(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
3−ヒドロキシアルカン酸ユニット（ただし3−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットまたは3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニットを除く）を含有するポリヒドロキシアルカノエートが粒状体である基材の少なくとも一部を被覆していることを特徴とする構造体。
【請求項２】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［１］から化学式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１に記載の構造体。
【化１】
0003684175.tif 000037
（ただし、該モノマーユニットは、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。R1が水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1がハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1がカルボキシル基あるいはその塩でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【化２】
0003684175.tif 000038
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【化３】
0003684175.tif 000039
（ただし、式中bは0から7の整数のいずれかを表し、R2は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化４】
0003684175.tif 000040
（ただし、式中cは1から8の整数のいずれかを表し、R3は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化５】
0003684175.tif 000041
（ただし、式中dは0から7の整数のいずれかを表し、R4は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化６】
0003684175.tif 000042
（ただし、式中eは１から８の整数のいずれかを表し、R5は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5，−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化７】
0003684175.tif 000043
（ただし、式中fは0から7の整数のいずれかを表す。）
【化８】
0003684175.tif 000044
（ただし、式中ｇは1から8の整数のいずれかを表す。）
【化９】
0003684175.tif 000045
（ただし、式中hは１から７の整数のいずれかを表し、R6は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2，−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【化１０】
0003684175.tif 000046
（ただし、式中iは１から７の整数のいずれかを表し、R７は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【化１１】
0003684175.tif 000047
（ただし、式中jは１から９の整数のいずれかを表す。）
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の構造体。
【請求項４】
前記の化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートが、少なくともグラフト鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項３に記載の構造体。
【請求項５】
前記グラフト鎖が、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの化学修飾によるグラフト鎖であることを特徴とする、請求項４に記載の構造体。
【請求項６】
前記グラフト鎖が、アミノ基を有する化合物のグラフト鎖であることを特徴とする、請求項４または請求項５に記載の構造体。
【請求項７】
前記のアミノ基を有する化合物が、末端アミノ変性化合物であることを特徴とする、請求項６に記載の構造体。
【請求項８】
前記末端アミノ変性化合物が、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つであることを特徴とする、請求項７に記載の構造体。
【請求項９】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項３に記載の構造体。
【請求項１０】
前記の架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートが架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項９に記載の構造体。
【請求項１１】
前記の架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、ジアミン化合物、無水コハク酸、２−エチル−４−メチルイミダゾール、電子線照射からなる群より選択される少なくとも一つにより架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の構造体。
【請求項１２】
前記ジアミン化合物が、ヘキサメチレンジアミンであることを特徴とする、請求項１１に記載の構造体。
【請求項１３】
前記基材が着色剤を含有していることを特徴とする、請求項１に記載の構造体。
【請求項１４】
前記着色剤が顔料であることを特徴とする、請求項１３に記載の構造体。
【請求項１５】
前記着色剤が染料であることを特徴とする、請求項１３に記載の構造体。
【請求項１６】
前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記構造体の内側から外側に向かう方向において変化していることを特徴とする請求項１３から１５のいずれかに記載の構造体。
【請求項１７】
前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記構造体の表面に対して垂直方向に変化していることを特徴とする請求項１６に記載の構造体。
【請求項１８】
前記基材にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が固定されていることを特徴とする請求項１から請求項１７のいずれかに記載の構造体。
【請求項１９】
中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を基材表面に固定し、該酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することにより、前記基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする構造体の製造方法。
【請求項２０】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［１］から化学式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートであり、前記ユニットのそれぞれに対して対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが順に化学式［１１］から化学式［２０］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａである、請求項１９に記載の構造体の製造方法。
【化１２】
0003684175.tif 000048
（ただし、該モノマーユニットは、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。R1が水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1がハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が カルボキシル基あるいはその塩でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【化１３】
0003684175.tif 000049
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【化１４】
0003684175.tif 000050
（ただし、式中bは0から7の整数のいずれかを表し、R2は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化１５】
0003684175.tif 000051
（ただし、式中cは1から8の整数のいずれかを表し、R3は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化１６】
0003684175.tif 000052
（ただし、式中dは0から7の整数のいずれかを表し、R4は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化１７】
0003684175.tif 000053
（ただし、式中eは1から8の整数のいずれかを表し、R5は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5，−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化１８】
0003684175.tif 000054
（ただし、式中fは0から7の整数のいずれかを表す。）
【化１９】
0003684175.tif 000055
（ただし、式中ｇは1から8の整数のいずれかを表す。）
【化２０】
0003684175.tif 000056
（ただし、式中hは1から7の整数のいずれかを表し、R6は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2，−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【化２１】
0003684175.tif 000057
（ただし、式中iは1から7の整数のいずれかを表し、R７は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【化２２】
0003684175.tif 000058
（ただし、式中jは1から9の整数のいずれかを表す。）
【化２３】
0003684175.tif 000059
（ただし、前記化学式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも一つであり、かつ、前記化学式［１］で表されるモノマーユニットにおけるR1およびａと対応する。R1が水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が ハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が 発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が カルボキシル基あるいはその塩でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【化２４】
0003684175.tif 000060
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【化２５】
0003684175.tif 000061
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、bは前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるbと対応する0から7の整数のいずれかを表し、R2は前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるR2と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化２６】
0003684175.tif 000062
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、cは前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるcと対応する1から8の整数のいずれかを表し、R3は前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるR3と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか1つを表す。）
【化２７】
0003684175.tif 000063
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、dは前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるdと対応する0から7の整数のいずれかを表し、R4は前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるR4と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化２８】
0003684175.tif 000064
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、eは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるeと対応する1から8の整数のいずれかを表し、R5は前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるR5と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5，−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化２９】
0003684175.tif 000065
（ただし、式中−SCoAはアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、fは前記化学式［６］で表されるモノマーユニットにおけるfと対応する0から7の整数のいずれかを表す。）
【化３０】
0003684175.tif 000066
（ただし、式中−SCoAはアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、ｇは前記化学式［７］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する1から8の整数のいずれかを表す。）
【化３１】
0003684175.tif 000067
（ただし、式中−SCoAはアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、hは前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるhと対応する1から7の整数のいずれかを表し、R6は前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるR6と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2，−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【化３２】
0003684175.tif 000068
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、iは前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるiと対応する1から7の整数のいずれかを表し、R7は前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるR７と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子,−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【化３３】
0003684175.tif 000069
（ただし、式中−SCoAはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、jは前記化学式［１０］で表されるモノマーユニットにおけるjと対応する1から9の整数のいずれかを表す。）
【請求項２１】
前記基材を被覆する前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部に化学修飾を施す工程をさらに有する、請求項１９または請求項２０に記載の構造体の製造方法。
【請求項２２】
前記化学修飾を施す工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部にグラフト鎖を付加する工程であることを特徴とする、請求項２１に記載の構造体の製造方法。
【請求項２３】
前記グラフト鎖を付加する工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と、末端に反応性官能基を有する化合物とを反応させる工程であることを特徴とする、請求項２２に記載の構造体の製造方法。
【請求項２４】
前記化学修飾を施す工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部を架橋化する工程であることを特徴とする、請求項２１に記載の構造体の製造方法。
【請求項２５】
前記架橋化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と架橋剤とを反応させる工程であることを特徴とする、請求項２４に記載の構造体の製造方法。
【請求項２６】
前記架橋化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートに電子線を照射する工程であることを特徴とする、請求項２４に記載の構造体の製造方法。
【請求項２７】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能を有する微生物を使って生産する、請求項１９に記載の構造体の製造方法。
【請求項２８】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産する、請求項１９に記載の構造体の製造方法。
【請求項２９】
前記遺伝子はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物から得られた遺伝子であることを特徴とする請求項２８に記載の構造体の製造方法。
【請求項３０】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Pseudomonas sp．）に属する微生物である、請求項２７または請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３１】
前記シュードモナス属（Pseudomonas sp．）に属する微生物が、シュードモナス・プチダ・P91株（Pseudomonas putida P91、FERM BP−7373）、シュードモナス・チコリアイ・H45株（Pseudoｍonas cichorii H45、FERMBP−7374）、シュードモナス・チコリアイ・YN2株（Pseudoｍonas cichorii YN2、FERM BP−7375）、シュードモナス・ジェッセニイ・P161株（Pseudoｍonas jessenii P161、FERM BP−7376）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項３０に記載の構造体の製造方法。
【請求項３２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バークホルデリア属（Burkholderia sp．）に属する微生物である、請求項２７または請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３３】
前記バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア属・OK3株（Burkholderia sp． OK3、FERM P−17370）、バークホルデリア属・OK4株（Burkholderia sp． OK4、FERM P−17371）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項３２に記載の構造体の製造方法。
【請求項３４】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌(Escheichia coli)である、請求項２８または請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３５】
請求項１から請求項１８のいずれかに記載の構造体を含むトナー。
【請求項３６】
請求項１から請求項１８のいずれかに記載の構造体から成るトナー。
【請求項３７】
3−ヒドロキシアルカン酸ユニット（ただし3−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットまたは3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニットを除く）を含有するポリヒドロキシアルカノエートで基材の少なくとも一部が被覆され、
前記ポリヒドロキシアルカノエートは、アミノ基を有する化合物のグラフト鎖を有することを特徴とする構造体。
【請求項３８】
3−ヒドロキシアルカン酸ユニット（ただし3−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットまたは3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニットを除く）を含有するポリヒドロキシアルカノエートで基材の少なくとも一部が被覆され、
前記基材にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が固定されていることを特徴とする構造体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートと基材とを備え、該ポリヒドロキシアルカノエートが該基材の少なくとも一部を被覆した構造を有していることを特徴とする構造体及びその製造方法に関するものである。より詳しくは、3−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットまたは3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニット以外の3−ヒドロキシアルカン酸ユニットをモノマーユニットとして少なくとも含有するポリヒドロキシアルカノエートと、基材とを備え、該ポリヒドロキシアルカノエートが該基材の少なくとも一部を被覆していることを特徴とする構造体に関するものである。また、本発明は、中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート生合成反応に関与するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を基材に固定化し、該酵素により3−ヒドロキシアシル補酵素Aを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成させることにより該基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする、構造体の製造方法に関するものである。また、本発明の構造体には、粒状の基材にポリヒドロキシアルカノエートを被覆した粒状の構造体（以下、「カプセル構造体」という）と、平板またはフィルム状の基材の少なくとも一部ををポリヒドロキシアルカノエートで被覆した、平板またはフィルム状の構造体（以下、「積層構造体」という）とが包含される。
【０００２】
本発明の構造体は、機能性構造体として幅広い用途に利用可能であり、例えば、カプセル構造体であれば電子写真用のカプセルトナーをはじめとする各種の機能性構造体として、また、積層構造体であればOHPフィルムやインクジェット記録紙などの記録媒体をはじめとする各種の機能性構造体として、それぞれ幅広い用途に利用可能である。
【０００３】
【従来の技術】
