(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドとの複合体に対して特異的な治療薬によって治療される対象体を同定する方法であって、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドであり、そして、
（ｉ）対象体から採取された異常細胞サンプルを、前記複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に接触させる工程、及び
（ｉｉ）前記異常細胞サンプルの少なくとも一部分の溶解を、前記治療の対象体の同定として検出する工程、を有する方法。
【請求項２】
細胞異常を有する対象体を治療するための薬剤であって、前記薬剤は、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体を提示する細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を活性化するものであって、そして、前記薬剤は、ヒトチロシナーゼをコードする発現ベクターを、前記細胞異常に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を活性化するのに十分な量、含む薬剤。
【請求項３】
ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドとの複合体をその表面に提示する細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を活性化するものであり、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコードする第２ベクターを有する、請求項２の薬剤。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドとの複合体をその表面に提示する細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を活性化するものであり、そして、前記ベクターが、ＨＬＡ−Ａ２をもコードする、請求項２の薬剤。
【請求項５】
細胞異常を有する対象体を治療するための薬剤であって、前記薬剤は、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のチロシナーゼ由来ペプチドとの複合体を提示する細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を活性化するものであって、そして、前記薬剤は、前記複合体をその表面に提示する非増殖性細胞のサンプルを、前記細胞異常に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を活性化するのに十分な量、含む薬剤。
【請求項６】
細胞異常を治療するための薬剤であって、前記薬剤は、異常細胞表面上におけるＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドとの複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を有し、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドであり、そして、前記複合体の提示によって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に前記異常細胞の溶解に十分な量投与する、薬剤。
【請求項７】
前記細胞傷害性Ｔ細胞は自己由来細胞である、請求項６の薬剤。
【請求項８】
ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドとの複合体に対して特異的な単離細胞傷害性Ｔ細胞であって、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドである、単離細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項９】
その表面に、ＨＬＡ−Ａ２分子と配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドとの複合体を提示する異常細胞を同定する方法であって、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドはチロシナーゼ由来ペプチドであり、そして、
（ｉ）異常細胞のサンプルを前記複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に接触させる工程と、
（ｉｉ）前記異常細胞サンプルの少なくとも一部分の溶解を、前記複合体を提示する細胞の同定として検出する工程を、有する方法。
【請求項１０】
配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４の単離ペプチド。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本出願は、１９９２年１２月２２日に出願された同時係属の米国特許出願第９９４，９２８号の一部継続出願である１９９３年４月２８日出願の同時係属の米国特許出願第０５４，７１４号の一部継続出願である１９９３年６月２３日に出願された同時係属の米国特許第０８／０８１，６７３号の一部継続出願である１９９４年２月２８日に出願された同時係属の米国特許第０８／２０３，０５４号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ｂ４４分子によって提示されるチロシナーゼ由来の単離ペプチドと、その利用方法に関する。加えて、本発明は、その異常細胞がこれらのペプチドとＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ｂ４４との複合体を提示する細胞異常によって特徴付けられる症状を有すると診断される個体の同定の可能性と、その提示ペプチド、更にこれらから導かれる応用とに関する。
発明の背景
ほ乳類の免疫システムが外来物質又は異物を認識しこれらに対して反応するプロセスは複雑なものである。このシステムの重要な側面は、Ｔ細胞反応である。この反応の為には、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）又は主要組織適合性抗原複合体（ＭＨＣ）と称される細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これらに対して反応する必要がある。これらペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセシングされるより大きな分子から由来するものである。この点に関しては、メール（Ｍａｌｅ）他のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ジェイ・ピー・ルピンコット・カンパニー（Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ），１９８７）、特にその第６〜１０章参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との間の相互反応は、特定のＨＬＡ分子とペプチドとの複合体に対して特定のＴ細胞が必要であるという意味において制限されている。即ち、もし特定のＴ細胞が存在しないならば、たとえそのパートナー複合体が存在してもＴ細胞反応は起こらない。同様に、もし特定の複合体が存在していなければ、対応するＴ細胞が存在していても反応は起こらない。このメカニズムが、異物に対する免疫システムの反応、及び自己免疫疾患や種々の細胞異常に対する免疫システムの反応に関与している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドとプロセシングされるメカニズムに関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９１９（１９９２）；マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９２７（１９９２）；ラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６４（１９９２）参照。
Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、癌にも関係している。例えば、ここに参考文献として添付する、１９９２年５月２２日に出願され１９９２年１１月２６日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４において、１つの遺伝子ファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、ペプチドとプロセシングされ、これらのペプチドが細胞表面に発現することによって、特定のＣＴＬによる腫瘍細胞のリーシス（細胞溶解）が可能となる。これらの遺伝子は、”腫瘍拒絶抗原先駆体”、略称”ＴＲＡＰ”分子をコードするものであると言われており、これらに由来するペプチドは、”腫瘍拒絶抗原”即ち”ＴＲＡ”と称される。この遺伝子ファミリーに関する更に詳しい情報については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５：１４５（１９９２）；ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４  ３（１９９１）参照。
ここに参考文献として添付した米国特許出願第９３８，３３４号には、前記ＨＬＡ−Ａ１分子に結合するノナペプチドが教示されている。この文献によれば、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が判っていれば、ひとつの特定のペプチドは１つのＨＬＡにのみ結合し、他のＨＬＡには結合しないと予測出来るとされている。これは重要である。というのは、ＨＬＡの表現型は個々人によって異なっているからである。その結果、特定のペプチドが特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであることの同定が、そこから導かれる診断的及び治療的効果を有していても、これらはその特定のＨＬＡ表現型を有する個体にしか適用できない。従って、細胞異常は１つの特定のＨＬＡ表現型に限られていないので、この領域において更なる研究が必要であり、標的療法の為には問題の異常細胞の表現型に関するなんらかの知識が必要である。
酵素チロシナーゼは、チロシンをジハイドロキシフェニールアラニン即ち”ＤＯＰＡ”へ変換する反応に対して触媒作用を及ぼし、これは専らメラノサイト（黒色素胞）に発現されると思われる（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）他，ＥＭＢＯＪ  ７：２７１５（１９８８））。ヒト酵素のｃＤＮＡに関する比較的初期の報告はクウォン（Ｋｗｏｎ）の米国特許第４，８９８，８１４号に見られる。そして、ブーチャード（Ｂｏｕｃｈａｒｄ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：２０２９（１９８９）によるより最近の報告には、僅かに異なった配列が提示されている。この酵素に対するインヒビタの同定に関して非常に多くの研究が行われてきた。というのは、それが色素形成疾患に関係していたからである。この点に関する参考文献としては、例えば、ジンバウ（Ｊｉｎｂｏｗ），ＷＯ９１１６３０２；ミシマ（Ｍｉｓｈｉｍａ）他，米国特許第５，０７７，０５９号、ナッツァロポール（Ｎａｚｚａｒｏｐｏｒ）米国特許第４，８１８，７６８号が挙げられるが、これらに類似の参考文献も当業者にとっては周知であろう。
１９９３年６月２３日に出願されここに参考文献として添付する米国特許出願第０８／０８１，６７３号は、チロシナーゼが外来抗原又はＴＲＡＰ分子に類似の方法でプロセシングされうることを教示している。即ち、メラノーマ（黒色腫）等のある種の細胞異常において、チロシナーゼがプロセシングされ、そこから派生するペプチドがある種の異常細胞上においてＨＬＡ分子と複合体を形成することが判ったのである。これらの複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞（”ＣＴＬｓ”）によって認識されることが判り、その後、ＣＴＬが提示細胞を溶解する。この驚くべき、かつ意外な現象から導かれる応用が記載された。今回、同様にＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原として作用する更に別のペプチドが発見された。これらは、１９９４年２月２８日に出願され、ここに参考文献として添付する出願番号第０８／２０３，０５４号に記載されている。
今回、チロシナーゼから派生する更に別のペプチドが、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｂ４４によって提示され、細胞傷害性Ｔ細胞によって溶解される腫瘍拒絶抗原であることが判った。
【図面の簡単な説明】
図１は、すべて細胞溶解に関する研究を説明するものであり、ここで、
図１Ａは、細胞系ＬＢ２４−ＭＥＬの溶解を示し、
図１Ｂは、細胞系ＳＫ２９−ＭＥＬの溶解を示し、
図１Ｃは、細胞系ＬＢ４．ＭＥＬの溶解を示し、
図１Ｄは、細胞系ＳＫ２３．ＭＥＬの溶解を示し、
図１Ｅは、細胞系ＬＥ５１６．ＭＥＬの溶解を示し、
図１Ｆは、ＨＬＡ−Ａ２発現を喪失した細胞系ＳＫ２９−ＭＥＬ．１．２２の溶解を示し、
図１Ｇは、ＭＺ２−ＭＥＬの溶解の欠如を示し、
図１Ｈは、ＮＫ標的Ｋ５６２に関する溶解の研究を示し、
図１Ｉは、ＨＬＡ−Ａ２に対する遺伝子のトランスフェクション後における図１Ｆの喪失変異体（ｌｏｓｓｖａｒｉａｎｔ）の溶解を示し、
図１Ｊは、患者ＳＫ２９からの自己由来ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の溶解を示し、
図２は、ＣＴＬ  ＩＶＳＢのＴＮＦ放出の研究を示し、
図３は、ＣＴＬ  ２１０／９のＴＮＦ放出の研究を示し、
図４は、ペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶが細胞傷害性Ｔ細胞クローンＣＴＬ−ＩＶＳＢによって認識されるが細胞傷害性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２／９によっては認識されないことを示し、
図５は、ペプチドＹＭＮＧＴＭＳＱＶが細胞傷害性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２１０／９によっては認識されないことを示し、
図６は、その表面にＨＬＡ−Ｂ４４を提示する細胞を含む種々の細胞に対してＴＮＦ放出アッセイを行うことによって得られた結果を示し、
図７は、すべて、３種類の細胞系に対する、本出願に記載されたペプチドを使用した一連のクロム放出アッセイを示し、
図７Ａは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドが使用された実験を示し、
