(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を更に備え、１０〜２６ヌクレオチドの長さを有し、少なくとも以下の配列:
配列９：ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇＡＧ
ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡ
の１０ヌクレオチドから成るフラグメントを含む第一のオリゴヌクレオチドと、１０〜２６ヌクレオチドの長さを有し、少なくとも以下の配列:
配列５：ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡ
の１０ヌクレオチドから成るフラグメントを含む第二のオリゴヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対と適当な増幅試薬とを使用してサンプルを核酸増幅反応で処理し、増幅された核酸の存在を検出することを特徴とするサンプル中のＨＩＶ−１核酸の検出方法。
【請求項３】
増幅された核酸の検出が、適当なハイブリダイゼーション条件下でサンプルを配列：
配列６：ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ
配列７：ＴＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  または
配列８：ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ
から成るグループから選択された（１つまたは複数の）配列を有しており前記配列の１つまたは複数が検出可能なラベルを備えている１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと反応させ、増幅された配列とプロープとによって形成されたハイブリッド中のラベルの存在を検出する処理から成る請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
使用される増幅技術が転写に基づく増幅技術であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項５】
−請求の範囲第１項記載のオリゴヌクレオチドプライマー対と、
−検出可能なラベルを備えており、増幅された核酸配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと、
−適当な増幅試薬と、
から成るサンプル中のＨＩＶ−１検出用検査キット。
【請求項６】
請求の範囲第１項記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を、適当な増幅試薬と増幅された核酸の検出手段と共に含むサンプル中のＨＩＶ−１検出用検査キット。
【請求項７】
ＨＩＶ−１のゲノムのＬＴＲ領域内部に局在するターゲット配列を増幅するためにプライマーセットとして使用される請求の範囲第１項記載のオリゴヌクレオチドプライマー対の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウイルス診断の分野、より特定的には、エイズの原因となるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染の診断に使用され得る核酸配列に関する。
【０００２】
従来のウイルス診断は主としてウイルス抗原またはその特異的抗体の検出に基づいているが、近年の研究の主流はウイルスゲノムまたはそれに由来の核酸配列即ちＲＮＡ及びＤＮＡの直接検出方法に移っている。これらの方法は概して核酸ハイブリダイゼーションに基づく。核酸ハイブリダイゼーションは、相補的配列を含む核酸の２つの鎖が適当な条件下で互いにアニーリングして二重鎖構造を形成する能力を有することに基づく。相補鎖がラベルで標識されているとき、このラベルを検出することができ、これがターゲット配列の存在の指標となる。これらの方法は、特に核酸配列の増幅方法と組合せることによって、ウイルス診断、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を検出するための重要なツールとなる。
【０００３】
血清学的方法が確実でない結果を与える場合または感染と抗ウイルス抗体の発生との間にかなりの時間的期間が存在する場合などには、核酸増幅技術が追加の技術として特に有用である。ＨＩＶの場合には通常、ウイルス接触後３−６カ月で血清変換が生じる。従って、慣用のイムノアッセイでは抗体は全く検出されないであろうが、プロウイルスＤＮＡまたは環状ウイルスＲＮＡは既に検出可能であろう。また、抗ウイルス治療をモニターする場合にも、核酸増幅に基づく方法は血清学的方法よりも優れたいくつかの利点を有している。特に、定量的増幅方法は、治療前及び治療中にウイルスの存在量の変化を評価する強力なツールとなる。
【０００４】
核酸配列の増幅及び検出においてプライマー及びプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの選択は、アッセイの感度及び特異性にとって極めて重要である。増幅されるべき配列はサンプル（例えばウイルス感染が疑われる患者から採取した血液サンプル）中に通常は少量しか存在しない。プライマーは、サンプル中に存在するウイルス核酸を効率的に増幅させるようにターゲット配列に十分に相補的でなければならない。（双方の鎖中のヌクレオチドの塩基の不対合が原因で）プライマーがターゲット配列に適正にアニーリングしないならば、増幅は著しく妨害されるであろう。これはアッセイの感度に影響を与え、誤った陰性の試験結果が生じるかもしれない。プライマー及びプローブがウイルスの変種の一部にだけ存在する配列を認識できるならば、ウイルスゲノムの不均質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が原因で誤った陰性の試験結果が生じるかもしれない。ＨＩＶウイルスは高度な不均質性を示す。種々の大陸から得られた単離物の間でも、個体間でも、疾病の異なる種々の時期の間でも、遺伝的変異の存在が証明された。