(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３として寄託された細胞株により産生される一つの抗体であって、ＣＤ２陽性ヒトＴ細胞のＣＤ２に結合する抗体。
【請求項２】
請求項１記載の抗体であることを特徴とする一つのヒト化形態。
【請求項３】
前記抗体が同種抗原特異的低応答性を誘導することを特徴とする請求項２記載の抗体。
【請求項４】
請求項１記載の抗体の一つのキメラ形態であって、ここで前記キメラ形態が、もう一つの種の抗体の定常領域と組合されて、ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３として寄託された細胞株により産生される前記抗体の可変領域を含むことを特徴とするキメラ形態。
【請求項５】
請求項４記載の抗体であって、ここで前記抗体が同種抗原特異的低応答性を誘導することを特徴とする抗体。
【請求項６】
患者を処置するためにＴ細胞媒介免疫応答を阻害するための一つの組成物であって、Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量で投与される請求項１記載の抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
移植拒絶反応を処置することを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項８】
移植拒絶反応を予防することを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項９】
移植片対宿主病を処置することを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項１０】
患者を処置するためにＴ細胞媒介免疫応答を阻害するための一つの組成物であって、Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量で投与される請求項２記載の抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
移植拒絶反応を処置することを特徴とする請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
移植拒絶反応を予防することを特徴とする請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
移植片対宿主病を処置することを特徴とする請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
患者を処置するためにＴ細胞媒介免疫応答を阻害するための一つの組成物であって、Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量で投与される請求項４記載の抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
移植拒絶反応を処置することを特徴とする請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
移植拒絶反応を予防することを特徴とする請求項１４記載の組成物。
【請求項１７】
移植片対宿主病を処置することを特徴とする請求項１４記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１の抗体を産生する、ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３として寄託された細胞株。
【請求項１９】
ＣＤ２陽性ヒトＴ細胞のＣＤ２に結合する抗体を産生する一つの方法であって、請求項１８記載の細胞株を培養し、前記抗体を前記細胞株から単離することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
この出願は１９９３年９月９日に提出された現在未決のアメリカ合衆国特許出願番号０８／１１９，０３２を部分継承するものであり、またそれも同じく未決の１９９３年３月５日に提出されたアメリカ合衆国特許出願番号０８／０２７，００８を部分継承するものである。
この発明は一つの抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）に関し、および望ましくはこの発明はヒトリンパ球に結合する一つの抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）に関する。より詳細には、この発明はそのような抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）の患者への投与を通じて、患者の進行性免疫応答を予防しおよびもしくは阻害することに関する。望ましくは、この発明はそのような抗体あるいは断片もしくはその誘導体の患者への投与を通じて、Ｔ細胞活性化および増殖を予防あるいは阻害することに関する。
従来の技術は、移植片拒絶のためＣＤ２抗原に対し抗体を使用する可能性を開示した。一般に従来の技術は、移植片拒絶を阻害するのに多分有用であるものとしてＣＤ２抗原に結合する抗体の使用を開示する。オーソファーマシューティカルズ  コーポレイション，アメリカ合衆国特許番号４，３６４，９７３；４，６１４，７２０；４，５１５，８９３；４，７４３，６８１および４，７９８，８０６を参照されたい。
このような抗体はヒト患者あるいは動物の移植片拒絶を阻害するのに有用であるとは知られていなかった。それは以下の引用文献、ジェイ．ヴイ．ジョルジ他「サル同種異系移植受容体におけるＯＫＴ１１Ａモノクローナル抗体の免疫抑制効果および免疫原性」移植紀要、１５巻、１号、１９８３年３月、およびピー．ジェイ．サーロー他「モノクローナル抗ＰＡＮ−Ｔ細胞抗体」移植、３６巻、３号、２９３−２９８ページで実証される。
【図面の簡単な説明】
図１
ビオチン化ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂＰＥによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２色染色。
図２
ヒトＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣで染色され、次いでａ）フィコエリトリン（ＰＥ）に接合されたＴ１１−ＰＥ（ＣＤ２に対するコールター抗体）、あるいはｂ）フィコエリトリン（ＰＥ）に接合されたＬｅｕ−５Ｂ−ＰＥ（ＣＤ２に対するベクトン・ディキンソン抗体）で染色された。いずれの場合もＬＯ−ＣＤ２ａによる前処理によって、変更される第２抗体による染色はなかった。
図３ａおよび３ｂ
膜マーカーに対するＬＯ−ＣＤ２ａの効果。ＰＢＭＣが２×１０６細胞数／ｍｌでＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（ソリッドライン）、あるいは存在下（ブロークンライン）で培養された。各図で示した時点で、細胞は収穫され、細胞蛍光定量分析を受けた。ａ）およびｂ）；ＰＢＭＣは抗ＣＤ３（Ｌｅｕ−４ａ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ）ｍＡｂｓ，抗クラスＩＩ抗原（ＬＯ−ＤＲａ−ＦＩＴＣ）あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）と標識された。商業用マウスｍＡｂｓのための負の対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコート（部分標本）であった。ラットｍＡｂｓのための負の対照は普通のラット血清で保温され、続いてＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）で保温された細胞であった。その結果は正細胞の割合で表示される。
図４ａおよび４ｂ
１×１０６細胞数／ｍｌのリンパ球培養液が（ａ）表示された時点で抗ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ１）ｍＡｂ、あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）で標識された。（ｂ）各ドナーの１×１０６細胞数／ｍｌの混合リンパ球培養が抗ＣＤ２・ｍＡｂ  Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標識）で染色された。商業用マウスｍＡｂｓに対する負の対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコートであった。ラットｍＡｂｓに対する負の対照は正常な血清で保温され、次いでＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）により保温された細胞であった。この結果は正細胞の割合で表示される。
図５ａおよび５ｂ
ＣＤ２発現に関するＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂの効果。ヒトＰＢＭＣが示された各時点でａ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）、あるいはｂ）（ＰＢＳに対し透析され、１：２で希釈された）Ｌｅｕ−５ｂで保温され、またａ）ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１）の発現およびＬＯ−ＣＤ２ａ（ＭａｒＫ−３−ＦＩＴＣ）の結合のため、あるいはｂ）ＣＤ２（ＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ，Ｔ１１−ＲＤ１）およびＬｅｕ−５ｂヤギ抗マウス（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ）の結合のために染色された。
図６
ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２の効果。ａ）０時間に加えられたＬＯ−ＣＤ２ａの濃度を増加させて６日間培養した混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は６日目に収穫された。ｂ）０時間に加えられたＬＯ−ＣＤ２ａの異なった濃度で培養された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は２４時間毎に収穫された。ｃ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（ソリッドライン）あるいは存在下（ブロークンライン）での混合リンパ球培養による３Ｈチミジン（３Ｈ−Ｔ）のとり込み（ｃｐｍ）、ｄ）保温開始後異なった時点で加えられたＬＯ−ＣＤ２ａによるＭＬＲの阻害。培養は６日目に収穫された。すべての培養は２００μｌ／ウエルの最終容量で３個（各ドナーの１×１０６細胞数／ｍｌ）ずつ作成された。３Ｈチミジンが培養収穫の８時間前に加えられた。ｃ）における結果は示された各時点で収穫されウエル当りとり込みｃｐｍ×１０−３で示される。ａ），ｂ）およびｄ）の結果は（ＬＯ−ＣＤ２ａのない）対照培養と比較した３個の培養のＭＬＲ阻害割合（平均値±標準偏差）で示される。
図７
末梢血単核細胞が２００ｎｇ／ｍｌのＬＯ−ＣＤ２ａを付加したあるいは付加しない混合リンパ球培養で培養された。示された各時点で、細胞は移され、ＣＤ２に対する抗体（Ｌｅｕ５ｂ−ＦＩＴＣ）で染色された後にフロー血球計算で分析された。芽細胞は前および横の散乱でゲーティングされ、指示されたマーカーの発現は芽細胞について定量された。
図８
ヒトリンパ球がＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の付加あるいは付加なしで培養された。示された各時点で細胞は移され、ＣＤ３（Ｌｅｕ  ４ａ−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ１）、ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ１）あるいはＣＤ２５（ＬＯ−ＴＡＣＴ−１−ＦＩＴＣ）で染色された。休止リンパ球は口径および粒状による差別的ゲーティングで確認され、その結果は、指示された抗体で染色された全休止リンパ球に対するパーセントで表現された。
図９
マイトジェン刺激リンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの効果。ＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃｏｎ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の不在下（平行棒）あるいは存在下（固形棒）で９６時間培養された。平行培養において、ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）はマイトジェンの１時間後（グレー棒）あるいはマイトジェンの１時間前（空白棒）に追加された。角棒はＬＯ−ＣＤ２ａのみの存在下で行われた培養を示す。（３個の）培養は保温の最後の８時間に３Ｈチミジンでパルス標識された。
図１０ａおよび１０ｂ
ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でエフェクター細胞および標的細胞（５１ＣＲ標識Ｋ５６２細胞群）の保温によるＮＫ活性の阻害。３個の濃度のＬＯ−ＣＤ２ａ：５ｍｇ／ｍｌ，１ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｇ／ｍｌがテストされた。エフェクター細胞はＮＫ活性の末梢血リンパ球であったが、それは標識された標的細胞の溶解パーセントで表現された。２個の正常な被検体が３種の比率：２００／１，１００／１，５０／１でテストされた。
図１１
ＰＭＢＣのマイトジェン駆動活性化に関するＬＯ−ＣＤ２ａの効果。２人のドナーから得たＰＭＢＣがＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＯＮ−Ａ（１０μｇ/ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で９６時間培養された。平行培養において、培養開始０日（０時間）、開始後１日（２４時間）、あるいは２日（４８時間）後にＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）が追加された。このグラフは各ドナーにおけるマイトジェン誘導増殖のＬＯ−ＣＤ２ａによる阻害割合を示している。
図１２
ＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日で１０日間（０日から９日）受け入れるマカクザルの末梢血のμ１当りの全リンパ球。
図１３
ＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日で１０日間（０日から９日）受け入れるマカクザルから得たＰＢＭＣ細胞は、指示された日にＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ）、ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ８およびＣ１１ｂ）およびＢ細胞（抗ＩｇＭ）に対するモノクローナル細胞で染色され、次いで、フロー血球計算で分析された。その結果が血液マイクロリッター当りの全染色細胞数の百分率で提示される。
図１４
ＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日で１０日間（０日から９日）受け入れるマカクザルのＮＫ活性。ＮＫ活性は１１日および２２日に検定され、２５／１，５０／１および１００／１のＥ／Ｔの溶解％で提示された。
図１５
抗体を２０ｍｇ／日で１０日間（０日から９日）受け入れるマカクザルのＬＯ−ＣＤ−２ａの血清濃度。モノクローナル抗体はテキスト記載のエリザで測定され、μｇ／ｍｌで示された。
図１６
ＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日で１０日間（０日から９日）受け入れるマカクザルのＬＯ−ＣＤ２ａに対するＩｇＧ抗体の成長。モノクローナル抗体に対する抗体は、テキスト記載のサンドイッチエリザにより指示された日に採取された血清の連続希釈で測定され、４９２ｎｍの光学濃度を表わされる。
図１７ａおよび１７ｂ
ａ）指示された日に血液がヒヒから得られ、細胞は、抗ＣＤ２抗体Ｔ１１ＲＤ１およびＬｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ、ＬＯ−ＣＤ２ａおよび結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するためにフルオレセインに結合したＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣマウス抗ラットカルパ１ｂ抗体で染色された。
ｂ）指示された日に採取された血清サンプルがエリザによりＬＯ−ＣＤ２ａの水準を評価された。
図１８ａおよび１８ｂ
指示された日に血清が採取され、細胞は結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するためにＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣおよびＭＡＲＫ２ｂ−８−ビオチン（ＰＥ結合ストレプタビジンで検出されるビオチンに結合したマウスモノクローナル抗ラット抗体）で染色された。
ａ）細胞の前処理のないもの
ｂ）循環抗体に占拠されていないいずれかの部位を検出するための染色に先立つＬＯ−ＣＤ２ａ，２．５μｇ／ｍｌを用いた保温。
図１９
指示された日に血液サンプルが採取され、Ｔ４−ＲＤ１（ＣＤ４），Ｔ８−ＲＤ１（ＣＤ８）あるいはＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ（結合ＬＯ−ＣＤ２ａ）で染色された。
図２０
同種異系移植拒絶反応のためＡＴＧ次いでＬＯ−ＣＤ２ａで治療される患者＃１の白血球、リンパ球およびクレアチニン。
図２１
患者＃１の治療の間および治療後のＬＯ−ＣＤ２ａの血清水準。
図２２
ＬＯ−ＣＤ２ａ治療の間および治療後に先立つ患者＃２のクレアチニン。
図２３
ＬＯ−ＣＤ２ａ治療の間および治療後に先立つ患者＃２の白血球およびリンパ球の計数。
図２４
各注射直前および注射２．５時間後に採取された患者＃２のＬＯ−ＣＤ２ａの血清水準。
図２５
肝臓同種異系移植拒絶反応のためＬＯ−ＣＤ２ａを受け入れる患者＃２の白血球計数、リンパ球計数および血清クレアチニン水準。
図２６
ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＮＫ細胞のマーカーである（２）Ｌｅｕ５ｂ、（３）Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、（４）Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、（５）Ｌｅｕ２ｂ（ＣＤ８）およびＬｅｕ１１（抗ＣＤ１６）による二重染色。ＬＯ−ＣＤ２ａ結合は、ヤギ抗ラットＩＧ−ＦＩＴＣで検出された。２個のカラーヒストグラムの上部セット（１−６）は二重染色を示している。下部セット（７−１２）は各抗体を使った単一染色を示している。
図２７
ＬＯ−ＣＤ２ａのラットイソタイプ対照（ファーミンゲン社、精製ラットＩｇＧ２ｂ、カッパ）あるいはＬＯ−ＣＤ２ａおよびＣＤ４（ｃ，ｄ）、ＣＤ８（ｅ，ｆ）、ＣＤ１６（ｇ，ｈ）、ＣＤ１９（ｉ，ｊ）およびＣＤ２（ｋ，ｌ）に対するフィコエリトリン接合抗体を用いたヒトＰＢＬの２色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａおよびイソタイプ対照はＦＩＴＣ接合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ′）２抗ラット免疫グロブリン（サザンバイオテクノロジー社）を用いて検出された。ＣＤ抗原に対する抗体はすべてベクトン・ディキンソン社より得られるフィコエリトリン接合抗体〔ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ１１ｂ）、ＣＤ１９（Ｌｅｕ１２）およびＣＤ２（Ｌｅｕ５ｂ）〕であった。それぞれのケースにおいて、イソタイプ対照を用いる染色は最初のヒストグラムで、またＬＯ−ＣＤ２ａは第２ヒストグラムで示される。ヒストグラムａはイソタイプ対照を用いたパターンを、またｂはＬＯ−ＣＤ２ａを用いたパターンを示す。
図２８
野生型ＣＤ２で形質移入されたＣＯＳ細胞染色の細胞蛍光定量分析。左側のパネルはＣＤ２を含まない対照ベクターで形質移入されたＣＯＳ細胞の染色ヒストグラムを示し、右側のパネルのセットは完全なＣＤ２分子を含むベクターで一時的に形質移入されたＣＯＳ細胞の染色を示している。各セットで最上部にあるヒストグラムは、マウスＷ６３２（ＣＯＳ細胞により発現されるものとして知られるクラスＩに対する抗体）および７６−２−１１（マウスＷ６３２にとってのイソタイプ対照）での染色を示す。中央部パネルはＬｅｕ５ｂ（ベクトン・ディキンソン社より得られる抗ＣＤ２）およびＬｅｕ５ｂ染色にとってのイソタイプ適合対照である７６−２−１１による染色を示し、また最下部パネルは、ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬＯ−ＣＤ２ａにとってのラットイソタイプ適合対照による染色を示す。
図２９ａおよび２９ｂ
ａ）ＭＲＣベクターよりのリーダー配列、ｂ）ＬＯ−ＣＤ２ａ遺伝子よりのリーダー配列、を持つヌクレオチドおよびＬＯ−ＣＤ２のＶＬ鎖アミノ酸配列。
図３０ａおよび３０ｂ
ａ）ＭＲＣベクターよりのリーダー配列、ｂ）ＬＯ−ＣＤ２ａの遺伝子よりのリーダー配列、を持つヌクレオチドおよびＬＯ−ＣＤ２ａのＶＨアミノ酸配列。
詳細な説明
この発明の一つの見地に従って、ＡＴＣＣデポジット番号ＨＢ１１４２３で寄託された細胞系により生産されたモノクローナル抗体として、ヒトリンパ球の同じエピトープ（あるいはその一部）に結合する分子（望ましくはモノクローナル抗体あるいはその断片）が提供される。デポジット細胞系により生産されるこの抗体は、以下で時々ＬＯ−ＣＤ２ａとして引用される。「分子」あるいは「ＬＯ−ＣＤ２ａと同じエピトープに結合する抗体」という用語はＬＯ−ＣＤ２ａを含む。「ＬＯ−ＣＤ２ａ」の用語は、寄託された細胞系ＡＴＣＣ  ＨＢ  １１４２３により生産される抗体、および例えば組換え技術により生産することのできる同一のものを含む。
この発明の分子あるいは抗体は、ヒトＴ細胞活性化および増殖を阻害し、出願人は、Ｔ細胞活性化を作用薬が刺激する前あるいは後にそれに分子あるいは抗体を加えることでこのような阻害が有効になり得ることを発見した。
この発明の分子あるいは抗体は、ＣＤ２抗原のエピトープ（ＣＤ２陽性ヒトＴ細胞）に結合するという特性を持つが、しかし、Ｔ細胞の活性化あるいは増殖を阻害するそのような分子あるいは抗体の能力はＣＤ２陽性細胞への結合を通じて行われることもあり、そうでない場合もあることが理解されねばならない。もっとも出願人は作用の機構がＣＤ２陽性細胞への分子あるいは抗体の結合を含むものと考える。
この発明のも一つの見地に従って、ＬＯ−ＣＤ２ａ（あるいは断片もしくはその誘導体）として以下で引用する一つの抗体、あるいはそのような抗体もしくはその誘導体あるいは断片によく似たいずれかの分子をヒト患者に投与することを通じて、その患者の進行性免疫応答を予防しおよびもしくは阻害する方法が提供される。
ＬＯ−ＣＤ２ａを生産する一つの細胞系が、アメリカ合衆国、２０８５２  メリーランド、ロックヴィル、パークローン  ドライブ  １２３０１、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクションに１９９３年７月２８日寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３が与えられた。この抗体はラットモノクローナル抗体である。
出願人はこの発明を何らかの理論的推論に限定するものではないが、免疫応答の発病度を予防しあるいは減少させ、またＴ細胞の活性化および増殖を阻害するようにすることをこの発明のモノクローナル抗体が出来る機構であるのは、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体がＴ細胞表面に発現されるＣＤ２の密度を減少させ、かくしてＣＤ２＋Ｔリンパ球の数を減少させる事実があるためであると考える。これらの作用機構は免疫応答の予防だけでなく、進行性免疫応答の減少の原因となり得るものと考えられている。加えて以下で実証されるように、ＬＯ−ＣＤ２の抗体は生体外でのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を阻害する。これはこの発明に関連する。というのはＮＫ細胞活性などの非ＭＨＣ制限細胞障害機構が、対宿主性移植片病に関連していると考えられているためである。
この発明の一つの見地に従って、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体のようなヒトリンパ球にある同一のエピトープ（あるいはそのいずれかの部分）に結合する分子（望ましくは抗体）の有効量をヒト患者に投与することによって、ヒト患者にあるＴ細胞の初期のあるいはもっと進んだ活性化および増殖を阻害する方法が提供される。望ましい分子はＬＯ−ＣＤ２ａあるいはそのキメラおよびもしくはヒト化形態のものである。このような分子は、例えばＬＯ−ＣＤ２ａ抗体として同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
出願人が意図してここで使用している「阻害する」という用語は、移植拒絶反応の予防、あるいは阻害、もしくは発病の減少、あるいは免疫寛容の誘導、もしくは逆転を意味するように意図される。この出願の目的のためにここで使用されている「移植(graft)」という用語は、必ずしもそれに限定されないが、同種移植および異種移植を含むいずれかすべての移植(transplantation)を含む。このような移植は実施例によって必ずしもそれに限定されないが細胞、骨髄、組織、固体器官、骨などの移植を含む。
ここで使用される「免疫応答」という用語は細胞作用およびＴ細胞依存型抗体を両方とも含むＴ細胞活性化および増殖に依存する免疫応答を意味し、ここで、前者の細胞作用およびＴ細胞依存型抗体は、その例として必ずしもそれに限定されないが、（ｉ）移植、(ii)対宿主性移植片病および(iii)自己免疫疾患より生じる自己抗原等に応答して誘発される。自己免疫疾患の例としては必ずしもそれに限定されないが、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化、糖尿病、頬炎などがある。
