(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともメイン粒子及びダミー粒子からなる展開粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、
前記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、
前記メイン粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、前記メイン粒子を構成する不溶性担体が、前記メンブランと識別可能な色をもつものであり、
前記ダミー粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであり、前記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、粒径が前記メイン粒子を構成する不溶性担体よりも大きく、免疫クロマトグラフィー装置の判定時間内に前記被測定物質判定部位に到達しない
ことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
少なくともメイン粒子及びダミー粒子からなる展開粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、
前記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、
前記メイン粒子は、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、前記メイン粒子を構成する不溶性担体が、前記メンブランと識別可能な色をもつものであり、
前記ダミー粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであり、前記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、前記メイン粒子と識別可能な色をもつものであり、更に、粒径が前記メイン粒子を構成する不溶性担体よりも小さい
ことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
少なくともメイン粒子及びダミー粒子からなる展開粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、
前記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、
前記メイン粒子は、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、前記メイン粒子を構成する不溶性担体が、前記メンブランと識別可能な色をもつものであり、
前記ダミー粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであり、前記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、前記メンブラン及び前記メイン粒子と識別可能な色をもつものであり、更に、粒径が前記メイン粒子を構成する不溶性担体よりも小さい
ことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項４】
予め、ダミー粒子が、メイン粒子よりも被検液添加部位に近い位置に保持されていることを特徴とする請求項１、２又は３記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項５】
少なくとも展開粒子を予め保持するコンジュゲートパッド、及び、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、
前記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、
前記展開粒子は、メイン粒子からなり、
前記メイン粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、前記メイン粒子を構成する不溶性担体が、前記メンブランと識別可能な色をもつものであり、
前記コンジュゲートパッドは、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである
ことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項６】
コンジュゲートパッド内において、予め、免疫学的に不活性な物質が、展開粒子を保持させた位置よりも被検液添加部位に近い位置に担持されていることを特徴とする請求項５記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項７】
少なくとも展開粒子を予め保持するコンジュゲートパッド、被測定物質判定部位が設けられたメンブラン、及び、吸収パッドから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、
前記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、
前記展開粒子は、メイン粒子からなり、
前記メイン粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、前記メイン粒子を構成する不溶性担体が、前記メンブランと識別可能な色をもつものであり、
前記吸収パッドは、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである
ことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項８】
メイン粒子を構成する不溶性担体は、着色ラテックスである請求項１〜７のいずれか一項記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項９】
被測定物質は、複数種類あり、