図７Ｂは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５のペプチドが使用された実験を示し、
図７Ｃは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２を使用して得られた結果を示す。
図７において、記号”○”が細胞系Ｔ２に対して使用され、”■”がＨＬＡ−Ａ２を提示しないＭＺ２−ＭＥＬに対して使用され、”●”がトランスフェクションされてＨＬＡ−Ａ２を提示するＭＺ２−ＭＥＬに対して使用されている。例１２はこれらのテストについて詳述している。
図８Ａ及び８Ｂは、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｂ４４を提示する細胞系、及び細胞傷害性Ｔ細胞クローン２２／２１（以下”ＣＴＬ２３／３１”）を使用した研究を示す。図８Ａにおいて、前記細胞系（”Ｒｏｓｉ  ＥＢＶ”）は、モノクローナル抗体Ｗ６／３２の存在下にて前培養され、これに対して図８Ｂにおいて、このような前培養は行われなかった。
好適実施例の詳細な説明
例  １
以下の実験において、研究者にとって古くから入手可能であったメラノーマ細胞系ＳＫ  ２９−ＭＥＬ（文献においてはＳＫ  ＭＥＬ−２９とも称される）とＬＢ２４−ＭＥＬとを使用した。
患者のＳＫ２９（ＡＶ）及びＬＢ２４から（これらの患者から、それぞれ、ＳＫ２９−ＭＥＬとＬＢ２４−ＭＥＬも採取した）、単核血液細胞を含むサンプルを採取した。これらの単核血液細胞を含むサンプルに、メラノーマ細胞系を接触させた。この混合物のメラノーマの溶解を観察したところ、サンプル中に、メラノーマ細胞によって提示されたペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が存在していることが判った。
使用した溶解アッセイは、その開示内容をここに参考文献として添付するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０〜３９６（１９８７）によるクロム放出アッセイであった。
しかし、このアッセイについてはここにおいても説明しておく。標的メラノーマ細胞をインビトロで成育させ、次に、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと３０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で１０7セル／ｍｌの密度で再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（51Ｃｒ）Ｏ4と共に３７℃で４５分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で再懸濁させ、その後、それぞれ１０3の細胞を含む懸濁液１００ｕｌずつを９６ウェルのマイクロプレートに分けた。１００ｕｌの同じ培養液にＰＢＬのサンプルを添加し、同様にアッセイを行った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離にかけ、５．５％の二酸化炭素を含有する雰囲気中にて３７℃で４時間培養した。
プレートを再び遠心分離にかけ、１００ｕｌの上清液を収集し、放射線をカウントした。51Ｃｒ放出の割合は以下の式によって表される。
0003721437.tif 000002
ここで、ＥＲは、観察された実験51Ｃｒ放出量、ＳＲは１０3の標識化細胞を２００ｕｌの培養液だけの中で培養することによって測定された自然放出量、そしてＭＲは、標的細胞に１００ｕｌの０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加することによって得られた最大放出量である。
高いＣＴＬ活性を示したこれらの単核血液サンプルを、拡張（ｅｘｐａｎｄｅｄ）して制限希釈によってクローン化し、前述と同じ方法によって再度スクリーニングした。
標的Ｋ５６２細胞のテストも同じ方法で行った。
ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ）を使用した時の唯一の相違点は、ＤＭＥＭ培養液の代わりに、５％のＦＣＳを添加したハンク（Ｈａｎｋ）培地を使用したことであった。
これらの実験によって、患者ＳＫ２９（ＡＶ）からＣＴＬクローン”ＩＶＳＢ”と、患者ＬＢ２４からＣＴＬクローン２１０／９とがそれぞれ単離された。
図１のＡ，Ｂ，Ｇ及びＩは、それぞれ、これらのアッセイの結果を示している。これらから、両方のＣＴＬが両方のメラノーマ細胞系を溶解したことと、Ｋ５６２及びＥＢＶ−Ｂ細胞系は溶解されなかったこと、とが判る。
例  ２
前述のＣＴＬを他のメラノーマ細胞系に対してもテストし、これらのＣＴＬが他のメラノーマ細胞系をも標的とすることが出来るかどうかを調べた。細胞系ＬＢ４．ＭＥＬ，ＳＫ２３．ＭＥＬ（ＳＫ  ＭＥＬ−２３としても知られている）及びＬＥ５１６．ＭＥＬに対して例１に記載した溶解を調べた。図１のＣ，Ｄ及びＥは、前記クローンがこれらの細胞系をも溶解したことを示している。
テストした細胞系はＨＬＡ−Ａ２型であることが知られており、その実験結果は、前記ＣＴＬがペプチドとＨＬＡ−Ａ２との複合体に対して特異性を有していることを示唆している。更に、この示唆は、ＨＬＡ−Ａ２発現を喪失したＳＫ２９−ＭＥＬの変異体をテストすることによって事実であることが確かめられた。図１Ｆはその結果を示す。即ち、どちらのクローンもこのＨＬＡ−喪失変異体は溶解しなかったのである。但し、この変異体をＳＫ２９−ＭＥＬのＨＬＡ−Ａ２遺伝子でトランスフェクションし、再テストした場合には、溶解が観察された。従って、前記提示分子はＨＬＡ−Ａ２であると結論付けることができる。
例  ３
提示分子としてＨＬＡ分子が同定されたところで、提示されたペプチドの源である、以下の記載において”腫瘍拒絶抗原先駆体”即ち”ＴＲＡＰ”分子と呼称される分子を同定するための研究を行った。
この目的のために、ＳＫ２９−ＭＥＬのサブクローンである細胞系ＳＫ２９−ＭＥＬ．１からその全ＲＮＡを単離した。このＲＮＡの単離は、オリゴ−ｄＴ結合キットを使用し、周知の技術に従って行った。全ＲＮＡを得た後、これを、再び標準方法を使用して、ｃＤＮＡに転写した。このｃＤＮＡを、製造業者の指示に従って、ＥｃｏＲＩアダプタに結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／ＡｍｐのＥｃｏＲＩサイトにクローン化した。次に、これらの組替えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１にエレクトロポレーションした（エレクトロポレーション条件：２５μファラドで１パルス、２５００Ｖ）。
トランスフェクションしたバクテリアをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）によって選抜し、次に、それぞれ２００のクローンを有する７００のプールに分割した。分析したところ約５０％のプラスミドがインサートを有していたので、各プールは、約１００種類のｃＤＮＡを示したことになる。各プールを増殖させて飽和させ、プラスミドＤＮＡを、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）に従い、アルカリ溶解、酢酸カリウム沈澱、フェノール抽出によって単離した。セシウム勾配遠心分離は使用しなかった。
例  ４