この発明で使用される分子は、ＬＯ−ＣＤ２ａのモノクローナル抗体と同じエピトープ（あるいはそのエピトープの一部分）に結合する分子である。「ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する」という用語は、ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体を説明するだけではなく、ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体と同じようにエピトープに結合する他の抗体、断片あるいはその誘導体もしくは分子を説明することを意図したものである。
このような他の抗体は、例によって必ずしもそれに限定されないが、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヒト、キメラ、ヒト化抗体、あるいは断片もしくはその誘導体を含む。
ここで使用される「誘導体」という用語は、キメラあるいはヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、あるいはＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体により認識されるものと同じエピトープ（あるいはその一部分）と結合するような他の抗体を意味する。
ここで使用される「断片」という用語は、一つの抗体の一部分を意味し、抗体のそのような部分はその例として必ずしもそれに限定されないが、ＣＤＲ、Ｆａｂ、あるいはＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されるのと同じエピトープあるいはそのいずれかの部分に結合する他の部分を含む。
ここで使用される「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、抗体断片、誘導体、およびモノクローナル抗体ＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されるのと同じエピトープあるいはその部分に結合するキメラあるいはヒト化抗体、一本鎖あるいは二重特異性抗体などのような組換え方法により調製された抗体を含む。「分子」という用語は、その例によって必ずしもそれに限定されないが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、あるいは抗体に類似するもしくは抗体断片もしくはその誘導体のように同じエピトープあるいはその部分に結合するいずれかの源から誘導された他の化合物を含む。
この発明のも一つの実施例は、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体、あるいは一つの抗体、もしくはその誘導体あるいは断片、もしくはＬＯ−ＣＤ２ａと同じエピトープ（あるいはその一部分）に結合する分子よりなるグループから選択される少なくとも一つのメンバーの有効量を使って移植組織を受け入れるべき、あるいは既に受け入れている患者の治療方法を提供する。治療は全体のあるいは完全なＬＯ−ＣＤ２ａ抗体を用いて行われることが望ましい。
ここで説明されるこの発明のモノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュタイン（ネイチャー、２５６巻、４９５−４９７ページ、１９７５）で説明されたような従来の技術およびここで開示される技術で生産することが出来る。モノクローナルＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の調製はこの出願の実施例１でより詳細に説明される。ここで示されるように、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は更に従来知られる手法を用いた組換え技術でも生産出来る。組換え抗体はキメラ抗体の形をとることも出来、ここではＬＯ−ＣＤ２ａラット抗体の可変領域あるいはＣＤＲ領域が他の種の抗体の定常部に結合する。かくして例えばモノクローナル抗体はラットＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体の可変あるいはＣＯＲ領域をヒト抗体の定常部を結合してキメラヒトラットモノクローナル抗体を提供することでヒト化することが出来る。
この発明の抗体あるいは分子は、望ましくは（ｉ）フロー血球計算で分析される白血球の２色染色で示されるように、すべてのＴ細胞およびヌル細胞と結合するがＢリンパ球とは結合せず（図２６および２７）、（ii）（抗ＣＤ３抗体Ｌｅｕ４による染色で確認されるように）すべてのＴ細胞、Ｌｅｕ３ａとＬｅｕ２ｂ抗体それぞれで定義されるようにすべてのＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞、またＣＤ３陰性（ヌル細胞）と結合し、(iv)ＮＫ細胞のマーカーであるＬｅｕ１１で検出されるＣＤ１６陽性細胞の染色により確証されるようにヌル細胞と結合する（図２６）。抗ＣＤ１９結合で定義されるように、Ｂ細胞の染色はＬＯ−ＣＤ２ａを使っては見られなかった（図２７）。ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体はまた望ましくは、抗体がヒトヌル細胞に結合し、両方がＣＤ２＋およびＣＤ１６＋であるヒト細胞よりも両方がＣＤ２＋およびＣＤ１４＋であるヒト細胞への染色強度が高く、また両方がＣＤ２＋およびＣＤ１６＋であるヒト細胞よりも両方がＣＤ２＋＋ＣＤ８＋であるヒト細胞の染色強度が高いという特性を持っている。
ＬＯ−ＣＤ２ａがＣＤ２に結合することはＣＯＳ細胞内でＣＤ２が一時的に発現することで確認された。
ピータースン，エイ．およびシード，ビー．，ネイチャー，３２９巻，１０／２９／８７，８４２−８４６ページに記述されるように、ＣＯＳ細胞は全ＣＤ２分子をエンコードする遺伝子を含むＣＤＭプラスミドで一時的に形質移入された。
形質移入はＤＥＡＥデキストラン法により行われた。細胞は抗ＣＤ２モノクローナル抗体Ｌｅｕ５ｂ（ベクトン−ディキンソン）およびＬＯ−ＣＤ２ａで、染色のための正の対照としてのＭＨＣクラスＩに対する抗体であるマウスＷ６３２で、また対応するイソタイプ適合対照で染色された。反応性の特異性は無関係のプラスミドで形質移入されたＣＯＳ細胞に同一パネルのモノクローナル抗体を結合させたものを評価して確認された。
一時的に発現された天然ＣＤ２上のこれらモノクローナル抗体の染色パターン（図２８）は、ＣＤ２による形質移入がＣＤ２に結合するＬＯ−ＣＤ２ａの性能を支援して両抗体の結合に導くことを示している。
この発明の目的に適したＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体の調製はここで示される教訓から当業者にとっては明らかである。
ここで説明されるタイプの抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害し、細胞表面のＣＤ２発現の密度を減少し、従ってＣＤ２＋Ｔリンパ球を少なくするため、この発明に従って生体内に投与することが出来る。
かくして例えば生体内処理において、このようなＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は免疫応答を予防しおよびもしくは阻害し、こうしてＴ細胞活性化および増殖を阻害するために投与される。
前記記載のタイプの抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、細胞表面にあるＣＤ２＋発現の密度を減少させ、ドナー細胞のＣＤ２＋細胞数を少なくさせるためにこの発明に従って半ビボで投与される。半ビボ処置においてその例として必ずしもそれに限定されないが、そのような抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、移植に際して対宿主性移植断片の発病を予防するために、移植に先立ちドナーの骨髄に注入されるであろう。
このような生体内あるいは半ビボ手法において、抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は薬理的に許容出来る担体（キャリア）で投与される。このような担体の代表例として、標準食塩水、緩衝液などが言及される。この薬理的担体は従来の技術で周知であり、適切な担体の選択はここに含まれる教訓から当業者の範囲内にあるものと見做される。
この発明のＬＯ−ＣＤ２ａ抗体あるいは他の分子は静脈内あるいは筋肉投与などにより生体内投与される。
前記記載の通り、この発明のＬＯ−ＣＤ２ａの抗体あるいは他の分子は移植片拒絶反応を阻害するための有効量で生体内に投与される。この出願の目的のため「有効量」という用語は、望ましい効果、すなわち移植片拒絶の阻害あるいはＴ細胞活性化の阻害を作り出すことの出来るモノクローナル抗体量を意味する。一般にこのような抗体少なくとも１ｍｇの量で投与される。それより少ない量で使用出来ることも理解されねばならない。加えて最初の投与後に、前記記載の量がもし必要とあれば続く治療の際には少なくされることもある。かくしてこの発明の範囲はこのような量で限定されることはない。
この発明の実施例に従って、Ｔ細胞活性化および移植片拒絶の阻害を継続するためにこのような抗体が繰返して投与される。かくしてその例として必ずしもそれに限定されないが、抗体は１時間から２時間にわたり約１ｍｇ／用量から約５０ｍｇ／用量で薬理的許容担体懸濁液として１日１乃至２回、必要に応じて約８日間からそれ以上にわたり静脈内注入により投与することが出来る。このような移植片拒絶の治療は、移植に先立ちあるいはその直後、もしくは移植片拒絶が生じた直後に開始される。この治療は、移植に対する選択的反応不全状態を誘導するために、移植が開始した時１，２日の出来るだけ少ない日時に１日１〜２回行うことが出来た。この発明に従って、抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子を投与することに関連する自己免疫疾患のこのような治療は、病理的免疫応答を阻害することが望ましいと所属医師が決定した時点で開始される。
Ｔ細胞の活性化を阻害するこの発明の手法は、Ｔ細胞活性化を阻害し、あるいは移植片拒絶もしくは対宿主性移植片病を阻害するために単独で、あるいは他の手法、薬剤あるいは化合物と併用して用いることが出来る。
この発明は後述する実施例に関連して詳細に説明され、これは実証的ではあるがこの発明の範囲を限定するものではない。
実施例で使用される細胞、培養、ｍＡｂおよびマイトジェンは従来の当業者に周知で実施されてきた方法および処置により調製され、使用することが出来る。以下はその後に続く各実施例で使用される細胞、培養、ｍＡｂおよびマイトジェンの調製および使用に利用することの出来る一つの方法あるいは処置についての一つの実施例である。
細胞および培養
ＰＢＭＣは当地の血液ドナーセンターで得られたヘパリン添加血液を沈降させたフィコール−ハイパック（スエーデン，ファルマチア社）より得られた。分離されたＰＢＭＣは富化培地：ペニシリン１０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、２０％のヒトＡＢプール血清あるいは１５％の熱不活性化牛胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ベルギー、ジブコ社）内で再懸濁された。ＰＢＭＣは１×１０５細胞数／ウエルで９６個のＵ型ウエルマイクロプレート（ファルコン社）内で培養培地／ウエルの最終容量２００μｌにして培養された。両方向ＭＬＣは前記の培養培地と同量で各ドナー／ウエルの１×１０５細胞数で行われた。すべての培養は３個ずつ作られた。結果に示した時点の８時間前に３Ｈ−Ｔ（ベルギー，アメルサム社；２４７．９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；６．７Ｃｉ／ｍｍｌｏ）２．０μＣｉ／ウエルでパルス標識され、培養にとり込まれた放射性同位元素はベータカウンター（ベックマン社、Ｌ５  ６０００  ＳＥ）内で液体シンチレーションにより定量された。阻害の割合は以下のように計算された：阻害パーセント＝［１−（検定培地の平均ｃｐｍ／対照培地の平均ｃｐｍ）］×１００。すべての結果は３個の独立培地の平均値で表現される。標準偏差はこれらの値がグラフに示されているものを除きいつも平均値の１５％以下であった。
細胞蛍光定量分析がコンソート３０プログラムを装備したヒューレットパッカードハードウェアと共にファクスキャン細胞蛍光グラフ（ベクトン・ディキンソン社）を用いて行われた。リンパ球および芽細胞染色の独自分析はサイズおよび粒状度を決めて差動ゲーティングを用いることが出来た。各サンプルに対し２５，０００事象が分析された。これらの実験でＬＯ−ＣＤ２ａ最終濃度は特に示されたものを除き２００ｎｇ／ｍｌであった。
ｍＡｂおよびマイトジェン
