(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と結合可能な官能基を同一分子内に２つ以上有する多官能性試薬を介して重合した重合抗体が、式（１）で示されるシアニン系色素で標識された色素標識重合抗体。
【化１】
0003625250.tif 000007
（ただし、Ｒ1およびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
【請求項２】
前記官能基が、スクシンイミジル基またはピリジルジスルフィド基である請求項１記載の色素標識重合抗体。
【請求項３】
前記多官能性試薬が、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ジスクシンイミジルタートレート、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである請求項１記載の色素標識重合抗体。
【請求項４】
前記シアニン系色素のスクシンイミジル基由来のアシル炭素と前記重合抗体のアミノ基由来の窒素との共有結合により前記色素の骨格が重合抗体に結合している請求項１記載の色素標識重合抗体。
【請求項５】
中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中で、抗体と結合可能な官能基を同一分子内に２つ以上有する多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程、およびこの緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を標識する工程を含むことを特徴とする色素標識重合抗体の製造方法。
【化２】
0003625250.tif 000008
（ただし、Ｒ1およびＲ2は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
【請求項６】
前記官能基が、スクシンイミジル基またはピリジルジスルフィド基である請求項５記載の色素標識重合抗体の製造方法。
【請求項７】
前記多官能性試薬が、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ジスクシンイミジルタートレート、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートである請求項５記載の色素標識重合抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シアニン系色素で標識された重合抗体およびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗体を色素で標識した色素標識抗体は、試料液中に含まれる抗原と特異的に反応し、かつ視認性があるため、例えば、免疫学的抗原抗体反応を利用して、試料液中に含まれる検体の検出を行う免疫センサに使用され、各種医療機関での診断に活用されている。
抗体を標識する色素としては、高いモル吸光係数を有し、反応性の高いシアニン系色素が使用される場合が多い（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＶＯＬ．４  Ｎｏ．２，ｐｐ１０５−１１１，１９９３）。
【０００３】
このようなシアニン系色素は、その官能基が抗体のアミノ基またはカルボキシル基と反応して共有結合し、１分子の抗体に対して２０〜５０分子の前記色素が結合する。
このようにして作製されたシアニン系色素標識抗体は、一般に視認性がよく、例えば免疫クロマトグラフィーに導入されて、妊婦の尿中にのみ存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン等の微量成分を検出するのに有効に用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
通常、１分子の抗体は、抗原と反応する部位が２か所と少ないため、抗原との反応感度が高くない。
そのため、従来の色素標識抗体を免疫センサ等に利用した場合、その感度に限界があり、試料液中に含まれる検出対象物（抗原）の濃度が低いと、その検出が困難であった。
本発明は、上記課題に鑑み、検出対象物が低濃度であっても、その検出が可能な高感度の色素標識重合抗体およびその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明による色素標識重合抗体は、抗体と結合可能な官能基を同一分子内に２つ以上有する多官能性試薬を介して重合した重合抗体が、式（１）で示されるシアニン系色素で標識されたものである。
【０００６】
【化３】