高分子材料は現代の産業や生活に不可欠のものであり、安価軽量であること、成形性が良いことなどから、家電品の筐体をはじめ包装材や緩衝材、あるいは繊維材料など、多岐に渡って利用されている。一方、これら高分子材料の安定な性質を利用して、高分子の分子鎖に様々な機能を発現する置換基を配して、液晶材料やコート剤などの各種機能材料も得られている。これら機能材料は構造材料としての高分子よりも付加価値が高いため、少量生産でも大きな市場ニーズが期待できる。このような高分子機能材料は、これまで高分子の合成プロセスの中で、あるいは合成した高分子を置換基で修飾することにより、有機合成化学的手法により得られている。高分子機能材料の基本骨格となる高分子はほとんどの場合、石油系原料から有機合成化学的手法によって得られている。ポリエチレン，ポリエチレンテレフタレート，ポリエステル，ポリスチレン，ポリ塩化ビニル，ポリアクリルアミドなどがその典型的な例である。
【０００４】
ところで、本願発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための一つの要素技術として、高分子化合物により基材を被覆した重層構造体に着目してきた。このように高分子化合物で特定の基材を被覆することによって、極めて有用な機能性を有する複合構造体を得ることができる。このような構造体の具体的な用途としては、例えば高分子化合物にトナー成分を内包させたマイクロカプセル構造体からなる電子写真用カプセルトナーや、高分子化合物でシート状の基材を被覆したインクジェット記録方式用記録媒体などが考えられる。
【０００５】
一般に、電子写真法は光導電性物質を利用し、種々の手段により感光体上に電気的潜像を形成し、次いで該潜像をトナーを用いて現像し、必要に応じて紙等の転写材にトナー画像を転写した後、加熱，圧力，加熱圧力，あるいは溶剤蒸気などにより定着し複写画像を得るものである。この目的に用いるトナーとして、従来、熱可塑性樹脂中に染・顔料からなる着色剤を溶融混合し、均一に分散した後、微粉砕装置および分級機により所望の粒径とする「粉砕トナー」が用いられてきた。該トナーは優れた能力を有するものではあるが、その製造工程上、脆性が要求されるため、材料の選択範囲等に一定の制限がある等の課題があった。このような課題を克服するため、特公昭36−10231号公報等により懸濁重合法による「重合トナー」の製造が提案されている。懸濁重合法においては、重合性単量体、着色剤、重合開始剤、さらに必要に応じて架橋剤、荷電制御剤等を均一に溶解または分散せしめた後、分散安定剤を含有する連続相（例えば水相）に攪拌機で分散し、同時に重合反応を行わせ、所望のトナーを得る。この方法は、粉砕工程が含まれないため、トナーに脆性が必要でなく、軟質の材料を使用できる等の利点がある。しかし、このような微小粒径の重合トナーでは、着色剤や電荷制御剤がトナー表層へ露出し易いため、着色剤の影響が生じ易くなり、また、帯電の均一性の低下が懸念された。これらの課題を解決するため、重合体粒子表面を高分子化合物からなる一層あるいは複数層の外被で被覆した、いわゆる「カプセルトナー」が提案されている。
【０００６】
このようなカプセルトナーとしては、例えば、特開平8−286416号公報において、極性樹脂を含有する外被で重合粒子を被覆した静電荷現像用カプセルトナー及びその製造方法が開示されている。この方法は、トナー成分を含む重合粒子からなるコアのまわりに、有機合成化学的手法により外被を形成させたものであり、上記の課題を改善し、画質耐久性の向上、帯電の均一化及び安定化を実現させた優れた静電荷現像用カプセルトナーが供給できる。また、特開平9−292735号公報では、強固な外被樹脂によって、離型剤材料および熱膨張の大きな材料からなるコアを被覆した画像形成用カプセルトナーが開示されている。前記トナーは、定着時の過熱によってコア内の熱膨張性材料が膨張して、外被を破壊することによって、内包する離型剤材料を外部に押し出すように構成された機能性マイクロカプセルであり、フィルム加熱型の定着装置を用いる場合にはオフセットを生じることがなく、また、ローラー定着器を使用した場合には低加圧での定着を可能としかつ紙シワを低減することができる等の効果が期待できる。同様に、高分子化合物を外被とするカプセルトナーとその製造方法としては、特開平5−119531号公報，特開平5−249725号公報，特開平6−332225号公報，特開平9−43896号公報，特開平10−78676号公報，特開平11−7163号公報，特開2000−66444号公報，特開2000−112174号公報，特開2000−330321号公報などが開示されており、いずれも懸濁重合法，乳化重合法，沈殿重合法，分散重合法，ソープフリー乳化重合法，シード重合法などの有機合成化学的手法により所望のカプセル構造体を製造している。
【０００７】
しかしながら、これらカプセルトナーの製造方法においては、その製造工程が極めて複雑となる、製造工程において大量の溶媒類や界面活性剤を使用するなどの課題もあった。
【０００８】
一方、高分子化合物でシート状の基材を被覆した積層構造体からなる記録媒体としては、
例えばインクジェット記録方式における記録媒体が挙げられる。インクジェット記録方式は、種々の作動原理によりインクの微小液滴を飛翔させて紙などの記録媒体に付着させ、画像、文字などの記録を行うものである。該記録方式では、インク中に水，水と有機溶剤の混合液といった多量の溶媒を含んでいるので、高色濃度を得るためには大量のインクを用いる必要がある。また、インク液滴は連続的に射出されるので、最初の液滴が射出されると、インク液滴が融合してインクのドットが接合するビーディング現象が生じて画像が乱れる。このため、インクジェット記録用媒体には、インク吸収量が大きく吸収速度が高いことが要求される。
【０００９】
このため、基材上にインク受容層を形成してインク吸収性を高めた記録媒体が提案されている。例えば、特開昭55−146786号などでは、基材をポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンなどの水溶性樹脂で被覆した記録媒体が提案されている。また、特開平5−221112号などでは、耐水性樹脂を用いた記録媒体が提案されている。さらに、イオン性樹脂をインク受容層として用いた記録媒体が提唱されており（例えば、特開平11−78221号公報、特開2000−190631号公報など）、水に対する濡れ性や耐水性，染料定着性等に優れ、インクの吸収乾燥性や画像鮮明性に優れた記録媒体が得られている。
【００１０】
インク吸収層を基材上に形成させる方法としては、従来は塗抹による方法が一般的であり、例えば、ブレードコート方式，エアナイフコート方式，ロールコート方式，フラッシュコート方式，グラビアコート方式，キスコート方式，ダイコート方式，エクストルージョン方式，スライドホッパー方式，カーテンコート方式，スプレー方式等を用いた方法により行われてきた。
【００１１】
なお、以上に例示したいずれの方法においても、基材の被覆のために用いる高分子化合物は有機合成的手法により合成・構造体化され、これに種々の機能が付加されている。
【００１２】
ところで、近年、生物工学的手法によって高分子化合物を製造する研究が活発に行われてきており、また、一部で実用化されている。例えば、微生物由来の高分子化合物として、ポリ−3−ヒドロキシ−n−酪酸（以下、PHBと略す場合もある）や3−ヒドロキシ−n−酪酸と3−ヒドロキシ−n−吉草酸との共重合体（以下、PHB／Vと略す場合もある）等のポリヒドロキシアルカノエート（以下、PHAと略す場合がある）、バクテリアセルロースやプルラン等の多糖類、ポリ−γ−グルタミン酸やポリリジン等のポリアミノ酸などが知られている。特にPHAは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用することができるうえ、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【００１３】
これまで、多くの微生物がPHAを生産し菌体内に蓄積することが報告されてきた。例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ16株（Alcaliｇenes  eutropus  H16、ATCC No．17699）、メチロバクテリウム属（Methylobacterium  sp．）、パラコッカス属（Paracoccus  sp．）、アルカリゲネス属（Alcaliｇenes  sp．）、シュードモナス属（Pseudomonas  sp．）の微生物によるPHB／Vの生産が報告されている（特開平5−74492号公報、特公平6−15604号公報、特公平7−14352号公報、特公平8−19227号公報など）。また、コマモナス・アシドボランス・IFO13852株（Comamonas  acidovorans  IFO13852）が、3−ヒドロキシ−n−酪酸と4−ヒドロキシ−n−酪酸とをモノマーユニットに持つPHAを生産することが開示されている（特開平9−191893号公報）。さらに、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas  caviae）により、3−ヒドロキシ−n−酪酸と3−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体を生産することが開示されている（特開平5−93049号公報、特開平7−265065号公報）。
【００１４】
これらPHBやPHB／Vの生合成は、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された（Ｒ）−3−ヒドロキシブチリルCoAまたは（Ｒ）−3−ヒドロキシバレリルCoAを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がPHB合成酵素（PHBポリメラーゼ、PHBシンターゼともいう）である。なお、ＣoＡとは補酵素A（coenzyme  A）の略称であり、その化学構造は下記化学式の通りである。
【００１５】
【化３４】
0003684175.tif 000002
【００１６】
また、近年、炭素数が3から12程度までの中鎖長（medium−chain−lenｇth）の3−ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート（以下、mcl−PHAと略す場合がある）についての研究が精力的に行われている。
【００１７】
例えば、特許公報第2642937号では、シュードモナス・オレオボランス・ATCC  29347株（Pseudomonas oleovorans  ATCC  29347）に非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が6から12までの3−ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するPHAが生産されることが開示されている。また、Appl．Environ．Microbiol．，58，746（1992）には、シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas  resinovorans）が、オクタン酸を単一炭素源として、3−ヒドロキシ−n−酪酸，3−ヒドロキシヘキサン酸，3−ヒドロキシオクタン酸，3−ヒドロキシデカン酸をモノマーユニットとするPHAを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、3−ヒドロキシ−n−酪酸，3−ヒドロキシヘキサン酸，3−ヒドロキシオクタン酸，3−ヒドロキシデカン酸をユニットとするPHAを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い3−ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットの導入は、後述の脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００１８】
Int．J．Biol．Macromol．，16（3），119（1994）には、シュードモナスsp．61−3株（Pseudomonas  sp．strain61−3）が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、3−ヒドロキシ−n−酪酸，3−ヒドロキシヘキサン酸，3−ヒドロキシオクタン酸，3−ヒドロキシデカン酸，3−ヒドロキシドデカン酸といった3−ヒドロキシアルカン酸、および、3−ヒドロキシ−5−cis−デセン酸，3−ヒドロキシ−5−cis−ドデセン酸といった3−ヒドロキシアルケン酸をユニットとするPHAを生産することが報告されている。
【００１９】
上記のPHAは側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるPHA（以下、usual−PHAと略す場合がある）である。しかし、より広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基（例えば、フェニル基，不飽和炭化水素，エステル基，アリル基，シアノ基，ハロゲン化炭化水素，エポキシドなどなど）を側鎖に導入したPHA（以下、unusual−PHAと略す場合がある）が極めて有用である。
【００２０】
フェニル基を有するunusual−PHAの生合成の例としては、例えば、Macromolecules，24，5256−5260（1991），Macromol．Chem．，191，1957−1965（1990），Chirality，3，492−494（1991）などで、シュードモナス・オレオボランスが、5−フェニル吉草酸から、3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸ユニットを含むPHAを生産すると報告されている。また、Ｍacroｍolecules，29，1762−1766（1996）で、シュードモナス・オレオボランスが、5−（4−トリル）吉草酸（5−（4−メチルフェニル）吉草酸）から、3−ヒドロキシ−5−（4−トリル）吉草酸ユニットを含むPHAを生産すると報告されている。さらに、Ｍacroｍolecules，32，2889−2895（1999）には、シュードモナス・オレオボランスが、5−（2，4−ジニトロフェニル）吉草酸から、3−ヒドロキシ−5−（2，4−ジニトロフェニル）吉草酸ユニットおよび3−ヒドロキシ−5−（4−ニトロフェニル）吉草酸ユニットを含むPHAを生産すると報告されている。
【００２１】
また、フェノキシ基を有するunusual−PHAの例としては、Macromol．Chem．Phys．，195，1665−1672（1994）で、シュードモナス・オレオボランスが、11−フェノキシウンデカン酸から3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸ユニットおよび3−ヒドロキシ−9−フェノキシノナン酸ユニットを含むPHAを生産すると報告されている。また、Macromolecules，29，3432−3435（1996）には、シュードモナス・オレオボランスが、6−フェノキシヘキサン酸から3−ヒドロキシ−4−フェノキシ酪酸ユニットおよび3−ヒドロキシ−6−フェノキシヘキサン酸ユニットを含むPHAを、8−フェノキシオクタン酸から3−ヒドロキシ−4−フェノキシ酪酸ユニット，3−ヒドロキシ−6−フェノキシヘキサン酸ユニットおよび3−ヒドロキシ−8−フェノキシオクタン酸ユニットを含むPHAを、11−フェノキシウンデカン酸から3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸ユニットおよび3−ヒドロキシ−7−フェノキシヘプタン酸ユニットを含むPHAを生産することが報告されている。さらに、Can．J．Microbiol．，41，32−43（1995）では、シュードモナス・オレオボランス・ATCC 29347株及びシュードモナス・プチダ・KT2442株（Pseudomonas  putida  KT2442）が、p−シアノフェノキシヘキサン酸または p−ニトロフェノキシヘキサン酸から、3−ヒドロキシ−p−シアノフェノキシヘキサン酸ユニットまたは3−ヒドロキシ−p−ニトロフェノキシヘキサン酸ユニットを含むPHAを生産すると報告している。特許第2989175号公報には、3−ヒドロキシ−5−（モノフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットあるいは3−ヒドロキシ−5−（ジフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットからなるホモポリマー、少なくとも3−ヒドロキシ−5−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエートユニットあるいは3−ヒドロキシ−5−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエートユニットを含有するコポリマーとその製造方法が記載されており、その効果として、融点が高く良好な加工性を保ちつつ、立体規則性、撥水性を付与することができるとしている。
【００２２】
また、シクロヘキシル基を有するunusual−PHAの例としては、Macromolecules，30，1611−1615（1997）に、シュードモナス・オレオボランスが、シクロヘキシル酪酸またはシクロヘキシル吉草酸から該PHAを生産するとの報告がある。
【００２３】
これらmcl−PHAやunusual−PHAの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（Ｒ）−3−ヒドロキシアシルCoAを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がPHA合成酵素（PHAポリメラーゼ、PHAシンターゼともいう）である。以下に、β酸化系およびPHA合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がPHAとなるまでの反応を示す。
【００２４】
【化３５】
0003684175.tif 000003
【００２５】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた（R）−3−ヒドロキシアシル−ACP（ACPとはアシルキャリアプロテインのことである）から変換された（R）−3−ヒドロキシアシルCoAを基質として、同様にPHA合成酵素によりPHAが合成されると考えられる。
【００２６】
近年、上記のPHB合成酵素やPHA合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（in  vitro）でPHAを合成しようとする試みが始まっている。
【００２７】
例えば、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，6279−6283（1995）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Alcaliｇenes eutrophus）由来のPHB合成酵素に3−ヒドロキシブチリルCoAを作用させることにより、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットからなるPHBを合成することに成功している。また、Int．J．Biol．Macromol．，25，55−60（1999）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のPHB合成酵素に、3−ヒドロキシブチリルCoAや3−ヒドロキシバレリルCoAを作用させることにより、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットや3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニットからなるPHAの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の3−ヒドロキシブチリルCoAを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、R体の3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットのみからなるPHBが合成されたとしている。Macromol．Rapid  Commun．，21，77−84（2000）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のPHB合成酵素を用いた細胞外でのPHB合成が報告されている。
【００２８】
また、FEMS  Microbiol．Lett．，168，319−324（1998）では、クロマチウム・ビノサム（Chromatium  vinosum）由来のPHB合成酵素に3−ヒドロキシブチリルCoAを作用させることにより、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットからなるPHBを合成することに成功している。
【００２９】
Appl．Microbiol．Biotechnol．，54，37−43（2000）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas  aeruｇinosa）のPHA合成酵素に3−ヒドロキシデカノイルCoAを作用させることにより、3−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるPHAを合成している。
【００３０】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、生物工学的手法を高分子化合物の合成に適用することによって、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の合成や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待されている。また、従来の有機合成化学的手法では多段階に渡る反応を要していた製造工程を、１段階の工程のみで実現できる場合も多くあり、製造プロセスの簡略化やコストダウン、所要時間の短縮等の効果も期待されている。さらに、有機溶剤や酸・アルカリ、界面活性剤等の使用削減、温和な反応条件の設定、非石油系原料や低純度原料のからの合成等が可能となり、より環境低負荷かつ資源循環型の合成プロセスの実現が可能となる。なお、低純度原料からの合成についてさらに詳しく説明すれば、生物工学的合成プロセスでは一般に、触媒である酵素の基質特異性が高いため、低純度の原料を用いても所望の反応を選択的に進めることが可能であり、よって、廃棄物やリサイクル原料などの使用も期待できる。
【００３１】
一方、前記の通り、本願発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための要素技術として、高分子化合物で基材を被覆した構造体に着目してきた。このように高分子化合物で特定の基材を被覆することによって、極めて有用な機能性を有する複合構造体を得ることができる。前記の如き構造体を作出する試みは従来、有機合成的手法によって多くなされてきたが、該手法には一定の限界があった。
【００３２】
仮に、かかる構造体を前述のような生物工学的手法により製造することができれば、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待できるうえ、より環境低負荷かつ資源循環型の製造プロセスを低コストで実現できるものと考えられる。例えば、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、従来の有機合成化学的手法では実現が困難であった新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたカプセル構造体や積層構造体を、極めて簡便かつ環境低負荷なプロセスで製造することが可能になる。
【００３３】
従って、本発明の目的は、生物工学的手法により製造することのできる高機能な高分子化合物構造体を提供することにある。また本発明は、機能性複合構造体として広範囲に利用可能な、高分子化合物により基材を被覆した構造体の効率的な製造方法を提供することにある。
【００３４】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、PHA合成酵素を基材表面に固定化し、ここに3−ヒドロキシアシルCoAを加えて反応させることにより、基材表面に所望のPHAを合成させ、基材をPHAで被覆した構造体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
また、該PHAに化学修飾を施すことにより、各種の特性等を改良した構造体を得ることができることを見出した。さらに詳しくは、例えば、該PHAにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたPHAが、基材の少なくとも一部を被覆した構造体を得ることができることを見出した。また、該PHAを架橋化せしめることにより、所望の物理化学的性質（例えば、機械的強度、耐薬品性、耐熱性など）を備えたPHAが、基材の少なくとも一部を被覆した構造体を得ることができることを見出した。なお、本発明における化学修飾（Chemical modification）とは、高分子材料の分子内または分子間、あるいは高分子材料と他の化学物質との間で化学反応を行わせることにより、該高分子材料の分子構造を改変することを言う。また、架橋（crosslinking）とは、高分子材料の分子内または分子間を化学的にあるいは物理化学的に結合せしめて網状構造をつくることを言い、架橋剤（crosslinking agent）とは、前記架橋反応を行うために添加する、前記高分子材料と一定の反応性を有する物質を言う。
