(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、並びにＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される安定化緩衝剤を含んで成る安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物。
【請求項２】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）がヒトG-CSF、ウシG-CSFおよびイヌG-CSFから成る群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）がウシG-CSFである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
生理学的pHにある請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
4.0〜7.5のpHにある請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
生理学的温度にある請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が少なくとも３日間保持される請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が生体内で少なくとも３日間持続する請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記M粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜5 mg/mLの範囲の濃度で存在する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記安定化緩衝剤が0.05 M〜２ Mの範囲の濃度で存在する請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記安定化緩衝剤がHEPESであり、１ Mの濃度で存在する請求項１〜10のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、並びにＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される医薬として許容される安定化緩衝剤を含んで成る、哺乳類への非経口投与のための安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物の医薬として許容される投与形態。
【請求項１３】
粘度改質剤および界面活性剤から成る群から選択される成分をさらに含んで成る請求項12に記載の投与形態。
【請求項１４】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜5 mg/mLの範囲の濃度で存在するウシG-CSFであり、前記哺乳類が雌ウシであり、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が少なくとも３日間維持され、そして前記組成物が7.5のpHにある請求項12または13に記載の投与形態。
【請求項１５】
前記緩衝液がHEPESであり、0.05 M〜２ Mの範囲の濃度で存在する請求項12〜14のいずれか１項に記載の投与形態。
【請求項１６】
前記ウシG-CSFが0.1 μg/kg〜50 μg/kgの範囲の用量で投与される請求項14又は15に記載の投与形態。
【請求項１７】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）と、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される安定化緩衝剤を一緒にする工程を含んで成る、哺乳類への非経口投与のための医薬として許容される投与形態の安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物の製造方法であって、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が少なくとも３日間哺乳類に対する防護を提供するのに十分な量で存在することを特徴とする製造方法。
【請求項１８】
安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物をヒト以外の哺乳類に投与する段階を含んで成るヒト以外の哺乳類における感染の治療または予防方法であって、当該安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）組成物が、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）並びにＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される安定化緩衝剤を含んで成り、当該組成物が少なくとも３日間、治療に有効なレベルの顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を保持し得ることを特徴とする方法。
【請求項１９】
安定化されたG-CSF含有持続性組成物を雌ウシに投与することを含んで成る畜牛における乳腺炎、子宮炎またはウシ呼吸器疾患の治療または予防方法であって、当該安定化されたG-CSF組成物が、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）並びにＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される安定化緩衝剤を含んで成り、当該組成物が少なくとも３日間、治療に有効なレベルの顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を保持し得ることを特徴とする方法。
【請求項２０】
安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物をヒト以外の哺乳類に投与することを含んで成る、当該ヒト以外の哺乳類において顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を療法に必要なレベルに保持する方法であって、当該安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物が、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）並びにＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される安定化緩衝剤を含んで成り、当該組成物が少なくとも３日間、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を治療に有効なレベルに保持し得ることを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜5 mg/mLの範囲の濃度で存在するウシG-CSFであり、そして当該組成物が7.5のpHである請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜5 mg/mLの範囲の濃度で存在するウシG-CSFであり、そして当該組成物が7.5のpHである請求項18に記載の方法。
【請求項２３】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜5 mg/mLの範囲の濃度で存在するウシG-CSFであり、そして当該組成物が7.5のpHである請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜5 mg/mLの範囲の濃度で存在するウシG-CSFであり、そして当該組成物が7.5のpHである請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を有する一次容器、並びにＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TRICINE）から成る群から選択される医薬として許容される安定化緩衝剤を有する二次容器を含んで成る、安定化された顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）含有持続性組成物を哺乳類に投与するためのキットであって、前記一次容器の顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が、前記二次容器の医薬として許容される安定化緩衝剤と組合わされており、少なくとも３日間、哺乳類において顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を治療に有効なレベルに保持し得るキット。
【請求項２６】
前記顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）が0.01〜５ mg/mLの範囲の濃度で存在するウシG-CSFであり、そして前記組成物が7.5のpHにある請求項25に記載のキット。
【請求項２７】
ウシG-CSFおよびHEPES緩衝液を含んで成る安定化されたウシG-CSF含有組成物であって、３週間〜18ヶ月の範囲の長期保存寿命を提供し得る組成物。
【請求項２８】
前記HEPES緩衝液が0.05 M〜２ Mの範囲の濃度にある組成物であって、7.5のpH及び40℃未満の温度を有する、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
温度が４℃である請求項28に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定化されたタンパク質組成物に関する。本発明の安定化された組成物は、療法的有効量のタンパク質、例えばコロニー刺激因子、例えばウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）を哺乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコに持続する期間中供給するのに有用である。特に、本発明の安定化された組成物は、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥがin vivo およびin vitroで持続する期間のタンパク質活性を保持し得るような安定化緩衝剤を含有する。
【０００２】
【従来の技術】
療法的有効量のタンパク質、例えばＧ−ＣＳＦの製剤は、in vitroおよびin vivo 活性の保存寿命を延長するよう製剤化するのが依然として難しい。このようなタンパク質の製剤は、有効な治療のために、適切な期間、それらの活性および生物学的完全性を保持しなければならない。さらに、このようなタンパク質の製剤は、医薬として許容される方法で製造可能で且つ動物に投与可能でなければならない。
【０００３】
タンパク質の製剤組成物は凍結または凍結乾燥形態で提供されており、長期間タンパク質活性を保持する保存条件下でin vitroで保持されている。凍結乾燥製剤は、医薬として許容される希釈剤、例えば注射用滅菌水を用いて使用前に再構成される。タンパク質の製剤組成物は、液体形態でも提供されている。このような液体タンパク質製剤は、特に高温での、長期間に亘るタンパク質活性の損失のために、保存で保持するのが難しい。
【０００４】
治療的に有効なタンパク質の製剤は、固体（凍結乾燥）であれ液体形態であれ、動物への例えば皮下注射による投与後の活性の突然の損失を伴わずに動物に投与するのは難しい。注射部位でのタンパク質活性の急速な損失のため、有効な療法のためには適用範囲の所望期間中毎日投与する必要があるために、動物における感染を治療するにはタンパク質は不便である。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えばウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）は、二次構造の損失およびジスルフィドインターチェンジ、ならびにその後の活性の損失のために、４０℃以上では不安定である。この活性の損失は、ウシの体温が約４０℃で、注射部位は生理学的ｐＨ範囲であるために、注射部位で起こる。
【０００５】
保存寿命を延ばすための種々のタンパク質製剤が知られている。米国特許第5,104,651 号（Boone 等、１９９２年４月１４日発行）は、１０００μｍｈｏｓ／ｃｍ未満の伝導率を有する、３．０〜３．７の範囲のｐＨのＧ−ＣＳＦと酸の製剤組成物に言及する。米国特許第4,992,271 号（Fernandes 等、１９９１年２月１２日発行）は、ｐＨ６．８〜７．８で水性ベースの担体媒質中に溶解された生物学的に活性な組換えインターロイキン２タンパク質を含有し、さらにヒト血清アルブミンのようなタンパク質のための安定剤を含有する製剤組成物に言及する。
【０００６】
