(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１有効成分としてのポリエチレングリコールと、第２有効成分としてのアミノアルコール、糖アルコール、グリセロール、その誘導体、ポリエチレングリコール以外の非イオン性界面活性剤、ポリスクロース、グリコールエーテルジアミノ４酢酸、アミノフェニルエチレングリコール４酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ニトリロ三酢酸およびアルカリ土類金属塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の物質とを含有することからなるエンドトキシン安定化剤。
【請求項２】
第２有効成分として、アミノアルコールと糖アルコール、グリセロールおよびその誘導体から選択された少なくとも１種の多価アルコールとを含有する請求項１記載のエンドトキシン安定化剤。
【請求項３】
第２有効成分として、ポリスクロースとアルカリ土類金属塩とを含有する請求項１記載のエンドトキシン安定化剤。
【請求項４】
第２有効成分として、トリエタノールアミンとグリコールエーテルジアミノ４酢酸、アミノフェニルエチレングリコール４酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウムおよびニトリロ三酢酸から選択された少なくとも１種のキレート剤とを含有することを特徴とする請求項１記載のエンドトキシン安定化剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のエンドトキシン安定化剤とエンドトキシンからなることを特徴とするエンドトキシン組成物。
【請求項６】
乾燥物または液体である請求項５記載のエンドトキシン組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のエンドトキシン安定化剤を検体に添加し、検体中のエンドトキシンを安定化することを特徴とするエンドトキシンの測定法。
【請求項８】
エンドトキシンの測定が、リムルス試薬を用いて行う方法である請求項７記載のエンドトキシンの測定法。
【請求項９】
検体が血液透析における透析液である請求項７記載のエンドトキシンの測定法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のエンドトキシン安定化剤とリムルス試薬とを少なくとも含むエンドトキシン測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は検体中に存在する、または標準品として使用されるエンドトキシンの安定化に関する。例えば、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いたリムルス反応によるエンドトキシンの測定において使用されるエンドトキシン標準品または検体中のエンドトキシンを安定化するためのエンドトキシン安定化剤、エンドトキシンと安定化剤からなるエンドトキシン組成物、およびそれらを用いたエンドトキシンの測定法に関し、特に、定量に使用するエンドトキシン標準品の分散性を一定に保持し、リムルス反応に対するエンドトキシン活性を安定に保ち、さらに、日常管理を必要とする臨床検査用検体、主として血液透析（人工透析）における透析液等の安全管理を目的とした透析液中のエンドトキシン測定を行う際に、透析液中のエンドトキシン活性を安定に保持し、適切な医療管理を実施するための改善手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下単にライセートという）を使用して、発熱物質であるエンドトキシンを測定する方法が知られており、ウサギの発熱性試験の代替法として公定法にも採用されている。この方法は、微量のエンドトキシンによりライセートが凝固する反応（以下、このような反応を「リムルス反応」という。）に基づいているが、その後の生化学的解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明かにされている（図１）（中村隆範、日本細菌学雑誌、３８、７８１ー８０３（１９８３））。この反応の引き金となるエンドトキシンは、グラム陰性菌細胞壁の外膜成分で、リポ多糖（リポポリサッカライド、ＬＰＳ）ともよばれており、親水性の糖鎖と疎水性のリピドＡ部分が分子内に局在した両親媒性物質である。ＬＰＳのサブユニットは、通常の条件では、疎水結合、イオン結合等で１０8ダルトンにも及ぶ巨大な分子集合状態（会合体）を形成し、共存蛋白やリピド等とも複雑なミセルを形成することが知られており、このミセル構造は、ＬＰＳのリムルス反応に対する反応性（以下、「リムルス活性」という。）にも大きく影響し、最大活性を示す分子サイズとそのミセル構造が存在する。