メイン粒子は、前記被測定物質の種類に応じて複数種類存在し、前記各メイン粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原をそれぞれ担持しており、
被測定物質判定部位は、前記被測定物質の種類に応じて複数種類存在するものである請求項１〜８のいずれか一項記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項１０】
各メイン粒子の色は、それぞれ識別可能な色である請求項９記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
免疫クロマトグラフィーによる被測定物質の測定方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項記載の免疫クロマトグラフィー装置に、被検液を添加することを特徴とする測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、診断用途における偽陽性反応を抑制する免疫クロマトグラフィー装置、及び、偽陽性反応を判定可能な免疫クロマトグラフィー装置、並びに、それを用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液、尿等に含まれる微量物質の測定に免疫測定方法が使われている。免疫測定方法は、抗原抗体反応の特異的な強い結合に基づいており、種々の物質が存在する試料からでも被測定物質を特異的に感度よく測定することが可能である。
【０００３】
これらの免疫測定法においては、血清等の検体と反応させたときに、被測定物質である抗原又は抗体を含む陽性検体のみならず、これら抗原又は抗体を含まない陰性検体に対しても反応を起こすことがある。このような非特異反応が起こる理由は明らかではなく、また、複数の理由があると考えられるが、一つには血清中に含まれる補体等の因子によるものと考えられている。これらの非特異反応を減少させることを目的として、従来から、検体をグリシン等の緩衝液で希釈したり、又は、血清中の補体を失活させる非動化処理が行われている。しかし、このような処理によっては非特異反応を充分に抑制することが困難であり、また、手間がかかるという問題がある。
【０００４】
一方、免疫測定方法には、ＥＩＡ法、ラテックス凝集法、免疫クロマトグラフィー法が有名であるが、なかでも免疫クロマトグラフィー法は特別な測定装置を必要とせず簡単に短時間で高感度の測定ができることから、近年様々な物質の測定に使用されるようになった。また、従来、免疫クロマトグラフィーに使用していた不溶性担体は、金コロイド粒子が大半を占めていたが、反応の視認性や色の選択性から、着色された高分子ラテックスが主流になりつつある。測定キット（免疫クロマトグラフィー装置）は、キットを構成するメンブラン上の被測定物質判定部位と検査終了判定部位の変色から、被測定物質の定性や定量結果と検査終了に関する情報が得られる。
【０００５】
しかし、前述のような非特異反応に関する情報は、これらの部位からは得られず、万一偽陽性であってもそれを認識する手段がなかった。また、非特異反応を抑制する方法としては、従来、非特異反応を起こさないように添加剤やブロッキング剤、ｐＨ、粘度等にわたって研究がなされてきているが、起こってしまった非特異反応を目立たなくするような研究はなされてこなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、起こってしまった非特異反応によるサインを見かけ上小さくして、より正しい検査結果を得られる免疫クロマトグラフィー装置、及び、非特異反応が起こっていることを検出し、より正しい検査結果が得られる免疫クロマトグラフィー装置、並びに、上記免疫クロマトグラフィー装置を用いる測定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明（以下、本発明１という）は、少なくともメイン粒子及びダミー粒子からなる展開粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、上記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、上記メイン粒子は、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、上記メイン粒子を構成する不溶性担体が、上記メンブランと識別可能な色をもつものであり、上記ダミー粒子は、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであり、上記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、粒径が上記メイン粒子を構成する不溶性担体よりも大きく、免疫クロマトグラフィー装置の判定時間内に上記被測定物質判定部位に到達しない免疫クロマトグラフィー装置である。以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明１は、展開粒子としてダミー粒子を加えることによって、メイン粒子で起こる非特異反応を同様にダミー粒子で起こさせることにより、被測定物質判定部位におけるメイン粒子の非特異反応を抑制するものである。
【０００９】
本明細書において、メイン粒子とは、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体を意味するものとし、ダミー粒子とは、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体を意味するものとする。
【００１０】
上記被測定物質に対する抗体又は抗原とは、被測定物質が抗原である場合、メイン粒子に担持するものはその抗原に対する抗体を意味し、被測定物質が抗体である場合、メイン粒子に担持するものはその抗体に対する抗原を意味するものとする。
【００１１】