米国特許第4,623,717 号（Fernandes 等、１９８６年１１月１８日発行）は、低温殺菌前に安定化量の糖または還元糖およびアミノ酸とタンパク質とを混合することにより熱感受性治療的活性タンパク質が低温滅菌される低温殺菌化治療的活性タンパク質組成物に言及する。米国特許第4,645,830 号（Yasushi 等、１９８７年２月２４日発行）は、溶液中にｐＨ３〜６でインターロイキン２、ヒト血清アルブミンおよび還元化合物を含有する安定インターロイキン２組成物に言及する。
【０００７】
米国特許第4,647,454 号（Cymbalista、１９８７年３月３日発行）は、ポリビニルピロリドンを用いたヒト繊維芽細胞インターフェロンを安定化する方法に言及する。米国特許第4,675,184 号（Hasegawa等、１９８７年６月２３日発行）は、インターフェロン、３価または多価糖アルコール、有機緩衝液および製剤担体または希釈剤を含有するウイルス感染を治療するための組成物であって、約３〜６のｐＨを有する組成物に言及する（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。
【０００８】
治療的に有効な種類のタンパク質の一例は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、コロニー刺激因子として知られているいくつかの糖タンパク質増殖因子の１つである。このようなコロニー刺激因子は、造血前駆細胞（haemopoietic progenitor cell）の増殖を支持し、特定の骨髄前駆細胞の増殖およびそれらの顆粒球への分化を刺激する。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、好中球性顆粒球コロニー形成を刺激し、in vitroでネズミ骨髄単球性白血病性細胞の末期分化を誘導し得る。Ｇ−ＣＳＦは、好中球の機能的活性を刺激して殺微生物活性増強を引き起こすことも示されている。Ｇ−ＣＳＦは、１７４個のアミノ酸の既知のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの組換え形態が調製されている。ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現は既知である（Nagata, S. et  al., Nature, 319, 415-418（1986））。WO-A-8604606およびWO-A-8604506は、ヒトＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を記載する。米国特許第5,606,024 号（Boone 等、１９９７年２月２５日発行）および米国特許第5,472,857 号（１９９５年１２月５日発行）は、イヌ顆粒球コロニー刺激因子（ｃＧ−ＣＳＦ）をコードするＤＮＡ配列ならびに、イヌまたはネコのような動物に有効量のヒトおよびイヌＧ−ＣＳＦを投与することによりこのような動物における感染の治療または予防方法を記載する。
【００１０】
米国特許第4,810,643 号（Souza 、１９８９年３月７日発行）は、ヒトＧ−ＣＳＦ様ポリペプチドを記載する。欧州特許出願第719860号（１９９６年７月３日公開）は、天然ウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）、ｂＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列および有効量のＧ−ＣＳＦを動物に投与することによる動物における乳腺炎の治療または予防方法を記載する。WO-A-8702060は、ヒトＧ−ＣＳＦ様ポリペプチド、それらをコードする配列およびそれらの製造方法を記載する。米国特許第4,833,127 号（Ono 等、１９８９年５月２３日発行）は、新規の生物学的に活性なヒト顆粒球コロニー刺激因子を記載する。欧州特許出願第612,846 号（１９９４年８月３１日公開）は、ある種のＧ−ＣＳＦ類似体およびこのような類似体を含有する組成物を記載する（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含まれる）。
【００１１】
顆粒球コロニー刺激因子は、増殖またはビルレンスに必要な特定の微生物標的をターゲッティングするというよりむしろ、動物の免疫受容能を増大する抗感染薬として有用である。非特異的免疫応答をターゲッティングして微生物感染に対する抵抗力の増大をもたらす獣医学に用いられるその他の市販の薬剤は多くない。利用可能な制御手段は、従来の抗菌薬および限定数の生化学的薬剤に限られている。畜牛における乳汁回収期に関連した経済的損失は、従来の抗菌薬の用途を限定する。近年のワクチンは限定数の種を標的にし、これらの薬剤の領域効能は広範に変化する。最も成功したワクチン（大腸菌Ｊ５）は、内毒素汚染に関連した安全性問題のために、それらの世界的使用が制限されている。
【００１２】
乳腺炎（mastitis）は、全世界の酪農生産者に影響を及ぼす大疾病問題である。乳腺炎に関連した米国内での経済的損失は、年間１０億ドルを超える。これらの損失は、死亡率、乳汁廃棄、乳汁産生における急性および慢性疾患、早期採集の増大、ならびに薬物および獣医師労働経費に関連がある。分娩周囲期の酪農雌ウシは、乳腺の細菌感染に対するそれらの感受性を増大する免疫応答（好中球機能）の損傷を示す。この感受性増大の衝撃は、新規の臨床的乳房内感染の約４０％が仔ウシ出産後、最初の２週間以内に起きるということにより例示される。乳腺炎は、広範な種々の細菌病原体、例えばグラム陽性菌およびグラム陰性菌に関連する。
【００１３】
乳腺炎を引き起こす既知の病原性微生物のいくつかは、大腸菌（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・アガラクチェ（Streptococcus agalactiae) 、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus  uberis)、ストレプトコッカス・ディスガラクチァ（Streptococcus  dysgalactiae)、アエロバクター・アエルギノーサ（Aerobacter  aerogenes)、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae)およびシュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa) である。これらの病原体は、乳頭管を通って乳腺に入り、乳汁産生組織の炎症を生じて、瘢痕組織を形成させて、これが乳汁産生能力の恒久的損失を引き起こし得る。乳腺炎の種々の形態を以下に挙げる：乳腺感染、慢性乳腺炎、臨床的乳腺炎および無症状性乳腺炎。
【００１４】
近年の抗菌療法およびワクチンは、授乳中の雌ウシにおけるそれらの効用を制限する多数の欠点を有する。乳腺炎を制御するための抗生物質療法は血管があることが見出されている。正常免疫受容能を回復させて、乳腺炎の発生数および重症度を低減させるのに有用な生物療法薬が必要とされる。
【００１５】
輸送熱とも呼ばれるウシ呼吸器疾患は、畜牛に影響を及ぼすもう一つの一般的疾患である。ウシ呼吸器疾患は、飼育用地へのまたは牧場への輸送後に畜牛を襲う疾患で、畜牛に影響を及ぼす種々のストレス、例えば離乳、去勢、角切り、絶食、過密、感染性作因への曝露、食餌変化および温度変化が、いくつかの既知の病原体のいずれかによる感染と組合さって引き起こされる。パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella  haemolytica）は、畜牛の呼吸器系に損傷を引き起こすこのような一般的病原体の１つである。
種々の生殖系疾患を含めたいくつかのさらに別の感染性疾患も、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギおよびヒツジに影響を及ぼすことが知られている。畜牛で発生するこのような疾患の一例が子宮炎である。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
in vivo での持続する期間中ずっと治療的に有効である安定したタンパク質組成物が必要である。さらに、in vitro保存寿命および保存の延長を提供するタンパク質の製剤が必要とされる。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、タンパク質および安定化緩衝剤を含んで成る安定化されたタンパク質組成物であって、持続する期間中、治療レベルのこのようなタンパク質を保持し得る組成物に関する。
本発明の特定の態様としては、生理学的ｐＨにある安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明の他の態様としては、安定化されたタンパク質組成物が生理的温度にある安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のその他の特定の態様としては、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
【００１８】
本発明のさらに別の特定の態様としては、持続する期間が少なくとも約３日間である安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のさらに別の特定の態様としては、タンパク質がコロニー刺激因子、ソマトトロピン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、抗体および抗原から成る群から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質がヒトＧ−ＣＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、Ｇ−ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
【００１９】
本発明のその他の特定の態様としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のその他のさらに特定の態様としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のさらに別の特定の態様としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして組成物が生理学的ｐＨにある安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
【００２０】
本発明のさらに別の特定の態様としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦであり、そして組成物が生理学的温度にある安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。本発明のさらに特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦである安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のその他の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そしてｂＧ−ＣＳＦが０．００１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のその他の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
【００２１】
本発明のさらに他の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そして安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のさらに別の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そして組成物が生理学的ｐＨである安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
本発明のさらに別の特定の態様としては、タンパク質がウシＧ−ＣＳＦであり、そして組成物が生理学的温度である安定化されたタンパク質組成物が挙げられる。
【００２２】
好ましくは、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中にウシＧ−ＣＳＦを含んで成る組成物である。さらに好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。このようなウシＧ−ＣＳＦ製剤は、好ましくは生理学的ｐＨ、例えばｐＨ７．５である。さらに、このような好ましいウシＧ−ＣＳＦ製剤は、少なくとも３日〜７日間、またはそれ以上の間の持続する期間中、治療レベルのウシＧ−ＣＳＦを保持し得る。
【００２３】