【００３５】
即ち本発明は、３−ヒドロキシアルカン酸ユニット（ただし3−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットまたは3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニットを除く）を含有するポリヒドロキシアルカノエートが粒状体である基材の少なくとも一部を被覆していることを特徴とする構造体に関する。
【００３６】
また本発明は中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を基材表面に固定し、該酵素により3−ヒドロキシアシル補酵素Aを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することにより、前記基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする構造体の製造方法に関する。
【００３７】
また本発明は、基材をコア（芯材料）とし、mcl−PHAやunusual−PHAを外被とするカプセル構造体に関し、さらに詳しくは、コアに着色剤を少なくとも含有していることを特徴とするカプセル構造体、該着色剤が顔料を少なくとも含有しているカプセル構造体、または、コアが顔料であるカプセル構造体に関する。
【００３８】
また本発明は、前記カプセル構造体からなる電子写真用カプセルトナーに関する。
【００３９】
さらに本発明は前記トナーを用いた画像形成方法、画像形成装置に関する。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明の構造体は、置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むPHAにより基材が被覆された形態を有する構造体であり、電子写真用カプセルトナーや記録媒体などの高機能性構造体として極めて有用である。以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００４１】
＜PHA＞
本発明に利用可能なPHAとしては、mcl−PHAの合成反応に関与するPHA合成酵素によって合成され得るPHA（即ち、各種のmcl−PHAやunusual−PHAなど）であれば、特に限定はされない。前述の通り、PHA合成酵素は、生物体内でのPHA合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているPHAであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のPHAに対応する3−ヒドロキシアシルCoAを、本発明における基材に固定化された該酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のPHAで基材を被覆した構造体を作成することが可能である。
【００４２】
このようなPHAとして、具体的には、下記化学式［１］から［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも含むPHAを例示することができる。
【００４３】
【化３６】
0003684175.tif 000004
【００４４】
（ただし、該モノマーユニットは、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００４５】
R1が水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1がハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が カルボキシル基あるいはその塩でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【００４６】
【化３７】
0003684175.tif 000005
【００４７】
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００４８】
【化３８】
0003684175.tif 000006
【００４９】
（ただし、式中bは0から7の整数のいずれかを表し、R2は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５０】
【化３９】
0003684175.tif 000007
【００５１】
（ただし、式中cは1から8の整数のいずれかを表し、R3は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５２】
【化４０】
0003684175.tif 000008
【００５３】
（ただし、式中dは0から7の整数のいずれかを表し、R4は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５４】
【化４１】
0003684175.tif 000009
【００５５】
（ただし、式中eは１から８の整数のいずれかを表し、R5は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5，−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００５６】
【化４２】
0003684175.tif 000010
【００５７】
（ただし、式中fは0から7の整数のいずれかを表す。）
【００５８】
【化４３】
0003684175.tif 000011
【００５９】
（ただし、式中ｇは1から8の整数のいずれかを表す。）
【００６０】
【化４４】
0003684175.tif 000012
【００６１】
（ただし、式中hは１から７の整数のいずれかを表し、R6は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2，−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【００６２】
【化４５】
0003684175.tif 000013
【００６３】
（ただし、式中iは１から７の整数のいずれかを表し、R７は水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子(H)，Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【００６４】
【化４６】
0003684175.tif 000014
【００６５】
（ただし、式中jは1から9の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素，塩素，臭素などを挙げることができる。また、前記の発色団としては、その3−ヒドロキシアシルCoA 体がPHA合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害などを考慮すると、3−ヒドロキシアシルCoA 分子内において、CoAの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数1から5のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、発色団の光吸収波長が可視域にあれば着色した構造体が得られ、可視域以外に光吸収波長があっても種々の電子材料として利用することができる。このような発色団の例として、ニトロソ、ニトロ、アゾ、ジアリールメタン、トリアリールメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、メチン、チアゾール、インダミン、インドフェノール、ラクトン、アミノケトン、ヒドロキシケトン、スチルベン、アジン、オカサジン、チアジン、アントラキノン、フタロシアニン、インジゴイドなどを挙げることができる。
【００６６】
本発明において用いられるPHAとしては上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したPHAの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。
【００６７】
さらに、基質である3−ヒドロキシアシルCoAの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、構造体の形状が粒状であれば内側から外側に向かう方向に、構造体の形状が平面状であれば垂直方向に、PHAのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。
【００６８】
これによって、例えばカプセルトナーの場合、ガラス転移温度の高いPHAをトナー表層に、ガラス転移温度の低いPHAをそれより内側の層に形成させることで、保存時には耐ブロッキング性に優れ、定着時には低温定着性に優れる等の複数の機能を同時に保有させることが可能となる。
【００６９】
また例えば、基材と親和性の低いPHAで被覆構造体を形成する必要がある場合、まず基材を基材と親和性の高いPHAで被覆し、その基材と親和性の高いPHAのモノマーユニット組成を、目的とするPHAのモノマーユニット組成に、内側から外側に向かう方向もしくは垂直方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、基材との結合を強固にしたPHA被膜を形成することが可能となる。
【００７０】
また、3−ヒドロキシプロピオン酸ユニット，3−ヒドロキシ−n−酪酸ユニット，3−ヒドロキシ−n−吉草酸ユニット，4−ヒドロキシ−n−酪酸ユニットなどは、それらのみからなるPHAとしてはmcl−PHAやunusual−PHAには該当しないが、これらのモノマーユニットが先に例示したようなモノマーユニット中に混在しているPHAについては、本発明において利用可能である。また必要に応じて、PHAを合成したのち、あるいは、合成中に、さらに化学修飾等を施しても良い。PHAの分子量は、数平均分子量で1，000から1，000万程度、仮に該構造体を電子写真用カプセルトナーとして使用する場合は3，000から100万程度とするのが望ましい。
【００７１】
なお、本発明の構造体に用いる、PHA合成酵素により合成されるPHAは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【００７２】
＜3−ヒドロキシアシルCoA＞
本発明のPHA合成酵素の基質として用いる3−ヒドロキシアシルCoAとして、具体的には、下記化学式［１１］から［２０］で表される3−ヒドロキシアシルCoAを例示することができる。
【００７３】
【化４７】
0003684175.tif 000015
【００７４】
（ただし、前記化学式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、式中R1およびaの組合せが下記のいずれかである群より選択される少なくとも一つであり、かつ、前記化学式［１］で表されるモノマーユニットにおけるR1およびａと対応する。
R1が 水素原子（H）でありaが3から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が ハロゲン原子でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が 発色団でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が カルボキシル基あるいはその塩でありaが1から10の整数のいずれかであるモノマーユニット、R1が、
【００７５】
【化４８】
0003684175.tif 000016
【００７６】
でありaが1から7の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００７７】
【化４９】
0003684175.tif 000017
【００７８】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、bは前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるbと対応する0から7の整数のいずれかを表し、R2は前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるR2と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００７９】
【化５０】
0003684175.tif 000018
【００８０】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、cは前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるcと対応する1から8の整数のいずれかを表し、R3は前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるR3と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか1つを表す。）
【００８１】
【化５１】
0003684175.tif 000019
【００８２】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、dは前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるdと対応する0から7の整数のいずれかを表し、R4は前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるR4と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００８３】
【化５２】
0003684175.tif 000020
【００８４】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、eは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるeと対応する1から8の整数のいずれかを表し、R5は前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるR5と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−CF3，−C2F5，−C3F7，−CH3，−C2H5，−C3H7からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００８５】
【化５３】
0003684175.tif 000021
【００８６】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、fは前記化学式［６］で表されるモノマーユニットにおけるfと対応する0から7の整数のいずれかを表す。）
【００８７】
【化５４】
0003684175.tif 000022
【００８８】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、ｇは前記化学式［７］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する1から8の整数のいずれかを表す。）
【００８９】
【化５５】
0003684175.tif 000023
【００９０】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、hは前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるhと対応する1から7の整数のいずれかを表し、R6は前記化学式［８］で表されるモノマーユニットにおけるR6と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子，−CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”，−CH3，−C2H5，−C3H7，−CH(CH3)2，−C(CH3)3からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【００９１】
【化５６】
0003684175.tif 000024
【００９２】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Aを表し、iは前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるiと対応する1から7の整数のいずれかを表し、R7は前記化学式［９］で表されるモノマーユニットにおけるR７と対応する、水素原子（H），ハロゲン原子, −CN，−NO2，−COOR'，−SO2R”からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、
ここでR'は水素原子（H），Na，K，−CH3，−C2H5のいずれかであり、R”は−OH，−ONa，−OK，ハロゲン原子，−OCH3，−OC2H5のいずれかである。）
【００９３】
【化５７】
0003684175.tif 000025
【００９４】
（ただし、式中−SCoA はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、jは前記化学式［１０］で表されるモノマーユニットにおけるjと対応する1から9の整数のいずれかを表す。）
これらの3−ヒドロキシアシルCoAは、例えば、酵素を用いたin  vitro合成法、微生物や植物などの生物体を用いたin vivo合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルCoAシンセターゼ（アシルCoAリガーゼ、E．C．6．2．1．3）を用いた下記反応、
アシルCoAシンセターゼ
3−ヒドロキシアルカン酸  ＋  CoA      →      3−ヒドロキシアシルCoA
を用いた方法などが知られている（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）、Appl．Microbiol．Biotechnol．，54，37−43（2000）など）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【００９５】
＜PHA合成酵素およびその生産菌＞
本発明に用いるPHA合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のPHA合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００９６】
PHA合成酵素を生産する微生物としては、例えば、mcl−PHAやunusual−PHAの生産菌を用いることができ、このような微生物として、前述のシュードモナス・オレオボランス，シュードモナス・レジノボランス，シュードモナス属61−3株，シュードモナス・プチダ・KT2442株，シュードモナス・アエルギノーサなどのほかに、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・P91株（Pseudomonas  putida P91），シュードモナス・チコリアイ・H45株（Pseudoｍonas  cichorii  H45），シュードモナス・チコリアイ・YN2株（Pseudoｍonas  cichorii  YN2），シュードモナス・ジェッセニイ・P161株（Pseudoｍonas  jessenii P161）等のシュードモナス属微生物や、特開2001−78753号公報に記載のバークホルデリア属・OK3株（Burkholderia  sp．OK3、FERM  P−17370），特開2001−69968号公報に記載のバークホルデリア属・OK4株（Burkholderia sp．OK4、FERM  P−17371）などのバークホルデリア属微生物を用いることができる。また、これら微生物に加えて、アエロモナス属（Aeromonas  sp．），コマモナス属（Comamonas  sp．）などに属し、mcl−PHAやunusual−PHAを生産する微生物を用いることも可能である。
【００９７】
なお、P91株は寄託番号FERM  BP−7373として、H45株は寄託番号FERM  BP−7374として、YN2株は寄託番号FERM  BP−7375として、P161株は寄託番号FERM  BP−7376として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（経済産業省産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院）生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）に国際寄託されている。
【００９８】
なお、前記のP91株，H45株，YN2株およびP161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。また、P161株については、16Ｓ  rRNAの塩基配列を配列番号：1に示す。
【００９９】
（シュードモナス・プチダ・P91株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ  ：桿菌、0．6μｍ×1．5μｍ
細胞の多形性      ：なし
運動性            ：あり
胞子形成          ：なし
グラム染色性      ：陰性
コロニー形状      ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ                      ：陽性
オキシダーゼ                    ：陽性
O／F試験                        ：酸化型
硝酸塩の還元                    ：陰性
インドールの生成                ：陰性
ブドウ糖酸性化                  ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ        ：陽性
ウレアーゼ                      ：陰性
エスクリン加水分解              ：陰性
ゼラチン加水分解                ：陰性
β−ガラクトシダーゼ            ：陰性
Kinｇ’s B寒天での蛍光色素産生    ：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖                        ：陽性
L−アラビノース                ：陰性
D−マンノース                  ：陰性
D−マンニトール                ：陰性
N−アセチル−D−グルコサミン  ：陰性
マルトース                      ：陰性
グルコン酸カリウム              ：陽性
n−カプリン酸                  ：陽性
アジピン酸                      ：陰性
dl−リンゴ酸                    ：陽性
クエン酸ナトリウム              ：陽性
酢酸フェニル                    ：陽性
（シュードモナス・チコリアイ・H45株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ  ：桿菌、0．8μｍ×1．0〜1．2μｍ
細胞の多形性      ：なし
運動性            ：あり
胞子形成          ：なし
グラム染色性      ：陰性
コロニー形状      ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ                        ：陽性
オキシダーゼ                      ：陽性
Ｏ／Ｆ試験                        ：酸化型
硝酸塩の還元                      ：陰性
インドールの生成                  ：陰性
ブドウ糖酸性化                    ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ          ：陰性
ウレアーゼ                        ：陰性
エスクリン加水分解                ：陰性
ゼラチン加水分解                  ：陰性
β−ガラクトシダーゼ              ：陰性
Ｋinｇ’sＢ寒天での蛍光色素産生    ：陽性
4％NaClでの生育                  ：陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積    ：陰性