増幅したプラスミドを真核細胞にトランスフェクションした。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、組織培養平底マイクロウェルに１５，０００セル／ウェルの割合で１０％の胎児ウシ血清を添加したＤｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中に播種（ｓｅｅｄ）した。これらの細胞を、３７℃で一晩培養し、培地を除去し、これを、１０％のＮｕ血清、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭのクロロギン、１００ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２、及び前述のｃＤＮＡライブラリのプールの１００ｎｇのＤＮＡを含有する３０μｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地によって置換した。プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２は、ＳＫ２９−ＭＥＬ由来のＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含有している。３７℃での４時間の培養後、前記培地を除去し、１０％のＤＭＳＯを含有する５０μｌのＰＢＳによって置換した。この培地を２分後に除去し、１０％のＦＣＳを添加した２００μｌのＤＭＥＭによって置換した。
この培地の変更後、ＣＯＳ細胞を３７℃で４８時間培養した。次に、培地を捨て、２０００細胞の前述のＣＴＬクローンのいずれかを、１０％のプールされたヒト血清を含有するアイスコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）培地１００μｌ中に添加した。クローン２１０／９が使用された場合には、培地に２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。２４時間後、上清を除去し、この文献の開示内容を参考文献として添付したトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５：１４５−１５２（１９９２）に記載されているように、ＷＥＨＩ細胞上のアッセイによってＴＮＦ含有率を測定した。
ＩＶＳＢでテストされた７００のウェルの内、６９６のウェルが１ミリリットル当り０．６ないし４ｐｇのＴＮＦを示した。残りの４つのウェルは、１ミリリットル当り１０ないし２０ｐｇのＴＮＦを含有していた。ＣＴＬ２１０／９でテストした同一のウェルも、類似の、明らかにより高い値を示した。図２及び３にこれらのデータを示す。
例  ５
高生成プールとして同定された４つのプールの内の３つ（番号”１２３”，”１８１”及び”３８４”）を選択して更に実験を行った。具体的には、バクテリアをクローン化し、各プールから５７０のバクテリアをテストした。そこからプラスミドＤＮＡを抽出し、前述と同じ方法により、ＣＯＳ細胞の新しいサンプルにトランスフェクションし、これらの細胞のＣＴＬ２１０／９及びＣＴＬ  ＩＶＳＢの活性化に対して再度テストした。１つの陽性クローンがプール１２３に見つかり（”ｐ１２３．Ｂ２”）、もう１つがプール３８４に見つかった（”ｐ３８４．Ｃ６”）。ｃＤＮＡとＨＬＡ−Ａ２遺伝子とでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２のみでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞との比較テストをすることによって、トランスフェクションされた細胞がＣＴＬによって認識されたという確証が得られた。ＣＴＬ上清中のＴＮＦの放出量を、ＷＥＨＩ細胞上のテストによって測定した。生存ＷＥＨＩ細胞の吸光度（ＯＤ）をＭＴＴを使用して測定した。その結果を表１に示す。
0003721437.tif 000003
ＷＥＨＩのＯＤの値は、ｃＤＮＡプラスＨＬＡ−２Ａについては２４ｐｇ／ｍｌのＴＮＦに対応し、一方、コントロールに対しては２．３ｐｇ／ｍｌであった。
前記陽性クローンからのプラスミドを取り出し、公知の技術によって配列決定した。その配列調査（シーケンスサーチ）の結果、そのプラスミドインサートは、その開示内容を参考文献として添付するブーチャード（Ｂｏｕｃｈａｒｄ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：２０２９（１９８９）に記載されているように、ヒトのチロシナーゼのｃＤＮＡ配列とほとんど同一であることが判った。従って、正常に存在する分子（即ち、チロシナーゼ）が、腫瘍拒絶抗原先駆体として作用し、これがプロセシングされて、ＨＬＡ−２Ａとともに細胞の表面に提示されるペプチド腫瘍拒絶抗原を形成し、これによってＣＴＬクローンによる溶解を活性化するものと推測される。同定された分子の塩基配列は配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１として示されている。
例  ６
チョメス（Ｃｈｏｍｅｚ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５：２４１（１９９２）によって報告されている先行研究は、抗原的ペプチドをコードする配列を含む小さな遺伝子フラグメントによって該ペプチドの発現が生じることを示した。その全部を参考文献としてここに添付するこの研究は、前述し、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１に示したヒトチロシナーゼｃＤＮＡの小部分のクローン化を示唆している。前述の例１〜５に記載した方法を使用して、このｃＤＮＡの様々なフラグメントをＣＯＳ−７細胞にＨＬＡ−Ａ２の遺伝子と共移入（コトランスフェクション）し、ＴＮＦ放出アッセイを行った。これらの実験によって、共移入実験に使用された時に、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞に対する特異性を有することが示された前述の細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ  ＩＶＢＳからのＴＮＦ放出を活性化する約４００塩基対のフラグメントが同定された。使用した約４００基本対のフラグメントは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１の塩基７１１〜１１５２に対応していた。このフラグメントがコードするアミノ酸配列が導かれ、次にこのアミノ酸配列をハント（Ｈｕｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１（１９９２）及びフォーク（Ｆａｌｋ）他，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０（１９９１）によって提供された情報と比較した。これらの文献の開示内容の全体を参考資料としてここに添付する。これらの文献は、ＨＬＡ−Ａ２提示ペプチドのコンセンサス配列について記載している。具体的には、ハント（Ｈｕｎｔ）は、ノナペプチドについて、Ｌｅｕ又はＩｌｅのいずれかが、常に第２残基に見られ、ここでＬｅｕが”優勢残基”であると述べている。又、第９の残基は必ず脂肪族炭化水素側鎖を備えた残基であると記載されている。Ｖａｌがこの位置の優勢残基である。ハント（Ｈｕｎｔ）は、第２残基においてＬｅｕに対する強力なシグナルとＭｅｔに対して中程度のシグナルが存在し、第６残基においてはＶａｌ，Ｌｅｕ，ＩｌｅまたはＴｈｒのいずれか１つに対するシグナル、第９残基においてはＶａｌ又はＬｅｕのいずれかに対するシグナルが存在し、Ｖａｌが特に強力であると述べている。前記比較をベースとして、ノナペプチドを合成し、次に、これらがＨＬＡ−Ａ２提示細胞を抗原に対して敏感にさせることが出来るかどうかをテストした。この目的のために、チロシナーゼ喪失変異体細胞系ＳＫ２９−ＭＥＬ  １．２１８及びＴ２０２ＬＢを使用した。これらの細胞系に対して、細胞傷害性Ｔ細胞クローンＣＴＬ  ＩＶＳＢ又は細胞傷害性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２／９とともに、テストするペプチドを様々な濃度で添加した。前述した従来の研究によって、前者のクローンは、ＨＬＡ−２Ａを提示するチロシナーゼ発現細胞を溶解したが、後者のクローンはこれを溶解しないことが示された。