ＬＯ−ＤＲＡおよびＬＯ−Ｔａｃｔ−１（いずれもＦＩＴＣ標識）は出願人の研究所で生産されたラットｍＡｂである（見解引用、アッシュ．バザン（編集），１９９０，２８７ページ）。ＬＯ−Ｔａｃｔ−１はＩＬ−２レセプターのｐ５５鎖に向けられる（見解引用文献、アッシュ．バザン「免疫学」、１９８４，およびジャンツェン，エム，バック，デ．およびメイノー，ヴェ．セ．，「白血球タイピングIV白細胞差動化抗原」ドゥブルヴェ．ナップ（編集），オクスフォード・ユニバーシティ・プレス，１９８９，４０３ページ）。マウス抗ヒトＣＤ２および抗ＣＤ３ｍＡｂ（Ｌｅｕ−５ｂおよびＬｅｕ−４ａ−ＦＩＴＣ標識）はベクトン・ディキンソン（ベルギー）から得た。マウス抗ヒトＣＤ４あるいは抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（フィコエリトリン標識）およびマウスＩｇＧ  ＦＩＴＣあるいはフィコエリトリン標識（陰性対照）はコールターから得た。ＯＫＴ３（ベルギー，オルト−シラーグ）は１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用された。フィトヘマグルチニンＡ（ＰＨＡ：英国，ウエルカム・ラブス）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ：アメリカ合衆国，カルビオケム社）は１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの最終濃度でそれぞれ使用された。
ＬＯ−ＣＤ２ａのビオチン化
精製ＬＯ−ＣＤ２ａの濃度はｐＨ８．４の重炭酸ソーダ緩衝液０．１Ｍ内で１ｍｇ／ｍｌで調節された。ＮＨＳビオチン（ベーリンガーマンハイム１００８９６０）が１．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解された。各ＭＡＢに対しＮＨＳビオチン溶液が加えられた。混合物は大気温度で２時間回転された。抗体各ｍｌに対してｐＨ８．０の２ＭトリスＨＣｌ，０．１ｍｌを加え（大気温度で１０分間）、次いで抗体各ｍｌに対しリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にＢＳＡ１％の１ｍｌを加えることによりこの反応は行われた。遊離ビオチンを除去するために、溶液はＰＢＳ１０００容量で４℃で一晩透析された。ビオチン化反応および接合ｍＡｂはアルミニウムホイルでおおい一晩明かりから保護された。
赤血球（ＲＢＣ）の溶解
ＲＢＣは全血液から塩化アンモニウムによる溶解で取り出された。１００ｍｌの容量に対しＮＨ４Ｃｌ  ９０ｇ、ＫＨＣＯ３  １０ｇ、ＥＤＴＡ  ３７０ｍｇ、および水からなる１０×保存溶液が調製された。１×塩化アンモニウム４０ｍｌｓが血液の各１０ｍｌに加えられ１０分間室温で保温された。混合物は次いで１２０ｒｐｍで１０分間遠心分離され、ペレットはアジ化物０．１％のＰＢＳ１０ｍｌで再懸濁された。
末梢血の染色
染色は円底の９６個のウエルクラスタープレート（コスター＃３７９０）で４℃で行われた。単一色染色のために、ｍＡｂ１０μｌがヒト免疫グロブリン０．２ｍｇを含むＰＢＳで適切に希釈され、各ウエルに加えられた。赤血球除去血液はウエル当り９０μｇの量でプレートに配分された。細胞およびｍＡｂはおだやかに軽打して混合され、３０分保温された。冷却ＢＰＳ５０μｌが各ウエルに加えられ、プレートは１９００ｒｐｍで２分遠心分離された。上澄みがプレートの逆転およびプレートの軽打で捨てられた。細胞はプレートをカウンターで軽打して分散された。洗浄処置は冷却ＰＢＳ２００μｌを加えて２回繰返された。ヤギＦ（ａｂ′）２抗ラット１ｇ−ＦＩＴＣの１／２０希釈液１０μｌが各液の分散細胞に加えられ、暗がりで３０分保温された。細胞は各ウエルに冷却ＰＢＳ１８０μｌを追加して洗浄され次いで１９００ｒｐｍで２分遠心分離された。上澄みは捨てられ、細胞は分散され、冷却０．５％のパラホルムアルデヒド２００μｌが各ウエルに加えられた。細胞は管（ファルコン＃２０５４）に移され、０．５％パラホルムアルデヒドで約０．５ｍｌに希釈された。サンプルはリシスＩＩソフトウェアを用いてベクトン−ディキンソン・ファクスキャン機で評価された。
二重染色が同様の実験記録により実施された。細胞は第一次ｍＡｂおよびＦＩＴＣ接合抗ラット試薬で保温された後、標準マウス血清の１／５希釈液が抗ラット試薬にあるいずれかの残存部位を遮断するために加えられた。１５分の保温（洗浄なし）の後、既知のＣＤ決定因子に特異的なＰＥ標識ｍＡｂ２０μｌが加えられ３０分保温された。細胞は洗浄され単一染色で説明した通りに固定された。
実施例１
ＬＯ−ＣＤ２ａはラット（ＩｇＧ２ｂ−カッパ）抗ＣＤ２モノクローナル抗体で、出願人の研究所で生産され特性が明らかにされており、別途示されている（下記引用文献参照：ズィーア，エイチ．，ラヴェット，エイ．エム．，ラタンヌ，デ．，ニナンヌ，ジ．，ドブリュイエール，エム．，ソーカル，ジェ．，およびバザン，アッシュ．「ラットハイブリドーマおよびラットモノクローナル抗体」アッシュ．バザン編、シーアールシー  プレス社，ボカレイトン，フロリダ，１９９０，３０９ページ。およびラヴェット，エイ．エム．，ラタンヌ，デ．，セゲール，ジ．，マヌーヴリーエ，ペ．，ニナンヌ，ジ．，ドブリュイエール，エム．，バザン，アッシュ．およびソーカル，ジェ，「ラットハイブリドーマおよびラットモノクローナル抗体」アッシュ．バザン編、シーアールシー  プレス社，ボカレイトン，フロリダ，１９９０，２８７ページ）。ＬＯ−ＣＤ２ａは免疫親和性クロマトグラフィーにより腹水症液から精製されたが、これは生じるハイブリドーマを受け入れるラットの免疫グロブリンとハイブリドーマより分泌されるｍＡｂとの間に存在するアロタイプの差異を利用するものであった（バザン，アッシュ．，コルモン，エフ．およびデクラーク，エル．，「免疫学方法論ジャーナル」１９８４，７１巻、９ページ）。これは図１にあるマウスｍＡｂ  Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標識）により染色された全集団、およびマウスＴ１１（ローダミン標識）ｍＡｂ（（データは示されていない）（図１参照））により標識された約９０％の集団を認識する。ＣＤ−２分子上のＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されたエピトープは、抗ＣＤ２マウスｍＡｂ  Ｌｅｕ−５ｂおよびＴ１１により認識されたエピトープとは異なる。
実施例２
ＬＯ−ＣＤ２ａはＰＢＭＣに対してマイトジェン作用ではなく調節作用を示す。
ラットｍＡｂ  ＬＯ−ＣＤ２ａの休止リンパ球に対する作用を測定するために、ＰＢＭＣがこのｍＡｂの濃度を次第に増加させる状態で保温された。表１で見ることが出来るように、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で６日間保温されたＰＢＭＣは、対照培養と比較して３Ｈ−Ｔ取り込みの割合に著しい変化を示してはいない。この期間の終りの時点での細胞生存度は変化するが、トリパンブル−排除法で評価されるように平均約８０％であった。休止ＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で保温された時、フロー血球計算で評価されるようにいくつかの膜マーカーの表現型発現に著しい変化はなかった。休止成熟Ｔ細胞の細胞マーカー（ＣＤ３，ＣＤ４およびＣＤ８など）はＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下での培養６日間で同じような変化のパターンを示し、またＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ／ｐ５５）などのような活性分子はこれらの実験条件では発現されず、あるいはＤＲ抗原決定因子の場合がそうであるようにＬＯ−ＣＤ２ａにより修飾されない。
ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でＰＢＭＣが６日間保温された時、Ｌｅｕ−５ｂ＋ゲートリンパ球の割合に著しい減少が観察された（図４）。ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球の割合はＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で６日間培養しても影響されないが、これは観察されたＣＤ２帯同リンパ球の減少がこれら細胞の排除に原因するものではなく、むしろＣＤ２分子の消失あるいはＬＯ−ＣＤ２ａの結合により生じる糖タンパク質の立体配座変化に起因するものであることを示している。
観察されたＬｅｕ−５ｂリンパ球の減少がＣＤ２の立体配座変化あるいはＬＯ−ＣＤ２ａの結合後この分子の消失（インターナリゼーションあるいは放出）によるものかどうかを立証するために、ＰＭＢＣがＬＯ−ＣＤ２ａ  ５００ｎｇ／ｍｌの存在下で培養され、Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標識）、Ｔ１１−ＲＤ１（ローダミン標識）およびＭＡＲＫ−３（ＦＩＴＣ標識）を用いて６日間フロー血球計算で分析された。図５ａに示されるように、Ｌｅｕ−５ｂあるいはＴ１１ｍＡｂは、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で２〜４日間の培養後ＰＢＭＣに結合出来ない。この条件下では、培養６日目のマウス抗ラットカッパ鎖ｍＡｂＭＡＲＫ−３標識された５０％の細胞は、もとのＣＤ２帯同細胞の３５％だけがその表面にＬＯ−ＣＤ２ａの存在を示さず、しかもＬｅｕ５ｂ−ＦＩＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１染色のものが２日目で著しく減少したことを示している。これは結合に利用出来ないＬｅｕ５ｂおよびＴ１１のエピトープを与えるＣＤ２の立体配座変更がＬＯ−ＣＤ２ａに応じて発生することを示唆している。
ＣＤ２＋細胞の平均蛍光分析は、このマーカーの発現密度がＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で時間と共に減少したことを示した。Ｌｅｕ−５ｂ  ＦＩＴＣ標識あるいはＬＯ−ＣＤ２ａ（ＭＡＲＫ−１  ＦＩＴＣ標識で明らかにされたもの）がＣＤ２＋リンパ球を検出するため使用されるかどうかという際にも同じ現象が観察された。同一ＰＢＭＣのアリコートがＬｅｕ−５ｂ（商業的に利用出来るｍＡｂでＰＢＳに対し透析され、培養培地で１：２に最終希釈されたもの）の存在下で平行して培養された。図６ｂで示されるようにこれらの実験条件下では、すべてのＣＤ２帯同細胞は（ヤギ抗マウスＦＩＴＣで明らかにされたように）Ｌｅｕ−５ｂ  ｍＡｂで被覆される。Ｔ１１−ＲＤ１による染色は著しく減少し、一方ＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂを認識するエピトープを提示する細胞の割合は少しかつゆっくりと減少することが観察された。これらの結果を考慮して、ＣＤ２分子はＬＯ−ＣＤ２ａに対応してその立体配座を部分的に変更し、また、ＣＤ２／ＬＯ−ＣＤ２ａのゆっくりした調節が起こるということが示される。フロー血球計算で測定されたように、培養の０日目に未刺激ＰＢＭＣに存在する芽細胞数は変化せず（２５，０００事象に対し芽細胞２００〜３００個）、あるいは研究期間中（ラットｍＡｂの存在下あるいは不在下で）減少したが、これは芽体形成でＬＯ−ＣＤ２ａの存在によっては誘発されなかったことを示している。
ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＬＲを阻害する
ＭＬＣが（６日目にわたり）ラットｍＡｂの濃度増加の存在下で行われた時、（３Ｈチミジン（３Ｈ−Ｔ）取り込みで測定されるように）ＭＬＲの著しい阻害が１２５ｎｇ／ｍｌもしくはそれ以下のｍＡｂ濃度で観察された。図６ａにおいて、ＬＯ−ＣＤ２ａによるＭＬＲ阻害の用量応答曲線の典型的な例が示される。この図６ａで見られるように、ＬＯ−ＣＤ２ａは２５０ｎｇ／ｍｌで（６日培養の）ＭＬＲの８０％阻害を誘導し、この阻害率は広範囲の濃度（ｍＡｂ，０．２５−５．０μｇ／ｍｌ）にわたり殆ど一定であり、場合によっては８０％以上になるものもある。図６ｂは培養の０日から６日までのＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの異なった濃度の阻害作用を時間進行で表わしている。（ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下での）ＭＬＣの３Ｈ−Ｔ取り込みの典型的な例は図６ｃで示され、ここでＬＯ−ＣＤ２ａは２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えられた。
図６ｄで（２００ｎｇ／ｍｌで）ＭＬＣの開始後このｍＡｂが異なった時間で加えられる時のＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用が示される。このｍＡｂが０日で加えられる時（３Ｈ−Ｔ取り込みで測定されるように）ＭＬＲの９０％以上の阻害が得られ、ＭＬＣの開始４日後にＬＯ−ＣＤ２ａが加えられる時、この阻害作用は未だ存在（この実施例では４５％の阻害が存在）している。（ここでは示されていないが）同じような結果が（０．２０から５．０μｇ／ｍｌまでの）ＬＯ−ＣＤ２ａにより高い濃度で得られた。
ＬＯ−ＣＤ２ａはＩＬ−２Ｒ発現の経路を遮断する