（３）基質資化能
ブドウ糖                        ：陽性
L−アラビノース                ：陰性
D−マンノース                  ：陽性
D−マンニトール                ：陽性
N−アセチル−D−グルコサミン    ：陽性
マルトース                      ：陰性
グルコン酸カリウム              ：陽性
n−カプリン酸                  ：陽性
アジピン酸                      ：陰性
dl−リンゴ酸                    ：陽性
クエン酸ナトリウム              ：陽性
酢酸フェニル                    ：陽性
（シュードモナス・チコリアイ・YN2株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ  ：桿菌、0．8μｍ×1．5〜2．0μｍ
細胞の多形性      ：なし
運動性            ：あり
胞子形成          ：なし
グラム染色性      ：陰性
コロニー形状      ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
（２）生理学的性質
カタラーゼ                      ：陽性
オキシダーゼ                    ：陽性
Ｏ／Ｆ試験                      ：酸化型
硝酸塩の還元                    ：陰性
インドールの生成                ：陽性
ブドウ糖酸性化                  ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ        ：陰性
ゼラチン加水分解                ：陰性
β−ガラクトシダーゼ            ：陰性
Ｋinｇ’s Ｂ寒天での蛍光色素産生  ：陽性
4％NaClでの生育                ：陽性（弱い生育）
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積  ：陰性
Tween 80の加水分解              ：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖                        ：陽性
L−アラビノース              ：陽性
D−マンノース                  ：陰性
D−マンニトール                ：陰性
N−アセチル−D−グルコサミン  ：陰性
マルトース                    ：陰性
グルコン酸カリウム            ：陽性
n−カプリン酸                  ：陽性
アジピン酸                      ：陰性
dl−リンゴ酸                    ：陽性
クエン酸ナトリウム              ：陽性
酢酸フェニル                    ：陽性
（シュードモナス・ジェッセニイ・P161株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ  ：球状 φ0．6μｍ、桿状 0．6μｍ×1．5〜2．0μｍ
細胞の多形性      ：あり（伸長型）
運動性            ：あり
胞子形成          ：なし
グラム染色性      ：陰性
コロニー形状      ：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、淡黄色
（２）生理学的性質
カタラーゼ                      ：陽性
オキシダーゼ                    ：陽性
Ｏ／Ｆ試験                      ：酸化型
硝酸塩の還元                    ：陽性
インドールの生成                ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ        ：陽性
ウレアーゼ                      ：陰性
エスクリン加水分解              ：陰性
ゼラチン加水分解                ：陰性
β−ガラクトシダーゼ            ：陰性
Ｋinｇ’sＢ寒天での蛍光色素産生  ：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖                        ：陽性
L−アラビノース                ：陽性
D−マンノース                  ：陽性
D−マンニトール                ：陽性
N−アセチル−D−グルコサミン    ：陽性
マルトース                        ：陰性
グルコン酸カリウム                ：陽性
n−カプリン酸                    ：陽性
アジピン酸                        ：陰性
dl−リンゴ酸                      ：陽性
クエン酸ナトリウム                ：陽性
酢酸フェニル                      ：陽性
本発明にかかるPHA合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、PHA合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地，酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【０１００】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養，フェドバッチ培養，半連続培養，連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１０１】
前記したようなPHA生産微生物を用いて、PHA合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法などを用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するmcl−PHAが菌体内に合成されることになるが、この場合、一般に、PHA合成酵素は菌体内に形成されるPHAの微粒子に結合して存在するとされている。しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のPHA合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【０１０２】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、アンモニウム塩，硝酸塩等）など、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、MSB培地，Ｅ培地（J．Biol．Chem．，218，97−106（1956）），M9培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるM9培地の組成は以下の通りである。
【０１０３】
Na2HPO4 ：    6．2 ｇ
KH2PO4     ：    3．0 ｇ
NaCl        ：    0．5 ｇ
NH4Cl        ：    1．0 ｇ
（培地1リットル中、pH7．0）
さらに、良好な増殖及びPHA合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を0．3％（v／v）程度添加するのが好ましい。
【０１０４】
（微量成分溶液）
ニトリロ三酢酸：  1．5 ｇ
MｇSO4        ：    3．0 ｇ
MnSO4        ：    0．5 ｇ
NaCl          ：    1．0 ｇ
FeSO4          ：    0．1 ｇ
CaCl2          ：    0．1 ｇ
CoCl2          ：    0．1 ｇ
ZnSO4          ：    0．1 ｇ
CuSO4          ：    0．1 ｇ
AlK（SO4）2    ：    0．1 ｇ
H3BO3      ：    0．1 ｇ
Na2MoO4    ：    0．1 ｇ
NiCl2        ：    0．1 ｇ
（1リットル中）
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 14〜40℃、好ましくは 20〜35℃程度が適当である。
【０１０５】
また、前述のPHA生産菌の持つPHA合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のPHA合成酵素を生産することも可能である。PHA合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、LB培地，M9培地等が挙げられる。また、培養温度は25から37℃の範囲で、好気的に8〜27時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたPHA合成酵素の回収を行うことができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン，アンピシリン，テトラサイクリン，クロラムフェニコール，ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（IPTＧ），テトラサイクリン，インドールアクリル酸（IAA）等が誘導物質として挙げられる。
【０１０６】
PHA合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物などの粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて、金属塩，グリセリン，ジチオスレイトール，EDTA，ウシ血清アルブミン（BSA）などの安定化剤，付活剤を適宜添加して用いることができる。
【０１０７】
PHA合成酵素の分離・精製方法は、PHA合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体を、フレンチプレス，超音波破砕機，リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕したのち、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー，陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質は、N末端やC末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン，血液凝固因子Xa等のプロテアーゼで切断する、pHを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてpTYB1（New Enｇlan Biolab社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はdithiothreitolなどで還元条件として切断する。アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンS−トランスフェラーゼ（ＧST），キチン結合ドメイン（CBD），マルトース結合タンパク（MBP），あるいはチオレドキシン（TRX）等も公知である。ＧST融合タンパク質は、ＧST親和性レジンによって精製することができる。
【０１０８】
PHA合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、3−ヒドロキシアシルCoAがPHA合成酵素の触媒作用により重合してPHAになる過程で放出されるCoAを、5，5’−ジチオビス−（2−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬1：ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）を0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に3．0 mｇ／ml溶解、試薬2：3−ヒドロキシオクタノイルCoAを0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に3．0 mM溶解、試薬3：トリクロロ酢酸を0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0） に10 mｇ／ml溶解、試薬4：5，5’−ジチオビス−（2−ニトロ安息香酸）を0．1 M トリス塩酸バッファー（pH8．0）に2．0 mM溶解。第1反応（PHA合成反応）：試料（酵素）溶液100μlに試薬1を100μl添加して混合し、30℃で1分間プレインキュベートする。ここに、試薬2を100μl添加して混合し、30℃で1〜30分間インキュベートしたのち、試薬3を添加して反応を停止させる。第2反応（遊離CoAの発色反応）：反応停止した第1反応液を遠心分離（15，000×ｇ、10分間）し、この上清500μlに試薬4を500μl添加し、30℃で10分間インキュベートしたのち、412 nmの吸光度を測定する。酵素活性の算出：1分間に1μmolのCoAを放出させる酵素量を1単位（U）とする。
【０１０９】
なお、該酵素により合成されるPHAは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１１０】
＜基材＞
本発明の方法に用いる基材としては、PHA合成酵素を固定化することのできるものであれば、一般的な高分子化合物や無機系固形物、例えば、樹脂，ガラス，金属等から適宜選択して用いることができる。また、PHA合成酵素の固定化方法や、作製した構造体の応用の形態等に応じて、基材の種類や構造を適宜選択して用いることができる。
【０１１１】
例えば、本発明のカプセル構造体における基材（コア）として、スチレン，α−メチルスチレン，β−メチルスチレン，o−メチルスチレン，m−メチルスチレン，p−メチルスチレン，2，4−ジメチルスチレン，p−n−ブチルスチレン，p−tert−ブチルスチレン，p−n−ヘキシルスチレン，p−n−オクチルスチレン，p−n−ノニルスチレン，p−n−デシルスチレン，p−n−ドデシルスチレン，p−メトキシスチレン，p−フェニルスチレンなどのスチレン系重合性モノマー、メチルアクリレート，エチルアクリレート，n−プロピルアクリレート，iso−プロピルアクリレート，n−ブチルアクリレート，iso−ブチルアクリレート，tert−ブチルアクリレート，n−アミルアクリレート，n−ヘキシルアクリレート，2−エチルヘキシルアクリレート，n−オクチルアクリレート，n−ノニルアクリレート，シクロヘキシルアクリレート，ベンジルアクリレート，ジメチルフォスフェートエチルアクリレート，ジエチルフォスフェートエチルアクリレート，ジブチルフォスフェートエチルアクリレート，2−ベンゾイルオキシエチルアクリレートなどのアクリル系重合性モノマー、メチルメタクリレート，エチルメタクリレート，n−プロピルメタクリレート，iso−プロピルメタクリレート，n−ブチルメタクリレート，iso−ブチルメタクリレート，tert−ブチルメタクリレート，n−アミルメタクリレート，n−ヘキシルメタクリレート，2−エチルヘキシルメタクリレート，n−オクチルメタクリレート，n−ノニルメタクリレート，ジエチルフォスフェートエチルメタクリレート，ジブチルフォスフェートエチルメタクリレートなどのメタクリル系重合性モノマー、メチレン脂肪族モノカルボン酸エステル類，酢酸ビニル，プロピオン酸ビニル，ベンゾエ酸ビニル，酪酸ビニル，安息香酸ビニル，ギ酸ビニルなどのビニルエステル類、ビニルメチルエーテル，ビニルエチルエーテル，ビニルイソブチルエーテル等のビニルエーテル類、ビニルメチルケトン，ビニルヘキシルケトン，ビニルイソプロピルケトン等のビニルケトン類などのビニル系重合性モノマー、からなる群より選択された重合性モノマーを重合させて製造された樹脂微粒子、あるいは、上記モノマー系に極性基重合体や着色剤などの各種添加剤を添加して製造された樹脂微粒子、パラフィンワックス，ポリオレフィンワックス，フィッシャートロピッシュワックス，アミドワックス，高級脂肪酸，エステルワックス及びこれらの誘導体又はこれらのグラフトまたはブロック化合物等を含有する微粒子、カオリナイト，ベントナイト，タルク，雲母等の粘土鉱物、アルミナ，二酸化チタン等の金属酸化物、シリカゲル，ヒドロキシアパタイト，リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩、カーボンブラック，酸化銅，二酸化マンガン，アニリンブラック，活性炭，非磁性フェライト，マグネタイトなどの黒色顔料、黄鉛，亜鉛黄，黄色酸化鉄，カドミウムイエロー，ミネラルファストイエロー，ニッケルチタンイエロー，ネーブルスイエロー，ナフトールイエローS，ハンザーイエローＧ，ハンザイエロー10Ｇ，ベンジジンイエローＧ，ベンジジンイエローＧR，キノリンイエローレーキ，パーマネントイエローNCＧ，タートラジンレーキなどの黄色顔料、赤色黄鉛，モリブデンオレンジ，パーマネントオレンジＧTR，ピラゾロンオレンジ，バルカンオレンジ，ベンジジンオレンジＧ，インダスレンブリリアントオレンジRK，インダスレンブリリアントオレンジＧKなどの橙色顔料、ベンカラ，カドミウムレッド鉛丹，硫化水銀，カドミウム，パーマネントレッド4R，リソールレッド，ピラゾロンレッド，ウォッチングレッド，カルシウム塩，レーキレッドC，レーキレッドD，ブリリアントカーミン6B，ブリリアントカーミン3B，エオキシンレーキ，ローダミンレーキB，アリザリンレーキなどの赤色顔料、紺青，コバルトブルー，アルカリブルーレーキ，ビクトリアブルーレーキ，フタロシアニンブルー，無金属フタロシアニンブルー，フタロシアニンブルー一部分塩素化合物，ファーストスカイブルー，インダスレンブルーBCなどの青色顔料、マンガン紫，ファストバイオレットB，メチルバイオレットレーキなどの紫色顔料、酸化クロム，クロムグリーン，ピグメントグリーンB，マラカイトグリーンレーキ，ファイナルイエローグリーンＧなどの緑色顔料、亜鉛華，酸化チタン，アンチモン白，硫化亜鉛などの白色顔料、バライト粉，炭酸バリウム，クレー，シリカ，ホワイトカーボン，タルク，アルミナホワイトなどの体質顔料などを用いることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。コアの形状は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、粒径0．1μmから1．0 mm の範囲内の粒径を有する粒子を用いると良い。さらに、該構造体を電子写真用のカプセルトナーとして用いる場合には、その粒径を3．0μmから10μmの範囲内で選択するとよい。
【０１１２】
また、本発明の積層構造体の基材としては、ポリエチレンテレフタレート（PET），ジアセテート，トリアセテート，セロハン，セルロイド，ポリカーボネート，ポリイミド，ポリビニルクロライド，ポリビニリデンクロライド，ポリアクリレート，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリエステルなどのプラスチックからなるフィルム、ポリビニルクロライド，ポリビニルアルコール，アセチルセルロース，ポリカーボネート，ナイロン，ポリプロピレン，ポリエチレン，テフロン等からなる多孔性高分子膜、木板、ガラス板、木綿，レーヨン，アクリル，絹，ポリエステルなどの布、上質紙，中質紙，アート紙，ボンド紙，再生紙，バライタ紙，キャストコート紙，ダンボール紙，レジンコート紙などの紙を用いることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。なお、前記基材の表面が滑らかなものであっても、凹凸のついたものであっても良いし、透明、半透明、不透明のいずれであっても良い。また、これら前記基材の中より2種類以上を互いに張り合わせたものであっても良い。
【０１１３】
＜構造体の作製＞
本発明の構造体の製造方法には、基材にPHA合成酵素を固定化する工程と、該固定化PHA合成酵素に3−ヒドロキシアシルCoAを反応させてPHAを合成させる工程とを含むものである。
【０１１４】
基材にPHA合成酵素を固定化する方法としては、該酵素の活性が保持され得るものであり、かつ、所望の基材において適用可能なものであれば、通常行われている酵素固定化方法の中から任意に選択して用いることができる。例えば、共有結合法，イオン吸着法，疎水吸着法，物理的吸着法，アフィニティ吸着法，架橋法，格子型包括法などを例示することができるが、特にイオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法が簡便である。
【０１１５】
PHA合成酵素などの酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン，ヒスチジン，アルギニン，アスパラギン酸，グルタミン酸などの遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，メチオニン，トリプトファン，フェニルアラニン，プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する固体表面に吸着させることが可能である。
【０１１６】
主にイオン吸着法によってPHA合成酵素を固定化する方法では、イオン性官能基を表面に発現しているコアを用いれば良く、例えば、カオリナイト，ベントナイト，タルク，雲母等の粘土鉱物、アルミナ，二酸化チタン等の金属酸化物、シリカゲル，ヒドロキシアパタイト，リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩などをコアとして用いることができる。また、これらを主要な成分とする無機顔料，イオン交換樹脂，キトサン，ポリアミノポリスチレン等の、イオン性官能基を有する重合体もイオン吸着性コアとして用いることができる。
【０１１７】
また、主に疎水吸着によってPHA合成酵素を固定化する方法では、表面が非極性であるコアを用いればよく、例えば、スチレン系ポリマー，アクリル系ポリマー，メタクリル系ポリマー，ビニルエステル類，ビニル系ポリマーなど、イオン性官能基を表面に発現していない、もしくは疎水性官能基を表面に発現している多くの重合体をコアとして用いることができる。芳香環を複数有するアゾ顔料や縮合多環のフタロシアニン系顔料，アントラキノン系顔料等の有機顔料，カーボンブラックなどは疎水吸着性である。
【０１１８】
イオン吸着法または疎水吸着法によるPHA合成酵素のコアへの固定化は、該酵素とコアとを所定の反応液中で混合することによって達成される。このとき、該酵素がコアの表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１１９】
反応液のpHや塩濃度、温度によってコアおよびPHA合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化するので、用いるコアの性質に合わせて、酵素活性上許容される範囲内で溶液の調整を行うことが望ましい。例えば、コアが主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、コアとPHA合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、pHを変える事により、両者の反対電荷を増やすことができる。コアが主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、コアやPHA合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した溶液条件を設定をすることもできる。さらに、コアとPHA合成酵素との吸着量を直接測定して条件を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、コアが分散された溶液に濃度既知のPHA合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のPHA合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いればよい。
【０１２０】
