(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞及び／又は組織を一般式（Ｉ）：
【化１】
0003625908.tif 000010
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、ＮＲ8aＲ8b（ここで、Ｒ8a及びＲ8bは、それぞれ独立に水素原子、カルバモイル基、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表す。）、ＯＲ9（ここで、Ｒ9は、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表す。）、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、Ｒ1d、Ｒ1e及びＲ1fは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に水素原子、水酸基又は炭素数１〜１２のアルキル基を表し；
Ｃ1−Ｃ2−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ7は、水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍは、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4を表す。）、ＮＲ10aＲ10b（ここで、Ｒ10a及びＲ10bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ11（ここで、Ｒ11は、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又は炭水化物残基を表す。）、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
ｎは１〜７の整数を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
又は一般式（II）：
【化２】
0003625908.tif 000011
［式中、Ｒ1a、Ｒ1b、Ｒ1c、Ｒ1d、Ｒ1e、Ｒ1f及びＲ1gは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｃ1−Ｃ2−Ｃ3−Ｃ4−Ｃ5−Ｃ6からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ7は、水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ4を表す。）、ＮＲ10aＲ10b（ここで、Ｒ10a及びＲ10bは、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ11（ここで、Ｒ11は、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又は炭水化物残基を表す。）、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
ｎは１〜７の整数を表し；
Ｒ12a及びＲ12bは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又はアミノ酸残基を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物の存在下に培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項２】
タキサン型ジテルペンがタキソール、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール、バッカチンIII、１０−デアセチルバッカチンIII、７−エピバッカチンIII、セファロマニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセファロマニン、バッカチンVI、タキサン１ａ、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール、タキソールＣ、１０−デアセチルタキソールＣ、タキシシンＩ、タキシシンII、タキシンＩ、タキシンII及びタキサギフィンからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項３】
タキサン型ジテルペンを産生する植物がイチイ属植物であることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）又は（II）で示される化合物の培地中の濃度が0.001〜1000μＭであることを特徴とする請求項１記載のタキサン型ジテルペンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソールを含むタキサン型ジテルペンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として有用であるタキソール（Ｔａｘｏｌ）  は、イチイ科イチイ属植物であるタイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  ＮＵＴＴ）  より単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、前記薬理活性と関連する複雑なエステルグループを有している。タキソールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの部位にも存在し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されている。現在、タキソールは天然の又は栽培された植物体から採取されているが、イチイ属植物は地上２０ｃｍの高さに成長するのに１０年以上かかる生育の遅い植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうため、大量のタキソールを得ることは容易でない。もし、タキソール及び／又はタキソールの前駆物質であるバッカチンＩＩＩ（ｂａｃｃａｔｉｎ  ＩＩＩ）  等のタキサン型ジテルペンの合成が組織培養を利用して行うことができれば、樹木を伐採することなく、大量のタキソールを容易に得ることができるので有利である。
【０００３】