ＨＩＶ−１では配列解析に基づいてグループＭ（“主系（ｍａｊｏｒ）”のＭ）及びグループＯ（“傍系（ｏｕｔｌｉｅｒ）”のＯ）の２つのグループが同定された。各々がフィロジェネティックな個々の配列セットを構成しているサブタイプ（Ａ−Ｈ）はグループＭに所属すると考えられ、その他のサブタイプも同定されている。この配列変異はゲノム全体に均一に分布していない。ＨＩＶ−１ゲノムはすべてのレトロウイルスゲノムと同様に、概して以下の領域から構成されている。ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇ遺伝子は、ウイルスのコアタンパク質（例えばｐ２４）をコードする領域である。ｅｎｖ遺伝子は大きい前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードしており、このタンパク質はプロセシングされてエンベロープタンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１を生じる。ｐｏｌ遺伝子はウイルスのポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードしている。末端反復配列（ＬＴＲ）領域は、ウイルスゲノムに存在し、宿主細胞によるウイルスの取り込み及びウイルス遺伝子の転写調節に関与する領域である。いくつかの領域はその他の領域よりも配列変異を生じ易い。特にｅｎｖドメインの配列変異は、種々のサブタイプで３０％という高い値になり得る。理想的には、候補プライマー配列の菌株間の変異及びプライマー部位におけるミスマッチの結果に関する知識に基づいてプライマーを選択すべきである。ＭｃＣｕｔｃｈａｎら，Ｊ．ＡＩＤＳ，４，１２４１−１２５０，１９９１は、種々のＨＩＶ−１単離物を遺伝的に比較するためにＰＣＲを使用した。アンカードＰＣＲを使用し（種々のセンスプライマーを一定のアンチセンスプライマーと共に使用した。プライマーはｇａｇ、ｅｎｖ及びＬＴＲ中の比較的保存された領域から選択した）、得られたＰＣＲ産物の量に対するプライマー不対合の影響を検査した。プライマーの３′端の不対合はときには増幅産物の量を１／１００に減少させた。
【０００５】
特に患者の管理、血液及び血液産物の安全性、臨床的及び疫学的研究の見地から、現在知られたＨＩＶ−１の全てのサブタイプを検出することが極めて重要である。現行の増幅アッセイ及びその後のＨＩＶ−１由来核酸配列の検出は一般にウイルスゲノムのｇａｇ領域の配列の増幅に基づく。これらのアッセイは欧州諸国及び米国の主要なサブタイプであるサブタイプＢに関して開発されたものである。しかしながらこれらの諸国でも、例えばアフリカ諸国への旅行機会の増加に伴って、これまではその存在が地域的に限定されていた他のサブタイプが増加しつつある。従って、ＨＩＶ−１ウイルスのできるだけ多数（好ましくは全部）の変種を検出し得る高感度アッセイが要望されている。
【０００６】
ＨＩＶ−１由来の核酸配列の確実な増幅に好適なプライマーセットを同定する目的の研究は過去何年間も続けられている。Ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，５５，３９１−４００，１９９５は、南アメリカのウェスタンケープに存在するサブタイプを検出するためにｅｎｖ，ｇａｇ及びＬＴＲプライマー対を使用する特異的高感度ＰＣＲの開発を目的とした研究を記載している。サブタイプＢ、Ｃ及びＤに所属することが判っていた２４の菌株を分析した。プライマー対の性能は種々のプライマー対に関する反応条件の最適化に大きく左右されることが知見された。低緊縮性条件を使用したときに限って（例えば、ＬＴＲプライマー対では長いサイクル時間及び低いアニーリング温度が必要であった）、試験した特定のＨＩＶの菌株をすべてのプライマー対によって十分な感度及び再現性で検出することが可能であった。
【０００７】
Ｚａｚｚｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，３８，１７２−１７４，１９９２は、臨床サンプル中のＨＩＶ−１  ＤＮＡを検出するために（入れ子型プライマーを使用する）２段階ＰＣＲ反応を開発した。増幅に使用したプライマーはｇａｇ遺伝子及びＬＴＲ領域に由来した。この研究で試験した患者はすべて近隣地域出身であり、従って、種々のウイルス菌株の中から少数の菌株だけを表すと考えられる。
【０００８】
ＬＴＲ由来の入れ子型プライマーを使用する定量的ＰＣＲ方法は、Ｖｅｎｅｒら，によってＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１，２４８−２５５，１９９６に記載されていた。この手順で試験した細胞はＨＩＶ−１ＭＮ感染した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）だけであった。従って、ウイルスの種々のサブタイプを検出するために使用されるプライマーの適性に関して判断することは全くできない。
【０００９】
本発明によれば、ＨＩＶ−１核酸を増幅及び検出するためにプライマー及びプローブとして使用され得るヌクレオチド配列が提供される。本発明によって提供されたオリゴヌクレオチド配列は、ＨＩＶウイルスゲノムのＬＴＲ部分に局在している。核酸の増幅及び検出方法に本発明の配列を使用することによって、ＨＩＶ−１の高感度の特異的検出を達成し得る。本発明の配列の利点は主として、本発明の配列から成るプライマー及びプローブを使用してＨＩＶ−１の現在知られたすべてのサブタイプを高精度及び高感度で検出できることにある。このような広い範囲のＨＩＶ−１変種を検出できるプライマー対またはハイブリダイゼーションプローブはこれまで開発されていなかった。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチド配列は核酸の増幅方法に特に有用である。
【００１１】