そして、コール酸、デオキシコール酸等の陰イオン性界面活性剤添加により該会合体は完全に単量体もしくは二量体に解離し、リムルス活性は完全に失われる。また、不安定なミセルは、測定の際のデータ変動を引き起こすのみならず、エンドトキシン溶液そのものの安定性を損なわせる原因となる。米国ＦＤＡ（食品医薬品局）では、１９８１年に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１３株由来のエンドトキシン標準品を改良し、従来の添加剤であるアルブミンからラクトース及びポリエチレングリコールに変更し、エンドトキシン活性の安定化をはかった。現在該標品は、米国薬局方（ＵＳＰ）標準品、ＥＣ−５としてＦＤＡから頒布されている。また日本では、１９８８年に、国立衛生試験所において、大腸菌ＵＫＴ−Ｂ由来のエンドトキシン標準品のエンドトキシン活性の安定化のため、賦形剤としてマンニトールが採用され、今日、日本薬局方（日局）標準品として広く使用されている。
【０００３】
一方、これらの標準品はいずれもエンドトキシン含量が、バイアル当たりそれぞれ、ＵＳＰ標準品では１０，０００エンドトキシン単位（ＥＵ）、日本薬局方では１６，０００ＥＵと高く、測定の際にかなり希釈する必要があり、その際の希釈誤差も大きく、定量的リムルス試験のような高い精度と再現性が要求される測定には大きな障害となっていた。したがって、非常に低含量で調製した状態から使用する方が好ましく、そのための安定で再現性のある添加剤が望まれていた。
【０００４】
また、エンドトキシン粉末を単に水に溶解したエンドトキシン水溶液の状態で放置しておくと、低濃度ではとくにその活性は短期間のうちに低下することが知られている。したがって、エンドトキシンを溶液として使用する場合は、用時調製するのが一般的で、使用後は不安定なため、廃棄せざるを得なく、面倒で、かつ不経済であった。
【０００５】
そこで、このような水溶液状態での不安定性の問題点を回避するためにエンドトキシンを凍結乾燥して保存しようと試みると、特にエンドトキシン濃度が希薄である場合、エンドトキシン粉末の飛散により各バイアル間でエンドトキシン量が大きく異なる、いわゆるバイアル間差が大きくなるという問題が生じた。
また、凍結乾燥品を用時に溶解するときに十分に溶解できない場合が生じるという問題もあった。
【０００６】
さらに、医療の場においても、体液中のエンドトキシンの日常管理は、感染症、特に敗血症の病態把握と治療および予後の判定、術後のモニタリング等に重要となる他、血液透析患者における透析液の安全管理にも不可欠な項目であることが知られているが、近年、透析液中のエンドトキシン活性が不安定で時間と共に低下することが指摘されている。そのため、透析液中のエンドトキシンを正確に測定することが困難で、透析液を正しく管理する上で、大きな障害となっていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、検体および標準品中のエンドトキシン活性を長期間にわたって安定に保持するために有用で、かつ特に標準品ではバイアル間差を低減し、特に溶液状態で長時間安定であり、何度も使用できるエンドトキシン標準品を調製するために有用なエンドトキシン安定化剤、そのようなエンドトキシン安定化剤とエンドトキシンからなるエンドトキシン組成物、およびそれらを用いたエンドトキシンの測定法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、以下により達成することができる。
１）第１有効成分としてのポリエチレングリコールと、第２有効成分としてのアミノアルコール、糖アルコール、グリセロール、その誘導体、ポリエチレングリコール以外の非イオン性界面活性剤、ポリスクロース、グリコールエーテルジアミノ４酢酸、アミノフェニルエチレングリコール４酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ニトリロ三酢酸およびアルカリ土類金属塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の物質とを含有することからなるエンドトキシン安定化剤。
【０００９】
２）第２有効成分として、アミノアルコールと糖アルコール、グリセロールおよびその誘導体から選択された少なくとも１種の多価アルコールとを含有する前記１）記載のエンドトキシン安定化剤。
３）第２有効成分として、ポリスクロースとアルカリ土類金属塩とを含有する前記１）記載のエンドトキシン安定化剤。
４）第２有効成分として、トリエタノールアミンとグリコールエーテルジアミノ４酢酸、アミノフェニルエチレングリコール４酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウムおよびニトリロ三酢酸から選択された少なくとも１種のキレート剤とを含有することを特徴とする前記１）記載のエンドトキシン安定化剤。