イオン吸着法や疎水吸着法によって酵素を固定化し難いコア材質の場合は、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を考慮すれば共有結合法によってもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有する固体粒子をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基，アミノ基を有する固体粒子と酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有する固体粒子と酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、臭化シアンで活性化した多糖類粒子と酵素のアミノ基を反応させる方法、固体粒子のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基，アミノ基を有する固体粒子と酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有する固体粒子と酵素のチオール基との間で交換反応させる方法などがある。
【０１２１】
また、アフィニティ吸着によって固体粒子に吸着してもよい。アフィニティ吸着とは、生体高分子とそれに特異的な親和力を示す、リガンドと呼ばれる特定物質との間の生物学的吸着で、例えば、酵素と基質、抗体と抗原、レセプターとアセチルコリン等の情報物質、mRNAとtRNAなどがある。一般に、アフィニティ吸着を利用して酵素を固定化する方法として、酵素の基質や反応生成物、拮抗阻害剤、補酵素、アロステリックエフェクター等をリガンドとして固体に結合させ、この固体に酵素を添加してアフィニティ吸着させる方法をとる。しかしながら、PHA合成酵素においては、例えば基質である3−ヒドロキシアシルCoAをリガンドとして用いた場合、該酵素のPHA合成を触媒する活性部位がリガンドとの結合により塞がれてしまうため、PHAを合成できなくなるという問題を生じる。しかしながら、他の生体高分子をPHA合成酵素に融合させ、該生体高分子のリガンドをアフィニティ吸着に用いることによって固定化後もPHA合成酵素のPHA合成活性を維持することができる。PHA合成酵素と生体高分子との融合は遺伝子工学的手法によって行っても良く、またPHA合成酵素に化学的に結合させてもよい。用いる生体高分子としては、対応するリガンドが入手容易で、そのリガンドがコアに容易に結合できるものであればいかなるものでも構わないが、遺伝子組換えによって融合物を発現させる場合には、タンパク質であることが好ましい。具体的には、形質転換によってＧSTを発現する遺伝子配列にPHA合成酵素の遺伝子配列を繋げた大腸菌を用いて、ＧSTとPHA合成酵素との融合タンパク質を生産し、これをＧSTのリガンドであるグルタチオンを結合したSepharoseに添加することで、PHA合成酵素をSepharoseにアフィニティ吸着させることができる。
【０１２２】
また、基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチドをPHA合成酵素に融合して提示させ、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列のペプチド部分と、基材との結合性に基づいて、該基材表面にPHA合成酵素を固定化することもできる。
【０１２３】
基材に対する結合能を有するアミノ酸配列は、例えばランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定することができる。特に例えばM13 系ファージの表面蛋白質（例えばgeneIII 蛋白質）のN末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージディスプレイペプチドライブラリーを好適に用いることが出来るが、この場合基材に対する結合能を有するアミノ酸配列を決定するには、次のような手順をとる。すなわち、基材あるいは該基材を構成する少なくとも一成分に対してファージディスプレイペプチドライブラリーを添加することによって接触させ、その後洗浄により結合ファージと非結合ファージを分離する。基材結合ファージを酸などにより溶出し緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の基材に結合能のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
【０１２４】
上記方法により得られた基材に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、PHA合成酵素に融合して利用される。基材に対する結合能を有するペプチドはPHA合成酵素のN末端あるいはC末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。スペーサー配列としては、約3〜約400アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、PHA合成酵素が機能するのを妨害せず、また、PHA合成酵素が基材に結合するのを妨害しないものである。
【０１２５】
上記方法により作製された固定化酵素は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。
【０１２６】
3−ヒドロキシアシルCoAの重合によりPHAが合成される反応において放出されるCoA量が1分間に1μmolとなるPHA合成酵素量を1単位（U）としたとき、基材に固定する酵素の量は、例えば基材がカプセル構造体のコアである場合、基材1 ｇあたり10 単位（U）から1，000単位（U）、望ましくは50 単位（U）から500単位（U） の範囲内に設定すると良い。
【０１２７】
前記の固定化酵素は所望のPHAの原料となる3−ヒドロキシアシルCoAを含む水系反応液中に投入され、基材表面のPHA合成酵素によりPHAが合成されることにより、基材がPHAにより被覆された構造体を形成する。上記水系反応液は、PHA合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整された反応系として構成されるべきであり、例えば通常、pH5．5からpH9．0、好ましくはpH7．0からpH 8．5となるよう、緩衝液により調製する。ただし、使用するPHA合成酵素の至適pHやpH安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。緩衝液の種類は、使用するPHA合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するpH領域等に応じて適宜選択して用いることができるが、例えば、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、具体的には、酢酸バッファー，リン酸バッファー，リン酸カリウムバッファー，3−（N−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（MOPS）バッファー，N−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−3−アミノプロパンスルフォン酸（TAPS）バッファー，トリス塩酸バッファー，グリシンバッファー，2−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（CHES）バッファーなどを用いると良い。緩衝液の濃度も、使用するPHA合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常5．0 mMから1．0 M、好ましくは0．1 Mから0．2 Mの濃度のものを使用すると良い。反応温度は、使用するPHA合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、4℃から50℃、好ましくは20℃から40℃に設定すると良い。ただし、使用するPHA合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。反応時間は、使用するPHA合成酵素の安定性等にもよるが、通常、1分間から24時間、好ましくは30分間から3時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の3−ヒドロキシアシルCoA濃度は、使用するPHA合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で適宜設定するものであるが、通常、0．1 mMから1．0 M、好ましくは0．2 mMから0．2 Mの範囲内で設定すると良い。なお、反応液中における3−ヒドロキシアシルCoA濃度が高い場合、一般に、反応系のpHが低下する傾向にあるため、3−ヒドロキシアシルCoA濃度を高く設定する場合は、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
【０１２８】
また、上記工程において、水系反応液中の3−ヒドロキシアシルCoAの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、構造体の形状が粒状であれば内側から外側に向かう方向に、構造体の形状が平面状であれば垂直方向に、基材を被覆するPHAのモノマーユニット組成を変化させることができる。
【０１２９】
このモノマーユニット組成の変化した構造体の形態として、例えば、PHA被膜の組成変化が連続的で、内側から外側に向かう方向もしくは垂直方向に組成の勾配を形成した１層のPHAが基材を被覆した形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、PHAを合成しながら反応液中に別組成の3−ヒドロキシアシルCoAを添加するなどの方法によればよい。
【０１３０】
また別の形態として、PHA被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるPHAが基材を多層に被覆した形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある3−ヒドロキシアシルCoAの組成でPHAを合成した後、遠心分離などによって調製中の構造体を反応液からいったん回収し、これに異なる3−ヒドロキシアシルCoAの組成からなる反応液を再度添加するなどの方法によればよい。
【０１３１】
上記反応により得られた構造体は、必要に応じて、洗浄工程に供する。構造体の洗浄方法は、該構造体製造の目的上好ましくない変化を、該構造体に及ぼすものでない限り、特に限定はされない。構造体が、基材をコアとしPHAを外被とするカプセル構造体である場合は、例えば、遠心分離によって該構造体を沈殿させ、上清を除去することによって、反応液に含まれる不要成分を除去することができる。ここに水，緩衝液，メタノール等の該PHAが不溶である洗浄剤を添加し、遠心分離をする操作を行うことにより、さらに洗浄することもできる。また、遠心分離の替わりに、濾過等の手法を用いても良い。一方、構造体が、平板状の基材をPHAで被覆した構造体である場合は、例えば、上記洗浄剤に浸漬するなどして洗浄することができる。さらに、上記構造体は、必要に応じて、乾燥工程に供することができる。さらに該構造体に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０１３２】
例えば、基材を被覆したPHAに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えた構造体を得ることができる。
【０１３３】
例えば、該PHAにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたPHAが、基材の少なくとも一部を被覆した構造体を得ることができる。また、該PHAを架橋化せしめることにより、構造体の機械的強度、耐薬品性、耐熱性などを制御することが可能である。
【０１３４】
化学修飾の方法は、所望の機能・構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定はされないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するPHAを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を、好適な方法として用いることができる。
【０１３５】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能・構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するPHAは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物などを添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０１３６】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、アミノ変性ポリシロキサン（アミノ変性シリコーンオイル）などのアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、J．Amer．Chem．Soc．，78，2278（1956）などに記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加による耐熱性の向上等の効果が期待できる。
【０１３７】
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン化合物，無水コハク酸，2−エチル−4−メチルイミダゾール，電子線照射などによる架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するPHAとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０１３８】
【化５８】
0003684175.tif 000026
【０１３９】
得られた構造体において、基材がPHAで被覆されていることを確認する方法としては、一般には、例えば、ガスクロマトグラフィー等による組成分析と電子顕微鏡等による形態観察とを組み合わせた方法や、飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF−SIMS）とイオンスパッタリング技術を用いて、各構成層のマススペクトルから構造を判定する方法などを用いることができる。しかし、さらに直接的かつ簡便な確認方法として、本発明者らによって新たに開発された、ナイルブルーA染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることもできる。本発明者らは、PHA合成酵素を用いた無細胞系（in vitro）でのPHA合成を簡便に判定できる方法について鋭意検討を続けてきた結果、PHAに特異的に結合して蛍光を発する性質を有する薬剤であり、Appl．Environ．Microbiol．，44，238−241（1982） において微生物細胞（in vivo）でのPHA生産の簡易的判別に用いることができると報告されているナイルブルーAが、適切な使用方法および使用条件の設定によって、無細胞系でのPHA合成の判定にも用いることができることを見出し、上記の方法を完成させた。即ち、本方法では、所定濃度のナイルブルーA溶液を濾過したのち、PHAを含む反応液に混合し、蛍光顕微鏡で一定の波長の励起光を照射しながら観察することにより、合成されたPHAのみから蛍光を発せしめ、これを観察することによって、無細胞系でのPHA合成を簡易に判定することができる。使用した基材が上記条件下で蛍光を発する性質を有するものでない限り、上記方法を本発明の構造体の製造に応用することにより、基材の表面を被覆したPHAを直接的に観察し、評価することができる。
【０１４０】
また、基材を被覆しているPHAの内側から外側に向かう方向もしくは垂直方向の組成分布は、イオンスパッタリング技術と飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF−SIMS）を組み合わせて評価することができる。
【０１４１】
＜構造体の利用＞
本発明の特徴の一つは、通常の有機合成化学的手法では製造が困難であった構造体の製造を可能にしたことであり、従って、従来の有機合成化学的手法で製造されたカプセル構造体や積層構造体にはない優れた特性を付与した構造体を得ることが可能である。例えば、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になる。さらに具体的には、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、従来の有機合成化学的手法では実現が困難であった新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたカプセル構造体や積層構造体等を、極めて簡便なプロセスで製造することが可能になる。
【０１４２】
上記の如き構造体の応用の一例としては、電子写真用高機能カプセルトナーが挙げられる。前述の通り、電子写真用カプセルトナーにおいては、その製造工程が極めて複雑となり、また、製造工程において大量の溶媒類や界面活性剤を使用するなどの課題があった。本発明の方法により、上記の如き課題を解決し、カプセルトナーを簡便に製造できる方法が提供される。さらに、その外被の厚さやモノマーユニット組成等も比較的容易に制御できる。また、特開平8−286416号公報によれば、カプセルトナーの外被にポリエステルなどの極性樹脂を含有させることにより、画質耐久性の向上、帯電の均一化および安定化等の効果が得られるとされているが、本発明の方法により得られるカプセルトナーにおけるPHAからなる外被にも、上記の如き効果が期待できる。さらに、本発明の方法では、様々な官能基を有するPHAを外被として用いることができるため、これら官能基によるトナーの表面物性の制御や、新たな機能性の付与等も可能となる。また、コア部分の製造工程を除けば、その製造において有機溶媒や界面活性剤などをほとんど、あるいは、全く使用せず、かつ、反応条件も極めて温和であるため、製造上の環境負荷を大幅に低減することが可能である。
【０１４３】
本発明の構造体の応用のもう一つの例としては、例えばインクジェット記録方式における記録媒体が挙げられる。前述の通り、該記録媒体においてインク吸収層を基材上に形成させる方法としては、従来は塗抹による方法が一般的であった。本発明の方法によって、上記方法を用いることなく、新たに記録媒体を製造することが可能となる。即ち、酵素を固定化した基材と、例えば、下記化学式［２１］、
【０１４４】
【化５９】
0003684175.tif 000027
【０１４５】
で表される3−ヒドロキシピメリルCoAとを反応させることによって、下記化学式［２２］、
【０１４６】
【化６０】
0003684175.tif 000028
【０１４７】
で表される、PHA、即ち、アニオン性官能基であるカルボキシル基を側鎖に有するPHAをインク受容層として重層した記録媒体を製造することができる。本発明の方法により、従来の手法では製造が困難であった、上記の如き新規機能性記録媒体の製造が可能となるが、従来、このような手法により該記録媒体を製造したとする報告は全くない。
【０１４８】
なお、本発明の構造体およびその利用方法およびその製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は重量基準である。
【０１５０】
（参考例１）  PHA合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
YN2株を100 mlのLB培地（1％ポリペプトン（日本製薬（株）製）、0．5％酵母エキス（Difco社製）、0．5％塩化ナトリウム、pH7．4）で30℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体DNAを分離回収した。得られた染色体DNAを制限酵素HindIIIで完全分解した。ベクターにはpUC18を使用し、制限酵素HindIIIで切断した。末端の脱リン酸処理（Molecular Cloninｇ，1，572，（1989）; Cold Sprinｇ Harbor Laboratory出版）ののち、DNAライゲーションキットVer．II（宝酒造（株）製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体DNAのHindIII完全分解断片とを連結した。この染色体DNA断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Escherichia coli）HB101株を形質転換し、YN2株のDNAライブラリーを作製した。次に、YN2株のPHA合成酵素遺伝子を含むDNA断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：2および配列番号：3の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行った。PCR増幅されてきたDNA断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系AlkPhosDirect（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）を利用して行った。得られた標識化プローブを用いて、YN2株の染色体DNAライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってPHA合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、PHA合成酵素遺伝子を含むDNA断片を得ることができた。ここで取得した遺伝子DNA断片を、不和合性グループであるIncP、IncQ、あるいはIncWの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターpBBR122（Mo Bi Tec）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイYN2ml株（PHA合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、YN2ml株のPHA合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子DNA断片は、シュードモナス・チコリアイYN2ml株内において、PHA合成酵素に翻訳可能な、PHA合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１５１】
このDNA断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：4および配列番号：5で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのPHA合成酵素遺伝子について、染色体DNAをテンプレートとしてPCRを行い、PHA合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。即ち、配列番号：4で示される塩基配列のPHA合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：6）および下流側プライマー（配列番号：7）、配列番号：5で示される塩基配列のPHA合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：8）および下流側プライマー（配列番号：9）をそれぞれ合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。
【０１５２】
これらのプライマーを用いて、配列番号：4および配列番号：5で示される塩基配列それぞれについてPCRを行い、PHA合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（LA−PCRキット；宝酒造（株）製）。次に、得られたPCR増幅断片および発現ベクターpTrc99Aを制限酵素HindIIIで切断し、脱リン酸化処理（Molecular Cloninｇ，1巻，572頁，1989年；Cold Sprinｇ Harbor Laboratory出版）したのち、この発現ベクターpTrc99Aの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたPHA合成酵素遺伝子の完全長を含むDNA断片を、DNAライゲーションキットVer．II（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【０１５３】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Escherichia coli HB101：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：４の遺伝子DNAを保持する組換えプラスミドをpYN2−C1、配列番号：５の遺伝子DNAを保持する組換えプラスミドをpYN2−C2とした。pYN2−C1、pYN2−C2で大腸菌（Escherichia coli HB101fB fadB欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、pYN2−C1組換え株、pYN2−C2組換え株を得た。
【０１５４】
（参考例２）  PHA合成酵素の生産１