これまでの植物の培養細胞を利用したタキソール生産方法については、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  ＮＵＴＴ  ）培養細胞によるタキソール生産法が米国で特許（米国特許第５０１９５０４  号）になっているが、そのタキソール生産量は１  〜３ｍｇ／ｌ  と記載されており、工業的生産には不十分である。また、従来の組織培養技術では、細胞培養によるタキソールの生産性は不安定であり、選抜で一次的には生産性の高い細胞が得られるが、継代培養してその含量を維持することは難しい［Ｅ．Ｒ．Ｍ．Ｗｉｃｋｒｅｍｅｓｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９９２）］  。
【０００４】
一方、タキソール生産法の先行技術としては、タキソール生合成前駆体であるバッカチンＩＩＩ  からの半合成法がＨｏｌｔｏｎらの米国特許第５０１５７４４  号明細書に開示されている。植物の組織培養法を用いれば、バッカチンＩＩＩ  等の半合成原料の生産も可能であり、前記半合成法によるタキソール生産にも利用できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物組織培養によるタキサン型ジテルペンの簡便な製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細胞又は培養組織の培地中にジャスモン酸類のイミノあるいはアミノ誘導体を添加して培養を行うと、培養物中のタキサン型ジテルペン生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の細胞及び／又は組織を一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
0003625908.tif 000002
【０００８】
［式中、Ｘは、水素原子、水酸基、ＮＲ８ａＲ８ｂ（ここで、Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、それぞれ独立に水素原子、カルバモイル基、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表す。）、ＯＲ９  （ここで、Ｒ９  は、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表す。）、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ及びＲ１ｆは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  及びＲ６  は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｃ１  −Ｃ２  −Ｃ３  −Ｃ４  −Ｃ５  −Ｃ６  からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ７  は、水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍは、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４  を表す。）、ＮＲ１０ａ  Ｒ１０ｂ  （ここで、Ｒ１０ａ  及びＲ１０ｂ  は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ１１（ここで、Ｒ１１は、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又は炭水化物残基を表す。）、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
ｎは１〜７の整数を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
又は一般式（ＩＩ）：
【０００９】
【化４】
0003625908.tif 000003
【００１０】
［式中、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ及びＲ１ｇは、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  及びＲ６  は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
Ｃ１  −Ｃ２  −Ｃ３  −Ｃ４  −Ｃ５  −Ｃ６  からなる側鎖は、１個又は２個以上の二重結合を含んでいてもよく；
Ｒ７  は、水酸基、ＯＭ（ここで、Ｍはアルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子又はＮＨ４  を表す。）、ＮＲ１０ａ  Ｒ１０ｂ  （ここで、Ｒ１０ａ  及びＲ１０ｂ  は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又はアミノ酸残基を表す。）、ＯＲ１１（ここで、Ｒ１１は、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又は炭水化物残基を表す。）、炭素数１〜１２のアルキル基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基を表し；
ｎは１〜７の整数を表し；
Ｒ１２ａ  及びＲ１２ｂ  は、それぞれ独立に水素原子、水酸基、炭素数１〜１２のアシル基、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数１〜１２のアルコキシ基、アリール基、置換基を有するアリール基、アリールアルキル基、置換基を有するアリールアルキル基又はアミノ酸残基を表し；
前記５員環は隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。］
で示される化合物の存在下に培養し、得られる培養物からタキサン型ジテルペンを回収することを特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法である。
【００１１】