さらに、本発明の安定化されたタンパク質組成物はＨＥＰＥＳ緩衝液中にウシＧ−ＣＳＦを含んで成る組成物であって、保存寿命および保存の延長を提供し得る。好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに好ましくは、このような組成物は、約４．０〜約７．５好ましくは４．０のｐＨで、約４０℃未満、好ましくは約４℃の温度に保持される。保存寿命および保存の延長は、約３週間〜約１８ヶ月の範囲、好ましくは約６週間〜約１年の範囲である。
【００２４】
本発明はさらに、タンパク質および医薬として許容される安定化緩衝剤を含んで成る哺乳類への非経口投与のための安定化されたタンパク質組成物の医薬として許容される投与形態であって、組成物が持続する期間中治療レベルのこのようなタンパク質を維持し得る、そしてタンパク質が持続する期間中哺乳類に治療利益を提供するのに十分な量で存在する投与形態に関する。
本発明の特定の態様としては、投与形態が粘度改質剤および界面活性剤から成る群から選択される成分をさらに含んで成る医薬として許容される投与形態が挙げられる。
【００２５】
本発明はさらに、タンパク質と安定化緩衝剤を一緒にする工程を含んで成る哺乳類への非経口投与のための医薬として許容される投与形態の安定化されたタンパク質組成物の製造方法であって、安定化されたタンパク質組成物が持続する期間中、治療レベルのこのようなタンパク質を保持することができ、そしてタンパク質が少なくとも約３日間哺乳類に対する防護を提供するのに十分な量で存在する方法に関する。
本発明はさらに、療法的有効量の安定化されたタンパク質組成物を哺乳類に投与することを含んで成る哺乳類における感染の治療または予防方法であって、安定化されたタンパク質組成物がタンパク質および安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が持続する期間中このようなタンパク質の治療レベルを保持し得ることを特徴とする方法に関する。
【００２６】
本発明の特定の態様としては、タンパク質がＧ−ＣＳＦである哺乳類における感染のこのような治療または予防方法が挙げられる。
本発明はさらに、療法的有効量の安定化Ｇ−ＣＳＦ組成物を哺乳類に投与することを含んで成る畜牛における乳腺炎、子宮炎またはウシ呼吸器疾患の治療または予防方法であって、安定化Ｇ−ＣＳＦ組成物がＧ−ＣＳＦおよび安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が持続する期間中、このようなタンパク質の治療レベルを保持し得ることを特徴とする方法に関する。
【００２７】
本発明はさらに、安定化されたタンパク質組成物を哺乳類に投与することを含んで成る、持続する期間中に哺乳類においてタンパク質を治療レベルに保持する方法であって、安定化されたタンパク質組成物がタンパク質および安定化緩衝剤を含んで成り、組成物が持続する期間中、このようなタンパク質の治療レベルを保持し得ることを特徴とする方法に関する。
本発明の特定の態様としては、持続する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質の保持方法であって、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択される方法が挙げられる。
【００２８】
本発明のその他の特定の態様としては、持続する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質のこのような保持方法であって、持続する期間が少なくとも約３日間である方法が挙げられる。
本発明のその他の特定の態様としては、持続する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質のこのような保持方法であって、タンパク質がコロニー刺激因子、ソマトトロピン、サイトカイン、抗体および抗原から成る群から選択される方法が挙げられる。サイトカインの特定の例としては、インターロイキン、例えばインターロイキン１〜１８、並びにインターフェロン、例えばインターフェロンα、βおよびガンマが挙げられる。
【００２９】
本発明のさらに特定の態様としては、持続する期間中の哺乳類における治療レベルのタンパク質のこのような保持方法であって、タンパク質がヒトＧ−ＣＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦおよびイヌＧ−ＣＳＦから成る群から選択される方法が挙げられる。
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、Ｇ−ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする方法が挙げられる。
【００３０】
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択されることを特徴とする方法が挙げられる。
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在することを特徴とする方法が挙げられる。
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、Ｇ−ＣＳＦがウシＧ−ＣＳＦであることを特徴とする方法が挙げられる。
【００３１】
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのｂＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、ｂＧ−ＣＳＦが０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする方法が挙げられる。
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのｂＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、安定化緩衝剤がＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥから成る群から選択されることを特徴とする方法が挙げられる。
本発明のさらに他の特定の態様としては、持続する期間中に哺乳類において治療レベルのｂＧ−ＣＳＦを保持する方法であって、安定化緩衝剤が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在することを特徴とする方法が挙げられる。
【００３２】
本発明はさらに、療法的有効量のタンパク質を有する一次容器、および医薬として許容される安定化緩衝剤を有する二次容器を含んで成る、安定化されたタンパク質組成物を哺乳類に投与するためのキットであって、一次容器の療法的有効量のタンパク質が、二次容器の医薬として許容される安定化緩衝剤と組合わされ、持続する期間中の哺乳類におけるこのようなタンパク質の治療レベルを保持し得るキットに関する。
本発明の特定の態様としては、タンパク質が少なくとも３日間、哺乳類に対する防護を提供するのに十分な量で存在するキットが挙げられる。
【００３３】
本発明の好ましい組成物は、ウシＧ−ＣＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含んで成り、in vivo で少なくとも３日間、哺乳類において治療レベルのウシＧ−ＣＳＦを保持し得る安定化されたタンパク質組成物であって、約７．５のｐＨを有し、ほぼ生理学的温度または４０℃の温度にある組成物である。このような組成物は、哺乳類が雌ウシである場合に特に有用である。特に、ＨＥＰＥＳ緩衝液は約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。ＨＥＰＥＳ緩衝液が約１Ｍの濃度で存在する場合が特に好ましい。好ましくはウシＧ−ＣＳＦは約０．０１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する。最も好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦの濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌである。
【００３４】
好ましくは、本発明はさらに、ウシＧ−ＣＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含んで成る安定化されたタンパク質組成物であって、約３週間〜約１８ヶ月の範囲の長期保存寿命を提供し得る組成物に関する。ＨＥＰＥＳ緩衝液が約０．０５Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する場合は特に好ましい。組成物が約７．５のｐＨであり、そして組成物の温度が約４０℃未満である場合も好ましく、最も好ましくは約４℃である。長期保存寿命が約６ヶ月〜約１年である場合も特に好ましい。あるいは、長期保存寿命を可能にするこのような安定化された組成物は、約４０℃の組成物温度で保持され得る。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明は、安定化されたタンパク質組成物がin vivo およびin vitroの両方で持続する期間のタンパク質活性を保持し得るように、タンパク質、特に哺乳類、例えばヒト、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびブタにおける感染の治療に有用なタンパク質が、安定化緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥのタンパク質への付加により安定化され得る、という意外な発見を基礎にした安定化されたタンパク質組成物に関する。in vivo 活性に関しては、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、持続する期間中、哺乳類における治療的有効レベルのこのようなタンパク質を保持し得る。
【００３６】
特に、本発明は、長期間の治療薬活性を提供する安定化緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳまたはＴＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの持続放出性（持続活性）製剤である。ｂＧ−ＣＳＦは、約４０℃の温度で変性し、そして中性ｐＨで不安定である、ということが知られている。これは、生理学的ｐＨが中性に近く、雌ウシの体温が約４０℃であるために、問題である。
【００３７】
本発明の安定化された組成物のタンパク質は、天然タンパク質、単離または精製されたタンパク質、あるいは組換え的に産生されたタンパク質であり得る。化学的に修飾されたタンパク質もすべて、本発明の範囲内に含まれる。タンパク質の化学的修飾としては、例えばメチオニン酸化、システインＳ−アルキル化およびβ−メルカプトエタノールを用いたジスルフィド付加、リジンアミノ基のアルキル化等が挙げられる。本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用いるのに好ましいタンパク質はＧ−ＣＳＦであり、最も好ましいのはタンパク質ｂＧ−ＣＳＦである。
【００３８】
「Ｇ−ＣＳＦ」とは、顆粒球コロニー刺激因子、例えばその天然形態の顆粒球コロニー刺激因子、ならびにその変異体（variant)および突然変異体（mutant) 、例えば１つ又はそれ以上のアミノ酸欠失、置換および／または付加を有する組換え変異体を意味する。このような変異体および突然変異体は、哺乳類における治療的利益を提供するためのすべてのまたは十分な生物学的活性を保有する。その天然形態のＧ−ＣＳＦは、１７４個のアミノ酸を有するタンパク質を包含する糖タンパク質であり、ある形態は３つの付加的アミノ酸を有する。両形態とも、５個のシステイン残基を有し、そのうちの４個は２つのジスルフィド結合を形成し、１個は遊離形態である。
【００３９】
本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用いるのに適したタンパク質のその他の例としては、例えばアクチビン、接着分子、例えばＬ−セレクチン、ＣＤ−１８およびＩＣＡＭ−１、ケモカイン、走化性因子、エリスロポエチン、増殖因子、インヒビン、インスリン、インターフェロン、例えばα、βおよびγ、インターロイキン、例えばインターロイキン１〜１８、レプチン、マクロファージ炎症性タンパク質、マクロファージ遊走阻止因子、マクロファージ刺激タンパク質、ニュートロフィン、好中球阻止因子、オンコスタチン、ソマトスタチン、ソマトトロピン（全種、例えばブタ、ウシまたはヒト）、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、トロンボポエチン、ならびに前記のタンパク質すべてに対する細胞関連および可溶性受容体、そして哺乳類に投与した場合に有益なまたは治療的結果を提供し得るその他のいずれかのおよびあらゆるタンパク質が挙げられる。
【００４０】