【００１１】
５）前記１）〜４）のいずれか１項に記載のエンドトキシン安定化剤とエンドトキシンからなることを特徴とするエンドトキシン組成物。
【００１２】
６）乾燥物または液体である前記５）のエンドトキシン組成物。
７）前記１）〜４）のいずれか１項に記載のエンドトキシン安定化剤を検体に添加し、検体中のエンドトキシンを安定化することを特徴とするエンドトキシンの測定法。
８）エンドトキシンの測定が、リムルス試薬を用いて行う方法である前記７）記載のエンドトキシンの測定法。
【００１３】
９）検体が血液透析における透析液である前記７）記載のエンドトキシンの測定法。
１０）前記１）〜４）のいずれか１項に記載のエンドトキシン安定化剤とリムルス試薬とを少なくとも含むエンドトキシン測定用キット。
【００１５】
本発明のエンドトキシン安定化剤（以下、本発明のエンドトキシン安定化剤を総称する場合は、単に安定化剤ともいう）は、エンドトキシン測定用標準品にも一般の測定用検体中のエンドトキシンの安定化にも適宜使用できる。該安定化剤の使用方法は任意であり、そのままの固形物を使用しても、該溶液、好ましくは水溶液を使用してもよい。該固形物の場合は、適量を分取して検体に添加してもよいが、好ましくは予め容器に所定量を分取しておくと都合がよい。この分取される安定化剤は溶液であってもよい。
【００１６】
本発明のエンドトキシン組成物を、定量的なエンドトキシン測定用の標準品として用いる場合は、エンドトキシン含量が既知でなければならないが、その他の目的、例えば、定性的測定に用いる場合は既知でなくともかまわない。また、該標準品のエンドトキシン含量の決定は、通常、エンドトキシン組成物形成前に行うが、該形成後でもかまわない。該エンドトキシンの由来は、特に制限はないが、通常、大腸菌（Escherichia coli; E. coli)、サルモネラ(Salmonella)属等のグラム陰性菌から公知の方法により調製されたものを使用することができる。
【００１７】
本発明のエンドトキシン組成物は、上記エンドトキシン調製物の水懸濁液あるいはその凍結乾燥物に安定化剤を混和することにより溶液としてまたは凍結乾燥物として調製することができる。この混和時のエンドトキシン組成物の各成分は、任意の順序で混和することができる。
本発明により調製したエンドトキシン組成物は、水に懸濁した状態において、均一な分散性を有し、長期間安定したリムルス活性を示す他、凍結乾燥粉末においても、長期間室温以上の比較的高温の条件下で、同様に安定な性質を有する。
【００１８】
例えば、エンドトキシン組成物を水に懸濁した状態では、４℃で少なくとも２週間、凍結乾燥状態では、４０℃で少なくとも２週間、４℃で少なくとも３年間安定である。
【００１９】
さらに本発明の安定化剤は、検体に含まれるエンドトキシンを安定化する場合にも使用される。具体的には、例えば、血液透析における透析液等の臨床検査用検体を採取する際に、特に容器は限定されないが、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン等の素材の適当な容器に予め安定化剤（固体もしくは溶液の形態）を含ませておくことによって検体中のエンドトキシンを安定化することが挙げられる。この様にして保存したエンドトキシン溶液は、検体を採取する際に混入する金属イオン（例、鉄イオン）や容器由来の極微量の影響物質に対しても全く干渉を受けず、均一な分散性と活性を保持し得る。例えば、このような検体を本発明の安定化剤で安定化する本発明のエンドトキシンの測定法においては、このような安定化した検体を通常、４℃で少なくとも１５日間、安定に維持することができる。エンドトキシンの測定は、リムルス反応を利用して行うことができる。
【００２０】
本発明のエンドトキシン安定化剤の有効成分について順次説明する。アミノアルコールは、アミノ基と水酸基を有する化合物であれば特に限定されないが、好ましくはトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、または２ーアミノエタノール（モノエタノールアミン）等を挙げることができる。多価アルコールとしては、具体的には、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール、グリセロール及びその誘導体（例えば、グリセロール  α−モノクロロヒドリン等）を挙げることができる。
【００２１】