種々の核酸増幅技術が当業界で公知である。ＤＮＡターゲットセグメントを増幅する技術の一例はいわゆる“ポリメラーゼ連鎖反応”（ＰＣＲ）である。ＰＣＲ技術によれば、特定ターゲットセグメントのコピー数はサイクル数に伴って指数関数的に増加する。一対のプライマーを使用し、各サイクルで二重鎖ＤＮＡ−ターゲット配列を構成する２つの鎖の各々の３′側に１つのＤＮＡプライマーをアニーリングする。種々のモノヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼによってプライマーを伸長させ二重鎖ＤＮＡを再形成する。熱変性によって二重鎖ＤＮＡの２つの鎖を互いから分離させ、鎖の各々を後続サイクル中にプライマーアニーリング及びその後の鎖伸長の鋳型とする。ＰＣＲ法はＳａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５，１９８５及び欧州特許ＥＰ２００３６２及びＥＰ２０１１８４に記載されている。
【００１２】
別の核酸増幅技術はいわゆる転写に基づく増幅方式（ＴＡＳ）である。ＴＡＳ法は国際特許出願ＷＯ８８／１０３１５に記載されている。転写に基づく増幅技術は一般に、一方がプロモーター配列から成る２つのオリゴヌクレオチドによってターゲット核酸を処理して機能性プロモーターを含む鋳型を形成させる段階を含む。この鋳型からＲＮＡの多数コピーが転写され、これをベースとして以後の増幅が行われる。
【００１３】
等熱性連続転写に基づく増幅方法は欧州特許ＥＰ３２９８２２に記載されたいわゆるＮＡＳＢＡ法（“ＮＡＳＢＡ”）である。ＮＡＳＢＡは、Ｔ７プロモーターを含む鋳型からＲＮＡの多数コピーを転写するためにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する。転写に基づく増幅技術の別の方法が欧州特許ＥＰ４０８２９５に記載されている。欧州特許ＥＰ４０８２９５は主として、２酵素転写に基づく増幅方法を開示している。欧州特許ＥＰ３２９８２２に記載のＮＡＳＢＡ法のような転写に基づく増幅方法では通常は１セットのオリゴヌクレオチドを使用し、一方のオリゴヌクレオチドがＴ７ポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を備えている。転写に基づく技術の複数の修正方法が当業界で公知である。これらの修正方法では例えば、（プロモーター配列を備え得る）ブロックされたオリゴヌクレオチドを使用する。これらのオリゴは、該オリゴから伸長反応が進行することを阻止するためにブロックされている（米国特許ＵＳ５５５４５１６）。１つまたは複数の“プロモーター−プライマー”（プロモーター配列を備えたオリゴヌクレオチド）は、プロモーター配列を備えていない１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの使用を任意に組合せた転写に基づく増幅技術に使用され得る。ＲＮＡ増幅の場合には転写に基づく増幅技術が好ましい方法である。ＰＣＲを使用する増幅もＲＮＡ鋳型をベースとして行うことができる。実際のＰＣＲでは、ＰＣＲに先立ってＲＮＡをＤＮＡにコピーする逆転写段階が必要である（ＲＴ−ＰＣＲ）。しかしながらＲＴ−ＰＣＲをウイルス転写物の検出に使用する場合には、ｍＲＮＡ−及びＤＮＡ−由来のＰＣＲ産物の識別が必要である。ＲＴ−ＰＣＲに先立ってＤＮアーゼ処理を使用することはできるが（Ｂｉｔｓｃｈ，Ａら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  １６７，７４０−７４３，１９９３；Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．８，２６１−２７１，１９９４）、夾雑ＤＮＡを十分に除去することはできない（Ｂｉｔｓｃｈ，Ａ．ら，１９９３）。
【００１４】
ＲＴ−ＰＣＲに対照的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写（Ｋｉｅｖｉｔｓら，１９９１；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１）に基づくＮＡＳＢＡは、主要ターゲットとしてＲＮＡを使用するのでＲＮＡ−及びＤＮＡ−由来の増幅産物の識別が不要である。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡバックグラウンド中でもＲＮＡターゲットを特異的に増幅させ得る。
【００１５】
本発明によるオリゴヌクレオチドの使用はいかなる特定の増幅技術またはそのいかなる特定の修正方法にも限定されない。本発明によるオリゴヌクレオチドが異なる多くの核酸増幅技術及びＨＩＶの（増幅された）核酸の存在を検出する種々の方法に使用できることは明らかである。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、定量的増幅方法にも使用され得る。このような定量的方法の一例が欧州特許ＥＰ５２５８８２に記載されている。
【００１６】
本文中で使用された“オリゴヌクレオチド”なる用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子を意味する。このようなオリゴヌクレオチドはプライマー及びプローブとして使用され得る。
【００１７】
勿論、本発明のオリゴヌクレオチドの配列に基づいて、オリゴヌクレオチドの類似体も調製できる。このような類似体は“ＰＮＡ”（正常な核酸のリン酸塩糖主鎖の代わりにペプチド様主鎖をもつ分子）のような代替的構造を形成し得る。本発明の配列を表すこれらの代替的構造も本発明の一部を構成することが明らかである。
【００１８】
本文中で使用された“プライマー”なる用語は、（例えば制限フラグメントとして）天然に産生するかまたは合成的に産生され、ヌクレオチドとＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性ポリメラーゼのような核酸重合剤との存在下で適当な条件（例えば、バッファ、塩、温度及びｐＨ）下に配置されたときに核酸の１つの鎖（鋳型またはターゲット配列）に相補的なプライマー伸長産物の合成の開始点となり得るオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始できる十分な長さを有していなければならない。典型的なプライマーは、ターゲット配列に実質的に相補的または相同な配列の少なくとも約１０ヌクレオチドの長さを有するが、これよりも幾らか長い配列が好ましい。プライマーは通常は約１５−２６ヌクレオチドを含むが、特に、プライマーが特定ポリメラーゼ用プロモーター配列のような追加の配列を含む場合にはもっと長いプライマーも使用し得る。通常は１組のプライマーセットが少なくとも２つのプライマー、即ち、１つの“上流”プライマーと１つの“下流”プライマーとから成り、増幅配列（これらのプライマーを使用して増幅される配列）は双方のプライマーによって規定される。
