(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）式で表されるＭＫ７９２４。
【化１】
0003608210.tif 000006
【請求項２】
コロノフォラ（Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ）属に属するＭＫ７９２４生産菌を培養し、その培養物から請求項１記載のＭＫ７９２４を採取することを特徴とするＭＫ７９２４の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規な化合物であるＭＫ７９２４およびその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および本発明が解決しようとする課題】
従来、微生物が生産する駆虫薬としてアベルメクチン〔アンチミクロバイアル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピイ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）第１５巻、第３６１頁（１９７９年）〕およびハイグロマイシンＢ〔ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）第８０巻、第２７１４頁（１９５８年）〕等がすでに実用化されている。その後も微生物由来駆虫薬の探索が続けられているが、実用性を有するものはほとんどアベルメクチン類、またはハイグロマイシン類に分類されるのが現状であり、上記２物質とまったく異なるタイプの化合物は僅少である。また、これらのアベルメクチン類、ハイグロマイシン類には、毒性が比較的強い等の問題があった。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは殺線虫活性を指標として駆虫活性物質を探索した結果、落葉落枝より分離されたコロノフォラ  グリガリア（Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）Ｌ２４９５株の培養物中に新規な殺線虫活性物質を見出だし、本発明を完成するに至った。
【０００４】
すなわち、本発明の要旨は、（Ｉ）式で表される新規物質ＭＫ７９２４およびその製造法に存する。
以下、本発明につき詳細に説明する。
本発明の新規物質（以下「ＭＫ７９２４」と略記する）は、例えばＭＫ７９２４を生産する能力を有するコロノフォラ（Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ）属に属する微生物の培養液から採取することができる。かかる微生物としては、コロノフォラ属に属し、ＭＫ７９２４を生産する能力を有するものであれば特に制限はされない。
【０００５】
具体的には、本発明者らが落葉落枝より分離し、工業技術院生命工学工業技術研究所に生命研菌寄第１３９０５号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３９０５）として寄託されているコロノフォラ  グリガリア（Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）Ｌ２４９５株（以下「本菌株」と略記することがある）が挙げられる。本菌株の微生物学的性状は以下のとおりである。
【０００６】
Ｉ．形態学的特徴
子嚢殻は宿主植物体上に散在あるいは群生する、はじめ植物樹皮下に埋没して生じ、のちに樹皮を破り乳頭状に突出した頸部を生じる、球形〜亜球形、直径１〜２．８ｍｍに至る、子座を有さず。頸部は孔口内壁に無色のペリフィシスを有する。子嚢殻の殻壁は厚さ１４０〜１９０μｍ、５〜９層の多角形細胞から成り、外側は黒褐色で厚膜、内側は淡褐色、薄膜となる。子嚢は多数生じ、棍棒型、長い柄を有す、（１４６〜１７０）×（１５〜２０）μｍ、頂端は丸く、一重壁を有す、多胞子性（ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）。子嚢胞子はウインナソーセージ形、（９〜１１．８）×（２．５〜３．０）μｍ、一細胞性、無色、平滑。
【０００７】
ＩＩ．各種培地上における培養上の特徴
▲１▼ジャガイモ・ブドウ糖寒天培地（ＰＤＡ）上、２７℃、７日間の培養
コロニーは７日間で直径７ｃｍに拡がる、コロニー色調ははじめ白色、のちに中央部で黄味がかった白色を呈する、基底菌糸は放射状に伸長し、分枝する、巾２．８〜６．６μｍ、隔壁を有する。気生菌糸は豊富に形成される。ＰＤＡ培地上ではアナモルフおよびテレオモルフは観察されなかった。
▲２▼麦芽寒天培地（ＭＡ）上、２７℃、７日間の培養
コロニーは７日間で直径６．５ｃｍに拡がる、コロニー色調ははじめ白色、のちに明るい茶灰色となる、基底菌糸は放射状に伸長し、分枝する、巾２．５〜８．５μｍ、隔壁を有する。気生菌糸は豊富に形成される。ＭＡ培地上ではアナモルフおよびテレオモルフは観察されなかった。
【０００８】
ＩＩＩ  ．生理学的性質
▲１▼最適生育条件
・最適ｐＨ；６（ＬＣＡ液体培地中、７日間培養）
・最適温度；２７℃（ＰＤＡ培地上、７日間培養）
▲２▼生育の範囲
・ｐＨ範囲；ｐＨ４〜９（ＬＣＡ液体培地中、７日間培養）
・温度範囲；１５〜３０℃、１０℃および３７℃では生育不可。（ＰＤＡ培地上、７日間培養）