pYN2−C1に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：10）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：11）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pYN2−C1をテンプレートとしてPCRを行い、上流にBamHI制限部位、下流にXhoI制限部位を有するPHA合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（LA−PCRキット；宝酒造（株）製）。
【０１５５】
同様にpYN2−C2に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：12）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：13）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pYN2−C2をテンプレートとしてPCRを行い、上流にBamHI制限部位、下流にXhoI制限部位を有するPHA合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（LA−PCRキット；宝酒造（株）製）。
【０１５６】
精製したそれぞれのPCR増幅産物をBamHIおよびXhoIにより消化し、プラスミドpＧEX−6P−1（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（JM109）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Miniprep（Wizard Minipreps DNA Purification Systems、PROMEＧA社製）を用いて大量に調製したプラスミドDNAをBamHI、XhoIで処理して得られるDNA断片により行った。得られた菌株をLB−Amp培地10 mlで一晩プレ・カルチャーした後、その0．1 mlを、10 mlのLB−Amp培地に添加し、37℃、170 rpmで3時間振とう培養した。その後IPTＧを添加 （終濃度 1 mM） し、37℃で4から12時間培養を続けた。
【０１５７】
IPTＧ 誘導した大腸菌を集菌（8，000×ｇ， 2分、4℃）し、1／10 量の 4℃ リン酸緩衝生理食塩水（PBS；8 ｇ NaCl，1．44 ｇ Na2HPO4，0．24 ｇ KH2PO4，0．2 ｇ KCl，1，000 ml精製水）に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 （8，000×ｇ， 10分、4℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS−PAＧEで確認した後、誘導され発現されたＧST融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４B（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）で精製した。使用するグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のPBSで3回洗浄（8，000×ｇ、１分、４℃）した後、4％ウシ血清アルブミン含有PBSを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のPBSで2回洗浄し、1／2量のPBSに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース 40μlを、無細胞抽出液1 ml に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧST−YN2−C1およびＧST−YN2−C2をグルタチオンセファロースに吸着させた。吸着後、遠心（8，000×ｇ、1分、4℃）してグルタチオンセファロースを回収し、400μlのPBSで3回洗浄した。その後、10 mMグルタチオン40μlを添加し、4℃で1時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（8，000×ｇ、2分、4℃）して上清を回収した後PBSに対して透析し、ＧST融合タンパク質を精製した。SDS−PAＧEにより、シングルバンドを確認した。
【０１５８】
各ＧST融合タンパク質500μｇをPreScissionプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製、5U）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧSTとを除去した。フロースルー分画をさらに、PBSで平衡化したセファデックスＧ200カラムにかけ、発現タンパク質YN2−C1およびYN2−C2の最終精製物を得た。SDS−PAＧEによりそれぞれ60．8kDa、および61．5kDaのシングルバンドを確認した。
【０１５９】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんAB−1100、アトー（株）製）を用いて濃縮し、10 U／mlの精製酵素溶液を得た。
【０１６０】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０１６１】
【表１】
表１
0003684175.tif 000029
【０１６２】
（参考例３）  PHA合成酵素の生産２
P91株、H45株、YN2株またはP161株を、酵母エキス（Difco社製）0．5％、オクタン酸0．1％とを含むＭ９培地200mlに植菌して、30℃、125ストローク／分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）によって回収し、0．1M トリス塩酸バッファー（pH8．0） 200 mlに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を0．1M トリス塩酸バッファー（pH8．0） 2．0 mlに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕したのち、遠心分離（12，000×ｇ、4℃、10分間）して上清を回収して粗酵素を得た。
【０１６３】
各精製酵素活性は前述の方法で測定し、その結果を表２に示した。
【０１６４】
【表２】
表２
0003684175.tif 000030
【０１６５】
（実施例１）  カプセル構造体の作製１
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１６６】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０１６７】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１６８】
対照として、0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）49質量部にアルミナ粒子1質量部を添加し、30℃で2．5時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーAで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０１６９】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧC−MS，島津QP−5050、EI法）で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図１に示す通り、該PHAは3−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるPHAであることが確認された。
【０１７０】
さらに、該PHAの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧPC；東ソーHLC−8020、カラム；ポリマーラボラトリーPLｇel MIXED−C（5μm）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍn＝21，000、Ｍｗ＝40，000であった。
【０１７１】
（実施例２）  カプセル構造体の作製２
pYN2−C2組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振盪してPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１７２】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０１７３】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１７４】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧC−MS，島津QP−5050、EI法）で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、実施例１の結果と同様に、該PHAは3−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるPHAであることが確認された。
【０１７５】
（実施例３）  カプセル構造体の作製３
YN2，H45株，P91株またはP161株由来のPHA合成酵素の粗酵素99質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１７６】
上記の各固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、それぞれ30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０１７７】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、いずれの固定化酵素の反応液においても、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はいずれも、PHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１７８】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧC−MS，島津QP−5050、EI法）で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、実施例１の結果と同様に、該PHAは3−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるPHAであることが確認された。
【０１７９】
（実施例４）  カプセル構造体の作製４
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１８０】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシ−5−フェニルバレリルCoA（Reformatsky反応により得られた3−ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０１８１】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１８２】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧC−MS，島津QP−5050、EI法）で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図２に示す通り、該PHAは3−ヒドロキシ−5−フェニル吉草酸ユニットからなるPHAであることが確認された。
【０１８３】
さらに、該PHAの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧPC；東ソーHLC−8020、カラム；ポリマーラボラトリーPLｇel MIXED−C（5μm）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍn＝16，000、Ｍｗ＝36，000であった。
【０１８４】
（実施例５）  カプセル構造体の作製５
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１８５】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）バレリルCoA（Reformatsky反応により得られた3−ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０１８６】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１８７】
さらに、該粒子の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧC−MS，島津QP−5050、EI法）で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図３に示す通り、当該PHAは3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）吉草酸をモノマーユニットとするPHAであることが確認された。
【０１８８】
（実施例６）カプセル構造体の作製６
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部に沈降法によって粒径をそろえたアルミナ粒子（体積平均粒子径1．45μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１８９】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０１９０】
反応後、上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１９１】
また、このカプセル構造体を遠心分離（10,000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、乾燥処理後、この粒状体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF−SIMS ＩＶ、CAMECA製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面はポリヒドロキシオクタノエートのホモポリマーで構成されていることがわかった。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体表面を少しずつ削りながら同様にTOF−SIMSによりマススペクトルを測定していったが、いずれもポリヒドロキシオクタノエートのホモポリマーで構成されていた。これより、本比較例のカプセル構造体は、親水性の無機粒子を直接疎水性のポリヒドロキシオクタノエートのホモポリマーで被覆したカプセル構造体であることがわかった。
【０１９２】
ここで、該PHAの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧPC；東ソーHLC−8020、カラム；ポリマーラボラトリーPLｇel MIXED−C（5μm）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍn＝23，000、Ｍｗ＝42，000であった。
【０１９３】
（実施例７）  カプセル構造体の作製７
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部に沈降法によって粒径をそろえたアルミナ粒子（体積平均粒子径1．45μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０１９４】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシピメリルCoA（J．Bacteriol．，182，2753−2760（2000） に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で１０分間緩やかに振盪した。次いで、30℃で緩やかに振盪しながらこの反応液に（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を含む0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）をマイクロチューブポンプ（東京理化器械社製MP−3N）を用いて1分間に１質量部の割合で添加した。さらに１時間３０分後、生成した粒状体を遠心分離（10,000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、上清を除いた後、この粒状体に（R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）1質量部、ウシ血清アルブミン（Sigma社製）0．1質量部を含む0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）を２５質量部添加し、30℃で２０分間緩やかに振盪した。
【０１９５】
反応後、上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０１９６】
また、このカプセル構造体を遠心分離（10,000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、乾燥処理後、この粒状体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF−SIMS ＩＶ、CAMECA製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面はポリヒドロキシオクタノエートのホモポリマーで構成されていることがわかった。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体表面を少しずつ削りながら同様にTOF−SIMSによりマススペクトルを測定していったところ、3−ヒドロキシオクタン酸と3−ヒドロキシピメリン酸の共重合体（モル比２１：１）が現れ、粒状体内部にいくにつれて前記共重合体における３−ヒドロキシオクタン酸の組成比率が次第に減少し、逆に３−ヒドロキシピメリン酸の組成比率が増加して最終的にポリヒドロキシピメレートのホモポリマーに変化することが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、親水性の粒状基材を、親水性官能基を有するポリヒドロキシピメレートで被覆し、その上を親水性官能基を有する3−ヒドロキシピメリン酸と疎水性官能基を有する3−ヒドロキシオクタン酸の共重合体によって、表層に至るにつれて3−ヒドロキシオクタン酸の組成比率を高めながら被覆し、さらに最表層をポリヒドロキシオクタノエートのホモポリマーで被覆したカプセル構造体であることがわかった。
【０１９７】
ここで、該PHAの平均分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧPC；東ソーHLC−8020、カラム；ポリマーラボラトリーPLｇel MIXED−C（5μm）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍn＝21，000、Ｍｗ＝40，000であった。
【０１９８】
（実施例８）  実施例６及び実施例７の評価
実施例６、実施例７のカプセル構造体と、比較例として沈降法によって粒径をそろえたアルミナ粒子（体積平均粒子径1．45μm）それぞれ１質量部を純水１０質量部に添加し、そのまま静置した場合と、ボルテックス・ミキサーによって５分間激しく攪拌した場合とで、カプセル構造体の体積平均粒子径及び３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を測定した。測定はレーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０；日機装社製）を用いて行い、攪拌を行わず静置した場合の結果を表３に、攪拌した場合の結果を表４に示した。
【０１９９】
【表３】
表３
0003684175.tif 000031
【０２００】
【表４】
表４
0003684175.tif 000032
その結果、攪拌を行わなかった場合、実施例６、実施例７のカプセル構造体の体積平均粒子径は、貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていることがわかった。一方、比較例のカプセル構造体の貯蔵後の体積平均粒子径は、貯蔵前と比較して増大した。
【０２０１】
また、攪拌を行った場合は、実施例７のカプセル構造体の体積平均粒子径は、貯蔵前後でほぼ同等の値を示したが、実施例６のカプセル構造体の貯蔵後の体積平均粒子径は、貯蔵前と比較してやや増大した。比較例は攪拌を行わなかった場合と同様の結果を示した。
【０２０２】
また、実施例６、実施例７の、攪拌を行った場合の貯蔵後のカプセル構造体を光学顕微鏡で観察したところ、実施例７では各カプセル構造体が良好に分散している様子が見られたが、実施例６ではカプセル構造体の凝集が見られ、さらに被覆したPHAが剥離しているカプセル構造体が観察された。
【０２０３】
以上より、無機基材を無機基材と親和性の高い親水性の官能基を有するPHAで被覆し、その上を親水性のPHAモノマーユニットと疎水性のPHAモノマーユニットの共重合体によって、表層に至るにつれて疎水性のPHAモノマーユニットの組成比率を高めながら被覆することで、無機基材をより安定的に内包できる疎水性PHAカプセルを作製できることがわかった。
【０２０４】
（実施例９）  カプセル構造体の作製８
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０２０５】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoA（3−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのReformatsky反応で得られた3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）0．8質量部、（R，S）−3−ヒドロキシ−7，8−エポキシオクタノイルCoA（Int．J．Biol．Macromol．，12，85−91（1990）に記載の方法で合成した3−ヒドロキシ−7−オクテン酸の不飽和部分を3−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）0．2質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪して試料1を得た。
【０２０６】
比較対照として、（R，S）−3−ヒドロキシ−7，8−エポキシオクタノイルCoAを、3−ヒドロキシオクタノイルCoAに変更する以外は、上記と同様の方法で試料2を得た。
【０２０７】
上記の試料10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、いずれの試料においても、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０２０８】
対照として、0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）49質量部にアルミナ粒子1質量部を添加し、30℃で2．5時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーAで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０２０９】
さらに、試料の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。この抽出液について1H−NMR分析を行った（使用機器：FT−NMR：Bruker DPX400、測定核種：1H，使用溶媒：重クロロホルム（TMS入り））。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％を表５に示す。
【０２１０】
【表５】
表５  カプセル構造体の外被PHAの組成（1H−NMR、ユニット％）
0003684175.tif 000033
【０２１１】
上記の試料1を50質量部遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）してカプセル構造体を回収し、精製水50質量部に懸濁する操作を3回繰返したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン0．5質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した（これを試料3とする）。さらに、試料3を70℃で12時間反応させた（これを試料4とする）。
【０２１２】