上記チロシナーゼ喪失変異体を、空の（ｅｍｐｔｙ）ＨＬＡ−Ａ２分子を安定化させるために使用する抗ＨＬＡ−Ａ２抗体ＭＡ２．１を添加、又は無添加の51Ｃｒを含有する溶解中にて３７℃で１時間培養した。これらのテストにおいて、細胞は４回洗浄され、１００μＭから０．０１μＭまでの種々の希釈度のペプチドとともに培養した。３０分後、エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞を４０／１のＥ／Ｔ比で添加し、１００λの上清を収集し、放射能カウントを行った。
図４は、ノナペプチドＴｙｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ（配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）で得られた結果を示している。
以下、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２と称するこのペプチドは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１に表されたチロシナーゼのｃＤＮＡ配列の塩基１１２９〜１１５５に対応している。ＨＬＡ−Ａ２とこのペプチドとの複合体はＣＴＬクローンＣＴＬ  ＩＶＳＢによって認識される。
平行して行った実験において、患者ＬＢ２４からのＣＴＬクローンＣＴＬ２１０／９は、ＨＬＡ−Ａ２とチロシナーゼ由来のある一つのペプチドとの複合体は認識するが、ＨＬＡ−Ａ２とこの配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のペプチドとの複合体は認識しないことが判った。従って、チロシナーゼは、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示された時にＣＴＬクローンによって認識される少なくとも１つの別のペプチドにプロセシングされる。
例  ７
追跡実験において、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のペプチドをコードしない第２の遺伝子フラグメントを使用した。このフラグメントは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１の塩基１に始まり、塩基１１０１で終端していた（即ち、ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメント）。前述の細胞傷害性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２１０／９を、前述の方法で、このフラグメントでトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞に対してテストした。ＣＴＬ  ＩＶＳＢもテストした。これらの結果、ＬＢ２４−ＣＴＬ２１０／９は、このフラグメントでトランスフェクションしたＨＬＡ−Ａ２を発現している細胞の表現上の抗原は認識するが、ＣＴＬ  ＩＶＳＢはこれを認識しないことが判った。従って、第２の腫瘍拒絶抗原ペプチドがチロシナーゼから導かれる。
例  ８
ＬＢ２４−ＣＴＬ  ２１０／９によって認識される前記腫瘍拒絶抗原を更に明確化するために、以下の実験を行った。
配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１の塩基４５１〜１１５８に対応する第２のフラグメントを、ＨＬＡ−Ａ２の遺伝子と共にＣＯＳ細胞にトランスフェクションし、ＴＮＦ放出アッセイを行った。この配列は、クローンＳＫ２９−ＣＴＬ  ＩＶＳＢからのＴＮＦの放出を活性化したが（２０ｐｇ／ｍｌ）、ＬＢ２４−ＣＴＬ  ２１０／９からの放出を活性化しなかった（３．８ｐｇ／ｍｌ）。これらの結果により、これら２つのＣＴＬクローンはそれぞれ別のペプチドを認識し、ＬＢ２４−ＣＴＬ  ２１０／９によって認識されるペプチドは、領域１〜４５１によってコードされるはずであることが確認された。
例  ９
ｃＤＮＡフラグメント１−４５１によってコード化されるチロシナーゼ由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ２に結合することが知られているコンセンサス配列を分析した。これらのコンセンサス配列に対応するペプチドを合成し、そのＨＬＡ−Ａ２提示細胞を抗原に対して敏感化させる能力についてテストした。この目的のために、サルター（Ｓａｌｔｅｒ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：２３５〜２４６（１９８５）に記載されているように、２つのチロシナーゼ陰性メラノーマ細胞系（即ち、ＮＡ８−ＭＥＬと、ＨＬＡ−Ａ２によってトランスフェクションしたＭＺ２−ＭＥＬ  ２．２）と、細胞系Ｔ２とを使用した。
これらの細胞を51Ｃｒと、ＨＬＡ−Ａ２に対して特異的なモノクローナル抗体ＭＡ．２．１と共に３７℃で５０分間培養し、その後、洗浄した（ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４４３〜４４６（１９８９）この文献の開示内容全部をここに参考資料として添付する）。標的細胞を、様々な濃度のペプチドと、ＬＢ２４−ＣＴＬクローン２１０／５又は２１０／９のいずれかとともに培養した。４時間の培養後、クロム放出率を測定した。
ペプチドＭｅｔ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３）は活性を有することが判った。
ここに要約する更に別の実験において、前の実験でＹＭＮＧＴＭＳＱＶを認識することが判ったＣＴＬ−ＩＶＳＢは、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：３のペプチドは認識しなかった。
この結果が次の表２〜４にまとめられている。
0003721437.tif 000004
0003721437.tif 000005
0003721437.tif 000006
例  １０
ＣＴＬクローン２２／３１を使用して更に別の実験を行った。このクローンは、前の実験で自己由来メラノーマ細胞系ＭＺ２−ＭＥＬからのサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３は溶解するが、ＭＺ２−ＭＥＬ３．０やＭＺ２−ＭＥＬ６１．２等の他のサブライン、あるいは、自己由来ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞やキラー細胞系Ｋ５６２は溶解しないこと示されていたものである（ファン・デア・エインデ（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４４：６３４〜６４０（１９８９）参照）。ＭＺ２−ＭＥＬ．４３によって提示される抗原を抗原Ｃと称する。