【０００９】
ＩＶ．分類学的考察
本菌株（Ｌ２４９５）は１）樹木の樹皮上に大型の子実体を形成する、２）子実体は菌糸マットと呼ばれる子座（ｓｔｒｏｍａ）を持たない、３）子嚢は一重壁構造である、４）子嚢胞子は多胞子性（ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）である特徴を有す。特に多胞子性の子嚢胞子を有することは本菌株（Ｌ２４９５）の顕著な特徴の一つであり、Ｍｕｎｋ（１９５７）の“Ｄａｎｉｓｈ  Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ”およびＤｅｎｎｉｓ（１９６８）の“Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ”に示される検索表によって属の検索を行ったところ、上記性状を有する菌群としてバルセラ（Ｖａｌｓｅｌｌａ）属、デイアトリペーラ（Ｄｉａｔｒｉｐｅｌｌａ）属、カロスファエリア（Ｃａｌｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ディトペイラ（Ｄｉｔｏｐｅｌｌａ）属、コロノフォラ（Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ）属の５属が挙げられた。しかし、前者４属は子嚢殻が子座によって囲まれる特徴を有すことから、明らかに本菌株とは区別された。本菌株はコロノフォラ属の特徴によく合致した。本菌株は子嚢菌亜門−核菌網−Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａｌｅｓ−Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａｃｅａｅ−Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ属に帰属する。
【００１０】
Ｍｕｎｋの“Ｄａｎｉｓｈ  Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ”  ｐｐ２８９〜ｐｐ２９２によれば、コロノフォラ属には４種が知られている（コロノフォラ  グリガリア（Ｃ．ｇｒｅｇａｒｉａ）、コロノフォラ  アンガスタータ（Ｃ．ａｎｇｕｓｔａｔａ）、コロノフォラ  アネクサ（Ｃ．ａｎｎｅｘａ）、コロノフォラ  オビパーラ（Ｃ．ｏｖｉｐａｒａ））。これらの種は子実体の大きさ、子嚢の大きさ、子嚢胞子の形態によって識別されている（表１参照）。本菌株の形態的性状はコロノフォラ  グリガリアにほぼ一致した。本菌株の子嚢胞子がコロノフォラ  グリガリアに比べてやや大きめである点に疑問はあるが、このような差異は種内における変異と考えられる。従って本菌株（Ｌ２４９５）はコロノフォラ  グリガリア（Ｃｏｒｏｎｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｒｉａ）Ｌ２４９５と同定した。
【００１１】
【表１】
0003608210.tif 000002
【００１２】
本菌株は、他の菌類に見られるようにその性状が変化しやすい。例えば、本菌株に由来する突然変異株（自然発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換え体であっても、ＭＫ７９２４物質を生産するものは全て本発明に使用できる。
【００１３】
本発明のＭＫ７９２４物質は、コロノフォラ属に属するＭＫ７９２４物質生産菌を、例えば米を培地とした固体培養にて培養することにより得ることができる。このとき、米の他に玄米、麦、ひえ、粟、とうもろこし等の雑穀類や、ポテトデキストロース寒天なども使用することができる。また、通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する液体培地で培養することも可能である。このときの炭素源としては、グルコース、水飴、デキストリン、シュークロース、デンプン、糖蜜、動植物油等が利用でき、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、魚粕、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、その他の無機窒素源、例えばアンモニウム塩等が用いられる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、およびその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加しても差し支えない。また菌の発育を助け、ＭＫ７９２４物質の生産を促進するような有機および無機物も、必要に応じて適宜添加することができる。
【００１４】
培養は、例えば好気または嫌気的条件下、好ましくは好気的条件下で静置的に行われる。培養に適当な温度は１５〜３０℃であり、好ましくは２５〜２７℃である。ＭＫ７９２４物質の生産は培地や培養条件により異なるが、通常１０〜１４日間でその蓄積量が最大に達する。従って、培養中のＭＫ７９２４物質の蓄積量が最大になったときに培養を停止し、培養液から目的とする物質を単離・精製する。
【００１５】