上記被測定物質が抗原である場合、メイン粒子に担持する抗体としては、モノクローナル抗体であってもよいし、免疫源を通常のウサギ、マウス、馬、ヤギ等の動物に接種することによって得られるポリクローナル抗体であってもよい。
上記モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、またそれらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して産生、取得できる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」岩崎辰夫ら著、講談社）。
【００１２】
上記メイン粒子及びダミー粒子に担持する免疫学的に不活性な物質は、被測定物質に対して免疫学的に不活性な物質であれば特に限定されず、例えば、免疫学的に不活性な物質であるブロッキング剤や免疫測定方法において一般に用いられる安定化剤等が挙げられる。
【００１３】
上記ブロッキングとは、被測定物質に対する抗原又は抗体をメイン粒子を構成する不溶性担体に固定化した後、更に、被測定物質に対して免疫学的に反応しないタンパク質等を不溶性担体に結合させること、及び、被測定物質に対する抗原又は抗体と同時に、被測定物質に対して免疫学的に反応しないタンパク質等を不溶性担体に結合させることである。上記ブロッキング剤としては特に限定されず、例えば、牛血清アルブミン（以下ＢＳＡともいう）、オボアルブミン、ラクトアルブミン、ゼラチン等が挙げられる。
【００１４】
上記ダミー粒子は、メイン粒子に対して被測定物質に対する抗原又は抗体を結合又は担持する処理を行うこと以外は、同一の処理を行うことが好ましい。上記ダミー粒子に対して、例えば、メイン粒子に施したのと同じブロッキング処理や熱処理を施すことにより、よりメイン粒子に起こる非特異反応をダミー粒子でも起こすことができるようになるので好ましい。即ち、メンブラン上の被測定物質判定部位における非特異反応による結合がメイン粒子で起こる場合には、同様にダミー粒子において非特異反応を起こすことが本発明１の主旨であるので、上記メイン粒子とダミー粒子に施す処理は同じであることが好ましい。
【００１５】
上記メイン粒子及びダミー粒子に用いられる不溶性担体としては特に限定されず、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン、高分子ラテックス、金属コロイド、シリカゲル；チタン、鉄、ニッケル等の金属片等が挙げられる。
上記ダミー粒子を構成する不溶性担体の材質は、上述した理由により、メイン粒子に使用される不溶性担体の材質と同種のものが好ましい。
【００１６】
上記メイン粒子又はダミー粒子を構成する不溶性担体への担持方法は、一般に使用されている方法を採用することができ、例えば、不溶性担体表面に物理的に吸着させる手法や、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結合法や共有結合法により、効率的に結合する手法が挙げられる。
【００１７】
上記メイン粒子を構成する不溶性担体は、上記メンブランと識別可能な色であれば特に限定されないが、色調の選択が豊富であり、色も濃いことから着色された高分子ラテックスが好ましい。上記色調のなかでも、黄色等はかなりの量があっても視認しにくいので、青や赤等の少量でも視認できる色が好ましい。
【００１８】
上記ダミー粒子は、少なくとも免疫クロマトグラフィー装置の判定時間内に被測定物質判定部位に到達しないものであるので、その色については何ら限定されない。上記免疫クロマトグラフィー装置の判定時間内とは、メイン粒子のうちの所定量が被測定物質判定部位に到達する時間を意味するものとし、メンブラン上で被測定物質判定部位の展開後方に設けられた検査終了判定部位の着色によっても、それを知ることができる。
【００１９】
上記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、粒径がメイン粒子を構成する不溶性担体よりも大きく、免疫クロマトグラフィー装置の判定時間内に被測定物質判定部位に到達しないものである。上記ダミー粒子の粒径は、被測定物質判定部位の位置からのメイン粒子とダミー粒子の保持（初期）位置までの距離に関係する。上記メイン粒子とダミー粒子を予め同じ位置に乾燥保持している場合には、クロマトグラフィーの原理から粒径が小さい方が粒子が移動する速度も速いので、メイン粒子をダミー粒子よりも小さくする必要がある。
【００２０】
上記メイン粒子の粒径が小さくなりすぎると、免疫反応を起こしていても発色が不充分となり識別されないおそれがあるので、高分子ラテックスを用いる場合にはメイン粒子の粒径は０．０５μｍより大きいことが好ましい。上記メイン粒子の粒径は、メンブランのポアサイズによって適宜選択されるが、０．１０〜０．５０μｍの粒径のものを使用することが多い。上記メイン粒子の粒径が小さいときは、メイン粒子と被測定物質判定部位の結合数を増やすようにすることが好ましい。
上記ダミー粒子はメンブラン上を流れない方が好ましいので、その粒径は０．４μｍよりも大きい方が好ましい。
【００２１】
上記粒径とは、特に記載がない場合は平均粒径を指すが、金コロイド等では、一般に粒度分布がブロードであり、メイン粒子とダミー粒子の粒径がその一部において逆転することもあるので、そのような場合にはメイン粒子の最大粒径よりもダミー粒子の最小粒径が大きい方が好ましい。
【００２２】
上記メイン粒子とダミー粒子の割合は、本発明１は非特異反応抑制にその主旨があるので、メイン粒子の総表面積とダミー粒子の総表面積でダミー粒子の方が少なくなりすぎなければよい。もし、非特異反応が起こったときにダミー粒子の総表面積とメイン粒子の総表面積が同じであれば、メイン粒子は通常の半分程度の抗原（又は抗体）を結合して展開するので発色が抑えられる。このことから考えて、メイン粒子の総表面積に対するダミー粒子の総表面積は、１／５〜５０倍程度が適当である。
【００２３】