【００１９】
主として転写に基づく増幅技術に使用するためには本発明によるオリゴヌクレオチドをプロモーター配列に連結し得る。“プロモーター配列”なる用語は、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列の１つの領域を意味しており、ＲＮＡポリメラーゼは、認識した配列に結合しＲＮＡ転写物を産生する転写プロセスを開始させる。プロモーター配列に対する既知の入手可能なポリメラーゼが存在し開始配列が認識され得る限り、原則としていかなるプロモーター配列も使用し得る。公知の有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６のようないくつかのバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターである。プロモーター配列に連結したオリゴヌクレオチドは“プロモータープライマー”という通称で呼ばれている。しかしながらそのプライマー機能、例えば伸長反応の開始点という機能は、転写に基づく増幅反応のいくつかの実施態様では前述したようにブロックされていてもよくまたは存在しなくてもよい。
【００２０】
本発明によるオリゴヌクレオチドはＨＩＶゲノムの核酸配列のＬＴＲ領域の配列に実質的に相補的であり、このオリゴヌクレオチドは１０−５０ヌクレオチドの長さを有しており、且つ、
配列１：Ｇ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡ
配列２：Ｇ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列３：ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡ
配列４：ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡ
配列５：ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡ
配列６：ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ
配列７：ＴＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ
配列８：ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ
配列１２：ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ
から成るグループから選択された配列またはその相補的配列の１０ヌクレオチドのフラグメントを少なくとも１つ含む。
【００２１】
本発明の配列から成るオリゴヌクレオチドが、得られる収量または産生物に有意な程度のマイナスの影響を与えない範囲で核酸塩基の些少な欠失、付加及び／または置換のような変異を含み得ることは理解されよう。本発明によるオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、これらの変異が、プローブのハイブリダイゼーション効率を低下させてはならない。例えば、転写に基づく増幅技術で１つまたは複数のプライマーがプロモーター配列を備え得る場合、プロモーター配列の直後にプリン富化（＝ＧまたはＡ）ハイブリダイズ配列を導入すると、転写にプラスの効果が与えられるであろう（Ｃ及びＴが存在する場合には不稔的転写が生じるであろう）。ターゲット核酸中でこのような配列が全く利用できない場合には、プリン富化配列をプロモーター配列の最後の３つのＧ残基の直後でオリゴヌクレオチドに挿入できる。本発明の配列はＤＮＡ配列として考えられている。これらの配列のＲＮＡ等価物も本発明の一部を構成する。本発明による好ましいオリゴヌクレオチドは本質的に、配列：
配列１：Ｇ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡ
配列２：Ｇ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列３：ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡ
配列４：ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡ
配列５：ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡ
配列６：ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ
配列７：ＴＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ
配列８：ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ
配列９：ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇＡＧ  ＡＧＧ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡ
配列１０：ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列１１：ａａｔ  ｔｃｔ  ａａｔ  ａｃｇ  ａｃｔ  ｃａｃ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｇＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡ
配列１２：ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ
から成るグループから選択された配列から成るオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
配列９−１１は実際には、配列１−３によって表される配列を含む。配列９−１１中で、配列１−３はプロモーター配列（Ｔ７プロモーター配列）に操作可能に連結されている。このため配列は、ＮＡＳＢＡのような転写に基づく増幅技術において上流プライマーとして特に好適に使用される。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様は、核酸増幅でセットとして使用される本発明の２つのオリゴヌクレオチドの組合せである。
【００２４】
ＨＩＶ−１のゲノムのＬＴＲ領域の内部に局在するターゲット配列を増幅するためにセットとして使用されるこのようなオリゴヌクレオチド対は、１０−５０ヌクレオチドの長さを有しており、且つ、配列：
配列１：Ｇ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡ
配列２：Ｇ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  Ａ
配列３：ＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＴＡ
から成るグループから選択された配列の１０ヌクレオチドのフラグメントを少なくとも１つ含む第一のオリゴヌクレオチドと、１０−５０ヌクレオチドの長さを有しており、且つ、配列：
配列４：ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡ
配列５：ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡ
配列１２：ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ
から成るグループから選択された配列の１０ヌクレオチドのフラグメントを少なくとも１つ含む第二のオリゴヌクレオチドとから成る。
【００２５】
オリゴヌクレオチドの１つは“上流オリゴヌクレオチド”即ち増幅反応で上流プライマーとして作用し、第二のオリゴヌクレオチドは“下流オリゴヌクレオチド”即ち増幅反応で下流プライマーとして作用する。このような対を構成する本発明の２つのオリゴヌクレオチドがアニーリングし得るＨＩＶ−ゲノム（またはこれに相補的な配列）の位置も、増幅される核酸の配列を規定するであろう。増幅される配列は、ＨＩＶ−ゲノムのＬＴＲ領域の内部の複数の“プライマー結合部位”の間に局在する。本発明によるオリゴヌクレオチド対を増幅反応に使用することによって、現在公知のＨＩＶのサブタイプ全部について、それらに由来する核酸の正確で確実な増幅を達成し得ることが知見された。
【００２６】
本発明による最も好ましいオリゴヌクレオチド対は配列１の配列を含む第一プライマーと配列５の配列をもつ第二プライマーとから構成されるであろう。転写に基づく増幅方法に使用するためには、配列９のオリゴヌクレオチドを配列５のオリゴヌクレオチドと併用するのが好ましい。
【００２７】
本発明によるオリゴヌクレオチドの一部は、本発明によるオリゴヌクレオチド対によって増幅させた核酸を検出するためのプローブとして特に好適に使用される。プローブとして使用されるとき、このオリゴヌクレオチドは検出可能なラベルを備えていてもよい。プローブとして特に好適な本発明によるオリゴヌクレオチドは本質的に、配列：
配列６：ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＣ
配列７：ＴＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴまたは
配列８：ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ
から成り検出可能なラベルを備えたものである。この点で最も好ましいオリゴヌクレオチドは配列６に示した配列をもつオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
種々のラベル用成分が当業界で公知である。この成分は例えば、放射性化合物、検出可能な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、ビオチンなどのハプテン、または、比色シグナル、蛍光シグナル、化学発光シグナルまたは電気化学発光シグナルなどの検出可能なシグナルを発生し得る他のいかなる成分でもよい。本発明によるオリゴヌクレオチドと（増幅された）ターゲット核酸とのハイブリッドはまた、当業者に公知の別の方法によって検出されてもよい。本発明によるオリゴヌクレオチドを使用する上記に引用した方法のような核酸増幅方法も本発明の一部であることは明らかであろう。
【００２９】
本発明は更に、ＨＩＶ核酸を増幅及び検出するための検査キットを提供する。この検査キットを使用すると、ＨＩＶ由来の核酸を含有すると疑われるサンプルを高精度及び高感度でスクリーニングできる。このような検査キットは、本発明のオリゴヌクレオチド対を含み、更に、増幅された物質の検出用プローブとして使用できる本発明のオリゴヌクレオチドを任意に含む。検査キットは更に、適当な増幅試薬を含んでいてもよい。これらの試薬は例えば、増幅反応を実施するために好適な酵素である。ＮＡＳＢＡで使用するように作製されたキットは例えば、適量の逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含み得る。これらの酵素は緩衝溶液の形態でキット中に存在してもよいが、凍結乾燥組成物、例えば凍結乾燥球状粒子として提供されてもよい。このような凍結乾燥粒子はＰＣＴ出願Ｎｏ．ＥＰ９５／０１２６８に開示されている。キットは更に、増幅反応の実施に適したバッファ組成物を含み得る。これらのバッファは、キットが目的とする特定の増幅技術に最適であり且つキットによって提供される特定のオリゴヌクレオチドに最適であればよい。ＮＡＳＢＡのような転写に基づく増幅技術においては、これらのバッファは例えば、（ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＵＳ９０／０４７３３に記載されているような）増幅反応を促進するＤＭＳＯを含有し得る。