本発明の製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はなく、具体的には、タキソール、１０−デアセチルタキソール、７−エピタキソール、バッカチンＩＩＩ  、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ  、７−エピバッカチンＩＩＩ  、セファロマニン、１０−デアセチルセファロマニン、７−エピセファロマニン、バッカチンＶＩ、タキサン１ａ、キシロシルセファロマニン、キシロシルタキソール、タキソールＣ、１０−デアセチルタキソールＣ、タキシシンＩ、タキシシンＩＩ、タキシンＩ、タキシンＩＩ、タキサギフィン等を例示できる。
【００１２】
本発明の製造方法に用いられるタキサン型ジテルペンを産生する植物としては、例えばセイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａ  ＬＩＮＮ）、イチイ（Ｔ．  ｃｕｓｐｉｄａｔａ  ＳＩＥＢ．ｅｔ  ＺＵＣＣ）  、キャラボク（Ｔ．  ｃｕｓｐｉｄａｔａ  ＳＩＥＢ．ｅｔ  ＺＵＣＣ  ｖａｒ．  ｎａｎａ  ＲＥＨＤＥＲ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔ．  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ  ＮＵＴＴ）、カナダイチイ（Ｔ．  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ  ＭＡＲＳＨ）  、中国イチイ（Ｔ．  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｔ．ｍｅｄｉａ  等のイチイ属植物が挙げられる。これらの中でもセイヨウイチイ及びＴ．ｍｅｄｉａ  が特に好ましい。
【００１３】
前記植物の組織培養は、本発明により前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物を添加する以外は、従来から知られている方法によって行うことができる。
本発明の対象となる化合物は、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物である。
【００１４】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ１ｇ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  、Ｒ７  、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、Ｒ９  、Ｒ１０ａ  、Ｒ１０ｂ  、Ｒ１１、Ｒ１２ａ  、Ｒ１２ｂ  又はＸで表される炭素数１〜１２のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。また、炭素数３以上のアルキル基の中には、環状アルキル基、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を含むアルキル基が包含される。
【００１５】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ１ｇ、Ｒ１２ａ  又はＲ１２ｂ  で表される炭素数１〜１２のアルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、ウンデシルオキシ基、ドデシルオキシ基等が挙げられる。また、炭素数３以上のアルコキシ基の中には、環状アルキル基、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等を含むアルコキシ基が包含される。
【００１６】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、Ｒ１０ａ  、Ｒ１０ｂ  、Ｒ１２ａ  又はＲ１２ｂ  で表される炭素数１〜１２のアシル基としては、直鎖、分岐鎖、芳香族を有する原子団のいずれでもよく、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、カプリロイル基、ペラルゴイル基、ベンゾイル基、トルオイル基、サリチロイル基、シンナモイル基等が挙げられる。
【００１７】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ１ｇ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  、Ｒ７  、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、Ｒ９  、Ｒ１０ａ  、Ｒ１０ｂ  、Ｒ１１、Ｒ１２ａ  、Ｒ１２ｂ  又はＸで表されるアリール基又は置換基を有するアリール基としては、フェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００１８】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ１ｇ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  、Ｒ７  、Ｒ７’、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、Ｒ９  、Ｒ１０ａ  、Ｒ１０ｂ  、Ｒ１１、Ｒ１２ａ  、Ｒ１２ｂ  又はＸで表されるアリールアルキル基又は置換基を有するアリールアルキル基としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基等が挙げられる。
【００１９】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ７  がＯＭである場合、Ｍで表されるアルカリ金属原子又はアルカリ土類金属原子としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムが挙げられる。
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ７  がＮＲ１０ａ  Ｒ１０ｂ  である場合におけるＲ１０ａ  又はＲ１０ｂ  で表されるアミノ酸残基、及び前記一般式（ＩＩ）において、Ｒ１２ａ  又はＲ１２ｂ  で表されるアミノ酸残基としては、例えばイソロイシル基、チロシル基、トリプトフィル基が挙げられる。
【００２０】