ポリエチレングリコール以外の非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテル類（ブリジ系界面活性剤等；通常、重合度８〜４０、特に末端基がイソオクチルフェニルエーテル基であるものが好ましい。）、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類〔ツィーン系界面活性剤等；モノラウレート（ツィーン２０、２１）、モノパルミテート（ツィーン４０）、モノステアレート（ツィーン６０、８０）等〕、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル類（トリトン系界面活性剤等；好ましくは、トリトンＸ−１００等）、アルキルグルコシド類（ｎ−オクチルグルコピラノシド、ｎ−ドデシルグルコピラノシド等）等を挙げることができる。
【００２２】
ポリスクロース（Ｐｏｌｙｓｕｃｒｏｓｅ）は、ケミカルアブストラクトサービス登録番号（ＣＡＳ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｎｕｍｂｅｒ）９０１２−９５−７で特定される物質で、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ；商品名，ファルマシア社）またはスクロースポリマー（Ｓｕｃｒｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ）とも呼ばれる物質である。通常、ショ糖（スクロース）とエピクロルヒドリンを共重合することによって合成される。ポリスクロースとして種々の分子量のものが市販されているが、本発明に使用するポリスクロースの分子量は特に限定されない。具体的には、フィコール４００（分子量４００，０００）、フィコール７０（分子量７０，０００）が例示される。
【００２３】
キレート剤としては、金属イオンに配位して安定な錯化合物を形成するもので、ＧＥＤＴＡ（ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール４酢酸；グリコールエーテルジアミノ４酢酸）、ＢＡＰＴＡ（アミノフェニルエチレングリコール４酢酸）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）が使用できる。なお、血液透析においては、透析装置の配管部分等に金属（例、鉄）が使用されることが多く、従って透析液中に微量の金属イオンが混入する場合がある。このような場合、検体中のエンドトキシンのリムルス活性は低下するが、上記のようなキレート剤を含む安定化剤を検体中に添加すれば、金属イオンによるエンドトキシンの活性の低下を防止することができる。
【００２４】
アルカリ土類金属塩としては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。
本発明の安定化剤として、上記成分と併用すると特に好ましい効果を奏するポリエチレングリコールとしては、二価アルコールであるエチレングリコールの重合体で平均分子量が、２００〜２，０００，０００、好ましくは２，０００〜４０，０００、さらに好ましくは４, ０００〜２０, ０００のものを挙げることができる。
【００２５】
本発明の安定化剤に使用される各成分の種類、エンドトキシンに対する濃度等は、各安定化剤で最適なものを選択することができるが、ほぼ各成分の種類は上記の範囲から共通に選択できる。本発明の安定化剤は、アミノアルコール、多価アルコールを第２有効成分として含むことができる。即ち、本発明の安定化剤として、次の組成が挙げられる。
（１）：：アミノアルコール、ポリエチレングリコール
（２）：アミノアルコール、多価アルコール、ポリエチレングリコール
また、本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物の各安定化剤成分の濃度、または検体に添加した場合の各成分の濃度を例示すれば、多価アルコールは、０．０１〜１重量／容量％（以下、％と略記）、好ましくは、０．０５〜０．２％の範囲であり、アミノアルコールは、０．０００１〜０．１％、好ましくは、０．０００５〜０．０５％の範囲であり、ポリエチレングリコールは、０．００１〜０．０２％、好ましくは、０．００２〜０．００６％の範囲である。
【００２６】
本発明の安定化剤は、キレート剤および非イオン性界面活性剤の少なくとも１種を第２有効成分として含有することができる。
【００２７】
また、上記本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物の各安定化剤成分の濃度、または検体に添加した場合の各成分の濃度を例示すれば、キレート剤は、０．０１〜０．５ｍＭ、好ましくは、０．０２〜０．２ｍＭの範囲であり、非イオン性界面活性剤は、０．０００５〜０．２％、好ましくは、０．００１〜０．０４％の範囲である。
【００２８】