本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用い得る特定のタンパク質の例を、表１〜表６に示す。本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用い得るその他のタンパク質としては、R&D Systems Catalogue, 614 McKinley Place NE, Minneapolis MN 55413, USA （この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されているものが挙げられる。
【００４１】
【表１】
0003641170.tif 000002
【００４２】
【表２】
0003641170.tif 000003
【００４３】
【表３】
0003641170.tif 000004
【００４４】
【表４】
0003641170.tif 000005
【００４５】
【表５】
0003641170.tif 000006
【００４６】
【表６】
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【００４７】
好ましいタンパク質は、哺乳類、例えばヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびネコにおける感染の治療または予防に有用なものである。このような感染は、細菌感染または原生動物感染であり、あるいはウイルスにより引き起こされ得る。
本明細書中で用いる場合は、別記しない限り、「感染」という用語は、哺乳類において生じる細菌、原生動物、真菌およびウイルス感染、ならびに本発明の安定化されたタンパク質組成物を投与することにより治療または予防され得るこのような感染に関連した疾病を含む。
【００４８】
本発明の安定化されたタンパク質組成物を用いて治療され得る感染性疾患としては、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、エシェリシア・コリ（Escherichia coli) 、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus  uberis)、ストレプトコッカス・ディスガラクチア（Streptococcus  dysgalactiae)、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、クレブシエラ・スペーシス（Klebsiella sp.) 、コリネバクテリウム・スペシス（Corynebucterium sp.)に関連するがこれらに限定されない畜牛の感染性疾患、例えばウシ乳腺炎；ウシの伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella  multocida）およびヘモフィルス・ソムナス（Haemophilus somnus）に関連するがこれらに限定されないウシ呼吸器疾患；生殖系疾患、例えば子宮炎；ならびに大腸菌およびアイメリア属に関連するが、これらに限定されないウシの下痢が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の安定化されたタンパク質組成物を用いて治療され得る感染性疾患のその他の例としては、イヌの感染性疾患、例えば膿皮症、ならびにケンネル咳とも呼ばれるイヌの呼吸器疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の安定化されたタンパク質組成物は、感染症の治療または予防以外の治療的利益を提供するために用い得る。感染症の治療または予防以外の治療的利益または作用の一例は、イヌおよびネコに組換えヒトＧ−ＣＳＦを投与して、化学療法誘導性骨髄抑制を改善し、癌治療プロトコールをより攻撃的にさせることである。
【００５０】
本明細書中で用いる場合、「安定化する」という用語は、別記しない限り、長時間、治療レベルのタンパク質を保持することを示す。タンパク質のこのような保持治療レベルは、本発明の安定化されたタンパク質組成物を哺乳類に投与後に、またはin vitroでは使用前または保存中に生じる。本発明のタンパク質組成物の安定度は、例えば本明細書に記載した方法を用いて、初期濃度に対する％対時間により確定され得る。
【００５１】
哺乳類への投与後に、本発明の安定化された組成物は、タンパク質が持続する期間中、その治療的または有益な作用を提供し得るように、保持治療レベルのタンパク質を提供する。本明細書中で用いる場合、別記しない限りは、「持続する期間」という用語は、本発明の安定化されたタンパク質組成物の哺乳類への投与後、あるいはin vitroでは使用前、または保存中に、治療レベルのタンパク質が保持される期間を示す。
【００５２】
タンパク質治療レベルの持続する期間は、例えば、水またはＰＢＳ中のタンパク質の対照溶液を用いて比較した場合、安定化緩衝剤の存在を伴わない哺乳類への同一タンパク質の投与により成され得るよりも長い期間、哺乳類における有益なまたは治療的作用を提供する。あるいは、in vitro保存条件下では、タンパク質治療レベルの持続する期間は、例えば、水またはＰＢＳ中のタンパク質の対照溶液を用いて比較した場合、安定化緩衝剤の存在を伴わない条件下での同一タンパク質の保存により成され得るよりも長い期間タンパク質の安定度増大を提供する。好ましくは、持続する期間は少なくとも３日である。最も好ましくは、持続する期間は約７日またはそれ以上である。
【００５３】
本明細書中で用いる場合、別記しない限り、「治療レベル」という用語は、種々の投与レジメンで治療効果を提供するタンパク質の量を指す。このような量はあ、当業者には容易に確定される。タンパク質の量は、感染の種類および重症度、投与経路等によっている。
「安定化緩衝剤」とは、本発明の安定化された組成物のタンパク質と組合わせた場合に、安定化されたタンパク質組成物を提供し、この組成物が持続する期間中、治療レベルのこのようなタンパク質を保持し得るいくつかの緩衝液のいずれかを意味する。
【００５４】
治療レベルの保持は、例えば、当業者に既知の方法により確定される場合、タンパク質活性を測定することにより確定され得る。好ましくは、安定化緩衝剤は、生理学的ｐＨで作用する。安定化緩衝剤としては、有機緩衝液、例えば一般的に「良好な緩衝液」と呼ばれ、６〜８．５の範囲で作用する両イオン性緩衝液、が挙げられるが、これらに限定されない。このような安定化緩衝剤の例としては、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２  アミノエタンスルホン酸）およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、カコジル酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩＳＴＲＩＳ）、ピペラジンＮ，Ｎ‘ビス−（２  エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、イミダゾールおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）が挙げられる。本発明の安定化されたタンパク質組成物中に用い得る緩衝液の例を、表７に示す。
【００５５】
【表７】
0003641170.tif 000008
【００５６】
本発明の安定化されたタンパク質組成物のｐＨは、約４．０〜約８の範囲である。
本明細書中で用いる場合、「生理学的ｐＨ」とは、別記しない限り、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコで認められるｐＨの範囲を指す。哺乳類の生理学的ｐＨは、一般に約６．５〜約８．０の範囲内である。
本発明の安定化されたタンパク質組成物の温度は、約２０℃〜約５０℃の範囲である。
【００５７】
本明細書中で用いる場合、「生理学的温度」とは、別記しない限り、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコで認められる体温の範囲を指す。哺乳類の生理学的温度は、一般に約３７℃〜約４０℃の範囲内である。哺乳類の生理学的温度のいくつかの例を以下に示す：ヒト  ３７℃；ウシ  ３９℃；ネコ  ３８℃；イヌ  ３９℃；ヤギ  ３９℃；ウマ  ３７℃；そしてブタ  ３７℃。
【００５８】
好ましくは、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液およびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液から選択される安定化緩衝剤中に、タンパク質としてＧ−ＣＳＦを、さらに好ましくはウシＧ−ＣＳＦを含有する。その結果生じる安定化されたタンパク質組成物は、ウシの生理学的ｐＨで、そして４０℃のウシの生理学的温度で、少なくとも３日間の持続する期間中、治療的有効レベルにｂＧ−ＣＳＦの活性を保持し得る。
【００５９】
安定化されたタンパク質組成物は、既知のそして一般に利用可能な組合せ技法を用いて、タンパク質および安定化緩衝剤を一緒にすることにより、調製し得る。安定化されたタンパク質組成物の特定の製造方法には、当業者に既知のタンパク質精製方法にしたがって調製された精製形態のタンパク質の使用が含まれる。
【００６０】
治療的値の特定のタンパク質に関しては、種々の濃度の、例えば０．０５Ｍ〜２Ｍの緩衝液濃度のいくつかの緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥまたはその他の緩衝液の各々の中に、特定のタンパク質を溶解し得る（最大溶解度まで）。さらに、溶液のｐＨは、典型的には約ｐＨ４．０〜約８．０に変わり得る。特定の緩衝液中のタンパク質の最大溶解度は、当業者に既知の従来の手段により決定され得る。
【００６１】
次に、タンパク質溶液が投与されるよう意図された哺乳類の生理学的温度で溶液を保存し得る。溶液中に存在するタンパク質の量は、時間の関数として決定し得る。溶液中のタンパク質の治療的レベルは、時間の関数としてのタンパク質の回収率％をモニタリングすることにより決定され得る。残留するタンパク質の量またはタンパク質の回収率％を、治療的利益に必要なタンパク質の既知の限界値（閾値）レベルと比較する。
【００６２】
次に、溶液中に残存するタンパク質の量が治療的利益に必要なタンパク質の既知の限界値（閾値）レベルと等しいかまたはそれより大きい日数として、持続する期間を決定し得る。安定化緩衝剤として有効な緩衝液は、特定のタンパク質と組合せた場合に、持続する期間中、即ち安定化緩衝剤の非存在下で哺乳類に同一タンパク質を投与することにより可能であるよりなぎ期間、タンパク質の治療的レベルの保持を提供するものである。
【００６３】
タンパク質の安定度は、時間の関数としてタンパク質の活性を測定することにより決定され得る。タンパク質のアンフォールディング（unfolding)温度（Ｔｍ）は、タンパク質に関する溶液安定度およびin vivo 安定度のマーカーとして用い得る。特定のタンパク質のアンフォールディング温度は、タンパク質がその二次構造を、典型的にはその活性を失い、そして当業者に既知の方法、例えば示差走査熱量計を用いて決定され得る温度を指す。
【００６４】
本発明の安定化されたタンパク質組成物中に存在するタンパク質の量は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲である。Ｇ−ＣＳＦに関しては、好ましい範囲は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌである。
本発明の安定化されたタンパク質組成物の一例は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する組成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＨＥＰＥＳ緩衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００６５】
本発明の安定化されたタンパク質組成物の別の例は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＴＥＳ緩衝液を含有する組成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＴＥＳ緩衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
本発明の安定化されたタンパク質組成物のさらに別の例は、ｂＧ−ＣＳＦおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液を含有する組成物であるが、この場合、ｂＧ−ＣＳＦは約０．１〜約５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し、そしてＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液は約０．１Ｍ〜約２Ｍの範囲の濃度で存在する。さらに好ましくは、ｂＧ−ＣＳＦ濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００６６】