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ７  がＯＲ１１である場合、Ｒ１１で表される炭水化物残基としては、グルコピラノシル基が挙げられる。
また、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物においては、５員環は、隣接する環員炭素原子間で二重結合を形成してもよい。
前記一般式（Ｉ）で示される化合物の具体例としては、以下に示す化合物が挙げられる。
【００２１】
（化合物Ａ）
Ｘ：−ＯＨ
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  ：Ｈ
Ｃ３  とＣ４  で二重結合形成
Ｒ７  ：−ＯＣＨ３  
ｎ：１
【００２２】
【化５】
0003625908.tif 000004
【００２３】
（化合物Ｂ）
Ｘ：−ＯＣＨ３  
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  ：Ｈ
Ｃ３  とＣ４  で二重結合形成
Ｒ７  ：−ＯＣＨ３  
ｎ：１
【００２４】
【化６】
0003625908.tif 000005
【００２５】
（化合物Ｃ）
Ｘ：−ＮＨ２  
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  ：Ｈ
Ｃ３  とＣ４  で二重結合形成
Ｒ７  ：−ＯＣＨ３  
ｎ：１
【００２６】
【化７】
0003625908.tif 000006
【００２７】
（化合物Ｄ）
Ｘ：−ＮＨＣＯＮＨ２  
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  ：Ｈ
Ｃ３  とＣ４  で二重結合形成
Ｒ７  ：−ＯＣＨ３  
ｎ：１
【００２８】
【化８】
0003625908.tif 000007
【００２９】
前記一般式（ＩＩ）で示される化合物の具体例としては、以下に示す化合物が挙げられる。
（化合物Ｅ）
Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ１ｃ、Ｒ１ｄ、Ｒ１ｅ、Ｒ１ｆ、Ｒ１ｇ、Ｒ２  、Ｒ３  、Ｒ４  、Ｒ５  、Ｒ６  、Ｒ１２ａ  ：Ｈ
Ｒ１２ｂ  ：ＯＨ
Ｃ３  とＣ４  で二重結合形成
Ｒ７  ：−ＯＣＨ３  
ｎ：１
【００３０】
【化９】
0003625908.tif 000008
【００３１】
本発明で使用される前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物には種々の異性体が存在するが、それぞれの異性体を単独で用いても、混合物の形で用いてもよい。
前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物は、ジャスモン酸類にアンモニア誘導体を付加反応させることなどにより容易に調製される（例えば、日本化学会編「新実験化学講座１４．有機化合物の合成と反応［ＩＩＩ］  」参照）。
【００３２】
アンモニア誘導体としては、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド、Ｏ−メチルヒドロキシルアミンもしくはＯ−エチルヒドロキシルアミン等、又はこれらの化合物の塩を挙げることができる。塩を用いる場合、必要に応じてカルボニル体（ジャスモン酸類）の存在下で酢酸ナトリウム又は酢酸カリウムを加えて、塩から塩基性の試薬を遊離させる。
【００３３】
付加反応は、塩基性窒素化合物によるカルボニル炭素への求核攻撃であり、反応には、反応液をちょうどよい酸性に調整することが好ましい。
このようにして得られるジャスモン酸類のイミノ誘導体を更に水素化アルミニウムリチウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム等の複合水素化合物やボラン等の還元剤と反応させることによりジャスモン酸類のアミノ誘導体を得ることができる。
【００３４】
本発明で使用される化合物を含む培地中で組織及び／又は細胞を培養し、得られる培養組織、培養細胞、培地等の培養物からタキサン型ジテルペンを回収することができる。
本発明で使用される化合物は、培地における濃度を  ０．００１〜１０００μＭとすることが好ましく、この中でも特に  ０．１〜５００  μＭの範囲に調整することが更に好ましい。
【００３５】
植物細胞培養物にジャスモン酸類を添加して特定の二次代謝産物の生産が促進されることはドイツで特許公告［ＤＥ  ４１２２２０８］になっているが、タキサン型ジテルペンの生産については全く記載されていない。本発明者らは、先にジャスモン酸類の添加によって培養物中のタキサン型ジテルペンの産生量が増大することを見出しているが［特願平６−１０４２１１号、特願平６−１０４２１２号、特願平７−４７５８０号］、本発明におけるジャスモン酸類のイミノあるいはアミノ誘導体にジャスモン酸類よりも高い生産促進効果があることは予想外のことであった。
【００３６】
本発明に使用される培地としては、従来から知られている植物の組織培養に用いられる培地、例えばムラシゲ・スクーグ（１９６２  年）［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ］の培地、リンスマイヤー・スクーグ（１９６５  年）［Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  Ｓｋｏｏｇ］の培地、ウッディー・プラント・メディウム（１９８１  年）［Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ］  の培地、ガンボルグ［Ｇａｍｂｏｒｇ］  のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等が挙げられる。
【００３７】
これら培地に植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて炭素源、無機成分、ビタミン類、アミノ酸等を添加することもできる。
植物ホルモンとしては、例えばインドール酢酸（ＩＡＡ）  、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）  、２，  ４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）  等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。