本発明の安定化剤は、アミノアルコール、キレート剤および非イオン性界面活性剤からなる群から選ばれた１種以上を第２有効成分として含有することができる。即ち、本発明の安定化剤として、好ましくは、次の組成が挙げられる。
（１）：ポリエチレングリコール、キレート剤
（２）：ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤
（３）：ポリエチレングリコール、キレート剤、非イオン性界面活性剤
（４）：ポリエチレングリコール、キレート剤、アミノアルコール
また、エンドトキシン組成物に含有、あるいは検体に添加される各安定化剤の各成分の量としては、前記安定化剤の濃度の項と同様の範囲が使用される。
【００２９】
本発明の安定化剤は、アルカリ土類金属塩を第２有効成分として含有することができる。この本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物の各安定化剤成分の濃度、または検体に添加した場合の各成分の濃度を例示すれば、ポリエチレングリコールは、０．００１〜０．０５％、好ましくは、０．００２〜０．０１％の範囲であり、アルカリ土類金属塩は、０．００１〜５ｍＭ、好ましくは、０．００５〜０．５ｍＭの範囲である。
【００３０】
本発明の安定化剤は、ポリスクロースおよびアルカリ土類金属塩を第２有効成分として含有することができる。この本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物の各安定化剤成分の濃度、または検体に添加した場合の各成分の濃度を例示すれば、ポリスクロースは、０．００５〜０．５％、好ましくは、０．０１〜０．１％の範囲であり、ポリエチレングリコールは、０．００１〜０．０５％、好ましくは、０．００２〜０．０１％の範囲であり、アルカリ土類金属塩は、０．００１〜５ｍＭ、好ましくは、０．００５〜０．５ｍＭの範囲である。
【００３１】
本発明は安定化剤によって安定化された検体中のエンドトキシンを測定するに際し、通常のリムルス試薬を用いる。即ち、該検体とリムルス試薬を接触させて前記リムルス反応を惹起させることによりエンドトキシンを測定することができる。
リムルス試薬としては、従来公知のものを使用することができる。具体的には、カブトガニ、例えば、リムルス・ポリフェムス（Limulus  polyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus  tridentatus）、タキプレウス・ギガス（T. gigas）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）等の血リンパ液から通常の方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８０，１０１１−１０２１（１９７６）参照）により調製した血球抽出物（ライセート）またはその加工物を挙げることができる。該加工物としては、例えば、ライセートをクロロホルム等の有機溶媒で抽出処理したり、界面活性剤を添加してＥｔに対する感受性を向上させたもの等が挙げられる。また、ライセートには、通常、Ｅｔ感受性因子（Ｃ因子）およびβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）の両方が含まれるが、上記加工物としては、デキストラン硫酸、スルホプロピル基等を結合した特異的な吸着担体または通常の担体等を用いてライセートを処理し、上記Ｃ因子またはＧ因子の何れか一方の因子を分画もしくは除去してＥｔのみに特異的に反応するように加工されたものが挙げられる。
【００３２】
さらに、ライセートに、例えば（１→３）−β−Ｄ−グルコシド構造単位が特定個数結合したポリグルコシド等を共存させることによって、Ｇ因子の活性化を阻害し、Ｅｔにのみ特異的に反応するように加工したものも上記加工物に包含される。
尚、ライセートとしては、市販のものも使用することができる。
【００３３】
本発明は、安定化剤とリムルス試薬とを少なくとも含むエンドトキシン測定用キットを提供する。
このキットは上述したような各種リムルス試薬の１種以上を各々収容した１個以上の容器と安定化剤を収容した容器と、所望により前記エンドトキシン組成物、リムルス反応に必須の２価金属塩、リムルス反応のクロッティングエンザイム活性をみるための発色合成基質、安定化剤あるいはエンドトキシン組成物を希釈するための蒸留水または緩衝液、リムルス反応におけるｐＨを調整するためのｐＨ調整用緩衝液等を各々収容した容器とから構成される。２価金属塩としては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩化物など）、硫酸塩等が、発色合成基質としては、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡのようなペプチド合成基質が、エンドトキシン組成物の希釈用あるいはｐＨ調整用緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液などが各々挙げられる。