細胞蛍光定量分析がＭＬＣのリンパ芽球サブセットについて行われた時（図７ａおよびｃ）下記の観察が行われた。ａ）ＭＬＣの開始の際に既に存在していた芽細胞（分析される２５０００事象の約３００−５００芽細胞）の数が対照培養の中で４日から６日までに急激に上昇（分析される２５０００事象から芽細胞１２００以上）した。ｂ）ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で行われるＭＬＣにおいて、培養の全期間にわたり、芽細胞の数には著しい変化は見られなかった。また６日目に芽細胞数は０日における最初の芽細胞数を常に下まわるかあるいは殆ど同じである（図７ａ）。ｃ）ＣＤ２５芽細胞の割合はＬＯ−ＣＤ２ａなしで保温された細胞内で急激に上昇した（図７ｂ）。ｄ）この割合はｍＡｂ存在下で保温されたＭＬＣからの少ない芽細胞数で２０％以下に留まり（図７ｂ）、また（ＣＤ２５発現の尺度としての）平均蛍光は（結果は提示されていないが）対照培養に存在する芽細胞と比較すると７５％減少した。ｅ）ｍＡｂの不在下で、ＣＤ３芽細胞の割合は培養の最初の４日間一定に留まり（図７ｂ）、６日目にＣＤ３細胞の割合は９０％に達し、一方ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でＣＤ３の割合はゆっくり上昇して６日目にようやく約４５％に達する。これらの結果は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在が、ＩＬ−２レゼプター（ＣＤ２５）の発現により特性付けられる活性化の経路でこれら細胞の入れ込みを阻害することを示す。ＣＤ２＋芽細胞数はＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で一定に留まるかあるいは減少し、この膜マーカーの発現密度は、（データは示されていないが）これらの条件下で大きく減少する。
ＭＬＣの休止（非芽細胞）リンパ球サブセットについて表現型分析が６日間行われた時、図３で説明されたものと同様の結果が得られた。ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下では、ＣＤ３＋，ＣＤ４＋あるいはＣＤ８＋リンパ球の割合は、対照培養と比べて著しい変化が検出出来なかった（図８）。６日間培養でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下を問わずＣＤ２５発現（活性化マーカー）は見られなかった。これらの結果は、ＭＬＣにおけるＴリンパ球の休止サブセットに対し、すなわち活性化の過程に入っていないＴ細胞においてはＬＯ−ＣＤ２ａがもしあるとしても非常に弱い作用しか持たないことを示している。同時に図４ｂで示されるように、ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＬＣの期間にＣＤ２＋リンパ球の割合を著しく減少させる。この現象はＬｅｕ−５ｂ  ｍＡｂにより検出されるように平均蛍光の著しい減少を伴うものとなる。
ＬＯ−ＣＤ２ａはＴｃＲ／ＣＤ３複合体あるいはマイトジェンレセプターに依存するＴ細胞活性化の経路を遮断することが出来る。
ＬＯ−ＣＤ２ａがマイトジェン活性化ＰＢＭＣに加えられた時、３Ｈ−Ｔ取り込みの著しい阻害が観察された。培養開始０時間あるいは１時間後のいずれかに加えられるＬＯ−ＣＤ２ａ存在下あるいは不在化で、マイトジェン（ＯＫＴ３，ＣｏｎＡおよびＰＨＡ）を使ってＰＢＭＣの３個の実験が行われた。最初の場合、マイトジェンは１時間後に加えられた。培養の開始１時間後にＬＯ−ＣＤ２ａが加えられた時、マイトジェンは０時間で加えられた。これは、マイトジェンあるいはＬＯ−ＣＤ２ａを用いるＰＢＭＣの前保温が第２の試薬の追加により影響を受ける事象を誘発出来るかどうかを知るために行われた。培養は９６時間後に３Ｈ−Ｔでパルス標識（６時間）をした後に収穫された。ＬＯ−ＣＤ２ａがマイトジェンの前あるいは後に加えられたかを問わず３Ｈ−Ｔ取り込みの阻害率が５０％以上になることが観察された（図９）。ＭＬＣの開始４日後に細胞が収穫されマイトジェンに曝された時同じ作用が観察された（結果は示されていない）。マイトジェンのみを受け入れた同じ培養と比較して、マイトジェンおよびＬＯ−ＣＤ２ａの両方を受け入れた培養でＭＬＣの開始２日後に３Ｈ−Ｔ取り込みの著しい減少が見られた（結果は示されていない）。マイトジェン追加の前にＬＯ−ＣＤ２ａを用いるＭＬＣの前保温はＯＫＴ３の無いＭＬＣと比較出来る値にまで３Ｈ−Ｔ取り込みを下げた。
ＬＯ−ＣＤ２ａはマイトジェン誘導増殖の開始１日前に加えられた場合には、それはマイトジェン誘導増殖を阻害することも出来た。２人のドナーで行われた実験結果は図１０で示される。ＰＭＢＣはマイトジェン（ＯＫＴ３，ＣｏｎＡおよびＰＨＡ）と一緒に保温された。これらの実験で、ＬＯ−ＣＤ２ａは培養の開始後０時間（０日）、２４時間（１日）あるいは４８時間（２日）で加えられた。ＬＯ−ＣＤ２ａによりＯＫＴ３およびＣｏｎＡに応答する増殖の阻害は、０時間でのマイトジェン追加の２４時間後に加えられた場合に著しいものがあった。
実施例３
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の阻害
ＰＢＭＣはフィコルハイパック沈降法によりヘパリン添加血液から分離された。洗浄の後、富化培地に懸濁されたエフェクター細胞は単核細胞を（付着により）除去するためにファルコンプレート内で１×１０６／ｍｌの濃度で１晩保温された。
標的細胞（Ｋ５６２細胞系）は５１クロム５１Ｃｒ（アメルサム、３×１０６／ｍｌでの細胞懸濁液０．９ｍｌ＋５ｍＣｉ／ｍｌ５１Ｃｒ溶液０．０２ｍｌ）で一晩保温されて標識された。
１６時間保温後、エフェクター細胞および標的細胞は４回洗浄され、計数され、異なったＥ／Ｔ（エフェクター細胞／標的細胞）比率：２００／１（エフェクター細胞４×１０６／ｍｌの懸濁液１００μｌ対標的細胞２×１０４／ｍｌの１００μｌ）、１００／１，５０／１および２５／１で９６個のＶ底マイクロプレートで保温された。
４時間保温の後、５１Ｃｒ放出がガンマカウンターで各ウエルからの上澄み１００μｌを計数することで測定された。
最大値（標的細胞＋ＨＣＬＩＮ）および自然放出（標的細胞＋富化培地）は特異細胞溶解率を計算して用いられた。
0003711143.tif 000002
２個の正常ドナーでのＮＫ検定においてＬＯ−ＣＤ２ａを５，１および０．５ｕｇ／ｍｌを含めたもの（図１０ａおよび１０ｂ）は、抗体のすべての試験濃度のものおよびすべての試験Ｅ／Ｔ比率にわたり約５０％の細胞毒性の阻害をもたらした。これは０．２５ｕｇ／ｍｌあるいはそれ以上での用量でのＭＬＲにおいて基本的に完全な増殖阻害を行うものと比較される。
実施例４
非ヒト霊長類における生体内研究
材料および方法
モノクローナル抗体
ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣはＦＩＴＣで結合されたラット１ｇカッパ１ｂアロタイプに指向するマウスｍＡｂである。ＭＡＲＧ２ｂ−ビオチンはビオチンで接合されたマウス抗ラット１ｇＧ２ｂ免疫グロブリンｍＡｂである。これら２個のｍＡｂは出願人の研究所で生産され標識された。免疫蛍光法テストで、これらのｍＡｂは２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用された。Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ（ベクトン−ディキンソン）およびＴ１１ローダミン（コールター）は、２個のマウス抗ヒトＣＤ２  ｍＡｂである。Ｔ４−およびＴ８−ローダミン標識（コールター）はそれぞれマウス抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８ｍＡｂである。
表現型分析
抗ヒトＴ細胞ｍＡｂ（抗ＣＤ２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、前記参照）が全血液のサンプル１００μｌに加えられ、４℃で４５分保温された。赤血球細胞はトリス緩衝塩化アンモニウム溶菌緩衝液（ＮＨ４ＣＬ１  １４４ｍＭ、トリス１７ｍＭ、ｐＨ７．２）で溶菌され、リンパ球はＰＢＳ／ＦＣＳ２％／ＮａＮ３  ０．２％で洗浄された。非標識ｍＡｂの検出に対して、第２のｍＡｂ（ＦＩＴＣ−あるいはビオチン接合体）が２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えられた。４℃で４５分間保温後、細胞はＰＢＳ／ＦＣＳ／ＮａＮ３で洗浄された。ビオチン追加ｍＡｂに対しては、更にストレプトアビジン−フィコエリトリン接合体を使って保温（１５分）が行われた。標識ヒトあるいはサルリンパ球はホルマリン溶液２％で再懸濁され、溶菌ＩＩプログラムを備えたファクサン細胞血球蛍光光度計（ベクトン−ディキンソン）でサイズ対粒度の計数としてリンパ球のゲーティングを分析された。非特異的染色のための対照として、細胞のアリコートがＦＩＴＣあるいはフィコエリトリン接合マウス１ｇｓ（コールター）で保温された。
循環Ａｂｓの水準
血清中のＬＯ−ＣＤ２ａは、第１層（被覆物）としてマウス抗ラットＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（出願人の研究所で生産されたＭＡＲＧ２ｂ−８）および検出のためのワサビダイコンペルオキシダーゼに共役された抗ラットカッパ鎖（ＭＡＲＫ−３）ｍＡｂを使ってエリザで定量された。要約すると、マイクロタイタプレート（ファルコン）はＭＡＲＧ２ｂ−８（５μｇ／ｍｌ）の１００μＬ／ウエルで一晩保温され、プラスチックの占拠されていない部位は粉ミルク（ウシ）５％を含むＰＢＳで飽和された。室温で１時間保温した後、プレートはとウィーン−２０，  ０．１％を含むＰＢＳで洗浄され、希釈サル血清あるいはヒト血清１００μｌ／ウエルで１時間保温された。未結合材料を洗い落とした後、プレートはＭＡＲＫ３−ペルオキシダーゼ（ＰＢＳ  ２  μｇ／ｍｌ）１００μｌ／ウエルで１時間保温された。再び洗浄した後、プレートはＨ２Ｏ２，０．０３％を含むクエン酸塩−りん酸塩緩衝液内でＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド、０．４ｍｇ／ｍｌ、シグマケミカルズ）を使って保温された。染色反応製品は４９２ｎｍで検出された。標準曲線は対照サル血清あるいはヒト血清のプールで連続的に希釈された精製ＬＯ−ＣＤ２ａの既知の濃度で平行にされた。
サルあるいはヒト抗ＬＯ−ＣＤ２抗体の検出は、ＬＯ−ＣＤ２ａ（５μｇ／ｍｌ）で被覆された９６個のウエルマイクロプレートを用いてエリザで行われた。プレートに結合した抗ＬＯ−ＣＤ２ａヒトあるいはサル抗体は、ラット抗ヒト１ｇＭ（ＬＯ−ＨＭ−７）あるいは１ｇＧ（ＨＯ−ＨＧ−２２）ｍＡｂで標識されたワサビダイコンペルオキシダーゼにより明らかにされた。
Ａ．マカクザル
１匹のマカクザルがＬＯ−ＣＤ２ａ，１０ｍｇ／日を３回連続して受け入れた。モノクローナル抗体は十分に寛容化された。
リンパ球の失血状態は最初の注射の後観察されたが、第２および第３の注射の後、追加の失血状態は非常に低かった。
第２のサルは２０ｍｇ／日を１０日間受け入れた。ｍＡｂは同じく十分に寛容化された。吐気あるいは胃腸障害の何らの徴候もなく、動物は活性で、敏活で十分に食事をしており、服用後には副作用は観察されなかった。
第２のサルのリンパ球計数および細胞集団が図１９および２０で要約される。ＮＫ活性は注射１０回の後僅かに減少した（図２１）。ｍＡｂの循環水準は非常に高く（図２２）、免疫化は治療の終りで発生した（図２３）。
ヒヒ
ここで説明される実験は、ＬＯ−ＣＤ２ａに対するヒヒの寛容性を測定し、ヒヒリンパ球の膜マーカーのいくつかに対するこのｍＡｂの作用を分析し、また血清にあるＬＯ−ＣＤ２ａの半減期を測定するために行われた。
ＬＯ−ＣＤ２ａでヒヒ細胞を染色すると、ヒヒ細胞と穏当な交差感受性で一致するヒト細胞を染色した場合に比べて著しく低い平均蛍光強度で陽性細胞２０％以下を生じる。
この研究は重さ８．８ｋｇのオスヒヒ(papio mormon)について行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａの各注射の前にサルは麻酔された。最初はケテラーKetaler（２ｍｌ）およびプレイジンPrazine（０．５ｍｌ）で、２回目はケテラーのみでまたそれ以降はケテラーおよびプレイジン（０．３ｍｌ）で行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａは生理血清１００ｍｌで希釈して静脈内（ｉ．ｖ．１０分間）注射された。リンパ球の表現型分析および（ＬＯ−ＣＤ２ａが注射され抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体が新しく形成され、交差感受性ヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体が前もって存在している）循環抗体の測定のために、血液サンプル（１０ｍｌ）が２個の管に採取された。リンパ球型別の管はＥＤＴＡを含んでいた。基線水準を決定する最初の処置に先立ちサンプルが採取された。
ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量（１０ｍｇ）がこの研究の０日に投与された。続いて４個の用量（１０ｍｇ／用量）が７日、８日、９日および１０日目に投与された。各ＬＯ−ＣＤ２ａの用量投与数分後に血液サンプルが採取された。７日および９日には（ＥＤＴＡ含有管に）補充血液サンプルがＬＯ−ＣＤ２ａ注射の前に採取された。血液サンプルは１，２，１１，１２，１３，１６および２４日に採取された。
ＬＯ−ＣＤ２ａ注射の期間あるいは研究の時期を通じて活性あるいは摂食習性に異常な応働は観察されなかった。動物の重さは０日で測定された約８．８ｋｇを維持していた（下記表参照）。
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このヒヒの末梢血リンパ球の蛍光染色はいくつかの興味深い特徴を明らかにした。
ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａの作用の下で、リンパ球のＣＤ２陽性サブセットは、血液中のｍＡｂの最大蓄積時点であるＬＯ−ＣＤ２ａの第５回用量の末端で（２個の異なった抗ＣＤ２ｍＡｂにより明らかにされたように）著しく減少した（図１７ａおよび１７ｂ参照）。リンパ球のＤＣ４＋およびＤＣ８＋サブセットがこの期間に減少しない（図１９）条件下で、またＤＣ４＋およびＤＣ８＋細胞が殆どのＣＤ２帯同リンパ球を含んでいるため、ＤＣ２＋細胞の減少はリンパ球が減少しているのではなく、膜マーカー発現が減少していることを示している。
図１７ａで見ることが出来るように、ＤＣ２＋（Ｌｅｕ−５ｂ＋あるいはＴ１１＋）陽性リンパ球の僅かな減少はＬＯ−ＣＤ２ａの最初の投与の後で観察される。個の最初の投与の２日後、ＣＤ２陽性細胞（Ｌｅｕ−５ｂ＋あるいはＴ１１＋）の水準は開始時の値に上昇した。
ＬＯ−ＣＤ２ａを２４時間間隔で４回投与（７〜１０日目）した時点で、ＣＤ２陽性細胞（Ｌｅｕ−５ｂ＋あるいはＴ１１＋）の割合は急激に減少し、ＬＯ−ＣＤ２ａの投与終了の３日後に徐々に上昇を開始した。
ｂ）同時にＬＯ−ＣＤ２ａ陽性細胞の割合、すなわち循環ｍＡｂにより結合される細胞の割合は、抗ＣＤ２ｍＡｂ，Ｌｅｕ５およびＴ１１により明らかにされたＣＤ２＋で行ったのと同じように、ＬＯ−ＣＤ２ａの第２回投与（７日目）の後２２％上昇し、次いで減少した（図１７）。ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少はＭＡＲＫ−３ＦＩＴＣにより明らかにされた（図１８）。
ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少は、ＭＡＲＫ−３ＦＩＴＣあるいはＭＡＲＧ２ｂ−８ビオチン接合ｍＡｂにより検出されたように、細胞に存在するＬＯ−ＣＤ２ａの検出で測定された（図１８ａ）。循環ｍＡｂにより占拠されていないすべての部位を飽和するために細胞が２．５ｍｇ／ｍｌのＬＯ−ＣＤ２ａでまず保温された場合にも、同じ現象が観察された。ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣあるいはＭＡＲＧ２ｂ−８ビオチンにより検出された（図１８）。
ｃ）図１９で見られるように、ヒヒリンパ球Ｔ４陽性サブセットは、Ｔ４＋リンパ球の割合がその当初の水準に戻った時から９〜１２日間におだやかな上昇を示した。Ｔ４＋細胞の上昇に付随して、Ｔ８陽性リンパ球の割合は９日から１１日目まで上昇した。その日以後、この割合は当初の値にまで戻った。
循環ｍＡｂ  ＬＯ−ＣＤ２ａの水準は最初の注射の３日後にバックグランドの値にまで減少した（図１７ｂ参照）。ＬＯ−ＣＤ２ａが（７日から１０日にかけて）４回短時間間隔で投与される時、血性ＬＯ−ＣＤ２ａの水準（この期間の最大値約３．７ｍｇ／ｍｌ）は最終投与（１０日から１６日）後ゆるやかに減少し、これはこの動物モデルにおけるｍＡｂの半減期が相対的に長いことを示している。ヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は１１，１２，１３，１６および２４日に採取された血液サンプルでは検出されなかった。
結論
ＬＯ−ＣＤ２ａはマカクザルヒヒで明白な反応がないことにより示されるように、非ヒト霊長類により十分に寛容化されているように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａはヒヒにおいては相対的に長い半減期を持つように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の投与より２４時間後（図２４ｂの１日目）、ｍＡｂの最大検出水準の５０％が未だに血清中に存在していた。ＬＯ−ＣＤ２ａの最終投与から３日後（図２４ｂの１３日目）、ｍＡｂの最大検出水準の５０％が未だに血清中に存在していた。
一方、ＣＤ２陽性リンパ球の割合の減少およびそれに続くこの細胞の割合のゆるやかな上昇は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下に培養されたヒトＰＭＢＣ単核細胞で観察されるのと同じような反応の起こる機構（キネティクス）を示している。
実施例５
ＬＯ−ＣＤ２ａ治療患者
特別条件でのＬＯ−ＣＤ２ａ治療患者
患者＃１（Ｍｂ．Ｅ．）
これは慢性腎盂腎炎の女性患者であり、腎臓不全の終期に腎臓同種異系移植の治療を受けた。拒絶反応発症が起こり、ＯＫＴ３で１０日間治療された。クレアチニン水準は２から１．４ｍｇ／ｄｌまで低下した。拒絶反応発症の約４ケ月後それは２ｍｇ／ｄｌのクレアチニン水準および生検により診断され、適度の拒絶反応を示した。患者はソルメドロール１．５ｇおよび続く８日間ＡＴＧコースで治療されたが、８日目のクレアチニン水準は１．６５ｍｇ／ｄｌであった。治療７日後生検が実施され、それは細胞拒絶反応および適度の血管拒絶反応を示した。生検（０日）の２日後、患者は無尿症となりクレアチニン水準は２．４ｍｇ／ｄｌとなった。同日患者はＬＯ−ＣＤ２ａ１０ｍｇ、ソルメドロール１．５ｇ、プラス、ポラリミン（抗ヒスタミンの一種）１ｇ、およびダファルガン（アセトアミノフェン）１ｇを受けた。副作用は見られなかった。２３時間後患者は７００ｍｌの尿を出し、クレアチニンは２．７２ｍｇ／ｄｌであった。次の９日間彼女はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ／日を受けた。患者は１１日にその時点で追跡生検を受けずに退院した。
ＡＴＧ治療期間および続くＬＯ−ＣＤ２ａ治療期間の血清クレアチニン水準の測定は、ＡＴＧ治療にも拘らずクレアチニン水準が上昇し、ＬＯ−ＣＤ２ａを使ってそれが降下し安定した（図２７）。
白血球数はＬＯ−ＣＤ２ａの治療期間に１０，０００の高水準から２，０００にまで低下し、２１日目の最後の測定まで降下を続けた（図２０）。リンパ球数は観察期間中に低水準にあり変動した。
ＬＯ−ＣＤ２ａ血清水準は各治療の直後２．０−３．０μｇ／ｍｌの最高値にまで上昇し、各治療の間に約１．０μｇ／ｍｌの最低水準に低下した（図２１）。９日目の最終治療により、この水準は２４時間後の５０％から１４日目の０まで低下した。この患者は４０日目に病院に戻った。
患者のクレアチニン水準は４０日目に２．２７となり、５０日には２．４８となり、また６６日には３．１１にまで上昇し、その時点で生検が得られ、重症細胞拒絶反応および間隙出血と一致する最初の報告があった。患者は腎臓への放射線１５０Ｒ、ソルメドロール３×１２５ｍｇで治療され、一方シクロスポリン、プラス、ステロイド１２．５ｍｇ／日の維持治療も続けられた。クレアチニン水準は続く期間中にも上昇を続けた。７０日にクレアチニン水準は３．３、８０日には５．６３、８４日には８．３５となった。８５日までにはクレアチニン水準は１０．８となり、移植腎摘出が８８日目に行われた。彼女の１０日目の退院から６６日目の生検までの期間のこの患者の維持免疫抑制への応諾は問題であり、明らかに成功する救助であるにも拘らず腎臓の欠損は不確定な応諾の因子として行動することになる。
(ii)患者＃２
患者はＣ＋肝炎の３８才の男性であった。彼は慢性間隙ネフロパシーによる末期腎臓不全の治療のために腎臓同種異系移植を受けた。１年３ケ月後彼はＯＫＴ３コースに耐性の急性細胞および血管拒絶反応のため移植腎摘出を受けた。
移植腎摘出から１年１０ケ月後、彼は２回目の腎同種異系移植を受けた。３日後の彼のクレアチニン水準は１．４ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。その日以後患者のクレアチニン水準は１．８ｍｇ／ｄｌであった。次の日彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。クレアチニンは３．２５ｍｇ／ｄｌであった。その翌日彼はソルメドロール５００ｍｇを受け、彼のクレアチニンは２．９５ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼のクレアチニン水準は２．３ｍｇ／ｄｌであり、彼は生検を受けたがそれは３プラス細胞拒絶反応を示した。３日後彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、プラスソルメドロール２００ｍｇ、ポララミンならびにダルファガンを与えられた。副作用としては眠気だけであり、過温症や高血圧はみられなかった。次の９日間彼は毎日ＣＯ−ＣＤ２ａ１０ｍｇの治療を受けた。この治療の終続に続く日に生検は拒絶反応の徴候を示さなかった。
患者はどの用量でも発熱あるいは高血圧のない状態を含めて治療副作用の証拠のないようにＬＯ−ＣＤ２ａのコースで十分に寛容化された。治療のコースの間に得られた（ＬＦＴを含む）従来の血液学治療化学実験テストは、抗体の投与に起因する何らの変化も示さなかった。ただ例外としては、リンパ球数が２９０／立方mmから１０／立方mmの低水準に減少し、また拒絶反応発症の消炎に関連するクレアチニン水準の減少（ＬＯ−ＣＤ２ａによる治療開始時２．７ｍｇ／ｄｌからコース終期の１．１０までの減少）がみられた。
図２２はこの患者の血清クレアチニン水準を示し、２．５からＬＯ−ＣＤ２ａによる治療を続けた日に約１．５まで低下したことが示される。患者は治療前および治療期間中はリンパ球減少症であり、白血球数は治療によって大幅な変化を示さなかった（図２３）。この患者においては、ＬＯ−ＣＤ２ａの血清水準は各治療後２．０μｇ／ｍｌ以上には上昇せず、１．０から０．２５μｇ／ｍｌ以下の低水準にまで降下した（図２４）。ＬＯ−ＣＤ２ａによる最初の治療の８ケ月後、この患者は正常な腎臓機能を示し、再発性拒絶反応の証拠はなかった。
患者２−生検＃１−診断：不確定性
生検は約２０個の糸球体を含み、これは目立たない数であった。また低い程度の間隙性水腫を伴う希薄な単核浸潤物があった。程度の軽い管状浸潤が見られたが、血管の病変はなかった。これらの研究成果は急性細胞拒絶反応の診断には不十分であった。小動脈には単核細胞は殆どなかったが、これは疑わしくはあったが、拒絶反応の診断の判断基準には合致しなかった。
患者２−生検＃２，最初の生検の２週間後−診断異常なし
この生検は従来の生検に類似しているようにみえ、約１０個の糸球体を含んでいた。浸潤物は情に希薄で血管病変は確認されなかった。
(iii)患者＃３
患者はフォン・ヴィレブランド病の１９才の人で、慢性腎盂腎炎による末期腎臓不全の治療で腎臓同種異系移植を受けた。ＯＫＴ３、６日コースの不全の後、続発性高血圧を伴う急性血管拒絶反応が生じたため、１７日後に移植は取除かれた。
５ケ月半後、彼は第２回目の腎臓同種異系移植を受けた。１０日目には彼のクレアチニン水準は６ｍｇ／ｄｌであった。その次の日クレアチニン水準は７ｍｇ／ｄｌであり、生検は３プラス細胞拒絶反応および血管拒絶反応（壊死あるいは血栓症のない増殖性動脈内膜炎）を示した。その同じ日に彼はＬＯ−ＣＤ２ａ１０ｍｇ、ソルメドロール４０ｍｇ、ポララミンおよびダファルガンを受けた。副作用はみられなかった。治療終了２日後、彼のクレアチニン水準は１．７５ｍｇ／ｄｌであり、生検は間隙性壊死および１個の慢性拒絶反応の病巣点を持っていたが急性拒絶反応の徴候を示さなかった。
治療上の副作用（ＢＰあるいは温度）は観察されなかった。従来の血液学および（ＬＦＴを含む）診療化学実験テストは抗体の投与に起因する変化を示さなかったが、例外として拒絶反応発症の消炎に関連するクレアチニン水準の減少（ＬＯ−ＣＤ２ａの治療の開始時の７．１０ｍｇ／ｄｌから１０日コースの終りの１．７５ｍｇ／ｄｌまでの減少）がみられた。リンパ球数は治療前３４０／立方mmであり、治療中に２２０／立方mmの低水準にまで降下し、ＬＯ−ＣＤ２ａによる治療の中止後、９日目に６９０／立方mmとなり、治療終結２３日後には１０００／立方mmにまで上昇した。
この患者の白血球数は治療による著しい変化を示さなかった（図２５）。ＬＯ−ＣＤ２ａによる最初の治療から７ケ月後、患者は正常な腎臓機能でうまくやっており、再発性拒絶反応の証拠はなかった。
患者３−生検＃１−診断：小動脈および程度は低いが間質および糸球体に影響する激しい細胞拒絶反応
アーチ形状動脈は弾性繊維の分断により内膜の著しい単核浸潤を示した。そこにはしばしば細管に浸潤する間質の希薄な浸潤物があった。間質はび慢性で軽い間隙水腫を示した。約７個糸球体がそこに存在していた。これらは単核細胞の過剰細胞充実度および内皮腫脹を示している。全体としてのこのパターンは激しい急性細胞拒絶反応の症状を示していた。
患者３−生検＃２，最初の生検から約２週間後−診断：治療拒絶反応に一致
生検は２、３の小動脈を示し、これは時には粘液状物質を伴うが細胞浸潤物が非常に少ない内膜繊維症を示している。間質は微細なび慢性繊維症および最小単核浸潤物を示した。細管は局所的には萎縮していたが他はあまり目立たなかった。活性細胞拒絶反応の証拠はなかった。
(iv)患者＃４
激しい対宿主性移植片病（高容量のプレドニソンに耐性の激しい皮膚、消化管、腎臓および中枢神経系毒性）を患う患者が、同種異系骨髄移植を受けた後、１２日間１０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受け入れた。彼の症候は改善され、腎機能は正常に戻り、下痢はとまり、皮膚も良くなり、錯乱も解決した。４日後抗体は停止し、症候が再発し抗体の第２コースが開始されたにも拘らず患者は死亡した。
ＬＯ−ＣＤ２ａはかくして外来性組織に対する進行性免疫応答を逆転するために使用することが出来る（外来性組織は同種異系および異種を含む。というのはＬＯ−ＣＤ２ａは同種ＭＬＲと同じように異種ＭＬＲを阻害するためである）。抗体は１日に１回乃至２回で１０日から１４日静脈内注入により与えられることになろう。それはまた器官移植の直後に誘導記録の一部としてＴ細胞活性化を予防するために使用することが出来る。