上記試料3及び試料4をクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出し、真空乾燥によりクロロホルムを除去し、示差走査熱量計（DSC；パーキンエルマー社製、Pyris 1、昇温：10℃／分）装置で測定を行った。その結果、試料3では90℃付近に明確な発熱ピークがみられ、ポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示される。一方、試料4では明確なヒートフローは見られず、架橋反応がほぼ完了していることが示される。
【０２１３】
さらに、同様のサンプルにつき、赤外吸収を測定した（FT−IR；パーキンエルマー社製、1720X）。その結果、試料3で見られたアミン（3340 cm-1付近）及びエポキシ（822 cm-1付近）のピークが試料4では消失している。
【０２１４】
以上の結果より、側鎖にエポキシユニットをもつPHAとヘキサメチレンジアミンを反応させることにより、架橋ポリマーが得られることが明らかとなった。
【０２１５】
一方、比較対照として試料2について同様の評価を行ったが、前記の如き、ポリマー同士の架橋を明確に示す評価結果は得られなかった。
【０２１６】
（実施例１０）  カプセル構造体の作製９
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）10質量部にアルミナ粒子（粒径0．12μm〜135μm）1質量部、PBS 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してPHA合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０２１７】
上記固定化酵素を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）48質量部に懸濁し、（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoA（3−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのReformatsky反応で得られた3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して3-ヒドロキシ-5-フェノキシ吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）0．8質量部、（R，S）−3−ヒドロキシ−7，8−エポキシオクタノイルCoA（Int．J．Biol．Macromol．，12，85−91（1990）に記載の方法で合成した3−ヒドロキシ−7−オクテン酸の不飽和部分を3−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）0．2質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）0．1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪して試料5を得た。
【０２１８】
上記の試料5の10μlをスライドグラス上に採取し、1％ナイルブルーA水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、いずれの試料においても、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はPHAにより表面を被覆されていることがわかった。
【０２１９】
対照として、0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）49質量部にアルミナ粒子1質量部を添加し、30℃で2．5時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーAで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０２２０】
さらに、試料5の一部を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すPHAを抽出した。この抽出液について1H−NMR分析を行った（使用機器：FT−NMR：Bruker DPX400、測定核種：1H，使用溶媒：重クロロホルム（TMS入り））。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸83％、3−ヒドロキシ−7，8−エポキシオクタン酸17％であった。
【０２２１】
上記の試料5を50質量部遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）してカプセル構造体を回収し、精製水50質量部に懸濁する操作を3回繰返したのち、凍結乾燥により水を除去した。ここに、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルTSF4700、ＧE東芝シリコーン（株）製）を10質量部添加し、70℃で2時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（10，000×ｇ、4℃、20分間）する操作を繰返すことにより洗浄し乾燥することで、ポリシロキサンのグラフト鎖を有するカプセル構造体を得た。
【０２２２】
（実施例１１）  積層構造体の作製
縦10 mm×横10 mm×厚さ１mmの多孔質ガラスシートを１％グルタルアルデヒドに１時間浸漬し、純水洗浄後、pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）に30℃で30分間浸漬して、該酵素を固定化した。未反応のPHA合成酵素をPBSで洗浄して除去し、固定化酵素を得た。
【０２２３】
30 mM （R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）、0．1％ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）を含む0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）に上記固定化酵素を浸漬し、30℃で2時間緩やかに振盪した。反応終了後、0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）で洗浄して、未反応物等を除去した。
【０２２４】
反応後のガラスシートを1％ナイルブルーA水溶液で染色し、蛍光顕微鏡（330〜380 nm励起フィルタ、420 nmロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、ガラスシートの表面に蛍光が認められたことから、該粒子はガラスシートからなる基材がPHAからなる膜で被覆された積層構造体であることがわかった。
【０２２５】
さらに、該積層構造体を真空乾燥したのち、クロロホルムに浸漬し、60℃で20時間攪拌して被覆層を成すPHAを抽出した。抽出液を孔径 0．45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧC−MS，島津QP−5050、EI法）で分析し、PHAモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図４に示す通り、当該PHAは3−ヒドロキシオクタン酸をモノマーユニットとするPHAであることが確認された。
【０２２６】
（実施例１２）  カプセルトナーの製造
まず、コアとして、下記の方法で重合体微粒子を製造した。イオン交換水710質量部に0．1M Na3PO4水溶液450質量部を投入し、60℃に加温した後、TK式ホモミキサー（特殊機化工（株）製）を用いて、12，000 rpmにて攪拌した。これに1．0M CaCl2水溶液68質量部を徐々に添加し、Ca3（PO4）2を含む水系媒体を得た。次に、スチレンモノマー165質量部、n−ブチルアクリレート35質量部、銅フタロシアニン顔料12質量部、不飽和ポリエステル（フマル酸−プロピレンオキサイド変性ビスフェノールA）10質量部、エステルワックス60質量部。これに重合開始剤2，2’−アゾビス（2，4−ジメチルバレロニトリル）10質量部を溶解し、重合性単量体組成物を調製し、これを60℃に加温し、TK式ホモミキサー（特殊機化工（株）製）を用いて、12，000 rpmで均一に溶解、分散した。前記水系媒体中に上記重合性単量体組成物を投入し、60℃，Ｎ2雰囲気下においてTK式ホモミキサーにて10，000 rpmで10分間攪拌し造粒した。その後、パドル攪拌翼で攪拌しつつ、80℃に昇温し、10時間反応させた。重合反応終了後、該重合体の懸濁液を冷却し、3．6質量部のNa2CO3を添加してpH11とした。次いで、スチレンモノマー82質量部、n−ブチルアクリレート12質量部、不飽和ポリエステル（フマル酸−プロピレンオキサイド変性ビスフェノールA）0．05質量部からなる重合性単量体系に重合開始剤として過硫酸カリウム0．3質量部を添加溶解させた溶液を滴下したのち、80℃に昇温し更に6時間重合させた。次いで、これを常温まで冷却し、塩酸を加えてリン酸カルシウム溶解除去させたのち、ろ過、乾燥の各工程を経てトナーのコア成分微粒子を得た。
【０２２７】
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）100質量部に対し、上記微粒子10質量部、PBS 390質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてPHA合成酵素を該微粒子表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０２２８】
上記固定化酵素10質量部を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）480質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）バレリルCoA（Reformatsky反応により得られた3−ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）10質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０２２９】
反応終了後、10，000×ｇで10分間遠心分離し、沈殿を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）1000質量部に懸濁し、再び遠心分離する操作を3回繰り返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経てカプセル構造体を得た。得られたカプセル構造体10質量部に対して、疎水性酸化チタン微粉末0．12質量部を外添し、カプセル構造体表面に酸化チタン微粉末を有するカプセルトナーAを得た。
【０２３０】
一方、対象として、前記コア成分微粒子10質量部に対して、疎水性酸化チタン微粉末0．12質量部を外添し、トナー表面に酸化チタン微粉末を有するトナーBを得た。
【０２３１】
それぞれのカプセルトナー6質量部に対して、アクリル樹脂で被覆したフェライトキャリア144質量部を混合して二成分現像剤とした。
【０２３２】
上記の現像剤を用いて、市販の複写機NP6000（キヤノン（株）製）にて23℃、60％RH環境下、画像を複写し、その画像耐久性、トナー飛散、かぶり等について評価した。その結果、表６に示す通り、カプセルトナーAを使用して調製した現像剤では、100，000枚の耐久においても画像濃度低下、トナー飛散、かぶり等の画像欠陥の発生は認められず良好な画質耐久性を示した。また、帯電性についてトリボ値を測定したところ、初期 −33 mC／kｇ、耐久後 −31 mC／kｇと安定していた。さらに、定着に関しても問題は認められなかった。一方、カプセルトナーBを使用して調製した現像剤では、200枚の耐久においても画像濃度低下、トナー飛散、かぶり等の画像欠陥の発生が認められ、オリジナル原稿に忠実な高精細な画質は得られなかった。また、トリボ値を測定したところ、初期 −24 mC／kｇ、耐久後 −18 mC／kｇと不均一で、安定のない帯電性を示していた。さらに、定着性試験においては、耐高温オフセット性に劣るものであった。
【０２３３】
【表６】
表６
0003684175.tif 000034
【０２３４】
備考  表中の記号；○：良好、△：やや不良、×：不良
（実施例１３）  カプセルトナーの製造
pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10 U／ml）100質量部に対し、実施例１２と同様の方法で作製したトナーのコア成分微粒子10質量部、PBS 390質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてPHA合成酵素を該微粒子表面に吸着させた。これを遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）し、沈殿をPBS溶液に懸濁し、再度遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）して固定化酵素を得た。
【０２３５】
上記固定化酵素10質量部を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）480質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）バレリルCoA（Reformatsky反応により得られた3−ヒドロキシフェニル吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）10質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）1質量部を添加し、30℃で１時間30分緩やかに振盪した。反応終了後、10，000×ｇで10分間遠心分離し、沈殿を回収した。
【０２３６】
次いでこの沈殿を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）480質量部に懸濁し、（R）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoA（J．Org．Chem．，55，1490−1492（1990）に記載の方法で合成した3-フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるReformatsky反応で得られた3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997） に記載の方法で調製）５質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）1質量部を添加し、30℃で30分緩やかに振盪した。
【０２３７】
反応終了後、10，000×ｇで10分間遠心分離し、沈殿を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）1000質量部に懸濁し、再び遠心分離する操作を3回繰り返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経てカプセル構造体を得た。
【０２３８】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF−SIMS ＩＶ、CAMECA製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体の表面はポリ−3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸で構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りながら同様にTOF-SIMSによりマススペクトルを測定していったところ、ある時点でカプセル構造体を構成するポリマーがポリ−3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）吉草酸に置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、コア微粒子を被覆した、ガラス転移温度の低いポリ−3−ヒドロキシ−5−（4−フルオロフェニル）吉草酸の上を、ガラス転移温度の比較的高いポリ−3−ヒドロキシ-5-フェノキシ吉草酸が被覆した、所望のカプセル構造体であることがわかった。
【０２３９】
このカプセル構造体10質量部に対して、疎水性酸化チタン微粉末0．12質量部を外添し、カプセル構造体表面に酸化チタン微粉末を有するカプセルトナーCを得た。
【０２４０】
このカプセルトナー6質量部に対して、アクリル樹脂で被覆したフェライトキャリア144質量部を混合して二成分現像剤とした。
【０２４１】
上記の現像剤を用いて、実施例７と同様にして市販の複写機NP6000（キヤノン（株）製）にて23℃、60％RH環境下、画像を複写し、その画像耐久性、トナー飛散、かぶり等について評価したところ、実施例７のカプセルトナーAと同様に、良好な性能を示した。
【０２４２】
また、カプセルトナーA、カプセルトナーCの低温定着性の評価を行うために、NP6000と同じ定着器構成を有する外部定着器による定着試験を行った。定着試験の方法としては、幅２ｃｍ、長さ１０ｃｍの短冊を作り、その上の未定着画像を、外部定着器の上部ローラーの温度をモニターしながら短冊の長さ方向にそってローラーを通過させることによって定着させ、得られた定着画像について、短冊の後部にオフセットが見られるか否かで定着性を判断した。その結果、カプセルトナーA、カプセルトナーCとも定着開始温度が９５℃と低く、低温定着性に優れることがわかった。
【０２４３】
さらに、カプセルトナーA、カプセルトナーCの耐ブロッキング性の評価を行うために、５０〜７０℃まで１℃おきに設定した温度下に、上記カプセルトナーをそれぞれ3日間放置した後の凝集性を観察し、各カプセルトナーを前述同様に現像化して画像評価を行った。そして、ハイライト領域のガサツキ具合の変化する点を耐ブロッキング温度とした。その結果、カプセルトナーCの耐ブロッキング温度は６１℃、カプセルトナーAの耐ブロッキング温度は５８℃と、カプセルトナーCは耐ブロッキング性において優れることがわかった。
【０２４４】
以上から、ガラス転移温度の低いPHAによってトナーをカプセル化することで低温定着性を実現することができ、さらにガラス転移温度の低いPHAで被覆されたカプセルをガラス転移温度の高いPHAで被覆することで、低温定着性と耐ブロッキング性を同時に実現できることがわかった。
【０２４５】
（実施例１４）  カプセルトナーの製造
3リットルの四つ口セパラブルフラスコに、還流冷却管、温度計、窒素導入管、撹拌機を取り付け、このフラスコ中に、イオン交換水1200部、ポリビニルアルコール15部、ドデシル硫酸ナトリウム0．1部、スチレンモノマー75部、アクリル酸−ｎ−ブチル25部、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルサリチル酸クロム錯塩5部、銅フタロシアニン5部、2，2−アゾビス（2，4−ジメチルバレロニトリル）6部からなる混合物を投入し、高速攪拌装置TK−ホモミキサーで10，000 rpm、10分間攪拌して造粒した後、回転数を1，000 rpmに減速し、窒素ガスによるバブリングを十分に行った。次に、攪拌装置を三日月形状の攪拌羽根に変更し、緩やかな攪拌と共に、80℃に加熱したオイルバス中で16時間重合した。
【０２４６】
重合反応終了後、反応容器を室温まで冷却した後、分散液を5回のデカンテーションにより洗浄し、濾過、水洗、乾燥して青色の粉体であるコア粒子を得た。前記コア粒子に実施例１２と同様の方法でpYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素を固定化し固定化酵素を得た。
【０２４７】
上記固定化酵素10質量部を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）480質量部に懸濁し、（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoA（3−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのReformatsky反応で得られた3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して3−ヒドロキシ−5−フェノキシ吉草酸を得たのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）8質量部、（R，S）−3−ヒドロキシ−7，8−エポキシオクタノイルCoA（Int．J．Biol．Macromol．，12，85−91（1990）に記載の方法で合成した3−ヒドロキシ−7−オクテン酸の不飽和部分を3−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）2質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０２４８】
反応終了後、上記反応液を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）してカプセル構造体を回収し、精製水100質量部に懸濁する操作を3回繰返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経て青色のカプセル構造体Dを得た。カプセル構造体D 10質量部に対し、解砕処理したBET値360 m2／ｇの疎水性シリカ0．2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してトナーDとした。
【０２４９】
さらに、前記カプセル構造体D 10質量部を精製水に懸濁し、架橋剤としてヘキサメチレンジアミン5質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去し、70℃で12時間反応させた。反応終了後、10，000×ｇで10分間遠心分離し、沈殿を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）1000質量部に懸濁し、再び遠心分離する操作を3回繰り返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経て青色のカプセル構造体Eを得た。カプセル構造体E 10質量部に対し、解砕処理したBET値360 m2／ｇの疎水性シリカ0．2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してトナーEとした。
【０２５０】
作製したトナーの画像評価を行うため、上記で得たトナー6部に対して、平均粒径が35μmのフェライトコアにシリコーン樹脂をコートしたキャリア94部をポリ瓶に入れ、ターブラーミキサーで混合撹拌して二成分現像剤を作製した。そして、この現像剤をカラーレーザー複写機CLC−500（キヤノン（株）製）改造機に搭載し、23℃，60％RH環境下、初期及び1万枚複写後の画像についてSEMで観察し、画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行った。
【０２５１】
画質の評価としては、１画素内でのレーザーのパルス幅変調（PWM）による多値記録により、極小スポットの再現性を顕微鏡観察により評価した。また、１万枚複写後の現像剤を走査電子顕微鏡で観察した。
【０２５２】
また、トナーの耐ブロッキング性の評価を行うために、各種温度条件下に、上記で得たトナーを3日間放置した後の凝集性を観察し、各トナー組成物を前述のキャリアを用いて同様に現像化して画像評価を行った。
【０２５３】
また、定着性の評価としては、CLC−500と同じ定着器構成を有する外部定着器による定着試験を行った。定着試験の方法としては、幅２cm、長さ10cmの短冊を作り、その上の未定着画像を、外部定着器の上部ローラーの温度をモニターしながら短冊の長さ方向にそってローラーを通過させることによって定着させ、得られた定着画像について、短冊の後部にオフセットが見られるか否かで定着性を判断した。
【０２５４】
さらに、前記カプセル構造体の代わりに、前記コア粒子をカプセル化せずにそのまま用いたトナーFを使用して、前記と同様の評価を行った。その結果を表７に示す。
【０２５５】
【表７】
表７
0003684175.tif 000035
備考  表中の記号；◎：非常に良好、○：良好、△：やや不良、×：不良
（ただし、上記の○、△、×は、前記実施例１２における○、△、×とは対応しない。）
（実施例１５）  カプセルトナーの製造３
実施例１４と同様の方法でコア粒子を製造し、pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素を固定化し固定化酵素を得た。この固定化酵素10質量部を0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）480質量部に懸濁し、（R，S）−3−ヒドロキシ−5−フェノキシバレリルCoA（実施例１４と同様の方法で調製）8質量部、（R，S）−3−ヒドロキシ−7，8−エポキシオクタノイルCoA（実施例１４と同様の方法で調製）2質量部、ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）1質量部を添加し、30℃で2時間緩やかに振盪した。