本発明のＭＫ７９２４物質を培養物から単離・精製するには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマトグラフィー法、ゲルろ過法、透析法、沈澱法等を単独、あるいは適宜組合わせて使用する。例えば培養液中に蓄積されたＭＫ７９２４物質は、水と混ざらない有機溶媒、例えば酢酸エチル、ブタノール等で抽出すると、有機溶媒層に抽出される。またＭＫ７９２４物質は、培養菌体中からはアセトン−水、メタノール−水、酢酸エチル等で抽出することができる。ＭＫ７９２４物質を更に精製するには、シリカゲル、アルミナ、各種合成吸着剤等を用いるカラムクロマトグラフィーを行うのがよい。
以上のような方法により得られたＭＫ７９２４は無色の粉末で以下の性状を有し、優れた殺線虫活性を示す。
【００１６】
0003608210.tif 000003
【００１７】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例によって限定されるものではない。
【００１８】
製造例１
１）培養
米６０ｇ、水６０ｍｌを三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間高圧滅菌した。ついでコロノフォラ  グリガリアＬ２４９５を５白金耳づつ植菌し、２６℃で１４日間静置培養した。
【００１９】
２）精製
上記１）で得られた培養菌体に５０％アセトン水溶液０．７リットルを添加、撹拌した後、遠心分離して菌体アセトン抽出液を得た。この抽出液を減圧下で０．３５リットルまで濃縮後、合成吸着剤ＨＰ−２０（三菱化成社製）に吸着させ、１００％メタノールで溶出させた。この１００％メタノール溶出画分を減圧下で濃縮し、茶褐色の油状物を得た。ついでこの油状物をクロロフォルム／メタノール＝２０／１で平衡化させたシリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  １００Ｍｅｒｋ）に付し、ステップワイズでメタノールの比率を増加させた。本物質はクロロフォルム／メタノール＝７／３溶出画分に含まれていた。このクロロフォルム／メタノール＝７／３溶出画分を減圧下で濃縮し、黄褐色油状物５００ｍｇを得た。この黄褐色油状物を４０ｍｌの蒸留水に懸濁後、４０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を取り、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下で濃縮したところ、黄褐色油状物３００ｍｇを得た。ついでこの油状物を３ｍｌのメタノールに溶解し、４℃で一昼夜放置したところ、白色沈殿が析出した。この白色沈殿を除いた上清を減圧下で濃縮し、溶媒を蒸発させたところ、約２００ｍｇの黄白色物質が得られた。この黄白色物質を少量のアセトニトリルに溶解し、逆相カラム（ＭＣｌ−ＧＥＬ  ＯＤＳ  ｌＨＵ  １０φ×３０ｍｍ  三菱化成社製）を用いた高速分取液体クロマトグラフィーにより精製し、純度９８％以上のＭＫ７９２４物質約１５０ｍｇを得た。得られたＭＫ７９２４物質の紫外吸収、赤外吸収、  １Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ，およびマスの各スペクトルの測定結果は次のとおりであった。
【００２０】
【表２】
0003608210.tif 000004
【００２１】
試験例１
土壌自活性線虫カエノルハブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を用いた殺線虫活性試験
土壌自活性線虫カエノルハブディティス  エレガンスを滅菌水に懸濁し、これにアッセイに供するサンプルを加えた後、２０℃で線虫を飼育し、その運動性を観察してサンプルの殺線虫活性を評価した。
【００２２】
ポジテイブコントロールにはアベルメクチン１００ｐｐｍ，ハイグロマイシンＢ１００ｐｐｍを用い、−、±、＋、＋＋、＋＋＋の５段階評価で殺線虫活性を評価した。
以下に本物質を評価した結果を示す。
【００２３】
【表３】
0003608210.tif 000005
【００２４】
【発明の効果】
本発明のＭＫ７９２４物質は殺線虫活性を有しており、駆虫薬としての有用性が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＫ７９２４物質のメタノール溶液中で測定した紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図２】ＭＫ７９２４物質の臭化カリ錠法における赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図３】ＭＫ７９２４物質の重メタノール中で測定した５００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】ＭＫ７９２４物質の重メタノール中で測定した５００ＭＨｚ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
0003608210.tif 000007
【図２】
0003608210.tif 000008
【図３】
0003608210.tif 000009
【図４】
0003608210.tif 000010