この発明は望ましい実施例において移植拒絶の阻害を目的としているけれども、発明の範囲はそれだけに限定されるものではなく、いずれかあらゆる目的でＴ細胞活性化を阻害するために一般に有用であることは理解されねばならない。
実施例６
キメラ抗体の構築および発現
Ａ．ＬＯ−ＣＤ２ａのＶＨおよびＶＬのクローニングと配列化
チャーグイン（「生化学」１８巻。５２９４ページ、１９７９）方法に従って、全ＲＮＡがＬＯ−ＣＤ２ａ細胞系（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３）から分離された。ｍＲＮＡは次いでオリゴテックス−ｄＴ  ｍＲＮＡキット（カリフォルニア、チャッツワース、キアゲン）を用いて調製された。ｍＲＮＡ約２００〜３００ｎｇがパーキン−エルマー・シータス（コネチカット、ノーウォーク）のＲＮＡ−ＰＣＲキットを用いて逆転写された。この反応は４２℃で１時間行われた。ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅に必要なオリゴヌクレオチドプライマーは下記の引用文献を用いて選択された。１）「免疫学的関心のタンパク質の配列」カバット他、第５版、１９９１。２）オーランディ他「全米科学アカデミー紀要」（アメリカ合衆国）、８６巻、３８３３−３８３７ページ（１９８９）。
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数字はカバット他、１９９１年で示されているように、アミノ酸残基を指す。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が次のような条件：９４℃で１分、６０℃で２分、また７２℃で２分よりなる３０サイクル、９４℃で５分の条件を用いてパーキンエルマーＤＮＡサーマルサイクラー４８０内で実施された。ＤＮＡ断片はキエックスゲル精製キット（カリフォルニア、チェッツワース、キアゲン）を用いてアガロース１％からゲル精製された。断片は次いでカヌンゴおよびパンディの方法「バイオテクニク」１４巻、９１２〜９１３ページ（１９９３）に従って平滑末端化され、ブルースクリプトＫＳＩＩ＋（カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジェン）のＳｍａ  Ｉ部位に結合された。多重クローンはシークエナーゼＴＭＴ７ポリメラーゼキット（オハイオ、クリーブランド，ユー．エス．バイオケミカル）を用いてジデオキシ鎖終結法により配列された。
ＰＣＲに固有の潜在的な誤差率のために、少なくとも３回反応が行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａＶＬおよびＶＨ遺伝子のもっとも普通に観察された配列は、図２９および図３０ａおよびｂで示されており、ここで図２９ａはＭＲＣベクターｈｃｍｖ−ｖｌｌｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏからのリーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶＬ鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、図２９ｂはＬＯ−ＣＤ２ａの遺伝子からのリーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶＬ鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、また図３０ａはＭＲＣベクターｈｃｍｖ−Ｖｈ−Ｌｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏからのリーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶＨ鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示し、図３０ｂはＬＯ−ＣＤ２ａ遺伝子からのリーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶＨ鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
Ｂ．一過性発現のためのベクターへの挿入
ＬＯ−ＣＤ２ａのキメラ軽鎖および重鎖それぞれの発現のために２個のベクターがロンドンにあるメディカル・リサーチカウンシル（ＭＲＣ）から許可された。９．２キロベース軽鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ｖｌｌｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏ）はヒトカッパ定常部のゲノムクローンおよびＨｉｎｄ  III−Ｂａｍ  ＨＩ断片として抗リゾチームのヒト化ＶＬドメインを含む。８．６キロベース重鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏ）はヒトγ１定常部のゲノムクローンおよびＨｉｎｄ  III−Ｂａｍ  ＨＩ断片として抗リゾチームの新形態ＶＨドメインを含む。これらベクターは前田他、「ヒト抗体ハイブリドーマ」２巻、１２４−１３４ページ（１９９１）でより詳細に説明される。
天然シグナルペプチドを含有するＤＮＡ断片が利用出来なかったため、ＬＯ−ＣＤ２ａのＶ領域がＭＲＣベクターに既に存在しているシグナル背後にクローンされた。シグナル断片と共に軽鎖Ｖ領域は以下に述べる独自のＰＣＲ反応から別個に誘導される２個の断片から構築された。
反応１：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ軽鎖ベクターであった。増幅された断片はシグナルペプチドに加えフレームワーク（ＦＲ）１の一部を含有していた。使用された２個のヌクレオチドは下記のものであった。
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アンチセンスプライマーは、抗リゾチームに対するＭＲＣベクターでは見られなかったＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１配列を含んでいた。ＰＣＲ反応はＨｉｎｄIII−ＴｔｈIII断片０．１５キロベースを生産した。
反応２：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａ、ＶＬクローンであった。増幅された断片は（ＴｔｈIII部位から）ＦＲ４末端までＬＯ−ＣＤ２ａ、ＦＲ１を含んでいた。ＭＲＣ軽鎖ベクターで見出される３′未翻訳領域は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＬＯ−ＣＤ２ａの３′末端に付加された。使用された２個のオリゴヌクレオチドは下記のものであった。
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この反応はＴｔｈIII−Ｂａｍ  ＨＩ断片０．３５キロベースを産出した。両ＰＣＲ製品はキエックスＱｉａｅｘを用いてゲル精製され、適切な酵素を用いて制限された。ＨｉｎｄIII−Ｔｔｈ  III断片プラスＴｔｈ  III−Ｂａｍ  ＨＩ断片は次いで３系連続でブルースクリプトのＨｉｎｄ  IIIおよびＢａｍ  ＨＩ断片の間で連結された。ＬＯ−ＣＤ２ａの全ＶＬ領域に加えてＭＲＣシグナルペプチドを含有するこの構築物は次いで配列化された。
重鎖ＬＯ−ＣＤ２ａ、Ｖ領域構築物はその５′末端にＭＲＣシグナル配列を、またその３′末端に同じくＭＲＣ  Ｈ鎖ベクターから誘導される長３′未翻訳領域を含む。最終構築物は３個の別個のＰＣＲ反応から以下のようにして作られる。
反応１：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ  Ｈ鎖ベクターであった。抗リゾチームのＶＬおよびＶＨ遺伝子が同じシグナルを使用するため、センスプライマーはＬＯ−ＣＤ２ａ構築物に使用されたもの、すなわち５′Ｖ１ｌｙｓｓｉｑと同じであった。アンチセンスプライマーは３′ＶＨｌｙｓｓｉｑであった。
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この反応はＭＲＣシグナルに加えてＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１の一部を含むＨｉｎｄIII−Ｐｓｔ  Ｉ断片０．１６キロベースを生産した。この断片はゲル精製され、制限され、かつ配列化のためＨｉｎｄIII−Ｐｓｔ  Ｉ切断ブルースクリプトに連続された。
反応２：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプトのＬＯ−ＣＤ２ａＶＨ領域であった。この反応はＶＨ領域の殆どを含むＰｓｔ  Ｉ  −Ｓｔｙ  Ｉ断片０．３キロベースを産出した。ＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ３には内部Ｐｓｔ  Ｉが存在していたために、Ｐｓｔ  Ｉ−Ｓｔｙ  Ｉ断片は下記のように２個のＰＣＲ反応から際構築されねばならなかった。
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前記の鋳型ＤＮＡはクローン８２−８、ブルースクリプトにあるＬＯ−ＣＤ２ａＶＨであった。
反応Ａ：オリゴヌクレオチド、以下オリゴ１および２として引用する、をプライマーとして使用し、断片０．２キロベースを産出する。
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前記オリゴ２および３はヌクレオチド配列内での変化を含み、それは、ＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸配列を変化させることなく内部Ｐｓｔ  Ｉ部位を移動させる。前記反応ＡおよびＢのオーバーラップ生成物のアリコート（２−５μｌ）は、組合され、第３ＰＣＲ反応のための鋳型として役立つ。この反応のオリゴヌクレオチドプライマーは前の図表の番号１および４であった。生成物０．３キロベースはキアックスで精製され、Ｐｓｔ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで制限された。断片がそのまま残ったために、内部Ｐｓｔ  Ｉ部位は成功裡に突然変異された。
反応３：最終ＶＨ断片はＭＲＣ重鎖ベクターを鋳型とて使用し生産された。このＳｔｙ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片０．２３キロベースは、ＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ４の一部およびＭＲＣベクターからの全３′未翻訳領域を含有していた。使用されたプライマーは以下のものであった。
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生成する断片はゲル精製され、Ｓｔｙ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで制限された。Ｐｓｔ  Ｉ−Ｓｔｙ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉ  −Ｂａｍ  ＨＩ断片は次いで配列化のためＰｓｔ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ切断ブルースクリプトに連続された。
すべてのヌクレオチドはアプライド・バイオシステム合成機で合成された。すべての配列化反応はシークエナーゼＴＭＴ７ポリメラーゼキット（オハイオ州、クリーブランド、ユー．エス．バイオケミカル）を用いて実行された。すべたのＰＣＲは下記の実験記録を使って実施された。９４℃  １分、５０℃  １分、７２℃  ２分、最終延長７２℃  ５分よりなる３５サイクル、９５℃  ５分。
正しい配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａＶＬおよびＶＨ断片はブルースクリプトから移され、それぞれＭＲＣ軽鎖および重鎖のＨｉｎｄ  IIIおよびＢａｍ  ＨＩ部位の間にクローンされた。Ｈ鎖にとって、５′Ｈｉｎｄ  III−Ｐｓｔ  Ｉ断片はまずブルースクリプトにある構築物（Ｐｓｔ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ）の残渣に結合され、全Ｈｉｎｄ  III−Ｂａｍ  ＨＩ断片は次いでＭＲＣベクターにクローンされた。
Ｃ．ＶＨおよびＶＬのＮ末端アミノ酸配列化
Ｎ末端アミノ酸配列分析がマサチューセッツ、ケンブリッジ、ハーバード・マイクロケミストリー・ラボラトリーによりＲＮＡ−ＰＣＲを用いて得られる配列を確認するためにＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖および軽鎖のサンプルについて行われた。サンプルは下記の通り用意された。
ＬＯ−ＣＤ２ａの２００μｇがＢメルカプトエタノールの存在化でＳＤＳポリアクリルアミドゲル流量１２％を通して適用された。電気泳動に続き、タンパク質はウエスタン移転器を用いてＰＶＤＲ膜に移転された。膜はポンソーＳで短時間染色され、酢酸１％で着色を取り除かれ、軽鎖および重鎖バンドは真空中で乾燥されアミノ酸分析およびＮ末端配列化を求められた。