本出願の親出願に報告されているものを含めた過去の研究において、チロシナーゼ遺伝子が、大半のＨＬＡ−Ａ２を発現するメラノーマ細胞上の自己由来ＣＴＬによって認識される抗原をコードすることが判った。この遺伝子の細胞系ＭＺ２−ＭＥＬのサブライン内における発現を、ＰＣＲ増幅によってテストした。その結果、クローンＭＺ２−ＭＥＬ．４３は、陽性であることが判った。一方、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０等の他のＭＺ２−ＭＥＬクローンは陰性であった。チロシナーゼ遺伝子の発現と抗原ＭＺ２−Ｃとの相関関係は、ＭＺ２−Ｃがチロシナーゼ由来の腫瘍拒絶抗原であり、ＭＺ２−ＭＥＬによって発現されるＨＬＡ分子によって提示されるものであるかもしれないことを示唆した。この細胞系は、ＨＬＡ−Ａ２を発現せず、これは、チロシナーゼ由来のペプチドがＴＲＡとして提示されるのであれば、第２のＨＬＡ分子が関係しているということを示すものである。
どのＨＬＡ分子がＣＴＬ２２／３１に抗原Ｃを提示したかを同定する研究を行った。これを調べるために、細胞表面上に存在することが知られているＨＬＡ分子のｃＤＮＡクローン、即ち、ＨＬＡ−Ａ２９，ＨＬＡ−Ｂ３７，ＨＬＡ−Ｂ４４．０２及びＨＬＡ−Ｃクローン１０、をＭＺ２−ＭＥＬ．４３ｃＤＮＡライブラリから単離し、次に、これらを発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐにクローン化した。その後、受容体ＣＯＳ７細胞に、これらのコンストラクトの１つ、又はＨＬＡ−Ａ１を含むコンストラクトと共に、チロシナーゼをコードするｃＤＮＡ（配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）とをコトランスフェクションした。このコトランスフェクションは前述の方法で行った。１日間後、ＣＴＬ  ２２／３１を添加し、その２４時間後、前述のトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他の方法に従って、ＷＥＨＩ−１６４−１３上の細胞毒性をテストすることによってＴＮＦ放出量を測定した。図６は、ＨＬＡ−Ｂ４４とチロシナーゼとの両方をトランスフェクションした細胞が存在するときにのみＣＴＬ  ２２／３１によってＴＮＦが放出されたことを示している。このことから、ＨＬＡ−Ｂ４４がチロシナーゼ由来腫瘍拒絶抗原を提示するものであると結論される。
例  １１
上述した諸実験は、とりわけ、デカマーＭＬＬＡＶＬＹＣＬＬが、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞の溶解を効果的に誘発させることを示すものであった。ＭＨＣ分子がノナペプチドを提示するということはかなり受け入れられている。この目的のために、実験を行い、ここで、２つのノナマー（ｎｏｎａｍｅｒ）をテストしたが、これらは陽性の結果を出したデカペプチドに基づくものであった。具体的には、第１又は第１０のアミノ酸を除去して２つのペプチドと作った。即ち、
Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４）
Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
これらのペプチドを、１０μＭ〜１ｎＭの範囲の濃度での前述した例において記載したように、前記デカペプチドをテストした時と同じ方法でテストした。３つの提示細胞を使用した。後記の表５に要約されているように、”Ｔ２”は、サルター（Ｓａｌｔｅｒ），Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：２３５（１９８５）によって記載されている突然変異体ヒト細胞系”ＣＥＭＸ  ７２１．１７４Ｔ２”である。この系は、ＨＬＡ−Ａ２を提示する。”Ｇ２．２”は、前記細胞系ＭＺ２−ＭＥＬの変異体である。この変異体は、ＨＬＡ−Ａ２をコードする遺伝子でトランスフェクションされている。略称”Ｇ２．２．５”は、ＨＬＡ−Ａ２を発現しない変異体を示す。全ての細胞を、細胞傷害性Ｔ細胞クローンとの接触の前に、モノクローナル抗体ＭＡ２．１と共に培養した。この手続きは、いわゆる”ｅｍｐｔｙ”なＭＨＣ分子を安定化する。但し、これが起こるメカニズムはよく理解されておらず、エフェクターＣＴＬ２１０／５と２１０／９との両方を使用した。その結果が、後記の表５に示されている。これらの結果は、１０μＭの濃度において、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のノナマーが、ＣＴＬクローン２１０／５と使用されたには２倍効果的であり、クローン２１０／９と使用された時には４倍効果的であるのに対して、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５のノナマーは、溶解の誘発において効果が無いことを示している。
例  １２
更に別の実験において、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４及び５、更に、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のペプチドを使用してクロム放出アッセイを行った。標的細胞は、同種異系のメラノーマ細胞、即ち予めＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションしておいたＭＺ２−ＭＥＬとＨＬＡ−Ａ２を提示するが、外来ペプチドを提示する能力の増大の原因となる抗原プロセシング欠陥を有する細胞系Ｔ２であった（セルンドーロ（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ）他，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：４４９（１９９０）。すべての細胞を、５０分間、モノクローナル抗体ＭＡ２．１で前処理した。これらの細胞を、種々の濃度で、３０分間、選択したペプチドと培養した。次に、ＣＴＬクローン２１０／９とＩＶＳＢの１つを、エフェクター：標的比６０で添加した。４時間後、クロム放出を前述した方法で測定した。
その結果を、図７、即ち、図７Ａ〜７Ｃに示す。配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４のペプチドは細胞を、ＣＴＬ２１０／９に対して敏感化したが、配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５は敏感化しなかった。
配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：６は、前述の例で既に述べたように、細胞をＣＴＬ  ＩＶＳＢに対して敏感化した。
0003721437.tif 000007
0003721437.tif 000008
0003721437.tif 000009
例  １３
ＨＬＡ−Ｂ４４によって提示される抗原的ペプチドを明確にするべく、次に例１０で説明した実験をフォローアップする作業を行った。これを行うために、前記チロシナーゼｃＤＮＡ配列のフラグメントに対応するｃＤＮＡ配列を、ＨＬＡ−Ｂ４４をコードする遺伝子とともに、ＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクションした。そのプロトコルは、実質的には、前述の例６において記載したものである。前述した細胞溶解Ｔ細胞クローン２２／３１を、使用した。ＴＮＦ放出を測定した。２つのフラグメント、即ち、フラグメント塩基１〜６１１と、４２７〜１１３４とがＴＮＦ放出を誘発した。これは、提示されたペプチドが重複領域に存在することを示唆するものであった。この知見の結果、より短いフラグメントをテストした。位置３８５，４４２，５１４及び５７４から始まるフラグメントは、ＴＮＦ放出を誘発することが出来たのに対して、位置５７９及び５８５から始まるフラグメントは誘発出来なかった。これらの知見は、１３アミノ酸ペプチドの、標準方法に従った合成が位置５７４から始まることを示唆した。