請求項２記載の発明（以下、本発明２という）は、少なくともメイン粒子及びダミー粒子からなる展開粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、上記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、上記メイン粒子は、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、上記メイン粒子を構成する不溶性担体が、上記メンブランと識別可能な色をもつものであり、上記ダミー粒子は、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであり、上記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、前記メイン粒子と識別可能な色をもつものであり、更に、粒径が上記メイン粒子を構成する不溶性担体よりも小さい免疫クロマトグラフィー装置である。
【００２４】
本発明２は、粒径がメイン粒子を構成する不溶性担体よりも小さいダミー粒子を免疫クロマトグラフィー装置に加えることによって、メイン粒子で起こる非特異反応を同様にダミー粒子で起こさせることにより、被測定物質判定部位におけるメイン粒子の非特異反応を抑制するものである。
【００２５】
上記ダミー粒子は、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである。上記免疫学的に不活性な物質としては、本発明１のダミー粒子において例示したものが挙げられる。
上記メイン粒子及びダミー粒子に用いられる不溶性担体としては、本発明１で例示したものが挙げられ、なかでもメイン粒子が着色した高分子ラテックスであることが好ましい。
【００２６】
上記ダミー粒子の表面は、本発明１で説明した理由と同様の理由により、メイン粒子から被測定物質に応じた抗原又は抗体を除いた他は、処理、担持方法及び材質において同一であることが好ましい。例えば、メイン粒子に施したのと同じブロッキング処理や熱処理をダミー粒子に施してやることにより、よりメイン粒子に起こる非特異反応をダミー粒子でも起こすことができるようになる。
【００２７】
上記ダミー粒子を構成する不溶性担体の色は、メイン粒子と識別可能な色であれば、特に限定されず、メンブランと識別不可能な色であってもよい。ダミー粒子を構成する不溶性担体の色が、メイン粒子と識別可能な色である必要があるのは、もし同じ色であれば、非特異反応も特異的反応も同じ結果となって現れ、識別できなくなるからである。
【００２８】
上記ダミー粒子の粒径は、被測定物質判定部位の位置からのメイン粒子とダミー粒子の保持（初期）位置までの距離に関係する。即ち、上記メイン粒子とダミー粒子を同じ位置に乾燥保持した場合には、クロマトグラフィーの原理から粒径が小さい方が粒子が移動する速度も速いので、ダミー粒子をメイン粒子よりも小さくすれば、被検液添加後、メイン粒子よりもダミー粒子の方を早く被測定物質判定部位に到達させることができる。
【００２９】
ダミー粒子をメイン粒子よりも被測定物質判定部位に近い位置に乾燥保持している場合には、必ずしもメイン粒子よりも粒径を小さくしなければならない必要性はないが、この場合でも、ダミー粒子の粒径は、メイン粒子より小さい方が好ましい。
【００３０】
上記ダミー粒子は、具体的には、粒径（直径）においてダミー粒子がメイン粒子よりも０．０４μｍ以上小さい方が好ましい。上記粒径とは特に記載がない場合は平均粒径を指すが、金コロイド等では、一般に、粒度分布がブロードでありメイン粒子とダミー粒子の粒径がその一部において逆転することもあるので、そのような場合には、メイン粒子の最小粒径よりもダミー粒子の最大粒径が小さい方が好ましい。
【００３１】
上記メイン粒子及びダミー粒子は、粒径が小さくなれば発色も弱くなり視認しにくくなる。粒径が小さいものを用いる場合、展開粒子と被測定物質判定部位の結合数を増やすようにすることが好ましい。上記不溶性担体として高分子ラテックスを用いる場合、上記ダミー粒子の粒径は０．０３μｍ〜１．５μｍ、上記メイン粒子の粒径は０．０７μｍ〜１．７５μｍのものが好ましい。上記メイン粒子の粒径は、メンブランのポアサイズによって適宜選択されるが、０．１０〜０．５０μｍの粒径のものを使用することが多い。
【００３２】
請求項３記載の発明（以下、本発明３という）は、少なくともメイン粒子及びダミー粒子からなる展開粒子、並びに、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、上記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、上記メイン粒子は、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、上記メイン粒子を構成する不溶性担体が、上記メンブランと識別可能な色をもつものであり、上記ダミー粒子は、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであり、上記ダミー粒子を構成する不溶性担体は、上記メンブラン及び上記メイン粒子と識別可能な色をもつものであり、粒径が上記メイン粒子を構成する不溶性担体よりも小さい免疫クロマトグラフィー装置である。
【００３３】
本発明３は、メンブラン及びメイン粒子と識別可能な色であり、更に、粒径がメイン粒子を構成する不溶性担体よりも小さいダミー粒子を免疫クロマトグラフィー装置に加えることによって、非特異反応が起こっていることを検出する。
【００３４】
上記ダミー粒子を構成する不溶性担体の色は、被測定物質判定部位において非特異反応が起こっていることを知らせるために、メンブラン及びメイン粒子とは識別できる色とする。もしメイン粒子と同じ色であれば、非特異反応も特異的反応も同じ結果となって現れ、識別できなくなる。従って、例えば、メイン粒子は青色で、ダミー粒子が赤色等のように識別しやすい色であるのが好ましい。上記色調については、黄色等はかなりの量があっても視認しにくいので、青や赤等の少量でも視認できる色が好ましい。
【００３５】