【００３０】
キットは更に、増幅手順に関するチェックとしてまたは増幅手順の欠陥に起因する誤った陰性検査結果の出現を防止するための内部対照を有し得る。転写に基づく増幅技術における内部対照の使用に関しては、ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＥＰ９３／０２２４８に記載されている。最適な対照配列は、増幅反応においてターゲット核酸と競合しないように選択される。キットはまた、増幅に先立って生物標本から核酸を単離するための試薬を含み得る。核酸の適当な単離方法は欧州特許ＥＰ３８９０６３に記載されている。
【００３１】
【実施例】
実施例１：ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの増幅及び検出
以下の実施例に記載のようにサンプルからＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡを増幅及び検出するために以下の手順を使用した。
【００３２】
サンプルの調製及び核酸の単離
Ｂｏｏｍら，１９９０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２８，４９５−５０３及び欧州特許Ｎｏ．ＥＰ０３８９０６３の記載に従って核酸の単離を実施した。簡単に説明すると、健康なドナーからプールした容量２００μｌの血漿（ＨＢｓＡｇ、抗ＨＩＶ及び抗ＨＣＶ陰性）を９００μｌの溶解バッファ（４７ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．２、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１．２％のトリトンＸ−１００、４．７Ｍのグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ，Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））に添加した。撹拌し遠心（３０秒、１３，０００ｒｐｍ）した後、Ｌａｙｎｅら，１９９２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９，６９５−７１４によってキャラクタライズされ記載されたＨＩＶ−１  ＲＮＡサブタイプＢ標準の系列希釈物またはＨＩＶ−１陽性標本を添加した。５０μｌの活性化シリコン（０．１ＮのＨＣｌ中に０．４ｇ／ｍｌの懸濁液）を添加し、懸濁液を定期的に撹拌しながら室温で１０分間インキュベートした。遠心（３０−６０秒、１３，０００ｒｐｍ）した後、シリコンペレットを１ｍｌの洗浄バッファ（５．２５ＭのＧｕＳＣＮ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．４）で２回洗浄し、次いで７０％のエタノールで２回、次いでアセトンで１回洗浄した。その後、シリコンペレットを５６℃の加熱用ブロック中で１０分間乾燥した。５０μｌの溶出バッファ（１．０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５）を添加し、５６℃で１０分間のインキュベーションによって核酸をシリコンから溶出させた。その後、５μｌの溶出液をペレットから採取し、以後の増幅反応で使用した。残りの溶出液を−７０℃で保存した。
【００３３】
ＮＡＳＢＡ増幅
１０μｌのプライマー混合物と５μｌの（単離した）核酸と５μｌの酵素混合物とから成る２０μｌの反応容量で増幅を実施した。凍結乾燥したａｃｃｕｓｐｈｅｒｅを５０μｌのａｃｃｕｓｐｈｅｒｅ希釈剤と５１．６μｌの水と８．４μｌの２ＭのＫＣｌと５μｌの各プライマー（１０μＭ）で復元させることによってプライマー混合物を調製した。使用する前に混合物を十分に撹拌した。このプライマー混合物の１０μｌを５μｌの（単離した）ＨＩＶ−１  ＲＮＡ（標準）に添加した。この混合物を６５℃で５分間インキュベートし、次いで４１℃で更に５分間インキュベートした。これらのインキュベーション後、５μｌの酵素混合物を添加し、４１℃で５分間インキュベートした。管を検出エリアに移し、４１℃で９０分間インキュベートした。増幅反応後、以後に使用するまで管を−２０℃で保存した。
【００３４】
各増幅反応は以下の試薬を含んでいた。
【００３５】
４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５
１２ｍＭのＭｇＣｌ２
７０ｍＭのＫＣｌ
１５％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド
５ｍＭのジチオトレイトール
１ｍＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸
２ｍＭのヌクレオシドγＡＴＰ、γＣＴＰ、γＵＴＰ
１．５ｍＭのγＧＴＰ
０．５ｍＭのＩＴＰ
０．１０５μｇ／μｌのＢＳＡ
０．０８単位のＲＮアーゼＨ
３２単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ
６．４単位のトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，ＵＳＡ）
０．２μＭの各プライマー
３７５ｍＭのソルビトール
４５．６ｍＭのショ糖
２８．５ｍＭのマンニトール
０．１３ｍＭのデキストランＴ４０。
【００３６】
増幅産物の検出
Ａ．ゲル電気泳動