0003625250.tif 000002
【０００７】
（ただし、Ｒ１およびＲ２は水素またはアルキル基、Ｘはハロゲン、Ｍは水素またはアルカリ金属、ｎは１〜４の整数を示す。）
【０００８】
重合した抗体は、抗原と反応する部位を多数有する多価抗体であるため、通常の２価の抗体に比べて、抗原との結合感度が優れる。
また、重合抗体１分子に結合する色素の数は、抗体１分子の場合よりも多くなるため、視認性が向上する。
したがって、本発明による色素標識重合抗体を、例えば、免疫クロマトグラフィーに用いれば、測定対象物（検体）の濃度が低い場合でも、検体を高感度に検出できる。また、その高感度から、本発明の色素標識重合抗体は、バイオセンサーにも適用可能である。
【０００９】
本発明による色素標識重合抗体は、前記シアニン系色素のスクシンイミジル基由来のアシル炭素と前記重合抗体のアミノ基由来の窒素とが共有結合することにより、前記色素の骨格が重合抗体に結合している構成であるのが好ましい。
本発明の色素標識重合抗体における抗体の重合度は、通常、２〜５０の範囲であるのがよい。
【００１０】
本発明による色素標識重合抗体の製造方法は、中性または弱アルカリ性のリン酸緩衝液中で多官能性試薬を用いて抗体を重合する工程、およびこの緩衝液中に式（１）で示されるシアニン系色素を添加して前記重合された抗体を標識する工程を含む。このときのリン酸緩衝液のｐＨは、７．０〜８．０の範囲であるのが好ましい。
【００１１】
本発明の色素標識重合抗体に用いることができる抗体は、特に制限されず、その由来やサブクラス等に関係なく使用できる。例えば、イムノグロブリン（Ｉｇ）として、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、マウスＩｇＡ、マウスＩｇＥ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ラットＩｇＡ、ラットＩｇＥ、ラビットＩｇＧ、ラビットＩｇＭ、ラビットＩｇＡ、ラビットＩｇＥ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヤギＩｇＥ、ヤギＩｇＡ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ヒツジＩｇＡ、ヒツジＩｇＥ等が挙げられる。これらの抗体は、市販品として入手しても、直接その動物から採取してもよい。
【００１２】
多官能性試薬には、抗体と結合可能な官能基（スクシンイミジル基、ピリジルジスルフィド基等）を同一分子内に２つ以上有する試薬が挙げられる。例えば、式（２）で示されるジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、式（３）で示されるビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、式（４）で示されるジスクシンイミジルタートレート、式（５）で示されるエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、式（６）で示されるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート等がある。
【００１３】
【化４】
0003625250.tif 000003
【００１４】
【化５】
0003625250.tif 000004
【００１５】
式（１）で示されるシアニン系色素は、肉眼で確認することが容易な赤色系統の色素で、共役炭素の数が少ないため、シアニン系色素の中では最も水溶性に富んでいる。
式（１）において、Ｘで示されるハロゲンとしては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。また、Ｍで示される金属としては、リチウム、ナトリウムおよびカリウム等が挙げられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に、式（１）で示されるシアニン系色素の合成経路の一例を示す。
【００１７】
【化６】
0003625250.tif 000005
【００１８】
まず、ヒドラジノベンゼンスルホン酸（７）とイソプロピルメチルケトンとを酸性溶媒に溶解し加熱することによってインドレニウムスルホネート（８）を作製する。そして、インドレニウムスルホネート（８）のアルコール溶液に金属水酸化物飽和のアルコール溶液を加えることによって、インドレニウムスルホネートの金属塩（９）を得る。