上記ダミー粒子は、本発明２で説明したのと同様に、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである。上記メイン粒子及びダミー粒子に用いられる不溶性担体としては、本発明２で例示したものと同様のものが挙げられる。上記ダミー粒子の表面の処理、担持方法及び材質については、本発明２で説明したのと同様のものでよい。また、上記ダミー粒子及びメイン粒子の粒径は、本発明２で説明したのと同様の粒径でよい。
【００３６】
本発明１、２及び３の免疫クロマトグラフィー装置は、少なくとも展開粒子、及び、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成されるものであり、必要に応じて、コンジュゲートパッドや吸収パッドを装着してもよい。
【００３７】
本発明１、２及び３の免疫クロマトグラフィー装置においては、メイン粒子よりも先に、ダミー粒子と非特異反応を起こさせるように、予め、ダミー粒子を、メイン粒子より被検液添加部位に近い位置に保持してもよい。例えば、展開粒子を予め保持するコンジュゲートパッドを装着する場合においては、コンジュゲートパッド内のうち、被検液添加部位に近い部分にダミー粒子を保持し、被検液添加部位から遠い部分にメイン粒子を保持させてもよい。また、コンジュゲートパッドに加えて、吸収パッドを装着する場合、被検液添加部位に近い吸収パッドにダミー粒子を保持し、被検液添加部位から遠いコンジュゲートパッドにメイン粒子を保持させてもよい。
【００３８】
請求項５記載の発明（以下、本発明４という）は、少なくとも展開粒子を予め保持するコンジュゲートパッド、及び、被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、上記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、上記展開粒子は、メイン粒子からなり、上記メイン粒子は、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、上記メイン粒子を構成する不溶性担体が、上記メンブランと識別可能な色をもつものであり、上記コンジュゲートパッドは、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである免疫クロマトグラフィー装置である。
【００３９】
本発明４は、被検液中にある変性を起こさせる物質を、メイン粒子と同様の免疫学的に不活性な物質を結合したコンジュゲートパッドにより吸収させることにより非特異反応を抑制するものである。
【００４０】
上記メイン粒子を構成する不溶性担体としては、本発明１で例示したものが挙げられ、なかでも着色した高分子ラテックスが好ましい。
上記メイン粒子の粒径は、本発明１のメイン粒子の粒径で説明した理由と同様の理由から、０．０５μｍより大きいことが好ましい。
【００４１】
上記コンジュゲートパッドとしては、展開粒子を予め乾燥担持できるものであれば特に限定されず、通常免疫クロマトグラフィー装置に使用される不織布等の多孔性ポリマーが挙げられる。
上記コンジュゲートパッドは、上記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである。上記免疫学的に不活性な物質としては、本発明１で説明したダミー粒子において例示したものと同様のものが挙げられる。
【００４２】
上記コンジュゲートパッドの表面は、メイン粒子に対して被測定物質に対する抗原又は抗体を担持する処理をすること以外は、メイン粒子に施した処理と同一であることが好ましい。例えば、メイン粒子に施したのと同じブロッキング処理や熱処理をコンジュゲートパッドに施してやることにより、よりメイン粒子に起こる非特異反応をコンジュゲートパッドでも起こすことができるようになる。即ち、メンブラン上の被測定物質判定部位において非特異反応による結合が、メイン粒子で起こる場合には、前もってコンジュゲートパッドが非特異反応を起こすようにすることが好ましい。
【００４３】
本発明４においては、メイン粒子よりも先に免疫学的に不活性な物質と非特異反応を起こさせるように、予め、コンジュゲートパッド内において、免疫学的に不活性な物質が、メイン粒子を保持させた位置よりも被検液添加部位に近い位置に担持されていてもよい。
【００４４】
請求項７記載の発明（以下、本発明５という）は、少なくとも展開粒子を予め保持するコンジュゲートパッド、被測定物質判定部位が設けられたメンブラン、及び、吸収パッドから構成される免疫クロマトグラフィー装置であって、前記展開粒子は、被検液によってメンブランを移動するものであり、前記展開粒子は、メイン粒子からなり、前記メイン粒子は、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持し、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持した不溶性担体から構成されるものであって、前記メイン粒子を構成する不溶性担体が、前記メンブランと識別可能な色をもつものであり、前記吸収パッドは、前記被測定物質に対する抗体又は抗原を担持しておらず、かつ、免疫学的に不活性な物質を担持したものである免疫クロマトグラフィー装置である。
【００４５】
本発明５は、被検液中にある変性を起こさせる物質を、メイン粒子と同様の免疫学的に不活性な物質を担持した吸収パッドにより吸収させることにより非特異反応を抑制するものである。
【００４６】
上記メイン粒子を構成する不溶性担体としては、本発明４で例示したものと同様のものが挙げられる。
また、上記コンジュゲートパッドとしては、本発明４で例示したものと同様のものが挙げられる。
【００４７】
上記吸収パッドは、検体液を添加、吸収するためのものであり、毛細管現象により被検液を吸収し、メンブランへと移動せしめる不活性材質であれば特に限定されず、例えば、濾紙、ガラス繊維シート、メンブランフィルターシート等が挙げられる。
【００４８】