アガロースゲル（１００ｍｌの２％Ｐｒｏｎａｒｏｓｅ及び０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム）及び１×ＴＡＥ（４０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）処理バッファを使用して増幅産物の存在を分析した。電気泳動を１００ボルトで約３０分間実施した。増幅産物の臭化エチジウム染色バンドをＵＶ照射によって可視化した。ブロットをハイブリダイゼーションミックス（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．７）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）中のビオチンプローブ（３μＭ）と共に５０℃で４時間インキュベートすることによってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ブロットを４５０ｍＭのＮａＣｌ、４５ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ６．４（２×ＳＳＰＥ）及び１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液によって５０℃で５分間の洗浄を２回繰り返し、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４、３６０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳによって室温で１０分間の洗浄を１回実施した。その後、ブロットを、１０ｍｌの５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、９００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．４及び０．５％ＳＤＳ中の２μｌのストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅの増強化学発光検出キット５００Ｕ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした。室温で２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で５分間の洗浄を２回、２×ＳＳＰＥ中で１０分間の洗浄を１回夫々実施した後、ブロットを組織間で乾燥し、Ａｍｅｒｓｈａｍキットプロトコルに従って現像し、フィルムに露光した。
【００３７】
Ｂ．電気化学発光（ＥＣＬ）プローブハイブリダイゼーション
増幅産物を検出用希釈液（１．０ｍＭのトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．５及び０．２ｇ／リットルの２−メチルイソチアゾロンＨＣｌ）で２倍に希釈した。その後、希釈した５μｌの増幅産物を、５μｇのストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（平均サイズ２．８μｍ±０．２μｍ、Ｄｙｎａｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ，ＮＹ、ＵＳＡ）に結合した０．０８４μＭのＨＩＶ−１特異的ビオチンプローブ及び２×１０１１分子のＥＣＬ（トリス〔２，２−ビピリジン〕ルテニウム〔ＩＩ〕複合体）で標識したプローブと共に７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム，ｐＨ６．４（５×ＳＳＣ）の総量２５μｌ中で４１℃で３０分間インキュベートした。陰性対照として、検出用希釈液をまた、ビーズ−プローブ混合物及びＥＣＬ−プローブ混合物と共にインキュベートした。インキュベーション中、管を１０分毎に振盪させてビーズを懸濁状態に維持した。その後、３００μｌのアッセイバッファ溶液（１００ｍＭのトリプロピルアミン，ｐＨ７．５）を添加し、管をＥＣＬ検出器具（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  ＢＶのＮＡＳＢＡ  ＱＲ−システム）に配置し、発生したＥＣＬシグナルを読み取った。
【００３８】
実施例２：ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの増幅及び検出
１０４コピー（分光光度法で２６０ｎｍの測定数）のＨＩＶ−１  ＲＮＡ標準に以下のプライマー対を試験した。ＲＮＡを増幅に直接添加した。実施例１に記載のゲル電気泳動によって増幅産物を分析した。結果を図１に示す。
【００３９】
本発明のプライマー対及びプローブはいずれも同程度にサブタイプＢからＨＩＶ−１  ＲＮＡを増幅し検出することが可能であった。初期濃度５．５×１０９コピー／ｍｌを有するＨＩＶ−１  ＲＮＡ標準の系列希釈物を使用して２組のプライマー対（配列９／配列５及び配列１１／配列５）の分析感度を測定する。配列７及び配列６に示す配列を有するプローブによって検出した。増幅及び検出は実施例１に記載の手順で実施した。表１は双方のプライマー対で得られた結果を示す。
【００４０】
【表１】
0003689333.tif 000002
【００４１】
双方のプライマー対はＨＩＶ−１  ＲＮＡ標準に対してほぼ同じ感度を有しており、配列９／配列５のプライマー対に対する検出率７０％及び配列３／配列５のプライマー対に対する検出率６３％である。
【００４２】
実施例３：内部対照の存在下でのＨＩＶ−１  ＲＮＡの増幅及び検出
この実施例では、配列９／配列５のプライマー対及び配列７のプローブを内部対照（ｉｃ−）ＲＮＡの存在下でのＨＩＶ−１  ＲＮＡ標準の系列希釈物について試験した。ｉｃ−ＲＮＡは、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ−２のＬＴＲ配列の一部を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物であり、核酸単離の前に１０4コピー（分光光度法で２６０ｎｍの測定数）を添加する。単離、増幅及びＥＣＬ検出は実施例１に記載の手順で実施した。比較として、Ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎら，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４３，１７７−１８８によって以前に記載されたＨＩＶ−１  ｇａｇ領域（Ｐ１／Ｐ２）に局在するプライマー対を使用して別の増幅及び検出を実施した。ｇａｇに基づくプライマー対によって産生した増幅産物を検出するために使用したプローブは、
ビオチンプローブ：５′−ＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡ
ＥＣＬプローブ：５′−ＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧ
であった。
【００４３】
結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
0003689333.tif 000003
【００４５】
この実施例のＬＴＲプライマー対及びｇａｇプライマー対はいずれも、核酸単離の前にｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生ＲＮＡの添加によって調節したアッセイで同様の量のＨＩＶ−１  ＲＮＡを検出することができた。
【００４６】
実施例４：ＨＩＶ−１陽性サンプル中のＨＩＶ−１  ＲＮＡの検出
この実施例では、種々の地域で採取した４０のＨＩＶ−１陽性サンプル中のＨＩＶ−１  ＲＮＡの存在を分析した。全部のサンプルを実施例１に記載の核酸単離方法によって単離した。増幅及び検出は配列９／配列５のプライマー対及び配列７のプローブまたは配列８のプローブを使用して実施例１に記載の手順で実施した。
【００４７】
比較のために、ｇａｇプライマー対と実施例３に記載のプローブとを使用して別の増幅及び検出を実施した。実施例１の方法に従って増幅産物の存在をＥＣＬプローブハイブリダイゼーションによって検出した。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
0003689333.tif 000004
【００４９】
この実施例に記載のＨＩＶ−１のＬＴＲ領域に由来のプライマー／プローブの組合せはいずれも、全ての試験サンプルでＨＩＶ−１を検出することができた。対照的に、ｇａｇアッセイのプライマー／プローブの組合せは多数のサンプルでＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡを検出することができなかった。
【００５０】
実施例５：規定サブタイプによるＨＩＶ−１  ＲＮＡの増幅及び検出
この実施例では、既知のエンベロープに基づくサブタイプのＨＩＶ−１  ＲＮＡを保有する３３のサンプルを試験した。サンプルは細胞培養物中で増殖させたサブタイプ化ウイルスから採取した。グループＭのサブタイプＡ−Ｈの変種及びグループＯの変種の双方から得られた細胞培養上清サンプルをＨＩＶ−１陰性ヒト血漿にスパイクし、実施例１の方法に従って処理した。増幅及び検出は実施例４とほぼ同様に実施した。試験の結果を、各タイプの試験サンプル総数に対するＨＩＶ−１  ＲＮＡが検出されたサンプル数として表４に示す。
【００５１】
【表４】
0003689333.tif 000005
【００５２】
配列９／配列５のＬＴＲプライマー対及び配列７のプローブを使用したときは３３のＨＩＶ−１サンプルの全部からＨＩＶ−１  ＲＮＡが検出された。対照的に、実施例３に記載のようなｇａｇプライマーとプローブとの組合せを使用したアッセイでは、サブタイプＡ及びサブタイプＥに検出されなかったサンプルが１つずつ存在し、また、ＨＩＶ−１  ＲＮＡを含有するグループＯの全部のサンプルを検出することができなかった。
【００５３】
実施例６：ＨＩＶ−１臨床サンプルの増幅及び検出
この実施例では、アフリカ、南アメリカ及びアジア出身の血清陽性患者から得られた７つのサンプルをＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの存在について検定した。これらの患者の血液サンプルは抗−ｐ２４抗体（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）及びウェスタンブロット（Ｇｅｎｅｌａｂｓ）の双方に陽性であるにも関わらず、実施例３のｇａｇプライマー対とプローブとの組合せを使用したＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ＱＬアッセイ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  ＢＶ）では全部のサンプルが陰性と判定され、５０μｌのサンプル容量を使用したＱｕａｎｔｉｐｌｅｘ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ２．０（Ｃｈｉｒｏｎ）アッセイでは唯１つのサンプル（Ｒ９６１２２２２）だけが検出され定量（ＲＮＡコピー数２９，５００／ｍｌ）された。対照的に、配列９／配列５のプライマー対及び配列７のプローブは同じサンプル容量で７つのサンプルから４つのサンプルを検出した（表５）。
【００５４】
【表５】
0003689333.tif 000006
【００５５】
ＬＴＲプライマーとプローブとの組合せが正しく判定できなかったサンプルに関しては、これらのサンプルが検出されなかった理由は、Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ２．０（Ｃｈｉｒｏｎ）アッセイでサンプル５０μｌあたりのＨＩＶ−１  ＲＮＡのコピー数が３０以下であると定量されたＨＩＶ−１  ＲＮＡレベルのサンプルを容量１ｍｌで使用したので、ウイルス負荷が検出レベルよりも低かったことにある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
以下のプライマー対を使用してＨＩＶ−１  ＲＮＡの存在下（パネルＡ）または非存在下（パネルＢ）で増幅後に得られたブロッティング後及び増強化学発光による検出後の増幅産物を示す図である。
レーン１  配列９−配列１０
レーン２  配列９−配列５
レーン３  配列１０−配列４
レーン４  配列１０−配列５
レーン５  配列３−配列１２
【配列表】
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0003689333.tif 000008
0003689333.tif 000009
0003689333.tif 000010
0003689333.tif 000011
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【図１】
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