次に、このペプチドを、それがＣＴＬ２２／３１による溶解を誘発したのか否かを判定する実験に使用した。後述の表６は、１３量体がＨＬＡ−Ｂ４４を発現する２つのＥＢＶトランスフェクション細胞系を溶解に対して敏感にさせたことを示している。
0003721437.tif 000010
フォローアップとして、更に短いペプチドをテストした。核酸塩基５７４〜６０４に対応する１０量体、即ち、
Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
は、ペプチド、
Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
と同様に溶解を誘発した。
これに対して、９量体、
Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）は認識されなかった。次の表７は、これらの結果を要約しており、これらは更に図８にも示されている。
ＨＬＡ−Ｂ４４に結合することが報告されている他の唯一のペプチドは、バローズ（Ｂｕｒｒｏｗａ）他，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６４：３９７４（１９９０）によって報告されている。
Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  （配列認識番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１０）
である。上述したデータは、第２位置のＧｌｕと第９位置のＰｈｅとがＨＬＡ−Ｂ４４に対するアンカー残基を表している可能性があることを示唆している。
0003721437.tif 000011
0003721437.tif 000012
前述の諸実験は、チロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆物質としてプロセシングされ、その結果得られる腫瘍拒絶抗原と少なくともいくつかの異常細胞上、例えば、例えば、ＨＬＡ−Ａ２やＨＬＡ−Ｂ４４等の表現型を有するメラノーマ細胞上、の分子との複合体が形成されるものであるということを示している。そして、この複合体がＣＴＬによって認識可能であり、その結果、提示細胞が溶解されるのである。この知見を様々な形で治療的及び診断的に利用することが可能であり、これらの応用が本発明の特徴を構成するものである。治療に関しては、上述の複合体を提示する異常細胞に対して特異的なＣＴＬが生成されるという知見から、様々な治療アプローチが示唆される。１つのそのようなアプローチは、問題の表現型の異常細胞を有する患者に対して、その複合体に対して特異的なＣＴＬを投与することである。尚、このようなＣＴＬをインビトロで開発することは当業者にとって容易であろう。具体的には、血液細胞等の細胞のサンプルを、前記複合体を提示する細胞と接触させ、特異的なＣＴＬの増殖を活性化することができる。標的細胞は、前述のタイプのＣＯＳ細胞等の移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）であってよい。これらの移入体は、その表面に所望の複合体を提示するものであり、問題のＣＴＬと結合した時に、その増殖を活性化するものである。当業者のこれらのＣＴＬの製造を可能にするために、問題の遺伝子を含むベクター、即ち、ｐｃＮＤＡ−１／Ａｍｐｌ（ＨＬＡ−Ａ２）及びｐ１２３．Ｂ２（ヒトチロシナーゼ）を、ブタペスト条約に基づいてパスツール研究所に寄託し、これらは、それぞれ承認番号Ｉ１２７５及びＩ１２７６を与えられている。ここに使用されているようなＣＯＳ細胞は広範囲に入手可能であり、他の適当なホスト細胞も同様である。
養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）；レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：２３８（７−１０−９２）；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３−１４１０（１９９１）；カスト（Ｋａｓｔ）他，Ｃｅｌｌ  ５９：６０３−６１４（１１−１７−８９））と称される治療方法について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞を、ＣＴＬと結合させ、それに対して特異的なＣＴＬを増殖させる。次に、この増殖したＣＴＬを、前記特定の複合体を提示する異常細胞のいくつかによって特徴付けられる細胞異常を有する患者に投与する。すると、ＣＴＬがこれらの異常細胞を溶解し、その結果、所望の治療目的が達成される。
上記治療方法は、被験体の異常細胞の内の少なくともいくつかの細胞が前記ＨＬＡ／チロシナーゼ由来ペプチド複合体の内の１つまたはいくつかを提示することを前提としている。これは容易に判定することができる。例えば、前述した移入体を使用してＣＴＬを同定し、単離後、これらＣＴＬを被験体の異常細胞のサンプルとともに使用してインビトロで溶解を調べることができる。溶解が観察された場合には、そのような治療方法において特定ＣＴＬを使用することによって、その異常細胞に関連する症状を軽減することができる。より簡単な方法は、標準的アッセイを使用してＨＬＡの異常細胞の表現型を調べ、ＰＣＲ等を利用した増幅によってチロシナーゼの発現を判定する方法である。種々の複数のＨＬＡ分子がチロシナーゼ由来のＴＲＡを提示するので、ここに記載した治療方法によって適切に治療される患者の数は多い。
養子移入のみが本発明において可能な治療方法ではない。多数のアプローチを使用してＣＴＬをインビボで活性化することができる。その内の１つのアプローチ、即ち、前記複合体を提示する非増殖的細胞の使用については既に記載した。このアプローチに使用される細胞は、放射線照射メラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前記遺伝子の１つ又は両方をトランスフェクションした細胞等の、該複合体を正常時に発現する細胞であってよい。チェン（Ｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１１０〜１１４（１９９１年１月）には、このアプローチの一例が記載されており、ここでは、治療領域にＨＰＶＥ７ペプチドを提示するトランスフェクション細胞が使用されている。細胞のタイプも様々なものを使用することができる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を有するベクターを使用することができる。ウィルス性又はバクテリア性ベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいて、問題の遺伝子は、例えばワクシニアウィルスやバクテリアＢＣＧ等によって運搬され、これらの材料は、実質上ホスト細胞に”感染”する。その結果、これらの細胞は問題の複合体を提示し、これらが自己由来ＣＴＬによって認識され、次にそのＣＴＬが増殖するのである。チロシナーゼ自身と、ＨＬＡ−Ａ２提示細胞への組み込みを促進するアジュバントとを結合することによっても類似の効果を達成することができる。次に、該酵素がプロセシングされてＨＬＡ分子のペプチドパートナーを作る。