本発明１〜５の免疫クロマトグラフィー装置は、少なくとも、展開粒子及び被測定物質判定部位が設けられたメンブランから構成され、さらに、本発明４では、コンジュゲートパッドを、本発明５では、コンジュゲートパッド及び吸収パッドを設けたものである。なお、本発明１〜３についても、コンジュゲートパッド及び／又は吸収パッドを、本発明４についても、吸収パッドを設けてもよい。
【００４９】
上記メンブランとしては、毛細管現象を起こす作用を有し、かつ、展開粒子と被測定物質との複合体が被検液によってすみやかに拡散、移動できるようなものであれば特に限定されず、例えば、ガラス繊維状のシート、濾紙、ナイロンシート、ニトロセルロースシート等が挙げられる。なかでもニトロセルロースシートが好ましい。
【００５０】
上記メンブランは、展開粒子と被測定物質との複合体が免疫クロマトグラフの展開液としても働く被検液等によって移動し、メンブラン上の被測定物質判定部位において抗原抗体反応を生じて着色する。
【００５１】
上記被測定物質判定部位は、任意に選んだ一定のゾーンに、被測定物質に対する抗原又は抗体（第二抗原又は抗体）を塗布又はスプレーで散布し、固相化する。上記被測定物質判定部位は、被測定物質が複数種類あれば、被測定物質の種類に応じて、位置の異なった部位を複数種類用意する。
【００５２】
上記メンブランは、抗原又は抗体を塗布した後、室温放置、又は、必要に応じて３０〜５０℃の熱風による乾燥若しくは真空乾燥等により乾燥させ、抗原又は抗体を固相化したゾーン以外の領域を不活性化するために、被測定物質に対して不活性な物質によってマスキングすることが通常行われる。上記マスキング剤としては、生理食塩水に０．２％を溶解したカゼイン溶液、１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）等が挙げられ、使用する抗原又は抗体、メンブランの性質によって、その都度適切なマスキング剤を選択する。
【００５３】
上記展開粒子としては、被測定物質が複数種類ある場合には、被測定物質に対する抗体又は抗原をそれぞれ担持したメイン粒子を被測定物質の種類に応じて複数種類用意する。
上記被測定物質が複数種類ある場合、各メイン粒子の色は、識別し易さの点から、それぞれ識別可能な色であることが好ましい。
【００５４】
本発明において、被測定物質としては生体試料中に含まれる生理活性物質であり、抗原抗体反応を利用して測定し得る物質であれば特に限定されず、例えば、タンパク質、糖タンパク質、脂質タンパク質、レセプター、酵素、ウイルス抗原・抗体等が挙げられ、具体的には、ヘモグロビン、ＣＲＰ、ヒトフィブリノーゲン、リウマチ因子、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ）、ＨＢｓ抗原、フェリチン、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体等が挙げられる。
【００５５】
上記被検液としては、本発明の免疫クロマトグラフィーにおいて展開液として働くものであれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、尿等の生体試料；上記被測定物質を溶解した緩衝液等が挙げられる。上記被検液が陽性の場合、被検液は被測定物質を含むものである。
【００５６】
上記展開粒子として、合成高分子標識着色ラテックス粒子を用いる場合、その調製法及び保持方法について具体的に説明する。
各々の色調を有する別々のラテックス粒子にそれぞれ複数の抗原又は抗体を担持するにあたっては、例えば、赤色のラテックス粒子には第１の抗原又は抗体、青色のラテックス粒子には第２の抗原又は抗体、更に黄色又は緑色のラテックス粒子には第３、第４の抗原又は抗体をそれぞれ個別に担持しておく。上記担持方法は本発明１において例示した方法が挙げられ、一般にはラテックス粒子と担持する物質を室温にて約１時間混和することによって達成できる。その後、各々担持した着色ラテックス粒子を個別に遠心分離等の方法又はミリポアフィルターによる吸引濾過法によって集め、通常使用されている緩衝液、例えば、リン酸緩衝液等でよく洗浄後、ブロッキング剤で各々の標識ラテックス粒子を個別にブロッキングしておく。
【００５７】
上記ブロッキング剤は、上記マスキング剤として使用したものと同様のものでよい。上記ブロッキング剤の選択は、担持に使用した抗原又は抗体及びメンブランの性質によって、その都度、適格か否かを判断する必要がある。このようにして、各々、個別に担持した着色ラテックス粒子を保存液に貯えておく。
【００５８】
上記展開粒子にダミー粒子を含む場合、ダミー粒子を調製する方法は、被測定物質に対する抗体又は抗原を担持せずに、数種類あるメイン粒子上の不活性物質の種類に応じて、同種の不活性物質を担持し、保存液に貯えておくことができる。
【００５９】
上記各々のラテックス粒子を保存した液よリ一定量ずつ取り出し、よく混和後、よく洗浄してコンジュゲートパッドに含浸させて凍結乾燥を行う。これをメンブランに装着することによって本発明の検出可能な試験片が完成する。
【００６０】
上記メンブランへの装着については特に限定されず、両面テープ、片面テープ等で固定することができ、ラテックス粒子を直接メンブランへ塗布する方法等も利用することができる。上記装着する位置については免疫クロマトグラフィーの展開方法によって定まるもので、例えば展開が上昇法の場合には下端部に、下降法の場合には上端に、水平方式の場合には両端部のどちらか一方に、円形方式の場合には同心円の中心部分に装着する。
【００６１】
上記展開粒子を保持しているコンジュゲートパッドには、更に、検体液を添加、吸収するための吸収パッドを装着することができる。上記吸収パッドとしては、本発明５で説明したのと同様のものを用いることができる。
【００６２】
上記メンブランには、被測定物質検出部位よりも展開後方に位置し、被測定物質を介さずにメイン粒子を捕捉する検査終了判定部位を設けることもできる。上記メンブランの検査終了判定部位の後方には、更に、メンブランを展開してきた液体を吸収し、展開速度を速める働きをする濾紙等の吸収パッドを設けることが好ましい。