【０２５６】
反応終了後、上記反応液を遠心分離（10，000×ｇ、4℃、10分間）してカプセル構造体を回収し、精製水100質量部に懸濁する操作を3回繰返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経て青色のカプセル構造体Ｇを得た。カプセル構造体Ｇ 10質量部に対し、解砕処理したBET値360 m2／ｇの疎水性シリカ0．2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してトナーＧとした。
【０２５７】
さらに、カプセル構造体Ｇ 10質量部に末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルTSF4700、ＧE東芝シリコーン（株）製）100質量部を添加し、70℃で2時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（10，000×ｇ、4℃、20分間）する操作を繰返すことにより洗浄し乾燥することで、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する青色のカプセル構造体Hを得た。カプセル構造体H 10質量部に対し、解砕処理したBET値360 m2／ｇの疎水性シリカ0．2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してトナーHとした。
【０２５８】
前記トナーは、実施例１４と同様の方法で画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行った。
【０２５９】
また、前記カプセル構造体の代わりに、前記コア粒子をカプセル化せずにそのまま用いたトナーIを使用して、前記と同様の評価を行った。その結果を表８に示す。
【０２６０】
【表８】
表８
0003684175.tif 000036
備考  表中の記号；◎：非常に良好、○：良好、△：やや不良、×：不良
（ただし、上記の○、△、×は、前記実施例１２における○、△、×とは対応しない。）
（実施例１６）  記録媒体の作製
PETフィルム（100Q80D、東レ（株）製）を１％グルタルアルデヒド溶液に１時間浸漬し、純水洗浄後、pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10U／ml）に30℃で30分間浸漬して、該酵素を固定化した。未反応のPHA合成酵素をPBSで洗浄して除去し、固定化酵素を得た。
【０２６１】
30 mM （R）−3−ヒドロキシピメリルCoA（J．Bacteriol．，182，2753−2760（2000） に記載の方法で調製）、0．1％ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）を含む0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）に上記PETフィルムを浸漬し、30℃で30分間緩やかに振盪した。反応終了後、0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）で洗浄して、未反応物等を除去して風乾することによって、イオン性ポリマーであるポリ−（R）−3−ヒドロキシピメリン酸をインク受容層とする、所望の記録媒体を得た。
【０２６２】
比較対照として、pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素のみを含まない系で同様の処理を施したPETフィルムを作製した。
【０２６３】
これらの記録媒体について、インクジェットプリンター（BJC−4301、キヤノン（株）製）を用いたて、ブラックおよびカラーの画像を印字し、それぞれインクのにじみ、ビーディングの有無を確認した。その結果、比較対照において、にじみやビーディングが極めて多く認められたのに対して、本発明の記録媒体にはにじみやビーディングがほとんど認められず、優れた画像が得られていた。
【０２６４】
（実施例１７）  記録媒体の作製
実施例１６と同様にPETフィルム（100Q80D、東レ（株）製）を１％グルタルアルデヒド溶液に１時間浸漬し、純水洗浄後、pYN2−C1組換え株由来のPHA合成酵素溶液（10U／ml）に30℃で30分間浸漬して、該酵素を固定化した。未反応のPHA合成酵素をPBSで洗浄して除去し、固定化酵素を得た。
【０２６５】
この酵素を固定化したPETフィルムを30 mM （R）−3−ヒドロキシオクタノイルCoA（Eur．J．Biochem．，250，432−439（1997）に記載の方法で調製）、0．1％ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）を含む0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）100質量部に浸漬した。次いで、30℃で緩やかに振盪しながらこの反応液に30 mM （R）−3−ヒドロキシピメリルCoA（J．Bacteriol．，182，2753−2760（2000） に記載の方法で調製）、0．1％ウシ血清アルブミン（Siｇma社製）を含む0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）をマイクロチューブポンプ（東京理化器械社製MP-3N）を用いて1分間に25質量部の割合で添加した。
【０２６６】
30分間振とう後、0．1 Mリン酸バッファー（pH7．0）で洗浄して、未反応物等を除去して風乾することによって、記録媒体を作製した。
【０２６７】
この記録媒体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（TOF−SIMS ＩＶ、CAMECA製）により測定した。得られたマススペクトルから、記録媒体表面は3−ヒドロキシピメリン酸と3−ヒドロキシオクタン酸の共重合体（モル比17：1）で構成されていることがわかった。また、イオンスパッタリングによりガラスシート表面を少しずつ削りながら同様にTOF−SIMSによりマススペクトルを測定していったところ、前記共重合体における3−ヒドロキシピメリン酸の組成比率が次第に減少し、3−ヒドロキシオクタン酸の組成比率が増加した。これより、本実施例の記録媒体は、表面を親水性官能基を有するポリヒドロキシピメレートで被覆し、その下を親水性官能基を有する3−ヒドロキシピメリン酸と疎水性官能基を有する3−ヒドロキシオクタン酸の共重合体によって、下層に至るにつれて3−ヒドロキシオクタン酸の組成比率を高めながら被覆した層をインク受容層とする、所望の記録媒体であることがわかった。
【０２６８】
この記録媒体について、実施例１６と同様にインクジェットプリンター（BJC−4301、キヤノン（株）製）を用いて、ブラックおよびカラーの画像を印字し、それぞれインクのにじみ、ビーディングの有無を確認し、実施例１６で作製した記録媒体の場合と比較した。その結果、本実施例の記録媒体は、実施例１６の記録媒体と比較して、インク受容層内部においてさらににじみが少なく、より鮮明な画像が得られることがわかった。これは、本実施例の記録媒体では、下層に至るにつれてPHA被膜が疎水的となるため、表面で吸収されたインクのインク受容層内部への拡散が徐々に抑制されるためだと考えられる。
【０２６９】
【発明の効果】
本発明の構造体は、粒状の構造体であれば、例えば電子写真用トナーなどとして用いるとにじみが少なく定着性の良い高品位な画像を得ることができる。一方、平板またはフィルム状の構造体を記録媒体として用いるとにじみのない良好な画像を得ることができる。
【０２７０】
【配列表】  SEQUENCE LISTING
<210> 1
<211> 1501
<212> DNA
<213> Pseudomonas jessenii 161 strain．
<400> 1
tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg atgacgggag cttgctcctg     60
aattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt    120
ctcgaaaggg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc    180
ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag    240
gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc    300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc    360
catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg    420
cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg    480
tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag    540
cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca    600
ttcaaaactg acaagctaga gtatggtaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa    660
atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctggact gatactgaca    720
ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa    780
acgatgtcaa ctagccgttg ggagccttga gctcttagtg gcgcagctaa cgcattaagt    840
tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca    900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac    960
atccaatgaa ctttccagag atggatgggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca   1020
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct   1080
tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg   1140
gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc   1200
tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc acaaaaccga   1260
tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc   1320
gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat   1380
gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggtt accacggtgt   1440
gattcatgac tggggtgaag tcgtaccaag gtagccgtag gggaacctgc ggctggatca   1500
c                                                                   1501
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgctggaact gatccagtac   20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gggttgagga tgctctggat gtg   23
<210> 4
<211> 1680
<212> DNA
<213> Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM P−17411
<400> 4
atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac    50
cttggggctt aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt   100
ctgctcgaat ggtgcttagg caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc   150
aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc aagaacgtac tgctgggtaa   200
atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc gatccggcct   250
ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg   300
cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga   350
tgtggcgcgt gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gccatggcgc   400
cgaccaacac cgcggccaac ccggcggcag tcaaacgctt tttcgaaacc   450
ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg cacctggcca aggatctggt   500
acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca ttcgaggtcg   550
gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg   600
ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc   650
gctgctggtg gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga   700
gcccggacaa gagcctggcg cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg   750
ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag gaacagcgag agtggggcct   800
gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgatgtc gttaccgcga   850
tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gcgcctgctc cggcggcatc   900
acttgcaccg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt   950
caacgccctg accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg  1000
atgttgccct gttcgtcaat gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac  1050
tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc gacatggcga aggtcttcgc  1100
ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc aacaattacc  1150
tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac  1200
accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa  1250
aaataaccca ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca  1300
tcgacctcaa gcaggtgacg gccgacatct tttccctggc cggcaccaac  1350
gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac aagtcggcgc aactgtttgg  1400
cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc cagagcatcc  1450
tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg  1500
gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc ataccgattc  1550
ctggtggctg cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga  1600
aaaagtcccc gacaaaactg ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg  1650
gcgccaggca cgtacgtgca cgaacggtaa                        1680
<210> 5
<211> 1683
<212> DNA
<213> Pseudomonas cichorii YN2 ; FERM P−17411
<400> 5
atgcgcgata aacctgcgag ggagtcacta cccacccccg ccaagttcat    50
caacgcacaa agtgcgatta ccggcctgcg tggccgggat ctggtttcga   100
ctttgcgcag tgtcgccgcc catggcctgc gccaccccgt gcacaccgcg   150
cgacacgcct tgaaactggg tggtcaactg ggacgcgtgt tgctgggcga   200
caccctgcat cccaccaacc cgcaagaccg tcgcttcgac gatccggcgt   250
ggagtctcaa tcccttttat cgtcgcagcc tgcaggcgta cctgagctgg   300
cagaagcagg tcaagagctg gatcgacgaa agcaacatga gcccggatga   350
ccgcgcccgt gcgcacttcg cgttcgccct gctcaacgat gccgtgtcgc   400
cgtccaacag cctgctcaat ccgctggcga tcaaggaaat cttcaactcc   450
ggcggcaaca gcctggtgcg cgggatcggc catctggtcg atgacctctt   500
gcacaacgat ggcttgcccc ggcaagtcac caggcatgca ttcgaggttg   550
gcaagaccgt cgccaccacc accggcgccg tggtgtttcg caacgagctg   600
ctggagctga tccaatacaa gccgatgagc gaaaagcagt attccaaacc   650
gctgctggtg gtgccgccac agatcaacaa gtactacatt tttgacctca   700
gcccccataa cagcttcgtc cagttcgcgc tcaagaacgg cctgcaaacc   750
ttcgtcatca gctggcgcaa tccggatgta cgtcaccgcg aatggggcct   800
gtcgacctac gtcgaagcgg tggaagaagc catgaatgtc tgccgggcaa   850
tcaccggcgc gcgcgaggtc aacctgatgg gcgcctgcgc tggcgggctg   900
accattgctg ccctgcaggg ccacttgcaa gccaagcgac agctgcgccg   950
cgtctccagc gcgacgtacc tggtgagcct gctcgacagc caactggaca  1000
gcccggccac actcttcgcc gacgaacaga ccctggaggc ggccaagcgc  1050
cgctcctacc agaaaggtgt gctggaaggc cgcgacatgg ccaaggtttt  1100
cgcctggatg cgccccaacg atttgatctg gagctacttc gtcaacaatt  1150
acctgatggg caaggagccg ccggcgttcg acattctcta ctggaacaat  1200
gacaacacac gcctgccggc cgccctgcat ggtgacttgc tggacttctt  1250
caagcacaac ccgctgagcc atccgggtgg cctggaagtg tgcggcaccc  1300
cgatcgactt gcaaaaggtc accgtcgaca gtttcagcgt ggccggcatc  1350
aacgatcaca tcacgccgtg ggacgcggtg tatcgctcaa ccctgttgct  1400
cggtggcgag cgtcgctttg tcctggccaa cagcggtcat gtgcagagca  1450
ttctcaaccc gccgaacaat ccgaaagcca actacctcga aggtgcaaaa  1500
ctaagcagcg accccagggc ctggtactac gacgccaagc ccgtcgacgg  1550
tagctggtgg acgcaatggc tgggctggat tcaggagcgc tcgggcgcgc  1600
aaaaagaaac ccacatggcc ctcggcaatc agaattatcc accgatggag  1650
gcggcgcccg ggacttacgt gcgcgtgcgc tga                    1683
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 6
ggaccaagct tctcgtctca gggcaatgg   29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 7
cgagcaagct tgctcctaca ggtgaaggc   29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 8
gtattaagct tgaagacgaa ggagtgttg   29
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 9
catccaagct tcttatgatc gggtcatgcc   30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 10
cgggatccag taacaagagt aacgatgagt     30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 11
cgatctcgag ttaccgttcg tgcacgtacg   30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 12
cgggatcccg cgataaacct gcgagggagt   30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for PCR multiplication
<400> 13
cgatctcgag gcgcacgcgc acgtaagtcc   30
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるカプセル構造体の外被のＧC−MS分析結果を示す図である。
【図２】実施例４におけるカプセル構造体の外被のＧC−MS分析結果を示す図である。
【図３】実施例５におけるカプセル構造体の外被のＧC−MS分析結果を示す図である。
【図４】実施例１１における積層構造体の被覆層のＧC−MS分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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