以上の記載において、”異常細胞”及び”細胞異常”という表現が使用されている。これらの表現はここではその最も広い意味に解釈されるべきものであり、これらは、問題の細胞が、この細胞と同じタイプの正常な細胞と異なっていることを示す少なくとも１つの特性を示しているようなすべての状況を指している。異常特性の例としては、形態上の変化や、生化学的変化があり、細胞異常としては、メラノーマ等の腫瘍、自己免疫障害、等が含まれる。
本発明は、更に、ＣＴＬ標的への先駆物質を同定する方法を提供する。これらの先駆物質は、標的細胞が腫瘍である場合には、腫瘍拒絶抗原と呼ばれるが、但し、異常によって特徴付けられるその細胞が腫瘍ではなない場合には、この分子を腫瘍拒絶抗原と呼ぶことは誤解を招くことを指摘しなければならない。本質的に、該方法は、前述したタイプの細胞傷害性Ｔ細胞の標的である細胞を同定することに関する。そのような細胞が同定されると、その全ＲＮＡをｃＤＮＡライブラリに転換し、次にこれを、関連するＨＬＡ分子と複合体を形成する抗原を提示可能な細胞サンプルにトランスフェクションする。これら移入体を前述のＣＴＬに接触させ、再び、ＣＴＬによる標的化を観察する（溶解及び／又はＴＮＦ生成）。次に溶解されたこれらの移入体を処理してｃＤＮＡを単離し、配列決定する。このようにして、腫瘍拒絶抗原先駆物質等の、異常状態の先駆物質を同定することができる。
本発明のその他の側面は当業者にとって明白であろう。従って、ここで繰り返すことは避ける。
尚、ここに使用した用語及び表面は記載のためのものであって限定のためのものではなく、これらの用語及び表現の使用においてここに図示及び記載した特徴構成の均等物を排除する意図は無く、本発明の範囲内においてその他様々な改変が可能である。
(1)一般情報：
(i)  出願人：  ヴォルフェル，トーマス；
ファン・ペル，アリーネ；
ブリチャード，ヴィンセント；
ブーン-ファラー，ティエリー
(ii)  発明の名称：単離チロシナーゼ由来ペプチド抗原とその利用方法
(iii)配列の数：  １０
(iv)  連絡先：
(A)  宛名    ：  フェルフェ・アンド・リンチ
(B)  通り名  ：  サード・アベニュー  805
(C)  都市名  ：  ニューヨーク・シティ
(D)  州名    ：  ニューヨーク
(E)  国名    ：  アメリカ合衆国
(F)  郵便番号：  10022
(V)  コンピュータ読み取り可能フォーム
(A)  媒体型式：  5.25  インチ  フロッピーディスク，360 kb  メモリ
(B)  コンピュータ：  IBM PS/2
(C)  オペレーティング・システム：  PC-DOS
(D)  ソフトウェア：  ワードパーフェクト(Wordperfect)
(vi)  現在の出願データ：
(A)  出願番号：  08/233,305
(B)  出願日  ：  1994年4月26日
(C)  分類    ：  514
(vi)  現在の出願データ：
(A)  出願番号：  08/203,054
(B)  出願日  ：  1994年2月28日
(vii)先の出願データ：
(A)  出願番号：  08/081,673
(B)  出願日  ：1993年6月23日
(vii)先の出願データ：
(A)  出願番号：  08/054,714
(B)  出願日  ：  1993年4月28日
(vii)先の出願データ：
(A)  出願番号：  07/994,928
(B)  出願日  ：  1992年12月22日
(viii)弁理士／代理人情報：
(A)  氏名    ：  ハンソン，ノーマン，ディ
(B)  登録番号：  30,946
(C)  参照／書類番号：  LUD 5360.1
(ix)  通信情報：
(A)  電話  ：      (212)688-9200
(B)  ファックス：  (212)838-3884
(2)配列認識番号1の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    1894  基本ペア
(B)  タイプ：  核酸
(C)  鎖の数：  一本鎖
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号1：
0003721437.tif 000013
0003721437.tif 000014
0003721437.tif 000015
0003721437.tif 000016
(2)配列認識番号2の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    9アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  一本鎖
(xi)  配列の記述：  配列認識番号2：
0003721437.tif 000017
(2)配列認識番号3の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    10アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  一本鎖
(xi)  配列の記述：  配列認識番号3：
0003721437.tif 000018
(2)配列認識番号4の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    9アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号4：
0003721437.tif 000019
(2)配列認識番号5の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    9アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号5：
0003721437.tif 000020
(2)配列認識番号6の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    13アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号6：
0003721437.tif 000021
(2)配列認識番号7の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    10アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号7：
0003721437.tif 000022
(2)配列認識番号8の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    9アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号8：
0003721437.tif 000023
(2)配列認識番号9の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    9アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号9：
0003721437.tif 000024
(2)配列認識番号10の情報：
(i)  配列特徴：
(A)  長さ：    10アミノ酸残基
(B)  タイプ：  アミノ酸
(D)  トポロジー：  直鎖状
(xi)  配列の記述：  配列認識番号10：
0003721437.tif 000025
【図１Ａ】
0003721437.tif 000026
0003721437.tif 000027
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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