本発明の安定化されたタンパク質組成物は、当業者に既知の従来の手段を用いて、凍結形態または凍結乾燥形態で調製し得る。凍結乾燥形態のタンパク質は、安定感漿液を用いて再構成し得る。あるいは、溶液は、すぐに用いるために、液体形態で保存し得る。好ましくは、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、長期保存中にその活性を保持する液体形態である。
本発明の安定化されたタンパク質組成物は、経口的に、非経口的（皮下、血管内、腹腔内および筋肉内）に、例えば吸入により鼻腔に、口腔内にまたは皮内に、あるいは当業者に既知の形態を用いた還流法により、投与し得る。非経口投与が好ましい。
【００６７】
投与経路にかかわらず、本発明の安定化されたタンパク質組成物は、当業者に既知の、または明らかな従来の方法により、医薬として許容される投薬形態に処方し得る。
本発明の安定化されたタンパク質組成物の医薬として許容される投薬形態は、好ましくは皮下投与に適している。皮下投与のための医薬として許容される投薬形態は、典型的には約２０ｍｌ以下の用量を有し（例えばウマおよびウシに投与するために）、滅菌性（哺乳類に適している）であり、さらに、哺乳類に十分耐容される、即ち注射部位に感知可能な腫脹、疼痛または壊死を誘発しない。
【００６８】
一般に、本発明の医薬として許容される投薬形態は、その他の医薬として許容される成分、例えば界面活性剤または洗剤、粘度改質剤、糖またはタンパク質を含有し、付加成分は、有効、安全な製剤投与に適した量で存在する。例えば、本発明の安定化されたタンパク質組成物の医薬として許容される投薬形態は担体、安定剤、希釈剤および／または防腐剤を用いて、一般に認められている慣習にしたがって、処方し得る。希釈剤としては、水、食塩水、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが特に挙げられる。安定剤としては、アルブミンが挙げられる。適切なその他のビヒクルおよび添加剤は、当業者には既知であるか、あるいは明らかになる。
【００６９】
本発明の安定化されたタンパク質組成物は、療法的有効量のタンパク質を有する一次容器、および医薬として許容される安定化緩衝剤を有する二次容器から成るキット中に提供され得る。タンパク質は固体、例えば凍結または凍結乾燥形態、あるいは液体形態である。次に、二次容器の医薬として許容される安定化緩衝剤と併合した場合に、一次容器の療法的有効量のタンパク質が持続する期間中、哺乳類においてこのようなタンパク質の治療レベルを保持し得るように、安定化緩衝剤をタンパク質と併合し、哺乳類に投与する。
【００７０】
本発明の特定の実施態様には、少なくとも３日間、哺乳類に防護を提供するのに十分な量でタンパク質が存在するキットが含まれる。
本発明の医薬として許容される投薬形態は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ、好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約３μｇ／ｋｇ〜約２５μｇ／ｋｇの範囲である。最も好ましい投薬形態は、ｂＧ−ＣＳＦの使用に関しては約２４μｇ／ｋｇである。用量は、少なくとも約３日間有効である。
以下に示した実施例は本発明の特定の実施態様の説明であって、本発明はそれらに限定されない。
【００７１】
【実施例】
実施例１．ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの持続安定度
０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍの緩衝液濃度を、３つの各緩衝液、即ちＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２  アミノエタンスルホン酸）およびＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）に関して調製した。
【００７２】
緩衝液は、Fluka  Biochemica  USAから入手した。各緩衝液のｐＨを、水酸化ナトリウム（J.T. Baker, USA ）を用いて７．５に調整した。０．２μＧＶフィルター（Millipore USA ）を用いて、緩衝液を滅菌濾過した。調製した緩衝液濃度を以下に示す：ＨＥＰＥＳ緩衝液：０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ；ＴＥＳ緩衝液：０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ；ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液：０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ。
【００７３】
前記の緩衝液濃度で、各緩衝液、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥおよびＨＥＰＥＳ中で、４．６９ｍｇの大量ｂＧ−ＣＳＦ（５３．３％の効力を基礎にして）を２５ｍｌ容量フラスコに付加し、次にこれを適切な緩衝液濃度を有する容量にして、０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。
表１に示した各緩衝液濃度で、各緩衝液、ＴＥＳ、ＴＲＩＣＩＮＥおよびＨＥＰＥＳ中で、９３．８ｍｇの大量ｂＧ−ＣＳＦ（５３．３％の効力を基礎にして）を２５ｍｌ容量フラスコに付加し、次にこれを適切な緩衝液濃度を有する容量にして、０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。
【００７４】
次にｂＧ−ＣＳＦを０．２２ミクロン低タンパク質結合フィルター（Millipore G.V.）を通して濾過した。１ｍｌの容量の各製剤を１ｍｌバイアルに入れた後、４０℃のオーブンに９日間入れた。調製されたｂＧ−ＣＳＦ緩衝液安定化溶液は、（１）ＨＥＰＥＳ緩衝液  ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中；（２）ＴＥＳ緩衝液  ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中；（３）ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液  ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍ中に０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦであった。試料は３日毎に各バイアルから取り出して、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した。結果を図１〜６、ならびに表８および９に示す。
【００７５】
【表８】
0003641170.tif 000009
表８は、前記のように調製した０．１ｍｇ／ｍｌ  ｂＧ−ＣＳＦ溶液の回収率％（残存）を時間の関数として示す。溶液は４０℃で保存した。
【００７６】
【表９】
0003641170.tif 000010
表９は、前記のように調製した２．０ｍｇ／ｍｌ  ｂＧ−ＣＳＦ溶液の回収率％（残存）を時間の関数として示す。溶液は４０℃で保存した。
【００７７】
図１〜３は、それぞれ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍの種々の濃度のＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中の、４０℃の保存条件下で、ｐＨ７．５での０．１ｍｇ／ｍｌ  ｂＧ−ＣＳＦ溶液の安定度を示す。図１〜３に示すように、緩衝液濃度が１Ｍおよびそれ以上に増大すると、ｂＧ−ＣＳＦ活性の安定度または保持は改善した。０．１ｍｇ／ｍｌ  ｂＧ−ＣＳＦでは、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの回収率は９０％であった（図１）。
【００７８】
図４〜６は、それぞれ０．１Ｍ、１Ｍおよび２Ｍの種々の濃度のＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中の、４０℃の保存条件下で、ｐＨ７．５での２．０ｍｇ／ｍｌ  ｂＧ−ＣＳＦ溶液の安定度を示す。この場合も、図４〜６に示すように、緩衝液濃度が１Ｍおよびそれ以上に増大すると、ｂＧ−ＣＳＦ活性の安定度または保持は改善した。
表８および９，ならびに図１〜６に示したデータは、緩衝液ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥの存在が、３〜９日間の持続する期間中のｂＧ−ＣＳＦの活性を有意に保持することを示す。
【００７９】
実施例２．水、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１Ｍ  ＴＥＳおよび１Ｍ  ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に処方したｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能
水、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１Ｍ  ＴＥＳおよび１Ｍ  ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo 検定を、仔ウシで実施した。２４μｇ／ｋｇ用量を仔ウシに投与し、ＰＭＮ（好中球）数をモニタリングした。
図７は、水、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１Ｍ  ＴＥＳおよび１Ｍ  ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に処方したｂＧ−ＣＳＦで処置したウシに関する総末梢血ＰＭＮ数（０時間値の制御％として表される）を示す。３つの緩衝液はすべて、１回注射から約１００時間の適用範囲を示した。これは、３つの緩衝液すべてが、注射部位でのin vivo でのタンパク質活性の持続する期間を提供することを実証する。
【００８０】
実施例３．ｂＧ−ＣＳＦのin vitro安定度に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液の作用
約７．０〜約８．５のｐＨ範囲で、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、下記のように種々の緩衝液系で、ｂＧ−ＣＳＦを配合した。全試料を、充填前に０．２ミクロンフィルター（Millipore G.V.）で濾過した。試料を４０℃で安定度に関して設置し、下記のように、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ  ＨＰＬＣ）、ＳＥＣ  ＨＰＬＣおよびバイオアッセイにより７〜１０日間、モニタリングした。ｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度は、ＶＰ−ＤＳＣ顕微熱量計システム（USA ）により測定した。
【００８１】
図８は、 Neupogen （登録商標)(市販のヒトＧ−ＣＳＦ（米国））（対照として使用）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、Hanks 緩衝液（市販、米国）および重炭酸緩衝液を含めた種々の緩衝液系中でのｂＧ−ＣＳＦの安定度の比較を提示する。結果は、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中に配合されたｂＧ−ＣＳＦが試験した全製剤の内で最も安定であり、 Neupogen （登録商標）緩衝液（ｐＨ４．０）に対しても同様の安定度を示した。ｂＧ−ＣＳＦは従来、中性または生理学的ｐＨ条件で、約４０℃またはそれ以上の温度で不安定であることが分かっていたので、図８に示したようなＨＥＰＥＳ緩衝液中でのｂＧ−ＣＳＦの安定度は、意外で且つ予期せぬことであった。ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、Hanks 緩衝液および重炭酸緩衝液中で処方したｂＧ−ＣＳＦは、安定でなかった。これは、表１０に記載したように確証された。
【００８２】
【表１０】
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【００８３】
４０℃で７日間の保存中、 Neupogen （登録商標）およびＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦはいかなる活性も失わなかった。図示したように、それぞれ初期値と比較して、ＰＢＣ中のｂＧ−ＣＳＦは活性が１０分の１になり、Hanks および重炭酸緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦは１００〜１０００分の１であった。
