〜約２５ｐｓｉの膜内外圧力差(transmembrane pressure)、約１０ｍ／ｓ、好ましくは約２ｍ／ｓのクロスフロー速度(crossflow velocity)、及び約１０リットル／分／ｍ2まで、好ましくは約３リットル／分／ｍ2の膜を通してのフラックス(flux)において行われる。
【００２８】
残留微生物を不活化し、残留有機物質を排除するために、オーシストをブリーチングすることができる。最初に、充分な量のブリーチング剤を加えてから、オーシストを、充分な時間、ブリーチング剤によってブリーチングするか又はブリーチング剤と接触させる。オーシストを１．５時間までの期間にわたってブリーチングすることができる。適当なブリーチング剤は次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、オゾン及びこれらの混合物を包含する。ブリーチング剤は最初に約２，０００〜約２０，０００ｍｇ／リットル、好ましくは約８，０００〜約１０，０００ｍｇ／リットル、より好ましくは８０００ｍｇ／リットルの量で存在することができる。ブリーチング剤はプロセス装置において腐蝕を惹起するほどの量で存在すべきではない。過酸化水素を胞子形成のために用いる場合には、ブリーチングと胞子形成とを同時に行うことができる。ブリーチング後に、必要な場合には、ブリーチング済み懸濁液を洗浄して、残留オキシダント濃度を許容レベルまで減ずることができる。次亜塩素酸ナトリウムがブリーチング剤である場合には、許容レベルは約１ｍｇ／リットル未満である。洗浄は連続洗浄又は透析洗浄のいずれかによって達成されうる。
【００２９】
ブリーチング済み懸濁液を濃縮して、効果的で、有効な取り扱いのために充分に高い濃度を有する無菌濃縮物を得ることができる。例えば、最終的濃縮被のう原生動物懸濁液は約２００ミクロン未満、好ましくは約２５ミクロン未満の最大固体サイズと、約０．９％未満の塩含量と、約１ｍｇ／リットル未満であるが残留微生物増殖の抑制を維持するために充分な遊離残留塩素濃度と、約１ｘ１０6〜２．５ｘ１０6シスト／ｍｌのシスト濃度とを包含することができる。
【００３０】
非常に多くの被のう原生動物又は１つの属の異なる種の被のう原生動物を単一ワクチンの生産に用いる予定である場合には、該異なる種からの無菌濃縮物を一緒にして、単一無菌濃縮物を得る。例えば、被のう原生動物は、それぞれの多重菌株(multiple strains)を包含する、エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッチ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘ）及びこれらの組み合わせを包含するトリコクシジウムオーシストでありうる。最後に、一緒にした濃縮物に対して無菌条件下で充填及びパッケージングを行って、ワクチンが生産される。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様を説明したが、本発明が非常に多くの種類の動物及びヒトのための他のワクチンを生産するために使用可能であることは理解される。この方法は実際に、例えばクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）及びギアルディア・ラムブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）のような、典型的な水生原生動物(waterborne protozoa)に対してヒトを免疫化するために用いることができる。さらに、全体的な回収プロセスを説明したとしても、その単位プロセスを、本発明の範囲又は要旨から逸脱することなく、独立的に用いるか又は他の回収、モニターリング又は処置スキーム中に挿入することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、本発明の第１部方法の実施態様を説明するフローチャートである；
図１Ｂは、本発明の第２部方法の実施態様を説明するフローチャートである。
【図２】  図２は、硫酸ナトリウム濃度に対するオーシスト濃度を示すプロットである。
【図３】  図３は、シスト回収後の時間に対する胞子形成％を示すプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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