【００３８】
炭素源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを使用できる。
無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合物として添加できる。
【００３９】
ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ１  ）、ピリドキシン（ビタミンＢ６  ）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられる。
アミノ酸類としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等を添加できる。
【００４０】
一般に前記の各成分は、植物ホルモン類が約０．０１〜約１０μＭ  、炭素源が約１〜約３０ｇ／ｌ  、無機成分が約０．１  μＭ  〜約１００ｍＭ  、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約０．１  〜約１００ｍｇ／ｌ  の濃度で用いられる。
なお、本発明には液体培地及び寒天やゲランガム等を通常０．１  〜１％含有する固形培地のいずれも使用できるが、通常は液体培地が好ましい。
【００４１】
本発明における組織培養においては、前記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを前記培地又は他の従来の培地によって組織培養して得られる培養細胞を使用することができる。
また本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  又は  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  を植物組織に感染することによって得られる腫瘍細胞及び／又は毛状根にも適用できる。
【００４２】
これらの組織又は細胞を本発明により前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物の存在下に組織培養すると、無添加又は無処理の場合と比較して、タキサン型ジテルペンの高生産性培養組織又は培養細胞が得られる。
以上のようにして得られた培養組織、培養細胞、培地等の培養物から、メタノール、ジクロロメタン等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。また、培地中に適当な吸着剤や有機溶媒を共存させ、連続的にタキサン型ジテルペンを回収することもできる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明における組織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。
先ず、イチイ属に属する植物の植物体、例えば根、生長点、葉、茎、種子等から採取される植物片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラント・メディウムの固体培地上に置床し、１０〜３５℃で１４〜６０日程度経過させて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質であるものをいう。
【００４４】
この安定化したカルスを増殖に適した液体培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又は該カルスを構成する細胞は、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物を含有する固体培地又は液体培地で培養される。
【００４５】
本発明で使用される化合物は、培養細胞の増殖期ないし定常期に添加することが最も効果的であり、この中でも特に増殖期から定常期に移行する時期に該化合物を添加することが本発明の方法にとって好ましい。例えば、２１日おきに細胞を移植している場合には、７〜１４日目が該化合物の添加の適期にあたる。また、添加方法としては、一度に行ってもよいし、複数回に分けて行ってもよい。
【００４６】
また、本発明で使用される化合物を用いて２段培養を行う場合、１段目の培養では、該化合物を含まない培地で細胞を増殖後、次に２段目の培養で該化合物を添加して培養することができる。その際、２段目に移行する細胞の状態は増殖期ないし定常期であることが好ましい。
本発明における組織培養の培養温度としては、通常は約１０〜約３５℃、特に約２３〜約２８℃が増殖速度が大きいので好適である。また、培養期間としては、１４〜４２日間が好適である。
【００４７】
本発明における培養において液体培地を用いた場合には、培養終了後に培養細胞をデカンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離し、培養細胞及び／又は培地から目的とするタキサン型ジテルペンを有機溶媒による抽出等の方法によって分離することができる。
本発明の効果を高める方法として、特開平７−１３５９６７号公報、特願平６−１０４２１３号明細書に開示されている、細胞を比重の違いにより複数の層に分け、少なくとも一つの層に含まれる細胞を培養する方法との併用が挙げられる。
【００４８】
また、本発明は、特願平６−１４６８２６号明細書に記載されている、培養器内の気相中の酸素濃度を培養初期より大気中の酸素濃度未満の条件下に制御して培養を行うか、或いは組織及び／又は細胞と接する流動性の培地中の溶存酸素濃度を培養初期よりその温度における飽和溶存酸素濃度未満である条件下に制御して培養する方法；特願平６−２０１１５０号明細書に記載されている、重金属を含む化合物及び／又は重金属イオンの存在下に培養する方法；特願平６−２０１１５１号明細書に記載されている、アミン類の存在下に培養する方法；特願平６−２９１７８３号明細書に記載されている、サイクロデキストリン等の環状多糖類の存在下に培養する方法；と併用してもよい。
【００４９】
以上のようにして得られた培養組織、培養細胞、培地等の培養物から、メタノール、ジクロロメタン等の有機溶媒による抽出によってタキサン型ジテルペンを分離することができる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例、比較例及び参考例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