図９は、４０℃での１０００ｍＭ、５００ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの安定度に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液濃度の作用を示す。図９に示すように、ＨＥＰＥＳの濃度を低減すると、ｂＧ−ＣＳＦの安定度の有意な損失が認められた。
【００８４】
図１０は、２つの異なるｂＧ−ＣＳＦ溶液のサーモグラムである。最大温度４７℃を示す上方のサーモグラムは、ｐＨ７．５でＰＢＳ中に配合したｂＧ−ＣＳＦに関するものであり、最大温度５９℃を示す下方のサーモグラムは、ｐＨ７．５で１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中で配合したｂＧ−ＣＳＦに関する。ＨＥＰＥＳ緩衝液の非存在下では、ｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度は約４０℃（開始温度）であったが、一方１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦはアンフォールディング温度の１０°Ｃの上昇を生じる。アンフォールディング温度の増大は、安定化を示す。
【００８５】
実施例４．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのin vivo 検定を、仔ウシで実施した。１２μｇ／ｋｇ用量を仔ウシに投与し、白血球（ＷＢＣ）およびＰＭＮ（好中球）数をモニタリングした。結果を図１１に示す。
％ＰＭＮ（好中球）対時間のプロットである図１１は、３つの製剤：水中ｂＧ−ＣＳＦ（対照）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中ｂＧ−ＣＳＦ、および１Ｍ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ポラキサマー中ｂＧ−ＣＳＦの比較である。図１１に示すように、ＰＭＮ数は３日間または７２時間、限界値（閾値)(防護関連レベル）を超えている。製剤当たり６匹のウシを試験した。
【００８６】
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ポラキサマー（polaxamer)中ｂＧ−ＣＳＦを用いて、２４μｇ／ｋｇ用量を仔ウシに投与した二次試験では、１回注射が約２００時間の防護を、あるいは約８日間のカバレージ（coverage) を提供した。この結果は、ＨＥＰＥＳ緩衝液がｂＧ−ＣＳＦのin vivo 安定度を改善し、次に活性の持続する期間を、したがってこのタンパク質の供給を提供することを実証する。
【００８７】
実施例５．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの溶解度
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中のｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦの溶解度を決定した。ｂＧ−ＣＳＦ  約８０ｍｇを３０ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させた。タンパク質溶液を０．２ミクロンGV  Millipore フィルターを通して濾過し、次に５０ｍｌの限外濾過セルに移した。セルは、１０，０００分子量（ＭＷ）カットオフを示す低タンパク質結合膜を備えていた。限外濾過セルを用いて、タンパク質溶液を濃縮した。種々の時点で、試料をセルから取り出して、３１０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分析（光散乱を測定）により分析し、ＲＰ  ＨＰＬＣにより濃縮した。
【００８８】
３１０ｎｍでの吸光度を、濃度に対してプロットした。３１０ｎｍでの吸光度は濃度に伴って直線状に増大し、飽和時には、３１０ｎｍで曲線が突然折れて、吸光度は３１０ｎｍで劇的に増大する。これが起きた濃度が最大溶解度である。この方法は当業者には既知であり、典型的にはタンパク質溶解度の確定に用いられる。図１２に示すように、ｐＨ７．５での１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中のｂＧ−ＣＳＦの最大溶解度は、約５ｍｇ／ｍｌである。タンパク質の最大溶解度は、曲線が折れ曲がった時点の濃度で示される。約５ｍｇ／ｍｌの濃度では、３１０ｎｍの吸光度の突然の増大が認められ、これはタンパク質の最大溶解度に対応する。
【００８９】
実施例６．ｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度に及ぼすＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液の作用
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１Ｍ  ＴＥＳ、２Ｍ  ＴＥＳおよび１Ｍ  ＴＲＩＣＩＮＥ中に０．５ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液、ならびに１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１Ｍ  ＴＥＳ、２Ｍ  ＴＥＳおよび１Ｍ  ＴＲＩＣＩＮＥ中に２ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦを含有する溶液を調製した。これらの溶液は、実施例１に記載したのと同様の方法で調製した。ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水，ｐＨ７．４）を用いて、対照溶液を調製した。ｂＧ−ＣＳＦ溶液のｐＨはｐＨ７．５であった。ｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度は、２０〜９０℃の範囲の温度で、６０度／時間の走査速度を用いて、示差走査熱量計（Microcal Inc., USA）により決定した。結果を表１１に示す。
【００９０】
【表１１】
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【００９１】
アンフォールディング温度は、タンパク質に関する溶液安定度およびin vivo 安定度のマーカーとして用いた。表１１の結果は、１Ｍおよびそれより高い濃度でＨＥＰＥＳ、ＴＥＳまたはＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦのアンフォールディング温度（Ｔｍ）がＰＢＳ対照と比較して有意に高かったことを示す。３つの緩衝液は、約２〜１１℃だけＴｍを上げた。緩衝液濃度は、Ｔｍの上昇の程度に実質的に影響を及ぼした。ｂＧ−ＣＳＦのＴｍは、緩衝液濃度が増大すると上昇した。ＨＥＰＥＳ濃度を１Ｍから２Ｍに上げると約３℃上昇し、ＴＥＳ濃度を１Ｍから２Ｍに上げると約５℃上昇した。ｂＧ−ＣＳＦ濃度を増大すると、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍは低下した。
【００９２】
ＨＥＰＥＳおよびＴＥＳ緩衝液中ｂＧ−ＣＳＦ濃度を０．５ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌに増大すると、約２℃の低下が認められた。ＴＥＳ緩衝液は、２Ｍの緩衝液濃度および０．５ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ濃度で、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍを１１℃以上上昇せしめた。
表１１の結果は、３つの緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥ）すべてが、ＰＢＳと比較して、ｂＧ−ＣＳＦのＴｍを有意に上昇せしめることを示す。２Ｍ  ＴＥＳ中に配合したｂＧ−ＣＳＦは、他の緩衝液に比して、最高溶液安定度を示した。
【００９３】
実施例７．ＰＢＳおよびＨＥＰＥＳ中でのヒトおよびウシＧ−ＣＳＦ製剤の安定度の比較
０．１５ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよびｂＧ−ＣＳＦの製剤を、リン酸緩衝液（ダルベッコのＰＢＳ，ｐＨ７．４）および１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）中で調製した。製剤を１ｍｌバイアルに入れ（充填容量  ４００μｌ）、４０℃で１０日間保存した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および肉眼的検査により３日毎に試料を検定した。
図１３は、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のヒトＧ−ＣＳＦの安定度が、ＰＢＳと比較して、有意に改善されたことを示す。ヒトＧ−ＣＳＦは、ＰＢＳ中にｐＨ７．４で配合した場合、４０℃で１０日間に及ぶ分解を示したが、一方１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合した場合には６５％の回収率が観察された。
【００９４】
図１３および１４は、ウシＧ−ＣＳＦが、ＨＥＰＥＳおよびＰＢＳ製剤において、ヒトＧ−ＣＳＦよりやや良好な安定度を示すことを明示している。１Ｍ  ＨＥＰＥＳ製剤中のウシＧ−ＣＳＦの約８０％の回収率が４０℃で１０日後に観察されたが、一方、ヒトＧ−ＣＳＦの約６５％の回収率が観察された。両方のタンパク質、即ちウシおよびヒトＧ−ＣＳＦは、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中ではＰＢＳ中よりも実質的により安定している。
【００９５】
実施例８．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ製剤中のヒトおよびウシＧ−ＣＳＦの安定度
０．１ｍｇ／ｍｌのｈＧ−ＣＳＦおよびｂＧ−ＣＳＦの製剤を、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５）中で調製した。製剤を１ｍｌバイアルに入れ（充填容量  ４００μｌ）、４０℃で１０日間保存した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および肉眼的検査により３日毎に試料を検定した。
図１５は、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ製剤中のウシＧ−ＣＳＦおよびヒトＧ−ＣＳＦの安定度を示す。ウシＧ−ＣＳＦの約９０％の回収率、およびヒトＧ−ＣＳＦの約７０％の回収率が、４０℃で１０日後に認められた。
【００９６】
実施例９．ｂＧ−ＣＳＦ安定度に及ぼす製剤ｐＨの作用
０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ溶液の製剤を、ｐＨ４．０および７．５で、１Ｍ  ＨＥＰＥＳおよび１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液中に配合した。製剤を１ｍＬバイアル（充填容量４００μｌ）に入れ、４０℃にて１０日間貯蔵した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により３日毎に試料を検定した。
図１６および１８に示したように、４０℃で１０日後のｂＧ−ＣＳＦの回収率は、ｐＨ４．０では約１００％であったが、これに比して、図１７および１９に示したように、ｂＧ−ＣＳＦをｐＨ７．５で配合した場合には、約８０〜８５％の回収率が観察された。
【００９７】
実施例１０．１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳおよびＴＥＳ製剤中のｂＧ−ＣＳＦの長期熱安定性試験の６ヶ月サンプリング
この試験に含まれた製剤を以下に示す。１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳの市販製剤はGibco BRL （ロット番号１０１６４３６）から入手し、一方１．０Ｍ  ＴＥＳは、Fluka Scientificから入手した粉末（ロット番号ＲＡ１２６０２）から調製した。緩衝液ｐＨ値を７．５に調整した。ｂＧ−ＣＳＦは、Bioprocess（ロット番号ＢＰ１８５−１１）から５３．３％の純度で提供された。
【００９８】
１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳおよび１．０Ｍ  ＴＥＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌおよび２．０ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦの製剤を調製した。
