(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の尿素をウレアーゼで加水分解させ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の存在下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）を作用させ、その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の減少の速度を測定することにより前記尿素由来の尿素窒素を測定する方法において、チオグリセロールをウレアーゼと共に存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法。
【請求項２】
構成成分として
i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、
ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、
iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、
iv) チオグリセロール及び
v) ウレアーゼ
を含む尿素窒素測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の尿素窒素を測定するための方法および試薬に関する。さらに詳しくは、本発明は高濃度の尿素窒素を含む試料においても測定が可能であり、さらに試料中に含まれるポリオールの影響を受けないことを特徴とする尿素窒素の測定方法およびその測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料等に存在する尿素窒素量は、腎不全等の腎機能障害や肝硬変等の肝障害により変動することが知られており、その測定は医学的診断や病態の解明を行う上で、さらには種々の治療の経過を判定する上で重要な指標である。近年、尿素窒素の測定方法はその正確性、特異性からウレアーゼ反応によって尿素を加水分解し、生じるアンモニアにα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧという）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨという）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨという）およびグルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨという）を作用させ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少量を紫外部の吸収変化としてとらえ測定する方法（以下この方法をウレアーゼ−ＧＬＤＨ法と略す）が広く普及している。
【０００３】
また、自動分析装置が年々目覚ましく進歩していることもあり、短時間で測定結果が得られ、かつ試料中の干渉物質の影響の少ない反応速度法による尿素窒素測定法が望まれている。
【０００４】
ところで反応速度法は、ウレアーゼの尿素に対するＫｍ値が測定系における尿素濃度より十分大きい場合に可能となり高濃度の尿素を測定できる。ウレアーゼのＫｍ値は通常、反応速度法で測定するときには小さすぎる場合が多いため、Ｋｍ値をみかけ上大きくするために阻害剤を加えることがある。このような阻害剤を用いる尿素窒素測定方法としては、ウレアーゼ阻害剤としてホウ酸またはその塩を用いる方法（特公平０３−６５１６０）が知られており、この方法によれば、高濃度の尿素を正確に測定できる。ホウ酸は、その性質から酵素中の糖鎖との相互作用によりキレート様錯体を形成し、その結果、阻害作用が現れるものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが上記のウレアーゼ阻害剤としてホウ酸またはその塩を用いる方法においては、試料中にマンニトール等のポリオールが存在する場合、ホウ酸がポリオールとキレート錯体を形成し、ウレアーゼの阻害作用が実質的に働かなくなるため、尿素窒素の測定において測定値の上昇が認められ、正確な測定が不可能となるという問題点があった。実際、臨床領域においては脳圧降下剤、利尿剤としてマンニトール製剤が使用される場合が多々あり、マンニトールは生体内ではほとんど代謝されず糸球体で容易にろ過され、また尿細管で再吸収もされないためほぼ全量が尿中に濃縮された形で排出される。この場合のマンニトール濃度は、２０％すなわち２００ｍｇ／ｍｌにも及ぶものと推定される。このため、マンニトール含有試料中の尿素窒素を測定するに際し上記の現象が大きな問題となる。
【０００６】
かかる問題に鑑み、本発明の目的は、マンニトール等のポリオール含有試料や高濃度の尿素窒素を含む試料においても尿素窒素を正確に測定できる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは公知方法の欠点を解決するため、ホウ酸に代わる新たなウレアーゼ阻害剤について鋭意検討した結果、反応速度法を用いたウレアーゼ−ＧＬＤＨ法による尿素窒素の定量において、阻害剤としてスルフヒドリル化合物を存在させることが問題解決に有効であることを見出し、本発明を完成させた。これによりウレアーゼのＫｍ値を増大させることで高濃度の尿素窒素が測定可能となり、かつ上記マンニトール等のポリオールの影響も回避可能となった。
【０００８】
すなわち本発明は、試料中の尿素をウレアーゼで加水分解させ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の存在下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）を作用させ、その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の減少の速度を測定することにより前記尿素由来の尿素窒素を測定する方法において、スルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法（以下、本発明の方法という）を第一の要旨とする。
【０００９】
また、本発明は、構成成分として
i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、
ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、
iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、
iv)スルフヒドリル化合物及び
v)ウレアーゼ
を含む尿素窒素測定用キット（以下、本発明のキットという）を第二の要旨とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明においては、尿素窒素を測定する方法ならびに尿素窒素測定用試薬の調製は、試薬にスルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に用いる以外は、慣用されている技術を通常そのまま使用することができる。例えばウレアーゼおよびスルフヒドリル化合物を作用させる前に、前処理として試料中に存在するアンモニアを消去させることもできる。
【００１１】
本発明の方法においては測定の精度を高めるために、尿素窒素測定の前に、α−ＫＧ及び、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下、ＧＬＤＨを作用させることにより、予め試料中のアンモニアを消去しておくことが好ましい。なお、アンモニアを消去するための試薬構成は、尿素窒素を測定する試薬構成と重複するので、尿素窒素を測定するときにそのまま、アンモニアを消去するための試薬構成を使用することができる。
【００１２】
本発明の方法において試料とは、尿素成分を含むものであれば特に限定されないが、例えば血漿、血清、尿、又はそれらの希釈液等を例示できる。
【００１３】
本発明の方法において使用することができるスルフヒドリル化合物としては、チオグリセロール、チオリンゴ酸、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、チオフェノール、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール等が挙げられる。スルフヒドリル化合物としては、チオグリセロールが好ましい。チオグリセロールは、臭いが少なく、さらに、安定性が良いからである。