ＬＯ−ＣＤ２ａＶＨの最初の２０残基のアミノ酸配列はクローン配列と完全に一致した。しかしＶＬの配列はＦＲ１にある２、３および７の残基がクローン遺伝子によりコードされたものとは異なることを示した。これらの差異は、すべて前に引用され文献から得られる最良の推量配列に基づいてクローニング目的に使用されるＰＣＲプライマーに存在する。
Ｄ．Ｎ末端アミノ酸配列のＤＮＡ配列確認とその補正
この配列を補正し同時にＬＯ−ＣＤ２ａのＶＬおよびＶＨ双方の天然シグナルペプチドをクローンするために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲが用いられた（Rapid Amplification of cDNA Ends;ｃＤＮＡ末端の急速増幅）：ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのｍＲＮＡは逆転写され、生成するｃＤＮＡはｄＧＴＰの存在下で末端トランスフェラーゼを用いて３′末端でＧ尾部結合された。ｃＤＮＡは次いでＧ尾部に相補的な３′オリゴヌクレオチドおよび５′オリゴヌクレオチドを使って増幅された。サブクローニングを単純化するために、適切な制限部位が各オリゴヌクレオチドの５′末端に加えられた。
ｃＤＮＡの調製のために使用されるオリゴヌクレオチドは下記の通りであった。
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ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応は下記の実験記録を用いて行われた：９４℃  ３０秒、５０℃  ３０秒、７２℃  ５０秒、次いで７２℃で５分延長を含む４０サイクル、９４℃  ５分。
ＬＯ−ＣＤ２ａＶＬおよびＶＨのために得られたＰＣＲ製品はキアエックスを用いてゲル抽出された。ＶＨ断片はＸｈｏ  ＩおよびＳｔｕ  Ｉで制限され、Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓｍａ  Ｉ切断ブルースクリプトに結合された。ＶＬ断片は平滑末端化されＳｍａ  Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。多数のクローンが軽鎖および重鎖Ｖ領域のために配列化され、シグナル配列が確認された。
免疫グロブリンで見出されるシグナル配列は一般にイントロンを有しているため、これらの配列は発現に重要となる。ＶＬおよびＶＨリーダー配列を含むゲノムクローンは同様に確認された。ゲノムＤＮＡは次のように調製された：４×１０７ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞は撚りをかけられ、冷却ＰＢＳで洗浄され、撚りをかけられ、再びＰＢＳで洗浄された。細胞は新鮮な追加プロティナーゼと共に消化緩衝液０．４ｍｌ内で再び撚りをかけられた。この混合物は５０℃で１２〜１５時間振られながら保温され、フェノール／フロロホルム／イソアミルアルコールの等量で抽出され、１７０００ｘｇで撚りをかけられた。水相のものは清潔な管に移され、７．５Ｍアンモニウムの１／２量およびエタノール９５％の２量が付加された。ＤＮＡは２分間１７００ｘｇの撚りかけによりペレット化された。このペレットはエタノール７０％を使って洗浄され空気乾燥された。ペレットは８０ｍｌのＴＥ、ｐＨ８．０で再懸濁された。
鋳型として細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａから得られたゲノムＤＮＡを使用して、ＶＬおよびＶＨ双方のゲノムリーダー配列、同じくユニーク制限部位（ＶＬにとってはＳｐｈ  Ｉ、ＶＨにはＰｓｔ  Ｉ）で終結するフレームワーク領域の一部を増幅するために、下記のオリゴヌクレオチドが指名された。
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ＰＣＲ反応は下記のように実施された：ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、オリゴＬＶＬおよびＢＫＡ（ＶＬ断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌあるいはＬＶＨおよびＰＶＨＡ（ＶＨ断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌ、１mmｄＮＴＰ１００μｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液１０μｌ。ｐｆｕ、ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジェン）１ｍｌ（２．５ユニット）、１００μｌまでの脱イオン水。ｐｆｕはタックポリメラーゼよりその精度が大きいために使用された。
反応条件は以下の通りであった：９４℃  ５分、５０℃  ５分、９４℃  １分の３５サイクル、５０℃  １分、７２℃  １分、続けて７２℃  ５分。ＰＣＲ製品はゲル精製され、制限され、配列化のためブルースクリプトに連結された。正しい配列を含むクローンが一度確認されると、これらクローンを含むブルースクリプトベクターはＨｉｎｄ  IIIおよびＳｐｈ  Ｉ(VＬ)であるいはＨｉｎｄ  IIIおよびＰｓｔ  Ｉ（ＶＨ）で切断され、断片はゲル精製された。Ｈｉｎｄ  III−Ｓｐｈ  Ｉ断片０．７５キロベースは次いでＨｉｎｄ  III−Ｓｐｈ  Ｉ断片が除去されたもとのＬＯ−ＣＤ２ａＶＬ構築物を含むブルースクリプトに連結された。新しい構築物は天然のＬＯ−ＣＤ２ａシグナルに加えてイントロンおよび（Ｎ末端配列と一致する）補正されたＦＲ１配列を含んでいた。Ｈｉｎｄ  III−Ｐｓｔ  Ｉ断片は、Ｈｉｎｄ  III−Ｐｓｔ  Ｉ断片が除去されたもとのＬＯ−ＣＤ２ａＶＨを含むブルースクリプトに連結された。新しい構築物は天然シグナル＋イントロンを含んでいた。新しく構築されたＶＬおよびＶＨ断片は、次いでＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除去され、ＣＯＳ細胞の発現のためにそれぞれＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターにクローンされた。
Ｅ、ＣＯＳ細胞における一過性発現
ＣＯＳ７細胞は、ＡＴＣＣより入手され、胎仔ウシ血清（ＥＢＳ）を使ってダルベッコ最少必要培地（ＤＭＥＭ）で成長した。最適の形質移入は粘着細胞の密集度約５０％で達成された。形質移入を用意するために、プラスミドＤＮＡがヌーセラム（ＮｕＳｅｒｕｍ）およびＤＥＡＥ−デキストラン／二リン酸クロロキンを含むＤＭＥＭに付加された。ＣＯＳ細胞培地は除去され、ＤＮＡ混合物は付加され、細胞は３時間３７℃で保温された。この培地は次いで除去され、ＰＢＳ内でＤＭＳＯ１０％が細胞に２分間加えられた後、除去された。ＦＢＳ１０％のＤＭＥＭが細胞に付加された。一晩保温の後、培地は取替えられ細胞は２日間３７℃で保温された。上澄みはキメラ抗体の分泌のためエリザ検定用として採取された。
Ｆ．エリザによる分泌キメラの検出
キメラ抗体の分泌は、ヒト抗体（あるいはその一部）の存在を検出するように設計されたエリザにある形質移入ＣＯＳ細胞からの上澄みの検定により確認された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５μｇ／ｍｌの濃度にまで希釈され、一晩４℃での保温によりエリザマイクロタイタプレートのウエルに結合された。プレートはエリザプレートウォッシャーを使って３回洗浄された。
残存遊離部位は３０分間室温でウシ血清アルブミン１％を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）２００μｌを付加することによって遮断された。上澄みおよび陽性対照参照標準（精製ヒトＩｇＧ１Ｋ）の２倍希釈液がＰＢＳ−ＢＳＡで用意された。培地のみおよびもしくはＰＢＳ−ＢＳＡのみが陰性対照を構成した。抗体希釈液および対照がウエルに付加され、室温で１．５時間保温された。プレートは次いでトウィーン２０、０．０５％を含むＰＢＳのプレートウォッシャーで３回洗浄された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異性）−ワサビダイコンペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗体あるいはヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ＨＲＰ接合抗体の適切な希釈液が各ウエルに付加され、室温で１時間保温された。プレートは前記ＰＢＳ−トウィーン２０で洗浄され、その後過酸化水素を含む発育中の基質が付加された。結合抗体は４０５ｎｍの波長での吸光度を読み取ることで検出された。
Ｇ．分泌キメラ抗体の結合特異性
キメラの結合特異性はＣＤ２発現突然変異株ジャーカット細胞系ＪＲＴ３−Ｔ３−５に結合する抗体のフロー血球計算分析により評価された。キメラ抗体（ヒトＩｇＧ１）の結合プロフィールは、無関係（非ＣＤ−２）結合特性を示す天然ラット抗体（ＩｇＧ２ｂ）およびイソタイプ照合対照ＭＡＢ（ヒトＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂ）のプロフィールと比較された。
ＪＲＴ３−Ｔ３−５（ジャーカット）細胞系の調製。ジャーカット細胞系はＡＴＣＣ（      ）から得られ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％、アミノ酸補足物（ＮＣＴＣ）１０％、およびＬグルタミン（完全培地）６ｍＭを含むＤＭＥＭで繁殖された。細胞は３７℃でＣＤ２  １０％の下で保持され、１：４の比率で週３回通過された（通過時の細胞濃度は約３×１０６／ｍｌであった）。ジャーカット細胞は収穫され、消費培地を除去するために遠心分離され、ＤＭＥＭで洗浄された。細胞は次いでアジドナトリウム（ＮａＡｚ）０．１％を持つリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁され、細胞定量のためアリコートが移された。成育可能細胞数はトリパンブルー排除法により測定された。
ジャーカット細胞の間接染色。細胞表面染色が９６個ウエルＵ底マイクロタイタプレートで行われた。９０μｌの量で約６×１０５細胞がマイクロタイタプレートの各ウエルに配分された。検定される抗体の希釈はＮａＡｚ０．１％を持つＰＢＳで用意され、１０μｌの量で適切なウエルに配分された。細胞は抗体と共に１５分室温で保温され、その後細胞は各ウエルにＮａＡｚ０．１％のＰＢＳを付加した洗浄され、また２分間１９００ｒｐｍ（ソーヴァルＲＴ６０００Ｄ）で遠心分離された。プレートを軽く打って細胞の再懸濁が行われた。最適なフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合二次抗体（抗ヒトＩｇあるいは抗ラットＩｇ）の１０μｌアリコートが適切なウエルに付加され、暗がりで１５分室温で保温された。プレートは前記のＮａＡｚ０．１％を含むＰＢＳで３回洗浄された。染色細胞はＰＢＳにパラホルムアルデヒド０．５％の２００μｌを付加して固定され、４℃で（１週間まで）貯蔵された。
染色ジャーカット細胞のフロー血球計算分析。染色細胞はベクトン−ディキンソン社のファクスキャンを使用するデータを獲得するために１２×１７mmのポリスチレン管に移された。データの獲得および分析はリシスIIソフトウエアを使って実施された。ＣＤ２発現ジャーカット細胞はＬＯ−ＣＤ２ａ（ラットＩｇＧ２ｂ）ＭＡＢ、ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒトＩｇＧｌ）、および対応するイソタイプ照合対照と共に保温された。結合抗体は前記記載の実験記録に従って適切なＦＩＴＣ接合二次抗体を用いて検出された。分析は天然ラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびキメラヒト−ラットＬＯ−ＣＤ２ａと類似の結合パターンを示している。
この発明について数多くの修飾および変形が前記技術に照らして可能であり、従って添付する請求の範囲の範囲内でこの発明は特に説明されるもの以外にも実施することが出来る。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａａ】
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【図２９Ａｂ】
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【図２９Ｂａ】
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【図２９Ｂｂ】
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【図３０Ａａ】
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【図３０Ａｂ】
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【図３０Ｂａ】
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【図３０Ｂｂ】
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