ジャスモン酸メチル１ｇ（４．５ｍｍｏｌ）  をメタノール５０ｍｌに溶かした溶液を氷冷し、硫酸ヒドロキシルアミン０．７４ｇ（４．５ｍｍｏｌ）  と酢酸カリウム０．８８ｇ（９．０ｍｍｏｌ）  を加え反応を行った。一夜放置後、メタノールを留去した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで繰り返し抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水分を除去した後、減圧乾燥により酢酸エチルを留去し、化合物Ａを得た。
【００５１】
ナフタレン酢酸を１０−５Ｍ  の濃度になるように添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培地（ゲランガム０．２５重量％）に、前もって２％アンチホルミン溶液又は７０％エタノール溶液等で滅菌処理したメディアイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｍｅｄｉａ）  の胚の一部を置床し、２５℃で暗所にて静置培養してメディアイチイカルスを得た。次にこのカルス１ｇ（新鮮重）を、前記成分を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウムの液体培地２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、１００ｒｐｍ）し、１４日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。
【００５２】
このようにして得られた培養細胞２ｇ（新鮮重）を、ウッディー・プラント・メディウム２０ｍｌ入りの三角フラスコに移し、ジャスモン酸類の誘導体として化合物Ａをその終濃度が０．０１〜１０００μＭになるように添加し、更に１４日間培養した。培養終了後、メディアイチイ培養細胞を濾過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得られた乾燥カルス及び培地からメタノール等を用いてタキサン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカチンＩＩＩ  と比較定量することによってタキサン型ジテルペン収量を測定した。その結果を表１に示す。
【００５３】
（比較例１）
実施例１において、ジャスモン酸類の誘導体を添加しない以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
（参考例１）
実施例１において、ジャスモン酸類の誘導体としてジャスモン酸メチルを１００μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００５４】
（実施例２）
ジャスモン酸メチル１ｇ（４．５ｍｍｏｌ）  をメタノール５０ｍｌに溶かした溶液を氷冷し、塩酸Ｏ−メチルヒドロキシルアミン０．４６ｇ（５．５ｍｍｏｌ）  と酢酸カリウム０．８８ｇ（９．０ｍｍｏｌ）  を加え反応を行った。一夜放置後、メタノールを留去した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで繰り返し抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水分を除去した後、減圧乾燥により酢酸エチルを留去し、化合物Ｂを得た。
実施例１において、ジャスモン酸類の誘導体として化合物Ｂを１００μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００５５】
（実施例３）
ジャスモン酸メチル１ｇ（４．５ｍｍｏｌ）  をメタノール５０ｍｌに溶かした溶液を氷冷し、ヒドラジン一水和物０．２７ｇ（５．４ｍｍｏｌ）  を加え反応を行った。一夜放置後、メタノールを留去した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで繰り返し抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水分を除去した後、減圧乾燥により酢酸エチルを留去し、化合物Ｃを得た。
実施例１おいて、ジャスモン酸類の誘導体として化合物Ｃを１００μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００５６】
（実施例４）
ジャスモン酸メチル１ｇ（４．５ｍｍｏｌ）  をメタノール５０ｍｌに溶かした溶液を氷冷し、セミカルバジド塩酸塩０．６０ｇ（５．４ｍｍｏｌ）  と酢酸カリウム０．５３ｇ（５．４ｍｍｏｌ）  を加え反応を行った。一夜放置後、メタノールを留去した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで繰り返し抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水分を除去した後、減圧乾燥により酢酸エチルを留去し、化合物Ｄを得た。
実施例１において、ジャスモン酸類の誘導体として化合物Ｄを１００μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００５７】
（実施例５）
実施例１において合成した化合物Ａ１ｇをメタノール５０ｍｌに溶かした溶液に、水素化ホウ素ナトリウム  ０．０８４ｇ（２．２ｍｍｏｌ）  をメタノール５ｍｌに溶かした溶液を滴下した。滴下終了後、反応混合物を更に３０分かき混ぜた。溶液を約１０ｍｌにまで減圧濃縮後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、生成物を酢酸エチルで繰り返し抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで水分を除去した後、減圧乾燥により酢酸エチルを留去し、化合物Ｅを得た。
実施例１において、ジャスモン酸類の誘導体として化合物Ｅを１００μＭ添加する以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
0003625908.tif 000009
【００５９】
【発明の効果】
本発明によれば、ジャスモン酸類のイミノ又はアミノ誘導体を含む組織培養培地を用いたタキサン型ジテルペン産生植物の組織培養によって、大量のタキサン型ジテルペンを簡便に得ることができる。