次に、前記金属塩（９）の有機溶媒溶液にハロゲン化アルキル酸を加えて、加熱してカルボキシアルキルインドレニウムスルホネートの金属塩（１０）を得る。ハロゲン化アルキル酸の炭素数は、水への溶解性を考え、１〜４が好ましい。そして、前記金属塩（１０）とＮ−カルボキシエチル−３，３−ジメチルインドレニンを塩基性有機溶媒に溶解し、加熱することによってカルボン酸誘導体（１１）を作製し、最後に、前記カルボン酸誘導体（１１）の有機溶媒溶液中に、ヒドロキシコハク酸イミドと、縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドとを加えて攪拌することにより、式（１）で示されるシアニン系標識色素を得る。
【００１９】
なお、式（１）、式（１０）および式（１１）で示される各化合物に含まれるハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素があげられる。また、式（１）、式（９）〜（１１）で示される各化合物に含まれる金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウムなどがあげられる。
【００２０】
以下に、多官能性試薬による抗体の重合反応のメカニズムを説明する。
【００２１】
【化７】
0003625250.tif 000006
【００２２】
まず、式（１２）に示すように、抗体に対し、多官能性試薬（スクシンイミジル基を２つ以上有するジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））を配合すると、式（１３）に示すように、前記試薬の一つのスクシンイミジル基のエステル結合部分に、抗体のアミノ基が接近する。
そして、式（１４）に示すように、前記アミノ基と前記エステル結合部分とが反応し、前記アミノ基から水素原子が１個奪われる。そして、このアミノ基から脱離した水素原子は、前記スクシンイミジル基のスクシンイミドと結合する。スクシンイミドはヒドロキシスクシンイミドとなってスクシンイミジル基から脱離し、これと同時に、前記スクシンイミジル基の残りの部分と、前記水素原子が一個奪われたアミノ基とがアミド結合を形成し、このアミド結合によって前記試薬と前記抗体とが結合する。
前記試薬の他のスクシンイミジル基においても前記と同様の反応が起き、式（１５）に示すように、前記試薬と他の抗体とがアミド結合により結合する。この反応を繰り返すことにより抗体が重合される。
【００２３】
なお、シアニン系色素のスクシンイミジル基と、抗体のアミノ基の結合反応のメカニズムも上記と同様である。
【００２４】
【実施例】
以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
（１）マウスＩｇＧの重合
１０ｍｇ（６．６６７×１０−５ｍｍｏｌ）のマウスＩｇＧ（以下、ＩｇＧと略す。）を１ｍｌのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳという。）に溶解した。これを室温で撹拌しながら、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ピアス社製；以下、ＤＴＳＳＰという。）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを滴下した。滴下したＤＴＳＳＰのＰＢＳ溶液中には、４．０５７ｍｇ（０．００６６６７ｍｍｏｌ、１００等量）のＤＴＳＳＰが含まれていた。
この後、３５℃で３０分間攪拌した後、セファロースゲル（ファルマシア社製；セファデックスＧ２５Ｍカラム）を用いて濾過し約６ｍｌの多量化ＩｇＧ（以下、ＩｇＧａｇｇ．とする。）のＰＢＳ溶液を得た。得られた溶液の濃度を、つぎのようにして求めた。
【００２６】
得られた溶液を０．５ｍｌ取り、２８０ｎｍでの吸光度を測定した結果、吸光度は２．４３であった。観測された２８０ｎｍの吸光はＩｇＧに由来するものであるので、多量化ＩｇＧのＩｇＧ１分子の濃度［ＩｇＧａｇｇ．］は、下記に示すようにして求めることができる。ただし、ＩｇＧの２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．０９９×１０５  とした。
［ＩｇＧａｇｇ．］＝２．４３／２．０９９×１０５  ＝１．１５８×１０−５（Ｍ）
【００２７】
（２）重合抗体の色素標識
式（１）で示す色素を０．２ｍｌのＰＢＳに溶解し（総タンパク量の４００倍等量）、色素溶液（以下、ＳＬＩＣ１とする。）２６．８ｍｇを調製した。ただし、式（１）におけるＸはヨウ素、Ｍはカリウム、炭素数ｎは２のものを用いた。
そして、ＳＬＩＣ１を、（１）で得られたＩｇＧａｇｇ．溶液（総抗体量を１０ｍｇとする。）にゆっくりと滴下した。その後、これを４℃で２０時間静置した後、未反応の色素分子を除くため、ＰＢＳに防腐剤としてナトリウムアジドを添加した溶液２０リットルに対して透析して、約６ｍｌのＳＬＩＣ１標識重合抗体のＰＢＳ溶液を得た。