【００１４】
スルフヒドリル化合物の濃度は、化合物の種類、試料の種類、測定条件その他の要因により適宜調整すべきであるが、通常０．１〜１０００ｍＭ、好ましくは１〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０〜５００ｍＭの範囲である。
【００１５】
本発明の方法で使用するα−ＫＧ、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨ、ウレアーゼの各濃度は、試料中に予め存在するアンモニア量および測定すべき尿素量により変動するが、適当な濃度を適宜選択することができる。例えばα−ＫＧ量は通常０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭの範囲である。またＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ量は通常０．０５〜５ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭの範囲であり、測定時の吸光度限界を超えない程度の範囲で選択すればよい。ＧＬＤＨは、由来は特に限定されないが牛肝臓由来や細菌由来のものが好ましい。ＧＬＤＨの使用濃度は０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは０．５〜７０単位／ｍｌの範囲である。ウレアーゼは、由来は特に限定されないがナタマメ由来や細菌由来のものがあげられ、その使用濃度は０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０単位／ｍｌ程度であり、スルフヒドリル化合物の添加量との関係に基づき適当な濃度を選択すべきである。
【００１６】
本発明の方法においては、尿素窒素測定時のｐＨは、通常ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０の範囲に調整する。なお、ｐＨの調整は、通常緩衝液によって行い、ここで使用できる緩衝液としては、トリス緩衝液、塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液；ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液等が挙げられる。
【００１７】
以上のように本発明は、尿素窒素量をＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの減少速度を指標として測定する反応速度法であるため、測定に要する時間は短く、かつ紫外部吸収をもつ試料中の干渉物質等の影響をほとんど受けない。その上スルフヒドリル化合物は試料と混合してもウレアーゼ阻害作用は影響を受けず、高濃度の尿素まで正確に定量できる。さらにマンニトール等のポリオール含有試料においてもウレアーゼ阻害作用は失われないため、従来では正確な結果が得られなかったマンニトール含有試料においても、正確な尿素窒素測定が可能であり、臨床検査等において極めて有用な方法である。
【００１８】
次に、本発明の尿素窒素測定用キットは、その構成成分として
i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、
ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、
iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、
iv)スルフヒドリル化合物及び
v)ウレアーゼ
を含むものである。
【００１９】
ここで、それぞれの構成成分の由来、使用濃度等は、本発明の方法の説明において詳述したとおりであり、ここでは省略する。
【００２０】
本発明のキットは、通常、緩衝液、α−ＫＧ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨを含む第一試薬と、緩衝液、α−ＫＧ、ウレアーゼ、スルフヒドリル化合物を含む第二試薬とからなっているのが好ましい。最初に第一試薬と試料を混合することにより、試料中に予め存在するアンモニアを消去することができ、正確な尿素窒素測定が可能となるからである。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明を実施例および比較例によりさらに具体的に説明する。
【００２２】
実施例１
第一試薬として、
トリス緩衝液            １００ｍＭ
α−ＫＧ                  １２ｍＭ
ＮＡＤＰＨ              ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ                  １０Ｕ／ｍｌ
を含み、かつｐＨ８．２の水溶液を用いた。
【００２３】
第二試薬として、
トリス緩衝液            １００ｍＭ
α−ＫＧ                  １２ｍＭ
ウレアーゼ                １０Ｕ／ｍｌ
チオグリセロール        ４００ｍＭ
を含み、かつｐＨ８．２の水溶液を用いた。
【００２４】
試料として、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの試料Ｍ0およびマンニトール２０％を含む尿素窒素５０ｍｇ／ｄｌの試料Ｍ5を調製した。さらに試料Ｍ5をＭ0で希釈し、マンニトール濃度が各々４、８、１２、１６％であり、かつ尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれ試料Ｍ1、Ｍ2、Ｍ3、Ｍ4とした。
【００２５】
吸光度測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行い、上記試料Ｍ0〜Ｍ5１２μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、続いて第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間あたりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度はあらかじめ作成した検量線より求めた。結果を表１および図１に示す。
【００２６】
比較例１
実施例１で使用した第二試薬の成分中、チオグリセロールの代わりにホウ酸７５ｍＭを用いた以外は、実施例１と同様に操作して、尿素窒素濃度を求めた。結果を表１および図１に示す。
【００２７】
【表１】
0003674015.tif 000002
【００２８】
図１中、実施例１の測定結果は−○−で、比較例１の測定結果は−●−で示し、縦軸に尿素窒素濃度（ｍｇ／ｄｌ）、横軸にマンニトール濃度（％）を示す。
【００２９】
表１及び図１の結果から、ウレアーゼ−ＧＬＤＨ法において、ウレアーゼ阻害剤として、チオグリセロールを用いた場合（実施例１）は、ウレアーゼ阻害剤としてホウ酸を用いた場合（比較例１）と比べ、試料中のマンニトールの影響を受けず、尿素窒素濃度を正確に測定できることがわかる。
【００３０】
実施例２
実施例１の本発明の方法と、現在信頼性が高いとされ臨床検査等に一般的に使用されている前記特公平３−６５１６０号公報記載の、ウレアーゼ阻害剤としてホウ酸を用いた方法（公知方法）との相関性を調べるため、ポリオールを含まない血清を試料としてそれぞれ尿素窒素測定を行った。その結果、図２に示す通り、本発明の方法は上記公知方法と極めて有意な相関性が認められた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、反応速度法による尿素窒素測定時に誤差を与えるマンニトール含有試料においても、正確に測定が可能であり、また高濃度の尿素窒素の測定ができる。したがって、臨床検査に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１および比較例１におけるマンニトールの尿素窒素測定結果に与える影響を示す図である。
【図２】図２は、本発明の方法（縦軸）と、公知方法（横軸）との尿素窒素測定結果における相関性を示す図である。
【図１】
0003674015.tif 000003
【図２】
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