【００３４】
本発明に用いるエンドトキシン組成物を調製する方法としては、前述したようにエンドトキシン溶液に後で上記安定化剤の各成分をそれぞれ別々に、あるいは予め混合して加えるか、予め安定化剤の混合液を調製し、これにエンドトキシンを添加する方法等を挙げることができるが、その順番はいずれであっても良く、更に、安定化剤の各成分の添加順序もとくに制限を受けるものではない。また組成物を調製する際の温度は０〜５０℃が適当で、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜２５℃である。一方、各成分を混合後は、通常、マグネティックスターラー等で１０秒〜１５分間均一になるまで攪拌するが、異常熱の発生を抑制するだけで、エンドトキシンのリムルス活性の低下を抑え、均一な分散液を得ることが可能である。
【００３５】
更に本発明のエンドトキシン組成物を乾燥物とするための手段は、エンドトキシンの活性を低下させない方法であれば特に限定されないが、低温下で脱水できる方法が好ましく、特に真空凍結乾燥が好ましい。使用する真空凍結乾燥機は、卓上、床置き等形状は問わず、所定の真空度を有していれば良い。本発明における安定化剤の濃度はエンドトキシンのリムルス活性に影響を与えない程度に上述の通り極めて低く調製されるが、前述した安定化剤の各成分は、ガラス製のバイアル等の容器へのエンドトキシンの付着能を高め、物理的な振動による組成物の容器からの離脱を完全に抑えることができるため、従来問題となった凍結乾燥時に粉末の一部が飛散するという問題を解消できた。
【００３６】
従って、本発明はエンドトキシンのリムルス活性測定値のバイアル間差の小さい安定したエンドトキシン組成物を容易に得ることができ、リムルステストの精度を著しく高めることができる。
【００３７】
本発明の安定化剤を使用して検体、例えば、透析液中のエンドトキシンを安定に保つ方法としては、適当な容器に予め安定化剤水溶液を少量分注した後凍結乾燥するか、もしくは液状のまま密栓すれば良く、とくに容器の材質や加える順番に限定されるものではない。
【００３８】
本発明では、このように調製したエンドトキシン組成物または安定化剤を含む水溶液（エンドトキシン含有）は無色透明かつ無臭で、均一な分散性と高いリムルス反応性を有するのみならず、長時間溶液状態で安定である。さらに本発明のエンドトキシン組成物は、１バイアル中の含量が非常に低いにもかかわらず、測定変動が極めて少なく、高精度のエンドトキシン標準品として使用され、該組成物は大量かつ簡便、容易に調製することが可能である。
【００３９】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  低含量エンドトキシン組成物の調製及び安定性試験
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵＫＴ−Ｂ株より調製したエンドトキシン（日局標準品、１６，０００ＥＵ／バイアル、国立衛生試験所頒布品）に１．６ｍｌの注射用蒸留水（大塚製薬（株））を加え、良く攪拌溶解した（１０，０００ＥＵ／ｍｌ）。これを原液とし蒸留水で適宜希釈した後、０．００１％トリエタノールアミン（東京化成（株））、０．００４％ポリエチレングリコール６，０００（和光純薬工業（株））、０．１％グリセロール（和光純薬工業（株））或いは、表１に記載の種々添加剤を含むエンドトキシン溶液（３ＥＵ／ｍｌ）を調製した。この混合液０．５ｍｌずつをガラスバイアルに分注し、真空凍結乾燥機（ラボコンコ（株））を用いて凍結乾燥した。この様にして調製した低含量エンドトキシン組成物のバイアル間誤差を検討する目的で、それぞれの方法で調製した低含量エンドトキシンの６バイアルを３．０ｍｌの上記蒸留水に溶解した。エンドトキシンフリーの９６穴マイクロプレート（トキシペットプレート９６Ｆ；生化学工業（株））にそれぞれのバイアルより１０μｌずつとり、５．８ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０に溶解したエンドトキシン特異的リムルス試薬（図１でエンドトキシンにのみ反応する因子を用いる高感度発色合成基質法リムルス試薬：エンドスぺシーＥＳ−２００（生化学工業（株）））１００μｌを加え、恒温槽と解析プログラム内蔵のマイクロプレートリーダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株））で３７℃、３０分間反応させ、４０５ｎｍ（対照波長４９２ｎｍ）における吸光度変化率を算出し（カイネティックアッセイ）、ＵＳＰ（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）標準エンドトキシンに対する換算値を算出した。