【００２８】
得られたＳＬＩＣ１標識重合抗体のＩｇＧ１分子あたりのＳＬＩＣ１の分子数をつぎのようにして求めた。
得られた溶液の２８０ｎｍ及び４３０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、吸光度はそれぞれ６．８０および４０．２であった。重合抗体は４３０ｎｍに吸収を持たないので、観測された吸光は結合したＳＬＩＣ１に由来するものである。したがって、ＳＬＩＣ１の濃度［ＳＬＩＣ１］は、次のように求めることができる。ただし、ＳＬＩＣ１の４３０ｎｍにおけるモル吸光係数を１×１０５とした。
［ＳＬＩＣ１］＝４０．２／１×１０５＝４．０２×１０−４（Ｍ）
【００２９】
また、観測された２８０ｎｍの吸光は重合抗体のＩｇＧに由来するものであるが、結合しているＳＬＩＣ１が２８０ｎｍにも吸収を持つので、この影響を差し引いて重合抗体のＩｇＧ分子の濃度［ＩｇＧａｇｇ．］を次のように求めることができる。ただし、重合抗体に由来する２８０ｎｍの吸光度をＡｂ２８０，ＩｇＧ．とし、ＳＬＩＣ１の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を９．８×１０３、重合抗体のＩｇＧ分子の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を２．０９９×１０５とした。
Ａｂ２８０，ＩｇＧ＝６．８−（４．０２×１０−４×９．８×１０３）＝２．８６
［ＩｇＧａｇｇ．］＝２．８６／２．０９９×１０５＝１．３６３×１０−５（Ｍ）
従って、ＳＬＩＣ１標識重合抗体のＩｇＧ１分子当たりに結合したＳＬＩＣ１の分子数は、次に示すようになる。
［ＳＬＩＣ１］／［ＩｇＧａｇｇ．］＝４．０２×１０−４／１．３６３×１０−５＝２９．５（個）
【００３０】
（３）色素標識重合抗体の評価
（２）で得られた色素標識重合抗体を免疫クロマトセンサーに用い、色素標識重合抗体の凝集による発光度（感度）を４３０ｎｍにおける吸光度を測定することにより調べた。
図１は、免疫クロマトセンサーの概略構成を示す斜視図である。ポリ塩化ビニル等のプラスチック製の板状支持体１の上に、第１のガラスろ紙２、ニトロセルロース製の抗体固定用膜５および第２のガラスろ紙６が、この順に配置されている。そして、第１のガラスろ紙２の抗体固定用膜５に接する側の端部には、（２）で得られた色素標識重合抗体を含浸させてあり、この部分が標識抗体部３となっている。また、抗体固定用膜５の所定の場所に、色素標識重合抗体と同じ抗原と反応する抗体が吸着により固定化され、抗体固定化部４となっている。
【００３１】
このような構成の免疫クロマトセンサーを用いての吸光度の測定は、例えば次のようにして行われる。
図１の第１のガラスろ紙２の抗体固定用膜５に接する側と反対側の端部に試料液を滴下すると、クロマトグラフィーの原理により、試料液は、第１のガラスろ紙２から第２のガラスろ紙６へ向かって移動する。そして、標識抗体部３において、試料液中の抗原に色素標識重合抗体が結合する。そして、この標識抗体と結合した抗原を含む試料液は、抗体固定化部４に移動し、ここで前記抗原は固定化抗体と結合し、ここに固定される。残りの試料液は抗体固定用膜５を移動し続け、第２のガラスろ紙６に吸収される。
吸光度は、抗体固定化部４に、波長４３０ｎｍの光（Ｌ１）を照射し、その反射光Ｌ２を測定することによって求めた。
【００３２】
比較例として、抗体を重合しなかった以外は、前記と同様の方法により、色素標識抗体を作製し、これを上記と同様にして免疫クロマトセンサーに用い、吸光度を測定した。
【００３３】
その結果、本発明による色素標識重合抗体を用いた場合は、その吸光度は約０．８であり、色素標識抗体を用いた場合の吸光度は約０．０７であった。
この結果から、本発明の実施例の色素標識重合抗体の感度は、比較例の感度の約１０倍であるといえる。
【００３４】
【発明の効果】
以上のように、本発明の色素標識重合抗体は、抗原との反応部位を多数有しているため、高感度のものである。したがって、例えば、本発明の色素標識重合抗体を免疫クロマトグラフィーを利用したセンサに導入することによって、従来法で作製した標識抗体を用いたときよりも高感度のセンサを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における免疫クロマトセンサーの構成の概略を示す斜視図である。
【符号の説明】
１  板状支持体
２  第１のガラスろ紙
３  標識抗体部
４  抗体固定化部
５  抗体固定用膜
６  第２のガラスろ紙
Ｌ１  照射光
Ｌ２  反射光
【図１】
0003625250.tif 000009