【００６３】
請求項１１記載の発明（以下、本発明６という）は、免疫クロマトグラフィーによる被測定物質の測定方法であって、本発明１〜５の免疫クロマトグラフィー装置に、上記被検液を添加することからなる測定方法である。
【００６４】
上記被検液を添加する方法としては、本発明１〜５の免疫クロマトグラフィー装置において記載したように、例えば、免疫クロマトグラフィー装置の吸収パッドに添加、吸収させる方法等が挙げられる。
【００６５】
本発明６は、本発明１もしくは２のダミー粒子、本発明４のコンジュゲートパッド又は本発明５の吸収パッドを免疫クロマトグラフィー測定系に加えることにより、万一、メイン粒子上の免疫学的に不活性な物質が被検液である尿や血液のある成分によって変性を起こし、メイン粒子とメンブラン上の被測定物質判定部位が非特異的な吸着を起こすようになったときに、ダミー粒子やパッドが非特異反応を抑制することができる。また、本発明３のダミー粒子を免疫クロマトグラフィー測定系に加えることにより、ダミー粒子が被測定物質判定部位に到着してメイン粒子と異なる色で発色することにより非特異反応が起こっていることを知らしめることができる。
【００６６】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１  ヒトヘモグロビンの測定
（１）メンブランＥの作製
ハイフローＴＭメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５ｍｍ×４０ｍｍに裁断したものを作り、その上端より１０ｍｍの位置に抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍＬ（日本バイオテスト社製）をエアーブラシ（オリンポス社製）を用いて塗布し抗ヒトヘモグロビン抗体のライン（被測定物質検出部位）を作製した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸生理食塩液）に３７°Ｃで２時間浸漬し、充分マスキングを行った。その後、充分に乾燥し抗体を固相化したメンブランＥを作製した。
【００６７】
（２）ブルーラテックス標識ヒトヘモグロビン抗体（メイン粒子）の作製
ブルーラテックス粒子分散液（カラーラテックスＣ−３００Ｂ、濃度１０％、粒径３００ｎｍ、積水化学工業社製）３００μＬにＰＢＳ１．２ｍＬを加え１５，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行った。沈査に抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）（日本バイオテスト社製）１ｍＬを加え、充分混和して、室温１時間反応を行った。未反応の抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体を除去するため、１５，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行い、沈査をＰＢＳ１．５ｍＬで懸濁させ再度遠心分離を行った。４％ブロックエース（明治乳業社製）１ｍＬを加え、室温６０分間反応させてブロッキングを行った。その後、１５，０００ｒｐｍ５分間遠心分離を行い、沈査を１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１．５ｍＬに懸濁させ、冷蔵保存した。
【００６８】
（３）ラテックス粒子（ダミー粒子）の作製
ラテックス粒子分散液（ラテックスＣ−６５０、濃度１０％、粒径６５０ｎｍ、積水化学工業社製）と４％ブロックエース（明治乳業社製）を用いて、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を加えない他は（２）と同様な操作で調整した。但し、粒径が大きいので、遠心分離の条件は、１２，０００ｒｐｍ、２０分間とした。
【００６９】
（４）コンジュゲートパッドＢの作製
上記（２）及び（３）で作製したメイン粒子及びダミー粒子をベンリーゼＴＭ不織布（旭化成社製、５ｍｍ×１０ｍｍ）にそれぞれ１０μＬ含浸させ凍結乾燥して調製した。
【００７０】
（５）キットの作製
上記（４）で調製したメイン粒子及びダミー粒子を含有したコンジュゲートパッドＢの下端５ｍｍを抗ヒトヘモグロビン抗体塗布メンブランＥの上端と重ね、テープで固定した。次に、該メンプランＥの下端と吸収パッドＨ（Ｎｏ．５２６、アドバンテック東洋社製５ｍｍ×１５ｍｍ）を５ｍｍ重ねテープで固定した。上記コンジュゲートパッドＢの上端から５ｍｍを吸収パッドＡ（Ｎｏ．５２６、アドバンテック東洋社製５ｍｍ×３０ｍｍ）と重なるようにテープで固定した。このクロマトグラフィーを、被検液が添加できるように吸収パッドＡの先端２０ｍｍを露出し、また、被測定物質判定部位が視認できるようにして、残りの部分をハウジングＩで覆いキットとした。
【００７１】
（６）ヒト血清を用いた反応性試験
ヒト血清を被検液として吸収パッドＡに充分添加し、被測定物質判定部位の発色を目視で確認した。なお、検体１、５、６及び１０は完全なヘモグロビン陰性検体、検体４及び９は完全なヘモグロビン陽性検体、検体２及び７は非特異も起こすヘモグロビン陰性検体、並びに、検体３及び８は非特異も起こすヘモグロビン陽性検体である。結果を表１に示した。
【００７２】
比較例１
実施例１からダミー粒子を除いた他は同様に作製し、実施例１と同一検体の測定を行った。結果を表１に示した。
【００７３】
比較例２
従来技術としてイムノクロマト法よりもより精度が高いとされるＥＩＡ法を用いて同一検体の測定を行った。結果を表１に示した。
【００７４】
【表１】
0003691971.tif 000002
【００７５】
実施例２  ＨＢｓ抗体の測定
（１）メンブランの作製