試料保存には、１．０ｍｌの充填容量を用いて１３ｍｍ  １８８８Gray T/Fストッパー（ロット番号Ｒ０５６１９−７４８７）を有する３．５ｍｌフリント１型バイアル（ロット番号Ｒ０４１０５−７３２２）を用いた。試料保存およびプルポイントの要約を表１２に示す。各製剤の５つのバイアルを、各検定時点のために保存した。
【００９９】
【表１２】
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２．０ｍｇ／ｍｌ  ｂＧ−ＣＳＦ製剤を、ＨＰＬＣ分析前に、１０倍に希釈した。
【０１００】
各製剤の３つの試料を各保存小室（５、３０、４０℃）から採取し、ｂＧ−ＣＳＦ効力に関して、ＲＰおよびＳＥ  ＨＰＬＣにより検定した。各試料を３回検定した。濃度は、予め決定された標準曲線を用いて算出した。開始時ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％を各分析のために決定し、各製剤に関して、各時点で、平均を算出した。平均％開始時ｂＧ−ＣＳＦ濃度対時間を、各保存温度に関してプロットし、ｂＧ−ＣＳＦ効力の低減をグラフに描いた。図２０および２１は、５℃で保存した試料に関して、それぞれ、ＲＰおよびＳＥ  ＨＰＬＣにより得られた結果である。３０℃で保存した試料に関して得られた結果を図２２および２３に示し、一方４０℃で保存した試料に関して得られた結果は図２４および２５に示されている。
１．０Ｍ  ＴＥＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌタンパク質製剤を除いて、５℃および３０℃で保存した試料に、ｂＧ−ＣＳＦ分解はほとんど認められなかった。
【０１０１】
実施例１１．生物療法タンパク質に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液の安定化能力
以下で考察する注目のタンパク質のＴｍ値を、MicroCal, ＶＰ−ＤＳＣ型顕微熱量測定を用いて、リン酸緩衝液およびＨＥＰＥＳ緩衝液の両方で確定した。Aldrich からのＮａ2 ＨＰＯ4 （ロット番号０８０１９ＰＱ）を用いて２５ｍＭ  リン酸緩衝溶液を調製し、ｐＨを７．５に調整した。１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．５、ロット番号１０１６４３６）は、Gibco BRL から入手した。緩衝液交換は、攪拌限外濾過セル  ８０１０型（Amicon, Inc.）を、タンパク質のサイズによって、YM10またはYM30  Diaflo（登録商標）限外濾過膜（Amicon, Inc.）と組合せて、成し遂げた。
【０１０２】
Bioprocessから入手した凍結乾燥ｐＳＴ（ロット番号４１５０９−２１７−２）  ２．０ｍｇを、２．０ｍｌのMilli-Q 水中で再構成した。５回交換後、再構成タンパク質  １．０ｍｌを、ＹＭ１０膜を用いて２５ｍＭ  リン酸緩衝液中に移した。残りの１．０ｍｌを次に１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中で交換した。試料を１．０ｍｇ／ｍｌ  タンパク質濃度に調製した後、顕微熱量測定により分析した。ｐＳＴの顕微熱量計分析は、リン酸およびＨＥＰＥＳ緩衝液中の両方で２回実施した。
【０１０３】
約２．０ｍｌのＮＩＦ（ロット番号４４０６３１−２２−７）を、２．９７の濃度でBioprocessから入手した。 Bioprocess から受理した試料を２つのアリコートに分けた。１．０ｍｌのタンパク質を２５ｍＭ  リン酸緩衝液中で交換し、残りのＮＩＦを１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中で交換した。各々の場合に、ＹＭ３０膜を用いて５回の交換を実施した。適切な緩衝液中で溶液を１．０ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、Ｔｍ値を微小熱量測定（microcalorimetory)で決定した。
試験した生物療法タンパク質を表１３に列挙するが、それらのそれぞれのＴｍ値は、リン酸およびＨＥＰＥＳ緩衝液に関して確定した値である。
【０１０４】
【表１３】
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表８は、ＨＥＰＥＳ緩衝液がＮＩＦおよびｐＳＴの両方の安定度の増大を提供することを示す。
【０１０５】
実施例１２．ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いた組換えウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｒｂＧ−ＣＳＦ）の持続性in vivo 活性
ウシ顆粒球コロニー刺激因子（ｂＧ−ＣＳＦ）はBioprocess Research  and  Development-Pfizer（Groton, CT）から、マンニトールはE.M. Industries （Hawthorne,, NY）から、１ｘダルベッコのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）はGibcoBRL（Grand Island, NY）から、クエン酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムはAldrich （Milwaukee, WI ）から、Tween-80、塩化ナトリウムおよび塩酸はJ.T.  Baker （Phillipsburg, USA ）から入手した。
【０１０６】
ＲＰ−ＨＰＬＣ  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣにより、溶液安定度をモニタリングした。ＲＰ−ＨＰＬＣは、０．１％ＴＦＡ  Ｈ２０（溶媒Ａ）および０．１％ＴＦＡ  ＣＡＮ（溶媒Ｂ）の移動相を用いて、Vydac, Protein C4 カラムを用いて実施した。流量：１ｍｌ／分；ＵＶ検出：２２０ｎｍ；温度：２５℃。サイズ排除クロマトグラフィーを、TosoHaas, TSK-GEL  SW XL，７．８ｍｍ  ＩＤｘ３０ｃｍカラムを用いて実施した。移動相：０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．７５）中の０．３Ｍ  ＮａＣｌ；流量：１ｍｌ／分；ＵＶ検出：２８０ｎｍ；温度：２５℃。
【０１０７】
微小熱量測定
VP  DES システム（MicroCal, Inc.）を用いて、変性温度（ＴＤ）を測定した。約１ｍｌの溶液をセルに載せ、参照プラセボ製剤に対して約１０°Ｃ／分の速度で動かした。
円二色性
温度走査測定アクセサリーを装備した円二色性分光計（CD* ORD  Model J-710/720-Japan Spectroscopic Co., LTD ）を用いて、ｂＧ−ＣＳＦの二次構造をモニタリングした。
【０１０８】
バイオアッセイ
ｂＧ−ＣＳＦ製剤のin vitro活性を、ネズミ骨髄細胞増殖検定（ＢＭＣ検定）を用いて決定した。骨髄細胞を、大腿骨を取り出して、３ｃｃ／２３Ｇ注射器およびHanks 平衡化食塩溶液（Gibco BRL ）を用いて骨から骨髄を静かにフラッシュさせることにより、雌ＣＦ１マウス（Charles River ）の大腿骨から無菌的に収穫した。細胞懸濁液をナイロンスクリーンに通して濾過し、破砕屑を除去し、次に室温で１１００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清を捨て、１０％ウシ胎仔血清（ Gibco BRL）、１％ペニシリンストレプトマイシン（１０，０００単位／ｍｌ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco BRL ）を補充したＲＰＭ１培地（Gibco BRL ）  １５ｍｌ中にペレットを再懸濁した。
【０１０９】
Coulter Channelyzer 256 を用いて骨髄細胞を定量し、細胞濃度を調整して収量を６．６７ｘ１０5 細胞／ｍｌとした。約１０5 個の細胞を９６ウエルプレートの各ウエルに付加した。次にウシ顆粒球コロニー刺激因子製剤を種々の濃度で各ウエルに（３通りに）付加した。３７℃、（５％ＣＯ2 ）３日間で３日インキュベーション後、3 Ｈ−チミジン（New England Nuclear, Boston, Mass ）を２μＣｉ／ｍｌの最終濃度で各ウエルに付加した。放射線標識を３７℃（５％ＣＯ2 ）で少なくとも１８時間継続した。
【０１１０】
プレートを−２０℃に凍結し、解氷して、Brandel 細胞収穫器（Biomedical Research and Development Laboratories, Gaithersburg, Maryland）を用いてガラス９６ウエルファイバーマット上に細胞を収穫した。Wallac 1205 Betaplate 液体シンチレーションカウンター（Wallac, Gaithersburg, Maryland）を用いて、活性を測定した。ｂＧ−ＣＳＦの活性は、培地制御数／分（フォールド・オーバー・バックグラウンド）により試料数／分を分けることにより、測定した。３またはそれ以上のフォールド・オーバー・バックグラウンドの活性は、陽性と考えられた。
【０１１１】
ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 活性
体重約１００〜１５０ｋｇの範囲の若い交雑肉用ウシで、ｂＧ−ＣＳＦ製剤のin vivo 活性を試験した。ウシは、Animal Health Research Center at Terre Haut, Indianaから購入し、輸送して、試験に割り当てる前に、最低２日間、施設に順化させた。ほとんどのウシを１つの試験に用いた後、少なくとも１週間休息させ、次に二次試験に割り当てた。ウシは２個より多くの試験には用いなかった。
【０１１２】
試験に割り当てる前に、直腸温度、体重、全般的健康状態並びに総白血球（ＷＢＣ）数および鑑別白血球数を査定することにより、試験開始の３日前にウシを予備スクリーニングした。一般に、直腸温度が≧１０４度で、総ＷＢＣ数が＜４０００／ｍｍ3 または＞１２，０００／ｍｍ3 〜であるウシは試験から排除した。０日目に、処置前にウシを採血し、計量した。２４μｇ／ｋｇ  ｂＧ−ＣＳＦ製剤の用量は、体重に基づいて各ウシに関して処置時点で計算し、頸部の前肩胛骨領域に皮下注射により投与した。処置後の予定時間に、頸部から静脈穿刺によりＷＢＣ／鑑別数に関して、ＥＤＴＡ抗凝固剤中に血液試料を収集した。
【０１１３】
総ＷＢＣ計数は、等張希釈液中の白血球の１：２５０希釈液を用いて、Nova Celltrak I 血球計数器で実施した。鑑別ＷＢＣ計数は、Diff-Quik 染色セット（Dade）で染色した乾燥血液塗抹を用いて実施した。１００ＷＢＣのすべてを計数し、１００ｘ油浸レンズおよび１２．５ｘ接眼レンズ（総倍率＝１２５０ｘ）を有するZeiss 光学顕微鏡で鑑別した。
【０１１４】
ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすｐＨおよび温度の影響
表１４は、ｂＧ−ＣＳＦの安定度に及ぼす温度の影響を示す                。ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼす温度の作用は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、バイオアッセイおよび肉眼観察により追跡調査した（製剤：０．１ｍｇ／ｍｌのｂＧ−ＣＳＦ、５％マンニトール、１０ｍＭ  酢酸緩衝液、０．００４％Tween-80，ｐＨ４．０）。表１４から分かるように、４０℃より高い温度ではｂＧ−ＣＳＦの安定性に不連続性が認められる。
【０１１５】
ＲＰ  ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣの両方により、４０℃以上で親タンパク質ピークの損失が認められる。高温での親ピークの消失の後には、溶液中の粒子の増大が生じる。これは、肉眼で、そして３１０ｎｍでの光散乱のモニタリングにより観察された。４０℃で３週間保存したウシＧ−ＣＳＦ溶液は、活性が５℃および３０℃の場合の１０〜１００分の１であった。
５０℃にて３週間後、５℃および３０℃で保存した溶液よりｂＧ−ＣＳＦは１００〜１０００分の１であった。
【０１１６】
【表１４】
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【０１１７】
円二色性（ＣＤ）を用いて、ｂＧ−ＣＳＦに及ぼす温度の作用を追跡した。ｂＧ−ＣＳＦのＣＤスペクトルを図２６に示す。スペクトルは、ｂＧ−ＣＳＦの二次構造がｂＧ−ＣＳＦと構造的に非常に似ているヒトＧ−ＣＳＦと同様にほとんどａ螺旋であることを示唆する。変性温度（ＴＤ）を決定するために、種々の温度でＣＤスペクトルを調べた。図２７は、温度の一関数としての２２２ｎｍの波長（ａ−螺旋に特徴的な波長）でのモル楕円率のプロットである。４０℃と５０℃の間で、モル楕円率は増大しているが、これはｂＧ−ＣＳＦの二次構造の損失および変性を示す。
【０１１８】
ｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすｐＨの影響も査定した。安定度に及ぼすｐＨの影響だけを表記し、温度による変性の作用は表記しないために、溶液を３０℃（ｂＧ−ＣＳＦのＴＤは４０〜５０℃の間）で保存した。表１５は、３０℃で２週間に及ぶｐＨの関数としてのｂＧ−ＣＳＦの安定度を要約する。タンパク質活性損失は、ｐＨが上昇すると増大する。データは、低ｐＨでは、ｂＧ−ＣＳＦ中のシステインがプロトン化され、それゆえ製剤が一増安定になることを示唆する。高ｐＨでは、この遊離システインはジスルフィド交換反応に関与し、不安定性の原因になると考えられる。
【０１１９】
【表１５】
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【０１２０】
ｂＧ−ＣＳＦ溶液安定度に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液の影響
ｐＨ７．５の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦは、４０℃で数日間保存した場合でも、高い溶液安定度を示す、ということを本発明者らは観察した。ｂＧ−ＣＳＦは中性ｐＨで不安定で、４０℃以上の温度では変性することが、従来知られていたために、これは予期せぬことであった。図２８は、４０℃の保存温度でｐＨ７．５でのｂＧ−ＣＳＦの溶液安定度に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液の影響を示す。ｂＧ−ＣＳＦの安定度は、ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度が低下すると、有意に低下した。
【０１２１】
ｂＧ−ＣＳＦの変性温度（ＴＤ）に及ぼす１Ｍ  ＨＥＰＥＳの作用を、微小熱量測定により測定した。図１０は、ｂＧ−ＣＳＦのＴＤで２つの製剤（１Ｍ  ＨＥＰＥＳを用いた場合と用いない場合）を比較したサーモグラムである。ＨＥＰＥＳ緩衝液の非存在下では、吸熱遷移の開始は約４０℃であるが、一方１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に配合したｂＧ−ＣＳＦは約５０℃のＴＤ開始を有する。変性温度の増大は、通常は安定化を示す。
【０１２２】
ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 活性
雌ウシにおけるこの製剤のin vivo 活性を、本発明者らは評価した。図２９は、ＷＢＣ数対時間のプロットで、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中に処方したｂＧ−ＣＳＦを「対照」製剤と比較したものである。「対照」とは、５％マンニトール、１０ｍＭ  酢酸緩衝液、Tween-80，ｐＨ４．０を含有する製剤を指す。
【０１２３】
図２９で分かるように、ＷＢＣ数は、約２４〜３０時間だけの間、２００％のベースラインレベル（感染に対する防護に関連したレベル）の限界値（閾値）を上回っている。しかしながら、ｂＧ−ＣＳＦを１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中で配合した場合は、ＰＭＮ数は、最低３日間または７２時間、限界値（閾値）を超えたままである（いくつかの場合には、ＶＶＴＣはほぼ１週間、限界値（閾値）を超えたままである）。
【０１２４】
この試験の結果は、ＨＥＰＥＳ緩衝液がin vitroでの安定剤として役立つだけでなく、ｂＧ−ＣＳＦのin vivo 性能を多少改善することを示唆する。
ｂＧ−ＣＳＦ性能に及ぼすＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて観察された予期せぬ結果は、同様の緩衝液、例えばＭＯＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥの研究を促した。これらの緩衝液も、ＨＥＰＥＳ緩衝液と同様にｂＧ−ＣＳＦのin vitro安定度の改良を示した。ｂＧ−ＣＳＦをＴＥＳ緩衝液およびＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中で処方したin vivo 試験を実施した結果、両製剤はＨＥＰＥＳ製剤と同様に、雌ウシにおけるｂＧ−ＣＳＦのin vivo 活性の延長を引き起こした。
【０１２５】
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中でｂＧ−ＣＳＦを処方すると、in vivo でのｂＧ−ＣＳＦの持続性活性がもたらされる。この持続性活性は、注射部位でのｂＧ−ＣＳＦの安定度改良の結果であると思われる。中性ｐＨおよび４０℃の温度でのｐＧ−ＣＳＦの溶液安定度は、ｂＧ−ＣＳＦを１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中で処方した場合には、有意に改良された。その他の有機緩衝液、例えばＭＯＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＴＥＳおよびＴＲＩＣＩＮＥも、ｂＧ−ＣＳＦの安定度の改良をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数としての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液  １ｍｌの安定度（回収％）を示す。
【図２】図２は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＥＳ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数としての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液  １ｍｌの安定度（回収％）を示す。
【図３】図３は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数としての、０．１ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液  １ｍｌの安定度（回収％）を示す。
【図４】図４は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数としての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液  １ｍｌの安定度（回収％）を示す。
【図５】図５は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＥＳ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数としての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液  １ｍｌの安定度（回収％）を示す。
【図６】図６は、０．１Ｍ、１Ｍおよび２ＭのＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液濃度で、４０℃の保存条件下で、時間の関数としての、２ｍｇ／ｂＧ−ＣＳＦ溶液  １ｍｌの安定度（回収％）を示す。
【図７】図７は、水、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液および１Ｍ  ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液中で製剤化したｂＧ−ＣＳＦで処置された畜牛に関する総末梢血ＰＭＮ（０時間での対照値に対する％として表す）を示す。
【図８】図８は、Neupogen（登録商標）緩衝液（対照、ｐＨ４．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、Hanks 緩衝液（ｐＨ８．５）および重炭酸緩衝液（ｐＨ８．２）中での、時間の関数としてのｂＧ−ＣＳＦの安定度（ｍｇ／ｍｌ  濃度）を示す。
【図９】図９は、４０℃での１０００ｍＭ、５００ｍＭ、１００ｍＭ、５０ｍＭおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中での、時間の関数としてのｂＧ−ＣＳＦの安定度（ｍｇ／ｍｌ  濃度）を示す。
【図１０】図１０は、２つのｂＧ−ＣＳＦ溶液に関する２つのサーモグラム（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇ）対温度（℃）を示す。最高温度４７℃を示す上方のサーモグラムは、ｐＨ７．５でＰＢＳ中に製剤化したｂＧ−ＣＳＦに関するものであり、最高温度５９℃を示す下方のサーモグラムは、ｐＨ７．５で１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中で製剤化したｂＧ−ＣＳＦに関する。
【図１１】図１１は、３つの製剤：水中ｂＧ−ＣＳＦ（対照）、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中ｂＧ−ＣＳＦ、および１Ｍ  ＨＥＰＥＳ＋１０％ポラキサマー中ｂＧ−ＣＳＦに関する、時間の関数としての畜牛における％ＰＭＮ（好中球）のプロットを示す。
【図１２】図１２は、３１０ｎｍでの吸光度対ｂＧ−ＣＳＦ濃度（ｍｇ／ｍｌ）により測定した場合の、ｐＨ７．５の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの溶解度を示す。
【図１３】図１３は、４０℃での１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中およびＰＢＳ中のウシＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃度に対する％）を示す。
【図１４】図１４は、４０℃での１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中およびＰＢＳ中のヒトＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃度に対する％）を示す。
【図１５】図１５は、ｐＨ７．５の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のヒトＧ−ＣＳＦおよびウシＧ−ＣＳＦの安定度（初期濃度に対する％）を比較する。
【図１６】図１６は、４０℃でのｐＨ４．０の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時間（日）を示す。
【図１７】図１７は、４０℃でのｐＨ７．５の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時間（日）を示す。
【図１８】図１８は、４０℃でのｐＨ４．０の１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時間（日）を示す。
【図１９】図１９は、４０℃でのｐＨ７．５の１Ｍ  ＴＥＳ緩衝液中のｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時間（日）を示す。
【図２０】図２０は、５℃で保存した試料に関する、ＲＰ  ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対時間（週）の結果を示す。
【図２１】図２１は、５℃で保存した試料に関する、ＳＥ  ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対時間（週）の結果を示す。
【図２２】図２２は、３０℃で保存した試料に関する、ＲＰ  ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対時間（週）の結果を示す。
【図２３】図２３は、３０℃で保存した試料に関する、ＳＥ  ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対時間（週）の結果を示す。
【図２４】図２４は、４０℃で保存した試料に関する、ＲＰ  ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％の結果を示す。
【図２５】図２５は、４０℃で保存した試料に関する、ＳＥ  ＨＰＬＣによる初期ｂＧ−ＣＳＦ濃度に対する％対時間（週）の結果を示す。
【図２６】図２６は、ｂＧ−ＣＳＦのＣＤ（円二色性）スペクトルである。
【図２７】図２７は、温度の関数としての、２２２ｎｍの波長でのモル楕円率のプロットである。
【図２８】図２８は、４０℃でｐＨ７．５での種々の濃度のＨＥＰＥＳ中でのｂＧ−ＣＳＦの初期濃度に対する％対時間（日）を示す。
【図２９】図２９は、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ中に製剤化したｂＧ−ＣＳＦ対対照製剤に関する、ＷＢＣ対注射後の時間（時間）のプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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