この試験を６回繰り返し、合計３６サンプル数の分析値を得た。この分析値の平均値と標準偏差を算出し、変動係数（ＣＶ）を求め、分析値のバイアル間差の指標とした。またこれとは別に、それぞれの方法で調製した低含量エンドトキシン４バイアルを３ｍｌの蒸留水に溶解し、４℃で７日及び１４日間保存した。この保存溶液につき、保存後のエンドトキシンの力価をリムルス活性としてエンドスペシーを用いて測定し、保存前の同測定法によるリムルス活性に対する相対値（残存リムルス活性（％））として表し、溶液状態での保存安定性を評価した。また、前記低含量エンドトキシン組成物（凍結乾燥物）を、４０℃、１４日間及び７０℃、３日間の２条件で保存した後、上記と同様に残存リムルス活性（％）を求め、乾燥状態での保存安定性を評価した。
【００４１】
【表１】
0003652738.tif 000002
【００４２】
表１に示したように、本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物は、安定剤としてポリエチレングリコール単独を含む比較例または添加剤なしの比較例に比べ、エンドトキシンの保存安定性およびバイアル間差が改善された。本発明は、希薄溶液でも長期間安定でかつ凍結乾燥品の高温下における保存安定性に優れた低含量エンドトキシン組成物を容易に調製することができる。さらに、本発明では、極微量のエンドトキシンを分注、凍結乾燥するにもかかわらず、バイアル間変動の著しく小さい乾燥状態のエンドトキシン組成物を再現性良く得ることができる。
【００４３】
実施例２  透析液中のエンドトキシン安定性に及ぼす種々添加剤の効果
通常の血液透析の透析回路において、コンソールの透析液供給側カプラーより、透析液を種々添加剤入りのガラス試験管に採取し、表２、表３記載の添加剤濃度に調整し、４℃下で１日、５日及び１５日間保存し、エンドスペシーを用いて実施例１と同様にエンドトキシンの力価を測定し、添加剤なしをコントロールとして残存活性を算出した。
【００４４】
【表２】
0003652738.tif 000003
【００４５】
【表３】
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【００４６】
表２、表３に示したように、予め容器の中に本発明の安定化剤を添加しておいたものは、４℃、５日間保存後においてもそのリムルス活性にほとんど変化はなく、添加しないものに比べ著しい保護効果が認められることが分かる。さらに、混合液Ａ、混合液Ｂ及び混合液Ｄ又はＥに関しては、１５日間の長期にわたり、一定の活性を保持し得ることが明かである。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明では微量のエンドトキシンを特定の安定化剤を含む溶媒に分散させることによりミセル構造を安定に保持し、長期間溶液状態においても安定した活性を発現できるように調製された低含量標品のエンドトキシン組成物を容易に提供できる。本発明により、エンドトキシン測定の変動も小さく、希釈に必要な器具もほとんど不要になり、測定に要する時間も短縮でき、また一度溶解した該溶液を破棄することなく再度使用することもできるため、リムルステストの測定精度を著しく高めるだけでなく、時間的にもコスト的にも多くの利点を提供することができる。
【００４８】
また、近年特に血液透析医療現場において、透析液中のエンドトキシンを精度良く測定するための大きな障害となっている検体中のエンドトキシンの安定性に関し、本発明では以下に示す飛躍的な解決策を提示することができる。すなわち、通常の透析液を前記特定の安定化剤を含む適当な溶媒と混合させることにより、透析液中に含有するエンドトキシンのミセル構造を安定に保ち、かつ容器への吸着も完全に抑えることがきるため、長期間その活性を保持させることが可能である。これにより、透析液中のエンドトキシン量を正確に測定することができるため、透析システムの安全管理を適切に行うことができる。特に、近年中空糸のポアサイズを大きくして有害物の除去率を高めたハイフラックス膜（ハイパフォーマンス膜）が多用されているため、それにともなうエンドトキシンの生体への逆流（バックフィルトレーション）が問題になっているが、本発明は、この様な重大な弊害をも未然に防止し、人体の安全をより的確に確保するための有用で効果的な保存法及びツールを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートのエンドトキシン及び（１→３）−β−Ｄ−グルカンによる反応機構を示す。
【図１】
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