ハイフローＴＭメンブレン（ＳＲＨＦ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５ｍｍ×４０ｍｍに裁断したものを作り、その上端より１０ｍｍの位置に、ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液を５０μＬエアーブラシ（オリンポス社製）を用いて塗布し、ＨＢｓ抗原のライン（被測定物質検出部位）を作製した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸生理食塩液）に３７℃で２時間浸漬し、充分マスキングを行った。その後、充分に乾燥し抗体を固相化したメンブランＥを作製した。
【００７６】
（２）ブルーラテックス粒子標識ヒトヘモグロビン抗体（メイン粒子）の作製
ブルーラテックス粒子分散液（カラーラテックスＣ−３００Ｂ、濃度１０％、粒径３００ｎｍ、積水化学工業社製）１．０ｍＬにリン酸−食塩緩衝液（０．０３６Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．６、０．１Ｍ−ＮａＣｌ）６．５ｍＬを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡ１．０重量％含有するＰＢＳ１５ｍＬを添加し、３７℃にて６０分間攪拌した後１５，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行った。沈査にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳ１００ｍＬを添加し、ラテックスを充分攪拌懸濁させてメイン粒子懸濁液を作製し、冷蔵保存した。
【００７７】
（３）ラテックス粒子（ダミー粒子）の作製
ＢＳＡを２重量％濃度でＰＢＳに溶解した液１０．０ｍＬとリン酸−食塩緩衝液（ｐＨ６．６、０．１Ｍ−ＮａＣｌ）９．０ｍＬにラテックス粒子分散液（ラテックスＣ−６５０、濃度１０％、粒径６５０ｎｍ、積水化学工業社製）１．０ｍＬを添加し、３７℃にて６０分間攪拌した。その後、１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離を行い、得られた沈査にＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳ５００ｍＬを添加し、ラテックスを充分攪拌懸濁させてダミー粒子懸濁液を作製し、冷蔵保存した。
【００７８】
（４）コンジュゲートパッドＢの作製
上記で作製したメイン粒子及びダミー粒子を、ベンリーゼＴＭ不織布（旭化成社製５ｍｍ×１０ｍｍ）にそれぞれ１０μＬ含浸させ凍結乾燥して調製した。
【００７９】
（５）キットの作製
上記（４）で調製したメイン粒子・ダミー粒子を含有したコンジュゲートパッドＢの下端５ｍｍを、ＨＢｓ抗原塗布メンブランＥの上端と重ねテープで固定した。次に、該メンブランＥの下端と吸収パッドＨ（Ｎｏ．５２６、アドバンテック東洋社製５ｍｍ×１５ｍｍ）を５ｍｍ重ねテープで固定した。コンジュゲートパッドＢの上端から５ｍｍを吸収パッドＡ（Ｎｏ．５２６、アドバンテック東洋社製５ｍｍ×３０ｍｍ）と重なるようにテープで固定した。このクロマトグラフィーを、被検液が添加できるように吸収パッドＡの先端２０ｍｍを露出し、また、被測定物質判定部位が視認できるようにして残りの部分をハウジングＩで覆い、キットとした。
【００８０】
（６）ヒト血清を用いた反応性試験
ヒト血清を被検液として吸収パッドＡに充分添加し、被測定物質判定部位の発色を目視で確認した。なお、検体１１、１５、１６及び２０は完全なＨＢｓ抗体陰性検体、検体１４及び１９は完全なＨＢｓ抗体陽性検体、検体１２及び１７は非特異も起こすＨＢｓ抗体陰性検体、並びに、検体１３及び１８は非特異も起こすＨＢｓ抗体陽性検体である。結果を表２に示した。
【００８１】
比較例３
実施例２からダミー粒子を除いた他は同様に作製し、実施例２と同一検体の測定を行った。結果を表２に示した。
【００８２】
比較例４
従来技術としてイムノクロマト法よりもより精度が高いとされるＥＩＡ法を用いて同一検体の測定を行った。結果を表２に示した。
【００８３】
【表２】
0003691971.tif 000003
【００８４】
実施例３  ヒトヘモグロビンの測定
実施例１中の（３）ラテックス粒子（ダミー粒子）の作製において、ラテックス粒子分散液としてレッドラテックス粒子分散液（カラーラテックスＣ−１２０Ｒ、濃度１０％、粒径１２０ｎｍ、積水化学工業社製）を用い、遠心分離の条件として、粒径が小さいので１８，０００ｒｐｍ、３０分間としたこと以外は、実施例１と同様にしてレッドラテックス粒子（ダミー粒子）を作製して、キットを作製した後、ヒト血清を用いた反応性試験を行った。結果を表３に示した。
【００８５】
【表３】
0003691971.tif 000004
【００８６】
実施例４  ＨＢｓ抗体の測定
実施例２中の（３）ラテックス粒子（ダミー粒子）の作製において、ラテックス粒子分散液としてレッドラテックス粒子分散液（カラーラテックスＣ−１２０Ｒ、濃度１０％、粒径１２０ｎｍ、積水化学工業社製）を用い、遠心分離の条件として、１８，０００ｒｐｍ、３０分間としたこと以外は、実施例２と同様にしてレッドラテックス粒子（ダミー粒子）を作製して、キットを作製した後、ヒト血清を用いた反応性試験を行った。結果を表４に示した。
【００８７】
【表４】
0003691971.tif 000005
【００８８】
【発明の効果】
本発明１、２、４及び５の免疫クロマトグラフィー並びにそれを利用した測定方法は、上述の構成よりなるので、従来のメイン粒子と被測定物質判定部位で非特異反応による結合が起こる場合でも、ダミー粒子、コンジュゲートパッドまたは吸収パッドが先に結合を起こして免疫不活性物質とメイン粒子の結合を妨げるため、被測定物質判定部位ではメイン粒子による非特異反応が抑制されて、誤って陽性の診断結果を出すことが無くなる。また、本発明３の免疫クロマトグラフィー及びそれを利用した測定方法は、万一、メイン粒子と被測定物質判定部位で非特異反応による結合が起こる場合でも、ダミー粒子が先に非特異反応を起こし被測定物質判定部位で捕捉されてメイン粒子とは異なる色に発色することから診断が正確に行われなかったことが視認でき、非特異反応が起こっていることを簡単に識別できる。